抗ＭＵＣ１のα／β抗体
本発明により、インタクトなＭＵＣ１タンパク質のα−サブユニットおよびβ−サブユニットに同時に結合する抗体、ならびにそのような抗体を作製し使用するための方法が提供される。一つの実施形態において、本発明は、αサブユニットまたはβサブユニットのいずれに対しても他方が存在しない場合には実質的には結合しないとの条件で、インタクトなＭＵＣ１タンパク質に特異的に結合する、ＭＵＣ１特異的抗体を提供する。本発明はまた、診断用途および免疫療法への適用においてこれらの抗体を使用するための方法を提供する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願についての相互参照
本出願は、２００５年２月２８日に出願した米国仮特許出願第６０／６４７，８７０号に対する利益を主張する。この仮出願の内容は、全て目的のために、その全体が参考として本明細書中に援用される。
【０００２】
連邦政府支援の研究開発下で行われた本発明の権利に関する状況
該当なし
（技術分野）
本発明は、ＭＵＣ１のα−サブユニットおよびβ−サブユニットの両方に特異的かつ同時に結合する抗体に関する。
【背景技術】
【０００３】
（発明の背景）
ＭＵＣ１は、多数のヒト上皮性悪性腫瘍（乳ガン、前立腺ガン、結腸ガン、卵巣ガン、および膵臓ガンを含む）において、ならびに多発性骨髄腫の悪性形質細胞上で高度に発現されている糖タンパク質である。オルタナティブスプライシングによって様々なＭＵＣ１イソ型が生じ得るが、最も集中的に研究されているＭＵＣ１タンパク質は、タンデムリピートアレイを含む重いグリコシル化された細胞外ドメイン、膜貫通ドメイン、および細胞質ドメインから構成されているＩ型膜貫通タンパク質（ＭＵＣ１／ＴＭ）である。ＭＵＣ１／ＴＭは、その合成の後に直ちにタンパク質分解によって切断されて、特異的に認識し、そして強力な共有結合ではない相互作用で結合する２つのサブユニット（αとβ）を生じる（図１、ＭＵＣ１／ＴＭを参照のこと）。ＭＵＣ１の２つのサブユニットへの切断は、多数の、細胞につながれているムチン様タンパク質において見られる高度に保存されているドメインであるＳＥＡモジュールの中で起こる（非特許文献１：Ｌｅｖｉｔｉｎ，ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．（２００５）２８０：３３３７４−８６）。細胞膜からのα−サブユニットの分割によっては、末梢循環中に可溶性のタンデムリピートアレイを含むＭＵＣ１が生じる。この分子は、ＭＵＣ１陽性悪性腫瘍の患者において血清ＭＵＣ１レベルを決定するために使用される分子である。
【０００４】
循環中の可溶性α−サブユニットＭＵＣ１タンパク質の存在は、ＭＵＣ１を発現する悪性腫瘍細胞を直接標的化するための適切な量の抗ＭＵＣ１抗体の送達における唯一の問題を呈する。これは、ＭＵＣ１の最も免疫原性である部分が、タンデムリピートアレイであり、今日までに作製された抗ＭＵＣ１抗体のほとんど全てがその免疫原性領域中のエピトープを排他的に認識することがその理由である。可溶性の循環しているＭＵＣ１ α−サブユニットによるタンデムリピート部分に対する抗体の分離は、細胞表面上のＭＵＣ１にうまく結合することができる抗体の量を厳しく制限する。さらに、タンデムリピート部分に対する抗体とその可溶性の循環しているＭＵＣ１標的の免疫複合体の蓄積によっては、有意な標的器官の損傷が導かれる可能性がある。
【０００５】
近年、免疫原として全長のＭＵＣ１／ＴＭ分子を使用して有効な抗ＭＵＣ１抗体を作製するための多くの努力が行われている。これらの試みを妨げる主要な障害は、ＭＵＣ１／ＴＭ分子全体での免疫化によっては、必ず、高度に免疫原性であるタンデムリピートアレイ上のエピトープを認識する抗体のほぼ全体からなる抗体反応が生じることである。ＭＵＣ１を発現する腫瘍細胞のインビボでの標的化における最終的な用途については、このような抗体は、上記に詳細に記載したように、反復部分に対する抗体に固有の欠点の全てを有している。
【０００６】
細胞表面につながれているＭＵＣ１エピトープを認識する抗体は、これらの問題点を未然に防げる可能性がある。概念上は簡単であるが、細胞表面に安定につながれているＭＵＣ１に対するモノクローナル抗体の作製には、最初に、細胞に結合した、分割されていない落ちないエピトープの特性決定が必要である。ＭＵＣ１ α−サブユニットが結合している膜に繋がれているβ−サブユニットによって形成される接点によって、このようなエピトープが提供される。
【非特許文献１】Ｌｅｖｉｔｉｎ，ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．（２００５）２８０：３３３７４−８６
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【０００７】
（発明の簡単な説明）
本発明により、インタクトなＭＵＣ１タンパク質のα−サブユニットおよびβ−サブユニットの両方に同時に結合する抗体（「抗ＭＵＣ１ α／β抗体」、これは、ＭＵＣ１ α／βサブユニットの接点に結合するが、一方が存在していない場合にはＭＵＣ１ α−サブユニットまたはＭＵＣ１ β−サブユニットのいずれにも実質的には結合しない）が提供される。本発明者らによって、さらに、このような抗体を生産するための方法、ならびに、例えば、診断用途および免疫療法への適用においてこれらの抗体を使用するための方法が提供される。
【０００８】
したがって、第１の態様においては、本発明によって、抗体が、一方が存在しない場合にはα−サブユニットまたはβ−サブユニットのいずれにも結合しないという条件で、インタクトなＭＵＣ１タンパク質に結合するＭＵＣ１特異的抗体が提供される。
【０００９】
抗体の実施形態に関して、いくつかの実施形態においては、抗体は、例えば、ＥＬＩＳＡにおいて、または１つのＭＵＣ１イソ型を発現する細胞を使用するフローサイトメトリーによって測定した場合に、イソ型ＭＵＣ１／Ｘには結合するが、イソ型ＭＵＣ１／Ｙには結合しない。いくつかの実施形態においては、抗体はＭＵＣ１／Ｘイソ型に結合し、これは、短縮型のα−サブユニットとβ−サブユニットに切断される。
【００１０】
抗体はポリクローナルでも、またモノクローナルでもあり得る。抗体は、約１０−７Ｍから約１０−１２Ｍの範囲、例えば、約１０−７Ｍ、１０−８Ｍ、１０−９Ｍ、１０−１０Ｍ、１０−１１Ｍ、１０−１２Ｍ、の解離定数（Ｋｄ）を有し得る。抗体は、約１０６Ｍ−１から約１０１０Ｍ−１の範囲、例えば、約１０６Ｍ−１、１０７Ｍ−１、１０８Ｍ−１、１０９Ｍ−１、または１０１０Ｍ−１の結合定数（Ｋａ）を有し得る。抗体は、ＭＵＣ１／ＴＭまたはＭＵＣ１／Ｘを抗原として使用してＥＬＩＳＡアッセイによって測定すると、約１：１００または１：３００から約１：３０，０００または１：５０，０００まで、例えば、約１：３００、１：１０００、１：５０００、１：１０，０００、１：２０，０００、１：３０，０００、１：５０，０００の力価を有し得る。
【００１１】
抗体には、任意の自然界に存在している定常領域、または任意のそれらのサブクラスが含まれ得る。これには、例えば、ＩｇＡ（ＩｇＡ１およびＩｇＡ２を含む）、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ（ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、およびＩｇＧ４を含む）、ならびにＩｇＭが含まれる。抗体は、哺乳類または鳥類を含む、抗体を生産することができる任意の動物に由来する定常領域を有し得る。抗体は、ヒトおよびヒト以外の哺乳動物（イヌ、ネコ、ウシ、ヒツジ、ウマ、ブタ、および齧歯類（ウサギ、ラット、ハムスター、マウスを含む）を含む）の中で生産させることができる。抗体はニワトリの中で生産させることもできる。
【００１２】
いくつかの実施形態においては、抗体はヒト化抗体であるか、またはヒト抗体である。いくつかの実施形態においては、抗体は定常領域を欠いている。例えば、抗体は、Ｆａｂ断片である場合も、また一本鎖の可変領域である場合もある。抗体は組み換えによって生産することができる。
【００１３】
抗体にはさらに、細胞傷害性部分（例えば、リシン分子、緑膿菌（ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）毒素、放射性同位元素）を含めることができる。抗体にはさらに、標識部分（例えば、放射性同位元素、酵素、蛍光色素分子）を含めることができる。
【００１４】
いくつかの実施形態においては、抗体は、ＭＵＣ１ α−サブユニットのβ−サブユニットからの解離を妨げる。いくつかの実施形態においては、抗体によって、ＭＵＣ１ β−サブユニットを介する細胞内シグナル伝達が減少するかまたは阻害される。
【００１５】
いくつかの実施形態においては、抗体は、ＤＭＣ２０９またはＤＭＣ１１１である。
【００１６】
本発明により、さらに、抗ＭＵＣ１ α／β抗体を含む細胞が提供される。例えば、細胞は、抗体を生産するハイブリドーマであり得る。細胞はまた、インタクトなＭＵＣ１タンパク質をその表面上に有している細胞であり得、この場合、ＭＵＣ１タンパク質は、抗ＭＵＣ１ α／β抗体に結合させられる（すなわち、付着させられる）。細胞はまた、本発明の抗体を発現するように組み換えによって修飾することができる。
【００１７】
別の態様においては、本発明により、治療上十分な量の本発明の抗ＭＵＣ１ α／β抗体を投与することによる、ＭＵＣ１を過剰発現しているガン細胞に対して免疫毒素を標的化させる方法、およびＭＵＣ１を過剰発現しているガン細胞の増殖を阻害または妨げる方法が提供される。
【００１８】
さらなる態様においては、本発明により、インタクトなＭＵＣ１タンパク質に結合するＭＵＣ１特異的抗体を生産する方法が提供される。この方法には、以下の工程が含まれる：
ｉ）インタクトなＭＵＣ１タンパク質に結合するＭＵＣ１特異的抗体を得るために十分な量のαサブユニットのタンデムリピートを含むＭＵＣ１／ＴＭ抗原で、１回以上、抗体を生産する能力を有している被験体を免疫化する工程；および
ｉｉ）ＭＵＣ１／Ｘ抗原に結合する抗体を選択する工程。
この場合、抗体は、一方が存在しない場合にはＭＵＣ１ α−サブユニットまたはＭＵＣ１ βサブユニットのいずれにも結合しない。
【００１９】
この方法のさらなる実施形態においては、被験体を、ＭＵＣ１／ＴＭ抗原での免疫化に続いて、イソ型ＭＵＣ１／Ｘ抗原で１回以上免疫化することができる。ＭＵＣ１抗原での免疫化には、状況に応じてアジュバントを含めることができる。
【００２０】
ＭＵＣ１／ＴＭおよびＭＵＣ／Ｘ抗原は別々に、核酸またはポリペプチドの形態で被験体に投与することができる。１つの実施形態においては、被験体は、最初に、ＭＵＣ１／ＴＭ抗原をコードする核酸（例えば、ｃＤＮＡ）で１回以上免疫化され、その後に続いて、ＭＵＣ１／Ｘ抗原をコードする核酸で１回以上免疫化される。
【００２１】
別の態様においては、本発明により、抗体が、一方が存在しない場合にはα−サブユニットまたはβ−サブユニットのいずれにも結合しないという条件で、インタクトなＭＵＣ１タンパク質に結合するＭＵＣ１特異的抗体をスクリーニングする方法が提供される。この方法には、以下の工程が含まれる：
ｉ）切断されたＭＵＣ１／Ｘ抗原およびＭＵＣ１／Ｙ抗原に対する、作製された複数の抗ＭＵＣ１抗体の結合を決定する工程；ならびに
ｉｉ）ＭＵＣ１／Ｘ抗原には特異的に結合するが、ＭＵＣ１／Ｙ抗原には特異的には結合しない抗体を選択する工程。
【００２２】
これらの方法において生産されるか、または使用される抗体の実施形態は、上記に記載されたものと同じである。
【００２３】
関連する態様においては、本発明により、目的の抗原に対する抗体を生産する方法が提供される。この方法には、以下の工程が含まれる：
ｉ）αサブユニットのタンデムリピートと目的の抗原を含むＭＵＣ１／ＴＭ抗原で１回以上被験体を免疫化する工程；および
ｉｉ）目的の抗原で１回以上被験体を免疫化する工程。
これによって、目的の抗原に対する抗体が生産される。
【００２４】
ＭＵＣ１／ＴＭ抗原と目的の抗原は、別々に、核酸またはポリペプチドの形態で被験体に投与することができる。
【００２５】
いくつかの実施形態においては、ＭＵＣ１／ＴＭ抗原と目的の抗原は一緒に投与される。いくつかの実施形態においては、ＭＵＣ１／ＴＭ抗原と目的の抗原は、化学的リンカーによって結合させられる。いくつかの実施形態においては、ＭＵＣ１／ＴＭ抗原と目的の抗原は融合タンパク質として投与される。
【００２６】
目的の抗原は、任意の抗原性ポリペプチド配列である場合も、また抗原性ポリペプチド配列をコードする任意の核酸である場合もある。目的の抗原は、ヒト、哺乳動物、動物、植物、細菌、ウイルス、または合成のものであり得るが、これらに限定はされない。目的の抗原は、腫瘍関連抗原（例えば、ガン胎児性抗原（ＣＥＡ）、糖鎖抗原（ＣＡ−１２５）、前立腺幹細胞抗原（ＰＳＣＡ）、メラノーマ抗原（ＭＡＧＥ、ＭＡＲＴ））であり得る。目的の抗原は、感染性疾患に関係している抗原であり得る。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２７】
定義
本明細書中で別段の定義がなければ、本明細書中で使用される全ての技術用語および科学用語は、本発明が属する分野の当業者によって一般的に理解されている意味と同じ意味を有する。例えば、Ｃｏｎｃｉｓｅ Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ ｏｆ Ｂｉｏｍｅｄｉｃｉｎｅ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｕｏ，Ｐｅｉ−Ｓｈｏｗ，第２版，２００２，ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ；Ｔｈｅ Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ ｏｆ Ｃｅｌｌ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，第３版，１９９９，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ；およびＯｘｆｏｒｄ Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ ｏｆ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ Ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｒｅｖｉｓｅｄ，２０００，Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓによって、本発明で使用される多くの用語についての一般的な辞書が当業者に提供されている。
【００２８】
アミノ酸は、それらの一般的に知られている３文字記号によって、またはＩＵＰＡＣ−ＩＵＢ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅ Ｃｏｍｍｉｓｓｉｏｎによって推奨されている１文字記号によってのいずれかで、本明細書中で記載され得る。同様に、ヌクレオチドは、それらの一般的に受け入れられている１文字コードによって記載され得る。本発明の目的については、以下の用語は以下のように定義される。
【００２９】
用語「特異的に結合する（ｂｉｎｄ（ｓ） ｓｐｅｃｉｆｉｃａｌｌｙ）」もしくは「特異的に結合する（ｓｐｅｃｉｆｉｃａｌｌｙ ｂｉｎｄ（ｓ））」、あるいは、「結合する（ａｔｔａｃｈｅｄ）」もしくは「結合している（ａｔｔａｃｈｉｎｇ）」は、その標的エピトープが欠失している細胞もしくは組織と比較した、特定の標的エピトープを有している細胞もしくは組織との、抗ＭＵＣ１ α／β抗体の全体または一部における優先的な会合を意味する。もちろん、一定の程度の非特異的相互作用が、抗体と標的ではないエピトープの間で起こり得ることが認識される。それにもかかわらず、特異的結合は、標的エピトープの特異的認識によって媒介されるので区別することができる。通常、特異的結合は、送達された分子と標的エピトープを有しているもの（例えば、アッセイ用ウェルまたは細胞）との間で、結合した抗体と標的エピトープを有していないもの（例えば、アッセイ用ウェルまたは細胞）との間よりも、はるかに強い会合を生じる。特異的結合によっては、通常、標的エピトープを有していない細胞または組織と比較すると、標的エピトープを有している細胞または組織に対しては、結合した抗ＭＵＣ１ α／β抗体の量（単位時間あたり）において約１０倍を超える量、そして最も好ましくは１００倍を超える量の増加が生じる。２つのものの間での特異的結合は、一般的には、少なくとも１０６Ｍ−１の親和性を意味する。１０８Ｍ−１より大きい親和性が好ましい。特異的結合は、ウェスタンブロット、ＥＬＩＳＡ、フローサイトメトリー、免疫組織化学を含む、当該分野で公知の抗体結合についての任意のアッセイを使用して決定することができる。
【００３０】
表現「実質的には結合しない」は、標的エピトープに特異的に結合する抗ＭＵＣ１ α／β抗体のわずか約１０〜１５％しか、特定の標的ではないエピトープに結合しないことを意味する。標的エピトープを含まないものに対する抗体の「実質的ではない結合」は、標的エピトープを有している同じものに対する抗体の特異的結合よりも、約１０倍少なく、そして好ましくは、約１００倍少ない。
【００３１】
用語「ＭＵＣ１」または「ムチン１」は、多形変異体、対立遺伝子、突然変異体、および種間ホモログを意味する。これは、（１）約２５個のアミノ酸、状況によっては、５０、１００、１５０、２００、２５０個のアミノ酸のウィンドウ全体にわたって、自然界に存在しているＭＵＣ１タンパク質（例えば、ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＮＰ＿００２４４７（ＭＵＣ１ムチンイソ型１）、ＮＰ＿００１０１８０１６（ＭＵＣ１ムチンイソ型２）、ＮＰ＿００１０１８０１７（ＭＵＣ１ムチンイソ型３）、もしくはＮＰ＿００１０１８０２１（ＭＵＣ１ムチンイソ型４）、イソ型ＭＵＣ１／ＴＭ、イソ型ＭＵＣ１／Ｘ、イソ型ＭＵＣ１／Ｙを含む）に対して約８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％のアミノ酸配列同一性を有しているものであるか；（２）自然界に存在しているＭＵＣ１タンパク質のアミノ酸配列（グリコシル化されたアミノ酸配列を含む）およびその保存的に修飾された変異体を含む免疫原に対して惹起させられた抗体に特異的に結合するものであるか、あるいは（３）約２５個のアミノ酸、状況によっては、５０、１００、１５０、２００、２５０、５００個の核酸のウィンドウ全体にわたって、自然界に存在しているＭＵＣ１核酸配列（例えば、ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＮＭ＿００２４５６（ＭＵＣ１転写変異体１）、ＮＭ＿００１０１８０１６（ＭＵＣ１転写変異体２）、ＮＭ＿００１０１８０１７（ＭＵＣ１転写変異体３）、もしくはＮＭ＿００１０１８０２１（ＭＵＣ１転写変異体４）、変異体ＭＵＣ１／ＴＭ、変異体ＭＵＣ１／Ｘ、変異体ＭＵＣ１／Ｙを含む）に対して約８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％の核酸配列同一性を有しているものである。
【００３２】
ＭＵＣ１は、反復ドメインと密集したＯ−グリコシル化を特徴とする、細胞表面および／または血清腫瘍マーカーである糖タンパク質である（Ｂａｌｄｕｓ，ｅｔ ａｌ．，Ｃｒｉｔ Ｒｅｖ Ｃｌｉｎ Ｌａｂ Ｓｃｉ（２００４）４１：１８９；Ｋａｒｓｔｅｎ，ｅｔ ａｌ．，（２００５）２６：２１７）。ＭＵＣ１は、最も単純な上皮細胞の内腔表面で発現され、そして多数の上皮性悪性腫瘍（乳ガン、前立腺ガン、卵巣ガン、および膵臓ガンを含む）のガン腫細胞、ならびに悪性形質細胞（例えば、多発性骨髄腫）上では過剰に発現されている（Ｔａｙｌｏｒ−Ｐａｐａｄｉｍｉｔｒｉｏｕ，ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍａｍｍａｒｙ Ｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌ Ｎｅｏｐｌａｓｉａ（２００２）７：２０９；Ｄｅｎｄａ−Ｎａｇａｉ ａｎｄ Ｉｒｉｍｕｒａ，Ｇｌｙｃｏｃｏｎｊ Ｊ（２０００）１７：６４９を参照のこと）。ＭＵＣ１は、可溶性のα−サブユニットと細胞につながれているβ−サブユニットから構成されている。ＭＵＣ１は、細胞−細胞接着を媒介する細胞内接着分子−１（ＩＣＡＭ−１）に結合し（Ｂａｌｄｕｓ ｅｔ ａｌ．，（前出）およびＲａｈｎ，ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．（２００４）２７９：２９３８６）、そしてシグナル伝達分子についてのドッキングタンパク質としての役割を果たす。ＭＵＣ１は、高度に保存されている細胞質テールを有しており、これは、ＭＵＣ１のリン酸化によって厳しく調節されるプロセスにおいて転写調節因子β−カテニンに結合する（Ｃａｒｒａｗａｙ，ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｅｓｓａｙｓ（２００３）２５：６６を参照のこと）。
【００３３】
用語「インタクトなＭＵＣ１タンパク質」は、本明細書中で使用される場合は、α−サブユニットとβ−サブユニットに切断されており、それぞれのサブユニットが自然な三次元折り畳みを有し、そしてこれらのサブユニットが互いに相互作用しているＭＵＣ１タンパク質を意味する。ＭＵＣ１イソ型であるＭＵＣ１／ＴＭとＭＵＣ１／Ｘは、インタクトなＭＵＣ１タンパク質であり得る。
【００３４】
「ＭＵＣ１／Ｘ」イソ型には、α−サブユニットの抗原性であるタンデムリピートアレイは含まれておらず、ＳＥＡモジュール内で短縮型α−サブユニットとβ−サブユニットに切断される（Ｌｅｖｉｔｉｎ，ｅｔ ａｌ．，前出）。
【００３５】
「ＭＵＣ１／Ｙ」イソ型には、α−サブユニットの抗原性であるタンデムリピートアレイは含まれておらず、ＳＥＡモジュール内で切断されない（Ｌｅｖｉｔｉｎ，ｅｔ ａｌ．，前出）。
【００３６】
用語「生理学的条件」は、目的の細胞の維持または増殖を可能にする条件（例えば、温度、ｐＨ、および浸透圧）を有している細胞外環境を意味する。
【００３７】
用語「抗体」は、体液性応答がインビトロまたはインビボで生じることによって得られる免疫グロブリン分子を意味し、これには、ポリクローナル抗体とモノクローナル抗体が含まれる。この用語にはまた、キメラ抗体（例えば、ヒト化マウス抗体）、ヘテロ結合体抗体（例えば、二重特異的抗体）、および組み換え体単鎖Ｆｖ断片（ｓｃＦｖ）のような、遺伝子操作された形態も含まれる。用語「抗体」にはまた、抗体断片の抗原結合形態（例えば、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ）２、ＶＨ−ＶＬＦａｂ断片）も含まれる。
【００３８】
用語「ヒト化抗体」は、ヒト以外のアミノ酸配列を含むが、その定常領域は、ヒトにおいて免疫原性が低下するように変更されている抗体を意味する。
【００３９】
用語「ヒト抗体」は、ヒト免疫グロブリン遺伝子によって生産される抗体を意味する。ヒト抗体は、例えば、ヒトの中で、機能性のヒト免疫グロブリン遺伝子を有しているヒト以外の動物（例えば、マウス、ハムスター、ウサギ、ウシ）によって、インビボで生産させることができる。このようなトランスジェニック動物は当該分野で公知である。例えば、Ｌｏｎｂｅｒｇ，Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈ（２００５）２３：１１１７；Ｒｏｂｌ，ｅｔ ａｌ．，Ｔｈｅｒｉｏｇｅｎｏｌｏｇｙ，（２００３）５９：１０７；およびＩｓｈｉｄａ，ｅｔ ａｌ．，Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ（２００２）４：９１を参照のこと。トランスジェニックマウスから完全なヒト抗体を生産している会社としては、Ｍｅｄａｒｅｘ，Ｍｉｌｐｉｔａｓ，ＣＡと、Ａｂｇｅｎｉｘ（現在は、Ａｍｇｅｎ）、Ｆｒｅｍｏｎｔ，ＣＡが挙げられる。ヒト抗体は、例えば、ヒト免疫グロブリン遺伝子の組み合わせライブラリーからインビトロで生産することができる。
【００４０】
用語「細胞外」は、脂質二重層を含む細胞の外側に広がる領域を意味する。
【００４１】
用語「抗原」は、抗体に特異的に結合することができる任意の分子を意味する。抗体生産を誘導することができる抗原は、「免疫原」と呼ばれる。Ｊａｎｅｗａｙ，ｅｔ ａｌ．，Ｉｍｍｕｎｏｂｉｏｌｏｇｙ，第５版，２００１、Ｇａｒｌａｎｄ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇを参照のこと。本発明の目的については、抗原は、抗原性ポリペプチドをコードするポリペプチドまたは核酸（例えば、ｃＤＮＡ）であり得る。
【００４２】
用語「エピトープ」または「抗原決定基」は、それに対してＢ細胞および／またはＴ細胞が応答する抗原上の部位を意味する。Ｂ細胞エピトープは、連続するアミノ酸によって形成される場合も、また、タンパク質の三次折り畳みによって近接して並べられる不連続なアミノ酸の両方によって形成される場合もある。連続するアミノ酸によって形成されるエピトープは、通常、変性溶媒に対する暴露の際にも維持されるが、三次折り畳みによって形成される（すなわち、立体構造によって決定される）エピトープは、通常、変性溶媒で処理されると消滅する。エピトープには、通常、少なくとも３個、より通常は、少なくとも５個または８〜１０個のアミノ酸が特有の空間的立体配置で含まれる。エピトープの空間的立体配置を決定する方法としては、例えば、ｘ線結晶解析と二次元核磁気共鳴が挙げられる。例えば、Ｅｐｉｔｏｐｅ Ｍａｐｐｉｎｇ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，第６６巻，Ｇｌｅｎｎ Ｅ．Ｍｏｒｒｉｓ，編，（１９９６）を参照のこと。同じエピトープを認識する抗体は、標的抗原に対する別の抗体の結合をブロックする１つの抗体の能力を示す簡単な免疫アッセイ（例えば、競合ＥＬＩＳＡまたは固相放射性免疫分析（ＳＰＲＩＡ））において同定することができる。Ｔ細胞は、ＣＤ８細胞については約９個のアミノ酸の連続するエピトープを、また、ＣＤ４細胞については約１３〜１５個のアミノ酸の連続するエピトープを認識する。エピトープを認識する細胞は、エピトープに反応して感作させられたＴ細胞による３Ｈ−チミジンの取り込みによって決定される、抗原依存性の増殖を測定するインビトロアッセイによって（Ｂｕｒｋｅ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｎｆ．Ｄｉｓ．，１７０，１１１０−１９（１９９４））、抗原依存性の死滅によって（細胞傷害性Ｔリンパ球アッセイ、Ｔｉｇｇｅｓ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．（１９９６）１５６：３９０１−３９１０）、またはサイトカインの分泌によって同定することができる。
【００４３】
（詳細な説明）
序論
本発明者らは、ＭＵＣ１ α−サブユニットとβ−サブユニットからなる切断された接点がそれによって形成される機構を研究した。これらの研究の過程で、本発明者らは、ＭＵＣ１／ＴＭ、ＭＵＣ１／Ｙ、およびＭＵＣ１／Ｘタンパク質の「切断可能性」を分析した（図１、および全ての目的についてその全体が引用により本明細書中に組み入れられるＬｅｖｉｔｉｎ，ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．（２００５）２８０：３３３７４）。ＭＵＣ１／ＹおよびＭＵＣ１／Ｘイソ型は、タンデムリピートアレイの上流と下流に存在しているドナー部位とアクセプター部位を利用する２つの異なる部位でスプライシングされたｍＲＮＡから生じ、結果として、いずれも、タンデムリピートアレイと隣接配列がスプライシングされた両方のイソ型である（図１およびＬｅｖｉｔｉｎ，ｅｔ ａｌ．）。したがって、ＭＵＣ１／ＸとＭＵＣ１／Ｙの両方の細胞外ドメインは、大きなタンデムリピートアレイを含むＭＵＣ１／ＴＭタンパク質よりも相当に単純な構造である。実際、ＭＵＣ１／Ｘタンパク質には、その細胞外ドメインの中に、ＭＵＣ１の３０個のＮ末端アミノ酸に融合させられたわずかに１２０個のアミノ酸のＳＥＡモジュールしか含まれていない。ＭＵＣ１／Ｙは、ＳＥＡモジュールのＮ末端にある１８個のアミノ酸の欠失を除くと、ＭＵＣ１／Ｘと同じである。明らかに、ＭＵＣ１／Ｘイソ型は、全長のＭＵＣ１／ＴＭタンパク質と同じ部位で切断され、それによって、α−サブユニットとβ−サブユニットの同じ共有結合ではない相互作用を生じる。対照的に、ＭＵＣ１／Ｙイソ型の中に存在しているＳＥＡモジュールのＮ末端短縮は、切断されないタンパク質を生じる。
【００４４】
ガン細胞を直接標的化する抗体を作製するために、本発明者らは、ＭＵＣ１ α／β接点に特異的な抗体（「抗ＭＵＣ１ α／β抗体（Ａｂｓ）」）を膜結合ＭＵＣ１だけを標的化すると推測した。タンデムリピート部分アレイに対する抗体の作製を回避するために、本発明者らは、免疫原として、かつスクリーニング試薬として、切断されたＭＵＣ１／Ｘタンパク質を使用した。本発明者らは、本明細書において、マウスを最初にＭＵＣ１／ＴＭ（例えば、ＤＮＡ）で感作させて抗ＭＵＣ１／ＴＭ応答を誘発させる新規の手順を報告する。得られる免疫応答には、ＭＵＣ１／Ｘイソ型と反応する抗体が含まれる。抗ＭＵＣ１／Ｘ力価をさらに上昇させるために、マウスをＭＵＣ１／Ｘ（例えば、可溶性タンパク質）でブーストした。これによっては、桁外れに高い抗ＭＵＣ１／Ｘ力価が生じた。このプロトコールを使用することにより、本発明者らは、細胞表面上の切断されたＭＵＣ１ α／β接点を認識するだけではなく、全長のＭＵＣ１／ＴＭを発現する悪性細胞にも結合するモノクローナル抗体を作製することに成功した。
【００４５】
したがって、本発明により、「抗ＭＵＣ１ α／β Ａｂｓ」と本明細書中で呼ばれる、細胞上のインタクトなＭＵＣ１タンパク質のＭＵＣ１ α／β接点に結合する抗体が提供される。抗体は、インタクトなＭＵＣ１タンパク質のα−サブユニットとβ−サブユニットの両方から構成される、立体構造によって決定されるエピトープに同時に結合する。本発明は、ＭＵＣ１イソ型であるＭＵＣ１／Ｘ（これは、免疫原性であるタンデムリピート領域を有していない）が免疫原性であり、全長のＭＵＣ１イソ型であるＭＵＣ１／ＴＭと同様に切断され得るという驚くべき発見に一部基づく（Ｌｅｖｉｔｉｎ，ｅｔ ａｌ．，（前出）を参照のこと）。
【００４６】
抗体
抗原と免疫化
本発明の抗ＭＵＣ１ α／β抗体は、インタクトなＭＵＣ１タンパク質のα／β接点に対して指向させられる。これらは、最初に、免疫原性であるタンデムリピート配列（「ＶＮＴＲ」）を含むＭＵＣ１ α／β−サブユニット配列（例えば、核酸または可溶性タンパク質）（図１、およびＧｅｎｄｌｅｒ，ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．（１９９０）２６５：１５２８６；Ｌｉｇｔｅｎｂｅｒｇ，ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．（１９９０）２６５：５５７３；およびＷｒｅｓｃｈｎｅｒ，ｅｔ ａｌ．，Ｅｕｒ Ｊ Ｂｉｏｃｈｅｍ（１９９０）１８９：４６３を参照のこと）、例えば、ＭＵＣ１／ＴＭで１回以上、抗体を生産することができる被験体を免疫化することによって生産される。状況に応じて、被験体を、免疫原性であるタンデムリピート配列が欠失しているが、α−サブユニットとβ−サブユニットへの切断のための切断配列セグメントは生きたままである、短縮型ＭＵＣ１ α／β−サブユニット配列（例えば、核酸または可溶性タンパク質）、例えば、イソ型ＭＵＣ１／Ｘに対する、その後の、１回以上の免疫化によってブーストすることができる。図１、および全ての目的についてその全体が引用により本明細書中に組み入れられるＬｅｖｉｔｉｎ，ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．（２００５）２８０：３３３７４を参照のこと。
【００４７】
抗原は、通常、可溶性ＭＵＣ１ポリペプチド（すなわち、膜貫通配列が欠失している）、またはＭＵＣ１ポリペプチド配列をコードする核酸（膜貫通配列を含むまたは含まない）として調製される。抗原、ＤＮＡ、またはタンパク質は、ＭＵＣ１を発現しているかまたは過剰発現している細胞から、あるいは、ＭＵＣ１抗原を組み換えによって発現するように修飾された細胞（例えば、当該分野で周知の細菌、酵母、または哺乳動物細胞発現系）から単離または精製することができる。組み換えによって発現させられたＭＵＣ１抗原には、通常、状況に応じて除去することが可能な精製および／または検出タグが含まれ得、これには、ＦＬＡＧ（ＤＹＫＤＤＤＤＫ）、連続するヒスチジン、免疫グロブリン定常領域（Ｆｃ）などが含まれるがこれらに限定はされない。Ｌｅｖｉｔｉｎ，ｅｔ ａｌ．（前出）を参照のこと。
【００４８】
１つの実施形態においては、抗ＭＵＣ１ α／β抗体は、ＭＵＣ１／ＴＭ ｃＤＮＡでの１回以上の一次免疫、およびＭＵＣ１／Ｘ ｃＤＮＡでの１回以上の二次免疫またはブースター免疫によって生産させることができる。１つの実施形態においては、抗ＭＵＣ１ α／β抗体は、ＭＵＣ１／ＴＭ ｃＤＮＡでの１回以上の一次免疫、および可溶性ＭＵＣ１／Ｘタンパク質での１回以上の二次免疫またはブースター免疫によって生産させることができる。
【００４９】
繰り返しの免疫化が、通常は、適切に、少なくとも２週間、３週間、４週間、５週間、６週間、７週間、８週間、または３ヶ月間、４ヶ月間、５ヶ月間、６ヶ月間の間隔で被験体に対して行われる。繰り返しの免疫化は、一定の間隔で投与することができるが、必ずしもそうである必要はない。繰り返しの免疫化を受ける被験体には、必要に応じて、一次抗原（例えば、ＭＵＣ１／ＴＭ）および／または二次抗原（例えば、ＭＵＣ１／Ｘ）を、１回、２回、３回、４回、５回、またはそれ以上投与することができる。
【００５０】
抗ＭＵＣ１ α／β抗体は、ＭＵＣ１／Ｘイソ型（好ましくは、切断されたＭＵＣ１／Ｘイソ型）のＭＵＣ１ α−サブユニットおよびβ−サブユニットに同時に結合するものを選択することによって同定される。好ましい抗体は、切断することができないＭＵＣ１／Ｙイソ型に、またはα−サブユニットもしくはβ−サブユニットのいずれかだけに結合することはない。
【００５１】
抗体の生産
抗ＭＵＣ１ α／β抗体は、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、Ｆａｂ断片（定常Ｆｃ領域が欠失している）、または組み換え体単鎖Ｆｖ抗体であり得る。ポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体を生産するための方法は、当業者に公知である。例えば、Ｃｏｌｉｇａｎ，ｅｔ ａｌ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，１９９１−２００６，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ；およびＨａｒｌｏｗ ａｎｄ Ｌａｎｅ（１９８９）Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ，Ｎ．Ｙ．；Ｈａｒｌｏｗ ａｎｄ Ｌａｎｅ（１９９８）Ｕｓｉｎｇ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ，Ｎ．Ｙ．；Ｓｔｉｔｅｓ ｅｔ ａｌ．，（編）Ｂａｓｉｃ ａｎｄ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（第４版）Ｌａｎｇｅ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ｌｏｓ Ａｌｔｏｓ，Ｃａｌｉｆ．，およびその中で引用されている参考文献；Ｇｏｄｉｎｇ（１９８６）Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ（第２版）Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．；ならびに、Ｋｏｈｌｅｒ ａｎｄ Ｍｉｌｓｔｅｉｎ（１９７５）Ｎａｔｕｒｅ ２５６：４９５−４９７を参照のこと；Ｈｕｓｅ ｅｔ ａｌ．，（１９８９）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４６：１２７５−１２８１；およびＷａｒｄ，ｅｔ ａｌ．，（１９８９）Ｎａｔｕｒｅ ３４１：５４４−５４６．Ｂｉｒｃｈ ａｎｄ Ｌｅｎｎｏｘ，Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ｗｉｌｅｙ−Ｌｉｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．（１９９５）を参照のこと。抗ＭＵＣ１ α／β抗体と、抗ＭＵＣ１ α／β抗体を生産するＢ細胞は、抗体を生産することができる任意の便利な動物（例えば、哺乳動物または鳥類）において誘発することができる。例えば、抗ＭＵＣ１ α／β抗体は、通常、ヒツジまたはヤギ（ヒツジ）、あるいは齧歯類（ウサギ、ラット、ハムスター、マウス）、あるいはニワトリ（野鶏属）において生産させることができる。
【００５２】
抗体の調製のための他の適切な技術としては、ファージベクターおよび他のベクター（ウイルスベクター、細菌ベクター、および酵母ベクターを含む）の中にヒト免疫グロブリン遺伝子が含まれている、組み換え体免疫グロブリン遺伝子のライブラリーの選択が挙げられる。ＭＵＣ１ α／β接点に対する高親和性抗体は、例えば、ベクターの表面上に組み換え体単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）断片もしくはＶＨ−ＶＬＦａｂ断片を発現させるためのベクターディスプレイ（例えば、ファージ）方法を使用することによって迅速に単離することができる。簡単に説明すると、ベクターの表面タンパク質をコードする遺伝子は、その遺伝子を有しているベクターの表面上に融合タンパク質として発現される抗体遺伝子の挿入が可能となるように変更される。所望される抗体を発現するベクターは、ＭＵＣ１ α／βサブユニットの接点に対するその親和性／親和力によって選択的に富化させ、そして単離することができる。抗体をコードするＤＮＡが同じベクターにパッケージされ、これによって、抗体をコードする遺伝子を単離することが可能となる。様々なこのような方法が文献において十分に議論されており、当業者に周知である。例えば、Ｗｉｎｔｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１２：４３３−４５５（１９９４）；Ｍａｒｋｓ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２２２：５８１−５９７（１９９１）；Ｖａｕｇｈａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １４：３０９−３１４（１９９６）、Ｈａｌｌｂｏｒｎ ａｎｄ Ｃａｒｌｓｓｏｎ，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，（２００２）Ｓｕｐｐｌ：３０−７、米国特許第４，６４２，３３４号；同第４，８１６，３９７号；同第４，８１６，５６７号；同第４，７０４，６９２号；ＷＯ８６／０１５３３；ＷＯ８８／０９３４４；ＷＯ８９／００９９９；ＷＯ９０／０２８０９；ＷＯ９０／０４０３６；ＥＰ ０ ３２４ １６２；およびＥＰ ０ ２３９ ４００を参照のこと。
【００５３】
好ましくは、抗体は、例えば、抗体の中に存在する自系（自己）配列の数を最大にすることによって、宿主中での免疫原性を最小にするように構築されるであろう。したがって、異種可変領域を有していないキメラ抗体が好ましい。異種部分が排除されている抗体の使用が特に好ましく、また、相補性決定領域に本質的に限定されること（すなわち、「ヒト化抗体」）が特に好ましい。
【００５４】
抗体結合アッセイ
インタクトなＭＵＣ１タンパク質に対する抗体の結合は、当該分野で周知の技術、例えば、ＥＬＩＳＡアッセイ、フローサイトメトリーアッセイ、または免疫組織化学アッセイを使用して決定することができる。結合アッセイの実施において、試験アッセイは、陽性対照および／または陰性対照と比較することができる。
【００５５】
ＥＬＩＳＡ
ＥＬＩＳＡアッセイに関して、ＥＬＩＳＡプレートは、免疫原性であるタンデムリピート領域を含まない可溶性のＭＵＣ１ α／βサブユニットタンパク質抗原（例えば、膜貫通領域を含まないイソ型ＭＵＣ１／ＸまたはＭＵＣ１／Ｙ）でコーティングすることができる。好ましくは、短縮型のＭＵＣ１ α／βサブユニットタンパク質抗原は、短縮型のα−サブユニットとβ−サブユニットの細胞外領域とに切り離され得る（例えば、イソ型ＭＵＣ１／Ｘ）。コーティングタンパク質抗原は、コーティングの前にα−サブユニットとβ−サブユニットに切り離され得るが、必ずしもコーティングの前に切り離される必要はない。タンパク質抗原は、ＥＬＩＳＡプレート上に直接コーティングすることができ、また、プレート上に直接コーティングされた免疫グロブリンの層に結合させることもできる。例えば、免疫グロブリン定常領域（Ｆｃ）を含む可溶性のイソ型ＭＵＣ１／Ｘおよび／またはＭＵＣ１／Ｙ融合体は、ＥＬＩＳＡプレート上に直接コーティングされた抗Ｆｃ抗体に結合させることができる。結合したタンパク質抗原を、その後、試験抗体に暴露することができる。
【００５６】
目的の抗体は、イソ型ＭＵＣ１／Ｘおよび／またはＭＵＣ１／Ｙに特異的に結合するが、α−サブユニットの免疫原性であるタンデムリピート領域、α−サブユニットだけ、またはβ−サブユニットだけには結合しない。好ましくは、抗体は、イソ型ＭＵＣ１／Ｘに特異的に結合するがＭＵＣ１／Ｙには結合しない。抗体は、切断されたイソ型ＭＵＣ１／Ｘと切断されたイソ型ＭＵＣ１／ＴＭに特異的に結合することが好ましい。
【００５７】
ＥＬＩＳＡアッセイ技術は当該分野で周知である。ＥＬＩＳＡアッセイの実施を教示しているテキストとしては、例えば、Ｔｈｅ Ｅｌｉｓａ Ｇｕｉｄｅｂｏｏｋ，Ｊ．Ｒ．Ｃｒｏｗｔｈｅｒ（編）、Ｈｕｍａｎａ Ｐｒ（２０００年８月）；Ｄｅｌｖｅｓ，Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ：Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ（１９９５）；Ｃｒｏｗｔｈｅｒ，Ｅｌｉｓａ：Ｔｈｅｏｒｙ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ，Ｈｕｍａｎ Ｐｒ（１９９５）；Ｈａｒｌｏｗ ａｎｄ Ｌａｎｅ，Ｕｓｉｎｇ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ（１９９８）；およびＣｏｌｉｇａｎ，ｅｔ ａｌ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｏｌｏｇｙ，１９９１−２００６，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ．が挙げられる。
【００５８】
ＥＬＩＳＡ技術は、試験抗体が直接標識されるかまたは二次抗体が標識されるかにはかかわらず、ハイスループット方法に極めて適している。標識された抗体は、酵素部分、化学発光部分、蛍光部分、または当該分野で公知の任意の他の便利な検出標識で標識することができる。ハイスループットＥＬＩＳＡを行うための製品は、例えば、Ｐａｎｏｍｉｃｓ，Ｒｅｄｗｏｏｄ Ｃｉｔｙ，ＣＡ；Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ；およびＢｉｏＭｅｄＴｅｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｔａｍｐａ，ＦＬから市販されている。自動ハイスループットシステムもまた、例えば、Ｃａｌｉｐｅｒ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｈｏｐｋｉｎｔｏｎ，ＭＡ；およびＢＭＧ Ｌａｂｔｅｃｈ，Ｄｕｒｈａｍ，ＮＣから市販されている。
【００５９】
フローサイトメトリー
インタクトなＭＵＣ１タンパク質に結合する抗体はまた、フローサイトメトリーを使用して検出することもできる。ＭＵＣ１イソ型（例えば、ＭＵＣ１／ＴＭ、ＭＵＣ１／Ｘ、ＭＵＣ１／Ｙ）（自然界に存在しているもの、または組み換えによって修飾されたもののいずれか）をそれらの細胞外表面上に発現しているインタクトな細胞が、抗ＭＵＣ１ α／β抗体に曝され得る。細胞は、生存しているものであっても、また固定されたものであってもよい。結合は、試験抗体または二次抗体を、例えば、蛍光色素分子で直接標識することによって決定することができる。フローサイトメトリーを使用する利点は、細胞の表面上で発現させられたＭＵＣ１抗原がインビボで遭遇するＭＵＣ１細胞表面抗原の典型である三次元立体構造で存在していることである。目的の抗体は、イソ型ＭＵＣ１／ＴＭおよびＭＵＣ１／Ｘのα−サブユニットおよびβ−サブユニットに特異的に結合し、そしてイソ型ＭＵＣ１／Ｙには結合しないことが好ましい。フローサイトメトリー分析はまた、ハイスループット方法に十分に適している。ハイスループットフローサイトメトリー分析のための製品およびシステムは、例えば、ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｓａｎ Ｊｏｓｅ ＣＡ ａｎｄ Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ；Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ，Ｆｕｌｌｅｒｔｏｎ，ＣＡ；Ｐａｒｔｅｃ，Ｍuｎｓｔｅｒ、Ｇeｒｍａｎｙ；およびＡｍｎｉｓ Ｃｏｒｐ．，Ｓｅａｔｔｌｅ，ＷＡから市販されている。
【００６０】
フローサイトメトリー技術は当該分野で周知である。フローサイトメトリーの実施を教示しているテキストとしては、例えば、Ｏｒｍｅｒｏｄ，Ｆｌｏｗ Ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ，Ｔａｙｌｏｒ ＆ Ｆｒａｎｃｉｓ（１９９９）；Ｆｌｏｗ Ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，Ｈａｗｌｅｙ ａｎｄ Ｈａｗｌｅｙ（編）Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ（２００４）；およびＦｌｏｗ Ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ ｉｎ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｄｉａｇｎｏｓｉｓ，Ｋｅｒｅｎ，ｅｔ ａｌ．，（編），ＡＳＣＰ Ｐｒｅｓｓ（２００１）が挙げられる。
【００６１】
免疫組織化学
インタクトなＭＵＣ１タンパク質に結合する抗体はまた、当該分野で周知の免疫組織化学技術を使用して検出することもできる。例えば、Ｈａｙａｔ，Ｈａｎｄｂｏｏｋ Ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｈｉｓｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ Ａｎｄ Ｉｎ Ｓｉｔｕ Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ Ｏｆ Ｈｕｍａｎ Ｃａｒｃｉｎｏｍａｓ：Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ，Ｃｏｌｏｒｅｃｔａｌ Ｃａｒｃｉｎｏｍａ，Ａｎｄ Ｐｒｏｓｔａｔｅ Ｃａｒｃｉｎｏｍａ，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒ（２００４）；Ｈａｙａｔ，Ｉｍｍｕｎｏｈｉｓｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ ｉｎ Ｓｉｔｕ Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ Ｈｕｍａｎ Ｃａｒｃｉｎｏｍａｓ：Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｌｕｎｇ ａｎｄ Ｂｒｅｓｔ Ｃａｒｃｉｎｏｍａｓ，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒ（２００４）；およびＤａｂｂｓ，Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ Ｉｍｍｕｎｏｈｉｓｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，Ｅｌｓｅｖｉｅｒ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｃｉｅｎｃｅ（２００１）を参照のこと。ＭＵＣ１抗原を発現するかまたは過剰発現することが公知である組織（例えば、乳房、卵巣、前立腺、膵臓、結腸組織）に由来する上皮切片を、抗ＭＵＣ１ α／β抗体に暴露することができる。抗体は、例えば、酵素部分、化学発光部分、蛍光部分で直接標識することができる。結合した抗体は、顕微鏡技術を使用して検出することができる。
【００６２】
抗ＭＵＣ１ α／β抗体を同定するための試験
本発明の抗ＭＵＣ１ α／β抗体は、ＭＵＣ１ αサブユニットとβサブユニットの接点に結合するが、αサブユニットのみ、またはβサブユニットのみのいずれにも結合しない。これは、例えば、上記のような競合ＥＬＩＳＡアッセイを行うことによって測定することができる。ＥＬＩＳＡプレートのウェルは、αサブユニットとβサブユニットの両方を有している可溶性のＭＵＣ１タンパク質抗原（例えば、ＭＵＣ１／ＴＭ、ＭＵＣ１／Ｘ、またはＭＵＣ１／Ｙ）で、そしてＭＵＣ１ α−サブユニットだけ、および可溶性（すなわち、膜貫通配列を含まない）ＭＵＣ１ βサブユニットだけでコーティングすることができ、その後、抗ＭＵＣ１ α／β抗体に曝すことができる。目的の抗体は、α−サブユニットとβ−サブユニットの両方を有しているＭＵＣ１タンパク質抗原に特異的に結合するが、ＭＵＣ１ α−サブユニットだけ、またはＭＵＣ１ β−サブユニットだけには実質的には結合しない。あるいは、これはウェスタンブロットを使用して測定することもでき、ウェスタンブロットの方法論は当該分野では周知である。Ｃｏｌｉｇａｎ，ｅｔ ａｌ．（前出）；およびＨａｒｌｏｗ ａｎｄ Ｌａｎｅ，１９８９および１９９８（前出）を参照のこと。
【００６３】
好ましくは、本発明の抗ＭＵＣ１ α／β抗体はイソ型ＭＵＣ１／ＴＭとＭＵＣ１／Ｘに結合するが、イソ型ＭＵＣ１／Ｙには実質的には結合しない。いかなる試論にも束縛はされないが、切断されたＭＵＣ１／Ｘは、細胞表面上のＭＵＣ１タンパク質のＭＵＣ１ α−サブユニットとβ−サブユニットの三次元接点を反映していると考えられる。これは、例えば、上記のような競合ＥＬＩＳＡアッセイまたは競合フローサイトメトリーアッセイを行うことによって測定することができる。例示的なＥＬＩＳＡアッセイにおいては、抗Ｆｃ抗体でコーティングされたＥＬＩＳＡプレートがＭＵＣ１／ＴＭ−Ｆｃ（すなわち、全長のα−サブユニットを有している可溶性ＭＵＣ１）、またはＭＵＣ１／Ｘ−Ｆｃ、およびＭＵＣ１／Ｙ−Ｆｃ融合タンパク質に結合させられ、その後、抗ＭＵＣ１ α／β抗体に曝される。目的の抗体は、ＭＵＣ１／Ｘ−Ｆｃ融合タンパク質が結合させられているか、またはＭＵＣ１／ＴＭ−Ｆｃ融合タンパク質が結合させられているウェルに特異的に結合するが、ＭＵＣ１／Ｙ−Ｆｃ融合タンパク質が結合させられているウェルには実質的には結合しない。以下の実施例１を参照のこと。あるいは、これは、競合フローサイトメトリーアッセイにおいては、１つのＭＵＣ１イソ型を、自然界においてまたは組み換えによって細胞外表面上に発現する細胞を使用して、測定することができる。目的の抗体は、ＭＵＣ１／ＴＭまたはＭＵＣ１／Ｘを発現する細胞に特異的に結合するが、ＭＵＣ１／Ｙを発現する細胞には実質的には結合しない。
【００６４】
抗ＭＵＣ１ α／β抗体を使用する方法
診断および予後診断の方法
抗ＭＵＣ１ α／β抗体は、ＭＵＣ１を過剰発現する組織のガンを診断する方法、またはその予後診断を提供する方法における使用が見出される。通常、組織は上皮組織であるが、これは血液に由来する場合もあり、例えば、形質細胞である（すなわち、Ｂリンパ球系統の血漿細胞、例えば、Ｈａｒｒｉｓｏｎ’ｓ Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ｏｆ Ｉｎｔｅｒｎａｌ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，第１６版，２００５，ＭｃＧｒａｗ−Ｈｉｌｌの第９８章を参照のこと）。診断および予後診断の方法については、乳房、卵巣、前立腺、膵臓、結腸、形質細胞、および他の組織に由来するＭＵＣ１を過剰発現しているガンを同定することにおける特定の使用が見出されている。ＭＵＣ１を過剰発現する組織または細胞は、正常であると確認された（すなわち、形質転換されていない、ガン性ではない）組織に由来する同じタイプの組織または細胞と比較して、少なくとも約２０％、５０％、８０％、１倍、２倍、３倍、４倍、またはそれ以上の検出可能なＭＵＣ１を有する。診断および予後診断の方法は、通常は、上記のフローサイトメトリーおよび／または免疫組織化学的方法を使用して行うことができる。
【００６５】
ガンの免疫療法の方法
ＭＵＣ１タンパク質は多くのガン（上皮および形質細胞骨髄腫（乳ガン、卵巣ガン、前立腺ガン、膵臓ガン、結腸ガン、および多発性骨髄腫の形質細胞を含む）を含むがこれらに限定はされない）において発現されているかまたは過剰発現されているので、これはガンの免疫療法の標的である。
【００６６】
したがって、本発明により、ガン（乳ガン、卵巣ガン、前立腺ガン、膵臓ガン、結腸ガン、および形質細胞骨髄腫を含む）を処置するために全身的に使用することができる抗ＭＵＣ１ α／β抗体が提供される。抗ＭＵＣ１ α／β抗体はまた、種々の他の良性腫瘍および悪性腫瘍の処置にも有用であり得る。したがって、本発明により、ＭＵＣ１抗原を発現しているかまたは過剰発現しているガンに罹患しやすいか、またはそのようなガンを有している患者を処置する方法が提供される。この方法には、治療有効量のＭＵＣ１ α／βサブユニットの接点に特異的に結合する抗体を上記患者に投与する工程が含まれる。別のアプローチにおいては、本発明により、ＭＵＣ１抗原を発現しているかまたは過剰発現している腫瘍細胞の増殖を阻害する方法が提供される。この方法には、ＭＵＣ１ α／βサブユニットの接点に特異的に結合する抗体を、腫瘍細胞の増殖を阻害するために有効な量で患者に投与する工程が含まれる。抗ＭＵＣ１ α／β抗体は、ＭＵＣ１抗原を発現しているかまたは過剰発現している細胞の増殖を選択的に阻害するか、またはそのような細胞を選択的に死滅させるための方法においても使用することができる。この方法には、抗ＭＵＣ１ α／β抗体免疫結合体または免疫毒素を、細胞の増殖を阻害するかまたは細胞を死滅させるために十分な量で、細胞と反応させる工程が含まれる。
【００６７】
例えば、結合していない抗ＭＵＣ１ α／β抗体（モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体、完全なヒト抗体、およびそれらの断片（例えば、組み換え体タンパク質）を含む）を、抗体がガン細胞上のインタクトなＭＵＣ１タンパク質に結合し、そしてそのような細胞および腫瘍の増殖の阻害（その崩壊を含む）を、複数の機構（これには、補体媒介性細胞溶解、抗体依存性細胞傷害性、ＭＵＣ１の生理学的機能の変更、および／またはリガンドの結合もしくはシグナル伝達経路の阻害が含まれ得る）によって媒介するように、患者に導入することができる。結合していない抗ＭＵＣ１ α／β抗体、その断片、および本発明の組み換え体タンパク質に加えて、放射性同位元素、リシン、および／または緑膿菌（ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）毒素を含む毒性の物質に結合させられた抗ＭＵＣ１ α／β抗体もまた、ＭＵＣ１を有している腫瘍細胞に直接毒性の物質を送達し、それによって腫瘍を崩壊させるために治療的に使用することもできる。
【００６８】
抗ＭＵＣ１ α／β抗体を使用するガンの免疫療法は、様々なアプローチによって生じる技術にしたがうことができる。これらは、以下を含むがこれらに限定はされないいくつかのタイプのガンに関してうまく使用されている：結腸ガン（Ａｒｌｅｎ ｅｔ ａｌ．，１９９８，Ｃｒｉｔ Ｒｅｖ Ｉｍｍｕｎｏｌ １８：１３３−１３８）、多発性骨髄腫（Ｏｚａｋｉ ｅｔ ａｌ．，１９９７，Ｂｌｏｏｄ ９０：３１７９−３１８６；Ｔｓｕｎｅｎａｒｉ ｅｔ ａｌ．，１９９７，Ｂｌｏｏｄ ９０：２４３７−２４４４）、胃ガン（Ｋａｓｐｒｚｙｋ ｅｔ ａｌ．，１９９２，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ ５２：２７７１−２７７６）、Ｂ細胞リンパ腫（Ｆｕｎａｋｉｓｈｉ ｅｔ ａｌ．，１９９６，Ｊ Ｉｍｍｕｎｔｈｅｒ Ｅｍｐｈａｓｉｓ Ｔｕｍｏｒ Ｉｍｍｕｎｏｌ １９：９３−１０１）、白血病（Ｚｈｏｎｇ ｅｔ ａｌ．，１９９６，Ｌｅｕｋ Ｒｅｓ ２０：５８１−５８９）、結腸直腸ガン（Ｍｏｕｎ ｅｔ ａｌ．，１９９４，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ ５４：６１６０−６１６６）；Ｖｅｌｄｅｒｓ ｅｔ ａｌ．，１９９５，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ ５５：４３９８−４４０３）、および乳ガン（Ｓｈｅｐａｒｄ ｅｔ ａｌ．，１９９１，Ｊ．Ｃｌｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌ １１：１１７−１２７）。ガンについての免疫毒素療法のさらなる例は、例えば、Ｗｏｎｇ，ｅｔ ａｌ．，Ｓｅｍｉｎ Ｏｎｃｏｌ（２００５）３２：５９１；Ｃｈｅｎ，ｅｔ ａｌ．，Ｅｘｐｅｒｔ Ｏｐｉｎ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖ（２００５）２：８７３；およびＬｉ，ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ Ｍｏｌ Ｉｍｍｕｎｏｌ（２００５）２：１０６にまとめられている。
【００６９】
例えば、抗ＭＵＣ１ α／β抗体を臨床的に投与するための１つの方法は、抗腫瘍活性（例えば、ＡＤＣＣ活性およびＣＤＣ活性）を示し、そしてまたはインビトロおよび／もしくは動物モデルにおいてインターナライズ能力を示す、モノクローナル抗ＭＵＣ１ α／β抗体を使用して、それらを修飾されていない形態で投与することである（例えば、Ｈｅｌｌｓｔｒｏｍ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８２：１４９９−１５０２（１９８５）を参照のこと）。ＡＤＣＣ活性およびＣＤＣ活性を検出するためには、モノクローナル抗体を、４時間のインキュベーション時間の間中、培養された５１Ｃｒ標識腫瘍標的細胞の溶解について試験することができる。標的細胞は、５１Ｃｒで標識され、その後、エフェクター細胞（リンパ球−分離媒体の使用によって精製されたヒトリンパ球の形態）と抗体（これは、例えば、０．１μｇ／ｍｌから１０μｇ／ｍｌの間で変化する濃度で添加される）の組み合わせに対して４時間暴露させることができる。標的細胞からの５１Ｃｒの放出が、腫瘍細胞の溶解（細胞傷害性）の証拠として測定される。対照には、標的細胞の単独での、あるいは、リンパ球またはモノクローナル抗体のいずれかとの別々でのインキュベーションが含まれる。放出させられ得る５１Ｃｒの全量が測定され、そしてＡＤＣＣが、単独でインキュベートされた標的細胞と比較された、モノクローナル抗体とエフェクター細胞を用いて観察された標的細胞の死滅の割合として計算される。ＣＤＣについての手順は、補体の供給源としてヒト血清（１：３から１：６に稀釈された）がエフェクター細胞の代わりに添加されることを除いて、ＡＤＣＣを検出するために使用される手順と同じである。
【００７０】
本発明の方法の実施においては、細胞表面上にＭＵＣ１を発現しているかまたは過剰発現しているガン細胞の増殖を阻害することができる抗ＭＵＣ１ α／β抗体が、その腫瘍がＭＵＣ１を発現しているかまたは過剰発現しているガン患者に対して、治療有効量で投与される。本発明の抗体療法の方法は、化学療法、放射線治療、および／または他の治療レジュメと併用される場合もある。
【００７１】
ガンの処置に有用な抗ＭＵＣ１ α／β抗体としては、腫瘍に対する強力な免疫応答を開始することができるもの、および細胞傷害性を指示することができるものが挙げられる。これに関して、抗ＭＵＣ１ α／β抗体は、補体媒介性の細胞傷害性機構または抗体依存性の細胞傷害性機構（ＡＤＣＣ）（いずれにも、エフェクター細胞Ｆｃ受容体部位または補体タンパク質との相互作用のために免疫グロブリン分子のインタクトなＦｃ部分が必要である）のいずれかによって、腫瘍細胞の溶解を誘発することができる。加えて、腫瘍の増殖に対して直接的な生物学的作用を発揮する抗ＭＵＣ１ α／β抗体は、本発明の実施において有用である。このような抗体は、その作用を発揮するためには、完全な免疫グロブリンを必要としない場合がある。このような直接的な細胞傷害性抗体がそれによって作用するであろうと考えられる機構としては、細胞増殖の阻害、細胞の分化の調節、腫瘍血管形成因子のプロフィールの調節、およびアポトーシスの誘導が挙げられる。特定の抗ＭＵＣ１ α／β抗体がそれによって抗腫瘍作用を発揮する機構は、ＡＤＣＣ、ＡＤＭＭＣ、補体媒介性細胞溶解を決定するために設計された、当該分野で公知のあらゆるインビトロアッセイを使用して評価することができる。例えば、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（前出）を参照のこと。
【００７２】
特定の抗ＭＵＣ１ α／β抗体、または複数の抗ＭＵＣ１ α／β抗体の組み合わせの抗腫瘍活性は、好ましくは、適切な動物モデルを使用してインビボで評価される。異種ガンモデル（この場合、ヒトのガンの移植片または継代された異種移植片組織が免疫機能が低下している動物（例えば、ヌードマウスまたはＳＣＩＤマウス）に導入される）が具体的には適切であり、知られている。例えば、ヒト前立腺ガンの異種移植片モデル（原発性腫瘍、微小転移巣の発生、および後期疾患の特徴である骨芽細胞への転移の形成を繰り返すことができる）が、Ｋｌｅｉｎ ｅｔ ａｌ．，１９９７、Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ ３：４０２−４０８、およびＰＣＴ特許出願番号ＷＯ９８／１６６２８、１９９８年４月２３日に公開されたＳａｗｙｅｒｓ ｅｔ ａｌ．，に記載されている。本明細書中の例によって、インビボでの抗ＭＵＣ１ α／β抗体調製物の抗腫瘍能力を評価するための詳細な実験プロトコールが提供される。例えば、確立された腫瘍の退行、転移の発生の妨害などを測定する、他のインビボでのアッセイが意図される。
【００７３】
マウスまたは他のヒト以外の動物と、キメラ（モノクローナル）抗体の使用によって、一部の患者においては中程度から強い免疫応答を誘導することができる場合があることに注目すべきである。最も重篤な場合には、そのような免疫応答によって、潜在的には腎不全を引き起こす可能性がある免疫複合体の大量の形成が導かれる可能性がある。したがって、本発明の治療方法の実施において使用される好ましい（モノクローナル）抗体は、完全なヒト抗体またはヒト化抗体のいずれかであり、そして高い親和性で標的であるインタクトなＭＵＣ１抗原に特異的に結合するが、患者においては低い抗原性しか示さないかもしくは抗原性を示さないものである。
【００７４】
本発明の方法は、１つの抗ＭＵＣ１ α／β抗体、ならびに、種々の個々の（モノクローナル）抗体（例えば、異なるエピトープを認識するもの）の組み合わせまたは「混合物」の投与をもくろむ。このような抗体混合物には、それらに異なるエピトープに結合する抗体が含まれること、および／または、様々なエフェクター機構を生かすか、もしくは、免疫エフェクター機能性による抗体と直接的に細胞傷害性である抗体を組み合わせるというような、特定の利点がある場合がある。組み合わせられたこのような抗体は相乗的な治療効果を示す場合がある。加えて、抗ＭＵＣ１ α／β抗体の投与は、他の治療薬（種々の化学療法薬、アンドロゲン阻害薬、免疫変調成分（例えば、ＩＬ−２、ＧＭ−ＣＳＦ）、他の治療用抗体（例えば、ＭＵＣ１上の他のエピトープに対する抗体、ＭＵＣ１以外の腫瘍関連抗原に対する抗体、他の治療上有用なエピトープに対する抗体）、ならびに感染性疾患および他の疾患に対する薬剤を含むが、これらに限定はされない）と組み合わせることができる。抗ＭＵＣ１ α／β抗体は、それらの「裸の」形態または結合させられていない形態で投与することができ、また、それらに結合させられた治療薬を有している場合もある。
【００７５】
本発明の方法の実施において使用される抗ＭＵＣ１ α／β抗体は、所望される送達方法に適している生理学的に適合性の担体を含む薬学的組成物に処方することができる。適切な担体としては、抗ＭＵＣ１ α／β抗体と組み合わせられた場合にも、抗体の抗腫瘍機能を維持でき、そして被験体の免疫系とは反応しない任意の物質が挙げられる。例としては、滅菌のリン酸緩衝化生理食塩溶液、静菌水などのような任意の多数の標準的な薬学的担体が挙げられるが、これらに限定はされない（一般的には、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙ，Ｇｅｎｎａｒｏ（編）Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ Ｗｉｌｌｉａｍｓ ＆ Ｗｉｌｋｉｎｓ（２００３）を参照のこと）。
【００７６】
抗ＭＵＣ１ α／β抗体処方物は、腫瘍部位に抗体を送達することができる任意の経路から投与することができる。有効であると考えられる投与経路としては、静脈内、腹腔内、筋肉内、腫瘍内、皮内などが挙げられるが、これらに限定はされない。好ましい投与経路は、静脈内注射による。静脈内注射に好ましい処方物には、保存された静菌水、滅菌の保存されていない水の溶液の中に抗ＭＵＣ１ α／β抗体が含まれており、そして／または、注射用の０．９％の滅菌の塩化ナトリウム（ＵＳＰ）を含むポリ塩化ビニルまたはポリエチレンバッグの中で稀釈される。抗ＭＵＣ１ α／β抗体調製物は凍結乾燥させることができ、そして滅菌粉末として、好ましくは減圧下で保存することができ、これはその後、例えば、ベンジルアルコール防腐剤を含む静菌水の中で、または注射の直前に滅菌水の中で再構成することができる。
【００７７】
処置には、一般的には、静脈内注射（ＩＶ）のような許容される投与経路による、有効用量の抗ＭＵＣ１ α／β抗体調製物の反復投与が含まれる。投与量は、当業者に一般的に十分に理解されている様々な要因（ガンのタイプおよび重篤度、悪性度、またはガンの進行度、使用される抗体（単数または複数）の結合親和性および半減期、患者の中でのＭＵＣ１の発現の程度、循環している分割されたＭＵＣ１ α−サブユニット抗原の程度、所望される定常状態の抗体濃度のレベル、処置の頻度、ならびに、本発明の処置方法と組み合わせて使用される化学療法薬の影響を含むがこれらに限定はされない）に応じて様々である。典型的な一日量は、約０．１から１００ｍｇ／ｋｇの範囲であり得る。１週間あたり１０〜５００ｍｇの抗体の範囲の用量が有効であり得、そして十分な耐量であるが、さらに多量の１週間の用量が適切であり、そして／または耐量である場合もある。適切な用量を定義することにおける重要な決定要因は、特定の状況において治療上有効であるために必要な特定の抗体の量である。反復投与が、腫瘍の阻害または退行を達成するために必要とされ得る。最初の負荷量はより多量であり得る。最初の負荷量は、注入として投与することができる。定期的な維持用量は、初回量が十分な耐量である限りにおいて、同様に投与することができる。
【００７８】
抗ＭＵＣ１ α／β抗体の直接の投与もまた可能であり、特定の状況においては利点を有する場合がある。例えば、卵巣ガンの処置については、抗ＭＵＣ１ α／β抗体は、腹腔内空間に直接注射することができる。
【００７９】
抗体に対する生物学的活性のある組成物の結合
抗体に対して生物学的活性のある成分（例えば、細胞傷害性部分）を結合させるための手順は、その成分の化学構造にしたがってさまざまである。一般的には、抗体には、それに対して薬剤を結合させるための生物学的活性のある分子上の適切な官能基との反応に利用することができる様々な官能基が含まれる。あるいは、抗体および／または生物学的活性のある成分は、別の反応性官能基に曝されるかまたは別の反応性官能基を結合させるために誘導される場合がある。誘導には、Ｐｉｅｒｃｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ Ｉ１１から入手することができるもののような、任意の多数のリンカー分子の結合が含まれ得る。「リンカー」は、本明細書中で使用される場合は、抗体と生物学的活性のある成分を共有結合によって、または共有結合ではない結合によって結合させるために使用される分子を意味する。適切なリンカーは当業者に周知であり、これには、直鎖または分岐鎖である炭素リンカー、複素環炭素リンカー、またはペプチドリンカーが含まれるが、これらに限定はされない。例えば、Ｂｉｒｃｈ ａｎｄ Ｌｅｎｎｏｘ，Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，第４章，Ｗｉｌｅｙ−Ｌｉｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．（１９９５）；米国特許第５，２１８，１１２号、同第５，０９０，９１４号；Ｈｅｒｍａｎｓｏｎ，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆ．（１９９６）を参照のこと。
【００８０】
両方の分子がポリペプチドである場合には、リンカーは、それらの側鎖を介して（例えば、システインに対するジスルフィド結合を介して）構成アミノ酸に結合させることができる。特定の生物学的活性のある成分上の基と反応する１つの官能基と抗体と反応する別の基を有している二官能性リンカーを、所望される結合体を形成させるための使用することができる。いくつかの実施形態においては、二官能性リンカーを２つの抗体（例えば、抗ＭＵＣ１ α／β抗体と別の抗体）を結合させるために使用することができる。あるいは、誘導には、成分の化学的な処理（例えば、遊離のアルデヒド基を生じさせるための過ヨウ素酸塩での糖タンパク質抗体の糖部分のグリコール切断）が含まれる場合もある。抗体上の遊離のアルデヒド基は、それに対して物質を結合させるために、物質上の遊離のアミン基またはヒドラジン基と反応させることができる（米国特許第４，６７１，９５８号を参照のこと）。抗体または抗体断片上に遊離のスルフヒドリル基を作製するための手順もまた公知である（米国特許第４，６５９，８３９号を参照のこと）。放射性核種金属錯体、毒素、および薬剤を含む様々な化合物の、抗体のようなタンパク質への結合のための多くの手順とリンカー分子は公知である。例えば、欧州特許出願番号１８８，２５６；米国特許第４，６７１，９５８号、同第４，６５９，８３９号、同第４，４１４，１４８号、同第４，６９９，７８４号；同第４，６８０，３３８号；同第４，５６９，７８９号；および同第４，５８９，０７１号；ならびに、Ｂｏｒｌｉｎｇｈａｕｓ ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．４７：４０７１−４０７５（１９８７）を参照のこと。化学的リンカーは、例えば、Ｐｉｅｒｃｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｒｏｃｋｆｏｌｄ，ＩＬから市販されている。
【００８１】
それが標的部位に到達した時点で結合している分子を放出することが所望されることがしばしばある。したがって、標的部位の近くで切断することができる連結を含む結合体を使用することができる。生物学的活性のある成分を抗体から放出するための連結の切断は、結合体が標的細胞の中、または標的部位の近くのいずれかで供される酵素活性または条件によって促進され得る。標的部位が腫瘍である場合には、腫瘍部位に存在している条件下で（例えば、腫瘍関連酵素または酸性ｐＨに曝されると）切断され得るリンカーを使用することができる。シス−アコニット酸スペーサーの使用が、エンドソームの中で生物学的活性のある成分を放出させるために有用である。同様に、ジスルフィド結合は、エンドソームの還元性の環境下で切断することができる。
【００８２】
多数の種々の切断可能なリンカーは当業者に公知である。米国特許第４，６１８，４９２号；同第４，５４２，２２５号、および同第４，６２５，０１４号を参照のこと。これらのリンカー基からの物質の放出のための機構としては、例えば、光解離性結合の照射、および酸触媒加水分解が挙げられる。米国特許第５，１４１，６４８号には、特異的な化学構造のリンカーを含む免疫結合体が開示されている。この場合、連結はインビボで切断され、それによって、結合している化合物が放出される（放射線治療薬、薬剤、毒素など）。リンカーは弱酸性のｐＨで切断されやすく、そして、標的細胞の細胞質への輸送の間に切断され、それによって、標的細胞の中で生物学的活性のある化合物を放出すると考えられている。米国特許第４，６７１，９５８号には、患者の補体システムのタンパク質分解酵素によってインビボで標的部位で切断されるリンカーを含む免疫結合体の記載が含まれている。種々の放射線診断用の化合物、放射線治療用化合物、薬剤、毒素、および他の成分を抗体に結合させることについて報告されている多数の方法を考慮して、当業者は本発明の抗体に対して所定の成分を結合させるための適切な方法を決定することができるであろう。
【００８３】
目的の抗原に対する免疫応答を刺激する方法
本発明によってはまた、任意の目的の抗原に対する免疫応答を誘発する、またはそのような抗原に対する免疫応答を改善する、またはそのような抗原に対する抗体を惹起させるための方法も提供される。この方法は、（ｉ）最初に、免疫原性であるタンデムリピート配列と目的の抗原を含むＭＵＣ１抗原で１回以上、抗体を生産することができる被験体を免疫化する工程；および（ｉｉ）次に、目的の抗原で１回以上ブーストする工程による。ＭＵＣ１抗原と目的の抗原は、別々に、ポリペプチドまたはポリペプチドをコードする核酸として投与することができる、ＭＵＣ１抗原と目的の抗原は、結合していない分子として、リンカーによって結合された分子として（上記）、または融合タンパク質として、同時に投与することができる。
【００８４】
目的の抗原は、任意の抗原性配列であり得、これには、ヒト、哺乳動物、動物、植物、細菌、ウイルス、または合成起源の抗原性配列が含まれるが、これらに限定はされない。
【００８５】
目的の抗原としては、任意の腫瘍関連抗原が挙げられ、これには、腫瘍胎児抗原、腫瘍遺伝子産物、組織系統抗原、ウイルス抗原が含まれる。例示的な腫瘍関連抗原としては、癌胎児性抗原（ＣＥＡ）、糖鎖抗原（ＣＡ−１２５）、ＭＵＣ１、前立腺特異的膜抗原（ＰＳＭＡ）、前立腺幹細胞抗原（ＰＳＣＡ）、前立腺特異抗原（ＰＳＡ）、メラニン形成細胞抗原（例えば、ＭＡＲＴ−１／Ｍｅｌａｎ Ａ、チロシナーゼ、ｇｐ１００、およびＴＲＰ−１（ｇｐ７５））、腫瘍胎児抗原（ＯＦＡ）、Ｈｅｒ２／ｎｅｕが挙げられる。
【００８６】
目的の抗原は、感染性疾患に関係している抗原であり得、例えば、寄生虫、細菌、ウイルスに由来し得る。例えば、マラリアに対する免疫応答を増大させることに有用な抗原は、例えば、Ｔｈｅ Ｉｎｔｏｌｅｒａｂｌｅ Ｂｕｒｄｅｎ ｏｆ Ｍａｌａｒｉａ：ＩＩ．Ｗｈａｔ’ｓ Ｎｅｗ，Ｗｈａｔ’ｓ Ｎｅｅｄｅｄ，Ｂｒｅｍａｎ，ｅｔ ａｌ．，（編）、Ｔｈｅ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｓｏｃｉｅｔｙ ｏｆ Ｔｒｏｐｉｃａｌ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ ａｎｄ Ｈｙｇｉｅｎｅ（２００４）に記載されている。ＨＩＶに対する抗体応答を誘発することにおいて有用な抗原は、例えば、Ｂｕｒｔｏｎ，ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．（２００５）１０２：１４９４３に記載されている。
【００８７】
以下の実施例は、請求される発明を説明するために提供され、発明を限定するためのものではない。
【実施例】
【００８８】
（実施例１）
抗ＭＵＣ１ α／β抗体の生産
以下の実施例は、最初に、ＭＵＣ１／ＴＭ ｃＤＮＡ抗原で免疫化し、その後、ＭＵＣ１／Ｘタンパク質抗原の細胞外ドメインでブーストすることによる、抗ＭＵＣ１ α／β抗体の生産を示す。抗体は、ＥＬＩＳＡアッセイにおいてＭＵＣ１／Ｘ−免疫グロブリン定常領域融合タンパク質に結合したものをスクリーニングすることによって選択した。
【００８９】
実験手順
材料および方法。試薬と化合物は、別段の記載がない限りは、Ｓｉｇｍａ（Ｓｔ Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）から入手した。ＭＵＣ１のタンデムリピート部分に対する抗体（抗ＥＭＡ、上皮膜抗原、Ｍｃ５）は、Ｃｈｅｍｉｃｏｎ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ（Ｔｅｍｅｌｕｃａ，ＣＡ）から入手した。
【００９０】
細胞の培養。細胞を、１０％の熱不活化ウシ胎児血清、２ｍＭのＬ−グルタミン、１００ＩＵ／ｍｌのペニシリン、および２５μｇ／ｍｌのストレプトマイシンを補充した培養培地中で、３７℃で５％のＣＯ２で増殖させた。ＤＡ３マウス乳腺腫瘍細胞、およびＨＫ２９３ヒト胚腎臓細胞を、ダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）の中で増殖させた。発現構築物を、リン酸カルシウム手順を使用して細胞にトランスフェクトした。
【００９１】
ＭＵＣ１／ＴＭを発現する安定なＤＡ３マウス乳腺腫瘍細胞トランスフェクタントの作製。ＤＡ３細胞を、真核生物発現プラスミドｐＣＬ−ＭＵＣ１／ＴＭ（または細胞質ＰｖｕＩＩ部位で短縮したｐＣＬ−ＭＵＣ／ＴＭ）とｐＳＶ２ｎｅｏ（ネオマイシン耐性をコードする）で同時トランスフェクトした。安定なトランスフェクタントをネオマイシンを用いて選択した。ＭＵＣ１タンパク質を発現するトランスフェクタントを、ＭＵＣ１細胞質ドメインに対して指向させられた、親和性によって精製したポリクローナル抗体を使用して、細胞溶解物の免疫ブロット分析によって同定した。
【００９２】
ＭＵＣ１／ＸおよびＭＵＣ１／Ｙ真核生物発現構築物と融合タンパク質の作製。この実験で使用したＭＵＣ１抗原ポリペプチドには、ＭＵＣ１／Ｘ−免疫グロブリン定常鎖融合タンパク質（「Ｆｌａｇ−Ｙｅｘ−ｈＦｃ」）とＭＵＣ１／Ｙ−免疫グロブリン定常鎖融合タンパク質（「Ｆｌａｇ−Ｘｅｘ−ｈＦｃ」）が含まれている（図１およびＬｅｖｉｔｉｎ，ｅｔ ａｌ．，（前出）に示され、記載されている）。標準的な分子生物学的方法を使用して、以前に記載されたように（Ｌｅｖｉｔｉｎ，ｅｔ ａｌ．，（前出））全ての構築物を作製した。
【００９３】
Ｆｌａｇ−ＭＵＣ１／Ｘｅｘ−ｈＦｃ融合タンパク質およびＦｌａｇ−ＭＵＣ１／Ｙｅｘ−ｈＦｃ融合タンパク質を発現するＨＫ２９３トランスフェクタントの作製と、ｈＦｃ−タグ化融合タンパク質の精製。ＨＫ２９３（ヒト腎臓）細胞を、ＦＬＡＧ−Ｘｅｘ−ｈＦｃ、Ｆｌａｇ−Ｙｅｘ−ｈＦｃ、または変異体ＭＵＣ１／Ｘタンパク質をコードする真核生物ｐＣＭＶ３発現ベクター（６μｇのＤＮＡ／２５ｃｍ２のフラスコ）で、リン酸カルシウムを使用して一時的にトランスフェクトした。安定なトランスフェクタントを得るために、ネオマイシン耐性クローンを、培養培地へのネオマイシンの添加後に単離した。分泌されたＭＵＣ１融合タンパク質を含む馴化培地（ＣＭ）を、１５，０００ｒｐｍで２０分間回転させ、上清を０．４５μｍのフィルターを通して濾過し、そして−７５℃で保存した。Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ４ Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗ（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）を使用して、Ｃ末端にｈＦｃタグが付けられたＦｌａｇ−Ｘｅｘ（Ｙｅｘ）−ｈＦｃタンパク質を精製した。
【００９４】
抗ＭＵＣ１抗体のＭＵＣ１／Ｘ（ＭＵＣ１／Ｙ）タンパク質に対する結合（ハイブリドーマ上清）およびＭＵＣ１ α／β接点に対する結合を決定するためのＥＬＩＳＡアッセイ。ＥｌｉｓａＩｍｍｕｎｏＡｓｓａｙプレート（Ｃｏｓｔｅｒ，Ｃｏｒｎｉｎｇ，ＮＹ）を、ポリクローナルヤギ抗ヒトＦｃ（Ｇα−ｈＦｃ，４μｇ／ｍｌ）でコーティングし、その後、ＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎ２０（０．０５％）で洗浄し、そしてＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎ＋５％の脱脂粉乳（Ｂｌｏｔｔｏ）でブロックした。その後、Ｆｌａｇ−Ｘｅｘ（またはＹｅｘ）−ｈＦｃタンパク質（変異体および野生型）を含む使用済みの培養培地をウェルに載せて、Ｆｌａｇ−Ｘｅｘ（Ｙｅｘ）−ｈＦｃタンパク質を結合させた。インキュベーション後、試料を取り出し、そしてウェルをＰＢＳ／Ｔｗｅｅｎで洗浄した。その後、ウェルをマウスモノクローナル抗体（またはハイブリドーマ上清）とともに、続いて、ＨＲＰ結合抗マウス抗体とともにインキュベートした。
【００９５】
マウスの免疫化とハイブリドーマの生産。マウスを、２１日の間隔を明けた連続する皮内ＤＮＡ免疫化によって免疫化した。注射したＤＮＡはｐＣＬ−ＭＵＣ１／ＴＭまたはｐＣＬ−ＭＵＣ１／Ｘ発現ベクタープラスミドのいずれかであった。最後に、マウスにフロイトの不完全なアジュバントと共にＭＵＣ１／Ｘタンパク質の細胞外ドメインを注射してブーストした。ハイブリドーマを免疫脾臓細胞との骨髄細胞体の融合によって調製し、ＥＬＩＳＡアッセイによってスクリーニングした（上記を参照のこと）。
【００９６】
結果
ＭＵＣ１／Ｘ ｃＤＮＡでの免疫化ではなくＭＵＣ１／ＴＭ ｃＤＮＡでの免疫化によって抗ＭＵＣ１ α／β接点抗体が誘導された。マウスを、α鎖のタンデムリピートアレイを含むＭＵＣ１／ＴＭタンパク質をコードするｃＤＮＡ、またはタンデムリピートを欠失させたＭＵＣ１／Ｘイソ型をコードするｃＤＮＡのいずれかを含む発現ベクターで免疫化した（図１）。４回の連続するＤＮＡ免疫化の後、血清を、ＭＵＣ１／Ｘに対して指向させられた抗体についてアッセイした。全長のＭＵＣ１／ＴＭ分子と同じ部位で切断されるＭＵＣ１／Ｘイソ型を、抗ＭＵＣ１ α／β接点抗体を同定するためのスクリーニングタンパク質とした。これによっていくつかの利点がもたらされた。ＭＵＣ１／Ｘ細胞外ドメインは中心にあるタンデムリピートアレイを含まないので、高度に免疫原性であるタンデムリピートアレイエピトープに対して指向させられた抗体は検出されないであろう。より重要なことは、ＭＵＣ１／Ｘが、自然界に存在しているα／β接点を形成する２つの小さい相互作用しているＭＵＣ１／Ｘ αサブユニットとβサブユニットだけから構成されているので、ＭＵＣ１／ＸとＭＵＣ１／ＴＭの両方に共通しているエピトープに対して指向させられた抗体だけが検出されであろうということである。自然界に存在しているＭＵＣ１ α／β接点は１つのそのような主要なエピトープであり、これにより、このスクリーニング手順が目的のこの重要な領域に結合する抗体についての簡単な検出システムとなる。
【００９７】
予想外に、ＭＵＣ１／Ｘ ｃＤＮＡで免疫化した全てのマウス（５匹のうちの５匹）は、有意な抗ＭＵＣ１／Ｘ抗体力価を惹起することができなかった（図２ＡおよびＢ）。対照的に、ＭＵＣ１／ＴＭ ｃＤＮＡで免疫化した５匹のマウスのうちの５匹が、高度に再現性はあるが、少量の抗ＭＵＣ１／Ｘ抗体力価を生じた（図２ＡおよびＢ）。これらの結果は、ＭＵＣ１／ＴＭ ｃＤＮＡでの免疫化によっては、ＭＵＣ１／Ｘタンパク質およびＭＵＣ１／ＴＭタンパク質の両方に共通しているエピトープを認識する抗体を誘導することができたが、ＭＵＣ１／Ｘ ｃＤＮＡでの免疫化によっては、わずかな力価の抗ＭＵＣ１／Ｘ抗体しか誘発できなかったことを示している。
【００９８】
本発明者らの主要な目的はα／β接点を認識するモノクローナル抗体を作製することであったので、はるかに高い抗ＭＵＣ１／Ｘ力価を有しているマウスが必要であった。高力価の抗ＭＵＣ１／Ｘを作製するために、本発明者らは、ＭＵＣ１／ＴＭ ｃＤＮＡで感作したマウスをＭＵＣ１／Ｘタンパク質でブーストした。１回のＭＵＣ１／Ｘタンパク質でのブーストの後、全ての免疫化されたマウスは、１：３００（ＭＵＣ１／ＴＭ ｃＤＮＡでの免疫化だけの後）から、ＭＵＣ１／Ｘタンパク質でのブースト後には少なくとも１：３０，０００に、抗ＭＵＣ１／Ｘ力価の１００倍の増加を示した（図３Ａ〜Ｄ）。高い力価は、ＭＵＣ１／Ｘタンパク質でのブーストの１８日後に観察され、３２日目にもまだなお高かった（図３Ａ〜Ｄ）。ハイブリドーマの形成に使用するために屠殺しなかった残りのマウスは、最初の１回のＭＵＣ１／Ｘタンパク質でのブーストの６ヵ月後にもなお、高い抗ＭＵＣ１／Ｘタンパク質力価を維持していた。抗α／β接点特異的抗体を作製するために最良であるために、本発明者らは、最も高い抗ＭＵＣ１／Ｘ抗体力価を示すマウスに由来する脾臓細胞を使用して、ハイブリドーマの形成を開始した。
【００９９】
切断されたα／β接点を認識するＤＭＣ２０９モノクローナル抗体の作製。融合させられた脾臓−骨髄腫細胞を含む１０個の９６ウェルプレートからの使用済みの培地を、切断されたα／β接点を認識する抗体についてアッセイした。このような抗体を同定するために、ハイブリドーマ上清を、切断されたＭＵＣ／Ｘタンパク質と、構造上は類似しているが切断されていないＭＵＣ１／Ｙイソ型に対して、同時にスクリーニングした（図１）。ＭＵＣ１／Ｘは、全長のＭＵＣ１／ＴＭタンパク質と同じ部位で切断され、αサブユニットとβサブユニットの相互作用を生じるが、切断されないＭＵＣ１／ＹはＭＵＣ１ α／β接点エピトープを含まない。本発明者らは、ＭＵＣ１／Ｘ陽性であり、ＭＵＣ１／Ｙ陰性であるハイブリドーマを選択した。
【０１００】
９５０個のハイブリドーマ上清をスクリーニングすることにより、ＭＵＣ１／Ｘタンパク質と高度に反応性であるが、ＭＵＣ１／Ｙとは反応しない２つのハイブリドーマが得られた。限界細胞稀釈によって、ＤＭＣ２０９、ＩｇＭ抗体、およびＤＭＣ１１１、Ｉｇγ２ａ抗体と命名した純粋なクローンを得た。
【０１０１】
ＤＭＣ２０９反応性とＤＭＣ１１１反応性の詳細なエピトープ分析。クローニングしたＤＭＣ２０９とＤＭＣ１１１によって作製したモノクローナル抗体の特異性の分析によって、いずれも、ＭＵＣ１／Ｘ陽性であり、そしてＭＵＣ１／Ｙ（＝Δ１ー１８、図４Ｂ）陰性であることを確認した。さらに、ＤＭＣ２０９およびＤＭＣ１１１はまた、切断されないΔ１−１１タンパク質とも反応しなかったが（図４Ｆ）、切断されるΔ１−７ＭＵＣ１／Ｘタンパク質とは反応した（図４Ｅ）。さらなる分析は、ＤＭＣ２０９およびＤＭＣ１１１が野生型ＭＵＣ１／Ｘタンパク質と、切断されるＳ６３→ＣおよびＳ６３→Ｔ変異体タンパク質に同等に十分に結合したが（図４Ｃ）、他の全てのＳ６３変異体である切断されないＭＵＣ１／Ｘタンパク質（図４Ｄ）はＤＭＣ２０９と完全に非反応性であったことを示していた。対照的に、ＤＭＣ１１１は、切断されるＭＵＣ１／Ｘタンパク質（野生型と切断されたＳ６３→ＣおよびＳ６３→Ｔ変異体タンパク質、図４Ｄ）、ならびに、切断されないＳ６３変異体タンパク質（図４Ｄ）のいずれとも等しく十分に反応した。これらの結果によって、２つのモノクローナル抗体によって認識されるエピトープが異なることが確認された。より重要なことは、ＤＭＣ２０９はその反応性については完全にＭＵＣ１の切断に依存していることである。明らかに、ＤＭＣ２０９は、ＭＵＣ１ α−サブユニットとβ−サブユニットのいずれとも、それぞれを単離物として試験した場合には反応しなかった。ＤＭＣ２０９は、相互作用しているものとして提示された場合にしか２つのサブユニットとは反応しない。これらの分析によって、ＤＭＣ２０９が（ｉ）切断に依存しており、そして（ｉｉ）α−サブユニットおよびβ−サブユニットが相互作用している接点を認識することの強力な証拠が提供された。さらなる分析（以下に記載する）によっては、主要なＭＵＣ１イソ型であるＭＵＣ１／ＴＭを発現している細胞に対するＤＭＣ２０９の強固な結合、および切断に依存しないＤＭＣ１１１抗体との結合は明らかに少ないことが明らかにされた。これ以降、本発明者らが報告する分析は、切断依存性抗体ＤＭＣ２０９に限定する。
【０１０２】
インタクトな細胞上でのＭＵＣ１／ＴＭに対するＤＭＣ２０９の結合。ＭＵＣ１／ＴＭは、全てのＭＵＣ１イソ型のうちの主要なＭＵＣ１タンパク質であり、膜に繋がれたα−サブユニットに対して共有結合以外によって結合させられた大きなタンデムリピートアレイを含むα−サブユニットから構成されている。これは、広い範囲の腺ガンにおいて、細胞表面ヘテロ二量体として細胞によって高レベルで発現されている（図１）。ＤＭＣ２０９は、ＭＵＣ１／Ｘタンパク質中に存在している切断されたα／β接点を認識し、そしてこの切断部位は全長のＭＵＣ１／ＴＭタンパク質の中に見られる切断部位と同じであることが示されているので、ＤＭＣ２０９がインタクトな細胞上に提示されるＭＵＣ１／ＴＭタンパク質に結合するかどうかを決定することが極めて重要であった。本発明者らは、最初に、ヒトＭＵＣ１／ＴＭを発現していないマウスの細胞が、ヒトＭＵＣ１／ＴＭでのトランスフェクションの後にＤＭＣ２０９と反応するようになるかどうかを試験することによって、この問題に着手した。トランスフェクトされていないもとのマウスの乳腺腫瘍細胞はＤＭＣ２０９とは完全に非反応性であったが（図５Ａ）、ＤＭＣ２０９は、全長のＭＵＣ１／ＴＭタンパク質（図５Ｂ）またはＭＵＣ１／ＴＭの細胞質ドメインが欠失しているイソ型（図５Ｃ）のいずれかを発現する同じ細胞に対しては明らかに結合した。ＭＵＣ１／ＴＭがこれらの細胞上で発現されていることを確認するために、α−鎖のタンデムリピートアレイに対する抗体を用いて行った対照は、予想したとおり、トランスフェクトされた細胞上でＭＵＣ１の発現を示した（図５ＩＩ）。
【０１０３】
ＤＭＣ２０９ ｍＡｂがトランスフェクトされた細胞中のＭＵＣ１／ＴＭに結合することを確立すると、本発明者らは、これらの抗体が、ＭＵＣ１／ＴＭを発現することが公知である腫瘍細胞株にも結合するかどうかを調べ始めた。ＨＥＹ（卵巣ガン細胞株）と乳ガン細胞株Ｔ４７ＤおよびＭＤＡ２３１はすべて、有意なＤＭＣ２０９結合を示した（それぞれ、図５Ｃ、Ｄ、およびＥ）。
【０１０４】
ＤＭＣ２０９は新しい骨髄吸引物の中のＭＵＣ１を発現する多発性骨髄腫細胞に結合する。最終的な臨床的な適用のためには、ＭＵＣ１ α／β接点に対する抗体は、ＭＵＣ１を発現している悪性腫瘍細胞を標的化することができなければならない。ＤＭＣ２０９抗体がインビボ様の設定において腫瘍細胞に選択的に結合できるかどうかを調べるために、多発性骨髄腫の患者から新しく得た骨髄吸引物中の悪性形質細胞を使用した。吸引物の中の異種細胞の集団によって、ＤＭＣ２０９結合特異性の直接の評価ができる。ＤＭＣ２０９は、ＭＵＣ１を高度に発現することが知られているが、同じ吸引物試料中に存在しているＭＵＣ１を発現していない細胞には結合しないかまたは最少にしか結合しない、多発性骨髄腫細胞に結合するはずである。さらに、吸引物材料の中でのＤＭＣ２０９細胞の結合は、よく知られている骨髄腫マーカーである抗シンデカン（ＣＤ１３８）での同時染色によって容易に比較することができる。
【０１０５】
プロットした、ＣＤ４５陽性細胞に対する側方散乱（細胞の粒度を反映する）によって、骨髄吸引物中に存在している混合された細胞集団の組成を評価した（図６Ａ）。これによって、骨髄吸引材料が顆粒球、好酸球、リンパ球、単球、有核赤血球、および悪性形質（骨髄腫）細胞を含む予想された異種細胞集団から構成されていることを確認した（図６Ａ）。赤色の蛍光で標識されたＤＭＣ２０９抗体を用いた同時分析によって、有意なＤＭＣ２０９反応性を示した細胞の別の集団が明らかになった。Ｒ１（図６Ｂ）と命名したこの選択した集団は、シンデカン−ＣＤ１３８に対する抗体と完全な一致を示した（図６Ｃ）。同様の結果が、多発性骨髄腫の患者に由来する、別の、３つの新しく得た骨髄吸引物のうちの３個を用いて得られた。同じ新しい操作していない吸引物試料の中での、ＭＵＣ１を発現している悪性形質細胞の認識と、ＭＵＣ１を発現していない細胞系統に対しては結合しないことは、ＭＵＣ１を発現している腫瘍細胞を識別することにおけるＤＭＣ２０９抗α／β接点抗体の優れた特異性を強調する。
【０１０６】
ＤＭＣ２０９抗α／β接点抗体での乳ガン組織の免疫組織化学的染色。乳ガン組織中に存在しているＭＵＣ１を発現している腫瘍細胞とのＤＭＣ２０９免疫反応性を視覚化するために、免疫組織化学的分析を、いずれも同じ外科的に切除した試料から得た悪性乳房組織と正常な乳房組織について行った。平衡して、切片を、ＭＵＣ１のタンデムリピートを認識する抗体で免疫組織化学的に分析した（α−ＥＭＡ−抗上皮膜抗原、実験手順を参照のこと）。α−ＥＭＡとＤＭＡ２０９抗α／β接点抗体のいずれもが、悪性乳ガン細胞と強く反応した。明らかに少ない染色が、悪性ではない正常な乳房組織においては観察された。
【０１０７】
本発明者らは、次に、ＤＭＣ２０９とタンデムリピート部分に対する抗体で、それぞれ、赤および緑の蛍光標識で同時に二重染色を行った。ＭＵＣ１免疫反応性は、悪性乳房組織の凍結切片の中で、赤色に標識されたＤＭＣ２０９を使用して容易に検出できた。強い抗ＭＵＣ１免疫反応性は、悪性乳房上皮細胞上で見られ、原則として、全ての免疫反応性は、未標識のＤＭＣ２０９抗体を添加することによって競合され、したがって、免疫反応性の特異性が立証された。染色は、結合組織の中に包埋されていた線維芽細胞においても、また、結合組織自体においても見られなかった。予想されたとおり、タンデムリピート部分に対する抗体との免疫反応性を示す緑色の標識は、赤色に標識されたＤＭＣ２０９について見られた標識と一緒に局在化していた。
【０１０８】
本明細書中で記載した実施例と実施形態は、説明の目的のためのものであり、その観点での様々な改良または変更が当業者に示唆され、本出願および添付の特許請求の範囲の精神および範囲に含まれることが理解される。本明細書中で引用された全ての刊行物、特許、および特許出願は、全ての目的についてそれらの全体が引用により本明細書中に組み入れられる。
【０１０９】
（配列表）
【０１１０】
【表１】
【０１１１】
【表２】
【図面の簡単な説明】
【０１１２】
【図１】図１は、ＭＵＣ１タンパク質イソ型とＭＵＣ１融合タンパク質を示す。タンデムリピートアレイを含む切断された膜貫通ＭＵＣ１タンパク質（ＭＵＣ１／ＴＭ）を左に示す。別のスプライシングでは、Ｓ．Ｄ．→によって示されるスプライシングドナーが利用され、これによって、２つの別のスプライシングアクセプター（Ｓ．Ａ．Ｙ→とＳ．Ａ．Ｘ→が生じ、これによって、ＭＵＣ１／ＹとＭＵＣ１／Ｘイソ型が形成される。テキストに記載されているように、抗体ＤＭＣ２０９は、ＭＵＣ１／ＸとＭＵＣ１／ＴＭタンパク質の両方に存在している切断されたα／β接点を認識するが、切断されていないＭＵＣ１／Ｙタンパク質とは反応しない。
【図２Ａ】図２Ａは、ＭＵＣ１／ＴＭ、ＭＵＣ１／Ｘ、およびＭＵＣ１／Ｙイソ型の配列を示す。ＭＵＣ１／ＴＭヌクレオチド（配列番号１）およびアミノ酸（配列番号２）の番号付けは、それぞれ、配列の左と右に示す。シグナルペプチドの切断は、２３位のグリシンと２４位のセリンの間で起こり、そして上向きの赤色の矢印によって示されている。Ｎ３０配列はＳＧＨＡＳからＥＫＮＡまでにまたがる。明確性のために、タンデムリピートアレイとその隣接配列を含むスプライシングされた中心領域を欠失させ、これは点線で示されている。ＭＵＣ１／ＴＭの切断は、３５７位のグリシンと３５８位のセリンの間（ＭＵＣ１／Ｘアミノ酸の６２位と６３位の間）で起こり、これは、上向きの赤色の矢印で示されている。ＭＵＣ１／ＸとＭＵＣ１／Ｙを生じるスプライシングドナー部位は、２１７位のヌクレオチド（ｇｔｇａｔ）に示され、そしてＭＵＣ１／ＸとＭＵＣ１／Ｙを生じるスプライシングアクセプター部位は、それぞれ、９２４位のヌクレオチド（ｃｃｃｃａｇ）と９９６位のヌクレオチド（ｃｔｃｃａｇ）にある。ＭＵＣ１／Ｘスプライシングアクセプター部位に対してすぐＣ末端側にあるＭＵＣ１／Ｘアミノ酸は、斜体文字で１から（ＬＳＴＧで始まる）から、膜貫通ドメインのすぐＮ末端側にある１２０（ＳＧＡＧ）まで番号付けされている。ＭＵＣ１／Ｘ核酸配列とアミノ酸配列は、それぞれ、配列番号３および４に示されている。ＭＵＣ１／Ｙ核酸配列とアミノ酸配列を、それぞれ、配列番号５および６に示されている。Ｌｅｖｉｔｉｎ，ｅｔ ａｌ．（前出）を参照のこと。
【図２Ｂ】図２Ｂは、ＭＵＣ１／ＴＭ、ＭＵＣ１／Ｘ、およびＭＵＣ１／Ｙイソ型の配列を示す。ＭＵＣ１／ＴＭヌクレオチド（配列番号１）およびアミノ酸（配列番号２）の番号付けは、それぞれ、配列の左と右に示す。シグナルペプチドの切断は、２３位のグリシンと２４位のセリンの間で起こり、そして上向きの赤色の矢印によって示されている。Ｎ３０配列はＳＧＨＡＳからＥＫＮＡまでにまたがる。明確性のために、タンデムリピートアレイとその隣接配列を含むスプライシングされた中心領域を欠失させ、これは点線で示されている。ＭＵＣ１／ＴＭの切断は、３５７位のグリシンと３５８位のセリンの間（ＭＵＣ１／Ｘアミノ酸の６２位と６３位の間）で起こり、これは、上向きの赤色の矢印で示されている。ＭＵＣ１／ＸとＭＵＣ１／Ｙを生じるスプライシングドナー部位は、２１７位のヌクレオチド（ｇｔｇａｔ）に示され、そしてＭＵＣ１／ＸとＭＵＣ１／Ｙを生じるスプライシングアクセプター部位は、それぞれ、９２４位のヌクレオチド（ｃｃｃｃａｇ）と９９６位のヌクレオチド（ｃｔｃｃａｇ）にある。ＭＵＣ１／Ｘスプライシングアクセプター部位に対してすぐＣ末端側にあるＭＵＣ１／Ｘアミノ酸は、斜体文字で１から（ＬＳＴＧで始まる）から、膜貫通ドメインのすぐＮ末端側にある１２０（ＳＧＡＧ）まで番号付けされている。ＭＵＣ１／Ｘ核酸配列とアミノ酸配列は、それぞれ、配列番号３および４に示されている。ＭＵＣ１／Ｙ核酸配列とアミノ酸配列を、それぞれ、配列番号５および６に示されている。Ｌｅｖｉｔｉｎ，ｅｔ ａｌ．（前出）を参照のこと。
【図３】図３は、ＭＵＣ１／ＴＭまたはＭＵＣ１／ＸのいずれかをコードするＤＮＡで免疫化したマウスにおいて作製させた抗ＭＵＣ１／Ｘ抗体を示す。マウスを、ＭＵＣ１／ＴＭタンパク質（グループＩＩ）をコードするｃＤＮＡ，またはタンデムリピートが欠失させられたＭＵＣ１／Ｘタンパク質をコードするｃＤＮＡ（グループＩ、図１を参照のこと）のいずれかを含む発現ベクターで免疫化した。血清を、実施例に記載するように、切断されたＭＵＣ１／Ｘタンパク質に対して指向させられた抗体力価についてアッセイした。グループＩＩのマウスの全てが、有意な抗ＭＵＣ１／Ｘ抗体力価を示したが、グループＩのマウスにおいては抗ＭＵＣ１／Ｘ抗体は検出されなかった（ＡおよびＢ）。
【図４】図４は、ＭＵＣ１／ＴＭ ｃＤＮＡで感作させ、１回のＭＵＣ１／Ｘタンパク質でのブーストを続いて行ったマウスにおける抗ＭＵＣ１／Ｘ力価を示す。ＭＵＣ１／ＴＭ ｃＤＮＡでの免疫化によって予め感作させたグループＩＩのマウス（図２を参照のこと）を、１回のＭＵＣ１／Ｘタンパク質での免疫化によってブーストした。血清を、タンパク質でのブーストの１８日後または３２日後に（それぞれ、ピンク色および緑色の線）、実施例に記載するように、抗ＭＵＣ１／Ｘ反応性についてアッセイした。個々のマウスについての力価が示される。
【図５】図５は、ＤＭＣ２０９およびＤＭＣ１１１モノクローナル抗体によって認識されるエピトープの詳細な分析を示す。野生型ＭＵＣ１／ＸおよびＭＵＣ１／Ｙタンパク質（ＡおよびＢ）、ならびに、点変異したＭＵＣ１／Ｘ（ＣおよびＤ）および内部欠失させられたＭＵＣ１／Ｘ（ＥおよびＦ）を、ＤＭＣ２０９およびＤＭＣ１１１抗体とのそれらの反応性について、実施例に記載するようにアッセイした。
【図６】図６は、ＭＵＣ１／ＴＭを発現する細胞のＤＭＣ２０９フローサイトメトリー分析を説明する。親であるトランスフェクトされていないマウス乳腺腫瘍細胞、または全長のＭＵＣ１／ＴＭもしくはその細胞質テールが短縮されているＭＵＣ１／ＴＭ（それぞれ、ＤＡ３／ＰＡＲ、ＤＡ３／ＴＭ、およびＤＡ３／ＴＭマイナスＣＹＴ）をコードするｃＤＮＡでトランスフェクトされた細胞をＤＭＣ２０９と反応させ、実施例に記載するようにフローサイトメトリーによって分析した。同様に、卵巣ガン細胞株ＨＥＹと乳ガン細胞である細胞株Ｔ４７ＤおよびＭＤＡ２３１を、ＤＭＣ２０９とのインキュベーションの後に分析した。赤色と緑色の軌跡は、それぞれ、蛍光標識された二次抗体だけと、または一次ＤＭＣ２０９抗体、続いて二次抗体との細胞の反応を示す。
【図７】図７は、多発性骨髄腫の患者から新しく得た骨髄細胞とのＤＭＣ２０９反応性のフローサイトメトリーによる分析を示す。骨髄の吸引物を、ＤＭＣ２０９と、ＣＤ４５、ＣＤ１３８、およびＣＤ３８に対する抗体を用いて、同時に分析した。抗体を蛍光色素（それぞれの蛍光色素は異なる放射波長を有している）で別々に標識した。側方散乱分析を、ＣＤ４５（Ａ１）およびＤＭＣ２０９（Ａ２）に対して行った。ＤＭＣ２０９陽性細胞をＲ１と命名し、ＣＤ１３８陽性細胞（Ａ３）に対するＣＤ３８陽性細胞のプロットは、ＤＭＣ２０９陽性集団（赤色で標識された細胞）がＣＤ１３８陽性細胞と一致することを示している。
【技術分野】
【０００１】
関連出願についての相互参照
本出願は、２００５年２月２８日に出願した米国仮特許出願第６０／６４７，８７０号に対する利益を主張する。この仮出願の内容は、全て目的のために、その全体が参考として本明細書中に援用される。
【０００２】
連邦政府支援の研究開発下で行われた本発明の権利に関する状況
該当なし
（技術分野）
本発明は、ＭＵＣ１のα−サブユニットおよびβ−サブユニットの両方に特異的かつ同時に結合する抗体に関する。
【背景技術】
【０００３】
（発明の背景）
ＭＵＣ１は、多数のヒト上皮性悪性腫瘍（乳ガン、前立腺ガン、結腸ガン、卵巣ガン、および膵臓ガンを含む）において、ならびに多発性骨髄腫の悪性形質細胞上で高度に発現されている糖タンパク質である。オルタナティブスプライシングによって様々なＭＵＣ１イソ型が生じ得るが、最も集中的に研究されているＭＵＣ１タンパク質は、タンデムリピートアレイを含む重いグリコシル化された細胞外ドメイン、膜貫通ドメイン、および細胞質ドメインから構成されているＩ型膜貫通タンパク質（ＭＵＣ１／ＴＭ）である。ＭＵＣ１／ＴＭは、その合成の後に直ちにタンパク質分解によって切断されて、特異的に認識し、そして強力な共有結合ではない相互作用で結合する２つのサブユニット（αとβ）を生じる（図１、ＭＵＣ１／ＴＭを参照のこと）。ＭＵＣ１の２つのサブユニットへの切断は、多数の、細胞につながれているムチン様タンパク質において見られる高度に保存されているドメインであるＳＥＡモジュールの中で起こる（非特許文献１：Ｌｅｖｉｔｉｎ，ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．（２００５）２８０：３３３７４−８６）。細胞膜からのα−サブユニットの分割によっては、末梢循環中に可溶性のタンデムリピートアレイを含むＭＵＣ１が生じる。この分子は、ＭＵＣ１陽性悪性腫瘍の患者において血清ＭＵＣ１レベルを決定するために使用される分子である。
【０００４】
循環中の可溶性α−サブユニットＭＵＣ１タンパク質の存在は、ＭＵＣ１を発現する悪性腫瘍細胞を直接標的化するための適切な量の抗ＭＵＣ１抗体の送達における唯一の問題を呈する。これは、ＭＵＣ１の最も免疫原性である部分が、タンデムリピートアレイであり、今日までに作製された抗ＭＵＣ１抗体のほとんど全てがその免疫原性領域中のエピトープを排他的に認識することがその理由である。可溶性の循環しているＭＵＣ１ α−サブユニットによるタンデムリピート部分に対する抗体の分離は、細胞表面上のＭＵＣ１にうまく結合することができる抗体の量を厳しく制限する。さらに、タンデムリピート部分に対する抗体とその可溶性の循環しているＭＵＣ１標的の免疫複合体の蓄積によっては、有意な標的器官の損傷が導かれる可能性がある。
【０００５】
近年、免疫原として全長のＭＵＣ１／ＴＭ分子を使用して有効な抗ＭＵＣ１抗体を作製するための多くの努力が行われている。これらの試みを妨げる主要な障害は、ＭＵＣ１／ＴＭ分子全体での免疫化によっては、必ず、高度に免疫原性であるタンデムリピートアレイ上のエピトープを認識する抗体のほぼ全体からなる抗体反応が生じることである。ＭＵＣ１を発現する腫瘍細胞のインビボでの標的化における最終的な用途については、このような抗体は、上記に詳細に記載したように、反復部分に対する抗体に固有の欠点の全てを有している。
【０００６】
細胞表面につながれているＭＵＣ１エピトープを認識する抗体は、これらの問題点を未然に防げる可能性がある。概念上は簡単であるが、細胞表面に安定につながれているＭＵＣ１に対するモノクローナル抗体の作製には、最初に、細胞に結合した、分割されていない落ちないエピトープの特性決定が必要である。ＭＵＣ１ α−サブユニットが結合している膜に繋がれているβ−サブユニットによって形成される接点によって、このようなエピトープが提供される。
【非特許文献１】Ｌｅｖｉｔｉｎ，ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．（２００５）２８０：３３３７４−８６
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【０００７】
（発明の簡単な説明）
本発明により、インタクトなＭＵＣ１タンパク質のα−サブユニットおよびβ−サブユニットの両方に同時に結合する抗体（「抗ＭＵＣ１ α／β抗体」、これは、ＭＵＣ１ α／βサブユニットの接点に結合するが、一方が存在していない場合にはＭＵＣ１ α−サブユニットまたはＭＵＣ１ β−サブユニットのいずれにも実質的には結合しない）が提供される。本発明者らによって、さらに、このような抗体を生産するための方法、ならびに、例えば、診断用途および免疫療法への適用においてこれらの抗体を使用するための方法が提供される。
【０００８】
したがって、第１の態様においては、本発明によって、抗体が、一方が存在しない場合にはα−サブユニットまたはβ−サブユニットのいずれにも結合しないという条件で、インタクトなＭＵＣ１タンパク質に結合するＭＵＣ１特異的抗体が提供される。
【０００９】
抗体の実施形態に関して、いくつかの実施形態においては、抗体は、例えば、ＥＬＩＳＡにおいて、または１つのＭＵＣ１イソ型を発現する細胞を使用するフローサイトメトリーによって測定した場合に、イソ型ＭＵＣ１／Ｘには結合するが、イソ型ＭＵＣ１／Ｙには結合しない。いくつかの実施形態においては、抗体はＭＵＣ１／Ｘイソ型に結合し、これは、短縮型のα−サブユニットとβ−サブユニットに切断される。
【００１０】
抗体はポリクローナルでも、またモノクローナルでもあり得る。抗体は、約１０−７Ｍから約１０−１２Ｍの範囲、例えば、約１０−７Ｍ、１０−８Ｍ、１０−９Ｍ、１０−１０Ｍ、１０−１１Ｍ、１０−１２Ｍ、の解離定数（Ｋｄ）を有し得る。抗体は、約１０６Ｍ−１から約１０１０Ｍ−１の範囲、例えば、約１０６Ｍ−１、１０７Ｍ−１、１０８Ｍ−１、１０９Ｍ−１、または１０１０Ｍ−１の結合定数（Ｋａ）を有し得る。抗体は、ＭＵＣ１／ＴＭまたはＭＵＣ１／Ｘを抗原として使用してＥＬＩＳＡアッセイによって測定すると、約１：１００または１：３００から約１：３０，０００または１：５０，０００まで、例えば、約１：３００、１：１０００、１：５０００、１：１０，０００、１：２０，０００、１：３０，０００、１：５０，０００の力価を有し得る。
【００１１】
抗体には、任意の自然界に存在している定常領域、または任意のそれらのサブクラスが含まれ得る。これには、例えば、ＩｇＡ（ＩｇＡ１およびＩｇＡ２を含む）、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ（ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、およびＩｇＧ４を含む）、ならびにＩｇＭが含まれる。抗体は、哺乳類または鳥類を含む、抗体を生産することができる任意の動物に由来する定常領域を有し得る。抗体は、ヒトおよびヒト以外の哺乳動物（イヌ、ネコ、ウシ、ヒツジ、ウマ、ブタ、および齧歯類（ウサギ、ラット、ハムスター、マウスを含む）を含む）の中で生産させることができる。抗体はニワトリの中で生産させることもできる。
【００１２】
いくつかの実施形態においては、抗体はヒト化抗体であるか、またはヒト抗体である。いくつかの実施形態においては、抗体は定常領域を欠いている。例えば、抗体は、Ｆａｂ断片である場合も、また一本鎖の可変領域である場合もある。抗体は組み換えによって生産することができる。
【００１３】
抗体にはさらに、細胞傷害性部分（例えば、リシン分子、緑膿菌（ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）毒素、放射性同位元素）を含めることができる。抗体にはさらに、標識部分（例えば、放射性同位元素、酵素、蛍光色素分子）を含めることができる。
【００１４】
いくつかの実施形態においては、抗体は、ＭＵＣ１ α−サブユニットのβ−サブユニットからの解離を妨げる。いくつかの実施形態においては、抗体によって、ＭＵＣ１ β−サブユニットを介する細胞内シグナル伝達が減少するかまたは阻害される。
【００１５】
いくつかの実施形態においては、抗体は、ＤＭＣ２０９またはＤＭＣ１１１である。
【００１６】
本発明により、さらに、抗ＭＵＣ１ α／β抗体を含む細胞が提供される。例えば、細胞は、抗体を生産するハイブリドーマであり得る。細胞はまた、インタクトなＭＵＣ１タンパク質をその表面上に有している細胞であり得、この場合、ＭＵＣ１タンパク質は、抗ＭＵＣ１ α／β抗体に結合させられる（すなわち、付着させられる）。細胞はまた、本発明の抗体を発現するように組み換えによって修飾することができる。
【００１７】
別の態様においては、本発明により、治療上十分な量の本発明の抗ＭＵＣ１ α／β抗体を投与することによる、ＭＵＣ１を過剰発現しているガン細胞に対して免疫毒素を標的化させる方法、およびＭＵＣ１を過剰発現しているガン細胞の増殖を阻害または妨げる方法が提供される。
【００１８】
さらなる態様においては、本発明により、インタクトなＭＵＣ１タンパク質に結合するＭＵＣ１特異的抗体を生産する方法が提供される。この方法には、以下の工程が含まれる：
ｉ）インタクトなＭＵＣ１タンパク質に結合するＭＵＣ１特異的抗体を得るために十分な量のαサブユニットのタンデムリピートを含むＭＵＣ１／ＴＭ抗原で、１回以上、抗体を生産する能力を有している被験体を免疫化する工程；および
ｉｉ）ＭＵＣ１／Ｘ抗原に結合する抗体を選択する工程。
この場合、抗体は、一方が存在しない場合にはＭＵＣ１ α−サブユニットまたはＭＵＣ１ βサブユニットのいずれにも結合しない。
【００１９】
この方法のさらなる実施形態においては、被験体を、ＭＵＣ１／ＴＭ抗原での免疫化に続いて、イソ型ＭＵＣ１／Ｘ抗原で１回以上免疫化することができる。ＭＵＣ１抗原での免疫化には、状況に応じてアジュバントを含めることができる。
【００２０】
ＭＵＣ１／ＴＭおよびＭＵＣ／Ｘ抗原は別々に、核酸またはポリペプチドの形態で被験体に投与することができる。１つの実施形態においては、被験体は、最初に、ＭＵＣ１／ＴＭ抗原をコードする核酸（例えば、ｃＤＮＡ）で１回以上免疫化され、その後に続いて、ＭＵＣ１／Ｘ抗原をコードする核酸で１回以上免疫化される。
【００２１】
別の態様においては、本発明により、抗体が、一方が存在しない場合にはα−サブユニットまたはβ−サブユニットのいずれにも結合しないという条件で、インタクトなＭＵＣ１タンパク質に結合するＭＵＣ１特異的抗体をスクリーニングする方法が提供される。この方法には、以下の工程が含まれる：
ｉ）切断されたＭＵＣ１／Ｘ抗原およびＭＵＣ１／Ｙ抗原に対する、作製された複数の抗ＭＵＣ１抗体の結合を決定する工程；ならびに
ｉｉ）ＭＵＣ１／Ｘ抗原には特異的に結合するが、ＭＵＣ１／Ｙ抗原には特異的には結合しない抗体を選択する工程。
【００２２】
これらの方法において生産されるか、または使用される抗体の実施形態は、上記に記載されたものと同じである。
【００２３】
関連する態様においては、本発明により、目的の抗原に対する抗体を生産する方法が提供される。この方法には、以下の工程が含まれる：
ｉ）αサブユニットのタンデムリピートと目的の抗原を含むＭＵＣ１／ＴＭ抗原で１回以上被験体を免疫化する工程；および
ｉｉ）目的の抗原で１回以上被験体を免疫化する工程。
これによって、目的の抗原に対する抗体が生産される。
【００２４】
ＭＵＣ１／ＴＭ抗原と目的の抗原は、別々に、核酸またはポリペプチドの形態で被験体に投与することができる。
【００２５】
いくつかの実施形態においては、ＭＵＣ１／ＴＭ抗原と目的の抗原は一緒に投与される。いくつかの実施形態においては、ＭＵＣ１／ＴＭ抗原と目的の抗原は、化学的リンカーによって結合させられる。いくつかの実施形態においては、ＭＵＣ１／ＴＭ抗原と目的の抗原は融合タンパク質として投与される。
【００２６】
目的の抗原は、任意の抗原性ポリペプチド配列である場合も、また抗原性ポリペプチド配列をコードする任意の核酸である場合もある。目的の抗原は、ヒト、哺乳動物、動物、植物、細菌、ウイルス、または合成のものであり得るが、これらに限定はされない。目的の抗原は、腫瘍関連抗原（例えば、ガン胎児性抗原（ＣＥＡ）、糖鎖抗原（ＣＡ−１２５）、前立腺幹細胞抗原（ＰＳＣＡ）、メラノーマ抗原（ＭＡＧＥ、ＭＡＲＴ））であり得る。目的の抗原は、感染性疾患に関係している抗原であり得る。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２７】
定義
本明細書中で別段の定義がなければ、本明細書中で使用される全ての技術用語および科学用語は、本発明が属する分野の当業者によって一般的に理解されている意味と同じ意味を有する。例えば、Ｃｏｎｃｉｓｅ Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ ｏｆ Ｂｉｏｍｅｄｉｃｉｎｅ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｕｏ，Ｐｅｉ−Ｓｈｏｗ，第２版，２００２，ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ；Ｔｈｅ Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ ｏｆ Ｃｅｌｌ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，第３版，１９９９，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ；およびＯｘｆｏｒｄ Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ ｏｆ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ Ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｒｅｖｉｓｅｄ，２０００，Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓによって、本発明で使用される多くの用語についての一般的な辞書が当業者に提供されている。
【００２８】
アミノ酸は、それらの一般的に知られている３文字記号によって、またはＩＵＰＡＣ−ＩＵＢ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅ Ｃｏｍｍｉｓｓｉｏｎによって推奨されている１文字記号によってのいずれかで、本明細書中で記載され得る。同様に、ヌクレオチドは、それらの一般的に受け入れられている１文字コードによって記載され得る。本発明の目的については、以下の用語は以下のように定義される。
【００２９】
用語「特異的に結合する（ｂｉｎｄ（ｓ） ｓｐｅｃｉｆｉｃａｌｌｙ）」もしくは「特異的に結合する（ｓｐｅｃｉｆｉｃａｌｌｙ ｂｉｎｄ（ｓ））」、あるいは、「結合する（ａｔｔａｃｈｅｄ）」もしくは「結合している（ａｔｔａｃｈｉｎｇ）」は、その標的エピトープが欠失している細胞もしくは組織と比較した、特定の標的エピトープを有している細胞もしくは組織との、抗ＭＵＣ１ α／β抗体の全体または一部における優先的な会合を意味する。もちろん、一定の程度の非特異的相互作用が、抗体と標的ではないエピトープの間で起こり得ることが認識される。それにもかかわらず、特異的結合は、標的エピトープの特異的認識によって媒介されるので区別することができる。通常、特異的結合は、送達された分子と標的エピトープを有しているもの（例えば、アッセイ用ウェルまたは細胞）との間で、結合した抗体と標的エピトープを有していないもの（例えば、アッセイ用ウェルまたは細胞）との間よりも、はるかに強い会合を生じる。特異的結合によっては、通常、標的エピトープを有していない細胞または組織と比較すると、標的エピトープを有している細胞または組織に対しては、結合した抗ＭＵＣ１ α／β抗体の量（単位時間あたり）において約１０倍を超える量、そして最も好ましくは１００倍を超える量の増加が生じる。２つのものの間での特異的結合は、一般的には、少なくとも１０６Ｍ−１の親和性を意味する。１０８Ｍ−１より大きい親和性が好ましい。特異的結合は、ウェスタンブロット、ＥＬＩＳＡ、フローサイトメトリー、免疫組織化学を含む、当該分野で公知の抗体結合についての任意のアッセイを使用して決定することができる。
【００３０】
表現「実質的には結合しない」は、標的エピトープに特異的に結合する抗ＭＵＣ１ α／β抗体のわずか約１０〜１５％しか、特定の標的ではないエピトープに結合しないことを意味する。標的エピトープを含まないものに対する抗体の「実質的ではない結合」は、標的エピトープを有している同じものに対する抗体の特異的結合よりも、約１０倍少なく、そして好ましくは、約１００倍少ない。
【００３１】
用語「ＭＵＣ１」または「ムチン１」は、多形変異体、対立遺伝子、突然変異体、および種間ホモログを意味する。これは、（１）約２５個のアミノ酸、状況によっては、５０、１００、１５０、２００、２５０個のアミノ酸のウィンドウ全体にわたって、自然界に存在しているＭＵＣ１タンパク質（例えば、ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＮＰ＿００２４４７（ＭＵＣ１ムチンイソ型１）、ＮＰ＿００１０１８０１６（ＭＵＣ１ムチンイソ型２）、ＮＰ＿００１０１８０１７（ＭＵＣ１ムチンイソ型３）、もしくはＮＰ＿００１０１８０２１（ＭＵＣ１ムチンイソ型４）、イソ型ＭＵＣ１／ＴＭ、イソ型ＭＵＣ１／Ｘ、イソ型ＭＵＣ１／Ｙを含む）に対して約８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％のアミノ酸配列同一性を有しているものであるか；（２）自然界に存在しているＭＵＣ１タンパク質のアミノ酸配列（グリコシル化されたアミノ酸配列を含む）およびその保存的に修飾された変異体を含む免疫原に対して惹起させられた抗体に特異的に結合するものであるか、あるいは（３）約２５個のアミノ酸、状況によっては、５０、１００、１５０、２００、２５０、５００個の核酸のウィンドウ全体にわたって、自然界に存在しているＭＵＣ１核酸配列（例えば、ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＮＭ＿００２４５６（ＭＵＣ１転写変異体１）、ＮＭ＿００１０１８０１６（ＭＵＣ１転写変異体２）、ＮＭ＿００１０１８０１７（ＭＵＣ１転写変異体３）、もしくはＮＭ＿００１０１８０２１（ＭＵＣ１転写変異体４）、変異体ＭＵＣ１／ＴＭ、変異体ＭＵＣ１／Ｘ、変異体ＭＵＣ１／Ｙを含む）に対して約８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％の核酸配列同一性を有しているものである。
【００３２】
ＭＵＣ１は、反復ドメインと密集したＯ−グリコシル化を特徴とする、細胞表面および／または血清腫瘍マーカーである糖タンパク質である（Ｂａｌｄｕｓ，ｅｔ ａｌ．，Ｃｒｉｔ Ｒｅｖ Ｃｌｉｎ Ｌａｂ Ｓｃｉ（２００４）４１：１８９；Ｋａｒｓｔｅｎ，ｅｔ ａｌ．，（２００５）２６：２１７）。ＭＵＣ１は、最も単純な上皮細胞の内腔表面で発現され、そして多数の上皮性悪性腫瘍（乳ガン、前立腺ガン、卵巣ガン、および膵臓ガンを含む）のガン腫細胞、ならびに悪性形質細胞（例えば、多発性骨髄腫）上では過剰に発現されている（Ｔａｙｌｏｒ−Ｐａｐａｄｉｍｉｔｒｉｏｕ，ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍａｍｍａｒｙ Ｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌ Ｎｅｏｐｌａｓｉａ（２００２）７：２０９；Ｄｅｎｄａ−Ｎａｇａｉ ａｎｄ Ｉｒｉｍｕｒａ，Ｇｌｙｃｏｃｏｎｊ Ｊ（２０００）１７：６４９を参照のこと）。ＭＵＣ１は、可溶性のα−サブユニットと細胞につながれているβ−サブユニットから構成されている。ＭＵＣ１は、細胞−細胞接着を媒介する細胞内接着分子−１（ＩＣＡＭ−１）に結合し（Ｂａｌｄｕｓ ｅｔ ａｌ．，（前出）およびＲａｈｎ，ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．（２００４）２７９：２９３８６）、そしてシグナル伝達分子についてのドッキングタンパク質としての役割を果たす。ＭＵＣ１は、高度に保存されている細胞質テールを有しており、これは、ＭＵＣ１のリン酸化によって厳しく調節されるプロセスにおいて転写調節因子β−カテニンに結合する（Ｃａｒｒａｗａｙ，ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｅｓｓａｙｓ（２００３）２５：６６を参照のこと）。
【００３３】
用語「インタクトなＭＵＣ１タンパク質」は、本明細書中で使用される場合は、α−サブユニットとβ−サブユニットに切断されており、それぞれのサブユニットが自然な三次元折り畳みを有し、そしてこれらのサブユニットが互いに相互作用しているＭＵＣ１タンパク質を意味する。ＭＵＣ１イソ型であるＭＵＣ１／ＴＭとＭＵＣ１／Ｘは、インタクトなＭＵＣ１タンパク質であり得る。
【００３４】
「ＭＵＣ１／Ｘ」イソ型には、α−サブユニットの抗原性であるタンデムリピートアレイは含まれておらず、ＳＥＡモジュール内で短縮型α−サブユニットとβ−サブユニットに切断される（Ｌｅｖｉｔｉｎ，ｅｔ ａｌ．，前出）。
【００３５】
「ＭＵＣ１／Ｙ」イソ型には、α−サブユニットの抗原性であるタンデムリピートアレイは含まれておらず、ＳＥＡモジュール内で切断されない（Ｌｅｖｉｔｉｎ，ｅｔ ａｌ．，前出）。
【００３６】
用語「生理学的条件」は、目的の細胞の維持または増殖を可能にする条件（例えば、温度、ｐＨ、および浸透圧）を有している細胞外環境を意味する。
【００３７】
用語「抗体」は、体液性応答がインビトロまたはインビボで生じることによって得られる免疫グロブリン分子を意味し、これには、ポリクローナル抗体とモノクローナル抗体が含まれる。この用語にはまた、キメラ抗体（例えば、ヒト化マウス抗体）、ヘテロ結合体抗体（例えば、二重特異的抗体）、および組み換え体単鎖Ｆｖ断片（ｓｃＦｖ）のような、遺伝子操作された形態も含まれる。用語「抗体」にはまた、抗体断片の抗原結合形態（例えば、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ）２、ＶＨ−ＶＬＦａｂ断片）も含まれる。
【００３８】
用語「ヒト化抗体」は、ヒト以外のアミノ酸配列を含むが、その定常領域は、ヒトにおいて免疫原性が低下するように変更されている抗体を意味する。
【００３９】
用語「ヒト抗体」は、ヒト免疫グロブリン遺伝子によって生産される抗体を意味する。ヒト抗体は、例えば、ヒトの中で、機能性のヒト免疫グロブリン遺伝子を有しているヒト以外の動物（例えば、マウス、ハムスター、ウサギ、ウシ）によって、インビボで生産させることができる。このようなトランスジェニック動物は当該分野で公知である。例えば、Ｌｏｎｂｅｒｇ，Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈ（２００５）２３：１１１７；Ｒｏｂｌ，ｅｔ ａｌ．，Ｔｈｅｒｉｏｇｅｎｏｌｏｇｙ，（２００３）５９：１０７；およびＩｓｈｉｄａ，ｅｔ ａｌ．，Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ（２００２）４：９１を参照のこと。トランスジェニックマウスから完全なヒト抗体を生産している会社としては、Ｍｅｄａｒｅｘ，Ｍｉｌｐｉｔａｓ，ＣＡと、Ａｂｇｅｎｉｘ（現在は、Ａｍｇｅｎ）、Ｆｒｅｍｏｎｔ，ＣＡが挙げられる。ヒト抗体は、例えば、ヒト免疫グロブリン遺伝子の組み合わせライブラリーからインビトロで生産することができる。
【００４０】
用語「細胞外」は、脂質二重層を含む細胞の外側に広がる領域を意味する。
【００４１】
用語「抗原」は、抗体に特異的に結合することができる任意の分子を意味する。抗体生産を誘導することができる抗原は、「免疫原」と呼ばれる。Ｊａｎｅｗａｙ，ｅｔ ａｌ．，Ｉｍｍｕｎｏｂｉｏｌｏｇｙ，第５版，２００１、Ｇａｒｌａｎｄ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇを参照のこと。本発明の目的については、抗原は、抗原性ポリペプチドをコードするポリペプチドまたは核酸（例えば、ｃＤＮＡ）であり得る。
【００４２】
用語「エピトープ」または「抗原決定基」は、それに対してＢ細胞および／またはＴ細胞が応答する抗原上の部位を意味する。Ｂ細胞エピトープは、連続するアミノ酸によって形成される場合も、また、タンパク質の三次折り畳みによって近接して並べられる不連続なアミノ酸の両方によって形成される場合もある。連続するアミノ酸によって形成されるエピトープは、通常、変性溶媒に対する暴露の際にも維持されるが、三次折り畳みによって形成される（すなわち、立体構造によって決定される）エピトープは、通常、変性溶媒で処理されると消滅する。エピトープには、通常、少なくとも３個、より通常は、少なくとも５個または８〜１０個のアミノ酸が特有の空間的立体配置で含まれる。エピトープの空間的立体配置を決定する方法としては、例えば、ｘ線結晶解析と二次元核磁気共鳴が挙げられる。例えば、Ｅｐｉｔｏｐｅ Ｍａｐｐｉｎｇ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，第６６巻，Ｇｌｅｎｎ Ｅ．Ｍｏｒｒｉｓ，編，（１９９６）を参照のこと。同じエピトープを認識する抗体は、標的抗原に対する別の抗体の結合をブロックする１つの抗体の能力を示す簡単な免疫アッセイ（例えば、競合ＥＬＩＳＡまたは固相放射性免疫分析（ＳＰＲＩＡ））において同定することができる。Ｔ細胞は、ＣＤ８細胞については約９個のアミノ酸の連続するエピトープを、また、ＣＤ４細胞については約１３〜１５個のアミノ酸の連続するエピトープを認識する。エピトープを認識する細胞は、エピトープに反応して感作させられたＴ細胞による３Ｈ−チミジンの取り込みによって決定される、抗原依存性の増殖を測定するインビトロアッセイによって（Ｂｕｒｋｅ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｎｆ．Ｄｉｓ．，１７０，１１１０−１９（１９９４））、抗原依存性の死滅によって（細胞傷害性Ｔリンパ球アッセイ、Ｔｉｇｇｅｓ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．（１９９６）１５６：３９０１−３９１０）、またはサイトカインの分泌によって同定することができる。
【００４３】
（詳細な説明）
序論
本発明者らは、ＭＵＣ１ α−サブユニットとβ−サブユニットからなる切断された接点がそれによって形成される機構を研究した。これらの研究の過程で、本発明者らは、ＭＵＣ１／ＴＭ、ＭＵＣ１／Ｙ、およびＭＵＣ１／Ｘタンパク質の「切断可能性」を分析した（図１、および全ての目的についてその全体が引用により本明細書中に組み入れられるＬｅｖｉｔｉｎ，ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．（２００５）２８０：３３３７４）。ＭＵＣ１／ＹおよびＭＵＣ１／Ｘイソ型は、タンデムリピートアレイの上流と下流に存在しているドナー部位とアクセプター部位を利用する２つの異なる部位でスプライシングされたｍＲＮＡから生じ、結果として、いずれも、タンデムリピートアレイと隣接配列がスプライシングされた両方のイソ型である（図１およびＬｅｖｉｔｉｎ，ｅｔ ａｌ．）。したがって、ＭＵＣ１／ＸとＭＵＣ１／Ｙの両方の細胞外ドメインは、大きなタンデムリピートアレイを含むＭＵＣ１／ＴＭタンパク質よりも相当に単純な構造である。実際、ＭＵＣ１／Ｘタンパク質には、その細胞外ドメインの中に、ＭＵＣ１の３０個のＮ末端アミノ酸に融合させられたわずかに１２０個のアミノ酸のＳＥＡモジュールしか含まれていない。ＭＵＣ１／Ｙは、ＳＥＡモジュールのＮ末端にある１８個のアミノ酸の欠失を除くと、ＭＵＣ１／Ｘと同じである。明らかに、ＭＵＣ１／Ｘイソ型は、全長のＭＵＣ１／ＴＭタンパク質と同じ部位で切断され、それによって、α−サブユニットとβ−サブユニットの同じ共有結合ではない相互作用を生じる。対照的に、ＭＵＣ１／Ｙイソ型の中に存在しているＳＥＡモジュールのＮ末端短縮は、切断されないタンパク質を生じる。
【００４４】
ガン細胞を直接標的化する抗体を作製するために、本発明者らは、ＭＵＣ１ α／β接点に特異的な抗体（「抗ＭＵＣ１ α／β抗体（Ａｂｓ）」）を膜結合ＭＵＣ１だけを標的化すると推測した。タンデムリピート部分アレイに対する抗体の作製を回避するために、本発明者らは、免疫原として、かつスクリーニング試薬として、切断されたＭＵＣ１／Ｘタンパク質を使用した。本発明者らは、本明細書において、マウスを最初にＭＵＣ１／ＴＭ（例えば、ＤＮＡ）で感作させて抗ＭＵＣ１／ＴＭ応答を誘発させる新規の手順を報告する。得られる免疫応答には、ＭＵＣ１／Ｘイソ型と反応する抗体が含まれる。抗ＭＵＣ１／Ｘ力価をさらに上昇させるために、マウスをＭＵＣ１／Ｘ（例えば、可溶性タンパク質）でブーストした。これによっては、桁外れに高い抗ＭＵＣ１／Ｘ力価が生じた。このプロトコールを使用することにより、本発明者らは、細胞表面上の切断されたＭＵＣ１ α／β接点を認識するだけではなく、全長のＭＵＣ１／ＴＭを発現する悪性細胞にも結合するモノクローナル抗体を作製することに成功した。
【００４５】
したがって、本発明により、「抗ＭＵＣ１ α／β Ａｂｓ」と本明細書中で呼ばれる、細胞上のインタクトなＭＵＣ１タンパク質のＭＵＣ１ α／β接点に結合する抗体が提供される。抗体は、インタクトなＭＵＣ１タンパク質のα−サブユニットとβ−サブユニットの両方から構成される、立体構造によって決定されるエピトープに同時に結合する。本発明は、ＭＵＣ１イソ型であるＭＵＣ１／Ｘ（これは、免疫原性であるタンデムリピート領域を有していない）が免疫原性であり、全長のＭＵＣ１イソ型であるＭＵＣ１／ＴＭと同様に切断され得るという驚くべき発見に一部基づく（Ｌｅｖｉｔｉｎ，ｅｔ ａｌ．，（前出）を参照のこと）。
【００４６】
抗体
抗原と免疫化
本発明の抗ＭＵＣ１ α／β抗体は、インタクトなＭＵＣ１タンパク質のα／β接点に対して指向させられる。これらは、最初に、免疫原性であるタンデムリピート配列（「ＶＮＴＲ」）を含むＭＵＣ１ α／β−サブユニット配列（例えば、核酸または可溶性タンパク質）（図１、およびＧｅｎｄｌｅｒ，ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．（１９９０）２６５：１５２８６；Ｌｉｇｔｅｎｂｅｒｇ，ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．（１９９０）２６５：５５７３；およびＷｒｅｓｃｈｎｅｒ，ｅｔ ａｌ．，Ｅｕｒ Ｊ Ｂｉｏｃｈｅｍ（１９９０）１８９：４６３を参照のこと）、例えば、ＭＵＣ１／ＴＭで１回以上、抗体を生産することができる被験体を免疫化することによって生産される。状況に応じて、被験体を、免疫原性であるタンデムリピート配列が欠失しているが、α−サブユニットとβ−サブユニットへの切断のための切断配列セグメントは生きたままである、短縮型ＭＵＣ１ α／β−サブユニット配列（例えば、核酸または可溶性タンパク質）、例えば、イソ型ＭＵＣ１／Ｘに対する、その後の、１回以上の免疫化によってブーストすることができる。図１、および全ての目的についてその全体が引用により本明細書中に組み入れられるＬｅｖｉｔｉｎ，ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．（２００５）２８０：３３３７４を参照のこと。
【００４７】
抗原は、通常、可溶性ＭＵＣ１ポリペプチド（すなわち、膜貫通配列が欠失している）、またはＭＵＣ１ポリペプチド配列をコードする核酸（膜貫通配列を含むまたは含まない）として調製される。抗原、ＤＮＡ、またはタンパク質は、ＭＵＣ１を発現しているかまたは過剰発現している細胞から、あるいは、ＭＵＣ１抗原を組み換えによって発現するように修飾された細胞（例えば、当該分野で周知の細菌、酵母、または哺乳動物細胞発現系）から単離または精製することができる。組み換えによって発現させられたＭＵＣ１抗原には、通常、状況に応じて除去することが可能な精製および／または検出タグが含まれ得、これには、ＦＬＡＧ（ＤＹＫＤＤＤＤＫ）、連続するヒスチジン、免疫グロブリン定常領域（Ｆｃ）などが含まれるがこれらに限定はされない。Ｌｅｖｉｔｉｎ，ｅｔ ａｌ．（前出）を参照のこと。
【００４８】
１つの実施形態においては、抗ＭＵＣ１ α／β抗体は、ＭＵＣ１／ＴＭ ｃＤＮＡでの１回以上の一次免疫、およびＭＵＣ１／Ｘ ｃＤＮＡでの１回以上の二次免疫またはブースター免疫によって生産させることができる。１つの実施形態においては、抗ＭＵＣ１ α／β抗体は、ＭＵＣ１／ＴＭ ｃＤＮＡでの１回以上の一次免疫、および可溶性ＭＵＣ１／Ｘタンパク質での１回以上の二次免疫またはブースター免疫によって生産させることができる。
【００４９】
繰り返しの免疫化が、通常は、適切に、少なくとも２週間、３週間、４週間、５週間、６週間、７週間、８週間、または３ヶ月間、４ヶ月間、５ヶ月間、６ヶ月間の間隔で被験体に対して行われる。繰り返しの免疫化は、一定の間隔で投与することができるが、必ずしもそうである必要はない。繰り返しの免疫化を受ける被験体には、必要に応じて、一次抗原（例えば、ＭＵＣ１／ＴＭ）および／または二次抗原（例えば、ＭＵＣ１／Ｘ）を、１回、２回、３回、４回、５回、またはそれ以上投与することができる。
【００５０】
抗ＭＵＣ１ α／β抗体は、ＭＵＣ１／Ｘイソ型（好ましくは、切断されたＭＵＣ１／Ｘイソ型）のＭＵＣ１ α−サブユニットおよびβ−サブユニットに同時に結合するものを選択することによって同定される。好ましい抗体は、切断することができないＭＵＣ１／Ｙイソ型に、またはα−サブユニットもしくはβ−サブユニットのいずれかだけに結合することはない。
【００５１】
抗体の生産
抗ＭＵＣ１ α／β抗体は、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、Ｆａｂ断片（定常Ｆｃ領域が欠失している）、または組み換え体単鎖Ｆｖ抗体であり得る。ポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体を生産するための方法は、当業者に公知である。例えば、Ｃｏｌｉｇａｎ，ｅｔ ａｌ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，１９９１−２００６，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ；およびＨａｒｌｏｗ ａｎｄ Ｌａｎｅ（１９８９）Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ，Ｎ．Ｙ．；Ｈａｒｌｏｗ ａｎｄ Ｌａｎｅ（１９９８）Ｕｓｉｎｇ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ，Ｎ．Ｙ．；Ｓｔｉｔｅｓ ｅｔ ａｌ．，（編）Ｂａｓｉｃ ａｎｄ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（第４版）Ｌａｎｇｅ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ｌｏｓ Ａｌｔｏｓ，Ｃａｌｉｆ．，およびその中で引用されている参考文献；Ｇｏｄｉｎｇ（１９８６）Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ（第２版）Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．；ならびに、Ｋｏｈｌｅｒ ａｎｄ Ｍｉｌｓｔｅｉｎ（１９７５）Ｎａｔｕｒｅ ２５６：４９５−４９７を参照のこと；Ｈｕｓｅ ｅｔ ａｌ．，（１９８９）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４６：１２７５−１２８１；およびＷａｒｄ，ｅｔ ａｌ．，（１９８９）Ｎａｔｕｒｅ ３４１：５４４−５４６．Ｂｉｒｃｈ ａｎｄ Ｌｅｎｎｏｘ，Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ｗｉｌｅｙ−Ｌｉｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．（１９９５）を参照のこと。抗ＭＵＣ１ α／β抗体と、抗ＭＵＣ１ α／β抗体を生産するＢ細胞は、抗体を生産することができる任意の便利な動物（例えば、哺乳動物または鳥類）において誘発することができる。例えば、抗ＭＵＣ１ α／β抗体は、通常、ヒツジまたはヤギ（ヒツジ）、あるいは齧歯類（ウサギ、ラット、ハムスター、マウス）、あるいはニワトリ（野鶏属）において生産させることができる。
【００５２】
抗体の調製のための他の適切な技術としては、ファージベクターおよび他のベクター（ウイルスベクター、細菌ベクター、および酵母ベクターを含む）の中にヒト免疫グロブリン遺伝子が含まれている、組み換え体免疫グロブリン遺伝子のライブラリーの選択が挙げられる。ＭＵＣ１ α／β接点に対する高親和性抗体は、例えば、ベクターの表面上に組み換え体単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）断片もしくはＶＨ−ＶＬＦａｂ断片を発現させるためのベクターディスプレイ（例えば、ファージ）方法を使用することによって迅速に単離することができる。簡単に説明すると、ベクターの表面タンパク質をコードする遺伝子は、その遺伝子を有しているベクターの表面上に融合タンパク質として発現される抗体遺伝子の挿入が可能となるように変更される。所望される抗体を発現するベクターは、ＭＵＣ１ α／βサブユニットの接点に対するその親和性／親和力によって選択的に富化させ、そして単離することができる。抗体をコードするＤＮＡが同じベクターにパッケージされ、これによって、抗体をコードする遺伝子を単離することが可能となる。様々なこのような方法が文献において十分に議論されており、当業者に周知である。例えば、Ｗｉｎｔｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１２：４３３−４５５（１９９４）；Ｍａｒｋｓ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２２２：５８１−５９７（１９９１）；Ｖａｕｇｈａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １４：３０９−３１４（１９９６）、Ｈａｌｌｂｏｒｎ ａｎｄ Ｃａｒｌｓｓｏｎ，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，（２００２）Ｓｕｐｐｌ：３０−７、米国特許第４，６４２，３３４号；同第４，８１６，３９７号；同第４，８１６，５６７号；同第４，７０４，６９２号；ＷＯ８６／０１５３３；ＷＯ８８／０９３４４；ＷＯ８９／００９９９；ＷＯ９０／０２８０９；ＷＯ９０／０４０３６；ＥＰ ０ ３２４ １６２；およびＥＰ ０ ２３９ ４００を参照のこと。
【００５３】
好ましくは、抗体は、例えば、抗体の中に存在する自系（自己）配列の数を最大にすることによって、宿主中での免疫原性を最小にするように構築されるであろう。したがって、異種可変領域を有していないキメラ抗体が好ましい。異種部分が排除されている抗体の使用が特に好ましく、また、相補性決定領域に本質的に限定されること（すなわち、「ヒト化抗体」）が特に好ましい。
【００５４】
抗体結合アッセイ
インタクトなＭＵＣ１タンパク質に対する抗体の結合は、当該分野で周知の技術、例えば、ＥＬＩＳＡアッセイ、フローサイトメトリーアッセイ、または免疫組織化学アッセイを使用して決定することができる。結合アッセイの実施において、試験アッセイは、陽性対照および／または陰性対照と比較することができる。
【００５５】
ＥＬＩＳＡ
ＥＬＩＳＡアッセイに関して、ＥＬＩＳＡプレートは、免疫原性であるタンデムリピート領域を含まない可溶性のＭＵＣ１ α／βサブユニットタンパク質抗原（例えば、膜貫通領域を含まないイソ型ＭＵＣ１／ＸまたはＭＵＣ１／Ｙ）でコーティングすることができる。好ましくは、短縮型のＭＵＣ１ α／βサブユニットタンパク質抗原は、短縮型のα−サブユニットとβ−サブユニットの細胞外領域とに切り離され得る（例えば、イソ型ＭＵＣ１／Ｘ）。コーティングタンパク質抗原は、コーティングの前にα−サブユニットとβ−サブユニットに切り離され得るが、必ずしもコーティングの前に切り離される必要はない。タンパク質抗原は、ＥＬＩＳＡプレート上に直接コーティングすることができ、また、プレート上に直接コーティングされた免疫グロブリンの層に結合させることもできる。例えば、免疫グロブリン定常領域（Ｆｃ）を含む可溶性のイソ型ＭＵＣ１／Ｘおよび／またはＭＵＣ１／Ｙ融合体は、ＥＬＩＳＡプレート上に直接コーティングされた抗Ｆｃ抗体に結合させることができる。結合したタンパク質抗原を、その後、試験抗体に暴露することができる。
【００５６】
目的の抗体は、イソ型ＭＵＣ１／Ｘおよび／またはＭＵＣ１／Ｙに特異的に結合するが、α−サブユニットの免疫原性であるタンデムリピート領域、α−サブユニットだけ、またはβ−サブユニットだけには結合しない。好ましくは、抗体は、イソ型ＭＵＣ１／Ｘに特異的に結合するがＭＵＣ１／Ｙには結合しない。抗体は、切断されたイソ型ＭＵＣ１／Ｘと切断されたイソ型ＭＵＣ１／ＴＭに特異的に結合することが好ましい。
【００５７】
ＥＬＩＳＡアッセイ技術は当該分野で周知である。ＥＬＩＳＡアッセイの実施を教示しているテキストとしては、例えば、Ｔｈｅ Ｅｌｉｓａ Ｇｕｉｄｅｂｏｏｋ，Ｊ．Ｒ．Ｃｒｏｗｔｈｅｒ（編）、Ｈｕｍａｎａ Ｐｒ（２０００年８月）；Ｄｅｌｖｅｓ，Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ：Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ（１９９５）；Ｃｒｏｗｔｈｅｒ，Ｅｌｉｓａ：Ｔｈｅｏｒｙ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ，Ｈｕｍａｎ Ｐｒ（１９９５）；Ｈａｒｌｏｗ ａｎｄ Ｌａｎｅ，Ｕｓｉｎｇ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ（１９９８）；およびＣｏｌｉｇａｎ，ｅｔ ａｌ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｏｌｏｇｙ，１９９１−２００６，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ．が挙げられる。
【００５８】
ＥＬＩＳＡ技術は、試験抗体が直接標識されるかまたは二次抗体が標識されるかにはかかわらず、ハイスループット方法に極めて適している。標識された抗体は、酵素部分、化学発光部分、蛍光部分、または当該分野で公知の任意の他の便利な検出標識で標識することができる。ハイスループットＥＬＩＳＡを行うための製品は、例えば、Ｐａｎｏｍｉｃｓ，Ｒｅｄｗｏｏｄ Ｃｉｔｙ，ＣＡ；Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ；およびＢｉｏＭｅｄＴｅｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｔａｍｐａ，ＦＬから市販されている。自動ハイスループットシステムもまた、例えば、Ｃａｌｉｐｅｒ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｈｏｐｋｉｎｔｏｎ，ＭＡ；およびＢＭＧ Ｌａｂｔｅｃｈ，Ｄｕｒｈａｍ，ＮＣから市販されている。
【００５９】
フローサイトメトリー
インタクトなＭＵＣ１タンパク質に結合する抗体はまた、フローサイトメトリーを使用して検出することもできる。ＭＵＣ１イソ型（例えば、ＭＵＣ１／ＴＭ、ＭＵＣ１／Ｘ、ＭＵＣ１／Ｙ）（自然界に存在しているもの、または組み換えによって修飾されたもののいずれか）をそれらの細胞外表面上に発現しているインタクトな細胞が、抗ＭＵＣ１ α／β抗体に曝され得る。細胞は、生存しているものであっても、また固定されたものであってもよい。結合は、試験抗体または二次抗体を、例えば、蛍光色素分子で直接標識することによって決定することができる。フローサイトメトリーを使用する利点は、細胞の表面上で発現させられたＭＵＣ１抗原がインビボで遭遇するＭＵＣ１細胞表面抗原の典型である三次元立体構造で存在していることである。目的の抗体は、イソ型ＭＵＣ１／ＴＭおよびＭＵＣ１／Ｘのα−サブユニットおよびβ−サブユニットに特異的に結合し、そしてイソ型ＭＵＣ１／Ｙには結合しないことが好ましい。フローサイトメトリー分析はまた、ハイスループット方法に十分に適している。ハイスループットフローサイトメトリー分析のための製品およびシステムは、例えば、ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｓａｎ Ｊｏｓｅ ＣＡ ａｎｄ Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ；Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ，Ｆｕｌｌｅｒｔｏｎ，ＣＡ；Ｐａｒｔｅｃ，Ｍuｎｓｔｅｒ、Ｇeｒｍａｎｙ；およびＡｍｎｉｓ Ｃｏｒｐ．，Ｓｅａｔｔｌｅ，ＷＡから市販されている。
【００６０】
フローサイトメトリー技術は当該分野で周知である。フローサイトメトリーの実施を教示しているテキストとしては、例えば、Ｏｒｍｅｒｏｄ，Ｆｌｏｗ Ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ，Ｔａｙｌｏｒ ＆ Ｆｒａｎｃｉｓ（１９９９）；Ｆｌｏｗ Ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，Ｈａｗｌｅｙ ａｎｄ Ｈａｗｌｅｙ（編）Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ（２００４）；およびＦｌｏｗ Ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ ｉｎ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｄｉａｇｎｏｓｉｓ，Ｋｅｒｅｎ，ｅｔ ａｌ．，（編），ＡＳＣＰ Ｐｒｅｓｓ（２００１）が挙げられる。
【００６１】
免疫組織化学
インタクトなＭＵＣ１タンパク質に結合する抗体はまた、当該分野で周知の免疫組織化学技術を使用して検出することもできる。例えば、Ｈａｙａｔ，Ｈａｎｄｂｏｏｋ Ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｈｉｓｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ Ａｎｄ Ｉｎ Ｓｉｔｕ Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ Ｏｆ Ｈｕｍａｎ Ｃａｒｃｉｎｏｍａｓ：Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ，Ｃｏｌｏｒｅｃｔａｌ Ｃａｒｃｉｎｏｍａ，Ａｎｄ Ｐｒｏｓｔａｔｅ Ｃａｒｃｉｎｏｍａ，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒ（２００４）；Ｈａｙａｔ，Ｉｍｍｕｎｏｈｉｓｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ ｉｎ Ｓｉｔｕ Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ Ｈｕｍａｎ Ｃａｒｃｉｎｏｍａｓ：Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｌｕｎｇ ａｎｄ Ｂｒｅｓｔ Ｃａｒｃｉｎｏｍａｓ，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒ（２００４）；およびＤａｂｂｓ，Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ Ｉｍｍｕｎｏｈｉｓｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，Ｅｌｓｅｖｉｅｒ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｃｉｅｎｃｅ（２００１）を参照のこと。ＭＵＣ１抗原を発現するかまたは過剰発現することが公知である組織（例えば、乳房、卵巣、前立腺、膵臓、結腸組織）に由来する上皮切片を、抗ＭＵＣ１ α／β抗体に暴露することができる。抗体は、例えば、酵素部分、化学発光部分、蛍光部分で直接標識することができる。結合した抗体は、顕微鏡技術を使用して検出することができる。
【００６２】
抗ＭＵＣ１ α／β抗体を同定するための試験
本発明の抗ＭＵＣ１ α／β抗体は、ＭＵＣ１ αサブユニットとβサブユニットの接点に結合するが、αサブユニットのみ、またはβサブユニットのみのいずれにも結合しない。これは、例えば、上記のような競合ＥＬＩＳＡアッセイを行うことによって測定することができる。ＥＬＩＳＡプレートのウェルは、αサブユニットとβサブユニットの両方を有している可溶性のＭＵＣ１タンパク質抗原（例えば、ＭＵＣ１／ＴＭ、ＭＵＣ１／Ｘ、またはＭＵＣ１／Ｙ）で、そしてＭＵＣ１ α−サブユニットだけ、および可溶性（すなわち、膜貫通配列を含まない）ＭＵＣ１ βサブユニットだけでコーティングすることができ、その後、抗ＭＵＣ１ α／β抗体に曝すことができる。目的の抗体は、α−サブユニットとβ−サブユニットの両方を有しているＭＵＣ１タンパク質抗原に特異的に結合するが、ＭＵＣ１ α−サブユニットだけ、またはＭＵＣ１ β−サブユニットだけには実質的には結合しない。あるいは、これはウェスタンブロットを使用して測定することもでき、ウェスタンブロットの方法論は当該分野では周知である。Ｃｏｌｉｇａｎ，ｅｔ ａｌ．（前出）；およびＨａｒｌｏｗ ａｎｄ Ｌａｎｅ，１９８９および１９９８（前出）を参照のこと。
【００６３】
好ましくは、本発明の抗ＭＵＣ１ α／β抗体はイソ型ＭＵＣ１／ＴＭとＭＵＣ１／Ｘに結合するが、イソ型ＭＵＣ１／Ｙには実質的には結合しない。いかなる試論にも束縛はされないが、切断されたＭＵＣ１／Ｘは、細胞表面上のＭＵＣ１タンパク質のＭＵＣ１ α−サブユニットとβ−サブユニットの三次元接点を反映していると考えられる。これは、例えば、上記のような競合ＥＬＩＳＡアッセイまたは競合フローサイトメトリーアッセイを行うことによって測定することができる。例示的なＥＬＩＳＡアッセイにおいては、抗Ｆｃ抗体でコーティングされたＥＬＩＳＡプレートがＭＵＣ１／ＴＭ−Ｆｃ（すなわち、全長のα−サブユニットを有している可溶性ＭＵＣ１）、またはＭＵＣ１／Ｘ−Ｆｃ、およびＭＵＣ１／Ｙ−Ｆｃ融合タンパク質に結合させられ、その後、抗ＭＵＣ１ α／β抗体に曝される。目的の抗体は、ＭＵＣ１／Ｘ−Ｆｃ融合タンパク質が結合させられているか、またはＭＵＣ１／ＴＭ−Ｆｃ融合タンパク質が結合させられているウェルに特異的に結合するが、ＭＵＣ１／Ｙ−Ｆｃ融合タンパク質が結合させられているウェルには実質的には結合しない。以下の実施例１を参照のこと。あるいは、これは、競合フローサイトメトリーアッセイにおいては、１つのＭＵＣ１イソ型を、自然界においてまたは組み換えによって細胞外表面上に発現する細胞を使用して、測定することができる。目的の抗体は、ＭＵＣ１／ＴＭまたはＭＵＣ１／Ｘを発現する細胞に特異的に結合するが、ＭＵＣ１／Ｙを発現する細胞には実質的には結合しない。
【００６４】
抗ＭＵＣ１ α／β抗体を使用する方法
診断および予後診断の方法
抗ＭＵＣ１ α／β抗体は、ＭＵＣ１を過剰発現する組織のガンを診断する方法、またはその予後診断を提供する方法における使用が見出される。通常、組織は上皮組織であるが、これは血液に由来する場合もあり、例えば、形質細胞である（すなわち、Ｂリンパ球系統の血漿細胞、例えば、Ｈａｒｒｉｓｏｎ’ｓ Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ｏｆ Ｉｎｔｅｒｎａｌ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，第１６版，２００５，ＭｃＧｒａｗ−Ｈｉｌｌの第９８章を参照のこと）。診断および予後診断の方法については、乳房、卵巣、前立腺、膵臓、結腸、形質細胞、および他の組織に由来するＭＵＣ１を過剰発現しているガンを同定することにおける特定の使用が見出されている。ＭＵＣ１を過剰発現する組織または細胞は、正常であると確認された（すなわち、形質転換されていない、ガン性ではない）組織に由来する同じタイプの組織または細胞と比較して、少なくとも約２０％、５０％、８０％、１倍、２倍、３倍、４倍、またはそれ以上の検出可能なＭＵＣ１を有する。診断および予後診断の方法は、通常は、上記のフローサイトメトリーおよび／または免疫組織化学的方法を使用して行うことができる。
【００６５】
ガンの免疫療法の方法
ＭＵＣ１タンパク質は多くのガン（上皮および形質細胞骨髄腫（乳ガン、卵巣ガン、前立腺ガン、膵臓ガン、結腸ガン、および多発性骨髄腫の形質細胞を含む）を含むがこれらに限定はされない）において発現されているかまたは過剰発現されているので、これはガンの免疫療法の標的である。
【００６６】
したがって、本発明により、ガン（乳ガン、卵巣ガン、前立腺ガン、膵臓ガン、結腸ガン、および形質細胞骨髄腫を含む）を処置するために全身的に使用することができる抗ＭＵＣ１ α／β抗体が提供される。抗ＭＵＣ１ α／β抗体はまた、種々の他の良性腫瘍および悪性腫瘍の処置にも有用であり得る。したがって、本発明により、ＭＵＣ１抗原を発現しているかまたは過剰発現しているガンに罹患しやすいか、またはそのようなガンを有している患者を処置する方法が提供される。この方法には、治療有効量のＭＵＣ１ α／βサブユニットの接点に特異的に結合する抗体を上記患者に投与する工程が含まれる。別のアプローチにおいては、本発明により、ＭＵＣ１抗原を発現しているかまたは過剰発現している腫瘍細胞の増殖を阻害する方法が提供される。この方法には、ＭＵＣ１ α／βサブユニットの接点に特異的に結合する抗体を、腫瘍細胞の増殖を阻害するために有効な量で患者に投与する工程が含まれる。抗ＭＵＣ１ α／β抗体は、ＭＵＣ１抗原を発現しているかまたは過剰発現している細胞の増殖を選択的に阻害するか、またはそのような細胞を選択的に死滅させるための方法においても使用することができる。この方法には、抗ＭＵＣ１ α／β抗体免疫結合体または免疫毒素を、細胞の増殖を阻害するかまたは細胞を死滅させるために十分な量で、細胞と反応させる工程が含まれる。
【００６７】
例えば、結合していない抗ＭＵＣ１ α／β抗体（モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体、完全なヒト抗体、およびそれらの断片（例えば、組み換え体タンパク質）を含む）を、抗体がガン細胞上のインタクトなＭＵＣ１タンパク質に結合し、そしてそのような細胞および腫瘍の増殖の阻害（その崩壊を含む）を、複数の機構（これには、補体媒介性細胞溶解、抗体依存性細胞傷害性、ＭＵＣ１の生理学的機能の変更、および／またはリガンドの結合もしくはシグナル伝達経路の阻害が含まれ得る）によって媒介するように、患者に導入することができる。結合していない抗ＭＵＣ１ α／β抗体、その断片、および本発明の組み換え体タンパク質に加えて、放射性同位元素、リシン、および／または緑膿菌（ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）毒素を含む毒性の物質に結合させられた抗ＭＵＣ１ α／β抗体もまた、ＭＵＣ１を有している腫瘍細胞に直接毒性の物質を送達し、それによって腫瘍を崩壊させるために治療的に使用することもできる。
【００６８】
抗ＭＵＣ１ α／β抗体を使用するガンの免疫療法は、様々なアプローチによって生じる技術にしたがうことができる。これらは、以下を含むがこれらに限定はされないいくつかのタイプのガンに関してうまく使用されている：結腸ガン（Ａｒｌｅｎ ｅｔ ａｌ．，１９９８，Ｃｒｉｔ Ｒｅｖ Ｉｍｍｕｎｏｌ １８：１３３−１３８）、多発性骨髄腫（Ｏｚａｋｉ ｅｔ ａｌ．，１９９７，Ｂｌｏｏｄ ９０：３１７９−３１８６；Ｔｓｕｎｅｎａｒｉ ｅｔ ａｌ．，１９９７，Ｂｌｏｏｄ ９０：２４３７−２４４４）、胃ガン（Ｋａｓｐｒｚｙｋ ｅｔ ａｌ．，１９９２，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ ５２：２７７１−２７７６）、Ｂ細胞リンパ腫（Ｆｕｎａｋｉｓｈｉ ｅｔ ａｌ．，１９９６，Ｊ Ｉｍｍｕｎｔｈｅｒ Ｅｍｐｈａｓｉｓ Ｔｕｍｏｒ Ｉｍｍｕｎｏｌ １９：９３−１０１）、白血病（Ｚｈｏｎｇ ｅｔ ａｌ．，１９９６，Ｌｅｕｋ Ｒｅｓ ２０：５８１−５８９）、結腸直腸ガン（Ｍｏｕｎ ｅｔ ａｌ．，１９９４，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ ５４：６１６０−６１６６）；Ｖｅｌｄｅｒｓ ｅｔ ａｌ．，１９９５，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ ５５：４３９８−４４０３）、および乳ガン（Ｓｈｅｐａｒｄ ｅｔ ａｌ．，１９９１，Ｊ．Ｃｌｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌ １１：１１７−１２７）。ガンについての免疫毒素療法のさらなる例は、例えば、Ｗｏｎｇ，ｅｔ ａｌ．，Ｓｅｍｉｎ Ｏｎｃｏｌ（２００５）３２：５９１；Ｃｈｅｎ，ｅｔ ａｌ．，Ｅｘｐｅｒｔ Ｏｐｉｎ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖ（２００５）２：８７３；およびＬｉ，ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ Ｍｏｌ Ｉｍｍｕｎｏｌ（２００５）２：１０６にまとめられている。
【００６９】
例えば、抗ＭＵＣ１ α／β抗体を臨床的に投与するための１つの方法は、抗腫瘍活性（例えば、ＡＤＣＣ活性およびＣＤＣ活性）を示し、そしてまたはインビトロおよび／もしくは動物モデルにおいてインターナライズ能力を示す、モノクローナル抗ＭＵＣ１ α／β抗体を使用して、それらを修飾されていない形態で投与することである（例えば、Ｈｅｌｌｓｔｒｏｍ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８２：１４９９−１５０２（１９８５）を参照のこと）。ＡＤＣＣ活性およびＣＤＣ活性を検出するためには、モノクローナル抗体を、４時間のインキュベーション時間の間中、培養された５１Ｃｒ標識腫瘍標的細胞の溶解について試験することができる。標的細胞は、５１Ｃｒで標識され、その後、エフェクター細胞（リンパ球−分離媒体の使用によって精製されたヒトリンパ球の形態）と抗体（これは、例えば、０．１μｇ／ｍｌから１０μｇ／ｍｌの間で変化する濃度で添加される）の組み合わせに対して４時間暴露させることができる。標的細胞からの５１Ｃｒの放出が、腫瘍細胞の溶解（細胞傷害性）の証拠として測定される。対照には、標的細胞の単独での、あるいは、リンパ球またはモノクローナル抗体のいずれかとの別々でのインキュベーションが含まれる。放出させられ得る５１Ｃｒの全量が測定され、そしてＡＤＣＣが、単独でインキュベートされた標的細胞と比較された、モノクローナル抗体とエフェクター細胞を用いて観察された標的細胞の死滅の割合として計算される。ＣＤＣについての手順は、補体の供給源としてヒト血清（１：３から１：６に稀釈された）がエフェクター細胞の代わりに添加されることを除いて、ＡＤＣＣを検出するために使用される手順と同じである。
【００７０】
本発明の方法の実施においては、細胞表面上にＭＵＣ１を発現しているかまたは過剰発現しているガン細胞の増殖を阻害することができる抗ＭＵＣ１ α／β抗体が、その腫瘍がＭＵＣ１を発現しているかまたは過剰発現しているガン患者に対して、治療有効量で投与される。本発明の抗体療法の方法は、化学療法、放射線治療、および／または他の治療レジュメと併用される場合もある。
【００７１】
ガンの処置に有用な抗ＭＵＣ１ α／β抗体としては、腫瘍に対する強力な免疫応答を開始することができるもの、および細胞傷害性を指示することができるものが挙げられる。これに関して、抗ＭＵＣ１ α／β抗体は、補体媒介性の細胞傷害性機構または抗体依存性の細胞傷害性機構（ＡＤＣＣ）（いずれにも、エフェクター細胞Ｆｃ受容体部位または補体タンパク質との相互作用のために免疫グロブリン分子のインタクトなＦｃ部分が必要である）のいずれかによって、腫瘍細胞の溶解を誘発することができる。加えて、腫瘍の増殖に対して直接的な生物学的作用を発揮する抗ＭＵＣ１ α／β抗体は、本発明の実施において有用である。このような抗体は、その作用を発揮するためには、完全な免疫グロブリンを必要としない場合がある。このような直接的な細胞傷害性抗体がそれによって作用するであろうと考えられる機構としては、細胞増殖の阻害、細胞の分化の調節、腫瘍血管形成因子のプロフィールの調節、およびアポトーシスの誘導が挙げられる。特定の抗ＭＵＣ１ α／β抗体がそれによって抗腫瘍作用を発揮する機構は、ＡＤＣＣ、ＡＤＭＭＣ、補体媒介性細胞溶解を決定するために設計された、当該分野で公知のあらゆるインビトロアッセイを使用して評価することができる。例えば、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（前出）を参照のこと。
【００７２】
特定の抗ＭＵＣ１ α／β抗体、または複数の抗ＭＵＣ１ α／β抗体の組み合わせの抗腫瘍活性は、好ましくは、適切な動物モデルを使用してインビボで評価される。異種ガンモデル（この場合、ヒトのガンの移植片または継代された異種移植片組織が免疫機能が低下している動物（例えば、ヌードマウスまたはＳＣＩＤマウス）に導入される）が具体的には適切であり、知られている。例えば、ヒト前立腺ガンの異種移植片モデル（原発性腫瘍、微小転移巣の発生、および後期疾患の特徴である骨芽細胞への転移の形成を繰り返すことができる）が、Ｋｌｅｉｎ ｅｔ ａｌ．，１９９７、Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ ３：４０２−４０８、およびＰＣＴ特許出願番号ＷＯ９８／１６６２８、１９９８年４月２３日に公開されたＳａｗｙｅｒｓ ｅｔ ａｌ．，に記載されている。本明細書中の例によって、インビボでの抗ＭＵＣ１ α／β抗体調製物の抗腫瘍能力を評価するための詳細な実験プロトコールが提供される。例えば、確立された腫瘍の退行、転移の発生の妨害などを測定する、他のインビボでのアッセイが意図される。
【００７３】
マウスまたは他のヒト以外の動物と、キメラ（モノクローナル）抗体の使用によって、一部の患者においては中程度から強い免疫応答を誘導することができる場合があることに注目すべきである。最も重篤な場合には、そのような免疫応答によって、潜在的には腎不全を引き起こす可能性がある免疫複合体の大量の形成が導かれる可能性がある。したがって、本発明の治療方法の実施において使用される好ましい（モノクローナル）抗体は、完全なヒト抗体またはヒト化抗体のいずれかであり、そして高い親和性で標的であるインタクトなＭＵＣ１抗原に特異的に結合するが、患者においては低い抗原性しか示さないかもしくは抗原性を示さないものである。
【００７４】
本発明の方法は、１つの抗ＭＵＣ１ α／β抗体、ならびに、種々の個々の（モノクローナル）抗体（例えば、異なるエピトープを認識するもの）の組み合わせまたは「混合物」の投与をもくろむ。このような抗体混合物には、それらに異なるエピトープに結合する抗体が含まれること、および／または、様々なエフェクター機構を生かすか、もしくは、免疫エフェクター機能性による抗体と直接的に細胞傷害性である抗体を組み合わせるというような、特定の利点がある場合がある。組み合わせられたこのような抗体は相乗的な治療効果を示す場合がある。加えて、抗ＭＵＣ１ α／β抗体の投与は、他の治療薬（種々の化学療法薬、アンドロゲン阻害薬、免疫変調成分（例えば、ＩＬ−２、ＧＭ−ＣＳＦ）、他の治療用抗体（例えば、ＭＵＣ１上の他のエピトープに対する抗体、ＭＵＣ１以外の腫瘍関連抗原に対する抗体、他の治療上有用なエピトープに対する抗体）、ならびに感染性疾患および他の疾患に対する薬剤を含むが、これらに限定はされない）と組み合わせることができる。抗ＭＵＣ１ α／β抗体は、それらの「裸の」形態または結合させられていない形態で投与することができ、また、それらに結合させられた治療薬を有している場合もある。
【００７５】
本発明の方法の実施において使用される抗ＭＵＣ１ α／β抗体は、所望される送達方法に適している生理学的に適合性の担体を含む薬学的組成物に処方することができる。適切な担体としては、抗ＭＵＣ１ α／β抗体と組み合わせられた場合にも、抗体の抗腫瘍機能を維持でき、そして被験体の免疫系とは反応しない任意の物質が挙げられる。例としては、滅菌のリン酸緩衝化生理食塩溶液、静菌水などのような任意の多数の標準的な薬学的担体が挙げられるが、これらに限定はされない（一般的には、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙ，Ｇｅｎｎａｒｏ（編）Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ Ｗｉｌｌｉａｍｓ ＆ Ｗｉｌｋｉｎｓ（２００３）を参照のこと）。
【００７６】
抗ＭＵＣ１ α／β抗体処方物は、腫瘍部位に抗体を送達することができる任意の経路から投与することができる。有効であると考えられる投与経路としては、静脈内、腹腔内、筋肉内、腫瘍内、皮内などが挙げられるが、これらに限定はされない。好ましい投与経路は、静脈内注射による。静脈内注射に好ましい処方物には、保存された静菌水、滅菌の保存されていない水の溶液の中に抗ＭＵＣ１ α／β抗体が含まれており、そして／または、注射用の０．９％の滅菌の塩化ナトリウム（ＵＳＰ）を含むポリ塩化ビニルまたはポリエチレンバッグの中で稀釈される。抗ＭＵＣ１ α／β抗体調製物は凍結乾燥させることができ、そして滅菌粉末として、好ましくは減圧下で保存することができ、これはその後、例えば、ベンジルアルコール防腐剤を含む静菌水の中で、または注射の直前に滅菌水の中で再構成することができる。
【００７７】
処置には、一般的には、静脈内注射（ＩＶ）のような許容される投与経路による、有効用量の抗ＭＵＣ１ α／β抗体調製物の反復投与が含まれる。投与量は、当業者に一般的に十分に理解されている様々な要因（ガンのタイプおよび重篤度、悪性度、またはガンの進行度、使用される抗体（単数または複数）の結合親和性および半減期、患者の中でのＭＵＣ１の発現の程度、循環している分割されたＭＵＣ１ α−サブユニット抗原の程度、所望される定常状態の抗体濃度のレベル、処置の頻度、ならびに、本発明の処置方法と組み合わせて使用される化学療法薬の影響を含むがこれらに限定はされない）に応じて様々である。典型的な一日量は、約０．１から１００ｍｇ／ｋｇの範囲であり得る。１週間あたり１０〜５００ｍｇの抗体の範囲の用量が有効であり得、そして十分な耐量であるが、さらに多量の１週間の用量が適切であり、そして／または耐量である場合もある。適切な用量を定義することにおける重要な決定要因は、特定の状況において治療上有効であるために必要な特定の抗体の量である。反復投与が、腫瘍の阻害または退行を達成するために必要とされ得る。最初の負荷量はより多量であり得る。最初の負荷量は、注入として投与することができる。定期的な維持用量は、初回量が十分な耐量である限りにおいて、同様に投与することができる。
【００７８】
抗ＭＵＣ１ α／β抗体の直接の投与もまた可能であり、特定の状況においては利点を有する場合がある。例えば、卵巣ガンの処置については、抗ＭＵＣ１ α／β抗体は、腹腔内空間に直接注射することができる。
【００７９】
抗体に対する生物学的活性のある組成物の結合
抗体に対して生物学的活性のある成分（例えば、細胞傷害性部分）を結合させるための手順は、その成分の化学構造にしたがってさまざまである。一般的には、抗体には、それに対して薬剤を結合させるための生物学的活性のある分子上の適切な官能基との反応に利用することができる様々な官能基が含まれる。あるいは、抗体および／または生物学的活性のある成分は、別の反応性官能基に曝されるかまたは別の反応性官能基を結合させるために誘導される場合がある。誘導には、Ｐｉｅｒｃｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ Ｉ１１から入手することができるもののような、任意の多数のリンカー分子の結合が含まれ得る。「リンカー」は、本明細書中で使用される場合は、抗体と生物学的活性のある成分を共有結合によって、または共有結合ではない結合によって結合させるために使用される分子を意味する。適切なリンカーは当業者に周知であり、これには、直鎖または分岐鎖である炭素リンカー、複素環炭素リンカー、またはペプチドリンカーが含まれるが、これらに限定はされない。例えば、Ｂｉｒｃｈ ａｎｄ Ｌｅｎｎｏｘ，Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，第４章，Ｗｉｌｅｙ−Ｌｉｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．（１９９５）；米国特許第５，２１８，１１２号、同第５，０９０，９１４号；Ｈｅｒｍａｎｓｏｎ，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆ．（１９９６）を参照のこと。
【００８０】
両方の分子がポリペプチドである場合には、リンカーは、それらの側鎖を介して（例えば、システインに対するジスルフィド結合を介して）構成アミノ酸に結合させることができる。特定の生物学的活性のある成分上の基と反応する１つの官能基と抗体と反応する別の基を有している二官能性リンカーを、所望される結合体を形成させるための使用することができる。いくつかの実施形態においては、二官能性リンカーを２つの抗体（例えば、抗ＭＵＣ１ α／β抗体と別の抗体）を結合させるために使用することができる。あるいは、誘導には、成分の化学的な処理（例えば、遊離のアルデヒド基を生じさせるための過ヨウ素酸塩での糖タンパク質抗体の糖部分のグリコール切断）が含まれる場合もある。抗体上の遊離のアルデヒド基は、それに対して物質を結合させるために、物質上の遊離のアミン基またはヒドラジン基と反応させることができる（米国特許第４，６７１，９５８号を参照のこと）。抗体または抗体断片上に遊離のスルフヒドリル基を作製するための手順もまた公知である（米国特許第４，６５９，８３９号を参照のこと）。放射性核種金属錯体、毒素、および薬剤を含む様々な化合物の、抗体のようなタンパク質への結合のための多くの手順とリンカー分子は公知である。例えば、欧州特許出願番号１８８，２５６；米国特許第４，６７１，９５８号、同第４，６５９，８３９号、同第４，４１４，１４８号、同第４，６９９，７８４号；同第４，６８０，３３８号；同第４，５６９，７８９号；および同第４，５８９，０７１号；ならびに、Ｂｏｒｌｉｎｇｈａｕｓ ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．４７：４０７１−４０７５（１９８７）を参照のこと。化学的リンカーは、例えば、Ｐｉｅｒｃｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｒｏｃｋｆｏｌｄ，ＩＬから市販されている。
【００８１】
それが標的部位に到達した時点で結合している分子を放出することが所望されることがしばしばある。したがって、標的部位の近くで切断することができる連結を含む結合体を使用することができる。生物学的活性のある成分を抗体から放出するための連結の切断は、結合体が標的細胞の中、または標的部位の近くのいずれかで供される酵素活性または条件によって促進され得る。標的部位が腫瘍である場合には、腫瘍部位に存在している条件下で（例えば、腫瘍関連酵素または酸性ｐＨに曝されると）切断され得るリンカーを使用することができる。シス−アコニット酸スペーサーの使用が、エンドソームの中で生物学的活性のある成分を放出させるために有用である。同様に、ジスルフィド結合は、エンドソームの還元性の環境下で切断することができる。
【００８２】
多数の種々の切断可能なリンカーは当業者に公知である。米国特許第４，６１８，４９２号；同第４，５４２，２２５号、および同第４，６２５，０１４号を参照のこと。これらのリンカー基からの物質の放出のための機構としては、例えば、光解離性結合の照射、および酸触媒加水分解が挙げられる。米国特許第５，１４１，６４８号には、特異的な化学構造のリンカーを含む免疫結合体が開示されている。この場合、連結はインビボで切断され、それによって、結合している化合物が放出される（放射線治療薬、薬剤、毒素など）。リンカーは弱酸性のｐＨで切断されやすく、そして、標的細胞の細胞質への輸送の間に切断され、それによって、標的細胞の中で生物学的活性のある化合物を放出すると考えられている。米国特許第４，６７１，９５８号には、患者の補体システムのタンパク質分解酵素によってインビボで標的部位で切断されるリンカーを含む免疫結合体の記載が含まれている。種々の放射線診断用の化合物、放射線治療用化合物、薬剤、毒素、および他の成分を抗体に結合させることについて報告されている多数の方法を考慮して、当業者は本発明の抗体に対して所定の成分を結合させるための適切な方法を決定することができるであろう。
【００８３】
目的の抗原に対する免疫応答を刺激する方法
本発明によってはまた、任意の目的の抗原に対する免疫応答を誘発する、またはそのような抗原に対する免疫応答を改善する、またはそのような抗原に対する抗体を惹起させるための方法も提供される。この方法は、（ｉ）最初に、免疫原性であるタンデムリピート配列と目的の抗原を含むＭＵＣ１抗原で１回以上、抗体を生産することができる被験体を免疫化する工程；および（ｉｉ）次に、目的の抗原で１回以上ブーストする工程による。ＭＵＣ１抗原と目的の抗原は、別々に、ポリペプチドまたはポリペプチドをコードする核酸として投与することができる、ＭＵＣ１抗原と目的の抗原は、結合していない分子として、リンカーによって結合された分子として（上記）、または融合タンパク質として、同時に投与することができる。
【００８４】
目的の抗原は、任意の抗原性配列であり得、これには、ヒト、哺乳動物、動物、植物、細菌、ウイルス、または合成起源の抗原性配列が含まれるが、これらに限定はされない。
【００８５】
目的の抗原としては、任意の腫瘍関連抗原が挙げられ、これには、腫瘍胎児抗原、腫瘍遺伝子産物、組織系統抗原、ウイルス抗原が含まれる。例示的な腫瘍関連抗原としては、癌胎児性抗原（ＣＥＡ）、糖鎖抗原（ＣＡ−１２５）、ＭＵＣ１、前立腺特異的膜抗原（ＰＳＭＡ）、前立腺幹細胞抗原（ＰＳＣＡ）、前立腺特異抗原（ＰＳＡ）、メラニン形成細胞抗原（例えば、ＭＡＲＴ−１／Ｍｅｌａｎ Ａ、チロシナーゼ、ｇｐ１００、およびＴＲＰ−１（ｇｐ７５））、腫瘍胎児抗原（ＯＦＡ）、Ｈｅｒ２／ｎｅｕが挙げられる。
【００８６】
目的の抗原は、感染性疾患に関係している抗原であり得、例えば、寄生虫、細菌、ウイルスに由来し得る。例えば、マラリアに対する免疫応答を増大させることに有用な抗原は、例えば、Ｔｈｅ Ｉｎｔｏｌｅｒａｂｌｅ Ｂｕｒｄｅｎ ｏｆ Ｍａｌａｒｉａ：ＩＩ．Ｗｈａｔ’ｓ Ｎｅｗ，Ｗｈａｔ’ｓ Ｎｅｅｄｅｄ，Ｂｒｅｍａｎ，ｅｔ ａｌ．，（編）、Ｔｈｅ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｓｏｃｉｅｔｙ ｏｆ Ｔｒｏｐｉｃａｌ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ ａｎｄ Ｈｙｇｉｅｎｅ（２００４）に記載されている。ＨＩＶに対する抗体応答を誘発することにおいて有用な抗原は、例えば、Ｂｕｒｔｏｎ，ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．（２００５）１０２：１４９４３に記載されている。
【００８７】
以下の実施例は、請求される発明を説明するために提供され、発明を限定するためのものではない。
【実施例】
【００８８】
（実施例１）
抗ＭＵＣ１ α／β抗体の生産
以下の実施例は、最初に、ＭＵＣ１／ＴＭ ｃＤＮＡ抗原で免疫化し、その後、ＭＵＣ１／Ｘタンパク質抗原の細胞外ドメインでブーストすることによる、抗ＭＵＣ１ α／β抗体の生産を示す。抗体は、ＥＬＩＳＡアッセイにおいてＭＵＣ１／Ｘ−免疫グロブリン定常領域融合タンパク質に結合したものをスクリーニングすることによって選択した。
【００８９】
実験手順
材料および方法。試薬と化合物は、別段の記載がない限りは、Ｓｉｇｍａ（Ｓｔ Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）から入手した。ＭＵＣ１のタンデムリピート部分に対する抗体（抗ＥＭＡ、上皮膜抗原、Ｍｃ５）は、Ｃｈｅｍｉｃｏｎ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ（Ｔｅｍｅｌｕｃａ，ＣＡ）から入手した。
【００９０】
細胞の培養。細胞を、１０％の熱不活化ウシ胎児血清、２ｍＭのＬ−グルタミン、１００ＩＵ／ｍｌのペニシリン、および２５μｇ／ｍｌのストレプトマイシンを補充した培養培地中で、３７℃で５％のＣＯ２で増殖させた。ＤＡ３マウス乳腺腫瘍細胞、およびＨＫ２９３ヒト胚腎臓細胞を、ダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）の中で増殖させた。発現構築物を、リン酸カルシウム手順を使用して細胞にトランスフェクトした。
【００９１】
ＭＵＣ１／ＴＭを発現する安定なＤＡ３マウス乳腺腫瘍細胞トランスフェクタントの作製。ＤＡ３細胞を、真核生物発現プラスミドｐＣＬ−ＭＵＣ１／ＴＭ（または細胞質ＰｖｕＩＩ部位で短縮したｐＣＬ−ＭＵＣ／ＴＭ）とｐＳＶ２ｎｅｏ（ネオマイシン耐性をコードする）で同時トランスフェクトした。安定なトランスフェクタントをネオマイシンを用いて選択した。ＭＵＣ１タンパク質を発現するトランスフェクタントを、ＭＵＣ１細胞質ドメインに対して指向させられた、親和性によって精製したポリクローナル抗体を使用して、細胞溶解物の免疫ブロット分析によって同定した。
【００９２】
ＭＵＣ１／ＸおよびＭＵＣ１／Ｙ真核生物発現構築物と融合タンパク質の作製。この実験で使用したＭＵＣ１抗原ポリペプチドには、ＭＵＣ１／Ｘ−免疫グロブリン定常鎖融合タンパク質（「Ｆｌａｇ−Ｙｅｘ−ｈＦｃ」）とＭＵＣ１／Ｙ−免疫グロブリン定常鎖融合タンパク質（「Ｆｌａｇ−Ｘｅｘ−ｈＦｃ」）が含まれている（図１およびＬｅｖｉｔｉｎ，ｅｔ ａｌ．，（前出）に示され、記載されている）。標準的な分子生物学的方法を使用して、以前に記載されたように（Ｌｅｖｉｔｉｎ，ｅｔ ａｌ．，（前出））全ての構築物を作製した。
【００９３】
Ｆｌａｇ−ＭＵＣ１／Ｘｅｘ−ｈＦｃ融合タンパク質およびＦｌａｇ−ＭＵＣ１／Ｙｅｘ−ｈＦｃ融合タンパク質を発現するＨＫ２９３トランスフェクタントの作製と、ｈＦｃ−タグ化融合タンパク質の精製。ＨＫ２９３（ヒト腎臓）細胞を、ＦＬＡＧ−Ｘｅｘ−ｈＦｃ、Ｆｌａｇ−Ｙｅｘ−ｈＦｃ、または変異体ＭＵＣ１／Ｘタンパク質をコードする真核生物ｐＣＭＶ３発現ベクター（６μｇのＤＮＡ／２５ｃｍ２のフラスコ）で、リン酸カルシウムを使用して一時的にトランスフェクトした。安定なトランスフェクタントを得るために、ネオマイシン耐性クローンを、培養培地へのネオマイシンの添加後に単離した。分泌されたＭＵＣ１融合タンパク質を含む馴化培地（ＣＭ）を、１５，０００ｒｐｍで２０分間回転させ、上清を０．４５μｍのフィルターを通して濾過し、そして−７５℃で保存した。Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ４ Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗ（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）を使用して、Ｃ末端にｈＦｃタグが付けられたＦｌａｇ−Ｘｅｘ（Ｙｅｘ）−ｈＦｃタンパク質を精製した。
【００９４】
抗ＭＵＣ１抗体のＭＵＣ１／Ｘ（ＭＵＣ１／Ｙ）タンパク質に対する結合（ハイブリドーマ上清）およびＭＵＣ１ α／β接点に対する結合を決定するためのＥＬＩＳＡアッセイ。ＥｌｉｓａＩｍｍｕｎｏＡｓｓａｙプレート（Ｃｏｓｔｅｒ，Ｃｏｒｎｉｎｇ，ＮＹ）を、ポリクローナルヤギ抗ヒトＦｃ（Ｇα−ｈＦｃ，４μｇ／ｍｌ）でコーティングし、その後、ＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎ２０（０．０５％）で洗浄し、そしてＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎ＋５％の脱脂粉乳（Ｂｌｏｔｔｏ）でブロックした。その後、Ｆｌａｇ−Ｘｅｘ（またはＹｅｘ）−ｈＦｃタンパク質（変異体および野生型）を含む使用済みの培養培地をウェルに載せて、Ｆｌａｇ−Ｘｅｘ（Ｙｅｘ）−ｈＦｃタンパク質を結合させた。インキュベーション後、試料を取り出し、そしてウェルをＰＢＳ／Ｔｗｅｅｎで洗浄した。その後、ウェルをマウスモノクローナル抗体（またはハイブリドーマ上清）とともに、続いて、ＨＲＰ結合抗マウス抗体とともにインキュベートした。
【００９５】
マウスの免疫化とハイブリドーマの生産。マウスを、２１日の間隔を明けた連続する皮内ＤＮＡ免疫化によって免疫化した。注射したＤＮＡはｐＣＬ−ＭＵＣ１／ＴＭまたはｐＣＬ−ＭＵＣ１／Ｘ発現ベクタープラスミドのいずれかであった。最後に、マウスにフロイトの不完全なアジュバントと共にＭＵＣ１／Ｘタンパク質の細胞外ドメインを注射してブーストした。ハイブリドーマを免疫脾臓細胞との骨髄細胞体の融合によって調製し、ＥＬＩＳＡアッセイによってスクリーニングした（上記を参照のこと）。
【００９６】
結果
ＭＵＣ１／Ｘ ｃＤＮＡでの免疫化ではなくＭＵＣ１／ＴＭ ｃＤＮＡでの免疫化によって抗ＭＵＣ１ α／β接点抗体が誘導された。マウスを、α鎖のタンデムリピートアレイを含むＭＵＣ１／ＴＭタンパク質をコードするｃＤＮＡ、またはタンデムリピートを欠失させたＭＵＣ１／Ｘイソ型をコードするｃＤＮＡのいずれかを含む発現ベクターで免疫化した（図１）。４回の連続するＤＮＡ免疫化の後、血清を、ＭＵＣ１／Ｘに対して指向させられた抗体についてアッセイした。全長のＭＵＣ１／ＴＭ分子と同じ部位で切断されるＭＵＣ１／Ｘイソ型を、抗ＭＵＣ１ α／β接点抗体を同定するためのスクリーニングタンパク質とした。これによっていくつかの利点がもたらされた。ＭＵＣ１／Ｘ細胞外ドメインは中心にあるタンデムリピートアレイを含まないので、高度に免疫原性であるタンデムリピートアレイエピトープに対して指向させられた抗体は検出されないであろう。より重要なことは、ＭＵＣ１／Ｘが、自然界に存在しているα／β接点を形成する２つの小さい相互作用しているＭＵＣ１／Ｘ αサブユニットとβサブユニットだけから構成されているので、ＭＵＣ１／ＸとＭＵＣ１／ＴＭの両方に共通しているエピトープに対して指向させられた抗体だけが検出されであろうということである。自然界に存在しているＭＵＣ１ α／β接点は１つのそのような主要なエピトープであり、これにより、このスクリーニング手順が目的のこの重要な領域に結合する抗体についての簡単な検出システムとなる。
【００９７】
予想外に、ＭＵＣ１／Ｘ ｃＤＮＡで免疫化した全てのマウス（５匹のうちの５匹）は、有意な抗ＭＵＣ１／Ｘ抗体力価を惹起することができなかった（図２ＡおよびＢ）。対照的に、ＭＵＣ１／ＴＭ ｃＤＮＡで免疫化した５匹のマウスのうちの５匹が、高度に再現性はあるが、少量の抗ＭＵＣ１／Ｘ抗体力価を生じた（図２ＡおよびＢ）。これらの結果は、ＭＵＣ１／ＴＭ ｃＤＮＡでの免疫化によっては、ＭＵＣ１／Ｘタンパク質およびＭＵＣ１／ＴＭタンパク質の両方に共通しているエピトープを認識する抗体を誘導することができたが、ＭＵＣ１／Ｘ ｃＤＮＡでの免疫化によっては、わずかな力価の抗ＭＵＣ１／Ｘ抗体しか誘発できなかったことを示している。
【００９８】
本発明者らの主要な目的はα／β接点を認識するモノクローナル抗体を作製することであったので、はるかに高い抗ＭＵＣ１／Ｘ力価を有しているマウスが必要であった。高力価の抗ＭＵＣ１／Ｘを作製するために、本発明者らは、ＭＵＣ１／ＴＭ ｃＤＮＡで感作したマウスをＭＵＣ１／Ｘタンパク質でブーストした。１回のＭＵＣ１／Ｘタンパク質でのブーストの後、全ての免疫化されたマウスは、１：３００（ＭＵＣ１／ＴＭ ｃＤＮＡでの免疫化だけの後）から、ＭＵＣ１／Ｘタンパク質でのブースト後には少なくとも１：３０，０００に、抗ＭＵＣ１／Ｘ力価の１００倍の増加を示した（図３Ａ〜Ｄ）。高い力価は、ＭＵＣ１／Ｘタンパク質でのブーストの１８日後に観察され、３２日目にもまだなお高かった（図３Ａ〜Ｄ）。ハイブリドーマの形成に使用するために屠殺しなかった残りのマウスは、最初の１回のＭＵＣ１／Ｘタンパク質でのブーストの６ヵ月後にもなお、高い抗ＭＵＣ１／Ｘタンパク質力価を維持していた。抗α／β接点特異的抗体を作製するために最良であるために、本発明者らは、最も高い抗ＭＵＣ１／Ｘ抗体力価を示すマウスに由来する脾臓細胞を使用して、ハイブリドーマの形成を開始した。
【００９９】
切断されたα／β接点を認識するＤＭＣ２０９モノクローナル抗体の作製。融合させられた脾臓−骨髄腫細胞を含む１０個の９６ウェルプレートからの使用済みの培地を、切断されたα／β接点を認識する抗体についてアッセイした。このような抗体を同定するために、ハイブリドーマ上清を、切断されたＭＵＣ／Ｘタンパク質と、構造上は類似しているが切断されていないＭＵＣ１／Ｙイソ型に対して、同時にスクリーニングした（図１）。ＭＵＣ１／Ｘは、全長のＭＵＣ１／ＴＭタンパク質と同じ部位で切断され、αサブユニットとβサブユニットの相互作用を生じるが、切断されないＭＵＣ１／ＹはＭＵＣ１ α／β接点エピトープを含まない。本発明者らは、ＭＵＣ１／Ｘ陽性であり、ＭＵＣ１／Ｙ陰性であるハイブリドーマを選択した。
【０１００】
９５０個のハイブリドーマ上清をスクリーニングすることにより、ＭＵＣ１／Ｘタンパク質と高度に反応性であるが、ＭＵＣ１／Ｙとは反応しない２つのハイブリドーマが得られた。限界細胞稀釈によって、ＤＭＣ２０９、ＩｇＭ抗体、およびＤＭＣ１１１、Ｉｇγ２ａ抗体と命名した純粋なクローンを得た。
【０１０１】
ＤＭＣ２０９反応性とＤＭＣ１１１反応性の詳細なエピトープ分析。クローニングしたＤＭＣ２０９とＤＭＣ１１１によって作製したモノクローナル抗体の特異性の分析によって、いずれも、ＭＵＣ１／Ｘ陽性であり、そしてＭＵＣ１／Ｙ（＝Δ１ー１８、図４Ｂ）陰性であることを確認した。さらに、ＤＭＣ２０９およびＤＭＣ１１１はまた、切断されないΔ１−１１タンパク質とも反応しなかったが（図４Ｆ）、切断されるΔ１−７ＭＵＣ１／Ｘタンパク質とは反応した（図４Ｅ）。さらなる分析は、ＤＭＣ２０９およびＤＭＣ１１１が野生型ＭＵＣ１／Ｘタンパク質と、切断されるＳ６３→ＣおよびＳ６３→Ｔ変異体タンパク質に同等に十分に結合したが（図４Ｃ）、他の全てのＳ６３変異体である切断されないＭＵＣ１／Ｘタンパク質（図４Ｄ）はＤＭＣ２０９と完全に非反応性であったことを示していた。対照的に、ＤＭＣ１１１は、切断されるＭＵＣ１／Ｘタンパク質（野生型と切断されたＳ６３→ＣおよびＳ６３→Ｔ変異体タンパク質、図４Ｄ）、ならびに、切断されないＳ６３変異体タンパク質（図４Ｄ）のいずれとも等しく十分に反応した。これらの結果によって、２つのモノクローナル抗体によって認識されるエピトープが異なることが確認された。より重要なことは、ＤＭＣ２０９はその反応性については完全にＭＵＣ１の切断に依存していることである。明らかに、ＤＭＣ２０９は、ＭＵＣ１ α−サブユニットとβ−サブユニットのいずれとも、それぞれを単離物として試験した場合には反応しなかった。ＤＭＣ２０９は、相互作用しているものとして提示された場合にしか２つのサブユニットとは反応しない。これらの分析によって、ＤＭＣ２０９が（ｉ）切断に依存しており、そして（ｉｉ）α−サブユニットおよびβ−サブユニットが相互作用している接点を認識することの強力な証拠が提供された。さらなる分析（以下に記載する）によっては、主要なＭＵＣ１イソ型であるＭＵＣ１／ＴＭを発現している細胞に対するＤＭＣ２０９の強固な結合、および切断に依存しないＤＭＣ１１１抗体との結合は明らかに少ないことが明らかにされた。これ以降、本発明者らが報告する分析は、切断依存性抗体ＤＭＣ２０９に限定する。
【０１０２】
インタクトな細胞上でのＭＵＣ１／ＴＭに対するＤＭＣ２０９の結合。ＭＵＣ１／ＴＭは、全てのＭＵＣ１イソ型のうちの主要なＭＵＣ１タンパク質であり、膜に繋がれたα−サブユニットに対して共有結合以外によって結合させられた大きなタンデムリピートアレイを含むα−サブユニットから構成されている。これは、広い範囲の腺ガンにおいて、細胞表面ヘテロ二量体として細胞によって高レベルで発現されている（図１）。ＤＭＣ２０９は、ＭＵＣ１／Ｘタンパク質中に存在している切断されたα／β接点を認識し、そしてこの切断部位は全長のＭＵＣ１／ＴＭタンパク質の中に見られる切断部位と同じであることが示されているので、ＤＭＣ２０９がインタクトな細胞上に提示されるＭＵＣ１／ＴＭタンパク質に結合するかどうかを決定することが極めて重要であった。本発明者らは、最初に、ヒトＭＵＣ１／ＴＭを発現していないマウスの細胞が、ヒトＭＵＣ１／ＴＭでのトランスフェクションの後にＤＭＣ２０９と反応するようになるかどうかを試験することによって、この問題に着手した。トランスフェクトされていないもとのマウスの乳腺腫瘍細胞はＤＭＣ２０９とは完全に非反応性であったが（図５Ａ）、ＤＭＣ２０９は、全長のＭＵＣ１／ＴＭタンパク質（図５Ｂ）またはＭＵＣ１／ＴＭの細胞質ドメインが欠失しているイソ型（図５Ｃ）のいずれかを発現する同じ細胞に対しては明らかに結合した。ＭＵＣ１／ＴＭがこれらの細胞上で発現されていることを確認するために、α−鎖のタンデムリピートアレイに対する抗体を用いて行った対照は、予想したとおり、トランスフェクトされた細胞上でＭＵＣ１の発現を示した（図５ＩＩ）。
【０１０３】
ＤＭＣ２０９ ｍＡｂがトランスフェクトされた細胞中のＭＵＣ１／ＴＭに結合することを確立すると、本発明者らは、これらの抗体が、ＭＵＣ１／ＴＭを発現することが公知である腫瘍細胞株にも結合するかどうかを調べ始めた。ＨＥＹ（卵巣ガン細胞株）と乳ガン細胞株Ｔ４７ＤおよびＭＤＡ２３１はすべて、有意なＤＭＣ２０９結合を示した（それぞれ、図５Ｃ、Ｄ、およびＥ）。
【０１０４】
ＤＭＣ２０９は新しい骨髄吸引物の中のＭＵＣ１を発現する多発性骨髄腫細胞に結合する。最終的な臨床的な適用のためには、ＭＵＣ１ α／β接点に対する抗体は、ＭＵＣ１を発現している悪性腫瘍細胞を標的化することができなければならない。ＤＭＣ２０９抗体がインビボ様の設定において腫瘍細胞に選択的に結合できるかどうかを調べるために、多発性骨髄腫の患者から新しく得た骨髄吸引物中の悪性形質細胞を使用した。吸引物の中の異種細胞の集団によって、ＤＭＣ２０９結合特異性の直接の評価ができる。ＤＭＣ２０９は、ＭＵＣ１を高度に発現することが知られているが、同じ吸引物試料中に存在しているＭＵＣ１を発現していない細胞には結合しないかまたは最少にしか結合しない、多発性骨髄腫細胞に結合するはずである。さらに、吸引物材料の中でのＤＭＣ２０９細胞の結合は、よく知られている骨髄腫マーカーである抗シンデカン（ＣＤ１３８）での同時染色によって容易に比較することができる。
【０１０５】
プロットした、ＣＤ４５陽性細胞に対する側方散乱（細胞の粒度を反映する）によって、骨髄吸引物中に存在している混合された細胞集団の組成を評価した（図６Ａ）。これによって、骨髄吸引材料が顆粒球、好酸球、リンパ球、単球、有核赤血球、および悪性形質（骨髄腫）細胞を含む予想された異種細胞集団から構成されていることを確認した（図６Ａ）。赤色の蛍光で標識されたＤＭＣ２０９抗体を用いた同時分析によって、有意なＤＭＣ２０９反応性を示した細胞の別の集団が明らかになった。Ｒ１（図６Ｂ）と命名したこの選択した集団は、シンデカン−ＣＤ１３８に対する抗体と完全な一致を示した（図６Ｃ）。同様の結果が、多発性骨髄腫の患者に由来する、別の、３つの新しく得た骨髄吸引物のうちの３個を用いて得られた。同じ新しい操作していない吸引物試料の中での、ＭＵＣ１を発現している悪性形質細胞の認識と、ＭＵＣ１を発現していない細胞系統に対しては結合しないことは、ＭＵＣ１を発現している腫瘍細胞を識別することにおけるＤＭＣ２０９抗α／β接点抗体の優れた特異性を強調する。
【０１０６】
ＤＭＣ２０９抗α／β接点抗体での乳ガン組織の免疫組織化学的染色。乳ガン組織中に存在しているＭＵＣ１を発現している腫瘍細胞とのＤＭＣ２０９免疫反応性を視覚化するために、免疫組織化学的分析を、いずれも同じ外科的に切除した試料から得た悪性乳房組織と正常な乳房組織について行った。平衡して、切片を、ＭＵＣ１のタンデムリピートを認識する抗体で免疫組織化学的に分析した（α−ＥＭＡ−抗上皮膜抗原、実験手順を参照のこと）。α−ＥＭＡとＤＭＡ２０９抗α／β接点抗体のいずれもが、悪性乳ガン細胞と強く反応した。明らかに少ない染色が、悪性ではない正常な乳房組織においては観察された。
【０１０７】
本発明者らは、次に、ＤＭＣ２０９とタンデムリピート部分に対する抗体で、それぞれ、赤および緑の蛍光標識で同時に二重染色を行った。ＭＵＣ１免疫反応性は、悪性乳房組織の凍結切片の中で、赤色に標識されたＤＭＣ２０９を使用して容易に検出できた。強い抗ＭＵＣ１免疫反応性は、悪性乳房上皮細胞上で見られ、原則として、全ての免疫反応性は、未標識のＤＭＣ２０９抗体を添加することによって競合され、したがって、免疫反応性の特異性が立証された。染色は、結合組織の中に包埋されていた線維芽細胞においても、また、結合組織自体においても見られなかった。予想されたとおり、タンデムリピート部分に対する抗体との免疫反応性を示す緑色の標識は、赤色に標識されたＤＭＣ２０９について見られた標識と一緒に局在化していた。
【０１０８】
本明細書中で記載した実施例と実施形態は、説明の目的のためのものであり、その観点での様々な改良または変更が当業者に示唆され、本出願および添付の特許請求の範囲の精神および範囲に含まれることが理解される。本明細書中で引用された全ての刊行物、特許、および特許出願は、全ての目的についてそれらの全体が引用により本明細書中に組み入れられる。
【０１０９】
（配列表）
【０１１０】
【表１】
【０１１１】
【表２】
【図面の簡単な説明】
【０１１２】
【図１】図１は、ＭＵＣ１タンパク質イソ型とＭＵＣ１融合タンパク質を示す。タンデムリピートアレイを含む切断された膜貫通ＭＵＣ１タンパク質（ＭＵＣ１／ＴＭ）を左に示す。別のスプライシングでは、Ｓ．Ｄ．→によって示されるスプライシングドナーが利用され、これによって、２つの別のスプライシングアクセプター（Ｓ．Ａ．Ｙ→とＳ．Ａ．Ｘ→が生じ、これによって、ＭＵＣ１／ＹとＭＵＣ１／Ｘイソ型が形成される。テキストに記載されているように、抗体ＤＭＣ２０９は、ＭＵＣ１／ＸとＭＵＣ１／ＴＭタンパク質の両方に存在している切断されたα／β接点を認識するが、切断されていないＭＵＣ１／Ｙタンパク質とは反応しない。
【図２Ａ】図２Ａは、ＭＵＣ１／ＴＭ、ＭＵＣ１／Ｘ、およびＭＵＣ１／Ｙイソ型の配列を示す。ＭＵＣ１／ＴＭヌクレオチド（配列番号１）およびアミノ酸（配列番号２）の番号付けは、それぞれ、配列の左と右に示す。シグナルペプチドの切断は、２３位のグリシンと２４位のセリンの間で起こり、そして上向きの赤色の矢印によって示されている。Ｎ３０配列はＳＧＨＡＳからＥＫＮＡまでにまたがる。明確性のために、タンデムリピートアレイとその隣接配列を含むスプライシングされた中心領域を欠失させ、これは点線で示されている。ＭＵＣ１／ＴＭの切断は、３５７位のグリシンと３５８位のセリンの間（ＭＵＣ１／Ｘアミノ酸の６２位と６３位の間）で起こり、これは、上向きの赤色の矢印で示されている。ＭＵＣ１／ＸとＭＵＣ１／Ｙを生じるスプライシングドナー部位は、２１７位のヌクレオチド（ｇｔｇａｔ）に示され、そしてＭＵＣ１／ＸとＭＵＣ１／Ｙを生じるスプライシングアクセプター部位は、それぞれ、９２４位のヌクレオチド（ｃｃｃｃａｇ）と９９６位のヌクレオチド（ｃｔｃｃａｇ）にある。ＭＵＣ１／Ｘスプライシングアクセプター部位に対してすぐＣ末端側にあるＭＵＣ１／Ｘアミノ酸は、斜体文字で１から（ＬＳＴＧで始まる）から、膜貫通ドメインのすぐＮ末端側にある１２０（ＳＧＡＧ）まで番号付けされている。ＭＵＣ１／Ｘ核酸配列とアミノ酸配列は、それぞれ、配列番号３および４に示されている。ＭＵＣ１／Ｙ核酸配列とアミノ酸配列を、それぞれ、配列番号５および６に示されている。Ｌｅｖｉｔｉｎ，ｅｔ ａｌ．（前出）を参照のこと。
【図２Ｂ】図２Ｂは、ＭＵＣ１／ＴＭ、ＭＵＣ１／Ｘ、およびＭＵＣ１／Ｙイソ型の配列を示す。ＭＵＣ１／ＴＭヌクレオチド（配列番号１）およびアミノ酸（配列番号２）の番号付けは、それぞれ、配列の左と右に示す。シグナルペプチドの切断は、２３位のグリシンと２４位のセリンの間で起こり、そして上向きの赤色の矢印によって示されている。Ｎ３０配列はＳＧＨＡＳからＥＫＮＡまでにまたがる。明確性のために、タンデムリピートアレイとその隣接配列を含むスプライシングされた中心領域を欠失させ、これは点線で示されている。ＭＵＣ１／ＴＭの切断は、３５７位のグリシンと３５８位のセリンの間（ＭＵＣ１／Ｘアミノ酸の６２位と６３位の間）で起こり、これは、上向きの赤色の矢印で示されている。ＭＵＣ１／ＸとＭＵＣ１／Ｙを生じるスプライシングドナー部位は、２１７位のヌクレオチド（ｇｔｇａｔ）に示され、そしてＭＵＣ１／ＸとＭＵＣ１／Ｙを生じるスプライシングアクセプター部位は、それぞれ、９２４位のヌクレオチド（ｃｃｃｃａｇ）と９９６位のヌクレオチド（ｃｔｃｃａｇ）にある。ＭＵＣ１／Ｘスプライシングアクセプター部位に対してすぐＣ末端側にあるＭＵＣ１／Ｘアミノ酸は、斜体文字で１から（ＬＳＴＧで始まる）から、膜貫通ドメインのすぐＮ末端側にある１２０（ＳＧＡＧ）まで番号付けされている。ＭＵＣ１／Ｘ核酸配列とアミノ酸配列は、それぞれ、配列番号３および４に示されている。ＭＵＣ１／Ｙ核酸配列とアミノ酸配列を、それぞれ、配列番号５および６に示されている。Ｌｅｖｉｔｉｎ，ｅｔ ａｌ．（前出）を参照のこと。
【図３】図３は、ＭＵＣ１／ＴＭまたはＭＵＣ１／ＸのいずれかをコードするＤＮＡで免疫化したマウスにおいて作製させた抗ＭＵＣ１／Ｘ抗体を示す。マウスを、ＭＵＣ１／ＴＭタンパク質（グループＩＩ）をコードするｃＤＮＡ，またはタンデムリピートが欠失させられたＭＵＣ１／Ｘタンパク質をコードするｃＤＮＡ（グループＩ、図１を参照のこと）のいずれかを含む発現ベクターで免疫化した。血清を、実施例に記載するように、切断されたＭＵＣ１／Ｘタンパク質に対して指向させられた抗体力価についてアッセイした。グループＩＩのマウスの全てが、有意な抗ＭＵＣ１／Ｘ抗体力価を示したが、グループＩのマウスにおいては抗ＭＵＣ１／Ｘ抗体は検出されなかった（ＡおよびＢ）。
【図４】図４は、ＭＵＣ１／ＴＭ ｃＤＮＡで感作させ、１回のＭＵＣ１／Ｘタンパク質でのブーストを続いて行ったマウスにおける抗ＭＵＣ１／Ｘ力価を示す。ＭＵＣ１／ＴＭ ｃＤＮＡでの免疫化によって予め感作させたグループＩＩのマウス（図２を参照のこと）を、１回のＭＵＣ１／Ｘタンパク質での免疫化によってブーストした。血清を、タンパク質でのブーストの１８日後または３２日後に（それぞれ、ピンク色および緑色の線）、実施例に記載するように、抗ＭＵＣ１／Ｘ反応性についてアッセイした。個々のマウスについての力価が示される。
【図５】図５は、ＤＭＣ２０９およびＤＭＣ１１１モノクローナル抗体によって認識されるエピトープの詳細な分析を示す。野生型ＭＵＣ１／ＸおよびＭＵＣ１／Ｙタンパク質（ＡおよびＢ）、ならびに、点変異したＭＵＣ１／Ｘ（ＣおよびＤ）および内部欠失させられたＭＵＣ１／Ｘ（ＥおよびＦ）を、ＤＭＣ２０９およびＤＭＣ１１１抗体とのそれらの反応性について、実施例に記載するようにアッセイした。
【図６】図６は、ＭＵＣ１／ＴＭを発現する細胞のＤＭＣ２０９フローサイトメトリー分析を説明する。親であるトランスフェクトされていないマウス乳腺腫瘍細胞、または全長のＭＵＣ１／ＴＭもしくはその細胞質テールが短縮されているＭＵＣ１／ＴＭ（それぞれ、ＤＡ３／ＰＡＲ、ＤＡ３／ＴＭ、およびＤＡ３／ＴＭマイナスＣＹＴ）をコードするｃＤＮＡでトランスフェクトされた細胞をＤＭＣ２０９と反応させ、実施例に記載するようにフローサイトメトリーによって分析した。同様に、卵巣ガン細胞株ＨＥＹと乳ガン細胞である細胞株Ｔ４７ＤおよびＭＤＡ２３１を、ＤＭＣ２０９とのインキュベーションの後に分析した。赤色と緑色の軌跡は、それぞれ、蛍光標識された二次抗体だけと、または一次ＤＭＣ２０９抗体、続いて二次抗体との細胞の反応を示す。
【図７】図７は、多発性骨髄腫の患者から新しく得た骨髄細胞とのＤＭＣ２０９反応性のフローサイトメトリーによる分析を示す。骨髄の吸引物を、ＤＭＣ２０９と、ＣＤ４５、ＣＤ１３８、およびＣＤ３８に対する抗体を用いて、同時に分析した。抗体を蛍光色素（それぞれの蛍光色素は異なる放射波長を有している）で別々に標識した。側方散乱分析を、ＣＤ４５（Ａ１）およびＤＭＣ２０９（Ａ２）に対して行った。ＤＭＣ２０９陽性細胞をＲ１と命名し、ＣＤ１３８陽性細胞（Ａ３）に対するＣＤ３８陽性細胞のプロットは、ＤＭＣ２０９陽性集団（赤色で標識された細胞）がＣＤ１３８陽性細胞と一致することを示している。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
αサブユニットまたはβサブユニットのいずれに対しても他方が存在しない場合には実質的には結合しないとの条件で、インタクトなＭＵＣ１タンパク質に特異的に結合する、ＭＵＣ１特異的抗体。
【請求項２】
イソ型ＭＵＣ１／Ｘに結合するが、イソ型ＭＵＣ１／Ｙには実質的には結合しない、請求項１に記載の抗体。
【請求項３】
前記イソ型ＭＵＣ１／Ｘが短縮型αサブユニットとβサブユニットに切断される、請求項２に記載の抗体。
【請求項４】
前記抗体がモノクローナル抗体である、請求項１に記載の抗体。
【請求項５】
前記抗体が約１：３００から約１：３０，０００までの力価を有している、請求項１に記載の抗体。
【請求項６】
前記抗体がＩｇＭである、請求項１に記載の抗体。
【請求項７】
前記抗体がＤＭＣ２０９である、請求項１に記載の抗体。
【請求項８】
前記抗体がＩｇＧである、請求項１に記載の抗体。
【請求項９】
前記抗体がＤＭＣ１１１である、請求項１に記載の抗体。
【請求項１０】
前記抗体がヒト化抗体である、請求項１に記載の抗体。
【請求項１１】
前記抗体がヒト抗体である、請求項１に記載の抗体。
【請求項１２】
前記抗体が抗体の組み換え体単鎖可変領域断片である、請求項１に記載の抗体。
【請求項１３】
細胞傷害性部分がさらに含まれている、請求項１に記載の抗体。
【請求項１４】
標識部分がさらに含まれている、請求項１に記載の抗体。
【請求項１５】
前記抗体によって、βサブユニットからのαサブユニットの解離が妨げられる、請求項１に記載の抗体。
【請求項１６】
請求項１に記載の抗体を含む細胞。
【請求項１７】
前記細胞がハイブリドーマ細胞である、請求項１６に記載の細胞。
【請求項１８】
前記細胞が、請求項１に記載の抗体に結合したインタクトなＭＵＣ１タンパク質をその表面上に含む、請求項１６に記載の細胞。
【請求項１９】
ＭＵＣ１を過剰発現しているガン細胞に対して免疫毒素を標的化させる方法であって、請求項１に記載の抗体を投与する工程を含む、方法。
【請求項２０】
インタクトなＭＵＣ１タンパク質に結合するＭＵＣ１特異的抗体を生産する方法であって、以下の工程：
ｉ）インタクトなＭＵＣ１タンパク質に特異的に結合するＭＵＣ１特異的抗体を得るために十分な量の、αサブユニットのタンデムリピートを含むＭＵＣ１／ＴＭ抗原で、抗体を生産する能力を有する被験体を免疫化する工程；および
ｉｉ）ＭＵＣ１／Ｘ抗原に結合する抗体を選択する工程；
が含まれ、ここでは、前記抗体は，ＭＵＣ１ αサブユニットまたはＭＵＣ１ βサブユニットのいずれに対しても他方が存在しない場合には実質的には結合しない、方法。
【請求項２１】
前記抗体が、イソ型ＭＵＣ１／Ｘに結合し、イソ型ＭＵＣ１／Ｙには実質的には結合しない、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
前記イソ型ＭＵＣ１／Ｘが、短縮型αサブユニットとβサブユニットに切断される、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
前記ＭＵＣ１／ＴＭ抗原がＭＵＣ１／ＴＭポリペプチドである、請求項２０に記載の方法。
【請求項２４】
前記ＭＵＣ１／ＴＭ抗原がＭＵＣ１／ＴＭポリペプチドをコードする核酸である、請求項２０に記載の方法。
【請求項２５】
前記工程ｉ）の後に、ＭＵＣ１／Ｘ抗原で被験体を免疫化する工程をさらに含む、請求項２０に記載の方法。
【請求項２６】
前記ＭＵＣ１／Ｘ抗原がＭＵＣ１／Ｘポリペプチドである、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
前記ＭＵＣ１／Ｘ抗原がＭＵＣ１／Ｘポリペプチドをコードする核酸である、請求項２５に記載の方法。
【請求項２８】
αサブユニットまたはβサブユニットのいずれに対しても他方が存在しない場合には結合しないとの条件で、インタクトなＭＵＣ１タンパク質に結合するＭＵＣ１特異的抗体をスクリーニングする方法であって、以下の工程：
ｉ）切断されたＭＵＣ１／Ｘ抗原とＭＵＣ１／Ｙ抗原に対する、生じた複数の抗ＭＵＣ１抗体の結合を決定する工程；および
ｉｉ）ＭＵＣ１／Ｘ抗原に特異的に結合するが、ＭＵＣ１／Ｙ抗原に対しては有意には結合しない抗体を選択する工程
を含む、方法。
【請求項２９】
目的の抗原に対する抗体を生産する方法であって、以下の工程：
ｉ）αサブユニットのタンデムリピートと目的の抗原を含むＭＵＣ１／ＴＭ抗原で被験体を免疫化する工程、および
ｉｉ）目的の抗原で被験体を免疫化する工程
を含み、それによって目的の抗原に対する抗体が生産される、方法。
【請求項３０】
前記ＭＵＣ１／ＴＭ抗原がＭＵＣ１／ＴＭポリペプチドである、請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
前記ＭＵＣ１／ＴＭ抗原がＭＵＣ１／ＴＭポリペプチドをコードする核酸である、請求項２９に記載の方法。
【請求項３２】
前記目的の抗原がポリペプチドである、請求項２９に記載の方法。
【請求項３３】
前記目的の抗原が目的の抗原をコードする核酸である、請求項２９に記載の方法。
【請求項３４】
ｉ）ＭＵＣ１／ＴＭと目的の抗原を含む融合抗原で被験体を免疫化する工程をさらに含む、請求項２９に記載の方法。
【請求項３５】
前記目的の抗原が、ヒト抗原、動物抗原、植物抗原、細菌抗原、ウイルス抗原、または合成の抗原からなる群より選択される、請求項２９に記載の方法。
【請求項３６】
前記目的の抗原が腫瘍関連抗原である、請求項２９に記載の方法。
【請求項３７】
前記目的の抗原が感染性疾患関連抗原である、請求項２９に記載の方法。
【請求項１】
αサブユニットまたはβサブユニットのいずれに対しても他方が存在しない場合には実質的には結合しないとの条件で、インタクトなＭＵＣ１タンパク質に特異的に結合する、ＭＵＣ１特異的抗体。
【請求項２】
イソ型ＭＵＣ１／Ｘに結合するが、イソ型ＭＵＣ１／Ｙには実質的には結合しない、請求項１に記載の抗体。
【請求項３】
前記イソ型ＭＵＣ１／Ｘが短縮型αサブユニットとβサブユニットに切断される、請求項２に記載の抗体。
【請求項４】
前記抗体がモノクローナル抗体である、請求項１に記載の抗体。
【請求項５】
前記抗体が約１：３００から約１：３０，０００までの力価を有している、請求項１に記載の抗体。
【請求項６】
前記抗体がＩｇＭである、請求項１に記載の抗体。
【請求項７】
前記抗体がＤＭＣ２０９である、請求項１に記載の抗体。
【請求項８】
前記抗体がＩｇＧである、請求項１に記載の抗体。
【請求項９】
前記抗体がＤＭＣ１１１である、請求項１に記載の抗体。
【請求項１０】
前記抗体がヒト化抗体である、請求項１に記載の抗体。
【請求項１１】
前記抗体がヒト抗体である、請求項１に記載の抗体。
【請求項１２】
前記抗体が抗体の組み換え体単鎖可変領域断片である、請求項１に記載の抗体。
【請求項１３】
細胞傷害性部分がさらに含まれている、請求項１に記載の抗体。
【請求項１４】
標識部分がさらに含まれている、請求項１に記載の抗体。
【請求項１５】
前記抗体によって、βサブユニットからのαサブユニットの解離が妨げられる、請求項１に記載の抗体。
【請求項１６】
請求項１に記載の抗体を含む細胞。
【請求項１７】
前記細胞がハイブリドーマ細胞である、請求項１６に記載の細胞。
【請求項１８】
前記細胞が、請求項１に記載の抗体に結合したインタクトなＭＵＣ１タンパク質をその表面上に含む、請求項１６に記載の細胞。
【請求項１９】
ＭＵＣ１を過剰発現しているガン細胞に対して免疫毒素を標的化させる方法であって、請求項１に記載の抗体を投与する工程を含む、方法。
【請求項２０】
インタクトなＭＵＣ１タンパク質に結合するＭＵＣ１特異的抗体を生産する方法であって、以下の工程：
ｉ）インタクトなＭＵＣ１タンパク質に特異的に結合するＭＵＣ１特異的抗体を得るために十分な量の、αサブユニットのタンデムリピートを含むＭＵＣ１／ＴＭ抗原で、抗体を生産する能力を有する被験体を免疫化する工程；および
ｉｉ）ＭＵＣ１／Ｘ抗原に結合する抗体を選択する工程；
が含まれ、ここでは、前記抗体は，ＭＵＣ１ αサブユニットまたはＭＵＣ１ βサブユニットのいずれに対しても他方が存在しない場合には実質的には結合しない、方法。
【請求項２１】
前記抗体が、イソ型ＭＵＣ１／Ｘに結合し、イソ型ＭＵＣ１／Ｙには実質的には結合しない、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
前記イソ型ＭＵＣ１／Ｘが、短縮型αサブユニットとβサブユニットに切断される、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
前記ＭＵＣ１／ＴＭ抗原がＭＵＣ１／ＴＭポリペプチドである、請求項２０に記載の方法。
【請求項２４】
前記ＭＵＣ１／ＴＭ抗原がＭＵＣ１／ＴＭポリペプチドをコードする核酸である、請求項２０に記載の方法。
【請求項２５】
前記工程ｉ）の後に、ＭＵＣ１／Ｘ抗原で被験体を免疫化する工程をさらに含む、請求項２０に記載の方法。
【請求項２６】
前記ＭＵＣ１／Ｘ抗原がＭＵＣ１／Ｘポリペプチドである、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
前記ＭＵＣ１／Ｘ抗原がＭＵＣ１／Ｘポリペプチドをコードする核酸である、請求項２５に記載の方法。
【請求項２８】
αサブユニットまたはβサブユニットのいずれに対しても他方が存在しない場合には結合しないとの条件で、インタクトなＭＵＣ１タンパク質に結合するＭＵＣ１特異的抗体をスクリーニングする方法であって、以下の工程：
ｉ）切断されたＭＵＣ１／Ｘ抗原とＭＵＣ１／Ｙ抗原に対する、生じた複数の抗ＭＵＣ１抗体の結合を決定する工程；および
ｉｉ）ＭＵＣ１／Ｘ抗原に特異的に結合するが、ＭＵＣ１／Ｙ抗原に対しては有意には結合しない抗体を選択する工程
を含む、方法。
【請求項２９】
目的の抗原に対する抗体を生産する方法であって、以下の工程：
ｉ）αサブユニットのタンデムリピートと目的の抗原を含むＭＵＣ１／ＴＭ抗原で被験体を免疫化する工程、および
ｉｉ）目的の抗原で被験体を免疫化する工程
を含み、それによって目的の抗原に対する抗体が生産される、方法。
【請求項３０】
前記ＭＵＣ１／ＴＭ抗原がＭＵＣ１／ＴＭポリペプチドである、請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
前記ＭＵＣ１／ＴＭ抗原がＭＵＣ１／ＴＭポリペプチドをコードする核酸である、請求項２９に記載の方法。
【請求項３２】
前記目的の抗原がポリペプチドである、請求項２９に記載の方法。
【請求項３３】
前記目的の抗原が目的の抗原をコードする核酸である、請求項２９に記載の方法。
【請求項３４】
ｉ）ＭＵＣ１／ＴＭと目的の抗原を含む融合抗原で被験体を免疫化する工程をさらに含む、請求項２９に記載の方法。
【請求項３５】
前記目的の抗原が、ヒト抗原、動物抗原、植物抗原、細菌抗原、ウイルス抗原、または合成の抗原からなる群より選択される、請求項２９に記載の方法。
【請求項３６】
前記目的の抗原が腫瘍関連抗原である、請求項２９に記載の方法。
【請求項３７】
前記目的の抗原が感染性疾患関連抗原である、請求項２９に記載の方法。
【図１】
【図２Ａ】
【図２Ｂ】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図２Ａ】
【図２Ｂ】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【公表番号】特表２００８−５２８６２３（Ｐ２００８−５２８６２３Ａ）
【公表日】平成２０年７月３１日（２００８．７．３１）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００７−５５３３２３（Ｐ２００７−５５３３２３）
【出願日】平成１８年１月２７日（２００６．１．２７）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００６／００３２１３
【国際公開番号】ＷＯ２００６／０８１５５３
【国際公開日】平成１８年８月３日（２００６．８．３）
【出願人】（５０７２５３７４９）ラモット アット テル アビブ ユニバーシティ， リミテッド (5)
【出願人】（５０７２５４５８４）バイオモディファイング エルエルシー (1)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２０年７月３１日（２００８．７．３１）
【国際特許分類】
【出願日】平成１８年１月２７日（２００６．１．２７）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００６／００３２１３
【国際公開番号】ＷＯ２００６／０８１５５３
【国際公開日】平成１８年８月３日（２００６．８．３）
【出願人】（５０７２５３７４９）ラモット アット テル アビブ ユニバーシティ， リミテッド (5)
【出願人】（５０７２５４５８４）バイオモディファイング エルエルシー (1)
【Ｆターム（参考）】
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