抗原パルスして得られた樹状細胞
疾患、主としてＢ型肝炎の予防、治療に有効な樹状細胞を提供する。 樹状細胞をＨＢｓ抗原でパルスする工程を含む方法によって得られたＨＢｓ抗原提示能を有する樹状細胞は、Ｂ型肝炎の予防、治療に有効である。ＨＢｓ抗原として、ＨＢワクチンに含まれるＨＢｓ抗原を用いることができる。樹状細胞をワクチンでパルスする工程を含む方法によって得られたワクチンパルス樹状細胞は、患者だけでなく健常者にも用いることができる。パルスに用いるワクチンとしては、様々な種類のワクチンを用いることができる。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、疾患の予防又は治療に用いることができる樹状細胞に関する。
【背景技術】
【０００２】
（樹状細胞療法とその問題点）
癌治療等の分野において、細胞免疫療法の一種である樹状細胞療法が注目されている。
【０００３】
樹状細胞は、生体内で最も強い抗原提示能を有する抗原提示細胞（ａｎｔｉｇｅｎ ｐｒｅｓｅｎｔｉｎｇ ｃｅｌｌ：ＡＰＣ）であり、取り込んだ抗原エピトープをＴ細胞に提示することによってＴ細胞を活性化し、免疫応答を高めることができる。
【０００４】
樹状細胞療法は、この樹状細胞を、癌細胞から抽出した物質又は癌特異的抗原を用いて、生体外でパルスし、抗原提示能を亢進させて生体内に戻す治療法である。
【０００５】
癌細胞から抽出した物質は、一般に、多種類の物質の混合物である。従って、癌細胞から抽出した物質を用いてパルスした樹状細胞は、細胞抽出物質中の多種類の癌抗原によって樹状細胞がパルスされたと考えられるため、癌に対する強力な免疫反応が誘導されると予想される。しかし、このように多種類の物質の混合物によってパルスした場合は、樹状細胞が提示する抗原を特定することができない。従って、癌患者に対して使用することは許されるが、健常者に対して使用することは許されない。
【０００６】
また、癌特異的抗原を用いてパルスした樹状細胞においては、樹状細胞が提示する抗原を特定することができるが、現在同定されている癌特異的抗原の数自体がまだ多くないという問題点がある。
【０００７】
樹状細胞に抗原を提示させる別の態様として、例えば、抗原に由来するペプチドをコードする遺伝子を樹状細胞に導入し、発現させる方法が知られている。しかし、このようにして調整した樹状細胞が、特定の抗原に対して強力な免疫応答を引き起こすことが可能であったとしても、現段階では、遺伝子操作を用いた樹状細胞を、疾患の予防等のために健常者に投与することは許されていない。
【０００８】
（肝炎について）
肝炎とは、肝臓に起こる炎症であり、主にウイルス、アルコール、薬物が原因となって引き起こされる。最も多い肝炎は肝炎ウイルスが原因のものであり、今日まで、７種類の肝炎ウイルスが見つかっている。また、日本のウイルス性肝炎においては、Ｂ型、Ｃ型がそのほとんどを占める。
【０００９】
肝炎は、急性肝炎と慢性肝炎に大別でき、慢性肝炎とは、肝炎が６ヶ月以上続くものを言う。Ａ型肝炎は、経口感染し、急性肝炎で留まり慢性化はしない。一方、Ｂ型、Ｃ型肝炎は、血液を介して感染し、母子間の垂直感染、家族や異性間の水平感染がある。また、Ｂ型、Ｃ型肝炎は、急性肝炎から慢性肝炎に進行するケースが多く、慢性化すると、肝硬変や肝臓癌等の重い肝臓疾病への移行率が極めて高いと言われている。
【００１０】
（Ｂ型肝炎について）
Ｂ型肝炎の患者は全世界的に分布しており、世界に３億５千万人のＢ型肝炎ウイルス感染者がいると言われている。特に、中国における感染者は１億２千万人と推定され極めて多く、東南アジア全体で、全世界の感染者数の７０％以上を占めるとされる。また、世界で毎年約１００万人が、この疾患が原因で死亡していることが報告されている。日本においては、１００万人以上のＢ型肝炎ウイルス感染者がいると推定され、その１０％程度が慢性肝炎患者であると推定される。
【００１１】
（Ｂ型肝炎の治療法とその問題点）
Ｂ型肝炎には特効的な治療薬はない。従って、治療は、ウイルスの数を減らしてその活動を抑えることが目的となる。代表的な治療法として、インターフェロン療法とラミブジン療法が知られている。
【００１２】
インターフェロン療法は、今から２０年ほど前に始められたＢ型肝炎の最初の治療法で、インターフェロンが免疫系の働きを助けてウイルスの増殖を抑える役割を果たす。インターフェロン療法は、ウイルス数が少ないほど効果が期待できるため、一般的に、ウイルス数がＢ型肝炎の１０００分の１であるＣ型肝炎の治療に優れた効果を発揮する一方、Ｂ型肝炎の治療には、約２０％の患者にしか効果を望めない。また、肝硬変に移行すると、よりインターフェロンが効きにくくなる。さらに、治療に用いられるインターフェロンは、開発し製品とするまでに大きなコストがかかり、１クールの治療で患者に２００〜３００万円の大きな経済的負担をもたらす等の問題点も多い。
【００１３】
ラミブジンは、本来、エイズの治療薬として開発された薬剤であるが、Ｂ型肝炎の治療にも有効であることが知られている。ラミブジンは、ウイルスＤＮＡの合成を直接抑える働きがあり、Ｂ型肝炎の急速な悪化や劇症化を食い止める効果がある。ラミブジンは、インターフェロンが効果を示さなかったＢ型肝炎患者にも効果を示すことが報告されているが、ウイルスが増殖状態にない時には効果が示されない。さらに、長期投与によってラミブジン耐性ウイルスが現れる等の問題点がある。
【００１４】
また、これらのＢ型肝炎の治療法は、効果の評価方法がそれぞれ異なっているため、一律に効果を比較することができない。また、これらの治療法を用いても、Ｂ型肝炎ウイルスを体内から完全になくすことは不可能であると考えられる。従って、前述のようなＢ型肝炎患者の増加を防ぐためには、Ｂ型肝炎を予防することが重要であると考えられる。
【００１５】
（Ｂ型肝炎の予防法とその問題点）
Ｂ型肝炎の予防の観点からは、一般に、ＨＢワクチンが有効である。
【００１６】
Ｂ型慢性肝炎を予防するためには、健常人であっても、体内に抗ＨＢｓ抗体を持ち、維持することが重要である。今日のＨＢワクチンは、Ｂ型肝炎ウイルスの表面抗原であるＨＢｓ抗原に基づいて作られている。通常、このＨＢワクチンを３回接種することにより、ＨＢワクチンの効くヒトには、体内に抗ＨＢｓ抗体ができる。抗体ができたヒトは、その後Ｂ型肝炎に感染することがないが、数年後に抗体値が低下した場合でも、一度抗ＨＢｓ抗体が体内にできていれば感染を免れる可能性があると考えられる。また、追加接種をすることによって、抗体値を再び高めることもできる。
【００１７】
しかし、ＨＢワクチンにも、いくつかの問題点が存在する。
【００１８】
まず、健常者のうちの約１０％はＨＢワクチンが非奏功（ｎｏｎ−ｒｅｓｐｏｎｄｅｒ）であり、ＨＢワクチンを投与しても抗ＨＢｓ抗体を産生することができない。医療従事者においてもＨＢワクチンｎｏｎ−ｒｅｓｐｏｎｄｅｒは少なくなく、日本には数十万人いると考えられる。
【００１９】
また、免疫能の低下を伴う疾患にかかっている人、例えば、ＨＩＶ患者、肝疾患患者、透析患者においても、ＨＢワクチンが十分に効果を発揮できない。肥満者や喫煙者にも免疫能の低下がみられるが、これらの人々もＨＢワクチンに対する反応性が低い。
【００２０】
さらに、肝移植対象者等の免疫抑制剤投与中の人にも、ＨＢワクチンが効かないため、患者は抗ＨＢｓ抗体を産生することができない。しかし、Ｂ型肝炎関連肝移植においては、抗ＨＢｓ抗体値を維持することが治療成績に大きな影響を及ぼすため、肝移植後、患者は繰り返し抗ＨＢｓヒト免疫グロブリンを投与することが必要となる。投与は２週間に１回の頻度で必要であり、このことは年間２５０万円という大きな経済的負担をもたらす。これからは、特に患者の多い東南アジアを中心に、Ｂ型肝炎関連肝移植が激増すると考えられるため、この経済的な問題の解決が世界的に必要とされている。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００２１】
本発明は、疾患の予防又は治療に有効な樹状細胞を提供することを目的とし、特に、Ｂ型肝炎の予防又は治療に好適に利用できる樹状細胞を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００２２】
１、ＨＢｓ抗原提示能を有する樹状細胞
本発明のＨＢｓ抗原提示能を有する樹状細胞は、樹状細胞をＨＢｓ抗原でパルスする工程を含む方法によって得られたＨＢｓ抗原提示能を有する樹状細胞である。
【００２３】
本発明のＨＢｓ抗原提示能を有する樹状細胞は、ＨＢｓ抗原エピトープをＴ細胞に提示することによってＴ細胞を活性化し、ＨＢｓ抗原に対する免疫応答を高めることができる。従って、本発明によれば、Ｂ型肝炎の予防又は治療に有効な、ＨＢｓ抗原提示能を有する樹状細胞を提供することができる。
【００２４】
本発明のＨＢｓ抗原提示能を有する樹状細胞において、前記方法はさらに、血液から前記樹状細胞を得る工程を含むことが好ましい。これによれば、血液由来の樹状細胞から、本発明のＨＢｓ抗原提示能を有する樹状細胞を提供することが可能である。また、血液を用いれば、従来公知の方法等を用いて、比較的簡便な操作によって樹状細胞を得ることが可能である。
【００２５】
本発明のＨＢｓ抗原提示能を有する樹状細胞において、前記方法はさらに、生物から前記血液を採取する工程を含むことが好ましい。
【００２６】
本発明のＨＢｓ抗原提示能を有する樹状細胞において、前記生物は、ヒトであることが好ましい。これによれば、ヒト由来の樹状細胞を得ることができるため、本発明によるＨＢｓ抗原提示能を有する樹状細胞を、ヒトに投与することが可能である。従って、本発明によって、ヒトのＢ型肝炎の予防又は治療に有効な、ＨＢｓ抗原提示能を有する樹状細胞を提供することができる。
【００２７】
本発明のＨＢｓ抗原提示能を有する樹状細胞において、前記ＨＢｓ抗原は、ＨＢワクチンに含まれるＨＢｓ抗原であることが好ましい。例えばヒトの場合、ＨＢワクチンとして実際に販売されるものは、健常者を含むヒトに安全性、有効性が認められ、認可を受けたものである。従って、本発明のＨＢｓ抗原提示能を有する樹状細胞によれば、例えばヒトに安全かつ有効に用いることができるＨＢｓ抗原提示能を有する樹状細胞を提供することができる。また、ＨＢワクチンは健常者に対して使用できるものであることから、本発明のＨＢｓ抗原提示能を有する樹状細胞は、Ｂ型肝炎患者等に対するＢ型肝炎の治療目的のみならず、健常者に対しても、Ｂ型肝炎の予防目的で使用することができる。なお、ヒトに限らず他の生物についても、その生物に安全かつ有効なＨＢワクチンを用いてパルスした樹状細胞を用いることによって、その生物のＢ型肝炎を予防又は治療することができる。
【００２８】
２、ＨＢｓ抗原提示能を有する樹状細胞の製造方法
本発明のＨＢｓ抗原提示能を有する樹状細胞の製造方法は、樹状細胞をＨＢｓ抗原でパルスする工程を含むことを特徴とする。これによれば、Ｂ型肝炎の予防又は治療に有効な、ＨＢｓ抗原提示能を有する樹状細胞を得ることができる。
【００２９】
本発明のＨＢｓ抗原提示能を有する樹状細胞の製造方法はさらに、血液から前記樹状細胞を得る工程を含むことが好ましい。これによれば、血液由来の樹状細胞から、本発明のＨＢｓ抗原提示能を有する樹状細胞を得ることが可能である。また、血液を用いれば、従来公知の方法等を用いて、比較的簡便な操作によって樹状細胞を得ることが可能である。
【００３０】
本発明のＨＢｓ抗原提示能を有する樹状細胞の製造方法はさらに、生物から前記血液を採取する工程を含むことが好ましい。
【００３１】
本発明のＨＢｓ抗原提示能を有する樹状細胞の製造方法において、前記生物は、ヒトとすることが好ましい。これによれば、ヒトのＢ型肝炎の予防又は治療に有効な、ＨＢｓ抗原提示能を有する樹状細胞を得ることが可能である。
【００３２】
本発明のＨＢｓ抗原提示能を有する樹状細胞の製造方法において、前記ＨＢｓ抗原は、ＨＢワクチンに含まれるＨＢｓ抗原であることが好ましい。これによれば、生物、例えば健常者を含むヒトに、安全かつ有効に用いることができるＢ型肝炎の予防又は治療に有効な、ＨＢｓ抗原提示能を有する樹状細胞を提供することができる。
【００３３】
３、ＨＢｓ抗原提示能を有する樹状細胞を含む組成物
本発明のＨＢｓ抗原提示能を有する樹状細胞を含む組成物は、本発明のＨＢｓ抗原提示能を有する樹状細胞を含むことを特徴とする。これによれば、本発明のＨＢｓ抗原提示能を有する樹状細胞を、例えば、他の物質と混合した状態、他の物質に懸濁した状態、他の物質と組み合わせた状態等で使用することができる。具体的には、本発明のＨＢｓ抗原提示能を有する樹状細胞を、例えば、ＰＢＳ、生理食塩水、ＲＰＭＩ１６４０培地等に懸濁した態様や、本発明のＨＢｓ抗原提示能を有する樹状細胞に、例えば、ＴＮＦ−α、ＩＬ−１２、ＨＢワクチン、ＧＭ−ＣＳＦ、ＯＫ４３２、その他免疫賦活剤等を添加した態様で用いることができる。従って、本発明によれば、本発明のＨＢｓ抗原提示能を有する樹状細胞を、使用目的に適した態様で又は本発明のＨＢｓ抗原提示能を有する樹状細胞の効果を高める態様で使用することが可能になる。
【００３４】
本発明のＨＢｓ抗原提示能を有する樹状細胞を含む組成物は、さらにＨＢワクチン添加物を含むことが好ましい。
【００３５】
本発明のＨＢｓ抗原提示能を有する樹状細胞を含む組成物において、前記組成物の形態としては、例えば、実験試薬又は実験キットがあげられる。これによれば、本発明のＨＢｓ抗原提示能を有する樹状細胞を、研究、例えば免疫研究に適した態様で用いることができる。
【００３６】
本発明のＨＢｓ抗原提示能を有する樹状細胞を含む組成物において、前記組成物は、医薬組成物とすることが好ましい。これによれば、本発明のＨＢｓ抗原提示能を有する樹状細胞を、医療、例えば、Ｂ型肝炎の予防又は治療に適した態様で用いることができる。
【００３７】
本発明のＨＢｓ抗原提示能を有する樹状細胞を含む組成物において、前記組成物は、免疫応答活性化製剤であることが好ましい。これによれば、本発明のＨＢｓ抗原提示能を有する樹状細胞を、ＨＢｓ抗原に対する免疫応答を活性化するのに適した投与剤形で用いることができる。
【００３８】
本発明のＨＢｓ抗原提示能を有する樹状細胞を含む組成物において、前記組成物は、細胞ワクチンであることが好ましい。これによれば、本発明のＨＢｓ抗原提示能を有する樹状細胞を、生体内に直接投与することが可能になり、ＨＢｓ抗原に対する免疫応答を活性化することができる。
【００３９】
本発明のＨＢｓ抗原提示能を有する樹状細胞を含む組成物において、前記細胞ワクチンは、Ｂ型肝炎の予防又は治療ワクチンであることが好ましい。これによれば、前記細胞ワクチンに含まれる本発明のＨＢｓ抗原提示能を有する樹状細胞が、生体内でＨＢｓ抗原に対する免疫応答を活性化することによって、Ｂ型肝炎を予防又は治療することが可能になる。
【００４０】
４、ＨＢｓ抗原提示能を有する樹状細胞を用いたＢ型肝炎の予防又は治療方法
本発明のＨＢｓ抗原提示能を有する樹状細胞を用いたＢ型肝炎の予防又は治療方法は、本発明のＨＢｓ抗原提示能を有する樹状細胞を用いることを特徴とする。これによれば、本発明のＨＢｓ抗原提示能を有する樹状細胞が、ＨＢｓ抗原に対する免疫応答を活性化することによって、Ｂ型肝炎を予防又は治療することができる。例えばヒトの場合、これまでのＨＢワクチンが非奏功であった健常者又は免疫能の低下を伴う疾患にかかっている人、免疫抑制剤投与中の人等、これまでのＨＢワクチンが効果を発揮できなかった人が、本発明のＢ型肝炎の予防又は治療方法によって、抗ＨＢｓ抗体を産生することができ、Ｂ型肝炎を予防又は治療することが可能になる。
【００４１】
本発明のＨＢｓ抗原提示能を有する樹状細胞を用いたＢ型肝炎の予防又は治療方法において、本発明のＨＢｓ抗原提示能を有する樹状細胞を、生物に投与する工程を含むことが好ましい。これによれば、本発明のＨＢｓ抗原提示能を有する樹状細胞が、生体内で、ＨＢｓ抗原に対する免疫応答を活性化することによって、Ｂ型肝炎を予防又は治療することができる。また、本発明のＢ型肝炎の予防又は治療方法は、ＨＢワクチンを直接生体内に投与するこれまでのＢ型肝炎の予防又は治療方法と比較して、高い効果を発揮することが可能である。
【００４２】
本発明のＨＢｓ抗原提示能を有する樹状細胞を用いたＢ型肝炎の予防又は治療方法において、前記生物は、ヒトであることが好ましい。これによれば、ヒトのＢ型肝炎を予防又は治療することが可能である。
【００４３】
５、ワクチンパルス樹状細胞
本発明のワクチンパルス樹状細胞は、樹状細胞をワクチンでパルスする工程を含む方法によって得られたワクチンパルス樹状細胞である。
【００４４】
本発明のワクチンパルス樹状細胞において、「ワクチンパルス樹状細胞」とは、ワクチンでパルスする工程を含む方法によって得られた抗原提示能を有する樹状細胞のことを言う。
【００４５】
本発明のワクチンパルス樹状細胞は、ワクチンに含まれる抗原エピトープをＴ細胞に提示することによってＴ細胞を活性化し、前記抗原に対する免疫応答を高めることができる。従って、本発明によれば、疾患の予防又は治療に有効な、ワクチンパルス樹状細胞を提供することができる。
【００４６】
また、例えばヒトの場合、ワクチンとして実際に販売されるものは、ヒトに安全性、有効性が認められ、認可を受けたものである。従って、本発明によれば、例えばヒトに安全かつ有効に用いることができるワクチンパルス樹状細胞を提供することができる。なお、ヒトに限らず他の生物についても、その生物に安全かつ有効なワクチンを用いてパルスしたワクチンパルス樹状細胞を用いることによって、その生物の疾患を予防又は治療することができる。
【００４７】
本発明のワクチンパルス樹状細胞において、前記方法はさらに、血液から前記樹状細胞を得る工程を含むことが好ましい。これによれば、血液由来の樹状細胞から、本発明のワクチンパルス樹状細胞を提供することが可能である。また、血液を用いれば、従来公知の方法等を用いて、比較的簡便な操作によって樹状細胞を得ることが可能である。
【００４８】
本発明のワクチンパルス樹状細胞において、前記方法はさらに、生物から前記血液を採取する工程を含むことが好ましい。
【００４９】
本発明のワクチンパルス樹状細胞において、前記生物は、ヒトとすることが好ましい。これによれば、ヒト由来の樹状細胞を得ることができるため、本発明によるワクチンパルス樹状細胞を、ヒトに投与することが可能である。従って、本発明によって、ヒト疾患の予防又は治療に有効な、ワクチンパルス樹状細胞を提供することができる。
【００５０】
本発明のワクチンパルス樹状細胞において、前記パルスに使用するワクチンは、疾患の予防又は治療ワクチンであることが好ましい。これによれば、これらのワクチンに含まれている、前記疾患に関わる抗原を提示するワクチンパルス樹状細胞を提供することができる。従って、前記疾患を予防又は治療することができる。
【００５１】
本発明のワクチンパルス樹状細胞において、前記パルスに使用するワクチンは、肝炎ワクチンであることが好ましい。肝炎ワクチンとしては、例えば、Ａ型肝炎ワクチン、Ｂ型肝炎ワクチン等が知られている。例えばヒトの場合、肝炎ワクチンとして実際に販売されるものは、健常者を含むヒトに安全性、有効性が認められ、認可を受けたものである。従って、本発明によれば、例えばヒトに安全かつ有効に用いることができる肝炎ウイルス抗原提示能を有する肝炎ワクチンパルス樹状細胞を提供することができる。また、肝炎ワクチンは健常者に対して使用できるものであることから、本発明の肝炎ワクチンパルス樹状細胞は、例えば、肝炎患者等に対する肝炎の治療目的のみならず、健常者に対しても、肝炎の予防目的で使用することができる。なお、ヒトに限らず他の生物についても、その生物に安全かつ有効な肝炎ワクチンを用いてパルスした樹状細胞を用いることによって、その生物の肝炎を予防又は治療することができる。
【００５２】
本発明のワクチンパルス樹状細胞において、前記肝炎ワクチンは、ＨＢｓ抗原を含むＨＢワクチンであることが好ましい。これによれば、生物、例えば健常者を含むヒトに、安全かつ有効に用いることができるＢ型肝炎の予防又は治療に有効な、ＨＢｓ抗原提示能を有するワクチンパルス樹状細胞を提供することができる。
【００５３】
６、ワクチンパルス樹状細胞の製造方法
本発明のワクチンパルス樹状細胞の製造方法は、樹状細胞をワクチンでパルスする工程を含むことを特徴とする。これによれば、疾患の予防又は治療に有効な、ワクチンパルス樹状細胞を得ることができる。
【００５４】
本発明のワクチンパルス樹状細胞の製造方法はさらに、血液から前記樹状細胞を得る工程を含むことが好ましい。これによれば、血液由来の樹状細胞から、本発明のワクチンパルス樹状細胞を得ることが可能である。また、血液を用いれば、従来公知の方法等を用いて、比較的簡便な操作によって樹状細胞を得ることが可能である。
【００５５】
本発明のワクチンパルス樹状細胞の製造方法はさらに、生物から前記血液を採取する工程を含むことが好ましい。
【００５６】
本発明のワクチンパルス樹状細胞の製造方法において、前記生物は、ヒトであることが好ましい。これによれば、ヒト疾患の予防又は治療に有効な、ワクチンパルス樹状細胞を得ることが可能である。
【００５７】
本発明のワクチンパルス樹状細胞の製造方法において、前記パルスに使用するワクチンは、疾患の予防又は治療ワクチンであることが好ましい。これによれば、前記疾患の予防又は治療に有効な、ワクチンパルス樹状細胞を提供することができる。
【００５８】
本発明のワクチンパルス樹状細胞の製造方法において、前記パルスに使用するワクチンは、肝炎ワクチンであることが好ましい。これによれば、生物、例えば健常者を含むヒトに、安全かつ有効に用いることができる肝炎の予防又は治療に有効な、肝炎ウイルス抗原提示能を有する肝炎ワクチンパルス樹状細胞を提供することができる。
【００５９】
本発明のワクチンパルス樹状細胞の製造方法において、前記肝炎ワクチンは、ＨＢｓ抗原を含むＨＢワクチンであることが好ましい。これによれば、生物、例えば健常者を含むヒトに、安全かつ有効に用いることができるＢ型肝炎の予防又は治療に有効な、ＨＢｓ抗原提示能を有するワクチンパルス樹状細胞を提供することができる。
【００６０】
７、ワクチンパルス樹状細胞を含む組成物
本発明のワクチンパルス樹状細胞を含む組成物は、本発明のワクチンパルス樹状細胞を含むことを特徴とする。これによれば、本発明のワクチンパルス樹状細胞を、例えば、他の物質と混合した状態、他の物質に懸濁した状態、他の物質と組み合わせた状態等で使用することができる。具体的には、本発明のＨＢｓ抗原提示能を有する樹状細胞を、例えば、ＰＢＳ、生理食塩水、ＲＰＭＩ １６４０培地等に懸濁した態様や、本発明のＨＢｓ抗原提示能を有する樹状細胞に、例えば、ＴＮＦ−α、ＩＬ−１２、ＨＢワクチン、ＧＭ−ＣＳＦ、ＯＫ４３２、その他免疫賦活剤等を添加した態様で用いることができる。従って、本発明によれば、本発明のワクチンパルス樹状細胞を、使用目的に適した態様で又は本発明のワクチンパルス樹状細胞の効果を高める態様で使用することが可能になる。
【００６１】
本発明のワクチンパルス樹状細胞を含む組成物は、さらにワクチン添加物を含むことが好ましい。
【００６２】
本発明のワクチンパルス樹状細胞を含む組成物において、前記組成物は、実験試薬又は実験キットであることが好ましい。これによれば、本発明のワクチンパルス樹状細胞を、研究、例えば免疫研究に適した態様で用いることができる。
【００６３】
本発明のワクチンパルス樹状細胞を含む組成物において、前記組成物は、医薬組成物であることが好ましい。これによれば、本発明のワクチンパルス樹状細胞を、医療、例えば、疾患の予防又は治療に適した態様で用いることができる。
【００６４】
本発明のワクチンパルス樹状細胞を含む組成物において、前記組成物は、免疫応答活性化製剤であることが好ましい。これによれば、本発明のワクチンパルス樹状細胞を、ワクチンに含まれていた抗原に対する免疫応答を活性化するのに適した投与剤形で用いることができる。
【００６５】
本発明のワクチンパルス樹状細胞を含む組成物において、前記組成物は、細胞ワクチンであることが好ましい。これによれば、本発明のワクチンパルス樹状細胞を、生体内に直接投与することが可能になり、ワクチンに含まれていた抗原に対する免疫応答を活性化することができる。
【００６６】
本発明のワクチンパルス樹状細胞を含む組成物において、前記細胞ワクチンは、疾患の予防又は治療ワクチンであることが好ましい。これによれば、前記細胞ワクチンに含まれる本発明のワクチンパルス樹状細胞が、生体内で、ワクチンに含まれていた抗原に対する免疫応答を活性化することによって、前記疾患を予防又は治療することが可能になる。
【００６７】
８、ワクチンパルス樹状細胞を用いた疾患の予防又は治療方法
本発明のワクチンパルス樹状細胞を用いた疾患の予防又は治療方法は、本発明のワクチンパルス樹状細胞を用いることを特徴とする。これによれば、本発明のワクチンパルス樹状細胞が、ワクチンに含まれていた抗原に対する免疫応答を活性化することによって、前記疾患を予防又は治療することができる。例えばヒトの場合、前記疾患を予防又は治療するためにこれまで用いられてきたワクチンが非奏功であった健常者又は免疫能の低下を伴う疾患にかかっている人、免疫抑制剤投与中の人等、ワクチンが十分な効果を発揮できなかった人が、本発明の疾患の予防又は治療方法によって、抗体を産生することができるようになり、前記疾患を予防又は治療することが可能になる。
【００６８】
本発明のワクチンパルス樹状細胞を用いた疾患の予防又は治療方法において、本発明のワクチンパルス樹状細胞を、生物に投与する工程を含むことが好ましい。これによれば、本発明のワクチンパルス樹状細胞が、生体内で、ワクチンに含まれていた抗原に対する免疫応答を活性化することによって、前記疾患を予防又は治療することができる。また、本発明の疾患の予防又は治療方法は、ワクチンを直接生体内に投与することによるこれまでの疾患の予防又は治療方法と比較して、高い効果を発揮することが可能である。
【００６９】
本発明のワクチンパルス樹状細胞を用いた疾患の予防又は治療方法において、前記生物は、ヒトであることが好ましい。これによれば、ヒトの疾患を予防又は治療することが可能である。
【００７０】
９、ヒト用ワクチンパルス樹状細胞
本発明のヒト用ワクチンパルス樹状細胞は、ヒトのＢ型肝炎の予防又は治療のためのワクチンパルス樹状細胞であり、前記ワクチンパルス樹状細胞は、Ｂ型肝炎患者又はＢ型肝炎ウイルスキャリアから末梢血を採取し、その末梢血から単離した単球を用いて樹状細胞を得る樹状細胞取得工程および前記樹状細胞をワクチンでパルスするパルス工程を含む製造方法によって得られたワクチンパルス樹状細胞であり、前記パルスに使用するワクチンは、Ｂ型肝炎の予防又は治療のためのワクチンであることを特徴とする。
【００７１】
本発明のヒト用ワクチンパルス樹状細胞において、前記ワクチンパルス樹状細胞は、例えば、Ｔｈ２を誘導し、Ｔｈ１を誘導しないことが好ましく、さらにＣＴＬを誘導しないことがより好ましい。
【００７２】
本発明のヒト用ワクチンパルス樹状細胞は、以下のような利点を有する。癌治療等で行われている樹状細胞療法においては、細胞傷害性Ｔ細胞（ＣＴＬ）の誘導を目的としているため、Ｔｈ１の誘導を促進し、Ｔｈ２を誘導しないように樹状細胞を活性化させている。これに対し、本発明のヒト用ワクチンパルス樹状細胞は、例えば、Ｔｈ２を誘導し、Ｔｈ１およびＣＴＬを誘導しないため、癌治療等で行われてきた樹状細胞療法とはメカニズムが全く異なる。つまり、本発明におけるワクチンパルス樹状細胞よれば、例えば、ＣＴＬを誘導することなく抗体の産生が可能となり、ＣＴＬによる肝細胞の攻撃に伴う肝障害（例えば、劇症肝炎等）を引き起こすこともない。従って、本発明のヒト用ワクチンパルス樹状細胞は、Ｂ型肝炎患者およびＢ型肝炎ウイルスキャリアに極めて有用である。なお、本発明のヒト用ワクチンパルス樹状細胞がＴｈ１やＣＴＬを誘導しないというメカニズムは不明である。
【００７３】
本発明のヒト用ワクチンパルス樹状細胞において、前記樹状細胞をワクチンでパルスする工程において、パルス時間は、例えば、８時間〜２４時間であることが好ましい。また、前記樹状細胞取得工程において、単離した単球をＧＭ−ＣＳＦおよびＩＬ−４で共培養することが好ましい。
【００７４】
１０、ヒト用ワクチンパルス樹状細胞の製造方法
本発明のヒト用ワクチンパルス樹状細胞の製造方法は、Ｂ型肝炎患者又はＢ型肝炎ウイルスキャリアから末梢血を採取し、その末梢血から単離した単球を用いて樹状細胞を得るヒト由来の血液から樹状細胞を得る樹状細胞取得工程、および、前記樹状細胞をワクチンでパルスして、ヒトのＢ型肝炎の予防又は治療のためのワクチンパルス樹状細胞を得るパルス工程を含む製造方法であって、前記パルス工程においてパルスに使用するワクチンは、Ｂ型肝炎の予防又は治療のためのワクチンであることを特徴とする。本発明の製造方法により得られたヒト用ワクチンパルス樹状細胞によれば、ヒトにおいて、例えば、Ｔｈ２を誘導し、Ｔｈ１を誘導しないことが好ましく、さらにＣＴＬを誘導しないことが好ましい。
【００７５】
本発明のヒト用ワクチンパルス樹状細胞の製造方法において、前記ワクチンパルス工程におけるパルス時間は、８時間〜２４時間であることが好ましい。
【００７６】
本発明のヒト用ワクチンパルス樹状細胞の製造方法の前記樹状細胞取得工程において、単離した単球をＧＭ−ＣＳＦおよびＩＬ−４と共培養することが好ましい。
【００７７】
１１、ヒトＢ型肝炎のための治療および予防のための医薬品
本発明のヒトＢ型肝炎のための治療および予防のための医薬品は、前記本発明のヒト用ワクチンパルス樹状細胞を含むことを特徴とする。本発明の医薬品において、本発明のワクチンパルス樹状細胞が、例えば、Ｔｈ２を誘導し、Ｔｈ１を誘導しないことが好ましく、さらにＣＴＬを誘導しないことが好ましい。このように、ＣＴＬを誘導しないため、本発明の医薬品によれば、例えば、ＣＴＬによる肝細胞の攻撃等により、劇症肝炎を引き起こすこともない。さらに、本発明の医薬品によれば、Ｂ型肝炎患者はもちろんのこと、Ｂ型肝炎を予防又は治療するためにこれまで用いられてきたワクチンが非奏功であった健常者等、ワクチンが十分な効果を発揮できなかった人が、抗体を産生することができるようになり、Ｂ型肝炎を予防又は治療することが可能になる。前記Ｂ型肝炎としては、Ｂ型慢性肝炎があげられる。本発明のヒトＢ型肝炎のための治療および予防のための医薬品の投与形態は特に制限されないが、例えば、皮下投与することが好ましい。
【００７８】
１２、ワクチンパルス樹状細胞を用いたヒトのＢ型肝炎の予防又は治療方法
本発明のヒト用ワクチンパルス樹状細胞を用いたヒトのＢ型肝炎の予防又は治療方法は、自己の樹状細胞由来のワクチンパルス樹状細胞をＢ型肝炎患者又はＢ型肝炎ウイルスキャリアに投与することを含む予防又は治療方法であって、前記ワクチンパルス樹状細胞は、Ｂ型肝炎患者又はＢ型肝炎ウイルスキャリアから末梢血を採取し、その末梢血から単離した単球を用いて樹状細胞を得る樹状細胞取得工程および前記樹状細胞をワクチンでパルスするパルス工程を含む製造方法によって得られたヒト用ワクチンパルス樹状細胞であり、前記パルスに使用するワクチンは、Ｂ型肝炎の予防又は治療のためのワクチンであることを特徴とする。
【００７９】
本発明のヒト用ワクチンパルス樹状細胞を用いたヒトのＢ型肝炎の予防又は治療方法において、本発明のヒト用ワクチンパルス樹状細胞が、例えば、Ｔｈ２を誘導し、Ｔｈ１を誘導しないことが好ましく、さらにＣＴＬを誘導しないことが好ましい。本発明の予防又は治療方法によれば、Ｂ型肝炎患者はもちろんのこと、Ｂ型肝炎を予防又は治療するためにこれまで用いられてきたワクチンが非奏功であった健常者等、ワクチンが十分な効果を発揮できなかった人が、抗体を産生することができるようになり、Ｂ型肝炎を予防又は治療することが可能になる。さらに、本発明の予防又は治療方法は、Ｂ型肝炎患者又はＢ型肝炎ウイルスキャリア自身の樹状細胞を使用しているため、安全性が極めて高いものとなる。前記Ｂ型肝炎としては、Ｂ型慢性肝炎があげられる。本発明のヒト用ワクチンパルス樹状細胞を用いたヒトのＢ型肝炎の予防又は治療方法において、ヒト用ワクチンパルス樹状細胞の投与形態は特に制限されないが、例えば、皮下投与が好ましい。
【００８０】
１３、ヒトＢ型肝炎の治療又は予防のためのヒト用ワクチンパルス樹状細胞の使用
本発明のヒトＢ型肝炎の治療又は予防のためのヒト用ワクチンパルス樹状細胞の使用は、前記ワクチンパルス樹状細胞は、Ｂ型肝炎患者又はＢ型肝炎ウイルスキャリアから末梢血を採取し、その末梢血から単離した単球を用いて樹状細胞を得る樹状細胞取得工程および前記樹状細胞をワクチンでパルスするパルス工程を含む製造方法によって得られたヒト用ワクチンパルス樹状細胞であり、前記パルスに使用するワクチンは、Ｂ型肝炎の予防又は治療のためのワクチンであり、前記ワクチンパルス樹状細胞を、末梢血を採取したＢ型肝炎患者又はＢ型肝炎ウイルスキャリアに投与することを含むことを特徴とする。
【００８１】
本発明のヒト用ワクチンパルス樹状細胞をヒトＢ型肝炎の治療又は予防に使用すれば、Ｂ型肝炎患者はもちろんのこと、Ｂ型肝炎を予防又は治療するためにこれまで用いられてきたワクチンが非奏功であった健常者等、ワクチンが十分な効果を発揮できなかった人が、抗体を産生することができるようになり、Ｂ型肝炎を予防又は治療することが可能になる。さらに、Ｂ型肝炎患者又はＢ型肝炎ウイルスキャリア自身の樹状細胞を使用しているため、安全性が極めて高いものとなる。本発明のヒト用ワクチンパルス樹状細胞が、例えば、Ｔｈ２を誘導し、Ｔｈ１を誘導しないことが好ましく、さらにＣＴＬを誘導しないことが好ましい。前記Ｂ型肝炎としては、Ｂ型慢性肝炎があげられる。
【図面の簡単な説明】
【００８２】
【図１】図１は、実施例１におけるＨＢワクチンパルス樹状細胞投与前の抗ＨＢｓ抗体値を示す。
【図２】図２は、前記実施例におけるＨＢワクチンパルスによる、樹状細胞のＨＬＡ−ＤＲ及びＣＤ８６の変化を示すグラフである。
【図３】図３は、前記実施例におけるＨＢワクチンパルスによる、樹状細胞のＴ細胞幼若化補助能の変化を示すグラフである。
【図４】図４は、前記実施例におけるＨＢｓメモリーＴ細胞を用いた、ＨＢワクチンパルス樹状細胞がＨＢｓメモリーＴ細胞の増殖能に及ぼす効果を示すグラフである。
【図５】図５は、前記実施例におけるＨＢｓメモリーＴ細胞を用いた、ＨＢワクチンパルス樹状細胞が抗ＨＢｓ抗体産生能に及ぼす効果を示すグラフである。
【図６】図６は、前記実施例における血液生化学的検査による、ＨＢワクチンパルス樹状細胞の安全性テストの検査項目を示す。
【図７】図７は、前記実施例におけるＡＬＴ検査の結果を示すグラフである。
【図８】図８は、前記実施例におけるＣＲＰ検査の結果を示すグラフである。
【図９】図９は、前記実施例におけるＰＴ検査の結果を示すグラフである。
【図１０】図１０は、前記実施例におけるＣｒｅａｔｉｎｉｎｅ検査の結果を示すグラフである。
【図１１】図１１は、前記実施例における血清生化学的検査を用いた自己免疫反応に関する安全性テストの結果を示すグラフである。
【図１２】図１２は、前記実施例におけるＨＢワクチンパルス樹状細胞投与による、抗ＨＢｓ抗体値の変化を示す。
【図１３】図１３は、前記実施例におけるＨＢワクチンパルス樹状細胞投与による、抗ＨＢｓ抗体値の変化を示すグラフである。
【図１４】図１４は、前記実施例におけるＨＢワクチンパルス樹状細胞投与による、ＨＢワクチンｎｏｎ−ｒｅｓｐｏｎｄｅｒの抗ＨＢｓ抗体値の推移を示すグラフである。
【図１５】図１５は、実施例２における血清生化学的検査を用いた自己免疫反応に関する安全性テストの結果を示すグラフである。
【図１６】図１６は、実施例３におけるＨＢワクチンパルス樹状細胞投与による、抗ＨＢｓ抗体値の変化を示すグラフである。
【発明を実施するための最良の形態】
【００８３】
以下、本発明の最良の実施の形態を説明する。本発明は、以下の実施形態に限定されず、本発明の要旨を超えない範囲で種々の変更が可能である。
【００８４】
１、ＨＢｓ抗原提示能を有する樹状細胞
本実施の形態に係るＨＢｓ抗原提示能を有する樹状細胞は、樹状細胞をＨＢｓ抗原でパルスする工程を含む方法によって得られる。本実施の形態に係るＨＢｓ抗原提示能を有する樹状細胞によれば、Ｂ型肝炎の予防又は治療に有効な、ＨＢｓ抗原提示能を有する樹状細胞を提供することができる。
【００８５】
本実施の形態において、「樹状細胞を抗原でパルスする」とは、樹状細胞を、抗原を取り込んで前記樹状細胞内で分解し、前記分解した抗原をペプチドとして提示しうる状態にすることを言う。
【００８６】
本実施の形態において、樹状細胞を抗原でパルスする具体的な方法としては、例えば、適切なサイトカイン等の存在下に、抗原と樹状細胞とを共存させて培養する方法が挙げられる。
【００８７】
樹状細胞を得る方法は、最終的に、抗原を取り込みこの抗原を提示しうる樹状細胞が得られれば特に限定されず、種々の手法を用いることができる。
【００８８】
例えば、血液から樹状細胞を得ることができる。具体的には、例えば、当業者に公知の方法を利用して、樹状細胞の前駆細胞を含む血液から樹状細胞を分化誘導する方法又は血液から樹状細胞を直接分離する方法を用いることができる。より具体的には、例えば、骨髄細胞、臍帯血又は末梢血のＣＤ３４陽性前駆細胞から主にＧＭ−ＣＳＦとＴＮＦ−αを用いて誘導する方法、臍帯血単核球又は末梢血単核球から主にＧＭ−ＣＳＦとＩＬ−４を用いて誘導する方法、末梢血単核球から主にＧＭ−ＣＳＦとＩＦＮ−αを用いて誘導する方法、末梢血単核球より直接分離する方法等によって、樹状細胞を得ることができる。
【００８９】
また、これらの樹状細胞を得る方法は、必要に応じてさらに、生物から血液を採取する工程を含むこともできる。前記生物は、Ｂ型肝炎に感染する可能性の有無によって特に限定されるものではないが、例えば、Ｂ型肝炎に感染しうる生物であることが好ましい。前記Ｂ型肝炎に感染しうる生物には、Ｂ型肝炎に自然に感染しうる生物や、Ｂ型肝炎を人工的に感染させることができる生物を含むことが好ましい。具体的には、前記Ｂ型肝炎に自然に感染しうる生物としては、例えば、ヒト、チンパンジー等の霊長類や、ウッドチャック、ペキンダック等のアヒル等、前記Ｂ型肝炎を人工的に感染させることができる生物としては、例えば、リス、ラット、カモ、ガチョウ、サギ、ツル、マウス等を挙げることができる。特に、Ｂ型肝炎による死亡者が世界で増加している点からも、本発明を、前記生物がヒトである場合に使用できる効果は大きい。
【００９０】
また、血液を利用せずに樹状細胞を得る方法としては、例えば、ＥＳ細胞を分化誘導して樹状細胞を得る方法があげられる。具体的には、例えば、胚盤胞の内部に存在する内部細胞塊から樹立されたＥＳ細胞を、適切なフィーダー細胞やサイトカインとともに培養することによって、樹状細胞に分化誘導することができる。
【００９１】
本実施の形態において、樹状細胞を培養する培地については、樹状細胞の前駆細胞から樹状細胞への分化誘導、樹状細胞の生存、抗原による樹状細胞のパルス等を阻害しない限り特に限定されないが、例えば、ＲＰＭＩ １６４０培地等を用いることができる。また、好ましくはＲＰＭＩ １６４０培地である。
【００９２】
本実施の形態において、樹状細胞の誘導には、サイトカインを使用することができる。樹状細胞の誘導に用いるサイトカインとしては、樹状細胞への分化誘導、樹状細胞の生存、抗原による樹状細胞のパルス等を阻害しない限り特に限定されないが、例えば、ＧＭ−ＣＳＦ、ＴＮＦ−α、ＩＬ−４、ＩＦＮ−α等を用いることができる。
【００９３】
本実施の形態において、ＨＢｓ抗原の態様は、最終的に、樹状細胞によって提示されることが可能ならば特に限定されず、完全なタンパク質の抗原でも、ペプチド抗原でもよい。
【００９４】
また、本実施の形態に係るＨＢｓ抗原は、例えば、様々な物質や液体と組み合わせた態様で用いることができる。具体的には、例えば、ＨＢｓ抗原をリポソーム等のリン脂質二重膜を用いて樹状細胞内に導入することや、ＨＢｓ抗原を緩衝液、例えばＰＢＳや、培地、例えばＲＰＭＩ １６４０培地に懸濁して樹状細胞に導入することができる。
【００９５】
また、ＨＢｓ抗原の添加時期は、結果として、ＨＢｓ抗原が樹状細胞によって提示されることが可能ならば特に限定されず、例えば、樹状細胞を分化誘導した後に添加することができる。また、分化誘導時にＨＢｓ抗原を添加して、一緒に培養することもできる。また、ＨＢｓ抗原のパルス時間も、結果として、ＨＢｓ抗原が樹状細胞によって提示されることが可能ならば特に限定されず、例えば、８時間から２４時間であることが好ましい。また、ＨＢｓ抗原は、ＨＢワクチンに含まれるＨＢｓ抗原であることが好ましい。
【００９６】
ワクチンには、例えば、生ワクチン、不活化ワクチン、トキソイド等、いくつかの種類が存在する。生ワクチンは、例えば、病原性を弱めたウイルスや細菌を生きたまま接種するワクチンを言う。不活化ワクチンは、例えば、ウイルスの粒子や細菌の菌体等を精製し、加熱やホルマリン等の薬剤を用いて処理して、病原性を消失又は無毒化して作られるワクチンを言う。トキソイドは、例えば、菌の毒素のみを取り出して精製し、ホルマリンを加えて免疫原性を失わせずに無毒化したものを言う。
【００９７】
本実施の形態におけるＨＢワクチンは、ＨＢｓ抗原が含まれていればその種類が限定されるものではないが、現在日本において、ヒトに使用が許可され販売されているＨＢワクチンは、不活化ワクチンに分類される。本実施の形態において、不活化ワクチンであるＨＢワクチンを用いる場合は、例えば、組換え沈降Ｂ型肝炎ワクチンや、沈降Ｂ型肝炎ワクチンを用いることができる。
【００９８】
組換え沈降Ｂ型肝炎ワクチンとしては、例えば、Ｂ型肝炎ウイルスＤＮＡのＨＢｓ抗原に相当する部分を、酵母菌や動物細胞等のＤＮＡに挿入し発現させることで、ワクチンの有効成分であるＨＢｓ抗原を作り、免疫増進剤のアルミニウムゲルを加えて調整したワクチンを用いることができる。動物細胞として、例えば、ＣＨＯ細胞を用いて調整したワクチンを用いることができる。
【００９９】
沈降Ｂ型肝炎ワクチンとしては、例えば、動物細胞等により生産されたＨＢｓ抗原を精製した後、アルミニウムゲルを加えて調整したワクチンを用いることができる。動物細胞として、例えば、ｈｕＧＫ−１４細胞を用いて調整したワクチンを用いることができる。
【０１００】
２、ＨＢｓ抗原提示能を有する樹状細胞の製造方法
本実施の形態に係るＨＢｓ抗原提示能を有する樹状細胞の製造方法は、樹状細胞をＨＢｓ抗原でパルスする工程を含む。これによれば、Ｂ型肝炎の予防又は治療に有効な、ＨＢｓ抗原提示能を有する樹状細胞を得ることができる。
【０１０１】
前記製造方法はさらに、血液から前記樹状細胞を得る工程を含むことが好ましい。これによれば、血液由来の樹状細胞から、本発明のＨＢｓ抗原提示能を有する樹状細胞を得ることが可能である。また、血液を用いれば、従来公知の方法等を用いて、比較的簡便な操作によって樹状細胞を得ることが可能である。
【０１０２】
また、前記製造方法はさらに、生物から前記血液を採取する工程を含むことが好ましい。
【０１０３】
前記生物は、ヒトであることが好ましい。これによれば、ヒトのＢ型肝炎の予防又は治療に有効な、ＨＢｓ抗原提示能を有する樹状細胞を得ることが可能である。
【０１０４】
また、前記ＨＢｓ抗原は、ＨＢワクチンに含まれるＨＢｓ抗原であることが好ましい。これによれば、生物、例えば健常者を含むヒトに、安全かつ有効に用いることができるＢ型肝炎の予防又は治療に有効な、ＨＢｓ抗原提示能を有する樹状細胞を提供することができる。
【０１０５】
３、ＨＢｓ抗原提示能を有する樹状細胞を含む組成物
本実施の形態に係る組成物は、本実施の形態に係るＨＢｓ抗原提示能を有する樹状細胞を含むことが好ましい。
【０１０６】
また、本実施の形態に係る組成物はさらに、ＨＢワクチン添加物を含むことが好ましい。
【０１０７】
本実施の形態において、「本実施の形態に係る組成物はさらに、ＨＢワクチン添加物を含む」とは、ＨＢワクチン添加物が、本実施の形態に係る組成物全体中のどこかに含まれている状態を言うとする。すなわち、ＨＢワクチン添加物が含まれる場所は、本実施の形態に係る組成物中の樹状細胞の外、中、細胞膜上等どこでもよく、特に限定されない。本実施の形態に係る組成物がワクチン添加物を含むことにより、ＨＢｓ抗原として、ＨＢワクチンに含まれるＨＢｓ抗原を用いて本実施の形態に係るＨＢｓ抗原提示能を有する樹状細胞を得たことが、判定可能となる。
【０１０８】
ＨＢワクチン添加物としては、例えば、保存剤、抗生物質、安定剤、防腐剤、免疫増進薬、緩衝剤、等張化剤等を挙げることができる。具体例としては、チメロサール、硫酸アルミニウムカリウム、水酸化ナトリウム、塩化アルミニウム、酢酸、酢酸ナトリウム、塩化ナトリウム等を挙げることができる。なお、ＨＢワクチン添加物はこれらに限定されない。
【０１０９】
ＨＢワクチン添加物の検出方法としては、例えば、公知の分析方法を用いることができる。具体的には、例えば、各種クロマトグラフを用いた分離分析、定量分析や、赤外線分光分析、核磁気共鳴分析、質量分析、元素分析などによる構造分析等を挙げることができる。
【０１１０】
本実施の形態に係る組成物は、実験試薬又は実験キットであることが好ましい。これによって、本実施の形態に係るＨＢｓ抗原提示能を有する樹状細胞を、様々な研究に適した態様で用いることができる。用いうる研究分野としては、例えば、免疫応答、免疫寛容、サイトカイン産生に関するシグナル伝達メカニズムについての研究や、樹状細胞を用いた免疫療法についての研究が挙げられる。また、例えば、Ｂ型肝炎の予防又は治療に関わる研究、例えば、遺伝子、ＲＮＡ、ペプチド、タンパク質、化合物、医薬、サイトカイン等のスクリーニング等の目的にも用いることができる。
【０１１１】
また、本実施の形態に係る組成物は、医薬組成物であることが好ましい。本実施の形態に係る医薬組成物は、例えば、生体内に直接投与する態様や、生体外で他の物質や細胞と混合する態様で用いることができる。
【０１１２】
また、本実施の形態に係る組成物は、免疫応答活性化製剤であることが好ましい。本実施の形態に係る免疫応答活性化製剤は、例えば、生体内に直接投与する態様や、生体外で他の物質や細胞と混合する態様で用いることができる。
【０１１３】
本実施の形態に係る組成物を生体外で用いる態様としては、例えば、本実施の形態に係る免疫応答活性化製剤とＴ細胞を混合して、ＨＢｓ抗原エピトープをＴ細胞に提示することによってＴ細胞を活性化する使用方法が挙げられる。また、このＴ細胞は生体内に投与して用いることが可能である。
【０１１４】
また、本実施の形態に係る組成物を生体内に直接投与する態様としては、例えば、細胞ワクチンとしての注射や点滴が挙げられる。細胞ワクチンとしては、好ましくは、Ｂ型肝炎の予防又は治療ワクチンである。また、本実施の形態に係る組成物を生体内に直接投与する場所としては、例えば、静脈内投与、動脈内投与、胸腔内投与、腹腔内投与、皮下投与、筋肉中投与、組織内（例えば肝臓内）投与、リンパ節投与等が挙げられる。投与の簡潔さの点から、皮下注射が好ましい。
【０１１５】
４、ＨＢｓ抗原提示能を有する樹状細胞を用いたＢ型肝炎の予防又は治療
本実施の形態に係るＨＢｓ抗原提示能を有する樹状細胞は、例えば、Ｂ型肝炎の予防又は治療に用いることができる。
【０１１６】
ＨＢｓ抗原提示能を有する樹状細胞を用いたＢ型肝炎の予防又は治療は、例えば、従来のＢ型肝炎の予防又は治療方法と組み合わせて用いることができる。
【０１１７】
また、本実施の形態に係るＨＢｓ抗原提示能を有する樹状細胞を用いたＢ型肝炎の予防又は治療は、ＨＢｓ抗原提示能を有する樹状細胞を、生物に投与する工程を含むことが好ましい。前記生物としては、例えば、前述のようなＢ型肝炎に感染しうる生物を挙げることができる。また、拒絶反応を抑えることができれば、樹状細胞が由来とする生物と、投与対象となる生物が、同種生物でも異種生物でもよい。同種生物の場合においては、本実施の形態に係る樹状細胞を、取り出した自己の体内に投与することも、組織適合性抗原が投与可能な程度に一致している非自己の体内に投与することも可能である。
【０１１８】
例えば、前記生物は、ヒトであることが好ましい。この場合、ＨＬＡの型が可能な限り一致していることが望ましい。従って、樹状細胞の由来は、好ましくは、血縁にあたる提供者に由来する樹状細胞である。自家細胞を用いればＨＬＡの型の適合性を考慮する必要がないため、より好ましくは、投与対象の本人に由来する樹状細胞である。
【０１１９】
本実施の形態に係るＨＢｓ抗原提示能を有する樹状細胞は、前述のように、生体内に直接投与する態様で用いることや、生体外でＴ細胞と混合してＴ細胞を活性化し、このＴ細胞は生体内に投与する態様で用いることが可能である。しかし、Ｔ細胞はエフェクター細胞であるため、一度機能を果たすと短時間で死に、消失してしまう。従って、Ｂ形肝炎を予防、治療するためには、Ｔ細胞を高頻度で繰り返し投与する必要がある。それに対し、樹状細胞は、ナイーブＴ細胞やＨＢｓメモリーＴ細胞、Ｂ細胞にも作用し、繰り返し刺激を与えるため、長時間でかつ強力な効果をもたらす。以上のことから、本実施の形態に係るＨＢｓ抗原提示能を有する樹状細胞を、生体内に直接投与する態様で用いる方がより好ましいと考えられる。
【０１２０】
５、本実施の形態に係るＨＢｓ抗原提示能を有する樹状細胞の使用例及びその効果
以下に、本実施の形態に係るＨＢｓ抗原提示能を有する樹状細胞の使用例及びその効果について示す。本使用例では、本実施の形態に係るＨＢｓ抗原提示能を有する樹状細胞を、ヒトに投与する工程を含むことが好ましい。本使用例は、Ｂ型肝炎の予防又は治療に適用することができる。なお、本使用例は、以下の場合に限定されず、本使用例に係る樹状細胞の使用態様は、本発明の要旨を超えない範囲で種々の変更が可能である。
【０１２１】
５−１、Ｂ型肝炎の予防への適用
健常者のうちの約１０％は、ＨＢワクチンに対して非奏功である人（ｎｏｎ−ｒｅｓｐｏｎｄｅｒ）であり、ＨＢワクチンを投与しても抗ＨＢｓ抗体を産生することができないことが知られている。Ｂ型肝炎は血液を介して感染するため、医療従事者等は、特に抗ＨＢｓ抗体の必要性が高いと考えられるが、これらの人々においてもＨＢワクチンｎｏｎ−ｒｅｓｐｏｎｄｅｒが少なくない。
【０１２２】
そこで、これらのＨＢワクチンｎｏｎ−ｒｅｓｐｏｎｄｅｒに、本実施の形態に係るＨＢｓ抗原提示能を有する樹状細胞を投与することによって、これらの人々が抗ＨＢｓ抗体を産生することが可能になる。Ｂ型肝炎の感染を予防するには、抗ＨＢｓ抗体値を少なくとも１０ｍＩＵ／ｍＬに維持することが必要であると言われている。後述の実験例１１の結果によれば、本実施の形態に係るＨＢｓ抗原提示能を有する樹状細胞を１回投与したことによって、ＨＢワクチンｎｏｎ−ｒｅｓｐｏｎｄｅｒの抗ＨＢｓ抗体値が平均３０ｍＩＵ／ｍＬまで上昇し、１０ｍＩＵ／ｍＬ以上の値をおよそ３〜６ヶ月間維持できることがわかった。従って、本実施の形態に係るＨＢｓ抗原提示能を有する樹状細胞によって、現在のＨＢワクチンｎｏｎ−ｒｅｓｐｏｎｄｅｒが抗ＨＢｓ抗体を産生できるようになり、Ｂ型肝炎に感染するのを予防することができる。
【０１２３】
また、現在、Ｂ型肝炎の予防に用いられているＨＢワクチンは、一定期間ごとに通常３回の接種を行う必要がある。後述の実験例１１の結果によれば、本実施の形態に係るＨＢｓ抗原提示能を有する樹状細胞を１回投与することによって、ＨＢワクチンｎｏｎ−ｒｅｓｐｏｎｄｅｒのみならず、ＨＢワクチンが奏功する健常者（ｒｅｓｐｏｎｄｅｒ）の抗ＨＢｓ抗体値も高めることが可能であることがわかった。従って、本実施の形態に係るＨＢｓ抗原提示能を有する樹状細胞は、ＨＢワクチンｎｏｎ−ｒｅｓｐｏｎｄｅｒのみならず、ＨＢワクチンｒｅｓｐｏｎｄｅｒに対しても、新たなＢ型肝炎の予防手段として用いることができ、接種回数と経済的負担を減らすことができる可能性がある。
【０１２４】
また、ＨＩＶ患者、肝疾患患者、透析患者、肥満者、喫煙者等の免疫能が低下している人にも、従来のＨＢワクチンが十分に効果を発揮できないことが知られている。このような人々も、本実施の形態に係るＨＢｓ抗原提示能を有する樹状細胞を用いることによって、抗ＨＢｓ抗体を産生することが可能になると考えられる。
【０１２５】
５−２、Ｂ型肝炎の治療への適用
Ｂ型肝炎の治療には、これまで主に抗ウイルス剤が用いられてきた。しかし、抗ウイルス剤を長期間投与することにより、抗ウイルス剤が効かない変異ウイルスが高頻度で出現することが知られている。その結果、Ｂ型肝炎ウイルス量が再上昇し、肝炎の憎悪をまねく危険性があった。
【０１２６】
そこで、本実施の形態に係るＨＢｓ抗原提示能を有する樹状細胞を用いれば、このような変異ウイルスの出現頻度を下げることができると予想され、これはＢ型肝炎治療において大きな利点であると考えられる。
【０１２７】
また、肝移植対象者等の免疫抑制剤投与中の人も、免疫抑制状態であるために通常のＨＢワクチンが効かず、抗ＨＢｓ抗体を産生できない。しかし、Ｂ型肝炎関連肝移植においては、抗ＨＢｓ抗体値を維持することが治療成績に大きな好影響を及ぼすことが知られているため、患者は移植後、抗ＨＢｓヒト免疫グロブリンを２週間に１回の頻度で投与することが必要である。このことは患者に、年間約２５０万円の負担をもたらしており、この経済的問題の解決が世界的に必要とされている。
【０１２８】
そこで、本実施の形態に係るＨＢｓ抗原提示能を有する樹状細胞を患者に投与することにより、患者は、抗ＨＢｓ抗体を産生できるようになると考えられる。さらに、後述の実験例１１の結果より、本実施の形態に係るＨＢｓ抗原提示能を有する樹状細胞を、例えば３〜６ヶ月に１回の頻度で投与することで、１０ｍＩＵ／ｍＬ以上の抗ＨＢｓ抗体値を維持できると予想される。このことから、本実施の形態に係るＨＢｓ抗原提示能を有する樹状細胞を用いれば、抗ＨＢｓヒト免疫グロブリンを用いるよりも投与頻度を大幅に減らすことが可能であり、その結果、患者の経済的負担を大幅に軽減できると考えられる。
【０１２９】
また、従来から存在するＨＢワクチンは、Ｂ型肝炎の予防ワクチンであり、Ｂ型肝炎の治療ワクチンは、あくまでも試験的にしか使用されていなかった。
【０１３０】
それに対して、前述のように、本実施の形態に従ってＨＢワクチンを用いて製造したＨＢｓ抗原提示能を有する樹状細胞は、従来から存在するＨＢワクチンを、Ｂ型肝炎の予防のみならず、治療にも用いることを可能にした。このことは、現在実際に使用されており、安全性、有効性が認められているＨＢワクチンの使用用途を広げるものであり、さらに、従来から存在するＨＢワクチンの効果を高める新たな使用態様を見出したものと言える。
【０１３１】
以上から、本実施の形態に係るＨＢｓ抗原提示能を有する樹状細胞には、広い使用用途と大きな利点が認められる。
【０１３２】
６、ワクチンパルス樹状細胞
本実施の形態に係るワクチンパルス樹状細胞は、樹状細胞をワクチンでパルスする工程を含む方法によって得られる。これによれば、疾患の予防又は治療に有効な、ワクチンパルス樹状細胞を提供することができる。
【０１３３】
前記方法はさらに、血液から樹状細胞を得る工程を含むことが好ましい。
【０１３４】
また、前記方法はさらに、生物から前記血液を採取する工程を含むことが好ましい。前記生物は、ヒトであることが好ましい。
【０１３５】
また、前記方法は、Ｂ型慢性肝炎又はキャリアの患者から末梢血を採取し、その末梢血から単離した単球を用いて樹状細胞を得ることが好ましい。ヒトの場合、末梢血は、安全かつ容易に繰り返し採取することができるからである。
【０１３６】
また、ワクチンの添加時期は、結果として、ワクチンに含まれる抗原が樹状細胞によって提示されることが可能ならば特に限定されず、例えば、樹状細胞を分化誘導した後に添加することができる。また、分化誘導時にワクチンを添加して、一緒に培養することもできる。また、ワクチンによるパルス時間も、結果として、ワクチンに含まれる抗原が樹状細胞によって提示されることが可能ならば特に限定されず、例えば、８時間から２４時間であることが好ましい。
【０１３７】
ワクチンとしては、結果として、前記ワクチンに含まれる抗原が樹状細胞によって提示されることが可能であれば特に限定されず、例えば、生ワクチン、不活化ワクチン、トキソイド、抗毒素等を用いることができる。また、ワクチンの形態も、結果として、前記ワクチンに含まれる抗原が樹状細胞によって提示されることが可能であれば特に限定されず、例えば、液状ワクチン、沈降型ワクチン、凍結乾燥ワクチン等を用いることができる。
【０１３８】
本実施の形態に用いうるワクチンの例として、百日せきワクチン、ジフテリアトキソイド、破傷風トキソイド、ポリオワクチン、麻疹ワクチン、風疹ワクチン、日本脳炎ワクチン、インフルエンザワクチン、ＢＣＧワクチン等の結核ワクチン、おたふくかぜワクチン、水痘ワクチン、Ａ型肝炎ワクチン、Ｂ型肝炎ワクチン、肺炎球菌ワクチン、黄熱ワクチン、狂犬病ワクチン、コレラワクチン、ワイル病秋やみ混合ワクチン、はぶ抗毒素、まむし抗毒素、ペストワクチン、ＭＭＲワクチン、腸チフスワクチン、インフルエンザｂ菌結合型ワクチン、髄膜炎菌ワクチン、赤痢ワクチン、マラリアワクチン等が挙げられる。なお、本実施の形態に用いうるワクチンは、ここに例示したものに限定されない。
【０１３９】
前記パルスに使用するワクチンは、疾患の予防又は治療ワクチンであることが好ましい。例えば、前記パルスに使用するワクチンは、肝炎ワクチンであることが好ましい。前記肝炎ワクチンは、例えば、ＨＢｓ抗原を含むＨＢワクチンであることが好ましい。
【０１４０】
７、ワクチンパルス樹状細胞の製造方法
本実施の形態に係るワクチンパルス樹状細胞の製造方法は、樹状細胞をワクチンでパルスする工程を含む。これによれば、疾患の予防又は治療に有効な、ワクチンパルス樹状細胞を得ることができる。
【０１４１】
前記製造方法はさらに、血液から前記樹状細胞を得る工程を含むことが好ましい。これによれば、血液由来の樹状細胞から、本発明のワクチンパルス樹状細胞を得ることが可能である。また、血液を用いれば、従来公知の方法等を用いて、比較的簡便な操作によって樹状細胞を得ることが可能である。
【０１４２】
また、前記製造方法はさらに、生物から前記血液を採取する工程を含むことが好ましい。
【０１４３】
前記生物は、ヒトであることが好ましい。これによれば、ヒト疾患の予防又は治療に有効な、ワクチンパルス樹状細胞を得ることが可能である。
【０１４４】
また、前記パルスに使用するワクチンは、疾患の予防又は治療ワクチンであることが好ましい。これによれば、前記疾患の予防又は治療に有効な、ワクチンパルス樹状細胞を提供することができる。
【０１４５】
前記パルスに使用するワクチンは、肝炎ワクチンであることが好ましい。これによれば、生物、例えば健常者を含むヒトに、安全かつ有効に用いることができる肝炎の予防又は治療に有効な、肝炎ウイルス抗原提示能を有する肝炎ワクチンパルス樹状細胞を提供することができる。
【０１４６】
前記肝炎ワクチンは、例えば、ＨＢｓ抗原を含むＨＢワクチンであることが好ましい。これによれば、生物、例えば健常者を含むヒトに、安全かつ有効に用いることができるＢ型肝炎の予防又は治療に有効な、ＨＢｓ抗原提示能を有する肝炎ワクチンパルス樹状細胞を提供することができる。
【０１４７】
８、ワクチンパルス樹状細胞を含む組成物
本実施の形態に係る組成物は、本実施の形態に係るワクチンパルス樹状細胞を含むことが好ましい。
【０１４８】
また、本実施の形態に係る組成物はさらに、ワクチン添加物を含むことが好ましい。
【０１４９】
本実施の形態において、「本実施の形態に係る組成物はさらに、ワクチン添加物を含む」とは、ワクチン添加物が、本実施の形態に係る組成物全体中のどこかに含まれている状態を言うとする。すなわち、ワクチン添加物が含まれる場所は、本実施の形態に係る組成物中の樹状細胞の外、中、細胞膜上等どこでもよく、特に限定されない。本実施の形態に係る組成物がワクチン添加物を含むことにより、抗原として、ワクチンに含まれる抗原を用いて、本実施の形態に係るワクチンパルス樹状細胞を得たことが、判定可能となる。
【０１５０】
ワクチン添加物としては、例えば、保存剤、抗生物質、安定剤、防腐剤、免疫増進薬、緩衝剤、等張化剤、着色剤等を挙げることができる。具体例としては、保存剤としてチメロサール、ホルマリン等、抗生物質としてエリスロマイシン、ラクトビオン酸エリスロマイシン、硫酸カナマイシン等、及び、他の添加物が挙げられる。他の添加物としては、例えば、精製白糖、Ｌ−グルタミン酸ナトリウム、ゼラチン、乳糖、グルタミン酸カリウム、Ｄ−ソルビトール、ヒト血清アルブミン、ポリソルベート８０、グリシン、ブドウ糖、水酸化ナトリウム、硫酸アルミニウムカリウム、塩化アルミニウム、酢酸、酢酸ナトリウム、塩化ナトリウム、塩化カリウム、リン酸二水素カリウム、リン酸水素ナトリウム、塩化ナトリウム、フェノールレッド、Ｌ−塩酸アルギニン、リン酸二ナトリウム、リン酸一カリウム、Ｌ−アルギニン酸、塩酸リジン等を挙げることができる。これらの他の添加物は、安定剤、防腐剤、免疫増進薬、緩衝剤、等張化剤、着色剤として添加されることができる。なお、ワクチン添加物はこれらに限定されない。
【０１５１】
本実施の形態に係る組成物は、実験試薬又は実験キットであることが好ましい。これによって、本実施の形態に係るワクチンパルス樹状細胞を、様々な研究に適した態様で用いることができる。用いうる研究分野としては、例えば、その疾患に関するシグナル伝達メカニズムについての研究や、樹状細胞を用いた免疫療法についての研究が挙げられる。また、例えば、その疾患の予防又は治療に関わる研究、例えば、遺伝子、ＲＮＡ、ペプチド、タンパク質、化合物、医薬、サイトカイン等のスクリーニング等の目的にも用いることができる。
【０１５２】
また、本実施の形態に係る組成物は、医薬組成物であることが好ましい。本実施の形態に係る医薬組成物は、例えば、生体内に直接投与する態様や、生体外で他の物質や細胞と混合する態様で用いることができる。
【０１５３】
また、本実施の形態に係る組成物は、免疫応答活性化製剤であることが好ましい。本実施の形態に係る免疫応答活性化製剤は、例えば、生体内に直接投与する態様や、生体外で他の物質や細胞と混合する態様で用いることができる。
【０１５４】
本実施の形態に係る組成物を生体外で用いる態様としては、例えば、本実施の形態に係る免疫応答活性化製剤とＴ細胞を混合して、ワクチンに含まれていた抗原エピトープをＴ細胞に提示することによってＴ細胞を活性化する使用方法が挙げられる。また、このＴ細胞は生体内に投与して用いることが可能である。
【０１５５】
また、本実施の形態に係る組成物を生体内に直接投与する態様としては、例えば、細胞ワクチンとしての注射や点滴が挙げられる。細胞ワクチンとしては、好ましくは、疾患の予防又は治療ワクチンである。また、本実施の形態に係る組成物を生体内に直接投与する場所としては、例えば、静脈内投与、動脈内投与、胸腔内投与、腹腔内投与、皮下投与、筋肉中投与、組織内（例えば肝臓等）投与、リンパ節投与等が挙げられる。投与の簡潔さの点から、皮下注射が好ましい。
【０１５６】
９、ワクチンパルス樹状細胞を用いた疾患の予防又は治療
本実施の形態に係るワクチンパルス樹状細胞は、疾患の予防又は治療に用いることができる。前記疾患としては、Ｂ型肝炎およびＢ型慢性肝炎があげられる。
【０１５７】
本実施の形態に係るワクチンパルス樹状細胞は、例えば、従来のその疾患の予防又は治療方法と組み合わせて用いることができる。
【０１５８】
また、本実施の形態に係る疾患の予防又は治療は、ワクチンパルス樹状細胞を、生物に投与する工程を含むことが好ましい。前記生物としては、例えば、前記疾患に感染しうる生物を挙げることができる。また、拒絶反応を抑えることができれば、樹状細胞が由来とする生物と、投与対象となる生物が、同種生物でも異種生物でもよい。同種生物の場合においては、本実施の形態に係る樹状細胞を、取り出した自己の体内に投与することも、組織適合性抗原が投与可能な程度に一致している非自己の体内に投与することも可能である。
【０１５９】
例えば、前記生物は、ヒトであることが好ましい。この場合、ＨＬＡの型が可能な限り一致していることが望ましい。従って、樹状細胞の由来は、好ましくは、血縁にあたる提供者に由来する樹状細胞である。自家細胞を用いればＨＬＡの型の適合性を考慮する必要がないため、より好ましくは、投与対象の本人に由来する樹状細胞である。
【０１６０】
本実施の形態に係るワクチンパルス樹状細胞は、前述のように、生体内に直接投与する態様で用いることや、生体外でＴ細胞と混合してＴ細胞を活性化し、このＴ細胞を生体内に投与する態様で用いることが可能である。しかし、Ｔ細胞はエフェクター細胞であるため、一度機能を果たすと短時間で死に、消失してしまう。従って、疾患を予防、治療するためには、Ｔ細胞を高頻度で繰り返し投与する必要がある。それに対し、樹状細胞は、ナイーブＴ細胞やメモリーＴ細胞、Ｂ細胞にも作用し、繰り返し刺激を与えるため、長時間でかつ強力な効果をもたらす。以上のことから、本実施の形態に係るワクチンパルス樹状細胞を、生体内に直接投与する態様で用いる方がより好ましいと考えられる。
【０１６１】
１０、本実施の形態に係るワクチンパルス樹状細胞の使用例及びその効果
以下に、本実施の形態に係るワクチンパルス樹状細胞の使用例及びその効果を示す。本使用例では、本実施の形態に係るワクチンパルス樹状細胞を、ヒトに投与する工程を含むことが好ましい。本使用例は、疾患の予防又は治療に適用することができる。なお、本使用例は、以下の場合に限定されず、本使用例に係る樹状細胞の使用態様は、本発明の要旨を超えない範囲で種々の変更が可能である。
【０１６２】
これまで、癌治療等で行われてきた樹状細胞療法においては、樹状細胞を、癌細胞から抽出した物質を用いてパルスしている。背景技術の項で前述したように、細胞から抽出した物質は、一般に、多種類の物質の混合物である。従って、細胞抽出物質を用いてパルスした樹状細胞は、細胞抽出物質中の多種類の抗原によってパルスされたと考えられる。そのように処理した樹状細胞は、特定できない抗原や、疾患に関連のない抗原を提示している樹状細胞を含む抗原提示能を有する多種類の樹状細胞の集団であると考えられる。このようにして作製された樹状細胞は、癌治療等の分野において、すでに疾患にかかった患者の治療に使用することは許されているが、健常者に投与することは許されない。従って、細胞抽出物質を用いてパルスした樹状細胞を、疾患の予防のために、健常者に対して用いることは不可能である。
【０１６３】
これに対して、本実施の形態におけるワクチンパルス樹状細胞は、ワクチンを用いて樹状細胞をパルスすることによって作製することができる。ワクチンとして実際に販売されるものは、健常者を含むヒトに安全性、有効性が認められ、認可を受けたものである。従って、本実施の形態による、ワクチンでパルスした樹状細胞は、疾患の治療のために患者に使用できるだけでなく、疾患の予防のために健常者にも使用することができる。
【０１６４】
また、例えば結核について、日本では戦後順調に患者数が減少してきたものの、１９８０年頃より減少率が鈍化し、１９９７年から３年連続で患者数が増加した。また、結核の治療には、抗結核剤の長期投与が不可欠だが、それによって薬剤耐性菌が生じる可能性が非常に高く、それを防ぐために２種類以上の多剤併用が鉄則であった。
【０１６５】
そこで、本実施の形態に係るワクチンパルス樹状細胞を、結核の治療に用いることができる。ここで本実施の形態に係るワクチンパルス樹状細胞として、ＢＣＧワクチン等の結核ワクチンでパルスする工程を含む方法によって得られたワクチンパルス樹状細胞を用いることができる。これによれば、前述のような薬剤耐性菌の出現頻度を下げることができると予想され、これは結核の治療において大きな利点であると考えられる。また、他の疾患についても、治療にワクチンパルス樹状細胞を用いることによって同様の効果が期待できる可能性があり、その疾患の治療に大きな利点となることが予想される。
【０１６６】
また、樹状細胞に抗原提示させる別の手法として、抗原をコードする遺伝子を、プラスミドベクター等に組み込んでトランスフェクションすることによって又はウイルスベクター等に組み込んで感染させることによって、樹状細胞内で目的抗原を発現させる方法が知られている。しかし今日では、このように遺伝子操作を施した樹状細胞を、疾患にかかった患者の治療に使用することが許される場合はあっても、健常者に対する疾患の予防のために用いることは許されていない。
【０１６７】
これに対して、本実施の形態におけるワクチンパルス樹状細胞は、前述のように、患者に対する疾患の治療ワクチンとして使用できるだけでなく、健常者に対する疾患の予防ワクチンとして使用が可能である。
【０１６８】
また、ワクチンが有効でない患者の原因の一つに、樹状細胞の機能低下が考えられる。すなわち、これまでのような生体へのワクチンの投与のみでは、十分に樹状細胞の活性化ができない状態が考えられる。
【０１６９】
そこで、本実施の形態に係るワクチンパルス樹状細胞を、例えば、生体内に直接投与する態様や、生体外でＴ細胞と混合してＴ細胞を活性化しこのＴ細胞を生体内に投与する態様で用いることによって、これまでワクチンが効かず抗体を産生できなかった健常者に対しても、目的抗原に対する抗体を産生させることが可能となる。
【０１７０】
以上から、本実施の形態に係るワクチンパルス樹状細胞には、広い使用用途と大きな利点が認められる。また、本実施の形態に係るワクチンパルス樹状細胞を用いた疾患の予防又は治療は、従来の樹状細胞療法とは全く区別されると考えられる。
【０１７１】
なお、この発明を実施するための最良の形態の項において、６、〜１０、における、パルスの定義、パルスの具体的な方法、樹状細胞を得る方法、樹状細胞培養のための培地やサイトカイン、ワクチン添加物の検出方法等は、特に記載しない限り、同項の１、〜５、に記したものと同様の解釈、方法、物質を用いることができるものとする。
【実施例１】
【０１７２】
以下、本発明を実験例に基づき具体的に説明するが、本発明は本実施例に限定されるものではない。
【０１７３】
（実験例１）樹状細胞の調製
（１）ヘパリン（ノボ・ヘパリン注１０００：アベンティス社製）で内腔をぬらした注射器（テルモシリンジＳＳ−５０ＥＳＺ：テルモ社製）を用いて、被験者（すでにＨＢワクチンの投与を繰り返し受けた経験がある健常人ボランティア５人を対象とした。）１人あたり４０〜６０ｍＬの採血を行った。得られた血液と、血液と同量のｐｈｏｓｐｈａｔｅ−ｂｕｆｆｅｒｅｄ ｓａｌｉｎｅ（ＰＢＳ）を、専用クリーンベンチ内で十分に混合した。次に、Ｆｉｃｏｌｌ−Ｃｏｎｒａｙ液（比重１．０７７）を用いた比重遠心法により、単核細胞を分離した。遠心は、室温、１８００ｒｐｍ〜３０００ｒｐｍで３０分間行い、遠心後の中間層を単核細胞として取り出した。
【０１７４】
（２）同時に、以下の手順に従って、それぞれの被験者から自己血清を得た。まず、ヘパリンを使用していない別の注射器（テルモシリンジＳＳ−１０ＥＳＺ：テルモ社製）を用いて、被験者１人あたり約１０ｍＬの採血を行った。次に、得られた血液を滅菌済みバキュテイナ採血管（ベクトン・ディッキンソン社製）を用いて３０００ｒｐｍで遠心し、血清を分離した。
【０１７５】
（３）（１）で得られた単核細胞にＰＢＳを加え、十分に混合した。次に、このサンプルを４℃、１８００ｒｐｍ〜２７００ｒｐｍで１０分間遠心し、（１）と同様の手順で、単核細胞を再度回収した。この操作を最低２回繰り返すことによって、単核細胞を十分に洗浄した。
【０１７６】
（４）（３）によって得られた単核細胞をカウントし、２×１０６〜２×１０７／ｍＬの細胞密度で、３５ｍｍ ｄｉｓｈに２ｍＬずつ加えた。培地は、（２）で得られた被験者それぞれの自己血清を１〜５％の濃度で加えたＲＰＭＩ １６４０培地（ニプロ社製）を用いた。培養は、専用培養室にて、３７℃、５％ＣＯ２濃度、７５％のａｉｒの条件で行った。
【０１７７】
（５）（４）の単核細胞を９０分間培養後、以下の手順に従って、付着細胞を分離した。まず、ｄｉｓｈを培養室から取り出し、クリーンベンチ内で５分間静置した。その後、ｄｉｓｈを斜めに傾け、培養液を付着細胞全体にゆっくりとかけて洗浄を行い、リンパ球を取り除いた。
【０１７８】
（６）（５）で得られた付着細胞（単球）を、１枚のｄｉｓｈにつき、ＧＭ−ＣＳＦ（ペプロテックＥＣ社製）を８００Ｕ／ｍＬ、ＩＬ−４（ペプロテックＥＣ社製）を５００Ｕ／ｍＬ、自己血清を１〜５％加えたＲＰＭＩ １６４０培地２ｍＬで４日間培養した。
【０１７９】
（７）培養４日目に、培養上清の１ｍＬを捨て、新たに（６）に記載した組成の培地を１ｍＬ加え、さらに４日間培養した。
【０１８０】
（８）培養８日目に、ｄｉｓｈから樹状細胞を回収し、樹状細胞数を測定した。
【０１８１】
（実験例２）ＨＢワクチンによる樹状細胞のパルス
（１）実験例１で得られた樹状細胞を２つに分けた。一方の樹状細胞に、ＨＢワクチン（ｒ−ＨＢワクチン「ミツビシ」：三菱ウェルファーマ社製）（組成：ＨＢｓ抗原２０μｇ、チメロサール０．０１ｗ／ｖ％、硫酸アルミニウムカリウム５．２ｇ（それぞれ１ｍＬあたり））を最終濃度２．５〜５μｇ／ｍＬになるように添加して８〜２４時間培養し、ＨＢｓ抗原を含むＨＢワクチンでパルスした樹状細胞を作製した。（以下、この細胞を「ＨＢワクチンパルス樹状細胞」と記す。）培養は、専用培養室にて、３７℃、５％ＣＯ２濃度、７５％のａｉｒの条件で行った。もう一方の樹状細胞は、ＨＢワクチンを添加せず、ネガティブコントロールとして培養した。
【０１８２】
（２）培養後、ｄｉｓｈからＨＢワクチンパルス樹状細胞を回収した。回収した細胞と、ＰＢＳを混合して、４℃、１５００ｒｐｍで５分間遠心後、上清を捨てた。この操作を５回繰り返すことによって、樹状細胞を十分に洗浄した。得られた樹状細胞を、ＰＢＳ５００μＬに加えた。また、ネガティブコントロールの樹状細胞についても同様の操作を行った。
【０１８３】
（実験例３）ＨＢワクチンパルス樹状細胞の投与
（１）ＨＢワクチンパルス樹状細胞投与前の抗ＨＢｓ抗体を測定した。まず、被験者（すでにＨＢワクチンの投与を繰り返し受けた経験がある健常人ボランティア）５人から採血を行い、実験例１（２）と同様の方法を用いて、それぞれの被験者から血清を得た。その血清を用いて、ＣＬＩＡ法によって抗ＨＢｓ抗体値を測定した。結果を図１に示す。図１に示すように、被験者５人のうち、２人が抗ＨＢｓ抗体を産生することができ（抗ＨＢｓ抗体陽性，ｒｅｓｐｏｎｄｅｒ）、３人が抗ＨＢｓ抗体を産生できない（抗ＨＢｓ抗体陰性，ｎｏｎ−ｒｅｓｐｏｎｄｅｒ）ことがわかった。
【０１８４】
（２）被験者へのＨＢワクチンパルス樹状細胞の投与を行った。まず、実験例２で得られたＨＢワクチンパルス樹状細胞５００μＬのうち５０μＬを用いて、それぞれの被験者に各自の樹状細胞に対するプリックテストを行った。その結果、すべての被験者においてプリックテストが陰性であった。次に、それぞれの被験者に、各自のＨＢワクチンパルス樹状細胞を４５０μＬ皮下投与した。なお、実験例１から実験例３に示したＨＢワクチンパルス樹状細胞の作製、投与の過程において、作業者は滅菌ガウン、滅菌マスク、滅菌キャップを着用して作業し、操作は可能な限りクリーンベンチ内で行った。使用試薬は、滅菌済みの試薬を購入して使用し（ＰＢＳ：インビトロジェン社製、ＲＰＭＩ １６４０：ニプロ社製、等）、使用に際して、肉眼及び顕微鏡で、試薬に混濁がないことを確認した。また、培養上清中のエンドトキシン測定等を実施することによって、培養過程での微生物による汚染がないことを確認した。
【０１８５】
（実験例４）ＨＢワクチンパルス樹状細胞の表面抗原解析
フローサイトメトリーを用いて、細胞表面抗原の解析を行った。
【０１８６】
（１）実験例２で得られた、ＨＢワクチンパルス樹状細胞、及び、パルスしていない樹状細胞を、５℃、１５００ｒｐｍで５分間遠心して回収した。回収した細胞をＦＣＭ ＰＢＳ（ｐＨ ７．２２：ギブコ社製）で洗浄し、再び５℃、１５００ｒｐｍで５分間遠心して回収した。
【０１８７】
（２）（１）で得られたそれぞれの樹状細胞を４本のスピッツ管に分け、（ａ）ＦＩＴＣ標識マウスＩｇＧ（Ｃａｔ．Ｎｏ．３４９０４１：ベクトン・ディッキンソン社製）を１０μＬ、（ｂ）ＰＥ標識マウスＩｇＧ（Ｃａｔ．Ｎｏ．３４９０４３：ベクトン・ディッキンソン社製）を２μＬ、（ｃ）ＦＩＴＣ標識マウス抗ヒトＨＬＡ−ＤＲモノクローナル抗体（ＰＭ−３２４１４Ｘ：ベクトン・ディッキンソン社製）を１０μＬ、（ｄ）ＰＥ標識抗ヒトＣＤ８６（Ｂ７０／Ｂ７−２）（Ｍａｔ．Ｎｏ．５５５６５８：ファーミンジェン社製）を１０μＬ添加したサンプルを作製した。これらを氷中に３０分間置き、ｌｙｓｉｎｇ ｓｏｌｕｔｉｏｎ（ベクトン・ディッキンソン社製）を２ｍＬ加えて混合し、５℃、２０００ｒｐｍで５分間遠心した。
【０１８８】
（３）回収した樹状細胞を、ＦＣＭ ＰＢＳ（ｐＨ ７．２２）を用いて十分に洗浄を繰り返した後、ＦＡＣＳｃａｌｉｂｕｒ（ベクトン・ディッキンソン社製）を用いて、表面抗原の解析を行った。
【０１８９】
（４）解析の結果を図２に示す。図２の横軸は解析した表面抗原、縦軸は表面抗原の相対濃度を示す。この結果より、ＨＢワクチンパルス樹状細胞は、パルスしていない樹状細胞と比較して、ＨＬＡ−ＤＲの発現が１．２倍、ＣＤ８６の発現が１．６倍に上昇していることがわかった。これらの結果から、ＨＢワクチンパルス樹状細胞が成熟していることがわかった。
【０１９０】
（実験例５）ＨＢワクチンパルス樹状細胞の機能解析−１
（１）ワクチンを打たない他人の末梢血から、実験例１（１）と同様にして単核細胞を採取した。
【０１９１】
（２）ａｕｔｏＭＡＣＳ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ社製）、Ｐａｎ Ｔ ｃｅｌｌ ｉｓｏｌａｔｉｏｎ ｋｉｔ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ社製）を用いて、単核細胞からＴ細胞を単離する操作を行った。まず、１×１０７あたりの単核細胞にＭＡＣＳ−Ｂｕｆｆｅｒを加えて８０μＬとし、さらに２０μＬのハプテン標識抗体カクテル（ＣＤ１１ｂ、ＣＤ１６、ＣＤ１９、ＣＤ３６、ＣＤ５６）を加えて、６〜１２℃にて１０分間混和した。次に、ＭＡＣＳ−Ｂｕｆｆｅｒを加えて洗浄し、上清を除く操作を２回行った。続いて、１×１０７あたりの単核細胞にＭＡＣＳ−Ｂｕｆｆｅｒを加えて８０μＬとし、さらに２０μＬのＭＡＣＳ抗ハプテン抗体標識マイクロビーズを加えて、６〜１２℃にて１５分間混和した。次に、ＭＡＣＳ−Ｂｕｆｆｅｒを加えて洗浄し、上清を除いた。続いて、１×１０７あたりの単核細胞にＭＡＣＳ−Ｂｕｆｆｅｒを５００μＬ加え、ａｕｔｏＭＡＣＳのＤｅｐｌｅｔｅプログラムにてデプリーションを行い、Ｔ細胞を採取した。
【０１９２】
（３）（ａ）パルスしていない樹状細胞１×１０４細胞、（ｂ）ＨＢワクチンパルス樹状細胞１×１０４細胞に、（２）で得られたＴ細胞をそれぞれ２×１０５細胞加えて、１０８時間培養した。培地は、１０％のＦＣＳ（フィルトロン社製）を加えたＲＰＭＩ １６４０培地を使用した。
【０１９３】
（４）それぞれに３Ｈで標識したサイミジンを添加してさらに１２時間培養した後、ｄｉｓｈから細胞を回収した。
【０１９４】
（５）γ線カウンター（ＬＳ６５００：ベックマン社製）を用いて、取り込み能の評価を行った結果を図３に示す。図３の縦軸はサイミジンの取り込み能を示し、横軸は左から（３）に示した（ａ）、（ｂ）の場合を示す。この結果から、ＨＬＡの一致していないＴ細胞に対して、ＨＢワクチンパルス樹状細胞は、パルスしていない樹状細胞と比較して、Ｔ細胞の幼若化補助能が１．５〜２倍に亢進していることがわかった。
【０１９５】
（実験例６）ＨＢワクチンパルス樹状細胞の機能解析−２
（１）被験者（すでにＨＢワクチンの投与を繰り返し受けた経験がある健常人ボランティアで、かつ、ＨＢワクチンｒｅｓｐｏｎｄｅｒ）から１人あたり６０ｍＬの採血を行い、実験例１（１）、実験例５（２）の方法を用いて、Ｔ細胞を採取した。（以下、このＴ細胞を「ＨＢｓメモリーＴ細胞」と記す。）
（２）同じ被験者から、実験例１の方法を用いて樹状細胞を採取し、二つに分けた。一方の樹状細胞は、実験例２の方法を用いて、ＨＢワクチンパルス樹状細胞とし、もう一方の樹状細胞は、ＨＢワクチンでパルスせずネガティブコントロールとした。
【０１９６】
（３）（ａ）ＨＢｓメモリーＴ細胞１×１０５細胞とＨＢワクチン１０μｇ、（ｂ）ＨＢｓメモリーＴ細胞１×１０５細胞とパルスしていない樹状細胞１×１０４細胞、（ｃ）ＨＢｓメモリーＴ細胞１×１０５細胞とＨＢワクチンパルス樹状細胞１×１０４細胞を、それぞれ混合培養した。
【０１９７】
（４）７日後、測定の１２時間前に３Ｈで標識したサイミジンを投与し、実験例５（５）と同様にγ線カウンターを用いてサイミジン取り込み能を測定した。
【０１９８】
（５）結果を図４示す。図４の縦軸は相対的ｃｐｍ比を表し、横軸に左から、（３）に記した（ａ）、（ｂ）、（ｃ）の場合を示す。この結果から、（ｂ）のパルスしていない樹状細胞と混合培養した場合と比較して、（ｃ）のＨＢワクチンパルス樹状細胞と混合培養したｃｐｍが、７倍となり、ＨＢｓメモリーＴ細胞が増殖していた。
【０１９９】
（実験例７）ＨＢワクチンパルス樹状細胞の機能解析−３
（１）被験者（すでにＨＢワクチンの投与を繰り返し受けた経験がある健常人ボランティアで、かつ、ＨＢワクチンｒｅｓｐｏｎｄｅｒ）から１人あたり６０ｍＬの採血を行い、実験例１（１）の方法を用いて単核細胞を採取した。
【０２００】
（２）単核細胞６×１０７細胞を、（ａ）何も混合せず、（ｂ）ＨＢワクチン１０μｇ、（ｃ）パルスしていない樹状細胞１×１０５細胞、（ｄ）ＨＢワクチンパルス樹状細胞１×１０５細胞と、それぞれ混合培養した。培養条件は、実験例１（４）と同様の条件で行った。
【０２０１】
（３）５日後、培養上清を回収し、ＣＬＩＡ法によって抗ＨＢｓ抗体値を測定した。
【０２０２】
（４）結果を図５に示す。図５の縦軸は抗ＨＢｓ抗体値を示し、横軸に左から、（２）に記した（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）の場合を示す。この結果から、ＨＢワクチンやパルスしていない樹状細胞を混合した場合は、抗ＨＢｓ抗体を産生させることができなかったが、ＨＢワクチンパルス樹状細胞を混合した場合は、抗ＨＢｓ抗体を１５〜５６ｍＩＵ／ｍＬ産生させることができることがわかった。
【０２０３】
（実験例８）ＨＢワクチンパルス樹状細胞投与に伴う過敏性反応テスト（０〜２４時間）
（１）実験例３にて、ＨＢワクチンパルス樹状細胞をそれぞれの被験者に皮下投与した後、０〜２４時間において、ワクチン投与に伴う炎症等の過敏性反応の有無を確認した。
【０２０４】
（２）その結果、ＨＢワクチンパルス樹状細胞を投与した被験者５人全例において、発熱、発赤、ショック等の急性期過敏性反応は見られなかった。従って、ＨＢワクチンパルス樹状細胞は安全であることが確認された。
【０２０５】
（実験例９）血液生化学的検査による安全性テスト（０、１、３、１４日目）
（１）実験例３にて被験者に投与したＨＢワクチンパルス樹状細胞の安全性をさらに確認するために、それぞれの被験者に対し、ＣＢＣ、肝機能、腎機能等についての５０項目以上の検査を行った。代表的な検査項目を図６に示す。
【０２０６】
（２）ＡＬＴ、ＣＲＰ、ＰＴ、Ｃｒｅａｔｉｎｉｎｅ検査の結果を図７〜１０に示す。それぞれの図の横軸は投与からの日数を示し、縦軸は検査項目とその値を表す。これらの結果より、ＨＢワクチンパルス樹状細胞を投与した被験者５人全例において、血液生化学的検査で異常は見られなかった。従って、ＨＢワクチンパルス樹状細胞は安全であることがわかった。
【０２０７】
（実験例１０）血清生化学的検査を用いた自己免疫反応に関する安全性テスト（０、１４日目）
（１）実験例３にて被験者に投与したＨＢワクチンパルス樹状細胞による自己免疫反応の有無を検討するために、ＩｇＧ量、ＩｇＭ量の測定や、サイロイドテスト、マイクロゾームテスト、抗核抗体などの自己抗体検査を行った。
【０２０８】
（２）結果を図１１に示す。これらの結果より、ＨＢワクチンパルス樹状細胞は、ＨＢワクチンパルス樹状細胞を投与した被験者５人全例で、自己免疫反応は見られなかった。従って、ＨＢワクチンパルス樹状細胞は安全であることがわかった。
【０２０９】
（実験例１１）ｉｎ ｖｉｖｏにおける、ＨＢワクチンパルス樹状細胞の抗ＨＢｓ抗体誘導能の評価（０日目、２、３、４、１２週間目）
（１）実験例３にてＨＢワクチンパルス樹状細胞の投与を受けた被験者それぞれから、実験例１（２）の方法を用いて血清を採取し、ＣＬＩＡ法によって抗ＨＢｓ抗体値を測定した。
【０２１０】
（２）結果を図１２、１３、１４に示す。図１２、１４の横軸は投与からの週を示し、縦軸は抗ＨＢｓ抗体値を示す。また、図１３は、図１２のグラフの値を数値化したものである。図１４は、ＨＢワクチンｎｏｎ−ｒｅｓｐｏｎｄｅｒである被験者の、抗ＨＢｓ抗体値の推移を示すグラフである。図１２、１３の結果より、１回のＨＢワクチンパルス樹状細胞投与によって、ＨＢワクチンｎｏｎ−ｒｅｓｐｏｎｄｅｒであった被験者３人について２人が、抗ＨＢｓ抗体を産生できるようになったことがわかった。また、ＨＢワクチンｒｅｓｐｏｎｄｅｒである被験者２人についても、抗ＨＢｓ抗体値が上昇した。これらの被験者４例は、抗ＨＢｓ抗体値が１０ｍＩＵ／ｍＬ以上であることから、１回のＨＢワクチンパルス樹状細胞投与によって、Ｂ型肝炎予防又は治療に十分な量の抗体を産生できていると考えられる。また、図１４の結果より、このＨＢワクチンｒｅｓｐｏｎｄｅｒであった被験者が、１０ｍＩＵ／ｍＬ以上の抗ＨＢｓ抗体値を少なくとも３ヶ月間は維持できることがわかった。
【実施例２】
【０２１１】
被験者（Ｂ型肝炎患者２人およびＢ型肝炎肝移植後の患者１人）から血液を採取し、前記実施例１の実験例１と同様にして、その血液を用いて樹状細胞を調製した。次に、得られた樹状細胞を用いて、前記実施例１の実験例２と同様にして、ＨＢワクチンパルス樹状細胞を作製した。
【０２１２】
前記実施例１の実験例１と同様にして、得られたＨＢワクチンパルス樹状細胞５００μＬのうち５０μＬを用いて、それぞれの被験者に各自の樹状細胞に対するプリックテストを行った。その結果、すべての被験者においてプリックテストが陰性であった。次に、それぞれの被験者に、各自のＨＢワクチンパルス樹状細胞を４５０μＬ皮下投与した。投与後、前記被験者には自覚症状に変化は見られなかった。
【０２１３】
被験者に投与したＨＢワクチンパルス樹状細胞の安全性をさらに確認するために、それぞれの被験者に対し、０、３、１４および２８日目に、ＣＢＣ、肝機能、腎機能等についての５０項目以上の検査を行った。前記全ての被験者において、血液性化学的検査では投与前後で変化はなく、異常はみられなかった。前記被験者のうち、Ｂ型肝炎患者１名のＡＬＴ、ＣＲＰ、ＰＴ、ＷＢＣ検査の結果を図１５に示す。前記図の横軸は投与からの日数を示し、縦軸は検査項目とその値を表す。従って、ＨＢワクチンパルス樹状細胞は、Ｂ型肝炎患者に対しても安全であるこどがわかった。
【実施例３】
【０２１４】
実施例２において各自のＨＢワクチンパルス樹状細胞の皮下投与を行った被験者（Ｂ型肝炎患者）に対して、前記投与から２週間後、および６週間後に、それぞれ、ＨＢワクチンパルス樹状細胞を４５０μＬ皮下投与した。その被験者から血清を採取し、その血清を用いて、ＣＬＩＡ法によって抗ＨＢｓ抗体値を測定した（０、２、６、１０、１４、１８および２２週間目）。その結果を図１６に示す。同図に示すように、１回目（０週間目）の投与終了後からＨＢｓ抗体が産生し、３回目（６週間目）の投与終了後も、ＨＢｓ抗体量が上昇した。なお、この測定期間中における肝機能検査の上昇およびトランスアミラーゼの上昇は見られなかった。
【０２１５】
以上の結果、ワクチンパルス樹状細胞の投与後、トランスアミラーゼの上昇が見られないことから、本発明のワクチンパルス樹状細胞によれば、ＣＴＬを誘導することなく、ＨＢｓ抗体が産生できることがわかった。通常、ＣＴＬが誘導されると、トランスアミラーゼが上昇するからである。このＣＴＬを誘導しないことのメカニズムは不明だが、パルスに使用したＨＢワクチンの組成が、このＣＴＬを誘導しないメカニズムと深く関係しているものと考えられる。また、本発明のワクチンパルス樹状細胞は、Ｂ型肝炎患者であっても、ＨＢｓ抗体産生を誘導できることから、体液性免疫を中心に誘導していることが示された。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、疾患の予防又は治療に用いることができる樹状細胞に関する。
【背景技術】
【０００２】
（樹状細胞療法とその問題点）
癌治療等の分野において、細胞免疫療法の一種である樹状細胞療法が注目されている。
【０００３】
樹状細胞は、生体内で最も強い抗原提示能を有する抗原提示細胞（ａｎｔｉｇｅｎ ｐｒｅｓｅｎｔｉｎｇ ｃｅｌｌ：ＡＰＣ）であり、取り込んだ抗原エピトープをＴ細胞に提示することによってＴ細胞を活性化し、免疫応答を高めることができる。
【０００４】
樹状細胞療法は、この樹状細胞を、癌細胞から抽出した物質又は癌特異的抗原を用いて、生体外でパルスし、抗原提示能を亢進させて生体内に戻す治療法である。
【０００５】
癌細胞から抽出した物質は、一般に、多種類の物質の混合物である。従って、癌細胞から抽出した物質を用いてパルスした樹状細胞は、細胞抽出物質中の多種類の癌抗原によって樹状細胞がパルスされたと考えられるため、癌に対する強力な免疫反応が誘導されると予想される。しかし、このように多種類の物質の混合物によってパルスした場合は、樹状細胞が提示する抗原を特定することができない。従って、癌患者に対して使用することは許されるが、健常者に対して使用することは許されない。
【０００６】
また、癌特異的抗原を用いてパルスした樹状細胞においては、樹状細胞が提示する抗原を特定することができるが、現在同定されている癌特異的抗原の数自体がまだ多くないという問題点がある。
【０００７】
樹状細胞に抗原を提示させる別の態様として、例えば、抗原に由来するペプチドをコードする遺伝子を樹状細胞に導入し、発現させる方法が知られている。しかし、このようにして調整した樹状細胞が、特定の抗原に対して強力な免疫応答を引き起こすことが可能であったとしても、現段階では、遺伝子操作を用いた樹状細胞を、疾患の予防等のために健常者に投与することは許されていない。
【０００８】
（肝炎について）
肝炎とは、肝臓に起こる炎症であり、主にウイルス、アルコール、薬物が原因となって引き起こされる。最も多い肝炎は肝炎ウイルスが原因のものであり、今日まで、７種類の肝炎ウイルスが見つかっている。また、日本のウイルス性肝炎においては、Ｂ型、Ｃ型がそのほとんどを占める。
【０００９】
肝炎は、急性肝炎と慢性肝炎に大別でき、慢性肝炎とは、肝炎が６ヶ月以上続くものを言う。Ａ型肝炎は、経口感染し、急性肝炎で留まり慢性化はしない。一方、Ｂ型、Ｃ型肝炎は、血液を介して感染し、母子間の垂直感染、家族や異性間の水平感染がある。また、Ｂ型、Ｃ型肝炎は、急性肝炎から慢性肝炎に進行するケースが多く、慢性化すると、肝硬変や肝臓癌等の重い肝臓疾病への移行率が極めて高いと言われている。
【００１０】
（Ｂ型肝炎について）
Ｂ型肝炎の患者は全世界的に分布しており、世界に３億５千万人のＢ型肝炎ウイルス感染者がいると言われている。特に、中国における感染者は１億２千万人と推定され極めて多く、東南アジア全体で、全世界の感染者数の７０％以上を占めるとされる。また、世界で毎年約１００万人が、この疾患が原因で死亡していることが報告されている。日本においては、１００万人以上のＢ型肝炎ウイルス感染者がいると推定され、その１０％程度が慢性肝炎患者であると推定される。
【００１１】
（Ｂ型肝炎の治療法とその問題点）
Ｂ型肝炎には特効的な治療薬はない。従って、治療は、ウイルスの数を減らしてその活動を抑えることが目的となる。代表的な治療法として、インターフェロン療法とラミブジン療法が知られている。
【００１２】
インターフェロン療法は、今から２０年ほど前に始められたＢ型肝炎の最初の治療法で、インターフェロンが免疫系の働きを助けてウイルスの増殖を抑える役割を果たす。インターフェロン療法は、ウイルス数が少ないほど効果が期待できるため、一般的に、ウイルス数がＢ型肝炎の１０００分の１であるＣ型肝炎の治療に優れた効果を発揮する一方、Ｂ型肝炎の治療には、約２０％の患者にしか効果を望めない。また、肝硬変に移行すると、よりインターフェロンが効きにくくなる。さらに、治療に用いられるインターフェロンは、開発し製品とするまでに大きなコストがかかり、１クールの治療で患者に２００〜３００万円の大きな経済的負担をもたらす等の問題点も多い。
【００１３】
ラミブジンは、本来、エイズの治療薬として開発された薬剤であるが、Ｂ型肝炎の治療にも有効であることが知られている。ラミブジンは、ウイルスＤＮＡの合成を直接抑える働きがあり、Ｂ型肝炎の急速な悪化や劇症化を食い止める効果がある。ラミブジンは、インターフェロンが効果を示さなかったＢ型肝炎患者にも効果を示すことが報告されているが、ウイルスが増殖状態にない時には効果が示されない。さらに、長期投与によってラミブジン耐性ウイルスが現れる等の問題点がある。
【００１４】
また、これらのＢ型肝炎の治療法は、効果の評価方法がそれぞれ異なっているため、一律に効果を比較することができない。また、これらの治療法を用いても、Ｂ型肝炎ウイルスを体内から完全になくすことは不可能であると考えられる。従って、前述のようなＢ型肝炎患者の増加を防ぐためには、Ｂ型肝炎を予防することが重要であると考えられる。
【００１５】
（Ｂ型肝炎の予防法とその問題点）
Ｂ型肝炎の予防の観点からは、一般に、ＨＢワクチンが有効である。
【００１６】
Ｂ型慢性肝炎を予防するためには、健常人であっても、体内に抗ＨＢｓ抗体を持ち、維持することが重要である。今日のＨＢワクチンは、Ｂ型肝炎ウイルスの表面抗原であるＨＢｓ抗原に基づいて作られている。通常、このＨＢワクチンを３回接種することにより、ＨＢワクチンの効くヒトには、体内に抗ＨＢｓ抗体ができる。抗体ができたヒトは、その後Ｂ型肝炎に感染することがないが、数年後に抗体値が低下した場合でも、一度抗ＨＢｓ抗体が体内にできていれば感染を免れる可能性があると考えられる。また、追加接種をすることによって、抗体値を再び高めることもできる。
【００１７】
しかし、ＨＢワクチンにも、いくつかの問題点が存在する。
【００１８】
まず、健常者のうちの約１０％はＨＢワクチンが非奏功（ｎｏｎ−ｒｅｓｐｏｎｄｅｒ）であり、ＨＢワクチンを投与しても抗ＨＢｓ抗体を産生することができない。医療従事者においてもＨＢワクチンｎｏｎ−ｒｅｓｐｏｎｄｅｒは少なくなく、日本には数十万人いると考えられる。
【００１９】
また、免疫能の低下を伴う疾患にかかっている人、例えば、ＨＩＶ患者、肝疾患患者、透析患者においても、ＨＢワクチンが十分に効果を発揮できない。肥満者や喫煙者にも免疫能の低下がみられるが、これらの人々もＨＢワクチンに対する反応性が低い。
【００２０】
さらに、肝移植対象者等の免疫抑制剤投与中の人にも、ＨＢワクチンが効かないため、患者は抗ＨＢｓ抗体を産生することができない。しかし、Ｂ型肝炎関連肝移植においては、抗ＨＢｓ抗体値を維持することが治療成績に大きな影響を及ぼすため、肝移植後、患者は繰り返し抗ＨＢｓヒト免疫グロブリンを投与することが必要となる。投与は２週間に１回の頻度で必要であり、このことは年間２５０万円という大きな経済的負担をもたらす。これからは、特に患者の多い東南アジアを中心に、Ｂ型肝炎関連肝移植が激増すると考えられるため、この経済的な問題の解決が世界的に必要とされている。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００２１】
本発明は、疾患の予防又は治療に有効な樹状細胞を提供することを目的とし、特に、Ｂ型肝炎の予防又は治療に好適に利用できる樹状細胞を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００２２】
１、ＨＢｓ抗原提示能を有する樹状細胞
本発明のＨＢｓ抗原提示能を有する樹状細胞は、樹状細胞をＨＢｓ抗原でパルスする工程を含む方法によって得られたＨＢｓ抗原提示能を有する樹状細胞である。
【００２３】
本発明のＨＢｓ抗原提示能を有する樹状細胞は、ＨＢｓ抗原エピトープをＴ細胞に提示することによってＴ細胞を活性化し、ＨＢｓ抗原に対する免疫応答を高めることができる。従って、本発明によれば、Ｂ型肝炎の予防又は治療に有効な、ＨＢｓ抗原提示能を有する樹状細胞を提供することができる。
【００２４】
本発明のＨＢｓ抗原提示能を有する樹状細胞において、前記方法はさらに、血液から前記樹状細胞を得る工程を含むことが好ましい。これによれば、血液由来の樹状細胞から、本発明のＨＢｓ抗原提示能を有する樹状細胞を提供することが可能である。また、血液を用いれば、従来公知の方法等を用いて、比較的簡便な操作によって樹状細胞を得ることが可能である。
【００２５】
本発明のＨＢｓ抗原提示能を有する樹状細胞において、前記方法はさらに、生物から前記血液を採取する工程を含むことが好ましい。
【００２６】
本発明のＨＢｓ抗原提示能を有する樹状細胞において、前記生物は、ヒトであることが好ましい。これによれば、ヒト由来の樹状細胞を得ることができるため、本発明によるＨＢｓ抗原提示能を有する樹状細胞を、ヒトに投与することが可能である。従って、本発明によって、ヒトのＢ型肝炎の予防又は治療に有効な、ＨＢｓ抗原提示能を有する樹状細胞を提供することができる。
【００２７】
本発明のＨＢｓ抗原提示能を有する樹状細胞において、前記ＨＢｓ抗原は、ＨＢワクチンに含まれるＨＢｓ抗原であることが好ましい。例えばヒトの場合、ＨＢワクチンとして実際に販売されるものは、健常者を含むヒトに安全性、有効性が認められ、認可を受けたものである。従って、本発明のＨＢｓ抗原提示能を有する樹状細胞によれば、例えばヒトに安全かつ有効に用いることができるＨＢｓ抗原提示能を有する樹状細胞を提供することができる。また、ＨＢワクチンは健常者に対して使用できるものであることから、本発明のＨＢｓ抗原提示能を有する樹状細胞は、Ｂ型肝炎患者等に対するＢ型肝炎の治療目的のみならず、健常者に対しても、Ｂ型肝炎の予防目的で使用することができる。なお、ヒトに限らず他の生物についても、その生物に安全かつ有効なＨＢワクチンを用いてパルスした樹状細胞を用いることによって、その生物のＢ型肝炎を予防又は治療することができる。
【００２８】
２、ＨＢｓ抗原提示能を有する樹状細胞の製造方法
本発明のＨＢｓ抗原提示能を有する樹状細胞の製造方法は、樹状細胞をＨＢｓ抗原でパルスする工程を含むことを特徴とする。これによれば、Ｂ型肝炎の予防又は治療に有効な、ＨＢｓ抗原提示能を有する樹状細胞を得ることができる。
【００２９】
本発明のＨＢｓ抗原提示能を有する樹状細胞の製造方法はさらに、血液から前記樹状細胞を得る工程を含むことが好ましい。これによれば、血液由来の樹状細胞から、本発明のＨＢｓ抗原提示能を有する樹状細胞を得ることが可能である。また、血液を用いれば、従来公知の方法等を用いて、比較的簡便な操作によって樹状細胞を得ることが可能である。
【００３０】
本発明のＨＢｓ抗原提示能を有する樹状細胞の製造方法はさらに、生物から前記血液を採取する工程を含むことが好ましい。
【００３１】
本発明のＨＢｓ抗原提示能を有する樹状細胞の製造方法において、前記生物は、ヒトとすることが好ましい。これによれば、ヒトのＢ型肝炎の予防又は治療に有効な、ＨＢｓ抗原提示能を有する樹状細胞を得ることが可能である。
【００３２】
本発明のＨＢｓ抗原提示能を有する樹状細胞の製造方法において、前記ＨＢｓ抗原は、ＨＢワクチンに含まれるＨＢｓ抗原であることが好ましい。これによれば、生物、例えば健常者を含むヒトに、安全かつ有効に用いることができるＢ型肝炎の予防又は治療に有効な、ＨＢｓ抗原提示能を有する樹状細胞を提供することができる。
【００３３】
３、ＨＢｓ抗原提示能を有する樹状細胞を含む組成物
本発明のＨＢｓ抗原提示能を有する樹状細胞を含む組成物は、本発明のＨＢｓ抗原提示能を有する樹状細胞を含むことを特徴とする。これによれば、本発明のＨＢｓ抗原提示能を有する樹状細胞を、例えば、他の物質と混合した状態、他の物質に懸濁した状態、他の物質と組み合わせた状態等で使用することができる。具体的には、本発明のＨＢｓ抗原提示能を有する樹状細胞を、例えば、ＰＢＳ、生理食塩水、ＲＰＭＩ１６４０培地等に懸濁した態様や、本発明のＨＢｓ抗原提示能を有する樹状細胞に、例えば、ＴＮＦ−α、ＩＬ−１２、ＨＢワクチン、ＧＭ−ＣＳＦ、ＯＫ４３２、その他免疫賦活剤等を添加した態様で用いることができる。従って、本発明によれば、本発明のＨＢｓ抗原提示能を有する樹状細胞を、使用目的に適した態様で又は本発明のＨＢｓ抗原提示能を有する樹状細胞の効果を高める態様で使用することが可能になる。
【００３４】
本発明のＨＢｓ抗原提示能を有する樹状細胞を含む組成物は、さらにＨＢワクチン添加物を含むことが好ましい。
【００３５】
本発明のＨＢｓ抗原提示能を有する樹状細胞を含む組成物において、前記組成物の形態としては、例えば、実験試薬又は実験キットがあげられる。これによれば、本発明のＨＢｓ抗原提示能を有する樹状細胞を、研究、例えば免疫研究に適した態様で用いることができる。
【００３６】
本発明のＨＢｓ抗原提示能を有する樹状細胞を含む組成物において、前記組成物は、医薬組成物とすることが好ましい。これによれば、本発明のＨＢｓ抗原提示能を有する樹状細胞を、医療、例えば、Ｂ型肝炎の予防又は治療に適した態様で用いることができる。
【００３７】
本発明のＨＢｓ抗原提示能を有する樹状細胞を含む組成物において、前記組成物は、免疫応答活性化製剤であることが好ましい。これによれば、本発明のＨＢｓ抗原提示能を有する樹状細胞を、ＨＢｓ抗原に対する免疫応答を活性化するのに適した投与剤形で用いることができる。
【００３８】
本発明のＨＢｓ抗原提示能を有する樹状細胞を含む組成物において、前記組成物は、細胞ワクチンであることが好ましい。これによれば、本発明のＨＢｓ抗原提示能を有する樹状細胞を、生体内に直接投与することが可能になり、ＨＢｓ抗原に対する免疫応答を活性化することができる。
【００３９】
本発明のＨＢｓ抗原提示能を有する樹状細胞を含む組成物において、前記細胞ワクチンは、Ｂ型肝炎の予防又は治療ワクチンであることが好ましい。これによれば、前記細胞ワクチンに含まれる本発明のＨＢｓ抗原提示能を有する樹状細胞が、生体内でＨＢｓ抗原に対する免疫応答を活性化することによって、Ｂ型肝炎を予防又は治療することが可能になる。
【００４０】
４、ＨＢｓ抗原提示能を有する樹状細胞を用いたＢ型肝炎の予防又は治療方法
本発明のＨＢｓ抗原提示能を有する樹状細胞を用いたＢ型肝炎の予防又は治療方法は、本発明のＨＢｓ抗原提示能を有する樹状細胞を用いることを特徴とする。これによれば、本発明のＨＢｓ抗原提示能を有する樹状細胞が、ＨＢｓ抗原に対する免疫応答を活性化することによって、Ｂ型肝炎を予防又は治療することができる。例えばヒトの場合、これまでのＨＢワクチンが非奏功であった健常者又は免疫能の低下を伴う疾患にかかっている人、免疫抑制剤投与中の人等、これまでのＨＢワクチンが効果を発揮できなかった人が、本発明のＢ型肝炎の予防又は治療方法によって、抗ＨＢｓ抗体を産生することができ、Ｂ型肝炎を予防又は治療することが可能になる。
【００４１】
本発明のＨＢｓ抗原提示能を有する樹状細胞を用いたＢ型肝炎の予防又は治療方法において、本発明のＨＢｓ抗原提示能を有する樹状細胞を、生物に投与する工程を含むことが好ましい。これによれば、本発明のＨＢｓ抗原提示能を有する樹状細胞が、生体内で、ＨＢｓ抗原に対する免疫応答を活性化することによって、Ｂ型肝炎を予防又は治療することができる。また、本発明のＢ型肝炎の予防又は治療方法は、ＨＢワクチンを直接生体内に投与するこれまでのＢ型肝炎の予防又は治療方法と比較して、高い効果を発揮することが可能である。
【００４２】
本発明のＨＢｓ抗原提示能を有する樹状細胞を用いたＢ型肝炎の予防又は治療方法において、前記生物は、ヒトであることが好ましい。これによれば、ヒトのＢ型肝炎を予防又は治療することが可能である。
【００４３】
５、ワクチンパルス樹状細胞
本発明のワクチンパルス樹状細胞は、樹状細胞をワクチンでパルスする工程を含む方法によって得られたワクチンパルス樹状細胞である。
【００４４】
本発明のワクチンパルス樹状細胞において、「ワクチンパルス樹状細胞」とは、ワクチンでパルスする工程を含む方法によって得られた抗原提示能を有する樹状細胞のことを言う。
【００４５】
本発明のワクチンパルス樹状細胞は、ワクチンに含まれる抗原エピトープをＴ細胞に提示することによってＴ細胞を活性化し、前記抗原に対する免疫応答を高めることができる。従って、本発明によれば、疾患の予防又は治療に有効な、ワクチンパルス樹状細胞を提供することができる。
【００４６】
また、例えばヒトの場合、ワクチンとして実際に販売されるものは、ヒトに安全性、有効性が認められ、認可を受けたものである。従って、本発明によれば、例えばヒトに安全かつ有効に用いることができるワクチンパルス樹状細胞を提供することができる。なお、ヒトに限らず他の生物についても、その生物に安全かつ有効なワクチンを用いてパルスしたワクチンパルス樹状細胞を用いることによって、その生物の疾患を予防又は治療することができる。
【００４７】
本発明のワクチンパルス樹状細胞において、前記方法はさらに、血液から前記樹状細胞を得る工程を含むことが好ましい。これによれば、血液由来の樹状細胞から、本発明のワクチンパルス樹状細胞を提供することが可能である。また、血液を用いれば、従来公知の方法等を用いて、比較的簡便な操作によって樹状細胞を得ることが可能である。
【００４８】
本発明のワクチンパルス樹状細胞において、前記方法はさらに、生物から前記血液を採取する工程を含むことが好ましい。
【００４９】
本発明のワクチンパルス樹状細胞において、前記生物は、ヒトとすることが好ましい。これによれば、ヒト由来の樹状細胞を得ることができるため、本発明によるワクチンパルス樹状細胞を、ヒトに投与することが可能である。従って、本発明によって、ヒト疾患の予防又は治療に有効な、ワクチンパルス樹状細胞を提供することができる。
【００５０】
本発明のワクチンパルス樹状細胞において、前記パルスに使用するワクチンは、疾患の予防又は治療ワクチンであることが好ましい。これによれば、これらのワクチンに含まれている、前記疾患に関わる抗原を提示するワクチンパルス樹状細胞を提供することができる。従って、前記疾患を予防又は治療することができる。
【００５１】
本発明のワクチンパルス樹状細胞において、前記パルスに使用するワクチンは、肝炎ワクチンであることが好ましい。肝炎ワクチンとしては、例えば、Ａ型肝炎ワクチン、Ｂ型肝炎ワクチン等が知られている。例えばヒトの場合、肝炎ワクチンとして実際に販売されるものは、健常者を含むヒトに安全性、有効性が認められ、認可を受けたものである。従って、本発明によれば、例えばヒトに安全かつ有効に用いることができる肝炎ウイルス抗原提示能を有する肝炎ワクチンパルス樹状細胞を提供することができる。また、肝炎ワクチンは健常者に対して使用できるものであることから、本発明の肝炎ワクチンパルス樹状細胞は、例えば、肝炎患者等に対する肝炎の治療目的のみならず、健常者に対しても、肝炎の予防目的で使用することができる。なお、ヒトに限らず他の生物についても、その生物に安全かつ有効な肝炎ワクチンを用いてパルスした樹状細胞を用いることによって、その生物の肝炎を予防又は治療することができる。
【００５２】
本発明のワクチンパルス樹状細胞において、前記肝炎ワクチンは、ＨＢｓ抗原を含むＨＢワクチンであることが好ましい。これによれば、生物、例えば健常者を含むヒトに、安全かつ有効に用いることができるＢ型肝炎の予防又は治療に有効な、ＨＢｓ抗原提示能を有するワクチンパルス樹状細胞を提供することができる。
【００５３】
６、ワクチンパルス樹状細胞の製造方法
本発明のワクチンパルス樹状細胞の製造方法は、樹状細胞をワクチンでパルスする工程を含むことを特徴とする。これによれば、疾患の予防又は治療に有効な、ワクチンパルス樹状細胞を得ることができる。
【００５４】
本発明のワクチンパルス樹状細胞の製造方法はさらに、血液から前記樹状細胞を得る工程を含むことが好ましい。これによれば、血液由来の樹状細胞から、本発明のワクチンパルス樹状細胞を得ることが可能である。また、血液を用いれば、従来公知の方法等を用いて、比較的簡便な操作によって樹状細胞を得ることが可能である。
【００５５】
本発明のワクチンパルス樹状細胞の製造方法はさらに、生物から前記血液を採取する工程を含むことが好ましい。
【００５６】
本発明のワクチンパルス樹状細胞の製造方法において、前記生物は、ヒトであることが好ましい。これによれば、ヒト疾患の予防又は治療に有効な、ワクチンパルス樹状細胞を得ることが可能である。
【００５７】
本発明のワクチンパルス樹状細胞の製造方法において、前記パルスに使用するワクチンは、疾患の予防又は治療ワクチンであることが好ましい。これによれば、前記疾患の予防又は治療に有効な、ワクチンパルス樹状細胞を提供することができる。
【００５８】
本発明のワクチンパルス樹状細胞の製造方法において、前記パルスに使用するワクチンは、肝炎ワクチンであることが好ましい。これによれば、生物、例えば健常者を含むヒトに、安全かつ有効に用いることができる肝炎の予防又は治療に有効な、肝炎ウイルス抗原提示能を有する肝炎ワクチンパルス樹状細胞を提供することができる。
【００５９】
本発明のワクチンパルス樹状細胞の製造方法において、前記肝炎ワクチンは、ＨＢｓ抗原を含むＨＢワクチンであることが好ましい。これによれば、生物、例えば健常者を含むヒトに、安全かつ有効に用いることができるＢ型肝炎の予防又は治療に有効な、ＨＢｓ抗原提示能を有するワクチンパルス樹状細胞を提供することができる。
【００６０】
７、ワクチンパルス樹状細胞を含む組成物
本発明のワクチンパルス樹状細胞を含む組成物は、本発明のワクチンパルス樹状細胞を含むことを特徴とする。これによれば、本発明のワクチンパルス樹状細胞を、例えば、他の物質と混合した状態、他の物質に懸濁した状態、他の物質と組み合わせた状態等で使用することができる。具体的には、本発明のＨＢｓ抗原提示能を有する樹状細胞を、例えば、ＰＢＳ、生理食塩水、ＲＰＭＩ １６４０培地等に懸濁した態様や、本発明のＨＢｓ抗原提示能を有する樹状細胞に、例えば、ＴＮＦ−α、ＩＬ−１２、ＨＢワクチン、ＧＭ−ＣＳＦ、ＯＫ４３２、その他免疫賦活剤等を添加した態様で用いることができる。従って、本発明によれば、本発明のワクチンパルス樹状細胞を、使用目的に適した態様で又は本発明のワクチンパルス樹状細胞の効果を高める態様で使用することが可能になる。
【００６１】
本発明のワクチンパルス樹状細胞を含む組成物は、さらにワクチン添加物を含むことが好ましい。
【００６２】
本発明のワクチンパルス樹状細胞を含む組成物において、前記組成物は、実験試薬又は実験キットであることが好ましい。これによれば、本発明のワクチンパルス樹状細胞を、研究、例えば免疫研究に適した態様で用いることができる。
【００６３】
本発明のワクチンパルス樹状細胞を含む組成物において、前記組成物は、医薬組成物であることが好ましい。これによれば、本発明のワクチンパルス樹状細胞を、医療、例えば、疾患の予防又は治療に適した態様で用いることができる。
【００６４】
本発明のワクチンパルス樹状細胞を含む組成物において、前記組成物は、免疫応答活性化製剤であることが好ましい。これによれば、本発明のワクチンパルス樹状細胞を、ワクチンに含まれていた抗原に対する免疫応答を活性化するのに適した投与剤形で用いることができる。
【００６５】
本発明のワクチンパルス樹状細胞を含む組成物において、前記組成物は、細胞ワクチンであることが好ましい。これによれば、本発明のワクチンパルス樹状細胞を、生体内に直接投与することが可能になり、ワクチンに含まれていた抗原に対する免疫応答を活性化することができる。
【００６６】
本発明のワクチンパルス樹状細胞を含む組成物において、前記細胞ワクチンは、疾患の予防又は治療ワクチンであることが好ましい。これによれば、前記細胞ワクチンに含まれる本発明のワクチンパルス樹状細胞が、生体内で、ワクチンに含まれていた抗原に対する免疫応答を活性化することによって、前記疾患を予防又は治療することが可能になる。
【００６７】
８、ワクチンパルス樹状細胞を用いた疾患の予防又は治療方法
本発明のワクチンパルス樹状細胞を用いた疾患の予防又は治療方法は、本発明のワクチンパルス樹状細胞を用いることを特徴とする。これによれば、本発明のワクチンパルス樹状細胞が、ワクチンに含まれていた抗原に対する免疫応答を活性化することによって、前記疾患を予防又は治療することができる。例えばヒトの場合、前記疾患を予防又は治療するためにこれまで用いられてきたワクチンが非奏功であった健常者又は免疫能の低下を伴う疾患にかかっている人、免疫抑制剤投与中の人等、ワクチンが十分な効果を発揮できなかった人が、本発明の疾患の予防又は治療方法によって、抗体を産生することができるようになり、前記疾患を予防又は治療することが可能になる。
【００６８】
本発明のワクチンパルス樹状細胞を用いた疾患の予防又は治療方法において、本発明のワクチンパルス樹状細胞を、生物に投与する工程を含むことが好ましい。これによれば、本発明のワクチンパルス樹状細胞が、生体内で、ワクチンに含まれていた抗原に対する免疫応答を活性化することによって、前記疾患を予防又は治療することができる。また、本発明の疾患の予防又は治療方法は、ワクチンを直接生体内に投与することによるこれまでの疾患の予防又は治療方法と比較して、高い効果を発揮することが可能である。
【００６９】
本発明のワクチンパルス樹状細胞を用いた疾患の予防又は治療方法において、前記生物は、ヒトであることが好ましい。これによれば、ヒトの疾患を予防又は治療することが可能である。
【００７０】
９、ヒト用ワクチンパルス樹状細胞
本発明のヒト用ワクチンパルス樹状細胞は、ヒトのＢ型肝炎の予防又は治療のためのワクチンパルス樹状細胞であり、前記ワクチンパルス樹状細胞は、Ｂ型肝炎患者又はＢ型肝炎ウイルスキャリアから末梢血を採取し、その末梢血から単離した単球を用いて樹状細胞を得る樹状細胞取得工程および前記樹状細胞をワクチンでパルスするパルス工程を含む製造方法によって得られたワクチンパルス樹状細胞であり、前記パルスに使用するワクチンは、Ｂ型肝炎の予防又は治療のためのワクチンであることを特徴とする。
【００７１】
本発明のヒト用ワクチンパルス樹状細胞において、前記ワクチンパルス樹状細胞は、例えば、Ｔｈ２を誘導し、Ｔｈ１を誘導しないことが好ましく、さらにＣＴＬを誘導しないことがより好ましい。
【００７２】
本発明のヒト用ワクチンパルス樹状細胞は、以下のような利点を有する。癌治療等で行われている樹状細胞療法においては、細胞傷害性Ｔ細胞（ＣＴＬ）の誘導を目的としているため、Ｔｈ１の誘導を促進し、Ｔｈ２を誘導しないように樹状細胞を活性化させている。これに対し、本発明のヒト用ワクチンパルス樹状細胞は、例えば、Ｔｈ２を誘導し、Ｔｈ１およびＣＴＬを誘導しないため、癌治療等で行われてきた樹状細胞療法とはメカニズムが全く異なる。つまり、本発明におけるワクチンパルス樹状細胞よれば、例えば、ＣＴＬを誘導することなく抗体の産生が可能となり、ＣＴＬによる肝細胞の攻撃に伴う肝障害（例えば、劇症肝炎等）を引き起こすこともない。従って、本発明のヒト用ワクチンパルス樹状細胞は、Ｂ型肝炎患者およびＢ型肝炎ウイルスキャリアに極めて有用である。なお、本発明のヒト用ワクチンパルス樹状細胞がＴｈ１やＣＴＬを誘導しないというメカニズムは不明である。
【００７３】
本発明のヒト用ワクチンパルス樹状細胞において、前記樹状細胞をワクチンでパルスする工程において、パルス時間は、例えば、８時間〜２４時間であることが好ましい。また、前記樹状細胞取得工程において、単離した単球をＧＭ−ＣＳＦおよびＩＬ−４で共培養することが好ましい。
【００７４】
１０、ヒト用ワクチンパルス樹状細胞の製造方法
本発明のヒト用ワクチンパルス樹状細胞の製造方法は、Ｂ型肝炎患者又はＢ型肝炎ウイルスキャリアから末梢血を採取し、その末梢血から単離した単球を用いて樹状細胞を得るヒト由来の血液から樹状細胞を得る樹状細胞取得工程、および、前記樹状細胞をワクチンでパルスして、ヒトのＢ型肝炎の予防又は治療のためのワクチンパルス樹状細胞を得るパルス工程を含む製造方法であって、前記パルス工程においてパルスに使用するワクチンは、Ｂ型肝炎の予防又は治療のためのワクチンであることを特徴とする。本発明の製造方法により得られたヒト用ワクチンパルス樹状細胞によれば、ヒトにおいて、例えば、Ｔｈ２を誘導し、Ｔｈ１を誘導しないことが好ましく、さらにＣＴＬを誘導しないことが好ましい。
【００７５】
本発明のヒト用ワクチンパルス樹状細胞の製造方法において、前記ワクチンパルス工程におけるパルス時間は、８時間〜２４時間であることが好ましい。
【００７６】
本発明のヒト用ワクチンパルス樹状細胞の製造方法の前記樹状細胞取得工程において、単離した単球をＧＭ−ＣＳＦおよびＩＬ−４と共培養することが好ましい。
【００７７】
１１、ヒトＢ型肝炎のための治療および予防のための医薬品
本発明のヒトＢ型肝炎のための治療および予防のための医薬品は、前記本発明のヒト用ワクチンパルス樹状細胞を含むことを特徴とする。本発明の医薬品において、本発明のワクチンパルス樹状細胞が、例えば、Ｔｈ２を誘導し、Ｔｈ１を誘導しないことが好ましく、さらにＣＴＬを誘導しないことが好ましい。このように、ＣＴＬを誘導しないため、本発明の医薬品によれば、例えば、ＣＴＬによる肝細胞の攻撃等により、劇症肝炎を引き起こすこともない。さらに、本発明の医薬品によれば、Ｂ型肝炎患者はもちろんのこと、Ｂ型肝炎を予防又は治療するためにこれまで用いられてきたワクチンが非奏功であった健常者等、ワクチンが十分な効果を発揮できなかった人が、抗体を産生することができるようになり、Ｂ型肝炎を予防又は治療することが可能になる。前記Ｂ型肝炎としては、Ｂ型慢性肝炎があげられる。本発明のヒトＢ型肝炎のための治療および予防のための医薬品の投与形態は特に制限されないが、例えば、皮下投与することが好ましい。
【００７８】
１２、ワクチンパルス樹状細胞を用いたヒトのＢ型肝炎の予防又は治療方法
本発明のヒト用ワクチンパルス樹状細胞を用いたヒトのＢ型肝炎の予防又は治療方法は、自己の樹状細胞由来のワクチンパルス樹状細胞をＢ型肝炎患者又はＢ型肝炎ウイルスキャリアに投与することを含む予防又は治療方法であって、前記ワクチンパルス樹状細胞は、Ｂ型肝炎患者又はＢ型肝炎ウイルスキャリアから末梢血を採取し、その末梢血から単離した単球を用いて樹状細胞を得る樹状細胞取得工程および前記樹状細胞をワクチンでパルスするパルス工程を含む製造方法によって得られたヒト用ワクチンパルス樹状細胞であり、前記パルスに使用するワクチンは、Ｂ型肝炎の予防又は治療のためのワクチンであることを特徴とする。
【００７９】
本発明のヒト用ワクチンパルス樹状細胞を用いたヒトのＢ型肝炎の予防又は治療方法において、本発明のヒト用ワクチンパルス樹状細胞が、例えば、Ｔｈ２を誘導し、Ｔｈ１を誘導しないことが好ましく、さらにＣＴＬを誘導しないことが好ましい。本発明の予防又は治療方法によれば、Ｂ型肝炎患者はもちろんのこと、Ｂ型肝炎を予防又は治療するためにこれまで用いられてきたワクチンが非奏功であった健常者等、ワクチンが十分な効果を発揮できなかった人が、抗体を産生することができるようになり、Ｂ型肝炎を予防又は治療することが可能になる。さらに、本発明の予防又は治療方法は、Ｂ型肝炎患者又はＢ型肝炎ウイルスキャリア自身の樹状細胞を使用しているため、安全性が極めて高いものとなる。前記Ｂ型肝炎としては、Ｂ型慢性肝炎があげられる。本発明のヒト用ワクチンパルス樹状細胞を用いたヒトのＢ型肝炎の予防又は治療方法において、ヒト用ワクチンパルス樹状細胞の投与形態は特に制限されないが、例えば、皮下投与が好ましい。
【００８０】
１３、ヒトＢ型肝炎の治療又は予防のためのヒト用ワクチンパルス樹状細胞の使用
本発明のヒトＢ型肝炎の治療又は予防のためのヒト用ワクチンパルス樹状細胞の使用は、前記ワクチンパルス樹状細胞は、Ｂ型肝炎患者又はＢ型肝炎ウイルスキャリアから末梢血を採取し、その末梢血から単離した単球を用いて樹状細胞を得る樹状細胞取得工程および前記樹状細胞をワクチンでパルスするパルス工程を含む製造方法によって得られたヒト用ワクチンパルス樹状細胞であり、前記パルスに使用するワクチンは、Ｂ型肝炎の予防又は治療のためのワクチンであり、前記ワクチンパルス樹状細胞を、末梢血を採取したＢ型肝炎患者又はＢ型肝炎ウイルスキャリアに投与することを含むことを特徴とする。
【００８１】
本発明のヒト用ワクチンパルス樹状細胞をヒトＢ型肝炎の治療又は予防に使用すれば、Ｂ型肝炎患者はもちろんのこと、Ｂ型肝炎を予防又は治療するためにこれまで用いられてきたワクチンが非奏功であった健常者等、ワクチンが十分な効果を発揮できなかった人が、抗体を産生することができるようになり、Ｂ型肝炎を予防又は治療することが可能になる。さらに、Ｂ型肝炎患者又はＢ型肝炎ウイルスキャリア自身の樹状細胞を使用しているため、安全性が極めて高いものとなる。本発明のヒト用ワクチンパルス樹状細胞が、例えば、Ｔｈ２を誘導し、Ｔｈ１を誘導しないことが好ましく、さらにＣＴＬを誘導しないことが好ましい。前記Ｂ型肝炎としては、Ｂ型慢性肝炎があげられる。
【図面の簡単な説明】
【００８２】
【図１】図１は、実施例１におけるＨＢワクチンパルス樹状細胞投与前の抗ＨＢｓ抗体値を示す。
【図２】図２は、前記実施例におけるＨＢワクチンパルスによる、樹状細胞のＨＬＡ−ＤＲ及びＣＤ８６の変化を示すグラフである。
【図３】図３は、前記実施例におけるＨＢワクチンパルスによる、樹状細胞のＴ細胞幼若化補助能の変化を示すグラフである。
【図４】図４は、前記実施例におけるＨＢｓメモリーＴ細胞を用いた、ＨＢワクチンパルス樹状細胞がＨＢｓメモリーＴ細胞の増殖能に及ぼす効果を示すグラフである。
【図５】図５は、前記実施例におけるＨＢｓメモリーＴ細胞を用いた、ＨＢワクチンパルス樹状細胞が抗ＨＢｓ抗体産生能に及ぼす効果を示すグラフである。
【図６】図６は、前記実施例における血液生化学的検査による、ＨＢワクチンパルス樹状細胞の安全性テストの検査項目を示す。
【図７】図７は、前記実施例におけるＡＬＴ検査の結果を示すグラフである。
【図８】図８は、前記実施例におけるＣＲＰ検査の結果を示すグラフである。
【図９】図９は、前記実施例におけるＰＴ検査の結果を示すグラフである。
【図１０】図１０は、前記実施例におけるＣｒｅａｔｉｎｉｎｅ検査の結果を示すグラフである。
【図１１】図１１は、前記実施例における血清生化学的検査を用いた自己免疫反応に関する安全性テストの結果を示すグラフである。
【図１２】図１２は、前記実施例におけるＨＢワクチンパルス樹状細胞投与による、抗ＨＢｓ抗体値の変化を示す。
【図１３】図１３は、前記実施例におけるＨＢワクチンパルス樹状細胞投与による、抗ＨＢｓ抗体値の変化を示すグラフである。
【図１４】図１４は、前記実施例におけるＨＢワクチンパルス樹状細胞投与による、ＨＢワクチンｎｏｎ−ｒｅｓｐｏｎｄｅｒの抗ＨＢｓ抗体値の推移を示すグラフである。
【図１５】図１５は、実施例２における血清生化学的検査を用いた自己免疫反応に関する安全性テストの結果を示すグラフである。
【図１６】図１６は、実施例３におけるＨＢワクチンパルス樹状細胞投与による、抗ＨＢｓ抗体値の変化を示すグラフである。
【発明を実施するための最良の形態】
【００８３】
以下、本発明の最良の実施の形態を説明する。本発明は、以下の実施形態に限定されず、本発明の要旨を超えない範囲で種々の変更が可能である。
【００８４】
１、ＨＢｓ抗原提示能を有する樹状細胞
本実施の形態に係るＨＢｓ抗原提示能を有する樹状細胞は、樹状細胞をＨＢｓ抗原でパルスする工程を含む方法によって得られる。本実施の形態に係るＨＢｓ抗原提示能を有する樹状細胞によれば、Ｂ型肝炎の予防又は治療に有効な、ＨＢｓ抗原提示能を有する樹状細胞を提供することができる。
【００８５】
本実施の形態において、「樹状細胞を抗原でパルスする」とは、樹状細胞を、抗原を取り込んで前記樹状細胞内で分解し、前記分解した抗原をペプチドとして提示しうる状態にすることを言う。
【００８６】
本実施の形態において、樹状細胞を抗原でパルスする具体的な方法としては、例えば、適切なサイトカイン等の存在下に、抗原と樹状細胞とを共存させて培養する方法が挙げられる。
【００８７】
樹状細胞を得る方法は、最終的に、抗原を取り込みこの抗原を提示しうる樹状細胞が得られれば特に限定されず、種々の手法を用いることができる。
【００８８】
例えば、血液から樹状細胞を得ることができる。具体的には、例えば、当業者に公知の方法を利用して、樹状細胞の前駆細胞を含む血液から樹状細胞を分化誘導する方法又は血液から樹状細胞を直接分離する方法を用いることができる。より具体的には、例えば、骨髄細胞、臍帯血又は末梢血のＣＤ３４陽性前駆細胞から主にＧＭ−ＣＳＦとＴＮＦ−αを用いて誘導する方法、臍帯血単核球又は末梢血単核球から主にＧＭ−ＣＳＦとＩＬ−４を用いて誘導する方法、末梢血単核球から主にＧＭ−ＣＳＦとＩＦＮ−αを用いて誘導する方法、末梢血単核球より直接分離する方法等によって、樹状細胞を得ることができる。
【００８９】
また、これらの樹状細胞を得る方法は、必要に応じてさらに、生物から血液を採取する工程を含むこともできる。前記生物は、Ｂ型肝炎に感染する可能性の有無によって特に限定されるものではないが、例えば、Ｂ型肝炎に感染しうる生物であることが好ましい。前記Ｂ型肝炎に感染しうる生物には、Ｂ型肝炎に自然に感染しうる生物や、Ｂ型肝炎を人工的に感染させることができる生物を含むことが好ましい。具体的には、前記Ｂ型肝炎に自然に感染しうる生物としては、例えば、ヒト、チンパンジー等の霊長類や、ウッドチャック、ペキンダック等のアヒル等、前記Ｂ型肝炎を人工的に感染させることができる生物としては、例えば、リス、ラット、カモ、ガチョウ、サギ、ツル、マウス等を挙げることができる。特に、Ｂ型肝炎による死亡者が世界で増加している点からも、本発明を、前記生物がヒトである場合に使用できる効果は大きい。
【００９０】
また、血液を利用せずに樹状細胞を得る方法としては、例えば、ＥＳ細胞を分化誘導して樹状細胞を得る方法があげられる。具体的には、例えば、胚盤胞の内部に存在する内部細胞塊から樹立されたＥＳ細胞を、適切なフィーダー細胞やサイトカインとともに培養することによって、樹状細胞に分化誘導することができる。
【００９１】
本実施の形態において、樹状細胞を培養する培地については、樹状細胞の前駆細胞から樹状細胞への分化誘導、樹状細胞の生存、抗原による樹状細胞のパルス等を阻害しない限り特に限定されないが、例えば、ＲＰＭＩ １６４０培地等を用いることができる。また、好ましくはＲＰＭＩ １６４０培地である。
【００９２】
本実施の形態において、樹状細胞の誘導には、サイトカインを使用することができる。樹状細胞の誘導に用いるサイトカインとしては、樹状細胞への分化誘導、樹状細胞の生存、抗原による樹状細胞のパルス等を阻害しない限り特に限定されないが、例えば、ＧＭ−ＣＳＦ、ＴＮＦ−α、ＩＬ−４、ＩＦＮ−α等を用いることができる。
【００９３】
本実施の形態において、ＨＢｓ抗原の態様は、最終的に、樹状細胞によって提示されることが可能ならば特に限定されず、完全なタンパク質の抗原でも、ペプチド抗原でもよい。
【００９４】
また、本実施の形態に係るＨＢｓ抗原は、例えば、様々な物質や液体と組み合わせた態様で用いることができる。具体的には、例えば、ＨＢｓ抗原をリポソーム等のリン脂質二重膜を用いて樹状細胞内に導入することや、ＨＢｓ抗原を緩衝液、例えばＰＢＳや、培地、例えばＲＰＭＩ １６４０培地に懸濁して樹状細胞に導入することができる。
【００９５】
また、ＨＢｓ抗原の添加時期は、結果として、ＨＢｓ抗原が樹状細胞によって提示されることが可能ならば特に限定されず、例えば、樹状細胞を分化誘導した後に添加することができる。また、分化誘導時にＨＢｓ抗原を添加して、一緒に培養することもできる。また、ＨＢｓ抗原のパルス時間も、結果として、ＨＢｓ抗原が樹状細胞によって提示されることが可能ならば特に限定されず、例えば、８時間から２４時間であることが好ましい。また、ＨＢｓ抗原は、ＨＢワクチンに含まれるＨＢｓ抗原であることが好ましい。
【００９６】
ワクチンには、例えば、生ワクチン、不活化ワクチン、トキソイド等、いくつかの種類が存在する。生ワクチンは、例えば、病原性を弱めたウイルスや細菌を生きたまま接種するワクチンを言う。不活化ワクチンは、例えば、ウイルスの粒子や細菌の菌体等を精製し、加熱やホルマリン等の薬剤を用いて処理して、病原性を消失又は無毒化して作られるワクチンを言う。トキソイドは、例えば、菌の毒素のみを取り出して精製し、ホルマリンを加えて免疫原性を失わせずに無毒化したものを言う。
【００９７】
本実施の形態におけるＨＢワクチンは、ＨＢｓ抗原が含まれていればその種類が限定されるものではないが、現在日本において、ヒトに使用が許可され販売されているＨＢワクチンは、不活化ワクチンに分類される。本実施の形態において、不活化ワクチンであるＨＢワクチンを用いる場合は、例えば、組換え沈降Ｂ型肝炎ワクチンや、沈降Ｂ型肝炎ワクチンを用いることができる。
【００９８】
組換え沈降Ｂ型肝炎ワクチンとしては、例えば、Ｂ型肝炎ウイルスＤＮＡのＨＢｓ抗原に相当する部分を、酵母菌や動物細胞等のＤＮＡに挿入し発現させることで、ワクチンの有効成分であるＨＢｓ抗原を作り、免疫増進剤のアルミニウムゲルを加えて調整したワクチンを用いることができる。動物細胞として、例えば、ＣＨＯ細胞を用いて調整したワクチンを用いることができる。
【００９９】
沈降Ｂ型肝炎ワクチンとしては、例えば、動物細胞等により生産されたＨＢｓ抗原を精製した後、アルミニウムゲルを加えて調整したワクチンを用いることができる。動物細胞として、例えば、ｈｕＧＫ−１４細胞を用いて調整したワクチンを用いることができる。
【０１００】
２、ＨＢｓ抗原提示能を有する樹状細胞の製造方法
本実施の形態に係るＨＢｓ抗原提示能を有する樹状細胞の製造方法は、樹状細胞をＨＢｓ抗原でパルスする工程を含む。これによれば、Ｂ型肝炎の予防又は治療に有効な、ＨＢｓ抗原提示能を有する樹状細胞を得ることができる。
【０１０１】
前記製造方法はさらに、血液から前記樹状細胞を得る工程を含むことが好ましい。これによれば、血液由来の樹状細胞から、本発明のＨＢｓ抗原提示能を有する樹状細胞を得ることが可能である。また、血液を用いれば、従来公知の方法等を用いて、比較的簡便な操作によって樹状細胞を得ることが可能である。
【０１０２】
また、前記製造方法はさらに、生物から前記血液を採取する工程を含むことが好ましい。
【０１０３】
前記生物は、ヒトであることが好ましい。これによれば、ヒトのＢ型肝炎の予防又は治療に有効な、ＨＢｓ抗原提示能を有する樹状細胞を得ることが可能である。
【０１０４】
また、前記ＨＢｓ抗原は、ＨＢワクチンに含まれるＨＢｓ抗原であることが好ましい。これによれば、生物、例えば健常者を含むヒトに、安全かつ有効に用いることができるＢ型肝炎の予防又は治療に有効な、ＨＢｓ抗原提示能を有する樹状細胞を提供することができる。
【０１０５】
３、ＨＢｓ抗原提示能を有する樹状細胞を含む組成物
本実施の形態に係る組成物は、本実施の形態に係るＨＢｓ抗原提示能を有する樹状細胞を含むことが好ましい。
【０１０６】
また、本実施の形態に係る組成物はさらに、ＨＢワクチン添加物を含むことが好ましい。
【０１０７】
本実施の形態において、「本実施の形態に係る組成物はさらに、ＨＢワクチン添加物を含む」とは、ＨＢワクチン添加物が、本実施の形態に係る組成物全体中のどこかに含まれている状態を言うとする。すなわち、ＨＢワクチン添加物が含まれる場所は、本実施の形態に係る組成物中の樹状細胞の外、中、細胞膜上等どこでもよく、特に限定されない。本実施の形態に係る組成物がワクチン添加物を含むことにより、ＨＢｓ抗原として、ＨＢワクチンに含まれるＨＢｓ抗原を用いて本実施の形態に係るＨＢｓ抗原提示能を有する樹状細胞を得たことが、判定可能となる。
【０１０８】
ＨＢワクチン添加物としては、例えば、保存剤、抗生物質、安定剤、防腐剤、免疫増進薬、緩衝剤、等張化剤等を挙げることができる。具体例としては、チメロサール、硫酸アルミニウムカリウム、水酸化ナトリウム、塩化アルミニウム、酢酸、酢酸ナトリウム、塩化ナトリウム等を挙げることができる。なお、ＨＢワクチン添加物はこれらに限定されない。
【０１０９】
ＨＢワクチン添加物の検出方法としては、例えば、公知の分析方法を用いることができる。具体的には、例えば、各種クロマトグラフを用いた分離分析、定量分析や、赤外線分光分析、核磁気共鳴分析、質量分析、元素分析などによる構造分析等を挙げることができる。
【０１１０】
本実施の形態に係る組成物は、実験試薬又は実験キットであることが好ましい。これによって、本実施の形態に係るＨＢｓ抗原提示能を有する樹状細胞を、様々な研究に適した態様で用いることができる。用いうる研究分野としては、例えば、免疫応答、免疫寛容、サイトカイン産生に関するシグナル伝達メカニズムについての研究や、樹状細胞を用いた免疫療法についての研究が挙げられる。また、例えば、Ｂ型肝炎の予防又は治療に関わる研究、例えば、遺伝子、ＲＮＡ、ペプチド、タンパク質、化合物、医薬、サイトカイン等のスクリーニング等の目的にも用いることができる。
【０１１１】
また、本実施の形態に係る組成物は、医薬組成物であることが好ましい。本実施の形態に係る医薬組成物は、例えば、生体内に直接投与する態様や、生体外で他の物質や細胞と混合する態様で用いることができる。
【０１１２】
また、本実施の形態に係る組成物は、免疫応答活性化製剤であることが好ましい。本実施の形態に係る免疫応答活性化製剤は、例えば、生体内に直接投与する態様や、生体外で他の物質や細胞と混合する態様で用いることができる。
【０１１３】
本実施の形態に係る組成物を生体外で用いる態様としては、例えば、本実施の形態に係る免疫応答活性化製剤とＴ細胞を混合して、ＨＢｓ抗原エピトープをＴ細胞に提示することによってＴ細胞を活性化する使用方法が挙げられる。また、このＴ細胞は生体内に投与して用いることが可能である。
【０１１４】
また、本実施の形態に係る組成物を生体内に直接投与する態様としては、例えば、細胞ワクチンとしての注射や点滴が挙げられる。細胞ワクチンとしては、好ましくは、Ｂ型肝炎の予防又は治療ワクチンである。また、本実施の形態に係る組成物を生体内に直接投与する場所としては、例えば、静脈内投与、動脈内投与、胸腔内投与、腹腔内投与、皮下投与、筋肉中投与、組織内（例えば肝臓内）投与、リンパ節投与等が挙げられる。投与の簡潔さの点から、皮下注射が好ましい。
【０１１５】
４、ＨＢｓ抗原提示能を有する樹状細胞を用いたＢ型肝炎の予防又は治療
本実施の形態に係るＨＢｓ抗原提示能を有する樹状細胞は、例えば、Ｂ型肝炎の予防又は治療に用いることができる。
【０１１６】
ＨＢｓ抗原提示能を有する樹状細胞を用いたＢ型肝炎の予防又は治療は、例えば、従来のＢ型肝炎の予防又は治療方法と組み合わせて用いることができる。
【０１１７】
また、本実施の形態に係るＨＢｓ抗原提示能を有する樹状細胞を用いたＢ型肝炎の予防又は治療は、ＨＢｓ抗原提示能を有する樹状細胞を、生物に投与する工程を含むことが好ましい。前記生物としては、例えば、前述のようなＢ型肝炎に感染しうる生物を挙げることができる。また、拒絶反応を抑えることができれば、樹状細胞が由来とする生物と、投与対象となる生物が、同種生物でも異種生物でもよい。同種生物の場合においては、本実施の形態に係る樹状細胞を、取り出した自己の体内に投与することも、組織適合性抗原が投与可能な程度に一致している非自己の体内に投与することも可能である。
【０１１８】
例えば、前記生物は、ヒトであることが好ましい。この場合、ＨＬＡの型が可能な限り一致していることが望ましい。従って、樹状細胞の由来は、好ましくは、血縁にあたる提供者に由来する樹状細胞である。自家細胞を用いればＨＬＡの型の適合性を考慮する必要がないため、より好ましくは、投与対象の本人に由来する樹状細胞である。
【０１１９】
本実施の形態に係るＨＢｓ抗原提示能を有する樹状細胞は、前述のように、生体内に直接投与する態様で用いることや、生体外でＴ細胞と混合してＴ細胞を活性化し、このＴ細胞は生体内に投与する態様で用いることが可能である。しかし、Ｔ細胞はエフェクター細胞であるため、一度機能を果たすと短時間で死に、消失してしまう。従って、Ｂ形肝炎を予防、治療するためには、Ｔ細胞を高頻度で繰り返し投与する必要がある。それに対し、樹状細胞は、ナイーブＴ細胞やＨＢｓメモリーＴ細胞、Ｂ細胞にも作用し、繰り返し刺激を与えるため、長時間でかつ強力な効果をもたらす。以上のことから、本実施の形態に係るＨＢｓ抗原提示能を有する樹状細胞を、生体内に直接投与する態様で用いる方がより好ましいと考えられる。
【０１２０】
５、本実施の形態に係るＨＢｓ抗原提示能を有する樹状細胞の使用例及びその効果
以下に、本実施の形態に係るＨＢｓ抗原提示能を有する樹状細胞の使用例及びその効果について示す。本使用例では、本実施の形態に係るＨＢｓ抗原提示能を有する樹状細胞を、ヒトに投与する工程を含むことが好ましい。本使用例は、Ｂ型肝炎の予防又は治療に適用することができる。なお、本使用例は、以下の場合に限定されず、本使用例に係る樹状細胞の使用態様は、本発明の要旨を超えない範囲で種々の変更が可能である。
【０１２１】
５−１、Ｂ型肝炎の予防への適用
健常者のうちの約１０％は、ＨＢワクチンに対して非奏功である人（ｎｏｎ−ｒｅｓｐｏｎｄｅｒ）であり、ＨＢワクチンを投与しても抗ＨＢｓ抗体を産生することができないことが知られている。Ｂ型肝炎は血液を介して感染するため、医療従事者等は、特に抗ＨＢｓ抗体の必要性が高いと考えられるが、これらの人々においてもＨＢワクチンｎｏｎ−ｒｅｓｐｏｎｄｅｒが少なくない。
【０１２２】
そこで、これらのＨＢワクチンｎｏｎ−ｒｅｓｐｏｎｄｅｒに、本実施の形態に係るＨＢｓ抗原提示能を有する樹状細胞を投与することによって、これらの人々が抗ＨＢｓ抗体を産生することが可能になる。Ｂ型肝炎の感染を予防するには、抗ＨＢｓ抗体値を少なくとも１０ｍＩＵ／ｍＬに維持することが必要であると言われている。後述の実験例１１の結果によれば、本実施の形態に係るＨＢｓ抗原提示能を有する樹状細胞を１回投与したことによって、ＨＢワクチンｎｏｎ−ｒｅｓｐｏｎｄｅｒの抗ＨＢｓ抗体値が平均３０ｍＩＵ／ｍＬまで上昇し、１０ｍＩＵ／ｍＬ以上の値をおよそ３〜６ヶ月間維持できることがわかった。従って、本実施の形態に係るＨＢｓ抗原提示能を有する樹状細胞によって、現在のＨＢワクチンｎｏｎ−ｒｅｓｐｏｎｄｅｒが抗ＨＢｓ抗体を産生できるようになり、Ｂ型肝炎に感染するのを予防することができる。
【０１２３】
また、現在、Ｂ型肝炎の予防に用いられているＨＢワクチンは、一定期間ごとに通常３回の接種を行う必要がある。後述の実験例１１の結果によれば、本実施の形態に係るＨＢｓ抗原提示能を有する樹状細胞を１回投与することによって、ＨＢワクチンｎｏｎ−ｒｅｓｐｏｎｄｅｒのみならず、ＨＢワクチンが奏功する健常者（ｒｅｓｐｏｎｄｅｒ）の抗ＨＢｓ抗体値も高めることが可能であることがわかった。従って、本実施の形態に係るＨＢｓ抗原提示能を有する樹状細胞は、ＨＢワクチンｎｏｎ−ｒｅｓｐｏｎｄｅｒのみならず、ＨＢワクチンｒｅｓｐｏｎｄｅｒに対しても、新たなＢ型肝炎の予防手段として用いることができ、接種回数と経済的負担を減らすことができる可能性がある。
【０１２４】
また、ＨＩＶ患者、肝疾患患者、透析患者、肥満者、喫煙者等の免疫能が低下している人にも、従来のＨＢワクチンが十分に効果を発揮できないことが知られている。このような人々も、本実施の形態に係るＨＢｓ抗原提示能を有する樹状細胞を用いることによって、抗ＨＢｓ抗体を産生することが可能になると考えられる。
【０１２５】
５−２、Ｂ型肝炎の治療への適用
Ｂ型肝炎の治療には、これまで主に抗ウイルス剤が用いられてきた。しかし、抗ウイルス剤を長期間投与することにより、抗ウイルス剤が効かない変異ウイルスが高頻度で出現することが知られている。その結果、Ｂ型肝炎ウイルス量が再上昇し、肝炎の憎悪をまねく危険性があった。
【０１２６】
そこで、本実施の形態に係るＨＢｓ抗原提示能を有する樹状細胞を用いれば、このような変異ウイルスの出現頻度を下げることができると予想され、これはＢ型肝炎治療において大きな利点であると考えられる。
【０１２７】
また、肝移植対象者等の免疫抑制剤投与中の人も、免疫抑制状態であるために通常のＨＢワクチンが効かず、抗ＨＢｓ抗体を産生できない。しかし、Ｂ型肝炎関連肝移植においては、抗ＨＢｓ抗体値を維持することが治療成績に大きな好影響を及ぼすことが知られているため、患者は移植後、抗ＨＢｓヒト免疫グロブリンを２週間に１回の頻度で投与することが必要である。このことは患者に、年間約２５０万円の負担をもたらしており、この経済的問題の解決が世界的に必要とされている。
【０１２８】
そこで、本実施の形態に係るＨＢｓ抗原提示能を有する樹状細胞を患者に投与することにより、患者は、抗ＨＢｓ抗体を産生できるようになると考えられる。さらに、後述の実験例１１の結果より、本実施の形態に係るＨＢｓ抗原提示能を有する樹状細胞を、例えば３〜６ヶ月に１回の頻度で投与することで、１０ｍＩＵ／ｍＬ以上の抗ＨＢｓ抗体値を維持できると予想される。このことから、本実施の形態に係るＨＢｓ抗原提示能を有する樹状細胞を用いれば、抗ＨＢｓヒト免疫グロブリンを用いるよりも投与頻度を大幅に減らすことが可能であり、その結果、患者の経済的負担を大幅に軽減できると考えられる。
【０１２９】
また、従来から存在するＨＢワクチンは、Ｂ型肝炎の予防ワクチンであり、Ｂ型肝炎の治療ワクチンは、あくまでも試験的にしか使用されていなかった。
【０１３０】
それに対して、前述のように、本実施の形態に従ってＨＢワクチンを用いて製造したＨＢｓ抗原提示能を有する樹状細胞は、従来から存在するＨＢワクチンを、Ｂ型肝炎の予防のみならず、治療にも用いることを可能にした。このことは、現在実際に使用されており、安全性、有効性が認められているＨＢワクチンの使用用途を広げるものであり、さらに、従来から存在するＨＢワクチンの効果を高める新たな使用態様を見出したものと言える。
【０１３１】
以上から、本実施の形態に係るＨＢｓ抗原提示能を有する樹状細胞には、広い使用用途と大きな利点が認められる。
【０１３２】
６、ワクチンパルス樹状細胞
本実施の形態に係るワクチンパルス樹状細胞は、樹状細胞をワクチンでパルスする工程を含む方法によって得られる。これによれば、疾患の予防又は治療に有効な、ワクチンパルス樹状細胞を提供することができる。
【０１３３】
前記方法はさらに、血液から樹状細胞を得る工程を含むことが好ましい。
【０１３４】
また、前記方法はさらに、生物から前記血液を採取する工程を含むことが好ましい。前記生物は、ヒトであることが好ましい。
【０１３５】
また、前記方法は、Ｂ型慢性肝炎又はキャリアの患者から末梢血を採取し、その末梢血から単離した単球を用いて樹状細胞を得ることが好ましい。ヒトの場合、末梢血は、安全かつ容易に繰り返し採取することができるからである。
【０１３６】
また、ワクチンの添加時期は、結果として、ワクチンに含まれる抗原が樹状細胞によって提示されることが可能ならば特に限定されず、例えば、樹状細胞を分化誘導した後に添加することができる。また、分化誘導時にワクチンを添加して、一緒に培養することもできる。また、ワクチンによるパルス時間も、結果として、ワクチンに含まれる抗原が樹状細胞によって提示されることが可能ならば特に限定されず、例えば、８時間から２４時間であることが好ましい。
【０１３７】
ワクチンとしては、結果として、前記ワクチンに含まれる抗原が樹状細胞によって提示されることが可能であれば特に限定されず、例えば、生ワクチン、不活化ワクチン、トキソイド、抗毒素等を用いることができる。また、ワクチンの形態も、結果として、前記ワクチンに含まれる抗原が樹状細胞によって提示されることが可能であれば特に限定されず、例えば、液状ワクチン、沈降型ワクチン、凍結乾燥ワクチン等を用いることができる。
【０１３８】
本実施の形態に用いうるワクチンの例として、百日せきワクチン、ジフテリアトキソイド、破傷風トキソイド、ポリオワクチン、麻疹ワクチン、風疹ワクチン、日本脳炎ワクチン、インフルエンザワクチン、ＢＣＧワクチン等の結核ワクチン、おたふくかぜワクチン、水痘ワクチン、Ａ型肝炎ワクチン、Ｂ型肝炎ワクチン、肺炎球菌ワクチン、黄熱ワクチン、狂犬病ワクチン、コレラワクチン、ワイル病秋やみ混合ワクチン、はぶ抗毒素、まむし抗毒素、ペストワクチン、ＭＭＲワクチン、腸チフスワクチン、インフルエンザｂ菌結合型ワクチン、髄膜炎菌ワクチン、赤痢ワクチン、マラリアワクチン等が挙げられる。なお、本実施の形態に用いうるワクチンは、ここに例示したものに限定されない。
【０１３９】
前記パルスに使用するワクチンは、疾患の予防又は治療ワクチンであることが好ましい。例えば、前記パルスに使用するワクチンは、肝炎ワクチンであることが好ましい。前記肝炎ワクチンは、例えば、ＨＢｓ抗原を含むＨＢワクチンであることが好ましい。
【０１４０】
７、ワクチンパルス樹状細胞の製造方法
本実施の形態に係るワクチンパルス樹状細胞の製造方法は、樹状細胞をワクチンでパルスする工程を含む。これによれば、疾患の予防又は治療に有効な、ワクチンパルス樹状細胞を得ることができる。
【０１４１】
前記製造方法はさらに、血液から前記樹状細胞を得る工程を含むことが好ましい。これによれば、血液由来の樹状細胞から、本発明のワクチンパルス樹状細胞を得ることが可能である。また、血液を用いれば、従来公知の方法等を用いて、比較的簡便な操作によって樹状細胞を得ることが可能である。
【０１４２】
また、前記製造方法はさらに、生物から前記血液を採取する工程を含むことが好ましい。
【０１４３】
前記生物は、ヒトであることが好ましい。これによれば、ヒト疾患の予防又は治療に有効な、ワクチンパルス樹状細胞を得ることが可能である。
【０１４４】
また、前記パルスに使用するワクチンは、疾患の予防又は治療ワクチンであることが好ましい。これによれば、前記疾患の予防又は治療に有効な、ワクチンパルス樹状細胞を提供することができる。
【０１４５】
前記パルスに使用するワクチンは、肝炎ワクチンであることが好ましい。これによれば、生物、例えば健常者を含むヒトに、安全かつ有効に用いることができる肝炎の予防又は治療に有効な、肝炎ウイルス抗原提示能を有する肝炎ワクチンパルス樹状細胞を提供することができる。
【０１４６】
前記肝炎ワクチンは、例えば、ＨＢｓ抗原を含むＨＢワクチンであることが好ましい。これによれば、生物、例えば健常者を含むヒトに、安全かつ有効に用いることができるＢ型肝炎の予防又は治療に有効な、ＨＢｓ抗原提示能を有する肝炎ワクチンパルス樹状細胞を提供することができる。
【０１４７】
８、ワクチンパルス樹状細胞を含む組成物
本実施の形態に係る組成物は、本実施の形態に係るワクチンパルス樹状細胞を含むことが好ましい。
【０１４８】
また、本実施の形態に係る組成物はさらに、ワクチン添加物を含むことが好ましい。
【０１４９】
本実施の形態において、「本実施の形態に係る組成物はさらに、ワクチン添加物を含む」とは、ワクチン添加物が、本実施の形態に係る組成物全体中のどこかに含まれている状態を言うとする。すなわち、ワクチン添加物が含まれる場所は、本実施の形態に係る組成物中の樹状細胞の外、中、細胞膜上等どこでもよく、特に限定されない。本実施の形態に係る組成物がワクチン添加物を含むことにより、抗原として、ワクチンに含まれる抗原を用いて、本実施の形態に係るワクチンパルス樹状細胞を得たことが、判定可能となる。
【０１５０】
ワクチン添加物としては、例えば、保存剤、抗生物質、安定剤、防腐剤、免疫増進薬、緩衝剤、等張化剤、着色剤等を挙げることができる。具体例としては、保存剤としてチメロサール、ホルマリン等、抗生物質としてエリスロマイシン、ラクトビオン酸エリスロマイシン、硫酸カナマイシン等、及び、他の添加物が挙げられる。他の添加物としては、例えば、精製白糖、Ｌ−グルタミン酸ナトリウム、ゼラチン、乳糖、グルタミン酸カリウム、Ｄ−ソルビトール、ヒト血清アルブミン、ポリソルベート８０、グリシン、ブドウ糖、水酸化ナトリウム、硫酸アルミニウムカリウム、塩化アルミニウム、酢酸、酢酸ナトリウム、塩化ナトリウム、塩化カリウム、リン酸二水素カリウム、リン酸水素ナトリウム、塩化ナトリウム、フェノールレッド、Ｌ−塩酸アルギニン、リン酸二ナトリウム、リン酸一カリウム、Ｌ−アルギニン酸、塩酸リジン等を挙げることができる。これらの他の添加物は、安定剤、防腐剤、免疫増進薬、緩衝剤、等張化剤、着色剤として添加されることができる。なお、ワクチン添加物はこれらに限定されない。
【０１５１】
本実施の形態に係る組成物は、実験試薬又は実験キットであることが好ましい。これによって、本実施の形態に係るワクチンパルス樹状細胞を、様々な研究に適した態様で用いることができる。用いうる研究分野としては、例えば、その疾患に関するシグナル伝達メカニズムについての研究や、樹状細胞を用いた免疫療法についての研究が挙げられる。また、例えば、その疾患の予防又は治療に関わる研究、例えば、遺伝子、ＲＮＡ、ペプチド、タンパク質、化合物、医薬、サイトカイン等のスクリーニング等の目的にも用いることができる。
【０１５２】
また、本実施の形態に係る組成物は、医薬組成物であることが好ましい。本実施の形態に係る医薬組成物は、例えば、生体内に直接投与する態様や、生体外で他の物質や細胞と混合する態様で用いることができる。
【０１５３】
また、本実施の形態に係る組成物は、免疫応答活性化製剤であることが好ましい。本実施の形態に係る免疫応答活性化製剤は、例えば、生体内に直接投与する態様や、生体外で他の物質や細胞と混合する態様で用いることができる。
【０１５４】
本実施の形態に係る組成物を生体外で用いる態様としては、例えば、本実施の形態に係る免疫応答活性化製剤とＴ細胞を混合して、ワクチンに含まれていた抗原エピトープをＴ細胞に提示することによってＴ細胞を活性化する使用方法が挙げられる。また、このＴ細胞は生体内に投与して用いることが可能である。
【０１５５】
また、本実施の形態に係る組成物を生体内に直接投与する態様としては、例えば、細胞ワクチンとしての注射や点滴が挙げられる。細胞ワクチンとしては、好ましくは、疾患の予防又は治療ワクチンである。また、本実施の形態に係る組成物を生体内に直接投与する場所としては、例えば、静脈内投与、動脈内投与、胸腔内投与、腹腔内投与、皮下投与、筋肉中投与、組織内（例えば肝臓等）投与、リンパ節投与等が挙げられる。投与の簡潔さの点から、皮下注射が好ましい。
【０１５６】
９、ワクチンパルス樹状細胞を用いた疾患の予防又は治療
本実施の形態に係るワクチンパルス樹状細胞は、疾患の予防又は治療に用いることができる。前記疾患としては、Ｂ型肝炎およびＢ型慢性肝炎があげられる。
【０１５７】
本実施の形態に係るワクチンパルス樹状細胞は、例えば、従来のその疾患の予防又は治療方法と組み合わせて用いることができる。
【０１５８】
また、本実施の形態に係る疾患の予防又は治療は、ワクチンパルス樹状細胞を、生物に投与する工程を含むことが好ましい。前記生物としては、例えば、前記疾患に感染しうる生物を挙げることができる。また、拒絶反応を抑えることができれば、樹状細胞が由来とする生物と、投与対象となる生物が、同種生物でも異種生物でもよい。同種生物の場合においては、本実施の形態に係る樹状細胞を、取り出した自己の体内に投与することも、組織適合性抗原が投与可能な程度に一致している非自己の体内に投与することも可能である。
【０１５９】
例えば、前記生物は、ヒトであることが好ましい。この場合、ＨＬＡの型が可能な限り一致していることが望ましい。従って、樹状細胞の由来は、好ましくは、血縁にあたる提供者に由来する樹状細胞である。自家細胞を用いればＨＬＡの型の適合性を考慮する必要がないため、より好ましくは、投与対象の本人に由来する樹状細胞である。
【０１６０】
本実施の形態に係るワクチンパルス樹状細胞は、前述のように、生体内に直接投与する態様で用いることや、生体外でＴ細胞と混合してＴ細胞を活性化し、このＴ細胞を生体内に投与する態様で用いることが可能である。しかし、Ｔ細胞はエフェクター細胞であるため、一度機能を果たすと短時間で死に、消失してしまう。従って、疾患を予防、治療するためには、Ｔ細胞を高頻度で繰り返し投与する必要がある。それに対し、樹状細胞は、ナイーブＴ細胞やメモリーＴ細胞、Ｂ細胞にも作用し、繰り返し刺激を与えるため、長時間でかつ強力な効果をもたらす。以上のことから、本実施の形態に係るワクチンパルス樹状細胞を、生体内に直接投与する態様で用いる方がより好ましいと考えられる。
【０１６１】
１０、本実施の形態に係るワクチンパルス樹状細胞の使用例及びその効果
以下に、本実施の形態に係るワクチンパルス樹状細胞の使用例及びその効果を示す。本使用例では、本実施の形態に係るワクチンパルス樹状細胞を、ヒトに投与する工程を含むことが好ましい。本使用例は、疾患の予防又は治療に適用することができる。なお、本使用例は、以下の場合に限定されず、本使用例に係る樹状細胞の使用態様は、本発明の要旨を超えない範囲で種々の変更が可能である。
【０１６２】
これまで、癌治療等で行われてきた樹状細胞療法においては、樹状細胞を、癌細胞から抽出した物質を用いてパルスしている。背景技術の項で前述したように、細胞から抽出した物質は、一般に、多種類の物質の混合物である。従って、細胞抽出物質を用いてパルスした樹状細胞は、細胞抽出物質中の多種類の抗原によってパルスされたと考えられる。そのように処理した樹状細胞は、特定できない抗原や、疾患に関連のない抗原を提示している樹状細胞を含む抗原提示能を有する多種類の樹状細胞の集団であると考えられる。このようにして作製された樹状細胞は、癌治療等の分野において、すでに疾患にかかった患者の治療に使用することは許されているが、健常者に投与することは許されない。従って、細胞抽出物質を用いてパルスした樹状細胞を、疾患の予防のために、健常者に対して用いることは不可能である。
【０１６３】
これに対して、本実施の形態におけるワクチンパルス樹状細胞は、ワクチンを用いて樹状細胞をパルスすることによって作製することができる。ワクチンとして実際に販売されるものは、健常者を含むヒトに安全性、有効性が認められ、認可を受けたものである。従って、本実施の形態による、ワクチンでパルスした樹状細胞は、疾患の治療のために患者に使用できるだけでなく、疾患の予防のために健常者にも使用することができる。
【０１６４】
また、例えば結核について、日本では戦後順調に患者数が減少してきたものの、１９８０年頃より減少率が鈍化し、１９９７年から３年連続で患者数が増加した。また、結核の治療には、抗結核剤の長期投与が不可欠だが、それによって薬剤耐性菌が生じる可能性が非常に高く、それを防ぐために２種類以上の多剤併用が鉄則であった。
【０１６５】
そこで、本実施の形態に係るワクチンパルス樹状細胞を、結核の治療に用いることができる。ここで本実施の形態に係るワクチンパルス樹状細胞として、ＢＣＧワクチン等の結核ワクチンでパルスする工程を含む方法によって得られたワクチンパルス樹状細胞を用いることができる。これによれば、前述のような薬剤耐性菌の出現頻度を下げることができると予想され、これは結核の治療において大きな利点であると考えられる。また、他の疾患についても、治療にワクチンパルス樹状細胞を用いることによって同様の効果が期待できる可能性があり、その疾患の治療に大きな利点となることが予想される。
【０１６６】
また、樹状細胞に抗原提示させる別の手法として、抗原をコードする遺伝子を、プラスミドベクター等に組み込んでトランスフェクションすることによって又はウイルスベクター等に組み込んで感染させることによって、樹状細胞内で目的抗原を発現させる方法が知られている。しかし今日では、このように遺伝子操作を施した樹状細胞を、疾患にかかった患者の治療に使用することが許される場合はあっても、健常者に対する疾患の予防のために用いることは許されていない。
【０１６７】
これに対して、本実施の形態におけるワクチンパルス樹状細胞は、前述のように、患者に対する疾患の治療ワクチンとして使用できるだけでなく、健常者に対する疾患の予防ワクチンとして使用が可能である。
【０１６８】
また、ワクチンが有効でない患者の原因の一つに、樹状細胞の機能低下が考えられる。すなわち、これまでのような生体へのワクチンの投与のみでは、十分に樹状細胞の活性化ができない状態が考えられる。
【０１６９】
そこで、本実施の形態に係るワクチンパルス樹状細胞を、例えば、生体内に直接投与する態様や、生体外でＴ細胞と混合してＴ細胞を活性化しこのＴ細胞を生体内に投与する態様で用いることによって、これまでワクチンが効かず抗体を産生できなかった健常者に対しても、目的抗原に対する抗体を産生させることが可能となる。
【０１７０】
以上から、本実施の形態に係るワクチンパルス樹状細胞には、広い使用用途と大きな利点が認められる。また、本実施の形態に係るワクチンパルス樹状細胞を用いた疾患の予防又は治療は、従来の樹状細胞療法とは全く区別されると考えられる。
【０１７１】
なお、この発明を実施するための最良の形態の項において、６、〜１０、における、パルスの定義、パルスの具体的な方法、樹状細胞を得る方法、樹状細胞培養のための培地やサイトカイン、ワクチン添加物の検出方法等は、特に記載しない限り、同項の１、〜５、に記したものと同様の解釈、方法、物質を用いることができるものとする。
【実施例１】
【０１７２】
以下、本発明を実験例に基づき具体的に説明するが、本発明は本実施例に限定されるものではない。
【０１７３】
（実験例１）樹状細胞の調製
（１）ヘパリン（ノボ・ヘパリン注１０００：アベンティス社製）で内腔をぬらした注射器（テルモシリンジＳＳ−５０ＥＳＺ：テルモ社製）を用いて、被験者（すでにＨＢワクチンの投与を繰り返し受けた経験がある健常人ボランティア５人を対象とした。）１人あたり４０〜６０ｍＬの採血を行った。得られた血液と、血液と同量のｐｈｏｓｐｈａｔｅ−ｂｕｆｆｅｒｅｄ ｓａｌｉｎｅ（ＰＢＳ）を、専用クリーンベンチ内で十分に混合した。次に、Ｆｉｃｏｌｌ−Ｃｏｎｒａｙ液（比重１．０７７）を用いた比重遠心法により、単核細胞を分離した。遠心は、室温、１８００ｒｐｍ〜３０００ｒｐｍで３０分間行い、遠心後の中間層を単核細胞として取り出した。
【０１７４】
（２）同時に、以下の手順に従って、それぞれの被験者から自己血清を得た。まず、ヘパリンを使用していない別の注射器（テルモシリンジＳＳ−１０ＥＳＺ：テルモ社製）を用いて、被験者１人あたり約１０ｍＬの採血を行った。次に、得られた血液を滅菌済みバキュテイナ採血管（ベクトン・ディッキンソン社製）を用いて３０００ｒｐｍで遠心し、血清を分離した。
【０１７５】
（３）（１）で得られた単核細胞にＰＢＳを加え、十分に混合した。次に、このサンプルを４℃、１８００ｒｐｍ〜２７００ｒｐｍで１０分間遠心し、（１）と同様の手順で、単核細胞を再度回収した。この操作を最低２回繰り返すことによって、単核細胞を十分に洗浄した。
【０１７６】
（４）（３）によって得られた単核細胞をカウントし、２×１０６〜２×１０７／ｍＬの細胞密度で、３５ｍｍ ｄｉｓｈに２ｍＬずつ加えた。培地は、（２）で得られた被験者それぞれの自己血清を１〜５％の濃度で加えたＲＰＭＩ １６４０培地（ニプロ社製）を用いた。培養は、専用培養室にて、３７℃、５％ＣＯ２濃度、７５％のａｉｒの条件で行った。
【０１７７】
（５）（４）の単核細胞を９０分間培養後、以下の手順に従って、付着細胞を分離した。まず、ｄｉｓｈを培養室から取り出し、クリーンベンチ内で５分間静置した。その後、ｄｉｓｈを斜めに傾け、培養液を付着細胞全体にゆっくりとかけて洗浄を行い、リンパ球を取り除いた。
【０１７８】
（６）（５）で得られた付着細胞（単球）を、１枚のｄｉｓｈにつき、ＧＭ−ＣＳＦ（ペプロテックＥＣ社製）を８００Ｕ／ｍＬ、ＩＬ−４（ペプロテックＥＣ社製）を５００Ｕ／ｍＬ、自己血清を１〜５％加えたＲＰＭＩ １６４０培地２ｍＬで４日間培養した。
【０１７９】
（７）培養４日目に、培養上清の１ｍＬを捨て、新たに（６）に記載した組成の培地を１ｍＬ加え、さらに４日間培養した。
【０１８０】
（８）培養８日目に、ｄｉｓｈから樹状細胞を回収し、樹状細胞数を測定した。
【０１８１】
（実験例２）ＨＢワクチンによる樹状細胞のパルス
（１）実験例１で得られた樹状細胞を２つに分けた。一方の樹状細胞に、ＨＢワクチン（ｒ−ＨＢワクチン「ミツビシ」：三菱ウェルファーマ社製）（組成：ＨＢｓ抗原２０μｇ、チメロサール０．０１ｗ／ｖ％、硫酸アルミニウムカリウム５．２ｇ（それぞれ１ｍＬあたり））を最終濃度２．５〜５μｇ／ｍＬになるように添加して８〜２４時間培養し、ＨＢｓ抗原を含むＨＢワクチンでパルスした樹状細胞を作製した。（以下、この細胞を「ＨＢワクチンパルス樹状細胞」と記す。）培養は、専用培養室にて、３７℃、５％ＣＯ２濃度、７５％のａｉｒの条件で行った。もう一方の樹状細胞は、ＨＢワクチンを添加せず、ネガティブコントロールとして培養した。
【０１８２】
（２）培養後、ｄｉｓｈからＨＢワクチンパルス樹状細胞を回収した。回収した細胞と、ＰＢＳを混合して、４℃、１５００ｒｐｍで５分間遠心後、上清を捨てた。この操作を５回繰り返すことによって、樹状細胞を十分に洗浄した。得られた樹状細胞を、ＰＢＳ５００μＬに加えた。また、ネガティブコントロールの樹状細胞についても同様の操作を行った。
【０１８３】
（実験例３）ＨＢワクチンパルス樹状細胞の投与
（１）ＨＢワクチンパルス樹状細胞投与前の抗ＨＢｓ抗体を測定した。まず、被験者（すでにＨＢワクチンの投与を繰り返し受けた経験がある健常人ボランティア）５人から採血を行い、実験例１（２）と同様の方法を用いて、それぞれの被験者から血清を得た。その血清を用いて、ＣＬＩＡ法によって抗ＨＢｓ抗体値を測定した。結果を図１に示す。図１に示すように、被験者５人のうち、２人が抗ＨＢｓ抗体を産生することができ（抗ＨＢｓ抗体陽性，ｒｅｓｐｏｎｄｅｒ）、３人が抗ＨＢｓ抗体を産生できない（抗ＨＢｓ抗体陰性，ｎｏｎ−ｒｅｓｐｏｎｄｅｒ）ことがわかった。
【０１８４】
（２）被験者へのＨＢワクチンパルス樹状細胞の投与を行った。まず、実験例２で得られたＨＢワクチンパルス樹状細胞５００μＬのうち５０μＬを用いて、それぞれの被験者に各自の樹状細胞に対するプリックテストを行った。その結果、すべての被験者においてプリックテストが陰性であった。次に、それぞれの被験者に、各自のＨＢワクチンパルス樹状細胞を４５０μＬ皮下投与した。なお、実験例１から実験例３に示したＨＢワクチンパルス樹状細胞の作製、投与の過程において、作業者は滅菌ガウン、滅菌マスク、滅菌キャップを着用して作業し、操作は可能な限りクリーンベンチ内で行った。使用試薬は、滅菌済みの試薬を購入して使用し（ＰＢＳ：インビトロジェン社製、ＲＰＭＩ １６４０：ニプロ社製、等）、使用に際して、肉眼及び顕微鏡で、試薬に混濁がないことを確認した。また、培養上清中のエンドトキシン測定等を実施することによって、培養過程での微生物による汚染がないことを確認した。
【０１８５】
（実験例４）ＨＢワクチンパルス樹状細胞の表面抗原解析
フローサイトメトリーを用いて、細胞表面抗原の解析を行った。
【０１８６】
（１）実験例２で得られた、ＨＢワクチンパルス樹状細胞、及び、パルスしていない樹状細胞を、５℃、１５００ｒｐｍで５分間遠心して回収した。回収した細胞をＦＣＭ ＰＢＳ（ｐＨ ７．２２：ギブコ社製）で洗浄し、再び５℃、１５００ｒｐｍで５分間遠心して回収した。
【０１８７】
（２）（１）で得られたそれぞれの樹状細胞を４本のスピッツ管に分け、（ａ）ＦＩＴＣ標識マウスＩｇＧ（Ｃａｔ．Ｎｏ．３４９０４１：ベクトン・ディッキンソン社製）を１０μＬ、（ｂ）ＰＥ標識マウスＩｇＧ（Ｃａｔ．Ｎｏ．３４９０４３：ベクトン・ディッキンソン社製）を２μＬ、（ｃ）ＦＩＴＣ標識マウス抗ヒトＨＬＡ−ＤＲモノクローナル抗体（ＰＭ−３２４１４Ｘ：ベクトン・ディッキンソン社製）を１０μＬ、（ｄ）ＰＥ標識抗ヒトＣＤ８６（Ｂ７０／Ｂ７−２）（Ｍａｔ．Ｎｏ．５５５６５８：ファーミンジェン社製）を１０μＬ添加したサンプルを作製した。これらを氷中に３０分間置き、ｌｙｓｉｎｇ ｓｏｌｕｔｉｏｎ（ベクトン・ディッキンソン社製）を２ｍＬ加えて混合し、５℃、２０００ｒｐｍで５分間遠心した。
【０１８８】
（３）回収した樹状細胞を、ＦＣＭ ＰＢＳ（ｐＨ ７．２２）を用いて十分に洗浄を繰り返した後、ＦＡＣＳｃａｌｉｂｕｒ（ベクトン・ディッキンソン社製）を用いて、表面抗原の解析を行った。
【０１８９】
（４）解析の結果を図２に示す。図２の横軸は解析した表面抗原、縦軸は表面抗原の相対濃度を示す。この結果より、ＨＢワクチンパルス樹状細胞は、パルスしていない樹状細胞と比較して、ＨＬＡ−ＤＲの発現が１．２倍、ＣＤ８６の発現が１．６倍に上昇していることがわかった。これらの結果から、ＨＢワクチンパルス樹状細胞が成熟していることがわかった。
【０１９０】
（実験例５）ＨＢワクチンパルス樹状細胞の機能解析−１
（１）ワクチンを打たない他人の末梢血から、実験例１（１）と同様にして単核細胞を採取した。
【０１９１】
（２）ａｕｔｏＭＡＣＳ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ社製）、Ｐａｎ Ｔ ｃｅｌｌ ｉｓｏｌａｔｉｏｎ ｋｉｔ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ社製）を用いて、単核細胞からＴ細胞を単離する操作を行った。まず、１×１０７あたりの単核細胞にＭＡＣＳ−Ｂｕｆｆｅｒを加えて８０μＬとし、さらに２０μＬのハプテン標識抗体カクテル（ＣＤ１１ｂ、ＣＤ１６、ＣＤ１９、ＣＤ３６、ＣＤ５６）を加えて、６〜１２℃にて１０分間混和した。次に、ＭＡＣＳ−Ｂｕｆｆｅｒを加えて洗浄し、上清を除く操作を２回行った。続いて、１×１０７あたりの単核細胞にＭＡＣＳ−Ｂｕｆｆｅｒを加えて８０μＬとし、さらに２０μＬのＭＡＣＳ抗ハプテン抗体標識マイクロビーズを加えて、６〜１２℃にて１５分間混和した。次に、ＭＡＣＳ−Ｂｕｆｆｅｒを加えて洗浄し、上清を除いた。続いて、１×１０７あたりの単核細胞にＭＡＣＳ−Ｂｕｆｆｅｒを５００μＬ加え、ａｕｔｏＭＡＣＳのＤｅｐｌｅｔｅプログラムにてデプリーションを行い、Ｔ細胞を採取した。
【０１９２】
（３）（ａ）パルスしていない樹状細胞１×１０４細胞、（ｂ）ＨＢワクチンパルス樹状細胞１×１０４細胞に、（２）で得られたＴ細胞をそれぞれ２×１０５細胞加えて、１０８時間培養した。培地は、１０％のＦＣＳ（フィルトロン社製）を加えたＲＰＭＩ １６４０培地を使用した。
【０１９３】
（４）それぞれに３Ｈで標識したサイミジンを添加してさらに１２時間培養した後、ｄｉｓｈから細胞を回収した。
【０１９４】
（５）γ線カウンター（ＬＳ６５００：ベックマン社製）を用いて、取り込み能の評価を行った結果を図３に示す。図３の縦軸はサイミジンの取り込み能を示し、横軸は左から（３）に示した（ａ）、（ｂ）の場合を示す。この結果から、ＨＬＡの一致していないＴ細胞に対して、ＨＢワクチンパルス樹状細胞は、パルスしていない樹状細胞と比較して、Ｔ細胞の幼若化補助能が１．５〜２倍に亢進していることがわかった。
【０１９５】
（実験例６）ＨＢワクチンパルス樹状細胞の機能解析−２
（１）被験者（すでにＨＢワクチンの投与を繰り返し受けた経験がある健常人ボランティアで、かつ、ＨＢワクチンｒｅｓｐｏｎｄｅｒ）から１人あたり６０ｍＬの採血を行い、実験例１（１）、実験例５（２）の方法を用いて、Ｔ細胞を採取した。（以下、このＴ細胞を「ＨＢｓメモリーＴ細胞」と記す。）
（２）同じ被験者から、実験例１の方法を用いて樹状細胞を採取し、二つに分けた。一方の樹状細胞は、実験例２の方法を用いて、ＨＢワクチンパルス樹状細胞とし、もう一方の樹状細胞は、ＨＢワクチンでパルスせずネガティブコントロールとした。
【０１９６】
（３）（ａ）ＨＢｓメモリーＴ細胞１×１０５細胞とＨＢワクチン１０μｇ、（ｂ）ＨＢｓメモリーＴ細胞１×１０５細胞とパルスしていない樹状細胞１×１０４細胞、（ｃ）ＨＢｓメモリーＴ細胞１×１０５細胞とＨＢワクチンパルス樹状細胞１×１０４細胞を、それぞれ混合培養した。
【０１９７】
（４）７日後、測定の１２時間前に３Ｈで標識したサイミジンを投与し、実験例５（５）と同様にγ線カウンターを用いてサイミジン取り込み能を測定した。
【０１９８】
（５）結果を図４示す。図４の縦軸は相対的ｃｐｍ比を表し、横軸に左から、（３）に記した（ａ）、（ｂ）、（ｃ）の場合を示す。この結果から、（ｂ）のパルスしていない樹状細胞と混合培養した場合と比較して、（ｃ）のＨＢワクチンパルス樹状細胞と混合培養したｃｐｍが、７倍となり、ＨＢｓメモリーＴ細胞が増殖していた。
【０１９９】
（実験例７）ＨＢワクチンパルス樹状細胞の機能解析−３
（１）被験者（すでにＨＢワクチンの投与を繰り返し受けた経験がある健常人ボランティアで、かつ、ＨＢワクチンｒｅｓｐｏｎｄｅｒ）から１人あたり６０ｍＬの採血を行い、実験例１（１）の方法を用いて単核細胞を採取した。
【０２００】
（２）単核細胞６×１０７細胞を、（ａ）何も混合せず、（ｂ）ＨＢワクチン１０μｇ、（ｃ）パルスしていない樹状細胞１×１０５細胞、（ｄ）ＨＢワクチンパルス樹状細胞１×１０５細胞と、それぞれ混合培養した。培養条件は、実験例１（４）と同様の条件で行った。
【０２０１】
（３）５日後、培養上清を回収し、ＣＬＩＡ法によって抗ＨＢｓ抗体値を測定した。
【０２０２】
（４）結果を図５に示す。図５の縦軸は抗ＨＢｓ抗体値を示し、横軸に左から、（２）に記した（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）の場合を示す。この結果から、ＨＢワクチンやパルスしていない樹状細胞を混合した場合は、抗ＨＢｓ抗体を産生させることができなかったが、ＨＢワクチンパルス樹状細胞を混合した場合は、抗ＨＢｓ抗体を１５〜５６ｍＩＵ／ｍＬ産生させることができることがわかった。
【０２０３】
（実験例８）ＨＢワクチンパルス樹状細胞投与に伴う過敏性反応テスト（０〜２４時間）
（１）実験例３にて、ＨＢワクチンパルス樹状細胞をそれぞれの被験者に皮下投与した後、０〜２４時間において、ワクチン投与に伴う炎症等の過敏性反応の有無を確認した。
【０２０４】
（２）その結果、ＨＢワクチンパルス樹状細胞を投与した被験者５人全例において、発熱、発赤、ショック等の急性期過敏性反応は見られなかった。従って、ＨＢワクチンパルス樹状細胞は安全であることが確認された。
【０２０５】
（実験例９）血液生化学的検査による安全性テスト（０、１、３、１４日目）
（１）実験例３にて被験者に投与したＨＢワクチンパルス樹状細胞の安全性をさらに確認するために、それぞれの被験者に対し、ＣＢＣ、肝機能、腎機能等についての５０項目以上の検査を行った。代表的な検査項目を図６に示す。
【０２０６】
（２）ＡＬＴ、ＣＲＰ、ＰＴ、Ｃｒｅａｔｉｎｉｎｅ検査の結果を図７〜１０に示す。それぞれの図の横軸は投与からの日数を示し、縦軸は検査項目とその値を表す。これらの結果より、ＨＢワクチンパルス樹状細胞を投与した被験者５人全例において、血液生化学的検査で異常は見られなかった。従って、ＨＢワクチンパルス樹状細胞は安全であることがわかった。
【０２０７】
（実験例１０）血清生化学的検査を用いた自己免疫反応に関する安全性テスト（０、１４日目）
（１）実験例３にて被験者に投与したＨＢワクチンパルス樹状細胞による自己免疫反応の有無を検討するために、ＩｇＧ量、ＩｇＭ量の測定や、サイロイドテスト、マイクロゾームテスト、抗核抗体などの自己抗体検査を行った。
【０２０８】
（２）結果を図１１に示す。これらの結果より、ＨＢワクチンパルス樹状細胞は、ＨＢワクチンパルス樹状細胞を投与した被験者５人全例で、自己免疫反応は見られなかった。従って、ＨＢワクチンパルス樹状細胞は安全であることがわかった。
【０２０９】
（実験例１１）ｉｎ ｖｉｖｏにおける、ＨＢワクチンパルス樹状細胞の抗ＨＢｓ抗体誘導能の評価（０日目、２、３、４、１２週間目）
（１）実験例３にてＨＢワクチンパルス樹状細胞の投与を受けた被験者それぞれから、実験例１（２）の方法を用いて血清を採取し、ＣＬＩＡ法によって抗ＨＢｓ抗体値を測定した。
【０２１０】
（２）結果を図１２、１３、１４に示す。図１２、１４の横軸は投与からの週を示し、縦軸は抗ＨＢｓ抗体値を示す。また、図１３は、図１２のグラフの値を数値化したものである。図１４は、ＨＢワクチンｎｏｎ−ｒｅｓｐｏｎｄｅｒである被験者の、抗ＨＢｓ抗体値の推移を示すグラフである。図１２、１３の結果より、１回のＨＢワクチンパルス樹状細胞投与によって、ＨＢワクチンｎｏｎ−ｒｅｓｐｏｎｄｅｒであった被験者３人について２人が、抗ＨＢｓ抗体を産生できるようになったことがわかった。また、ＨＢワクチンｒｅｓｐｏｎｄｅｒである被験者２人についても、抗ＨＢｓ抗体値が上昇した。これらの被験者４例は、抗ＨＢｓ抗体値が１０ｍＩＵ／ｍＬ以上であることから、１回のＨＢワクチンパルス樹状細胞投与によって、Ｂ型肝炎予防又は治療に十分な量の抗体を産生できていると考えられる。また、図１４の結果より、このＨＢワクチンｒｅｓｐｏｎｄｅｒであった被験者が、１０ｍＩＵ／ｍＬ以上の抗ＨＢｓ抗体値を少なくとも３ヶ月間は維持できることがわかった。
【実施例２】
【０２１１】
被験者（Ｂ型肝炎患者２人およびＢ型肝炎肝移植後の患者１人）から血液を採取し、前記実施例１の実験例１と同様にして、その血液を用いて樹状細胞を調製した。次に、得られた樹状細胞を用いて、前記実施例１の実験例２と同様にして、ＨＢワクチンパルス樹状細胞を作製した。
【０２１２】
前記実施例１の実験例１と同様にして、得られたＨＢワクチンパルス樹状細胞５００μＬのうち５０μＬを用いて、それぞれの被験者に各自の樹状細胞に対するプリックテストを行った。その結果、すべての被験者においてプリックテストが陰性であった。次に、それぞれの被験者に、各自のＨＢワクチンパルス樹状細胞を４５０μＬ皮下投与した。投与後、前記被験者には自覚症状に変化は見られなかった。
【０２１３】
被験者に投与したＨＢワクチンパルス樹状細胞の安全性をさらに確認するために、それぞれの被験者に対し、０、３、１４および２８日目に、ＣＢＣ、肝機能、腎機能等についての５０項目以上の検査を行った。前記全ての被験者において、血液性化学的検査では投与前後で変化はなく、異常はみられなかった。前記被験者のうち、Ｂ型肝炎患者１名のＡＬＴ、ＣＲＰ、ＰＴ、ＷＢＣ検査の結果を図１５に示す。前記図の横軸は投与からの日数を示し、縦軸は検査項目とその値を表す。従って、ＨＢワクチンパルス樹状細胞は、Ｂ型肝炎患者に対しても安全であるこどがわかった。
【実施例３】
【０２１４】
実施例２において各自のＨＢワクチンパルス樹状細胞の皮下投与を行った被験者（Ｂ型肝炎患者）に対して、前記投与から２週間後、および６週間後に、それぞれ、ＨＢワクチンパルス樹状細胞を４５０μＬ皮下投与した。その被験者から血清を採取し、その血清を用いて、ＣＬＩＡ法によって抗ＨＢｓ抗体値を測定した（０、２、６、１０、１４、１８および２２週間目）。その結果を図１６に示す。同図に示すように、１回目（０週間目）の投与終了後からＨＢｓ抗体が産生し、３回目（６週間目）の投与終了後も、ＨＢｓ抗体量が上昇した。なお、この測定期間中における肝機能検査の上昇およびトランスアミラーゼの上昇は見られなかった。
【０２１５】
以上の結果、ワクチンパルス樹状細胞の投与後、トランスアミラーゼの上昇が見られないことから、本発明のワクチンパルス樹状細胞によれば、ＣＴＬを誘導することなく、ＨＢｓ抗体が産生できることがわかった。通常、ＣＴＬが誘導されると、トランスアミラーゼが上昇するからである。このＣＴＬを誘導しないことのメカニズムは不明だが、パルスに使用したＨＢワクチンの組成が、このＣＴＬを誘導しないメカニズムと深く関係しているものと考えられる。また、本発明のワクチンパルス樹状細胞は、Ｂ型肝炎患者であっても、ＨＢｓ抗体産生を誘導できることから、体液性免疫を中心に誘導していることが示された。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
樹状細胞をＨＢｓ抗原でパルスする工程を含む方法によって得られた、ＨＢｓ抗原提示能を有する樹状細胞。
【請求項２】
前記方法はさらに、血液から前記樹状細胞を得る工程を含む請求項１に記載のＨＢｓ抗原提示能を有する樹状細胞。
【請求項３】
前記方法はさらに、生物から前記血液を採取する工程を含む請求項２に記載のＨＢｓ抗原提示能を有する樹状細胞。
【請求項４】
前記生物は、ヒトである請求項３に記載のＨＢｓ抗原提示能を有する樹状細胞。
【請求項５】
前記ＨＢｓ抗原は、ＨＢワクチンに含まれるＨＢｓ抗原である請求項１に記載のＨＢｓ抗原提示能を有する樹状細胞。
【請求項６】
樹状細胞をＨＢｓ抗原でパルスする工程を含むＨＢｓ抗原提示能を有する樹状細胞の製造方法。
【請求項７】
さらに血液から前記樹状細胞を得る工程を含む請求項６に記載のＨＢｓ抗原提示能を有する樹状細胞の製造方法。
【請求項８】
さらに生物から前記血液を採取する工程を含む請求項７に記載のＨＢｓ抗原提示能を有する樹状細胞の製造方法。
【請求項９】
前記生物は、ヒトである請求項８に記載のＨＢｓ抗原提示能を有する樹状細胞の製造方法。
【請求項１０】
前記ＨＢｓ抗原は、ＨＢワクチンに含まれるＨＢｓ抗原である請求項６に記載のＨＢｓ抗原提示能を有する樹状細胞の製造方法。
【請求項１１】
請求項１に記載のＨＢｓ抗原提示能を有する樹状細胞を含む組成物。
【請求項１２】
さらにＨＢワクチン添加物が含まれる請求項１１に記載の組成物。
【請求項１３】
前記組成物は、実験試薬又は実験キットである請求項１１に記載の組成物。
【請求項１４】
前記組成物は、医薬組成物である請求項１１に記載の組成物。
【請求項１５】
前記組成物は、免疫応答活性化製剤である請求項１１に記載の組成物。
【請求項１６】
前記組成物は、細胞ワクチンである請求項１１に記載の組成物。
【請求項１７】
前記細胞ワクチンは、Ｂ型肝炎の予防又は治療ワクチンである請求項１６に記載の組成物。
【請求項１８】
請求項１に記載のＨＢｓ抗原提示能を有する樹状細胞を用いたＢ型肝炎の予防又は治療方法。
【請求項１９】
前記ＨＢｓ抗原提示能を有する樹状細胞を、生物に投与する工程を含む請求項１８に記載のＢ型肝炎の予防又は治療方法。
【請求項２０】
前記生物は、ヒトである請求項１９に記載のＢ型肝炎の予防又は治療方法。
【請求項２１】
樹状細胞をワクチンでパルスする工程を含む方法によって得られた、ワクチンパルス樹状細胞。
【請求項２２】
前記方法はさらに、血液から前記樹状細胞を得る工程を含む請求項２１に記載のワクチンパルス樹状細胞。
【請求項２３】
前記方法はさらに、生物から前記血液を採取する工程を含む請求項２２に記載のワクチンパルス樹状細胞。
【請求項２４】
前記生物は、ヒトである請求項２３に記載のワクチンパルス樹状細胞。
【請求項２５】
前記パルスに使用するワクチンは、疾患の予防又は治療ワクチンである請求項２１に記載のワクチンパルス樹状細胞。
【請求項２６】
前記パルスに使用するワクチンは、肝炎ワクチンである請求項２１に記載のワクチンパルス樹状細胞。
【請求項２７】
前記肝炎ワクチンは、ＨＢｓ抗原を含むＨＢワクチンである請求項２６に記載のワクチンパルス樹状細胞。
【請求項２８】
樹状細胞をワクチンでパルスする工程を含むワクチンパルス樹状細胞の製造方法。
【請求項２９】
さらに血液から前記樹状細胞を得る工程を含む請求項２８に記載のワクチンパルス樹状細胞の製造方法。
【請求項３０】
さらに生物から前記血液を採取する工程を含む請求項２９に記載のワクチンパルス樹状細胞の製造方法。
【請求項３１】
前記生物は、ヒトである請求項３０に記載のワクチンパルス樹状細胞の製造方法。
【請求項３２】
前記パルスに使用するワクチンは、疾患の予防又は治療ワクチンである請求項２８に記載のワクチンパルス樹状細胞の製造方法。
【請求項３３】
前記パルスに使用するワクチンは、肝炎ワクチンである請求項２８に記載のワクチンパルス樹状細胞の製造方法。
【請求項３４】
前記肝炎ワクチンが、ＨＢｓ抗原を含むＨＢワクチンである請求項３３に記載のワクチンパルス樹状細胞の製造方法。
【請求項３５】
請求項２１に記載のワクチンパルス樹状細胞を含む組成物。
【請求項３６】
さらにワクチン添加物が含まれる請求項３５に記載の組成物。
【請求項３７】
前記組成物は、実験試薬又は実験キットである請求項３５に記載の組成物。
【請求項３８】
前記組成物は、医薬組成物である請求項３５に記載の組成物。
【請求項３９】
前記組成物は、免疫応答活性化製剤である請求項３５に記載の組成物。
【請求項４０】
前記組成物は、細胞ワクチンである請求項３５に記載の組成物。
【請求項４１】
前記細胞ワクチンが、疾患の予防又は治療ワクチンである請求項４０に記載の組成物。
【請求項４２】
請求項２１に記載のワクチンパルス樹状細胞を用いた疾患の予防又は治療方法。
【請求項４３】
前記ワクチンパルス樹状細胞を、生物に投与する工程を含む請求項４２に記載の疾患の予防又は治療方法。
【請求項４４】
前記生物は、ヒトである請求項４３に記載の疾患の予防又は治療方法。
【請求項４５】
ヒト用ワクチンパルス樹状細胞であって、前記ワクチンパルス樹状細胞は、ヒトのＢ型肝炎の予防又は治療のためのワクチンパルス樹状細胞であり、前記ワクチンパルス樹状細胞は、Ｂ型肝炎患者又はＢ型肝炎ウイルスキャリアから末梢血を採取し、その末梢血から単離した単球を用いて樹状細胞を得る樹状細胞取得工程および前記樹状細胞をワクチンでパルスするパルス工程を含む製造方法によって得られたワクチンパルス樹状細胞であり、前記パルスに使用するワクチンは、Ｂ型肝炎の予防又は治療のためのワクチンであるヒト用ワクチンパルス樹状細胞。
【請求項４６】
前記ワクチンパルス工程において、パルス時間が、８時間〜２４時間である請求項４５に記載のヒト用ワクチンパルス樹状細胞。
【請求項４７】
前記樹状細胞取得工程において、単離した単球をＧＭ−ＣＳＦおよびＩＬ−４と共培養する請求項４５に記載のヒト用ワクチンパルス樹状細胞。
【請求項４８】
ヒトにおいて、Ｔｈ２を誘導し、Ｔｈ１を誘導しない請求項４５に記載のヒト用ワクチンパルス樹状細胞。
【請求項４９】
ヒトにおいて、ＣＴＬを誘導しない請求項４８に記載のヒト用ワクチンパルス樹状細胞。
【請求項５０】
ヒトＢ型肝炎のための治療および予防のための医薬品であって、請求項４９に記載のヒト用ワクチンパルス樹状細胞を含む医薬品。
【請求項５１】
前記Ｂ型肝炎が、Ｂ型慢性肝炎である請求項５０に記載の医薬品。
【請求項５２】
ヒト用ワクチンパルス樹状細胞の製造方法であって、Ｂ型肝炎患者又はＢ型肝炎ウイルスキャリアから末梢血を採取し、その末梢血から単離した単球を用いて樹状細胞を得るヒト由来の血液から樹状細胞を得る樹状細胞取得工程、および、前記樹状細胞をワクチンでパルスして、ヒトのＢ型肝炎の予防又は治療のためのワクチンパルス樹状細胞を得るパルス工程を含み、前記パルス工程においてパルスに使用するワクチンは、Ｂ型肝炎の予防又は治療のためのワクチンである製造方法。
【請求項５３】
前記ワクチンパルス工程において、パルス時間が、８時間〜２４時間である請求項４５に記載の製造方法。
【請求項５４】
前記樹状細胞取得工程において、前記単離した単球をＧＭ−ＣＳＦおよびＩＬ−４と共培養する請求項４５に記載の製造方法。
【請求項５５】
前記ヒト用ワクチンパルス樹状細胞が、ヒトにおいて、Ｔｈ２を誘導し、Ｔｈ１を誘導しない請求項４５に記載の製造方法。
【請求項５６】
前記ヒト用ワクチンパルス樹状細胞が、ヒトにおいて、ＣＴＬを誘導しない請求項４８に記載の製造方法。
【請求項５７】
ヒト用ワクチンパルス樹状細胞を用いたヒトのＢ型肝炎の予防又は治療方法であって、自己の樹状細胞由来のワクチンパルス樹状細胞をＢ型肝炎患者又はＢ型肝炎ウイルスキャリアに投与することを含み、前記ワクチンパルス樹状細胞は、Ｂ型肝炎患者又はＢ型肝炎ウイルスキャリアから末梢血を採取し、その末梢血から単離した単球を用いて樹状細胞を得る樹状細胞取得工程および前記樹状細胞をワクチンでパルスするパルス工程を含む製造方法によって得られたヒト用ワクチンパルス樹状細胞であり、前記パルスに使用するワクチンは、Ｂ型肝炎の予防又は治療のためのワクチンである予防又は治療方法。
【請求項５８】
前記ヒト用ワクチンパルス樹状細胞が、Ｔｈ２を誘導し、Ｔｈ１を誘導しない請求項５８に記載の予防又は治療方法。
【請求項５９】
前記ヒト用ワクチンパルス樹状細胞が、ＣＴＬを誘導しない請求項５９に記載の予防又は治療方法。
【請求項６０】
前記Ｂ型肝炎が、Ｂ型慢性肝炎である請求項５９記載の予防又は治療方法。
【請求項６１】
ヒトＢ型肝炎の治療又は予防のためのヒト用ワクチンパルス樹状細胞の使用であって、前記ワクチンパルス樹状細胞は、Ｂ型肝炎患者又はＢ型肝炎ウイルスキャリアから末梢血を採取し、その末梢血から単離した単球を用いて樹状細胞を得る樹状細胞取得工程および前記樹状細胞をワクチンでパルスするパルス工程を含む製造方法によって得られたヒト用ワクチンパルス樹状細胞であり、前記パルスに使用するワクチンは、Ｂ型肝炎の予防又は治療のためのワクチンであり、前記ワクチンパルス樹状細胞を、前記末梢血を採取したＢ型肝炎患者又はＢ型肝炎ウイルスキャリアに投与することを含む使用。
【請求項１】
樹状細胞をＨＢｓ抗原でパルスする工程を含む方法によって得られた、ＨＢｓ抗原提示能を有する樹状細胞。
【請求項２】
前記方法はさらに、血液から前記樹状細胞を得る工程を含む請求項１に記載のＨＢｓ抗原提示能を有する樹状細胞。
【請求項３】
前記方法はさらに、生物から前記血液を採取する工程を含む請求項２に記載のＨＢｓ抗原提示能を有する樹状細胞。
【請求項４】
前記生物は、ヒトである請求項３に記載のＨＢｓ抗原提示能を有する樹状細胞。
【請求項５】
前記ＨＢｓ抗原は、ＨＢワクチンに含まれるＨＢｓ抗原である請求項１に記載のＨＢｓ抗原提示能を有する樹状細胞。
【請求項６】
樹状細胞をＨＢｓ抗原でパルスする工程を含むＨＢｓ抗原提示能を有する樹状細胞の製造方法。
【請求項７】
さらに血液から前記樹状細胞を得る工程を含む請求項６に記載のＨＢｓ抗原提示能を有する樹状細胞の製造方法。
【請求項８】
さらに生物から前記血液を採取する工程を含む請求項７に記載のＨＢｓ抗原提示能を有する樹状細胞の製造方法。
【請求項９】
前記生物は、ヒトである請求項８に記載のＨＢｓ抗原提示能を有する樹状細胞の製造方法。
【請求項１０】
前記ＨＢｓ抗原は、ＨＢワクチンに含まれるＨＢｓ抗原である請求項６に記載のＨＢｓ抗原提示能を有する樹状細胞の製造方法。
【請求項１１】
請求項１に記載のＨＢｓ抗原提示能を有する樹状細胞を含む組成物。
【請求項１２】
さらにＨＢワクチン添加物が含まれる請求項１１に記載の組成物。
【請求項１３】
前記組成物は、実験試薬又は実験キットである請求項１１に記載の組成物。
【請求項１４】
前記組成物は、医薬組成物である請求項１１に記載の組成物。
【請求項１５】
前記組成物は、免疫応答活性化製剤である請求項１１に記載の組成物。
【請求項１６】
前記組成物は、細胞ワクチンである請求項１１に記載の組成物。
【請求項１７】
前記細胞ワクチンは、Ｂ型肝炎の予防又は治療ワクチンである請求項１６に記載の組成物。
【請求項１８】
請求項１に記載のＨＢｓ抗原提示能を有する樹状細胞を用いたＢ型肝炎の予防又は治療方法。
【請求項１９】
前記ＨＢｓ抗原提示能を有する樹状細胞を、生物に投与する工程を含む請求項１８に記載のＢ型肝炎の予防又は治療方法。
【請求項２０】
前記生物は、ヒトである請求項１９に記載のＢ型肝炎の予防又は治療方法。
【請求項２１】
樹状細胞をワクチンでパルスする工程を含む方法によって得られた、ワクチンパルス樹状細胞。
【請求項２２】
前記方法はさらに、血液から前記樹状細胞を得る工程を含む請求項２１に記載のワクチンパルス樹状細胞。
【請求項２３】
前記方法はさらに、生物から前記血液を採取する工程を含む請求項２２に記載のワクチンパルス樹状細胞。
【請求項２４】
前記生物は、ヒトである請求項２３に記載のワクチンパルス樹状細胞。
【請求項２５】
前記パルスに使用するワクチンは、疾患の予防又は治療ワクチンである請求項２１に記載のワクチンパルス樹状細胞。
【請求項２６】
前記パルスに使用するワクチンは、肝炎ワクチンである請求項２１に記載のワクチンパルス樹状細胞。
【請求項２７】
前記肝炎ワクチンは、ＨＢｓ抗原を含むＨＢワクチンである請求項２６に記載のワクチンパルス樹状細胞。
【請求項２８】
樹状細胞をワクチンでパルスする工程を含むワクチンパルス樹状細胞の製造方法。
【請求項２９】
さらに血液から前記樹状細胞を得る工程を含む請求項２８に記載のワクチンパルス樹状細胞の製造方法。
【請求項３０】
さらに生物から前記血液を採取する工程を含む請求項２９に記載のワクチンパルス樹状細胞の製造方法。
【請求項３１】
前記生物は、ヒトである請求項３０に記載のワクチンパルス樹状細胞の製造方法。
【請求項３２】
前記パルスに使用するワクチンは、疾患の予防又は治療ワクチンである請求項２８に記載のワクチンパルス樹状細胞の製造方法。
【請求項３３】
前記パルスに使用するワクチンは、肝炎ワクチンである請求項２８に記載のワクチンパルス樹状細胞の製造方法。
【請求項３４】
前記肝炎ワクチンが、ＨＢｓ抗原を含むＨＢワクチンである請求項３３に記載のワクチンパルス樹状細胞の製造方法。
【請求項３５】
請求項２１に記載のワクチンパルス樹状細胞を含む組成物。
【請求項３６】
さらにワクチン添加物が含まれる請求項３５に記載の組成物。
【請求項３７】
前記組成物は、実験試薬又は実験キットである請求項３５に記載の組成物。
【請求項３８】
前記組成物は、医薬組成物である請求項３５に記載の組成物。
【請求項３９】
前記組成物は、免疫応答活性化製剤である請求項３５に記載の組成物。
【請求項４０】
前記組成物は、細胞ワクチンである請求項３５に記載の組成物。
【請求項４１】
前記細胞ワクチンが、疾患の予防又は治療ワクチンである請求項４０に記載の組成物。
【請求項４２】
請求項２１に記載のワクチンパルス樹状細胞を用いた疾患の予防又は治療方法。
【請求項４３】
前記ワクチンパルス樹状細胞を、生物に投与する工程を含む請求項４２に記載の疾患の予防又は治療方法。
【請求項４４】
前記生物は、ヒトである請求項４３に記載の疾患の予防又は治療方法。
【請求項４５】
ヒト用ワクチンパルス樹状細胞であって、前記ワクチンパルス樹状細胞は、ヒトのＢ型肝炎の予防又は治療のためのワクチンパルス樹状細胞であり、前記ワクチンパルス樹状細胞は、Ｂ型肝炎患者又はＢ型肝炎ウイルスキャリアから末梢血を採取し、その末梢血から単離した単球を用いて樹状細胞を得る樹状細胞取得工程および前記樹状細胞をワクチンでパルスするパルス工程を含む製造方法によって得られたワクチンパルス樹状細胞であり、前記パルスに使用するワクチンは、Ｂ型肝炎の予防又は治療のためのワクチンであるヒト用ワクチンパルス樹状細胞。
【請求項４６】
前記ワクチンパルス工程において、パルス時間が、８時間〜２４時間である請求項４５に記載のヒト用ワクチンパルス樹状細胞。
【請求項４７】
前記樹状細胞取得工程において、単離した単球をＧＭ−ＣＳＦおよびＩＬ−４と共培養する請求項４５に記載のヒト用ワクチンパルス樹状細胞。
【請求項４８】
ヒトにおいて、Ｔｈ２を誘導し、Ｔｈ１を誘導しない請求項４５に記載のヒト用ワクチンパルス樹状細胞。
【請求項４９】
ヒトにおいて、ＣＴＬを誘導しない請求項４８に記載のヒト用ワクチンパルス樹状細胞。
【請求項５０】
ヒトＢ型肝炎のための治療および予防のための医薬品であって、請求項４９に記載のヒト用ワクチンパルス樹状細胞を含む医薬品。
【請求項５１】
前記Ｂ型肝炎が、Ｂ型慢性肝炎である請求項５０に記載の医薬品。
【請求項５２】
ヒト用ワクチンパルス樹状細胞の製造方法であって、Ｂ型肝炎患者又はＢ型肝炎ウイルスキャリアから末梢血を採取し、その末梢血から単離した単球を用いて樹状細胞を得るヒト由来の血液から樹状細胞を得る樹状細胞取得工程、および、前記樹状細胞をワクチンでパルスして、ヒトのＢ型肝炎の予防又は治療のためのワクチンパルス樹状細胞を得るパルス工程を含み、前記パルス工程においてパルスに使用するワクチンは、Ｂ型肝炎の予防又は治療のためのワクチンである製造方法。
【請求項５３】
前記ワクチンパルス工程において、パルス時間が、８時間〜２４時間である請求項４５に記載の製造方法。
【請求項５４】
前記樹状細胞取得工程において、前記単離した単球をＧＭ−ＣＳＦおよびＩＬ−４と共培養する請求項４５に記載の製造方法。
【請求項５５】
前記ヒト用ワクチンパルス樹状細胞が、ヒトにおいて、Ｔｈ２を誘導し、Ｔｈ１を誘導しない請求項４５に記載の製造方法。
【請求項５６】
前記ヒト用ワクチンパルス樹状細胞が、ヒトにおいて、ＣＴＬを誘導しない請求項４８に記載の製造方法。
【請求項５７】
ヒト用ワクチンパルス樹状細胞を用いたヒトのＢ型肝炎の予防又は治療方法であって、自己の樹状細胞由来のワクチンパルス樹状細胞をＢ型肝炎患者又はＢ型肝炎ウイルスキャリアに投与することを含み、前記ワクチンパルス樹状細胞は、Ｂ型肝炎患者又はＢ型肝炎ウイルスキャリアから末梢血を採取し、その末梢血から単離した単球を用いて樹状細胞を得る樹状細胞取得工程および前記樹状細胞をワクチンでパルスするパルス工程を含む製造方法によって得られたヒト用ワクチンパルス樹状細胞であり、前記パルスに使用するワクチンは、Ｂ型肝炎の予防又は治療のためのワクチンである予防又は治療方法。
【請求項５８】
前記ヒト用ワクチンパルス樹状細胞が、Ｔｈ２を誘導し、Ｔｈ１を誘導しない請求項５８に記載の予防又は治療方法。
【請求項５９】
前記ヒト用ワクチンパルス樹状細胞が、ＣＴＬを誘導しない請求項５９に記載の予防又は治療方法。
【請求項６０】
前記Ｂ型肝炎が、Ｂ型慢性肝炎である請求項５９記載の予防又は治療方法。
【請求項６１】
ヒトＢ型肝炎の治療又は予防のためのヒト用ワクチンパルス樹状細胞の使用であって、前記ワクチンパルス樹状細胞は、Ｂ型肝炎患者又はＢ型肝炎ウイルスキャリアから末梢血を採取し、その末梢血から単離した単球を用いて樹状細胞を得る樹状細胞取得工程および前記樹状細胞をワクチンでパルスするパルス工程を含む製造方法によって得られたヒト用ワクチンパルス樹状細胞であり、前記パルスに使用するワクチンは、Ｂ型肝炎の予防又は治療のためのワクチンであり、前記ワクチンパルス樹状細胞を、前記末梢血を採取したＢ型肝炎患者又はＢ型肝炎ウイルスキャリアに投与することを含む使用。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図１６】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図１６】
【国際公開番号】ＷＯ２００５／０９７９７６
【国際公開日】平成１７年１０月２０日（２００５．１０．２０）
【発行日】平成１９年８月１６日（２００７．８．１６）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００６−５１２０９１（Ｐ２００６−５１２０９１）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＪＰ２００５／００６６７９
【国際出願日】平成１７年４月５日（２００５．４．５）
【出願人】（５０４１４７２５４）国立大学法人愛媛大学 (214)
【Ｆターム（参考）】
【国際公開日】平成１７年１０月２０日（２００５．１０．２０）
【発行日】平成１９年８月１６日（２００７．８．１６）
【国際特許分類】
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＪＰ２００５／００６６７９
【国際出願日】平成１７年４月５日（２００５．４．５）
【出願人】（５０４１４７２５４）国立大学法人愛媛大学 (214)
【Ｆターム（参考）】
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