性交渉感染症を引き起こす細菌のプローブ、ＤＮＡチップ及び遺伝子型解析キット
淋菌、クラミジア・トラコマチス、ウレアプラズマ・ウレアリティカム、マイコプラズマ・ジェニタリウムのような性交渉感染症（ＳＴＤ）病原菌の内、最も頻繁に発症する４種との感染を素早く正確に診断するためのＤＮＡチップ及び遺伝子型決定キット、及びそれに使用するオリゴヌクレオチドプローブを提供する。前記ＤＮＡチップ及び遺伝子型決定キットは、ＳＴＤの診断において、感度、特異性及び再現性に優れており、そして様々なサンプルにおける細菌の４種の型の素早い自動分析に効果的である。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、性交渉感染症（ＳＴＤ）の病原体の内、最も発病率の高い４種の細菌である淋菌、クラミジア・トラコマチス、ウレアプラズマ・ウレアリティカム、及びマイコプラズマ・ジェニタリウムの感染を迅速かつ正確に診断するためのＤＮＡチップ、遺伝子型決定キット及びアッセイ、並びにそれを用いたオリゴヌクレオチドプローブに関するものである。
【背景技術】
【０００２】
性交渉感染症（ＳＴＤ）は、一般に、性行動によって伝染する疾患を指す。
【０００３】
ＳＴＤの疫学は、原因の９５％以上が（１）淋病、（２）クラミジア感染症および（３）非淋菌性尿道炎（ＮＧＵ）からなることを示す。非淋菌性尿道炎は、ここでは、尿道炎に罹った男性に淋菌が発見されない場合を示すものとする。非淋菌性尿道炎の最も一般的な病原菌は、クラミジア・トラコマチスと、その他ウレアプラズマ・ウレアリティカム及びマイコプラズマ・ジェニタリウムもまた主な病原菌として指摘される。つまり、４種の細菌、すなわち淋菌、クラミジア・トラコマチス、ウレアプラズマ・ウレアリティカム及びマイコプラズマ・ジェニタリウムは、ＳＴＤ原因の絶対多数である。これらの細菌は、前部尿道炎の共通する主な原因の全てであり、副睾丸炎および前立腺炎と合併するかもしれなく、不妊の重要な原因にもなる。これらはまた、女性の子宮頸管炎及び骨盤内炎症性疾患の主な原因であり、卵管閉塞を引き起こすことで不妊及び子宮外妊娠のような合併症を引き起こすかもしれない。
【０００４】
今日では、西欧諸国ではクラミジア感染症が最も一般的であり、韓国においても淋病が減少すると共にクラミジア感染症及び非淋菌性尿道炎は近年増える傾向に有る。
【０００５】
ＳＴＤは、多くの場合いくつかの症状が引き起こされる他の疾病と異なり、症状が無い状態で潜伏し、そして再感染しやすいものである。そのため、その初期段階でＳＴＤ病原菌を検出する方法及び症状の無いキャリアーを効率的に診断する方法の開発もまた重要である。
【０００６】
一部の患者に尿道炎が発見された際に、先ず淋菌性か非淋菌性かどうかを判別するべきである。なぜならば、それぞれによって疾病の治療及び進行度が異なるからである。しかしながら、抗生物質の濫用及び誤用による細菌の変異及び複合感染により、それらの間の区別が不明瞭になってきており、正確な診断に、本発明における分子遺伝学的検査を必要とする。
【０００７】
淋菌性尿道炎を引き起こす淋菌は、ナイセリア属に属する。
【０００８】
淋菌の診断は、主にグラム染色によって行われる。細胞中の特徴的なグラム陰性双球菌の存在を確認するグラム染色は、容易で、比較的高い精度を有するので、広く使用されている方法である。しかしながら、症状がない又はわずかである淋菌性尿道炎に対しては、グラム染色は多くの場合、不明瞭な識別又は偽陰性となるかもしれない。
【０００９】
グラム染色を補うために、淋菌の培養が試みられている。前記淋菌の培養は、多くの観点から有益で、正確な分析であるが、分析結果がわかるまでに多くの時間とコストを消費するという欠点を有する。
【００１０】
また、酵素免疫測定法（ＥＩＡ）及び免疫蛍光法が、淋菌感染症の診断で抗原を検出する新しい方法として用いられる。これらは、培養試験より早く結果を得ることができると報告されており、より高い感度及び特異性を有するが、高コストであるという欠点を有する。
【００１１】
非淋菌性尿道炎は発病率が減少しているが、一方で淋菌性尿道炎は、近年増加している。非淋菌性尿道炎は様々な微生物から引き起こされる一種の症候群であり単一の疾病ではない。非淋菌性尿道炎を引き起こす最も重要な微生物は、クラミジア・トラコマチスである。クラミジア・トラコマチスは、ゲノム上にＤＮＡ及びＲＮＡの両方を有する細胞内に寄生するライフサイクルを有し、合計１５血清型を有する。それらの内Ｄ−Ｋ型は、非淋菌性尿道炎を引き起こす。それらによって発病させられるヒト疾患は、尿道炎、子宮頸管炎、副睾丸炎および骨盤内炎症性疾患を含むトラコーマＳＴＤ、呼吸感染症及びＳＴＤを含む。クラミジアが心筋炎を引き起こすことが、近年報告された。
【００１２】
クラミジア・トラコマチスを同定するための方法として、（１）感染領域から集められた材料を培養、分離することにより細菌を同定する方法、（２）感染領域の上皮の直接塗抹標本染色により細菌を同定する方法及び（３）患者の血清から抗体を分離することにより細菌を同定する方法のようないくつかの方法が用いられており、そして近年（４）ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）及びハイブリダイゼーションを用いた方法のような分子遺伝学的技術を用いる方法が好まれる。
【００１３】
サンプルを培養・分離する方法は、長い時間を要し、低診断感度であることなどから臨床診断の目的には適さない。感染領域の上皮の直接塗抹標本染色により細菌を同定する方法は、簡易であるという利点が有るが、低い診断感度を有する。また、モノクローナル抗体に結合する蛍光物質であるＦＩＴＣ（フルオロセインイソチオシアネート）（蛍光物質）のような試薬を用いた蛍光抗体法は、相対的に高い感度を有するが、高いコスト及び専用の装置を必要とするという短所が有り、結果としてその使用が制限される。
【００１４】
ヒト及び様々な哺乳動物に広く存在し、泌尿生殖器に感染を引き起こすかもしれないマイコプラズマ属及びウレアプラズマ属に属するウレアプラズマ・ウレアリティカム及びマイコプラズマ・ジェニタリウムは、培養技術が非常に異なり、染色又は免疫学的方法によって検出することも困難である。従って、近年の診断傾向はＰＣＲを基にした分子遺伝学的検査である。この場合、使用方法は、主に各細菌種に対する遺伝子特異的なＤＮＡ塩基配列をＰＣＲ増幅することによる細菌の同定、シークエンシング反応による同定、ハイブリダイゼーションなどの方法でできている。今までに同定された１３種類のマイコプラズマおよび２種類のウレアプラズマは、１６ＳリボソームＲＮＡ（１６Ｓ ｒＲＮＡ）の５’方向のＶ３の隣接領域及び３’方向のＶ６の隣接領域に共通の塩基配列を有する。一方、Ｖ４及びＶ５領域の約２５０塩基の配列、又は１６Ｓ〜２３ＳリボソームＲＮＡ間の領域の塩基配列は、各種によって異なる。その為、これを分析する方法は有効であり、すなわち、ウレアプラズマ・ウレアリティカムの場合では、それに固有のウレアーゼサブユニットの塩基配列の分析の方法にもまた利用できる（例えば、非特許文献１、非特許文献２参照）。
【００１５】
細菌感染症の病原菌の正確な同定は、正確な診断のためだけではなく、疾病の感染源及び条件の発見、疾病の進行と予後を予測し、治療プランを決め、そしてそのワクチンを開発するためにも欠かすことができない。この時、病原菌診断において、属及び種だけでなく亜種及び変種も同様に容易に検出することが重要である。
【００１６】
細菌感染症における病原菌の正確な検出の為に、検査は１００%近い感度、特異性及び再現性を有するべきである。前記培養試験又は免疫分析のような従来の細菌表現型分析は、このような条件を満足することはなかなかできない。これに反して、細菌ゲノムの遺伝子型、すなわちＤＮＡ及びＲＮＡの塩基配列を分析する遺伝学的検査は、理論的には３つの条件全てを満たすことができ（例えば、非特許文献３参照）、ＰＣＲ技術を用いて淋菌感染及びクラミジア感染を検査する診断キットはすでに市場に出され、用いられている（例えば、非特許文献４参照）。
【００１７】
しかしながら、細菌検出用遺伝学的検査は、臨床試験及び治療、又は他の研究室で活発に用いられ、臨床試験及び治療に重要な助力を与えるためには、言及した条件に加えて満たすべき多くの条件を有する。具体的には、前記遺伝学的検査は、扱いやすく、容易に解釈され、かつ単純であり、すばやく結果が得られ、そして特別高価な設備を必要としないことが必要である。また、多くのサンプルのすばやい検査を可能とするために自動化されるべきであり、検査コストは高価であってはならない。その為、ＰＣＲは、可能であれば、対象となる細菌は一ＰＣＲ反応を一体型チューブで検査するマルチプレックス型ＰＣＲとなることが必要である。検査される遺伝子及び塩基配列領域は、ＰＣＲにおいて変種レベルで正確に各対象細菌を判別するために適切に選択される必要が有り、これに従って、最適ＰＣＲ条件が確立されなければならない。しかしながら、尿道炎及び子宮頸管炎に対する４種の主な病原菌、すなわち淋菌、クラミジア・トラコマチス、ウレアプラズマ・ウレアリティカム又はマイコプラズマ・ジェニタリウムを一度に調査するマルチプレックス型ＰＣＲに関しては、今まで報告されておらず、そして、そのようなＰＣＲキットはまだ市場に出ていない。
【００１８】
更にまた、ＰＣＲ後の増幅された産物が所望の細菌の正確なＤＮＡであるかどうかを正確に同定する検査が必要である。更に、遺伝学的検査は、正確に細菌の遺伝子型を読み込む必要があり、それにより正確に抗生物質に対する耐性、生物侵入率などを予測することが可能になる。それにより、一度に様々なＳＴＤ病原菌を検査し、更にまた、抗生物質に対する耐性のような情報を与えるＤＮＡチップ（又はＤＮＡマイクロアレイ）を開発することが急務である。
【非特許文献１】Ｊｅｎｓｅｎ Ｊ．Ｓ． ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｃｌｉｎ． Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． ２００３； ４１： ２６１−６
【非特許文献２】Ｙｏｓｈｉｄａ Ｔ． ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｃｌｉｎ． Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． ２００２； ４０： １０５−１１０
【非特許文献３】Ｏｌｉｖｅ ＤＭ ｅｔ ａｌ． Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ． １９９９：３７：１６６１−９
【非特許文献４】Ｓｈａｆｅｒ Ｍ． ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｃｌｉｎ． Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． ２００３； ４１： ４３９５−９
【非特許文献５】Ｏｌｓｅｎ Ｇ．Ｊ． ｅｔ ａｌ．， Ｒｉｂｏｓｏｍａｌ ＲＮＡ： ａ ｋｅｙ ｔｏ ｐｈｙｌｏｇｅｎｙ．ＦＡＳＥＢ １９９３； ７：１１３−１２３
【非特許文献６】Ｌａｎｅ ＤＪＢ ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ． １９８５； ９２：６９５５−９
【非特許文献７】Ｙｏｓｈｉｄａ Ｔ． ｅｔ ａｌ． Ｊ． Ｃｌｉｎ． Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． ２００２； ４０：１０５−１１０
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１９】
本発明の一態様によれば、尿道炎、子宮頸管炎及び骨盤内炎症性疾患の４種の主要な病原菌であり、ＳＴＤ原因の９０%以上の絶対多数を占める淋菌、クラミジア・トラコマチス、ウレアプラズマ・ウレアリティカム、及びマイコプラズマ・ジェニタリウムの遺伝子を増幅することができるマルチプレックス型ＰＣＲ法を提供する。
【００２０】
本発明の別の態様によれば、４種の主な病原菌及びヒトβグロブリンのＰＣＲ増幅に効率的なプライマーを提供する。
【００２１】
本発明の更に別の態様によれば、各前記４種の細菌、制御遺伝子、及び抗生物質耐性遺伝子に固有の塩基配列の遺伝子をより正確に検出することを可能にするオリゴヌクレオチドプローブを提供する。
【００２２】
本発明の更に別の態様によれば、集められたプローブを含む、前記４種の主な病原菌の検出及び遺伝子型決定用のＤＮＡチップを提供する。
【００２３】
本発明の更に別の態様によれば、プローブを含む、前記４種の主な病原菌の検出及び遺伝子型決定用キットを提供する。
【課題を解決するための手段】
【００２４】
本発明において、検査される前記４種の細菌及び検査されるヒトβグロブリンの遺伝子及びその領域、並びにそれらの増幅に必要なＰＣＲプライマーを設計し（実施例１）、コントロール系統及び各系統の標的遺伝子のＤＮＡクローンを固定し（実施例２）、サンプルを採取し、保存する方法を確立し（実施例３）、サンプルからＤＮＡを分離する方法を確立し（実施例４）、細菌の標的遺伝子に対するシングルＰＣＲ条件を確立し（実施例５）、臨床サンプルにシングルＰＣＲ及びシークエンシングを行い、その結果からデータベースを作成し（実施例６及び７）、前記４種の細菌及びヒトβグロブリンの遺伝子に対するマルチプレックスＰＣＲ条件を確立し（実施例８）、そしてそのマルチプレックスアッセイをヒトサンプルで行い、それにより前記アッセイの品質管理を確認する（実施例９）。前記４種の細菌及びヒトβグロブリン遺伝子のハイブリダイゼーションアッセイ用プローブを設計し、これを用いたＤＮＡチップを作成し（実施例１０及び１１）、人工サンプルを前記ＤＮＡチップで分析し、それにより分析条件を確立し（実施例１２）、臨床サンプルを前記ＤＮＡチップで分析し（実施例１３）、それにより前記４種の細菌が感染していることがわかり、同様に感染細菌の遺伝子型が判別される（実施例１３）。これにより本発明は完成する。
【００２５】
本発明は、以下に例示される。
【００２６】
本発明のプライマーは、配列番号１又は２の塩基配列を有する淋菌の核酸増幅用プライマー、配列番号３又は４の塩基配列を有するクラミジア・トラコマチスの核酸増幅用プライマー、配列番号５又は６の塩基配列を有するウレアプラズマ・ウレアリティカムの核酸増幅用プライマー、配列番号７又は８の塩基配列を有するマイコプラズマ・ジェニタリウムの核酸増幅用プライマー、配列番号９又は１０の塩基配列を有するヒトβグロブリンの核酸増幅用プライマーを含む。
【００２７】
本発明のＰＣＲ増幅法は、少なくとも一つのプライマーを用いたシングル又はマルチプレックスＰＣＲ増幅法である。
【００２８】
本発明のＳＴＤ病原菌の検出用プローブは、淋菌及びマイコプラズマ・ジェニタリウムの１６Ｓ ｒＲＮＡ及びウレアプラズマ・ウレアリティカムの１６Ｓ〜２３Ｓの遺伝子間領域、又はクラミジア・トラコマチスのクリプティックプラスミド（ｃｒｙｐｔｉｃ ｐｌａｓｍｉｄ）の一部を含むオリゴヌクレオチドを含む。より好ましくは、前記プローブは配列番号１１〜配列番号３３の塩基配列を有するオリゴヌクレオチド、及びそれらオリゴヌクレオチドに相補的な塩基配列を有するオリゴヌクレオチドからなる群から選択される。
【００２９】
本発明のＤＮＡチップは、配列番号１１〜配列番号３３の塩基配列を有するオリゴヌクレオチド及びそれらのオリゴヌクレオチドと相補的な塩基配列を有するオリゴヌクレオチドからなる群から選択される一又はそれ以上の種類のプローブを含む。
【００３０】
配列番号１１〜１６はウレアプラズマ・ウレアリティカムの検出用プローブであり、配列番号１７〜２１は淋菌の検出用プローブであり、配列番号１１〜２８はクラミジア・トラコマチスの検出用プローブであり、配列番号２９〜３３はマイコプラズマ・ジェニタリウムの検出用プローブである。
【００３１】
本発明のもう一つの実施形態におけるＳＴＤ病原菌の検出用ＤＮＡチップは、リファレンスマーカー（ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ ｍａｒｋｅｒ）としてβグロブリン、アクチン又はグリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼを更に含んでもよく、そして、リファレンスマーカーがβグロブリンである場合、それは配列番号４０で表わされる塩基配列であることが好ましく、その増幅用プライマーは配列番号９及び配列番号１０の塩基配列を有するβグロブリンＤＮＡ増幅用プライマーである。前記リファレンスマーカーの使用は前記ＤＮＡチップでのハイブリダイゼーション、並びに従来手順であるＤＮＡ分離手順及びＰＣＲ増幅手順に対する品質管理を評価し、偽陰性を検出することを可能にする。
【００３２】
本発明のもう一つの実施形態におけるＳＴＤ病原菌の検出用ＤＮＡチップは、テトラサイクリン耐性遺伝子（ＴｅｔＣ）の検出用の一つ又はそれ以上の種類のプローブを更に含んでもよい。テトラサイクリン抗生物質耐性遺伝子も分析することは、ＳＴＤ治療に最も広く用いられている抗生物質であるテトラサイクリン系抗生物質に対する耐性を前もって正確に検出することができ、治療プランの決定及び治療の助力となる。前記テトラサイクリン抗生物質耐性遺伝子のプローブは、好ましくは配列番号３４〜３９の塩基配列を有する。
【００３３】
本発明のＤＮＡチップを製造する方法は、ＳＴＤ病原菌の核酸に相補的に結合することができる塩基配列及び５’末端アミン結合を有するＤＮＡプローブを生成する手順、アルデヒドが結合した固体の表面に結合された該生成したＤＮＡプローブを備えさせる手順、およびＤＮＡプローブが結合した固体表面に存在するアミンに結合しないアルデヒドを還元する手順を含む。
【００３４】
前記プローブＤＮＡと固体表面上のアルデヒドとの結合は、アミンとアルデヒドのシッフ塩基反応によって行われ、前記固体はガラス、二酸化ケイ素、プラスチック又はセラミックから選択される。
【００３５】
本発明の性交渉感染症（ＳＴＤ）病原菌の検出用キットは、ＳＴＤ病原菌のＤＮＡサンプルのＰＣＲ増幅用プライマーセット、ＳＴＤ病原菌検出用ＤＮＡチップ、並びに前記ＤＮＡチップの検出用マーカー及びハイブリダイゼーションするための増幅されたＤＮＡを含む。
【００３６】
本発明の性交渉感染症（ＳＴＤ）病原菌検出の方法は、（ａ）ＳＴＤ病原菌ＤＮＡ増幅用プライマーを用いてＳＴＤ病原菌のＤＮＡサンプルを増幅する工程、（ｂ）配列番号１１〜配列番号３３の塩基配列を有するオリゴヌクレオチド及びそれらのオリゴヌクレオチドに相補的な塩基配列を有するオリゴヌクレオチドからなる群から選択された一つ又はそれ以上の種類のプローブを含むＤＮＡチップ上に増幅されたＤＮＡをハイブリダイゼーションする工程、（ｃ）前記プローブ及びハイブリダイゼーション反応物を検出する工程を含む。
【００３７】
アッセイキット及びＳＴＤ病原菌を検出するための検出方法は、前記プライマー及び前記マーカーを含んでもよい。前記プライマーは、配列番号１〜配列番号８の塩基配列からなる群から選択されるＳＴＤ病原菌を増幅するためのプライマーであってもよく、そして塩基配列９及び１０の塩基配列からなるβグロブリンプライマーを含んでもよい。
【００３８】
前記マーカーとして、公知である様々な標識、例えば、Ｃｙ５、Ｃｙ３、ビオチン結合性物質、ＥＤＡＮＳ（５−（２’−アミノエチル）アミノ−１−ナフタレン硫酸）、テトラメチルローダミン（ＴＭＲ）、テトラメチルローダミンイソシアネート（ＴＭＲＩＴＤ）、ｘ−ローダミン又はテキサスレッドを用いることができる。Ｃｙ５を標識として用いる場合、蛍光シグナルは、効率的で感度の高い結果を導く標識化された反応物の検出で、付加的な反応なしで、共焦点レーザースキャナのようなアナライザーを用いて直接分析することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３９】
本発明が、以下の実施例により、更に詳しく記述される。しかしながら、以下の実施例は、本発明の構成と効果を示すことを目的とし、本発明を限定するものではない。
【実施例１】
【００４０】
ＰＣＲプライマーの設計
分析する前記４種の細菌の遺伝子及びその領域を決定し、それらの増幅に必要なＰＣＲプライマーが設計された。その上、ヒトβグロブリン遺伝子は、いくつかの内部基準遺伝子及びコントロール遺伝子であるハウスキーピング遺伝子として選択され、ＤＮＡ分離及びＰＣＲ反応の制御品質を確認した。そしてそのＰＣＲ増幅のためのプライマーもまた設計された。
【００４１】
分析する遺伝子領域は、１６Ｓ ｒＲＮＡ若しくは２３Ｓ ｒＲＮＡ、又はそれらの中間部から先ず選択され、その空間遺伝子間領域は、細菌の系統発生の発見に最も広く用いられている（例えば、非特許文献５、非特許文献６参照）。
【００４２】
この時、ＰＣＲ増幅領域のスタンダードとして、全ての細菌及び同属の細菌に共通の塩基配列、いわゆる高度保存領域は一方向に配列され、標的細菌の種（属）に固有の塩基配列、いわゆる超可変領域はもう一方向に配列された。あるいは、前記保存領域は両方向に配列され、前記可変領域はそれらの間に配列された。もし、１６Ｓ ｒＲＮＡ若しくは２３Ｓ ｒＲＮＡ又は１６Ｓと２３Ｓの間の領域上に適切な塩基配列が無かったなら、標的細菌の固有遺伝子及び固有塩基配列は、分析のため他の領域から選択される。例えば、淋菌の場合、シトシンメチルトランスフェラーゼ遺伝子もまた、１６Ｓ ｒＲＮＡの代わりに分析されてもよく、クラミジアの場合は、主要外膜タンパク質（ＭＯＭＰ）のｏｍｐ１遺伝子もまた、分析されてよい。加えて、クラミジア・トラコマチスの場合、この系統に潜伏しているクリプティックプラスミドの塩基配列もまた、調査され得る（例えば、非特許文献７参照）。
【００４３】
【表１】
【００４４】
＊遺伝子バンク登録番号：Ｘ０７７１４
＊＊遺伝子バンク登録番号：Ｘ０７５４７
＊＊＊遺伝子バンク登録番号：ＡＦ０７３４５５＆Ｘ５８５６１
＊＊＊＊遺伝子バンク登録番号：Ｘ７７３３４
＊＊＊＊＊遺伝子バンク登録番号：ＮＧ−０００００７
ＮＧ（淋菌）、ＣＴ（クラミジア・トラコマチス）、ＵＵ（ウレアプラズマ・ウレアリティカム）、ＭＧ（マイコプラズマ・ジェニタリウム）、ＨＢＢ（ヒトβグロブリン）、Ｆ（正方向）、Ｒ（逆方向）
【実施例２】
【００４５】
コントロール群系統並びにサンプル及びそのクローンの確保
分析する４種の細菌のそれぞれに対するスタンダードポジティブコントロール群の系統は、ＡＴＣＣ，ＵＳＡ（米国マナッサス，ＶＡ２００１０８）で購入し、そして又、各細菌がすでに感染していると同定されたサンプルを得た。ＤＮＡをこれらから分離し、その後、分析する標的遺伝子領域を、各細菌に対してＰＣＲ増幅し、クローニング及びシークエンシングにより同定し、それによりそれらのそれぞれに対してプラスミドクローンが確保された。
【００４６】
クローニング実験方法は、以下の公知の方法を用いて行われ、そして前記ポジティブコントロール群の細菌系統及び確保されたプラスミドクローンの特性を、表３に示す。ＰＣＲの方法は、後の実施例で繰り返されるので、その詳細はここでは省略する。
【００４７】
１）淋菌及びマイコプラズマ・ジェニタリウムの１６Ｓ ｒＲＮＡ、ウレアプラズマ・ウレアリティカムの１６Ｓ〜２３Ｓ遺伝子間領域並びにヒトβグロブリン遺伝子のＰＣＲにより増幅されたＰＣＲ産物は、ゲルリカバリーキット（米国ｚｙｍｏ ｒｅｓｅａｒｃｈ社製造）を用いたアガロースゲル上で分離され、その濃度を分光光度計又はアガロースゲルの濃度測定法により測定した。
【００４８】
２）冷凍保管されていたｐＧＥＭ(R)−Ｔ（米国Ｐｒｏｍｅｇａ社製、Ａ１３６０）及び２ｘラピッドライゲーションバッファーは、指の端部で軽くチューブを振盪して溶解、混合し、軽く遠心分離し、それによって、０．５ｍｌチューブに、クローニングする挿入ＤＮＡと、表２に示す割合にし、ライゲーション反応の準備をした。
【００４９】
【表２】
【００５０】
３）各反応溶液を、ピペットでよく混合し、ライゲーション反応のため室温で１時間保持した。もし多量の形質転換細胞が必要であれば、４℃で一晩反応させるために保持してもよい。
【００５１】
４）ライゲーションされたサンプルは、−７０℃で保存されていた５０μｌ ＪＭ１０９コンピテント細胞（＝１×１０８ｃｆｕ／μｇ ＤＮＡ）を用いて形質転換させた。
【００５２】
５）先ず、上記により得られた２μｌのライゲーション反応産物（ライゲート）を１．５ｍｌチューブに加えた。直ちに解凍された５０μｌのコンピテント細胞をそこに再度加え、該混合物をよく混合し、その後氷上で２０分間反応させるために保持した。
【００５３】
６）前記細胞は、４２℃循環水浴中におき、４０〜５０秒の熱ショック処理をした。
【００５４】
７）室温に調整した９５０μｌ ＳＯＣ培地をそこに加え、約１時間半３７℃で振盪恒温槽で培養した。
【００５５】
８）約１００μｌの培養溶液をＬＢ／アンピシリン／ＩＰＴＧ／Ｘ−Ｇａｌ プレートに注ぎ、その後前記プレートを反転し、３７℃に調節された恒温槽で１６〜２４時間培養した。その後、コロニー数を計数（コロニー計数）し、白色のコロニーのみを選択し、３ｍｌ ＬＢ／アンピシリン培養溶液で培養し、それからＭｉｎｉ−Ｐｒｅｐ手順でプラスミドＤＮＡを分離、精製した。その後、挿入ＤＮＡが制限酵素によるＰＣＲおよび開裂反応を用いて適切に挿入されたかどうか同定し、こうして得られたクローンの塩基配列をオートシーケンサーを用いて分析した。
【００５６】
【表３】
【実施例３】
【００５７】
臨床サンプルの採取
尿道、頸部又は口からの分泌物、消毒綿またはブラシで集めた細胞によって得られたスワブサンプル、尿、尿道洗浄溶液並びに前立腺溶液のような様々なサンプルを人体から採取する適切な方法を確立し、分析前にそれらを運搬及び保存した。ここで、男性尿の採取は、従来の三杯試験により、ＶＢ（排せつされた尿：ｖｏｉｄｅｄ ｂｌａｄｄｅｒ）１，ＶＢ２，ＶＢ３及び前立腺圧出液（ＥＰＳ）に分割することにより行った。ＶＢ１は、排尿の始め（すなわち、早期尿流）に出される１０から２０ｍｌを言う。ＶＢ２は、排尿の中間に出された中期尿流を言う。前立腺圧出液は、前立腺マッサージに続いて尿道に出てくる分泌物を言う。ＶＢ３は、前立腺マッサージの後の排尿で始めに出る１０から２０ｍｌの尿を言う。ここで、ＶＢ１は尿道のサンプルを意味し、ＶＢ２は膀胱サンプルを意味し、そしてＶＢ３は前立腺サンプルを意味する。
【００５８】
サンプル採取の方法、そのために用いられた器具及びサンプルを運搬、保存する方法は、以下の通りである。
【００５９】
このＳＴＤ分析において、男性のスタンダードサンプルは、尿道のスワブサンプル及び早期尿流（ＶＢ１）のサンプルであり、もし必要であれば、尿道分泌物又は前立腺マッサージ後の尿（ＶＢ３）をそこに加える。一方、女性のスタンダードサンプルは、頸部のスワブサンプル又は擦りとったサンプルであり、もし必要であればスワブサンプル若しくは膣の分泌物又は尿をそこに加える。ここで、同性愛者又は特定職業従事者の場合、サンプルを直腸又は肛門から更に得てもよい。
【００６０】
男性の尿道のスワブサンプルの入手する時、先端に綿又はブラシを付随させた滅菌消毒綿を尿道口の内側２〜３ｃｍに挿入し、左右に動かしそれにより集合したものとして尿道中の分泌物及び細胞を採取した。その上、女性から頸部のスワブサンプルを得る時、先端にブラシを付随させた滅菌消毒綿を頸部の内側に挿入し、左右に動かし、それにより集合したものとして分泌物及び細胞を採取した。ここで、採集するスワブ用器具として、ＣＯＰＡＮ（米国ＣＯＰＡＮ ｉｎｎｏｖａｔｉｏｎ社）が提供した消毒綿若しくはＳａｎｇ−Ａ Ｍｅｄｉｃａｌ社（韓国ソウル市）が提供したＰａｐブラシ、又はその同等物を用いた。その後、消毒綿の綿部分又はブラシ部分は、滅菌したサンプル保存溶液を内側に有し、スクリューキャップを有するチューブ内に入れられ、移動及び保存された。
【００６１】
尿又はスワブサンプルのような採取されたサンプルは、可能であれば４８時間以内に研究室に運搬されるべきであり、移動中も冷凍する温度に維持するべきである。これは遺伝子増幅が差し迫った細菌の分離を助け、急速発育性細菌の異常増殖を阻止する。
【００６２】
予め、滅菌したサンプル保存溶液をサンプル採集チューブに満たした。その組成物は、１００ｍｌの３７〜４０％ホルムアルデヒドと、１５ｍｌメタノール、６．５ｇのＮａ２ＨＰＯ４及び４．０ｇのＮａＨ２ＰＯ４を混合し、滅菌三重蒸留水（ｔｒｉｐｌｅ−ｄｉｓｔｉｌｌｅｄ ｗａｔｅｒ）をそこに加え、最終体積を１Ｌにすることで作られた。
【００６３】
尿サンプルの場合、スクリューキャップを有する体積３０ｍｌの滅菌チューブに、上記方法で採集された新鮮な尿１０から２０ｍｌを加え、移動し、分析前に４℃で保存した。他の方法として、遠心分離して細胞沈殿層を得て、-７０度で保存し、後でＤＮＡ分離を行った。
【実施例４】
【００６４】
ＤＮＡ分離
ＤＮＡを、実施例３の様々なヒトサンプルからＤＮＡを分離するための市販キットを用いた方法及び手作業で用意した試薬を用いる方法によって、分離・精製した。
【００６５】
市販キットとして、ＱＩＡ ａｍｐ ＤＮＡ ｂｌｏｏｄ ｍｉｎｉ ｋｉｔ（米国カリフォルニア州ヴァレンシアＱｉａｇｅｎ社製、カタログＮｏ．５１１０６）を次のように用いた。
【００６６】
尿又はスワブサンプルを、スイングローター遠心分離機を用いて３０分間３０００ｒｐｍで遠心分離した。その上澄みを注ぎだし、沈殿物は５００μｌＰＢＳで再懸濁し、その後、懸濁液を１．５ｍｌマイクロ遠心チューブに移した。前記懸濁液を２分間遠心分離し、再度上澄みを注ぎだした。２００μｌのリン酸バッファーナトリウム（ＰＢＳ、ｐＨ７．４）及び２０μｌのプロテナーゼＫをそこに加え、その後沈殿物が完全に懸濁されるまで約２分間ボルテックスで混合した。２００μｌ ＡＬバッファーをそこに加え、該混合物を更に２分間ボルテックスで混合し、その後２０分間、５６℃の恒温水浴で反応させた。次に、２００μｌの無水エタノールをそこに加え、ピペットで攪拌した。それにより処理した反応液を、スピンカラムに移し、２ｍｌコレクションチューブを取り付け、その後１〜２分間８０００ｒｐｍで遠心分離した。その後、新しい２ｍｌコレクションチューブをスピンカラムに取り付け、５００μｌのＡＷ２バッファーをスピンカラムに送り込み、その後１分間８０００ｒｐｍで遠心分離した。再び新しい２ｍｌコレクションチューブを取り付け、５００μｌのＡＷ２バッファーをスピンカラムに送り込み、その後、３〜５分間１２０００ｒｐｍで遠心分離した。１．５ｍｌマイクロ遠心チューブをそこに取り付け、６０μｌ ＡＥバッファー又は滅菌蒸留水をスピンカラムに送り込んだ。その後、該混合物を３〜５分間室温で反応させた。その後、該反応混合物は３分間１２０００ｒｐｍで遠心分離し、ＤＮＡを分離した。該分離ＤＮＡの濃度は、分光光度計又はアガロースゲルで測定された。約２０ｎｇ／μｌのＤＮＡ濃度が得られた場合、３μｌの分離されたＤＮＡがＰＣＲで用いられ、１．５％アガロースゲル上にＤＮＡバンドが示されない場合、６μｌの分離されたＤＮＡが用いられた。
【００６７】
本発明の手作業で用意した試薬を用いる方法は、次の通りである。約１ｍｌの尿サンプル又はスワブサンプルを３０分間１５０００ｒｐｍで遠心分離し、上澄みを廃棄し、その後、残渣をＰＢＳ（ｐＨ７．４）で洗浄した。その後１０ｍＭ Ｔｒｉｓ ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、１ｍＭ ＥＤＴＡ、０．５％ Ｔｗｅｅｎ−５０、０．５％ ノニデットＰ−４０及び２００μｇ／ｍｌ プロテナーゼＫで構成される細胞融解バッファー１００μｌをそこに加え、３０分間５５℃で反応させた。前述した組成物の代わりに融解バッファーは１０ｍＭ Ｔｒｉｓ ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、５０ｍＭ ＫＣｌ、１．５ｍＭ ＭｇＣｌ２、０．５％ ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）、０．５％Ｔｗｅｅｎ−５０、０．５％ ノニデットＰ−４０及び７００μｇ／ｍｌ プロテナーゼＫで構成されてもよく、その５００μｌを処理に用いることができる。細胞融解手順後、前記反応結果物は、プロテナーゼＫを不活性化するため、１５分間９４℃で熱し、その後、再び遠心分離し、濃縮された沈殿物を得た。続いて、前記沈殿物をフェノールクロロホルムで処理し、エタノールで沈殿させ、その後遠心分離することでＤＮＡを得た。前記沈殿物を５０μｌの滅菌三重蒸留水又はＴＥバッファー（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ［ｐＨ８．０］及び１ｍＭ ＥＤＴＡ）で溶解し、その３〜６μｌをＰＣＲで用いた。
【実施例５】
【００６８】
シングルＰＣＲの条件を確立するためのＰＣＲ
人工サンプルは、１０、１００、１０００及び１００００毎の多重コピーである各細菌を検査するための、実施例２で得られた標的遺伝子のプラスミドクローンを、滅菌三重蒸留水、実施例３のサンプル保存溶液及び感染症状の無い正常男性の新鮮な尿に加えることによって作製した。その後、各細菌の標的遺伝子のシングルＰＣＲを繰り返し行い、それによりシングルＰＣＲに適切な条件を確立した。ＰＣＲを行っているとき、内部基準遺伝子であるヒトβグロブリンのＰＣＲを、確実に一緒に行った。その上、その後マルチプレックスＰＣＲを考慮して、各ＰＣＲ産物の大きさがそれぞれ特徴的に異なり、そしてアニーリング温度が大きな違いを有さないように設計された。
【００６９】
本発明のＰＣＲ方法において、反応溶液の構成と条件は、表４〜８に示す。本発明の方法が、本発明において設計されたプライマーを用いて行われる場合、１ｍｌのサンプル溶液に１０〜１００コピーのプラスミドクローンが含まれている限りいつでも調査が可能である。前記方法によるＰＣＲを行った後、その産物を、１．５〜２．０％アガロースゲル電気泳動にかけることによって確認し、その結果を図１〜５に例示する。
【００７０】
【表４】
【００７１】
【表５】
【００７２】
【表６】
【００７３】
【表７】
【００７４】
【表８】
【実施例６】
【００７５】
臨床サンプルのシングルＰＣＲ
ＳＴＤの羅病の疑いで国内病院の泌尿器科及び産婦人科を訪れた５４１人の成人男性及び成人女性患者、及び性交感染の症状が無い１０３人の成人男性および成人女性から、新鮮な尿（ＶＢ１）又は尿道炎、子宮頸管炎等のスワブのような様々なサンプルを実施例３の方法によって集めた。その後、ＤＮＡをそれらから実施例４の方法により分離し、実施例５によるシングルＰＣＲが行われた。
【実施例７】
【００７６】
臨床サンプルについてのＰＣＲ産物のシークエンシング
実施例６のＰＣＲ産物は、ＡＢＩ Ｐｒｉｓｍ ＢｉｇＤｙｅ Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ Ｃｙｃｌｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ Ｒｅａｄｙ Ｒｅａｃｔｉｏｎキット（米国Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）を用いてシークエンシング反応にかけて、その後、ＡＢＩ Ｐｒｉｓｍ ３７７ Ａｕｔｏｍａｔｅｄ Ｂａｓｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｅｒ（米国Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ社製）を用いて塩基配列の分析を行った。これらの手順は、次の順序で行われた。
【００７７】
（１）シークエンシング反応において主な材料として各サンプルから得られたＰＣＲ産物を用いるために、最も適切な濃度に調整した。例えば、１００〜２００ｂｐの長さの産物を有する場合、１〜３ｎｇ／μｌの濃度が必要であり、２００〜５００ｂｐの場合は約３〜１０ｎｇ／μｌが必要である。
【００７８】
（２）それぞれのＰＣＲ産物、並びに３．２ｐｍｏｌプライマー及び８μｌのターミネーターレディリアクションミックスを薄壁マイクロ遠心チューブに送り込み、そこに滅菌蒸留水を加え、それによりチューブ内の最終体積が２０μｌなるようにし、その後、軽く攪拌した。
【００７９】
（３）（２）の混合物を、Ｇｅｎｅ Ａｍｐ ２７００（米国ＰＥ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）を用いて、合計２５サイクルにおける各サイクルが１０秒間
９６℃、５秒間５０℃そして６分間６０℃であるサイクルシークエンシング反応にかけた。
【００８０】
（４）得られた反応物は、エタノールで沈殿させ、遠心分離することで、ターミネーターレディリアクションミックス中の遊離プライマー及び蛍光物質が付与されたジデオキシヌクレオチド（蛍光標識ｄｄＮＴＰ）を除去し、その後乾燥させた。
【００８１】
（５）（４）で得たＤＮＡを、クロロホルムアミド：２５ｍＭ ＥＤＴＡ（ｐＨ８．０）：ブルーデキストラン及びローディングバッファーの混合物１０μｌと混合し、５分間沸騰水中で変性させ、その後、該サンプルは冷凍保存された。
【００８２】
（６）（５）の変性ＤＮＡを、５．５％ロングレンジャーゲル（ｌｏｎｇ ｒａｎｇｅｒ ｇｅｌ）（米国ＢＭＡ社製、カタログＮｏ．５０６１１）に直ちに流し込まれるプレートの各ウェルに入れ、２〜４時間電気泳動にかけた後、シーケンサーを用いて塩基配列を分析した。
【００８３】
本発明のシークエンシング分析から、ＳＴＤを引き起こす４種の病原菌を調査するためのシングルＰＣＲ及びヒトβグロブリン遺伝子のシングルＰＣＲの適切さが確認され、結果として分子疫学上のデータベース、及びＳＴＤの４種の主な病原菌の遺伝子型が、韓国人について確立された。その為、ＳＴＤ感染及びその原因となる細菌の存在がＰＣＲ及びシークエンシングによって確認されたサンプルを、マルチプレックスＰＲＣ及びＤＮＡチップの評価分析に、その後用いた。
【００８４】
ＰＣＲ及びシークエンシング反応分析の結果を表９に示す。ＳＴＤの疑いのため病院を訪れた４７６人のうち３８７人は、淋菌、クラミジア・トラコマチス、ウレアプラズマ・ウレアリティカム及びマイコプラズマ・ジェニタリウムの少なくとも１種又はそれ以上を示したが、正常コントロール群の１０３人のうち４人のみにクラミジア・トラコマチス及びウレアプラズマ・ウレアリティカムを示した。細菌検出の頻度の観点から、クラミジアは４５．２％で最も頻度が高かった。１０５サンプル（２７．２％）では、２又はそれ以上の細菌の複合感染を示し、特に、淋菌感染の場合、複合感染は５２．２％となり、より頻度が高かった。
【００８５】
【表９】
【実施例８】
【００８６】
マルチプレックスＰＣＲに対する条件を確立する実験
人工サンプルは、１０、１００、１０００及び１００００毎の多重コピーである各細菌を検査するため、実施例２で得られた１〜４つの型からなる特定遺伝子のプラスミドクローンを、滅菌三重蒸留水、実施例３のサンプル保存溶液及びＳＴＤの症状が無い正常成人男性の新鮮な尿（ＶＢ１）に加えることによって作製した。その後、一つのチューブに人工サンプルで細菌毎に対しての標的遺伝子の４つの型のプライマーを加えることによって同時にＰＣＲを行うマルチプレックスＰＣＲが行われた。更に、前記マルチプレックスＰＣＲの時に、ハウスキーピング遺伝子であるヒトβグロブリン遺伝子もまたコントロール遺伝子として増幅した。
【００８７】
マルチプレックスＰＣＲの構成及び条件を表１０に示す。マルチプレックスＰＣＲ後、その産物を１．５〜２．０％アガロースゲル電気泳動にかけることにより確認した（図６〜９）。前記ＰＣＲ産物の電気泳動による画像を見ると、上から、それぞれウレアプラズマ・ウレアリティカムの産物は８１２ｂｐで、淋菌の産物は３８６ｂｐで、クラミジア・トラコマチスの産物は３１４ｂｐで、マイコプラズマ・ジェニタリウムの産物は２０７ｂｐで、ヒトβグロブリン遺伝子の増幅産物は１１０ｂｐである。本発明の方法を用いる際、１種類から５種類の様々な混合物中に、淋菌、クラミジア・トラコマチス、ウレアプラズマ・ウレアリティカム、マイコプラズマ・ジェニタリウム、及びヒトβグロブリン遺伝子の様々なＤＮＡを混合する場合、ＤＮＡにマルチプレックスＰＣＲを用いることで一度に正確に調査できるかもしれない。この時に、それぞれと異なる細菌遺伝子の１０〜１００コピーのプラスミドクローンが１ｍｌのサンプル中に含まれていれば、各ＤＮＡを常に区別することができる（図１０）。
【００８８】
【表１０】
【実施例９】
【００８９】
臨床サンプルのマルチプレックスＰＣＲ
上記実施例７でシングルＰＣＲ及びシークエンシング分析によって、ＳＴＤ感染及び原因となる細菌の存在が直ちに確認されたヒトサンプルのＤＮＡを、上記実施例８で確立された方法であるマルチプレックスＰＣＲにかけた。
【００９０】
試験対象に含まれるＤＮＡサンプルは、淋菌に感染したサンプルの５０例、クラミジア・トラコマチスに感染したサンプルの５０例、ウレアプラズマ・ウレアリティカムに感染したサンプルの５０例、マイコプラズマ・ジェニタリウムに感染したサンプルの５０例及び非感染サンプルの５０例である。マルチプレックスＰＣＲとそのシークエンシング間の比較分析によって、ＳＴＤ原因となる細菌の検出の感度と特異性が研究された。それにより、マルチプレックスＰＣＲを、臨床的にＳＴＤ原因となる４種の主な病原菌の選択及び調査に用いてもよいかどうか、分析が行われた。
【００９１】
シングルＰＣＲ及びシークエンシング分析の結果と比較したマルチプレックスＰＣＲの分析の結果を、表１１に示し、その実施形態を図１１及び１２に示す。シングルＰＣＲ後、マルチプレックスＰＣＲの感度は、前記シークエンシング分析に基づく場合、９４〜９６％、平均９５％であり、特異性は９６％であった。複合感染の検出感度は、８７．５％であり、シングルＰＣＲより低かった。
【００９２】
【表１１】
【００９３】
図６〜９は、本発明のマルチプレックスＰＣＲ法を用いて、淋菌、クラミジア・トラコマチス、ウレアプラズマ・ウレアリティカム及びマイコプラズマ・ジェニタリウムの遺伝子を増幅した後、オートシーケンサーによって確認したシークエンシングの結果である。非常に高い選択性を有するＰＣＲ産物は、本発明で設計された４種の細菌、ヒトβグロブリン遺伝子のプライマー及びＰＣＲ法を用いることによって精製することができる。
【実施例１０】
【００９４】
ハイブリダイゼーションアッセイのために設計したプローブ
ＳＴＤを引き起こす４種の主な病原菌の遺伝子及び一チップ上でハイブリダイゼーション反応によって同時にコントロール遺伝子のＰＣＲ産物を分析するためのＤＮＡチップを製造するために、先ず、適切な塩基配列を有するオリゴヌクレオチドプローブの組み合わせを設計した。
【００９５】
これは、本発明のＤＮＡチップを開発する基本的な段階であり、すなわち、これはＤＮＡチップと結合するオリゴヌクレオチドプローブを確立し準備する手順である。米国の全米バイオテクノロジー情報センターの遺伝子バンクのデータベース及び実施例７で得たＳＴＤを引き起こす４種の病原菌及び韓国人において検出されたヒトβグロブリン遺伝子のデータベースが分析され、各遺伝子型塩基配列が得られた。得られたＤＮＡ配列は、コンピュータープログラムのＤＮＡＳＴＡＲ（ＭｅｇＡｌｉｇｎＴＭ ５、ＤＮＡＳＴＡＲ社製）を用いてＣｌｕｓｔａｌＷによって、ペアワイズアライメント（ｐａｉｒｗｉｓｅ ａｌｉｇｎｍｅｎｔ）及びマルチプル塩基アライメントにかけられ、その後、系統樹が書かれ、各群の型特異性塩基配列が選択された。次に型特異性プローブが、再びコンピュータープログラムＰｒｉｍｅｒ Ｐｒｉｍｅｒ ５（ＰＲＥＭＩＥＲ Ｂｉｏｓｏｆｔ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ社製）を用いて設計された。この時、プローブに、長さが２０±２及び１８±２ｂｐを有するオリゴヌクレオチドがセットされ、合計３０タイプの遺伝子型特異性プローブが設計された。その名称、配列番号及びこれらプローブの遺伝子型を表１２に示す。
【００９６】
【表１２】
【００９７】
注釈）オリゴプローブの塩濃度は５０ｍＭに統一される。
【００９８】
ＴｅｔＣ：テトラサイクリン耐性型Ｃ
＊ＰＣＲ産物の塩基配列中のプローブ配列の位置（正及び逆方向でのプライマー配列を除く。）
【実施例１１】
【００９９】
ＤＮＡチップの製造
実施例１０で設計されたオリゴヌクレオチドプローブは、適切な試薬と混合され、その後、アレイヤー（ａｒｒａｙｅｒ）を用いて顕微鏡用スライドガラスに結合させることで、オリゴヌクレオチドマイクロアレイ、又はＳＴＤを引き起こす病原菌の遺伝子型検出用オリゴＤＮＡチップを次の順序、方法によって製造した。更に、チップ上に８つの格子を有し、その上に８種の異なるサンプルを同時分析するために結合させてもよい改良チップもまた製造された（図１３及び１４）。
【０１００】
１．各ＳＴＤ遺伝子型プローブをＤＮＡチップ上に結合させる順の格子の書き込み
本発明において、チップでのハイブリダイゼーション反応後のような群に格子を書き込むことで、特定の細菌を、そのＳＴＤ遺伝子型により示される蛍光シグナルによって容易に検出することができる。格子配列の模擬図を図１３に示す。最も左側に、ウレアプラズマ・ウレアリティカムの１６Ｓ〜２３Ｓリボソームに対する６つのプローブの境界スペーサを結合し、その右側に、マイコプラズマ・ジェニタリウムの１６Ｓ ｒＲＮＡに対する５つのプローブを結合させた。更に、最も右側に、テトラサイクリン抗体の耐性遺伝子に対する６つのプローブを結合させた。加えて、コントロール遺伝子であるヒトβグロブリン遺伝子に特異的なオリゴヌクレオチドプローブをコーナーマーカーとして、その２組が、左及び右側上部に位置し、そして各一つが左及び右側下部に位置するように結合させた。
【０１０１】
各オリゴヌクレオチドプローブは、スポットされ、又はアレイヤーを用いて結合された。この時、同じプローブを、細菌の各遺伝子型が少なくても２回、多くて４回示されるよう設計するために、２通りに結合した。
【０１０２】
本発明のＤＮＡチップの最も重要な改良の一つは、分割カバーを用いて、一つのチップ上を６〜８の区画に等しく分割する格子を有することである。それにより、６〜８のそれぞれ異なるサンプルを一つのチップ上で調査することができ、そしてこれは、時間、人的資源及びコストを減らすことに非常に有益である（図１３）。
【０１０３】
２．チップ上にオリゴヌクレオチドプローブをスポットするための溶液の準備及びマスタープレート上への分配。
【０１０４】
Ｃ６位にアミンが付与されることにより合成された実施例１０により設計されたオリゴヌクレオチドプローブを、高速液体クロマトグラフィーを用いて精製し、その後、最終濃度が２００ｐＭになるよう滅菌三重蒸留水に溶解した。従って、準備したオリゴプローブは、スポッティング溶液であるマイクロスポッティング溶液プラス（米国Ｔｅｌｅｃｈｅｍ社製、ＴＣ−ＭＳＰ）と４．３倍の比率で混合し、そのため最終濃度が３８ｐＭとなった。例えば、２００ｐＭの濃度のオリゴプローブ７．６μｌに３２．４μｌのスポッティング溶液を混合し、合計４０μｌとした。従って、準備された混合物を、順にそれぞれ９６ウェルマスタープレートに分配した。
【０１０５】
３．オリゴヌクレオチドプローブの固定
アレイヤーを用いて、オリゴプローブを含むスポッティング溶液を、マスタープレートから、明確にコーティングされたスライドガラスに移し、ダブルヒット（ｄｏｕｂｌｅ ｈｉｔ）でそこに結合した。平均約０．００５μｌの体積が、１スポットで結合される。チップの基板にするスライドガラスとして、ＢＭＴアルデヒドスライドガラス（韓国Ｂｉｏｍｅｔｒｉｘ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社製）又は７．５×２．５ｃｍのサイズを有するそれに対応する生成物で、スーパーアルデヒドによるコーティングを有するものが好ましい。アレイヤーとして、ＧＭＳ ４１７ アレイヤー（米国Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ社製）、ＭＧＩＩ（米国Ｂｉｏｒｏｂｏｔｉｃｓ社製、ＭＡ０１８０１）又はそれに対応する装置が好ましい。
【０１０６】
上記説明したようにスライドガラスにプローブを結合することによって準備したＤＮＡチップを、湿度８０％で維持されたガラスジャー中に室温で１５分間反応させた。
【０１０７】
４．後処理手順
前記反応終了後、固定されたスライドガラスは、乾燥機で１時間３０分、１２０℃で焼かれた。その後、前記スライドガラスを０．２％ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）で２回、２分間洗浄し、その後、三重蒸留水に移し、２回、２分間洗浄した。それから後、前記スライドガラスを９５℃に熱した三重蒸留水に３分間浸し、それによりスライドガラスに結合させたオリゴヌクレオチドプローブを変性させ、その後、三重蒸留水に移し、１分間洗浄した。洗浄後スライドガラスを１５分間ブロッキング溶液（１ｇのＮａＢＨ４、３００ｍｌのＰＢＳ及び１００ｍｌのエタノール）中で低減させ、０．２％ ＳＤＳ溶液で２回、２分間洗浄し、その後三重蒸留水に移し、２回、２分間洗浄した。スライドガラス上の水は、１分３０秒間８００ｒｐｍで遠心分離することにより取り除き、その後、室温のデシケーター中のスライドボックスで保存した。
【０１０８】
上記手順で準備した本発明のチップの条件及び品質は以下の実施例１２で説明する方法を用いて観察及び管理した。
【実施例１２】
【０１０９】
ＤＮＡチップ上のハイブリダイゼーション反応の分析及び結果
各細菌のプラスミドクローンとヒトβグロブリン遺伝子のプラスミドクローンを様々な組み合わせ及び濃度で混合することにより作製された人工サンプルを、マルチプレックスＰＣＲにかけ、その産物を実施例１１で準備したＳＴＤ ＤＮＡチップ上に結合させ、複数回ハイブリダイゼーション反応させ、その後、前記ＤＮＡチップを蛍光スキャナを用いて分析した。その方法は、次の通りであり、その実施形態を図１５〜２３に示す。
【０１１０】
１．マルチプレックスＰＣＲ
淋菌及びマイコプラズマ・ジェニタリウムの１６Ｓ ｒＲＮＡ及びウレアプラズマ・ウレアリティカムの１６Ｓ〜２３Ｓ遺伝子間領域、クラミジア・トラコマチスのクリプティックプラスミド並びにヒトβグロブリンのコントロール遺伝子のマルチプレックスＰＣＲは、実施例８及び９に従って行われ、逆方向にプライマーを有するプライマーの組み合わせの内、すなわち、ＮＧＲ、ＣＴＲ、ＵＵＲ、ＭＧＲ及びＨＢＢＲの場合、Ｃｙ５蛍光で標識されたオリゴヌクレオチドプライマーを用いた。
【０１１１】
２．ハイブリダイゼーション反応
スライドガラスチップ上に、３０種の型のオリゴヌクレオチドプローブをスポットし、淋菌及びマイコプラズマ・ジェニタリウムの１６Ｓ ｒＲＮＡ、ウレアプラズマ・ウレアリティカムの１６Ｓ〜２３Ｓ遺伝子間領域、クラミジア・トラコマチスのクリプティックプラスミド並びにヒトβグロブリンのコントロール遺伝子がＰＣＲで増幅された産物を、主な材料としてサンプルのＤＮＡを有することによって結合し、ハイブリダイゼーション反応が行われた。この時、１００μｌの能力を有する灌流８ウェルチャンバー（独国Ｓｃｈｅｉｃｈｅｒ ＆ Ｓｃｈｕｅｌｌ ＢｉｏＳｃｉｅｎｃｅ社製）をハイブリダイゼーション反応チャンバーに用いた。
【０１１２】
淋菌及びマイコプラズマ・ジェニタリウムの１６Ｓ ｒＲＮＡ、ウレアプラズマ・ウレアリティカムの１６Ｓ〜２３Ｓ遺伝子間領域、クラミジア・トラコマチスのクリプティックプラスミド並びにヒトβグロブリンのコントロール遺伝子が増幅された各々１０μｌの産物を混合し、５０μｌの最終体積にし、該混合物を５分間９５℃で変性し、その後直ちに氷上に３分間立たせて放置した。その後、５０μｌのハイブリダイゼーション反応溶液をそこに加え、最終体積を１００μｌに調整し、その後前記混合物を、４５℃でスライドガラス上に固定したプローブと３０分間反応させた。この時、前記ハイブリダイゼーション反応溶液は、２ｍｌの２０ｘ ＳＳＣ、１．７ｍｌの９０％グリセロール及び６．３ｍｌの５０ｍＭリン酸バッファー溶液を混合し、最終体積を１０ｍｌにすることにより構成された。
【０１１３】
３．洗浄
前記ハイブリダイゼーション反応終了後、ウェルカバーを前記ＤＮＡチップから取り除き、前記スライドガラスを３ｘ ＳＳＰＥ（ＮａＣｌ（２６．１９５ｇ）、ＮａＨ２ＰＯ４−１Ｈ２Ｏ（４．１４ｇ）、蒸留水１Ｌに溶解したＮａ２ＥＤＴＡ（１．１１ｇ）、及び１０Ｎ ＮａＯＨでｐＨを７．４に調整した。）溶液に浸し、室温で２分間洗浄した。前記スライドガラスを１ｘ ＳＳＰＥ（ＮａＣｌ（８．７６５ｇ）、ＮａＨ２ＰＯ４−１Ｈ２Ｏ（１．３８ｇ）、蒸留水１Ｌに溶解したＮａ２ＥＤＴＡ（０．３７ｇ）、及び１０Ｎ ＮａＯＨでｐＨを７．４に調整した。）溶液で更に２分間室温で洗浄し、１分３０秒間８００ｒｐｍで遠心分離することで乾燥させた。
【０１１４】
４．スキャン分析
ハイブリダイゼーションし、洗浄により非特異性シグナルを取り除きその後乾燥したスライドガラスを、共焦点レーザー蛍光スキャナを用いて、その蛍光シグナル及び画像を分析した。この時、スキャナとして、Ａｆｆｉｍｅｔｒｉｘ ４２８ Ａｒｒａｙ Ｓｃａｎｎｅｒ（米国Ａｆｆｒｙｍｅｔｒｉｘ社製）、Ｓｃａｎ Ａｒｒａｙ Ｌｉｔｅ（米国Ｐａｃｋａｒｄ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社製）又はそれに対応する装置が好ましい。
【実施例１３】
【０１１５】
本発明によるＤＮＡチップの確認実験
実施例７でＰＣＲ後のシークエンシング反応によりＳＴＤ及びその原因となる細菌の存在が確認され、実施例９でマルチプレックスＰＣＲの正確な分析を受けた様々なヒトサンプルのＤＮＡを、再びマルチプレックスＰＣＲにかけ、そのＰＣＲ産物を実施例１１及び１２で製造されたＳＴＤ ＤＮＡチップ上に結合させ、実施例１２で説明されたものと同様の手順でハイブリダイゼーション反応にかけ、その後蛍光スキャナで分析した。試験対象に含まれるＤＮＡサンプルは、淋菌に感染したサンプルの５０例、クラミジア・トラコマチスに感染したサンプルの５０例、ウレアプラズマ・ウレアリティカムに感染したサンプルの５０例、マイコプラズマ・ジェニタリウムに感染したサンプルの５０例及び非感染サンプルの５０例である。感染サンプルの２００例の内には、複合感染の４０例も含まれていた。
【０１１６】
前記ＤＮＡチップ分析の感度、特異性及び再現性は、異なる観察者によって、間に時間間隔を置いて二回の同じ試験を繰り返すことによって研究された。それにより本発明のＤＮＡチップが、臨床において正確に４種の主なＳＴＤの病原菌を検出することができるかどうか、特に、前記ＤＮＡチップが、同様に複合感染を検出することができるかどうか分析した。
【０１１７】
ＳＴＤ ＤＮＡチップ分析並びにシングルＰＣＲ及びシークエンシング分析の比較の結果を、表１３に示す。
【０１１８】
シングルＰＣＲ後、シークエンシング分析に基づく時、マルチプレックスＰＣＲの感度は９８〜１００％、平均９９％となり、特異性は１００％となり、再現性は９９％となった。これらの結果は、ＤＮＡチップの特異性は、マルチプレックスＰＣＲと比較してより優れており、そして複合感染検出感度は、より優れていることを示している。
【０１１９】
本発明を、ある特定の実施形態に関して説明するが、本発明の思想から離れることなく、当業者にとって多くの改良及び変更をすることができるであろう。その為、添付した特許請求の範囲は、本発明の真の思想及び目的の中でそのような改良及び変更を全て保護することを目的とする。
【０１２０】
【表１３】
【０１２１】
［産業上の利用可能性］
本発明により、マルチプレックス型ＰＣＲ法及びＤＮＡチップは、ＳＴＤ原因の９０％以上の絶対多数であり、尿道炎、子宮頸管炎、及び骨盤内炎症疾患の４種の主な病原菌として存在する、淋菌、クラミジア・トラコマチス、ウレアプラズマ・ウレアリティカム、及びマイコプラズマ・ジェニタリウムを、正確に素早く同時に検出できるかもしれない。更に本発明のＤＮＡチップは、ＳＴＤ診断において、ほぼ１００％の感度、特異性、及び再現性を示す点で優れている。前記ＤＮＡチップは、正確に複合感染を検出し、試験方法が使いやすく、そして結果の分析が容易であるかもしれない。素早く正確に短時間で様々なサンプルの自動分析を考慮する観点から、前記ＤＮＡチップは、従来の方法と比較して、より優れており、経済的である。その為、本発明は、ＳＴＤの最初の検出及び診断のため、そして治療方針の決定のために広く用いられてもよい。その上、本発明は、培養又は染色、及びシングルＰＣＲのような従来のＤＮＡ試験キットを置き換え、医薬産業上の観点から非常に効果的である。
[配列表のテキスト]
【０１２２】
配列番号１〜１０は、核酸を増幅するためのプライマーの塩基配列からなっており、配列番号１１〜４０は、核酸と相補的に結合するプローブの塩基配列からなり、それらをここに添付する。
【図面の簡単な説明】
【０１２３】
【図１】特定の塩基配列のプライマーセットを用いた淋菌の１６ＳリボソームＲＮＡ（１６Ｓ ｒＲＮＡ）遺伝子に対するＰＣＲ増幅によって得られた生成物の２％アガロースゲル電気泳動写真（レーン１及び９：１００ｂｐ ＤＮＡサイズマーカー、レーン２：ネガティブコントロール群，レーン３：正常者の尿と、淋菌の１６ｓ ＲＮＡのプラスミドクローン１０コピーとを混合することによって作られた人工サンプルであるポジティブコントロール群，レーン４：正常者の尿と、淋菌の１６ｓ ＲＮＡのプラスミドクローン１００コピーとを混合することによって作られた人工サンプルであるポジティブコントロール群，レーン５：淋菌に感染した男性の尿道分泌物，レーン６：殺菌綿で淋菌に感染した男性の尿道を擦ることによって得られたサンプル，レーン７：ブラシで淋菌に感染した女性の子宮頸管を擦ることによって得られたサンプル，及びレーン８：淋菌に感染した男性の尿）。
【図２】特定の塩基配列のプライマーセットを用いたクラミジア・トラコマチスのクリプティックプラスミドＤＮＡに対するＰＣＲ増幅によって得られた生成物の２％アガロースゲル電気泳動写真（レーン１：１００ｂｐ ＤＮＡサイズマーカー，レーン２：ネガティブコントロール群，レーン３：正常者の尿とクラミジア・トラコマチスを挿入されたクリプティックプラスミドクローンが入ったプラスミド１００コピーとを混合することによって作られた人工サンプルであるポジティブコントロール，レーン４：正常者の尿とクラミジア・トラコマチスを挿入されたクリプティックプラスミドクローンが入ったプラスミド１００コピーとを混合することによって作られた人工サンプルであるポジティブコントロール，レーン５：クラミジア・トラコマチスに感染した男性の尿道分泌物，レーン６：殺菌綿でクラミジア・トラコマチスに感染した男性の尿道を擦ることによって得られたサンプル，レーン７：ブラシでクラミジア・トラコマチスに感染した女性の子宮頸管を擦ることによって得られたサンプル，レーン８：クラミジア・トラコマチスに感染した男性の尿）。
【図３】特定の塩基配列のプライマーセットを用いたウレアプラズマ・ウレアリティカムの１６ＳリボソームＲＮＡ及び２３ＳリボソームＲＮＡの遺伝子間空間領域（１６Ｓ〜２３Ｓ ＲＮＡ 遺伝子間空間領域）に対するＰＣＲ増幅後の１．５％アガロースゲル電気泳動写真（レーン１及び９：１００ｂｐ、１ｋｂＤＮＡサイズマーカー，レーン２：ネガティブコントロール群，レーン３：正常者の尿とウレアプラズマ・ウレアリティカムの１６Ｓ〜２３ＳリボソームＲＮＡ遺伝子間空間領域のプラスミド１０コピーとを混合することによって作られた人工サンプルであるポジティブコントロール，レーン４：正常者の尿とウレアプラズマ・ウレアリティカムの１６Ｓ〜２３ＳリボソームＲＮＡ遺伝子間空間領域のプラスミド１０コピーとを混合することによって作られた人工サンプルであるポジティブコントロール，レーン５：ウレアプラズマ・ウレアリティカムに感染した男性の尿道分泌物，レーン６：滅菌綿でウレアプラズマ・ウレアリティカムに感染した男性の尿道を擦ることによって得られたサンプル，レーン７：ブラシでウレアプラズマ・ウレアリティカムに感染した女性の子宮頸管を擦ることによって得られたサンプル，レーン８：ウレアプラズマ・ウレアリティカムに感染した男性の尿）。
【図４】特定の塩基配列のプライマーセットを用いたマイコプラズマ・ジェニタリウムの１６ＳリボソームＲＮＡ（１６Ｓ ｒＲＮＡ）遺伝子に対するＰＣＲ増幅後の２％アガロースゲル電気泳動写真（レーン１及び９：１００ｂｐ ＤＮＡサイズマーカー，レーン２：ネガティブコントロール群，レーン３：正常者の尿とマイコプラズマ・ジェニタリウムの１６Ｓ ｒＲＮＡプラスミドクローン１０コピーとを混合することによって作られた人工サンプルであるポジティブコントロール群，レーン４：正常者の尿と、マイコプラズマ・ジェニタリウムの１６Ｓ ｒＲＮＡプラスミドクローン１００コピーとを混合することによって作られた人工サンプルであるポジティブコントロール群，レーン５：マイコプラズマ・ジェニタリウムに感染した男性の尿道分泌物，レーン６：滅菌綿でマイコプラズマ・ジェニタリウムに感染した男性の尿道を擦ることによって得られたサンプル，レーン７：ブラシでマイコプラズマ・ジェニタリウムに感染した女性の子宮頸管を擦ることによって得られたサンプル，レーン８マイコプラズマ・ジェニタリウムに感染した男性の尿）。
【図５】ＳＴＤ感染していない正常者及びＳＴＤ感染患者の尿サンプルからＤＮＡを分離し、該ヒトサンプルにおけるＤＮＡ分離手順及びＰＣＲ増幅手順の品質管理（ＱＣ）を確認するために５８℃でハウスキーピング遺伝子であるヒトβグロブリン（ＨＢＢ）のＰＣＲ増幅によって得られ、１．８％アガロースゲルで分析された生成物の電気泳動写真（レーン１：１００ｂｐ ＤＮＡサイズマーカー，レーン２：正常者の尿サンプル，レーン３及び４：ＳＴＤ感染患者の尿サンプル）。
【図６】本発明のマルチプレックスＰＣＲを用いて臨床サンプル中の淋菌、クラミジア・トラコマチス、ウレアプラズマ・ウレアリティカム及びマイコプラズマ・ジェニタリウムの遺伝子を増幅した後、オートシーケンサーで検出された結果の内、淋菌の１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子に対してのシークエンシングのグラフ。
【図７】本発明のマルチプレックスＰＣＲを用いて臨床サンプル中の淋菌、クラミジア・トラコマチス、ウレアプラズマ・ウレアリティカム及びマイコプラズマ・ジェニタリウムの遺伝子を増幅した後、オートシーケンサーで検出された結果の内、クラミジアのクリプティックプラスミドに対するシークエンシングのグラフ。
【図８】本発明のマルチプレックスＰＣＲを用いて臨床サンプル中の淋菌、クラミジア・トラコマチス、ウレアプラズマ・ウレアリティカム及びマイコプラズマ・ジェニタリウムの遺伝子を増幅した後、オートシーケンサーで検出された結果の内、ウレアプラズマ・ウレアリティカムの１６Ｓ〜２３Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子間空間領域に対するシークエンシングのグラフ。
【図９】本発明のマルチプレックスＰＣＲを用いて臨床サンプル中の淋菌、クラミジア・トラコマチス、ウレアプラズマ・ウレアリティカム及びマイコプラズマ・ジェニタリウムの遺伝子を増幅した後、オートシーケンサーで検出された結果の内、マイコプラズマ・ジェニタリウムの１６Ｓ ｒＲＮＡに対するシークエンシングのグラフ。
【図１０】淋菌、マイコプラズマ・ジェニタリウム、ウレアプラズマ・ウレアリティカム、及びクラミジア・トラコマチス、並びにヒトβグロブリン遺伝子のＤＮＡの各標的遺伝子のＤＮＡが挿入された各プラスミドクローン１０コピー及び１００コピーのそれぞれと、サンプル保存試薬とを混和し、一つのチューブにＤＮＡと特異的に結合するプライマーセットと共に混合物を加え、その後、５６℃でマルチプレックスＰＣＲを行うことによって得られた１．８％アガロースゲル電気泳動写真（レーン１及び６：１００ｂｐ及び１ｋｂ ＤＮＡラダー，レーン２：ネガティブコントロール群（βグロブリン），レーン３：プライマーセットの濃度が全て１０ｐｍｏｌ／μｌで同じ場合，レーン４：プライマーセットの濃度が、ウレアプラズマ・ウレアリティカムで１０ｐｍｏｌ／μｌ、淋菌、クラミジア・トラコマチス及びマイコプラズマ・ジェニタリウムの全てで５ｐｍｏｌ／μｌの場合，レーン５：プライマーの濃度がウレアプラズマ・ウレアリティカムで２０ｐｍｏｌ／μｌ、及び残りのものは１０ｐｍｏｌ／μｌである場合）。（ａ）は１０コピーを加えた場合。（ｂ）は１００コピーを加えた場合。
【図１１】ＳＴＤ感染及び病原菌であるとすでに同定されている臨床サンプルから抽出されたＤＮＡサンプル４μｌに対して、５８℃で、本発明のＳＴＤマルチプレックスＰＣＲを行った後の、１．８％アガロースゲル電気泳動写真（レーン１及び８：１００ｂｐ及び１ｋｂ ＤＮＡラダー，レーン２：ネガティブコントロール群（ヒトβグロブリン），レーン３：ポジティブコントロール群（４種の病原菌及びヒトβグロブリン遺伝子のＤＮＡの各標的遺伝子のＤＮＡが挿入された各プラスミドクローン１０コピー及び１００コピーのそれぞれと、サンプル保存試薬とを混和することによって得られた人工サンプル），レーン４：マイコプラズマ・ジェニタリウムの感染であると検出された男性の尿サンプル，レーン５：クラミジア・トラコマチスの感染であると検出された男性の尿サンプル，レーン６：淋菌の感染であると検出された男性の尿サンプル，レーン７：ウレアプラズマ・ウレアリティカムの感染であると検出された男性の尿サンプル）。
【図１２】２種又はそれ以上の細菌による過剰感染であると既に検出されている患者のＤＮＡサンプル４μｌに対して、本発明のＳＴＤマルチプレックスＰＣＲを行うことによって得られた生成物の１．８％アガロースゲル電気泳動写真（レーン１及び１０：１００ｂｐ ＤＮＡラダー，レーン２：ネガティブコントロール群（ＨＢＢ），レーン３：ポジティブコントロール群（ポジティブコントロール群（４種の病原菌及びヒトβグロブリン遺伝子のＤＮＡの各標的遺伝子のＤＮＡが挿入された各プラスミドクローン１００コピーと、サンプル保存試薬とを混和することによって得られた人工サンプル），レーン４：クラミジア・トラコマチス及びウレアプラズマ・ウレアリティカムの複合感染であると検出された男性の尿サンプル，レーン５：ウレアプラズマ・ウレアリティカム及び淋菌の複合感染であると検出された男性の尿サンプル，レーン６：ウレアプラズマ・ウレアリティカム及びマイコプラズマ・ジェニタリウムの複合感染であると検出された男性の尿サンプル，レーン７：マイコプラズマ・ジェニタリウム及びクラミジア・トラコマチスの複合感染であると検出された男性の尿サンプル，レーン８：淋菌、クラミジア・トラコマチス及びウレアプラズマ・ウレアリティカムの複合感染であると検出された男性の尿サンプル）。
【図１３】マルチプレックスＰＣＲ後生成物が配置された、同定のためにハイブリダイゼーション反応を行うＤＮＡチップ（ＳＴＤ遺伝子型決定オリゴヌクレオチドマイクロアレイ）の概略図。
【図１４】本発明のＳＴＤ ＤＮＡチップの一種であり、８つの格子を有するＤＮＡチップの写真。
【図１５】本発明のＳＴＤ遺伝子型診断用ＤＮＡチップで分析された、淋菌に感染した臨床サンプルの蛍光スキャナイメージ。
【図１６】本発明のＳＴＤ遺伝子型診断用ＤＮＡチップで分析された、クラミジア・トラコマチスに感染した臨床サンプルの蛍光スキャナイメージ。
【図１７】本発明のＳＴＤ遺伝子型診断用ＤＮＡチップで分析された、ウレアプラズマ・ウレアリティカムに感染した臨床サンプルの蛍光スキャナイメージ。
【図１８】本発明のＳＴＤ遺伝子型診断用ＤＮＡチップで分析された、マイコプラズマ・ジェニタリウムに感染した臨床サンプルの蛍光スキャナイメージ。
【図１９】本発明のＳＴＤ遺伝子型診断用ＤＮＡチップで分析された淋菌及びクラミジア・トラコマチスにより複合感染した臨床サンプルの蛍光スキャナイメージ。
【図２０】本発明のＳＴＤ遺伝子型診断用ＤＮＡチップで分析された淋菌及びウレアプラズマ・ウレアリティカムにより複合感染した臨床サンプルの蛍光スキャナイメージ。
【図２１】本発明のＳＴＤ遺伝子型診断用ＤＮＡチップで分析された淋菌及びマイコプラズマ・ジェニタリウムにより複合感染した臨床サンプルの蛍光スキャナイメージ。
【図２２】本発明のＳＴＤ遺伝子型診断用ＤＮＡチップで分析されたクラミジア・トラコマチス及びウレアプラズマ・ウレアリティカムにより複合感染した臨床サンプルの蛍光スキャナイメージ。
【図２３】本発明のＳＴＤ遺伝子型診断用ＤＮＡチップで分析され、ヒトβグロブリンの信号だけが見える、ＳＴＤに感染していないネガティブコントロール群の蛍光スキャナイメージ。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、性交渉感染症（ＳＴＤ）の病原体の内、最も発病率の高い４種の細菌である淋菌、クラミジア・トラコマチス、ウレアプラズマ・ウレアリティカム、及びマイコプラズマ・ジェニタリウムの感染を迅速かつ正確に診断するためのＤＮＡチップ、遺伝子型決定キット及びアッセイ、並びにそれを用いたオリゴヌクレオチドプローブに関するものである。
【背景技術】
【０００２】
性交渉感染症（ＳＴＤ）は、一般に、性行動によって伝染する疾患を指す。
【０００３】
ＳＴＤの疫学は、原因の９５％以上が（１）淋病、（２）クラミジア感染症および（３）非淋菌性尿道炎（ＮＧＵ）からなることを示す。非淋菌性尿道炎は、ここでは、尿道炎に罹った男性に淋菌が発見されない場合を示すものとする。非淋菌性尿道炎の最も一般的な病原菌は、クラミジア・トラコマチスと、その他ウレアプラズマ・ウレアリティカム及びマイコプラズマ・ジェニタリウムもまた主な病原菌として指摘される。つまり、４種の細菌、すなわち淋菌、クラミジア・トラコマチス、ウレアプラズマ・ウレアリティカム及びマイコプラズマ・ジェニタリウムは、ＳＴＤ原因の絶対多数である。これらの細菌は、前部尿道炎の共通する主な原因の全てであり、副睾丸炎および前立腺炎と合併するかもしれなく、不妊の重要な原因にもなる。これらはまた、女性の子宮頸管炎及び骨盤内炎症性疾患の主な原因であり、卵管閉塞を引き起こすことで不妊及び子宮外妊娠のような合併症を引き起こすかもしれない。
【０００４】
今日では、西欧諸国ではクラミジア感染症が最も一般的であり、韓国においても淋病が減少すると共にクラミジア感染症及び非淋菌性尿道炎は近年増える傾向に有る。
【０００５】
ＳＴＤは、多くの場合いくつかの症状が引き起こされる他の疾病と異なり、症状が無い状態で潜伏し、そして再感染しやすいものである。そのため、その初期段階でＳＴＤ病原菌を検出する方法及び症状の無いキャリアーを効率的に診断する方法の開発もまた重要である。
【０００６】
一部の患者に尿道炎が発見された際に、先ず淋菌性か非淋菌性かどうかを判別するべきである。なぜならば、それぞれによって疾病の治療及び進行度が異なるからである。しかしながら、抗生物質の濫用及び誤用による細菌の変異及び複合感染により、それらの間の区別が不明瞭になってきており、正確な診断に、本発明における分子遺伝学的検査を必要とする。
【０００７】
淋菌性尿道炎を引き起こす淋菌は、ナイセリア属に属する。
【０００８】
淋菌の診断は、主にグラム染色によって行われる。細胞中の特徴的なグラム陰性双球菌の存在を確認するグラム染色は、容易で、比較的高い精度を有するので、広く使用されている方法である。しかしながら、症状がない又はわずかである淋菌性尿道炎に対しては、グラム染色は多くの場合、不明瞭な識別又は偽陰性となるかもしれない。
【０００９】
グラム染色を補うために、淋菌の培養が試みられている。前記淋菌の培養は、多くの観点から有益で、正確な分析であるが、分析結果がわかるまでに多くの時間とコストを消費するという欠点を有する。
【００１０】
また、酵素免疫測定法（ＥＩＡ）及び免疫蛍光法が、淋菌感染症の診断で抗原を検出する新しい方法として用いられる。これらは、培養試験より早く結果を得ることができると報告されており、より高い感度及び特異性を有するが、高コストであるという欠点を有する。
【００１１】
非淋菌性尿道炎は発病率が減少しているが、一方で淋菌性尿道炎は、近年増加している。非淋菌性尿道炎は様々な微生物から引き起こされる一種の症候群であり単一の疾病ではない。非淋菌性尿道炎を引き起こす最も重要な微生物は、クラミジア・トラコマチスである。クラミジア・トラコマチスは、ゲノム上にＤＮＡ及びＲＮＡの両方を有する細胞内に寄生するライフサイクルを有し、合計１５血清型を有する。それらの内Ｄ−Ｋ型は、非淋菌性尿道炎を引き起こす。それらによって発病させられるヒト疾患は、尿道炎、子宮頸管炎、副睾丸炎および骨盤内炎症性疾患を含むトラコーマＳＴＤ、呼吸感染症及びＳＴＤを含む。クラミジアが心筋炎を引き起こすことが、近年報告された。
【００１２】
クラミジア・トラコマチスを同定するための方法として、（１）感染領域から集められた材料を培養、分離することにより細菌を同定する方法、（２）感染領域の上皮の直接塗抹標本染色により細菌を同定する方法及び（３）患者の血清から抗体を分離することにより細菌を同定する方法のようないくつかの方法が用いられており、そして近年（４）ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）及びハイブリダイゼーションを用いた方法のような分子遺伝学的技術を用いる方法が好まれる。
【００１３】
サンプルを培養・分離する方法は、長い時間を要し、低診断感度であることなどから臨床診断の目的には適さない。感染領域の上皮の直接塗抹標本染色により細菌を同定する方法は、簡易であるという利点が有るが、低い診断感度を有する。また、モノクローナル抗体に結合する蛍光物質であるＦＩＴＣ（フルオロセインイソチオシアネート）（蛍光物質）のような試薬を用いた蛍光抗体法は、相対的に高い感度を有するが、高いコスト及び専用の装置を必要とするという短所が有り、結果としてその使用が制限される。
【００１４】
ヒト及び様々な哺乳動物に広く存在し、泌尿生殖器に感染を引き起こすかもしれないマイコプラズマ属及びウレアプラズマ属に属するウレアプラズマ・ウレアリティカム及びマイコプラズマ・ジェニタリウムは、培養技術が非常に異なり、染色又は免疫学的方法によって検出することも困難である。従って、近年の診断傾向はＰＣＲを基にした分子遺伝学的検査である。この場合、使用方法は、主に各細菌種に対する遺伝子特異的なＤＮＡ塩基配列をＰＣＲ増幅することによる細菌の同定、シークエンシング反応による同定、ハイブリダイゼーションなどの方法でできている。今までに同定された１３種類のマイコプラズマおよび２種類のウレアプラズマは、１６ＳリボソームＲＮＡ（１６Ｓ ｒＲＮＡ）の５’方向のＶ３の隣接領域及び３’方向のＶ６の隣接領域に共通の塩基配列を有する。一方、Ｖ４及びＶ５領域の約２５０塩基の配列、又は１６Ｓ〜２３ＳリボソームＲＮＡ間の領域の塩基配列は、各種によって異なる。その為、これを分析する方法は有効であり、すなわち、ウレアプラズマ・ウレアリティカムの場合では、それに固有のウレアーゼサブユニットの塩基配列の分析の方法にもまた利用できる（例えば、非特許文献１、非特許文献２参照）。
【００１５】
細菌感染症の病原菌の正確な同定は、正確な診断のためだけではなく、疾病の感染源及び条件の発見、疾病の進行と予後を予測し、治療プランを決め、そしてそのワクチンを開発するためにも欠かすことができない。この時、病原菌診断において、属及び種だけでなく亜種及び変種も同様に容易に検出することが重要である。
【００１６】
細菌感染症における病原菌の正確な検出の為に、検査は１００%近い感度、特異性及び再現性を有するべきである。前記培養試験又は免疫分析のような従来の細菌表現型分析は、このような条件を満足することはなかなかできない。これに反して、細菌ゲノムの遺伝子型、すなわちＤＮＡ及びＲＮＡの塩基配列を分析する遺伝学的検査は、理論的には３つの条件全てを満たすことができ（例えば、非特許文献３参照）、ＰＣＲ技術を用いて淋菌感染及びクラミジア感染を検査する診断キットはすでに市場に出され、用いられている（例えば、非特許文献４参照）。
【００１７】
しかしながら、細菌検出用遺伝学的検査は、臨床試験及び治療、又は他の研究室で活発に用いられ、臨床試験及び治療に重要な助力を与えるためには、言及した条件に加えて満たすべき多くの条件を有する。具体的には、前記遺伝学的検査は、扱いやすく、容易に解釈され、かつ単純であり、すばやく結果が得られ、そして特別高価な設備を必要としないことが必要である。また、多くのサンプルのすばやい検査を可能とするために自動化されるべきであり、検査コストは高価であってはならない。その為、ＰＣＲは、可能であれば、対象となる細菌は一ＰＣＲ反応を一体型チューブで検査するマルチプレックス型ＰＣＲとなることが必要である。検査される遺伝子及び塩基配列領域は、ＰＣＲにおいて変種レベルで正確に各対象細菌を判別するために適切に選択される必要が有り、これに従って、最適ＰＣＲ条件が確立されなければならない。しかしながら、尿道炎及び子宮頸管炎に対する４種の主な病原菌、すなわち淋菌、クラミジア・トラコマチス、ウレアプラズマ・ウレアリティカム又はマイコプラズマ・ジェニタリウムを一度に調査するマルチプレックス型ＰＣＲに関しては、今まで報告されておらず、そして、そのようなＰＣＲキットはまだ市場に出ていない。
【００１８】
更にまた、ＰＣＲ後の増幅された産物が所望の細菌の正確なＤＮＡであるかどうかを正確に同定する検査が必要である。更に、遺伝学的検査は、正確に細菌の遺伝子型を読み込む必要があり、それにより正確に抗生物質に対する耐性、生物侵入率などを予測することが可能になる。それにより、一度に様々なＳＴＤ病原菌を検査し、更にまた、抗生物質に対する耐性のような情報を与えるＤＮＡチップ（又はＤＮＡマイクロアレイ）を開発することが急務である。
【非特許文献１】Ｊｅｎｓｅｎ Ｊ．Ｓ． ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｃｌｉｎ． Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． ２００３； ４１： ２６１−６
【非特許文献２】Ｙｏｓｈｉｄａ Ｔ． ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｃｌｉｎ． Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． ２００２； ４０： １０５−１１０
【非特許文献３】Ｏｌｉｖｅ ＤＭ ｅｔ ａｌ． Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ． １９９９：３７：１６６１−９
【非特許文献４】Ｓｈａｆｅｒ Ｍ． ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｃｌｉｎ． Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． ２００３； ４１： ４３９５−９
【非特許文献５】Ｏｌｓｅｎ Ｇ．Ｊ． ｅｔ ａｌ．， Ｒｉｂｏｓｏｍａｌ ＲＮＡ： ａ ｋｅｙ ｔｏ ｐｈｙｌｏｇｅｎｙ．ＦＡＳＥＢ １９９３； ７：１１３−１２３
【非特許文献６】Ｌａｎｅ ＤＪＢ ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ． １９８５； ９２：６９５５−９
【非特許文献７】Ｙｏｓｈｉｄａ Ｔ． ｅｔ ａｌ． Ｊ． Ｃｌｉｎ． Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． ２００２； ４０：１０５−１１０
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１９】
本発明の一態様によれば、尿道炎、子宮頸管炎及び骨盤内炎症性疾患の４種の主要な病原菌であり、ＳＴＤ原因の９０%以上の絶対多数を占める淋菌、クラミジア・トラコマチス、ウレアプラズマ・ウレアリティカム、及びマイコプラズマ・ジェニタリウムの遺伝子を増幅することができるマルチプレックス型ＰＣＲ法を提供する。
【００２０】
本発明の別の態様によれば、４種の主な病原菌及びヒトβグロブリンのＰＣＲ増幅に効率的なプライマーを提供する。
【００２１】
本発明の更に別の態様によれば、各前記４種の細菌、制御遺伝子、及び抗生物質耐性遺伝子に固有の塩基配列の遺伝子をより正確に検出することを可能にするオリゴヌクレオチドプローブを提供する。
【００２２】
本発明の更に別の態様によれば、集められたプローブを含む、前記４種の主な病原菌の検出及び遺伝子型決定用のＤＮＡチップを提供する。
【００２３】
本発明の更に別の態様によれば、プローブを含む、前記４種の主な病原菌の検出及び遺伝子型決定用キットを提供する。
【課題を解決するための手段】
【００２４】
本発明において、検査される前記４種の細菌及び検査されるヒトβグロブリンの遺伝子及びその領域、並びにそれらの増幅に必要なＰＣＲプライマーを設計し（実施例１）、コントロール系統及び各系統の標的遺伝子のＤＮＡクローンを固定し（実施例２）、サンプルを採取し、保存する方法を確立し（実施例３）、サンプルからＤＮＡを分離する方法を確立し（実施例４）、細菌の標的遺伝子に対するシングルＰＣＲ条件を確立し（実施例５）、臨床サンプルにシングルＰＣＲ及びシークエンシングを行い、その結果からデータベースを作成し（実施例６及び７）、前記４種の細菌及びヒトβグロブリンの遺伝子に対するマルチプレックスＰＣＲ条件を確立し（実施例８）、そしてそのマルチプレックスアッセイをヒトサンプルで行い、それにより前記アッセイの品質管理を確認する（実施例９）。前記４種の細菌及びヒトβグロブリン遺伝子のハイブリダイゼーションアッセイ用プローブを設計し、これを用いたＤＮＡチップを作成し（実施例１０及び１１）、人工サンプルを前記ＤＮＡチップで分析し、それにより分析条件を確立し（実施例１２）、臨床サンプルを前記ＤＮＡチップで分析し（実施例１３）、それにより前記４種の細菌が感染していることがわかり、同様に感染細菌の遺伝子型が判別される（実施例１３）。これにより本発明は完成する。
【００２５】
本発明は、以下に例示される。
【００２６】
本発明のプライマーは、配列番号１又は２の塩基配列を有する淋菌の核酸増幅用プライマー、配列番号３又は４の塩基配列を有するクラミジア・トラコマチスの核酸増幅用プライマー、配列番号５又は６の塩基配列を有するウレアプラズマ・ウレアリティカムの核酸増幅用プライマー、配列番号７又は８の塩基配列を有するマイコプラズマ・ジェニタリウムの核酸増幅用プライマー、配列番号９又は１０の塩基配列を有するヒトβグロブリンの核酸増幅用プライマーを含む。
【００２７】
本発明のＰＣＲ増幅法は、少なくとも一つのプライマーを用いたシングル又はマルチプレックスＰＣＲ増幅法である。
【００２８】
本発明のＳＴＤ病原菌の検出用プローブは、淋菌及びマイコプラズマ・ジェニタリウムの１６Ｓ ｒＲＮＡ及びウレアプラズマ・ウレアリティカムの１６Ｓ〜２３Ｓの遺伝子間領域、又はクラミジア・トラコマチスのクリプティックプラスミド（ｃｒｙｐｔｉｃ ｐｌａｓｍｉｄ）の一部を含むオリゴヌクレオチドを含む。より好ましくは、前記プローブは配列番号１１〜配列番号３３の塩基配列を有するオリゴヌクレオチド、及びそれらオリゴヌクレオチドに相補的な塩基配列を有するオリゴヌクレオチドからなる群から選択される。
【００２９】
本発明のＤＮＡチップは、配列番号１１〜配列番号３３の塩基配列を有するオリゴヌクレオチド及びそれらのオリゴヌクレオチドと相補的な塩基配列を有するオリゴヌクレオチドからなる群から選択される一又はそれ以上の種類のプローブを含む。
【００３０】
配列番号１１〜１６はウレアプラズマ・ウレアリティカムの検出用プローブであり、配列番号１７〜２１は淋菌の検出用プローブであり、配列番号１１〜２８はクラミジア・トラコマチスの検出用プローブであり、配列番号２９〜３３はマイコプラズマ・ジェニタリウムの検出用プローブである。
【００３１】
本発明のもう一つの実施形態におけるＳＴＤ病原菌の検出用ＤＮＡチップは、リファレンスマーカー（ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ ｍａｒｋｅｒ）としてβグロブリン、アクチン又はグリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼを更に含んでもよく、そして、リファレンスマーカーがβグロブリンである場合、それは配列番号４０で表わされる塩基配列であることが好ましく、その増幅用プライマーは配列番号９及び配列番号１０の塩基配列を有するβグロブリンＤＮＡ増幅用プライマーである。前記リファレンスマーカーの使用は前記ＤＮＡチップでのハイブリダイゼーション、並びに従来手順であるＤＮＡ分離手順及びＰＣＲ増幅手順に対する品質管理を評価し、偽陰性を検出することを可能にする。
【００３２】
本発明のもう一つの実施形態におけるＳＴＤ病原菌の検出用ＤＮＡチップは、テトラサイクリン耐性遺伝子（ＴｅｔＣ）の検出用の一つ又はそれ以上の種類のプローブを更に含んでもよい。テトラサイクリン抗生物質耐性遺伝子も分析することは、ＳＴＤ治療に最も広く用いられている抗生物質であるテトラサイクリン系抗生物質に対する耐性を前もって正確に検出することができ、治療プランの決定及び治療の助力となる。前記テトラサイクリン抗生物質耐性遺伝子のプローブは、好ましくは配列番号３４〜３９の塩基配列を有する。
【００３３】
本発明のＤＮＡチップを製造する方法は、ＳＴＤ病原菌の核酸に相補的に結合することができる塩基配列及び５’末端アミン結合を有するＤＮＡプローブを生成する手順、アルデヒドが結合した固体の表面に結合された該生成したＤＮＡプローブを備えさせる手順、およびＤＮＡプローブが結合した固体表面に存在するアミンに結合しないアルデヒドを還元する手順を含む。
【００３４】
前記プローブＤＮＡと固体表面上のアルデヒドとの結合は、アミンとアルデヒドのシッフ塩基反応によって行われ、前記固体はガラス、二酸化ケイ素、プラスチック又はセラミックから選択される。
【００３５】
本発明の性交渉感染症（ＳＴＤ）病原菌の検出用キットは、ＳＴＤ病原菌のＤＮＡサンプルのＰＣＲ増幅用プライマーセット、ＳＴＤ病原菌検出用ＤＮＡチップ、並びに前記ＤＮＡチップの検出用マーカー及びハイブリダイゼーションするための増幅されたＤＮＡを含む。
【００３６】
本発明の性交渉感染症（ＳＴＤ）病原菌検出の方法は、（ａ）ＳＴＤ病原菌ＤＮＡ増幅用プライマーを用いてＳＴＤ病原菌のＤＮＡサンプルを増幅する工程、（ｂ）配列番号１１〜配列番号３３の塩基配列を有するオリゴヌクレオチド及びそれらのオリゴヌクレオチドに相補的な塩基配列を有するオリゴヌクレオチドからなる群から選択された一つ又はそれ以上の種類のプローブを含むＤＮＡチップ上に増幅されたＤＮＡをハイブリダイゼーションする工程、（ｃ）前記プローブ及びハイブリダイゼーション反応物を検出する工程を含む。
【００３７】
アッセイキット及びＳＴＤ病原菌を検出するための検出方法は、前記プライマー及び前記マーカーを含んでもよい。前記プライマーは、配列番号１〜配列番号８の塩基配列からなる群から選択されるＳＴＤ病原菌を増幅するためのプライマーであってもよく、そして塩基配列９及び１０の塩基配列からなるβグロブリンプライマーを含んでもよい。
【００３８】
前記マーカーとして、公知である様々な標識、例えば、Ｃｙ５、Ｃｙ３、ビオチン結合性物質、ＥＤＡＮＳ（５−（２’−アミノエチル）アミノ−１−ナフタレン硫酸）、テトラメチルローダミン（ＴＭＲ）、テトラメチルローダミンイソシアネート（ＴＭＲＩＴＤ）、ｘ−ローダミン又はテキサスレッドを用いることができる。Ｃｙ５を標識として用いる場合、蛍光シグナルは、効率的で感度の高い結果を導く標識化された反応物の検出で、付加的な反応なしで、共焦点レーザースキャナのようなアナライザーを用いて直接分析することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３９】
本発明が、以下の実施例により、更に詳しく記述される。しかしながら、以下の実施例は、本発明の構成と効果を示すことを目的とし、本発明を限定するものではない。
【実施例１】
【００４０】
ＰＣＲプライマーの設計
分析する前記４種の細菌の遺伝子及びその領域を決定し、それらの増幅に必要なＰＣＲプライマーが設計された。その上、ヒトβグロブリン遺伝子は、いくつかの内部基準遺伝子及びコントロール遺伝子であるハウスキーピング遺伝子として選択され、ＤＮＡ分離及びＰＣＲ反応の制御品質を確認した。そしてそのＰＣＲ増幅のためのプライマーもまた設計された。
【００４１】
分析する遺伝子領域は、１６Ｓ ｒＲＮＡ若しくは２３Ｓ ｒＲＮＡ、又はそれらの中間部から先ず選択され、その空間遺伝子間領域は、細菌の系統発生の発見に最も広く用いられている（例えば、非特許文献５、非特許文献６参照）。
【００４２】
この時、ＰＣＲ増幅領域のスタンダードとして、全ての細菌及び同属の細菌に共通の塩基配列、いわゆる高度保存領域は一方向に配列され、標的細菌の種（属）に固有の塩基配列、いわゆる超可変領域はもう一方向に配列された。あるいは、前記保存領域は両方向に配列され、前記可変領域はそれらの間に配列された。もし、１６Ｓ ｒＲＮＡ若しくは２３Ｓ ｒＲＮＡ又は１６Ｓと２３Ｓの間の領域上に適切な塩基配列が無かったなら、標的細菌の固有遺伝子及び固有塩基配列は、分析のため他の領域から選択される。例えば、淋菌の場合、シトシンメチルトランスフェラーゼ遺伝子もまた、１６Ｓ ｒＲＮＡの代わりに分析されてもよく、クラミジアの場合は、主要外膜タンパク質（ＭＯＭＰ）のｏｍｐ１遺伝子もまた、分析されてよい。加えて、クラミジア・トラコマチスの場合、この系統に潜伏しているクリプティックプラスミドの塩基配列もまた、調査され得る（例えば、非特許文献７参照）。
【００４３】
【表１】
【００４４】
＊遺伝子バンク登録番号：Ｘ０７７１４
＊＊遺伝子バンク登録番号：Ｘ０７５４７
＊＊＊遺伝子バンク登録番号：ＡＦ０７３４５５＆Ｘ５８５６１
＊＊＊＊遺伝子バンク登録番号：Ｘ７７３３４
＊＊＊＊＊遺伝子バンク登録番号：ＮＧ−０００００７
ＮＧ（淋菌）、ＣＴ（クラミジア・トラコマチス）、ＵＵ（ウレアプラズマ・ウレアリティカム）、ＭＧ（マイコプラズマ・ジェニタリウム）、ＨＢＢ（ヒトβグロブリン）、Ｆ（正方向）、Ｒ（逆方向）
【実施例２】
【００４５】
コントロール群系統並びにサンプル及びそのクローンの確保
分析する４種の細菌のそれぞれに対するスタンダードポジティブコントロール群の系統は、ＡＴＣＣ，ＵＳＡ（米国マナッサス，ＶＡ２００１０８）で購入し、そして又、各細菌がすでに感染していると同定されたサンプルを得た。ＤＮＡをこれらから分離し、その後、分析する標的遺伝子領域を、各細菌に対してＰＣＲ増幅し、クローニング及びシークエンシングにより同定し、それによりそれらのそれぞれに対してプラスミドクローンが確保された。
【００４６】
クローニング実験方法は、以下の公知の方法を用いて行われ、そして前記ポジティブコントロール群の細菌系統及び確保されたプラスミドクローンの特性を、表３に示す。ＰＣＲの方法は、後の実施例で繰り返されるので、その詳細はここでは省略する。
【００４７】
１）淋菌及びマイコプラズマ・ジェニタリウムの１６Ｓ ｒＲＮＡ、ウレアプラズマ・ウレアリティカムの１６Ｓ〜２３Ｓ遺伝子間領域並びにヒトβグロブリン遺伝子のＰＣＲにより増幅されたＰＣＲ産物は、ゲルリカバリーキット（米国ｚｙｍｏ ｒｅｓｅａｒｃｈ社製造）を用いたアガロースゲル上で分離され、その濃度を分光光度計又はアガロースゲルの濃度測定法により測定した。
【００４８】
２）冷凍保管されていたｐＧＥＭ(R)−Ｔ（米国Ｐｒｏｍｅｇａ社製、Ａ１３６０）及び２ｘラピッドライゲーションバッファーは、指の端部で軽くチューブを振盪して溶解、混合し、軽く遠心分離し、それによって、０．５ｍｌチューブに、クローニングする挿入ＤＮＡと、表２に示す割合にし、ライゲーション反応の準備をした。
【００４９】
【表２】
【００５０】
３）各反応溶液を、ピペットでよく混合し、ライゲーション反応のため室温で１時間保持した。もし多量の形質転換細胞が必要であれば、４℃で一晩反応させるために保持してもよい。
【００５１】
４）ライゲーションされたサンプルは、−７０℃で保存されていた５０μｌ ＪＭ１０９コンピテント細胞（＝１×１０８ｃｆｕ／μｇ ＤＮＡ）を用いて形質転換させた。
【００５２】
５）先ず、上記により得られた２μｌのライゲーション反応産物（ライゲート）を１．５ｍｌチューブに加えた。直ちに解凍された５０μｌのコンピテント細胞をそこに再度加え、該混合物をよく混合し、その後氷上で２０分間反応させるために保持した。
【００５３】
６）前記細胞は、４２℃循環水浴中におき、４０〜５０秒の熱ショック処理をした。
【００５４】
７）室温に調整した９５０μｌ ＳＯＣ培地をそこに加え、約１時間半３７℃で振盪恒温槽で培養した。
【００５５】
８）約１００μｌの培養溶液をＬＢ／アンピシリン／ＩＰＴＧ／Ｘ−Ｇａｌ プレートに注ぎ、その後前記プレートを反転し、３７℃に調節された恒温槽で１６〜２４時間培養した。その後、コロニー数を計数（コロニー計数）し、白色のコロニーのみを選択し、３ｍｌ ＬＢ／アンピシリン培養溶液で培養し、それからＭｉｎｉ−Ｐｒｅｐ手順でプラスミドＤＮＡを分離、精製した。その後、挿入ＤＮＡが制限酵素によるＰＣＲおよび開裂反応を用いて適切に挿入されたかどうか同定し、こうして得られたクローンの塩基配列をオートシーケンサーを用いて分析した。
【００５６】
【表３】
【実施例３】
【００５７】
臨床サンプルの採取
尿道、頸部又は口からの分泌物、消毒綿またはブラシで集めた細胞によって得られたスワブサンプル、尿、尿道洗浄溶液並びに前立腺溶液のような様々なサンプルを人体から採取する適切な方法を確立し、分析前にそれらを運搬及び保存した。ここで、男性尿の採取は、従来の三杯試験により、ＶＢ（排せつされた尿：ｖｏｉｄｅｄ ｂｌａｄｄｅｒ）１，ＶＢ２，ＶＢ３及び前立腺圧出液（ＥＰＳ）に分割することにより行った。ＶＢ１は、排尿の始め（すなわち、早期尿流）に出される１０から２０ｍｌを言う。ＶＢ２は、排尿の中間に出された中期尿流を言う。前立腺圧出液は、前立腺マッサージに続いて尿道に出てくる分泌物を言う。ＶＢ３は、前立腺マッサージの後の排尿で始めに出る１０から２０ｍｌの尿を言う。ここで、ＶＢ１は尿道のサンプルを意味し、ＶＢ２は膀胱サンプルを意味し、そしてＶＢ３は前立腺サンプルを意味する。
【００５８】
サンプル採取の方法、そのために用いられた器具及びサンプルを運搬、保存する方法は、以下の通りである。
【００５９】
このＳＴＤ分析において、男性のスタンダードサンプルは、尿道のスワブサンプル及び早期尿流（ＶＢ１）のサンプルであり、もし必要であれば、尿道分泌物又は前立腺マッサージ後の尿（ＶＢ３）をそこに加える。一方、女性のスタンダードサンプルは、頸部のスワブサンプル又は擦りとったサンプルであり、もし必要であればスワブサンプル若しくは膣の分泌物又は尿をそこに加える。ここで、同性愛者又は特定職業従事者の場合、サンプルを直腸又は肛門から更に得てもよい。
【００６０】
男性の尿道のスワブサンプルの入手する時、先端に綿又はブラシを付随させた滅菌消毒綿を尿道口の内側２〜３ｃｍに挿入し、左右に動かしそれにより集合したものとして尿道中の分泌物及び細胞を採取した。その上、女性から頸部のスワブサンプルを得る時、先端にブラシを付随させた滅菌消毒綿を頸部の内側に挿入し、左右に動かし、それにより集合したものとして分泌物及び細胞を採取した。ここで、採集するスワブ用器具として、ＣＯＰＡＮ（米国ＣＯＰＡＮ ｉｎｎｏｖａｔｉｏｎ社）が提供した消毒綿若しくはＳａｎｇ−Ａ Ｍｅｄｉｃａｌ社（韓国ソウル市）が提供したＰａｐブラシ、又はその同等物を用いた。その後、消毒綿の綿部分又はブラシ部分は、滅菌したサンプル保存溶液を内側に有し、スクリューキャップを有するチューブ内に入れられ、移動及び保存された。
【００６１】
尿又はスワブサンプルのような採取されたサンプルは、可能であれば４８時間以内に研究室に運搬されるべきであり、移動中も冷凍する温度に維持するべきである。これは遺伝子増幅が差し迫った細菌の分離を助け、急速発育性細菌の異常増殖を阻止する。
【００６２】
予め、滅菌したサンプル保存溶液をサンプル採集チューブに満たした。その組成物は、１００ｍｌの３７〜４０％ホルムアルデヒドと、１５ｍｌメタノール、６．５ｇのＮａ２ＨＰＯ４及び４．０ｇのＮａＨ２ＰＯ４を混合し、滅菌三重蒸留水（ｔｒｉｐｌｅ−ｄｉｓｔｉｌｌｅｄ ｗａｔｅｒ）をそこに加え、最終体積を１Ｌにすることで作られた。
【００６３】
尿サンプルの場合、スクリューキャップを有する体積３０ｍｌの滅菌チューブに、上記方法で採集された新鮮な尿１０から２０ｍｌを加え、移動し、分析前に４℃で保存した。他の方法として、遠心分離して細胞沈殿層を得て、-７０度で保存し、後でＤＮＡ分離を行った。
【実施例４】
【００６４】
ＤＮＡ分離
ＤＮＡを、実施例３の様々なヒトサンプルからＤＮＡを分離するための市販キットを用いた方法及び手作業で用意した試薬を用いる方法によって、分離・精製した。
【００６５】
市販キットとして、ＱＩＡ ａｍｐ ＤＮＡ ｂｌｏｏｄ ｍｉｎｉ ｋｉｔ（米国カリフォルニア州ヴァレンシアＱｉａｇｅｎ社製、カタログＮｏ．５１１０６）を次のように用いた。
【００６６】
尿又はスワブサンプルを、スイングローター遠心分離機を用いて３０分間３０００ｒｐｍで遠心分離した。その上澄みを注ぎだし、沈殿物は５００μｌＰＢＳで再懸濁し、その後、懸濁液を１．５ｍｌマイクロ遠心チューブに移した。前記懸濁液を２分間遠心分離し、再度上澄みを注ぎだした。２００μｌのリン酸バッファーナトリウム（ＰＢＳ、ｐＨ７．４）及び２０μｌのプロテナーゼＫをそこに加え、その後沈殿物が完全に懸濁されるまで約２分間ボルテックスで混合した。２００μｌ ＡＬバッファーをそこに加え、該混合物を更に２分間ボルテックスで混合し、その後２０分間、５６℃の恒温水浴で反応させた。次に、２００μｌの無水エタノールをそこに加え、ピペットで攪拌した。それにより処理した反応液を、スピンカラムに移し、２ｍｌコレクションチューブを取り付け、その後１〜２分間８０００ｒｐｍで遠心分離した。その後、新しい２ｍｌコレクションチューブをスピンカラムに取り付け、５００μｌのＡＷ２バッファーをスピンカラムに送り込み、その後１分間８０００ｒｐｍで遠心分離した。再び新しい２ｍｌコレクションチューブを取り付け、５００μｌのＡＷ２バッファーをスピンカラムに送り込み、その後、３〜５分間１２０００ｒｐｍで遠心分離した。１．５ｍｌマイクロ遠心チューブをそこに取り付け、６０μｌ ＡＥバッファー又は滅菌蒸留水をスピンカラムに送り込んだ。その後、該混合物を３〜５分間室温で反応させた。その後、該反応混合物は３分間１２０００ｒｐｍで遠心分離し、ＤＮＡを分離した。該分離ＤＮＡの濃度は、分光光度計又はアガロースゲルで測定された。約２０ｎｇ／μｌのＤＮＡ濃度が得られた場合、３μｌの分離されたＤＮＡがＰＣＲで用いられ、１．５％アガロースゲル上にＤＮＡバンドが示されない場合、６μｌの分離されたＤＮＡが用いられた。
【００６７】
本発明の手作業で用意した試薬を用いる方法は、次の通りである。約１ｍｌの尿サンプル又はスワブサンプルを３０分間１５０００ｒｐｍで遠心分離し、上澄みを廃棄し、その後、残渣をＰＢＳ（ｐＨ７．４）で洗浄した。その後１０ｍＭ Ｔｒｉｓ ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、１ｍＭ ＥＤＴＡ、０．５％ Ｔｗｅｅｎ−５０、０．５％ ノニデットＰ−４０及び２００μｇ／ｍｌ プロテナーゼＫで構成される細胞融解バッファー１００μｌをそこに加え、３０分間５５℃で反応させた。前述した組成物の代わりに融解バッファーは１０ｍＭ Ｔｒｉｓ ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、５０ｍＭ ＫＣｌ、１．５ｍＭ ＭｇＣｌ２、０．５％ ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）、０．５％Ｔｗｅｅｎ−５０、０．５％ ノニデットＰ−４０及び７００μｇ／ｍｌ プロテナーゼＫで構成されてもよく、その５００μｌを処理に用いることができる。細胞融解手順後、前記反応結果物は、プロテナーゼＫを不活性化するため、１５分間９４℃で熱し、その後、再び遠心分離し、濃縮された沈殿物を得た。続いて、前記沈殿物をフェノールクロロホルムで処理し、エタノールで沈殿させ、その後遠心分離することでＤＮＡを得た。前記沈殿物を５０μｌの滅菌三重蒸留水又はＴＥバッファー（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ［ｐＨ８．０］及び１ｍＭ ＥＤＴＡ）で溶解し、その３〜６μｌをＰＣＲで用いた。
【実施例５】
【００６８】
シングルＰＣＲの条件を確立するためのＰＣＲ
人工サンプルは、１０、１００、１０００及び１００００毎の多重コピーである各細菌を検査するための、実施例２で得られた標的遺伝子のプラスミドクローンを、滅菌三重蒸留水、実施例３のサンプル保存溶液及び感染症状の無い正常男性の新鮮な尿に加えることによって作製した。その後、各細菌の標的遺伝子のシングルＰＣＲを繰り返し行い、それによりシングルＰＣＲに適切な条件を確立した。ＰＣＲを行っているとき、内部基準遺伝子であるヒトβグロブリンのＰＣＲを、確実に一緒に行った。その上、その後マルチプレックスＰＣＲを考慮して、各ＰＣＲ産物の大きさがそれぞれ特徴的に異なり、そしてアニーリング温度が大きな違いを有さないように設計された。
【００６９】
本発明のＰＣＲ方法において、反応溶液の構成と条件は、表４〜８に示す。本発明の方法が、本発明において設計されたプライマーを用いて行われる場合、１ｍｌのサンプル溶液に１０〜１００コピーのプラスミドクローンが含まれている限りいつでも調査が可能である。前記方法によるＰＣＲを行った後、その産物を、１．５〜２．０％アガロースゲル電気泳動にかけることによって確認し、その結果を図１〜５に例示する。
【００７０】
【表４】
【００７１】
【表５】
【００７２】
【表６】
【００７３】
【表７】
【００７４】
【表８】
【実施例６】
【００７５】
臨床サンプルのシングルＰＣＲ
ＳＴＤの羅病の疑いで国内病院の泌尿器科及び産婦人科を訪れた５４１人の成人男性及び成人女性患者、及び性交感染の症状が無い１０３人の成人男性および成人女性から、新鮮な尿（ＶＢ１）又は尿道炎、子宮頸管炎等のスワブのような様々なサンプルを実施例３の方法によって集めた。その後、ＤＮＡをそれらから実施例４の方法により分離し、実施例５によるシングルＰＣＲが行われた。
【実施例７】
【００７６】
臨床サンプルについてのＰＣＲ産物のシークエンシング
実施例６のＰＣＲ産物は、ＡＢＩ Ｐｒｉｓｍ ＢｉｇＤｙｅ Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ Ｃｙｃｌｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ Ｒｅａｄｙ Ｒｅａｃｔｉｏｎキット（米国Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）を用いてシークエンシング反応にかけて、その後、ＡＢＩ Ｐｒｉｓｍ ３７７ Ａｕｔｏｍａｔｅｄ Ｂａｓｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｅｒ（米国Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ社製）を用いて塩基配列の分析を行った。これらの手順は、次の順序で行われた。
【００７７】
（１）シークエンシング反応において主な材料として各サンプルから得られたＰＣＲ産物を用いるために、最も適切な濃度に調整した。例えば、１００〜２００ｂｐの長さの産物を有する場合、１〜３ｎｇ／μｌの濃度が必要であり、２００〜５００ｂｐの場合は約３〜１０ｎｇ／μｌが必要である。
【００７８】
（２）それぞれのＰＣＲ産物、並びに３．２ｐｍｏｌプライマー及び８μｌのターミネーターレディリアクションミックスを薄壁マイクロ遠心チューブに送り込み、そこに滅菌蒸留水を加え、それによりチューブ内の最終体積が２０μｌなるようにし、その後、軽く攪拌した。
【００７９】
（３）（２）の混合物を、Ｇｅｎｅ Ａｍｐ ２７００（米国ＰＥ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）を用いて、合計２５サイクルにおける各サイクルが１０秒間
９６℃、５秒間５０℃そして６分間６０℃であるサイクルシークエンシング反応にかけた。
【００８０】
（４）得られた反応物は、エタノールで沈殿させ、遠心分離することで、ターミネーターレディリアクションミックス中の遊離プライマー及び蛍光物質が付与されたジデオキシヌクレオチド（蛍光標識ｄｄＮＴＰ）を除去し、その後乾燥させた。
【００８１】
（５）（４）で得たＤＮＡを、クロロホルムアミド：２５ｍＭ ＥＤＴＡ（ｐＨ８．０）：ブルーデキストラン及びローディングバッファーの混合物１０μｌと混合し、５分間沸騰水中で変性させ、その後、該サンプルは冷凍保存された。
【００８２】
（６）（５）の変性ＤＮＡを、５．５％ロングレンジャーゲル（ｌｏｎｇ ｒａｎｇｅｒ ｇｅｌ）（米国ＢＭＡ社製、カタログＮｏ．５０６１１）に直ちに流し込まれるプレートの各ウェルに入れ、２〜４時間電気泳動にかけた後、シーケンサーを用いて塩基配列を分析した。
【００８３】
本発明のシークエンシング分析から、ＳＴＤを引き起こす４種の病原菌を調査するためのシングルＰＣＲ及びヒトβグロブリン遺伝子のシングルＰＣＲの適切さが確認され、結果として分子疫学上のデータベース、及びＳＴＤの４種の主な病原菌の遺伝子型が、韓国人について確立された。その為、ＳＴＤ感染及びその原因となる細菌の存在がＰＣＲ及びシークエンシングによって確認されたサンプルを、マルチプレックスＰＲＣ及びＤＮＡチップの評価分析に、その後用いた。
【００８４】
ＰＣＲ及びシークエンシング反応分析の結果を表９に示す。ＳＴＤの疑いのため病院を訪れた４７６人のうち３８７人は、淋菌、クラミジア・トラコマチス、ウレアプラズマ・ウレアリティカム及びマイコプラズマ・ジェニタリウムの少なくとも１種又はそれ以上を示したが、正常コントロール群の１０３人のうち４人のみにクラミジア・トラコマチス及びウレアプラズマ・ウレアリティカムを示した。細菌検出の頻度の観点から、クラミジアは４５．２％で最も頻度が高かった。１０５サンプル（２７．２％）では、２又はそれ以上の細菌の複合感染を示し、特に、淋菌感染の場合、複合感染は５２．２％となり、より頻度が高かった。
【００８５】
【表９】
【実施例８】
【００８６】
マルチプレックスＰＣＲに対する条件を確立する実験
人工サンプルは、１０、１００、１０００及び１００００毎の多重コピーである各細菌を検査するため、実施例２で得られた１〜４つの型からなる特定遺伝子のプラスミドクローンを、滅菌三重蒸留水、実施例３のサンプル保存溶液及びＳＴＤの症状が無い正常成人男性の新鮮な尿（ＶＢ１）に加えることによって作製した。その後、一つのチューブに人工サンプルで細菌毎に対しての標的遺伝子の４つの型のプライマーを加えることによって同時にＰＣＲを行うマルチプレックスＰＣＲが行われた。更に、前記マルチプレックスＰＣＲの時に、ハウスキーピング遺伝子であるヒトβグロブリン遺伝子もまたコントロール遺伝子として増幅した。
【００８７】
マルチプレックスＰＣＲの構成及び条件を表１０に示す。マルチプレックスＰＣＲ後、その産物を１．５〜２．０％アガロースゲル電気泳動にかけることにより確認した（図６〜９）。前記ＰＣＲ産物の電気泳動による画像を見ると、上から、それぞれウレアプラズマ・ウレアリティカムの産物は８１２ｂｐで、淋菌の産物は３８６ｂｐで、クラミジア・トラコマチスの産物は３１４ｂｐで、マイコプラズマ・ジェニタリウムの産物は２０７ｂｐで、ヒトβグロブリン遺伝子の増幅産物は１１０ｂｐである。本発明の方法を用いる際、１種類から５種類の様々な混合物中に、淋菌、クラミジア・トラコマチス、ウレアプラズマ・ウレアリティカム、マイコプラズマ・ジェニタリウム、及びヒトβグロブリン遺伝子の様々なＤＮＡを混合する場合、ＤＮＡにマルチプレックスＰＣＲを用いることで一度に正確に調査できるかもしれない。この時に、それぞれと異なる細菌遺伝子の１０〜１００コピーのプラスミドクローンが１ｍｌのサンプル中に含まれていれば、各ＤＮＡを常に区別することができる（図１０）。
【００８８】
【表１０】
【実施例９】
【００８９】
臨床サンプルのマルチプレックスＰＣＲ
上記実施例７でシングルＰＣＲ及びシークエンシング分析によって、ＳＴＤ感染及び原因となる細菌の存在が直ちに確認されたヒトサンプルのＤＮＡを、上記実施例８で確立された方法であるマルチプレックスＰＣＲにかけた。
【００９０】
試験対象に含まれるＤＮＡサンプルは、淋菌に感染したサンプルの５０例、クラミジア・トラコマチスに感染したサンプルの５０例、ウレアプラズマ・ウレアリティカムに感染したサンプルの５０例、マイコプラズマ・ジェニタリウムに感染したサンプルの５０例及び非感染サンプルの５０例である。マルチプレックスＰＣＲとそのシークエンシング間の比較分析によって、ＳＴＤ原因となる細菌の検出の感度と特異性が研究された。それにより、マルチプレックスＰＣＲを、臨床的にＳＴＤ原因となる４種の主な病原菌の選択及び調査に用いてもよいかどうか、分析が行われた。
【００９１】
シングルＰＣＲ及びシークエンシング分析の結果と比較したマルチプレックスＰＣＲの分析の結果を、表１１に示し、その実施形態を図１１及び１２に示す。シングルＰＣＲ後、マルチプレックスＰＣＲの感度は、前記シークエンシング分析に基づく場合、９４〜９６％、平均９５％であり、特異性は９６％であった。複合感染の検出感度は、８７．５％であり、シングルＰＣＲより低かった。
【００９２】
【表１１】
【００９３】
図６〜９は、本発明のマルチプレックスＰＣＲ法を用いて、淋菌、クラミジア・トラコマチス、ウレアプラズマ・ウレアリティカム及びマイコプラズマ・ジェニタリウムの遺伝子を増幅した後、オートシーケンサーによって確認したシークエンシングの結果である。非常に高い選択性を有するＰＣＲ産物は、本発明で設計された４種の細菌、ヒトβグロブリン遺伝子のプライマー及びＰＣＲ法を用いることによって精製することができる。
【実施例１０】
【００９４】
ハイブリダイゼーションアッセイのために設計したプローブ
ＳＴＤを引き起こす４種の主な病原菌の遺伝子及び一チップ上でハイブリダイゼーション反応によって同時にコントロール遺伝子のＰＣＲ産物を分析するためのＤＮＡチップを製造するために、先ず、適切な塩基配列を有するオリゴヌクレオチドプローブの組み合わせを設計した。
【００９５】
これは、本発明のＤＮＡチップを開発する基本的な段階であり、すなわち、これはＤＮＡチップと結合するオリゴヌクレオチドプローブを確立し準備する手順である。米国の全米バイオテクノロジー情報センターの遺伝子バンクのデータベース及び実施例７で得たＳＴＤを引き起こす４種の病原菌及び韓国人において検出されたヒトβグロブリン遺伝子のデータベースが分析され、各遺伝子型塩基配列が得られた。得られたＤＮＡ配列は、コンピュータープログラムのＤＮＡＳＴＡＲ（ＭｅｇＡｌｉｇｎＴＭ ５、ＤＮＡＳＴＡＲ社製）を用いてＣｌｕｓｔａｌＷによって、ペアワイズアライメント（ｐａｉｒｗｉｓｅ ａｌｉｇｎｍｅｎｔ）及びマルチプル塩基アライメントにかけられ、その後、系統樹が書かれ、各群の型特異性塩基配列が選択された。次に型特異性プローブが、再びコンピュータープログラムＰｒｉｍｅｒ Ｐｒｉｍｅｒ ５（ＰＲＥＭＩＥＲ Ｂｉｏｓｏｆｔ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ社製）を用いて設計された。この時、プローブに、長さが２０±２及び１８±２ｂｐを有するオリゴヌクレオチドがセットされ、合計３０タイプの遺伝子型特異性プローブが設計された。その名称、配列番号及びこれらプローブの遺伝子型を表１２に示す。
【００９６】
【表１２】
【００９７】
注釈）オリゴプローブの塩濃度は５０ｍＭに統一される。
【００９８】
ＴｅｔＣ：テトラサイクリン耐性型Ｃ
＊ＰＣＲ産物の塩基配列中のプローブ配列の位置（正及び逆方向でのプライマー配列を除く。）
【実施例１１】
【００９９】
ＤＮＡチップの製造
実施例１０で設計されたオリゴヌクレオチドプローブは、適切な試薬と混合され、その後、アレイヤー（ａｒｒａｙｅｒ）を用いて顕微鏡用スライドガラスに結合させることで、オリゴヌクレオチドマイクロアレイ、又はＳＴＤを引き起こす病原菌の遺伝子型検出用オリゴＤＮＡチップを次の順序、方法によって製造した。更に、チップ上に８つの格子を有し、その上に８種の異なるサンプルを同時分析するために結合させてもよい改良チップもまた製造された（図１３及び１４）。
【０１００】
１．各ＳＴＤ遺伝子型プローブをＤＮＡチップ上に結合させる順の格子の書き込み
本発明において、チップでのハイブリダイゼーション反応後のような群に格子を書き込むことで、特定の細菌を、そのＳＴＤ遺伝子型により示される蛍光シグナルによって容易に検出することができる。格子配列の模擬図を図１３に示す。最も左側に、ウレアプラズマ・ウレアリティカムの１６Ｓ〜２３Ｓリボソームに対する６つのプローブの境界スペーサを結合し、その右側に、マイコプラズマ・ジェニタリウムの１６Ｓ ｒＲＮＡに対する５つのプローブを結合させた。更に、最も右側に、テトラサイクリン抗体の耐性遺伝子に対する６つのプローブを結合させた。加えて、コントロール遺伝子であるヒトβグロブリン遺伝子に特異的なオリゴヌクレオチドプローブをコーナーマーカーとして、その２組が、左及び右側上部に位置し、そして各一つが左及び右側下部に位置するように結合させた。
【０１０１】
各オリゴヌクレオチドプローブは、スポットされ、又はアレイヤーを用いて結合された。この時、同じプローブを、細菌の各遺伝子型が少なくても２回、多くて４回示されるよう設計するために、２通りに結合した。
【０１０２】
本発明のＤＮＡチップの最も重要な改良の一つは、分割カバーを用いて、一つのチップ上を６〜８の区画に等しく分割する格子を有することである。それにより、６〜８のそれぞれ異なるサンプルを一つのチップ上で調査することができ、そしてこれは、時間、人的資源及びコストを減らすことに非常に有益である（図１３）。
【０１０３】
２．チップ上にオリゴヌクレオチドプローブをスポットするための溶液の準備及びマスタープレート上への分配。
【０１０４】
Ｃ６位にアミンが付与されることにより合成された実施例１０により設計されたオリゴヌクレオチドプローブを、高速液体クロマトグラフィーを用いて精製し、その後、最終濃度が２００ｐＭになるよう滅菌三重蒸留水に溶解した。従って、準備したオリゴプローブは、スポッティング溶液であるマイクロスポッティング溶液プラス（米国Ｔｅｌｅｃｈｅｍ社製、ＴＣ−ＭＳＰ）と４．３倍の比率で混合し、そのため最終濃度が３８ｐＭとなった。例えば、２００ｐＭの濃度のオリゴプローブ７．６μｌに３２．４μｌのスポッティング溶液を混合し、合計４０μｌとした。従って、準備された混合物を、順にそれぞれ９６ウェルマスタープレートに分配した。
【０１０５】
３．オリゴヌクレオチドプローブの固定
アレイヤーを用いて、オリゴプローブを含むスポッティング溶液を、マスタープレートから、明確にコーティングされたスライドガラスに移し、ダブルヒット（ｄｏｕｂｌｅ ｈｉｔ）でそこに結合した。平均約０．００５μｌの体積が、１スポットで結合される。チップの基板にするスライドガラスとして、ＢＭＴアルデヒドスライドガラス（韓国Ｂｉｏｍｅｔｒｉｘ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社製）又は７．５×２．５ｃｍのサイズを有するそれに対応する生成物で、スーパーアルデヒドによるコーティングを有するものが好ましい。アレイヤーとして、ＧＭＳ ４１７ アレイヤー（米国Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ社製）、ＭＧＩＩ（米国Ｂｉｏｒｏｂｏｔｉｃｓ社製、ＭＡ０１８０１）又はそれに対応する装置が好ましい。
【０１０６】
上記説明したようにスライドガラスにプローブを結合することによって準備したＤＮＡチップを、湿度８０％で維持されたガラスジャー中に室温で１５分間反応させた。
【０１０７】
４．後処理手順
前記反応終了後、固定されたスライドガラスは、乾燥機で１時間３０分、１２０℃で焼かれた。その後、前記スライドガラスを０．２％ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）で２回、２分間洗浄し、その後、三重蒸留水に移し、２回、２分間洗浄した。それから後、前記スライドガラスを９５℃に熱した三重蒸留水に３分間浸し、それによりスライドガラスに結合させたオリゴヌクレオチドプローブを変性させ、その後、三重蒸留水に移し、１分間洗浄した。洗浄後スライドガラスを１５分間ブロッキング溶液（１ｇのＮａＢＨ４、３００ｍｌのＰＢＳ及び１００ｍｌのエタノール）中で低減させ、０．２％ ＳＤＳ溶液で２回、２分間洗浄し、その後三重蒸留水に移し、２回、２分間洗浄した。スライドガラス上の水は、１分３０秒間８００ｒｐｍで遠心分離することにより取り除き、その後、室温のデシケーター中のスライドボックスで保存した。
【０１０８】
上記手順で準備した本発明のチップの条件及び品質は以下の実施例１２で説明する方法を用いて観察及び管理した。
【実施例１２】
【０１０９】
ＤＮＡチップ上のハイブリダイゼーション反応の分析及び結果
各細菌のプラスミドクローンとヒトβグロブリン遺伝子のプラスミドクローンを様々な組み合わせ及び濃度で混合することにより作製された人工サンプルを、マルチプレックスＰＣＲにかけ、その産物を実施例１１で準備したＳＴＤ ＤＮＡチップ上に結合させ、複数回ハイブリダイゼーション反応させ、その後、前記ＤＮＡチップを蛍光スキャナを用いて分析した。その方法は、次の通りであり、その実施形態を図１５〜２３に示す。
【０１１０】
１．マルチプレックスＰＣＲ
淋菌及びマイコプラズマ・ジェニタリウムの１６Ｓ ｒＲＮＡ及びウレアプラズマ・ウレアリティカムの１６Ｓ〜２３Ｓ遺伝子間領域、クラミジア・トラコマチスのクリプティックプラスミド並びにヒトβグロブリンのコントロール遺伝子のマルチプレックスＰＣＲは、実施例８及び９に従って行われ、逆方向にプライマーを有するプライマーの組み合わせの内、すなわち、ＮＧＲ、ＣＴＲ、ＵＵＲ、ＭＧＲ及びＨＢＢＲの場合、Ｃｙ５蛍光で標識されたオリゴヌクレオチドプライマーを用いた。
【０１１１】
２．ハイブリダイゼーション反応
スライドガラスチップ上に、３０種の型のオリゴヌクレオチドプローブをスポットし、淋菌及びマイコプラズマ・ジェニタリウムの１６Ｓ ｒＲＮＡ、ウレアプラズマ・ウレアリティカムの１６Ｓ〜２３Ｓ遺伝子間領域、クラミジア・トラコマチスのクリプティックプラスミド並びにヒトβグロブリンのコントロール遺伝子がＰＣＲで増幅された産物を、主な材料としてサンプルのＤＮＡを有することによって結合し、ハイブリダイゼーション反応が行われた。この時、１００μｌの能力を有する灌流８ウェルチャンバー（独国Ｓｃｈｅｉｃｈｅｒ ＆ Ｓｃｈｕｅｌｌ ＢｉｏＳｃｉｅｎｃｅ社製）をハイブリダイゼーション反応チャンバーに用いた。
【０１１２】
淋菌及びマイコプラズマ・ジェニタリウムの１６Ｓ ｒＲＮＡ、ウレアプラズマ・ウレアリティカムの１６Ｓ〜２３Ｓ遺伝子間領域、クラミジア・トラコマチスのクリプティックプラスミド並びにヒトβグロブリンのコントロール遺伝子が増幅された各々１０μｌの産物を混合し、５０μｌの最終体積にし、該混合物を５分間９５℃で変性し、その後直ちに氷上に３分間立たせて放置した。その後、５０μｌのハイブリダイゼーション反応溶液をそこに加え、最終体積を１００μｌに調整し、その後前記混合物を、４５℃でスライドガラス上に固定したプローブと３０分間反応させた。この時、前記ハイブリダイゼーション反応溶液は、２ｍｌの２０ｘ ＳＳＣ、１．７ｍｌの９０％グリセロール及び６．３ｍｌの５０ｍＭリン酸バッファー溶液を混合し、最終体積を１０ｍｌにすることにより構成された。
【０１１３】
３．洗浄
前記ハイブリダイゼーション反応終了後、ウェルカバーを前記ＤＮＡチップから取り除き、前記スライドガラスを３ｘ ＳＳＰＥ（ＮａＣｌ（２６．１９５ｇ）、ＮａＨ２ＰＯ４−１Ｈ２Ｏ（４．１４ｇ）、蒸留水１Ｌに溶解したＮａ２ＥＤＴＡ（１．１１ｇ）、及び１０Ｎ ＮａＯＨでｐＨを７．４に調整した。）溶液に浸し、室温で２分間洗浄した。前記スライドガラスを１ｘ ＳＳＰＥ（ＮａＣｌ（８．７６５ｇ）、ＮａＨ２ＰＯ４−１Ｈ２Ｏ（１．３８ｇ）、蒸留水１Ｌに溶解したＮａ２ＥＤＴＡ（０．３７ｇ）、及び１０Ｎ ＮａＯＨでｐＨを７．４に調整した。）溶液で更に２分間室温で洗浄し、１分３０秒間８００ｒｐｍで遠心分離することで乾燥させた。
【０１１４】
４．スキャン分析
ハイブリダイゼーションし、洗浄により非特異性シグナルを取り除きその後乾燥したスライドガラスを、共焦点レーザー蛍光スキャナを用いて、その蛍光シグナル及び画像を分析した。この時、スキャナとして、Ａｆｆｉｍｅｔｒｉｘ ４２８ Ａｒｒａｙ Ｓｃａｎｎｅｒ（米国Ａｆｆｒｙｍｅｔｒｉｘ社製）、Ｓｃａｎ Ａｒｒａｙ Ｌｉｔｅ（米国Ｐａｃｋａｒｄ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社製）又はそれに対応する装置が好ましい。
【実施例１３】
【０１１５】
本発明によるＤＮＡチップの確認実験
実施例７でＰＣＲ後のシークエンシング反応によりＳＴＤ及びその原因となる細菌の存在が確認され、実施例９でマルチプレックスＰＣＲの正確な分析を受けた様々なヒトサンプルのＤＮＡを、再びマルチプレックスＰＣＲにかけ、そのＰＣＲ産物を実施例１１及び１２で製造されたＳＴＤ ＤＮＡチップ上に結合させ、実施例１２で説明されたものと同様の手順でハイブリダイゼーション反応にかけ、その後蛍光スキャナで分析した。試験対象に含まれるＤＮＡサンプルは、淋菌に感染したサンプルの５０例、クラミジア・トラコマチスに感染したサンプルの５０例、ウレアプラズマ・ウレアリティカムに感染したサンプルの５０例、マイコプラズマ・ジェニタリウムに感染したサンプルの５０例及び非感染サンプルの５０例である。感染サンプルの２００例の内には、複合感染の４０例も含まれていた。
【０１１６】
前記ＤＮＡチップ分析の感度、特異性及び再現性は、異なる観察者によって、間に時間間隔を置いて二回の同じ試験を繰り返すことによって研究された。それにより本発明のＤＮＡチップが、臨床において正確に４種の主なＳＴＤの病原菌を検出することができるかどうか、特に、前記ＤＮＡチップが、同様に複合感染を検出することができるかどうか分析した。
【０１１７】
ＳＴＤ ＤＮＡチップ分析並びにシングルＰＣＲ及びシークエンシング分析の比較の結果を、表１３に示す。
【０１１８】
シングルＰＣＲ後、シークエンシング分析に基づく時、マルチプレックスＰＣＲの感度は９８〜１００％、平均９９％となり、特異性は１００％となり、再現性は９９％となった。これらの結果は、ＤＮＡチップの特異性は、マルチプレックスＰＣＲと比較してより優れており、そして複合感染検出感度は、より優れていることを示している。
【０１１９】
本発明を、ある特定の実施形態に関して説明するが、本発明の思想から離れることなく、当業者にとって多くの改良及び変更をすることができるであろう。その為、添付した特許請求の範囲は、本発明の真の思想及び目的の中でそのような改良及び変更を全て保護することを目的とする。
【０１２０】
【表１３】
【０１２１】
［産業上の利用可能性］
本発明により、マルチプレックス型ＰＣＲ法及びＤＮＡチップは、ＳＴＤ原因の９０％以上の絶対多数であり、尿道炎、子宮頸管炎、及び骨盤内炎症疾患の４種の主な病原菌として存在する、淋菌、クラミジア・トラコマチス、ウレアプラズマ・ウレアリティカム、及びマイコプラズマ・ジェニタリウムを、正確に素早く同時に検出できるかもしれない。更に本発明のＤＮＡチップは、ＳＴＤ診断において、ほぼ１００％の感度、特異性、及び再現性を示す点で優れている。前記ＤＮＡチップは、正確に複合感染を検出し、試験方法が使いやすく、そして結果の分析が容易であるかもしれない。素早く正確に短時間で様々なサンプルの自動分析を考慮する観点から、前記ＤＮＡチップは、従来の方法と比較して、より優れており、経済的である。その為、本発明は、ＳＴＤの最初の検出及び診断のため、そして治療方針の決定のために広く用いられてもよい。その上、本発明は、培養又は染色、及びシングルＰＣＲのような従来のＤＮＡ試験キットを置き換え、医薬産業上の観点から非常に効果的である。
[配列表のテキスト]
【０１２２】
配列番号１〜１０は、核酸を増幅するためのプライマーの塩基配列からなっており、配列番号１１〜４０は、核酸と相補的に結合するプローブの塩基配列からなり、それらをここに添付する。
【図面の簡単な説明】
【０１２３】
【図１】特定の塩基配列のプライマーセットを用いた淋菌の１６ＳリボソームＲＮＡ（１６Ｓ ｒＲＮＡ）遺伝子に対するＰＣＲ増幅によって得られた生成物の２％アガロースゲル電気泳動写真（レーン１及び９：１００ｂｐ ＤＮＡサイズマーカー、レーン２：ネガティブコントロール群，レーン３：正常者の尿と、淋菌の１６ｓ ＲＮＡのプラスミドクローン１０コピーとを混合することによって作られた人工サンプルであるポジティブコントロール群，レーン４：正常者の尿と、淋菌の１６ｓ ＲＮＡのプラスミドクローン１００コピーとを混合することによって作られた人工サンプルであるポジティブコントロール群，レーン５：淋菌に感染した男性の尿道分泌物，レーン６：殺菌綿で淋菌に感染した男性の尿道を擦ることによって得られたサンプル，レーン７：ブラシで淋菌に感染した女性の子宮頸管を擦ることによって得られたサンプル，及びレーン８：淋菌に感染した男性の尿）。
【図２】特定の塩基配列のプライマーセットを用いたクラミジア・トラコマチスのクリプティックプラスミドＤＮＡに対するＰＣＲ増幅によって得られた生成物の２％アガロースゲル電気泳動写真（レーン１：１００ｂｐ ＤＮＡサイズマーカー，レーン２：ネガティブコントロール群，レーン３：正常者の尿とクラミジア・トラコマチスを挿入されたクリプティックプラスミドクローンが入ったプラスミド１００コピーとを混合することによって作られた人工サンプルであるポジティブコントロール，レーン４：正常者の尿とクラミジア・トラコマチスを挿入されたクリプティックプラスミドクローンが入ったプラスミド１００コピーとを混合することによって作られた人工サンプルであるポジティブコントロール，レーン５：クラミジア・トラコマチスに感染した男性の尿道分泌物，レーン６：殺菌綿でクラミジア・トラコマチスに感染した男性の尿道を擦ることによって得られたサンプル，レーン７：ブラシでクラミジア・トラコマチスに感染した女性の子宮頸管を擦ることによって得られたサンプル，レーン８：クラミジア・トラコマチスに感染した男性の尿）。
【図３】特定の塩基配列のプライマーセットを用いたウレアプラズマ・ウレアリティカムの１６ＳリボソームＲＮＡ及び２３ＳリボソームＲＮＡの遺伝子間空間領域（１６Ｓ〜２３Ｓ ＲＮＡ 遺伝子間空間領域）に対するＰＣＲ増幅後の１．５％アガロースゲル電気泳動写真（レーン１及び９：１００ｂｐ、１ｋｂＤＮＡサイズマーカー，レーン２：ネガティブコントロール群，レーン３：正常者の尿とウレアプラズマ・ウレアリティカムの１６Ｓ〜２３ＳリボソームＲＮＡ遺伝子間空間領域のプラスミド１０コピーとを混合することによって作られた人工サンプルであるポジティブコントロール，レーン４：正常者の尿とウレアプラズマ・ウレアリティカムの１６Ｓ〜２３ＳリボソームＲＮＡ遺伝子間空間領域のプラスミド１０コピーとを混合することによって作られた人工サンプルであるポジティブコントロール，レーン５：ウレアプラズマ・ウレアリティカムに感染した男性の尿道分泌物，レーン６：滅菌綿でウレアプラズマ・ウレアリティカムに感染した男性の尿道を擦ることによって得られたサンプル，レーン７：ブラシでウレアプラズマ・ウレアリティカムに感染した女性の子宮頸管を擦ることによって得られたサンプル，レーン８：ウレアプラズマ・ウレアリティカムに感染した男性の尿）。
【図４】特定の塩基配列のプライマーセットを用いたマイコプラズマ・ジェニタリウムの１６ＳリボソームＲＮＡ（１６Ｓ ｒＲＮＡ）遺伝子に対するＰＣＲ増幅後の２％アガロースゲル電気泳動写真（レーン１及び９：１００ｂｐ ＤＮＡサイズマーカー，レーン２：ネガティブコントロール群，レーン３：正常者の尿とマイコプラズマ・ジェニタリウムの１６Ｓ ｒＲＮＡプラスミドクローン１０コピーとを混合することによって作られた人工サンプルであるポジティブコントロール群，レーン４：正常者の尿と、マイコプラズマ・ジェニタリウムの１６Ｓ ｒＲＮＡプラスミドクローン１００コピーとを混合することによって作られた人工サンプルであるポジティブコントロール群，レーン５：マイコプラズマ・ジェニタリウムに感染した男性の尿道分泌物，レーン６：滅菌綿でマイコプラズマ・ジェニタリウムに感染した男性の尿道を擦ることによって得られたサンプル，レーン７：ブラシでマイコプラズマ・ジェニタリウムに感染した女性の子宮頸管を擦ることによって得られたサンプル，レーン８マイコプラズマ・ジェニタリウムに感染した男性の尿）。
【図５】ＳＴＤ感染していない正常者及びＳＴＤ感染患者の尿サンプルからＤＮＡを分離し、該ヒトサンプルにおけるＤＮＡ分離手順及びＰＣＲ増幅手順の品質管理（ＱＣ）を確認するために５８℃でハウスキーピング遺伝子であるヒトβグロブリン（ＨＢＢ）のＰＣＲ増幅によって得られ、１．８％アガロースゲルで分析された生成物の電気泳動写真（レーン１：１００ｂｐ ＤＮＡサイズマーカー，レーン２：正常者の尿サンプル，レーン３及び４：ＳＴＤ感染患者の尿サンプル）。
【図６】本発明のマルチプレックスＰＣＲを用いて臨床サンプル中の淋菌、クラミジア・トラコマチス、ウレアプラズマ・ウレアリティカム及びマイコプラズマ・ジェニタリウムの遺伝子を増幅した後、オートシーケンサーで検出された結果の内、淋菌の１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子に対してのシークエンシングのグラフ。
【図７】本発明のマルチプレックスＰＣＲを用いて臨床サンプル中の淋菌、クラミジア・トラコマチス、ウレアプラズマ・ウレアリティカム及びマイコプラズマ・ジェニタリウムの遺伝子を増幅した後、オートシーケンサーで検出された結果の内、クラミジアのクリプティックプラスミドに対するシークエンシングのグラフ。
【図８】本発明のマルチプレックスＰＣＲを用いて臨床サンプル中の淋菌、クラミジア・トラコマチス、ウレアプラズマ・ウレアリティカム及びマイコプラズマ・ジェニタリウムの遺伝子を増幅した後、オートシーケンサーで検出された結果の内、ウレアプラズマ・ウレアリティカムの１６Ｓ〜２３Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子間空間領域に対するシークエンシングのグラフ。
【図９】本発明のマルチプレックスＰＣＲを用いて臨床サンプル中の淋菌、クラミジア・トラコマチス、ウレアプラズマ・ウレアリティカム及びマイコプラズマ・ジェニタリウムの遺伝子を増幅した後、オートシーケンサーで検出された結果の内、マイコプラズマ・ジェニタリウムの１６Ｓ ｒＲＮＡに対するシークエンシングのグラフ。
【図１０】淋菌、マイコプラズマ・ジェニタリウム、ウレアプラズマ・ウレアリティカム、及びクラミジア・トラコマチス、並びにヒトβグロブリン遺伝子のＤＮＡの各標的遺伝子のＤＮＡが挿入された各プラスミドクローン１０コピー及び１００コピーのそれぞれと、サンプル保存試薬とを混和し、一つのチューブにＤＮＡと特異的に結合するプライマーセットと共に混合物を加え、その後、５６℃でマルチプレックスＰＣＲを行うことによって得られた１．８％アガロースゲル電気泳動写真（レーン１及び６：１００ｂｐ及び１ｋｂ ＤＮＡラダー，レーン２：ネガティブコントロール群（βグロブリン），レーン３：プライマーセットの濃度が全て１０ｐｍｏｌ／μｌで同じ場合，レーン４：プライマーセットの濃度が、ウレアプラズマ・ウレアリティカムで１０ｐｍｏｌ／μｌ、淋菌、クラミジア・トラコマチス及びマイコプラズマ・ジェニタリウムの全てで５ｐｍｏｌ／μｌの場合，レーン５：プライマーの濃度がウレアプラズマ・ウレアリティカムで２０ｐｍｏｌ／μｌ、及び残りのものは１０ｐｍｏｌ／μｌである場合）。（ａ）は１０コピーを加えた場合。（ｂ）は１００コピーを加えた場合。
【図１１】ＳＴＤ感染及び病原菌であるとすでに同定されている臨床サンプルから抽出されたＤＮＡサンプル４μｌに対して、５８℃で、本発明のＳＴＤマルチプレックスＰＣＲを行った後の、１．８％アガロースゲル電気泳動写真（レーン１及び８：１００ｂｐ及び１ｋｂ ＤＮＡラダー，レーン２：ネガティブコントロール群（ヒトβグロブリン），レーン３：ポジティブコントロール群（４種の病原菌及びヒトβグロブリン遺伝子のＤＮＡの各標的遺伝子のＤＮＡが挿入された各プラスミドクローン１０コピー及び１００コピーのそれぞれと、サンプル保存試薬とを混和することによって得られた人工サンプル），レーン４：マイコプラズマ・ジェニタリウムの感染であると検出された男性の尿サンプル，レーン５：クラミジア・トラコマチスの感染であると検出された男性の尿サンプル，レーン６：淋菌の感染であると検出された男性の尿サンプル，レーン７：ウレアプラズマ・ウレアリティカムの感染であると検出された男性の尿サンプル）。
【図１２】２種又はそれ以上の細菌による過剰感染であると既に検出されている患者のＤＮＡサンプル４μｌに対して、本発明のＳＴＤマルチプレックスＰＣＲを行うことによって得られた生成物の１．８％アガロースゲル電気泳動写真（レーン１及び１０：１００ｂｐ ＤＮＡラダー，レーン２：ネガティブコントロール群（ＨＢＢ），レーン３：ポジティブコントロール群（ポジティブコントロール群（４種の病原菌及びヒトβグロブリン遺伝子のＤＮＡの各標的遺伝子のＤＮＡが挿入された各プラスミドクローン１００コピーと、サンプル保存試薬とを混和することによって得られた人工サンプル），レーン４：クラミジア・トラコマチス及びウレアプラズマ・ウレアリティカムの複合感染であると検出された男性の尿サンプル，レーン５：ウレアプラズマ・ウレアリティカム及び淋菌の複合感染であると検出された男性の尿サンプル，レーン６：ウレアプラズマ・ウレアリティカム及びマイコプラズマ・ジェニタリウムの複合感染であると検出された男性の尿サンプル，レーン７：マイコプラズマ・ジェニタリウム及びクラミジア・トラコマチスの複合感染であると検出された男性の尿サンプル，レーン８：淋菌、クラミジア・トラコマチス及びウレアプラズマ・ウレアリティカムの複合感染であると検出された男性の尿サンプル）。
【図１３】マルチプレックスＰＣＲ後生成物が配置された、同定のためにハイブリダイゼーション反応を行うＤＮＡチップ（ＳＴＤ遺伝子型決定オリゴヌクレオチドマイクロアレイ）の概略図。
【図１４】本発明のＳＴＤ ＤＮＡチップの一種であり、８つの格子を有するＤＮＡチップの写真。
【図１５】本発明のＳＴＤ遺伝子型診断用ＤＮＡチップで分析された、淋菌に感染した臨床サンプルの蛍光スキャナイメージ。
【図１６】本発明のＳＴＤ遺伝子型診断用ＤＮＡチップで分析された、クラミジア・トラコマチスに感染した臨床サンプルの蛍光スキャナイメージ。
【図１７】本発明のＳＴＤ遺伝子型診断用ＤＮＡチップで分析された、ウレアプラズマ・ウレアリティカムに感染した臨床サンプルの蛍光スキャナイメージ。
【図１８】本発明のＳＴＤ遺伝子型診断用ＤＮＡチップで分析された、マイコプラズマ・ジェニタリウムに感染した臨床サンプルの蛍光スキャナイメージ。
【図１９】本発明のＳＴＤ遺伝子型診断用ＤＮＡチップで分析された淋菌及びクラミジア・トラコマチスにより複合感染した臨床サンプルの蛍光スキャナイメージ。
【図２０】本発明のＳＴＤ遺伝子型診断用ＤＮＡチップで分析された淋菌及びウレアプラズマ・ウレアリティカムにより複合感染した臨床サンプルの蛍光スキャナイメージ。
【図２１】本発明のＳＴＤ遺伝子型診断用ＤＮＡチップで分析された淋菌及びマイコプラズマ・ジェニタリウムにより複合感染した臨床サンプルの蛍光スキャナイメージ。
【図２２】本発明のＳＴＤ遺伝子型診断用ＤＮＡチップで分析されたクラミジア・トラコマチス及びウレアプラズマ・ウレアリティカムにより複合感染した臨床サンプルの蛍光スキャナイメージ。
【図２３】本発明のＳＴＤ遺伝子型診断用ＤＮＡチップで分析され、ヒトβグロブリンの信号だけが見える、ＳＴＤに感染していないネガティブコントロール群の蛍光スキャナイメージ。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１〜配列番号８のいずれか一つから選択された塩基配列を有する性交渉感染症（ＳＴＤ）病原菌の核酸増幅用プライマー。
【請求項２】
配列番号９又は配列番号１０の塩基配列を有するヒトβグロブリンの核酸増幅用プライマー。
【請求項３】
ＰＣＲ増幅のための方法において、請求項１又は請求項２記載のプライマーの少なくとも一つを用いることを特徴とする方法。
【請求項４】
（ａ）配列番号１及び配列番号２の塩基配列を有する淋菌増幅用プライマーセット、配列番号３及び配列番号４の塩基配列を有するクラミジア・トラコマチス増幅用プライマーセット、配列番号５及び配列番号６の塩基配列を有するウレアプラズマ・ウレアリティカム増幅用プライマーセット、配列番号７及び配列番号８の塩基配列を有するマイコプラズマ・ジェニタリウム増幅用プライマーセットからなる群から選択されたプライマーセットと、Ｔａｑ ＤＮＡ ポリメラーゼ、ｄＮＴＰ（デオキシヌクレオチド三リン酸）、蒸留水、及びＰＣＲバッファーとを混合する工程；
（ｂ）９５℃で１５分間、反応器中で該混合物を前変性させる工程；
（ｃ）９５℃で３０秒間変性させ、５６℃で４０秒間プライマーと結合させ、７２℃で４５秒間伸張させる手順を３５サイクル繰り返す工程；
（ｄ）７２℃で最終延長反応を行う工程；を含む請求項３記載のＰＣＲ増幅のための方法。
【請求項５】
（ａ）配列番号１及び配列番号２と、配列番号３及び配列番号４と、配列番号５及び配列番号６と、配列番号７及び配列番号８とを有するＳＴＤ病原菌増幅用プライマーセット、並びに配列番号９及び配列番号１０を有するヒトβグロブリン増幅用プライマーセットと、鋳型ＤＮＡ、Ｔａｑ ＤＮＡ ポリメラーゼ、ｄＮＴＰ、蒸留水、及びＰＣＲバッファーとを混合する工程；
（ｂ）９５℃で５分間、反応器中で該混合物を前変性させる工程；
（ｃ）９５℃で３０秒間変性させ、５６〜５８℃で４０秒間プライマーと結合させ、７２℃で４５秒間伸長（ｅｘｔｅｎｄｉｎｇ）させる手順を３５サイクル繰り返す工程；
（ｄ）７２℃で最終伸長反応を行う工程；を含むマルチプレックスＰＣＲ増幅のための方法。
【請求項６】
前記マルチプレックスＰＣＲ増幅のための方法において、配列番号１及び配列番号２の塩基配列を有するＳＴＤ病原菌増幅用プライマーセット、配列番号３及び配列番号４の塩基配列を有するＳＴＤ病原菌増幅用プライマーセット、配列番号５及び配列番号６の塩基配列を有するＳＴＤ病原菌増幅用プライマーセット、配列番号７及び配列番号８の塩基配列を有するＳＴＤ病原菌増幅用プライマーセット、並びに配列番号９及び配列番号１０を有するヒトβグロブリン増幅用プライマーセットの割合が、１：１：１：１：２であることを特徴とする請求項５記載の方法。
【請求項７】
前記マルチプレックスＰＣＲ増幅のための方法において、ウレアプラズマ・ウレアリティカムのＰＣＲ産物の大きさは、８１２ｂｐであり、淋菌のＰＣＲ産物の大きさは、３８６ｂｐであり、クラミジア・トラコマチスのＰＣＲ産物の大きさは、３１４ｂｐであり、そして、マイコプラズマ・ジェニタリウムのＰＣＲ産物の大きさは１１０ｂｐであることを特徴とする請求項５又は６記載の方法。
【請求項８】
配列番号１１〜配列番号１６の塩基配列を有するオリゴヌクレオチド、及びウレアプラズマ・ウレアリティカムの核酸と相補的に結合する前記オリゴヌクレオチドに相補的な塩基配列を有するオリゴヌクレオチドからなる群から選択されるプローブ。
【請求項９】
配列番号１７〜配列番号２１の塩基配列を有するオリゴヌクレオチド、及び淋菌の核酸と相補的に結合する前記オリゴヌクレオチドに相補的な塩基配列を有するオリゴヌクレオチドからなる群から選択されるプローブ。
【請求項１０】
配列番号２２〜配列番号２８の塩基配列を有するオリゴヌクレオチド、及びクラミジア・トラコマチスの核酸と相補的に結合する前記オリゴヌクレオチドに相補的な塩基配列を有するオリゴヌクレオチドからなる群から選択されるプローブ。
【請求項１１】
配列番号２９〜配列番号３３の塩基配列を有するオリゴヌクレオチド、及びマイコプラズマ・ジェニタリウムの核酸と相補的に結合する前記オリゴヌクレオチドに相補的な塩基配列を有するオリゴヌクレオチドからなる群から選択されるプローブ。
【請求項１２】
配列番号３４〜配列番号３９の塩基配列を有するオリゴヌクレオチド、及びテトラサイクリン耐性遺伝子の核酸と相補的に結合する前記オリゴヌクレオチドに相補的な塩基配列を有するオリゴヌクレオチドからなる群から選択されるプローブ。
【請求項１３】
配列番号４０の塩基配列を有するヒトβグロブリン遺伝子と相補的に結合するプローブ。
【請求項１４】
請求項８〜１１のいずれか一項に記載のプローブを含む性交渉感染症（ＳＴＤ）病原菌検出用ＤＮＡチップ。
【請求項１５】
前記ＤＮＡチップにおいて、前記ＤＮＡチップ上に結合されるプローブ溶液の濃度は、少なくとも３８ｐｍｏｌ／μｌであることを特徴とする請求項１４記載のＤＮＡチップ。
【請求項１６】
前記ＤＮＡチップにおいて、ＤＮＡプローブの５’末端のアミン基は、シッフ塩基反応を介して前記チップの固体表面上のアルデヒド基と固定されることを特徴とする請求項１４記載のＤＮＡチップ。
【請求項１７】
性交渉感染症（ＳＴＤ）病原菌検出用ＤＮＡチップにおいて、前記ＤＮＡチップは、各々一つの試薬と結合するために６〜８区画に分割されることを特徴とするＤＮＡチップ。
【請求項１８】
請求項８〜１１のいずれか一項から選択されるプローブの少なくとも一つ、ヒトβグロブリン遺伝子検出用プローブ、ヒトβグロブリン遺伝子検出用プローブ、及びテトラサイクリン耐性遺伝子検出用プローブ又はそれらのうちいずれか少なくとも一つのプローブからなることを特徴とする性交渉感染症（ＳＴＤ）病原菌検出用ＤＮＡキット。
【請求項１９】
前記性交渉感染症（ＳＴＤ）病原菌検出用ＤＮＡチップにおいて、ヒトβグロブリン遺伝子検出用プローブは、配列番号４０の塩基配列を有することを特徴とする請求項１８記載のＤＮＡキット。
【請求項２０】
配列番号１１〜配列番号４０で示される塩基配列を有するプローブを含む性交渉感染症（ＳＴＤ）病原菌検出用ＤＮＡチップ。
【請求項２１】
請求項１４記載のＳＴＤ病原菌検出用ＤＡＮチップ、ウレアプラズマ・ウレアリティカム、クラミジア・トラコマチス及びマイコプラズマ・ジェニタリウムからなる群から選択される一つ以上のＤＮＡサンプル増幅用プライマーセット、並びに前記ＤＮＡチップとハイブリダイゼーションされた増幅されたＤＮＡ検出用マーカーを含む性交渉感染症（ＳＴＤ）病原菌検出用キット。
【請求項２２】
前記性交渉感染症（ＳＴＤ）病原菌検出用キットにおいて、前記マーカーはＣｙ５であることを特徴とする請求項２１記載のキット。
【請求項２３】
配列番号１及び配列番号２の塩基配列を有する淋菌ＤＮＡ増幅用プライマーセット、配列番号３および配列番号４の塩基配列を有するクラミジア・トラコマチスＤＮＡ増幅用プライマーセット、配列番号５又は配列番号６の塩基配列を有するウレアプラズマ・ウレアリティカムＤＮＡ増幅用プライマーセット、配列番号７又は配列番号８の塩基配列を有するマイコプラズマ・ジェニタリウム増幅用プライマーセットからなる群から選択されたプライマーセットを含む請求項２１記載の性交渉感染症（ＳＴＤ）病原菌検出用キット。
【請求項２４】
前記性交渉感染症（ＳＴＤ）病原菌検出用キットにおいて、前記プライマーセットは、配列番号９及び配列番号１０の塩基配列を有するβグロブリンＤＮＡ増幅用プライマーペアを更に含むことを特徴とする請求項２１〜２３のいずれか一項に記載のキット。
【請求項２５】
（ａ）性交渉感染症病原菌のＤＮＡ増幅用プライマーを用いてＤＮＡサンプルをＰＣＲ増幅する工程；
（ｂ）請求項１４記載のＤＮＡチップ上に、上述した増幅したＤＮＡをハイブリダイゼーションさせる工程；
（ｃ）プローブを用いて、ハイブリダイゼーション反応産物を検出する工程；を含む性交渉感染症（ＳＴＤ）病原菌検出のための方法。
【請求項２６】
前記性交渉感染症（ＳＴＤ）病原菌検出のための方法において、配列番号１〜配列番号１０から選択される一つ以上の塩基配列を有するプライマーは、前記マルチプレックスＰＣＲ増幅に用いられることを特徴とする請求項２５記載の方法。
【請求項２７】
前記性交渉感染症（ＳＴＤ）病原菌検出のための方法において、前記検出は、遺伝子がＣｙ５で標識されている場合、共焦点レーザースキャナを用いて蛍光シグナルを分析することによって行われることを特徴とする請求項２５又は２６記載の方法。
【請求項２８】
前記性交渉感染症（ＳＴＤ）病原菌検出のための方法において、前記Ｃｙ５蛍光物質は、逆方向プライマーに含まれることを特徴とする請求項２７記載の方法。
【請求項１】
配列番号１〜配列番号８のいずれか一つから選択された塩基配列を有する性交渉感染症（ＳＴＤ）病原菌の核酸増幅用プライマー。
【請求項２】
配列番号９又は配列番号１０の塩基配列を有するヒトβグロブリンの核酸増幅用プライマー。
【請求項３】
ＰＣＲ増幅のための方法において、請求項１又は請求項２記載のプライマーの少なくとも一つを用いることを特徴とする方法。
【請求項４】
（ａ）配列番号１及び配列番号２の塩基配列を有する淋菌増幅用プライマーセット、配列番号３及び配列番号４の塩基配列を有するクラミジア・トラコマチス増幅用プライマーセット、配列番号５及び配列番号６の塩基配列を有するウレアプラズマ・ウレアリティカム増幅用プライマーセット、配列番号７及び配列番号８の塩基配列を有するマイコプラズマ・ジェニタリウム増幅用プライマーセットからなる群から選択されたプライマーセットと、Ｔａｑ ＤＮＡ ポリメラーゼ、ｄＮＴＰ（デオキシヌクレオチド三リン酸）、蒸留水、及びＰＣＲバッファーとを混合する工程；
（ｂ）９５℃で１５分間、反応器中で該混合物を前変性させる工程；
（ｃ）９５℃で３０秒間変性させ、５６℃で４０秒間プライマーと結合させ、７２℃で４５秒間伸張させる手順を３５サイクル繰り返す工程；
（ｄ）７２℃で最終延長反応を行う工程；を含む請求項３記載のＰＣＲ増幅のための方法。
【請求項５】
（ａ）配列番号１及び配列番号２と、配列番号３及び配列番号４と、配列番号５及び配列番号６と、配列番号７及び配列番号８とを有するＳＴＤ病原菌増幅用プライマーセット、並びに配列番号９及び配列番号１０を有するヒトβグロブリン増幅用プライマーセットと、鋳型ＤＮＡ、Ｔａｑ ＤＮＡ ポリメラーゼ、ｄＮＴＰ、蒸留水、及びＰＣＲバッファーとを混合する工程；
（ｂ）９５℃で５分間、反応器中で該混合物を前変性させる工程；
（ｃ）９５℃で３０秒間変性させ、５６〜５８℃で４０秒間プライマーと結合させ、７２℃で４５秒間伸長（ｅｘｔｅｎｄｉｎｇ）させる手順を３５サイクル繰り返す工程；
（ｄ）７２℃で最終伸長反応を行う工程；を含むマルチプレックスＰＣＲ増幅のための方法。
【請求項６】
前記マルチプレックスＰＣＲ増幅のための方法において、配列番号１及び配列番号２の塩基配列を有するＳＴＤ病原菌増幅用プライマーセット、配列番号３及び配列番号４の塩基配列を有するＳＴＤ病原菌増幅用プライマーセット、配列番号５及び配列番号６の塩基配列を有するＳＴＤ病原菌増幅用プライマーセット、配列番号７及び配列番号８の塩基配列を有するＳＴＤ病原菌増幅用プライマーセット、並びに配列番号９及び配列番号１０を有するヒトβグロブリン増幅用プライマーセットの割合が、１：１：１：１：２であることを特徴とする請求項５記載の方法。
【請求項７】
前記マルチプレックスＰＣＲ増幅のための方法において、ウレアプラズマ・ウレアリティカムのＰＣＲ産物の大きさは、８１２ｂｐであり、淋菌のＰＣＲ産物の大きさは、３８６ｂｐであり、クラミジア・トラコマチスのＰＣＲ産物の大きさは、３１４ｂｐであり、そして、マイコプラズマ・ジェニタリウムのＰＣＲ産物の大きさは１１０ｂｐであることを特徴とする請求項５又は６記載の方法。
【請求項８】
配列番号１１〜配列番号１６の塩基配列を有するオリゴヌクレオチド、及びウレアプラズマ・ウレアリティカムの核酸と相補的に結合する前記オリゴヌクレオチドに相補的な塩基配列を有するオリゴヌクレオチドからなる群から選択されるプローブ。
【請求項９】
配列番号１７〜配列番号２１の塩基配列を有するオリゴヌクレオチド、及び淋菌の核酸と相補的に結合する前記オリゴヌクレオチドに相補的な塩基配列を有するオリゴヌクレオチドからなる群から選択されるプローブ。
【請求項１０】
配列番号２２〜配列番号２８の塩基配列を有するオリゴヌクレオチド、及びクラミジア・トラコマチスの核酸と相補的に結合する前記オリゴヌクレオチドに相補的な塩基配列を有するオリゴヌクレオチドからなる群から選択されるプローブ。
【請求項１１】
配列番号２９〜配列番号３３の塩基配列を有するオリゴヌクレオチド、及びマイコプラズマ・ジェニタリウムの核酸と相補的に結合する前記オリゴヌクレオチドに相補的な塩基配列を有するオリゴヌクレオチドからなる群から選択されるプローブ。
【請求項１２】
配列番号３４〜配列番号３９の塩基配列を有するオリゴヌクレオチド、及びテトラサイクリン耐性遺伝子の核酸と相補的に結合する前記オリゴヌクレオチドに相補的な塩基配列を有するオリゴヌクレオチドからなる群から選択されるプローブ。
【請求項１３】
配列番号４０の塩基配列を有するヒトβグロブリン遺伝子と相補的に結合するプローブ。
【請求項１４】
請求項８〜１１のいずれか一項に記載のプローブを含む性交渉感染症（ＳＴＤ）病原菌検出用ＤＮＡチップ。
【請求項１５】
前記ＤＮＡチップにおいて、前記ＤＮＡチップ上に結合されるプローブ溶液の濃度は、少なくとも３８ｐｍｏｌ／μｌであることを特徴とする請求項１４記載のＤＮＡチップ。
【請求項１６】
前記ＤＮＡチップにおいて、ＤＮＡプローブの５’末端のアミン基は、シッフ塩基反応を介して前記チップの固体表面上のアルデヒド基と固定されることを特徴とする請求項１４記載のＤＮＡチップ。
【請求項１７】
性交渉感染症（ＳＴＤ）病原菌検出用ＤＮＡチップにおいて、前記ＤＮＡチップは、各々一つの試薬と結合するために６〜８区画に分割されることを特徴とするＤＮＡチップ。
【請求項１８】
請求項８〜１１のいずれか一項から選択されるプローブの少なくとも一つ、ヒトβグロブリン遺伝子検出用プローブ、ヒトβグロブリン遺伝子検出用プローブ、及びテトラサイクリン耐性遺伝子検出用プローブ又はそれらのうちいずれか少なくとも一つのプローブからなることを特徴とする性交渉感染症（ＳＴＤ）病原菌検出用ＤＮＡキット。
【請求項１９】
前記性交渉感染症（ＳＴＤ）病原菌検出用ＤＮＡチップにおいて、ヒトβグロブリン遺伝子検出用プローブは、配列番号４０の塩基配列を有することを特徴とする請求項１８記載のＤＮＡキット。
【請求項２０】
配列番号１１〜配列番号４０で示される塩基配列を有するプローブを含む性交渉感染症（ＳＴＤ）病原菌検出用ＤＮＡチップ。
【請求項２１】
請求項１４記載のＳＴＤ病原菌検出用ＤＡＮチップ、ウレアプラズマ・ウレアリティカム、クラミジア・トラコマチス及びマイコプラズマ・ジェニタリウムからなる群から選択される一つ以上のＤＮＡサンプル増幅用プライマーセット、並びに前記ＤＮＡチップとハイブリダイゼーションされた増幅されたＤＮＡ検出用マーカーを含む性交渉感染症（ＳＴＤ）病原菌検出用キット。
【請求項２２】
前記性交渉感染症（ＳＴＤ）病原菌検出用キットにおいて、前記マーカーはＣｙ５であることを特徴とする請求項２１記載のキット。
【請求項２３】
配列番号１及び配列番号２の塩基配列を有する淋菌ＤＮＡ増幅用プライマーセット、配列番号３および配列番号４の塩基配列を有するクラミジア・トラコマチスＤＮＡ増幅用プライマーセット、配列番号５又は配列番号６の塩基配列を有するウレアプラズマ・ウレアリティカムＤＮＡ増幅用プライマーセット、配列番号７又は配列番号８の塩基配列を有するマイコプラズマ・ジェニタリウム増幅用プライマーセットからなる群から選択されたプライマーセットを含む請求項２１記載の性交渉感染症（ＳＴＤ）病原菌検出用キット。
【請求項２４】
前記性交渉感染症（ＳＴＤ）病原菌検出用キットにおいて、前記プライマーセットは、配列番号９及び配列番号１０の塩基配列を有するβグロブリンＤＮＡ増幅用プライマーペアを更に含むことを特徴とする請求項２１〜２３のいずれか一項に記載のキット。
【請求項２５】
（ａ）性交渉感染症病原菌のＤＮＡ増幅用プライマーを用いてＤＮＡサンプルをＰＣＲ増幅する工程；
（ｂ）請求項１４記載のＤＮＡチップ上に、上述した増幅したＤＮＡをハイブリダイゼーションさせる工程；
（ｃ）プローブを用いて、ハイブリダイゼーション反応産物を検出する工程；を含む性交渉感染症（ＳＴＤ）病原菌検出のための方法。
【請求項２６】
前記性交渉感染症（ＳＴＤ）病原菌検出のための方法において、配列番号１〜配列番号１０から選択される一つ以上の塩基配列を有するプライマーは、前記マルチプレックスＰＣＲ増幅に用いられることを特徴とする請求項２５記載の方法。
【請求項２７】
前記性交渉感染症（ＳＴＤ）病原菌検出のための方法において、前記検出は、遺伝子がＣｙ５で標識されている場合、共焦点レーザースキャナを用いて蛍光シグナルを分析することによって行われることを特徴とする請求項２５又は２６記載の方法。
【請求項２８】
前記性交渉感染症（ＳＴＤ）病原菌検出のための方法において、前記Ｃｙ５蛍光物質は、逆方向プライマーに含まれることを特徴とする請求項２７記載の方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図１６】
【図１７】
【図１８】
【図１９】
【図２０】
【図２１】
【図２２】
【図２３】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図１６】
【図１７】
【図１８】
【図１９】
【図２０】
【図２１】
【図２２】
【図２３】
【公表番号】特表２００８−５１５４２３（Ｐ２００８−５１５４２３Ａ）
【公表日】平成２０年５月１５日（２００８．５．１５）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００７−５３５５９３（Ｐ２００７−５３５５９３）
【出願日】平成１７年３月１７日（２００５．３．１７）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＫＲ２００５／０００７７３
【国際公開番号】ＷＯ２００６／０３８７５２
【国際公開日】平成１８年４月１３日（２００６．４．１３）
【出願人】（５０７０７３３５４）グッジェン インク (4)
【氏名又は名称原語表記】ＧＯＯＤＧＥＮＥ ＩＮＣ．
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２０年５月１５日（２００８．５．１５）
【国際特許分類】
【出願日】平成１７年３月１７日（２００５．３．１７）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＫＲ２００５／０００７７３
【国際公開番号】ＷＯ２００６／０３８７５２
【国際公開日】平成１８年４月１３日（２００６．４．１３）
【出願人】（５０７０７３３５４）グッジェン インク (4)
【氏名又は名称原語表記】ＧＯＯＤＧＥＮＥ ＩＮＣ．
【Ｆターム（参考）】
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