抗ＣＤ１４抗体融合蛋白質
【課題】抗ＣＤ１４抗体と蛋白分解酵素阻害物質とを含有する新規蛋白質、それをコードするポリヌクレオチド、新規蛋白質の製造方法および新規蛋白質を含有する敗血症予防治療剤等の提供。
【解決手段】（Ｉ）抗ＣＤ１４抗体もしくはその活性断片またはそれらの誘導体、および、（II）蛋白分解酵素の阻害物質もしくはその活性断片またはそれらの誘導体を含有する蛋白質の提供。
【解決手段】（Ｉ）抗ＣＤ１４抗体もしくはその活性断片またはそれらの誘導体、および、（II）蛋白分解酵素の阻害物質もしくはその活性断片またはそれらの誘導体を含有する蛋白質の提供。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、抗ＣＤ１４抗体と蛋白分解酵素阻害物質とを含有する新規蛋白質、それをコードするポリヌクレオチド、新規蛋白質の製造方法および敗血症等における新規蛋白質等の医薬用途に関する。
【背景技術】
【０００２】
敗血症は、感染素因があり全身性炎症性症候群（ＳＩＲＳ）の病態を呈する疾患と定義される（非特許文献１参照）。初期症状として悪寒、発汗、発熱や血圧低下が認められるが、各種の炎症性メディエーターおよび血液凝固系因子の亢進が全身性に起こると、微小循環障害を惹起し、組織障害、臓器障害へと病態が重症化し、しばしば多臓器不全あるいは敗血症性ショックを続発して死亡に至る疾患である。
敗血症発症のトリガー段階は、感染細菌の構成成分、例えば、グラム陰性細菌におけるリポ多糖（ＬＰＳ）やグラム陽性細菌におけるリポタイコ酸（ＬＴＡ）などが白血球（単球／マクロファージおよび好中球）や血管内皮細胞に作用し、各種炎症メディエーターの産生を惹起するイベントである。近年の研究により、細菌構成成分によるこれら標的細胞の活性化には、本来白血球の分化抗原として見出されたＣＤ１４（非特許文献２参照）、および自然免疫系におけるパターン認識分子として位置付けられるToll-like-receptors（ＴＬＲ）が重要な働きをしていることが明らかにされている（非特許文献３参照）。
【０００３】
ＣＤ１４は膜結合型と可溶型の２つの形態で存在する。膜結合型はグリコシルフォスファチジルイノシノトールにより細胞膜上にアンカリングされて存在し、可溶型には肝臓で合成されたものと、白血球上でフォスファチジルイノシトール特異的フォスフォリパーゼによって切り出されて血中に存在する（非特許文献４参照）ものがある。例えばＬＰＳによる標的細胞の活性化は、血中に存在するＬＰＳ結合蛋白質（ＬＢＰ）による触媒的作用を受けてＬＰＳのＣＤ１４への結合が促進され、細胞膜上のＴＬＲに結合して活性化シグナルを標的細胞に伝える。活性化シグナルを受けた標的細胞からは、ＴＮＦ-α、ＩＬ-１、ＩＬ-６、ＩＬ-８等のサイトカイン産生や組織因子の発現など、炎症反応に関わる各種のメディエーターが産生される。代表的なメディエーターであるサイトカインは好中球やマクロファージを活性化し、血管内皮への接着、組織内遊走、好中球エラスターゼに代表される中性プロテアーゼの放出、および活性酸素種の産生が起こる。これには凝固・線溶系の活性化、補体系の活性化、カリクレインの活性化も関与する。このように分子レベルおよび細胞レベルでは、多数のメディエーター分子およびエフェクター分子が病態形成に関わっており、一連の反応が過剰に亢進した場合には、全身的な傷害作用が現れる結果となり、前述の通り、微小循環障害から、組織障害、臓器障害へと病態が重症化する。
【０００４】
このように複雑な病態を呈する敗血症に関して、その治療薬に関する研究が数多くなされている。治療薬開発のアプローチとしては、発症起因物質である細菌構成物質の作用を阻害する方法と発症起因物質のシグナルに応答して生体側が応答して発現する各種の因子を阻害する方法とに大別することができる。
【０００５】
グラム陰性細菌由来のエンドトキシンの作用を阻害することによる治療法としては、（１）抗エンドトキシン抗体を用いる方法（非特許文献５〜６参照）（２）エンドトキシンアンタゴニストを用いる方法（非特許文献７参照）、（３）ポリミキシンＢを用いる方法（非特許文献８参照）、および（４）ＢＰＩを用いる方法（非特許文献９参照）等が考案されている。エンドトキシンは、グラム陰性細菌の菌体成分であり、グラム陽性細菌や真菌などの敗血症起因細菌には存在しない物質であるため、エンドトキシンを標的とした敗血症治療薬はグラム陰性細菌以外の原因菌の場合には適応できないという問題を抱えている。
【０００６】
グラム陰性細菌の構成物質であるＬＰＳの受容体として機能するＣＤ１４を標的とする敗血症治療薬も考案されている。近年、ＣＤ１４はＬＰＳ受容体としてのみならず、グラム陽性細菌の構成物質であるリポタイコ酸やペプチドグリカン等の細菌構成物質の受容体としても機能していることが判明しており（非特許文献１０参照）、ＣＤ１４を標的とする敗血症治療薬の適用範囲がグラム陰性細菌敗血症にとどまらないことが示唆される。具体的な治療薬として抗ＣＤ１４抗体（特許文献１〜２参照）や可溶型ＣＤ１４（非特許文献１１参照、特許文献３〜４参照）が考案されているが、実用には至っていない。敗血症病態は、原因菌構成物質による炎症反応のトリガー段階からシーケンシャルにかつ複合的に形成され、重症化へと進展していくものと推定される。ＣＤ１４標的治療薬の短所は、その作用が病態形成の初期のトリガー段階にフォーカスされるため、重症化した病態後期への効果が懸念されることである。
【０００７】
一方、生体側の過剰産生因子を標的とする治療法のうち、サイトカイン等の炎症メディエーターを阻害することによる治療法としては、（１）抗ＴＮＦ抗体を用いる方法（非特許文献１２参照）、（２）可溶型ＴＮＦ受容体を用いる方法（非特許文献１３参照）、（３）ＩＬ-１受容体アンタゴニストを用いる方法（非特許文献１４参照）、（４）ＰＡＦ阻害剤を用いる方法（非特許文献１５参照）、（５）ＮＯ阻害剤を用いる方法（非特許文献１６参照）などが考案されている。これらの治療法は、実験動物および小規模の臨床試験段階ではその効果が示されているものの、大規模な臨床試験段階ではその有効性、有用性を明確に実証するには至っていない。前述の通り、サイトカイン等の炎症メディエーターは、各々が複数の活性を持ち、各々が作用を補完し、また相互に発現を誘導するなど、複雑なネットワークを形成してイベントを発生させているため、一つの因子を阻害することによる治療には限界があるものと推察されている（非特許文献１７参照）。
【０００８】
一連の敗血症病態形成に関るメディエーターの相互作用の過程で亢進する血液凝固系因子を標的とする治療法も考案されている。血液凝固系の亢進は、微小血液循環系障害を招き、これが末梢組織への酸素供給低下、組織障害、さらには多臓器不全へと至るため治療薬の重要ターゲットの一つと考えられている。具体的な方法として、（１）活性化プロテインＣを用いる方法 （非特許文献１８参照）、（２）アンチトロンビンIIIを用いる方法（非特許文献１９参照）、および（３）ＴＦＰＩを用いる治療法（非特許文献２０参照）などがある。活性化プロテインＣによる重症敗血症治療は大規模な臨床試験においても有意な治療効果を示し（非特許文献２１参照）、臨床の場に提供されているが、出血傾向のある患者への適用禁忌など、実践的に利用する場面では大きな制限があることが問題とされている。
【０００９】
【特許文献１】特許第２７４４１３０号公報
【特許文献２】国際公開第０２／４２３３３号パンフレット
【特許文献３】特表平１０−５１２１４２号公報
【特許文献４】国際公開第０１／７２９９３号パンフレット
【非特許文献１】The ACCP／SCCM Consensus Conference Committee. Chest,1992,101,1644-1655
【非特許文献２】Goyert S.M.,Ferrero E., in McMichael A.(ed.): Leukocyte Typing III. Oxford,Oxford University Press,1987
【非特許文献３】Zhang G., Ghosh S., Endotxin Res.,2000,6,453-457
【非特許文献４】Stelter F., Structure／Function relationship of CD14; in Jack R.S.(ed.): CD14 in the Inflammatory Response. Chem. Immunol..Basl, Karger,2000,74, pp25-41
【非特許文献５】Ziegler E.J., et al., New Engl. J. Med.,1991,324, 429-436
【非特許文献６】Greenman R.L.,et al., JAMA,1991,266,1097-1102
【非特許文献７】Kawata T., et al., Prog Clin Biol Res.,1995,392.499-509
【非特許文献８】Tani T., et al., Artif. Organs,1998,22, 1038-1045
【非特許文献９】Lin Y., et al., Antimicrob. Agents Chemother.,1996,40,65-69
【非特許文献１０】Cleveland, Infect Immun.,1996,64,1906-1912
【非特許文献１１】Goyert S.M., J.Immunol.,1995,154,6529-6532
【非特許文献１２】Fischer C.J.,et al., Crit,Care Med.,1993,21,318-327
【非特許文献１３】Fischer C.J., et al., N. Engl.J.Med.,1996,334,1697-1702
【非特許文献１４】Fischer C.J.,et al., JAMA,1994,271,1836-1843
【非特許文献１５】Dhainaut J.F., et al., Crit. Care Med.,1994,22,1720-1728
【非特許文献１６】Gachot B., Intensive Care Med.,1995,21,1027-1031
【非特許文献１７】Vincent J.L., et al., CID,2002,34,1984-1093
【非特許文献１８】Rivard G.E., et al., J.Peditr.,1995,126,646-652
【非特許文献１９】Fourrier F.,et al., Chest,1993,104,882-888
【非特許文献２０】Abraham E., et al., Crit.Care Med.,2000,28,S31-33
【非特許文献２１】Bernard,G.R.,et al., N. Engl. J. Med.,2001,344,699-709
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
かかる状況において、本発明者らは、抗ＣＤ１４抗体と蛋白分解酵素阻害物質とを結合させた新規蛋白質が従来技術の問題を解決し得ることを着想し、新規蛋白質を作製してその効果を確認した。本発明の目的は、抗ＣＤ１４抗体と蛋白分解酵素阻害物質とを含有する新規蛋白質、それをコードするポリヌクレオチド、新規蛋白質の製造方法および新規蛋白質を含有する敗血症予防治療剤等を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明の代表的な態様を以下に示す。本発明の第一の態様は、（Ｉ）抗ＣＤ１４抗体もしくはその活性断片またはそれらの誘導体、および、（II）蛋白分解酵素の阻害物質もしくはその活性断片またはそれらの誘導体を含有する、新規な蛋白質である。すなわち、
（１）（Ｉ）抗ＣＤ１４抗体もしくはその活性断片またはそれらの誘導体、および、（II）蛋白分解酵素の阻害物質もしくはその活性断片またはそれらの誘導体を含有する蛋白質、
（２）前記（II）の阻害物質が蛋白性阻害物質である、前記（１）の蛋白質、
（３）前記（II）の阻害物質が多価酵素阻害物質である、前記（１）〜（２）の蛋白質、
（４）前記（II）の蛋白分解酵素が血液凝固因子（血液凝固系蛋白分解酵素）または炎症性プロテアーゼである、前記（１）〜（３）の蛋白質、
（５）前記（II）の蛋白分解酵素がＦＸａおよび／またはＦXIａである、前記（１）〜（４）の蛋白質、
（６）前記（II）の蛋白分解酵素がトロンビンである、前記（１）〜（４）の蛋白質、
（７）前記（II）の阻害物質がＵＴＩ由来である、前記（１）〜（６）の蛋白質、
（８）前記（II）の阻害物質がトロンボモジュリン由来である、前記（１）〜（６）の蛋白質、
（９）前記（II）の阻害物質がＵＴＩの第二ドメイン由来である、前記（１）〜（６）の蛋白質、
（１０）前記（II）の阻害物質がトロンボモジュリンの機能ドメイン由来、特にＥＧＦ様ドメイン由来である、前記（１）〜（８）の蛋白質、
（１１）前記（II）の蛋白分解酵素がエラスターゼである、前記（１）〜（４）の蛋白質、
（１２）前記（II）の阻害物質が分泌性白血球プロテアーゼインヒビターである、前記（１）〜（４）または（１１）の蛋白質、
（１３）前記（II）の阻害物質がＵＴＩ第二ドメインの１〜４の何れかの数のアミノ酸置換変異体である、前記（１）〜（１１）の蛋白質、
（１４）前記（Ｉ）の抗ＣＤ１４抗体が中和能を有する抗体である、前記（１）〜（１３）の蛋白質、
（１５）前記（Ｉ）の抗ＣＤ１４抗体がヒトＣＤ１４のアミノ酸番号２６９〜３１５の領域の少なくとも一部を認識する抗体である、前記（１）〜（１４）の蛋白質、
（１６）前記（Ｉ）の抗ＣＤ１４抗体がキメラ抗体である、前記（１）〜（１５）の蛋白質、
（１７）前記（Ｉ）の抗ＣＤ１４抗体がヒト化抗体である、前記（１）〜（１６）の蛋白質、または、
（１８）前記（Ｉ）の抗ＣＤ１４抗体が、表２に記載の重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を重鎖可変領域のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３として、または、表２に記載の軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を軽鎖可変領域のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３として含有する、前記（１）〜（１７）の蛋白質である。
【００１２】
本発明の第二の態様は、第一の態様の蛋白質の少なくとも一部をコードするポリヌクレオチドである。すなわち、
（１９）前記（１）〜（１８）の蛋白質の少なくとも一部をコードするポリヌクレオチドである。
本発明の第三の態様は、本発明の第二の態様のポリヌクレオチドを含有するベクターである。すなわち、
（２０）前記（１９）のポリヌクレオチドを含有するベクターである。
本発明の第四の態様は、本発明の第二の態様のポリヌクレオチドまたは本発明の第三の態様のベクターを含有する細胞である。すなわち、
（２１）前記（１９）のポリヌクレオチドまたは前記（２０）のベクターを含有する細胞である。
本発明の第五の態様は、本発明の第二の態様のポリヌクレオチド、本発明の第三の態様のベクターまたは本発明の第四の態様の細胞の少なくともいずれか一つを用いることを特徴とする、本発明第一の態様の蛋白質の製造方法である。すなわち、
（２２）前記（１９）のポリヌクレオチド、前記（２０）のベクターまたは前記（２１）の細胞の少なくともいずれか一つを用いることを特徴とする、前記（１）〜（１８）の蛋白質の製造方法である。
本発明の第六の態様は、本発明第一の態様の蛋白質、本発明の第二の態様のポリヌクレオチド、本発明の第三の態様のベクターまたは本発明の第四の態様の細胞の少なくともいずれか一つを含有することを特徴とする、疾患の予防および／または治療剤である。すなわち、
（２３）前記（１）〜（１８）の蛋白質、前記（１９）のポリヌクレオチド、前記（２０）のベクターまたは前記（２１）の細胞の少なくともいずれか一つを含有することを特徴とする、疾患の予防および／または治療剤、または、
（２４）前記疾患が敗血症、重症敗血症もしくは敗血症ショック、ＳＩＲＳ関連疾患、エンドトキシンショック、またはＡＲＤＳである、前記（２３）の予防および／または治療剤である。
【発明の効果】
【００１３】
本発明に係る新規蛋白質は、抗ＣＤ１４抗体または蛋白分解酵素阻害物質等がそれぞれ単独では無効または効果が不充分な、疾患もしくは病態、またはそれらにおける特定の症状もしくは治療指標に対して、有効である。該蛋白質は、in vivoにおける安定した抗炎症作用ならびに抗凝固作用および／またはエラスターゼ阻害作用を併せ持つことにより、たとえば、敗血症の予防および／または治療薬として有用である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１４】
以下に本発明をさらに詳細に説明する。
本発明第一の態様の蛋白質は、その種類については特に制限されず、単純蛋白質（またはポリペプチド）および複合蛋白質（糖蛋白質他）等を含む。
本発明第一の態様の蛋白質において、（Ｉ）抗ＣＤ１４抗体もしくはその活性断片またはそれらの誘導体と（II）蛋白分解酵素阻害物質もしくはその活性断片またはそれらの誘導体の結合様式は、特に限定されず、通常共有結合であるが、化学的方法（化学合成法もしくはケミカルコンジュゲーション）または遺伝子組換技術の何れによる結合であっても良い。本発明第一の態様の蛋白質は、好ましくは遺伝子工学的に作製される融合蛋白質である。
【００１５】
前記（II）の蛋白分解酵素阻害物質は、抗体の重鎖もしくは軽鎖の何れか、または双方に結合しても良いが、通常、抗体の重鎖、特に、重鎖のＣ末端側に融合させる。前記（II）の蛋白分解酵素阻害物質の結合数は必ずしも限定されず、抗体あたり１分子でも複数分子でも良い。また、必要に応じて、適当なリンカーまたはスペーサー等を用いてもよい。これらの方法、リンカーまたはスペーサー等は当業者に周知であり、具体的な例は実施例に示されている。
【００１６】
本発明の蛋白質において、（Ｉ）抗ＣＤ１４抗体または（II）蛋白分解酵素阻害物質の活性断片とは、（Ｉ）抗ＣＤ１４抗体または（II）蛋白分解酵素阻害物質が本来有する活性または機能の少なくとも一つを発現または保持し得る部分を含有する断片であり、活性領域または機能ドメインを包含する。また、本発明の蛋白質において、（Ｉ）抗ＣＤ１４抗体もしくは（II）蛋白分解酵素の阻害物質またはそれらの活性断片の誘導体とは、（Ｉ）抗ＣＤ１４抗体もしくは（II）蛋白分解酵素の阻害物質またはそれらの活性断片に何らかの修飾もしくは変異または付加等を伴うもので、例えば、他の化学物質（例えば、ポリエチレングリコール等）を含有するもの、または、１以上、好ましくは１ないし数個のアミノ酸の変異、例えば、付加、欠失、挿入または置換を伴うものが含まれ、変異体、改変体および修飾体を包含する。これらは、（Ｉ）抗ＣＤ１４抗体もしくは蛋白分解酵素阻害物質またはその活性断片が本来有する活性または機能の少なくとも一つ、好ましくは全てを発現または保持し得る。
【００１７】
本発明第一の態様の蛋白質は、（Ｉ）抗ＣＤ１４抗体または（II）蛋白分解酵素阻害物質が本来有する活性の各々少なくとも一つ、好ましくは全てを発現または保持する。本発明第一の態様の蛋白質は、（Ｉ）抗ＣＤ１４抗体および（II）蛋白分解酵素阻害物質の本来の活性の各々少なくとも一つ、好ましくは全てを併せ持つことにより、（Ｉ）抗ＣＤ１４抗体または（II）蛋白分解酵素阻害物質等単独では無効または効果が不充分な、疾患もしくは病態、またはそれらにおける特定の症状もしくは治療指標に対しても、有効である。
本発明第一の態様の蛋白質において（II）蛋白分解酵素の阻害物質は必ずしも限定されず、非蛋白性阻害物質または低分子化合物等であっても良いが、好ましくは蛋白性阻害物質である。
【００１８】
（II）は特定の酵素に特異的であっても良いが、複数の酵素を阻害する多価酵素阻害物質が好ましい。多価酵素阻害作用を有する物質としては、クニッツ型プロテアーゼインヒビター、例えば、尿トリプシンインヒビター（ＵＴＩ）、分泌性白血球プロテア−ゼインヒビター（ＳＬＰＩ：Secretory Leucocyte Protease Inhibitor）、組織因子経路インヒビター（ＴＦＰＩ：tissue Factor pathway inhibitor）およびアプロチニン等が挙げられ、好ましくは、ＵＴＩ、ＳＬＰＩおよびＴＦＰＩである。
ＵＴＩは、ビクニンまたはウリナスタチンと同一であり、トリプシン、プラスミンおよび好中球エラスターゼ等に対するプロテアーゼインヒビターである。
ＳＬＰＩは、好中球エラスターゼおよびカテプシン等に対するインヒビターである。
ＴＦＰＩは、リポ蛋白結合性凝固インヒビター（ＬＡＣＩ：lipoprotein-associated coagulation inhibitor）または外因系凝固インヒビター（ＥＰＩ：extrinsic pathway inhibitor）とも呼ばれ、血液凝固第Ｘａ因子（ＦＸａ）と結合して、第VIIａ因子−組織因子（第III因子）複合体を阻害し、外因系血液凝固の開始を抑制する。
【００１９】
その他の多価酵素阻害物質としては、α２-マクログロブリン（α２-ＭＧ）、アンチトロンビンIII（ＡＴIII）およびα１-アンチトリプシン（α１-ＡＴ：α１-antitrypsin）がある。α２-ＭＧは、約７７０,０００の巨大な分子量を持つ血漿蛋白の１つで、トロンビン、ＦＸａ、プラスミン、トリプシン、キモトリプシンおよびエラスターゼ等を阻害する。ＡＴIIIは、ＦＸａやトロンビンなどのセリンプロテアーゼと１対１の複合体を形成し、凝固反応を制御する。ＡＴIIIは、Ｎ末端にヘパリン結合ドメインを、Ｃ末端にトロンビンとの反応部位を有し、ヘパリンとの結合によりその抗トロンビン活性が約１０００倍に増強する。α１-ＡＴは、分子量５１０００、３９４個のアミノ酸からなる糖蛋白で、トロンビン、プラスミン、トリプシン、キモトリプシンおよびエラスターゼ等の種々のセリンプロテアーゼを阻害する。
【００２０】
本発明の蛋白質における前記（II）は、抗凝固作用もしくはブラジキニン産生をもたらす因子を含む血液凝固因子（血液凝固系蛋白分解酵素）阻害作用、特に活性化血液凝固因子阻害作用、または、抗炎症作用もしくは炎症性プロテアーゼ阻害作用を有する阻害物質が好ましい。ここで、血液凝固因子としては、具体的にはカリクレイン、トロンビン、ＦＶａ、ＦVIIａ、ＦVIIIａ、ＦIXａ、ＦＸａ、ＦXIａ、ＦXIIａおよびＦXIIIａ等が挙げられ、それらの内、特に、カリクレイン、トロンビン、ＦＶａ、ＦVIIIａ、ＦIXａ、ＦＸａ、ＦXIａおよびＦXIIIａが重要な、さらに、トロンビン、またはＦＸａおよびＦXIａが最も重要な標的酵素である。また、炎症性プロテアーゼとしては、具体的にはエラスターゼ、トリプシン、キモトリプシンおよびカテプシン類が挙げられ、特にエラスターゼ、具体的には好中球エラスターゼおよび膵エラスターゼ、特に好中球エラスターゼが重要な標的酵素である。本発明の蛋白質または本発明の蛋白質における前記（II）の阻害物質の蛋白分解酵素阻害活性は、公知の材料および方法を利用して測定し得るが、具体例は実施例に記載されている。
【００２１】
抗凝固作用または血液凝固因子阻害作用を有する阻害物質としては、公知の物質を利用し得る。具体的にはＴＦＰＩ、ＡＴIII、α１-ＡＴおよびα２-ＭＧ、ならびに、ＵＴＩおよびトロンボモジュリン（ＴＭ）、それらの活性断片およびそれらの誘導体等が挙げられ、好ましくは、ＴＭまたはＵＴＩ、それらの活性断片もしくはそれらの誘導体、より好ましくは、ＴＭ機能ドメインまたはＦＸａおよび／またはＦXIａに対する阻害活性を有するＵＴＩの第二ドメイン（ＵＴＩ-Ｄ２）もしくはその改変体、特にその３アミノ酸置換変異体（ＵＴＩ-Ｄ２(3)）である。ＵＴＩ、ＵＴＩ-Ｄ２およびＵＴＩ-Ｄ２（３）のアミノ酸配列およびヌクレオチド配列ならびに調製方法等は、特開平５−８４０８３、特開平５−３０８９８８、特開平６−２５２８９および特開平６−３２１９８９等に記載されており、これらを参考とし得る。
トロンボモジュリン（ＴＭ）は、血管内皮細胞が産生する抗凝固因子の１つであり、細胞膜上でトロンビンと複合体を作り、続いてプロテインＣが活性化され、血液凝固反応が抑制される。ＴＭは１９８１年に発見され、血管内皮細胞上に存在し、トロンビンを凝固酵素から抗凝固酵素に変換する。また、トロンビン活性を直接阻害するとともに、プロテインＣ（ＰＣ）の活性化を促進し、生じた活性化プロテインＣ（ＡＰＣ）は、活性化血液凝固因子第Ｖ因子（ＦＶａ）、第VIII因子（ＦVIIIａ）を不活性化することによって血液凝固カスケード反応にネガティブフィードバックをかけ、トロンビンの生成を抑制する。つまりＴＭはトロンビン依存性に凝固・線溶活性の双方を阻害する。この作用には、ヘパリンのようにアンチトロンビンIIIを必要とせず、出血傾向の助長が少ないとされている。
本発明で用いるＴＭ、その活性断片および誘導体は、ＴＭのアミノ酸配列およびそれをコードする核酸配列、ならびにＴＭのドメイン構造と機能が公知（例えば、黒澤晋一郎、別冊・医学のあゆみ 血液疾患−ｓｔａｔｅ ｏｆ ａｒｔｓ （Ｖｅｒ．２），１９９８年、２０５−２０７頁）であることから、それらを基に、公知の方法で調製し、また、活性を測定しうる（例えば、特開平１−６２１９及びＷＯ８８/５０５３）。ＴＭは５つのドメイン、すなわち、細胞外のＮ末端より、レクチン様ドメイン、Ｅｐｉｄｅｒｍａｌ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ（ＥＧＦ）様ドメイン、Ｏ型糖鎖結合ドメイン、膜貫通ドメインおよび細胞質ドメイン（Kurosawa，S et al.,J.Biol.Chem.,263,5993,1988）からなりそのひとつＥＧＦ様ドメインは６つの繰り返し単位からなる（本明細書ではＥＧＦ１−６またはＴＭ１２３４５６のように記載することがある）。その活性最小単位は、ＥＧＦ様ドメインの第４〜６番目の繰り返し単位、すなわちＥＧＦ４−６とされている。
ＴＭの好ましい活性断片、誘導体または機能ドメインの例としては、ＥＧＦ様ドメイン、それを含有するＴＭの活性断片もしくはその誘導体、またはＥＧＦ様ドメインの活性断片もしくはその誘導体、好ましくはＥＧＦ４−６、さらに好ましくはＥＧＦ３−６、特に好ましくはＥＧＦ２−６、それを含有するＴＭの活性断片もしくはその誘導体、具体的には、実施例で作製されたＴＭの活性断片もしくはその誘導体であり、特に、ＴＭ２３４５６Ｍ、ＴＭ２３４５６７Ｍまたはそれらの活性断片もしくは誘導体である。誘導体の好ましい例としては、ＴＭのアミノ酸番号３８８番目のメチオニンをロイシンに置換した変異体（Ｍ３８８Ｌ）が挙げられ、ＴＭ２３４５６ＬおよびＴＭ２３４５６７Ｌである。これらの作製方法および活性測定方法は、公知の方法に従ってもよく、具体的には、実施例に記載されている。
【００２２】
抗炎症作用または炎症性プロテアーゼ阻害作用を有する阻害物質としては、種々のものが知られているが、特にエラスターゼ阻害物質が好ましく、公知の物質を利用し得る。具体的には、ＵＴＩ、ＵＴＩ-Ｄ２、ＳＬＰＩ、α１-ＡＴおよびα２-ＭＧもしくはこれらの活性断片もしくは誘導体、好ましくはＵＴＩ、特にエラスターゼ阻害活性を有するＵＴＩ第二ドメイン改変体、具体的にはＵＴＩ−Ｄ２の３アミノ酸置換変異体、ＵＴＩ−Ｄ２の４アミノ酸置換変異体（ＵＴＩ−Ｄ２（４）のように記載することもある）および、ＳＬＰＩ、特にその後半部分（Ｃ末端ポリペプチド）である。ＳＬＰＩおよびその後半部分（Ｃ末端ポリペプチド）のアミノ酸配列およびヌクレオチド配列ならびに調製方法等は、特開平６−８０６９７等に記載されており、これらを参考とし得る。
ＵＴＩ−Ｄ２の３アミノ酸または４アミノ酸置換変異体の具体例は、実施例７の表９に示されており、特に、ＵＴＩ−Ｄ２（４）（Ｒ１１Ｓ/Ｒ１５Ｔ/Ｑ１９Ｋ/Ｙ４６Ｄ）が好ましい。
ＦＸａおよび／またはＦXIａに対する阻害活性ならびにエラスターゼ阻害活性を有する、ＵＴＩ第二ドメイン改変体、具体的にはＵＴＩ-Ｄ２（３）は特に好ましい。
【００２３】
本発明第１の態様の蛋白質において、抗ＣＤ１４抗体は、ＣＤ１４、好ましくはヒトＣＤ１４に結合するものであれば、特定の抗体に限定されない。本発明の蛋白質において、前記（Ｉ）の抗ＣＤ１４抗体は、蛋白分解酵素阻害物質と相乗的に作用し、または、該蛋白質もしくは該阻害物質の機能もしくは効果を向上させる。本発明第１の態様の蛋白質における前記（Ｉ）の抗ＣＤ１４抗体は、ＣＤ１４阻害作用の有無によっては限定されないが、好ましくはＣＤ１４阻害作用を有する抗体である。ここで、ＣＤ１４阻害作用とは、ＣＤ１４の機能、例えば、ＬＰＳとの結合能、ＴＬＲとの相互作用、ＴＬＲ発現細胞の活性化、具体的にはＮＦ-κＢの活性化もしくはＩＬ-８産生、または内皮細胞のサイトカイン産生、例えば、ＩＬ-６産生等の少なくとも1つを阻害する作用を言い、好ましくは、ＣＤ１４とＴＬＲ、特に、ＴＬＲ２またはＴＬＲ４との結合を阻害する作用である。
【００２４】
好適な例として、公知の抗ＣＤ１４抗体、特に、ＷＯ０２／４２３３３等に開示された抗体、および、公知の方法、特に、ＷＯ０２／４２３３３等に開示された方法により取得される抗体が挙げられる。また、それらの抗体から作製されるキメラ抗体およびヒト化抗体も本発明の蛋白質における、前記（Ｉ）の抗ＣＤ１４抗体に含まれる。
【００２５】
本発明の蛋白質において、前記（Ｉ）の抗ＣＤ１４抗体は、ＣＤ１４、好ましくはヒトＣＤ１４に結合するものであれば、その認識領域または結合領域は必ずしも限定されないが、好ましくは、ヒトＣＤ１４のＣ末端側領域、特に、アミノ酸番号２６９〜３１５、より好ましくはアミノ酸番号２８５〜３０７、さらに好ましくは、アミノ酸番号２９４〜２９６の少なくとも一部を認識または結合するものであり、具体的には、これらのいずれかを含有するＣＤ１４の部分またはＣＤ１４上の抗原決定領域を認識または結合する抗体である。また、表５に記載のＣＤ１４アミノ酸置換変異体（以下、アミノ酸置換体、アミノ酸置換改変体またはアミノ酸改変体と記載することがある）の内、Ｐ２９４Ｈ、Ｑ２９５Ａ、Ｐ２９６ＨおよびＰ２９４／２９６Ａの少なくとも１つ、好ましくは全てとの結合性がヒトＣＤ１４との結合性と比較して有意に低下している抗体であり、より好ましくは、該結合性の低下に加えて、他の変異体との結合性が実質的に変化していない抗体である。本発明の蛋白質における（Ｉ）の抗ＣＤ１４抗体の認識領域または結合領域は、公知の材料および方法、例えば、ＷＯ０２／４２３３３に記載の材料および方法を利用して確認し得るが、好適な例は実施例に記載されている。
また、表５に記載の変異体の内、特定のもの、特に、Ｐ２９４Ｈ、Ｑ２９５Ａ、Ｐ２９６ＨおよびＰ２９４／２９６Ａの少なくとも１つ、好ましくは全てとの結合性がヒトＣＤ１４との結合性と比較して有意に低下していること、より好ましくは、該特定の変異体に対する結合性の低下に加えて、他の変異体との結合性が実質的に変化していないことを指標として、ＣＤ１４阻害活性を有する抗ＣＤ１４抗体を簡便にスクリーニングもしくは同定または調製することができ、本発明はそのような方法をも提供する。
【００２６】
本発明第一の態様の蛋白質において、前記（Ｉ）の抗体は、ポリクローナル抗体であっても良いが、モノクローナル抗体が好ましい。また、由来する動物種は特に限定されない。抗体作製の容易さの面では、マウスまたはラットが好ましい。医薬品組成物の構成物の面では、キメラ抗体、ＣＤＲ移植抗体、ヒト化抗体またはヒト抗体であることが好ましい。ヒト抗体には、ヒト抗体遺伝子組換トランスジェニックマウスに免疫して作製したヒト抗体も含まれる。この他にもファージ抗体等も本発明の抗体に含まれる。ヒト化抗体は、定常領域と、フレームワーク領域（ＦＲ）がヒト由来で、相補性決定領域（ＣＤＲ）が非ヒト由来であるＣＤＲ移植抗体、または、そのＦＲにさらに変異を導入した抗体である。ファージ抗体は繊維状ファージのコート蛋白質に抗体を融合させることによってファージ粒子表面上に抗体を提示させ、作製する抗体であり、単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）フォームあるいはＦａｂフォームが主に使用される。キメラ抗体は、ヒト以外の哺乳動物、例えば、ラットまたはマウスのモノクローナル抗体の可変領域と、ヒト抗体の定常領域とからなる抗体である。本発明第一の態様の蛋白質において、前記（Ｉ）の抗体はその分子種は特に限定されない。いずれのクラス（例えば、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、特に、ＩｇＧ）、サブクラス（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、特に、ＩｇＧ４）およびイソタイプに分類される抗体であってもよい。抗体軽鎖については、カッパー鎖およびラムダ鎖のいずれも使用可能である。また、生物学的に活性のあるＦab（fragment of antigen binding ）、Ｆab'、（Ｆab'）2、抗体の活性断片をリンカー等で結合したものとして例えば一本鎖抗体（single chain Ｆｖ：ｓｃＦｖ）（Bird, R.E.ら，Science,1988;242:423-426）、ジスルフィド安定化抗体（disulfide stabilized Fv：ｄｓＦｖ）（Reiterら，Protein Engineering,1994;7:697）、 ダイアボディー（diabody）（Holliger P.ら，Proc Natl Acad Sci USA 1993;90:6444-8）、単一ドメイン抗体（ｄＡｂ）（Ward E.S.ら，Nature.,1989;341:544-6）等の活性断片および誘導体も、本発明に含まれる。これらは、遺伝子組換技術または適当な蛋白分解酵素で抗体を処理する方法等、公知技術を用いることにより作製できる。
【００２７】
キメラ抗体は、軽鎖遺伝子および重鎖遺伝子が、典型的には遺伝子工学により、異なった種に属する抗体遺伝子セグメントから構成されている抗体である。例えば、ラットまたはマウスモノクローナル抗体からの遺伝子の可変（Ｖ）セグメントは、ヒト定常（Ｃ）セグメント、例えば、γ１およびγ４と連結され得る。従って、他の哺乳動物種も用いられ得るけれども、典型的な治療用キメラ抗体は、ラットまたはマウス抗体からのＶ又は抗原結合ドメインおよびヒト抗体からのＣ又はエフェクタードメインから成るハイブリッド蛋白質である。
本発明第一の態様の蛋白質における前記（Ｉ）の抗体の可変領域配列の好ましい例を図１および図２（配列番号１２３〜１２６）に、および、該抗体がキメラ抗体である融合蛋白質の好ましい例を図７〜１７および実施例に示した。
【００２８】
また、通常抗体は抗原結合に関して多価（ＩｇＧであれば、２価）であるが、本発明の蛋白質における前記（Ｉ）の抗体は、ある局面においては、一価であることが好ましい。例えば、Ｆａｂ、または、抗体の定常領域、特に重鎖の定常領域（ＣＨ）においてアミノ酸変異を導入することによって、通常の重鎖間ジスルフィド結合を形成し得ないような変異、具体的には、Ｃｙｓ残基、特に抗体重鎖のヒンジ領域のＣｙｓ残基を他のアミノ酸残基に置換等行なうことによって、作製される一価の抗体が挙げられる。好適な例を実施例に示した。
【００２９】
「相補性決定領域（ＣＤＲ）」の定義およびその位置を決定する方法は複数報告されており、これらの何れも採用し得るが、代表的なものとしてKabatの定義（Sequences of proteins of immunological interest, 5th ed.,U.S. Department of Health and Human Services,1991）とChothiaの定義（チョシアおよびレスク，J. Mol. Biol.,1987；196：901-917）がある。本発明においては、Kabatの定義によるＣＤＲを好適な例として採用するが、必ずしもこれに限定されない。また、場合によっては、Kabatの定義とChothiaの定義の両方を考慮して決定しても良く、例えば、各々の定義によるＣＤＲの重複部分を、または、各々の定義によるＣＤＲの両方を含んだ部分をＣＤＲとすることもできる。そのような方法の具体例としては、Kabatの定義とChothiaの定義の折衷案である、Oxford Molecular's AbM antibody modeling softwareを用いたMartinらの方法（Proc.Natl.Acad.Sci.USA,1989;86:9268-9272）がある。
【００３０】
「フレームワーク領域」とは、Kabat 等による定義の如く、単一種中の種々の抗体の内で、比較的保存されている（すなわち、ＣＤＲ以外の）抗体軽鎖および重鎖可変領域の部分を云う。本明細書において、「ヒトフレームワーク領域」とは、自然に生じるヒト抗体のフレームワーク領域と又はいくつかのこのような抗体の共通配列と実質的に同一（約８５％又はそれ以上）であるところのフレームワーク領域である。
「ヒト化抗体」とは、ヒトフレームワーク、非ヒト抗体からの少なくとも一つのＣＤＲを含む抗体を云い、その中に存在する何らかの定常領域は、ヒト抗体定常領域と実質的に同一である、すなわち少なくとも約８５〜９０％、好ましくは少なくとも９５％同一である。従って、恐らくＣＤＲを除く、ヒト化抗体の全ての部分は、１以上の天然のヒト抗体配列の対応する部分と実質的に同一である。例えば、ヒト化抗体は、キメラマウス可変領域／ヒト定常領域抗体を含まない。
【００３１】
これらの抗体は、より特異的には、本発明における（Ｉ）の抗体は、複数の、好ましくは一つのヒト受容体（アクセプター）抗体からのフレームワーク領域（ＦＲ）の少なくとも一つ、好ましくは一方の鎖の全て（４つ）、より好ましくはすべて（各鎖について４つ）を含有し、そして、Ｆ１０２４抗体からの１以上、好ましくはすべて（各鎖について３つ）の相補性決定領域（ＣＤＲ）を含有するヒト化抗体である。該抗体は、軽鎖／重鎖複合体の２つのペアを有することができ、少なくとも一つの鎖、特に重鎖は、ヒトフレームワーク領域セグメントに機能的に連結された、１以上、好ましくは全て（３つ）の供与体（例えばラットまたはマウス、以下同様）抗体の相補性決定領域を含む。例えば、供与体相補性決定領域は、追加の自然に随伴する供与体アミノ酸残基と共に又はなしで、ヒトフレームワーク領域中に導入する。さらに明確な例としては、本発明のヒト化抗体は、各々、表２に記載されたＣＤＲのいずれかのアミノ酸配列を含有するまたは該アミノ酸配列からなるＣＤＲの少なくとも一つ、好ましくはすべて（各鎖３つ）を含有するものである。ヒト化抗体における各ＣＤＲおよびフレームワークの位置は元の供与体抗体における位置と対応していることが望ましい。
【００３２】
一般に、本発明における（Ｉ）のヒト化抗体は、ヒト化抗体重鎖可変領域フレームワークおよび供与体抗体重鎖可変領域フレームワーク間において、６５％以上９５％以下、好ましくは７０％以上９０％以下の相同性（すなわち、配列同一のパーセント）が好ましい。標準的には、同じヒト抗体からの重鎖および軽鎖が、フレームワーク配列を提供するために選択されて、２つの鎖の集合における非適合性の可能性を減少させるが、異なる２以上のヒト抗体から由来してもよい。
【００３３】
ヒトフレームワーク領域に関しては、ＣＤＲを得る非ヒト抗体のフレームワークまたは可変領域アミノ酸配列をヒト抗体配列コレクション中の対応する配列と比較し相同性の高い配列を選び用いる。好ましくは、フレームワークアミノ酸配列の相同性は６０％以上、より好ましくは６５％以上である。また、好ましくは、受容体抗体重鎖可変領域のアミノ酸配列は、供与体抗体重鎖可変領域のアミノ酸配列と最も相同なヒト抗体重鎖可変領域配列の代表的コレクション中の５つ、より好ましくは３つの中にある。ヒト化抗体の設計は、以下のように行うことができる。
【００３４】
１）アミノ酸が以下の（ａ）〜（ｃ）のカテゴリーに該当する場合は、用いられるヒト抗体（受容体抗体）のフレームワークアミノ酸はＣＤＲを供与する非ヒト抗体（供与体抗体）由来のアミノ酸で置換される。
（ａ）受容体抗体のヒトフレームワーク領域中の該アミノ酸がヒト抗体のその位置に稀であり、そして供与体抗体中の対応するアミノ酸がヒト抗体中のその位置に典型的である；
（ｂ）該アミノ酸がＣＤＲの１つに一次配列上近接もしくは隣接している；または、
（ｃ）該アミノ酸が供与体もしくはヒト化抗体の三次元モデルにおいてＣＤＲの約５、好ましくは４、より好ましくは３オングストローム以内に原子を有する（Coら, Proc，Natl. Acad. Sci. USA，1991;88:2869）。
【００３５】
２）受容体抗体のヒトフレームワーク領域中の該アミノ酸および供与体抗体の対応するアミノ酸がヒト抗体中のその位置に稀である場合、ヒトフレームワークのその位置に典型的であるアミノ酸に置換する。
ヒト化抗体の製造の詳細な説明については、Queenら，Proc，Natl. Acad. Sci. USA，1989;86：10029、ＷＯ９０／０７８６１、ＷＯ９２／１１０１８、Coら, Proc，Natl. Acad. Sci. USA，1991;88:2869、CoおよびQueen, Nature, 1991;351:501頁、ならびに、Coら, J. Immunol., 1992;148:1149（これらの引例をもって本明細書の一部と成す）が参照される。
【００３６】
一般に、全ての又は殆どのアミノ酸の置換が上記基準を満たしているのが望ましい。しかしながら、個々のアミノ酸が上記基準にあっているかどうかについては曖昧であることもあり、そして、代わりの様々な抗体が製造され、その内の一つはその特定の置換を有するものもあるが、有さないものもある。このため、コンピューターモデリングによるＣＤＲとＦＲの最適化を行えばよい。
【００３７】
相同性の高いヒト抗体Ｖ領域が見出された後、そのフレームワーク部分に供与体、特にＦ１０２４抗体のＣＤＲ配列を移植し、コンピューター分子モデリングで立体構造をシミュレーションする。このときに使用するプログラムとしてはＡＢＭＯＤやＥＮＣＡＤ（Biochemistry，1990；29：10032）が用いられる。この立体構造のシミュレーションにより、ＣＤＲ領域のアミノ酸の配置がＣＤ１４との結合活性を最適に有するように、ＣＤＲ近傍のＦＲのアミノ酸を他のアミノ酸に置換することにより、最適化が行える。
【００３８】
また、ＣＤＲとＦＲの最適化には、供与体、特にＦ１０２４抗体のＦＲの一部のアミノ酸配列をそのまま用いて、ヒト抗体Ｖ領域に移植する方法も可能である。ヒト抗体Ｖ領域にＦ１０２４抗体のＣＤＲとＦＲの一部の配列を移植し、コンピューター分子モデリングで立体構造をシュミレーションする。このときに使用するプログラムとしては、ModelerおよびQUANTA／CHARMm（MolecularSumilations社）等が用いられる。
軽鎖では３〜４箇所を、重鎖では７〜８箇所を供与体、例えばラット由来のアミノ酸に変更することによりＦＲがラット抗体の構造に近くなり、ＣＤＲ領域のアミノ酸の配置がＣＤ１４との結合活性を最適にすることが容易になる場合がある。
【００３９】
また、抗ＣＤ１４抗体としての結合活性が維持されていれば、ＣＤＲ領域のアミノ酸の１または２以上のアミノ酸の欠失、置換、挿入もしくは付加をしてもよい。この場合、例えばＧｌｙとＡｌａ、Ｖａｌ、ＬｅｕとＩｌｅ、ＡｓｎとＧｌｎ、ＣｙｓとＭｅｔまたはＬｙｓとＡｒｇ等、同族に分類されるアミノ酸同士の置換は、抗ＣＤ１４抗体としての結合活性が維持されていやすいと理解される。また、フレームワーク領域中のいくつかの位置のアミノ酸は抗原と直接相互作用、例えば非共有結合的に接触することができ、これらの位置も上記置換の対象となるが、特に、重鎖の２６から３０の位置のアミノ酸は立体構造上超可変ループに含まれるとされており（チョシアおよびレスク，J. Mol. Biol., 1987；196：901-917）、その意味ではＣＤＲと同様に移植することも可能である。
【００４０】
得られたアミノ酸配列に基づき、ヒト化抗体を作成する。例えば、上記より決定したアミノ酸配列より、ヒト化抗体遺伝子配列を決定し、ヒト化モノクローナル抗体をコードする遺伝子を作製する。具体的にはヒトＶ領域の遺伝子よりＣＤＲをエンコードするＤＮＡを削除し、かわりに供与体、例えばラット由来のＣＤＲをエンコードするＤＮＡを挿入する。さらに、分子モデリングにより変更するアミノ酸に応じて、対応するＤＮＡ配列をＰＣＲを用いた部位特異的突然変異導入法等により改変し、組換ヒトＶ領域遺伝子を作製する。これをヒト抗体の重鎖、軽鎖のＣ領域を含むベクターにクローニングし発現ベクターを得る。このとき使用するヒト由来の配列を変更することにより、ヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ３、好ましくは、ＩｇＧ４等の抗体のサブクラスを得ることができる。発現ベクターはマウスミエローマ細胞Ｓｐ２-Ｏ-ａｇ１４（ＡＴＣＣ ＣＲＬ１５８１）やハムスター卵巣細胞ＣＨＯに遺伝子導入し、発現を行う。
【００４１】
ヒト化抗体は、ヒトの治療における使用のために、非ヒト抗体、例えばマウスまたはラット抗体に比べ、そしていくつかの場合にはキメラ抗体に比べ、少なくとも３つの潜在的な利点を有する。
１）エフェクター部分がヒトであるので、ヒト免疫系の他の部分とより良好に相互作用しうる（例えば、補体依存性細胞障害（ＣＤＣ）又は抗体依存性細胞障害（ＡＤＣＣ）による、より効率的な標的細胞の破壊）。
２）ヒト免疫系は、ヒト化抗体のフレームワーク又はＣ領域を異物として認識せず、従って、このような投与された抗体に対する抗体応答は、全部が異物であるマウス抗体又は一部分が異物であるキメラ抗体より少ない。
３）投与されたラットまたはマウス抗体は、通常の抗体の半減期よりも非常に短い、ヒト体内での循環における半減期を有すると報告されている（ショー D.ら、J.Immunol., 1987；138：4534-4538）。投与されたヒト化抗体は、恐らく、自然に生じるヒト抗体の半減期とより近い半減期を有し、より少量、又はより少ない頻度の投与で有効である。
【００４２】
また、前記（Ｉ）の抗ＣＤ１４抗体は、実施例に示される抗体、特に、Ｆ１０２４抗体のＣＤＲの少なくとも１つ、好ましくは重鎖可変領域（ＶＨ）もしくは軽鎖可変領域（ＶＬ）の３つ、さらに好ましくは６つ全てのＣＤＲを対応する位置に有し、具体的には、表２に記載の重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を重鎖可変領域のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３として、および／または、表２に記載の軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を軽鎖可変領域のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３として含有する抗体、特に、ヒト化抗体である。
【００４３】
前記（Ｉ）の抗ＣＤ１４抗体がヒト抗体の場合、体外免疫によるヒトリンパ球の活性化を利用してハイブリドーマを作製する方法、ヒト抗体ファージライブラリーを用いる方法およびヒト抗体遺伝子を組み換えた非ヒト動物、特にトランスジェニックマウス、例えば、ＫＭマウスを用いてハイブリドーマを作製する方法等が挙げられる（ＷＯ２００２／０７０６４８（特表２００５-５０４５０７）、ＷＯ２００２／０４３４７８（特表２００４-５１５２３０））。
【００４４】
ヒト抗体ファージライブラリーは、ヒトＢ細胞から調製した抗体遺伝子をファージ遺伝子に挿入することによりFab、一本鎖抗体等の抗体の活性断片をファージ表面に発現させたライブラリーである。これらのライブラリーをスクリーニングすることによっても本発明の抗体は入手され得る。これらの方法および他の方法は、当業者に周知である（Huseら, Science,246:1275-1281（1989）、WinterおよびHarris,Immunol.Today 14:243-246（1993）、Wardら, Nature 341:544-546（1989）、HarlowおよびLane (1988),前出）、Hilyardら, Protein Engineering:A practical approach（IRL Press 1992）、Borrabeck, Antibody Engineering, 第２版（Oxford University Press 1995）、Barbas, C.F.I., Burton, D.R., Scott, J.K., and Silverman, G.J. 2001. Phage display: a laboratory manual. Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor, New York, USA. 736 pp.）。該ライブラリーより、抗原を固定化した基質に対する結合活性を指標として所望の抗原結合活性を有する抗体の活性断片を発現しているファージを回収することができる。該抗体の活性断片は、更に遺伝子工学的手法により、２本の完全なＨ鎖および２本の完全なＬ鎖からなるヒト抗体分子へも変換することができる。
【００４５】
本発明第二の態様のポリヌクレオチドは、いずれの分子種のものであっても良く、核酸を包含する。すなわち、ＤＮＡおよびＲＮＡ、ならびに、ポリデオキシリボヌクレオチドおよびポリリボヌクレオチドが含まれ、本発明第一の態様の蛋白質の少なくとも一部をコードするものであれば、それらの混合型および修飾体であっても良い。本発明の第二の態様のポリヌクレオチドは、前記（Ｉ）および／または（II）を産生する細胞から公知の方法、特に遺伝子工学的手法で取得できる。具体例は実施例に記載されている。
【００４６】
本発明の第二の態様は、第一の態様の蛋白質、好ましくは融合蛋白質、具体的には、抗体を含有する融合蛋白質をコードするポリヌクレオチドであるが、抗体が本来複数のポリペプチド鎖からなる蛋白質であるため、本発明のポリヌクレオチドは、単一分子上で本発明の蛋白質をコードする場合、および、複数、例えば、２または３の分子上にコードする場合があり、それらの何れをも含む。具体例は実施例に記載されている。ここで、本発明第一の態様の蛋白質の少なくとも一部としては、例えば、抗体の重鎖、特に重鎖可変領域（ＶＨ）部分、もしくは重鎖部分と阻害物質部分、好ましくはそれらの融合蛋白質をコードするポリヌクレオチド、または、抗体の軽鎖、特に軽鎖可変領域（ＶＬ）部分もしくは軽鎖部分と阻害物質部分、好ましくはそれらの融合蛋白質をコードするポリヌクレオチドが挙げられる。好適なポリヌクレオチドの例として、配列表の配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３および２５で示されるものが挙げられる。
【００４７】
本発明第三の態様のベクターは、第二の態様のポリヌクレオチドを単一ベクター上に含有する場合、および、複数、例えば、２または３のベクター上に含有する場合があり、それらの何れをも含む。また、本発明第三の態様のベクターは、第二の態様のポリヌクレオチド以外に、ベクターの複製に必要な成分、および、第二の態様のポリヌクレオチドの発現制御に必要な成分等を含有するが、これらの成分は当業者に周知である。
第二の態様のポリヌクレオチドを組み込むベクターとしては、必ずしも限定されないが、蛋白質遺伝子等の発現に汎用され、特に抗体または抗体を含有する融合蛋白質等の遺伝子発現に適合するベクターまたは高発現用ベクターが好ましい。好適な例としては、ヒトエロンゲーションファクター（ＥＦ）１αプロモーターおよび／またはＣＭＶエンハンサーを含有するベクターが挙げられ、例えば、pEF-BOSまたは実施例で用いたベクターがある。また、通常、ＶＨ部分もしくはＶＨ部分と阻害物質部分、好ましくはそれらの融合蛋白質をコードするポリヌクレオチド、および、ＶＬ部分もしくはＶＬ部分と阻害物質部分、好ましくはそれらの融合蛋白質をコードするポリヌクレオチドを組み込んだ発現ベクターをそれぞれ作製し、宿主細胞にcotransfectするが、単一の発現ベクターに組み込んでも良い。以上については公知の材料および方法を利用し得るが、具体例は実施例に記載されている。
【００４８】
本発明第三の態様のベクターを適当な宿主細胞に公知方法に従って導入することにより、本発明第四の態様の細胞を作製し得る。そのような細胞の例としては、ハイブリドーマ、形質転換体、または本発明のポリヌクレオチドまたはベクターを導入した遺伝子組換え細胞等がある。用いる宿主細胞としては、必ずしも限定されないが、蛋白質遺伝子等の発現に汎用され、特に抗体または抗体を含有する融合蛋白質等の発現に適合する細胞が好ましい。例えば、細菌（大腸菌等）、放線菌、酵母、昆虫細胞（ＳＦ９等）、好ましくは、哺乳類細胞（ＣＯＳ-１、ＣＨＯ、ミエローマ細胞等）が挙げられる。以上については公知の材料および方法を利用し得るが、具体例は実施例に記載されている。
本発明第一の態様の蛋白質は、本発明の第二の態様のポリヌクレオチドまたは第三の態様のベクターを用いたin vitro翻訳により、または、本発明の第四の態様の細胞を適当な条件下で培養することにより生産することができる（本発明の第五の態様）。生産された蛋白質は公知の適当な精製方法を組み合わせることにより単離することができる。好適な例は実施例に記載されている。
【００４９】
本発明の第六の態様の疾患の予防および／または治療剤は、本発明第一の態様の蛋白質、本発明の第二の態様のポリヌクレオチド、本発明の第三の態様のベクターまたは本発明の第四の態様の細胞の少なくともいずれか一つを有効成分として含有する医薬組成物であり、本発明のポリヌクレオチドおよびベクターは例えば遺伝子治療に、形質転換細胞は細胞治療に応用することができる。これらは、必要に応じて、製剤学的に許容される添加剤を含有しても良い。
【００５０】
本発明の第六の態様の疾患の予防および／または治療剤の適用となる疾患もしくは病態、またはそれらにおける特定の治療指標としては、種々のものが含まれ、必ずしも限定されないが、好ましくは、ＣＤ１４の分布もしくは機能、蛋白質分解酵素の分布もしくは機能または細菌感染と関連する疾患等である。例えば、敗血症およびその関連疾患、全身性もしくは心循環疾患、感染性疾患、炎症性疾患、呼吸器疾患もしくは呼吸不全、自己免疫疾患、多臓器不全（ＭＯＤＳ）または個々の臓器の不全もしくは障害等の疾患等が挙げられる。具体的には、敗血症、重症敗血症、敗血症性ＡＲＤＳもしくは敗血症性ショック等の敗血症およびその関連疾患、ＳＩＲＳ関連疾患、エンドトキシンショック、エキソトキシンショック、出血性ショックもしくは術中・術後ショック等の各種ショック、虚血性再灌流臓器障害、虚血性脳障害、急性虚血性脳卒中、急性期脳血栓症、急性冠微小血管塞栓、ショック性血管塞栓、散在性血管内血液凝固症候群（ＤＩＣ）、心筋梗塞およびその後遺症、低血圧等の全身性もしくは心循環疾患、歯周病、急性バクテリア髄膜炎、侵襲製ブドウ球菌感染症、感染性心内膜炎、急性ウィルス脳炎もしくはＡＩＤＳ等の感染性疾患、乾癬、胃炎、消化性潰瘍、膵炎、腎炎、心筋炎、肺炎、肝炎、肝硬変、脳炎、骨関節炎、アトピー性皮膚炎、アレルギー性接触皮膚炎、アレルギー性鼻炎、逆流性食道炎もしくは硬化性脊椎炎等の炎症性疾患、急性呼吸促迫症候群（ＡＲＤＳ）、幼児性呼吸窮迫症候群（ＩＲＤＳ）、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）、肺気腫および喘息等の呼吸器疾患もしくは呼吸不全、慢性関節リウマチ、難治性大腸炎、潰瘍性大腸炎、クローン病、糸球体腎炎、ＳＬＥ、強皮症、多発性硬化症もしくはシェーグレン症候群等の自己免疫疾患、多臓器不全、臓器移植後の臓器障害もしくは拒絶反応、または、心不全、不安定狭心症、心弁膜炎、腎不全、心筋症、腎アトニー、肝不全、もしくは劇症肝炎等の個々の臓器不全が挙げられる。
【００５１】
好ましくは対象疾患として、敗血症、重症敗血症、敗血症性ＡＲＤＳもしくは敗血症性ショック、ＳＩＲＳ、エンドトキシンショックまたはＡＲＤＳ等の疾患が挙げられる。
また、これらの疾患に伴う炎症性サイトカイン、特に血中のＴＮＦ濃度の上昇に伴う症状の改善または予防に有用である。さらに、ＬＰＳが関与するグラム陰性細菌感染、ＬＴＡ若しくはペプチドグリカン等が関与するグラム陽性細菌感染、またはマイコプラズマ感染に伴う敗血症の治療または予防、すなわち、これらの疾患の症状が表れたとき若しくは進行したときの治療効果のみならず、血中にＬＰＳ、ＬＴＡもしくはマイコプラズマ等が高値である患者、特定のＣＤ１４分子種（ＷＯ０１／２２０８５およびＷＯ２００４／４４００５参照）の血中濃度が高値である患者または以上のような状況に置かれることが予想される細菌感染者における予防効果が期待できる。
【００５２】
製剤学的に許容される添加物としては、例えば、担体、賦形剤、安定剤、滑沢剤、着色剤、崩壊剤、防腐剤、等張化剤、安定化剤、分散剤、酸化防止剤、緩衝剤、保存剤、懸濁化剤、乳化剤、一般的に用いられる適当な溶媒の類（滅菌水や植物油等）、さらには生理学的に許容しえる溶解補助剤などを適宜含んでいてもよい。
また、本発明の医薬組成物は、抗生物質、ステロイド、各種サイトカイン抗体もしくは抗凝固因子等を含んでいてもよい。これらは、有効成分である本発明の蛋白質と相加効果もしくは相乗効果を示し、より有効な医薬組成物と成ることができる。
【００５３】
本発明の医薬組成物を薬剤として投与するときの投与量は、特に限定されず、患者の症状、体重、年齢や性別等を考慮して適宜決定されるが、例えば、本発明の蛋白質を有効成分とするときには、０.１ｍｇ／ｋｇ以上が好ましい。より好ましくは１〜１０ｍｇ／ｋｇの投与量である。
【００５４】
本発明の医薬組成物を薬剤として用いるときの剤形は、必ずしも限定されないが、錠剤、注射剤、散剤、坐剤、吸入剤等、特に注射剤および吸入剤等が好適である。また種々の投与経路が可能であるが、非経口投与が好ましい。非経口投与としては例えば、静脈内投与（ボーラス投与、連続点滴、間欠的点滴）、動脈内投与、皮下投与、筋肉内投与等の注射が一般的であり、吸入も好ましく、その他に、直腸内投与、経皮吸収、関節内投与、経鼻投与、経粘膜吸収等が挙げられる。また、投与時期もしくは回数は、患者の状態にも依存するが、予防投与、単回投与もしくは連続投与等が例示される。
【００５５】
本発明の第六の態様の疾患の予防および／または治療剤の適用となる疾患もしくは病態に、本発明の医薬組成物を主成分とする薬剤を使用した治療方法。
【実施例】
【００５６】
次に本発明を実施例により具体的に説明するが、本発明はこれら実施例に限定されるものではない。
（実施例１）キメラ抗体および抗体融合蛋白質の構築
１-１）キメラ抗体および抗体融合蛋白質の構築（Ｆ１０２４）
（１）材料
用いた主な材料および装置は以下のとおりである。すなわち、
プライマー：表１に記載のプライマー（SIGMA Genosys Japanにて合成）、
ＰＣＲ反応用酵素：Ex Taq（TAKARA BIO INC.）、
制限酵素：Eco RI、Bam HI、Not I、 Nhe I、Eco RV、Stu I、Bgl II等（TAKARA BIO INC.）、
ゲノムＤＮＡ：ＨｅＬａ genome（lot. N34707-1、BD Biosciences Clontech）、
ＰＣＲ装置：ＤＮＡ Engine（MJ RESEARCH, INC.）、
アガロース電気泳動ゲル：SeaKem GTG Agarose（TAKARA BIO INC.）、
５０ｘＴＡＥ（２mol／Ｌ Tris-acetate,０.０５mol／Ｌ ＥＤＴＡ）（NIPPON GENE）、
分子量マーカー（Sty I 消化λＤＮＡ断片）、
ゲルからのＤＮＡ断片抽出キットQIAEX II（QIAGEN K.K.）、
哺乳細胞用発現ベクター：pEF2cew（pEF-BOSの改良型ベクター）、
ヒトＩｇＧ４重鎖定常領域（Ｃγ４）遺伝子を有するプラスミド：pTK-2232、
ＴＡクローニング用ベクター：pT7BlueT（NOVAGEN）およびライゲーション用試薬：TaKaRa ライゲーション Kit ver.2（TAKARA BIO INC.）、
E. coli Competent cell：JM109（TAKARA BIO INC.）、
プラスミドＤＮＡおよびゲノムＤＮＡ精製キット（QIAGEN K.K.）、
シークエンス用キット：DYEnamic ET Terminator Cycle Sequencing Premix Kit lot.1767 （Amersham Biosciences）および解析装置：ABI3100 genetic analyzer （Applied Biosystems）、
トータルＲＮＡ分離試薬：TRIzol（GIBCO BRL）、
５'RACE用キット：５'RACE system for Rapid Amplification of cＤＮＡ Ends, v.2.0 （Invitrogen）、
ダルベッコＭＥＭ培地（SIGMA）、
トランスフェクション用試薬：FuGENE6（ロシュダイアグノスティックス）
等を用いた。
【００５７】
【表１】
【００５８】
（２）実験方法
用いた主な実験方法を以下に示す。
・ＰＣＲ反応
酵素付属の取り扱い説明書に従って行った。
・アガロースゲル電気泳動
まず、０.８％濃度のアガロースゲルを作製し、これを１ｘＴＡＥを満たした泳動槽に置き、ウエルにサンプル５μＬをアプライ後、１３５Ｖで１５分間泳動を行った。泳動終了後、ゲルをエチジウムブロマイドで染色し、さらにＵＶ照射することでバンドを検出した。
・ゲルからのＤＮＡ断片抽出
目的とするバンドを剃刀で切り出し、付属の取扱説明書に従い、QIAEX IIキットを用いてゲル片からＤＮＡ断片を抽出した。抽出されたＤＮＡ断片を２０μＬの滅菌水に溶解した。
【００５９】
・ライゲーション反応
抽出を終えたＤＮＡ断片１μＬとクローニング用ベクターのpT7BlueTを１μＬ、およびライゲーション kit ver.2のＩ液２μＬを混和し、室温で１５分間静置することでライゲーションを行った。
・大腸菌への形質転換
コンピテント大腸菌５０μＬを氷上で融解し、ライゲーション反応産物４μＬを加え、そのまま氷上に３０分間静置した。４２℃で４５秒熱ショックを与え、終濃度５０μｇ／ｍＬアンピシリン含有ＬＢプレート上に塗布し、３７℃で一晩インキュベートした。
・プラスミドの精製およびシークエンス反応
キットの取り扱い説明書に従って行った。
・ハイブリドーマからのトータルＲＮＡの分離と５'ＲＡＣＥ
キットの取り扱い説明書に従って行った。なお、ハイブリドーマは５×１０７個使用した。
・トランスフェクション
FuGENE6の取り扱い説明書に従って行った。すなわち、６穴プレートの場合、トランスフェクション前日にＣＯＳ-１細胞を１.５×１０5cells／ｍＬの密度で各ウェルに２ｍＬ植え込んだ。翌日、９７μＬのダルベッコＭＥＭ培地に３μＬのFuGENE6と１μgの発現プラスミドを混和し１５分以上静置した後、２ｍＬの無血清ダルベッコ-ＭＥＭ培地に滴下し、この培養液と交換することで、トランスフェクションを行った。
【００６０】
（３）ハイブリドーマ抗体遺伝子可変領域のクローニングおよび配列決定（Ｆ１０２４）
ＷＯ０２／４２３３３に記載の方法で得られたハイブリドーマＦ１０２４（１×１０７細胞）を、ＰＢＳ−（SIGMA）で洗浄後、TRIzol（GIBCO BRL）を用いてトータルＲＮＡを抽出した。次に、５μｇのトータルＲＮＡを、５'RACE system for Rapid Amplification of cＤＮＡ Ends, v.2.0 （Invitrogen）を用いて５'RACEを行い、重鎖および軽鎖可変領域をコードする遺伝子断片をそれぞれ増幅した。尚、操作手順はキット付属のマニュアルに従い、重鎖可変領域はｒＩｇＨ-ｃプライマーで逆転写反応を行った後、ターミナルデオキシヌクレオチドトランスフェラーゼで末端にdCを付加し、ｒＩｇＨ-ｃプライマーとＡＡＰプライマー（キット付属）とで１回目のＰＣＲを行った。軽鎖可変領域も同様に、ｒＩｇＫ-ｂプライマーで逆転写反応後、ｒＩｇＫ-ｂプライマーとＡＡＰプライマーとで１回目のＰＣＲを行った。つづいて、各反応産物を鋳型とした2回目のＰＣＲ反応を、重鎖可変領域はｒＩｇＨ-ｂプライマーとＡＵＡＰプライマー（キット付属）とで、軽鎖可変領域はｒＩｇＫ-ａプライマーとＡＵＡＰプライマーとで行い、それぞれ特異的に増幅されたＤＮＡ断片をアガロースゲルでの電気泳動で確認した。ＤＮＡ断片をゲルから抽出後、塩基配列を決定し、各領域のアミノ酸配列を決定した（図１および２）。なお、表２にKabatの定義に従った場合のＣＤＲ配列を示す。また、表２に示した配列は、配列番号１７３〜１７８に示す。
【００６１】
【表２】
【００６２】
（４）各種キメラ抗体融合蛋白質発現プラスミドの構築
抗原結合活性を有する可変領域がハイブリドーマ抗体由来、すなわちラット抗体由来であり、定常領域がヒト由来の抗体であるキメラ抗体を作製することにより、ヒトへの抗原性が少ない抗体を得ることが出来る。キメラ抗体は1984年のMorrisonら（Proc, Natl. Acad. Sci. USA, 81：6851, 1984）の報告以来多くのものが開発されている。
各可変領域の開始コドンの直前に、制限酵素Eco RIの認識配列を付した５'側プライマー（重鎖は１０２４Ｈ-ａ、軽鎖は１０２４Ｋ-ａ）と、各可変領域の３'側配列のアミノ酸配列を変えることなく、ヒト定常領域との連結可能な制限酵素認識部位（重鎖はNhe I認識配列、軽鎖はBsi WI認識配列）を付した３'側プライマー（重鎖はHchainEco47NheI、軽鎖はrIgK-BsiWI）を設計した。これらのプライマーを用いて、本実施例１−１）−(3)で調製した逆転写反応後の重鎖および軽鎖各サンプルを鋳型としたＰＣＲをあらためて行った。増幅されたＰＣＲ産物とpT7BlueTベクター（NOVAGEN）を混和し、TaKaRa ライゲーション Kit ver.2（TAKARA BIO INC.）を用いて室温１５分でライゲーション反応を行った。その反応液を用いてコンピテントセルE. coli（JM109、TAKARA BIO INC.）にトランスフォーメーションを行った。
【００６３】
出現したコロニーをピックアップし、Ex Taq polymerase（TAKARA BIO INC.）、Ｍ４プライマーおよびＴ７プライマーを用いて、コロニーダイレクトＰＣＲでインサートがベクターに挿入されていることを確認した。
次に、インサートが確認されたコロニーをＬＢ培地で一晩培養し、QIAGEN plasmid midi kit（QIAGEN）を用いてプラスミドを精製した（重鎖可変領域をコードする遺伝子断片をもつプラスミドをpT7-1024H、軽鎖可変領域をコードする遺伝子断片をもつプラスミドをpT7-1024Kとした。）。精製したプラスミドは、Ｍ４プライマーおよびＴ７プライマーを用いて塩基配列を確認した。
【００６４】
pT7-1024Hを制限酵素Eco RIおよびNhe Iで切断し、重鎖可変領域をコードする遺伝子断片Ａを調製した。同様に、pT7-1024Kを制限酵素Eco RIおよびBsi WIで切断し、軽鎖可変領域をコードする遺伝子断片Ｂを調製した。
【００６５】
ヒトＩｇＧ４重鎖定常領域（Ｃγ４）遺伝子を有するプラスミドpTK-2232（ＷＯ２００５／７８００を参照）を鋳型とし、プライマー対（IgG4-mとIgG4-v）でＰＣＲを行うことで、Ｃγ４の５'末端に制限酵素Nhe Iの認識配列を、３'末端に、停止コドンを除去し、代わりに制限酵素Bam HIの認識配列を有する遺伝子断片を増幅した。この断片を制限酵素Nhe IおよびBam HIで切断し、遺伝子断片Ｃを調製した。
【００６６】
pTK-2232を鋳型としたＰＣＲを行い、２種類のプライマー対（IgG4-mとIgG4-s）および（IgG4-rとIgG4-v）で各遺伝子断片をそれぞれ増幅した。これらの遺伝子断片を混合して鋳型とし、再度プライマー対（IgG4-mとIgG4-v）でＰＣＲを行うことで、重鎖間の2量体化に必要な２つのシステイン残基をグリシン残基に置換し、５'末端に制限酵素Nhe Iの認識配列を、３'末端には停止コドンの代わりに制限酵素Bam HIの認識配列を有する遺伝子断片を増幅した。この断片を制限酵素Nhe I およびBam HIで切断し、遺伝子断片Ｄを調製した。
【００６７】
ＨｅＬａゲノムＤＮＡを鋳型とし、プライマー（BsiWI-hIgKおよびIgK-e）によるＰＣＲを行い、ヒト軽鎖定常領域（Ｃκ）を増幅し、さらにこの増幅産物をpT7BlueTベクターへクローニングし、pT7-hIgKを構築した。このプラスミドから、ヒト軽鎖定常領域を切り出すことができる適当な制限酵素（Bsi WIとBam HI）を用いて、断片Ｅを調製した。
【００６８】
ヒトＵＴＩ第１ドメインおよび第２ドメイン（Ｄ１Ｄ２）を有するプラスミドpM1213を鋳型とし、プライマー対（ＵＴＩ-ａとＵＴＩ-ｃ）によるＰＣＲで、Ｄ１Ｄ２の５'末端に制限酵素Bam HIの認識配列を、３'末端は停止コドンの直後に制限酵素Not I認識配列を有する遺伝子断片を増幅した。この断片をBam HIおよびNot Iで切断し、遺伝子断片Ｆを調製した。
【００６９】
pM1213を鋳型とし、プライマー対（ＵＴＩ-bとＵＴＩ-c）によるＰＣＲで、Ｄ２の５'末端に制限酵素Bam HIの認識配列を、３'末端は停止コドンの直後に制限酵素Not I認識配列を有する遺伝子断片を増幅した。この断片をBam HIおよびNot Iで切断し、遺伝子断片Ｇを調製した。
【００７０】
ヒトＵＴＩ第２ドメイン３アミノ酸改変体｛Ｄ２(3)｝を有するプラスミドpM765（特開平６−３２１９８９参照）を鋳型とし、プライマー対（ＵＴＩ-ｂとＵＴＩ-ｃ）によるＰＣＲで、Ｄ２(3)の５'末端に制限酵素Bam HIの認識配列を、３'末端は停止コドンの直後に制限酵素Not I認識配列を有する遺伝子断片を増幅した。この断片をBam HIおよびNot Iで切断し、遺伝子断片Ｈを調製した。
【００７１】
pM1213を鋳型とし、プライマー対（ＵＴＩ-ａとＵＴＩ-ｆ）によるＰＣＲで、Ｄ１Ｄ２の５'末端に制限酵素Bam HIの認識配列を、３'末端は停止コドンを除去し、グリシン4残基からなるリンカーを付加し、さらにその直後に制限酵素Eco RV認識配列を有する遺伝子断片を増幅した。この断片をBam HIおよびEco RVで切断し、遺伝子断片Ｉを調製した。
【００７２】
pM1213を鋳型とし、プライマー対（ＵＴＩ-ｂとＵＴＩ-ｆ）によるＰＣＲで、Ｄ２の５'末端に制限酵素Bam HIの認識配列を、３'末端は停止コドンを除去し、グリシン4残基からなるリンカーを付加し、さらにその直後に制限酵素Eco RV認識配列を有する遺伝子断片を増幅した。この断片をBam HIおよびEco RVで切断し、遺伝子断片Ｊを調製した。
【００７３】
pM1213を鋳型とし、プライマー対（ＵＴＩ-ｈとＵＴＩ-ｃ）によるＰＣＲで、Ｄ１Ｄ２の５'末端にグリシン4残基からなるリンカーを付加し、さらにその直前に制限酵素Eco RVの認識配列を、３'末端は停止コドンの直後に制限酵素Not I認識配列を有する遺伝子断片を増幅した。この断片をEco RVおよびNot Iで切断し、遺伝子断片Ｋを調製した。
【００７４】
pM1213を鋳型とし、プライマー対（ＵＴＩ-ｉとＵＴＩ-ｃ）によるＰＣＲで、Ｄ２の５'末端にグリシン4残基からなるリンカーを付加し、さらにその直前に制限酵素Eco RVの認識配列を、３'末端は停止コドンの直後に制限酵素Not I認識配列を有する遺伝子断片を増幅した。この断片をEco RVおよびNot Iで切断し、遺伝子断片Ｌを調製した。
【００７５】
pM1213を鋳型とし、プライマー対（ＵＴＩ-ｈとＵＴＩ-ｇ）によるＰＣＲで、Ｄ１Ｄ２の５'末端にグリシン4残基からなるリンカーを付加し、さらにその直前に制限酵素Eco RVの認識配列を、３'末端は停止コドンを除去し、グリシン4残基からなるリンカーを付加し、さらにその直後に制限酵素Stu I認識配列を有する遺伝子断片を増幅した。この断片をpT7BlueTベクターへクローニングした後、Eco RVとBam HIで切断し、そこへ遺伝子断片Iを結合させ、Ｄ１Ｄ２Ｄ１Ｄ２配列をもつ中間体プラスミドを構築した。さらにBam HIとStu Iで切断し、遺伝子断片Ｍを調製した。
【００７６】
pM1213を鋳型とし、プライマー対（ＵＴＩ-ｉとＵＴＩ-ｇ）によるＰＣＲで、Ｄ２の５'末端にグリシン4残基からなるリンカーを付加し、さらにその直前に制限酵素Eco RVの認識配列を、３'末端は停止コドンを除去し、グリシン4残基からなるリンカーを付加し、さらにその直後に制限酵素Stu I認識配列を有する遺伝子断片を増幅した。この断片をpT7BlueTベクターへクローニングした後、Eco RVとBam HIで切断し、そこへ遺伝子断片Jを結合させ、Ｄ２Ｄ２配列をもつ中間体プラスミドを構築した。さらにBam HIとStu Iで切断し、遺伝子断片Ｎを調製した。
【００７７】
ＨｅＬａゲノムＤＮＡを鋳型とし、以下のプライマー対でＰＣＲ反応を行った。その結果、ＳＬＰＩ-ｃおよびＳＬＰＩ-ｅでＰＣＲ増幅産物Ｏ、ＳＬＰＩ-ｄおよびＳＬＰＩ-ｇでＰＣＲ増幅産物Ｐ、ＳＬＰＩ-ａおよびＳＬＰＩ-ｇでＰＣＲ増幅産物Ｒがそれぞれ得られた。
ＯとＰを混合して鋳型とし、再度プライマーＳＬＰＩ-ｃおよびＳＬＰＩ-ｇでＰＣＲ反応を行うことで、両断片が連結された増幅産物Ｑを得た。
この増幅産物ＱおよびＲを、それぞれpT7BlueTベクターにクローニングし、ヒトＳＬＰＩのＳｅｒ１−Ａｌａ１０７（ＳＬＰＩ（Ｄ１Ｄ２）と記載することがある）およびＡｒｇ５８−Ａｌａ１０７（ＳＬＰＩ（Ｄ２）と記載することがある）をコードする配列であることを確認し、pT7-ＳＬＰＩ（Ｄ１Ｄ２）およびpT7-ＳＬＰＩ（Ｄ２）とした。いずれも、ＳＬＰＩの５'側には制限酵素Bgl IIの認識配列、３'側の停止コドンの直後にはNot Iの認識配列を有するように構築した。各プラスミドをそれぞれ制限酵素Bgl IIおよびNot Iで切断し、ＳＬＰＩ（Ｄ１Ｄ２）断片SとＳＬＰＩ（Ｄ２）断片Ｔを調製した。
【００７８】
以上の遺伝子断片を、Eco RI およびNot I、あるいはEco RI およびBam HIで切断して調製した発現ベクターpEF2cewのEF1αプロモーター下流に適切な組み合わせで連結し、各発現プラスミドを構築した。表３に、各発現プラスミド名とベクターに組み込んだ遺伝子断片名をまとめて示す。なお、キメラ抗体軽鎖発現プラスミドpTK-2344はすべての重鎖に対し、共通で使用した。また、各融合蛋白質の構造ならびにヌクレオチド配列および推定アミノ酸配列を図７〜１７ならびに配列表（配列番号１〜２６）に示す。なお、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０および２４のアミノ酸配列において、それぞれアミノ酸番号１−１９はシグナルペプチド配列に対応し、配列番号２２及び２６のアミノ酸配列において、それぞれアミノ酸番号１−２０はシグナルペプチド配列に対応する。よって、実際の本発明の融合蛋白質の推定アミノ酸配列はこれらのシグナルペプチドを除いたアミノ酸配列である。
【００７９】
【表３】
【００８０】
（５）各融合蛋白質の小スケールでの発現および精製
ＣＯＳ-１細胞は１０％牛胎児血清入りのダルベッコＭＥＭ培地で継代し、トランスフェクション前日に、１.５×１０５cells／ｍＬの密度で培養容器に植え込んだ。翌日、軽鎖発現プラスミド（pTK-2344）と各重鎖発現プラスミドを１：１の重量比で混合後、トランスフェクション試薬（FuGENE6、ロシュダイアグノスティックス）と適当量混和した後に、無血清のダルベッコＭＥＭ培地に滴下し、これを培養液と交換することで、トランスフェクションを行った。５％ ＣＯ２存在下、３７℃で２〜３日間培養し、上清を回収した。精製はProsep-Aカラム（MILLIPORE）を用いて行い、ＰＢＳ（ｐＨ７.４）で透析後、２８０ｎｍの吸光度より濃度を算出した。
【００８１】
１-２）キメラ抗体および抗体融合蛋白質の構築（Ｆ１０３１）
（１）ハイブリドーマ抗体遺伝子可変領域のクローニングおよび配列決定（Ｆ１０３１）
ＣＤ１４に結合するが、ＣＤ１４阻害活性のない抗ヒトＣＤ１４抗体、Ｆ１０３１-１３-２抗体（マウスＩｇＧ２ｂ／κ）のＣＤＲ配列を以下の方法で決定した。
まず、Ｆ１０３１-１３-２発現ハイブリドーマより、TRIzolを用いてtotal ＲＮＡを調製し、SuperScript III First-Strand Synthesis System for RT-PCR（Invitrogen）を用いて一本鎖ｃＤＮＡの合成を行った。
一方、マウスＩｇＧ２ｂ重鎖の可変領域増幅用としセンスプライマー１０３１H-ａおよびｍＩｇＧ２ｂ-ｃ、アンチセンスプライマーｍＩｇＧ２ｂ-ａ、を合成し、κ鎖可変領域増幅用としてセンスプライマーＩＧＫＶ４-１-ａおよびＩｇＫ-ｄ、アンチセンスプライマーｒＩｇＫ-ａ、をそれぞれ合成した（表１参照）。
次に合成したハイブリドーマ一本鎖ｃＤＮＡを鋳型に、プライマーは重鎖（ｉ）１０３１H-ａとｍＩｇＧ２ｂ-ａ、重鎖（ii）ｍＩｇＧ２ｂ-ｃとｍＩｇＧ２ｂ-ａ、軽鎖（ｉ）ＩＧＫＶ４-１-ａとｒＩｇＫ-ａ、軽鎖（ii）ＩｇＫ-ｄとｒＩｇＫ-ａとの組み合わせでＰＣＲを行った。ＰＣＲ反応条件は反応液を９６℃で２分熱した後に、９６℃ ３０秒、５５℃ ３０秒、７２℃ ３０秒のサイクルを２５回繰り返した。
得られた産物について直接配列を決定した結果、重鎖（ｉ）（ii）、軽鎖（ｉ）（ii）共に同一の配列であった。尚、軽鎖については５'端が不完全で翻訳開始コドンが確定できなかったため、これまで報告のあるマウスκ鎖において、フレーム領域で相同性を示す配列を検索した。図３および４（配列番号１２７〜１３０）にＦ１０３１-１３-２抗体の可変領域重鎖および軽鎖配列（核酸およびアミノ酸）を示す。尚、下線はプライマー由来の配列である。
【００８２】
（２）キメラ抗体発現プラスミドの構築（Ｆ１０３１）
Ｆ１０３１-１３-２キメラ抗体発現プラスミドは実施例１−１）（Ｆ１０２４キメラ抗体発現プラスミド構築）と同様の方法で構築した。すなわち、上記１−２）（１）で得られた配列を参考に、重鎖発現プラスミド構築用プライマーとして、可変領域の開始コドン直前に制限酵素EcoRI認識配列を付加した５'側プライマー13HcS-EcoRおよび可変領域の３'側配列のアミノ酸配列を変えることなく、ヒト定常領域との連結可能な制限酵素NheI認識部位を付加した３'側プライマー13HcA-Nheを合成した。軽鎖の５'側の配列は確定していないが、相同性検索から５'端側の配列を予想し、可変領域の開始コドン直前に制限酵素EcoRI認識配列を付加した５'側プライマー13LcS-EcoRおよび可変領域の３'側配列のアミノ酸配列を変えることなく、ヒト定常領域との連結可能な制限酵素BsiWI認識部位を付加した３'側プライマー13LcA-BsiWを合成した（表１参照）。
【００８３】
次に、上記１−２）（１）で合成した１本鎖ｃＤＮＡを鋳型に、ＰＣＲを行った。反応条件は９０℃ ２分間で熱した後、（１）９４℃ ３０秒、（２）５０℃ ３０秒、（３）７２℃ １分のサイクルを３０回繰り返した。得られた重鎖構築用ＰＣＲ産物をEcoRIおよびNheIで、軽鎖構築用ＰＣＲ産物はEcoRIおよびBsiWIで消化し、それぞれ約０.４ｋｂの断片を回収した。
次に実施例１−１）で構築したＦ１０２４キメラ抗体重鎖発現プラスミドｐＴＫ-２３７０あるいは軽鎖発現プラスミドｐＴＫ-２３４４をそれぞれEcoRIおよびNheIあるいはEcoRIおよびBsiWIで消化し、それぞれ約５.７ｋｂあるいは４.８ｋｂの断片を回収した。これらに先のＰＣＲ産物由来断片をそれぞれ挿入し、定法に従いＪＭ１０９大腸菌コンピテントセルを形質転換してＦ１０３１-１３-２重鎖発現プラスミドｐＦ３１-１３ＨＵあるいは軽鎖発現プラスミドｐＦ３１-１３Ｌを得た。Ｆ１０３１-１３-２軽鎖の５'端配列については、本構築において新たに確定した配列もあるため、図５および６（配列番号１３１〜１３４）に発現プラスミドの重鎖可変領域および軽鎖可変領域配列について再度示した。尚、下線は構築用のプライマー由来の配列である。
【００８４】
（３）各種キメラ抗体融合蛋白質の発現確認
上記１−２）（２）で構築した重鎖発現プラスミドおよび軽鎖発現プラスミドをＣＯＳ-１細胞へ導入し、キメラ抗体融合蛋白質の発現を確認した。
まず、ＣＯＳ-１細胞を１０％非働化ＦＢＳ含有ＤＭＥＭ培地にて、２.０−２.４×１０５cells／wellで６ウェルプレートへ植え込み、３７℃、５％ＣＯ２条件下で一晩培養した。翌日、FuGENE６ ６μＬと重鎖発現プラスミド１μｇ＋軽鎖発現プラスミド１μｇを混合し、FuGENE６添付プロトコールに従い、ＣＯＳ-１細胞へ滴下した。尚、ＦＢＳ由来イムノグロブリンの混入を防ぐために、FuGENE／plasmid混合液を細胞に滴下する前に以下の操作を行った。ＣＯＳ-１細胞を一晩培養後、細胞の上清を除去し、生産培地（Hybridoma-ＳＦＭ（Invitrogen）もしくはCellgro Complete Serum Free Medium（Mediatech））で２回洗浄を行った。その後、２ｍＬ／wellの生産培地をプレートに添加し、FuGENE／plasmid混合液を細胞に滴下した。３７℃、５％ＣＯ２で３〜４日間培養を続けた後、上清を回収し、上清中に含まれるキメラ抗体融合蛋白質の量を実施例２に記載するＥＩＡ法と同様の操作により確認した。但し、検出に用いたＨＲＰ標識抗体として、ペルオキシダーゼ標識ＵＴＩ抗体の代わりに、ＨＲＰ標識抗ヒトκ軽鎖抗体（DAKO）を用いた。その結果、キメラ抗体は１０−２０μｇ／ｍＬ程度の発現であった。なお、本実験で調製した培養上清を、実施例１−３）(1)のＩＬ-６産生抑制活性実験に用いた。
【００８５】
１−３）活性確認試験
（１）ＩＬ-６産生抑制活性確認試験
実施例１−１）および１−２）で調製した抗体融合蛋白質の抗体機能ドメインの活性について調べるために、以下の実験を行った。
ヒト膠腫由来細胞株U-373 MGを、２％非働化ＦＢＳを含むＭＥＭ培地（SIGMA）にて９６-well plateに、１×１０４cells／wellで植え込み、５％ＣＯ２、３７℃で一晩培養を行った。翌日、以下の溶液をそれぞれ調製した。
１）０.２％ヒト血清アルブミン（SIGMA）を含む生理食塩水（大塚製薬）（以下０.２％ＨＳＡ／生理食塩水と表記）
２）０.２％ヒト血清アルブミン（SIGMA）を含むＭＥＭ培地（以下０.２％ＨＳＡ／ＭＥＭと表記）
３）０.２％ＨＳＡ／生理食塩水と０.２％ＨＳＡ／ＭＥＭを１：１の割合で混合した溶液（以下０.１％ＨＳＡ／1／2ＭＥＭと表記）
４）４％ヒト血清を含むＭＥＭ培地（以下４％ＨＳ／ＭＥＭと表記）
５）ＬＰＳ（E.Coli 0111:Ｂ４、SIGMA）を生理食塩水で１ｍｇ／ｍＬに調製した溶液を１０分間ソニケーションした後に、０.２％ＨＳＡ／ＭＥＭにて２００ｎｇ／ｍＬに希釈した溶液（以下２００ｎｇ／ｍＬ ＬＰＳ Ｂ４と表記）
６）４％ＨＳ／ＭＥＭと２００ｎｇ／ｍＬ ＬＰＳ Ｂ４を９：１の割合で混合した溶液（以下２×（ＨＳ＋ＬＰＳ）と表記）
【００８６】
被験試料を０.２％ＨＳＡ／生理食塩水で目的濃度の２倍濃度に希釈し、サンプルを調製した。一晩培養を行ったＵ-３７３ＭＧ細胞の培養上清を捨て、０.１％ＨＳＡ／1／2ＭＥＭで二度洗浄し、上記サンプルと２×（ＨＳ+ＬＰＳ）とを等量混合した液を１００μＬ／wellずつ添加し、さらに５％ＣＯ２、３７℃で約１８時間培養を行った。その後、培養上清中のＩＬ-６量をヒトＩＬ-６検出キット（Eli-PAIR hIL-6；Invitrogen社）にて定量した。図１８ないし図２０に典型的な試験結果を示す。
その結果、ＣＤ１４阻害活性を示す抗体の場合、キメラ抗体融合蛋白質においても抗体活性は維持されており、ＣＤ１４阻害活性を示さないＦ１０３１-１３-２抗体の場合、キメラ抗体融合蛋白質にしても抑制活性を示さなかった。なお、図２０中、試料未添加のＩＬ-６産生量を１００％（ＩＬ-６％Control）として表記した。
【００８７】
（２）酵素阻害活性確認試験
実施例１−１）および１−２）で調製した抗体融合蛋白質の酵素阻害機能ドメインの活性を確認するためにトリプシン阻害活性を以下のように測定した。
被験試料を０.１mol／ＬNaCl／5mmol／Ｌ CaCl2／20mmol／Ｌ Tris-HCl（ｐＨ７.４）（以下、希釈液）にて終濃度の１０倍濃度となるように希釈調製した。これと併行してヒト膵由来トリプシン（Athens Research and Technology）を０.１w／v％ＢＳＡ／１mmol／Ｌ ＨＣＬにて１μｇ／ｍＬ調製し、また合成基質S2222（テストチーム、第一化学薬品）を水にて４mmol／Ｌに希釈調製した。
各試薬類を調製後、９６ウエルマイクロタイタープレート（Nunc）に希釈液７０μＬ、１μｇ／ｍＬヒトトリプシン溶液を１０μＬ、および被験試料溶液１０μＬを添加し、３７℃にて３分間インキュベーションした。次いで、合成基質S2222溶液を各ウエルに１０μＬ添加して、さらに３７℃にて６０分間インキュベーションした。その後、２０v／v％酢酸水溶液にて反応を停止させ、反応液の４０５ｎｍにおける吸光度を測定した。図２１に典型的な試験結果を示す。その結果、キメラ抗体融合蛋白質においても酵素阻害活性はほぼ維持されていた。
【００８８】
（実施例２）抗体融合蛋白質の大量調製
（１）Ｆ１０２４Ｓ-Ｄ２(3)およびＦ１０３１-１３Ｓ-Ｄ２(3)の大量生産
Ｆ１０２４Ｓ-Ｄ２(3)を大量生産するためにＣＯＳ-１細胞を利用した一過性発現の系を用いた。すなわち、CellsTACK-１０ Chamber（Corning）に１０％非働化ＦＢＳおよび１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７.０−７.６）を含むＤＭＥＭ培地１７００ｍＬを添加し、これに２１×１０６のＣＯＳ-１細胞を植え込んだ。CellsTACK-１０ Chamber内を５％ＣＯ２を含む混合ガスに置換した後、密栓し、３７℃でインキュベーションした。
４日後に以下の手順にてトランスフェクションを行った。
まず、ＤＭＥＭ培地６３.６ｍＬにFuGENE６トランスフェクション試薬（ロシュ・ダイアグノスティックス株式会社）２.１２ｍＬを添加・混合した。５分後に実施例１で調製した重鎖をコードするプラスミドｐＴＫ２３７０および軽鎖をコードするプラスミドpTK2344を各５３０μｇずつ添加し、混合後、１５分間室温で静置した。一方、CellsTACK-１０ Chamberの培地を１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７.０−７.６）を含むHybridoma-ＳＦＭ（インビトロジェン株式会社）（以下、生産培地）１３００ｍＬに交換し、調製したトランスフェクション試薬・プラスミド混合溶液を添加した。３７℃で３日間インキュベーションした後、生産培地を回収した。さらに、CellsTACK-１０ Chamberに新しい生産培地１３００ｍLを添加し、４日後に再度生産培地を回収した。
また、Ｆ１０３１-１３Ｓ-Ｄ２(3)についても、実施例１で調製した重鎖をコードするプラスミドｐＦ３１-１３ＨＵおよび軽鎖をコードするプラスミドＦ３１-１３Ｌを用いて同様に生産した。
【００８９】
（２）Ｆ１０２４Ｓ-Ｄ２(3)およびＦ１０３１-１３Ｓ-Ｄ２(3)の測定系（ＥＩＡ）
サンドイッチＥＩＡ法によりＦ１０２４Ｓ-Ｄ２(3)濃度を測定した。
固相化蛋白質として、実施例６と同様の方法で調製した、ヒトＣＤ１４の全長３５６アミノ酸からなる組換ヒトＣＤ１４、および、標識抗体として、特開２００２−１４１０４に記載された手順に従って作製したペルオキシダーゼ標識ＵＴＩ抗体を用いたサンドイッチＥＩＡ系を作製した。
標準品として実施例１にて調製したＦ１０２４Ｓ-Ｄ２(3)を用いた。すなわち、組換ヒトＣＤ１４をＰＢＳ（ｐＨ７.４）で４μｇ／ｍＬに希釈し、NUNC-Immuno plate Maxisorp（NUNC）の各ウェルに５０μＬ添加した。４℃で一晩反応後、０.０５％Tween２０／０.９％塩化ナトリウム溶液で３回洗浄し、２％StabilGuard（SurModics, Inc.）を含むＰＢＳ（ｐＨ７.４）を各ウェルに１００μＬ添加し、ブロッキングした。次に０.１％ＢＳＡを含むＰＢＳ（ｐＨ７.４）を希釈液として測定試料および標準品の希釈検体を調製した。同時に１０％ウサギ血清を含むＰＢＳ（ｐＨ７.４）で希釈したペルオキシダーゼ標識ＵＴＩ抗体を調製した。各ウェルに、希釈したペルオキシダーゼ標識抗体２５μＬおよび希釈検体２５μＬを添加し、３７℃で１時間反応させた。反応終了後、０.０５％Tween２０／０.９％塩化ナトリウム溶液で３回洗浄し、テトラメチルベンジジン溶液（BioFX）を各ウェルに５０μＬずつ添加した。室温で約２０分反応後、１ｍｏｌ／Ｌ塩酸溶液５０μＬで反応停止し、プレート分光光度計で４５０ｎｍの吸光度を測定した。
また、Ｆ１０３１-１３Ｓ-Ｄ２(3)についても同様に濃度を測定した。ただし、標準品として濃度既知のＦ１０３１-１３Ｓ-Ｄ２(3)を用いた。
【００９０】
（３）Ｆ１０２４Ｓ-Ｄ２(3)大量精製
以下の操作は特に記載のない限り、４℃にて実施した。
実施例２（１）で生産されたＣＯＳ培養上清を１μｍのカプセルカートリッジフィルター（アドバンテック東洋）に、０.２２μｍのフロロダインII-DFLPフィルター（日本ポール）を接続し、培養上清中の不溶物を除去した。このろ過液を予めＰＢＳ（シグマ）にて平衡化したProSep-ｖＡカラム（日本ミリポア株式会社）に供し、非吸着成分をＰＢＳにて洗い流した。更に非特異的に吸着している成分を１０×ＰＢＳ（シグマ）にて洗い流した後、２５ｍＭ Glycine-ＨＣｌ（ｐＨ２.５）にて溶出し、Ｆ１０２４Ｓ-Ｄ２(3)を回収した。得られた溶出画分はMacIlvaineバッファーを加えｐＨ５に調製した。溶出液に認められた沈殿を遠心分離により除去後、遠心上清液を分子量カットオフ１０，０００の透析チューブ（SPECTRUM社）を用い生理食塩液に対して透析し、得られた透析液を精製標品とした。
【００９１】
（４）Ｆ１０３１-１３Ｓ-Ｄ２(3)の大量精製
以下の操作は特に記載のない限り、４℃にて実施した。
実施例２（１）で生産されたＣＯＳ培養上清を１μｍのカプセルカートリッジフィルター（アドバンテック東洋）に、０.２２μｍのフロロダインII-DFLPフィルター（日本ポール）を接続し、培養上清中の不溶物を除去した。このろ過液を予めＰＢＳ（シグマ）にて平衡化したProSep-ｖＡカラムに供し、非吸着成分をＰＢＳにて洗い流した。更に非特異的に吸着している成分を１Ｍ塩化ナトリウム溶液にて洗い流した後、１００ｍＭ Glycine-ＨＣｌ（ｐＨ２.７）にて溶出し、Ｆ１０３１-１３Ｓ-Ｄ２(3)を回収した。得られた溶出画分は１Ｍトリス塩酸ｐＨ８.０を加え中和した。これを分子量カットオフ３,５００の透析チューブ（SPECTRUM社）を用い生理食塩液に対して透析した。さらにＹＭ１０限外ろ過膜（日本ミリポア株式会社）を用いて濃縮し、得られた濃縮液を精製標品とした。
【００９２】
（実施例３）効力評価（in vitro）
３−１）抗体活性の確認
（１）ヒト血管内皮細胞のＬＰＳ誘導ＩＬ-６産生に対する阻害活性の確認
ヒト臍帯静脈血管内皮細胞（HUVEC、三光純薬社）を０.０５％トリプシン、０.０２％ ＥＤＴＡを含むＰＢＳ（−）で剥離後、ヒト血清（TENNESSEE BLOOD SERVICE社）を１０％含むＲＰＭＩ-１６４０培地（SIGMA社）にて懸濁し、９６ウェルプレートに２×１０４細胞／wellで播種し、３７℃、５％ＣＯ２の条件下で一晩培養した。培養後、ＬＰＳ（WE.coli 055：Ｂ５、DIFCO社）を終濃度が１０ｎｇ／ｍＬとなるように添加すると同時に、Ｆ１０２４Ｓ-Ｄ２(3)を終濃度が０.０３、０.１、０.３、１、３、１０μｇ／ｍＬとなるように添加した。３７℃、５％ＣＯ２の条件下で６時間培養した後、培養上清中のＩＬ-６を、添付のプロトコールに従い、ヒトＩＬ-６ ＥＩＡキット（DIACLONE Research社）で測定した。Ｆ１０２４Ｓ-Ｄ２(3)のＩＬ-６産生阻害のＩＣ５０値は、０.３８μｇ／ｍＬであった。この結果より、Ｆ１０２４Ｓ-Ｄ２(3)がグラム陰性菌の菌体成分であるＬＰＳにより誘導される、ヒト血管内皮細胞のサイトカイン産生を抑制することが示された。
Ｆ１０３１-１３Ｓ-Ｄ２(3)、Ｆ１０２４Ｄ-ＳＬＰＩ（Ｄ１Ｄ２）、Ｆ１０２４Ｄ-ＳＬＰＩ（Ｄ２）、Ｆ１０２４Ｓ-ＳＬＰＩ（Ｄ１Ｄ２）またはＦ１０２４Ｓ-ＳＬＰＩ（Ｄ２）の阻害活性を同様のアッセイ系を用いて評価する。
【００９３】
（２）ヒト血管内皮細胞のＬＰＳ誘導Ｅ−Selectin発現に対する阻害活性の確認
ヒト臍帯静脈血管内皮細胞（HUVEC、三光純薬社）を実施例３−１）（１）に示す方法で播種し、培養後、ＬＰＳ（WE.coli 055：Ｂ５、DIFCO社）を終濃度が１０ｎｇ／ｍＬとなるように添加すると同時に、Ｆ１０２４Ｓ-Ｄ２(3)を終濃度が０.０３、０.１、０.３、１、３、１０μｇ／ｍＬとなるように添加した。３７℃、５％ＣＯ２の条件下で６時間培養した後に、培養液を除去し、ＰＢＳ（−）で２回洗浄した。ドライヤーで乾燥させた後に、２％パラホルムアルデヒドを含有するＰＢＳ（−）を１００μＬ／wellで添加した。室温で２０分間インキュベーションした後に、ＰＢＳ（−）で３回洗浄した。１％ヒト血清を含有するＲＰＭＩ１６４０で希釈したビオチン化抗ヒトＥ-Selectin抗体（コスモ・バイオ社）を１００μＬ／wellで添加し、室温で６０分間インキュベーションした。その後、ＰＢＳ（−）で３回洗浄し、ペルオキシダーゼ標識したストレプトアビジン溶液（DAKO Cytomation社）を１００μＬ／wellで添加し、室温で３０分間インキュベーションした。洗浄後、発色基質（ＴＭＢ）を１００μＬ／wellで添加し、室温で３０分間反応させた後に、２Ｎ硫酸を１００μＬ／wellで加えて反応を停止した。４５０ｎｍと６５０ｎｍの波長での吸光度を測定し、ΔＯＤ（４５０ｎｍ−６５０ｎｍ）をＥ-Selectinの発現量とした。Ｆ１０２４Ｓ-Ｄ２(3)のＥ-Selectin発現阻害のＩＣ５０値は、０.４３μｇ／ｍＬであった。この結果より、Ｆ１０２４Ｓ-Ｄ２(3)がＬＰＳにより誘導されるヒト血管内皮細胞の接着分子発現を抑制することが示された。
Ｆ１０３１-１３Ｓ-Ｄ２(3)およびＦ１０２４Ｄ-ＳＬＰＩ（Ｄ１Ｄ２）、Ｆ１０２４Ｄ-ＳＬＰＩ（Ｄ２）、Ｆ１０２４Ｓ-ＳＬＰＩ（Ｄ１Ｄ２）またはＦ１０２４Ｓ-ＳＬＰＩ（Ｄ２）の阻害活性を同様のアッセイ系を用いて評価する。
【００９４】
（３）ヒト末梢血単核球のＬＰＳ誘導ＴＮＦ-α産生に対する阻害活性の確認
正常ヒト末梢血単核球（ｈＰＢＭＣ、Bio Whittaker社）を、１０％ヒト血清および２５ｍＭ ＨＥＰＥＳ（SIGMA社）を含有するＲＰＭＩ１６４０で懸濁し、９６ウェルプレートに２.５×１０５細胞／wellで播種した。Ｆ１０２４Ｓ-Ｄ２(3)を終濃度が０.１、０.３、１、３、１０、３０μｇ／ｍＬとなるように添加し、室温で２０分間静置した後に、ＬＰＳ（WE.coli 055：Ｂ５、DIFCO社）を終濃度が０.１ｎｇ／ｍＬとなるように添加した。３７℃、５％ＣＯ２の条件下で６時間培養した後、培養上清中のＴＮＦ-αを、添付のプロトコールに従い、ヒトＴＮＦ-α ＥＩＡキット（DIACLONE Research社）で測定した。
Ｆ１０２４Ｓ-Ｄ２(3)のＴＮＦ-α産生阻害のＩＣ５０値は、０.５８μｇ／ｍＬであった。この結果より、Ｆ１０２４Ｓ-Ｄ２(3)がＬＰＳにより誘導されるヒト白血球のサイトカイン産生を抑制することが示された。
Ｆ１０３１-１３Ｓ-Ｄ２(3)およびＦ１０２４Ｄ-ＳＬＰＩ（Ｄ１Ｄ２）、Ｆ１０２４Ｄ-ＳＬＰＩ（Ｄ２）、Ｆ１０２４Ｓ-ＳＬＰＩ（Ｄ１Ｄ２）またはＦ１０２４Ｓ-ＳＬＰＩ（Ｄ２）の阻害活性を同様のアッセイ系を用いて評価する。
【００９５】
（４）ヒト末梢血単核球のＬＰＳ誘導Procoagulant Activity（ＰＣＡ）促進に対する阻害活性の確認
正常ヒト末梢血単核球（ｈＰＢＭＣ、Bio Whittaker社）を実施例３−１）（３）に示す方法で播種し、Ｆ１０２４Ｓ-Ｄ２(3)を終濃度が０.１、０.３、１、３、１０、３０μｇ／ｍＬとなるように添加し、室温で２０分間静置した後に、ＬＰＳ（WE.coli 055：Ｂ５、DIFCO社）を終濃度が０.１ｎｇ／ｍＬとなるように添加した。３７℃、５％ＣＯ２の条件下で６時間培養し、細胞懸濁液のＰＣＡを正常ヒト血漿（DADE BEHRING社）を用いて測定した。すなわち、０.１５Ｍ ＮａＣｌおよび０.１％ＢＳＡを含有する５０ｍＭ Tris-ＨＣｌ（ｐＨ７.４）溶液で２.５倍希釈した後、２０秒間超音波破砕（SHIMAZU社）し、このサンプルを血液凝固測定装置（ＡＭＡＸ ＣＳ１９０、エム・シー・メディカル社）にセットした。血液凝固測定装置にてサンプルを２０μＬ分取し、２５ｍＭ ＣａＣｌ２を２０μＬ添加して、３７℃で３分間インキュベートした。正常ヒト血漿を９０μＬ添加して凝固反応を開始し、凝固時間を測定した。凝固時間から算出したＦ１０２４Ｓ-Ｄ２(3)のＰＣＡ阻害のＩＣ５０値は、２０.８６μｇ／ｍＬであった。この結果より、Ｆ１０２４Ｓ-Ｄ２(3)がＬＰＳに誘導されるヒト白血球のＰＣＡ促進を抑制することが示された。
Ｆ１０３１-１３Ｓ-Ｄ２(3)およびＦ１０２４Ｄ-ＳＬＰＩ（Ｄ１Ｄ２）、Ｆ１０２４Ｄ-ＳＬＰＩ（Ｄ２）、Ｆ１０２４Ｓ-ＳＬＰＩ（Ｄ１Ｄ２）またはＦ１０２４Ｓ-ＳＬＰＩ（Ｄ２）の阻害活性を同様のアッセイ系を用いて評価する。
【００９６】
（５）ＬＰＳによるウサギ全血のＴＮＦ-α産生に対する阻害活性の確認
雄性ウサギ（ニュージーランドホワイト種、３.４ｋｇ、北山ラベス）の耳動脈よりヘパリン（持田製薬）を１０unit／ｍＬ添加して採血した全血をマイクロチューブに移し、Ｆ１０２４Ｓ-Ｄ２(3)を終濃度が０.３、１、３、１０、３０μｇ／ｍＬとなるように添加した。室温で３０分間静置した後に、ＬＰＳ（WE.coli 055：Ｂ５、DIFCO社）を終濃度が０.１ｎｇ／ｍＬとなるように添加した。
３７℃で６時間インキュベーションした後、４℃、８０００ｒｐｍ（TOMY社）の条件で１０分間遠心して血漿分離し、血漿中のＴＮＦ-αを抗ウサギＴＮＦ-α抗体を用いたサンドイッチＥＬＩＳＡで測定した。すなわち、１％ＢＳＡを含有するＰＢＳ（−）で希釈した血漿１００μＬを抗ウサギＴＮＦ-α抗体（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社）を４μｇ／ｍＬで固相化したプレートに移し、室温で２時間インキュベーションした。０.０５％Tween２０を含むＰＢＳ（−）４００μＬ／wellで３回洗浄し、ビオチン化抗ウサギＴＮＦ-α抗体溶液（２μｇ／ｍＬ、ＢＤ Biosciences社）を１００μＬ／wellで添加し、室温で１時間インキュベートした。洗浄後、ペルオキシダーゼ標識したストレプトアビジン溶液（Invitrogen社）を１００μＬ／wellで添加し、室温で３０分間インキュベーションを行った。洗浄後、発色基質（ＴＭＢ）を１００μＬ／wellで添加し、室温で３０分間反応させた後に、２Ｎ硫酸を１００μＬ／wellで加えて反応を停止した。４５０ｎｍと６５０ｎｍの波長での吸光度を測定し、サンプル中のＴＮＦ-α産生量を算出した。Ｆ１０２４Ｓ-Ｄ２(3)のＴＮＦ-α産生阻害のＩＣ５０値は、０.８３μｇ／ｍＬであった。この結果より、Ｆ１０２４Ｓ-Ｄ２(3)がＬＰＳにより誘導されるウサギ全血のサイトカイン産生を抑制することが示された。
Ｆ１０３１-１３Ｓ-Ｄ２(3)およびＦ１０２４Ｄ-ＳＬＰＩ（Ｄ１Ｄ２）、Ｆ１０２４Ｄ-ＳＬＰＩ（Ｄ２）、Ｆ１０２４Ｓ-ＳＬＰＩ（Ｄ１Ｄ２）またはＦ１０２４Ｓ-ＳＬＰＩ（Ｄ２）の阻害活性を同様のアッセイ系を用いて評価する。
【００９７】
３−２）酵素阻害活性の確認
Ｆ１０２４Ｓ-Ｄ２(3)およびＦ１０２４Ｄ-Ｄ２(3)の酵素阻害機能ドメインの活性を確認するために、各種酵素に対する阻害活性を以下のように測定した。また、各測定系において、活性測定用サンプルの蛋白質濃度は、ウシγグロブリン（日本バイオ・ラッド ラボラトリーズ株式会社）をスタンダードとしてプロテインアッセイ染色液（日本バイオ・ラッド ラボラトリーズ株式会社）を用いて測定し、抗体融合蛋白質の推定分子量よりモル濃度に換算した。試験結果を図２２ないし２５に示す。各図の縦軸は各種酵素の残存活性、横軸は活性測定用サンプルの反応液中の濃度を示す。
【００９８】
（１）FactorＸａ阻害活性
Ｆ１０２４Ｓ-Ｄ２(3)およびＦ１０２４Ｄ-Ｄ２(3)を０.１４Ｍ塩化ナトリウム／５ｍＭ塩化カルシウム／２０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７.４）と１０％ＢＳＡを９９：１の比率で混合した希釈液（以下、希釈液）で段階希釈し、阻害活性測定用サンプルとした。これと併行して、Human FactorＸａ（Enzyme Research Laboratories）を希釈液にて０.１Ｕ／ｍＬとなるよう調製し、FactorＸａ溶液とした。また、合成基質Ｓ-２２２２（第一化学薬品株式会社）を希釈液にて２ｍＭとなるよう調製し、Ｓ-２２２２溶液とした。各試薬類を調製後、９６ウェルマイクロタイタープレート（Nunc）に、阻害活性測定用サンプル１０μＬ、希釈液５０μＬおよびFactorＸａ溶液２０μＬを添加し、３７℃で５分間インキュベーションした。次いで、Ｓ-２２２２溶液を各ウェルに２０μＬ添加して、さらに３７℃で３０分間インキュベーションした。その後、各ウェルに２０％酢酸溶液５０μＬを添加して反応を停止し、反応液の波長４０５ｎｍにおける吸光度を測定した。
【００９９】
なお、コントロールとして、希釈液６０μＬにFactorＸａ溶液２０μＬを混合し、３７℃で５分間インキュベーションした後、Ｓ-２２２２溶液２０μＬを加え、３７℃で３０分間インキュベーション後、２０％酢酸溶液５０μＬを加えたものを使用した。図２２に示す結果より、ＦＸａ阻害活性を保持していることが確認された。
Ｆ１０３１-１３Ｓ-Ｄ２(3)の阻害活性を同様のアッセイ系を用いて評価する。
【０１００】
（２）FactorXIａ阻害活性
Ｆ１０２４Ｓ-Ｄ２(3)およびＦ１０２４Ｄ-Ｄ２(3)を希釈液（既出）で段階希釈し、阻害活性測定用サンプルとした。これと併行して、Human FactorXIａ（American Diagnostica Inc.）を希釈液にて７５０ｎｇ／ｍＬとなるよう調製し、FactorXIａ溶液とした。また、合成基質Ｓ-２３６６（第一化学薬品株式会社）を水にて５ｍＭとなるよう調製し、Ｓ-２３６６溶液とした。
各試薬類を調製後、９６ウェルマイクロタイタープレート（Nunc）に、阻害活性測定用サンプル１０μＬ、希釈液６０μＬおよびFactorXIａ溶液１０μＬを添加し、３７℃で５分間インキュベーションした。次いで、Ｓ-２３６６溶液を各ウェルに２０μＬ添加して、さらに３７℃で３０分間インキュベーションした。その後、各ウェルに２０％酢酸溶液１００μＬを加えて反応を停止させ、反応液の波長４０５ｎｍにおける吸光度を測定した。
【０１０１】
なお、コントロールとして、希釈液７０μＬにFactorXIａ溶液１０μＬを混合し、３７℃で５分間インキュベーションした後、Ｓ-２３６６溶液２０μＬを加え、３７℃で３０分間インキュベーション後、２０％酢酸溶液１００μＬを加えたものを使用した。
図２３に示す結果より、Ｄ２(3)がＦXIａ阻害活性を有することが判明した。
Ｆ１０３１-１３Ｓ-Ｄ２(3)の阻害活性を同様のアッセイ系を用いて評価する。
【０１０２】
（３）エラスターゼ阻害活性
Ｆ１０２４Ｓ-Ｄ２(3)およびＦ１０２４Ｄ-Ｄ２(3)を希釈液（既出）で段階希釈し、阻害活性測定用サンプルとした。これと併行して、５００ｍＭ塩化ナトリウム／５０ｍＭ酢酸ナトリウム（ｐＨ５.５）に溶解して凍結保存していたElastase，Human Neutrophil（Athens Research ＆ Technology）を希釈液にて２０μｇ／ｍＬとなるよう調製し、エラスターゼ溶液とした。また、合成基質Ｓ-２４８４（第一化学薬品株式会社）はジメチルスルホキシドに溶解して冷蔵保存し、使用時に水にて２ｍＭとなるよう調製し、Ｓ-２４８４溶液とした。
各試薬類を調製後、９６ウェルマイクロタイタープレート（Nunc）に、阻害活性測定用サンプル１０μＬ、希釈液７０μＬおよびエラスターゼ溶液１０μＬを添加し、３７℃で３分間インキュベーションした。次いで、Ｓ-２４８４溶液を各ウェルに１０μＬ添加して、さらに３７℃で正確に１０分間インキュベーションした。その後、各ウェルに２０％酢酸溶液５０μＬを加えて反応を停止させ、反応液の波長４０５ｎｍにおける吸光度を測定した。
【０１０３】
なお、コントロールとして、希釈液８０μＬにエラスターゼ溶液１０μＬを混合し、３７℃で３分間インキュベーションした後、Ｓ-２４８４溶液１０μＬを加え、３７℃で正確に１０分間インキュベーション後、２０％酢酸溶液５０μＬを加えたものを使用した。図２４に示す結果より、エラスターゼ阻害活性を保持していることが確認された。
Ｆ１０３１-１３Ｓ-Ｄ２(3)およびＦ１０２４Ｄ-ＳＬＰＩ（Ｄ１Ｄ２）、Ｆ１０２４Ｄ-ＳＬＰＩ（Ｄ２）、Ｆ１０２４Ｓ-ＳＬＰＩ（Ｄ１Ｄ２）またはＦ１０２４Ｓ-ＳＬＰＩ（Ｄ２）のの融合蛋白質の阻害活性を同様のアッセイ系を用いて評価する。
【０１０４】
（４）血漿カリクレイン
Ｆ１０２４Ｓ-Ｄ２(3)およびＦ１０２４Ｄ-Ｄ２(3)を希釈液（既出）で段階希釈し、阻害活性測定用サンプルとした。これと併行して、Kallicrein from Human plasma（SIGMA-Aldrich Co.）を希釈液にて２０ｍＵ／ｍＬとなるよう調製し、血漿カリクレイン溶液とした。また、合成基質Ｓ-２３０２（第一化学薬品株式会社）を水にて４ｍＭとなるよう調製し、Ｓ-２３０２溶液とした。
各試薬類を調製後、９６ウェルマイクロタイタープレート（Nunc）に、阻害活性測定用サンプル１０μＬ、希釈液７０μＬおよび血漿カリクレイン溶液１０μＬを添加し、３７℃で３分間インキュベーションした。次いで、Ｓ-２３０２溶液を各ウェルに１０μＬ添加して、さらに３７℃で３０分間インキュベーションした。その後、各ウェルに２０％酢酸溶液５０μＬを加えて反応を停止させ、反応液の波長４０５ｎｍにおける吸光度を測定した。
【０１０５】
なお、コントロールとして、希釈液８０μＬに血漿カリクレイン溶液１０μＬを混合し、３７℃で３分間インキュベーションした後、Ｓ-２３０２溶液１０μＬを加え、３７℃で３０分間インキュベーション後、２０％酢酸溶液５０μＬを加えたものを使用した。図２５に示す。
Ｆ１０３１-１３Ｓ-Ｄ２(3)の阻害活性を同様のアッセイ系を用いて評価する。
【０１０６】
３−３）凝固阻害作用の確認
（１）ヒトおよびウサギにおける活性化部分トロンボプラスチン時間（ＡＰＴＴ）延長作用の確認
正常ヒト血漿は、デイドサイトロールレベル１（ＤＡＤＥ ＢＥＨＲＩＮＧ社）を使用した。ウサギ血漿は、雄性ウサギ（ニュージーランドホワイト種、２.６〜２.７ｋｇ、北山ラベス）の耳動脈より１／１０容の３.８％クエン酸ナトリウム（血沈用チトラート、岩城製薬）を含むシリンジを用いて採血し、４℃、３０００ｒｐｍ（０５ＰＲ-２２、日立社）の条件で１０分間遠心することにより取得した。
ヒトあるいはウサギ血漿１１３μＬに、Ｆ１０２４Ｓ-Ｄ２(3)）溶液２０μＬを終濃度が０、１.５６、３.１３、６.２５、１２.５、２５、５０、１００μg／ｍＬとなるように添加し、血液凝固測定装置（ＡＭＡＸ ＣＳ１９０、エム・シー・メディカル社）にセットした。血液凝固測定装置にて混合液から５０μＬを分取し、ＡＰＴＴ測定用試薬（ＤＡＤＥ BEHRING社）５０μＬを加え、２分間インキュベーションした後に、２５ｍＭ ＣａＣｌ２を５０μＬ添加して、凝固時間を測定した。その結果、Ｆ１０２４Ｓ-Ｄ２(3)は、濃度に依存してヒトおよびウサギＡＰＴＴを延長し、ヒトおよびウサギのＡＰＴＴ１.５倍延長濃度は、それぞれ９.０６μｇ／ｍＬおよび４０.９６μｇ／ｍＬであった。
Ｆ１０３１-１３Ｓ-Ｄ２(3)のＡＰＴＴ延長を同様のアッセイ系を用いて評価する。
【０１０７】
（実施例４）in vivoにおける有効性の評価
４−１）ＬＰＳ負荷ウサギ敗血症モデルにおける融合蛋白質の生存率改善効果
ＬＰＳ負荷ウサギ敗血症致死モデルを作製し、融合蛋白質の後投与での生存率改善を検討した。
ＬＰＳ負荷ウサギ敗血症モデルを、Schimkeらの方法（Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 95:13875, 1998）に準じ、ニュージーランドホワイト種（１.８−２.６ｋｇ、北山ラベス）にＬＰＳ（Salmonella Minnesota Re595、SIGMA社）を１５μｇ／ｋｇで０、５および２４時間に耳静脈内投与して作製した。Ｆ１０２４Ｓ-Ｄ２(3)を１ｍｇ／ｋｇの用量で２、８および２３時間に耳介静脈内投与した。対照群には融合蛋白質の替わりにヒト免疫グロブリンを投与した。４８時間まで生死を観察し、カプランマイヤー生存曲線を描いた。その結果、Ｆ１０２４Ｓ-Ｄ２(3)投与により、対照群に比べて生存率が改善された（図２６）。
同試験系において、Ｆ１０２４Ｄ-ＳＬＰＩ（Ｄ１Ｄ２）、Ｆ１０２４Ｄ-ＳＬＰＩ（Ｄ２）、Ｆ１０２４Ｓ-ＳＬＰＩ（Ｄ１Ｄ２）またはＦ１０２４Ｓ-ＳＬＰＩ（Ｄ２）の投与も生存率改善作用を示す。
【０１０８】
４−２）ＬＰＳ負荷ウサギ敗血症モデルにおける融合蛋白質の炎症および凝固パラメーター改善効果
ＬＰＳ負荷ウサギ敗血症モデルを作製し、融合蛋白質の後投与での炎症および凝固パラメーターへの影響を検討した。
ＬＰＳ負荷ウサギ敗血症モデルは、Schimkeらの方法（Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 95:13875, 1998）に準じ、ニュージーランドホワイト種（１.８−２.６ｋｇ、北山ラベス）にＬＰＳ（Salmonella Minnesota Re595、SIGMA社）を１０μｇ／ｋｇで０、５および２４時間に耳静脈内投与して作製した。Ｆ１０２４Ｓ-Ｄ２(3)を０.３、１および３ｍｇ／ｋｇの用量で２、８および２３時間に耳介静脈内投与した。対照群には融合蛋白質の替わりにヒト免疫グロブリンの３ｍｇ／ｋｇを投与した。
【０１０９】
ＬＰＳ投与前、ならびに投与１.５、２５、２６および２８時間後に耳介動脈採血（クエン酸加血）し、炎症パラメーターおよび凝固パラメーターを測定した。
炎症パラメーターは白血球数および血漿中ＴＮＦ−濃度、凝固パラメーターは血小板数および血漿中アンチトロンビンIII活性とした。
血球数はSysmex Ｆ-８２０（シスメックス株式会社）を用いて計数した。ＴＮＦ-α濃度はPurified Goat Anti-rabbit ＴＮＦ polyclonal Antibody（ＢＤ Biosciences）およびBiotinylated Mouse Anti-rabbit ＴＮＦ-α monoclonal Antibody（ＢＤ Biosciences）によるサンドイッチＥＬＩＳＡ法にて測定した。
アンチトロンビンIII活性はテストチームＡＴIII・２キット（第一化学薬品株式会社）を用いて測定した。
【０１１０】
なお，血漿中ＴＮＦ−α濃度はサンドイッチＥＬＩＳＡの検出感度である０.４ｎｇ／ｍＬ以上および未満をそれぞれ陽性および陰性とした。その結果、Ｆ１０２４Ｓ-Ｄ２(3)投与群は対照群と比較して、用量依存的な白血球数の減少（図２７）、血漿中ＴＮＦ-α濃度の上昇（表４）、血小板数の減少（図２８）およびアンチトロンビンIII活性の減少（図２９）を改善した。以上の結果より、Ｆ１０２４Ｓ-Ｄ２(3)による炎症および凝固パラメーターの改善が明らかとなった。
同試験系においてＦ１０３１-１３Ｓ-Ｄ２(3)投与群は対照群と比較して、白血球数の減少、血漿中ＴＮＦ-α濃度の上昇、血小板数の現象およびアンチトロンビンIII活性の減少に対して改善作用を示す。
【０１１１】
【表４】
【０１１２】
４-３）ＬＰＳ負荷ウサギ敗血症モデルにおける融合蛋白質の血圧低下改善効果
ＬＰＳ負荷ウサギ敗血症モデルを作製し、融合蛋白質の後投与での血圧低下改善効果を検討した。
ＬＰＳ負荷ウサギ敗血症モデルは、Schimkeらの方法（Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 95:13875, 1998）に準じ、ニュージーランドホワイト種（１.８-２.６ｋｇ、北山ラベス）にＬＰＳ（Salmonella Minnesota Re595、SIGMA社）を５μｇ／ｋｇで０および５時間に耳静脈内投与して作製した。Ｆ１０２４Ｓ-Ｄ２(3)は１ｍｇ／ｋｇの用量でＬＰＳ初回投与後２時間に耳介静脈内投与した。対照群には融合蛋白質の替わりにヒト免疫グロブリンの１ｍｇ／ｋｇを投与した。
ＬＰＳ投与前、ならびに投与４、６および８時間後に頸動脈に挿入したカテーテルを血圧トランスデューサー（DT-XX、日本BDメディカルシステムズ）に接続して平均動脈血圧を測定した。その結果、Ｆ１０２４Ｓ-Ｄ２(3)投与群は対照群と比較して血圧低下が改善された（図３０）。
同試験系においてＦ１０３１-１３Ｓ-Ｄ２(3)投与群は対照群と比較して血圧低下を改善することが確認される。
【０１１３】
（実施例５）抗体融合蛋白質の安定生産株の樹立
５−１）Ｆ１０２４Ｓ-Ｄ２(3)およびＦ１０２４Ｄ-Ｄ２(3)生産株用発現プラスミドの構築
Ｆ１０２４Ｓ-Ｄ２(3)およびＦ１０２４Ｄ-Ｄ２(3)を生産する安定生産株の樹立に用いる発現プラスミドは以下の方法で構築した。
実施例１で構築したＦ１０２４Ｓ-Ｄ２(3)重鎖発現プラスミドｐＴＫ-２３７０あるいはＦ１０２４Ｄ-Ｄ２(3)重鎖発現プラスミドｐＴＫ-２３６８をそれぞれEcoRIおよびＫｐｎＩで消化し、約１.７ｋｂの断片を回収した。また、マウスＤＨＦＲ発現ユニット、ＥＦ１αプロモーターを持つ発現プラスミドｐＭ１１０３（ＷＯ９７／４２３１９参照）を、同様にEcoRIおよびＫｐｎＩで消化し、約７.９ｋｂの断片を回収した。それぞれの重鎖発現プラスミドの消化断片と、ｐＭ１１０３消化断片をライゲーションした後、定法に従いＪＭ１０９コンピテントセルを形質転換することで、生産株作製用Ｆ１０２４Ｓ-Ｄ２(3)重鎖発現プラスミドｐＥＦＤ２３７０あるいはＦ１０２４Ｄ-Ｄ２(3)重鎖発現プラスミドｐＥＦＤ２３６８を得た。一方、軽鎖発現プラスミドはＦ１０２４Ｓ-Ｄ２(3)、Ｆ１０２４Ｄ-Ｄ２(3)で共通であり、以下の方法で構築した。一過性用発現プラスミドｐＴＫ-２３４４をＢａｍＨＩで消化後、末端を平滑化し、さらにEcoRIで消化することにより、０.７ｋｂの断片を回収した。また、ｐＭ１１０３をＫｐｎＩで消化後、末端を平滑化した後に、EcoRI消化して約７.９ｋｂの断片を回収した。ｐＴＫ-２３４４消化断片とｐＭ１１０３消化断片をライゲーションした後、定法に従いＪＭ１０９コンピテントセルを形質転換することで、生産株作製用軽鎖発現プラスミドｐＥＦＤ２３４４を得た。
【０１１４】
５−２）Ｆ１０２４Ｓ-Ｄ２(3)およびＦ１０２４Ｄ-Ｄ２(3)を生産する形質転換株の樹立
ＤＨＦＲ遺伝子欠損ＣＨＯ細胞に実施例５−１）で構築した重鎖および軽鎖発現プラスミドをco-transfectionし、キメラ抗体融合蛋白質産生形質転換ＣＨＯを樹立した。すなわち、ＨＴ media Supplement（５０×）Hybri-Max（SIGMA；終濃度１×で使用）および２００ｍＭ Ｌ-Glutamine（SIGMA；終濃度４ｍＭで使用）を含むEX-CELL 325 PF CHO（ＪＲＨ Bioscience）にて馴化培養したＣＨＯ ＤＸＢ１１をtransfection当日に遠心後、８×１０６cells／１５０Rouxの濃度でフラスコに植え込んだ。FuGENE６（ロッシュダイアグノティクス）１２５μＬを用いて、重鎖発現プラスミド１２.５μｇと軽鎖発現プラスミド１２.５μｇ（すなわち、ｐＥＦＤ２３７０＋ｐＥＦＤ２３４４あるいはｐＥＦＤ２３６８＋ｐＥＦＤ２３４４）をFuGENE６添付プロトコールに準じ調製し、先のＣＨＯ ＤＸＢ１１へco-transfectionした。５％ＣＯ２で３７℃、２日間培養した後に、細胞を回収し、ＨＴ不含４ｍＭ Ｌ-Glutamine含有EX-CELL 325 PF CHO培地（以下ＥＸ-ＣＥＬＬ（ＨＴ−）と記載）で一度、ＰＢＳ−で一度洗浄し、ＥＸ-ＣＥＬＬ（ＨＴ−）に再度懸濁した。次に３,０００〜４８,０００cells／wellで９６ウェルプレートに細胞を蒔き直し、５％ＣＯ２、３７℃で培養を続け、３日あるいは４日毎に培地の半量を新しいＥＸ-ＣＥＬＬ（ＨＴ−）に交換した。約１ヶ月間培養を続けた後、コロニーが発生したウェル内の細胞を新しいプレートに移し、培養上清中のキメラ抗体量を実施例２に記載のＥＩＡ方で測定した。上清中にキメラ抗体の発現が確認された細胞をキメラ抗体融合蛋白質産生形質転換株として得た。
【０１１５】
５−３）Methotrexateを用いた遺伝子増幅
実施例５−２）で得られたキメラ抗体融合蛋白質発現形質転換ＣＨＯ株を、Methotrexate（以下ＭＴＸと表記）を含むＥＸ-ＣＥＬＬ（ＨＴ−）培地で選択培養することにより、遺伝子増幅作業を行い目的のキメラ抗体融合蛋白質の生産量が上昇しているクローンの選択を行った。
【０１１６】
（１）ＣＨＯ-Ｆ１０２４ＳＣ９３ｔ３Ｌ１の樹立
上記５−２）で得られたＦ１０２４Ｓ-Ｄ２(3)産生形質転換株を１００ｎＭ ＭＴＸ含有ＥＸ-ＣＥＬＬ（ＨＴ−）培地に懸濁し、９６ウェルプレートに巻き込んだ。３日あるいは４日毎に培地の半量を新しい１００ｎＭ ＭＴＸ含有ＥＸ-ＣＥＬＬ（ＨＴ−）に交換し、コロニーが生じるまで５％ＣＯ２、３７℃で培養を続けた。得られたコロニーの発現量をＥＩＡ法で確認し、生産量の増加しているクローンを選択し、引き続き３００ｎＭ ＭＴＸ含有ＥＸ-ＣＥＬＬ（ＨＴ−）培地にて懸濁し、９６ウェルプレートに巻き込み選択培養を行った。その後、１００ｎＭ ＭＴＸの選択培養と同様の操作を行い、生産量が約２０倍上昇した形質転換株を得ることができた。尚、ＭＴＸの濃度を３〜１０倍段階的に上げた培地で選択培養を繰り返すことで、さらに生産量が増加するクローンを得ることができる。
【０１１７】
（２）ＣＨＯ-Ｆ１０２４ＤＣ７８ｕ１の樹立
上記５−２）で得られたＦ１０２４Ｄ-Ｄ２(3)産生形質転換株を実施例５−２）と同様の方法で処理し高生産株を得た。ＭＴＸ選択培養は１回目が１００ｎＭの濃度で、２回目は１０００ｎＭの濃度で行った。その結果、生産量がＥＩＡ値で約６０μｇ／ｍＬのクローンを得ることができた。
【０１１８】
（実施例６）Ｆ１０２４抗体の結合に重要な配列の解析
６−１）可溶型ヒトＣＤ１４アミノ酸置換体発現プラスミド構築
Ｆ１０２４抗体の認識領域を解析するため、表５に記載した可溶型ヒトＣＤ１４アミノ酸置換体３１種をそれぞれ作製した。尚、可溶型ＣＤ１４分子のＮ末端より２６３番目のＡｓｎをＧｌｎに置換した１アミノ酸置換体を「Ｎ２６３Ｑ」と記載し、他の１アミノ酸置換体も同様に記載した。但し、２９４番目のＰｒｏおよび２９６番目のＰｒｏの両方をＡｌａに置換した２アミノ酸置換体は「Ｐ２９４／２９６Ａ」と記載した。これらの置換体発現プラスミドは以下の方法で構築した。
【０１１９】
まず、ＷＯ０２／４２３３３またはＵＳ２００４／００９２７１２に記載のアミノ酸置換体ポリペプチド発現プラスミドの構築と同様の方法でｓＣＤ１４（１−３０７）アミノ酸置換改変体発現プラスミドの構築を行った。例えば、Ｐ２９４Ｈ、Ｐ２９４／２９６Ａ、Ｑ２９５ＡあるいはＰ２９６Ｈの置換を導入したｓＣＤ１４（１−３０７）アミノ酸置換改変体発現プラスミドの構築には、アミノ置換配列をコードする、表６に記載したプライマーセットを設計し、ＰＣＲに用いた。なお、アミノ酸置換部分をコードするコドンは太字（下線）で示した（表６）。
【０１２０】
次にリコンビナントＰＣＲ法を用いて、アミノ酸置換（コドン変異）導入ＤＮＡ断片を調製し、可溶型ヒトＣＤ１４アミノ酸置換体発現プラスミドを構築した。具体的には、例えばＰ２９４Ｈ、Ｐ２９４／２９６Ａ、Ｑ２９５ＡあるいはＰ２９６Ｈ発現プラスミドの構築は以下の方法で行った。センスプライマーＳ１（５'−ＧＣＧ ＧＣＡ ＧＴＡ ＴＧＣ ＴＧＡ ＣＡＣ ＧＧ−３'）、センスプライマーＳ２（５'−ＧＡＴ ＡＡＣ ＣＴＧ ＡＣＡ ＣＴＧ ＧＡＣ ＧＧＧ ＡＡＴ ＣＣＣ ＴＴＣ−３'）、センスプライマーＳ３（５'−ＧＣＣ ＡＴＣ ＣＡＧ ＡＡＴ ＣＴＡ ＧＣＧ ＣＴ−３'）およびアンチセンスプライマーＡ１（５'− ＧＡＡ ＧＧＧ ＡＴＴ ＣＣＣ ＧＴＣ ＣＡＧ ＴＧＴ ＣＡＧ ＧＴＴ ＡＴＣ−３'）、アンチセンスプライマーＡ２（５'−ＡＴＴ ＡＧＣ ＣＡＧ ＡＡＧ ＴＣＡ ＧＡＴ ＧＣＴ Ｃ−３'）、アンチセンスプライマーＡ３（５'−ＧＧＧ ＣＡＴ ＴＧＧ ＣＣＡ ＣＡＣ ＣＡＧ Ｃ−３'）を合成し、先に得られた各ｓＣＤ１４（１−３０７）アミノ酸置換改変体発現プラスミドを鋳型として、センスプライマーＳ１とＡ１でＰＣＲを行った。増幅産物については電気泳動により、分離精製した（ＰＣＲ産物Ａ）。また、ｐＣＡＧ３５６を鋳型にセンスプライマーＳ２とＡ２でＰＣＲを行い、増幅産物を電気泳動により、分離精製した（ＰＣＲ産物Ｂ）。さらにＰＣＲ産物ＡとＰＣＲ産物Ｂの混合物を鋳型に、センスプライマーＳ３とＡ３でＰＣＲを行い、ＰＣＲ産物を電気泳動により、分離精製した（ＰＣＲ産物Ｃ）。次に、ＰＣＲ産物ＣをＰｖｕIIおよびＫｐｎＩで消化し、電気泳動により、約０.２ｋｂの断片を分離回収した。一方、ｐＣＡＧ３５６を同様にＰｖｕIIおよびＫｐｎＩで消化し、約５.８ｋｂの断片を電気泳動により回収し、先に得られた約０.２ｋｂの断片をライゲーションした。定法に従い、大腸菌ＸＬ１-Ｂｌｕｅ（STRATAGENE）を形質転換し、目的の発現プラスミドを得た。尚、ｐＣＡＧ３５６はｐＣＡＧＧＳ（GENE、Vol.15（1989）pp269-277）にＷＯ０２／４２３３３に記載のｓＣＤ１４発現プラスミドｐＭ１６５６由来のＣＤ１４遺伝子（ＧＰＩアンカーリングサイトに変異を導入）を挿入したプラスミドである。
【０１２１】
【表５】
【０１２２】
【表６】
【０１２３】
６−２）可溶型ヒトＣＤ１４アミノ酸置換体の発現
上記６−１）で作製した各発現プラスミドを下記の方法でＣＯＳ-１細胞に導入した。すなわち、FuGENE６（ロシュ・ダイアグノスティックス社）５０μＬを上記プラスミドＤＮＡ各１２.５μｇと添付プロトコールに従い混合し、１５０ｃｍ3フラスコにセミコンフルエントに増殖したＣＯＳ-１細胞に添加した。引き続き、５％ＣＯ２、３７℃の条件下で３〜４日間培養行い、上清中にヒトＣＤ１４アミノ酸置換体を発現させた。発現の有無の確認はＷＯ０２／４２３３３に記載のＣＤ１４抗体を用いたＥＩＡ法にて行った。その結果、表５に記載の置換体の内、Ｎ２６３Ｑ、Ｌ２７６Ａ、Ｌ２８３Ａ、Ｎ２８８ＡおよびＬ２９０Ａ以外の全ての発現が確認できた。
【０１２４】
６−３）可溶型ヒトＣＤ１４アミノ酸置換体の精製
可溶型ヒトＣＤ１４アミノ酸置換体を以下の方法で精製した。上記６−２）で得られた培養上清を、抗ヒトＣＤ１４抗体（３Ｃ１０）を結合したアフィニティー精製用カラム（ＮＨＳ-activated Sepharose４ Fast Flow；アマシャム バイオサイエンス）に供して選択的に吸着させ、１０ｍＭ ＨＣｌにて溶出した。得られた溶出画分は、直ちに１０×ＰＢＳ−（SIGMA）を終濃度２×になるように加え、中和した。その後、生理食塩水に対して透析し、得られた透析液を精製標品とした。
【０１２５】
６−４）Ｆ１０２４抗体に対する競合実験
各可溶型ヒトＣＤ１４アミノ酸置換体のＦ１０２４抗体に対する反応性を確認するために、以下の競合実験を行った。まず、可溶型ＣＤ１４分子（３５６（ＣＨＯ）；調製方法は下記６−５）に記載）をＰＢＳ−にて４μｇ／ｍＬに希釈し、９６ウェルプレート（Ｆ８ MaxiSorp；NUNC）に５０μＬ／wellで添加し、４℃で一晩静置した。その後、０.０５％Tween２０を含むＰＢＳ−で３回洗浄し、２％StabilGuard（SurModics, Inc.）を含むＰＢＳ−を各ウェルに２００μＬ／well添加し、３７℃で３０分インキュベーションした後に、4℃で保存した。一方、実施例６−３）で精製した各可溶型ヒトＣＤ１４アミノ酸置換体を０.１％ＢＳＡ含有ＰＢＳ−で２〜０.０２μｇ／ｍＬに希釈した。また、ＨＲＰ標識Ｆ１０２４抗体を０.１％ＢＳＡ含有ＰＢＳ−で２μｇ／ｍＬに希釈し、先のヒトＣＤ１４アミノ酸置換体と等量（２５μＬ＋２５μＬ）混合した。次に可溶型ＣＤ１４固相化プレートのwellから液を除去し、ＣＤ１４アミノ酸置換体／ＨＲＰ標識Ｆ１０２４混合液を５０μＬ／well添加し、３７℃で２時間インキュベーションした。０.０５％Tween２０含有ＰＢＳ−で５回洗浄後、発色基質としてＴＭＢ溶液（BioFX）を各ウェルに５０μＬ／wellずつ添加した。室温で５分間反応後、１Ｍ 塩酸溶液５０μＬ／wellで反応を停止し、プレート分光光度計で４５０ｎｍの吸光度を測定した。
【０１２６】
アミノ酸置換体未添加時の吸光度を１００％として、結果を図３１に示す。なお、図中の３５６（ＣＨＯ）は、固相化に用いた可溶型ＣＤ１４分子を添加した場合の吸光度推移を示す。
その結果、多くのアミノ酸置換体は添加濃度依存的に吸光度が低下しており、３５６（ＣＨＯ）と競合して、Ｆ１０２４抗体に結合しているのが確認されたが、Ｐ２９４Ｈ、Ｐ２９４／２９６Ａ、Ｑ２９５ＡおよびＰ２９６Ｈでは、添加濃度に関わらず、吸光度の低下が確認されず、Ｆ１０２４抗体への結合が起きていないと判断した（図３１）。すなわち、ＣＤ１４の２９４、２９５、２９６番目のＰｒｏ、Ｇｌｎ、ＰｒｏがＦ１０２４抗体の結合に重要な領域であることが明らかになった。
【０１２７】
６−５）可溶型ヒトＣＤ１４分子（３５６（ＣＨＯ））の調製
ＣＨＯ細胞を用いて可溶型ヒトＣＤ１４分子（３５６（ＣＨＯ））を以下の方法で調製した。
（１）発現プラスミドの構築
ＷＯ０２／４２３３３に記載のｐＭ１６５６をHindIIIで消化し、ＤＮＡ Blunting Kit（タカラバイオ）を用いて、末端を平滑化した。次にXbaＩで消化を行い、電気泳動により、約１.４ｋｂの断片を分離回収した。また、マウスＤＨＦＲ発現ユニット、ＥＦ１αプロモーターを持つ発現プラスミドpM1103をNotＩで消化し、ＤＮＡ Blunting Kit（タカラバイオ）を用いて、末端を平滑化した。次にXbaＩで消化を行い、電気泳動により、約８.０ｋｂの断片を分離回収した。この約８.０ｋｂの断片にｐＭ１６５６由来の約１.４ｋｂ断片を挿入ライゲーションし、大腸菌ＪＭ１０９を形質転換することで、３５６（ＣＨＯ）発現プラスミドを得ることができた。
【０１２８】
（２）３５６（ＣＨＯ）発現形質転換株の樹立
ＤＨＦＲ遺伝子欠損ＣＨＯ細胞にこの発現プラスミドを導入し、３５６（ＣＨＯ）を発現する形質転換株を樹立した。すなわち、すなわちFuGENE６（ロシュ・ダイアグノスティックス）５０μＬを上記プラスミドＤＮＡ１２.５μｇと添付プロトコールに従い混合し、１５０ｃｍ２フラスコにセミコンフルエントに増殖したＣＨＯ ＤＸＢ１１細胞（増殖培地は１０％非働化ＦＢＳ含有Ham's Ｆ-１２培地（Invitrogen）を使用）に添加し、５％ＣＯ２で３７℃、一晩培養した。翌日、細胞をトリプシンで剥離回収し、１０％非働化透析ＦＢＳ含有α-ＭＥＭ（リボヌクレオシド・デオキシリボヌクレオシド不含）（Invitrogen）培地（以下、選択培地と記載）にて、９６ウェルプレートに細胞を蒔き直した。５％ＣＯ２、３７℃で培養を続け、３日あるいは４日毎に培地の半量を新しい選択培地に交換した。３〜４週間培養を続けた後、コロニーが発生したウェル内の細胞を新しいプレートに移し、培養上清中の可溶型ＣＤ１４産生量をＷＯ０２／４２３３３に記載のＣＤ１４抗体を用いたＥＩＡ法にて行った。発現量の高いクローンＮｏ.Ｐ３を可溶型ＣＤ１４発現株として樹立した。
【０１２９】
（３）Methotrexate（ＭＴＸ）を用いた遺伝子増幅
３５６（ＣＨＯ）発現量を増加させるために、ＭＴＸを含む選択培地でＰ３クローンを選択培養し、遺伝子増幅により３５６（ＣＨＯ）の生産量を増加させた。すなわち、実施例６−５）（２）で得られたＰ３クローンを、１５ｎＭのＭＴＸを含む選択培地に懸濁し、１０ｃｍ培養dishに巻き込んだ。３日あるいは４日毎に培地を新しい１５ｎＭ ＭＴＸ含有選択培地に交換し、コロニーが生じるまで５％ＣＯ２、３７℃で培養を続けた。得られたコロニーをプレートに植え継ぎ、上清中の３５６（ＣＨＯ）発現量をＥＩＡ法で確認し、発現量の増加しているクローンＰ３-５４を得た。
【０１３０】
（４）３５６（ＣＨＯ）の生産および精製
上記６−５）（３）で得られたＰ３-５４クローンを選択培地で培養し、その上清中に発現している３５６（ＣＨＯ）を実施例６−３）と同様の方法で精製した。
【０１３１】
（実施例７） 抗体融合蛋白質（Ｆ１０２４Ｓ−Ｄ２）のＵＴＩ第２ドメインの改変
７−１）Ｆ１０２４Ｓ−Ｄ２のＵＴＩ第２ドメインの改変体の作製
ＵＴＩドメインの１５番目のアルギニンをアラニンに置換（Ｒ１５Ａと表記）した場合を例にとると、先ず、変異を導入したい部分およびその近傍１０アミノ酸前後をコードするプライマー（表７）を設計し、合成を行った。
【０１３２】
【表７】
【０１３３】
次に、ｐＴＫ−２３５５を鋳型として、プライマー対（ＩｇＧ４−ｗ,Ｄ２−Ｒ１５Ａ−ｓ）および（ｐＥＦ２ｃｅ−２７,Ｄ２−Ｒ１５Ａ−ａ）でそれぞれＰＣＲを行い、得られた増幅産物を混合し、プライマー対（ＩｇＧ４−ｗ,ｐＥＦ２ｃｅ−２７）（表８）で再度ＰＣＲを行った。
この増幅産物を制限酵素ＢａｍＨＩおよびＮｏｔＩで切断後、アガロースゲル電気泳動し、その断片を抽出した後に、予め同様にＢａｍＨＩおよびＮｏｔＩで切断しておいたｐＴＫ−２３５５のベクター部分とＴ４ＤＮＡリガーゼで連結することにより、Ｒ１５Ａ変異を導入したＦ１０２４Ｓ−Ｄ２改変体重鎖を発現可能なプラスミド（ｐＴＫ−２７３０）を構築することができた。このプラスミドをＣＯＳ−１細胞に、軽鎖発現プラスミド（ｐＴＫ−２３４４）とコトランスフェクションさせることで、培養上清中にＦ１０２４Ｓ−Ｄ２（Ｒ１５Ａ）改変体が発現されるのを確認し、Ｐｒｏｓｅｐ−Ａカラムで発現産物の精製を行った。
同様の方法を用いることで、表９に示す８０種類のＦ１０２４Ｓ−Ｄ２のＵＴＩ第２ドメイン改変体を作製し、ＣＤ１４抗原に対し、結合能を保持していることを確認した。また、表９に示す各改変体のＵＴＩ第２ドメインのアミノ酸配列は、図３２〜図３５に示す。
【０１３４】
【表８】
【０１３５】
【表９】
【表１０】
【０１３６】
７−２）Ｆ１０２４Ｓ−Ｄ２改変体のエラスターゼ阻害活性
実施例３−２）の（３）と同様の方法により、上記で作製した８０種類のＦ１０２４Ｓ−Ｄ２改変体及びＦ１０２４−Ｄ２（３）のエラスターゼ阻害活性を測定した。ただし、Ｓ−２４８４溶液添加後の３７℃インキュベーションは５分間とした。その結果、以下の発現プラスミド由来融合蛋白質（Ｆ１０２４Ｓ−Ｄ２改変体）はＦ１０２４Ｓ−Ｄ２（３）と同等のエラスターゼ阻害活性を示すことが確認された。
ｐＴＫ−２７３０（Ｒ１５Ａ）、ｐＴＫ−２７３７（Ｒ１５Ｉ）、ｐＴＫ−２７３９(Ｒ１５Ｌ)、ｐＴＫ−２７４０(Ｒ１５Ｍ)、ｐＴＫ−２７４５(Ｒ１５Ｔ)、ｐＴＫ−２７４６(Ｒ１５Ｖ)、ｐＴＫ−２８６６(Ｒ１１Ｓ／Ｒ１５Ｔ／Ｑ１９Ａ／Ｙ４６Ｄ)、ｐＴＫ−２８６７(Ｒ１１Ｓ／Ｒ１５Ｔ／Ｑ１９Ｃ／Ｙ４６Ｄ)、ｐＴＫ−２８６８(Ｒ１１Ｓ／Ｒ１５Ｔ／Ｑ１９Ｄ／Ｙ４６Ｄ)、ｐＴＫ−２８６９(Ｒ１１Ｓ／Ｒ１５Ｔ／Ｑ１９Ｅ／Ｙ４６Ｄ)、ｐＴＫ−２８７０(Ｒ１１Ｓ／Ｒ１５Ｔ／Ｑ１９Ｆ／Ｙ４６Ｄ)、ｐＴＫ−２８７１(Ｒ１１Ｓ／Ｒ１５Ｔ／Ｑ１９Ｇ／Ｙ４６Ｄ)、ｐＴＫ−２８７２(Ｒ１１Ｓ／Ｒ１５Ｔ／Ｑ１９Ｈ／Ｙ４６Ｄ)、ｐＴＫ−２８７３(Ｒ１１Ｓ／Ｒ１５Ｔ／Ｑ１９Ｉ／Ｙ４６Ｄ)、ｐＴＫ−２８７４(Ｒ１１Ｓ／Ｒ１５Ｔ／Ｑ１９Ｌ／Ｙ４６Ｄ)、ｐＴＫ−２８７５(Ｒ１１Ｓ／Ｒ１５Ｔ／Ｑ１９Ｍ／Ｙ４６Ｄ)、ｐＴＫ−２８７６(Ｒ１１Ｓ／Ｒ１５Ｔ／Ｑ１９Ｎ／Ｙ４６Ｄ)、ｐＴＫ−２８７７(Ｒ１１Ｓ／Ｒ１５Ｔ／Ｑ１９Ｐ／Ｙ４６Ｄ)、ｐＴＫ−２８７８(Ｒ１１Ｓ／Ｒ１５Ｔ／Ｙ４６Ｄ)、ｐＴＫ−２８７９(Ｒ１１Ｓ／Ｒ１５Ｔ／Ｑ１９Ｒ／Ｙ４６Ｄ)、ｐＴＫ−２８８０(Ｒ１１Ｓ／Ｒ１５Ｔ／Ｑ１９Ｓ／Ｙ４６Ｄ)、ｐＴＫ−２８８１(Ｒ１１Ｓ／Ｒ１５Ｔ／Ｑ１９Ｔ／Ｙ４６Ｄ)、ｐＴＫ−２８８２(Ｒ１１Ｓ／Ｒ１５Ｔ／Ｑ１９Ｖ／Ｙ４６Ｄ)、ｐＴＫ−２８８３(Ｒ１１Ｓ／Ｒ１５Ｔ／Ｑ１９Ｗ／Ｙ４６Ｄ)、ｐＴＫ−２８８４(Ｒ１１Ｓ／Ｒ１５Ｔ／Ｑ１９Ｙ／Ｙ４６Ｄ)、ｐＴＫ−２８８９(Ｒ１１Ｓ／Ｒ１５Ｔ／Ｆ１７Ａ／Ｙ４６Ｄ)、ｐＴＫ−２８９０(Ｒ１１Ｓ／Ｒ１５Ｔ／Ｆ１７Ｃ／Ｙ４６Ｄ)、ｐＴＫ−２８９１(Ｒ１１Ｓ／Ｒ１５Ｔ／Ｆ１７Ｄ／Ｙ４６Ｄ)、ｐＴＫ−２８９２(Ｒ１１Ｓ／Ｒ１５Ｔ／Ｆ１７Ｅ／Ｙ４６Ｄ)、ｐＴＫ−２９３２(Ｒ１１Ａ／Ｒ１５Ｔ／Ｙ４６Ｄ)、ｐＴＫ−２８９３(Ｒ１１Ｓ／Ｒ１５Ｔ／Ｆ１７Ｇ／Ｙ４６Ｄ)、ｐＴＫ−２９３３(Ｒ１１Ｃ／Ｒ１５Ｔ／Ｙ４６Ｄ)、ｐＴＫ−２８９５(Ｒ１１Ｓ／Ｒ１５Ｔ／Ｆ１７Ｈ／Ｙ４６Ｄ)、ｐＴＫ−２９３４(Ｒ１１Ｄ／Ｒ１５Ｔ／Ｙ４６Ｄ)、ｐＴＫ−２８９６(Ｒ１１Ｓ／Ｒ１５Ｔ／Ｆ１７Ｉ／Ｙ４６Ｄ)、ｐＴＫ−２９３５(Ｒ１１Ｅ／Ｒ１５Ｔ／Ｙ４６Ｄ)、ｐＴＫ−２８９７(Ｒ１１Ｓ／Ｒ１５Ｔ／Ｆ１７Ｌ／Ｙ４６Ｄ)、ｐＴＫ−２９３６(Ｒ１１Ｆ／Ｒ１５Ｔ／Ｙ４６Ｄ)、ｐＴＫ−２８９８(Ｒ１１Ｓ／Ｒ１５Ｔ／Ｆ１７Ｍ／Ｙ４６Ｄ)、ｐＴＫ−２９３７(Ｒ１１Ｇ／Ｒ１５Ｔ／Ｙ４６Ｄ)、ｐＴＫ−２８９９(Ｒ１１Ｓ／Ｒ１５Ｔ／Ｆ１７Ｎ／Ｙ４６Ｄ)、ｐＴＫ−２９３８(Ｒ１１Ｈ／Ｒ１５Ｔ／Ｙ４６Ｄ)、ｐＴＫ−２９００(Ｒ１１Ｓ／Ｒ１５Ｔ／Ｆ１７Ｐ／Ｙ４６Ｄ)、ｐＴＫ−２９３９(Ｒ１１Ｉ／Ｒ１５Ｔ／Ｙ４６Ｄ)、ｐＴＫ−２９０１(Ｒ１１Ｓ／Ｒ１５Ｔ／Ｆ１７Ｑ／Ｙ４６Ｄ)、ｐＴＫ−２９４０(Ｒ１１Ｋ／Ｒ１５Ｔ／Ｙ４６Ｄ)、ｐＴＫ−２９０２(Ｒ１１Ｓ／Ｒ１５Ｔ／Ｆ１７Ｒ／Ｙ４６Ｄ)、ｐＴＫ−２９４１(Ｒ１１Ｌ／Ｒ１５Ｔ／Ｙ４６Ｄ)、ｐＴＫ−２９０３(Ｒ１１Ｓ／Ｒ１５Ｔ／Ｆ１７Ｓ／Ｙ４６Ｄ)、ｐＴＫ−２９４２(Ｒ１１Ｍ／Ｒ１５Ｔ／Ｙ４６Ｄ)、ｐＴＫ−２９０４(Ｒ１１Ｓ／Ｒ１５Ｔ／Ｆ１７Ｔ／Ｙ４６Ｄ)、ｐＴＫ−２９４３(Ｒ１１Ｎ／Ｒ１５Ｔ／Ｙ４６Ｄ)、ｐＴＫ−２９０５(Ｒ１１Ｓ／Ｒ１５Ｔ／Ｆ１７Ｖ／Ｙ４６Ｄ)、ｐＴＫ−２９４４(Ｒ１１Ｐ／Ｒ１５Ｔ／Ｙ４６Ｄ)、ｐＴＫ-２９０６(Ｒ１１Ｓ/Ｒ１５Ｔ/Ｆ１７Ｗ/Ｙ４６Ｄ)、ｐＴＫ-２９４５(Ｒ１１Ｑ/Ｒ１５Ｔ/Ｙ４６Ｄ)、ｐＴＫ-２９０７(Ｒ１１Ｓ/Ｒ１５Ｔ/Ｆ１７Ｙ/Ｙ４６Ｄ)、ｐＴＫ-２９４６(Ｒ１５Ｔ/Ｙ４６Ｄ)、ｐＴＫ-２９４７(Ｒ１１Ｔ/Ｒ１５Ｔ/Ｙ４６Ｄ)、ｐＴＫ-２９４８(Ｒ１１Ｖ/Ｒ１５Ｔ/Ｙ４６Ｄ)、ｐＴＫ-２９４９(Ｒ１１Ｗ/Ｒ１５Ｔ/Ｙ４６Ｄ)、ｐＴＫ-２９５０(Ｒ１１Ｙ/Ｒ１５Ｔ/Ｙ４６Ｄ)、ｐＴＫ-２８２４(Ｒ１１Ｓ/Ｒ１５Ｉ/Ｑ１９Ｋ/Ｙ４６Ｄ)、ｐＴＫ-２８２５(Ｒ１１Ｓ/Ｒ１５Ｌ/Ｑ１９Ｋ/Ｙ４６Ｄ)、ｐＴＫ-２８２６(Ｒ１１Ｓ/Ｒ１５Ｔ/Ｑ１９Ｋ/Ｙ４６Ｄ)、ｐＴＫ-２８２７(Ｒ１１Ｓ/Ｒ１５Ｖ/Ｑ１９Ｋ/Ｙ４６Ｄ)
【０１３７】
特に、発現プラスミドｐＴＫ-２８２６(Ｒ１１Ｓ/Ｒ１５Ｔ/Ｑ１９Ｋ/Ｙ４６Ｄ)由来融合蛋白質の５０％阻害濃度は４.４３μｇ／ｍＬであり、Ｆ１０２４Ｓ−Ｄ２（３）の５０％阻害濃度が８.９０μｇ／ｍＬであるのに比べて、Ｄ２（３）部分の１５番目のアルギニンをスレオニンに置換することによりエラスターゼ阻害活性が増強された。
融合蛋白質Ｆ１０２４−Ｄ２（４）(Ｒ１１Ｓ/Ｒ１５Ｔ/Ｑ１９Ｋ/Ｙ４６Ｄ)の全アミノ酸配列の説明図を示したものを図３６に示す。
【０１３８】
（実施例８） 抗体融合蛋白質（Ｆ１０２４Ｓ−トロンボモジュリン(ＴＭ)機能ドメイン）
８−１）Ｆ１０２４Ｓ-ＴＭ発現プラスミドの構築
抗ＣＤ１４抗体(Ｆ１０２４Ｓ)とＴＭの各種機能ドメインとの融合蛋白質を作製するため、ＨｅＬａゲノムＤＮＡを鋳型とし、プライマー対(ＴＭ-ｂ,ＴＭ-ｇ)によるＰＣＲを行って、ヒトのトロンボモジュリン（以下ＴＭ）遺伝子全長を増幅し、ｐＴ７-ＢｌｕｅベクターへＴＡクローニングした。配列を確認後、ｐＴ７-ＴＭとした。
次にｐＴ７-ＴＭを鋳型とし、プライマー対(ＴＭＤ１２３４５６,ＴＭｄｏｍａｉｎ２-Ｎｏｔ１Ｂｇｌ２)でＰＣＲを行い、得られた増幅断片を制限酵素ＢａｍＨＩおよびＢｇｌＩＩで切断後、予め調製しておいたベクター（実施例１表３に記載のｐＴＫ-２３５４を、制限酵素ＢａｍＨＩで切断後、脱リン酸化処理を行って調製）と混合し、Ｔ４ＤＮＡリガーゼによる結合反応を行うことで、ＴＭのアミノ酸番号２２７番目のシステイン〜４６２番目のシステイン(Ｃｙｓ２２７〜Ｃｙｓ４６２)をＦ１０２４Ｓに付加した融合蛋白質（Ｆ１０２４Ｓ-ＴＭ１２３４５６Ｍと表記）の重鎖を発現可能なプラスミドｐＴＫ-２７５４を構築した。同様の方法で、プライマー対（ＴＭＤ１２３４５６,ＴＭｄｏｍａｉｎ３-Ｎｏｔ１Ｂｇｌ２）を用いることで、アミノ酸番号２２７番目のシステイン〜４９７番目のセリン（Ｃｙｓ２２７〜Ｓｅｒ４９７）を付加した融合蛋白質(Ｆ１０２４Ｓ-ＴＭ１２３４５６７Ｍと表記)の重鎖を発現可能なプラスミドｐＴＫ-２７５５を、プライマー対（ＴＭＤ２３４５６,ＴＭｄｏｍａｉｎ２-Ｎｏｔ１Ｂｇｌ２）を用いることで、２６３番目のトレオニン〜４６２番目のシステイン（Ｔｈｒ２６３〜Ｃｙｓ４６２）を付加した融合蛋白質（Ｆ１０２４Ｓ-ＴＭ２３４５６Ｍと表記）の重鎖を発現可能なプラスミドｐＴＫ-２７５６を、プライマー対（ＴＭＤ２３４５６,ＴＭｄｏｍａｉｎ３-Ｎｏｔ１Ｂｇｌ２）を用いることで、２６３番目のトレオニン〜４９７番目のセリン（Ｔｈｒ２６３〜Ｓｅｒ４９７）を付加した融合蛋白質（Ｆ１０２４Ｓ-ＴＭ２３４５６７Ｍと表記）の重鎖を発現可能なプラスミドｐＴＫ-２７５７を、プライマー対（ＴＭＤ３４５６,ＴＭｄｏｍａｉｎ２-Ｎｏｔ１Ｂｇｌ２）を用いることで、３０６番目のグルタミン〜４６２番目のシステイン（Ｇｌｕ３０６〜Ｃｙｓ４６２）を付加した融合蛋白質(Ｆ１０２４Ｓ-ＴＭ３４５６Ｍと表記)の重鎖を発現可能なプラスミドｐＴＫ-２７５８を、プライマー対（ＴＭＤ３４５６,ＴＭｄｏｍａｉｎ３-Ｎｏｔ１Ｂｇｌ２）を用いることで、３０６番目のグルタミン〜４９７番目のセリン（Ｇｌｕ３０６〜Ｓｅｒ４９７）を付加した融合蛋白質(Ｆ１０２４Ｓ-ＴＭ３４５６７Ｍと表記)の重鎖を発現可能なプラスミドｐＴＫ-２７５９を、プライマー対（ＴＭＤ４５６,ＴＭｄｏｍａｉｎ２-Ｎｏｔ１Ｂｇｌ２）を用いることで、３４５番目のバリン〜４６２番目のシステイン（Ｖａｌ３４５〜Ｃｙｓ４６２）を付加した融合蛋白質（Ｆ１０２４Ｓ-ＴＭ４５６Ｍと表記）の重鎖を発現可能なプラスミドｐＴＫ-２７６０を、プライマー対（ＴＭＤ４５６,ＴＭｄｏｍａｉｎ３-Ｎｏｔ１Ｂｇｌ２）を用いることで、３４５番目のバリン〜４９７番目のセリン（Ｖａｌ３４５〜Ｓｅｒ４９７）を付加した融合蛋白質（Ｆ１０２４Ｓ-ＴＭ４５６７Ｍと表記）の重鎖を発現可能なプラスミドｐＴＫ-２７６１をそれぞれ構築した。
一方、ＴＭの酸化による活性低下を抑制する為に、アミノ酸番号３８８番目のメチオニン（Ｍｅｔ３８８）をロイシン（Ｌｅｕ）に置換した変異体(Ｍ３８８Ｌ)も、以下の方法で作製した〔Ｃｌａｒｋｅ, ＪＨ．ら、Ｊ.Ｂｉｏｌ.Ｃｈｅｍ.２６８,６３０９-６３１５(１９９３)〕。すなわち、ｐＴ７-ＴＭを鋳型とし、各プライマー対〔ＴＭＤ１２３４５６，ＴＭ(Ｍ３８８Ｌ)-ａ〕および〔ＴＭｄｏｍａｉｎ２-Ｎｏｔ１Ｂｇｌ２，ＴＭ(Ｍ３８８Ｌ)-ｓ〕によるPCR反応後に、各増幅産物を混合し、プライマー対（ＴＭＤ１２３４５６，ＴＭｄｏｍａｉｎ２-Ｎｏｔ１Ｂｇｌ２）で再度ＰＣＲすることで、Ｍ３８８Ｌの変異を有した２２７番目のシステインから４６２番目のシステイン（Ｃｙｓ２２７〜Ｃｙｓ４６２）をコードする遺伝子断片を増幅することができた。上記と同様に、この断片を制限酵素ＢａｍＨＩおよびＢｇｌＩＩによる切断およびリガーゼ反応によるベクターへの結合によって、Ｍ３８８Ｌの変異を有するＴＭの２２７番目のシステインから４６２番目のシステイン（Ｃｙｓ２２７〜Ｃｙｓ４６２）領域を、抗体分子Ｆ１０２４Ｓに付加した融合蛋白質(Ｆ１０２４Ｓ-ＴＭ１２３４５６Ｌと表記)の重鎖を発現可能なプラスミドｐＴＫ-２７６２を構築した。最終的に、ｐＴＫ-２７５５にＭ３８８Ｌの変異を導入した融合蛋白質（Ｆ１０２４Ｓ-ＴＭ１２３４５６７Ｌと表記）の重鎖を発現可能なｐＴＫ-２７６３、ｐＴＫ-２７５６にＭ３８８Ｌの変異を導入した融合蛋白質（Ｆ１０２４Ｓ-ＴＭ２３４５６Ｌと表記）の重鎖を発現可能なｐＴＫ-２７６４、ｐＴＫ-２７５７にＭ３８８Ｌの変異を導入した融合蛋白質（Ｆ１０２４Ｓ-ＴＭ２３４５６７Ｌと表記）の重鎖を発現可能なｐＴＫ-２７６５、ｐＴＫ-２７５８にＭ３８８Ｌの変異を導入した融合蛋白質(Ｆ１０２４Ｓ-ＴＭ３４５６Ｌと表記)の重鎖を発現可能なｐＴＫ-２７６６、ｐＴＫ-２７５９にＭ３８８Ｌの変異を導入した融合蛋白質(Ｆ１０２４Ｓ-ＴＭ３４５６７Ｌと表記)の重鎖を発現可能なｐＴＫ-２７６７、ｐＴＫ-２７６０にＭ３８８Ｌの変異を導入した融合蛋白質(Ｆ１０２４Ｓ-ＴＭ４５６Ｌと表記)の重鎖を発現可能なｐＴＫ-２７６８、ｐＴＫ-２７６１にＭ３８８Ｌの変異を導入した融合蛋白質(Ｆ１０２４Ｓ-ＴＭ４５６７Ｌと表記)の重鎖を発現可能なｐＴＫ-２７６９をそれぞれ構築した。
表１０に使用したプライマーの配列、表１１に、各抗ＣＤ１４抗体（Ｆ１０２４Ｓ）融合蛋白質と各発現プラスミドを示す。
なお、各抗ＣＤ１４抗体（Ｆ１０２４Ｓ）融合蛋白質のアミノ酸配列は、図３７〜４４並びに配列表に示す。
また、融合蛋白質Ｆ１０２４−ＴＭ２３４５６Ｌの全アミノ酸配列の説明図を示したものを図４５に示す。
【０１３９】
【表１１】
【０１４０】
【表１２】
【０１４１】
各プラスミドを、ＣＯＳ-1細胞に軽鎖発現プラスミド（ｐＴＫ−２３４４）とコトランスフェクションさせることで、培養上清中にＦ１０２４Ｓ−ＴＭが発現された。この上清を、Ｐｒｏｓｅｐ−Ａカラムによる精製を行い、以後のアッセイに供した。
尚、各融合蛋白質がＣＤ１４抗原に対し結合活性があることを、ＥＩＡによる結合実験で確認した。
【０１４２】
８−２）トロンボモジュリン（ＴＭ）活性測定
トロンボモジュリン（ＴＭ）が、血中でトロンビンと複合体を形成し、血液凝固阻害因子のプロテインＣを活性化する作用を指標として以下のようにＴＭ活性を測定した。
反応（活性測定）はマルチチューブにて実施した。希釈は０．１４ｍｏｌ／Ｌ塩化ナトリウム、１０ｍｍｏｌ／Ｌ塩化カルシウム及び１ｍｇ／ｍＬ牛血清アルブミンを含む２５ｍｍｏｌ／Ｌトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７．４）で行った。検体４０μＬに６Ｕ／ｍＬヒトトロンビン（ＳＩＧＭＡ）１０μＬを加え、３７℃で１０分間プレインキュベートした。次いで、２４μｇ／ｍＬプロテインＣ（ａｍｅｒｉｃａｎ ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃａ ｉｎｃ.）１０μＬを加え、３７℃で５分間インキュベートした。０．１５Ｕ／ｍＬアンチトロンビンIII(ミドリ十字)−１５Ｕ／ｍＬヘパリン(持田製薬)混合液４０μＬを加え、３７℃で１０分間インキュベートした。３．２ｍｍｏｌ／Ｌ活性化プロテインＣ基質Ｓ−２３６６(第一化学薬品)１００μＬを加え３７℃で１０分間インキュベート後、５０％酢酸２００μＬを加え反応を停止した。反応液３００μＬを９６穴平底プレートに移し、プレートリーダー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ）にて４０５ｎｍの吸光度を測定した。ポジティブコントロールとしてはヒトトロンボモジュリンＭＲ−３３(持田製薬)を使用した。その結果、すべてのＦ１０２４Ｓ−ＴＭ融合蛋白質はプロテインＣ活性化促進活性を有していた。特に、Ｆ１０２４Ｓ−ＴＭ２３４５６Ｍ、Ｆ１０２４Ｓ−ＴＭ２３４５６７Ｍ、Ｆ１０２４Ｓ−ＴＭ２３４５６ＬおよびＦ１０２４Ｓ−ＴＭ２３４５６７Ｌは高いプロテインＣ活性化促進活性を有していた。また、Ｍ３８８Ｌ型の置換変異体の活性が相対的に高かった（図４６）。
【０１４３】
（実施例９） 抗体融合蛋白質（Ｆ１０２４Ｓ−ＳＬＰＩ）のリンカー部分の改変
９−１）発現プラスミドの構築
ＬｉｎｋｅｒＳＧ−４−ｓ（５’ ｐＧＡＴＣＴＧＧＡＧＧＴＧＧＡＧ ３’：５’端はリン酸化）およびＬｉｎｋｅｒ ＳＧ−４−ａ（５’ ｐＧＡＴＣＣＴＣＣＡＣＣＴＣＣＡ ３’：５’端はリン酸化）を混合後、９６℃で２分間インキュベートし、ゆっくり室温にもどしアニールさせた。その適量を予め調製しておいたベクター断片〔実施例１に記載のｐＴ７−ＳＬＰＩ（Ｄ２）を、制限酵素ＢｇｌＩＩで切断し、さらに脱リン酸化処理を行って、アガロースゲル電気泳動およびゲルからの断片抽出を行ったもの〕と混合し、Ｔ４ＤＮＡリガーゼで結合させた。この作業によって、ＳＬＰＩ（Ｄ２）に１コピーのＧＧＧＧＳリンカーが付加されたプラスミドｐＴＫ−２７２９を構築した。さらに、このｐＴＫ−２７２９を制限酵素ＢｇｌＩＩで切断し、上記と同様の作業を繰り返すことで、ＳＬＰＩ（Ｄ２）に２コピーのＧＧＧＧＳリンカーが付加されたｐＴＫ−２７４９と３コピーが付加されたｐＴＫ−２７５０を構築した。
次に、ｐＴＫ−２７２９、ｐＴＫ−２７４９およびｐＴＫ−２７５０を制限酵素ＢｇｌＩＩおよびＮｏｔＩで切断し、リンカー＋ＳＬＰＩ（Ｄ２）部分をコードする遺伝子断片を調製した（それぞれ、断片１、断片２および断片３）。実施例１（表３）に記載のｐＴＫ-２３９６構築時と同様、遺伝子断片ＡおよびＤと各断片とをＴ４ＤＮＡリガーゼによりひとつにつなげ、抗体分子とＳＬＰＩ（Ｄ２）との間にリンカーとしてＧＳＧＧＧＧＳ或いはＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ、ＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳを有するＦ１０２４Ｓ−ＳＬＰＩ（Ｄ２）リンカー改変体重鎖発現プラスミド（それぞれｐＴＫ−２７５１、ｐＴＫ−２７５２、ｐＴＫ−２７５３）を構築した。
これらのプラスミドをＣＯＳ−１細胞に、軽鎖発現プラスミド（ｐＴＫ−２３４４）とコトランスフェクションさせることで、培養上清中にＦ１０２４Ｓ-ＳＬＰＩ（Ｄ２）リンカー改変体が発現され、Ｐｒｏｓｅｐ−Ａカラムで発現産物の精製を行った。
精製産物は、いずれもＣＤ１４抗原に対して結合活性があることを確認した。
なお、表１２および表１３に各プライマーおよびリンカーの配列番号を示す。
【０１４４】
【表１３】
【表１４】
【０１４５】
９−２）Ｆ１０２４Ｓ-ＳＬＰＩのエラスターゼ阻害活性
実施例３−２）の（３）と同様の方法により１０２４Ｄ−ＳＬＰＩ（Ｄ１Ｄ２）、Ｆ１０２４Ｄ−ＳＬＰＩ（Ｄ２）、Ｆ１０２４Ｓ−ＳＬＰＩ（Ｄ１Ｄ２）およびＦ１０２４Ｓ−ＳＬＰＩ（Ｄ２）、さらには、ＳＬＰＩ（Ｄ２）に１、２および３コピーのＧＧＧＧＳリンカーが付加された融合蛋白質のエラスターゼ阻害活性を測定した。ただし、Ｓ−２４８４溶液添加後の３７℃インキュベーションは５分間とした。
なお、コントロールとして、希釈液８０μＬにエラスターゼ溶液１０μＬを混合し、３７℃で３分間インキュベーションした後、Ｓ−２４８４溶液１０μＬを加え、３７℃で正確に５分間インキュベーション後、２０％酢酸溶液５０μＬを加えたものを使用した。その結果、Ｆ１０２４Ｓ−ＳＬＰＩ（Ｄ１Ｄ２）、Ｆ１０２４Ｓ−ＳＬＰＩ（Ｄ２）の５０％阻害濃度はそれぞれ２２.５μｇ／ｍLおよび２６.９μｇ／ｍLであった。また、ＳＬＰＩ（Ｄ２）に１、２および３コピーのＧＧＧＧＳリンカーが付加された融合蛋白質の５０％阻害濃度はそれぞれ１１.６μｇ／ｍL、１１.９μｇ／ｍLおよび１１.６μｇ／ｍLであった。
【０１４６】
(実施例１０) ヒト化抗体（ｈＦ１０２４Ｓ-Ｄ２（３））の作製
Ｆ１０２４-１-３ラット抗体の重鎖および軽鎖可変領域の各アミノ酸配列をデータベース上でサーチした結果、それぞれヒト抗体であるＩＧＨＶ７-８１（ ＢＣ０３２７３３）およびＨＵＭＩＧＲＦＦＭ（Ｌ４８２４２）と相同性が高いと判断した。そこで、Ｆ１０２４抗体両鎖の３つの相補性決定領域（ＣＤＲ）を、(1)ＩＧＨＶ７-８１およびＨＵＭＩＧＲＦＦＭ（以下ＲＦと表記）の、あるいは(2)結晶構造解析が詳細に行われているＮＥＷ、ＥｕおよびＲＥＩの、各フレームワーク（ＦＲ）に移植することで、ヒト化を行った（図４７参考）。各アミノ酸配列（図４８）を基に、塩基配列を設計し、いくつかに分割して合成することで、全６種類の遺伝子断片をそれぞれ調製した。各断片を、重鎖はｐＴＫ-２３７０、軽鎖はｐＴＫ-２３４４の各可変領域と置換し、発現プラスミド（重鎖：ＩＧＨＶ７-８１-ＨＡはｐＴＫ-２８８７、ＮＥＷ-ＨＡはｐＴＫ-２６７９、Ｅｕ-ＨＡはｐＴＫ-２６８５、軽鎖：ＲＦ-ＫＡはｐＴＫ-２９５５、ＲＥＩ-ＫＡはｐＴＫ-２６８０、Ｅｕ-ＫＡはｐＴＫ-２６８１）を構築した。これらの各プラスミドと、キメラ抗体発現プラスミド（重鎖はｐＴＫ-２３７０、軽鎖はｐＴＫ-２３４４）とをＣＯＳ-１細胞に様々な組み合わせでコトランスフェクションし、その上清中に分泌された抗体の、ＧＰＶＩ抗原に対する結合活性を比較した。
重鎖に関しては、ヒト化したことによって、いずれも発現量が著しく低下していた。そこで、各ＦＲにいくつかの変異を導入して検討を行なった。一方、軽鎖はいずれも発現および結合活性が確認できた。
３種類のヒト化重鎖発現プラスミドに関しては、ＦＲ中のヒト特異的配列のいくつかをラット由来の配列に戻して作製した変異体を多数構築し、詳細に解析したことで、最終的に発現および結合活性を維持した配列（ＩＧＨＶ７-８１-ＨＣはｐＴＫ-２９０９、ＩＧＨＶ７-８１-ＨＸはｐＴＫ-３００７、ＮＥＷ-ＨＢはｐＴＫ-２８０３、Ｅｕ-ＨＢはｐＴＫ-２８１１）を得ることができた。（図４９にアミノ酸配列を記載）
最後に、ヒト化重鎖およびヒト化軽鎖の組み合わせを検討し、最も発現および結合活性の高い組み合わせが、ＩＧＨＶ７-８１-ＨＸとＲＦ-ＫＡその他の軽鎖との組合せであった。
同様の手法を用いて、他の抗体融合蛋白質についても抗体部分をヒト化する。
【０１４７】
（実施例１１） 抗体融合蛋白質F１０２４Ｓ-Ｄ２（３）の安定高生産株の作製
１１−１ Ｆ１０２４Ｓ-Ｄ２（３）安定高発現プラスミド（ｐＴＫ-２６７１）の構築
Ｆ１０２４Ｓ-Ｄ２（３）重鎖一過性発現プラスミド（ｐＴＫ-２３７０：実施例１に記載）を鋳型とし、表１４に示すプライマー対（Ｆ１０２４Ｈ-ｋｏｚａｋ,ＩｇＧ４-ｌ）でＰＣＲを行った。この増幅産物を制限酵素ＥｃｏＲＩおよびＮｈｅＩで切断後、アガロースゲルで電気泳動し、Ｆ１０２４抗体重鎖可変領域を含む遺伝子断片（断片Ｕ）を抽出した。なお、表１４に使用プライマーの配列番号を示す。
【０１４８】
【表１５】
【０１４９】
ｐＴＫ-２３７０を制限酵素ＮｈｅＩおよびＳｓｅ８３８７Ｉで切断後、アガロースゲルで電気泳動し、Ｆ１０２４Ｓ-Ｄ２（３）の重鎖定常領域およびＤ２（３）をコードする遺伝子配列とＳＶ４０ ｐｏｌｙＡシグナルを含む遺伝子断片（断片Ｖ）を抽出した。Ｆ１０２４軽鎖発現プラスミド（ｐＴＫ-２３４４：実施例１に記載）を制限酵素ＢｓｉＷＩおよびＮｃｏＩで切断後、アガロースゲルで電気泳動し、Ｆ１０２４抗体軽鎖可変領域を含む遺伝子断片（断片Ｗ）を抽出した。
ＥＦプロモーター、ヒト軽鎖定常領域およびマウスＤＨＦＲ発現ユニット〔プロモーターとしてＳＶ４０プロモーター（エンハンサー領域は含まない）、ｐｏｌｙＡシグナルもＳＶ４０由来〕を有するプラスミド（ｐＴＫ-２５７７）を、制限酵素ＢｓｉＷＩおよびＥｃｏＲＩで切断後、アガロースゲルで電気泳動し、目的とするベクター断片（断片Ｘ）を抽出した。一方、Ｓｓｅ８３８７ＩおよびＮｃｏＩで切断後、アガロースゲルで電気泳動し、ＥＦプロモーター領域を含む遺伝子断片（断片Ｙ）も抽出した。
各遺伝子断片Ｕ〜Ｙを、Ｔ４ＤＮＡリガーゼ（タカラバイオ株式会社）で、ひとつにつなげ、Ｆ１０２４Ｓ-Ｄ２（３）の重鎖、軽鎖を同時に発現可能であり、導入細胞でのマーカーとなるマウスＤＨＦＲ発現ユニットを有する安定発現用プラスミド（ｐＴＫ-２６７１）を構築した。
他の抗体融合蛋白質についても同様の手法を用いて、安定高発現プラスミドを構築する。
【０１５０】
（実施例１２）効力評価（ｉｎ ｖｉｔｒｏ）
１２−１）ブラジキニン産生阻害作用の確認
（１）ＡＰＴＴ試薬惹起ヒトおよびウサギ血漿中ブラジキニン産生に対する抑制作用の確認
正常ヒト血漿はデイドサイトロールレベル1（ＤＡＤＥ ＢＥＨＲＩＮＧ社）を使用した。ウサギ血漿は、雄性ウサギ（ニュージーランドホワイト種、北山ラベス）の耳動脈より１／１０容の３．８％クエン酸ナトリウム（血沈用チトラート、岩城製薬）を含むシリンジを用いて採血し、４℃、３０００ｒｐｍ（０５ＰＲ−２２、日立）の条件で１０分間遠心して取得した。ヒトあるいはウサギ血漿８０μＬにｏ−ｐｈｅｎａｎｔｈｒｏｌｉｎｅ溶液を添加後、希釈液で段階希釈したＦ１０２４Ｓ−Ｄ２(３)溶液を終濃度が０、１、３、１０および３０μg／ｍＬとなるように、あるいはヒト免疫グロブリン（hIg）は終濃度が３０μg／ｍＬになるように添加し、混合した後に、３７℃で１０分間インキュベーションした。ミリＱ水で希釈したＡＰＴＴ試薬を８０μＬ添加し、３７℃で１０分間インキュベーションした。採取した１００μＬにブラジキニン測定キット（マーキットＭブラジキニン、大日本製薬）に付属の除蛋白剤を２０μＬ添加した後、４℃、１００００ｒｐｍ（ＭＲＸ−１５０、ＴＯＭＹ）、１０分間の遠心で取得した上清中のブラジキン濃度をブラジキニン測定キットを用いて測定した。その結果、Ｆ１０２４Ｓ−Ｄ２(３)は濃度に依存してヒトおよびウサギのＡＰＴＴ試薬惹起血漿中ブラジキニン産生を抑制した（図５０〜５１）。
【０１５１】
１２−２）凝固阻害作用の確認
（１）トロンボプラスチン惹起（ＦａｃｔｏｒＸＩ依存性）ヒト血漿中トロンビン産生に対する抑制作用の確認
ヒト血小板３×１０５／μＬを含むヒト血漿およびウサギ血小板３×１０５／μＬを含むウサギ血漿のそれぞれにＦ１０２４Ｓ−Ｄ２(３)溶液を終濃度が０、３、１０、３０、１００、３００μｇ／ｍＬになるように、あるいはヒト免疫グロブリン（ｈＩｇ）は終濃度が３００μｇ／ｍＬになるように加え、３７℃にて１０分間プレインキュベートした。その後、２５ｍｍｏｌ/Ｌ ＣａＣｌ２溶液にて８０００倍に希釈したトロンボプラスチン（シンプラスチンエクセル、BIOMERIEUX）溶液を添加し、３７℃でインキュベートを開始した。トロンボプラスチン溶液添加前および添加後は経時的にインキュベート溶液を５μＬずつ採取し、Ｂｕｆｆｅｒ Ｂ（(０．５ｍｇ／ｍＬ ＢＳＡ、０．１ｍｏｌ／Ｌ ＮａＣｌ、２０ｍｍｏｌ／Ｌ ＥＤＴＡを含む５０ｍｍｏｌ／Ｌ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液(ｐＨ７.９)) １００μＬと２ｍｍｏｌ／Ｌ Ｓ−２２３８ ２５μＬの混合液に添加して、３７℃にて１０分間インキュベートした。５０ｖｏｌ％ 酢酸 １００μＬを添加した後、反応液を２００μＬ／ｗｅｌｌずつ９６穴プレートに移し、４０５ｎｍにおける吸光度をプレートリーダー(Ｔｈｅｒｍｏｍａｘ ｍｉｃｒｏｐｌａｔｅ ｒｅａｄｅｒ、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅ)にて測定した。その結果、Ｆ１０２４Ｓ−Ｄ２(３)は濃度に依存してトロンボプラスチン惹起ヒトおよびウサギ血漿中トロンビン産生を抑制した（図５２〜５３）。
【０１５２】
１２−３）凝固阻害作用の確認
（１）ヒトＡＰＴＴ延長作用の確認
実施例８で作製したＦ１０２４Ｓ−ＴＭ２３４５６Ｍ、Ｆ１０２４Ｓ−ＴＭ２３４５６Ｌ、Ｆ１０２４Ｓ−ＴＭ２３４５６７ＭおよびＦ１０２４Ｓ−ＴＭ２３４５６７ＬのＡＰＴＴ延長作用を終濃度としてそれぞれ２.００、２.００、１.９５および２.２９μｇ／ｍＬにおいて、実施例３−３）の（１）と同様の方法でヒト正常血漿を用いて評価した。その結果、上記の４つの融合蛋白質はＡＰＴＴをそれぞれ２６、３２、４２および５７％延長した。
【０１５３】
（実施例１３）ｅｘ ｖｉｖｏ試験における有効性の評価
１３−１）Ｆ１０２４Ｓ−Ｄ２(３)の抗炎症作用の確認
ウサギ、ニュージーランドホワイト種（１．８−２．６ｋｇ，北山ラベス）にＦ１０２４Ｓ−Ｄ２(３)の１０ｍｇ／ｋｇを耳介静脈内投与し、経時的にクエン酸加採血した。採取した血液にＬＰＳ（ＷＥ.Ｃｏｌｉ ０５５：Ｂ５、ＤＩＦＣＯ）を終濃度１ｎｇ／ｍLで添加し、３７℃で４時間インキュベーションした。４℃、１００００ｒｐｍ（ＭＲＸ−１５０、ＴＯＭＹ）、１０分間の遠心で取得した血漿中のＴＮＦ−α濃度を抗ウサギＴＮＦ−α抗体を用いたＥＬＩＳＡにより測定した。その結果、ＬＰＳ刺激血液のＴＮＦ−α産生はＦ１０２４Ｓ−Ｄ２(３)投与後２４時間まで抑制された（図５４）。
【０１５４】
１３−２）Ｆ１０２４Ｓ−Ｄ２(３)の抗凝固作用の確認
実施例１３−１）の採血直後に遠心分離により取得した血漿を活性化トロンボプラスチン時間（ＡＰＴＴ）の測定に供した。ＡＰＴＴの測定は実施例３−３）と同様に実施した。その結果、Ｆ１０２４Ｓ−Ｄ２(３)投与後８時間までＡＰＴＴ延長がみられた（図５５）。
【０１５５】
（実施例１４）in vivoにおける有効性の評価
１４−１）ウサギ盲腸穿刺腹膜炎（ＣＬＰ：Cecal Ligation and Ｐuncture）モデル
ウサギ盲腸穿刺腹膜炎モデルを作製し、Ｆ１０２４Ｓ−Ｄ２(３)投与後での生存率および凝固パラメーターの改善を確認した。
ウサギ盲腸穿刺腹膜炎モデルは、Ｋｅｉｔｈ Ａらの方法（Journal of Surgical Research,29:189,1980）に準じ，ニュージーランドホワイト種（１．８−２．６ｋｇ，北山ラベス）に麻酔下で盲腸に穴を開け、盲腸内容物を腹腔に播種することにより作製した．２時間後にＦ１０２４Ｓ−Ｄ２(３)の１０ｍｇ／ｋｇを耳介静脈内投与し、以後は１日２回の同投与を３日間続けた。対照群にはＦ１０２４Ｓ−Ｄ２(３)の替わりにヒト免疫グロブリン（ｈIg）を投与した。７２時間まで生死の観察、記録を行い、カプランマイヤー生存曲線を描いた。さらに盲腸穿刺後８時間にクエン酸加採血し、血漿中の凝固パラメーターとしてＤダイマーを測定した。その結果、生存率（図５６）およびＤダイマー（図５７）ともにＦ１０２４Ｓ−Ｄ２(３)群は対照群に比べて改善された。
なお、図５６および図５７の対照群の概要を表１５に示す。
【０１５６】
【表１６】
【図面の簡単な説明】
【０１５７】
【図１】Ｆ１０２４抗体重鎖可変領域のＤＮＡ配列とアミノ酸配列を示す。
【図２】Ｆ１０２４抗体軽鎖可変領域のＤＮＡ配列とアミノ酸配列を示す。
【図３】Ｆ１０３１−１３−２抗体重鎖可変領域のＤＮＡ配列とアミノ酸配列を示す。
【図４】Ｆ１０３１−１３−２抗体軽鎖可変領域のＤＮＡ配列とアミノ酸配列を示す。
【図５】Ｆ１０３１−１３−２抗体重鎖可変領域のＤＮＡ配列とアミノ酸配列を示す。
【図６】Ｆ１０３１−１３−２抗体軽鎖可変領域のＤＮＡ配列とアミノ酸配列を示す。
【図７】融合蛋白質Ｆ１０２４Ｄ-Ｄ１Ｄ２の全アミノ酸配列構造の説明図である。
【図８】融合蛋白質Ｆ１０２４Ｄ-Ｄ２の全アミノ酸配列構造の説明図である。
【図９】融合蛋白質Ｆ１０２４Ｄ-Ｄ２（３）の全アミノ酸配列構造の説明図である。
【図１０】融合蛋白質Ｆ１０２４Ｓ-Ｄ１Ｄ２の全アミノ酸配列構造の説明図である。
【図１１】融合蛋白質Ｆ１０２４Ｓ-Ｄ２の全アミノ酸配列構造の説明図である。
【図１２】融合蛋白質Ｆ１０２４Ｓ-Ｄ２(3)の全アミノ酸配列構造の説明図である。
【図１３】融合蛋白質Ｆ１０２４Ｄ-ＳＬＰ１（Ｄ１Ｄ２）の全アミノ酸配列構造の説明図である。
【図１４】融合蛋白質Ｆ１０２４Ｄ-ＳＬＰ１（Ｄ２）の全アミノ酸配列構造の説明図である。
【図１５】融合蛋白質Ｆ１０２４Ｓ-ＳＬＰ１（Ｄ１Ｄ２）の全アミノ酸配列構造の説明図である。
【図１６】融合蛋白質Ｆ１０２４Ｓ-ＳＬＰ１（Ｄ２）の全アミノ酸配列構造の説明図である。
【図１７】融合蛋白質Ｆ１０３１-１３Ｓ-Ｄ２（３）の全アミノ酸配列構造の説明図である。
【図１８】Ｆ１０２４（抗ＣＤ１４抗体）または抗体融合蛋白質のＬＰＳ刺激Ｕ３７３ＭＧ細胞のＩＬ-６産生に対する抑制作用を示す図である。
【図１９】Ｆ１０２４（抗ＣＤ１４抗体）または抗体融合蛋白質のＬＰＳ刺激Ｕ３７３ＭＧ細胞のＩＬ-６産生に対する抑制作用を示す図である。
【図２０】抗体融合蛋白質各のＩＬ-６産生に対する抑制活性を示す図である。
【図２１】ＵＴＩ由来蛋白質および抗ＣＤ１４抗体融合蛋白質のトリプシン阻害活性を示す図である。
【図２２】抗ＣＤ１４抗体融合蛋白質のFactorＸａ阻害活性を示す。
【図２３】抗ＣＤ１４抗体融合蛋白質のFactorＸＩａ阻害活性を示す。
【図２４】抗ＣＤ１４抗体融合蛋白質のエラスターゼ阻害活性を示す。
【図２５】抗ＣＤ１４抗体融合蛋白質の血漿カリクレイン阻害活性を示す。
【図２６】ＬＰＳ負荷ウサギ敗血症モデルでの融合蛋白質Ｆ１０２４Ｓ-Ｄ２（３）の生存率改善効果を示す。
【図２７】ＬＰＳ負荷ウサギ敗血症モデルでの融合蛋白質Ｆ１０２４Ｓ-Ｄ２（３）が白血球数に及ぼす影響（ＬＰＳ負荷ウサギ敗血症モデルにおけるＬＰＳ初回投与後２８時間の白血球数）を示す。
【図２８】ＬＰＳ負荷ウサギ敗血症モデルでの融合蛋白質Ｆ１０２４Ｓ-Ｄ２（３）が血小板数に及ぼす影響（ＬＰＳ負荷ウサギ敗血症モデルにおけるＬＰＳ初回投与後２６時間の血小板数）を示す。
【図２９】ＬＰＳ負荷ウサギ敗血症モデルでの融合蛋白質Ｆ１０２４Ｓ-Ｄ２（３）がアンチトロンビン（ＡＴ）III活性減少に及ぼす影響（ＬＰＳ負荷ウサギ敗血症モデルにおけるＬＰＳ初回投与後２８時間のＡＴIII活性の減少）を示す。
【図３０】ＬＰＳ負荷ウサギ敗血症モデルでの融合蛋白質Ｆ１０２４Ｓ-Ｄ２（３）の血圧低下改善効果を示す。
【図３１】Ｆ１０２４抗体に対する結合競合実験の結果を示す。
【図３２】融合蛋白質Ｆ１０２４−Ｄ２のＵＴＩ第２ドメインの各改変体のアミノ酸配列を示す。
【図３３】融合蛋白質Ｆ１０２４−Ｄ２のＵＴＩ第２ドメインの各改変体のアミノ酸配列を示す。
【図３４】融合蛋白質Ｆ１０２４−Ｄ２のＵＴＩ第２ドメインの各改変体のアミノ酸配列を示す。
【図３５】融合蛋白質Ｆ１０２４−Ｄ２のＵＴＩ第２ドメインの各改変体のアミノ酸配列を示す。
【図３６】融合蛋白質Ｆ１０２４Ｓ-Ｄ２（４）（Ｒ１１Ｓ/Ｒ１５Ｔ/Ｑ１９Ｋ/Ｙ４６Ｄ）の全アミノ酸配列構造の説明図を示す。
【図３７】融合蛋白質Ｆ１０２４−ＴＭのＴＭの各種機能ドメインの各改変体のアミノ酸配列を示す。
【図３８】融合蛋白質Ｆ１０２４−ＴＭのＴＭの各種機能ドメインの各改変体のアミノ酸配列を示す。
【図３９】融合蛋白質Ｆ１０２４−ＴＭのＴＭの各種機能ドメインの各改変体のアミノ酸配列を示す。
【図４０】融合蛋白質Ｆ１０２４−ＴＭのＴＭの各種機能ドメインの各改変体のアミノ酸配列を示す。
【図４１】融合蛋白質Ｆ１０２４−ＴＭのＴＭの各種機能ドメインの各改変体のアミノ酸配列を示す。
【図４２】融合蛋白質Ｆ１０２４−ＴＭのＴＭの各種機能ドメインの各改変体のアミノ酸配列を示す。
【図４３】融合蛋白質Ｆ１０２４−ＴＭのＴＭの各種機能ドメインの各改変体のアミノ酸配列を示す。
【図４４】融合蛋白質Ｆ１０２４−ＴＭのＴＭの各種機能ドメインの各改変体のアミノ酸配列を示す。
【図４５】融合蛋白質Ｆ１０２４Ｓ-ＴＭ２３４５６Ｌの全アミノ酸配列構造の説明図を示す。
【図４６】融合蛋白質Ｆ１０２４Ｓ−ＴＭのＴＭの各種機能ドメインの各改変体のトロンボモジュリン活性を示す。
【図４７】ヒト化Ｆ１０２４Ｓ−Ｄ２（３）の全アミノ酸配列構造の説明図を示す。
【図４８】Ｆ１０２４−１−３ラット抗体の重鎖および軽鎖可変領域のアミノ酸配列およびヒト化Ｆ１０２４Ｓ−Ｄ２（３）の重鎖および軽鎖可変領域と相同性の高いヒト抗体のアミノ酸配列を示す。
【図４９】ヒト化抗体の重鎖の発現および結合活性維持が可能なアミノ酸配列を示す。
【図５０】ＡＰＴＴ試薬惹起ヒト血漿中ブラジキニン産生に対する抑制作用を示す。
【図５１】ＡＰＴＴ試薬惹起ウサギ血漿中ブラジキニン産生に対する抑制作用を示す。
【図５２】トロンボプラスチン惹起ヒト血漿中トロンビン産生に対する抑制作用を示す。
【図５３】トロンボプラスチン惹起ウサギ血漿中トロンビン産生に対する抑制作用を示す。
【図５４】Ｆ１０２４Ｓ−Ｄ２（３）投与後のＬＰＳ惹起ウサギ全血ＴＮＦ−α産生に対する抑制作用の経時変化を示す。
【図５５】ウサギＦ１０２４Ｓ−Ｄ２（３）投与後のＡＰＴＴの経時変化を示す。
【図５６】ウサギ盲腸穿刺腹膜炎（ＣＬＰ）モデルＦ１０２４Ｓ−Ｄ２（３）投与後の生存率の変化を示す。
【図５７】ウサギ盲腸穿刺腹膜炎（ＣＬＰ）モデルＦ１０２４Ｓ−Ｄ２（３）投与後の血漿中のＤダイマーの変化を示す。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、抗ＣＤ１４抗体と蛋白分解酵素阻害物質とを含有する新規蛋白質、それをコードするポリヌクレオチド、新規蛋白質の製造方法および敗血症等における新規蛋白質等の医薬用途に関する。
【背景技術】
【０００２】
敗血症は、感染素因があり全身性炎症性症候群（ＳＩＲＳ）の病態を呈する疾患と定義される（非特許文献１参照）。初期症状として悪寒、発汗、発熱や血圧低下が認められるが、各種の炎症性メディエーターおよび血液凝固系因子の亢進が全身性に起こると、微小循環障害を惹起し、組織障害、臓器障害へと病態が重症化し、しばしば多臓器不全あるいは敗血症性ショックを続発して死亡に至る疾患である。
敗血症発症のトリガー段階は、感染細菌の構成成分、例えば、グラム陰性細菌におけるリポ多糖（ＬＰＳ）やグラム陽性細菌におけるリポタイコ酸（ＬＴＡ）などが白血球（単球／マクロファージおよび好中球）や血管内皮細胞に作用し、各種炎症メディエーターの産生を惹起するイベントである。近年の研究により、細菌構成成分によるこれら標的細胞の活性化には、本来白血球の分化抗原として見出されたＣＤ１４（非特許文献２参照）、および自然免疫系におけるパターン認識分子として位置付けられるToll-like-receptors（ＴＬＲ）が重要な働きをしていることが明らかにされている（非特許文献３参照）。
【０００３】
ＣＤ１４は膜結合型と可溶型の２つの形態で存在する。膜結合型はグリコシルフォスファチジルイノシノトールにより細胞膜上にアンカリングされて存在し、可溶型には肝臓で合成されたものと、白血球上でフォスファチジルイノシトール特異的フォスフォリパーゼによって切り出されて血中に存在する（非特許文献４参照）ものがある。例えばＬＰＳによる標的細胞の活性化は、血中に存在するＬＰＳ結合蛋白質（ＬＢＰ）による触媒的作用を受けてＬＰＳのＣＤ１４への結合が促進され、細胞膜上のＴＬＲに結合して活性化シグナルを標的細胞に伝える。活性化シグナルを受けた標的細胞からは、ＴＮＦ-α、ＩＬ-１、ＩＬ-６、ＩＬ-８等のサイトカイン産生や組織因子の発現など、炎症反応に関わる各種のメディエーターが産生される。代表的なメディエーターであるサイトカインは好中球やマクロファージを活性化し、血管内皮への接着、組織内遊走、好中球エラスターゼに代表される中性プロテアーゼの放出、および活性酸素種の産生が起こる。これには凝固・線溶系の活性化、補体系の活性化、カリクレインの活性化も関与する。このように分子レベルおよび細胞レベルでは、多数のメディエーター分子およびエフェクター分子が病態形成に関わっており、一連の反応が過剰に亢進した場合には、全身的な傷害作用が現れる結果となり、前述の通り、微小循環障害から、組織障害、臓器障害へと病態が重症化する。
【０００４】
このように複雑な病態を呈する敗血症に関して、その治療薬に関する研究が数多くなされている。治療薬開発のアプローチとしては、発症起因物質である細菌構成物質の作用を阻害する方法と発症起因物質のシグナルに応答して生体側が応答して発現する各種の因子を阻害する方法とに大別することができる。
【０００５】
グラム陰性細菌由来のエンドトキシンの作用を阻害することによる治療法としては、（１）抗エンドトキシン抗体を用いる方法（非特許文献５〜６参照）（２）エンドトキシンアンタゴニストを用いる方法（非特許文献７参照）、（３）ポリミキシンＢを用いる方法（非特許文献８参照）、および（４）ＢＰＩを用いる方法（非特許文献９参照）等が考案されている。エンドトキシンは、グラム陰性細菌の菌体成分であり、グラム陽性細菌や真菌などの敗血症起因細菌には存在しない物質であるため、エンドトキシンを標的とした敗血症治療薬はグラム陰性細菌以外の原因菌の場合には適応できないという問題を抱えている。
【０００６】
グラム陰性細菌の構成物質であるＬＰＳの受容体として機能するＣＤ１４を標的とする敗血症治療薬も考案されている。近年、ＣＤ１４はＬＰＳ受容体としてのみならず、グラム陽性細菌の構成物質であるリポタイコ酸やペプチドグリカン等の細菌構成物質の受容体としても機能していることが判明しており（非特許文献１０参照）、ＣＤ１４を標的とする敗血症治療薬の適用範囲がグラム陰性細菌敗血症にとどまらないことが示唆される。具体的な治療薬として抗ＣＤ１４抗体（特許文献１〜２参照）や可溶型ＣＤ１４（非特許文献１１参照、特許文献３〜４参照）が考案されているが、実用には至っていない。敗血症病態は、原因菌構成物質による炎症反応のトリガー段階からシーケンシャルにかつ複合的に形成され、重症化へと進展していくものと推定される。ＣＤ１４標的治療薬の短所は、その作用が病態形成の初期のトリガー段階にフォーカスされるため、重症化した病態後期への効果が懸念されることである。
【０００７】
一方、生体側の過剰産生因子を標的とする治療法のうち、サイトカイン等の炎症メディエーターを阻害することによる治療法としては、（１）抗ＴＮＦ抗体を用いる方法（非特許文献１２参照）、（２）可溶型ＴＮＦ受容体を用いる方法（非特許文献１３参照）、（３）ＩＬ-１受容体アンタゴニストを用いる方法（非特許文献１４参照）、（４）ＰＡＦ阻害剤を用いる方法（非特許文献１５参照）、（５）ＮＯ阻害剤を用いる方法（非特許文献１６参照）などが考案されている。これらの治療法は、実験動物および小規模の臨床試験段階ではその効果が示されているものの、大規模な臨床試験段階ではその有効性、有用性を明確に実証するには至っていない。前述の通り、サイトカイン等の炎症メディエーターは、各々が複数の活性を持ち、各々が作用を補完し、また相互に発現を誘導するなど、複雑なネットワークを形成してイベントを発生させているため、一つの因子を阻害することによる治療には限界があるものと推察されている（非特許文献１７参照）。
【０００８】
一連の敗血症病態形成に関るメディエーターの相互作用の過程で亢進する血液凝固系因子を標的とする治療法も考案されている。血液凝固系の亢進は、微小血液循環系障害を招き、これが末梢組織への酸素供給低下、組織障害、さらには多臓器不全へと至るため治療薬の重要ターゲットの一つと考えられている。具体的な方法として、（１）活性化プロテインＣを用いる方法 （非特許文献１８参照）、（２）アンチトロンビンIIIを用いる方法（非特許文献１９参照）、および（３）ＴＦＰＩを用いる治療法（非特許文献２０参照）などがある。活性化プロテインＣによる重症敗血症治療は大規模な臨床試験においても有意な治療効果を示し（非特許文献２１参照）、臨床の場に提供されているが、出血傾向のある患者への適用禁忌など、実践的に利用する場面では大きな制限があることが問題とされている。
【０００９】
【特許文献１】特許第２７４４１３０号公報
【特許文献２】国際公開第０２／４２３３３号パンフレット
【特許文献３】特表平１０−５１２１４２号公報
【特許文献４】国際公開第０１／７２９９３号パンフレット
【非特許文献１】The ACCP／SCCM Consensus Conference Committee. Chest,1992,101,1644-1655
【非特許文献２】Goyert S.M.,Ferrero E., in McMichael A.(ed.): Leukocyte Typing III. Oxford,Oxford University Press,1987
【非特許文献３】Zhang G., Ghosh S., Endotxin Res.,2000,6,453-457
【非特許文献４】Stelter F., Structure／Function relationship of CD14; in Jack R.S.(ed.): CD14 in the Inflammatory Response. Chem. Immunol..Basl, Karger,2000,74, pp25-41
【非特許文献５】Ziegler E.J., et al., New Engl. J. Med.,1991,324, 429-436
【非特許文献６】Greenman R.L.,et al., JAMA,1991,266,1097-1102
【非特許文献７】Kawata T., et al., Prog Clin Biol Res.,1995,392.499-509
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【非特許文献１４】Fischer C.J.,et al., JAMA,1994,271,1836-1843
【非特許文献１５】Dhainaut J.F., et al., Crit. Care Med.,1994,22,1720-1728
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【非特許文献１９】Fourrier F.,et al., Chest,1993,104,882-888
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【非特許文献２１】Bernard,G.R.,et al., N. Engl. J. Med.,2001,344,699-709
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
かかる状況において、本発明者らは、抗ＣＤ１４抗体と蛋白分解酵素阻害物質とを結合させた新規蛋白質が従来技術の問題を解決し得ることを着想し、新規蛋白質を作製してその効果を確認した。本発明の目的は、抗ＣＤ１４抗体と蛋白分解酵素阻害物質とを含有する新規蛋白質、それをコードするポリヌクレオチド、新規蛋白質の製造方法および新規蛋白質を含有する敗血症予防治療剤等を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明の代表的な態様を以下に示す。本発明の第一の態様は、（Ｉ）抗ＣＤ１４抗体もしくはその活性断片またはそれらの誘導体、および、（II）蛋白分解酵素の阻害物質もしくはその活性断片またはそれらの誘導体を含有する、新規な蛋白質である。すなわち、
（１）（Ｉ）抗ＣＤ１４抗体もしくはその活性断片またはそれらの誘導体、および、（II）蛋白分解酵素の阻害物質もしくはその活性断片またはそれらの誘導体を含有する蛋白質、
（２）前記（II）の阻害物質が蛋白性阻害物質である、前記（１）の蛋白質、
（３）前記（II）の阻害物質が多価酵素阻害物質である、前記（１）〜（２）の蛋白質、
（４）前記（II）の蛋白分解酵素が血液凝固因子（血液凝固系蛋白分解酵素）または炎症性プロテアーゼである、前記（１）〜（３）の蛋白質、
（５）前記（II）の蛋白分解酵素がＦＸａおよび／またはＦXIａである、前記（１）〜（４）の蛋白質、
（６）前記（II）の蛋白分解酵素がトロンビンである、前記（１）〜（４）の蛋白質、
（７）前記（II）の阻害物質がＵＴＩ由来である、前記（１）〜（６）の蛋白質、
（８）前記（II）の阻害物質がトロンボモジュリン由来である、前記（１）〜（６）の蛋白質、
（９）前記（II）の阻害物質がＵＴＩの第二ドメイン由来である、前記（１）〜（６）の蛋白質、
（１０）前記（II）の阻害物質がトロンボモジュリンの機能ドメイン由来、特にＥＧＦ様ドメイン由来である、前記（１）〜（８）の蛋白質、
（１１）前記（II）の蛋白分解酵素がエラスターゼである、前記（１）〜（４）の蛋白質、
（１２）前記（II）の阻害物質が分泌性白血球プロテアーゼインヒビターである、前記（１）〜（４）または（１１）の蛋白質、
（１３）前記（II）の阻害物質がＵＴＩ第二ドメインの１〜４の何れかの数のアミノ酸置換変異体である、前記（１）〜（１１）の蛋白質、
（１４）前記（Ｉ）の抗ＣＤ１４抗体が中和能を有する抗体である、前記（１）〜（１３）の蛋白質、
（１５）前記（Ｉ）の抗ＣＤ１４抗体がヒトＣＤ１４のアミノ酸番号２６９〜３１５の領域の少なくとも一部を認識する抗体である、前記（１）〜（１４）の蛋白質、
（１６）前記（Ｉ）の抗ＣＤ１４抗体がキメラ抗体である、前記（１）〜（１５）の蛋白質、
（１７）前記（Ｉ）の抗ＣＤ１４抗体がヒト化抗体である、前記（１）〜（１６）の蛋白質、または、
（１８）前記（Ｉ）の抗ＣＤ１４抗体が、表２に記載の重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を重鎖可変領域のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３として、または、表２に記載の軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を軽鎖可変領域のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３として含有する、前記（１）〜（１７）の蛋白質である。
【００１２】
本発明の第二の態様は、第一の態様の蛋白質の少なくとも一部をコードするポリヌクレオチドである。すなわち、
（１９）前記（１）〜（１８）の蛋白質の少なくとも一部をコードするポリヌクレオチドである。
本発明の第三の態様は、本発明の第二の態様のポリヌクレオチドを含有するベクターである。すなわち、
（２０）前記（１９）のポリヌクレオチドを含有するベクターである。
本発明の第四の態様は、本発明の第二の態様のポリヌクレオチドまたは本発明の第三の態様のベクターを含有する細胞である。すなわち、
（２１）前記（１９）のポリヌクレオチドまたは前記（２０）のベクターを含有する細胞である。
本発明の第五の態様は、本発明の第二の態様のポリヌクレオチド、本発明の第三の態様のベクターまたは本発明の第四の態様の細胞の少なくともいずれか一つを用いることを特徴とする、本発明第一の態様の蛋白質の製造方法である。すなわち、
（２２）前記（１９）のポリヌクレオチド、前記（２０）のベクターまたは前記（２１）の細胞の少なくともいずれか一つを用いることを特徴とする、前記（１）〜（１８）の蛋白質の製造方法である。
本発明の第六の態様は、本発明第一の態様の蛋白質、本発明の第二の態様のポリヌクレオチド、本発明の第三の態様のベクターまたは本発明の第四の態様の細胞の少なくともいずれか一つを含有することを特徴とする、疾患の予防および／または治療剤である。すなわち、
（２３）前記（１）〜（１８）の蛋白質、前記（１９）のポリヌクレオチド、前記（２０）のベクターまたは前記（２１）の細胞の少なくともいずれか一つを含有することを特徴とする、疾患の予防および／または治療剤、または、
（２４）前記疾患が敗血症、重症敗血症もしくは敗血症ショック、ＳＩＲＳ関連疾患、エンドトキシンショック、またはＡＲＤＳである、前記（２３）の予防および／または治療剤である。
【発明の効果】
【００１３】
本発明に係る新規蛋白質は、抗ＣＤ１４抗体または蛋白分解酵素阻害物質等がそれぞれ単独では無効または効果が不充分な、疾患もしくは病態、またはそれらにおける特定の症状もしくは治療指標に対して、有効である。該蛋白質は、in vivoにおける安定した抗炎症作用ならびに抗凝固作用および／またはエラスターゼ阻害作用を併せ持つことにより、たとえば、敗血症の予防および／または治療薬として有用である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１４】
以下に本発明をさらに詳細に説明する。
本発明第一の態様の蛋白質は、その種類については特に制限されず、単純蛋白質（またはポリペプチド）および複合蛋白質（糖蛋白質他）等を含む。
本発明第一の態様の蛋白質において、（Ｉ）抗ＣＤ１４抗体もしくはその活性断片またはそれらの誘導体と（II）蛋白分解酵素阻害物質もしくはその活性断片またはそれらの誘導体の結合様式は、特に限定されず、通常共有結合であるが、化学的方法（化学合成法もしくはケミカルコンジュゲーション）または遺伝子組換技術の何れによる結合であっても良い。本発明第一の態様の蛋白質は、好ましくは遺伝子工学的に作製される融合蛋白質である。
【００１５】
前記（II）の蛋白分解酵素阻害物質は、抗体の重鎖もしくは軽鎖の何れか、または双方に結合しても良いが、通常、抗体の重鎖、特に、重鎖のＣ末端側に融合させる。前記（II）の蛋白分解酵素阻害物質の結合数は必ずしも限定されず、抗体あたり１分子でも複数分子でも良い。また、必要に応じて、適当なリンカーまたはスペーサー等を用いてもよい。これらの方法、リンカーまたはスペーサー等は当業者に周知であり、具体的な例は実施例に示されている。
【００１６】
本発明の蛋白質において、（Ｉ）抗ＣＤ１４抗体または（II）蛋白分解酵素阻害物質の活性断片とは、（Ｉ）抗ＣＤ１４抗体または（II）蛋白分解酵素阻害物質が本来有する活性または機能の少なくとも一つを発現または保持し得る部分を含有する断片であり、活性領域または機能ドメインを包含する。また、本発明の蛋白質において、（Ｉ）抗ＣＤ１４抗体もしくは（II）蛋白分解酵素の阻害物質またはそれらの活性断片の誘導体とは、（Ｉ）抗ＣＤ１４抗体もしくは（II）蛋白分解酵素の阻害物質またはそれらの活性断片に何らかの修飾もしくは変異または付加等を伴うもので、例えば、他の化学物質（例えば、ポリエチレングリコール等）を含有するもの、または、１以上、好ましくは１ないし数個のアミノ酸の変異、例えば、付加、欠失、挿入または置換を伴うものが含まれ、変異体、改変体および修飾体を包含する。これらは、（Ｉ）抗ＣＤ１４抗体もしくは蛋白分解酵素阻害物質またはその活性断片が本来有する活性または機能の少なくとも一つ、好ましくは全てを発現または保持し得る。
【００１７】
本発明第一の態様の蛋白質は、（Ｉ）抗ＣＤ１４抗体または（II）蛋白分解酵素阻害物質が本来有する活性の各々少なくとも一つ、好ましくは全てを発現または保持する。本発明第一の態様の蛋白質は、（Ｉ）抗ＣＤ１４抗体および（II）蛋白分解酵素阻害物質の本来の活性の各々少なくとも一つ、好ましくは全てを併せ持つことにより、（Ｉ）抗ＣＤ１４抗体または（II）蛋白分解酵素阻害物質等単独では無効または効果が不充分な、疾患もしくは病態、またはそれらにおける特定の症状もしくは治療指標に対しても、有効である。
本発明第一の態様の蛋白質において（II）蛋白分解酵素の阻害物質は必ずしも限定されず、非蛋白性阻害物質または低分子化合物等であっても良いが、好ましくは蛋白性阻害物質である。
【００１８】
（II）は特定の酵素に特異的であっても良いが、複数の酵素を阻害する多価酵素阻害物質が好ましい。多価酵素阻害作用を有する物質としては、クニッツ型プロテアーゼインヒビター、例えば、尿トリプシンインヒビター（ＵＴＩ）、分泌性白血球プロテア−ゼインヒビター（ＳＬＰＩ：Secretory Leucocyte Protease Inhibitor）、組織因子経路インヒビター（ＴＦＰＩ：tissue Factor pathway inhibitor）およびアプロチニン等が挙げられ、好ましくは、ＵＴＩ、ＳＬＰＩおよびＴＦＰＩである。
ＵＴＩは、ビクニンまたはウリナスタチンと同一であり、トリプシン、プラスミンおよび好中球エラスターゼ等に対するプロテアーゼインヒビターである。
ＳＬＰＩは、好中球エラスターゼおよびカテプシン等に対するインヒビターである。
ＴＦＰＩは、リポ蛋白結合性凝固インヒビター（ＬＡＣＩ：lipoprotein-associated coagulation inhibitor）または外因系凝固インヒビター（ＥＰＩ：extrinsic pathway inhibitor）とも呼ばれ、血液凝固第Ｘａ因子（ＦＸａ）と結合して、第VIIａ因子−組織因子（第III因子）複合体を阻害し、外因系血液凝固の開始を抑制する。
【００１９】
その他の多価酵素阻害物質としては、α２-マクログロブリン（α２-ＭＧ）、アンチトロンビンIII（ＡＴIII）およびα１-アンチトリプシン（α１-ＡＴ：α１-antitrypsin）がある。α２-ＭＧは、約７７０,０００の巨大な分子量を持つ血漿蛋白の１つで、トロンビン、ＦＸａ、プラスミン、トリプシン、キモトリプシンおよびエラスターゼ等を阻害する。ＡＴIIIは、ＦＸａやトロンビンなどのセリンプロテアーゼと１対１の複合体を形成し、凝固反応を制御する。ＡＴIIIは、Ｎ末端にヘパリン結合ドメインを、Ｃ末端にトロンビンとの反応部位を有し、ヘパリンとの結合によりその抗トロンビン活性が約１０００倍に増強する。α１-ＡＴは、分子量５１０００、３９４個のアミノ酸からなる糖蛋白で、トロンビン、プラスミン、トリプシン、キモトリプシンおよびエラスターゼ等の種々のセリンプロテアーゼを阻害する。
【００２０】
本発明の蛋白質における前記（II）は、抗凝固作用もしくはブラジキニン産生をもたらす因子を含む血液凝固因子（血液凝固系蛋白分解酵素）阻害作用、特に活性化血液凝固因子阻害作用、または、抗炎症作用もしくは炎症性プロテアーゼ阻害作用を有する阻害物質が好ましい。ここで、血液凝固因子としては、具体的にはカリクレイン、トロンビン、ＦＶａ、ＦVIIａ、ＦVIIIａ、ＦIXａ、ＦＸａ、ＦXIａ、ＦXIIａおよびＦXIIIａ等が挙げられ、それらの内、特に、カリクレイン、トロンビン、ＦＶａ、ＦVIIIａ、ＦIXａ、ＦＸａ、ＦXIａおよびＦXIIIａが重要な、さらに、トロンビン、またはＦＸａおよびＦXIａが最も重要な標的酵素である。また、炎症性プロテアーゼとしては、具体的にはエラスターゼ、トリプシン、キモトリプシンおよびカテプシン類が挙げられ、特にエラスターゼ、具体的には好中球エラスターゼおよび膵エラスターゼ、特に好中球エラスターゼが重要な標的酵素である。本発明の蛋白質または本発明の蛋白質における前記（II）の阻害物質の蛋白分解酵素阻害活性は、公知の材料および方法を利用して測定し得るが、具体例は実施例に記載されている。
【００２１】
抗凝固作用または血液凝固因子阻害作用を有する阻害物質としては、公知の物質を利用し得る。具体的にはＴＦＰＩ、ＡＴIII、α１-ＡＴおよびα２-ＭＧ、ならびに、ＵＴＩおよびトロンボモジュリン（ＴＭ）、それらの活性断片およびそれらの誘導体等が挙げられ、好ましくは、ＴＭまたはＵＴＩ、それらの活性断片もしくはそれらの誘導体、より好ましくは、ＴＭ機能ドメインまたはＦＸａおよび／またはＦXIａに対する阻害活性を有するＵＴＩの第二ドメイン（ＵＴＩ-Ｄ２）もしくはその改変体、特にその３アミノ酸置換変異体（ＵＴＩ-Ｄ２(3)）である。ＵＴＩ、ＵＴＩ-Ｄ２およびＵＴＩ-Ｄ２（３）のアミノ酸配列およびヌクレオチド配列ならびに調製方法等は、特開平５−８４０８３、特開平５−３０８９８８、特開平６−２５２８９および特開平６−３２１９８９等に記載されており、これらを参考とし得る。
トロンボモジュリン（ＴＭ）は、血管内皮細胞が産生する抗凝固因子の１つであり、細胞膜上でトロンビンと複合体を作り、続いてプロテインＣが活性化され、血液凝固反応が抑制される。ＴＭは１９８１年に発見され、血管内皮細胞上に存在し、トロンビンを凝固酵素から抗凝固酵素に変換する。また、トロンビン活性を直接阻害するとともに、プロテインＣ（ＰＣ）の活性化を促進し、生じた活性化プロテインＣ（ＡＰＣ）は、活性化血液凝固因子第Ｖ因子（ＦＶａ）、第VIII因子（ＦVIIIａ）を不活性化することによって血液凝固カスケード反応にネガティブフィードバックをかけ、トロンビンの生成を抑制する。つまりＴＭはトロンビン依存性に凝固・線溶活性の双方を阻害する。この作用には、ヘパリンのようにアンチトロンビンIIIを必要とせず、出血傾向の助長が少ないとされている。
本発明で用いるＴＭ、その活性断片および誘導体は、ＴＭのアミノ酸配列およびそれをコードする核酸配列、ならびにＴＭのドメイン構造と機能が公知（例えば、黒澤晋一郎、別冊・医学のあゆみ 血液疾患−ｓｔａｔｅ ｏｆ ａｒｔｓ （Ｖｅｒ．２），１９９８年、２０５−２０７頁）であることから、それらを基に、公知の方法で調製し、また、活性を測定しうる（例えば、特開平１−６２１９及びＷＯ８８/５０５３）。ＴＭは５つのドメイン、すなわち、細胞外のＮ末端より、レクチン様ドメイン、Ｅｐｉｄｅｒｍａｌ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ（ＥＧＦ）様ドメイン、Ｏ型糖鎖結合ドメイン、膜貫通ドメインおよび細胞質ドメイン（Kurosawa，S et al.,J.Biol.Chem.,263,5993,1988）からなりそのひとつＥＧＦ様ドメインは６つの繰り返し単位からなる（本明細書ではＥＧＦ１−６またはＴＭ１２３４５６のように記載することがある）。その活性最小単位は、ＥＧＦ様ドメインの第４〜６番目の繰り返し単位、すなわちＥＧＦ４−６とされている。
ＴＭの好ましい活性断片、誘導体または機能ドメインの例としては、ＥＧＦ様ドメイン、それを含有するＴＭの活性断片もしくはその誘導体、またはＥＧＦ様ドメインの活性断片もしくはその誘導体、好ましくはＥＧＦ４−６、さらに好ましくはＥＧＦ３−６、特に好ましくはＥＧＦ２−６、それを含有するＴＭの活性断片もしくはその誘導体、具体的には、実施例で作製されたＴＭの活性断片もしくはその誘導体であり、特に、ＴＭ２３４５６Ｍ、ＴＭ２３４５６７Ｍまたはそれらの活性断片もしくは誘導体である。誘導体の好ましい例としては、ＴＭのアミノ酸番号３８８番目のメチオニンをロイシンに置換した変異体（Ｍ３８８Ｌ）が挙げられ、ＴＭ２３４５６ＬおよびＴＭ２３４５６７Ｌである。これらの作製方法および活性測定方法は、公知の方法に従ってもよく、具体的には、実施例に記載されている。
【００２２】
抗炎症作用または炎症性プロテアーゼ阻害作用を有する阻害物質としては、種々のものが知られているが、特にエラスターゼ阻害物質が好ましく、公知の物質を利用し得る。具体的には、ＵＴＩ、ＵＴＩ-Ｄ２、ＳＬＰＩ、α１-ＡＴおよびα２-ＭＧもしくはこれらの活性断片もしくは誘導体、好ましくはＵＴＩ、特にエラスターゼ阻害活性を有するＵＴＩ第二ドメイン改変体、具体的にはＵＴＩ−Ｄ２の３アミノ酸置換変異体、ＵＴＩ−Ｄ２の４アミノ酸置換変異体（ＵＴＩ−Ｄ２（４）のように記載することもある）および、ＳＬＰＩ、特にその後半部分（Ｃ末端ポリペプチド）である。ＳＬＰＩおよびその後半部分（Ｃ末端ポリペプチド）のアミノ酸配列およびヌクレオチド配列ならびに調製方法等は、特開平６−８０６９７等に記載されており、これらを参考とし得る。
ＵＴＩ−Ｄ２の３アミノ酸または４アミノ酸置換変異体の具体例は、実施例７の表９に示されており、特に、ＵＴＩ−Ｄ２（４）（Ｒ１１Ｓ/Ｒ１５Ｔ/Ｑ１９Ｋ/Ｙ４６Ｄ）が好ましい。
ＦＸａおよび／またはＦXIａに対する阻害活性ならびにエラスターゼ阻害活性を有する、ＵＴＩ第二ドメイン改変体、具体的にはＵＴＩ-Ｄ２（３）は特に好ましい。
【００２３】
本発明第１の態様の蛋白質において、抗ＣＤ１４抗体は、ＣＤ１４、好ましくはヒトＣＤ１４に結合するものであれば、特定の抗体に限定されない。本発明の蛋白質において、前記（Ｉ）の抗ＣＤ１４抗体は、蛋白分解酵素阻害物質と相乗的に作用し、または、該蛋白質もしくは該阻害物質の機能もしくは効果を向上させる。本発明第１の態様の蛋白質における前記（Ｉ）の抗ＣＤ１４抗体は、ＣＤ１４阻害作用の有無によっては限定されないが、好ましくはＣＤ１４阻害作用を有する抗体である。ここで、ＣＤ１４阻害作用とは、ＣＤ１４の機能、例えば、ＬＰＳとの結合能、ＴＬＲとの相互作用、ＴＬＲ発現細胞の活性化、具体的にはＮＦ-κＢの活性化もしくはＩＬ-８産生、または内皮細胞のサイトカイン産生、例えば、ＩＬ-６産生等の少なくとも1つを阻害する作用を言い、好ましくは、ＣＤ１４とＴＬＲ、特に、ＴＬＲ２またはＴＬＲ４との結合を阻害する作用である。
【００２４】
好適な例として、公知の抗ＣＤ１４抗体、特に、ＷＯ０２／４２３３３等に開示された抗体、および、公知の方法、特に、ＷＯ０２／４２３３３等に開示された方法により取得される抗体が挙げられる。また、それらの抗体から作製されるキメラ抗体およびヒト化抗体も本発明の蛋白質における、前記（Ｉ）の抗ＣＤ１４抗体に含まれる。
【００２５】
本発明の蛋白質において、前記（Ｉ）の抗ＣＤ１４抗体は、ＣＤ１４、好ましくはヒトＣＤ１４に結合するものであれば、その認識領域または結合領域は必ずしも限定されないが、好ましくは、ヒトＣＤ１４のＣ末端側領域、特に、アミノ酸番号２６９〜３１５、より好ましくはアミノ酸番号２８５〜３０７、さらに好ましくは、アミノ酸番号２９４〜２９６の少なくとも一部を認識または結合するものであり、具体的には、これらのいずれかを含有するＣＤ１４の部分またはＣＤ１４上の抗原決定領域を認識または結合する抗体である。また、表５に記載のＣＤ１４アミノ酸置換変異体（以下、アミノ酸置換体、アミノ酸置換改変体またはアミノ酸改変体と記載することがある）の内、Ｐ２９４Ｈ、Ｑ２９５Ａ、Ｐ２９６ＨおよびＰ２９４／２９６Ａの少なくとも１つ、好ましくは全てとの結合性がヒトＣＤ１４との結合性と比較して有意に低下している抗体であり、より好ましくは、該結合性の低下に加えて、他の変異体との結合性が実質的に変化していない抗体である。本発明の蛋白質における（Ｉ）の抗ＣＤ１４抗体の認識領域または結合領域は、公知の材料および方法、例えば、ＷＯ０２／４２３３３に記載の材料および方法を利用して確認し得るが、好適な例は実施例に記載されている。
また、表５に記載の変異体の内、特定のもの、特に、Ｐ２９４Ｈ、Ｑ２９５Ａ、Ｐ２９６ＨおよびＰ２９４／２９６Ａの少なくとも１つ、好ましくは全てとの結合性がヒトＣＤ１４との結合性と比較して有意に低下していること、より好ましくは、該特定の変異体に対する結合性の低下に加えて、他の変異体との結合性が実質的に変化していないことを指標として、ＣＤ１４阻害活性を有する抗ＣＤ１４抗体を簡便にスクリーニングもしくは同定または調製することができ、本発明はそのような方法をも提供する。
【００２６】
本発明第一の態様の蛋白質において、前記（Ｉ）の抗体は、ポリクローナル抗体であっても良いが、モノクローナル抗体が好ましい。また、由来する動物種は特に限定されない。抗体作製の容易さの面では、マウスまたはラットが好ましい。医薬品組成物の構成物の面では、キメラ抗体、ＣＤＲ移植抗体、ヒト化抗体またはヒト抗体であることが好ましい。ヒト抗体には、ヒト抗体遺伝子組換トランスジェニックマウスに免疫して作製したヒト抗体も含まれる。この他にもファージ抗体等も本発明の抗体に含まれる。ヒト化抗体は、定常領域と、フレームワーク領域（ＦＲ）がヒト由来で、相補性決定領域（ＣＤＲ）が非ヒト由来であるＣＤＲ移植抗体、または、そのＦＲにさらに変異を導入した抗体である。ファージ抗体は繊維状ファージのコート蛋白質に抗体を融合させることによってファージ粒子表面上に抗体を提示させ、作製する抗体であり、単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）フォームあるいはＦａｂフォームが主に使用される。キメラ抗体は、ヒト以外の哺乳動物、例えば、ラットまたはマウスのモノクローナル抗体の可変領域と、ヒト抗体の定常領域とからなる抗体である。本発明第一の態様の蛋白質において、前記（Ｉ）の抗体はその分子種は特に限定されない。いずれのクラス（例えば、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、特に、ＩｇＧ）、サブクラス（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、特に、ＩｇＧ４）およびイソタイプに分類される抗体であってもよい。抗体軽鎖については、カッパー鎖およびラムダ鎖のいずれも使用可能である。また、生物学的に活性のあるＦab（fragment of antigen binding ）、Ｆab'、（Ｆab'）2、抗体の活性断片をリンカー等で結合したものとして例えば一本鎖抗体（single chain Ｆｖ：ｓｃＦｖ）（Bird, R.E.ら，Science,1988;242:423-426）、ジスルフィド安定化抗体（disulfide stabilized Fv：ｄｓＦｖ）（Reiterら，Protein Engineering,1994;7:697）、 ダイアボディー（diabody）（Holliger P.ら，Proc Natl Acad Sci USA 1993;90:6444-8）、単一ドメイン抗体（ｄＡｂ）（Ward E.S.ら，Nature.,1989;341:544-6）等の活性断片および誘導体も、本発明に含まれる。これらは、遺伝子組換技術または適当な蛋白分解酵素で抗体を処理する方法等、公知技術を用いることにより作製できる。
【００２７】
キメラ抗体は、軽鎖遺伝子および重鎖遺伝子が、典型的には遺伝子工学により、異なった種に属する抗体遺伝子セグメントから構成されている抗体である。例えば、ラットまたはマウスモノクローナル抗体からの遺伝子の可変（Ｖ）セグメントは、ヒト定常（Ｃ）セグメント、例えば、γ１およびγ４と連結され得る。従って、他の哺乳動物種も用いられ得るけれども、典型的な治療用キメラ抗体は、ラットまたはマウス抗体からのＶ又は抗原結合ドメインおよびヒト抗体からのＣ又はエフェクタードメインから成るハイブリッド蛋白質である。
本発明第一の態様の蛋白質における前記（Ｉ）の抗体の可変領域配列の好ましい例を図１および図２（配列番号１２３〜１２６）に、および、該抗体がキメラ抗体である融合蛋白質の好ましい例を図７〜１７および実施例に示した。
【００２８】
また、通常抗体は抗原結合に関して多価（ＩｇＧであれば、２価）であるが、本発明の蛋白質における前記（Ｉ）の抗体は、ある局面においては、一価であることが好ましい。例えば、Ｆａｂ、または、抗体の定常領域、特に重鎖の定常領域（ＣＨ）においてアミノ酸変異を導入することによって、通常の重鎖間ジスルフィド結合を形成し得ないような変異、具体的には、Ｃｙｓ残基、特に抗体重鎖のヒンジ領域のＣｙｓ残基を他のアミノ酸残基に置換等行なうことによって、作製される一価の抗体が挙げられる。好適な例を実施例に示した。
【００２９】
「相補性決定領域（ＣＤＲ）」の定義およびその位置を決定する方法は複数報告されており、これらの何れも採用し得るが、代表的なものとしてKabatの定義（Sequences of proteins of immunological interest, 5th ed.,U.S. Department of Health and Human Services,1991）とChothiaの定義（チョシアおよびレスク，J. Mol. Biol.,1987；196：901-917）がある。本発明においては、Kabatの定義によるＣＤＲを好適な例として採用するが、必ずしもこれに限定されない。また、場合によっては、Kabatの定義とChothiaの定義の両方を考慮して決定しても良く、例えば、各々の定義によるＣＤＲの重複部分を、または、各々の定義によるＣＤＲの両方を含んだ部分をＣＤＲとすることもできる。そのような方法の具体例としては、Kabatの定義とChothiaの定義の折衷案である、Oxford Molecular's AbM antibody modeling softwareを用いたMartinらの方法（Proc.Natl.Acad.Sci.USA,1989;86:9268-9272）がある。
【００３０】
「フレームワーク領域」とは、Kabat 等による定義の如く、単一種中の種々の抗体の内で、比較的保存されている（すなわち、ＣＤＲ以外の）抗体軽鎖および重鎖可変領域の部分を云う。本明細書において、「ヒトフレームワーク領域」とは、自然に生じるヒト抗体のフレームワーク領域と又はいくつかのこのような抗体の共通配列と実質的に同一（約８５％又はそれ以上）であるところのフレームワーク領域である。
「ヒト化抗体」とは、ヒトフレームワーク、非ヒト抗体からの少なくとも一つのＣＤＲを含む抗体を云い、その中に存在する何らかの定常領域は、ヒト抗体定常領域と実質的に同一である、すなわち少なくとも約８５〜９０％、好ましくは少なくとも９５％同一である。従って、恐らくＣＤＲを除く、ヒト化抗体の全ての部分は、１以上の天然のヒト抗体配列の対応する部分と実質的に同一である。例えば、ヒト化抗体は、キメラマウス可変領域／ヒト定常領域抗体を含まない。
【００３１】
これらの抗体は、より特異的には、本発明における（Ｉ）の抗体は、複数の、好ましくは一つのヒト受容体（アクセプター）抗体からのフレームワーク領域（ＦＲ）の少なくとも一つ、好ましくは一方の鎖の全て（４つ）、より好ましくはすべて（各鎖について４つ）を含有し、そして、Ｆ１０２４抗体からの１以上、好ましくはすべて（各鎖について３つ）の相補性決定領域（ＣＤＲ）を含有するヒト化抗体である。該抗体は、軽鎖／重鎖複合体の２つのペアを有することができ、少なくとも一つの鎖、特に重鎖は、ヒトフレームワーク領域セグメントに機能的に連結された、１以上、好ましくは全て（３つ）の供与体（例えばラットまたはマウス、以下同様）抗体の相補性決定領域を含む。例えば、供与体相補性決定領域は、追加の自然に随伴する供与体アミノ酸残基と共に又はなしで、ヒトフレームワーク領域中に導入する。さらに明確な例としては、本発明のヒト化抗体は、各々、表２に記載されたＣＤＲのいずれかのアミノ酸配列を含有するまたは該アミノ酸配列からなるＣＤＲの少なくとも一つ、好ましくはすべて（各鎖３つ）を含有するものである。ヒト化抗体における各ＣＤＲおよびフレームワークの位置は元の供与体抗体における位置と対応していることが望ましい。
【００３２】
一般に、本発明における（Ｉ）のヒト化抗体は、ヒト化抗体重鎖可変領域フレームワークおよび供与体抗体重鎖可変領域フレームワーク間において、６５％以上９５％以下、好ましくは７０％以上９０％以下の相同性（すなわち、配列同一のパーセント）が好ましい。標準的には、同じヒト抗体からの重鎖および軽鎖が、フレームワーク配列を提供するために選択されて、２つの鎖の集合における非適合性の可能性を減少させるが、異なる２以上のヒト抗体から由来してもよい。
【００３３】
ヒトフレームワーク領域に関しては、ＣＤＲを得る非ヒト抗体のフレームワークまたは可変領域アミノ酸配列をヒト抗体配列コレクション中の対応する配列と比較し相同性の高い配列を選び用いる。好ましくは、フレームワークアミノ酸配列の相同性は６０％以上、より好ましくは６５％以上である。また、好ましくは、受容体抗体重鎖可変領域のアミノ酸配列は、供与体抗体重鎖可変領域のアミノ酸配列と最も相同なヒト抗体重鎖可変領域配列の代表的コレクション中の５つ、より好ましくは３つの中にある。ヒト化抗体の設計は、以下のように行うことができる。
【００３４】
１）アミノ酸が以下の（ａ）〜（ｃ）のカテゴリーに該当する場合は、用いられるヒト抗体（受容体抗体）のフレームワークアミノ酸はＣＤＲを供与する非ヒト抗体（供与体抗体）由来のアミノ酸で置換される。
（ａ）受容体抗体のヒトフレームワーク領域中の該アミノ酸がヒト抗体のその位置に稀であり、そして供与体抗体中の対応するアミノ酸がヒト抗体中のその位置に典型的である；
（ｂ）該アミノ酸がＣＤＲの１つに一次配列上近接もしくは隣接している；または、
（ｃ）該アミノ酸が供与体もしくはヒト化抗体の三次元モデルにおいてＣＤＲの約５、好ましくは４、より好ましくは３オングストローム以内に原子を有する（Coら, Proc，Natl. Acad. Sci. USA，1991;88:2869）。
【００３５】
２）受容体抗体のヒトフレームワーク領域中の該アミノ酸および供与体抗体の対応するアミノ酸がヒト抗体中のその位置に稀である場合、ヒトフレームワークのその位置に典型的であるアミノ酸に置換する。
ヒト化抗体の製造の詳細な説明については、Queenら，Proc，Natl. Acad. Sci. USA，1989;86：10029、ＷＯ９０／０７８６１、ＷＯ９２／１１０１８、Coら, Proc，Natl. Acad. Sci. USA，1991;88:2869、CoおよびQueen, Nature, 1991;351:501頁、ならびに、Coら, J. Immunol., 1992;148:1149（これらの引例をもって本明細書の一部と成す）が参照される。
【００３６】
一般に、全ての又は殆どのアミノ酸の置換が上記基準を満たしているのが望ましい。しかしながら、個々のアミノ酸が上記基準にあっているかどうかについては曖昧であることもあり、そして、代わりの様々な抗体が製造され、その内の一つはその特定の置換を有するものもあるが、有さないものもある。このため、コンピューターモデリングによるＣＤＲとＦＲの最適化を行えばよい。
【００３７】
相同性の高いヒト抗体Ｖ領域が見出された後、そのフレームワーク部分に供与体、特にＦ１０２４抗体のＣＤＲ配列を移植し、コンピューター分子モデリングで立体構造をシミュレーションする。このときに使用するプログラムとしてはＡＢＭＯＤやＥＮＣＡＤ（Biochemistry，1990；29：10032）が用いられる。この立体構造のシミュレーションにより、ＣＤＲ領域のアミノ酸の配置がＣＤ１４との結合活性を最適に有するように、ＣＤＲ近傍のＦＲのアミノ酸を他のアミノ酸に置換することにより、最適化が行える。
【００３８】
また、ＣＤＲとＦＲの最適化には、供与体、特にＦ１０２４抗体のＦＲの一部のアミノ酸配列をそのまま用いて、ヒト抗体Ｖ領域に移植する方法も可能である。ヒト抗体Ｖ領域にＦ１０２４抗体のＣＤＲとＦＲの一部の配列を移植し、コンピューター分子モデリングで立体構造をシュミレーションする。このときに使用するプログラムとしては、ModelerおよびQUANTA／CHARMm（MolecularSumilations社）等が用いられる。
軽鎖では３〜４箇所を、重鎖では７〜８箇所を供与体、例えばラット由来のアミノ酸に変更することによりＦＲがラット抗体の構造に近くなり、ＣＤＲ領域のアミノ酸の配置がＣＤ１４との結合活性を最適にすることが容易になる場合がある。
【００３９】
また、抗ＣＤ１４抗体としての結合活性が維持されていれば、ＣＤＲ領域のアミノ酸の１または２以上のアミノ酸の欠失、置換、挿入もしくは付加をしてもよい。この場合、例えばＧｌｙとＡｌａ、Ｖａｌ、ＬｅｕとＩｌｅ、ＡｓｎとＧｌｎ、ＣｙｓとＭｅｔまたはＬｙｓとＡｒｇ等、同族に分類されるアミノ酸同士の置換は、抗ＣＤ１４抗体としての結合活性が維持されていやすいと理解される。また、フレームワーク領域中のいくつかの位置のアミノ酸は抗原と直接相互作用、例えば非共有結合的に接触することができ、これらの位置も上記置換の対象となるが、特に、重鎖の２６から３０の位置のアミノ酸は立体構造上超可変ループに含まれるとされており（チョシアおよびレスク，J. Mol. Biol., 1987；196：901-917）、その意味ではＣＤＲと同様に移植することも可能である。
【００４０】
得られたアミノ酸配列に基づき、ヒト化抗体を作成する。例えば、上記より決定したアミノ酸配列より、ヒト化抗体遺伝子配列を決定し、ヒト化モノクローナル抗体をコードする遺伝子を作製する。具体的にはヒトＶ領域の遺伝子よりＣＤＲをエンコードするＤＮＡを削除し、かわりに供与体、例えばラット由来のＣＤＲをエンコードするＤＮＡを挿入する。さらに、分子モデリングにより変更するアミノ酸に応じて、対応するＤＮＡ配列をＰＣＲを用いた部位特異的突然変異導入法等により改変し、組換ヒトＶ領域遺伝子を作製する。これをヒト抗体の重鎖、軽鎖のＣ領域を含むベクターにクローニングし発現ベクターを得る。このとき使用するヒト由来の配列を変更することにより、ヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ３、好ましくは、ＩｇＧ４等の抗体のサブクラスを得ることができる。発現ベクターはマウスミエローマ細胞Ｓｐ２-Ｏ-ａｇ１４（ＡＴＣＣ ＣＲＬ１５８１）やハムスター卵巣細胞ＣＨＯに遺伝子導入し、発現を行う。
【００４１】
ヒト化抗体は、ヒトの治療における使用のために、非ヒト抗体、例えばマウスまたはラット抗体に比べ、そしていくつかの場合にはキメラ抗体に比べ、少なくとも３つの潜在的な利点を有する。
１）エフェクター部分がヒトであるので、ヒト免疫系の他の部分とより良好に相互作用しうる（例えば、補体依存性細胞障害（ＣＤＣ）又は抗体依存性細胞障害（ＡＤＣＣ）による、より効率的な標的細胞の破壊）。
２）ヒト免疫系は、ヒト化抗体のフレームワーク又はＣ領域を異物として認識せず、従って、このような投与された抗体に対する抗体応答は、全部が異物であるマウス抗体又は一部分が異物であるキメラ抗体より少ない。
３）投与されたラットまたはマウス抗体は、通常の抗体の半減期よりも非常に短い、ヒト体内での循環における半減期を有すると報告されている（ショー D.ら、J.Immunol., 1987；138：4534-4538）。投与されたヒト化抗体は、恐らく、自然に生じるヒト抗体の半減期とより近い半減期を有し、より少量、又はより少ない頻度の投与で有効である。
【００４２】
また、前記（Ｉ）の抗ＣＤ１４抗体は、実施例に示される抗体、特に、Ｆ１０２４抗体のＣＤＲの少なくとも１つ、好ましくは重鎖可変領域（ＶＨ）もしくは軽鎖可変領域（ＶＬ）の３つ、さらに好ましくは６つ全てのＣＤＲを対応する位置に有し、具体的には、表２に記載の重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を重鎖可変領域のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３として、および／または、表２に記載の軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を軽鎖可変領域のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３として含有する抗体、特に、ヒト化抗体である。
【００４３】
前記（Ｉ）の抗ＣＤ１４抗体がヒト抗体の場合、体外免疫によるヒトリンパ球の活性化を利用してハイブリドーマを作製する方法、ヒト抗体ファージライブラリーを用いる方法およびヒト抗体遺伝子を組み換えた非ヒト動物、特にトランスジェニックマウス、例えば、ＫＭマウスを用いてハイブリドーマを作製する方法等が挙げられる（ＷＯ２００２／０７０６４８（特表２００５-５０４５０７）、ＷＯ２００２／０４３４７８（特表２００４-５１５２３０））。
【００４４】
ヒト抗体ファージライブラリーは、ヒトＢ細胞から調製した抗体遺伝子をファージ遺伝子に挿入することによりFab、一本鎖抗体等の抗体の活性断片をファージ表面に発現させたライブラリーである。これらのライブラリーをスクリーニングすることによっても本発明の抗体は入手され得る。これらの方法および他の方法は、当業者に周知である（Huseら, Science,246:1275-1281（1989）、WinterおよびHarris,Immunol.Today 14:243-246（1993）、Wardら, Nature 341:544-546（1989）、HarlowおよびLane (1988),前出）、Hilyardら, Protein Engineering:A practical approach（IRL Press 1992）、Borrabeck, Antibody Engineering, 第２版（Oxford University Press 1995）、Barbas, C.F.I., Burton, D.R., Scott, J.K., and Silverman, G.J. 2001. Phage display: a laboratory manual. Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor, New York, USA. 736 pp.）。該ライブラリーより、抗原を固定化した基質に対する結合活性を指標として所望の抗原結合活性を有する抗体の活性断片を発現しているファージを回収することができる。該抗体の活性断片は、更に遺伝子工学的手法により、２本の完全なＨ鎖および２本の完全なＬ鎖からなるヒト抗体分子へも変換することができる。
【００４５】
本発明第二の態様のポリヌクレオチドは、いずれの分子種のものであっても良く、核酸を包含する。すなわち、ＤＮＡおよびＲＮＡ、ならびに、ポリデオキシリボヌクレオチドおよびポリリボヌクレオチドが含まれ、本発明第一の態様の蛋白質の少なくとも一部をコードするものであれば、それらの混合型および修飾体であっても良い。本発明の第二の態様のポリヌクレオチドは、前記（Ｉ）および／または（II）を産生する細胞から公知の方法、特に遺伝子工学的手法で取得できる。具体例は実施例に記載されている。
【００４６】
本発明の第二の態様は、第一の態様の蛋白質、好ましくは融合蛋白質、具体的には、抗体を含有する融合蛋白質をコードするポリヌクレオチドであるが、抗体が本来複数のポリペプチド鎖からなる蛋白質であるため、本発明のポリヌクレオチドは、単一分子上で本発明の蛋白質をコードする場合、および、複数、例えば、２または３の分子上にコードする場合があり、それらの何れをも含む。具体例は実施例に記載されている。ここで、本発明第一の態様の蛋白質の少なくとも一部としては、例えば、抗体の重鎖、特に重鎖可変領域（ＶＨ）部分、もしくは重鎖部分と阻害物質部分、好ましくはそれらの融合蛋白質をコードするポリヌクレオチド、または、抗体の軽鎖、特に軽鎖可変領域（ＶＬ）部分もしくは軽鎖部分と阻害物質部分、好ましくはそれらの融合蛋白質をコードするポリヌクレオチドが挙げられる。好適なポリヌクレオチドの例として、配列表の配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３および２５で示されるものが挙げられる。
【００４７】
本発明第三の態様のベクターは、第二の態様のポリヌクレオチドを単一ベクター上に含有する場合、および、複数、例えば、２または３のベクター上に含有する場合があり、それらの何れをも含む。また、本発明第三の態様のベクターは、第二の態様のポリヌクレオチド以外に、ベクターの複製に必要な成分、および、第二の態様のポリヌクレオチドの発現制御に必要な成分等を含有するが、これらの成分は当業者に周知である。
第二の態様のポリヌクレオチドを組み込むベクターとしては、必ずしも限定されないが、蛋白質遺伝子等の発現に汎用され、特に抗体または抗体を含有する融合蛋白質等の遺伝子発現に適合するベクターまたは高発現用ベクターが好ましい。好適な例としては、ヒトエロンゲーションファクター（ＥＦ）１αプロモーターおよび／またはＣＭＶエンハンサーを含有するベクターが挙げられ、例えば、pEF-BOSまたは実施例で用いたベクターがある。また、通常、ＶＨ部分もしくはＶＨ部分と阻害物質部分、好ましくはそれらの融合蛋白質をコードするポリヌクレオチド、および、ＶＬ部分もしくはＶＬ部分と阻害物質部分、好ましくはそれらの融合蛋白質をコードするポリヌクレオチドを組み込んだ発現ベクターをそれぞれ作製し、宿主細胞にcotransfectするが、単一の発現ベクターに組み込んでも良い。以上については公知の材料および方法を利用し得るが、具体例は実施例に記載されている。
【００４８】
本発明第三の態様のベクターを適当な宿主細胞に公知方法に従って導入することにより、本発明第四の態様の細胞を作製し得る。そのような細胞の例としては、ハイブリドーマ、形質転換体、または本発明のポリヌクレオチドまたはベクターを導入した遺伝子組換え細胞等がある。用いる宿主細胞としては、必ずしも限定されないが、蛋白質遺伝子等の発現に汎用され、特に抗体または抗体を含有する融合蛋白質等の発現に適合する細胞が好ましい。例えば、細菌（大腸菌等）、放線菌、酵母、昆虫細胞（ＳＦ９等）、好ましくは、哺乳類細胞（ＣＯＳ-１、ＣＨＯ、ミエローマ細胞等）が挙げられる。以上については公知の材料および方法を利用し得るが、具体例は実施例に記載されている。
本発明第一の態様の蛋白質は、本発明の第二の態様のポリヌクレオチドまたは第三の態様のベクターを用いたin vitro翻訳により、または、本発明の第四の態様の細胞を適当な条件下で培養することにより生産することができる（本発明の第五の態様）。生産された蛋白質は公知の適当な精製方法を組み合わせることにより単離することができる。好適な例は実施例に記載されている。
【００４９】
本発明の第六の態様の疾患の予防および／または治療剤は、本発明第一の態様の蛋白質、本発明の第二の態様のポリヌクレオチド、本発明の第三の態様のベクターまたは本発明の第四の態様の細胞の少なくともいずれか一つを有効成分として含有する医薬組成物であり、本発明のポリヌクレオチドおよびベクターは例えば遺伝子治療に、形質転換細胞は細胞治療に応用することができる。これらは、必要に応じて、製剤学的に許容される添加剤を含有しても良い。
【００５０】
本発明の第六の態様の疾患の予防および／または治療剤の適用となる疾患もしくは病態、またはそれらにおける特定の治療指標としては、種々のものが含まれ、必ずしも限定されないが、好ましくは、ＣＤ１４の分布もしくは機能、蛋白質分解酵素の分布もしくは機能または細菌感染と関連する疾患等である。例えば、敗血症およびその関連疾患、全身性もしくは心循環疾患、感染性疾患、炎症性疾患、呼吸器疾患もしくは呼吸不全、自己免疫疾患、多臓器不全（ＭＯＤＳ）または個々の臓器の不全もしくは障害等の疾患等が挙げられる。具体的には、敗血症、重症敗血症、敗血症性ＡＲＤＳもしくは敗血症性ショック等の敗血症およびその関連疾患、ＳＩＲＳ関連疾患、エンドトキシンショック、エキソトキシンショック、出血性ショックもしくは術中・術後ショック等の各種ショック、虚血性再灌流臓器障害、虚血性脳障害、急性虚血性脳卒中、急性期脳血栓症、急性冠微小血管塞栓、ショック性血管塞栓、散在性血管内血液凝固症候群（ＤＩＣ）、心筋梗塞およびその後遺症、低血圧等の全身性もしくは心循環疾患、歯周病、急性バクテリア髄膜炎、侵襲製ブドウ球菌感染症、感染性心内膜炎、急性ウィルス脳炎もしくはＡＩＤＳ等の感染性疾患、乾癬、胃炎、消化性潰瘍、膵炎、腎炎、心筋炎、肺炎、肝炎、肝硬変、脳炎、骨関節炎、アトピー性皮膚炎、アレルギー性接触皮膚炎、アレルギー性鼻炎、逆流性食道炎もしくは硬化性脊椎炎等の炎症性疾患、急性呼吸促迫症候群（ＡＲＤＳ）、幼児性呼吸窮迫症候群（ＩＲＤＳ）、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）、肺気腫および喘息等の呼吸器疾患もしくは呼吸不全、慢性関節リウマチ、難治性大腸炎、潰瘍性大腸炎、クローン病、糸球体腎炎、ＳＬＥ、強皮症、多発性硬化症もしくはシェーグレン症候群等の自己免疫疾患、多臓器不全、臓器移植後の臓器障害もしくは拒絶反応、または、心不全、不安定狭心症、心弁膜炎、腎不全、心筋症、腎アトニー、肝不全、もしくは劇症肝炎等の個々の臓器不全が挙げられる。
【００５１】
好ましくは対象疾患として、敗血症、重症敗血症、敗血症性ＡＲＤＳもしくは敗血症性ショック、ＳＩＲＳ、エンドトキシンショックまたはＡＲＤＳ等の疾患が挙げられる。
また、これらの疾患に伴う炎症性サイトカイン、特に血中のＴＮＦ濃度の上昇に伴う症状の改善または予防に有用である。さらに、ＬＰＳが関与するグラム陰性細菌感染、ＬＴＡ若しくはペプチドグリカン等が関与するグラム陽性細菌感染、またはマイコプラズマ感染に伴う敗血症の治療または予防、すなわち、これらの疾患の症状が表れたとき若しくは進行したときの治療効果のみならず、血中にＬＰＳ、ＬＴＡもしくはマイコプラズマ等が高値である患者、特定のＣＤ１４分子種（ＷＯ０１／２２０８５およびＷＯ２００４／４４００５参照）の血中濃度が高値である患者または以上のような状況に置かれることが予想される細菌感染者における予防効果が期待できる。
【００５２】
製剤学的に許容される添加物としては、例えば、担体、賦形剤、安定剤、滑沢剤、着色剤、崩壊剤、防腐剤、等張化剤、安定化剤、分散剤、酸化防止剤、緩衝剤、保存剤、懸濁化剤、乳化剤、一般的に用いられる適当な溶媒の類（滅菌水や植物油等）、さらには生理学的に許容しえる溶解補助剤などを適宜含んでいてもよい。
また、本発明の医薬組成物は、抗生物質、ステロイド、各種サイトカイン抗体もしくは抗凝固因子等を含んでいてもよい。これらは、有効成分である本発明の蛋白質と相加効果もしくは相乗効果を示し、より有効な医薬組成物と成ることができる。
【００５３】
本発明の医薬組成物を薬剤として投与するときの投与量は、特に限定されず、患者の症状、体重、年齢や性別等を考慮して適宜決定されるが、例えば、本発明の蛋白質を有効成分とするときには、０.１ｍｇ／ｋｇ以上が好ましい。より好ましくは１〜１０ｍｇ／ｋｇの投与量である。
【００５４】
本発明の医薬組成物を薬剤として用いるときの剤形は、必ずしも限定されないが、錠剤、注射剤、散剤、坐剤、吸入剤等、特に注射剤および吸入剤等が好適である。また種々の投与経路が可能であるが、非経口投与が好ましい。非経口投与としては例えば、静脈内投与（ボーラス投与、連続点滴、間欠的点滴）、動脈内投与、皮下投与、筋肉内投与等の注射が一般的であり、吸入も好ましく、その他に、直腸内投与、経皮吸収、関節内投与、経鼻投与、経粘膜吸収等が挙げられる。また、投与時期もしくは回数は、患者の状態にも依存するが、予防投与、単回投与もしくは連続投与等が例示される。
【００５５】
本発明の第六の態様の疾患の予防および／または治療剤の適用となる疾患もしくは病態に、本発明の医薬組成物を主成分とする薬剤を使用した治療方法。
【実施例】
【００５６】
次に本発明を実施例により具体的に説明するが、本発明はこれら実施例に限定されるものではない。
（実施例１）キメラ抗体および抗体融合蛋白質の構築
１-１）キメラ抗体および抗体融合蛋白質の構築（Ｆ１０２４）
（１）材料
用いた主な材料および装置は以下のとおりである。すなわち、
プライマー：表１に記載のプライマー（SIGMA Genosys Japanにて合成）、
ＰＣＲ反応用酵素：Ex Taq（TAKARA BIO INC.）、
制限酵素：Eco RI、Bam HI、Not I、 Nhe I、Eco RV、Stu I、Bgl II等（TAKARA BIO INC.）、
ゲノムＤＮＡ：ＨｅＬａ genome（lot. N34707-1、BD Biosciences Clontech）、
ＰＣＲ装置：ＤＮＡ Engine（MJ RESEARCH, INC.）、
アガロース電気泳動ゲル：SeaKem GTG Agarose（TAKARA BIO INC.）、
５０ｘＴＡＥ（２mol／Ｌ Tris-acetate,０.０５mol／Ｌ ＥＤＴＡ）（NIPPON GENE）、
分子量マーカー（Sty I 消化λＤＮＡ断片）、
ゲルからのＤＮＡ断片抽出キットQIAEX II（QIAGEN K.K.）、
哺乳細胞用発現ベクター：pEF2cew（pEF-BOSの改良型ベクター）、
ヒトＩｇＧ４重鎖定常領域（Ｃγ４）遺伝子を有するプラスミド：pTK-2232、
ＴＡクローニング用ベクター：pT7BlueT（NOVAGEN）およびライゲーション用試薬：TaKaRa ライゲーション Kit ver.2（TAKARA BIO INC.）、
E. coli Competent cell：JM109（TAKARA BIO INC.）、
プラスミドＤＮＡおよびゲノムＤＮＡ精製キット（QIAGEN K.K.）、
シークエンス用キット：DYEnamic ET Terminator Cycle Sequencing Premix Kit lot.1767 （Amersham Biosciences）および解析装置：ABI3100 genetic analyzer （Applied Biosystems）、
トータルＲＮＡ分離試薬：TRIzol（GIBCO BRL）、
５'RACE用キット：５'RACE system for Rapid Amplification of cＤＮＡ Ends, v.2.0 （Invitrogen）、
ダルベッコＭＥＭ培地（SIGMA）、
トランスフェクション用試薬：FuGENE6（ロシュダイアグノスティックス）
等を用いた。
【００５７】
【表１】
【００５８】
（２）実験方法
用いた主な実験方法を以下に示す。
・ＰＣＲ反応
酵素付属の取り扱い説明書に従って行った。
・アガロースゲル電気泳動
まず、０.８％濃度のアガロースゲルを作製し、これを１ｘＴＡＥを満たした泳動槽に置き、ウエルにサンプル５μＬをアプライ後、１３５Ｖで１５分間泳動を行った。泳動終了後、ゲルをエチジウムブロマイドで染色し、さらにＵＶ照射することでバンドを検出した。
・ゲルからのＤＮＡ断片抽出
目的とするバンドを剃刀で切り出し、付属の取扱説明書に従い、QIAEX IIキットを用いてゲル片からＤＮＡ断片を抽出した。抽出されたＤＮＡ断片を２０μＬの滅菌水に溶解した。
【００５９】
・ライゲーション反応
抽出を終えたＤＮＡ断片１μＬとクローニング用ベクターのpT7BlueTを１μＬ、およびライゲーション kit ver.2のＩ液２μＬを混和し、室温で１５分間静置することでライゲーションを行った。
・大腸菌への形質転換
コンピテント大腸菌５０μＬを氷上で融解し、ライゲーション反応産物４μＬを加え、そのまま氷上に３０分間静置した。４２℃で４５秒熱ショックを与え、終濃度５０μｇ／ｍＬアンピシリン含有ＬＢプレート上に塗布し、３７℃で一晩インキュベートした。
・プラスミドの精製およびシークエンス反応
キットの取り扱い説明書に従って行った。
・ハイブリドーマからのトータルＲＮＡの分離と５'ＲＡＣＥ
キットの取り扱い説明書に従って行った。なお、ハイブリドーマは５×１０７個使用した。
・トランスフェクション
FuGENE6の取り扱い説明書に従って行った。すなわち、６穴プレートの場合、トランスフェクション前日にＣＯＳ-１細胞を１.５×１０5cells／ｍＬの密度で各ウェルに２ｍＬ植え込んだ。翌日、９７μＬのダルベッコＭＥＭ培地に３μＬのFuGENE6と１μgの発現プラスミドを混和し１５分以上静置した後、２ｍＬの無血清ダルベッコ-ＭＥＭ培地に滴下し、この培養液と交換することで、トランスフェクションを行った。
【００６０】
（３）ハイブリドーマ抗体遺伝子可変領域のクローニングおよび配列決定（Ｆ１０２４）
ＷＯ０２／４２３３３に記載の方法で得られたハイブリドーマＦ１０２４（１×１０７細胞）を、ＰＢＳ−（SIGMA）で洗浄後、TRIzol（GIBCO BRL）を用いてトータルＲＮＡを抽出した。次に、５μｇのトータルＲＮＡを、５'RACE system for Rapid Amplification of cＤＮＡ Ends, v.2.0 （Invitrogen）を用いて５'RACEを行い、重鎖および軽鎖可変領域をコードする遺伝子断片をそれぞれ増幅した。尚、操作手順はキット付属のマニュアルに従い、重鎖可変領域はｒＩｇＨ-ｃプライマーで逆転写反応を行った後、ターミナルデオキシヌクレオチドトランスフェラーゼで末端にdCを付加し、ｒＩｇＨ-ｃプライマーとＡＡＰプライマー（キット付属）とで１回目のＰＣＲを行った。軽鎖可変領域も同様に、ｒＩｇＫ-ｂプライマーで逆転写反応後、ｒＩｇＫ-ｂプライマーとＡＡＰプライマーとで１回目のＰＣＲを行った。つづいて、各反応産物を鋳型とした2回目のＰＣＲ反応を、重鎖可変領域はｒＩｇＨ-ｂプライマーとＡＵＡＰプライマー（キット付属）とで、軽鎖可変領域はｒＩｇＫ-ａプライマーとＡＵＡＰプライマーとで行い、それぞれ特異的に増幅されたＤＮＡ断片をアガロースゲルでの電気泳動で確認した。ＤＮＡ断片をゲルから抽出後、塩基配列を決定し、各領域のアミノ酸配列を決定した（図１および２）。なお、表２にKabatの定義に従った場合のＣＤＲ配列を示す。また、表２に示した配列は、配列番号１７３〜１７８に示す。
【００６１】
【表２】
【００６２】
（４）各種キメラ抗体融合蛋白質発現プラスミドの構築
抗原結合活性を有する可変領域がハイブリドーマ抗体由来、すなわちラット抗体由来であり、定常領域がヒト由来の抗体であるキメラ抗体を作製することにより、ヒトへの抗原性が少ない抗体を得ることが出来る。キメラ抗体は1984年のMorrisonら（Proc, Natl. Acad. Sci. USA, 81：6851, 1984）の報告以来多くのものが開発されている。
各可変領域の開始コドンの直前に、制限酵素Eco RIの認識配列を付した５'側プライマー（重鎖は１０２４Ｈ-ａ、軽鎖は１０２４Ｋ-ａ）と、各可変領域の３'側配列のアミノ酸配列を変えることなく、ヒト定常領域との連結可能な制限酵素認識部位（重鎖はNhe I認識配列、軽鎖はBsi WI認識配列）を付した３'側プライマー（重鎖はHchainEco47NheI、軽鎖はrIgK-BsiWI）を設計した。これらのプライマーを用いて、本実施例１−１）−(3)で調製した逆転写反応後の重鎖および軽鎖各サンプルを鋳型としたＰＣＲをあらためて行った。増幅されたＰＣＲ産物とpT7BlueTベクター（NOVAGEN）を混和し、TaKaRa ライゲーション Kit ver.2（TAKARA BIO INC.）を用いて室温１５分でライゲーション反応を行った。その反応液を用いてコンピテントセルE. coli（JM109、TAKARA BIO INC.）にトランスフォーメーションを行った。
【００６３】
出現したコロニーをピックアップし、Ex Taq polymerase（TAKARA BIO INC.）、Ｍ４プライマーおよびＴ７プライマーを用いて、コロニーダイレクトＰＣＲでインサートがベクターに挿入されていることを確認した。
次に、インサートが確認されたコロニーをＬＢ培地で一晩培養し、QIAGEN plasmid midi kit（QIAGEN）を用いてプラスミドを精製した（重鎖可変領域をコードする遺伝子断片をもつプラスミドをpT7-1024H、軽鎖可変領域をコードする遺伝子断片をもつプラスミドをpT7-1024Kとした。）。精製したプラスミドは、Ｍ４プライマーおよびＴ７プライマーを用いて塩基配列を確認した。
【００６４】
pT7-1024Hを制限酵素Eco RIおよびNhe Iで切断し、重鎖可変領域をコードする遺伝子断片Ａを調製した。同様に、pT7-1024Kを制限酵素Eco RIおよびBsi WIで切断し、軽鎖可変領域をコードする遺伝子断片Ｂを調製した。
【００６５】
ヒトＩｇＧ４重鎖定常領域（Ｃγ４）遺伝子を有するプラスミドpTK-2232（ＷＯ２００５／７８００を参照）を鋳型とし、プライマー対（IgG4-mとIgG4-v）でＰＣＲを行うことで、Ｃγ４の５'末端に制限酵素Nhe Iの認識配列を、３'末端に、停止コドンを除去し、代わりに制限酵素Bam HIの認識配列を有する遺伝子断片を増幅した。この断片を制限酵素Nhe IおよびBam HIで切断し、遺伝子断片Ｃを調製した。
【００６６】
pTK-2232を鋳型としたＰＣＲを行い、２種類のプライマー対（IgG4-mとIgG4-s）および（IgG4-rとIgG4-v）で各遺伝子断片をそれぞれ増幅した。これらの遺伝子断片を混合して鋳型とし、再度プライマー対（IgG4-mとIgG4-v）でＰＣＲを行うことで、重鎖間の2量体化に必要な２つのシステイン残基をグリシン残基に置換し、５'末端に制限酵素Nhe Iの認識配列を、３'末端には停止コドンの代わりに制限酵素Bam HIの認識配列を有する遺伝子断片を増幅した。この断片を制限酵素Nhe I およびBam HIで切断し、遺伝子断片Ｄを調製した。
【００６７】
ＨｅＬａゲノムＤＮＡを鋳型とし、プライマー（BsiWI-hIgKおよびIgK-e）によるＰＣＲを行い、ヒト軽鎖定常領域（Ｃκ）を増幅し、さらにこの増幅産物をpT7BlueTベクターへクローニングし、pT7-hIgKを構築した。このプラスミドから、ヒト軽鎖定常領域を切り出すことができる適当な制限酵素（Bsi WIとBam HI）を用いて、断片Ｅを調製した。
【００６８】
ヒトＵＴＩ第１ドメインおよび第２ドメイン（Ｄ１Ｄ２）を有するプラスミドpM1213を鋳型とし、プライマー対（ＵＴＩ-ａとＵＴＩ-ｃ）によるＰＣＲで、Ｄ１Ｄ２の５'末端に制限酵素Bam HIの認識配列を、３'末端は停止コドンの直後に制限酵素Not I認識配列を有する遺伝子断片を増幅した。この断片をBam HIおよびNot Iで切断し、遺伝子断片Ｆを調製した。
【００６９】
pM1213を鋳型とし、プライマー対（ＵＴＩ-bとＵＴＩ-c）によるＰＣＲで、Ｄ２の５'末端に制限酵素Bam HIの認識配列を、３'末端は停止コドンの直後に制限酵素Not I認識配列を有する遺伝子断片を増幅した。この断片をBam HIおよびNot Iで切断し、遺伝子断片Ｇを調製した。
【００７０】
ヒトＵＴＩ第２ドメイン３アミノ酸改変体｛Ｄ２(3)｝を有するプラスミドpM765（特開平６−３２１９８９参照）を鋳型とし、プライマー対（ＵＴＩ-ｂとＵＴＩ-ｃ）によるＰＣＲで、Ｄ２(3)の５'末端に制限酵素Bam HIの認識配列を、３'末端は停止コドンの直後に制限酵素Not I認識配列を有する遺伝子断片を増幅した。この断片をBam HIおよびNot Iで切断し、遺伝子断片Ｈを調製した。
【００７１】
pM1213を鋳型とし、プライマー対（ＵＴＩ-ａとＵＴＩ-ｆ）によるＰＣＲで、Ｄ１Ｄ２の５'末端に制限酵素Bam HIの認識配列を、３'末端は停止コドンを除去し、グリシン4残基からなるリンカーを付加し、さらにその直後に制限酵素Eco RV認識配列を有する遺伝子断片を増幅した。この断片をBam HIおよびEco RVで切断し、遺伝子断片Ｉを調製した。
【００７２】
pM1213を鋳型とし、プライマー対（ＵＴＩ-ｂとＵＴＩ-ｆ）によるＰＣＲで、Ｄ２の５'末端に制限酵素Bam HIの認識配列を、３'末端は停止コドンを除去し、グリシン4残基からなるリンカーを付加し、さらにその直後に制限酵素Eco RV認識配列を有する遺伝子断片を増幅した。この断片をBam HIおよびEco RVで切断し、遺伝子断片Ｊを調製した。
【００７３】
pM1213を鋳型とし、プライマー対（ＵＴＩ-ｈとＵＴＩ-ｃ）によるＰＣＲで、Ｄ１Ｄ２の５'末端にグリシン4残基からなるリンカーを付加し、さらにその直前に制限酵素Eco RVの認識配列を、３'末端は停止コドンの直後に制限酵素Not I認識配列を有する遺伝子断片を増幅した。この断片をEco RVおよびNot Iで切断し、遺伝子断片Ｋを調製した。
【００７４】
pM1213を鋳型とし、プライマー対（ＵＴＩ-ｉとＵＴＩ-ｃ）によるＰＣＲで、Ｄ２の５'末端にグリシン4残基からなるリンカーを付加し、さらにその直前に制限酵素Eco RVの認識配列を、３'末端は停止コドンの直後に制限酵素Not I認識配列を有する遺伝子断片を増幅した。この断片をEco RVおよびNot Iで切断し、遺伝子断片Ｌを調製した。
【００７５】
pM1213を鋳型とし、プライマー対（ＵＴＩ-ｈとＵＴＩ-ｇ）によるＰＣＲで、Ｄ１Ｄ２の５'末端にグリシン4残基からなるリンカーを付加し、さらにその直前に制限酵素Eco RVの認識配列を、３'末端は停止コドンを除去し、グリシン4残基からなるリンカーを付加し、さらにその直後に制限酵素Stu I認識配列を有する遺伝子断片を増幅した。この断片をpT7BlueTベクターへクローニングした後、Eco RVとBam HIで切断し、そこへ遺伝子断片Iを結合させ、Ｄ１Ｄ２Ｄ１Ｄ２配列をもつ中間体プラスミドを構築した。さらにBam HIとStu Iで切断し、遺伝子断片Ｍを調製した。
【００７６】
pM1213を鋳型とし、プライマー対（ＵＴＩ-ｉとＵＴＩ-ｇ）によるＰＣＲで、Ｄ２の５'末端にグリシン4残基からなるリンカーを付加し、さらにその直前に制限酵素Eco RVの認識配列を、３'末端は停止コドンを除去し、グリシン4残基からなるリンカーを付加し、さらにその直後に制限酵素Stu I認識配列を有する遺伝子断片を増幅した。この断片をpT7BlueTベクターへクローニングした後、Eco RVとBam HIで切断し、そこへ遺伝子断片Jを結合させ、Ｄ２Ｄ２配列をもつ中間体プラスミドを構築した。さらにBam HIとStu Iで切断し、遺伝子断片Ｎを調製した。
【００７７】
ＨｅＬａゲノムＤＮＡを鋳型とし、以下のプライマー対でＰＣＲ反応を行った。その結果、ＳＬＰＩ-ｃおよびＳＬＰＩ-ｅでＰＣＲ増幅産物Ｏ、ＳＬＰＩ-ｄおよびＳＬＰＩ-ｇでＰＣＲ増幅産物Ｐ、ＳＬＰＩ-ａおよびＳＬＰＩ-ｇでＰＣＲ増幅産物Ｒがそれぞれ得られた。
ＯとＰを混合して鋳型とし、再度プライマーＳＬＰＩ-ｃおよびＳＬＰＩ-ｇでＰＣＲ反応を行うことで、両断片が連結された増幅産物Ｑを得た。
この増幅産物ＱおよびＲを、それぞれpT7BlueTベクターにクローニングし、ヒトＳＬＰＩのＳｅｒ１−Ａｌａ１０７（ＳＬＰＩ（Ｄ１Ｄ２）と記載することがある）およびＡｒｇ５８−Ａｌａ１０７（ＳＬＰＩ（Ｄ２）と記載することがある）をコードする配列であることを確認し、pT7-ＳＬＰＩ（Ｄ１Ｄ２）およびpT7-ＳＬＰＩ（Ｄ２）とした。いずれも、ＳＬＰＩの５'側には制限酵素Bgl IIの認識配列、３'側の停止コドンの直後にはNot Iの認識配列を有するように構築した。各プラスミドをそれぞれ制限酵素Bgl IIおよびNot Iで切断し、ＳＬＰＩ（Ｄ１Ｄ２）断片SとＳＬＰＩ（Ｄ２）断片Ｔを調製した。
【００７８】
以上の遺伝子断片を、Eco RI およびNot I、あるいはEco RI およびBam HIで切断して調製した発現ベクターpEF2cewのEF1αプロモーター下流に適切な組み合わせで連結し、各発現プラスミドを構築した。表３に、各発現プラスミド名とベクターに組み込んだ遺伝子断片名をまとめて示す。なお、キメラ抗体軽鎖発現プラスミドpTK-2344はすべての重鎖に対し、共通で使用した。また、各融合蛋白質の構造ならびにヌクレオチド配列および推定アミノ酸配列を図７〜１７ならびに配列表（配列番号１〜２６）に示す。なお、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０および２４のアミノ酸配列において、それぞれアミノ酸番号１−１９はシグナルペプチド配列に対応し、配列番号２２及び２６のアミノ酸配列において、それぞれアミノ酸番号１−２０はシグナルペプチド配列に対応する。よって、実際の本発明の融合蛋白質の推定アミノ酸配列はこれらのシグナルペプチドを除いたアミノ酸配列である。
【００７９】
【表３】
【００８０】
（５）各融合蛋白質の小スケールでの発現および精製
ＣＯＳ-１細胞は１０％牛胎児血清入りのダルベッコＭＥＭ培地で継代し、トランスフェクション前日に、１.５×１０５cells／ｍＬの密度で培養容器に植え込んだ。翌日、軽鎖発現プラスミド（pTK-2344）と各重鎖発現プラスミドを１：１の重量比で混合後、トランスフェクション試薬（FuGENE6、ロシュダイアグノスティックス）と適当量混和した後に、無血清のダルベッコＭＥＭ培地に滴下し、これを培養液と交換することで、トランスフェクションを行った。５％ ＣＯ２存在下、３７℃で２〜３日間培養し、上清を回収した。精製はProsep-Aカラム（MILLIPORE）を用いて行い、ＰＢＳ（ｐＨ７.４）で透析後、２８０ｎｍの吸光度より濃度を算出した。
【００８１】
１-２）キメラ抗体および抗体融合蛋白質の構築（Ｆ１０３１）
（１）ハイブリドーマ抗体遺伝子可変領域のクローニングおよび配列決定（Ｆ１０３１）
ＣＤ１４に結合するが、ＣＤ１４阻害活性のない抗ヒトＣＤ１４抗体、Ｆ１０３１-１３-２抗体（マウスＩｇＧ２ｂ／κ）のＣＤＲ配列を以下の方法で決定した。
まず、Ｆ１０３１-１３-２発現ハイブリドーマより、TRIzolを用いてtotal ＲＮＡを調製し、SuperScript III First-Strand Synthesis System for RT-PCR（Invitrogen）を用いて一本鎖ｃＤＮＡの合成を行った。
一方、マウスＩｇＧ２ｂ重鎖の可変領域増幅用としセンスプライマー１０３１H-ａおよびｍＩｇＧ２ｂ-ｃ、アンチセンスプライマーｍＩｇＧ２ｂ-ａ、を合成し、κ鎖可変領域増幅用としてセンスプライマーＩＧＫＶ４-１-ａおよびＩｇＫ-ｄ、アンチセンスプライマーｒＩｇＫ-ａ、をそれぞれ合成した（表１参照）。
次に合成したハイブリドーマ一本鎖ｃＤＮＡを鋳型に、プライマーは重鎖（ｉ）１０３１H-ａとｍＩｇＧ２ｂ-ａ、重鎖（ii）ｍＩｇＧ２ｂ-ｃとｍＩｇＧ２ｂ-ａ、軽鎖（ｉ）ＩＧＫＶ４-１-ａとｒＩｇＫ-ａ、軽鎖（ii）ＩｇＫ-ｄとｒＩｇＫ-ａとの組み合わせでＰＣＲを行った。ＰＣＲ反応条件は反応液を９６℃で２分熱した後に、９６℃ ３０秒、５５℃ ３０秒、７２℃ ３０秒のサイクルを２５回繰り返した。
得られた産物について直接配列を決定した結果、重鎖（ｉ）（ii）、軽鎖（ｉ）（ii）共に同一の配列であった。尚、軽鎖については５'端が不完全で翻訳開始コドンが確定できなかったため、これまで報告のあるマウスκ鎖において、フレーム領域で相同性を示す配列を検索した。図３および４（配列番号１２７〜１３０）にＦ１０３１-１３-２抗体の可変領域重鎖および軽鎖配列（核酸およびアミノ酸）を示す。尚、下線はプライマー由来の配列である。
【００８２】
（２）キメラ抗体発現プラスミドの構築（Ｆ１０３１）
Ｆ１０３１-１３-２キメラ抗体発現プラスミドは実施例１−１）（Ｆ１０２４キメラ抗体発現プラスミド構築）と同様の方法で構築した。すなわち、上記１−２）（１）で得られた配列を参考に、重鎖発現プラスミド構築用プライマーとして、可変領域の開始コドン直前に制限酵素EcoRI認識配列を付加した５'側プライマー13HcS-EcoRおよび可変領域の３'側配列のアミノ酸配列を変えることなく、ヒト定常領域との連結可能な制限酵素NheI認識部位を付加した３'側プライマー13HcA-Nheを合成した。軽鎖の５'側の配列は確定していないが、相同性検索から５'端側の配列を予想し、可変領域の開始コドン直前に制限酵素EcoRI認識配列を付加した５'側プライマー13LcS-EcoRおよび可変領域の３'側配列のアミノ酸配列を変えることなく、ヒト定常領域との連結可能な制限酵素BsiWI認識部位を付加した３'側プライマー13LcA-BsiWを合成した（表１参照）。
【００８３】
次に、上記１−２）（１）で合成した１本鎖ｃＤＮＡを鋳型に、ＰＣＲを行った。反応条件は９０℃ ２分間で熱した後、（１）９４℃ ３０秒、（２）５０℃ ３０秒、（３）７２℃ １分のサイクルを３０回繰り返した。得られた重鎖構築用ＰＣＲ産物をEcoRIおよびNheIで、軽鎖構築用ＰＣＲ産物はEcoRIおよびBsiWIで消化し、それぞれ約０.４ｋｂの断片を回収した。
次に実施例１−１）で構築したＦ１０２４キメラ抗体重鎖発現プラスミドｐＴＫ-２３７０あるいは軽鎖発現プラスミドｐＴＫ-２３４４をそれぞれEcoRIおよびNheIあるいはEcoRIおよびBsiWIで消化し、それぞれ約５.７ｋｂあるいは４.８ｋｂの断片を回収した。これらに先のＰＣＲ産物由来断片をそれぞれ挿入し、定法に従いＪＭ１０９大腸菌コンピテントセルを形質転換してＦ１０３１-１３-２重鎖発現プラスミドｐＦ３１-１３ＨＵあるいは軽鎖発現プラスミドｐＦ３１-１３Ｌを得た。Ｆ１０３１-１３-２軽鎖の５'端配列については、本構築において新たに確定した配列もあるため、図５および６（配列番号１３１〜１３４）に発現プラスミドの重鎖可変領域および軽鎖可変領域配列について再度示した。尚、下線は構築用のプライマー由来の配列である。
【００８４】
（３）各種キメラ抗体融合蛋白質の発現確認
上記１−２）（２）で構築した重鎖発現プラスミドおよび軽鎖発現プラスミドをＣＯＳ-１細胞へ導入し、キメラ抗体融合蛋白質の発現を確認した。
まず、ＣＯＳ-１細胞を１０％非働化ＦＢＳ含有ＤＭＥＭ培地にて、２.０−２.４×１０５cells／wellで６ウェルプレートへ植え込み、３７℃、５％ＣＯ２条件下で一晩培養した。翌日、FuGENE６ ６μＬと重鎖発現プラスミド１μｇ＋軽鎖発現プラスミド１μｇを混合し、FuGENE６添付プロトコールに従い、ＣＯＳ-１細胞へ滴下した。尚、ＦＢＳ由来イムノグロブリンの混入を防ぐために、FuGENE／plasmid混合液を細胞に滴下する前に以下の操作を行った。ＣＯＳ-１細胞を一晩培養後、細胞の上清を除去し、生産培地（Hybridoma-ＳＦＭ（Invitrogen）もしくはCellgro Complete Serum Free Medium（Mediatech））で２回洗浄を行った。その後、２ｍＬ／wellの生産培地をプレートに添加し、FuGENE／plasmid混合液を細胞に滴下した。３７℃、５％ＣＯ２で３〜４日間培養を続けた後、上清を回収し、上清中に含まれるキメラ抗体融合蛋白質の量を実施例２に記載するＥＩＡ法と同様の操作により確認した。但し、検出に用いたＨＲＰ標識抗体として、ペルオキシダーゼ標識ＵＴＩ抗体の代わりに、ＨＲＰ標識抗ヒトκ軽鎖抗体（DAKO）を用いた。その結果、キメラ抗体は１０−２０μｇ／ｍＬ程度の発現であった。なお、本実験で調製した培養上清を、実施例１−３）(1)のＩＬ-６産生抑制活性実験に用いた。
【００８５】
１−３）活性確認試験
（１）ＩＬ-６産生抑制活性確認試験
実施例１−１）および１−２）で調製した抗体融合蛋白質の抗体機能ドメインの活性について調べるために、以下の実験を行った。
ヒト膠腫由来細胞株U-373 MGを、２％非働化ＦＢＳを含むＭＥＭ培地（SIGMA）にて９６-well plateに、１×１０４cells／wellで植え込み、５％ＣＯ２、３７℃で一晩培養を行った。翌日、以下の溶液をそれぞれ調製した。
１）０.２％ヒト血清アルブミン（SIGMA）を含む生理食塩水（大塚製薬）（以下０.２％ＨＳＡ／生理食塩水と表記）
２）０.２％ヒト血清アルブミン（SIGMA）を含むＭＥＭ培地（以下０.２％ＨＳＡ／ＭＥＭと表記）
３）０.２％ＨＳＡ／生理食塩水と０.２％ＨＳＡ／ＭＥＭを１：１の割合で混合した溶液（以下０.１％ＨＳＡ／1／2ＭＥＭと表記）
４）４％ヒト血清を含むＭＥＭ培地（以下４％ＨＳ／ＭＥＭと表記）
５）ＬＰＳ（E.Coli 0111:Ｂ４、SIGMA）を生理食塩水で１ｍｇ／ｍＬに調製した溶液を１０分間ソニケーションした後に、０.２％ＨＳＡ／ＭＥＭにて２００ｎｇ／ｍＬに希釈した溶液（以下２００ｎｇ／ｍＬ ＬＰＳ Ｂ４と表記）
６）４％ＨＳ／ＭＥＭと２００ｎｇ／ｍＬ ＬＰＳ Ｂ４を９：１の割合で混合した溶液（以下２×（ＨＳ＋ＬＰＳ）と表記）
【００８６】
被験試料を０.２％ＨＳＡ／生理食塩水で目的濃度の２倍濃度に希釈し、サンプルを調製した。一晩培養を行ったＵ-３７３ＭＧ細胞の培養上清を捨て、０.１％ＨＳＡ／1／2ＭＥＭで二度洗浄し、上記サンプルと２×（ＨＳ+ＬＰＳ）とを等量混合した液を１００μＬ／wellずつ添加し、さらに５％ＣＯ２、３７℃で約１８時間培養を行った。その後、培養上清中のＩＬ-６量をヒトＩＬ-６検出キット（Eli-PAIR hIL-6；Invitrogen社）にて定量した。図１８ないし図２０に典型的な試験結果を示す。
その結果、ＣＤ１４阻害活性を示す抗体の場合、キメラ抗体融合蛋白質においても抗体活性は維持されており、ＣＤ１４阻害活性を示さないＦ１０３１-１３-２抗体の場合、キメラ抗体融合蛋白質にしても抑制活性を示さなかった。なお、図２０中、試料未添加のＩＬ-６産生量を１００％（ＩＬ-６％Control）として表記した。
【００８７】
（２）酵素阻害活性確認試験
実施例１−１）および１−２）で調製した抗体融合蛋白質の酵素阻害機能ドメインの活性を確認するためにトリプシン阻害活性を以下のように測定した。
被験試料を０.１mol／ＬNaCl／5mmol／Ｌ CaCl2／20mmol／Ｌ Tris-HCl（ｐＨ７.４）（以下、希釈液）にて終濃度の１０倍濃度となるように希釈調製した。これと併行してヒト膵由来トリプシン（Athens Research and Technology）を０.１w／v％ＢＳＡ／１mmol／Ｌ ＨＣＬにて１μｇ／ｍＬ調製し、また合成基質S2222（テストチーム、第一化学薬品）を水にて４mmol／Ｌに希釈調製した。
各試薬類を調製後、９６ウエルマイクロタイタープレート（Nunc）に希釈液７０μＬ、１μｇ／ｍＬヒトトリプシン溶液を１０μＬ、および被験試料溶液１０μＬを添加し、３７℃にて３分間インキュベーションした。次いで、合成基質S2222溶液を各ウエルに１０μＬ添加して、さらに３７℃にて６０分間インキュベーションした。その後、２０v／v％酢酸水溶液にて反応を停止させ、反応液の４０５ｎｍにおける吸光度を測定した。図２１に典型的な試験結果を示す。その結果、キメラ抗体融合蛋白質においても酵素阻害活性はほぼ維持されていた。
【００８８】
（実施例２）抗体融合蛋白質の大量調製
（１）Ｆ１０２４Ｓ-Ｄ２(3)およびＦ１０３１-１３Ｓ-Ｄ２(3)の大量生産
Ｆ１０２４Ｓ-Ｄ２(3)を大量生産するためにＣＯＳ-１細胞を利用した一過性発現の系を用いた。すなわち、CellsTACK-１０ Chamber（Corning）に１０％非働化ＦＢＳおよび１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７.０−７.６）を含むＤＭＥＭ培地１７００ｍＬを添加し、これに２１×１０６のＣＯＳ-１細胞を植え込んだ。CellsTACK-１０ Chamber内を５％ＣＯ２を含む混合ガスに置換した後、密栓し、３７℃でインキュベーションした。
４日後に以下の手順にてトランスフェクションを行った。
まず、ＤＭＥＭ培地６３.６ｍＬにFuGENE６トランスフェクション試薬（ロシュ・ダイアグノスティックス株式会社）２.１２ｍＬを添加・混合した。５分後に実施例１で調製した重鎖をコードするプラスミドｐＴＫ２３７０および軽鎖をコードするプラスミドpTK2344を各５３０μｇずつ添加し、混合後、１５分間室温で静置した。一方、CellsTACK-１０ Chamberの培地を１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７.０−７.６）を含むHybridoma-ＳＦＭ（インビトロジェン株式会社）（以下、生産培地）１３００ｍＬに交換し、調製したトランスフェクション試薬・プラスミド混合溶液を添加した。３７℃で３日間インキュベーションした後、生産培地を回収した。さらに、CellsTACK-１０ Chamberに新しい生産培地１３００ｍLを添加し、４日後に再度生産培地を回収した。
また、Ｆ１０３１-１３Ｓ-Ｄ２(3)についても、実施例１で調製した重鎖をコードするプラスミドｐＦ３１-１３ＨＵおよび軽鎖をコードするプラスミドＦ３１-１３Ｌを用いて同様に生産した。
【００８９】
（２）Ｆ１０２４Ｓ-Ｄ２(3)およびＦ１０３１-１３Ｓ-Ｄ２(3)の測定系（ＥＩＡ）
サンドイッチＥＩＡ法によりＦ１０２４Ｓ-Ｄ２(3)濃度を測定した。
固相化蛋白質として、実施例６と同様の方法で調製した、ヒトＣＤ１４の全長３５６アミノ酸からなる組換ヒトＣＤ１４、および、標識抗体として、特開２００２−１４１０４に記載された手順に従って作製したペルオキシダーゼ標識ＵＴＩ抗体を用いたサンドイッチＥＩＡ系を作製した。
標準品として実施例１にて調製したＦ１０２４Ｓ-Ｄ２(3)を用いた。すなわち、組換ヒトＣＤ１４をＰＢＳ（ｐＨ７.４）で４μｇ／ｍＬに希釈し、NUNC-Immuno plate Maxisorp（NUNC）の各ウェルに５０μＬ添加した。４℃で一晩反応後、０.０５％Tween２０／０.９％塩化ナトリウム溶液で３回洗浄し、２％StabilGuard（SurModics, Inc.）を含むＰＢＳ（ｐＨ７.４）を各ウェルに１００μＬ添加し、ブロッキングした。次に０.１％ＢＳＡを含むＰＢＳ（ｐＨ７.４）を希釈液として測定試料および標準品の希釈検体を調製した。同時に１０％ウサギ血清を含むＰＢＳ（ｐＨ７.４）で希釈したペルオキシダーゼ標識ＵＴＩ抗体を調製した。各ウェルに、希釈したペルオキシダーゼ標識抗体２５μＬおよび希釈検体２５μＬを添加し、３７℃で１時間反応させた。反応終了後、０.０５％Tween２０／０.９％塩化ナトリウム溶液で３回洗浄し、テトラメチルベンジジン溶液（BioFX）を各ウェルに５０μＬずつ添加した。室温で約２０分反応後、１ｍｏｌ／Ｌ塩酸溶液５０μＬで反応停止し、プレート分光光度計で４５０ｎｍの吸光度を測定した。
また、Ｆ１０３１-１３Ｓ-Ｄ２(3)についても同様に濃度を測定した。ただし、標準品として濃度既知のＦ１０３１-１３Ｓ-Ｄ２(3)を用いた。
【００９０】
（３）Ｆ１０２４Ｓ-Ｄ２(3)大量精製
以下の操作は特に記載のない限り、４℃にて実施した。
実施例２（１）で生産されたＣＯＳ培養上清を１μｍのカプセルカートリッジフィルター（アドバンテック東洋）に、０.２２μｍのフロロダインII-DFLPフィルター（日本ポール）を接続し、培養上清中の不溶物を除去した。このろ過液を予めＰＢＳ（シグマ）にて平衡化したProSep-ｖＡカラム（日本ミリポア株式会社）に供し、非吸着成分をＰＢＳにて洗い流した。更に非特異的に吸着している成分を１０×ＰＢＳ（シグマ）にて洗い流した後、２５ｍＭ Glycine-ＨＣｌ（ｐＨ２.５）にて溶出し、Ｆ１０２４Ｓ-Ｄ２(3)を回収した。得られた溶出画分はMacIlvaineバッファーを加えｐＨ５に調製した。溶出液に認められた沈殿を遠心分離により除去後、遠心上清液を分子量カットオフ１０，０００の透析チューブ（SPECTRUM社）を用い生理食塩液に対して透析し、得られた透析液を精製標品とした。
【００９１】
（４）Ｆ１０３１-１３Ｓ-Ｄ２(3)の大量精製
以下の操作は特に記載のない限り、４℃にて実施した。
実施例２（１）で生産されたＣＯＳ培養上清を１μｍのカプセルカートリッジフィルター（アドバンテック東洋）に、０.２２μｍのフロロダインII-DFLPフィルター（日本ポール）を接続し、培養上清中の不溶物を除去した。このろ過液を予めＰＢＳ（シグマ）にて平衡化したProSep-ｖＡカラムに供し、非吸着成分をＰＢＳにて洗い流した。更に非特異的に吸着している成分を１Ｍ塩化ナトリウム溶液にて洗い流した後、１００ｍＭ Glycine-ＨＣｌ（ｐＨ２.７）にて溶出し、Ｆ１０３１-１３Ｓ-Ｄ２(3)を回収した。得られた溶出画分は１Ｍトリス塩酸ｐＨ８.０を加え中和した。これを分子量カットオフ３,５００の透析チューブ（SPECTRUM社）を用い生理食塩液に対して透析した。さらにＹＭ１０限外ろ過膜（日本ミリポア株式会社）を用いて濃縮し、得られた濃縮液を精製標品とした。
【００９２】
（実施例３）効力評価（in vitro）
３−１）抗体活性の確認
（１）ヒト血管内皮細胞のＬＰＳ誘導ＩＬ-６産生に対する阻害活性の確認
ヒト臍帯静脈血管内皮細胞（HUVEC、三光純薬社）を０.０５％トリプシン、０.０２％ ＥＤＴＡを含むＰＢＳ（−）で剥離後、ヒト血清（TENNESSEE BLOOD SERVICE社）を１０％含むＲＰＭＩ-１６４０培地（SIGMA社）にて懸濁し、９６ウェルプレートに２×１０４細胞／wellで播種し、３７℃、５％ＣＯ２の条件下で一晩培養した。培養後、ＬＰＳ（WE.coli 055：Ｂ５、DIFCO社）を終濃度が１０ｎｇ／ｍＬとなるように添加すると同時に、Ｆ１０２４Ｓ-Ｄ２(3)を終濃度が０.０３、０.１、０.３、１、３、１０μｇ／ｍＬとなるように添加した。３７℃、５％ＣＯ２の条件下で６時間培養した後、培養上清中のＩＬ-６を、添付のプロトコールに従い、ヒトＩＬ-６ ＥＩＡキット（DIACLONE Research社）で測定した。Ｆ１０２４Ｓ-Ｄ２(3)のＩＬ-６産生阻害のＩＣ５０値は、０.３８μｇ／ｍＬであった。この結果より、Ｆ１０２４Ｓ-Ｄ２(3)がグラム陰性菌の菌体成分であるＬＰＳにより誘導される、ヒト血管内皮細胞のサイトカイン産生を抑制することが示された。
Ｆ１０３１-１３Ｓ-Ｄ２(3)、Ｆ１０２４Ｄ-ＳＬＰＩ（Ｄ１Ｄ２）、Ｆ１０２４Ｄ-ＳＬＰＩ（Ｄ２）、Ｆ１０２４Ｓ-ＳＬＰＩ（Ｄ１Ｄ２）またはＦ１０２４Ｓ-ＳＬＰＩ（Ｄ２）の阻害活性を同様のアッセイ系を用いて評価する。
【００９３】
（２）ヒト血管内皮細胞のＬＰＳ誘導Ｅ−Selectin発現に対する阻害活性の確認
ヒト臍帯静脈血管内皮細胞（HUVEC、三光純薬社）を実施例３−１）（１）に示す方法で播種し、培養後、ＬＰＳ（WE.coli 055：Ｂ５、DIFCO社）を終濃度が１０ｎｇ／ｍＬとなるように添加すると同時に、Ｆ１０２４Ｓ-Ｄ２(3)を終濃度が０.０３、０.１、０.３、１、３、１０μｇ／ｍＬとなるように添加した。３７℃、５％ＣＯ２の条件下で６時間培養した後に、培養液を除去し、ＰＢＳ（−）で２回洗浄した。ドライヤーで乾燥させた後に、２％パラホルムアルデヒドを含有するＰＢＳ（−）を１００μＬ／wellで添加した。室温で２０分間インキュベーションした後に、ＰＢＳ（−）で３回洗浄した。１％ヒト血清を含有するＲＰＭＩ１６４０で希釈したビオチン化抗ヒトＥ-Selectin抗体（コスモ・バイオ社）を１００μＬ／wellで添加し、室温で６０分間インキュベーションした。その後、ＰＢＳ（−）で３回洗浄し、ペルオキシダーゼ標識したストレプトアビジン溶液（DAKO Cytomation社）を１００μＬ／wellで添加し、室温で３０分間インキュベーションした。洗浄後、発色基質（ＴＭＢ）を１００μＬ／wellで添加し、室温で３０分間反応させた後に、２Ｎ硫酸を１００μＬ／wellで加えて反応を停止した。４５０ｎｍと６５０ｎｍの波長での吸光度を測定し、ΔＯＤ（４５０ｎｍ−６５０ｎｍ）をＥ-Selectinの発現量とした。Ｆ１０２４Ｓ-Ｄ２(3)のＥ-Selectin発現阻害のＩＣ５０値は、０.４３μｇ／ｍＬであった。この結果より、Ｆ１０２４Ｓ-Ｄ２(3)がＬＰＳにより誘導されるヒト血管内皮細胞の接着分子発現を抑制することが示された。
Ｆ１０３１-１３Ｓ-Ｄ２(3)およびＦ１０２４Ｄ-ＳＬＰＩ（Ｄ１Ｄ２）、Ｆ１０２４Ｄ-ＳＬＰＩ（Ｄ２）、Ｆ１０２４Ｓ-ＳＬＰＩ（Ｄ１Ｄ２）またはＦ１０２４Ｓ-ＳＬＰＩ（Ｄ２）の阻害活性を同様のアッセイ系を用いて評価する。
【００９４】
（３）ヒト末梢血単核球のＬＰＳ誘導ＴＮＦ-α産生に対する阻害活性の確認
正常ヒト末梢血単核球（ｈＰＢＭＣ、Bio Whittaker社）を、１０％ヒト血清および２５ｍＭ ＨＥＰＥＳ（SIGMA社）を含有するＲＰＭＩ１６４０で懸濁し、９６ウェルプレートに２.５×１０５細胞／wellで播種した。Ｆ１０２４Ｓ-Ｄ２(3)を終濃度が０.１、０.３、１、３、１０、３０μｇ／ｍＬとなるように添加し、室温で２０分間静置した後に、ＬＰＳ（WE.coli 055：Ｂ５、DIFCO社）を終濃度が０.１ｎｇ／ｍＬとなるように添加した。３７℃、５％ＣＯ２の条件下で６時間培養した後、培養上清中のＴＮＦ-αを、添付のプロトコールに従い、ヒトＴＮＦ-α ＥＩＡキット（DIACLONE Research社）で測定した。
Ｆ１０２４Ｓ-Ｄ２(3)のＴＮＦ-α産生阻害のＩＣ５０値は、０.５８μｇ／ｍＬであった。この結果より、Ｆ１０２４Ｓ-Ｄ２(3)がＬＰＳにより誘導されるヒト白血球のサイトカイン産生を抑制することが示された。
Ｆ１０３１-１３Ｓ-Ｄ２(3)およびＦ１０２４Ｄ-ＳＬＰＩ（Ｄ１Ｄ２）、Ｆ１０２４Ｄ-ＳＬＰＩ（Ｄ２）、Ｆ１０２４Ｓ-ＳＬＰＩ（Ｄ１Ｄ２）またはＦ１０２４Ｓ-ＳＬＰＩ（Ｄ２）の阻害活性を同様のアッセイ系を用いて評価する。
【００９５】
（４）ヒト末梢血単核球のＬＰＳ誘導Procoagulant Activity（ＰＣＡ）促進に対する阻害活性の確認
正常ヒト末梢血単核球（ｈＰＢＭＣ、Bio Whittaker社）を実施例３−１）（３）に示す方法で播種し、Ｆ１０２４Ｓ-Ｄ２(3)を終濃度が０.１、０.３、１、３、１０、３０μｇ／ｍＬとなるように添加し、室温で２０分間静置した後に、ＬＰＳ（WE.coli 055：Ｂ５、DIFCO社）を終濃度が０.１ｎｇ／ｍＬとなるように添加した。３７℃、５％ＣＯ２の条件下で６時間培養し、細胞懸濁液のＰＣＡを正常ヒト血漿（DADE BEHRING社）を用いて測定した。すなわち、０.１５Ｍ ＮａＣｌおよび０.１％ＢＳＡを含有する５０ｍＭ Tris-ＨＣｌ（ｐＨ７.４）溶液で２.５倍希釈した後、２０秒間超音波破砕（SHIMAZU社）し、このサンプルを血液凝固測定装置（ＡＭＡＸ ＣＳ１９０、エム・シー・メディカル社）にセットした。血液凝固測定装置にてサンプルを２０μＬ分取し、２５ｍＭ ＣａＣｌ２を２０μＬ添加して、３７℃で３分間インキュベートした。正常ヒト血漿を９０μＬ添加して凝固反応を開始し、凝固時間を測定した。凝固時間から算出したＦ１０２４Ｓ-Ｄ２(3)のＰＣＡ阻害のＩＣ５０値は、２０.８６μｇ／ｍＬであった。この結果より、Ｆ１０２４Ｓ-Ｄ２(3)がＬＰＳに誘導されるヒト白血球のＰＣＡ促進を抑制することが示された。
Ｆ１０３１-１３Ｓ-Ｄ２(3)およびＦ１０２４Ｄ-ＳＬＰＩ（Ｄ１Ｄ２）、Ｆ１０２４Ｄ-ＳＬＰＩ（Ｄ２）、Ｆ１０２４Ｓ-ＳＬＰＩ（Ｄ１Ｄ２）またはＦ１０２４Ｓ-ＳＬＰＩ（Ｄ２）の阻害活性を同様のアッセイ系を用いて評価する。
【００９６】
（５）ＬＰＳによるウサギ全血のＴＮＦ-α産生に対する阻害活性の確認
雄性ウサギ（ニュージーランドホワイト種、３.４ｋｇ、北山ラベス）の耳動脈よりヘパリン（持田製薬）を１０unit／ｍＬ添加して採血した全血をマイクロチューブに移し、Ｆ１０２４Ｓ-Ｄ２(3)を終濃度が０.３、１、３、１０、３０μｇ／ｍＬとなるように添加した。室温で３０分間静置した後に、ＬＰＳ（WE.coli 055：Ｂ５、DIFCO社）を終濃度が０.１ｎｇ／ｍＬとなるように添加した。
３７℃で６時間インキュベーションした後、４℃、８０００ｒｐｍ（TOMY社）の条件で１０分間遠心して血漿分離し、血漿中のＴＮＦ-αを抗ウサギＴＮＦ-α抗体を用いたサンドイッチＥＬＩＳＡで測定した。すなわち、１％ＢＳＡを含有するＰＢＳ（−）で希釈した血漿１００μＬを抗ウサギＴＮＦ-α抗体（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社）を４μｇ／ｍＬで固相化したプレートに移し、室温で２時間インキュベーションした。０.０５％Tween２０を含むＰＢＳ（−）４００μＬ／wellで３回洗浄し、ビオチン化抗ウサギＴＮＦ-α抗体溶液（２μｇ／ｍＬ、ＢＤ Biosciences社）を１００μＬ／wellで添加し、室温で１時間インキュベートした。洗浄後、ペルオキシダーゼ標識したストレプトアビジン溶液（Invitrogen社）を１００μＬ／wellで添加し、室温で３０分間インキュベーションを行った。洗浄後、発色基質（ＴＭＢ）を１００μＬ／wellで添加し、室温で３０分間反応させた後に、２Ｎ硫酸を１００μＬ／wellで加えて反応を停止した。４５０ｎｍと６５０ｎｍの波長での吸光度を測定し、サンプル中のＴＮＦ-α産生量を算出した。Ｆ１０２４Ｓ-Ｄ２(3)のＴＮＦ-α産生阻害のＩＣ５０値は、０.８３μｇ／ｍＬであった。この結果より、Ｆ１０２４Ｓ-Ｄ２(3)がＬＰＳにより誘導されるウサギ全血のサイトカイン産生を抑制することが示された。
Ｆ１０３１-１３Ｓ-Ｄ２(3)およびＦ１０２４Ｄ-ＳＬＰＩ（Ｄ１Ｄ２）、Ｆ１０２４Ｄ-ＳＬＰＩ（Ｄ２）、Ｆ１０２４Ｓ-ＳＬＰＩ（Ｄ１Ｄ２）またはＦ１０２４Ｓ-ＳＬＰＩ（Ｄ２）の阻害活性を同様のアッセイ系を用いて評価する。
【００９７】
３−２）酵素阻害活性の確認
Ｆ１０２４Ｓ-Ｄ２(3)およびＦ１０２４Ｄ-Ｄ２(3)の酵素阻害機能ドメインの活性を確認するために、各種酵素に対する阻害活性を以下のように測定した。また、各測定系において、活性測定用サンプルの蛋白質濃度は、ウシγグロブリン（日本バイオ・ラッド ラボラトリーズ株式会社）をスタンダードとしてプロテインアッセイ染色液（日本バイオ・ラッド ラボラトリーズ株式会社）を用いて測定し、抗体融合蛋白質の推定分子量よりモル濃度に換算した。試験結果を図２２ないし２５に示す。各図の縦軸は各種酵素の残存活性、横軸は活性測定用サンプルの反応液中の濃度を示す。
【００９８】
（１）FactorＸａ阻害活性
Ｆ１０２４Ｓ-Ｄ２(3)およびＦ１０２４Ｄ-Ｄ２(3)を０.１４Ｍ塩化ナトリウム／５ｍＭ塩化カルシウム／２０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７.４）と１０％ＢＳＡを９９：１の比率で混合した希釈液（以下、希釈液）で段階希釈し、阻害活性測定用サンプルとした。これと併行して、Human FactorＸａ（Enzyme Research Laboratories）を希釈液にて０.１Ｕ／ｍＬとなるよう調製し、FactorＸａ溶液とした。また、合成基質Ｓ-２２２２（第一化学薬品株式会社）を希釈液にて２ｍＭとなるよう調製し、Ｓ-２２２２溶液とした。各試薬類を調製後、９６ウェルマイクロタイタープレート（Nunc）に、阻害活性測定用サンプル１０μＬ、希釈液５０μＬおよびFactorＸａ溶液２０μＬを添加し、３７℃で５分間インキュベーションした。次いで、Ｓ-２２２２溶液を各ウェルに２０μＬ添加して、さらに３７℃で３０分間インキュベーションした。その後、各ウェルに２０％酢酸溶液５０μＬを添加して反応を停止し、反応液の波長４０５ｎｍにおける吸光度を測定した。
【００９９】
なお、コントロールとして、希釈液６０μＬにFactorＸａ溶液２０μＬを混合し、３７℃で５分間インキュベーションした後、Ｓ-２２２２溶液２０μＬを加え、３７℃で３０分間インキュベーション後、２０％酢酸溶液５０μＬを加えたものを使用した。図２２に示す結果より、ＦＸａ阻害活性を保持していることが確認された。
Ｆ１０３１-１３Ｓ-Ｄ２(3)の阻害活性を同様のアッセイ系を用いて評価する。
【０１００】
（２）FactorXIａ阻害活性
Ｆ１０２４Ｓ-Ｄ２(3)およびＦ１０２４Ｄ-Ｄ２(3)を希釈液（既出）で段階希釈し、阻害活性測定用サンプルとした。これと併行して、Human FactorXIａ（American Diagnostica Inc.）を希釈液にて７５０ｎｇ／ｍＬとなるよう調製し、FactorXIａ溶液とした。また、合成基質Ｓ-２３６６（第一化学薬品株式会社）を水にて５ｍＭとなるよう調製し、Ｓ-２３６６溶液とした。
各試薬類を調製後、９６ウェルマイクロタイタープレート（Nunc）に、阻害活性測定用サンプル１０μＬ、希釈液６０μＬおよびFactorXIａ溶液１０μＬを添加し、３７℃で５分間インキュベーションした。次いで、Ｓ-２３６６溶液を各ウェルに２０μＬ添加して、さらに３７℃で３０分間インキュベーションした。その後、各ウェルに２０％酢酸溶液１００μＬを加えて反応を停止させ、反応液の波長４０５ｎｍにおける吸光度を測定した。
【０１０１】
なお、コントロールとして、希釈液７０μＬにFactorXIａ溶液１０μＬを混合し、３７℃で５分間インキュベーションした後、Ｓ-２３６６溶液２０μＬを加え、３７℃で３０分間インキュベーション後、２０％酢酸溶液１００μＬを加えたものを使用した。
図２３に示す結果より、Ｄ２(3)がＦXIａ阻害活性を有することが判明した。
Ｆ１０３１-１３Ｓ-Ｄ２(3)の阻害活性を同様のアッセイ系を用いて評価する。
【０１０２】
（３）エラスターゼ阻害活性
Ｆ１０２４Ｓ-Ｄ２(3)およびＦ１０２４Ｄ-Ｄ２(3)を希釈液（既出）で段階希釈し、阻害活性測定用サンプルとした。これと併行して、５００ｍＭ塩化ナトリウム／５０ｍＭ酢酸ナトリウム（ｐＨ５.５）に溶解して凍結保存していたElastase，Human Neutrophil（Athens Research ＆ Technology）を希釈液にて２０μｇ／ｍＬとなるよう調製し、エラスターゼ溶液とした。また、合成基質Ｓ-２４８４（第一化学薬品株式会社）はジメチルスルホキシドに溶解して冷蔵保存し、使用時に水にて２ｍＭとなるよう調製し、Ｓ-２４８４溶液とした。
各試薬類を調製後、９６ウェルマイクロタイタープレート（Nunc）に、阻害活性測定用サンプル１０μＬ、希釈液７０μＬおよびエラスターゼ溶液１０μＬを添加し、３７℃で３分間インキュベーションした。次いで、Ｓ-２４８４溶液を各ウェルに１０μＬ添加して、さらに３７℃で正確に１０分間インキュベーションした。その後、各ウェルに２０％酢酸溶液５０μＬを加えて反応を停止させ、反応液の波長４０５ｎｍにおける吸光度を測定した。
【０１０３】
なお、コントロールとして、希釈液８０μＬにエラスターゼ溶液１０μＬを混合し、３７℃で３分間インキュベーションした後、Ｓ-２４８４溶液１０μＬを加え、３７℃で正確に１０分間インキュベーション後、２０％酢酸溶液５０μＬを加えたものを使用した。図２４に示す結果より、エラスターゼ阻害活性を保持していることが確認された。
Ｆ１０３１-１３Ｓ-Ｄ２(3)およびＦ１０２４Ｄ-ＳＬＰＩ（Ｄ１Ｄ２）、Ｆ１０２４Ｄ-ＳＬＰＩ（Ｄ２）、Ｆ１０２４Ｓ-ＳＬＰＩ（Ｄ１Ｄ２）またはＦ１０２４Ｓ-ＳＬＰＩ（Ｄ２）のの融合蛋白質の阻害活性を同様のアッセイ系を用いて評価する。
【０１０４】
（４）血漿カリクレイン
Ｆ１０２４Ｓ-Ｄ２(3)およびＦ１０２４Ｄ-Ｄ２(3)を希釈液（既出）で段階希釈し、阻害活性測定用サンプルとした。これと併行して、Kallicrein from Human plasma（SIGMA-Aldrich Co.）を希釈液にて２０ｍＵ／ｍＬとなるよう調製し、血漿カリクレイン溶液とした。また、合成基質Ｓ-２３０２（第一化学薬品株式会社）を水にて４ｍＭとなるよう調製し、Ｓ-２３０２溶液とした。
各試薬類を調製後、９６ウェルマイクロタイタープレート（Nunc）に、阻害活性測定用サンプル１０μＬ、希釈液７０μＬおよび血漿カリクレイン溶液１０μＬを添加し、３７℃で３分間インキュベーションした。次いで、Ｓ-２３０２溶液を各ウェルに１０μＬ添加して、さらに３７℃で３０分間インキュベーションした。その後、各ウェルに２０％酢酸溶液５０μＬを加えて反応を停止させ、反応液の波長４０５ｎｍにおける吸光度を測定した。
【０１０５】
なお、コントロールとして、希釈液８０μＬに血漿カリクレイン溶液１０μＬを混合し、３７℃で３分間インキュベーションした後、Ｓ-２３０２溶液１０μＬを加え、３７℃で３０分間インキュベーション後、２０％酢酸溶液５０μＬを加えたものを使用した。図２５に示す。
Ｆ１０３１-１３Ｓ-Ｄ２(3)の阻害活性を同様のアッセイ系を用いて評価する。
【０１０６】
３−３）凝固阻害作用の確認
（１）ヒトおよびウサギにおける活性化部分トロンボプラスチン時間（ＡＰＴＴ）延長作用の確認
正常ヒト血漿は、デイドサイトロールレベル１（ＤＡＤＥ ＢＥＨＲＩＮＧ社）を使用した。ウサギ血漿は、雄性ウサギ（ニュージーランドホワイト種、２.６〜２.７ｋｇ、北山ラベス）の耳動脈より１／１０容の３.８％クエン酸ナトリウム（血沈用チトラート、岩城製薬）を含むシリンジを用いて採血し、４℃、３０００ｒｐｍ（０５ＰＲ-２２、日立社）の条件で１０分間遠心することにより取得した。
ヒトあるいはウサギ血漿１１３μＬに、Ｆ１０２４Ｓ-Ｄ２(3)）溶液２０μＬを終濃度が０、１.５６、３.１３、６.２５、１２.５、２５、５０、１００μg／ｍＬとなるように添加し、血液凝固測定装置（ＡＭＡＸ ＣＳ１９０、エム・シー・メディカル社）にセットした。血液凝固測定装置にて混合液から５０μＬを分取し、ＡＰＴＴ測定用試薬（ＤＡＤＥ BEHRING社）５０μＬを加え、２分間インキュベーションした後に、２５ｍＭ ＣａＣｌ２を５０μＬ添加して、凝固時間を測定した。その結果、Ｆ１０２４Ｓ-Ｄ２(3)は、濃度に依存してヒトおよびウサギＡＰＴＴを延長し、ヒトおよびウサギのＡＰＴＴ１.５倍延長濃度は、それぞれ９.０６μｇ／ｍＬおよび４０.９６μｇ／ｍＬであった。
Ｆ１０３１-１３Ｓ-Ｄ２(3)のＡＰＴＴ延長を同様のアッセイ系を用いて評価する。
【０１０７】
（実施例４）in vivoにおける有効性の評価
４−１）ＬＰＳ負荷ウサギ敗血症モデルにおける融合蛋白質の生存率改善効果
ＬＰＳ負荷ウサギ敗血症致死モデルを作製し、融合蛋白質の後投与での生存率改善を検討した。
ＬＰＳ負荷ウサギ敗血症モデルを、Schimkeらの方法（Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 95:13875, 1998）に準じ、ニュージーランドホワイト種（１.８−２.６ｋｇ、北山ラベス）にＬＰＳ（Salmonella Minnesota Re595、SIGMA社）を１５μｇ／ｋｇで０、５および２４時間に耳静脈内投与して作製した。Ｆ１０２４Ｓ-Ｄ２(3)を１ｍｇ／ｋｇの用量で２、８および２３時間に耳介静脈内投与した。対照群には融合蛋白質の替わりにヒト免疫グロブリンを投与した。４８時間まで生死を観察し、カプランマイヤー生存曲線を描いた。その結果、Ｆ１０２４Ｓ-Ｄ２(3)投与により、対照群に比べて生存率が改善された（図２６）。
同試験系において、Ｆ１０２４Ｄ-ＳＬＰＩ（Ｄ１Ｄ２）、Ｆ１０２４Ｄ-ＳＬＰＩ（Ｄ２）、Ｆ１０２４Ｓ-ＳＬＰＩ（Ｄ１Ｄ２）またはＦ１０２４Ｓ-ＳＬＰＩ（Ｄ２）の投与も生存率改善作用を示す。
【０１０８】
４−２）ＬＰＳ負荷ウサギ敗血症モデルにおける融合蛋白質の炎症および凝固パラメーター改善効果
ＬＰＳ負荷ウサギ敗血症モデルを作製し、融合蛋白質の後投与での炎症および凝固パラメーターへの影響を検討した。
ＬＰＳ負荷ウサギ敗血症モデルは、Schimkeらの方法（Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 95:13875, 1998）に準じ、ニュージーランドホワイト種（１.８−２.６ｋｇ、北山ラベス）にＬＰＳ（Salmonella Minnesota Re595、SIGMA社）を１０μｇ／ｋｇで０、５および２４時間に耳静脈内投与して作製した。Ｆ１０２４Ｓ-Ｄ２(3)を０.３、１および３ｍｇ／ｋｇの用量で２、８および２３時間に耳介静脈内投与した。対照群には融合蛋白質の替わりにヒト免疫グロブリンの３ｍｇ／ｋｇを投与した。
【０１０９】
ＬＰＳ投与前、ならびに投与１.５、２５、２６および２８時間後に耳介動脈採血（クエン酸加血）し、炎症パラメーターおよび凝固パラメーターを測定した。
炎症パラメーターは白血球数および血漿中ＴＮＦ−濃度、凝固パラメーターは血小板数および血漿中アンチトロンビンIII活性とした。
血球数はSysmex Ｆ-８２０（シスメックス株式会社）を用いて計数した。ＴＮＦ-α濃度はPurified Goat Anti-rabbit ＴＮＦ polyclonal Antibody（ＢＤ Biosciences）およびBiotinylated Mouse Anti-rabbit ＴＮＦ-α monoclonal Antibody（ＢＤ Biosciences）によるサンドイッチＥＬＩＳＡ法にて測定した。
アンチトロンビンIII活性はテストチームＡＴIII・２キット（第一化学薬品株式会社）を用いて測定した。
【０１１０】
なお，血漿中ＴＮＦ−α濃度はサンドイッチＥＬＩＳＡの検出感度である０.４ｎｇ／ｍＬ以上および未満をそれぞれ陽性および陰性とした。その結果、Ｆ１０２４Ｓ-Ｄ２(3)投与群は対照群と比較して、用量依存的な白血球数の減少（図２７）、血漿中ＴＮＦ-α濃度の上昇（表４）、血小板数の減少（図２８）およびアンチトロンビンIII活性の減少（図２９）を改善した。以上の結果より、Ｆ１０２４Ｓ-Ｄ２(3)による炎症および凝固パラメーターの改善が明らかとなった。
同試験系においてＦ１０３１-１３Ｓ-Ｄ２(3)投与群は対照群と比較して、白血球数の減少、血漿中ＴＮＦ-α濃度の上昇、血小板数の現象およびアンチトロンビンIII活性の減少に対して改善作用を示す。
【０１１１】
【表４】
【０１１２】
４-３）ＬＰＳ負荷ウサギ敗血症モデルにおける融合蛋白質の血圧低下改善効果
ＬＰＳ負荷ウサギ敗血症モデルを作製し、融合蛋白質の後投与での血圧低下改善効果を検討した。
ＬＰＳ負荷ウサギ敗血症モデルは、Schimkeらの方法（Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 95:13875, 1998）に準じ、ニュージーランドホワイト種（１.８-２.６ｋｇ、北山ラベス）にＬＰＳ（Salmonella Minnesota Re595、SIGMA社）を５μｇ／ｋｇで０および５時間に耳静脈内投与して作製した。Ｆ１０２４Ｓ-Ｄ２(3)は１ｍｇ／ｋｇの用量でＬＰＳ初回投与後２時間に耳介静脈内投与した。対照群には融合蛋白質の替わりにヒト免疫グロブリンの１ｍｇ／ｋｇを投与した。
ＬＰＳ投与前、ならびに投与４、６および８時間後に頸動脈に挿入したカテーテルを血圧トランスデューサー（DT-XX、日本BDメディカルシステムズ）に接続して平均動脈血圧を測定した。その結果、Ｆ１０２４Ｓ-Ｄ２(3)投与群は対照群と比較して血圧低下が改善された（図３０）。
同試験系においてＦ１０３１-１３Ｓ-Ｄ２(3)投与群は対照群と比較して血圧低下を改善することが確認される。
【０１１３】
（実施例５）抗体融合蛋白質の安定生産株の樹立
５−１）Ｆ１０２４Ｓ-Ｄ２(3)およびＦ１０２４Ｄ-Ｄ２(3)生産株用発現プラスミドの構築
Ｆ１０２４Ｓ-Ｄ２(3)およびＦ１０２４Ｄ-Ｄ２(3)を生産する安定生産株の樹立に用いる発現プラスミドは以下の方法で構築した。
実施例１で構築したＦ１０２４Ｓ-Ｄ２(3)重鎖発現プラスミドｐＴＫ-２３７０あるいはＦ１０２４Ｄ-Ｄ２(3)重鎖発現プラスミドｐＴＫ-２３６８をそれぞれEcoRIおよびＫｐｎＩで消化し、約１.７ｋｂの断片を回収した。また、マウスＤＨＦＲ発現ユニット、ＥＦ１αプロモーターを持つ発現プラスミドｐＭ１１０３（ＷＯ９７／４２３１９参照）を、同様にEcoRIおよびＫｐｎＩで消化し、約７.９ｋｂの断片を回収した。それぞれの重鎖発現プラスミドの消化断片と、ｐＭ１１０３消化断片をライゲーションした後、定法に従いＪＭ１０９コンピテントセルを形質転換することで、生産株作製用Ｆ１０２４Ｓ-Ｄ２(3)重鎖発現プラスミドｐＥＦＤ２３７０あるいはＦ１０２４Ｄ-Ｄ２(3)重鎖発現プラスミドｐＥＦＤ２３６８を得た。一方、軽鎖発現プラスミドはＦ１０２４Ｓ-Ｄ２(3)、Ｆ１０２４Ｄ-Ｄ２(3)で共通であり、以下の方法で構築した。一過性用発現プラスミドｐＴＫ-２３４４をＢａｍＨＩで消化後、末端を平滑化し、さらにEcoRIで消化することにより、０.７ｋｂの断片を回収した。また、ｐＭ１１０３をＫｐｎＩで消化後、末端を平滑化した後に、EcoRI消化して約７.９ｋｂの断片を回収した。ｐＴＫ-２３４４消化断片とｐＭ１１０３消化断片をライゲーションした後、定法に従いＪＭ１０９コンピテントセルを形質転換することで、生産株作製用軽鎖発現プラスミドｐＥＦＤ２３４４を得た。
【０１１４】
５−２）Ｆ１０２４Ｓ-Ｄ２(3)およびＦ１０２４Ｄ-Ｄ２(3)を生産する形質転換株の樹立
ＤＨＦＲ遺伝子欠損ＣＨＯ細胞に実施例５−１）で構築した重鎖および軽鎖発現プラスミドをco-transfectionし、キメラ抗体融合蛋白質産生形質転換ＣＨＯを樹立した。すなわち、ＨＴ media Supplement（５０×）Hybri-Max（SIGMA；終濃度１×で使用）および２００ｍＭ Ｌ-Glutamine（SIGMA；終濃度４ｍＭで使用）を含むEX-CELL 325 PF CHO（ＪＲＨ Bioscience）にて馴化培養したＣＨＯ ＤＸＢ１１をtransfection当日に遠心後、８×１０６cells／１５０Rouxの濃度でフラスコに植え込んだ。FuGENE６（ロッシュダイアグノティクス）１２５μＬを用いて、重鎖発現プラスミド１２.５μｇと軽鎖発現プラスミド１２.５μｇ（すなわち、ｐＥＦＤ２３７０＋ｐＥＦＤ２３４４あるいはｐＥＦＤ２３６８＋ｐＥＦＤ２３４４）をFuGENE６添付プロトコールに準じ調製し、先のＣＨＯ ＤＸＢ１１へco-transfectionした。５％ＣＯ２で３７℃、２日間培養した後に、細胞を回収し、ＨＴ不含４ｍＭ Ｌ-Glutamine含有EX-CELL 325 PF CHO培地（以下ＥＸ-ＣＥＬＬ（ＨＴ−）と記載）で一度、ＰＢＳ−で一度洗浄し、ＥＸ-ＣＥＬＬ（ＨＴ−）に再度懸濁した。次に３,０００〜４８,０００cells／wellで９６ウェルプレートに細胞を蒔き直し、５％ＣＯ２、３７℃で培養を続け、３日あるいは４日毎に培地の半量を新しいＥＸ-ＣＥＬＬ（ＨＴ−）に交換した。約１ヶ月間培養を続けた後、コロニーが発生したウェル内の細胞を新しいプレートに移し、培養上清中のキメラ抗体量を実施例２に記載のＥＩＡ方で測定した。上清中にキメラ抗体の発現が確認された細胞をキメラ抗体融合蛋白質産生形質転換株として得た。
【０１１５】
５−３）Methotrexateを用いた遺伝子増幅
実施例５−２）で得られたキメラ抗体融合蛋白質発現形質転換ＣＨＯ株を、Methotrexate（以下ＭＴＸと表記）を含むＥＸ-ＣＥＬＬ（ＨＴ−）培地で選択培養することにより、遺伝子増幅作業を行い目的のキメラ抗体融合蛋白質の生産量が上昇しているクローンの選択を行った。
【０１１６】
（１）ＣＨＯ-Ｆ１０２４ＳＣ９３ｔ３Ｌ１の樹立
上記５−２）で得られたＦ１０２４Ｓ-Ｄ２(3)産生形質転換株を１００ｎＭ ＭＴＸ含有ＥＸ-ＣＥＬＬ（ＨＴ−）培地に懸濁し、９６ウェルプレートに巻き込んだ。３日あるいは４日毎に培地の半量を新しい１００ｎＭ ＭＴＸ含有ＥＸ-ＣＥＬＬ（ＨＴ−）に交換し、コロニーが生じるまで５％ＣＯ２、３７℃で培養を続けた。得られたコロニーの発現量をＥＩＡ法で確認し、生産量の増加しているクローンを選択し、引き続き３００ｎＭ ＭＴＸ含有ＥＸ-ＣＥＬＬ（ＨＴ−）培地にて懸濁し、９６ウェルプレートに巻き込み選択培養を行った。その後、１００ｎＭ ＭＴＸの選択培養と同様の操作を行い、生産量が約２０倍上昇した形質転換株を得ることができた。尚、ＭＴＸの濃度を３〜１０倍段階的に上げた培地で選択培養を繰り返すことで、さらに生産量が増加するクローンを得ることができる。
【０１１７】
（２）ＣＨＯ-Ｆ１０２４ＤＣ７８ｕ１の樹立
上記５−２）で得られたＦ１０２４Ｄ-Ｄ２(3)産生形質転換株を実施例５−２）と同様の方法で処理し高生産株を得た。ＭＴＸ選択培養は１回目が１００ｎＭの濃度で、２回目は１０００ｎＭの濃度で行った。その結果、生産量がＥＩＡ値で約６０μｇ／ｍＬのクローンを得ることができた。
【０１１８】
（実施例６）Ｆ１０２４抗体の結合に重要な配列の解析
６−１）可溶型ヒトＣＤ１４アミノ酸置換体発現プラスミド構築
Ｆ１０２４抗体の認識領域を解析するため、表５に記載した可溶型ヒトＣＤ１４アミノ酸置換体３１種をそれぞれ作製した。尚、可溶型ＣＤ１４分子のＮ末端より２６３番目のＡｓｎをＧｌｎに置換した１アミノ酸置換体を「Ｎ２６３Ｑ」と記載し、他の１アミノ酸置換体も同様に記載した。但し、２９４番目のＰｒｏおよび２９６番目のＰｒｏの両方をＡｌａに置換した２アミノ酸置換体は「Ｐ２９４／２９６Ａ」と記載した。これらの置換体発現プラスミドは以下の方法で構築した。
【０１１９】
まず、ＷＯ０２／４２３３３またはＵＳ２００４／００９２７１２に記載のアミノ酸置換体ポリペプチド発現プラスミドの構築と同様の方法でｓＣＤ１４（１−３０７）アミノ酸置換改変体発現プラスミドの構築を行った。例えば、Ｐ２９４Ｈ、Ｐ２９４／２９６Ａ、Ｑ２９５ＡあるいはＰ２９６Ｈの置換を導入したｓＣＤ１４（１−３０７）アミノ酸置換改変体発現プラスミドの構築には、アミノ置換配列をコードする、表６に記載したプライマーセットを設計し、ＰＣＲに用いた。なお、アミノ酸置換部分をコードするコドンは太字（下線）で示した（表６）。
【０１２０】
次にリコンビナントＰＣＲ法を用いて、アミノ酸置換（コドン変異）導入ＤＮＡ断片を調製し、可溶型ヒトＣＤ１４アミノ酸置換体発現プラスミドを構築した。具体的には、例えばＰ２９４Ｈ、Ｐ２９４／２９６Ａ、Ｑ２９５ＡあるいはＰ２９６Ｈ発現プラスミドの構築は以下の方法で行った。センスプライマーＳ１（５'−ＧＣＧ ＧＣＡ ＧＴＡ ＴＧＣ ＴＧＡ ＣＡＣ ＧＧ−３'）、センスプライマーＳ２（５'−ＧＡＴ ＡＡＣ ＣＴＧ ＡＣＡ ＣＴＧ ＧＡＣ ＧＧＧ ＡＡＴ ＣＣＣ ＴＴＣ−３'）、センスプライマーＳ３（５'−ＧＣＣ ＡＴＣ ＣＡＧ ＡＡＴ ＣＴＡ ＧＣＧ ＣＴ−３'）およびアンチセンスプライマーＡ１（５'− ＧＡＡ ＧＧＧ ＡＴＴ ＣＣＣ ＧＴＣ ＣＡＧ ＴＧＴ ＣＡＧ ＧＴＴ ＡＴＣ−３'）、アンチセンスプライマーＡ２（５'−ＡＴＴ ＡＧＣ ＣＡＧ ＡＡＧ ＴＣＡ ＧＡＴ ＧＣＴ Ｃ−３'）、アンチセンスプライマーＡ３（５'−ＧＧＧ ＣＡＴ ＴＧＧ ＣＣＡ ＣＡＣ ＣＡＧ Ｃ−３'）を合成し、先に得られた各ｓＣＤ１４（１−３０７）アミノ酸置換改変体発現プラスミドを鋳型として、センスプライマーＳ１とＡ１でＰＣＲを行った。増幅産物については電気泳動により、分離精製した（ＰＣＲ産物Ａ）。また、ｐＣＡＧ３５６を鋳型にセンスプライマーＳ２とＡ２でＰＣＲを行い、増幅産物を電気泳動により、分離精製した（ＰＣＲ産物Ｂ）。さらにＰＣＲ産物ＡとＰＣＲ産物Ｂの混合物を鋳型に、センスプライマーＳ３とＡ３でＰＣＲを行い、ＰＣＲ産物を電気泳動により、分離精製した（ＰＣＲ産物Ｃ）。次に、ＰＣＲ産物ＣをＰｖｕIIおよびＫｐｎＩで消化し、電気泳動により、約０.２ｋｂの断片を分離回収した。一方、ｐＣＡＧ３５６を同様にＰｖｕIIおよびＫｐｎＩで消化し、約５.８ｋｂの断片を電気泳動により回収し、先に得られた約０.２ｋｂの断片をライゲーションした。定法に従い、大腸菌ＸＬ１-Ｂｌｕｅ（STRATAGENE）を形質転換し、目的の発現プラスミドを得た。尚、ｐＣＡＧ３５６はｐＣＡＧＧＳ（GENE、Vol.15（1989）pp269-277）にＷＯ０２／４２３３３に記載のｓＣＤ１４発現プラスミドｐＭ１６５６由来のＣＤ１４遺伝子（ＧＰＩアンカーリングサイトに変異を導入）を挿入したプラスミドである。
【０１２１】
【表５】
【０１２２】
【表６】
【０１２３】
６−２）可溶型ヒトＣＤ１４アミノ酸置換体の発現
上記６−１）で作製した各発現プラスミドを下記の方法でＣＯＳ-１細胞に導入した。すなわち、FuGENE６（ロシュ・ダイアグノスティックス社）５０μＬを上記プラスミドＤＮＡ各１２.５μｇと添付プロトコールに従い混合し、１５０ｃｍ3フラスコにセミコンフルエントに増殖したＣＯＳ-１細胞に添加した。引き続き、５％ＣＯ２、３７℃の条件下で３〜４日間培養行い、上清中にヒトＣＤ１４アミノ酸置換体を発現させた。発現の有無の確認はＷＯ０２／４２３３３に記載のＣＤ１４抗体を用いたＥＩＡ法にて行った。その結果、表５に記載の置換体の内、Ｎ２６３Ｑ、Ｌ２７６Ａ、Ｌ２８３Ａ、Ｎ２８８ＡおよびＬ２９０Ａ以外の全ての発現が確認できた。
【０１２４】
６−３）可溶型ヒトＣＤ１４アミノ酸置換体の精製
可溶型ヒトＣＤ１４アミノ酸置換体を以下の方法で精製した。上記６−２）で得られた培養上清を、抗ヒトＣＤ１４抗体（３Ｃ１０）を結合したアフィニティー精製用カラム（ＮＨＳ-activated Sepharose４ Fast Flow；アマシャム バイオサイエンス）に供して選択的に吸着させ、１０ｍＭ ＨＣｌにて溶出した。得られた溶出画分は、直ちに１０×ＰＢＳ−（SIGMA）を終濃度２×になるように加え、中和した。その後、生理食塩水に対して透析し、得られた透析液を精製標品とした。
【０１２５】
６−４）Ｆ１０２４抗体に対する競合実験
各可溶型ヒトＣＤ１４アミノ酸置換体のＦ１０２４抗体に対する反応性を確認するために、以下の競合実験を行った。まず、可溶型ＣＤ１４分子（３５６（ＣＨＯ）；調製方法は下記６−５）に記載）をＰＢＳ−にて４μｇ／ｍＬに希釈し、９６ウェルプレート（Ｆ８ MaxiSorp；NUNC）に５０μＬ／wellで添加し、４℃で一晩静置した。その後、０.０５％Tween２０を含むＰＢＳ−で３回洗浄し、２％StabilGuard（SurModics, Inc.）を含むＰＢＳ−を各ウェルに２００μＬ／well添加し、３７℃で３０分インキュベーションした後に、4℃で保存した。一方、実施例６−３）で精製した各可溶型ヒトＣＤ１４アミノ酸置換体を０.１％ＢＳＡ含有ＰＢＳ−で２〜０.０２μｇ／ｍＬに希釈した。また、ＨＲＰ標識Ｆ１０２４抗体を０.１％ＢＳＡ含有ＰＢＳ−で２μｇ／ｍＬに希釈し、先のヒトＣＤ１４アミノ酸置換体と等量（２５μＬ＋２５μＬ）混合した。次に可溶型ＣＤ１４固相化プレートのwellから液を除去し、ＣＤ１４アミノ酸置換体／ＨＲＰ標識Ｆ１０２４混合液を５０μＬ／well添加し、３７℃で２時間インキュベーションした。０.０５％Tween２０含有ＰＢＳ−で５回洗浄後、発色基質としてＴＭＢ溶液（BioFX）を各ウェルに５０μＬ／wellずつ添加した。室温で５分間反応後、１Ｍ 塩酸溶液５０μＬ／wellで反応を停止し、プレート分光光度計で４５０ｎｍの吸光度を測定した。
【０１２６】
アミノ酸置換体未添加時の吸光度を１００％として、結果を図３１に示す。なお、図中の３５６（ＣＨＯ）は、固相化に用いた可溶型ＣＤ１４分子を添加した場合の吸光度推移を示す。
その結果、多くのアミノ酸置換体は添加濃度依存的に吸光度が低下しており、３５６（ＣＨＯ）と競合して、Ｆ１０２４抗体に結合しているのが確認されたが、Ｐ２９４Ｈ、Ｐ２９４／２９６Ａ、Ｑ２９５ＡおよびＰ２９６Ｈでは、添加濃度に関わらず、吸光度の低下が確認されず、Ｆ１０２４抗体への結合が起きていないと判断した（図３１）。すなわち、ＣＤ１４の２９４、２９５、２９６番目のＰｒｏ、Ｇｌｎ、ＰｒｏがＦ１０２４抗体の結合に重要な領域であることが明らかになった。
【０１２７】
６−５）可溶型ヒトＣＤ１４分子（３５６（ＣＨＯ））の調製
ＣＨＯ細胞を用いて可溶型ヒトＣＤ１４分子（３５６（ＣＨＯ））を以下の方法で調製した。
（１）発現プラスミドの構築
ＷＯ０２／４２３３３に記載のｐＭ１６５６をHindIIIで消化し、ＤＮＡ Blunting Kit（タカラバイオ）を用いて、末端を平滑化した。次にXbaＩで消化を行い、電気泳動により、約１.４ｋｂの断片を分離回収した。また、マウスＤＨＦＲ発現ユニット、ＥＦ１αプロモーターを持つ発現プラスミドpM1103をNotＩで消化し、ＤＮＡ Blunting Kit（タカラバイオ）を用いて、末端を平滑化した。次にXbaＩで消化を行い、電気泳動により、約８.０ｋｂの断片を分離回収した。この約８.０ｋｂの断片にｐＭ１６５６由来の約１.４ｋｂ断片を挿入ライゲーションし、大腸菌ＪＭ１０９を形質転換することで、３５６（ＣＨＯ）発現プラスミドを得ることができた。
【０１２８】
（２）３５６（ＣＨＯ）発現形質転換株の樹立
ＤＨＦＲ遺伝子欠損ＣＨＯ細胞にこの発現プラスミドを導入し、３５６（ＣＨＯ）を発現する形質転換株を樹立した。すなわち、すなわちFuGENE６（ロシュ・ダイアグノスティックス）５０μＬを上記プラスミドＤＮＡ１２.５μｇと添付プロトコールに従い混合し、１５０ｃｍ２フラスコにセミコンフルエントに増殖したＣＨＯ ＤＸＢ１１細胞（増殖培地は１０％非働化ＦＢＳ含有Ham's Ｆ-１２培地（Invitrogen）を使用）に添加し、５％ＣＯ２で３７℃、一晩培養した。翌日、細胞をトリプシンで剥離回収し、１０％非働化透析ＦＢＳ含有α-ＭＥＭ（リボヌクレオシド・デオキシリボヌクレオシド不含）（Invitrogen）培地（以下、選択培地と記載）にて、９６ウェルプレートに細胞を蒔き直した。５％ＣＯ２、３７℃で培養を続け、３日あるいは４日毎に培地の半量を新しい選択培地に交換した。３〜４週間培養を続けた後、コロニーが発生したウェル内の細胞を新しいプレートに移し、培養上清中の可溶型ＣＤ１４産生量をＷＯ０２／４２３３３に記載のＣＤ１４抗体を用いたＥＩＡ法にて行った。発現量の高いクローンＮｏ.Ｐ３を可溶型ＣＤ１４発現株として樹立した。
【０１２９】
（３）Methotrexate（ＭＴＸ）を用いた遺伝子増幅
３５６（ＣＨＯ）発現量を増加させるために、ＭＴＸを含む選択培地でＰ３クローンを選択培養し、遺伝子増幅により３５６（ＣＨＯ）の生産量を増加させた。すなわち、実施例６−５）（２）で得られたＰ３クローンを、１５ｎＭのＭＴＸを含む選択培地に懸濁し、１０ｃｍ培養dishに巻き込んだ。３日あるいは４日毎に培地を新しい１５ｎＭ ＭＴＸ含有選択培地に交換し、コロニーが生じるまで５％ＣＯ２、３７℃で培養を続けた。得られたコロニーをプレートに植え継ぎ、上清中の３５６（ＣＨＯ）発現量をＥＩＡ法で確認し、発現量の増加しているクローンＰ３-５４を得た。
【０１３０】
（４）３５６（ＣＨＯ）の生産および精製
上記６−５）（３）で得られたＰ３-５４クローンを選択培地で培養し、その上清中に発現している３５６（ＣＨＯ）を実施例６−３）と同様の方法で精製した。
【０１３１】
（実施例７） 抗体融合蛋白質（Ｆ１０２４Ｓ−Ｄ２）のＵＴＩ第２ドメインの改変
７−１）Ｆ１０２４Ｓ−Ｄ２のＵＴＩ第２ドメインの改変体の作製
ＵＴＩドメインの１５番目のアルギニンをアラニンに置換（Ｒ１５Ａと表記）した場合を例にとると、先ず、変異を導入したい部分およびその近傍１０アミノ酸前後をコードするプライマー（表７）を設計し、合成を行った。
【０１３２】
【表７】
【０１３３】
次に、ｐＴＫ−２３５５を鋳型として、プライマー対（ＩｇＧ４−ｗ,Ｄ２−Ｒ１５Ａ−ｓ）および（ｐＥＦ２ｃｅ−２７,Ｄ２−Ｒ１５Ａ−ａ）でそれぞれＰＣＲを行い、得られた増幅産物を混合し、プライマー対（ＩｇＧ４−ｗ,ｐＥＦ２ｃｅ−２７）（表８）で再度ＰＣＲを行った。
この増幅産物を制限酵素ＢａｍＨＩおよびＮｏｔＩで切断後、アガロースゲル電気泳動し、その断片を抽出した後に、予め同様にＢａｍＨＩおよびＮｏｔＩで切断しておいたｐＴＫ−２３５５のベクター部分とＴ４ＤＮＡリガーゼで連結することにより、Ｒ１５Ａ変異を導入したＦ１０２４Ｓ−Ｄ２改変体重鎖を発現可能なプラスミド（ｐＴＫ−２７３０）を構築することができた。このプラスミドをＣＯＳ−１細胞に、軽鎖発現プラスミド（ｐＴＫ−２３４４）とコトランスフェクションさせることで、培養上清中にＦ１０２４Ｓ−Ｄ２（Ｒ１５Ａ）改変体が発現されるのを確認し、Ｐｒｏｓｅｐ−Ａカラムで発現産物の精製を行った。
同様の方法を用いることで、表９に示す８０種類のＦ１０２４Ｓ−Ｄ２のＵＴＩ第２ドメイン改変体を作製し、ＣＤ１４抗原に対し、結合能を保持していることを確認した。また、表９に示す各改変体のＵＴＩ第２ドメインのアミノ酸配列は、図３２〜図３５に示す。
【０１３４】
【表８】
【０１３５】
【表９】
【表１０】
【０１３６】
７−２）Ｆ１０２４Ｓ−Ｄ２改変体のエラスターゼ阻害活性
実施例３−２）の（３）と同様の方法により、上記で作製した８０種類のＦ１０２４Ｓ−Ｄ２改変体及びＦ１０２４−Ｄ２（３）のエラスターゼ阻害活性を測定した。ただし、Ｓ−２４８４溶液添加後の３７℃インキュベーションは５分間とした。その結果、以下の発現プラスミド由来融合蛋白質（Ｆ１０２４Ｓ−Ｄ２改変体）はＦ１０２４Ｓ−Ｄ２（３）と同等のエラスターゼ阻害活性を示すことが確認された。
ｐＴＫ−２７３０（Ｒ１５Ａ）、ｐＴＫ−２７３７（Ｒ１５Ｉ）、ｐＴＫ−２７３９(Ｒ１５Ｌ)、ｐＴＫ−２７４０(Ｒ１５Ｍ)、ｐＴＫ−２７４５(Ｒ１５Ｔ)、ｐＴＫ−２７４６(Ｒ１５Ｖ)、ｐＴＫ−２８６６(Ｒ１１Ｓ／Ｒ１５Ｔ／Ｑ１９Ａ／Ｙ４６Ｄ)、ｐＴＫ−２８６７(Ｒ１１Ｓ／Ｒ１５Ｔ／Ｑ１９Ｃ／Ｙ４６Ｄ)、ｐＴＫ−２８６８(Ｒ１１Ｓ／Ｒ１５Ｔ／Ｑ１９Ｄ／Ｙ４６Ｄ)、ｐＴＫ−２８６９(Ｒ１１Ｓ／Ｒ１５Ｔ／Ｑ１９Ｅ／Ｙ４６Ｄ)、ｐＴＫ−２８７０(Ｒ１１Ｓ／Ｒ１５Ｔ／Ｑ１９Ｆ／Ｙ４６Ｄ)、ｐＴＫ−２８７１(Ｒ１１Ｓ／Ｒ１５Ｔ／Ｑ１９Ｇ／Ｙ４６Ｄ)、ｐＴＫ−２８７２(Ｒ１１Ｓ／Ｒ１５Ｔ／Ｑ１９Ｈ／Ｙ４６Ｄ)、ｐＴＫ−２８７３(Ｒ１１Ｓ／Ｒ１５Ｔ／Ｑ１９Ｉ／Ｙ４６Ｄ)、ｐＴＫ−２８７４(Ｒ１１Ｓ／Ｒ１５Ｔ／Ｑ１９Ｌ／Ｙ４６Ｄ)、ｐＴＫ−２８７５(Ｒ１１Ｓ／Ｒ１５Ｔ／Ｑ１９Ｍ／Ｙ４６Ｄ)、ｐＴＫ−２８７６(Ｒ１１Ｓ／Ｒ１５Ｔ／Ｑ１９Ｎ／Ｙ４６Ｄ)、ｐＴＫ−２８７７(Ｒ１１Ｓ／Ｒ１５Ｔ／Ｑ１９Ｐ／Ｙ４６Ｄ)、ｐＴＫ−２８７８(Ｒ１１Ｓ／Ｒ１５Ｔ／Ｙ４６Ｄ)、ｐＴＫ−２８７９(Ｒ１１Ｓ／Ｒ１５Ｔ／Ｑ１９Ｒ／Ｙ４６Ｄ)、ｐＴＫ−２８８０(Ｒ１１Ｓ／Ｒ１５Ｔ／Ｑ１９Ｓ／Ｙ４６Ｄ)、ｐＴＫ−２８８１(Ｒ１１Ｓ／Ｒ１５Ｔ／Ｑ１９Ｔ／Ｙ４６Ｄ)、ｐＴＫ−２８８２(Ｒ１１Ｓ／Ｒ１５Ｔ／Ｑ１９Ｖ／Ｙ４６Ｄ)、ｐＴＫ−２８８３(Ｒ１１Ｓ／Ｒ１５Ｔ／Ｑ１９Ｗ／Ｙ４６Ｄ)、ｐＴＫ−２８８４(Ｒ１１Ｓ／Ｒ１５Ｔ／Ｑ１９Ｙ／Ｙ４６Ｄ)、ｐＴＫ−２８８９(Ｒ１１Ｓ／Ｒ１５Ｔ／Ｆ１７Ａ／Ｙ４６Ｄ)、ｐＴＫ−２８９０(Ｒ１１Ｓ／Ｒ１５Ｔ／Ｆ１７Ｃ／Ｙ４６Ｄ)、ｐＴＫ−２８９１(Ｒ１１Ｓ／Ｒ１５Ｔ／Ｆ１７Ｄ／Ｙ４６Ｄ)、ｐＴＫ−２８９２(Ｒ１１Ｓ／Ｒ１５Ｔ／Ｆ１７Ｅ／Ｙ４６Ｄ)、ｐＴＫ−２９３２(Ｒ１１Ａ／Ｒ１５Ｔ／Ｙ４６Ｄ)、ｐＴＫ−２８９３(Ｒ１１Ｓ／Ｒ１５Ｔ／Ｆ１７Ｇ／Ｙ４６Ｄ)、ｐＴＫ−２９３３(Ｒ１１Ｃ／Ｒ１５Ｔ／Ｙ４６Ｄ)、ｐＴＫ−２８９５(Ｒ１１Ｓ／Ｒ１５Ｔ／Ｆ１７Ｈ／Ｙ４６Ｄ)、ｐＴＫ−２９３４(Ｒ１１Ｄ／Ｒ１５Ｔ／Ｙ４６Ｄ)、ｐＴＫ−２８９６(Ｒ１１Ｓ／Ｒ１５Ｔ／Ｆ１７Ｉ／Ｙ４６Ｄ)、ｐＴＫ−２９３５(Ｒ１１Ｅ／Ｒ１５Ｔ／Ｙ４６Ｄ)、ｐＴＫ−２８９７(Ｒ１１Ｓ／Ｒ１５Ｔ／Ｆ１７Ｌ／Ｙ４６Ｄ)、ｐＴＫ−２９３６(Ｒ１１Ｆ／Ｒ１５Ｔ／Ｙ４６Ｄ)、ｐＴＫ−２８９８(Ｒ１１Ｓ／Ｒ１５Ｔ／Ｆ１７Ｍ／Ｙ４６Ｄ)、ｐＴＫ−２９３７(Ｒ１１Ｇ／Ｒ１５Ｔ／Ｙ４６Ｄ)、ｐＴＫ−２８９９(Ｒ１１Ｓ／Ｒ１５Ｔ／Ｆ１７Ｎ／Ｙ４６Ｄ)、ｐＴＫ−２９３８(Ｒ１１Ｈ／Ｒ１５Ｔ／Ｙ４６Ｄ)、ｐＴＫ−２９００(Ｒ１１Ｓ／Ｒ１５Ｔ／Ｆ１７Ｐ／Ｙ４６Ｄ)、ｐＴＫ−２９３９(Ｒ１１Ｉ／Ｒ１５Ｔ／Ｙ４６Ｄ)、ｐＴＫ−２９０１(Ｒ１１Ｓ／Ｒ１５Ｔ／Ｆ１７Ｑ／Ｙ４６Ｄ)、ｐＴＫ−２９４０(Ｒ１１Ｋ／Ｒ１５Ｔ／Ｙ４６Ｄ)、ｐＴＫ−２９０２(Ｒ１１Ｓ／Ｒ１５Ｔ／Ｆ１７Ｒ／Ｙ４６Ｄ)、ｐＴＫ−２９４１(Ｒ１１Ｌ／Ｒ１５Ｔ／Ｙ４６Ｄ)、ｐＴＫ−２９０３(Ｒ１１Ｓ／Ｒ１５Ｔ／Ｆ１７Ｓ／Ｙ４６Ｄ)、ｐＴＫ−２９４２(Ｒ１１Ｍ／Ｒ１５Ｔ／Ｙ４６Ｄ)、ｐＴＫ−２９０４(Ｒ１１Ｓ／Ｒ１５Ｔ／Ｆ１７Ｔ／Ｙ４６Ｄ)、ｐＴＫ−２９４３(Ｒ１１Ｎ／Ｒ１５Ｔ／Ｙ４６Ｄ)、ｐＴＫ−２９０５(Ｒ１１Ｓ／Ｒ１５Ｔ／Ｆ１７Ｖ／Ｙ４６Ｄ)、ｐＴＫ−２９４４(Ｒ１１Ｐ／Ｒ１５Ｔ／Ｙ４６Ｄ)、ｐＴＫ-２９０６(Ｒ１１Ｓ/Ｒ１５Ｔ/Ｆ１７Ｗ/Ｙ４６Ｄ)、ｐＴＫ-２９４５(Ｒ１１Ｑ/Ｒ１５Ｔ/Ｙ４６Ｄ)、ｐＴＫ-２９０７(Ｒ１１Ｓ/Ｒ１５Ｔ/Ｆ１７Ｙ/Ｙ４６Ｄ)、ｐＴＫ-２９４６(Ｒ１５Ｔ/Ｙ４６Ｄ)、ｐＴＫ-２９４７(Ｒ１１Ｔ/Ｒ１５Ｔ/Ｙ４６Ｄ)、ｐＴＫ-２９４８(Ｒ１１Ｖ/Ｒ１５Ｔ/Ｙ４６Ｄ)、ｐＴＫ-２９４９(Ｒ１１Ｗ/Ｒ１５Ｔ/Ｙ４６Ｄ)、ｐＴＫ-２９５０(Ｒ１１Ｙ/Ｒ１５Ｔ/Ｙ４６Ｄ)、ｐＴＫ-２８２４(Ｒ１１Ｓ/Ｒ１５Ｉ/Ｑ１９Ｋ/Ｙ４６Ｄ)、ｐＴＫ-２８２５(Ｒ１１Ｓ/Ｒ１５Ｌ/Ｑ１９Ｋ/Ｙ４６Ｄ)、ｐＴＫ-２８２６(Ｒ１１Ｓ/Ｒ１５Ｔ/Ｑ１９Ｋ/Ｙ４６Ｄ)、ｐＴＫ-２８２７(Ｒ１１Ｓ/Ｒ１５Ｖ/Ｑ１９Ｋ/Ｙ４６Ｄ)
【０１３７】
特に、発現プラスミドｐＴＫ-２８２６(Ｒ１１Ｓ/Ｒ１５Ｔ/Ｑ１９Ｋ/Ｙ４６Ｄ)由来融合蛋白質の５０％阻害濃度は４.４３μｇ／ｍＬであり、Ｆ１０２４Ｓ−Ｄ２（３）の５０％阻害濃度が８.９０μｇ／ｍＬであるのに比べて、Ｄ２（３）部分の１５番目のアルギニンをスレオニンに置換することによりエラスターゼ阻害活性が増強された。
融合蛋白質Ｆ１０２４−Ｄ２（４）(Ｒ１１Ｓ/Ｒ１５Ｔ/Ｑ１９Ｋ/Ｙ４６Ｄ)の全アミノ酸配列の説明図を示したものを図３６に示す。
【０１３８】
（実施例８） 抗体融合蛋白質（Ｆ１０２４Ｓ−トロンボモジュリン(ＴＭ)機能ドメイン）
８−１）Ｆ１０２４Ｓ-ＴＭ発現プラスミドの構築
抗ＣＤ１４抗体(Ｆ１０２４Ｓ)とＴＭの各種機能ドメインとの融合蛋白質を作製するため、ＨｅＬａゲノムＤＮＡを鋳型とし、プライマー対(ＴＭ-ｂ,ＴＭ-ｇ)によるＰＣＲを行って、ヒトのトロンボモジュリン（以下ＴＭ）遺伝子全長を増幅し、ｐＴ７-ＢｌｕｅベクターへＴＡクローニングした。配列を確認後、ｐＴ７-ＴＭとした。
次にｐＴ７-ＴＭを鋳型とし、プライマー対(ＴＭＤ１２３４５６,ＴＭｄｏｍａｉｎ２-Ｎｏｔ１Ｂｇｌ２)でＰＣＲを行い、得られた増幅断片を制限酵素ＢａｍＨＩおよびＢｇｌＩＩで切断後、予め調製しておいたベクター（実施例１表３に記載のｐＴＫ-２３５４を、制限酵素ＢａｍＨＩで切断後、脱リン酸化処理を行って調製）と混合し、Ｔ４ＤＮＡリガーゼによる結合反応を行うことで、ＴＭのアミノ酸番号２２７番目のシステイン〜４６２番目のシステイン(Ｃｙｓ２２７〜Ｃｙｓ４６２)をＦ１０２４Ｓに付加した融合蛋白質（Ｆ１０２４Ｓ-ＴＭ１２３４５６Ｍと表記）の重鎖を発現可能なプラスミドｐＴＫ-２７５４を構築した。同様の方法で、プライマー対（ＴＭＤ１２３４５６,ＴＭｄｏｍａｉｎ３-Ｎｏｔ１Ｂｇｌ２）を用いることで、アミノ酸番号２２７番目のシステイン〜４９７番目のセリン（Ｃｙｓ２２７〜Ｓｅｒ４９７）を付加した融合蛋白質(Ｆ１０２４Ｓ-ＴＭ１２３４５６７Ｍと表記)の重鎖を発現可能なプラスミドｐＴＫ-２７５５を、プライマー対（ＴＭＤ２３４５６,ＴＭｄｏｍａｉｎ２-Ｎｏｔ１Ｂｇｌ２）を用いることで、２６３番目のトレオニン〜４６２番目のシステイン（Ｔｈｒ２６３〜Ｃｙｓ４６２）を付加した融合蛋白質（Ｆ１０２４Ｓ-ＴＭ２３４５６Ｍと表記）の重鎖を発現可能なプラスミドｐＴＫ-２７５６を、プライマー対（ＴＭＤ２３４５６,ＴＭｄｏｍａｉｎ３-Ｎｏｔ１Ｂｇｌ２）を用いることで、２６３番目のトレオニン〜４９７番目のセリン（Ｔｈｒ２６３〜Ｓｅｒ４９７）を付加した融合蛋白質（Ｆ１０２４Ｓ-ＴＭ２３４５６７Ｍと表記）の重鎖を発現可能なプラスミドｐＴＫ-２７５７を、プライマー対（ＴＭＤ３４５６,ＴＭｄｏｍａｉｎ２-Ｎｏｔ１Ｂｇｌ２）を用いることで、３０６番目のグルタミン〜４６２番目のシステイン（Ｇｌｕ３０６〜Ｃｙｓ４６２）を付加した融合蛋白質(Ｆ１０２４Ｓ-ＴＭ３４５６Ｍと表記)の重鎖を発現可能なプラスミドｐＴＫ-２７５８を、プライマー対（ＴＭＤ３４５６,ＴＭｄｏｍａｉｎ３-Ｎｏｔ１Ｂｇｌ２）を用いることで、３０６番目のグルタミン〜４９７番目のセリン（Ｇｌｕ３０６〜Ｓｅｒ４９７）を付加した融合蛋白質(Ｆ１０２４Ｓ-ＴＭ３４５６７Ｍと表記)の重鎖を発現可能なプラスミドｐＴＫ-２７５９を、プライマー対（ＴＭＤ４５６,ＴＭｄｏｍａｉｎ２-Ｎｏｔ１Ｂｇｌ２）を用いることで、３４５番目のバリン〜４６２番目のシステイン（Ｖａｌ３４５〜Ｃｙｓ４６２）を付加した融合蛋白質（Ｆ１０２４Ｓ-ＴＭ４５６Ｍと表記）の重鎖を発現可能なプラスミドｐＴＫ-２７６０を、プライマー対（ＴＭＤ４５６,ＴＭｄｏｍａｉｎ３-Ｎｏｔ１Ｂｇｌ２）を用いることで、３４５番目のバリン〜４９７番目のセリン（Ｖａｌ３４５〜Ｓｅｒ４９７）を付加した融合蛋白質（Ｆ１０２４Ｓ-ＴＭ４５６７Ｍと表記）の重鎖を発現可能なプラスミドｐＴＫ-２７６１をそれぞれ構築した。
一方、ＴＭの酸化による活性低下を抑制する為に、アミノ酸番号３８８番目のメチオニン（Ｍｅｔ３８８）をロイシン（Ｌｅｕ）に置換した変異体(Ｍ３８８Ｌ)も、以下の方法で作製した〔Ｃｌａｒｋｅ, ＪＨ．ら、Ｊ.Ｂｉｏｌ.Ｃｈｅｍ.２６８,６３０９-６３１５(１９９３)〕。すなわち、ｐＴ７-ＴＭを鋳型とし、各プライマー対〔ＴＭＤ１２３４５６，ＴＭ(Ｍ３８８Ｌ)-ａ〕および〔ＴＭｄｏｍａｉｎ２-Ｎｏｔ１Ｂｇｌ２，ＴＭ(Ｍ３８８Ｌ)-ｓ〕によるPCR反応後に、各増幅産物を混合し、プライマー対（ＴＭＤ１２３４５６，ＴＭｄｏｍａｉｎ２-Ｎｏｔ１Ｂｇｌ２）で再度ＰＣＲすることで、Ｍ３８８Ｌの変異を有した２２７番目のシステインから４６２番目のシステイン（Ｃｙｓ２２７〜Ｃｙｓ４６２）をコードする遺伝子断片を増幅することができた。上記と同様に、この断片を制限酵素ＢａｍＨＩおよびＢｇｌＩＩによる切断およびリガーゼ反応によるベクターへの結合によって、Ｍ３８８Ｌの変異を有するＴＭの２２７番目のシステインから４６２番目のシステイン（Ｃｙｓ２２７〜Ｃｙｓ４６２）領域を、抗体分子Ｆ１０２４Ｓに付加した融合蛋白質(Ｆ１０２４Ｓ-ＴＭ１２３４５６Ｌと表記)の重鎖を発現可能なプラスミドｐＴＫ-２７６２を構築した。最終的に、ｐＴＫ-２７５５にＭ３８８Ｌの変異を導入した融合蛋白質（Ｆ１０２４Ｓ-ＴＭ１２３４５６７Ｌと表記）の重鎖を発現可能なｐＴＫ-２７６３、ｐＴＫ-２７５６にＭ３８８Ｌの変異を導入した融合蛋白質（Ｆ１０２４Ｓ-ＴＭ２３４５６Ｌと表記）の重鎖を発現可能なｐＴＫ-２７６４、ｐＴＫ-２７５７にＭ３８８Ｌの変異を導入した融合蛋白質（Ｆ１０２４Ｓ-ＴＭ２３４５６７Ｌと表記）の重鎖を発現可能なｐＴＫ-２７６５、ｐＴＫ-２７５８にＭ３８８Ｌの変異を導入した融合蛋白質(Ｆ１０２４Ｓ-ＴＭ３４５６Ｌと表記)の重鎖を発現可能なｐＴＫ-２７６６、ｐＴＫ-２７５９にＭ３８８Ｌの変異を導入した融合蛋白質(Ｆ１０２４Ｓ-ＴＭ３４５６７Ｌと表記)の重鎖を発現可能なｐＴＫ-２７６７、ｐＴＫ-２７６０にＭ３８８Ｌの変異を導入した融合蛋白質(Ｆ１０２４Ｓ-ＴＭ４５６Ｌと表記)の重鎖を発現可能なｐＴＫ-２７６８、ｐＴＫ-２７６１にＭ３８８Ｌの変異を導入した融合蛋白質(Ｆ１０２４Ｓ-ＴＭ４５６７Ｌと表記)の重鎖を発現可能なｐＴＫ-２７６９をそれぞれ構築した。
表１０に使用したプライマーの配列、表１１に、各抗ＣＤ１４抗体（Ｆ１０２４Ｓ）融合蛋白質と各発現プラスミドを示す。
なお、各抗ＣＤ１４抗体（Ｆ１０２４Ｓ）融合蛋白質のアミノ酸配列は、図３７〜４４並びに配列表に示す。
また、融合蛋白質Ｆ１０２４−ＴＭ２３４５６Ｌの全アミノ酸配列の説明図を示したものを図４５に示す。
【０１３９】
【表１１】
【０１４０】
【表１２】
【０１４１】
各プラスミドを、ＣＯＳ-1細胞に軽鎖発現プラスミド（ｐＴＫ−２３４４）とコトランスフェクションさせることで、培養上清中にＦ１０２４Ｓ−ＴＭが発現された。この上清を、Ｐｒｏｓｅｐ−Ａカラムによる精製を行い、以後のアッセイに供した。
尚、各融合蛋白質がＣＤ１４抗原に対し結合活性があることを、ＥＩＡによる結合実験で確認した。
【０１４２】
８−２）トロンボモジュリン（ＴＭ）活性測定
トロンボモジュリン（ＴＭ）が、血中でトロンビンと複合体を形成し、血液凝固阻害因子のプロテインＣを活性化する作用を指標として以下のようにＴＭ活性を測定した。
反応（活性測定）はマルチチューブにて実施した。希釈は０．１４ｍｏｌ／Ｌ塩化ナトリウム、１０ｍｍｏｌ／Ｌ塩化カルシウム及び１ｍｇ／ｍＬ牛血清アルブミンを含む２５ｍｍｏｌ／Ｌトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７．４）で行った。検体４０μＬに６Ｕ／ｍＬヒトトロンビン（ＳＩＧＭＡ）１０μＬを加え、３７℃で１０分間プレインキュベートした。次いで、２４μｇ／ｍＬプロテインＣ（ａｍｅｒｉｃａｎ ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃａ ｉｎｃ.）１０μＬを加え、３７℃で５分間インキュベートした。０．１５Ｕ／ｍＬアンチトロンビンIII(ミドリ十字)−１５Ｕ／ｍＬヘパリン(持田製薬)混合液４０μＬを加え、３７℃で１０分間インキュベートした。３．２ｍｍｏｌ／Ｌ活性化プロテインＣ基質Ｓ−２３６６(第一化学薬品)１００μＬを加え３７℃で１０分間インキュベート後、５０％酢酸２００μＬを加え反応を停止した。反応液３００μＬを９６穴平底プレートに移し、プレートリーダー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ）にて４０５ｎｍの吸光度を測定した。ポジティブコントロールとしてはヒトトロンボモジュリンＭＲ−３３(持田製薬)を使用した。その結果、すべてのＦ１０２４Ｓ−ＴＭ融合蛋白質はプロテインＣ活性化促進活性を有していた。特に、Ｆ１０２４Ｓ−ＴＭ２３４５６Ｍ、Ｆ１０２４Ｓ−ＴＭ２３４５６７Ｍ、Ｆ１０２４Ｓ−ＴＭ２３４５６ＬおよびＦ１０２４Ｓ−ＴＭ２３４５６７Ｌは高いプロテインＣ活性化促進活性を有していた。また、Ｍ３８８Ｌ型の置換変異体の活性が相対的に高かった（図４６）。
【０１４３】
（実施例９） 抗体融合蛋白質（Ｆ１０２４Ｓ−ＳＬＰＩ）のリンカー部分の改変
９−１）発現プラスミドの構築
ＬｉｎｋｅｒＳＧ−４−ｓ（５’ ｐＧＡＴＣＴＧＧＡＧＧＴＧＧＡＧ ３’：５’端はリン酸化）およびＬｉｎｋｅｒ ＳＧ−４−ａ（５’ ｐＧＡＴＣＣＴＣＣＡＣＣＴＣＣＡ ３’：５’端はリン酸化）を混合後、９６℃で２分間インキュベートし、ゆっくり室温にもどしアニールさせた。その適量を予め調製しておいたベクター断片〔実施例１に記載のｐＴ７−ＳＬＰＩ（Ｄ２）を、制限酵素ＢｇｌＩＩで切断し、さらに脱リン酸化処理を行って、アガロースゲル電気泳動およびゲルからの断片抽出を行ったもの〕と混合し、Ｔ４ＤＮＡリガーゼで結合させた。この作業によって、ＳＬＰＩ（Ｄ２）に１コピーのＧＧＧＧＳリンカーが付加されたプラスミドｐＴＫ−２７２９を構築した。さらに、このｐＴＫ−２７２９を制限酵素ＢｇｌＩＩで切断し、上記と同様の作業を繰り返すことで、ＳＬＰＩ（Ｄ２）に２コピーのＧＧＧＧＳリンカーが付加されたｐＴＫ−２７４９と３コピーが付加されたｐＴＫ−２７５０を構築した。
次に、ｐＴＫ−２７２９、ｐＴＫ−２７４９およびｐＴＫ−２７５０を制限酵素ＢｇｌＩＩおよびＮｏｔＩで切断し、リンカー＋ＳＬＰＩ（Ｄ２）部分をコードする遺伝子断片を調製した（それぞれ、断片１、断片２および断片３）。実施例１（表３）に記載のｐＴＫ-２３９６構築時と同様、遺伝子断片ＡおよびＤと各断片とをＴ４ＤＮＡリガーゼによりひとつにつなげ、抗体分子とＳＬＰＩ（Ｄ２）との間にリンカーとしてＧＳＧＧＧＧＳ或いはＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ、ＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳを有するＦ１０２４Ｓ−ＳＬＰＩ（Ｄ２）リンカー改変体重鎖発現プラスミド（それぞれｐＴＫ−２７５１、ｐＴＫ−２７５２、ｐＴＫ−２７５３）を構築した。
これらのプラスミドをＣＯＳ−１細胞に、軽鎖発現プラスミド（ｐＴＫ−２３４４）とコトランスフェクションさせることで、培養上清中にＦ１０２４Ｓ-ＳＬＰＩ（Ｄ２）リンカー改変体が発現され、Ｐｒｏｓｅｐ−Ａカラムで発現産物の精製を行った。
精製産物は、いずれもＣＤ１４抗原に対して結合活性があることを確認した。
なお、表１２および表１３に各プライマーおよびリンカーの配列番号を示す。
【０１４４】
【表１３】
【表１４】
【０１４５】
９−２）Ｆ１０２４Ｓ-ＳＬＰＩのエラスターゼ阻害活性
実施例３−２）の（３）と同様の方法により１０２４Ｄ−ＳＬＰＩ（Ｄ１Ｄ２）、Ｆ１０２４Ｄ−ＳＬＰＩ（Ｄ２）、Ｆ１０２４Ｓ−ＳＬＰＩ（Ｄ１Ｄ２）およびＦ１０２４Ｓ−ＳＬＰＩ（Ｄ２）、さらには、ＳＬＰＩ（Ｄ２）に１、２および３コピーのＧＧＧＧＳリンカーが付加された融合蛋白質のエラスターゼ阻害活性を測定した。ただし、Ｓ−２４８４溶液添加後の３７℃インキュベーションは５分間とした。
なお、コントロールとして、希釈液８０μＬにエラスターゼ溶液１０μＬを混合し、３７℃で３分間インキュベーションした後、Ｓ−２４８４溶液１０μＬを加え、３７℃で正確に５分間インキュベーション後、２０％酢酸溶液５０μＬを加えたものを使用した。その結果、Ｆ１０２４Ｓ−ＳＬＰＩ（Ｄ１Ｄ２）、Ｆ１０２４Ｓ−ＳＬＰＩ（Ｄ２）の５０％阻害濃度はそれぞれ２２.５μｇ／ｍLおよび２６.９μｇ／ｍLであった。また、ＳＬＰＩ（Ｄ２）に１、２および３コピーのＧＧＧＧＳリンカーが付加された融合蛋白質の５０％阻害濃度はそれぞれ１１.６μｇ／ｍL、１１.９μｇ／ｍLおよび１１.６μｇ／ｍLであった。
【０１４６】
(実施例１０) ヒト化抗体（ｈＦ１０２４Ｓ-Ｄ２（３））の作製
Ｆ１０２４-１-３ラット抗体の重鎖および軽鎖可変領域の各アミノ酸配列をデータベース上でサーチした結果、それぞれヒト抗体であるＩＧＨＶ７-８１（ ＢＣ０３２７３３）およびＨＵＭＩＧＲＦＦＭ（Ｌ４８２４２）と相同性が高いと判断した。そこで、Ｆ１０２４抗体両鎖の３つの相補性決定領域（ＣＤＲ）を、(1)ＩＧＨＶ７-８１およびＨＵＭＩＧＲＦＦＭ（以下ＲＦと表記）の、あるいは(2)結晶構造解析が詳細に行われているＮＥＷ、ＥｕおよびＲＥＩの、各フレームワーク（ＦＲ）に移植することで、ヒト化を行った（図４７参考）。各アミノ酸配列（図４８）を基に、塩基配列を設計し、いくつかに分割して合成することで、全６種類の遺伝子断片をそれぞれ調製した。各断片を、重鎖はｐＴＫ-２３７０、軽鎖はｐＴＫ-２３４４の各可変領域と置換し、発現プラスミド（重鎖：ＩＧＨＶ７-８１-ＨＡはｐＴＫ-２８８７、ＮＥＷ-ＨＡはｐＴＫ-２６７９、Ｅｕ-ＨＡはｐＴＫ-２６８５、軽鎖：ＲＦ-ＫＡはｐＴＫ-２９５５、ＲＥＩ-ＫＡはｐＴＫ-２６８０、Ｅｕ-ＫＡはｐＴＫ-２６８１）を構築した。これらの各プラスミドと、キメラ抗体発現プラスミド（重鎖はｐＴＫ-２３７０、軽鎖はｐＴＫ-２３４４）とをＣＯＳ-１細胞に様々な組み合わせでコトランスフェクションし、その上清中に分泌された抗体の、ＧＰＶＩ抗原に対する結合活性を比較した。
重鎖に関しては、ヒト化したことによって、いずれも発現量が著しく低下していた。そこで、各ＦＲにいくつかの変異を導入して検討を行なった。一方、軽鎖はいずれも発現および結合活性が確認できた。
３種類のヒト化重鎖発現プラスミドに関しては、ＦＲ中のヒト特異的配列のいくつかをラット由来の配列に戻して作製した変異体を多数構築し、詳細に解析したことで、最終的に発現および結合活性を維持した配列（ＩＧＨＶ７-８１-ＨＣはｐＴＫ-２９０９、ＩＧＨＶ７-８１-ＨＸはｐＴＫ-３００７、ＮＥＷ-ＨＢはｐＴＫ-２８０３、Ｅｕ-ＨＢはｐＴＫ-２８１１）を得ることができた。（図４９にアミノ酸配列を記載）
最後に、ヒト化重鎖およびヒト化軽鎖の組み合わせを検討し、最も発現および結合活性の高い組み合わせが、ＩＧＨＶ７-８１-ＨＸとＲＦ-ＫＡその他の軽鎖との組合せであった。
同様の手法を用いて、他の抗体融合蛋白質についても抗体部分をヒト化する。
【０１４７】
（実施例１１） 抗体融合蛋白質F１０２４Ｓ-Ｄ２（３）の安定高生産株の作製
１１−１ Ｆ１０２４Ｓ-Ｄ２（３）安定高発現プラスミド（ｐＴＫ-２６７１）の構築
Ｆ１０２４Ｓ-Ｄ２（３）重鎖一過性発現プラスミド（ｐＴＫ-２３７０：実施例１に記載）を鋳型とし、表１４に示すプライマー対（Ｆ１０２４Ｈ-ｋｏｚａｋ,ＩｇＧ４-ｌ）でＰＣＲを行った。この増幅産物を制限酵素ＥｃｏＲＩおよびＮｈｅＩで切断後、アガロースゲルで電気泳動し、Ｆ１０２４抗体重鎖可変領域を含む遺伝子断片（断片Ｕ）を抽出した。なお、表１４に使用プライマーの配列番号を示す。
【０１４８】
【表１５】
【０１４９】
ｐＴＫ-２３７０を制限酵素ＮｈｅＩおよびＳｓｅ８３８７Ｉで切断後、アガロースゲルで電気泳動し、Ｆ１０２４Ｓ-Ｄ２（３）の重鎖定常領域およびＤ２（３）をコードする遺伝子配列とＳＶ４０ ｐｏｌｙＡシグナルを含む遺伝子断片（断片Ｖ）を抽出した。Ｆ１０２４軽鎖発現プラスミド（ｐＴＫ-２３４４：実施例１に記載）を制限酵素ＢｓｉＷＩおよびＮｃｏＩで切断後、アガロースゲルで電気泳動し、Ｆ１０２４抗体軽鎖可変領域を含む遺伝子断片（断片Ｗ）を抽出した。
ＥＦプロモーター、ヒト軽鎖定常領域およびマウスＤＨＦＲ発現ユニット〔プロモーターとしてＳＶ４０プロモーター（エンハンサー領域は含まない）、ｐｏｌｙＡシグナルもＳＶ４０由来〕を有するプラスミド（ｐＴＫ-２５７７）を、制限酵素ＢｓｉＷＩおよびＥｃｏＲＩで切断後、アガロースゲルで電気泳動し、目的とするベクター断片（断片Ｘ）を抽出した。一方、Ｓｓｅ８３８７ＩおよびＮｃｏＩで切断後、アガロースゲルで電気泳動し、ＥＦプロモーター領域を含む遺伝子断片（断片Ｙ）も抽出した。
各遺伝子断片Ｕ〜Ｙを、Ｔ４ＤＮＡリガーゼ（タカラバイオ株式会社）で、ひとつにつなげ、Ｆ１０２４Ｓ-Ｄ２（３）の重鎖、軽鎖を同時に発現可能であり、導入細胞でのマーカーとなるマウスＤＨＦＲ発現ユニットを有する安定発現用プラスミド（ｐＴＫ-２６７１）を構築した。
他の抗体融合蛋白質についても同様の手法を用いて、安定高発現プラスミドを構築する。
【０１５０】
（実施例１２）効力評価（ｉｎ ｖｉｔｒｏ）
１２−１）ブラジキニン産生阻害作用の確認
（１）ＡＰＴＴ試薬惹起ヒトおよびウサギ血漿中ブラジキニン産生に対する抑制作用の確認
正常ヒト血漿はデイドサイトロールレベル1（ＤＡＤＥ ＢＥＨＲＩＮＧ社）を使用した。ウサギ血漿は、雄性ウサギ（ニュージーランドホワイト種、北山ラベス）の耳動脈より１／１０容の３．８％クエン酸ナトリウム（血沈用チトラート、岩城製薬）を含むシリンジを用いて採血し、４℃、３０００ｒｐｍ（０５ＰＲ−２２、日立）の条件で１０分間遠心して取得した。ヒトあるいはウサギ血漿８０μＬにｏ−ｐｈｅｎａｎｔｈｒｏｌｉｎｅ溶液を添加後、希釈液で段階希釈したＦ１０２４Ｓ−Ｄ２(３)溶液を終濃度が０、１、３、１０および３０μg／ｍＬとなるように、あるいはヒト免疫グロブリン（hIg）は終濃度が３０μg／ｍＬになるように添加し、混合した後に、３７℃で１０分間インキュベーションした。ミリＱ水で希釈したＡＰＴＴ試薬を８０μＬ添加し、３７℃で１０分間インキュベーションした。採取した１００μＬにブラジキニン測定キット（マーキットＭブラジキニン、大日本製薬）に付属の除蛋白剤を２０μＬ添加した後、４℃、１００００ｒｐｍ（ＭＲＸ−１５０、ＴＯＭＹ）、１０分間の遠心で取得した上清中のブラジキン濃度をブラジキニン測定キットを用いて測定した。その結果、Ｆ１０２４Ｓ−Ｄ２(３)は濃度に依存してヒトおよびウサギのＡＰＴＴ試薬惹起血漿中ブラジキニン産生を抑制した（図５０〜５１）。
【０１５１】
１２−２）凝固阻害作用の確認
（１）トロンボプラスチン惹起（ＦａｃｔｏｒＸＩ依存性）ヒト血漿中トロンビン産生に対する抑制作用の確認
ヒト血小板３×１０５／μＬを含むヒト血漿およびウサギ血小板３×１０５／μＬを含むウサギ血漿のそれぞれにＦ１０２４Ｓ−Ｄ２(３)溶液を終濃度が０、３、１０、３０、１００、３００μｇ／ｍＬになるように、あるいはヒト免疫グロブリン（ｈＩｇ）は終濃度が３００μｇ／ｍＬになるように加え、３７℃にて１０分間プレインキュベートした。その後、２５ｍｍｏｌ/Ｌ ＣａＣｌ２溶液にて８０００倍に希釈したトロンボプラスチン（シンプラスチンエクセル、BIOMERIEUX）溶液を添加し、３７℃でインキュベートを開始した。トロンボプラスチン溶液添加前および添加後は経時的にインキュベート溶液を５μＬずつ採取し、Ｂｕｆｆｅｒ Ｂ（(０．５ｍｇ／ｍＬ ＢＳＡ、０．１ｍｏｌ／Ｌ ＮａＣｌ、２０ｍｍｏｌ／Ｌ ＥＤＴＡを含む５０ｍｍｏｌ／Ｌ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液(ｐＨ７.９)) １００μＬと２ｍｍｏｌ／Ｌ Ｓ−２２３８ ２５μＬの混合液に添加して、３７℃にて１０分間インキュベートした。５０ｖｏｌ％ 酢酸 １００μＬを添加した後、反応液を２００μＬ／ｗｅｌｌずつ９６穴プレートに移し、４０５ｎｍにおける吸光度をプレートリーダー(Ｔｈｅｒｍｏｍａｘ ｍｉｃｒｏｐｌａｔｅ ｒｅａｄｅｒ、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅ)にて測定した。その結果、Ｆ１０２４Ｓ−Ｄ２(３)は濃度に依存してトロンボプラスチン惹起ヒトおよびウサギ血漿中トロンビン産生を抑制した（図５２〜５３）。
【０１５２】
１２−３）凝固阻害作用の確認
（１）ヒトＡＰＴＴ延長作用の確認
実施例８で作製したＦ１０２４Ｓ−ＴＭ２３４５６Ｍ、Ｆ１０２４Ｓ−ＴＭ２３４５６Ｌ、Ｆ１０２４Ｓ−ＴＭ２３４５６７ＭおよびＦ１０２４Ｓ−ＴＭ２３４５６７ＬのＡＰＴＴ延長作用を終濃度としてそれぞれ２.００、２.００、１.９５および２.２９μｇ／ｍＬにおいて、実施例３−３）の（１）と同様の方法でヒト正常血漿を用いて評価した。その結果、上記の４つの融合蛋白質はＡＰＴＴをそれぞれ２６、３２、４２および５７％延長した。
【０１５３】
（実施例１３）ｅｘ ｖｉｖｏ試験における有効性の評価
１３−１）Ｆ１０２４Ｓ−Ｄ２(３)の抗炎症作用の確認
ウサギ、ニュージーランドホワイト種（１．８−２．６ｋｇ，北山ラベス）にＦ１０２４Ｓ−Ｄ２(３)の１０ｍｇ／ｋｇを耳介静脈内投与し、経時的にクエン酸加採血した。採取した血液にＬＰＳ（ＷＥ.Ｃｏｌｉ ０５５：Ｂ５、ＤＩＦＣＯ）を終濃度１ｎｇ／ｍLで添加し、３７℃で４時間インキュベーションした。４℃、１００００ｒｐｍ（ＭＲＸ−１５０、ＴＯＭＹ）、１０分間の遠心で取得した血漿中のＴＮＦ−α濃度を抗ウサギＴＮＦ−α抗体を用いたＥＬＩＳＡにより測定した。その結果、ＬＰＳ刺激血液のＴＮＦ−α産生はＦ１０２４Ｓ−Ｄ２(３)投与後２４時間まで抑制された（図５４）。
【０１５４】
１３−２）Ｆ１０２４Ｓ−Ｄ２(３)の抗凝固作用の確認
実施例１３−１）の採血直後に遠心分離により取得した血漿を活性化トロンボプラスチン時間（ＡＰＴＴ）の測定に供した。ＡＰＴＴの測定は実施例３−３）と同様に実施した。その結果、Ｆ１０２４Ｓ−Ｄ２(３)投与後８時間までＡＰＴＴ延長がみられた（図５５）。
【０１５５】
（実施例１４）in vivoにおける有効性の評価
１４−１）ウサギ盲腸穿刺腹膜炎（ＣＬＰ：Cecal Ligation and Ｐuncture）モデル
ウサギ盲腸穿刺腹膜炎モデルを作製し、Ｆ１０２４Ｓ−Ｄ２(３)投与後での生存率および凝固パラメーターの改善を確認した。
ウサギ盲腸穿刺腹膜炎モデルは、Ｋｅｉｔｈ Ａらの方法（Journal of Surgical Research,29:189,1980）に準じ，ニュージーランドホワイト種（１．８−２．６ｋｇ，北山ラベス）に麻酔下で盲腸に穴を開け、盲腸内容物を腹腔に播種することにより作製した．２時間後にＦ１０２４Ｓ−Ｄ２(３)の１０ｍｇ／ｋｇを耳介静脈内投与し、以後は１日２回の同投与を３日間続けた。対照群にはＦ１０２４Ｓ−Ｄ２(３)の替わりにヒト免疫グロブリン（ｈIg）を投与した。７２時間まで生死の観察、記録を行い、カプランマイヤー生存曲線を描いた。さらに盲腸穿刺後８時間にクエン酸加採血し、血漿中の凝固パラメーターとしてＤダイマーを測定した。その結果、生存率（図５６）およびＤダイマー（図５７）ともにＦ１０２４Ｓ−Ｄ２(３)群は対照群に比べて改善された。
なお、図５６および図５７の対照群の概要を表１５に示す。
【０１５６】
【表１６】
【図面の簡単な説明】
【０１５７】
【図１】Ｆ１０２４抗体重鎖可変領域のＤＮＡ配列とアミノ酸配列を示す。
【図２】Ｆ１０２４抗体軽鎖可変領域のＤＮＡ配列とアミノ酸配列を示す。
【図３】Ｆ１０３１−１３−２抗体重鎖可変領域のＤＮＡ配列とアミノ酸配列を示す。
【図４】Ｆ１０３１−１３−２抗体軽鎖可変領域のＤＮＡ配列とアミノ酸配列を示す。
【図５】Ｆ１０３１−１３−２抗体重鎖可変領域のＤＮＡ配列とアミノ酸配列を示す。
【図６】Ｆ１０３１−１３−２抗体軽鎖可変領域のＤＮＡ配列とアミノ酸配列を示す。
【図７】融合蛋白質Ｆ１０２４Ｄ-Ｄ１Ｄ２の全アミノ酸配列構造の説明図である。
【図８】融合蛋白質Ｆ１０２４Ｄ-Ｄ２の全アミノ酸配列構造の説明図である。
【図９】融合蛋白質Ｆ１０２４Ｄ-Ｄ２（３）の全アミノ酸配列構造の説明図である。
【図１０】融合蛋白質Ｆ１０２４Ｓ-Ｄ１Ｄ２の全アミノ酸配列構造の説明図である。
【図１１】融合蛋白質Ｆ１０２４Ｓ-Ｄ２の全アミノ酸配列構造の説明図である。
【図１２】融合蛋白質Ｆ１０２４Ｓ-Ｄ２(3)の全アミノ酸配列構造の説明図である。
【図１３】融合蛋白質Ｆ１０２４Ｄ-ＳＬＰ１（Ｄ１Ｄ２）の全アミノ酸配列構造の説明図である。
【図１４】融合蛋白質Ｆ１０２４Ｄ-ＳＬＰ１（Ｄ２）の全アミノ酸配列構造の説明図である。
【図１５】融合蛋白質Ｆ１０２４Ｓ-ＳＬＰ１（Ｄ１Ｄ２）の全アミノ酸配列構造の説明図である。
【図１６】融合蛋白質Ｆ１０２４Ｓ-ＳＬＰ１（Ｄ２）の全アミノ酸配列構造の説明図である。
【図１７】融合蛋白質Ｆ１０３１-１３Ｓ-Ｄ２（３）の全アミノ酸配列構造の説明図である。
【図１８】Ｆ１０２４（抗ＣＤ１４抗体）または抗体融合蛋白質のＬＰＳ刺激Ｕ３７３ＭＧ細胞のＩＬ-６産生に対する抑制作用を示す図である。
【図１９】Ｆ１０２４（抗ＣＤ１４抗体）または抗体融合蛋白質のＬＰＳ刺激Ｕ３７３ＭＧ細胞のＩＬ-６産生に対する抑制作用を示す図である。
【図２０】抗体融合蛋白質各のＩＬ-６産生に対する抑制活性を示す図である。
【図２１】ＵＴＩ由来蛋白質および抗ＣＤ１４抗体融合蛋白質のトリプシン阻害活性を示す図である。
【図２２】抗ＣＤ１４抗体融合蛋白質のFactorＸａ阻害活性を示す。
【図２３】抗ＣＤ１４抗体融合蛋白質のFactorＸＩａ阻害活性を示す。
【図２４】抗ＣＤ１４抗体融合蛋白質のエラスターゼ阻害活性を示す。
【図２５】抗ＣＤ１４抗体融合蛋白質の血漿カリクレイン阻害活性を示す。
【図２６】ＬＰＳ負荷ウサギ敗血症モデルでの融合蛋白質Ｆ１０２４Ｓ-Ｄ２（３）の生存率改善効果を示す。
【図２７】ＬＰＳ負荷ウサギ敗血症モデルでの融合蛋白質Ｆ１０２４Ｓ-Ｄ２（３）が白血球数に及ぼす影響（ＬＰＳ負荷ウサギ敗血症モデルにおけるＬＰＳ初回投与後２８時間の白血球数）を示す。
【図２８】ＬＰＳ負荷ウサギ敗血症モデルでの融合蛋白質Ｆ１０２４Ｓ-Ｄ２（３）が血小板数に及ぼす影響（ＬＰＳ負荷ウサギ敗血症モデルにおけるＬＰＳ初回投与後２６時間の血小板数）を示す。
【図２９】ＬＰＳ負荷ウサギ敗血症モデルでの融合蛋白質Ｆ１０２４Ｓ-Ｄ２（３）がアンチトロンビン（ＡＴ）III活性減少に及ぼす影響（ＬＰＳ負荷ウサギ敗血症モデルにおけるＬＰＳ初回投与後２８時間のＡＴIII活性の減少）を示す。
【図３０】ＬＰＳ負荷ウサギ敗血症モデルでの融合蛋白質Ｆ１０２４Ｓ-Ｄ２（３）の血圧低下改善効果を示す。
【図３１】Ｆ１０２４抗体に対する結合競合実験の結果を示す。
【図３２】融合蛋白質Ｆ１０２４−Ｄ２のＵＴＩ第２ドメインの各改変体のアミノ酸配列を示す。
【図３３】融合蛋白質Ｆ１０２４−Ｄ２のＵＴＩ第２ドメインの各改変体のアミノ酸配列を示す。
【図３４】融合蛋白質Ｆ１０２４−Ｄ２のＵＴＩ第２ドメインの各改変体のアミノ酸配列を示す。
【図３５】融合蛋白質Ｆ１０２４−Ｄ２のＵＴＩ第２ドメインの各改変体のアミノ酸配列を示す。
【図３６】融合蛋白質Ｆ１０２４Ｓ-Ｄ２（４）（Ｒ１１Ｓ/Ｒ１５Ｔ/Ｑ１９Ｋ/Ｙ４６Ｄ）の全アミノ酸配列構造の説明図を示す。
【図３７】融合蛋白質Ｆ１０２４−ＴＭのＴＭの各種機能ドメインの各改変体のアミノ酸配列を示す。
【図３８】融合蛋白質Ｆ１０２４−ＴＭのＴＭの各種機能ドメインの各改変体のアミノ酸配列を示す。
【図３９】融合蛋白質Ｆ１０２４−ＴＭのＴＭの各種機能ドメインの各改変体のアミノ酸配列を示す。
【図４０】融合蛋白質Ｆ１０２４−ＴＭのＴＭの各種機能ドメインの各改変体のアミノ酸配列を示す。
【図４１】融合蛋白質Ｆ１０２４−ＴＭのＴＭの各種機能ドメインの各改変体のアミノ酸配列を示す。
【図４２】融合蛋白質Ｆ１０２４−ＴＭのＴＭの各種機能ドメインの各改変体のアミノ酸配列を示す。
【図４３】融合蛋白質Ｆ１０２４−ＴＭのＴＭの各種機能ドメインの各改変体のアミノ酸配列を示す。
【図４４】融合蛋白質Ｆ１０２４−ＴＭのＴＭの各種機能ドメインの各改変体のアミノ酸配列を示す。
【図４５】融合蛋白質Ｆ１０２４Ｓ-ＴＭ２３４５６Ｌの全アミノ酸配列構造の説明図を示す。
【図４６】融合蛋白質Ｆ１０２４Ｓ−ＴＭのＴＭの各種機能ドメインの各改変体のトロンボモジュリン活性を示す。
【図４７】ヒト化Ｆ１０２４Ｓ−Ｄ２（３）の全アミノ酸配列構造の説明図を示す。
【図４８】Ｆ１０２４−１−３ラット抗体の重鎖および軽鎖可変領域のアミノ酸配列およびヒト化Ｆ１０２４Ｓ−Ｄ２（３）の重鎖および軽鎖可変領域と相同性の高いヒト抗体のアミノ酸配列を示す。
【図４９】ヒト化抗体の重鎖の発現および結合活性維持が可能なアミノ酸配列を示す。
【図５０】ＡＰＴＴ試薬惹起ヒト血漿中ブラジキニン産生に対する抑制作用を示す。
【図５１】ＡＰＴＴ試薬惹起ウサギ血漿中ブラジキニン産生に対する抑制作用を示す。
【図５２】トロンボプラスチン惹起ヒト血漿中トロンビン産生に対する抑制作用を示す。
【図５３】トロンボプラスチン惹起ウサギ血漿中トロンビン産生に対する抑制作用を示す。
【図５４】Ｆ１０２４Ｓ−Ｄ２（３）投与後のＬＰＳ惹起ウサギ全血ＴＮＦ−α産生に対する抑制作用の経時変化を示す。
【図５５】ウサギＦ１０２４Ｓ−Ｄ２（３）投与後のＡＰＴＴの経時変化を示す。
【図５６】ウサギ盲腸穿刺腹膜炎（ＣＬＰ）モデルＦ１０２４Ｓ−Ｄ２（３）投与後の生存率の変化を示す。
【図５７】ウサギ盲腸穿刺腹膜炎（ＣＬＰ）モデルＦ１０２４Ｓ−Ｄ２（３）投与後の血漿中のＤダイマーの変化を示す。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
（Ｉ）抗ＣＤ１４抗体もしくはその活性断片またはそれらの誘導体、および、（II）蛋白分解酵素の阻害物質もしくはその活性断片またはそれらの誘導体を含有する蛋白質。
【請求項２】
前記（II）の阻害物質が蛋白性阻害物質である、請求項１に記載の蛋白質。
【請求項３】
前記（II）の阻害物質が多価酵素阻害物質である、請求項１または２に記載の蛋白質。
【請求項４】
前記（II）の蛋白分解酵素が血液凝固因子（血液凝固系蛋白分解酵素）または炎症性プロテアーゼである、請求項１ないし３のいずれかに記載の蛋白質。
【請求項５】
前記（II）の蛋白分解酵素がＦＸａおよび／またはＦＸＩａである、請求項１ないし４のいずれかに記載の蛋白質。
【請求項６】
前記（II）の蛋白分解酵素がトロンビンである、請求項１ないし４のいずれかに記載の蛋白質。
【請求項７】
前記（II）の阻害物質がＵＴＩ由来である、請求項１ないし６のいずれかに記載の蛋白質。
【請求項８】
前記（II）の阻害物質がトロンボモジュリン由来である、請求項１ないし６のいずれかに記載の蛋白質。
【請求項９】
前記（II）の阻害物質がトロンボモジュリンの機能ドメイン由来、特にＥＧＦ様ドメイン由来である、請求項１ないし６および８のいずれかに記載の蛋白質。
【請求項１０】
前記（II）の蛋白分解酵素がエラスターゼである、請求項１ないし４のいずれかに記載の蛋白質。
【請求項１１】
前記（II）の阻害物質が分泌性白血球プロテアーゼインヒビターである、請求項１ないし４および１０のいずれかに記載の蛋白質。
【請求項１２】
前記（Ｉ）の抗ＣＤ１４抗体が中和能を有する抗体である、請求項１ないし１１のいずれかに記載の蛋白質。
【請求項１３】
前記（Ｉ）の抗ＣＤ１４抗体がヒトＣＤ１４のアミノ酸番号２６９〜３１５の領域の少なくとも一部を認識する抗体である、請求項１ないし１２のいずれかに記載の蛋白質。
【請求項１４】
前記（Ｉ）の抗ＣＤ１４抗体がキメラ抗体である、請求項１ないし１３のいずれかに記載の蛋白質。
【請求項１５】
前記（Ｉ）の抗ＣＤ１４抗体がヒト化抗体である、請求項１ないし１４のいずれかに記載の蛋白質。
【請求項１６】
前記（Ｉ）の抗ＣＤ１４抗体が、表２に記載の重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を重鎖可変領域のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３として、または、表２に記載の軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を軽鎖可変領域のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３として含有する、請求項１ないし１５のいずれかに記載の蛋白質。
【請求項１７】
請求項１ないし１６のいずれかに記載の蛋白質の少なくとも一部をコードするポリヌクレオチド。
【請求項１８】
請求項１７のポリヌクレオチドを含有するベクター。
【請求項１９】
請求項１７に記載のポリヌクレオチドまたは請求項１８に記載のベクターを含有する細胞。
【請求項２０】
請求項１７に記載のポリヌクレオチド、請求項１８に記載のベクターまたは請求項１９に記載の細胞の少なくともいずれか一つを用いることを特徴とする、請求項１ないし１６のいずれかに記載の蛋白質の製造方法。
【請求項２１】
請求項１ないし１６のいずれかに記載の蛋白質、請求項１７に記載のポリヌクレオチド、請求項１８に記載のベクターまたは請求項１９に記載の細胞の少なくともいずれか一つを含有することを特徴とする、疾患の予防および／または治療剤。
【請求項２２】
前記疾患が敗血症、重敗血症もしくは敗血症ショック、ＳＩＲＳ関連疾患、エンドトキシンショック、またはＡＲＤＳである、請求項２１の予防および／または治療剤。
【請求項１】
（Ｉ）抗ＣＤ１４抗体もしくはその活性断片またはそれらの誘導体、および、（II）蛋白分解酵素の阻害物質もしくはその活性断片またはそれらの誘導体を含有する蛋白質。
【請求項２】
前記（II）の阻害物質が蛋白性阻害物質である、請求項１に記載の蛋白質。
【請求項３】
前記（II）の阻害物質が多価酵素阻害物質である、請求項１または２に記載の蛋白質。
【請求項４】
前記（II）の蛋白分解酵素が血液凝固因子（血液凝固系蛋白分解酵素）または炎症性プロテアーゼである、請求項１ないし３のいずれかに記載の蛋白質。
【請求項５】
前記（II）の蛋白分解酵素がＦＸａおよび／またはＦＸＩａである、請求項１ないし４のいずれかに記載の蛋白質。
【請求項６】
前記（II）の蛋白分解酵素がトロンビンである、請求項１ないし４のいずれかに記載の蛋白質。
【請求項７】
前記（II）の阻害物質がＵＴＩ由来である、請求項１ないし６のいずれかに記載の蛋白質。
【請求項８】
前記（II）の阻害物質がトロンボモジュリン由来である、請求項１ないし６のいずれかに記載の蛋白質。
【請求項９】
前記（II）の阻害物質がトロンボモジュリンの機能ドメイン由来、特にＥＧＦ様ドメイン由来である、請求項１ないし６および８のいずれかに記載の蛋白質。
【請求項１０】
前記（II）の蛋白分解酵素がエラスターゼである、請求項１ないし４のいずれかに記載の蛋白質。
【請求項１１】
前記（II）の阻害物質が分泌性白血球プロテアーゼインヒビターである、請求項１ないし４および１０のいずれかに記載の蛋白質。
【請求項１２】
前記（Ｉ）の抗ＣＤ１４抗体が中和能を有する抗体である、請求項１ないし１１のいずれかに記載の蛋白質。
【請求項１３】
前記（Ｉ）の抗ＣＤ１４抗体がヒトＣＤ１４のアミノ酸番号２６９〜３１５の領域の少なくとも一部を認識する抗体である、請求項１ないし１２のいずれかに記載の蛋白質。
【請求項１４】
前記（Ｉ）の抗ＣＤ１４抗体がキメラ抗体である、請求項１ないし１３のいずれかに記載の蛋白質。
【請求項１５】
前記（Ｉ）の抗ＣＤ１４抗体がヒト化抗体である、請求項１ないし１４のいずれかに記載の蛋白質。
【請求項１６】
前記（Ｉ）の抗ＣＤ１４抗体が、表２に記載の重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を重鎖可変領域のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３として、または、表２に記載の軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を軽鎖可変領域のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３として含有する、請求項１ないし１５のいずれかに記載の蛋白質。
【請求項１７】
請求項１ないし１６のいずれかに記載の蛋白質の少なくとも一部をコードするポリヌクレオチド。
【請求項１８】
請求項１７のポリヌクレオチドを含有するベクター。
【請求項１９】
請求項１７に記載のポリヌクレオチドまたは請求項１８に記載のベクターを含有する細胞。
【請求項２０】
請求項１７に記載のポリヌクレオチド、請求項１８に記載のベクターまたは請求項１９に記載の細胞の少なくともいずれか一つを用いることを特徴とする、請求項１ないし１６のいずれかに記載の蛋白質の製造方法。
【請求項２１】
請求項１ないし１６のいずれかに記載の蛋白質、請求項１７に記載のポリヌクレオチド、請求項１８に記載のベクターまたは請求項１９に記載の細胞の少なくともいずれか一つを含有することを特徴とする、疾患の予防および／または治療剤。
【請求項２２】
前記疾患が敗血症、重敗血症もしくは敗血症ショック、ＳＩＲＳ関連疾患、エンドトキシンショック、またはＡＲＤＳである、請求項２１の予防および／または治療剤。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図１６】
【図１７】
【図１８】
【図１９】
【図２０】
【図２１】
【図２２】
【図２３】
【図２４】
【図２５】
【図２６】
【図２７】
【図２８】
【図２９】
【図３０】
【図３１】
【図３２】
【図３３】
【図３４】
【図３５】
【図３６】
【図３７】
【図３８】
【図３９】
【図４０】
【図４１】
【図４２】
【図４３】
【図４４】
【図４５】
【図４６】
【図４７】
【図４８】
【図４９】
【図５０】
【図５１】
【図５２】
【図５３】
【図５４】
【図５５】
【図５６】
【図５７】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図１６】
【図１７】
【図１８】
【図１９】
【図２０】
【図２１】
【図２２】
【図２３】
【図２４】
【図２５】
【図２６】
【図２７】
【図２８】
【図２９】
【図３０】
【図３１】
【図３２】
【図３３】
【図３４】
【図３５】
【図３６】
【図３７】
【図３８】
【図３９】
【図４０】
【図４１】
【図４２】
【図４３】
【図４４】
【図４５】
【図４６】
【図４７】
【図４８】
【図４９】
【図５０】
【図５１】
【図５２】
【図５３】
【図５４】
【図５５】
【図５６】
【図５７】
【公開番号】特開２００７−２１５５４６（Ｐ２００７−２１５５４６Ａ）
【公開日】平成１９年８月３０日（２００７．８．３０）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００７−７６８９０（Ｐ２００７−７６８９０）
【出願日】平成１９年３月２３日（２００７．３．２３）
【分割の表示】特願２００６−５５１１３１（Ｐ２００６−５５１１３１）の分割
【原出願日】平成１８年６月５日（２００６．６．５）
【出願人】（０００１８１１４７）持田製薬株式会社 (62)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成１９年８月３０日（２００７．８．３０）
【国際特許分類】
【出願日】平成１９年３月２３日（２００７．３．２３）
【分割の表示】特願２００６−５５１１３１（Ｐ２００６−５５１１３１）の分割
【原出願日】平成１８年６月５日（２００６．６．５）
【出願人】（０００１８１１４７）持田製薬株式会社 (62)
【Ｆターム（参考）】
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