抗癌治療の効力を推定するための感受性試験
本開示は、種々の抗癌治療に対する癌細胞の感受性を決定するための方法、およびこれらの治療の効力を推定するための方法を提供する。具体的には、本開示は、インビトロで患者の癌細胞を候補抗癌治療に曝した後に、患者の癌細胞の感受性を決定することに基づいて、患者における１種以上の候補抗癌治療の効力を推定するための方法を提供する。本開示は、患者の癌細胞のインビトロでの感受性試験および代理宿主に移植したこの患者の癌細胞の代理インビボ効力試験を使用することによって、候補抗癌治療の効力を推定する方法をさらに提供する。本開示は、患者にとって最も有効な抗癌治療を選択し、それによって、効果のないまたは不要な処置を避けるための方法をさらに提供する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（関連技術）
本願は、米国特許出願第６０／４９４０２２号（２００３年８月８日出願）に対する優先権の利益を主張する。
【０００２】
（発明の分野）
本開示は、種々の治療に対する癌細胞の感受性を決定するための方法に関する。具体的には、本開示は、患者における１つ以上の候補抗癌治療の効力を、候補抗癌治療としてスクリーニングされている種々の処置レジメンに対するこの患者の癌細胞の感受性を決定することに基づいて、推定するための方法に関する。この開示は、各患者にとって最も有効な抗癌治療を選択し、それによって、不要な処置を避けるための方法に関する。
【背景技術】
【０００３】
（背景）
現在、最も臨床的に有効な抗癌治療は、試験されるヒト癌細胞のわずか約１０〜５０％において望ましい応答を生じるにすぎず、抗癌処置は、しばしば、望ましくない副作用が付随する。
【０００４】
候補抗癌治療が、癌細胞を阻害または死滅させる能力を測定するための既存の方法としては、新たな腫瘍生検材料におけるテトラゾリウムブルー還元に対する効果を測定すること（Ｂｌａｃｋら，１９５４，Ｊ Ｎａｔ Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｓｔ １４：１１４７−１１５８）、ヒト腫瘍幹細胞のクローニングに対する効果を測定すること（Ｓａｌｍｏｎら，１９７８，Ｎ Ｅｎｇｌ Ｊ Ｍｅｄ ２９８：１３２１−１３２７）、試験されている抗癌剤の存在下および非存在下で、腫瘍細胞による放射性標識チミジンの取り込みに対する効果を測定すること（Ｋｅｒｎら，１９８７，Ｉｎｔｌ Ｊ Ｃｅｌｌ Ｃｌｏｎｉｎｇ ５：４２１−４３１）、生細胞および死細胞の染色特性の差に対する影響を測定すること（Ｗｅｉｓｅｎｔｈａｌら，１９９１，Ｏｎｃｏｌｏｇｙ，５：９３−１０３）が挙げられる。コロニー形成試験は、インビトロで癌細胞の増殖に対する候補抗癌治療の効果を決定するための方法として、現時点では好都合であるが、試験が成功するだけ十分長い期間にわたって、腫瘍細胞はインビトロで十分に増殖しない可能性があることが理解されている。これらの方法の各々は、候補抗癌治療に対する癌細胞の感受性の何らかの尺度を提供するが、これらのアッセイの多くは、完了するまでに１〜３週間を要する。一般に、医師も患者も、結果を得るためにそれほど長い時間待つことはできない。
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【０００５】
（発明の要旨）
本発明は、３〜５日間以内に、種々の抗癌治療に対する患者の癌細胞の感度を決定する方法を提供し、この方法は、この患者から取り出されインビトロで種々の抗癌治療に曝された細胞のＤＮＡ含有量を測定することにより行われる。種々の抗癌治療に対する患者の癌細胞の感受性を決定するための迅速な方法を提供することによって、本発明は、個体ベースで最も有効な抗癌治療を同定および選択するための方法を提供する。種々の抗癌治療に対する患者の癌細胞の感受性を決定するための迅速な方法を提供することによって、本発明は、望ましい性質（例えば、患者の癌細胞に対する高選択的細胞傷害性および患者の非癌細胞に対する低細胞傷害性）を有する治療を同定するために、望まれるだけ多くの候補抗癌治療をスクリーニングするための適した方法を提供する。
【０００６】
本発明は、候補抗癌治療に対する患者の癌細胞の感受性を決定するための方法を提供し、この方法は、患者の癌細胞サンプルを、インビトロでこの候補抗癌治療に曝す工程、この候補抗癌治療に曝した後にこのサンプル中の各癌細胞のＤＮＡ含有量を測定する工程、この候補抗癌治療に曝した後に、このサンプルの細胞周期分布を決定する工程により行われ、ここでこの候補抗癌治療に曝した後のこのサンプルの細胞周期分布における変化は、この患者の癌細胞が、この候補抗癌治療に対して感受性であることを示す。特に、本発明は、候補抗癌治療に対する患者の癌細胞の感受性を決定するための方法を提供し、ここでこの候補抗癌治療に曝した後の癌細胞のサンプルにおけるＧ１期に達しない集団の増加は、この治療がこの患者の癌細胞に対して細胞傷害性であることを示す。この候補抗癌治療に曝した後のこのサンプル中のＧ２／Ｍ期集団の増加は、この治療が、この患者の癌細胞の増殖を阻害することを示す。
【０００７】
本発明は、候補抗癌治療に対する患者の癌細胞の感受性を決定するための方法を提供し、この方法は、この候補抗癌治療に対するこの患者の非癌細胞の感受性を決定する工程もまた包含する。
【０００８】
本発明は、候補抗癌治療に対する患者の癌細胞の感受性を迅速に決定するための方法を提供し、この方法は、この患者の癌細胞のサンプルを、インビトロでその候補抗癌治療に曝す工程、この候補抗癌治療に曝した後にこのサンプル中の各癌細胞のＤＮＡ含有量を測定する工程、この候補抗癌治療に曝した後に、このサンプルの細胞周期分布を決定する工程により行われ、ここでこの方法は、約３日間〜約５日間以内に完了する。本発明は、約３日間以内に候補抗癌治療に対する患者の癌細胞の感受性を決定するための方法を提供する。本発明は、約４日間以内に候補抗癌治療に対する患者の癌細胞の感受性を決定するための方法を提供する。本発明は、約５日間以内に候補抗癌治療に対する患者の癌細胞の感受性を決定するための方法を提供する。
【０００９】
本発明は、複数の候補抗癌治療に対する患者の癌細胞の感受性を決定するための方法を提供し、この方法は、複数の癌細胞のサンプルを複数の候補抗癌治療に曝す工程によって行われる。各治療に対するこの患者の癌細胞の感受性に基づいて、この候補抗癌治療の有効性を順位付けする方法、およびこの患者にとって最も有効な候補抗癌治療を同定するための方法が提供される。
【００１０】
本発明は、候補抗癌治療に対する患者の癌細胞の感受性を迅速に決定するための方法を提供し、この方法は、この患者の癌細胞のサンプルを、インビトロでその候補抗癌治療に曝す工程、この候補抗癌治療に曝した後にこのサンプル中の各癌細胞のＤＮＡ含有量を測定する工程、この候補抗癌治療に曝した後に、このサンプルの細胞周期分布を決定する工程により行われ、ここでこの候補抗癌治療は、ＤＮＡ損傷因子またはＧ２チェックポイント抑止因子であり得る。本発明は、例えば、以下の１種以上の非ペプチドＧ２チェックポイント抑止化合物に対する患者の癌細胞の感受性を決定するための方法を提供する：４−クロロ−安息香酸４−メトキシ−フェニルエステル（ＣＤＢＣ００４）、４−クロロ−安息香酸ｐ−トリルエステル（ＣＢＤＣ４０１）；４−ブロモ−安息香酸ｐ−トリルエステル（ＣＢＤＣ４０２）；３，４，５−トリフルオロ−安息香酸ｐ−トリルエステル（ＣＢＤＣ４０３）；４−フルオロ−安息香酸４−ブロモ−フェニルエステル；エタンとの化合物（ＣＢＤＣ４０４）、３，４−ジクロロ−安息香酸ｐ−トリルエステル；エタンとの化合物（ＣＢＤＣ４０５）、２，４−ジクロロ−安息香酸ｐ−トリルエステル；エタンとの化合物（ＣＢＤＣ４０６）、４−フルオロ−安息香酸ｐ−トリルエステル；エタンとの化合物（ＣＢＤＣ４０７）、２，３，４，５，６−ペンタフルオロ−安息香酸ｐ−トリルエステル；エタンとの化合物（ＣＢＤＣ４０８）、４−クロロ−安息香酸３，４−ジメチル−フェニルエステル；エタンとの化合物（ＣＢＤＣ４０９）、４−クロロ−安息香酸４−ヒドロキシ−フェニルエステル；エタンとの化合物（ＣＢＤＣ４１０）、４−フルオロ−安息香酸４−ヒドロキシ−フェニルエステル；エタンとの化合物（ＣＢＤＣ４１１）、４−ブロモ−安息香酸４−フルオロ−フェニルエステル（ＣＢＤＣ４１２）、４−ブロモ−安息香酸４−トリフルオロメチル−フェニルエステル（ＣＢＤＣ４１３）、４−ブロモ−安息香酸４−ヒドロキシ−フェニルエステル（ＣＢＤＣ４１４）、４−ブロモ−安息香酸４−トリフルオロメトキシ−フェニルエステル（ＣＢＤＣ４１５）、４−ブロモ−安息香酸６−メチル−ピリジン−３−イルエステル（ＣＢＤＣ４１８）、４−ブロモ−チオ安息香酸O−ｐ−トリルエステル（ＣＢＤＣ４４０）、４−ブロモ−ジチオ安息香酸ｐ−トリルエステル（ＣＢＤＣ４４１）、または４−ブロモ−チオ安息香酸Ｓ−ｐ−トリルエステル（ＣＢＤＣ４４２）。本発明は、例えば、以下の１種以上のＧ２チェックポイント抑止ペプチドまたはＧ２チェックポイント抑止ペプチド模倣物に対する患者の癌細胞の感受性を決定するための方法を提供する：ＣＢＰ５００（配列番号２６）、ＣＢＰ５０１（配列番号２７）、ＣＢＰ５０４（配列番号２９）、ＣＢＰ５０５（配列番号３０）、ＣＢＰ５０６（配列番号３１）、ＣＢＰ５１０（配列番号３２）、ＣＢＰ５１１（配列番号３３）、ＣＢＰ５１２（配列番号３４）、またはＣＢＰ６０３（配列番号３７）。
【００１１】
本発明は、候補抗癌治療に対する患者の癌細胞の感受性を迅速に決定するための方法を提供し、この方法は、この患者の癌細胞のサンプルを、インビトロでその候補抗癌治療に曝す工程、この候補抗癌治療に曝した後にこのサンプル中の各癌細胞のＤＮＡ含有量を測定する工程、この候補抗癌治療に曝した後に、このサンプルの細胞周期分布を決定する工程により行われ、ここでこの抗癌治療は、併用療法である。併用療法は、特に、ＤＮＡ損傷因子およびＧ２チェックポイント抑止因子の併用が癌細胞に対して選択的に細胞傷害性である場合、ＤＮＡ損傷因子およびＧ２チェックポイント抑止因子を含む。このＧ２チェックポイント抑止因子は、ＤＮＡ損傷因子の細胞傷害性効果に対して癌細胞を選択的に感受性にする併用療法の効力を推定するための方法が提供される。１つの併用療法において、このＤＮＡ損傷因子はイリノテカン（ＣＰＴ−１１）であり、このＧ２チェックポイント抑止因子はＣＢＤＣ４０２である。別の併用療法において、このＤＮＡ損傷因子はイリノテカン（ＣＰＴ−１１）であり、このＧ２チェックポイント抑止因子はＣＢＤＣ００４である。別の併用療法において、このＤＮＡ損傷因子はシスプラチン（ＣＤＤＰ）であり、このＧ２チェックポイント抑止因子はＣＢＰ５０１（配列番号２７）である。
【００１２】
本発明は、候補抗癌治療に対する患者の癌細胞の感受性を決定するための方法を提供し、この方法は、インビトロで癌細胞の感受性を測定する工程を包含し、候補抗癌治療の代理インビボ効力試験もまた包含する。この代理効力試験は、異種移植片腫瘍アッセイであり、このアッセイは、この患者の癌細胞のサンプルを代理宿主に移植する工程、この代理宿主において腫瘍を形成させる工程、この代理宿主を候補抗癌治療で処置する工程、およびこの腫瘍に対するこの候補抗癌治療の効果を測定する工程を包含する。
【００１３】
本発明は、患者に対する抗癌治療の効果を推定するための方法を提供し、この方法は、この患者の癌細胞のサンプルを、この候補抗癌治療にインビトロで曝す工程、この候補抗癌治療に曝した後に、この癌細胞のサンプルの細胞周期分布を決定する工程、およびこの患者の癌細胞に対するこの候補抗癌治療の細胞傷害性を決定する工程、を包含する。本発明は、この候補抗癌治療の安全性を決定するための方法をさらに提供し、この方法は、この患者の非癌細胞のサンプルを、この候補抗癌治療にインビトロで曝す工程、およびこの患者の非癌細胞に対するこの候補抗癌治療の細胞障害性を決定する工程による。
【００１４】
本発明は、患者にとって最も有効な抗癌治療を選択するための方法を提供し、この方法は、複数の候補抗癌治療に対してこの患者の癌細胞および非癌細胞の感受性を決定する工程、この患者の癌細胞および非癌細胞に対する各候補抗癌治療の細胞傷害性を決定する工程、ならびにこの細胞に対して最大の細胞傷害性を有しかつこの患者の非癌細胞に対して最小の細胞傷害性を有する治療を選択する工程により行われる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１５】
（発明の詳細な説明）
本開示は、種々の抗癌治療に対する癌細胞の感受性を決定するための方法を提供する。特に、本開示は、患者における種々の抗癌治療の効力を、種々の抗癌治療に対する患者の癌細胞の感受性を決定することに基づいて、推定するための方法を提供する。この開示は、患者にとって最も有効な抗癌治療を、候補抗癌治療としてスクリーニングされている化合物および／または処置に対する患者の癌細胞の感受性を決定するためのエキソビボ方法に基づいて、選択するための方法をさらに提供する。多くの候補治療が、患者の癌細胞に対する適切な高レベルの選択的細胞傷害性、かつこの患者の非癌細胞に対する許容可能に低いレベルの非選択的細胞傷害性を有する治療を見出すためにスクリーニングされ得る場合、非特異的な副作用がより少ない、有効な抗癌治療を選択するための方法が提供される。従って、本開示は、患者を処置する前に、種々の抗癌治療に対する患者の癌細胞の応答を推定するための方法を提供する。その結果、各患者にとって最も有望な処置レジメンが選択され得、不要な処置または効果のない処置が避けられ得る。本願の主題は、全体が参考として援用される、米国特許出願第１０／４５７，０２９号（２００３年６月６日出願）の主題に関連する。
【００１６】
別段規定されなければ、本明細書で使用される全ての技術用語および科学用語は、本発明が属する分野の当業者によって一般に理解されている意味を有する。本明細書で使用される場合、単数形「１つの（ある）（ａ）」、「および（と）（ａｎｄ）」、「この（その）（ｔｈｅ）」、「である（ｉｓ）」は、文脈が明らかに別のものを示さなければ、複数形を包含する。例えば、１つの「化合物」に対する言及は、複数の化合物を包含し、「（１つの）残基」または「（１つの）アミノ酸残基」に対する言及は、１つ以上の残基および１つ以上のアミノ酸に対する言及を包含する。本明細書で引用される全ての刊行物、特許、および特許出願は、全ての目的で、明白に参考として本明細書に援用される。
【００１７】
（抗癌治療の効力を推定するための方法）
本発明は、抗癌治療の効力を推定するための方法を提供する。特に、増殖性障害（例えば、癌（転移性および非転移性の固形腫瘍または液状腫瘍（ｌｉｑｕｉｄ ｔｕｍｏｒ）が挙げられる））に対して有効な候補治療を同定するための方法が提供される。より具体的には、増殖性障害に罹患している個々の被験体（特にヒト患者）にとって最も有効な候補治療を同定するための方法が提供される。本明細書に提供される方法は、同様に、増殖性障害を処置する（例えば、癌（転移性および非転移性の固形腫瘍または液状腫瘍（ｌｉｑｕｉｄ ｔｕｍｏｒ）が挙げられる）を処置する）ために使用され得る。本明細書で使用される場合、用語「増殖性障害」および「増殖性状態」とは、少なくとも１つの細胞の異常な増殖または望ましくない増殖により特徴づけられる任意の病理的生理学的状態または非病理的生理学的状態（望ましくないかまたは所望されていない細胞増殖または細胞生存によって特徴づけられる状態、欠損したアポトーシスまたは異常なアポトーシスによって特徴づけられる状態、ならびに異常な細胞生存または望ましくない細胞生存または所望されない細胞生存により特徴づけられる状態が挙げられる）を意味する。本明細書で使用される場合、用語「癌」とは、増殖性障害をいう。本明細書で使用される場合、用語「癌細胞」とは、増殖性障害（例えば、癌）の異常な細胞増殖特性を受けているか、またはこのような特性を受ける可能性がある、細胞をいう。本明細書で使用される場合、「抗癌治療」とは、被験体における増殖性障害（特に、癌）の症状を阻害、改善、低減するかまたはその増殖症外を排除する、処置レジメンをいう。「抗癌治療」は、１つ以上の化合物、１つ以上の物理的処置（例えば、照射、熱、またはさらに手術）、または化合物と物理的処置との併用を包含し得る、処置レジメンをいう。「候補抗癌治療」とは、被験体における増殖性障害（特に、癌）の症状を阻害、改善、低減するか、またはその増殖性障害を排除することを意図した処置レジメンをいい、ここでこの候補抗癌治療は、本発明の方法に従って施されている。
【００１８】
本明細書に提供される方法は、増殖性障害（例えば、癌）を受けやすい任意の被験体におけるこのような障害に対して有効な、候補抗癌治療を同定するために使用され得る。用語「被験体」とは、動物、代表的には、哺乳動物（例えば、霊長類（ヒト、サル、テナガザル、チンパンジー、オランウータン、マカク）、家畜（イヌおよびネコ）、家畜（ｆａｒｍ ａｎｉｍａｌ）（ウマ、ウシ、ヤギ、ヒツジ、ブタ）および実験動物（マウス、ラット、ウサギ、モルモット）をいう。被験体としては、動物疾患モデル（例えば、腫瘍を保有するマウスまたはラット）、特に、ヒト癌細胞がマウスに移植されて腫瘍を形成する異種移植片マウスモデルが挙げられる。本明細書で使用される場合、用語「患者」とは、抗癌治療での処置が必要なヒト被験体をいう。
【００１９】
本発明は、被験体に由来する癌細胞を提供する工程、癌細胞と、候補抗癌治療剤とを接触させる工程、および候補抗癌治療に曝された癌細胞のサンプルの１細胞あたりのＤＮＡ含有量を決定する工程を包含する方法を提供する。以下に開示されるように、候補抗癌治療に曝された細胞のサンプル中の各癌細胞のＤＮＡ含有量を決定することにより、この候補治療が、癌細胞に対して望ましい細胞傷害性効果または阻害性効果を有するか否かを決定することが可能になる。本発明の方法はまた、一般に、被験体に由来する非癌（正常）細胞を使用して、この候補治療が癌細胞に対する選択的効果を有するか否かを決定するために、同じ工程を実施することを包含することが理解される。本発明は、種々の抗癌治療に対する被験体の癌細胞の感受性を決定するためのエキソビボ方法、試験される各抗癌治療の有効性および安全性を推定するためのエキソビボ方法、ならびに短時間で最も有効な治療を選択するためのエキソビボ方法を提供する。
【００２０】
本明細書に提供される方法は、候補抗癌治療をスクリーニングして、特定の被験体にとって最も有効な抗癌治療を同定するために適している。本発明の一局面に従って、癌細胞は、患者から単離され、候補抗癌治療に曝され、各サンプルにおける各細胞のＤＮＡ含有量が決定される。このことは、患者の癌細胞に対する各候補抗癌治療の効果のインビトロでの測定を提供し、これによって、各候補治療に対する患者の癌細胞の感受性のインビトロでの推定を提供する。一実施形態において、上記のインビトロ方法は、多くの候補抗癌治療をスクリーニングして、患者の癌細胞に対するそれらの有効性を決定するために適している。別の実施形態において、上記のインビトロ方法は、複数の患者に由来する癌細胞を用いて実施される。別の実施形態において、上記のインビトロ方法は、抗癌治療における候補化合物または候補処置の潜在的有用性についてこれらの化合物または処置をスクリーニングするために使用される。別の実施形態において、上記のインビトロ方法は、複数の患者に由来する細胞を使用して実施されて、抗癌治療におけるそれらの潜在的有用性について、候補化合物または候補処置がスクリーニングされる。
【００２１】
本発明の方法はまた、一般に、被験体に由来する非癌（正常）細胞を用いて、候補治療が癌細胞に対して選択的効果を有するか否かを決定するために、同じ工程を実施することを包含することが理解される。非癌細胞に対する効果を測定することはまた、患者の癌細胞に対して有効であると思われる候補抗癌治療の安全性および潜在的副作用を推定するために使用され得る。一実施形態において、非癌細胞に対する効果は、試験されている各候補抗癌治療について測定される。別の実施形態において、非癌細胞に対する効果は、患者の癌細胞に対して望ましい細胞傷害性または阻害性効果を有すると同定された各候補抗癌治療について測定される。
【００２２】
本明細書に提供される方法は、実験動物モデルを使用して、候補抗癌治療をスクリーニングするために適している。一局面に従って、候補抗癌治療は、種々の増殖性障害に対する動物モデルまたは代理と考えられる動物から単離された癌細胞に対するインビトロ効果を測定することによって、スクリーニングされ得る。特に、候補抗癌治療は、特定の型の癌に関する動物モデルまたは代理と考えられる動物から単離された癌細胞に対するインビトロ効果を測定することによってスクリーニングされ得る。一実施形態において、このインビトロスクリーニング方法は、特定の型の癌の１以上の動物モデルに由来する細胞を使用して、多数の候補抗癌治療をスクリーニングするために使用される。別の実施形態において、このインビトロスクリーニング方法は、特定の型の癌の１以上の動物モデルに由来する細胞を使用して、抗癌治療におけるそれらの潜在的有用性について、候補化合物または候補処置をスクリーニングするために使用される。
【００２３】
本発明の方法は、培養した細胞のインビトロ感受性試験、および代理インビボ効力試験を使用して、候補抗癌治療をスクリーニングするために特に適している。このことにより、候補抗癌治療に対する患者の癌細胞の感受性を推定するための少なくとも２つのエキソビボ方法を提供する。上記異種移植片腫瘍アッセイは、本発明に従って、候補抗癌治療についての適切な代理インビボ効力試験を提供する。インビトロ感受性試験、および異種移植片腫瘍アッセイを用いる代理インビボ効力試験の両方を使用する実施形態の非限定的な例が、以下の実施例１、２、および３において開示される。ヒト患者から単離された癌細胞は、培養において増殖され、１つ以上の候補抗癌治療に曝され、各細胞のＤＮＡ含有量が測定される。このことにより、各候補治療に対するその患者の癌細胞の感受性のインビトロでの尺度を提供する。異種移植片腫瘍アッセイにおいて、ヒト被験体から単離された癌細胞は、適切な宿主（例えば、マウス）に移植されて、腫瘍を形成する。その後、この宿主動物は、候補抗癌治療で処置されて、腫瘍増殖に対する効果が、測定される。宿主において移植されたヒト腫瘍に対する候補抗癌治療の効果を測定することによって、異種移植片腫瘍アッセイは、候補治療にヒト患者を曝さす必要なしに、各候補治療に対する患者の癌細胞の感受性についｔれ、第２の代理のインビトロでの尺度を提供する。非癌細胞はまた、患者から単離され、上記のインビトロ方法を使用して試験されて、候補抗癌治療の安全性および潜在的副作用を決定し得ることが理解される。
【００２４】
インビトロ感受性試験および代理インビボアッセイの両方を包含する方法は、特に臨床状況において、候補抗癌治療に対する患者の癌細胞の感受性を推定するための、安全かつ有効な方法を提供する。さらに、このような方法は、インビトロでの結果の確認を提供し、あり得る副作用を検出するための代理アッセイ系を提供する。最後に、このような方法は、標準的な処置のインビトロでの効果および代理のインビボでの効果を測定し、これらの効果を、候補抗癌治療（特に、新規な候補抗癌治療またはこれまでに試験されていない候補抗癌治療）のインビトロでの効果および代理のインビボでの効果とを比較することにより、スクリーニングアッセイを較正するための手段を提供する。
【００２５】
本発明は、患者に合わせて調整された抗癌治療を設計するための方法を提供し、より好都合な応答速度を提供する。さらに、本発明は、患者において不要な、危険な、またはあまり有効でない抗癌治療の使用を避け、それによって、所望されない副作用を避けるかまたは最小にするための方法を提供する。
【００２６】
一局面に従って、本発明の方法は、患者の癌細胞が感受性である抗癌治療のみを選択して使用するためのガイダンスを提供し、これによって、その患者について成功する可能性が低い治療を避けることによって、費用効率を提供する。成功する可能性が低い処置を避けることによって、この患者は、効果のない処置の副作用を被ることから保護される。種々の実施形態において、患者の癌細胞の感受性は、その細胞が患者から取り出されて後に、約２日間以内、３日間以内、４日間以内、５日間以内、６日間以内、７日間以内、８日間以内、９日間以内または１０日間以内に決定され得る。特定の実施形態において、患者の癌細胞の感度は、患者から取り出されてから約３日〜約５日後に、決定され得る。
【００２７】
（試験用の細胞）
一局面によれば、癌細胞は、以下の方法（末梢血の採血、骨髄の吸引、組織（腫瘍）生検、または例えば、腫瘍または他の癌組織を取り出す手術の間に外科的に癌細胞を取り出すことが挙げられるが、これらに限定されない）を用いて、被験体（特定にヒト患者）から細胞を単離することによって提供される。非癌細胞がまた、特定の実施形態において処置されている場合、これらの細胞は、被験体の適切な位置から単離され得る。必要であれば、細胞は、１つ以上の候補抗癌治療に曝す前に、さらに走査され得る（例えば、細胞塊を、酵素消化して、単一の細胞懸濁物を調製し得るか、または細胞集団を、細胞培養を用いてインビトロで拡大し得る）。本発明の方法は、広く種々の癌（癌腫、新生物、増殖性障害）に由来する癌細胞を試験するために使用され得る。これらの癌としては、卵巣癌、膀胱癌、肺癌（小細胞癌を含む）、子宮頚癌、乳癌、前立腺癌、神経膠腫、線維肉腫、網膜芽腫、黒色腫、軟部組織肉腫、骨肉腫、白血病、胃癌、結腸癌、腎臓の癌腫、胃腸癌、唾液腺の癌、膵臓癌、ホジキン病、非ホジキンリンパ腫、急性リンパ性白血病および慢性リンパ性白血病、多発性骨髄腫、神経芽腫、ウィルムス腫瘍、精巣癌、軟部組織肉腫、慢性リンパ性白血病、原発性マクログロブリン血症、慢性顆粒球性白血病、原発性脳癌腫、悪性膵臓インスリノーマ、悪性類癌腫（ｃａｒｃｉｎｏｉｄ ｃａｒｃｉｎｏｍａ）、悪性黒色腫、絨毛上皮腫、菌状息肉腫、頭部および頸部の癌腫、骨原性肉腫、膵臓癌種、急性顆粒球性白血病、ヘアリーセル白血病、神経芽腫、横紋筋肉腫、カポージ肉腫、尿生殖器の癌腫、甲状腺の癌種、食道の癌腫、悪性高カルシウム血症、頸部過形成、腎細胞癌、子宮内膜癌腫、真性赤血球増加症、本態性血小板減少症、副腎皮質癌腫、皮膚癌、および前立腺癌腫が挙げられるが、これらに限定されない。当業者は、本明細書に提供される教示を適合させて、本明細書に列挙されていない他の癌に対する候補抗癌治療の有効性を試験し得ることが、理解される。同様に、当業者は本明細書に提供される方法を実施して、任意の増殖性障害の適切な動物モデルを使用して、候補抗癌治療の効力を試験し得ることが、理解される。
【００２８】
一局面に従って、正常（非癌）細胞のサンプルおよび癌細胞のサンプルのＤＮＡ含有量を別個に分析して、インビトロでの感受性試験の精度を高めるための方法が提供される。一実施形態において、癌細胞および正常（非癌）細胞は、別個の位置から取り出され、そのサンプルは、いつでも別個に保持される。正常細胞および癌細胞の両方が存在するサンプルにおいて、これらの細胞は、種々の方法によって区別され得、これらの方法としては、正常細胞と癌細胞との間を区別する抗体または他のプローブを使用すること、癌細胞における異数性を検出すること、または正常細胞と癌細胞との間の形態的な差異を観察することが挙げられる。一実施形態において、混合サンプル中の正常細胞および癌細胞は、ＤＮＡ含有量を分析する前に、別個のサンプルに分けられて細胞周期が決定される。別の実施形態において、混合サンプル中の正常細胞および癌細胞が分析され、その細胞型（正常または癌）が、各細胞のＤＮＡ含有量が測定されると同時に区別される。
【００２９】
種々の癌から単離された癌細胞に対する抗癌治療の効果を別個に分析するための方法が、本明細書で提供される。一局面に従って、候補抗癌治療の効果は、種々の位置から単離された癌細胞サンプルについて別個に評価される。一実施形態において、癌細胞サンプルは、患者の身体内の種々の位置からの癌細胞が等しい感受性を有するか否かを決定するために、その種々の位置における癌組織から採取される。一実施形態において、癌細胞は、その身体の種々の位置で見出される別個の腫瘍から単離される。一実施形態において、癌細胞は、１種を超える形態で存在する癌（例えば、いくつかの位置では固形腫瘍を形成し、血液もしくはリンパ中に循環もする、癌）から単離される。別の実施形態において、癌細胞は、癌組織内の種々の位置から（例えば、単一の腫瘍内の複数の位置から、または肝臓組織、肺組織、もしくは乳房組織内の複数の位置で癌細胞が増殖しているこれらの組織から）単離される。別の局面に従って、癌細胞のサンプルは、異なる個体から単離された同じ型の癌細胞の感受性を比較するために、同じ型の癌と診断された複数の患者から、採取される。
【００３０】
（サンプル中の細胞周期の決定）
本発明は、候補抗癌治療に対する被験体の癌細胞の感受性を決定するための方法を提供し、この方法は、以下に記載される細胞周期分布に対する影響を測定することにより行われる。候補抗癌治療に対して曝露した後のサンプルの細胞周期分布のシフトは、サンプル中の細胞が、治療に対して高感度であったことを示す。サンプル中の各細胞のＤＮＡ含有量を測定し、各細胞の細胞周期段階を決定することによって、正常細胞周期段階（Ｇ０／Ｇ１、Ｓ、およびＧ２／Ｍ）の各々にあるサンプル中の細胞数、ならびにサンプル中の死細胞（「Ｇ１期に達していない」細胞）数および異数性細胞数を決定することが可能である。従って、「サンプル中の細胞周期分布を決定すること」とは、正常細胞周期段階（Ｇ０／Ｇ１、Ｓ、およびＧ２／Ｍ）にあるサンプル中の細胞の割合、およびサンプル中の死細胞（「Ｇ１期に達していない」細胞）と異数性細胞の割合を決定することをいう。
【００３１】
本発明に従って、候補癌治療で処置された細胞のサンプル中の各細胞のＤＮＡ含有量および細胞周期段階は、ＤＮＡに化学量論的に結合し、かつ核におけるＤＮＡ量に比例する検出可能なシグナルを発する化合物で、細胞ＤＮＡを染色し、次いで、選択されたＤＮＡ染色化合物に適した任意の方法を用いて１細胞あたりのＤＮＡ含有量を決定することを包含する、組成物および方法を用いて決定され得る。適切な化合物としては、ヨウ化プロピジウム（ＰＩ）、ブロモデオキシウリジン（ＢｒｄＵ）、Ｈｏｅｃｈｓｔ色素（特に、Ｈｏｅｃｈｓｔ ３３３４２）、サイバーグリーン、ミトラマイシン、ＤＡＰＩ、または当該分野で公知の他のＤＮＡ染色化合物が挙げられるが、これらに限定されない。細胞のＤＮＡ含有量は、種々のアプローチ（例えば、フローサイトメトリー、レーザースキャンニングサイトメトリー、ならびに当該分野で公知の他の適切な方法、および以下の実施例において記載される他の適切な方法、ならびに例えば、Ｇｉｖａｎ、Ｆｌｏｗ Ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ：Ｆｉｒｓｔ Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ（Ｗｉｌｅｙ，２００２）またはＳｈａｐｉｒｏ，Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ｆｌｏｗ Ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ，第４版（Ｗｉｌｅｙ，２００３）に記載される方法）を用いて分析され得る。
【００３２】
細胞のＤＮＡ含有量は、細胞の細胞周期段階の指標として使用され得る。ここでこのＤＮＡ含有量は、ＤＮＡに化学量論定に結合する蛍光色素（例えば、ヨウ化プロピジウム（ＰＩ））の蛍光強度に比例する。サンプル中で、細胞周期のＧ１期（第１のギャップ）、Ｓ期（ＤＮＡ合成）、Ｇ２／Ｍ期（第２のギャップ／有糸分裂）の各々における細胞の分布は、集団中の各細胞の核ＤＮＡ含有量を測定することによって決定され得る。Ｇ２／Ｍ細胞のＤＮＡ含有量は、Ｇ１細胞のＤＮＡ含有量の２倍である。Ｓ期の細胞は、Ｇ１期集団とＧ２／Ｍ期集団との間に分布する。細胞周期が回っていない細胞は、Ｇ０期にあると考えられる。
【００３３】
数学的処理（逆重畳が挙げられるが、これらに限定されない）は、ＤＮＡ含有量の測定値を、サンプル中の細胞集団の細胞周期分布の代表に変換するために、使用される。細胞周期分布を表す１つの一般的な方法は、特定のＤＮＡ含有量を有する細胞数を示す「ヒストグラム」を生成することである。一般に、類似のＤＮＡ含有量を有する細胞集団を表すヒストグラムのクラスターの代表は、特定の値の周りに集まった「ピーク」のように見えるものを形成する。正常（非癌）細胞のＤＮＡヒストグラムは、大きな正規分布した（ガウス）ピーク（これは、二倍体のＧ０／Ｇ１細胞のＤＮＡ含有量を示す）により通常特徴づけられる。癌細胞のＤＮＡ含有量は、しばしば正常なＤＮＡ含有量から変動するので、癌細胞のサンプルは、しばしば、ＤＮＡヒストグラム上の異なる水平（ｘ軸）位置で第２のＧ０／Ｇ１ピーク中に示される。２つ（または２以上）のＧ０／Ｇ１ピークの出現が、ＤＮＡ含有量異常性が存在することを確立することにおいて重要な特徴である。細胞周期が回っていない集団、すなわち細胞周期が停止した集団は、しばしば、Ｓ期細胞およびＧ２／Ｍ細胞を欠いているが、細胞周期が回っている集団は、大きな割合のＳ期細胞およびＧ２／Ｍ細胞を有する。細胞周期が停止した癌細胞は、ときおり、他の細胞集団に比較して、Ｓ期およびＧ２／Ｍに存在する細胞数が有意に減少しており、そして／またはＧ０／Ｇ１に存在する細胞数が有意に増大している、細胞集団と同定され得る。
【００３４】
死細胞および異数体細胞はまた、それらのＤＮＡ含有量に基づいて同定され得る。アポトーシス（細胞死）の間に、ＤＮＡは、エンドヌクレアーゼによりフラグメント化され、これらの小さなＤＮＡフラグメントは、細胞から外に漏出し得、Ｇ１期よりも少ない、減少した総ＤＮＡ含有量を生じる。従って、「Ｇ１期に達していない」蛍光ピークは、集団中の死細胞数を示すと理解される。
【００３５】
本発明に従って、候補抗癌治療に曝した後のサンプル中の細胞周期分布における変化は、細胞がその治療に感受性であることを示す。細胞周期分布における特定の変化は、感受性細胞に対する抗癌治療の作用の様式の指標として使用され得る。候補抗癌治療に曝されたサンプル中のＧ１期に達していない集団の増大は、その治療がそのサンプル中の細胞に対して細胞傷害性であったことを示すと理解される。特に、候補抗癌治療に曝した癌細胞のサンプル中のＧ１期に達していない集団の増大は、この治療が、これらの癌細胞に対して細胞傷害性であったことを示すと理解される。この候補抗癌治療に曝した後のサンプル中のＧ２／Ｍ集団の増大は、この治療がこのサンプル中の細胞の増殖（分裂、有糸分裂）を示すと理解される。特に、候補抗癌治療に曝した後の癌細胞のサンプル中のＧ２／Ｍ集団における増大は、この治療が癌細胞の集団を阻害することを示すと理解される。
【００３６】
特定の実施形態において、患者の癌細胞に対して細胞傷害性である抗癌治療が好ましい。他の実施形態において、患者の癌細胞の増殖を阻害する抗癌治療が好ましい。他の実施形態において、感受性の癌細胞に対して他の効果を有する抗癌治療が好ましい。当業者は、特定の実施形態について調べた抗癌治療の作用の好ましい態様を決定し得る。
【００３７】
上記のように、正常（非癌）細胞も、一般に、候補抗癌治療に曝され、それらのＤＮＡ含有量もまた、この抗癌治療の選択性を決定する「コントロール」として測定される。本発明のこの局面に従って、候補抗癌治療に曝露した後の正常（非癌）細胞のサンプルにおけるＧ１期に達していない集団の増大は、非選択的細胞傷害性を示す。逆に、癌細胞のサンプルにおけるＧ１期に達していない集団の増大、および同じ患者に由来する正常（非癌）細胞のサンプル中のＧ１期に達していない集団が、ほとんどまたは全く増大していないことにより、研究されている患者に由来する癌細胞に対する候補抗癌治療の選択的細胞傷害性が示される。癌細胞に対する選択的細胞傷害性を有する抗癌治療が好ましいことが理解される。
【００３８】
（さらなるパラメーターの測定）
本発明の別の局面に従って、候補抗癌剤の効力を決定するための方法は、必要に応じて、ＤＮＡ含有量以外の他のパラメーターを測定することを包含する。いくつかの場合において、さらなる測定が、候補抗癌治療の標的をより正確に決定するために使用され得る。望ましい場合、癌細胞が、例えば、研究されている癌の型に特異的な抗体で標識され得る。同様に、当業者は、研究されている癌の他の特有の特徴（例えば、研究されている癌細胞を特徴づける、遺伝子発現または酵素活性）を測定し得る。遺伝子発現は、当該分野で公知の方法を用いて測定され得る。これらの方法としては、特異的ｍＲＮＡまたは特異的タンパク質のレベルを決定することが挙げられるが、これらの限定されない。タンパク質レベルは、例えば、特異的抗血清を用いるウェスタンブロッティングにより、またはコードされたタンパク質の活性を測定することにより、例えば、癌関連転写因子の活性を検出するためにＤＮＡゲルシフトアッセイを用いることにより、またはこのような因子によって活性化されることが公知の遺伝子の発現を分析することにより、分析され得る。発現はまた、例えば、ｍＲＮＡ転写物を検出するための特異的プローブでのノーザンブロッティングにより、遺伝子転写物を測定することにより測定され得る。研究されている癌細胞の特有の特徴を測定することにより、これらの細胞の正体の確認が提供され得る。さらに、特有の特徴を測定することにより、どのような特有の特徴が候補抗癌治療により標的化されるかもまた示され得る。
【００３９】
候補抗癌治療の他の効果のさらなる測定を行うことも可能である。例示すると、細胞の大きさおよび形態は、細胞周期停止状態にある癌細胞を同定するためのさらなる手がかりを提供するために使用され得る。サンプル中の小さな癌細胞は、細胞周期が停止した癌細胞であり得、それらの大きさにより、これらの癌細胞が（より大きな）悪性の対応物から分化することになる。癌細胞形態に関して、細胞周期が停止した癌細胞はまた、一般に、活発でない外観を有する核（例えば、凝集したクロマチンを有する核、または異常な核小体もしくは顕著な核小体を有する核）を有する細胞として同定され得る。癌細胞は、細胞性癌原遺伝子のような特定の重要な遺伝子の発現に基づいて、周期が停止中であると同定され得る。例えば、ｃ−ｍｙｃ遺伝子の発現の減少は、停止した細胞の１つの指標であり得る。ＡＰ１転写因子をコードする遺伝子（例えば、ｃ−ｊｕｎ、およびなおより具体的には、ｃ−ｆｏｓ）の発現の増大もまた、細胞周期が停止した癌細胞に特徴的であると考えられる。特定の実施形態において、細胞周期が停止した癌細胞の測定は、特定の患者に由来する特定の型の癌細胞を停止させるが、死滅させない候補抗癌治療を同定するために有用であり得る。
【００４０】
（抗癌治療）
本発明は、被験体に対する抗癌処置の効力を推定するための方法を提供し、この方法は、この抗癌治療に対するこの被験体の癌細胞の感受性を決定する工程によって行われる。本発明の方法に従って、癌細胞は、候補抗癌化合物の存在下または非存在下で、インビトロで癌細胞を培養する工程、またはインビトロで培養した癌細胞を、候補の抗癌性物理的処理で処理する工程を包含するが、これらに限定されない方法を用いて、候補抗癌治療と接触される。本発明の方法において使用するために適した抗癌治療としては、ＤＮＡ損傷因子、Ｇ２チェックポイント抑止非ペプチド化合物、Ｇ２チェックポイント抑止ペプチドおよびＧ２チェックポイント抑止ペプチド模倣物、ならびに併用療法が挙げられるが、これらに限定されない。当業者は、本明細書に記載されていない候補抗癌治療の有効性を評価するために、本発明の方法を利用し得、本発明の方法を実施することによって得られた結果に基づいて、患者に対して個々に合わせた処置計画を展開し得る。
【００４１】
（抗癌治療：ＤＮＡ損傷因子）
本発明の方法において使用するために適した抗癌治療としては、ＤＮＡ損傷因子が挙げられ、この薬剤は、直接的にまたは間接的にＤＮＡを損傷する任意の処置レジメンを包含する。ＤＮＡ損傷因子は、ＤＮＡ損傷を引き起こすことが公知である、化合物処置および物理的処置を包含し、そして／あるいはスクリーニング法（例えば、米国特許出願第０９／６６７，３６５号に記載される）によって同定される。ＤＮＡ損傷因子の具体的な例としては、５−フルオロウラシル（５−ＦＵ）、レベッカマイシン、ブレオマイシン、シスプラチン、高体温、ＵＶ照射、ガンマ線照射、α線照射、高温、アルキル化剤、ニトロソウレア、代謝拮抗物質、植物アルカロイド、植物抽出物、放射性同位体、カペシタビン、Ｓ−１（テガフール、５−クロロ−２，４−ジヒドロキシピリジンおよびオキソン酸）、５−エチニルウラシル、アラビノシルシトシン（ａｒａ−Ｃ）、５−アザシチジン（５−ＡＣ）、２’，２’−ジフルオロ−２’−デオキシシチジン（ｄＦｄＣ）、プリン代謝拮抗物質（メルカプトプリン、アザチオプリン、チオグアニン）、ゲムシタビン塩酸（ジェムザール）、ペントスタチン、アロプリノール、２−フルオロ−アラビノシル−アデニン（２Ｆ−ａｒａ−Ａ）、ヒドロキシウレア、硫黄マスタード（ビスクロロエチルスルフィド）、メクロレタミン、メルファラン、クロラムブシル、シクロホスファミド、イホスファミド、チオテパ、ＡＺＱ、マイトマイシンＣ、ジアンヒドロガラクチトール、ジブロモスルシトール（ｄｉｂｒｏｍｏｄｕｃｉｔｏｌ）、アルキルスルホネート（ブスルファン）、ニトロソウレア（ＢＣＮＵ、ＣＣＮＵ、４−メチルＣＣＮＵまたはＡＣＮＵ）、プロカルバジン、デカルバジン、アントラサイクリン（例えば、ドキソルビシン（アドリアマイシン；ＡＤＲ）、ダウノルビシン（セルビシン）、イダルビシン（イダマイシン）およびエピルビシン（Ｅｌｌｅｎｃｅ））、アントラサイクリンアナログ（例えば、ミトキサントロン、アクチノマイシンＤ（ａｃｔｉｎｉｍｙｃｉｎ Ｄ）、非挿入トポイソメラーゼインヒビター（例えば、エピポドフィロトキシン（エトオシド＝ＶＰ１６、テニポシド＝ＶＭ−２６）、ポドフィロトキシン、ブレオマイシン（Ｂｌｅｏ）、ペプレオマイシン、白金誘導体（シスプラチン（ＣＤＤＰ）、シスプラチンのトランスアナログ、カルボプラチン、イプロプラチン、テトラプラチンおよびオキサリプラチン）を含む核酸との付加物を形成する化合物））、ならびにカンプトテシン、トポテカン、イリノテカン（ＣＰＴ−１１）、およびＳＮ−３８が挙げられるが、これらに限定されない。核酸損傷処置の具体的な例としては、照射（例えば、紫外線（ＵＶ）、赤外線（ＩＲ）、またはα線照射、β線照射、γ線照射）ならびに環境ショック（例えば、高体温）が挙げられる。当業者は、本発明の方法において使用するために適切な他のＤＮＡ損傷因子およびＤＮＡ損傷処理を同定および利用し得る。
【００４２】
（抗癌治療：Ｇ２チェックポイント抑止因子）
本発明の別の実施形態に従って、Ｇ２チェックポイント抑止因子の効力を試験および推定するための方法が提供され、この因子としては、米国特許出願第１０／４５７，０２９号に開示されるペプチドでないＧ２チェックポイント抑止非ペプチド化合物、ならびに米国特許出願第１０／３４７，１４５号および標題「Ｐｅｐｔｉｄｅｓ ａｎｄ ｐｅｐｔｉｄｏｍｉｍｅｔｉｃｓ ｈａｖｉｎｇ ｉｍｍｕｎｅ−ｍｏｄｕｌａｔｉｎｇ， ａｎｔｉ−ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ，ａｎｄ ａｎｔｉ−ｖｉｒａｌ ａｃｔｉｖｉｔｙ」（２００４年６月２５日出願）に開示されるＧ２チェックポイント抑止ペプチドおよびＧ２チェックポイント抑止ペプチド模倣物が挙げられるが、これらに限定されない。これらの出願は、これら各々の全体が、本明細書に参考として援用される。
【００４３】
用語「Ｇ２チェックポイントを抑止する」または「Ｇ２チェックポイント抑止」、またはこれらの用語の任意の文法的同義語は、細胞がＧ２チェックポイントで細胞周期を停止する能力を抑止する能力をいう。Ｇ２細胞周期チェックポイントは、ＤＮＡ複製およびＤＮＡ修復が完了するまで有糸分裂の開始を制限し、Ｇ２チェックポイントの混乱により、ＤＮＡ複製およびＤＮＡ修復が完了する前に、有糸分裂の開始が早まる。この理論に制限されることは望まないが、蓄積したＤＮＡ損傷を有する細胞において、Ｇ２チェックポイントの抑止は、細胞がＧ２チェックポイントでＤＮＡ損傷を修正または修復する機会を有さず、代わりに、ＤＮＡ修復なしにＧ２期を通過して進行し、有糸分裂カタストロフィー、アポトーシス、または細胞抑制もしくは細胞死を生じる他の状態をもたらすことを意味すると考えられる。本明細書で使用される場合、用語「アポトーシス」とは、プログラムされた細胞死、および当該分野で理解されているような、細胞生理における関連した変化（核酸フラグメント化、カスパーゼ活性化、染色体凝集などが挙げられる）をいう。用語「有糸分裂カタストロフィー」とは、有糸分裂プロセスにおけるエラーから生じる細胞死を意味する。
【００４４】
細胞周期Ｇ２チェックポイントの抑止は、別の方法で細胞におけるＧ２細胞周期停止を引き起こす状態での抑止（例えば、特定の抗腫瘍剤、Ｘ線照射、ガンマ線照射、ＵＶ照射、または高体温によるＤＮＡ損傷の蓄積）を包含する。このような状態でのＧ２チェックポイントの抑止は、「Ｇ２チェックポイントの抑止」と考えられるが、より具体的には、ＤＮＡ損傷誘導性Ｇ２チェックポイントが、ＤＮＡ損傷の認識およびＧ２細胞周期停止を通常生じるシグナルの生成を包含することが理解される場合、「ＤＮＡ損傷誘導性Ｇ２チェックポイント」の抑止であると考えられる。細胞周期Ｇ２チェックポイントが抑止される細胞は、細胞がＧ２チェックポイントにある時間の長さの減少を示す。この時間は、Ｇ２チェックポイントが全くない状態（Ｇ２チェックポイント停止）、から適切な条件下で、数分間、数時間、数日間、数週間またはそれ以上の時間の減少を有するＧ２チェックポイントまでの範囲に及び得る。従って、本発明の化合物と接触した細胞は、この化合物の非存在下で細胞が通常有するよりも短いＧ２チェックポイント時間を有する。例えば、Ｇ２チェックポイント時間の長さの減少は、特定の時間（例えば、４時間）の間にＧ２に存在する細胞が、本発明の化合物と接触された場合に、４時間未満（例えば、３．５時間、３時間、２．５時間、２時間、１時間または一時間未満）にわたってＧ２に存在することを意味する。用語「Ｇ２抑止」または「Ｇ２チェックポイント抑止」または「Ｇ２チェックポイント阻害活性」または任意の文法的同義語は、任意の量のＧ２チェックポイントの抑止または阻害を意味する。
【００４５】
本発明は、Ｇ２チェックポイント抑止因子に対する癌細胞の感受性を試験するための方法を提供する。本発明の局面に従って、Ｇ２チェックポイント抑止因子は、候補抗癌治療としてスクリーニングまたは評価される。癌細胞は、Ｇ２チェックポイント抑止因子の存在下または非存在下で、インビトロで癌細胞を培養する工程、あるいはＧ２チェックポイント抑止因子でインビトロで培養した癌細胞を処理する工程を包含するが、これらに限定されない方法を用いて、Ｇ２チェックポイント抑止因子と接触させ得る。
【００４６】
（Ｇ２抑止非ペプチド化合物）
本発明は、細胞に投与された場合にG２チェックポイント（特に、ＤＮＡ損傷誘導性Ｇ２チェックポイント）を抑止し、細胞を死滅させうるかまたは抑制する、Ｇ２チェックポイント抑止非ペプチド化合物に対する被験体の癌細胞（特に、ヒト患者の癌細胞）の感受性を推定するための方法を提供する。Ｇ２チェックポイント抑止非ペプチド化合物（例えば、米国特許出願第１０／４５７，０２９号に開示されるもの）は、ＤＮＡ損傷処置ありまたはなしで、細胞を死滅させうるかまたは抑制し得ることが理解される。
【００４７】
本発明は、候補抗癌治療としてのＧ２チェックポイント抑止非ペプチド化合物をスクリーニングするための方法およびこれらの化合物を評価するための方法を提供し、これらの化合物は、以下の一般構造：
【００４８】
【化１】
を有し、ここでいずれか一方または両方のベンゼンが、ピラジン、ピリミジン、ピペラジン、モルホリン、シクロヘキサン、ピペリジンまたはピリジンで置換され得る；Ｒ１は、ハロゲン（例えば、臭素（Ｂｒ）、塩素（Ｃｌ）、フッ素（Ｆ）、ヨウ素（Ｉ）、アミノ（ＮＨ２）、ニトロ（ＮＯ２）、ヒドロキシ（ＯＨ）、Ｏ−メチル（ＯＣＨ３）、メチル（ＣＨ３）または水素（Ｈ）であり、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５および／またはＲ６は、臭素（Ｂｒ）、塩素（Ｃｌ）、フッ素（Ｆ）、ヨウ素（Ｉ）、アミノ（ＮＨ２）、ニトロ（ＮＯ２）、メチル（ＣＨ３）、Ｏ−メチル（ＯＣＨ３）、ヒドロキシ（ＯＨ）、ＣＨ（ＣＨ３）２、ＣＨＯ、ＣＨＯＣＨ３、Ｏ（ＣＨ２）ｎＣＨ３、ＯＣＯ（Ｃ６Ｈ１２）Ｃｌ、ＣＯＯＣＨ３または水素であり；Ｘ１は、窒素（ＮＨ）、酸素（Ｏ）またはスルフェート（Ｓ）であり；Ｘ２は、酸素（Ｏ）またはスルフェート（Ｓ）である。例示的実施形態は、図４に見出されるが、本発明の化合物は、これらの実施形態に限定されない。
【００４９】
本発明は、候補抗癌治療としてのＧ２チェックポイント抑止非ペプチド化合物をスクリーニングするための方法およびこれらの化合物を評価するための方法をさらに提供し、ここでこれらの化合物は、以下の一般構造：
【００５０】
【化２】
を有し、ここでいずれか一方または両方のベンゼンが、ピラジン、ピリミジン、ピペラジン、モルホリン、シクロヘキサン、ピペリジンまたはピリジンで置換され得る；Ｒ１は、臭素（Ｂｒ）、塩素（Ｃｌ）、フッ素（Ｆ）、ヨウ素（Ｉ）、アミノ（ＮＨ２）、ニトロ（ＮＯ２）、ヒドロキシ（ＯＨ）、Ｏ−メチル（ＯＣＨ３）、メチル（ＣＨ３）または水素（Ｈ）であり、Ｒ２は、臭素（Ｂｒ）、塩素（Ｃｌ）、フッ素（Ｆ）、ヨウ素（Ｉ）、アミノ（ＮＨ２）、ニトロ（ＮＯ２）、メチル（ＣＨ３）、Ｏ−メチル（ＯＣＨ３）、ヒドロキシ（ＯＨ）、ＣＨ（ＣＨ３）２、ＣＨＯ、ＣＨＯＣＨ３、Ｏ（ＣＨ２）ｎＣＨ３、ＯＣＯ（Ｃ６Ｈ１２）Ｃｌ、ＣＯＯＣＨ３または水素であり；Ｘ１は、窒素（ＮＨ）、酸素（Ｏ）またはスルフェート（Ｓ）であり；Ｘ２は、酸素（Ｏ）またはスルフェート（Ｓ）である。例示的実施形態は、図４に見出される。
【００５１】
本発明は、候補抗癌治療としてのＧ２チェックポイント抑止非ペプチド化合物をスクリーニングするための方法およびこれらの化合物を評価するための方法をさらに提供し、ここでこれらの化合物は、以下の一般構造：
【００５２】
【化３】
を有し、ここでＲ１位〜Ｒ６位での異なる分子の置換は、得られた化合物のＧ２チェックポイント抑止活性に影響を及ぼす。以下の構造−活性関連性が決定された：
Ｒ１において、臭素（Ｂｒ）は、塩素（Ｃｌ）、フッ素（Ｆ）またはメチル（ＣＨ３）よりも高い活性を提供する
Ｒ２において、メチル（ＣＨ３）またはＯ−メチル（ＯＣＨ３）は、ヒドロキシド（ＯＨ）、臭素（Ｂｒ）、塩素（Ｃｌ）、ＣＨ（ＣＨ３）２、ＣＨＯ、ＣＨＯＣＨ３，Ｏ（ＣＨ２）ｎＣＨ３、ＯＣＯ（Ｃ６Ｈ１２）ＣｌまたはＣＯＯＣＨ３またはＨよりも高い活性を提供する
Ｒ３において、メチル（ＣＨ３）は、ＨまたはＯ−メチル（ＯＣＨ３）より高い活性を提供した
Ｒ４において、臭素（Ｂｒ）、フッ素（Ｆ）、塩素（Ｃｌ）、またはＨが使用され得る
Ｒ５において、臭素（Ｂｒ）、フッ素（Ｆ）、塩素（Ｃｌ）、またはＨが使用され得る
Ｒ６において、臭素（Ｂｒ）、フッ素（Ｆ）、塩素（Ｃｌ）、またはＨが使用され得る。
【００５３】
前述のリストは、例示に過ぎず、網羅的ではない。例示的実施形態は、図４に見出される。当業者は、本開示の教示に従って、さらなる置換および活性の決定を行って、さらなる本発明の化合物を獲得し得る。特定の置換により、ＤＮＡ損傷誘導性Ｇ２チェックポイント抑止に関して他の構造より高い活性を有する構造を生成することが観察されたが、本発明は、全ての置換および全てのレベルの活性を有する化合物を提供することが、当業者によって理解される。。特定の実施形態について、当業者は、その実施形態において使用するために、特定の標的に対する化合物の活性に加えて、本発明の化合物を選択することにおいて複数の要因を考慮する。当業者は、化合物の活性、アベイラビリティー、安定性、合成の容易さまたは合成効率、薬学的組成物における処方の適切性、服薬しやすさ（ｄｒｕｇａｂｉｌｉｔｙ）、インビボでの他の化合物との相互作用、エキソビボでの他の化合物との相互作用またはインビトロでの他の化合物との相互作用、細胞を死滅させる能力、細胞の増殖を抑制する能力、正常な細胞に対する影響、および他の活性を考慮する。
【００５４】
本発明は、Ｇ２チェックポイント抑止非ペプチド化合物に対する被験体の癌細胞、特に患者の癌細胞の感度を決定することによって、そのＧ２チェックポイント抑止非ペプチド化合物の抗癌治療としての有効性を推定するための方法を提供する。本発明は、被験体の癌細胞の、化合物（この化合物は、Ｇ１チェックポイント欠損細胞（例えば、癌細胞）におけるＤＮＡ損傷誘導性細胞周期Ｇ２チェックポイントを選択的に抑止し、ＤＮＡ損傷因子で処理した細胞におけるＤＮＡ損傷誘導性Ｇ２チェックポイントを選択的に抑止する）に対する感受性を決定するための方法を提供する。本発明は、被験体の癌細胞の、化合物（これは、異種移植片腫瘍増殖を、単独でまたは他の抗癌治療と組み合わせて阻害する）に対する感受性を決定するための方法をさらに提供する。本発明は、被験体の癌細胞の、化合物（これは、インビトロで、癌細胞でのコロニー形成を抑制する）単独に対する感受性または他の抗癌治療と組み合わせたこの化合物に対する感受性を、決定するための方法を提供する。特に、本発明は、被験体の癌細胞の、化合物（これは、Ｇ２チェックポイントを抑止し、そして／または癌細胞を抑制するかもしくは死滅させる）に対する感受性を決定するための方法を提供する。これらの化合物としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：
ＣＤＢＣ００４：４−クロロ−安息香酸４−メトキシ−フェニルエステル
ＣＢＤＣ４０１：４−クロロ−安息香酸ｐ−トリルエステル
ＣＢＤＣ４０２：４−ブロモ−安息香酸ｐ−トリルエステル
ＣＢＤＣ４０３：３，４，５−トリフルオロ−安息香酸ｐ−トリルエステル
ＣＢＤＣ４０４：４−フルオロ−安息香酸４−ブロモ−フェニルエステル；エタンとの化合物
ＣＢＤＣ４０５：３，４−ジクロロ−安息香酸ｐ−トリルエステル；エタンとの化合物
ＣＢＤＣ４０６：２，４−ジクロロ−安息香酸ｐ−トリルエステル；エタンとの化合物
ＣＢＤＣ４０７：４−フルオロ−安息香酸ｐ−トリルエステル；エタンとの化合物
ＣＢＤＣ４０８：２，３，４，５，６−ペンタフルオロ−安息香酸ｐ−トリルエステル；エタンとの化合物
ＣＢＤＣ４０９：４−クロロ−安息香酸３，４−ジメチル−フェニルエステル；エタンとの化合物
ＣＢＤＣ４１０：４−クロロ−安息香酸４−ヒドロキシ−フェニルエステル；エタンとの化合物
ＣＢＤＣ４１１：４−フルオロ−安息香酸４−ヒドロキシ−フェニルエステル；エタンとの化合物
ＣＢＤＣ４１２：４−ブロモ−安息香酸４−フルオロ−フェニルエステル
ＣＢＤＣ４１３：４−ブロモ−安息香酸４−トリフルオロメチル−フェニルエステル
ＣＢＤＣ４１４：４−ブロモ−安息香酸４−ヒドロキシ−フェニルエステル
ＣＢＤＣ４１５：４−ブロモ−安息香酸４−トリフルオロメトキシ−フェニルエステル
ＣＢＤＣ４１８：４−ブロモ−安息香酸６−メチル−ピリジン−３−イルエステル
ＣＢＤＣ４４０：４−ブロモ−チオ安息香酸Ｏ−ｐ−トリルエステル
ＣＢＤＣ４４１：４−ブロモ−ジチオ安息香酸ｐ−トリルエステル
ＣＢＤＣ４４２：４−ブロモ−チオ安息香酸Ｓ−ｐ−トリルエステル。
【００５５】
これらの化合物の構造は、図４に提供される。
【００５６】
（Ｇ２チェックポイント抑止ペプチドおよびＧ２チェックポイント抑止ペプチド模倣物）
本発明は、被験体の癌細胞、特にヒト患者の癌細胞の、候補抗癌治療としてのＧ２チェックポイント抑止ペプチドおよびＧ２チェックポイント抑止ペプチド模倣物（２００４年６月２５日出願の米国特許出願第１０／３４７，１４５号および米国特許出願（標題「Ｐｅｐｔｉｄｅｓ ａｎｄ ｐｅｐｔｉｄｏｍｉｍｅｔｉｃｓ ｈａｖｉｎｇ ｉｍｍｕｎｅ−ｍｏｄｕｌａｔｉｎｇ，ａｎｔｉ−ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ，ａｎｄ ａｎｔｉ−ｖｉｒａｌ ａｃｔｉｖｉｔｙ」に開示される）に対する感受性を推定するための方法を提供する。
【００５７】
本発明は、候補抗癌治療としてのＧ２チェックポイント抑止ペプチドおよびＧ２チェックポイント抑止ペプチド模倣物（特に、以下の構造のいずれかを形成するように配置された領域Ａ（残基Ｐ１〜Ｐ５）および領域Ｂ（残基Ｐ６〜Ｐ１１）を含む構造を有するＣＢＰペプチドおよびＣＢＰペプチド模倣物）をスクリーニングおよび評価するための方法を提供する：Ｐ１，Ｐ２，Ｐ３，Ｐ４，Ｐ５，Ｐ６，Ｐ７，Ｐ８，Ｐ９，Ｐ１０，Ｐ１１（配列番号１）またはＰ６，Ｐ７，Ｐ８，Ｐ９，Ｐ１０，Ｐ１１，Ｐ１，Ｐ２，Ｐ３，Ｐ４，Ｐ５（配列番号２）、またはＰ１，Ｐ２，Ｐ３，Ｐ４，Ｐ５（配列番号３）。ここでＰ１およびＰ５は、ベンゾイル−フェニルアラニン（Ｂｐａ）、またはチロシン（Ｔｙｒ）、またはフェニルアラニン（Ｐｈｅ）、またはシクロヘキシルアラニン（Ｃｈａ）、またはフェニル残基の２位、３位、４位、５位および６位にフッ素を有するフェニルアラニン（Ｐｈｅ−２，３，４，５，６−Ｆ）またはＴｙｒＴｙｒ、またはＰｈｅＰｈｅ、またはＣｈａＰｈｅ−２，３，４，５，６−Ｆ、または１つまたは２つのベンゼン様側鎖構造もしくはシクロヘキサン様側鎖構造により占められる側鎖空間と類似する側鎖空間を占有する部分（ここでこの部分は、１つもしくは２つのアミノ酸またはアミノ酸構造／機能アナログであり得る。これらのアナログとしては、非天然アミノ酸、合成アミノ酸、アミノ酸模倣物、およびキメラ分子が挙げられる）である。Ｐ２位およびＰ４位は、任意のアミノ酸であり、Ｐ３は、トリプトファン（Ｔｒｐ）またはＴｒｐ側鎖によって占められる空間と類似する側鎖空間を占める任意の部分である。Ｐ６位、Ｐ７位、Ｐ８位、Ｐ９位、Ｐ１０位、Ｐ１１位は、Ｐ２および／またはＰ３がＡｒｇでない場合、５つ以上の位置でアルギニン（Ａｒｇ）を含み、任意の非Ａｒｇ位置は、任意のアミノ酸であり得るかまたはなにもない。Ｐ２および／またはＰ３がＡｒｇである場合、Ｐ６〜Ｐ１１は、５つ未満のＡｒｇを含み得る。
【００５８】
本発明は、候補抗癌治療としてのＧ２チェックポイント抑止ＣＢＰペプチドおよびＧ２チェックポイント抑止ペプチド模倣物をスクリーニングする方法およびこれらを評価するための方法をさらに提供する。ここでこのＣＢＰ化合物は、以下を含む：ＣＢＰ５００（配列番号２６）；ＣＢＰ５０１（配列番号２７）；ＣＢＰ５０４（配列番号２９）；ＣＢＰ５０５（配列番号３０）；ＣＢＰ５０６（配列番号３１）；ＣＢＰ５１０（配列番号３２）；ＣＢＰ５１１（配列番号３３）；ＣＢＰ５１２（配列番号３４）；ＣＢＰ６０３（配列番号３７）。前述のＣＢＰ化合物の各々の配列は、以下の表１に開示される。
【００５９】
本発明は、候補抗癌治療としてのＧ２チェックポイント抑止ＣＢＰペプチドおよびＧ２チェックポイント抑止ＣＢＰペプチド模倣物をスクリーニングするための方法およびこれらを評価するための方法をさらに提供する。ここでこのＣＢＰ化合物は、一般構造：上記のＰ１，Ｐ２，Ｐ３，Ｐ４，Ｐ５，Ｐ６，Ｐ７，Ｐ８，Ｐ９，Ｐ１０，Ｐ１１（配列番号１）またはＰ６，Ｐ７，Ｐ８，Ｐ９，Ｐ１０，Ｐ１１，Ｐ１，Ｐ２，Ｐ３，Ｐ４，Ｐ５（配列番号１）の構造を有し、化合物ＣＢＰ５０１（配列番号２７）と類似のＧ２チェックポイント抑止活性を有する。当業者は、候補抗癌治療としての他のＧ２チェックポイント抑止ペプチドおよびＧ２チェックポイント抑止ペプチド模倣物をスクリーニングおよび評価するために、本明細書に提供された技術を適合させ得る。
【００６０】
（表１．例示的ペプチドおよびペプチド模倣物の配列、配列番号、およびＣＢＰコード名）
【００６１】
【表１−１】
【００６２】
【表１−２】
【００６３】
【表１−３】
（抗癌治療：併用療法）
本発明の別の局面に従って、併用療法に対する被験体の癌細胞の感受性を決定することにより、被験体の抗癌処置の効力を推定するための方法を提供する。一局面に従って、本発明は、ＤＮＡ損傷因子およびＧ２チェックポイント抑止因子を含む併用療法を試験するための方法を提供する。一実施形態において、併用療法は、ＤＮＡ損傷因子であるＣＰＴ−１１（カンプトテカン−１１（これは、イリノテカンまたはカンプトスター（ｃａｍｐｔｏｓｔａｒ）としても公知である）およびＣＢＤＣ４０２を含む。別の実施形態において、併用療法は、ＣＰＴ−１１およびＣＢＤＣ００４を含む。別の実施形態において、併用療法は、ＤＮＡ損傷因子であるＣＤＤＰ（シスプラチンとしても公知のアルキル化剤）およびＧ２チェックポイント抑止ペプチドであるＣＢＰ５０１（配列番号２７）を含む。
【００６４】
本発明の一局面に従って、併用療法の効力を試験する方法が提供され、この併用療法において、癌細胞に対するＤＮＡ損傷因子の細胞傷害性が、本明細書に開示されるＧ２チェックポイント抑止薬剤（Ｇ２チェックポイント抑止非ペプチド化合物およびＧ２チェックポイント抑止ペプチドおよびＧ２チェックポイント抑止ペプチド模倣物を含む）によって強化されるかまたは高められる。この理論に制限されることが望まないが、Ｇ２チェックポイント抑止因子が、ＤＮＡ損傷因子（これは、正常な細胞に対してほとんどまたは何ら細胞傷害性効果がない）の細胞傷害性効果に対して癌細胞を選択的に感受性にし得ることが理解される。多くの従来の抗癌剤は、癌細胞であるか正常な細胞であるかどうかに関係なく、増殖している細胞を標的とし、結果として、多くの従来の抗癌治療は、悪心、下痢または脱毛のような副作用を生じている。対照的に、Ｇ２チェックポイント抑止因子は、ＤＮＡが損傷した（例えば、細胞周期チェックポイントが損なわれている）細胞を選択的に標的とし、よって、正常な細胞に対しては、ほとんどまたは何ら細胞傷害性の影響がない。よって、本発明は、Ｇ２チェックポイント抑止因子がＤＮＡ損傷処置の効果を強化する能力について、併用療法をスクリーニングする方法およびこれらを評価する方法を提供する。
【００６５】
本発明の別の局面に従って、最も有効な併用療法を同定する方法が提供される。実施例３における模範的な例証に開示されるように、ＣＢＰ５０１（配列番号２７）とシスプラチン（ＣＤＤＰ）との併用療法は、いずれかの処置単独よりも高いレベルの抗癌活性を有した。実施例３に示されるように、培養したヒト癌細胞を用いるインビトロの結果により、各化合物単独（ＣＢＰ５０１およびシスプラチン）が、いくつかの抗癌効力を有するが、化合物の併用が、より著しい抗癌効果を有することが示された。異種移植片腫瘍アッセイを用いて、ヒト癌細胞を宿主マウスに移植し、このマウスにおいて、ヒト癌細胞は腫瘍を生成し、このことにより、候補抗癌治療の効力の代理「インビボ」試験が提供された。次いで、腫瘍を、候補抗癌治療をマウス宿主に投与し、腫瘍サイズに対する効果を測定することによって「インビボで」処理した。異種移植片腫瘍アッセイを使用するインビボの結果により、ＣＢＰ５０１とＣＤＤＰとの併用が、いずれかの化合物単独より有効であるというインビトロの結果の推定が確認された。
【００６６】
本発明の多くの実施形態が記載されてきた。にもかかわらず、種々の改変が、本発明の趣旨および範囲から逸脱することなく行われ得ることが、理解される。従って、以下の実施例は、特許請求の範囲に記載される発明の範囲を例示するのであって、限定するのではないことが意図される。
【実施例】
【００６７】
（実施例１．ＣＢＤＣ４０２を用いたインビトロでの感受性試験とインビボでの効力試験との相関）
ヒト結腸癌由来細胞株ＨＣＴ−１１６の細胞を、細胞のＤＮＡ含有量をフローサイトメトリーによって測定するインビトロでの感受性試験、および異種移植片腫瘍増殖を測定するインビボでの効力試験において使用した。従来の抗癌治療ＣＰＴ−１１、新規な候補抗癌治療ＣＢＤＣ４０２、この２つの化合物の併用、またはコントロール処置（ビヒクル）の効果を、各試験系において測定し、比較した。
【００６８】
インビトロでの感受性試験： ＨＣＴ−１１６細胞（ＡＴＣＣから）を、Ｌ−グルタミン（Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．）と、ペニシリン−ストレプトマイシンと、１０％ウシ胎児血清とを含有するマッコイ５Ａ培地（Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．）中、３７℃にて５％ ＣＯ２／空気中で培養した。培養細胞（１．６×１０５）を、遠心分離によりペレットにし、次いで、再懸濁し、３００μｌのＫｒｉｓｈａｎ溶液（０．１％クエン酸ナトリウム、５０μｇ／ｍｌ ヨウ化プロピジウム、２０μｇ／ｍｌ ＲＮａｓｅ Ａ、０．５％ Ｎｏｎｉｄｅｔ Ｐ−４０）中、４℃で１時間インキュベートした。各細胞におけるＤＮＡの量を、蛍光活性化細胞スキャナ（ＦＡＣＳｃａｎ（登録商標）Ｂｅｃｋｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ，Ｍｏｕｎｔａｉｎ Ｖｉｅｗ，ＣＡ）を用いて決定し、結果を、ＣＥＬＬＱｕｅｓｔ（登録商標）ソフトウェア（Ｂｅｃｋｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）を用いて分析した。
【００６９】
各細胞のＤＮＡ含有量を、２４時間目に測定した。ＣＢＤＣ４０２処置単独（２μＭ、１０μＭ、または５０μＭを３時間）は、インビトロでのＨＣＴ−１１６細胞のＤＮＡ含有量を変化させなかった（図１Ａ；上パネル）。ＣＰＴ−１１処置（５０μＭで３時間）により、細胞周期分布は劇的に変化し、ここでＧ１期にある細胞集団は減少し、Ｇ２／Ｍ期にある細胞集団は増大した。この結果により、Ｇ１に達しない集団は何ら増加しなかったので、細胞が細胞周期のＧ２／Ｍ期で停止した（増殖が阻害された）が、細胞は死滅しないことが示された。ＣＰＴ−１１（５０μＭで３時間）およびＣＢＤＣ４０２（２μＭ、１０μＭ、５０μＭで、３時間）の両方での併用処置に曝したＨＣＴ−１１６細胞は、ＣＰＴ−１１誘導性Ｇ２／Ｍ集団およびＧ１集団の両方の蓄積の減少を示し、Ｇ１に達しない（死細胞）集団（図１Ａ、下パネル）の増加もまた示した。このことは、この併用処置が、ＨＣＴ−１１６細胞に対して細胞傷害性であることを示した。
【００７０】
インビトロでの感受性試験のこれらの結果により、ＣＢＤＣ４０２単独では、インビボでのＨＣＴ−１１６異種移植片腫瘍増殖を抑制せず、ＣＰＴ−１１は、中程度に腫瘍増殖を抑制し、ＣＢＤＣ４０２とＣＰＴ−１１との併用療法は、腫瘍増殖を最も効率的に抑制する、ということが推定された。
【００７１】
代理インビボ効力試験： 図１Ｂは、異種移植片腫瘍アッセイを含む代理インビボ効力試験の結果を示す。ＨＣＴ−１１６細胞を、雄性ＳＣＩＤマウス（重症複合型免疫不全マウス，Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ Ｌａｂ．，Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ，ＭＡ）に細胞を皮下注射することにより移植した。この腫瘍の大きさが、約０．２ｃｍ３の大きさに達したときに、処置を開始した。腫瘍の大きさを、ノギスを用いて１週間に３回測定した。腫瘍体積を、以下のように計算した：体積（ｃｍ３）＝［幅（ｍｍ）２×長さ（ｍｍ）］／２０００。平均腫瘍サイズ（体積）を標準偏差とともにプロットした（図１ｂ）。動物を、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ ｆｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ａｎｉｍａｌ Ｃａｒｅの指針に従って飼育した。このプロトコルは、ＣａｎＢａｓ Ｃｏ．Ｌｔｄの社内動物ケア委員会によって承認された。
【００７２】
ＳＣＩＤマウスにおいて樹立したＨＣＴ−１１６異種移植片（０．２ｃｍ３）を、以下を腹腔内注射することによって２週間処置した：ビヒクル単独（ＤＭＳＯ、１週間に２回）、ＣＢＤＣ４０２（４０ｍｇ／ｋｇ；１週間に２回）、ＣＰＴ−１１（２０ｍｇ／ｋｇ；１週間に１回）、またはＣＢＤＣ４０２（１週間に２回）とＣＰＴ−１１（１週間に１回）との併用。図１（ｂ）に示されるように、ＣＰＢＣ４０２単独では、腫瘍増殖を有意に抑制しなかったが、ＣＰＴ−１１は、中程度の腫瘍抑制活性を有し、ＣＢＤＣ４０２＋ＣＰＴ−１１は、強い腫瘍抑制活性を示した。この結果は、上記のＣＢＤＣ００４を用いたインビトロでの感受性試験の結果に基づく推定と相関している。
【００７３】
（実施例２．ＣＢＤＣ００４を用いる、インビトロでの感受性試験とインビボでの効力試験との相関）
ヒト結腸癌由来細胞株ＨＣＴ−１１６の細胞を、細胞のＤＮＡ含有量をフローサイトメトリーによって測定するインビトロでの感受性試験、および異種移植片腫瘍増殖を測定するインビボでの効力試験において使用した。従来の抗癌治療ＣＰＴ−１１、新規な候補抗癌治療ＣＢＤＣ００４、この２つの化合物の併用、またはコントロール処置（ビヒクル）の効果を、各試験系において測定し、比較した。
【００７４】
インビトロでの感受性試験：ＨＣＴ−１１６細胞およびフローサイトメトリーを用いるインビトロでの感受性試験を、ＣＢＤＣ００４をＣＢＤＣ４０２の代わりに用いるという改変を行って、上記のように行った。各細胞のＤＮＡ含有量を、２４時間目に測定した。ＣＢＤＣ００４処置単独（２μＭ、１０μＭ、５０μＭで３時間）は、インビトロでのＨＣＴ−１１６細胞のＤＮＡ含有量を変化させなかった（図２Ａ；上パネル）。ＣＰＴ−１１単独での処置（５０μＭで３時間）により、細胞周期分布は劇的に変化し、ここでＧ１期にある細胞集団は減少し、Ｇ２／Ｍ期にある細胞集団は増大した。このことにより、Ｇ１に達しない集団は何ら増加しなかったので、上記細胞は、細胞周期のＧ２／Ｍ期で停止したが、死滅しないことが示された。ＣＰＴ−１１（５０μＭで３時間）およびＣＢＤＣ００４（２μＭ、１０μＭ、５０μＭで、３時間）の両方での併用処置に曝したＨＣＴ−１１６細胞は、ＣＰＴ−１１単独を超えるほどには、ＤＮＡ含有量を変化させなかった（図２Ａ、下パネル）。
【００７５】
インビトロでの感受性試験のこれらの結果により、ＣＢＤＣ００４単独では、インビボでのＨＣＴ−１１６異種移植片腫瘍増殖を抑制せず、ＣＰＴ−１１は、中程度にこの腫瘍増殖を抑制し、ＣＢＤＣ００４とＣＰＴ−１１との併用療法は、ＣＰＴ−１１単独と同程度でこの腫瘍増殖を抑制する、ということが推定された。
【００７６】
代理インビボ効力試験： ＨＣＴ−１１６異種移植片腫瘍増殖に対する種々の化合物の効果を測定する代理インビボ効力試験を、ＣＢＤＣ４０２の代わりに、ＣＢＤＣ００４を用いるという改変を行って、上記のように実施した。
【００７７】
ＳＣＩＤマウスにおいて樹立したＨＣＴ−１１６異種移植片（０．２ｃｍ３）を、以下を腹腔内注射することによって２週間処置した：ビヒクル単独（ＤＭＳＯ、１週間に２回）、ＣＢＤＣ００４（３０ｍｇ／ｋｇ；１週間に２回）、ＣＰＴ−１１（２０ｍｇ／ｋｇ；１週間に１回）、またはＣＢＤＣ４０２（１週間に２回）とＣＰＴ−１１（１週間に１回）との併用。図２Ｂに示されるように、ＣＢＤＣ００４は、単独でも、ＰＣＴ−１１との併用においても腫瘍増殖を抑制しなかった。そしてＣＰＴ−１１は、中程度の腫瘍抑制活性を有した。これらの結果は、上記のＣＢＤＣ００４を用いたインビトロでの感受性試験の結果に基づく推定と相関している。
【００７８】
（実施例３．臨床適用のための感受性試験のシミュレーション）
臨床状況のための感受性試験のシミュレーションとして、ＳＣＩＤマウスにおけるＭＩＡＰａＣａ２細胞の樹立された異種移植片腫瘍を、マウスから抽出し、従来の抗癌治療および新規の候補抗癌治療ＣＢＰ５０１（配列番号２７）の存在下または非存在下で、以下のプロトコルに従って、インビトロで培養した。
【００７９】
（プロトコル：）
（１日目 抽出した異種移植片腫瘍からの単一細胞懸濁液の調製）
ＭＩＡＰａＣａ２細胞の異種移植片腫瘍を、異種移植片腫瘍を有するマウスから切り出し、３７℃、５％ＣＯ２／空気で、完全培養培地（ＤＭＥＭ（Ｄａｉｎｉｈｏｎｓｅｉｙａｋｕ Ｃｏ．，Ｏｓａｋａ，Ｊａｐａｎ）（ＭＩＡＰａＣａ２のための２．５％ ウマ血清（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃｏ．，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）と、１０％ ウシ胎仔血清（Ｅｑｕｉｔｅｃｈ−ｂｉｏ，Ｋｅｒｒｖｉｌｌｅ，ＴＸ）を含有）１０ｍｌを含む１０ｃｍプレートに入れた。この組織を、小片にスライスし、非腫瘍組織を可能な限り除去した。このスライスした小片を、完全培養培地を含む別の１０ｃｍプレートに入れ、カミソリの刃で切り刻んだ。次いで、細胞を、ピペットで出し入れして培養培地に分散させ、１２００×ｇで５分間遠心分離した。
【００８０】
次いで、その細胞ペレットを、コラゲナーゼを含む緩衝液中で、３７℃で２時間インキュベートした。２回目の遠心分離の後、その細胞ペレットを、トリプシンを含む緩衝液中で、室温で５分間インキュベートし、次いで、培養培地に懸濁し、ナイロンメッシュに通して、再度遠心分離した。ペレットになった細胞を再懸濁し、この再懸濁した細胞をチャンバースライドに播種し、インキュベーター中で一晩培養した。
【００８１】
（２日目 抗癌治療での細胞の処理）
チャンバースライド中の細胞を、抗癌治療またはコントロール処理で、以下のように処理した：コントロール溶液、１０μＭのＣＢＰ５０１（配列番号２７）、１０μｇ／ｍｌのシスプラチン（ＣＤＤＰ）、またはＣＢＰ５０１とシスプラチンとの組み合わせを、チャンバースライドに添加し、３時間インキュベートした。培養培地を交換し、チャンバースライドを、さらに２４時間〜４８時間培養した。
【００８２】
（３日目、４日目または５日目 染色および分析）
示された日（３日目、４日目または５日目）のはじめに、培地をチャンバースライドから吸引し、７０％エタノールを添加し、その後１５分間室温でインキュベートすることで、細胞を固定した。上清を廃棄し、５０μｇ／ｍｌ ヨウ化プロピジウム（Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）（０．１％ ＲＮａｓｅ（Ｓｉｇｍａ）含有）を含有するリン酸緩衝化生理食塩水をスライドに添加し、室温で３０分間インキュベートした。チャンバースライド上の細胞を、次いで、レーザー走査サイトメトリー（Ｏｌｙｍｐｕｓ顕微鏡を備えたＬＳＣ（登録商標）Ｓｙｓｔｅｍ）で分析した。
【００８３】
（結果）
図３Ａに示されるように、ＣＢＰ５０１（配列番号２７）での処理は、ＤＮＡ含有量の値のヒストグラム（特に、Ｇ１期にある細胞に対応するヒストグラム）の形状を拡げるが、細胞周期分布は、有意に変化しなかった。シスプラチン（ＣＤＤＰ）での処理により、Ｇ２／Ｍ期にある細胞の蓄積が生じた。ＣＢＰ５０１とシスプラチンとを併用して処理すると、Ｇ１のピークおよびＧ２／Ｍのピークがともに劇的に減少し、Ｇ１期に達しない集団（これは細胞死を示す）が増加した。各ヒストグラムにおける（垂線の間の）「１」と記されたピークは、細胞培養物に夾雑している、癌でないマウスの正常な線維芽細胞のＧ１集団を示す。細胞形態を直接観察すると、この併用処置により、腫瘍細胞の集団における細胞死が劇的に増加したことが示された。
【００８４】
これらの結果により、ＣＢＰ５０１（配列番号２７）またはシスプラチン（ＣＤＤＰ）いずれかでの処理は、腫瘍細胞に対して何らかの影響を有するが、ＣＢＰ５０１とシスプラチンとの併用処理は、いずれかの処理単独よりも有効であり、そして併用処理は、腫瘍細胞に対して非常に有効であるということが推定された。
【００８５】
代理インビボ効力試験： 異種移植片腫瘍アッセイを使用する代理インビボ効力試験を、改変をして、上記のように行った。ＭＩＡＰａＣａ２細胞（ｎ＝５）を、雄性ＳＣＩＤマウス（Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ Ｌａｂ．，Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ，ＭＡ）に細胞を皮下注射することによって移植した。腫瘍の大きさが約０．１５ｃｍ３の大きさに達したときに、処置を開始した。腫瘍の大きさを、ノギスを用いて１週間に３回測定した。腫瘍体積を、以下のように計算した：体積（ｃｍ３）＝［幅（ｍｍ）２×長さ（ｍｍ）］／２０００。平均腫瘍サイズ（体積）を標準偏差とともにプロットした（図１ｂ）。動物を、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ ｆｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ａｎｉｍａｌ Ｃａｒｅの指針に従って飼育した。このプロトコルは、ＣａｎＢａｓ Ｃｏ．Ｌｔｄの社内動物ケア委員会によって承認された。
【００８６】
ＳＣＩＤマウスにおいて樹立したＨＣＴ−１１６異種移植片（０．２ｃｍ３）を、以下を腹腔内注射することによって２週間にわたり、各週に２回（すなわち、１日目、５日目、８日目および１２日目に）処置した：ビヒクル単独（ＤＭＳＯ）；ＣＢＰ５０１（１２０ｍｇ／ｍ２）；シスプラチン（ＣＤＤＰ、３ｍｇ／ｋｇ）；ＣＢＰ５０１（３０ｍｇ／ｍ２）とシスプラチン（ＣＤＤＰ、３ｍｇ／ｋｇ）との併用；ＣＢＰ５０１（６０ｍｇ／ｍ２）とシスプラチン（ＣＤＤＰ、３ｍｇ／ｋｇ）との併用；ＣＢＰ５０１（１２０ｍｇ／ｍ２）とシスプラチン（ＣＤＤＰ、３ｍｇ／ｋｇ）。図３Ｂに示されるように、ＣＢＰ５０１単独またはシスプラチン（ＣＤＤＰ）単独では、腫瘍増殖にほとんどまたは何ら効果がなかった。しかし、ＣＢＰとシスプラチン（ＣＤＤＰ）との併用処置により、異種移植片腫瘍増殖の有意な阻害が生じた。興味深いことに、ＣＢＰ５０１とシスプラチン（ＣＤＤＰ）との併用の効果は、ＣＢＰ５０１の濃度に無関係であるようであった：３０ｍｇ／ｍ２、６０ｍｇ／ｍ２、１２０ｍｇ／ｍ２のＣＢＰ５０１を使用した併用処置は、同様の有効性を示した。対照的に、ＣＢＰ５０１単独では、試験した最高濃度である１２０ｍｇ／ｍ２でも、異種移植片腫瘍増殖は有意には阻害されなかった。
【００８７】
これらの結果は、上記のようなＣＢＰ５０１とシスプラチン（ＣＤＤＰ）とを用いるインビトロでの感受性試験の結果に基づく推定と相関している。
【００８８】
添付の特許請求の範囲に規定される本発明の趣旨および範囲を逸脱することなく、好ましい実施形態に対して種々の改変が行われ得る。
【図面の簡単な説明】
【００８９】
【図１】図１は、ＨＣＴ−１１６細胞に対するＣＢＤＣ４０２、ＣＰＴ−１１、およびＣＢＤＣ４０２とＣＰＴ−１１との併用の効力を試験するための、フローサイトメトリーを用いるインビトロ感受性試験（図１Ａ）、および異種移植片腫瘍アッセイを用いる代理インビボ効力試験（図１Ｂ）の相関を示す。
【図２】図２は、ＨＣＴ−１１６細胞に対するＣＢＤＣ００４、ＣＰＴ−１１、およびＣＢＤＣ００４とＣＰＴ−１１との併用の効力を試験するための、フローサイトメトリーを用いるインビトロ感受性試験（図２Ａ）、および異種移植片腫瘍アッセイを用いる代理インビボ効力試験（図２Ｂ）の相関を示す。
【図３Ａ】図３は、臨床適用のための感受性試験のシミュレーションを示す。このシミュレーションは、ＭＩＡＰａＣａ２細胞に対するＣＢＰ５０１、シスプラチン（シスジアミンジクロロ白金、ＣＤＤＰ）またはＣＢＰ５０１とシスプラチンとの併用の効力を試験するために、チャンバースライド上の培養異種移植片腫瘍細胞のレーザースキャニングサイトメトリーを用いるインビトロ感受性試験（図３Ａ）、および異種移植片腫瘍アッセイを用いる代理インビボ効力試験からの結果を比較する。
【図３Ｂ】図３は、臨床適用のための感受性試験のシミュレーションを示す。このシミュレーションは、ＭＩＡＰａＣａ２細胞に対するＣＢＰ５０１、シスプラチン（シスジアミンジクロロ白金、ＣＤＤＰ）またはＣＢＰ５０１とシスプラチンとの併用の効力を試験するために、チャンバースライド上の培養異種移植片腫瘍細胞のレーザースキャニングサイトメトリーを用いるインビトロ感受性試験からの結果（図３Ａ）と、異種移植片腫瘍アッセイを用いる代理インビボ効力試験からの結果とを比較する。
【図４Ａ】図４は、抗癌治療の効力を推定するために使用される例示的Ｇ２チェックポイント抑止非ペプチド化合物の構造およびＣＢＤＣコード名を示す。
【図４Ｂ】図４は、抗癌治療の効力を推定するために使用される例示的Ｇ２チェックポイント抑止非ペプチド化合物の構造およびＣＢＤＣコード名を示す。
【図４Ｃ】図４は、抗癌治療の効力を推定するために使用される例示的Ｇ２チェックポイント抑止非ペプチド化合物の構造およびＣＢＤＣコード名を示す。
【００９０】
（表１） 表１は、抗癌治療の効力を推定するために使用される例示的なＧ２チェックポイント抑止ペプチドおよびＧ２チェックポイント抑止ペプチド模倣物の配列、配列番号、およびＣＢＰコード名を示す。
【技術分野】
【０００１】
（関連技術）
本願は、米国特許出願第６０／４９４０２２号（２００３年８月８日出願）に対する優先権の利益を主張する。
【０００２】
（発明の分野）
本開示は、種々の治療に対する癌細胞の感受性を決定するための方法に関する。具体的には、本開示は、患者における１つ以上の候補抗癌治療の効力を、候補抗癌治療としてスクリーニングされている種々の処置レジメンに対するこの患者の癌細胞の感受性を決定することに基づいて、推定するための方法に関する。この開示は、各患者にとって最も有効な抗癌治療を選択し、それによって、不要な処置を避けるための方法に関する。
【背景技術】
【０００３】
（背景）
現在、最も臨床的に有効な抗癌治療は、試験されるヒト癌細胞のわずか約１０〜５０％において望ましい応答を生じるにすぎず、抗癌処置は、しばしば、望ましくない副作用が付随する。
【０００４】
候補抗癌治療が、癌細胞を阻害または死滅させる能力を測定するための既存の方法としては、新たな腫瘍生検材料におけるテトラゾリウムブルー還元に対する効果を測定すること（Ｂｌａｃｋら，１９５４，Ｊ Ｎａｔ Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｓｔ １４：１１４７−１１５８）、ヒト腫瘍幹細胞のクローニングに対する効果を測定すること（Ｓａｌｍｏｎら，１９７８，Ｎ Ｅｎｇｌ Ｊ Ｍｅｄ ２９８：１３２１−１３２７）、試験されている抗癌剤の存在下および非存在下で、腫瘍細胞による放射性標識チミジンの取り込みに対する効果を測定すること（Ｋｅｒｎら，１９８７，Ｉｎｔｌ Ｊ Ｃｅｌｌ Ｃｌｏｎｉｎｇ ５：４２１−４３１）、生細胞および死細胞の染色特性の差に対する影響を測定すること（Ｗｅｉｓｅｎｔｈａｌら，１９９１，Ｏｎｃｏｌｏｇｙ，５：９３−１０３）が挙げられる。コロニー形成試験は、インビトロで癌細胞の増殖に対する候補抗癌治療の効果を決定するための方法として、現時点では好都合であるが、試験が成功するだけ十分長い期間にわたって、腫瘍細胞はインビトロで十分に増殖しない可能性があることが理解されている。これらの方法の各々は、候補抗癌治療に対する癌細胞の感受性の何らかの尺度を提供するが、これらのアッセイの多くは、完了するまでに１〜３週間を要する。一般に、医師も患者も、結果を得るためにそれほど長い時間待つことはできない。
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【０００５】
（発明の要旨）
本発明は、３〜５日間以内に、種々の抗癌治療に対する患者の癌細胞の感度を決定する方法を提供し、この方法は、この患者から取り出されインビトロで種々の抗癌治療に曝された細胞のＤＮＡ含有量を測定することにより行われる。種々の抗癌治療に対する患者の癌細胞の感受性を決定するための迅速な方法を提供することによって、本発明は、個体ベースで最も有効な抗癌治療を同定および選択するための方法を提供する。種々の抗癌治療に対する患者の癌細胞の感受性を決定するための迅速な方法を提供することによって、本発明は、望ましい性質（例えば、患者の癌細胞に対する高選択的細胞傷害性および患者の非癌細胞に対する低細胞傷害性）を有する治療を同定するために、望まれるだけ多くの候補抗癌治療をスクリーニングするための適した方法を提供する。
【０００６】
本発明は、候補抗癌治療に対する患者の癌細胞の感受性を決定するための方法を提供し、この方法は、患者の癌細胞サンプルを、インビトロでこの候補抗癌治療に曝す工程、この候補抗癌治療に曝した後にこのサンプル中の各癌細胞のＤＮＡ含有量を測定する工程、この候補抗癌治療に曝した後に、このサンプルの細胞周期分布を決定する工程により行われ、ここでこの候補抗癌治療に曝した後のこのサンプルの細胞周期分布における変化は、この患者の癌細胞が、この候補抗癌治療に対して感受性であることを示す。特に、本発明は、候補抗癌治療に対する患者の癌細胞の感受性を決定するための方法を提供し、ここでこの候補抗癌治療に曝した後の癌細胞のサンプルにおけるＧ１期に達しない集団の増加は、この治療がこの患者の癌細胞に対して細胞傷害性であることを示す。この候補抗癌治療に曝した後のこのサンプル中のＧ２／Ｍ期集団の増加は、この治療が、この患者の癌細胞の増殖を阻害することを示す。
【０００７】
本発明は、候補抗癌治療に対する患者の癌細胞の感受性を決定するための方法を提供し、この方法は、この候補抗癌治療に対するこの患者の非癌細胞の感受性を決定する工程もまた包含する。
【０００８】
本発明は、候補抗癌治療に対する患者の癌細胞の感受性を迅速に決定するための方法を提供し、この方法は、この患者の癌細胞のサンプルを、インビトロでその候補抗癌治療に曝す工程、この候補抗癌治療に曝した後にこのサンプル中の各癌細胞のＤＮＡ含有量を測定する工程、この候補抗癌治療に曝した後に、このサンプルの細胞周期分布を決定する工程により行われ、ここでこの方法は、約３日間〜約５日間以内に完了する。本発明は、約３日間以内に候補抗癌治療に対する患者の癌細胞の感受性を決定するための方法を提供する。本発明は、約４日間以内に候補抗癌治療に対する患者の癌細胞の感受性を決定するための方法を提供する。本発明は、約５日間以内に候補抗癌治療に対する患者の癌細胞の感受性を決定するための方法を提供する。
【０００９】
本発明は、複数の候補抗癌治療に対する患者の癌細胞の感受性を決定するための方法を提供し、この方法は、複数の癌細胞のサンプルを複数の候補抗癌治療に曝す工程によって行われる。各治療に対するこの患者の癌細胞の感受性に基づいて、この候補抗癌治療の有効性を順位付けする方法、およびこの患者にとって最も有効な候補抗癌治療を同定するための方法が提供される。
【００１０】
本発明は、候補抗癌治療に対する患者の癌細胞の感受性を迅速に決定するための方法を提供し、この方法は、この患者の癌細胞のサンプルを、インビトロでその候補抗癌治療に曝す工程、この候補抗癌治療に曝した後にこのサンプル中の各癌細胞のＤＮＡ含有量を測定する工程、この候補抗癌治療に曝した後に、このサンプルの細胞周期分布を決定する工程により行われ、ここでこの候補抗癌治療は、ＤＮＡ損傷因子またはＧ２チェックポイント抑止因子であり得る。本発明は、例えば、以下の１種以上の非ペプチドＧ２チェックポイント抑止化合物に対する患者の癌細胞の感受性を決定するための方法を提供する：４−クロロ−安息香酸４−メトキシ−フェニルエステル（ＣＤＢＣ００４）、４−クロロ−安息香酸ｐ−トリルエステル（ＣＢＤＣ４０１）；４−ブロモ−安息香酸ｐ−トリルエステル（ＣＢＤＣ４０２）；３，４，５−トリフルオロ−安息香酸ｐ−トリルエステル（ＣＢＤＣ４０３）；４−フルオロ−安息香酸４−ブロモ−フェニルエステル；エタンとの化合物（ＣＢＤＣ４０４）、３，４−ジクロロ−安息香酸ｐ−トリルエステル；エタンとの化合物（ＣＢＤＣ４０５）、２，４−ジクロロ−安息香酸ｐ−トリルエステル；エタンとの化合物（ＣＢＤＣ４０６）、４−フルオロ−安息香酸ｐ−トリルエステル；エタンとの化合物（ＣＢＤＣ４０７）、２，３，４，５，６−ペンタフルオロ−安息香酸ｐ−トリルエステル；エタンとの化合物（ＣＢＤＣ４０８）、４−クロロ−安息香酸３，４−ジメチル−フェニルエステル；エタンとの化合物（ＣＢＤＣ４０９）、４−クロロ−安息香酸４−ヒドロキシ−フェニルエステル；エタンとの化合物（ＣＢＤＣ４１０）、４−フルオロ−安息香酸４−ヒドロキシ−フェニルエステル；エタンとの化合物（ＣＢＤＣ４１１）、４−ブロモ−安息香酸４−フルオロ−フェニルエステル（ＣＢＤＣ４１２）、４−ブロモ−安息香酸４−トリフルオロメチル−フェニルエステル（ＣＢＤＣ４１３）、４−ブロモ−安息香酸４−ヒドロキシ−フェニルエステル（ＣＢＤＣ４１４）、４−ブロモ−安息香酸４−トリフルオロメトキシ−フェニルエステル（ＣＢＤＣ４１５）、４−ブロモ−安息香酸６−メチル−ピリジン−３−イルエステル（ＣＢＤＣ４１８）、４−ブロモ−チオ安息香酸O−ｐ−トリルエステル（ＣＢＤＣ４４０）、４−ブロモ−ジチオ安息香酸ｐ−トリルエステル（ＣＢＤＣ４４１）、または４−ブロモ−チオ安息香酸Ｓ−ｐ−トリルエステル（ＣＢＤＣ４４２）。本発明は、例えば、以下の１種以上のＧ２チェックポイント抑止ペプチドまたはＧ２チェックポイント抑止ペプチド模倣物に対する患者の癌細胞の感受性を決定するための方法を提供する：ＣＢＰ５００（配列番号２６）、ＣＢＰ５０１（配列番号２７）、ＣＢＰ５０４（配列番号２９）、ＣＢＰ５０５（配列番号３０）、ＣＢＰ５０６（配列番号３１）、ＣＢＰ５１０（配列番号３２）、ＣＢＰ５１１（配列番号３３）、ＣＢＰ５１２（配列番号３４）、またはＣＢＰ６０３（配列番号３７）。
【００１１】
本発明は、候補抗癌治療に対する患者の癌細胞の感受性を迅速に決定するための方法を提供し、この方法は、この患者の癌細胞のサンプルを、インビトロでその候補抗癌治療に曝す工程、この候補抗癌治療に曝した後にこのサンプル中の各癌細胞のＤＮＡ含有量を測定する工程、この候補抗癌治療に曝した後に、このサンプルの細胞周期分布を決定する工程により行われ、ここでこの抗癌治療は、併用療法である。併用療法は、特に、ＤＮＡ損傷因子およびＧ２チェックポイント抑止因子の併用が癌細胞に対して選択的に細胞傷害性である場合、ＤＮＡ損傷因子およびＧ２チェックポイント抑止因子を含む。このＧ２チェックポイント抑止因子は、ＤＮＡ損傷因子の細胞傷害性効果に対して癌細胞を選択的に感受性にする併用療法の効力を推定するための方法が提供される。１つの併用療法において、このＤＮＡ損傷因子はイリノテカン（ＣＰＴ−１１）であり、このＧ２チェックポイント抑止因子はＣＢＤＣ４０２である。別の併用療法において、このＤＮＡ損傷因子はイリノテカン（ＣＰＴ−１１）であり、このＧ２チェックポイント抑止因子はＣＢＤＣ００４である。別の併用療法において、このＤＮＡ損傷因子はシスプラチン（ＣＤＤＰ）であり、このＧ２チェックポイント抑止因子はＣＢＰ５０１（配列番号２７）である。
【００１２】
本発明は、候補抗癌治療に対する患者の癌細胞の感受性を決定するための方法を提供し、この方法は、インビトロで癌細胞の感受性を測定する工程を包含し、候補抗癌治療の代理インビボ効力試験もまた包含する。この代理効力試験は、異種移植片腫瘍アッセイであり、このアッセイは、この患者の癌細胞のサンプルを代理宿主に移植する工程、この代理宿主において腫瘍を形成させる工程、この代理宿主を候補抗癌治療で処置する工程、およびこの腫瘍に対するこの候補抗癌治療の効果を測定する工程を包含する。
【００１３】
本発明は、患者に対する抗癌治療の効果を推定するための方法を提供し、この方法は、この患者の癌細胞のサンプルを、この候補抗癌治療にインビトロで曝す工程、この候補抗癌治療に曝した後に、この癌細胞のサンプルの細胞周期分布を決定する工程、およびこの患者の癌細胞に対するこの候補抗癌治療の細胞傷害性を決定する工程、を包含する。本発明は、この候補抗癌治療の安全性を決定するための方法をさらに提供し、この方法は、この患者の非癌細胞のサンプルを、この候補抗癌治療にインビトロで曝す工程、およびこの患者の非癌細胞に対するこの候補抗癌治療の細胞障害性を決定する工程による。
【００１４】
本発明は、患者にとって最も有効な抗癌治療を選択するための方法を提供し、この方法は、複数の候補抗癌治療に対してこの患者の癌細胞および非癌細胞の感受性を決定する工程、この患者の癌細胞および非癌細胞に対する各候補抗癌治療の細胞傷害性を決定する工程、ならびにこの細胞に対して最大の細胞傷害性を有しかつこの患者の非癌細胞に対して最小の細胞傷害性を有する治療を選択する工程により行われる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１５】
（発明の詳細な説明）
本開示は、種々の抗癌治療に対する癌細胞の感受性を決定するための方法を提供する。特に、本開示は、患者における種々の抗癌治療の効力を、種々の抗癌治療に対する患者の癌細胞の感受性を決定することに基づいて、推定するための方法を提供する。この開示は、患者にとって最も有効な抗癌治療を、候補抗癌治療としてスクリーニングされている化合物および／または処置に対する患者の癌細胞の感受性を決定するためのエキソビボ方法に基づいて、選択するための方法をさらに提供する。多くの候補治療が、患者の癌細胞に対する適切な高レベルの選択的細胞傷害性、かつこの患者の非癌細胞に対する許容可能に低いレベルの非選択的細胞傷害性を有する治療を見出すためにスクリーニングされ得る場合、非特異的な副作用がより少ない、有効な抗癌治療を選択するための方法が提供される。従って、本開示は、患者を処置する前に、種々の抗癌治療に対する患者の癌細胞の応答を推定するための方法を提供する。その結果、各患者にとって最も有望な処置レジメンが選択され得、不要な処置または効果のない処置が避けられ得る。本願の主題は、全体が参考として援用される、米国特許出願第１０／４５７，０２９号（２００３年６月６日出願）の主題に関連する。
【００１６】
別段規定されなければ、本明細書で使用される全ての技術用語および科学用語は、本発明が属する分野の当業者によって一般に理解されている意味を有する。本明細書で使用される場合、単数形「１つの（ある）（ａ）」、「および（と）（ａｎｄ）」、「この（その）（ｔｈｅ）」、「である（ｉｓ）」は、文脈が明らかに別のものを示さなければ、複数形を包含する。例えば、１つの「化合物」に対する言及は、複数の化合物を包含し、「（１つの）残基」または「（１つの）アミノ酸残基」に対する言及は、１つ以上の残基および１つ以上のアミノ酸に対する言及を包含する。本明細書で引用される全ての刊行物、特許、および特許出願は、全ての目的で、明白に参考として本明細書に援用される。
【００１７】
（抗癌治療の効力を推定するための方法）
本発明は、抗癌治療の効力を推定するための方法を提供する。特に、増殖性障害（例えば、癌（転移性および非転移性の固形腫瘍または液状腫瘍（ｌｉｑｕｉｄ ｔｕｍｏｒ）が挙げられる））に対して有効な候補治療を同定するための方法が提供される。より具体的には、増殖性障害に罹患している個々の被験体（特にヒト患者）にとって最も有効な候補治療を同定するための方法が提供される。本明細書に提供される方法は、同様に、増殖性障害を処置する（例えば、癌（転移性および非転移性の固形腫瘍または液状腫瘍（ｌｉｑｕｉｄ ｔｕｍｏｒ）が挙げられる）を処置する）ために使用され得る。本明細書で使用される場合、用語「増殖性障害」および「増殖性状態」とは、少なくとも１つの細胞の異常な増殖または望ましくない増殖により特徴づけられる任意の病理的生理学的状態または非病理的生理学的状態（望ましくないかまたは所望されていない細胞増殖または細胞生存によって特徴づけられる状態、欠損したアポトーシスまたは異常なアポトーシスによって特徴づけられる状態、ならびに異常な細胞生存または望ましくない細胞生存または所望されない細胞生存により特徴づけられる状態が挙げられる）を意味する。本明細書で使用される場合、用語「癌」とは、増殖性障害をいう。本明細書で使用される場合、用語「癌細胞」とは、増殖性障害（例えば、癌）の異常な細胞増殖特性を受けているか、またはこのような特性を受ける可能性がある、細胞をいう。本明細書で使用される場合、「抗癌治療」とは、被験体における増殖性障害（特に、癌）の症状を阻害、改善、低減するかまたはその増殖症外を排除する、処置レジメンをいう。「抗癌治療」は、１つ以上の化合物、１つ以上の物理的処置（例えば、照射、熱、またはさらに手術）、または化合物と物理的処置との併用を包含し得る、処置レジメンをいう。「候補抗癌治療」とは、被験体における増殖性障害（特に、癌）の症状を阻害、改善、低減するか、またはその増殖性障害を排除することを意図した処置レジメンをいい、ここでこの候補抗癌治療は、本発明の方法に従って施されている。
【００１８】
本明細書に提供される方法は、増殖性障害（例えば、癌）を受けやすい任意の被験体におけるこのような障害に対して有効な、候補抗癌治療を同定するために使用され得る。用語「被験体」とは、動物、代表的には、哺乳動物（例えば、霊長類（ヒト、サル、テナガザル、チンパンジー、オランウータン、マカク）、家畜（イヌおよびネコ）、家畜（ｆａｒｍ ａｎｉｍａｌ）（ウマ、ウシ、ヤギ、ヒツジ、ブタ）および実験動物（マウス、ラット、ウサギ、モルモット）をいう。被験体としては、動物疾患モデル（例えば、腫瘍を保有するマウスまたはラット）、特に、ヒト癌細胞がマウスに移植されて腫瘍を形成する異種移植片マウスモデルが挙げられる。本明細書で使用される場合、用語「患者」とは、抗癌治療での処置が必要なヒト被験体をいう。
【００１９】
本発明は、被験体に由来する癌細胞を提供する工程、癌細胞と、候補抗癌治療剤とを接触させる工程、および候補抗癌治療に曝された癌細胞のサンプルの１細胞あたりのＤＮＡ含有量を決定する工程を包含する方法を提供する。以下に開示されるように、候補抗癌治療に曝された細胞のサンプル中の各癌細胞のＤＮＡ含有量を決定することにより、この候補治療が、癌細胞に対して望ましい細胞傷害性効果または阻害性効果を有するか否かを決定することが可能になる。本発明の方法はまた、一般に、被験体に由来する非癌（正常）細胞を使用して、この候補治療が癌細胞に対する選択的効果を有するか否かを決定するために、同じ工程を実施することを包含することが理解される。本発明は、種々の抗癌治療に対する被験体の癌細胞の感受性を決定するためのエキソビボ方法、試験される各抗癌治療の有効性および安全性を推定するためのエキソビボ方法、ならびに短時間で最も有効な治療を選択するためのエキソビボ方法を提供する。
【００２０】
本明細書に提供される方法は、候補抗癌治療をスクリーニングして、特定の被験体にとって最も有効な抗癌治療を同定するために適している。本発明の一局面に従って、癌細胞は、患者から単離され、候補抗癌治療に曝され、各サンプルにおける各細胞のＤＮＡ含有量が決定される。このことは、患者の癌細胞に対する各候補抗癌治療の効果のインビトロでの測定を提供し、これによって、各候補治療に対する患者の癌細胞の感受性のインビトロでの推定を提供する。一実施形態において、上記のインビトロ方法は、多くの候補抗癌治療をスクリーニングして、患者の癌細胞に対するそれらの有効性を決定するために適している。別の実施形態において、上記のインビトロ方法は、複数の患者に由来する癌細胞を用いて実施される。別の実施形態において、上記のインビトロ方法は、抗癌治療における候補化合物または候補処置の潜在的有用性についてこれらの化合物または処置をスクリーニングするために使用される。別の実施形態において、上記のインビトロ方法は、複数の患者に由来する細胞を使用して実施されて、抗癌治療におけるそれらの潜在的有用性について、候補化合物または候補処置がスクリーニングされる。
【００２１】
本発明の方法はまた、一般に、被験体に由来する非癌（正常）細胞を用いて、候補治療が癌細胞に対して選択的効果を有するか否かを決定するために、同じ工程を実施することを包含することが理解される。非癌細胞に対する効果を測定することはまた、患者の癌細胞に対して有効であると思われる候補抗癌治療の安全性および潜在的副作用を推定するために使用され得る。一実施形態において、非癌細胞に対する効果は、試験されている各候補抗癌治療について測定される。別の実施形態において、非癌細胞に対する効果は、患者の癌細胞に対して望ましい細胞傷害性または阻害性効果を有すると同定された各候補抗癌治療について測定される。
【００２２】
本明細書に提供される方法は、実験動物モデルを使用して、候補抗癌治療をスクリーニングするために適している。一局面に従って、候補抗癌治療は、種々の増殖性障害に対する動物モデルまたは代理と考えられる動物から単離された癌細胞に対するインビトロ効果を測定することによって、スクリーニングされ得る。特に、候補抗癌治療は、特定の型の癌に関する動物モデルまたは代理と考えられる動物から単離された癌細胞に対するインビトロ効果を測定することによってスクリーニングされ得る。一実施形態において、このインビトロスクリーニング方法は、特定の型の癌の１以上の動物モデルに由来する細胞を使用して、多数の候補抗癌治療をスクリーニングするために使用される。別の実施形態において、このインビトロスクリーニング方法は、特定の型の癌の１以上の動物モデルに由来する細胞を使用して、抗癌治療におけるそれらの潜在的有用性について、候補化合物または候補処置をスクリーニングするために使用される。
【００２３】
本発明の方法は、培養した細胞のインビトロ感受性試験、および代理インビボ効力試験を使用して、候補抗癌治療をスクリーニングするために特に適している。このことにより、候補抗癌治療に対する患者の癌細胞の感受性を推定するための少なくとも２つのエキソビボ方法を提供する。上記異種移植片腫瘍アッセイは、本発明に従って、候補抗癌治療についての適切な代理インビボ効力試験を提供する。インビトロ感受性試験、および異種移植片腫瘍アッセイを用いる代理インビボ効力試験の両方を使用する実施形態の非限定的な例が、以下の実施例１、２、および３において開示される。ヒト患者から単離された癌細胞は、培養において増殖され、１つ以上の候補抗癌治療に曝され、各細胞のＤＮＡ含有量が測定される。このことにより、各候補治療に対するその患者の癌細胞の感受性のインビトロでの尺度を提供する。異種移植片腫瘍アッセイにおいて、ヒト被験体から単離された癌細胞は、適切な宿主（例えば、マウス）に移植されて、腫瘍を形成する。その後、この宿主動物は、候補抗癌治療で処置されて、腫瘍増殖に対する効果が、測定される。宿主において移植されたヒト腫瘍に対する候補抗癌治療の効果を測定することによって、異種移植片腫瘍アッセイは、候補治療にヒト患者を曝さす必要なしに、各候補治療に対する患者の癌細胞の感受性についｔれ、第２の代理のインビトロでの尺度を提供する。非癌細胞はまた、患者から単離され、上記のインビトロ方法を使用して試験されて、候補抗癌治療の安全性および潜在的副作用を決定し得ることが理解される。
【００２４】
インビトロ感受性試験および代理インビボアッセイの両方を包含する方法は、特に臨床状況において、候補抗癌治療に対する患者の癌細胞の感受性を推定するための、安全かつ有効な方法を提供する。さらに、このような方法は、インビトロでの結果の確認を提供し、あり得る副作用を検出するための代理アッセイ系を提供する。最後に、このような方法は、標準的な処置のインビトロでの効果および代理のインビボでの効果を測定し、これらの効果を、候補抗癌治療（特に、新規な候補抗癌治療またはこれまでに試験されていない候補抗癌治療）のインビトロでの効果および代理のインビボでの効果とを比較することにより、スクリーニングアッセイを較正するための手段を提供する。
【００２５】
本発明は、患者に合わせて調整された抗癌治療を設計するための方法を提供し、より好都合な応答速度を提供する。さらに、本発明は、患者において不要な、危険な、またはあまり有効でない抗癌治療の使用を避け、それによって、所望されない副作用を避けるかまたは最小にするための方法を提供する。
【００２６】
一局面に従って、本発明の方法は、患者の癌細胞が感受性である抗癌治療のみを選択して使用するためのガイダンスを提供し、これによって、その患者について成功する可能性が低い治療を避けることによって、費用効率を提供する。成功する可能性が低い処置を避けることによって、この患者は、効果のない処置の副作用を被ることから保護される。種々の実施形態において、患者の癌細胞の感受性は、その細胞が患者から取り出されて後に、約２日間以内、３日間以内、４日間以内、５日間以内、６日間以内、７日間以内、８日間以内、９日間以内または１０日間以内に決定され得る。特定の実施形態において、患者の癌細胞の感度は、患者から取り出されてから約３日〜約５日後に、決定され得る。
【００２７】
（試験用の細胞）
一局面によれば、癌細胞は、以下の方法（末梢血の採血、骨髄の吸引、組織（腫瘍）生検、または例えば、腫瘍または他の癌組織を取り出す手術の間に外科的に癌細胞を取り出すことが挙げられるが、これらに限定されない）を用いて、被験体（特定にヒト患者）から細胞を単離することによって提供される。非癌細胞がまた、特定の実施形態において処置されている場合、これらの細胞は、被験体の適切な位置から単離され得る。必要であれば、細胞は、１つ以上の候補抗癌治療に曝す前に、さらに走査され得る（例えば、細胞塊を、酵素消化して、単一の細胞懸濁物を調製し得るか、または細胞集団を、細胞培養を用いてインビトロで拡大し得る）。本発明の方法は、広く種々の癌（癌腫、新生物、増殖性障害）に由来する癌細胞を試験するために使用され得る。これらの癌としては、卵巣癌、膀胱癌、肺癌（小細胞癌を含む）、子宮頚癌、乳癌、前立腺癌、神経膠腫、線維肉腫、網膜芽腫、黒色腫、軟部組織肉腫、骨肉腫、白血病、胃癌、結腸癌、腎臓の癌腫、胃腸癌、唾液腺の癌、膵臓癌、ホジキン病、非ホジキンリンパ腫、急性リンパ性白血病および慢性リンパ性白血病、多発性骨髄腫、神経芽腫、ウィルムス腫瘍、精巣癌、軟部組織肉腫、慢性リンパ性白血病、原発性マクログロブリン血症、慢性顆粒球性白血病、原発性脳癌腫、悪性膵臓インスリノーマ、悪性類癌腫（ｃａｒｃｉｎｏｉｄ ｃａｒｃｉｎｏｍａ）、悪性黒色腫、絨毛上皮腫、菌状息肉腫、頭部および頸部の癌腫、骨原性肉腫、膵臓癌種、急性顆粒球性白血病、ヘアリーセル白血病、神経芽腫、横紋筋肉腫、カポージ肉腫、尿生殖器の癌腫、甲状腺の癌種、食道の癌腫、悪性高カルシウム血症、頸部過形成、腎細胞癌、子宮内膜癌腫、真性赤血球増加症、本態性血小板減少症、副腎皮質癌腫、皮膚癌、および前立腺癌腫が挙げられるが、これらに限定されない。当業者は、本明細書に提供される教示を適合させて、本明細書に列挙されていない他の癌に対する候補抗癌治療の有効性を試験し得ることが、理解される。同様に、当業者は本明細書に提供される方法を実施して、任意の増殖性障害の適切な動物モデルを使用して、候補抗癌治療の効力を試験し得ることが、理解される。
【００２８】
一局面に従って、正常（非癌）細胞のサンプルおよび癌細胞のサンプルのＤＮＡ含有量を別個に分析して、インビトロでの感受性試験の精度を高めるための方法が提供される。一実施形態において、癌細胞および正常（非癌）細胞は、別個の位置から取り出され、そのサンプルは、いつでも別個に保持される。正常細胞および癌細胞の両方が存在するサンプルにおいて、これらの細胞は、種々の方法によって区別され得、これらの方法としては、正常細胞と癌細胞との間を区別する抗体または他のプローブを使用すること、癌細胞における異数性を検出すること、または正常細胞と癌細胞との間の形態的な差異を観察することが挙げられる。一実施形態において、混合サンプル中の正常細胞および癌細胞は、ＤＮＡ含有量を分析する前に、別個のサンプルに分けられて細胞周期が決定される。別の実施形態において、混合サンプル中の正常細胞および癌細胞が分析され、その細胞型（正常または癌）が、各細胞のＤＮＡ含有量が測定されると同時に区別される。
【００２９】
種々の癌から単離された癌細胞に対する抗癌治療の効果を別個に分析するための方法が、本明細書で提供される。一局面に従って、候補抗癌治療の効果は、種々の位置から単離された癌細胞サンプルについて別個に評価される。一実施形態において、癌細胞サンプルは、患者の身体内の種々の位置からの癌細胞が等しい感受性を有するか否かを決定するために、その種々の位置における癌組織から採取される。一実施形態において、癌細胞は、その身体の種々の位置で見出される別個の腫瘍から単離される。一実施形態において、癌細胞は、１種を超える形態で存在する癌（例えば、いくつかの位置では固形腫瘍を形成し、血液もしくはリンパ中に循環もする、癌）から単離される。別の実施形態において、癌細胞は、癌組織内の種々の位置から（例えば、単一の腫瘍内の複数の位置から、または肝臓組織、肺組織、もしくは乳房組織内の複数の位置で癌細胞が増殖しているこれらの組織から）単離される。別の局面に従って、癌細胞のサンプルは、異なる個体から単離された同じ型の癌細胞の感受性を比較するために、同じ型の癌と診断された複数の患者から、採取される。
【００３０】
（サンプル中の細胞周期の決定）
本発明は、候補抗癌治療に対する被験体の癌細胞の感受性を決定するための方法を提供し、この方法は、以下に記載される細胞周期分布に対する影響を測定することにより行われる。候補抗癌治療に対して曝露した後のサンプルの細胞周期分布のシフトは、サンプル中の細胞が、治療に対して高感度であったことを示す。サンプル中の各細胞のＤＮＡ含有量を測定し、各細胞の細胞周期段階を決定することによって、正常細胞周期段階（Ｇ０／Ｇ１、Ｓ、およびＧ２／Ｍ）の各々にあるサンプル中の細胞数、ならびにサンプル中の死細胞（「Ｇ１期に達していない」細胞）数および異数性細胞数を決定することが可能である。従って、「サンプル中の細胞周期分布を決定すること」とは、正常細胞周期段階（Ｇ０／Ｇ１、Ｓ、およびＧ２／Ｍ）にあるサンプル中の細胞の割合、およびサンプル中の死細胞（「Ｇ１期に達していない」細胞）と異数性細胞の割合を決定することをいう。
【００３１】
本発明に従って、候補癌治療で処置された細胞のサンプル中の各細胞のＤＮＡ含有量および細胞周期段階は、ＤＮＡに化学量論的に結合し、かつ核におけるＤＮＡ量に比例する検出可能なシグナルを発する化合物で、細胞ＤＮＡを染色し、次いで、選択されたＤＮＡ染色化合物に適した任意の方法を用いて１細胞あたりのＤＮＡ含有量を決定することを包含する、組成物および方法を用いて決定され得る。適切な化合物としては、ヨウ化プロピジウム（ＰＩ）、ブロモデオキシウリジン（ＢｒｄＵ）、Ｈｏｅｃｈｓｔ色素（特に、Ｈｏｅｃｈｓｔ ３３３４２）、サイバーグリーン、ミトラマイシン、ＤＡＰＩ、または当該分野で公知の他のＤＮＡ染色化合物が挙げられるが、これらに限定されない。細胞のＤＮＡ含有量は、種々のアプローチ（例えば、フローサイトメトリー、レーザースキャンニングサイトメトリー、ならびに当該分野で公知の他の適切な方法、および以下の実施例において記載される他の適切な方法、ならびに例えば、Ｇｉｖａｎ、Ｆｌｏｗ Ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ：Ｆｉｒｓｔ Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ（Ｗｉｌｅｙ，２００２）またはＳｈａｐｉｒｏ，Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ｆｌｏｗ Ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ，第４版（Ｗｉｌｅｙ，２００３）に記載される方法）を用いて分析され得る。
【００３２】
細胞のＤＮＡ含有量は、細胞の細胞周期段階の指標として使用され得る。ここでこのＤＮＡ含有量は、ＤＮＡに化学量論定に結合する蛍光色素（例えば、ヨウ化プロピジウム（ＰＩ））の蛍光強度に比例する。サンプル中で、細胞周期のＧ１期（第１のギャップ）、Ｓ期（ＤＮＡ合成）、Ｇ２／Ｍ期（第２のギャップ／有糸分裂）の各々における細胞の分布は、集団中の各細胞の核ＤＮＡ含有量を測定することによって決定され得る。Ｇ２／Ｍ細胞のＤＮＡ含有量は、Ｇ１細胞のＤＮＡ含有量の２倍である。Ｓ期の細胞は、Ｇ１期集団とＧ２／Ｍ期集団との間に分布する。細胞周期が回っていない細胞は、Ｇ０期にあると考えられる。
【００３３】
数学的処理（逆重畳が挙げられるが、これらに限定されない）は、ＤＮＡ含有量の測定値を、サンプル中の細胞集団の細胞周期分布の代表に変換するために、使用される。細胞周期分布を表す１つの一般的な方法は、特定のＤＮＡ含有量を有する細胞数を示す「ヒストグラム」を生成することである。一般に、類似のＤＮＡ含有量を有する細胞集団を表すヒストグラムのクラスターの代表は、特定の値の周りに集まった「ピーク」のように見えるものを形成する。正常（非癌）細胞のＤＮＡヒストグラムは、大きな正規分布した（ガウス）ピーク（これは、二倍体のＧ０／Ｇ１細胞のＤＮＡ含有量を示す）により通常特徴づけられる。癌細胞のＤＮＡ含有量は、しばしば正常なＤＮＡ含有量から変動するので、癌細胞のサンプルは、しばしば、ＤＮＡヒストグラム上の異なる水平（ｘ軸）位置で第２のＧ０／Ｇ１ピーク中に示される。２つ（または２以上）のＧ０／Ｇ１ピークの出現が、ＤＮＡ含有量異常性が存在することを確立することにおいて重要な特徴である。細胞周期が回っていない集団、すなわち細胞周期が停止した集団は、しばしば、Ｓ期細胞およびＧ２／Ｍ細胞を欠いているが、細胞周期が回っている集団は、大きな割合のＳ期細胞およびＧ２／Ｍ細胞を有する。細胞周期が停止した癌細胞は、ときおり、他の細胞集団に比較して、Ｓ期およびＧ２／Ｍに存在する細胞数が有意に減少しており、そして／またはＧ０／Ｇ１に存在する細胞数が有意に増大している、細胞集団と同定され得る。
【００３４】
死細胞および異数体細胞はまた、それらのＤＮＡ含有量に基づいて同定され得る。アポトーシス（細胞死）の間に、ＤＮＡは、エンドヌクレアーゼによりフラグメント化され、これらの小さなＤＮＡフラグメントは、細胞から外に漏出し得、Ｇ１期よりも少ない、減少した総ＤＮＡ含有量を生じる。従って、「Ｇ１期に達していない」蛍光ピークは、集団中の死細胞数を示すと理解される。
【００３５】
本発明に従って、候補抗癌治療に曝した後のサンプル中の細胞周期分布における変化は、細胞がその治療に感受性であることを示す。細胞周期分布における特定の変化は、感受性細胞に対する抗癌治療の作用の様式の指標として使用され得る。候補抗癌治療に曝されたサンプル中のＧ１期に達していない集団の増大は、その治療がそのサンプル中の細胞に対して細胞傷害性であったことを示すと理解される。特に、候補抗癌治療に曝した癌細胞のサンプル中のＧ１期に達していない集団の増大は、この治療が、これらの癌細胞に対して細胞傷害性であったことを示すと理解される。この候補抗癌治療に曝した後のサンプル中のＧ２／Ｍ集団の増大は、この治療がこのサンプル中の細胞の増殖（分裂、有糸分裂）を示すと理解される。特に、候補抗癌治療に曝した後の癌細胞のサンプル中のＧ２／Ｍ集団における増大は、この治療が癌細胞の集団を阻害することを示すと理解される。
【００３６】
特定の実施形態において、患者の癌細胞に対して細胞傷害性である抗癌治療が好ましい。他の実施形態において、患者の癌細胞の増殖を阻害する抗癌治療が好ましい。他の実施形態において、感受性の癌細胞に対して他の効果を有する抗癌治療が好ましい。当業者は、特定の実施形態について調べた抗癌治療の作用の好ましい態様を決定し得る。
【００３７】
上記のように、正常（非癌）細胞も、一般に、候補抗癌治療に曝され、それらのＤＮＡ含有量もまた、この抗癌治療の選択性を決定する「コントロール」として測定される。本発明のこの局面に従って、候補抗癌治療に曝露した後の正常（非癌）細胞のサンプルにおけるＧ１期に達していない集団の増大は、非選択的細胞傷害性を示す。逆に、癌細胞のサンプルにおけるＧ１期に達していない集団の増大、および同じ患者に由来する正常（非癌）細胞のサンプル中のＧ１期に達していない集団が、ほとんどまたは全く増大していないことにより、研究されている患者に由来する癌細胞に対する候補抗癌治療の選択的細胞傷害性が示される。癌細胞に対する選択的細胞傷害性を有する抗癌治療が好ましいことが理解される。
【００３８】
（さらなるパラメーターの測定）
本発明の別の局面に従って、候補抗癌剤の効力を決定するための方法は、必要に応じて、ＤＮＡ含有量以外の他のパラメーターを測定することを包含する。いくつかの場合において、さらなる測定が、候補抗癌治療の標的をより正確に決定するために使用され得る。望ましい場合、癌細胞が、例えば、研究されている癌の型に特異的な抗体で標識され得る。同様に、当業者は、研究されている癌の他の特有の特徴（例えば、研究されている癌細胞を特徴づける、遺伝子発現または酵素活性）を測定し得る。遺伝子発現は、当該分野で公知の方法を用いて測定され得る。これらの方法としては、特異的ｍＲＮＡまたは特異的タンパク質のレベルを決定することが挙げられるが、これらの限定されない。タンパク質レベルは、例えば、特異的抗血清を用いるウェスタンブロッティングにより、またはコードされたタンパク質の活性を測定することにより、例えば、癌関連転写因子の活性を検出するためにＤＮＡゲルシフトアッセイを用いることにより、またはこのような因子によって活性化されることが公知の遺伝子の発現を分析することにより、分析され得る。発現はまた、例えば、ｍＲＮＡ転写物を検出するための特異的プローブでのノーザンブロッティングにより、遺伝子転写物を測定することにより測定され得る。研究されている癌細胞の特有の特徴を測定することにより、これらの細胞の正体の確認が提供され得る。さらに、特有の特徴を測定することにより、どのような特有の特徴が候補抗癌治療により標的化されるかもまた示され得る。
【００３９】
候補抗癌治療の他の効果のさらなる測定を行うことも可能である。例示すると、細胞の大きさおよび形態は、細胞周期停止状態にある癌細胞を同定するためのさらなる手がかりを提供するために使用され得る。サンプル中の小さな癌細胞は、細胞周期が停止した癌細胞であり得、それらの大きさにより、これらの癌細胞が（より大きな）悪性の対応物から分化することになる。癌細胞形態に関して、細胞周期が停止した癌細胞はまた、一般に、活発でない外観を有する核（例えば、凝集したクロマチンを有する核、または異常な核小体もしくは顕著な核小体を有する核）を有する細胞として同定され得る。癌細胞は、細胞性癌原遺伝子のような特定の重要な遺伝子の発現に基づいて、周期が停止中であると同定され得る。例えば、ｃ−ｍｙｃ遺伝子の発現の減少は、停止した細胞の１つの指標であり得る。ＡＰ１転写因子をコードする遺伝子（例えば、ｃ−ｊｕｎ、およびなおより具体的には、ｃ−ｆｏｓ）の発現の増大もまた、細胞周期が停止した癌細胞に特徴的であると考えられる。特定の実施形態において、細胞周期が停止した癌細胞の測定は、特定の患者に由来する特定の型の癌細胞を停止させるが、死滅させない候補抗癌治療を同定するために有用であり得る。
【００４０】
（抗癌治療）
本発明は、被験体に対する抗癌処置の効力を推定するための方法を提供し、この方法は、この抗癌治療に対するこの被験体の癌細胞の感受性を決定する工程によって行われる。本発明の方法に従って、癌細胞は、候補抗癌化合物の存在下または非存在下で、インビトロで癌細胞を培養する工程、またはインビトロで培養した癌細胞を、候補の抗癌性物理的処理で処理する工程を包含するが、これらに限定されない方法を用いて、候補抗癌治療と接触される。本発明の方法において使用するために適した抗癌治療としては、ＤＮＡ損傷因子、Ｇ２チェックポイント抑止非ペプチド化合物、Ｇ２チェックポイント抑止ペプチドおよびＧ２チェックポイント抑止ペプチド模倣物、ならびに併用療法が挙げられるが、これらに限定されない。当業者は、本明細書に記載されていない候補抗癌治療の有効性を評価するために、本発明の方法を利用し得、本発明の方法を実施することによって得られた結果に基づいて、患者に対して個々に合わせた処置計画を展開し得る。
【００４１】
（抗癌治療：ＤＮＡ損傷因子）
本発明の方法において使用するために適した抗癌治療としては、ＤＮＡ損傷因子が挙げられ、この薬剤は、直接的にまたは間接的にＤＮＡを損傷する任意の処置レジメンを包含する。ＤＮＡ損傷因子は、ＤＮＡ損傷を引き起こすことが公知である、化合物処置および物理的処置を包含し、そして／あるいはスクリーニング法（例えば、米国特許出願第０９／６６７，３６５号に記載される）によって同定される。ＤＮＡ損傷因子の具体的な例としては、５−フルオロウラシル（５−ＦＵ）、レベッカマイシン、ブレオマイシン、シスプラチン、高体温、ＵＶ照射、ガンマ線照射、α線照射、高温、アルキル化剤、ニトロソウレア、代謝拮抗物質、植物アルカロイド、植物抽出物、放射性同位体、カペシタビン、Ｓ−１（テガフール、５−クロロ−２，４−ジヒドロキシピリジンおよびオキソン酸）、５−エチニルウラシル、アラビノシルシトシン（ａｒａ−Ｃ）、５−アザシチジン（５−ＡＣ）、２’，２’−ジフルオロ−２’−デオキシシチジン（ｄＦｄＣ）、プリン代謝拮抗物質（メルカプトプリン、アザチオプリン、チオグアニン）、ゲムシタビン塩酸（ジェムザール）、ペントスタチン、アロプリノール、２−フルオロ−アラビノシル−アデニン（２Ｆ−ａｒａ−Ａ）、ヒドロキシウレア、硫黄マスタード（ビスクロロエチルスルフィド）、メクロレタミン、メルファラン、クロラムブシル、シクロホスファミド、イホスファミド、チオテパ、ＡＺＱ、マイトマイシンＣ、ジアンヒドロガラクチトール、ジブロモスルシトール（ｄｉｂｒｏｍｏｄｕｃｉｔｏｌ）、アルキルスルホネート（ブスルファン）、ニトロソウレア（ＢＣＮＵ、ＣＣＮＵ、４−メチルＣＣＮＵまたはＡＣＮＵ）、プロカルバジン、デカルバジン、アントラサイクリン（例えば、ドキソルビシン（アドリアマイシン；ＡＤＲ）、ダウノルビシン（セルビシン）、イダルビシン（イダマイシン）およびエピルビシン（Ｅｌｌｅｎｃｅ））、アントラサイクリンアナログ（例えば、ミトキサントロン、アクチノマイシンＤ（ａｃｔｉｎｉｍｙｃｉｎ Ｄ）、非挿入トポイソメラーゼインヒビター（例えば、エピポドフィロトキシン（エトオシド＝ＶＰ１６、テニポシド＝ＶＭ−２６）、ポドフィロトキシン、ブレオマイシン（Ｂｌｅｏ）、ペプレオマイシン、白金誘導体（シスプラチン（ＣＤＤＰ）、シスプラチンのトランスアナログ、カルボプラチン、イプロプラチン、テトラプラチンおよびオキサリプラチン）を含む核酸との付加物を形成する化合物））、ならびにカンプトテシン、トポテカン、イリノテカン（ＣＰＴ−１１）、およびＳＮ−３８が挙げられるが、これらに限定されない。核酸損傷処置の具体的な例としては、照射（例えば、紫外線（ＵＶ）、赤外線（ＩＲ）、またはα線照射、β線照射、γ線照射）ならびに環境ショック（例えば、高体温）が挙げられる。当業者は、本発明の方法において使用するために適切な他のＤＮＡ損傷因子およびＤＮＡ損傷処理を同定および利用し得る。
【００４２】
（抗癌治療：Ｇ２チェックポイント抑止因子）
本発明の別の実施形態に従って、Ｇ２チェックポイント抑止因子の効力を試験および推定するための方法が提供され、この因子としては、米国特許出願第１０／４５７，０２９号に開示されるペプチドでないＧ２チェックポイント抑止非ペプチド化合物、ならびに米国特許出願第１０／３４７，１４５号および標題「Ｐｅｐｔｉｄｅｓ ａｎｄ ｐｅｐｔｉｄｏｍｉｍｅｔｉｃｓ ｈａｖｉｎｇ ｉｍｍｕｎｅ−ｍｏｄｕｌａｔｉｎｇ， ａｎｔｉ−ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ，ａｎｄ ａｎｔｉ−ｖｉｒａｌ ａｃｔｉｖｉｔｙ」（２００４年６月２５日出願）に開示されるＧ２チェックポイント抑止ペプチドおよびＧ２チェックポイント抑止ペプチド模倣物が挙げられるが、これらに限定されない。これらの出願は、これら各々の全体が、本明細書に参考として援用される。
【００４３】
用語「Ｇ２チェックポイントを抑止する」または「Ｇ２チェックポイント抑止」、またはこれらの用語の任意の文法的同義語は、細胞がＧ２チェックポイントで細胞周期を停止する能力を抑止する能力をいう。Ｇ２細胞周期チェックポイントは、ＤＮＡ複製およびＤＮＡ修復が完了するまで有糸分裂の開始を制限し、Ｇ２チェックポイントの混乱により、ＤＮＡ複製およびＤＮＡ修復が完了する前に、有糸分裂の開始が早まる。この理論に制限されることは望まないが、蓄積したＤＮＡ損傷を有する細胞において、Ｇ２チェックポイントの抑止は、細胞がＧ２チェックポイントでＤＮＡ損傷を修正または修復する機会を有さず、代わりに、ＤＮＡ修復なしにＧ２期を通過して進行し、有糸分裂カタストロフィー、アポトーシス、または細胞抑制もしくは細胞死を生じる他の状態をもたらすことを意味すると考えられる。本明細書で使用される場合、用語「アポトーシス」とは、プログラムされた細胞死、および当該分野で理解されているような、細胞生理における関連した変化（核酸フラグメント化、カスパーゼ活性化、染色体凝集などが挙げられる）をいう。用語「有糸分裂カタストロフィー」とは、有糸分裂プロセスにおけるエラーから生じる細胞死を意味する。
【００４４】
細胞周期Ｇ２チェックポイントの抑止は、別の方法で細胞におけるＧ２細胞周期停止を引き起こす状態での抑止（例えば、特定の抗腫瘍剤、Ｘ線照射、ガンマ線照射、ＵＶ照射、または高体温によるＤＮＡ損傷の蓄積）を包含する。このような状態でのＧ２チェックポイントの抑止は、「Ｇ２チェックポイントの抑止」と考えられるが、より具体的には、ＤＮＡ損傷誘導性Ｇ２チェックポイントが、ＤＮＡ損傷の認識およびＧ２細胞周期停止を通常生じるシグナルの生成を包含することが理解される場合、「ＤＮＡ損傷誘導性Ｇ２チェックポイント」の抑止であると考えられる。細胞周期Ｇ２チェックポイントが抑止される細胞は、細胞がＧ２チェックポイントにある時間の長さの減少を示す。この時間は、Ｇ２チェックポイントが全くない状態（Ｇ２チェックポイント停止）、から適切な条件下で、数分間、数時間、数日間、数週間またはそれ以上の時間の減少を有するＧ２チェックポイントまでの範囲に及び得る。従って、本発明の化合物と接触した細胞は、この化合物の非存在下で細胞が通常有するよりも短いＧ２チェックポイント時間を有する。例えば、Ｇ２チェックポイント時間の長さの減少は、特定の時間（例えば、４時間）の間にＧ２に存在する細胞が、本発明の化合物と接触された場合に、４時間未満（例えば、３．５時間、３時間、２．５時間、２時間、１時間または一時間未満）にわたってＧ２に存在することを意味する。用語「Ｇ２抑止」または「Ｇ２チェックポイント抑止」または「Ｇ２チェックポイント阻害活性」または任意の文法的同義語は、任意の量のＧ２チェックポイントの抑止または阻害を意味する。
【００４５】
本発明は、Ｇ２チェックポイント抑止因子に対する癌細胞の感受性を試験するための方法を提供する。本発明の局面に従って、Ｇ２チェックポイント抑止因子は、候補抗癌治療としてスクリーニングまたは評価される。癌細胞は、Ｇ２チェックポイント抑止因子の存在下または非存在下で、インビトロで癌細胞を培養する工程、あるいはＧ２チェックポイント抑止因子でインビトロで培養した癌細胞を処理する工程を包含するが、これらに限定されない方法を用いて、Ｇ２チェックポイント抑止因子と接触させ得る。
【００４６】
（Ｇ２抑止非ペプチド化合物）
本発明は、細胞に投与された場合にG２チェックポイント（特に、ＤＮＡ損傷誘導性Ｇ２チェックポイント）を抑止し、細胞を死滅させうるかまたは抑制する、Ｇ２チェックポイント抑止非ペプチド化合物に対する被験体の癌細胞（特に、ヒト患者の癌細胞）の感受性を推定するための方法を提供する。Ｇ２チェックポイント抑止非ペプチド化合物（例えば、米国特許出願第１０／４５７，０２９号に開示されるもの）は、ＤＮＡ損傷処置ありまたはなしで、細胞を死滅させうるかまたは抑制し得ることが理解される。
【００４７】
本発明は、候補抗癌治療としてのＧ２チェックポイント抑止非ペプチド化合物をスクリーニングするための方法およびこれらの化合物を評価するための方法を提供し、これらの化合物は、以下の一般構造：
【００４８】
【化１】
を有し、ここでいずれか一方または両方のベンゼンが、ピラジン、ピリミジン、ピペラジン、モルホリン、シクロヘキサン、ピペリジンまたはピリジンで置換され得る；Ｒ１は、ハロゲン（例えば、臭素（Ｂｒ）、塩素（Ｃｌ）、フッ素（Ｆ）、ヨウ素（Ｉ）、アミノ（ＮＨ２）、ニトロ（ＮＯ２）、ヒドロキシ（ＯＨ）、Ｏ−メチル（ＯＣＨ３）、メチル（ＣＨ３）または水素（Ｈ）であり、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５および／またはＲ６は、臭素（Ｂｒ）、塩素（Ｃｌ）、フッ素（Ｆ）、ヨウ素（Ｉ）、アミノ（ＮＨ２）、ニトロ（ＮＯ２）、メチル（ＣＨ３）、Ｏ−メチル（ＯＣＨ３）、ヒドロキシ（ＯＨ）、ＣＨ（ＣＨ３）２、ＣＨＯ、ＣＨＯＣＨ３、Ｏ（ＣＨ２）ｎＣＨ３、ＯＣＯ（Ｃ６Ｈ１２）Ｃｌ、ＣＯＯＣＨ３または水素であり；Ｘ１は、窒素（ＮＨ）、酸素（Ｏ）またはスルフェート（Ｓ）であり；Ｘ２は、酸素（Ｏ）またはスルフェート（Ｓ）である。例示的実施形態は、図４に見出されるが、本発明の化合物は、これらの実施形態に限定されない。
【００４９】
本発明は、候補抗癌治療としてのＧ２チェックポイント抑止非ペプチド化合物をスクリーニングするための方法およびこれらの化合物を評価するための方法をさらに提供し、ここでこれらの化合物は、以下の一般構造：
【００５０】
【化２】
を有し、ここでいずれか一方または両方のベンゼンが、ピラジン、ピリミジン、ピペラジン、モルホリン、シクロヘキサン、ピペリジンまたはピリジンで置換され得る；Ｒ１は、臭素（Ｂｒ）、塩素（Ｃｌ）、フッ素（Ｆ）、ヨウ素（Ｉ）、アミノ（ＮＨ２）、ニトロ（ＮＯ２）、ヒドロキシ（ＯＨ）、Ｏ−メチル（ＯＣＨ３）、メチル（ＣＨ３）または水素（Ｈ）であり、Ｒ２は、臭素（Ｂｒ）、塩素（Ｃｌ）、フッ素（Ｆ）、ヨウ素（Ｉ）、アミノ（ＮＨ２）、ニトロ（ＮＯ２）、メチル（ＣＨ３）、Ｏ−メチル（ＯＣＨ３）、ヒドロキシ（ＯＨ）、ＣＨ（ＣＨ３）２、ＣＨＯ、ＣＨＯＣＨ３、Ｏ（ＣＨ２）ｎＣＨ３、ＯＣＯ（Ｃ６Ｈ１２）Ｃｌ、ＣＯＯＣＨ３または水素であり；Ｘ１は、窒素（ＮＨ）、酸素（Ｏ）またはスルフェート（Ｓ）であり；Ｘ２は、酸素（Ｏ）またはスルフェート（Ｓ）である。例示的実施形態は、図４に見出される。
【００５１】
本発明は、候補抗癌治療としてのＧ２チェックポイント抑止非ペプチド化合物をスクリーニングするための方法およびこれらの化合物を評価するための方法をさらに提供し、ここでこれらの化合物は、以下の一般構造：
【００５２】
【化３】
を有し、ここでＲ１位〜Ｒ６位での異なる分子の置換は、得られた化合物のＧ２チェックポイント抑止活性に影響を及ぼす。以下の構造−活性関連性が決定された：
Ｒ１において、臭素（Ｂｒ）は、塩素（Ｃｌ）、フッ素（Ｆ）またはメチル（ＣＨ３）よりも高い活性を提供する
Ｒ２において、メチル（ＣＨ３）またはＯ−メチル（ＯＣＨ３）は、ヒドロキシド（ＯＨ）、臭素（Ｂｒ）、塩素（Ｃｌ）、ＣＨ（ＣＨ３）２、ＣＨＯ、ＣＨＯＣＨ３，Ｏ（ＣＨ２）ｎＣＨ３、ＯＣＯ（Ｃ６Ｈ１２）ＣｌまたはＣＯＯＣＨ３またはＨよりも高い活性を提供する
Ｒ３において、メチル（ＣＨ３）は、ＨまたはＯ−メチル（ＯＣＨ３）より高い活性を提供した
Ｒ４において、臭素（Ｂｒ）、フッ素（Ｆ）、塩素（Ｃｌ）、またはＨが使用され得る
Ｒ５において、臭素（Ｂｒ）、フッ素（Ｆ）、塩素（Ｃｌ）、またはＨが使用され得る
Ｒ６において、臭素（Ｂｒ）、フッ素（Ｆ）、塩素（Ｃｌ）、またはＨが使用され得る。
【００５３】
前述のリストは、例示に過ぎず、網羅的ではない。例示的実施形態は、図４に見出される。当業者は、本開示の教示に従って、さらなる置換および活性の決定を行って、さらなる本発明の化合物を獲得し得る。特定の置換により、ＤＮＡ損傷誘導性Ｇ２チェックポイント抑止に関して他の構造より高い活性を有する構造を生成することが観察されたが、本発明は、全ての置換および全てのレベルの活性を有する化合物を提供することが、当業者によって理解される。。特定の実施形態について、当業者は、その実施形態において使用するために、特定の標的に対する化合物の活性に加えて、本発明の化合物を選択することにおいて複数の要因を考慮する。当業者は、化合物の活性、アベイラビリティー、安定性、合成の容易さまたは合成効率、薬学的組成物における処方の適切性、服薬しやすさ（ｄｒｕｇａｂｉｌｉｔｙ）、インビボでの他の化合物との相互作用、エキソビボでの他の化合物との相互作用またはインビトロでの他の化合物との相互作用、細胞を死滅させる能力、細胞の増殖を抑制する能力、正常な細胞に対する影響、および他の活性を考慮する。
【００５４】
本発明は、Ｇ２チェックポイント抑止非ペプチド化合物に対する被験体の癌細胞、特に患者の癌細胞の感度を決定することによって、そのＧ２チェックポイント抑止非ペプチド化合物の抗癌治療としての有効性を推定するための方法を提供する。本発明は、被験体の癌細胞の、化合物（この化合物は、Ｇ１チェックポイント欠損細胞（例えば、癌細胞）におけるＤＮＡ損傷誘導性細胞周期Ｇ２チェックポイントを選択的に抑止し、ＤＮＡ損傷因子で処理した細胞におけるＤＮＡ損傷誘導性Ｇ２チェックポイントを選択的に抑止する）に対する感受性を決定するための方法を提供する。本発明は、被験体の癌細胞の、化合物（これは、異種移植片腫瘍増殖を、単独でまたは他の抗癌治療と組み合わせて阻害する）に対する感受性を決定するための方法をさらに提供する。本発明は、被験体の癌細胞の、化合物（これは、インビトロで、癌細胞でのコロニー形成を抑制する）単独に対する感受性または他の抗癌治療と組み合わせたこの化合物に対する感受性を、決定するための方法を提供する。特に、本発明は、被験体の癌細胞の、化合物（これは、Ｇ２チェックポイントを抑止し、そして／または癌細胞を抑制するかもしくは死滅させる）に対する感受性を決定するための方法を提供する。これらの化合物としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：
ＣＤＢＣ００４：４−クロロ−安息香酸４−メトキシ−フェニルエステル
ＣＢＤＣ４０１：４−クロロ−安息香酸ｐ−トリルエステル
ＣＢＤＣ４０２：４−ブロモ−安息香酸ｐ−トリルエステル
ＣＢＤＣ４０３：３，４，５−トリフルオロ−安息香酸ｐ−トリルエステル
ＣＢＤＣ４０４：４−フルオロ−安息香酸４−ブロモ−フェニルエステル；エタンとの化合物
ＣＢＤＣ４０５：３，４−ジクロロ−安息香酸ｐ−トリルエステル；エタンとの化合物
ＣＢＤＣ４０６：２，４−ジクロロ−安息香酸ｐ−トリルエステル；エタンとの化合物
ＣＢＤＣ４０７：４−フルオロ−安息香酸ｐ−トリルエステル；エタンとの化合物
ＣＢＤＣ４０８：２，３，４，５，６−ペンタフルオロ−安息香酸ｐ−トリルエステル；エタンとの化合物
ＣＢＤＣ４０９：４−クロロ−安息香酸３，４−ジメチル−フェニルエステル；エタンとの化合物
ＣＢＤＣ４１０：４−クロロ−安息香酸４−ヒドロキシ−フェニルエステル；エタンとの化合物
ＣＢＤＣ４１１：４−フルオロ−安息香酸４−ヒドロキシ−フェニルエステル；エタンとの化合物
ＣＢＤＣ４１２：４−ブロモ−安息香酸４−フルオロ−フェニルエステル
ＣＢＤＣ４１３：４−ブロモ−安息香酸４−トリフルオロメチル−フェニルエステル
ＣＢＤＣ４１４：４−ブロモ−安息香酸４−ヒドロキシ−フェニルエステル
ＣＢＤＣ４１５：４−ブロモ−安息香酸４−トリフルオロメトキシ−フェニルエステル
ＣＢＤＣ４１８：４−ブロモ−安息香酸６−メチル−ピリジン−３−イルエステル
ＣＢＤＣ４４０：４−ブロモ−チオ安息香酸Ｏ−ｐ−トリルエステル
ＣＢＤＣ４４１：４−ブロモ−ジチオ安息香酸ｐ−トリルエステル
ＣＢＤＣ４４２：４−ブロモ−チオ安息香酸Ｓ−ｐ−トリルエステル。
【００５５】
これらの化合物の構造は、図４に提供される。
【００５６】
（Ｇ２チェックポイント抑止ペプチドおよびＧ２チェックポイント抑止ペプチド模倣物）
本発明は、被験体の癌細胞、特にヒト患者の癌細胞の、候補抗癌治療としてのＧ２チェックポイント抑止ペプチドおよびＧ２チェックポイント抑止ペプチド模倣物（２００４年６月２５日出願の米国特許出願第１０／３４７，１４５号および米国特許出願（標題「Ｐｅｐｔｉｄｅｓ ａｎｄ ｐｅｐｔｉｄｏｍｉｍｅｔｉｃｓ ｈａｖｉｎｇ ｉｍｍｕｎｅ−ｍｏｄｕｌａｔｉｎｇ，ａｎｔｉ−ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ，ａｎｄ ａｎｔｉ−ｖｉｒａｌ ａｃｔｉｖｉｔｙ」に開示される）に対する感受性を推定するための方法を提供する。
【００５７】
本発明は、候補抗癌治療としてのＧ２チェックポイント抑止ペプチドおよびＧ２チェックポイント抑止ペプチド模倣物（特に、以下の構造のいずれかを形成するように配置された領域Ａ（残基Ｐ１〜Ｐ５）および領域Ｂ（残基Ｐ６〜Ｐ１１）を含む構造を有するＣＢＰペプチドおよびＣＢＰペプチド模倣物）をスクリーニングおよび評価するための方法を提供する：Ｐ１，Ｐ２，Ｐ３，Ｐ４，Ｐ５，Ｐ６，Ｐ７，Ｐ８，Ｐ９，Ｐ１０，Ｐ１１（配列番号１）またはＰ６，Ｐ７，Ｐ８，Ｐ９，Ｐ１０，Ｐ１１，Ｐ１，Ｐ２，Ｐ３，Ｐ４，Ｐ５（配列番号２）、またはＰ１，Ｐ２，Ｐ３，Ｐ４，Ｐ５（配列番号３）。ここでＰ１およびＰ５は、ベンゾイル−フェニルアラニン（Ｂｐａ）、またはチロシン（Ｔｙｒ）、またはフェニルアラニン（Ｐｈｅ）、またはシクロヘキシルアラニン（Ｃｈａ）、またはフェニル残基の２位、３位、４位、５位および６位にフッ素を有するフェニルアラニン（Ｐｈｅ−２，３，４，５，６−Ｆ）またはＴｙｒＴｙｒ、またはＰｈｅＰｈｅ、またはＣｈａＰｈｅ−２，３，４，５，６−Ｆ、または１つまたは２つのベンゼン様側鎖構造もしくはシクロヘキサン様側鎖構造により占められる側鎖空間と類似する側鎖空間を占有する部分（ここでこの部分は、１つもしくは２つのアミノ酸またはアミノ酸構造／機能アナログであり得る。これらのアナログとしては、非天然アミノ酸、合成アミノ酸、アミノ酸模倣物、およびキメラ分子が挙げられる）である。Ｐ２位およびＰ４位は、任意のアミノ酸であり、Ｐ３は、トリプトファン（Ｔｒｐ）またはＴｒｐ側鎖によって占められる空間と類似する側鎖空間を占める任意の部分である。Ｐ６位、Ｐ７位、Ｐ８位、Ｐ９位、Ｐ１０位、Ｐ１１位は、Ｐ２および／またはＰ３がＡｒｇでない場合、５つ以上の位置でアルギニン（Ａｒｇ）を含み、任意の非Ａｒｇ位置は、任意のアミノ酸であり得るかまたはなにもない。Ｐ２および／またはＰ３がＡｒｇである場合、Ｐ６〜Ｐ１１は、５つ未満のＡｒｇを含み得る。
【００５８】
本発明は、候補抗癌治療としてのＧ２チェックポイント抑止ＣＢＰペプチドおよびＧ２チェックポイント抑止ペプチド模倣物をスクリーニングする方法およびこれらを評価するための方法をさらに提供する。ここでこのＣＢＰ化合物は、以下を含む：ＣＢＰ５００（配列番号２６）；ＣＢＰ５０１（配列番号２７）；ＣＢＰ５０４（配列番号２９）；ＣＢＰ５０５（配列番号３０）；ＣＢＰ５０６（配列番号３１）；ＣＢＰ５１０（配列番号３２）；ＣＢＰ５１１（配列番号３３）；ＣＢＰ５１２（配列番号３４）；ＣＢＰ６０３（配列番号３７）。前述のＣＢＰ化合物の各々の配列は、以下の表１に開示される。
【００５９】
本発明は、候補抗癌治療としてのＧ２チェックポイント抑止ＣＢＰペプチドおよびＧ２チェックポイント抑止ＣＢＰペプチド模倣物をスクリーニングするための方法およびこれらを評価するための方法をさらに提供する。ここでこのＣＢＰ化合物は、一般構造：上記のＰ１，Ｐ２，Ｐ３，Ｐ４，Ｐ５，Ｐ６，Ｐ７，Ｐ８，Ｐ９，Ｐ１０，Ｐ１１（配列番号１）またはＰ６，Ｐ７，Ｐ８，Ｐ９，Ｐ１０，Ｐ１１，Ｐ１，Ｐ２，Ｐ３，Ｐ４，Ｐ５（配列番号１）の構造を有し、化合物ＣＢＰ５０１（配列番号２７）と類似のＧ２チェックポイント抑止活性を有する。当業者は、候補抗癌治療としての他のＧ２チェックポイント抑止ペプチドおよびＧ２チェックポイント抑止ペプチド模倣物をスクリーニングおよび評価するために、本明細書に提供された技術を適合させ得る。
【００６０】
（表１．例示的ペプチドおよびペプチド模倣物の配列、配列番号、およびＣＢＰコード名）
【００６１】
【表１−１】
【００６２】
【表１−２】
【００６３】
【表１−３】
（抗癌治療：併用療法）
本発明の別の局面に従って、併用療法に対する被験体の癌細胞の感受性を決定することにより、被験体の抗癌処置の効力を推定するための方法を提供する。一局面に従って、本発明は、ＤＮＡ損傷因子およびＧ２チェックポイント抑止因子を含む併用療法を試験するための方法を提供する。一実施形態において、併用療法は、ＤＮＡ損傷因子であるＣＰＴ−１１（カンプトテカン−１１（これは、イリノテカンまたはカンプトスター（ｃａｍｐｔｏｓｔａｒ）としても公知である）およびＣＢＤＣ４０２を含む。別の実施形態において、併用療法は、ＣＰＴ−１１およびＣＢＤＣ００４を含む。別の実施形態において、併用療法は、ＤＮＡ損傷因子であるＣＤＤＰ（シスプラチンとしても公知のアルキル化剤）およびＧ２チェックポイント抑止ペプチドであるＣＢＰ５０１（配列番号２７）を含む。
【００６４】
本発明の一局面に従って、併用療法の効力を試験する方法が提供され、この併用療法において、癌細胞に対するＤＮＡ損傷因子の細胞傷害性が、本明細書に開示されるＧ２チェックポイント抑止薬剤（Ｇ２チェックポイント抑止非ペプチド化合物およびＧ２チェックポイント抑止ペプチドおよびＧ２チェックポイント抑止ペプチド模倣物を含む）によって強化されるかまたは高められる。この理論に制限されることが望まないが、Ｇ２チェックポイント抑止因子が、ＤＮＡ損傷因子（これは、正常な細胞に対してほとんどまたは何ら細胞傷害性効果がない）の細胞傷害性効果に対して癌細胞を選択的に感受性にし得ることが理解される。多くの従来の抗癌剤は、癌細胞であるか正常な細胞であるかどうかに関係なく、増殖している細胞を標的とし、結果として、多くの従来の抗癌治療は、悪心、下痢または脱毛のような副作用を生じている。対照的に、Ｇ２チェックポイント抑止因子は、ＤＮＡが損傷した（例えば、細胞周期チェックポイントが損なわれている）細胞を選択的に標的とし、よって、正常な細胞に対しては、ほとんどまたは何ら細胞傷害性の影響がない。よって、本発明は、Ｇ２チェックポイント抑止因子がＤＮＡ損傷処置の効果を強化する能力について、併用療法をスクリーニングする方法およびこれらを評価する方法を提供する。
【００６５】
本発明の別の局面に従って、最も有効な併用療法を同定する方法が提供される。実施例３における模範的な例証に開示されるように、ＣＢＰ５０１（配列番号２７）とシスプラチン（ＣＤＤＰ）との併用療法は、いずれかの処置単独よりも高いレベルの抗癌活性を有した。実施例３に示されるように、培養したヒト癌細胞を用いるインビトロの結果により、各化合物単独（ＣＢＰ５０１およびシスプラチン）が、いくつかの抗癌効力を有するが、化合物の併用が、より著しい抗癌効果を有することが示された。異種移植片腫瘍アッセイを用いて、ヒト癌細胞を宿主マウスに移植し、このマウスにおいて、ヒト癌細胞は腫瘍を生成し、このことにより、候補抗癌治療の効力の代理「インビボ」試験が提供された。次いで、腫瘍を、候補抗癌治療をマウス宿主に投与し、腫瘍サイズに対する効果を測定することによって「インビボで」処理した。異種移植片腫瘍アッセイを使用するインビボの結果により、ＣＢＰ５０１とＣＤＤＰとの併用が、いずれかの化合物単独より有効であるというインビトロの結果の推定が確認された。
【００６６】
本発明の多くの実施形態が記載されてきた。にもかかわらず、種々の改変が、本発明の趣旨および範囲から逸脱することなく行われ得ることが、理解される。従って、以下の実施例は、特許請求の範囲に記載される発明の範囲を例示するのであって、限定するのではないことが意図される。
【実施例】
【００６７】
（実施例１．ＣＢＤＣ４０２を用いたインビトロでの感受性試験とインビボでの効力試験との相関）
ヒト結腸癌由来細胞株ＨＣＴ−１１６の細胞を、細胞のＤＮＡ含有量をフローサイトメトリーによって測定するインビトロでの感受性試験、および異種移植片腫瘍増殖を測定するインビボでの効力試験において使用した。従来の抗癌治療ＣＰＴ−１１、新規な候補抗癌治療ＣＢＤＣ４０２、この２つの化合物の併用、またはコントロール処置（ビヒクル）の効果を、各試験系において測定し、比較した。
【００６８】
インビトロでの感受性試験： ＨＣＴ−１１６細胞（ＡＴＣＣから）を、Ｌ−グルタミン（Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．）と、ペニシリン−ストレプトマイシンと、１０％ウシ胎児血清とを含有するマッコイ５Ａ培地（Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．）中、３７℃にて５％ ＣＯ２／空気中で培養した。培養細胞（１．６×１０５）を、遠心分離によりペレットにし、次いで、再懸濁し、３００μｌのＫｒｉｓｈａｎ溶液（０．１％クエン酸ナトリウム、５０μｇ／ｍｌ ヨウ化プロピジウム、２０μｇ／ｍｌ ＲＮａｓｅ Ａ、０．５％ Ｎｏｎｉｄｅｔ Ｐ−４０）中、４℃で１時間インキュベートした。各細胞におけるＤＮＡの量を、蛍光活性化細胞スキャナ（ＦＡＣＳｃａｎ（登録商標）Ｂｅｃｋｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ，Ｍｏｕｎｔａｉｎ Ｖｉｅｗ，ＣＡ）を用いて決定し、結果を、ＣＥＬＬＱｕｅｓｔ（登録商標）ソフトウェア（Ｂｅｃｋｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）を用いて分析した。
【００６９】
各細胞のＤＮＡ含有量を、２４時間目に測定した。ＣＢＤＣ４０２処置単独（２μＭ、１０μＭ、または５０μＭを３時間）は、インビトロでのＨＣＴ−１１６細胞のＤＮＡ含有量を変化させなかった（図１Ａ；上パネル）。ＣＰＴ−１１処置（５０μＭで３時間）により、細胞周期分布は劇的に変化し、ここでＧ１期にある細胞集団は減少し、Ｇ２／Ｍ期にある細胞集団は増大した。この結果により、Ｇ１に達しない集団は何ら増加しなかったので、細胞が細胞周期のＧ２／Ｍ期で停止した（増殖が阻害された）が、細胞は死滅しないことが示された。ＣＰＴ−１１（５０μＭで３時間）およびＣＢＤＣ４０２（２μＭ、１０μＭ、５０μＭで、３時間）の両方での併用処置に曝したＨＣＴ−１１６細胞は、ＣＰＴ−１１誘導性Ｇ２／Ｍ集団およびＧ１集団の両方の蓄積の減少を示し、Ｇ１に達しない（死細胞）集団（図１Ａ、下パネル）の増加もまた示した。このことは、この併用処置が、ＨＣＴ−１１６細胞に対して細胞傷害性であることを示した。
【００７０】
インビトロでの感受性試験のこれらの結果により、ＣＢＤＣ４０２単独では、インビボでのＨＣＴ−１１６異種移植片腫瘍増殖を抑制せず、ＣＰＴ−１１は、中程度に腫瘍増殖を抑制し、ＣＢＤＣ４０２とＣＰＴ−１１との併用療法は、腫瘍増殖を最も効率的に抑制する、ということが推定された。
【００７１】
代理インビボ効力試験： 図１Ｂは、異種移植片腫瘍アッセイを含む代理インビボ効力試験の結果を示す。ＨＣＴ−１１６細胞を、雄性ＳＣＩＤマウス（重症複合型免疫不全マウス，Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ Ｌａｂ．，Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ，ＭＡ）に細胞を皮下注射することにより移植した。この腫瘍の大きさが、約０．２ｃｍ３の大きさに達したときに、処置を開始した。腫瘍の大きさを、ノギスを用いて１週間に３回測定した。腫瘍体積を、以下のように計算した：体積（ｃｍ３）＝［幅（ｍｍ）２×長さ（ｍｍ）］／２０００。平均腫瘍サイズ（体積）を標準偏差とともにプロットした（図１ｂ）。動物を、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ ｆｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ａｎｉｍａｌ Ｃａｒｅの指針に従って飼育した。このプロトコルは、ＣａｎＢａｓ Ｃｏ．Ｌｔｄの社内動物ケア委員会によって承認された。
【００７２】
ＳＣＩＤマウスにおいて樹立したＨＣＴ−１１６異種移植片（０．２ｃｍ３）を、以下を腹腔内注射することによって２週間処置した：ビヒクル単独（ＤＭＳＯ、１週間に２回）、ＣＢＤＣ４０２（４０ｍｇ／ｋｇ；１週間に２回）、ＣＰＴ−１１（２０ｍｇ／ｋｇ；１週間に１回）、またはＣＢＤＣ４０２（１週間に２回）とＣＰＴ−１１（１週間に１回）との併用。図１（ｂ）に示されるように、ＣＰＢＣ４０２単独では、腫瘍増殖を有意に抑制しなかったが、ＣＰＴ−１１は、中程度の腫瘍抑制活性を有し、ＣＢＤＣ４０２＋ＣＰＴ−１１は、強い腫瘍抑制活性を示した。この結果は、上記のＣＢＤＣ００４を用いたインビトロでの感受性試験の結果に基づく推定と相関している。
【００７３】
（実施例２．ＣＢＤＣ００４を用いる、インビトロでの感受性試験とインビボでの効力試験との相関）
ヒト結腸癌由来細胞株ＨＣＴ−１１６の細胞を、細胞のＤＮＡ含有量をフローサイトメトリーによって測定するインビトロでの感受性試験、および異種移植片腫瘍増殖を測定するインビボでの効力試験において使用した。従来の抗癌治療ＣＰＴ−１１、新規な候補抗癌治療ＣＢＤＣ００４、この２つの化合物の併用、またはコントロール処置（ビヒクル）の効果を、各試験系において測定し、比較した。
【００７４】
インビトロでの感受性試験：ＨＣＴ−１１６細胞およびフローサイトメトリーを用いるインビトロでの感受性試験を、ＣＢＤＣ００４をＣＢＤＣ４０２の代わりに用いるという改変を行って、上記のように行った。各細胞のＤＮＡ含有量を、２４時間目に測定した。ＣＢＤＣ００４処置単独（２μＭ、１０μＭ、５０μＭで３時間）は、インビトロでのＨＣＴ−１１６細胞のＤＮＡ含有量を変化させなかった（図２Ａ；上パネル）。ＣＰＴ−１１単独での処置（５０μＭで３時間）により、細胞周期分布は劇的に変化し、ここでＧ１期にある細胞集団は減少し、Ｇ２／Ｍ期にある細胞集団は増大した。このことにより、Ｇ１に達しない集団は何ら増加しなかったので、上記細胞は、細胞周期のＧ２／Ｍ期で停止したが、死滅しないことが示された。ＣＰＴ−１１（５０μＭで３時間）およびＣＢＤＣ００４（２μＭ、１０μＭ、５０μＭで、３時間）の両方での併用処置に曝したＨＣＴ−１１６細胞は、ＣＰＴ−１１単独を超えるほどには、ＤＮＡ含有量を変化させなかった（図２Ａ、下パネル）。
【００７５】
インビトロでの感受性試験のこれらの結果により、ＣＢＤＣ００４単独では、インビボでのＨＣＴ−１１６異種移植片腫瘍増殖を抑制せず、ＣＰＴ−１１は、中程度にこの腫瘍増殖を抑制し、ＣＢＤＣ００４とＣＰＴ−１１との併用療法は、ＣＰＴ−１１単独と同程度でこの腫瘍増殖を抑制する、ということが推定された。
【００７６】
代理インビボ効力試験： ＨＣＴ−１１６異種移植片腫瘍増殖に対する種々の化合物の効果を測定する代理インビボ効力試験を、ＣＢＤＣ４０２の代わりに、ＣＢＤＣ００４を用いるという改変を行って、上記のように実施した。
【００７７】
ＳＣＩＤマウスにおいて樹立したＨＣＴ−１１６異種移植片（０．２ｃｍ３）を、以下を腹腔内注射することによって２週間処置した：ビヒクル単独（ＤＭＳＯ、１週間に２回）、ＣＢＤＣ００４（３０ｍｇ／ｋｇ；１週間に２回）、ＣＰＴ−１１（２０ｍｇ／ｋｇ；１週間に１回）、またはＣＢＤＣ４０２（１週間に２回）とＣＰＴ−１１（１週間に１回）との併用。図２Ｂに示されるように、ＣＢＤＣ００４は、単独でも、ＰＣＴ−１１との併用においても腫瘍増殖を抑制しなかった。そしてＣＰＴ−１１は、中程度の腫瘍抑制活性を有した。これらの結果は、上記のＣＢＤＣ００４を用いたインビトロでの感受性試験の結果に基づく推定と相関している。
【００７８】
（実施例３．臨床適用のための感受性試験のシミュレーション）
臨床状況のための感受性試験のシミュレーションとして、ＳＣＩＤマウスにおけるＭＩＡＰａＣａ２細胞の樹立された異種移植片腫瘍を、マウスから抽出し、従来の抗癌治療および新規の候補抗癌治療ＣＢＰ５０１（配列番号２７）の存在下または非存在下で、以下のプロトコルに従って、インビトロで培養した。
【００７９】
（プロトコル：）
（１日目 抽出した異種移植片腫瘍からの単一細胞懸濁液の調製）
ＭＩＡＰａＣａ２細胞の異種移植片腫瘍を、異種移植片腫瘍を有するマウスから切り出し、３７℃、５％ＣＯ２／空気で、完全培養培地（ＤＭＥＭ（Ｄａｉｎｉｈｏｎｓｅｉｙａｋｕ Ｃｏ．，Ｏｓａｋａ，Ｊａｐａｎ）（ＭＩＡＰａＣａ２のための２．５％ ウマ血清（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃｏ．，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）と、１０％ ウシ胎仔血清（Ｅｑｕｉｔｅｃｈ−ｂｉｏ，Ｋｅｒｒｖｉｌｌｅ，ＴＸ）を含有）１０ｍｌを含む１０ｃｍプレートに入れた。この組織を、小片にスライスし、非腫瘍組織を可能な限り除去した。このスライスした小片を、完全培養培地を含む別の１０ｃｍプレートに入れ、カミソリの刃で切り刻んだ。次いで、細胞を、ピペットで出し入れして培養培地に分散させ、１２００×ｇで５分間遠心分離した。
【００８０】
次いで、その細胞ペレットを、コラゲナーゼを含む緩衝液中で、３７℃で２時間インキュベートした。２回目の遠心分離の後、その細胞ペレットを、トリプシンを含む緩衝液中で、室温で５分間インキュベートし、次いで、培養培地に懸濁し、ナイロンメッシュに通して、再度遠心分離した。ペレットになった細胞を再懸濁し、この再懸濁した細胞をチャンバースライドに播種し、インキュベーター中で一晩培養した。
【００８１】
（２日目 抗癌治療での細胞の処理）
チャンバースライド中の細胞を、抗癌治療またはコントロール処理で、以下のように処理した：コントロール溶液、１０μＭのＣＢＰ５０１（配列番号２７）、１０μｇ／ｍｌのシスプラチン（ＣＤＤＰ）、またはＣＢＰ５０１とシスプラチンとの組み合わせを、チャンバースライドに添加し、３時間インキュベートした。培養培地を交換し、チャンバースライドを、さらに２４時間〜４８時間培養した。
【００８２】
（３日目、４日目または５日目 染色および分析）
示された日（３日目、４日目または５日目）のはじめに、培地をチャンバースライドから吸引し、７０％エタノールを添加し、その後１５分間室温でインキュベートすることで、細胞を固定した。上清を廃棄し、５０μｇ／ｍｌ ヨウ化プロピジウム（Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）（０．１％ ＲＮａｓｅ（Ｓｉｇｍａ）含有）を含有するリン酸緩衝化生理食塩水をスライドに添加し、室温で３０分間インキュベートした。チャンバースライド上の細胞を、次いで、レーザー走査サイトメトリー（Ｏｌｙｍｐｕｓ顕微鏡を備えたＬＳＣ（登録商標）Ｓｙｓｔｅｍ）で分析した。
【００８３】
（結果）
図３Ａに示されるように、ＣＢＰ５０１（配列番号２７）での処理は、ＤＮＡ含有量の値のヒストグラム（特に、Ｇ１期にある細胞に対応するヒストグラム）の形状を拡げるが、細胞周期分布は、有意に変化しなかった。シスプラチン（ＣＤＤＰ）での処理により、Ｇ２／Ｍ期にある細胞の蓄積が生じた。ＣＢＰ５０１とシスプラチンとを併用して処理すると、Ｇ１のピークおよびＧ２／Ｍのピークがともに劇的に減少し、Ｇ１期に達しない集団（これは細胞死を示す）が増加した。各ヒストグラムにおける（垂線の間の）「１」と記されたピークは、細胞培養物に夾雑している、癌でないマウスの正常な線維芽細胞のＧ１集団を示す。細胞形態を直接観察すると、この併用処置により、腫瘍細胞の集団における細胞死が劇的に増加したことが示された。
【００８４】
これらの結果により、ＣＢＰ５０１（配列番号２７）またはシスプラチン（ＣＤＤＰ）いずれかでの処理は、腫瘍細胞に対して何らかの影響を有するが、ＣＢＰ５０１とシスプラチンとの併用処理は、いずれかの処理単独よりも有効であり、そして併用処理は、腫瘍細胞に対して非常に有効であるということが推定された。
【００８５】
代理インビボ効力試験： 異種移植片腫瘍アッセイを使用する代理インビボ効力試験を、改変をして、上記のように行った。ＭＩＡＰａＣａ２細胞（ｎ＝５）を、雄性ＳＣＩＤマウス（Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ Ｌａｂ．，Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ，ＭＡ）に細胞を皮下注射することによって移植した。腫瘍の大きさが約０．１５ｃｍ３の大きさに達したときに、処置を開始した。腫瘍の大きさを、ノギスを用いて１週間に３回測定した。腫瘍体積を、以下のように計算した：体積（ｃｍ３）＝［幅（ｍｍ）２×長さ（ｍｍ）］／２０００。平均腫瘍サイズ（体積）を標準偏差とともにプロットした（図１ｂ）。動物を、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ ｆｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ａｎｉｍａｌ Ｃａｒｅの指針に従って飼育した。このプロトコルは、ＣａｎＢａｓ Ｃｏ．Ｌｔｄの社内動物ケア委員会によって承認された。
【００８６】
ＳＣＩＤマウスにおいて樹立したＨＣＴ−１１６異種移植片（０．２ｃｍ３）を、以下を腹腔内注射することによって２週間にわたり、各週に２回（すなわち、１日目、５日目、８日目および１２日目に）処置した：ビヒクル単独（ＤＭＳＯ）；ＣＢＰ５０１（１２０ｍｇ／ｍ２）；シスプラチン（ＣＤＤＰ、３ｍｇ／ｋｇ）；ＣＢＰ５０１（３０ｍｇ／ｍ２）とシスプラチン（ＣＤＤＰ、３ｍｇ／ｋｇ）との併用；ＣＢＰ５０１（６０ｍｇ／ｍ２）とシスプラチン（ＣＤＤＰ、３ｍｇ／ｋｇ）との併用；ＣＢＰ５０１（１２０ｍｇ／ｍ２）とシスプラチン（ＣＤＤＰ、３ｍｇ／ｋｇ）。図３Ｂに示されるように、ＣＢＰ５０１単独またはシスプラチン（ＣＤＤＰ）単独では、腫瘍増殖にほとんどまたは何ら効果がなかった。しかし、ＣＢＰとシスプラチン（ＣＤＤＰ）との併用処置により、異種移植片腫瘍増殖の有意な阻害が生じた。興味深いことに、ＣＢＰ５０１とシスプラチン（ＣＤＤＰ）との併用の効果は、ＣＢＰ５０１の濃度に無関係であるようであった：３０ｍｇ／ｍ２、６０ｍｇ／ｍ２、１２０ｍｇ／ｍ２のＣＢＰ５０１を使用した併用処置は、同様の有効性を示した。対照的に、ＣＢＰ５０１単独では、試験した最高濃度である１２０ｍｇ／ｍ２でも、異種移植片腫瘍増殖は有意には阻害されなかった。
【００８７】
これらの結果は、上記のようなＣＢＰ５０１とシスプラチン（ＣＤＤＰ）とを用いるインビトロでの感受性試験の結果に基づく推定と相関している。
【００８８】
添付の特許請求の範囲に規定される本発明の趣旨および範囲を逸脱することなく、好ましい実施形態に対して種々の改変が行われ得る。
【図面の簡単な説明】
【００８９】
【図１】図１は、ＨＣＴ−１１６細胞に対するＣＢＤＣ４０２、ＣＰＴ−１１、およびＣＢＤＣ４０２とＣＰＴ−１１との併用の効力を試験するための、フローサイトメトリーを用いるインビトロ感受性試験（図１Ａ）、および異種移植片腫瘍アッセイを用いる代理インビボ効力試験（図１Ｂ）の相関を示す。
【図２】図２は、ＨＣＴ−１１６細胞に対するＣＢＤＣ００４、ＣＰＴ−１１、およびＣＢＤＣ００４とＣＰＴ−１１との併用の効力を試験するための、フローサイトメトリーを用いるインビトロ感受性試験（図２Ａ）、および異種移植片腫瘍アッセイを用いる代理インビボ効力試験（図２Ｂ）の相関を示す。
【図３Ａ】図３は、臨床適用のための感受性試験のシミュレーションを示す。このシミュレーションは、ＭＩＡＰａＣａ２細胞に対するＣＢＰ５０１、シスプラチン（シスジアミンジクロロ白金、ＣＤＤＰ）またはＣＢＰ５０１とシスプラチンとの併用の効力を試験するために、チャンバースライド上の培養異種移植片腫瘍細胞のレーザースキャニングサイトメトリーを用いるインビトロ感受性試験（図３Ａ）、および異種移植片腫瘍アッセイを用いる代理インビボ効力試験からの結果を比較する。
【図３Ｂ】図３は、臨床適用のための感受性試験のシミュレーションを示す。このシミュレーションは、ＭＩＡＰａＣａ２細胞に対するＣＢＰ５０１、シスプラチン（シスジアミンジクロロ白金、ＣＤＤＰ）またはＣＢＰ５０１とシスプラチンとの併用の効力を試験するために、チャンバースライド上の培養異種移植片腫瘍細胞のレーザースキャニングサイトメトリーを用いるインビトロ感受性試験からの結果（図３Ａ）と、異種移植片腫瘍アッセイを用いる代理インビボ効力試験からの結果とを比較する。
【図４Ａ】図４は、抗癌治療の効力を推定するために使用される例示的Ｇ２チェックポイント抑止非ペプチド化合物の構造およびＣＢＤＣコード名を示す。
【図４Ｂ】図４は、抗癌治療の効力を推定するために使用される例示的Ｇ２チェックポイント抑止非ペプチド化合物の構造およびＣＢＤＣコード名を示す。
【図４Ｃ】図４は、抗癌治療の効力を推定するために使用される例示的Ｇ２チェックポイント抑止非ペプチド化合物の構造およびＣＢＤＣコード名を示す。
【００９０】
（表１） 表１は、抗癌治療の効力を推定するために使用される例示的なＧ２チェックポイント抑止ペプチドおよびＧ２チェックポイント抑止ペプチド模倣物の配列、配列番号、およびＣＢＰコード名を示す。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
候補抗癌治療に対する患者の癌細胞の感受性を決定するための方法であって、該方法は、以下の工程：
（ａ）該患者の癌細胞のサンプルを、インビトロで該候補抗癌治療に曝す工程；
（ｂ）該候補抗癌治療に曝した後に、該サンプル中の各癌細胞のＤＮＡ含有量を測定する工程；および
（ｃ）該候補抗癌治療に曝した後に、該サンプルの細胞周期分布を決定する工程；
を包含し、ここで該候補抗癌治療に曝した後の該サンプルの細胞周期分布における変化は、該治療に対する該患者の癌細胞の感受性を示す、方法。
【請求項２】
前記候補抗癌治療に曝した後の前記サンプル中のＧ１期に達していない集団の増加は、該治療が前記患者の癌細胞に対して細胞傷害性であることを示す、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記候補抗癌治療に曝した後の前記サンプル中のＧ２／Ｍ期集団の増加は、該治療が、前記患者の癌細胞の増殖を阻害することを示す、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記候補抗癌治療に対する前記患者の非癌細胞の感受性を決定する工程をさらに包含する、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記方法は、約３日間以内に完了する、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記方法は、約４日間以内に完了する、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記方法は、約５日間以内に完了する、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
癌細胞の複数のサンプルを、複数の候補抗癌治療に曝す工程を包含する、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
各治療に対する前記患者の癌細胞の感受性に基づいて、前記複数の候補抗癌治療を順位付けする工程をさらに包含する、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記患者にとって最も有効な候補抗癌治療を同定する工程をさらに包含する、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記候補抗癌治療は、ＤＮＡ損傷因子を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
前記候補抗癌治療は、Ｇ２チェックポイント抑止因子を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
前記Ｇ２チェックポイント抑止因子は、非ペプチドのＧ２−チェックポイント抑止化合物であり、該非ペプチドのＧ２−チェックポイント抑止化合物は、４−クロロ−安息香酸４−メトキシ−フェニルエステル（ＣＤＢＣ００４）、４−クロロ−安息香酸ｐ−トリルエステル（ＣＢＤＣ４０１）、４−ブロモ−安息香酸ｐ−トリルエステル（ＣＢＤＣ４０２）、３，４，５−トリフルオロ−安息香酸ｐ−トリルエステル（ＣＢＤＣ４０３）、４−フルオロ−安息香酸４−ブロモ−フェニルエステル；エタンとの化合物（ＣＢＤＣ４０４）、３，４−ジクロロ−安息香酸ｐ−トリルエステル；エタンとの化合物（ＣＢＤＣ４０５）、２，４−ジクロロ−安息香酸ｐ−トリルエステル；エタンとの化合物（ＣＢＤＣ４０６）、４−フルオロ−安息香酸ｐ−トリルエステル；エタンとの化合物（ＣＢＤＣ４０７）、２，３，４，５，６−ペンタフルオロ−安息香酸ｐ−トリルエステル；エタンとの化合物（ＣＢＤＣ４０８）、４−クロロ−安息香酸３，４−ジメチル−フェニルエステル；エタンとの化合物（ＣＢＤＣ４０９）、４−クロロ−安息香酸４−ヒドロキシ−フェニルエステル；エタンとの化合物（ＣＢＤＣ４１０）、４−フルオロ−安息香酸４−ヒドロキシ−フェニルエステル；エタンとの化合物（ＣＢＤＣ４１１）、４−ブロモ−安息香酸４−フルオロ−フェニルエステル（ＣＢＤＣ４１２）、４−ブロモ−安息香酸４−トリフルオロメチル−フェニルエステル（ＣＢＤＣ４１３）、４−ブロモ−安息香酸４−ヒドロキシ−フェニルエステル（ＣＢＤＣ４１４）、４−ブロモ−安息香酸４−トリフルオロメトキシ−フェニルエステル（ＣＢＤＣ４１５）、４−ブロモ−安息香酸６−メチル−ピリジン−３−イルエステル（ＣＢＤＣ４１８）、４−ブロモ−チオ安息香酸O−ｐ−トリルエステル（ＣＢＤＣ４４０）、４−ブロモ−ジチオ安息香酸ｐ−トリルエステル（ＣＢＤＣ４４１）、または４−ブロモ−チオ安息香酸Ｓ−ｐ−トリルエステル（ＣＢＤＣ４４２）から選択される、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記Ｇ２チェックポイント抑止因子は、Ｇ２チェックポイント抑止ペプチドまたはＧ２チェックポイント抑止ペプチド模倣物を含む、請求項１２に記載の方法。
【請求項１５】
前記Ｇ２チェックポイント抑止ペプチドまたはＧ２チェックポイント抑止ペプチド模倣物は、ＣＢＰ５００（配列番号２６）、ＣＢＰ５０１（配列番号２７）、ＣＢＰ５０４（配列番号２９）、ＣＢＰ５０５（配列番号３０）、ＣＢＰ５０６（配列番号３１）、ＣＢＰ５１０（配列番号３２）、ＣＢＰ５１１（配列番号３３）、ＣＢＰ５１２（配列番号３４）、またはＣＢＰ６０３（配列番号３７）から選択される、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記候補抗癌治療は、併用療法を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１７】
前記併用療法は、ＤＮＡ損傷因子およびＧ２チェックポイント抑止因子を含む、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
さらに、前記Ｇ２チェックポイント抑止因子は、前記ＤＮＡ損傷因子の細胞傷害性効果に対して癌細胞を選択的に感受性にする、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記ＤＮＡ損傷因子はイリノテカン（ＣＰＴ−１１）であり、前記Ｇ２チェックポイント抑止因子はＣＢＤＣ４０２である、請求項１７に記載の方法。
【請求項２０】
前記ＤＮＡ損傷因子はイリノテカン（ＣＰＴ−１１）であり、前記Ｇ２チェックポイント抑止因子はＣＢＤＣ００４である、請求項１７に記載の方法。
【請求項２１】
前記ＤＮＡ損傷因子はシスプラチン（ＣＤＤＰ）であり、前記Ｇ２チェックポイント抑止因子はＣＢＰ５０１（配列番号２７）である、請求項１７に記載の方法。
【請求項２２】
候補抗癌治療の代理インビボ効力試験をさらに包含する、請求項１に記載の方法。
【請求項２３】
前記代理効力試験は、異種移植片腫瘍アッセイである、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
請求項２３に記載の方法。前記異種移植片腫瘍アッセイは、以下の工程：
（ａ）前記患者の癌細胞のサンプルを代理宿主に移植する工程；
（ｂ）該代理宿主において腫瘍を形成させる工程；
（ｃ）該代理宿主を候補抗癌治療で処置する工程；および
（ｄ）該腫瘍に対する該候補抗癌治療の効果を測定する工程、
を包含する、方法。
【請求項２５】
患者に対する抗癌治療の効力を推定するための方法であって、該方法は、以下の工程：
（ａ）該患者の癌細胞のサンプルを、該候補抗癌治療にインビトロで曝す工程；
（ｂ）該候補抗癌治療に曝した後に、該癌細胞のサンプルの細胞周期分布を決定する工程；および
（ｃ）該患者の癌細胞に対する該候補抗癌治療の細胞傷害性を決定する工程、
を包含する、方法。
【請求項２６】
前記患者の非癌細胞のサンプルを、前記候補抗癌治療にインビトロで曝す工程、および該患者の非癌細胞に対する該候補抗癌治療の細胞障害性を決定する工程により、該候補抗癌治療の安全性を決定する工程をさらに包含する、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
患者にとって最も有効な抗癌治療を選択するための方法であって、複数の候補抗癌治療に対して請求項２６に記載の方法を行う工程、および該患者の癌細胞に対して最大の細胞傷害性を有し、かつ該患者の非癌細胞に対して最小の細胞傷害性を有する治療を選択する工程を包含する、方法。
【請求項１】
候補抗癌治療に対する患者の癌細胞の感受性を決定するための方法であって、該方法は、以下の工程：
（ａ）該患者の癌細胞のサンプルを、インビトロで該候補抗癌治療に曝す工程；
（ｂ）該候補抗癌治療に曝した後に、該サンプル中の各癌細胞のＤＮＡ含有量を測定する工程；および
（ｃ）該候補抗癌治療に曝した後に、該サンプルの細胞周期分布を決定する工程；
を包含し、ここで該候補抗癌治療に曝した後の該サンプルの細胞周期分布における変化は、該治療に対する該患者の癌細胞の感受性を示す、方法。
【請求項２】
前記候補抗癌治療に曝した後の前記サンプル中のＧ１期に達していない集団の増加は、該治療が前記患者の癌細胞に対して細胞傷害性であることを示す、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記候補抗癌治療に曝した後の前記サンプル中のＧ２／Ｍ期集団の増加は、該治療が、前記患者の癌細胞の増殖を阻害することを示す、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記候補抗癌治療に対する前記患者の非癌細胞の感受性を決定する工程をさらに包含する、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記方法は、約３日間以内に完了する、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記方法は、約４日間以内に完了する、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記方法は、約５日間以内に完了する、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
癌細胞の複数のサンプルを、複数の候補抗癌治療に曝す工程を包含する、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
各治療に対する前記患者の癌細胞の感受性に基づいて、前記複数の候補抗癌治療を順位付けする工程をさらに包含する、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記患者にとって最も有効な候補抗癌治療を同定する工程をさらに包含する、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記候補抗癌治療は、ＤＮＡ損傷因子を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
前記候補抗癌治療は、Ｇ２チェックポイント抑止因子を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
前記Ｇ２チェックポイント抑止因子は、非ペプチドのＧ２−チェックポイント抑止化合物であり、該非ペプチドのＧ２−チェックポイント抑止化合物は、４−クロロ−安息香酸４−メトキシ−フェニルエステル（ＣＤＢＣ００４）、４−クロロ−安息香酸ｐ−トリルエステル（ＣＢＤＣ４０１）、４−ブロモ−安息香酸ｐ−トリルエステル（ＣＢＤＣ４０２）、３，４，５−トリフルオロ−安息香酸ｐ−トリルエステル（ＣＢＤＣ４０３）、４−フルオロ−安息香酸４−ブロモ−フェニルエステル；エタンとの化合物（ＣＢＤＣ４０４）、３，４−ジクロロ−安息香酸ｐ−トリルエステル；エタンとの化合物（ＣＢＤＣ４０５）、２，４−ジクロロ−安息香酸ｐ−トリルエステル；エタンとの化合物（ＣＢＤＣ４０６）、４−フルオロ−安息香酸ｐ−トリルエステル；エタンとの化合物（ＣＢＤＣ４０７）、２，３，４，５，６−ペンタフルオロ−安息香酸ｐ−トリルエステル；エタンとの化合物（ＣＢＤＣ４０８）、４−クロロ−安息香酸３，４−ジメチル−フェニルエステル；エタンとの化合物（ＣＢＤＣ４０９）、４−クロロ−安息香酸４−ヒドロキシ−フェニルエステル；エタンとの化合物（ＣＢＤＣ４１０）、４−フルオロ−安息香酸４−ヒドロキシ−フェニルエステル；エタンとの化合物（ＣＢＤＣ４１１）、４−ブロモ−安息香酸４−フルオロ−フェニルエステル（ＣＢＤＣ４１２）、４−ブロモ−安息香酸４−トリフルオロメチル−フェニルエステル（ＣＢＤＣ４１３）、４−ブロモ−安息香酸４−ヒドロキシ−フェニルエステル（ＣＢＤＣ４１４）、４−ブロモ−安息香酸４−トリフルオロメトキシ−フェニルエステル（ＣＢＤＣ４１５）、４−ブロモ−安息香酸６−メチル−ピリジン−３−イルエステル（ＣＢＤＣ４１８）、４−ブロモ−チオ安息香酸O−ｐ−トリルエステル（ＣＢＤＣ４４０）、４−ブロモ−ジチオ安息香酸ｐ−トリルエステル（ＣＢＤＣ４４１）、または４−ブロモ−チオ安息香酸Ｓ−ｐ−トリルエステル（ＣＢＤＣ４４２）から選択される、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記Ｇ２チェックポイント抑止因子は、Ｇ２チェックポイント抑止ペプチドまたはＧ２チェックポイント抑止ペプチド模倣物を含む、請求項１２に記載の方法。
【請求項１５】
前記Ｇ２チェックポイント抑止ペプチドまたはＧ２チェックポイント抑止ペプチド模倣物は、ＣＢＰ５００（配列番号２６）、ＣＢＰ５０１（配列番号２７）、ＣＢＰ５０４（配列番号２９）、ＣＢＰ５０５（配列番号３０）、ＣＢＰ５０６（配列番号３１）、ＣＢＰ５１０（配列番号３２）、ＣＢＰ５１１（配列番号３３）、ＣＢＰ５１２（配列番号３４）、またはＣＢＰ６０３（配列番号３７）から選択される、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記候補抗癌治療は、併用療法を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１７】
前記併用療法は、ＤＮＡ損傷因子およびＧ２チェックポイント抑止因子を含む、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
さらに、前記Ｇ２チェックポイント抑止因子は、前記ＤＮＡ損傷因子の細胞傷害性効果に対して癌細胞を選択的に感受性にする、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記ＤＮＡ損傷因子はイリノテカン（ＣＰＴ−１１）であり、前記Ｇ２チェックポイント抑止因子はＣＢＤＣ４０２である、請求項１７に記載の方法。
【請求項２０】
前記ＤＮＡ損傷因子はイリノテカン（ＣＰＴ−１１）であり、前記Ｇ２チェックポイント抑止因子はＣＢＤＣ００４である、請求項１７に記載の方法。
【請求項２１】
前記ＤＮＡ損傷因子はシスプラチン（ＣＤＤＰ）であり、前記Ｇ２チェックポイント抑止因子はＣＢＰ５０１（配列番号２７）である、請求項１７に記載の方法。
【請求項２２】
候補抗癌治療の代理インビボ効力試験をさらに包含する、請求項１に記載の方法。
【請求項２３】
前記代理効力試験は、異種移植片腫瘍アッセイである、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
請求項２３に記載の方法。前記異種移植片腫瘍アッセイは、以下の工程：
（ａ）前記患者の癌細胞のサンプルを代理宿主に移植する工程；
（ｂ）該代理宿主において腫瘍を形成させる工程；
（ｃ）該代理宿主を候補抗癌治療で処置する工程；および
（ｄ）該腫瘍に対する該候補抗癌治療の効果を測定する工程、
を包含する、方法。
【請求項２５】
患者に対する抗癌治療の効力を推定するための方法であって、該方法は、以下の工程：
（ａ）該患者の癌細胞のサンプルを、該候補抗癌治療にインビトロで曝す工程；
（ｂ）該候補抗癌治療に曝した後に、該癌細胞のサンプルの細胞周期分布を決定する工程；および
（ｃ）該患者の癌細胞に対する該候補抗癌治療の細胞傷害性を決定する工程、
を包含する、方法。
【請求項２６】
前記患者の非癌細胞のサンプルを、前記候補抗癌治療にインビトロで曝す工程、および該患者の非癌細胞に対する該候補抗癌治療の細胞障害性を決定する工程により、該候補抗癌治療の安全性を決定する工程をさらに包含する、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
患者にとって最も有効な抗癌治療を選択するための方法であって、複数の候補抗癌治療に対して請求項２６に記載の方法を行う工程、および該患者の癌細胞に対して最大の細胞傷害性を有し、かつ該患者の非癌細胞に対して最小の細胞傷害性を有する治療を選択する工程を包含する、方法。
【図１】
【図２】
【図３Ａ】
【図３Ｂ】
【図４Ａ】
【図４Ｂ】
【図４Ｃ】
【図２】
【図３Ａ】
【図３Ｂ】
【図４Ａ】
【図４Ｂ】
【図４Ｃ】
【公表番号】特表２００７−５０１６０８（Ｐ２００７−５０１６０８Ａ）
【公表日】平成１９年２月１日（２００７．２．１）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００６−５２２４４６（Ｐ２００６−５２２４４６）
【出願日】平成１６年８月６日（２００４．８．６）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＩＢ２００４／００２７９２
【国際公開番号】ＷＯ２００５／０１４８５６
【国際公開日】平成１７年２月１７日（２００５．２．１７）
【出願人】（５０４２７５５６８）株式会社 キャンバス (6)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成１９年２月１日（２００７．２．１）
【国際特許分類】
【出願日】平成１６年８月６日（２００４．８．６）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＩＢ２００４／００２７９２
【国際公開番号】ＷＯ２００５／０１４８５６
【国際公開日】平成１７年２月１７日（２００５．２．１７）
【出願人】（５０４２７５５６８）株式会社 キャンバス (6)
【Ｆターム（参考）】
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