抗癌剤で誘発される毒性の抑制剤及びこれを含有する抗癌剤組成物
本発明は、抗癌剤で誘発される肝毒性、腎毒性などの毒性が抑制できる抑制剤及びこれを含有する抗癌剤組成物を提供する。本発明は、抗癌剤、及び抗癌剤で誘発される毒性を抑制するための有効成分であるザンソリゾールを含有することを特徴とする抗癌剤組成物を提供する。ザンソリゾールは抗癌剤の投与により発生される肝毒性、腎毒性のような副作用を抑制するのに優れた効果を発揮する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は抗癌剤で誘発される肝毒性、腎毒性などの毒性が抑制できる抑制剤及びこれを含有する抗癌剤組成物に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
癌(ｃａｎｃｅｒ)は、世界的に年間約７００万人の死亡原因となる疾病であり、米国だけで１９９７年の１年間約１５０万人以上の新たな癌患者が生じたという報告もある。このような趨勢を勘案すると、癌はもうすぐ世界第１の死亡原因になると推定される。癌を治す方法としては、放射線療法、外科療法、遺伝子治療法など多くの方法が開発されたが、最も多く用いられている治療方法の一つが抗癌剤投与による化学療法である。
【０００３】
抗癌剤は、正常細胞と癌細胞間の薬に対する感受性差を用いて癌細胞に対して選択的に動かせる化学療法剤であるが、正常細胞に対する毒性も誘発するという問題点がある。
【０００４】
代表的な抗癌剤として百金系抗癌剤であるシスプラチン(ｃｉｓ-ｄｉａｍｍｉｎｅｄｉｃｈｌｏｒｏｐｌａｔｉｎｕｍ[II])が挙げられるが、この抗癌剤は卵巣癌、 膀胱癌、肺がん、頭頚部癌、睾丸癌などの治療のための化学療法剤として臨床であまねく使用されている(Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ Ｂ．，Ｃａｎｃｅｒ，５５:２３０３-２３１５，１９８５)。 シスプラチンは癌細胞でＤＮＡのｉｎｔｅｒ-ｉｎｔｒａｓｔｒａｎｄ ｃｒｏｓｓ-ｌｉｎｋｉｎｇ、ＤＮＡ付加体の形成を導いて抗癌効果を表すことと知られている。 しかし、シスプラチンは治療過程中薬物の制限された含量以上で聴覚喪失、神経毒性、腎臓毒性のような副作用が出て(Ｍｏｌｌｍａｎｅｔａｌ．，１９９８;ＳｃｒｅｎｃｉａｎｄＭｃＫｅａｇｅ，１９９９)、高濃度のシスプラチンの投与時には肝毒性も頻りに観察されると知られている(Ｃｅｒｏｓｉｍｏ Ｒ．Ｊ．，Ａｎｎ．Ｐｈａｒｍ．，２７:４３８-４４１，１９９３;Ｃａｖａｌｌｉ Ｆ．ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｔｒｅａｔ．Ｒｅｐ．，６２:２１２５-２１２６，１９７８;Ｐｏｌｌｅｒａ Ｃ．Ｆ．ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｏｎｃｏｌ．，５:３１８-３１９，１９８７)。
【０００５】
従って、抗癌剤が十分な抗癌効果を出すように安全に用いられるためには、毒性の誘発が最少化された抗癌剤または抗癌剤投与によって誘発される毒性が抑制できる抑制剤の開発が必要である。最近、シスプラチンとグルタチオンエステル(ｇｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ ｅｓｔｅｒ)を共に投与したとき、シスプラチンによる腎臓毒性が効果的に抑制されるという研究結果が報告され(Ｂａｂｕ Ｅ．ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１４４:７-１１，１９９５)、食餌を通じて抗酸化物質を摂取してシスプラチンによる毒性を抑える方法に対しても関心が集中している(Ａｐｐｅｎｒｏｔｈ Ｄ．ｅｔ ａｌ．，Ａｒｃｈ．Ｔｏｘｉｃｏｌ．，７１:６７７-６８３，１９９７;Ｂｏｇｉｎ Ｅ．ｅｔ ａｌ．，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｃｈｅｍ．Ｃｌｉｎ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，３２:８４３-８５１，１９９４;Ｒａｏ Ｍ．ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１２５:３８３-３９０，１９９９)。
【発明の詳細な説明】
【０００６】
従って、本発明が解決しようとする技術的課題は、上記問題点を解決して抗癌剤で誘発される肝毒性、腎毒性などの毒性が抑制できる抑制剤及びこれを含有する抗癌剤組成物を提供することにある。
【０００７】
上記技術的課題を達成するために、本発明はザンソリゾール(Ｘａｎｔｈｏｒｒｈｉｚｏｌ)を有効成分として含有することを特徴とする、抗癌剤で誘発される毒性の抑制剤を提供する。
【０００８】
本発明において、毒性を誘発する抗癌剤としては、シスプラチン(ｃｉｓ-ｄｉａｍｍｉｎｅｄｉｃｈｌｏｒｏｐｌａｔｉｎｕｍ[II])、カルボプラチン(ｃａｒｂｏｐｌａｔｉｎ)、 オキサリプラチン(ｏｘａｌｉｐｌａｔｉｎ)、ネダプラチン(ｎｅｄａｐｌａｔｉｎ)及びこれらの混合物から成る群より選択された白金系抗癌剤が挙げられる。
【０００９】
また、本発明は抗癌剤;及び抗癌剤で誘発される毒性を抑えるための有効成分であるザンソリゾール(Ｘａｎｔｈｏｒｒｈｉｚｏｌ);を含有することを特徴とする抗癌剤組成物を提供する。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
明細書内に統合されており、明細書の一部を構成する添付図面は、発明の現在の望ましい実施例を例示し、後述の望ましい実施例の詳細な説明と共に本発明の原理を説明する役割を果たすのである。
【００１１】
図１は、シスプラチンによって誘導された肝毒性においてザンソリゾールの影響を評価するためのＮＦ-κＢ(Ａ)及びＡＰ-１(Ｂ)のＤＮＡ-結合活性を示した図面である。ＮＦ-κＢ及びＡＰ-１のＤＮＡ-結合活性は、肝組織のＥＭＳＡ(ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｔｉｃ ｍｏｂｉｌｉｔｙ ｓｈｉｆｔ ａｓｓａｙ)を用いて評価した。 黒色矢印はＮＦ-κＢ、ＡＰ-１の転写因子-ＤＮＡ複合体を示し、白色矢印は結合されなかったオリゴヌクレオチドプロブを示す。バンドの密度はＲＦＬＰｓｃａｎソフトウェアで測定された。
【００１２】
図２は、ＣＯＸ-２及びｉＮＯＳのｍＲＮＡ発現レベルを示す。 ＮＦ-κＢ依存性遺伝子であるＣＯＸ-２及びｉＮＯＳ遺伝子ｍＲＮＡ発現レベルは、特異的プライマーセットを用いて半定量的ＲＴ-ＰＣＲ(ｓｅｍｉｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ ＲＴ-ＰＣＲ)で分析した。 β-ａｃｔｉｎ及びＧＡＰＤＨが対比物質として用いられた。
【００１３】
図３は、シスプラチンによってアップレギュレートされる２個の遺伝子であるＳ１００Ａ９及びＫｉｎ(Ａ)と、シスプラチンによってダウンレギュレートされる２個の遺伝子であるＣｌｐＸ及びＣＰ(Ｂ)のＤＤＲＴ-ＰＣＲ及び半定量的ＲＴ-ＰＣＲの結果を示す。各遺伝子のｍＲＮＡ発現レベルは特異的プライマーセットと対比物質に用いられたＧＡＰＤＨ遺伝子を用いて確認された。
【発明の実施のための最善の形態】
【００１４】
以下、本発明に係る抗癌剤で誘発される毒性の抑制剤及びこれを含有する抗癌剤組成物に対して詳しく説明する。
【００１５】
本発明の抗癌剤で誘発される毒性の抑制剤に有効成分として含有されるザンソリゾール(Ｘａｎｔｈｏｒｒｈｉｚｏｌ)とは、１９７０年ドイツのリンプラー(Ｒｉｍｐｌｅｒ)などによってクルクマザンソリザー(Ｃｕｒｃｕｍａ ｘａｎｔｈｏｒｒｈｉｚａ)から初めて分離されたセスキテルペン(ｓｅｓｑｕｉｔｅｒｐｅｎｅ)系の化合物である。
【００１６】
このようなザンソリゾールはネズミ(ｒａｔ)子宮の強直性収縮を濃度依存的に抑制し(Ｐｏｎｃｅ-Ｍｏｎｔｅｒ Ｈ．，ｅｔ ａｌ．，Ｐｈｙｔｏｔｈｅｒ．Ｒｅｓ．，１３:２０２-２０５，１９９９)、ストレプトコカスミュータンス(Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｍｕｔａｎｓ)のような口腔病菌に対して抗菌活性を示すと報告されている(Ｈｗａｎｇ Ｊ．Ｋ．，Ｆｉｔｏｔｅｒａｐｉａ，７１:３２１-３２３，２０００;Ｈｗａｎｇ Ｊ．Ｋ．，Ｐｌａｎｔａ Ｍｅｄ．，６６:１９６-１９７，２０００)。この他にもザンソリゾールは癌の予防と治療に効果的に作用すると知られている。
【００１７】
このように、ザンソリゾールは、口腔病菌に対する抗菌剤、抗癌剤などの効果があると知られているが、本発明者らは抗癌剤の投与によって発生される肝毒性、腎毒性のような副作用が抑制できる物質を研究した結果、ザンソリゾールが抗癌剤で誘発される毒性に対する抑制剤として強力な効果を奏するということを明らかにしたのである。
【００１８】
ザンソリゾールは、化学式１の構造を有するが、インドネシアの伝統薬剤のショウガ科植物であるクルクマザンソリザー(Ｃｕｒｃｕｍａ ｘａｎｔｈｏｒｒｈｉｚａ Ｒｏｘｂ．)から抽出することができる。抽出方法としては、大韓民国公開特許公報第２０００−７３２９５号及び国際公開公報ＷＯ８８/０５３０４号に開示されたように、有機溶媒抽出法、超臨界流体抽出法、マイクロウェーブ抽出法及び超音波抽出法などが使用され得る。
【００１９】
【化１】
【００２０】
このようなザンソリゾールは抗癌剤の投与によって発生される肝毒性、腎毒性のような副作用を抑制するのに優れた効果を示す。副作用が抑制される抗癌剤としては白金系抗癌剤、シクロホスファミド(ｃｙｃｌｏｐｈｏｓｐｈａｍｉｄｅ)、ブレオマイシン(ｂｌｅｏｍｙｃｉｎ)、 ドキソルビシン(ｄｏｘｏｒｕｂｉｃｉｎ)などが挙げられるが、特にシスプラチン(ｃｉｓ-ｄｉａｍｍｉｎｅｄｉｃｈｌｏｒｏｐｌａｔｉｎｕｍ[II])、カルボプラチン(ｃａｒｂｏｐｌａｔｉｎ)、オキサリプラチン(ｏｘａｌｉｐｌａｔｉｎ)、ネダプラチン(ｎｅｄａｐｌａｔｉｎ)などの白金系抗癌剤の肝毒性と腎毒性とを抑制するのに優れる。 ザンソリゾールの抗癌剤による副作用の抑制効果は抗癌剤によって生成された活性酸素種の正常細胞に働くことを抑えるためであると考えられる。
【００２１】
代表的な白金系抗癌剤であるシスプラチンから誘発された肝毒性及び腎毒性に対するザンソリゾールの抑制効果の検証方法は次の通りである。
【００２２】
シスプラチンをマウスの腹腔に注射した後、所定時間後に体重を測定し、毒性が誘発されることが分かった。エーテルでマウスを麻醉した後、心臓から血液を分取して肝毒性と腎毒性の誘発と係わった生化学的指標(ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ ｍａｒｋｅｒ)を調べ、腎臓と脾臓を分離して各臓器の重さもまた測定して比較した。
【００２３】
血清中に各種酵素の活性を測定することは多くの疾病に対する貴重な診断上の情報を提供する。 アミノ基伝達酵素は、肝臓で非常に活性が高く、血中で極微量に検出されるが、肝毒性が誘発された場合はレベルが増加する。シスプラチン処理によって変性された肝臓は、結果的に損傷された肝細胞からＧＰＴ(Ｇｌｕｔａｍａｔｅ-Ｐｙｒｕｖａｔｅ Ｔｒａｎｓａｍｉｎａｓｅ)とＧＯＴ(Ｇｌｕｔａｍａｔｅ-Ｏｘａｌｏａｃｅｔａｔｅ Ｔｒａｎｓａｍｉｎａｓｅ)とを血中に漏出する。シスプラチンを腹腔注射する前、口腔にザンソリゾールを投与した群は、シスプラチンのみを投与した群に比べて血中のＧＰＴ濃度及びＧＯＴ濃度が有意義に減少した。
【００２４】
また、シスプラチン投与時現される副作用である腎毒性でのザンソリゾールの毒性抑制効果を確認するために腎臓比重の変化を測定した。シスプラチンを高濃度で投与した群ではシスプラチンを投与しなかった対照群より腎臓の比重が増加するが、 ザンソリゾールをシスプラチン投与前、所定期間の間、口腔投与した場合には、腎臓の比重がほとんど増加しないことを確認した。
【００２５】
また、シスプラチンにより腎臓の毒性が誘発されれば、活性酸素(ｒｅａｃｔｉｖｅ ｏｘｙｇｅｎ ｓｐｅｃｉｅｓ)が増加することになり、腎臓の濾過と排泄機能の効率が低下されながら体重の変化が生じ、血中に濾過されなかった尿素窒素(ｕｒｅａｎｉｔｒｏｇｅｎ)とクレアチニン(ｃｒｅａｔｉｎｉｎｅ)とが増加するようになる。シスプラチンを投与する前に、ザンソリゾールを所定期間、投与した場合にはシスプラチンのみを投与した群より血中尿素窒素の含量が有意義に減少したことを確認した。
【００２６】
なお、シスプラチンのような白金系抗癌剤の投与によりＮＦ-κＢ(ｎｕｃｌｅａｒｆａｃｔｏｒ-ｋａｐｐａ Ｂ)とＡＰ-１(ａｃｔｉｖａｔｏｒ ｐｒｏｔｅｉｎ-1)のような転写因子が活性化或いは抑制され、このような転写因子の活性化、特にＮＦ-κＢの活性化はＣＯＸ-２(ｃｙｃｌｏｏｘｙｇｅｎａｓｅ-２)及びｉＮＯＳ(ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ ｎｉｔｒｉｃ ｏｘｉｄｅ ｓｙｎｔｈａｓｅ)のようなＮＦ-κＢ-依存性遺伝子の発現を活性化すると知られている。このようなＣＯＸ-２及びｉＮＯＳは、前-炎症(ｐｒｏ-ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ)遺伝子であって、炎症及び毒性と係わったものであるとよく知られている(Ｎａｎｊｉ，Ａ．Ａ，ｅｔ ａｌ．，２００３. Ａｍ．Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．:Ｇａｓｔｒｏｎｉｎｔｅｓｔ．Ｌｉｖｅｒ Ｐｈｙｓｉｏｌ．２８４，Ｇ３２１-２７;Ｒｅｉｌｌｙ，Ｔ．Ｐ．，ｅｔ ａｌ．，Ｃｈｅｍ．Ｒｅｓ．Ｔｏｘｉｃｏｌ．１４，１６２０-１６２８;及びＧａｒｄｎｅｒ，Ｃ．Ｒ．，ｅｔ ａｌ．，Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ２７，７４８-７５４参照)。
【００２７】
本発明の実験において、比較例として用いられたクルクミンは、特に、ＮＦ-κＢの活性を抑えて生理的な機能をするものであると知られている(Ｈａｎ，Ｓ．Ｓ．，ｅｔ ａｌ．，２００２. Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３５，３３７-３４２及びＮａｎｊｉ，Ａ．Ａ．，ｅｔ ａｌ．，２００３. Ａｍ．Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．:Ｇａｓｔｒｏｎｉｎｔｅｓｔ．Ｌｉｖｅｒ Ｐｈｙｓｉｏｌ．２８４，Ｇ３２１-２７参照)。
【００２８】
本発明者らは、シスプラチンにより転写因子であるＮＦ-κＢが活性化されることを確認した。また、シスプラチンによりＣＯＸ-２及びｉＮＯＳ遺伝子のｍＲＮＡ発現が増加することを確認した。本発明者らは、ザンソリゾール及びクルクミンをシスプラチン投与前に予め投与することで、このような遺伝子のｍＲＮＡ発現増加を抑制することができたが、ザンソリゾールはシスプラチンによって引起されたＣＯＸ-２及びｉＮＯＳ遺伝子のｍＲＮＡ発現すべてを抑制することができた一方、クルクミンは、単にＣＯＸ-２遺伝子のｍＲＮＡ発現のみを抑制することができたのである。これは、ザンソリゾールがシスプラチンによって引き起こった肝毒性の治療に効果があるということを暗示するのである。
【００２９】
また、本発明者らはシスプラチン-誘導肝毒性に対するザンソリゾールの予防的効果と関連した、差別的に発現される遺伝子を確認するために、ＤＤＲＴ-ＰＣＲ(ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ ｄｉｓｐｌａｙ ｒｅｖｅｒｓｅ ｔｒａｎｓｃｉｐｔｉｏｎ-ＰＣＲ)を施した。 シスプラチンによってアップレギュレートされる７個の遺伝子及びダウンレギュレートされる５個の遺伝子が確認された。
【００３０】
このような遺伝子のうちアップレギュレートされるＳ１００カルシウム結合蛋白質Ａ９(Ｓ１００Ａ９)ｍＲＮＡは、シスプラチンがＳ１００Ａ９の発現にネガチブ作用する転写因子であるＡＰ-１のＤＮＡ結合活性を減少させるためであると考えられる(Ｇｅｂｈａｒｄｔ，Ｃ．，ｅｔ ａｌ．，２００２. Ｏｎｃｏｇｅｎｅ ２１，４２６６-４２７６参照)。 このようなＳ１００Ａ９の発現は、細胞骨格、細胞形態、信号伝達(Ｋｅｒｋｈｏｆｆ，Ｃ．，ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７４，３２６７２-３２６７９参照)及び細胞内カルシウム調節(Ｓｃｈａｆｅｒ，Ｂ．Ｗ．，ｅｔ ａｌ．，Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｓｃｉ．２１，１３４-１４０参照)に影響を及ぼすと知られている。Ｓ１００Ａ９遺伝子の発現異常は、結局、カルシウムイオン恒常性の破壊を引き起こす。 ザンソリゾールの投与はクルクミンの投与時とは異なり、シスプラチンによって引き起こるＡＰ-１の抑制程度を減少させ、これがＳ１００Ａ９ｍＲＮＡの発現を減少させてシスプラチンによって引き起こった肝毒性に効果があると考えられる。
【００３１】
Ｒｅｃ-Ａ蛋白質の抗原決定子(Ｋｉｎ)は核蛋白質であって、バクテリアＲｅｃＡ蛋白質と関連した交差免疫反応を示し、カーブ型ＤＮＡに効率的に結合する(Ｔｉｓｓｉｅｒ，Ａ．，ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｉｍｉｅ ７７，８５４-８６０参照)。このような遺伝的相互作用は、ＤＮＡ回復と真核細胞での変則的組換えを暗示し得る。シスプラチンによるＫｉｎ ｍＲＮＡの増加発現は、Ｋｉｎ蛋白質のレベルを増加させる(Ａｎｇｕｌｏ，Ｊ．Ｆ．，ｅｔ ａｌ．，Ｍｕｔａｔ．Ｒｅｓ．２１７，１２３-１３４参照)。 シスプラチンが投与されたマウスにおいてＫｉｎ ｍＲＮＡの増加は、肝でシスプラチンによって誘導されたＤＮＡ損傷を取り戻す活性を反映し得る。従って、本発明者らはｉＮＯＳの発現に対するザンソリゾールの影響と同様に、シスプラチンによって誘導されたアップレギュレートされたＫｉｎ ｍＲＮＡの発現がザンソリゾールの投与によりドラマチックに減ることを確認できたが、これは、ザンソリゾールがシスプラチンによる毒性に影響を及ぼすということを意味する。
【００３２】
シスプラチンの投与はまた、ミトコンドリア内の変化を引き起こす。シスプラチンはマウス肝の呼吸チェーンの複合体Ｉ及びIIの活性を抑制すると知られている(Ｒｏｓｅｎ，Ｍ．，ｅｔ ａｌ．，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｅｘｐ．Ｐａｔｈｏｌ． ７３，６１-７４参照)。 なお、シスプラチンは、ミトコンドリアの全体機能に影響を及ぼすミトコンドリア膜ポテンシャルの損失を引き起こす(Ｋｒｕｉｄｅｒｉｎｇ，Ｍ．，ｅｔ ａｌ．，Ｅｘｐ．Ｎｅｐｈｒｏｌ．２，３３４-３４４参照)。
【００３３】
ミトコンドリアの機能異常は、非正常的に発現されたマウス遺伝子であるＣｌｐＸ(ｃａｓｅｉｎｏｌｙｔｉｃ ｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ Ｘ)によって説明することもできる。ＣｌｐＸ蛋白質は、内的ＡＴＰａｓｅ活性を示し、ミトコンドリア蛋白質の恒常性に重要な役割を果たす組織-特異哺乳動物ミトコンドリアシャペロン(ｃｈａｐｅｒｏｎｅ)として作用する(Ｓａｎｔａｇａｔａ，Ｓ．，ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ． ２７４，１６３１１-１６３１９参照)。 それの発現減少はミトコンドリアの不安定を引き起こすが、ザンソリゾールを予め投与することでＣｌｐＸ ｍＲＮＡの発現をシスプラチン投与前の程度に維持することができたのである。これは、ザンソリゾールがシスプラチンの投与による毒性を弱化することができたということを意味する。
【００３４】
Ｃｅｒｕｌｏｐｌａｓｍｉｎ(ＣＰ)は、脊椎動物の血漿で見つかる総銅の９５％以上を含有する血清α２-グリコ蛋白質である(Ｔａｋａｈａｓｈｉ，Ｎ．，ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８１，３９０-３９４参照)。ＣＰは、血漿銅と強固に結合して血漿内で予防的抗酸化剤として作用し、鉄-依存性脂質過酸化及びヒドロキシルラジカルの形成を抑制する。興味なのは、シスプラチンの投与はＣＰを含めて、様々な血漿抗酸化剤のレベルを減少させる。これは、一般的に用いられる抗癌剤による酸化的毒性に対抗できる防御的機転が崩れることを意味する(Ｗｅｉｊｌ，Ｎ．Ｉ．，ｅｔ ａｌ．，Ａｎｎ．Ｏｎｃｏｌ． ９、１３３１-１３３７参照)。 本発明者らは、ザンソリゾールを予め投与することで、ＣＰのｍＲＮＡ発現を回復させることを確認し、これは、ザンソリゾールがシスプラチンの毒性抑制剤として用いられることを意味する。比較対象で投与されたクルクミンにおいては上記のような効果が示されなかった。
【００３５】
上記のような結果から、ザンソリゾールは抗癌剤の投与によって発生される肝毒性、腎毒性のような副作用を抑制するのに優れた効果を奏することが分かり、クルクミンに比べて毒性抑制効果が非常に優れることが確認できたのである。
【００３６】
ザンソリゾールは、一般的な経路を通じて投与される。 即ち、局部、経口、非経口、鼻内、静脈内、筋肉内、皮下、眼内、硬皮などに投与でき、溶液、懸濁液、 錠製、丸薬、カプセル、徐放型製剤に製形化することができる。ザンソリゾールの投与量は、抗癌剤の種類及び投与量、年齢、性別などによって当業界の技術を考慮して決定する。 ザンソリゾールは、抗癌剤投与前、または、後に単独で投与でき、抗癌剤と混合して抗癌剤組成物として共に投与することもできる。
【００３７】
本発明のザンソリゾールは患者の状態、白金系抗癌剤の投与量、抗癌剤の投与期間などによってシスプラチン総投与重量対比約０．０１倍乃至１０倍重量が投与されることが望ましく、約０．１乃至５倍重量が投与されることがさらに望ましい。
【００３８】
本発明の抗癌剤;及び抗癌剤で誘発される毒性を抑制するための有効成分であるザンソリゾール;を含有することを特徴とする抗癌剤組成物において、上記ザンソリゾールの含量は抗癌剤重量対比約０．０１乃至１０倍重量であるのが望ましく、抗癌剤重量対比約０．１乃至５倍重量であることがさらに望ましい。
【００３９】
ザンソリゾールを含有する本発明の抗癌剤で誘発される毒性の抑制剤及びこれを含有する抗癌剤組成物は、薬学的に許容可能な添加剤あるいは希釈剤をさらに含むことができる。添加剤または希釈剤としては、製薬分野で通常用いられる賦形剤、結合剤、滑澤剤、湿潤剤、懸濁化剤、溶媒、分散剤、 放出調節剤、着香剤、着色剤、コーテイング剤などが用いられる。
【００４０】
以下、本発明を具体的に説明するために実施例を挙げて、詳しく説明することにする。 しかし、本発明による実施例は様々な異なる形態に変形でき、本発明の範囲が以下に詳述する実施例に限定されることと解釈されてはいけない。 本発明の実施例は、当業界で平均的な知識を有する者に本発明をより完全に説明するために提供されるのである。
【００４１】
下記実施例の実験結果は、平均値±ＳＥで示した。統計的分析はＳｔｕｄｅｎｔｔ-ｔｅｓｔを用いた。 Ｐ ｖａｌｕｅが０．０５以下であれば、有意性があると評価した。
実験例１:動物モデルの設計
【００４２】
シスプラチンを用いてマウス(ｍｏｕｓｅ)において肝毒性と腎毒性を誘発する場合、ザンソリゾールとクルクミン(ｃｕｒｃｕｍｉｎ)の毒性抑制効果を調べた。
【００４３】
実験群当り１０匹のＩＣＲマウスマウス(５週齢、雄)を用いた。マウスにトウモロコシ油に溶かしたザンソリゾール(１００ｍｇ/ｋｇ、２００ｍｇ/ｋｇ)とクルクミン(２００ｍｇ/ｋｇ)を４日間、口腔投与し、陰性対照群にはトウモロコシ油を口腔投与した。ザンソリゾールとクルクミンの最後の投与の後、３時間後に緩衝溶液(ＰＢＳ ｂｕｆｆｅｒ)に溶かしたシスプラチンを４５ｍｇ/ｋｇの濃度で腹腔注射し、陰性対照群には緩衝溶液を注射した。１６時間後に体重を測定してエーテルでマウスを麻醉した後、血液と肝のサンプルを分取した。腎臓と脾臓を分離して各臓器の重さを測定した。 下記表１に実施例及び比較例による抗癌剤及び毒性抑制剤の投与方法及び容量を示した。
【００４４】
【表１】
実験例２:血清生化学的指標の測定
【００４５】
心臓から分取した血液は、低温で２時間放置した後、３０００ｒｐｍで１０分間遠心分離して血清を得て蛋白質分析のために低温で保管した。採取した血清を用いてＧＰＴ(Ｇｌｕｔａｍａｔｅ-Ｐｙｒｕｖａｔｅ Ｔｒａｎｓａｍｉｎａｓｅ)、ＧＯＴ(Ｇｌｕｔａｍａｔｅ-Ｏｘａｌｏａｃｅｔａｔｅ Ｔｒａｎｓａｍｉｎａｓｅ)、 血中尿素窒素(Ｂｌｏｏｄ Ｕｒｅａ Ｎｉｔｒｏｇｅｎ)、そしてクレアチニン(ｃｒｅａｔｉｎｉｎｅ)含量を定量し、その結果を表２に示した。
ＧＰＴ(Ｇｌｕｔａｍａｔｅ-Ｐｙｒｕｖａｔｅ Ｔｒａｎｓａｍｉｎａｓｅ)、ＧＯＴ(Ｇｌｕｔａｍａｔｅ-Ｏｘａｌｏａｃｅｔａｔｅ Ｔｒａｎｓａｍｉｎａｓｅ)の定量方法
【００４６】
ＧＰＴとＧＯＴの含量はＲｅｉｔｍａｎとＦｒａｎｋｅｌ(１９５７)の方法によって測定した。 この方法は、ａｌａｎｉｎｅ+α-ｋｅｔｏｇｌｕｔａｒｉｃ ａｃｉｄ→ｐｙｒｕｖｉｃ ａｃｉｄ+ｇｌｕｔａｍｉｃ ａｃｉｄ反応過程で、ＧＰＴ酵素によって形成されるｐｙｒｕｖｉｃ ａｃｉｄを２，４-ｄｉｎｉｔｒｏｐｈｅｎｙｌｈｙｄｒａｚｉｎｅと反応させて表される色の程度をＧＰＴとＧＯＴ酵素の活性程度に示したものであって、５０５ｎｍの波長でその吸光度を測定することである。ＧＰＴとＧＯＴの測定用Ｓｉｇｍａ ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．(Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，Ｕ．Ｓ．Ａ．)の製品を用いて定量した。溶血された血清内には正常血清より高いＧＰＴとＧＯＴ酵素があるので溶血された血清を用いないように注意し、 特に、ＧＰＴとＧＯＴ酵素は低温で５日後からは酵素の活性が低下されるのでＧＰＴとＧＯＴ酵素の測定に用いた血清は４℃に保管しながら５日以内に実験に用いることにした。
【００４７】
試験管に１ｍｌのＡｌａｎｉｎｅ-α-ＫＧ Ｓｕｂｓｔｒａｔｅを入れて３７℃の水槽に２-３分間加温させる。各試験管に０．２ｍｌの被検血清を入れて、３７℃水槽で３０分間反応させた後、発色液(２４-Ｄｉｎｉｔｒｏｐｈｅｎｙｌｈｙｄｒａｚｉｎｅ)１ｍｌを入れて、室温で２０分間放置させた。各試験管に０．４水酸化ナトリウム(ＮａＯＨ)１０ｍｌを入れて、充分に混合した後、蒸留水を対照して各々ＧＰＴの吸光度を読み出した。ＧＯＴの測定の場合には、１ｍｌのＡｓｐａｒａｔａｔｅ-α-ＫＧ Ｓｕｂｓｔｒａｔｅを３７℃の水槽に２-３分間加温させた後、各試験管に０．２ｍｌの被検血清を入れて３７℃水槽で６０分間反応させた後ＧＯＴの吸光度を測定した。
尿素窒素(Ｕｒｅａ Ｎｉｔｒｏｇｅｎ)の定量方法
【００４８】
ウレアーニトロゲンの含量はＦａｗｃｅｔｔら(１９６０)の方法で定量した。 Ｂｌｏｏｄ Ｕｒｅａ Ｎｉｔｒｏｇｅｎ測定用のキットを用いて尿素(ｕｒｅａ)の加水分解(ｈｙｄｒｏｌｙｚｅ)時生成されるアンモニア(ＮＨ3)を色反応を通じて５７０ｎｍでその吸光度を測定した。
【００４９】
試験管にＵｒｅａｓｅ溶液０．５ｍｌを入れて被検血清１０ｍｌをよく混ぜた後３７℃水槽で５-１０分間反応させた。各試験管に１ｍｌのＰｈｅｎｏｌ Ｎｉｔｒｏｐｒｕｓｓｉｄｅ溶液と１ｍｌＡｌａｋｌｉｎｅ Ｈｙｐｏｃｈｌｏｒｉｔｅ溶液を混合し、５ｍｌ蒸留水と反応させて蒸留水に対照して吸光度値を読み出した。尿素窒素(Ｕｒｅａ Ｎｉｔｒｏｇｅｎ)の定量は、Ｓｉｇｍａ ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．(Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，Ｕ．Ｓ．Ａ．)の製品を用いて標準検量線に従って定量した。
クレアチニン(Ｃｒｅａｔｉｎｉｎｅ)の定量方法
【００５０】
クレアチニンの含量は、クレアチニン代謝物にａｌｋａｌｉｎｅ ｐｉｃｒａｔｅの処理時表される黄色の色反応を５００ｎｍでその吸光度を測定するＪａｆｆｅら(１８８６)の方法で測定し、標準検量線に従ってクレアチニンを定量した。
【００５１】
Ａｌｋａｌｉｎｅ ｐｉｃｒａｔｅ溶液３ｍｌと被検血清０．３ｍｌをよく混合して３７℃水槽で２０分間反応させた後、蒸留水を入れた盲検を対照にして検体の吸光度(Ａ１)を読み出した。各試験管にエシード(Ｍｉｘｔｕｒｅ ｏｆ ｓｕｌｆｕｒｉｃ ａｃｉｄ ａｎｄ ａｃｅｔｉｃ ａｃｉｄ)溶液０．１ｍｌを入れて３７℃水槽で５分間放置した後、蒸留水を入れた盲検を対照にして検体の吸光度(Ａ２)を読み出した。 検体の吸光度はＡ１吸光度でＡ２の吸光度を引いた値を用いて標準検量線に従ってクレアチニンの含量を定量した。クレアチニンの定量は、Ｓｉｇｍａ ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．(Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，Ｕ．Ｓ．Ａ．)の製品を用いた。
【００５２】
【表２】
【００５３】
上記表２において、Ｋ．Ｗ/Ｂ．Ｗはｋｉｄｎｅｙ ｗｅｉｇｈｔ/ｂｏｄｙ ｗｅｉｇｈｔであり、Ｓ．Ｗ/Ｂ．Ｗはｓｐｌｅｅｎ ｗｅｉｇｈｔ/ｂｏｄｙ ｗｅｉｇｈｔであり、ＢＵＮはＢｌｏｏｄ Ｕｒｅａ ｎｉｔｒｏｇｅｎを示す。
【００５４】
表２に示された結果を分析すると次の通りである。
シスプラチンを腹腔注射する前の４日間、口腔にザンソリゾールを２００ｍｇ/ｋｇの濃度で投与した群ではシスプラチンのみを投与した群に比べて血中のＧＰＴ濃度が有意義に減少し、クルクミン(２００ｍｇ/ｋｇ)を投与した群より優れた効果を見せた。また、シスプラチンを高濃度で投与した群ではシスプラチンを投与しなかった対照群より腎臓の比重が増加したが、クルクミンとザンソリゾールをシスプラチン投与前４日間、口腔投与した場合、腎臓の比重が対照群と同じ水準に減ることを確認し、ザンソリゾールがクルクミンよりさらに効果が優れると観察された。
【００５５】
なお、シスプラチンを投与する前に、ザンソリゾール(２００ｍｇ/ｋｇ)を４日間投与した場合、シスプラチンのみを投与した群より血中尿素窒素の含量が有意義に減少した。シスプラチンを投与して腎臓毒性を誘導した群ではクレアチニンの含量が大きく増加した反面、ザンソリゾール(２００ｍｇ/ｋｇ)を前投与した群では、シスプラチンのみを投与した群より血中クレアチニンが顕著に減ることを確認した。
実験例３:ＮＦ-κＢ及びＡＰ-１に対したザンソリゾールの影響評価
ＮＦ-κＢ及びＡＰ-1に対する影響を評価するためにＥＭＳＡ(ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｔｉｃ ｍｏｂｉｌｉｔｙ ｓｈｉｆｔ ａｓｓａｙ)を施した。上記実験例１の動物モデル設計の実施例１及び２と比較例１及び２とから得られた肝組織を液体窒素下で粉末化し、５００μlの冷却貯蔵緩衝液(１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ(ｐＨ７.８)、１０ｍＭ ＫＣｌ、１.５ｍＭ ＭｇＣｌ2、０.５ｍＭ ＤＴＴ、０.２ｍＭ ＰＭＳＦ)に均質化した。 この均質化したものに１２５μlの１０％ＮＰ-４０溶液を加えて、その混合液を１２、０００×ｇで１分間遠心分離した。生成されたペレットを１００μlの上記貯蔵緩衝液と１２.５μlのＮＰ-４０溶液で洗浄した後、遠心分離して５０μlの４２０ｍＭ ＮａＣｌ、 １.５ｍＭ ＭｇＣｌ2、０.２ｍＭ ＥＤＴＡ、０.５ｍＭ ＤＴＴ、０.２ｍＭ ＰＭＳＦ、及び２０％グリセロールを含めた２０ｍＭ冷却ＨＥＰＥＳ緩衝液(ｐＨ７.８)で再懸濁し、 ４℃、１２、０００×ｇで５分間遠心分離した。核蛋白質を含む上澄液が集められ、蛋白質濃度の測定後−７０℃で保管された。ＮＦ-κＢオリゴヌクレオチドプロブ(５'-ＡＧＴ ＴＧＡ ＧＧＧ ＧＡＣ ＴＴＴ ＣＣＣ ＡＧＧ Ｃ-３';Ｐｒｏｍｅｇａ、ウィスコンシン)またはＡＰ-１(ｃ-Ｊｕｎ)オリゴヌクレオチドプロブ(５'-ＣＧＣ ＴＴＧ ＡＴＧ ＡＧＴ ＣＡＧ ＣＣＧ ＧＡＡ-３Ｖ;Ｐｒｏｍｅｇａ)を[γ-32Ｐ]ＡＴＰ及びＴ４ポリオヌクレオチドキナーゼを用いて標識し、Ｎｉｃｈコラム(パーマシーア、Ｕｐｐｓａｌａ、スウェーデン)を用いて精製した。 結合反応は５μlの培養緩衝液(１０ｍＭ Ｔｒｉｓ-ＨＣｌ(ｐＨ７.５)、１００ｍＭ ＮａＣｌ，１ｍＭ ＤＴＴ，１ｍＭ ＥＤＴＡ，４％(ｖ/ｖ)グリセロール，及び０.１ｍｇ/ｍｌの超音波処理された鮭精子ＤＮＡ)、１０μgの核抽出物、及び１００、０００ｃｐｍの標識されたプロブを含む２５μｌ混合液内で遂行した。室温で５０分間培養した後、３μｌのローディング緩衝液(２５０ｍＭ Ｔｒｉｓ-ＨＣｌ(ｐＨ７.５))、０.２％ブロモフェノールブルー、４０％グリセロール)と混合されたサンプルを６％非変性ポリアクリルアミドゲルで１５０Ｖで２時間電気泳動した。ゲルを乾燥した後、Ｘ-レイフィルムに露出させた。その結果を図１に示した。
【００５６】
図１に示されるように、シスプラチンの投与はマウスの肝においてＮＦ-κＢの結合活性を増加させ、逆にＡＰ-１の結合活性は減少させた。 しかし、ザンソリゾールまたはクルクミンを予め投与することでシスプラチン-誘導ＮＦ-κＢの結合活性を抑制することができた。 また、同量投与した場合に、クルクミンよりザンソリゾールの効果が格段に高いことが分かる。シスプラチンによるＡＰ-１の抑制された結合活性は、ザンソリゾールを予め投与して５０％程度回復したが、クルクミンを予め投与することによる影響はなかった。
実験例４:遺伝子単位でザンソリゾール投与の影響評価
総ＲＮＡの分離及びＤＮａｓｅＩ処理
【００５７】
上記実験例１の動物モデル設計の実施例１及び２と比較例１及び２とから得られた肝組織を液体窒素下で粉末化し、ＴＲＩｚｏｌTM試薬(Ｌｉｆｅ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，オーストリア)に均質化した。 均質化されたサンプルを室温で５分間培養して核蛋白質複合体が完全に分離されれるようにした。０.２ボリュームのクロロホルムを添加した後に、サンプルを１５秒間強く振って、２〜３分間培養した。その後、４℃で１５分間１２、０００×ｇで遠心分離した。上部水相に存在する総ＲＮＡを同量のイソプロパノールと混合して沈澱させた。その混合液を４℃で１０分間培養した後、４℃で１０分間１２、０００×ｇで遠心分離した。総ＲＮＡペレットを７５％エタノールで洗浄し、乾燥した後、ＲＮａｓｅがない水に溶解させた。染色体ＤＮＡの汚染を防ぐために、総ＤＮＡサンプルは１０ユニットのＤＮａｓｅＩ（ＧｅｎＨｕｎｔｅｒ Ｃｏｒｐ．，ナッシュビル、米国）と共に３７℃で３０分間培養した。その後、ＤＮＡがないＲＮＡをＴＲＩｚｏｌ試薬を用いて分離した。総ＲＮＡ及びＤＮａｓｅ-I処理されたＲＮＡの濃度と純度とは２６０及び２８０ｎｍで吸光度を持って計算された。
ＤＤＲＴ-ＰＣＲの遂行
【００５８】
ＲＮＡｉｍａｇｅキット(ＧｅｎＨｕｎｔｅｒ Ｃｏｒｐ．)を用いてＤＤＲＴ-ＰＣＲ(ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ ｄｉｓｐｌａｙ ｒｅｖｅｒｓｅ ｔｒａｎｓｃｉｐｔｉｏｎ-ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ｃｈａｉｎ ｒｅａｃｔｉｏｎ)を施した。 上記ＤＮａｓｅＩ-処理された総ＲＮＡプール(各グループ当り２００ｎｇ)を逆転写緩衝液(２５ｍＭ Ｔｒｉｓ-ＨＣｌ，ｐＨ８.３，３７．６ｍＭ ＫＣｌ，１.５ｍｇ ＭｇＣｌ2，及び５ｍＭ ＤＴＴ)で５ユニット/μｌのＭＭＬＶ-逆転写酵素、２０μＭのｄＮＴＰ混合、及び０.２μＭのグアノシン-固定されたオリゴ(ｄＴ)プライマー(ＨＴ11-Ｇ)を用いて逆転写した。そのＲＴ混合液を１０倍希釈してＰＣＲに使用した。継続的なＰＣＲ(２０μｌ)は２μＭのｄＮＴＰ，０.２μＭのＨＴ11-Ｇ，０.２μＭの任意のプライマー(Ｈ-ＡＰ１からＨ-ＡＰ１０まで)、０.２μｌのα-[33P]ｄＡＴＰ(２０００Ｃｉ/ｍｍｏｌ)、及び０.０５ユニット/μｌのＡｍｐｌｉＴａｑ ＤＮＡポリマラーゼ(Ｐｅｒｋｉｎ_Ｅｌｍｅｒ)を含むＰＣＲ緩衝液(１０ｍＭ Ｔｒｉｓ-ＨＣｌ，ｐＨ８.４，５０ｍＭＫＣｌ，１.５ｍＭ ＭｇＣｌ２及び０.００１％ゼラチン)で施した。 熱サイクルラー(ＧｅｎｅＡｍｐ ＰＣＲ Ｓｙｓｔｅｍ ９７００、Ｐｅｒｋｉｎ-Ｅｌｍｅｒ)は次のようにプログラムされた:９４℃で３０秒、４０℃で２分、 及び７２℃から３０秒、４０回反復。７２℃で５分間維持して最後の拡張を中止させた。33Ｐ-標識されたＰＣＲ産物を６％変性ポリアクリルアミドゲルで３.５時間の間、６０Ｗの一定の力を用いて分離した。所定片の３Ｍ紙の上で、８０℃１時間の間、真空状態で乾燥した。 乾燥されたゲルに向けられたオートラジオグラフィで露出し現像された。
クローニング及びＤＮＡシーケンシング
【００５９】
関連のあるｃＤＮＡ断片を乾燥されたゲルから切り出した後、沸いた水を用いて溶出させた。その後、同一のプライマーを用いて、ＤＤ-ＰＣＲと同一のＰＣＲ条件でＰＣＲで再増幅した。再増幅されたＰＣＲ産物は、ＰＣＲ-ＴＲＡＰクローニングシステム(ＧｅｎＨｕｎｔｅｒ)を用いてＰＣＲ-ＴＲＡＰベクターにクローニングした。ＤＮＡ挿入を含むプラスミドに対するＤＮＡシーケンシングは、Ｔａｋａｒａ Ｋｏｒｅａ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ Ｉｎｃ．(水原、韓国)に委託して遂行したし、配列整列は標準ヌクレオチドーヌクレオチドＢＬＡＳＴ(ｂｌａｓｔｎ)プログラムを用いてＧｅｎＢａｎｋ ｏｆ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ(ＮＣＢＩ)とＦａｓｔａ３プログラムを用いてＥＭＢＬ ｌｉｂｒａｒｉｅｓで施した。
プライマー設計及びＲＴ-ＰＣＲ
【００６０】
上記ＤＤＲＴ-ＰＣＲからの結果を確認するために半定量的ＲＴ-ＰＣＲ(ｓｅｍｉｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ ＲＴ-ＰＣＲ)を用いた。最適のＰＣＲ増幅条件を設定するために、関連のある遺伝子に対するプライマーがオン-ラインプライマー設計プログラム(Ｒｏｚｅｎ及びＳｋａｌｅｔｓｋｙ，２０００)を用いて決定した。 本発明に用いられたプライマーセットは表３に示した。
【００６１】
【表３】
【００６２】
一番目-ら旋ｃＤＮＡは、１μgの総ＲＮＡ及び１μＭのオリゴ-ｄＴ15プライマーとＯｍｎｉｓｃｒｉｐｔ逆転写酵素(Ｑｉａｇｅｎ，カリフォルニア)を用いて合成した。 Ｔａｑ ＰＣＲ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ ｋｉｔ(Ｑｉａｇｅｎ)を用いて継続的なＰＣＲを０.５μｌの一番目-ら旋ｃＤＮＡ及び２０ｐｍｏｌのプライマー(表１参照)を用いて遂行した。ＰＣＲ反応は、３分、９４℃での初期変性、４０秒９４℃、４０秒５２℃、１分７２℃の三段階サイクリング(３０回)、及び１０分７２℃の増幅終結から構成される。増幅されたＰＣＲ産物を１.２％アガロースゲルにローディングした。エチウムブロマイド染色後に、ゲルをＵＶ透過照明器上で照射してその結果をポラロイドＤＳ-３４即席カメラシステム(コダック、 米国)を用いて測定した。その結果を各々図２及び図３に示した。
【００６３】
図２に示されたように、ＮＦ-κＢ-依存性遺伝子であるＣＯＸ-２及びｉＮＯＳのｍＲＮＡの発現レベルは、半定量的ＲＴ-ＰＣＲによって評価される。 二種類のハウスキーピング遺伝子であるβ-アクチンとＧＡＰＤＨが各々のｍＲＮＡ発現を標準化するために用いられた。図２で示されるように、二つの遺伝子はシスプラチンの投与によって非常に多く誘導され、ザンソリゾールまたはクルクミン同量(２００ｍｇ/ｋｇ)を予め投与した場合においては、シスプラチン-誘導ＣＯＸ-２ ｍＲＮＡの発現が初期水準に留まった。 シスプラチンによるｉＮＯＳの誘導は、ザンソリゾールを予め投与することで、強く抑制された反面、クルクミンを予め投与した場合においては抑制されなかったのである。
【００６４】
図３に示されたように、シスプラチン-誘導肝毒性に対するザンソリゾールの予防的効果と係わった発現された遺伝子を差別的に確認するために、ＤＤＲＴ-ＰＣＲを遂行した。１０セットのプライマー組を用いて表４に示されたシスプラチンによってアップレギュレートされる７個の遺伝子及び表５に示したシスプラチンにってダウンレギュレートされる５個の遺伝子を確認した。半定量的ＲＴ-ＰＣＲを用いて２個のアップレギュレートされる遺伝子(Ｓ１００Ａ９及びｋｉｎ)及び２個のダウンレギュレートされる遺伝子(ＣｌｐＸ及びＣＰ)がザンソリゾールを予め投与することで活性化または抑制されることを確認できたのである。クルクミンと比べてその効果が格段に優れることが確認できたのである。
【００６５】
【表４】
【００６６】
【表５】
【産業上の利用可能性】
【００６７】
このように、ザンソリゾールは抗癌剤の投与により発生される肝毒性、腎毒性のような副作用を抑制するのに優れた効果を発揮するので、抗癌剤で誘発される毒性の抑制剤として有用であり、抗癌剤と混合して抗癌剤組成物として使用時、抗癌効果を維持しながらも副作用を最少化することができる。
【００６８】
本明細書に記載された実施例と図面に示された構成は本発明の最も望ましい一実施例に過ぎず、本発明の技術的思想のすべてを代弁するものではないため、本出願時点においてこれらに代替できる多様な均等物と変更例が有り得ることを理解すべきである。
【図１】
【図２】
【図３】
【技術分野】
【０００１】
本発明は抗癌剤で誘発される肝毒性、腎毒性などの毒性が抑制できる抑制剤及びこれを含有する抗癌剤組成物に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
癌(ｃａｎｃｅｒ)は、世界的に年間約７００万人の死亡原因となる疾病であり、米国だけで１９９７年の１年間約１５０万人以上の新たな癌患者が生じたという報告もある。このような趨勢を勘案すると、癌はもうすぐ世界第１の死亡原因になると推定される。癌を治す方法としては、放射線療法、外科療法、遺伝子治療法など多くの方法が開発されたが、最も多く用いられている治療方法の一つが抗癌剤投与による化学療法である。
【０００３】
抗癌剤は、正常細胞と癌細胞間の薬に対する感受性差を用いて癌細胞に対して選択的に動かせる化学療法剤であるが、正常細胞に対する毒性も誘発するという問題点がある。
【０００４】
代表的な抗癌剤として百金系抗癌剤であるシスプラチン(ｃｉｓ-ｄｉａｍｍｉｎｅｄｉｃｈｌｏｒｏｐｌａｔｉｎｕｍ[II])が挙げられるが、この抗癌剤は卵巣癌、 膀胱癌、肺がん、頭頚部癌、睾丸癌などの治療のための化学療法剤として臨床であまねく使用されている(Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ Ｂ．，Ｃａｎｃｅｒ，５５:２３０３-２３１５，１９８５)。 シスプラチンは癌細胞でＤＮＡのｉｎｔｅｒ-ｉｎｔｒａｓｔｒａｎｄ ｃｒｏｓｓ-ｌｉｎｋｉｎｇ、ＤＮＡ付加体の形成を導いて抗癌効果を表すことと知られている。 しかし、シスプラチンは治療過程中薬物の制限された含量以上で聴覚喪失、神経毒性、腎臓毒性のような副作用が出て(Ｍｏｌｌｍａｎｅｔａｌ．，１９９８;ＳｃｒｅｎｃｉａｎｄＭｃＫｅａｇｅ，１９９９)、高濃度のシスプラチンの投与時には肝毒性も頻りに観察されると知られている(Ｃｅｒｏｓｉｍｏ Ｒ．Ｊ．，Ａｎｎ．Ｐｈａｒｍ．，２７:４３８-４４１，１９９３;Ｃａｖａｌｌｉ Ｆ．ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｔｒｅａｔ．Ｒｅｐ．，６２:２１２５-２１２６，１９７８;Ｐｏｌｌｅｒａ Ｃ．Ｆ．ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｏｎｃｏｌ．，５:３１８-３１９，１９８７)。
【０００５】
従って、抗癌剤が十分な抗癌効果を出すように安全に用いられるためには、毒性の誘発が最少化された抗癌剤または抗癌剤投与によって誘発される毒性が抑制できる抑制剤の開発が必要である。最近、シスプラチンとグルタチオンエステル(ｇｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ ｅｓｔｅｒ)を共に投与したとき、シスプラチンによる腎臓毒性が効果的に抑制されるという研究結果が報告され(Ｂａｂｕ Ｅ．ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１４４:７-１１，１９９５)、食餌を通じて抗酸化物質を摂取してシスプラチンによる毒性を抑える方法に対しても関心が集中している(Ａｐｐｅｎｒｏｔｈ Ｄ．ｅｔ ａｌ．，Ａｒｃｈ．Ｔｏｘｉｃｏｌ．，７１:６７７-６８３，１９９７;Ｂｏｇｉｎ Ｅ．ｅｔ ａｌ．，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｃｈｅｍ．Ｃｌｉｎ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，３２:８４３-８５１，１９９４;Ｒａｏ Ｍ．ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１２５:３８３-３９０，１９９９)。
【発明の詳細な説明】
【０００６】
従って、本発明が解決しようとする技術的課題は、上記問題点を解決して抗癌剤で誘発される肝毒性、腎毒性などの毒性が抑制できる抑制剤及びこれを含有する抗癌剤組成物を提供することにある。
【０００７】
上記技術的課題を達成するために、本発明はザンソリゾール(Ｘａｎｔｈｏｒｒｈｉｚｏｌ)を有効成分として含有することを特徴とする、抗癌剤で誘発される毒性の抑制剤を提供する。
【０００８】
本発明において、毒性を誘発する抗癌剤としては、シスプラチン(ｃｉｓ-ｄｉａｍｍｉｎｅｄｉｃｈｌｏｒｏｐｌａｔｉｎｕｍ[II])、カルボプラチン(ｃａｒｂｏｐｌａｔｉｎ)、 オキサリプラチン(ｏｘａｌｉｐｌａｔｉｎ)、ネダプラチン(ｎｅｄａｐｌａｔｉｎ)及びこれらの混合物から成る群より選択された白金系抗癌剤が挙げられる。
【０００９】
また、本発明は抗癌剤;及び抗癌剤で誘発される毒性を抑えるための有効成分であるザンソリゾール(Ｘａｎｔｈｏｒｒｈｉｚｏｌ);を含有することを特徴とする抗癌剤組成物を提供する。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
明細書内に統合されており、明細書の一部を構成する添付図面は、発明の現在の望ましい実施例を例示し、後述の望ましい実施例の詳細な説明と共に本発明の原理を説明する役割を果たすのである。
【００１１】
図１は、シスプラチンによって誘導された肝毒性においてザンソリゾールの影響を評価するためのＮＦ-κＢ(Ａ)及びＡＰ-１(Ｂ)のＤＮＡ-結合活性を示した図面である。ＮＦ-κＢ及びＡＰ-１のＤＮＡ-結合活性は、肝組織のＥＭＳＡ(ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｔｉｃ ｍｏｂｉｌｉｔｙ ｓｈｉｆｔ ａｓｓａｙ)を用いて評価した。 黒色矢印はＮＦ-κＢ、ＡＰ-１の転写因子-ＤＮＡ複合体を示し、白色矢印は結合されなかったオリゴヌクレオチドプロブを示す。バンドの密度はＲＦＬＰｓｃａｎソフトウェアで測定された。
【００１２】
図２は、ＣＯＸ-２及びｉＮＯＳのｍＲＮＡ発現レベルを示す。 ＮＦ-κＢ依存性遺伝子であるＣＯＸ-２及びｉＮＯＳ遺伝子ｍＲＮＡ発現レベルは、特異的プライマーセットを用いて半定量的ＲＴ-ＰＣＲ(ｓｅｍｉｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ ＲＴ-ＰＣＲ)で分析した。 β-ａｃｔｉｎ及びＧＡＰＤＨが対比物質として用いられた。
【００１３】
図３は、シスプラチンによってアップレギュレートされる２個の遺伝子であるＳ１００Ａ９及びＫｉｎ(Ａ)と、シスプラチンによってダウンレギュレートされる２個の遺伝子であるＣｌｐＸ及びＣＰ(Ｂ)のＤＤＲＴ-ＰＣＲ及び半定量的ＲＴ-ＰＣＲの結果を示す。各遺伝子のｍＲＮＡ発現レベルは特異的プライマーセットと対比物質に用いられたＧＡＰＤＨ遺伝子を用いて確認された。
【発明の実施のための最善の形態】
【００１４】
以下、本発明に係る抗癌剤で誘発される毒性の抑制剤及びこれを含有する抗癌剤組成物に対して詳しく説明する。
【００１５】
本発明の抗癌剤で誘発される毒性の抑制剤に有効成分として含有されるザンソリゾール(Ｘａｎｔｈｏｒｒｈｉｚｏｌ)とは、１９７０年ドイツのリンプラー(Ｒｉｍｐｌｅｒ)などによってクルクマザンソリザー(Ｃｕｒｃｕｍａ ｘａｎｔｈｏｒｒｈｉｚａ)から初めて分離されたセスキテルペン(ｓｅｓｑｕｉｔｅｒｐｅｎｅ)系の化合物である。
【００１６】
このようなザンソリゾールはネズミ(ｒａｔ)子宮の強直性収縮を濃度依存的に抑制し(Ｐｏｎｃｅ-Ｍｏｎｔｅｒ Ｈ．，ｅｔ ａｌ．，Ｐｈｙｔｏｔｈｅｒ．Ｒｅｓ．，１３:２０２-２０５，１９９９)、ストレプトコカスミュータンス(Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｍｕｔａｎｓ)のような口腔病菌に対して抗菌活性を示すと報告されている(Ｈｗａｎｇ Ｊ．Ｋ．，Ｆｉｔｏｔｅｒａｐｉａ，７１:３２１-３２３，２０００;Ｈｗａｎｇ Ｊ．Ｋ．，Ｐｌａｎｔａ Ｍｅｄ．，６６:１９６-１９７，２０００)。この他にもザンソリゾールは癌の予防と治療に効果的に作用すると知られている。
【００１７】
このように、ザンソリゾールは、口腔病菌に対する抗菌剤、抗癌剤などの効果があると知られているが、本発明者らは抗癌剤の投与によって発生される肝毒性、腎毒性のような副作用が抑制できる物質を研究した結果、ザンソリゾールが抗癌剤で誘発される毒性に対する抑制剤として強力な効果を奏するということを明らかにしたのである。
【００１８】
ザンソリゾールは、化学式１の構造を有するが、インドネシアの伝統薬剤のショウガ科植物であるクルクマザンソリザー(Ｃｕｒｃｕｍａ ｘａｎｔｈｏｒｒｈｉｚａ Ｒｏｘｂ．)から抽出することができる。抽出方法としては、大韓民国公開特許公報第２０００−７３２９５号及び国際公開公報ＷＯ８８/０５３０４号に開示されたように、有機溶媒抽出法、超臨界流体抽出法、マイクロウェーブ抽出法及び超音波抽出法などが使用され得る。
【００１９】
【化１】
【００２０】
このようなザンソリゾールは抗癌剤の投与によって発生される肝毒性、腎毒性のような副作用を抑制するのに優れた効果を示す。副作用が抑制される抗癌剤としては白金系抗癌剤、シクロホスファミド(ｃｙｃｌｏｐｈｏｓｐｈａｍｉｄｅ)、ブレオマイシン(ｂｌｅｏｍｙｃｉｎ)、 ドキソルビシン(ｄｏｘｏｒｕｂｉｃｉｎ)などが挙げられるが、特にシスプラチン(ｃｉｓ-ｄｉａｍｍｉｎｅｄｉｃｈｌｏｒｏｐｌａｔｉｎｕｍ[II])、カルボプラチン(ｃａｒｂｏｐｌａｔｉｎ)、オキサリプラチン(ｏｘａｌｉｐｌａｔｉｎ)、ネダプラチン(ｎｅｄａｐｌａｔｉｎ)などの白金系抗癌剤の肝毒性と腎毒性とを抑制するのに優れる。 ザンソリゾールの抗癌剤による副作用の抑制効果は抗癌剤によって生成された活性酸素種の正常細胞に働くことを抑えるためであると考えられる。
【００２１】
代表的な白金系抗癌剤であるシスプラチンから誘発された肝毒性及び腎毒性に対するザンソリゾールの抑制効果の検証方法は次の通りである。
【００２２】
シスプラチンをマウスの腹腔に注射した後、所定時間後に体重を測定し、毒性が誘発されることが分かった。エーテルでマウスを麻醉した後、心臓から血液を分取して肝毒性と腎毒性の誘発と係わった生化学的指標(ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ ｍａｒｋｅｒ)を調べ、腎臓と脾臓を分離して各臓器の重さもまた測定して比較した。
【００２３】
血清中に各種酵素の活性を測定することは多くの疾病に対する貴重な診断上の情報を提供する。 アミノ基伝達酵素は、肝臓で非常に活性が高く、血中で極微量に検出されるが、肝毒性が誘発された場合はレベルが増加する。シスプラチン処理によって変性された肝臓は、結果的に損傷された肝細胞からＧＰＴ(Ｇｌｕｔａｍａｔｅ-Ｐｙｒｕｖａｔｅ Ｔｒａｎｓａｍｉｎａｓｅ)とＧＯＴ(Ｇｌｕｔａｍａｔｅ-Ｏｘａｌｏａｃｅｔａｔｅ Ｔｒａｎｓａｍｉｎａｓｅ)とを血中に漏出する。シスプラチンを腹腔注射する前、口腔にザンソリゾールを投与した群は、シスプラチンのみを投与した群に比べて血中のＧＰＴ濃度及びＧＯＴ濃度が有意義に減少した。
【００２４】
また、シスプラチン投与時現される副作用である腎毒性でのザンソリゾールの毒性抑制効果を確認するために腎臓比重の変化を測定した。シスプラチンを高濃度で投与した群ではシスプラチンを投与しなかった対照群より腎臓の比重が増加するが、 ザンソリゾールをシスプラチン投与前、所定期間の間、口腔投与した場合には、腎臓の比重がほとんど増加しないことを確認した。
【００２５】
また、シスプラチンにより腎臓の毒性が誘発されれば、活性酸素(ｒｅａｃｔｉｖｅ ｏｘｙｇｅｎ ｓｐｅｃｉｅｓ)が増加することになり、腎臓の濾過と排泄機能の効率が低下されながら体重の変化が生じ、血中に濾過されなかった尿素窒素(ｕｒｅａｎｉｔｒｏｇｅｎ)とクレアチニン(ｃｒｅａｔｉｎｉｎｅ)とが増加するようになる。シスプラチンを投与する前に、ザンソリゾールを所定期間、投与した場合にはシスプラチンのみを投与した群より血中尿素窒素の含量が有意義に減少したことを確認した。
【００２６】
なお、シスプラチンのような白金系抗癌剤の投与によりＮＦ-κＢ(ｎｕｃｌｅａｒｆａｃｔｏｒ-ｋａｐｐａ Ｂ)とＡＰ-１(ａｃｔｉｖａｔｏｒ ｐｒｏｔｅｉｎ-1)のような転写因子が活性化或いは抑制され、このような転写因子の活性化、特にＮＦ-κＢの活性化はＣＯＸ-２(ｃｙｃｌｏｏｘｙｇｅｎａｓｅ-２)及びｉＮＯＳ(ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ ｎｉｔｒｉｃ ｏｘｉｄｅ ｓｙｎｔｈａｓｅ)のようなＮＦ-κＢ-依存性遺伝子の発現を活性化すると知られている。このようなＣＯＸ-２及びｉＮＯＳは、前-炎症(ｐｒｏ-ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ)遺伝子であって、炎症及び毒性と係わったものであるとよく知られている(Ｎａｎｊｉ，Ａ．Ａ，ｅｔ ａｌ．，２００３. Ａｍ．Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．:Ｇａｓｔｒｏｎｉｎｔｅｓｔ．Ｌｉｖｅｒ Ｐｈｙｓｉｏｌ．２８４，Ｇ３２１-２７;Ｒｅｉｌｌｙ，Ｔ．Ｐ．，ｅｔ ａｌ．，Ｃｈｅｍ．Ｒｅｓ．Ｔｏｘｉｃｏｌ．１４，１６２０-１６２８;及びＧａｒｄｎｅｒ，Ｃ．Ｒ．，ｅｔ ａｌ．，Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ２７，７４８-７５４参照)。
【００２７】
本発明の実験において、比較例として用いられたクルクミンは、特に、ＮＦ-κＢの活性を抑えて生理的な機能をするものであると知られている(Ｈａｎ，Ｓ．Ｓ．，ｅｔ ａｌ．，２００２. Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３５，３３７-３４２及びＮａｎｊｉ，Ａ．Ａ．，ｅｔ ａｌ．，２００３. Ａｍ．Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．:Ｇａｓｔｒｏｎｉｎｔｅｓｔ．Ｌｉｖｅｒ Ｐｈｙｓｉｏｌ．２８４，Ｇ３２１-２７参照)。
【００２８】
本発明者らは、シスプラチンにより転写因子であるＮＦ-κＢが活性化されることを確認した。また、シスプラチンによりＣＯＸ-２及びｉＮＯＳ遺伝子のｍＲＮＡ発現が増加することを確認した。本発明者らは、ザンソリゾール及びクルクミンをシスプラチン投与前に予め投与することで、このような遺伝子のｍＲＮＡ発現増加を抑制することができたが、ザンソリゾールはシスプラチンによって引起されたＣＯＸ-２及びｉＮＯＳ遺伝子のｍＲＮＡ発現すべてを抑制することができた一方、クルクミンは、単にＣＯＸ-２遺伝子のｍＲＮＡ発現のみを抑制することができたのである。これは、ザンソリゾールがシスプラチンによって引き起こった肝毒性の治療に効果があるということを暗示するのである。
【００２９】
また、本発明者らはシスプラチン-誘導肝毒性に対するザンソリゾールの予防的効果と関連した、差別的に発現される遺伝子を確認するために、ＤＤＲＴ-ＰＣＲ(ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ ｄｉｓｐｌａｙ ｒｅｖｅｒｓｅ ｔｒａｎｓｃｉｐｔｉｏｎ-ＰＣＲ)を施した。 シスプラチンによってアップレギュレートされる７個の遺伝子及びダウンレギュレートされる５個の遺伝子が確認された。
【００３０】
このような遺伝子のうちアップレギュレートされるＳ１００カルシウム結合蛋白質Ａ９(Ｓ１００Ａ９)ｍＲＮＡは、シスプラチンがＳ１００Ａ９の発現にネガチブ作用する転写因子であるＡＰ-１のＤＮＡ結合活性を減少させるためであると考えられる(Ｇｅｂｈａｒｄｔ，Ｃ．，ｅｔ ａｌ．，２００２. Ｏｎｃｏｇｅｎｅ ２１，４２６６-４２７６参照)。 このようなＳ１００Ａ９の発現は、細胞骨格、細胞形態、信号伝達(Ｋｅｒｋｈｏｆｆ，Ｃ．，ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７４，３２６７２-３２６７９参照)及び細胞内カルシウム調節(Ｓｃｈａｆｅｒ，Ｂ．Ｗ．，ｅｔ ａｌ．，Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｓｃｉ．２１，１３４-１４０参照)に影響を及ぼすと知られている。Ｓ１００Ａ９遺伝子の発現異常は、結局、カルシウムイオン恒常性の破壊を引き起こす。 ザンソリゾールの投与はクルクミンの投与時とは異なり、シスプラチンによって引き起こるＡＰ-１の抑制程度を減少させ、これがＳ１００Ａ９ｍＲＮＡの発現を減少させてシスプラチンによって引き起こった肝毒性に効果があると考えられる。
【００３１】
Ｒｅｃ-Ａ蛋白質の抗原決定子(Ｋｉｎ)は核蛋白質であって、バクテリアＲｅｃＡ蛋白質と関連した交差免疫反応を示し、カーブ型ＤＮＡに効率的に結合する(Ｔｉｓｓｉｅｒ，Ａ．，ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｉｍｉｅ ７７，８５４-８６０参照)。このような遺伝的相互作用は、ＤＮＡ回復と真核細胞での変則的組換えを暗示し得る。シスプラチンによるＫｉｎ ｍＲＮＡの増加発現は、Ｋｉｎ蛋白質のレベルを増加させる(Ａｎｇｕｌｏ，Ｊ．Ｆ．，ｅｔ ａｌ．，Ｍｕｔａｔ．Ｒｅｓ．２１７，１２３-１３４参照)。 シスプラチンが投与されたマウスにおいてＫｉｎ ｍＲＮＡの増加は、肝でシスプラチンによって誘導されたＤＮＡ損傷を取り戻す活性を反映し得る。従って、本発明者らはｉＮＯＳの発現に対するザンソリゾールの影響と同様に、シスプラチンによって誘導されたアップレギュレートされたＫｉｎ ｍＲＮＡの発現がザンソリゾールの投与によりドラマチックに減ることを確認できたが、これは、ザンソリゾールがシスプラチンによる毒性に影響を及ぼすということを意味する。
【００３２】
シスプラチンの投与はまた、ミトコンドリア内の変化を引き起こす。シスプラチンはマウス肝の呼吸チェーンの複合体Ｉ及びIIの活性を抑制すると知られている(Ｒｏｓｅｎ，Ｍ．，ｅｔ ａｌ．，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｅｘｐ．Ｐａｔｈｏｌ． ７３，６１-７４参照)。 なお、シスプラチンは、ミトコンドリアの全体機能に影響を及ぼすミトコンドリア膜ポテンシャルの損失を引き起こす(Ｋｒｕｉｄｅｒｉｎｇ，Ｍ．，ｅｔ ａｌ．，Ｅｘｐ．Ｎｅｐｈｒｏｌ．２，３３４-３４４参照)。
【００３３】
ミトコンドリアの機能異常は、非正常的に発現されたマウス遺伝子であるＣｌｐＸ(ｃａｓｅｉｎｏｌｙｔｉｃ ｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ Ｘ)によって説明することもできる。ＣｌｐＸ蛋白質は、内的ＡＴＰａｓｅ活性を示し、ミトコンドリア蛋白質の恒常性に重要な役割を果たす組織-特異哺乳動物ミトコンドリアシャペロン(ｃｈａｐｅｒｏｎｅ)として作用する(Ｓａｎｔａｇａｔａ，Ｓ．，ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ． ２７４，１６３１１-１６３１９参照)。 それの発現減少はミトコンドリアの不安定を引き起こすが、ザンソリゾールを予め投与することでＣｌｐＸ ｍＲＮＡの発現をシスプラチン投与前の程度に維持することができたのである。これは、ザンソリゾールがシスプラチンの投与による毒性を弱化することができたということを意味する。
【００３４】
Ｃｅｒｕｌｏｐｌａｓｍｉｎ(ＣＰ)は、脊椎動物の血漿で見つかる総銅の９５％以上を含有する血清α２-グリコ蛋白質である(Ｔａｋａｈａｓｈｉ，Ｎ．，ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８１，３９０-３９４参照)。ＣＰは、血漿銅と強固に結合して血漿内で予防的抗酸化剤として作用し、鉄-依存性脂質過酸化及びヒドロキシルラジカルの形成を抑制する。興味なのは、シスプラチンの投与はＣＰを含めて、様々な血漿抗酸化剤のレベルを減少させる。これは、一般的に用いられる抗癌剤による酸化的毒性に対抗できる防御的機転が崩れることを意味する(Ｗｅｉｊｌ，Ｎ．Ｉ．，ｅｔ ａｌ．，Ａｎｎ．Ｏｎｃｏｌ． ９、１３３１-１３３７参照)。 本発明者らは、ザンソリゾールを予め投与することで、ＣＰのｍＲＮＡ発現を回復させることを確認し、これは、ザンソリゾールがシスプラチンの毒性抑制剤として用いられることを意味する。比較対象で投与されたクルクミンにおいては上記のような効果が示されなかった。
【００３５】
上記のような結果から、ザンソリゾールは抗癌剤の投与によって発生される肝毒性、腎毒性のような副作用を抑制するのに優れた効果を奏することが分かり、クルクミンに比べて毒性抑制効果が非常に優れることが確認できたのである。
【００３６】
ザンソリゾールは、一般的な経路を通じて投与される。 即ち、局部、経口、非経口、鼻内、静脈内、筋肉内、皮下、眼内、硬皮などに投与でき、溶液、懸濁液、 錠製、丸薬、カプセル、徐放型製剤に製形化することができる。ザンソリゾールの投与量は、抗癌剤の種類及び投与量、年齢、性別などによって当業界の技術を考慮して決定する。 ザンソリゾールは、抗癌剤投与前、または、後に単独で投与でき、抗癌剤と混合して抗癌剤組成物として共に投与することもできる。
【００３７】
本発明のザンソリゾールは患者の状態、白金系抗癌剤の投与量、抗癌剤の投与期間などによってシスプラチン総投与重量対比約０．０１倍乃至１０倍重量が投与されることが望ましく、約０．１乃至５倍重量が投与されることがさらに望ましい。
【００３８】
本発明の抗癌剤;及び抗癌剤で誘発される毒性を抑制するための有効成分であるザンソリゾール;を含有することを特徴とする抗癌剤組成物において、上記ザンソリゾールの含量は抗癌剤重量対比約０．０１乃至１０倍重量であるのが望ましく、抗癌剤重量対比約０．１乃至５倍重量であることがさらに望ましい。
【００３９】
ザンソリゾールを含有する本発明の抗癌剤で誘発される毒性の抑制剤及びこれを含有する抗癌剤組成物は、薬学的に許容可能な添加剤あるいは希釈剤をさらに含むことができる。添加剤または希釈剤としては、製薬分野で通常用いられる賦形剤、結合剤、滑澤剤、湿潤剤、懸濁化剤、溶媒、分散剤、 放出調節剤、着香剤、着色剤、コーテイング剤などが用いられる。
【００４０】
以下、本発明を具体的に説明するために実施例を挙げて、詳しく説明することにする。 しかし、本発明による実施例は様々な異なる形態に変形でき、本発明の範囲が以下に詳述する実施例に限定されることと解釈されてはいけない。 本発明の実施例は、当業界で平均的な知識を有する者に本発明をより完全に説明するために提供されるのである。
【００４１】
下記実施例の実験結果は、平均値±ＳＥで示した。統計的分析はＳｔｕｄｅｎｔｔ-ｔｅｓｔを用いた。 Ｐ ｖａｌｕｅが０．０５以下であれば、有意性があると評価した。
実験例１:動物モデルの設計
【００４２】
シスプラチンを用いてマウス(ｍｏｕｓｅ)において肝毒性と腎毒性を誘発する場合、ザンソリゾールとクルクミン(ｃｕｒｃｕｍｉｎ)の毒性抑制効果を調べた。
【００４３】
実験群当り１０匹のＩＣＲマウスマウス(５週齢、雄)を用いた。マウスにトウモロコシ油に溶かしたザンソリゾール(１００ｍｇ/ｋｇ、２００ｍｇ/ｋｇ)とクルクミン(２００ｍｇ/ｋｇ)を４日間、口腔投与し、陰性対照群にはトウモロコシ油を口腔投与した。ザンソリゾールとクルクミンの最後の投与の後、３時間後に緩衝溶液(ＰＢＳ ｂｕｆｆｅｒ)に溶かしたシスプラチンを４５ｍｇ/ｋｇの濃度で腹腔注射し、陰性対照群には緩衝溶液を注射した。１６時間後に体重を測定してエーテルでマウスを麻醉した後、血液と肝のサンプルを分取した。腎臓と脾臓を分離して各臓器の重さを測定した。 下記表１に実施例及び比較例による抗癌剤及び毒性抑制剤の投与方法及び容量を示した。
【００４４】
【表１】
実験例２:血清生化学的指標の測定
【００４５】
心臓から分取した血液は、低温で２時間放置した後、３０００ｒｐｍで１０分間遠心分離して血清を得て蛋白質分析のために低温で保管した。採取した血清を用いてＧＰＴ(Ｇｌｕｔａｍａｔｅ-Ｐｙｒｕｖａｔｅ Ｔｒａｎｓａｍｉｎａｓｅ)、ＧＯＴ(Ｇｌｕｔａｍａｔｅ-Ｏｘａｌｏａｃｅｔａｔｅ Ｔｒａｎｓａｍｉｎａｓｅ)、 血中尿素窒素(Ｂｌｏｏｄ Ｕｒｅａ Ｎｉｔｒｏｇｅｎ)、そしてクレアチニン(ｃｒｅａｔｉｎｉｎｅ)含量を定量し、その結果を表２に示した。
ＧＰＴ(Ｇｌｕｔａｍａｔｅ-Ｐｙｒｕｖａｔｅ Ｔｒａｎｓａｍｉｎａｓｅ)、ＧＯＴ(Ｇｌｕｔａｍａｔｅ-Ｏｘａｌｏａｃｅｔａｔｅ Ｔｒａｎｓａｍｉｎａｓｅ)の定量方法
【００４６】
ＧＰＴとＧＯＴの含量はＲｅｉｔｍａｎとＦｒａｎｋｅｌ(１９５７)の方法によって測定した。 この方法は、ａｌａｎｉｎｅ+α-ｋｅｔｏｇｌｕｔａｒｉｃ ａｃｉｄ→ｐｙｒｕｖｉｃ ａｃｉｄ+ｇｌｕｔａｍｉｃ ａｃｉｄ反応過程で、ＧＰＴ酵素によって形成されるｐｙｒｕｖｉｃ ａｃｉｄを２，４-ｄｉｎｉｔｒｏｐｈｅｎｙｌｈｙｄｒａｚｉｎｅと反応させて表される色の程度をＧＰＴとＧＯＴ酵素の活性程度に示したものであって、５０５ｎｍの波長でその吸光度を測定することである。ＧＰＴとＧＯＴの測定用Ｓｉｇｍａ ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．(Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，Ｕ．Ｓ．Ａ．)の製品を用いて定量した。溶血された血清内には正常血清より高いＧＰＴとＧＯＴ酵素があるので溶血された血清を用いないように注意し、 特に、ＧＰＴとＧＯＴ酵素は低温で５日後からは酵素の活性が低下されるのでＧＰＴとＧＯＴ酵素の測定に用いた血清は４℃に保管しながら５日以内に実験に用いることにした。
【００４７】
試験管に１ｍｌのＡｌａｎｉｎｅ-α-ＫＧ Ｓｕｂｓｔｒａｔｅを入れて３７℃の水槽に２-３分間加温させる。各試験管に０．２ｍｌの被検血清を入れて、３７℃水槽で３０分間反応させた後、発色液(２４-Ｄｉｎｉｔｒｏｐｈｅｎｙｌｈｙｄｒａｚｉｎｅ)１ｍｌを入れて、室温で２０分間放置させた。各試験管に０．４水酸化ナトリウム(ＮａＯＨ)１０ｍｌを入れて、充分に混合した後、蒸留水を対照して各々ＧＰＴの吸光度を読み出した。ＧＯＴの測定の場合には、１ｍｌのＡｓｐａｒａｔａｔｅ-α-ＫＧ Ｓｕｂｓｔｒａｔｅを３７℃の水槽に２-３分間加温させた後、各試験管に０．２ｍｌの被検血清を入れて３７℃水槽で６０分間反応させた後ＧＯＴの吸光度を測定した。
尿素窒素(Ｕｒｅａ Ｎｉｔｒｏｇｅｎ)の定量方法
【００４８】
ウレアーニトロゲンの含量はＦａｗｃｅｔｔら(１９６０)の方法で定量した。 Ｂｌｏｏｄ Ｕｒｅａ Ｎｉｔｒｏｇｅｎ測定用のキットを用いて尿素(ｕｒｅａ)の加水分解(ｈｙｄｒｏｌｙｚｅ)時生成されるアンモニア(ＮＨ3)を色反応を通じて５７０ｎｍでその吸光度を測定した。
【００４９】
試験管にＵｒｅａｓｅ溶液０．５ｍｌを入れて被検血清１０ｍｌをよく混ぜた後３７℃水槽で５-１０分間反応させた。各試験管に１ｍｌのＰｈｅｎｏｌ Ｎｉｔｒｏｐｒｕｓｓｉｄｅ溶液と１ｍｌＡｌａｋｌｉｎｅ Ｈｙｐｏｃｈｌｏｒｉｔｅ溶液を混合し、５ｍｌ蒸留水と反応させて蒸留水に対照して吸光度値を読み出した。尿素窒素(Ｕｒｅａ Ｎｉｔｒｏｇｅｎ)の定量は、Ｓｉｇｍａ ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．(Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，Ｕ．Ｓ．Ａ．)の製品を用いて標準検量線に従って定量した。
クレアチニン(Ｃｒｅａｔｉｎｉｎｅ)の定量方法
【００５０】
クレアチニンの含量は、クレアチニン代謝物にａｌｋａｌｉｎｅ ｐｉｃｒａｔｅの処理時表される黄色の色反応を５００ｎｍでその吸光度を測定するＪａｆｆｅら(１８８６)の方法で測定し、標準検量線に従ってクレアチニンを定量した。
【００５１】
Ａｌｋａｌｉｎｅ ｐｉｃｒａｔｅ溶液３ｍｌと被検血清０．３ｍｌをよく混合して３７℃水槽で２０分間反応させた後、蒸留水を入れた盲検を対照にして検体の吸光度(Ａ１)を読み出した。各試験管にエシード(Ｍｉｘｔｕｒｅ ｏｆ ｓｕｌｆｕｒｉｃ ａｃｉｄ ａｎｄ ａｃｅｔｉｃ ａｃｉｄ)溶液０．１ｍｌを入れて３７℃水槽で５分間放置した後、蒸留水を入れた盲検を対照にして検体の吸光度(Ａ２)を読み出した。 検体の吸光度はＡ１吸光度でＡ２の吸光度を引いた値を用いて標準検量線に従ってクレアチニンの含量を定量した。クレアチニンの定量は、Ｓｉｇｍａ ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．(Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，Ｕ．Ｓ．Ａ．)の製品を用いた。
【００５２】
【表２】
【００５３】
上記表２において、Ｋ．Ｗ/Ｂ．Ｗはｋｉｄｎｅｙ ｗｅｉｇｈｔ/ｂｏｄｙ ｗｅｉｇｈｔであり、Ｓ．Ｗ/Ｂ．Ｗはｓｐｌｅｅｎ ｗｅｉｇｈｔ/ｂｏｄｙ ｗｅｉｇｈｔであり、ＢＵＮはＢｌｏｏｄ Ｕｒｅａ ｎｉｔｒｏｇｅｎを示す。
【００５４】
表２に示された結果を分析すると次の通りである。
シスプラチンを腹腔注射する前の４日間、口腔にザンソリゾールを２００ｍｇ/ｋｇの濃度で投与した群ではシスプラチンのみを投与した群に比べて血中のＧＰＴ濃度が有意義に減少し、クルクミン(２００ｍｇ/ｋｇ)を投与した群より優れた効果を見せた。また、シスプラチンを高濃度で投与した群ではシスプラチンを投与しなかった対照群より腎臓の比重が増加したが、クルクミンとザンソリゾールをシスプラチン投与前４日間、口腔投与した場合、腎臓の比重が対照群と同じ水準に減ることを確認し、ザンソリゾールがクルクミンよりさらに効果が優れると観察された。
【００５５】
なお、シスプラチンを投与する前に、ザンソリゾール(２００ｍｇ/ｋｇ)を４日間投与した場合、シスプラチンのみを投与した群より血中尿素窒素の含量が有意義に減少した。シスプラチンを投与して腎臓毒性を誘導した群ではクレアチニンの含量が大きく増加した反面、ザンソリゾール(２００ｍｇ/ｋｇ)を前投与した群では、シスプラチンのみを投与した群より血中クレアチニンが顕著に減ることを確認した。
実験例３:ＮＦ-κＢ及びＡＰ-１に対したザンソリゾールの影響評価
ＮＦ-κＢ及びＡＰ-1に対する影響を評価するためにＥＭＳＡ(ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｔｉｃ ｍｏｂｉｌｉｔｙ ｓｈｉｆｔ ａｓｓａｙ)を施した。上記実験例１の動物モデル設計の実施例１及び２と比較例１及び２とから得られた肝組織を液体窒素下で粉末化し、５００μlの冷却貯蔵緩衝液(１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ(ｐＨ７.８)、１０ｍＭ ＫＣｌ、１.５ｍＭ ＭｇＣｌ2、０.５ｍＭ ＤＴＴ、０.２ｍＭ ＰＭＳＦ)に均質化した。 この均質化したものに１２５μlの１０％ＮＰ-４０溶液を加えて、その混合液を１２、０００×ｇで１分間遠心分離した。生成されたペレットを１００μlの上記貯蔵緩衝液と１２.５μlのＮＰ-４０溶液で洗浄した後、遠心分離して５０μlの４２０ｍＭ ＮａＣｌ、 １.５ｍＭ ＭｇＣｌ2、０.２ｍＭ ＥＤＴＡ、０.５ｍＭ ＤＴＴ、０.２ｍＭ ＰＭＳＦ、及び２０％グリセロールを含めた２０ｍＭ冷却ＨＥＰＥＳ緩衝液(ｐＨ７.８)で再懸濁し、 ４℃、１２、０００×ｇで５分間遠心分離した。核蛋白質を含む上澄液が集められ、蛋白質濃度の測定後−７０℃で保管された。ＮＦ-κＢオリゴヌクレオチドプロブ(５'-ＡＧＴ ＴＧＡ ＧＧＧ ＧＡＣ ＴＴＴ ＣＣＣ ＡＧＧ Ｃ-３';Ｐｒｏｍｅｇａ、ウィスコンシン)またはＡＰ-１(ｃ-Ｊｕｎ)オリゴヌクレオチドプロブ(５'-ＣＧＣ ＴＴＧ ＡＴＧ ＡＧＴ ＣＡＧ ＣＣＧ ＧＡＡ-３Ｖ;Ｐｒｏｍｅｇａ)を[γ-32Ｐ]ＡＴＰ及びＴ４ポリオヌクレオチドキナーゼを用いて標識し、Ｎｉｃｈコラム(パーマシーア、Ｕｐｐｓａｌａ、スウェーデン)を用いて精製した。 結合反応は５μlの培養緩衝液(１０ｍＭ Ｔｒｉｓ-ＨＣｌ(ｐＨ７.５)、１００ｍＭ ＮａＣｌ，１ｍＭ ＤＴＴ，１ｍＭ ＥＤＴＡ，４％(ｖ/ｖ)グリセロール，及び０.１ｍｇ/ｍｌの超音波処理された鮭精子ＤＮＡ)、１０μgの核抽出物、及び１００、０００ｃｐｍの標識されたプロブを含む２５μｌ混合液内で遂行した。室温で５０分間培養した後、３μｌのローディング緩衝液(２５０ｍＭ Ｔｒｉｓ-ＨＣｌ(ｐＨ７.５))、０.２％ブロモフェノールブルー、４０％グリセロール)と混合されたサンプルを６％非変性ポリアクリルアミドゲルで１５０Ｖで２時間電気泳動した。ゲルを乾燥した後、Ｘ-レイフィルムに露出させた。その結果を図１に示した。
【００５６】
図１に示されるように、シスプラチンの投与はマウスの肝においてＮＦ-κＢの結合活性を増加させ、逆にＡＰ-１の結合活性は減少させた。 しかし、ザンソリゾールまたはクルクミンを予め投与することでシスプラチン-誘導ＮＦ-κＢの結合活性を抑制することができた。 また、同量投与した場合に、クルクミンよりザンソリゾールの効果が格段に高いことが分かる。シスプラチンによるＡＰ-１の抑制された結合活性は、ザンソリゾールを予め投与して５０％程度回復したが、クルクミンを予め投与することによる影響はなかった。
実験例４:遺伝子単位でザンソリゾール投与の影響評価
総ＲＮＡの分離及びＤＮａｓｅＩ処理
【００５７】
上記実験例１の動物モデル設計の実施例１及び２と比較例１及び２とから得られた肝組織を液体窒素下で粉末化し、ＴＲＩｚｏｌTM試薬(Ｌｉｆｅ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，オーストリア)に均質化した。 均質化されたサンプルを室温で５分間培養して核蛋白質複合体が完全に分離されれるようにした。０.２ボリュームのクロロホルムを添加した後に、サンプルを１５秒間強く振って、２〜３分間培養した。その後、４℃で１５分間１２、０００×ｇで遠心分離した。上部水相に存在する総ＲＮＡを同量のイソプロパノールと混合して沈澱させた。その混合液を４℃で１０分間培養した後、４℃で１０分間１２、０００×ｇで遠心分離した。総ＲＮＡペレットを７５％エタノールで洗浄し、乾燥した後、ＲＮａｓｅがない水に溶解させた。染色体ＤＮＡの汚染を防ぐために、総ＤＮＡサンプルは１０ユニットのＤＮａｓｅＩ（ＧｅｎＨｕｎｔｅｒ Ｃｏｒｐ．，ナッシュビル、米国）と共に３７℃で３０分間培養した。その後、ＤＮＡがないＲＮＡをＴＲＩｚｏｌ試薬を用いて分離した。総ＲＮＡ及びＤＮａｓｅ-I処理されたＲＮＡの濃度と純度とは２６０及び２８０ｎｍで吸光度を持って計算された。
ＤＤＲＴ-ＰＣＲの遂行
【００５８】
ＲＮＡｉｍａｇｅキット(ＧｅｎＨｕｎｔｅｒ Ｃｏｒｐ．)を用いてＤＤＲＴ-ＰＣＲ(ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ ｄｉｓｐｌａｙ ｒｅｖｅｒｓｅ ｔｒａｎｓｃｉｐｔｉｏｎ-ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ｃｈａｉｎ ｒｅａｃｔｉｏｎ)を施した。 上記ＤＮａｓｅＩ-処理された総ＲＮＡプール(各グループ当り２００ｎｇ)を逆転写緩衝液(２５ｍＭ Ｔｒｉｓ-ＨＣｌ，ｐＨ８.３，３７．６ｍＭ ＫＣｌ，１.５ｍｇ ＭｇＣｌ2，及び５ｍＭ ＤＴＴ)で５ユニット/μｌのＭＭＬＶ-逆転写酵素、２０μＭのｄＮＴＰ混合、及び０.２μＭのグアノシン-固定されたオリゴ(ｄＴ)プライマー(ＨＴ11-Ｇ)を用いて逆転写した。そのＲＴ混合液を１０倍希釈してＰＣＲに使用した。継続的なＰＣＲ(２０μｌ)は２μＭのｄＮＴＰ，０.２μＭのＨＴ11-Ｇ，０.２μＭの任意のプライマー(Ｈ-ＡＰ１からＨ-ＡＰ１０まで)、０.２μｌのα-[33P]ｄＡＴＰ(２０００Ｃｉ/ｍｍｏｌ)、及び０.０５ユニット/μｌのＡｍｐｌｉＴａｑ ＤＮＡポリマラーゼ(Ｐｅｒｋｉｎ_Ｅｌｍｅｒ)を含むＰＣＲ緩衝液(１０ｍＭ Ｔｒｉｓ-ＨＣｌ，ｐＨ８.４，５０ｍＭＫＣｌ，１.５ｍＭ ＭｇＣｌ２及び０.００１％ゼラチン)で施した。 熱サイクルラー(ＧｅｎｅＡｍｐ ＰＣＲ Ｓｙｓｔｅｍ ９７００、Ｐｅｒｋｉｎ-Ｅｌｍｅｒ)は次のようにプログラムされた:９４℃で３０秒、４０℃で２分、 及び７２℃から３０秒、４０回反復。７２℃で５分間維持して最後の拡張を中止させた。33Ｐ-標識されたＰＣＲ産物を６％変性ポリアクリルアミドゲルで３.５時間の間、６０Ｗの一定の力を用いて分離した。所定片の３Ｍ紙の上で、８０℃１時間の間、真空状態で乾燥した。 乾燥されたゲルに向けられたオートラジオグラフィで露出し現像された。
クローニング及びＤＮＡシーケンシング
【００５９】
関連のあるｃＤＮＡ断片を乾燥されたゲルから切り出した後、沸いた水を用いて溶出させた。その後、同一のプライマーを用いて、ＤＤ-ＰＣＲと同一のＰＣＲ条件でＰＣＲで再増幅した。再増幅されたＰＣＲ産物は、ＰＣＲ-ＴＲＡＰクローニングシステム(ＧｅｎＨｕｎｔｅｒ)を用いてＰＣＲ-ＴＲＡＰベクターにクローニングした。ＤＮＡ挿入を含むプラスミドに対するＤＮＡシーケンシングは、Ｔａｋａｒａ Ｋｏｒｅａ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ Ｉｎｃ．(水原、韓国)に委託して遂行したし、配列整列は標準ヌクレオチドーヌクレオチドＢＬＡＳＴ(ｂｌａｓｔｎ)プログラムを用いてＧｅｎＢａｎｋ ｏｆ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ(ＮＣＢＩ)とＦａｓｔａ３プログラムを用いてＥＭＢＬ ｌｉｂｒａｒｉｅｓで施した。
プライマー設計及びＲＴ-ＰＣＲ
【００６０】
上記ＤＤＲＴ-ＰＣＲからの結果を確認するために半定量的ＲＴ-ＰＣＲ(ｓｅｍｉｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ ＲＴ-ＰＣＲ)を用いた。最適のＰＣＲ増幅条件を設定するために、関連のある遺伝子に対するプライマーがオン-ラインプライマー設計プログラム(Ｒｏｚｅｎ及びＳｋａｌｅｔｓｋｙ，２０００)を用いて決定した。 本発明に用いられたプライマーセットは表３に示した。
【００６１】
【表３】
【００６２】
一番目-ら旋ｃＤＮＡは、１μgの総ＲＮＡ及び１μＭのオリゴ-ｄＴ15プライマーとＯｍｎｉｓｃｒｉｐｔ逆転写酵素(Ｑｉａｇｅｎ，カリフォルニア)を用いて合成した。 Ｔａｑ ＰＣＲ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ ｋｉｔ(Ｑｉａｇｅｎ)を用いて継続的なＰＣＲを０.５μｌの一番目-ら旋ｃＤＮＡ及び２０ｐｍｏｌのプライマー(表１参照)を用いて遂行した。ＰＣＲ反応は、３分、９４℃での初期変性、４０秒９４℃、４０秒５２℃、１分７２℃の三段階サイクリング(３０回)、及び１０分７２℃の増幅終結から構成される。増幅されたＰＣＲ産物を１.２％アガロースゲルにローディングした。エチウムブロマイド染色後に、ゲルをＵＶ透過照明器上で照射してその結果をポラロイドＤＳ-３４即席カメラシステム(コダック、 米国)を用いて測定した。その結果を各々図２及び図３に示した。
【００６３】
図２に示されたように、ＮＦ-κＢ-依存性遺伝子であるＣＯＸ-２及びｉＮＯＳのｍＲＮＡの発現レベルは、半定量的ＲＴ-ＰＣＲによって評価される。 二種類のハウスキーピング遺伝子であるβ-アクチンとＧＡＰＤＨが各々のｍＲＮＡ発現を標準化するために用いられた。図２で示されるように、二つの遺伝子はシスプラチンの投与によって非常に多く誘導され、ザンソリゾールまたはクルクミン同量(２００ｍｇ/ｋｇ)を予め投与した場合においては、シスプラチン-誘導ＣＯＸ-２ ｍＲＮＡの発現が初期水準に留まった。 シスプラチンによるｉＮＯＳの誘導は、ザンソリゾールを予め投与することで、強く抑制された反面、クルクミンを予め投与した場合においては抑制されなかったのである。
【００６４】
図３に示されたように、シスプラチン-誘導肝毒性に対するザンソリゾールの予防的効果と係わった発現された遺伝子を差別的に確認するために、ＤＤＲＴ-ＰＣＲを遂行した。１０セットのプライマー組を用いて表４に示されたシスプラチンによってアップレギュレートされる７個の遺伝子及び表５に示したシスプラチンにってダウンレギュレートされる５個の遺伝子を確認した。半定量的ＲＴ-ＰＣＲを用いて２個のアップレギュレートされる遺伝子(Ｓ１００Ａ９及びｋｉｎ)及び２個のダウンレギュレートされる遺伝子(ＣｌｐＸ及びＣＰ)がザンソリゾールを予め投与することで活性化または抑制されることを確認できたのである。クルクミンと比べてその効果が格段に優れることが確認できたのである。
【００６５】
【表４】
【００６６】
【表５】
【産業上の利用可能性】
【００６７】
このように、ザンソリゾールは抗癌剤の投与により発生される肝毒性、腎毒性のような副作用を抑制するのに優れた効果を発揮するので、抗癌剤で誘発される毒性の抑制剤として有用であり、抗癌剤と混合して抗癌剤組成物として使用時、抗癌効果を維持しながらも副作用を最少化することができる。
【００６８】
本明細書に記載された実施例と図面に示された構成は本発明の最も望ましい一実施例に過ぎず、本発明の技術的思想のすべてを代弁するものではないため、本出願時点においてこれらに代替できる多様な均等物と変更例が有り得ることを理解すべきである。
【図１】
【図２】
【図３】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ザンソリゾール(Ｘａｎｔｈｏｒｒｈｉｚｏｌ)を有効成分として含有することを特徴とする、抗癌剤で誘発される毒性の抑制剤。
【請求項２】
上記抗癌剤で誘発される毒性は肝毒性または腎毒性であることを特徴とする請求項１に記載の抗癌剤で誘発される毒性の抑制剤。
【請求項３】
上記抗癌剤は、シスプラチン(ｃｉｓ−ｄｉａｍｍｉｎｅｄｉｃｈｌｏｒｏｐｌａｔｉｎｕｍ［II］)、カルボプラチン(ｃａｒｂｏｐｌａｔｉｎ)、オキサリプラチン(ｏｘａｌｉｐｌａｔｉｎ)、ネダプラチン(ｎｅｄａｐｌａｔｉｎ)及びこれらの混合物からなる群より選択された白金系抗癌剤であることを特徴とする請求項１または２に記載の抗癌剤で誘発される毒性の抑制剤。
【請求項４】
抗癌剤；及び当該抗癌剤で誘発される毒性を抑制するための有効成分であるザンソリゾール(Ｘａｎｔｈｏｒｒｈｉｚｏｌ)；を含むことを特徴とする抗癌剤組成物。
【請求項５】
上記抗癌剤は、シスプラチン(ｃｉｓ−ｄｉａｍｍｉｎｅｄｉｃｈｌｏｒｏｐｌａｔｉｎｕｍ［II］)、カルボプラチン(ｃａｒｂｏｐｌａｔｉｎ)、オキサリプラチン(ｏｘａｌｉｐｌａｔｉｎ)、ネダプラチン(ｎｅｄａｐｌａｔｉｎ)及びこれらの混合物からなる群より選択された白金系抗癌剤であることを特徴とする請求項４に記載の抗癌剤組成物。
【請求項６】
上記ザンソリゾールの含量は、抗癌剤の総重量対比０．０１倍乃至１０倍であることを特徴とする抗癌剤組成物。
【請求項１】
ザンソリゾール(Ｘａｎｔｈｏｒｒｈｉｚｏｌ)を有効成分として含有することを特徴とする、抗癌剤で誘発される毒性の抑制剤。
【請求項２】
上記抗癌剤で誘発される毒性は肝毒性または腎毒性であることを特徴とする請求項１に記載の抗癌剤で誘発される毒性の抑制剤。
【請求項３】
上記抗癌剤は、シスプラチン(ｃｉｓ−ｄｉａｍｍｉｎｅｄｉｃｈｌｏｒｏｐｌａｔｉｎｕｍ［II］)、カルボプラチン(ｃａｒｂｏｐｌａｔｉｎ)、オキサリプラチン(ｏｘａｌｉｐｌａｔｉｎ)、ネダプラチン(ｎｅｄａｐｌａｔｉｎ)及びこれらの混合物からなる群より選択された白金系抗癌剤であることを特徴とする請求項１または２に記載の抗癌剤で誘発される毒性の抑制剤。
【請求項４】
抗癌剤；及び当該抗癌剤で誘発される毒性を抑制するための有効成分であるザンソリゾール(Ｘａｎｔｈｏｒｒｈｉｚｏｌ)；を含むことを特徴とする抗癌剤組成物。
【請求項５】
上記抗癌剤は、シスプラチン(ｃｉｓ−ｄｉａｍｍｉｎｅｄｉｃｈｌｏｒｏｐｌａｔｉｎｕｍ［II］)、カルボプラチン(ｃａｒｂｏｐｌａｔｉｎ)、オキサリプラチン(ｏｘａｌｉｐｌａｔｉｎ)、ネダプラチン(ｎｅｄａｐｌａｔｉｎ)及びこれらの混合物からなる群より選択された白金系抗癌剤であることを特徴とする請求項４に記載の抗癌剤組成物。
【請求項６】
上記ザンソリゾールの含量は、抗癌剤の総重量対比０．０１倍乃至１０倍であることを特徴とする抗癌剤組成物。
【公表番号】特表２００７−５２１２６０（Ｐ２００７−５２１２６０Ａ）
【公表日】平成１９年８月２日（２００７．８．２）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００６−５１６９４４（Ｐ２００６−５１６９４４）
【出願日】平成１６年６月２４日（２００４．６．２４）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＫＲ２００４／００１５２６
【国際公開番号】ＷＯ２００４／１１２７６４
【国際公開日】平成１６年１２月２９日（２００４．１２．２９）
【公序良俗違反の表示】
（特許庁注：以下のものは登録商標）
１．ポラロイド
【出願人】（５０３３４４０７８）バイオケア カンパニ−リミテッド (4)
【出願人】（５０３３４４０８９）
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成１９年８月２日（２００７．８．２）
【国際特許分類】
【出願日】平成１６年６月２４日（２００４．６．２４）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＫＲ２００４／００１５２６
【国際公開番号】ＷＯ２００４／１１２７６４
【国際公開日】平成１６年１２月２９日（２００４．１２．２９）
【公序良俗違反の表示】
（特許庁注：以下のものは登録商標）
１．ポラロイド
【出願人】（５０３３４４０７８）バイオケア カンパニ−リミテッド (4)
【出願人】（５０３３４４０８９）
【Ｆターム（参考）】
[ Back to top ]