抗原提示細胞に対する抗体およびその使用
抗原提示細胞に対する抗体を利用して、抗原提示細胞と、Ｔ細胞を含む免疫細胞との相互作用を妨げることができる。ペプチドを前記抗体に連結させ、それによってかかるペプチドに対する免疫応答を発生させることができる。好ましくは、抗体に連結されたペプチドは、自己免疫と関連する。本発明の１つの実施形態により、Ｌ−ＳＩＧＮ受容体を認識し、２時間のうちに、単離されたヒト肝臓非実質性細胞中への少なくとも４０パーセントの内在化を示す抗体が、提供される。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（関連出願の引用）
本出願は、米国出願第１１／０１６６４７号（２００４年１２月１７日出願）の部分継続出願である。この米国出願は、ＰＣＴ／ＵＳ０４／０６５７０（２００４年３月４日出願）の部分継続出願であり、このＰＣＴ出願は、米国仮特許出願第６０／５４８，３８５号（２００４年２月２８日出願）；米国仮特許出願第６０／５２９，５００号（２００３年１２月１５日出願）；および米国仮特許出願第６０／４５１，８１６号（２００３年３月４日出願）の優先権を主張する。これらの全ての出願の完全な開示は、本明細書中で参考として援用される。
（技術分野）
自己免疫疾患を治療または予防するための、自己抗原に対する自然免疫寛容を開発および修復すること。
【背景技術】
【０００２】
（関連技術の背景）
Ｔ細胞媒介性疾患、インスリン依存性糖尿病（「Ｔ１ＤＭ」）は、大きな健康上の問題であり、１５０万人を超えるアメリカ人が罹患している。この自己免疫疾患は、膵臓内のランゲルハンス島のインスリン産生β−細胞の、Ｔ細胞媒介性の破壊から生じる。インスリンでの治療にもかかわらず、Ｔ１ＤＭに起因する死亡は過去２０年間で増大しているが、癌、心臓血管疾患および脳卒中での死亡率は減少している（Ｈｕｒｌｂｅｒｔら、２００１年）。また、腎症、ニューロパシーおよび網膜症を含む、外因性インスリンでの治療の合併症は、非常に消耗性である。
【０００３】
Ｔ１ＤＭは、Ｔｈ１媒介性疾患であると考えられており、例えばＩＬ−４の全身性投与によって、免疫応答をＴｈ２型に転換する早期の介入が、疾患の発症を予防し得る（Ｃａｍｅｒｏｎら、１９９７年）。エフェクターＴ細胞、Ｔｈ１およびＴｈ２のバランスは、免疫寛容の維持において重要であり得、バランスの変化は、自己免疫を生じ得る。しかしながら、ＮＯＤマウス由来のＴｈ２細胞系もまた疾患を転移することが示されているので、自己免疫疾患からの保護は、Ｔｈ２細胞の固有の特性ではない（Ｐａｋｋａｌａら、１９９７年）。
【０００４】
免疫系は、自己寛容を維持するように、複雑に進化してきた。胸腺は、Ｔ細胞の重要な最初の選択を提供する。この選択は、胸腺に存在する自己抗原に対して寛容なＴ細胞の、末梢への輸送を生じる。しかしながら、多くの組織特異的タンパク質は、寛容性を誘導するのに十分なレベルで発現されない。例えば、ランゲルハンス島反応性Ｔ細胞は健康な被験体で見られているが、おそらく親和性は低い（Ｌｏｈｍａｎら、１９９６年）。末梢寛容性のいくつかの機構は、胸腺の中心的な寛容性機構を補完して、自己反応性Ｔ細胞を制御下に維持する。末梢寛容性の重要なメディエータの１つは、抗原提示細胞（「ＡＰＣ」）である。樹状細胞（「ＤＣ」）およびマクロファージ等のＡＰＣは、他の細胞から自己抗原を捕捉し、それらを自己反応性Ｔ細胞に提示して、欠失、アネルギー、および／または調節性Ｔ細胞の発生によって、Ｔ細胞寛容性を誘導する（非特許文献１）。現在の仮説は、おそらく共刺激分子を欠くために、定常状態の免疫系におけるＡＰＣ等の未成熟なＡＰＣが、Ｔ細胞を活性化するよりむしろ寛容化するというものである。Ｈａｗｉｇｅｒらは、ＤＣ制限エンドサイト受容体であるＤＥＣ−２０５に対する抗体を用いて、ＤＣの主要組織適合性クラスＩＩ（「ＭＨＣ ＩＩ」）経路に抗原を標的とした（Ｈａｗｉｇｅｒら、２００１年）。その後のペプチド免疫に対する応答を欠くことから示されるように、これらのＤＣによる抗原提示はＣＤ４＋Ｔ細胞増殖の短いバーストを刺激し、その後欠失が起こり、レシピエントは抗原に対して寛容になった。対照的に、抗ＣＤ４０等の強力なＤＣ成熟刺激によって抗原標的化が達成されると、免疫が誘導された。
【０００５】
樹状細胞はまた、抑制性サイトカインまたは接触依存性機構を通じてエフェクターＴ細胞の機能に影響を及ぼす調節性Ｔ細胞を生じることによって、末梢寛容性を誘導することができる（非特許文献２、Ｊｏｎｕｌｅｉｔら、２０００年、ＤｈｏｄａｐｋａｒおよびＳｔｅｉｎｍａｎ、２００１年）。一般に「最適以下」のＴ細胞刺激によって、調節性Ｔ細胞の誘導のための多くの異なるプロトコルが開発されている。Ｔ細胞の最適以下の刺激は、共刺激なしの抗原提示、もしくは炎症によって、またはＴ細胞受容体もしくはその補助受容体ＣＤ４およびＣＤ８の部分的ブロッキングによって、達成することができる。調節性Ｔ細胞の表現型および作用の機構は異質性である。多くのサプレッサ細胞はＣＤ４＋ＣＤ２５＋であるが、多くの状況においてＣＤ４＋ＣＤ２５＋細胞は同程度に効果的であることがますます明らかになってきている。調節性Ｔ細胞集団において同定される他のマーカーとしては、ＣＤ６２Ｌ、ＧＩＴＲおよびＣＤ１０３が挙げられ（ＬａｆａｉｌｌｅおよびＬａｆａｉｌｌｅ、２００２年）、ＣＤ８＋調節性Ｔ細胞もまた、報告されている（ＤｈｏｄａｐｋａｒおよびＳｔｅｉｎｍａｎ、２００２年）。いくつかの調節性Ｔ細胞は、免疫抑制性サイトカインであるインターロイキン（「ＩＬ」）−１０を産生することが示されている（Ｗａｋｋａｃｈら、２００１年、Ｂａｒｒａｔら、２００２年）が、経口免疫寛容によって誘導された調節性Ｔ細胞は、Ｔｈ２型サイトカインであるＩＬ−４およびＩＬ−１０に加えて、トランスホーミング増殖因子−β（「ＴＧＦ−β」）の産生によって特徴付けられている（Ｗｅｉｎｅｒ、２００１年）。接触依存性サプレッサ細胞は、ＴＧＦ−β存在下でＣＤ４＋ＣＤ４５ＲＡ＋ヒト末梢Ｔ細胞を活性化することによって生じている（Ｙａｍｉｇａｗａら、２００１年）。調節性Ｔ細胞の誘導はＴ細胞受容体を通じた刺激を必要とするが、それらの抑制効果は非抗原特異的であるようである（ＴｈｏｒｔｏｎおよびＳｈｅｖａｃｈ、２０００年）。
【０００６】
免疫調節性Ｔ細胞は、ＮＯＤマウスにおける病原性自己反応性Ｔ細胞を下方調節する上で役割を果たすことが示されている。糖尿病前症マウスが免疫調節性Ｔ細胞を含むことおよびそれらの数またはそれらの機能的能力の減少が、疾患進行における主な寄与事象であるという証拠がある（非特許文献３）。共転移実験から、糖尿病前症マウス由来のＣＤ４＋Ｔ脾臓細胞は糖尿病誘発細胞による免疫不全レシピエントへの疾患転移を完全に防ぐことが示されている（Ｂｏｉｔａｒｄら、１９８９年、ＨｕｔｃｈｉｎｇｓおよびＣｏｏｋｅ、１９９０年）。また、ＮＯＤマウスモデルにおいて、未成熟なＤＣによる調節性Ｔ細胞の誘導は疾患予防と相関があった（Ｈｕｇｅｓら、２００２年）。
【０００７】
ヒトにおいて、インスリン、グルタミン酸デカルボキシラーゼ（「ＧＡＤ」）、熱ショックタンパク質（「ＨＳＰ」）６０、またはタンパク質チロシンホスファターゼ様分子（「ＩＡ−２」）、および他の不確定のβ細胞抗原に応答する自己反応性Ｔ細胞が記載されている（Ｒｏｅｐら、１９９０年、Ａｔｋｉｎｓｏｎら、１９９２年、Ｈｏｎｅｙｍａｎら、１９９３年、Ｒｅｉｊｏｎｅｎら、２００２年）。
【０００８】
ＧＡＤは、抑制性神経伝達物質であるγアミノ酪酸の生合成酵素である（Ｂａｅｋｋｅｓｋｏｖら、１９９０年）。６５％の相同性の、２つの異なるアイソフォーム、ＧＡＤ６５およびＧＡＤ６７がクローニングされている。ＧＡＤ６５はヒトにおける支配的なアイソフォームであるが、ＧＡＤ６７は、ＮＯＤマウスにおける主な形態であり、両方のアイソフォームに対する抗体がヒトにおいて検出される（Ｋａｕｆｍａｎら、１９９２年）。ＮＯＤマウスにおいて、膵島炎の発症以前または発症時、および他のβ細胞抗原に対する抗体が発生する前に、抗ＧＡＤ抗体が以前に検出された。このタイミングは、ＧＡＤが、このモデルにおいてβ細胞自己免疫を開始する主要抗原であることを含意する（Ｔｉｓｃｈら、１９９３年）。糖尿病におけるＧＡＤの重要な役割のさらなる証拠は、糖尿病マウスの脾臓または膵臓から単離されたＧＡＤ特異的Ｔ細胞が未処置の動物に疾患を転移し得るという、多くの実験室による観察から生じる（非特許文献４、Ｗｅｎら、１９９８年、Ｚｅｋｚｅｒら、１９９８年）。Ｔ１ＤＭの病原におけるＧＡＤの中心的な役割に関する論争は依然としてあるが、動物実験からの証拠から、少なくとも、このタンパク質の重要な役割が示唆される。
【０００９】
若年期における胸腺内または静脈内のいずれかでの精製ＧＡＤ６５での免疫化は、ＮＯＤマウスにおいて、膵臓β細細胞に対してＴ細胞を寛容化して、それによって膵島炎および糖尿病を防ぐことができる（Ｔｉａｎら、１９９６年、Ｍａら、１９９７年）。ＧＡＤに対する寛容化はまた、ＨＳＰ６５等の他の抗原に対する免疫反応の発生を防ぐこともできた。さらなる研究は、どのＧＡＤペプチドが寛容性を誘導できるかを検討した（Ｔｉｓｃｈら、２００１年、Ｔｉｓｃｈら、１９９９年、Ｚｅｃｈｅｌら、１９９８年）。糖尿病発症からの保護はまた、静脈内、皮下、経口または経鼻経路によって、インスリンまたはＨＳＰ６５処置のいずれかによって達成することができる（Ｅｌｉａｓら、１９９１年、ＥｌｉａｓおよびＣｏｈｅｎ、１９９４年、Ｅｌｉａｓら、１９９７年、Ａｔｋｉｎｓｏｎら、１９９０年）。抗原特異的療法は、早期に投与すると疾患発症の予防において高度に効果的であるが、進行中の疾患の制御では、わずかな試みしか成功していない（ＥｌｉａｓおよびＣｏｈｅｎ、１９９４年、Ｔｉａｎら、１９９６年）。
【００１０】
一般的なペプチド免疫は、免疫性を誘導する段階で、または寛容性に対する免疫応答を変化させ得る抗原提示細胞によって、抗原提示細胞がペプチドを提示するかどうかを制御できず、したがって、免疫刺激または免疫抑制のいずれかを生じ得る。
【００１１】
免疫系を弱めることにより、糖尿病の発生を予防することができる。ＦＫ５０６、抗ＣＤ４、抗ＣＤ８、抗ＣＴＬＡ−４および他のもの等の、Ｔ細胞機能を抑制する、ありとあらゆる一般的な作用物質は、ＮＯＤマウスにおいて糖尿病の発症を予防または遅延することが示されている（ＡｔｋｉｎｓｏｎおよびＬｅｉｔｅｒ、１９９９年で概説されている）。しかしながら、これらの試薬に、糖尿病誘発Ｔ細胞に特異的なものはなく、これらの大部分は疾患の発症を予防することができるが、一旦疾患が確立されると効果がない。臨床試験で試験されたシクロスポリン等の一般的な免疫抑制剤は、短期で効果的であった（Ｆｅｕｔｒｅｎら、１９８８年、ＳｋｙｌｅｒおよびＲａｂｉｎｏｖｉｔｃｈ、１９９２年）。しかしながら、免疫抑制の中止は即座の再発につながり、腎毒性等の副作用が長期治療を妨げる（Ｐａｒｖｉｎｇら、１９９９年）。
【００１２】
糖尿病の抗原特異的療法の効能を評価するために、臨床試験が開始された。早発型糖尿病において、ＨＳＰ６Ｏ ｐ２７７ペプチド（ＤｉａＰｅｐ２７７）が試験された（Ｒａｚら、２００１年）。ペプチドでの多重免疫は疾患進行の速度を落とし、結果を確認および拡張するために、大規模な研究が開始された。ヒトインスリンのβ鎖をフロイント不完全アジュバント、インスリンＢ９−２３の改変ペプチドリガンドおよびＧＡＤと組み合わせて用いた臨床試験が進行中である。しかしながら、経口インスリンでの、最近診断された糖尿病を治療する試験は失敗し（Ｐｏｚｚｉｌｉら、２０００年、Ｃｈａｉｌｌｏｕｓら、２０００年）、非経口インスリン投与は、危険性の大きい糖尿病前症の予防が不成功であった（Ｄｉａｂｅｔｅｓ Ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ Ｔｒｉａｌ−Ｔｙｐｅ １ （ＤＰＴ） Ｓｔｕｄｙ Ｇｒｏｕｐ、２００２年）。失敗は、抗原の選択、抗原用量（Ｋｕｒｔｓら、１９９９年）、投与のタイミングおよび経路を含む、いくつかの要因によると考えられる。また、抗原療法は、どの型の免疫細胞が抗原を吸収するかを制御することができない。マウスは、制御された、病原を含まない条件下にあるが、これはヒトの試験には当てはまらない。同時の細菌またはウイルス感染がある場合、寛容よりむしろ初回刺激が起こる。動物において、糖尿病は、ある条件下での抗原免疫によって誘導されることができた（Ｂｌａｎａら、１９９６年、Ｂｅｌｌｍａｎｎら、１９９８年）。
【００１３】
免疫系がどのようにして自己抗原に対する寛容性を維持するかの理解は過去１０年で相当発達したので、Ｔ１ＤＭを予防または治療するための現在の治療戦略は、β細胞抗原に対する免疫寛容を回復させようと意図している。現在の免疫療法戦略は、自己反応性Ｔ細胞を直接不活性化することおよび／または調節能力によってＴ細胞を誘導することのいずれかによって、β細胞抗原に対する寛容性を誘導するよう意図されている。調節性Ｔ細胞の誘導は、多くの自己免疫疾患の治療のための、見込みのあるアプローチのようである。
【非特許文献１】Ｈｅａｔｈ ＷＲおよびＣａｒｂｏｎｅ ＦＲ，「Ｃｒｏｓｓ−ｐｒｅｓｅｎｔａｔｉｏｎ，ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ ｃｅｌｌｓ，ｔｏｌｅｒａｎｃｅ ａｎｄｉｍｍｕｎｉｔｙ．」，Ａｎｎｕ Ｒｅｖ Ｉｍｍｕｎｏｌ，２００１年，第１９巻，ｐ．４７−４９
【非特許文献２】Ｒｏｎｃａｒｏｌｏ ＭＧ，Ｌｅｖｉｎｇｓ ＭＫ，Ｔｒａｖｅｒｓｉ Ｃ，「Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ ｏｆ Ｔ ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ ｃｅｌｌｓ ｂｙ ｉｍｍａｔｕｒｅ ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ ｃｅｌｌｓ．」，Ｊ Ｅｘｐ Ｍｅｄ，２００１年，第１９３巻，Ｆ５−Ｆ９
【非特許文献３】Ｓｅｍｐｅ Ｐ，Ｒｉｃｈａｒｄ ＭＦ，Ｂａｃｈ ＪＦ，Ｂｏｉｔａｒｄ Ｃ，「Ｅｖｉｄｅｎｃｅ ｏｆ ＣＤ４＋ ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ Ｔ ｃｅｌｌｓ ｉｎ ｔｈｅ ｎｏｎ−ｏｂｅｓｅ ｄｉａｂｅｔｉｃ ｍａｌｅ ｍｏｕｓｅ．」，Ｄｉａｂｅｔｏｌｏｇｉｃａ，１９９４年，第３７巻，ｐ．３３７−３４３
【非特許文献４】Ｒｏｈａｎｅ ＰＷ，Ｓｈｉｍａｄａ Ａ，Ｋｉｍ ＤＴ，Ｅｄｗａｒｄｓ ＣＴ，Ｃｈａｒｌｔｏｎ Ｂ，Ｓｈｕｌｔｚ ＬＤ，Ｆａｔｈｍａｎ ＣＧ，Ｉｓｌｅｔ−ｉｎｆｉｌｔｒａｔｉｎｇ ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅｓ ｆｒｏｍ ｐｒｅｄｉａｂｅｔｉｃ ＮＯＤ ｍｉｃｅ ｒａｐｉｄｌｙ ｔｒａｎｓｆｅｒ ｄｉａｂｅｔｅｓ ｔｏ ＮＯＤ−ｓｃｉｄ／ｓｃｉｄ ｍｉｃｅ．」，Ｄｉａｂｅｔｅｓ，１９９５年，第４４巻，ｐ．５５０−５５４
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【００１４】
（要旨）
本開示は、免疫寛容を誘導することによって自己免疫疾患を治療する方法に関する。抗原提示細胞上に自己抗原を提示することによって、免疫寛容が誘導される。自己抗原が、抗原内在化受容体を認識する抗体に連結される。抗原提示細胞によって、抗原提示細胞上に自己抗原が内在化され、自己反応性Ｔ細胞の阻害が引き起こされる。
【００１５】
特に有用な実施形態において、本明細書中に記載される方法および化合物を用いて、とりわけβ細胞抗原、ＧＡＤまたはそのエピトープ、インスリンまたはそのエピトープ、ＨＳＰまたはそのエピトープであり得る自己抗原に対する免疫寛容を誘導することによって、真性糖尿病が治療される。自己抗原は、抗原内在化受容体であるＤＣ−ＳＩＧＮＲまたはＤＣ−ＳＩＧＮＲの変異を認識する抗体に連結される。自己抗原が、標的肝類洞内皮細胞または表面にＤＣ−ＳＩＧＮＲを発現している他の寛容化ＡＰＣに内在化される。自己抗原が標的肝類洞内皮細胞に提示され、自己反応性Ｔ細胞の増殖を阻害するか、または調節性Ｔ細胞の抑制効果を活性化する。
【００１６】
別の態様において、ペプチドに連結された、抗原提示細胞上の受容体に対する抗体を含む抗体／ペプチドコンストラクトが説明される。好ましくは、ペプチドは抗原であり、より好ましくは自己抗原である。特に有用な実施形態において、抗体／自己抗原コンストラクトまたはその一部は抗原提示細胞によって内在化され、自己抗原に対する免疫寛容が達成される。いくつかの場合において、毒素を本開示の抗原と組み合わせ、患者に投与することができる。毒素が、例えば腫瘍細胞に対する場合、本開示の抗体を利用して毒素を腫瘍細胞に導き、それによって毒素の投与を腫瘍細胞に集中させることができる。
【００１７】
別の態様において、自己抗原に連結された、受容体または抗原提示細胞に対する抗体を含む操作された抗体を組み換えによって生成する方法が説明される。
【００１８】
本開示はまた、ＤＣ−ＳＩＧＮＲ発現細胞と、Ｔ細胞等のＩＣＡＭ発現細胞との相互作用に干渉する、ＤＣ−ＳＩＧＮＲに対する抗体に関する。かかる相互作用のブロッキングは、免疫刺激を生じ得る。さらに、Ｌ−ＳＩＧＮに対して拮抗関係にある抗体は、標的細胞の抗原提示特性を変化させ得、これは免疫の活性化または抑制のいずれかを生じ得る。
【００１９】
別の態様において、ＤＣ−ＳＩＧＮＲに対する抗体は、肝類洞内皮細胞等の肝細胞を含む細胞へのウイルスの侵入および他の細胞へのそれらの感染を防ぐ。ＤＣ−ＳＩＧＮＲに対する抗体を利用して、Ｔ細胞へのウイルスの侵入および他の細胞へのそれらの感染も防ぐこともできる。いくつかの実施形態において、本開示は、ワクチンにおける、ＤＣ−ＳＩＧＮＲに対する抗体の使用を含む。
【００２０】
他の実施形態において、本開示の抗体を利用して、ＤＣ−ＳＩＧＮＲおよび／またはＬ−ＳＩＧＮに結合させ、それによって、ＨＩＶ、ＨＣＶ、エボラ、ＳＡＲＳ、ＣＭＶおよびシンドビス等のウイルスを含むがこれらに限定されない感染性作用物質の結合、感染、および伝播をブロックすることができる。
【００２１】
さらに別の実施形態において、ＤＣ−ＳＩＧＮＲに対する抗体を利用して、ヒト結核菌（Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）およびウシ結核菌（Ｍ．ｂｏｖｉｓ）を含むミコバクテリウム（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属の細菌の結合、感染、および伝播をブロックすることができる。他の実施形態において、ＤＣ−ＳＩＧＮＲに対する抗体を利用して、マンソン住血吸虫（Ｓｃｈｉｓｔｏｓｏｍａ ｍａｎｓｏｎｉ）等の寄生生物の結合、感染、および伝播をブロックすることができる。
【００２２】
さらに別の実施形態において、本開示の抗体または抗体／ペプチドコンストラクトは、ＤＣ−ＳＩＧＮＲ発現細胞に対する毒素で標識され得る。次いで、毒素で標識された抗ＤＣ−ＳＩＧＮＲ抗体または抗ＤＣ−ＳＩＧＮＲ抗体／ペプチドコンストラクトの投与を利用して、ＤＣ−ＳＩＧＮＲ発現細胞のレベルを減少させることができ、これは自己免疫疾患の治療等のいくつかの例において、有益であり得る。
【００２３】
本開示のＤＣ−ＳＩＧＮＲに対する抗体はまた、ＤＣ−ＳＩＧＮＲ発現と関連のある腫瘍型の通法の診断法としても利用することができ、いくつかの実施形態においては、診断キットの一部として提供することもできる。
【００２４】
本開示のＤＣ−ＳＩＧＮＲに対する抗体はまた、ＤＣ−ＳＩＧＮＲ発現と関連のある癌および腫瘍型の治療のための治療術としても利用することができる。
【００２５】
本開示の抗体を利用して、ＤＣ−ＳＩＧＮＲを発現しない細胞からＤＣ−ＳＩＧＮＲ発現細胞を単離することもできる。
【００２６】
いくつかの実施形態において、本開示のＤＣ−ＳＩＧＮＲに対する抗体は、ヒト化抗体であり得る。他の実施形態において、本開示のＤＣ−ＳＩＧＮＲに対する抗体は、ｓｃＦｖであり得る。
【００２７】
いくつかの実施形態において、本開示は、Ｌ−ＳＩＧＮ受容体を認識し、Ｌ−ＳＩＧＮへのＨＩＶｇｐ１２０の結合をブロックする抗体、Ｌ−ＳＩＧＮ受容体を認識し、Ｌ−ＳＩＧＮへのエボラエンベロープタンパク質の結合をブロックする抗体、Ｌ−ＳＩＧＮ受容体を認識し、ＤＣ−ＳＩＧＮへのＨＩＶｇｐ１２０の結合をブロックする抗体、Ｌ−ＳＩＧＮ受容体を認識し、ＤＣ−ＳＩＧＮへのエボラエンベロープタンパク質の結合をブロックする抗体、Ｌ−ＳＩＧＮ受容体およびＤＣ−ＳＩＧＮ受容体の両方を認識し、ＤＣ−ＳＩＧＮへのＨＩＶｇｐ１２０の結合をブロックする抗体、ならびに／またはＬ−ＳＩＧＮ受容体およびＤＣ−ＳＩＧＮ受容体の両方を認識し、ＤＣ−ＳＩＧＮへのエボラエンベロープタンパク質の結合をブロックする抗体に関する。この抗体は、エボラエンベロープタンパク質またはＨＩＶｇｐ１２０が結合するエピトープと同じエピトープに結合し得る。
【００２８】
さらに他の実施形態において、本開示は、非ヒト可変ドメインが抗原提示細胞上の受容体、場合によりＤＣ−ＳＩＧＮ受容体に結合する、非ヒト可変ドメインおよびヒトＩｇＧ定常領域を含むキメラ抗体に関する。いくつかの実施形態において、非ヒト可変ドメインはＬ−ＳＩＧＮ受容体を認識し、ヒト定常領域はＩｇＧ１領域である。かかる抗体は、Ｌ−ＳＩＧＮおよび／またはＤＣ−ＳＩＧＮへの、ＨＩＶｇｐ１２０またはエボラエンベロープタンパク質の結合をブロックし得る。キメラ抗体は、非ヒト可変ドメインのみの場合よりも有利にＬ−ＳＩＧＮおよび／またはＤＣ−ＳＩＧＮに結合することができる。
【００２９】
本開示のさらなる実施形態は、組成物を用いた、および／または上述の方法を包含する、予防技術ならびに診断技術に関する。薬学的に許容され得る担体中に本開示のＤＣ−ＳＩＧＮＲに対する抗体を含む組成物も提供される。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３０】
（詳細な説明）
本方法は、自己免疫疾患に関与する、自己抗原または自己ペプチドに対する免疫寛容を誘導する。
【００３１】
抗体／自己抗原コンストラクト（本明細書中で「操作された抗体」と呼ばれることがある）を被験体に投与することによって、本開示により、免疫寛容が誘導される。抗体／自己抗原コンストラクトとしては、抗体に連結された自己抗原が挙げられる。
【００３２】
抗体成分は、任意の抗原提示細胞上の任意の受容体に結合する抗体であり得る。当業者が認めるように、抗原提示細胞の型としては、樹状細胞、マクロファージ、内皮細胞 クップファー細胞およびＢ細胞が挙げられる。現在公知の受容体または抗原提示細胞には、ＤＥＣ−２０５、マンノース受容体、ＤＣ−ＳＩＧＮ、ＤＣ−ＳＩＧＮＲ、ＭＨＣ、ｔｏｌｌ受容体、ランゲリン、アシアロ糖タンパク質受容体、β−グルカン受容体、Ｃ型レクチン受容体および樹状細胞免疫受容体がある。特に有用な実施形態において、受容体は、ＳＴＴ抗体を内在化するものである。内在化が特定の受容体で起こるかどうかは、当業者に公知の技術を用いて実験的に決定することができる。抗体の内在化を提供することが現在知られている受容体または抗原提示細胞としては、ＤＥＣ−２０５、マンノース受容体、ＤＣ−ＳＩＧＮおよびＤＣ−ＳＩＧＮＲが挙げられる。
【００３３】
抗体成分は、天然の抗体（従来の技術を用いて単離される）であってよく、または当業者の認識範囲内にある組み換え方法により合成によって調製される抗体であってもよい。抗体は、例えば、完全ヒト抗体、非ヒト抗体、ヒト化抗体、キメラ抗体または任意の方法（例えば、部位特異的修飾または脱免疫）で操作された前述の型の抗体のいずれかであり得る。抗体は、例えばファージディスプレイおよびパニング等の当業者に公知の技術を用いて、抗体のライブラリーから有利に選択することができる。
【００３４】
本明細書中で使用される場合、「抗体」および「免疫グロブリン」は交換可能に使用され、免疫グロブリン分子全体、または免疫グロブリン分子全体の免疫学的に活性のある部分を含む分子をいい、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、ｓｃＦｖ、Ｆｖ、重鎖可変領域および軽鎖可変領域を含む。
【００３５】
抗体をコードする核酸は、選択されると、例えば、その開示が参照によって本明細書中に援用されている、２００２年９月１９日に提出された米国特許出願第１０／２５１０８５号および２００１年１２月１０日に提出された同第１０／０１４０１２号にそれぞれ記載されている、従来のＰＣＲまたは増幅技術等の、当業者に公知の技術を用いて増幅することができる。
【００３６】
自己抗原を抗体に連結させて、本開示による抗体／自己抗原コンストラクトが調製される。本開示の目的のために、用語「抗体／自己抗原コンストラクト」および「抗体／ペプチド」は、交換可能に使用される。
【００３７】
任意の自己抗原を使用することができる。自己抗原は天然に存在するものであってよく、当業者に公知の技術を用いて単離されてもよい。あるいは、自己抗原のアミノ酸配列が既知である場合、これは公知の技術を用いて合成によって調製することができる。適した自己抗原としては、インスリン、ＧＡＤ、Ｈｓｐ、核抗原、アセチルコリン受容体、ミエリン塩基性タンパク質、ミエリン希突起神経膠細胞糖タンパク質、プロテオリピドタンパク質、ミエリン関連糖タンパク質、糸球体基底膜タンパク質および甲状腺刺激ホルモン受容体が挙げられる。特に有用な実施形態において、自己抗原は、寛容化抗原提示細胞による提示のときに免疫寛容を誘導するものである。
【００３８】
任意の適した方法によって、自己抗原を抗体に連結することができる。ある特定の方法を下記の実施例で述べるが、本開示は、抗体／自己抗原コンストラクトを製造するいかなる特定の方法にも限定されない。
【００３９】
自己抗原に対する免疫寛容を誘導する本方法は、抗原提示細胞（「ＡＰＣ」）を標的とし、抗体によって自己抗原をこれらの細胞に導く。図１は、本開示による抗体／自己抗原コンストラクトと、抗原提示細胞（ＡＰＣ）およびＴ細胞との相互作用を略図で示す。抗体は、標的とする細胞上の受容体を認識する。抗体による自己抗原の送達を導くために、これら２つを連結する。本開示はベクタークローニングの使用を描写するが、この連結は任意の方法によって達成することができる。抗体は、独特の抗原内在化受容体のみを標的として、結合し、それによって所望の細胞型への自己抗原の送達を確実にする。
【００４０】
標的とする抗原内在化受容体に抗体が結合した後、連結した自己抗原および抗体が抗原提示細胞中に内在化される。自己抗原が、おそらく細胞内の主要組織適合性複合体（「ＭＨＣ」）との自己抗原の相互作用を介して、ＡＰＣの表面に提示される。自己抗原が共刺激能力によってＡＰＣの表面で発現されると、未処置の自己反応性Ｔ細胞は、活性化状態になり、その特異的自己抗原を標的とし、それと反応することができる。ＡＰＣの表面に共刺激分子がないことは、Ｔ細胞応答の限定に最も関係がありそうである。自己反応性エフェクターＴ細胞は、限られた数の抗原発現組織細胞しか死滅させることができない。少数の標的細胞を死滅させた後、エフェクター細胞は死滅する。次いで、自己抗原提示細胞が寛容化される。寛容化抗原提示細胞による、未処置のＴ細胞への抗原の提示は、調節性Ｔ細胞を誘導する。続いて、調節性Ｔ細胞が、刺激性抗原提示細胞による、他の潜在的な自己反応性Ｔ細胞の活性化を防ぐ。
【００４１】
したがって、いくつかの実施形態において、本開示の抗体を利用して、肝類洞内皮細胞に結合することができる抗体／自己抗原コンストラクトを形成し、それによって調節性細胞の増殖を刺激することができるか、または本開示の抗体を利用して、肝類洞内皮細胞に結合することができる抗体／自己抗原コンストラクトを形成し、それによって自己反応性Ｔ細胞の活性を抑制することができる。本開示の抗体／自己抗原コンストラクトはまた、ワクチン抗原を、リンパ節で見られるものを含む類洞内皮細胞に送達するのに使用して、それによって抗原特異的Ｔ細胞の増殖を刺激することもできる。
【００４２】
本抗体／自己抗原コンストラクトは、公知の方法、例えば、静脈内、腹腔内、大脳内、筋肉内、皮下、眼内、動脈内、鞘内、吸入もしくは病変内経路による注射もしくは注入、局所的、または下記のような徐放性システムに従って、投与することができる。抗体／自己抗原コンストラクトは、好ましくは、注入によって、またはボーラス注射によって、継続的に投与される。抗体／自己抗原コンストラクトは、局所的または全身性の様式で投与することができる。
【００４３】
抗体／自己抗原コンストラクトは、薬学的に許容され得る担体との混合物中で調製することができる。本願の化合物の製剤化および投与の技術は、「Ｒａｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ」、Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．、ペンシルバニア州イーストン、最新版に見ることができる。この治療組成物は、静脈内、または鼻もしくは肺を通して、好ましくは液体または粉末エーロゾル（凍結乾燥）として、投与することができる。組成物はまた、所望により、非経口または皮下で投与することができる。全身に投与される場合、治療組成物は、無菌で、熱源物質を含まず、ｐＨ、等張性、および安定性を相当に顧慮した非経口的に許容され得る溶液中にあるべきである。これらの条件は、当業者に公知である。
【００４４】
簡潔に述べると、本抗体／自己抗原コンストラクトの投薬製剤は、所望の程度の純度を有する化合物を生理学的に許容され得る担体、賦形剤、または安定剤と混合することによって、保存または投与のために調製される。かかる物質は、使用される投薬量および濃度ではレシピエントにとって無毒であり、ＴＲＩＳ ＨＣｌ、リン酸塩、クエン酸塩、酢酸塩および他の有機酸塩などのバッファー；アスコルビン酸等の抗酸化物質；ポリアルギニン等の低分子量（約１０残基未満）ペプチド、および血清アルブミン、ゼラチン、または免疫グロブリン等のタンパク質；ポリビニルピロリドン等の親水性ポリマー；グリシン、グルタミン酸、アスパラギン酸、またはアルギニン等のアミノ酸；単糖、二糖、およびセルロースもしくはその誘導体、グルコース、マンノース、またはデキストリンを含む他の炭化水素；ＥＤＴＡ等のキレート化剤；マンニトールまたはソルビトール等の糖アルコール；ナトリウム等の対イオン；ならびに／またはＴＷＥＥＮ、ＰＬＵＲＯＮＩＣＳまたはポリエチレングリコール等の非イオン性界面活性剤を含み得る。
【００４５】
インビトロ投与に使用される場合、抗体／自己抗原コンストラクト製剤は無菌でなければならず、従来の医薬の慣例に従って製剤化することができる。これは、凍結乾燥および再構成の前または後に、無菌ろ過膜を通したろ過によって容易に達成される。抗体は、通常、凍結乾燥形態または溶液中で保存される。ゴマ、落花生、もしくは綿実油のような天然に存在する植物性油またはオレイン酸エチル等のような合成脂肪ビヒクル等の他のビヒクルが所望され得る。バッファー、保存薬、抗酸化物質等は、一般に容認された医薬の慣例に従って組み込むことができる。
【００４６】
使用に適した医薬組成物としては、１つまたは複数の抗体／自己抗原コンストラクトが、それらの意図される目的を達成するのに有効な量含まれた、組成物が挙げられる。より具体的には、治療有効量とは、疾患の症状を予防、緩和、もしくは改善するのに、または治療される被験体の生存を延長するのに有効な抗体の量を意味する。治療有効量の決定は、特に本明細書中に提供される詳細な開示に照らして、十分に当業者の能力の範囲内である。治療有効量は、インビトロおよびインビボの方法を用いることによって決定することができる。
【００４７】
治療に使用される有効量の抗体／自己抗原コンストラクトは、例えば、治療目的、投与の経路、および患者の状態に依存する。また、主治医は、重症度および疾患の型、体重、性別、食事、投与の時間および経路、他の薬物適用ならびに他の関連性のある臨床上の要因を含む、薬物の作用を変化させることが公知の種々の要因を考慮に入れる。したがって、療法士は、最適の治療効果を得るのに必要なように、投薬量を滴定し、投与の経路を変更する必要がある。典型的には、臨床家は、所望の効果を達成する投薬量に達するまで、抗体／自己抗原コンストラクトを投与する。この療法の進行は、従来のアッセイによって容易にモニタリングされる。
【００４８】
任意の抗体／自己抗原コンストラクトについて、治療有効量は、細胞培養アッセイから最初に推定することができる。例えば、動物モデルにおいて用量を処方して、細胞培養物中で測定されるＥＣ５０を含む循環濃度範囲を達成することができる（例えば、細胞増殖または分化を促進または阻害する試験分子の濃度）。かかる情報を用いて、ヒトにおける有用な用量をより正確に決定することができる。
【００４９】
本明細書中に記載される抗体／自己抗原コンストラクトの毒性および治療効能は、例えばＬＤ５０（集団の５０％にとって致死的な用量）およびＥＤ５０（集団の５０％において治療上有効な用量）を決定するために、細胞培養物または実験動物において、標準的な医薬の手順によって決定することができる。毒性および治療効能の間の用量比は治療指数であり、これはＬＤ５０とＥＤ５０との間の比として表すことができる。高い治療指数を示す分子が好ましい。これらの細胞培養アッセイおよび動物研究から得られるデータは、ヒトにおける使用のための投薬の範囲を処方するのに使用することができる。かかる分子の投薬量は、好ましくは、毒性がわずかであるかまたは毒性のない、ＥＤ５０を含む循環濃度の範囲内にある。投薬量は、使用される投薬形態および利用される投与の経路に応じて、この範囲内で変化し得る。正確な製剤化、投与の経路および投薬量は、患者の状態を考慮して、それぞれの医師によって選択され得る。（例えば、Ｆｉｎｇｌら、１９７５年、「Ｔｈｅ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ Ｂａｓｉｓ ｏｆ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ」中、第１章１頁参照。）
投薬の量および間隔を個々に調節して、細胞増殖または分化を促進または阻害するのに十分である抗体／自己抗原コンストラクトの血漿レベルまたは最小有効濃度（ＭＥＣ）を提供することができる。ＭＥＣは、各抗体／自己抗原コンストラクトについて変化するが、記載されるアッセイを用いたインビトロデータから推定することができる。ＭＥＣを達成するのに必要な投薬量は、個々の特徴および投与の経路に依存する。しかしながら、ＨＰＬＣアッセイまたはバイオアッセイを用いて、血漿濃度を決定することができる。
【００５０】
投薬間隔もまた、ＭＥＣ値を用いて決定することができる。抗体／自己抗原コンストラクト分子は、時間の１０〜９０％、好ましくは３０〜９０％の間、最も好ましくは５０〜９０％の間にわたって、ＭＥＣより高い血漿レベルを維持する養生法を用いて投与されるべきである。
【００５１】
局所的投与または選択的取り込みの場合、抗体／自己抗原コンストラクトの効果的な局所濃度は、血漿濃度と関連していなくてもよい。
【００５２】
典型的な１日の投薬量は、上述の要因により、約１μｇ／ｋｇ〜１０００ｍｇ／ｋｇまで、またはそれより多い範囲であり得る。典型的には、臨床家は、投薬量が所望の効果を達成する量に達するまで、抗体／自己抗原コンストラクトを投与する。この療法の進行は、従来のアッセイによって容易にモニタリングされる。
【００５３】
疾患の型および重症度に応じて、例えば、１つもしくは複数の別々の投与によってであれ、または継続的な注入によってであれ、約０．００１ｍｇ／ｋｇ〜約１０００ｍｇ／ｋｇ、より好ましくは約０．０１ｍｇ〜１００ｍｇ／ｋｇ、より好ましくは約０．０１０〜２０ｍｇ／ｋｇの抗体／自己抗原コンストラクトが、患者への投与のための最初の候補の投薬量であり得る。数日またはより長い期間にわたる繰り返しの投与のために、状態に応じて、疾患症状の所望の抑制が起こるか、または患者の状態の所望の改善が達成されるまで、治療が繰り返される。しかしながら、他の投与計画もまた、有用であり得る。
【００５４】
特に有用な実施形態において、開示される方法を用いて、膵臓内のランゲルハンス島のインスリン産生β細胞に対する免疫寛容を誘導することによって、真正糖尿病を治療することができる。これらの細胞の自己抗原を、所望の抗原内在化受容体を認識する抗体に連結させる。本開示における使用に適した自己抗原は、β細胞抗原、ならびに、インスリン、グルタミン酸デカルボキシラーゼ（「ＧＡＤ」）および熱ショックタンパク質（「ＨＳＰ」）の、エピトープ、またはエピトープを提示するペプチドである。インスリン、ＧＡＤおよびｈｓｐからのエピトープを覆う一連のペプチドを抗ＤＣ−ＳＩＧＮＲ抗体に連結させることは、Ｔ１ＤＭに関与するすべての主要抗原に対する寛容性を誘導する能力を有する。他の自己抗原は、当業者によって、公知であり、使用され得るか、または発見されて使用され得る。
【００５５】
抗原内在化受容体は、特殊化したＡＰＣ上に提示されている。この方法のために、選択された抗原内在化受容体は、ＤＣ−ＳＩＧＮＲ（樹状細胞特異的細胞間接着分子３−捕捉性非インテグリン関連受容体）である。ＤＣ−ＳＩＧＮＲは、肝臓常在性の抗原提示細胞である、肝類洞内皮細胞（「ＬＳＥＣ」）によって発現される。（１Ｐｏｈｌｍａｎｎら、２００１年）。ＤＣ−ＳＩＧＮＲは、受容体結合タンパク質を内在化させ、抗原提示を容易にする、病原体内在化受容体のファミリーに属する。（１Ｇｅｉｊｔｅｎｂｅｅｋら、２００２年）。ＬＳＥＣによる抗原の提示が抗原特異的寛容性を生じることが示されている（Ｌｉｍｍｅｒら、２０００年）。未成熟の免疫寛容誘発状態から活性化状態へと成熟し得る他の樹状細胞型と対照的に、肝類洞内皮細胞は、活性化抗原提示細胞に発達するよう誘導されることができない（２Ｋｎｏｌｌｅら、１９９９年）。ヒトＤＣ−ＳＩＧＮに対するヒトＤＣ−ＳＩＧＮＲ（Ｌ−ＳＩＧＮとも呼ばれる）ホモログは、ＤＣ−ＳＩＧＮに対して、アミノ酸レベルで７７％の同一性を示し、内在化受容体の典型的なドメインを有する（Ｂａｓｈｉｒｏｖａら、２００１年、Ｓｏｉｌｌｅｕｘら、２０００年）。ＤＣ−ＳＩＧＮＲはＬＳＥＣで高度に発現され、リンパ節マクロファージ様細胞の副次集団にも見られるが、ＤＣによって発現されない。
【００５６】
本開示の目的のために、用語「ＤＣ−ＳＩＧＮＲ」および「Ｌ−ＳＩＧＮ」は、交換可能に使用される。
【００５７】
Ｃ型レクチンマウスＤＣ−ＳＩＧＮ（ＤＣ２０９）は、最近、ＤＣ特異的受容体として同定された。ＤＣ−ＳＩＧＮは、一時的なＤＣ−Ｔ細胞相互作用を開始させることによって初期免疫応答を可能にする、ＤＣの経内皮移動を媒介する（３Ｇｅｉｊｔｅｎｂｅｅｋら、２０００年、２Ｇｅｉｊｔｅｎｂｅｅｋら、２０００年）。ＤＣ−ＳＩＧＮはまた、炭水化物構造を通して病原体を認識する内在化抗原受容体として働く。ＤＣ−Ｔ細胞クラスター化およびＴ細胞応答の開始におけるその顕著な役割の他に、ＤＣ−ＳＩＧＮは、ＨＩＶ−１、ＨＩＶ−２、ＳＩＶ−１、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）、エボラウイルス、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）、デング熱ウイルス等のウイルス；ヘリコバクターピロリ（Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ ｐｙｌｏｒｉ）、肺炎杆菌（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｎａｅ）、ヒト結核菌等の細菌；カンジダアルビカンス（Ｃａｎｄｉｄａ ａｌｂｉｃａｎｓ）等の酵母；およびピファノリーシュマニア（Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａ ｐｉｆａｎｏｉ）、マンソン住血吸虫等の寄生生物の、ＤＣの感染およびそれに続くＴ細胞への伝播に関係する主要な受容体である。ＤＣ−ＳＩＧＮＲのマウスのホモログであるｍＳＩＧＮＲ１は、迅速に内在化されプロセシングのためにリソゾームに標的化される、抗原を捕捉する（１Ｇｅｉｊｔｅｎｂｅｅｋら、２００２年）。アミノ酸配列に基づくと、マウスｍＳＩＧＮＲ１は、ヒトＤＣ−ＳＩＧＮに対するのと同程度に、ヒトＤＣ−ＳＩＧＮＲに対して相同であり、したがって、動物モデリング研究に有用である。
【００５８】
したがって、別の態様において、本開示は、抗ＤＣ−ＳＩＧＮＲ（すなわち、抗Ｌ−ＳＩＧＮ）抗体に関する。上記のように、用語「抗体」は、本明細書中で使用される場合、免疫グロブリン分子全体、または、免疫グロブリン分子全体の免疫学的に活性のある一部を含む分子をいい、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、ｓｃＦｖ、Ｆｖ、重鎖可変領域および軽鎖可変領域を含む。
【００５９】
ある実施形態において、本開示の抗体は、軽鎖を含む。本明細書中で使用される場合、「軽鎖」は、１つの可変ドメイン（ＶＬ）および１つの定常ドメイン（ＣＬ）で構成される抗体分子の、小さい方のポリペプチド、またはその断片を意味する。別の実施形態において、抗体の一部は、重鎖を含む。本明細書中で使用される場合、「重鎖」は、１つの可変ドメイン（ＶＨ）および３つもしくは４つの定常ドメイン（ＣＨ１、ＣＨ２、ＣＨ３、およびＣＨ４）で構成される抗体分子の、大きい方のポリペプチド、またはその断片を意味する。
【００６０】
別の実施形態において、抗体は、抗体のＦａｂ部分を含む。本明細書中で使用される場合、「Ｆａｂ」は、１つの軽鎖および重鎖の一部からなる、免疫グロブリンの、一価の抗原結合断片を意味する。これは、短時間のパパイン消化によって、または組み換え方法によって得ることができる。別の実施形態において、抗体の一部は、抗体のＦ（ａｂ’）２部分を含む。本明細書中で使用される場合、「Ｆ（ａｂ’）２断片」は、両方の軽鎖および両方の重鎖の一部からなる、免疫グロブリンの、二価の抗原結合断片を意味する。これは、短時間のペプシン消化、または組み換え方法によって得ることができる。他の実施形態において、抗体は、Ｆａｂ’断片であり得る。Ｆａｂ発現ライブラリーは、例えば、Ｈｕｓｅら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４５： １２７５頁（１９８９年）の方法によって得ることができる。
【００６１】
さらに、抗原提示細胞上の受容体に結合する「ヒト化」抗体を用いてもよい。ヒト化の方法は、例えば、国際公開第９８／４９３０６号、米国特許第５５８５０８９号、同第５２２５５３９号および同第５６９３７６１号ならびに国際公開第９０／０７８６１号に開示されており、その開示は、その全体が参照によって本明細書中に援用される。本明細書中で使用される場合、「ヒト化」抗体は、ＣＤＲ外部のアミノ酸が、ヒト免疫グロブリン分子由来の対応するアミノ酸で置換されている抗体である。「ＣＤＲ」または「相補性決定領域」は、抗体の可変ドメインにおける、高度に可変性のアミノ酸の配列を意味する。組み換えＤＮＡ技術を用いて、ヒト化抗体が所望の標的を認識するがヒト被験体の免疫系によって相当に認識されないように、１つの免疫グロブリンの可変領域のＣＤＲが異なる特異性を有する免疫グロブリン由来のＣＤＲで置換された、ヒト化抗体を生成することができる。
【００６２】
他の実施形態において、ヒト定常領域に連結された任意の抗原提示細胞上の任意の受容体に結合する非ヒト可変ドメインを含むキメラ抗体が企図される。可変ドメインが結合する受容体は、例えば、Ｌ−ＳＩＧＮまたはＤＣ−ＳＩＧＮであってよく、定常領域は、ヒトＩｇＧ１定常領域であってよい。驚くべきことに、下記でより詳細に説明されている特定の実施形態において、かかるキメラ抗体は、任意の抗原提示細胞上の受容体に対して、可変ドメイン単独よりも有利な結合を示すことがわかっている。
【００６３】
抗体クローンの、完全なＩｇＧへの変換のために、軽鎖および重鎖の両方、またはその断片のコード領域を、細菌ベクターから、哺乳動物ベクター（複数可）内へ、別々にクローニングすることができる。ｐＤＲ１またのその誘導体等の単一のベクター系を用いて、軽鎖および重鎖カセットの両方を、同じプラスミドにクローニングすることができる。あるいは、重鎖および軽鎖が別々のプラスミドによって生成される二重発現ベクターを用いることができる。哺乳動物シグナル配列は、最終的なベクターにすでに存在しているか、または軽鎖および重鎖ＤＮＡインサートの５’末端に付加されるかの、いずれかである必要がある。これは、適当な哺乳動物リーダー配列を含むシャトルベクター（複数可）への、最初の鎖の転移によって達成することができる。制限酵素消化の後、軽鎖および重鎖領域、またはその断片を、ＩｇＧの残りの定常領域がイントロンありまたはなしで提供される、最終的なベクター（複数可）に導入する。
【００６４】
本開示による抗体は、Ｌ−ＳＩＧＮおよびＤＣ−ＳＩＧＮの両方に結合することができ、Ｌ−ＳＩＧＮ優先的に結合する。すなわち、Ｌ−ＳＩＧＮへの結合は、ＤＣ−ＳＩＧＮへの結合よりも強くあり得る。Ｌ−ＳＩＧＮへの結合は、例えば、ＤＣ−ＳＩＧＮへの結合よりも、１．１〜２００倍強くあり得る。あるいは、−ＳＩＧＮへの結合は、ＤＣ−ＳＩＧＮへの結合よりも、１．２〜１００倍強くあり得る。
【００６５】
いくつかの実施形態において、ＤＣ−ＳＩＧＮＲに対する抗体は、ＤＣ−ＳＩＧＮＲ発現細胞の、ＩＣＡＭ発現細胞との相互作用を調節、すなわち、阻害または増強する。一実施形態において、抗ＤＣ−ＳＩＧＮＲ抗体は、ＬＳＥＣ等の抗原提示細胞の表面上のＤＣ−ＳＩＧＮＲ受容体部位に結合し、ＬＳＥＣとＴ細胞との間の相互作用（複数可）を妨げる。より具体的には、ＤＣ−ＳＩＧＮＲに対する抗体は、Ｔ細胞の表面上のＤＣ−ＳＩＧＮＲとＩＣＡＭ受容体との間の接着に干渉することによって、ＬＳＥＣとＴ細胞との間の接着を減少させる。この相互作用のブロッキングによって、免疫応答を調節することができる。例えば、ＤＣ−ＳＩＧＮＲに対する抗体は、Ｌ−ＳＩＧＮとＴ細胞との相互作用をブロックすることによって免疫機能を調節することができ、それによって、肝臓で見られるものを含む、調節性Ｔ細胞の増殖を引き起こすことができる。別の実施形態において、ＤＣ−ＳＩＧＮＲに対する抗体は、Ｌ−ＳＩＧＮとＴ細胞との相互作用をブロックすることによって免疫機能を調節することができ、それによって、リンパ節で見られるものを含む、自己反応性Ｔ細胞の増殖を抑制することができる。
【００６６】
いくつかのさらなる実施形態において、本開示の抗体を利用して、肝類洞内皮細胞に結合することができる抗体−ペプチドコンストラクトを形成することができ、それによって、調節性細胞の増殖を刺激することができるか、または、本開示の抗体を利用して、肝類洞内皮細胞に結合することができる抗体−ペプチドコンストラクトを形成することができ、それによって、自己反応性Ｔ細胞の活性を抑制することができる。本開示の抗体−ペプチドコンストラクトを用いて、リンパ節で見られるものを含む類洞内皮細胞に、ワクチン抗原を送達することもでき、それによって、抗原特異的Ｔ細胞の増殖を刺激することができる。
【００６７】
本明細書中で使用される場合、「ＩＣＡＭ受容体（複数可）」は、ＩＣＡＭ−２およびＩＣＡＭ−３受容体の両方、特にＩＣＡＭ−３を意味する。
【００６８】
いくつかの実施形態において、本開示のＤＣ−ＳＩＧＮＲに対する抗体は、ＤＣ−ＳＩＧＮに結合しない。他の実施形態において、本開示の抗体は、ＤＣ−ＳＩＧＮＲに対する高い親和性およびＤＣ−ＳＩＧＮに対する低い親和性を有する。本開示の抗体は、ＤＣ−ＳＩＧＮＲ上の線状および立体的エピトープの両方に結合できる場合もある。
【００６９】
本抗体または抗体／ペプチドコンストラクトがＤＣ−ＳＩＧＮＲ提示細胞に対する毒素で標識することができることも企図される。次いで、毒素で標識された、抗ＤＣ−ＳＩＧＮＲ抗体または抗ＤＣ−ＳＩＧＮＲ抗体／ペプチドコンストラクトの投与を利用して、ＤＣ−ＳＩＧＮＲ発現細胞のレベルを減少させることができ、これは自己免疫疾患、癌または炎症性疾患の治療等のいくつかの場合において有利であり得る。このようにして、本抗体または抗体／ペプチドコンストラクトを利用して、ＤＣ−ＳＩＧＮＲ発現細胞をインビボで死滅させるか、または除去することもできる。これは、細胞毒性薬物（例えば、毒素または放射線放射化合物）に結合した、抗体または抗体／ペプチドコンストラクトを、かかる処置を必要とする被験体に投与することを含む。抗体または抗体／ペプチドコンストラクトはＤＣ−ＳＩＧＮＲ発現細胞（例えば、癌細胞または肝類洞内皮細胞）を認識するので、抗体または抗体／ペプチドコンストラクトが結合している任意のかかる細胞が破壊される。一実施形態において、本開示による、癌を治療する方法は、効果的な、癌細胞を死滅させる量の、毒素の結合している、抗ＤＣ−ＳＩＧＮＲ抗体または抗ＤＣ−ＳＩＧＮＲ抗体／ペプチドコンストラクトを、癌患者に投与すること含む。別の実施形態において、本開示による、炎症性疾患を治療する方法は、効果的な、ＤＣ−ＳＩＧＮＲ発現細胞を死滅させる量の、毒素の結合している抗ＤＣ−ＳＩＧＮＲ抗体または抗ＤＣ−ＳＩＧＮＲ抗体／ペプチドコンストラクトを、炎症性疾患に罹患した患者に投与することを含む。
【００７０】
他の実施形態において、本開示のＤＣ−ＳＩＧＮＲに対する抗体は、肝類洞細胞等の肝細胞へのウイルスの侵入および他の細胞へのそれらの感染をブロックする。本開示のＤＣ−ＳＩＧＮＲに対する抗体はまた、Ｔ細胞へのウイルスの侵入および他の細胞へのそれらの感染をブロックすることができる。
【００７１】
いくつかの実施形態において、本開示のＤＣ−ＳＩＧＮＲに対する抗体を利用して、ミコバクテリウム属の細菌による感染をブロックすることができる。ブロックすることができる感染としては、ヒト結核菌およびウシ結核菌によって引き起こされるものが挙げられる。
【００７２】
抗原提示細胞へのＴ細胞の接着に干渉することによって、ＤＣ−ＳＩＧＮＲに対する抗体の使用は、抗原提示細胞−Ｔ細胞クラスター化、Ｔ細胞活性化、および抗原提示細胞とＴ細胞との間の接触に依存する他の相互作用に影響を及ぼす。これらの他の相互作用としては、直接の細胞−細胞接触、または抗原提示細胞とＴ細胞とがきわめて近接していることが挙げられる。
【００７３】
他の実施形態において、本開示の抗ＤＣ−ＳＩＧＮＲ抗体は、自己抗原、または自己抗原のペプチド等の、ペプチドに連結される。これらのペプチドは、ベクターを抗体断片に移植して、連結したベクター／抗体をクローニングすること、または化学的に連結することを含む、任意の適した方法によって、抗ＤＣ−ＳＩＧＮＲ抗体に連結することができる。ベクターの連結、クローニングまたは化学的連結の方法は、当業者に周知である。
【００７４】
連結した抗体に沿った、ペプチド、好ましくは自己抗原は、次いで、ＬＳＥＣに内在化される。ＬＳＥＣは、ＭＨＣ ＩＩ、ＣＤ８０およびＣＤ８６等の、抗原提示に必要な表面分子を有する（Ｌｏｈｓｅら、１９９６年、Ｒｕｂｉｎｓｔｅｉｎら、１９８６年）。未処置のＣＤ４＋Ｔ細胞において調節性の表現型を誘導することに加えて（Ｋｎｏｌｌｅら、１９９９年）、ＬＳＥＣは、外因性抗原を交差提示することによって、ＣＤ８＋Ｔ細胞における寛容性を誘導することができる（Ｌｉｍｍｅｒら、２０００年）。ＬＳＥＣは、ＭＨＣのダウンレギュレーション、およびエンドソームのプロセシングを妨げることによって、ＴＮＦ−αおよび内毒素としての刺激に応答する（２Ｋｎｏｌｌｅら、１９９９年）。さらに、ＬＳＥＣは、肝臓からリンパ器官へ移動しない。
【００７５】
この内在化によって、ＭＨＣ相互作用によって媒介される、ＬＳＥＣの表面への、自己抗原のペプチドの提示が容易になる。一旦自己抗原が共刺激能力を有するＬＳＥＣの表面で発現されると、未処置の自己反応性Ｔ細胞が活性化状態になり得る。Ｔ細胞は、連結した自己抗原を標的とし、これと反応する。エフェクターＴ細胞は、少数のＬＳＥＣを死滅させ、共刺激分子なしで死に絶える。ＬＳＥＣによる、自己抗原のこの提示は、自己抗原特異的寛容性を生じる。
【００７６】
肝臓は、ＩＬ−１０およびＴＧＦ−β等の豊富な免疫寛容誘発メディエータ、ならびに免疫学的寛容性の発達に有利である特殊化したＡＰＣを有する、独特の微環境を有する（１ＫｎｏｌｌｅおよびＧｅｒｋｅｎ、２０００年）。肝臓の免疫寛容誘発特性は、同種異系の肝臓移植がＭＨＣ障壁を横切って許容され得るという発見によって支持されている（Ｃａｌｎｅ、１９６９年）。さらに、門脈による抗原の適用は、抗原の全身性の適用よりも、寛容性に、よりつながりそうである（Ｋａｍｅｉら、１９９０年）。肝臓を通した排出が、経口免疫寛容誘導の必要条件であると報告されている（Ｙａｎｇら、１９９４年）。肝血管を通る血液は、まずクップファー細胞およびＬＳＥＣと接触するようになる。肝類洞を通った血流は遅く、肝類洞細胞集団と通過する白血球との間の接触が可能になる。ＬＳＥＣは、ＭＨＣＩＩ、ＣＤ８０およびＣＤ８６等の、抗原提示に必要な表面分子を有する（Ｌｏｈｓｅら、１９９６年、Ｒｕｂｉｎｓｔｅｉｎら、１９８６年）。未処置のＣＤ４＋Ｔ細胞において調節性の表現型を誘導することに加えて（Ｋｎｏｌｌｅら、１９９９年）、ＬＳＥＣは、外因性抗原を交差提示することによって、ＣＤ８＋Ｔ細胞における寛容性を誘導することができる（Ｌｉｍｍｅｒら、２０００年）。Ｋｌｕｇｅｗｉｔｚら（Ｋｌｕｇｅｗｉｔｚら、２００２年）は、マウスへのＴｈ１、ＩＦＮ−γ産生ＴＣＲトランスジェニック細胞の注射が、静脈内タンパク質免疫の後に、肝臓におけるこれらの細胞によるＩＦＮ−γ産生の抑制、およびＴｈ２細胞の促進を生じることを示した。未成熟な免疫寛容誘発段階から免疫を開始する成熟した段階へ分化することができるプロフェッショナル骨髄性ＡＰＣと対照的に、ＬＳＥＣは、ＭＨＣのダウンレギュレーション、およびエンドソームのプロセシングを妨げることによって、ＴＮＦ−αおよび内毒素としての刺激に応答する（２Ｋｎｏｌｌｅら、１９９９年）。さらに、ＬＳＥＣは、肝臓からリンパ器官へ移動しない。ＬＳＥＣは、寛容性を誘導するときに特殊化される唯一のＡＰＣではないこともある。Ｐｕｇｌｉｅｓｅらは、最近、内因性で発現された自己抗原を提示することによって寛容性を誘導した脾臓ＤＣの小さいサブセットを同定した（Ｐｕｇｌｉｅｓｅら、２００１年）。全体的に見て、ＬＳＥＣは、寛容性誘導の目的でβ細胞抗原を提示するのに望ましい細胞型のようである。
【００７７】
また、ＤＣ−ＳＩＧＮおよびＬ−ＳＩＧＮの両方とも、多くのウイルス、例えばＨＩＶ（Ｂａｓｈｉｒｏｖａら、２００１年、２Ｐｏｈｌｍａｎｎら、２００１年）、ＨＣＶ（Ｇａｒｄｎｅｒら、２００３年）、エボラ（Ａｌｖａｒｅｚら、２００２年、Ｓｉｍｍｏｎｓら、２００３年）、ＳＡＲＳ（Ｊｅｆｆｅｒｓら、２００４年）、ＣＭＶ（Ｈａｌａｒｙら、２００２年）、およびシンドビス（Ｋｌｉｍｓｔｒａら、２００３年）に結合することが示されている。これらの受容体は、ＨＩＶおよびＨＣＶの接着点として、これらを他の細胞、例えばＴ細胞へ途中で伝播して作用するが（Ｂａｓｈｉｒｏｖａら、２００１年、２Ｐｏｈｌｍａｎｎら、２００１年、Ｃｏｒｍｉｅｒら、２００４年）、これらはまた、エボラ、ＳＡＲＳ、ＣＭＶおよびシンドビスウイルスに結合し、これらよる受容体発現細胞への侵入および感染を許す。また、ＤＣ−ＳＩＧＮおよびＬ−ＳＩＧＮの両方とも、ヒト結核菌を含むミコバクテリウム属の細菌性病原体（４Ｇｅｉｊｔｅｎｂｅｅｋら、２００３年、Ｋｏｐｐｅｌら、２００４年）、ならびにマンソン住血吸虫等の寄生生物（Ｖａｎ Ｌｉｅｍｐｔら、２００４年）による感染のための受容体として働く。
【００７８】
したがって、別の実施形態において、本開示の抗体を利用して、ＤＣ−ＳＩＧＮおよび／またはＬ−ＳＩＧＮに結合し、それによって、ＨＩＶ、ＨＣＶ、エボラ、ＳＡＲＳ、ＣＭＶおよびシンドビス等のウイルス、ヒト結核菌およびウシ結核菌を含むミコバクテリウム属の細菌性病原体、ならびにマンソン住血吸虫等の寄生生物を含むがこれらに限定されない感染性作用物質の結合、感染、および伝播をブロックすることができる。
【００７９】
本開示のＤＣ−ＳＩＧＮＲに対する抗体はまた、ＤＣ−ＳＩＧＮＲ発現に関連する腫瘍型の、通法の診断法として利用することもできる。例えば、免疫受容体のアップレギュレーションは免疫系による圧力下でのみ起こると予測されるので、癌試料におけるＤＣ−ＳＩＧＮＲのアップレギュレーションを、癌が免疫系に曝露されるようになったかどうかを評価するための診断手段の基礎として利用することができた。免疫組織化学および／またはＦＡＣＳ解析を含む、当業者に公知の方法を用いて、腫瘍生検をＤＣ−ＳＩＧＮＲに対する抗体に曝露し、次いで、ＤＣ−ＳＩＧＮＲ発現に関連する癌の指標である、結合した抗体の存在について解析してもよい。いくつかの実施形態において、抗体は、ＤＣ−ＳＩＧＮＲを発現する癌の存在を決定するための診断キットの一部として提供されてもよい。
【００８０】
本開示のＤＣ−ＳＩＧＮＲに対する抗体はまた、癌治療のための治療術として利用することもできる。一実施形態において、本開示の抗体は、腫瘍細胞のＡＤＣＣ（抗体依存性細胞毒性）またはＣＤＣ（補体依存性細胞毒性）を誘導し、それによって前記細胞を死滅させる。
【００８１】
本抗体または抗体／ペプチドコンストラクトを利用して、癌性細胞をインビボで死滅させるか、または除去することもできる。これは、細胞毒性薬物に結合した抗体または抗体／ペプチドコンストラクトを、かかる処置を必要とする被験体に投与することを含む。抗体または抗体／ペプチドコンストラクトは癌細胞を認識するので、抗体または抗体／ペプチドコンストラクトが結合している任意のかかる細胞が、破壊される。
【００８２】
本開示の抗体または抗体／ペプチドコンストラクトを用いて、種々の細胞毒性化合物を送達することができる。任意の細胞毒性化合物を本抗体または抗体／ペプチドコンストラクトに融合させることができる。融合は、化学的または遺伝学的に（例えば、単一の融合分子としての発現によって）達成することができる。細胞毒性化合物は、ポリペプチド等の生物学的、または小さい分子であり得る。当業者が認めるように、小さい分子については化学的融合が用いられるが、生物学的化合物については、化学的または遺伝学的融合のいずれかを使用することができる。
【００８３】
本開示の抗体または抗体／ペプチドコンストラクトを用いて、治療薬；放射線を放射する化合物；植物、真菌、または細菌由来の分子；生物学的タンパク質；およびそれらの混合物を含む、種々の細胞毒性薬物を送達することができる。細胞毒性薬物は、例えば短距離高エネルギーα−放射体を含む、短距離放射線放射体等の、細胞内で作用する細胞毒性薬物であってもよい。酵素的に活性のある毒素およびその断片は、例えば、ジフテリア毒素Ａ断片、ジフテリア毒素の非結合活性断片、外毒素Ａ（緑膿菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）由来）、リシンＡ鎖、アブリンＡ鎖、モデシンＡ鎖、α−サクリン、ある種のシナアブラギリ（Ａｌｅｕｒｉｔｅｓ ｆｏｒｄｉｉ）タンパク質、ある種のジアンチンタンパク質、ヨウシュヤマゴボウ（Ｐｈｙｔｏｌａｃｃａ ａｍｅｒｉｃａｎａ）タンパク質（ＰＡＰ、ＰＡＰＩＩおよびＰＡＰ−Ｓ）、モロディカカランチア（Ｍｏｒｏｄｉｃａ ｃｈａｒａｎｔｉａ）インヒビター、クルシン、クロチン、サボンソウ（Ｓａｐｏｎａｒｉａ ｏｆｆｉｃｉｎａｌｉｓ）インヒビター、ゲロニン、マイトジリン、レストリクトシン、フェノマイシン、およびエノマイシンによって例示される。免疫毒素の、酵素的に活性のあるポリペプチドの調製のための手順は、参照によって本明細書中に援用される、国際公開第８４／０３５０８号および国際公開第８５／０３５０８号に記載されている。ある種の細胞毒性部分は、例えば、アドリアマイシン、クロラムブシル、ダウノマイシン、メトトレキサート、ネオカルチノスタチン、および白金に由来する。
【００８４】
抗体または抗体／ペプチドコンストラクトを細胞毒性作用物質と複合化する手順は、これまでに記載されている。
【００８５】
あるいは、本開示の抗体または抗体／ペプチドコンストラクトを、腫瘍部位に局在すると数細胞直径を死滅させる、高エネルギー放射線放射体、例えば、γ−放射体である１３１Ｉ等の放射性同位元素に、結合してもよい。例えば、参照によって本明細書中に援用される、Ｓ． Ｅ． Ｏｒｄｅｒ、「Ａｎａｌｙｓｉｓ， Ｒｅｓｕｌｔｓ， ａｎｄ Ｆｕｔｕｒｅ Ｐｒｏｓｐｅｃｔｉｖｅ ｏｆ ｔｈｅ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ｕｓｅ ｏｆ Ｒａｄｉｏｌａｂｅｌｅｄ Ａｎｔｉｂｏｄｙ ｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒａｐｙ」、Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｆｏｒ Ｃａｎｃｅｒ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ａｎｄ Ｔｈｅｒａｐｙ、Ｒ． Ｗ． Ｂａｌｄｗｉｎら（編）、３０３〜３１６頁（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、１９８５年）を参照のこと。他の適した放射性同位元素としては、２１２Ｂｉ、２１３Ｂｉ、および２１１Ａｔ等のα−放射体、ならびに１８６Ｒｅおよび９０Ｙ等のβ−放射体が挙げられる。前立腺癌は比較的放射線感受性の腫瘍なので、放射線治療は、前立腺癌に関連して、特に効果的であると期待される。
【００８６】
別の実施形態において、Ｌ−ＳＩＧＮに結合すること、およびＬ−ＳＩＧＮ発現癌細胞を通した免疫系の負の調節を防ぐことによって、本開示のＬ−ＳＩＧＮに対する抗体を、腫瘍を治療するための治療術として利用することができる。この負の調節を防ぐことによって、免疫系が進行して癌細胞を根絶することができる。
【００８７】
上述の治療の効能は、異種移植モデルを含む、当業者に公知の方法を利用して確認することができる。
【００８８】
癌治療術として利用される、本開示によるＬ−ＳＩＧＮに対する抗体はまた、癌ワクチン、抗ＣＴＬＡ−４、抗ＣＤ２５またはシクロホスファミド等の任意の他の免疫調節療法と組み合わせて、癌の治療において、治療効能の増大を達成することができる。
【００８９】
本開示によるＬ−ＳＩＧＮに対する抗体をいくつかの実施形態において用いて、Ｌ−ＳＩＧＮを発現していない細胞が含まれる細胞の混合物中で見られる、Ｌ−ＳＩＧＮ発現細胞を単離することもできる。例えば、類洞内皮細胞、赤血球、クップファー細胞および他の少数の細胞集団の混合物を含むヒト非実質性肝細胞は、商業的供給源から容易に得ることができる。ヒト非実質性肝細胞から、Ｌ−ＳＩＧＮ発現細胞、すなわち肝類洞細胞を単離するために、赤血球を、赤血球の溶解を生じる塩化アンモニウム等の作用物質に曝露することができる。ミルテニーバイオテク（ドイツ）によって販売されているものを含む市販の死細胞除去キットを用いて、死細胞を除くことができる。残りの細胞を計数し、抗Ｌ−ＳＩＧＮ抗体で標識することができる。細胞を洗浄した後、それらを適切なバッファーに再懸濁し、残りの細胞を、いくつかの場合においてビーズまたは同様の分離媒体に複合化してもよい抗Ｌ−ＳＩＧＮ抗体に曝露することによって、目的の細胞、すなわちＬ−ＳＩＧＮ発現細胞を単離することができる。市販の分離媒体およびそれらの使用の方法は当業者に公知であり、ミルテニーからの市販のビーズを含む。いくつかの特に有用な実施形態において、製造業者の使用説明書（ミルテニー）に従って、抗Ｌ−ＳＩＧＮ複合ビーズ、例えば抗マウスＩｇＧ複合ビーズを用いることによって、Ｌ−ＳＩＧＮ発現細胞を、Ｌ−ＳＩＧＮを発現していない細胞から単離することができる。抗Ｌ−ＳＩＧＮ抗体に結合している細胞はＬ−ＳＩＧＮ発現細胞であり、それによって、Ｌ−ＳＩＧＮを発現していない残りの細胞から単離される。一旦残りの細胞から単離されると、Ｌ−ＳＩＧＮ発現細胞は、当業者に容易に知られている方法を用いて抗Ｌ−ＳＩＧＮ抗体から除去することができる。単離の質は、ＣＤ５４、マンノース受容体、ＬＹＶＥ−１、ＣＤ４０、アシアロ糖タンパク質および他のもの等の分子に対する一団の抗体を用いたＦＡＣＳ解析を含む、当業者に公知の方法によってモニタリングすることができる。
【００９０】
そのさらなる好ましい態様および実施形態を含む、本方法の実際は、例示のためのみに提示される以下の実施例から、より深く理解され、決して限定すると解釈されるべきではない。
【実施例】
【００９１】
（実施例１）
抗ｍＳＩＧＮＲ１抗体を得ること
ファージディスプレイ技術を用いて、ｍＳＩＧＮＲ１を認識する一団の単鎖抗体（ｓｃＦｖ）を同定した。ｓｃＦｖは、リンカーによって連結された、可変軽鎖領域および可変重鎖領域を含む。それらの短い長さによって、これらの抗体断片が、抗原結合に非常に適するようになり、受容体への結合能力が保存される。ウサギを組み換えｍＳＩＧＮＲ１で免疫し、その開示が参照によって本明細書中に援用される、２００２年６月１３日に公開された国際出願公開第０２／４６４３６Ａ２号に記載されている、ファージディスプレイベクターｐＲＬ４を用いて、ｓｃＦｖ抗体ライブラリーを構築した。このシステムにおける抗体断片は、ファージの遺伝子ＩＩＩコートタンパク質上に提示される。ｍＳＩＧＮＲ１を認識する抗体を、組み換えｍＳＩＧＮＲ１の４回の固相パニングによって単離した。６つの異なる抗体を同定した。これら６つの抗体のアミノ酸配列を、図２ＡおよびＢに示す（それぞれ配列番号１〜６および７〜１２）。すべての抗体は、固相ＥＬＩＳＡにおいてｍＳＩＧＮＲ１を認識し、ヒトＤＣ−ＳＩＧＮのマウスホモログであるｍＤＣ−ＳＩＧＮとの交差反応性は観察されなかった。抗体を、ＨＡおよびＨＩＳ６でエピトープタグした。ｍＳＩＧＮＲ１およびＤＣ−ＳＩＧＮＨＩＳの両方とも、３Ｔ３ ＥＢＮＡ細胞によって生成し、ニッケルカラムで精製した。
【００９２】
（実施例２）
細胞表面受容体への結合のときに内在化される抗ｍＳＩＧＮＲ１抗体を同定すること
ｍＳＩＧＮＲ１を発現している細胞系のスクリーニング
一団のマウスマクロファージ細胞系（Ｐ３８８Ｄ１、１−１３．３５、ＷＥＨＩ−３およびＪ７７４）を、標準的な方法によるＲＴ−ＰＣＲによって、ｍＳＩＧＮＲ１の発現についてスクリーニングする。ｍＳＩＧＮＲ１ ＧｅｎＢａｎｋ配列に基づいてプライマーを設計し、これらをマウス器官のＲＴ−ＰＣＲにおいて使用した。ｍＲＮＡレベルでｍＳＩＧＮＲ１を発現している細胞系を同定し、ＦＡＣＳ解析によって表面発現を確認する。５×１０５個の細胞を、１％ＢＳＡおよび０．１％ＮａＮ３を含むＰＢＳ中の１μｇの抗ｍＳＩＧＮＲ１抗体とともに、氷上で１５分間、抗体内在化を可能にしない条件でインキュベートした。１％ＢＳＡおよび０．１％ＮａＮ３を含むＰＢＳでの２回の洗浄の後、結合した抗ｍＳＩＧＮＲ１を、ビオチン化抗ＨＡ（ロシュ）とそれに続くＰＥ複合ストレプトアビジン（ベクトンディッキンソン）によって検出し、ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒ（ベクトンディッキンソン、カリフォルニア州マウンテンビュー）を用いて細胞を解析する。あるいは、肝類洞内皮細胞等の、ｍＳＩＧＮＲ１を発現することが知られている初代細胞で内在化を決定する。ＬＳＥＣでのｍＳＩＧＮＲ１の発現もまた、上述のようにＦＡＣＳによって確認することができるが、１反応あたり１×１０５個の細胞のみを加える。
【００９３】
内在化の測定
一旦ｍＳＩＧＮＲ１発現細胞系または初代細胞型を同定すると、ＦＡＣＳ解析によって抗体の一団の内在化を評価する。内在化がｍＳＩＧＮＲ１結合に基づくことを示すために、ＪＡＷＳ１マウス樹状細胞等の、ｍＳＩＧＮＲ１を発現しない細胞系を含める。インタクトおよび透過化細胞でのビオチン化抗ＨＡ抗体とそれに続くＰＥ複合ストレプトアビジンを用いた抗ｍＳＩＧＮＲ１検出を、抗ＤＥＣ−２０５抗体について記載されているように比較する（Ｍａｈｎｋｅら、２０００年）。細胞系について１．５×１０６個の細胞、または初代細胞について３×１０５個の細胞を、１％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を含むＰＢＳ中の３μｇのｍＳＩＧＮＲ１とともに２０分間４℃でインキュベートし、内在化なしに抗体を表面に結合させる。４℃で１％ＢＳＡを含むＰＢＳでの２回の洗浄によって、結合していない抗体を除去する。各試料を３つに分割する。３分の１を４％パラホルムアルデヒドで固定し、表面抗体を上述のように検出する。他方の３分の２をさらに３７℃で３０分間インキュベートし、固定する前に内在化を可能にする。２分の１を抗ＨＡおよびストレプトアビジンで直接検出し、残りの半分を、細胞を０．１％（体積／重量）サポニン（シグマ−アルドリッチ）を含むＰＢＳとともにインキュベートすることによって透過化する。内在化した抗体の量を、固定した細胞中の平均蛍光を固定および透過化した細胞で記録したものから引くことによって計算する。３０分以内に最も高いパーセンテージの内在化のあった抗体を、ペプチドを抗体に連結させるさらなる研究のために選択する。既存の、関連のないウサギｓｃＦｖを陰性対照として使用し、ｍＳＩＧＮＲ１に結合することが最近示された市販のＥＲ−ＴＲ９抗体（１Ｇｅｉｊｔｅｎｂｅｅｋら、２００２年）を陽性対照として使用する。また、ＥＲ−ＴＲ９のＦａｂ断片を、パパイン消化によって生成し、内在化について試験して、二量体化が内在化の要件でないことを実証する。所望される場合、ｓｃＦｖをＦａｂ’２またはＩｇＧに転換してもよい。
【００９４】
代替的な実施形態において、ｍＳＩＧＮＲ１ライブラリーを、Ｊａｍｅｓ Ｄ． Ｍａｒｋｓのグループによって記載されているように、内在化抗体についてパニングする（Ｐｏｕｌら、２０００年）。この実施形態に適したプロセスについて、以下で概略を述べる。
【００９５】
ｍＳＩＧＮＲ１ファージライブラリーからの内在化抗体の選択
上述のように、ｍＳＩＧＮＲ１を発現すると同定された５×１０６個の細胞を、表面上で遺伝子３タンパク質に融合した抗体断片を提示するｍＳＩＧＮＲ１ライブラリーからのファージの１×１０１２個のコロニー形成単位とともに、１．５時間、４℃でインキュベートして、内在化なしにファージの結合を可能にする。ファージ結合の後、リン酸緩衝生理食塩水で細胞を５回洗浄して、非特異的に、または弱く結合しているファージを除去する。次いで、細胞を３７℃で１５分間インキュベートして、表面結合ファージのエンドサイトーシスを可能にするが、細胞内でのファージ分解は避ける。細胞表面に結合したファージを除去するために、低ｐＨグリシンバッファーで３回洗浄することによって、細胞を取り除く。次いで細胞をトリプシン化し、ＰＢＳで洗浄した後、高ｐＨトリエチルアミンで溶解させる。ファージを含む細胞溶解物を用いて大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）を感染させ、次の回の選択のためのファージを調製する。合計３回の選択を行う。細胞表面に結合したファージの力価（最初の低ｐＨグリシン洗浄において見られる）および細胞内から回収されたファージの数を、各回についてモニタリングする。エンドサイトーシスされたファージの数の増大は、内在化ファージ抗体の選択の成功を示す。
【００９６】
内在化ｓｃＦｖ抗体断片のいずれかがｍＳＩＧＮＲ１に結合したかどうかを判定するために、３回目の５００個のクローンを、ロボットＱｐｉｘ（ジェネティクス）システムを用いて選択し、ＨｉＧｒｏｗシェイカー（ジーンマシーンズ）において、ＳＢ培地中、９６ウェルディッシュ中で一晩増殖させる。翌日、ディッシュの回転速度を下げ、ロボットＧｅｎｅｓｉｓフリーダム２００（テカン）システムを用いた固相ｍＳＩＧＮＲ１ ＥＬＩＳＡにおいて、上清を試験する。９６ウェルＥＬＩＳＡプレートを、１μｇのｍＳＩＧＮＲ１／ｍｌ ＰＢＳで、４℃で一晩コートする。翌日、プレートを１％ＢＳＡによってブロックし、それに続いて、０．０５％Ｔｗｅｅｎを含むＰＢＳで３回洗浄する。対照プレートを１％ＢＳＡでコートする。抗体を含む上清を、１％ＢＳＡを含むＰＢＳ中０．０５〜５μｇ／ｍｌの間の濃度で、ｍＳＩＧＮＲ１またはＢＳＡのみのウェルに加える。シェイカー上、室温で２時間の後、プレートを、０．０５％Ｔｗｅｅｎを含むＰＢＳで３回洗浄する。結合したｓｃＦｖの検出のために、抗ＨＡ抗体（１２ＣＡ５マウス腹水、ストラテジックバイオソリューションズ、デラウェア州）を、１％ＢＳＡを含むＰＢＳ中、１：１，０００希釈で加える。シェイカー上、室温で２時間の後、プレートを再び洗浄し、アルカリホスファターゼ複合抗マウスＩｇＧ（シグマ）を２時間にわたって加える。３回のさらなる洗浄の後、シグマ１０４（登録商標）基質を用いて、結合した抗体を検出する。ＥＬＳＡプレートリーダー（モレキュラーデバイス）を用い、ＯＤ４０５で、種々の時点でプレートを読み取る。
【００９７】
ＥＬＩＳＡにおいて陽性のシグナルを示すクローンは、制限酵素消化パターンによって特徴付けられる。キアゲンのミニプレップキットを用いて、ＤＮＡを単離する。２μｇのＤＮＡを、５ＵのＥｃｏＲＩＩで２時間、３７℃で消化し、次いで試料を４％ＮｕＳｉｅｖｅアガロースゲル上に流す。パターンを比較し、少量（約１００〜３００μｇ）で配列を精製する。ｓｃＦｖを細菌の細胞膜周辺腔に適切に集合させ、分泌させる。ｓｃＦｖは、上清または細胞膜周辺腔のいずれかから単離してもよい。クローンを４リットルのＳＢ中で、０．８のＯＤ６００まで増殖させ、１ｍＭイソプロピル−ｐ−Ｄ−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）で、３〜４時間３０℃で誘導して、最適な量のｓｃＦｖを生成する。細胞膜周辺腔から単鎖抗体を単離するために、細胞ペレットを、Ｃｏｍｐｌｅｔｅ Ｍｉｎｉ（ロシュ）プロテアーゼインヒビターを添加した冷ＰＢＳに再懸濁し、ソニックスＶｉｂｒａ−ｃｅｌｌ ＶＣ７５０で音波破砕する。細胞残屑をペレット化し、Ａｋｔａ ＦＰＬＣ（ファルマシア）を用いて上清をキアゲンＮｉ−ＮＴＡカラムにアプライする。抗体をイミダゾールで溶出する。この方法は、一般に、約１００〜３００μｇの精製抗体／リットルを生じる。内毒素を、一般にＬＡＬ試験（バイオウィッタカーから市販されているアッセイ）によって測定して１０Ｕ／ｍｌ未満の内毒素を含む抗体調製物を生じる、Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ ＱＩ５フィルターを通したろ過によって除去する。抗体を、内在化について上述のように再び解析し、固相ＥＬＩＳＡにおいて、組み換えｍＳＩＧＮＲ１への結合について解析する。３０分以内の内在化のパーセンテージが最も高い抗体および固相ＥＬＩＳＡにおけるよいシグナル（１μｇ／ｍｌで１時間後に＞１０Ｄ）を選択して、ペプチド−抗体コンストラクトを作製する。
【００９８】
（実施例３）
ＧＡＤペプチドを抗体に結合させる
ベクターおよびクローニング戦略
最良の、細菌によって生成されるｓｃＦｖの同定の後に、哺乳動物発現系への転換を行う。哺乳動物発現によって、ペプチドの適切な二次修飾、および内毒素を含まない生成が可能になる。図３に示されるような、適合性のある制限酵素認識部位を有するベクター（例えば、その開示が参照によって本明細書中に援用される米国特許第６３５５２４５号に記載されている）を用いる。ｐＲＬ４（上述）中の、目的の抗体由来のＤＮＡを、Ｓｆｉで切断し、ＣＭＶプロモーターおよび哺乳動物抗体リーダー配列を含むＡｐｅｘ ３Ｐベクターに挿入する。目的のペプチドをコードするヌクレオチドを挿入するために、抗体配列内に含まれない、入手可能な部位（ＭＣＳ＝ＮａｅＩ、ＦｓｅＩ、ＸｂａＩ、ＥｃｏＲＩ、ＰｓｔＩ、ＥｃｏＲＶ、ＢＳＡＢＩ、ＢｓｔＸＩ、ＮｏｔＩ、ＢｓｒＢＩ、Ｘｈｏ、ＰｂｖＩＯＩ、ＳｐｈＩ、ＮｓｉＩ、ＸｂａＩ）から、制限酵素認識部位を選択する。ペプチドをコードするオリゴヌクレオチドを、両端に適切な制限酵素認識部位を有するオペロンによって合成し、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼを用いて挿入する。得られるコンストラクトは、ｓｃＦｖと、それに続く、選択される制限酵素によって決定されるスペーサーと、それに続くペプチドおよびＨＩＳ−タグを含む（図３）。標準的な技術を用いて配列を確認した後、抗体産生のために、ＤＮＡを３９３ＥＢＮＡ細胞にトランスフェクトする。
【００９９】
ペプチドの選択
公知の糖尿病自己抗原のペプチドであるインスリン、ｈｓｐならびにＧＡＤ６５および６７のいずれも、本明細書中に記載される方法において用いることができることが理解されるべきであるが、以下の実験のために、ペプチドとしてＧＡＤを選択する。ＧＡＤ反応性Ｔ細胞は、ＮＯＤマウスにおいて検出された最初の自己反応性Ｔ細胞であり（Ｔｉｓｃｈら、１９９３年、Ｋａｕｆｍａｎら、１９９３年）、疾患過程において重要であることが示されている。さらに、ヒトおよびマウスＧＡＤは９５％相同である。脾臓ＮＯＤ Ｔ細胞によって認識されるエピトープは、広範に特徴付けされており（Ｋａｕｆｍａｎら、１９９３年、Ｔｉｓｃｈら、１９９９年、Ｚｅｃｈｅｌら、１９９８年）、多くの免疫優性ペプチドがＮＯＤマウスおよびＴ１ＤＭ患者において類似しており、インビトロＴ細胞アッセイにおいて交換可能に使用されている（Ｋａｕｆｍａｎら、１９９３年）。ＮＯＤマウスにおける初期免疫応答を、ＧＡＤ６５のカルボキシ末端領域中の定義された領域（ペプチド５０９〜５２８、ペプチド５２４〜５４３）に対して導く（Ｋａｕｆｍａｎら、１９９３年）。後に、Ｔ細胞応答を、２００〜３００の間の他の領域ならびに他の自己抗原に対しても導く。早期のＣＤ４ ＧＡＤ６５ Ｔ細胞エピトープ、ペプチド５２４〜５４３（ＳＲＬＳＫＶＡＰＶＩＫＡＲＭＭＥＹＧＧＴ（配列番号１３）、マウスおよびヒトにおいて同じ配列）ならびに後期に生じるマウスＧＡＤ６５エピトープ、ペプチド２４７〜２６６（ＮＭＹＡＭＬＩＡＲＹＫＭＦＰＥＶＫＥＫＧ（配列番号１４）、下線を引いたヒトとマウスとの間で１アミノ酸の差）、およびペプチド２９０〜３０９（ＡＬＧＩＧＴＤＳＶＩＬＩＫＣＤＥＲＧＫ（配列番号１５）、マウスおよびヒトにおいて同じ配列）の２つを、本実験におけるペプチドとしての使用のために選択する。３つすべてのエピトープは、ＮＯＤ脾細胞において、自発的増殖応答を誘導することができる。さらに、ペプチド２４７〜２６６および２９０〜３０９でのペプチド免疫は、ＮＯＤマウスにおいて糖尿病発症を遅らせることが示されている（Ｍａら、１９９７年、Ｔｉｓｃｈら、１９９９年、Ｚｅｃｈｅｌら、１９９８年）。ＣＤ４ Ｔ細胞エピトープに加えて、ＣＤ８ Ｔ細胞エピトープに対する寛容性もまた、重要であると報告されている（Ｑｕｉｎｎら、２００１年、Ｂｅｒｃｏｖｉｃｉら、２０００年）。陰性対照として、鶏卵リゾチームペプチド１１６〜１ ２４（ＫＧＴＤＶＱＡＷＩ（配列番号１６）で、抗体コンストラクト作製する。次いで、これらのインビトロ研究からの最も効果的なペプチドを種々の組合せで抗体コンストラクトと連結し、ＮＯＤ糖尿病モデルにおいて試験する。
【０１００】
（実施例４）
抗体−ペプチドコンストラクト生成および精製
Ｔ細胞実験のために、およそ３００μｇの各抗体コンストラクトを、ＥＢＮＡ２９３ヒト胎児腎臓細胞において生成する。細胞を、１０％ＦＣＳ、２ｍＭグルタミンおよび２５０Ｕ／ｍｌ Ｇ４１８（シグマ）を含むＤＭＥＭ中で増殖させる。製造業者の使用説明書に従って、キアゲンのＥｆｆｅｃｔｉｎ試薬を用いて、ＴＩ７５フラスコ中の細胞をＤＮＡでトランスフェクトする。３日後、培地を、血清を含まない培地に交換する。４日目および８日目に上清を回収し、細胞残屑を遠心分離によって除去し、Ａｋｔａ−ＦＰＬＣを用いて、澄ませた上清をＮｉカラムにロードする。抗体をイミダゾールで溶出させ、ＰＢＳ中に透析し、１μｇをＳＤＳゲル上に流すことによって正しいサイズを実証する。
【０１０１】
（実施例５）
ペプチド提示を生じるＬＳＥＣによる抗体−ペプチドコンストラクトの内在化、およびＴ細胞に対するこの提示の効果
ペプチド−抗体コンストラクトで、肝類洞細胞をインビトロで標的とし、これらの細胞が、若いＮＯＤまたはＢａｌｂ ｌｃマウス由来のＴ細胞において表現型変化を誘導することができるかどうかを決定する。
【０１０２】
マウス類洞内皮細胞の単離
３週齢のＮＯＤまたは４〜６週齢のＢａｌｂ／ｃマウスから、肝類洞内皮細胞を単離する。Ｋｒｅｔｚ−Ｒｏｍｍｅｌによって記載されているように、まずＥＧＴＡでの門脈かん流によってカルシウムをキレート化し、細胞−細胞接触を緩め、それに続いてハンクスバッファー中０．０５％コラゲナーゼＡでのかん流によって細胞間マトリックスを分解することによって、細胞を得る（Ｋｒｅｔｚ−ＲｏｍｍｅｌおよびＢｏｅｌｓｔｅｒｌｉ、１９９５年）。かん流した肝臓をマウスから取り除き、屈曲鉗子で穏やかに作業する。得られた粗細胞懸濁液を、一連の金属製ふるい（３０、５０、８０メッシュ）を通してろ過して、より大きい組織断片を除去する。メトリザマイド勾配上（１．０８９ｇ／ｃｍ３）で密度勾配遠心分離法によって実質性細胞から類洞細胞を分離し、それに続く２回の洗浄工程によって細胞残屑を除去する（３Ｋｎｏｌｌｅら、１９９９年）。この時点で、クップファー細胞および肝類洞細胞の混合物が得られる。クップファー細胞を認識するが肝類洞細胞を認識しないＦ４／８０抗体を用いてクップファー細胞を肝類洞内皮細胞と区別することができるので、ＦＡＣＳ実験のためにこれは十分である。しかしながら、Ｔ細胞およびペプチドとの共培養実験のために、細胞をＰＥ−複合Ｆ４／８０（ＢＤファーミンゲン）での標識、それに続くミルテニーの抗ＰＥマイクロビーズ、ならびに製造業者の使用説明書に従ってＭＡＣＳカラムおよび分離器を用いた標識細胞の磁気分離によって、クップファー細胞を除去する。残りの細胞集団を、１０％ウシ胎仔血清および２％グルタミンを補充したダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）中、９６ウェル組織プレートに播種する。抗ｍＳＩＧＮＲ１および抗Ｆ４／８０を用いた表面マーカーについてのＦＡＣＳ染色によって、単離の３日後に細胞集団の純度を調査する。クップファー細胞上にはｍＳＩＧＮＲ１がない（１Ｇｅｉｊｔｅｎｂｅｅｋら、２００２年）。９０％の純度は、実験を続けるのに十分であると考えられる。１実験あたり２つのマウス肝臓を用い、期待される収量は約２×１０７個の細胞である（ＫｎｏｏｋおよびＳｌｅｙｓｔｅｒ、１９７６年、マウスについて推定する）。
【０１０３】
Ｔ細胞表現型アッセイ
Ｔ細胞アッセイは、ペプチド−抗体コンストラクトが、肝類洞内皮細胞によるペプチドの提示を生じるかどうか、およびペプチド提示がＴ細胞の表現型変化を誘導することができるかどうかを示す。肝類洞内皮細胞を、平底マイクロタイタープレート中、１×１０５個の細胞／ウェルの密度で培養する。類洞細胞を３日間維持した後、３週齢および８週齢のＮＯＤマウスまたは４〜６週齢のＢａｌｂ／ｃマウスから、ＣＤ４＋Ｔ細胞を上述のように精製し、１０４または１０５個の細胞／ウェルで加える。また、０．１〜５ｐｇ／ウェルの濃度の各抗体−ペプチドコンストラクトを加える。陽性対照として、各ＧＡＤおよび対照ペプチドのみを含める。ＳｙｎＰｅｐ（ダブリン、カリフォルニア州）によってペプチドを合成する。陰性対照ウェルは、Ｔ細胞単独、または肝類洞細胞単独を含む。
【０１０４】
ＬＳＥＣによるＴ細胞へのペプチド提示の、４つの可能性のある結果がある。１）ＴＧＦ−Ｐおよび／もしくはＩＬ−１０およびＩＬ−４の産生またはＣＤ４＋ＣＤ２５＋ＣＤ６２Ｌの発現によって特徴付けられる、調節性Ｔ細胞の誘導、２）Ｔ細胞の欠失または３）完全に欠くことまたは応答。４）寛容性を誘導する代わりに、ペプチド提示が、ＩＬ−２を産生するＴｈ１細胞の刺激を生じることもまた考えられる。これらの可能性を区別するために、培養物上清（それぞれ１００ｐｌ）を２４および４８時間で回収し、後述するようにサイトカイン産生についてアッセイする。３週齢のＴ細胞応答を、８週齢のＮＯＤマウスのもの、ならびにＧＡＤに対して自発的応答を示さないＢａｌｂ／ｃマウス由来のＴ細胞と比較する。アッセイを三連で組み立て、２回繰り返す。Ｔ細胞の混合物を用いるので、上清中のサイトカイン応答は、容易に見ることができないであろう。しかしながら、細胞の混合物はインビボの状態を反映し、全脾細胞を用いてＧＡＤ特異的Ｔ細胞応答が見られる（Ｔｉｓｃｈら、１９９３年）。
【０１０５】
調節性Ｔ細胞の誘導についてのより感度の高い測定として、培養物中で３日後に、ＦＡＣＳ解析によって、ＣＤ２５、ＣＤ４およびＣＤ６２Ｌ等（ＬａｆａｉｌｌｅおよびＬａｆａｉｌｌｅ、２００２年）の典型的な表面マーカーの発現について細胞を評価する。すべての試薬は、ＢＤ−ファーミンゲンから入手可能である。また、ＦＡＣＳによってＩＬ−４産生を解析する。後述されるようなＬＳＥＣ／ペプチド露出Ｔ細胞の潜在的な免疫調節特性の機能的試験は、本システムにおける寛容性誘導についての最終的な試験である。製造業者の使用説明書に従ってロシュの細胞死ＥＬＩＳＡキットを用いて、細胞死を誘導する、ＬＳＥＣによって提示されるペプチドの可能性を、培養物上清中で評価する。
【０１０６】
脾細胞およびＣＤ４＋Ｔ細胞の単離
当業者の認識範囲内の技術を用いて、Ｂａｌｂ／ｃマウスのＮＯＤからの脾臓を無菌環境で取り除き、ＰＢＳに入れる。１８〜２１標準規格注射針を用いて細胞を分離させ、より大きい片を沈下させる。上清を除去し、２００ｇで７分間遠心分離する。脾臓１つあたり５ｍｌの０．８３％ＮＨ４Ｃｌを用いて赤血球を溶解させる。ＰＢＳ中で細胞を２回洗浄し、次いで培地中に再懸濁する。ある種の実験のためには、全脾細胞を用いる。他の実験のためには、製造業者の使用説明書に従ってミルテニー（カリフォルニア州オーバーン）のＣＤ４＋Ｔ細胞単離キットを用いてＣＤ４＋Ｔ細胞を単離する。種々の細胞集団の磁気単離は、当業者の認識範囲内である。ある方法において、単離は、ＣＤ８ａ、ＣＤＩ １ｂ、ＣＤ４５Ｒ、ＤＸ５およびＴｅｒ−１ １９に対するビオチン複合モノクローナル抗体のカクテルを用いた非ＣＤ４＋Ｔ細胞の枯渇に基づく。単離した集団の純度を、ＦＩＴＣ複合抗ＣＤ４、ＰＥ複合抗ＣＤ８、ＡＰＣ複合抗ＣＤ１１ｂおよびｃｙ−５複合ＣＤ４５Ｒ（すべてイーバイオサイエンス、カリフォルニア州サンディエゴ）の混合物の染色によって評価する。期待される純度は９０〜９５％で、７０％の収率である。マウス脾臓から少なくとも１×１０８個の細胞を得ることができ、約２５％の脾細胞がＣＤ４＋であり、１７５個の９６ウェルマイクロタイタープレートウェルに十分な、約１．７５×１０７個の細胞を得ることができる。
【０１０７】
サイトカイン産生の測定
Ｔ細胞／ＬＳＥＣ共培養物の上清中のＩＬ−１０、ＴＧＦ−Ｐ、ＩＦＮ−γ、ＩＬ−４およびＩＬ−２の存在を、記載されているように、標準的なサンドイッチＥＬＩＳＡによって測定する（Ｋｒｅｔｚ−ＲｏｍｍｅｌおよびＲｕｂｉｎ、１９９７年）。すべての抗体対は、ＢＤファーミンゲンから入手可能である。サイトカイン捕捉抗体をＰＢＳ中４℃で一晩、プレート上にコートする。ＰＢＳ／０．０５％Ｔｗｅｅｎでの３回の洗浄の後、培養物上清および標準曲線のマウス組み換えサイトカインを加え、シェイカー上、室温で２時間インキュベートする。プレートを再び洗浄し、結合しているサイトカインをアルカリホスファターゼ複合抗サイトカイン抗体で検出する。３回の洗浄の後、シグマ１０４（商標）基質を加え、ＥＬＩＳＡプレートリーダー（モレキュラーデバイス）を用いて、種々の時点で、ＯＤ４０５でプレートを読み取る。
【０１０８】
（実施例６）
ＬＳＥＣ上に提示されたＧＡＤペプチドに曝露したＴ細胞が、それに続いて、ＧＡＤを提示するプロフェッショナルＡＰＣによって自己反応性Ｔ細胞の活性化を防ぐことができるかどうかを評価する
さらなる実験において、肝類洞内皮細胞上のペプチドに３日間曝露したＴ細胞が、脾臓のプロフェッショナルＡＰＣ上に提示されるペプチドによって、自己反応性Ｔ細胞の活性化を負に調節できるかどうかを試験する。インビトロでの調節特性を有するＴ細胞の誘導の実行可能性は、多くの研究室によって示されている（Ｗａｋｋａｃｈら、２００１年、Ｂａｒｒａｔら、２００２年、ＴｈｏｒｔｏｎおよびＳｈｅｖａｃｈ、１９９８年）。免疫抑制特性は、調節性Ｔ細胞を、免疫刺激が通常観察される培養系に加えることによって、試験することができる。ＡＰＣおよびＴ細胞の両方を含む７週齢のＮＯＤマウス由来の脾細胞に、ＧＡＤペプチドを加えることによって、強力な増殖性応答によって見られるような、かかる免疫刺激系が提供される。調節性Ｔ細胞の添加は、この応答を排除する。１０５または１０６個の脾細胞を、ＬＳＥＣおよびペプチド結合抗体に曝露したＴ細胞を含むウェル１つあたり０．１、１、または１０μｍのペプチドとともに加える。対照ウェルは、脾細胞を、ペプチド単独およびＬＳＥＣ＋Ｔ細胞単独とともに含む。さらに、推定されるＴ細胞による増殖の有意な寄与を排除するために、対照ウェルはまた、照射を受けた脾細胞（６００ＲＡＤ、Ｊｏｅ ＡｇｕｉｌｅｒａによるＵＣＳＤ放射サービス施設で行う）ならびにＬＳＥＣおよびペプチド−抗体コンストラクトに以前に曝露したＴ細胞も含む。照射を受けた脾細胞は、抗原を提示することができるが、増殖しない。７２時間の培養期間の最後の１６時間の間に、１μＣｉ３Ｈ−チミジンを各ウェルに加えて、新たに合成されたＤＮＡを増殖の読み出しとして標識する。パッカードのＵｎｉｖｅｒｓａｌ Ｃｅｌｌ Ｈａｒｖｅｓｔｅｒを用いて細胞を採取し、Ｔｏｐｃｏｕｎｔ（パッカード）を用いて、取り込まれた３Ｈ−チミジンを評価する。脾細胞、および以前にＬＳＥＣ＋ペプチドに曝露したＴ細胞を含む培養物中の３Ｈ−チミジンの取り込みが、脾細胞培養物と比較して低下する場合、Ｔ細胞は、調節特性でうまく誘導されている。ペプチド複合抗ｍＳＩＧＮＲ１抗体がＮＯＤマウスにおいて、調節性Ｔ細胞を誘導できるかどうか、および疾患を停止できるかどうかもまた、試験する。
【０１０９】
（実施例７）
組み換えファージ技術を用いて、マウス抗ヒトＬ−ＳＩＧＮ抗体を同定した。組み換えヒトＬ−ＳＩＧＮで免疫したマウスの重鎖および軽鎖の組合せ由来のマウスライブラリー（ＩｇＧ１ｋおよびＩｇＧ２ａｋ）を、内容が参照によって本明細書中に援用される、国際公開第０３／０２５２０２号に開示される方法によって調製した。一旦調製すると、ライブラリーをまずヒトＤＣ−ＳＩＧＮに関してパニングして、ＤＣ−ＳＩＧＮと交差反応性のある抗体を除去した。結合していない上清を、Ｌ−ＳＩＧＮと独特に反応性のあるクローンを選択するために使用した。２つのライブラリー（ＩｇＧ１およびＩｇＧ２ａ）のそれぞれについて合計９５個のコロニー（３６／回）を誘導し、抗体産生、およびＬ−ＳＩＧＮとのそれらの反応性を、捕捉ＥＬＩＳＡによって決定した。簡潔に述べると、抗ヒトＦｃ（カルタグ）を、５００ｎｇ／ｍｌで一晩ＥＬＩＳＡプレート上にコートした。１％ＢＳＡを含むＰＢＳでプレートをブロックし、それに続いて組み換えＬ−ＳＩＧＮを２μｇ／ｍｌで加えた。プレートをＰＢＳで洗浄した後、上清を加えた。室温で１２時間のインキュベーションの後、プレートを３回洗浄し、アルカリ−ホスファターゼ複合抗Ｆａｂ抗体を２時間加えた。ＳｉｇｍａＳ基質を加えた後のシグナルを、ＥＬＩＳＡリーダー（モレキュラーデバイス）を用いて評価した。
【０１１０】
クローンの大部分は、ファージ上の抗体の良好な結合（ＯＤ４０５＞１．０）を示した。ＩｇＧ１およびＩｇＧ２ａライブラリーの両方由来のいくつかのクローンは、ヒトＬ−ＳＩＧＮとの陽性の反応性を示した。結果を図４および５に示す。図４は、ヒトＬ−ＳＩＧＮとのＩｇＧ１クローンを示す。図５は、ヒトＬ−ＳＩＧＮとのＩｇＧ２ａクローンの反応性を示す。
【０１１１】
（実施例８）
ヒトＬ−ＳＩＧＮと独特に反応性のあるクローンを同定するために、バックグラウンドよりもＯＤ値が５倍大きい実施例７のすべてのクローンを選択して、ＥＬＩＳＡによって、ヒトＤＣ−ＳＩＧＮとのそれらの反応性を試験した。抗ヒトＦｃ（カルタグ）を、５００ｎｇ／ｍｌで一晩ＥＬＩＳＡプレート上にコートした。１％ＢＳＡを含むＰＢＳでプレートをブロックし、それに続いて組み換えＤＣ−ＳＩＧＮを２μｇ／ｍｌで加えた。プレートをＰＢＳで洗浄した後、上清を加えた。室温で１２時間のインキュベーションの後、プレートを３回洗浄し、アルカリ−ホスファターゼ複合抗Ｆａｂ抗体を２時間加えた。ＳｉｇｍａＳ基質を加えた後のシグナルを、ＥＬＩＳＡリーダー（モレキュラーデバイス）を用いて評価した。
【０１１２】
ＩｇＧ１ライブラリー由来の１０個のクローンおよびＩｇＧ２ａライブラリー由来の３つのクローンが、ヒトＬ−ＳＩＧＮと独特に反応性があることがわかった（ＤＣ−ＳＩＧＮに対して５〜１０倍高いＯＤ値）。結果を図６および７に示す。図６は、Ｌ−ＳＩＧＮおよびＤＣ−ＳＩＧＮとの、ＩｇＧ１陽性クローンの反応性を示す。図７は、Ｌ−ＳＩＧＮおよびＤＣ−ＳＩＧＮとの、ＩｇＧ２ａクローンの反応性を示す。
【０１１３】
（実施例９）
ヒトＬ−ＳＩＧＮとのみ反応性があると同定された１３個のクローン、ならびに実施例８で上記のように同定された、Ｌ−ＳＩＧＮおよびＤＣ−ＳＩＧＮの両方と強力な反応性のある９つのクローンを配列決定して、独特のクローンの数を決定した。配列決定は、当業者に公知の技術によって決定した。これらのクローンの配列を図８および９に示す。重鎖クローンの配列を図８Ａ〜８Ｃに示す（配列番号１７〜３６）。軽鎖クローンの配列を図９Ａ〜９Ｂに示す（配列番号３７〜５５）。
【０１１４】
配列決定の結果から、軽鎖と比較して、より多様なグループの重鎖が示された。抗体クローンの多様性はまた、異なる軽鎖と同じ重鎖との交差対形成によって増強された。Ｌ−ＳＩＧＮと反応性のある合計５個の独特のクローンを同定し、それらのアミノ酸配列の類似性に基づいてクローンを分類した（下記の表１参照）。
【０１１５】
（表１）
アミノ酸配列類似性に基づく、ヒトＬ−ＳＩＧＮと反応性のある抗体クローンの分類
【０１１６】
【表１】
ａＬ−ＳＩＧＮとのみ反応性のある抗体クローン
ｂＬ−ＳＩＧＮおよびＤＣ−ＳＩＧＮの両方と反応性のある抗体クローン
ｃ２．１〜２．３は、類似した軽鎖だが独特の重鎖を示す
Ｌ−ＳＩＧＮおよびＤＣ−ＳＩＧＮでの配列決定のために選択したクローンの反応性（ＯＤ値）を、下記で表２に示す。
【０１１７】
（表２）
【０１１８】
【表２】
＊＝Ｌ−ＳＩＧＮおよびＤＣ−ＳＩＧＮでの配列決定のために選択したクローン
図８に示すように、ヒトＤＣ−ＳＩＧＮＲに結合する抗体の重鎖ＣＤＲ３領域は、以下のアミノ酸配列
【０１１９】
【化１】
の１つを有することがわかった。図９に示されるように、抗体のＤＣ−ＳＩＧＮＲに結合する抗体の軽鎖ＣＤＲ３領域は、以下のアミノ酸配列
【０１２０】
【化２】
の１つを有することがわかった。
【０１２１】
（実施例１０）
実施例７で上述された手順を利用して、上述の実施例７のさらなるクローンを、それらがＬ−ＳＩＧＮに結合する能力について調べた。当業者に公知の技術によって、配列決定を決定した。これらのさらなるクローンの配列を、図１０に示す（配列番号６３〜８２）。図１０に示されるように、ヒトＤＣ−ＳＩＧＮＲに結合する抗体の、５つのさらなる重鎖ＣＤＲ３領域は、以下のアミノ酸配列
【０１２２】
【化３】
の１つを有することがわかった。ヒトＤＣ−ＳＩＧＮＲに結合するこれらのクローンのＣＤＲ２領域は、以下のアミノ酸配列
【０１２３】
【化４】
の１つを有することがわかった。
【０１２４】
表３は、Ｌ−ＳＩＧＮを発現する細胞との反応性に基づいて選択した、さらなるＩｇＧ１ｋ抗体クローンを示す。
【０１２５】
（表３）
【０１２６】
【表３】
以下の表４は、さらなるＩｇＧ１ｋ抗体クローンの、ＬＳＩＧＮを発現する細胞（幾何平均蛍光）ならびに組み換えＬ−ＳＩＧＮおよびＤＣ−ＳＩＧＮタンパク質（ＯＤ値）との反応性を示す。
【０１２７】
（表４）
【０１２８】
【表４】
図１１に示されるように、ヒトＤＣ−ＳＩＧＮＲに結合するさらなるクローンを同定した（配列番号９６〜１１５）。これらのクローンは、以下のアミノ酸配列
【０１２９】
【化５】
の１つを有するＩｇＧ１ｋ軽鎖ＣＤＲ３領域を有することがわかった。ヒトＤＣ−ＳＩＧＮＲに結合するこれらのクローンのＣＤＲ２領域は、以下のアミノ酸配列
【０１３０】
【化６】
の１つを有することがわかった。
【０１３１】
表５は、Ｌ−ＳＩＧＮを発現する細胞との反応性に基づいて選択した、さらなるＩｇＧ２ａｋ抗体クローンを示す。
【０１３２】
（表５）
【０１３３】
【表５】
＊これらの配列は停止コドンを含む
表６は、さらなるＩｇＧ２ａｋ抗体クローンの、ＬＳＩＧＮ（幾何平均蛍光）ならびに組み換えＬ−ＳＩＧＮおよびＤＣ−ＳＩＧＮタンパク質（ＯＤ値）を発現する細胞との反応性を示す。
【０１３４】
（表６）
【０１３５】
【表６】
図１２に示されるように、ヒトＤＣ−ＳＩＧＮＲに結合するさらなる重鎖クローンを同定した（配列番号１３３〜１５４）。これらのクローンは、以下のアミノ酸配列
【０１３６】
【化７】
の１つを有するＩｇＧ２ａｋ重鎖ＣＤＲ３領域を有することがわかった。ヒトＤＣ−ＳＩＧＮＲに結合したこれらのクローンのＣＤＲ２領域は、以下のアミノ酸配列
【０１３７】
【化８】
の１つを有することがわかった。
【０１３８】
図１３に示されるように、ヒトＤＣ−ＳＩＧＮＲに結合するさらなる軽鎖クローンを同定した（配列番号１６９〜１８９）。これらのクローンは、以下のアミノ酸配列
【０１３９】
【化９】
の１つを有するＩｇＧ２ａｋ軽鎖ＣＤＲ３領域を有することがわかった。ヒトＤＣ−ＳＩＧＮＲに結合したこれらのクローンのＣＤＲ２領域は、以下のアミノ酸配列
【０１４０】
【化１０】
の１つを有することがわかった。
【０１４１】
（実施例１１）
候補可溶性Ｌ−ＳＩＧＮ抗体の、ＤＣ−ＳＩＧＮ受容体でなくＬ−ＳＩＧＮ受容体との、選択的反応性
ファージ−Ｆａｂスクリーニング、ＤＮＡ配列決定（図１０および１１）に基づいて、Ｌ−ＳＩＧＮ受容体を発現する細胞との最もよい反応性を有する６つの抗体（クローン名、Ｃ７、Ｄ１２、Ｅ４、Ｅ１０、Ｇ３、Ｇ１０）（表４）をサブクローニングして、コートＩＩＩタンパク質を除去した。これら６つの候補抗体のそれぞれを発現させ、可溶性Ｆａｂ部分として精製し、それらが細胞上のＬ−ＳＩＧＮ受容体を認識するがＤＣ−ＳＩＧＮを認識しない能力について、再び試験した。図１４に示されるように、６つすべての抗体は、Ｌ−ＳＩＧＮ受容体との、非常に良好な結合を示したが、３つの抗体（Ｄ１２、Ｇ３およびＥ１０）は、ＤＣ−ＳＩＧＮとも、実質的により低いレベルではあるが反応した。すべての抗体（２０ｕｇ／ｍｌ）を、ＦＡＣＳバッファー（１％ＢＳＡ、０．１％アジ化合物を含むＤＰＢＳ）中で、０．５×１０６個の細胞（Ｋ５６２、Ｋ５６２／ＤＣ−ＳＩＧＮ、Ｋ５６２／Ｌ−ＳＩＧＮ）とともに、４℃で１時間インキュベートし、ＦＡＣＳバッファーで洗浄し、ＦＡＣＳバッファー中１：５０希釈のフィコエリトリン（ＰＥ）複合ヤギ抗マウス抗体（ジャクソンイムノリサーチ、ペンシルバニア州ウエストグローブ）とともに、４℃で３０分間インキュベートし、洗浄し、１％ホルムアルデヒド中に再懸濁し、ＢＤ ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒ（ベクトンディッキンソン、カリフォルニア州マウンテンビュー）で解析した。
【０１４２】
（実施例１２）
Ｌ−ＳＩＧＮ抗体の相対的親和性およびエピトープ特性
６つの候補抗体を、Ｌ−ＳＩＧＮタンパク質に対するそれらの親和性、および認識されるエピトープの性質に関して、さらに特徴付けた。図１５に示されるように、すべての抗体はＬ−ＳＩＧＮ受容体とナノモル単位の親和性で反応するが、Ｅ１０クローンは、ピコモル単位の範囲でも結合を示した。ＥＬＩＳＡにおいて、種々の抗体のエピトープ特異性を、Ｌ−ＳＩＧＮＦｃ融合タンパク質と結合するＬ−ＳＩＧＮ特異的モノクローナル抗体（ｍａｂ１６２）と競合させることによって、特徴付けた。図１６に示されるように、４つの抗体クローン、Ｃ７、Ｄ１２、Ｇ１０およびＥ４は濃度依存的にｍａｂ１６２と競合したが、クローンＧ３およびＥ１０は競合しなかった。これらのデータは、競合研究でのわずかな違いによって示されるように、クローンＣ７、Ｄ１２、Ｇ１０およびＥ４が、同じエピトープを共有するか、または重複するエピトープに結合するかのいずれかであることを含意する。６つの抗体によって結合されるエピトープの性質（立体的対線状、単量体対多量体）を特徴付けるために、変性および還元性条件下で調製したＫ５６２／Ｌ−ＳＩＧＮ細胞の細胞溶解物全体を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分離し、それぞれの抗体で膜をプローブした。２つの抗体（クローンＤ１２およびＥ１０）は単量体に対応するタンパク質バンドを認識したが、クローンＧ３は三量体形態の受容体に対応するタンパク質バンドを認識した。これらのデータはまた、クローンＤ１２、Ｅ１０およびＧ３によって認識されるエピトープは線状であるが、抗体クローンＣ７、Ｅ４およびＧ１０によって認識されるエピトープは立体的であることを示す。Ｌ−ＳＩＧＮ ｆａｂによって認識されるエピトープの性質を、ウェスタンブロッティング研究によって描写した。簡潔に述べると、百万個のＫ５６２／Ｌ−ＳＩＧＮ細胞を、５０ｕｌの溶解バッファー（１５０ｍＭ ＮａＣｌ、２５ｍＭ Ｔｒｉｓ、ｐＨ７．４、２ｍＭ ＥＤＴＡ、１ｍＭオルトバナジウム酸ナトリウム、１０ｍＭフッ化ナトリウム、１％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００、０．５ｍＭ ＰＭＳＦ、１０μｇ／ｍｌアプロチニンおよび１０μｇ／ｍｌロイペプチン）で溶解した。４℃で２０分間の穏やかな回転によって、溶解を達成した。細胞溶解物を遠心分離（１４，０００×ｇ、１０分間）して、細胞残屑を除去し、１ｍＭ ＤＴＴを含むＳＤＳ試料バッファー中で５分間煮沸した。タンパク質溶解物を４〜１５％ＳＤＳ−ＰＡＧＥ勾配ゲル（バイオ−ラッド番号１１６−１１５８）上で分離し、ニトロセルロース膜に移し、次いで、それぞれＬ−ＳＩＧＮ特異的ｆａｂ（１μｇ／ｍｌ）でプローブした。タンパク質転移を、予め染色した分子量標準（バイオ−ラッド番号１６１−０３２４）でモニタリングした。ＨＲＰ複合ヤギ抗マウスＩｇＧ（バイオ−ラッド番号１７０−６５１６）を用いて、増強された化学発光（ＳｕｐｅｒシグナルＷｅｓｔ Ｐｉｃｏキット、ピアス、イリノイ州ロックフォード）によって、免疫反応性バンドを検出した。
【０１４３】
（実施例１３）
Ｌ−ＳＩＧＮ抗体は、ヒト肝臓非実質性細胞上の受容体に結合すると、内在化を経る
抗原を、免疫寛容を引き起こすことが知られているＬ−ＳＩＧＮ発現類洞内皮細胞（ＬＳＥＣ）中に送達するために、フローサイトメトリーおよび共焦点顕微鏡法によって、抗体の内在化能力を評価した。新しく単離したヒト肝臓非実質性細胞を、６つの候補抗体とともにインキュベートした。図１７に示されるように、３つの抗体（Ｃ７、Ｅ１０およびＧ１０）は、２時間のうちに、４０パーセントを超える内在化を示した。この内在化のレベルは、統計的に有意であることがわかった（ｐ＜０．０５）。さらに、抗体内在化はまた、共焦点顕微鏡法研究によって直接確認もした。６つすべての抗体は、９０分間のインキュベーションの後、Ｋ５６２／Ｌ−ＳＩＧＮ細胞内部に見られたが、本研究で対照として使用したＫ５６２／ＤＣ−ＳＩＧＮ細胞では、取り込みは観察されなかった。これらの研究から、Ｌ−ＳＩＧＮ抗体のすべては内在化することができるが、３つの抗体（クローンＣ７、Ｅ１０およびＧ１０）が最も効率的に内在化することが示される。
【０１４４】
抗体内在化アッセイ−Ｔａｋａｈａｒａ Ｋら（Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、２００４年）によって記載されているように、アッセイを行った。簡潔に述べると、０．５×１０６個の細胞（新鮮なヒトＬＳＥＣまたはＫ５６２／Ｌ−ＳＩＧＮ）を、２０μｇ／ｍｌのＬ−ＳＩＧＮ ｆａｂとともに、ＤＰＢＳ／１％ＢＳＡ中４℃で３０分間インキュベートし、結合していない抗体を洗い落とし、次いで、３７℃でさらに２時間インキュベートして、内在化を可能にした。ＤＰＢＳ／１％ＢＳＡ／０．１％アジ化合物中、４℃で維持した２組の試料を対照とした。インキュベーション期間の終わりに、細胞を、フィコエリトリン（ＰＥ）複合ヤギ抗マウス抗体とともに、ＤＰＢＳ／１％ＢＳＡ／０．１％アジ化合物中、４℃で３０分間インキュベートし、洗浄し、１％ホルムアルデヒド中で固定し、ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒ（ベクトンディッキンソン）で解析した。
【０１４５】
共焦点顕微鏡法 １０５個のＫ５６２被形質導入体を、１０μｇ／ｍｌの種々の抗体とともに、１０％ウシ胎仔血清を補充したＲＰＭＩ １６４０（ギブコ，ライフテクノロジー、オランダ、ブレダ）中、３７℃で９０分間インキュベートした。次いで、細胞をＰＢＳで洗浄し、ＰＢＳ／４％パラホルムアルデヒド中で固定し、再び洗浄し、ポリ−Ｌ−リシンでコートしたカバーガラスに接着させた（室温で２０分間）。細胞をブロッキングバッファー、ＰＢＳ／３％ＢＳＡ（シグマケミカルカンパニー、ミズーリ州セントルイス）／１０ｍＭグリシン（メルク、ドイツ、ダルムシュタット）／０．１％サポニン（リーデルデハーン、ドイツ、ゼールズ）とともに、室温で１時間インキュベートした。続いて、細胞を、１０μｇ／ｍｌのウサギ抗ヒトＣＤ５５（サンタクルスバイオテクノロジー、カリフォルニア州サンタクルス）とともに室温で１時間インキュベートし、ブロッキングバッファーで洗浄し、１０μｇ／ｍｌのヤギ抗マウスＩｇＧ Ａｌｅｘａ ６４７（モレキュラープローブ、オランダ、ライデン）および１０μｇ／ｍｌのヤギ抗ウサギＩｇＧ Ａｌｅｘａ ４８８（モレキュラープローブ）とともに、ブロッキングバッファー中、室温で１時間インキュベートした。次いで、細胞をブロッキングバッファー、ＰＢＳ、および最終的には５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌで洗浄した。最後に、Ｍｏｗｉｏｌ（カルビオケム，オムニラボインターナショナル、オランダ、ブレダ）でカバーガラスをスライドガラス上にマウントした。
【０１４６】
（実施例１４）
Ｌ−ＳＩＧＮ抗体は、受容体へのリガンドの結合をブロックする
いくつかのウイルス、例えばエボラ、ＳＡＲＳ、ＨＩＶおよびＨＣＶは、Ｌ−ＳＩＧＮ受容体を利用して細胞への侵入を増大させることが示されている。ウイルスの表面上のエンベロープ糖タンパク質および宿主Ｔ細胞の表面上のＩＣＡＭ−３の両方とも、Ｌ−ＳＩＧＮのレクチン結合ドメインと相互作用することが知られている。本抗体がＬ−ＳＩＧＮ受容体およびリガンド相互作用をブロックすることができるかどうかを決定するために、リガンドコート蛍光ビーズ−ブロッキングアッセイを行った。図１８に示されるように、最も効率的に内在化した３つの抗体（Ｃ７、Ｇ１０およびＥ１０）はまた、アッセイにおいて対照として使用した、ＩＣＡＭ−１でコートしたビーズの結合に影響を及ぼすことなく、Ｌ−ＳＩＧＮ受容体へのＩＣＡＭ−３の結合を、最もよく（４０％より高い阻害が観察された）ブロックした。（図１８参照。）
リガンドブロッキングについての蛍光ビーズ接着アッセイ。ＩＣＡＭ−１ビーズについてこれまでに記載されているように（５Ｇｅｉｊｔｅｎｂｅｅｋら、１９９９年）、カルボン酸修飾ＴｒａｎｓＦｌｕｏｒＳｐｈｅｒｅ（４８８／６４５ｎｍ、１．０μｍ、モレキュラープローブ）を、ＩＣＡＭ−３ Ｆｃタンパク質（Ｒ＆Ｄシステムズ、ミネソタ州ミネアポリス）でコートした。簡潔に述べると、ストレプトアビジンでコートしたビーズを、ビオチン化ヤギ抗ヒト抗Ｆｃ Ｆａｂ２断片とともに、ＰＢＳ、０．５％ＢＳＡ中、３７℃で２時間インキュベートした。ビーズを洗浄し、ヒトＩｇＧ１ Ｆｃ融合ＩＣＡＭ−３ Ｆｃ（２５０ｎｇ／ｍＬ）とともに、４℃で一晩インキュベートした。ＩＣＡＭ−３ビーズへの接着のために、Ｋ５６２／Ｌ−ＳＩＧＮ細胞を、Ｔｒｉｓ−ナトリウム−ＢＳＡ（２０ｍｍｏｌ／Ｌ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８．０、１５０ｍｍｏｌ／Ｌ ＮａＣｌ、１ｍｍｏｌ／Ｌ ＣａＣｌ２、２ｍｍｏｌ／Ｌ ＭｇＣｌ２、０．５％ＢＳＡ（重量／体積）、５Å約１０６個の細胞／ｍＬ）に再懸濁した。５万個の細胞を、Ｌ−ＳＩＧＮ ｆａｂ（２０μｇ／ｍＬ）ありまたはなしで、室温で１０分間、９６ウェルＶ型底プレート中で、プレインキュベートした。リガンドでコートしたビーズ（２０個のビーズ／細胞）を加え、懸濁液を３７℃で３０分間インキュベートした。洗浄後、細胞をＴｒｉｓ−ナトリウム−ＢＳＡバッファーに再懸濁した。Ｋ５６２／ＬＳＩＧＮ細胞のＩＣＡＭ−３媒介性接着を、ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒ（ベクトンディッキンソン）を用いたフローサイトメトリーによって測定した。抗体なしでＩＣＡＭ−３に結合している細胞のパーセンテージを１００に設定し、Ｌ−ＳＩＧＮ抗体存在下での結合の減少を、リガンドブロッキングとして表した。
【０１４７】
（実施例１５）
Ｌ−ＳＩＧＮ特異的抗体によって媒介される生物学的活性の概要
前述の研究に基づいて（下記の表７参照）、少なくとも３つの抗体クローン、Ｃ７、Ｇ１０およびＥ１０は、自己免疫および感染性疾患における治療用途のための、優れた候補である。
【０１４８】
（表７）
Ｌ−ＳＩＧＮ Ｆａｂによって媒介される生物学的活性
【０１４９】
【表７】
ａ（％）パーセント内在化は、（４℃での平均蛍光強度−３７℃での平均蛍光強度）／（４℃での平均蛍光強度）×１００として決定した。
ｂ（％）パーセントブロッキングは、（Ｆａｂありでリガンドに結合している細胞の数−Ｆａｂなしでリガンドに結合している細胞の数）／（Ｆａｂなしでリガンドに結合している細胞の数）×１００として決定した。
【０１５０】
（実施例１６）
受容体へのリガンド結合をブロックすることによってウイルス結合をブロックすることのできる抗体を選択すること
いくつかのウイルス、例えば、エボラ、ＳＡＲＳ、ＨＩＶおよびＨＣＶは、細胞への侵入を増大させるために、ＤＣ−ＳＩＧＮおよびＬ−ＳＩＧＮ受容体を利用することが示されている。Ｔ細胞上のＩＣＡＭ−３およびウイルス上のエンベロープ糖タンパク質の両方とも、重複しているが別個の様式で、ＳＩＧＮ受容体の炭水化物認識ドメイン（ＣＲＤ）と相互作用することがわかった。リガンド結合をブロックすることができるＣＲＤ反応性Ｆａｂが単離されたかどうかを判定するために、５Ｇｅｉｊｔｅｎｂｅｅｋら（１９９９年）によって記載されているのと本質的に同じように、リガンドコート蛍光ビーズ−ブロッキングアッセイを行った。簡潔に述べると、５万個のＫ５６２／Ｌ−ＳＩＧＮトランスフェクト細胞を、Ｌ−ＳＩＧＮ Ｆａｂ（２０μｇ／ｍＬ）ありまたはなしで、室温で１０分間、９６ウェルＶ型底プレート中でプレインキュベートする。ウイルスエンベロープタンパク質、例えばＨＣＶ Ｅ１／Ｅ２またはＨＩＶｇｐ１２０でコートした蛍光ビーズ（２０個のビーズ／細胞）を加え、懸濁液を３７℃でさらに３０分間インキュベートする。洗浄後、細胞をＴｒｉｓ−ナトリウム−ＢＳＡバッファーに再懸濁する。Ｋ５６２／Ｌ−ＳＩＧＮ細胞への、ウイルスでコートしたビーズの、抗体によるブロッキングの程度を、ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒ（ベクトンディッキンソン）を用いて測定する。抗体なしでウイルスビーズに結合している細胞のパーセンテージ（陰性対照）を１００とし、Ｌ−ＳＩＧＮ抗体存在下での結合の減少を％ブロッキングとして表す。リガンドでコートした蛍光ビーズは、細胞表面受容体へのリガンドの多量体結合を模倣するだけではなく、フローサイトメトリーによるリガンド結合の容易な定量化も可能にする。まず、Ｋ５６２／ＤＣ−ＳＩＧＮおよびＫ５６２／Ｌ−ＳＩＧＮへの、エボラおよびＨＩＶのエンベロープ糖タンパク質でコートした蛍光ビーズの接着を、抗体なしで評価した。図１９Ａに示されるように、エボラエンベロープ糖タンパク質はＤＣ−ＳＩＧＮおよびＬ−ＳＩＧＮ発現細胞の両方に同程度によく結合するが、Ｌ−ＳＩＧＮへのＨＩＶエンベロープ糖タンパク質の結合は、ＤＣ−ＳＩＧＮ発現細胞への結合よりもかなり弱かった。ＳＩＧＮ分子へのウイルスタンパク質結合におけるこれらの違いは、Ｆａｂがウイルスタンパク質の接着をブロックする能力に対して、甚大な効果を有した。６つすべてのＦａｂはＬ−ＳＩＧＮへのＨＩＶｇｐ１２０結合をブロックすることができたが（３３％〜６６％）、２つのクローン、Ｃ７およびＥ１０だけは、エボラｇｐ結合の有意なブロッキング（それぞれ７５％および６４％）を示した（図１９Ｂ参照）。３つのＤＣ−ＳＩＧＮ交差反応性クローン、Ｄ１２、Ｅ１０およびＧ３のうち、Ｅ１０だけが、ＤＣ−ＳＩＧＮへの両方のウイルスタンパク質の結合をブロックした。対照的に、Ｌ−ＳＩＧＮと独特に反応性のある他の３つのＦａｂは、ＤＣ−ＳＩＧＮへのリガンド結合に対してブロッキング効果を有さなかった（図１９Ｃ参照）。また、ウイルスタンパク質結合を最もよくブロックした３つのＦａｂ、クローンＣ７、Ｅ１０およびＧ１０はまた、Ｋ５６２／Ｌ−ＳＩＧＮ細胞へのＩＣＡＭ−３の結合を最もよく防いだ（表７参照）。
【０１５１】
ＦａｂをＩｇＧに転換することは、受容体結合およびウイルスタンパク質接着のブロッキングを向上させる
受容体結合、内在化およびＩＣＡＭ−３ブロッキング結果に基づいて、従来の方法を用いてＦａｂのマウス可変ドインをヒトＩｇＧ１の定常領域に融合させることによって、２つのＦａｂクローン、Ｅ１０およびＧ１０を、完全ＩｇＧに転換した。これらのキメラＩｇＧを、受容体への結合、およびウイルスタンパク質接着をブロックすることについて、評価した。図２０Ａに示されるように、ＦａｂからＩｇＧへの転換は、両方のクローン、Ｅ１０およびＧ１０の受容体結合を大いに向上させた。また、クローンＧ１０はＦａｂとしてＤＣ−ＳＩＧＮへのいかなる結合も示さなかったが、これは、ＩｇＧとしてＤＣ−ＳＩＧＮへのいくらかの結合を示し、これは受容体に対する増大した親和力の結果である可能性が高い。また、完全ＩｇＧは、ウイルスタンパク質結合の、それらのＦａｂ相対物と比較して増大したブロッキングを示した（図１９Ｂおよび１９Ｃ参照）。ＦａｂからＩｇＧへの転換の最も甚大な効果は、クローンＧ１０で観察され、ここで完全ＩｇＧは、Ｌ−ＳＩＧＮへのエボラエンベロープｇｐの、９０％を超えるブロッキングを生じたのに対し、Ｆａｂ相対物で観察されたブロッキングはほとんど〜まったく観察されなかった（図１９Ｃ参照）。ＦａｂからＩｇＧへの転換は、クローンＧ１０のブロッキング能力を大いに向上させたが、Ｆａｂ分子としてクローンＣ７と同様に強力な遮断薬であるクローンＥ１０に対して、より穏やかな効果を有した。
【０１５２】
最も効率的に内在化した３つのＦａｂクローン、Ｃ７、Ｅ１０およびＧ１０はまた、リガンド結合を最もよくブロックした。受容体の炭水化物認識ドメインへの抗体の結合によって、それらが、免疫応答の調節およびウイルス伝播の予防におけるそれらの使用のための優れた候補になる。クローン、Ｃ７およびＥ１０は、Ｌ−ＳＩＧＮ受容体へのＩＣＡＭ−３およびウイルスタンパク質の結合を、一貫して、および効果的にブロックした（ｐ＜０．０５）。クローンＧ１０は、ＩＣＡＭ−３およびＨＩＶｇｐ１２０の結合をブロックすることができたが、エボラエンベロープ糖タンパク質の結合はブロックすることができなかった（上記の表７に要約する）。前述に基づくと、クローンＧ１０は、何らかの機構の立体的干渉によってリガンド結合をブロックするが、クローンＣ７およびクローンＥ１０によって生じるブロッキング効果は、リガンド結合部位への直接の競合のためである。
【０１５３】
（実施例１７）
ウイルス侵入をブロックすること
上述の実施例１６における、受容体へのウイルス結合をブロックすることができる抗体を選択した後、これらの抗体がウイルス侵入をブロックする能力を試験する。Ｌ−ＳＩＧＮトランスフェクトＫ−５６２細胞を、抗体とともに３０分間プレインキュベートした後、目的のエンベロープタンパク質を発現するレポーターウイルスを加えるか、または実行可能な場合、ウイルス＋またはウイルス−ドナーからの血清を加える。３７℃で１時間のインキュベーションの後、細胞をリン酸緩衝生理食塩水で５回洗浄し、キアゲンのウイルスＲＮＡミニスピンキットを用いて、細胞からウイルスＲＮＡを抽出する。このようにして得たウイルスＲＮＡを、Ｇａｒｄｎｅｒら（２００３年）の手順に従ってＲＴ−ＰＣＲによって増幅し、サザンブロットを行う。
【０１５４】
（実施例１８）
ウイルス伝播を防ぐこと
実施例１６で同定した抗体が、受容体陽性内皮細胞からヒトＴ細胞または肝細胞のいずれかへのウイルスの転移を防ぐことができるかどうかを試験するために、Ｋ５６２／Ｌ−ＳＩＧＮ細胞または新しく単離したヒト肝類洞内皮細胞（Ｌ−ＳＩＧＮ＋）または樹状細胞（ＤＣ−ＳＩＧＮ＋）を、実施例１６の抗体とともに３０分間インキュベートした後、目的のエンベロープタンパク質、例えばＨＣＶ−Ｅ２、ＨＩＶｇｐ１２０、エボラ（Ａｌｖａｒｅｚら、２００２年）またはシンドビス（Ｋｌｉｍｓｔｒａら、２００３年）を発現するルシフェラーゼまたは緑色蛍光タンパク質レポーターウイルスを加える。培地で洗浄した後、細胞をＴ細胞（Ｃ８１６６）またはヒト肝細胞（Ｈｕｈ−７）とともに共培養する。標的細胞溶解物中のルシフェラーゼ活性の測定（相対発光単位）、または標的細胞上の適した表面マーカー二重染色（例えば、Ｔ細胞上のＣＤ３）と組み合わせたＧＦＰ陽性標的細胞のフローサイトメトリー解析のいずれかによって、レポーターウイルス伝播を評価する。
【０１５５】
（実施例１９）
ヒト結核菌からの感染のブロッキングにおける抗体の役割を評価すること
ヒト結核菌の表面に存在する、炭水化物に富んだ構造であるマンノース化リポアラビノマンナン（ＭａｎＬＡＭ）は、ＤＣ−ＳＩＧＮ（４Ｇｅｉｊｔｅｎｂｅｅｋら、２００３年）およびＬ−ＳＩＧＮ（Ｋｏｐｐｅｌら、２００４年）の両方と相互作用することが示されている。ＭａｎＬＡＭに対する高い抗体力価が、活発な結核を有する人々において観察され、受動的防御実験における細菌負荷を減少させることが示されている（Ｈａｍａｓｕｒら、２００４年）。ミコバクテリウムの結合および感染は、ＭａｎＬＡＭと高い親和性で結合することができる、Ｌ−ＳＩＧＮ抗体またはＬ−ＳＩＧＮペプチド模倣物を用いて、阻害される。細菌の株、例えばウシ結核菌およびヒト結核菌を、４Ｇｅｉｊｔｅｎｂｅｅｋら（２００３年）に詳述されているように、フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）で標識する。Ｋ５６２／Ｌ−ＳＩＧＮ細胞を、Ｌ−ＳＩＧＮペプチド模倣物（５０μｇ／ｍｌ）ありまたはなしで、ＦＩＴＣ複合細菌とともに、１〜２０の比でインキュベートする。解毒薬または模倣物によるブロッキングの程度（蛍光の減少）を、フローサイトメトリー解析によって決定する。
【０１５６】
（実施例２０）
ＨＣＶ感染肝臓を有する移植患者の治療
ウイルス伝播が予防されると、ドナーが潜在的にＨＣＶ感染を有する移植環境において、抗体を使用することができる。これを試験するために、健康なＨＬＡ適合ヒトドナー由来の初代血中リンパ球の注射とともに、軽度にＨＣＶ感染したヒトドナー肝臓をＮＯＤ／ＳＯＩＤ等の免疫欠損マウスに移植する。１〜６カ月の期間にわたって、マウスを抗体で処置する。移植の１〜６カ月後、マウスを屠殺し、肝臓におけるＨＣＶ感染の程度を評価する。また、ＰＣＲによって、Ｔ細胞をウイルス感染について調べる。
【０１５７】
（実施例２１）
Ｌ−ＳＩＧＮを発現している癌型の同定
悪性組織および対になる正常な組織を回収し、パラ−ホルムアルデヒド中で固定するか、またはＯＣＴ中で瞬間凍結する。ミクロトームを用いて切片を調製し、ＦＩＴＣ等の適した蛍光色素に直接複合化したＬ−ＳＩＧＮ抗体、または二次抗体蛍光色素複合抗マウスＩｇＧのいずれかを用いることによって、Ｌ−ＳＩＧＮの存在について切片を染色する。正常な組織の染色よりも有意に強い悪性組織についての染色結果が、Ｌ−ＳＩＧＮを発現している癌型の指標である。
【０１５８】
次いで、Ｌ−ＳＩＧＮを発現しているこれらの癌型についての市販の細胞系を得て、Ｌ−ＳＩＧＮの存在をＦＡＣＳ解析によって評価する。簡潔に述べると、百万個の細胞を、１％ＢＳＡおよび０．１％ＮａＮ３を含むＰＢＳ中の１μｇの抗Ｌ−ＳＩＧＮ抗体とともにインキュベートする。３０分間のインキュベーションの後、細胞を洗浄し、蛍光色素複合抗マウスＩｇＧとともに、さらに３０分間インキュベートした後、ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒ（ベクトンディッキンソン）で解析する。
【０１５９】
（実施例２２）
抗Ｌ−ＳＩＧＮ抗体の治療上の使用
直接の細胞死滅
上述の実施例２１のように、Ｌ−ＳＩＧＮ発現細胞腫瘍型を同定すると、抗Ｌ−ＳＩＧＮ抗体を、それらがＡＤＣＣまたはＣＤＣをインビトロで誘導する能力について試験する。ＡＤＣＣを評価するために、標的細胞（腫瘍細胞）を、まず５１Ｃｒで標識する。次いで、Ｌ−ＳＩＧＮに対する抗体を、１〜５０μｇの間の濃度で加え、ＰＢＭＣによる標的細胞溶解を、１：１０〜１：１００のエフェクター対標的比で４時間後に測定する。ＣＤＣの評価のために、腫瘍細胞を、ヒト補体およびＬ−ＳＩＧＮ抗体とともにインキュベートする。死細胞にのみ侵入でき、生細胞には侵入できない試薬であるヨウ化プロピジウムの添加の後、細胞死滅をＦＡＣＳ解析によって評価する。ＡＤＣＣまたはＣＤＣを誘導しない抗体については、何らかの放射性同位元素標識または毒性試薬が抗体に複合化したままである。
【０１６０】
むき出しの、または複合化した抗Ｌ−ＳＩＧＮ抗体のいずれかの、腫瘍増殖を停止させる能力を、異種移植片モデルにおいて評価する。簡潔に述べると、Ｌ−ＳＩＧＮを発現している腫瘍細胞に皮下、腹腔内または静脈内注射する。動物を、対照または抗Ｌ−ＳＩＧＮ抗体のいずれかで処置する。腫瘍増殖を、皮下処置についてはサイズによって、または腹腔内もしくは静脈内処置については生存時間によって、測定する。抗Ｌ−ＳＩＧＮ処置群における腫瘍増殖が、対照群と比較して３０％より多く減少すると、抗体は、癌治療術として利用することができる。
【０１６１】
免疫系での、癌細胞の負の調節性相互作用のブロッキング
実施例１４に記載されているように、Ｌ−ＳＩＧＮと免疫細胞との相互作用をブロックする抗体を、蛍光ビーズアッセイを用いて同定する。抗体を、Ｌ−ＳＩＧＮ発現癌細胞による免疫系の負の調節を防ぐことによって免疫系が癌細胞を根絶できることに関する、その治療上の有用性について評価する。
【０１６２】
Ｌ−ＳＩＧＮ発現腫瘍細胞を、ＮＯＤ／ＳＯＩＤ等の免疫欠損マウスに、皮下、腹腔内または静脈内移植する。マウスに、健康なドナー由来の２百万のＰＢＭＣも施す（または、自然に腫瘍に拒絶反応を起こすのに十分ではない任意の数のＰＢＭＣ）。抗Ｌ−ＳＩＧＮ抗体ありまたはなしでの腫瘍増殖を対照抗体と比較する。腫瘍増殖を、皮下処置についてはサイズによって、または全身性腫瘍については生存時間によって、測定する。抗Ｌ−ＳＩＧＮ処置群における腫瘍増殖が、対照群と比較して３０％より多く減少すると、抗体は、癌治療術として利用することができる。
【０１６３】
（実施例２３）
Ｌ−ＳＩＧＮ発現細胞を単離するためのＬ−ＳＩＧＮ抗体の使用
新鮮なヒト非実質性肝細胞を、商業的供給源（例えば、セルズダイレクト、アリゾナ州トゥーソン）から得る。非実質性肝細胞は、類洞内皮細胞、赤血球、クップファー細胞および他の少数の細胞集団の混合物を含む。肝類洞細胞を単離するために、塩化アンモニウムを用いて赤血球を溶解する。市販の死細胞除去キット（ミルテニーバイオテク、ドイツ）を用いて、死細胞を除去する。細胞を計数し、０．１μｇ／百万個の細胞の抗Ｌ−ＳＩＧＮ抗体で標識する。細胞を洗浄した後、それらをＭＡＣＳバッファー（ミルテニー）中に再懸濁し、製造業者の使用説明書（ミルテニー）に従って抗マウスＩｇＧ複合ビーズを用いて、目的の細胞を単離する。ＣＤ５４、マンノース受容体、ＬＹＶＥ−１、ＣＤ４０、アシアロ糖タンパク質および他のもの等の分子に対する一団の抗体を用いたＦＡＣＳ解析によって、単離の質をモニタリングする。
【０１６４】
以下の参考文献は、それらの全体がこの参照によって本明細書中に援用される。
【０１６５】
【数１】
【０１６６】
【数２】
【０１６７】
【数３】
【０１６８】
【数４】
【０１６９】
【数５】
【０１７０】
【数６】
【０１７１】
【数７】
【０１７２】
【数８】
【０１７３】
【数９】
【０１７４】
【数１０】
【０１７５】
【数１１】
【０１７６】
【数１２】
上述の記載は限定として解釈されるべきではなく、単に好ましい実施形態の例示として解釈されるべきである。本明細書中に開示される実施形態に種々の変更がなされ得ることが理解されよう。例えば、当業者が認めるように、本明細書中に記載される特定の配列は、抗体または抗体断片の機能性に必ずしも有害に影響を及ぼすことなく、わずかに改変することができる。例えば、抗体配列における単一または複数のアミノ酸の置換は、抗体または断片の機能性を破壊することなく、頻繁に行うことができる。したがって、本明細書中に記載される特定の抗体に対して７０％より高い程度の相同性を有する抗体が、本開示の範囲内であることが理解されるべきである。特に有用な実施形態において、本明細書中に記載される特定の抗体に対して約８０％より高い相同性を有する抗体が企図される。他の有用な実施形態においては、本明細書中に記載される特定の抗体に対して約９０％より高い相同性を有する抗体が企図される。したがって、上述の記載は限定として解釈されるべきではなく、単に好ましい実施形態の例示として解釈されるべきである。当業者は、本開示の範囲内および精神内の、他の変更を構想するであろう。
【図面の簡単な説明】
【０１７７】
【図１】図１は、本開示による抗体／自己抗原コンストラクトと抗原提示細胞（ＡＰＣ）およびＴ細胞との相互作用を略図で示す。
【図２Ａ】図２Ａは、ウサギ抗ｍＳＩＧＮＲ１ ｓｃＦＶ抗体の軽鎖アミノ酸配列（配列番号１〜６）および重鎖アミノ酸配列を示す。
【図２Ｂ】図２Ｂは、ウサギ抗ｍＳＩＧＮＲ１ ｓｃＦＶ抗体の重鎖アミノ酸配列（配列番号７〜１２）を示す。
【図３】図３は、抗体ペプチドコンストラクト生成のためのベクターの一部の概略図である。
【図４】図４は、ヒトＤＣ−ＳＩＧＮＲとのＩｇＧ１クローンの反応性を示す、本開示によるインビトロ実験の結果のグラフ描写である。
【図５】図５は、ヒトＤＣ−ＳＩＧＮＲとのＩｇＧ２ａクローンの反応性を示す、本開示によるインビトロ実験の結果のグラフ描写である。
【図６】図６は、ヒトＤＣ−ＳＩＧＮＲおよびＤＣ−ＳＩＧＮとのＩｇＧ１クローンの反応性を示す、本開示によるインビトロ実験の結果のグラフ描写である。
【図７】図７は、ヒトＤＣ−ＳＩＧＮＲおよびＤＣ−ＳＩＧＮとのＩｇＧ２ａクローンの反応性を示す、本開示によるインビトロ実験の結果のグラフ描写である。
【図８Ａ】図８Ａ〜８Ｃは、ヒトＤＣ−ＳＩＧＮＲと反応性のある重鎖クローンのアミノ酸配列を示す（配列番号１７〜３６）。
【図８Ｂ】図８Ａ〜８Ｃは、ヒトＤＣ−ＳＩＧＮＲと反応性のある重鎖クローンのアミノ酸配列を示す（配列番号１７〜３６）。
【図８Ｃ】図８Ａ〜８Ｃは、ヒトＤＣ−ＳＩＧＮＲと反応性のある重鎖クローンのアミノ酸配列を示す（配列番号１７〜３６）。
【図９Ａ】図９Ａ〜９Ｂは、ヒトＤＣ−ＳＩＧＮＲと反応性のある軽鎖クローンのアミノ酸配列を示す（配列番号３７〜５５）。
【図９Ｂ】図９Ａ〜９Ｂは、ヒトＤＣ−ＳＩＧＮＲと反応性のある軽鎖クローンのアミノ酸配列を示す（配列番号３７〜５５）。
【図１０−１】図１０は、ヒトＤＣ−ＳＩＧＮＲと反応性のあるＩｇＧ１重鎖クローンのさらなるアミノ酸配列を示す（配列番号６３〜８２）。
【図１０−２】図１０は、ヒトＤＣ−ＳＩＧＮＲと反応性のあるＩｇＧ１重鎖クローンのさらなるアミノ酸配列を示す（配列番号６３〜８２）。
【図１１−１】図１１は、ＤＣ−ＳＩＧＮＲと反応性のあるＩｇＧ１軽鎖クローンのさらなるアミノ酸配列を示す（配列番号９６〜１１５）。
【図１１−２】図１１は、ＤＣ−ＳＩＧＮＲと反応性のあるＩｇＧ１軽鎖クローンのさらなるアミノ酸配列を示す（配列番号９６〜１１５）。
【図１２−１】図１２は、ＤＣ−ＳＩＧＮＲと反応性のあるＩｇＧ２ａ重鎖クローンのさらなるアミノ酸配列を示す（配列番号１３３〜１５４）。
【図１２−２】図１２は、ＤＣ−ＳＩＧＮＲと反応性のあるＩｇＧ２ａ重鎖クローンのさらなるアミノ酸配列を示す（配列番号１３３〜１５４）。
【図１３−１】図１３は、ＤＣ−ＳＩＧＮＲと反応性のあるＩｇＧ２ａ軽鎖クローンのさらなるアミノ酸配列を示す（配列番号１６９〜１８９）。
【図１３−２】図１３は、ＤＣ−ＳＩＧＮＲと反応性のあるＩｇＧ２ａ軽鎖クローンのさらなるアミノ酸配列を示す（配列番号１６９〜１８９）。
【図１４】図１４は、６つの抗体（クローン名Ｃ７、Ｄ１２、Ｅ４、Ｅ１０、Ｇ３、Ｇ１０）がＬ−ＳＩＧＮ受容体との非常に良好な結合を示したが、３つの抗体（Ｄ１２、Ｇ３およびＥ１０）はＤＣ−ＳＩＧＮとも、実質的により低いレベルではあるが反応したことを示す。
【図１５】図１５は、Ｌ−ＳＩＧＮタンパク質に対する、種々の抗体の親和性を示す。
【図１６】図１６は、ＥＬＩＳＡにおける、Ｌ−ＳＩＧＮＦｃ融合タンパク質に結合するＬ−ＳＩＧＮ特異的モノクローナル抗体（ｍａｂ１６２）と競合することによって特徴付けられる、種々の抗体に対するエピトープ特異性を示す。
【図１７】図１７は、肝類洞内皮細胞による抗体内在化の結果を示す。
【図１８】図１８は、フローサイトメトリーで測定した、Ｋ５６２／ＬＳＩＧＮ細胞のＩＣＡＭ−１およびＩＣＡＭ−３媒介性接着を測定するのに用いた、リガンドブロッキングのための蛍光ビーズ接着アッセイの結果を示す。
【図１９】図１９Ａは、エボラＫ５６２／ＤＣ−ＳＩＧＮおよびＫ５６２／Ｌ−ＳＩＧＮのエンベロープ糖タンパク質でコートした蛍光ビーズの接着を示す。抗体なしで、５万個のＫ５６２／Ｌ−ＳＩＧＮ細胞およびＫ５６２／ＤＣ−ＳＩＧＮ細胞を、ＨＩＶおよびエボラのエンベロープ糖タンパク質でコートした蛍光ビーズ（２０個のビーズ／細胞）とともに３０分間インキュベートし、ウイルスタンパク質でコートしたビーズによる結合の程度を、ＦＬ−３中のフローサイトメトリーによって測定した。図１９Ｂは、Ｆａｂが、Ｌ−ＳＩＧＮに結合したＨＩＶｇｐ１２０およびエボラｇｐ結合の接着をブロックする能力を示す。Ｌ−ＳＩＧＮ Ｆａｂ（２０ｕｇ／ｍｌ）の存在下で、５万個のＫ５６２／Ｌ−ＳＩＧＮ細胞を、ＨＩＶおよびエボラのエンベロープ糖タンパク質でコートした蛍光ビーズ（２０個のビーズ／細胞）とともに３０分間インキュベートし、ウイルスタンパク質でコートしたビーズに結合している細胞の数を、フローサイトメトリーによって測定した。図１９Ｃは、ＦａｂがＤＣ−ＳＩＧＮへの両方のウイルスタンパク質の結合をブロックする能力を示す。Ｌ−ＳＩＧＮ Ｆａｂ（２０ｕｇ／ｍｌ）の存在下で、５万個のＫ５６２／ＤＣ−ＳＩＧＮ細胞を、ＨＩＶおよびエボラのエンベロープ糖タンパク質でコートした蛍光ビーズ（２０個のビーズ／細胞）とともに３０分間インキュベートし、ウイルスタンパク質でコートしたビーズに結合している細胞の数を、フローサイトメトリーによって測定した。図１９Ａ〜Ｃ中のパーセント結合は、Ｆａｂありで、タンパク質でコートしたビーズに結合している細胞の数を、Ｆａｂなしで、タンパク質でコートしたビーズに結合している細胞の数で割って、１００倍することとして決定した。棒は、２つの独立した実験の平均値＋ＳＤを表す。
【図２０】図２０Ａ〜Ｃは、受容体への、完全ＩｇＧバージョンのＦａｂ、Ｅ１０およびＧ１０の結合、ならびにウイルスタンパク質接着のブロッキングを示す。図２０Ａのデータを生成するために、５×１０５個のＫ５６２、Ｋ５６２／ＤＣ−ＳＩＧＮおよびＫ５６２／Ｌ−ＳＩＧＮ細胞を、精製したＦａｂ（２０μｇ／ｍＬ）とともに１時間インキュベートし、それらの結合の程度を、ＰＥ複合ヤギ抗マウス（Ｆａｂ検出）またはヤギ抗ヒト（ＩｇＧ検出）二次抗体を用いたフローサイトメトリーによって評価した。ｍＡｂ１６２（Ｌ−ＳＩＧＮ特異的）およびｍＡｂ１６２１１（ＤＣ−ＳＩＧＮ／Ｌ−ＳＩＧＮ交差反応性）を陽性対照として使用した。図２０Ｂのデータを生成するために、Ａｂ（２０ｕｇ／ｍｌ）存在下で、５万個のＫ５６２／Ｌ−ＳＩＧＮおよびＫ５６２／ＤＣ−ＳＩＧＮ細胞を、ＨＩＶｇｐ１２０でコートした蛍光ビーズ（２０個のビーズ／細胞）とともに３０分間インキュベートし、ウイルスタンパク質でコートしたビーズに結合している細胞の数を、フローサイトメトリーによって測定した。図２０Ｃのデータを生成するために、Ａｂ（２０ｕｇ／ｍｌ）存在下で、５万個のＫ５６２／Ｌ−ＳＩＧＮおよびＫ５６２／ＤＣ−ＳＩＧＮ細胞を、エボラエンベロープ糖タンパク質でコートした蛍光ビーズ（２０個のビーズ／細胞）とともに３０分間インキュベートし、ウイルスタンパク質でコートしたビーズに結合している細胞の数を、フローサイトメトリーによって測定した。ｍＡｂ１６２（Ｌ−ＳＩＧＮ特異的）およびｍＡｂＡＺＮＤ１（ＤＣ−ＳＩＧＮ特異的）を陽性対照として使用した。パーセント結合は、Ａｂありで、タンパク質でコートしたビーズに結合している細胞の数を、Ａｂなしで、タンパク質でコートしたビーズに結合している細胞の数で割って、１００倍することとして決定した。棒は、２つの独立した実験の平均値＋ＳＤを表す。
【技術分野】
【０００１】
（関連出願の引用）
本出願は、米国出願第１１／０１６６４７号（２００４年１２月１７日出願）の部分継続出願である。この米国出願は、ＰＣＴ／ＵＳ０４／０６５７０（２００４年３月４日出願）の部分継続出願であり、このＰＣＴ出願は、米国仮特許出願第６０／５４８，３８５号（２００４年２月２８日出願）；米国仮特許出願第６０／５２９，５００号（２００３年１２月１５日出願）；および米国仮特許出願第６０／４５１，８１６号（２００３年３月４日出願）の優先権を主張する。これらの全ての出願の完全な開示は、本明細書中で参考として援用される。
（技術分野）
自己免疫疾患を治療または予防するための、自己抗原に対する自然免疫寛容を開発および修復すること。
【背景技術】
【０００２】
（関連技術の背景）
Ｔ細胞媒介性疾患、インスリン依存性糖尿病（「Ｔ１ＤＭ」）は、大きな健康上の問題であり、１５０万人を超えるアメリカ人が罹患している。この自己免疫疾患は、膵臓内のランゲルハンス島のインスリン産生β−細胞の、Ｔ細胞媒介性の破壊から生じる。インスリンでの治療にもかかわらず、Ｔ１ＤＭに起因する死亡は過去２０年間で増大しているが、癌、心臓血管疾患および脳卒中での死亡率は減少している（Ｈｕｒｌｂｅｒｔら、２００１年）。また、腎症、ニューロパシーおよび網膜症を含む、外因性インスリンでの治療の合併症は、非常に消耗性である。
【０００３】
Ｔ１ＤＭは、Ｔｈ１媒介性疾患であると考えられており、例えばＩＬ−４の全身性投与によって、免疫応答をＴｈ２型に転換する早期の介入が、疾患の発症を予防し得る（Ｃａｍｅｒｏｎら、１９９７年）。エフェクターＴ細胞、Ｔｈ１およびＴｈ２のバランスは、免疫寛容の維持において重要であり得、バランスの変化は、自己免疫を生じ得る。しかしながら、ＮＯＤマウス由来のＴｈ２細胞系もまた疾患を転移することが示されているので、自己免疫疾患からの保護は、Ｔｈ２細胞の固有の特性ではない（Ｐａｋｋａｌａら、１９９７年）。
【０００４】
免疫系は、自己寛容を維持するように、複雑に進化してきた。胸腺は、Ｔ細胞の重要な最初の選択を提供する。この選択は、胸腺に存在する自己抗原に対して寛容なＴ細胞の、末梢への輸送を生じる。しかしながら、多くの組織特異的タンパク質は、寛容性を誘導するのに十分なレベルで発現されない。例えば、ランゲルハンス島反応性Ｔ細胞は健康な被験体で見られているが、おそらく親和性は低い（Ｌｏｈｍａｎら、１９９６年）。末梢寛容性のいくつかの機構は、胸腺の中心的な寛容性機構を補完して、自己反応性Ｔ細胞を制御下に維持する。末梢寛容性の重要なメディエータの１つは、抗原提示細胞（「ＡＰＣ」）である。樹状細胞（「ＤＣ」）およびマクロファージ等のＡＰＣは、他の細胞から自己抗原を捕捉し、それらを自己反応性Ｔ細胞に提示して、欠失、アネルギー、および／または調節性Ｔ細胞の発生によって、Ｔ細胞寛容性を誘導する（非特許文献１）。現在の仮説は、おそらく共刺激分子を欠くために、定常状態の免疫系におけるＡＰＣ等の未成熟なＡＰＣが、Ｔ細胞を活性化するよりむしろ寛容化するというものである。Ｈａｗｉｇｅｒらは、ＤＣ制限エンドサイト受容体であるＤＥＣ−２０５に対する抗体を用いて、ＤＣの主要組織適合性クラスＩＩ（「ＭＨＣ ＩＩ」）経路に抗原を標的とした（Ｈａｗｉｇｅｒら、２００１年）。その後のペプチド免疫に対する応答を欠くことから示されるように、これらのＤＣによる抗原提示はＣＤ４＋Ｔ細胞増殖の短いバーストを刺激し、その後欠失が起こり、レシピエントは抗原に対して寛容になった。対照的に、抗ＣＤ４０等の強力なＤＣ成熟刺激によって抗原標的化が達成されると、免疫が誘導された。
【０００５】
樹状細胞はまた、抑制性サイトカインまたは接触依存性機構を通じてエフェクターＴ細胞の機能に影響を及ぼす調節性Ｔ細胞を生じることによって、末梢寛容性を誘導することができる（非特許文献２、Ｊｏｎｕｌｅｉｔら、２０００年、ＤｈｏｄａｐｋａｒおよびＳｔｅｉｎｍａｎ、２００１年）。一般に「最適以下」のＴ細胞刺激によって、調節性Ｔ細胞の誘導のための多くの異なるプロトコルが開発されている。Ｔ細胞の最適以下の刺激は、共刺激なしの抗原提示、もしくは炎症によって、またはＴ細胞受容体もしくはその補助受容体ＣＤ４およびＣＤ８の部分的ブロッキングによって、達成することができる。調節性Ｔ細胞の表現型および作用の機構は異質性である。多くのサプレッサ細胞はＣＤ４＋ＣＤ２５＋であるが、多くの状況においてＣＤ４＋ＣＤ２５＋細胞は同程度に効果的であることがますます明らかになってきている。調節性Ｔ細胞集団において同定される他のマーカーとしては、ＣＤ６２Ｌ、ＧＩＴＲおよびＣＤ１０３が挙げられ（ＬａｆａｉｌｌｅおよびＬａｆａｉｌｌｅ、２００２年）、ＣＤ８＋調節性Ｔ細胞もまた、報告されている（ＤｈｏｄａｐｋａｒおよびＳｔｅｉｎｍａｎ、２００２年）。いくつかの調節性Ｔ細胞は、免疫抑制性サイトカインであるインターロイキン（「ＩＬ」）−１０を産生することが示されている（Ｗａｋｋａｃｈら、２００１年、Ｂａｒｒａｔら、２００２年）が、経口免疫寛容によって誘導された調節性Ｔ細胞は、Ｔｈ２型サイトカインであるＩＬ−４およびＩＬ−１０に加えて、トランスホーミング増殖因子−β（「ＴＧＦ−β」）の産生によって特徴付けられている（Ｗｅｉｎｅｒ、２００１年）。接触依存性サプレッサ細胞は、ＴＧＦ−β存在下でＣＤ４＋ＣＤ４５ＲＡ＋ヒト末梢Ｔ細胞を活性化することによって生じている（Ｙａｍｉｇａｗａら、２００１年）。調節性Ｔ細胞の誘導はＴ細胞受容体を通じた刺激を必要とするが、それらの抑制効果は非抗原特異的であるようである（ＴｈｏｒｔｏｎおよびＳｈｅｖａｃｈ、２０００年）。
【０００６】
免疫調節性Ｔ細胞は、ＮＯＤマウスにおける病原性自己反応性Ｔ細胞を下方調節する上で役割を果たすことが示されている。糖尿病前症マウスが免疫調節性Ｔ細胞を含むことおよびそれらの数またはそれらの機能的能力の減少が、疾患進行における主な寄与事象であるという証拠がある（非特許文献３）。共転移実験から、糖尿病前症マウス由来のＣＤ４＋Ｔ脾臓細胞は糖尿病誘発細胞による免疫不全レシピエントへの疾患転移を完全に防ぐことが示されている（Ｂｏｉｔａｒｄら、１９８９年、ＨｕｔｃｈｉｎｇｓおよびＣｏｏｋｅ、１９９０年）。また、ＮＯＤマウスモデルにおいて、未成熟なＤＣによる調節性Ｔ細胞の誘導は疾患予防と相関があった（Ｈｕｇｅｓら、２００２年）。
【０００７】
ヒトにおいて、インスリン、グルタミン酸デカルボキシラーゼ（「ＧＡＤ」）、熱ショックタンパク質（「ＨＳＰ」）６０、またはタンパク質チロシンホスファターゼ様分子（「ＩＡ−２」）、および他の不確定のβ細胞抗原に応答する自己反応性Ｔ細胞が記載されている（Ｒｏｅｐら、１９９０年、Ａｔｋｉｎｓｏｎら、１９９２年、Ｈｏｎｅｙｍａｎら、１９９３年、Ｒｅｉｊｏｎｅｎら、２００２年）。
【０００８】
ＧＡＤは、抑制性神経伝達物質であるγアミノ酪酸の生合成酵素である（Ｂａｅｋｋｅｓｋｏｖら、１９９０年）。６５％の相同性の、２つの異なるアイソフォーム、ＧＡＤ６５およびＧＡＤ６７がクローニングされている。ＧＡＤ６５はヒトにおける支配的なアイソフォームであるが、ＧＡＤ６７は、ＮＯＤマウスにおける主な形態であり、両方のアイソフォームに対する抗体がヒトにおいて検出される（Ｋａｕｆｍａｎら、１９９２年）。ＮＯＤマウスにおいて、膵島炎の発症以前または発症時、および他のβ細胞抗原に対する抗体が発生する前に、抗ＧＡＤ抗体が以前に検出された。このタイミングは、ＧＡＤが、このモデルにおいてβ細胞自己免疫を開始する主要抗原であることを含意する（Ｔｉｓｃｈら、１９９３年）。糖尿病におけるＧＡＤの重要な役割のさらなる証拠は、糖尿病マウスの脾臓または膵臓から単離されたＧＡＤ特異的Ｔ細胞が未処置の動物に疾患を転移し得るという、多くの実験室による観察から生じる（非特許文献４、Ｗｅｎら、１９９８年、Ｚｅｋｚｅｒら、１９９８年）。Ｔ１ＤＭの病原におけるＧＡＤの中心的な役割に関する論争は依然としてあるが、動物実験からの証拠から、少なくとも、このタンパク質の重要な役割が示唆される。
【０００９】
若年期における胸腺内または静脈内のいずれかでの精製ＧＡＤ６５での免疫化は、ＮＯＤマウスにおいて、膵臓β細細胞に対してＴ細胞を寛容化して、それによって膵島炎および糖尿病を防ぐことができる（Ｔｉａｎら、１９９６年、Ｍａら、１９９７年）。ＧＡＤに対する寛容化はまた、ＨＳＰ６５等の他の抗原に対する免疫反応の発生を防ぐこともできた。さらなる研究は、どのＧＡＤペプチドが寛容性を誘導できるかを検討した（Ｔｉｓｃｈら、２００１年、Ｔｉｓｃｈら、１９９９年、Ｚｅｃｈｅｌら、１９９８年）。糖尿病発症からの保護はまた、静脈内、皮下、経口または経鼻経路によって、インスリンまたはＨＳＰ６５処置のいずれかによって達成することができる（Ｅｌｉａｓら、１９９１年、ＥｌｉａｓおよびＣｏｈｅｎ、１９９４年、Ｅｌｉａｓら、１９９７年、Ａｔｋｉｎｓｏｎら、１９９０年）。抗原特異的療法は、早期に投与すると疾患発症の予防において高度に効果的であるが、進行中の疾患の制御では、わずかな試みしか成功していない（ＥｌｉａｓおよびＣｏｈｅｎ、１９９４年、Ｔｉａｎら、１９９６年）。
【００１０】
一般的なペプチド免疫は、免疫性を誘導する段階で、または寛容性に対する免疫応答を変化させ得る抗原提示細胞によって、抗原提示細胞がペプチドを提示するかどうかを制御できず、したがって、免疫刺激または免疫抑制のいずれかを生じ得る。
【００１１】
免疫系を弱めることにより、糖尿病の発生を予防することができる。ＦＫ５０６、抗ＣＤ４、抗ＣＤ８、抗ＣＴＬＡ−４および他のもの等の、Ｔ細胞機能を抑制する、ありとあらゆる一般的な作用物質は、ＮＯＤマウスにおいて糖尿病の発症を予防または遅延することが示されている（ＡｔｋｉｎｓｏｎおよびＬｅｉｔｅｒ、１９９９年で概説されている）。しかしながら、これらの試薬に、糖尿病誘発Ｔ細胞に特異的なものはなく、これらの大部分は疾患の発症を予防することができるが、一旦疾患が確立されると効果がない。臨床試験で試験されたシクロスポリン等の一般的な免疫抑制剤は、短期で効果的であった（Ｆｅｕｔｒｅｎら、１９８８年、ＳｋｙｌｅｒおよびＲａｂｉｎｏｖｉｔｃｈ、１９９２年）。しかしながら、免疫抑制の中止は即座の再発につながり、腎毒性等の副作用が長期治療を妨げる（Ｐａｒｖｉｎｇら、１９９９年）。
【００１２】
糖尿病の抗原特異的療法の効能を評価するために、臨床試験が開始された。早発型糖尿病において、ＨＳＰ６Ｏ ｐ２７７ペプチド（ＤｉａＰｅｐ２７７）が試験された（Ｒａｚら、２００１年）。ペプチドでの多重免疫は疾患進行の速度を落とし、結果を確認および拡張するために、大規模な研究が開始された。ヒトインスリンのβ鎖をフロイント不完全アジュバント、インスリンＢ９−２３の改変ペプチドリガンドおよびＧＡＤと組み合わせて用いた臨床試験が進行中である。しかしながら、経口インスリンでの、最近診断された糖尿病を治療する試験は失敗し（Ｐｏｚｚｉｌｉら、２０００年、Ｃｈａｉｌｌｏｕｓら、２０００年）、非経口インスリン投与は、危険性の大きい糖尿病前症の予防が不成功であった（Ｄｉａｂｅｔｅｓ Ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ Ｔｒｉａｌ−Ｔｙｐｅ １ （ＤＰＴ） Ｓｔｕｄｙ Ｇｒｏｕｐ、２００２年）。失敗は、抗原の選択、抗原用量（Ｋｕｒｔｓら、１９９９年）、投与のタイミングおよび経路を含む、いくつかの要因によると考えられる。また、抗原療法は、どの型の免疫細胞が抗原を吸収するかを制御することができない。マウスは、制御された、病原を含まない条件下にあるが、これはヒトの試験には当てはまらない。同時の細菌またはウイルス感染がある場合、寛容よりむしろ初回刺激が起こる。動物において、糖尿病は、ある条件下での抗原免疫によって誘導されることができた（Ｂｌａｎａら、１９９６年、Ｂｅｌｌｍａｎｎら、１９９８年）。
【００１３】
免疫系がどのようにして自己抗原に対する寛容性を維持するかの理解は過去１０年で相当発達したので、Ｔ１ＤＭを予防または治療するための現在の治療戦略は、β細胞抗原に対する免疫寛容を回復させようと意図している。現在の免疫療法戦略は、自己反応性Ｔ細胞を直接不活性化することおよび／または調節能力によってＴ細胞を誘導することのいずれかによって、β細胞抗原に対する寛容性を誘導するよう意図されている。調節性Ｔ細胞の誘導は、多くの自己免疫疾患の治療のための、見込みのあるアプローチのようである。
【非特許文献１】Ｈｅａｔｈ ＷＲおよびＣａｒｂｏｎｅ ＦＲ，「Ｃｒｏｓｓ−ｐｒｅｓｅｎｔａｔｉｏｎ，ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ ｃｅｌｌｓ，ｔｏｌｅｒａｎｃｅ ａｎｄｉｍｍｕｎｉｔｙ．」，Ａｎｎｕ Ｒｅｖ Ｉｍｍｕｎｏｌ，２００１年，第１９巻，ｐ．４７−４９
【非特許文献２】Ｒｏｎｃａｒｏｌｏ ＭＧ，Ｌｅｖｉｎｇｓ ＭＫ，Ｔｒａｖｅｒｓｉ Ｃ，「Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ ｏｆ Ｔ ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ ｃｅｌｌｓ ｂｙ ｉｍｍａｔｕｒｅ ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ ｃｅｌｌｓ．」，Ｊ Ｅｘｐ Ｍｅｄ，２００１年，第１９３巻，Ｆ５−Ｆ９
【非特許文献３】Ｓｅｍｐｅ Ｐ，Ｒｉｃｈａｒｄ ＭＦ，Ｂａｃｈ ＪＦ，Ｂｏｉｔａｒｄ Ｃ，「Ｅｖｉｄｅｎｃｅ ｏｆ ＣＤ４＋ ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ Ｔ ｃｅｌｌｓ ｉｎ ｔｈｅ ｎｏｎ−ｏｂｅｓｅ ｄｉａｂｅｔｉｃ ｍａｌｅ ｍｏｕｓｅ．」，Ｄｉａｂｅｔｏｌｏｇｉｃａ，１９９４年，第３７巻，ｐ．３３７−３４３
【非特許文献４】Ｒｏｈａｎｅ ＰＷ，Ｓｈｉｍａｄａ Ａ，Ｋｉｍ ＤＴ，Ｅｄｗａｒｄｓ ＣＴ，Ｃｈａｒｌｔｏｎ Ｂ，Ｓｈｕｌｔｚ ＬＤ，Ｆａｔｈｍａｎ ＣＧ，Ｉｓｌｅｔ−ｉｎｆｉｌｔｒａｔｉｎｇ ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅｓ ｆｒｏｍ ｐｒｅｄｉａｂｅｔｉｃ ＮＯＤ ｍｉｃｅ ｒａｐｉｄｌｙ ｔｒａｎｓｆｅｒ ｄｉａｂｅｔｅｓ ｔｏ ＮＯＤ−ｓｃｉｄ／ｓｃｉｄ ｍｉｃｅ．」，Ｄｉａｂｅｔｅｓ，１９９５年，第４４巻，ｐ．５５０−５５４
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【００１４】
（要旨）
本開示は、免疫寛容を誘導することによって自己免疫疾患を治療する方法に関する。抗原提示細胞上に自己抗原を提示することによって、免疫寛容が誘導される。自己抗原が、抗原内在化受容体を認識する抗体に連結される。抗原提示細胞によって、抗原提示細胞上に自己抗原が内在化され、自己反応性Ｔ細胞の阻害が引き起こされる。
【００１５】
特に有用な実施形態において、本明細書中に記載される方法および化合物を用いて、とりわけβ細胞抗原、ＧＡＤまたはそのエピトープ、インスリンまたはそのエピトープ、ＨＳＰまたはそのエピトープであり得る自己抗原に対する免疫寛容を誘導することによって、真性糖尿病が治療される。自己抗原は、抗原内在化受容体であるＤＣ−ＳＩＧＮＲまたはＤＣ−ＳＩＧＮＲの変異を認識する抗体に連結される。自己抗原が、標的肝類洞内皮細胞または表面にＤＣ−ＳＩＧＮＲを発現している他の寛容化ＡＰＣに内在化される。自己抗原が標的肝類洞内皮細胞に提示され、自己反応性Ｔ細胞の増殖を阻害するか、または調節性Ｔ細胞の抑制効果を活性化する。
【００１６】
別の態様において、ペプチドに連結された、抗原提示細胞上の受容体に対する抗体を含む抗体／ペプチドコンストラクトが説明される。好ましくは、ペプチドは抗原であり、より好ましくは自己抗原である。特に有用な実施形態において、抗体／自己抗原コンストラクトまたはその一部は抗原提示細胞によって内在化され、自己抗原に対する免疫寛容が達成される。いくつかの場合において、毒素を本開示の抗原と組み合わせ、患者に投与することができる。毒素が、例えば腫瘍細胞に対する場合、本開示の抗体を利用して毒素を腫瘍細胞に導き、それによって毒素の投与を腫瘍細胞に集中させることができる。
【００１７】
別の態様において、自己抗原に連結された、受容体または抗原提示細胞に対する抗体を含む操作された抗体を組み換えによって生成する方法が説明される。
【００１８】
本開示はまた、ＤＣ−ＳＩＧＮＲ発現細胞と、Ｔ細胞等のＩＣＡＭ発現細胞との相互作用に干渉する、ＤＣ−ＳＩＧＮＲに対する抗体に関する。かかる相互作用のブロッキングは、免疫刺激を生じ得る。さらに、Ｌ−ＳＩＧＮに対して拮抗関係にある抗体は、標的細胞の抗原提示特性を変化させ得、これは免疫の活性化または抑制のいずれかを生じ得る。
【００１９】
別の態様において、ＤＣ−ＳＩＧＮＲに対する抗体は、肝類洞内皮細胞等の肝細胞を含む細胞へのウイルスの侵入および他の細胞へのそれらの感染を防ぐ。ＤＣ−ＳＩＧＮＲに対する抗体を利用して、Ｔ細胞へのウイルスの侵入および他の細胞へのそれらの感染も防ぐこともできる。いくつかの実施形態において、本開示は、ワクチンにおける、ＤＣ−ＳＩＧＮＲに対する抗体の使用を含む。
【００２０】
他の実施形態において、本開示の抗体を利用して、ＤＣ−ＳＩＧＮＲおよび／またはＬ−ＳＩＧＮに結合させ、それによって、ＨＩＶ、ＨＣＶ、エボラ、ＳＡＲＳ、ＣＭＶおよびシンドビス等のウイルスを含むがこれらに限定されない感染性作用物質の結合、感染、および伝播をブロックすることができる。
【００２１】
さらに別の実施形態において、ＤＣ−ＳＩＧＮＲに対する抗体を利用して、ヒト結核菌（Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）およびウシ結核菌（Ｍ．ｂｏｖｉｓ）を含むミコバクテリウム（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属の細菌の結合、感染、および伝播をブロックすることができる。他の実施形態において、ＤＣ−ＳＩＧＮＲに対する抗体を利用して、マンソン住血吸虫（Ｓｃｈｉｓｔｏｓｏｍａ ｍａｎｓｏｎｉ）等の寄生生物の結合、感染、および伝播をブロックすることができる。
【００２２】
さらに別の実施形態において、本開示の抗体または抗体／ペプチドコンストラクトは、ＤＣ−ＳＩＧＮＲ発現細胞に対する毒素で標識され得る。次いで、毒素で標識された抗ＤＣ−ＳＩＧＮＲ抗体または抗ＤＣ−ＳＩＧＮＲ抗体／ペプチドコンストラクトの投与を利用して、ＤＣ−ＳＩＧＮＲ発現細胞のレベルを減少させることができ、これは自己免疫疾患の治療等のいくつかの例において、有益であり得る。
【００２３】
本開示のＤＣ−ＳＩＧＮＲに対する抗体はまた、ＤＣ−ＳＩＧＮＲ発現と関連のある腫瘍型の通法の診断法としても利用することができ、いくつかの実施形態においては、診断キットの一部として提供することもできる。
【００２４】
本開示のＤＣ−ＳＩＧＮＲに対する抗体はまた、ＤＣ−ＳＩＧＮＲ発現と関連のある癌および腫瘍型の治療のための治療術としても利用することができる。
【００２５】
本開示の抗体を利用して、ＤＣ−ＳＩＧＮＲを発現しない細胞からＤＣ−ＳＩＧＮＲ発現細胞を単離することもできる。
【００２６】
いくつかの実施形態において、本開示のＤＣ−ＳＩＧＮＲに対する抗体は、ヒト化抗体であり得る。他の実施形態において、本開示のＤＣ−ＳＩＧＮＲに対する抗体は、ｓｃＦｖであり得る。
【００２７】
いくつかの実施形態において、本開示は、Ｌ−ＳＩＧＮ受容体を認識し、Ｌ−ＳＩＧＮへのＨＩＶｇｐ１２０の結合をブロックする抗体、Ｌ−ＳＩＧＮ受容体を認識し、Ｌ−ＳＩＧＮへのエボラエンベロープタンパク質の結合をブロックする抗体、Ｌ−ＳＩＧＮ受容体を認識し、ＤＣ−ＳＩＧＮへのＨＩＶｇｐ１２０の結合をブロックする抗体、Ｌ−ＳＩＧＮ受容体を認識し、ＤＣ−ＳＩＧＮへのエボラエンベロープタンパク質の結合をブロックする抗体、Ｌ−ＳＩＧＮ受容体およびＤＣ−ＳＩＧＮ受容体の両方を認識し、ＤＣ−ＳＩＧＮへのＨＩＶｇｐ１２０の結合をブロックする抗体、ならびに／またはＬ−ＳＩＧＮ受容体およびＤＣ−ＳＩＧＮ受容体の両方を認識し、ＤＣ−ＳＩＧＮへのエボラエンベロープタンパク質の結合をブロックする抗体に関する。この抗体は、エボラエンベロープタンパク質またはＨＩＶｇｐ１２０が結合するエピトープと同じエピトープに結合し得る。
【００２８】
さらに他の実施形態において、本開示は、非ヒト可変ドメインが抗原提示細胞上の受容体、場合によりＤＣ−ＳＩＧＮ受容体に結合する、非ヒト可変ドメインおよびヒトＩｇＧ定常領域を含むキメラ抗体に関する。いくつかの実施形態において、非ヒト可変ドメインはＬ−ＳＩＧＮ受容体を認識し、ヒト定常領域はＩｇＧ１領域である。かかる抗体は、Ｌ−ＳＩＧＮおよび／またはＤＣ−ＳＩＧＮへの、ＨＩＶｇｐ１２０またはエボラエンベロープタンパク質の結合をブロックし得る。キメラ抗体は、非ヒト可変ドメインのみの場合よりも有利にＬ−ＳＩＧＮおよび／またはＤＣ−ＳＩＧＮに結合することができる。
【００２９】
本開示のさらなる実施形態は、組成物を用いた、および／または上述の方法を包含する、予防技術ならびに診断技術に関する。薬学的に許容され得る担体中に本開示のＤＣ−ＳＩＧＮＲに対する抗体を含む組成物も提供される。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３０】
（詳細な説明）
本方法は、自己免疫疾患に関与する、自己抗原または自己ペプチドに対する免疫寛容を誘導する。
【００３１】
抗体／自己抗原コンストラクト（本明細書中で「操作された抗体」と呼ばれることがある）を被験体に投与することによって、本開示により、免疫寛容が誘導される。抗体／自己抗原コンストラクトとしては、抗体に連結された自己抗原が挙げられる。
【００３２】
抗体成分は、任意の抗原提示細胞上の任意の受容体に結合する抗体であり得る。当業者が認めるように、抗原提示細胞の型としては、樹状細胞、マクロファージ、内皮細胞 クップファー細胞およびＢ細胞が挙げられる。現在公知の受容体または抗原提示細胞には、ＤＥＣ−２０５、マンノース受容体、ＤＣ−ＳＩＧＮ、ＤＣ−ＳＩＧＮＲ、ＭＨＣ、ｔｏｌｌ受容体、ランゲリン、アシアロ糖タンパク質受容体、β−グルカン受容体、Ｃ型レクチン受容体および樹状細胞免疫受容体がある。特に有用な実施形態において、受容体は、ＳＴＴ抗体を内在化するものである。内在化が特定の受容体で起こるかどうかは、当業者に公知の技術を用いて実験的に決定することができる。抗体の内在化を提供することが現在知られている受容体または抗原提示細胞としては、ＤＥＣ−２０５、マンノース受容体、ＤＣ−ＳＩＧＮおよびＤＣ−ＳＩＧＮＲが挙げられる。
【００３３】
抗体成分は、天然の抗体（従来の技術を用いて単離される）であってよく、または当業者の認識範囲内にある組み換え方法により合成によって調製される抗体であってもよい。抗体は、例えば、完全ヒト抗体、非ヒト抗体、ヒト化抗体、キメラ抗体または任意の方法（例えば、部位特異的修飾または脱免疫）で操作された前述の型の抗体のいずれかであり得る。抗体は、例えばファージディスプレイおよびパニング等の当業者に公知の技術を用いて、抗体のライブラリーから有利に選択することができる。
【００３４】
本明細書中で使用される場合、「抗体」および「免疫グロブリン」は交換可能に使用され、免疫グロブリン分子全体、または免疫グロブリン分子全体の免疫学的に活性のある部分を含む分子をいい、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、ｓｃＦｖ、Ｆｖ、重鎖可変領域および軽鎖可変領域を含む。
【００３５】
抗体をコードする核酸は、選択されると、例えば、その開示が参照によって本明細書中に援用されている、２００２年９月１９日に提出された米国特許出願第１０／２５１０８５号および２００１年１２月１０日に提出された同第１０／０１４０１２号にそれぞれ記載されている、従来のＰＣＲまたは増幅技術等の、当業者に公知の技術を用いて増幅することができる。
【００３６】
自己抗原を抗体に連結させて、本開示による抗体／自己抗原コンストラクトが調製される。本開示の目的のために、用語「抗体／自己抗原コンストラクト」および「抗体／ペプチド」は、交換可能に使用される。
【００３７】
任意の自己抗原を使用することができる。自己抗原は天然に存在するものであってよく、当業者に公知の技術を用いて単離されてもよい。あるいは、自己抗原のアミノ酸配列が既知である場合、これは公知の技術を用いて合成によって調製することができる。適した自己抗原としては、インスリン、ＧＡＤ、Ｈｓｐ、核抗原、アセチルコリン受容体、ミエリン塩基性タンパク質、ミエリン希突起神経膠細胞糖タンパク質、プロテオリピドタンパク質、ミエリン関連糖タンパク質、糸球体基底膜タンパク質および甲状腺刺激ホルモン受容体が挙げられる。特に有用な実施形態において、自己抗原は、寛容化抗原提示細胞による提示のときに免疫寛容を誘導するものである。
【００３８】
任意の適した方法によって、自己抗原を抗体に連結することができる。ある特定の方法を下記の実施例で述べるが、本開示は、抗体／自己抗原コンストラクトを製造するいかなる特定の方法にも限定されない。
【００３９】
自己抗原に対する免疫寛容を誘導する本方法は、抗原提示細胞（「ＡＰＣ」）を標的とし、抗体によって自己抗原をこれらの細胞に導く。図１は、本開示による抗体／自己抗原コンストラクトと、抗原提示細胞（ＡＰＣ）およびＴ細胞との相互作用を略図で示す。抗体は、標的とする細胞上の受容体を認識する。抗体による自己抗原の送達を導くために、これら２つを連結する。本開示はベクタークローニングの使用を描写するが、この連結は任意の方法によって達成することができる。抗体は、独特の抗原内在化受容体のみを標的として、結合し、それによって所望の細胞型への自己抗原の送達を確実にする。
【００４０】
標的とする抗原内在化受容体に抗体が結合した後、連結した自己抗原および抗体が抗原提示細胞中に内在化される。自己抗原が、おそらく細胞内の主要組織適合性複合体（「ＭＨＣ」）との自己抗原の相互作用を介して、ＡＰＣの表面に提示される。自己抗原が共刺激能力によってＡＰＣの表面で発現されると、未処置の自己反応性Ｔ細胞は、活性化状態になり、その特異的自己抗原を標的とし、それと反応することができる。ＡＰＣの表面に共刺激分子がないことは、Ｔ細胞応答の限定に最も関係がありそうである。自己反応性エフェクターＴ細胞は、限られた数の抗原発現組織細胞しか死滅させることができない。少数の標的細胞を死滅させた後、エフェクター細胞は死滅する。次いで、自己抗原提示細胞が寛容化される。寛容化抗原提示細胞による、未処置のＴ細胞への抗原の提示は、調節性Ｔ細胞を誘導する。続いて、調節性Ｔ細胞が、刺激性抗原提示細胞による、他の潜在的な自己反応性Ｔ細胞の活性化を防ぐ。
【００４１】
したがって、いくつかの実施形態において、本開示の抗体を利用して、肝類洞内皮細胞に結合することができる抗体／自己抗原コンストラクトを形成し、それによって調節性細胞の増殖を刺激することができるか、または本開示の抗体を利用して、肝類洞内皮細胞に結合することができる抗体／自己抗原コンストラクトを形成し、それによって自己反応性Ｔ細胞の活性を抑制することができる。本開示の抗体／自己抗原コンストラクトはまた、ワクチン抗原を、リンパ節で見られるものを含む類洞内皮細胞に送達するのに使用して、それによって抗原特異的Ｔ細胞の増殖を刺激することもできる。
【００４２】
本抗体／自己抗原コンストラクトは、公知の方法、例えば、静脈内、腹腔内、大脳内、筋肉内、皮下、眼内、動脈内、鞘内、吸入もしくは病変内経路による注射もしくは注入、局所的、または下記のような徐放性システムに従って、投与することができる。抗体／自己抗原コンストラクトは、好ましくは、注入によって、またはボーラス注射によって、継続的に投与される。抗体／自己抗原コンストラクトは、局所的または全身性の様式で投与することができる。
【００４３】
抗体／自己抗原コンストラクトは、薬学的に許容され得る担体との混合物中で調製することができる。本願の化合物の製剤化および投与の技術は、「Ｒａｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ」、Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．、ペンシルバニア州イーストン、最新版に見ることができる。この治療組成物は、静脈内、または鼻もしくは肺を通して、好ましくは液体または粉末エーロゾル（凍結乾燥）として、投与することができる。組成物はまた、所望により、非経口または皮下で投与することができる。全身に投与される場合、治療組成物は、無菌で、熱源物質を含まず、ｐＨ、等張性、および安定性を相当に顧慮した非経口的に許容され得る溶液中にあるべきである。これらの条件は、当業者に公知である。
【００４４】
簡潔に述べると、本抗体／自己抗原コンストラクトの投薬製剤は、所望の程度の純度を有する化合物を生理学的に許容され得る担体、賦形剤、または安定剤と混合することによって、保存または投与のために調製される。かかる物質は、使用される投薬量および濃度ではレシピエントにとって無毒であり、ＴＲＩＳ ＨＣｌ、リン酸塩、クエン酸塩、酢酸塩および他の有機酸塩などのバッファー；アスコルビン酸等の抗酸化物質；ポリアルギニン等の低分子量（約１０残基未満）ペプチド、および血清アルブミン、ゼラチン、または免疫グロブリン等のタンパク質；ポリビニルピロリドン等の親水性ポリマー；グリシン、グルタミン酸、アスパラギン酸、またはアルギニン等のアミノ酸；単糖、二糖、およびセルロースもしくはその誘導体、グルコース、マンノース、またはデキストリンを含む他の炭化水素；ＥＤＴＡ等のキレート化剤；マンニトールまたはソルビトール等の糖アルコール；ナトリウム等の対イオン；ならびに／またはＴＷＥＥＮ、ＰＬＵＲＯＮＩＣＳまたはポリエチレングリコール等の非イオン性界面活性剤を含み得る。
【００４５】
インビトロ投与に使用される場合、抗体／自己抗原コンストラクト製剤は無菌でなければならず、従来の医薬の慣例に従って製剤化することができる。これは、凍結乾燥および再構成の前または後に、無菌ろ過膜を通したろ過によって容易に達成される。抗体は、通常、凍結乾燥形態または溶液中で保存される。ゴマ、落花生、もしくは綿実油のような天然に存在する植物性油またはオレイン酸エチル等のような合成脂肪ビヒクル等の他のビヒクルが所望され得る。バッファー、保存薬、抗酸化物質等は、一般に容認された医薬の慣例に従って組み込むことができる。
【００４６】
使用に適した医薬組成物としては、１つまたは複数の抗体／自己抗原コンストラクトが、それらの意図される目的を達成するのに有効な量含まれた、組成物が挙げられる。より具体的には、治療有効量とは、疾患の症状を予防、緩和、もしくは改善するのに、または治療される被験体の生存を延長するのに有効な抗体の量を意味する。治療有効量の決定は、特に本明細書中に提供される詳細な開示に照らして、十分に当業者の能力の範囲内である。治療有効量は、インビトロおよびインビボの方法を用いることによって決定することができる。
【００４７】
治療に使用される有効量の抗体／自己抗原コンストラクトは、例えば、治療目的、投与の経路、および患者の状態に依存する。また、主治医は、重症度および疾患の型、体重、性別、食事、投与の時間および経路、他の薬物適用ならびに他の関連性のある臨床上の要因を含む、薬物の作用を変化させることが公知の種々の要因を考慮に入れる。したがって、療法士は、最適の治療効果を得るのに必要なように、投薬量を滴定し、投与の経路を変更する必要がある。典型的には、臨床家は、所望の効果を達成する投薬量に達するまで、抗体／自己抗原コンストラクトを投与する。この療法の進行は、従来のアッセイによって容易にモニタリングされる。
【００４８】
任意の抗体／自己抗原コンストラクトについて、治療有効量は、細胞培養アッセイから最初に推定することができる。例えば、動物モデルにおいて用量を処方して、細胞培養物中で測定されるＥＣ５０を含む循環濃度範囲を達成することができる（例えば、細胞増殖または分化を促進または阻害する試験分子の濃度）。かかる情報を用いて、ヒトにおける有用な用量をより正確に決定することができる。
【００４９】
本明細書中に記載される抗体／自己抗原コンストラクトの毒性および治療効能は、例えばＬＤ５０（集団の５０％にとって致死的な用量）およびＥＤ５０（集団の５０％において治療上有効な用量）を決定するために、細胞培養物または実験動物において、標準的な医薬の手順によって決定することができる。毒性および治療効能の間の用量比は治療指数であり、これはＬＤ５０とＥＤ５０との間の比として表すことができる。高い治療指数を示す分子が好ましい。これらの細胞培養アッセイおよび動物研究から得られるデータは、ヒトにおける使用のための投薬の範囲を処方するのに使用することができる。かかる分子の投薬量は、好ましくは、毒性がわずかであるかまたは毒性のない、ＥＤ５０を含む循環濃度の範囲内にある。投薬量は、使用される投薬形態および利用される投与の経路に応じて、この範囲内で変化し得る。正確な製剤化、投与の経路および投薬量は、患者の状態を考慮して、それぞれの医師によって選択され得る。（例えば、Ｆｉｎｇｌら、１９７５年、「Ｔｈｅ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ Ｂａｓｉｓ ｏｆ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ」中、第１章１頁参照。）
投薬の量および間隔を個々に調節して、細胞増殖または分化を促進または阻害するのに十分である抗体／自己抗原コンストラクトの血漿レベルまたは最小有効濃度（ＭＥＣ）を提供することができる。ＭＥＣは、各抗体／自己抗原コンストラクトについて変化するが、記載されるアッセイを用いたインビトロデータから推定することができる。ＭＥＣを達成するのに必要な投薬量は、個々の特徴および投与の経路に依存する。しかしながら、ＨＰＬＣアッセイまたはバイオアッセイを用いて、血漿濃度を決定することができる。
【００５０】
投薬間隔もまた、ＭＥＣ値を用いて決定することができる。抗体／自己抗原コンストラクト分子は、時間の１０〜９０％、好ましくは３０〜９０％の間、最も好ましくは５０〜９０％の間にわたって、ＭＥＣより高い血漿レベルを維持する養生法を用いて投与されるべきである。
【００５１】
局所的投与または選択的取り込みの場合、抗体／自己抗原コンストラクトの効果的な局所濃度は、血漿濃度と関連していなくてもよい。
【００５２】
典型的な１日の投薬量は、上述の要因により、約１μｇ／ｋｇ〜１０００ｍｇ／ｋｇまで、またはそれより多い範囲であり得る。典型的には、臨床家は、投薬量が所望の効果を達成する量に達するまで、抗体／自己抗原コンストラクトを投与する。この療法の進行は、従来のアッセイによって容易にモニタリングされる。
【００５３】
疾患の型および重症度に応じて、例えば、１つもしくは複数の別々の投与によってであれ、または継続的な注入によってであれ、約０．００１ｍｇ／ｋｇ〜約１０００ｍｇ／ｋｇ、より好ましくは約０．０１ｍｇ〜１００ｍｇ／ｋｇ、より好ましくは約０．０１０〜２０ｍｇ／ｋｇの抗体／自己抗原コンストラクトが、患者への投与のための最初の候補の投薬量であり得る。数日またはより長い期間にわたる繰り返しの投与のために、状態に応じて、疾患症状の所望の抑制が起こるか、または患者の状態の所望の改善が達成されるまで、治療が繰り返される。しかしながら、他の投与計画もまた、有用であり得る。
【００５４】
特に有用な実施形態において、開示される方法を用いて、膵臓内のランゲルハンス島のインスリン産生β細胞に対する免疫寛容を誘導することによって、真正糖尿病を治療することができる。これらの細胞の自己抗原を、所望の抗原内在化受容体を認識する抗体に連結させる。本開示における使用に適した自己抗原は、β細胞抗原、ならびに、インスリン、グルタミン酸デカルボキシラーゼ（「ＧＡＤ」）および熱ショックタンパク質（「ＨＳＰ」）の、エピトープ、またはエピトープを提示するペプチドである。インスリン、ＧＡＤおよびｈｓｐからのエピトープを覆う一連のペプチドを抗ＤＣ−ＳＩＧＮＲ抗体に連結させることは、Ｔ１ＤＭに関与するすべての主要抗原に対する寛容性を誘導する能力を有する。他の自己抗原は、当業者によって、公知であり、使用され得るか、または発見されて使用され得る。
【００５５】
抗原内在化受容体は、特殊化したＡＰＣ上に提示されている。この方法のために、選択された抗原内在化受容体は、ＤＣ−ＳＩＧＮＲ（樹状細胞特異的細胞間接着分子３−捕捉性非インテグリン関連受容体）である。ＤＣ−ＳＩＧＮＲは、肝臓常在性の抗原提示細胞である、肝類洞内皮細胞（「ＬＳＥＣ」）によって発現される。（１Ｐｏｈｌｍａｎｎら、２００１年）。ＤＣ−ＳＩＧＮＲは、受容体結合タンパク質を内在化させ、抗原提示を容易にする、病原体内在化受容体のファミリーに属する。（１Ｇｅｉｊｔｅｎｂｅｅｋら、２００２年）。ＬＳＥＣによる抗原の提示が抗原特異的寛容性を生じることが示されている（Ｌｉｍｍｅｒら、２０００年）。未成熟の免疫寛容誘発状態から活性化状態へと成熟し得る他の樹状細胞型と対照的に、肝類洞内皮細胞は、活性化抗原提示細胞に発達するよう誘導されることができない（２Ｋｎｏｌｌｅら、１９９９年）。ヒトＤＣ−ＳＩＧＮに対するヒトＤＣ−ＳＩＧＮＲ（Ｌ−ＳＩＧＮとも呼ばれる）ホモログは、ＤＣ−ＳＩＧＮに対して、アミノ酸レベルで７７％の同一性を示し、内在化受容体の典型的なドメインを有する（Ｂａｓｈｉｒｏｖａら、２００１年、Ｓｏｉｌｌｅｕｘら、２０００年）。ＤＣ−ＳＩＧＮＲはＬＳＥＣで高度に発現され、リンパ節マクロファージ様細胞の副次集団にも見られるが、ＤＣによって発現されない。
【００５６】
本開示の目的のために、用語「ＤＣ−ＳＩＧＮＲ」および「Ｌ−ＳＩＧＮ」は、交換可能に使用される。
【００５７】
Ｃ型レクチンマウスＤＣ−ＳＩＧＮ（ＤＣ２０９）は、最近、ＤＣ特異的受容体として同定された。ＤＣ−ＳＩＧＮは、一時的なＤＣ−Ｔ細胞相互作用を開始させることによって初期免疫応答を可能にする、ＤＣの経内皮移動を媒介する（３Ｇｅｉｊｔｅｎｂｅｅｋら、２０００年、２Ｇｅｉｊｔｅｎｂｅｅｋら、２０００年）。ＤＣ−ＳＩＧＮはまた、炭水化物構造を通して病原体を認識する内在化抗原受容体として働く。ＤＣ−Ｔ細胞クラスター化およびＴ細胞応答の開始におけるその顕著な役割の他に、ＤＣ−ＳＩＧＮは、ＨＩＶ−１、ＨＩＶ−２、ＳＩＶ−１、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）、エボラウイルス、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）、デング熱ウイルス等のウイルス；ヘリコバクターピロリ（Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ ｐｙｌｏｒｉ）、肺炎杆菌（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｎａｅ）、ヒト結核菌等の細菌；カンジダアルビカンス（Ｃａｎｄｉｄａ ａｌｂｉｃａｎｓ）等の酵母；およびピファノリーシュマニア（Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａ ｐｉｆａｎｏｉ）、マンソン住血吸虫等の寄生生物の、ＤＣの感染およびそれに続くＴ細胞への伝播に関係する主要な受容体である。ＤＣ−ＳＩＧＮＲのマウスのホモログであるｍＳＩＧＮＲ１は、迅速に内在化されプロセシングのためにリソゾームに標的化される、抗原を捕捉する（１Ｇｅｉｊｔｅｎｂｅｅｋら、２００２年）。アミノ酸配列に基づくと、マウスｍＳＩＧＮＲ１は、ヒトＤＣ−ＳＩＧＮに対するのと同程度に、ヒトＤＣ−ＳＩＧＮＲに対して相同であり、したがって、動物モデリング研究に有用である。
【００５８】
したがって、別の態様において、本開示は、抗ＤＣ−ＳＩＧＮＲ（すなわち、抗Ｌ−ＳＩＧＮ）抗体に関する。上記のように、用語「抗体」は、本明細書中で使用される場合、免疫グロブリン分子全体、または、免疫グロブリン分子全体の免疫学的に活性のある一部を含む分子をいい、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、ｓｃＦｖ、Ｆｖ、重鎖可変領域および軽鎖可変領域を含む。
【００５９】
ある実施形態において、本開示の抗体は、軽鎖を含む。本明細書中で使用される場合、「軽鎖」は、１つの可変ドメイン（ＶＬ）および１つの定常ドメイン（ＣＬ）で構成される抗体分子の、小さい方のポリペプチド、またはその断片を意味する。別の実施形態において、抗体の一部は、重鎖を含む。本明細書中で使用される場合、「重鎖」は、１つの可変ドメイン（ＶＨ）および３つもしくは４つの定常ドメイン（ＣＨ１、ＣＨ２、ＣＨ３、およびＣＨ４）で構成される抗体分子の、大きい方のポリペプチド、またはその断片を意味する。
【００６０】
別の実施形態において、抗体は、抗体のＦａｂ部分を含む。本明細書中で使用される場合、「Ｆａｂ」は、１つの軽鎖および重鎖の一部からなる、免疫グロブリンの、一価の抗原結合断片を意味する。これは、短時間のパパイン消化によって、または組み換え方法によって得ることができる。別の実施形態において、抗体の一部は、抗体のＦ（ａｂ’）２部分を含む。本明細書中で使用される場合、「Ｆ（ａｂ’）２断片」は、両方の軽鎖および両方の重鎖の一部からなる、免疫グロブリンの、二価の抗原結合断片を意味する。これは、短時間のペプシン消化、または組み換え方法によって得ることができる。他の実施形態において、抗体は、Ｆａｂ’断片であり得る。Ｆａｂ発現ライブラリーは、例えば、Ｈｕｓｅら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４５： １２７５頁（１９８９年）の方法によって得ることができる。
【００６１】
さらに、抗原提示細胞上の受容体に結合する「ヒト化」抗体を用いてもよい。ヒト化の方法は、例えば、国際公開第９８／４９３０６号、米国特許第５５８５０８９号、同第５２２５５３９号および同第５６９３７６１号ならびに国際公開第９０／０７８６１号に開示されており、その開示は、その全体が参照によって本明細書中に援用される。本明細書中で使用される場合、「ヒト化」抗体は、ＣＤＲ外部のアミノ酸が、ヒト免疫グロブリン分子由来の対応するアミノ酸で置換されている抗体である。「ＣＤＲ」または「相補性決定領域」は、抗体の可変ドメインにおける、高度に可変性のアミノ酸の配列を意味する。組み換えＤＮＡ技術を用いて、ヒト化抗体が所望の標的を認識するがヒト被験体の免疫系によって相当に認識されないように、１つの免疫グロブリンの可変領域のＣＤＲが異なる特異性を有する免疫グロブリン由来のＣＤＲで置換された、ヒト化抗体を生成することができる。
【００６２】
他の実施形態において、ヒト定常領域に連結された任意の抗原提示細胞上の任意の受容体に結合する非ヒト可変ドメインを含むキメラ抗体が企図される。可変ドメインが結合する受容体は、例えば、Ｌ−ＳＩＧＮまたはＤＣ−ＳＩＧＮであってよく、定常領域は、ヒトＩｇＧ１定常領域であってよい。驚くべきことに、下記でより詳細に説明されている特定の実施形態において、かかるキメラ抗体は、任意の抗原提示細胞上の受容体に対して、可変ドメイン単独よりも有利な結合を示すことがわかっている。
【００６３】
抗体クローンの、完全なＩｇＧへの変換のために、軽鎖および重鎖の両方、またはその断片のコード領域を、細菌ベクターから、哺乳動物ベクター（複数可）内へ、別々にクローニングすることができる。ｐＤＲ１またのその誘導体等の単一のベクター系を用いて、軽鎖および重鎖カセットの両方を、同じプラスミドにクローニングすることができる。あるいは、重鎖および軽鎖が別々のプラスミドによって生成される二重発現ベクターを用いることができる。哺乳動物シグナル配列は、最終的なベクターにすでに存在しているか、または軽鎖および重鎖ＤＮＡインサートの５’末端に付加されるかの、いずれかである必要がある。これは、適当な哺乳動物リーダー配列を含むシャトルベクター（複数可）への、最初の鎖の転移によって達成することができる。制限酵素消化の後、軽鎖および重鎖領域、またはその断片を、ＩｇＧの残りの定常領域がイントロンありまたはなしで提供される、最終的なベクター（複数可）に導入する。
【００６４】
本開示による抗体は、Ｌ−ＳＩＧＮおよびＤＣ−ＳＩＧＮの両方に結合することができ、Ｌ−ＳＩＧＮ優先的に結合する。すなわち、Ｌ−ＳＩＧＮへの結合は、ＤＣ−ＳＩＧＮへの結合よりも強くあり得る。Ｌ−ＳＩＧＮへの結合は、例えば、ＤＣ−ＳＩＧＮへの結合よりも、１．１〜２００倍強くあり得る。あるいは、−ＳＩＧＮへの結合は、ＤＣ−ＳＩＧＮへの結合よりも、１．２〜１００倍強くあり得る。
【００６５】
いくつかの実施形態において、ＤＣ−ＳＩＧＮＲに対する抗体は、ＤＣ−ＳＩＧＮＲ発現細胞の、ＩＣＡＭ発現細胞との相互作用を調節、すなわち、阻害または増強する。一実施形態において、抗ＤＣ−ＳＩＧＮＲ抗体は、ＬＳＥＣ等の抗原提示細胞の表面上のＤＣ−ＳＩＧＮＲ受容体部位に結合し、ＬＳＥＣとＴ細胞との間の相互作用（複数可）を妨げる。より具体的には、ＤＣ−ＳＩＧＮＲに対する抗体は、Ｔ細胞の表面上のＤＣ−ＳＩＧＮＲとＩＣＡＭ受容体との間の接着に干渉することによって、ＬＳＥＣとＴ細胞との間の接着を減少させる。この相互作用のブロッキングによって、免疫応答を調節することができる。例えば、ＤＣ−ＳＩＧＮＲに対する抗体は、Ｌ−ＳＩＧＮとＴ細胞との相互作用をブロックすることによって免疫機能を調節することができ、それによって、肝臓で見られるものを含む、調節性Ｔ細胞の増殖を引き起こすことができる。別の実施形態において、ＤＣ−ＳＩＧＮＲに対する抗体は、Ｌ−ＳＩＧＮとＴ細胞との相互作用をブロックすることによって免疫機能を調節することができ、それによって、リンパ節で見られるものを含む、自己反応性Ｔ細胞の増殖を抑制することができる。
【００６６】
いくつかのさらなる実施形態において、本開示の抗体を利用して、肝類洞内皮細胞に結合することができる抗体−ペプチドコンストラクトを形成することができ、それによって、調節性細胞の増殖を刺激することができるか、または、本開示の抗体を利用して、肝類洞内皮細胞に結合することができる抗体−ペプチドコンストラクトを形成することができ、それによって、自己反応性Ｔ細胞の活性を抑制することができる。本開示の抗体−ペプチドコンストラクトを用いて、リンパ節で見られるものを含む類洞内皮細胞に、ワクチン抗原を送達することもでき、それによって、抗原特異的Ｔ細胞の増殖を刺激することができる。
【００６７】
本明細書中で使用される場合、「ＩＣＡＭ受容体（複数可）」は、ＩＣＡＭ−２およびＩＣＡＭ−３受容体の両方、特にＩＣＡＭ−３を意味する。
【００６８】
いくつかの実施形態において、本開示のＤＣ−ＳＩＧＮＲに対する抗体は、ＤＣ−ＳＩＧＮに結合しない。他の実施形態において、本開示の抗体は、ＤＣ−ＳＩＧＮＲに対する高い親和性およびＤＣ−ＳＩＧＮに対する低い親和性を有する。本開示の抗体は、ＤＣ−ＳＩＧＮＲ上の線状および立体的エピトープの両方に結合できる場合もある。
【００６９】
本抗体または抗体／ペプチドコンストラクトがＤＣ−ＳＩＧＮＲ提示細胞に対する毒素で標識することができることも企図される。次いで、毒素で標識された、抗ＤＣ−ＳＩＧＮＲ抗体または抗ＤＣ−ＳＩＧＮＲ抗体／ペプチドコンストラクトの投与を利用して、ＤＣ−ＳＩＧＮＲ発現細胞のレベルを減少させることができ、これは自己免疫疾患、癌または炎症性疾患の治療等のいくつかの場合において有利であり得る。このようにして、本抗体または抗体／ペプチドコンストラクトを利用して、ＤＣ−ＳＩＧＮＲ発現細胞をインビボで死滅させるか、または除去することもできる。これは、細胞毒性薬物（例えば、毒素または放射線放射化合物）に結合した、抗体または抗体／ペプチドコンストラクトを、かかる処置を必要とする被験体に投与することを含む。抗体または抗体／ペプチドコンストラクトはＤＣ−ＳＩＧＮＲ発現細胞（例えば、癌細胞または肝類洞内皮細胞）を認識するので、抗体または抗体／ペプチドコンストラクトが結合している任意のかかる細胞が破壊される。一実施形態において、本開示による、癌を治療する方法は、効果的な、癌細胞を死滅させる量の、毒素の結合している、抗ＤＣ−ＳＩＧＮＲ抗体または抗ＤＣ−ＳＩＧＮＲ抗体／ペプチドコンストラクトを、癌患者に投与すること含む。別の実施形態において、本開示による、炎症性疾患を治療する方法は、効果的な、ＤＣ−ＳＩＧＮＲ発現細胞を死滅させる量の、毒素の結合している抗ＤＣ−ＳＩＧＮＲ抗体または抗ＤＣ−ＳＩＧＮＲ抗体／ペプチドコンストラクトを、炎症性疾患に罹患した患者に投与することを含む。
【００７０】
他の実施形態において、本開示のＤＣ−ＳＩＧＮＲに対する抗体は、肝類洞細胞等の肝細胞へのウイルスの侵入および他の細胞へのそれらの感染をブロックする。本開示のＤＣ−ＳＩＧＮＲに対する抗体はまた、Ｔ細胞へのウイルスの侵入および他の細胞へのそれらの感染をブロックすることができる。
【００７１】
いくつかの実施形態において、本開示のＤＣ−ＳＩＧＮＲに対する抗体を利用して、ミコバクテリウム属の細菌による感染をブロックすることができる。ブロックすることができる感染としては、ヒト結核菌およびウシ結核菌によって引き起こされるものが挙げられる。
【００７２】
抗原提示細胞へのＴ細胞の接着に干渉することによって、ＤＣ−ＳＩＧＮＲに対する抗体の使用は、抗原提示細胞−Ｔ細胞クラスター化、Ｔ細胞活性化、および抗原提示細胞とＴ細胞との間の接触に依存する他の相互作用に影響を及ぼす。これらの他の相互作用としては、直接の細胞−細胞接触、または抗原提示細胞とＴ細胞とがきわめて近接していることが挙げられる。
【００７３】
他の実施形態において、本開示の抗ＤＣ−ＳＩＧＮＲ抗体は、自己抗原、または自己抗原のペプチド等の、ペプチドに連結される。これらのペプチドは、ベクターを抗体断片に移植して、連結したベクター／抗体をクローニングすること、または化学的に連結することを含む、任意の適した方法によって、抗ＤＣ−ＳＩＧＮＲ抗体に連結することができる。ベクターの連結、クローニングまたは化学的連結の方法は、当業者に周知である。
【００７４】
連結した抗体に沿った、ペプチド、好ましくは自己抗原は、次いで、ＬＳＥＣに内在化される。ＬＳＥＣは、ＭＨＣ ＩＩ、ＣＤ８０およびＣＤ８６等の、抗原提示に必要な表面分子を有する（Ｌｏｈｓｅら、１９９６年、Ｒｕｂｉｎｓｔｅｉｎら、１９８６年）。未処置のＣＤ４＋Ｔ細胞において調節性の表現型を誘導することに加えて（Ｋｎｏｌｌｅら、１９９９年）、ＬＳＥＣは、外因性抗原を交差提示することによって、ＣＤ８＋Ｔ細胞における寛容性を誘導することができる（Ｌｉｍｍｅｒら、２０００年）。ＬＳＥＣは、ＭＨＣのダウンレギュレーション、およびエンドソームのプロセシングを妨げることによって、ＴＮＦ−αおよび内毒素としての刺激に応答する（２Ｋｎｏｌｌｅら、１９９９年）。さらに、ＬＳＥＣは、肝臓からリンパ器官へ移動しない。
【００７５】
この内在化によって、ＭＨＣ相互作用によって媒介される、ＬＳＥＣの表面への、自己抗原のペプチドの提示が容易になる。一旦自己抗原が共刺激能力を有するＬＳＥＣの表面で発現されると、未処置の自己反応性Ｔ細胞が活性化状態になり得る。Ｔ細胞は、連結した自己抗原を標的とし、これと反応する。エフェクターＴ細胞は、少数のＬＳＥＣを死滅させ、共刺激分子なしで死に絶える。ＬＳＥＣによる、自己抗原のこの提示は、自己抗原特異的寛容性を生じる。
【００７６】
肝臓は、ＩＬ−１０およびＴＧＦ−β等の豊富な免疫寛容誘発メディエータ、ならびに免疫学的寛容性の発達に有利である特殊化したＡＰＣを有する、独特の微環境を有する（１ＫｎｏｌｌｅおよびＧｅｒｋｅｎ、２０００年）。肝臓の免疫寛容誘発特性は、同種異系の肝臓移植がＭＨＣ障壁を横切って許容され得るという発見によって支持されている（Ｃａｌｎｅ、１９６９年）。さらに、門脈による抗原の適用は、抗原の全身性の適用よりも、寛容性に、よりつながりそうである（Ｋａｍｅｉら、１９９０年）。肝臓を通した排出が、経口免疫寛容誘導の必要条件であると報告されている（Ｙａｎｇら、１９９４年）。肝血管を通る血液は、まずクップファー細胞およびＬＳＥＣと接触するようになる。肝類洞を通った血流は遅く、肝類洞細胞集団と通過する白血球との間の接触が可能になる。ＬＳＥＣは、ＭＨＣＩＩ、ＣＤ８０およびＣＤ８６等の、抗原提示に必要な表面分子を有する（Ｌｏｈｓｅら、１９９６年、Ｒｕｂｉｎｓｔｅｉｎら、１９８６年）。未処置のＣＤ４＋Ｔ細胞において調節性の表現型を誘導することに加えて（Ｋｎｏｌｌｅら、１９９９年）、ＬＳＥＣは、外因性抗原を交差提示することによって、ＣＤ８＋Ｔ細胞における寛容性を誘導することができる（Ｌｉｍｍｅｒら、２０００年）。Ｋｌｕｇｅｗｉｔｚら（Ｋｌｕｇｅｗｉｔｚら、２００２年）は、マウスへのＴｈ１、ＩＦＮ−γ産生ＴＣＲトランスジェニック細胞の注射が、静脈内タンパク質免疫の後に、肝臓におけるこれらの細胞によるＩＦＮ−γ産生の抑制、およびＴｈ２細胞の促進を生じることを示した。未成熟な免疫寛容誘発段階から免疫を開始する成熟した段階へ分化することができるプロフェッショナル骨髄性ＡＰＣと対照的に、ＬＳＥＣは、ＭＨＣのダウンレギュレーション、およびエンドソームのプロセシングを妨げることによって、ＴＮＦ−αおよび内毒素としての刺激に応答する（２Ｋｎｏｌｌｅら、１９９９年）。さらに、ＬＳＥＣは、肝臓からリンパ器官へ移動しない。ＬＳＥＣは、寛容性を誘導するときに特殊化される唯一のＡＰＣではないこともある。Ｐｕｇｌｉｅｓｅらは、最近、内因性で発現された自己抗原を提示することによって寛容性を誘導した脾臓ＤＣの小さいサブセットを同定した（Ｐｕｇｌｉｅｓｅら、２００１年）。全体的に見て、ＬＳＥＣは、寛容性誘導の目的でβ細胞抗原を提示するのに望ましい細胞型のようである。
【００７７】
また、ＤＣ−ＳＩＧＮおよびＬ−ＳＩＧＮの両方とも、多くのウイルス、例えばＨＩＶ（Ｂａｓｈｉｒｏｖａら、２００１年、２Ｐｏｈｌｍａｎｎら、２００１年）、ＨＣＶ（Ｇａｒｄｎｅｒら、２００３年）、エボラ（Ａｌｖａｒｅｚら、２００２年、Ｓｉｍｍｏｎｓら、２００３年）、ＳＡＲＳ（Ｊｅｆｆｅｒｓら、２００４年）、ＣＭＶ（Ｈａｌａｒｙら、２００２年）、およびシンドビス（Ｋｌｉｍｓｔｒａら、２００３年）に結合することが示されている。これらの受容体は、ＨＩＶおよびＨＣＶの接着点として、これらを他の細胞、例えばＴ細胞へ途中で伝播して作用するが（Ｂａｓｈｉｒｏｖａら、２００１年、２Ｐｏｈｌｍａｎｎら、２００１年、Ｃｏｒｍｉｅｒら、２００４年）、これらはまた、エボラ、ＳＡＲＳ、ＣＭＶおよびシンドビスウイルスに結合し、これらよる受容体発現細胞への侵入および感染を許す。また、ＤＣ−ＳＩＧＮおよびＬ−ＳＩＧＮの両方とも、ヒト結核菌を含むミコバクテリウム属の細菌性病原体（４Ｇｅｉｊｔｅｎｂｅｅｋら、２００３年、Ｋｏｐｐｅｌら、２００４年）、ならびにマンソン住血吸虫等の寄生生物（Ｖａｎ Ｌｉｅｍｐｔら、２００４年）による感染のための受容体として働く。
【００７８】
したがって、別の実施形態において、本開示の抗体を利用して、ＤＣ−ＳＩＧＮおよび／またはＬ−ＳＩＧＮに結合し、それによって、ＨＩＶ、ＨＣＶ、エボラ、ＳＡＲＳ、ＣＭＶおよびシンドビス等のウイルス、ヒト結核菌およびウシ結核菌を含むミコバクテリウム属の細菌性病原体、ならびにマンソン住血吸虫等の寄生生物を含むがこれらに限定されない感染性作用物質の結合、感染、および伝播をブロックすることができる。
【００７９】
本開示のＤＣ−ＳＩＧＮＲに対する抗体はまた、ＤＣ−ＳＩＧＮＲ発現に関連する腫瘍型の、通法の診断法として利用することもできる。例えば、免疫受容体のアップレギュレーションは免疫系による圧力下でのみ起こると予測されるので、癌試料におけるＤＣ−ＳＩＧＮＲのアップレギュレーションを、癌が免疫系に曝露されるようになったかどうかを評価するための診断手段の基礎として利用することができた。免疫組織化学および／またはＦＡＣＳ解析を含む、当業者に公知の方法を用いて、腫瘍生検をＤＣ−ＳＩＧＮＲに対する抗体に曝露し、次いで、ＤＣ−ＳＩＧＮＲ発現に関連する癌の指標である、結合した抗体の存在について解析してもよい。いくつかの実施形態において、抗体は、ＤＣ−ＳＩＧＮＲを発現する癌の存在を決定するための診断キットの一部として提供されてもよい。
【００８０】
本開示のＤＣ−ＳＩＧＮＲに対する抗体はまた、癌治療のための治療術として利用することもできる。一実施形態において、本開示の抗体は、腫瘍細胞のＡＤＣＣ（抗体依存性細胞毒性）またはＣＤＣ（補体依存性細胞毒性）を誘導し、それによって前記細胞を死滅させる。
【００８１】
本抗体または抗体／ペプチドコンストラクトを利用して、癌性細胞をインビボで死滅させるか、または除去することもできる。これは、細胞毒性薬物に結合した抗体または抗体／ペプチドコンストラクトを、かかる処置を必要とする被験体に投与することを含む。抗体または抗体／ペプチドコンストラクトは癌細胞を認識するので、抗体または抗体／ペプチドコンストラクトが結合している任意のかかる細胞が、破壊される。
【００８２】
本開示の抗体または抗体／ペプチドコンストラクトを用いて、種々の細胞毒性化合物を送達することができる。任意の細胞毒性化合物を本抗体または抗体／ペプチドコンストラクトに融合させることができる。融合は、化学的または遺伝学的に（例えば、単一の融合分子としての発現によって）達成することができる。細胞毒性化合物は、ポリペプチド等の生物学的、または小さい分子であり得る。当業者が認めるように、小さい分子については化学的融合が用いられるが、生物学的化合物については、化学的または遺伝学的融合のいずれかを使用することができる。
【００８３】
本開示の抗体または抗体／ペプチドコンストラクトを用いて、治療薬；放射線を放射する化合物；植物、真菌、または細菌由来の分子；生物学的タンパク質；およびそれらの混合物を含む、種々の細胞毒性薬物を送達することができる。細胞毒性薬物は、例えば短距離高エネルギーα−放射体を含む、短距離放射線放射体等の、細胞内で作用する細胞毒性薬物であってもよい。酵素的に活性のある毒素およびその断片は、例えば、ジフテリア毒素Ａ断片、ジフテリア毒素の非結合活性断片、外毒素Ａ（緑膿菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）由来）、リシンＡ鎖、アブリンＡ鎖、モデシンＡ鎖、α−サクリン、ある種のシナアブラギリ（Ａｌｅｕｒｉｔｅｓ ｆｏｒｄｉｉ）タンパク質、ある種のジアンチンタンパク質、ヨウシュヤマゴボウ（Ｐｈｙｔｏｌａｃｃａ ａｍｅｒｉｃａｎａ）タンパク質（ＰＡＰ、ＰＡＰＩＩおよびＰＡＰ−Ｓ）、モロディカカランチア（Ｍｏｒｏｄｉｃａ ｃｈａｒａｎｔｉａ）インヒビター、クルシン、クロチン、サボンソウ（Ｓａｐｏｎａｒｉａ ｏｆｆｉｃｉｎａｌｉｓ）インヒビター、ゲロニン、マイトジリン、レストリクトシン、フェノマイシン、およびエノマイシンによって例示される。免疫毒素の、酵素的に活性のあるポリペプチドの調製のための手順は、参照によって本明細書中に援用される、国際公開第８４／０３５０８号および国際公開第８５／０３５０８号に記載されている。ある種の細胞毒性部分は、例えば、アドリアマイシン、クロラムブシル、ダウノマイシン、メトトレキサート、ネオカルチノスタチン、および白金に由来する。
【００８４】
抗体または抗体／ペプチドコンストラクトを細胞毒性作用物質と複合化する手順は、これまでに記載されている。
【００８５】
あるいは、本開示の抗体または抗体／ペプチドコンストラクトを、腫瘍部位に局在すると数細胞直径を死滅させる、高エネルギー放射線放射体、例えば、γ−放射体である１３１Ｉ等の放射性同位元素に、結合してもよい。例えば、参照によって本明細書中に援用される、Ｓ． Ｅ． Ｏｒｄｅｒ、「Ａｎａｌｙｓｉｓ， Ｒｅｓｕｌｔｓ， ａｎｄ Ｆｕｔｕｒｅ Ｐｒｏｓｐｅｃｔｉｖｅ ｏｆ ｔｈｅ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ｕｓｅ ｏｆ Ｒａｄｉｏｌａｂｅｌｅｄ Ａｎｔｉｂｏｄｙ ｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒａｐｙ」、Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｆｏｒ Ｃａｎｃｅｒ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ａｎｄ Ｔｈｅｒａｐｙ、Ｒ． Ｗ． Ｂａｌｄｗｉｎら（編）、３０３〜３１６頁（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、１９８５年）を参照のこと。他の適した放射性同位元素としては、２１２Ｂｉ、２１３Ｂｉ、および２１１Ａｔ等のα−放射体、ならびに１８６Ｒｅおよび９０Ｙ等のβ−放射体が挙げられる。前立腺癌は比較的放射線感受性の腫瘍なので、放射線治療は、前立腺癌に関連して、特に効果的であると期待される。
【００８６】
別の実施形態において、Ｌ−ＳＩＧＮに結合すること、およびＬ−ＳＩＧＮ発現癌細胞を通した免疫系の負の調節を防ぐことによって、本開示のＬ−ＳＩＧＮに対する抗体を、腫瘍を治療するための治療術として利用することができる。この負の調節を防ぐことによって、免疫系が進行して癌細胞を根絶することができる。
【００８７】
上述の治療の効能は、異種移植モデルを含む、当業者に公知の方法を利用して確認することができる。
【００８８】
癌治療術として利用される、本開示によるＬ−ＳＩＧＮに対する抗体はまた、癌ワクチン、抗ＣＴＬＡ−４、抗ＣＤ２５またはシクロホスファミド等の任意の他の免疫調節療法と組み合わせて、癌の治療において、治療効能の増大を達成することができる。
【００８９】
本開示によるＬ−ＳＩＧＮに対する抗体をいくつかの実施形態において用いて、Ｌ−ＳＩＧＮを発現していない細胞が含まれる細胞の混合物中で見られる、Ｌ−ＳＩＧＮ発現細胞を単離することもできる。例えば、類洞内皮細胞、赤血球、クップファー細胞および他の少数の細胞集団の混合物を含むヒト非実質性肝細胞は、商業的供給源から容易に得ることができる。ヒト非実質性肝細胞から、Ｌ−ＳＩＧＮ発現細胞、すなわち肝類洞細胞を単離するために、赤血球を、赤血球の溶解を生じる塩化アンモニウム等の作用物質に曝露することができる。ミルテニーバイオテク（ドイツ）によって販売されているものを含む市販の死細胞除去キットを用いて、死細胞を除くことができる。残りの細胞を計数し、抗Ｌ−ＳＩＧＮ抗体で標識することができる。細胞を洗浄した後、それらを適切なバッファーに再懸濁し、残りの細胞を、いくつかの場合においてビーズまたは同様の分離媒体に複合化してもよい抗Ｌ−ＳＩＧＮ抗体に曝露することによって、目的の細胞、すなわちＬ−ＳＩＧＮ発現細胞を単離することができる。市販の分離媒体およびそれらの使用の方法は当業者に公知であり、ミルテニーからの市販のビーズを含む。いくつかの特に有用な実施形態において、製造業者の使用説明書（ミルテニー）に従って、抗Ｌ−ＳＩＧＮ複合ビーズ、例えば抗マウスＩｇＧ複合ビーズを用いることによって、Ｌ−ＳＩＧＮ発現細胞を、Ｌ−ＳＩＧＮを発現していない細胞から単離することができる。抗Ｌ−ＳＩＧＮ抗体に結合している細胞はＬ−ＳＩＧＮ発現細胞であり、それによって、Ｌ−ＳＩＧＮを発現していない残りの細胞から単離される。一旦残りの細胞から単離されると、Ｌ−ＳＩＧＮ発現細胞は、当業者に容易に知られている方法を用いて抗Ｌ−ＳＩＧＮ抗体から除去することができる。単離の質は、ＣＤ５４、マンノース受容体、ＬＹＶＥ−１、ＣＤ４０、アシアロ糖タンパク質および他のもの等の分子に対する一団の抗体を用いたＦＡＣＳ解析を含む、当業者に公知の方法によってモニタリングすることができる。
【００９０】
そのさらなる好ましい態様および実施形態を含む、本方法の実際は、例示のためのみに提示される以下の実施例から、より深く理解され、決して限定すると解釈されるべきではない。
【実施例】
【００９１】
（実施例１）
抗ｍＳＩＧＮＲ１抗体を得ること
ファージディスプレイ技術を用いて、ｍＳＩＧＮＲ１を認識する一団の単鎖抗体（ｓｃＦｖ）を同定した。ｓｃＦｖは、リンカーによって連結された、可変軽鎖領域および可変重鎖領域を含む。それらの短い長さによって、これらの抗体断片が、抗原結合に非常に適するようになり、受容体への結合能力が保存される。ウサギを組み換えｍＳＩＧＮＲ１で免疫し、その開示が参照によって本明細書中に援用される、２００２年６月１３日に公開された国際出願公開第０２／４６４３６Ａ２号に記載されている、ファージディスプレイベクターｐＲＬ４を用いて、ｓｃＦｖ抗体ライブラリーを構築した。このシステムにおける抗体断片は、ファージの遺伝子ＩＩＩコートタンパク質上に提示される。ｍＳＩＧＮＲ１を認識する抗体を、組み換えｍＳＩＧＮＲ１の４回の固相パニングによって単離した。６つの異なる抗体を同定した。これら６つの抗体のアミノ酸配列を、図２ＡおよびＢに示す（それぞれ配列番号１〜６および７〜１２）。すべての抗体は、固相ＥＬＩＳＡにおいてｍＳＩＧＮＲ１を認識し、ヒトＤＣ−ＳＩＧＮのマウスホモログであるｍＤＣ−ＳＩＧＮとの交差反応性は観察されなかった。抗体を、ＨＡおよびＨＩＳ６でエピトープタグした。ｍＳＩＧＮＲ１およびＤＣ−ＳＩＧＮＨＩＳの両方とも、３Ｔ３ ＥＢＮＡ細胞によって生成し、ニッケルカラムで精製した。
【００９２】
（実施例２）
細胞表面受容体への結合のときに内在化される抗ｍＳＩＧＮＲ１抗体を同定すること
ｍＳＩＧＮＲ１を発現している細胞系のスクリーニング
一団のマウスマクロファージ細胞系（Ｐ３８８Ｄ１、１−１３．３５、ＷＥＨＩ−３およびＪ７７４）を、標準的な方法によるＲＴ−ＰＣＲによって、ｍＳＩＧＮＲ１の発現についてスクリーニングする。ｍＳＩＧＮＲ１ ＧｅｎＢａｎｋ配列に基づいてプライマーを設計し、これらをマウス器官のＲＴ−ＰＣＲにおいて使用した。ｍＲＮＡレベルでｍＳＩＧＮＲ１を発現している細胞系を同定し、ＦＡＣＳ解析によって表面発現を確認する。５×１０５個の細胞を、１％ＢＳＡおよび０．１％ＮａＮ３を含むＰＢＳ中の１μｇの抗ｍＳＩＧＮＲ１抗体とともに、氷上で１５分間、抗体内在化を可能にしない条件でインキュベートした。１％ＢＳＡおよび０．１％ＮａＮ３を含むＰＢＳでの２回の洗浄の後、結合した抗ｍＳＩＧＮＲ１を、ビオチン化抗ＨＡ（ロシュ）とそれに続くＰＥ複合ストレプトアビジン（ベクトンディッキンソン）によって検出し、ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒ（ベクトンディッキンソン、カリフォルニア州マウンテンビュー）を用いて細胞を解析する。あるいは、肝類洞内皮細胞等の、ｍＳＩＧＮＲ１を発現することが知られている初代細胞で内在化を決定する。ＬＳＥＣでのｍＳＩＧＮＲ１の発現もまた、上述のようにＦＡＣＳによって確認することができるが、１反応あたり１×１０５個の細胞のみを加える。
【００９３】
内在化の測定
一旦ｍＳＩＧＮＲ１発現細胞系または初代細胞型を同定すると、ＦＡＣＳ解析によって抗体の一団の内在化を評価する。内在化がｍＳＩＧＮＲ１結合に基づくことを示すために、ＪＡＷＳ１マウス樹状細胞等の、ｍＳＩＧＮＲ１を発現しない細胞系を含める。インタクトおよび透過化細胞でのビオチン化抗ＨＡ抗体とそれに続くＰＥ複合ストレプトアビジンを用いた抗ｍＳＩＧＮＲ１検出を、抗ＤＥＣ−２０５抗体について記載されているように比較する（Ｍａｈｎｋｅら、２０００年）。細胞系について１．５×１０６個の細胞、または初代細胞について３×１０５個の細胞を、１％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を含むＰＢＳ中の３μｇのｍＳＩＧＮＲ１とともに２０分間４℃でインキュベートし、内在化なしに抗体を表面に結合させる。４℃で１％ＢＳＡを含むＰＢＳでの２回の洗浄によって、結合していない抗体を除去する。各試料を３つに分割する。３分の１を４％パラホルムアルデヒドで固定し、表面抗体を上述のように検出する。他方の３分の２をさらに３７℃で３０分間インキュベートし、固定する前に内在化を可能にする。２分の１を抗ＨＡおよびストレプトアビジンで直接検出し、残りの半分を、細胞を０．１％（体積／重量）サポニン（シグマ−アルドリッチ）を含むＰＢＳとともにインキュベートすることによって透過化する。内在化した抗体の量を、固定した細胞中の平均蛍光を固定および透過化した細胞で記録したものから引くことによって計算する。３０分以内に最も高いパーセンテージの内在化のあった抗体を、ペプチドを抗体に連結させるさらなる研究のために選択する。既存の、関連のないウサギｓｃＦｖを陰性対照として使用し、ｍＳＩＧＮＲ１に結合することが最近示された市販のＥＲ−ＴＲ９抗体（１Ｇｅｉｊｔｅｎｂｅｅｋら、２００２年）を陽性対照として使用する。また、ＥＲ−ＴＲ９のＦａｂ断片を、パパイン消化によって生成し、内在化について試験して、二量体化が内在化の要件でないことを実証する。所望される場合、ｓｃＦｖをＦａｂ’２またはＩｇＧに転換してもよい。
【００９４】
代替的な実施形態において、ｍＳＩＧＮＲ１ライブラリーを、Ｊａｍｅｓ Ｄ． Ｍａｒｋｓのグループによって記載されているように、内在化抗体についてパニングする（Ｐｏｕｌら、２０００年）。この実施形態に適したプロセスについて、以下で概略を述べる。
【００９５】
ｍＳＩＧＮＲ１ファージライブラリーからの内在化抗体の選択
上述のように、ｍＳＩＧＮＲ１を発現すると同定された５×１０６個の細胞を、表面上で遺伝子３タンパク質に融合した抗体断片を提示するｍＳＩＧＮＲ１ライブラリーからのファージの１×１０１２個のコロニー形成単位とともに、１．５時間、４℃でインキュベートして、内在化なしにファージの結合を可能にする。ファージ結合の後、リン酸緩衝生理食塩水で細胞を５回洗浄して、非特異的に、または弱く結合しているファージを除去する。次いで、細胞を３７℃で１５分間インキュベートして、表面結合ファージのエンドサイトーシスを可能にするが、細胞内でのファージ分解は避ける。細胞表面に結合したファージを除去するために、低ｐＨグリシンバッファーで３回洗浄することによって、細胞を取り除く。次いで細胞をトリプシン化し、ＰＢＳで洗浄した後、高ｐＨトリエチルアミンで溶解させる。ファージを含む細胞溶解物を用いて大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）を感染させ、次の回の選択のためのファージを調製する。合計３回の選択を行う。細胞表面に結合したファージの力価（最初の低ｐＨグリシン洗浄において見られる）および細胞内から回収されたファージの数を、各回についてモニタリングする。エンドサイトーシスされたファージの数の増大は、内在化ファージ抗体の選択の成功を示す。
【００９６】
内在化ｓｃＦｖ抗体断片のいずれかがｍＳＩＧＮＲ１に結合したかどうかを判定するために、３回目の５００個のクローンを、ロボットＱｐｉｘ（ジェネティクス）システムを用いて選択し、ＨｉＧｒｏｗシェイカー（ジーンマシーンズ）において、ＳＢ培地中、９６ウェルディッシュ中で一晩増殖させる。翌日、ディッシュの回転速度を下げ、ロボットＧｅｎｅｓｉｓフリーダム２００（テカン）システムを用いた固相ｍＳＩＧＮＲ１ ＥＬＩＳＡにおいて、上清を試験する。９６ウェルＥＬＩＳＡプレートを、１μｇのｍＳＩＧＮＲ１／ｍｌ ＰＢＳで、４℃で一晩コートする。翌日、プレートを１％ＢＳＡによってブロックし、それに続いて、０．０５％Ｔｗｅｅｎを含むＰＢＳで３回洗浄する。対照プレートを１％ＢＳＡでコートする。抗体を含む上清を、１％ＢＳＡを含むＰＢＳ中０．０５〜５μｇ／ｍｌの間の濃度で、ｍＳＩＧＮＲ１またはＢＳＡのみのウェルに加える。シェイカー上、室温で２時間の後、プレートを、０．０５％Ｔｗｅｅｎを含むＰＢＳで３回洗浄する。結合したｓｃＦｖの検出のために、抗ＨＡ抗体（１２ＣＡ５マウス腹水、ストラテジックバイオソリューションズ、デラウェア州）を、１％ＢＳＡを含むＰＢＳ中、１：１，０００希釈で加える。シェイカー上、室温で２時間の後、プレートを再び洗浄し、アルカリホスファターゼ複合抗マウスＩｇＧ（シグマ）を２時間にわたって加える。３回のさらなる洗浄の後、シグマ１０４（登録商標）基質を用いて、結合した抗体を検出する。ＥＬＳＡプレートリーダー（モレキュラーデバイス）を用い、ＯＤ４０５で、種々の時点でプレートを読み取る。
【００９７】
ＥＬＩＳＡにおいて陽性のシグナルを示すクローンは、制限酵素消化パターンによって特徴付けられる。キアゲンのミニプレップキットを用いて、ＤＮＡを単離する。２μｇのＤＮＡを、５ＵのＥｃｏＲＩＩで２時間、３７℃で消化し、次いで試料を４％ＮｕＳｉｅｖｅアガロースゲル上に流す。パターンを比較し、少量（約１００〜３００μｇ）で配列を精製する。ｓｃＦｖを細菌の細胞膜周辺腔に適切に集合させ、分泌させる。ｓｃＦｖは、上清または細胞膜周辺腔のいずれかから単離してもよい。クローンを４リットルのＳＢ中で、０．８のＯＤ６００まで増殖させ、１ｍＭイソプロピル−ｐ−Ｄ−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）で、３〜４時間３０℃で誘導して、最適な量のｓｃＦｖを生成する。細胞膜周辺腔から単鎖抗体を単離するために、細胞ペレットを、Ｃｏｍｐｌｅｔｅ Ｍｉｎｉ（ロシュ）プロテアーゼインヒビターを添加した冷ＰＢＳに再懸濁し、ソニックスＶｉｂｒａ−ｃｅｌｌ ＶＣ７５０で音波破砕する。細胞残屑をペレット化し、Ａｋｔａ ＦＰＬＣ（ファルマシア）を用いて上清をキアゲンＮｉ−ＮＴＡカラムにアプライする。抗体をイミダゾールで溶出する。この方法は、一般に、約１００〜３００μｇの精製抗体／リットルを生じる。内毒素を、一般にＬＡＬ試験（バイオウィッタカーから市販されているアッセイ）によって測定して１０Ｕ／ｍｌ未満の内毒素を含む抗体調製物を生じる、Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ ＱＩ５フィルターを通したろ過によって除去する。抗体を、内在化について上述のように再び解析し、固相ＥＬＩＳＡにおいて、組み換えｍＳＩＧＮＲ１への結合について解析する。３０分以内の内在化のパーセンテージが最も高い抗体および固相ＥＬＩＳＡにおけるよいシグナル（１μｇ／ｍｌで１時間後に＞１０Ｄ）を選択して、ペプチド−抗体コンストラクトを作製する。
【００９８】
（実施例３）
ＧＡＤペプチドを抗体に結合させる
ベクターおよびクローニング戦略
最良の、細菌によって生成されるｓｃＦｖの同定の後に、哺乳動物発現系への転換を行う。哺乳動物発現によって、ペプチドの適切な二次修飾、および内毒素を含まない生成が可能になる。図３に示されるような、適合性のある制限酵素認識部位を有するベクター（例えば、その開示が参照によって本明細書中に援用される米国特許第６３５５２４５号に記載されている）を用いる。ｐＲＬ４（上述）中の、目的の抗体由来のＤＮＡを、Ｓｆｉで切断し、ＣＭＶプロモーターおよび哺乳動物抗体リーダー配列を含むＡｐｅｘ ３Ｐベクターに挿入する。目的のペプチドをコードするヌクレオチドを挿入するために、抗体配列内に含まれない、入手可能な部位（ＭＣＳ＝ＮａｅＩ、ＦｓｅＩ、ＸｂａＩ、ＥｃｏＲＩ、ＰｓｔＩ、ＥｃｏＲＶ、ＢＳＡＢＩ、ＢｓｔＸＩ、ＮｏｔＩ、ＢｓｒＢＩ、Ｘｈｏ、ＰｂｖＩＯＩ、ＳｐｈＩ、ＮｓｉＩ、ＸｂａＩ）から、制限酵素認識部位を選択する。ペプチドをコードするオリゴヌクレオチドを、両端に適切な制限酵素認識部位を有するオペロンによって合成し、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼを用いて挿入する。得られるコンストラクトは、ｓｃＦｖと、それに続く、選択される制限酵素によって決定されるスペーサーと、それに続くペプチドおよびＨＩＳ−タグを含む（図３）。標準的な技術を用いて配列を確認した後、抗体産生のために、ＤＮＡを３９３ＥＢＮＡ細胞にトランスフェクトする。
【００９９】
ペプチドの選択
公知の糖尿病自己抗原のペプチドであるインスリン、ｈｓｐならびにＧＡＤ６５および６７のいずれも、本明細書中に記載される方法において用いることができることが理解されるべきであるが、以下の実験のために、ペプチドとしてＧＡＤを選択する。ＧＡＤ反応性Ｔ細胞は、ＮＯＤマウスにおいて検出された最初の自己反応性Ｔ細胞であり（Ｔｉｓｃｈら、１９９３年、Ｋａｕｆｍａｎら、１９９３年）、疾患過程において重要であることが示されている。さらに、ヒトおよびマウスＧＡＤは９５％相同である。脾臓ＮＯＤ Ｔ細胞によって認識されるエピトープは、広範に特徴付けされており（Ｋａｕｆｍａｎら、１９９３年、Ｔｉｓｃｈら、１９９９年、Ｚｅｃｈｅｌら、１９９８年）、多くの免疫優性ペプチドがＮＯＤマウスおよびＴ１ＤＭ患者において類似しており、インビトロＴ細胞アッセイにおいて交換可能に使用されている（Ｋａｕｆｍａｎら、１９９３年）。ＮＯＤマウスにおける初期免疫応答を、ＧＡＤ６５のカルボキシ末端領域中の定義された領域（ペプチド５０９〜５２８、ペプチド５２４〜５４３）に対して導く（Ｋａｕｆｍａｎら、１９９３年）。後に、Ｔ細胞応答を、２００〜３００の間の他の領域ならびに他の自己抗原に対しても導く。早期のＣＤ４ ＧＡＤ６５ Ｔ細胞エピトープ、ペプチド５２４〜５４３（ＳＲＬＳＫＶＡＰＶＩＫＡＲＭＭＥＹＧＧＴ（配列番号１３）、マウスおよびヒトにおいて同じ配列）ならびに後期に生じるマウスＧＡＤ６５エピトープ、ペプチド２４７〜２６６（ＮＭＹＡＭＬＩＡＲＹＫＭＦＰＥＶＫＥＫＧ（配列番号１４）、下線を引いたヒトとマウスとの間で１アミノ酸の差）、およびペプチド２９０〜３０９（ＡＬＧＩＧＴＤＳＶＩＬＩＫＣＤＥＲＧＫ（配列番号１５）、マウスおよびヒトにおいて同じ配列）の２つを、本実験におけるペプチドとしての使用のために選択する。３つすべてのエピトープは、ＮＯＤ脾細胞において、自発的増殖応答を誘導することができる。さらに、ペプチド２４７〜２６６および２９０〜３０９でのペプチド免疫は、ＮＯＤマウスにおいて糖尿病発症を遅らせることが示されている（Ｍａら、１９９７年、Ｔｉｓｃｈら、１９９９年、Ｚｅｃｈｅｌら、１９９８年）。ＣＤ４ Ｔ細胞エピトープに加えて、ＣＤ８ Ｔ細胞エピトープに対する寛容性もまた、重要であると報告されている（Ｑｕｉｎｎら、２００１年、Ｂｅｒｃｏｖｉｃｉら、２０００年）。陰性対照として、鶏卵リゾチームペプチド１１６〜１ ２４（ＫＧＴＤＶＱＡＷＩ（配列番号１６）で、抗体コンストラクト作製する。次いで、これらのインビトロ研究からの最も効果的なペプチドを種々の組合せで抗体コンストラクトと連結し、ＮＯＤ糖尿病モデルにおいて試験する。
【０１００】
（実施例４）
抗体−ペプチドコンストラクト生成および精製
Ｔ細胞実験のために、およそ３００μｇの各抗体コンストラクトを、ＥＢＮＡ２９３ヒト胎児腎臓細胞において生成する。細胞を、１０％ＦＣＳ、２ｍＭグルタミンおよび２５０Ｕ／ｍｌ Ｇ４１８（シグマ）を含むＤＭＥＭ中で増殖させる。製造業者の使用説明書に従って、キアゲンのＥｆｆｅｃｔｉｎ試薬を用いて、ＴＩ７５フラスコ中の細胞をＤＮＡでトランスフェクトする。３日後、培地を、血清を含まない培地に交換する。４日目および８日目に上清を回収し、細胞残屑を遠心分離によって除去し、Ａｋｔａ−ＦＰＬＣを用いて、澄ませた上清をＮｉカラムにロードする。抗体をイミダゾールで溶出させ、ＰＢＳ中に透析し、１μｇをＳＤＳゲル上に流すことによって正しいサイズを実証する。
【０１０１】
（実施例５）
ペプチド提示を生じるＬＳＥＣによる抗体−ペプチドコンストラクトの内在化、およびＴ細胞に対するこの提示の効果
ペプチド−抗体コンストラクトで、肝類洞細胞をインビトロで標的とし、これらの細胞が、若いＮＯＤまたはＢａｌｂ ｌｃマウス由来のＴ細胞において表現型変化を誘導することができるかどうかを決定する。
【０１０２】
マウス類洞内皮細胞の単離
３週齢のＮＯＤまたは４〜６週齢のＢａｌｂ／ｃマウスから、肝類洞内皮細胞を単離する。Ｋｒｅｔｚ−Ｒｏｍｍｅｌによって記載されているように、まずＥＧＴＡでの門脈かん流によってカルシウムをキレート化し、細胞−細胞接触を緩め、それに続いてハンクスバッファー中０．０５％コラゲナーゼＡでのかん流によって細胞間マトリックスを分解することによって、細胞を得る（Ｋｒｅｔｚ−ＲｏｍｍｅｌおよびＢｏｅｌｓｔｅｒｌｉ、１９９５年）。かん流した肝臓をマウスから取り除き、屈曲鉗子で穏やかに作業する。得られた粗細胞懸濁液を、一連の金属製ふるい（３０、５０、８０メッシュ）を通してろ過して、より大きい組織断片を除去する。メトリザマイド勾配上（１．０８９ｇ／ｃｍ３）で密度勾配遠心分離法によって実質性細胞から類洞細胞を分離し、それに続く２回の洗浄工程によって細胞残屑を除去する（３Ｋｎｏｌｌｅら、１９９９年）。この時点で、クップファー細胞および肝類洞細胞の混合物が得られる。クップファー細胞を認識するが肝類洞細胞を認識しないＦ４／８０抗体を用いてクップファー細胞を肝類洞内皮細胞と区別することができるので、ＦＡＣＳ実験のためにこれは十分である。しかしながら、Ｔ細胞およびペプチドとの共培養実験のために、細胞をＰＥ−複合Ｆ４／８０（ＢＤファーミンゲン）での標識、それに続くミルテニーの抗ＰＥマイクロビーズ、ならびに製造業者の使用説明書に従ってＭＡＣＳカラムおよび分離器を用いた標識細胞の磁気分離によって、クップファー細胞を除去する。残りの細胞集団を、１０％ウシ胎仔血清および２％グルタミンを補充したダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）中、９６ウェル組織プレートに播種する。抗ｍＳＩＧＮＲ１および抗Ｆ４／８０を用いた表面マーカーについてのＦＡＣＳ染色によって、単離の３日後に細胞集団の純度を調査する。クップファー細胞上にはｍＳＩＧＮＲ１がない（１Ｇｅｉｊｔｅｎｂｅｅｋら、２００２年）。９０％の純度は、実験を続けるのに十分であると考えられる。１実験あたり２つのマウス肝臓を用い、期待される収量は約２×１０７個の細胞である（ＫｎｏｏｋおよびＳｌｅｙｓｔｅｒ、１９７６年、マウスについて推定する）。
【０１０３】
Ｔ細胞表現型アッセイ
Ｔ細胞アッセイは、ペプチド−抗体コンストラクトが、肝類洞内皮細胞によるペプチドの提示を生じるかどうか、およびペプチド提示がＴ細胞の表現型変化を誘導することができるかどうかを示す。肝類洞内皮細胞を、平底マイクロタイタープレート中、１×１０５個の細胞／ウェルの密度で培養する。類洞細胞を３日間維持した後、３週齢および８週齢のＮＯＤマウスまたは４〜６週齢のＢａｌｂ／ｃマウスから、ＣＤ４＋Ｔ細胞を上述のように精製し、１０４または１０５個の細胞／ウェルで加える。また、０．１〜５ｐｇ／ウェルの濃度の各抗体−ペプチドコンストラクトを加える。陽性対照として、各ＧＡＤおよび対照ペプチドのみを含める。ＳｙｎＰｅｐ（ダブリン、カリフォルニア州）によってペプチドを合成する。陰性対照ウェルは、Ｔ細胞単独、または肝類洞細胞単独を含む。
【０１０４】
ＬＳＥＣによるＴ細胞へのペプチド提示の、４つの可能性のある結果がある。１）ＴＧＦ−Ｐおよび／もしくはＩＬ−１０およびＩＬ−４の産生またはＣＤ４＋ＣＤ２５＋ＣＤ６２Ｌの発現によって特徴付けられる、調節性Ｔ細胞の誘導、２）Ｔ細胞の欠失または３）完全に欠くことまたは応答。４）寛容性を誘導する代わりに、ペプチド提示が、ＩＬ−２を産生するＴｈ１細胞の刺激を生じることもまた考えられる。これらの可能性を区別するために、培養物上清（それぞれ１００ｐｌ）を２４および４８時間で回収し、後述するようにサイトカイン産生についてアッセイする。３週齢のＴ細胞応答を、８週齢のＮＯＤマウスのもの、ならびにＧＡＤに対して自発的応答を示さないＢａｌｂ／ｃマウス由来のＴ細胞と比較する。アッセイを三連で組み立て、２回繰り返す。Ｔ細胞の混合物を用いるので、上清中のサイトカイン応答は、容易に見ることができないであろう。しかしながら、細胞の混合物はインビボの状態を反映し、全脾細胞を用いてＧＡＤ特異的Ｔ細胞応答が見られる（Ｔｉｓｃｈら、１９９３年）。
【０１０５】
調節性Ｔ細胞の誘導についてのより感度の高い測定として、培養物中で３日後に、ＦＡＣＳ解析によって、ＣＤ２５、ＣＤ４およびＣＤ６２Ｌ等（ＬａｆａｉｌｌｅおよびＬａｆａｉｌｌｅ、２００２年）の典型的な表面マーカーの発現について細胞を評価する。すべての試薬は、ＢＤ−ファーミンゲンから入手可能である。また、ＦＡＣＳによってＩＬ−４産生を解析する。後述されるようなＬＳＥＣ／ペプチド露出Ｔ細胞の潜在的な免疫調節特性の機能的試験は、本システムにおける寛容性誘導についての最終的な試験である。製造業者の使用説明書に従ってロシュの細胞死ＥＬＩＳＡキットを用いて、細胞死を誘導する、ＬＳＥＣによって提示されるペプチドの可能性を、培養物上清中で評価する。
【０１０６】
脾細胞およびＣＤ４＋Ｔ細胞の単離
当業者の認識範囲内の技術を用いて、Ｂａｌｂ／ｃマウスのＮＯＤからの脾臓を無菌環境で取り除き、ＰＢＳに入れる。１８〜２１標準規格注射針を用いて細胞を分離させ、より大きい片を沈下させる。上清を除去し、２００ｇで７分間遠心分離する。脾臓１つあたり５ｍｌの０．８３％ＮＨ４Ｃｌを用いて赤血球を溶解させる。ＰＢＳ中で細胞を２回洗浄し、次いで培地中に再懸濁する。ある種の実験のためには、全脾細胞を用いる。他の実験のためには、製造業者の使用説明書に従ってミルテニー（カリフォルニア州オーバーン）のＣＤ４＋Ｔ細胞単離キットを用いてＣＤ４＋Ｔ細胞を単離する。種々の細胞集団の磁気単離は、当業者の認識範囲内である。ある方法において、単離は、ＣＤ８ａ、ＣＤＩ １ｂ、ＣＤ４５Ｒ、ＤＸ５およびＴｅｒ−１ １９に対するビオチン複合モノクローナル抗体のカクテルを用いた非ＣＤ４＋Ｔ細胞の枯渇に基づく。単離した集団の純度を、ＦＩＴＣ複合抗ＣＤ４、ＰＥ複合抗ＣＤ８、ＡＰＣ複合抗ＣＤ１１ｂおよびｃｙ−５複合ＣＤ４５Ｒ（すべてイーバイオサイエンス、カリフォルニア州サンディエゴ）の混合物の染色によって評価する。期待される純度は９０〜９５％で、７０％の収率である。マウス脾臓から少なくとも１×１０８個の細胞を得ることができ、約２５％の脾細胞がＣＤ４＋であり、１７５個の９６ウェルマイクロタイタープレートウェルに十分な、約１．７５×１０７個の細胞を得ることができる。
【０１０７】
サイトカイン産生の測定
Ｔ細胞／ＬＳＥＣ共培養物の上清中のＩＬ−１０、ＴＧＦ−Ｐ、ＩＦＮ−γ、ＩＬ−４およびＩＬ−２の存在を、記載されているように、標準的なサンドイッチＥＬＩＳＡによって測定する（Ｋｒｅｔｚ−ＲｏｍｍｅｌおよびＲｕｂｉｎ、１９９７年）。すべての抗体対は、ＢＤファーミンゲンから入手可能である。サイトカイン捕捉抗体をＰＢＳ中４℃で一晩、プレート上にコートする。ＰＢＳ／０．０５％Ｔｗｅｅｎでの３回の洗浄の後、培養物上清および標準曲線のマウス組み換えサイトカインを加え、シェイカー上、室温で２時間インキュベートする。プレートを再び洗浄し、結合しているサイトカインをアルカリホスファターゼ複合抗サイトカイン抗体で検出する。３回の洗浄の後、シグマ１０４（商標）基質を加え、ＥＬＩＳＡプレートリーダー（モレキュラーデバイス）を用いて、種々の時点で、ＯＤ４０５でプレートを読み取る。
【０１０８】
（実施例６）
ＬＳＥＣ上に提示されたＧＡＤペプチドに曝露したＴ細胞が、それに続いて、ＧＡＤを提示するプロフェッショナルＡＰＣによって自己反応性Ｔ細胞の活性化を防ぐことができるかどうかを評価する
さらなる実験において、肝類洞内皮細胞上のペプチドに３日間曝露したＴ細胞が、脾臓のプロフェッショナルＡＰＣ上に提示されるペプチドによって、自己反応性Ｔ細胞の活性化を負に調節できるかどうかを試験する。インビトロでの調節特性を有するＴ細胞の誘導の実行可能性は、多くの研究室によって示されている（Ｗａｋｋａｃｈら、２００１年、Ｂａｒｒａｔら、２００２年、ＴｈｏｒｔｏｎおよびＳｈｅｖａｃｈ、１９９８年）。免疫抑制特性は、調節性Ｔ細胞を、免疫刺激が通常観察される培養系に加えることによって、試験することができる。ＡＰＣおよびＴ細胞の両方を含む７週齢のＮＯＤマウス由来の脾細胞に、ＧＡＤペプチドを加えることによって、強力な増殖性応答によって見られるような、かかる免疫刺激系が提供される。調節性Ｔ細胞の添加は、この応答を排除する。１０５または１０６個の脾細胞を、ＬＳＥＣおよびペプチド結合抗体に曝露したＴ細胞を含むウェル１つあたり０．１、１、または１０μｍのペプチドとともに加える。対照ウェルは、脾細胞を、ペプチド単独およびＬＳＥＣ＋Ｔ細胞単独とともに含む。さらに、推定されるＴ細胞による増殖の有意な寄与を排除するために、対照ウェルはまた、照射を受けた脾細胞（６００ＲＡＤ、Ｊｏｅ ＡｇｕｉｌｅｒａによるＵＣＳＤ放射サービス施設で行う）ならびにＬＳＥＣおよびペプチド−抗体コンストラクトに以前に曝露したＴ細胞も含む。照射を受けた脾細胞は、抗原を提示することができるが、増殖しない。７２時間の培養期間の最後の１６時間の間に、１μＣｉ３Ｈ−チミジンを各ウェルに加えて、新たに合成されたＤＮＡを増殖の読み出しとして標識する。パッカードのＵｎｉｖｅｒｓａｌ Ｃｅｌｌ Ｈａｒｖｅｓｔｅｒを用いて細胞を採取し、Ｔｏｐｃｏｕｎｔ（パッカード）を用いて、取り込まれた３Ｈ−チミジンを評価する。脾細胞、および以前にＬＳＥＣ＋ペプチドに曝露したＴ細胞を含む培養物中の３Ｈ−チミジンの取り込みが、脾細胞培養物と比較して低下する場合、Ｔ細胞は、調節特性でうまく誘導されている。ペプチド複合抗ｍＳＩＧＮＲ１抗体がＮＯＤマウスにおいて、調節性Ｔ細胞を誘導できるかどうか、および疾患を停止できるかどうかもまた、試験する。
【０１０９】
（実施例７）
組み換えファージ技術を用いて、マウス抗ヒトＬ−ＳＩＧＮ抗体を同定した。組み換えヒトＬ−ＳＩＧＮで免疫したマウスの重鎖および軽鎖の組合せ由来のマウスライブラリー（ＩｇＧ１ｋおよびＩｇＧ２ａｋ）を、内容が参照によって本明細書中に援用される、国際公開第０３／０２５２０２号に開示される方法によって調製した。一旦調製すると、ライブラリーをまずヒトＤＣ−ＳＩＧＮに関してパニングして、ＤＣ−ＳＩＧＮと交差反応性のある抗体を除去した。結合していない上清を、Ｌ−ＳＩＧＮと独特に反応性のあるクローンを選択するために使用した。２つのライブラリー（ＩｇＧ１およびＩｇＧ２ａ）のそれぞれについて合計９５個のコロニー（３６／回）を誘導し、抗体産生、およびＬ−ＳＩＧＮとのそれらの反応性を、捕捉ＥＬＩＳＡによって決定した。簡潔に述べると、抗ヒトＦｃ（カルタグ）を、５００ｎｇ／ｍｌで一晩ＥＬＩＳＡプレート上にコートした。１％ＢＳＡを含むＰＢＳでプレートをブロックし、それに続いて組み換えＬ−ＳＩＧＮを２μｇ／ｍｌで加えた。プレートをＰＢＳで洗浄した後、上清を加えた。室温で１２時間のインキュベーションの後、プレートを３回洗浄し、アルカリ−ホスファターゼ複合抗Ｆａｂ抗体を２時間加えた。ＳｉｇｍａＳ基質を加えた後のシグナルを、ＥＬＩＳＡリーダー（モレキュラーデバイス）を用いて評価した。
【０１１０】
クローンの大部分は、ファージ上の抗体の良好な結合（ＯＤ４０５＞１．０）を示した。ＩｇＧ１およびＩｇＧ２ａライブラリーの両方由来のいくつかのクローンは、ヒトＬ−ＳＩＧＮとの陽性の反応性を示した。結果を図４および５に示す。図４は、ヒトＬ−ＳＩＧＮとのＩｇＧ１クローンを示す。図５は、ヒトＬ−ＳＩＧＮとのＩｇＧ２ａクローンの反応性を示す。
【０１１１】
（実施例８）
ヒトＬ−ＳＩＧＮと独特に反応性のあるクローンを同定するために、バックグラウンドよりもＯＤ値が５倍大きい実施例７のすべてのクローンを選択して、ＥＬＩＳＡによって、ヒトＤＣ−ＳＩＧＮとのそれらの反応性を試験した。抗ヒトＦｃ（カルタグ）を、５００ｎｇ／ｍｌで一晩ＥＬＩＳＡプレート上にコートした。１％ＢＳＡを含むＰＢＳでプレートをブロックし、それに続いて組み換えＤＣ−ＳＩＧＮを２μｇ／ｍｌで加えた。プレートをＰＢＳで洗浄した後、上清を加えた。室温で１２時間のインキュベーションの後、プレートを３回洗浄し、アルカリ−ホスファターゼ複合抗Ｆａｂ抗体を２時間加えた。ＳｉｇｍａＳ基質を加えた後のシグナルを、ＥＬＩＳＡリーダー（モレキュラーデバイス）を用いて評価した。
【０１１２】
ＩｇＧ１ライブラリー由来の１０個のクローンおよびＩｇＧ２ａライブラリー由来の３つのクローンが、ヒトＬ−ＳＩＧＮと独特に反応性があることがわかった（ＤＣ−ＳＩＧＮに対して５〜１０倍高いＯＤ値）。結果を図６および７に示す。図６は、Ｌ−ＳＩＧＮおよびＤＣ−ＳＩＧＮとの、ＩｇＧ１陽性クローンの反応性を示す。図７は、Ｌ−ＳＩＧＮおよびＤＣ−ＳＩＧＮとの、ＩｇＧ２ａクローンの反応性を示す。
【０１１３】
（実施例９）
ヒトＬ−ＳＩＧＮとのみ反応性があると同定された１３個のクローン、ならびに実施例８で上記のように同定された、Ｌ−ＳＩＧＮおよびＤＣ−ＳＩＧＮの両方と強力な反応性のある９つのクローンを配列決定して、独特のクローンの数を決定した。配列決定は、当業者に公知の技術によって決定した。これらのクローンの配列を図８および９に示す。重鎖クローンの配列を図８Ａ〜８Ｃに示す（配列番号１７〜３６）。軽鎖クローンの配列を図９Ａ〜９Ｂに示す（配列番号３７〜５５）。
【０１１４】
配列決定の結果から、軽鎖と比較して、より多様なグループの重鎖が示された。抗体クローンの多様性はまた、異なる軽鎖と同じ重鎖との交差対形成によって増強された。Ｌ−ＳＩＧＮと反応性のある合計５個の独特のクローンを同定し、それらのアミノ酸配列の類似性に基づいてクローンを分類した（下記の表１参照）。
【０１１５】
（表１）
アミノ酸配列類似性に基づく、ヒトＬ−ＳＩＧＮと反応性のある抗体クローンの分類
【０１１６】
【表１】
ａＬ−ＳＩＧＮとのみ反応性のある抗体クローン
ｂＬ−ＳＩＧＮおよびＤＣ−ＳＩＧＮの両方と反応性のある抗体クローン
ｃ２．１〜２．３は、類似した軽鎖だが独特の重鎖を示す
Ｌ−ＳＩＧＮおよびＤＣ−ＳＩＧＮでの配列決定のために選択したクローンの反応性（ＯＤ値）を、下記で表２に示す。
【０１１７】
（表２）
【０１１８】
【表２】
＊＝Ｌ−ＳＩＧＮおよびＤＣ−ＳＩＧＮでの配列決定のために選択したクローン
図８に示すように、ヒトＤＣ−ＳＩＧＮＲに結合する抗体の重鎖ＣＤＲ３領域は、以下のアミノ酸配列
【０１１９】
【化１】
の１つを有することがわかった。図９に示されるように、抗体のＤＣ−ＳＩＧＮＲに結合する抗体の軽鎖ＣＤＲ３領域は、以下のアミノ酸配列
【０１２０】
【化２】
の１つを有することがわかった。
【０１２１】
（実施例１０）
実施例７で上述された手順を利用して、上述の実施例７のさらなるクローンを、それらがＬ−ＳＩＧＮに結合する能力について調べた。当業者に公知の技術によって、配列決定を決定した。これらのさらなるクローンの配列を、図１０に示す（配列番号６３〜８２）。図１０に示されるように、ヒトＤＣ−ＳＩＧＮＲに結合する抗体の、５つのさらなる重鎖ＣＤＲ３領域は、以下のアミノ酸配列
【０１２２】
【化３】
の１つを有することがわかった。ヒトＤＣ−ＳＩＧＮＲに結合するこれらのクローンのＣＤＲ２領域は、以下のアミノ酸配列
【０１２３】
【化４】
の１つを有することがわかった。
【０１２４】
表３は、Ｌ−ＳＩＧＮを発現する細胞との反応性に基づいて選択した、さらなるＩｇＧ１ｋ抗体クローンを示す。
【０１２５】
（表３）
【０１２６】
【表３】
以下の表４は、さらなるＩｇＧ１ｋ抗体クローンの、ＬＳＩＧＮを発現する細胞（幾何平均蛍光）ならびに組み換えＬ−ＳＩＧＮおよびＤＣ−ＳＩＧＮタンパク質（ＯＤ値）との反応性を示す。
【０１２７】
（表４）
【０１２８】
【表４】
図１１に示されるように、ヒトＤＣ−ＳＩＧＮＲに結合するさらなるクローンを同定した（配列番号９６〜１１５）。これらのクローンは、以下のアミノ酸配列
【０１２９】
【化５】
の１つを有するＩｇＧ１ｋ軽鎖ＣＤＲ３領域を有することがわかった。ヒトＤＣ−ＳＩＧＮＲに結合するこれらのクローンのＣＤＲ２領域は、以下のアミノ酸配列
【０１３０】
【化６】
の１つを有することがわかった。
【０１３１】
表５は、Ｌ−ＳＩＧＮを発現する細胞との反応性に基づいて選択した、さらなるＩｇＧ２ａｋ抗体クローンを示す。
【０１３２】
（表５）
【０１３３】
【表５】
＊これらの配列は停止コドンを含む
表６は、さらなるＩｇＧ２ａｋ抗体クローンの、ＬＳＩＧＮ（幾何平均蛍光）ならびに組み換えＬ−ＳＩＧＮおよびＤＣ−ＳＩＧＮタンパク質（ＯＤ値）を発現する細胞との反応性を示す。
【０１３４】
（表６）
【０１３５】
【表６】
図１２に示されるように、ヒトＤＣ−ＳＩＧＮＲに結合するさらなる重鎖クローンを同定した（配列番号１３３〜１５４）。これらのクローンは、以下のアミノ酸配列
【０１３６】
【化７】
の１つを有するＩｇＧ２ａｋ重鎖ＣＤＲ３領域を有することがわかった。ヒトＤＣ−ＳＩＧＮＲに結合したこれらのクローンのＣＤＲ２領域は、以下のアミノ酸配列
【０１３７】
【化８】
の１つを有することがわかった。
【０１３８】
図１３に示されるように、ヒトＤＣ−ＳＩＧＮＲに結合するさらなる軽鎖クローンを同定した（配列番号１６９〜１８９）。これらのクローンは、以下のアミノ酸配列
【０１３９】
【化９】
の１つを有するＩｇＧ２ａｋ軽鎖ＣＤＲ３領域を有することがわかった。ヒトＤＣ−ＳＩＧＮＲに結合したこれらのクローンのＣＤＲ２領域は、以下のアミノ酸配列
【０１４０】
【化１０】
の１つを有することがわかった。
【０１４１】
（実施例１１）
候補可溶性Ｌ−ＳＩＧＮ抗体の、ＤＣ−ＳＩＧＮ受容体でなくＬ−ＳＩＧＮ受容体との、選択的反応性
ファージ−Ｆａｂスクリーニング、ＤＮＡ配列決定（図１０および１１）に基づいて、Ｌ−ＳＩＧＮ受容体を発現する細胞との最もよい反応性を有する６つの抗体（クローン名、Ｃ７、Ｄ１２、Ｅ４、Ｅ１０、Ｇ３、Ｇ１０）（表４）をサブクローニングして、コートＩＩＩタンパク質を除去した。これら６つの候補抗体のそれぞれを発現させ、可溶性Ｆａｂ部分として精製し、それらが細胞上のＬ−ＳＩＧＮ受容体を認識するがＤＣ−ＳＩＧＮを認識しない能力について、再び試験した。図１４に示されるように、６つすべての抗体は、Ｌ−ＳＩＧＮ受容体との、非常に良好な結合を示したが、３つの抗体（Ｄ１２、Ｇ３およびＥ１０）は、ＤＣ−ＳＩＧＮとも、実質的により低いレベルではあるが反応した。すべての抗体（２０ｕｇ／ｍｌ）を、ＦＡＣＳバッファー（１％ＢＳＡ、０．１％アジ化合物を含むＤＰＢＳ）中で、０．５×１０６個の細胞（Ｋ５６２、Ｋ５６２／ＤＣ−ＳＩＧＮ、Ｋ５６２／Ｌ−ＳＩＧＮ）とともに、４℃で１時間インキュベートし、ＦＡＣＳバッファーで洗浄し、ＦＡＣＳバッファー中１：５０希釈のフィコエリトリン（ＰＥ）複合ヤギ抗マウス抗体（ジャクソンイムノリサーチ、ペンシルバニア州ウエストグローブ）とともに、４℃で３０分間インキュベートし、洗浄し、１％ホルムアルデヒド中に再懸濁し、ＢＤ ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒ（ベクトンディッキンソン、カリフォルニア州マウンテンビュー）で解析した。
【０１４２】
（実施例１２）
Ｌ−ＳＩＧＮ抗体の相対的親和性およびエピトープ特性
６つの候補抗体を、Ｌ−ＳＩＧＮタンパク質に対するそれらの親和性、および認識されるエピトープの性質に関して、さらに特徴付けた。図１５に示されるように、すべての抗体はＬ−ＳＩＧＮ受容体とナノモル単位の親和性で反応するが、Ｅ１０クローンは、ピコモル単位の範囲でも結合を示した。ＥＬＩＳＡにおいて、種々の抗体のエピトープ特異性を、Ｌ−ＳＩＧＮＦｃ融合タンパク質と結合するＬ−ＳＩＧＮ特異的モノクローナル抗体（ｍａｂ１６２）と競合させることによって、特徴付けた。図１６に示されるように、４つの抗体クローン、Ｃ７、Ｄ１２、Ｇ１０およびＥ４は濃度依存的にｍａｂ１６２と競合したが、クローンＧ３およびＥ１０は競合しなかった。これらのデータは、競合研究でのわずかな違いによって示されるように、クローンＣ７、Ｄ１２、Ｇ１０およびＥ４が、同じエピトープを共有するか、または重複するエピトープに結合するかのいずれかであることを含意する。６つの抗体によって結合されるエピトープの性質（立体的対線状、単量体対多量体）を特徴付けるために、変性および還元性条件下で調製したＫ５６２／Ｌ−ＳＩＧＮ細胞の細胞溶解物全体を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分離し、それぞれの抗体で膜をプローブした。２つの抗体（クローンＤ１２およびＥ１０）は単量体に対応するタンパク質バンドを認識したが、クローンＧ３は三量体形態の受容体に対応するタンパク質バンドを認識した。これらのデータはまた、クローンＤ１２、Ｅ１０およびＧ３によって認識されるエピトープは線状であるが、抗体クローンＣ７、Ｅ４およびＧ１０によって認識されるエピトープは立体的であることを示す。Ｌ−ＳＩＧＮ ｆａｂによって認識されるエピトープの性質を、ウェスタンブロッティング研究によって描写した。簡潔に述べると、百万個のＫ５６２／Ｌ−ＳＩＧＮ細胞を、５０ｕｌの溶解バッファー（１５０ｍＭ ＮａＣｌ、２５ｍＭ Ｔｒｉｓ、ｐＨ７．４、２ｍＭ ＥＤＴＡ、１ｍＭオルトバナジウム酸ナトリウム、１０ｍＭフッ化ナトリウム、１％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００、０．５ｍＭ ＰＭＳＦ、１０μｇ／ｍｌアプロチニンおよび１０μｇ／ｍｌロイペプチン）で溶解した。４℃で２０分間の穏やかな回転によって、溶解を達成した。細胞溶解物を遠心分離（１４，０００×ｇ、１０分間）して、細胞残屑を除去し、１ｍＭ ＤＴＴを含むＳＤＳ試料バッファー中で５分間煮沸した。タンパク質溶解物を４〜１５％ＳＤＳ−ＰＡＧＥ勾配ゲル（バイオ−ラッド番号１１６−１１５８）上で分離し、ニトロセルロース膜に移し、次いで、それぞれＬ−ＳＩＧＮ特異的ｆａｂ（１μｇ／ｍｌ）でプローブした。タンパク質転移を、予め染色した分子量標準（バイオ−ラッド番号１６１−０３２４）でモニタリングした。ＨＲＰ複合ヤギ抗マウスＩｇＧ（バイオ−ラッド番号１７０−６５１６）を用いて、増強された化学発光（ＳｕｐｅｒシグナルＷｅｓｔ Ｐｉｃｏキット、ピアス、イリノイ州ロックフォード）によって、免疫反応性バンドを検出した。
【０１４３】
（実施例１３）
Ｌ−ＳＩＧＮ抗体は、ヒト肝臓非実質性細胞上の受容体に結合すると、内在化を経る
抗原を、免疫寛容を引き起こすことが知られているＬ−ＳＩＧＮ発現類洞内皮細胞（ＬＳＥＣ）中に送達するために、フローサイトメトリーおよび共焦点顕微鏡法によって、抗体の内在化能力を評価した。新しく単離したヒト肝臓非実質性細胞を、６つの候補抗体とともにインキュベートした。図１７に示されるように、３つの抗体（Ｃ７、Ｅ１０およびＧ１０）は、２時間のうちに、４０パーセントを超える内在化を示した。この内在化のレベルは、統計的に有意であることがわかった（ｐ＜０．０５）。さらに、抗体内在化はまた、共焦点顕微鏡法研究によって直接確認もした。６つすべての抗体は、９０分間のインキュベーションの後、Ｋ５６２／Ｌ−ＳＩＧＮ細胞内部に見られたが、本研究で対照として使用したＫ５６２／ＤＣ−ＳＩＧＮ細胞では、取り込みは観察されなかった。これらの研究から、Ｌ−ＳＩＧＮ抗体のすべては内在化することができるが、３つの抗体（クローンＣ７、Ｅ１０およびＧ１０）が最も効率的に内在化することが示される。
【０１４４】
抗体内在化アッセイ−Ｔａｋａｈａｒａ Ｋら（Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、２００４年）によって記載されているように、アッセイを行った。簡潔に述べると、０．５×１０６個の細胞（新鮮なヒトＬＳＥＣまたはＫ５６２／Ｌ−ＳＩＧＮ）を、２０μｇ／ｍｌのＬ−ＳＩＧＮ ｆａｂとともに、ＤＰＢＳ／１％ＢＳＡ中４℃で３０分間インキュベートし、結合していない抗体を洗い落とし、次いで、３７℃でさらに２時間インキュベートして、内在化を可能にした。ＤＰＢＳ／１％ＢＳＡ／０．１％アジ化合物中、４℃で維持した２組の試料を対照とした。インキュベーション期間の終わりに、細胞を、フィコエリトリン（ＰＥ）複合ヤギ抗マウス抗体とともに、ＤＰＢＳ／１％ＢＳＡ／０．１％アジ化合物中、４℃で３０分間インキュベートし、洗浄し、１％ホルムアルデヒド中で固定し、ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒ（ベクトンディッキンソン）で解析した。
【０１４５】
共焦点顕微鏡法 １０５個のＫ５６２被形質導入体を、１０μｇ／ｍｌの種々の抗体とともに、１０％ウシ胎仔血清を補充したＲＰＭＩ １６４０（ギブコ，ライフテクノロジー、オランダ、ブレダ）中、３７℃で９０分間インキュベートした。次いで、細胞をＰＢＳで洗浄し、ＰＢＳ／４％パラホルムアルデヒド中で固定し、再び洗浄し、ポリ−Ｌ−リシンでコートしたカバーガラスに接着させた（室温で２０分間）。細胞をブロッキングバッファー、ＰＢＳ／３％ＢＳＡ（シグマケミカルカンパニー、ミズーリ州セントルイス）／１０ｍＭグリシン（メルク、ドイツ、ダルムシュタット）／０．１％サポニン（リーデルデハーン、ドイツ、ゼールズ）とともに、室温で１時間インキュベートした。続いて、細胞を、１０μｇ／ｍｌのウサギ抗ヒトＣＤ５５（サンタクルスバイオテクノロジー、カリフォルニア州サンタクルス）とともに室温で１時間インキュベートし、ブロッキングバッファーで洗浄し、１０μｇ／ｍｌのヤギ抗マウスＩｇＧ Ａｌｅｘａ ６４７（モレキュラープローブ、オランダ、ライデン）および１０μｇ／ｍｌのヤギ抗ウサギＩｇＧ Ａｌｅｘａ ４８８（モレキュラープローブ）とともに、ブロッキングバッファー中、室温で１時間インキュベートした。次いで、細胞をブロッキングバッファー、ＰＢＳ、および最終的には５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌで洗浄した。最後に、Ｍｏｗｉｏｌ（カルビオケム，オムニラボインターナショナル、オランダ、ブレダ）でカバーガラスをスライドガラス上にマウントした。
【０１４６】
（実施例１４）
Ｌ−ＳＩＧＮ抗体は、受容体へのリガンドの結合をブロックする
いくつかのウイルス、例えばエボラ、ＳＡＲＳ、ＨＩＶおよびＨＣＶは、Ｌ−ＳＩＧＮ受容体を利用して細胞への侵入を増大させることが示されている。ウイルスの表面上のエンベロープ糖タンパク質および宿主Ｔ細胞の表面上のＩＣＡＭ−３の両方とも、Ｌ−ＳＩＧＮのレクチン結合ドメインと相互作用することが知られている。本抗体がＬ−ＳＩＧＮ受容体およびリガンド相互作用をブロックすることができるかどうかを決定するために、リガンドコート蛍光ビーズ−ブロッキングアッセイを行った。図１８に示されるように、最も効率的に内在化した３つの抗体（Ｃ７、Ｇ１０およびＥ１０）はまた、アッセイにおいて対照として使用した、ＩＣＡＭ−１でコートしたビーズの結合に影響を及ぼすことなく、Ｌ−ＳＩＧＮ受容体へのＩＣＡＭ−３の結合を、最もよく（４０％より高い阻害が観察された）ブロックした。（図１８参照。）
リガンドブロッキングについての蛍光ビーズ接着アッセイ。ＩＣＡＭ−１ビーズについてこれまでに記載されているように（５Ｇｅｉｊｔｅｎｂｅｅｋら、１９９９年）、カルボン酸修飾ＴｒａｎｓＦｌｕｏｒＳｐｈｅｒｅ（４８８／６４５ｎｍ、１．０μｍ、モレキュラープローブ）を、ＩＣＡＭ−３ Ｆｃタンパク質（Ｒ＆Ｄシステムズ、ミネソタ州ミネアポリス）でコートした。簡潔に述べると、ストレプトアビジンでコートしたビーズを、ビオチン化ヤギ抗ヒト抗Ｆｃ Ｆａｂ２断片とともに、ＰＢＳ、０．５％ＢＳＡ中、３７℃で２時間インキュベートした。ビーズを洗浄し、ヒトＩｇＧ１ Ｆｃ融合ＩＣＡＭ−３ Ｆｃ（２５０ｎｇ／ｍＬ）とともに、４℃で一晩インキュベートした。ＩＣＡＭ−３ビーズへの接着のために、Ｋ５６２／Ｌ−ＳＩＧＮ細胞を、Ｔｒｉｓ−ナトリウム−ＢＳＡ（２０ｍｍｏｌ／Ｌ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８．０、１５０ｍｍｏｌ／Ｌ ＮａＣｌ、１ｍｍｏｌ／Ｌ ＣａＣｌ２、２ｍｍｏｌ／Ｌ ＭｇＣｌ２、０．５％ＢＳＡ（重量／体積）、５Å約１０６個の細胞／ｍＬ）に再懸濁した。５万個の細胞を、Ｌ−ＳＩＧＮ ｆａｂ（２０μｇ／ｍＬ）ありまたはなしで、室温で１０分間、９６ウェルＶ型底プレート中で、プレインキュベートした。リガンドでコートしたビーズ（２０個のビーズ／細胞）を加え、懸濁液を３７℃で３０分間インキュベートした。洗浄後、細胞をＴｒｉｓ−ナトリウム−ＢＳＡバッファーに再懸濁した。Ｋ５６２／ＬＳＩＧＮ細胞のＩＣＡＭ−３媒介性接着を、ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒ（ベクトンディッキンソン）を用いたフローサイトメトリーによって測定した。抗体なしでＩＣＡＭ−３に結合している細胞のパーセンテージを１００に設定し、Ｌ−ＳＩＧＮ抗体存在下での結合の減少を、リガンドブロッキングとして表した。
【０１４７】
（実施例１５）
Ｌ−ＳＩＧＮ特異的抗体によって媒介される生物学的活性の概要
前述の研究に基づいて（下記の表７参照）、少なくとも３つの抗体クローン、Ｃ７、Ｇ１０およびＥ１０は、自己免疫および感染性疾患における治療用途のための、優れた候補である。
【０１４８】
（表７）
Ｌ−ＳＩＧＮ Ｆａｂによって媒介される生物学的活性
【０１４９】
【表７】
ａ（％）パーセント内在化は、（４℃での平均蛍光強度−３７℃での平均蛍光強度）／（４℃での平均蛍光強度）×１００として決定した。
ｂ（％）パーセントブロッキングは、（Ｆａｂありでリガンドに結合している細胞の数−Ｆａｂなしでリガンドに結合している細胞の数）／（Ｆａｂなしでリガンドに結合している細胞の数）×１００として決定した。
【０１５０】
（実施例１６）
受容体へのリガンド結合をブロックすることによってウイルス結合をブロックすることのできる抗体を選択すること
いくつかのウイルス、例えば、エボラ、ＳＡＲＳ、ＨＩＶおよびＨＣＶは、細胞への侵入を増大させるために、ＤＣ−ＳＩＧＮおよびＬ−ＳＩＧＮ受容体を利用することが示されている。Ｔ細胞上のＩＣＡＭ−３およびウイルス上のエンベロープ糖タンパク質の両方とも、重複しているが別個の様式で、ＳＩＧＮ受容体の炭水化物認識ドメイン（ＣＲＤ）と相互作用することがわかった。リガンド結合をブロックすることができるＣＲＤ反応性Ｆａｂが単離されたかどうかを判定するために、５Ｇｅｉｊｔｅｎｂｅｅｋら（１９９９年）によって記載されているのと本質的に同じように、リガンドコート蛍光ビーズ−ブロッキングアッセイを行った。簡潔に述べると、５万個のＫ５６２／Ｌ−ＳＩＧＮトランスフェクト細胞を、Ｌ−ＳＩＧＮ Ｆａｂ（２０μｇ／ｍＬ）ありまたはなしで、室温で１０分間、９６ウェルＶ型底プレート中でプレインキュベートする。ウイルスエンベロープタンパク質、例えばＨＣＶ Ｅ１／Ｅ２またはＨＩＶｇｐ１２０でコートした蛍光ビーズ（２０個のビーズ／細胞）を加え、懸濁液を３７℃でさらに３０分間インキュベートする。洗浄後、細胞をＴｒｉｓ−ナトリウム−ＢＳＡバッファーに再懸濁する。Ｋ５６２／Ｌ−ＳＩＧＮ細胞への、ウイルスでコートしたビーズの、抗体によるブロッキングの程度を、ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒ（ベクトンディッキンソン）を用いて測定する。抗体なしでウイルスビーズに結合している細胞のパーセンテージ（陰性対照）を１００とし、Ｌ−ＳＩＧＮ抗体存在下での結合の減少を％ブロッキングとして表す。リガンドでコートした蛍光ビーズは、細胞表面受容体へのリガンドの多量体結合を模倣するだけではなく、フローサイトメトリーによるリガンド結合の容易な定量化も可能にする。まず、Ｋ５６２／ＤＣ−ＳＩＧＮおよびＫ５６２／Ｌ−ＳＩＧＮへの、エボラおよびＨＩＶのエンベロープ糖タンパク質でコートした蛍光ビーズの接着を、抗体なしで評価した。図１９Ａに示されるように、エボラエンベロープ糖タンパク質はＤＣ−ＳＩＧＮおよびＬ−ＳＩＧＮ発現細胞の両方に同程度によく結合するが、Ｌ−ＳＩＧＮへのＨＩＶエンベロープ糖タンパク質の結合は、ＤＣ−ＳＩＧＮ発現細胞への結合よりもかなり弱かった。ＳＩＧＮ分子へのウイルスタンパク質結合におけるこれらの違いは、Ｆａｂがウイルスタンパク質の接着をブロックする能力に対して、甚大な効果を有した。６つすべてのＦａｂはＬ−ＳＩＧＮへのＨＩＶｇｐ１２０結合をブロックすることができたが（３３％〜６６％）、２つのクローン、Ｃ７およびＥ１０だけは、エボラｇｐ結合の有意なブロッキング（それぞれ７５％および６４％）を示した（図１９Ｂ参照）。３つのＤＣ−ＳＩＧＮ交差反応性クローン、Ｄ１２、Ｅ１０およびＧ３のうち、Ｅ１０だけが、ＤＣ−ＳＩＧＮへの両方のウイルスタンパク質の結合をブロックした。対照的に、Ｌ−ＳＩＧＮと独特に反応性のある他の３つのＦａｂは、ＤＣ−ＳＩＧＮへのリガンド結合に対してブロッキング効果を有さなかった（図１９Ｃ参照）。また、ウイルスタンパク質結合を最もよくブロックした３つのＦａｂ、クローンＣ７、Ｅ１０およびＧ１０はまた、Ｋ５６２／Ｌ−ＳＩＧＮ細胞へのＩＣＡＭ−３の結合を最もよく防いだ（表７参照）。
【０１５１】
ＦａｂをＩｇＧに転換することは、受容体結合およびウイルスタンパク質接着のブロッキングを向上させる
受容体結合、内在化およびＩＣＡＭ−３ブロッキング結果に基づいて、従来の方法を用いてＦａｂのマウス可変ドインをヒトＩｇＧ１の定常領域に融合させることによって、２つのＦａｂクローン、Ｅ１０およびＧ１０を、完全ＩｇＧに転換した。これらのキメラＩｇＧを、受容体への結合、およびウイルスタンパク質接着をブロックすることについて、評価した。図２０Ａに示されるように、ＦａｂからＩｇＧへの転換は、両方のクローン、Ｅ１０およびＧ１０の受容体結合を大いに向上させた。また、クローンＧ１０はＦａｂとしてＤＣ−ＳＩＧＮへのいかなる結合も示さなかったが、これは、ＩｇＧとしてＤＣ−ＳＩＧＮへのいくらかの結合を示し、これは受容体に対する増大した親和力の結果である可能性が高い。また、完全ＩｇＧは、ウイルスタンパク質結合の、それらのＦａｂ相対物と比較して増大したブロッキングを示した（図１９Ｂおよび１９Ｃ参照）。ＦａｂからＩｇＧへの転換の最も甚大な効果は、クローンＧ１０で観察され、ここで完全ＩｇＧは、Ｌ−ＳＩＧＮへのエボラエンベロープｇｐの、９０％を超えるブロッキングを生じたのに対し、Ｆａｂ相対物で観察されたブロッキングはほとんど〜まったく観察されなかった（図１９Ｃ参照）。ＦａｂからＩｇＧへの転換は、クローンＧ１０のブロッキング能力を大いに向上させたが、Ｆａｂ分子としてクローンＣ７と同様に強力な遮断薬であるクローンＥ１０に対して、より穏やかな効果を有した。
【０１５２】
最も効率的に内在化した３つのＦａｂクローン、Ｃ７、Ｅ１０およびＧ１０はまた、リガンド結合を最もよくブロックした。受容体の炭水化物認識ドメインへの抗体の結合によって、それらが、免疫応答の調節およびウイルス伝播の予防におけるそれらの使用のための優れた候補になる。クローン、Ｃ７およびＥ１０は、Ｌ−ＳＩＧＮ受容体へのＩＣＡＭ−３およびウイルスタンパク質の結合を、一貫して、および効果的にブロックした（ｐ＜０．０５）。クローンＧ１０は、ＩＣＡＭ−３およびＨＩＶｇｐ１２０の結合をブロックすることができたが、エボラエンベロープ糖タンパク質の結合はブロックすることができなかった（上記の表７に要約する）。前述に基づくと、クローンＧ１０は、何らかの機構の立体的干渉によってリガンド結合をブロックするが、クローンＣ７およびクローンＥ１０によって生じるブロッキング効果は、リガンド結合部位への直接の競合のためである。
【０１５３】
（実施例１７）
ウイルス侵入をブロックすること
上述の実施例１６における、受容体へのウイルス結合をブロックすることができる抗体を選択した後、これらの抗体がウイルス侵入をブロックする能力を試験する。Ｌ−ＳＩＧＮトランスフェクトＫ−５６２細胞を、抗体とともに３０分間プレインキュベートした後、目的のエンベロープタンパク質を発現するレポーターウイルスを加えるか、または実行可能な場合、ウイルス＋またはウイルス−ドナーからの血清を加える。３７℃で１時間のインキュベーションの後、細胞をリン酸緩衝生理食塩水で５回洗浄し、キアゲンのウイルスＲＮＡミニスピンキットを用いて、細胞からウイルスＲＮＡを抽出する。このようにして得たウイルスＲＮＡを、Ｇａｒｄｎｅｒら（２００３年）の手順に従ってＲＴ−ＰＣＲによって増幅し、サザンブロットを行う。
【０１５４】
（実施例１８）
ウイルス伝播を防ぐこと
実施例１６で同定した抗体が、受容体陽性内皮細胞からヒトＴ細胞または肝細胞のいずれかへのウイルスの転移を防ぐことができるかどうかを試験するために、Ｋ５６２／Ｌ−ＳＩＧＮ細胞または新しく単離したヒト肝類洞内皮細胞（Ｌ−ＳＩＧＮ＋）または樹状細胞（ＤＣ−ＳＩＧＮ＋）を、実施例１６の抗体とともに３０分間インキュベートした後、目的のエンベロープタンパク質、例えばＨＣＶ−Ｅ２、ＨＩＶｇｐ１２０、エボラ（Ａｌｖａｒｅｚら、２００２年）またはシンドビス（Ｋｌｉｍｓｔｒａら、２００３年）を発現するルシフェラーゼまたは緑色蛍光タンパク質レポーターウイルスを加える。培地で洗浄した後、細胞をＴ細胞（Ｃ８１６６）またはヒト肝細胞（Ｈｕｈ−７）とともに共培養する。標的細胞溶解物中のルシフェラーゼ活性の測定（相対発光単位）、または標的細胞上の適した表面マーカー二重染色（例えば、Ｔ細胞上のＣＤ３）と組み合わせたＧＦＰ陽性標的細胞のフローサイトメトリー解析のいずれかによって、レポーターウイルス伝播を評価する。
【０１５５】
（実施例１９）
ヒト結核菌からの感染のブロッキングにおける抗体の役割を評価すること
ヒト結核菌の表面に存在する、炭水化物に富んだ構造であるマンノース化リポアラビノマンナン（ＭａｎＬＡＭ）は、ＤＣ−ＳＩＧＮ（４Ｇｅｉｊｔｅｎｂｅｅｋら、２００３年）およびＬ−ＳＩＧＮ（Ｋｏｐｐｅｌら、２００４年）の両方と相互作用することが示されている。ＭａｎＬＡＭに対する高い抗体力価が、活発な結核を有する人々において観察され、受動的防御実験における細菌負荷を減少させることが示されている（Ｈａｍａｓｕｒら、２００４年）。ミコバクテリウムの結合および感染は、ＭａｎＬＡＭと高い親和性で結合することができる、Ｌ−ＳＩＧＮ抗体またはＬ−ＳＩＧＮペプチド模倣物を用いて、阻害される。細菌の株、例えばウシ結核菌およびヒト結核菌を、４Ｇｅｉｊｔｅｎｂｅｅｋら（２００３年）に詳述されているように、フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）で標識する。Ｋ５６２／Ｌ−ＳＩＧＮ細胞を、Ｌ−ＳＩＧＮペプチド模倣物（５０μｇ／ｍｌ）ありまたはなしで、ＦＩＴＣ複合細菌とともに、１〜２０の比でインキュベートする。解毒薬または模倣物によるブロッキングの程度（蛍光の減少）を、フローサイトメトリー解析によって決定する。
【０１５６】
（実施例２０）
ＨＣＶ感染肝臓を有する移植患者の治療
ウイルス伝播が予防されると、ドナーが潜在的にＨＣＶ感染を有する移植環境において、抗体を使用することができる。これを試験するために、健康なＨＬＡ適合ヒトドナー由来の初代血中リンパ球の注射とともに、軽度にＨＣＶ感染したヒトドナー肝臓をＮＯＤ／ＳＯＩＤ等の免疫欠損マウスに移植する。１〜６カ月の期間にわたって、マウスを抗体で処置する。移植の１〜６カ月後、マウスを屠殺し、肝臓におけるＨＣＶ感染の程度を評価する。また、ＰＣＲによって、Ｔ細胞をウイルス感染について調べる。
【０１５７】
（実施例２１）
Ｌ−ＳＩＧＮを発現している癌型の同定
悪性組織および対になる正常な組織を回収し、パラ−ホルムアルデヒド中で固定するか、またはＯＣＴ中で瞬間凍結する。ミクロトームを用いて切片を調製し、ＦＩＴＣ等の適した蛍光色素に直接複合化したＬ−ＳＩＧＮ抗体、または二次抗体蛍光色素複合抗マウスＩｇＧのいずれかを用いることによって、Ｌ−ＳＩＧＮの存在について切片を染色する。正常な組織の染色よりも有意に強い悪性組織についての染色結果が、Ｌ−ＳＩＧＮを発現している癌型の指標である。
【０１５８】
次いで、Ｌ−ＳＩＧＮを発現しているこれらの癌型についての市販の細胞系を得て、Ｌ−ＳＩＧＮの存在をＦＡＣＳ解析によって評価する。簡潔に述べると、百万個の細胞を、１％ＢＳＡおよび０．１％ＮａＮ３を含むＰＢＳ中の１μｇの抗Ｌ−ＳＩＧＮ抗体とともにインキュベートする。３０分間のインキュベーションの後、細胞を洗浄し、蛍光色素複合抗マウスＩｇＧとともに、さらに３０分間インキュベートした後、ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒ（ベクトンディッキンソン）で解析する。
【０１５９】
（実施例２２）
抗Ｌ−ＳＩＧＮ抗体の治療上の使用
直接の細胞死滅
上述の実施例２１のように、Ｌ−ＳＩＧＮ発現細胞腫瘍型を同定すると、抗Ｌ−ＳＩＧＮ抗体を、それらがＡＤＣＣまたはＣＤＣをインビトロで誘導する能力について試験する。ＡＤＣＣを評価するために、標的細胞（腫瘍細胞）を、まず５１Ｃｒで標識する。次いで、Ｌ−ＳＩＧＮに対する抗体を、１〜５０μｇの間の濃度で加え、ＰＢＭＣによる標的細胞溶解を、１：１０〜１：１００のエフェクター対標的比で４時間後に測定する。ＣＤＣの評価のために、腫瘍細胞を、ヒト補体およびＬ−ＳＩＧＮ抗体とともにインキュベートする。死細胞にのみ侵入でき、生細胞には侵入できない試薬であるヨウ化プロピジウムの添加の後、細胞死滅をＦＡＣＳ解析によって評価する。ＡＤＣＣまたはＣＤＣを誘導しない抗体については、何らかの放射性同位元素標識または毒性試薬が抗体に複合化したままである。
【０１６０】
むき出しの、または複合化した抗Ｌ−ＳＩＧＮ抗体のいずれかの、腫瘍増殖を停止させる能力を、異種移植片モデルにおいて評価する。簡潔に述べると、Ｌ−ＳＩＧＮを発現している腫瘍細胞に皮下、腹腔内または静脈内注射する。動物を、対照または抗Ｌ−ＳＩＧＮ抗体のいずれかで処置する。腫瘍増殖を、皮下処置についてはサイズによって、または腹腔内もしくは静脈内処置については生存時間によって、測定する。抗Ｌ−ＳＩＧＮ処置群における腫瘍増殖が、対照群と比較して３０％より多く減少すると、抗体は、癌治療術として利用することができる。
【０１６１】
免疫系での、癌細胞の負の調節性相互作用のブロッキング
実施例１４に記載されているように、Ｌ−ＳＩＧＮと免疫細胞との相互作用をブロックする抗体を、蛍光ビーズアッセイを用いて同定する。抗体を、Ｌ−ＳＩＧＮ発現癌細胞による免疫系の負の調節を防ぐことによって免疫系が癌細胞を根絶できることに関する、その治療上の有用性について評価する。
【０１６２】
Ｌ−ＳＩＧＮ発現腫瘍細胞を、ＮＯＤ／ＳＯＩＤ等の免疫欠損マウスに、皮下、腹腔内または静脈内移植する。マウスに、健康なドナー由来の２百万のＰＢＭＣも施す（または、自然に腫瘍に拒絶反応を起こすのに十分ではない任意の数のＰＢＭＣ）。抗Ｌ−ＳＩＧＮ抗体ありまたはなしでの腫瘍増殖を対照抗体と比較する。腫瘍増殖を、皮下処置についてはサイズによって、または全身性腫瘍については生存時間によって、測定する。抗Ｌ−ＳＩＧＮ処置群における腫瘍増殖が、対照群と比較して３０％より多く減少すると、抗体は、癌治療術として利用することができる。
【０１６３】
（実施例２３）
Ｌ−ＳＩＧＮ発現細胞を単離するためのＬ−ＳＩＧＮ抗体の使用
新鮮なヒト非実質性肝細胞を、商業的供給源（例えば、セルズダイレクト、アリゾナ州トゥーソン）から得る。非実質性肝細胞は、類洞内皮細胞、赤血球、クップファー細胞および他の少数の細胞集団の混合物を含む。肝類洞細胞を単離するために、塩化アンモニウムを用いて赤血球を溶解する。市販の死細胞除去キット（ミルテニーバイオテク、ドイツ）を用いて、死細胞を除去する。細胞を計数し、０．１μｇ／百万個の細胞の抗Ｌ−ＳＩＧＮ抗体で標識する。細胞を洗浄した後、それらをＭＡＣＳバッファー（ミルテニー）中に再懸濁し、製造業者の使用説明書（ミルテニー）に従って抗マウスＩｇＧ複合ビーズを用いて、目的の細胞を単離する。ＣＤ５４、マンノース受容体、ＬＹＶＥ−１、ＣＤ４０、アシアロ糖タンパク質および他のもの等の分子に対する一団の抗体を用いたＦＡＣＳ解析によって、単離の質をモニタリングする。
【０１６４】
以下の参考文献は、それらの全体がこの参照によって本明細書中に援用される。
【０１６５】
【数１】
【０１６６】
【数２】
【０１６７】
【数３】
【０１６８】
【数４】
【０１６９】
【数５】
【０１７０】
【数６】
【０１７１】
【数７】
【０１７２】
【数８】
【０１７３】
【数９】
【０１７４】
【数１０】
【０１７５】
【数１１】
【０１７６】
【数１２】
上述の記載は限定として解釈されるべきではなく、単に好ましい実施形態の例示として解釈されるべきである。本明細書中に開示される実施形態に種々の変更がなされ得ることが理解されよう。例えば、当業者が認めるように、本明細書中に記載される特定の配列は、抗体または抗体断片の機能性に必ずしも有害に影響を及ぼすことなく、わずかに改変することができる。例えば、抗体配列における単一または複数のアミノ酸の置換は、抗体または断片の機能性を破壊することなく、頻繁に行うことができる。したがって、本明細書中に記載される特定の抗体に対して７０％より高い程度の相同性を有する抗体が、本開示の範囲内であることが理解されるべきである。特に有用な実施形態において、本明細書中に記載される特定の抗体に対して約８０％より高い相同性を有する抗体が企図される。他の有用な実施形態においては、本明細書中に記載される特定の抗体に対して約９０％より高い相同性を有する抗体が企図される。したがって、上述の記載は限定として解釈されるべきではなく、単に好ましい実施形態の例示として解釈されるべきである。当業者は、本開示の範囲内および精神内の、他の変更を構想するであろう。
【図面の簡単な説明】
【０１７７】
【図１】図１は、本開示による抗体／自己抗原コンストラクトと抗原提示細胞（ＡＰＣ）およびＴ細胞との相互作用を略図で示す。
【図２Ａ】図２Ａは、ウサギ抗ｍＳＩＧＮＲ１ ｓｃＦＶ抗体の軽鎖アミノ酸配列（配列番号１〜６）および重鎖アミノ酸配列を示す。
【図２Ｂ】図２Ｂは、ウサギ抗ｍＳＩＧＮＲ１ ｓｃＦＶ抗体の重鎖アミノ酸配列（配列番号７〜１２）を示す。
【図３】図３は、抗体ペプチドコンストラクト生成のためのベクターの一部の概略図である。
【図４】図４は、ヒトＤＣ−ＳＩＧＮＲとのＩｇＧ１クローンの反応性を示す、本開示によるインビトロ実験の結果のグラフ描写である。
【図５】図５は、ヒトＤＣ−ＳＩＧＮＲとのＩｇＧ２ａクローンの反応性を示す、本開示によるインビトロ実験の結果のグラフ描写である。
【図６】図６は、ヒトＤＣ−ＳＩＧＮＲおよびＤＣ−ＳＩＧＮとのＩｇＧ１クローンの反応性を示す、本開示によるインビトロ実験の結果のグラフ描写である。
【図７】図７は、ヒトＤＣ−ＳＩＧＮＲおよびＤＣ−ＳＩＧＮとのＩｇＧ２ａクローンの反応性を示す、本開示によるインビトロ実験の結果のグラフ描写である。
【図８Ａ】図８Ａ〜８Ｃは、ヒトＤＣ−ＳＩＧＮＲと反応性のある重鎖クローンのアミノ酸配列を示す（配列番号１７〜３６）。
【図８Ｂ】図８Ａ〜８Ｃは、ヒトＤＣ−ＳＩＧＮＲと反応性のある重鎖クローンのアミノ酸配列を示す（配列番号１７〜３６）。
【図８Ｃ】図８Ａ〜８Ｃは、ヒトＤＣ−ＳＩＧＮＲと反応性のある重鎖クローンのアミノ酸配列を示す（配列番号１７〜３６）。
【図９Ａ】図９Ａ〜９Ｂは、ヒトＤＣ−ＳＩＧＮＲと反応性のある軽鎖クローンのアミノ酸配列を示す（配列番号３７〜５５）。
【図９Ｂ】図９Ａ〜９Ｂは、ヒトＤＣ−ＳＩＧＮＲと反応性のある軽鎖クローンのアミノ酸配列を示す（配列番号３７〜５５）。
【図１０−１】図１０は、ヒトＤＣ−ＳＩＧＮＲと反応性のあるＩｇＧ１重鎖クローンのさらなるアミノ酸配列を示す（配列番号６３〜８２）。
【図１０−２】図１０は、ヒトＤＣ−ＳＩＧＮＲと反応性のあるＩｇＧ１重鎖クローンのさらなるアミノ酸配列を示す（配列番号６３〜８２）。
【図１１−１】図１１は、ＤＣ−ＳＩＧＮＲと反応性のあるＩｇＧ１軽鎖クローンのさらなるアミノ酸配列を示す（配列番号９６〜１１５）。
【図１１−２】図１１は、ＤＣ−ＳＩＧＮＲと反応性のあるＩｇＧ１軽鎖クローンのさらなるアミノ酸配列を示す（配列番号９６〜１１５）。
【図１２−１】図１２は、ＤＣ−ＳＩＧＮＲと反応性のあるＩｇＧ２ａ重鎖クローンのさらなるアミノ酸配列を示す（配列番号１３３〜１５４）。
【図１２−２】図１２は、ＤＣ−ＳＩＧＮＲと反応性のあるＩｇＧ２ａ重鎖クローンのさらなるアミノ酸配列を示す（配列番号１３３〜１５４）。
【図１３−１】図１３は、ＤＣ−ＳＩＧＮＲと反応性のあるＩｇＧ２ａ軽鎖クローンのさらなるアミノ酸配列を示す（配列番号１６９〜１８９）。
【図１３−２】図１３は、ＤＣ−ＳＩＧＮＲと反応性のあるＩｇＧ２ａ軽鎖クローンのさらなるアミノ酸配列を示す（配列番号１６９〜１８９）。
【図１４】図１４は、６つの抗体（クローン名Ｃ７、Ｄ１２、Ｅ４、Ｅ１０、Ｇ３、Ｇ１０）がＬ−ＳＩＧＮ受容体との非常に良好な結合を示したが、３つの抗体（Ｄ１２、Ｇ３およびＥ１０）はＤＣ−ＳＩＧＮとも、実質的により低いレベルではあるが反応したことを示す。
【図１５】図１５は、Ｌ−ＳＩＧＮタンパク質に対する、種々の抗体の親和性を示す。
【図１６】図１６は、ＥＬＩＳＡにおける、Ｌ−ＳＩＧＮＦｃ融合タンパク質に結合するＬ−ＳＩＧＮ特異的モノクローナル抗体（ｍａｂ１６２）と競合することによって特徴付けられる、種々の抗体に対するエピトープ特異性を示す。
【図１７】図１７は、肝類洞内皮細胞による抗体内在化の結果を示す。
【図１８】図１８は、フローサイトメトリーで測定した、Ｋ５６２／ＬＳＩＧＮ細胞のＩＣＡＭ−１およびＩＣＡＭ−３媒介性接着を測定するのに用いた、リガンドブロッキングのための蛍光ビーズ接着アッセイの結果を示す。
【図１９】図１９Ａは、エボラＫ５６２／ＤＣ−ＳＩＧＮおよびＫ５６２／Ｌ−ＳＩＧＮのエンベロープ糖タンパク質でコートした蛍光ビーズの接着を示す。抗体なしで、５万個のＫ５６２／Ｌ−ＳＩＧＮ細胞およびＫ５６２／ＤＣ−ＳＩＧＮ細胞を、ＨＩＶおよびエボラのエンベロープ糖タンパク質でコートした蛍光ビーズ（２０個のビーズ／細胞）とともに３０分間インキュベートし、ウイルスタンパク質でコートしたビーズによる結合の程度を、ＦＬ−３中のフローサイトメトリーによって測定した。図１９Ｂは、Ｆａｂが、Ｌ−ＳＩＧＮに結合したＨＩＶｇｐ１２０およびエボラｇｐ結合の接着をブロックする能力を示す。Ｌ−ＳＩＧＮ Ｆａｂ（２０ｕｇ／ｍｌ）の存在下で、５万個のＫ５６２／Ｌ−ＳＩＧＮ細胞を、ＨＩＶおよびエボラのエンベロープ糖タンパク質でコートした蛍光ビーズ（２０個のビーズ／細胞）とともに３０分間インキュベートし、ウイルスタンパク質でコートしたビーズに結合している細胞の数を、フローサイトメトリーによって測定した。図１９Ｃは、ＦａｂがＤＣ−ＳＩＧＮへの両方のウイルスタンパク質の結合をブロックする能力を示す。Ｌ−ＳＩＧＮ Ｆａｂ（２０ｕｇ／ｍｌ）の存在下で、５万個のＫ５６２／ＤＣ−ＳＩＧＮ細胞を、ＨＩＶおよびエボラのエンベロープ糖タンパク質でコートした蛍光ビーズ（２０個のビーズ／細胞）とともに３０分間インキュベートし、ウイルスタンパク質でコートしたビーズに結合している細胞の数を、フローサイトメトリーによって測定した。図１９Ａ〜Ｃ中のパーセント結合は、Ｆａｂありで、タンパク質でコートしたビーズに結合している細胞の数を、Ｆａｂなしで、タンパク質でコートしたビーズに結合している細胞の数で割って、１００倍することとして決定した。棒は、２つの独立した実験の平均値＋ＳＤを表す。
【図２０】図２０Ａ〜Ｃは、受容体への、完全ＩｇＧバージョンのＦａｂ、Ｅ１０およびＧ１０の結合、ならびにウイルスタンパク質接着のブロッキングを示す。図２０Ａのデータを生成するために、５×１０５個のＫ５６２、Ｋ５６２／ＤＣ−ＳＩＧＮおよびＫ５６２／Ｌ−ＳＩＧＮ細胞を、精製したＦａｂ（２０μｇ／ｍＬ）とともに１時間インキュベートし、それらの結合の程度を、ＰＥ複合ヤギ抗マウス（Ｆａｂ検出）またはヤギ抗ヒト（ＩｇＧ検出）二次抗体を用いたフローサイトメトリーによって評価した。ｍＡｂ１６２（Ｌ−ＳＩＧＮ特異的）およびｍＡｂ１６２１１（ＤＣ−ＳＩＧＮ／Ｌ−ＳＩＧＮ交差反応性）を陽性対照として使用した。図２０Ｂのデータを生成するために、Ａｂ（２０ｕｇ／ｍｌ）存在下で、５万個のＫ５６２／Ｌ−ＳＩＧＮおよびＫ５６２／ＤＣ−ＳＩＧＮ細胞を、ＨＩＶｇｐ１２０でコートした蛍光ビーズ（２０個のビーズ／細胞）とともに３０分間インキュベートし、ウイルスタンパク質でコートしたビーズに結合している細胞の数を、フローサイトメトリーによって測定した。図２０Ｃのデータを生成するために、Ａｂ（２０ｕｇ／ｍｌ）存在下で、５万個のＫ５６２／Ｌ−ＳＩＧＮおよびＫ５６２／ＤＣ−ＳＩＧＮ細胞を、エボラエンベロープ糖タンパク質でコートした蛍光ビーズ（２０個のビーズ／細胞）とともに３０分間インキュベートし、ウイルスタンパク質でコートしたビーズに結合している細胞の数を、フローサイトメトリーによって測定した。ｍＡｂ１６２（Ｌ−ＳＩＧＮ特異的）およびｍＡｂＡＺＮＤ１（ＤＣ−ＳＩＧＮ特異的）を陽性対照として使用した。パーセント結合は、Ａｂありで、タンパク質でコートしたビーズに結合している細胞の数を、Ａｂなしで、タンパク質でコートしたビーズに結合している細胞の数で割って、１００倍することとして決定した。棒は、２つの独立した実験の平均値＋ＳＤを表す。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｌ−ＳＩＧＮ受容体を認識し、２時間のうちに、単離されたヒト肝臓非実質性細胞中への少なくとも４０パーセントの内在化を示す抗体。
【請求項２】
単離されたヒト肝臓非実質性細胞中に内在化して、ＩＣＡＭ−１の結合に影響を及ぼすことなくＬ−ＳＩＧＮ受容体へのＩＣＡＭ−３の結合をブロックする抗体。
【請求項３】
請求項１に記載の抗体および薬学的に許容され得る担体を含む組成物。
【請求項４】
請求項１に記載の抗体を含むワクチン。
【請求項５】
細胞へのウイルスの結合を効果的にブロックすることができる、細胞上のＬ−ＳＩＧＮ受容体を認識する抗体。
【請求項６】
細胞への、ＨＩＶ、ＨＣＶ、エボラ、ＳＡＲＳ、ＣＭＶおよびシンドビスからなる群より選択されるウイルスの結合を効果的にブロックすることができる、請求項５に記載の抗体。
【請求項７】
ウイルスによる細胞の感染を効果的にブロックすることができる、細胞上のＬ−ＳＩＧＮ受容体を認識する抗体。
【請求項８】
ＨＩＶ、ＨＣＶ、エボラ、ＳＡＲＳ、ＣＭＶおよびシンドビスからなる群より選択されるウイルスによる細胞の感染を効果的にブロックすることができる、請求項７に記載の抗体。
【請求項９】
細胞から別の細胞へのウイルスの伝播を効果的にブロックすることができる、細胞上のＬ−ＳＩＧＮ受容体を認識する抗体。
【請求項１０】
細胞から別の細胞への、ＨＩＶ、ＨＣＶ、エボラ、ＳＡＲＳ、ＣＭＶおよびシンドビスからなる群より選択されるウイルスの伝播を効果的にブロックすることができる、請求項９に記載の抗体。
【請求項１１】
請求項５に記載の抗体を含むワクチン。
【請求項１２】
細胞へのミコバクテリウム（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属の細菌の結合を効果的にブロックすることができる、細胞上のＬ−ＳＩＧＮ受容体を認識する抗体。
【請求項１３】
細胞への、ヒト結核菌（Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）およびウシ結核菌（Ｍ．Ｂｏｖｉｓ）からなる群より選択される細菌の結合を効果的にブロックすることができる、請求項１２に記載の抗体。
【請求項１４】
ミコバクテリウム属の細菌による細胞の感染を効果的にブロックすることができる、細胞上のＬ−ＳＩＧＮ受容体を認識する抗体。
【請求項１５】
ヒト結核菌およびウシ結核菌からなる群より選択される細菌による細胞の感染を効果的にブロックすることができる、請求項１４に記載の抗体。
【請求項１６】
細胞から別の細胞へのミコバクテリウム属の細菌の伝播を効果的にブロックすることができる、細胞上のＬ−ＳＩＧＮ受容体を認識する抗体。
【請求項１７】
細胞から別の細胞への、ヒト結核菌およびウシ結核菌からなる群より選択される細菌の伝播を効果的にブロックすることができる、請求項１６に記載の抗体。
【請求項１８】
細胞へのマンソン住血吸虫（Ｓｃｈｉｓｔｏｓｏｍａ ｍａｎｓｏｎｉ）の結合を効果的にブロックすることができる、細胞上のＬ−ＳＩＧＮ受容体を認識する抗体。
【請求項１９】
マンソン住血吸虫による細胞の感染を効果的にブロックすることができる、細胞上のＬ−ＳＩＧＮ受容体を認識する抗体。
【請求項２０】
細胞から別の細胞へのマンソン住血吸虫の伝播を効果的にブロックすることができる、細胞上のＬ−ＳＩＧＮ受容体を認識する抗体。
【請求項２１】
Ｌ−ＳＩＧＮ受容体を認識する抗体を含む、増大したＬ−ＳＩＧＮ発現によって特徴付けられる腫瘍の診断薬。
【請求項２２】
請求項２１に記載の診断薬を含む診断キット。
【請求項２３】
癌を有する疑いのある被験体から組織試料を得ること、および
該組織試料がＬ−ＳＩＧＮ受容体を認識する抗体と結合する程度を測定すること
を含み、
対応する正常組織と比較した結合の程度の増大が癌の存在を示す、
癌を診断するための方法。
【請求項２４】
前記測定する工程が、Ｌ−ＳＩＧＮの存在を染色することを含む、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
Ｌ−ＳＩＧＮ受容体を認識する抗体を含む、増大したＬ−ＳＩＧＮ発現によって特徴付けられる癌を治療するための治療剤。
【請求項２６】
癌細胞死滅させる量の、Ｌ−ＳＩＧＮ受容体を認識する抗体を含む組成物を、被験体に投与することを含む、癌を治療するための方法。
【請求項２７】
前記Ｌ−ＳＩＧＮ受容体を認識する抗体が癌細胞の抗体依存性細胞毒性を誘導する、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
前記Ｌ−ＳＩＧＮ受容体を認識する抗体が癌細胞の補体依存性細胞毒性を誘導する、請求項２６に記載の方法。
【請求項２９】
前記Ｌ−ＳＩＧＮ受容体を認識する抗体がＬ−ＳＩＧＮ発現癌細胞による免疫系の負の調節を防ぐ、請求項２６に記載の方法。
【請求項３０】
前記Ｌ−ＳＩＧＮ受容体を認識する抗体が毒素に融合している、請求項２６に記載の方法。
【請求項３１】
前記Ｌ−ＳＩＧＮ受容体を認識する抗体が高エネルギー放射線放射体に融合している、請求項２４に記載の方法。
【請求項３２】
Ｌ−ＳＩＧＮ発現細胞を死滅させる量の、Ｌ−ＳＩＧＮ受容体を認識する抗体を含む組成物を、被験体に投与することを含む、炎症性疾患を治療するための方法。
【請求項３３】
前記Ｌ−ＳＩＧＮ受容体を認識する抗体がＬ−ＳＩＧＮ発現細胞の抗体依存性細胞毒性を誘導する、請求項３２に記載の方法。
【請求項３４】
前記Ｌ−ＳＩＧＮ受容体を認識する抗体がＬ−ＳＩＧＮ発現細胞の補体依存性細胞毒性を誘導する、請求項３２に記載の方法。
【請求項３５】
前記Ｌ−ＳＩＧＮ受容体を認識する抗体がＬ−ＳＩＧＮ発現細胞による免疫系の負の調節を防ぐ、請求項３２に記載の方法。
【請求項３６】
前記Ｌ−ＳＩＧＮ受容体を認識する抗体が毒素に融合している、請求項３２に記載の方法。
【請求項３７】
前記Ｌ−ＳＩＧＮ受容体を認識する抗体が高エネルギー放射線放射体に融合している、請求項３２に記載の方法。
【請求項３８】
Ｌ−ＳＩＧＮに対して高い親和性を有するがＤＣ−ＳＩＧＮに対して低い親和性を有する抗体。
【請求項３９】
Ｌ−ＳＩＧＮ上の線状エピトープおよびＬ−ＳＩＧＮ上の立体的エピトープに結合する抗体。
【請求項４０】
Ｌ−ＳＩＧＮ−Ｔ細胞相互作用をブロックし、それによって調節性Ｔ細胞の増殖を引き起こす抗体。
【請求項４１】
肝臓において調節性Ｔ細胞の増殖が起こる、請求項４０に記載の抗体。
【請求項４２】
Ｌ−ＳＩＧＮ−Ｔ細胞相互作用をブロックし、それによって自己反応性Ｔ細胞の増殖を抑制する抗体。
【請求項４３】
リンパ節において自己反応性Ｔ細胞の増殖の抑制が起こる、請求項４２に記載の抗体。
【請求項４４】
自己抗原を肝類洞内皮細胞に送達し、それによって調節性細胞の増殖を刺激する抗体−ペプチドコンストラクト。
【請求項４５】
自己抗原を肝類洞内皮細胞に送達し、それによって自己反応性Ｔ細胞の活性を抑制する抗体−ペプチドコンストラクト。
【請求項４６】
ワクチン抗原をリンパ節中の類洞内皮細胞に送達し、それによって抗原特異的Ｔ細胞の増殖を刺激する抗体−ペプチドコンストラクト。
【請求項４７】
Ｌ−ＳＩＧＮを発現していない細胞と組み合わせたＬ−ＳＩＧＮ発現細胞の混合物を得ること、
該混合物を抗Ｌ−ＳＩＧＮ抗体に曝露すること、および
該Ｌ−ＳＩＧＮ発現細胞を該抗Ｌ−ＳＩＧＮ抗体に結合させ、それによって、該Ｌ−ＳＩＧＮを発現していない細胞から該Ｌ−ＳＩＧＮ発現細胞を単離すること
を含む、Ｌ−ＳＩＧＮ発現細胞を単離するための方法。
【請求項４８】
請求項２に記載の抗体および薬学的に許容され得る担体を含む組成物。
【請求項４９】
請求項２に記載の抗体を含むワクチン。
【請求項５０】
請求項７に記載の抗体を含むワクチン。
【請求項５１】
請求項９に記載の抗体を含むワクチン。
【請求項５２】
Ｌ−ＳＩＧＮ受容体を認識し、Ｌ−ＳＩＧＮへのＨＩＶｇｐ１２０の結合をブロックする抗体。
【請求項５３】
Ｌ−ＳＩＧＮ受容体を認識し、Ｌ−ＳＩＧＮへのエボラエンベロープタンパク質の結合をブロックする抗体。
【請求項５４】
Ｌ−ＳＩＧＮ受容体を認識し、ＤＣ−ＳＩＧＮへのＨＩＶｇｐ１２０の結合をブロックする抗体。
【請求項５５】
Ｌ−ＳＩＧＮ受容体を認識し、ＤＣ−ＳＩＧＮへのエボラエンベロープタンパク質の結合をブロックする抗体。
【請求項５６】
Ｌ−ＳＩＧＮ受容体およびＤＣ−ＳＩＧＮ受容体の両方を認識し、ＤＣ−ＳＩＧＮへのＨＩＶｇｐ１２０の結合をブロックする抗体。
【請求項５７】
Ｌ−ＳＩＧＮ受容体およびＤＣ−ＳＩＧＮ受容体の両方を認識し、ＤＣ−ＳＩＧＮへのエボラエンベロープタンパク質の結合をブロックする抗体。
【請求項５８】
請求項５２から５７のいずれかに記載の抗体および薬学的に許容され得る担体を含む組成物。
【請求項５９】
請求項５２から５７のいずれかに記載の抗体を含むワクチン。
【請求項６０】
抗体およびエボラエンベロープタンパク質が同じエピトープに結合する、請求項５３に記載の抗体。
【請求項６１】
細胞へのウイルスの結合をブロックすることができる、細胞上のＬ−ＳＩＧＮ受容体を認識する抗体。
【請求項６２】
細胞への、ＨＩＶ、ＨＣＶ、エボラ、ＳＡＲＳ、ＣＭＶおよびシンドビスからなる群より選択されるウイルスの結合をブロックすることができる、請求項６１に記載の抗体。
【請求項６３】
ＤＣ−ＳＩＧＮ受容体も認識する、請求項６１に記載の抗体。
【請求項６４】
非ヒト可変ドメインおよびヒトＩｇＧ１定常領域を含み、非ヒト可変ドメインが任意の抗原提示細胞上の受容体に結合する、キメラ抗体。
【請求項６５】
非ヒト可変領域がＬ−ＳＩＧＮ受容体を認識する、請求項６４に記載のキメラ抗体。
【請求項６６】
非ヒト可変領域がＤＣ−ＳＩＧＮ受容体をさらに認識する、請求項６５に記載のキメラ抗体。
【請求項６７】
非ヒト可変領域がマウスのものである、請求項６４に記載のキメラ抗体。
【請求項６８】
ヒトＩｇＧ定常領域がヒトＩｇＧ１定常領域である、請求項６４に記載のキメラ抗体。
【請求項６９】
Ｌ−ＳＩＧＮへのＨＩＶｇｐ１２０の結合をブロックする、請求項６４に記載のキメラ抗体。
【請求項７０】
Ｌ−ＳＩＧＮへのエボラエンベロープタンパク質の結合をブロックする、請求項６４に記載のキメラ抗体。
【請求項７１】
Ｌ−ＳＩＧＮへのエボラエンベロープタンパク質の結合を少なくとも約９０％ブロックする、請求項６４に記載のキメラ抗体。
【請求項７２】
非ヒト可変ドメイン単独よりもよくＬ−ＳＩＧＮへのエボラエンベロープタンパク質の結合をブロックする、請求項６４に記載のキメラ抗体。
【請求項７３】
非ヒト可変ドメイン単独よりもよくＤＣ−ＳＩＧＮへのエボラエンベロープタンパク質の結合をブロックする、請求項６４に記載のキメラ抗体。
【請求項７４】
非ヒト可変ドメイン単独よりもよくＬ−ＳＩＧＮへのＨＩＶｇｐ１２０の結合をブロックする、請求項６４に記載のキメラ抗体。
【請求項７５】
非ヒト可変ドメイン単独よりもよくＤＣ−ＳＩＧＮへのＨＩＶｇｐ１２０の結合をブロックする、請求項６４に記載のキメラ抗体。
【請求項７６】
Ｌ−ＳＩＧＮ受容体の認識がＤＣ−ＳＩＧＮ受容体の認識よりも強い、Ｌ−ＳＩＧＮ受容体およびＤＣ−ＳＩＧＮ受容体の両方を認識する抗体。
【請求項７７】
Ｌ−ＳＩＧＮ受容体の認識がＤＣ−ＳＩＧＮの認識よりも約１．１倍〜約２０倍強い、請求項７６に記載の抗体。
【請求項７８】
Ｌ−ＳＩＧＮ受容体の認識がＤＣ−ＳＩＧＮの認識よりも約１．２倍〜約１０倍強い、請求項７６に記載の抗体。
【請求項１】
Ｌ−ＳＩＧＮ受容体を認識し、２時間のうちに、単離されたヒト肝臓非実質性細胞中への少なくとも４０パーセントの内在化を示す抗体。
【請求項２】
単離されたヒト肝臓非実質性細胞中に内在化して、ＩＣＡＭ−１の結合に影響を及ぼすことなくＬ−ＳＩＧＮ受容体へのＩＣＡＭ−３の結合をブロックする抗体。
【請求項３】
請求項１に記載の抗体および薬学的に許容され得る担体を含む組成物。
【請求項４】
請求項１に記載の抗体を含むワクチン。
【請求項５】
細胞へのウイルスの結合を効果的にブロックすることができる、細胞上のＬ−ＳＩＧＮ受容体を認識する抗体。
【請求項６】
細胞への、ＨＩＶ、ＨＣＶ、エボラ、ＳＡＲＳ、ＣＭＶおよびシンドビスからなる群より選択されるウイルスの結合を効果的にブロックすることができる、請求項５に記載の抗体。
【請求項７】
ウイルスによる細胞の感染を効果的にブロックすることができる、細胞上のＬ−ＳＩＧＮ受容体を認識する抗体。
【請求項８】
ＨＩＶ、ＨＣＶ、エボラ、ＳＡＲＳ、ＣＭＶおよびシンドビスからなる群より選択されるウイルスによる細胞の感染を効果的にブロックすることができる、請求項７に記載の抗体。
【請求項９】
細胞から別の細胞へのウイルスの伝播を効果的にブロックすることができる、細胞上のＬ−ＳＩＧＮ受容体を認識する抗体。
【請求項１０】
細胞から別の細胞への、ＨＩＶ、ＨＣＶ、エボラ、ＳＡＲＳ、ＣＭＶおよびシンドビスからなる群より選択されるウイルスの伝播を効果的にブロックすることができる、請求項９に記載の抗体。
【請求項１１】
請求項５に記載の抗体を含むワクチン。
【請求項１２】
細胞へのミコバクテリウム（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属の細菌の結合を効果的にブロックすることができる、細胞上のＬ−ＳＩＧＮ受容体を認識する抗体。
【請求項１３】
細胞への、ヒト結核菌（Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）およびウシ結核菌（Ｍ．Ｂｏｖｉｓ）からなる群より選択される細菌の結合を効果的にブロックすることができる、請求項１２に記載の抗体。
【請求項１４】
ミコバクテリウム属の細菌による細胞の感染を効果的にブロックすることができる、細胞上のＬ−ＳＩＧＮ受容体を認識する抗体。
【請求項１５】
ヒト結核菌およびウシ結核菌からなる群より選択される細菌による細胞の感染を効果的にブロックすることができる、請求項１４に記載の抗体。
【請求項１６】
細胞から別の細胞へのミコバクテリウム属の細菌の伝播を効果的にブロックすることができる、細胞上のＬ−ＳＩＧＮ受容体を認識する抗体。
【請求項１７】
細胞から別の細胞への、ヒト結核菌およびウシ結核菌からなる群より選択される細菌の伝播を効果的にブロックすることができる、請求項１６に記載の抗体。
【請求項１８】
細胞へのマンソン住血吸虫（Ｓｃｈｉｓｔｏｓｏｍａ ｍａｎｓｏｎｉ）の結合を効果的にブロックすることができる、細胞上のＬ−ＳＩＧＮ受容体を認識する抗体。
【請求項１９】
マンソン住血吸虫による細胞の感染を効果的にブロックすることができる、細胞上のＬ−ＳＩＧＮ受容体を認識する抗体。
【請求項２０】
細胞から別の細胞へのマンソン住血吸虫の伝播を効果的にブロックすることができる、細胞上のＬ−ＳＩＧＮ受容体を認識する抗体。
【請求項２１】
Ｌ−ＳＩＧＮ受容体を認識する抗体を含む、増大したＬ−ＳＩＧＮ発現によって特徴付けられる腫瘍の診断薬。
【請求項２２】
請求項２１に記載の診断薬を含む診断キット。
【請求項２３】
癌を有する疑いのある被験体から組織試料を得ること、および
該組織試料がＬ−ＳＩＧＮ受容体を認識する抗体と結合する程度を測定すること
を含み、
対応する正常組織と比較した結合の程度の増大が癌の存在を示す、
癌を診断するための方法。
【請求項２４】
前記測定する工程が、Ｌ−ＳＩＧＮの存在を染色することを含む、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
Ｌ−ＳＩＧＮ受容体を認識する抗体を含む、増大したＬ−ＳＩＧＮ発現によって特徴付けられる癌を治療するための治療剤。
【請求項２６】
癌細胞死滅させる量の、Ｌ−ＳＩＧＮ受容体を認識する抗体を含む組成物を、被験体に投与することを含む、癌を治療するための方法。
【請求項２７】
前記Ｌ−ＳＩＧＮ受容体を認識する抗体が癌細胞の抗体依存性細胞毒性を誘導する、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
前記Ｌ−ＳＩＧＮ受容体を認識する抗体が癌細胞の補体依存性細胞毒性を誘導する、請求項２６に記載の方法。
【請求項２９】
前記Ｌ−ＳＩＧＮ受容体を認識する抗体がＬ−ＳＩＧＮ発現癌細胞による免疫系の負の調節を防ぐ、請求項２６に記載の方法。
【請求項３０】
前記Ｌ−ＳＩＧＮ受容体を認識する抗体が毒素に融合している、請求項２６に記載の方法。
【請求項３１】
前記Ｌ−ＳＩＧＮ受容体を認識する抗体が高エネルギー放射線放射体に融合している、請求項２４に記載の方法。
【請求項３２】
Ｌ−ＳＩＧＮ発現細胞を死滅させる量の、Ｌ−ＳＩＧＮ受容体を認識する抗体を含む組成物を、被験体に投与することを含む、炎症性疾患を治療するための方法。
【請求項３３】
前記Ｌ−ＳＩＧＮ受容体を認識する抗体がＬ−ＳＩＧＮ発現細胞の抗体依存性細胞毒性を誘導する、請求項３２に記載の方法。
【請求項３４】
前記Ｌ−ＳＩＧＮ受容体を認識する抗体がＬ−ＳＩＧＮ発現細胞の補体依存性細胞毒性を誘導する、請求項３２に記載の方法。
【請求項３５】
前記Ｌ−ＳＩＧＮ受容体を認識する抗体がＬ−ＳＩＧＮ発現細胞による免疫系の負の調節を防ぐ、請求項３２に記載の方法。
【請求項３６】
前記Ｌ−ＳＩＧＮ受容体を認識する抗体が毒素に融合している、請求項３２に記載の方法。
【請求項３７】
前記Ｌ−ＳＩＧＮ受容体を認識する抗体が高エネルギー放射線放射体に融合している、請求項３２に記載の方法。
【請求項３８】
Ｌ−ＳＩＧＮに対して高い親和性を有するがＤＣ−ＳＩＧＮに対して低い親和性を有する抗体。
【請求項３９】
Ｌ−ＳＩＧＮ上の線状エピトープおよびＬ−ＳＩＧＮ上の立体的エピトープに結合する抗体。
【請求項４０】
Ｌ−ＳＩＧＮ−Ｔ細胞相互作用をブロックし、それによって調節性Ｔ細胞の増殖を引き起こす抗体。
【請求項４１】
肝臓において調節性Ｔ細胞の増殖が起こる、請求項４０に記載の抗体。
【請求項４２】
Ｌ−ＳＩＧＮ−Ｔ細胞相互作用をブロックし、それによって自己反応性Ｔ細胞の増殖を抑制する抗体。
【請求項４３】
リンパ節において自己反応性Ｔ細胞の増殖の抑制が起こる、請求項４２に記載の抗体。
【請求項４４】
自己抗原を肝類洞内皮細胞に送達し、それによって調節性細胞の増殖を刺激する抗体−ペプチドコンストラクト。
【請求項４５】
自己抗原を肝類洞内皮細胞に送達し、それによって自己反応性Ｔ細胞の活性を抑制する抗体−ペプチドコンストラクト。
【請求項４６】
ワクチン抗原をリンパ節中の類洞内皮細胞に送達し、それによって抗原特異的Ｔ細胞の増殖を刺激する抗体−ペプチドコンストラクト。
【請求項４７】
Ｌ−ＳＩＧＮを発現していない細胞と組み合わせたＬ−ＳＩＧＮ発現細胞の混合物を得ること、
該混合物を抗Ｌ−ＳＩＧＮ抗体に曝露すること、および
該Ｌ−ＳＩＧＮ発現細胞を該抗Ｌ−ＳＩＧＮ抗体に結合させ、それによって、該Ｌ−ＳＩＧＮを発現していない細胞から該Ｌ−ＳＩＧＮ発現細胞を単離すること
を含む、Ｌ−ＳＩＧＮ発現細胞を単離するための方法。
【請求項４８】
請求項２に記載の抗体および薬学的に許容され得る担体を含む組成物。
【請求項４９】
請求項２に記載の抗体を含むワクチン。
【請求項５０】
請求項７に記載の抗体を含むワクチン。
【請求項５１】
請求項９に記載の抗体を含むワクチン。
【請求項５２】
Ｌ−ＳＩＧＮ受容体を認識し、Ｌ−ＳＩＧＮへのＨＩＶｇｐ１２０の結合をブロックする抗体。
【請求項５３】
Ｌ−ＳＩＧＮ受容体を認識し、Ｌ−ＳＩＧＮへのエボラエンベロープタンパク質の結合をブロックする抗体。
【請求項５４】
Ｌ−ＳＩＧＮ受容体を認識し、ＤＣ−ＳＩＧＮへのＨＩＶｇｐ１２０の結合をブロックする抗体。
【請求項５５】
Ｌ−ＳＩＧＮ受容体を認識し、ＤＣ−ＳＩＧＮへのエボラエンベロープタンパク質の結合をブロックする抗体。
【請求項５６】
Ｌ−ＳＩＧＮ受容体およびＤＣ−ＳＩＧＮ受容体の両方を認識し、ＤＣ−ＳＩＧＮへのＨＩＶｇｐ１２０の結合をブロックする抗体。
【請求項５７】
Ｌ−ＳＩＧＮ受容体およびＤＣ−ＳＩＧＮ受容体の両方を認識し、ＤＣ−ＳＩＧＮへのエボラエンベロープタンパク質の結合をブロックする抗体。
【請求項５８】
請求項５２から５７のいずれかに記載の抗体および薬学的に許容され得る担体を含む組成物。
【請求項５９】
請求項５２から５７のいずれかに記載の抗体を含むワクチン。
【請求項６０】
抗体およびエボラエンベロープタンパク質が同じエピトープに結合する、請求項５３に記載の抗体。
【請求項６１】
細胞へのウイルスの結合をブロックすることができる、細胞上のＬ−ＳＩＧＮ受容体を認識する抗体。
【請求項６２】
細胞への、ＨＩＶ、ＨＣＶ、エボラ、ＳＡＲＳ、ＣＭＶおよびシンドビスからなる群より選択されるウイルスの結合をブロックすることができる、請求項６１に記載の抗体。
【請求項６３】
ＤＣ−ＳＩＧＮ受容体も認識する、請求項６１に記載の抗体。
【請求項６４】
非ヒト可変ドメインおよびヒトＩｇＧ１定常領域を含み、非ヒト可変ドメインが任意の抗原提示細胞上の受容体に結合する、キメラ抗体。
【請求項６５】
非ヒト可変領域がＬ−ＳＩＧＮ受容体を認識する、請求項６４に記載のキメラ抗体。
【請求項６６】
非ヒト可変領域がＤＣ−ＳＩＧＮ受容体をさらに認識する、請求項６５に記載のキメラ抗体。
【請求項６７】
非ヒト可変領域がマウスのものである、請求項６４に記載のキメラ抗体。
【請求項６８】
ヒトＩｇＧ定常領域がヒトＩｇＧ１定常領域である、請求項６４に記載のキメラ抗体。
【請求項６９】
Ｌ−ＳＩＧＮへのＨＩＶｇｐ１２０の結合をブロックする、請求項６４に記載のキメラ抗体。
【請求項７０】
Ｌ−ＳＩＧＮへのエボラエンベロープタンパク質の結合をブロックする、請求項６４に記載のキメラ抗体。
【請求項７１】
Ｌ−ＳＩＧＮへのエボラエンベロープタンパク質の結合を少なくとも約９０％ブロックする、請求項６４に記載のキメラ抗体。
【請求項７２】
非ヒト可変ドメイン単独よりもよくＬ−ＳＩＧＮへのエボラエンベロープタンパク質の結合をブロックする、請求項６４に記載のキメラ抗体。
【請求項７３】
非ヒト可変ドメイン単独よりもよくＤＣ−ＳＩＧＮへのエボラエンベロープタンパク質の結合をブロックする、請求項６４に記載のキメラ抗体。
【請求項７４】
非ヒト可変ドメイン単独よりもよくＬ−ＳＩＧＮへのＨＩＶｇｐ１２０の結合をブロックする、請求項６４に記載のキメラ抗体。
【請求項７５】
非ヒト可変ドメイン単独よりもよくＤＣ−ＳＩＧＮへのＨＩＶｇｐ１２０の結合をブロックする、請求項６４に記載のキメラ抗体。
【請求項７６】
Ｌ−ＳＩＧＮ受容体の認識がＤＣ−ＳＩＧＮ受容体の認識よりも強い、Ｌ−ＳＩＧＮ受容体およびＤＣ−ＳＩＧＮ受容体の両方を認識する抗体。
【請求項７７】
Ｌ−ＳＩＧＮ受容体の認識がＤＣ−ＳＩＧＮの認識よりも約１．１倍〜約２０倍強い、請求項７６に記載の抗体。
【請求項７８】
Ｌ−ＳＩＧＮ受容体の認識がＤＣ−ＳＩＧＮの認識よりも約１．２倍〜約１０倍強い、請求項７６に記載の抗体。
【図１】
【図２Ａ】
【図２Ｂ】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８Ａ】
【図８Ｂ】
【図８Ｃ】
【図９Ａ】
【図９Ｂ】
【図１０−１】
【図１０−２】
【図１１−１】
【図１１−２】
【図１２−１】
【図１２−２】
【図１３−１】
【図１３−２】
【図１４】
【図１５】
【図１６】
【図１７】
【図１８】
【図１９】
【図２０】
【図２Ａ】
【図２Ｂ】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８Ａ】
【図８Ｂ】
【図８Ｃ】
【図９Ａ】
【図９Ｂ】
【図１０−１】
【図１０−２】
【図１１−１】
【図１１−２】
【図１２−１】
【図１２−２】
【図１３−１】
【図１３−２】
【図１４】
【図１５】
【図１６】
【図１７】
【図１８】
【図１９】
【図２０】
【公表番号】特表２００８−５２４２４５（Ｐ２００８−５２４２４５Ａ）
【公表日】平成２０年７月１０日（２００８．７．１０）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００７−５４６９５１（Ｐ２００７−５４６９５１）
【出願日】平成１７年１２月１６日（２００５．１２．１６）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００５／０４５７０６
【国際公開番号】ＷＯ２００６／０７３７４８
【国際公開日】平成１８年７月１３日（２００６．７．１３）
【出願人】（５０３１０２６７４）アレクシオン ファーマシューティカルズ， インコーポレイテッド (51)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２０年７月１０日（２００８．７．１０）
【国際特許分類】
【出願日】平成１７年１２月１６日（２００５．１２．１６）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００５／０４５７０６
【国際公開番号】ＷＯ２００６／０７３７４８
【国際公開日】平成１８年７月１３日（２００６．７．１３）
【出願人】（５０３１０２６７４）アレクシオン ファーマシューティカルズ， インコーポレイテッド (51)
【Ｆターム（参考）】
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