抗フェロポーチン１モノクローナル抗体およびその使用
ヒトＦＰＮ１に結合し、その活性を阻害するモノクローナル抗体およびその抗原結合フラグメントを提供し、当該モノクローナル抗体およびその抗原結合フラグメントは、哺乳動物細胞からの鉄輸送を維持もしくは増加させるか、ならびに／あるいはインビボにて被験体における血清鉄濃度、網状赤血球数、赤血球数、ヘモグロビン、および／またはヘマトクリットを維持もしくは増加させるのに有効である。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、フェロポーチン１（ＦＰＮ１）に結合する抗体、および、貧血の治療におけるその抗体の使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
鉄は、多くの細胞機能に必要な必須微量元素である。哺乳動物において、身体への鉄の供給は、十二指腸細胞による鉄吸収レベルにて身体の鉄必要量と一致するよう調節される。腸細胞の側底膜を横断する鉄輸送は、フェロポーチン１（鉄調節輸送体１（ＩＲＥＧ−１）、金属輸送タンパク質１（ＭＴＰ１）およびＳＬＣ４０Ａ１しても知られる）（以後、本願明細書においてＦＰＮ１と称する）により媒介されると考えられている。
【０００３】
現在、ＦＰＮ１は、鉄貯蔵および炎症に応答して肝臓により生成されるポリペプチドホルモンである、ヘプシジンについての受容体として知られている。成熟ヘプシジンのＦＰＮ１への結合は、ＦＰＮ１の内在化および分解を導き、細胞の鉄輸送を防ぎ、そして、全身の鉄恒常性の主要な制御因子となる。
【０００４】
特許文献１は、とりわけ、ヒトＦＰＮ１タンパク質をコードするヌクレオチド配列、鉄輸送機能を有するヒトＦＰＮ１タンパク質、および、ヒトＦＰＮ１のＣ末端１９アミノ酸からなるペプチドに対して生成されるウサギポリクローナル抗血清について開示している。特許文献２は、フェロポーチンＭａｂとこれらを用いて鉄恒常性の疾患を治療する方法について記載している。より具体的には、特許文献２は、ヒトＦＰＮ１タンパク質の種々のエピトープに対する、齧歯類および完全にヒトのモノクローナル抗体について記載している。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】米国特許第７，１６６，４４８号明細書
【特許文献２】国際公開第２００９／０９４５５１号パンフレット
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
鉄輸送におけるＦＰＮ１の関与、および、鉄恒常性の疾患とＦＰＮ１変異との関連を考慮すると、治療に有用なＦＰＮ１アンタゴニストが必要とされており、当該アンタゴニストは、ＦＰＮ１の細胞外エピトープに対して高親和性にて結合し、結合すると、成熟ヘプシジンにより媒介されるＦＰＮ１内在化を阻害して、これにより、細胞内貯蔵からの鉄輸送を維持または促進する。加えて、ＦＰＮ１の細胞外エピトープへの成熟ヘプシジンの結合を阻害することを目的に、Ｍａｂまたはその抗原結合フラグメントを用いて治療的にＦＰＮ１を標的とすることは、その標的と結合することで、抗体が細胞鉄の流出を著しく乱さないおよび／または内在化を誘導しないよう十分に正確に行わなければならない。加えて、ヒトの薬物治療において使用することを意図した抗ＦＰＮ抗体は、それらを治療的に使用できるようにするためにインビボでの安定性および／または排出半減期を含む十分な薬物動態的特徴および薬力学的特徴を示さなければならない。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本願明細書において開示される抗ヒトＦＰＮ１抗体のうちの１つ以上は、
（ａ）４０３ＳＰＦＥＤＩＲＳＲＦＩＱＧＥＳＩＴＰＴＫ４２２（配列番号１２）；
（ｂ）４０６ＥＤＩＲＳＲＦＩＱＧＥＳＩＴ４１９（配列番号１３）；
（ｃ）４０９ＲＳＲＦＩＱＧＥＳＩＴＰＴＫ４２２（配列番号１４）；
（ｄ）４０３ＳＰＦＥＤＩＲＳＲＦＩＱＧ４１５（配列番号１５）；
（ｅ）４０９ＲＳＲＦＩＱＧＥＳＩＴ４１９（配列番号１６）；および
（ｆ）４０９ＲＳＲＦＩＱＧ４１５（配列番号９５）
からなる群より選択されるヒトＦＰＮ１の少なくとも一つのペプチドフラグメントを含む、ヒトＦＰＮ１に特異的に結合し、フェロポーチンへのヘプシジンの結合をブロックし、インビトロにおけるヘプシジン活性を潜在的に阻害し、インビボにおいて用量依存的に血清鉄濃度を上昇させ、そして、受容可能な溶解性、インビボでの安定性、および、排出半減期の特性を有し、これら抗ヒトＦＰＮ１抗体を、静脈内注入を介して（または、おそらく皮下注射を介してであっても）投与することにより、それらは、貧血の治療を必要とする被験体において貧血を治療および／または予防するのに有用な薬剤となる。
【０００８】
したがって、その種々の態様の間で、本発明は、
（ａ）４０３ＳＰＦＥＤＩＲＳＲＦＩＱＧＥＳＩＴＰＴＫ４２２（配列番号１２）；
（ｂ）４０６ＥＤＩＲＳＲＦＩＱＧＥＳＩＴ４１９（配列番号１３）；
（ｃ）４０９ＲＳＲＦＩＱＧＥＳＩＴＰＴＫ４２２（配列番号１４）；
（ｄ）４０３ＳＰＦＥＤＩＲＳＲＦＩＱＧ４１５（配列番号１５）；
（ｅ）４０９ＲＳＲＦＩＱＧＥＳＩＴ４１９（配列番号１６）；および
（ｆ）４０９ＲＳＲＦＩＱＧ４１５（配列番号９５）
からなる群より選択される１つ以上のアミノ酸配列に局在するアミノ酸を含むエピトープにて、配列番号１に示されるアミノ酸配列からなるヒトフェロポーチン１に特異的に結合する、モノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメントを提供する。
【０００９】
いくつかの実施形態において、本発明は、配列番号３７、１２９、２２、１０７、１１８および１２０にそれぞれ示されるアミノ酸配列を含む、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、ＬＣＤＲ３、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２およびＨＣＤＲ３を含むＭａｂまたはその抗原結合フラグメントを提供し、当該Ｍａｂまたはその抗原結合フラグメントは、配列番号１２に示されるアミノ酸または配列番号１２に示されるアミノ酸配列に局在するアミノ酸を含むエピトープにて、好ましくはＭａｂについて２５℃およびＦａｂについて３７℃にて表面プラズモン共鳴により測定される場合、約１００ｎＭ以下のＫＤで、配列番号１に示されるアミノ酸配列からなるヒトＦＰＮ１と結合する。
【００１０】
いくつかの実施形態において、本発明のＭａｂまたはその抗原結合フラグメントは、
（ｉ）配列番号２０、３２、３３、３０、３１、および１９にそれぞれ示されるアミノ酸配列を含む、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、ＬＣＤＲ３、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２およびＨＣＤＲ３；
（ｉｉ）配列番号４２、３２、３３、３０、４３、および１９にそれぞれ示されるアミノ酸配列を含む、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、ＬＣＤＲ３、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２およびＨＣＤＲ３；
（ｉｉｉ）配列番号４２、２７、２２、２３、４１、および１９にそれぞれ示されるアミノ酸配列を含む、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、ＬＣＤＲ３、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２およびＨＣＤＲ３；
（ｉｖ）配列番号４２、３２、３３、２３、４１、および１９にそれぞれ示されるアミノ酸配列を含む、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、ＬＣＤＲ３、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２およびＨＣＤＲ３；
（ｖ）配列番号２０、２１、２２、１７、１８、および１９にそれぞれ示されるアミノ酸配列を含む、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、ＬＣＤＲ３、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２およびＨＣＤＲ３；
（ｖｉ）配列番号２０、２７、２９、２３、２４、および１９にそれぞれ示されるアミノ酸配列を含む、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、ＬＣＤＲ３、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２およびＨＣＤＲ３；
（ｖｉｉ）配列番号３７、２７、２２、２３、４１、および１９にそれぞれ示されるアミノ酸配列を含む、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、ＬＣＤＲ３、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２およびＨＣＤＲ３；
（ｖｉｉｉ）配列番号１７０、１７１、１７２、１８２、１７３、および１９にそれぞれ示されるアミノ酸配列を含む、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、ＬＣＤＲ３、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２およびＨＣＤＲ３；
（ｉｘ）配列番号３７、１２７、２２、２３、１１６、および１９にそれぞれ示されるアミノ酸配列を含む、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、ＬＣＤＲ３、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２およびＨＣＤＲ３；
（ｘ）配列番号３７、１２５、２２、２３、１１０、および１９にそれぞれ示されるアミノ酸配列を含む、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、ＬＣＤＲ３、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２およびＨＣＤＲ３；
（ｘｉ）配列番号３７、１２２、２２、２３、１１０、および１９にそれぞれ示されるアミノ酸配列を含む、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、ＬＣＤＲ３、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２およびＨＣＤＲ３；
（ｘｉｉ）配列番号３７、１２９、２２、１０７、１１８、および１２０にそれぞれ示されるアミノ酸配列を含む、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、ＬＣＤＲ３、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２およびＨＣＤＲ３；
（ｘｉｉｉ）配列番号３７、１２８、２２、１０５、４１、および１１９にそれぞれ示されるアミノ酸配列を含む、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、ＬＣＤＲ３、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２およびＨＣＤＲ３；
（ｘｉｖ）配列番号３７、１７４、２２、１７５、１７６、および１２０にそれぞれ示されるアミノ酸配列を含む、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、ＬＣＤＲ３、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２およびＨＣＤＲ３；
（ｘｖｉ）配列番号３７、１２８、２２、１０５、１１７、および１９にそれぞれ示されるアミノ酸配列を含む、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、ＬＣＤＲ３、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２およびＨＣＤＲ３；ならびに
（ｘｖｉｉ）配列番号３７、１７７、２２、２３、１１２、および１９にそれぞれ示されるアミノ酸配列を含む、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、ＬＣＤＲ３、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２およびＨＣＤＲ３
からなる群より選択される６個のＣＤＲを含み、また、本発明のＭａｂまたはその抗原結合フラグメントは、
（ａ）４０３ＳＰＦＥＤＩＲＳＲＦＩＱＧＥＳＩＴＰＴＫ４２２（配列番号１２）；
（ｂ）４０６ＥＤＩＲＳＲＦＩＱＧＥＳＩＴ４１９（配列番号１３）；
（ｃ）４０９ＲＳＲＦＩＱＧＥＳＩＴＰＴＫ４２２（配列番号１４）；
（ｄ）４０３ＳＰＦＥＤＩＲＳＲＦＩＱＧ４１５（配列番号１５）；
（ｅ）４０９ＲＳＲＦＩＱＧＥＳＩＴ４１９（配列番号１６）；および
（ｆ）４０９ＲＳＲＦＩＱＧ４１５（配列番号９５）
からなる群より選択されるアミノ酸配列に局在する１つのアミノ酸または複数のアミノ酸からなるか、またはそれらから実質的になるエピトープにて、好ましくはＭａｂについて２５℃およびＦａｂについて３７℃にてＳＰＲにより測定される場合、約１００ｎＭ未満のＫＤで、配列番号１に示されるアミノ酸配列からなるヒトＦＰＮ１に結合する。
【００１１】
特定の実施形態において、本発明のＭａｂまたはその抗原結合フラグメントは、ヘプシジンにより誘導されるヒトＦＰＮ１の内在化および／または分解を阻害し、これにより、被験体（好ましくは、ヒト被験体）において、（１）細胞からの鉄輸送、（２）血清鉄濃度、（３）網状赤血球数、（４）赤血球数、（５）ヘモグロビン、および／または（６）ヘマトクリットを維持するか、あるいは当該Ｍａｂまたはその抗原結合フラグメントの非存在下での当該被験体におけるそれらのものと比べて少なくとも約１０％増加させる。
【００１２】
別の態様において、本発明の抗ヒトＦＰＮ１Ｍａｂまたはその抗原結合フラグメントをコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドが提供される。
【００１３】
別の態様において、本願明細書に開示されるＭａｂまたはその抗原結合フラグメントのいずれかおよび薬学的に受容可能な担体、希釈剤、または賦形剤を含む薬学的組成物が提供される。また、（１）治療（好ましくは、貧血の治療または予防のための治療）における本願明細書に開示されるＭａｂまたはその抗原結合フラグメントの使用、（２）併用療法（好ましくは、貧血の治療または予防のための併用療法）における本願明細書に開示されるＭａｂまたはその抗原結合フラグメントの使用、（３）被験体（好ましくは、ヒト）において血清鉄濃度、網状赤血球数、赤血球数、ヘモグロビン、および／またはヘマトクリットを維持または増加させる、貧血の治療または予防のための本願明細書に開示されるＭａｂまたはその抗原結合フラグメントの使用、（４）被験体（好ましくは、ヒト）において血清鉄濃度、網状赤血球数、赤血球数、ヘモグロビン、および／またはヘマトクリットを維持または増加させる、貧血の治療または予防のための医薬に製造のための、本願明細書に開示されるＭａｂまたはその抗原結合フラグメントの使用、ならびに、（５）ヒトにおいて血清鉄濃度、網状赤血球数、赤血球数、ヘモグロビン、および／またはヘマトクリットを増加させる、貧血の治療または予防のための併用療法に用いられる医薬の製造のおける本願明細書に開示されるＭａｂまたはその抗原結合フラグメントの使用も提供される。ここで、当該医薬は、貧血の治療に従来から用いられている１つ以上のＥＳＡまたは他の治療剤または治療的処置と組み合わせて投与され、ヒトにおける血清鉄濃度、網状赤血球数、赤血球数、ヘモグロビン、および／またはヘマトクリットを維持または増加させる。
【００１４】
さらに別の態様において、（１）本願明細書において開示される有効量のＭａｂまたはその抗原結合フラグメントを、それを必要とする被験体に対して投与することを含む、被験体（好ましくはヒト）において血清鉄濃度、網状赤血球数、赤血球数、ヘモグロビン、および／またはヘマトクリットを維持または増加させる方法、（２）本願明細書において開示される有効量のＭａｂまたはその抗原結合フラグメントを、それを必要とする被験体（好ましくはヒト）に対して投与することを含む、限定されないが、慢性疾患による貧血、癌による貧血、および、炎症による貧血を含む貧血を治療または予防する方法、（３）本願明細書において開示されるＭａｂまたはその抗原結合フラグメントの組み合わせ、または、本願明細書において開示される少なくとも１つのＭａｂおよび少なくとも１つの抗原結合フラグメントの混合物の有効量を、それを必要とする被験体（好ましくはヒト患者）に対して投与することを含む、限定されないが、慢性疾患による貧血、癌による貧血、および、炎症による貧血を含む貧血を治療または予防する方法、ならびに、（４）ヒトにおいて血清鉄濃度、網状赤血球数、赤血球数、ヘモグロビン、および／またはヘマトクリットを維持または増加させるために投与される、ＥＳＡもしくは他の治療剤または治療的処置を、当該ヒト患者に対して投与することをさらに含む、上述の方法（１）から（３）のうちのいずれかの方法が提供される。
【００１５】
さらに別の態様において、ＦＰＮ１と、本願明細書に開示される有効量の少なくとも１つのＭａｂまたはその抗原結合フラグメントを接触させることを含む、成熟ヘプシジンにより誘導される当該ＦＰＮ１の内在化および分解を阻害するための方法が提供される。
【００１６】
また、ヒトＦＰＮ１と、本願明細書に開示される有効量の少なくとも１つのＭａｂおよび／またはその抗原結合フラグメントを接触させることを含む、当該ヒトＦＰＮ１への成熟ヒトヘプシジンの結合を減少させる方法が提供される。
【００１７】
また、本願明細書に開示される有効量の少なくとも１つのＭａｂおよび／またはその抗原結合フラグメントを、それを必要とするヒト患者に対して投与することを含む、ＦＰＮ１タンパク質を発現する細胞により内在化されるＦＰＮ１タンパク質の量を減少させる方法が提供される。
【図面の簡単な説明】
【００１８】
【図１】図１は、抗ＦＰＮ１抗体の生成に使用される免疫原のフラグメントを含む種々のペプチドの配列、および、抗ＦＰＮ１ Ｍａｂ ３４Ａ９のエピトープを規定するためにペプチドを用いるペプチド−抗体結合実験の結果を示す。下線のアミノ酸は、実際のフェロポーチン配列を示す。Ｍａｂ ３４Ａ９は、ペプチドＦｐｎＥ３ａ、０６０７１９Ｚ、０７０８Ｌ４Ｃ、および０７０８Ｌ４Ｄ（これらはすべて共通アミノ酸配列であるＲＳＲＦＩＱＧ（配列番号９５）を含む）に対して結合する。
【図２】図２Ａは、散在ＣＤＲを有する完全ヒト軽鎖フレームワークＯ２のアミノ酸配列を示す。４つのフレームワーク領域は、ＦＲＬ１、ＦＲＬ２、ＦＲＬ３、およびＦＲＬ４として表記される（それぞれ配列番号７４、７５、７６、および７７）。図２Ｂは、散在ＣＤＲを有するヒト重鎖フレームワークＶＨ１−６９のアミノ酸配列を示す。４つのフレームワーク領域は、ＦＲＨ１〜４として表記される（それぞれ配列番号７８〜８１）。
【図３】図３Ａは、散在ＣＤＲを有するヒト軽鎖フレームワークＯ１８のアミノ酸配列を示す。４つのフレームワーク領域は、ＦＲＬ１、ＦＲＬ２、ＦＲＬ３、およびＦＲＬ４として表記される（それぞれ配列番号７４、７５、８２、および７７）。Ｏ２残基と異なる残基は、太字下線にて示される。図３Ｂは、散在ＣＤＲを有するヒト重鎖フレームワークＶＨ１−１８のアミノ酸配列を示す。４つのフレームワーク領域は、ＦＲＨ１、ＦＲＨ２、ＦＲＨ３、およびＦＲＨ４として表記される（それぞれ配列番号８３、７９、８４、および８１）。ＶＨ１−６９残基と異なる残基は、太字下線にて示される。
【図４】図４Ａは、散在ＣＤＲを有するヒト軽鎖フレームワークＬ１２のアミノ酸配列を示す。４つのフレームワーク領域は、ＦＲＬ１、ＦＲＬ２、ＦＲＬ３、およびＦＲＬ４として表記される（それぞれ配列番号８５、７５、８６、および７７）。Ｏ２残基と異なる残基は、太字下線にて示される。図４Ｂは、散在ＣＤＲを有するヒト重鎖フレームワークＶＨ１−４６のアミノ酸配列を示す。４つのフレームワーク領域は、ＦＲＨ１、ＦＲＨ２、ＦＲＨ３、およびＦＲＨ４として表記される（それぞれ配列番号８３、７９、８７、および８１）。ＶＨ１−６９残基と異なる残基は、太字下線にて示される。
【図５】図５は、散在ＣＤＲを有するヒト軽鎖フレームワークＬ１のアミノ酸配列を示す。４つのフレームワーク領域は、ＦＲＬ１、ＦＲＬ２、ＦＲＬ３、およびＦＲＬ４として表記される（それぞれ配列番号７４、１６８、７６、および１６９）。Ｏ２残基と異なる残基は、太字下線にて示される。ヒト軽鎖フレームワークＬ１２のＦＲ１の生殖細胞系列の配列は、配列番号８５に示され、ここで、ヒト軽鎖フレームワークＬ１のＦＲ１領域のアミノ酸配列の変形は、配列番号７４に示され、本発明の特定の実施形態として企図される。
【図６】図６は、投与量３０ｍｇ／ｋｇの単回Ｉ．Ｖ．として投与された対照マウスＩｇＧ１またはマウスＭａｂ１Ｇ９投与後の雄性カニクイザルにおける血清ヘプシジン濃度のグラフを示す。データは、個々の動物からのものである。
【図７】図７は、投与量３０ｍｇ／ｋｇの単回Ｉ．Ｖ．として投与された対照マウスＩｇＧ１またはマウスＭａｂ１Ｇ９投与後の雄性カニクイザルにおける血清鉄濃度のグラフを示す。データは、個々の動物からのものである。
【図８】図８は、本発明の抗体およびその抗原結合フラグメントについての好ましい重鎖可変領域のアミノ酸配列およびコンセンサスアミノ酸配列を示す。ピリオド（．）は、その位置におけるアミノ酸が配列番号１の対応するアミノ酸と同一であることを示す。ＣＤＲは配列番号１について太線下線にて示される。
【図９】図９は、本発明の抗体およびその抗原結合フラグメントについての好ましい軽鎖可変領域のアミノ酸配列およびコンセンサスアミノ酸配列を示す。ピリオド（．）は、その位置におけるアミノ酸が配列番号１の対応するアミノ酸と同一であることを示す。ＣＤＲは配列番号１について太線下線にて示される。
【図１０】図１０は、０．３、１．０、または３．０ｍｇ／ｋｇの単回ｉ．ｖ．ボーラス投与の後の、カニクイザルにおけるＭａｂ ４Ａ１０−３およびＭａｂ Ｃｏｍｂｉ１１の血清濃度を示す。０．３ｍｇ／ｋｇ投与におけるＭａｂ Ｃｏｍｂｉ１１の血清濃度は、アッセイの検出限界以下（＜２０ ｎｇ／ｍＬ）であった。データは、平均±ＳＤで示される。
【図１１】図１１は、３．０ｍｇ／ｋｇの単回ｉ．ｖ．ボーラス投与の後の、スプラーグドーリー（Ｓｐｒａｇｕｅ Ｄａｗｌｅｙ）ラットにおけるＭａｂ ４Ａ１０−３およびＭａｂ Ｃｏｍｂｉ１１の血清濃度を示す。データは、平均±ＳＤで示される。
【発明を実施するための形態】
【００１９】
以下の略語が本願明細書において使用される。ＢＣＡ：ビシンコニン酸、ＢＳＡ：ウシ血清アルブミン、ＣＤＲ：相補性決定領域、ＤＴＴ：ジチオスレイトール、ＤＭＥＭ：ダルベッコ変法イーグル培地、Ｄ−ＰＢＳ：ダルベッコリン酸緩衝生理食塩水、ＥＤＴＡ：エチレンジアミン四酢酸、ＥＬＩＳＡ：酵素免疫測定法、ＥＳＡ：赤血球生成促進剤、ＦＡＣ：クエン酸第二鉄アンモニウム、ＦＢＳ：ウシ胎仔血清、Ｆｅ：ＮＴＡ：鉄ニトリロ三酢酸、ＦＬＵ：蛍光単位、ＧＦＰ：緑色蛍光タンパク質、Ｉ．Ｖ．：静脈内、ＩＰＴＧ：イソプロピルβ−Ｄ−１−チオガラクトピラノシド、ＩＭＡＣ：固定化金属イオン親和性クロマトグラフィー、Ｍａｂ：モノクローナル抗体、Ｍａｂｓ：モノクローナル抗体（複数）、ＯＰＤ：ｏ−フェニレンジアミン二塩酸塩、ＰＢＳ：リン酸緩衝生理食塩水、ＰＢＳＴ：リン酸緩衝生理食塩水Ｔｗｅｅｎ−２０、ＳＤＳ：ドデシル硫酸ナトリウム、ＴＢＳ：トリス緩衝生理食塩水、Ｔｒｉｓ：トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン、Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ：４−（１，１，３，３−テトラメチルブチル）フェニル−ポリエチレングリコールｔ−オクチルフェノキシポリエトキシエタノールポリエチレングリコールｔｅｒｔ−オクチルフェニルエーテル、Ｔｗｅｅｎ−２０：ポリソフベート２０。
【００２０】
本発明のＭａｂまたはその抗原結合フラグメントは、配列番号１に示されるアミノ酸配列を有するヒトＦＰＮ１ポリペプチドのアミノ酸４０３〜４２２（配列番号１２）に局在する１つのアミノ酸または複数のアミノ酸を含むか、またはそれらから実質的になるか、またはそれらからなるエピトープに結合する。好ましい実施形態において、これらの抗体またはその抗原結合フラグメントは、成熟ヒトヘプシジンにより誘導されるヒトＦＰＮ１の内在化および／または分解を阻害し、これにより、インビトロおよびインビボにおける細胞からの鉄輸送を増加させ、また、インビボにおける血清鉄濃度を上昇させる。例えば、好ましい実施形態において、本発明の抗体は、Ｃａｃｏ−２細胞（インビトロにおいてＦＰＮ１を内在的に発現するヒト腸細胞株（実施例５を参照））内のフェリチンの成熟ヘプシジンにより誘導される蓄積を顕著に減少させる。
【００２１】
天然に存在する完全長抗体は、ジスフィルド結合により相互接続された２本の重鎖および２本の軽鎖を含む免疫グロブリン分子である。各鎖のアミノ末端部分は、その中に含有されるＣＤＲによる抗原認識に主に関連する約１００〜１１０以上のアミノ酸の可変領域を含む。各鎖のカルボキシ末端部分は、エフェクター機能に主に関連する定常領域を規定する。
【００２２】
本願明細書において使用される用語「ＣＤＲ」は、重鎖および軽鎖の両方のポリペプチドの可変領域内に見出される非隣接抗原結合部位を意味することを意図する。これらの特定の領域は、Ｋａｂａｔら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５２，６６０９−６６１６（１９７７）、Ｋａｂａｔら，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ ｐｒｏｔｅｉｎ ｏｆ ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ ｉｎｔｅｒｅｓｔ，（１９９１）、Ｃｈｏｔｈｉａら，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９６：９０１−９１７（１９８７）、および、ＭａｃＣａｌｌｕｍら，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２６２：７３２−７４５（１９９６）に記載され、その定義は、互いに比較した場合、アミノ酸残基の重複またはサブセットを含む。
【００２３】
ＣＤＲは、フレームワーク領域（「ＦＲ」）と称されるより保存的な領域が散在している。各軽鎖可変領域（ＬＣＶＲ）および重鎖可変領域（ＨＣＶＲ）は、３つのＣＤＲおよび４つのＦＲから構成され、以下の順序：ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、ＦＲ４においてアミノ末端からカルボキシ末端まで配列される。軽鎖の３つのＣＤＲは、「ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、およびＬＣＤＲ３」と称され、また、重鎖の３つのＣＤＲは、「ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、およびＨＣＤＲ３」と称される。ＣＤＲは、抗原と特異的に相互作用する形態である多くの残基を含む。ＬＣＶＲおよびＨＣＶＲ領域内のＣＤＲアミノ酸残基の番号付けおよび位置付けは、周知の従来法（例えば、Ｋａｂａｔ，（１９９１）および／またはＣｈｏｔｈｉａ （１９８７））にしたがっている。
【００２４】
本願明細書において使用される語句「Ｋａｂａｔ番号付け」は、当該技術分野において理解され、また、抗体の重鎖および軽鎖領域内の他のアミノ酸残基よりもより可変（すなわち、超可変）であるアミノ酸残基の番号付けシステムを意味する（Ｋａｂａｔら，Ａｎｎ．ＮＹ Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，１９０：３８２−９３（１９７１）；Ｋａｂａｔら，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，第５版，Ｕ．Ｓ．Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ Ｈｕｍａｎ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ，ＮＩＨ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ Ｎｏ．９１−３２４２（１９９１））。
【００２５】
本願明細書において使用される、用語「モノクローナル抗体」（Ｍａｂ）は、単一のコピーまたはクローン（例えば、任意の真核生物、原核生物、または、ファージクローンを含む）に由来する抗体を意味し、その方法によって産生される抗体を意味するのではない。本発明のＭａｂは、好ましくは、均質または実質的に均質な集団において存在する。完全なＭａｂは、２本の重鎖および２本の軽鎖を含む。本発明のモノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメントは、例えば、組み換え技術、ファージディスプレイ技術、合成技術（例えば、ＣＤＲグラフティング）またはこれら技術の組み合わせ、あるいは、当該技術分野において公知な他の技術により産生され得る。
【００２６】
本願明細書において使用される、Ｍａｂの「抗原結合フラグメント」という語句は、例えば、Ｆａｂフラグメント、Ｆａｂ’フラグメント、Ｆ（ａｂ’）２フラグメント、および単鎖Ｆｖフラグメントを含む。
【００２７】
用語「抗体」またはその文法的に変形した型は、他に指定されない限り、Ｍａｂ、その抗原結合フラグメント、および、その組み合わせ（例えば、Ｆａｂの組み合わせ、および、ＭａｂとＦａｂの組み合わせを含む）を意味する。本発明による抗体と類似の機能的特性を示すさらなる抗体は、従来の方法によって産生され得る。例えば、マウスは、例えば、ＦＰＮ１発現細胞、ＦＰＮ１またはそのフラグメントで免疫性を与えられ得、得られた抗体は回収および精製され得、そして、それらが本願明細書に開示される抗体と類似するかたまたは同様の結合特性、薬物動態特性、および、機能的特性を有するかどうかの決定が、本願明細書において以下に示す実施例３〜１４において開示される方法により評価され得る。抗原結合フラグメントはまた、当該技術分野において周知の従来の方法によって調製され得る。抗体および抗原結合フラグメントの生成および精製方法はまた、当該技術分野において周知である。
【００２８】
本願明細書において使用される、語句「特異的に結合する」とは、特定のポリペプチドもしくはペプチド、好ましくは、配列番号１に示されるアミノ酸配列からなるヒトフェロポーチン１またはその特定のペプチドフラグメントに対して、本願明細書において記載される親和性ＥＬＩＳＡまたはＳＰＲアッセイ（または例えば当該技術分野において公知の類似のアッセイ）により測定される場合、約１０００ｎＭ未満、約１００ｎＭ未満、約１０ｎＭ未満、約１ｎＭ未満、約１００ｐＭ未満、または、約１０ｐＭ未満のＫＤで結合する本発明の抗体の能力を意味する。
【００２９】
加えてまたはその代わりに、本発明の抗体に関する語句「特異的に結合する」とは、配列番号１に示されるアミノ酸配列またはそのペプチドフラグメントからなるヒトフェロポーチン１に結合するかまたはそれを検出する抗体の能力を示し、この能力は、別のポリペプチド（例えば、ヘパリン）または任意選択としてヒトフェロポーチン１の別の特定のペプチドフラグメントに結合するかまたはそれを検出する能力よりも、少なくとも約５倍、少なくとも約１０倍、少なくとも約２０倍、少なくとも約５０倍、少なくとも約１００倍、少なくとも約２００倍、少なくとも約５００倍、または、少なくとも約１０００倍よりも大きい。
【００３０】
本発明はまた、Ｍａｂまたはその抗原結合フラグメントをコードするヌクレオチド配列を含む単離されたポリヌクレオチドを提供する。特定の実施形態において、本発明はまた、（ｉ）配列番号５０、５１、５２、１５０、１５２、１５６、１６０、および１６４に示されるアミノ酸配列を有する重鎖ポリペプチド、および／または、（ｉｉ）配列番号５３、５４、５５、１５１、１５４、１５８、１６２、および１６６に示されるアミノ酸配列を有する軽鎖ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む単離されたポリヌクレオチドを提供する。
【００３１】
別の実施形態において、本発明は、Ｍａｂまたはその抗原結合フラグメントをコードするポリヌクレオチドを含む組み換え発現ベクターを提供する。特定の実施形態において、本発明はまた、（ｉ）配列番号５０、５１、５２、１５０、１５２、１５６、１６０、および１６４に示されるアミノ酸配列を有する重鎖ポリペプチド、および／または、（ｉｉ）配列番号５３、５４、５５、１５１、１５４、１５８、１６２、および１６６に示されるアミノ酸配列を有する軽鎖ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含む組み換え発現ベクターを提供する。
【００３２】
本願明細書において使用される場合、用語「ヘプシジン」は、哺乳動物に存在するものとして公知のヘプシジンタンパク質の任意の形態を意味する。本願明細書において使用される場合、用語「成熟ヘプシジン」は、哺乳動物において発現されるヘプシジンタンパク質の任意の成熟した生物活性形態を意味する。本願明細書において使用される場合、語句「ヒトヘプシジン」は、ヒトに存在するヘプシジンタンパク質の任意の形態を意味する。本願明細書において使用される場合、語句「成熟ヒトヘプシジン」は、ヒトに存在するものとして公知のヘプシジンタンパク質の任意の成熟した生物活性形態を意味する。好ましくは、「成熟ヒトヘプシジン」は、配列番号９１に示されるアミノ酸配列を有するヒトヘプシジンの成熟形態である、「ヒトヘプシジン−２５」と称される。
【００３３】
用語「生物活性」は、成熟ヘプシジンポリペプチド（例えば、ヘプシジン−２５）に関し、限定されないが、その受容体ＦＰＮ１に対する成熟ヘプシジンの特異的結合、成熟ヘプシジンの１つ以上のＦＰＮ１により媒介される機能、例えば、（ａ）成熟ヘプシジンにより誘導されるＦＰＮ１の内在化および／または分解（例えば、Ｎｅｍｅｔｈ，Ｅ．ら，Ｓｃｉｅｎｃｅ，３０６：２０９０−２０９３，（２００４））を参照）、（ｂ）ＦＰＮ１により媒介される（ｉ）鉄流出、（ｉｉ）血清鉄濃度、（ｉｉｉ）網状赤血球数、（ｉｖ）赤血球数、（ｖ）ヘモグロビン濃度、（ｖｉ）ヘマトクリット、（ｖｉｉ）ヘプシジンポリペプチドの発現レベル、および／または、（ｖｉｉｉ）ヘプシジンポリペプチドの組織分布の成熟ヘプシジン調節を含む。
【００３４】
語句「ヒト改変抗体」は、本願明細書に開示される特定の抗体、ならびに、本願明細書に開示される抗体と類似する本発明による結合特性および機能的特性を有し、かつ、本願明細書に開示される非ヒト抗体またはその抗原結合フラグメント由来のＣＤＲ周囲の実質的にヒトまたは完全にヒトであるフレームワーク領域を有する抗体を意味する。「フレームワーク領域」または「フレームワーク配列」は、フレームワーク領域１〜４のうちいずれか一つを意味する。本発明により包含されるヒト改変抗体およびその抗原結合フラグメントは、分子を含み、ここで、フレーム領域１〜４のうち任意の１つ以上は、実質的にまたは完全にヒトである（すなわち、ここで、個々の実質的にまたは完全にヒトフレームワーク領域１〜４の任意の可能な組み合わせが存在する）。例えば、これは、実質的にまたは完全にヒトである、フレームワーク領域１およびフレームワーク領域２、フレームワーク領域１およびフレームワーク領域３、フレームワーク領域１、２、および３等の分子を含む。実質的にヒトフレームワークは、既知のヒト生殖細胞系列フレームワーク配列に対して少なくとも約８０％の配列同一性を有するものである。好ましくは、実質的にヒトフレームワークは、既知のヒト生殖細胞系列フレームワーク配列に対して少なくとも約８５％、約９０％、または、約９５％の配列同一性を有するものである。
【００３５】
完全ヒトフレームワークは、既知のヒト生殖細胞系列フレームワーク配列と同一のものである。ヒトフレームワーク生殖細胞系列配列は、ＩｍＭｕｎｏＧｅｎｅＴｉｃｓ（ＩＭＧＴ）からそのウェブサイト（ｈｔｔｐ：／／ｉｍｇｔ．ｃｉｎｅｓ．ｆｒ）により、またはＴｈｅ Ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ Ｆａｃｔｓ Ｂｏｏｋ ｂｙ Ｍａｒｉｅ−Ｐａｕｌｅ Ｌｅｆｒａｎｃ ａｎｄ Ｇｅｒａｒｄ Ｌｅｆｒａｎｃ，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，２００１，ＩＳＢＮ ０１２４４１３５１から取得され得る。例えば、生殖細胞系列軽鎖フレームワークは、Ａｌ１、Ａ１７、Ａ１８、Ａ１９、Ａ２０、Ａ２７、Ａ３０、Ｌ１、Ｌ１１、Ｌ１２、Ｌ２、Ｌ５、Ｌ１５、Ｌ６、Ｌ８、Ｏ１２、Ｏ２、およびＯ８からなる群より選択され得、また、生殖細胞系列重鎖フレームワーク領域は、ＶＨ２−５、ＶＨ２−２６、ＶＨ２−７０、ＶＨ３−２０、ＶＨ３−７２、ＶＨ１−４６、ＶＨ３−９、ＶＨ３−６６、ＶＨ３−７４、ＶＨ４−３１、ＶＨ１−１８、ＶＨ１−６９、ＶＩ−１３−７、ＶＨ３−１１、ＶＨ３−１５、ＶＨ３−２１、ＶＨ３−２３、ＶＨ３−３０、ＶＨ３−４８、ＶＨ４−３９、ＶＨ４−５９、およびＶＨ５−５１からなる群より選択され得る。好ましくは、生殖細胞系列軽鎖フレームワークは、Ｏ２、Ｏ１８、およびＬ１２、Ｌ１からなる群より選択され、また、生殖細胞系列重鎖フレームワーク領域は、ＶＨ１−６９、ＶＨ１−１８、またはＶＨ１−４６からなる群より選択される。より好ましくは、生殖細胞系列軽鎖フレームワークは、Ｏ２およびＬ１からなる群より選択され、また、生殖細胞系列重鎖フレームワークは、ＶＨ１−６９およびＶＨ１−１８からなる群より選択される。最も好ましくは、生殖細胞系列軽鎖フレームワークは、Ｏ２であり、また、生殖細胞系列重鎖フレームワーク領域は、ＶＨ１−６９である。
【００３６】
本願明細書に開示されるヒト改変抗体に加えて、本発明による抗体と類似の機能的特性を示すヒト改変抗体は、いくつかの異なる方法を用いて生成され得る。本願明細書に具体的に開示される抗体は、さらなる抗体を調製するための鋳型または親抗体として使用され得る。１つのアプローチでは、親抗体のＣＤＲは、親抗体フレームワークに対する高い配列同一性を有するヒトフレームワークへとグラフトされる。新規フレームワークの配列同一性は、親抗体中の対応するフレームワークの配列に対して、一般的に、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、または少なくとも約９９％同一でなる。このグラフティングは、親抗体の結合親和性と比較して結合親和性の減少を引き起こし得る。この場合、フレームワークは、Ｑｕｅｅｎら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．，８８：２８６９（１９９１）に開示された、特定の基準に基づいて、特定の位置にて親フレームワークへと復帰突然変異され得る。マウス抗体のヒト化に有用な方法を記載したさらなる参考文献としては、米国特許第４，８１６，３９７号、同第５，２２５，５３９号、および、同第５，６９３，７６１号；Ｌｅｖｉｔｔ，Ｊ．，Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１６８：５９５−６２０（１９８３）に記載されたコンピュータプログラムＡＢＭＯＤおよびＥＮＣＡＤ；ならびに、Ｗｉｎｔｅとその共同研究者の方法（Ｊｏｎｅｓら，Ｎａｔｕｒｅ ３２１：５２２−５２５（１９８６）；Ｒｉｅｃｈｍａｎｎら，Ｎａｔｕｒｅ，３３２：３２３−３２７（１９８８）；およびＶｅｒｈｏｅｙｅｎら，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２３９：１５３４−１５３６（１９８８））。
【００３７】
復帰突然変異について考慮するための残基の同定は、以下に示すように行われ得る。
アミノ酸が以下のカテゴリー下にある場合、使用されているヒト生殖細胞系列配列（「アセプターフレームワーク」）のフレームワークアミノ酸は、親抗体のフレームワーク（「ドナーフレームワーク」）からのフレームワークアミノ酸により置換される。
（ａ）アセプターフレームワークのヒトフレームワーク領域内のアミノ酸は、その位置におけるヒトフレームワークには稀であるが、ドナー免疫グロブリン内の対応するアミノ酸は、その位置におけるヒトフレームワークに典型的である；
（ｂ）アミノ酸の位置は、ＣＤＲのうち一つと直接隣接している；または、
（ｃ）フレームワークアミノ酸の任意の側鎖原子は、３次元免疫グロブリンモデル内のＣＤＲアミノ酸の任意の原子の約５〜６オングストローム（中心間）以内である。
【００３８】
アセプターフレームワークのヒトフレームワーク領域内のアミノ酸の各々、および、ドナーフレームワーク内の対応するアミノ酸が、一般的にその位置におけるヒトフレームワークに稀である場合、このようなアミノ酸は、その位置におけるヒトフレームワークに典型的なアミノ酸により置換され得る。この復帰突然変異基準は、親抗体の活性を復帰させることができる。
【００３９】
本願明細書に開示される抗体に類似する機能的特性を示すヒト改変抗体を生成する別のアプローチは、グラフトされたＣＤＲ内でフレームワークを変更することなくランダムにアミノ酸を変異させること、および、親抗体と同じ程度に良好または親抗体よりも良好な結合親和性および他の機能的特性について、得られた分子をスクリーニングすることに関する。単一突然変異はまた、各ＣＤＲ内の各アミノ酸位置にて導入され得、その後、結合親和性および他の機能的特性についてこのような変異の効果が評価され得る。改善された特性を生み出す単一突然変異は、互いに組み合わせてそれらの効果を評価するために組み合わされ得る。
【００４０】
さらに、上述の両方のアプローチの組み合わせが可能である。ＣＤＲグラフティングの後、１つは、ＣＤＲ内のアミノ酸変化を導入することに加えて、特定のフレームワーク領域に復帰突然変異し得る。この手法は、Ｗｕら，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２９４：１５１−１６２（１９９９）に記載される。好ましくは、フレームワーク内のアミノ酸置換は、本願明細書に開示される軽鎖フレームワーク領域および／または重鎖フレームワーク領域（図２〜５に示されるフレームワーク領域）のうちの任意の１つ以上内にて１つ、２つ、または３つの位置に限定される。好ましくは、ＣＤＲ内のアミノ酸置換は、３つの軽鎖および／または重鎖ＣＤＲのうち任意の１つ以上内にて１つ、２つ、または３つの位置に限定される。フレームワーク領域およびＣＤＲ内の記載された種々の変更の組み合わせもまた、本願明細書において企図される。本発明のこの態様の特定の実施形態において、このようなヒト改変Ｍａｂまたはその抗原結合フラグメントのすべての軽鎖可変領域フレームワーク領域および重鎖可変領域フレームワーク領域は、完全にヒトである。
【００４１】
以下の表１Ａおよび１Ｂは、本発明の好ましい抗体またはその抗原結合フラグメントのＣＤＲアミノ酸配列およびコンセンサスアミノ酸配列を示す。以下の表２Ａおよび２Ｂは、本発明のより好ましい抗体またはその抗原結合フラグメントのＣＤＲアミノ酸配列およびコンセンサスアミノ酸配列を示す。
【００４２】
【表１−１】
【表１−２】
【００４３】
【表２−１】
【表２−２】
＊表１Ａおよび１Ｂ：コンセンサス配列１〜５（Ｃ１〜Ｃ５）において、Ｘ１はＮまたはＳであり、Ｘ２はＥ、ＫまたはＲであり、Ｘ３はＥまたはＡであり、Ｘ６はＳまたはＩであり、Ｘ７はＮまたはＫであり、Ｘ４はＴ、ＫまたはＲであり、Ｘ５はＦ、Ｈ、Ｑであり、Ｘ８はＬ、Ｔ、ＳまたはＡである。
【００４４】
【表３−１】
【表３−２】
【００４５】
【表４−１】
【表４−２】
＊表２Ａおよび２Ｂ：コンセンサス配列６において、Ｘ１はＹ、ＲまたはＫであり、Ｘ２はＡまたはＲであり、Ｘ３はＴまたはＲであり、Ｘ４はＧまたはＲであり、Ｘ５はＧまたはＲであり、Ｘ６はＴまたはＲであり、Ｘ７はＥ、Ｔ、ＳまたはＷであり、Ｘ８はＫまたはＶであり、Ｘ９はＧまたはＲであり、Ｘ１０はＤまたはＶであり、Ｘ１１はＬまたはＲであり、Ｘ１２はＨ、Ｒ、ＶまたはＹであり、Ｘ１３はＳ、ＷまたはＹである。
【００４６】
本発明のさらにより好ましい抗体またはその抗原結合フラグメントは、配列番号１７０、１７１、１７２、２３、１７３、および１９、または配列番号１７０、１７１、１７２、１８２、１７３、および１９にそれぞれ示されるアミノ酸配列含む、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、ＬＣＤＲ３、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、およびＨＣＤＲ３を含む。本発明のさらにより好ましい抗体またはその抗原結合フラグメントは、配列番号３７、１７４、２２、１７５、１７６、および１２０にそれぞれ示されるアミノ酸配列含む、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、ＬＣＤＲ３、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、およびＨＣＤＲ３を含む。薬物動態学的特性（例えば、実施例１１を参照）および薬力学的特性（例えば、実施例１０および１２を参照）、ならびに、例示的な抗ＦＰＮ１ Ｍａｂ、またはその抗原結合フラグメントの機能的特性（例えば、実施例３（エピトープマッピング）、実施例４（親和性）、実施例５（インビトロにおける細胞内のフェリチン濃度の影響）、実施例６（インビトロにてＦＰＮ１−ＧＦＰ融合を発現するよう遺伝子操作された細胞による成熟ヘプシジンの結合の影響）、実施例７および９（インビトロにおけるヘプシジンにより誘導されるＦＰＮ１の内在化および分解の影響）、ならびに実施例８（インビボにおける血清鉄濃度の影響）を参照）に基づくと、本発明の最も好ましいＭａｂまたはその抗原結合フラグメントは、Ｍａｂ ４Ａ１０−３、Ｌ２．２−４、およびＣｏｍ１１ＧＹ、またはその抗原結合フラグメントである。Ｍａｂ ３４Ａ９、１Ｇ９、３Ｄ８、Ｃｏｍｂｉ１１、４Ａ１０−３、Ｌ２．２−４、１Ｂ７、１Ｆ８、およびＣｏｍ１１ＧＹに関する重鎖、軽鎖、重鎖可変領域、軽鎖可変領域、および、ＣＤＲをコードするアミノ酸配列を、配列番号を参照して以下の表３（ａ）および表３（ｂ）に示す。
【００４７】
【表５】
【００４８】
【表６】
【００４９】
一部の実施形態において、本願明細書に開示される抗ＦＰＮ１ Ｍａｂ、またはその抗原結合フラグメントは、ＥＳＡ治療剤単独の投与と比べた場合の貧血患者の血清鉄濃度の増加、ヘマトクリットの増加、ヘモグロビン濃度の増加、輸血の必要性の減少、ならびに／または機能状態、生産性、および生活の質の改善に関するさらなる利点を提供するために、１つ以上のＥＳＡと組み合わせて使用されてもよい。用語「併用療法」または「と組み合わせて」とは、本発明の抗ＦＰＮ１ Ｍａｂ、またはその抗原結合フラグメントが、抗ＦＰＮ１ Ｍａｂ、またはその抗原結合フラグメント単独の投与と比べた場合の貧血患者の血清鉄濃度の増加、ヘマトクリットの増加、ヘモグロビン濃度の増加、輸血の必要性の減少、ならびに／または機能状態、生産性、および生活の質の改善を意図する別の薬剤と別個に、同時に、または連続して投与されることを意味する。
【００５０】
一部の実施形態において、本願明細書に開示される抗ＦＰＮ１ Ｍａｂ、またはその抗原結合フラグメントは、ＥＳＡ治療を許容できないか、またはＥＳＡ治療に反応しない患者においてＥＳＡ治療の代わりに投与されてもよい。
【００５１】
用語「赤血球生成促進剤」または「赤血球生成促進因子」とは、例えば、受容体に結合し、その受容体の二量化を生じることによって、または内因性エリスロポエチン発現を促進することによってエリスロポエチン受容体の直接的または間接的な活性化を引き起こす化合物を意味する。ＥＳＡとしては、エリスロポエチン受容体に結合し、活性化するエリスロポエチンおよびその変異体、類似体、または誘導体；エリスロポエチン受容体に結合し、その受容体を活性化する抗体；あるいはエリスロポエチン受容体に結合し、活性化するペプチド；あるいはエリスロポエチン受容体に結合し、活性化する、必要に応じて分子量が約１０００ダルトン未満の有機化学小化合物が挙げられる。ＥＳＡとしては、限定されないが、エポエチンアルファ、エポエチンベータ、エポエチンデルタ、エポエチンオメガ、エポエチンイオタ、エポエチンゼータ、およびそれらの類似体、ペグ化エリスロポエチン、カルバミル化エリスロポエチン、模倣ペプチド（ＥＭＰｌ／ヘマタイド（ｈｅｍａｔｉｄｅ）を含む）、模倣抗体およびＨＩＦ阻害剤（米国特許出願公開第２００５／００２０４８７号明細書を参照のこと）が挙げられる。例示的なＥＳＡとしては、エリスロポエチン、ダルベポエチン、エリスロポエチンアゴニスト変異体、ならびに米国特許出願公開第２００３／０２１５４４４号および２００６／００４０８５８号に報告されている化合物を含むエリスロポエチン受容体に結合し、活性化するペプチドまたは抗体、ならびに当該技術分野においても公知であるエリスロポエチン分子またはその変異体もしくは類似体が挙げられる。エリスロポエチンとしては、限定されないが、配列番号８８に記載されるアミノ酸配列を含むポリペプチドが挙げられる。用語「エポエチン」には、限定されないが、エポエチンアルファ、エポエチンベータ、エポエチンデルタ、エポエチンオメガ、エポエチンイオタ、エポエチンガンマ、エポエチンゼルタなどが含まれる。さらに、エポエチンはまた、例えば１つ以上の水溶性ポリマー、例えばポリエチレングリコール（ＰＥＧ−ＥＰＯ−ベータを含む）などの化学的に修飾されている上述のエポエチンのいずれかを含む。組み換えヒトエリスロポエチンの例示的な配列、製造、精製および使用は、限定されないが、米国特許第４，７０３，００８号および同第４，６６７，０１６号を含む、多くの特許文献に記載されている。ダーベポエチンおよび他のエリスロポエチン類似体の例示的な配列、製造、精製および使用は、Ｓｔｒｉｃｋｌａｎｄら、９１／０５８６７号、ならびに国際公開第９５／０５４６５号、国際公開第００／２４８９３号、および国際公開第０１／８１４０５号を含む、多くの特許文献に記載されている。天然または類似体ポリペプチドの誘導体には、例えば、水溶性ポリマー（例えばペグ化）、放射性核種、あるいは他の診断的または標的または治療的部分を結合するために、化学的に修飾されているものが含まれる。
【００５２】
用語「赤血球生成活性」とは、インビボアッセイ、例えば赤血球増加性過低酸素症マウスアッセイ（ｅｘｈｙｐｏｘｉｃ，ｐｏｌｙｃｙｔｈｅｍｉｃ ｍｏｕｓｅ ａｓｓａｙ）（例えば、ＣｏｔｅｓおよびＢａｎｇｈａｍ，Ｎａｔｕｒｅ，１９１：１０６５（１９６１）を参照のこと）に実証されるような赤血球生成を促進する活性を意味する。
【００５３】
用語「エピトープ」とは、１つ以上の抗体の抗原結合領域において抗体により認識され、結合され得る任意の分子の部分を指す。エピトープは、しばしば、アミノ酸または糖側鎖などの分子の化学的に活性な表面基からなり、特定の三次元構造特性および特定の電荷特性を有する。本願明細書に開示されるヒトＦＰＮ１エピトープは、ＦＰＮ１の一次アミノ酸構造（配列番号１）の状態で提示される。しかしながら、エピトープの一部は、アミノ酸残基と連続するというよりむしろ、不連続であってもよく、連続ペプチド結合においてというよりむしろ、ＦＰＮ１の三次または四次構造およびこの分子の表面上でそれらの結果として生じる形態の結果として互いに空間的に近接して存在してもよい。好ましくは、本発明の抗ＦＰＮ１ Ｍａｂ、またはその抗原結合フラグメントは、配列番号９に示されるアミノ酸配列に局在する１つのアミノ酸または複数のアミノ酸を含むか、またはそれらから実質的になるか、またはそれらからなるエピトープにて、配列番号１に示されるアミノ酸配列からなるヒトＦＰＮ１に結合する。より好ましくは、本発明の抗ＦＰＮ１ Ｍａｂ、またはその抗原結合フラグメントは、配列番号１２、１３、１４、１５、１６、および９５からなる群より選択されるアミノ酸配列に局在する１つのアミノ酸または複数のアミノ酸を含むか、またはそれらから実質的になるか、またはそれらからなるエピトープにて、配列番号１に示されるアミノ酸配列からなるヒトＦＰＮ１に結合する。さらにより好ましくは、本発明の抗ＦＰＮ１ Ｍａｂ、またはその抗原結合フラグメントは、配列番号１２、１３、１４、１５、１６、および９５からなる群より選択されるアミノ酸配列に局在する１つのアミノ酸または複数のアミノ酸を含むか、またはそれらから実質的になるか、またはそれらからなるエピトープにて、配列番号１に示されるアミノ酸配列からなるヒトＦＰＮ１に結合するが、配列番号９８、１８３〜２１４からなる群より選択される１つ以上のペプチドに結合しない。
【００５４】
本発明の抗体はまた、カニクイザルＦＰＮ１（配列番号３）に結合し、義務的な前臨床の安全性および１種以上の主要なモデルにおける効果的な治療薬開発研究を促進する。
【００５５】
用語「ヒトフェロポーチン１」または、代替的に、「ヒトＦＰＮ１」とは、配列番号１に示されるアミノ酸配列を有する、ヒトにおいて発現される鉄輸送タンパク質を指し、また、成熟ヒトヘプシジンとの相互作用に応答して細胞内の鉄を排出する能力を保持する変異体を指す。
【００５６】
好ましくは、本発明の抗ＦＰＮ１ Ｍａｂ、またはその抗原結合フラグメントは、
１）配列番号１３６および配列番号１３４にそれぞれ示される軽鎖可変領域および重鎖可変領域；
２）配列番号１８０および配列番号１７８にそれぞれ示される軽鎖可変領域および重鎖可変領域；または
３）配列番号１４０および配列番号１３８にそれぞれ示される軽鎖可変領域および重鎖可変領域、
を含む。さらにより好ましくは、本発明の抗ＦＰＮ１ Ｍａｂ、またはその抗原結合フラグメントは、
１）配列番号１５４および配列番号１５２にそれぞれ示される軽鎖および重鎖；
２）配列番号１８１および配列番号１７９にそれぞれ示される軽鎖および重鎖；または
３）配列番号１５８および配列番号１５６にそれぞれ示される軽鎖および重鎖、
を含む。さらにより好ましくは、本発明のモノクローナル抗体または抗原結合フラグメントは、
１）２本の軽鎖ポリペプチドおよび２本の重鎖ポリペプチドであって、その軽鎖ポリペプチドの各々は配列番号１５４に示されるアミノ酸配列を有し、その重鎖ポリペプチドの各々は配列番号１５２に示されるアミノ酸配列を有する、２本の軽鎖ポリペプチドおよび２本の重鎖ポリペプチド；
２）２本の軽鎖ポリペプチドおよび２本の重鎖ポリペプチドであって、その軽鎖ポリペプチドの各々は配列番号１８１に示されるアミノ酸配列を有し、その重鎖ポリペプチドの各々は配列番号１７９に示されるアミノ酸配列を有する、２本の軽鎖ポリペプチドおよび２本の重鎖ポリペプチド；または
３）２本の軽鎖ポリペプチドおよび２本の重鎖ポリペプチドであって、その軽鎖ポリペプチドの各々は配列番号１５８に示されるアミノ酸配列を有し、その重鎖ポリペプチドの各々は配列番号１５６に示されるアミノ酸配列を有する、２本の軽鎖ポリペプチドおよび２本の重鎖ポリペプチドを含む。さらにより好ましくは、本発明のモノクローナル抗体または抗原結合フラグメントは、２５℃にて表面プラズモン共鳴によって測定される場合、約１０ｎＭ未満のＫＤでヒトフェロポーチン１に結合する。さらにより好ましくは、本発明のモノクローナル抗体または抗原結合フラグメントはＦａｂを含み、そのＦａｂは、３７℃にて表面プラズモン共鳴によって測定される場合、約１００ｎＭ未満のＫＤでヒトフェロポーチン１に結合する。さらにより好ましくは、Ｆａｂは、３７℃にてＳＰＲによって測定される場合、ヒトフェロポーチン１に対して約７．５×１０−３Ｓ−１〜約９×１０−４ｓ−１の解離速度（ｋｏｆｆ）を有する。さらにより好ましくは、Ｆａｂは、約１００ｎＭ〜約１ｎＭのＫＤでヒトフェロポーチン１に結合する。さらにより好ましくは、Ｆａｂは、約１０ｎＭ〜約０．５ｎＭのＫＤでヒトフェロポーチン１に結合する。さらにより好ましくは、モノクローナル抗体または抗原結合フラグメントは、ヘプシジン−２５生物活性のインビトロアッセイにおいて約１００ｎＭ〜約１ｎＭのＩＣ５０を有する。さらにより好ましくは、モノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメントは、ヘプシジン−２５生物活性のインビトロアッセイにおいて約１００ｎＭ〜約１０ｎＭのＩＣ５０を有する。さらにより好ましくは、ヘプシジン−２５生物活性は、フェロポーチン１の内在化および／または分解である。さらにより好ましくは、モノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメントは、ヘプシジン−２５生物活性のインビボアッセイにおいて約１００ｎＭ〜約１ｎＭのＩＣ５０を有する。さらにより好ましくは、ヘプシジン−２５生物活性のインビボアッセイは、霊長類における血清鉄濃度のＩＬ−６により誘導される減少を測定する。最も好ましくは、抗ＦＰＮ１ Ｍａｂ、またはその抗原結合フラグメントは、配列番号９８、１８３〜２１４からなる群より選択される１つ以上のペプチドに結合しない。
【００５７】
特定の実施形態において、本発明の抗ＦＰＮ１ Ｍａｂ、またはその抗原結合フラグメントは、好ましくはＭａｂについて２５℃、およびＦａｂについて３７℃にてＳＰＲによって測定される場合、約１００ｎＭ未満、約７５ｎＭ未満、約５０ｎＭ未満、約２５ｎＭ未満、または約１０ｎＭ未満のＫＤで、配列番号１２、１３、１４、１５、１６、および９５からなる群より選択されるアミノ酸配列に局在する１つのアミノ酸または複数のアミノ酸を含むか、またはそれらから実質的になるか、またはそれらからなるエピトープにて、配列番号１に示されるアミノ酸配列からなるヒトＦＰＮ１に結合することにより特徴付けられる。好ましくは、抗ＦＰＮ Ｍａｂ、またはその抗原結合フラグメントは、配列番号９８、１８３〜２１４からなる群より選択される１つ以上のペプチドに結合しない。
【００５８】
特定の実施形態において、本発明の抗ＦＰＮ１ Ｍａｂ、またはその抗原結合フラグメントは、好ましくはＭａｂについて２５℃、およびＦａｂについて３７℃にてＳＰＲによって測定される場合、約１００ｎＭ〜約０．５ｎＭ、好ましくは約１００ｎＭ〜約０．５ｎＭ、より好ましくは約７５ｎＭ〜約５ｎＭ、さらにより好ましくは約５０ｎＭ〜約１０ｎＭ、さらにより好ましくは約１５ｎＭ〜約１０ｎＭ、さらにより好ましくは約１０ｎＭ〜約０．５ｎＭ、さらにより好ましくは約５ｎＭ〜約０．５ｎＭ、さらにより好ましくは約５ｎｍ〜約０．７ｎＭ、さらにより好ましくは約３ｎＭ〜約０．７ｎＭ、または最も好ましくは約３ｎＭ〜約１ｎＭのＫＤで、配列番号１２、１３、１４、１５、１６、および９５からなる群より選択されるアミノ酸または配列番号１２、１３、１４、１５、１６、および９５からなる群より選択されるアミノ酸配列に局在する１つのアミノ酸または複数のアミノ酸を含むか、またはそれらから実質的になるか、またはそれらからなるエピトープにて、配列番号１に示されるアミノ酸配列からなるヒトＦＰＮ１に結合することにより特徴付けられる。好ましくは、抗ＦＰＮ１ Ｍａｂ、またはその抗原結合フラグメントは、配列番号９８、１８３〜２１４からなる群より選択される１つ以上のペプチドに結合しない。
【００５９】
特定の実施形態において、本発明の抗ＦＰＮ１ Ｍａｂ、またはその抗原結合フラグメントは、好ましくはＭａｂについて２５℃、およびＦａｂについて３７℃にてＳＰＲによって測定される場合、約７．５×１０−３ｓ−１〜約１×１０−４ｓ−１、好ましくは約２．５×１０−３ｓ−１〜約１×１０−４ｓ−１、より好ましくは約１×１０−３ｓ−１〜約１×１０−４ｓ−１、さらにより好ましくは約５×１０−４ｓ−１〜約１×１０−４ｓ−１の、ヒトフェロポーチン１に対する解離速度（ｋｏｆｆ）で、配列番号１２、１３、１４、１５、１６、および９５からなる群より選択されるアミノ酸配列に局在する１つのアミノ酸または複数のアミノ酸を含むか、またはそれらから実質的になるか、またはそれらからなるエピトープにて、配列番号１に示されるアミノ酸配列からなるヒトＦＰＮ１に結合することにより特徴付けられる。好ましくは、抗ＦＰＮ１ Ｍａｂ、またはその抗原結合フラグメントは、配列番号９８、１８３〜２１４からなる群より選択される１つ以上のペプチドに結合しない。
【００６０】
特定の実施形態において、本発明の抗ＦＰＮ１ Ｍａｂ、またはその抗原結合フラグメントは、好ましくはＭａｂについて２５℃、およびＦａｂについて３７℃にてＳＰＲによって測定される場合、約１００ｎＭ未満、約７５ｎＭ未満、約５０ｎＭ未満、約２５ｎＭ未満、または約１０ｎＭ未満のＫＤ、かつ、約７．５×１０−３ｓ−１〜約１×１０−４ｓ−１、好ましくは約２．５×１０−３ｓ−１〜約１×１０−４ｓ−１、より好ましくは約１×１０−３ｓ−１〜約１×１０−４ｓ−１、さらにより好ましくは約５×１０−４ｓ−１〜約１×１０−４ｓ−１の、ヒトフェロポーチン１に対する解離速度（ｋｏｆｆ）で、配列番号１２、１３、１４、１５、１６、および９５からなる群より選択されるアミノ酸配列に局在する１つのアミノ酸または複数のアミノ酸を含むか、またはそれらから実質的になるか、またはそれらからなるエピトープにて、配列番号１に示されるアミノ酸配列からなるヒトＦＰＮ１に結合することにより特徴付けられる。好ましくは、抗ＦＰＮ１ Ｍａｂ、またはその抗原結合フラグメントは、配列番号９８、１８３〜２１４からなる群より選択される１つ以上のペプチドに結合しない。
【００６１】
特定の実施形態において、本発明の抗ＦＰＮ１ Ｍａｂ、またはその抗原結合フラグメントは、好ましくはＭａｂについて２５℃、およびＦａｂについて３７℃にてＳＰＲによって測定される場合、約１００ｎＭ〜約０．５ｎＭ、好ましくは約１００ｎＭ〜約１ｎＭ、より好ましくは約７５ｎＭ〜約５ｎＭ、さらにより好ましくは約５０ｎＭ〜約１０ｎＭ、さらにより好ましくは約１５ｎＭ〜約１０ｎＭ、さらにより好ましくは約１０ｎＭ〜約０．５ｎＭ、さらにより好ましくは約５ｎＭ〜約０．５ｎＭ、さらにより好ましくは約５ｎＭ〜約０．７ｎＭ、さらにより好ましくは約３ｎＭ〜約０．７ｎＭ、または最も好ましくは約３ｎＭ〜約１ｎＭのＫＤ、かつ、約７．５×１０−３ｓ−１〜約１×１０−４ｓ−１、好ましくは約２．５×１０−３ｓ−１〜約１×１０−４ｓ−１、より好ましくは約１×１０−３ｓ−１〜約１×１０−４ｓ−１、さらにより好ましくは約５×１０−４ｓ−１〜約１×１０−４ｓ−１の、ヒトフェロポーチン１に対する解離速度（ｋｏｆｆ）で、配列番号１２、１３、１４、１５、１６、および９５からなる群より選択されるアミノ酸または配列番号１２、１３、１４、１５、１６、および９５からなる群より選択されるアミノ酸配列に局在する１つのアミノ酸または複数のアミノ酸を含むか、またはそれらから実質的になるか、またはそれらからなるエピトープにて、配列番号１に示されるアミノ酸配列からなるヒトＦＰＮ１に結合することにより特徴付けられる。好ましくは、抗ＦＰＮ１ Ｍａｂ、またはその抗原結合フラグメントは、配列番号９８、１８３〜２１４からなる群より選択される１つ以上のペプチドに結合しない。
【００６２】
特定の実施形態において、本発明の抗ＦＰＮ１ Ｍａｂ、またはその抗原結合フラグメントは、配列番号３７、１２９、２２、１０７、１１８、および１２０にそれぞれ示されるアミノ酸配列を含むＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、ＬＣＤＲ３、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、およびＨＣＤＲ３を含み、好ましくはＭａｂについて２５℃、およびＦａｂについて３７℃にてＳＰＲによって測定される場合、約１００ｎＭ未満、約７５ｎＭ未満、約５０ｎＭ未満、約２５ｎＭ未満、または約１０ｎＭ未満のＫＤで、配列番号１２、１３、１４、１５、１６、および９５からなる群より選択されるアミノ酸配列に局在する１つのアミノ酸または複数のアミノ酸を含むか、またはそれらから実質的になるか、またはそれらからなるエピトープにて、配列番号１に示されるアミノ酸配列からなるヒトＦＰＮ１に結合する。好ましくは、抗ＦＰＮ１ Ｍａｂ、またはその抗原結合フラグメントは、配列番号９８、１８３〜２１４からなる群より選択される１つ以上のペプチドに結合しない。
【００６３】
一部の実施形態において、本発明の抗ＦＰＮ１ Ｍａｂ、またはその抗原結合フラグメントは、配列番号３７、１２９、２２、１０７、１１８、および１２０にそれぞれ示されるアミノ酸配列を含むＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、ＬＣＤＲ３、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、およびＨＣＤＲ３を含み、好ましくはＭａｂについて２５℃、およびＦａｂについて３７℃にてＳＰＲによって測定される場合、約１００ｎＭ〜約０．５ｎＭ、好ましくは約１００ｎＭ〜約１ｎＭ、より好ましくは約７５ｎＭ〜約５ｎＭ、さらにより好ましくは約５０ｎＭ〜約１０ｎＭ、さらにより好ましくは約１５ｎＭ〜約１０ｎＭ、さらにより好ましくは約１０ｎＭ〜約０．５ｎＭ、さらにより好ましくは約５ｎＭ〜約０．５ｎＭ、さらにより好ましくは約５ｎＭ〜約０．７ｎＭ、さらにより好ましくは約３ｎＭ〜約０．７ｎＭ、または最も好ましくは約３ｎＭ〜約１ｎＭのＫＤで、配列番号１２、１３、１４、１５、１６、および９５からなる群より選択されるアミノ酸配列に局在する１つのアミノ酸または複数のアミノ酸を含むか、またはそれらから実質的になるか、またはそれらからなるエピトープにて、配列番号１に示されるアミノ酸配列からなるヒトＦＰＮ１に結合する。好ましくは、抗ＦＰＮ１ Ｍａｂ、またはその抗原結合フラグメントは、配列番号９８、１８３〜２１４からなる群より選択される１つ以上のペプチドに結合しない。
【００６４】
他の実施形態において、本発明は、配列番号３７、１２９、２２、１０７、１１８、および１２０にそれぞれ示されるアミノ酸配列を含むＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、ＬＣＤＲ３、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、およびＨＣＤＲ３を含み、好ましくはＭａｂについて２５℃、およびＦａｂについて３７℃にてＳＰＲによって測定される場合、約７．５×１０−３ｓ−１〜約１×１０−４ｓ−１、好ましくは約２．５×１０−３ｓ−１〜約１×１０−４ｓ−１、より好ましくは約１×１０−３ｓ−１〜約１×１０−４ｓ−１、さらにより好ましくは約５×１０−４ｓ−１〜約１×１０−４ｓ−１の、ヒトフェロポーチン１に対する解離速度（ｋｏｆｆ）で、配列番号１２、１３、１４、１５、１６、および９５からなる群より選択されるアミノ酸配列に局在する１つのアミノ酸または複数のアミノ酸を含むか、またはそれらから実質的になるか、またはそれらからなるエピトープにて、配列番号１に示されるアミノ酸配列からなるヒトＦＰＮ１に結合する、Ｍａｂまたはその抗原結合フラグメントを提供する。好ましくは、抗ＦＰＮ１ Ｍａｂ、またはその抗原結合フラグメントは、配列番号９８、１８３〜２１４からなる群より選択される１つ以上のペプチドに結合しない。
【００６５】
特定の実施形態において、本発明の抗ＦＰＮ１ Ｍａｂ、またはその抗原結合フラグメントは、配列番号３７、１２９、２２、１０７、１１８、および１２０にそれぞれ示されるアミノ酸配列を含むＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、ＬＣＤＲ３、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、およびＨＣＤＲ３を含み、好ましくはＭａｂについて２５℃、およびＦａｂについて３７℃にてＳＰＲによって測定される場合、約１００ｎＭ未満、約７５ｎＭ未満、約５０ｎＭ未満、約２５ｎＭ未満、または約１０ｎＭ未満のＫＤ、かつ、約７．５×１０−３ｓ−１〜約１×１０−４ｓ−１、好ましくは約２．５×１０−３ｓ−１〜約１×１０−４ｓ−１、より好ましくは約１×１０−３ｓ−１〜約１×１０−４ｓ−１、さらにより好ましくは約５×１０−４ｓ−１〜約１×１０−４ｓ−１の、ヒトフェロポーチン１に対する解離速度（ｋｏｆｆ）で、配列番号１２、１３、１４、１５、１６、および９５からなる群より選択されるアミノ酸または配列番号１２、１３、１４、１５、１６、および９５からなる群より選択されるアミノ酸配列に局在する１つのアミノ酸または複数のアミノ酸を含むか、またはそれらから実質的になるか、またはそれらからなるエピトープにて、配列番号１に示されるアミノ酸配列からなるヒトＦＰＮ１に結合する。好ましくは、抗ＦＰＮ Ｍａｂ、またはその抗原結合フラグメントは、配列番号９８、１８３〜２１４からなる群より選択される１つ以上のペプチドに結合しない。
【００６６】
一部の実施形態において、本発明の抗ＦＰＮ１ Ｍａｂ、またはその抗原結合フラグメントは、配列番号３７、１２９、２２、１０７、１１８、および１２０にそれぞれ示されるアミノ酸配列を含むＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、ＬＣＤＲ３、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、およびＨＣＤＲ３を含み、好ましくはＭａｂについて２５℃、およびＦａｂについて３７℃にてＳＰＲによって測定される場合、約１００ｎＭ〜約０．５ｎＭ、好ましくは約１００ｎＭ〜約１ｎＭ、より好ましくは約７５ｎＭ〜約５ｎＭ、さらにより好ましくは約５０ｎＭ〜約１０ｎＭ、さらにより好ましくは約１５ｎＭ〜約１０ｎＭ、さらにより好ましくは約１０ｎＭ〜約０．５ｎＭ、さらにより好ましくは約５ｎＭ〜約０．５ｎＭ、さらにより好ましくは約５ｎＭ〜約０．７ｎＭ、さらにより好ましくは約３ｎＭ〜約０．７ｎＭ、または最も好ましくは約３ｎＭ〜約１ｎＭのＫＤ、かつ、約７．５×１０−３ｓ−１〜約１×１０−４ｓ−１、好ましくは約２．５×１０−３ｓ−１〜約１×１０−４ｓ−１、より好ましくは約１×１０−３ｓ−１〜約１×１０−４ｓ−１、さらにより好ましくは約５×１０−４ｓ−１〜約１×１０−４ｓ−１の、ヒトフェロポーチン１に対する解離速度（ｋｏｆｆ）で、配列番号１２、１３、１４、１５、１６、および９５からなる群より選択されるアミノ酸配列に局在する１つのアミノ酸または複数のアミノ酸を含むか、またはそれらから実質的になるか、またはそれらからなるエピトープにて、配列番号１に示されるアミノ酸配列からなるヒトＦＰＮ１に結合する。好ましくは、抗ＦＰＮ１ Ｍａｂ、またはその抗原結合フラグメントは、配列番号９８、１８３〜２１４からなる群より選択される１つ以上のペプチドに結合しない。
【００６７】
用語「阻害する」とは、ＦＰＮ１の生物学的作用および／または限定されないが、例えば本願明細書の実施例５〜１１、１３もしくは１４において測定される成熟ヒトヘプシジン生物活性を含む、成熟ヘプシジンの生物活性を拮抗、妨げ、防止、抑制、遅延、破壊、除去、停止、減少、または反転する能力を意味する。
【００６８】
特定の実施形態において、本発明の抗ＦＰＮ１ Ｍａｂ、またはその抗原結合フラグメントは、ヘプシジン−２５生物活性のインビボアッセイにおいて約２５０ｎＭ〜約２５ｎＭ、好ましくは１００ｎＭ〜約２５ｎＭ、またはより好ましくは５０ｎＭ〜約２５ｎＭのＩＣ５０を有することにより特徴付けられる。好ましくは、インビボアッセイは、血清鉄濃度のＩＬ−６により誘導される減少を測定する。
【００６９】
さらに、または代替として、本発明の抗ＦＰＮ１ Ｍａｂ、またはその抗原結合フラグメントは、ヘプシジン−２５生物活性のインビトロアッセイにおいて、約１００ｎＭ〜約１ｎＭ、好ましくは約７５ｎＭ〜約１ｎＭ、より好ましくは約５０ｎＭ〜約１ｎＭ、さらにより好ましくは約２５ｎＭ〜約１ｎＭのＩＣ５０を有することにより特徴付けられる。好ましくは、ヘプシジン−２５生物活性アッセイのインビトロアッセイは、ヘプシジンにより誘導されるフェロポーチン１の内在化および／または分解を測定する。さらにより好ましくは、抗ＦＰＮ１ Ｍａｂ、またはその抗原結合フラグメントは、配列番号９８、１８３〜２１４からなる群より選択される１つ以上のペプチドに結合しない。
【００７０】
特定の実施形態において、本発明の抗ＦＰＮ１ Ｍａｂ、またはその抗原結合フラグメントは、好ましくはＭａｂについて２５℃、およびＦａｂについて３７℃にてＳＰＲによって測定される場合、約１００ｎＭ未満、約７５ｎＭ未満、約５０ｎＭ未満、約２５ｎＭ未満、または約１０ｎＭ未満のＫＤ、かつ、ヘプシジン−２５生物活性のインビボアッセイにおいて約２５０ｎＭ〜約２５ｎＭ、好ましくは１００ｎＭ〜約２５ｎＭ、またはより好ましくは５０ｎＭ〜約２５ｎＭのＩＣ５０で、配列番号１２、１３、１４、１５、１６、および９５からなる群より選択されるアミノ酸配列に局在する１つのアミノ酸または複数のアミノ酸を含むか、またはそれらから実質的になるか、またはそれらからなるエピトープにて、配列番号１に示されるアミノ酸配列からなるヒトＦＰＮ１に結合することにより特徴付けられる。好ましくは、インビボアッセイは、血清鉄濃度のＩＬ−６により誘導される減少を測定する。さらにより好ましくは、抗ＦＰＮ１ Ｍａｂ、またはその抗原結合フラグメントは、配列番号９８、１８３〜２１４からなる群より選択される１つ以上のペプチドに結合しない。
【００７１】
特定の実施形態において、本発明の抗ＦＰＮ１ Ｍａｂ、またはその抗原結合フラグメントは、好ましくはＭａｂについて２５℃、およびＦａｂについて３７℃にてＳＰＲによって測定される場合、約１００ｎＭ〜約０．５ｎＭ、好ましくは約１００ｎＭ〜約１ｎＭ、より好ましくは約７５ｎＭ〜約５ｎＭ、さらにより好ましくは約５０ｎＭ〜約１０ｎＭ、さらにより好ましくは約１５ｎＭ〜約１０ｎＭ、さらにより好ましくは約１０ｎＭ〜約０．５ｎＭ、さらにより好ましくは約５ｎＭ〜約０．５ｎＭ、さらにより好ましくは約５ｎＭ〜約０．７ｎＭ、さらにより好ましくは約３ｎＭ〜約０．７ｎＭ、または最も好ましくは約３ｎＭ〜約１ｎＭのＫＤで、配列番号１２、１３、１４、１５、１６、および９５からなる群より選択されるアミノ酸配列に局在する１つのアミノ酸または複数のアミノ酸を含むか、またはそれらから実質的になるか、またはそれらからなるエピトープにて、配列番号１に示されるアミノ酸配列からなるヒトＦＰＮ１に結合することにより特徴付けられ、ヘプシジン−２５生物活性のインビボアッセイにおいて約２５０ｎＭ〜約２５ｎＭ、好ましくは１００ｎＭ〜約２５ｎＭ、またはより好ましくは５０ｎＭ〜約２５ｎＭのＩＣ５０を有することによりさらに特徴付けられる。好ましくは、インビボアッセイは、血清鉄濃度のＩＬ−６により誘導される減少を測定する。さらにより好ましくは、抗ＦＰＮ１ Ｍａｂ、または抗原結合フラグメントは、配列番号９８、１８３〜２１４からなる群より選択される１つ以上のペプチドに結合しない。
【００７２】
特定の実施形態において、本発明の抗ＦＰＮ１ Ｍａｂ、またはその抗原結合フラグメントは、好ましくはＭａｂについて２５℃、およびＦａｂについて３７℃にてＳＰＲによって測定される場合、約１００ｎＭ〜約０．５ｎＭ、好ましくは約１００ｎＭ〜約１ｎＭ、より好ましくは約７５ｎＭ〜約５ｎＭ、さらにより好ましくは約５０ｎＭ〜約１０ｎＭ、さらにより好ましくは約１５ｎＭ〜約１０ｎＭ、さらにより好ましくは約１０ｎＭ〜約０．５ｎＭ、さらにより好ましくは約５ｎＭ〜約０．５ｎＭ、さらにより好ましくは約５ｎＭ〜約０．７ｎＭ、さらにより好ましくは約３ｎＭ〜約０．７ｎＭ、または最も好ましくは約３ｎＭ〜約１ｎＭのＫＤで、配列番号１２、１３、１４、１５、１６、および９５からなる群より選択されるアミノ酸配列に局在する１つのアミノ酸または複数のアミノ酸を含むか、またはそれらから実質的になるか、またはそれらからなるエピトープにて、配列番号１に示されるアミノ酸配列からなるヒトＦＰＮ１に結合し、好ましくはＭａｂについて２５℃、およびＦａｂについて３７℃にてＳＰＲによって測定される場合、約７．５×１０−３ｓ−１〜約１×１０−４ｓ−１、好ましくは約２．５×１０−３ｓ−１〜約１×１０−４ｓ−１、より好ましくは約１×１０−３ｓ−１〜約１×１０−４ｓ−１、さらにより好ましくは約５×１０−４ｓ−１〜約１×１０−４ｓ−１の、ヒトフェロポーチン１に対する解離速度（ｋｏｆｆ）を有することにより特徴付けられ、さらに、ヘプシジン−２５生物活性のインビボアッセイにおいて約２５０ｎＭ〜約２５ｎＭ、好ましくは１００ｎＭ〜約２５ｎＭ、またはより好ましくは５０ｎＭ〜約２５ｎＭのＩＣ５０を有することにより特徴付けられる。好ましくは、インビボアッセイは、血清鉄濃度のＩＬ−６により誘導される減少を測定する。さらにより好ましくは、抗ＦＰＮ１ Ｍａｂ、またはその抗原結合フラグメントは、配列番号９８、１８３〜２１４からなる群より選択される１つ以上のペプチドに結合しない。
【００７３】
特定の実施形態において、本発明の抗ＦＰＮ１ Ｍａｂ、またはその抗原結合フラグメントは、配列番号３７、１２９、２２、１０７、１１８、および１２０にそれぞれ示されるアミノ酸配列を含むＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、ＬＣＤＲ３、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、およびＨＣＤＲ３を含み、好ましくはＭａｂについて２５℃、およびＦａｂについて３７℃にてＳＰＲによって測定される場合、約１００ｎＭ未満、約７５ｎＭ未満、約５０ｎＭ未満、約２５ｎＭ未満、または約１０ｎＭ未満のＫＤ、かつ、好ましくはＭａｂについて２５℃、およびＦａｂについて３７℃にてＳＰＲによって測定される場合、約７．５×１０−３ｓ−１〜約１×１０−４ｓ−１、好ましくは約２．５×１０−３ｓ−１〜約１×１０−４ｓ−１、より好ましくは約１×１０−３ｓ−１〜約１×１０−４ｓ−１、さらにより好ましくは約５×１０−４ｓ−１〜約１×１０−４ｓ−１の、ヒトフェロポーチン１に対する解離速度（ｋｏｆｆ）で、配列番号１２、１３、１４、１５、１６、および９５からなる群より選択されるアミノ酸配列に局在する１つのアミノ酸または複数のアミノ酸を含むか、またはそれらから実質的になるか、またはそれらからなるエピトープにて、配列番号１に示されるアミノ酸配列からなるヒトＦＰＮ１に結合し、さらに、ヘプシジン−２５生物活性のインビボアッセイにおいて約２５０ｎＭ〜約２５ｎＭ、好ましくは１００ｎＭ〜約２５ｎＭ、またはより好ましくは５０ｎＭ〜約２５ｎＭのＩＣ５０を有することにより特徴付けられる。好ましくは、インビボアッセイは、血清鉄濃度のＩＬ−６により誘導される減少を測定する。さらにより好ましくは、抗ＦＰＮ Ｍａｂ、またはその抗原結合フラグメントは、配列番号９８、１８３〜２１４からなる群より選択される１つ以上のペプチドに結合しない。
【００７４】
一部の実施形態において、本発明の抗ＦＰＮ１ Ｍａｂ、またはその抗原結合フラグメントは、配列番号３７、１２９、２２、１０７、１１８、および１２０にそれぞれ示されるアミノ酸配列を含むＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、ＬＣＤＲ３、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、およびＨＣＤＲ３を含み、好ましくはＭａｂについて２５℃、およびＦａｂについて３７℃にてＳＰＲによって測定される場合、約１００ｎＭ〜約０．５ｎＭ、好ましくは約１００ｎＭ〜約１ｎＭ、より好ましくは約７５ｎＭ〜約５ｎＭ、さらにより好ましくは約５０ｎＭ〜約１０ｎＭ、さらにより好ましくは約１５ｎＭ〜約１０ｎＭ、さらにより好ましくは約１０ｎＭ〜約０．５ｎＭ、さらにより好ましくは約５ｎＭ〜約０．５ｎＭ、さらにより好ましくは約５ｎＭ〜約０．７ｎＭ、さらにより好ましくは約３ｎＭ〜約０．７ｎＭ、または最も好ましくは約３ｎＭ〜約１ｎＭのＫＤ、かつ、好ましくはＭａｂについて２５℃、およびＦａｂについて３７℃にてＳＰＲによって測定される場合、約７．５×１０−３ｓ−１〜約１×１０−４ｓ−１、好ましくは約２．５×１０−３ｓ−１〜約１×１０−４ｓ−１、より好ましくは約１×１０−３ｓ−１〜約１×１０−４ｓ−１、さらにより好ましくは約５×１０−４ｓ−１〜約１×１０−４ｓ−１の、ヒトフェロポーチン１に対する解離速度（ｋｏｆｆ）で、配列番号１２、１３、１４、１５、１６、および９５からなる群より選択されるアミノ酸配列に局在する１つのアミノ酸または複数のアミノ酸を含むか、またはそれらから実質的になるか、またはそれらからなるエピトープにて、配列番号１に示されるアミノ酸配列からなるヒトＦＰＮ１に結合し、さらに、ヘプシジン−２５生物活性のインビボアッセイにおいて、約２５０ｎＭ〜約２５ｎＭ、好ましくは１００ｎＭ〜約２５ｎＭ、またはより好ましくは５０ｎＭ〜約２５ｎＭのＩＣ５０を有することにより特徴付けられる。好ましくは、インビボアッセイは、血清鉄濃度のＩＬ−６により誘導される減少を測定する。さらにより好ましくは、抗ＦＰＮ１ Ｍａｂ、またはその抗原結合フラグメントは、配列番号９８、１８３〜２１４からなる群より選択される１つ以上のペプチドに結合しない。
【００７５】
本発明の一部の実施形態において、抗ＦＰＮ１ Ｍａｂ、またはその抗原結合フラグメントは、好ましくはＭａｂについて２５℃、およびＦａｂについて３７℃にてＳＰＲによって測定される場合、約７５ｎＭ未満、約５０ｎＭ未満、約２５ｎＭ未満、または約１０ｎＭ未満のＫＤで、配列番号１２、１３、１４、１５、１６、および９５からなる群より選択されるアミノ酸配列に局在する１つのアミノ酸または複数のアミノ酸を含むか、またはそれらから実質的になるか、またはそれらからなるエピトープにて、配列番号１に示されるアミノ酸配列からなるヒトＦＰＮ１に結合し、ヘプシジン−２５生物活性のインビボアッセイにおいて約２５０ｎＭ〜約２５ｎＭ、好ましくは１００ｎＭ〜約２５ｎＭ、またはより好ましくは５０ｎＭ〜約２５ｎＭのＩＣ５０を有することにより特徴付けられ、さらに、ヘプシジン−２５生物活性のインビトロアッセイにおいて約１００ｎＭ〜約１ｎＭ、好ましくは約７５ｎＭ〜約１ｎＭ、より好ましくは約５０ｎＭ〜約１ｎＭ、さらにより好ましくは約２５ｎＭ〜約１ｎＭのＩＣ５０を有することにより特徴付けられる。好ましくは、インビボアッセイは、血清鉄濃度のＩＬ−６により誘導される減少を測定する。好ましくは、ヘプシジン−２５生物活性アッセイのインビトロアッセイは、フェロポーチン１のヘプシジンにより誘導される内在化および／または分解を測定する。さらにより好ましくは、抗ＦＰＮ１ Ｍａｂ、またはその抗原結合フラグメントは、配列番号９８、１８３〜２１４からなる群より選択される１つ以上のペプチドに結合しない。
【００７６】
特定の実施形態において、本発明の抗ＦＰＮ１ Ｍａｂ、またはその抗原結合フラグメントは、好ましくはＭａｂについて２５℃、およびＦａｂについて３７℃にてＳＰＲによって測定される場合、約１００ｎＭ〜約０．５ｎＭ、好ましくは約１００ｎＭ〜約１ｎＭ、より好ましくは約７５ｎＭ〜約５ｎＭ、さらにより好ましくは約５０ｎＭ〜約１０ｎＭ、さらにより好ましくは約１５ｎＭ〜約１０ｎＭ、さらにより好ましくは約１０ｎＭ〜約０．５ｎＭ、さらにより好ましくは約５ｎＭ〜約０．５ｎＭ、さらにより好ましくは約５ｎＭ〜約０．７ｎＭ、さらにより好ましくは約３ｎＭ〜約０．７ｎＭ、または最も好ましくは約３ｎＭ〜約１ｎＭのＫＤで、配列番号１２、１３、１４、１５、１６、および９５からなる群より選択されるアミノ酸配列に局在する１つのアミノ酸または複数のアミノ酸を含むか、またはそれらから実質的になるか、またはそれらからなるエピトープにて、配列番号１に示されるアミノ酸配列からなるヒトＦＰＮ１に結合し、ヘプシジン−２５生物活性のインビボアッセイにおいて、約２５０ｎＭ〜約２５ｎＭ、好ましくは１００ｎＭ〜約２５ｎＭ、またはより好ましくは５０ｎＭ〜約２５ｎＭのＩＣ５０を有することにより特徴付けられ、さらに、ヘプシジン−２５生物活性のインビトロアッセイにおいて、約１００ｎＭ〜約１ｎＭ、好ましくは約７５ｎＭ〜約１ｎＭ、より好ましくは約５０ｎＭ〜約１ｎＭ、さらにより好ましくは約２５ｎＭ〜約１ｎＭのＩＣ５０を有することにより特徴付けられる。好ましくは、インビボアッセイは、血清鉄濃度のＩＬ−６により誘導される減少を測定する。好ましくは、ヘプシジン−２５生物活性のインビトロアッセイは、フェロポーチン１のヘプシジンにより誘導される内在化および／または分解を測定する。さらにより好ましくは、抗ＦＰＮ１ Ｍａｂ、またはその抗原結合フラグメントは、配列番号９８、１８３〜２１４からなる群より選択される１つ以上のペプチドに結合しない。
【００７７】
一部の実施形態において、本発明は、配列番号１２、１３、１４、１５、１６、および９５からなる群より選択されるアミノ酸配列に局在する１つのアミノ酸または複数のアミノ酸を含むか、またはそれらから実質的になるか、またはそれらからなるエピトープにて、配列番号１に示されるアミノ酸配列からなるヒトＦＰＮ１に結合する、Ｍａｂ、またはその抗原結合フラグメント、および１）好ましくはＭａｂについて２５℃、およびＦａｂについて３７℃にてＳＰＲによって測定される場合、約１００ｎＭ〜約０．５ｎＭ、好ましくは約１００ｎＭ〜約１ｎＭ、より好ましくは約７５ｎＭ〜約５ｎＭ、さらにより好ましくは約５０ｎＭ〜約１０ｎＭ、さらにより好ましくは約１５ｎＭ〜約１０ｎＭ、さらにより好ましくは約１０ｎＭ〜約０．５ｎＭ、さらにより好ましくは約５ｎＭ〜約０．５ｎＭ、さらにより好ましくは約５ｎＭ〜約０．７ｎＭ、さらにより好ましくは約３ｎＭ〜約０．７ｎＭ、または最も好ましくは約３ｎＭ〜約１ｎＭのＫＤ、２）ヘプシジン−２５生物活性のインビボアッセイにおいて、約２５０ｎＭ〜約２５ｎＭ、好ましくは１００ｎＭ〜約２５ｎＭ、またはより好ましくは５０ｎＭ〜約２５ｎＭのＩＣ５０、３）ヘプシジン−２５生物活性のインビトロアッセイにおいて、約１００ｎＭ〜約１ｎＭ、好ましくは約７５ｎＭ〜約１ｎＭ、より好ましくは約５０ｎＭ〜約１ｎＭ、さらにより好ましくは約２５ｎＭ〜約１ｎＭのＩＣ５０、および４）好ましくはＭａｂについて２５℃、およびＦａｂについて３７℃にてＳＰＲによって測定される場合、約７．５×１０−３ｓ−１〜約１×１０−４ｓ−１、好ましくは約２．５×１０−３ｓ−１〜約１×１０−４ｓ−１、より好ましくは約１×１０−３ｓ−１〜約１×１０−４ｓ−１、さらにより好ましくは約５×１０−４ｓ−１〜約１×１０−４ｓ−１の、ヒトフェロポーチン１に対する解離速度（ｋｏｆｆ）を提供する。好ましくは、インビボアッセイは、血清鉄濃度のＩＬ−６により誘導される減少を測定する。好ましくは、ヘプシジン−２５生物活性アッセイのインビトロアッセイは、フェロポーチン１のヘプシジンにより誘導される内在化および／または分解を測定する。さらにより好ましくは、抗ＦＰＮ１ Ｍａｂ、またはその抗原結合フラグメントは、配列番号９８、１８３〜２１４からなる群より選択される１つ以上のペプチドに結合しない。
【００７８】
特定の実施形態において、本発明の抗ＦＰＮ１ Ｍａｂ、またはその抗原結合フラグメントは、配列番号３７、１２９、２２、１０７、１１８、および１２０にそれぞれ示されるアミノ酸配列を含むＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、ＬＣＤＲ３、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、およびＨＣＤＲ３を含み、ヘプシジン−２５生物活性のインビボアッセイにおいて約２５０ｎＭ〜約２５ｎＭ、好ましくは約１００ｎＭ〜約２５ｎＭ、またはより好ましくは５０ｎＭ〜約２５ｎＭのＩＣ５０を有することにより特徴付けられる。好ましくは、インビボアッセイは、血清鉄濃度のＩＬ−６により誘導される減少を測定する。さらにより好ましくは、抗ＦＰＮ１ Ｍａｂ、またはその抗原結合フラグメントは、配列番号９８、１８３〜２１４からなる群より選択される１つ以上のペプチドに結合しない。
【００７９】
特定の実施形態において、本発明の抗ＦＰＮ１ Ｍａｂ、またはその抗原結合フラグメントは、配列番号３７、１２９、２２、１０７、１１８、および１２０にそれぞれ示されるアミノ酸配列を含むＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、ＬＣＤＲ３、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、およびＨＣＤＲ３を含み、ヘプシジン−２５生物活性のインビボアッセイにおいて、約２５０ｎＭ〜約２５ｎＭ、好ましくは１００ｎＭ〜約２５ｎＭ、またはより好ましくは５０ｎｍ〜約２５ｎＭのＩＣ５０およびヘプシジン−２５生物活性のインビトロアッセイにおいて約１００ｎＭ〜約１ｎＭ、好ましくは約７５ｎＭ〜約１ｎＭ、より好ましくは約５０ｎＭ〜約１ｎＭ、さらにより好ましくは約２５ｎＭ〜約１ｎＭのＩＣ５０を有することにより特徴付けられる。好ましくは、インビボアッセイは、血清鉄濃度のＩＬ−６により誘導される減少を測定する。好ましくは、ヘプシジン−２５生物活性のインビトロアッセイは、フェロポーチン１のヘプシジンにより誘導される内在化および／または分解を測定する。さらにより好ましくは、抗ＦＰＮ１ Ｍａｂ、またはその抗原結合フラグメントは、配列番号９８、１８３〜２１４からなる群より選択される１つ以上のペプチドに結合しない。
【００８０】
特定の実施形態において、本発明の抗ＦＰＮ１ Ｍａｂ、またはその抗原結合フラグメントは、配列番号３７、１２９、２２、１０７、１１８、および１２０にそれぞれ示されるアミノ酸配列を含むＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、ＬＣＤＲ３、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、およびＨＣＤＲ３を含み、好ましくはＭａｂについて２５℃、およびＦａｂについて３７℃にてＳＰＲによって測定される場合、約１００ｎＭ未満、約７５ｎＭ未満、約５０ｎＭ未満、約２５ｎＭ未満、または約１０ｎＭ未満のＫＤ、かつ、ヘプシジン−２５生物活性のインビボアッセイにおいて、約２５０ｎＭ〜約２５ｎＭ、好ましくは１００ｎＭ〜約２５ｎＭ、またはより好ましくは５０ｎＭ〜約２５ｎＭのＩＣ５０で、配列番号１２、１３、１４、１５、１６、および９５からなる群より選択されるアミノ酸配列に局在する１つのアミノ酸または複数のアミノ酸を含むか、またはそれらから実質的になるか、またはそれらからなるエピトープにて、配列番号１に示されるアミノ酸配列からなるヒトＦＰＮ１に結合する。好ましくは、インビボアッセイは、血清鉄濃度のＩＬ−６により誘導される減少を測定する。さらにより好ましくは、抗ＦＰＮ１ Ｍａｂ、またはその抗原結合フラグメントは、配列番号９８、１８３〜２１４からなる群より選択される１つ以上のペプチドに結合しない。
【００８１】
特定の実施形態において、本発明の抗ＦＰＮ１ Ｍａｂ、またはその抗原結合フラグメントは、配列番号３７、１２９、２２、１０７、１１８、および１２０にそれぞれ示されるアミノ酸配列を含むＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、ＬＣＤＲ３、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、およびＨＣＤＲ３を含み、好ましくはＭａｂについて２５℃、およびＦａｂについて３７℃にてＳＰＲによって測定される場合、約１００ｎＭ〜約０．５ｎＭ、好ましくは約１００ｎＭ〜約１ｎＭ、より好ましくは約７５ｎＭ〜約５ｎＭ、さらにより好ましくは約５０ｎＭ〜約１０ｎＭ、さらにより好ましくは約１５ｎＭ〜約１０ｎＭ、さらにより好ましくは約１０ｎＭ〜約０．５ｎＭ、さらにより好ましくは約５ｎＭ〜約０．５ｎＭ、さらにより好ましくは約５ｎＭ〜約０．７ｎＭ、さらにより好ましくは約３ｎＭ〜約０．７ｎＭ、または最も好ましくは約３ｎＭ〜約１ｎＭのＫＤで、配列番号１２、１３、１４、１５、１６、および９５からなる群より選択されるアミノ酸配列に局在する１つのアミノ酸または複数のアミノ酸を含むか、またはそれらから実質的になるか、またはそれらからなるエピトープにて、配列番号１に示されるアミノ酸配列からなるヒトＦＰＮ１に結合し、さらに、ヘプシジン−２５生物活性のインビボアッセイにおいて、約２５０ｎＭ〜約２５ｎＭ、好ましくは１００ｎＭ〜約２５ｎＭ、またはより好ましくは５０ｎＭ〜約２５ｎＭのＩＣ５０を有することにより特徴付けられる。好ましくは、インビボアッセイは、血清鉄濃度のＩＬ−６により誘導される減少を測定する。さらにより好ましくは、抗ＦＰＮ１ Ｍａｂ、またはその抗原結合フラグメントは、配列番号９８、１８３〜２１４からなる群より選択される１つ以上のペプチドに結合しない。
【００８２】
特定の実施形態において、本発明の抗ＦＰＮ１ Ｍａｂ、またはその抗原結合フラグメントは、配列番号３７、１２９、２２、１０７、１１８、および１２０にそれぞれ示されるアミノ酸配列を含むＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、ＬＣＤＲ３、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、およびＨＣＤＲ３を含み、好ましくはＭａｂについて２５℃、およびＦａｂについて３７℃にてＳＰＲによって測定される場合、約１００ｎＭ〜約０．５ｎＭ、好ましくは約１００ｎＭ〜約１ｎＭ、より好ましくは約７５ｎＭ〜約５ｎＭ、さらにより好ましくは約５０ｎＭ〜約１０ｎＭ、さらにより好ましくは約１５ｎＭ〜約１０ｎＭ、さらにより好ましくは約１０ｎＭ〜約０．５ｎＭ、さらにより好ましくは約５ｎＭ〜約０．５ｎＭ、さらにより好ましくは約５ｎＭ〜約０．７ｎＭ、さらにより好ましくは約３ｎＭ〜約０．７ｎＭ、または最も好ましくは約３ｎＭ〜約１ｎＭのＫＤで、配列番号１２、１３、１４、１５、１６、および９５からなる群より選択されるアミノ酸配列に局在する１つのアミノ酸または複数のアミノ酸を含むか、またはそれらから実質的になるか、またはそれらからなるエピトープにて、配列番号１に示されるアミノ酸配列からなるヒトＦＰＮ１に結合し、好ましくはＭａｂについて２５℃、およびＦａｂについて３７℃にてＳＰＲによって測定される場合、約７．５×１０−３ｓ−１〜約１×１０−４ｓ−１、好ましくは約２．５×１０−３ｓ−１〜約１×１０−４ｓ−１、より好ましくは約１×１０−３ｓ−１〜約１×１０−４ｓ−１、さらにより好ましくは約５×１０−４ｓ−１〜約１×１０−４ｓ−１の、ヒトフェロポーチン１に対する解離速度（ｋｏｆｆ）を有し、さらに、ヘプシジン−２５生物活性のインビボアッセイにおいて、約２５０ｎＭ〜約２５ｎＭ、好ましくは１００ｎＭ〜約２５ｎＭ、またはより好ましくは５０ｎＭ〜約２５ｎＭのＩＣ５０を有することにより特徴付けられる。好ましくは、インビボアッセイは、血清鉄濃度のＩＬ−６により誘導される減少を測定する。さらにより好ましくは、抗ＦＰＮ１ Ｍａｂ、またはその抗原結合フラグメントは、配列番号９８、１８３〜２１４からなる群より選択される１つ以上のペプチドに結合しない。
【００８３】
特定の実施形態において、本発明の抗ＦＰＮ１ Ｍａｂ、またはその抗原結合フラグメントは、配列番号３７、１２９、２２、１０７、１１８、および１２０にそれぞれ示されるアミノ酸配列を含むＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、ＬＣＤＲ３、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、およびＨＣＤＲ３を含み、好ましくはＭａｂについて２５℃、およびＦａｂについて３７℃にてＳＰＲによって測定される場合、約１００ｎＭ未満、約７５ｎＭ未満、約５０ｎＭ未満、約２５ｎＭ未満、または約１０ｎＭ未満のＫＤ、かつ、好ましくはＭａｂについて２５℃、およびＦａｂについて３７℃にてＳＰＲによって測定される場合、約７．５×１０−３ｓ−１〜約１×１０−４ｓ−１、好ましくは約２．５×１０−３ｓ−１〜約１×１０−４ｓ−１、より好ましくは約１×１０−３ｓ−１〜約１×１０−４ｓ−１、さらにより好ましくは約５×１０−４ｓ−１〜約１×１０−４ｓ−１の、ヒトフェロポーチン１に対する解離速度（ｋｏｆｆ）で、配列番号１２、１３、１４、１５、１６、および９５からなる群より選択されるアミノ酸配列に局在する１つのアミノ酸または複数のアミノ酸を含むか、またはそれらから実質的になるか、またはそれらからなるエピトープにて、配列番号１に示されるアミノ酸配列からなるヒトＦＰＮ１に結合し、さらに、ヘプシジン−２５生物活性のインビボアッセイにおいて、約２５０ｎＭ〜約２５ｎＭ、好ましくは１００ｎＭ〜約２５ｎＭ、またはより好ましくは５０ｎＭ〜約２５ｎＭのＩＣ５０を有することにより特徴付けられる。好ましくは、インビボアッセイは、血清鉄濃度のＩＬ６により誘導される減少を測定する。さらにより好ましくは、抗ＦＰＮ１ Ｍａｂ、またはその抗原結合フラグメントは、配列番号９８、１８３〜２１４からなる群より選択される１つ以上のペプチドに結合しない。
【００８４】
本発明の一部の実施形態において、抗ＦＰＮ１ Ｍａｂ、またはその抗原結合フラグメントは、配列番号３７、１２９、２２、１０７、１１８、および１２０にそれぞれ示されるアミノ酸配列を含むＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、ＬＣＤＲ３、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、およびＨＣＤＲ３を含み、好ましくはＭａｂについて２５℃、およびＦａｂについて３７℃にてＳＰＲによって測定される場合、約７５ｎＭ未満、約５０ｎＭ未満、約２５ｎＭ未満、または約１０ｎＭ未満のＫＤで、配列番号１２、１３、１４、１５、１６、および９５からなる群より選択されるアミノ酸または配列番号１２、１３、１４、１５、１６、および９５からなる群より選択されるアミノ酸配列に局在する１つのアミノ酸または複数のアミノ酸を含むか、またはそれらから実質的になるか、またはそれらからなるエピトープにて、配列番号１に示されるアミノ酸配列からなるヒトＦＰＮ１に結合し、ヘプシジン−２５生物活性のインビボアッセイにおいて、約２５０ｎＭ〜約２５ｎＭ、好ましくは１００ｎＭ〜約２５ｎＭ、またはより好ましくは５０ｎＭ〜約２５ｎＭのＩＣ５０を有し、さらに、ヘプシジン−２５生物活性のインビトロアッセイにおいて、約１００ｎＭ〜約１ｎＭ、好ましくは約７５ｎＭ〜約１ｎＭ、より好ましくは約５０ｎＭ〜約１ｎＭ、さらにより好ましくは約２５ｎＭ〜約１ｎＭのＩＣ５０を有することにより特徴付けられる。好ましくは、インビボアッセイは、血清鉄濃度のＩＬ６により誘導される減少を測定する。好ましくは、ヘプシジン−２５生物活性アッセイのインビトロアッセイは、フェロポーチン１のヘプシジンにより誘導される内在化および／または分解を測定する。さらにより好ましくは、抗ＦＰＮ１ Ｍａｂ、またはその抗原結合フラグメントは、配列番号９８、１８３〜２１４からなる群より選択される１つ以上のペプチドに結合しない。
【００８５】
特定の実施形態において、本発明の抗ＦＰＮ１ Ｍａｂ、またはその抗原結合フラグメントは、配列番号３７、１２９、２２、１０７、１１８、および１２０にそれぞれ示されるアミノ酸配列を含むＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、ＬＣＤＲ３、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、およびＨＣＤＲ３を含み、好ましくはＭａｂについて２５℃、およびＦａｂについて３７℃にてＳＰＲによって測定される場合、約１００ｎＭ〜約０．５ｎＭ、好ましくは約１００ｎＭ〜約１ｎＭ、より好ましくは約７５ｎＭ〜約５ｎＭ、さらにより好ましくは約５０ｎＭ〜約１０ｎＭ、さらにより好ましくは約１５ｎＭ〜約１０ｎＭ、さらにより好ましくは約１０ｎＭ〜約０．５ｎＭ、さらにより好ましくは約５ｎＭ〜約０．５ｎＭ、さらにより好ましくは約５ｎＭ〜約０．７ｎＭ、さらにより好ましくは約３ｎＭ〜約０．７ｎＭ、または最も好ましくは約３ｎＭ〜約１ｎＭのＫＤで、配列番号１２、１３、１４、１５、１６、および９５からなる群より選択されるアミノ酸配列に局在する１つのアミノ酸または複数のアミノ酸を含むか、またはそれらから実質的になるか、またはそれらからなるエピトープにて、配列番号１に示されるアミノ酸配列からなるヒトＦＰＮ１に結合し、ヘプシジン−２５生物活性のインビボアッセイにおいて、約２５０ｎＭ〜約２５ｎＭ、好ましくは１００ｎＭ〜約２５ｎＭ、またはより好ましくは５０ｎＭ〜約２５ｎＭのＩＣ５０を有し、さらに、ヘプシジン−２５生物活性のインビトロアッセイにおいて、約１００ｎＭ〜約１ｎＭ、好ましくは約７５ｎＭ〜約１ｎＭ、より好ましくは約５０ｎＭ〜約１ｎＭ、さらにより好ましくは約２５ｎＭ〜約１ｎＭのＩＣ５０を有することにより特徴付けられる。好ましくは、インビボアッセイは、血清鉄濃度のＩＬ−６により誘導される減少を測定する。好ましくは、ヘプシジン−２５生物活性アッセイのインビトロアッセイは、フェロポーチン１のヘプシジンにより誘導される内在化および／または分解を測定する。さらにより好ましくは、抗ＦＰＮ１ Ｍａｂ、またはその抗原結合フラグメントは、配列番号９８、１８３〜２１４からなる群より選択される１つ以上のペプチドに結合しない。
【００８６】
特定の実施形態において、本発明の抗ＦＰＮ１ Ｍａｂ、またはその抗原結合フラグメントは、配列番号３７、１２９、２２、１０７、１１８、および１２０にそれぞれ示されるアミノ酸配列を含むＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、ＬＣＤＲ３、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、およびＨＣＤＲ３を含み、配列番号１２、１３、１４、１５、１６、および９５からなる群より選択されるアミノ酸配列に局在する１つのアミノ酸または複数のアミノ酸を含むか、またはそれらから実質的になるか、またはそれらからなるエピトープにて、配列番号１に示されるアミノ酸配列からなるヒトＦＰＮ１に結合し、１）好ましくはＭａｂについて２５℃、およびＦａｂについて３７℃にてＳＰＲによって測定される場合、約１００ｎＭ〜約０．５ｎＭ、好ましくは約１００ｎＭ〜約１ｎＭ、より好ましくは約７５ｎＭ〜約５ｎＭ、さらにより好ましくは約５０ｎＭ〜約１０ｎＭ、さらにより好ましくは約１５ｎＭ〜約１０ｎＭ、さらにより好ましくは約１０ｎＭ〜約０．５ｎＭ、さらにより好ましくは約５ｎＭ〜約０．５ｎＭ、さらにより好ましくは約５ｎＭ〜約０．７ｎＭ、さらにより好ましくは約３ｎＭ〜約０．７ｎＭ、または最も好ましくは約３ｎＭ〜約１ｎＭのＫＤ、２）ヘプシジン−２５生物活性のインビボアッセイにおいて、約２５０ｎＭ〜約２５ｎＭ、好ましくは１００ｎＭ〜約２５ｎＭ、またはより好ましくは５０ｎＭ〜約２５ｎＭのＩＣ５０、３）ヘプシジン−２５生物活性のインビトロアッセイにおいて、約１００ｎＭ〜約１ｎＭ、好ましくは約７５ｎＭ〜約１ｎＭ、より好ましくは約５０ｎＭ〜約１ｎＭ、さらにより好ましくは約２５ｎＭ〜約１ｎＭのＩＣ５０、および４）好ましくはＭａｂについて２５℃、およびＦａｂについて３７℃にてＳＰＲによって測定される場合、約７．５×１０−３ｓ−１〜約１×１０−４ｓ−１、好ましくは約２．５×１０−３ｓ−１〜約１×１０−４ｓ−１、より好ましくは約１×１０−３ｓ−１〜約１×１０−４ｓ−１、さらにより好ましくは約５×１０−４ｓ−１〜約１×１０−４ｓ−１の、ヒトフェロポーチン１に対する解離速度（ｋｏｆｆ）を有する。好ましくは、インビボアッセイは、血清鉄濃度のＩＬ−６により誘導される減少を測定する。好ましくは、ヘプシジン−２５生物活性アッセイのインビトロアッセイは、フェロポーチン１のヘプシジンにより誘導される内在化および／または分解を測定する。さらにより好ましくは、抗ＦＰＮ１ Ｍａｂ、またはその抗原結合フラグメントは、配列番号９８、１８３〜２１４からなる群より選択される１つ以上のペプチドに結合しない。
【００８７】
特定の実施形態において、本発明の抗ＦＰＮ１ Ｍａｂ、またはその抗原結合フラグメントは、配列番号３７、１２５、２２、２３、１１０、および１９にそれぞれ示されるアミノ酸配列を含むＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、ＬＣＤＲ３、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、およびＨＣＤＲ３を含み、配列番号１２、１３、１４、１５、１６、および９５からなる群より選択されるアミノ酸配列に局在する１つのアミノ酸または複数のアミノ酸を含むか、またはそれらから実質的になるか、またはそれらからなるエピトープにて、配列番号１に示されるアミノ酸配列からなるヒトＦＰＮ１に結合し、好ましくはＭａｂについて２５℃、およびＦａｂについて３７℃にてＳＰＲによって測定される場合、約１００ｎＭ〜約０．５ｎＭ、好ましくは約１００ｎＭ〜約１ｎＭ、より好ましくは約７５ｎＭ〜約５ｎＭ、さらにより好ましくは約５０ｎＭ〜約１０ｎＭ、さらにより好ましくは約１５ｎＭ〜約１０ｎＭ、さらにより好ましくは約１０ｎＭ〜約０．５ｎＭ、さらにより好ましくは約５ｎＭ〜約０．５ｎＭ、さらにより好ましくは約５ｎＭ〜約０．７ｎＭ、さらにより好ましくは約３ｎＭ〜約０．７ｎＭ、または最も好ましくは約３ｎＭ〜約１ｎＭのＫＤ、２）ヘプシジン−２５生物活性のインビボアッセイにおいて、約２５０ｎＭ〜約２５ｎＭ、好ましくは１００ｎＭ〜約２５ｎＭ、またはより好ましくは５０ｎＭ〜約２５ｎＭのＩＣ５０、３）ヘプシジン−２５生物活性のインビトロアッセイにおいて、約１００ｎＭ〜約１ｎＭ、好ましくは約７５ｎＭ〜約１ｎＭ、より好ましくは約５０ｎＭ〜約１ｎＭ、さらにより好ましくは約２５ｎＭ〜約１ｎＭのＩＣ５０、および４）好ましくはＭａｂについて２５℃、およびＦａｂについて３７℃にてＳＰＲによって測定される場合、約７．５×１０−３ｓ−１〜約１×１０−４ｓ−１、好ましくは約２．５×１０−３ｓ−１〜約１×１０−４ｓ−１、より好ましくは約１×１０−３ｓ−１〜約１×１０−４ｓ−１、さらにより好ましくは約５×１０−４ｓ−１〜約１×１０−４ｓ−１の、ヒトフェロポーチン１に対する解離速度（ｋｏｆｆ）を有することにより特徴付けられる。好ましくは、インビボアッセイは、血清鉄濃度のＩＬ−６により誘導される減少を測定する。好ましくは、ヘプシジン−２５生物活性アッセイのインビトロアッセイは、フェロポーチン１のヘプシジンにより誘導される内在化および／または分解を測定する。さらにより好ましくは、抗ＦＰＮ１ Ｍａｂ、またはその抗原結合フラグメントは、配列番号９８、１８３〜２１４からなる群より選択される１つ以上のペプチドに結合しない。さらにより好ましくは、抗ＦＰＮ１ Ｍａｂ、またはその抗原結合フラグメントは、配列番号９８、１８３〜２１４からなる群より選択される１つ以上のペプチドに結合しない。
【００８８】
特定の実施形態において、本発明の抗ＦＰＮ１ Ｍａｂ、またはその抗原結合フラグメントは、配列番号３７、１７７、２２、２３、１１２、および１９にそれぞれ示されるアミノ酸配列を含むＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、ＬＣＤＲ３、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、およびＨＣＤＲ３を含み、配列番号１２、１３、１４、１５、１６、および９５からなる群より選択されるアミノ酸配列に局在する１つのアミノ酸または複数のアミノ酸を含むか、またはそれらから実質的になるか、またはそれらからなるエピトープにて、配列番号１に示されるアミノ酸配列からなるヒトＦＰＮ１に結合し、１）好ましくはＭａｂについて２５℃、およびＦａｂについて３７℃にてＳＰＲによって測定される場合、約１００ｎＭ〜約０．５ｎＭ、好ましくは約１００ｎＭ〜約１ｎＭ、より好ましくは約７５ｎＭ〜約５ｎＭ、さらにより好ましくは約５０ｎＭ〜約１０ｎＭ、さらにより好ましくは約１５ｎＭ〜約１０ｎＭ、さらにより好ましくは約１０ｎＭ〜約０．５ｎＭ、さらにより好ましくは約５ｎＭ〜約０．５ｎＭ、さらにより好ましくは約５ｎＭ〜約０．７ｎＭ、さらにより好ましくは約３ｎＭ〜約０．７ｎＭ、または最も好ましくは約３ｎＭ〜約１ｎＭのＫＤ、２）ヘプシジン−２５生物活性のインビボアッセイにおいて、約２５０ｎＭ〜約２５ｎＭ、好ましくは１００ｎＭ〜約２５ｎＭ、またはより好ましくは５０ｎＭ〜約２５ｎＭのＩＣ５０、３）ヘプシジン−２５生物活性のインビトロアッセイにおいて、約１００ｎＭ〜約１ｎＭ、好ましくは約７５ｎＭ〜約１ｎＭ、より好ましくは約５０ｎＭ〜約１ｎＭ、さらにより好ましくは約２５ｎＭ〜約１ｎＭのＩＣ５０、および４）好ましくはＭａｂについて２５℃、およびＦａｂについて３７℃にてＳＰＲによって測定される場合、約７．５×１０−３ｓ−１〜約１×１０−４ｓ−１、好ましくは約２．５×１０−３ｓ−１〜約１×１０−４ｓ−１、より好ましくは約１×１０−３ｓ−１〜約１×１０−４ｓ−１、さらにより好ましくは約５×１０−４ｓ−１〜約１×１０−４ｓ−１の、ヒトフェロポーチン１に対する解離速度（ｋｏｆｆ）を有することにより特徴付けられる。好ましくは、インビボアッセイは、血清鉄濃度のＩＬ−６により誘導される減少を測定する。好ましくは、ヘプシジン−２５生物活性アッセイのインビトロアッセイは、フェロポーチン１のヘプシジンにより誘導される内在化および／または分解を測定する。さらにより好ましくは、抗ＦＰＮ１ Ｍａｂ、またはその抗原結合フラグメントは、配列番号９８、１８３〜２１４からなる群より選択される１つ以上のペプチドに結合しない。
【００８９】
特定の実施形態において、本発明の抗ＦＰＮ１ Ｍａｂ、またはその抗原結合フラグメントは、配列番号３７、１２２、２２、２３、１１０、および１９にそれぞれ示されるアミノ酸配列を含むＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、ＬＣＤＲ３、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、およびＨＣＤＲ３を含み、配列番号１２、１３、１４、１５、１６、および９５からなる群より選択されるアミノ酸配列に局在する１つのアミノ酸または複数のアミノ酸を含むか、またはそれらから実質的になるか、またはそれらからなるエピトープにて、配列番号１に示されるアミノ酸配列からなるヒトＦＰＮ１に結合し、１）好ましくはＭａｂについて２５℃、およびＦａｂについて３７℃にてＳＰＲによって測定される場合、約１００ｎＭ〜約０．５ｎＭ、好ましくは約１００ｎＭ〜約１ｎＭ、より好ましくは約７５ｎＭ〜約５ｎＭ、さらにより好ましくは約５０ｎＭ〜約１０ｎＭ、さらにより好ましくは約１５ｎＭ〜約１０ｎＭ、さらにより好ましくは約１０ｎＭ〜約０．５ｎＭ、さらにより好ましくは約５ｎＭ〜約０．５ｎＭ、さらにより好ましくは約５ｎＭ〜約０．７ｎＭ、さらにより好ましくは約３ｎＭ〜約０．７ｎＭ、または最も好ましくは約３ｎＭ〜約１ｎＭのＫＤ、２）ヘプシジン−２５生物活性のインビボアッセイにおいて、約２５０ｎＭ〜約２５ｎＭ、好ましくは１００ｎＭ〜約２５ｎＭ、またはより好ましくは５０ｎＭ〜約２５ｎＭのＩＣ５０、３）ヘプシジン−２５生物活性のインビトロアッセイにおいて、約１００ｎＭ〜約１ｎＭ、好ましくは約７５ｎＭ〜約１ｎＭ、より好ましくは約５０ｎＭ〜約１ｎＭ、さらにより好ましくは約２５ｎＭ〜約１ｎＭのＩＣ５０、および４）好ましくはＭａｂについて２５℃、およびＦａｂについて３７℃にてＳＰＲによって測定される場合、約７．５×１０−３ｓ−１〜約１×１０−４ｓ−１、好ましくは約２．５×１０−３ｓ−１〜約１×１０−４ｓ−１、より好ましくは約１×１０−３ｓ−１〜約１×１０−４ｓ−１、さらにより好ましくは約５×１０−４ｓ−１〜約１×１０−４ｓ−１の、ヒトフェロポーチン１に対する解離速度（ｋｏｆｆ）を有することにより特徴付けられる。好ましくは、インビボアッセイは、血清鉄濃度のＩＬ−６により誘導される減少を測定する。好ましくは、ヘプシジン−２５生物活性アッセイのインビトロアッセイは、フェロポーチン１のヘプシジンにより誘導される内在化および／または分解を測定する。さらにより好ましくは、抗ＦＰＮ１ Ｍａｂ、またはその抗原結合フラグメントは、配列番号９８、１８３〜２１４からなる群より選択される１つ以上のペプチドに結合しない。
【００９０】
特定の実施形態において、本発明の抗ＦＰＮ１ Ｍａｂ、またはその抗原結合性フラグメントは、
（ａ）配列番号１５４および配列番号１５２にそれぞれ示される軽鎖および重鎖；
（ｂ）配列番号１８１および配列番号１７９にそれぞれ示される軽鎖および重鎖；または、
（ｃ）配列番号１５８および配列番号１５６にそれぞれ示される軽鎖および重鎖、
を含み、配列番号１２、１３、１４、１５、１６、および９５からなる群より選択されるアミノ酸配列に局在する１つのアミノ酸または複数のアミノ酸を含むか、またはそれらから実質的になるか、またはそれらからなるエピトープにて、配列番号１に示されるアミノ酸配列からなるヒトＦＰＮ１に結合し、１）好ましくはＭａｂについて２５℃、およびＦａｂについて３７℃にてＳＰＲによって測定される場合、約１００ｎＭ〜約０．５ｎＭ、好ましくは約１００ｎＭ〜約１ｎＭ、より好ましくは約７５ｎＭ〜約５ｎＭ、さらにより好ましくは約５０ｎＭ〜約１０ｎＭ、さらにより好ましくは約１５ｎＭ〜約１０ｎＭ、さらにより好ましくは約１０ｎＭ〜約０．５ｎＭ、さらにより好ましくは約５ｎＭ〜約０．５ｎＭ、さらにより好ましくは約５ｎＭ〜約０．７ｎＭ、さらにより好ましくは約３ｎＭ〜約０．７ｎＭ、または最も好ましくは約３ｎＭ〜約１ｎＭのＫＤ、２）ヘプシジン−２５生物活性のインビボアッセイにおいて、約２５０ｎＭ〜約２５ｎＭ、好ましくは１００ｎＭ〜約２５ｎＭ、またはより好ましくは５０ｎＭ〜約２５ｎＭのＩＣ５０、３）ヘプシジン−２５生物活性のインビトロアッセイにおいて、約１００ｎＭ〜約１ｎＭ、好ましくは約７５ｎＭ〜約１ｎＭ、より好ましくは約５０ｎＭ〜約１ｎＭ、さらにより好ましくは約２５ｎＭ〜約１ｎＭのＩＣ５０、および４）好ましくはＭａｂについて２５℃、およびＦａｂについて３７℃にてＳＰＲによって測定される場合、約７．５×１０−３ｓ−１〜約１×１０−４ｓ−１、好ましくは約２．５×１０−３ｓ−１〜約１×１０−４ｓ−１、より好ましくは約１×１０−３ｓ−１〜約１×１０−４ｓ−１、さらにより好ましくは約５×１０−４ｓ−１〜約１×１０−４ｓ−１の、ヒトフェロポーチン１に対する解離速度（ｋｏｆｆ）を有することにより特徴付けられる。好ましくは、インビボアッセイは、血清鉄濃度のＩＬ−６により誘導される減少を測定する。好ましくは、ヘプシジン−２５生物活性アッセイのインビトロアッセイは、フェロポーチン１のヘプシジンにより誘導される内在化および／または分解を測定する。
【００９１】
用語「治療している」（あるいは「治療する」または「治療」）とは、症状、障害、状態、または疾患の進行または重症度を遅延すること、妨げること、抑止すること、制御すること、停止すること、減少させること、または反転することを意味するが、必ずしも、あらゆる疾患に関連する症状、状態、または障害の完全な除去を含まなくてもよい。
【００９２】
用語「予防している」（あるいは「予防する」または「予防」）とは、症状、障害、状態、または疾患の発病または発生を予防すること、抑制すること、または阻害することを意味する。急性事象および慢性疾患が治療および予防され得る。急性事象において、抗体またはその抗原結合フラグメントを、症状、障害、状態、または疾患が生じたときに投与し、その急性事象が終わったときには中断する。これに対して、慢性的な症状、障害、状態、または疾患は、より長期的な期間にわたって治療される。
【００９３】
「障害」とは、本発明による治療が有益であるいずれかの状態である。用語「障害」、「状態」、および「疾患」は、本願明細書においては同じ意味で用い、限定されないが、慢性疾患による貧血を含む、限定されないが、貧血を含む、慢性および急性の成熟ヘプシジンにより促進される障害を含む。
【００９４】
用語「慢性疾患による貧血」とは、例えば、幅広い感染、炎症、および腫瘍性疾患の結果として発症するいずれかの貧血のことをいう。発症した貧血は、多くの場合、赤血球の寿命を短くし、マクロファージにおいて鉄を隔離することによって特徴付けられ、その結果、新たな赤血球を生成するのに利用可能な鉄の量を減少させる。慢性疾患による貧血に付随する状態としては、限定されないが、慢性の細菌性心内膜炎、骨髄炎、リウマチ熱、潰瘍性大腸炎、および腫瘍性疾患が挙げられる。さらなる状態としては、例えば、炎症性感染（例えば肺膿瘍、結核）、非感染性炎症性疾患（例えばリウマチ性関節炎、全身性エリテマトーデス、クローン病、肝炎、炎症性腸疾患）、ならびに種々の癌、腫瘍、および悪性腫瘍（例えば癌腫、肉腫、リンパ腫）を含む、感染症、炎症、および腫瘍に付随する他の疾患および障害が挙げられる。慢性疾患による貧血は、低鉄血症および細網内皮細胞の鉄隔離に関連する。
【００９５】
炎症性サイトカインは、ヘプシジン発現の強力な誘導因子であり、ヘプシジン過剰は、これらの被験体における貧血の発病において重要な役割を果たし得る（Ｗｅｉｓｓら，Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．，３５２：１０１１−１０２３（２００５）；Ｐｉｇｅｏｎ．ら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７６：７８１１−７８１９（２００１）；Ｎｉｃｏｌａｓら，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．１１０：１０３７−１０４４（２００２）；Ｎｅｍｅｔｈら，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．１１３：１２７１−１２７６（２００４）；Ｎｅｍｅｔｈら，Ｂｌｏｏｄ，１０１：２４６１−２４６３（２００３）；Ｌｅｅら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．，１０２：１９０６−１９１０（２００５））。ＩＬ−６等の炎症性メディエータは、ＳＴＡＴ３によるヘプシジン発現を調節し得る（Ｗｒｉｇｈｔｉｎｇら，Ｂｌｏｏｄ，１０８：３２０４−３２０９（２００６）；Ｖｅｒｇａ Ｆａｌｚａｃａｐｐａら，Ｂｌｏｏｄ，１０９：３５３−３５８（２００７）；Ｐｉｅｔｒａｎｇｅｌｏら，Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ，１３２：２９４−３００（２００７））。本願明細書において提示されるデータは、本発明の抗ＦＰＮ１ Ｍａｂが血清鉄濃度を上昇させるという、インビボでの証拠を提供する。
【００９６】
本発明の抗ＦＰＮ１ Ｍａｂ、またはその抗原結合性フラグメントの投与を含む貧血を治療する方法もまた本発明によって提供される。一部の実施形態において、貧血を治療する方法は、抗ＦＰＮ１ Ｍａｂまたはその抗原結合性フラグメントを含む薬学的組成物を、本願明細書において記載される病状、例えば、貧血疾患の危険性がある、またはその病状を発症している被験体に、標準的な投与技術を用いて投与する工程を含む。
【００９７】
本願明細書において用いられる用語「有効量」は、所望の治療結果を達成するのに必要な量（投与量、期間、および投与手段）のことをいう。抗体の有効量は、例えば、個体の疾患段階、年齢、性別、および体重、ならびに、個体において所望の反応を生じさせるための抗体または抗体の一部の能力などの要因に従って変化し得る。有効量はまた、抗体の毒性または有害作用に対して治療に有益な効果が勝るものである。
【００９８】
有効量は、被験体に治療的有効性を与えるのに必要な活性剤の少なくとも最小量であるが、毒性量未満である。別の言い方をすれば、本発明の抗体の有効量または治療的に有効な量は、哺乳動物、好ましくはヒトにおいて、（ｉ）血清鉄濃度、網状赤血球数、赤血球数、ヘモグロビンおよび／またはヘマトクリットを上昇させ、または（ｉｉ）成熟ヘプシジンの存在が、望ましくない病理学的作用を生じるか、またはその一因となる障害を治療するか、または（ｉｉｉ）成熟ヘプシジンの生物活性を減少させ、その結果、哺乳動物、好ましくはヒトにおいて、限定されないが、感染、炎症、および／または癌に起因する貧血を含む、限定されないが、慢性疾患による貧血を含む、限定されないが、貧血を含む、治療に有益な効果を生じる、量である。本発明の抗体の有効量は、単回投与または複数回投与で投与され得る。さらに、本発明の抗体の有効量は、一度のみ投与される場合、有効量未満である量の複数回投与で投与され得る。
【００９９】
医学分野において周知であるように、いずれか一人の被験体に対する投与量は、患者の体格、体表面積、年齢、投与される特定の化合物、性別、投与の時間および経路、一般的な健康状態、および同時に投与される他の薬剤を含む多くの要因に依存する。投与量は、さらに、疾患の種類および重症度に依存して変化し得る。典型的な用量は、例えば、約１ｍｇ〜約１００ｍｇ、好ましくは、約２ｍｇ〜約１００ｍｇ、より好ましくは、約５ｍｇ〜約１００ｍｇ、さらにより好ましくは、約５ｍｇ〜約５０ｍｇ、さらにより好ましくは、約５ｍｇ〜約２５ｍｇ、さらにより好ましくは、約５ｍｇ〜約２０ｍｇ、さらにより好ましくは、約５ｍｇ〜約１５ｍｇの範囲であってよいが、特に、前述の要因を考慮して、この例示的な範囲未満またはそれより多い用量が想定される。一日の非経口投与計画は、約１０μｇ／ｋｇ〜約１００ｍｇ／ｋｇ、好ましくは約１００μｇ／ｋｇ〜約１００ｍｇ／ｋｇ、さらに好ましくは約１ｍｇ／ｋｇ〜約１００ｍｇ／ｋｇ、さらにより好ましくは、約１ｍｇ／ｋｇ〜約３０ｍｇ／ｋｇ、さらにより好ましくは約３ｍｇ／ｋｇ〜約３０ｍｇ／ｋｇ、あるいは最も好ましくは約３ｍｇ／ｋｇ〜約３０ｍｇ／ｋｇであってもよい。進行は定期的な評価によって監視されてもよく、それに従って用量が調整されてよい。
【０１００】
抗ＦＰＮ１抗体のこれらの示唆された量は、治療上の裁量に多大に依存する。適切な投与およびスケジューリングを選択することにおける主な要因は、得られた結果である。これに関連して想定される要因は、治療される特定の障害、個々の患者の病態、障害の原因、抗体の送達部位、抗体の特定の種類、投与方法、投与のスケジューリング、および医師に既知の他の要因を含む。
【０１０１】
本発明の抗体は、様々な経路によって投与される、ヒトの医療における医薬として使用されてもよい。最も好ましくは、このような組成物は、非経口投与用である。このような薬学的組成物は、当該技術分野において周知である方法によって調製可能である。例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙ，第１９版，（１９９５），Ｇｅｎｎａｒｏ，Ａ．ら，Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．を参照のこと。従って、本発明はまた、１つ以上の薬学的に受容可能な担体、希釈剤、または賦形剤と組み合わせた、本発明の１つ以上の抗体を含む薬学的組成物を提供する。特定の実施形態において、薬学的組成物はさらに、１つ以上の他の治療薬を含む。
【０１０２】
本願明細書において用いられる用語、非経口とは、静脈、筋肉内、皮下、直腸、膣、または腹腔内投与を含む。静脈内注入、あるいは静脈内、腹腔内、または皮下注射による非経口の送達が好ましい。皮下注射が最も好ましい。そのような注射のために適切なビヒクルは当該技術分野において周知である。
【０１０３】
薬学的組成物は、典型的に、滅菌されている必要があり、提供される容器、例えば、密封バイアル、シリンジ、または他の送達装置、例えばペン等を含む容器内での製造および保存の条件下で安定している必要がある。それゆえ、薬学的組成物は、製剤作製後、濾過滅菌され得るか、またはそうでなければ微生物学的に許容可能に作製され得る。
【０１０４】
本発明の抗体は、ヒトの被験体に投与するのに適切な薬学的組成物に組み込むことができる。本発明の抗体は、単独で、あるいは、薬学的に受容可能な担体および／または希釈剤と組み合わせて単回投与または複数回投与でヒト被験体に投与されてもよい。このような薬学的組成物は、選択される投与方法に適するように設計され、薬学的に受容可能な希釈剤、担体、および／または賦形剤、例えば、分散剤、緩衝剤、界面活性剤、防腐剤、可溶化剤、限定されないが塩化ナトリウムを含む等張剤、安定剤などが適切な場合、使用される。前記組成物は、例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ，Ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙ，第１９版，Ｇｅｎｎａｒｏ，Ｅｄ．，Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．，Ｅａｓｔｏｎ，ＰＡ（１９９５）に開示されている従来技術に従って設計可能であり、この文献は、医師には一般的に公知であるような製剤技術の概要を提供している。薬学的組成物に適切な担体は、本発明の抗体と組み合わされる場合、分子の活性を保持し、被験体の免疫系に反応しない任意の物質を含む。
【０１０５】
本願明細書において置き換え可能に用いられる用語「被験体」および「患者」は、哺乳動物、好ましくはヒトのことをいう。特定の実施形態において、患者は、低い成熟ヘプシジン濃度、成熟ヘプシジンの生物活性の減少、および／または血清鉄濃度、網状赤血球数、赤血球数、ヘモグロビン、および／またはヘマトクリットの増加が有益である障害を有する。
【０１０６】
ＦＰＮ１抗体化合物を単独で投与することは、例えば、望ましくない副作用のために、任意の用量または高い用量のみのいずれかにおいて、１つ以上のＥＳＡを許容できない患者に有益であり得る。単独で投与されるか、またはＥＳＡと組み合わされた本発明のＦＰＮ１ Ｍａｂ、またはその抗原結合フラグメントはまた、従来の用量または高用量のいずれかにおいて、ＥＳＡのみを用いて患者のヘマトクリットの目標値に到達することができないＥＳＡ抵抗性を有する患者に有用であり得る。
【０１０７】
本発明のＦＰＮ１ Ｍａｂ、またはその抗原結合フラグメントはまた、ＥＳＡの使用を含む、併用薬物療法が患者のヘマトクリットの目標値に到達させるのに不十分である場合に投与されてもよい。
【０１０８】
別の実施形態において、本発明は、ヒトにおける血清鉄濃度、網状赤血球数、赤血球数、ヘモグロビンおよび／またはヘマトクリットを増加させるための医薬を製造するための、本発明のモノクローナル抗体およびその抗原結合フラグメントの使用を提供する。
【０１０９】
別の実施形態において、本発明は、ヒトにおける血清鉄濃度、網状赤血球数、赤血球数、ヘモグロビンおよび／またはヘマトクリットを増加させるための併用療法において使用するための医薬の製造における、モノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメントの使用を提供し、前記医薬は、エポエチンアルファ、エポエチンベータ、ダーベポエチンアルファ、ヘマタイド（ｈｅｍａｔｉｄｅ）、メトキシポリエチレングリコール−エポエチンベータ、あるいはヒトにおける血清鉄濃度、網状赤血球数、赤血球数、ヘモグロビンおよび／またはヘマトクリットを増加させるために従来利用されている他の治療的薬剤、もしくは治療的処置からなる群より選択される１つ以上のＥＳＡと組み合わせて投与される
【０１１０】
以下の非限定的な例は、本願明細書において開示される抗ＦＰＮ１抗体の様々な特性を示す。
【実施例】
【０１１１】
実施例１：ヒトヘプシジン−２５の生成
ヒトヘプシジン−２５は、商業的供給源（例えば、Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ（Ｌｏｕｉｓｖｉｌｌｅ、Ｋｅｎｔｕｃｋｙ））から入手され得るか、または当該技術分野で公知の様々な合成または組換え技術によって生成され得る。あるいは、ヒトヘプシジン−２５配列の２５のアミノ酸を含みかつ配列番号９１に示されるアミノ酸配列を有する融合タンパク質は、大腸菌の中で発現される。封入体を、３リットルのヒトヘプシジン融合タンパク質を発現する大腸菌から、３７℃での１ｍＭ ＩＰＴＧを用いた３〜６時間の誘導後に単離する。この封入体を、緩衝剤Ａ（５０ｍＭ Ｔｒｉｓおよび８Ｍ 尿素（ｐＨ ８．０））の中で可溶化する。上清をＩＭＡＣカラム（２０ｍＬ 樹脂）に通す。吸光度がベースラインまで戻るまでこのカラムを緩衝剤Ａで洗浄し、結合したポリペプチドを、緩衝剤Ａ中の０．５Ｍ イミダゾールによってこのカラムからバッチ溶出する。このヒトヘプシジン−２５融合タンパク質をプールし、５０ｍＭ ＤＴＴを用いて還元する。次いでこの融合タンパク質を、プールした物質を５０μｇ／ｍＬ未満の最終タンパク質濃度まで２Ｍ 尿素、３ｍＭ システイン、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ（ｐＨ ８．０）の中へ希釈することによりリフォールディングする（ｒｅｆｏｌｄｅｄ）。この物質を室温で撹拌し、４８時間空気酸化する。酸化したポリペプチドを、５ｍＬ／分の流量でＩＭＡＣカラム（２０ｍＬ）に通し、このヒトヘプシジン−２５融合タンパク質を、緩衝剤Ａ中の０．５Ｍ イミダゾールによってこのカラムからバッチ溶出する。このヒトヘプシジン−２５融合タンパク質を含有するプールした画分を濃縮し、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ、４Ｍ 尿素、ｐＨ ８．０で平衡にしたＳｕｐｅｒｄｅｘ ７５（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、ＸＫ２６／６０）サイズ分け（ｓｉｚｉｎｇ）カラムに３ｍＬ／分の流量で通した。このモノマーの融合タンパク質をプールし、次いで５０ｍＭ Ｔｒｉｓ、２Ｍ 尿素、５ｍＭ ＣａＣｌ２、ｐＨ ８．０に希釈し、次いでエンテロキナーゼを用いて切断し、配列番号１のヒトヘプシジン−２５を生成した。切断されないヒトヘプシジン−２５融合タンパク質をパッシブ（ｐａｓｓｉｖｅ）ＩＭＡＣクロマトグラフィ（上に概略を示したとおり）によって除去した。このＩＭＡＣカラムから通り抜けた流れは、次いで４．０ｍＬ／分間の流量でＣ−１８逆相カラムに通す。吸光度がベースラインまで戻るまでこのカラムを水中の０．１％ ＴＦＡで洗浄し、０．５％／分の速度の０．１％ ＴＦＡを用いた２０％から４０％へのアセトニトリルの線形勾配を用いて、結合したポリペプチドをカラムから溶出した。このヒトヘプシジン−２５ポリペプチドを含有する画分をプールし、Ｎ末端アミノ酸配列決定およびマトリックス支援レーザー脱離／イオン化質量分析（ＭＡＬＤＩ−ＭＳ）によって分析した。ラット、マウス、およびカニクイザルヘプシジン−２５および種々のＮ末端で短縮された形態のヒトヘプシジン−２５をコードするポリペプチド（ヘプシジン−２２およびヘプシジン−２０を含む）を、市販品として入手した（例えば、Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ）。
【０１１２】
実施例２：３４Ａ９ Ｆａｂの生成
抗ＦＰＮ１抗体は、マウスを配列番号１１に示されるアミノ酸配列を有する免疫原性のペプチドで免役することにより得てもよい。より特定すれば、ペプチドリンカーによって配列番号１２に示されるアミノ酸配列（ヒトＦＰＮ１の細胞外のループの少なくとも一部分で考えられる）に連結したＯＶＡエピトープを含む免疫原性のペプチドを使用して、マウスを免役してもよい。免疫化後、マウス脾臓を回収し、脾臓細胞を、配列番号１２に示されるアミノ酸配列を有するビオチン化されたペプチドおよびストレプトアビジンビーズを使用するＭａｇｎｅｔｉｃ Ａｃｔｉｖａｔｅｄ Ｃｅｌｌ Ｓｏｒｔｉｎｇによって細胞分離する（ｓｏｒｔｅｄ）。ＲＮＡを抗原結合細胞から単離し、ｏｌｉｇｏ ｄＴを使用してｃＤＮＡへと転化する。抗体の重鎖および軽鎖可変領域を、抗体フレームワークプライマーを使用するＰＣＲによって得て、ファージベクターにクローン化してＦａｂ抗体ライブラリーを作製する。このファージ抗体ライブラリーを、配列番号１２に示されるアミノ酸配列を有するビオチン化されたペプチド、例えば、１００ｎＭでスクリーニングする。次いで陽性に結合するクローンを、ＤＮＡ配列決定、Ｆａｂ発現ならびにヒトフェロポーチンを発現する免疫性（ｉｍｍｕｎｉｚｉｎｇ）ペプチドおよび／または細胞への結合によって特徴づける。Ｆａｂ ３４Ａ９を、基本的に上記のとおりの手順に従って同定した。
【０１１３】
実施例３：抗ＦＰＮ１ Ｍａｂのエピトープマッピング
ＦＰＮ１関連免疫原の部分配列を含有するペプチドをドットブロット（ｄｏｔ ｂｌｏｔ）ハイブリダイゼーション実験で使用して、マウスＭａｂ ３４Ａ９のエピトープを決定し得る。以下のペプチドが合成されて水に溶解され得る（下線を引いたアミノ酸は実際のＦＰＮ１アミノ酸配列を表す）：
【０１１４】
FpnE3a （配列番号 96）： GGSPFEDIRSRFIQGESITPTKGC
060719Z （配列番号 97）： GGSPFEDIRSRFIQGC
060719Y （配列番号 98）： GGIQGESITPTKIPEITTEGC
0708L4A （配列番号 99）： GGMPGSPLDLSVSPFEDGC
0708L4B （配列番号 100）： GGSPLDLSVSPFEDIRSGC
0708L4C （配列番号 101）： GGEDIRSRFIQGESITGC
0708L4D （配列番号 102）： GGRSRFIQGESITPTKGC
【０１１５】
各ペプチドについて、３μｌの１〜５μｇ／ｍＬのペプチドを一片のニトロセルロース膜の上へとスポッティングし（ｓｐｏｔｔｅｄ）、風乾する。ブロッキング緩衝剤（例えば、１％ ＢＳＡを含有するＰＢＳ）を用いてこの膜をブロッキングし、次いでブロッキング緩衝剤中の３〜５μｇ／ｍＬ ＦＰＮ１抗体とともに室温で１時間インキュベーションする。この膜を１×ＰＢＳＴ（１０ｍＭ リン酸ナトリウム、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、０．１％ Ｔｗｅｅｎ−２０、ｐＨ ７．４）で３回（各５分）洗浄し、その後これを、製造業者のプロトコル（ＬｉＣｏｒ，Ｉｎｃ；Ｌｉｎｃｏｌｎ、ＮＥ）に従ってＩＲ７００標識−ヤギ−抗マウス抗体とともにインキュベーションする。この膜を１×ＰＢＳＴで３回（各５分）洗浄し、Ｏｄｙｓｓｅｙ撮像システムおよびＯｄｙｓｓｅｙソフトウェア（ＬｉＣｏｒ，Ｉｎｃ）で撮像する。
【０１１６】
図１は、Ｍａｂ ３４Ａ９がペプチドＦｐｎＥ３ａ、０６０７１９Ｚ、０７０８Ｌ４Ｃ、および０７０８Ｌ４Ｄ（これらはすべて配列番号１のアミノ酸４０９〜４１５を含有する）に結合するということを示す。Ｍａｂ ３４Ａ９は、ペプチド０７０８Ｌ４Ｄへの結合によって示されるとおり、ＥＤＩのアミノ酸配列を必要とはしない。Ｍａｂ ３４Ａ９はペプチド０６０７１９Ｚに対して０７０８Ｌ４Ｃよりも弱く結合する。後者のペプチドはＦＰＮ１（配列番号１）のアミノ酸４１６〜４１９を含有する。
【０１１７】
実施例４：ＳＰＲによって測定される場合の抗ＦＰＮ１ ＦａｂおよびＭａｂの親和性
ＦＰＮ１に結合するＦａｂおよびＭａｂの親和性は、Ｂｉａｃｏｒｅ Ｔ１００で、およびＢｉａｃｏｒｅ Ｔ１００評価ソフトウェア（ＢＩＡｃｏｒｅ（登録商標） ＡＢ、Ｕｐｓａｌａ、Ｓｗｅｄｅｎ）での１：１結合モデルを使用して決定され得る。手短に言うと、ウイルス性トランス活性化因子を含まない市販のテトラサイクリンで制御された発現系であるＴ−ＲＥｘシステム（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）を、Ｔ−Ｒｅｘ ＨＥＫ ２９３細胞における安定な細胞株生成のために使用する。すべての増殖条件はＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎによって提供されるＴ−ＲＥｘマニュアルに記載されている。ＦＰＮ１は、ＧＦＰとＣ末端で融合している。ＦＰＮ１−ＧＦＰの発現を、１〜１０ｎｇ／ｍＬのドキシサイクリンによって１〜２４時間誘導する。誘導した細胞をフラスコからこそげ取ることにより回収し、次いで１×ＰＢＳで洗浄する。細胞ペレットは、使用するまで−８０℃で保存し得る。約５×１０６の誘導した細胞を、０．２％ Ｔｗｅｅｎ−２０およびプロテアーゼ阻害剤、例えば、Ｃｏｍｐｌｅｔｅ（商標）プロテアーゼ阻害剤カクテル錠剤（Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ Ｃｏｒｐ．、Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ、ＩＮ）を含む１０ｍＭ リン酸緩衝剤に再懸濁する。３サイクルの凍結／解凍／超音波処理を使用して細胞を溶解する。この可溶化物をＢｉａｃｏｒｅランニング緩衝剤で２倍に希釈し、遠心して細胞片（ｄｅｂｒｉｓ）を除去する。
【０１１８】
Ｂｉａｃｏｒｅ Ｔ１００上で、ウサギ抗ＧＦＰ抗体またはヤギ抗ＧＦＰ抗体を、５０００〜１５０００ ＲｕｓでＣＭ５チップのフローセル１〜４上に固定化する。ＦＰＮ１−ＧＦＰを、誘導した細胞の可溶化物からフローセル２、３、または４上に捕捉する。フローセル１は、基準として使用する。次いですべてのフローセルを異なる濃度の抗体とともに注入し、結合および動力学を評価する。親和性効果を最小にするために、Ｆａｂなどの一価の抗原結合フラグメントを使用する表面プラズモン共鳴に基づく測定が、このアッセイフォーマットで多価の抗体を使用する測定よりも一般に好ましい。表４ａおよび４ｂは、それぞれウサギ抗ＧＦＰ抗体（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ（カタログ番号Ａ１１１２２））およびヤギ抗ＧＦＰ抗体（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ、Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ、ＭＮ（カタログ番号ＡＦ４２４０））を使用した抗ヒトＦＰＮ１に結合するＦａｂについての結合特性を示す。
【０１１９】
表４（ａ）：ＦＰＮ１抗体からヒトＦＰＮ１へのＦａｂの結合動力学（３７℃でＢｉａｃｏｒｅ Ｔ１００によって測定）
【０１２０】
【表７】
【０１２１】
表４（ａ）に示すように、マウスＦａｂ ３４Ａ９のヒトＦＰＮ１についてのＫＤは、このアッセイフォーマットにおいて３７℃でＳＰＲによって測定すると、およそ４１ｎＭである。マウスＦａｂ ３４Ａ９の親和性成熟体であるマウス Ｆａｂ １Ｇ９のヒトＦＰＮ１についてのＫＤは、３７℃でＳＰＲによって測定すると、約７．７ｎＭであり、およそ５倍の結合親和性の改善がある。ヒト重鎖フレームワークＶＨ１−６９および軽鎖フレームワークＯ２を有するマウスＦａｂ １Ｇ９のヒト化形態であるＦａｂ ３Ｄ８は、このアッセイフォーマットにおいて３７℃でＳＰＲによって測定すると、約１０ｎＭのヒトＦＰＮ１についてのＫＤを示した。
【０１２２】
表４（ｂ）：ＦＰＮ１抗体からヒトＦＰＮ１へのＦａｂの結合動力学（３７℃でＢｉａｃｏｒｅ Ｔ１００によって測定）
【０１２３】
【表８】
【０１２４】
表４（ｂ）に示すように、マウスＦａｂ ３４Ａ９の親和性成熟体であるマウスＦａｂ １Ｇ９のヒトＦＰＮ１についてのＫＤは、このアッセイフォーマットにおいて３７℃でＳＰＲによって測定すると、約２．９ｎＭである。ヒト重鎖フレームワークＶＨ１−６９および軽鎖フレームワークＯ２を有するマウスＦａｂ １Ｇ９のヒト化形態であるＦａｂ ３Ｄ８は、このアッセイフォーマットにおいて３７℃でＳＰＲによって測定すると、約６．３ｎＭのヒトＦＰＮ１についてのＫＤを示した。親和性が成熟したＦａｂ ４Ａ１０−３、Ｃｏｍｂｉ１１、およびＬ２．２−４は、このアッセイフォーマットにおいて３７℃でＳＰＲによって測定すると、約２．４ｎＭ〜約１．８ｎＭの間のヒトＦＰＮ１についてのＫＤを示した。
【０１２５】
表５は、ウサギ抗ＧＦＰ抗体（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ（カタログ番号Ａ１１１２２））を使用する、抗ヒトＦＰＮ１に結合するＭａｂについての結合特性を示す。
【０１２６】
表５：ヒトＦＰＮ１に対するＭａｂの結合動力学
（２５℃または３７℃でＢｉａｃｏｒｅ Ｔ１００によって測定）
【０１２７】
【表９】
【０１２８】
マウス３４Ａ９ ＭａｂのヒトＦＰＮ１についてのＫＤは、２５℃でＳＰＲによって測定すると、およそ１．１ｎＭである。マウス３４Ａ９ Ｍａｂの親和性成熟体であるマウス１Ｇ９ ＭａｂのヒトＦＰＮ１についてのＫＤは、２５℃でＳＰＲによって測定すると、約０．７３ｎＭである。ヒト重鎖および軽鎖フレームワーク（それぞれＶＨ１−６９およびＯ２）を有するマウス１Ｇ９ Ｍａｂのヒト化形態、３Ｄ８ Ｍａｂは、３７℃でＳＰＲによって測定すると、約３．４ｎＭのヒトＦＰＮ１についてのＫＤを示した。
【０１２９】
この実施例で記載したようにして測定されるヒトＦＰＮ１についてのＫＤは、高親和性でヒトＦＰＮ１に結合し、そして、より具体的には、ヒトＦＰＮ１が細胞によって発現され細胞膜に局在化されるときでさえ存在するＦＰＮ１のエピトープに結合するヒトＦＰＮ１に対する抗体の生成を例証する。
【０１３０】
実施例５：細胞のフェリチンレベルに対するＦＰＮ１ Ｍａｂの効果のインビトロアッセイ
ＦＰＮ１を内因的に発現するＣａｃｏ−２細胞（ヒト腸細胞細胞株）はフェリチンの変化についてモニターされ得る。Ｃａｃｏ−２細胞中のフェリチン濃度は、外因性の鉄源を添加することにより増加する可能性があり、この濃度は鉄排出を防止するヘプシジンを添加するとさらに増大され得る。従って、Ｃａｃｏ−２細胞における成熟ヘプシジンによって調節される鉄制御に対する抗ヒトＦＰＮ１抗体の効果は、以下のようにして測定され得る。
【０１３１】
トリプシン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）を使用してＣａｃｏ−２細胞を細胞培養液容器から取り出す。この細胞を集め、増殖培地（例えば、ＤＭＥＭ＋１０％ ＦＢＳ＋１％ 非必須アミノ酸＋１％ 抗生物質／抗真菌薬）の中で洗浄し、緩やかな遠心分離によって集める。細胞を培地の中に再懸濁し、数える。細胞濃度を増殖培地中の１×１０６細胞／ｍＬに調整し、２．５μＭ Ｆｅ：ＮＴＡ（１：４モル比で調製する）をこの細胞に加える。１００μｌの細胞を９６平穴プレートのウェルに加え，次いで３７℃、５％ ＣＯ２で２４時間インキュベーションする。マウスＩｇＧ１（陰性対照）、およびヒトＦＰＮ１に対する異なる親和性を有する２つの抗体を、６×の最終濃度にて増殖培地中で調製する。抗体希釈物（２５μＬ）または培地を三重にウェルに加える。このプレートを室温で１５分間インキュベーションし、このとき６００ｎＭ ヘプシジン（１００ｎＭ 最終濃度）を含むかまたは含まない２５μＬの５μＭ Ｆｅ：ＮＴＡを適切なウェルに加える。この細胞を３７℃、５％ ＣＯ２で２４時間インキュベーションし、次いで２００μｌのＤｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ ＰＢＳで３回洗浄し、プロテアーゼ阻害剤、例えば、Ｃｏｍｐｌｅｔｅ（商標）プロテアーゼ阻害剤カクテル錠剤（Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ Ｃｏｒｐ．、Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ、ＩＮ）を添加した５０μＬの放射性免疫沈降法アッセイ緩衝剤（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ、ｐＨ ７．５、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、０．１％ ＳＤＳ、１％ Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ１００（登録商標）、および０．５％ デオキシコール酸ナトリウム）に溶解し、混合し、ＥＬＩＳＡを使用してフェリチンについてアッセイするまで−７０℃で凍結する。
【０１３２】
手短に言うと、マイクロタイタープレートを１１０μＬ／ウェルの１μｇ／ｍＬ 抗ヒトフェリチン（Ｌｅｉｎｃｏ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）でコーティングし、４℃で一晩インキュベーションする。このプレートを洗浄緩衝剤（０．０２Ｍ Ｔｒｉｓ、０．１５Ｍ ＮａＣｌ、０．１％ Ｔｗｅｅｎ ２０、ｐＨ ７．４）で２回洗浄し、ＰＢＳ中の１５０μｌの１％ カゼイン（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、ＩＬ）でブロックする。このプレートを、室温で１時間インキュベーションする。１００マイクロリットル（μＬ）の可溶化物および標品（ヒト肝臓フェリチン、Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ／ＥＭＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｌａ Ｊｏｌｌａ、ＣＡ）を適切なウェルに加え、室温で１時間インキュベーションする。このプレートを３回洗浄し、結合したフェリチンを、１：２０００希釈の１ウェルあたり１００μＬの抗フェリチン−ＨＲＰ接合体（Ｌｅｉｎｃｏ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）および室温で１時間のインキュベーションを使用して検出した。このプレートを４回洗浄し、および１００μＬのＯＰＤ基質（５μｌの３０％ Ｈ２Ｏ２を含む５ｍｇ 基質錠剤、１２．５ｍＬの０．１Ｍ Ｎａ２ＨＰＯ４、０．０５Ｍ クエン酸、ｐＨ ５．０に溶解する）をすべてのウェルに分配する。この反応を、１０分後に１００μＬ １Ｎ ＨＣｌを用いて停止する。４９０ｎｍでの吸光度（Ａ４９０）を適切なＥＬＩＳＡプレートリーダーを使用して読み取る。また、各サンプル中のタンパク質濃度は、ＢＣＡタンパク質アッセイキット（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用して測定する。起こり得るウェルごとの細胞数の差を説明するために、フェリチン濃度データをタンパク質濃度に対して正規化し、加えた抗体の効果を、阻害（％）として表す。
【０１３３】
この実施例に記載したようにして行う実験から、この細胞中のフェリチン濃度に対するヒトヘプシジン−２５の効果はＭａｂ ３４Ａ９および１Ｇ９によって阻害されるということが示される（表６）。さらには、これらの結果は、抗ＦＰＮ１ Ｍａｂの親和性はその機能性に対して直接に関係するということを示す。より具体的には、より低い親和性のＭａｂ ３４Ａ９は、最高濃度（２００μｇ／ｍＬ）であってさえも成熟したヘプシジンによって誘導される効果をわずかに阻害しただけであったのに対し（２５％阻害±０．５％）、より高い親和性のＭａｂ １Ｇ９は用量依存的に顕著な阻害を呈した。
【０１３４】
【表１０】
【０１３５】
このデータは、Ｍａｂ １Ｇ９および３４Ａ９はヒトヘプシジン−２５の、フェロポーチンの内在化および分解を誘導し、従ってこの細胞から排出される鉄を減少させるという能力をブロックするということを例証する。
【０１３６】
実施例６：ＦＰＮ１に結合するヒトヘプシジン−２５の阻害についてのアッセイ
安定にトランスフェクトされたＦＰＮ−ＧＦＰ／２９３細胞を、８０μｌのアッセイ培地（ＤＭＥＭ １１９６５、１０％ 透析したＦＢＳ、２０μＭ ＦＡＣ、ペニシリン−ストレプトマイシン）中に１ウェルあたり６０，０００細胞でポリ−Ｄ−リジンコーティングしたプレートの中にプレーティングし、３７℃、１０％ ＣＯ２で４時間インキュベーションする。ＦＰＮ１発現を誘導するために、ドキシサイクリンを１１．２ｎＭの最終濃度まで加える。ドキシサイクリンで誘導した細胞および誘導していない対照細胞を３７℃で一晩インキュベーションする。次に、この増殖培地を捨て、３０μｌのアッセイ培地中の試験抗体もしくはアイソタイプの対照抗体、または３０μｌのアッセイ培地のみの対照で置き換え、３７℃で１時間インキュベーションする。次に、２０μｌのビオチン化された成熟したヒトヘプシジンを３０ｎＭの最終濃度までウェルに加える。このサンプルを３７℃で１時間保管しておき、その後で２００μＬ ２％ ＦＢＳ、Ｄ−ＰＢＳ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）で４回洗浄する。次に、６５μｌの溶解緩衝剤（０．５％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００、１０ｍＭ ＥＤＴＡ）を加え、このプレートを１０分間振盪する。次に、各ウェルの溶液５０μＬをストレプトアビジンでコーティングしたプレート（ＰＢＳ中の６０μｌの２μｇ／ｍＬ ストレプトアビジン、４℃で一晩インキュベーションし、２回洗浄し（０．１％ Ｔｗｅｅｎ ２０、ＴＢＳ）、カゼイン／ＰＢＳでブロックする）の個々のウェルに移し、次いで室温で１時間インキュベーションする。次に、このプレートのウェルを３回洗浄し（０．１％ Ｔｗｅｅｎ ２０、ＴＢＳ）、５０μＬの０．５μｇ／ｍＬの抗ヒトヘプシジン−２５ Ｍａｂ ３．２３を加え、このサンプルを室温で１時間インキュベーションする。この抗ヒトヘプシジン−２５ Ｍａｂ ３．２３はＰＣＴ国際特許出願公開公報ＷＯ２００９／０５８７９７に記載されている。次に、このプレートを３回洗浄し、５０μＬの抗ヒトＩｇＧ−西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）を１：２０００希釈で加える。室温で１時間インキュベーションした後、５０μｌのＯＰＤ基質を加える。４分後に、この反応を１００μＬ １Ｎ ＨＣｌで停止する。４９０ｎｍでの吸光度（Ａ４９０）を適切なＥＬＩＳＡプレートリーダーを使用して読み取る。
【０１３７】
【表１１】
【０１３８】
基本的に実施例６に記載したようにして行った実験で生成したデータは、Ｍａｂ １Ｇ９および３４Ａ９がヒトヘプシジン−２５の、ヒトＦＰＮ１に結合する能力を阻害するということを実証する。
【０１３９】
実施例７：ヘプシジン−２５によって誘導される内在化および分解の抗ＦＰＮ１抗体阻害についての細胞ベースのアッセイ
インビトロでの細胞ベースのアッセイを使用して、ヒトＦＰＮ１に対して向けられるＭａｂ、またはその抗原−結合断片フラグメントの成熟したヘプシジン中和活性を測定し得る。このようなアッセイは、成熟したヘプシジンの受容体、ＦＰＮ１の成熟したヘプシジンによって誘導される内在化および分解に基づき得る。例えば、ＦＰＮ１の誘導可能な発現を許容するＨＥＫ ２９３安定細胞株が調製される。追跡目的のために、ＦＰＮ１は、Ｃ末端でＧＦＰと融合する。このＦＰＮ１−ＧＦＰ分子の誘導可能な発現を、Ｔ−ＲＥｘ ｓｙｓｔｅｍ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）を使用して制御する。このＦＰＮ１−ＧＦＰコード配列を、誘導可能なプロモーターおよびゼオシン耐性マーカーを含むｐＣＤＮＡ４／ＴＯベクターにクローン化する。得られたコンストラクトを、ドキシサイクリンにより誘導可能な発現のために必要とされる調節タンパク質を発現するＴ−ＲＥｘ−２９３細胞にトランスフェクトする。ゼオシン耐性クローンをＦＰＮ−ＧＦＰの誘導可能な発現について試験する。細胞増殖条件は、基本的にＴ−ＲＥｘ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）についての製造業者の使用説明書に記載されているとおりである。手短に言うと、細胞をＤＭＥＭ、１０％ 透析したＦＢＳ、２０μＭ ＦＡＣ、さらに５μｇ／ｍＬ ペニシリン−ストレプトマイシンの中で増殖させる。１００μｇ／ｍＬ ゼオシンおよび５μｇ／ｍＬブラストサイジンを用いて選択を維持する。細胞をポリ−Ｄ−リジンでコーティングされた９６穴の黒／透明プレート上にプレーティングする。Ａｃｕｍｅｎ Ｅｘｐｌｏｒｅｒ ＨＴＳ、高分解能蛍光プレートリーダーを、１ウェルあたりの全蛍光を読み取るために使用する。
【０１４０】
トリプシン処理後、ＦＰＮ１−ＧＦＰ／ＴＲＥｘ ２９３安定細胞株を使用して、９６穴アッセイプレートに９，０００細胞／ウェルで播種する。１ウェルあたりの播種量は８０μＬである。細胞を一晩付着させる。翌日の早朝に、９μｌの３０ｎｇ／ｍＬ ドキシサイクリンを各ウェルに加えてＦＰＮ１−ＧＦＰ発現を誘導する。３７℃での８時間の誘導後、培地を吸引し、これらのウェルを、１５０μＬ／ウェルのＰＢＳで慎重に洗浄する。
【０１４１】
洗浄後にアッセイプレートに素早く添加するために、所望の処置（例えば、ヒトヘプシジン−２５および／または試験抗体）を９６穴フォーマットの中で設定する。１ウェルあたりの最終のアッセイ体積は４５μＬである。上記処置を加えた直後に、Ａｃｕｍｅｎ Ｅｘｐｌｏｒｅｒ（チャネル１で５５０ボルトに設定する）を使用してアッセイプレートを読み取る。この読み取りは一般に０時間読み取りであり、１ウェルあたりの細胞数（１ウェルあたりの全蛍光単位（ＦＬＵ）と相関する）について正規化するために使用される。ＦＰＮ１の成熟したヒトヘプシジンによって誘導される内在化および分解について、最大効果は０．５μＭ 成熟したヒトヘプシジンで見られる。成熟したヒトヘプシジンのＩＣ５０はおよそ１０ｎＭである。抗ＦＰＮ１抗体中和アッセイについて、ヒトヘプシジン−２５濃度を１２０ｎＭに保ち、抗ＦＰＮ１ Ｍａｂを６００ｎＭ、２００ｎＭ、６７ｎＭ、２２ｎＭ、および７．４ｎＭで試験した。このプレートを２４時間インキュベーションし、その後、プレートを再度読み取り、データが、２４時間での１ウェルあたりの全ＦＬＵを０時間での１ウェルあたりの全ＦＬＵで割った比として生成される。すべてのデータ点を四重に行う。阻害パーセント（％）を、１２０ｎＭの成熟したヒトヘプシジン処置についての値を差し引き、次いでＦＰＮ１抗体処置の値をヒトヘプシジン−２５処置なしの値で割ることにより、測定する。
【０１４２】
基本的に上記のとおりにして行ったインビトロアッセイにおいて、ヒトヘプシジン−２５生物活性は、下記の表８に示すようにして測定した阻害パーセントでもって種々の抗ＦＰＮ１ Ｍａｂで中和された。
【０１４３】
表８：インビトロでの成熟したヒトヘプシジンによって誘導される内在化および分解の抗ＦＰＮ１ Ｍａｂ阻害パーセント（％）
【０１４４】
【表１２】
【０１４５】
基本的に実施例７に記載したようにして行った実験で生成したデータは、Ｍａｂ １Ｇ９、３４Ａ９、および３Ｄ８はヒトヘプシジン−２５の、インビトロでヒトＦＰＮ１の内在化および分解を引き起こす能力を大きく阻害するという結論を支持する。
【０１４６】
実施例８：カニクイザルへの単回静脈内用量後の対照マウスのＩｇＧ１に対するＭａｂ １Ｇ９の生物活性
血清ヘプシジンおよび血清鉄濃度に対する抗ヒトＦＰＮ１マウスのＭａｂ １Ｇ９の生理学的効果を、Ｍａｂを単回静脈内用量として雄性カニクイザル（Ｍａｃａｃａ ｆａｓｃｉｃｕｌａｒｉｓ；３〜４ｋｇ）に投与して、その効果をマウスのＩｇＧ１の対照投与と比較することにより検討した。投与後、血清鉄および血清ヘプシジンの分析のために血液サンプルを集めた。用量（３０ｍｇ／ｋｇ）を、伏在静脈を介して注射として投与した。用量投与の直後であるが、その動物から針が取り出される前に、この用量装置におよそ２ｍＬの生理食塩水を流した。
【０１４７】
【表１３】
【０１４８】
血清ヘプシジンについてのサンプリング：
用量前および用量後０．５、１、３、６、１０、２４、４８、７２、９６、および１６８時間後に血液を集めた。血液（およそ０．５ｍＬ）、大腿静脈を介して抗凝固薬を含有しないチューブの中へと集めた。血清を得るために、遠心分離の前に血液を周囲条件下で凝固させた。およそ−７０℃で保存する前に血清サンプルをドライアイス上に置いた。
【０１４９】
血清鉄についてのサンプリング：
用量前および用量後１、３、６、２４、４８、７２、９６、および１６８時間後に血液を集めた。医学界内で許容できると考えられる方法に従ってすべての血液サンプルを集め、取り扱い、処理し、保存し、そして分析した。血清鉄濃度は、医学界内で、全血清鉄（Ｆｅ）を測定する許容できる方法であると一般に考えられる当該技術分野で公知の任意の方法によって測定され得る。ヘプシジンの血清濃度は、基本的にＭｕｒｐｈｙら、Ｂｌｏｏｄ、１１０：１０４８−５４（２００７）に記載されているようにして、液体クロマトグラフィ−質量分析によって測定した。血清鉄を測定するためのアッセイは当該技術分野で周知である（例えば、Ｇｏｏｄｗｉｎ，Ｊ．Ｆ．ら，Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ １２：４７−５７（１９６６）、およびＪ．Ｃｌｉｎ．Ｐａｔｈ．，２４：３３４−３３５（１９７１）を参照のこと）。
【０１５０】
血清ヘプシジン濃度は、対照マウスのＩｇＧ１の投与によって影響を受けず、研究した時間的経過にわたって１．５〜３１ｎｇ／ｍＬの範囲であった。対照動物における平均ヘプシジン濃度は、１１．５±８．８ｎｇ／ｍＬ（平均±ＳＤ）であった。マウスのＭａｂ １Ｇ９の投与後、血清ヘプシジン濃度はそれぞれ７．６および１４．７ｎｇ／ｍＬというベースラインから４９．７および７９．１ｎｇ／ｍＬというピークへと上昇した。血清ヘプシジンのピークは、マウスのＭａｂ １Ｇ９の投与のおよそ１０時間後に生じた（図６）。血清ヘプシジンの上昇は、マウスのＭａｂ １Ｇ９と、その標的のＦＰＮ１（これは、ＦＰＮ１に結合するとＦＰＮ１とヘプシジンとの相互作用をブロックし、これによりＦＰＮ１クリアランスおよび／または内在化を緩慢化する）との相互作用に起因する可能性が高い。
【０１５１】
血清鉄は、対照マウスのＩｇＧで処置した動物においては上昇せず、研究した時間枠にわたっては６４〜９７μｇ／ｄＬの範囲であった。マウスのＭａｂ １Ｇ９の投与後、血清鉄濃度は、それぞれ１３６および１４４μｇ／ｄＬのベースラインから３０６および２９２μｇ／ｄＬのピークへと上昇した。血清鉄のピークは、マウスのＭａｂ １Ｇ９の投与のおよそ４８時間後に生じた（図７）。血清鉄濃度は、投与後９６時間までに徐々にベースラインまで戻り、これは血清鉄濃度の上昇が不可逆的であるということを示す。
【０１５２】
実施例９：ヘプシジン−２５によって誘導される内在化および分解の抗ＦＰＮ１抗体阻害についての細胞ベースのアッセイ
基本的に上記の実施例７に記載したようにして行った実験は、Ｍａｂ Ｃｏｍｂｉ−１１、４Ａ１０−３、およびＬ２．２−４は、Ｍａｂ ３４Ａ９、３Ｄ８、および１Ｇ９と比べて、インビトロでより効果的にヒトＦＰＮ１のヒトヘプシジン−２５によって誘導される内在化および分解を阻害する（表１０を参照のこと）ことを実証する。より具体的には、抗ＦＰＮ１ Ｍａｂを、９００ｎＭから始まり３倍の段階希釈を実施する９点濃度曲線で試験した。阻害パーセント（％）を、１２０ｎＭ ヒトヘプシジン処置についての値を差し引き、次いでＭａｂ処置の値をヘプシジン処置なしの値で割ることにより、測定した。相対的ＩＣ５０をシグマプロットで測定した。最高阻害パーセント（％）ならびに相対的および絶対的ＩＣ５０を表１０に示す。
【０１５３】
【表１４】
【０１５４】
実施例１０：カニクイザルにおけるヒト化抗フェロポーチンモノクローナル抗体４Ａ１０−３の薬力学的効果
抗フェロポーチンＭａｂの薬力学は、当業者に公知の方法に従って、静脈内用量を雌性カニクイザルに投与した後に研究され得る。例えば、５つの独立の研究で、Ｍａｂ ４Ａ１０−３を、カニクイザルに単回静脈内ボーラス（ｎ＝４／群）として０．３、１．０、３．０、１０および３０ｍｇ／ｋｇの用量で投与した。血液サンプル（複数の鉄パラメータについておよそ０．５ｍＬ）を、最初の用量の前および用量後１、６、１２、２４、４８、７２、９６、１６８および２６４時間に採取した。より高い用量レベルでは、さらなる血液サンプルを、用量後３６０、４５６、５５２、および６４８時間に採取した。投薬時には、これらの動物の体重は２〜３ｋｇの間であった。血液サンプルを、各動物から、大腿静脈を介して抗凝固薬を含まないチューブの中へと集めた。
【０１５５】
０．３、１．０、３．０、１０および３０ｍｇ／ｋｇ Ｍａｂ ４Ａ１０−３を雄性カニクイザルへと静脈内投与した後の血清鉄濃度−時間特性は、投薬後２４時間でピークとなる用量依存的な血清鉄の増加と関連した。ピーク鉄反応（およそ２倍の増加）および１０ｍｇ／ｋｇ〜３０ｍｇ／ｋｇ用量の間の反応の継続期間は類似していた。０．３、１．０、および３．０ｍｇ／ｋｇ用量が投与された動物では、投与後約４８時間で、血清鉄はベースライン値まで戻った。１０ｍｇ／ｋｇおよび３０ｍｇ／ｋｇ用量が投与された動物では、投与後約７２時間で、血清鉄はベースラインまで戻った。
【０１５６】
さらには、１回の研究では、１０ｍｇ／ｋｇの用量のＭａｂ ４Ａ１０−３の単回皮下注射の投与は、強度および継続期間の両方において、血清鉄において、等価な静脈内用量（ｎ＝４；平均±ＳＤ）の後に観察されたものと同一の反応（ｎ＝２；平均±ＳＤ）をもたらした。
【０１５７】
実施例１１：ラットおよびカニクイザルにおけるヒト化抗フェロポーチンモノクローナル抗体の薬物動態
抗フェロポーチンＭａｂの薬物動態は、当業者に周知の方法に従ってインビボで研究され得る。抗ＦＰＮ１ Ｍａｂ ４Ａ１０−３およびＣｏｍｂｉ １１の薬物動態を、例えば雄性カニクイザルおよびスプラーグドーリー（Ｓｐｒａｇｕｅ Ｄａｗｌｅｙ）ラットへの単回静脈内用量の後に検討した。投薬時には、使用したカニクイザルの体重は２．２〜５．５ｋｇの間であり、スプラーグドーリー（Ｓｐｒａｇｕｅ Ｄａｗｌｅｙ）ラットの体重は２４０〜２６５ｇの間であった。
【０１５８】
カニクイザルで行った薬物動態研究は３つの段階で実施し、１．０ｍｇ／ｋｇ、３．０ｍｇ／ｋｇ、および０．３ｍｇ／ｋｇの用量をおよそ２週間の間隔で投与した。各段階で、Ｍａｂ ４Ａ１０−３またはＭａｂ Ｃｏｍｂｉ１１のいずれかを単回静脈内ボーラスとして投与した（１群あたりｎ＝４）。最初の用量前および用量後１、６、１２、２４、４８、７２、９６、１６８、および２６４時間で血液サンプルを採取した。
【０１５９】
ラットでは、Ｍａｂ ４Ａ１０−３またはＭａｂ Ｃｏｍｂｉ １１を３ｍｇ／ｋｇの単回静脈内ボーラス用量として投与した（１群あたりｎ＝３）。連続的な血液サンプルを、用量前および用量後０．０８、１、４、８、２４、４８、７２、１２０および１６８時間で採取した。
【０１６０】
Ｍａｂ ４Ａ１０−３およびＣｏｍｂｉ １１の血清濃度を、ヒトＩｇＧサンドイッチＥＬＩＳＡフォーマットを使用して測定した。標準曲線範囲は５〜４００ｎｇ／ｍＬであり、作業用の定量下限（ＬＬＯＱ）は１０ｎｇ／ｍＬと定まった。ＷｉｎＮｏｎｌｉｎバージョン５．２での非区画分析（ｎｏｎ−ｃｏｍｐａｒｔｍｅｎｔａｌ ａｎａｌｙｓｉｓ）を使用して薬物動態パラメータを測定した。
【０１６１】
雄性カニクイザルへの静脈内投与後の血清濃度−時間特性を図１０にプロットする。Ｍａｂ ４Ａ１０−３は、研究したすべての用量でＭａｂ Ｃｏｍｂｉ１１よりもはるかにゆっくりと（およそ５倍）浄化された。検討したＭａｂ Ｃｏｍｂｉ１１の血清濃度がＭａｂ ４Ａ１０−３について観察された血清濃度のおよそ５０％であった最初の時間（１時間）で、差は明らかであった。用量後２４時間で、Ｍａｂ ４Ａ１０−３の血清濃度は、Ｃｏｍｂｉ１１についてのわずか６〜９％と比べて、Ｃｍａｘの２０〜３３％であった。Ｍａｂ Ｃｏｍｂｉ１１の末梢濃度は０．３ｍｇ／ｋｇ用量後は明白ではなかった。Ｍａｂ ４Ａ１０−３のクリアランスは３ｍｇ／ｋｇ用量と比べてより２つの低い用量ではいくらか速かった。Ｍａｂ ４Ａ１０−３についてのＴ１／２は２〜３日の範囲であった。しかしながら、Ｍａｂ Ｃｏｍｂｉ１１についてのＴ１／２は約１２〜約２７時間の範囲であった。
【０１６２】
Ｍａｂ ４Ａ１０−３よりも高められたＭａｂ Ｃｏｍｂｉ１１のクリアランスは、Ｍａｂ ４Ａ１０−３については起こらない、Ｍａｂ Ｃｏｍｂｉ１１と細胞表面タンパク質との非特異的な相互作用の増加に由来すると仮定した。この仮定を評価するために、Ｍａｂ ４Ａ１０−３およびＭａｂ Ｃｏｍｂｉ１１の薬物動態をラットで研究した。これは、Ｍａｂはラットのフェロポーチンに効果的には結合しないからである。
【０１６３】
雄性ラットへの静脈内投与後の血清濃度−時間特性を図１１にプロットする。霊長類での観察と同様に、ラットにおいてＭａｂ ４Ａ１０−３はＭａｂ Ｃｏｍｂｉ１１よりもゆっくりと（およそ５倍）浄化された（データは示さず）。ここでも、検討したＭａｂ Ｃｏｍｂｉ１１の血清濃度がＭａｂ ４Ａ１０−３について観察された血清濃度のおよそ５０％であった最初の時間点（０．０８時間）で、差は明らかであった。Ｍａｂ ４Ａ１０−３およびＭａｂ Ｃｏｍｂｉ１１についてのＴ１／２は、ラットではそれぞれおよそ４．５日および３日であった（データは示さず）。
【０１６４】
これらのデータは、Ｍａｂ Ｃｏｍｂｉ１１について観察されたより迅速なクリアランスは、標的受容体によって媒介されるクリアランスが原因であったということを強く示唆する。なぜなら、Ｍａｂ ４Ａ１０−３もＭａｂ Ｃｏｍｂｉ１１もラットフェロポーチンに結合しないからである。
【０１６５】
実施例１２：遅延したクリアランスおよび／または低非特異的（ヘパリン）結合を有する抗ヒトＦＰＮ１ Ｍａｂ
実施例１１で上記されたＭａｂ Ｃｏｍｂｉ１１の薬物動態研究は、Ｍａｂ Ｃｏｍｂｉ１１がＭａｂ ４Ａ１０−３と比べてより迅速に血清から浄化されるということを示唆した。このデータはまた、Ｍａｂ ４Ａ１０−３と比べたＭａｂ Ｃｏｍｂｉ１１のより迅速なクリアランスはＭａｂ ４Ａ１０−３よりもＭａｂ Ｃｏｍｂｉ１１の、標的受容体によって媒介されるクリアランスの増加が原因ではないということを示唆した。
【０１６６】
複数のアルギニン残基がＭａｂ Ｃｏｍｂｉ１１の遺伝子操作の間に導入されたため、Ｍａｂ ４Ａ１０−３と比べて得られたＭａｂ Ｃｏｍｂｉ１１の正電荷の増加が、例えば、負に帯電した膜表面へのおよびヘパリンへの望ましくない非特異的結合の増加をもたらしたということが疑われた。実際、Ｍａｂ Ｃｏｍｂｉ１１の構造のモデリングから、Ｍａｂ ４Ａ１０−３およびＭａｂ Ｌ２．２−４を含めた他のヒトの遺伝子操作された抗ＦＰＮ１ ＭａｂのいくつかよりもＭａｂ Ｃｏｍｂｉ１１においてはっきりとした、Ｍａｂ Ｃｏｍｂｉ１１の表面上の強い正に帯電したパッチ（ｐａｔｃｈ）が示された。
【０１６７】
Ｍａｂ Ｃｏｍｂｉ１１、４Ａ１０−３、およびＬ２．２−４を、当業者に公知の方法に従ってヘパリンＥＬＩＳＡを使用して非特異的ヘパリン結合について試験した。Ｍａｂ Ｃｏｍｂｉ１１、４Ａ１０−３、３Ｄ８、およびＬ２．２−４を、ＨＥＫ ２９３細胞を発現するヒトＦＰＮ１への結合、および細胞表面で発現されるヒトＦＰＮ１を欠く対照のＨＥＫ ２９３細胞への結合についても試験した。
【０１６８】
Ｍａｂ Ｃｏｍｂｉ−１１を使用したヘパリンＥＬＩＳＡは、Ｍａｂ Ｃｏｍｂｉ１１はヘパリンに強く結合するが、Ｍａｂ ４Ａ１０−３およびＬ２．２−４はそうではないということを示した。さらには、Ｍａｂ Ｃｏｍｂｉ−１１はＨＥＫ ２９３細胞を発現するヒトＦＰＮ１および細胞表面で発現されるヒトＦＰＮ１を欠く対照のＨＥＫ ２９３細胞の両方にも強く結合した。他方、Ｍａｂ ４Ａ１０−３、３Ｄ８、およびＬ２．２−４は、ＨＥＫ ２９３細胞を発現するヒトＦＰＮ１には顕著に結合したが、対照のＨＥＫ ２９３細胞に対してはそうではなかった。
【０１６９】
それゆえ、ＨＣＤＲ２の中のアルギニンアミノ酸残基をグリシンアミノ酸残基で置き換えることによって、Ｍａｂ Ｃｏｍｂｉ１１に関して観察される非特異的結合を減少させるためにＭａｂ Ｃｏｍ１１ＧＹを生成した。加えて、Ｍａｂ Ｃｏｍｂｉ１１で見出された別の潜在的に問題があるアミノ酸残基、ＬＣＤＲ２中のトリプトファンアミノ酸残基を、Ｍａｂ Ｃｏｍ１１ＧＹの中ではチロシンアミノ酸残基で置き換えた。Ｍａｂ Ｃｏｍ１１ＧＹを発現する細胞由来の上清を使用した予備段階の結合データは、対照のＨＥＫ ２９３細胞、すなわちヒトＦＰＮ１を発現しない細胞への非特異的結合の欠如を実証したが、Ｍａｂ １Ｂ７および１Ｆ８はともに同じ対照細胞に対する著しくより非特異的な結合を実証した。
【０１７０】
実施例１３：ＦＰＮ１に結合するヒトヘプシジン−２５の阻害についてのアッセイ
ヒトの遺伝子操作された、親和性が成熟した抗ヒトＦＰＮ１抗体は、ＨＥＫ ２９３細胞の中で発現されるヒトＦＰＮ１に結合するヒトヘプシジン−２５を阻害する能力についてアッセイされ得る。手短に言うと、トランスフェクトされたＦＰＮ／２９３細胞を、９６穴プレート上でポリ−Ｄ−リジンコーティングしたプレート（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｓａｎ Ｊｏｓｅ、ＣＡ；ＢＤ Ｂｉｏｃｏａｔ プレート番号３５ ４６４０）の中で、８０μｌのアッセイ培地（ＤＭＥＭ １１９６５、１０％ 透析したＦＢＳ、２０μＭ ＦＡＣ、ペニシリン−ストレプトマイシン）中に１ウェルあたり４０，０００細胞でプレーティングし、毎分１０００回転で１分間遠心分離し、次いで３７℃、１０％ ＣＯ２で４時間インキュベーションする。ＦＰＮ１発現を、１０ｎＭのドキシサイクリン２０μｌをこのプレーティングした細胞に加える（２ｎＭの、ドキシサイクリンの最終濃度）ことによって誘導する。ドキシサイクリンで誘導される細胞および誘導されない対照細胞を３７℃、１０％ ＣＯ２で５時間インキュベーションする。次に、このプレートをＤＭＥＭで２回洗浄することによりこの誘導剤を除去する。この細胞を、１００μｌのアッセイ培地の中で一晩インキュベーションする。次に、このアッセイ培地を除去し、４０μＬの試験抗体またはアイソタイプの対照抗体溶液で三重に置き換え、３７℃、１０％ ＣＯ２で２０分間インキュベーションする。次に、２０μｌのビオチン化された成熟したヒトヘプシジンをこのウェルに、１ウェルあたり３０ｎＭの最終濃度で加える。このサンプルを３７℃、１０％ ＣＯ２で１時間インキュベーションし、その後、２００μＬ ２％ ＦＢＳ、Ｄ−ＰＢＳ（Ｇｉｂｃｏ、カタログ番号１４０４０）で４回洗浄する。次に、６５μｌの溶解緩衝剤（０．５％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００、１０ｍＭ ＥＤＴＡ）をすべてのウェルに加え、このプレートを１０分間振盪する。次に、各ウェルの中の溶液５０μＬを、ストレプトアビジンでコーティングしたＧｒｅｉｎｅｒマイクロタイタープレート（ＰＢＳ中の６０μｌの２μｇ／ｍＬ ストレプトアビジン（Ｓｉｇｍａ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ；カタログ番号 Ｓ４７６２）、４℃で一晩インキュベーションし、２回（０．１％ Ｔｗｅｅｎ ２０、ＴＢＳ）洗浄し、カゼイン／ＰＢＳでブロックする）の個々のウェルに移し、次いで室温で１時間インキュベーションした。次に、このプレートのウェルを３回洗浄し（０．１％ Ｔｗｅｅｎ ２０、ＴＢＳ）、０．５μｇ／ｍＬの５０μＬの抗ヒトヘプシジン−２５ Ｍａｂ ３．２３を加え、このサンプルを室温で１時間インキュベーションする。この抗ヒトヘプシジン−２５ Ｍａｂ ３．２３は、ＰＣＴ国際特許出願公開公報ＷＯ２００９／０５８７９７号に記載されている。次に、このプレートを３回洗浄し、５０μｌのヤギ抗ヒトＩｇＧ−西洋ワサビペルオキシダーゼ（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ Ｂｉｏｔｅｃｈカタログ番号２０６０−０５）を１：２０００希釈で加える。室温で１時間のインキュベーション後、このプレートを４回洗浄し、５０μｌのＯＰＤ基質（Ｓｉｇｍａ；カタログ番号Ｐ６９１２）を加える。この反応を、４分後に１００μＬ １Ｎ ＨＣｌで停止する。４９０ｎｍでの吸光度（Ａ４９０）を、適切なＥＬＩＳＡプレートリーダーを使用して読み取る。アッセイ範囲は、対照抗体を受け取った誘導されたウェルから誘導されないウェルのＡ４９０を差し引くことにより測定される。
【０１７１】
表１１に示すデータは、ヒト化Ｍａｂ ３Ｄ８およびその親和性が成熟した変異体は、ヒトヘプシジン−２５の、ヒトＦＰＮ１に結合する能力を有意に阻害することを実証する。より具体的には、ヒト重鎖フレームワークＶＨ１−６９および軽鎖フレームワークＯ２を有するＭａｂ ３Ｄ８、マウスＭａｂ １Ｇ９のヒト化体は、このアッセイフォーマットにおいて測定すると、約４００ｎＭ のＩＣ５０を実証した。親和性が成熟したＭａｂ ４Ａ１０−３、Ｃｏｍｂｉ１１、およびＬ２．２−４は、このアッセイフォーマットにおいて測定すると、結合の有意に改善された阻害を実証した。
【０１７２】
【表１５】
【０１７３】
実施例１４：細胞のフェリチンレベルに対するＦＰＮ１ Ｍａｂの効果のインビトロアッセイ
実施例５に記載したように、ＦＰＮ１を内因的に発現するＣａｃｏ−２細胞、ヒト腸細胞細胞株は、フェリチンの変化についてモニターされ得る。基本的に実施例５に記載したようにして行った実験では、Ｃａｃｏ−２細胞における成熟したヘプシジンによって調節される鉄制御に対する抗ヒトＦＰＮ１抗体の効果を測定し、いくつかの独立の実験にわたって平均した阻害パーセントとして下記の表１２に表す。
【０１７４】
このデータは、この細胞におけるフェリチン濃度に対するヘプシジンの効果は抗ヒトＦＰＮ１ Ｍａｂによって用量依存的に阻害され得るということを示す。ＥＣ５０値によって示されるように、いくつかの抗ヒトＭａｂは、他のものよりも、ヘプシジンの効果を阻害することにおいて強力である、例えば、Ｃｏｍｂｉ１１において、およそ４Ａ１０−３＞Ｌ２−２−４＞３Ｄ８である。
【０１７５】
表１２：インビトロでのＣａｃｏ−２細胞における細胞のフェリチンレベルの成熟したヘプシジンによって誘導された増加に対する、抗ヒトＦＰＮ１ Ｍａｂによる阻害率（±ＳＥＭ）
【０１７６】
【表１６】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、フェロポーチン１（ＦＰＮ１）に結合する抗体、および、貧血の治療におけるその抗体の使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
鉄は、多くの細胞機能に必要な必須微量元素である。哺乳動物において、身体への鉄の供給は、十二指腸細胞による鉄吸収レベルにて身体の鉄必要量と一致するよう調節される。腸細胞の側底膜を横断する鉄輸送は、フェロポーチン１（鉄調節輸送体１（ＩＲＥＧ−１）、金属輸送タンパク質１（ＭＴＰ１）およびＳＬＣ４０Ａ１しても知られる）（以後、本願明細書においてＦＰＮ１と称する）により媒介されると考えられている。
【０００３】
現在、ＦＰＮ１は、鉄貯蔵および炎症に応答して肝臓により生成されるポリペプチドホルモンである、ヘプシジンについての受容体として知られている。成熟ヘプシジンのＦＰＮ１への結合は、ＦＰＮ１の内在化および分解を導き、細胞の鉄輸送を防ぎ、そして、全身の鉄恒常性の主要な制御因子となる。
【０００４】
特許文献１は、とりわけ、ヒトＦＰＮ１タンパク質をコードするヌクレオチド配列、鉄輸送機能を有するヒトＦＰＮ１タンパク質、および、ヒトＦＰＮ１のＣ末端１９アミノ酸からなるペプチドに対して生成されるウサギポリクローナル抗血清について開示している。特許文献２は、フェロポーチンＭａｂとこれらを用いて鉄恒常性の疾患を治療する方法について記載している。より具体的には、特許文献２は、ヒトＦＰＮ１タンパク質の種々のエピトープに対する、齧歯類および完全にヒトのモノクローナル抗体について記載している。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】米国特許第７，１６６，４４８号明細書
【特許文献２】国際公開第２００９／０９４５５１号パンフレット
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
鉄輸送におけるＦＰＮ１の関与、および、鉄恒常性の疾患とＦＰＮ１変異との関連を考慮すると、治療に有用なＦＰＮ１アンタゴニストが必要とされており、当該アンタゴニストは、ＦＰＮ１の細胞外エピトープに対して高親和性にて結合し、結合すると、成熟ヘプシジンにより媒介されるＦＰＮ１内在化を阻害して、これにより、細胞内貯蔵からの鉄輸送を維持または促進する。加えて、ＦＰＮ１の細胞外エピトープへの成熟ヘプシジンの結合を阻害することを目的に、Ｍａｂまたはその抗原結合フラグメントを用いて治療的にＦＰＮ１を標的とすることは、その標的と結合することで、抗体が細胞鉄の流出を著しく乱さないおよび／または内在化を誘導しないよう十分に正確に行わなければならない。加えて、ヒトの薬物治療において使用することを意図した抗ＦＰＮ抗体は、それらを治療的に使用できるようにするためにインビボでの安定性および／または排出半減期を含む十分な薬物動態的特徴および薬力学的特徴を示さなければならない。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本願明細書において開示される抗ヒトＦＰＮ１抗体のうちの１つ以上は、
（ａ）４０３ＳＰＦＥＤＩＲＳＲＦＩＱＧＥＳＩＴＰＴＫ４２２（配列番号１２）；
（ｂ）４０６ＥＤＩＲＳＲＦＩＱＧＥＳＩＴ４１９（配列番号１３）；
（ｃ）４０９ＲＳＲＦＩＱＧＥＳＩＴＰＴＫ４２２（配列番号１４）；
（ｄ）４０３ＳＰＦＥＤＩＲＳＲＦＩＱＧ４１５（配列番号１５）；
（ｅ）４０９ＲＳＲＦＩＱＧＥＳＩＴ４１９（配列番号１６）；および
（ｆ）４０９ＲＳＲＦＩＱＧ４１５（配列番号９５）
からなる群より選択されるヒトＦＰＮ１の少なくとも一つのペプチドフラグメントを含む、ヒトＦＰＮ１に特異的に結合し、フェロポーチンへのヘプシジンの結合をブロックし、インビトロにおけるヘプシジン活性を潜在的に阻害し、インビボにおいて用量依存的に血清鉄濃度を上昇させ、そして、受容可能な溶解性、インビボでの安定性、および、排出半減期の特性を有し、これら抗ヒトＦＰＮ１抗体を、静脈内注入を介して（または、おそらく皮下注射を介してであっても）投与することにより、それらは、貧血の治療を必要とする被験体において貧血を治療および／または予防するのに有用な薬剤となる。
【０００８】
したがって、その種々の態様の間で、本発明は、
（ａ）４０３ＳＰＦＥＤＩＲＳＲＦＩＱＧＥＳＩＴＰＴＫ４２２（配列番号１２）；
（ｂ）４０６ＥＤＩＲＳＲＦＩＱＧＥＳＩＴ４１９（配列番号１３）；
（ｃ）４０９ＲＳＲＦＩＱＧＥＳＩＴＰＴＫ４２２（配列番号１４）；
（ｄ）４０３ＳＰＦＥＤＩＲＳＲＦＩＱＧ４１５（配列番号１５）；
（ｅ）４０９ＲＳＲＦＩＱＧＥＳＩＴ４１９（配列番号１６）；および
（ｆ）４０９ＲＳＲＦＩＱＧ４１５（配列番号９５）
からなる群より選択される１つ以上のアミノ酸配列に局在するアミノ酸を含むエピトープにて、配列番号１に示されるアミノ酸配列からなるヒトフェロポーチン１に特異的に結合する、モノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメントを提供する。
【０００９】
いくつかの実施形態において、本発明は、配列番号３７、１２９、２２、１０７、１１８および１２０にそれぞれ示されるアミノ酸配列を含む、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、ＬＣＤＲ３、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２およびＨＣＤＲ３を含むＭａｂまたはその抗原結合フラグメントを提供し、当該Ｍａｂまたはその抗原結合フラグメントは、配列番号１２に示されるアミノ酸または配列番号１２に示されるアミノ酸配列に局在するアミノ酸を含むエピトープにて、好ましくはＭａｂについて２５℃およびＦａｂについて３７℃にて表面プラズモン共鳴により測定される場合、約１００ｎＭ以下のＫＤで、配列番号１に示されるアミノ酸配列からなるヒトＦＰＮ１と結合する。
【００１０】
いくつかの実施形態において、本発明のＭａｂまたはその抗原結合フラグメントは、
（ｉ）配列番号２０、３２、３３、３０、３１、および１９にそれぞれ示されるアミノ酸配列を含む、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、ＬＣＤＲ３、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２およびＨＣＤＲ３；
（ｉｉ）配列番号４２、３２、３３、３０、４３、および１９にそれぞれ示されるアミノ酸配列を含む、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、ＬＣＤＲ３、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２およびＨＣＤＲ３；
（ｉｉｉ）配列番号４２、２７、２２、２３、４１、および１９にそれぞれ示されるアミノ酸配列を含む、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、ＬＣＤＲ３、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２およびＨＣＤＲ３；
（ｉｖ）配列番号４２、３２、３３、２３、４１、および１９にそれぞれ示されるアミノ酸配列を含む、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、ＬＣＤＲ３、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２およびＨＣＤＲ３；
（ｖ）配列番号２０、２１、２２、１７、１８、および１９にそれぞれ示されるアミノ酸配列を含む、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、ＬＣＤＲ３、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２およびＨＣＤＲ３；
（ｖｉ）配列番号２０、２７、２９、２３、２４、および１９にそれぞれ示されるアミノ酸配列を含む、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、ＬＣＤＲ３、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２およびＨＣＤＲ３；
（ｖｉｉ）配列番号３７、２７、２２、２３、４１、および１９にそれぞれ示されるアミノ酸配列を含む、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、ＬＣＤＲ３、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２およびＨＣＤＲ３；
（ｖｉｉｉ）配列番号１７０、１７１、１７２、１８２、１７３、および１９にそれぞれ示されるアミノ酸配列を含む、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、ＬＣＤＲ３、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２およびＨＣＤＲ３；
（ｉｘ）配列番号３７、１２７、２２、２３、１１６、および１９にそれぞれ示されるアミノ酸配列を含む、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、ＬＣＤＲ３、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２およびＨＣＤＲ３；
（ｘ）配列番号３７、１２５、２２、２３、１１０、および１９にそれぞれ示されるアミノ酸配列を含む、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、ＬＣＤＲ３、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２およびＨＣＤＲ３；
（ｘｉ）配列番号３７、１２２、２２、２３、１１０、および１９にそれぞれ示されるアミノ酸配列を含む、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、ＬＣＤＲ３、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２およびＨＣＤＲ３；
（ｘｉｉ）配列番号３７、１２９、２２、１０７、１１８、および１２０にそれぞれ示されるアミノ酸配列を含む、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、ＬＣＤＲ３、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２およびＨＣＤＲ３；
（ｘｉｉｉ）配列番号３７、１２８、２２、１０５、４１、および１１９にそれぞれ示されるアミノ酸配列を含む、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、ＬＣＤＲ３、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２およびＨＣＤＲ３；
（ｘｉｖ）配列番号３７、１７４、２２、１７５、１７６、および１２０にそれぞれ示されるアミノ酸配列を含む、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、ＬＣＤＲ３、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２およびＨＣＤＲ３；
（ｘｖｉ）配列番号３７、１２８、２２、１０５、１１７、および１９にそれぞれ示されるアミノ酸配列を含む、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、ＬＣＤＲ３、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２およびＨＣＤＲ３；ならびに
（ｘｖｉｉ）配列番号３７、１７７、２２、２３、１１２、および１９にそれぞれ示されるアミノ酸配列を含む、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、ＬＣＤＲ３、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２およびＨＣＤＲ３
からなる群より選択される６個のＣＤＲを含み、また、本発明のＭａｂまたはその抗原結合フラグメントは、
（ａ）４０３ＳＰＦＥＤＩＲＳＲＦＩＱＧＥＳＩＴＰＴＫ４２２（配列番号１２）；
（ｂ）４０６ＥＤＩＲＳＲＦＩＱＧＥＳＩＴ４１９（配列番号１３）；
（ｃ）４０９ＲＳＲＦＩＱＧＥＳＩＴＰＴＫ４２２（配列番号１４）；
（ｄ）４０３ＳＰＦＥＤＩＲＳＲＦＩＱＧ４１５（配列番号１５）；
（ｅ）４０９ＲＳＲＦＩＱＧＥＳＩＴ４１９（配列番号１６）；および
（ｆ）４０９ＲＳＲＦＩＱＧ４１５（配列番号９５）
からなる群より選択されるアミノ酸配列に局在する１つのアミノ酸または複数のアミノ酸からなるか、またはそれらから実質的になるエピトープにて、好ましくはＭａｂについて２５℃およびＦａｂについて３７℃にてＳＰＲにより測定される場合、約１００ｎＭ未満のＫＤで、配列番号１に示されるアミノ酸配列からなるヒトＦＰＮ１に結合する。
【００１１】
特定の実施形態において、本発明のＭａｂまたはその抗原結合フラグメントは、ヘプシジンにより誘導されるヒトＦＰＮ１の内在化および／または分解を阻害し、これにより、被験体（好ましくは、ヒト被験体）において、（１）細胞からの鉄輸送、（２）血清鉄濃度、（３）網状赤血球数、（４）赤血球数、（５）ヘモグロビン、および／または（６）ヘマトクリットを維持するか、あるいは当該Ｍａｂまたはその抗原結合フラグメントの非存在下での当該被験体におけるそれらのものと比べて少なくとも約１０％増加させる。
【００１２】
別の態様において、本発明の抗ヒトＦＰＮ１Ｍａｂまたはその抗原結合フラグメントをコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドが提供される。
【００１３】
別の態様において、本願明細書に開示されるＭａｂまたはその抗原結合フラグメントのいずれかおよび薬学的に受容可能な担体、希釈剤、または賦形剤を含む薬学的組成物が提供される。また、（１）治療（好ましくは、貧血の治療または予防のための治療）における本願明細書に開示されるＭａｂまたはその抗原結合フラグメントの使用、（２）併用療法（好ましくは、貧血の治療または予防のための併用療法）における本願明細書に開示されるＭａｂまたはその抗原結合フラグメントの使用、（３）被験体（好ましくは、ヒト）において血清鉄濃度、網状赤血球数、赤血球数、ヘモグロビン、および／またはヘマトクリットを維持または増加させる、貧血の治療または予防のための本願明細書に開示されるＭａｂまたはその抗原結合フラグメントの使用、（４）被験体（好ましくは、ヒト）において血清鉄濃度、網状赤血球数、赤血球数、ヘモグロビン、および／またはヘマトクリットを維持または増加させる、貧血の治療または予防のための医薬に製造のための、本願明細書に開示されるＭａｂまたはその抗原結合フラグメントの使用、ならびに、（５）ヒトにおいて血清鉄濃度、網状赤血球数、赤血球数、ヘモグロビン、および／またはヘマトクリットを増加させる、貧血の治療または予防のための併用療法に用いられる医薬の製造のおける本願明細書に開示されるＭａｂまたはその抗原結合フラグメントの使用も提供される。ここで、当該医薬は、貧血の治療に従来から用いられている１つ以上のＥＳＡまたは他の治療剤または治療的処置と組み合わせて投与され、ヒトにおける血清鉄濃度、網状赤血球数、赤血球数、ヘモグロビン、および／またはヘマトクリットを維持または増加させる。
【００１４】
さらに別の態様において、（１）本願明細書において開示される有効量のＭａｂまたはその抗原結合フラグメントを、それを必要とする被験体に対して投与することを含む、被験体（好ましくはヒト）において血清鉄濃度、網状赤血球数、赤血球数、ヘモグロビン、および／またはヘマトクリットを維持または増加させる方法、（２）本願明細書において開示される有効量のＭａｂまたはその抗原結合フラグメントを、それを必要とする被験体（好ましくはヒト）に対して投与することを含む、限定されないが、慢性疾患による貧血、癌による貧血、および、炎症による貧血を含む貧血を治療または予防する方法、（３）本願明細書において開示されるＭａｂまたはその抗原結合フラグメントの組み合わせ、または、本願明細書において開示される少なくとも１つのＭａｂおよび少なくとも１つの抗原結合フラグメントの混合物の有効量を、それを必要とする被験体（好ましくはヒト患者）に対して投与することを含む、限定されないが、慢性疾患による貧血、癌による貧血、および、炎症による貧血を含む貧血を治療または予防する方法、ならびに、（４）ヒトにおいて血清鉄濃度、網状赤血球数、赤血球数、ヘモグロビン、および／またはヘマトクリットを維持または増加させるために投与される、ＥＳＡもしくは他の治療剤または治療的処置を、当該ヒト患者に対して投与することをさらに含む、上述の方法（１）から（３）のうちのいずれかの方法が提供される。
【００１５】
さらに別の態様において、ＦＰＮ１と、本願明細書に開示される有効量の少なくとも１つのＭａｂまたはその抗原結合フラグメントを接触させることを含む、成熟ヘプシジンにより誘導される当該ＦＰＮ１の内在化および分解を阻害するための方法が提供される。
【００１６】
また、ヒトＦＰＮ１と、本願明細書に開示される有効量の少なくとも１つのＭａｂおよび／またはその抗原結合フラグメントを接触させることを含む、当該ヒトＦＰＮ１への成熟ヒトヘプシジンの結合を減少させる方法が提供される。
【００１７】
また、本願明細書に開示される有効量の少なくとも１つのＭａｂおよび／またはその抗原結合フラグメントを、それを必要とするヒト患者に対して投与することを含む、ＦＰＮ１タンパク質を発現する細胞により内在化されるＦＰＮ１タンパク質の量を減少させる方法が提供される。
【図面の簡単な説明】
【００１８】
【図１】図１は、抗ＦＰＮ１抗体の生成に使用される免疫原のフラグメントを含む種々のペプチドの配列、および、抗ＦＰＮ１ Ｍａｂ ３４Ａ９のエピトープを規定するためにペプチドを用いるペプチド−抗体結合実験の結果を示す。下線のアミノ酸は、実際のフェロポーチン配列を示す。Ｍａｂ ３４Ａ９は、ペプチドＦｐｎＥ３ａ、０６０７１９Ｚ、０７０８Ｌ４Ｃ、および０７０８Ｌ４Ｄ（これらはすべて共通アミノ酸配列であるＲＳＲＦＩＱＧ（配列番号９５）を含む）に対して結合する。
【図２】図２Ａは、散在ＣＤＲを有する完全ヒト軽鎖フレームワークＯ２のアミノ酸配列を示す。４つのフレームワーク領域は、ＦＲＬ１、ＦＲＬ２、ＦＲＬ３、およびＦＲＬ４として表記される（それぞれ配列番号７４、７５、７６、および７７）。図２Ｂは、散在ＣＤＲを有するヒト重鎖フレームワークＶＨ１−６９のアミノ酸配列を示す。４つのフレームワーク領域は、ＦＲＨ１〜４として表記される（それぞれ配列番号７８〜８１）。
【図３】図３Ａは、散在ＣＤＲを有するヒト軽鎖フレームワークＯ１８のアミノ酸配列を示す。４つのフレームワーク領域は、ＦＲＬ１、ＦＲＬ２、ＦＲＬ３、およびＦＲＬ４として表記される（それぞれ配列番号７４、７５、８２、および７７）。Ｏ２残基と異なる残基は、太字下線にて示される。図３Ｂは、散在ＣＤＲを有するヒト重鎖フレームワークＶＨ１−１８のアミノ酸配列を示す。４つのフレームワーク領域は、ＦＲＨ１、ＦＲＨ２、ＦＲＨ３、およびＦＲＨ４として表記される（それぞれ配列番号８３、７９、８４、および８１）。ＶＨ１−６９残基と異なる残基は、太字下線にて示される。
【図４】図４Ａは、散在ＣＤＲを有するヒト軽鎖フレームワークＬ１２のアミノ酸配列を示す。４つのフレームワーク領域は、ＦＲＬ１、ＦＲＬ２、ＦＲＬ３、およびＦＲＬ４として表記される（それぞれ配列番号８５、７５、８６、および７７）。Ｏ２残基と異なる残基は、太字下線にて示される。図４Ｂは、散在ＣＤＲを有するヒト重鎖フレームワークＶＨ１−４６のアミノ酸配列を示す。４つのフレームワーク領域は、ＦＲＨ１、ＦＲＨ２、ＦＲＨ３、およびＦＲＨ４として表記される（それぞれ配列番号８３、７９、８７、および８１）。ＶＨ１−６９残基と異なる残基は、太字下線にて示される。
【図５】図５は、散在ＣＤＲを有するヒト軽鎖フレームワークＬ１のアミノ酸配列を示す。４つのフレームワーク領域は、ＦＲＬ１、ＦＲＬ２、ＦＲＬ３、およびＦＲＬ４として表記される（それぞれ配列番号７４、１６８、７６、および１６９）。Ｏ２残基と異なる残基は、太字下線にて示される。ヒト軽鎖フレームワークＬ１２のＦＲ１の生殖細胞系列の配列は、配列番号８５に示され、ここで、ヒト軽鎖フレームワークＬ１のＦＲ１領域のアミノ酸配列の変形は、配列番号７４に示され、本発明の特定の実施形態として企図される。
【図６】図６は、投与量３０ｍｇ／ｋｇの単回Ｉ．Ｖ．として投与された対照マウスＩｇＧ１またはマウスＭａｂ１Ｇ９投与後の雄性カニクイザルにおける血清ヘプシジン濃度のグラフを示す。データは、個々の動物からのものである。
【図７】図７は、投与量３０ｍｇ／ｋｇの単回Ｉ．Ｖ．として投与された対照マウスＩｇＧ１またはマウスＭａｂ１Ｇ９投与後の雄性カニクイザルにおける血清鉄濃度のグラフを示す。データは、個々の動物からのものである。
【図８】図８は、本発明の抗体およびその抗原結合フラグメントについての好ましい重鎖可変領域のアミノ酸配列およびコンセンサスアミノ酸配列を示す。ピリオド（．）は、その位置におけるアミノ酸が配列番号１の対応するアミノ酸と同一であることを示す。ＣＤＲは配列番号１について太線下線にて示される。
【図９】図９は、本発明の抗体およびその抗原結合フラグメントについての好ましい軽鎖可変領域のアミノ酸配列およびコンセンサスアミノ酸配列を示す。ピリオド（．）は、その位置におけるアミノ酸が配列番号１の対応するアミノ酸と同一であることを示す。ＣＤＲは配列番号１について太線下線にて示される。
【図１０】図１０は、０．３、１．０、または３．０ｍｇ／ｋｇの単回ｉ．ｖ．ボーラス投与の後の、カニクイザルにおけるＭａｂ ４Ａ１０−３およびＭａｂ Ｃｏｍｂｉ１１の血清濃度を示す。０．３ｍｇ／ｋｇ投与におけるＭａｂ Ｃｏｍｂｉ１１の血清濃度は、アッセイの検出限界以下（＜２０ ｎｇ／ｍＬ）であった。データは、平均±ＳＤで示される。
【図１１】図１１は、３．０ｍｇ／ｋｇの単回ｉ．ｖ．ボーラス投与の後の、スプラーグドーリー（Ｓｐｒａｇｕｅ Ｄａｗｌｅｙ）ラットにおけるＭａｂ ４Ａ１０−３およびＭａｂ Ｃｏｍｂｉ１１の血清濃度を示す。データは、平均±ＳＤで示される。
【発明を実施するための形態】
【００１９】
以下の略語が本願明細書において使用される。ＢＣＡ：ビシンコニン酸、ＢＳＡ：ウシ血清アルブミン、ＣＤＲ：相補性決定領域、ＤＴＴ：ジチオスレイトール、ＤＭＥＭ：ダルベッコ変法イーグル培地、Ｄ−ＰＢＳ：ダルベッコリン酸緩衝生理食塩水、ＥＤＴＡ：エチレンジアミン四酢酸、ＥＬＩＳＡ：酵素免疫測定法、ＥＳＡ：赤血球生成促進剤、ＦＡＣ：クエン酸第二鉄アンモニウム、ＦＢＳ：ウシ胎仔血清、Ｆｅ：ＮＴＡ：鉄ニトリロ三酢酸、ＦＬＵ：蛍光単位、ＧＦＰ：緑色蛍光タンパク質、Ｉ．Ｖ．：静脈内、ＩＰＴＧ：イソプロピルβ−Ｄ−１−チオガラクトピラノシド、ＩＭＡＣ：固定化金属イオン親和性クロマトグラフィー、Ｍａｂ：モノクローナル抗体、Ｍａｂｓ：モノクローナル抗体（複数）、ＯＰＤ：ｏ−フェニレンジアミン二塩酸塩、ＰＢＳ：リン酸緩衝生理食塩水、ＰＢＳＴ：リン酸緩衝生理食塩水Ｔｗｅｅｎ−２０、ＳＤＳ：ドデシル硫酸ナトリウム、ＴＢＳ：トリス緩衝生理食塩水、Ｔｒｉｓ：トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン、Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ：４−（１，１，３，３−テトラメチルブチル）フェニル−ポリエチレングリコールｔ−オクチルフェノキシポリエトキシエタノールポリエチレングリコールｔｅｒｔ−オクチルフェニルエーテル、Ｔｗｅｅｎ−２０：ポリソフベート２０。
【００２０】
本発明のＭａｂまたはその抗原結合フラグメントは、配列番号１に示されるアミノ酸配列を有するヒトＦＰＮ１ポリペプチドのアミノ酸４０３〜４２２（配列番号１２）に局在する１つのアミノ酸または複数のアミノ酸を含むか、またはそれらから実質的になるか、またはそれらからなるエピトープに結合する。好ましい実施形態において、これらの抗体またはその抗原結合フラグメントは、成熟ヒトヘプシジンにより誘導されるヒトＦＰＮ１の内在化および／または分解を阻害し、これにより、インビトロおよびインビボにおける細胞からの鉄輸送を増加させ、また、インビボにおける血清鉄濃度を上昇させる。例えば、好ましい実施形態において、本発明の抗体は、Ｃａｃｏ−２細胞（インビトロにおいてＦＰＮ１を内在的に発現するヒト腸細胞株（実施例５を参照））内のフェリチンの成熟ヘプシジンにより誘導される蓄積を顕著に減少させる。
【００２１】
天然に存在する完全長抗体は、ジスフィルド結合により相互接続された２本の重鎖および２本の軽鎖を含む免疫グロブリン分子である。各鎖のアミノ末端部分は、その中に含有されるＣＤＲによる抗原認識に主に関連する約１００〜１１０以上のアミノ酸の可変領域を含む。各鎖のカルボキシ末端部分は、エフェクター機能に主に関連する定常領域を規定する。
【００２２】
本願明細書において使用される用語「ＣＤＲ」は、重鎖および軽鎖の両方のポリペプチドの可変領域内に見出される非隣接抗原結合部位を意味することを意図する。これらの特定の領域は、Ｋａｂａｔら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５２，６６０９−６６１６（１９７７）、Ｋａｂａｔら，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ ｐｒｏｔｅｉｎ ｏｆ ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ ｉｎｔｅｒｅｓｔ，（１９９１）、Ｃｈｏｔｈｉａら，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９６：９０１−９１７（１９８７）、および、ＭａｃＣａｌｌｕｍら，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２６２：７３２−７４５（１９９６）に記載され、その定義は、互いに比較した場合、アミノ酸残基の重複またはサブセットを含む。
【００２３】
ＣＤＲは、フレームワーク領域（「ＦＲ」）と称されるより保存的な領域が散在している。各軽鎖可変領域（ＬＣＶＲ）および重鎖可変領域（ＨＣＶＲ）は、３つのＣＤＲおよび４つのＦＲから構成され、以下の順序：ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、ＦＲ４においてアミノ末端からカルボキシ末端まで配列される。軽鎖の３つのＣＤＲは、「ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、およびＬＣＤＲ３」と称され、また、重鎖の３つのＣＤＲは、「ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、およびＨＣＤＲ３」と称される。ＣＤＲは、抗原と特異的に相互作用する形態である多くの残基を含む。ＬＣＶＲおよびＨＣＶＲ領域内のＣＤＲアミノ酸残基の番号付けおよび位置付けは、周知の従来法（例えば、Ｋａｂａｔ，（１９９１）および／またはＣｈｏｔｈｉａ （１９８７））にしたがっている。
【００２４】
本願明細書において使用される語句「Ｋａｂａｔ番号付け」は、当該技術分野において理解され、また、抗体の重鎖および軽鎖領域内の他のアミノ酸残基よりもより可変（すなわち、超可変）であるアミノ酸残基の番号付けシステムを意味する（Ｋａｂａｔら，Ａｎｎ．ＮＹ Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，１９０：３８２−９３（１９７１）；Ｋａｂａｔら，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，第５版，Ｕ．Ｓ．Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ Ｈｕｍａｎ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ，ＮＩＨ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ Ｎｏ．９１−３２４２（１９９１））。
【００２５】
本願明細書において使用される、用語「モノクローナル抗体」（Ｍａｂ）は、単一のコピーまたはクローン（例えば、任意の真核生物、原核生物、または、ファージクローンを含む）に由来する抗体を意味し、その方法によって産生される抗体を意味するのではない。本発明のＭａｂは、好ましくは、均質または実質的に均質な集団において存在する。完全なＭａｂは、２本の重鎖および２本の軽鎖を含む。本発明のモノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメントは、例えば、組み換え技術、ファージディスプレイ技術、合成技術（例えば、ＣＤＲグラフティング）またはこれら技術の組み合わせ、あるいは、当該技術分野において公知な他の技術により産生され得る。
【００２６】
本願明細書において使用される、Ｍａｂの「抗原結合フラグメント」という語句は、例えば、Ｆａｂフラグメント、Ｆａｂ’フラグメント、Ｆ（ａｂ’）２フラグメント、および単鎖Ｆｖフラグメントを含む。
【００２７】
用語「抗体」またはその文法的に変形した型は、他に指定されない限り、Ｍａｂ、その抗原結合フラグメント、および、その組み合わせ（例えば、Ｆａｂの組み合わせ、および、ＭａｂとＦａｂの組み合わせを含む）を意味する。本発明による抗体と類似の機能的特性を示すさらなる抗体は、従来の方法によって産生され得る。例えば、マウスは、例えば、ＦＰＮ１発現細胞、ＦＰＮ１またはそのフラグメントで免疫性を与えられ得、得られた抗体は回収および精製され得、そして、それらが本願明細書に開示される抗体と類似するかたまたは同様の結合特性、薬物動態特性、および、機能的特性を有するかどうかの決定が、本願明細書において以下に示す実施例３〜１４において開示される方法により評価され得る。抗原結合フラグメントはまた、当該技術分野において周知の従来の方法によって調製され得る。抗体および抗原結合フラグメントの生成および精製方法はまた、当該技術分野において周知である。
【００２８】
本願明細書において使用される、語句「特異的に結合する」とは、特定のポリペプチドもしくはペプチド、好ましくは、配列番号１に示されるアミノ酸配列からなるヒトフェロポーチン１またはその特定のペプチドフラグメントに対して、本願明細書において記載される親和性ＥＬＩＳＡまたはＳＰＲアッセイ（または例えば当該技術分野において公知の類似のアッセイ）により測定される場合、約１０００ｎＭ未満、約１００ｎＭ未満、約１０ｎＭ未満、約１ｎＭ未満、約１００ｐＭ未満、または、約１０ｐＭ未満のＫＤで結合する本発明の抗体の能力を意味する。
【００２９】
加えてまたはその代わりに、本発明の抗体に関する語句「特異的に結合する」とは、配列番号１に示されるアミノ酸配列またはそのペプチドフラグメントからなるヒトフェロポーチン１に結合するかまたはそれを検出する抗体の能力を示し、この能力は、別のポリペプチド（例えば、ヘパリン）または任意選択としてヒトフェロポーチン１の別の特定のペプチドフラグメントに結合するかまたはそれを検出する能力よりも、少なくとも約５倍、少なくとも約１０倍、少なくとも約２０倍、少なくとも約５０倍、少なくとも約１００倍、少なくとも約２００倍、少なくとも約５００倍、または、少なくとも約１０００倍よりも大きい。
【００３０】
本発明はまた、Ｍａｂまたはその抗原結合フラグメントをコードするヌクレオチド配列を含む単離されたポリヌクレオチドを提供する。特定の実施形態において、本発明はまた、（ｉ）配列番号５０、５１、５２、１５０、１５２、１５６、１６０、および１６４に示されるアミノ酸配列を有する重鎖ポリペプチド、および／または、（ｉｉ）配列番号５３、５４、５５、１５１、１５４、１５８、１６２、および１６６に示されるアミノ酸配列を有する軽鎖ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む単離されたポリヌクレオチドを提供する。
【００３１】
別の実施形態において、本発明は、Ｍａｂまたはその抗原結合フラグメントをコードするポリヌクレオチドを含む組み換え発現ベクターを提供する。特定の実施形態において、本発明はまた、（ｉ）配列番号５０、５１、５２、１５０、１５２、１５６、１６０、および１６４に示されるアミノ酸配列を有する重鎖ポリペプチド、および／または、（ｉｉ）配列番号５３、５４、５５、１５１、１５４、１５８、１６２、および１６６に示されるアミノ酸配列を有する軽鎖ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含む組み換え発現ベクターを提供する。
【００３２】
本願明細書において使用される場合、用語「ヘプシジン」は、哺乳動物に存在するものとして公知のヘプシジンタンパク質の任意の形態を意味する。本願明細書において使用される場合、用語「成熟ヘプシジン」は、哺乳動物において発現されるヘプシジンタンパク質の任意の成熟した生物活性形態を意味する。本願明細書において使用される場合、語句「ヒトヘプシジン」は、ヒトに存在するヘプシジンタンパク質の任意の形態を意味する。本願明細書において使用される場合、語句「成熟ヒトヘプシジン」は、ヒトに存在するものとして公知のヘプシジンタンパク質の任意の成熟した生物活性形態を意味する。好ましくは、「成熟ヒトヘプシジン」は、配列番号９１に示されるアミノ酸配列を有するヒトヘプシジンの成熟形態である、「ヒトヘプシジン−２５」と称される。
【００３３】
用語「生物活性」は、成熟ヘプシジンポリペプチド（例えば、ヘプシジン−２５）に関し、限定されないが、その受容体ＦＰＮ１に対する成熟ヘプシジンの特異的結合、成熟ヘプシジンの１つ以上のＦＰＮ１により媒介される機能、例えば、（ａ）成熟ヘプシジンにより誘導されるＦＰＮ１の内在化および／または分解（例えば、Ｎｅｍｅｔｈ，Ｅ．ら，Ｓｃｉｅｎｃｅ，３０６：２０９０−２０９３，（２００４））を参照）、（ｂ）ＦＰＮ１により媒介される（ｉ）鉄流出、（ｉｉ）血清鉄濃度、（ｉｉｉ）網状赤血球数、（ｉｖ）赤血球数、（ｖ）ヘモグロビン濃度、（ｖｉ）ヘマトクリット、（ｖｉｉ）ヘプシジンポリペプチドの発現レベル、および／または、（ｖｉｉｉ）ヘプシジンポリペプチドの組織分布の成熟ヘプシジン調節を含む。
【００３４】
語句「ヒト改変抗体」は、本願明細書に開示される特定の抗体、ならびに、本願明細書に開示される抗体と類似する本発明による結合特性および機能的特性を有し、かつ、本願明細書に開示される非ヒト抗体またはその抗原結合フラグメント由来のＣＤＲ周囲の実質的にヒトまたは完全にヒトであるフレームワーク領域を有する抗体を意味する。「フレームワーク領域」または「フレームワーク配列」は、フレームワーク領域１〜４のうちいずれか一つを意味する。本発明により包含されるヒト改変抗体およびその抗原結合フラグメントは、分子を含み、ここで、フレーム領域１〜４のうち任意の１つ以上は、実質的にまたは完全にヒトである（すなわち、ここで、個々の実質的にまたは完全にヒトフレームワーク領域１〜４の任意の可能な組み合わせが存在する）。例えば、これは、実質的にまたは完全にヒトである、フレームワーク領域１およびフレームワーク領域２、フレームワーク領域１およびフレームワーク領域３、フレームワーク領域１、２、および３等の分子を含む。実質的にヒトフレームワークは、既知のヒト生殖細胞系列フレームワーク配列に対して少なくとも約８０％の配列同一性を有するものである。好ましくは、実質的にヒトフレームワークは、既知のヒト生殖細胞系列フレームワーク配列に対して少なくとも約８５％、約９０％、または、約９５％の配列同一性を有するものである。
【００３５】
完全ヒトフレームワークは、既知のヒト生殖細胞系列フレームワーク配列と同一のものである。ヒトフレームワーク生殖細胞系列配列は、ＩｍＭｕｎｏＧｅｎｅＴｉｃｓ（ＩＭＧＴ）からそのウェブサイト（ｈｔｔｐ：／／ｉｍｇｔ．ｃｉｎｅｓ．ｆｒ）により、またはＴｈｅ Ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ Ｆａｃｔｓ Ｂｏｏｋ ｂｙ Ｍａｒｉｅ−Ｐａｕｌｅ Ｌｅｆｒａｎｃ ａｎｄ Ｇｅｒａｒｄ Ｌｅｆｒａｎｃ，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，２００１，ＩＳＢＮ ０１２４４１３５１から取得され得る。例えば、生殖細胞系列軽鎖フレームワークは、Ａｌ１、Ａ１７、Ａ１８、Ａ１９、Ａ２０、Ａ２７、Ａ３０、Ｌ１、Ｌ１１、Ｌ１２、Ｌ２、Ｌ５、Ｌ１５、Ｌ６、Ｌ８、Ｏ１２、Ｏ２、およびＯ８からなる群より選択され得、また、生殖細胞系列重鎖フレームワーク領域は、ＶＨ２−５、ＶＨ２−２６、ＶＨ２−７０、ＶＨ３−２０、ＶＨ３−７２、ＶＨ１−４６、ＶＨ３−９、ＶＨ３−６６、ＶＨ３−７４、ＶＨ４−３１、ＶＨ１−１８、ＶＨ１−６９、ＶＩ−１３−７、ＶＨ３−１１、ＶＨ３−１５、ＶＨ３−２１、ＶＨ３−２３、ＶＨ３−３０、ＶＨ３−４８、ＶＨ４−３９、ＶＨ４−５９、およびＶＨ５−５１からなる群より選択され得る。好ましくは、生殖細胞系列軽鎖フレームワークは、Ｏ２、Ｏ１８、およびＬ１２、Ｌ１からなる群より選択され、また、生殖細胞系列重鎖フレームワーク領域は、ＶＨ１−６９、ＶＨ１−１８、またはＶＨ１−４６からなる群より選択される。より好ましくは、生殖細胞系列軽鎖フレームワークは、Ｏ２およびＬ１からなる群より選択され、また、生殖細胞系列重鎖フレームワークは、ＶＨ１−６９およびＶＨ１−１８からなる群より選択される。最も好ましくは、生殖細胞系列軽鎖フレームワークは、Ｏ２であり、また、生殖細胞系列重鎖フレームワーク領域は、ＶＨ１−６９である。
【００３６】
本願明細書に開示されるヒト改変抗体に加えて、本発明による抗体と類似の機能的特性を示すヒト改変抗体は、いくつかの異なる方法を用いて生成され得る。本願明細書に具体的に開示される抗体は、さらなる抗体を調製するための鋳型または親抗体として使用され得る。１つのアプローチでは、親抗体のＣＤＲは、親抗体フレームワークに対する高い配列同一性を有するヒトフレームワークへとグラフトされる。新規フレームワークの配列同一性は、親抗体中の対応するフレームワークの配列に対して、一般的に、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、または少なくとも約９９％同一でなる。このグラフティングは、親抗体の結合親和性と比較して結合親和性の減少を引き起こし得る。この場合、フレームワークは、Ｑｕｅｅｎら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．，８８：２８６９（１９９１）に開示された、特定の基準に基づいて、特定の位置にて親フレームワークへと復帰突然変異され得る。マウス抗体のヒト化に有用な方法を記載したさらなる参考文献としては、米国特許第４，８１６，３９７号、同第５，２２５，５３９号、および、同第５，６９３，７６１号；Ｌｅｖｉｔｔ，Ｊ．，Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１６８：５９５−６２０（１９８３）に記載されたコンピュータプログラムＡＢＭＯＤおよびＥＮＣＡＤ；ならびに、Ｗｉｎｔｅとその共同研究者の方法（Ｊｏｎｅｓら，Ｎａｔｕｒｅ ３２１：５２２−５２５（１９８６）；Ｒｉｅｃｈｍａｎｎら，Ｎａｔｕｒｅ，３３２：３２３−３２７（１９８８）；およびＶｅｒｈｏｅｙｅｎら，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２３９：１５３４−１５３６（１９８８））。
【００３７】
復帰突然変異について考慮するための残基の同定は、以下に示すように行われ得る。
アミノ酸が以下のカテゴリー下にある場合、使用されているヒト生殖細胞系列配列（「アセプターフレームワーク」）のフレームワークアミノ酸は、親抗体のフレームワーク（「ドナーフレームワーク」）からのフレームワークアミノ酸により置換される。
（ａ）アセプターフレームワークのヒトフレームワーク領域内のアミノ酸は、その位置におけるヒトフレームワークには稀であるが、ドナー免疫グロブリン内の対応するアミノ酸は、その位置におけるヒトフレームワークに典型的である；
（ｂ）アミノ酸の位置は、ＣＤＲのうち一つと直接隣接している；または、
（ｃ）フレームワークアミノ酸の任意の側鎖原子は、３次元免疫グロブリンモデル内のＣＤＲアミノ酸の任意の原子の約５〜６オングストローム（中心間）以内である。
【００３８】
アセプターフレームワークのヒトフレームワーク領域内のアミノ酸の各々、および、ドナーフレームワーク内の対応するアミノ酸が、一般的にその位置におけるヒトフレームワークに稀である場合、このようなアミノ酸は、その位置におけるヒトフレームワークに典型的なアミノ酸により置換され得る。この復帰突然変異基準は、親抗体の活性を復帰させることができる。
【００３９】
本願明細書に開示される抗体に類似する機能的特性を示すヒト改変抗体を生成する別のアプローチは、グラフトされたＣＤＲ内でフレームワークを変更することなくランダムにアミノ酸を変異させること、および、親抗体と同じ程度に良好または親抗体よりも良好な結合親和性および他の機能的特性について、得られた分子をスクリーニングすることに関する。単一突然変異はまた、各ＣＤＲ内の各アミノ酸位置にて導入され得、その後、結合親和性および他の機能的特性についてこのような変異の効果が評価され得る。改善された特性を生み出す単一突然変異は、互いに組み合わせてそれらの効果を評価するために組み合わされ得る。
【００４０】
さらに、上述の両方のアプローチの組み合わせが可能である。ＣＤＲグラフティングの後、１つは、ＣＤＲ内のアミノ酸変化を導入することに加えて、特定のフレームワーク領域に復帰突然変異し得る。この手法は、Ｗｕら，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２９４：１５１−１６２（１９９９）に記載される。好ましくは、フレームワーク内のアミノ酸置換は、本願明細書に開示される軽鎖フレームワーク領域および／または重鎖フレームワーク領域（図２〜５に示されるフレームワーク領域）のうちの任意の１つ以上内にて１つ、２つ、または３つの位置に限定される。好ましくは、ＣＤＲ内のアミノ酸置換は、３つの軽鎖および／または重鎖ＣＤＲのうち任意の１つ以上内にて１つ、２つ、または３つの位置に限定される。フレームワーク領域およびＣＤＲ内の記載された種々の変更の組み合わせもまた、本願明細書において企図される。本発明のこの態様の特定の実施形態において、このようなヒト改変Ｍａｂまたはその抗原結合フラグメントのすべての軽鎖可変領域フレームワーク領域および重鎖可変領域フレームワーク領域は、完全にヒトである。
【００４１】
以下の表１Ａおよび１Ｂは、本発明の好ましい抗体またはその抗原結合フラグメントのＣＤＲアミノ酸配列およびコンセンサスアミノ酸配列を示す。以下の表２Ａおよび２Ｂは、本発明のより好ましい抗体またはその抗原結合フラグメントのＣＤＲアミノ酸配列およびコンセンサスアミノ酸配列を示す。
【００４２】
【表１−１】
【表１−２】
【００４３】
【表２−１】
【表２−２】
＊表１Ａおよび１Ｂ：コンセンサス配列１〜５（Ｃ１〜Ｃ５）において、Ｘ１はＮまたはＳであり、Ｘ２はＥ、ＫまたはＲであり、Ｘ３はＥまたはＡであり、Ｘ６はＳまたはＩであり、Ｘ７はＮまたはＫであり、Ｘ４はＴ、ＫまたはＲであり、Ｘ５はＦ、Ｈ、Ｑであり、Ｘ８はＬ、Ｔ、ＳまたはＡである。
【００４４】
【表３−１】
【表３−２】
【００４５】
【表４−１】
【表４−２】
＊表２Ａおよび２Ｂ：コンセンサス配列６において、Ｘ１はＹ、ＲまたはＫであり、Ｘ２はＡまたはＲであり、Ｘ３はＴまたはＲであり、Ｘ４はＧまたはＲであり、Ｘ５はＧまたはＲであり、Ｘ６はＴまたはＲであり、Ｘ７はＥ、Ｔ、ＳまたはＷであり、Ｘ８はＫまたはＶであり、Ｘ９はＧまたはＲであり、Ｘ１０はＤまたはＶであり、Ｘ１１はＬまたはＲであり、Ｘ１２はＨ、Ｒ、ＶまたはＹであり、Ｘ１３はＳ、ＷまたはＹである。
【００４６】
本発明のさらにより好ましい抗体またはその抗原結合フラグメントは、配列番号１７０、１７１、１７２、２３、１７３、および１９、または配列番号１７０、１７１、１７２、１８２、１７３、および１９にそれぞれ示されるアミノ酸配列含む、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、ＬＣＤＲ３、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、およびＨＣＤＲ３を含む。本発明のさらにより好ましい抗体またはその抗原結合フラグメントは、配列番号３７、１７４、２２、１７５、１７６、および１２０にそれぞれ示されるアミノ酸配列含む、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、ＬＣＤＲ３、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、およびＨＣＤＲ３を含む。薬物動態学的特性（例えば、実施例１１を参照）および薬力学的特性（例えば、実施例１０および１２を参照）、ならびに、例示的な抗ＦＰＮ１ Ｍａｂ、またはその抗原結合フラグメントの機能的特性（例えば、実施例３（エピトープマッピング）、実施例４（親和性）、実施例５（インビトロにおける細胞内のフェリチン濃度の影響）、実施例６（インビトロにてＦＰＮ１−ＧＦＰ融合を発現するよう遺伝子操作された細胞による成熟ヘプシジンの結合の影響）、実施例７および９（インビトロにおけるヘプシジンにより誘導されるＦＰＮ１の内在化および分解の影響）、ならびに実施例８（インビボにおける血清鉄濃度の影響）を参照）に基づくと、本発明の最も好ましいＭａｂまたはその抗原結合フラグメントは、Ｍａｂ ４Ａ１０−３、Ｌ２．２−４、およびＣｏｍ１１ＧＹ、またはその抗原結合フラグメントである。Ｍａｂ ３４Ａ９、１Ｇ９、３Ｄ８、Ｃｏｍｂｉ１１、４Ａ１０−３、Ｌ２．２−４、１Ｂ７、１Ｆ８、およびＣｏｍ１１ＧＹに関する重鎖、軽鎖、重鎖可変領域、軽鎖可変領域、および、ＣＤＲをコードするアミノ酸配列を、配列番号を参照して以下の表３（ａ）および表３（ｂ）に示す。
【００４７】
【表５】
【００４８】
【表６】
【００４９】
一部の実施形態において、本願明細書に開示される抗ＦＰＮ１ Ｍａｂ、またはその抗原結合フラグメントは、ＥＳＡ治療剤単独の投与と比べた場合の貧血患者の血清鉄濃度の増加、ヘマトクリットの増加、ヘモグロビン濃度の増加、輸血の必要性の減少、ならびに／または機能状態、生産性、および生活の質の改善に関するさらなる利点を提供するために、１つ以上のＥＳＡと組み合わせて使用されてもよい。用語「併用療法」または「と組み合わせて」とは、本発明の抗ＦＰＮ１ Ｍａｂ、またはその抗原結合フラグメントが、抗ＦＰＮ１ Ｍａｂ、またはその抗原結合フラグメント単独の投与と比べた場合の貧血患者の血清鉄濃度の増加、ヘマトクリットの増加、ヘモグロビン濃度の増加、輸血の必要性の減少、ならびに／または機能状態、生産性、および生活の質の改善を意図する別の薬剤と別個に、同時に、または連続して投与されることを意味する。
【００５０】
一部の実施形態において、本願明細書に開示される抗ＦＰＮ１ Ｍａｂ、またはその抗原結合フラグメントは、ＥＳＡ治療を許容できないか、またはＥＳＡ治療に反応しない患者においてＥＳＡ治療の代わりに投与されてもよい。
【００５１】
用語「赤血球生成促進剤」または「赤血球生成促進因子」とは、例えば、受容体に結合し、その受容体の二量化を生じることによって、または内因性エリスロポエチン発現を促進することによってエリスロポエチン受容体の直接的または間接的な活性化を引き起こす化合物を意味する。ＥＳＡとしては、エリスロポエチン受容体に結合し、活性化するエリスロポエチンおよびその変異体、類似体、または誘導体；エリスロポエチン受容体に結合し、その受容体を活性化する抗体；あるいはエリスロポエチン受容体に結合し、活性化するペプチド；あるいはエリスロポエチン受容体に結合し、活性化する、必要に応じて分子量が約１０００ダルトン未満の有機化学小化合物が挙げられる。ＥＳＡとしては、限定されないが、エポエチンアルファ、エポエチンベータ、エポエチンデルタ、エポエチンオメガ、エポエチンイオタ、エポエチンゼータ、およびそれらの類似体、ペグ化エリスロポエチン、カルバミル化エリスロポエチン、模倣ペプチド（ＥＭＰｌ／ヘマタイド（ｈｅｍａｔｉｄｅ）を含む）、模倣抗体およびＨＩＦ阻害剤（米国特許出願公開第２００５／００２０４８７号明細書を参照のこと）が挙げられる。例示的なＥＳＡとしては、エリスロポエチン、ダルベポエチン、エリスロポエチンアゴニスト変異体、ならびに米国特許出願公開第２００３／０２１５４４４号および２００６／００４０８５８号に報告されている化合物を含むエリスロポエチン受容体に結合し、活性化するペプチドまたは抗体、ならびに当該技術分野においても公知であるエリスロポエチン分子またはその変異体もしくは類似体が挙げられる。エリスロポエチンとしては、限定されないが、配列番号８８に記載されるアミノ酸配列を含むポリペプチドが挙げられる。用語「エポエチン」には、限定されないが、エポエチンアルファ、エポエチンベータ、エポエチンデルタ、エポエチンオメガ、エポエチンイオタ、エポエチンガンマ、エポエチンゼルタなどが含まれる。さらに、エポエチンはまた、例えば１つ以上の水溶性ポリマー、例えばポリエチレングリコール（ＰＥＧ−ＥＰＯ−ベータを含む）などの化学的に修飾されている上述のエポエチンのいずれかを含む。組み換えヒトエリスロポエチンの例示的な配列、製造、精製および使用は、限定されないが、米国特許第４，７０３，００８号および同第４，６６７，０１６号を含む、多くの特許文献に記載されている。ダーベポエチンおよび他のエリスロポエチン類似体の例示的な配列、製造、精製および使用は、Ｓｔｒｉｃｋｌａｎｄら、９１／０５８６７号、ならびに国際公開第９５／０５４６５号、国際公開第００／２４８９３号、および国際公開第０１／８１４０５号を含む、多くの特許文献に記載されている。天然または類似体ポリペプチドの誘導体には、例えば、水溶性ポリマー（例えばペグ化）、放射性核種、あるいは他の診断的または標的または治療的部分を結合するために、化学的に修飾されているものが含まれる。
【００５２】
用語「赤血球生成活性」とは、インビボアッセイ、例えば赤血球増加性過低酸素症マウスアッセイ（ｅｘｈｙｐｏｘｉｃ，ｐｏｌｙｃｙｔｈｅｍｉｃ ｍｏｕｓｅ ａｓｓａｙ）（例えば、ＣｏｔｅｓおよびＢａｎｇｈａｍ，Ｎａｔｕｒｅ，１９１：１０６５（１９６１）を参照のこと）に実証されるような赤血球生成を促進する活性を意味する。
【００５３】
用語「エピトープ」とは、１つ以上の抗体の抗原結合領域において抗体により認識され、結合され得る任意の分子の部分を指す。エピトープは、しばしば、アミノ酸または糖側鎖などの分子の化学的に活性な表面基からなり、特定の三次元構造特性および特定の電荷特性を有する。本願明細書に開示されるヒトＦＰＮ１エピトープは、ＦＰＮ１の一次アミノ酸構造（配列番号１）の状態で提示される。しかしながら、エピトープの一部は、アミノ酸残基と連続するというよりむしろ、不連続であってもよく、連続ペプチド結合においてというよりむしろ、ＦＰＮ１の三次または四次構造およびこの分子の表面上でそれらの結果として生じる形態の結果として互いに空間的に近接して存在してもよい。好ましくは、本発明の抗ＦＰＮ１ Ｍａｂ、またはその抗原結合フラグメントは、配列番号９に示されるアミノ酸配列に局在する１つのアミノ酸または複数のアミノ酸を含むか、またはそれらから実質的になるか、またはそれらからなるエピトープにて、配列番号１に示されるアミノ酸配列からなるヒトＦＰＮ１に結合する。より好ましくは、本発明の抗ＦＰＮ１ Ｍａｂ、またはその抗原結合フラグメントは、配列番号１２、１３、１４、１５、１６、および９５からなる群より選択されるアミノ酸配列に局在する１つのアミノ酸または複数のアミノ酸を含むか、またはそれらから実質的になるか、またはそれらからなるエピトープにて、配列番号１に示されるアミノ酸配列からなるヒトＦＰＮ１に結合する。さらにより好ましくは、本発明の抗ＦＰＮ１ Ｍａｂ、またはその抗原結合フラグメントは、配列番号１２、１３、１４、１５、１６、および９５からなる群より選択されるアミノ酸配列に局在する１つのアミノ酸または複数のアミノ酸を含むか、またはそれらから実質的になるか、またはそれらからなるエピトープにて、配列番号１に示されるアミノ酸配列からなるヒトＦＰＮ１に結合するが、配列番号９８、１８３〜２１４からなる群より選択される１つ以上のペプチドに結合しない。
【００５４】
本発明の抗体はまた、カニクイザルＦＰＮ１（配列番号３）に結合し、義務的な前臨床の安全性および１種以上の主要なモデルにおける効果的な治療薬開発研究を促進する。
【００５５】
用語「ヒトフェロポーチン１」または、代替的に、「ヒトＦＰＮ１」とは、配列番号１に示されるアミノ酸配列を有する、ヒトにおいて発現される鉄輸送タンパク質を指し、また、成熟ヒトヘプシジンとの相互作用に応答して細胞内の鉄を排出する能力を保持する変異体を指す。
【００５６】
好ましくは、本発明の抗ＦＰＮ１ Ｍａｂ、またはその抗原結合フラグメントは、
１）配列番号１３６および配列番号１３４にそれぞれ示される軽鎖可変領域および重鎖可変領域；
２）配列番号１８０および配列番号１７８にそれぞれ示される軽鎖可変領域および重鎖可変領域；または
３）配列番号１４０および配列番号１３８にそれぞれ示される軽鎖可変領域および重鎖可変領域、
を含む。さらにより好ましくは、本発明の抗ＦＰＮ１ Ｍａｂ、またはその抗原結合フラグメントは、
１）配列番号１５４および配列番号１５２にそれぞれ示される軽鎖および重鎖；
２）配列番号１８１および配列番号１７９にそれぞれ示される軽鎖および重鎖；または
３）配列番号１５８および配列番号１５６にそれぞれ示される軽鎖および重鎖、
を含む。さらにより好ましくは、本発明のモノクローナル抗体または抗原結合フラグメントは、
１）２本の軽鎖ポリペプチドおよび２本の重鎖ポリペプチドであって、その軽鎖ポリペプチドの各々は配列番号１５４に示されるアミノ酸配列を有し、その重鎖ポリペプチドの各々は配列番号１５２に示されるアミノ酸配列を有する、２本の軽鎖ポリペプチドおよび２本の重鎖ポリペプチド；
２）２本の軽鎖ポリペプチドおよび２本の重鎖ポリペプチドであって、その軽鎖ポリペプチドの各々は配列番号１８１に示されるアミノ酸配列を有し、その重鎖ポリペプチドの各々は配列番号１７９に示されるアミノ酸配列を有する、２本の軽鎖ポリペプチドおよび２本の重鎖ポリペプチド；または
３）２本の軽鎖ポリペプチドおよび２本の重鎖ポリペプチドであって、その軽鎖ポリペプチドの各々は配列番号１５８に示されるアミノ酸配列を有し、その重鎖ポリペプチドの各々は配列番号１５６に示されるアミノ酸配列を有する、２本の軽鎖ポリペプチドおよび２本の重鎖ポリペプチドを含む。さらにより好ましくは、本発明のモノクローナル抗体または抗原結合フラグメントは、２５℃にて表面プラズモン共鳴によって測定される場合、約１０ｎＭ未満のＫＤでヒトフェロポーチン１に結合する。さらにより好ましくは、本発明のモノクローナル抗体または抗原結合フラグメントはＦａｂを含み、そのＦａｂは、３７℃にて表面プラズモン共鳴によって測定される場合、約１００ｎＭ未満のＫＤでヒトフェロポーチン１に結合する。さらにより好ましくは、Ｆａｂは、３７℃にてＳＰＲによって測定される場合、ヒトフェロポーチン１に対して約７．５×１０−３Ｓ−１〜約９×１０−４ｓ−１の解離速度（ｋｏｆｆ）を有する。さらにより好ましくは、Ｆａｂは、約１００ｎＭ〜約１ｎＭのＫＤでヒトフェロポーチン１に結合する。さらにより好ましくは、Ｆａｂは、約１０ｎＭ〜約０．５ｎＭのＫＤでヒトフェロポーチン１に結合する。さらにより好ましくは、モノクローナル抗体または抗原結合フラグメントは、ヘプシジン−２５生物活性のインビトロアッセイにおいて約１００ｎＭ〜約１ｎＭのＩＣ５０を有する。さらにより好ましくは、モノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメントは、ヘプシジン−２５生物活性のインビトロアッセイにおいて約１００ｎＭ〜約１０ｎＭのＩＣ５０を有する。さらにより好ましくは、ヘプシジン−２５生物活性は、フェロポーチン１の内在化および／または分解である。さらにより好ましくは、モノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメントは、ヘプシジン−２５生物活性のインビボアッセイにおいて約１００ｎＭ〜約１ｎＭのＩＣ５０を有する。さらにより好ましくは、ヘプシジン−２５生物活性のインビボアッセイは、霊長類における血清鉄濃度のＩＬ−６により誘導される減少を測定する。最も好ましくは、抗ＦＰＮ１ Ｍａｂ、またはその抗原結合フラグメントは、配列番号９８、１８３〜２１４からなる群より選択される１つ以上のペプチドに結合しない。
【００５７】
特定の実施形態において、本発明の抗ＦＰＮ１ Ｍａｂ、またはその抗原結合フラグメントは、好ましくはＭａｂについて２５℃、およびＦａｂについて３７℃にてＳＰＲによって測定される場合、約１００ｎＭ未満、約７５ｎＭ未満、約５０ｎＭ未満、約２５ｎＭ未満、または約１０ｎＭ未満のＫＤで、配列番号１２、１３、１４、１５、１６、および９５からなる群より選択されるアミノ酸配列に局在する１つのアミノ酸または複数のアミノ酸を含むか、またはそれらから実質的になるか、またはそれらからなるエピトープにて、配列番号１に示されるアミノ酸配列からなるヒトＦＰＮ１に結合することにより特徴付けられる。好ましくは、抗ＦＰＮ Ｍａｂ、またはその抗原結合フラグメントは、配列番号９８、１８３〜２１４からなる群より選択される１つ以上のペプチドに結合しない。
【００５８】
特定の実施形態において、本発明の抗ＦＰＮ１ Ｍａｂ、またはその抗原結合フラグメントは、好ましくはＭａｂについて２５℃、およびＦａｂについて３７℃にてＳＰＲによって測定される場合、約１００ｎＭ〜約０．５ｎＭ、好ましくは約１００ｎＭ〜約０．５ｎＭ、より好ましくは約７５ｎＭ〜約５ｎＭ、さらにより好ましくは約５０ｎＭ〜約１０ｎＭ、さらにより好ましくは約１５ｎＭ〜約１０ｎＭ、さらにより好ましくは約１０ｎＭ〜約０．５ｎＭ、さらにより好ましくは約５ｎＭ〜約０．５ｎＭ、さらにより好ましくは約５ｎｍ〜約０．７ｎＭ、さらにより好ましくは約３ｎＭ〜約０．７ｎＭ、または最も好ましくは約３ｎＭ〜約１ｎＭのＫＤで、配列番号１２、１３、１４、１５、１６、および９５からなる群より選択されるアミノ酸または配列番号１２、１３、１４、１５、１６、および９５からなる群より選択されるアミノ酸配列に局在する１つのアミノ酸または複数のアミノ酸を含むか、またはそれらから実質的になるか、またはそれらからなるエピトープにて、配列番号１に示されるアミノ酸配列からなるヒトＦＰＮ１に結合することにより特徴付けられる。好ましくは、抗ＦＰＮ１ Ｍａｂ、またはその抗原結合フラグメントは、配列番号９８、１８３〜２１４からなる群より選択される１つ以上のペプチドに結合しない。
【００５９】
特定の実施形態において、本発明の抗ＦＰＮ１ Ｍａｂ、またはその抗原結合フラグメントは、好ましくはＭａｂについて２５℃、およびＦａｂについて３７℃にてＳＰＲによって測定される場合、約７．５×１０−３ｓ−１〜約１×１０−４ｓ−１、好ましくは約２．５×１０−３ｓ−１〜約１×１０−４ｓ−１、より好ましくは約１×１０−３ｓ−１〜約１×１０−４ｓ−１、さらにより好ましくは約５×１０−４ｓ−１〜約１×１０−４ｓ−１の、ヒトフェロポーチン１に対する解離速度（ｋｏｆｆ）で、配列番号１２、１３、１４、１５、１６、および９５からなる群より選択されるアミノ酸配列に局在する１つのアミノ酸または複数のアミノ酸を含むか、またはそれらから実質的になるか、またはそれらからなるエピトープにて、配列番号１に示されるアミノ酸配列からなるヒトＦＰＮ１に結合することにより特徴付けられる。好ましくは、抗ＦＰＮ１ Ｍａｂ、またはその抗原結合フラグメントは、配列番号９８、１８３〜２１４からなる群より選択される１つ以上のペプチドに結合しない。
【００６０】
特定の実施形態において、本発明の抗ＦＰＮ１ Ｍａｂ、またはその抗原結合フラグメントは、好ましくはＭａｂについて２５℃、およびＦａｂについて３７℃にてＳＰＲによって測定される場合、約１００ｎＭ未満、約７５ｎＭ未満、約５０ｎＭ未満、約２５ｎＭ未満、または約１０ｎＭ未満のＫＤ、かつ、約７．５×１０−３ｓ−１〜約１×１０−４ｓ−１、好ましくは約２．５×１０−３ｓ−１〜約１×１０−４ｓ−１、より好ましくは約１×１０−３ｓ−１〜約１×１０−４ｓ−１、さらにより好ましくは約５×１０−４ｓ−１〜約１×１０−４ｓ−１の、ヒトフェロポーチン１に対する解離速度（ｋｏｆｆ）で、配列番号１２、１３、１４、１５、１６、および９５からなる群より選択されるアミノ酸配列に局在する１つのアミノ酸または複数のアミノ酸を含むか、またはそれらから実質的になるか、またはそれらからなるエピトープにて、配列番号１に示されるアミノ酸配列からなるヒトＦＰＮ１に結合することにより特徴付けられる。好ましくは、抗ＦＰＮ１ Ｍａｂ、またはその抗原結合フラグメントは、配列番号９８、１８３〜２１４からなる群より選択される１つ以上のペプチドに結合しない。
【００６１】
特定の実施形態において、本発明の抗ＦＰＮ１ Ｍａｂ、またはその抗原結合フラグメントは、好ましくはＭａｂについて２５℃、およびＦａｂについて３７℃にてＳＰＲによって測定される場合、約１００ｎＭ〜約０．５ｎＭ、好ましくは約１００ｎＭ〜約１ｎＭ、より好ましくは約７５ｎＭ〜約５ｎＭ、さらにより好ましくは約５０ｎＭ〜約１０ｎＭ、さらにより好ましくは約１５ｎＭ〜約１０ｎＭ、さらにより好ましくは約１０ｎＭ〜約０．５ｎＭ、さらにより好ましくは約５ｎＭ〜約０．５ｎＭ、さらにより好ましくは約５ｎＭ〜約０．７ｎＭ、さらにより好ましくは約３ｎＭ〜約０．７ｎＭ、または最も好ましくは約３ｎＭ〜約１ｎＭのＫＤ、かつ、約７．５×１０−３ｓ−１〜約１×１０−４ｓ−１、好ましくは約２．５×１０−３ｓ−１〜約１×１０−４ｓ−１、より好ましくは約１×１０−３ｓ−１〜約１×１０−４ｓ−１、さらにより好ましくは約５×１０−４ｓ−１〜約１×１０−４ｓ−１の、ヒトフェロポーチン１に対する解離速度（ｋｏｆｆ）で、配列番号１２、１３、１４、１５、１６、および９５からなる群より選択されるアミノ酸または配列番号１２、１３、１４、１５、１６、および９５からなる群より選択されるアミノ酸配列に局在する１つのアミノ酸または複数のアミノ酸を含むか、またはそれらから実質的になるか、またはそれらからなるエピトープにて、配列番号１に示されるアミノ酸配列からなるヒトＦＰＮ１に結合することにより特徴付けられる。好ましくは、抗ＦＰＮ１ Ｍａｂ、またはその抗原結合フラグメントは、配列番号９８、１８３〜２１４からなる群より選択される１つ以上のペプチドに結合しない。
【００６２】
特定の実施形態において、本発明の抗ＦＰＮ１ Ｍａｂ、またはその抗原結合フラグメントは、配列番号３７、１２９、２２、１０７、１１８、および１２０にそれぞれ示されるアミノ酸配列を含むＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、ＬＣＤＲ３、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、およびＨＣＤＲ３を含み、好ましくはＭａｂについて２５℃、およびＦａｂについて３７℃にてＳＰＲによって測定される場合、約１００ｎＭ未満、約７５ｎＭ未満、約５０ｎＭ未満、約２５ｎＭ未満、または約１０ｎＭ未満のＫＤで、配列番号１２、１３、１４、１５、１６、および９５からなる群より選択されるアミノ酸配列に局在する１つのアミノ酸または複数のアミノ酸を含むか、またはそれらから実質的になるか、またはそれらからなるエピトープにて、配列番号１に示されるアミノ酸配列からなるヒトＦＰＮ１に結合する。好ましくは、抗ＦＰＮ１ Ｍａｂ、またはその抗原結合フラグメントは、配列番号９８、１８３〜２１４からなる群より選択される１つ以上のペプチドに結合しない。
【００６３】
一部の実施形態において、本発明の抗ＦＰＮ１ Ｍａｂ、またはその抗原結合フラグメントは、配列番号３７、１２９、２２、１０７、１１８、および１２０にそれぞれ示されるアミノ酸配列を含むＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、ＬＣＤＲ３、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、およびＨＣＤＲ３を含み、好ましくはＭａｂについて２５℃、およびＦａｂについて３７℃にてＳＰＲによって測定される場合、約１００ｎＭ〜約０．５ｎＭ、好ましくは約１００ｎＭ〜約１ｎＭ、より好ましくは約７５ｎＭ〜約５ｎＭ、さらにより好ましくは約５０ｎＭ〜約１０ｎＭ、さらにより好ましくは約１５ｎＭ〜約１０ｎＭ、さらにより好ましくは約１０ｎＭ〜約０．５ｎＭ、さらにより好ましくは約５ｎＭ〜約０．５ｎＭ、さらにより好ましくは約５ｎＭ〜約０．７ｎＭ、さらにより好ましくは約３ｎＭ〜約０．７ｎＭ、または最も好ましくは約３ｎＭ〜約１ｎＭのＫＤで、配列番号１２、１３、１４、１５、１６、および９５からなる群より選択されるアミノ酸配列に局在する１つのアミノ酸または複数のアミノ酸を含むか、またはそれらから実質的になるか、またはそれらからなるエピトープにて、配列番号１に示されるアミノ酸配列からなるヒトＦＰＮ１に結合する。好ましくは、抗ＦＰＮ１ Ｍａｂ、またはその抗原結合フラグメントは、配列番号９８、１８３〜２１４からなる群より選択される１つ以上のペプチドに結合しない。
【００６４】
他の実施形態において、本発明は、配列番号３７、１２９、２２、１０７、１１８、および１２０にそれぞれ示されるアミノ酸配列を含むＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、ＬＣＤＲ３、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、およびＨＣＤＲ３を含み、好ましくはＭａｂについて２５℃、およびＦａｂについて３７℃にてＳＰＲによって測定される場合、約７．５×１０−３ｓ−１〜約１×１０−４ｓ−１、好ましくは約２．５×１０−３ｓ−１〜約１×１０−４ｓ−１、より好ましくは約１×１０−３ｓ−１〜約１×１０−４ｓ−１、さらにより好ましくは約５×１０−４ｓ−１〜約１×１０−４ｓ−１の、ヒトフェロポーチン１に対する解離速度（ｋｏｆｆ）で、配列番号１２、１３、１４、１５、１６、および９５からなる群より選択されるアミノ酸配列に局在する１つのアミノ酸または複数のアミノ酸を含むか、またはそれらから実質的になるか、またはそれらからなるエピトープにて、配列番号１に示されるアミノ酸配列からなるヒトＦＰＮ１に結合する、Ｍａｂまたはその抗原結合フラグメントを提供する。好ましくは、抗ＦＰＮ１ Ｍａｂ、またはその抗原結合フラグメントは、配列番号９８、１８３〜２１４からなる群より選択される１つ以上のペプチドに結合しない。
【００６５】
特定の実施形態において、本発明の抗ＦＰＮ１ Ｍａｂ、またはその抗原結合フラグメントは、配列番号３７、１２９、２２、１０７、１１８、および１２０にそれぞれ示されるアミノ酸配列を含むＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、ＬＣＤＲ３、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、およびＨＣＤＲ３を含み、好ましくはＭａｂについて２５℃、およびＦａｂについて３７℃にてＳＰＲによって測定される場合、約１００ｎＭ未満、約７５ｎＭ未満、約５０ｎＭ未満、約２５ｎＭ未満、または約１０ｎＭ未満のＫＤ、かつ、約７．５×１０−３ｓ−１〜約１×１０−４ｓ−１、好ましくは約２．５×１０−３ｓ−１〜約１×１０−４ｓ−１、より好ましくは約１×１０−３ｓ−１〜約１×１０−４ｓ−１、さらにより好ましくは約５×１０−４ｓ−１〜約１×１０−４ｓ−１の、ヒトフェロポーチン１に対する解離速度（ｋｏｆｆ）で、配列番号１２、１３、１４、１５、１６、および９５からなる群より選択されるアミノ酸または配列番号１２、１３、１４、１５、１６、および９５からなる群より選択されるアミノ酸配列に局在する１つのアミノ酸または複数のアミノ酸を含むか、またはそれらから実質的になるか、またはそれらからなるエピトープにて、配列番号１に示されるアミノ酸配列からなるヒトＦＰＮ１に結合する。好ましくは、抗ＦＰＮ Ｍａｂ、またはその抗原結合フラグメントは、配列番号９８、１８３〜２１４からなる群より選択される１つ以上のペプチドに結合しない。
【００６６】
一部の実施形態において、本発明の抗ＦＰＮ１ Ｍａｂ、またはその抗原結合フラグメントは、配列番号３７、１２９、２２、１０７、１１８、および１２０にそれぞれ示されるアミノ酸配列を含むＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、ＬＣＤＲ３、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、およびＨＣＤＲ３を含み、好ましくはＭａｂについて２５℃、およびＦａｂについて３７℃にてＳＰＲによって測定される場合、約１００ｎＭ〜約０．５ｎＭ、好ましくは約１００ｎＭ〜約１ｎＭ、より好ましくは約７５ｎＭ〜約５ｎＭ、さらにより好ましくは約５０ｎＭ〜約１０ｎＭ、さらにより好ましくは約１５ｎＭ〜約１０ｎＭ、さらにより好ましくは約１０ｎＭ〜約０．５ｎＭ、さらにより好ましくは約５ｎＭ〜約０．５ｎＭ、さらにより好ましくは約５ｎＭ〜約０．７ｎＭ、さらにより好ましくは約３ｎＭ〜約０．７ｎＭ、または最も好ましくは約３ｎＭ〜約１ｎＭのＫＤ、かつ、約７．５×１０−３ｓ−１〜約１×１０−４ｓ−１、好ましくは約２．５×１０−３ｓ−１〜約１×１０−４ｓ−１、より好ましくは約１×１０−３ｓ−１〜約１×１０−４ｓ−１、さらにより好ましくは約５×１０−４ｓ−１〜約１×１０−４ｓ−１の、ヒトフェロポーチン１に対する解離速度（ｋｏｆｆ）で、配列番号１２、１３、１４、１５、１６、および９５からなる群より選択されるアミノ酸配列に局在する１つのアミノ酸または複数のアミノ酸を含むか、またはそれらから実質的になるか、またはそれらからなるエピトープにて、配列番号１に示されるアミノ酸配列からなるヒトＦＰＮ１に結合する。好ましくは、抗ＦＰＮ１ Ｍａｂ、またはその抗原結合フラグメントは、配列番号９８、１８３〜２１４からなる群より選択される１つ以上のペプチドに結合しない。
【００６７】
用語「阻害する」とは、ＦＰＮ１の生物学的作用および／または限定されないが、例えば本願明細書の実施例５〜１１、１３もしくは１４において測定される成熟ヒトヘプシジン生物活性を含む、成熟ヘプシジンの生物活性を拮抗、妨げ、防止、抑制、遅延、破壊、除去、停止、減少、または反転する能力を意味する。
【００６８】
特定の実施形態において、本発明の抗ＦＰＮ１ Ｍａｂ、またはその抗原結合フラグメントは、ヘプシジン−２５生物活性のインビボアッセイにおいて約２５０ｎＭ〜約２５ｎＭ、好ましくは１００ｎＭ〜約２５ｎＭ、またはより好ましくは５０ｎＭ〜約２５ｎＭのＩＣ５０を有することにより特徴付けられる。好ましくは、インビボアッセイは、血清鉄濃度のＩＬ−６により誘導される減少を測定する。
【００６９】
さらに、または代替として、本発明の抗ＦＰＮ１ Ｍａｂ、またはその抗原結合フラグメントは、ヘプシジン−２５生物活性のインビトロアッセイにおいて、約１００ｎＭ〜約１ｎＭ、好ましくは約７５ｎＭ〜約１ｎＭ、より好ましくは約５０ｎＭ〜約１ｎＭ、さらにより好ましくは約２５ｎＭ〜約１ｎＭのＩＣ５０を有することにより特徴付けられる。好ましくは、ヘプシジン−２５生物活性アッセイのインビトロアッセイは、ヘプシジンにより誘導されるフェロポーチン１の内在化および／または分解を測定する。さらにより好ましくは、抗ＦＰＮ１ Ｍａｂ、またはその抗原結合フラグメントは、配列番号９８、１８３〜２１４からなる群より選択される１つ以上のペプチドに結合しない。
【００７０】
特定の実施形態において、本発明の抗ＦＰＮ１ Ｍａｂ、またはその抗原結合フラグメントは、好ましくはＭａｂについて２５℃、およびＦａｂについて３７℃にてＳＰＲによって測定される場合、約１００ｎＭ未満、約７５ｎＭ未満、約５０ｎＭ未満、約２５ｎＭ未満、または約１０ｎＭ未満のＫＤ、かつ、ヘプシジン−２５生物活性のインビボアッセイにおいて約２５０ｎＭ〜約２５ｎＭ、好ましくは１００ｎＭ〜約２５ｎＭ、またはより好ましくは５０ｎＭ〜約２５ｎＭのＩＣ５０で、配列番号１２、１３、１４、１５、１６、および９５からなる群より選択されるアミノ酸配列に局在する１つのアミノ酸または複数のアミノ酸を含むか、またはそれらから実質的になるか、またはそれらからなるエピトープにて、配列番号１に示されるアミノ酸配列からなるヒトＦＰＮ１に結合することにより特徴付けられる。好ましくは、インビボアッセイは、血清鉄濃度のＩＬ−６により誘導される減少を測定する。さらにより好ましくは、抗ＦＰＮ１ Ｍａｂ、またはその抗原結合フラグメントは、配列番号９８、１８３〜２１４からなる群より選択される１つ以上のペプチドに結合しない。
【００７１】
特定の実施形態において、本発明の抗ＦＰＮ１ Ｍａｂ、またはその抗原結合フラグメントは、好ましくはＭａｂについて２５℃、およびＦａｂについて３７℃にてＳＰＲによって測定される場合、約１００ｎＭ〜約０．５ｎＭ、好ましくは約１００ｎＭ〜約１ｎＭ、より好ましくは約７５ｎＭ〜約５ｎＭ、さらにより好ましくは約５０ｎＭ〜約１０ｎＭ、さらにより好ましくは約１５ｎＭ〜約１０ｎＭ、さらにより好ましくは約１０ｎＭ〜約０．５ｎＭ、さらにより好ましくは約５ｎＭ〜約０．５ｎＭ、さらにより好ましくは約５ｎＭ〜約０．７ｎＭ、さらにより好ましくは約３ｎＭ〜約０．７ｎＭ、または最も好ましくは約３ｎＭ〜約１ｎＭのＫＤで、配列番号１２、１３、１４、１５、１６、および９５からなる群より選択されるアミノ酸配列に局在する１つのアミノ酸または複数のアミノ酸を含むか、またはそれらから実質的になるか、またはそれらからなるエピトープにて、配列番号１に示されるアミノ酸配列からなるヒトＦＰＮ１に結合することにより特徴付けられ、ヘプシジン−２５生物活性のインビボアッセイにおいて約２５０ｎＭ〜約２５ｎＭ、好ましくは１００ｎＭ〜約２５ｎＭ、またはより好ましくは５０ｎＭ〜約２５ｎＭのＩＣ５０を有することによりさらに特徴付けられる。好ましくは、インビボアッセイは、血清鉄濃度のＩＬ−６により誘導される減少を測定する。さらにより好ましくは、抗ＦＰＮ１ Ｍａｂ、または抗原結合フラグメントは、配列番号９８、１８３〜２１４からなる群より選択される１つ以上のペプチドに結合しない。
【００７２】
特定の実施形態において、本発明の抗ＦＰＮ１ Ｍａｂ、またはその抗原結合フラグメントは、好ましくはＭａｂについて２５℃、およびＦａｂについて３７℃にてＳＰＲによって測定される場合、約１００ｎＭ〜約０．５ｎＭ、好ましくは約１００ｎＭ〜約１ｎＭ、より好ましくは約７５ｎＭ〜約５ｎＭ、さらにより好ましくは約５０ｎＭ〜約１０ｎＭ、さらにより好ましくは約１５ｎＭ〜約１０ｎＭ、さらにより好ましくは約１０ｎＭ〜約０．５ｎＭ、さらにより好ましくは約５ｎＭ〜約０．５ｎＭ、さらにより好ましくは約５ｎＭ〜約０．７ｎＭ、さらにより好ましくは約３ｎＭ〜約０．７ｎＭ、または最も好ましくは約３ｎＭ〜約１ｎＭのＫＤで、配列番号１２、１３、１４、１５、１６、および９５からなる群より選択されるアミノ酸配列に局在する１つのアミノ酸または複数のアミノ酸を含むか、またはそれらから実質的になるか、またはそれらからなるエピトープにて、配列番号１に示されるアミノ酸配列からなるヒトＦＰＮ１に結合し、好ましくはＭａｂについて２５℃、およびＦａｂについて３７℃にてＳＰＲによって測定される場合、約７．５×１０−３ｓ−１〜約１×１０−４ｓ−１、好ましくは約２．５×１０−３ｓ−１〜約１×１０−４ｓ−１、より好ましくは約１×１０−３ｓ−１〜約１×１０−４ｓ−１、さらにより好ましくは約５×１０−４ｓ−１〜約１×１０−４ｓ−１の、ヒトフェロポーチン１に対する解離速度（ｋｏｆｆ）を有することにより特徴付けられ、さらに、ヘプシジン−２５生物活性のインビボアッセイにおいて約２５０ｎＭ〜約２５ｎＭ、好ましくは１００ｎＭ〜約２５ｎＭ、またはより好ましくは５０ｎＭ〜約２５ｎＭのＩＣ５０を有することにより特徴付けられる。好ましくは、インビボアッセイは、血清鉄濃度のＩＬ−６により誘導される減少を測定する。さらにより好ましくは、抗ＦＰＮ１ Ｍａｂ、またはその抗原結合フラグメントは、配列番号９８、１８３〜２１４からなる群より選択される１つ以上のペプチドに結合しない。
【００７３】
特定の実施形態において、本発明の抗ＦＰＮ１ Ｍａｂ、またはその抗原結合フラグメントは、配列番号３７、１２９、２２、１０７、１１８、および１２０にそれぞれ示されるアミノ酸配列を含むＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、ＬＣＤＲ３、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、およびＨＣＤＲ３を含み、好ましくはＭａｂについて２５℃、およびＦａｂについて３７℃にてＳＰＲによって測定される場合、約１００ｎＭ未満、約７５ｎＭ未満、約５０ｎＭ未満、約２５ｎＭ未満、または約１０ｎＭ未満のＫＤ、かつ、好ましくはＭａｂについて２５℃、およびＦａｂについて３７℃にてＳＰＲによって測定される場合、約７．５×１０−３ｓ−１〜約１×１０−４ｓ−１、好ましくは約２．５×１０−３ｓ−１〜約１×１０−４ｓ−１、より好ましくは約１×１０−３ｓ−１〜約１×１０−４ｓ−１、さらにより好ましくは約５×１０−４ｓ−１〜約１×１０−４ｓ−１の、ヒトフェロポーチン１に対する解離速度（ｋｏｆｆ）で、配列番号１２、１３、１４、１５、１６、および９５からなる群より選択されるアミノ酸配列に局在する１つのアミノ酸または複数のアミノ酸を含むか、またはそれらから実質的になるか、またはそれらからなるエピトープにて、配列番号１に示されるアミノ酸配列からなるヒトＦＰＮ１に結合し、さらに、ヘプシジン−２５生物活性のインビボアッセイにおいて約２５０ｎＭ〜約２５ｎＭ、好ましくは１００ｎＭ〜約２５ｎＭ、またはより好ましくは５０ｎＭ〜約２５ｎＭのＩＣ５０を有することにより特徴付けられる。好ましくは、インビボアッセイは、血清鉄濃度のＩＬ−６により誘導される減少を測定する。さらにより好ましくは、抗ＦＰＮ Ｍａｂ、またはその抗原結合フラグメントは、配列番号９８、１８３〜２１４からなる群より選択される１つ以上のペプチドに結合しない。
【００７４】
一部の実施形態において、本発明の抗ＦＰＮ１ Ｍａｂ、またはその抗原結合フラグメントは、配列番号３７、１２９、２２、１０７、１１８、および１２０にそれぞれ示されるアミノ酸配列を含むＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、ＬＣＤＲ３、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、およびＨＣＤＲ３を含み、好ましくはＭａｂについて２５℃、およびＦａｂについて３７℃にてＳＰＲによって測定される場合、約１００ｎＭ〜約０．５ｎＭ、好ましくは約１００ｎＭ〜約１ｎＭ、より好ましくは約７５ｎＭ〜約５ｎＭ、さらにより好ましくは約５０ｎＭ〜約１０ｎＭ、さらにより好ましくは約１５ｎＭ〜約１０ｎＭ、さらにより好ましくは約１０ｎＭ〜約０．５ｎＭ、さらにより好ましくは約５ｎＭ〜約０．５ｎＭ、さらにより好ましくは約５ｎＭ〜約０．７ｎＭ、さらにより好ましくは約３ｎＭ〜約０．７ｎＭ、または最も好ましくは約３ｎＭ〜約１ｎＭのＫＤ、かつ、好ましくはＭａｂについて２５℃、およびＦａｂについて３７℃にてＳＰＲによって測定される場合、約７．５×１０−３ｓ−１〜約１×１０−４ｓ−１、好ましくは約２．５×１０−３ｓ−１〜約１×１０−４ｓ−１、より好ましくは約１×１０−３ｓ−１〜約１×１０−４ｓ−１、さらにより好ましくは約５×１０−４ｓ−１〜約１×１０−４ｓ−１の、ヒトフェロポーチン１に対する解離速度（ｋｏｆｆ）で、配列番号１２、１３、１４、１５、１６、および９５からなる群より選択されるアミノ酸配列に局在する１つのアミノ酸または複数のアミノ酸を含むか、またはそれらから実質的になるか、またはそれらからなるエピトープにて、配列番号１に示されるアミノ酸配列からなるヒトＦＰＮ１に結合し、さらに、ヘプシジン−２５生物活性のインビボアッセイにおいて、約２５０ｎＭ〜約２５ｎＭ、好ましくは１００ｎＭ〜約２５ｎＭ、またはより好ましくは５０ｎＭ〜約２５ｎＭのＩＣ５０を有することにより特徴付けられる。好ましくは、インビボアッセイは、血清鉄濃度のＩＬ−６により誘導される減少を測定する。さらにより好ましくは、抗ＦＰＮ１ Ｍａｂ、またはその抗原結合フラグメントは、配列番号９８、１８３〜２１４からなる群より選択される１つ以上のペプチドに結合しない。
【００７５】
本発明の一部の実施形態において、抗ＦＰＮ１ Ｍａｂ、またはその抗原結合フラグメントは、好ましくはＭａｂについて２５℃、およびＦａｂについて３７℃にてＳＰＲによって測定される場合、約７５ｎＭ未満、約５０ｎＭ未満、約２５ｎＭ未満、または約１０ｎＭ未満のＫＤで、配列番号１２、１３、１４、１５、１６、および９５からなる群より選択されるアミノ酸配列に局在する１つのアミノ酸または複数のアミノ酸を含むか、またはそれらから実質的になるか、またはそれらからなるエピトープにて、配列番号１に示されるアミノ酸配列からなるヒトＦＰＮ１に結合し、ヘプシジン−２５生物活性のインビボアッセイにおいて約２５０ｎＭ〜約２５ｎＭ、好ましくは１００ｎＭ〜約２５ｎＭ、またはより好ましくは５０ｎＭ〜約２５ｎＭのＩＣ５０を有することにより特徴付けられ、さらに、ヘプシジン−２５生物活性のインビトロアッセイにおいて約１００ｎＭ〜約１ｎＭ、好ましくは約７５ｎＭ〜約１ｎＭ、より好ましくは約５０ｎＭ〜約１ｎＭ、さらにより好ましくは約２５ｎＭ〜約１ｎＭのＩＣ５０を有することにより特徴付けられる。好ましくは、インビボアッセイは、血清鉄濃度のＩＬ−６により誘導される減少を測定する。好ましくは、ヘプシジン−２５生物活性アッセイのインビトロアッセイは、フェロポーチン１のヘプシジンにより誘導される内在化および／または分解を測定する。さらにより好ましくは、抗ＦＰＮ１ Ｍａｂ、またはその抗原結合フラグメントは、配列番号９８、１８３〜２１４からなる群より選択される１つ以上のペプチドに結合しない。
【００７６】
特定の実施形態において、本発明の抗ＦＰＮ１ Ｍａｂ、またはその抗原結合フラグメントは、好ましくはＭａｂについて２５℃、およびＦａｂについて３７℃にてＳＰＲによって測定される場合、約１００ｎＭ〜約０．５ｎＭ、好ましくは約１００ｎＭ〜約１ｎＭ、より好ましくは約７５ｎＭ〜約５ｎＭ、さらにより好ましくは約５０ｎＭ〜約１０ｎＭ、さらにより好ましくは約１５ｎＭ〜約１０ｎＭ、さらにより好ましくは約１０ｎＭ〜約０．５ｎＭ、さらにより好ましくは約５ｎＭ〜約０．５ｎＭ、さらにより好ましくは約５ｎＭ〜約０．７ｎＭ、さらにより好ましくは約３ｎＭ〜約０．７ｎＭ、または最も好ましくは約３ｎＭ〜約１ｎＭのＫＤで、配列番号１２、１３、１４、１５、１６、および９５からなる群より選択されるアミノ酸配列に局在する１つのアミノ酸または複数のアミノ酸を含むか、またはそれらから実質的になるか、またはそれらからなるエピトープにて、配列番号１に示されるアミノ酸配列からなるヒトＦＰＮ１に結合し、ヘプシジン−２５生物活性のインビボアッセイにおいて、約２５０ｎＭ〜約２５ｎＭ、好ましくは１００ｎＭ〜約２５ｎＭ、またはより好ましくは５０ｎＭ〜約２５ｎＭのＩＣ５０を有することにより特徴付けられ、さらに、ヘプシジン−２５生物活性のインビトロアッセイにおいて、約１００ｎＭ〜約１ｎＭ、好ましくは約７５ｎＭ〜約１ｎＭ、より好ましくは約５０ｎＭ〜約１ｎＭ、さらにより好ましくは約２５ｎＭ〜約１ｎＭのＩＣ５０を有することにより特徴付けられる。好ましくは、インビボアッセイは、血清鉄濃度のＩＬ−６により誘導される減少を測定する。好ましくは、ヘプシジン−２５生物活性のインビトロアッセイは、フェロポーチン１のヘプシジンにより誘導される内在化および／または分解を測定する。さらにより好ましくは、抗ＦＰＮ１ Ｍａｂ、またはその抗原結合フラグメントは、配列番号９８、１８３〜２１４からなる群より選択される１つ以上のペプチドに結合しない。
【００７７】
一部の実施形態において、本発明は、配列番号１２、１３、１４、１５、１６、および９５からなる群より選択されるアミノ酸配列に局在する１つのアミノ酸または複数のアミノ酸を含むか、またはそれらから実質的になるか、またはそれらからなるエピトープにて、配列番号１に示されるアミノ酸配列からなるヒトＦＰＮ１に結合する、Ｍａｂ、またはその抗原結合フラグメント、および１）好ましくはＭａｂについて２５℃、およびＦａｂについて３７℃にてＳＰＲによって測定される場合、約１００ｎＭ〜約０．５ｎＭ、好ましくは約１００ｎＭ〜約１ｎＭ、より好ましくは約７５ｎＭ〜約５ｎＭ、さらにより好ましくは約５０ｎＭ〜約１０ｎＭ、さらにより好ましくは約１５ｎＭ〜約１０ｎＭ、さらにより好ましくは約１０ｎＭ〜約０．５ｎＭ、さらにより好ましくは約５ｎＭ〜約０．５ｎＭ、さらにより好ましくは約５ｎＭ〜約０．７ｎＭ、さらにより好ましくは約３ｎＭ〜約０．７ｎＭ、または最も好ましくは約３ｎＭ〜約１ｎＭのＫＤ、２）ヘプシジン−２５生物活性のインビボアッセイにおいて、約２５０ｎＭ〜約２５ｎＭ、好ましくは１００ｎＭ〜約２５ｎＭ、またはより好ましくは５０ｎＭ〜約２５ｎＭのＩＣ５０、３）ヘプシジン−２５生物活性のインビトロアッセイにおいて、約１００ｎＭ〜約１ｎＭ、好ましくは約７５ｎＭ〜約１ｎＭ、より好ましくは約５０ｎＭ〜約１ｎＭ、さらにより好ましくは約２５ｎＭ〜約１ｎＭのＩＣ５０、および４）好ましくはＭａｂについて２５℃、およびＦａｂについて３７℃にてＳＰＲによって測定される場合、約７．５×１０−３ｓ−１〜約１×１０−４ｓ−１、好ましくは約２．５×１０−３ｓ−１〜約１×１０−４ｓ−１、より好ましくは約１×１０−３ｓ−１〜約１×１０−４ｓ−１、さらにより好ましくは約５×１０−４ｓ−１〜約１×１０−４ｓ−１の、ヒトフェロポーチン１に対する解離速度（ｋｏｆｆ）を提供する。好ましくは、インビボアッセイは、血清鉄濃度のＩＬ−６により誘導される減少を測定する。好ましくは、ヘプシジン−２５生物活性アッセイのインビトロアッセイは、フェロポーチン１のヘプシジンにより誘導される内在化および／または分解を測定する。さらにより好ましくは、抗ＦＰＮ１ Ｍａｂ、またはその抗原結合フラグメントは、配列番号９８、１８３〜２１４からなる群より選択される１つ以上のペプチドに結合しない。
【００７８】
特定の実施形態において、本発明の抗ＦＰＮ１ Ｍａｂ、またはその抗原結合フラグメントは、配列番号３７、１２９、２２、１０７、１１８、および１２０にそれぞれ示されるアミノ酸配列を含むＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、ＬＣＤＲ３、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、およびＨＣＤＲ３を含み、ヘプシジン−２５生物活性のインビボアッセイにおいて約２５０ｎＭ〜約２５ｎＭ、好ましくは約１００ｎＭ〜約２５ｎＭ、またはより好ましくは５０ｎＭ〜約２５ｎＭのＩＣ５０を有することにより特徴付けられる。好ましくは、インビボアッセイは、血清鉄濃度のＩＬ−６により誘導される減少を測定する。さらにより好ましくは、抗ＦＰＮ１ Ｍａｂ、またはその抗原結合フラグメントは、配列番号９８、１８３〜２１４からなる群より選択される１つ以上のペプチドに結合しない。
【００７９】
特定の実施形態において、本発明の抗ＦＰＮ１ Ｍａｂ、またはその抗原結合フラグメントは、配列番号３７、１２９、２２、１０７、１１８、および１２０にそれぞれ示されるアミノ酸配列を含むＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、ＬＣＤＲ３、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、およびＨＣＤＲ３を含み、ヘプシジン−２５生物活性のインビボアッセイにおいて、約２５０ｎＭ〜約２５ｎＭ、好ましくは１００ｎＭ〜約２５ｎＭ、またはより好ましくは５０ｎｍ〜約２５ｎＭのＩＣ５０およびヘプシジン−２５生物活性のインビトロアッセイにおいて約１００ｎＭ〜約１ｎＭ、好ましくは約７５ｎＭ〜約１ｎＭ、より好ましくは約５０ｎＭ〜約１ｎＭ、さらにより好ましくは約２５ｎＭ〜約１ｎＭのＩＣ５０を有することにより特徴付けられる。好ましくは、インビボアッセイは、血清鉄濃度のＩＬ−６により誘導される減少を測定する。好ましくは、ヘプシジン−２５生物活性のインビトロアッセイは、フェロポーチン１のヘプシジンにより誘導される内在化および／または分解を測定する。さらにより好ましくは、抗ＦＰＮ１ Ｍａｂ、またはその抗原結合フラグメントは、配列番号９８、１８３〜２１４からなる群より選択される１つ以上のペプチドに結合しない。
【００８０】
特定の実施形態において、本発明の抗ＦＰＮ１ Ｍａｂ、またはその抗原結合フラグメントは、配列番号３７、１２９、２２、１０７、１１８、および１２０にそれぞれ示されるアミノ酸配列を含むＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、ＬＣＤＲ３、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、およびＨＣＤＲ３を含み、好ましくはＭａｂについて２５℃、およびＦａｂについて３７℃にてＳＰＲによって測定される場合、約１００ｎＭ未満、約７５ｎＭ未満、約５０ｎＭ未満、約２５ｎＭ未満、または約１０ｎＭ未満のＫＤ、かつ、ヘプシジン−２５生物活性のインビボアッセイにおいて、約２５０ｎＭ〜約２５ｎＭ、好ましくは１００ｎＭ〜約２５ｎＭ、またはより好ましくは５０ｎＭ〜約２５ｎＭのＩＣ５０で、配列番号１２、１３、１４、１５、１６、および９５からなる群より選択されるアミノ酸配列に局在する１つのアミノ酸または複数のアミノ酸を含むか、またはそれらから実質的になるか、またはそれらからなるエピトープにて、配列番号１に示されるアミノ酸配列からなるヒトＦＰＮ１に結合する。好ましくは、インビボアッセイは、血清鉄濃度のＩＬ−６により誘導される減少を測定する。さらにより好ましくは、抗ＦＰＮ１ Ｍａｂ、またはその抗原結合フラグメントは、配列番号９８、１８３〜２１４からなる群より選択される１つ以上のペプチドに結合しない。
【００８１】
特定の実施形態において、本発明の抗ＦＰＮ１ Ｍａｂ、またはその抗原結合フラグメントは、配列番号３７、１２９、２２、１０７、１１８、および１２０にそれぞれ示されるアミノ酸配列を含むＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、ＬＣＤＲ３、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、およびＨＣＤＲ３を含み、好ましくはＭａｂについて２５℃、およびＦａｂについて３７℃にてＳＰＲによって測定される場合、約１００ｎＭ〜約０．５ｎＭ、好ましくは約１００ｎＭ〜約１ｎＭ、より好ましくは約７５ｎＭ〜約５ｎＭ、さらにより好ましくは約５０ｎＭ〜約１０ｎＭ、さらにより好ましくは約１５ｎＭ〜約１０ｎＭ、さらにより好ましくは約１０ｎＭ〜約０．５ｎＭ、さらにより好ましくは約５ｎＭ〜約０．５ｎＭ、さらにより好ましくは約５ｎＭ〜約０．７ｎＭ、さらにより好ましくは約３ｎＭ〜約０．７ｎＭ、または最も好ましくは約３ｎＭ〜約１ｎＭのＫＤで、配列番号１２、１３、１４、１５、１６、および９５からなる群より選択されるアミノ酸配列に局在する１つのアミノ酸または複数のアミノ酸を含むか、またはそれらから実質的になるか、またはそれらからなるエピトープにて、配列番号１に示されるアミノ酸配列からなるヒトＦＰＮ１に結合し、さらに、ヘプシジン−２５生物活性のインビボアッセイにおいて、約２５０ｎＭ〜約２５ｎＭ、好ましくは１００ｎＭ〜約２５ｎＭ、またはより好ましくは５０ｎＭ〜約２５ｎＭのＩＣ５０を有することにより特徴付けられる。好ましくは、インビボアッセイは、血清鉄濃度のＩＬ−６により誘導される減少を測定する。さらにより好ましくは、抗ＦＰＮ１ Ｍａｂ、またはその抗原結合フラグメントは、配列番号９８、１８３〜２１４からなる群より選択される１つ以上のペプチドに結合しない。
【００８２】
特定の実施形態において、本発明の抗ＦＰＮ１ Ｍａｂ、またはその抗原結合フラグメントは、配列番号３７、１２９、２２、１０７、１１８、および１２０にそれぞれ示されるアミノ酸配列を含むＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、ＬＣＤＲ３、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、およびＨＣＤＲ３を含み、好ましくはＭａｂについて２５℃、およびＦａｂについて３７℃にてＳＰＲによって測定される場合、約１００ｎＭ〜約０．５ｎＭ、好ましくは約１００ｎＭ〜約１ｎＭ、より好ましくは約７５ｎＭ〜約５ｎＭ、さらにより好ましくは約５０ｎＭ〜約１０ｎＭ、さらにより好ましくは約１５ｎＭ〜約１０ｎＭ、さらにより好ましくは約１０ｎＭ〜約０．５ｎＭ、さらにより好ましくは約５ｎＭ〜約０．５ｎＭ、さらにより好ましくは約５ｎＭ〜約０．７ｎＭ、さらにより好ましくは約３ｎＭ〜約０．７ｎＭ、または最も好ましくは約３ｎＭ〜約１ｎＭのＫＤで、配列番号１２、１３、１４、１５、１６、および９５からなる群より選択されるアミノ酸配列に局在する１つのアミノ酸または複数のアミノ酸を含むか、またはそれらから実質的になるか、またはそれらからなるエピトープにて、配列番号１に示されるアミノ酸配列からなるヒトＦＰＮ１に結合し、好ましくはＭａｂについて２５℃、およびＦａｂについて３７℃にてＳＰＲによって測定される場合、約７．５×１０−３ｓ−１〜約１×１０−４ｓ−１、好ましくは約２．５×１０−３ｓ−１〜約１×１０−４ｓ−１、より好ましくは約１×１０−３ｓ−１〜約１×１０−４ｓ−１、さらにより好ましくは約５×１０−４ｓ−１〜約１×１０−４ｓ−１の、ヒトフェロポーチン１に対する解離速度（ｋｏｆｆ）を有し、さらに、ヘプシジン−２５生物活性のインビボアッセイにおいて、約２５０ｎＭ〜約２５ｎＭ、好ましくは１００ｎＭ〜約２５ｎＭ、またはより好ましくは５０ｎＭ〜約２５ｎＭのＩＣ５０を有することにより特徴付けられる。好ましくは、インビボアッセイは、血清鉄濃度のＩＬ−６により誘導される減少を測定する。さらにより好ましくは、抗ＦＰＮ１ Ｍａｂ、またはその抗原結合フラグメントは、配列番号９８、１８３〜２１４からなる群より選択される１つ以上のペプチドに結合しない。
【００８３】
特定の実施形態において、本発明の抗ＦＰＮ１ Ｍａｂ、またはその抗原結合フラグメントは、配列番号３７、１２９、２２、１０７、１１８、および１２０にそれぞれ示されるアミノ酸配列を含むＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、ＬＣＤＲ３、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、およびＨＣＤＲ３を含み、好ましくはＭａｂについて２５℃、およびＦａｂについて３７℃にてＳＰＲによって測定される場合、約１００ｎＭ未満、約７５ｎＭ未満、約５０ｎＭ未満、約２５ｎＭ未満、または約１０ｎＭ未満のＫＤ、かつ、好ましくはＭａｂについて２５℃、およびＦａｂについて３７℃にてＳＰＲによって測定される場合、約７．５×１０−３ｓ−１〜約１×１０−４ｓ−１、好ましくは約２．５×１０−３ｓ−１〜約１×１０−４ｓ−１、より好ましくは約１×１０−３ｓ−１〜約１×１０−４ｓ−１、さらにより好ましくは約５×１０−４ｓ−１〜約１×１０−４ｓ−１の、ヒトフェロポーチン１に対する解離速度（ｋｏｆｆ）で、配列番号１２、１３、１４、１５、１６、および９５からなる群より選択されるアミノ酸配列に局在する１つのアミノ酸または複数のアミノ酸を含むか、またはそれらから実質的になるか、またはそれらからなるエピトープにて、配列番号１に示されるアミノ酸配列からなるヒトＦＰＮ１に結合し、さらに、ヘプシジン−２５生物活性のインビボアッセイにおいて、約２５０ｎＭ〜約２５ｎＭ、好ましくは１００ｎＭ〜約２５ｎＭ、またはより好ましくは５０ｎＭ〜約２５ｎＭのＩＣ５０を有することにより特徴付けられる。好ましくは、インビボアッセイは、血清鉄濃度のＩＬ６により誘導される減少を測定する。さらにより好ましくは、抗ＦＰＮ１ Ｍａｂ、またはその抗原結合フラグメントは、配列番号９８、１８３〜２１４からなる群より選択される１つ以上のペプチドに結合しない。
【００８４】
本発明の一部の実施形態において、抗ＦＰＮ１ Ｍａｂ、またはその抗原結合フラグメントは、配列番号３７、１２９、２２、１０７、１１８、および１２０にそれぞれ示されるアミノ酸配列を含むＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、ＬＣＤＲ３、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、およびＨＣＤＲ３を含み、好ましくはＭａｂについて２５℃、およびＦａｂについて３７℃にてＳＰＲによって測定される場合、約７５ｎＭ未満、約５０ｎＭ未満、約２５ｎＭ未満、または約１０ｎＭ未満のＫＤで、配列番号１２、１３、１４、１５、１６、および９５からなる群より選択されるアミノ酸または配列番号１２、１３、１４、１５、１６、および９５からなる群より選択されるアミノ酸配列に局在する１つのアミノ酸または複数のアミノ酸を含むか、またはそれらから実質的になるか、またはそれらからなるエピトープにて、配列番号１に示されるアミノ酸配列からなるヒトＦＰＮ１に結合し、ヘプシジン−２５生物活性のインビボアッセイにおいて、約２５０ｎＭ〜約２５ｎＭ、好ましくは１００ｎＭ〜約２５ｎＭ、またはより好ましくは５０ｎＭ〜約２５ｎＭのＩＣ５０を有し、さらに、ヘプシジン−２５生物活性のインビトロアッセイにおいて、約１００ｎＭ〜約１ｎＭ、好ましくは約７５ｎＭ〜約１ｎＭ、より好ましくは約５０ｎＭ〜約１ｎＭ、さらにより好ましくは約２５ｎＭ〜約１ｎＭのＩＣ５０を有することにより特徴付けられる。好ましくは、インビボアッセイは、血清鉄濃度のＩＬ６により誘導される減少を測定する。好ましくは、ヘプシジン−２５生物活性アッセイのインビトロアッセイは、フェロポーチン１のヘプシジンにより誘導される内在化および／または分解を測定する。さらにより好ましくは、抗ＦＰＮ１ Ｍａｂ、またはその抗原結合フラグメントは、配列番号９８、１８３〜２１４からなる群より選択される１つ以上のペプチドに結合しない。
【００８５】
特定の実施形態において、本発明の抗ＦＰＮ１ Ｍａｂ、またはその抗原結合フラグメントは、配列番号３７、１２９、２２、１０７、１１８、および１２０にそれぞれ示されるアミノ酸配列を含むＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、ＬＣＤＲ３、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、およびＨＣＤＲ３を含み、好ましくはＭａｂについて２５℃、およびＦａｂについて３７℃にてＳＰＲによって測定される場合、約１００ｎＭ〜約０．５ｎＭ、好ましくは約１００ｎＭ〜約１ｎＭ、より好ましくは約７５ｎＭ〜約５ｎＭ、さらにより好ましくは約５０ｎＭ〜約１０ｎＭ、さらにより好ましくは約１５ｎＭ〜約１０ｎＭ、さらにより好ましくは約１０ｎＭ〜約０．５ｎＭ、さらにより好ましくは約５ｎＭ〜約０．５ｎＭ、さらにより好ましくは約５ｎＭ〜約０．７ｎＭ、さらにより好ましくは約３ｎＭ〜約０．７ｎＭ、または最も好ましくは約３ｎＭ〜約１ｎＭのＫＤで、配列番号１２、１３、１４、１５、１６、および９５からなる群より選択されるアミノ酸配列に局在する１つのアミノ酸または複数のアミノ酸を含むか、またはそれらから実質的になるか、またはそれらからなるエピトープにて、配列番号１に示されるアミノ酸配列からなるヒトＦＰＮ１に結合し、ヘプシジン−２５生物活性のインビボアッセイにおいて、約２５０ｎＭ〜約２５ｎＭ、好ましくは１００ｎＭ〜約２５ｎＭ、またはより好ましくは５０ｎＭ〜約２５ｎＭのＩＣ５０を有し、さらに、ヘプシジン−２５生物活性のインビトロアッセイにおいて、約１００ｎＭ〜約１ｎＭ、好ましくは約７５ｎＭ〜約１ｎＭ、より好ましくは約５０ｎＭ〜約１ｎＭ、さらにより好ましくは約２５ｎＭ〜約１ｎＭのＩＣ５０を有することにより特徴付けられる。好ましくは、インビボアッセイは、血清鉄濃度のＩＬ−６により誘導される減少を測定する。好ましくは、ヘプシジン−２５生物活性アッセイのインビトロアッセイは、フェロポーチン１のヘプシジンにより誘導される内在化および／または分解を測定する。さらにより好ましくは、抗ＦＰＮ１ Ｍａｂ、またはその抗原結合フラグメントは、配列番号９８、１８３〜２１４からなる群より選択される１つ以上のペプチドに結合しない。
【００８６】
特定の実施形態において、本発明の抗ＦＰＮ１ Ｍａｂ、またはその抗原結合フラグメントは、配列番号３７、１２９、２２、１０７、１１８、および１２０にそれぞれ示されるアミノ酸配列を含むＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、ＬＣＤＲ３、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、およびＨＣＤＲ３を含み、配列番号１２、１３、１４、１５、１６、および９５からなる群より選択されるアミノ酸配列に局在する１つのアミノ酸または複数のアミノ酸を含むか、またはそれらから実質的になるか、またはそれらからなるエピトープにて、配列番号１に示されるアミノ酸配列からなるヒトＦＰＮ１に結合し、１）好ましくはＭａｂについて２５℃、およびＦａｂについて３７℃にてＳＰＲによって測定される場合、約１００ｎＭ〜約０．５ｎＭ、好ましくは約１００ｎＭ〜約１ｎＭ、より好ましくは約７５ｎＭ〜約５ｎＭ、さらにより好ましくは約５０ｎＭ〜約１０ｎＭ、さらにより好ましくは約１５ｎＭ〜約１０ｎＭ、さらにより好ましくは約１０ｎＭ〜約０．５ｎＭ、さらにより好ましくは約５ｎＭ〜約０．５ｎＭ、さらにより好ましくは約５ｎＭ〜約０．７ｎＭ、さらにより好ましくは約３ｎＭ〜約０．７ｎＭ、または最も好ましくは約３ｎＭ〜約１ｎＭのＫＤ、２）ヘプシジン−２５生物活性のインビボアッセイにおいて、約２５０ｎＭ〜約２５ｎＭ、好ましくは１００ｎＭ〜約２５ｎＭ、またはより好ましくは５０ｎＭ〜約２５ｎＭのＩＣ５０、３）ヘプシジン−２５生物活性のインビトロアッセイにおいて、約１００ｎＭ〜約１ｎＭ、好ましくは約７５ｎＭ〜約１ｎＭ、より好ましくは約５０ｎＭ〜約１ｎＭ、さらにより好ましくは約２５ｎＭ〜約１ｎＭのＩＣ５０、および４）好ましくはＭａｂについて２５℃、およびＦａｂについて３７℃にてＳＰＲによって測定される場合、約７．５×１０−３ｓ−１〜約１×１０−４ｓ−１、好ましくは約２．５×１０−３ｓ−１〜約１×１０−４ｓ−１、より好ましくは約１×１０−３ｓ−１〜約１×１０−４ｓ−１、さらにより好ましくは約５×１０−４ｓ−１〜約１×１０−４ｓ−１の、ヒトフェロポーチン１に対する解離速度（ｋｏｆｆ）を有する。好ましくは、インビボアッセイは、血清鉄濃度のＩＬ−６により誘導される減少を測定する。好ましくは、ヘプシジン−２５生物活性アッセイのインビトロアッセイは、フェロポーチン１のヘプシジンにより誘導される内在化および／または分解を測定する。さらにより好ましくは、抗ＦＰＮ１ Ｍａｂ、またはその抗原結合フラグメントは、配列番号９８、１８３〜２１４からなる群より選択される１つ以上のペプチドに結合しない。
【００８７】
特定の実施形態において、本発明の抗ＦＰＮ１ Ｍａｂ、またはその抗原結合フラグメントは、配列番号３７、１２５、２２、２３、１１０、および１９にそれぞれ示されるアミノ酸配列を含むＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、ＬＣＤＲ３、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、およびＨＣＤＲ３を含み、配列番号１２、１３、１４、１５、１６、および９５からなる群より選択されるアミノ酸配列に局在する１つのアミノ酸または複数のアミノ酸を含むか、またはそれらから実質的になるか、またはそれらからなるエピトープにて、配列番号１に示されるアミノ酸配列からなるヒトＦＰＮ１に結合し、好ましくはＭａｂについて２５℃、およびＦａｂについて３７℃にてＳＰＲによって測定される場合、約１００ｎＭ〜約０．５ｎＭ、好ましくは約１００ｎＭ〜約１ｎＭ、より好ましくは約７５ｎＭ〜約５ｎＭ、さらにより好ましくは約５０ｎＭ〜約１０ｎＭ、さらにより好ましくは約１５ｎＭ〜約１０ｎＭ、さらにより好ましくは約１０ｎＭ〜約０．５ｎＭ、さらにより好ましくは約５ｎＭ〜約０．５ｎＭ、さらにより好ましくは約５ｎＭ〜約０．７ｎＭ、さらにより好ましくは約３ｎＭ〜約０．７ｎＭ、または最も好ましくは約３ｎＭ〜約１ｎＭのＫＤ、２）ヘプシジン−２５生物活性のインビボアッセイにおいて、約２５０ｎＭ〜約２５ｎＭ、好ましくは１００ｎＭ〜約２５ｎＭ、またはより好ましくは５０ｎＭ〜約２５ｎＭのＩＣ５０、３）ヘプシジン−２５生物活性のインビトロアッセイにおいて、約１００ｎＭ〜約１ｎＭ、好ましくは約７５ｎＭ〜約１ｎＭ、より好ましくは約５０ｎＭ〜約１ｎＭ、さらにより好ましくは約２５ｎＭ〜約１ｎＭのＩＣ５０、および４）好ましくはＭａｂについて２５℃、およびＦａｂについて３７℃にてＳＰＲによって測定される場合、約７．５×１０−３ｓ−１〜約１×１０−４ｓ−１、好ましくは約２．５×１０−３ｓ−１〜約１×１０−４ｓ−１、より好ましくは約１×１０−３ｓ−１〜約１×１０−４ｓ−１、さらにより好ましくは約５×１０−４ｓ−１〜約１×１０−４ｓ−１の、ヒトフェロポーチン１に対する解離速度（ｋｏｆｆ）を有することにより特徴付けられる。好ましくは、インビボアッセイは、血清鉄濃度のＩＬ−６により誘導される減少を測定する。好ましくは、ヘプシジン−２５生物活性アッセイのインビトロアッセイは、フェロポーチン１のヘプシジンにより誘導される内在化および／または分解を測定する。さらにより好ましくは、抗ＦＰＮ１ Ｍａｂ、またはその抗原結合フラグメントは、配列番号９８、１８３〜２１４からなる群より選択される１つ以上のペプチドに結合しない。さらにより好ましくは、抗ＦＰＮ１ Ｍａｂ、またはその抗原結合フラグメントは、配列番号９８、１８３〜２１４からなる群より選択される１つ以上のペプチドに結合しない。
【００８８】
特定の実施形態において、本発明の抗ＦＰＮ１ Ｍａｂ、またはその抗原結合フラグメントは、配列番号３７、１７７、２２、２３、１１２、および１９にそれぞれ示されるアミノ酸配列を含むＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、ＬＣＤＲ３、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、およびＨＣＤＲ３を含み、配列番号１２、１３、１４、１５、１６、および９５からなる群より選択されるアミノ酸配列に局在する１つのアミノ酸または複数のアミノ酸を含むか、またはそれらから実質的になるか、またはそれらからなるエピトープにて、配列番号１に示されるアミノ酸配列からなるヒトＦＰＮ１に結合し、１）好ましくはＭａｂについて２５℃、およびＦａｂについて３７℃にてＳＰＲによって測定される場合、約１００ｎＭ〜約０．５ｎＭ、好ましくは約１００ｎＭ〜約１ｎＭ、より好ましくは約７５ｎＭ〜約５ｎＭ、さらにより好ましくは約５０ｎＭ〜約１０ｎＭ、さらにより好ましくは約１５ｎＭ〜約１０ｎＭ、さらにより好ましくは約１０ｎＭ〜約０．５ｎＭ、さらにより好ましくは約５ｎＭ〜約０．５ｎＭ、さらにより好ましくは約５ｎＭ〜約０．７ｎＭ、さらにより好ましくは約３ｎＭ〜約０．７ｎＭ、または最も好ましくは約３ｎＭ〜約１ｎＭのＫＤ、２）ヘプシジン−２５生物活性のインビボアッセイにおいて、約２５０ｎＭ〜約２５ｎＭ、好ましくは１００ｎＭ〜約２５ｎＭ、またはより好ましくは５０ｎＭ〜約２５ｎＭのＩＣ５０、３）ヘプシジン−２５生物活性のインビトロアッセイにおいて、約１００ｎＭ〜約１ｎＭ、好ましくは約７５ｎＭ〜約１ｎＭ、より好ましくは約５０ｎＭ〜約１ｎＭ、さらにより好ましくは約２５ｎＭ〜約１ｎＭのＩＣ５０、および４）好ましくはＭａｂについて２５℃、およびＦａｂについて３７℃にてＳＰＲによって測定される場合、約７．５×１０−３ｓ−１〜約１×１０−４ｓ−１、好ましくは約２．５×１０−３ｓ−１〜約１×１０−４ｓ−１、より好ましくは約１×１０−３ｓ−１〜約１×１０−４ｓ−１、さらにより好ましくは約５×１０−４ｓ−１〜約１×１０−４ｓ−１の、ヒトフェロポーチン１に対する解離速度（ｋｏｆｆ）を有することにより特徴付けられる。好ましくは、インビボアッセイは、血清鉄濃度のＩＬ−６により誘導される減少を測定する。好ましくは、ヘプシジン−２５生物活性アッセイのインビトロアッセイは、フェロポーチン１のヘプシジンにより誘導される内在化および／または分解を測定する。さらにより好ましくは、抗ＦＰＮ１ Ｍａｂ、またはその抗原結合フラグメントは、配列番号９８、１８３〜２１４からなる群より選択される１つ以上のペプチドに結合しない。
【００８９】
特定の実施形態において、本発明の抗ＦＰＮ１ Ｍａｂ、またはその抗原結合フラグメントは、配列番号３７、１２２、２２、２３、１１０、および１９にそれぞれ示されるアミノ酸配列を含むＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、ＬＣＤＲ３、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、およびＨＣＤＲ３を含み、配列番号１２、１３、１４、１５、１６、および９５からなる群より選択されるアミノ酸配列に局在する１つのアミノ酸または複数のアミノ酸を含むか、またはそれらから実質的になるか、またはそれらからなるエピトープにて、配列番号１に示されるアミノ酸配列からなるヒトＦＰＮ１に結合し、１）好ましくはＭａｂについて２５℃、およびＦａｂについて３７℃にてＳＰＲによって測定される場合、約１００ｎＭ〜約０．５ｎＭ、好ましくは約１００ｎＭ〜約１ｎＭ、より好ましくは約７５ｎＭ〜約５ｎＭ、さらにより好ましくは約５０ｎＭ〜約１０ｎＭ、さらにより好ましくは約１５ｎＭ〜約１０ｎＭ、さらにより好ましくは約１０ｎＭ〜約０．５ｎＭ、さらにより好ましくは約５ｎＭ〜約０．５ｎＭ、さらにより好ましくは約５ｎＭ〜約０．７ｎＭ、さらにより好ましくは約３ｎＭ〜約０．７ｎＭ、または最も好ましくは約３ｎＭ〜約１ｎＭのＫＤ、２）ヘプシジン−２５生物活性のインビボアッセイにおいて、約２５０ｎＭ〜約２５ｎＭ、好ましくは１００ｎＭ〜約２５ｎＭ、またはより好ましくは５０ｎＭ〜約２５ｎＭのＩＣ５０、３）ヘプシジン−２５生物活性のインビトロアッセイにおいて、約１００ｎＭ〜約１ｎＭ、好ましくは約７５ｎＭ〜約１ｎＭ、より好ましくは約５０ｎＭ〜約１ｎＭ、さらにより好ましくは約２５ｎＭ〜約１ｎＭのＩＣ５０、および４）好ましくはＭａｂについて２５℃、およびＦａｂについて３７℃にてＳＰＲによって測定される場合、約７．５×１０−３ｓ−１〜約１×１０−４ｓ−１、好ましくは約２．５×１０−３ｓ−１〜約１×１０−４ｓ−１、より好ましくは約１×１０−３ｓ−１〜約１×１０−４ｓ−１、さらにより好ましくは約５×１０−４ｓ−１〜約１×１０−４ｓ−１の、ヒトフェロポーチン１に対する解離速度（ｋｏｆｆ）を有することにより特徴付けられる。好ましくは、インビボアッセイは、血清鉄濃度のＩＬ−６により誘導される減少を測定する。好ましくは、ヘプシジン−２５生物活性アッセイのインビトロアッセイは、フェロポーチン１のヘプシジンにより誘導される内在化および／または分解を測定する。さらにより好ましくは、抗ＦＰＮ１ Ｍａｂ、またはその抗原結合フラグメントは、配列番号９８、１８３〜２１４からなる群より選択される１つ以上のペプチドに結合しない。
【００９０】
特定の実施形態において、本発明の抗ＦＰＮ１ Ｍａｂ、またはその抗原結合性フラグメントは、
（ａ）配列番号１５４および配列番号１５２にそれぞれ示される軽鎖および重鎖；
（ｂ）配列番号１８１および配列番号１７９にそれぞれ示される軽鎖および重鎖；または、
（ｃ）配列番号１５８および配列番号１５６にそれぞれ示される軽鎖および重鎖、
を含み、配列番号１２、１３、１４、１５、１６、および９５からなる群より選択されるアミノ酸配列に局在する１つのアミノ酸または複数のアミノ酸を含むか、またはそれらから実質的になるか、またはそれらからなるエピトープにて、配列番号１に示されるアミノ酸配列からなるヒトＦＰＮ１に結合し、１）好ましくはＭａｂについて２５℃、およびＦａｂについて３７℃にてＳＰＲによって測定される場合、約１００ｎＭ〜約０．５ｎＭ、好ましくは約１００ｎＭ〜約１ｎＭ、より好ましくは約７５ｎＭ〜約５ｎＭ、さらにより好ましくは約５０ｎＭ〜約１０ｎＭ、さらにより好ましくは約１５ｎＭ〜約１０ｎＭ、さらにより好ましくは約１０ｎＭ〜約０．５ｎＭ、さらにより好ましくは約５ｎＭ〜約０．５ｎＭ、さらにより好ましくは約５ｎＭ〜約０．７ｎＭ、さらにより好ましくは約３ｎＭ〜約０．７ｎＭ、または最も好ましくは約３ｎＭ〜約１ｎＭのＫＤ、２）ヘプシジン−２５生物活性のインビボアッセイにおいて、約２５０ｎＭ〜約２５ｎＭ、好ましくは１００ｎＭ〜約２５ｎＭ、またはより好ましくは５０ｎＭ〜約２５ｎＭのＩＣ５０、３）ヘプシジン−２５生物活性のインビトロアッセイにおいて、約１００ｎＭ〜約１ｎＭ、好ましくは約７５ｎＭ〜約１ｎＭ、より好ましくは約５０ｎＭ〜約１ｎＭ、さらにより好ましくは約２５ｎＭ〜約１ｎＭのＩＣ５０、および４）好ましくはＭａｂについて２５℃、およびＦａｂについて３７℃にてＳＰＲによって測定される場合、約７．５×１０−３ｓ−１〜約１×１０−４ｓ−１、好ましくは約２．５×１０−３ｓ−１〜約１×１０−４ｓ−１、より好ましくは約１×１０−３ｓ−１〜約１×１０−４ｓ−１、さらにより好ましくは約５×１０−４ｓ−１〜約１×１０−４ｓ−１の、ヒトフェロポーチン１に対する解離速度（ｋｏｆｆ）を有することにより特徴付けられる。好ましくは、インビボアッセイは、血清鉄濃度のＩＬ−６により誘導される減少を測定する。好ましくは、ヘプシジン−２５生物活性アッセイのインビトロアッセイは、フェロポーチン１のヘプシジンにより誘導される内在化および／または分解を測定する。
【００９１】
用語「治療している」（あるいは「治療する」または「治療」）とは、症状、障害、状態、または疾患の進行または重症度を遅延すること、妨げること、抑止すること、制御すること、停止すること、減少させること、または反転することを意味するが、必ずしも、あらゆる疾患に関連する症状、状態、または障害の完全な除去を含まなくてもよい。
【００９２】
用語「予防している」（あるいは「予防する」または「予防」）とは、症状、障害、状態、または疾患の発病または発生を予防すること、抑制すること、または阻害することを意味する。急性事象および慢性疾患が治療および予防され得る。急性事象において、抗体またはその抗原結合フラグメントを、症状、障害、状態、または疾患が生じたときに投与し、その急性事象が終わったときには中断する。これに対して、慢性的な症状、障害、状態、または疾患は、より長期的な期間にわたって治療される。
【００９３】
「障害」とは、本発明による治療が有益であるいずれかの状態である。用語「障害」、「状態」、および「疾患」は、本願明細書においては同じ意味で用い、限定されないが、慢性疾患による貧血を含む、限定されないが、貧血を含む、慢性および急性の成熟ヘプシジンにより促進される障害を含む。
【００９４】
用語「慢性疾患による貧血」とは、例えば、幅広い感染、炎症、および腫瘍性疾患の結果として発症するいずれかの貧血のことをいう。発症した貧血は、多くの場合、赤血球の寿命を短くし、マクロファージにおいて鉄を隔離することによって特徴付けられ、その結果、新たな赤血球を生成するのに利用可能な鉄の量を減少させる。慢性疾患による貧血に付随する状態としては、限定されないが、慢性の細菌性心内膜炎、骨髄炎、リウマチ熱、潰瘍性大腸炎、および腫瘍性疾患が挙げられる。さらなる状態としては、例えば、炎症性感染（例えば肺膿瘍、結核）、非感染性炎症性疾患（例えばリウマチ性関節炎、全身性エリテマトーデス、クローン病、肝炎、炎症性腸疾患）、ならびに種々の癌、腫瘍、および悪性腫瘍（例えば癌腫、肉腫、リンパ腫）を含む、感染症、炎症、および腫瘍に付随する他の疾患および障害が挙げられる。慢性疾患による貧血は、低鉄血症および細網内皮細胞の鉄隔離に関連する。
【００９５】
炎症性サイトカインは、ヘプシジン発現の強力な誘導因子であり、ヘプシジン過剰は、これらの被験体における貧血の発病において重要な役割を果たし得る（Ｗｅｉｓｓら，Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．，３５２：１０１１−１０２３（２００５）；Ｐｉｇｅｏｎ．ら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７６：７８１１−７８１９（２００１）；Ｎｉｃｏｌａｓら，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．１１０：１０３７−１０４４（２００２）；Ｎｅｍｅｔｈら，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．１１３：１２７１−１２７６（２００４）；Ｎｅｍｅｔｈら，Ｂｌｏｏｄ，１０１：２４６１−２４６３（２００３）；Ｌｅｅら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．，１０２：１９０６−１９１０（２００５））。ＩＬ−６等の炎症性メディエータは、ＳＴＡＴ３によるヘプシジン発現を調節し得る（Ｗｒｉｇｈｔｉｎｇら，Ｂｌｏｏｄ，１０８：３２０４−３２０９（２００６）；Ｖｅｒｇａ Ｆａｌｚａｃａｐｐａら，Ｂｌｏｏｄ，１０９：３５３−３５８（２００７）；Ｐｉｅｔｒａｎｇｅｌｏら，Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ，１３２：２９４−３００（２００７））。本願明細書において提示されるデータは、本発明の抗ＦＰＮ１ Ｍａｂが血清鉄濃度を上昇させるという、インビボでの証拠を提供する。
【００９６】
本発明の抗ＦＰＮ１ Ｍａｂ、またはその抗原結合性フラグメントの投与を含む貧血を治療する方法もまた本発明によって提供される。一部の実施形態において、貧血を治療する方法は、抗ＦＰＮ１ Ｍａｂまたはその抗原結合性フラグメントを含む薬学的組成物を、本願明細書において記載される病状、例えば、貧血疾患の危険性がある、またはその病状を発症している被験体に、標準的な投与技術を用いて投与する工程を含む。
【００９７】
本願明細書において用いられる用語「有効量」は、所望の治療結果を達成するのに必要な量（投与量、期間、および投与手段）のことをいう。抗体の有効量は、例えば、個体の疾患段階、年齢、性別、および体重、ならびに、個体において所望の反応を生じさせるための抗体または抗体の一部の能力などの要因に従って変化し得る。有効量はまた、抗体の毒性または有害作用に対して治療に有益な効果が勝るものである。
【００９８】
有効量は、被験体に治療的有効性を与えるのに必要な活性剤の少なくとも最小量であるが、毒性量未満である。別の言い方をすれば、本発明の抗体の有効量または治療的に有効な量は、哺乳動物、好ましくはヒトにおいて、（ｉ）血清鉄濃度、網状赤血球数、赤血球数、ヘモグロビンおよび／またはヘマトクリットを上昇させ、または（ｉｉ）成熟ヘプシジンの存在が、望ましくない病理学的作用を生じるか、またはその一因となる障害を治療するか、または（ｉｉｉ）成熟ヘプシジンの生物活性を減少させ、その結果、哺乳動物、好ましくはヒトにおいて、限定されないが、感染、炎症、および／または癌に起因する貧血を含む、限定されないが、慢性疾患による貧血を含む、限定されないが、貧血を含む、治療に有益な効果を生じる、量である。本発明の抗体の有効量は、単回投与または複数回投与で投与され得る。さらに、本発明の抗体の有効量は、一度のみ投与される場合、有効量未満である量の複数回投与で投与され得る。
【００９９】
医学分野において周知であるように、いずれか一人の被験体に対する投与量は、患者の体格、体表面積、年齢、投与される特定の化合物、性別、投与の時間および経路、一般的な健康状態、および同時に投与される他の薬剤を含む多くの要因に依存する。投与量は、さらに、疾患の種類および重症度に依存して変化し得る。典型的な用量は、例えば、約１ｍｇ〜約１００ｍｇ、好ましくは、約２ｍｇ〜約１００ｍｇ、より好ましくは、約５ｍｇ〜約１００ｍｇ、さらにより好ましくは、約５ｍｇ〜約５０ｍｇ、さらにより好ましくは、約５ｍｇ〜約２５ｍｇ、さらにより好ましくは、約５ｍｇ〜約２０ｍｇ、さらにより好ましくは、約５ｍｇ〜約１５ｍｇの範囲であってよいが、特に、前述の要因を考慮して、この例示的な範囲未満またはそれより多い用量が想定される。一日の非経口投与計画は、約１０μｇ／ｋｇ〜約１００ｍｇ／ｋｇ、好ましくは約１００μｇ／ｋｇ〜約１００ｍｇ／ｋｇ、さらに好ましくは約１ｍｇ／ｋｇ〜約１００ｍｇ／ｋｇ、さらにより好ましくは、約１ｍｇ／ｋｇ〜約３０ｍｇ／ｋｇ、さらにより好ましくは約３ｍｇ／ｋｇ〜約３０ｍｇ／ｋｇ、あるいは最も好ましくは約３ｍｇ／ｋｇ〜約３０ｍｇ／ｋｇであってもよい。進行は定期的な評価によって監視されてもよく、それに従って用量が調整されてよい。
【０１００】
抗ＦＰＮ１抗体のこれらの示唆された量は、治療上の裁量に多大に依存する。適切な投与およびスケジューリングを選択することにおける主な要因は、得られた結果である。これに関連して想定される要因は、治療される特定の障害、個々の患者の病態、障害の原因、抗体の送達部位、抗体の特定の種類、投与方法、投与のスケジューリング、および医師に既知の他の要因を含む。
【０１０１】
本発明の抗体は、様々な経路によって投与される、ヒトの医療における医薬として使用されてもよい。最も好ましくは、このような組成物は、非経口投与用である。このような薬学的組成物は、当該技術分野において周知である方法によって調製可能である。例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙ，第１９版，（１９９５），Ｇｅｎｎａｒｏ，Ａ．ら，Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．を参照のこと。従って、本発明はまた、１つ以上の薬学的に受容可能な担体、希釈剤、または賦形剤と組み合わせた、本発明の１つ以上の抗体を含む薬学的組成物を提供する。特定の実施形態において、薬学的組成物はさらに、１つ以上の他の治療薬を含む。
【０１０２】
本願明細書において用いられる用語、非経口とは、静脈、筋肉内、皮下、直腸、膣、または腹腔内投与を含む。静脈内注入、あるいは静脈内、腹腔内、または皮下注射による非経口の送達が好ましい。皮下注射が最も好ましい。そのような注射のために適切なビヒクルは当該技術分野において周知である。
【０１０３】
薬学的組成物は、典型的に、滅菌されている必要があり、提供される容器、例えば、密封バイアル、シリンジ、または他の送達装置、例えばペン等を含む容器内での製造および保存の条件下で安定している必要がある。それゆえ、薬学的組成物は、製剤作製後、濾過滅菌され得るか、またはそうでなければ微生物学的に許容可能に作製され得る。
【０１０４】
本発明の抗体は、ヒトの被験体に投与するのに適切な薬学的組成物に組み込むことができる。本発明の抗体は、単独で、あるいは、薬学的に受容可能な担体および／または希釈剤と組み合わせて単回投与または複数回投与でヒト被験体に投与されてもよい。このような薬学的組成物は、選択される投与方法に適するように設計され、薬学的に受容可能な希釈剤、担体、および／または賦形剤、例えば、分散剤、緩衝剤、界面活性剤、防腐剤、可溶化剤、限定されないが塩化ナトリウムを含む等張剤、安定剤などが適切な場合、使用される。前記組成物は、例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ，Ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙ，第１９版，Ｇｅｎｎａｒｏ，Ｅｄ．，Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．，Ｅａｓｔｏｎ，ＰＡ（１９９５）に開示されている従来技術に従って設計可能であり、この文献は、医師には一般的に公知であるような製剤技術の概要を提供している。薬学的組成物に適切な担体は、本発明の抗体と組み合わされる場合、分子の活性を保持し、被験体の免疫系に反応しない任意の物質を含む。
【０１０５】
本願明細書において置き換え可能に用いられる用語「被験体」および「患者」は、哺乳動物、好ましくはヒトのことをいう。特定の実施形態において、患者は、低い成熟ヘプシジン濃度、成熟ヘプシジンの生物活性の減少、および／または血清鉄濃度、網状赤血球数、赤血球数、ヘモグロビン、および／またはヘマトクリットの増加が有益である障害を有する。
【０１０６】
ＦＰＮ１抗体化合物を単独で投与することは、例えば、望ましくない副作用のために、任意の用量または高い用量のみのいずれかにおいて、１つ以上のＥＳＡを許容できない患者に有益であり得る。単独で投与されるか、またはＥＳＡと組み合わされた本発明のＦＰＮ１ Ｍａｂ、またはその抗原結合フラグメントはまた、従来の用量または高用量のいずれかにおいて、ＥＳＡのみを用いて患者のヘマトクリットの目標値に到達することができないＥＳＡ抵抗性を有する患者に有用であり得る。
【０１０７】
本発明のＦＰＮ１ Ｍａｂ、またはその抗原結合フラグメントはまた、ＥＳＡの使用を含む、併用薬物療法が患者のヘマトクリットの目標値に到達させるのに不十分である場合に投与されてもよい。
【０１０８】
別の実施形態において、本発明は、ヒトにおける血清鉄濃度、網状赤血球数、赤血球数、ヘモグロビンおよび／またはヘマトクリットを増加させるための医薬を製造するための、本発明のモノクローナル抗体およびその抗原結合フラグメントの使用を提供する。
【０１０９】
別の実施形態において、本発明は、ヒトにおける血清鉄濃度、網状赤血球数、赤血球数、ヘモグロビンおよび／またはヘマトクリットを増加させるための併用療法において使用するための医薬の製造における、モノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメントの使用を提供し、前記医薬は、エポエチンアルファ、エポエチンベータ、ダーベポエチンアルファ、ヘマタイド（ｈｅｍａｔｉｄｅ）、メトキシポリエチレングリコール−エポエチンベータ、あるいはヒトにおける血清鉄濃度、網状赤血球数、赤血球数、ヘモグロビンおよび／またはヘマトクリットを増加させるために従来利用されている他の治療的薬剤、もしくは治療的処置からなる群より選択される１つ以上のＥＳＡと組み合わせて投与される
【０１１０】
以下の非限定的な例は、本願明細書において開示される抗ＦＰＮ１抗体の様々な特性を示す。
【実施例】
【０１１１】
実施例１：ヒトヘプシジン−２５の生成
ヒトヘプシジン−２５は、商業的供給源（例えば、Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ（Ｌｏｕｉｓｖｉｌｌｅ、Ｋｅｎｔｕｃｋｙ））から入手され得るか、または当該技術分野で公知の様々な合成または組換え技術によって生成され得る。あるいは、ヒトヘプシジン−２５配列の２５のアミノ酸を含みかつ配列番号９１に示されるアミノ酸配列を有する融合タンパク質は、大腸菌の中で発現される。封入体を、３リットルのヒトヘプシジン融合タンパク質を発現する大腸菌から、３７℃での１ｍＭ ＩＰＴＧを用いた３〜６時間の誘導後に単離する。この封入体を、緩衝剤Ａ（５０ｍＭ Ｔｒｉｓおよび８Ｍ 尿素（ｐＨ ８．０））の中で可溶化する。上清をＩＭＡＣカラム（２０ｍＬ 樹脂）に通す。吸光度がベースラインまで戻るまでこのカラムを緩衝剤Ａで洗浄し、結合したポリペプチドを、緩衝剤Ａ中の０．５Ｍ イミダゾールによってこのカラムからバッチ溶出する。このヒトヘプシジン−２５融合タンパク質をプールし、５０ｍＭ ＤＴＴを用いて還元する。次いでこの融合タンパク質を、プールした物質を５０μｇ／ｍＬ未満の最終タンパク質濃度まで２Ｍ 尿素、３ｍＭ システイン、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ（ｐＨ ８．０）の中へ希釈することによりリフォールディングする（ｒｅｆｏｌｄｅｄ）。この物質を室温で撹拌し、４８時間空気酸化する。酸化したポリペプチドを、５ｍＬ／分の流量でＩＭＡＣカラム（２０ｍＬ）に通し、このヒトヘプシジン−２５融合タンパク質を、緩衝剤Ａ中の０．５Ｍ イミダゾールによってこのカラムからバッチ溶出する。このヒトヘプシジン−２５融合タンパク質を含有するプールした画分を濃縮し、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ、４Ｍ 尿素、ｐＨ ８．０で平衡にしたＳｕｐｅｒｄｅｘ ７５（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、ＸＫ２６／６０）サイズ分け（ｓｉｚｉｎｇ）カラムに３ｍＬ／分の流量で通した。このモノマーの融合タンパク質をプールし、次いで５０ｍＭ Ｔｒｉｓ、２Ｍ 尿素、５ｍＭ ＣａＣｌ２、ｐＨ ８．０に希釈し、次いでエンテロキナーゼを用いて切断し、配列番号１のヒトヘプシジン−２５を生成した。切断されないヒトヘプシジン−２５融合タンパク質をパッシブ（ｐａｓｓｉｖｅ）ＩＭＡＣクロマトグラフィ（上に概略を示したとおり）によって除去した。このＩＭＡＣカラムから通り抜けた流れは、次いで４．０ｍＬ／分間の流量でＣ−１８逆相カラムに通す。吸光度がベースラインまで戻るまでこのカラムを水中の０．１％ ＴＦＡで洗浄し、０．５％／分の速度の０．１％ ＴＦＡを用いた２０％から４０％へのアセトニトリルの線形勾配を用いて、結合したポリペプチドをカラムから溶出した。このヒトヘプシジン−２５ポリペプチドを含有する画分をプールし、Ｎ末端アミノ酸配列決定およびマトリックス支援レーザー脱離／イオン化質量分析（ＭＡＬＤＩ−ＭＳ）によって分析した。ラット、マウス、およびカニクイザルヘプシジン−２５および種々のＮ末端で短縮された形態のヒトヘプシジン−２５をコードするポリペプチド（ヘプシジン−２２およびヘプシジン−２０を含む）を、市販品として入手した（例えば、Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ）。
【０１１２】
実施例２：３４Ａ９ Ｆａｂの生成
抗ＦＰＮ１抗体は、マウスを配列番号１１に示されるアミノ酸配列を有する免疫原性のペプチドで免役することにより得てもよい。より特定すれば、ペプチドリンカーによって配列番号１２に示されるアミノ酸配列（ヒトＦＰＮ１の細胞外のループの少なくとも一部分で考えられる）に連結したＯＶＡエピトープを含む免疫原性のペプチドを使用して、マウスを免役してもよい。免疫化後、マウス脾臓を回収し、脾臓細胞を、配列番号１２に示されるアミノ酸配列を有するビオチン化されたペプチドおよびストレプトアビジンビーズを使用するＭａｇｎｅｔｉｃ Ａｃｔｉｖａｔｅｄ Ｃｅｌｌ Ｓｏｒｔｉｎｇによって細胞分離する（ｓｏｒｔｅｄ）。ＲＮＡを抗原結合細胞から単離し、ｏｌｉｇｏ ｄＴを使用してｃＤＮＡへと転化する。抗体の重鎖および軽鎖可変領域を、抗体フレームワークプライマーを使用するＰＣＲによって得て、ファージベクターにクローン化してＦａｂ抗体ライブラリーを作製する。このファージ抗体ライブラリーを、配列番号１２に示されるアミノ酸配列を有するビオチン化されたペプチド、例えば、１００ｎＭでスクリーニングする。次いで陽性に結合するクローンを、ＤＮＡ配列決定、Ｆａｂ発現ならびにヒトフェロポーチンを発現する免疫性（ｉｍｍｕｎｉｚｉｎｇ）ペプチドおよび／または細胞への結合によって特徴づける。Ｆａｂ ３４Ａ９を、基本的に上記のとおりの手順に従って同定した。
【０１１３】
実施例３：抗ＦＰＮ１ Ｍａｂのエピトープマッピング
ＦＰＮ１関連免疫原の部分配列を含有するペプチドをドットブロット（ｄｏｔ ｂｌｏｔ）ハイブリダイゼーション実験で使用して、マウスＭａｂ ３４Ａ９のエピトープを決定し得る。以下のペプチドが合成されて水に溶解され得る（下線を引いたアミノ酸は実際のＦＰＮ１アミノ酸配列を表す）：
【０１１４】
FpnE3a （配列番号 96）： GGSPFEDIRSRFIQGESITPTKGC
060719Z （配列番号 97）： GGSPFEDIRSRFIQGC
060719Y （配列番号 98）： GGIQGESITPTKIPEITTEGC
0708L4A （配列番号 99）： GGMPGSPLDLSVSPFEDGC
0708L4B （配列番号 100）： GGSPLDLSVSPFEDIRSGC
0708L4C （配列番号 101）： GGEDIRSRFIQGESITGC
0708L4D （配列番号 102）： GGRSRFIQGESITPTKGC
【０１１５】
各ペプチドについて、３μｌの１〜５μｇ／ｍＬのペプチドを一片のニトロセルロース膜の上へとスポッティングし（ｓｐｏｔｔｅｄ）、風乾する。ブロッキング緩衝剤（例えば、１％ ＢＳＡを含有するＰＢＳ）を用いてこの膜をブロッキングし、次いでブロッキング緩衝剤中の３〜５μｇ／ｍＬ ＦＰＮ１抗体とともに室温で１時間インキュベーションする。この膜を１×ＰＢＳＴ（１０ｍＭ リン酸ナトリウム、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、０．１％ Ｔｗｅｅｎ−２０、ｐＨ ７．４）で３回（各５分）洗浄し、その後これを、製造業者のプロトコル（ＬｉＣｏｒ，Ｉｎｃ；Ｌｉｎｃｏｌｎ、ＮＥ）に従ってＩＲ７００標識−ヤギ−抗マウス抗体とともにインキュベーションする。この膜を１×ＰＢＳＴで３回（各５分）洗浄し、Ｏｄｙｓｓｅｙ撮像システムおよびＯｄｙｓｓｅｙソフトウェア（ＬｉＣｏｒ，Ｉｎｃ）で撮像する。
【０１１６】
図１は、Ｍａｂ ３４Ａ９がペプチドＦｐｎＥ３ａ、０６０７１９Ｚ、０７０８Ｌ４Ｃ、および０７０８Ｌ４Ｄ（これらはすべて配列番号１のアミノ酸４０９〜４１５を含有する）に結合するということを示す。Ｍａｂ ３４Ａ９は、ペプチド０７０８Ｌ４Ｄへの結合によって示されるとおり、ＥＤＩのアミノ酸配列を必要とはしない。Ｍａｂ ３４Ａ９はペプチド０６０７１９Ｚに対して０７０８Ｌ４Ｃよりも弱く結合する。後者のペプチドはＦＰＮ１（配列番号１）のアミノ酸４１６〜４１９を含有する。
【０１１７】
実施例４：ＳＰＲによって測定される場合の抗ＦＰＮ１ ＦａｂおよびＭａｂの親和性
ＦＰＮ１に結合するＦａｂおよびＭａｂの親和性は、Ｂｉａｃｏｒｅ Ｔ１００で、およびＢｉａｃｏｒｅ Ｔ１００評価ソフトウェア（ＢＩＡｃｏｒｅ（登録商標） ＡＢ、Ｕｐｓａｌａ、Ｓｗｅｄｅｎ）での１：１結合モデルを使用して決定され得る。手短に言うと、ウイルス性トランス活性化因子を含まない市販のテトラサイクリンで制御された発現系であるＴ−ＲＥｘシステム（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）を、Ｔ−Ｒｅｘ ＨＥＫ ２９３細胞における安定な細胞株生成のために使用する。すべての増殖条件はＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎによって提供されるＴ−ＲＥｘマニュアルに記載されている。ＦＰＮ１は、ＧＦＰとＣ末端で融合している。ＦＰＮ１−ＧＦＰの発現を、１〜１０ｎｇ／ｍＬのドキシサイクリンによって１〜２４時間誘導する。誘導した細胞をフラスコからこそげ取ることにより回収し、次いで１×ＰＢＳで洗浄する。細胞ペレットは、使用するまで−８０℃で保存し得る。約５×１０６の誘導した細胞を、０．２％ Ｔｗｅｅｎ−２０およびプロテアーゼ阻害剤、例えば、Ｃｏｍｐｌｅｔｅ（商標）プロテアーゼ阻害剤カクテル錠剤（Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ Ｃｏｒｐ．、Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ、ＩＮ）を含む１０ｍＭ リン酸緩衝剤に再懸濁する。３サイクルの凍結／解凍／超音波処理を使用して細胞を溶解する。この可溶化物をＢｉａｃｏｒｅランニング緩衝剤で２倍に希釈し、遠心して細胞片（ｄｅｂｒｉｓ）を除去する。
【０１１８】
Ｂｉａｃｏｒｅ Ｔ１００上で、ウサギ抗ＧＦＰ抗体またはヤギ抗ＧＦＰ抗体を、５０００〜１５０００ ＲｕｓでＣＭ５チップのフローセル１〜４上に固定化する。ＦＰＮ１−ＧＦＰを、誘導した細胞の可溶化物からフローセル２、３、または４上に捕捉する。フローセル１は、基準として使用する。次いですべてのフローセルを異なる濃度の抗体とともに注入し、結合および動力学を評価する。親和性効果を最小にするために、Ｆａｂなどの一価の抗原結合フラグメントを使用する表面プラズモン共鳴に基づく測定が、このアッセイフォーマットで多価の抗体を使用する測定よりも一般に好ましい。表４ａおよび４ｂは、それぞれウサギ抗ＧＦＰ抗体（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ（カタログ番号Ａ１１１２２））およびヤギ抗ＧＦＰ抗体（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ、Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ、ＭＮ（カタログ番号ＡＦ４２４０））を使用した抗ヒトＦＰＮ１に結合するＦａｂについての結合特性を示す。
【０１１９】
表４（ａ）：ＦＰＮ１抗体からヒトＦＰＮ１へのＦａｂの結合動力学（３７℃でＢｉａｃｏｒｅ Ｔ１００によって測定）
【０１２０】
【表７】
【０１２１】
表４（ａ）に示すように、マウスＦａｂ ３４Ａ９のヒトＦＰＮ１についてのＫＤは、このアッセイフォーマットにおいて３７℃でＳＰＲによって測定すると、およそ４１ｎＭである。マウスＦａｂ ３４Ａ９の親和性成熟体であるマウス Ｆａｂ １Ｇ９のヒトＦＰＮ１についてのＫＤは、３７℃でＳＰＲによって測定すると、約７．７ｎＭであり、およそ５倍の結合親和性の改善がある。ヒト重鎖フレームワークＶＨ１−６９および軽鎖フレームワークＯ２を有するマウスＦａｂ １Ｇ９のヒト化形態であるＦａｂ ３Ｄ８は、このアッセイフォーマットにおいて３７℃でＳＰＲによって測定すると、約１０ｎＭのヒトＦＰＮ１についてのＫＤを示した。
【０１２２】
表４（ｂ）：ＦＰＮ１抗体からヒトＦＰＮ１へのＦａｂの結合動力学（３７℃でＢｉａｃｏｒｅ Ｔ１００によって測定）
【０１２３】
【表８】
【０１２４】
表４（ｂ）に示すように、マウスＦａｂ ３４Ａ９の親和性成熟体であるマウスＦａｂ １Ｇ９のヒトＦＰＮ１についてのＫＤは、このアッセイフォーマットにおいて３７℃でＳＰＲによって測定すると、約２．９ｎＭである。ヒト重鎖フレームワークＶＨ１−６９および軽鎖フレームワークＯ２を有するマウスＦａｂ １Ｇ９のヒト化形態であるＦａｂ ３Ｄ８は、このアッセイフォーマットにおいて３７℃でＳＰＲによって測定すると、約６．３ｎＭのヒトＦＰＮ１についてのＫＤを示した。親和性が成熟したＦａｂ ４Ａ１０−３、Ｃｏｍｂｉ１１、およびＬ２．２−４は、このアッセイフォーマットにおいて３７℃でＳＰＲによって測定すると、約２．４ｎＭ〜約１．８ｎＭの間のヒトＦＰＮ１についてのＫＤを示した。
【０１２５】
表５は、ウサギ抗ＧＦＰ抗体（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ（カタログ番号Ａ１１１２２））を使用する、抗ヒトＦＰＮ１に結合するＭａｂについての結合特性を示す。
【０１２６】
表５：ヒトＦＰＮ１に対するＭａｂの結合動力学
（２５℃または３７℃でＢｉａｃｏｒｅ Ｔ１００によって測定）
【０１２７】
【表９】
【０１２８】
マウス３４Ａ９ ＭａｂのヒトＦＰＮ１についてのＫＤは、２５℃でＳＰＲによって測定すると、およそ１．１ｎＭである。マウス３４Ａ９ Ｍａｂの親和性成熟体であるマウス１Ｇ９ ＭａｂのヒトＦＰＮ１についてのＫＤは、２５℃でＳＰＲによって測定すると、約０．７３ｎＭである。ヒト重鎖および軽鎖フレームワーク（それぞれＶＨ１−６９およびＯ２）を有するマウス１Ｇ９ Ｍａｂのヒト化形態、３Ｄ８ Ｍａｂは、３７℃でＳＰＲによって測定すると、約３．４ｎＭのヒトＦＰＮ１についてのＫＤを示した。
【０１２９】
この実施例で記載したようにして測定されるヒトＦＰＮ１についてのＫＤは、高親和性でヒトＦＰＮ１に結合し、そして、より具体的には、ヒトＦＰＮ１が細胞によって発現され細胞膜に局在化されるときでさえ存在するＦＰＮ１のエピトープに結合するヒトＦＰＮ１に対する抗体の生成を例証する。
【０１３０】
実施例５：細胞のフェリチンレベルに対するＦＰＮ１ Ｍａｂの効果のインビトロアッセイ
ＦＰＮ１を内因的に発現するＣａｃｏ−２細胞（ヒト腸細胞細胞株）はフェリチンの変化についてモニターされ得る。Ｃａｃｏ−２細胞中のフェリチン濃度は、外因性の鉄源を添加することにより増加する可能性があり、この濃度は鉄排出を防止するヘプシジンを添加するとさらに増大され得る。従って、Ｃａｃｏ−２細胞における成熟ヘプシジンによって調節される鉄制御に対する抗ヒトＦＰＮ１抗体の効果は、以下のようにして測定され得る。
【０１３１】
トリプシン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）を使用してＣａｃｏ−２細胞を細胞培養液容器から取り出す。この細胞を集め、増殖培地（例えば、ＤＭＥＭ＋１０％ ＦＢＳ＋１％ 非必須アミノ酸＋１％ 抗生物質／抗真菌薬）の中で洗浄し、緩やかな遠心分離によって集める。細胞を培地の中に再懸濁し、数える。細胞濃度を増殖培地中の１×１０６細胞／ｍＬに調整し、２．５μＭ Ｆｅ：ＮＴＡ（１：４モル比で調製する）をこの細胞に加える。１００μｌの細胞を９６平穴プレートのウェルに加え，次いで３７℃、５％ ＣＯ２で２４時間インキュベーションする。マウスＩｇＧ１（陰性対照）、およびヒトＦＰＮ１に対する異なる親和性を有する２つの抗体を、６×の最終濃度にて増殖培地中で調製する。抗体希釈物（２５μＬ）または培地を三重にウェルに加える。このプレートを室温で１５分間インキュベーションし、このとき６００ｎＭ ヘプシジン（１００ｎＭ 最終濃度）を含むかまたは含まない２５μＬの５μＭ Ｆｅ：ＮＴＡを適切なウェルに加える。この細胞を３７℃、５％ ＣＯ２で２４時間インキュベーションし、次いで２００μｌのＤｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ ＰＢＳで３回洗浄し、プロテアーゼ阻害剤、例えば、Ｃｏｍｐｌｅｔｅ（商標）プロテアーゼ阻害剤カクテル錠剤（Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ Ｃｏｒｐ．、Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ、ＩＮ）を添加した５０μＬの放射性免疫沈降法アッセイ緩衝剤（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ、ｐＨ ７．５、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、０．１％ ＳＤＳ、１％ Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ１００（登録商標）、および０．５％ デオキシコール酸ナトリウム）に溶解し、混合し、ＥＬＩＳＡを使用してフェリチンについてアッセイするまで−７０℃で凍結する。
【０１３２】
手短に言うと、マイクロタイタープレートを１１０μＬ／ウェルの１μｇ／ｍＬ 抗ヒトフェリチン（Ｌｅｉｎｃｏ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）でコーティングし、４℃で一晩インキュベーションする。このプレートを洗浄緩衝剤（０．０２Ｍ Ｔｒｉｓ、０．１５Ｍ ＮａＣｌ、０．１％ Ｔｗｅｅｎ ２０、ｐＨ ７．４）で２回洗浄し、ＰＢＳ中の１５０μｌの１％ カゼイン（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、ＩＬ）でブロックする。このプレートを、室温で１時間インキュベーションする。１００マイクロリットル（μＬ）の可溶化物および標品（ヒト肝臓フェリチン、Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ／ＥＭＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｌａ Ｊｏｌｌａ、ＣＡ）を適切なウェルに加え、室温で１時間インキュベーションする。このプレートを３回洗浄し、結合したフェリチンを、１：２０００希釈の１ウェルあたり１００μＬの抗フェリチン−ＨＲＰ接合体（Ｌｅｉｎｃｏ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）および室温で１時間のインキュベーションを使用して検出した。このプレートを４回洗浄し、および１００μＬのＯＰＤ基質（５μｌの３０％ Ｈ２Ｏ２を含む５ｍｇ 基質錠剤、１２．５ｍＬの０．１Ｍ Ｎａ２ＨＰＯ４、０．０５Ｍ クエン酸、ｐＨ ５．０に溶解する）をすべてのウェルに分配する。この反応を、１０分後に１００μＬ １Ｎ ＨＣｌを用いて停止する。４９０ｎｍでの吸光度（Ａ４９０）を適切なＥＬＩＳＡプレートリーダーを使用して読み取る。また、各サンプル中のタンパク質濃度は、ＢＣＡタンパク質アッセイキット（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用して測定する。起こり得るウェルごとの細胞数の差を説明するために、フェリチン濃度データをタンパク質濃度に対して正規化し、加えた抗体の効果を、阻害（％）として表す。
【０１３３】
この実施例に記載したようにして行う実験から、この細胞中のフェリチン濃度に対するヒトヘプシジン−２５の効果はＭａｂ ３４Ａ９および１Ｇ９によって阻害されるということが示される（表６）。さらには、これらの結果は、抗ＦＰＮ１ Ｍａｂの親和性はその機能性に対して直接に関係するということを示す。より具体的には、より低い親和性のＭａｂ ３４Ａ９は、最高濃度（２００μｇ／ｍＬ）であってさえも成熟したヘプシジンによって誘導される効果をわずかに阻害しただけであったのに対し（２５％阻害±０．５％）、より高い親和性のＭａｂ １Ｇ９は用量依存的に顕著な阻害を呈した。
【０１３４】
【表１０】
【０１３５】
このデータは、Ｍａｂ １Ｇ９および３４Ａ９はヒトヘプシジン−２５の、フェロポーチンの内在化および分解を誘導し、従ってこの細胞から排出される鉄を減少させるという能力をブロックするということを例証する。
【０１３６】
実施例６：ＦＰＮ１に結合するヒトヘプシジン−２５の阻害についてのアッセイ
安定にトランスフェクトされたＦＰＮ−ＧＦＰ／２９３細胞を、８０μｌのアッセイ培地（ＤＭＥＭ １１９６５、１０％ 透析したＦＢＳ、２０μＭ ＦＡＣ、ペニシリン−ストレプトマイシン）中に１ウェルあたり６０，０００細胞でポリ−Ｄ−リジンコーティングしたプレートの中にプレーティングし、３７℃、１０％ ＣＯ２で４時間インキュベーションする。ＦＰＮ１発現を誘導するために、ドキシサイクリンを１１．２ｎＭの最終濃度まで加える。ドキシサイクリンで誘導した細胞および誘導していない対照細胞を３７℃で一晩インキュベーションする。次に、この増殖培地を捨て、３０μｌのアッセイ培地中の試験抗体もしくはアイソタイプの対照抗体、または３０μｌのアッセイ培地のみの対照で置き換え、３７℃で１時間インキュベーションする。次に、２０μｌのビオチン化された成熟したヒトヘプシジンを３０ｎＭの最終濃度までウェルに加える。このサンプルを３７℃で１時間保管しておき、その後で２００μＬ ２％ ＦＢＳ、Ｄ−ＰＢＳ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）で４回洗浄する。次に、６５μｌの溶解緩衝剤（０．５％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００、１０ｍＭ ＥＤＴＡ）を加え、このプレートを１０分間振盪する。次に、各ウェルの溶液５０μＬをストレプトアビジンでコーティングしたプレート（ＰＢＳ中の６０μｌの２μｇ／ｍＬ ストレプトアビジン、４℃で一晩インキュベーションし、２回洗浄し（０．１％ Ｔｗｅｅｎ ２０、ＴＢＳ）、カゼイン／ＰＢＳでブロックする）の個々のウェルに移し、次いで室温で１時間インキュベーションする。次に、このプレートのウェルを３回洗浄し（０．１％ Ｔｗｅｅｎ ２０、ＴＢＳ）、５０μＬの０．５μｇ／ｍＬの抗ヒトヘプシジン−２５ Ｍａｂ ３．２３を加え、このサンプルを室温で１時間インキュベーションする。この抗ヒトヘプシジン−２５ Ｍａｂ ３．２３はＰＣＴ国際特許出願公開公報ＷＯ２００９／０５８７９７に記載されている。次に、このプレートを３回洗浄し、５０μＬの抗ヒトＩｇＧ−西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）を１：２０００希釈で加える。室温で１時間インキュベーションした後、５０μｌのＯＰＤ基質を加える。４分後に、この反応を１００μＬ １Ｎ ＨＣｌで停止する。４９０ｎｍでの吸光度（Ａ４９０）を適切なＥＬＩＳＡプレートリーダーを使用して読み取る。
【０１３７】
【表１１】
【０１３８】
基本的に実施例６に記載したようにして行った実験で生成したデータは、Ｍａｂ １Ｇ９および３４Ａ９がヒトヘプシジン−２５の、ヒトＦＰＮ１に結合する能力を阻害するということを実証する。
【０１３９】
実施例７：ヘプシジン−２５によって誘導される内在化および分解の抗ＦＰＮ１抗体阻害についての細胞ベースのアッセイ
インビトロでの細胞ベースのアッセイを使用して、ヒトＦＰＮ１に対して向けられるＭａｂ、またはその抗原−結合断片フラグメントの成熟したヘプシジン中和活性を測定し得る。このようなアッセイは、成熟したヘプシジンの受容体、ＦＰＮ１の成熟したヘプシジンによって誘導される内在化および分解に基づき得る。例えば、ＦＰＮ１の誘導可能な発現を許容するＨＥＫ ２９３安定細胞株が調製される。追跡目的のために、ＦＰＮ１は、Ｃ末端でＧＦＰと融合する。このＦＰＮ１−ＧＦＰ分子の誘導可能な発現を、Ｔ−ＲＥｘ ｓｙｓｔｅｍ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）を使用して制御する。このＦＰＮ１−ＧＦＰコード配列を、誘導可能なプロモーターおよびゼオシン耐性マーカーを含むｐＣＤＮＡ４／ＴＯベクターにクローン化する。得られたコンストラクトを、ドキシサイクリンにより誘導可能な発現のために必要とされる調節タンパク質を発現するＴ−ＲＥｘ−２９３細胞にトランスフェクトする。ゼオシン耐性クローンをＦＰＮ−ＧＦＰの誘導可能な発現について試験する。細胞増殖条件は、基本的にＴ−ＲＥｘ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）についての製造業者の使用説明書に記載されているとおりである。手短に言うと、細胞をＤＭＥＭ、１０％ 透析したＦＢＳ、２０μＭ ＦＡＣ、さらに５μｇ／ｍＬ ペニシリン−ストレプトマイシンの中で増殖させる。１００μｇ／ｍＬ ゼオシンおよび５μｇ／ｍＬブラストサイジンを用いて選択を維持する。細胞をポリ−Ｄ−リジンでコーティングされた９６穴の黒／透明プレート上にプレーティングする。Ａｃｕｍｅｎ Ｅｘｐｌｏｒｅｒ ＨＴＳ、高分解能蛍光プレートリーダーを、１ウェルあたりの全蛍光を読み取るために使用する。
【０１４０】
トリプシン処理後、ＦＰＮ１−ＧＦＰ／ＴＲＥｘ ２９３安定細胞株を使用して、９６穴アッセイプレートに９，０００細胞／ウェルで播種する。１ウェルあたりの播種量は８０μＬである。細胞を一晩付着させる。翌日の早朝に、９μｌの３０ｎｇ／ｍＬ ドキシサイクリンを各ウェルに加えてＦＰＮ１−ＧＦＰ発現を誘導する。３７℃での８時間の誘導後、培地を吸引し、これらのウェルを、１５０μＬ／ウェルのＰＢＳで慎重に洗浄する。
【０１４１】
洗浄後にアッセイプレートに素早く添加するために、所望の処置（例えば、ヒトヘプシジン−２５および／または試験抗体）を９６穴フォーマットの中で設定する。１ウェルあたりの最終のアッセイ体積は４５μＬである。上記処置を加えた直後に、Ａｃｕｍｅｎ Ｅｘｐｌｏｒｅｒ（チャネル１で５５０ボルトに設定する）を使用してアッセイプレートを読み取る。この読み取りは一般に０時間読み取りであり、１ウェルあたりの細胞数（１ウェルあたりの全蛍光単位（ＦＬＵ）と相関する）について正規化するために使用される。ＦＰＮ１の成熟したヒトヘプシジンによって誘導される内在化および分解について、最大効果は０．５μＭ 成熟したヒトヘプシジンで見られる。成熟したヒトヘプシジンのＩＣ５０はおよそ１０ｎＭである。抗ＦＰＮ１抗体中和アッセイについて、ヒトヘプシジン−２５濃度を１２０ｎＭに保ち、抗ＦＰＮ１ Ｍａｂを６００ｎＭ、２００ｎＭ、６７ｎＭ、２２ｎＭ、および７．４ｎＭで試験した。このプレートを２４時間インキュベーションし、その後、プレートを再度読み取り、データが、２４時間での１ウェルあたりの全ＦＬＵを０時間での１ウェルあたりの全ＦＬＵで割った比として生成される。すべてのデータ点を四重に行う。阻害パーセント（％）を、１２０ｎＭの成熟したヒトヘプシジン処置についての値を差し引き、次いでＦＰＮ１抗体処置の値をヒトヘプシジン−２５処置なしの値で割ることにより、測定する。
【０１４２】
基本的に上記のとおりにして行ったインビトロアッセイにおいて、ヒトヘプシジン−２５生物活性は、下記の表８に示すようにして測定した阻害パーセントでもって種々の抗ＦＰＮ１ Ｍａｂで中和された。
【０１４３】
表８：インビトロでの成熟したヒトヘプシジンによって誘導される内在化および分解の抗ＦＰＮ１ Ｍａｂ阻害パーセント（％）
【０１４４】
【表１２】
【０１４５】
基本的に実施例７に記載したようにして行った実験で生成したデータは、Ｍａｂ １Ｇ９、３４Ａ９、および３Ｄ８はヒトヘプシジン−２５の、インビトロでヒトＦＰＮ１の内在化および分解を引き起こす能力を大きく阻害するという結論を支持する。
【０１４６】
実施例８：カニクイザルへの単回静脈内用量後の対照マウスのＩｇＧ１に対するＭａｂ １Ｇ９の生物活性
血清ヘプシジンおよび血清鉄濃度に対する抗ヒトＦＰＮ１マウスのＭａｂ １Ｇ９の生理学的効果を、Ｍａｂを単回静脈内用量として雄性カニクイザル（Ｍａｃａｃａ ｆａｓｃｉｃｕｌａｒｉｓ；３〜４ｋｇ）に投与して、その効果をマウスのＩｇＧ１の対照投与と比較することにより検討した。投与後、血清鉄および血清ヘプシジンの分析のために血液サンプルを集めた。用量（３０ｍｇ／ｋｇ）を、伏在静脈を介して注射として投与した。用量投与の直後であるが、その動物から針が取り出される前に、この用量装置におよそ２ｍＬの生理食塩水を流した。
【０１４７】
【表１３】
【０１４８】
血清ヘプシジンについてのサンプリング：
用量前および用量後０．５、１、３、６、１０、２４、４８、７２、９６、および１６８時間後に血液を集めた。血液（およそ０．５ｍＬ）、大腿静脈を介して抗凝固薬を含有しないチューブの中へと集めた。血清を得るために、遠心分離の前に血液を周囲条件下で凝固させた。およそ−７０℃で保存する前に血清サンプルをドライアイス上に置いた。
【０１４９】
血清鉄についてのサンプリング：
用量前および用量後１、３、６、２４、４８、７２、９６、および１６８時間後に血液を集めた。医学界内で許容できると考えられる方法に従ってすべての血液サンプルを集め、取り扱い、処理し、保存し、そして分析した。血清鉄濃度は、医学界内で、全血清鉄（Ｆｅ）を測定する許容できる方法であると一般に考えられる当該技術分野で公知の任意の方法によって測定され得る。ヘプシジンの血清濃度は、基本的にＭｕｒｐｈｙら、Ｂｌｏｏｄ、１１０：１０４８−５４（２００７）に記載されているようにして、液体クロマトグラフィ−質量分析によって測定した。血清鉄を測定するためのアッセイは当該技術分野で周知である（例えば、Ｇｏｏｄｗｉｎ，Ｊ．Ｆ．ら，Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ １２：４７−５７（１９６６）、およびＪ．Ｃｌｉｎ．Ｐａｔｈ．，２４：３３４−３３５（１９７１）を参照のこと）。
【０１５０】
血清ヘプシジン濃度は、対照マウスのＩｇＧ１の投与によって影響を受けず、研究した時間的経過にわたって１．５〜３１ｎｇ／ｍＬの範囲であった。対照動物における平均ヘプシジン濃度は、１１．５±８．８ｎｇ／ｍＬ（平均±ＳＤ）であった。マウスのＭａｂ １Ｇ９の投与後、血清ヘプシジン濃度はそれぞれ７．６および１４．７ｎｇ／ｍＬというベースラインから４９．７および７９．１ｎｇ／ｍＬというピークへと上昇した。血清ヘプシジンのピークは、マウスのＭａｂ １Ｇ９の投与のおよそ１０時間後に生じた（図６）。血清ヘプシジンの上昇は、マウスのＭａｂ １Ｇ９と、その標的のＦＰＮ１（これは、ＦＰＮ１に結合するとＦＰＮ１とヘプシジンとの相互作用をブロックし、これによりＦＰＮ１クリアランスおよび／または内在化を緩慢化する）との相互作用に起因する可能性が高い。
【０１５１】
血清鉄は、対照マウスのＩｇＧで処置した動物においては上昇せず、研究した時間枠にわたっては６４〜９７μｇ／ｄＬの範囲であった。マウスのＭａｂ １Ｇ９の投与後、血清鉄濃度は、それぞれ１３６および１４４μｇ／ｄＬのベースラインから３０６および２９２μｇ／ｄＬのピークへと上昇した。血清鉄のピークは、マウスのＭａｂ １Ｇ９の投与のおよそ４８時間後に生じた（図７）。血清鉄濃度は、投与後９６時間までに徐々にベースラインまで戻り、これは血清鉄濃度の上昇が不可逆的であるということを示す。
【０１５２】
実施例９：ヘプシジン−２５によって誘導される内在化および分解の抗ＦＰＮ１抗体阻害についての細胞ベースのアッセイ
基本的に上記の実施例７に記載したようにして行った実験は、Ｍａｂ Ｃｏｍｂｉ−１１、４Ａ１０−３、およびＬ２．２−４は、Ｍａｂ ３４Ａ９、３Ｄ８、および１Ｇ９と比べて、インビトロでより効果的にヒトＦＰＮ１のヒトヘプシジン−２５によって誘導される内在化および分解を阻害する（表１０を参照のこと）ことを実証する。より具体的には、抗ＦＰＮ１ Ｍａｂを、９００ｎＭから始まり３倍の段階希釈を実施する９点濃度曲線で試験した。阻害パーセント（％）を、１２０ｎＭ ヒトヘプシジン処置についての値を差し引き、次いでＭａｂ処置の値をヘプシジン処置なしの値で割ることにより、測定した。相対的ＩＣ５０をシグマプロットで測定した。最高阻害パーセント（％）ならびに相対的および絶対的ＩＣ５０を表１０に示す。
【０１５３】
【表１４】
【０１５４】
実施例１０：カニクイザルにおけるヒト化抗フェロポーチンモノクローナル抗体４Ａ１０−３の薬力学的効果
抗フェロポーチンＭａｂの薬力学は、当業者に公知の方法に従って、静脈内用量を雌性カニクイザルに投与した後に研究され得る。例えば、５つの独立の研究で、Ｍａｂ ４Ａ１０−３を、カニクイザルに単回静脈内ボーラス（ｎ＝４／群）として０．３、１．０、３．０、１０および３０ｍｇ／ｋｇの用量で投与した。血液サンプル（複数の鉄パラメータについておよそ０．５ｍＬ）を、最初の用量の前および用量後１、６、１２、２４、４８、７２、９６、１６８および２６４時間に採取した。より高い用量レベルでは、さらなる血液サンプルを、用量後３６０、４５６、５５２、および６４８時間に採取した。投薬時には、これらの動物の体重は２〜３ｋｇの間であった。血液サンプルを、各動物から、大腿静脈を介して抗凝固薬を含まないチューブの中へと集めた。
【０１５５】
０．３、１．０、３．０、１０および３０ｍｇ／ｋｇ Ｍａｂ ４Ａ１０−３を雄性カニクイザルへと静脈内投与した後の血清鉄濃度−時間特性は、投薬後２４時間でピークとなる用量依存的な血清鉄の増加と関連した。ピーク鉄反応（およそ２倍の増加）および１０ｍｇ／ｋｇ〜３０ｍｇ／ｋｇ用量の間の反応の継続期間は類似していた。０．３、１．０、および３．０ｍｇ／ｋｇ用量が投与された動物では、投与後約４８時間で、血清鉄はベースライン値まで戻った。１０ｍｇ／ｋｇおよび３０ｍｇ／ｋｇ用量が投与された動物では、投与後約７２時間で、血清鉄はベースラインまで戻った。
【０１５６】
さらには、１回の研究では、１０ｍｇ／ｋｇの用量のＭａｂ ４Ａ１０−３の単回皮下注射の投与は、強度および継続期間の両方において、血清鉄において、等価な静脈内用量（ｎ＝４；平均±ＳＤ）の後に観察されたものと同一の反応（ｎ＝２；平均±ＳＤ）をもたらした。
【０１５７】
実施例１１：ラットおよびカニクイザルにおけるヒト化抗フェロポーチンモノクローナル抗体の薬物動態
抗フェロポーチンＭａｂの薬物動態は、当業者に周知の方法に従ってインビボで研究され得る。抗ＦＰＮ１ Ｍａｂ ４Ａ１０−３およびＣｏｍｂｉ １１の薬物動態を、例えば雄性カニクイザルおよびスプラーグドーリー（Ｓｐｒａｇｕｅ Ｄａｗｌｅｙ）ラットへの単回静脈内用量の後に検討した。投薬時には、使用したカニクイザルの体重は２．２〜５．５ｋｇの間であり、スプラーグドーリー（Ｓｐｒａｇｕｅ Ｄａｗｌｅｙ）ラットの体重は２４０〜２６５ｇの間であった。
【０１５８】
カニクイザルで行った薬物動態研究は３つの段階で実施し、１．０ｍｇ／ｋｇ、３．０ｍｇ／ｋｇ、および０．３ｍｇ／ｋｇの用量をおよそ２週間の間隔で投与した。各段階で、Ｍａｂ ４Ａ１０−３またはＭａｂ Ｃｏｍｂｉ１１のいずれかを単回静脈内ボーラスとして投与した（１群あたりｎ＝４）。最初の用量前および用量後１、６、１２、２４、４８、７２、９６、１６８、および２６４時間で血液サンプルを採取した。
【０１５９】
ラットでは、Ｍａｂ ４Ａ１０−３またはＭａｂ Ｃｏｍｂｉ １１を３ｍｇ／ｋｇの単回静脈内ボーラス用量として投与した（１群あたりｎ＝３）。連続的な血液サンプルを、用量前および用量後０．０８、１、４、８、２４、４８、７２、１２０および１６８時間で採取した。
【０１６０】
Ｍａｂ ４Ａ１０−３およびＣｏｍｂｉ １１の血清濃度を、ヒトＩｇＧサンドイッチＥＬＩＳＡフォーマットを使用して測定した。標準曲線範囲は５〜４００ｎｇ／ｍＬであり、作業用の定量下限（ＬＬＯＱ）は１０ｎｇ／ｍＬと定まった。ＷｉｎＮｏｎｌｉｎバージョン５．２での非区画分析（ｎｏｎ−ｃｏｍｐａｒｔｍｅｎｔａｌ ａｎａｌｙｓｉｓ）を使用して薬物動態パラメータを測定した。
【０１６１】
雄性カニクイザルへの静脈内投与後の血清濃度−時間特性を図１０にプロットする。Ｍａｂ ４Ａ１０−３は、研究したすべての用量でＭａｂ Ｃｏｍｂｉ１１よりもはるかにゆっくりと（およそ５倍）浄化された。検討したＭａｂ Ｃｏｍｂｉ１１の血清濃度がＭａｂ ４Ａ１０−３について観察された血清濃度のおよそ５０％であった最初の時間（１時間）で、差は明らかであった。用量後２４時間で、Ｍａｂ ４Ａ１０−３の血清濃度は、Ｃｏｍｂｉ１１についてのわずか６〜９％と比べて、Ｃｍａｘの２０〜３３％であった。Ｍａｂ Ｃｏｍｂｉ１１の末梢濃度は０．３ｍｇ／ｋｇ用量後は明白ではなかった。Ｍａｂ ４Ａ１０−３のクリアランスは３ｍｇ／ｋｇ用量と比べてより２つの低い用量ではいくらか速かった。Ｍａｂ ４Ａ１０−３についてのＴ１／２は２〜３日の範囲であった。しかしながら、Ｍａｂ Ｃｏｍｂｉ１１についてのＴ１／２は約１２〜約２７時間の範囲であった。
【０１６２】
Ｍａｂ ４Ａ１０−３よりも高められたＭａｂ Ｃｏｍｂｉ１１のクリアランスは、Ｍａｂ ４Ａ１０−３については起こらない、Ｍａｂ Ｃｏｍｂｉ１１と細胞表面タンパク質との非特異的な相互作用の増加に由来すると仮定した。この仮定を評価するために、Ｍａｂ ４Ａ１０−３およびＭａｂ Ｃｏｍｂｉ１１の薬物動態をラットで研究した。これは、Ｍａｂはラットのフェロポーチンに効果的には結合しないからである。
【０１６３】
雄性ラットへの静脈内投与後の血清濃度−時間特性を図１１にプロットする。霊長類での観察と同様に、ラットにおいてＭａｂ ４Ａ１０−３はＭａｂ Ｃｏｍｂｉ１１よりもゆっくりと（およそ５倍）浄化された（データは示さず）。ここでも、検討したＭａｂ Ｃｏｍｂｉ１１の血清濃度がＭａｂ ４Ａ１０−３について観察された血清濃度のおよそ５０％であった最初の時間点（０．０８時間）で、差は明らかであった。Ｍａｂ ４Ａ１０−３およびＭａｂ Ｃｏｍｂｉ１１についてのＴ１／２は、ラットではそれぞれおよそ４．５日および３日であった（データは示さず）。
【０１６４】
これらのデータは、Ｍａｂ Ｃｏｍｂｉ１１について観察されたより迅速なクリアランスは、標的受容体によって媒介されるクリアランスが原因であったということを強く示唆する。なぜなら、Ｍａｂ ４Ａ１０−３もＭａｂ Ｃｏｍｂｉ１１もラットフェロポーチンに結合しないからである。
【０１６５】
実施例１２：遅延したクリアランスおよび／または低非特異的（ヘパリン）結合を有する抗ヒトＦＰＮ１ Ｍａｂ
実施例１１で上記されたＭａｂ Ｃｏｍｂｉ１１の薬物動態研究は、Ｍａｂ Ｃｏｍｂｉ１１がＭａｂ ４Ａ１０−３と比べてより迅速に血清から浄化されるということを示唆した。このデータはまた、Ｍａｂ ４Ａ１０−３と比べたＭａｂ Ｃｏｍｂｉ１１のより迅速なクリアランスはＭａｂ ４Ａ１０−３よりもＭａｂ Ｃｏｍｂｉ１１の、標的受容体によって媒介されるクリアランスの増加が原因ではないということを示唆した。
【０１６６】
複数のアルギニン残基がＭａｂ Ｃｏｍｂｉ１１の遺伝子操作の間に導入されたため、Ｍａｂ ４Ａ１０−３と比べて得られたＭａｂ Ｃｏｍｂｉ１１の正電荷の増加が、例えば、負に帯電した膜表面へのおよびヘパリンへの望ましくない非特異的結合の増加をもたらしたということが疑われた。実際、Ｍａｂ Ｃｏｍｂｉ１１の構造のモデリングから、Ｍａｂ ４Ａ１０−３およびＭａｂ Ｌ２．２−４を含めた他のヒトの遺伝子操作された抗ＦＰＮ１ ＭａｂのいくつかよりもＭａｂ Ｃｏｍｂｉ１１においてはっきりとした、Ｍａｂ Ｃｏｍｂｉ１１の表面上の強い正に帯電したパッチ（ｐａｔｃｈ）が示された。
【０１６７】
Ｍａｂ Ｃｏｍｂｉ１１、４Ａ１０−３、およびＬ２．２−４を、当業者に公知の方法に従ってヘパリンＥＬＩＳＡを使用して非特異的ヘパリン結合について試験した。Ｍａｂ Ｃｏｍｂｉ１１、４Ａ１０−３、３Ｄ８、およびＬ２．２−４を、ＨＥＫ ２９３細胞を発現するヒトＦＰＮ１への結合、および細胞表面で発現されるヒトＦＰＮ１を欠く対照のＨＥＫ ２９３細胞への結合についても試験した。
【０１６８】
Ｍａｂ Ｃｏｍｂｉ−１１を使用したヘパリンＥＬＩＳＡは、Ｍａｂ Ｃｏｍｂｉ１１はヘパリンに強く結合するが、Ｍａｂ ４Ａ１０−３およびＬ２．２−４はそうではないということを示した。さらには、Ｍａｂ Ｃｏｍｂｉ−１１はＨＥＫ ２９３細胞を発現するヒトＦＰＮ１および細胞表面で発現されるヒトＦＰＮ１を欠く対照のＨＥＫ ２９３細胞の両方にも強く結合した。他方、Ｍａｂ ４Ａ１０−３、３Ｄ８、およびＬ２．２−４は、ＨＥＫ ２９３細胞を発現するヒトＦＰＮ１には顕著に結合したが、対照のＨＥＫ ２９３細胞に対してはそうではなかった。
【０１６９】
それゆえ、ＨＣＤＲ２の中のアルギニンアミノ酸残基をグリシンアミノ酸残基で置き換えることによって、Ｍａｂ Ｃｏｍｂｉ１１に関して観察される非特異的結合を減少させるためにＭａｂ Ｃｏｍ１１ＧＹを生成した。加えて、Ｍａｂ Ｃｏｍｂｉ１１で見出された別の潜在的に問題があるアミノ酸残基、ＬＣＤＲ２中のトリプトファンアミノ酸残基を、Ｍａｂ Ｃｏｍ１１ＧＹの中ではチロシンアミノ酸残基で置き換えた。Ｍａｂ Ｃｏｍ１１ＧＹを発現する細胞由来の上清を使用した予備段階の結合データは、対照のＨＥＫ ２９３細胞、すなわちヒトＦＰＮ１を発現しない細胞への非特異的結合の欠如を実証したが、Ｍａｂ １Ｂ７および１Ｆ８はともに同じ対照細胞に対する著しくより非特異的な結合を実証した。
【０１７０】
実施例１３：ＦＰＮ１に結合するヒトヘプシジン−２５の阻害についてのアッセイ
ヒトの遺伝子操作された、親和性が成熟した抗ヒトＦＰＮ１抗体は、ＨＥＫ ２９３細胞の中で発現されるヒトＦＰＮ１に結合するヒトヘプシジン−２５を阻害する能力についてアッセイされ得る。手短に言うと、トランスフェクトされたＦＰＮ／２９３細胞を、９６穴プレート上でポリ−Ｄ−リジンコーティングしたプレート（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｓａｎ Ｊｏｓｅ、ＣＡ；ＢＤ Ｂｉｏｃｏａｔ プレート番号３５ ４６４０）の中で、８０μｌのアッセイ培地（ＤＭＥＭ １１９６５、１０％ 透析したＦＢＳ、２０μＭ ＦＡＣ、ペニシリン−ストレプトマイシン）中に１ウェルあたり４０，０００細胞でプレーティングし、毎分１０００回転で１分間遠心分離し、次いで３７℃、１０％ ＣＯ２で４時間インキュベーションする。ＦＰＮ１発現を、１０ｎＭのドキシサイクリン２０μｌをこのプレーティングした細胞に加える（２ｎＭの、ドキシサイクリンの最終濃度）ことによって誘導する。ドキシサイクリンで誘導される細胞および誘導されない対照細胞を３７℃、１０％ ＣＯ２で５時間インキュベーションする。次に、このプレートをＤＭＥＭで２回洗浄することによりこの誘導剤を除去する。この細胞を、１００μｌのアッセイ培地の中で一晩インキュベーションする。次に、このアッセイ培地を除去し、４０μＬの試験抗体またはアイソタイプの対照抗体溶液で三重に置き換え、３７℃、１０％ ＣＯ２で２０分間インキュベーションする。次に、２０μｌのビオチン化された成熟したヒトヘプシジンをこのウェルに、１ウェルあたり３０ｎＭの最終濃度で加える。このサンプルを３７℃、１０％ ＣＯ２で１時間インキュベーションし、その後、２００μＬ ２％ ＦＢＳ、Ｄ−ＰＢＳ（Ｇｉｂｃｏ、カタログ番号１４０４０）で４回洗浄する。次に、６５μｌの溶解緩衝剤（０．５％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００、１０ｍＭ ＥＤＴＡ）をすべてのウェルに加え、このプレートを１０分間振盪する。次に、各ウェルの中の溶液５０μＬを、ストレプトアビジンでコーティングしたＧｒｅｉｎｅｒマイクロタイタープレート（ＰＢＳ中の６０μｌの２μｇ／ｍＬ ストレプトアビジン（Ｓｉｇｍａ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ；カタログ番号 Ｓ４７６２）、４℃で一晩インキュベーションし、２回（０．１％ Ｔｗｅｅｎ ２０、ＴＢＳ）洗浄し、カゼイン／ＰＢＳでブロックする）の個々のウェルに移し、次いで室温で１時間インキュベーションした。次に、このプレートのウェルを３回洗浄し（０．１％ Ｔｗｅｅｎ ２０、ＴＢＳ）、０．５μｇ／ｍＬの５０μＬの抗ヒトヘプシジン−２５ Ｍａｂ ３．２３を加え、このサンプルを室温で１時間インキュベーションする。この抗ヒトヘプシジン−２５ Ｍａｂ ３．２３は、ＰＣＴ国際特許出願公開公報ＷＯ２００９／０５８７９７号に記載されている。次に、このプレートを３回洗浄し、５０μｌのヤギ抗ヒトＩｇＧ−西洋ワサビペルオキシダーゼ（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ Ｂｉｏｔｅｃｈカタログ番号２０６０−０５）を１：２０００希釈で加える。室温で１時間のインキュベーション後、このプレートを４回洗浄し、５０μｌのＯＰＤ基質（Ｓｉｇｍａ；カタログ番号Ｐ６９１２）を加える。この反応を、４分後に１００μＬ １Ｎ ＨＣｌで停止する。４９０ｎｍでの吸光度（Ａ４９０）を、適切なＥＬＩＳＡプレートリーダーを使用して読み取る。アッセイ範囲は、対照抗体を受け取った誘導されたウェルから誘導されないウェルのＡ４９０を差し引くことにより測定される。
【０１７１】
表１１に示すデータは、ヒト化Ｍａｂ ３Ｄ８およびその親和性が成熟した変異体は、ヒトヘプシジン−２５の、ヒトＦＰＮ１に結合する能力を有意に阻害することを実証する。より具体的には、ヒト重鎖フレームワークＶＨ１−６９および軽鎖フレームワークＯ２を有するＭａｂ ３Ｄ８、マウスＭａｂ １Ｇ９のヒト化体は、このアッセイフォーマットにおいて測定すると、約４００ｎＭ のＩＣ５０を実証した。親和性が成熟したＭａｂ ４Ａ１０−３、Ｃｏｍｂｉ１１、およびＬ２．２−４は、このアッセイフォーマットにおいて測定すると、結合の有意に改善された阻害を実証した。
【０１７２】
【表１５】
【０１７３】
実施例１４：細胞のフェリチンレベルに対するＦＰＮ１ Ｍａｂの効果のインビトロアッセイ
実施例５に記載したように、ＦＰＮ１を内因的に発現するＣａｃｏ−２細胞、ヒト腸細胞細胞株は、フェリチンの変化についてモニターされ得る。基本的に実施例５に記載したようにして行った実験では、Ｃａｃｏ−２細胞における成熟したヘプシジンによって調節される鉄制御に対する抗ヒトＦＰＮ１抗体の効果を測定し、いくつかの独立の実験にわたって平均した阻害パーセントとして下記の表１２に表す。
【０１７４】
このデータは、この細胞におけるフェリチン濃度に対するヘプシジンの効果は抗ヒトＦＰＮ１ Ｍａｂによって用量依存的に阻害され得るということを示す。ＥＣ５０値によって示されるように、いくつかの抗ヒトＭａｂは、他のものよりも、ヘプシジンの効果を阻害することにおいて強力である、例えば、Ｃｏｍｂｉ１１において、およそ４Ａ１０−３＞Ｌ２−２−４＞３Ｄ８である。
【０１７５】
表１２：インビトロでのＣａｃｏ−２細胞における細胞のフェリチンレベルの成熟したヘプシジンによって誘導された増加に対する、抗ヒトＦＰＮ１ Ｍａｂによる阻害率（±ＳＥＭ）
【０１７６】
【表１６】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）４０３ＳＰＦＥＤＩＲＳＲＦＩＱＧＥＳＩＴＰＴＫ４２２（配列番号１２）；
（ｂ）４０６ＥＤＩＲＳＲＦＩＱＧＥＳＩＴ４１９（配列番号１３）；
（ｃ）４０９ＲＳＲＦＩＱＧＥＳＩＴＰＴＫ４２２（配列番号１４）；
（ｄ）４０３ＳＰＦＥＤＩＲＳＲＦＩＱＧ４１５（配列番号１５）；
（ｅ）４０９ＲＳＲＦＩＱＧＥＳＩＴ４１９（配列番号１６）；および
（ｆ）４０９ＲＳＲＦＩＱＧ４１５（配列番号９５）
からなる群から選択される１つ以上のアミノ酸配列に局在するアミノ酸を含むエピトープにて、配列番号１に示されるアミノ酸配列からなるヒトフェロポーチン１に結合する、モノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメント。
【請求項２】
（ａ）４０３ＳＰＦＥＤＩＲＳＲＦＩＱＧＥＳＩＴＰＴＫ４２２（配列番号１２）；
（ｂ）４０６ＥＤＩＲＳＲＦＩＱＧＥＳＩＴ４１９（配列番号１３）；
（ｃ）４０９ＲＳＲＦＩＱＧＥＳＩＴＰＴＫ４２２（配列番号１４）；
（ｄ）４０３ＳＰＦＥＤＩＲＳＲＦＩＱＧ４１５（配列番号１５）；
（ｅ）４０９ＲＳＲＦＩＱＧＥＳＩＴ４１９（配列番号１６）；および
（ｆ）４０９ＲＳＲＦＩＱＧ４１５（配列番号９５）
からなる群から選択される１つ以上のアミノ酸配列に局在するアミノ酸から実質的になるエピトープにて、配列番号１に示されるアミノ酸配列からなるヒトフェロポーチン１に結合する、請求項１に記載のモノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメント。
【請求項３】
配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、および配列番号９５からなる群から選択される１つ以上のペプチドに結合する、請求項１または２に記載のモノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメント。
【請求項４】
配列番号９８、１８３〜２１４からなる群から選択される１つ以上のペプチドに結合しない、請求項１から３のいずれか一項に記載のモノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメント。
【請求項５】
配列番号３７、１２９、２２、１０７、１１８および１２０にそれぞれ示されるアミノ酸配列を含む、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、ＬＣＤＲ３、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２およびＨＣＤＲ３を含む、請求項１から４のいずれか一項に記載のモノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメント。
【請求項６】
配列番号３７、１７４、２２、１７５、１７６および１２０にそれぞれ示されるアミノ酸配列を含む、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、ＬＣＤＲ３、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２およびＨＣＤＲ３を含む、請求項１から４のいずれか一項に記載のモノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメント。
【請求項７】
配列番号３７、１２５、２２、２３、１１０および１９にそれぞれ示されるアミノ酸配列を含む、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、ＬＣＤＲ３、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２およびＨＣＤＲ３を含む、請求項１から４のいずれか一項に記載のモノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメント。
【請求項８】
配列番号３７、１７７、２２、２３、１１２および１９にそれぞれ示されるアミノ酸配列を含む、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、ＬＣＤＲ３、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２およびＨＣＤＲ３を含む、請求項１から４のいずれか一項に記載のモノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメント。
【請求項９】
配列番号３７、１２２、２２、２３、１１０および１９にそれぞれ示されるアミノ酸配列を含む、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、ＬＣＤＲ３、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２およびＨＣＤＲ３を含む、請求項１から４のいずれか一項に記載のモノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメント。
【請求項１０】
配列番号１３６および配列番号１３４にそれぞれ示される軽鎖可変領域および重鎖可変領域を含む、請求項５に記載のモノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメント。
【請求項１１】
配列番号１８０および配列番号１７８にそれぞれ示される軽鎖可変領域および重鎖可変領域を含む、請求項６に記載のモノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメント。
【請求項１２】
配列番号１４０および配列番号１３８にそれぞれ示される軽鎖可変領域および重鎖可変領域を含む、請求項７に記載のモノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメント。
【請求項１３】
（ａ）配列番号１５４および配列番号１５２にそれぞれ示される軽鎖および重鎖；
（ｂ）配列番号１８１および配列番号１７９にそれぞれ示される軽鎖および重鎖；または
（ｃ）配列番号１５８および配列番号１５６にそれぞれ示される軽鎖および重鎖
を含む、請求項１から４のいずれか一項に記載のモノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメント。
【請求項１４】
２つの軽鎖ポリペプチドおよび２つの重鎖ポリペプチドを含み、前記軽鎖ポリペプチドの各々は配列番号１５４に示されるアミノ酸配列を有し、前記重鎖ポリペプチドの各々は配列番号１５２に示されるアミノ酸配列を有する、請求項１３に記載のモノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメント。
【請求項１５】
２つの軽鎖ポリペプチドおよび２つの重鎖ポリペプチドを含み、前記軽鎖ポリペプチドの各々は配列番号１８１に示されるアミノ酸配列を有し、前記重鎖ポリペプチドの各々は配列番号１７９に示されるアミノ酸配列を有する、請求項１３に記載のモノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメント。
【請求項１６】
２つの軽鎖ポリペプチドおよび２つの重鎖ポリペプチドを含み、前記軽鎖ポリペプチドの各々は配列番号１５８に示されるアミノ酸配列を有し、前記重鎖ポリペプチドの各々は配列番号１５６に示されるアミノ酸配列を有する、請求項１３に記載のモノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメント。
【請求項１７】
２５℃にて表面プラズモン共鳴により測定される場合、約１０ｎＭ未満のＫＤでヒトフェロポーチン１に結合する、請求項１から１６のいずれか一項に記載のモノクローナル抗体。
【請求項１８】
３７℃にて表面プラズモン共鳴により測定される場合、約１００ｎＭ未満のＫＤでヒトフェロポーチン１に結合するＦａｂを含む、請求項１から１２のいずれか一項に記載のモノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメント。
【請求項１９】
前記Ｆａｂは、ヒトフェロポーチン１について３７℃にてＳＰＲにより測定される場合、約７．５×１０−３ｓ−１〜約９×１０−４ｓ−１の解離速度（ｋｏｆｆ）を有する、請求項１８に記載のモノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメント。
【請求項２０】
前記Ｆａｂは、約１００ｎＭ〜約１ｎＭのＫＤでヒトフェロポーチン１に結合する、請求項１８または１９に記載のモノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメント。
【請求項２１】
前記Ｆａｂは、約１０ｎＭ〜約０．５ｎＭのＫＤでヒトフェロポーチン１に結合する、請求項１８から２０のいずれか一項に記載のモノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメント。
【請求項２２】
ヘプシジン−２５生物活性のインビトロアッセイにおいて約１００ｎＭ〜約１ｎＭのＩＣ５０を有する、請求項１から２１のいずれか一項に記載のモノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメント。
【請求項２３】
前記ＩＣ５０は、約１００ｎＭ〜約１０ｎＭである、請求項２２に記載のモノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメント。
【請求項２４】
前記ヘプシジン−２５生物活性は、フェロポーチン１の内在化および／または分解である、請求項２３に記載のモノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメント。
【請求項２５】
ヘプシジン−２５生物活性のインビボアッセイにおいて約１００ｎＭ〜約１ｎＭのＩＣ５０を有する、請求項１から２４のいずれか一項に記載のモノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメント。
【請求項２６】
前記アッセイは、霊長類における血清鉄濃度のＩＬ−６により誘導される減少を測定する、請求項２５に記載のモノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメント。
【請求項２７】
請求項１から２６のいずれか一項に記載のモノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメントをコードする核酸配列を含む、ポリヌクレオチド。
【請求項２８】
請求項２７に記載のポリヌクレオチドを含む、組み換え発現ベクター。
【請求項２９】
請求項２８に記載の発現ベクターにより形質転換された、宿主細胞。
【請求項３０】
前記宿主細胞は、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、ＮＳ０骨髄腫細胞、ＣＯＳ細胞、または、ＳＰ２／０細胞である、請求項２９に記載の宿主細胞。
【請求項３１】
治療に使用するための請求項１から２６のいずれか一項に記載のモノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメント。
【請求項３２】
医薬として使用するための請求項１から２６のいずれか一項に記載のモノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメント。
【請求項３３】
貧血、癌による貧血、または、ヘプシジンの向上した濃度と関連する癌による貧血を治療するための、請求項１から２６のいずれか一項に記載のモノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメント。
【請求項３４】
被験体において、貧血、癌による貧血、または、ヘプシジンの向上した濃度と関連する癌による貧血を治療または予防するための医薬を調製するための、請求項１から２６のいずれか一項に記載のモノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメントの使用。
【請求項３５】
ヒトにおいて血清鉄濃度、網状赤血球数、赤血球数、ヘモグロビン、および／またはヘマトクリットを増加させるのに使用するための、請求項１から２６のいずれか一項に記載のモノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメント。
【請求項３６】
請求項１から２６のいずれか一項に記載のモノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメントの有効量を被験体に投与する工程を含む、血清鉄濃度、網状赤血球数、赤血球数、ヘモグロビン、および／またはヘマトクリットを増加させる方法。
【請求項３７】
請求項１から２６のいずれか一項に記載のモノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメントの有効量を被験体に投与する工程を含む、被験体において貧血または癌による貧血を治療する方法。
【請求項３８】
ＥＳＡ、あるいはヒトにおいて血清鉄濃度、網状赤血球数、赤血球数、ヘモグロビン、および／またはヘマトクリットを増加させるために通常利用される他の治療剤または治療的処置を、前記ヒト患者に施す工程をさらに含む、請求項３６または３７に記載の方法。
【請求項３９】
請求項１から２６のいずれか一項に記載のモノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメント、および薬学的に受容可能な担体、希釈剤、または賦形剤を含む、薬学的組成物。
【請求項４０】
１つ以上の他の治療剤をさらに含む、請求項３９に記載の薬学的組成物。
【請求項４１】
（ｉ）モノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメントを発現させるのに適切な条件下にて請求項２９または３０に記載の宿主細胞を培養する工程、および、
（ｉｉ）前記発現させたモノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメントを回収する工程、
を含む、モノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメントを生成する方法。
【請求項４２】
請求項４１に記載の方法により取得可能なモノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメント。
【請求項１】
（ａ）４０３ＳＰＦＥＤＩＲＳＲＦＩＱＧＥＳＩＴＰＴＫ４２２（配列番号１２）；
（ｂ）４０６ＥＤＩＲＳＲＦＩＱＧＥＳＩＴ４１９（配列番号１３）；
（ｃ）４０９ＲＳＲＦＩＱＧＥＳＩＴＰＴＫ４２２（配列番号１４）；
（ｄ）４０３ＳＰＦＥＤＩＲＳＲＦＩＱＧ４１５（配列番号１５）；
（ｅ）４０９ＲＳＲＦＩＱＧＥＳＩＴ４１９（配列番号１６）；および
（ｆ）４０９ＲＳＲＦＩＱＧ４１５（配列番号９５）
からなる群から選択される１つ以上のアミノ酸配列に局在するアミノ酸を含むエピトープにて、配列番号１に示されるアミノ酸配列からなるヒトフェロポーチン１に結合する、モノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメント。
【請求項２】
（ａ）４０３ＳＰＦＥＤＩＲＳＲＦＩＱＧＥＳＩＴＰＴＫ４２２（配列番号１２）；
（ｂ）４０６ＥＤＩＲＳＲＦＩＱＧＥＳＩＴ４１９（配列番号１３）；
（ｃ）４０９ＲＳＲＦＩＱＧＥＳＩＴＰＴＫ４２２（配列番号１４）；
（ｄ）４０３ＳＰＦＥＤＩＲＳＲＦＩＱＧ４１５（配列番号１５）；
（ｅ）４０９ＲＳＲＦＩＱＧＥＳＩＴ４１９（配列番号１６）；および
（ｆ）４０９ＲＳＲＦＩＱＧ４１５（配列番号９５）
からなる群から選択される１つ以上のアミノ酸配列に局在するアミノ酸から実質的になるエピトープにて、配列番号１に示されるアミノ酸配列からなるヒトフェロポーチン１に結合する、請求項１に記載のモノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメント。
【請求項３】
配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、および配列番号９５からなる群から選択される１つ以上のペプチドに結合する、請求項１または２に記載のモノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメント。
【請求項４】
配列番号９８、１８３〜２１４からなる群から選択される１つ以上のペプチドに結合しない、請求項１から３のいずれか一項に記載のモノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメント。
【請求項５】
配列番号３７、１２９、２２、１０７、１１８および１２０にそれぞれ示されるアミノ酸配列を含む、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、ＬＣＤＲ３、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２およびＨＣＤＲ３を含む、請求項１から４のいずれか一項に記載のモノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメント。
【請求項６】
配列番号３７、１７４、２２、１７５、１７６および１２０にそれぞれ示されるアミノ酸配列を含む、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、ＬＣＤＲ３、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２およびＨＣＤＲ３を含む、請求項１から４のいずれか一項に記載のモノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメント。
【請求項７】
配列番号３７、１２５、２２、２３、１１０および１９にそれぞれ示されるアミノ酸配列を含む、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、ＬＣＤＲ３、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２およびＨＣＤＲ３を含む、請求項１から４のいずれか一項に記載のモノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメント。
【請求項８】
配列番号３７、１７７、２２、２３、１１２および１９にそれぞれ示されるアミノ酸配列を含む、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、ＬＣＤＲ３、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２およびＨＣＤＲ３を含む、請求項１から４のいずれか一項に記載のモノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメント。
【請求項９】
配列番号３７、１２２、２２、２３、１１０および１９にそれぞれ示されるアミノ酸配列を含む、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、ＬＣＤＲ３、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２およびＨＣＤＲ３を含む、請求項１から４のいずれか一項に記載のモノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメント。
【請求項１０】
配列番号１３６および配列番号１３４にそれぞれ示される軽鎖可変領域および重鎖可変領域を含む、請求項５に記載のモノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメント。
【請求項１１】
配列番号１８０および配列番号１７８にそれぞれ示される軽鎖可変領域および重鎖可変領域を含む、請求項６に記載のモノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメント。
【請求項１２】
配列番号１４０および配列番号１３８にそれぞれ示される軽鎖可変領域および重鎖可変領域を含む、請求項７に記載のモノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメント。
【請求項１３】
（ａ）配列番号１５４および配列番号１５２にそれぞれ示される軽鎖および重鎖；
（ｂ）配列番号１８１および配列番号１７９にそれぞれ示される軽鎖および重鎖；または
（ｃ）配列番号１５８および配列番号１５６にそれぞれ示される軽鎖および重鎖
を含む、請求項１から４のいずれか一項に記載のモノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメント。
【請求項１４】
２つの軽鎖ポリペプチドおよび２つの重鎖ポリペプチドを含み、前記軽鎖ポリペプチドの各々は配列番号１５４に示されるアミノ酸配列を有し、前記重鎖ポリペプチドの各々は配列番号１５２に示されるアミノ酸配列を有する、請求項１３に記載のモノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメント。
【請求項１５】
２つの軽鎖ポリペプチドおよび２つの重鎖ポリペプチドを含み、前記軽鎖ポリペプチドの各々は配列番号１８１に示されるアミノ酸配列を有し、前記重鎖ポリペプチドの各々は配列番号１７９に示されるアミノ酸配列を有する、請求項１３に記載のモノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメント。
【請求項１６】
２つの軽鎖ポリペプチドおよび２つの重鎖ポリペプチドを含み、前記軽鎖ポリペプチドの各々は配列番号１５８に示されるアミノ酸配列を有し、前記重鎖ポリペプチドの各々は配列番号１５６に示されるアミノ酸配列を有する、請求項１３に記載のモノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメント。
【請求項１７】
２５℃にて表面プラズモン共鳴により測定される場合、約１０ｎＭ未満のＫＤでヒトフェロポーチン１に結合する、請求項１から１６のいずれか一項に記載のモノクローナル抗体。
【請求項１８】
３７℃にて表面プラズモン共鳴により測定される場合、約１００ｎＭ未満のＫＤでヒトフェロポーチン１に結合するＦａｂを含む、請求項１から１２のいずれか一項に記載のモノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメント。
【請求項１９】
前記Ｆａｂは、ヒトフェロポーチン１について３７℃にてＳＰＲにより測定される場合、約７．５×１０−３ｓ−１〜約９×１０−４ｓ−１の解離速度（ｋｏｆｆ）を有する、請求項１８に記載のモノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメント。
【請求項２０】
前記Ｆａｂは、約１００ｎＭ〜約１ｎＭのＫＤでヒトフェロポーチン１に結合する、請求項１８または１９に記載のモノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメント。
【請求項２１】
前記Ｆａｂは、約１０ｎＭ〜約０．５ｎＭのＫＤでヒトフェロポーチン１に結合する、請求項１８から２０のいずれか一項に記載のモノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメント。
【請求項２２】
ヘプシジン−２５生物活性のインビトロアッセイにおいて約１００ｎＭ〜約１ｎＭのＩＣ５０を有する、請求項１から２１のいずれか一項に記載のモノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメント。
【請求項２３】
前記ＩＣ５０は、約１００ｎＭ〜約１０ｎＭである、請求項２２に記載のモノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメント。
【請求項２４】
前記ヘプシジン−２５生物活性は、フェロポーチン１の内在化および／または分解である、請求項２３に記載のモノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメント。
【請求項２５】
ヘプシジン−２５生物活性のインビボアッセイにおいて約１００ｎＭ〜約１ｎＭのＩＣ５０を有する、請求項１から２４のいずれか一項に記載のモノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメント。
【請求項２６】
前記アッセイは、霊長類における血清鉄濃度のＩＬ−６により誘導される減少を測定する、請求項２５に記載のモノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメント。
【請求項２７】
請求項１から２６のいずれか一項に記載のモノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメントをコードする核酸配列を含む、ポリヌクレオチド。
【請求項２８】
請求項２７に記載のポリヌクレオチドを含む、組み換え発現ベクター。
【請求項２９】
請求項２８に記載の発現ベクターにより形質転換された、宿主細胞。
【請求項３０】
前記宿主細胞は、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、ＮＳ０骨髄腫細胞、ＣＯＳ細胞、または、ＳＰ２／０細胞である、請求項２９に記載の宿主細胞。
【請求項３１】
治療に使用するための請求項１から２６のいずれか一項に記載のモノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメント。
【請求項３２】
医薬として使用するための請求項１から２６のいずれか一項に記載のモノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメント。
【請求項３３】
貧血、癌による貧血、または、ヘプシジンの向上した濃度と関連する癌による貧血を治療するための、請求項１から２６のいずれか一項に記載のモノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメント。
【請求項３４】
被験体において、貧血、癌による貧血、または、ヘプシジンの向上した濃度と関連する癌による貧血を治療または予防するための医薬を調製するための、請求項１から２６のいずれか一項に記載のモノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメントの使用。
【請求項３５】
ヒトにおいて血清鉄濃度、網状赤血球数、赤血球数、ヘモグロビン、および／またはヘマトクリットを増加させるのに使用するための、請求項１から２６のいずれか一項に記載のモノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメント。
【請求項３６】
請求項１から２６のいずれか一項に記載のモノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメントの有効量を被験体に投与する工程を含む、血清鉄濃度、網状赤血球数、赤血球数、ヘモグロビン、および／またはヘマトクリットを増加させる方法。
【請求項３７】
請求項１から２６のいずれか一項に記載のモノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメントの有効量を被験体に投与する工程を含む、被験体において貧血または癌による貧血を治療する方法。
【請求項３８】
ＥＳＡ、あるいはヒトにおいて血清鉄濃度、網状赤血球数、赤血球数、ヘモグロビン、および／またはヘマトクリットを増加させるために通常利用される他の治療剤または治療的処置を、前記ヒト患者に施す工程をさらに含む、請求項３６または３７に記載の方法。
【請求項３９】
請求項１から２６のいずれか一項に記載のモノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメント、および薬学的に受容可能な担体、希釈剤、または賦形剤を含む、薬学的組成物。
【請求項４０】
１つ以上の他の治療剤をさらに含む、請求項３９に記載の薬学的組成物。
【請求項４１】
（ｉ）モノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメントを発現させるのに適切な条件下にて請求項２９または３０に記載の宿主細胞を培養する工程、および、
（ｉｉ）前記発現させたモノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメントを回収する工程、
を含む、モノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメントを生成する方法。
【請求項４２】
請求項４１に記載の方法により取得可能なモノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメント。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【公表番号】特表２０１２−５１０８１４（Ｐ２０１２−５１０８１４Ａ）
【公表日】平成２４年５月１７日（２０１２．５．１７）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１１−５３９６２５（Ｐ２０１１−５３９６２５）
【出願日】平成２１年１２月１日（２００９．１２．１）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００９／０６６１８７
【国際公開番号】ＷＯ２０１０／０６５４９６
【国際公開日】平成２２年６月１０日（２０１０．６．１０）
【出願人】（５９４１９７８７２）イーライ リリー アンド カンパニー (301)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２４年５月１７日（２０１２．５．１７）
【国際特許分類】
【出願日】平成２１年１２月１日（２００９．１２．１）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００９／０６６１８７
【国際公開番号】ＷＯ２０１０／０６５４９６
【国際公開日】平成２２年６月１０日（２０１０．６．１０）
【出願人】（５９４１９７８７２）イーライ リリー アンド カンパニー (301)
【Ｆターム（参考）】
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