抗生物質化合物
Ｎｏｃａｒｄｉａ種による栄養培地の発酵は、構造式（Ｉ）の新規な広域抗生物質化合物または医薬的に許容されるその塩、エステル、鏡像異性体、ジアステレオマーまたはそれらの混合物を産生する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は細菌感染症の治療に有用な広域チアゾリル−ペプチド抗生物質化合物に関する。
【背景技術】
【０００２】
細菌が引き起こす感染症は、これらの多くの細菌が種々の抗生物質に耐性であるため、医学的な懸念が増している。このような細菌としては、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ｈｅｍｏｌｙｔｉｃｕｓ、Ｐｅｄｉｏｃｏｃｃｕｓ種およびＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ、Ｖｉｂｒｉｏ ｃｈｏｌｅｒａｅ、Ｖｉｂｒｉｏ ｐａｒａｈｅｍｏｌｙｔｉｃｕｓ、Ａｃｔｉｎｏｂａｃｔｅｒ ｃａｌｃｏａｅｔｉｃｕｓ、Ｓｔｅｎｏｔｒｏｐｈｏｍｏｎａｓ ｍａｌｔｏｐｈｉｌｉａがある。従って本発明の抗生物質は、種々の既知抗生物質に耐性の感染症を治療する療法に大きく貢献できる。
【０００３】
同じくチアゾリル−ペプチドであり、細菌感染症の治療に使用されている従来技術の化合物は、チオストレプトン、ＧＥ２２７０Ａ，ノカチアシン、グリコチオヘキシドおよびノシヘプチドである。
【０００４】
本発明では、チアゾリル−ペプチド抗生物質がＮｏｃａｒｄｉａ種の発酵によって産生される。これらは、慣用の抗生物質に感受性および抵抗性を有している細菌感染症に対して抗菌活性を有している。
【発明の開示】
【０００５】
本発明は、式Ｉ：
【０００６】
【化５】
【０００７】
［式中、
Ｒは、−Ｃ（Ｏ）ＮＨ２、−Ｃ（Ｏ）ＮＨＣ＝ＣＨ２Ｃ（Ｏ）ＮＨ２を表し；
Ｒ１、Ｒ２およびＲ３は独立にＯＨを表すか；またはＲ１、Ｒ１およびＲ３が一緒に
【０００８】
【化６】
を表し；
Ｒ４は、ＯＨ
【０００９】
【化７】
を表し；
Ｒ５は水素またはＯＨを表す］
の新規なチアゾリル−ペプチド抗生物質または医薬的に許容されるその塩、エステル、鏡像異性体、ジアステレオマーまたはそれらの混合物に関する。
【００１０】
本発明はまた、Ｎｏｃａｒｄｉａ種の発酵による式Ｉの化合物の製造方法に関する。本発明はまた、発酵ブロスから式Ｉの化合物を単離する方法に関する。
【００１１】
本発明はまた、式Ｉの化合物、特に、構造式Ｉａ、Ｉｂ、Ｉｃ、Ｉｄ、Ｉｅ、Ｉｆ、Ｉｇ、ＩｈおよびＩｉ：
【００１２】
【化８】
の化合物または医薬的に許容されるその塩、エステル、鏡像異性体、ジアステレオマーまたはそれらの混合物に関する。
【００１３】
本発明の化合物の医薬的に許容される塩は、無機または有機の無毒性塩基から形成されるような慣用の無毒性塩基を含む。例えば、このような慣用の無毒性塩基は、カリウム、ナトリウム、リチウム、カルシウムまたはマグネシウムなどのアルカリ金属またはアルカリ土類金属の水酸化物のような無機塩基から誘導された塩、ジベンジルエチレンジアミン、トリメチルアミン、ピペリジン、ピロリジン、ベンジルアミンなどのアミンのような有機塩基から製造された塩、または、水酸化テトラメチルアンモニウムのような水酸化第四級アンモニウムを含む。
【００１４】
医薬的に許容される塩は慣用の化学的方法によって本発明の化合物から合成できる。一般に、塩は、遊離酸を化学量論的量または過剰量の所望の無機または有機の塩形成性塩基と共に適当な溶媒または種々の混合溶媒中で反応させることによって製造される。
【００１５】
本発明の化合物は細菌感染症の治療に有用な広域抗生物質である。これらは主として、多くの既知抗生物質に耐性の種を含むＳ．ａｕｒｅｕｓ、Ｅ．ｆａｅｃａｌｉｓ、Ｅ．ｆａｅｃｉｕｍ、Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ、Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｕｓに対して抗菌活性を示す。これらの試験菌株の最小阻止濃度（ＭＩＣ）は、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ｈｅｍｏｌｙｔｉｃｕｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ、およびＥ．ｆａｅｃａｌｉｓのような試験菌株に対しては０．０１ｕｇ／ｍＬから２００ｕｇ／ｍＬ未満の範囲である。本発明の化合物は、化合物を医薬的に許容される担体に組合せることによって医薬組成物に配合できる。このような担体の例は後述する。
【００１６】
化合物は、粉末または結晶質形態、液体溶液、または、懸濁液として使用し得る。これらは多様な手段によって投与し得る。表在投与、経口投与および注射（静脈内または筋肉内）による非経口投与が有利な主要投与経路である。
【００１７】
１つの配給経路である注射用の組成物はアンプルまたは多用量容器に入れた単位剤形で調製し得る。注射用組成物は、油性もしくは水性ビヒクル中の懸濁液、溶液またはエマルションのような形態でよく、様々な配合剤を含有し得る。あるいは、有効成分が、配給のときに滅菌水のような適当なビヒクルで復元される粉末（凍結乾燥または非凍結乾燥）でもよい。注射用組成物中の担体は典型的には、滅菌水、生理食塩水またはその他の注射可能液体から成り、例えば、筋肉内注射の場合にはピーナツ油から成る。また、種々の緩衝剤、保存剤なども含有させることができる。
【００１８】
表在投与の場合、軟膏、クリーム、ローションを形成するためには疎水性または親水性担体のような担体、塗布剤を形成するためには水性、油脂性またはアルコール性液体、粉末を形成するためには乾燥稀釈剤のような担体中で配合するとよい。
【００１９】
経口組成物は、錠剤、カプセル剤、経口懸濁液および経口溶液のような形態を有し得る。経口組成物には慣用の配合剤のような担体を利用でき、持続放出形態にも即時配給形態にもできる。
【００２０】
投与すべき薬用量は、治療下の患者の状態および体格、投与の経路および頻度、化合物に対する病原体の感受性、感染のビルレンスおよびその他の要因に大きく左右される。しかしながらこれらの事項は抗生物質の分野で公知の治療方針に従って日常的に処方を行う医師に一任される。
【００２１】
ヒトに投与される組成物は、液体であるか固体であるかにかかわりなく、単位剤形あたり約０．０１％−約９９％の化合物Ｉを含有し得る。この範囲の一例は約１０−６０％である。組成物は一般に約２ｍｇ−約２．５ｇの化合物Ｉを含有し、この範囲の一例は約２ｍｇ−１０００ｍｇである。非経口投与の場合、単位剤形は典型的には、滅菌水溶液中に純粋な化合物Ｉを含むかまたは中性ｐＨおよび等張性に調整できる溶液とするための可溶粉末の形態である。
【００２２】
本文中に記載の本発明はまた、感染症の治療に有効な量の式Ｉの化合物を哺乳動物に投与する段階を含む、治療を要する哺乳動物の細菌感染症の治療方法を含む。
【００２３】
式Ｉの化合物の投与方法の１つの実施態様は、経口および非経口方法、例えば、静脈内注入、動脈内濃縮塊および筋肉内注射を含む。
【００２４】
成人に対しては、体重１ｋｇあたり０．１−５０ｍｇの式Ｉの化合物の１日１−４回の投与が好ましい。好ましい用量は、２ｍｇ−１０００ｍｇの抗菌剤の１日１−４回の投与である。より特定的に、軽度な感染症に対しては約５−２００ｍｇの用量の１日２−３回の投与が推奨される。極めて感染力の強いグラム陽性微生物による中度の感染症に対しては約２０−１０００ｍｇの用量の１日３−４回の投与が推奨される。抗生物質に上限の感受性をもつ微生物による生命に危険な重篤な感染症に対しては約１００−２０００ｍｇの用量の１日３−４回の投与が推奨される。
【００２５】
小児に対しては、典型的には、体重１ｋｇあたり０．１−５０ｍｇの式Ｉの化合物の１日１−４回の投与が推奨される。本発明の別の目的は、２ｍｇ−１０００ｍｇの抗菌剤の１日１−４回の投与という用量で達成される。
【００２６】
本発明の別の目的は、Ｎｏｃａｒｄｉａ種微生物を適当な栄養培地で培養し次いで発酵ブロスから本発明の化合物を回収する段階を含む式Ｉの化合物の製造方法である。問題の微生物は、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ （ＡＴＣＣ），１２３０１ Ｐａｒｋｌａｗｎ Ｄｒｉｖｅ，Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，Ｍａｒｙｌａｎｄ，２０８５２から受託番号ＡＴＣＣ ２０２０９９で入手できる。これはＭｅｒｃｋ ｃｕｌｔｕｒｅ ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎに受託番号ＭＡ７３３２で寄託されている。微生物の公然入手（ｐｕｂｌｉｃ ａｃｃｅｓｓ）に関する制限は特許許諾のときに最終的に排除される。本発明に関してはこの特定種の使用を記載したが、式Ｉの化合物を産生できる上記微生物の他の種および変異体も存在するであろう。本発明の実施にはそれらの使用も考察する。
【００２７】
構造式Ｉの化合物は、ＡＴＣＣ受託番号２０２０９９の培養物の接種により管理条件下で適当な培地を好気性発酵させることによって製造する。適当な培地は好ましくは水性であり、同化性炭素源、窒素源および無機塩を含有している。
【００２８】
発酵に使用される培地は主として、単独で使用されるかまたは当業者に常用の栄養物を加えて使用される公知のＤｉｆｃｏトリプチック・ダイズブロスである。
【００２９】
本文中に記載の栄養培地が使用できる多様な培地の単なる代表例であり、本発明の範囲がこれらに限定されないことを理解されたい。
【００３０】
発酵は約１０℃−約４０℃の範囲の温度で行う。しかしながら最適結果を得るためには、発酵を約３１−３２℃で行うのが好ましい。発酵中の栄養培地のｐＨは、約５．５−約７．５でよい。
【００３１】
本発明の化合物の発酵生産について、本発明がＡＴＣＣ受託番号２０２０９９の特定のＮｏｃａｒｄｉａ種に限定されないことを理解されたい。本発明の化合物を産生できるならば記載の培養物から産生または誘導された他の天然または人工の突然変異体またはＮｏｃａｒｄｉａ属の他の変異体または種の使用が本発明の範囲内に含まれることは特に希望しまた意図するものである。ＡＴＣＣ ２０２０９９のＮｏｃａｒｄｉａの突然変異種または菌株を人工的に産生するためには、慣用の物理的または化学的な突然変異誘発物質、例えば、記載の培養物の紫外線照射、または、ニトロソグアニジン処理などを用いるとよい。プロトプラスト融合、プラスミド組込み、染色体フラグメント組込み、などのような組換えＤＮＡ技術も有用であることが立証されている。
【実施例１】
【００３２】
段階１ａ：化合物Ｉａ、Ｉｃ、Ｉｄ、Ｉｅ、Ｉｆ、ＩｈおよびＩｉを産生するための発酵。１ｍＬの凍結したＮｏｃａｒｄｉａ種ＡＴＣＣ ２０２０９９（ＭＡ７３３２）の発育性原培養物を使用し、２５０ｍＬ容のフラスコに入れた５０ｍＬの母培地に接種した。母培地は水１リットルあたり、２０ｇのデンプン、５ｇのデキストロース、３ｇのＮ−Ｚアミン（Ｋｅｒｒｙ Ｂｉｏ−Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ｈｏｆｆｍａｎ Ｅｓｔａｔｅｓ，ＩＬ）、２ｇの酵母エキス、５ｇのＰｈａｒｍａｍｅｄｉａ（Ｔｒａｄｅｒｓ Ｐｒｏｔｅｉｎ，Ｍｅｍｐｈｉｓ，ＴＮ）、１ｇの炭酸カルシウムを含有していた。培養物を２２０ｒｐｍで作動している回転撹拌器に載せ、３２℃で３日間インキュベートした。得られた培養物の２０ｍＬを使用し、２リットル容のフラスコに入れた５００ｍＬの母培地に接種し、母培地は上記の５０ｍＬ培地と同じ成分を含有していた。培養物を１８０ｒｐｍで作動している回転撹拌器に載せ、３２℃で１日間インキュベートした。得られた５００ｍＬの培養物を使用し、３０リットル容の発酵槽に入れた２０Ｌの培地に接種し、培地は水１リットルあたり、２０ｇのデキストロース、５ｇのペプトン、１０ｇの一次酵母、５ｇのＡｌｌｏｐｈｏｓｉｔｅ（ケイ酸アルミニウム）、１ｍＬのＰ２０００抑泡剤（これは泡立ちを防止する高分子材料、Ｄｏｗ Ｃｈｅｍｉｃａｌ，Ｍｉｄｌａｎｄ，ＭＩ製）を含有していた。産生発酵は、温度３２℃、背圧５ｐｓｉおよび撹拌速度３００ｒｐｍで行った。発酵槽に１０ｓｌｐｍで空気を散布し、ＮａＯＨおよびＨ２ＳＯ４でｐＨを７．０に調整した。発酵槽を１３日間作動させ、ここで培養物を採集し、化合物を段階２ａに記載のようにして抽出し単離した。
【００３３】
段階１ｂ−１：化合物Ｉｂを産生するための発酵：
１ｍＬの凍結したＮｏｃａｒｄｉａ種ＡＴＣＣ ２０２０９９（ＭＡ７３３２）の発育性原培養物を使用し、２５０ｍＬ容のフラスコに入れた５０ｍＬの母培地に接種した。母培地は水１リットルあたり、２０ｇのデンプン、５ｇのデキストロース、３ｇのＮ−Ｚアミン、２ｇの酵母エキス、５ｇのＰｈａｒｍａｍｅｄｉａ、１ｇの炭酸カルシウムを含有していた。培養物を２２０ｒｐｍで作動している回転撹拌器に載せ、３２℃で２日間インキュベートした。得られた培養物の２０ｍＬを使用し、２リットル容のフラスコに入れた５００ｍＬの母培地に接種した。母培地は上記の５０ｍＬ培地と同じ成分を含有していた。培養物を１８０ｒｐｍで作動している回転撹拌器に載せ、３２℃で２日間インキュベートした。得られた５００ｍＬの培養物を使用し、２３リットル容の発酵槽に入れた１５Ｌの培地に接種した。培地は水１リットルあたり、２５ｇの可溶性デンプン、１５ｇのグルコース、７．５ｇの酸加水分解したカゼイン、１２ｇの酵母エキス、３．５ｇのダイズひき割り、３．５ｇのビーフエキス、１ｍＬの抑泡剤（Ｐ２０００）を含有していた。産生発酵は、温度３２℃、背圧５ｐｓｉおよび撹拌速度３００ｒｐｍで行った。発酵槽に５標準リットル／分（ｓｌｐｍ）で空気を散布し、ＮａＯＨおよびＨ２ＳＯ４でｐＨを７．０に調整した。発酵槽を１０日間作動させ、ここで培養物を採集し、化合物Ｉｂを単離するために後述のようにして抽出した。
【００３４】
段階１ｂ−２：化合物Ｉｇを産生するための発酵：
ｍＬの凍結したＮｏｃａｒｄｉａ種ＡＴＣＣ ２０２０９９（ＭＡ７３３２）の１発育性原培養物を使用し、２５０ｍＬ容のフラスコに入れた５０ｍＬの母培地に接種した。母培地は水１リットルあたり、２０ｇのデンプン、５ｇのデキストロース、３ｇのＮ−Ｚアミン、２ｇの酵母エキス、５ｇのＰｈａｒｍａｍｅｄｉａ、１ｇの炭酸カルシウムを含有していた。培養物を２２０ｒｐｍで作動している回転撹拌器に載せ、３２℃で２日間インキュベートした。得られた培養物の２０ｍＬを使用し、２リットル容のフラスコに入れた５００ｍＬの母培地に接種した。母培地は上記の５０ｍＬ培地と同じ成分を含有していた。培養物を１８０ｒｐｍで作動している回転撹拌器に載せ、３２℃で２日間インキュベートした。得られた５００ｍＬの培養物を使用し、３０リットル容の発酵槽に入れた２０Ｌの培地に接種した。培地は水１リットルあたり、２０ｇのデキストロース、５ｇのペプトン、１０ｇの一次酵母、５ｇのＡｌｌｏｐｈｏｓｉｔｅ（ケイ酸アルミニウム）、２ｍＬのＰ２０００抑泡剤（これは泡立ちを防止する高分子材料）を含有していた。産生発酵は、温度３２℃、背圧５ｐｓｉおよび撹拌速度３００ｒｐｍで行った。発酵槽に１０ｓｌｐｍで空気を散布し、ＮａＯＨおよびＨ２ＳＯ４でｐＨを７．０に調整した。発酵槽を１０日間作動させ、ここで培養物を採集し、化合物Ｉｇを回収するために酢酸エチルで抽出した。
【００３５】
段階２ａ：化合物Ｉａ、Ｉｃ、Ｉｄ、Ｉｅ、Ｉｆ、ＩｈおよびＩｉの単離。１８リットルの発酵ブロス（ｐＨ＝５．０）を各１８および１６リットルの酢酸エチルと共に室温で一夜撹拌することによって２回抽出した。酢酸エチル層を分離し、プールして減圧下で濃縮すると、７．１グラムの固体が得られた。水層をセライトで濾過し、ケーキを各８リットルのアセトンで２回抽出した。プールしたアセトン抽出物を濃縮乾固すると１５．６グラムの固体が得られたので、これを焼結ガラス漏斗に載せ、ヘキサン（４×１５０ｍＬ）で洗浄すると、１２．８グラムの固体が得られた。これを２５０ｍＬの１：１のメチレンクロリド−メタノールに懸濁させ、濾過した。３５グラムのＳｅｐｈａｄｅｘ ＬＨ２０のアリコートを濾液に注ぎ、減圧下で溶媒を除去した。化合物で被覆されたＬＨ２０粉末を、１：４のヘキサン−メチレンクロリドを充填した２．０リットル容のＳｅｐｈａｄｅｘ ＬＨ２０カラムの頂上部に充填した。カラムを各２カラム容の１：４のヘキサン−メチレンクロリド（画分３）、２．５％のメタノール−メチレンクロリド（画分４−６）、１．５カラム容の５％メタノール−メチレンクロリド（画分７−１１）１カラム容の１０％メタノール−メチレンクロリド（画分１２−１５）、各１．５カラム容の２０（画分１６−１８）、５０（１９−２１）および最後に１００％のメタノールで溶出させた。ＴＬＣ分析および分析用ＨＰＬＣに基づいて画分をプールすると、溶出溶媒と共に括弧内に示した画分１−２１が得られた。
【００３６】
化合物Ｉａの単離：ＬＨ２０画分３（１グラム）を５０％のメタノール−メチレンクロリドに溶解し、５ｇのシリカゲル６０（２３０−４００メッシュ、Ｅ−Ｍ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｇｅｒｍａｎｙ）に吸着させた。これを減圧下で乾燥し、真空液体クロマトグラフィーを使用して内径２０ｃｍの焼結ガラス漏斗に入れた１００ｇのシリカゲル６０（２３０−４００メッシュ、Ｅ−Ｍ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｇｅｒｍａｎｙ）で精製した。これを０．５Ｌのクロロホルムで溶出し、次いで１Ｌの１０％メタノール−クロロホルム、０．５Ｌの２０％メタノール−クロロホルム、１Ｌの５０％メタノール−クロロホルムで溶出し、最後に５０％メタノール−クロロホルム中の５％水酸化アンモニウムで洗浄した。１０％メタノール−クロロホルム溶出から得られた画分を減圧下に濃縮し、凍結乾燥すると６５０ｍｇの固体材料が得られた。これを、Ｚｏｒｂａｘ ＳＢ Ｐｈｅｎｙｌを使用して１３回の同一処理を行う分取ＨＰＬＣによって精製した（２１×２５０ｍｍ、０．１％のＴＦＡを含有する４０−５０％のアセトニトリル−水の勾配で３６分溶出、流速１２ｍＬ／分）。化合物Ｉａは３２−３３分後に溶出した。これを凍結乾燥すると、４２ｍｇの淡黄色粉末材料が得られたので、Ｚｏｒｂａｘ ＳＢ Ｐｈｅｎｙｌをもっと緩やかな勾配で使用する分取ＨＰＬＣによって精製した（２１×２５０ｍｍ、０．１％のＴＦＡを含有する４０−５０％のアセトニトリル−水の勾配で４２分溶出、流速１２ｍＬ／分）。化合物Ｉａは３３−３７分後に溶出した。画分をプールし、これを凍結乾燥すると、化合物Ｉａが淡黄色粉末として得られた。
【００３７】
化合物Ｉｃの単離：メチレンクロリド中の５％メタノール中に溶出したＬＨ−２０画分０７を濃縮乾固すると４００ｍｇの材料が得られたので、これをプレパックした焼結ガラス漏斗中でシリカゲルクロマトグラフィー処理し（４０ｇシリカゲル、ＥＭ ｓｃｉｅｎｃｅ、粒度２３０−２４０ｍｍ）、各１００ｍｌの酢酸／メタノール／クロロホルム１：０：９９、１：１：９８、１：２：９７、１：３：９６、１：４：９５および１：５：９４（５×１００ｍＬ）で溶出し、次いで水酸化アンモニウム／メタノール／クロロホルム１：７．５：９１．５（１００ｍＬ）、１：１０：８９（３×１００ｍＬ）、１：２５：７４（２×１００ｍＬ）、１：９９：０（１００ｍＬ）で溶出した。最後の３００ｍＬの１：５：９４酢酸／メタノール／クロロホルム溶出溶媒で溶出した画分をプールし、水酸化アンモニウムによってｐＨ＝７．０に調整し、濃縮乾固し、水と研和し、濾過し、濾液を濃縮乾固すると、３３．５ｍｇの材料が得られたので、これを、分取ＨＰＬＣ（ＹＭＣ ＯＤＳ−ＡＱ，２０×２５０ｍｍ，５ｍＬ／分、０．０５％のＴＦＡを含有する４０−５０％水アセトニトリル、６０分超、２１５ｎｍ）でクロマトグラフィー処理した。４６分後に溶出する画分を凍結乾燥すると化合物Ｉｃが得られた。
【００３８】
化合物Ｉｄの単離：上述したように２３Ｌ容の発酵タンクで７日間増殖させたＮｏｃａｒｄｉａ種の１５Ｌの発酵物を１５Ｌの酢酸エチルで抽出し濾過した。回転蒸発器を使用して減圧下で濾液を濃縮し凍結乾燥すると、１５ｇの油性材料が得られた。乾燥した酢酸エチル抽出物（１５ｇ）を５０ｍＬの９０％メタノール−メチレンクロリドに溶解し、２ＬのＳｅｐｈａｄｅｘ ＬＨ２０カラムに充填し、流速５ｍＬ／分のメタノール−メチレンクロリド（３：１）で溶出した。４０ｍＬの画分を採集した。目的の化合物は画分２１−３６に溶出した（０．８−１．４カラム容）。これらの画分をプールし、濃縮乾固すると、４．５ｇの油性材料が得られた。これを５０％メタノール−メチレンクロリドに溶解し、１２ｇのシリカゲル６０（２３０−４００メッシュ、Ｅ−Ｍ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｇｅｒｍａｎｙ）に吸着させた。これを減圧下で乾燥し、内径８．５ｃｍの焼結ガラス漏斗中の１００ｇのシリカゲル６０（２３０−４００メッシュ、Ｅ−Ｍ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｇｅｒｍａｎｙ）上で真空液体クロマトグラフィーを使用して精製した。これを２Ｌのメタノール−水−メレンクロリド（３：０．０２５：９７）で洗浄し、化合物Ｉｄを２Ｌのメタノール−水−メレンクロリド（３５：０．０２５：６５）で溶出した。これを減圧下で濃縮し凍結乾燥すると、１．８ｇの固体材料が得られたので、１０％のメタノール−メチレンクロリドに溶解して、３ｇのＤｉｏｌ（ＤＬ１２Ｓ５０，１２０Ａ，ｓ−５０μｍ ＹＭＣ Ｃｏ．Ｌｔｄ．Ｊａｐａｎ）に吸着させた。これを減圧下で乾燥し、５ｍＬ／分の流速の１５０ｇのＤｉｏｌ（ＤＬ１２Ｓ５０，１２０Ａ，ｓ−５０μｍ ＹＭＣ Ｃｏ．Ｌｔｄ．Ｊａｐａｎ）カラム（１．７５×８インチ）で精製した。これをメチレンクロリドで溶出し、次いでメタノール−水−メチレンクロリド（１：０．５：９９）からメタノールのパーセンテージが漸増して最終的にメタノール−水−メチレンクロリド（１５：１：８４）となる溶媒系で溶出し、最後に、（１０：１：８９の）メタノール−水酸化アンモニウム−ジクロロメタンで洗浄し、５０ｍＬの画分を収集した。最後の溶媒で溶出した画分をプールすると４８ｍｇの半精製画分が得られたので、１０％メタノール−メチレンクロリドに溶解し、０．５ｇのシリカゲル６０（２３０−４００メッシュ、Ｅ−Ｍ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｇｅｒｍａｎｙ）に予め吸着させ、１．５ｍＬ／分の流速で使用する１０ｇのシリカゲル６０（２３０−４００メッシュ、Ｅ−Ｍ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｇｅｒｍａｎｙ）カラム（０．５×８．５インチ）で精製した。これを２５０ｍＬのクロロホルムで溶出し、次いで、メタノールのパーセンテージが漸増するクロロホルム−水酸化アンモニウム［すなわち、メタノール−水酸化アンモニウム−クロロホルム２．５：０．１２５：９７．５（６００ｍＬ）、３：０．１２５：９７（８００ｍＬ）、５：０．１２５：９５（８００ｍＬ）、１０：０．１２５：９０（１．４Ｌ）、１５：０．１２５：８５（６００ｍＬ）、２５：０．１２５：７５（２００ ｍＬ）、４０：０．１２５：６０（２００ｍＬ）］で抽出した。化合物Ｉｄを含有する画分は１０：０．１２５：９０（メタノール−水酸化アンモニウム−クロロホルム）で溶出した。これらをプールし、減圧下で濃縮し、凍結乾燥すると、４ｍｇの化合物Ｉｄが得られた。
【００３９】
化合物Ｉｅの単離：ＬＨ２０画分１６（４３２ｍｇ）をクロロホルム／メタノール（１：１）に溶解し、２ｇのシリカゲルに吸着させ、減圧下で溶媒を除去し、粉末をシリカゲル充填焼結ガラス漏斗（２５ｇ、ＥＭ ｓｃｉｅｎｃｅ、粒度２３０−２４０ｍｍ、ｈｏｕｓｅ ｖａｃｕｕｍ）に塗布し、各１００ｍＬの２．５％、５．０％、７．５％、１０％、１５％、２０％、３０％、５０％、７５％のメタノール／クロロホルムで溶出させ、最後に４００ｍＬの１００％メタノールで洗浄した。メタノール画分を濃縮すると、８４．４ｍｇの材料が得られたので、これを分取ＨＰＬＣ分画化（ＹＭＣ ＯＤＳ−ＡＱ、２０×２５０ｍｍ、１０ｍＬ／分、ＴＦＡ非含有の２５−３５％アセトニトリル、４０分超、２１５ｎｍ）処理した。２５分後に溶出したＨＰＬＣ画分を凍結乾燥すると、化合物Ｉｅが粉末として得られた。
【００４０】
化合物Ｉｆの単離：メチレンクロリド中の５％メタノールに溶出したＬＨ−２０画分０７を濃縮乾固すると４００ｍｇの材料が得られたので、これをプレパック焼結ガラス漏斗（４０ｇシリカゲル、ＥＭ ｓｃｉｅｎｃｅ、粒度２３０−２４０ｍｍ）でシリカゲルクロマトグラフィー処理し、各１００ｍＬの１：０：９９、１：１：９８、１：２：９７、１：３：９６、１：４：９５および１：５：９４（５×１００ｍＬ）の酢酸／メタノール／クロロホルムで溶出し、次いで１：７．５：９１．５（１００ｍＬ）、１：１０：８９（３×１００ｍＬ）、１：２５：７４（２×１００ｍＬ）、１：９９：０（１００ｍＬ）の水酸化アンモニウム／メタノール／クロロホルムで溶出した。最後の３００ｍＬの１：５：９４酢酸／メタノール／クロロホルム溶出溶媒で溶出する画分をプールし、水酸化アンモニウムでｐＨ７．０に調整し、濃縮乾固し、水と研和し、濾過し、濾液を濃縮乾固すると、３３．５ｍｇの材料が得られた。これを分取ＨＰＬＣによってクロマトグラフィー処理した（ＹＭＣ ＯＤＳ−ＡＱ、２０×２５０ｍｍ、５ｍＬ／分、０．０５％ＴＦＡを含有する４０−５０％水アセトニトリル、６０分超、２１５ｎｍ）。３１分後に溶出する画分を凍結乾燥すると化合物Ｉｆが得られた。
【００４１】
化合物ＩｈおよびＩｉの単離：５０％メタノール−メチレンクロリドで溶出したＬＨ−２０画分２１（１７５．０ｍｇ）をＹＭＣ ＯＤＳ−ＡＱ、２０×２５０ｍｍカラムを流速１０ｍＬ／分で０．０５％のＴＦＡを含有する２５−３５％水アセトニトリルの４０分勾配と共に使用し２１４ｎｍで検出する分取ＨＰＬＣによって処理した。２２分および３１分後に得られた画分を凍結乾燥すると、それぞれ化合物ＩｉおよびＩｈが粉末として得られた。
【００４２】
化合物Ｉｂの単離：段階Ｉｂ−１に記載したように６個のタンクから得られた１００Ｌのブロスを、５０Ｌの酢酸エチルで抽出した。一番上の酢酸エチル層を除去し、水層をセライトで濾過した。酢酸エチル抽出物を濃縮乾固し、ヘキサンと研和すると１０ｇの材料が得られた。濾過したケーキを２×２０Ｌのアセトンで抽出した。アセトンを除去した後、沈殿した化合物を焼結ガラス漏斗で濾過した。酢酸エチルおよびアセトンによる抽出から得られた固体をプールし、ヘキサン（５００ｍＬ）で洗浄し、１：１のメタノール／メチレンクロリド（５００ｍＬ）に溶解し、焼結ガラス漏斗で濾過した。濾液を濃縮乾固すると、４２グラムの固体が得られたので、これを１：１のメチレンクロリド／メタノール（２００ｍＬ）に溶解し、５０ｇのシリカゲルに予め吸着させ、５５０ｇのシリカゲルを詰めた１２×１７ｃｍの焼結ガラス漏斗に塗布し、１％の酢酸を含む２Ｌの１％メタノール／クロロホルム、１％の酢酸を含む１Ｌの２％メタノール／クロロホルム、１％の酢酸を含む１Ｌの３％メタノール／クロロホルム、１％の酢酸を含む１Ｌの４％メタノール／クロロホルム、１％の酢酸を含む４Ｌの５％メタノール／クロロホルム、１％の酢酸を含む１Ｌの６％メタノール／クロロホルム、１％の酢酸を含む３Ｌの７．５％メタノール／クロロホルム、１％の水酸化アンモニウムを含む５Ｌの７．５％メタノール／クロロホルム、１％の水酸化アンモニウムを含む２Ｌの１５％メタノール／クロロホルム、１％の水酸化アンモニウムを含む２Ｌの３０％メタノール／クロロホルム、１％の水酸化アンモニウムを含む２Ｌの６０％メタノール／クロロホルム、１％の水酸化アンモニウムを含む３Ｌの１００％メタノールで順次溶出した（５００ｍＬ／画分、合計５４画分）。
【００４３】
画分３０を濃縮乾固すると、１４６．５ｍｇの粉末が得られたので、これを分取ＨＰＬＣ（Ｚｏｒｂａｘ ＳＢ−ｐｈｅｎｙｌ、２１．２×２５０ｍｍ、１２ｍＬ／分、０．１％ＴＦＡ含有の４０−５０％アセトニトリル水、４５分超、２１４ｎｍ）で処理した。３９−４０分後に溶出する画分をプールし、凍結乾燥すると、化合物Ｉｂが得られた。
【００４４】
化合物Ｉｇの単離：段階１ｂ−２の１４リットルのブロスを１４リットルの酢酸エチルで抽出した。混合物を濾過し、セルを各２リットルのアセトンで２回抽出し、集めた。アセトン抽出物を減圧下で１．５リットルの沈殿性水溶液に濃縮し、濾過すると５．８ｇの固体が得られた。５ｇの固体アリコートをメタノール−メチレンクロリドに溶解し、５ｇのシリカゲルを添加した。減圧下に溶媒を除去すると粉末が得られたので、これを９９−１クロロホルム−酢酸中で２リットルの焼結ガラス漏斗に入れた２５０グラムのシリカ層の頂上部に加えた。各３倍容の９９−１クロロホルム−酢酸、９９−１−１のクロロホルム−メタノール−酢酸、次いで、９８−２−１、９７−３−１、９６−４−１、９５−５−１、９０−１０−１および９０−１０−１のクロロホルム−メタノール−水酸化アンモニウムで溶出した。９５−５−１の溶媒組成で溶出する画分１７および１８を集めて（１０５ｍｇ）、溶解し、３−５ｇのシリカゲルに加えて濃縮乾固した。１５ｇのシリカゲルをドライパックしたカラムの頂上部にこれを加え、各画分の合計１５５．６ｍＬに対して３０カラム容の９７−３−１のクロロホルム−メタノール−水で溶出した。画分を最初にシリカＴＬＣによって分析し、選択した画分をＨＰＬＣによって検定した。画分２１−５０（２０ｍｇ）を１ｇのシリカゲルに加えて濃縮乾固した。１５ｇのシリカゲルをドライパックしたカラムの頂上部にこれを加え、各画分の合計２４０．６ｍＬに対して４８カラム容の９８−２−１クロロホルム−メタノール−水で溶出した。画分１８０−２１０を集めて濃縮乾固すると、３．２ｍｇの粗Ｉｇが得られた。これをＺｏｒａｘ ｐｈｅｎｙｌ半分取ＨＰＬＣカラム（９．４×２５０ｍｍ）で、２１分間の４０−６０％水アセトニトリル勾配を保持時間２分で使用する多重注入によって更に精製した。１４分後に溶出する画分を集めて凍結乾燥すると、化合物Ｉｇが得られた。
【００４５】
段階３：Ｉａ−Ｉｅの生理化学的特性
化合物Ｉａ、Ｉｂ、Ｉｃ、Ｉｄ、Ｉｅ、Ｉｆ、Ｉｇ、ＩｈおよびＩｉの構造を質量分析法、１Ｈ ＮＭＲおよび１３Ｃ ＮＭＲの使用によって決定した。
【００４６】
化合物Ｉａ：
分子量：１４３４
分子式：Ｃ６１Ｈ５８Ｎ１４Ｏ１８Ｓ５
ＨＲＥＳＩＭＳ（ｍ／ｚ）：１４３５．２６９６（Ｍ＋Ｈの測定値）、１４３５．２７３４（計算値）
ＵＶ（メタノール）λｍａｘ（ｌｏｇε）２２２（４．７７），２８８（４．４０），３５８（４．０８）ｎｍ
ＩＲ（ｎｅａｔ）νｍａｘ３３８９，３０９６，２９２９，１６６９，１６３８，１５３５，１４７６，１４２４，１３８７，１３２０，１２５３，１２０３，１２２９，１０９９，１０３８，１０１６ｃｍ−１
ｌＨ ＮＭＲ（ＣＤＣ１３＋ＣＤ３ＯＤ）δｐｐｍ δ８．３８（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝１０Ｈｚ），８．３１（１Ｈ，ｓ），８．２７（１Ｈ，ｓ），８．２１（１Ｈ，ｓ），８．０８（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝１１．５Ｈｚ），７．９３（１Ｈ，ｓ），７．７６（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝８．５ Ｈｚ），７．６８（１Ｈ，ｓ），７．６４（１Ｈ，ｓ），７．３６（１Ｈ，ｔ，Ｊ＝８．５Ｈｚ）， ７．１６（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝７．０Ｈｚ），６．５８（１Ｈ，ｓ），５．９６（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝１２．０Ｈｚ），５．９３（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝１０．０ Ｈｚ），５．７０（１Ｈ，ｍ），５．５９（１Ｈ，ｓ），５．２６（１Ｈ，ｍ），５．０４（１Ｈ，ｔ，Ｊ＝７．０Ｈｚ），４．９７（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝５．０Ｈｚ），４．９１（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝１２．５Ｈｚ），４．８４（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝１０．０Ｈｚ），４．４０（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝９．５Ｈｚ），４．２４（１Ｈ，ｍ），４．１９（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝５．５Ｈｚ），４．１６（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝１２．０Ｈｚ），３．８７（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝６．０Ｈｚ），３．８１（３Ｈ，ｓ），３．５６（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝１０．５Ｈｚ），２．９１（１Ｈ，ｍ），２．７０（１Ｈ，ｓ），２．３７（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝１６．０，５．５Ｈｚ），１．９０（３Ｈ，ｓ），１．８３（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝１５．０，７．０Ｈｚ），１．４０（３Ｈ，ｓ），１．３９（３Ｈ，ｄ，Ｊ＝６．０Ｈｚ），０．７２（３Ｈ，ｄ，Ｊ＝６．５Ｈｚ）
１３Ｃ ＮＭＲ（ＣＤＣ１３＋ＣＤ３ＯＤ）δ１７２．０，１６９．７，１６９．４，１６７．８，１６６．６，１６６．２，１６５．５，１６２．３，１６２．０，１６１．７，１６１．６，１６０．６，１５９．５，１５８．８，１５５．３，１５１．７，１４９．９，１４９．８，１４９．３，１４６．１，１４４．１，１３５．５，１３４．８，１３３．１，１３０．３，１２７．９，１２６．９，１２６．６，１２５．７，１２５．４，１２４．９，１２４．３，１２４．０，１２０．５，１１９．６，１１２．４，１１０．５，１１０．１，１０４．３，９３．９，８４．８，８１．６，７２．０，７０．０，６８．３，６６．３，６４．７，６４．２，６４．２，５６．５，５５．９，４１．３，３５．９，２５．４，１８．２，１６．３，１３．８。
【００４７】
化合物Ｉｂ：
分子量：１４４８
分子式：Ｃ６２Ｈ６０Ｎ１４Ｏ１８Ｓ５
ＵＶ（メタノール＋ＴＨＦ，１：１）λｍａｘ２２２（ε５２７３６），２８８（ε２３１１０），３６２（ε９３８３）
ＩＲ（ＺｎＳｅ）νｍａｘ３３８７，２９７８，１７４２，１６６７（ｂｒ，ｓｔｒｏｎｇ），１５３１，１４７５，１４２２，１３２０，１２５２，１２００，１１２８，１０９７，１０７０，１０２５，８３２，８０１，７２１ｃｍ−１
ＨＲＥＳＩＭＳ：１４４９．２９３０（Ｍ＋Ｈの測定値），１４４９．２８９２（Ｍ＋Ｈの計算値）
ｌＨ ＮＭＲ（ＣＤＣ１３＋ＣＤ３ＯＤ）δ（ｐｐｍ）：８．３９（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝１０．８Ｈｚ），８．３３（１Ｈ，ｂｒｓ），８．２４（１Ｈ，ｂｒｓ），８．２１（１Ｈ，ｓ），８．１０（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝１０．９Ｈｚ），７．９３（１Ｈ，ｓ），７．９４（１Ｈ，ｂｒｓ），７．７６（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝７．２Ｈｚ），７．６９（１Ｈ，ｓ），７．６２（１Ｈ，ｂｒｓ），７．３７（１Ｈ，ｔ，Ｊ＝７．０Ｈｚ），７．１３（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝７．０Ｈｚ），６．５７（１Ｈ，ｂｒｓ），５．９８（１Ｈ，ｍ），５．９６（１Ｈ，ｍ），５．６７（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝１０．１，５．１Ｈｚ），５．５８（１Ｈ，ｂｒｓ），５．２７（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝１０．１，５．１Ｈｚ），５．０７（１Ｈ，ｔ，Ｊ＝６．３Ｈｚ），４．９３（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝１２．３Ｈｚ），４．８４（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝１０．１Ｈｚ），４．４６（１Ｈ，ｂｒｓ），４．４３（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝９．１Ｈｚ），４．４１（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝１０．９Ｈｚ），４．２２（１Ｈ，ｂｒｓ），４．１７（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝１０．３Ｈｚ），３．９３（１Ｈ，ｑ，Ｊ＝６．５Ｈｚ），３．８１（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝１０．０Ｈｚ），３．８０（３Ｈ，ｓ），３．００（１Ｈ，ｂｒｓ），２．９４（１Ｈ，ｂｒｓ），２．７３（３Ｈ，ｓ），２．４１（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝１５．７，５．５Ｈｚ），１．８９（３Ｈ，ｓ），１．８０（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝１５．７，７．８Ｈｚ），１．４５（３Ｈ，ｂｒｓ），１．４０（３Ｈ，ｂｒｓ），１．３９（３Ｈ，ｓ），０．７５（３Ｈ，ｄ，Ｊ＝６．１Ｈｚ）
１３Ｃ ＮＭＲ（ＣＤＣ１３＋ＣＤ３ＯＤ）δ（ｐｐｍ）１７１．４，１６９．３，１６９．１，１６７．４，１６６．３，１６５．９，１６５．１， １６２．１，１６１．７，１６１．４，１６１．３，１６０．３，１５９．２，１５８．４，１５５．０，１５１．３，１４９．６，１４９．５，１４８．９，１４５．８，１４３．８，１３５．２，１３４．４，１３２．８，１２９．９，１２７．５，１２６．６，１２６．３，１２６．３，１２５．４，１２４．９，１２４．３，１２４．０，１２３．７，１２０．１，１１９．３，１１１．９，１１０．１，１０９．７，１０３．７，９３．１，９１．９，８１．０，７９．３，７２．６，６９．２，６７．１，６５．９，６４．１，６４．１，６３．５，５６．０，５５．３，４８．７，４８．４，３９．６，３５．４，２４．８，１７．５，１５．１，１４．５，１３．３。
【００４８】
化合物Ｉｃ：
分子量：１４０９
分子式：Ｃ５９Ｈ５５Ｎ１３Ｏ１９Ｓ５
ＨＲＥＳＩＭＳ：１４１０．２４２９（Ｍ＋Ｈの測定値），１４１０．２４１９（Ｍ＋Ｈの計算値）、
ｌＨ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３＋ＣＤ３ＯＤ）δ８．３１（１Ｈ，ｓ），８．２９（１Ｈ，ｓ），８．２４（１Ｈ，ｓ），８．００（１Ｈ，ｓ），７．８３（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝８．６Ｈｚ），７．６９（１Ｈ，ｓ），７．６６（１Ｈ，ｓ），７．４２（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝８．６，７．０Ｈｚ），７．１６（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝７．０ Ｈｚ），６．６２（１Ｈ，ｓ），６．０７（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝１２．３Ｈｚ），５．８１（１Ｈ，ｂｒｄ，Ｊ＝９．１Ｈｚ），５．６９（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝１０．２，５．４Ｈｚ），５．５４（１Ｈ，ｓ），５．３０（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝１１．３，５．９Ｈｚ），４．９５（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝１２．３Ｈｚ），４．９０（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝１０．７Ｈｚ），４．８９（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝４．３Ｈｚ），４．４４（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝１１．３，９．７Ｈｚ），４．４２（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝１０．２Ｈｚ），４．２８（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝４．３Ｈｚ），４．２３（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝１０．７Ｈｚ），３．９１（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝１０．２Ｈｚ），３．８３（３Ｈ，ｓ），３．３５（１Ｈ，ｍ），３．０５（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝９．７Ｈｚ），２．９３（１Ｈ，ｍ），２．１７（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝１３．９Ｈｚ），１．９１（３Ｈ，ｓ），１．８９（ｌＨ，ｄ，Ｊ＝１３．９Ｈｚ），１．４９（３Ｈ，ｓ），１．３９（３Ｈ，ｄ，Ｊ＝６．４Ｈｚ），０．６７（３Ｈ，ｄ，Ｊ＝６．４Ｈｚ）。
【００４９】
化合物Ｉｄ：
分子量：１３５１
分子式：Ｃ５８Ｈ５８Ｎ１３Ｏ１６Ｓ５
ＥＳＩＭＳ：１３５２（Ｍ＋Ｈの測定値）
ｌＨ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３＋ＣＤ３ＯＤ）δ（ｐｐｍ）８．４４（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝９．５Ｈｚ），８．３８（１Ｈ，ｓ），８．２９（１Ｈ，ｓ），８．２５（１Ｈ，ｓ），８．００（１Ｈ，ｓ），７．８３（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝１０．５Ｈｚ），７．７４（１Ｈ，ｓ），７．７１（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝８．５Ｈｚ），７．６０（１Ｈ，ｓ），７．３９（２Ｈ，ｍ），７．１６（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝９．０Ｈｚ），６．１５（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝１２．５Ｈｚ），５．８２（１Ｈ，ｂｒｄ，Ｊ＝８．０Ｈｚ），５．７６（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝１１，４Ｈｚ），５．３８（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝１ｌ，４．５Ｈｚ），５．１６（１Ｈ，ｄ， Ｊ＝１０Ｈｚ），５．０５（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝５Ｈｚ），４．９５（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝１２．５Ｈｚ），４．６５（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝１１．５Ｈｚ），４．４３（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝９．５Ｈｚ），４．３０（１Ｈ，ｍ），４．２１（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝１０Ｈｚ），３．９９（１Ｈ，ｂｒｄ，Ｊ＝６Ｈｚ），３．９４（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝９．５，１．５Ｈｚ），３．８６（３Ｈ，ｓ），２．６０（６Ｈ，ｓ），２．２９（１Ｈ，ｍ），２．０７（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝１４．５Ｈｚ），１．９７（１Ｈ，ｍ），１．９５（３Ｈ，ｓ），１．５７（３Ｈ，ｓ），１．３２（３Ｈ，ｄ，Ｊ＝６Ｈｚ），０．７８（３Ｈ，ｄ，Ｊ＝７Ｈｚ）。
【００５０】
化合物Ｉｅ：
分子量：１２５３
分子式：Ｃ５０Ｈ５５Ｎ１３Ｏ１６Ｓ５
ＵＶ（メタノール＋ＴＨＦ，１：１）λｍａｘ２２４（ε６０２４４），３６４（ε１１５０２）
ＩＲ（ＺｎＳｅ）νｍａｘ３３６８，１６５７（ｂｒ，ｓｔｒｏｎｇ），１５３６，１４７９， １４２３，１３２１，１２５１，１１２４，１０２５，８８７，７６１ｃｍ−１
ＨＲＥＳＩＭＳ：１２５４．２５５１（Ｍ＋Ｈの測定値），１２５４．２５７１（Ｍ＋Ｈの計算値）
ｌＨ ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６）δ（ｐｐｍ）：１０．０８（１Ｈ，ｓ，ＮＨ），９．５５（１Ｈ，ｂｒｓ，ＮＨ），８．６１（１Ｈ，ｂｒｓ，ＮＨ），８．５５（１Ｈ，ｓ），８．５１（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝８．８Ｈｚ，ＮＨ），８．４３（１Ｈ，ｓ），８．３５（１Ｈ，ｓ），８．１９（１Ｈ，ｓ），８．０５（１Ｈ，ｂｒｓ，ＮＨ），７．５９（１Ｈ，ｂｒｓ，ＮＨ），７．８７（１Ｈ，ｓ），７．８１（１Ｈ，ｓ），７．３８（１Ｈ，ｂｒｓ，ＮＨ），５．７２（１Ｈ，ｂｒｓ），６．３５（１Ｈ，ｂｒｓ），５．６６（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝９．３，２．７Ｈｚ），５．２６（１Ｈ，ｄｄｄ，Ｊ＝９．３，９．３，４．４Ｈｚ），５．１２（１Ｈ，ｂｒｓ），４．７８（１Ｈ，ｂｒｓ），４．６６（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝７．９Ｈｚ），４．５５（１Ｈ，ｂｒｓ），４．０２（１Ｈ，ｍ），４．００（１Ｈ，ｍ），３．８８（３Ｈ，ｓ），３．７２（１Ｈ，ｍ），３．５０（１Ｈ，ｔ，Ｊ＝１０．２Ｈｚ），３．７０（１Ｈ，ｍ），２．６０（６Ｈ，ｓ），２．３６（１Ｈ，ｂｒｓ），２．０２（３Ｈ，ｓ），１．８８（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝１３．６，３．４Ｈｚ），１．７４（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝１３．６Ｈｚ），１．４６（３Ｈ，ｓ），１．３０（３Ｈ，ｄ，Ｊ＝５．７Ｈｚ），０．９５（３Ｈ，ｄ，Ｊ＝６．２Ｈｚ）
１３Ｃ ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−Ｄ６）δ（ｐｐｍ）１７１．７，１６９．３，１６９．２，１６８．８，１６６．７，１６５．１，１６４．２，１６２．２，１６０．８，１６０．５，１６０．１，１６０．０，１５８．５，１５３．６，１５１．５，１４９．９，１４９．４，１４９．２，１４６．６，１４１．６，１３５．１，１３４．３，１２９．５，１２７．２，１２７．１，１２５．４，１２４．８，１２３．０，１１８．４，１１０．２，１０３．５，９４．４，７２．７，７２．４，６９．４，６８．４，６７．２，６５．１，６２．１，５６．０，５５．７，５２．９，４９．６，４４．１，４０．１，３０．１，２０．９，１８．２，１２．７。
【００５１】
化合物Ｉｆ：
分子量：１２４９
分子式：Ｃ５２Ｈ４３Ｎ１３Ｏ１５Ｓ５
ＨＲＥＳＩＭＳ（ｍ／ｚ）：１２５０．１６７０（Ｍ＋Ｈの測定値），１２５０．１６８３（Ｍ＋Ｈの計算値）
ｌＨ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３−ＣＤ３ＯＤ）δ（ｐｐｍ）１０．７（１Ｈ，ｂｒｓ，ＮＨ），９．７（１Ｈ，ｓ，ＮＨ），８．３２（１Ｈ，ｓ），８．３１（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝９．７Ｈｚ），８．２３（１Ｈ，ｓ），８．１８（１Ｈ，ｓ），８．０９（１Ｈ，ｂｒｓ，ＯＨ），７．９２（ｓ），７．８１（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝１０．８Ｈｚ），７．７２（１Ｈ，ｓ），７．６１（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝８．５Ｈｚ），７．５７（１Ｈ，ｓ），７．３０（１Ｈ，ｍ），７．３０（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝７．５Ｈｚ），７．０７（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝７．０Ｈｚ），５．９９（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝１２．３Ｈｚ），４．９３（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝１２．６Ｈｚ），５．９５（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝９．６，１．８Ｈｚ），５．７０（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝１１．０，３．９Ｈｚ），５．５７（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝１．７Ｈｚ），６．５２（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝１．８Ｈｚ），５．３１（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝１１．８，４．４Ｈｚ），４．５９（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝１１．４Ｈｚ），５．０７（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝１０．１Ｈｚ），４．０８（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝１０．０Ｈｚ），４．２１（１Ｈ，ｂｒｄ，Ｊ＝７．４Ｈｚ），４．２０（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝９．３Ｈｚ），３．７４（３Ｈ，ｓ），３．６５（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝９．６，１．９Ｈｚ），１．８５（３Ｈ，ｓ），１．８５（ｌＨ，ｍ），１．２５（３Ｈ，ｄ，Ｊ＝６．３Ｈｚ）
１３Ｃ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３−ＣＤ３ＯＤ）δ（ｐｐｍ）１７４．４，１６９．３，１６８．２，１６８．２，１６６．４，１６６．３，１６５．７，１６４．３，１６１．８，１６１．７，１６１．４，１５９．２，１５９．２，１５８．５，１５４．９，１５１．６，１５０．１，１４９．４，１４９．１，１４６．０，１４２．６，１３６．４，１３４．２，１３２．８，１２９．５，１２７．０，１２６．３，１２５．９，１２５．９，１２４．３，１２４．１，１２４．１，１２３．６，１２３．４，１２２．８，１１９．３，１１５．８，１１５．８，１１０．０，１０３．７，８１．４，６８．０，６７．３，６６．２，６４．４，６２．０，５５．３，５４．６，５０．７，４９．２，１７．６，１２．９。
【００５２】
化合物Ｉｇ：
分子量：１１９６
分子式：Ｃ４９Ｈ４０Ｎ１２Ｏ１５Ｓ５
ＨＲＥＳＩＭＳ（ｍ／ｚ） １１９７．１４２０（Ｍ＋Ｈの測定値），１１９７．１４１２（Ｍ＋Ｈの計算値）
ｌＨ ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６）：δ（ｐｐｍ）１０．８３（１Ｈ，ｓ），８．９５（１Ｈ，ｓ），８．６４（１Ｈ，ｓ），８．５６（１Ｈ，ｓ），８．５１（１Ｈ，ｓ），８．４５（１Ｈ，ｓ），８．３８（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝８．５Ｈｚ），８．２４（１Ｈ，ｓ），７．９９（１Ｈ，ｓ），７．９１（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝１１Ｈｚ），７．８６（１Ｈ，ｓ），７．７１（１Ｈ，ｓ ｂｒ），７．７０，（１Ｈ，ｓ ｂｒ），７．３８（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝８．０Ｈｚ），７．３４ （１Ｈ，ｔ，Ｊ＝８．０Ｈｚ），７．１７（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝７．０Ｈｚ），６．０８（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝７．０Ｈｚ），５．９２（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝１２．０Ｈｚ），５．８７（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝９．５Ｈｚ），５．７５（１Ｈ，ｓ），５．７４（１Ｈ，ｍ），５．２２（１Ｈ，ｍ），５．０２（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝１２．０Ｈｚ），４．６９（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝１０．５Ｈｚ），４．５３（１Ｈ，ｍ），４．９０，（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝１０．５Ｈｚ），４．２０（１Ｈ，ｍ），４．１０（１Ｈ，ｍ），４．０２（１Ｈ，ｄｄ，９．５，７．５），３．８８（３Ｈ，ｓ），３．７３（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝９．５Ｈｚ），２．５３（１Ｈ，ｍ），１２．９（３Ｈ，ｓ），１．１６（３Ｈ，ｓ ｂｒ）
１３Ｃ ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６）δ（ｐｐｍ）１７４．３，１６７．９，１６７．９，１６７．７，１６７．６，１６３．８，１６２．７，１６１．０，１６０．９，１６０．２，１６０．２，１５９．１，１５７．８，１５７．５，１５０．９，１５０．６，１４９．４，１４８．６，１４５．９，１４３．１，１３４．８，１３４．４，１３０．０，１２８．４，１２７．４，１２６．７，１２６．２，１２５．４，１２５．０，１２４．０，１２２．９，１２０．０，１１９．４，１１２．３，１１１．２，１０９．７，８１．３，６７．７，６７．１，６５．１，６４．３，６３．１，５６．０，５５．７，４９．５，４９．３，１７．８，１３．０。
【００５３】
化合物Ｉｈ：
分子量：１０８２
分子式：Ｃ４１Ｈ３８Ｎ１４Ｏ１２Ｓ５
ＨＲＥＳＩＭＳ（ｍ／ｚ）：１０８３．１２７７（Ｍ＋Ｈの測定値），１０８３．１３１２（Ｍ＋Ｈの計算値）
ｌＨ ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６）δ（ｐｐｍ）８．５９（１Ｈ，ｓ），８．４５（１Ｈ，ｓ），８．４０（１Ｈ，ｓ），８．２０（１Ｈ，ｓ），７．９２（１Ｈ，ｓ），７．８６（１Ｈ，ｓ），６．３４（１Ｈ，ｓ），５．８８（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝９．７，２．５Ｈｚ），５．７４（１Ｈ，ｓ），５．３２（１Ｈ，ｄｄｄ，Ｊ＝９．５，９．５，５．２Ｈｚ），４．６６（１Ｈ，ｂｄ，Ｊ＝８．８Ｈｚ），４．０５（１Ｈ，ｂｓ），３．８９（３Ｈ，ｓ），３．７３（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝１１．１，４．４Ｈｚ），３．６８（１Ｈ，ｂｒｓ），３．６０（１Ｈ，ｂｒｓ），３．５１（１Ｈ，ｔ，Ｊ＝１０．２Ｈｚ），２．０５（３Ｈ，ｓ），０．９０（３Ｈ，ｄ，Ｊ＝ ６．５Ｈｚ）
１３Ｃ ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６）δ（ｐｐｍ）１７３．６，１６９．４，１６９．４，１６９．１，１６７．１，１６５．１，１６４．０，１６２．２，１６０．５，１６０．５，１６０．４，１６０．４，１５８．４，１５３．４，１５０．８，１４９．８，１４９．８，１４９．２，１４６．６，１４２．６，１３５．１，１３４．３，１２９．６，１２７．３，１２７．１，１２５．７，１２５．５，１２３．５，１１９．０，１１０．０，１０３．８，７３．６，７１．５，６６．１，６２．２，５６．３，５５．８，５３．１，４９．７，１６．９，１２．７。
【００５４】
化合物Ｉｉ：
分子量：１０１３
分子式：Ｃ３８Ｈ３５Ｎ１３Ｏ１１Ｓ５
ＨＲＥＳＩＭＳ（ｍ／ｚ）：１０１４．１０７３（Ｍ＋Ｈの測定値），１０１４．１０９７（Ｍ＋Ｈの計算値）
ｌＨ ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６）δ（ｐｐｍ）８．５６（１Ｈ，ｓ），８．４５（１Ｈ，ｓ），８．３９（１Ｈ，ｓ），８．１９（１Ｈ，ｓ），７．９４（１Ｈ，ｓ），７．８４（１Ｈ，ｓ），５．８６（１Ｈ，ｂｒｄ，Ｊ＝９．４Ｈｚ），５．３１（１Ｈ，ｍ），４．６５（１Ｈ，ｂｄ，７．３Ｈｚ），４．０３（１Ｈ，ｍ），３．８８（３Ｈ，ｓ），３．７７（１Ｈ，ｍ），３．７３（１Ｈ，ｍ），３．５９（１Ｈ，ｍ），３．４９（１Ｈ，ｍ），２．０３（３Ｈ， ｓ），０．８８（３Ｈ，ｄ，Ｊ＝６．５Ｈｚ）。
【００５５】
化合物Ｉの抗生物質活性を定量するために使用したプロトコルを以下に記載する。
【００５６】
材料：
カチオン調節ミュラー・ヒントンブロス（ＭＨ；ＢＢＬ）
５０％溶解ウマ血液（ＬＨＢ；ＢＢＬ）（凍結保存）
ＲＰＭＩ １６４０（Ｂｉｏ Ｗｈｉｔｔａｋｅｒ）
ヒト血清（Ｐｅｌ−Ｆｒｅｅｚ）
ＲＰＭＩ １６４０（Ｂｉｏ Ｗｈｉｔｔａｋｅｒ）
ヘモフィルス試験培地（ＨＴＭ，Ｒｅｍｅｌ）
トリプチケース・ダイズブロス（ＴＳＢ、５ｍＬ／管；ＢＢＬ）
０．９％塩化ナトリウム（生理食塩水；Ｂａｘｔｅｒ）
トリプチケースダイズ＋５％ヒツジ血液寒天プレート（ＴＳＡ；ＢＢＬ）
サブローデキストロース寒天プレート（ＢＢＬ）
チョコレート寒天プレート（ＢＢＬ）
２×脱脂乳（Ｒｅｍｅｌ）
マイクロバンクビーズ（Ｋｒａｍｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）
ＭＩＣ２０００マイクロタイタープレート接種器
２×トリプチケース・ダイズブロス（ＴＳＢ，ＢＢＬ）＋１５％グリセロール／５０％ウマ血清
９６−ウェルマイクロタイタープレート、蓋、接種物トレー（Ｄｙｎｅｘ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）
８−チャンネルのＦｉｎｎマルチチャンネルピペッター、容量０．５−１０μＬ。
【００５７】
方法
培地調製
カチオン調節ミュラー・ヒントンブロス（ＭＨ；ＢＢＬ）：製造業者の指示通りに調製した（２２ｇを１０００ｍＬの水に溶解し、２２分間オートクレーブ処理）。冷蔵保存した。使用前にＣｏｒｎｉｎｇ ０．４５Ｔｍ酢酸セルロースフィルターを使用して濾過滅菌した。
【００５８】
５０％溶解ウマ血液：線維素除去したウマ血液を滅菌蒸留水で１：１に希釈し、凍結し、解凍し、再凍結し（少なくとも７回）、次いで遠心する。−２０℃で冷凍保存した。
【００５９】
カチオン調節ミュラー・ヒントン＋２．５％溶解ウマ血液：１００ｍＬのカチオン調節ミュラー・ヒントンブロスに５ｍＬの５０％溶解ウマ血液を無菌的に添加する。使用前にＣｏｒｎｉｎｇ ０．４５Ｔｍ酢酸セルロースフィルターを使用して濾過滅菌する。
【００６０】
カチオン調節ミュラー・ヒントン＋５０％ヒト血清：５０ｍＬ×２のカチオン調節ミュラー・ヒントンブロスに５０ｍＬのヒト血清を無菌的に添加する。使用前にＣｏｒｎｉｎｇ ０．４５Ｔｍ酢酸セルロースフィルターを使用して濾過滅菌する。
【００６１】
ヘモフィルス試験培地（Ｒｅｍｅｌ）：製造業者から調製済みで入手した。使用前にＣｏｒｎｉｎｇ ０．４５Ｔｍ酢酸セルロースフィルターを使用して濾過滅菌した。
【００６２】
０．９％塩化ナトリウム（生理食塩水；Ａｂｂｏｔｔ Ｌａｂｓ）：製造業者から調製済みで入手した。
【００６３】
２×脱脂乳（Ｒｅｍｅｌ）：製造業者から調製済みで入手した
寒天プレートはすべて製造業者から調製済みで入手した。
【００６４】
【表１】
【００６５】
単離物の選択と維持
使用した菌株は、Ｍｅｒｃｋ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ、Ｍｅｒｃｋ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｃｕｌｔｕｒｅ ＣｏｌｌｅｃｔｉｏｎまたはＣｌｉｎｉｃａｌ Ｔｒｉａｌｓからの単離物である。Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ菌株は、Ｍｅｒｃｋでｉｎ ｖｉｖｏ試験に使用したマウス病原体である。Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ菌株は、細胞壁透過性菌株である。Ｃａｎｄｉｄａ ａｌｂｉｃａｎｓ菌株を対照として使用する。これらの培養物を−８０℃の凍結予製液として、ａ）マイクロバンクビーズ；ｂ）２×脱脂乳；またはｃ）２×トリプチケース・ダイズブロス＋１５％グリセロール／５０％ウマ血清中に維持する（ＨａｅｍｏｐｈｉｌｕｓおよびＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）。
【００６６】
接種物の調製
選択した単離物をチョコレート寒天プレート（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ）、トリプチケース・ダイズブロス＋５％ヒツジ血液寒天プレート（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ）またはサブローデキストロース寒天培地（Ｃａｎｄｉｄａ）で継代培養し、３５℃でインキュベートする。ＨａｅｍｏｐｈｉｌｕｓおよびＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅは５％ＣＯ２中でインキュベートする。その他の単離物はすべて周囲空気中でインキュベートする。アッセイ前に単離物を２×継代培養する。
【００６７】
プレートからコロニーを選択し、トリプチケース・ダイズブロス中で０．５ ＭｃＦａｒｌａｎｄ標準に等価の接種物を調製する。Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅの場合には１．０ ＭｃＦａｒｌａｎｄ標準に等価の密度の接種物を調製する。すべての培養物の接種密度は、ＴＳＢ中で〜１０８ＣＦＵ／ｍＬである。このＴＳＢ接種物を滅菌生理食塩水で１：１０に希釈し（４ｍＬの接種物＋３６ｍＬの生理食塩水；〜１０７ＣＦＵ／ｍＬに等価）、マイクロタイタープレートに接種するまで氷上で保存する。
【００６８】
ランダムに選択した単離物をコロニーカウントしてＣＦＵ／ウェルを確認する（ＴＳＢ接種物をＴＳＡ ＩＩ＋５％ＳＢまたはチョコレート寒天プレートに１０−５、１０−６に平板培養し、３５℃、ＣＯ２で一夜インキュベートした）。
【００６９】
プレート充填
９６ウェルマイクロタイタープレート（Ｄｙｎｅｘ）の全部のウェルに１００ＴＬの培地を充填する。Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅを試験するためにヘモフィルス試験培地を調製する；Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅの試験にはカチオン調節ミュラー・ヒントン＋５％溶解ウマ血液プレートを調製する；Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉおよびＢａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓの試験にはカチオン調節ミュラー・ヒントンプレートを調製する。Ｃａｎｄｉｄａの試験にはＲＰＭＩ １６４０を使用する。Ｓ．ａｕｒｅｕｓ Ｓｍｉｔｈに対するＭＩＣはカチオン調節ミュラー・ヒントンおよびカチオン調節ミュラー・ヒントン＋５０％ヒト血清中で定量し、化合物が血清中の何らかの成分によって失活するか否か（ＭＩＣの増加が指標）を判定する。充填したプレートをプラスチックバッグに包み（蒸発を最低限に抑制するため）、冷凍保存し、使用前に解凍する。
【００７０】
化合物の調製
化合物は、重量基準で調製する。１００％ＤＭＳＯ中に２−１０ｍｇ／ｍＬになるように化合物を調製し、次いで１：１に希釈したＤＭＳＯ／２×ＣＡＭＨＢ（最終濃度＝５０％ＤＭＳＯ／５０％ＣＡＭＨＢ）で１ｍｇ／ｍＬに希釈する。ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ Ｄｅｅｐ Ｗｅｌｌポリプロピレン９６ウェルプレート中、化合物を５０％ＤＭＳＯ／５０％ＣＡＭＨＢで１：１に系列希釈する（出発濃度１−５ｍｇ／ｍＬ）。
【００７１】
マイクロブロス希釈アッセイ
Ｆｉｎｎ全自動マルチチャンネルピペット（０．５−１０μＬ容）を使用し、６．４ＴＬの抗菌作用性溶液を充填マイクロタイタープレートのウェルに加える（第一ウェルの抗菌剤の濃度＝５１２−６４μｇ／ｍＬ；ＤＭＳＯの濃度＝３．２％）。各ウェルのＤＭＳＯの量を一定に保つため（化合物を溶解状態に維持するため、および、ＤＭＳＯによる非特異的殺菌の可能性を補正するため）にこのようにして抗菌剤を加える。最終列は３．２％ＤＭＳＯから成る増殖対照を含む。
【００７２】
各アッセイと共に対照を処理する。対照は、化合物と同様にして調製したペニシリンＧおよびクロラムフェニコールである。血清タンパク質結合アッセイに対する対照としてエルタペネムが含まれる。
【００７３】
プレート接種
ウェルあたり１．５ＴＬの接種物を配給する全自動接種デバイスであるＭＩＣ２０００システムを使用して（生理食塩水に希釈した）培養物をマイクロタイタープレートの全部のウェルに接種する。プレートを周囲空気中、３５℃でインキュベートする。接種しなかったプレートも無菌性チェックとしてインキュベートする。２２−２４時間のインキュベーション後の結果を記録する。プレートが無増殖になるまで読取りを行う。ＭＩＣは２２−２４時間のインキュベーション後に無増殖という結果を示した抗菌剤の最小量レベルであると定義する。
【００７４】
化合物Ｉａ−Ｉｉは、Ｓ．ａｕｒｅｕｓ、Ｅ．ｆａｅｃａｌｉｓ、Ｅ．ｆａｅｃｉｕｍ、Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｕｓおよびＳ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅの種々の菌株に抗菌活性を示す。化合物Ｉａ−Ｉｉはまた、メチシリン耐性Ｓ．ａｕｒｅｕｓ（ＭＲＳＡ）、バンコマイシン耐性Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ種（ＶＲＥ）、多剤耐性Ｅ．ｆａｅｃｉｕｍ、マクロライド耐性Ｓ．ａｕｒｅｕｓおよびＳ．ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ、リネゾリド耐性Ｓ．ａｕｒｅｕｓおよびＥ．ｆａｅｃｉｕｍのような多くの既知抗生物質に耐性の様々な種に抗菌活性を示す。これらの被験菌株に対する最小阻止濃度（ＭＩＣ）の値は０．０１−２００ｕｇ／ｍＬの範囲である。ＭＩＣはＮＣＣＬＳガイドラインによって得られる。
【技術分野】
【０００１】
本発明は細菌感染症の治療に有用な広域チアゾリル−ペプチド抗生物質化合物に関する。
【背景技術】
【０００２】
細菌が引き起こす感染症は、これらの多くの細菌が種々の抗生物質に耐性であるため、医学的な懸念が増している。このような細菌としては、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ｈｅｍｏｌｙｔｉｃｕｓ、Ｐｅｄｉｏｃｏｃｃｕｓ種およびＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ、Ｖｉｂｒｉｏ ｃｈｏｌｅｒａｅ、Ｖｉｂｒｉｏ ｐａｒａｈｅｍｏｌｙｔｉｃｕｓ、Ａｃｔｉｎｏｂａｃｔｅｒ ｃａｌｃｏａｅｔｉｃｕｓ、Ｓｔｅｎｏｔｒｏｐｈｏｍｏｎａｓ ｍａｌｔｏｐｈｉｌｉａがある。従って本発明の抗生物質は、種々の既知抗生物質に耐性の感染症を治療する療法に大きく貢献できる。
【０００３】
同じくチアゾリル−ペプチドであり、細菌感染症の治療に使用されている従来技術の化合物は、チオストレプトン、ＧＥ２２７０Ａ，ノカチアシン、グリコチオヘキシドおよびノシヘプチドである。
【０００４】
本発明では、チアゾリル−ペプチド抗生物質がＮｏｃａｒｄｉａ種の発酵によって産生される。これらは、慣用の抗生物質に感受性および抵抗性を有している細菌感染症に対して抗菌活性を有している。
【発明の開示】
【０００５】
本発明は、式Ｉ：
【０００６】
【化５】
【０００７】
［式中、
Ｒは、−Ｃ（Ｏ）ＮＨ２、−Ｃ（Ｏ）ＮＨＣ＝ＣＨ２Ｃ（Ｏ）ＮＨ２を表し；
Ｒ１、Ｒ２およびＲ３は独立にＯＨを表すか；またはＲ１、Ｒ１およびＲ３が一緒に
【０００８】
【化６】
を表し；
Ｒ４は、ＯＨ
【０００９】
【化７】
を表し；
Ｒ５は水素またはＯＨを表す］
の新規なチアゾリル−ペプチド抗生物質または医薬的に許容されるその塩、エステル、鏡像異性体、ジアステレオマーまたはそれらの混合物に関する。
【００１０】
本発明はまた、Ｎｏｃａｒｄｉａ種の発酵による式Ｉの化合物の製造方法に関する。本発明はまた、発酵ブロスから式Ｉの化合物を単離する方法に関する。
【００１１】
本発明はまた、式Ｉの化合物、特に、構造式Ｉａ、Ｉｂ、Ｉｃ、Ｉｄ、Ｉｅ、Ｉｆ、Ｉｇ、ＩｈおよびＩｉ：
【００１２】
【化８】
の化合物または医薬的に許容されるその塩、エステル、鏡像異性体、ジアステレオマーまたはそれらの混合物に関する。
【００１３】
本発明の化合物の医薬的に許容される塩は、無機または有機の無毒性塩基から形成されるような慣用の無毒性塩基を含む。例えば、このような慣用の無毒性塩基は、カリウム、ナトリウム、リチウム、カルシウムまたはマグネシウムなどのアルカリ金属またはアルカリ土類金属の水酸化物のような無機塩基から誘導された塩、ジベンジルエチレンジアミン、トリメチルアミン、ピペリジン、ピロリジン、ベンジルアミンなどのアミンのような有機塩基から製造された塩、または、水酸化テトラメチルアンモニウムのような水酸化第四級アンモニウムを含む。
【００１４】
医薬的に許容される塩は慣用の化学的方法によって本発明の化合物から合成できる。一般に、塩は、遊離酸を化学量論的量または過剰量の所望の無機または有機の塩形成性塩基と共に適当な溶媒または種々の混合溶媒中で反応させることによって製造される。
【００１５】
本発明の化合物は細菌感染症の治療に有用な広域抗生物質である。これらは主として、多くの既知抗生物質に耐性の種を含むＳ．ａｕｒｅｕｓ、Ｅ．ｆａｅｃａｌｉｓ、Ｅ．ｆａｅｃｉｕｍ、Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ、Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｕｓに対して抗菌活性を示す。これらの試験菌株の最小阻止濃度（ＭＩＣ）は、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ｈｅｍｏｌｙｔｉｃｕｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ、およびＥ．ｆａｅｃａｌｉｓのような試験菌株に対しては０．０１ｕｇ／ｍＬから２００ｕｇ／ｍＬ未満の範囲である。本発明の化合物は、化合物を医薬的に許容される担体に組合せることによって医薬組成物に配合できる。このような担体の例は後述する。
【００１６】
化合物は、粉末または結晶質形態、液体溶液、または、懸濁液として使用し得る。これらは多様な手段によって投与し得る。表在投与、経口投与および注射（静脈内または筋肉内）による非経口投与が有利な主要投与経路である。
【００１７】
１つの配給経路である注射用の組成物はアンプルまたは多用量容器に入れた単位剤形で調製し得る。注射用組成物は、油性もしくは水性ビヒクル中の懸濁液、溶液またはエマルションのような形態でよく、様々な配合剤を含有し得る。あるいは、有効成分が、配給のときに滅菌水のような適当なビヒクルで復元される粉末（凍結乾燥または非凍結乾燥）でもよい。注射用組成物中の担体は典型的には、滅菌水、生理食塩水またはその他の注射可能液体から成り、例えば、筋肉内注射の場合にはピーナツ油から成る。また、種々の緩衝剤、保存剤なども含有させることができる。
【００１８】
表在投与の場合、軟膏、クリーム、ローションを形成するためには疎水性または親水性担体のような担体、塗布剤を形成するためには水性、油脂性またはアルコール性液体、粉末を形成するためには乾燥稀釈剤のような担体中で配合するとよい。
【００１９】
経口組成物は、錠剤、カプセル剤、経口懸濁液および経口溶液のような形態を有し得る。経口組成物には慣用の配合剤のような担体を利用でき、持続放出形態にも即時配給形態にもできる。
【００２０】
投与すべき薬用量は、治療下の患者の状態および体格、投与の経路および頻度、化合物に対する病原体の感受性、感染のビルレンスおよびその他の要因に大きく左右される。しかしながらこれらの事項は抗生物質の分野で公知の治療方針に従って日常的に処方を行う医師に一任される。
【００２１】
ヒトに投与される組成物は、液体であるか固体であるかにかかわりなく、単位剤形あたり約０．０１％−約９９％の化合物Ｉを含有し得る。この範囲の一例は約１０−６０％である。組成物は一般に約２ｍｇ−約２．５ｇの化合物Ｉを含有し、この範囲の一例は約２ｍｇ−１０００ｍｇである。非経口投与の場合、単位剤形は典型的には、滅菌水溶液中に純粋な化合物Ｉを含むかまたは中性ｐＨおよび等張性に調整できる溶液とするための可溶粉末の形態である。
【００２２】
本文中に記載の本発明はまた、感染症の治療に有効な量の式Ｉの化合物を哺乳動物に投与する段階を含む、治療を要する哺乳動物の細菌感染症の治療方法を含む。
【００２３】
式Ｉの化合物の投与方法の１つの実施態様は、経口および非経口方法、例えば、静脈内注入、動脈内濃縮塊および筋肉内注射を含む。
【００２４】
成人に対しては、体重１ｋｇあたり０．１−５０ｍｇの式Ｉの化合物の１日１−４回の投与が好ましい。好ましい用量は、２ｍｇ−１０００ｍｇの抗菌剤の１日１−４回の投与である。より特定的に、軽度な感染症に対しては約５−２００ｍｇの用量の１日２−３回の投与が推奨される。極めて感染力の強いグラム陽性微生物による中度の感染症に対しては約２０−１０００ｍｇの用量の１日３−４回の投与が推奨される。抗生物質に上限の感受性をもつ微生物による生命に危険な重篤な感染症に対しては約１００−２０００ｍｇの用量の１日３−４回の投与が推奨される。
【００２５】
小児に対しては、典型的には、体重１ｋｇあたり０．１−５０ｍｇの式Ｉの化合物の１日１−４回の投与が推奨される。本発明の別の目的は、２ｍｇ−１０００ｍｇの抗菌剤の１日１−４回の投与という用量で達成される。
【００２６】
本発明の別の目的は、Ｎｏｃａｒｄｉａ種微生物を適当な栄養培地で培養し次いで発酵ブロスから本発明の化合物を回収する段階を含む式Ｉの化合物の製造方法である。問題の微生物は、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ （ＡＴＣＣ），１２３０１ Ｐａｒｋｌａｗｎ Ｄｒｉｖｅ，Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，Ｍａｒｙｌａｎｄ，２０８５２から受託番号ＡＴＣＣ ２０２０９９で入手できる。これはＭｅｒｃｋ ｃｕｌｔｕｒｅ ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎに受託番号ＭＡ７３３２で寄託されている。微生物の公然入手（ｐｕｂｌｉｃ ａｃｃｅｓｓ）に関する制限は特許許諾のときに最終的に排除される。本発明に関してはこの特定種の使用を記載したが、式Ｉの化合物を産生できる上記微生物の他の種および変異体も存在するであろう。本発明の実施にはそれらの使用も考察する。
【００２７】
構造式Ｉの化合物は、ＡＴＣＣ受託番号２０２０９９の培養物の接種により管理条件下で適当な培地を好気性発酵させることによって製造する。適当な培地は好ましくは水性であり、同化性炭素源、窒素源および無機塩を含有している。
【００２８】
発酵に使用される培地は主として、単独で使用されるかまたは当業者に常用の栄養物を加えて使用される公知のＤｉｆｃｏトリプチック・ダイズブロスである。
【００２９】
本文中に記載の栄養培地が使用できる多様な培地の単なる代表例であり、本発明の範囲がこれらに限定されないことを理解されたい。
【００３０】
発酵は約１０℃−約４０℃の範囲の温度で行う。しかしながら最適結果を得るためには、発酵を約３１−３２℃で行うのが好ましい。発酵中の栄養培地のｐＨは、約５．５−約７．５でよい。
【００３１】
本発明の化合物の発酵生産について、本発明がＡＴＣＣ受託番号２０２０９９の特定のＮｏｃａｒｄｉａ種に限定されないことを理解されたい。本発明の化合物を産生できるならば記載の培養物から産生または誘導された他の天然または人工の突然変異体またはＮｏｃａｒｄｉａ属の他の変異体または種の使用が本発明の範囲内に含まれることは特に希望しまた意図するものである。ＡＴＣＣ ２０２０９９のＮｏｃａｒｄｉａの突然変異種または菌株を人工的に産生するためには、慣用の物理的または化学的な突然変異誘発物質、例えば、記載の培養物の紫外線照射、または、ニトロソグアニジン処理などを用いるとよい。プロトプラスト融合、プラスミド組込み、染色体フラグメント組込み、などのような組換えＤＮＡ技術も有用であることが立証されている。
【実施例１】
【００３２】
段階１ａ：化合物Ｉａ、Ｉｃ、Ｉｄ、Ｉｅ、Ｉｆ、ＩｈおよびＩｉを産生するための発酵。１ｍＬの凍結したＮｏｃａｒｄｉａ種ＡＴＣＣ ２０２０９９（ＭＡ７３３２）の発育性原培養物を使用し、２５０ｍＬ容のフラスコに入れた５０ｍＬの母培地に接種した。母培地は水１リットルあたり、２０ｇのデンプン、５ｇのデキストロース、３ｇのＮ−Ｚアミン（Ｋｅｒｒｙ Ｂｉｏ−Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ｈｏｆｆｍａｎ Ｅｓｔａｔｅｓ，ＩＬ）、２ｇの酵母エキス、５ｇのＰｈａｒｍａｍｅｄｉａ（Ｔｒａｄｅｒｓ Ｐｒｏｔｅｉｎ，Ｍｅｍｐｈｉｓ，ＴＮ）、１ｇの炭酸カルシウムを含有していた。培養物を２２０ｒｐｍで作動している回転撹拌器に載せ、３２℃で３日間インキュベートした。得られた培養物の２０ｍＬを使用し、２リットル容のフラスコに入れた５００ｍＬの母培地に接種し、母培地は上記の５０ｍＬ培地と同じ成分を含有していた。培養物を１８０ｒｐｍで作動している回転撹拌器に載せ、３２℃で１日間インキュベートした。得られた５００ｍＬの培養物を使用し、３０リットル容の発酵槽に入れた２０Ｌの培地に接種し、培地は水１リットルあたり、２０ｇのデキストロース、５ｇのペプトン、１０ｇの一次酵母、５ｇのＡｌｌｏｐｈｏｓｉｔｅ（ケイ酸アルミニウム）、１ｍＬのＰ２０００抑泡剤（これは泡立ちを防止する高分子材料、Ｄｏｗ Ｃｈｅｍｉｃａｌ，Ｍｉｄｌａｎｄ，ＭＩ製）を含有していた。産生発酵は、温度３２℃、背圧５ｐｓｉおよび撹拌速度３００ｒｐｍで行った。発酵槽に１０ｓｌｐｍで空気を散布し、ＮａＯＨおよびＨ２ＳＯ４でｐＨを７．０に調整した。発酵槽を１３日間作動させ、ここで培養物を採集し、化合物を段階２ａに記載のようにして抽出し単離した。
【００３３】
段階１ｂ−１：化合物Ｉｂを産生するための発酵：
１ｍＬの凍結したＮｏｃａｒｄｉａ種ＡＴＣＣ ２０２０９９（ＭＡ７３３２）の発育性原培養物を使用し、２５０ｍＬ容のフラスコに入れた５０ｍＬの母培地に接種した。母培地は水１リットルあたり、２０ｇのデンプン、５ｇのデキストロース、３ｇのＮ−Ｚアミン、２ｇの酵母エキス、５ｇのＰｈａｒｍａｍｅｄｉａ、１ｇの炭酸カルシウムを含有していた。培養物を２２０ｒｐｍで作動している回転撹拌器に載せ、３２℃で２日間インキュベートした。得られた培養物の２０ｍＬを使用し、２リットル容のフラスコに入れた５００ｍＬの母培地に接種した。母培地は上記の５０ｍＬ培地と同じ成分を含有していた。培養物を１８０ｒｐｍで作動している回転撹拌器に載せ、３２℃で２日間インキュベートした。得られた５００ｍＬの培養物を使用し、２３リットル容の発酵槽に入れた１５Ｌの培地に接種した。培地は水１リットルあたり、２５ｇの可溶性デンプン、１５ｇのグルコース、７．５ｇの酸加水分解したカゼイン、１２ｇの酵母エキス、３．５ｇのダイズひき割り、３．５ｇのビーフエキス、１ｍＬの抑泡剤（Ｐ２０００）を含有していた。産生発酵は、温度３２℃、背圧５ｐｓｉおよび撹拌速度３００ｒｐｍで行った。発酵槽に５標準リットル／分（ｓｌｐｍ）で空気を散布し、ＮａＯＨおよびＨ２ＳＯ４でｐＨを７．０に調整した。発酵槽を１０日間作動させ、ここで培養物を採集し、化合物Ｉｂを単離するために後述のようにして抽出した。
【００３４】
段階１ｂ−２：化合物Ｉｇを産生するための発酵：
ｍＬの凍結したＮｏｃａｒｄｉａ種ＡＴＣＣ ２０２０９９（ＭＡ７３３２）の１発育性原培養物を使用し、２５０ｍＬ容のフラスコに入れた５０ｍＬの母培地に接種した。母培地は水１リットルあたり、２０ｇのデンプン、５ｇのデキストロース、３ｇのＮ−Ｚアミン、２ｇの酵母エキス、５ｇのＰｈａｒｍａｍｅｄｉａ、１ｇの炭酸カルシウムを含有していた。培養物を２２０ｒｐｍで作動している回転撹拌器に載せ、３２℃で２日間インキュベートした。得られた培養物の２０ｍＬを使用し、２リットル容のフラスコに入れた５００ｍＬの母培地に接種した。母培地は上記の５０ｍＬ培地と同じ成分を含有していた。培養物を１８０ｒｐｍで作動している回転撹拌器に載せ、３２℃で２日間インキュベートした。得られた５００ｍＬの培養物を使用し、３０リットル容の発酵槽に入れた２０Ｌの培地に接種した。培地は水１リットルあたり、２０ｇのデキストロース、５ｇのペプトン、１０ｇの一次酵母、５ｇのＡｌｌｏｐｈｏｓｉｔｅ（ケイ酸アルミニウム）、２ｍＬのＰ２０００抑泡剤（これは泡立ちを防止する高分子材料）を含有していた。産生発酵は、温度３２℃、背圧５ｐｓｉおよび撹拌速度３００ｒｐｍで行った。発酵槽に１０ｓｌｐｍで空気を散布し、ＮａＯＨおよびＨ２ＳＯ４でｐＨを７．０に調整した。発酵槽を１０日間作動させ、ここで培養物を採集し、化合物Ｉｇを回収するために酢酸エチルで抽出した。
【００３５】
段階２ａ：化合物Ｉａ、Ｉｃ、Ｉｄ、Ｉｅ、Ｉｆ、ＩｈおよびＩｉの単離。１８リットルの発酵ブロス（ｐＨ＝５．０）を各１８および１６リットルの酢酸エチルと共に室温で一夜撹拌することによって２回抽出した。酢酸エチル層を分離し、プールして減圧下で濃縮すると、７．１グラムの固体が得られた。水層をセライトで濾過し、ケーキを各８リットルのアセトンで２回抽出した。プールしたアセトン抽出物を濃縮乾固すると１５．６グラムの固体が得られたので、これを焼結ガラス漏斗に載せ、ヘキサン（４×１５０ｍＬ）で洗浄すると、１２．８グラムの固体が得られた。これを２５０ｍＬの１：１のメチレンクロリド−メタノールに懸濁させ、濾過した。３５グラムのＳｅｐｈａｄｅｘ ＬＨ２０のアリコートを濾液に注ぎ、減圧下で溶媒を除去した。化合物で被覆されたＬＨ２０粉末を、１：４のヘキサン−メチレンクロリドを充填した２．０リットル容のＳｅｐｈａｄｅｘ ＬＨ２０カラムの頂上部に充填した。カラムを各２カラム容の１：４のヘキサン−メチレンクロリド（画分３）、２．５％のメタノール−メチレンクロリド（画分４−６）、１．５カラム容の５％メタノール−メチレンクロリド（画分７−１１）１カラム容の１０％メタノール−メチレンクロリド（画分１２−１５）、各１．５カラム容の２０（画分１６−１８）、５０（１９−２１）および最後に１００％のメタノールで溶出させた。ＴＬＣ分析および分析用ＨＰＬＣに基づいて画分をプールすると、溶出溶媒と共に括弧内に示した画分１−２１が得られた。
【００３６】
化合物Ｉａの単離：ＬＨ２０画分３（１グラム）を５０％のメタノール−メチレンクロリドに溶解し、５ｇのシリカゲル６０（２３０−４００メッシュ、Ｅ−Ｍ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｇｅｒｍａｎｙ）に吸着させた。これを減圧下で乾燥し、真空液体クロマトグラフィーを使用して内径２０ｃｍの焼結ガラス漏斗に入れた１００ｇのシリカゲル６０（２３０−４００メッシュ、Ｅ−Ｍ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｇｅｒｍａｎｙ）で精製した。これを０．５Ｌのクロロホルムで溶出し、次いで１Ｌの１０％メタノール−クロロホルム、０．５Ｌの２０％メタノール−クロロホルム、１Ｌの５０％メタノール−クロロホルムで溶出し、最後に５０％メタノール−クロロホルム中の５％水酸化アンモニウムで洗浄した。１０％メタノール−クロロホルム溶出から得られた画分を減圧下に濃縮し、凍結乾燥すると６５０ｍｇの固体材料が得られた。これを、Ｚｏｒｂａｘ ＳＢ Ｐｈｅｎｙｌを使用して１３回の同一処理を行う分取ＨＰＬＣによって精製した（２１×２５０ｍｍ、０．１％のＴＦＡを含有する４０−５０％のアセトニトリル−水の勾配で３６分溶出、流速１２ｍＬ／分）。化合物Ｉａは３２−３３分後に溶出した。これを凍結乾燥すると、４２ｍｇの淡黄色粉末材料が得られたので、Ｚｏｒｂａｘ ＳＢ Ｐｈｅｎｙｌをもっと緩やかな勾配で使用する分取ＨＰＬＣによって精製した（２１×２５０ｍｍ、０．１％のＴＦＡを含有する４０−５０％のアセトニトリル−水の勾配で４２分溶出、流速１２ｍＬ／分）。化合物Ｉａは３３−３７分後に溶出した。画分をプールし、これを凍結乾燥すると、化合物Ｉａが淡黄色粉末として得られた。
【００３７】
化合物Ｉｃの単離：メチレンクロリド中の５％メタノール中に溶出したＬＨ−２０画分０７を濃縮乾固すると４００ｍｇの材料が得られたので、これをプレパックした焼結ガラス漏斗中でシリカゲルクロマトグラフィー処理し（４０ｇシリカゲル、ＥＭ ｓｃｉｅｎｃｅ、粒度２３０−２４０ｍｍ）、各１００ｍｌの酢酸／メタノール／クロロホルム１：０：９９、１：１：９８、１：２：９７、１：３：９６、１：４：９５および１：５：９４（５×１００ｍＬ）で溶出し、次いで水酸化アンモニウム／メタノール／クロロホルム１：７．５：９１．５（１００ｍＬ）、１：１０：８９（３×１００ｍＬ）、１：２５：７４（２×１００ｍＬ）、１：９９：０（１００ｍＬ）で溶出した。最後の３００ｍＬの１：５：９４酢酸／メタノール／クロロホルム溶出溶媒で溶出した画分をプールし、水酸化アンモニウムによってｐＨ＝７．０に調整し、濃縮乾固し、水と研和し、濾過し、濾液を濃縮乾固すると、３３．５ｍｇの材料が得られたので、これを、分取ＨＰＬＣ（ＹＭＣ ＯＤＳ−ＡＱ，２０×２５０ｍｍ，５ｍＬ／分、０．０５％のＴＦＡを含有する４０−５０％水アセトニトリル、６０分超、２１５ｎｍ）でクロマトグラフィー処理した。４６分後に溶出する画分を凍結乾燥すると化合物Ｉｃが得られた。
【００３８】
化合物Ｉｄの単離：上述したように２３Ｌ容の発酵タンクで７日間増殖させたＮｏｃａｒｄｉａ種の１５Ｌの発酵物を１５Ｌの酢酸エチルで抽出し濾過した。回転蒸発器を使用して減圧下で濾液を濃縮し凍結乾燥すると、１５ｇの油性材料が得られた。乾燥した酢酸エチル抽出物（１５ｇ）を５０ｍＬの９０％メタノール−メチレンクロリドに溶解し、２ＬのＳｅｐｈａｄｅｘ ＬＨ２０カラムに充填し、流速５ｍＬ／分のメタノール−メチレンクロリド（３：１）で溶出した。４０ｍＬの画分を採集した。目的の化合物は画分２１−３６に溶出した（０．８−１．４カラム容）。これらの画分をプールし、濃縮乾固すると、４．５ｇの油性材料が得られた。これを５０％メタノール−メチレンクロリドに溶解し、１２ｇのシリカゲル６０（２３０−４００メッシュ、Ｅ−Ｍ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｇｅｒｍａｎｙ）に吸着させた。これを減圧下で乾燥し、内径８．５ｃｍの焼結ガラス漏斗中の１００ｇのシリカゲル６０（２３０−４００メッシュ、Ｅ−Ｍ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｇｅｒｍａｎｙ）上で真空液体クロマトグラフィーを使用して精製した。これを２Ｌのメタノール−水−メレンクロリド（３：０．０２５：９７）で洗浄し、化合物Ｉｄを２Ｌのメタノール−水−メレンクロリド（３５：０．０２５：６５）で溶出した。これを減圧下で濃縮し凍結乾燥すると、１．８ｇの固体材料が得られたので、１０％のメタノール−メチレンクロリドに溶解して、３ｇのＤｉｏｌ（ＤＬ１２Ｓ５０，１２０Ａ，ｓ−５０μｍ ＹＭＣ Ｃｏ．Ｌｔｄ．Ｊａｐａｎ）に吸着させた。これを減圧下で乾燥し、５ｍＬ／分の流速の１５０ｇのＤｉｏｌ（ＤＬ１２Ｓ５０，１２０Ａ，ｓ−５０μｍ ＹＭＣ Ｃｏ．Ｌｔｄ．Ｊａｐａｎ）カラム（１．７５×８インチ）で精製した。これをメチレンクロリドで溶出し、次いでメタノール−水−メチレンクロリド（１：０．５：９９）からメタノールのパーセンテージが漸増して最終的にメタノール−水−メチレンクロリド（１５：１：８４）となる溶媒系で溶出し、最後に、（１０：１：８９の）メタノール−水酸化アンモニウム−ジクロロメタンで洗浄し、５０ｍＬの画分を収集した。最後の溶媒で溶出した画分をプールすると４８ｍｇの半精製画分が得られたので、１０％メタノール−メチレンクロリドに溶解し、０．５ｇのシリカゲル６０（２３０−４００メッシュ、Ｅ−Ｍ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｇｅｒｍａｎｙ）に予め吸着させ、１．５ｍＬ／分の流速で使用する１０ｇのシリカゲル６０（２３０−４００メッシュ、Ｅ−Ｍ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｇｅｒｍａｎｙ）カラム（０．５×８．５インチ）で精製した。これを２５０ｍＬのクロロホルムで溶出し、次いで、メタノールのパーセンテージが漸増するクロロホルム−水酸化アンモニウム［すなわち、メタノール−水酸化アンモニウム−クロロホルム２．５：０．１２５：９７．５（６００ｍＬ）、３：０．１２５：９７（８００ｍＬ）、５：０．１２５：９５（８００ｍＬ）、１０：０．１２５：９０（１．４Ｌ）、１５：０．１２５：８５（６００ｍＬ）、２５：０．１２５：７５（２００ ｍＬ）、４０：０．１２５：６０（２００ｍＬ）］で抽出した。化合物Ｉｄを含有する画分は１０：０．１２５：９０（メタノール−水酸化アンモニウム−クロロホルム）で溶出した。これらをプールし、減圧下で濃縮し、凍結乾燥すると、４ｍｇの化合物Ｉｄが得られた。
【００３９】
化合物Ｉｅの単離：ＬＨ２０画分１６（４３２ｍｇ）をクロロホルム／メタノール（１：１）に溶解し、２ｇのシリカゲルに吸着させ、減圧下で溶媒を除去し、粉末をシリカゲル充填焼結ガラス漏斗（２５ｇ、ＥＭ ｓｃｉｅｎｃｅ、粒度２３０−２４０ｍｍ、ｈｏｕｓｅ ｖａｃｕｕｍ）に塗布し、各１００ｍＬの２．５％、５．０％、７．５％、１０％、１５％、２０％、３０％、５０％、７５％のメタノール／クロロホルムで溶出させ、最後に４００ｍＬの１００％メタノールで洗浄した。メタノール画分を濃縮すると、８４．４ｍｇの材料が得られたので、これを分取ＨＰＬＣ分画化（ＹＭＣ ＯＤＳ−ＡＱ、２０×２５０ｍｍ、１０ｍＬ／分、ＴＦＡ非含有の２５−３５％アセトニトリル、４０分超、２１５ｎｍ）処理した。２５分後に溶出したＨＰＬＣ画分を凍結乾燥すると、化合物Ｉｅが粉末として得られた。
【００４０】
化合物Ｉｆの単離：メチレンクロリド中の５％メタノールに溶出したＬＨ−２０画分０７を濃縮乾固すると４００ｍｇの材料が得られたので、これをプレパック焼結ガラス漏斗（４０ｇシリカゲル、ＥＭ ｓｃｉｅｎｃｅ、粒度２３０−２４０ｍｍ）でシリカゲルクロマトグラフィー処理し、各１００ｍＬの１：０：９９、１：１：９８、１：２：９７、１：３：９６、１：４：９５および１：５：９４（５×１００ｍＬ）の酢酸／メタノール／クロロホルムで溶出し、次いで１：７．５：９１．５（１００ｍＬ）、１：１０：８９（３×１００ｍＬ）、１：２５：７４（２×１００ｍＬ）、１：９９：０（１００ｍＬ）の水酸化アンモニウム／メタノール／クロロホルムで溶出した。最後の３００ｍＬの１：５：９４酢酸／メタノール／クロロホルム溶出溶媒で溶出する画分をプールし、水酸化アンモニウムでｐＨ７．０に調整し、濃縮乾固し、水と研和し、濾過し、濾液を濃縮乾固すると、３３．５ｍｇの材料が得られた。これを分取ＨＰＬＣによってクロマトグラフィー処理した（ＹＭＣ ＯＤＳ−ＡＱ、２０×２５０ｍｍ、５ｍＬ／分、０．０５％ＴＦＡを含有する４０−５０％水アセトニトリル、６０分超、２１５ｎｍ）。３１分後に溶出する画分を凍結乾燥すると化合物Ｉｆが得られた。
【００４１】
化合物ＩｈおよびＩｉの単離：５０％メタノール−メチレンクロリドで溶出したＬＨ−２０画分２１（１７５．０ｍｇ）をＹＭＣ ＯＤＳ−ＡＱ、２０×２５０ｍｍカラムを流速１０ｍＬ／分で０．０５％のＴＦＡを含有する２５−３５％水アセトニトリルの４０分勾配と共に使用し２１４ｎｍで検出する分取ＨＰＬＣによって処理した。２２分および３１分後に得られた画分を凍結乾燥すると、それぞれ化合物ＩｉおよびＩｈが粉末として得られた。
【００４２】
化合物Ｉｂの単離：段階Ｉｂ−１に記載したように６個のタンクから得られた１００Ｌのブロスを、５０Ｌの酢酸エチルで抽出した。一番上の酢酸エチル層を除去し、水層をセライトで濾過した。酢酸エチル抽出物を濃縮乾固し、ヘキサンと研和すると１０ｇの材料が得られた。濾過したケーキを２×２０Ｌのアセトンで抽出した。アセトンを除去した後、沈殿した化合物を焼結ガラス漏斗で濾過した。酢酸エチルおよびアセトンによる抽出から得られた固体をプールし、ヘキサン（５００ｍＬ）で洗浄し、１：１のメタノール／メチレンクロリド（５００ｍＬ）に溶解し、焼結ガラス漏斗で濾過した。濾液を濃縮乾固すると、４２グラムの固体が得られたので、これを１：１のメチレンクロリド／メタノール（２００ｍＬ）に溶解し、５０ｇのシリカゲルに予め吸着させ、５５０ｇのシリカゲルを詰めた１２×１７ｃｍの焼結ガラス漏斗に塗布し、１％の酢酸を含む２Ｌの１％メタノール／クロロホルム、１％の酢酸を含む１Ｌの２％メタノール／クロロホルム、１％の酢酸を含む１Ｌの３％メタノール／クロロホルム、１％の酢酸を含む１Ｌの４％メタノール／クロロホルム、１％の酢酸を含む４Ｌの５％メタノール／クロロホルム、１％の酢酸を含む１Ｌの６％メタノール／クロロホルム、１％の酢酸を含む３Ｌの７．５％メタノール／クロロホルム、１％の水酸化アンモニウムを含む５Ｌの７．５％メタノール／クロロホルム、１％の水酸化アンモニウムを含む２Ｌの１５％メタノール／クロロホルム、１％の水酸化アンモニウムを含む２Ｌの３０％メタノール／クロロホルム、１％の水酸化アンモニウムを含む２Ｌの６０％メタノール／クロロホルム、１％の水酸化アンモニウムを含む３Ｌの１００％メタノールで順次溶出した（５００ｍＬ／画分、合計５４画分）。
【００４３】
画分３０を濃縮乾固すると、１４６．５ｍｇの粉末が得られたので、これを分取ＨＰＬＣ（Ｚｏｒｂａｘ ＳＢ−ｐｈｅｎｙｌ、２１．２×２５０ｍｍ、１２ｍＬ／分、０．１％ＴＦＡ含有の４０−５０％アセトニトリル水、４５分超、２１４ｎｍ）で処理した。３９−４０分後に溶出する画分をプールし、凍結乾燥すると、化合物Ｉｂが得られた。
【００４４】
化合物Ｉｇの単離：段階１ｂ−２の１４リットルのブロスを１４リットルの酢酸エチルで抽出した。混合物を濾過し、セルを各２リットルのアセトンで２回抽出し、集めた。アセトン抽出物を減圧下で１．５リットルの沈殿性水溶液に濃縮し、濾過すると５．８ｇの固体が得られた。５ｇの固体アリコートをメタノール−メチレンクロリドに溶解し、５ｇのシリカゲルを添加した。減圧下に溶媒を除去すると粉末が得られたので、これを９９−１クロロホルム−酢酸中で２リットルの焼結ガラス漏斗に入れた２５０グラムのシリカ層の頂上部に加えた。各３倍容の９９−１クロロホルム−酢酸、９９−１−１のクロロホルム−メタノール−酢酸、次いで、９８−２−１、９７−３−１、９６−４−１、９５−５−１、９０−１０−１および９０−１０−１のクロロホルム−メタノール−水酸化アンモニウムで溶出した。９５−５−１の溶媒組成で溶出する画分１７および１８を集めて（１０５ｍｇ）、溶解し、３−５ｇのシリカゲルに加えて濃縮乾固した。１５ｇのシリカゲルをドライパックしたカラムの頂上部にこれを加え、各画分の合計１５５．６ｍＬに対して３０カラム容の９７−３−１のクロロホルム−メタノール−水で溶出した。画分を最初にシリカＴＬＣによって分析し、選択した画分をＨＰＬＣによって検定した。画分２１−５０（２０ｍｇ）を１ｇのシリカゲルに加えて濃縮乾固した。１５ｇのシリカゲルをドライパックしたカラムの頂上部にこれを加え、各画分の合計２４０．６ｍＬに対して４８カラム容の９８−２−１クロロホルム−メタノール−水で溶出した。画分１８０−２１０を集めて濃縮乾固すると、３．２ｍｇの粗Ｉｇが得られた。これをＺｏｒａｘ ｐｈｅｎｙｌ半分取ＨＰＬＣカラム（９．４×２５０ｍｍ）で、２１分間の４０−６０％水アセトニトリル勾配を保持時間２分で使用する多重注入によって更に精製した。１４分後に溶出する画分を集めて凍結乾燥すると、化合物Ｉｇが得られた。
【００４５】
段階３：Ｉａ−Ｉｅの生理化学的特性
化合物Ｉａ、Ｉｂ、Ｉｃ、Ｉｄ、Ｉｅ、Ｉｆ、Ｉｇ、ＩｈおよびＩｉの構造を質量分析法、１Ｈ ＮＭＲおよび１３Ｃ ＮＭＲの使用によって決定した。
【００４６】
化合物Ｉａ：
分子量：１４３４
分子式：Ｃ６１Ｈ５８Ｎ１４Ｏ１８Ｓ５
ＨＲＥＳＩＭＳ（ｍ／ｚ）：１４３５．２６９６（Ｍ＋Ｈの測定値）、１４３５．２７３４（計算値）
ＵＶ（メタノール）λｍａｘ（ｌｏｇε）２２２（４．７７），２８８（４．４０），３５８（４．０８）ｎｍ
ＩＲ（ｎｅａｔ）νｍａｘ３３８９，３０９６，２９２９，１６６９，１６３８，１５３５，１４７６，１４２４，１３８７，１３２０，１２５３，１２０３，１２２９，１０９９，１０３８，１０１６ｃｍ−１
ｌＨ ＮＭＲ（ＣＤＣ１３＋ＣＤ３ＯＤ）δｐｐｍ δ８．３８（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝１０Ｈｚ），８．３１（１Ｈ，ｓ），８．２７（１Ｈ，ｓ），８．２１（１Ｈ，ｓ），８．０８（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝１１．５Ｈｚ），７．９３（１Ｈ，ｓ），７．７６（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝８．５ Ｈｚ），７．６８（１Ｈ，ｓ），７．６４（１Ｈ，ｓ），７．３６（１Ｈ，ｔ，Ｊ＝８．５Ｈｚ）， ７．１６（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝７．０Ｈｚ），６．５８（１Ｈ，ｓ），５．９６（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝１２．０Ｈｚ），５．９３（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝１０．０ Ｈｚ），５．７０（１Ｈ，ｍ），５．５９（１Ｈ，ｓ），５．２６（１Ｈ，ｍ），５．０４（１Ｈ，ｔ，Ｊ＝７．０Ｈｚ），４．９７（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝５．０Ｈｚ），４．９１（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝１２．５Ｈｚ），４．８４（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝１０．０Ｈｚ），４．４０（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝９．５Ｈｚ），４．２４（１Ｈ，ｍ），４．１９（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝５．５Ｈｚ），４．１６（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝１２．０Ｈｚ），３．８７（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝６．０Ｈｚ），３．８１（３Ｈ，ｓ），３．５６（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝１０．５Ｈｚ），２．９１（１Ｈ，ｍ），２．７０（１Ｈ，ｓ），２．３７（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝１６．０，５．５Ｈｚ），１．９０（３Ｈ，ｓ），１．８３（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝１５．０，７．０Ｈｚ），１．４０（３Ｈ，ｓ），１．３９（３Ｈ，ｄ，Ｊ＝６．０Ｈｚ），０．７２（３Ｈ，ｄ，Ｊ＝６．５Ｈｚ）
１３Ｃ ＮＭＲ（ＣＤＣ１３＋ＣＤ３ＯＤ）δ１７２．０，１６９．７，１６９．４，１６７．８，１６６．６，１６６．２，１６５．５，１６２．３，１６２．０，１６１．７，１６１．６，１６０．６，１５９．５，１５８．８，１５５．３，１５１．７，１４９．９，１４９．８，１４９．３，１４６．１，１４４．１，１３５．５，１３４．８，１３３．１，１３０．３，１２７．９，１２６．９，１２６．６，１２５．７，１２５．４，１２４．９，１２４．３，１２４．０，１２０．５，１１９．６，１１２．４，１１０．５，１１０．１，１０４．３，９３．９，８４．８，８１．６，７２．０，７０．０，６８．３，６６．３，６４．７，６４．２，６４．２，５６．５，５５．９，４１．３，３５．９，２５．４，１８．２，１６．３，１３．８。
【００４７】
化合物Ｉｂ：
分子量：１４４８
分子式：Ｃ６２Ｈ６０Ｎ１４Ｏ１８Ｓ５
ＵＶ（メタノール＋ＴＨＦ，１：１）λｍａｘ２２２（ε５２７３６），２８８（ε２３１１０），３６２（ε９３８３）
ＩＲ（ＺｎＳｅ）νｍａｘ３３８７，２９７８，１７４２，１６６７（ｂｒ，ｓｔｒｏｎｇ），１５３１，１４７５，１４２２，１３２０，１２５２，１２００，１１２８，１０９７，１０７０，１０２５，８３２，８０１，７２１ｃｍ−１
ＨＲＥＳＩＭＳ：１４４９．２９３０（Ｍ＋Ｈの測定値），１４４９．２８９２（Ｍ＋Ｈの計算値）
ｌＨ ＮＭＲ（ＣＤＣ１３＋ＣＤ３ＯＤ）δ（ｐｐｍ）：８．３９（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝１０．８Ｈｚ），８．３３（１Ｈ，ｂｒｓ），８．２４（１Ｈ，ｂｒｓ），８．２１（１Ｈ，ｓ），８．１０（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝１０．９Ｈｚ），７．９３（１Ｈ，ｓ），７．９４（１Ｈ，ｂｒｓ），７．７６（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝７．２Ｈｚ），７．６９（１Ｈ，ｓ），７．６２（１Ｈ，ｂｒｓ），７．３７（１Ｈ，ｔ，Ｊ＝７．０Ｈｚ），７．１３（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝７．０Ｈｚ），６．５７（１Ｈ，ｂｒｓ），５．９８（１Ｈ，ｍ），５．９６（１Ｈ，ｍ），５．６７（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝１０．１，５．１Ｈｚ），５．５８（１Ｈ，ｂｒｓ），５．２７（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝１０．１，５．１Ｈｚ），５．０７（１Ｈ，ｔ，Ｊ＝６．３Ｈｚ），４．９３（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝１２．３Ｈｚ），４．８４（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝１０．１Ｈｚ），４．４６（１Ｈ，ｂｒｓ），４．４３（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝９．１Ｈｚ），４．４１（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝１０．９Ｈｚ），４．２２（１Ｈ，ｂｒｓ），４．１７（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝１０．３Ｈｚ），３．９３（１Ｈ，ｑ，Ｊ＝６．５Ｈｚ），３．８１（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝１０．０Ｈｚ），３．８０（３Ｈ，ｓ），３．００（１Ｈ，ｂｒｓ），２．９４（１Ｈ，ｂｒｓ），２．７３（３Ｈ，ｓ），２．４１（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝１５．７，５．５Ｈｚ），１．８９（３Ｈ，ｓ），１．８０（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝１５．７，７．８Ｈｚ），１．４５（３Ｈ，ｂｒｓ），１．４０（３Ｈ，ｂｒｓ），１．３９（３Ｈ，ｓ），０．７５（３Ｈ，ｄ，Ｊ＝６．１Ｈｚ）
１３Ｃ ＮＭＲ（ＣＤＣ１３＋ＣＤ３ＯＤ）δ（ｐｐｍ）１７１．４，１６９．３，１６９．１，１６７．４，１６６．３，１６５．９，１６５．１， １６２．１，１６１．７，１６１．４，１６１．３，１６０．３，１５９．２，１５８．４，１５５．０，１５１．３，１４９．６，１４９．５，１４８．９，１４５．８，１４３．８，１３５．２，１３４．４，１３２．８，１２９．９，１２７．５，１２６．６，１２６．３，１２６．３，１２５．４，１２４．９，１２４．３，１２４．０，１２３．７，１２０．１，１１９．３，１１１．９，１１０．１，１０９．７，１０３．７，９３．１，９１．９，８１．０，７９．３，７２．６，６９．２，６７．１，６５．９，６４．１，６４．１，６３．５，５６．０，５５．３，４８．７，４８．４，３９．６，３５．４，２４．８，１７．５，１５．１，１４．５，１３．３。
【００４８】
化合物Ｉｃ：
分子量：１４０９
分子式：Ｃ５９Ｈ５５Ｎ１３Ｏ１９Ｓ５
ＨＲＥＳＩＭＳ：１４１０．２４２９（Ｍ＋Ｈの測定値），１４１０．２４１９（Ｍ＋Ｈの計算値）、
ｌＨ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３＋ＣＤ３ＯＤ）δ８．３１（１Ｈ，ｓ），８．２９（１Ｈ，ｓ），８．２４（１Ｈ，ｓ），８．００（１Ｈ，ｓ），７．８３（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝８．６Ｈｚ），７．６９（１Ｈ，ｓ），７．６６（１Ｈ，ｓ），７．４２（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝８．６，７．０Ｈｚ），７．１６（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝７．０ Ｈｚ），６．６２（１Ｈ，ｓ），６．０７（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝１２．３Ｈｚ），５．８１（１Ｈ，ｂｒｄ，Ｊ＝９．１Ｈｚ），５．６９（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝１０．２，５．４Ｈｚ），５．５４（１Ｈ，ｓ），５．３０（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝１１．３，５．９Ｈｚ），４．９５（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝１２．３Ｈｚ），４．９０（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝１０．７Ｈｚ），４．８９（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝４．３Ｈｚ），４．４４（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝１１．３，９．７Ｈｚ），４．４２（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝１０．２Ｈｚ），４．２８（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝４．３Ｈｚ），４．２３（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝１０．７Ｈｚ），３．９１（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝１０．２Ｈｚ），３．８３（３Ｈ，ｓ），３．３５（１Ｈ，ｍ），３．０５（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝９．７Ｈｚ），２．９３（１Ｈ，ｍ），２．１７（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝１３．９Ｈｚ），１．９１（３Ｈ，ｓ），１．８９（ｌＨ，ｄ，Ｊ＝１３．９Ｈｚ），１．４９（３Ｈ，ｓ），１．３９（３Ｈ，ｄ，Ｊ＝６．４Ｈｚ），０．６７（３Ｈ，ｄ，Ｊ＝６．４Ｈｚ）。
【００４９】
化合物Ｉｄ：
分子量：１３５１
分子式：Ｃ５８Ｈ５８Ｎ１３Ｏ１６Ｓ５
ＥＳＩＭＳ：１３５２（Ｍ＋Ｈの測定値）
ｌＨ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３＋ＣＤ３ＯＤ）δ（ｐｐｍ）８．４４（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝９．５Ｈｚ），８．３８（１Ｈ，ｓ），８．２９（１Ｈ，ｓ），８．２５（１Ｈ，ｓ），８．００（１Ｈ，ｓ），７．８３（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝１０．５Ｈｚ），７．７４（１Ｈ，ｓ），７．７１（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝８．５Ｈｚ），７．６０（１Ｈ，ｓ），７．３９（２Ｈ，ｍ），７．１６（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝９．０Ｈｚ），６．１５（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝１２．５Ｈｚ），５．８２（１Ｈ，ｂｒｄ，Ｊ＝８．０Ｈｚ），５．７６（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝１１，４Ｈｚ），５．３８（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝１ｌ，４．５Ｈｚ），５．１６（１Ｈ，ｄ， Ｊ＝１０Ｈｚ），５．０５（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝５Ｈｚ），４．９５（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝１２．５Ｈｚ），４．６５（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝１１．５Ｈｚ），４．４３（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝９．５Ｈｚ），４．３０（１Ｈ，ｍ），４．２１（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝１０Ｈｚ），３．９９（１Ｈ，ｂｒｄ，Ｊ＝６Ｈｚ），３．９４（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝９．５，１．５Ｈｚ），３．８６（３Ｈ，ｓ），２．６０（６Ｈ，ｓ），２．２９（１Ｈ，ｍ），２．０７（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝１４．５Ｈｚ），１．９７（１Ｈ，ｍ），１．９５（３Ｈ，ｓ），１．５７（３Ｈ，ｓ），１．３２（３Ｈ，ｄ，Ｊ＝６Ｈｚ），０．７８（３Ｈ，ｄ，Ｊ＝７Ｈｚ）。
【００５０】
化合物Ｉｅ：
分子量：１２５３
分子式：Ｃ５０Ｈ５５Ｎ１３Ｏ１６Ｓ５
ＵＶ（メタノール＋ＴＨＦ，１：１）λｍａｘ２２４（ε６０２４４），３６４（ε１１５０２）
ＩＲ（ＺｎＳｅ）νｍａｘ３３６８，１６５７（ｂｒ，ｓｔｒｏｎｇ），１５３６，１４７９， １４２３，１３２１，１２５１，１１２４，１０２５，８８７，７６１ｃｍ−１
ＨＲＥＳＩＭＳ：１２５４．２５５１（Ｍ＋Ｈの測定値），１２５４．２５７１（Ｍ＋Ｈの計算値）
ｌＨ ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６）δ（ｐｐｍ）：１０．０８（１Ｈ，ｓ，ＮＨ），９．５５（１Ｈ，ｂｒｓ，ＮＨ），８．６１（１Ｈ，ｂｒｓ，ＮＨ），８．５５（１Ｈ，ｓ），８．５１（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝８．８Ｈｚ，ＮＨ），８．４３（１Ｈ，ｓ），８．３５（１Ｈ，ｓ），８．１９（１Ｈ，ｓ），８．０５（１Ｈ，ｂｒｓ，ＮＨ），７．５９（１Ｈ，ｂｒｓ，ＮＨ），７．８７（１Ｈ，ｓ），７．８１（１Ｈ，ｓ），７．３８（１Ｈ，ｂｒｓ，ＮＨ），５．７２（１Ｈ，ｂｒｓ），６．３５（１Ｈ，ｂｒｓ），５．６６（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝９．３，２．７Ｈｚ），５．２６（１Ｈ，ｄｄｄ，Ｊ＝９．３，９．３，４．４Ｈｚ），５．１２（１Ｈ，ｂｒｓ），４．７８（１Ｈ，ｂｒｓ），４．６６（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝７．９Ｈｚ），４．５５（１Ｈ，ｂｒｓ），４．０２（１Ｈ，ｍ），４．００（１Ｈ，ｍ），３．８８（３Ｈ，ｓ），３．７２（１Ｈ，ｍ），３．５０（１Ｈ，ｔ，Ｊ＝１０．２Ｈｚ），３．７０（１Ｈ，ｍ），２．６０（６Ｈ，ｓ），２．３６（１Ｈ，ｂｒｓ），２．０２（３Ｈ，ｓ），１．８８（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝１３．６，３．４Ｈｚ），１．７４（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝１３．６Ｈｚ），１．４６（３Ｈ，ｓ），１．３０（３Ｈ，ｄ，Ｊ＝５．７Ｈｚ），０．９５（３Ｈ，ｄ，Ｊ＝６．２Ｈｚ）
１３Ｃ ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−Ｄ６）δ（ｐｐｍ）１７１．７，１６９．３，１６９．２，１６８．８，１６６．７，１６５．１，１６４．２，１６２．２，１６０．８，１６０．５，１６０．１，１６０．０，１５８．５，１５３．６，１５１．５，１４９．９，１４９．４，１４９．２，１４６．６，１４１．６，１３５．１，１３４．３，１２９．５，１２７．２，１２７．１，１２５．４，１２４．８，１２３．０，１１８．４，１１０．２，１０３．５，９４．４，７２．７，７２．４，６９．４，６８．４，６７．２，６５．１，６２．１，５６．０，５５．７，５２．９，４９．６，４４．１，４０．１，３０．１，２０．９，１８．２，１２．７。
【００５１】
化合物Ｉｆ：
分子量：１２４９
分子式：Ｃ５２Ｈ４３Ｎ１３Ｏ１５Ｓ５
ＨＲＥＳＩＭＳ（ｍ／ｚ）：１２５０．１６７０（Ｍ＋Ｈの測定値），１２５０．１６８３（Ｍ＋Ｈの計算値）
ｌＨ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３−ＣＤ３ＯＤ）δ（ｐｐｍ）１０．７（１Ｈ，ｂｒｓ，ＮＨ），９．７（１Ｈ，ｓ，ＮＨ），８．３２（１Ｈ，ｓ），８．３１（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝９．７Ｈｚ），８．２３（１Ｈ，ｓ），８．１８（１Ｈ，ｓ），８．０９（１Ｈ，ｂｒｓ，ＯＨ），７．９２（ｓ），７．８１（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝１０．８Ｈｚ），７．７２（１Ｈ，ｓ），７．６１（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝８．５Ｈｚ），７．５７（１Ｈ，ｓ），７．３０（１Ｈ，ｍ），７．３０（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝７．５Ｈｚ），７．０７（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝７．０Ｈｚ），５．９９（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝１２．３Ｈｚ），４．９３（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝１２．６Ｈｚ），５．９５（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝９．６，１．８Ｈｚ），５．７０（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝１１．０，３．９Ｈｚ），５．５７（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝１．７Ｈｚ），６．５２（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝１．８Ｈｚ），５．３１（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝１１．８，４．４Ｈｚ），４．５９（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝１１．４Ｈｚ），５．０７（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝１０．１Ｈｚ），４．０８（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝１０．０Ｈｚ），４．２１（１Ｈ，ｂｒｄ，Ｊ＝７．４Ｈｚ），４．２０（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝９．３Ｈｚ），３．７４（３Ｈ，ｓ），３．６５（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝９．６，１．９Ｈｚ），１．８５（３Ｈ，ｓ），１．８５（ｌＨ，ｍ），１．２５（３Ｈ，ｄ，Ｊ＝６．３Ｈｚ）
１３Ｃ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３−ＣＤ３ＯＤ）δ（ｐｐｍ）１７４．４，１６９．３，１６８．２，１６８．２，１６６．４，１６６．３，１６５．７，１６４．３，１６１．８，１６１．７，１６１．４，１５９．２，１５９．２，１５８．５，１５４．９，１５１．６，１５０．１，１４９．４，１４９．１，１４６．０，１４２．６，１３６．４，１３４．２，１３２．８，１２９．５，１２７．０，１２６．３，１２５．９，１２５．９，１２４．３，１２４．１，１２４．１，１２３．６，１２３．４，１２２．８，１１９．３，１１５．８，１１５．８，１１０．０，１０３．７，８１．４，６８．０，６７．３，６６．２，６４．４，６２．０，５５．３，５４．６，５０．７，４９．２，１７．６，１２．９。
【００５２】
化合物Ｉｇ：
分子量：１１９６
分子式：Ｃ４９Ｈ４０Ｎ１２Ｏ１５Ｓ５
ＨＲＥＳＩＭＳ（ｍ／ｚ） １１９７．１４２０（Ｍ＋Ｈの測定値），１１９７．１４１２（Ｍ＋Ｈの計算値）
ｌＨ ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６）：δ（ｐｐｍ）１０．８３（１Ｈ，ｓ），８．９５（１Ｈ，ｓ），８．６４（１Ｈ，ｓ），８．５６（１Ｈ，ｓ），８．５１（１Ｈ，ｓ），８．４５（１Ｈ，ｓ），８．３８（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝８．５Ｈｚ），８．２４（１Ｈ，ｓ），７．９９（１Ｈ，ｓ），７．９１（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝１１Ｈｚ），７．８６（１Ｈ，ｓ），７．７１（１Ｈ，ｓ ｂｒ），７．７０，（１Ｈ，ｓ ｂｒ），７．３８（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝８．０Ｈｚ），７．３４ （１Ｈ，ｔ，Ｊ＝８．０Ｈｚ），７．１７（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝７．０Ｈｚ），６．０８（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝７．０Ｈｚ），５．９２（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝１２．０Ｈｚ），５．８７（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝９．５Ｈｚ），５．７５（１Ｈ，ｓ），５．７４（１Ｈ，ｍ），５．２２（１Ｈ，ｍ），５．０２（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝１２．０Ｈｚ），４．６９（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝１０．５Ｈｚ），４．５３（１Ｈ，ｍ），４．９０，（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝１０．５Ｈｚ），４．２０（１Ｈ，ｍ），４．１０（１Ｈ，ｍ），４．０２（１Ｈ，ｄｄ，９．５，７．５），３．８８（３Ｈ，ｓ），３．７３（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝９．５Ｈｚ），２．５３（１Ｈ，ｍ），１２．９（３Ｈ，ｓ），１．１６（３Ｈ，ｓ ｂｒ）
１３Ｃ ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６）δ（ｐｐｍ）１７４．３，１６７．９，１６７．９，１６７．７，１６７．６，１６３．８，１６２．７，１６１．０，１６０．９，１６０．２，１６０．２，１５９．１，１５７．８，１５７．５，１５０．９，１５０．６，１４９．４，１４８．６，１４５．９，１４３．１，１３４．８，１３４．４，１３０．０，１２８．４，１２７．４，１２６．７，１２６．２，１２５．４，１２５．０，１２４．０，１２２．９，１２０．０，１１９．４，１１２．３，１１１．２，１０９．７，８１．３，６７．７，６７．１，６５．１，６４．３，６３．１，５６．０，５５．７，４９．５，４９．３，１７．８，１３．０。
【００５３】
化合物Ｉｈ：
分子量：１０８２
分子式：Ｃ４１Ｈ３８Ｎ１４Ｏ１２Ｓ５
ＨＲＥＳＩＭＳ（ｍ／ｚ）：１０８３．１２７７（Ｍ＋Ｈの測定値），１０８３．１３１２（Ｍ＋Ｈの計算値）
ｌＨ ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６）δ（ｐｐｍ）８．５９（１Ｈ，ｓ），８．４５（１Ｈ，ｓ），８．４０（１Ｈ，ｓ），８．２０（１Ｈ，ｓ），７．９２（１Ｈ，ｓ），７．８６（１Ｈ，ｓ），６．３４（１Ｈ，ｓ），５．８８（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝９．７，２．５Ｈｚ），５．７４（１Ｈ，ｓ），５．３２（１Ｈ，ｄｄｄ，Ｊ＝９．５，９．５，５．２Ｈｚ），４．６６（１Ｈ，ｂｄ，Ｊ＝８．８Ｈｚ），４．０５（１Ｈ，ｂｓ），３．８９（３Ｈ，ｓ），３．７３（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝１１．１，４．４Ｈｚ），３．６８（１Ｈ，ｂｒｓ），３．６０（１Ｈ，ｂｒｓ），３．５１（１Ｈ，ｔ，Ｊ＝１０．２Ｈｚ），２．０５（３Ｈ，ｓ），０．９０（３Ｈ，ｄ，Ｊ＝ ６．５Ｈｚ）
１３Ｃ ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６）δ（ｐｐｍ）１７３．６，１６９．４，１６９．４，１６９．１，１６７．１，１６５．１，１６４．０，１６２．２，１６０．５，１６０．５，１６０．４，１６０．４，１５８．４，１５３．４，１５０．８，１４９．８，１４９．８，１４９．２，１４６．６，１４２．６，１３５．１，１３４．３，１２９．６，１２７．３，１２７．１，１２５．７，１２５．５，１２３．５，１１９．０，１１０．０，１０３．８，７３．６，７１．５，６６．１，６２．２，５６．３，５５．８，５３．１，４９．７，１６．９，１２．７。
【００５４】
化合物Ｉｉ：
分子量：１０１３
分子式：Ｃ３８Ｈ３５Ｎ１３Ｏ１１Ｓ５
ＨＲＥＳＩＭＳ（ｍ／ｚ）：１０１４．１０７３（Ｍ＋Ｈの測定値），１０１４．１０９７（Ｍ＋Ｈの計算値）
ｌＨ ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６）δ（ｐｐｍ）８．５６（１Ｈ，ｓ），８．４５（１Ｈ，ｓ），８．３９（１Ｈ，ｓ），８．１９（１Ｈ，ｓ），７．９４（１Ｈ，ｓ），７．８４（１Ｈ，ｓ），５．８６（１Ｈ，ｂｒｄ，Ｊ＝９．４Ｈｚ），５．３１（１Ｈ，ｍ），４．６５（１Ｈ，ｂｄ，７．３Ｈｚ），４．０３（１Ｈ，ｍ），３．８８（３Ｈ，ｓ），３．７７（１Ｈ，ｍ），３．７３（１Ｈ，ｍ），３．５９（１Ｈ，ｍ），３．４９（１Ｈ，ｍ），２．０３（３Ｈ， ｓ），０．８８（３Ｈ，ｄ，Ｊ＝６．５Ｈｚ）。
【００５５】
化合物Ｉの抗生物質活性を定量するために使用したプロトコルを以下に記載する。
【００５６】
材料：
カチオン調節ミュラー・ヒントンブロス（ＭＨ；ＢＢＬ）
５０％溶解ウマ血液（ＬＨＢ；ＢＢＬ）（凍結保存）
ＲＰＭＩ １６４０（Ｂｉｏ Ｗｈｉｔｔａｋｅｒ）
ヒト血清（Ｐｅｌ−Ｆｒｅｅｚ）
ＲＰＭＩ １６４０（Ｂｉｏ Ｗｈｉｔｔａｋｅｒ）
ヘモフィルス試験培地（ＨＴＭ，Ｒｅｍｅｌ）
トリプチケース・ダイズブロス（ＴＳＢ、５ｍＬ／管；ＢＢＬ）
０．９％塩化ナトリウム（生理食塩水；Ｂａｘｔｅｒ）
トリプチケースダイズ＋５％ヒツジ血液寒天プレート（ＴＳＡ；ＢＢＬ）
サブローデキストロース寒天プレート（ＢＢＬ）
チョコレート寒天プレート（ＢＢＬ）
２×脱脂乳（Ｒｅｍｅｌ）
マイクロバンクビーズ（Ｋｒａｍｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）
ＭＩＣ２０００マイクロタイタープレート接種器
２×トリプチケース・ダイズブロス（ＴＳＢ，ＢＢＬ）＋１５％グリセロール／５０％ウマ血清
９６−ウェルマイクロタイタープレート、蓋、接種物トレー（Ｄｙｎｅｘ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）
８−チャンネルのＦｉｎｎマルチチャンネルピペッター、容量０．５−１０μＬ。
【００５７】
方法
培地調製
カチオン調節ミュラー・ヒントンブロス（ＭＨ；ＢＢＬ）：製造業者の指示通りに調製した（２２ｇを１０００ｍＬの水に溶解し、２２分間オートクレーブ処理）。冷蔵保存した。使用前にＣｏｒｎｉｎｇ ０．４５Ｔｍ酢酸セルロースフィルターを使用して濾過滅菌した。
【００５８】
５０％溶解ウマ血液：線維素除去したウマ血液を滅菌蒸留水で１：１に希釈し、凍結し、解凍し、再凍結し（少なくとも７回）、次いで遠心する。−２０℃で冷凍保存した。
【００５９】
カチオン調節ミュラー・ヒントン＋２．５％溶解ウマ血液：１００ｍＬのカチオン調節ミュラー・ヒントンブロスに５ｍＬの５０％溶解ウマ血液を無菌的に添加する。使用前にＣｏｒｎｉｎｇ ０．４５Ｔｍ酢酸セルロースフィルターを使用して濾過滅菌する。
【００６０】
カチオン調節ミュラー・ヒントン＋５０％ヒト血清：５０ｍＬ×２のカチオン調節ミュラー・ヒントンブロスに５０ｍＬのヒト血清を無菌的に添加する。使用前にＣｏｒｎｉｎｇ ０．４５Ｔｍ酢酸セルロースフィルターを使用して濾過滅菌する。
【００６１】
ヘモフィルス試験培地（Ｒｅｍｅｌ）：製造業者から調製済みで入手した。使用前にＣｏｒｎｉｎｇ ０．４５Ｔｍ酢酸セルロースフィルターを使用して濾過滅菌した。
【００６２】
０．９％塩化ナトリウム（生理食塩水；Ａｂｂｏｔｔ Ｌａｂｓ）：製造業者から調製済みで入手した。
【００６３】
２×脱脂乳（Ｒｅｍｅｌ）：製造業者から調製済みで入手した
寒天プレートはすべて製造業者から調製済みで入手した。
【００６４】
【表１】
【００６５】
単離物の選択と維持
使用した菌株は、Ｍｅｒｃｋ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ、Ｍｅｒｃｋ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｃｕｌｔｕｒｅ ＣｏｌｌｅｃｔｉｏｎまたはＣｌｉｎｉｃａｌ Ｔｒｉａｌｓからの単離物である。Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ菌株は、Ｍｅｒｃｋでｉｎ ｖｉｖｏ試験に使用したマウス病原体である。Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ菌株は、細胞壁透過性菌株である。Ｃａｎｄｉｄａ ａｌｂｉｃａｎｓ菌株を対照として使用する。これらの培養物を−８０℃の凍結予製液として、ａ）マイクロバンクビーズ；ｂ）２×脱脂乳；またはｃ）２×トリプチケース・ダイズブロス＋１５％グリセロール／５０％ウマ血清中に維持する（ＨａｅｍｏｐｈｉｌｕｓおよびＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）。
【００６６】
接種物の調製
選択した単離物をチョコレート寒天プレート（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ）、トリプチケース・ダイズブロス＋５％ヒツジ血液寒天プレート（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ）またはサブローデキストロース寒天培地（Ｃａｎｄｉｄａ）で継代培養し、３５℃でインキュベートする。ＨａｅｍｏｐｈｉｌｕｓおよびＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅは５％ＣＯ２中でインキュベートする。その他の単離物はすべて周囲空気中でインキュベートする。アッセイ前に単離物を２×継代培養する。
【００６７】
プレートからコロニーを選択し、トリプチケース・ダイズブロス中で０．５ ＭｃＦａｒｌａｎｄ標準に等価の接種物を調製する。Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅの場合には１．０ ＭｃＦａｒｌａｎｄ標準に等価の密度の接種物を調製する。すべての培養物の接種密度は、ＴＳＢ中で〜１０８ＣＦＵ／ｍＬである。このＴＳＢ接種物を滅菌生理食塩水で１：１０に希釈し（４ｍＬの接種物＋３６ｍＬの生理食塩水；〜１０７ＣＦＵ／ｍＬに等価）、マイクロタイタープレートに接種するまで氷上で保存する。
【００６８】
ランダムに選択した単離物をコロニーカウントしてＣＦＵ／ウェルを確認する（ＴＳＢ接種物をＴＳＡ ＩＩ＋５％ＳＢまたはチョコレート寒天プレートに１０−５、１０−６に平板培養し、３５℃、ＣＯ２で一夜インキュベートした）。
【００６９】
プレート充填
９６ウェルマイクロタイタープレート（Ｄｙｎｅｘ）の全部のウェルに１００ＴＬの培地を充填する。Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅを試験するためにヘモフィルス試験培地を調製する；Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅの試験にはカチオン調節ミュラー・ヒントン＋５％溶解ウマ血液プレートを調製する；Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉおよびＢａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓの試験にはカチオン調節ミュラー・ヒントンプレートを調製する。Ｃａｎｄｉｄａの試験にはＲＰＭＩ １６４０を使用する。Ｓ．ａｕｒｅｕｓ Ｓｍｉｔｈに対するＭＩＣはカチオン調節ミュラー・ヒントンおよびカチオン調節ミュラー・ヒントン＋５０％ヒト血清中で定量し、化合物が血清中の何らかの成分によって失活するか否か（ＭＩＣの増加が指標）を判定する。充填したプレートをプラスチックバッグに包み（蒸発を最低限に抑制するため）、冷凍保存し、使用前に解凍する。
【００７０】
化合物の調製
化合物は、重量基準で調製する。１００％ＤＭＳＯ中に２−１０ｍｇ／ｍＬになるように化合物を調製し、次いで１：１に希釈したＤＭＳＯ／２×ＣＡＭＨＢ（最終濃度＝５０％ＤＭＳＯ／５０％ＣＡＭＨＢ）で１ｍｇ／ｍＬに希釈する。ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ Ｄｅｅｐ Ｗｅｌｌポリプロピレン９６ウェルプレート中、化合物を５０％ＤＭＳＯ／５０％ＣＡＭＨＢで１：１に系列希釈する（出発濃度１−５ｍｇ／ｍＬ）。
【００７１】
マイクロブロス希釈アッセイ
Ｆｉｎｎ全自動マルチチャンネルピペット（０．５−１０μＬ容）を使用し、６．４ＴＬの抗菌作用性溶液を充填マイクロタイタープレートのウェルに加える（第一ウェルの抗菌剤の濃度＝５１２−６４μｇ／ｍＬ；ＤＭＳＯの濃度＝３．２％）。各ウェルのＤＭＳＯの量を一定に保つため（化合物を溶解状態に維持するため、および、ＤＭＳＯによる非特異的殺菌の可能性を補正するため）にこのようにして抗菌剤を加える。最終列は３．２％ＤＭＳＯから成る増殖対照を含む。
【００７２】
各アッセイと共に対照を処理する。対照は、化合物と同様にして調製したペニシリンＧおよびクロラムフェニコールである。血清タンパク質結合アッセイに対する対照としてエルタペネムが含まれる。
【００７３】
プレート接種
ウェルあたり１．５ＴＬの接種物を配給する全自動接種デバイスであるＭＩＣ２０００システムを使用して（生理食塩水に希釈した）培養物をマイクロタイタープレートの全部のウェルに接種する。プレートを周囲空気中、３５℃でインキュベートする。接種しなかったプレートも無菌性チェックとしてインキュベートする。２２−２４時間のインキュベーション後の結果を記録する。プレートが無増殖になるまで読取りを行う。ＭＩＣは２２−２４時間のインキュベーション後に無増殖という結果を示した抗菌剤の最小量レベルであると定義する。
【００７４】
化合物Ｉａ−Ｉｉは、Ｓ．ａｕｒｅｕｓ、Ｅ．ｆａｅｃａｌｉｓ、Ｅ．ｆａｅｃｉｕｍ、Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｕｓおよびＳ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅの種々の菌株に抗菌活性を示す。化合物Ｉａ−Ｉｉはまた、メチシリン耐性Ｓ．ａｕｒｅｕｓ（ＭＲＳＡ）、バンコマイシン耐性Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ種（ＶＲＥ）、多剤耐性Ｅ．ｆａｅｃｉｕｍ、マクロライド耐性Ｓ．ａｕｒｅｕｓおよびＳ．ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ、リネゾリド耐性Ｓ．ａｕｒｅｕｓおよびＥ．ｆａｅｃｉｕｍのような多くの既知抗生物質に耐性の様々な種に抗菌活性を示す。これらの被験菌株に対する最小阻止濃度（ＭＩＣ）の値は０．０１−２００ｕｇ／ｍＬの範囲である。ＭＩＣはＮＣＣＬＳガイドラインによって得られる。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
式Ｉ：
【化１】
［式中、
Ｒは、−Ｃ（Ｏ）ＮＨ２、−Ｃ（Ｏ）ＮＨＣ＝ＣＨ２Ｃ（Ｏ）ＮＨ２を表し；
Ｒ１、Ｒ２およびＲ３は独立にＯＨを表すか；またはＲ１、Ｒ１およびＲ３が一緒に
【化２】
を表し；
Ｒ４は、ＯＨ
【化３】
を表し；
Ｒ５は水素またはＯＨを表す］
の化合物または医薬的に許容されるその塩、エステル、鏡像異性体、ジアステレオマーまたはそれらの混合物。
【請求項２】
【化４】
の化合物または医薬的に許容されるその塩、エステル、鏡像異性体、ジアステレオマーまたはそれらの混合物。
【請求項３】
ＡＴＣＣ受託番号２０２０９９のＮｏｃａｒｄｉａ種またはその天然または人工の突然変異体を栄養培地で培養し発酵ブロスから構造式Ｉの化合物を回収する段階を含む請求項１に記載の構造式Ｉの化合物の製造方法。
【請求項４】
発酵を約１０℃−約４０℃の温度で行う請求項３に記載の方法。
【請求項５】
発酵を約３１℃−３２℃の温度で行う請求項４に記載の方法。
【請求項６】
医薬的に許容される担体と有効量の請求項１に記載の構造式Ｉの化合物とを含む医薬組成物。
【請求項７】
治療を要する宿主の細菌感染症を治療する医薬を製造するための請求項１に記載の式Ｉの化合物の使用。
【請求項１】
式Ｉ：
【化１】
［式中、
Ｒは、−Ｃ（Ｏ）ＮＨ２、−Ｃ（Ｏ）ＮＨＣ＝ＣＨ２Ｃ（Ｏ）ＮＨ２を表し；
Ｒ１、Ｒ２およびＲ３は独立にＯＨを表すか；またはＲ１、Ｒ１およびＲ３が一緒に
【化２】
を表し；
Ｒ４は、ＯＨ
【化３】
を表し；
Ｒ５は水素またはＯＨを表す］
の化合物または医薬的に許容されるその塩、エステル、鏡像異性体、ジアステレオマーまたはそれらの混合物。
【請求項２】
【化４】
の化合物または医薬的に許容されるその塩、エステル、鏡像異性体、ジアステレオマーまたはそれらの混合物。
【請求項３】
ＡＴＣＣ受託番号２０２０９９のＮｏｃａｒｄｉａ種またはその天然または人工の突然変異体を栄養培地で培養し発酵ブロスから構造式Ｉの化合物を回収する段階を含む請求項１に記載の構造式Ｉの化合物の製造方法。
【請求項４】
発酵を約１０℃−約４０℃の温度で行う請求項３に記載の方法。
【請求項５】
発酵を約３１℃−３２℃の温度で行う請求項４に記載の方法。
【請求項６】
医薬的に許容される担体と有効量の請求項１に記載の構造式Ｉの化合物とを含む医薬組成物。
【請求項７】
治療を要する宿主の細菌感染症を治療する医薬を製造するための請求項１に記載の式Ｉの化合物の使用。
【公表番号】特表２００８−５１３４８６（Ｐ２００８−５１３４８６Ａ）
【公表日】平成２０年５月１日（２００８．５．１）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００７−５３２５４６（Ｐ２００７−５３２５４６）
【出願日】平成１７年９月１６日（２００５．９．１６）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００５／０３３３２６
【国際公開番号】ＷＯ２００６／０８６０１２
【国際公開日】平成１８年８月１７日（２００６．８．１７）
【出願人】（３９００２３５２６）メルク エンド カムパニー インコーポレーテッド (924)
【氏名又は名称原語表記】ＭＥＲＣＫ ＆ ＣＯＭＰＡＮＹ ＩＮＣＯＰＯＲＡＴＥＤ
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２０年５月１日（２００８．５．１）
【国際特許分類】
【出願日】平成１７年９月１６日（２００５．９．１６）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００５／０３３３２６
【国際公開番号】ＷＯ２００６／０８６０１２
【国際公開日】平成１８年８月１７日（２００６．８．１７）
【出願人】（３９００２３５２６）メルク エンド カムパニー インコーポレーテッド (924)
【氏名又は名称原語表記】ＭＥＲＣＫ ＆ ＣＯＭＰＡＮＹ ＩＮＣＯＰＯＲＡＴＥＤ
【Ｆターム（参考）】
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