志賀トキソイドキメラタンパク質
本発明のキメラ志賀トキソイドは、酵素的に不活化されたＳｔｘＡサブユニット及び天然のＳｔｘＢサブユニットを含む。このハイブリッド志賀トキソイドは、免疫の後に、志賀毒素に対する交差反応性の広い抗体種の産生を誘導する。ＳｔｘＡサブユニットは、酵素的に不活性になるように改変される。すなわち、本発明は、志賀トキソイド又はその断片、及び志賀トキソイドの核酸配列又はその断片を包含する。本発明はさらに、志賀トキソイドの製造、志賀トキソイドを用いる抗体の製造、及び製造方法、並びに志賀トキソイドを含む免疫原性組成物を包含する。
【発明の詳細な説明】
【発明の分野】
【０００１】
本発明は、志賀毒素（Ｓｈｉｇａ ｔｏｘｉｎｓ）に対するワクチン接種に用いることができるキメラ志賀トキソイドに関する。
【０００２】
連邦政府の支援に対する謝辞：
本発明の一部分は、連邦政府助成金ＮＩＨ ＡＩ２０１４８−２３により資金を受けた研究に基づく。
【０００３】
関連出願：
本出願は、参照されることによりその全体が本明細書に組み込まれる、２００６年２月１６日に出願された米国仮出願第６０／７７３６５８号の利益を主張する。
【発明の背景】
【０００４】
米国において、志賀毒素（Ｓｔｘ）産生大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）（ＳＴＥＣ）は、感染性出血性下痢の最も一般的な原因であり（Ｒａｎｇｅｌら（２００５）、Ｅｍｅｒｇ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ．１１、６０３〜９）、年間約１１００００件の感染の原因である（Ｍｅａｄら（１９９９）、Ｅｍｅｒｇ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ．５、６０７〜２５）。Ｓｔｘ媒介疾患の大部分は、原型の血清型Ｏ１５７：Ｈ７を含むＳＴＥＣ、腸管出血性大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）、のサブセットが原因である。溶血尿毒症症候群（ＨＵＳ）は、特に最も脆弱な患者、すなわち小児及び老人の間で、溶血性貧血、血栓性血小板減少症、及び腎不全を特徴とするＳＴＥＣ（特にＯ１５７：Ｈ７）感染の重篤な後遺症である。ＨＵＳを経験した患者における致死率は５〜１０パーセントであり、生存者の間では腎臓の後遺症及び神経損傷の潜在性がある。ＳＴＥＣ感染の治療法は、対症療法、水分補給及び腎臓透析を含む（Ａｎｄｒｅｏｌｉら（２００２）、Ｐｅｄｉａｔｒ．Ｎｅｐｈｒｏｌ．１７、２９３〜８；Ｋｌｅｉｎら（２００２）、Ｊ．Ｐｅｄｉａｔｒ．１４１、１７２〜７；及びＴａｒｒら（２００５）、Ｌａｎｃｅｔ ３６５（９４６４）、１０７３〜８６）。現在、介入療法又はワクチンは利用可能でない。さらに、抗生物質治療は、大腸菌のＳｔｘをコードする毒素転換ファージの溶菌サイクルの誘導に起因し得るＨＵＳの危険性が増加することから禁忌である（Ｗｏｎｇら（２０００）、Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３４２、１９３０〜６）。
【０００５】
Ｓｔｘには２つの主な型がある。第１の型のメンバーである、志賀赤痢菌（Ｓ．ｄｙｓｅｎｔｅｒｉａｅ）１型により産生されるＳｔｘ、及び大腸菌により産生されるＳｔｘ１は、実質的に同一である。第２の型であるＳｔｘ２も大腸菌によりコードされる。しかし、これは、Ｓｔｘ１に対するポリクローナル抗血清により交差中和されず、その逆も同じである（Ｏ’Ｂｒｉｅｎら（１９８４）、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２２６（４６７５）、６９４〜６）。各Ｓｔｘ血清型のバリアントが存在する（例えばＳｔｘ１ｃ、Ｓｔｘ１ｄ、Ｓｔｘ２ｃ、Ｓｔｘ２ｄ、Ｓｔｘ２ｄ−活性化型、Ｓｔｘ２ｅ、Ｓｔｘ２ｆ）（Ｍｅｌｔｏｎ−Ｃｅｌｓａら（２００５）、ＥｃｏＳａｌ−Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ａｎｄ Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ：Ｃｅｌｌｕｌａｒ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、ＡＳＭ Ｐｒｅｓｓ、第８．７．８章）が、これらは、原型毒素に対するポリクローナル血清により中和可能なままである（Ｓｃｈｍｉｔｔら（１９９１）、Ｉｎｆｅｃｔ Ｉｍｍｕｎ ５９、１０６５〜７３；Ｌｉｎｄｇｒｅｎら（１９９４）、Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．６２、６２３〜３１）。Ｓｔｘは、ＡＢ５配置を有する複合ホロ毒素である。これらは、酵素活性（Ａ）サブユニットと、それぞれ約７．７ｋＤａで五量体を形成する５つの同一のＢタンパク質で構成される結合ドメイン（Ｂ）と、を有する。Ａサブユニットは、約３２ｋＤａタンパク質であり、これは、トリプシン又はフューリンによりＡ１サブユニット（約２７ｋＤａ）と、ジスルフィド結合を介して会合したままのＡ２ペプチド（約５ｋＤａ）と、に非対称に切断される。Ｓｔｘ１及びＳｔｘ２の成熟Ａ及びＢサブユニットは、それぞれ５５％及び６１％の同一性、並びに６８％及び７３％の類似性を有する。アミノ酸配列の違いに関わらず、ホロ毒素の結晶構造は著しく類似しており（Ｆｒａｓｅｒら（１９９４）、Ｎａｔ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．１、５９〜６４；Ｆｒａｓｅｒら（２００４）、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７９、２７５１１〜７）、これらの毒素は同じ作用機序を有する。Ａ１サブユニットは酵素活性領域であるＮ−グリコシダーゼを含み、これは、６０Ｓリボソーム由来の２８Ｓ ｒＲＮＡからアデノシン残基を除去する。この変更がタンパク質合成を停止させ、中毒になった細胞を死滅させる。Ａ２ペプチドは、Ｂ五量体を横切ってホロ毒素を非共有結合的に一緒につなぎとめる。Ｂの五量体は、真核細胞受容体グロボトリアオシルセラミド（Ｇｂ３）又はＧｂ４（Ｓｔｘ２ｅの場合）に結合する。
【０００６】
両方の型のＳｔｘに対して防御性があるワクチンを開発するための努力は、今のところ思うようになっていない。Ｓｔｘは非常に強力であり、ホロ毒素をワクチンとして利用するには酵素活性の不活性化が必要である。１つの選択肢は、Ｂサブユニットを用いて、Ｂ五量体のＧＢ３細胞受容体への結合を遮断する抗体を誘発することである。このアプローチは、ＳｔｘＢ１を用いて、Ｓｔｘ１曝露に対する防御を高めるのに成功しているが、ＳｔｘＢ２サブユニットを用いる免疫は、Ｓｔｘ２に対する防御においては効果がない。さらに、抗ＳｔｘＡ２モノクローナル抗体を用いるマウスの受動免疫は、Ｓｔｘ２産生株への感染の影響からマウスを防御するが、抗ＳｔｘＢ１モノクローナル抗体はこのような曝露に対して防御性がない（Ｗａｄｏｌｋｏｗｓｋｉら（１９９０）、Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．５８、２４３８〜４５；Ｌｉｎｄｇｒｅｎら（１９９３）、Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．６１、３８３２〜４２）。しかし、それぞれ抗ＳｔｘＢ１又は抗ＳｔｘＡ２での受動免疫を行うことにより、そうでなければ致死的である量のＳｔｘ１又はＳｔｘ２を注射されたマウスは防御される。ＳｔｘＡサブユニットの毒性は、Ｂ五量体結合ドメインなしでは大きく抑制され、ＳｔｘＡ１及びＳｔｘＡ２で構成されるワクチンがウサギにおいて同種毒素防御を提供するという証拠がある（Ｂｉｅｌａｓｚｅｗｓｋａら（１９９７）、Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．６５、２５０９〜１６）。しかし、安全性の観点から、ヒトにおいてＡサブユニットワクチンを用いるには酵素活性の不活化が必要であろう。ホロ毒素はサブユニットワクチンよりも防御抗体のより広いスペクトルを与えやすいという見通しから、サブユニットワクチンは一般にあまり望ましくない。
【０００７】
トキソイド（不活化ホロ毒素）ワクチンを用いる免疫による、毒素媒介疾患に対する防御は、破傷風及びジフテリアについて成功している。残念なことに、ホルムアルデヒド又はグルタルアルデヒドを用いるＳｔｘの化学的不活化は、残留毒性（Ｍｅｔｚら（２００３）、Ｖａｃｃｉｎｅ ２２、１５６〜６７；Ｇｏｒｄｏｎら（１９９２）、Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．６０、４８５〜９０）、又は中和抗体が作製されないか、低い力価になるような天然ホロ毒素構造の潜在的なゆがみ、をもたらし得る中途半端な化学的プロセスである。化学的に調製された志賀トキソイドを用いてワクチン接種された動物において、交差中和が達成されたことを示唆する文献報告がいくつかある（Ｂｉｅｌａｓｚｅｗｓｋａら（１９９７）、Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．６５、２５０９〜１６；Ｌｕｄｗｉｇら（２００２）、Ｃａｎ．Ｊ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．４８、９９〜１０３）。しかし、このような生命を脅かすワクチンの潜在的な毒性は、ヒトにおける化学的Ｓｔｘトキソイドの使用を排除する。化学的に誘導されるＳｔｘトキソイドよりも安全な代替物は、ＳｔｘＡサブユニット遺伝子に特定の変異を導入して酵素活性ドメインの重要なアミノ酸を改変することによる、遺伝的トキソイドの構築である。ハイブリッドＳｔｘ１及びＳｔｘ２毒素は、Ａ及びＢサブユニットの単一オペロンとしての発現を可能にするオペロン融合（Ｗｅｉｎｓｔｅｉｎら（１９８９）、Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．５７、３７４３〜５０）を始めとするＳｔｘの機能的研究のために作製されている（Ｈｅａｄら（１９９１）、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６６、３６１７〜３６２１；Ｗｅｉｎｓｔｅｉｎら、既出；Ｍｅｌｔｏｎ−Ｃｅｌｓａら（２００２）、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ ４３、２０７〜２１５）。致死的な結果をもたらすＳｔｘ１又はＳｔｘ２のいずれかの曝露から動物を防御する、Ｓｔｘ１又はＳｔｘ２の遺伝的トキソイドは、以前に作製されている（Ｇｏｒｄｏｎら（１９９２）、Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．６０、４８５〜９０；Ｉｓｈｉｋａｗａら（２００３）、Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｎｕｎ．７１、３２３５〜９；Ｗｅｎら（２００６）、Ｖａｃｃｉｎｅ ２４、１１４２〜８）。しかし、このような遺伝的トキソイドは、Ｓｔｘ１及びＳｔｘ２血清グループの間の交差中和の欠失を回避することができず、それらが作製されたＳｔｘグループに対してのみ防御する。今日まで、Ｓｔｘハイブリッドトキソイドが作製されたという文献報告はない。
【発明の概要】
【０００８】
本発明は、１つ又は複数の活性部位に１つ又は複数の改変を有する少なくとも１つのＳｔｘＡポリペプチド又はその断片と、少なくとも１つのＳｔｘＢポリペプチドと、を含むキメラタンパク質を包含する。いくつかの実施形態において、キメラタンパク質は、五量体として存在する。さらなる実施形態において、ＳｔｘＢポリペプチド又はその断片は、１つ又は複数の改変を含み、該１つ又は複数の改変はアミノ酸置換、付加及び／又は欠失である。いくつかの実施形態において、置換は保存的アミノ酸置換である。さらなる実施形態において、ＳｔｘＡポリペプチドは、ＳｔｘＡ２若しくはその断片であり、かつ／又はＳｔｘＢポリペプチドは、ＳｔｘＢ１若しくはその断片である。別の実施形態において、タンパク質は、配列番号２及び／又は３のアミノ酸配列を含むか、該アミノ酸配列からなる。
【０００９】
さらなる実施形態において、本発明のキメラタンパク質は、Ｓｔｘ２Ａポリペプチド又はその断片中の、残基７７、１６７又は１７０に相当するアミノ酸残基での１つ又は複数の改変を含む。いくつかの実施形態において、残基７７での改変はセリン残基への置換であり、残基１６７での改変はグルタミン、アスパラギン又はその他のアミノ酸残基への置換であり、残基１７０での改変はロイシン残基への置換である。いくつかの実施形態において、改変は、本明細書に記載のＳｔｘ２Ａポリペプチドの酵素活性を減少させるか、消失させることができる。他の実施形態において、改変は、タンパク質を哺乳動物にとって無毒化する。
【００１０】
本発明はまた、本明細書に記載の本発明のキメラトキソイドタンパク質に結合する単離抗体を包含する。いくつかの実施形態において、抗体はポリクローナル抗体である。本発明はまた、本明細書に記載の１つ又は複数の本発明のキメラトキソイドタンパク質のいずれかを含む組成物を包含する。いくつかの実施形態において、キメラタンパク質は、これに限定されないが、志賀毒素に対する免疫原性応答を含む免疫原性応答を誘導可能なものである。いくつかの実施形態において、組成物は、１つ又は複数の薬学的に許容される担体及び／又はアジュバントをさらに含む。別の実施形態において、組成物はヒトへの投与に適する。
【００１１】
本発明は、本明細書に記載の本発明のキメラトキソイドタンパク質をコードする単離核酸分子をさらに包含する。いくつかの実施形態において、単離核酸分子は、配列番号２及び／又は３を含むアミノ酸配列をコードする。さらなる実施形態において、核酸分子は、配列番号１のヌクレオチド配列を含むか、又はそのヌクレオチド配列からなる。いくつかの実施形態において、ヌクレオチド配列は、配列番号１の連続したヌクレオチド配列と少なくとも９０％、９５％又は９９％までもの配列同一性を示し、かつＳｔｘに対する免疫原性応答を誘導可能なポリペプチドをコードする。
【００１２】
本発明は、本明細書に記載の本発明の核酸を含むように形質転換された宿主細胞を包含し、また、単離核酸を含むベクターを包含する。本発明はまた、前記ベクターを含む宿主細胞を包含する。いくつかの実施形態において、宿主は、原核生物宿主及び真核生物宿主からなる群より選択される。本発明は、本発明の核酸分子で形質転換された宿主細胞を、前記核酸分子によりコードされるタンパク質が発現される条件下で培養するステップを含む、ポリペプチドを製造する方法をさらに包含する。
【００１３】
本発明は、本明細書に記載の本発明のキメラトキソイドタンパク質を、哺乳動物又は細胞培養物に投与するステップを含む、Ｓｔｘに結合可能な抗体を作製する方法を包含する。本発明は、本発明のキメラトキソイドタンパク質を含む組成物を哺乳動物に投与するステップを含む、Ｓｔｘに結合可能な抗体を作製する方法をさらに包含する。いくつかの実施形態において、哺乳動物はヒトである。さらなる実施形態において、ヒトは、下痢及び／又は溶血尿毒症症候群に罹患している。
【００１４】
本発明はまた、本発明のキメラトキソイドタンパク質を含む組成物を投与するステップを含む、ヒトにおける溶血尿毒症症候群を予防する方法を包含する。本発明は、前記組成物を投与するステップを含む、ヒトにおける志賀毒素産生大腸菌感染に関連する下痢を予防する方法を包含する。本発明は、これらの方法のいずれかにより製造された単離抗体、及び該抗体を含むキットを包含する。いくつかの実施形態において、キットは、１つ又は複数の本発明のキメラトキソイドタンパク質をさらに含む。
【詳細な説明】
【００１５】
Ｓｔｘ及び溶血尿毒症症候群（ＨＵＳ）に対する免疫の目標は、これに限定されないが、Ｓｔｘ１及び２、並びにＳｔｘ１及びＳｔｘ２のバリアントを含む複数の型のＳｔｘに対して広く反応性がある中和抗体応答（ＮＡ）を誘導することである。本発明者らは、Ｓｔｘ産生大腸菌（ＳＴＥＣ）を研究し、このハイブリッドトキソイド中の１つ又は複数の部位での改変を有するキメラ志賀トキソイドの創出により、免疫の後に、Ｓｔｘに対する交差反応性の広い抗体種の産生が誘導されることを見出した。すなわち、本発明は、キメラ志賀トキソイド、使用方法及び組成物を包含する。本明細書において、「トキソイド」とは、不活化されたホロ毒素のことである。本明細書において、「酵素不活化ＳｔｘＡ２サブユニット」とは、例えば置換、付加及び／又は欠失のような変異によりその機能を失ったＳｔｘＡ２サブユニットのことである。
【００１６】
志賀トキソイドキメラタンパク質及び使用方法：
本発明は、酵素不活化ＳｔｘＡ２サブユニットと天然のＳｔｘＢ１サブユニットとを含むキメラ志賀トキソイドタンパク質を包含する。ＳｔｘＡ２サブユニットは、部位特異的突然変異誘発により単独又は組合せで１つ又は複数の部位にて不活化されている。いくつかの実施形態において、アミノ酸は欠失されており、いくつかの実施形態においては、アミノ酸は置換されている。欠失及び／又は置換にも関わらず、ＳｔｘＡ２サブユニットの立体配座は、哺乳動物への投与の後に、Ｓｔｘの多様なサブユニットに対する抗体を誘導できるように十分に損なわれないままである。改変されたキメラトキソイドで免疫される哺乳動物（例えば、ヒト及び／又はマウス。これらに限定されない。）は、免疫応答を生じ、これがＨＵＳ又はＳＴＥＣ感染若しくはＳｔｘ中毒のその他の影響を減少させるか、遮断する。
【００１７】
ＳｔｘＡ２タンパク質中の適切な置換部位の例としては、これらに限定されないが、配列番号２の残基７７、１６７及び１７０に相当するＳｔｘＡ２のアミノ酸が挙げられる。置換は、Ｙ７７Ｓ、Ｅ１６７Ｑ及びＲ１７０Ｌ又はその等価物であってもよい。本発明のある実施形態において、本発明は、配列番号２及び３に示すアミノ酸配列並びにそれらの断片を含む。本発明の別の実施形態において、本発明は、配列番号２及び／又は３に示すアミノ酸配列並びにその断片の、酵素不活化ＳｔｘＡ２サブユニット及び天然ＳｔｘＢ１サブユニットを含むキメラ志賀トキソイドを包含する。
【００１８】
本発明のある実施形態において、ＳｔｘＢ１サブユニットは、ＧＢ３受容体に結合しないか、又はＧＢ３受容体への結合が制限されているが、防御抗体応答を誘発可能である。
【００１９】
本発明は、少なくとも１つの志賀トキソイドタンパク質と少なくとも１つの第２のポリペプチドとを含む、キメラ及び／又は融合ポリペプチド並びにその塩を含む。ある実施形態において、第２のポリペプチドは、第２の型のＳｔｘを含む。
【００２０】
第２のポリペプチドは、融合ポリペプチドの半減期をｉｎ ｖｉｔｒｏ及びｉｎ ｖｉｖｏで増大させる安定化ドメインも含み得る。本明細書において、「安定化ドメイン」とは、志賀トキソイド単独と比較したときに、志賀トキソイドのｉｎ ｖｉｔｒｏ及びｉｎ ｖｉｖｏでの半減期を延長可能なアミノ酸配列のことをいう。安定化ドメインは、ヒト血清アルブミン、トランスフェリンのようなヒトタンパク質（例えば細胞外断片からの全長又は短縮された可溶性タンパク質など）、又はキメラトキソイドタンパク質のｉｎ ｖｉｖｏ又はｉｎ ｖｉｔｒｏでの半減期を安定化するその他のタンパク質を含み得る。これらの付加的な機能的ドメインは、それら自体で、例えば志賀トキソイドを第２のタンパク質に接続するためのリンカーペプチドとして働いてもよい。或いは、これらは、融合分子の他の場所（例えば、そのアミノ又はカルボキシ末端）に位置してもよい。他の実施形態において、安定化ドメインは、化学的部分（ｃｈｅｍｉｃａｌ ｍｏｉｅｔｙ）（例えば、ＰＥＧ（ポリエチレングリコール）又はデキストラン）である。
【００２１】
本明細書において、「キメラ」又は「融合ポリペプチド」とは、（ｉ）所定の機能的ドメイン（すなわち志賀トキソイド）が、そのカルボキシ末端にて、非共有結合により、第２のタンパク質（すなわち第２の志賀トキソイド）のアミノ末端又はそれ自体が非共有結合により第２のタンパク質のアミノ末端に結合するリンカーペプチドのいずれかに結合し、（ｉｉ）所定の機能的ドメイン（すなわち志賀トキソイド）が、そのアミノ末端にて、非共有結合により、第２のタンパク質（すなわち第２の志賀トキソイド）のカルボキシ末端又はそれ自体が非共有結合により第２のタンパク質のカルボキシ末端に結合するリンカーペプチドのいずれかに結合し、及び／又は（ｉｉｉ）Ｓｔｘが本明細書に記載のＡＢ５配置を有し、酵素活性（Ａ）サブユニットと、五量体を形成する５つの同一のＢタンパク質で構成される結合ドメイン（Ｂ）と、を有する複合ホロ毒素として存在するポリペプチドのことをいう。
【００２２】
同様に、本発明の核酸中間体に関連して用いる場合、「融合」は、タンパク質をコードするヌクレオチド配列の３’−［又は５’−］末端が、第２のタンパク質をコードするヌクレオチド配列のそれぞれの３’−［又は５’−］末端に、共有結合により、又はそれ自体が第１機能的ドメインをコードするポリヌクレオチドと所望により第２機能的ドメインをコードする核酸に好ましくはその末端にて共有結合するヌクレオチドリンカーを介して間接的に、結合していることを意味する。
【００２３】
本発明のキメラ又は融合ポリペプチドの例は、これらに限定されないが、下記式により表され得る。
Ｒ１−Ｌ−Ｒ２ （ｉ）
Ｒ２−Ｌ−Ｒ１ （ｉｉ）
Ｒ１−Ｌ−Ｒ２−Ｌ−Ｒ１ （ｉｉｉ）
Ｒ１−Ｌ−Ｒ１−Ｌ−Ｒ２ （ｉｖ）
Ｒ２−Ｌ−Ｒ１−Ｌ−Ｒ１ （ｉｖ）
式中、Ｒ１は第１志賀トキソイドのアミノ酸配列であり、Ｒ２は第２志賀トキソイド又は安定化ドメイン（例えばヒト血清アルブミン）のアミノ酸配列であり、それぞれのＬは、Ｒ１及び／又はＲ２の末端に共有結合により結合するリンカーペプチドである（ここで、上記の分子断片は、方向付けて読まれる。すなわち、左側は分子のアミノ末端に、右側はカルボキシ末端に相当する）。別の実施形態において、インチミン結合ドメイン（カルボキシ末端）を含むインチミンタンパク質（Ｃａｒｖａｌｈｏら（２００５）、Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．７３、２５４１〜２５４６）の全て又は一部分はＲ１であり、Ｒ２はキメラトキソイドタンパク質である。
【００２４】
核酸分子及び使用方法：
本発明は、酵素不活化ＳｔｘＡ２サブユニットと天然ＳｔｘＢ１サブユニットとを有するキメラタンパク質又はその断片を含む本発明のキメラ志賀トキソイドタンパク質をコードする、好ましくは単離された形の核酸分子をさらに提供する。本明細書において、「核酸」とは、上記で定義されるタンパク質又はペプチドをコードするか、このようなペプチドをコードする核酸配列に相補的であるか、酵素不活化ＳｔｘＡ２サブユニットと天然ＳｔｘＢ１サブユニットとをコードする核酸分子にオープンリーディングフレームにわたって適切なストリンジェンシー条件下でハイブリダイズするか、又は不活化ＳｔｘＡ２と少なくとも約６５％の同一性及びＳｔｘＢ１と約９１％の同一性、若しくは不活化ＳｔｘＡ２と少なくとも約９０％の同一性及びＳｔｘＢ１と約９１％の同一性、若しくは不活化ＳｔｘＡ２と少なくとも約９９％の同一性及びＳｔｘＢ１と約９５％の同一性、若しくは不活化ＳｔｘＡ２と少なくとも９９．４％の同一性及びＳｔｘＢ１と約９９％の同一性を有するポリペプチドをコードするＲＮＡ又はＤＮＡとして定義される。
【００２５】
本発明の核酸は、配列番号２及び／又は３を含む酵素不活化ＳｔｘＡ２サブユニット及び天然ＳｔｘＢ１サブユニットを含むキメラ志賀トキソイドをコードする核酸分子の連続したヌクレオチド配列と、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％又はそれより高い同一性を有する核酸分子、をさらに含む。
【００２６】
本発明のいくつかの実施形態において、核酸分子は、例えばＳｔｘＡ２タンパク質（配列番号２）のアミノ酸残基７７、１６７及び１７０をコードするコドンのように、適切な置換部位をコードするコドンにおけるＳｔｘＡ２遺伝子のコード領域内に、二重又は三重の塩基置換を含む。
【００２７】
別の実施形態において、核酸分子は、ＳｔｘＢ１タンパク質が腎臓細胞と（例えば宿主細胞のＧＢ３受容体を介して）相互作用するのを妨げる改変（例えば置換、付加及び／又は欠失）を、ＳｔｘＢ１遺伝子のコード領域内に含む。ある実施形態において、このような改変は、ＳｔｘＢ１タンパク質のアミノ酸残基１６及び／又は１７をコードする１つ又は複数のコドンにある。これらの改変は、Ｄ１６Ｈ及びＤ１７Ｈ又はその等価物のアミノ酸置換を増加させ得る。別の実施形態において、このような改変は、ＳｔｘＢ１タンパク質のアミノ酸残基３３、４３及び／又は６０をコードする１つ又は複数のコドンにある。これらの改変は、Ｒ３３Ｃ、Ａ４３Ｔ及びＧ６０Ｄ又はその等価物のアミノ酸置換を増加させ得る。さらに別の実施形態において、このような改変は、ＳｔｘＢ１のアミノ酸残基１６及び／又は１７をコードする１つ又は複数のコドンと、ＳｔｘＢ１タンパク質のアミノ酸残基３３、４３及び／又は６０をコードする１つ又は複数のコドンとにある。これらの改変は、Ｄ１６Ｈ及びＤ１７Ｈ又はその等価物のアミノ酸置換と、Ｒ３３Ｃ、Ａ４３Ｔ及びＧ６０Ｄ又はその等価物のアミノ酸置換と、を増加させ得る。
【００２８】
特に企図されているのは、ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ｍＲＮＡ及びアンチセンス分子、並びに代替骨格をベースとするか代替塩基を含む核酸（天然の供給源に由来するか、合成のものか、は問わない。）である。しかし、そのような核酸は、本発明のタンパク質をコードする核酸、該核酸と適切なストリンジェンシー条件下でハイブリダイズする核酸、又は該核酸に相補的である核酸、を含むいずれの従来の核酸に対しても、さらに、新規かつ非自明であるものとする。ヌクレオチド又はアミノ酸配列のレベルでの相同性又は同一性は、配列類似性検索のために作られたｂｌａｓｔｐ、ｂｌａｓｔｎ、ｂｌａｓｔｘ、ｔｂｌａｓｔｎ及びｔｂｌａｓｔｘ（Ａｌｔｓｃｈｕｌら（１９９７）、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２５、３３８９〜３４０２；及びＫａｒｌｉｎら（１９９０）、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８７、２２６４〜２２６８。ともに、参照されることによりその全体が本明細書に組み込まれる。）のプログラムにより採用されるアルゴリズムを用いるＢＬＡＳＴ（Ｂａｓｉｃ Ｌｏｃａｌ Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ Ｓｅａｒｃｈ Ｔｏｏｌ）分析により決定される。ＢＬＡＳＴプログラムにより用いられるアプローチは、まず、問合せ配列とデータベース配列との間のギャップの存否での類似セグメントを考慮し、次に、同定された全ての一致の統計的有意性を評価し、最後に、有意性の予め選択した閾値を満足する一致のみをまとめることである。配列データベースの類似性検索における基本的な問題の論説については、Ａｌｔｓｃｈｕｌら（１９９４）、Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ６、１１９〜１２９（参照されることによりその全体が本明細書に組み込まれる。）を参照されたい。ヒストグラム、表示、アラインメント、期待値（すなわち、データベース配列に対する一致を報告するための統計的有意性の閾値）、カットオフ、行列及びフィルタ（低い複雑度）のついての検索パラメータは初期設定である。ｂｌａｓｔｐ、ｂｌａｓｔｘ、ｔｂｌａｓｔｎ及びｔｂｌａｓｔｘにより用いられる初期設定のスコア行列は、長さ８５（ヌクレオチド塩基）を超える問合せ配列に推奨されるＢＬＯＳＵＭ６２行列（Ｈｅｎｉｋｏｆｆら（１９９２）、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８９、１０９１５〜１０９１９。参照されることによりその全体が本明細書に組み込まれる。）である。
【００２９】
ｂｌａｓｔｎについて、スコア行列は、Ｍ（すなわち一致残基の対についてのリワードスコア）のＮ（すなわち不一致残基についてのペナルティスコア）に対する比（ここで、Ｍ及びＮについての初期設定値はそれぞれ＋５及び−４である）により設定される。ｂｌａｓｔｎについての４つのパラメータは、以下のようにして調節した：Ｑ＝１０（ギャップ生成ペナルティ）；Ｒ＝１０（ギャップ伸長ペナルティ）；ｗｉｎｋ＝１（問合せに沿ってｗｉｎｋ番目の位置ごとにワードヒットを作製する）；及びｇａｐｗ＝１６（ギャップを含むアラインメントを作製する範囲内でウィンドウ幅を設定する）。等価なＢｌａｓｔｐパラメータ設定は、Ｑ＝９；Ｒ＝２；ｗｉｎｋ＝１及びｇａｐｗ＝３２であった。ＧＣＧパッケージバージョン１０．０で利用可能な配列間のＢｅｓｔｆｉｔ比較は、ＤＮＡパラメータＧＡＰ＝５０（ギャップ生成ペナルティ）及びＬＥＮ＝３（ギャップ伸長ペナルティ）を用い、タンパク質比較における等価な設定は、ＧＡＰ＝８及びＬＥＮ＝２である。
【００３０】
「ストリンジェントな条件」とは、（１）低イオン強度及び高温を洗浄に用いる（例えば、５０℃〜６８℃で、０．０１５Ｍ ＮａＣｌ／０．００１５Ｍクエン酸ナトリウム／０．１％ ＳＤＳを用いる）か、或いは（２）ハイブリダイゼーション時にホルムアルデヒドのような変性剤を用いる（例えば、５０％（体積／体積）ホルムアルデヒドを、０．１％ウシ血清アルブミン／０．１％フィコール／０．１％ポリビニルピロリドン／５０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６．５）（７５０ｍＭ ＮａＣｌ、７５ｍＭクエン酸ナトリウムを含む。）とともに４２℃で用いる）条件である。別の例としては、５０％ホルムアルデヒド、５×ＳＳＣ（０．７５Ｍ ＮａＣｌ、０．０７５Ｍクエン酸ナトリウム）、５０ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ６．８）、０．１％ピロリン酸ナトリウム、５×デンハルト溶液、超音波処理サケ精子ＤＮＡ（５０μｇ／ｍｌ）、０．１％ ＳＤＳ、１０％硫酸デキストラン中、４２℃でのハイブリダイゼーションと、０．２×ＳＳＣ、０．１％ ＳＤＳ中、４２℃、又は０．１×ＳＳＣ、０．５％ ＳＤＳ中、６８℃での洗浄と、を行うことが挙げられる。当業者であれば、容易に、ストリンジェンシー条件を適宜決定、変更して、明確で検出可能なハイブリダイゼーションシグナルを得ることができる。好ましい分子は、配列番号１の相補鎖に上記の条件下でハイブリダイズし、機能的タンパク質をコードするものである。さらに好ましいハイブリダイジング分子は、酵素不活化ＳｔｘＡ２サブユニットと天然ＳｔｘＢ１サブユニットとを含むキメラ志賀トキソイドをコードする核酸のオープンリーディングフレームの相補鎖に、上記の条件下でハイブリダイズするものである。本明細書において、核酸分子が他のポリペプチドをコードする混入核酸分子から実質的に分離されている場合、核酸分子は「単離された」という。
【００３１】
酵素不活化ＳｔｘＡ２サブユニットと天然ＳｔｘＢ１サブユニットとを含むキメラ志賀トキソイドをコードする核酸分子は、オペロンの一部分である。本発明のある実施形態は、酵素不活化ＳｔｘＡ２サブユニットをコードする核酸と、続いて、ＳｔｘＢ１の翻訳のためのリボソーム結合部位を含む天然ｓｔｘＢ１遺伝子間領域をコードする核酸分子と、次いで、天然ＳｔｘＢ１をコードする核酸分子とで構成される融合オペロンである。
【００３２】
本発明は、酵素不活化ＳｔｘＡ２サブユニットと天然ＳｔｘＢ１サブユニットとを含むキメラ志賀トキソイドを含む核酸分子をコードする断片をさらに提供する。本明細書において、コード核酸分子の断片とは、全体のタンパク質コード配列の小さい部分のことをいう。断片のサイズは、目的の用途により決定される。例えば、推定抗原領域に相当するペプチドをコードする断片を調製してもよい。断片が、核酸プローブ又はＰＣＲプライマーとして用いられる場合、断片の長さは、プローブ付加／プライマー結合の間の偽陽性を比較的少数にするように選択される。
【００３３】
本発明のタンパク質をコードする遺伝子配列を合成するために用いられる本発明の核酸分子をコードする断片（すなわち合成オリゴヌクレオチド）は、例えば、Ｍａｔｔｅｕｃｃｉら（１９８１）、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１０３、３１８５〜３１９１のホスホトリエステル法のような化学的手法により、又は自動合成法を用いて容易に合成できる。さらに、より大きいＤＮＡセグメントは、遺伝子の種々のモジュラーセグメントを規定するオリゴヌクレオチドの群の合成、続いて、オリゴヌクレオチドの連結による完全改変遺伝子の構築のような公知の方法により容易に調製できる。ある実施形態において、本発明の核酸分子は、少なくとも約１２５３ヌクレオチドの連続したオープンリーディングフレームを含み、この配列は、最適化されたシャイン−ダルガルノ配列で始まり、ｓｔｘＢ１停止コドンの後に終結する。
【００３４】
本発明のコード核酸分子は、診断及びプローブ目的の検出可能な標識を含むようにさらに改変されてもよい。本発明のコード核酸分子は、単離用の標識を含むようにさらに改変（例えば、ニッケルアフィニティー精製で用いるヒスチジン分子をコードする反復コドンを付加）してもよい。このような多様な標識は、当技術分野において知られており、本明細書に記載のコード分子とともに容易に用い得る。適切な標識としては、これらに限定されないが、例えば、ビオチン、放射性標識ヌクレオチドが挙げられる。当業者であれば、容易に、そのような標識を用いて、本発明の核酸分子の標識されたバリアントを得ることができる。翻訳の間にタンパク質配列中へ組み込まれるアミノ酸の欠失、付加又は変更による１次構造自体の改変は、タンパク質の活性を破壊することなく行い得る。
【００３５】
ある実施形態において、６ヒスチジンタグを天然又はわずかに改変されたＳｔｘＢ１タンパク質のＣ末端に付加して、例えばニッケルアフィニティー法によるＳｔｘＡ２／ＳｔｘＢ１トキソイドの精製を補助する。別の実施形態において、６ヒスチジンタグを天然又はわずかに改変されたＳｔｘＢ１タンパク質のＣ末端に付加し、６ヒスチジンタグをＳｔｘＡ２タンパク質にも付加する。ＳｔｘＡ２タンパク質中のヒスチジンタグは、ＳｔｘＡ２の２４４及び２４５位に存在する２つのヒスチジンのすぐ近傍に位置してもよい。ヒスチジンタグは、例えばＱ２４６Ｈ、Ｇ２４７Ｈ、Ａ２４８Ｈ及びＲ２４９Ｈのように、ＳｔｘＡ２タンパク質中の４つ以下のアミノ酸を変化させることにより付加してもよい。有利には、ＳｔｘＡ２及びＳｔｘＢ１サブユニットへのそれぞれのタグ付加は、ニッケルアフィニティーカラム精製と組み合わせてイオン交換及びサイズ排除精製手法を用いる、サブユニットのよりよい精製を可能にする。
【００３６】
組換え核酸及び使用方法：
本発明は、キメラ酵素不活化ＳｔｘＡ２サブユニット及び天然ＳｔｘＢ１サブユニットのコード配列を含む組換え核酸分子（例えば、ＤＮＡ、ＲＮＡ）をさらに提供する。本明細書において、「組換え核酸分子」は、ｉｎ ｓｉｔｕでの分子操作に供された核酸分子である。組換え核酸分子を作製する方法は、当技術分野で公知であり、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら（２００１）、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ−Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓを参照されたい。好ましい組換え核酸分子において、コードヌクレオチド配列は、発現調節配列及び／又はベクター配列に操作可能に連結している。
【００３７】
本発明のタンパク質ファミリーコード配列の１つが操作可能に連結しているベクター及び／又は発現調節配列の選択は、当技術分野において知られているように、所望の機能的特性、例えばタンパク質発現、及び形質転換される宿主細胞に直接依存する。本発明が意図するベクターは、組換え核酸分子に含まれる構造遺伝子の複製又は宿主染色体への挿入、及び好ましくは発現をも、少なくとも支配し得る。
【００３８】
操作可能に連結されたタンパク質コード配列の発現を調節するために用いられる発現制御要素は、当技術分野において知られており、これらに限定されないが、誘導性プロモーター、構成性プロモーター、分泌シグナル、及びその他の調節要素を含む。好ましくは、誘導性プロモーターは、宿主細胞の培地中の栄養素に応答性であるように、容易に制御される。
【００３９】
ある実施形態において、コード核酸分子を含むベクターは、原核生物レプリコン、すなわち自律複製及び形質転換される細菌宿主細胞のような原核生物宿主細胞内の染色体外での組換えＤＮＡ分子の維持を支配し得る能力を有するＤＮＡ配列を含む。このようなレプリコンは、当技術分野において公知である。さらに、原核生物レプリコンを含むベクターは、その発現が薬剤耐性のような検出可能なマーカーを与える遺伝子も含んでもよい。典型的な細菌薬剤耐性遺伝子は、アンピシリン又はテトラサイクリンへの耐性を与えるものである。
【００４０】
原核生物レプリコンを含むベクターは、大腸菌のような細菌宿主細胞におけるコード遺伝子配列の発現（転写及び翻訳）を支配し得る原核生物又はバクテリオファージのプロモーターをさらに含み得る。プロモーターは、ＲＮＡポリメラーゼの結合と、転写の開始を可能にするＤＮＡ配列により形成される発現制御要素である。細菌宿主に適合するプロモーター配列は、本発明のＤＮＡセグメントの挿入のための簡便な制限部位を含むプラスミドベクターに、典型的には提供される。このようなベクタープラスミドの典型的な例は、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＩＩ ＫＳ（−）（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）、ｐＴｒｃＨｉｓ２Ｃ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、ｐＵＣ８、ｐＵＣ９、ｐＢＲ３２２及びｐＢＲ３２９（ＢｉｏＲａｄ）、ｐＰＬ及びｐＫＫ２２３（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）である。
【００４１】
真核細胞に適合する発現ベクター、好ましくは脊椎動物細胞に適合するものを用いても、コード配列を含む組換え核酸分子を形成できる。ウイルスベクターを含む真核細胞発現ベクターは、当技術分野において公知であり、いくつかの商業的供給元から入手可能である。典型的には、このようなベクターは、所望のＤＮＡセグメントの挿入のための簡便な制限部位を含んで提供される。このようなベクターの典型は、ｐＳＶＬ及びｐＫＳＶ−１０（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）、ｐＢＰＶ−１／ｐＭＬ２ｄ（Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｉｎｃ．）、ｐＴＤＴ１（ＡＴＣＣ）、本明細書に記載のベクターｐＣＤＭ８などの真核生物発現ベクターである。
【００４２】
本発明の組換え核酸分子を構築するために用いられる真核細胞発現ベクターは、真核細胞で効果がある選択可能なマーカー、好ましくは薬剤耐性選択マーカーをさらに含んでもよい。好ましい薬剤耐性マーカーは、その発現がネオマイシン耐性をもたらす遺伝子、すなわちネオマイシンホスホトランスフェラーゼ（ｎｅｏ）遺伝子である（Ｓｏｕｔｈｅｒｎら（１９８２）、Ｊ．Ｍｏｌ．Ａｎａｌ．Ｇｅｎｅｔ．１、３２７〜３４１）。或いは、選択可能なマーカーは、別のプラスミド上に存在することができ、２つのベクターが宿主細胞の同時トランスフェクションにより導入され、選択可能なマーカーについての適切な薬剤中で培養することにより選択される。本発明は、本発明のタンパク質をコードする核酸分子で形質転換された宿主細胞をさらに提供する。宿主細胞は、原核生物又は真核生物のいずれかであり得る。
【００４３】
本発明のキメラタンパク質の発現に有用な真核細胞は、細胞株が細胞培養法と適合し、発現ベクターの伝播及び遺伝子産物の発現に適合する限り限定されない。適切な真核生物宿主細胞としては、これらに限定されないが、酵母、昆虫及び哺乳動物細胞、好ましくは脊椎動物細胞（例えば、マウス、ラット、サル又はヒトの細胞株由来のもの）が挙げられる。真核生物宿主細胞の例は、ＡＴＣＣからＣＣＬ６１として入手可能なチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、ＡＴＣＣからＣＲＬ１６５８として入手可能なＮＩＨスイスマウス胚細胞（ＮＩＨ−３Ｔ３）、ハムスター仔腎臓細胞（ＢＨＫ）などの真核生物組織培養細胞株を含む。
【００４４】
本発明のキメラタンパク質をコードする組換え核酸分子を発現するために、いずれの原核生物宿主も用い得る。ある実施形態において、原核生物宿主は、ＤＨ５α又はＢＬ２１株のような大腸菌である。別の実施形態において、原核生物宿主は、フレクスナー赤痢菌（Ｓｈｉｇｅｌｌａ ｆｌｅｘｎｅｒｉ）（Ｂａｒｒｙら（２００３）、Ｖａｃｃｉｎｅ ２１、３３３〜４０）又はコレラ菌（Ｖ．ｃｈｏｌｅｒａｅ）（Ｌｅｙｔｅｎら（２００５）、Ｖａｃｃｉｎｅ ２３、５１２０〜５１２６）のような生弱毒口腔細菌ワクチン株である。
【００４５】
本発明のｒＤＮＡ分子を用いる適切な細胞宿主の形質転換は、用いられるベクターの型と採用する宿主系に典型的に依存する公知の方法により達成される。原核生物宿主細胞の形質転換について、エレクトロポレーション及び塩処理法が典型的に用いられ、例えばＣｏｈｅｎら（１９７２）、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ６９、２１１０；及びＳａｍｂｒｏｏｋら（２００１）、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ−Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓを参照されたい。ｒＤＮＡを含むベクターを用いる脊椎動物細胞の形質転換について、エレクトロポレーション、カチオン脂質又は塩処理法が典型的に用いられ、たとえばＧｒａｈａｍら（１９７３）、Ｖｉｒｏｌ．５２、４５６；Ｗｉｇｌｅｒら（１９７９）、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ７６、１３７３〜１３７６を参照されたい。
【００４６】
形質転換が成功した細胞、すなわち本発明の組換え核酸分子を含む細胞は、選択可能なマーカーの選択を含む公知の方法により同定することができる。例えば、本発明の組換え核酸の導入により得られる細胞は、クローン化して、単一のコロニーを産生することができる。これらのコロニーからの細胞を採集し、溶解し、それらの核酸含量を、Ｓｏｕｔｈｅｒｎ（１９７５）、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．９８、５０３〜５０４又はＢｅｒｅｎｔら（１９８５）、Ｂｉｏｔｅｃｈ．３、２０８〜２０９に記載の方法のような方法を用いて、組換え核酸の存在について調べ、或いは細胞から産生されるタンパク質を免疫学的方法によりアッセイすることができる。
【００４７】
組換えタンパク質の製造：
当業者であれば、本発明のキメラ志賀トキソイドをコードする組換え核酸分子をどのように作製するか、が分かるであろう。さらに、当業者であれば、これらの組換え核酸分子を用いて、それによりコードされるタンパク質をどのように得るか（これは、ハイブリッド志賀トキソイドをコードする組換え核酸分子について、本明細書に記載されている）、が分かるであろう。
【００４８】
本発明では、ハイブリッド志賀トキソイドの発現のための多くのベクター系を採用することができる。例えば、あるクラスのベクターは、ウシパピローマウイルス、ポリオーマウイルス、アデノウイルス、ワクシニアウイルス、バキュロウイルス、レトロウイルス（ＲＳＶ、ＭＭＴＶ又はＭｏＭＬＶ）、セムリキ森林ウイルス又はＳＶ４０ウイルスのような動物ウイルスに由来するＤＮＡ要素を利用する。さらに、それらの染色体にＤＮＡを安定に組み込んだ細胞は、トランスフェクトされた宿主細胞の選択を可能にする１つ又は複数のマーカーを導入することにより選択することができる。マーカーは、例えば、栄養要求宿主に対する原栄養性、殺生物剤耐性（例えば、抗生物質）、又は銅のような重金属に対する耐性を提供するものであってもよい。選択可能なマーカー遺伝子は、発現されるＤＮＡ配列に直接連結するか、又は同時形質転換により同じ細胞に導入することができる。ｍＲＮＡの最適な合成のために、さらなる要素を要求してもよい。そのような要素としては、スプライシングシグナルの他、転写プロモーター、エンハンサー及び終結シグナルが挙げられる。そのような要素を組み込んだｃＤＮＡ発現ベクターとしては、Ｏｋａｙａｍａ（１９８３）、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．３、２８０〜２８９に記載のものが挙げられる。
【００４９】
ハイブリッド志賀トキソイドは、（ａ）細胞を、ハイブリッド志賀トキソイドをコードする発現ベクターでトランスフェクトするステップと、（ｂ）得られたトランスフェクト細胞を、ハイブリッド志賀トキソイドが産生される条件下で培養するステップと、（ｃ）細胞培養培地又は細胞自体からハイブリッド志賀トキソイドを回収するステップと、により製造することができる。
【００５０】
発現ベクター又は構築物を含むＤＮＡ配列を発現用に調製した後、発現ベクターは、適切な真核生物又は原核生物の細胞宿主にトランスフェクト又は導入することができる。これを実現するために、例えばプロトプラスト融合、リン酸カルシウム沈殿、エレクトロポレーション又はその他の従来の方法のような種々の方法を用いることができる。プロトプラスト融合の場合、細胞を培地中で増殖させ、適切な活性についてスクリーニングする。
【００５１】
得られたトランスフェクト細胞の培養、及びそのようにして製造されたハイブリッド志賀トキソイドの回収のための方法及び条件は、当業者に公知であり、採用する具体的な発現ベクター及び宿主細胞に応じて変更又は最適化することができる。
【００５２】
ハイブリッド志賀トキソイドを発現するための宿主細胞は、原核生物であっても真核生物であってもよい。原核生物宿主の例は、大腸菌ＤＨ５α又はＢＬ２１のような大腸菌を含む。真核生物宿主の例は、バキュロウイルスベクター／昆虫細胞発現系、酵母シャトルベクター／酵母細胞発現系を含む。培養培地からハイブリッド志賀トキソイドを精製する方法及び条件は本発明において提供されるが、これらの手順は変更又は最適化することができること（当業者には周知である。）が認識されるべきである。
【００５３】
本発明のハイブリッド志賀トキソイドタンパク質は、任意の既知の合成法により調製することができる。簡便には、タンパク質は、Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ（１９６５）（参照されることにより、本明細書に組み込まれる。）により最初に記載された固相合成法を用いて調製することができる。その他のペプチド合成法は、例えばＢｏｄａｎｓｚｋｙら（１９７６）、Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ、Ｗｉｌｅｙに見出される。
【００５４】
免疫原性組成物及びその使用：
本発明のキメラハイブリッド志賀トキソイドは、ワクチン、免疫原性組成物又は医薬組成物中で用いて、Ｓｔｘに対する免疫応答を発生させることができる。キメラ志賀トキソイドは、免疫原性のより小さい他の組成物と併用して、免疫原性組成物に対する免疫応答の誘発を補助することもできる。一般に、他の免疫原性組成物と併用する場合、免疫原性組成物自体は、免疫応答を誘発するのにも、病原体に対する防御効果を提供するのにも十分でない。ある実施形態において、本発明の志賀トキソイドは、ジフテリア菌（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｄｉｐｈｔｈｅｒｉａｅ）による感染に対する防御効果を提供するための手段として、ジフテリア毒素と併用される。
【００５５】
ある実施形態において、ハイブリッド志賀トキソイドは、当技術分野において通常理解されるように、適切なアジュバントとともに用いられる。現在、米国でヒトへの使用について認可されているアジュバントは、例えばアルミニウム塩（ミョウバン）を含む。これらのアジュバントは、Ｂ型肝炎、ジフテリア、ポリオ、狂犬病及びインフルエンザを含むいくつかのワクチンに有用である。その他の有用なアジュバントは、完全フロイントアジュバント（ＣＦＡ）、ムラミルジペプチド（ＭＤＰ）、ＭＤＰの合成類似体、Ｎ−アセチルムラミル−Ｌ−アラニル−Ｄ−イソグルタミル−Ｌ−アラニン−２−［１，２−ジパルミトイル−ｓ−グリセロ−３−（ヒドロキシホスホリルオキシ）］エチルアミド（ＭＴＰ−ＰＥ）、不完全フロイントアジュバント（ＩＦＡ）、及び実質的に全ての油滴が直径１ミクロン未満の油滴である水中油型エマルジョンの形で油と乳化剤とが存在する、分解性油及び乳化剤を含む組成物を含む。
【００５６】
本発明のワクチン、免疫原性組成物又は医薬組成物の製剤は、有効量のキメラ志賀トキソイドを用いる。すなわち、アジュバントと併用されて、その後のＳｔｘへの曝露からの防御を個体に与えるような特異的かつ十分な免疫原性応答を個体に生じさせる量の抗原が含まれる。免疫原性組成物として用いる場合、製剤は、アジュバントと併用されて、個体に特異的抗体を産生させる量の抗原を含む。そして、それは診断又は治療目的で用いることができる。
【００５７】
本発明のワクチン、免疫原性組成物又は医薬組成物は、溶血尿毒症症候群（ＨＵＳ）の予防若しくは治療、及び／又は下痢の治療に有用であり得る。ある実施形態において、ワクチン及び／又は免疫原性組成物は、老人及び小児のＨＵＳの予防に用いられる。別の実施形態において、ワクチン及び／又は免疫原性組成物は、ＨＵＳの予防、又は特に軍の職員への投与のための、テロリズムの行動により引き起こされたＳＴＥＣ感染若しくはＳｔｘ中毒のその他の結果のために用いられる。しばしば、所望の予防的又は治療的効果をもたらすために、１回より多い投与が必要とされる。正確なプロトコール（投与量及び頻度）は、標準の臨床手法により確立され得る。
【００５８】
ハイブリッド志賀トキソイド、又は本発明のハイブリッド志賀トキソイドを含む医薬組成物は、腸管外、皮下、静脈内、筋内、腹腔内、経皮又は頬側経路を介して投与できる。代わりに、又は同時に、投与は経口経路によるものでもよい。小児に特に適切なある実施形態において、志賀トキソイドを含む医薬組成物は、経口経路により投与される。投与される投与量は、受容者の年齢、健康及び体重、存在するならば併用療法の種類、治療頻度、並びに所望の効果の性質に依存する。
【００５９】
本発明の医薬組成物は、作用部位への送達のために薬学的に使用可能な製剤への活性化合物の加工を容易にする賦形剤及び添加剤を含む、薬学的に許容される適切な担体を含んでもよい。腸管外投与用に適する製剤としては、水溶性形態の活性化合物、例えば水溶性塩の水性液剤、が挙げられる。さらに、適切な油性注射懸濁剤として、活性化合物の懸濁剤を投与してもよい。適切な親油性溶剤又はビヒクルとしては、例えば、ごま油のような脂肪油、又はエチルオレエート、トリグリセリドのような合成脂肪酸エステルが挙げられる。水性注射懸濁剤は、例えば、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ソルビトール、デキストランのような、懸濁剤の粘度を増加させる物質を含んでもよい。所望により、懸濁剤は安定化剤を含んでもよい。
【００６０】
予防又は治療のいずれかにおいて用いられる正確な量及び製剤は、抗原の固有の純度及び活性、任意の付随的な成分又は担体、投与方法などの状況に応じて変動し得る。
【００６１】
本発明の全身投与用の医薬製剤は、経腸、腸管外又は局所投与用に処方してもよい。実際に、３つの型全ての製剤を同時に用いて、活性成分の全身投与を実現することができる。
【００６２】
局所投与を用いてもよい。液剤、懸濁剤、ゲル剤、軟膏、膏薬のような任意の通常の局所製剤を採用することができる。このような局所製剤の調製については、例えばＧｅｎｎａｒｏら（２０００）、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇを始めとする、医薬製剤に関する技術文献に記載されている。局所投与のために、組成物は、散剤又は噴霧剤として、特にエアロゾルの形態で投与することもできる。
【００６３】
経口投与用の適切な製剤としては、ゼラチンハード若しくはゼラチンソフトカプセル、丸剤、被覆錠剤を始めとする錠剤、エリキシル剤、懸濁剤、シロップ剤又は吸入剤、及びそれらの放出制御形態のものが挙げられる。
【００６４】
以下の説明は本発明を限定するものではないが、投与されるワクチン投与量は、典型的には、抗原に関して、最少で約０．１ｍｇ／用量、より典型的には最少で約１ｍｇ／用量、及びしばしば最少で約１０ｍｇ／用量である。最大投与量は、典型的には、重要でない。しかし、通常、投与量は、５００ｍｇ／用量以下、しばしば２５０ｍｇ／用量以下である。これらの投与量は、投与量を保持するのに十分な容量の任意の薬学的な適切なビヒクル又は担体中に懸濁することができる。一般に、担体、アジュバント等を含む最終容量は、典型的には少なくとも０．１ｍｌ、より典型的には少なくとも約０．２ｍｌである。上限は、投与される量の実行可能性に支配され、通常、約０．５ｍｌ〜約１．０ｍｌ以下である。
【００６５】
他の形態において、ワクチン、免疫原性組成物又は医薬組成物は、キメラハイブリッド志賀トキソイド又はその断片を宿主動物中で発現するワクチンベクターとして調製することができる。生ベネズエラウマ脳炎ウイルス（ｌｉｖｅ Ｖｅｎｅｚｕｅｌａｎ Ｅｑｕｉｎｅ Ｅｎｃｅｐｈａｌｉｔｉｓ ｖｉｒｕｓ）（米国特許第５６４３５７６号を参照されたい）、ポリオウイルス（ｐｏｌｉｏｖｉｒｕｓ）（米国特許第５６３９６４９号を参照されたい）、ポックスウイルス（ｐｏｘ ｖｉｒｕｓ）（米国特許第５７７０２１１号を参照されたい）、及びワクシニアウイルス（ｖａｃｃｉｎａ ｖｉｒｕｓ）（米国特許第４６０３１１２号及び第５７６２９３８号を参照されたい）を含む任意の入手可能なワクチンベクターを用いることができる。或いは、タンパク質又はその断片をコードする裸の核酸を直接投与して、抗原を発現させてもよい（米国特許第５７３９１１８号を参照されたい）。
【００６６】
本発明のある実施形態において、ハイブリッド志賀トキソイドをコードするヌクレオチドは、フレクスナー赤痢菌（Ｓｈｉｇｅｌｌａ ｆｌｅｘｎｅｒｉ）（Ｂａｒｒｙら（２００３）、Ｖａｃｃｉｎｅ ２１、３３３〜４０）又はコレラ菌（Ｖ．ｃｈｏｌｅｒａｅ）（Ｌｅｙｔｅｎら（２００５）、Ｖａｃｃｉｎｅ ２３、５１２０〜５１２６）のような生弱毒口腔細菌ワクチン株に形質転換される。したがって、そのような口腔細菌ワクチン株は、Ｓｔｘを含む拡張された防御範囲を有する。
【００６７】
本発明の別の実施形態では、ハイブリッド志賀トキソイドをコードするヌクレオチドを植物に形質転換して、食用植物ベースのワクチンを創出する。或いは、ハイブリッド志賀トキソイドをコードするヌクレオチドは、ＤＮＡに基づくワクチンとして投与することができる。キメラトキソイドをコードする核酸は、単一遺伝子又は遺伝子の組合せのいずれかとしてのＤＮＡワクチンとして投与される。裸のＤＮＡワクチンは、当技術分野において一般に知られている（Ｂｒｏｗｅｒ（１９９８）、Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、１６：１３０４〜１３０５を参照されたい）。ＤＮＡワクチンとしての遺伝子の使用方法は、当業者に公知であり、キメラトキソイド遺伝子又はその一部分を、治療を必要とする個体における発現のためのプロモーターの制御下におくことを含む。ＤＮＡワクチンに用いられる遺伝子は、全長キメラトキソイドタンパク質をコードし得るが、任意の志賀毒素遺伝子に由来するペプチドを含むトキソイドタンパク質の部分をコードしてもよい。ＤＮＡワクチンは、個別の及び／又は別のプロモーターの支配の下での個別のオペロンとしての発現のためのＡ及びＢサブユニット遺伝子を含んでよく、２つのコード領域の順序の並べ替えを含む。ウイルス又は真核生物起源の５’及び３’非翻訳領域の組み込み、ポリアデニル化シグナル、真核生物系での最適発現のためのコドンの最適化のようなヌクレオチド配列への改変も、本発明において包含される。ある実施形態において、個体は、キメラトキソイドタンパク質をコードする複数のヌクレオチド配列を含むＤＮＡワクチンで免疫される。同様に、本明細書で定義される複数のトキソイド遺伝子又はその一部分で個体を免疫することも可能である。
【００６８】
別の実施形態において、ＤＮＡワクチンは、ＤＮＡワクチンとともにアジュバント分子をコードする遺伝子を含む。このようなアジュバント分子は、ＤＮＡワクチンによりコードされるトキソイドタンパク質に対する免疫原性応答を増加させるサイトカインを含む。付加的又は代替的なアジュバントは当業者に知られており、本発明でも用いられる。或いは、キメラトキソイド遺伝子自体を、別の異なる免疫原をコードする核酸を含むＤＮＡワクチンにおけるアジュバントとして作用させることができる。
【００６９】
ハイブリッド志賀トキソイドは、別の疾患のためのワクチンとともに、例えば同時に併用してもよい。したがって、ハイブリッド志賀トキソイドは、旅行者下痢を含む赤痢及び下痢の治療及び予防のための組成物の一部分であってもよい。このような組成物は、Ｓｔｘ及び／又はＳｔｘを発現する細菌に曝される第三世界の小児に特に有用であろう。小児におけるＳｔｘの影響は、重篤になる傾向があり、永続性の腎臓損傷を導く場合もある。したがって、Ｓｔｘへの小児の感染、その後の曝露を予防することは、本発明のキメラ志賀トキソイドタンパク質の好ましい使用である。
【００７０】
抗体及び使用方法：
本発明は、ＳｔｘＡ２サブユニットの少なくとも１つのエピトープ及びＳｔｘＢ１サブユニットの少なくとも１つのエピトープを対象とし、溶血尿毒症症候群を予防、治療又は診断することができるポリクローナル抗体をさらに提供する。
【００７１】
本発明の抗体は、検出可能なマーカーで標識することができる。本発明の実施において有用な検出可能なマーカーは当業者に公知であり、これらに限定されないが、例えば、放射性同位体、色素、ペルオキシダーゼ又はアルカリホスファターゼのような酵素、及びナノ粒子である。検出可能なマーカーで標識された抗体は、診断用に特に有用である。キットは、検出可能なマーカー及び当技術分野で公知のその他の置換基で標識されたモノクローナル又はポリクローナル抗ＳｔｘＡ２及び抗ＳｔｘＢ１抗体をさらに含んでもよい。このようなキットは、Ｓｔｘ、又は志賀赤痢菌及び大腸菌のようなＳｔｘ産生細菌のｉｎ ｖｉｔｒｏ及びｉｎ ｖｉｖｏでの検出、並びにＨＵＳの診断のために特に有用である。
【００７２】
本発明は、ヒトポリクローナル抗体に対する抗イディオタイプ抗体にも関する。この抗イディオタイプ抗体も、検出可能なマーカーで標識することができる。適切な検出可能なマーカーは当業者に公知であり、これらに限定されないが、例えば、放射性同位体、色素、又はペルオキシダーゼ若しくはアルカリホスファターゼのような酵素である。
【００７３】
抗イディオタイプ抗体は、ＳｔｘＡ２サブユニットの１つのエピトープ及びＳｔｘＢ１サブユニットの少なくとも１つのエピトープに結合するポリクローナル抗体を動物に注射したときに産生される。動物は、次いで、注射された抗体のイディオタイプ決定基に対する抗体を産生する（Ｗａｓｓｅｒｍａｎら（１９８２）、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．７９、４８１０〜４８１４）。
【００７４】
或いは、抗イディオタイプ抗体は、（１）動物のリンパ系細胞を、抗体発生有効量の抗原（すなわち、ＳｔｘＡ２サブユニットの１つのエピトープ及びＳｔｘＢ１サブユニットの少なくとも１つのエピトープに結合するポリクローナル抗体）と接触させるステップと、（２）得られたリンパ系細胞を回収し、回収したリンパ系細胞を骨髄腫細胞と融合させて、それぞれがモノクローナル抗体を産生する一連のハイブリドーマ細胞を作製するステップと、（３）一連のハイブリドーマ細胞をスクリーニングして、そのようにして同定された得られたハイブリドーマ細胞に結合可能なモノクローナル抗体を分泌するものを同定するステップと、（４）この細胞により産生される抗イディオタイプ抗体を別個に回収するステップと、により作製される（Ｃｌｅｖｅｌａｎｄら（１９８３）、Ｎａｔｕｒｅ ３０５、５６〜５７）。上記の２つの方法のいずれかで抗イディオタイプ抗体の作製のために使用可能な動物としては、これらに限定されないが、例えば、ヒト、霊長類、マウス、ラット又はウサギが挙げられる。
【００７５】
診断アッセイ：
本発明のハイブリッド志賀トキソイドは、免疫アッセイにおいて診断試薬として用いて、抗Ｓｔｘ抗体、特に抗ＳｔｘＡ２抗体及び抗ＳｔｘＢ１抗体を検出することができる。免疫アッセイのプロトコールは、例えば、配合、直接反応又はサンドイッチ型のアッセイをベースとするものである。プロトコールはまた、例えば、不均質で、固体支持体を用いるものでもよく、また、均質で、溶液中の免疫反応を含むものでもよい。ほとんどのアッセイでは、標識抗体又はポリペプチドを使用する。標識は、例えば、蛍光、化学発光、放射活性、ナノ粒子、又は色素分子である。プローブからのシグナルを増幅するアッセイも知られており、そのようなアッセイの例は、ビオチン及びアビジンを用いるもの、並びにＥＬＩＳＡアッセイのような酵素標識媒介免疫アッセイである。
【００７６】
典型的には、抗Ｓｔｘ抗体についての免疫アッセイは、生体試料のような試験試料を選択及び調製するステップと、次いで、これを本発明の改変ハイブリッド志賀トキソイドと、抗原−抗体複合体の形成を可能にする条件下でインキュベートするステップと、を含む。このような条件は、当技術分野において公知である。不均質な形式において、タンパク質又はペプチドは、固体支持体に結合して、インキュベーション後にポリペプチドからの試料の分離を促進する。用い得る固体支持体の例は、メンブレン又はマイクロタイターウェルの形のニトロセルロース、シート又はマイクロタイターウェルのポリ塩化ビニル、ビーズ又はマイクロタイタープレートのポリスチレンラテックス、ポリフッ化ビニリデン、ジアゾ化された紙、ナイロンメンブレン、活性ビーズ、及びプロテインＡビーズである。最も好ましくは、Ｄｙｎａｔｅｃｈ、Ｉｍｍｕｌｏｎ（登録商標）マイクロタイタープレート、又は０．２５インチポリスチレンビーズを、不均質な形式で用いる。固体支持体は、それを試験試料から分離した後に、典型的に洗浄される。
【００７７】
一方、均質な形式において、試験試料は、溶液のハイブリッド志賀トキソイドと、当技術分野において知られているように、形成されるいずれの抗原−抗体複合体も沈殿する条件下でインキュベートされる。沈殿した複合体は、次いで、例えば遠心分離により試験試料から分離される。抗Ｓｔｘ抗体を含む形成された複合体は、次いで、任意の数の方法により検出される。形式に応じて、複合体は、標識抗異種免疫グロブリンを用いて、又は競合形式が用いられる場合は、結合した標識競合抗体の量を測定することにより検出できる。これらの及びその他の形式は、当技術分野において公知である。
【００７８】
本発明のこのようなアッセイにおいて有用な診断プローブは、Ｓｔｘに対する抗体を含む。抗体は、当技術分野で公知の標準的な方法を用いて作製された、モノクローナル抗体又はポリクローナル抗体であってもよい（Ｈａｒｌｏｗ及びＬａｎｅ（１９８８）、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓを参照されたい）。これらは、タンパク質に特異的に結合し、その後、ＥＬＩＳＡ、ウェスタンブロットなどにより抗体−タンパク質複合体を検出することによりＳｔｘを検出するために用い得る。これらの抗体を誘発するために用いられるハイブリッド志賀トキソイドは、上記の任意のバリアントであり得る。抗体も、当技術分野の標準的な方法を用いて、ハイブリッド志賀トキソイドのペプチド配列から作製される（Ｈａｒｌｏｗ及びＬａｎｅ、既出）。免疫学的に重要な部分を含むモノクローナル又はポリクローナル抗血清の断片も調製できる。
【００７９】
以下の実際の実施例は、本発明の好ましい実施形態を具体的に指し示すものであり、本開示の残りの部分を、どんな形であれ限定するものと解釈されるべきではない。他の一般的な構成は、当業者にとって明らかである。
【実施例】
【００８０】
〔実施例１：キメラｓｔｘＡ２／ｓｔｘＢ１及びトキソイド変異の構築〕
Ｓｔｘ１及びＳｔｘ２の両方に対して防御するワクチンとして用い得る、Ｓｔｘの遺伝子的にトキソイド化した型を構築した。ＳｔｘＢ１タンパク質は、免疫原性が高く、ＳｔｘＢ２サブユニットタンパク質よりも防御性が高いので（Ｍａｒｃａｔｏら（２００１）、Ｊ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ．１８３、４３５〜４３）、ＳｔｘＢ１をワクチンのＢサブユニット部分のために用いた。ＳｔｘＡ２を、ワクチン構築物のＡサブユニットとして選択した。
【００８１】
ｓｔｘＡ２及びｓｔｘＢ１遺伝子を、一緒にスプライスして、ｓｔｘＡ２、その後に続くＳｔｘＢ１の翻訳のためのリボソーム結合部位を含む天然ｓｔｘＢ１遺伝子間領域、そしてｓｔｘＢ１遺伝子で構成される融合オペロンを作製した。ホロトキソイド発現カセットを、天然のオペロン構成中に設計して、ＡＢ５ホロトキソイドの翻訳及び組立てを最適化した。
【００８２】
次に、キメラトキソイドのＳｔｘＡ２部分を、３つの改変（Ｙ７７Ｓ、Ｅ１６７Ｑ及びＲ１７０Ｌ）を導入することにより改変して、毒性復帰の可能性を阻害し、免疫原性を最大化した。これらの変異の選択は、これらの変異が毒素の細胞毒性を低減させるか、トキソイドの免疫原性を増加させることを示した以前の研究に基づくものであった。７７位のチロシンのセリンへの置換を行ったのは、この変異がＳｔｘ１の活性を実質的に低減させること、同様のことがＳｔｘ２にも当てはまると予測したことによる（Ｄｅｒｅｓｉｅｗｉｃｚら（１９９２）、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ３１、３２７２〜８０；Ｄｅｒｅｓｉｅｗｉｃｚら（１９９３）、Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｔ．２４１、４６７〜７３）。ＳｔｘＡ２の１６７位のグルタミン酸をグルタミンに改変したのは、このアミノ酸がＳｔｘ１及びＳｔｘ２の両方の活性部位にあり、このような改変が毒素のベロ細胞活性の劇的な減少を導くことによる（Ｇｏｒｄｏｎら（１９９２）、Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．６５、２５０９〜１６；Ｈｏｖｄｅら（１９８８）、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８５ ２５６８〜７２；Ｊａｃｋｓｏｎら（１９９０）、Ｊ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ １８２、３３４６〜５０；Ｙａｍａｓｋｉら（１９９１）、Ｍｉｒｃｏｂ．Ｐａｔｈｏｇ．１１、１〜９）。１７０位のアルギニンのロイシンへの置換は、ＳｔｘＡ１タンパク質が、このような置換の後に、より強い免疫原性を有するというＩｓｈｉｋａｗａらの観察を反映したものである（Ｉｓｈｉｋａｗａら（２００３）、Ｉｎｆｅｃｔ Ｉｍｍｕｎ ７１、３２３５〜９）。方法の詳細な説明は次のとおりである。
【００８３】
用いた細菌プラスミドを表１に列挙する。細菌は、組換えプラスミドの選択のために必要であれば１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを補ったルリア−ベルターニ（ＬＢ）ブロス中又はＬＢ寒天上（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）上で成長させた。
【００８４】
【表１】
【００８５】
キメラｓｔｘＡ２／ｓｔｘＢ１オペロンは、一連のポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）の後に、重複伸長（ＳＯＥ）ステップによるスプライシングを行うことにより創出した（Ｈｉｇｕｃｈｉら（１９８９）、ＰＣＲ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、Ｓｔｏｃｋｔｏｎ Ｐｒｅｓｓ）。具体的には、プライマーＭＪＳ５及びＭＪＳ３２（表２を参照されたい）を用いるｐＭＪＳ２からの配列のＰＣＲ増幅を用いて、ｓｔｘＡ２を合成した。同様に、プライマーＭＪＳ２０及びＭＪＳ２を用いるｐＭＪＳ１からの配列のＰＣＲ増幅を用いて、ｓｔｘＢ１を作製した。ｓｔｘＡ２及びｓｔｘＢ１の後に、ＰＣＲ産物を一緒にスプライスし、キメラｓｔｘＡ２／ｓｔｘＢ１オペロンを、ｓｔｘ２プロモーターの支配下にｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＩＩ ＫＳ−（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）にクローニングした。得られたプラスミドをｐＭＪＳ２１と命名し、大腸菌ＤＨ５αを形質転換した。
【００８６】
【表２】
【００８７】
次に、一連のヌクレオチドの変異を、ｓｔｘＡ２／ｓｔｘＢ１のｓｔｘＡ２遺伝子中に作り出して、ハイブリッドトキソイド分子が発現され得るオペロンを作製した。具体的には、ＳｔｘＡ２成熟タンパク質の７７位のチロシンを、突然変異誘発プライマーＭＪＳ８８及びＭＪＳ８９、並びに隣接プライマーＭＪＳ２及びＭＪＳ５を用いてＤＮＡを増幅することにより、セリン残基に変更して、ｐＭＪＳ２２を得た。突然変異誘発プライマーＭＪＳ９０及びＭＪＳ９１、並びに隣接プライマーＭＪＳ２及びＭＪＳ５を用いるＰＣＲにより、ＳｔｘＡ２の活性部位のグルタミン酸（残基１６７）がグルタミンに変更され、同時に、１７０位のアルギニンがリジンに変更されて、ｐＭＪＳ２３を得た。キメラトキソイドオペロンを、次いで、２Ａ５ＳＤ及びＭＪＳ２プライマーを用いるＰＣＲによりｐＭＪＳ２３から、増幅して、最適シャイン−ダルガルノ配列（ＴＡＡＧＧＡＧＧＡＣＡＧＣＴＡＴＧ）（配列番号２４）をＳｔｘＡ２の開始コドンの上流に導入して、天然ｓｔｘ２プロモーターを除去した。得られたキメラクローンを、発現ベクターｐＴｒｃＨｉｓ２ Ｃ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に連結し、大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）株を形質転換した。ＤＮＡ配列の分析は、Ｕｎｉｆｏｒｍｅｄ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ ＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙのＢｉｏｍｅｄｉｃａｌ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔａｔｉｏｎ Ｃｅｎｔｅｒにより行って、正しい変異が行われたことを確認した。
【００８８】
〔実施例２：ＳｔｘＡ２／ＳｔｘＢ１トキソイドの精製〕
ＳｔｘＡ２／ＳｔｘＢ１トキソイドの精製は、従来文献に記載の方法（Ｉｓｈｉｋａｗａら（２００３）、Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．７１、３２３５〜９；Ｗｅｎら、既出）で、Ｇｂ３アフィニティー精製により行った。Ｇｂ３アフィニティー精製は、Ｂサブユニット結合ドメインを捕捉する方法である。ｐＴｒｃＨｉｓ２ Ｃ−ｓｔｘＡ２／ｓｔｘＢ１クローンを含む大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）の１晩培養物を、それぞれ５００ｍｌのＬＢブロスを含む２つのフラスコで１：５０に希釈した。２時間成長させた後に、培養物を１ｍＭのイソプロピル ３−Ｄ−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）で誘導し、さらに４時間インキュベートした。
【００８９】
細菌を、遠心分離により沈殿させ、１０ｍｌの１×リン酸緩衝食塩水、ｐＨ７．４（ＰＢＳ）に再懸濁することにより５０倍に濃縮した。濃縮した細菌懸濁物を、次いで、超音波破砕し、得られた溶解物を遠心分離により清澄化した。ＳｔｘＡ２／ＳｔｘＢ１トキソイドは、これらの溶解物から、従来文献に記載の方法（Ｉｓｈｉｋａｗａら、既出；Ｗｅｎら、既出）で、Ｇｌｏｂｏｔｒｉｏｓｅ Ｆｒａｃｔｏｇｅｌカラム（ＩｓｏＳｅｐ ＡＢ）でのＧｂ３アフィニティー精製により精製した。トキソイドの精製の後に、ＢＣＡアッセイ（Ｐｉｅｒｃｅ）を行って、調製物のタンパク質濃度を定量した。
【００９０】
〔実施例３：細胞毒性アッセイ〕
種々の試料のベロ細胞についての細胞毒性活性を、従来文献に記載の方法で評価した。手短に説明すると、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＩＩ ＫＳ（−）中のトキシンクローンで形質転換された大腸菌ＤＨ５αを、同じ光学密度（Ｏ．Ｄ．）６００に標準化し、細菌を超音波破砕し、遠心分離により清澄化した。清澄化した超音波溶解物又は精製されたトキソイドを、ベロ細胞での細胞毒性活性について、９％胎児ウシ血清（ＢｉｏＳｏｕｒｃｅ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ）、１．８ｍＭグルタミン（Ｃａｍｂｒｅｘ）、９Ｕ／ｍｌのペニシリン ９ｐｇ／ｍｌのストレプトマイシン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）、及び９０μｇ／ｍｌのゲンタマイシン（Ｑｕａｌｉｔｙ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ）を補ったイーグル最少必須培地（Ｃａｍｂｒｅｘ ＢｉｏＳｃｉｅｎｃｅ）（完全ＥＭＥＭ）で試料を希釈した後に、評価した（Ｓｃｈｍｉｔｔら（１９９１）Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．５９、１０６５〜７３；Ｇｅｎｔｒｙら（１９８０）２６、２１２７〜３１）。試料の５０％細胞毒性用量（ＣＤ５０）は、未処置の対照細胞と比較して、ベロ細胞の５０％を死滅させる希釈の逆数として定義した。
【００９１】
種々の型の変異ＳｔｘＡ２／ＳｔｘＢ１トキソイドのベロ細胞についての細胞毒性活性を、親のＳｔｘＡ２／ＳｔｘＢ１毒素と比較した（表３を参照されたい）。親のハイブリッドトキシンの清澄化された超音波溶解物１ｍｌは、７．２×１０４のＣＤ５０を含んでいたが、単独変異（Ｙ７７Ｓ）又は三重変異（Ｙ７７Ｓ、Ｅ１６７Ｑ及びＲ１７０Ｌ）のいずれかを有する変更されたキメラ分子の同様に調製された溶解物は、細胞毒性活性を示さず、これにより、これらの構築物がトキソイドを産生したことが確認された。さらに、２．１μｇの精製ＳｔｘＡ２／ＳｔｘＢ１トキソイドは、ベロ細胞に対して細胞毒性でなかった。これは、アッセイした親のＳｔｘＡ２／Ｓｔｘ１Ｂトキシンの濃度の約９７倍であった。親のＳｔｘＡ２／Ｓｔｘ１Ｂトキシンの量は、Ｓｔｘ２に対するポリクローナル抗体を用い、Ｓｔｘ２標準物質との比較によりＳｔＡ２サブユニットを定量するウェスタンブロット分析により測定した。非常に低いレベルのＳｔｘ２Ａ／Ｓｔｘ１Ｂトキソイドでいずれかの残存活性があるかを確認するために、粗細菌溶解物の１００倍の調製物を、ベロ細胞に対する細胞毒性及びマウスにおける毒性について試験した。５匹のＣＤ−１雄性マウスに、８６μｇのトキソイド（これは、マウスを免疫し、追加免疫するために用いられる量の２０倍に相当する）を腹腔内注射し、全てのマウスは生存した。さらに、１００倍調製粗細菌溶解物からの６１．３μｇのトキソイドを、細胞毒性について試験し、ベロ細胞に対して非細胞毒性であることが見出された。
【００９２】
【表３】
【００９３】
毒素溶解物は、ｐＭＪＳ１（Ｓｔｘ１）、ｐＭＪＳ２（Ｓｔｘ２）、ｐＭＪＳ２１（ＳｔｘＡ２／ＳｔｘＢ１）、ｐＭＪＳ２２（ＳｔｘＡ２ Ｙ７７Ｓを有するＳｔｘＡ２／ＳｔｘＢ１）、ｐＭＪＳ２３（ＳｔｘＡ２ Ｙ７７Ｓ、Ｅ１６７Ｑ及びＲ１７０Ｌを有するＳｔｘＡ２／ＳｔｘＢ１）で形質転換された大腸菌ＤＨ５αからであった。精製ＳｔｘＡ２／ＳｔｘＢ１トキソイドは、大腸菌Ｂｌ２１から精製した。値は、５０％のベロ細胞を死滅させた希釈の逆数を表す。この実験の検出限界は、１×１０２であった。
【００９４】
〔実施例４：ウェスタンブロット分析〕
精製Ｓｔｘ１、Ｓｔｘ２又はＳｔｘＡ２／ＳｔｘＢ１トキソイド（それぞれ３００ｎｇ）を、ドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ；１５％ポリアクリルアミド）に供し、次いで、タンパク質を０．４５μＭ Ｏｐｔｉｔｒａｎニトロセルロースメンブレン（Ｓｃｈｌｅｉｃｈｅｒ＆Ｓｃｈｕｅｌｌ）に、Ｔｒａｎｓ−Ｂｌｏｔ ＳＤ Ｓｅｍｉ−Ｄｒｙトランスファー装置（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）を用いて移動させた（図１を参照されたい）。メンブレンを、０．１％ Ｔｗｅｅｎ ２０を加えた１×Ｔｒｉｓ緩衝食塩水（ｐＨ７．５）（ＴＢＳＴ）中の５％脱脂粉乳溶液中で４℃にて１晩ブロックした。それぞれ抗ＳｔｘＡ２及び抗ＳｔｘＢ１モノクローナル抗体（ＭＡｂ）１１Ｅ１０及び１３Ｃ４の、ブロッキング溶液中でそれぞれ１：５に希釈されたハイブリドーマ組織培養上清である１次抗体（Ｇｅｎｔｒｙら（１９８０）、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．１２、３６１〜６；Ｐｅｒｅｒａら（１９８０）、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．２６、２１２７〜３１）を、イムノブロットと２時間インキュベートした。次いで、メンブレンを、ＴＢＳＴで洗浄し、ブロッキング溶液で１：３０００に希釈したセイヨウワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）にコンジュゲートしたヤギ抗マウス免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）と１時間インキュベートした。メンブレンを、上記のようにして再び洗浄し、２次抗体を、ＥＣＬ−Ｐｌｕｓ Ｗｅｓｔｅｒｎ Ｂｌｏｔｔｉｎｇ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎキット（Ａｍｅｒｓｈａｍ）を用いて化学発光により検出した。
【００９５】
精製トキソイドのイムノブロットにより、ＳｔｘＢ１及びＳｔｘＡ２がともに存在することが明らかになり（図１を参照されたい）、ホロトキソイドがワクチン構築物により発現されるという我々の仮定が確認された。さらに、トキソイドの免疫反応性のバンドのサイズは、対照の天然毒素サブユニットに相当した（図１を参照されたい）。ＳｔｘＡ２及びＳｔｘＢ１サブユニットは、銀染色されたゲルでも確認され、さらなる混入タンパク質は、ほとんどないことが示された（データは示さず）。
【００９６】
〔実施例５：マウスの免疫及び曝露〕
免疫前血清を、体重１４〜１６グラムの雄性ＣＤ−１マウス（Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ）から採取した。マウスを、次いで、ＰＢＳ、又は油中水型アジュバントであるＴｉｔｅｒＭａｘ Ｇｏｌｄ（ＴｉｔｅｒＭａｘ ＵＳＡ）と１：１で混合した、ＰＢＳ中の４．３μｇの精製ＳｔｘＡ２／ＳｔｘＢ１トキソイド（合計容量１００μｌ）のいずれかで、腹腔内（ｉ．ｐ．）免疫した。マウスは、３週間の間隔で、合計３回の追加免疫をした。最初の免疫から１０日後、及び各追加免疫の後に血清を採取して、Ｓｔｘ１又はＳｔｘ２に対する血清免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）のレベルを測定した。マウスに、３回目の追加免疫の１４日後に、Ｓｔｘ１（１２５０ｎｇ）若しくはＳｔｘ２（１０ｎｇ）のいずれか、又はＳｔｘ１及びＳｔｘ２の両方（それぞれ１２５０及び１０ｎｇ／マウス）の５０％致死用量（ＬＤ５０）の１０倍で、ｉ．ｐ．曝露した。
【００９７】
ＰＢＳで免疫されたマウスは全て、投与されたＳｔｘの型に関わらず、４日目までに死亡した（表４を参照されたい）。キメラトキソイドで免疫され、その後、Ｓｔｘ１又はＳｔｘ２のいずれかに曝露されたマウスは全て、観察期間の１４日間全て生存した。キメラトキソイドで免疫され、その後、Ｓｔｘ１及びＳｔｘ２の両方に曝露された１０匹のマウスのうち、９匹が生存した。致死容量のＳｔｘ１及びＳｔｘ２の両方に曝露された後に死亡した、キメラトキソイドで免疫されたマウスは、抗Ｓｔｘ１中和抗体も抗Ｓｔｘ２中和抗体も産生できなかったマウスであった。このマウスは、擬似免疫された動物が死亡したのとほぼ同じ時期に死亡した。ＬＤ５０は、Ｓｔｘ１及びＳｔｘ２について１２５及び１ｎｇ／マウスであることが以前に測定されている。曝露されたときのマウスの平均体重は、４０．４ｇであった。
【００９８】
【表４】
【００９９】
〔実施例６：ＥＬＩＳＡによる抗Ｓｔｘ１又は抗Ｓｔｘ２抗体の測定〕
雄性ＣＤ−１マウスを免疫し、ＰＢＳ、又は三重変異トキソイドのいずれかで３週間隔で追加免疫した。３回目の最終の追加免疫の後に、各マウスから血清を採取し、Ｓｔｘ１及びＳｔｘ２に対するＩｇＧ抗体の力価を、ＥＬＩＳＡにより適切な免疫前血清試料と比較した（図２を参照されたい）。
【０１００】
精製Ｓｔｘ１又はＳｔｘ２（１００ｍｌ ＰＢＳ中に１００ｎｇ）を用いて、Ｕ底９６ウェルマイクロタイタープレート（Ｔｈｅｒｍｏ Ｅｌｅｃｔｒｏｎ）のウェルを被覆し、マイクロタイタープレートを、４℃にて１晩インキュベートした。次いで、マイクロタイタープレートを、０．０５％ Ｔｗｅｅｎ−２０を含むＰＢＳ（ＰＢＳＴ）で３回洗浄し、ウェルあたり２００μｌの３％ウシ血清アルブミン含有ＰＢＳＴで、４℃にて１晩ブロックした。次の日に、別のマイクロタイタープレートにて、１：５０の最初の希釈、及びその後１：５の希釈で、マウスの免疫前及び免疫後の血清をＰＢＳＴで希釈した。ブロックしたマイクロタイタープレートを洗浄した後に、１００μｌの希釈した血清をＥＬＩＳＡの１次抗体として用い、マイクロタイタープレートを３７℃にて２時間インキュベートした。次いで、１００μｌの２次抗体であるＨＲＰにコンジュゲートしたヤギ抗マウスＩｇＧを、ＰＢＳＴ中の１：３０００の希釈で加え、プレートを室温にて４５分間インキュベートした。２次抗体は、ＴＭＢ Ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ ＥＩＡ基質キット（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）で検出し、マイクロタイタープレートを室温にて１５分間インキュベートして、色の変化を発生させた。次いで、１００μｌの１Ｍ Ｈ２ＳＯ４を加えて反応を停止し、色の発生を、ＯＤ４５０の測定により判定した。ＥＬＩＳＡの力価を、バックグラウンド及び免疫前のレベルの両方を超える血清希釈と定義した。免疫前のレベルが免疫後のレベルよりも高い場合は、ＥＬＩＳＡ力価として０．３の値を当てた。これらのアッセイは、重複して１回行った。抗Ｓｔｘ１及び抗Ｓｔｘ２ ＥＬＩＳＡのための陽性対照は、１次抗体として、ＰＢＳＴで１：２００００にそれぞれ希釈した精製１１Ｅ１０又は１３Ｃ４（Ｈｙｃｕｌｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）のいずれかであった。
【０１０１】
〔実施例７：Ｉｎ ｖｉｔｒｏ Ｓｔｘ１及びＳｔｘ２毒素中和アッセイ〕
毒素中和力価は、ＥＬＩＳＡ力価よりもＳｔｘに対する防御応答についてのよりよい予測となるので（Ｗｅｎら、既出）、精製Ｓｔｘ１又はＳｔｘ２に対するｉｎ ｖｉｔｒｏベロ細胞中和アッセイも、血清試料に対して行った。
【０１０２】
免疫前及び免疫後の血清を、以前に報告されるようにして（Ｍａｒｑｕｅｓら（１９８６）、Ｊ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ．１５４、３３８〜４１）、Ｓｔｘ１及びＳｔｘ２についての中和アッセイにおいて用いた。中和力価を、Ｓｔｘ１又はＳｔｘ２の細胞毒性の５０％を中和するマウス血清の希釈と定義した。これらのアッセイにおいて用いたＳｔｘ１又はＳｔｘ２の量は、それぞれ２０又は３８ＣＤ５０であった。擬似免疫されたマウスの血清又は免疫後血清がＳｔｘ１もＳｔｘ２も中和しなかった場合、中和力価として０．３の値を当てた。これらのアッセイは、重複して１回行った。
【０１０３】
〔実施例８：統計的分析による中和抗体力価の比較〕
トキソイドで免疫された群からの抗Ｓｔｘ１又は抗Ｓｔｘ２ ＥＬＩＳＡ及びｉｎ ｖｉｔｒｏ中和抗体力価を、プログラムＳＰＳＳ １２．０．１を用いる両側ｔ検定により、擬似免疫された群と比較した。免疫されたマウスの生存は、Ｓｔｘ１若しくはＳｔｘ２又はＳｔｘ１及びＳｔｘ２のいずれかの１０ＬＤ５０で曝露した後の擬似免疫されたマウスと、フィッシャーの正確確率検定により比較した。これらの結果は、ｐ値が＜０．０５であると有意差があるとみなした。
【０１０４】
免疫前の及び擬似免疫されたマウスは、Ｓｔｘ１及びＳｔｘ２と反応する抗体のバックグラウンドレベルが低かった（図２を参照されたい）。トキソイドで免疫されたマウスは、１匹以外全て、Ｓｔｘ１及びＳｔｘ２の両方に対して高いＩｇＧ力価を示し、バックグラウンドよりもそれぞれ４．４及び４．１ｌｏｇ高かった。トキソイドで免疫されたマウスのＥＬＩＳＡ力価を擬似免疫されたマウスと比較した場合、結果は有意であった（ｐ＜０．００１）。
【０１０５】
Ｓｔｘ１又はＳｔｘ２のいずれに対する中和抗体も、免疫前又は擬似免疫されたマウスにおいて測定できなかった（図３を参照されたい）。対照的に、トキソイドで免疫されたマウスは、１匹以外全てがＳｔｘ１及びＳｔｘ２に対して中和力価を示した（図３を参照されたい）。平均の抗Ｓｔｘ１及び抗Ｓｔｘ２中和力価は、バックグラウンドより２．９及び１．９ｌｏｇ高かった。Ｓｔｘ２中和力価がより低いことは、中和アッセイにおいてＳｔｘ１よりも高い濃度のＳｔｘ２を用いたことに起因するであろう（それぞれ２０ＣＤ５０に比較して、約３８ＣＤ５０）。乏しい抗Ｓｔｘ１ ＥＬＩＳＡ力価を示したトキソイド免疫されたマウスは、いずれの毒素に対する中和抗体も産生できなかった。トキソイド免疫されたマウスの中和力価を、擬似免疫されたマウスと比較したときに、結果は、有意に異なっていた（ｐ＜０．００１）。
【０１０６】
本発明を詳細に説明したが、本発明の意図から逸脱することなく、種々の変更を行うことができることが理解される。したがって、本発明は、以下の特許請求の範囲によってのみ限定される。本出願において言及される全ての引用特許、特許出願及び文献は、参照されることによりその全体が本明細書に組み込まれる。
【図面の簡単な説明】
【０１０７】
【図１】キメラＳｔｘＡ２／ＳｔｘＢ１トキソイドのウェスタンブロット分析。野生型Ｓｔｘ１、Ｓｔｘ２及びキメラＳｔｘＡ２／ＳｔｘＢ１トキソイド（それぞれ３００ｎｇ）を、１５％のＳＤＳポリアクリルアミドゲルで分離し、ＳｔｘＢ１及びＳｔｘＡ２に対して誘導されたモノクローナル抗体（ＭＡｂ）ハイブリドーマ上清（それぞれ１３Ｃ４及び１１Ｅ１０ＭＡｂ）をプローブ付加した。レーン１はＳｔｘ１を含み、レーン２はＳｔｘ２を含み、レーン３はＳｔｘＡ２／ＳｔｘＢ１トキソイドを含む。
【図２】ＥＬＩＳＡによる抗Ｓｔｘ１又は抗Ｓｔｘ２抗体の検出。ＰＢＳ（群Ａ及びＣ）又はＳｔｘＡ２／ＳｔｘＢ１トキソイド（群Ｂ、Ｄ及びＥ）のいずれかで免疫されたマウスからのＳｔｘ１（左）又はＳｔｘ２（右）に対する血清ＩｇＧ力価を図２に示す。水平のバーは、Ｓｔｘ１又はＳｔｘ２に対するＩｇＧ血清力価のｌｏｇの幾何平均を表し、誤差バーは、±１標準偏差を示す。群Ｅの影をつけた丸は、Ｓｔｘ１及びＳｔｘ２に曝露したときに死亡したマウスを表す。点線は検出限界を表す。
【図３】ｉｎ ｖｉｔｒｏでのＳｔｘ１及びＳｔｘ２毒素中和アッセイ。ＰＢＳ（群Ａ及びＣ）又はＳｔｘＡ２／ＳｔｘＢ１トキソイド（群Ｂ、Ｄ及びＥ）のいずれかで免疫されたマウスからの抗血清での、Ｓｔｘ１（左）又はＳｔｘ２（右）に対するｉｎ ｖｉｔｒｏ中和力価を、図３に示す。水平のバーは、Ｓｔｘ１又はＳｔｘ２に対する中和力価のｌｏｇの幾何平均を表し、誤差バーは、±１標準偏差を示す。用いたＳｔｘ１及びＳｔｘ２の量は、それぞれ２０及び３８ ５０％細胞毒性用量（ＣＤ５０）であった。群Ｅの影をつけた丸は、Ｓｔｘ１及びＳｔｘ２に曝露したときに死亡したマウスを表す。点線は検出限界を表す。
【発明の分野】
【０００１】
本発明は、志賀毒素（Ｓｈｉｇａ ｔｏｘｉｎｓ）に対するワクチン接種に用いることができるキメラ志賀トキソイドに関する。
【０００２】
連邦政府の支援に対する謝辞：
本発明の一部分は、連邦政府助成金ＮＩＨ ＡＩ２０１４８−２３により資金を受けた研究に基づく。
【０００３】
関連出願：
本出願は、参照されることによりその全体が本明細書に組み込まれる、２００６年２月１６日に出願された米国仮出願第６０／７７３６５８号の利益を主張する。
【発明の背景】
【０００４】
米国において、志賀毒素（Ｓｔｘ）産生大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）（ＳＴＥＣ）は、感染性出血性下痢の最も一般的な原因であり（Ｒａｎｇｅｌら（２００５）、Ｅｍｅｒｇ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ．１１、６０３〜９）、年間約１１００００件の感染の原因である（Ｍｅａｄら（１９９９）、Ｅｍｅｒｇ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ．５、６０７〜２５）。Ｓｔｘ媒介疾患の大部分は、原型の血清型Ｏ１５７：Ｈ７を含むＳＴＥＣ、腸管出血性大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）、のサブセットが原因である。溶血尿毒症症候群（ＨＵＳ）は、特に最も脆弱な患者、すなわち小児及び老人の間で、溶血性貧血、血栓性血小板減少症、及び腎不全を特徴とするＳＴＥＣ（特にＯ１５７：Ｈ７）感染の重篤な後遺症である。ＨＵＳを経験した患者における致死率は５〜１０パーセントであり、生存者の間では腎臓の後遺症及び神経損傷の潜在性がある。ＳＴＥＣ感染の治療法は、対症療法、水分補給及び腎臓透析を含む（Ａｎｄｒｅｏｌｉら（２００２）、Ｐｅｄｉａｔｒ．Ｎｅｐｈｒｏｌ．１７、２９３〜８；Ｋｌｅｉｎら（２００２）、Ｊ．Ｐｅｄｉａｔｒ．１４１、１７２〜７；及びＴａｒｒら（２００５）、Ｌａｎｃｅｔ ３６５（９４６４）、１０７３〜８６）。現在、介入療法又はワクチンは利用可能でない。さらに、抗生物質治療は、大腸菌のＳｔｘをコードする毒素転換ファージの溶菌サイクルの誘導に起因し得るＨＵＳの危険性が増加することから禁忌である（Ｗｏｎｇら（２０００）、Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３４２、１９３０〜６）。
【０００５】
Ｓｔｘには２つの主な型がある。第１の型のメンバーである、志賀赤痢菌（Ｓ．ｄｙｓｅｎｔｅｒｉａｅ）１型により産生されるＳｔｘ、及び大腸菌により産生されるＳｔｘ１は、実質的に同一である。第２の型であるＳｔｘ２も大腸菌によりコードされる。しかし、これは、Ｓｔｘ１に対するポリクローナル抗血清により交差中和されず、その逆も同じである（Ｏ’Ｂｒｉｅｎら（１９８４）、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２２６（４６７５）、６９４〜６）。各Ｓｔｘ血清型のバリアントが存在する（例えばＳｔｘ１ｃ、Ｓｔｘ１ｄ、Ｓｔｘ２ｃ、Ｓｔｘ２ｄ、Ｓｔｘ２ｄ−活性化型、Ｓｔｘ２ｅ、Ｓｔｘ２ｆ）（Ｍｅｌｔｏｎ−Ｃｅｌｓａら（２００５）、ＥｃｏＳａｌ−Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ａｎｄ Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ：Ｃｅｌｌｕｌａｒ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、ＡＳＭ Ｐｒｅｓｓ、第８．７．８章）が、これらは、原型毒素に対するポリクローナル血清により中和可能なままである（Ｓｃｈｍｉｔｔら（１９９１）、Ｉｎｆｅｃｔ Ｉｍｍｕｎ ５９、１０６５〜７３；Ｌｉｎｄｇｒｅｎら（１９９４）、Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．６２、６２３〜３１）。Ｓｔｘは、ＡＢ５配置を有する複合ホロ毒素である。これらは、酵素活性（Ａ）サブユニットと、それぞれ約７．７ｋＤａで五量体を形成する５つの同一のＢタンパク質で構成される結合ドメイン（Ｂ）と、を有する。Ａサブユニットは、約３２ｋＤａタンパク質であり、これは、トリプシン又はフューリンによりＡ１サブユニット（約２７ｋＤａ）と、ジスルフィド結合を介して会合したままのＡ２ペプチド（約５ｋＤａ）と、に非対称に切断される。Ｓｔｘ１及びＳｔｘ２の成熟Ａ及びＢサブユニットは、それぞれ５５％及び６１％の同一性、並びに６８％及び７３％の類似性を有する。アミノ酸配列の違いに関わらず、ホロ毒素の結晶構造は著しく類似しており（Ｆｒａｓｅｒら（１９９４）、Ｎａｔ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．１、５９〜６４；Ｆｒａｓｅｒら（２００４）、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７９、２７５１１〜７）、これらの毒素は同じ作用機序を有する。Ａ１サブユニットは酵素活性領域であるＮ−グリコシダーゼを含み、これは、６０Ｓリボソーム由来の２８Ｓ ｒＲＮＡからアデノシン残基を除去する。この変更がタンパク質合成を停止させ、中毒になった細胞を死滅させる。Ａ２ペプチドは、Ｂ五量体を横切ってホロ毒素を非共有結合的に一緒につなぎとめる。Ｂの五量体は、真核細胞受容体グロボトリアオシルセラミド（Ｇｂ３）又はＧｂ４（Ｓｔｘ２ｅの場合）に結合する。
【０００６】
両方の型のＳｔｘに対して防御性があるワクチンを開発するための努力は、今のところ思うようになっていない。Ｓｔｘは非常に強力であり、ホロ毒素をワクチンとして利用するには酵素活性の不活性化が必要である。１つの選択肢は、Ｂサブユニットを用いて、Ｂ五量体のＧＢ３細胞受容体への結合を遮断する抗体を誘発することである。このアプローチは、ＳｔｘＢ１を用いて、Ｓｔｘ１曝露に対する防御を高めるのに成功しているが、ＳｔｘＢ２サブユニットを用いる免疫は、Ｓｔｘ２に対する防御においては効果がない。さらに、抗ＳｔｘＡ２モノクローナル抗体を用いるマウスの受動免疫は、Ｓｔｘ２産生株への感染の影響からマウスを防御するが、抗ＳｔｘＢ１モノクローナル抗体はこのような曝露に対して防御性がない（Ｗａｄｏｌｋｏｗｓｋｉら（１９９０）、Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．５８、２４３８〜４５；Ｌｉｎｄｇｒｅｎら（１９９３）、Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．６１、３８３２〜４２）。しかし、それぞれ抗ＳｔｘＢ１又は抗ＳｔｘＡ２での受動免疫を行うことにより、そうでなければ致死的である量のＳｔｘ１又はＳｔｘ２を注射されたマウスは防御される。ＳｔｘＡサブユニットの毒性は、Ｂ五量体結合ドメインなしでは大きく抑制され、ＳｔｘＡ１及びＳｔｘＡ２で構成されるワクチンがウサギにおいて同種毒素防御を提供するという証拠がある（Ｂｉｅｌａｓｚｅｗｓｋａら（１９９７）、Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．６５、２５０９〜１６）。しかし、安全性の観点から、ヒトにおいてＡサブユニットワクチンを用いるには酵素活性の不活化が必要であろう。ホロ毒素はサブユニットワクチンよりも防御抗体のより広いスペクトルを与えやすいという見通しから、サブユニットワクチンは一般にあまり望ましくない。
【０００７】
トキソイド（不活化ホロ毒素）ワクチンを用いる免疫による、毒素媒介疾患に対する防御は、破傷風及びジフテリアについて成功している。残念なことに、ホルムアルデヒド又はグルタルアルデヒドを用いるＳｔｘの化学的不活化は、残留毒性（Ｍｅｔｚら（２００３）、Ｖａｃｃｉｎｅ ２２、１５６〜６７；Ｇｏｒｄｏｎら（１９９２）、Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．６０、４８５〜９０）、又は中和抗体が作製されないか、低い力価になるような天然ホロ毒素構造の潜在的なゆがみ、をもたらし得る中途半端な化学的プロセスである。化学的に調製された志賀トキソイドを用いてワクチン接種された動物において、交差中和が達成されたことを示唆する文献報告がいくつかある（Ｂｉｅｌａｓｚｅｗｓｋａら（１９９７）、Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．６５、２５０９〜１６；Ｌｕｄｗｉｇら（２００２）、Ｃａｎ．Ｊ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．４８、９９〜１０３）。しかし、このような生命を脅かすワクチンの潜在的な毒性は、ヒトにおける化学的Ｓｔｘトキソイドの使用を排除する。化学的に誘導されるＳｔｘトキソイドよりも安全な代替物は、ＳｔｘＡサブユニット遺伝子に特定の変異を導入して酵素活性ドメインの重要なアミノ酸を改変することによる、遺伝的トキソイドの構築である。ハイブリッドＳｔｘ１及びＳｔｘ２毒素は、Ａ及びＢサブユニットの単一オペロンとしての発現を可能にするオペロン融合（Ｗｅｉｎｓｔｅｉｎら（１９８９）、Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．５７、３７４３〜５０）を始めとするＳｔｘの機能的研究のために作製されている（Ｈｅａｄら（１９９１）、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６６、３６１７〜３６２１；Ｗｅｉｎｓｔｅｉｎら、既出；Ｍｅｌｔｏｎ−Ｃｅｌｓａら（２００２）、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ ４３、２０７〜２１５）。致死的な結果をもたらすＳｔｘ１又はＳｔｘ２のいずれかの曝露から動物を防御する、Ｓｔｘ１又はＳｔｘ２の遺伝的トキソイドは、以前に作製されている（Ｇｏｒｄｏｎら（１９９２）、Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．６０、４８５〜９０；Ｉｓｈｉｋａｗａら（２００３）、Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｎｕｎ．７１、３２３５〜９；Ｗｅｎら（２００６）、Ｖａｃｃｉｎｅ ２４、１１４２〜８）。しかし、このような遺伝的トキソイドは、Ｓｔｘ１及びＳｔｘ２血清グループの間の交差中和の欠失を回避することができず、それらが作製されたＳｔｘグループに対してのみ防御する。今日まで、Ｓｔｘハイブリッドトキソイドが作製されたという文献報告はない。
【発明の概要】
【０００８】
本発明は、１つ又は複数の活性部位に１つ又は複数の改変を有する少なくとも１つのＳｔｘＡポリペプチド又はその断片と、少なくとも１つのＳｔｘＢポリペプチドと、を含むキメラタンパク質を包含する。いくつかの実施形態において、キメラタンパク質は、五量体として存在する。さらなる実施形態において、ＳｔｘＢポリペプチド又はその断片は、１つ又は複数の改変を含み、該１つ又は複数の改変はアミノ酸置換、付加及び／又は欠失である。いくつかの実施形態において、置換は保存的アミノ酸置換である。さらなる実施形態において、ＳｔｘＡポリペプチドは、ＳｔｘＡ２若しくはその断片であり、かつ／又はＳｔｘＢポリペプチドは、ＳｔｘＢ１若しくはその断片である。別の実施形態において、タンパク質は、配列番号２及び／又は３のアミノ酸配列を含むか、該アミノ酸配列からなる。
【０００９】
さらなる実施形態において、本発明のキメラタンパク質は、Ｓｔｘ２Ａポリペプチド又はその断片中の、残基７７、１６７又は１７０に相当するアミノ酸残基での１つ又は複数の改変を含む。いくつかの実施形態において、残基７７での改変はセリン残基への置換であり、残基１６７での改変はグルタミン、アスパラギン又はその他のアミノ酸残基への置換であり、残基１７０での改変はロイシン残基への置換である。いくつかの実施形態において、改変は、本明細書に記載のＳｔｘ２Ａポリペプチドの酵素活性を減少させるか、消失させることができる。他の実施形態において、改変は、タンパク質を哺乳動物にとって無毒化する。
【００１０】
本発明はまた、本明細書に記載の本発明のキメラトキソイドタンパク質に結合する単離抗体を包含する。いくつかの実施形態において、抗体はポリクローナル抗体である。本発明はまた、本明細書に記載の１つ又は複数の本発明のキメラトキソイドタンパク質のいずれかを含む組成物を包含する。いくつかの実施形態において、キメラタンパク質は、これに限定されないが、志賀毒素に対する免疫原性応答を含む免疫原性応答を誘導可能なものである。いくつかの実施形態において、組成物は、１つ又は複数の薬学的に許容される担体及び／又はアジュバントをさらに含む。別の実施形態において、組成物はヒトへの投与に適する。
【００１１】
本発明は、本明細書に記載の本発明のキメラトキソイドタンパク質をコードする単離核酸分子をさらに包含する。いくつかの実施形態において、単離核酸分子は、配列番号２及び／又は３を含むアミノ酸配列をコードする。さらなる実施形態において、核酸分子は、配列番号１のヌクレオチド配列を含むか、又はそのヌクレオチド配列からなる。いくつかの実施形態において、ヌクレオチド配列は、配列番号１の連続したヌクレオチド配列と少なくとも９０％、９５％又は９９％までもの配列同一性を示し、かつＳｔｘに対する免疫原性応答を誘導可能なポリペプチドをコードする。
【００１２】
本発明は、本明細書に記載の本発明の核酸を含むように形質転換された宿主細胞を包含し、また、単離核酸を含むベクターを包含する。本発明はまた、前記ベクターを含む宿主細胞を包含する。いくつかの実施形態において、宿主は、原核生物宿主及び真核生物宿主からなる群より選択される。本発明は、本発明の核酸分子で形質転換された宿主細胞を、前記核酸分子によりコードされるタンパク質が発現される条件下で培養するステップを含む、ポリペプチドを製造する方法をさらに包含する。
【００１３】
本発明は、本明細書に記載の本発明のキメラトキソイドタンパク質を、哺乳動物又は細胞培養物に投与するステップを含む、Ｓｔｘに結合可能な抗体を作製する方法を包含する。本発明は、本発明のキメラトキソイドタンパク質を含む組成物を哺乳動物に投与するステップを含む、Ｓｔｘに結合可能な抗体を作製する方法をさらに包含する。いくつかの実施形態において、哺乳動物はヒトである。さらなる実施形態において、ヒトは、下痢及び／又は溶血尿毒症症候群に罹患している。
【００１４】
本発明はまた、本発明のキメラトキソイドタンパク質を含む組成物を投与するステップを含む、ヒトにおける溶血尿毒症症候群を予防する方法を包含する。本発明は、前記組成物を投与するステップを含む、ヒトにおける志賀毒素産生大腸菌感染に関連する下痢を予防する方法を包含する。本発明は、これらの方法のいずれかにより製造された単離抗体、及び該抗体を含むキットを包含する。いくつかの実施形態において、キットは、１つ又は複数の本発明のキメラトキソイドタンパク質をさらに含む。
【詳細な説明】
【００１５】
Ｓｔｘ及び溶血尿毒症症候群（ＨＵＳ）に対する免疫の目標は、これに限定されないが、Ｓｔｘ１及び２、並びにＳｔｘ１及びＳｔｘ２のバリアントを含む複数の型のＳｔｘに対して広く反応性がある中和抗体応答（ＮＡ）を誘導することである。本発明者らは、Ｓｔｘ産生大腸菌（ＳＴＥＣ）を研究し、このハイブリッドトキソイド中の１つ又は複数の部位での改変を有するキメラ志賀トキソイドの創出により、免疫の後に、Ｓｔｘに対する交差反応性の広い抗体種の産生が誘導されることを見出した。すなわち、本発明は、キメラ志賀トキソイド、使用方法及び組成物を包含する。本明細書において、「トキソイド」とは、不活化されたホロ毒素のことである。本明細書において、「酵素不活化ＳｔｘＡ２サブユニット」とは、例えば置換、付加及び／又は欠失のような変異によりその機能を失ったＳｔｘＡ２サブユニットのことである。
【００１６】
志賀トキソイドキメラタンパク質及び使用方法：
本発明は、酵素不活化ＳｔｘＡ２サブユニットと天然のＳｔｘＢ１サブユニットとを含むキメラ志賀トキソイドタンパク質を包含する。ＳｔｘＡ２サブユニットは、部位特異的突然変異誘発により単独又は組合せで１つ又は複数の部位にて不活化されている。いくつかの実施形態において、アミノ酸は欠失されており、いくつかの実施形態においては、アミノ酸は置換されている。欠失及び／又は置換にも関わらず、ＳｔｘＡ２サブユニットの立体配座は、哺乳動物への投与の後に、Ｓｔｘの多様なサブユニットに対する抗体を誘導できるように十分に損なわれないままである。改変されたキメラトキソイドで免疫される哺乳動物（例えば、ヒト及び／又はマウス。これらに限定されない。）は、免疫応答を生じ、これがＨＵＳ又はＳＴＥＣ感染若しくはＳｔｘ中毒のその他の影響を減少させるか、遮断する。
【００１７】
ＳｔｘＡ２タンパク質中の適切な置換部位の例としては、これらに限定されないが、配列番号２の残基７７、１６７及び１７０に相当するＳｔｘＡ２のアミノ酸が挙げられる。置換は、Ｙ７７Ｓ、Ｅ１６７Ｑ及びＲ１７０Ｌ又はその等価物であってもよい。本発明のある実施形態において、本発明は、配列番号２及び３に示すアミノ酸配列並びにそれらの断片を含む。本発明の別の実施形態において、本発明は、配列番号２及び／又は３に示すアミノ酸配列並びにその断片の、酵素不活化ＳｔｘＡ２サブユニット及び天然ＳｔｘＢ１サブユニットを含むキメラ志賀トキソイドを包含する。
【００１８】
本発明のある実施形態において、ＳｔｘＢ１サブユニットは、ＧＢ３受容体に結合しないか、又はＧＢ３受容体への結合が制限されているが、防御抗体応答を誘発可能である。
【００１９】
本発明は、少なくとも１つの志賀トキソイドタンパク質と少なくとも１つの第２のポリペプチドとを含む、キメラ及び／又は融合ポリペプチド並びにその塩を含む。ある実施形態において、第２のポリペプチドは、第２の型のＳｔｘを含む。
【００２０】
第２のポリペプチドは、融合ポリペプチドの半減期をｉｎ ｖｉｔｒｏ及びｉｎ ｖｉｖｏで増大させる安定化ドメインも含み得る。本明細書において、「安定化ドメイン」とは、志賀トキソイド単独と比較したときに、志賀トキソイドのｉｎ ｖｉｔｒｏ及びｉｎ ｖｉｖｏでの半減期を延長可能なアミノ酸配列のことをいう。安定化ドメインは、ヒト血清アルブミン、トランスフェリンのようなヒトタンパク質（例えば細胞外断片からの全長又は短縮された可溶性タンパク質など）、又はキメラトキソイドタンパク質のｉｎ ｖｉｖｏ又はｉｎ ｖｉｔｒｏでの半減期を安定化するその他のタンパク質を含み得る。これらの付加的な機能的ドメインは、それら自体で、例えば志賀トキソイドを第２のタンパク質に接続するためのリンカーペプチドとして働いてもよい。或いは、これらは、融合分子の他の場所（例えば、そのアミノ又はカルボキシ末端）に位置してもよい。他の実施形態において、安定化ドメインは、化学的部分（ｃｈｅｍｉｃａｌ ｍｏｉｅｔｙ）（例えば、ＰＥＧ（ポリエチレングリコール）又はデキストラン）である。
【００２１】
本明細書において、「キメラ」又は「融合ポリペプチド」とは、（ｉ）所定の機能的ドメイン（すなわち志賀トキソイド）が、そのカルボキシ末端にて、非共有結合により、第２のタンパク質（すなわち第２の志賀トキソイド）のアミノ末端又はそれ自体が非共有結合により第２のタンパク質のアミノ末端に結合するリンカーペプチドのいずれかに結合し、（ｉｉ）所定の機能的ドメイン（すなわち志賀トキソイド）が、そのアミノ末端にて、非共有結合により、第２のタンパク質（すなわち第２の志賀トキソイド）のカルボキシ末端又はそれ自体が非共有結合により第２のタンパク質のカルボキシ末端に結合するリンカーペプチドのいずれかに結合し、及び／又は（ｉｉｉ）Ｓｔｘが本明細書に記載のＡＢ５配置を有し、酵素活性（Ａ）サブユニットと、五量体を形成する５つの同一のＢタンパク質で構成される結合ドメイン（Ｂ）と、を有する複合ホロ毒素として存在するポリペプチドのことをいう。
【００２２】
同様に、本発明の核酸中間体に関連して用いる場合、「融合」は、タンパク質をコードするヌクレオチド配列の３’−［又は５’−］末端が、第２のタンパク質をコードするヌクレオチド配列のそれぞれの３’−［又は５’−］末端に、共有結合により、又はそれ自体が第１機能的ドメインをコードするポリヌクレオチドと所望により第２機能的ドメインをコードする核酸に好ましくはその末端にて共有結合するヌクレオチドリンカーを介して間接的に、結合していることを意味する。
【００２３】
本発明のキメラ又は融合ポリペプチドの例は、これらに限定されないが、下記式により表され得る。
Ｒ１−Ｌ−Ｒ２ （ｉ）
Ｒ２−Ｌ−Ｒ１ （ｉｉ）
Ｒ１−Ｌ−Ｒ２−Ｌ−Ｒ１ （ｉｉｉ）
Ｒ１−Ｌ−Ｒ１−Ｌ−Ｒ２ （ｉｖ）
Ｒ２−Ｌ−Ｒ１−Ｌ−Ｒ１ （ｉｖ）
式中、Ｒ１は第１志賀トキソイドのアミノ酸配列であり、Ｒ２は第２志賀トキソイド又は安定化ドメイン（例えばヒト血清アルブミン）のアミノ酸配列であり、それぞれのＬは、Ｒ１及び／又はＲ２の末端に共有結合により結合するリンカーペプチドである（ここで、上記の分子断片は、方向付けて読まれる。すなわち、左側は分子のアミノ末端に、右側はカルボキシ末端に相当する）。別の実施形態において、インチミン結合ドメイン（カルボキシ末端）を含むインチミンタンパク質（Ｃａｒｖａｌｈｏら（２００５）、Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．７３、２５４１〜２５４６）の全て又は一部分はＲ１であり、Ｒ２はキメラトキソイドタンパク質である。
【００２４】
核酸分子及び使用方法：
本発明は、酵素不活化ＳｔｘＡ２サブユニットと天然ＳｔｘＢ１サブユニットとを有するキメラタンパク質又はその断片を含む本発明のキメラ志賀トキソイドタンパク質をコードする、好ましくは単離された形の核酸分子をさらに提供する。本明細書において、「核酸」とは、上記で定義されるタンパク質又はペプチドをコードするか、このようなペプチドをコードする核酸配列に相補的であるか、酵素不活化ＳｔｘＡ２サブユニットと天然ＳｔｘＢ１サブユニットとをコードする核酸分子にオープンリーディングフレームにわたって適切なストリンジェンシー条件下でハイブリダイズするか、又は不活化ＳｔｘＡ２と少なくとも約６５％の同一性及びＳｔｘＢ１と約９１％の同一性、若しくは不活化ＳｔｘＡ２と少なくとも約９０％の同一性及びＳｔｘＢ１と約９１％の同一性、若しくは不活化ＳｔｘＡ２と少なくとも約９９％の同一性及びＳｔｘＢ１と約９５％の同一性、若しくは不活化ＳｔｘＡ２と少なくとも９９．４％の同一性及びＳｔｘＢ１と約９９％の同一性を有するポリペプチドをコードするＲＮＡ又はＤＮＡとして定義される。
【００２５】
本発明の核酸は、配列番号２及び／又は３を含む酵素不活化ＳｔｘＡ２サブユニット及び天然ＳｔｘＢ１サブユニットを含むキメラ志賀トキソイドをコードする核酸分子の連続したヌクレオチド配列と、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％又はそれより高い同一性を有する核酸分子、をさらに含む。
【００２６】
本発明のいくつかの実施形態において、核酸分子は、例えばＳｔｘＡ２タンパク質（配列番号２）のアミノ酸残基７７、１６７及び１７０をコードするコドンのように、適切な置換部位をコードするコドンにおけるＳｔｘＡ２遺伝子のコード領域内に、二重又は三重の塩基置換を含む。
【００２７】
別の実施形態において、核酸分子は、ＳｔｘＢ１タンパク質が腎臓細胞と（例えば宿主細胞のＧＢ３受容体を介して）相互作用するのを妨げる改変（例えば置換、付加及び／又は欠失）を、ＳｔｘＢ１遺伝子のコード領域内に含む。ある実施形態において、このような改変は、ＳｔｘＢ１タンパク質のアミノ酸残基１６及び／又は１７をコードする１つ又は複数のコドンにある。これらの改変は、Ｄ１６Ｈ及びＤ１７Ｈ又はその等価物のアミノ酸置換を増加させ得る。別の実施形態において、このような改変は、ＳｔｘＢ１タンパク質のアミノ酸残基３３、４３及び／又は６０をコードする１つ又は複数のコドンにある。これらの改変は、Ｒ３３Ｃ、Ａ４３Ｔ及びＧ６０Ｄ又はその等価物のアミノ酸置換を増加させ得る。さらに別の実施形態において、このような改変は、ＳｔｘＢ１のアミノ酸残基１６及び／又は１７をコードする１つ又は複数のコドンと、ＳｔｘＢ１タンパク質のアミノ酸残基３３、４３及び／又は６０をコードする１つ又は複数のコドンとにある。これらの改変は、Ｄ１６Ｈ及びＤ１７Ｈ又はその等価物のアミノ酸置換と、Ｒ３３Ｃ、Ａ４３Ｔ及びＧ６０Ｄ又はその等価物のアミノ酸置換と、を増加させ得る。
【００２８】
特に企図されているのは、ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ｍＲＮＡ及びアンチセンス分子、並びに代替骨格をベースとするか代替塩基を含む核酸（天然の供給源に由来するか、合成のものか、は問わない。）である。しかし、そのような核酸は、本発明のタンパク質をコードする核酸、該核酸と適切なストリンジェンシー条件下でハイブリダイズする核酸、又は該核酸に相補的である核酸、を含むいずれの従来の核酸に対しても、さらに、新規かつ非自明であるものとする。ヌクレオチド又はアミノ酸配列のレベルでの相同性又は同一性は、配列類似性検索のために作られたｂｌａｓｔｐ、ｂｌａｓｔｎ、ｂｌａｓｔｘ、ｔｂｌａｓｔｎ及びｔｂｌａｓｔｘ（Ａｌｔｓｃｈｕｌら（１９９７）、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２５、３３８９〜３４０２；及びＫａｒｌｉｎら（１９９０）、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８７、２２６４〜２２６８。ともに、参照されることによりその全体が本明細書に組み込まれる。）のプログラムにより採用されるアルゴリズムを用いるＢＬＡＳＴ（Ｂａｓｉｃ Ｌｏｃａｌ Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ Ｓｅａｒｃｈ Ｔｏｏｌ）分析により決定される。ＢＬＡＳＴプログラムにより用いられるアプローチは、まず、問合せ配列とデータベース配列との間のギャップの存否での類似セグメントを考慮し、次に、同定された全ての一致の統計的有意性を評価し、最後に、有意性の予め選択した閾値を満足する一致のみをまとめることである。配列データベースの類似性検索における基本的な問題の論説については、Ａｌｔｓｃｈｕｌら（１９９４）、Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ６、１１９〜１２９（参照されることによりその全体が本明細書に組み込まれる。）を参照されたい。ヒストグラム、表示、アラインメント、期待値（すなわち、データベース配列に対する一致を報告するための統計的有意性の閾値）、カットオフ、行列及びフィルタ（低い複雑度）のついての検索パラメータは初期設定である。ｂｌａｓｔｐ、ｂｌａｓｔｘ、ｔｂｌａｓｔｎ及びｔｂｌａｓｔｘにより用いられる初期設定のスコア行列は、長さ８５（ヌクレオチド塩基）を超える問合せ配列に推奨されるＢＬＯＳＵＭ６２行列（Ｈｅｎｉｋｏｆｆら（１９９２）、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８９、１０９１５〜１０９１９。参照されることによりその全体が本明細書に組み込まれる。）である。
【００２９】
ｂｌａｓｔｎについて、スコア行列は、Ｍ（すなわち一致残基の対についてのリワードスコア）のＮ（すなわち不一致残基についてのペナルティスコア）に対する比（ここで、Ｍ及びＮについての初期設定値はそれぞれ＋５及び−４である）により設定される。ｂｌａｓｔｎについての４つのパラメータは、以下のようにして調節した：Ｑ＝１０（ギャップ生成ペナルティ）；Ｒ＝１０（ギャップ伸長ペナルティ）；ｗｉｎｋ＝１（問合せに沿ってｗｉｎｋ番目の位置ごとにワードヒットを作製する）；及びｇａｐｗ＝１６（ギャップを含むアラインメントを作製する範囲内でウィンドウ幅を設定する）。等価なＢｌａｓｔｐパラメータ設定は、Ｑ＝９；Ｒ＝２；ｗｉｎｋ＝１及びｇａｐｗ＝３２であった。ＧＣＧパッケージバージョン１０．０で利用可能な配列間のＢｅｓｔｆｉｔ比較は、ＤＮＡパラメータＧＡＰ＝５０（ギャップ生成ペナルティ）及びＬＥＮ＝３（ギャップ伸長ペナルティ）を用い、タンパク質比較における等価な設定は、ＧＡＰ＝８及びＬＥＮ＝２である。
【００３０】
「ストリンジェントな条件」とは、（１）低イオン強度及び高温を洗浄に用いる（例えば、５０℃〜６８℃で、０．０１５Ｍ ＮａＣｌ／０．００１５Ｍクエン酸ナトリウム／０．１％ ＳＤＳを用いる）か、或いは（２）ハイブリダイゼーション時にホルムアルデヒドのような変性剤を用いる（例えば、５０％（体積／体積）ホルムアルデヒドを、０．１％ウシ血清アルブミン／０．１％フィコール／０．１％ポリビニルピロリドン／５０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６．５）（７５０ｍＭ ＮａＣｌ、７５ｍＭクエン酸ナトリウムを含む。）とともに４２℃で用いる）条件である。別の例としては、５０％ホルムアルデヒド、５×ＳＳＣ（０．７５Ｍ ＮａＣｌ、０．０７５Ｍクエン酸ナトリウム）、５０ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ６．８）、０．１％ピロリン酸ナトリウム、５×デンハルト溶液、超音波処理サケ精子ＤＮＡ（５０μｇ／ｍｌ）、０．１％ ＳＤＳ、１０％硫酸デキストラン中、４２℃でのハイブリダイゼーションと、０．２×ＳＳＣ、０．１％ ＳＤＳ中、４２℃、又は０．１×ＳＳＣ、０．５％ ＳＤＳ中、６８℃での洗浄と、を行うことが挙げられる。当業者であれば、容易に、ストリンジェンシー条件を適宜決定、変更して、明確で検出可能なハイブリダイゼーションシグナルを得ることができる。好ましい分子は、配列番号１の相補鎖に上記の条件下でハイブリダイズし、機能的タンパク質をコードするものである。さらに好ましいハイブリダイジング分子は、酵素不活化ＳｔｘＡ２サブユニットと天然ＳｔｘＢ１サブユニットとを含むキメラ志賀トキソイドをコードする核酸のオープンリーディングフレームの相補鎖に、上記の条件下でハイブリダイズするものである。本明細書において、核酸分子が他のポリペプチドをコードする混入核酸分子から実質的に分離されている場合、核酸分子は「単離された」という。
【００３１】
酵素不活化ＳｔｘＡ２サブユニットと天然ＳｔｘＢ１サブユニットとを含むキメラ志賀トキソイドをコードする核酸分子は、オペロンの一部分である。本発明のある実施形態は、酵素不活化ＳｔｘＡ２サブユニットをコードする核酸と、続いて、ＳｔｘＢ１の翻訳のためのリボソーム結合部位を含む天然ｓｔｘＢ１遺伝子間領域をコードする核酸分子と、次いで、天然ＳｔｘＢ１をコードする核酸分子とで構成される融合オペロンである。
【００３２】
本発明は、酵素不活化ＳｔｘＡ２サブユニットと天然ＳｔｘＢ１サブユニットとを含むキメラ志賀トキソイドを含む核酸分子をコードする断片をさらに提供する。本明細書において、コード核酸分子の断片とは、全体のタンパク質コード配列の小さい部分のことをいう。断片のサイズは、目的の用途により決定される。例えば、推定抗原領域に相当するペプチドをコードする断片を調製してもよい。断片が、核酸プローブ又はＰＣＲプライマーとして用いられる場合、断片の長さは、プローブ付加／プライマー結合の間の偽陽性を比較的少数にするように選択される。
【００３３】
本発明のタンパク質をコードする遺伝子配列を合成するために用いられる本発明の核酸分子をコードする断片（すなわち合成オリゴヌクレオチド）は、例えば、Ｍａｔｔｅｕｃｃｉら（１９８１）、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１０３、３１８５〜３１９１のホスホトリエステル法のような化学的手法により、又は自動合成法を用いて容易に合成できる。さらに、より大きいＤＮＡセグメントは、遺伝子の種々のモジュラーセグメントを規定するオリゴヌクレオチドの群の合成、続いて、オリゴヌクレオチドの連結による完全改変遺伝子の構築のような公知の方法により容易に調製できる。ある実施形態において、本発明の核酸分子は、少なくとも約１２５３ヌクレオチドの連続したオープンリーディングフレームを含み、この配列は、最適化されたシャイン−ダルガルノ配列で始まり、ｓｔｘＢ１停止コドンの後に終結する。
【００３４】
本発明のコード核酸分子は、診断及びプローブ目的の検出可能な標識を含むようにさらに改変されてもよい。本発明のコード核酸分子は、単離用の標識を含むようにさらに改変（例えば、ニッケルアフィニティー精製で用いるヒスチジン分子をコードする反復コドンを付加）してもよい。このような多様な標識は、当技術分野において知られており、本明細書に記載のコード分子とともに容易に用い得る。適切な標識としては、これらに限定されないが、例えば、ビオチン、放射性標識ヌクレオチドが挙げられる。当業者であれば、容易に、そのような標識を用いて、本発明の核酸分子の標識されたバリアントを得ることができる。翻訳の間にタンパク質配列中へ組み込まれるアミノ酸の欠失、付加又は変更による１次構造自体の改変は、タンパク質の活性を破壊することなく行い得る。
【００３５】
ある実施形態において、６ヒスチジンタグを天然又はわずかに改変されたＳｔｘＢ１タンパク質のＣ末端に付加して、例えばニッケルアフィニティー法によるＳｔｘＡ２／ＳｔｘＢ１トキソイドの精製を補助する。別の実施形態において、６ヒスチジンタグを天然又はわずかに改変されたＳｔｘＢ１タンパク質のＣ末端に付加し、６ヒスチジンタグをＳｔｘＡ２タンパク質にも付加する。ＳｔｘＡ２タンパク質中のヒスチジンタグは、ＳｔｘＡ２の２４４及び２４５位に存在する２つのヒスチジンのすぐ近傍に位置してもよい。ヒスチジンタグは、例えばＱ２４６Ｈ、Ｇ２４７Ｈ、Ａ２４８Ｈ及びＲ２４９Ｈのように、ＳｔｘＡ２タンパク質中の４つ以下のアミノ酸を変化させることにより付加してもよい。有利には、ＳｔｘＡ２及びＳｔｘＢ１サブユニットへのそれぞれのタグ付加は、ニッケルアフィニティーカラム精製と組み合わせてイオン交換及びサイズ排除精製手法を用いる、サブユニットのよりよい精製を可能にする。
【００３６】
組換え核酸及び使用方法：
本発明は、キメラ酵素不活化ＳｔｘＡ２サブユニット及び天然ＳｔｘＢ１サブユニットのコード配列を含む組換え核酸分子（例えば、ＤＮＡ、ＲＮＡ）をさらに提供する。本明細書において、「組換え核酸分子」は、ｉｎ ｓｉｔｕでの分子操作に供された核酸分子である。組換え核酸分子を作製する方法は、当技術分野で公知であり、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら（２００１）、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ−Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓを参照されたい。好ましい組換え核酸分子において、コードヌクレオチド配列は、発現調節配列及び／又はベクター配列に操作可能に連結している。
【００３７】
本発明のタンパク質ファミリーコード配列の１つが操作可能に連結しているベクター及び／又は発現調節配列の選択は、当技術分野において知られているように、所望の機能的特性、例えばタンパク質発現、及び形質転換される宿主細胞に直接依存する。本発明が意図するベクターは、組換え核酸分子に含まれる構造遺伝子の複製又は宿主染色体への挿入、及び好ましくは発現をも、少なくとも支配し得る。
【００３８】
操作可能に連結されたタンパク質コード配列の発現を調節するために用いられる発現制御要素は、当技術分野において知られており、これらに限定されないが、誘導性プロモーター、構成性プロモーター、分泌シグナル、及びその他の調節要素を含む。好ましくは、誘導性プロモーターは、宿主細胞の培地中の栄養素に応答性であるように、容易に制御される。
【００３９】
ある実施形態において、コード核酸分子を含むベクターは、原核生物レプリコン、すなわち自律複製及び形質転換される細菌宿主細胞のような原核生物宿主細胞内の染色体外での組換えＤＮＡ分子の維持を支配し得る能力を有するＤＮＡ配列を含む。このようなレプリコンは、当技術分野において公知である。さらに、原核生物レプリコンを含むベクターは、その発現が薬剤耐性のような検出可能なマーカーを与える遺伝子も含んでもよい。典型的な細菌薬剤耐性遺伝子は、アンピシリン又はテトラサイクリンへの耐性を与えるものである。
【００４０】
原核生物レプリコンを含むベクターは、大腸菌のような細菌宿主細胞におけるコード遺伝子配列の発現（転写及び翻訳）を支配し得る原核生物又はバクテリオファージのプロモーターをさらに含み得る。プロモーターは、ＲＮＡポリメラーゼの結合と、転写の開始を可能にするＤＮＡ配列により形成される発現制御要素である。細菌宿主に適合するプロモーター配列は、本発明のＤＮＡセグメントの挿入のための簡便な制限部位を含むプラスミドベクターに、典型的には提供される。このようなベクタープラスミドの典型的な例は、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＩＩ ＫＳ（−）（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）、ｐＴｒｃＨｉｓ２Ｃ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、ｐＵＣ８、ｐＵＣ９、ｐＢＲ３２２及びｐＢＲ３２９（ＢｉｏＲａｄ）、ｐＰＬ及びｐＫＫ２２３（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）である。
【００４１】
真核細胞に適合する発現ベクター、好ましくは脊椎動物細胞に適合するものを用いても、コード配列を含む組換え核酸分子を形成できる。ウイルスベクターを含む真核細胞発現ベクターは、当技術分野において公知であり、いくつかの商業的供給元から入手可能である。典型的には、このようなベクターは、所望のＤＮＡセグメントの挿入のための簡便な制限部位を含んで提供される。このようなベクターの典型は、ｐＳＶＬ及びｐＫＳＶ−１０（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）、ｐＢＰＶ−１／ｐＭＬ２ｄ（Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｉｎｃ．）、ｐＴＤＴ１（ＡＴＣＣ）、本明細書に記載のベクターｐＣＤＭ８などの真核生物発現ベクターである。
【００４２】
本発明の組換え核酸分子を構築するために用いられる真核細胞発現ベクターは、真核細胞で効果がある選択可能なマーカー、好ましくは薬剤耐性選択マーカーをさらに含んでもよい。好ましい薬剤耐性マーカーは、その発現がネオマイシン耐性をもたらす遺伝子、すなわちネオマイシンホスホトランスフェラーゼ（ｎｅｏ）遺伝子である（Ｓｏｕｔｈｅｒｎら（１９８２）、Ｊ．Ｍｏｌ．Ａｎａｌ．Ｇｅｎｅｔ．１、３２７〜３４１）。或いは、選択可能なマーカーは、別のプラスミド上に存在することができ、２つのベクターが宿主細胞の同時トランスフェクションにより導入され、選択可能なマーカーについての適切な薬剤中で培養することにより選択される。本発明は、本発明のタンパク質をコードする核酸分子で形質転換された宿主細胞をさらに提供する。宿主細胞は、原核生物又は真核生物のいずれかであり得る。
【００４３】
本発明のキメラタンパク質の発現に有用な真核細胞は、細胞株が細胞培養法と適合し、発現ベクターの伝播及び遺伝子産物の発現に適合する限り限定されない。適切な真核生物宿主細胞としては、これらに限定されないが、酵母、昆虫及び哺乳動物細胞、好ましくは脊椎動物細胞（例えば、マウス、ラット、サル又はヒトの細胞株由来のもの）が挙げられる。真核生物宿主細胞の例は、ＡＴＣＣからＣＣＬ６１として入手可能なチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、ＡＴＣＣからＣＲＬ１６５８として入手可能なＮＩＨスイスマウス胚細胞（ＮＩＨ−３Ｔ３）、ハムスター仔腎臓細胞（ＢＨＫ）などの真核生物組織培養細胞株を含む。
【００４４】
本発明のキメラタンパク質をコードする組換え核酸分子を発現するために、いずれの原核生物宿主も用い得る。ある実施形態において、原核生物宿主は、ＤＨ５α又はＢＬ２１株のような大腸菌である。別の実施形態において、原核生物宿主は、フレクスナー赤痢菌（Ｓｈｉｇｅｌｌａ ｆｌｅｘｎｅｒｉ）（Ｂａｒｒｙら（２００３）、Ｖａｃｃｉｎｅ ２１、３３３〜４０）又はコレラ菌（Ｖ．ｃｈｏｌｅｒａｅ）（Ｌｅｙｔｅｎら（２００５）、Ｖａｃｃｉｎｅ ２３、５１２０〜５１２６）のような生弱毒口腔細菌ワクチン株である。
【００４５】
本発明のｒＤＮＡ分子を用いる適切な細胞宿主の形質転換は、用いられるベクターの型と採用する宿主系に典型的に依存する公知の方法により達成される。原核生物宿主細胞の形質転換について、エレクトロポレーション及び塩処理法が典型的に用いられ、例えばＣｏｈｅｎら（１９７２）、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ６９、２１１０；及びＳａｍｂｒｏｏｋら（２００１）、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ−Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓを参照されたい。ｒＤＮＡを含むベクターを用いる脊椎動物細胞の形質転換について、エレクトロポレーション、カチオン脂質又は塩処理法が典型的に用いられ、たとえばＧｒａｈａｍら（１９７３）、Ｖｉｒｏｌ．５２、４５６；Ｗｉｇｌｅｒら（１９７９）、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ７６、１３７３〜１３７６を参照されたい。
【００４６】
形質転換が成功した細胞、すなわち本発明の組換え核酸分子を含む細胞は、選択可能なマーカーの選択を含む公知の方法により同定することができる。例えば、本発明の組換え核酸の導入により得られる細胞は、クローン化して、単一のコロニーを産生することができる。これらのコロニーからの細胞を採集し、溶解し、それらの核酸含量を、Ｓｏｕｔｈｅｒｎ（１９７５）、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．９８、５０３〜５０４又はＢｅｒｅｎｔら（１９８５）、Ｂｉｏｔｅｃｈ．３、２０８〜２０９に記載の方法のような方法を用いて、組換え核酸の存在について調べ、或いは細胞から産生されるタンパク質を免疫学的方法によりアッセイすることができる。
【００４７】
組換えタンパク質の製造：
当業者であれば、本発明のキメラ志賀トキソイドをコードする組換え核酸分子をどのように作製するか、が分かるであろう。さらに、当業者であれば、これらの組換え核酸分子を用いて、それによりコードされるタンパク質をどのように得るか（これは、ハイブリッド志賀トキソイドをコードする組換え核酸分子について、本明細書に記載されている）、が分かるであろう。
【００４８】
本発明では、ハイブリッド志賀トキソイドの発現のための多くのベクター系を採用することができる。例えば、あるクラスのベクターは、ウシパピローマウイルス、ポリオーマウイルス、アデノウイルス、ワクシニアウイルス、バキュロウイルス、レトロウイルス（ＲＳＶ、ＭＭＴＶ又はＭｏＭＬＶ）、セムリキ森林ウイルス又はＳＶ４０ウイルスのような動物ウイルスに由来するＤＮＡ要素を利用する。さらに、それらの染色体にＤＮＡを安定に組み込んだ細胞は、トランスフェクトされた宿主細胞の選択を可能にする１つ又は複数のマーカーを導入することにより選択することができる。マーカーは、例えば、栄養要求宿主に対する原栄養性、殺生物剤耐性（例えば、抗生物質）、又は銅のような重金属に対する耐性を提供するものであってもよい。選択可能なマーカー遺伝子は、発現されるＤＮＡ配列に直接連結するか、又は同時形質転換により同じ細胞に導入することができる。ｍＲＮＡの最適な合成のために、さらなる要素を要求してもよい。そのような要素としては、スプライシングシグナルの他、転写プロモーター、エンハンサー及び終結シグナルが挙げられる。そのような要素を組み込んだｃＤＮＡ発現ベクターとしては、Ｏｋａｙａｍａ（１９８３）、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．３、２８０〜２８９に記載のものが挙げられる。
【００４９】
ハイブリッド志賀トキソイドは、（ａ）細胞を、ハイブリッド志賀トキソイドをコードする発現ベクターでトランスフェクトするステップと、（ｂ）得られたトランスフェクト細胞を、ハイブリッド志賀トキソイドが産生される条件下で培養するステップと、（ｃ）細胞培養培地又は細胞自体からハイブリッド志賀トキソイドを回収するステップと、により製造することができる。
【００５０】
発現ベクター又は構築物を含むＤＮＡ配列を発現用に調製した後、発現ベクターは、適切な真核生物又は原核生物の細胞宿主にトランスフェクト又は導入することができる。これを実現するために、例えばプロトプラスト融合、リン酸カルシウム沈殿、エレクトロポレーション又はその他の従来の方法のような種々の方法を用いることができる。プロトプラスト融合の場合、細胞を培地中で増殖させ、適切な活性についてスクリーニングする。
【００５１】
得られたトランスフェクト細胞の培養、及びそのようにして製造されたハイブリッド志賀トキソイドの回収のための方法及び条件は、当業者に公知であり、採用する具体的な発現ベクター及び宿主細胞に応じて変更又は最適化することができる。
【００５２】
ハイブリッド志賀トキソイドを発現するための宿主細胞は、原核生物であっても真核生物であってもよい。原核生物宿主の例は、大腸菌ＤＨ５α又はＢＬ２１のような大腸菌を含む。真核生物宿主の例は、バキュロウイルスベクター／昆虫細胞発現系、酵母シャトルベクター／酵母細胞発現系を含む。培養培地からハイブリッド志賀トキソイドを精製する方法及び条件は本発明において提供されるが、これらの手順は変更又は最適化することができること（当業者には周知である。）が認識されるべきである。
【００５３】
本発明のハイブリッド志賀トキソイドタンパク質は、任意の既知の合成法により調製することができる。簡便には、タンパク質は、Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ（１９６５）（参照されることにより、本明細書に組み込まれる。）により最初に記載された固相合成法を用いて調製することができる。その他のペプチド合成法は、例えばＢｏｄａｎｓｚｋｙら（１９７６）、Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ、Ｗｉｌｅｙに見出される。
【００５４】
免疫原性組成物及びその使用：
本発明のキメラハイブリッド志賀トキソイドは、ワクチン、免疫原性組成物又は医薬組成物中で用いて、Ｓｔｘに対する免疫応答を発生させることができる。キメラ志賀トキソイドは、免疫原性のより小さい他の組成物と併用して、免疫原性組成物に対する免疫応答の誘発を補助することもできる。一般に、他の免疫原性組成物と併用する場合、免疫原性組成物自体は、免疫応答を誘発するのにも、病原体に対する防御効果を提供するのにも十分でない。ある実施形態において、本発明の志賀トキソイドは、ジフテリア菌（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｄｉｐｈｔｈｅｒｉａｅ）による感染に対する防御効果を提供するための手段として、ジフテリア毒素と併用される。
【００５５】
ある実施形態において、ハイブリッド志賀トキソイドは、当技術分野において通常理解されるように、適切なアジュバントとともに用いられる。現在、米国でヒトへの使用について認可されているアジュバントは、例えばアルミニウム塩（ミョウバン）を含む。これらのアジュバントは、Ｂ型肝炎、ジフテリア、ポリオ、狂犬病及びインフルエンザを含むいくつかのワクチンに有用である。その他の有用なアジュバントは、完全フロイントアジュバント（ＣＦＡ）、ムラミルジペプチド（ＭＤＰ）、ＭＤＰの合成類似体、Ｎ−アセチルムラミル−Ｌ−アラニル−Ｄ−イソグルタミル−Ｌ−アラニン−２−［１，２−ジパルミトイル−ｓ−グリセロ−３−（ヒドロキシホスホリルオキシ）］エチルアミド（ＭＴＰ−ＰＥ）、不完全フロイントアジュバント（ＩＦＡ）、及び実質的に全ての油滴が直径１ミクロン未満の油滴である水中油型エマルジョンの形で油と乳化剤とが存在する、分解性油及び乳化剤を含む組成物を含む。
【００５６】
本発明のワクチン、免疫原性組成物又は医薬組成物の製剤は、有効量のキメラ志賀トキソイドを用いる。すなわち、アジュバントと併用されて、その後のＳｔｘへの曝露からの防御を個体に与えるような特異的かつ十分な免疫原性応答を個体に生じさせる量の抗原が含まれる。免疫原性組成物として用いる場合、製剤は、アジュバントと併用されて、個体に特異的抗体を産生させる量の抗原を含む。そして、それは診断又は治療目的で用いることができる。
【００５７】
本発明のワクチン、免疫原性組成物又は医薬組成物は、溶血尿毒症症候群（ＨＵＳ）の予防若しくは治療、及び／又は下痢の治療に有用であり得る。ある実施形態において、ワクチン及び／又は免疫原性組成物は、老人及び小児のＨＵＳの予防に用いられる。別の実施形態において、ワクチン及び／又は免疫原性組成物は、ＨＵＳの予防、又は特に軍の職員への投与のための、テロリズムの行動により引き起こされたＳＴＥＣ感染若しくはＳｔｘ中毒のその他の結果のために用いられる。しばしば、所望の予防的又は治療的効果をもたらすために、１回より多い投与が必要とされる。正確なプロトコール（投与量及び頻度）は、標準の臨床手法により確立され得る。
【００５８】
ハイブリッド志賀トキソイド、又は本発明のハイブリッド志賀トキソイドを含む医薬組成物は、腸管外、皮下、静脈内、筋内、腹腔内、経皮又は頬側経路を介して投与できる。代わりに、又は同時に、投与は経口経路によるものでもよい。小児に特に適切なある実施形態において、志賀トキソイドを含む医薬組成物は、経口経路により投与される。投与される投与量は、受容者の年齢、健康及び体重、存在するならば併用療法の種類、治療頻度、並びに所望の効果の性質に依存する。
【００５９】
本発明の医薬組成物は、作用部位への送達のために薬学的に使用可能な製剤への活性化合物の加工を容易にする賦形剤及び添加剤を含む、薬学的に許容される適切な担体を含んでもよい。腸管外投与用に適する製剤としては、水溶性形態の活性化合物、例えば水溶性塩の水性液剤、が挙げられる。さらに、適切な油性注射懸濁剤として、活性化合物の懸濁剤を投与してもよい。適切な親油性溶剤又はビヒクルとしては、例えば、ごま油のような脂肪油、又はエチルオレエート、トリグリセリドのような合成脂肪酸エステルが挙げられる。水性注射懸濁剤は、例えば、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ソルビトール、デキストランのような、懸濁剤の粘度を増加させる物質を含んでもよい。所望により、懸濁剤は安定化剤を含んでもよい。
【００６０】
予防又は治療のいずれかにおいて用いられる正確な量及び製剤は、抗原の固有の純度及び活性、任意の付随的な成分又は担体、投与方法などの状況に応じて変動し得る。
【００６１】
本発明の全身投与用の医薬製剤は、経腸、腸管外又は局所投与用に処方してもよい。実際に、３つの型全ての製剤を同時に用いて、活性成分の全身投与を実現することができる。
【００６２】
局所投与を用いてもよい。液剤、懸濁剤、ゲル剤、軟膏、膏薬のような任意の通常の局所製剤を採用することができる。このような局所製剤の調製については、例えばＧｅｎｎａｒｏら（２０００）、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇを始めとする、医薬製剤に関する技術文献に記載されている。局所投与のために、組成物は、散剤又は噴霧剤として、特にエアロゾルの形態で投与することもできる。
【００６３】
経口投与用の適切な製剤としては、ゼラチンハード若しくはゼラチンソフトカプセル、丸剤、被覆錠剤を始めとする錠剤、エリキシル剤、懸濁剤、シロップ剤又は吸入剤、及びそれらの放出制御形態のものが挙げられる。
【００６４】
以下の説明は本発明を限定するものではないが、投与されるワクチン投与量は、典型的には、抗原に関して、最少で約０．１ｍｇ／用量、より典型的には最少で約１ｍｇ／用量、及びしばしば最少で約１０ｍｇ／用量である。最大投与量は、典型的には、重要でない。しかし、通常、投与量は、５００ｍｇ／用量以下、しばしば２５０ｍｇ／用量以下である。これらの投与量は、投与量を保持するのに十分な容量の任意の薬学的な適切なビヒクル又は担体中に懸濁することができる。一般に、担体、アジュバント等を含む最終容量は、典型的には少なくとも０．１ｍｌ、より典型的には少なくとも約０．２ｍｌである。上限は、投与される量の実行可能性に支配され、通常、約０．５ｍｌ〜約１．０ｍｌ以下である。
【００６５】
他の形態において、ワクチン、免疫原性組成物又は医薬組成物は、キメラハイブリッド志賀トキソイド又はその断片を宿主動物中で発現するワクチンベクターとして調製することができる。生ベネズエラウマ脳炎ウイルス（ｌｉｖｅ Ｖｅｎｅｚｕｅｌａｎ Ｅｑｕｉｎｅ Ｅｎｃｅｐｈａｌｉｔｉｓ ｖｉｒｕｓ）（米国特許第５６４３５７６号を参照されたい）、ポリオウイルス（ｐｏｌｉｏｖｉｒｕｓ）（米国特許第５６３９６４９号を参照されたい）、ポックスウイルス（ｐｏｘ ｖｉｒｕｓ）（米国特許第５７７０２１１号を参照されたい）、及びワクシニアウイルス（ｖａｃｃｉｎａ ｖｉｒｕｓ）（米国特許第４６０３１１２号及び第５７６２９３８号を参照されたい）を含む任意の入手可能なワクチンベクターを用いることができる。或いは、タンパク質又はその断片をコードする裸の核酸を直接投与して、抗原を発現させてもよい（米国特許第５７３９１１８号を参照されたい）。
【００６６】
本発明のある実施形態において、ハイブリッド志賀トキソイドをコードするヌクレオチドは、フレクスナー赤痢菌（Ｓｈｉｇｅｌｌａ ｆｌｅｘｎｅｒｉ）（Ｂａｒｒｙら（２００３）、Ｖａｃｃｉｎｅ ２１、３３３〜４０）又はコレラ菌（Ｖ．ｃｈｏｌｅｒａｅ）（Ｌｅｙｔｅｎら（２００５）、Ｖａｃｃｉｎｅ ２３、５１２０〜５１２６）のような生弱毒口腔細菌ワクチン株に形質転換される。したがって、そのような口腔細菌ワクチン株は、Ｓｔｘを含む拡張された防御範囲を有する。
【００６７】
本発明の別の実施形態では、ハイブリッド志賀トキソイドをコードするヌクレオチドを植物に形質転換して、食用植物ベースのワクチンを創出する。或いは、ハイブリッド志賀トキソイドをコードするヌクレオチドは、ＤＮＡに基づくワクチンとして投与することができる。キメラトキソイドをコードする核酸は、単一遺伝子又は遺伝子の組合せのいずれかとしてのＤＮＡワクチンとして投与される。裸のＤＮＡワクチンは、当技術分野において一般に知られている（Ｂｒｏｗｅｒ（１９９８）、Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、１６：１３０４〜１３０５を参照されたい）。ＤＮＡワクチンとしての遺伝子の使用方法は、当業者に公知であり、キメラトキソイド遺伝子又はその一部分を、治療を必要とする個体における発現のためのプロモーターの制御下におくことを含む。ＤＮＡワクチンに用いられる遺伝子は、全長キメラトキソイドタンパク質をコードし得るが、任意の志賀毒素遺伝子に由来するペプチドを含むトキソイドタンパク質の部分をコードしてもよい。ＤＮＡワクチンは、個別の及び／又は別のプロモーターの支配の下での個別のオペロンとしての発現のためのＡ及びＢサブユニット遺伝子を含んでよく、２つのコード領域の順序の並べ替えを含む。ウイルス又は真核生物起源の５’及び３’非翻訳領域の組み込み、ポリアデニル化シグナル、真核生物系での最適発現のためのコドンの最適化のようなヌクレオチド配列への改変も、本発明において包含される。ある実施形態において、個体は、キメラトキソイドタンパク質をコードする複数のヌクレオチド配列を含むＤＮＡワクチンで免疫される。同様に、本明細書で定義される複数のトキソイド遺伝子又はその一部分で個体を免疫することも可能である。
【００６８】
別の実施形態において、ＤＮＡワクチンは、ＤＮＡワクチンとともにアジュバント分子をコードする遺伝子を含む。このようなアジュバント分子は、ＤＮＡワクチンによりコードされるトキソイドタンパク質に対する免疫原性応答を増加させるサイトカインを含む。付加的又は代替的なアジュバントは当業者に知られており、本発明でも用いられる。或いは、キメラトキソイド遺伝子自体を、別の異なる免疫原をコードする核酸を含むＤＮＡワクチンにおけるアジュバントとして作用させることができる。
【００６９】
ハイブリッド志賀トキソイドは、別の疾患のためのワクチンとともに、例えば同時に併用してもよい。したがって、ハイブリッド志賀トキソイドは、旅行者下痢を含む赤痢及び下痢の治療及び予防のための組成物の一部分であってもよい。このような組成物は、Ｓｔｘ及び／又はＳｔｘを発現する細菌に曝される第三世界の小児に特に有用であろう。小児におけるＳｔｘの影響は、重篤になる傾向があり、永続性の腎臓損傷を導く場合もある。したがって、Ｓｔｘへの小児の感染、その後の曝露を予防することは、本発明のキメラ志賀トキソイドタンパク質の好ましい使用である。
【００７０】
抗体及び使用方法：
本発明は、ＳｔｘＡ２サブユニットの少なくとも１つのエピトープ及びＳｔｘＢ１サブユニットの少なくとも１つのエピトープを対象とし、溶血尿毒症症候群を予防、治療又は診断することができるポリクローナル抗体をさらに提供する。
【００７１】
本発明の抗体は、検出可能なマーカーで標識することができる。本発明の実施において有用な検出可能なマーカーは当業者に公知であり、これらに限定されないが、例えば、放射性同位体、色素、ペルオキシダーゼ又はアルカリホスファターゼのような酵素、及びナノ粒子である。検出可能なマーカーで標識された抗体は、診断用に特に有用である。キットは、検出可能なマーカー及び当技術分野で公知のその他の置換基で標識されたモノクローナル又はポリクローナル抗ＳｔｘＡ２及び抗ＳｔｘＢ１抗体をさらに含んでもよい。このようなキットは、Ｓｔｘ、又は志賀赤痢菌及び大腸菌のようなＳｔｘ産生細菌のｉｎ ｖｉｔｒｏ及びｉｎ ｖｉｖｏでの検出、並びにＨＵＳの診断のために特に有用である。
【００７２】
本発明は、ヒトポリクローナル抗体に対する抗イディオタイプ抗体にも関する。この抗イディオタイプ抗体も、検出可能なマーカーで標識することができる。適切な検出可能なマーカーは当業者に公知であり、これらに限定されないが、例えば、放射性同位体、色素、又はペルオキシダーゼ若しくはアルカリホスファターゼのような酵素である。
【００７３】
抗イディオタイプ抗体は、ＳｔｘＡ２サブユニットの１つのエピトープ及びＳｔｘＢ１サブユニットの少なくとも１つのエピトープに結合するポリクローナル抗体を動物に注射したときに産生される。動物は、次いで、注射された抗体のイディオタイプ決定基に対する抗体を産生する（Ｗａｓｓｅｒｍａｎら（１９８２）、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．７９、４８１０〜４８１４）。
【００７４】
或いは、抗イディオタイプ抗体は、（１）動物のリンパ系細胞を、抗体発生有効量の抗原（すなわち、ＳｔｘＡ２サブユニットの１つのエピトープ及びＳｔｘＢ１サブユニットの少なくとも１つのエピトープに結合するポリクローナル抗体）と接触させるステップと、（２）得られたリンパ系細胞を回収し、回収したリンパ系細胞を骨髄腫細胞と融合させて、それぞれがモノクローナル抗体を産生する一連のハイブリドーマ細胞を作製するステップと、（３）一連のハイブリドーマ細胞をスクリーニングして、そのようにして同定された得られたハイブリドーマ細胞に結合可能なモノクローナル抗体を分泌するものを同定するステップと、（４）この細胞により産生される抗イディオタイプ抗体を別個に回収するステップと、により作製される（Ｃｌｅｖｅｌａｎｄら（１９８３）、Ｎａｔｕｒｅ ３０５、５６〜５７）。上記の２つの方法のいずれかで抗イディオタイプ抗体の作製のために使用可能な動物としては、これらに限定されないが、例えば、ヒト、霊長類、マウス、ラット又はウサギが挙げられる。
【００７５】
診断アッセイ：
本発明のハイブリッド志賀トキソイドは、免疫アッセイにおいて診断試薬として用いて、抗Ｓｔｘ抗体、特に抗ＳｔｘＡ２抗体及び抗ＳｔｘＢ１抗体を検出することができる。免疫アッセイのプロトコールは、例えば、配合、直接反応又はサンドイッチ型のアッセイをベースとするものである。プロトコールはまた、例えば、不均質で、固体支持体を用いるものでもよく、また、均質で、溶液中の免疫反応を含むものでもよい。ほとんどのアッセイでは、標識抗体又はポリペプチドを使用する。標識は、例えば、蛍光、化学発光、放射活性、ナノ粒子、又は色素分子である。プローブからのシグナルを増幅するアッセイも知られており、そのようなアッセイの例は、ビオチン及びアビジンを用いるもの、並びにＥＬＩＳＡアッセイのような酵素標識媒介免疫アッセイである。
【００７６】
典型的には、抗Ｓｔｘ抗体についての免疫アッセイは、生体試料のような試験試料を選択及び調製するステップと、次いで、これを本発明の改変ハイブリッド志賀トキソイドと、抗原−抗体複合体の形成を可能にする条件下でインキュベートするステップと、を含む。このような条件は、当技術分野において公知である。不均質な形式において、タンパク質又はペプチドは、固体支持体に結合して、インキュベーション後にポリペプチドからの試料の分離を促進する。用い得る固体支持体の例は、メンブレン又はマイクロタイターウェルの形のニトロセルロース、シート又はマイクロタイターウェルのポリ塩化ビニル、ビーズ又はマイクロタイタープレートのポリスチレンラテックス、ポリフッ化ビニリデン、ジアゾ化された紙、ナイロンメンブレン、活性ビーズ、及びプロテインＡビーズである。最も好ましくは、Ｄｙｎａｔｅｃｈ、Ｉｍｍｕｌｏｎ（登録商標）マイクロタイタープレート、又は０．２５インチポリスチレンビーズを、不均質な形式で用いる。固体支持体は、それを試験試料から分離した後に、典型的に洗浄される。
【００７７】
一方、均質な形式において、試験試料は、溶液のハイブリッド志賀トキソイドと、当技術分野において知られているように、形成されるいずれの抗原−抗体複合体も沈殿する条件下でインキュベートされる。沈殿した複合体は、次いで、例えば遠心分離により試験試料から分離される。抗Ｓｔｘ抗体を含む形成された複合体は、次いで、任意の数の方法により検出される。形式に応じて、複合体は、標識抗異種免疫グロブリンを用いて、又は競合形式が用いられる場合は、結合した標識競合抗体の量を測定することにより検出できる。これらの及びその他の形式は、当技術分野において公知である。
【００７８】
本発明のこのようなアッセイにおいて有用な診断プローブは、Ｓｔｘに対する抗体を含む。抗体は、当技術分野で公知の標準的な方法を用いて作製された、モノクローナル抗体又はポリクローナル抗体であってもよい（Ｈａｒｌｏｗ及びＬａｎｅ（１９８８）、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓを参照されたい）。これらは、タンパク質に特異的に結合し、その後、ＥＬＩＳＡ、ウェスタンブロットなどにより抗体−タンパク質複合体を検出することによりＳｔｘを検出するために用い得る。これらの抗体を誘発するために用いられるハイブリッド志賀トキソイドは、上記の任意のバリアントであり得る。抗体も、当技術分野の標準的な方法を用いて、ハイブリッド志賀トキソイドのペプチド配列から作製される（Ｈａｒｌｏｗ及びＬａｎｅ、既出）。免疫学的に重要な部分を含むモノクローナル又はポリクローナル抗血清の断片も調製できる。
【００７９】
以下の実際の実施例は、本発明の好ましい実施形態を具体的に指し示すものであり、本開示の残りの部分を、どんな形であれ限定するものと解釈されるべきではない。他の一般的な構成は、当業者にとって明らかである。
【実施例】
【００８０】
〔実施例１：キメラｓｔｘＡ２／ｓｔｘＢ１及びトキソイド変異の構築〕
Ｓｔｘ１及びＳｔｘ２の両方に対して防御するワクチンとして用い得る、Ｓｔｘの遺伝子的にトキソイド化した型を構築した。ＳｔｘＢ１タンパク質は、免疫原性が高く、ＳｔｘＢ２サブユニットタンパク質よりも防御性が高いので（Ｍａｒｃａｔｏら（２００１）、Ｊ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ．１８３、４３５〜４３）、ＳｔｘＢ１をワクチンのＢサブユニット部分のために用いた。ＳｔｘＡ２を、ワクチン構築物のＡサブユニットとして選択した。
【００８１】
ｓｔｘＡ２及びｓｔｘＢ１遺伝子を、一緒にスプライスして、ｓｔｘＡ２、その後に続くＳｔｘＢ１の翻訳のためのリボソーム結合部位を含む天然ｓｔｘＢ１遺伝子間領域、そしてｓｔｘＢ１遺伝子で構成される融合オペロンを作製した。ホロトキソイド発現カセットを、天然のオペロン構成中に設計して、ＡＢ５ホロトキソイドの翻訳及び組立てを最適化した。
【００８２】
次に、キメラトキソイドのＳｔｘＡ２部分を、３つの改変（Ｙ７７Ｓ、Ｅ１６７Ｑ及びＲ１７０Ｌ）を導入することにより改変して、毒性復帰の可能性を阻害し、免疫原性を最大化した。これらの変異の選択は、これらの変異が毒素の細胞毒性を低減させるか、トキソイドの免疫原性を増加させることを示した以前の研究に基づくものであった。７７位のチロシンのセリンへの置換を行ったのは、この変異がＳｔｘ１の活性を実質的に低減させること、同様のことがＳｔｘ２にも当てはまると予測したことによる（Ｄｅｒｅｓｉｅｗｉｃｚら（１９９２）、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ３１、３２７２〜８０；Ｄｅｒｅｓｉｅｗｉｃｚら（１９９３）、Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｔ．２４１、４６７〜７３）。ＳｔｘＡ２の１６７位のグルタミン酸をグルタミンに改変したのは、このアミノ酸がＳｔｘ１及びＳｔｘ２の両方の活性部位にあり、このような改変が毒素のベロ細胞活性の劇的な減少を導くことによる（Ｇｏｒｄｏｎら（１９９２）、Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．６５、２５０９〜１６；Ｈｏｖｄｅら（１９８８）、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８５ ２５６８〜７２；Ｊａｃｋｓｏｎら（１９９０）、Ｊ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ １８２、３３４６〜５０；Ｙａｍａｓｋｉら（１９９１）、Ｍｉｒｃｏｂ．Ｐａｔｈｏｇ．１１、１〜９）。１７０位のアルギニンのロイシンへの置換は、ＳｔｘＡ１タンパク質が、このような置換の後に、より強い免疫原性を有するというＩｓｈｉｋａｗａらの観察を反映したものである（Ｉｓｈｉｋａｗａら（２００３）、Ｉｎｆｅｃｔ Ｉｍｍｕｎ ７１、３２３５〜９）。方法の詳細な説明は次のとおりである。
【００８３】
用いた細菌プラスミドを表１に列挙する。細菌は、組換えプラスミドの選択のために必要であれば１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを補ったルリア−ベルターニ（ＬＢ）ブロス中又はＬＢ寒天上（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）上で成長させた。
【００８４】
【表１】
【００８５】
キメラｓｔｘＡ２／ｓｔｘＢ１オペロンは、一連のポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）の後に、重複伸長（ＳＯＥ）ステップによるスプライシングを行うことにより創出した（Ｈｉｇｕｃｈｉら（１９８９）、ＰＣＲ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、Ｓｔｏｃｋｔｏｎ Ｐｒｅｓｓ）。具体的には、プライマーＭＪＳ５及びＭＪＳ３２（表２を参照されたい）を用いるｐＭＪＳ２からの配列のＰＣＲ増幅を用いて、ｓｔｘＡ２を合成した。同様に、プライマーＭＪＳ２０及びＭＪＳ２を用いるｐＭＪＳ１からの配列のＰＣＲ増幅を用いて、ｓｔｘＢ１を作製した。ｓｔｘＡ２及びｓｔｘＢ１の後に、ＰＣＲ産物を一緒にスプライスし、キメラｓｔｘＡ２／ｓｔｘＢ１オペロンを、ｓｔｘ２プロモーターの支配下にｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＩＩ ＫＳ−（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）にクローニングした。得られたプラスミドをｐＭＪＳ２１と命名し、大腸菌ＤＨ５αを形質転換した。
【００８６】
【表２】
【００８７】
次に、一連のヌクレオチドの変異を、ｓｔｘＡ２／ｓｔｘＢ１のｓｔｘＡ２遺伝子中に作り出して、ハイブリッドトキソイド分子が発現され得るオペロンを作製した。具体的には、ＳｔｘＡ２成熟タンパク質の７７位のチロシンを、突然変異誘発プライマーＭＪＳ８８及びＭＪＳ８９、並びに隣接プライマーＭＪＳ２及びＭＪＳ５を用いてＤＮＡを増幅することにより、セリン残基に変更して、ｐＭＪＳ２２を得た。突然変異誘発プライマーＭＪＳ９０及びＭＪＳ９１、並びに隣接プライマーＭＪＳ２及びＭＪＳ５を用いるＰＣＲにより、ＳｔｘＡ２の活性部位のグルタミン酸（残基１６７）がグルタミンに変更され、同時に、１７０位のアルギニンがリジンに変更されて、ｐＭＪＳ２３を得た。キメラトキソイドオペロンを、次いで、２Ａ５ＳＤ及びＭＪＳ２プライマーを用いるＰＣＲによりｐＭＪＳ２３から、増幅して、最適シャイン−ダルガルノ配列（ＴＡＡＧＧＡＧＧＡＣＡＧＣＴＡＴＧ）（配列番号２４）をＳｔｘＡ２の開始コドンの上流に導入して、天然ｓｔｘ２プロモーターを除去した。得られたキメラクローンを、発現ベクターｐＴｒｃＨｉｓ２ Ｃ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に連結し、大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）株を形質転換した。ＤＮＡ配列の分析は、Ｕｎｉｆｏｒｍｅｄ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ ＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙのＢｉｏｍｅｄｉｃａｌ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔａｔｉｏｎ Ｃｅｎｔｅｒにより行って、正しい変異が行われたことを確認した。
【００８８】
〔実施例２：ＳｔｘＡ２／ＳｔｘＢ１トキソイドの精製〕
ＳｔｘＡ２／ＳｔｘＢ１トキソイドの精製は、従来文献に記載の方法（Ｉｓｈｉｋａｗａら（２００３）、Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．７１、３２３５〜９；Ｗｅｎら、既出）で、Ｇｂ３アフィニティー精製により行った。Ｇｂ３アフィニティー精製は、Ｂサブユニット結合ドメインを捕捉する方法である。ｐＴｒｃＨｉｓ２ Ｃ−ｓｔｘＡ２／ｓｔｘＢ１クローンを含む大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）の１晩培養物を、それぞれ５００ｍｌのＬＢブロスを含む２つのフラスコで１：５０に希釈した。２時間成長させた後に、培養物を１ｍＭのイソプロピル ３−Ｄ−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）で誘導し、さらに４時間インキュベートした。
【００８９】
細菌を、遠心分離により沈殿させ、１０ｍｌの１×リン酸緩衝食塩水、ｐＨ７．４（ＰＢＳ）に再懸濁することにより５０倍に濃縮した。濃縮した細菌懸濁物を、次いで、超音波破砕し、得られた溶解物を遠心分離により清澄化した。ＳｔｘＡ２／ＳｔｘＢ１トキソイドは、これらの溶解物から、従来文献に記載の方法（Ｉｓｈｉｋａｗａら、既出；Ｗｅｎら、既出）で、Ｇｌｏｂｏｔｒｉｏｓｅ Ｆｒａｃｔｏｇｅｌカラム（ＩｓｏＳｅｐ ＡＢ）でのＧｂ３アフィニティー精製により精製した。トキソイドの精製の後に、ＢＣＡアッセイ（Ｐｉｅｒｃｅ）を行って、調製物のタンパク質濃度を定量した。
【００９０】
〔実施例３：細胞毒性アッセイ〕
種々の試料のベロ細胞についての細胞毒性活性を、従来文献に記載の方法で評価した。手短に説明すると、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＩＩ ＫＳ（−）中のトキシンクローンで形質転換された大腸菌ＤＨ５αを、同じ光学密度（Ｏ．Ｄ．）６００に標準化し、細菌を超音波破砕し、遠心分離により清澄化した。清澄化した超音波溶解物又は精製されたトキソイドを、ベロ細胞での細胞毒性活性について、９％胎児ウシ血清（ＢｉｏＳｏｕｒｃｅ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ）、１．８ｍＭグルタミン（Ｃａｍｂｒｅｘ）、９Ｕ／ｍｌのペニシリン ９ｐｇ／ｍｌのストレプトマイシン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）、及び９０μｇ／ｍｌのゲンタマイシン（Ｑｕａｌｉｔｙ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ）を補ったイーグル最少必須培地（Ｃａｍｂｒｅｘ ＢｉｏＳｃｉｅｎｃｅ）（完全ＥＭＥＭ）で試料を希釈した後に、評価した（Ｓｃｈｍｉｔｔら（１９９１）Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．５９、１０６５〜７３；Ｇｅｎｔｒｙら（１９８０）２６、２１２７〜３１）。試料の５０％細胞毒性用量（ＣＤ５０）は、未処置の対照細胞と比較して、ベロ細胞の５０％を死滅させる希釈の逆数として定義した。
【００９１】
種々の型の変異ＳｔｘＡ２／ＳｔｘＢ１トキソイドのベロ細胞についての細胞毒性活性を、親のＳｔｘＡ２／ＳｔｘＢ１毒素と比較した（表３を参照されたい）。親のハイブリッドトキシンの清澄化された超音波溶解物１ｍｌは、７．２×１０４のＣＤ５０を含んでいたが、単独変異（Ｙ７７Ｓ）又は三重変異（Ｙ７７Ｓ、Ｅ１６７Ｑ及びＲ１７０Ｌ）のいずれかを有する変更されたキメラ分子の同様に調製された溶解物は、細胞毒性活性を示さず、これにより、これらの構築物がトキソイドを産生したことが確認された。さらに、２．１μｇの精製ＳｔｘＡ２／ＳｔｘＢ１トキソイドは、ベロ細胞に対して細胞毒性でなかった。これは、アッセイした親のＳｔｘＡ２／Ｓｔｘ１Ｂトキシンの濃度の約９７倍であった。親のＳｔｘＡ２／Ｓｔｘ１Ｂトキシンの量は、Ｓｔｘ２に対するポリクローナル抗体を用い、Ｓｔｘ２標準物質との比較によりＳｔＡ２サブユニットを定量するウェスタンブロット分析により測定した。非常に低いレベルのＳｔｘ２Ａ／Ｓｔｘ１Ｂトキソイドでいずれかの残存活性があるかを確認するために、粗細菌溶解物の１００倍の調製物を、ベロ細胞に対する細胞毒性及びマウスにおける毒性について試験した。５匹のＣＤ−１雄性マウスに、８６μｇのトキソイド（これは、マウスを免疫し、追加免疫するために用いられる量の２０倍に相当する）を腹腔内注射し、全てのマウスは生存した。さらに、１００倍調製粗細菌溶解物からの６１．３μｇのトキソイドを、細胞毒性について試験し、ベロ細胞に対して非細胞毒性であることが見出された。
【００９２】
【表３】
【００９３】
毒素溶解物は、ｐＭＪＳ１（Ｓｔｘ１）、ｐＭＪＳ２（Ｓｔｘ２）、ｐＭＪＳ２１（ＳｔｘＡ２／ＳｔｘＢ１）、ｐＭＪＳ２２（ＳｔｘＡ２ Ｙ７７Ｓを有するＳｔｘＡ２／ＳｔｘＢ１）、ｐＭＪＳ２３（ＳｔｘＡ２ Ｙ７７Ｓ、Ｅ１６７Ｑ及びＲ１７０Ｌを有するＳｔｘＡ２／ＳｔｘＢ１）で形質転換された大腸菌ＤＨ５αからであった。精製ＳｔｘＡ２／ＳｔｘＢ１トキソイドは、大腸菌Ｂｌ２１から精製した。値は、５０％のベロ細胞を死滅させた希釈の逆数を表す。この実験の検出限界は、１×１０２であった。
【００９４】
〔実施例４：ウェスタンブロット分析〕
精製Ｓｔｘ１、Ｓｔｘ２又はＳｔｘＡ２／ＳｔｘＢ１トキソイド（それぞれ３００ｎｇ）を、ドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ；１５％ポリアクリルアミド）に供し、次いで、タンパク質を０．４５μＭ Ｏｐｔｉｔｒａｎニトロセルロースメンブレン（Ｓｃｈｌｅｉｃｈｅｒ＆Ｓｃｈｕｅｌｌ）に、Ｔｒａｎｓ−Ｂｌｏｔ ＳＤ Ｓｅｍｉ−Ｄｒｙトランスファー装置（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）を用いて移動させた（図１を参照されたい）。メンブレンを、０．１％ Ｔｗｅｅｎ ２０を加えた１×Ｔｒｉｓ緩衝食塩水（ｐＨ７．５）（ＴＢＳＴ）中の５％脱脂粉乳溶液中で４℃にて１晩ブロックした。それぞれ抗ＳｔｘＡ２及び抗ＳｔｘＢ１モノクローナル抗体（ＭＡｂ）１１Ｅ１０及び１３Ｃ４の、ブロッキング溶液中でそれぞれ１：５に希釈されたハイブリドーマ組織培養上清である１次抗体（Ｇｅｎｔｒｙら（１９８０）、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．１２、３６１〜６；Ｐｅｒｅｒａら（１９８０）、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．２６、２１２７〜３１）を、イムノブロットと２時間インキュベートした。次いで、メンブレンを、ＴＢＳＴで洗浄し、ブロッキング溶液で１：３０００に希釈したセイヨウワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）にコンジュゲートしたヤギ抗マウス免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）と１時間インキュベートした。メンブレンを、上記のようにして再び洗浄し、２次抗体を、ＥＣＬ−Ｐｌｕｓ Ｗｅｓｔｅｒｎ Ｂｌｏｔｔｉｎｇ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎキット（Ａｍｅｒｓｈａｍ）を用いて化学発光により検出した。
【００９５】
精製トキソイドのイムノブロットにより、ＳｔｘＢ１及びＳｔｘＡ２がともに存在することが明らかになり（図１を参照されたい）、ホロトキソイドがワクチン構築物により発現されるという我々の仮定が確認された。さらに、トキソイドの免疫反応性のバンドのサイズは、対照の天然毒素サブユニットに相当した（図１を参照されたい）。ＳｔｘＡ２及びＳｔｘＢ１サブユニットは、銀染色されたゲルでも確認され、さらなる混入タンパク質は、ほとんどないことが示された（データは示さず）。
【００９６】
〔実施例５：マウスの免疫及び曝露〕
免疫前血清を、体重１４〜１６グラムの雄性ＣＤ−１マウス（Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ）から採取した。マウスを、次いで、ＰＢＳ、又は油中水型アジュバントであるＴｉｔｅｒＭａｘ Ｇｏｌｄ（ＴｉｔｅｒＭａｘ ＵＳＡ）と１：１で混合した、ＰＢＳ中の４．３μｇの精製ＳｔｘＡ２／ＳｔｘＢ１トキソイド（合計容量１００μｌ）のいずれかで、腹腔内（ｉ．ｐ．）免疫した。マウスは、３週間の間隔で、合計３回の追加免疫をした。最初の免疫から１０日後、及び各追加免疫の後に血清を採取して、Ｓｔｘ１又はＳｔｘ２に対する血清免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）のレベルを測定した。マウスに、３回目の追加免疫の１４日後に、Ｓｔｘ１（１２５０ｎｇ）若しくはＳｔｘ２（１０ｎｇ）のいずれか、又はＳｔｘ１及びＳｔｘ２の両方（それぞれ１２５０及び１０ｎｇ／マウス）の５０％致死用量（ＬＤ５０）の１０倍で、ｉ．ｐ．曝露した。
【００９７】
ＰＢＳで免疫されたマウスは全て、投与されたＳｔｘの型に関わらず、４日目までに死亡した（表４を参照されたい）。キメラトキソイドで免疫され、その後、Ｓｔｘ１又はＳｔｘ２のいずれかに曝露されたマウスは全て、観察期間の１４日間全て生存した。キメラトキソイドで免疫され、その後、Ｓｔｘ１及びＳｔｘ２の両方に曝露された１０匹のマウスのうち、９匹が生存した。致死容量のＳｔｘ１及びＳｔｘ２の両方に曝露された後に死亡した、キメラトキソイドで免疫されたマウスは、抗Ｓｔｘ１中和抗体も抗Ｓｔｘ２中和抗体も産生できなかったマウスであった。このマウスは、擬似免疫された動物が死亡したのとほぼ同じ時期に死亡した。ＬＤ５０は、Ｓｔｘ１及びＳｔｘ２について１２５及び１ｎｇ／マウスであることが以前に測定されている。曝露されたときのマウスの平均体重は、４０．４ｇであった。
【００９８】
【表４】
【００９９】
〔実施例６：ＥＬＩＳＡによる抗Ｓｔｘ１又は抗Ｓｔｘ２抗体の測定〕
雄性ＣＤ−１マウスを免疫し、ＰＢＳ、又は三重変異トキソイドのいずれかで３週間隔で追加免疫した。３回目の最終の追加免疫の後に、各マウスから血清を採取し、Ｓｔｘ１及びＳｔｘ２に対するＩｇＧ抗体の力価を、ＥＬＩＳＡにより適切な免疫前血清試料と比較した（図２を参照されたい）。
【０１００】
精製Ｓｔｘ１又はＳｔｘ２（１００ｍｌ ＰＢＳ中に１００ｎｇ）を用いて、Ｕ底９６ウェルマイクロタイタープレート（Ｔｈｅｒｍｏ Ｅｌｅｃｔｒｏｎ）のウェルを被覆し、マイクロタイタープレートを、４℃にて１晩インキュベートした。次いで、マイクロタイタープレートを、０．０５％ Ｔｗｅｅｎ−２０を含むＰＢＳ（ＰＢＳＴ）で３回洗浄し、ウェルあたり２００μｌの３％ウシ血清アルブミン含有ＰＢＳＴで、４℃にて１晩ブロックした。次の日に、別のマイクロタイタープレートにて、１：５０の最初の希釈、及びその後１：５の希釈で、マウスの免疫前及び免疫後の血清をＰＢＳＴで希釈した。ブロックしたマイクロタイタープレートを洗浄した後に、１００μｌの希釈した血清をＥＬＩＳＡの１次抗体として用い、マイクロタイタープレートを３７℃にて２時間インキュベートした。次いで、１００μｌの２次抗体であるＨＲＰにコンジュゲートしたヤギ抗マウスＩｇＧを、ＰＢＳＴ中の１：３０００の希釈で加え、プレートを室温にて４５分間インキュベートした。２次抗体は、ＴＭＢ Ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ ＥＩＡ基質キット（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）で検出し、マイクロタイタープレートを室温にて１５分間インキュベートして、色の変化を発生させた。次いで、１００μｌの１Ｍ Ｈ２ＳＯ４を加えて反応を停止し、色の発生を、ＯＤ４５０の測定により判定した。ＥＬＩＳＡの力価を、バックグラウンド及び免疫前のレベルの両方を超える血清希釈と定義した。免疫前のレベルが免疫後のレベルよりも高い場合は、ＥＬＩＳＡ力価として０．３の値を当てた。これらのアッセイは、重複して１回行った。抗Ｓｔｘ１及び抗Ｓｔｘ２ ＥＬＩＳＡのための陽性対照は、１次抗体として、ＰＢＳＴで１：２００００にそれぞれ希釈した精製１１Ｅ１０又は１３Ｃ４（Ｈｙｃｕｌｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）のいずれかであった。
【０１０１】
〔実施例７：Ｉｎ ｖｉｔｒｏ Ｓｔｘ１及びＳｔｘ２毒素中和アッセイ〕
毒素中和力価は、ＥＬＩＳＡ力価よりもＳｔｘに対する防御応答についてのよりよい予測となるので（Ｗｅｎら、既出）、精製Ｓｔｘ１又はＳｔｘ２に対するｉｎ ｖｉｔｒｏベロ細胞中和アッセイも、血清試料に対して行った。
【０１０２】
免疫前及び免疫後の血清を、以前に報告されるようにして（Ｍａｒｑｕｅｓら（１９８６）、Ｊ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ．１５４、３３８〜４１）、Ｓｔｘ１及びＳｔｘ２についての中和アッセイにおいて用いた。中和力価を、Ｓｔｘ１又はＳｔｘ２の細胞毒性の５０％を中和するマウス血清の希釈と定義した。これらのアッセイにおいて用いたＳｔｘ１又はＳｔｘ２の量は、それぞれ２０又は３８ＣＤ５０であった。擬似免疫されたマウスの血清又は免疫後血清がＳｔｘ１もＳｔｘ２も中和しなかった場合、中和力価として０．３の値を当てた。これらのアッセイは、重複して１回行った。
【０１０３】
〔実施例８：統計的分析による中和抗体力価の比較〕
トキソイドで免疫された群からの抗Ｓｔｘ１又は抗Ｓｔｘ２ ＥＬＩＳＡ及びｉｎ ｖｉｔｒｏ中和抗体力価を、プログラムＳＰＳＳ １２．０．１を用いる両側ｔ検定により、擬似免疫された群と比較した。免疫されたマウスの生存は、Ｓｔｘ１若しくはＳｔｘ２又はＳｔｘ１及びＳｔｘ２のいずれかの１０ＬＤ５０で曝露した後の擬似免疫されたマウスと、フィッシャーの正確確率検定により比較した。これらの結果は、ｐ値が＜０．０５であると有意差があるとみなした。
【０１０４】
免疫前の及び擬似免疫されたマウスは、Ｓｔｘ１及びＳｔｘ２と反応する抗体のバックグラウンドレベルが低かった（図２を参照されたい）。トキソイドで免疫されたマウスは、１匹以外全て、Ｓｔｘ１及びＳｔｘ２の両方に対して高いＩｇＧ力価を示し、バックグラウンドよりもそれぞれ４．４及び４．１ｌｏｇ高かった。トキソイドで免疫されたマウスのＥＬＩＳＡ力価を擬似免疫されたマウスと比較した場合、結果は有意であった（ｐ＜０．００１）。
【０１０５】
Ｓｔｘ１又はＳｔｘ２のいずれに対する中和抗体も、免疫前又は擬似免疫されたマウスにおいて測定できなかった（図３を参照されたい）。対照的に、トキソイドで免疫されたマウスは、１匹以外全てがＳｔｘ１及びＳｔｘ２に対して中和力価を示した（図３を参照されたい）。平均の抗Ｓｔｘ１及び抗Ｓｔｘ２中和力価は、バックグラウンドより２．９及び１．９ｌｏｇ高かった。Ｓｔｘ２中和力価がより低いことは、中和アッセイにおいてＳｔｘ１よりも高い濃度のＳｔｘ２を用いたことに起因するであろう（それぞれ２０ＣＤ５０に比較して、約３８ＣＤ５０）。乏しい抗Ｓｔｘ１ ＥＬＩＳＡ力価を示したトキソイド免疫されたマウスは、いずれの毒素に対する中和抗体も産生できなかった。トキソイド免疫されたマウスの中和力価を、擬似免疫されたマウスと比較したときに、結果は、有意に異なっていた（ｐ＜０．００１）。
【０１０６】
本発明を詳細に説明したが、本発明の意図から逸脱することなく、種々の変更を行うことができることが理解される。したがって、本発明は、以下の特許請求の範囲によってのみ限定される。本出願において言及される全ての引用特許、特許出願及び文献は、参照されることによりその全体が本明細書に組み込まれる。
【図面の簡単な説明】
【０１０７】
【図１】キメラＳｔｘＡ２／ＳｔｘＢ１トキソイドのウェスタンブロット分析。野生型Ｓｔｘ１、Ｓｔｘ２及びキメラＳｔｘＡ２／ＳｔｘＢ１トキソイド（それぞれ３００ｎｇ）を、１５％のＳＤＳポリアクリルアミドゲルで分離し、ＳｔｘＢ１及びＳｔｘＡ２に対して誘導されたモノクローナル抗体（ＭＡｂ）ハイブリドーマ上清（それぞれ１３Ｃ４及び１１Ｅ１０ＭＡｂ）をプローブ付加した。レーン１はＳｔｘ１を含み、レーン２はＳｔｘ２を含み、レーン３はＳｔｘＡ２／ＳｔｘＢ１トキソイドを含む。
【図２】ＥＬＩＳＡによる抗Ｓｔｘ１又は抗Ｓｔｘ２抗体の検出。ＰＢＳ（群Ａ及びＣ）又はＳｔｘＡ２／ＳｔｘＢ１トキソイド（群Ｂ、Ｄ及びＥ）のいずれかで免疫されたマウスからのＳｔｘ１（左）又はＳｔｘ２（右）に対する血清ＩｇＧ力価を図２に示す。水平のバーは、Ｓｔｘ１又はＳｔｘ２に対するＩｇＧ血清力価のｌｏｇの幾何平均を表し、誤差バーは、±１標準偏差を示す。群Ｅの影をつけた丸は、Ｓｔｘ１及びＳｔｘ２に曝露したときに死亡したマウスを表す。点線は検出限界を表す。
【図３】ｉｎ ｖｉｔｒｏでのＳｔｘ１及びＳｔｘ２毒素中和アッセイ。ＰＢＳ（群Ａ及びＣ）又はＳｔｘＡ２／ＳｔｘＢ１トキソイド（群Ｂ、Ｄ及びＥ）のいずれかで免疫されたマウスからの抗血清での、Ｓｔｘ１（左）又はＳｔｘ２（右）に対するｉｎ ｖｉｔｒｏ中和力価を、図３に示す。水平のバーは、Ｓｔｘ１又はＳｔｘ２に対する中和力価のｌｏｇの幾何平均を表し、誤差バーは、±１標準偏差を示す。用いたＳｔｘ１及びＳｔｘ２の量は、それぞれ２０及び３８ ５０％細胞毒性用量（ＣＤ５０）であった。群Ｅの影をつけた丸は、Ｓｔｘ１及びＳｔｘ２に曝露したときに死亡したマウスを表す。点線は検出限界を表す。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
１つ又は複数の活性部位に１つ又は複数の改変を有する少なくとも１つのＳｔｘＡポリペプチド又はその断片と、少なくとも１つのＳｔｘＢポリペプチドと、を含むキメラタンパク質。
【請求項２】
前記ＳｔｘＢポリペプチド又はその断片が１つ又は複数の改変を含む、請求項１に記載のキメラタンパク質。
【請求項３】
前記１つ又は複数の改変がアミノ酸の置換又は欠失である、請求項１又は２に記載のキメラタンパク質。
【請求項４】
前記置換が保存的置換である、請求項３に記載のキメラタンパク質。
【請求項５】
前記ＳｔｘＡポリペプチドがＳｔｘＡ２又はその断片である、請求項１に記載のキメラタンパク質。
【請求項６】
前記ＳｔｘＢポリペプチドがＳｔｘＢ１又はその断片である、請求項１に記載のキメラタンパク質。
【請求項７】
配列番号２及び３のアミノ酸配列を含む、請求項１に記載のキメラタンパク質。
【請求項８】
配列番号２及び３のアミノ酸からなる、請求項１に記載のキメラタンパク質。
【請求項９】
前記１つ又は複数の改変が、前記Ｓｔｘ２Ａポリペプチド又はその断片中の、残基７７、１６７又は１７０に相当するアミノ酸残基に存在する、請求項５に記載のキメラタンパク質。
【請求項１０】
残基７７での改変がセリン残基への置換である、請求項９に記載のキメラタンパク質。
【請求項１１】
残基１６７での改変がグルタミン残基への置換である、請求項９に記載のキメラタンパク質。
【請求項１２】
残基１７０での改変がロイシン残基への置換である、請求項９に記載のキメラタンパク質。
【請求項１３】
前記１つ又は複数の改変が、前記ＳｔｘＢ１ポリペプチド中の、残基１６、１７、３３、４３又は６０に相当するアミノ酸残基に存在する、請求項６に記載のキメラタンパク質。
【請求項１４】
残基１６での改変が、アスパラギン酸残基のヒスチジンへの置換である、請求項１３に記載のキメラタンパク質。
【請求項１５】
残基１７での改変が、アスパラギン酸残基のヒスチジンへの置換である、請求項１３に記載のキメラタンパク質。
【請求項１６】
残基３３での改変が、アルギニン残基のシステインへの置換である、請求項１３に記載のキメラタンパク質。
【請求項１７】
残基４３での改変が、アラニン残基のスレオニンへの置換である、請求項１３に記載のキメラタンパク質。
【請求項１８】
残基６０での改変が、グリシン残基のアスパラギン酸への置換である、請求項１３に記載のキメラタンパク質。
【請求項１９】
請求項１に記載のキメラタンパク質に結合する単離抗体。
【請求項２０】
ポリクローナルである、請求項１９に記載の単離抗体。
【請求項２１】
請求項１に記載のキメラタンパク質を含む組成物。
【請求項２２】
前記キメラタンパク質が、免疫原性応答を誘導可能なものである、請求項２１に記載の組成物。
【請求項２３】
前記キメラタンパク質が、志賀毒素に対する免疫原性応答を誘導可能なものである、請求項２１に記載の組成物。
【請求項２４】
薬学的に許容される担体をさらに含む、請求項２１に記載の組成物。
【請求項２５】
アジュバントをさらに含む、請求項２１に記載の組成物。
【請求項２６】
ヒトへの投与に適する、請求項２１に記載の組成物。
【請求項２７】
請求項１に記載のキメラタンパク質をコードする単離核酸分子。
【請求項２８】
配列番号２及び／又は３を含むアミノ酸配列をコードする単離核酸分子。
【請求項２９】
配列番号１のヌクレオチド配列を含む、請求項２８に記載の単離核酸分子。
【請求項３０】
配列番号１のヌクレオチド配列からなる、請求項２８に記載の単離核酸分子。
【請求項３１】
請求項２７に記載の核酸分子を含むように形質転換された宿主細胞。
【請求項３２】
請求項２７に記載の単離核酸分子を含むベクター。
【請求項３３】
請求項３２に記載のベクターを含む宿主細胞。
【請求項３４】
前記宿主が、原核生物宿主及び真核生物宿主からなる群より選択される、請求項３３に記載の宿主細胞。
【請求項３５】
ポリペプチドを製造する方法であって、請求項３３に記載の核酸分子で形質転換された宿主細胞を、前記核酸分子によりコードされるタンパク質が発現される条件下で培養するステップを含む方法。
【請求項３６】
ヌクレオチド配列が、配列番号１の連続したヌクレオチド配列と少なくとも９０％の配列同一性を示し、かつＳｔｘに対する免疫原性応答を誘導可能なポリペプチドをコードする、請求項２７に記載の単離核酸分子。
【請求項３７】
ヌクレオチド配列が、配列番号１の連続したヌクレオチド配列と少なくとも９５％の配列同一性を示し、かつＳｔｘに対する免疫原性応答を誘導可能なタンパク質をコードする、請求項２７に記載の単離核酸分子。
【請求項３８】
ヌクレオチド配列が、配列番号１の連続したヌクレオチド配列と少なくとも９９％の配列同一性を示し、かつＳｔｘに対する免疫原性応答を誘導可能なタンパク質をコードする、請求項２７に記載の単離核酸分子。
【請求項３９】
Ｓｔｘに結合可能な抗体を作製する方法であって、請求項１に記載のキメラタンパク質を哺乳動物に投与するステップを含む方法。
【請求項４０】
Ｓｔｘに結合可能な抗体を作製する方法であって、請求項１に記載のキメラタンパク質を細胞培養物に投与するステップを含む方法。
【請求項４１】
Ｓｔｘに結合可能な抗体を作製する方法であって、請求項２１に記載の組成物を哺乳動物に投与するステップを含む方法。
【請求項４２】
前記哺乳動物がヒトである、請求項３９又は４１に記載の方法。
【請求項４３】
前記ヒトが下痢に罹患している、請求項４２に記載の方法。
【請求項４４】
前記ヒトが溶血尿毒症症候群に罹患している、請求項４２に記載の方法。
【請求項４５】
ヒトにおける溶血尿毒症症候群を予防する方法であって、請求項１に記載のキメラタンパク質を含む組成物を投与するステップを含む方法。
【請求項４６】
ヒトにおける志賀毒素産生大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）感染に関連する下痢を予防する方法であって、請求項１に記載のキメラタンパク質を含む組成物を投与するステップを含む方法。
【請求項４７】
請求項３９、４０又は４１に記載の方法により製造された単離抗体。
【請求項４８】
請求項４７に記載の抗体を含むキット。
【請求項４９】
請求項１に記載のキメラタンパク質を含むキット。
【請求項１】
１つ又は複数の活性部位に１つ又は複数の改変を有する少なくとも１つのＳｔｘＡポリペプチド又はその断片と、少なくとも１つのＳｔｘＢポリペプチドと、を含むキメラタンパク質。
【請求項２】
前記ＳｔｘＢポリペプチド又はその断片が１つ又は複数の改変を含む、請求項１に記載のキメラタンパク質。
【請求項３】
前記１つ又は複数の改変がアミノ酸の置換又は欠失である、請求項１又は２に記載のキメラタンパク質。
【請求項４】
前記置換が保存的置換である、請求項３に記載のキメラタンパク質。
【請求項５】
前記ＳｔｘＡポリペプチドがＳｔｘＡ２又はその断片である、請求項１に記載のキメラタンパク質。
【請求項６】
前記ＳｔｘＢポリペプチドがＳｔｘＢ１又はその断片である、請求項１に記載のキメラタンパク質。
【請求項７】
配列番号２及び３のアミノ酸配列を含む、請求項１に記載のキメラタンパク質。
【請求項８】
配列番号２及び３のアミノ酸からなる、請求項１に記載のキメラタンパク質。
【請求項９】
前記１つ又は複数の改変が、前記Ｓｔｘ２Ａポリペプチド又はその断片中の、残基７７、１６７又は１７０に相当するアミノ酸残基に存在する、請求項５に記載のキメラタンパク質。
【請求項１０】
残基７７での改変がセリン残基への置換である、請求項９に記載のキメラタンパク質。
【請求項１１】
残基１６７での改変がグルタミン残基への置換である、請求項９に記載のキメラタンパク質。
【請求項１２】
残基１７０での改変がロイシン残基への置換である、請求項９に記載のキメラタンパク質。
【請求項１３】
前記１つ又は複数の改変が、前記ＳｔｘＢ１ポリペプチド中の、残基１６、１７、３３、４３又は６０に相当するアミノ酸残基に存在する、請求項６に記載のキメラタンパク質。
【請求項１４】
残基１６での改変が、アスパラギン酸残基のヒスチジンへの置換である、請求項１３に記載のキメラタンパク質。
【請求項１５】
残基１７での改変が、アスパラギン酸残基のヒスチジンへの置換である、請求項１３に記載のキメラタンパク質。
【請求項１６】
残基３３での改変が、アルギニン残基のシステインへの置換である、請求項１３に記載のキメラタンパク質。
【請求項１７】
残基４３での改変が、アラニン残基のスレオニンへの置換である、請求項１３に記載のキメラタンパク質。
【請求項１８】
残基６０での改変が、グリシン残基のアスパラギン酸への置換である、請求項１３に記載のキメラタンパク質。
【請求項１９】
請求項１に記載のキメラタンパク質に結合する単離抗体。
【請求項２０】
ポリクローナルである、請求項１９に記載の単離抗体。
【請求項２１】
請求項１に記載のキメラタンパク質を含む組成物。
【請求項２２】
前記キメラタンパク質が、免疫原性応答を誘導可能なものである、請求項２１に記載の組成物。
【請求項２３】
前記キメラタンパク質が、志賀毒素に対する免疫原性応答を誘導可能なものである、請求項２１に記載の組成物。
【請求項２４】
薬学的に許容される担体をさらに含む、請求項２１に記載の組成物。
【請求項２５】
アジュバントをさらに含む、請求項２１に記載の組成物。
【請求項２６】
ヒトへの投与に適する、請求項２１に記載の組成物。
【請求項２７】
請求項１に記載のキメラタンパク質をコードする単離核酸分子。
【請求項２８】
配列番号２及び／又は３を含むアミノ酸配列をコードする単離核酸分子。
【請求項２９】
配列番号１のヌクレオチド配列を含む、請求項２８に記載の単離核酸分子。
【請求項３０】
配列番号１のヌクレオチド配列からなる、請求項２８に記載の単離核酸分子。
【請求項３１】
請求項２７に記載の核酸分子を含むように形質転換された宿主細胞。
【請求項３２】
請求項２７に記載の単離核酸分子を含むベクター。
【請求項３３】
請求項３２に記載のベクターを含む宿主細胞。
【請求項３４】
前記宿主が、原核生物宿主及び真核生物宿主からなる群より選択される、請求項３３に記載の宿主細胞。
【請求項３５】
ポリペプチドを製造する方法であって、請求項３３に記載の核酸分子で形質転換された宿主細胞を、前記核酸分子によりコードされるタンパク質が発現される条件下で培養するステップを含む方法。
【請求項３６】
ヌクレオチド配列が、配列番号１の連続したヌクレオチド配列と少なくとも９０％の配列同一性を示し、かつＳｔｘに対する免疫原性応答を誘導可能なポリペプチドをコードする、請求項２７に記載の単離核酸分子。
【請求項３７】
ヌクレオチド配列が、配列番号１の連続したヌクレオチド配列と少なくとも９５％の配列同一性を示し、かつＳｔｘに対する免疫原性応答を誘導可能なタンパク質をコードする、請求項２７に記載の単離核酸分子。
【請求項３８】
ヌクレオチド配列が、配列番号１の連続したヌクレオチド配列と少なくとも９９％の配列同一性を示し、かつＳｔｘに対する免疫原性応答を誘導可能なタンパク質をコードする、請求項２７に記載の単離核酸分子。
【請求項３９】
Ｓｔｘに結合可能な抗体を作製する方法であって、請求項１に記載のキメラタンパク質を哺乳動物に投与するステップを含む方法。
【請求項４０】
Ｓｔｘに結合可能な抗体を作製する方法であって、請求項１に記載のキメラタンパク質を細胞培養物に投与するステップを含む方法。
【請求項４１】
Ｓｔｘに結合可能な抗体を作製する方法であって、請求項２１に記載の組成物を哺乳動物に投与するステップを含む方法。
【請求項４２】
前記哺乳動物がヒトである、請求項３９又は４１に記載の方法。
【請求項４３】
前記ヒトが下痢に罹患している、請求項４２に記載の方法。
【請求項４４】
前記ヒトが溶血尿毒症症候群に罹患している、請求項４２に記載の方法。
【請求項４５】
ヒトにおける溶血尿毒症症候群を予防する方法であって、請求項１に記載のキメラタンパク質を含む組成物を投与するステップを含む方法。
【請求項４６】
ヒトにおける志賀毒素産生大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）感染に関連する下痢を予防する方法であって、請求項１に記載のキメラタンパク質を含む組成物を投与するステップを含む方法。
【請求項４７】
請求項３９、４０又は４１に記載の方法により製造された単離抗体。
【請求項４８】
請求項４７に記載の抗体を含むキット。
【請求項４９】
請求項１に記載のキメラタンパク質を含むキット。
【図１】
【図２】
【図３】
【図２】
【図３】
【公表番号】特表２００９−５２７２２６（Ｐ２００９−５２７２２６Ａ）
【公表日】平成２１年７月３０日（２００９．７．３０）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００８−５５５４２１（Ｐ２００８−５５５４２１）
【出願日】平成１９年２月１６日（２００７．２．１６）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００７／００４５１３
【国際公開番号】ＷＯ２００７／０９８２０１
【国際公開日】平成１９年８月３０日（２００７．８．３０）
【出願人】（５０１０５１１２５）ザ ヘンリー エム． ジャクソン ファウンデーション フォー ザ アドヴァンスメント オブ ミリタリー メディシン インコーポレイテッド (9)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２１年７月３０日（２００９．７．３０）
【国際特許分類】
【出願日】平成１９年２月１６日（２００７．２．１６）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００７／００４５１３
【国際公開番号】ＷＯ２００７／０９８２０１
【国際公開日】平成１９年８月３０日（２００７．８．３０）
【出願人】（５０１０５１１２５）ザ ヘンリー エム． ジャクソン ファウンデーション フォー ザ アドヴァンスメント オブ ミリタリー メディシン インコーポレイテッド (9)
【Ｆターム（参考）】
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