拡張天然型化学的ライゲーション
【課題】ペプチドのアミド結合による天然型化学的ライゲーションを提供する。
【解決手段】Ｎ置換アミド化合物であって、式Ｉ：Ｊ１−Ｃ（Ｏ）−Ｎ（Ｃ１（Ｒ１）−Ｃ２−ＳＨ）−Ｊ２または式ＩＩ：Ｊ１−Ｃ（Ｏ）−Ｎ（Ｃ１（Ｒ１）−Ｃ２（Ｒ２）−Ｃ３（Ｒ３）−ＳＨ）−Ｊ２を有し、これらの式において、Ｊ１及びＪ２が、それぞれ個別に、随意に保護された一つ以上のアミノ酸側鎖を有するペプチドであり、Ｒ１、Ｒ２、及びＲ３が、それぞれ個別に、共有結合によってＣ１に複合したＨまたは電子供与基であり、Ｃ２及びＣ３は炭素である。ただし前記Ｒ１、Ｒ２、及びＲ３のうち少なくとも一つが、Ｃ１に複合した前記電子供与基から成る、ことを特徴とするＮ置換アミド化合物である。
【解決手段】Ｎ置換アミド化合物であって、式Ｉ：Ｊ１−Ｃ（Ｏ）−Ｎ（Ｃ１（Ｒ１）−Ｃ２−ＳＨ）−Ｊ２または式ＩＩ：Ｊ１−Ｃ（Ｏ）−Ｎ（Ｃ１（Ｒ１）−Ｃ２（Ｒ２）−Ｃ３（Ｒ３）−ＳＨ）−Ｊ２を有し、これらの式において、Ｊ１及びＪ２が、それぞれ個別に、随意に保護された一つ以上のアミノ酸側鎖を有するペプチドであり、Ｒ１、Ｒ２、及びＲ３が、それぞれ個別に、共有結合によってＣ１に複合したＨまたは電子供与基であり、Ｃ２及びＣ３は炭素である。ただし前記Ｒ１、Ｒ２、及びＲ３のうち少なくとも一つが、Ｃ１に複合した前記電子供与基から成る、ことを特徴とするＮ置換アミド化合物である。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は、米国仮（ｐｒｏｖｉｓｉｏｎａｌ）特許出願第６０／２３１，３３９号（２０００年９月８日出願）に基づく優先権を主張するものである。
【０００２】
本発明は、部分的に、国立衛生研究所（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ）ポストドクター特別研究員補助金（Ｐｏｓｔｄｏｃｔｏｒａｌ Ｆｅｌｌｏｗｓｈｉｐ ｇｒａｎｔ）ＧＮ１９０４０２による援助を受けてなされたものである。合衆国政府は、一部の権利を保有しうる。
【０００３】
本発明は、幅広い範囲のペプチド、ポリペプチド、その他のポリマー、及びその他の分子のアミド結合によるライゲーションを可能にする天然型化学的ライゲーション（ｎａｔｉｖｅ ｃｈｅｍｉｃａｌ ｌｉｇａｔｉｏｎ）技術の拡張のための方法及び組成物に関する。
【背景技術】
【０００４】
化学的ライゲーションは、第一の化学要素と第二の化学要素との間に選択的共有結合を形成させることを含む。第一及び第二の成分上に存在するそれぞれ一意性の相互反応性官能基を、ライゲーション反応を化学選択性とするために使用することができる。たとえば、ペプチド及びポリペプチドの化学的ライゲーションは、ペプチドまたはポリペプチドセグメントを有する、両立する一意性の相互反応性Ｃ末端及びＮ末端アミノ酸残基の化学選択反応を含む。いくつかの異なる化学反応がこの目的のために使用されており、その例として、天然型化学的ライゲーション（Ｄａｗｓｏｎ，ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ（１９９４）２６６：７７６−７７９；Ｋｅｎｔ ｅｔ．ａｌ．，ＷＯ９６／３４８７８；Ｋｅｎｔ ｅｔ．ａｌ．，ＷＯ９８／２８４３４）、オキシム生成化学的ライゲーション（Ｒｏｓｅ，ｅｔ．ａｌ．，Ｊ．Ａｍｅｒ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．（１９９４）１１６：３０−３４）、チオエステル生成ライゲーション（Ｓｃｈｎｏｌｚｅｒ，ｅｔ．ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ（１９９２）２５６：２２１−２２５）、チオエーテル生成ライゲーション（Ｅｎｇｌｅｂｒｅｔｓｅｎ，ｅｔ．ａｌ．，Ｔｅｔ．Ｌｅｔｔｓ．（１９９５）３６（４８）：８８７１−８８７４）、ヒドラゾン生成ライゲーション（Ｇａｅｒｔｎｅｒ，ｅｔ．ａｌ．，Ｂｉｏｃｏｎｊ．Ｃｈｅｍ．（１９９４）５（４）：３３３−３３８）、ならびにチアゾリジン生成ライゲーション及びオキサゾリジン生成ライゲーション（Ｚｈａｎｇ，ｅｔ．ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（１９９８）９５（１６）：９１８４−９１８９；Ｔａｍ，ｅｔ．ａｌ．，ＷＯ９５／００８４６；米国特許第５，５８９，３５６号明細書）がある。
【０００５】
これらの方法のうち、天然型化学的ライゲーション法のみがライゲーション部位に天然アミド（すなわち、ペプチド）結合を有するライゲーション生成物を与える。初期の天然型化学的ライゲーション法（Ｄａｗｓｏｎ ｅｔ．ａｌ．，前記；及びＷＯ９６／３４８７８）は、ライゲーション部位に天然アミド結合を生成するための強力な方法であることがわかっている。天然型化学的ライゲーションは、Ｃ末端αカルボキシチオエステル成分を有する第一のペプチドまたはポリペプチドセグメントとＮ末端システイン残基を有する第二のペプチドまたはポリペプチドとの間の化学選択反応を含む。チオール交換反応により、チオエステル結合初期中間体が生成され、この中間体は、自発的に転位して、ライゲーション部位に天然アミド結合を与え、一方、システイン側鎖チオールを再生させる。初期の天然型化学的ライゲーション法の主要な欠点は、この方法が、Ｎ末端システインを必要とするということ、すなわちこの方法が、ライゲーション部位にシステインを有するペプチド及びポリペプチドセグメントの結合を可能にするだけであるということ、である。
【０００６】
この欠点にもかかわらず、システインではないＮ末端アミノ酸とのペプチドの天然型化学的ライゲーションが提案されている（ＷＯ９８／２８４３４）。この方法においては、ライゲーションは、Ｃ末端αカルボキシチオエステルを有する第一のペプチドまたはポリペプチドセグメントと、式 ＨＳ−ＣＨ2−ＣＨ2−Ｏ−ＮＨ−［ペプチド］ で表されるＮ末端Ｎ−｛チオール置換補助｝基を有する第二のペプチドまたはポリペプチドセグメントとを使用して実施される。ライゲーションの後、Ｎ−｛チオール置換補助｝基は、ＨＳ−ＣＨ2−ＣＨ2−Ｏ−補助基を開裂してライゲーション部位に天然アミド結合を生成させることによって、除去される。この方法における一つの制限は、メルカプトエトキシ補助基の使用がグリシン残基においてのみアミド結合を首尾よく生じさせうる、ということである。そのため、開裂において、第二のペプチドまたはポリペプチドセグメントのＮ置換アミノ酸の位置にグリシン残基が生じるライゲーション生成物が作られる。したがって、前記方法の実施が適当であるのは、反応のライゲーション生成物が前記位置にグリシン残基を有することが望ましい場合だけであり、とにかく、ライゲーション収率、前駆体の安定性、Ｏ結合補助基の除去能力に関して問題が起こりうる。他の補助基、たとえばＨＳＣＨ2ＣＨ2ＮＨ−［ペプチド］も、グリシン残基におけるライゲーションための反応を制限することなしに使用できるが、そのような補助基は、ライゲーション生成物から除去することができない。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
したがって、必要なことは、有効な容易に除去できるチオール含有補助基によって、天然型化学的ライゲーションを、いろいろな種類のアミノ酸残基、ペプチド、ポリペプチド、ポリマー、及びその他の分子、にまで拡張し、かつそのような分子をライゲーション部位における天然アミド結合によって結合する、幅広く適用できる強力な化学的ライゲーション法である。本発明は、これら及びその他の要望に応えるものである。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明は、拡張天然型化学的ライゲーションに関係する方法と組成物とにかかわる。本発明の拡張天然型化学的ライゲーション法は、
Ｎ置換アミド結合初期ライゲーション生成物であって、
式
Ｊ１−Ｃ（Ｏ）−Ｎ（Ｃ１（Ｒ１）−Ｃ２−ＳＨ）−Ｊ２ Ｉ
または
Ｊ１−Ｃ（Ｏ）−Ｎ（Ｃ１（Ｒ１）−Ｃ２（Ｒ２）−Ｃ３（Ｒ３）−ＳＨ）
−Ｊ２ ＩＩ
を有し、
これらの式において、
Ｊ１が、それぞれ個別に、随意に保護された一つ以上のアミノ酸側鎖を有するペプチドもしくはポリペプチド、またはそのようなペプチドもしくはポリペプチドの成分、ポリマー、染料、好適に官能基を有する（ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌｉｚｅｄ）表面、リンカーもしくは検出可能なマーカー、または化学的ペプチド合成もしくは拡張天然型化学的ライゲーションに適合する任意の他の化学成分であり、
Ｒ１、Ｒ２、及びＲ３が、それぞれ個別に、Ｃ１に複合したＨまたは電子供与基であるが、ただし前記Ｒ１、Ｒ２、及びＲ３のうち少なくとも一つがＣ１に複合した前記電子供与基から成り、
Ｊ２が、それぞれ個別に、随意に保護された一つ以上のアミノ酸側鎖を有するペプチドもしくはポリペプチド、またはそのようなペプチドもしくはポリペプチドの成分、ポリマー、染料、好適に官能基を有する表面、リンカーもしくは検出可能なマーカー、または化学的ペプチド合成もしくは拡張天然型化学的ライゲーションに適合する任意の他の化学成分である、
Ｎ置換アミド結合初期ライゲーション生成物、
を生成させることから成る。
【０００９】
ライゲーション生成物は、
式 Ｊ１−Ｃ（Ｏ）ＳＲ のカルボキシルチオエステルから成る第一の要素を、
式
ＨＳ−Ｃ２−Ｃ１（Ｒ１）−ＨＮ−Ｊ２ ＩＩＩ
または
ＨＳ−Ｃ３（Ｒ３）−Ｃ２（Ｒ２）−Ｃ１（Ｒ１）−ＨＮ−Ｊ２ ＩＶ
を有し、これらの式において、Ｊ２、Ｒ１、Ｒ２、及びＲ３は、前記のとおりである、酸安定なＮ置換２または３炭素鎖アミノアルキルまたはアリールチオールから成る第二の要素に、結合させ、
その後、随意に、２または３炭素鎖アルキルまたはアリールチオールを、Ｎ置換アミド結合ライゲーション生成物から除去する、
プロセスによって生成される。好ましい実施形態においては、そのような開裂は、ペプチドに適合する開裂条件下でＣ１に共鳴安定化陽イオンを生成させることによって促進される。Ｎからのアルキルまたはアリールチオール鎖の除去により、
式
Ｊ１−Ｃ（Ｏ）−ＨＮ−Ｊ２ Ｖ
を有し、この式において、Ｊ１、Ｊ２、Ｒ１、Ｒ２、及びＲ３が前記のとおりである最終ライゲーション生成物が得られる。
【００１０】
本発明は、また、前記のような拡張天然型化学的ライゲーションを実施するための組成物及び該組成物を収容するカートリッジ及びキットにも関する。この組成物は、完全保護、部分保護、または完全非保護の酸安定なＮ置換，好ましくはＮα置換，２または３炭素鎖アミノアルキルまたはアリールチオールであって、
式
ＳＸ２−Ｃ２−Ｃ１（Ｒ１）−Ｘ１Ｎ−ＣＨ（Ｚ２）−Ｃ（Ｏ）−Ｊ２
ＶＩ
または
ＳＸ２−Ｃ３（Ｒ３）−Ｃ２（Ｒ２）−Ｃ１（Ｒ１）−Ｘ１Ｎ―ＣＨ
（Ｚ２）−Ｃ（Ｏ）−Ｊ２ ＶＩＩ
を有する。これらの式において、Ｘ１は、Ｈまたはアミノ保護基、Ｘ２は、Ｈまたはチオール保護基、Ｊ２、Ｒ１、Ｒ２、及びＲ３は前記のとおりであり、Ｚ２は、化学的ペプチド合成または拡張天然型化学的ライゲーションに適合する任意の化学成分（単なる例示として、たとえば、アミノ酸側鎖）である。本発明は、また、実質的にラセミ混合物またはジアステレオマーを含まない本発明の前記化合物のキラル形にも関する。
【００１１】
本発明は、さらに、前記の完全保護、部分保護、または完全非保護のＮ置換２または３炭素鎖アミノアルキルまたはアリールチオールの、溶液相及び固相での生成法にも関する。これらの化合物を生成する方法には、固相ペプチド合成法に適合するＮα保護、Ｎアルキル化、Ｓ保護、アミノアルキルまたはアリール−チオールアミノ酸前駆体のハロゲン仲介アミノアルキル化、還元アミノ化、及び生成が含まれる。
【００１２】
カルボキシチオエステル要素のＪ１成分は、該カルボキシチオエステルと拡張天然型化学的ライゲーションのための反応条件とに適合する任意の化学成分から成ることができ、また本発明のＮ置換要素は、単独で提供することができ、あるいはいろいろな化学成分、たとえばアミノ酸、ペプチド、ポリペプチド、核酸、または他の化学成分（たとえば、染料、ハプテン、炭水化物、脂質、固体支持体、生体適合性のポリマーもしくは他のポリマー、その他）と結合させることができる。本発明の拡張天然型化学的ライゲーション法は、強力であり、中性に近いｐＨとある範囲の温度との条件下で水性の系で実施することができる。本発明のＮ置換要素を生成する方法も強力なものであり、これらの新しい化合物を得るためのいろいろな合成経路により、予想外の高い収率で純粋の生成物を与える。本発明のＮα保護、Ｎアルキル化、Ｓ保護、アミノアルキルまたはアリール−チオールアミノ酸前駆体は、通常のペプチド合成及び他の有機合成方策を使用する、高速の自動合成のために特に有効である。さらに、本発明の保護されたＮ置換要素は、化学的ライゲーションの用途を多要素のライゲーション法まで拡張するものであり、たとえば、多重ライゲーション法たとえば三つ以上のセグメントのライゲーション法または収束的（ｃｏｎｖｅｒｇｅｎｔ）ライゲーション合成法によって、ポリペプチドを生成する場合の、多要素のライゲーション法まで拡張するものである。たとえば、本発明の方法と組成物は、カルボキシチオエステルとＮ置換要素との第一の対を使用して所望の分子の第一の部分を合成し、またカルボキシチオエステルとＮ置換要素との別の対を使用して該分子の別の部分を合成することを可能にするものである。次に、そのようにして合成されたそれぞれのライゲーション生成物を、結合させて（適当な脱保護及び／または改質の後）所望の分子を生成させることができる。
【００１３】
したがって、本発明の方法と組成物は、天然型化学的ライゲーションの範囲を大いに拡張するものであり、また本発明の出発、中間、及び最終生成物は、広範囲の用途を有する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１４】
本発明は、拡張天然型化学的ライゲーションに関係する方法と組成物にかかわる。一般に、この方法は、カルボキシルチオエステル、好ましくはα−カルボキシルチオエステル、から成る第一の要素を、酸安定なＮ置換、好ましくはＮα置換、２または３炭素鎖アミノアルキルまたはアリールチオールから成る第二の要素と結合させることを含む。第一の要素のカルボキシチオエステルと第二の要素のＮ置換２または３炭素鎖アルキルまたはアリールチオールのチオールとの間の化学選択的反応が、チオエステル結合中間体を介して進行し、初期ライゲーション生成物に変化する。もっと詳しく言うと、ＣＯＳＲチオエステル要素とアミノアルキルチオール要素との間で起こるチオール交換により、チオエステル結合中間ライゲーション生成物が生じ、該生成物は、５員環または６員環中間体を通過する自発転位の後、
式
Ｊ１−Ｃ（Ｏ）−Ｎ（Ｃ１（Ｒ１）−Ｃ２−ＳＨ）−Ｊ２ Ｉ
または
Ｊ１−Ｃ（Ｏ）−Ｎ（Ｃ１（Ｒ１）−Ｃ２（Ｒ２）−Ｃ３（Ｒ３）−ＳＨ）
−Ｊ２ ＩＩ
を有する第一のアミド結合ライゲーション生成物を生じる。これらの式において、Ｊ１、Ｊ２、Ｒ１、Ｒ２、及びＲ３は上で定義したものである。
【００１５】
ライゲーション部位にあるＮ置換２または３炭素鎖アルキルまたはアリールチオール［ＨＳ−Ｃ２−Ｃ１（Ｒ１）−］または［ＨＳ−Ｃ３（Ｒ３）−Ｃ２（Ｒ２）−Ｃ１（Ｒ１）−］は、ペプチドに適合する条件下で、生成物の損傷なしで、除去されやすく、
式
Ｊ１−Ｃ（Ｏ）−ＨＮ−Ｊ２ Ｖ
を有する最終ライゲーション生成物を生じる。この式において、Ｊ１、Ｊ２、Ｒ１、Ｒ２、及びＲ３は、上で定義したものである。この最終ライゲーション生成物はライゲーション部位に天然アミド結合を有する。
【００１６】
さらに詳しく言うと、本発明の拡張天然型化学的ライゲーション法は、（ｉ）式 Ｊ１−Ｃ（Ｏ）ＳＲ を有するα−カルボキシルチオエステルから成る第一の要素と、（ｉｉ）酸安定なＮ置換２または３炭素鎖アミノアルキルまたはアリールチオールから成る第二の要素であって、
式
Ｊ１−Ｃ（Ｏ）−Ｎ（Ｃ１（Ｒ１）−Ｃ２−ＳＨ）−Ｊ２ Ｉ
または
Ｊ１−Ｃ（Ｏ）−Ｎ（Ｃ１（Ｒ１）−Ｃ２（Ｒ２）−Ｃ３（Ｒ３）−ＳＨ）
−Ｊ２ ＩＩ
を有する第二の要素との化学的ライゲーションから成る。これらの式において、Ｊ１、Ｊ２、Ｒ１、Ｒ２、及びＲ３は、上で定義したものである。
【００１７】
Ｒ１、Ｒ２、及びＲ３基は、ペプチドに適合する開裂条件下で、Ｎ−Ｃ１結合の開裂を容易にするように選択する。たとえば、電子供与基を、特にＣ１に複合させる場合、Ｃ１に開裂を容易にする共鳴安定化陽イオンを生成させるために使用することができる。この化学的ライゲーション反応は、好ましくは、賦形剤（ｅｘｃｉｐｉｅｎｔ）としてチオール触媒を含み、水性または有機−水性混合条件下で、中性付近のｐＨ条件で実施される。第一の要素と第二の要素との化学的ライゲーションは、自発転位してＮ置換アミド結合ライゲーション生成物を生じる５員環または６員環を通じて進行させることができる。第一及び第二の要素がペプチドまたはポリペプチドである場合、Ｎ置換アミド結合ライゲーション生成物は、
式
Ｊ１−Ｃ（Ｏ）−Ｎａ（Ｃ１（Ｒ１）−Ｃ２−ＳＨ）−ＣＨ（Ｚ２）
−Ｃ（Ｏ）−Ｊ２ ＶＩＩＩ
または
Ｊ１−Ｃ（Ｏ）−Ｎａ（Ｃ１（Ｒ１）−Ｃ２（Ｒ２）−Ｃ３（Ｒ３）
−ＳＨ）−ＣＨ（Ｚ２）−Ｃ（Ｏ）−Ｊ２ ＩＸ
を有する。これらの式において、Ｊ１、Ｊ２、及びＲ１、Ｒ２、Ｒ３、及びＺ２は、上で定義したものである。
【００１８】
Ｎ置換アミド結合ライゲーション生成物の複合電子供与基Ｒ１、Ｒ２、及びＲ３は、Ｎ置換アミド結合ライゲーション生成物からの、Ｎ−Ｃ１結合の開裂及び２または３炭素鎖アルキルまたはアリールチオールの除去を容易にする。ペプチドに適合する開裂条件下でのＮのアルキルまたはアリールチオール鎖の除去により、ライゲーション部位に天然アミド結合を有するライゲーション生成物が生じる。第一及び第二の要素がペプチドまたはポリペプチドである場合、ライゲーション生成物は、
式
Ｊ１−ＣＯＮａＨ−ＣＨ（Ｚ２）−Ｃ（Ｏ）−Ｊ２ Ｘ
を有する。
【００１９】
本発明は、従来の化学的ライゲーション法に比して、多くの利点を与える。そのような利点のうちいくつかは、本発明のＮ置換２または３炭素鎖アルキルまたはアリールチオール要素の精密に調整された性質に関係する。第一に、結合されていないＮ置換要素は、酸性条件に対して安定であり、それによって強力な合成と安定した貯蔵とが行われる。第二に、該要素は、カルボキシチオエステル要素と選択的に反応して、ライゲーション部位にＮ置換アミド結合を有する初期ライゲーション生成物を生じる。第三に、初期ライゲーション生成物のライゲーション部位のＮα位置にある再生アルキルまたはアリールチオール成分は、非保護、部分保護、または完全保護ペプチド、ポリペプチド、またはその他の成分に十分に適合する条件下で、選択的に除去することができる。すなわち、アルキルまたはアリールチオール成分を、所望のライゲーション生成物に損傷を与えることなく、除去することができる。この選択的開裂反応は、ライゲーションのために選択した特定のＮ置換アルキルまたはアリールチオール成分に応じた、標準的なペプチド適合性の開裂条件下、たとえば酸性、光分解、または還元性条件下で、容易に実施することができる。したがって、本発明のもう一つの利点は、ライゲーション要素の残留部分上の一つ以上の基（存在する場合）を、意図する最終用途に応じて、非保護、部分保護、または完全保護とすることができる、ということである。さらに、与えられた、カルボキシルチオエステル及びＮ置換２または３炭素鎖アルキルまたはアリールチオールの化学選択的性質と溶解度特性との下で、ライゲーション反応は、室温付近において、水性条件下で、ｐＨ７付近で、高速かつ正確に実施して、高い生成物収率を得ることができる。したがって、本発明においては、穏やかな条件下で、部分または完全非保護ペプチド、ポリペプチド、またはその他のポリマーのライゲーションが非常に柔軟に行われる。
【００２０】
本発明のＮ置換２炭素鎖アルキルまたはアリールチオール要素を有するペプチド要素の場合、この化合物は、下記の表Ｉに示すように、
式
ＨＳ−Ｃ２−Ｃ１（Ｒ１）−ＮＨａ−ＣＨ（Ｚ２）−Ｃ（Ｏ）−Ｊ２
ＸＩ
を有する。Ｊ２及びＲ２は、前記のものであり、Ｚ２は、Ｎ置換アミノ酸に適合する任意の側鎖基、たとえばアミノ酸の側鎖、である。Ｒ１は、好ましくは、Ｃ１に対するオルトまたはパラ位置において電子供与基で置換されたフェニル基、またはピコリル基（非置換、またはＣ１に対するオルトまたはパラ位置においてヒドロキシルまたはチオールで置換されたもの）である。
【００２１】
【表１】
【００２２】
オルトまたはパラ位置のフェニル及びピコリル電子供与置換基Ｒ１'、Ｒ３'、及びＲ５'の配置は、ライゲーション後のＮ−Ｃ１結合の開裂を容易にするためのＣ１炭素への電子的複合を維持するのに必要である。Ｒ１'、Ｒ３'、及びＲ５'として好ましい電子供与基の例としては、強力な電子供与基たとえばメトキシ（−ＯＣＨ3）、チオール（−ＳＨ）、ヒドロキシル（−ＯＨ）、メチルチオ（−ＳＣＨ3）、及び中程度の電子供与体（ｄｏｎａｔｏｒ）たとえばメチル（−ＣＨ3）、エチル（−ＣＨ2−ＣＨ3）、プロピル（−ＣＨ2−ＣＨ2−ＣＨ3）、イソプロピル（−ＣＨ2（ＣＨ3）3）がある。ただし、Ｒ１'、Ｒ３'、及びＲ５'の任意のものまたはすべてをＨとすることができる。一般的な観察結果によれば、強力な電子供与基は、２炭素鎖アルキルまたはアリールチオールの、ライゲーション後の開裂に対する敏感性を高める。Ｒ１'、Ｒ３'、またはＲ５'置換基として単一の電子供与基が存在する場合、ライゲーション反応は高速で進行しうるが、開裂はゆっくりであり、あるいはより厳しい開裂条件が必要である。Ｒ１'、Ｒ３'、またはＲ５'置換基として、二つ以上の電子供与基が存在する場合、ライゲーション反応はゆっくりでありうるが、開裂は高速であり、あるいはより厳しくない開裂条件が必要である。したがって、条件に応じて特定の電子供与基を選択することができる。
【００２３】
本発明のもう一つの実施形態は、Ｎ置換２炭素鎖化合物に関する。該化合物は、Ｒ１'及びＲ５'位置にＲ１の置換基としてチオールを含む。Ｃ１に複合した電子供与基に加えて、これらの位置の一つまたは両方にチオールを導入することにより、Ｒ１基に仲介される６員環を通過して結合する化合物が生じる（また、Ｎα−２炭素鎖アルキルチオールの場合５員環を通過する）。また、この導入により、αカルボキシチオエステルとの反応のために使用できるチオールの局所濃度も増大し、構造的条件に関してさらに適当なライゲーションを良くできる立体配座が与えられる。
【００２４】
本発明のＮα置換３炭素鎖アルキルまたはアリールチオール要素に関して述べると、この化合物は、下記の表ＩＩに示す式 ＨＳ−Ｃ３（Ｒ３）−Ｃ２（Ｒ２）−Ｃ１（Ｒ１）−ＮＨα−ＣＨ（Ｚ２）−Ｃ（Ｏ）−Ｊ２ を有している。
【００２５】
【表２】
【００２６】
前述のように、Ｊ２は、化学的ペプチド合成または拡張天然型化学的ライゲーションに適合する任意の化学成分とすることができ、Ｚ２は、Ｎ置換アミノ酸に適合する任意の側鎖基たとえばアミノ酸の側鎖である。Ｒ１が水素でない場合、Ｒ２とＲ３は水素であり、Ｒ１は、非置換の、またはより好ましくはＣ１に対するオルトもしくはパラ位置において電子供与基で置換されたフェニル成分であるか、またはピコリル（非置換、またはＣ１に対するオルトもしくはパラ位置においてヒドロキシルもしくはチオールで置換されたもの）である。Ｒ２とＲ３が水素でない場合、Ｒ１は水素であり、Ｒ３とＲ２は、Ｃ１に対するオルトもしくはパラ位置において電子供与基で置換されたベンジル基であるか、またはピコリル（非置換、またはＣ１に対するオルトもしくはパラ位置においてヒドロキシルもしくはチオールで置換されたもの）である。
【００２７】
Ｎ置換２炭素鎖化合物の場合と同様に、オルトまたはパラ位置のフェニル及びピコリル電子供与置換基Ｒ１'、Ｒ３'、及びＲ５'の配置は、ライゲーション後のＮα−Ｃ１結合の確かな開裂のためのＣ１炭素への電子的複合を維持するのに必要である。しかし、Ｒ２及びＲ３がＣ２及びＣ３を有するベンジル基である場合、Ｒ１'とＲ３'のうち少なくとも一つが強力な電子供与基であり、このとき、Ｒ１'またはＲ３'がメトキシ（−ＯＣＨ3）、チオール（−ＳＨ）、ヒドロキシル（−ＯＨ）、及びチオメチル（−ＳＣＨ3）から選択される。Ｒ２とＲ３が水素であるＮ置換３炭素鎖チオールの場合、Ｒ１はフェニルまたはピコリル基から成り、このときＲ１'、Ｒ３'、及びＲ５'は、強力もしくは中程度の電子供与基またはこれらの組合せを含む。Ｎ置換２炭素鎖アルキルまたはアリールチオールの場合と同様に、強力な電子供与基は、３炭素鎖アルキルまたはアリールチオールの、ライゲーション後の開裂に対する敏感性を高める。したがって、条件に応じて特定の電子供与基またはその組合せを選択することができる。
【００２８】
本発明のＮ置換３炭素鎖化合物は、Ｎ置換２炭素鎖化合物の場合と同様に、問題の構造における置換に使用できる場合、Ｒ１'及びＲ５'位置におけるＲ１の置換基として、チオールを含むことができる。この場合も、電子供与チオール基はＣ１に複合しており、前記位置へのこの基の導入により、この化合物は、６員環形成ライゲーション現象への二つの経路を有することができる。また、この導入により、αカルボキシチオエステルとの反応のために使用できるチオールの局所濃度も増大し、構造的条件に関してさらに適当なライゲーションを良くできる配列が与えられる
【００２９】
本発明のＮ末端Ｎ置換２または３炭素鎖アルキルまたはアリールチオールアミノ酸の合成は、ここでたとえば方法Ｉ及び方法ＩＩ、ならびに実施例に述べるようにして、当業者に公知の標準的な有機化学技術を用いて、実施することができる。たとえば、"Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，Ｒｅａｃｔｉｏｎｓ，Ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ，ａｎｄ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ，"４thＥｄｉｔｉｏｎ，Ｊ．Ｍａｒｃｈ（Ｅｄ．），Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ＮＹ，１９９２；"Ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎｓ，Ａ Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ Ｇｒｏｕｐ ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎｓ，"Ｒ．Ｌａｒｏｃｋ（Ｅｄ．），ＶＣＨ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ＮＹ，１９８９，を参照されたい。これらのアミノ酸は、溶液中において、ポリマー支持合成により、またはこれらの組合せによって合成することができる。好ましい方法においては、Ｎα保護Ｎアルキル化Ｓ保護アミノアルキルまたはアリールチオールアミノ酸前駆体を使用する。合成のために使用する反応物質は商業的供給源のどこからでも得ることができる。また、十分に理解されるように、出発要素及びいろいろな中間体たとえばそれぞれのアミノ酸誘導体は、キットその他に入れて、あとからの使用のために保存することができる。
【００３０】
本発明のＮ末端Ｎα置換２または３炭素鎖アルキルまたはアリールチオールアミノ酸の生成においては、保護基法が使用される。いろいろな合成方策において使用するのに好ましい保護基（ＰＧ）は、一般に、固相ペプチド合成（"ＳＰＰＳ"）に適合するものである。場合によっては、いろいろな条件下で除去できる直交（ｏｒｔｈｏｇｏｎａｌ）保護基の使用も必要になる。多くのそのような保護基が公知であり、ここでの目的のために適当である（たとえば、"Ｐｒｏｔｅｃｔｉｎｇ Ｇｒｏｕｐｓ ｉｎ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ"３ｒｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｔ．Ｗ．Ｇｒｅｅｎｅ ａｎｄ Ｐ．Ｇ．Ｍ．Ｗｕｔｓ，Ｅｄｓ．，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，１９９９；ＮｏｖａＢｉｏｃｈｅｍ． Ｃａｔａｌｏｇ ２０００；"Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ Ｐｅｐｔｉｄｅｓ，Ａ Ｕｓｅｒ'ｓ Ｇｕｉｄｅ，"Ｇ．Ａ．Ｇｒａｎｔ，Ｅｄ．，Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ ＆ Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ＮＹ，１９９２；"Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｃｈｅｍｔｅｃｈ Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎａｌ ＆ Ｓｏｌｉｄ Ｐｈａｓｅ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，"Ｗ．Ｄ．．Ｂｅｎｎｅｔ，Ｊ．Ｗ．Ｃｈｒｉｓｔｅｎｓｅｎ，Ｌ．Ｋ．Ｈａｍａｋｅｒ，Ｍ．Ｌ．Ｐｅｔｅｒｓｏｎ，Ｍ．Ｒ．Ｒｈｏｄｅｓ，ａｎｄ Ｈ．Ｈ．Ｓａｎｅｉｉ，Ｅｄｓ．，Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｃｈｅｍｔｅｃｈ，１９９８；"Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ｏｆ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，２ｎｄ ｅｄ．，"Ｍ．Ｂｏｄａｎｓｚｋｙ，Ｅｄ．，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ，１９９３；"Ｔｈｅ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，２ｎｄ ｅｄ．，"Ｍ．Ｂｏｄａｎｓｚｋｙ ａｎｄ Ａ．Ｂｏｄａｎｓｚｋｙ，Ｅｄｓ．，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ，１９９４；"Ｐｒｏｔｅｃｔｉｎｇ Ｇｒｏｕｐｓ，"Ｐ．Ｊ．Ｋｏｃｉｅｎｓｋｉ，Ｅｄ．，Ｇｅｏｒｇ Ｔｈｉｅｍｅ Ｖｅｒｌａｇ，Ｓｔｕｔｔｇａｒｔ，Ｇｅｒｍａｎｙ，１９９４，を参照されたい）。イオウ成分の場合、適当な保護基の単なる例示としては、ベンジル、４−メチルベンジル、４−メトキシベンジル、トリチル（ｔｒｉｔｙｌ）、Ａｃｍ、ＴＡＣＡＭ、キサンチル（ｘａｎｔｈｙｌ）、ジスルフィド誘導体、ピコリル、及びフェナシル（ｐｈｅｎａｃｙｌ）がある。
【００３１】
もっと詳しく言うと、Ｎα置換２または３炭素鎖アルキルまたはアリールチオールは、方法Ｉ（Ｎα置換前駆体の固相生成）、方法ＩＩ（Ｎα置換前駆体の溶液相生成）にしたがって生成することができる。方法Ｉの場合、Ｎα置換２または３炭素鎖アルキルまたはアリールチオールは、ポリマー支持有機合成の標準的方法により、固相上で直接に集成されるが、一方、方法ＩＩのＮα保護、Ｎアルキル化、Ｓ保護、アミノアルキルまたはアリールチオールアミノ酸前駆体は、標準的な結合手順により、樹脂に結合される。方法Ｉの場合、Ｘは、水素であり、Ｒ１及びＲ２は、前記のもので、保護または非保護成分として予備生成させるかまたは樹脂上で合成することができ、Ｊ２は、好ましくはＸ−ＣＨ（Ｒ）−Ｊ２−樹脂の形にハロゲンに結合させる。この式で、Ｒは、ハロゲンまたはその他の側鎖である。容易に理解しうるように、たとえばβもしくはγアミノ酸または類似の分子の合成において、たとえば、ハロゲンＸとＪ２−樹脂とが複数の炭素によって分離される場合には、Ｊ２はいろいろな基とすることができる。グリオキサル成分（ＨＣ（Ｏ）−Ｃ（Ｏ）−Ｊ２−樹脂）が使用される場合、生成される側鎖Ｒは水素である。方法ＩＩの場合、Ｘは、ハロゲンであり、Ｒ１及びＲ２は、前記のもので、保護または非保護成分として予備生成させるかまたは溶液中もしくは樹脂上で合成することができ、ここで、Ｒは、ハロゲンまたはその他の側鎖である。グリオキサル酸成分（ＨＣ（Ｏ）−Ｃ（Ｏ）−ＯＨ）が使用される場合、生成される側鎖Ｒは水素である。前記のことから、方法ＩとＩＩが、３炭素鎖アルキルまたはアリールチオールの合成に使用することができるということは明らかであろう。ラセミまたはジアステレオマー生成物が生じる場合、拡張天然型化学的ライゲーションに使用する前に、これらを標準的な方法によって分離することが必要になりうる。
【００３２】
【化９】
【００３３】
【化１０】
【００３４】
本発明の拡張天然型化学的ライゲーション法のために使用する第一の要素のカルボキシチオエステル成分について述べると、この化合物は式 Ｊ１−ＣＯ−ＳＲ を有する。より好ましいカルボキシチオエステル要素は、式 Ｊ１−ＮＨ−Ｃ（Ｚ１）−ＣＯ−ＳＲ のα−カルボキシルチオエステルアミノ酸から成る。基Ｊ１は、化学選択反応に適合する任意の化学成分、たとえば保護もしくは非保護アミノ酸、ペプチド、ポリペプチド、その他のポリマー、染料、リンカー、その他とすることができる。Ｚ１は、αＣＯ−ＳＲチオエステルに適合する任意の側鎖基たとえばアミノ酸の側鎖である。Ｒは、チオエステル基に適合する任意の基であり、たとえば単なる例示として、アリール、ベンジル、及びアルキル基がある。Ｒの例としては、３−カルボキシ−４−ニトロフェニルチオエステル、ベンジルチオエステル、及びメルカプトプロピオン酸ロイシンチオエステルがある（たとえば、Ｄａｗｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ（１９９４）２６６：７７６−７７９；Ｃａｎｎｅ ｅｔ ａｌ．Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔ．（１９９５）３６：１２１７−１２２０；Ｋｅｎｔ，ｅｔ ａｌ．，ＷＯ９６／３４８７８；Ｋｅｎｔ，ｅｔ ａｌ．，ＷＯ９８／２８４３４；Ｉｎｇｅｎｉｔｏ ｅｔ ａｌ．，ＪＡＣＳ（１９９９）１２１（４９）：１１３６９−１１３７４；Ｈａｃｋｅｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．（１９９９）９６：１００６８−１００７３，を参照されたい）。その他の例としては、インテイン（ｉｎｔｅｉｎ）仲介生物学的方法によって生成できる、ジチオトレイトール、またはアルキルもしくはアリールチオエステルがあり、これらも公知である（たとえば、Ｃｈｏｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅ（１９９７）１９２：２７７−２８１；Ｃｈｏｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．（１９９８）２６：５１０９−５１１５：Ｅｖａｎｓ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉｅｎｃｅ（１９９８）７：２２５６−２２６４；Ｃｏｔｔｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ＆ Ｂｉｏｌｏｇｙ（１９９９）６（９）：２４７−２５６，を参照されたい）。
【００３５】
αカルボキシチオエステルは、当業者に公知の標準的な技術に従い、化学的または生物学的方法、たとえばここで述べる方法たとえば実施例に含まれるもの、によって生成することができる。化学的合成の場合、α−カルボキシチオエステルペプチドは、溶液中またはチオエステル生成樹脂によって生成することができる。その技術は公知である（たとえば、Ｄａｗｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，前記；Ｃａｎｎｅ ｅｔ ａｌ．，前記；Ｈａｃｋｅｎｇ ｅｔ ａｌ．，前記；Ｈｏｊｏ Ｈ，Ａｉｍｏｔｏ，Ｓ．（１９９１）Ｂｕｌｌ Ｃｈｅｍ Ｓｏｃ Ｊｐｎ ６４：１１１−１１７を参照されたい）。たとえば、化学合成チオエステルペプチドは、対応するペプチドα−チオ酸から作ることができ、α−チオ酸は、チオエステル樹脂上または溶液中で合成することができるが、樹脂法が好ましい。ペプチド−α−チオ酸は、対応する３−カルボキシ−４−ニトロフェニルチオエステル、対応するベンジルエステル、またはいろいろなアルキルチオエステルの任意のものに転化させることができる。これらのチオエステルは、すべて、ライゲーション反応のために十分な離脱基を与え、３−カルボキシ−４−ニトロフェニルチオエステルのほうが対応するベンジルチオエステルよりもやや大きな反応速度を示し、ベンジルチオエステルは、アルキルチオエステルよりも反応性が大きくなりうる。別の例として、トリチル会合（ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ）メルカプトプロピオン酸（ｍｅｒｃａｐｔｏｐｒｏｐｒｉｏｎｉｃ ａｃｉｄ）ロイシンチオエステル生成樹脂を、Ｃ末端チオエステルの生成のために使用することができる（Ｈａｃｋｅｎｇ ｅｔ ａｌ．，前記）。Ｃ末端チオエステル合成は、３−カルボキシプロパンスルホンアミド安全捕捉（ｓａｆｅｔｙ ｃａｔｃｈ）リンカーを使用し、ジアゾメタンまたはヨードアセトニトリルによる活性化の後、適当なチオールによる置換を行うことによっても、実現することができる（Ｉｎｇｅｎｉｔｏ ｅｔ ａｌ．，前記；Ｓｈｉｎ ｅｔ ａｌ．，（１９９９）Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，１２１，１１６８４−１１６８９）。
【００３６】
ペプチドまたはポリペプチドＣ末端α−カルボキシエステルも、生物学的方法によって生成することができる。たとえば、インテイン発現系（ｉｎｔｅｉｎ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｓｙｓｔｅｍ）を、標識、たとえば親和性標識、あり、またはなしで使用して、Ｃ末端チオエステルペプチドまたはポリペプチドセグメントを生成するのに適当なチオールの存在下で、"インテイン"たんぱく質スプライシング要素の誘導できる自己開裂活性を使用することができる。特に、インテインは、Ｃ末端チオエステルを有するペプチドセグメントを生成するチオールたとえばＤＴＴ、β−メルカプトエタノール、β−メルカプトエタンスルホン酸、またはシステインの存在下で、独特の自己開裂を引起こす。たとえば、Ｃｈｏｎｇ ｅｔ ａｌ．，（１９９７）前記；Ｃｈｏｎｇ ｅｔ ａｌ．，（１９９８）前記；Ｅｖａｎｓ ｅｔ ａｌ．，前記；及びＣｏｔｔｏｎ ｅｔ ａｌ．，前記、を参照されたい。
【００３７】
図１は、ペプチドの拡張天然型化学的ライゲーションを仲介する能力を示すことによって、本発明を説明するものであり、同じ方法は、任意の適当な分子のライゲーションの実施のために使用することができる。図示されているように、第一の要素は、式 Ｊ１−ＨＮ−ＣＨ（Ｚ１）−αＣＯ−ＳＲ のα−カルボキシルチオエステルを有し、第二の要素は、式 ＨＳ−Ｃ２−Ｃ１（Ｒ１）−ＮＨα−ＣＨ（Ｚ２）−Ｃ（Ｏ）−Ｊ２ のＮ末端の酸安定なＮα置換２炭素鎖アルキルまたはアリールチオールを有する。要素Ｊ１及びＪ２は、化学選択的ライゲーション反応に適合する任意の化学成分たとえば保護または非保護アミノ酸、ペプチド、ポリペプチド、その他のポリマー、染料、リンカー、その他とすることができる。Ｚ１は、αＣＯ−ＳＲチオエステルに適合する任意の側鎖基、たとえばアミノ酸の保護または非保護側鎖である。Ｚ２は、Ｎα置換アミノ酸に適合する任意の側鎖基、たとえばアミノ酸の保護または非保護側鎖である。Ｒ１は、Ｃ１に対する好ましくはオルトまたはパラ位置において電子供与基で置換されたベンジル成分（Ｃ１に関して述べる場合にはベンジルであり、他の場合にはフェニルである）、またはピコリル（ｐｉｃｏｌｙｌ）（非置換、またはＣ１に対するオルトまたはパラ位置においてヒドロキシルまたはチオールで置換されたもの）である。
【００３８】
チオール交換が、αＣＯＳＲチオエステル要素とアミノＮ−｛アルキルチオール｝要素との間で起こる。この交換により、チオエステル結合中間ライゲーション生成物が生じ、この生成物は、５員環中間体を通過する自発転位の後、式 Ｊ１−ＨＮ−ＣＨ（Ｚ１）−Ｃ（Ｏ）−Ｎα（Ｃ１（Ｒ１）−Ｃ２−ＳＨ）−ＣＨ（Ｚ２）−Ｃ（Ｏ）−Ｊ２ の第一のライゲーション生成物を生じ、この生成物はライゲーション部位に除去できるＮα置換２炭素鎖アルキルまたはアリールチオール［ＨＳ−Ｃ２−Ｃ１（Ｒ１）−］を有する。ライゲーション部位のこのＮα置換２炭素鎖アルキルまたはアリールチオール［ＨＳ−Ｃ２−Ｃ１（Ｒ１）−］は、ペプチドに適合する条件下で、除去しやすく、式 Ｊ１−ＨＮ−ＣＨ（Ｚ１）−ＣＯ−ＮＨ−ＣＨ（Ｚ２）−ＣＯ−Ｊ２ の最終ライゲーション生成物を生じ、この生成物はライゲーション部位に天然アミド結合を有する。
【００３９】
図２は、ペプチドの拡張天然型化学的ライゲーションを仲介する能力を示すことによって、本発明を説明するものであり、同じ方法は任意の適当な分子のライゲーションの実施のために使用することができる。図示されているように、第一の要素は、式 Ｊ１−ＨＮ−ＣＨ（Ｚ１）−αＣＯ−ＳＲ のα−カルボキシルチオエステルを有し、第二の要素は、式 ＨＳ−Ｃ３（Ｒ３）−Ｃ２（Ｒ２）−Ｃ１（Ｒ１）−ＮＨα−ＣＨ（Ｚ２）−Ｃ（Ｏ）−Ｊ２ の酸安定なＮα置換３炭素鎖アルキルまたはアリールチオールを有する。要素Ｊ１及びＪ２は、化学選択的ライゲーション反応に適合する任意の化学成分たとえば保護または非保護アミノ酸、ペプチド、ポリペプチド、その他のポリマー、染料、リンカー、その他とすることができる。Ｚ１は、αＣＯ−ＳＲチオエステルに適合する任意の側鎖基、たとえばアミノ酸の保護または非保護側鎖である。Ｚ２は、Ｎα置換アミノ酸に適合する任意の側鎖基、たとえばアミノ酸の保護または非保護側鎖である。Ｒ１が水素でない場合、Ｒ２とＲ３は水素であり、Ｒ１は、非置換の、またはＣ１に対するオルトまたはパラ位置において電子供与基で置換されたフェニル成分、ピコリル（非置換、またはＣ１に対するオルトまたはパラ位置においてヒドロキシルまたはチオールで置換されたもの）、メタンチオール、またはスルホキシメチルである。Ｒ２とＲ３が水素でない場合、Ｒ１は水素であり、Ｒ３とＲ２は、Ｃ１に対するオルトまたはパラ位置において電子供与基で置換されたベンジル基、またはピコリル（非置換、またはＣ１に対するオルトまたはパラ位置においてヒドロキシルまたはチオールで置換されたもの）である。
【００４０】
チオール交換が、ＣＯＳＲチオエステル要素とアミノアルキルチオール要素との間で起こる。この交換により、チオエステル結合中間ライゲーション生成物が生じ、この生成物は、６員環中間体を通過する自発転位の後、式 Ｊ１−ＨＮ−ＣＨ（Ｚ１）−Ｃ（Ｏ）−Ｎα（Ｃ１−Ｃ２（Ｒ２）−Ｃ３（Ｒ３）−ＳＨ）−ＣＨ（Ｚ２）−Ｊ２ の第一のライゲーション生成物を生じ、この生成物はライゲーション部位に除去できるＮα置換３炭素鎖アルキルまたはアリールチオール［ＨＳ−Ｃ３（Ｒ３）−Ｃ２（Ｒ２）−Ｃ１（Ｒ１）−］を有する。ライゲーション部位のこのＮα置換３炭素鎖アリールチオール［ＨＳ−Ｃ３（Ｒ３）−Ｃ２（Ｒ２）−Ｃ１（Ｒ１）−］は、ペプチドに適合する条件下で、除去しやすく、式 Ｊ１−ＨＮ−ＣＨ（Ｚ１）−ＣＯ−ＮＨ−ＣＨ（Ｚ２）−ＣＯ−Ｊ２ の最終ライゲーション生成物を生じ、この生成物はライゲーション部位に天然アミド結合を有する。
【００４１】
図３は多要素の拡張天然型化学的ライゲーション法を示す。図１に示すような式 ＨＳ−Ｃ２−Ｃ１（Ｒ１）−Ｎα（ＰＧ１）−ＣＨ（Ｚ２）−Ｃ（Ｏ）−Ｊ２ のＮα保護Ｎ末端ポリペプチドＮα置換２炭素鎖アルキルまたはアリールチオールを有するポリペプチドα−カルボキシルチオエステルが、Ｎ末端Ｃｙｓ残基を含むペプチドと反応する。Ｒ１は、非置換のフェニル、もしくは好ましくはＣ１に対するオルトまたはパラ位置において電子供与基で置換されたフェニル、またはピコリル（非置換、またはＣ１に対するオルトまたはパラ位置においてヒドロキシルもしくはチオールで置換されたもの）である。保護基（ＰＧ１）は、任意の適当な保護基，たとえばアルキルカルボニル保護基（たとえば、ベンジルオキシカルボニル（Ｚ）、Ｂｏｃ、Ｂｐｏｃ、Ｆｍｏｃ、その他）、トリフェニルメチル保護基（Ｔｒｔ）、２−ニトロフェニルスルフェニル保護基（Ｎｐｓ）、その他とすることができる。この保護基は第一のライゲーション反応後に除去される。
【００４２】
第一の天然型化学的ライゲーション反応は、図１に示すような式 ＨＳ−Ｃ２−Ｃ１（Ｒ１）−Ｎα（ＰＧ１）−ＣＨ（Ｚ２）−Ｃ（Ｏ）−Ｊ２ のＮα保護Ｎ末端ポリペプチドＮα置換２炭素鎖アルキルまたはアリールチオールを有するポリペプチドα−カルボキシルチオエステルと、Ｎ末端Ｃｙｓ−ペプチドとの間で行われ、式 ＨＳ−Ｃ２−Ｃ１（Ｒ１）−Ｎα（ＰＧ１）−ＣＨ（Ｚ２）−Ｃ（Ｏ）−ペプチド２−ペプチド３ の第一ライゲーション生成物を与える。次に、保護基ＰＧ１が除去され、式 ＨＳ−Ｃ２−Ｃ１（Ｒ１）−Ｎα（Ｈ）−ＣＨ（Ｚ２）−Ｃ（Ｏ）−ペプチド２−ペプチド３ のライゲーション生成物が与えられる。次に、この生成物は第三のチオエステル含有要素と反応させられる。ＣＯＳＲチオエステル要素とアミノＮ−｛アルキルチオール｝要素との間で、チオール交換が行われる。この交換により、チオエステル結合中間ライゲーション生成物が生じ、該生成物は、５員環中間体を通過する自発転位の後、式 ペプチド１−Ｃ（Ｏ）−Ｎα（Ｃ１（Ｒ１）−Ｃ２−ＳＨ）−ＣＨ（Ｚ２）−Ｃ（Ｏ）ペプチド２−Ｃｙｓ−ペプチド３ の第二のライゲーション生成物を生じ、該生成物は、第二のライゲーション部位に除去できるＮα置換２炭素鎖アルキルまたはアリールチオール［ＨＳ−Ｃ２−Ｃ１（Ｒ１）−］を有する。第二のライゲーション部位のこのＮα置換２炭素鎖アルキルまたはアリールチオール［ＨＳ−Ｃ２−Ｃ１（Ｒ１）−］は、ペプチドに適合する条件下で、除去されやすく、第一及び第二のライゲーション部位に天然アミド結合を有する、式 ペプチド１−Ｃ（Ｏ）−ＮαＨ−ＣＨ（Ｚ２）−Ｃ（Ｏ）ペプチド２−Ｃｙｓ−ペプチド３ の最終ライゲーション生成物を生じる。
【００４３】
図１、２、及び３に示すように、第一のカルボキシチオエステル要素を有する本発明のＮ置換２または３炭素鎖アルキルまたはアリールチオール要素は、ライゲーション部位にＮ置換アミド結合を有するライゲーション生成物を生じる。反応のライゲーション条件は、Ｎ置換２または３炭素鎖アルキルまたはアリールチオール成分とのチオエステルの選択的反応性が維持されるように、選択される。好ましい実施形態の場合、ライゲーション反応は、ｐＨ６〜８、好ましくはｐＨ６．５〜７．５、を有する緩衝液中で実施される。この緩衝液は水性、有機、またはこれらの混合物とすることができる。ライゲーション反応は、また、一つ以上の触媒及び／または一つ以上の還元剤、脂質、界面活性剤、その他の変性剤または可溶化剤、ならびにその他を含むことができる。好ましい触媒の例としては、チオール及びホスフィン含有成分たとえばチオフェノール、ベンジルメルカプタン、ＴＣＥＰ、及びアルキルホスフィンがある。変性剤及び／または可溶化剤の例としては、グアニジニウム、尿素の水溶液もしくは尿素を有機溶剤たとえばＴＦＥ、ＨＦＩＰ、ＤＭＦ、ＮＭＰに溶解させたもの、アセトニトリルと水との混合物、またはアセトニトリルをグアニジニウムと尿素との水溶液と混合したもの、がある。温度も、ライゲーション反応の速度の調節のために使用することができる。温度は、通常５〜５５℃、好ましくは１５〜４０℃、とする。一例として、ライゲーション反応は、６Ｍのグアニジニウム中に２％のチオフェノールを含むｐＨ６．８〜７．８の反応系において、十分に進行する。
【００４４】
Ｎ置換２炭素鎖アルキルまたはアリールチオールの場合、ライゲーション現象は、ＣＯＳＲチオエステル要素とアミノアルキルチオール要素との間で起こるチオール交換によって生じる。この交換によりチオエステル結合中間ライゲーション生成物が生じ、該生成物は、５員環中間体を通過する自発転位の後、式 Ｊ１−ＨＮ−ＣＨ（Ｚ１）−Ｃ（Ｏ）−Ｎα（Ｃ１（Ｒ１）−Ｃ２−ＳＨ）−ＣＨ（Ｚ２）−Ｊ２ を有する第一のライゲーション生成物を生じ、この生成物は、ライゲーション部位に除去できるＮ置換２炭素鎖アルキルまたはアリールチオール［ＨＳ−Ｃ２−Ｃ１（Ｒ１）−］を有する。ここで、置換基は前記のとおりである。ライゲーション部位にあるＮ置換２炭素鎖アルキルまたはアリールチオール［ＨＳ−Ｃ２−Ｃ１（Ｒ１）−］は、ペプチドに適合する条件下で除去されやすく、ライゲーション部位に天然アミド結合を有する、式 Ｊ１−ＨＮ−ＣＨ（Ｚ１）−ＣＯ−ＮＨ−ＣＨ（Ｚ２）−ＣＯ−Ｊ２ の最終ライゲーション生成物を生じる。
【００４５】
Ｎ置換３炭素鎖アリールまたはアルキルチオールの場合、ＣＯＳＲチオエステル要素とアミノアルキルチオール要素との間のチオール交換によって、チオエステル結合中間ライゲーション生成物が生じ、該生成物は、６員環中間体を通過する自発転位の後、式 Ｊ１−ＨＮ−ＣＨ（Ｚ１）−Ｃ（Ｏ）−Ｎα（Ｃ１−Ｃ２（Ｒ２）−Ｃ３（Ｒ３）−ＳＨ）−ＣＨ（Ｚ２）−Ｊ２ を有する第一のライゲーション生成物を生じ、この生成物は、ライゲーション部位に除去できるＮ置換３炭素鎖アルキルまたはアリールチオール［ＨＳ−Ｃ３（Ｒ３）−Ｃ２（Ｒ２）−Ｃ１（Ｒ１）−］を有する。ライゲーション部位にあるＮ置換３炭素鎖アリールチオール［ＨＳ−Ｃ３（Ｒ３）−Ｃ２（Ｒ２）−Ｃ１（Ｒ１）−］は、ペプチドに適合する条件下で除去されやすく、ライゲーション部位に天然アミド結合を有する、式 Ｊ１−ＨＮ−ＣＨ（Ｚ１）−ＣＯ−ＮＨ−ＣＨ（Ｚ２）−ＣＯ−Ｊ２ の最終ライゲーション生成物を生じる。
【００４６】
Ｎ置換アルキルまたはアリールチオール基の除去は、好ましくは、Ｎ−Ｃ１結合の開裂を促進する酸性条件下で実施し、ライゲーション部位に安定化された非置換アミド結合を生じるようにする。"ペプチドに適合する開裂条件"という言葉は、ペプチドに適合し、またライゲーション生成物からのＮ結合アルキルまたはアリールチオール成分の開裂に適した物理化学的条件を意味するものとする。ペプチドに適合する開裂条件は、一般に、使用するＮαアルキルまたはアリールチオール成分に合わせて選択する。これらの成分は、定型的な周知の方法によって容易に誘導することができる（たとえば、"Ｐｒｏｔｅｃｔｉｎｇ Ｇｒｏｕｐｓ ｉｎ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ"３ｒｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｔ．Ｗ．Ｇｒｅｅｎｅ ａｎｄ Ｐ．Ｇ．Ｍ．Ｗｕｔｓ，Ｅｄｓ．，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，１９９９；ＮｏｖａＢｉｏｃｈｅｍ． Ｃａｔａｌｏｇ ２０００；"Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ Ｐｅｐｔｉｄｅｓ，Ａ Ｕｓｅｒ'ｓ Ｇｕｉｄｅ，"Ｇ．Ａ．Ｇｒａｎｔ，Ｅｄ．，Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ ＆ Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ＮＹ，１９９２；"Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｃｈｅｍｔｅｃｈ Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎａｌ ＆ Ｓｏｌｉｄ Ｐｈａｓｅ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，"Ｗ．Ｄ．．Ｂｅｎｎｅｔ，Ｊ．Ｗ．Ｃｈｒｉｓｔｅｎｓｅｎ，Ｌ．Ｋ．Ｈａｍａｋｅｒ，Ｍ．Ｌ．Ｐｅｔｅｒｓｏｎ，Ｍ．Ｒ．Ｒｈｏｄｅｓ，ａｎｄ Ｈ．Ｈ．Ｓａｎｅｉｉ，Ｅｄｓ．，Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｃｈｅｍｔｅｃｈ，１９９８；"Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ｏｆ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，２ｎｄ ｅｄ．，"Ｍ．Ｂｏｄａｎｓｚｋｙ，Ｅｄ．，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ，１９９３；"Ｔｈｅ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，２ｎｄ ｅｄ．，"Ｍ．Ｂｏｄａｎｓｚｋｙ ａｎｄ Ａ．Ｂｏｄａｎｓｚｋｙ，Ｅｄｓ．，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ，１９９４；"Ｐｒｏｔｅｃｔｉｎｇ Ｇｒｏｕｐｓ，"Ｐ．Ｊ．Ｋｏｃｉｅｎｓｋｉ，Ｅｄ．，Ｇｅｏｒｇ Ｔｈｉｅｍｅ Ｖｅｒｌａｇ，Ｓｔｕｔｔｇａｒｔ，Ｇｅｒｍａｎｙ，１９９４，を参照されたい）。
【００４７】
たとえば、Ｒ１'、Ｒ２'、またはＲ３'置換基が、メトキシ、ヒドロキシル、チオールまたはチオメチル、メチル、及びその他から成る場合、除去のためのより汎用的な方法は、ペプチド合成化学において一般的な酸性開裂条件を含む。この条件は、強酸性条件下または水−酸の条件下で、還元剤及び／またはスカベンジャー系（たとえば、酸、たとえば無水フッ化水素（ＨＦ）、トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）、またはトリフルオロメタンスルホン酸（ＴＦＭＳＡ）、その他）ありまたはなしで、Ｎ−Ｃ１結合を開裂させることを含む。それぞれの酸性開裂系は、所定の構造のためにアリールまたはアルキルチオール成分を除去するために、Ｎα−Ｃ１結合の開裂が最適化されるように選択することができる。そのような条件は、周知であり、ペプチドの完全性を維持するのに適合したものである。開裂のための別の方法においては、ペプチドまたはポリへプチド配列にトリプトファンが存在する場合にチオールスカベンジャーを使用し、トリプトファン側鎖と遊離したアリールまたはアルキルチオール成分との反応が起こらないようにする。チオールスカベンジャーの例としては、エタンジオール、システイン、β−メルカプトエタノール、及びチオクレゾールがある。したがって、本発明の別の実施形態は、アリールまたはアルキルチオール成分を除去するためにＮ−Ｃ１結合を開裂させる場合に、チオールスカベンジャーの添加を含むものである。
【００４８】
その他の特別の開裂条件は、ピコリル基が置換基である場合、光または還元開裂条件を含む。一例として、Ｒ１、またはＲ２及びＲ３置換基がピコリル成分から成る場合、光分解（たとえば、紫外線）、亜鉛／酢酸または電解還元を、標準的な手順に従う開裂に使用することができる。Ｎ置換２炭素鎖チオールのＲ１がＲ１にあるチオメタンから成る場合、水銀（ＩＩ）またはＨＦ開裂が使用できる。この開裂系は、また、第一または第二のライゲーション要素が他の保護基を有する場合、固体支持体からの同時開裂のため、及び／または脱保護反応物質として、使用することができる。たとえば、Ｎ−ピコリル基は、活性化亜鉛（〜０．５ｇ／ｍｌ）を含む１０％酢酸／水溶液にポリペプチドを溶解させることによって除去することができる。チオメタン基たとえば２−メルカプト，１−メチルスルフィニルエタン基（ＨＳ−Ｃ２−Ｃ１（Ｓ（Ｏ）−ＣＨ３）−Ｎα）は、ライゲーションの後、還元及び水銀、メルカプタン仲介開裂によって除去することができる。一例として、メチルスルフィニルエタン基は、チオメタン形への還元のために、Ｎ−メチルメルカプトアセトアミド（ＭＭＡ）を含む３％酢酸水溶液にポリペプチドを溶解させ（たとえば、０．５ｍｌの酢酸／水と０．０５ｍｌのＭＭＡとに１ｍｇのポリペプチド）、一晩の反応後、混合物を凍結乾燥（ｆｒｅｅｚｉｎｇ ａｎｄ ｌｙｏｐｈｉｌｉｚａｔｉｏｎ）することによって除去することができる。その後、還元された補助基を、酢酸水銀（Ｈｇ（ＯＡＣ）2）を含む３％水溶液中で（たとえば、水に０．５ｍｌの酢酸を加えた溶液に１０ｍｇのＨｇ（ＯＡＣ）2を添加したものに、約１時間）処理してから、β−メルカプトエタノール（たとえば、０．２ｍｌのβメルカプトエタノール）を添加することによって、除去することができる。次に、生成物を、標準的な方法たとえば逆相ＨＰＬＣ（ＲＰＨＰＬＣ）によって精製することができる。
【００４９】
容易に理解しうるであろうが、開裂系には、一つ以上の触媒及び／または賦形剤、たとえば一つ以上のスカベンジャー、界面活性剤、溶剤、金属、その他をも使用することができる。一般に、特定スカベンジャーの選択は存在するアミノ酸に応じてなされる。たとえば、スカベンジャーの存在は、開裂時に生じるカルボニウムイオンがある種のアミノ酸（たとえば、Ｍｅｔ、Ｃｙｓ、Ｔｒｐ、及びＴｙｒ）に対して及ぼしうる損傷効果を抑えるために、使用することができる。その他の添加剤たとえば界面活性剤、ポリマー、塩、有機溶剤、その他も、溶解度を調節して開裂を改善するために使用することができる。レドックス系を調節する触媒その他の化学物質も、有効なものでありうる。また、容易に理解しうるように、いろいろな他の物理−化学的条件たとえば緩衝系、ｐＨ、及び温度を通常のように調節して、所定の開裂系を最適化することができる。
【００５０】
本発明は、また、保護された形の、本発明のＮα置換２または３炭素鎖アルキルまたはアリールチオールを与える。これらの化合物は、自動ペプチド合成ならびに直交及び収束（ｏｒｔｈｏｇｏｎａｌ ａｎｄ ｃｏｎｖｅｒｇｅｎｔ）ライゲーション法において、特に有用である。これらの化合物は、下記の表ＩＩＩ及び表ＩＶに示す、式 （ＰＧ２）Ｓ−Ｃ２−Ｃ１（Ｒ１）−Ｎα（ＰＧ１）−ＣＨ（Ｚ２）−Ｃ（Ｏ）−Ｊ２ または （ＰＧ２）Ｓ−Ｃ３（Ｒ３）−Ｃ２（Ｒ２）−Ｃ１（Ｒ１）−Ｎα（ＰＧ１）−ＣＨ（Ｚ２）−Ｃ（Ｏ）−Ｊ２ の、完全保護、部分保護、または完全非保護酸安定Ｎα置換２または３炭素鎖アミノアルキルまたはアリールチオールから成る。特に、Ｒ１、Ｒ２、及びＲ３のうち一つ以上がＣ１に複合した電子供与基を有し、該基は、Ｎα置換アミノアルキルまたはアリールチオールの、Ｎα置換アミドアルキルまたはアリールチオールへの転化の後、Ｃ１において共鳴安定陽イオンを形成することができ、該イオンはペプチドに適合する開裂条件下でＮα−Ｃ１結合の開裂を促進する。ＰＧ１及びＰＧ２は保護基であって、これらは個別または組合せで存在し、あるいは存在しない場合もあり、同じかまたは異なるものであることができる。ここで、Ｚ２は、化学的ペプチド合成または拡張天然型化学的ライゲーションに適合する任意の化学成分であり、またここで、Ｊ２は、化学的ペプチド合成または拡張天然型化学的ライゲーションに適合する任意の化学成分である。
【００５１】
ＰＧ１（またはＸ１）は、アミンを保護するための基である。ＰＧ２（またはＸ２）は、チオールを保護するための基である。多くのそのような保護基が公知であり、ここでの目的のために適当である（たとえば、"Ｐｒｏｔｅｃｔｉｎｇ Ｇｒｏｕｐｓ ｉｎ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ"３ｒｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｔ．Ｗ．Ｇｒｅｅｎｅ ａｎｄ Ｐ．Ｇ．Ｍ．Ｗｕｔｓ，Ｅｄｓ．，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，１９９９；ＮｏｖａＢｉｏｃｈｅｍ． Ｃａｔａｌｏｇ ２０００；"Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ Ｐｅｐｔｉｄｅｓ，Ａ Ｕｓｅｒ'ｓ Ｇｕｉｄｅ，"Ｇ．Ａ．Ｇｒａｎｔ，Ｅｄ．，Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ ＆ Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ＮＹ，１９９２；"Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｃｈｅｍｔｅｃｈ Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎａｌ ＆ Ｓｏｌｉｄ Ｐｈａｓｅ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，"Ｗ．Ｄ．．Ｂｅｎｎｅｔ，Ｊ．Ｗ．Ｃｈｒｉｓｔｅｎｓｅｎ，Ｌ．Ｋ．Ｈａｍａｋｅｒ，Ｍ．Ｌ．Ｐｅｔｅｒｓｏｎ，Ｍ．Ｒ．Ｒｈｏｄｅｓ，ａｎｄ Ｈ．Ｈ．Ｓａｎｅｉｉ，Ｅｄｓ．，Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｃｈｅｍｔｅｃｈ，１９９８；"Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ｏｆ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，２ｎｄ ｅｄ．，"Ｍ．Ｂｏｄａｎｓｚｋｙ，Ｅｄ．，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ，１９９３；"Ｔｈｅ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，２ｎｄ ｅｄ．，"Ｍ．Ｂｏｄａｎｓｚｋｙ ａｎｄ Ａ．Ｂｏｄａｎｓｚｋｙ，Ｅｄｓ．，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ，１９９４；"Ｐｒｏｔｅｃｔｉｎｇ Ｇｒｏｕｐｓ，"Ｐ．Ｊ．Ｋｏｃｉｅｎｓｋｉ，Ｅｄ．，Ｇｅｏｒｇ Ｔｈｉｅｍｅ Ｖｅｒｌａｇ，Ｓｔｕｔｔｇａｒｔ，Ｇｅｒｍａｎｙ，１９９４，を参照されたい）。
【００５２】
【表３】
【００５３】
ＰＧ１及びＸ１として好ましい保護基の単なる例示としては、［Ｂｏｃ（ｔ−ブチルカルバメート）、Ｔｒｏｃ（２，２，２，−トリクロロエチルカルバメート）、Ｆｍｏｃ（９−フルオレニルメチルカルバメート）、Ｂｒ−ＺまたはＣｌ−Ｚ（Ｂｒ−またはＣｌ−ベンジルカルバメート）、Ｄｄｅ（４，４，−ジメチル−２，６−ジオキソシクロエクス１−イリデン）、ＭｓＺ（４−メチルスルフィニルベンジルカルバメート）、Ｍｓｃ（２−メチルスルホエチルカルバメート）、Ｎｓｃ（４−ニトロフェニルエチルスルホニル−エチルオキシカルボニル）がある。好ましいＰＧ１及びＸ１保護基は、"Ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ Ｇｒｏｕｐｓ ｉｎ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，"Ｇｒｅｅｎ ａｎｄ Ｗｕｔｓ，Ｔｈｉｒｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ，（１９９９）から選択され、もっとも好ましいのはＦｍｏｃ及びＮｓｃである。ＰＧ２として好ましい保護基の単なる例示としては、［Ａｃｍ（アセトアミドメチル）、ＭｅＯＢｚｌまたはＭｏｂ（ｐ−メトキシベンジル）、ＭｅＢｚｌ（ｐ−メチルベンジル）、Ｔｒｔ（トリチル）、Ｘａｎ（キサンテニル）、ｔＢｕｔｈｉｏ（ｓ−ｔ−ブチル）、Ｍｍｔ（ｐ−メトキシトリチル）、２または４ピコリル（２または４ピリジル）］、Ｆｍ（９−フルオレニルメチル）、ｔＢｕ（ｔ−ブチル）、Ｔａｃａｍ（トリメチルアセトアミドメチル）］がある。好ましい保護基ＰＧ２及びＸ２は、"Ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ Ｇｒｏｕｐｓ ｉｎ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，"Ｇｒｅｅｎ ａｎｄ Ｗｕｔｓ，Ｔｈｉｒｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ，（１９９９），から選択され、もっとも好ましいのは、Ａｃｍ、Ｍｏｂ、ＭｅＢｚｌ、ピコリルである。
【００５４】
直交保護法は、異なる化学的機構によって除去される二つ以上の種または基を含み、したがって任意の順序で、他の種の存在下で、除去することができる。直交法は相当に穏やかな全体的条件の可能性を与える。選択性を、反応速度ではなく、化学的性質の違いにもとづいて実現できるからである。
【００５５】
【表４】
【００５６】
本発明の保護された形のＮα置換２または３炭素鎖アルキルまたはアリールチオールは、前記の方法ＩまたはＩＩにしたがって生成することができる。
【００５７】
図４は、二つの異なる１−フェニル−２−メルカプトエチル補助基を使用する、本発明のライゲーション方策の概要を示す。
【００５８】
図５Ａ及び５Ｂは、Ｎα−１−（４−メトキシフェニル）−２−メルカプトエチル補助基を使用する、実施例２１で述べるようなシトクロムｂ５６２に対するライゲーション反応に関する、分析高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）の結果を示す。図５Ａは、時刻＝０におけるライゲーション反応の状態を示す。図５Ｂは、反応を一晩進行させたあとのライゲーションの状態を示す。また、図５Ｂに示されているように、Ｎα−１−（４−メトキシフェニル）−２−メルカプトエチル補助基のＣ１の非キラル中心から生じる二つのライゲーション生成物が観察される。
【００５９】
図６Ａ及び６Ｂは、Ｎα−｛１−（４−メトキシフェニル）２−メルカプトエタノ｝改質Ｎ末端セグメントとの拡張天然型化学的ライゲーションを使用することによって生成されたライゲーション生成物シトクロムｂ５６２残基１−１０６の再構成エレクトロスプレー（ｒｅｃｏｎｓｔｒｕｃｔｅｄ ｅｌｅｃｔｒｏｓｐｒａｙ）質量分析（ＭＳ）の結果を示す。Ｃ末端αチオエステルを有するシトクロムｂ５６２残基１−６３が、Ｎ末端Ｎα−｛１−（４−メトキシフェニル）２−メルカプトエタノ｝グリシンを有するシトクロムｂ５６２残基６４−１０６と結合している。図６Ａは、ライゲーション部位に除去できるＮα−｛１−（４−メトキシフェニル）２−メルカプトエタノ｝基を有する初期ライゲーション生成物のＭＳ再構成を示す。図６Ｂは、ライゲーション部位に天然アミド結合を生成させるためにＮα−｛１−（４−メトキシフェニル）２−メルカプトエタノ｝基を除去するフッ化水素（ＨＦ）処理後のライゲーション生成物のＭＳ再構成を示す。測定された質量は、１１９４８±１Ｄａ（ＨＦ処理前）及び１１７８１±１Ｄａ（ＨＦ処理後）であって、損失は１６７±２Ｄａであり、これは、１−（４−メトキシフェニル）２−メルカプトエタノ補助基の除去に関して予想される１６６Ｄａの損失とよく一致している。
【００６０】
図７Ａ及び７Ｂは、図６Ｂに示す直鎖状シトクロムｂ５６２物質の代表的な分析ＨＰＬＣの結果（図７Ａ）、及び折りたたみ（ｆｏｌｄｉｎｇ）後の該物質のイオン交換クロマトグラム（図７Ｂ）を示す。
【００６１】
本発明の化合物は、いろいろな手段のいずれか、たとえばハロゲン仲介アミノアルキル化、還元アミノ化によって、また固相または溶液アミノ酸またはペプチド合成法に適合する、Ｎα保護、Ｎアルキル化、Ｓ保護、アミノアルキルまたはアリールチオールアミノ酸前駆体を用いることによって生成することができる。必要な場合には、許容されるキラル純度の化合物を与えるために、生成されるラセミ混合物またはジアステレオマーの分離を、標準的な方法によって実施することができる。
【００６２】
上述のように、場合によっては、許容されるキラル純度のＮα置換２または３炭素鎖アルキルまたはアリールチオールが好ましい。実施例２１及び図５Ｂに示すように、シトクロムｂ５６２の生成におけるＮα−１−（４−メトキシフェニル）−２−メルカプトエチル補助基の使用により、精製プロファイルの重なった二つのライゲーション生成物（ジアステレオマー）が生じた。Ｎα補助基の除去により、単一の主生成物が生じるが、小さなパーセンテージの欠失（ｄｅｌｅｔｉｏｎ）と副反応生成物とが最終生成物に存在し、これは好ましくないと思われる。たとえば、ｃｙｔ ｂ５６２の合成に使用するＮα−１−（４−メトキシフェニル）−２−メルカプトエチル補助基の合成に使用される実施例４〜６に述べるような還元アミノ化合成法の場合、必ず、キラル中心Ｃ１に二つのエピマーの生成がもたらされる。必要な場合、前記のように、許容されるキラル純度の化合物を与えるために、生成されるラセミ混合物及びジアステレオマーの分離を、標準的な方法によって実施することができる。
【００６３】
許容されるキラル純度の本発明のＮα補助基を得るための標準的な方法は、（１）キラルクロマトグラフィー、（２）キラル合成、（３）共有ジアステレオマー抱合体の使用、及び（４）鏡像体的に純粋なキラル補助基を与えるための結晶化または他の通常の分離法、である。（たとえば、Ａｈｕｊａ，Ｓａｔｉｎｄｅｒ．'Ｃｈｉｒａｌ ｓｅｐａｒａｔｉｏｎｓ．Ａｎ ｏｖｅｒｖｉｅｗ．'ＡＣＳ Ｓｙｍｐ．Ｓｅｒ．（１９９１），４７１（Ｃｈｉｒａｌ Ｓｅｐ．Ｌｉｑ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ．），１−２６；Ｃｏｌｌｅｔ，Ａｎｄｒｅ．"Ｓｅｐａｒａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ Ｅｎａｎｔｉｏｍｅｒｓ ｂｙ Ｃｒｙｓｔａｌｌｉｚａｔｉｏｎ Ｍｅｔｈｏｄｓ，"Ｉｎ：Ｅｎａｎｔｉｏｍｅｒ（１９９９）４：１５７−１７２；Ｌｏｐａｔａ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｃｈｅｍ．Ｒｅｓ．Ｍｉｎｉｐｐｒｉｎｔ（１９８４）１０：２９３０−２９６２；Ｌｏｐａｔａ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｃｈｅｍ．Ｒｅｓ．（１９８４）１０：２９５３−２９７３；Ａｈｕｊａ，Ｓａｔｉｎｄｅｒ．'Ｃｈｉｒａｌ ｓｅｐａｒａｔｉｏｎｓ ａｎｄ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：ａｎ ｏｖｅｒｖｉｅｗ．'Ｃｈｉｒａｌ Ｓｅｐ．（１９９７），１−７；Ｃｈｉｒａｌ Ｓｅｐａｒａｔｉｏｎｓ：Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ａｎｄ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ．Ａｈｕｊａ Ｓａｔｉｎｄｅｒ；Ｅｄｉｔｏｒ．ＵＳＡ．（１９９７），３４９ｐｐ．Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒ：（ＡＣＳ，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，Ｄ．Ｃ．）を参照されたい）。これらの標準的な方法のやり方はすべて、許容されるキラル純度の化合物を得るために、ラセミ混合物またはジアステレオマーの分離に使用することができる。たとえば、結晶化を、鏡像体（鏡像異性体）の光学的分離のために使用することができる。キラルクロマトグラフィーの場合、周知のように、ラセミ混合物を、キラル媒質を使用する分離（ｐｒｅｐａｒａｔｉｖｅ）クロマトグラフィーによって、キラル的に純粋な鏡像体に分離することができる。たとえば、キラルＮα補助基の全体的合成のための還元アミノ化法によって生成されるラセミ混合物を使用して、キラル的に純粋な形のそれぞれの鏡像体を生成することができる。これは、たとえば、下にアミノ酸補助基に関して示すように、なされる（ここでＲは、たとえば、アミノ酸側鎖である）。
【化１１】
【００６４】
どちらか一方の鏡像体をキラル的に純粋の形で得ることができ、あるいは両方をキラル的に純粋の形で得ることができる。どちらの鏡像体も、キラル的に純粋な補助基で改質した要素たとえばペプチドセグメント（すなわち、二つのキラル的に純粋なエピマー）の生成に使用することができ、これらの要素は、他のエピマー及び不純物の存在による妨害なしで厳重に精製することができる。両方の鏡像体を使用するという何らかの備えがなされない限り、補助基の全量の５０％が無駄になるということに注意されたい。このとき、たとえば、二つのキラル的に純粋な補助基で改質されたペプチドセグメントを、別々のＥＮＣＬ反応に使用して、キラル的に純粋な補助基で改質されたライゲーション生成物の混合物を得ることができる。分離精製の後、補助基をエピマーライゲーション生成物から除去し（個別に、または化合させたあと）、同じ天然構造のライゲーション生成物を得る。その後、これを精製する。
【００６５】
キラル合成の場合、好ましい方法においては、鏡像体的に純粋なキラル出発材料を使用する。これを、下にパラ−メトキシフェニル置換Ｎα−２炭素補助基に関して示す。
【化１２】
得られるキラル的に純粋な前駆体化合物を、次に、どちらかの保護された（Ｎ置換）アミノ酸を作るために使用することができる。すなわち、下記のようである。
【化１３】
または、前記化合物を、直接に'サブモノマー'ペプトイド（ｐｅｐｔｏｉｄ）法で使用して、ポリマー支持体上に補助基で改質したペプチドを生成させることができる。すなわち、下記のようである。
【化１４】
その後の脱保護／開裂により、キラル的に純粋な形の補助基改質ペプチドセグメントが得られる。すなわち、下記のようである。
【化１５】
たとえば、本発明のキラル的に純粋なＮα補助基を、容易に得られるキラリティー既知のパラ置換フェニルグリシンから作ることができる。この場合、キラリティーが既知なので、得られる補助基のキラリティーとキラル純度をあらかじめ見積もることができる。
【００６６】
あるいは、別の好ましい実施形態では、非対称還元を使用して補助基を生成させる鏡像体選択合成を使用する。たとえば、下記のようである。
【化１６】
非対称還元は、Ｎα補助基改質アミノ酸を生成させるための鏡像体選択合成にも使用することができる。たとえば、グリシンの場合、下記のようである。
【化１７】
適当に実施された非対称合成の場合、一つの鏡像体が他の鏡像体に対してかなり過剰に生成されるが、それでもかなりの量の他の鏡像体が存在すると予想される。後者は、純粋な形の主要鏡像体を得るためのキラル精製ステップにより処理することができる。鏡像体選択合成法の主要な利点は、キラルクロマトグラフィー分離が容易であり、また大量の材料が廃棄（浪費）されない、ということである。
【００６７】
もう一つの好ましい標準的方法は、共有ジアステレオマー抱合体を使用する分離である。一般に、この方法では、たとえば下記のように、キラルアミノ酸（たとえば、Ａｌａ）を使用して、ラセミ補助基混合物を改質し、また標準的な（非キラル）クロマトグラフィー法により生成されたジアステレオマーを分離する。たとえば、ラセミ補助基１を、第二のキラル中心の共有取り込みにより、ジアステレオマーの混合物に転化させることができる。すなわち、下記のようである。
【化１８】
この場合、ラセミ混合物は、ＳＮ求核反応（反転（ｉｎｖｅｒｓｉｏｎ）を伴う）によって、（Ｒ）２−Ｂｒ−プロピオン酸と反応し、示されている一対のジアステレオマーを生成する。ここでは、実際に、Ｎ結合キラルチオール含有補助基によって、Ｌ−Ａｌａを生成させた。
【００６８】
一般に、これら二つの化合物は、ジアステレオマーとしては、非キラル（ａｃｈｒａｌ）クロマトグラフィー条件下で、異なるクロマトグラフィー挙動を示し、したがって実用的な分離条件下で分離して、純粋のエピマーを別々に得ることができる。Ｎα成分の適当な保護の後、それぞれの化合物を使用して、非保護または部分保護された、Ｎ末端Ａｌａ残基を有する、キラル的に純粋の補助基で改質されたペプチドセグメントを生成させることができる。
【００６９】
本発明の保護されたＮα置換要素は、通常のペプチド合成を使用する高速自動合成及びその他の有機合成法において、特に有効である。また、これらの要素は、化学的ライゲーションの使用を多要素ライゲーション法にまで拡張するものであり、たとえば、直交ライゲーション法、たとえば三つ以上のセグメントのライゲーション法または収束ライゲーション合成法、が関与するポリペプチドの生成の場合にまで拡張するものである。
【００７０】
たとえば、本発明の拡張天然型化学的ライゲーション法と組成物とは、求核物質に対して安定なチオエステル生成法及びチオエステル安全捕捉（ｓａｆｅｔｙ ｃａｔｃｈ）法と組合わせて、たとえば本願と同時係属中のＰＣＴ出願番号［未付与］明細書（２００１年８月３１日出願）、及び米国仮特許出願第６０／２２９，２９５号明細書（２０００年９月１日出願）に記載されているオルトチオロエステル及びカルボキシエステルチオールとともに、使用することができる。なお、これらの明細書は、参照により本明細書に組み込まれるものとする。簡単に言えば、求核物質に対して安定なチオエステル生成化合物は、オルトチオロエステルまたはカルボキシエステルチオールから成り、これらの化合物は、有機合成、たとえばペプチドチオエステル、ポリペプチドチオエステル、及びその他のポリマーチオエステルの生成、において幅広い用途を有する。求核物質に対して安定なチオエステル生成化合物は、強力な求核物質（たとえば、Ｆｍｏｃ ＳＰＰＳによって生成されたペプチドまたはポリペプチド）が使用される条件下で生成される前駆体から活性化チオエステルを生成させる場合、また意図する特定のライゲーションまたは複合反応を導くための両立する選択保護法が必要な（または、その使用により利益を受ける）多段階ライゲーションまたは複合法の場合に、特に有用である。求核物質に対して安定なオルトチオロエステルは、式 Ｘ−Ｃ（ＯＲ'）2−Ｓ−Ｒ を有し、ここでＸは、意図する標的分子であり、随意に一つ以上の求核物質によって開裂することのできる保護基を有し、Ｒ'は、非求核開裂条件下で除去することのできる求核物質に対して安定な保護基であり、Ｒは、オルトチオロエステル−Ｃ（ＯＲ'）−Ｓ−に適合する任意の基である。求核物質に対して安定なオルトチオロエステルチオエステル生成樹脂も存在し、これは、式 Ｘ−Ｃ（ＯＲ'）2−Ｓ−Ｒ−リンカー−樹脂 または Ｘ−Ｃ（（ＯＲ1'−リンカー−樹脂（ＯＲ2'））−ＳＲ を有する。ここで、Ｘ、Ｒ'、及びＲは、前記のとおりであり、リンカーと樹脂は、固相有機合成で使用するのに適当な求核物質に対して安定な任意のリンカーと樹脂、たとえば、後で開裂のために求核物質に対して不安定なリンカーに転化させることのできる安全捕捉リンカーである。求核物質に対して安定なオルトチオロエステルは、いろいろな非求核条件たとえば酸加水分解条件によって、活性チオエステルに転化させることができる。求核物質に対して安定なカルボキシエステルチオールは、式 Ｘ−Ｃ（Ｏ）−Ｏ−ＣＨ（Ｒ''）−（ＣＨ2）n−Ｓ−Ｒ''' を有し、ここでＸは、求核物質に対して不安定な保護基を一つ以上有する、意図する標的分子であり、Ｒ''は、非求核物質に対して安定な基であり、ｎは、１または２であり、ｎ＝１が好ましく、Ｒ'''は、水素、保護基、または、非求核条件下で除去できる、樹脂または保護基に結合した、酸もしくは還元不安定なリンカーもしくは安全捕捉リンカーである。求核物質に対して安定なカルボキシエステルチオール基材のチオエステル生成樹脂も存在して、式 Ｘ−Ｃ（Ｏ）−Ｏ−ＣＨ（Ｒ''）−（ＣＨ2）n−Ｓ−リンカー−樹脂 または Ｘ−Ｃ（Ｏ）−Ｏ−ＣＨ（Ｒ''−リンカー−樹脂）−（ＣＨ2）n−Ｓ−Ｒ''' を有し、これらの式において、Ｘ、Ｒ''、ｎ、及びＲ'''は、前記のものであり、リンカー及び樹脂は、固相有機合成での使用に適した求核物質に対して安定な任意のリンカー及び樹脂である。この求核物質に対して安定なカルボキシエステルチオールは、チオール触媒、たとえばチオフェノール、の添加により、活性チオエステルに転化させることができる。したがって、本発明の拡張天然型化学的ライゲーション法と組成物は、多セグメントの収束ライゲーション法において使用することができる。このとき、標的化合物の一端が本発明の保護または非保護Ｎα−２または３炭素鎖アルキルまたはアリールチオールを有することができ、他端が活性チオエステルへの後続の転化とライゲーションとのためのオルトチオロエステルまたはカルボキシエステルチオール成分を有することができる。
【００７１】
やはり容易に理解しうるであろうが、本発明のＮα−２または３炭素鎖アルキルまたはアリールチオールは、他のライゲーション法、たとえば天然型化学的ライゲーション（Ｄａｗｓｏｎ ｅｔ．ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ（１９９４）２６６：７７６−７７９；Ｋｅｎｔ ｅｔ．ａｌ．，ＷＯ ９６／３４８７８）、拡張された一般化学的ライゲーション（Ｋｅｎｔ ｅｔ．ａｌ．，ＷＯ９８／２８４３４）、オキシム生成化学的ライゲーション（Ｒｏｓｅ ｅｔ．ａｌ．，Ｊ．Ａｍｅｒ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ，（１９９４）１１６：３０−３３）、チオエステル生成ライゲーション（Ｓｃｈｎｏｌｚｏｒ，ｅｔ．ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ（１９９２）２５６：２２１−２２５）、チオエーテル生成化学的ライゲーション（Ｅｎｇｌｅｂｒｅｔｓｅｎ，ｅｔ．ａｌ．，Ｔｅｔ．Ｌｅｔｔｓ．（１９９５）３６（４８）：８８７１−８８７４）、ヒドラゾン生成ライゲーション（Ｇａｅｒｔｎｅｒ，ｅｔ．ａｌ．，Ｂｉｏｃｏｎｊ．Ｃｈｅｍ．（１９９４）５（４）：３３３−３３８）、ならびにチアゾリジン生成ライゲーション及びオキサゾリジン生成ライゲーション（Ｚｈａｎｇ，ｅｔ．ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（１９９８）９５（１６）：９１８４−９１８９；Ｔａｍ ｅｔ．ａｌ．，ＷＯ９５／００８４６）、または他の方法（Ｙａｎ，Ｌ．Ｚ．ａｎｄ Ｄａｗｓｏｎ，Ｐ．Ｅ．，"Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｏｆ Ｐｅｐｔｉｄｅｓ ａｎｄ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｗｉｔｈｏｕｔ Ｃｙｓｔｅｉｎｅ Ｒｅｓｉｄｕｅｓ ｂｙ Ｎａｔｉｖｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｌｉｇａｔｉｏｎ Ｃｏｍｂｉｎｅｄ ｗｉｔｈ Ｄｅｓｕｌｆｕｒｉｚａｔｉｏｎ，"Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．２００１，１２３，５２６−５３３（参照により本明細書に組み込むものとする。）；Ｇｉｅｓｅｌｎａｎ ｅｔ．ａｌ．，Ｏｒｇ．Ｌｅｔｔ．２００１ ３（９）：１３３１−１３３４；Ｓａｘｏｎ，Ｅ．ｅｔ．ａｌ．，"Ｔｒａｃｅｌｅｓｓ" Ｓｔａｕｄｉｎｇｅｒ Ｌｉｇａｔｉｏｎ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｃｈｅｍｏｓｅｌｅｃｔｉｖｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｏｆ Ａｍｉｄｅ Ｂｏｎｄｓ．Ｏｒｇ．Ｌｅｔｔ．２０００，２，２１４１−２１４３）と組合せて、使用することができる。さらに、本発明で意図するのは、本発明のＮα−２または３炭素鎖アルキルまたはアリールチオールにおいてチオールイオウをセレンで置換することである。
【００７２】
本発明の方法と組成物は、多くの用途を有する。本発明の方法と組成物は、特に、ペプチド、ポリペプチド、及びその他のポリマーのライゲーションに有効である。実質的にすべてのアミノ酸、たとえば天然に産するアミノ酸及び非天然のアミノ酸及び誘導体において天然型化学的ライゲーションを実行しうる能力により、適正なシステインライゲーション部位を欠く標的に対する天然型化学的ライゲーションの範囲が拡大される。本発明は、また、ペプチドまたはポリペプチドセグメントのほか、ポリマー成分を、Ｎα置換アミド結合または全部天然のアミド結合を有するリンカーによってライゲーション部位に結合するのが望ましい場合に、そのような成分のライゲーションにも使用することができる。本発明は、また、発現たんぱく質ライゲーション（ＥＰＬ）用のいろいろな種類のペプチド標識の生成にも使用することができる。たとえば、ＥＰＬ生成チオエステルポリペプチドは、意図する最終用途に応じて、Ｎα置換アルキルもしくはアリールチオールアミド結合または完全に天然のアミド結合により、いろいろな種類のペプチドに結合させることができる。本発明は、また、システインを有しないペプチドまたはポリペプチドの場合でも、環化点（ｃｙｃｌｉｚａｔｉｏｎ ｐｏｉｎｔ）に天然アミド結合を有するいろいろな環状ペプチド及びポリペプチドの生成に使用することができる。これは、たとえば、大部分の環状ペプチド、たとえば産業標準規格に従って生成される抗生物質及びその他の薬剤、は、環化（すなわち、頭から尾まで）ライゲーション部位に天然アミド結合を形成するのに使用できるシステイン残基を有しないので、重要である。
【００７３】
本明細書で挙げるすべての公刊物及び特許明細書は、それぞれの公刊物及び特許明細書が個別に参照により本明細書に組み込まれると述べるのと同様に、参照により本明細書に組み込まれるものとする。
【００７４】
（実施例）
下記の生成法と実施例は、当業者が、本発明をより明瞭に理解し、本発明を実施できるようにするために示すものである。これらは、本発明の権利範囲を限定するものと解釈してはならない。これらは、単に、本発明の説明のために、代表例を示すものと解釈すべきである。
【００７５】
【００７６】
実施例１： 共通の材料と方法
ペプチドは、標準的な手順（Ｈａｃｋｅｎｇ ｅｔ．ａｌ．，前記；Ｓｃｈｎｏｌｚｅｒ ｅｔ．ａｌ．，（１９９２）Ｉｎｔ．Ｊ．Ｐｅｐｔ．Ｐｒｏｔ．Ｒｅｓ．，４０：１８０−１９３；Ｋｅｎｔ，Ｓ．Ｂ．Ｈ．（１９８８）Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．５７，９５７−９８４）に従い、ＰＡＭ樹脂またはチオエステル生成樹脂上でのＢｏｃ化学作用のためのその場中和／ＨＢＴＵ活性化手順により、ＳＰＰＳによって、改造ＡＢＩ４３０Ａペプチド合成装置を使用して段階的に合成した。鎖集成の後、５％のｐ−クレゾールを含む無水フッ酸（ＨＦ）による処理によって、ペプチドを脱保護すると同時に開裂させ、それから凍結乾燥して、分離ＨＰＬＣによって精製した。Ｂｏｃ保護アミノ酸は、Ｐｅｐｔｉｄｅｓ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ ａｎｄ Ｍｉｄｗｅｓｔ Ｂｉｏｔｅｃｈから入手した。トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）は、Ｈａｌｏｃａｒｂｏｎから購入した。その他の化学薬品は、ＦｌｕｋａまたはＡｌｄｒｉｃｈから購入した。分析及び分離ＨＰＬＣは、２１４ｎｍ ＵＶ検出を使用するＲａｉｎｉｎ ＨＰＬＣシステムにより、Ｖｙｄａｃ Ｃ４分析剤または分離剤を用いて、実施した。ペプチド及びたんぱく質の質量分析は、Ｓｃｉｅｘ ＡＰＩ−Ｉエレクトロスプレー質量分析計によって実施した。
【００７７】
実施例２： ２（４'メトキシベンジルチオ）ベンジルブロミドの合成
２−ヒドロキシメチルチオフェノール（１０ｍｍｏｌ １．４ｇ）を、室温で、１０ｍｌのＤＦＭ中で、１０ｍｍｏｌの４−メトキシベンジルクロリド及び１．７５ｍｌのＤＩＥＡと反応させた。この反応を１０分で終わらせた。ｐＨ３の５０ｍｌの水を添加した。生成物を酢酸エチルで抽出し、硫酸ナトリウム上で乾燥させた。次に、得られた粗製油（ｃｒｕｄｅ ｏｉｌ）を、２０ｍｌのＴＨＦで、１１ｍｍｏｌの四臭化炭素（３．６４ｇ）及び１１ｍｍｏｌのトリフェニルホスフィン（２．８８ｇ）と反応させた。一晩の反応の後、ＴＨＦを蒸発させた。生成物を、移動相としてヘキサン／酢酸エチル（６／１）を使用して、シリカゲルクロマトグラフィーによって精製した。１．８ｇが採取された。
【００７８】
実施例３： Ｎα（２−メルカプトベンジル）グリシン−ペプチドの生成
Ｎ末端Ｂｏｃ保護Ａｌａを有する樹脂に束縛されたペプチド（７８ｍｇ）に、純粋の（ｎｅａｔ）ＴＦＡを添加し、Ｂｏｃ基を除去した。標準的な化学手順を使用し、ＢｏｃグリシンＯスクシンイミドを、樹脂に結合させた。結合が完了したあと、Ｂｏｃ基を除去してから、樹脂を、ＤＭＦに１０％のジイソプロピルエチルアミンを溶解させた溶液で２回洗浄して、中和した。次に、樹脂をＤＭＦとＤＭＳＯで洗浄した。次に、０．２ｍｌのＤＭＳＯと０．０１ｍｌのジイソプロピルエチルアミンに、９ｍｇの２（４'メトキシベンジルチオ）ベンジルブロミドを添加した。この混合物を、室温で１２時間反応させた。標準的な手順により、ＨＦ条件下で、ペプチドを開裂させ、脱保護した。正しい質量２，０７９Ｄａのピークが、全ペプチド物質の約１２％（ＨＰＬＣによって測定）に存在した。この正しいペプチドを、標準的な半分離（ｓｅｍｉ−ｐｒｅｐａｒａｔｉｖｅ）ＨＰＬＣによって精製した。
【００７９】
実施例４： ４'−メトキシ２（４'メチルベンジルチオ）アセトフェノンの生成
４−メチルベンジルメルカプタン４ｍｍｏｌ（０．５４２ｍｌ）と、４'メトキシ２ブロモアセトフェノン４ｍｍｏｌ（９１６．３ｍｇ）を、４ｍｌのＤＭＦに溶解させた。次に、ジイソプロピルエチルアミン４ｍｍｏｌ（０．７ｍｌ）を添加した。この混合物を室温で１時間撹拌した。混合物を希塩酸に注ぎ、酢酸エチルによって抽出してから、硫酸ナトリウム上で乾燥した。油（ｏｉｌ）を、酢酸エチルに溶解させ、石油エーテルの添加によって沈殿させた。４５０ｍｇの白色固体が採取された。
【００８０】
実施例５： １アミノ，１（４−メトキシフェニル），２（４−メチルベンジルチオ）エタンの生成
４'−メトキシ２（４'メチルベンジルチオ）アセトフェノン１．４４ｍｍｏｌ（４１１ｍｇ）とアミノオキシ酢酸４．３ｍｍｏｌ（９４１ｍｇ）を、２０ｍｌのＴＭＯＦに溶解させ、０．０４７ｍｌのメタンスルホン酸を、触媒として、室温で添加した。４８時間後、溶剤を蒸発させ、残留物を酢酸エチルで採取し、１Ｍの硫酸一水素カリウムで洗浄し、硫酸ナトリウム上で乾燥した。粗製物を、シリカゲルクロマトグラフィーによって精製し、２００ｍｇのオキシム複合体を得た。この２００ｍｇのオキシム複合体０．５５６ｍｍｏｌを、２ｍｌのＴＨＦに溶解させてから、１．６７ｍｌの１Ｍ ＢＨ３／ＴＨＦ複合体を添加した。２７時間後、出発材料は残っていなかった。３ｍｌの水を添加し、また１．５ｍｌの１０Ｎ水酸化ナトリウムを添加した。混合物を１時間還流させた（ｒｅｆｌｕｘｅｄ）。次に、混合物を、酢酸エチル（４×）で抽出し、硫酸ナトリウム上で乾燥した。次に、最終生成物（４０ｍｇ）を、シリカゲルクロマトグラフィーによって精製した。
【００８１】
実施例６： Ｎα １−（４−メトキシフェニル）２−メルカプトエタングリシン−ペプチドの生成
Ｎ末端Ｂｏｃ保護Ａｌａを有する、樹脂に束縛されたモデルペプチド（７８ｇ）に、純粋のＴＦＡを加えて、Ｂｏｃ基を除去した。標準的な化学的手順に従って、ブロモ酢酸を樹脂に結合させた。次に、１アミノ，１（４−メトキシフェニル），２（４−メチルベンジルチオ）エタン１７ｍｇを、０．０１０ｍｌのジイソプロピルエチルアミンを含む０．３ｍｌのＤＭＳＯに溶解させたものを、樹脂に加えた。一晩の反応ののち、樹脂を洗浄し、標準的なＨＦ手順により、ペプチドを開裂させ、脱保護した。次に、半分離ＨＰＬＣにより、所望の生成物を生成した。
【００８２】
別のＮα １−（４−メトキシフェニル）２−メルカプトエタングリシン−ペプチドの生成
標準的な結合手順により、配列 Ｓ−Ｙ−Ｒ−Ｆ−Ｌ−ポリマー のモデルペプチド樹脂０．１ｍｍｏｌに、ブロモ酢酸を結合させた。結合の後、樹脂をＤＭＳＯで洗浄した。次に、１アミノ，１（４−メトキシフェニル），２（４−メチルベンジルチオ）エタン３２．５ｍｇ（０．１２ｍｍｏｌ）を０．３ｍｌのＤＭＳＯと０．０２５ｍｌのジイソプロピルエチルアミンに溶解させたものを、加えた。混合物を一晩放置して反応を進行させた。標準的なＨＦ手順により、ペプチドを開裂させ、脱保護した。粗製開裂生成物のＨＰＬＣにより、全生成物の６０％が所望の生成物（ＭＷ ２，１２２）であることがわかった。ｎ−アルキルエタンチオール基はＨＦ中で９７％が安定であった。
【００８３】
実施例７： ２'，４'−ジメトキシ２（４'メチルベンジルチオ）アセトフェノンの生成
４−メチルベンジルメルカプタン３．９４ｍｍｏｌ（０．５３４ｍｌ）と２'，４'ジメトキシ２−ブロモアセトフェノン３．８６ｍｍｏｌ（１ｇ）を、４ｍｌのＤＭＦに溶解させた。次に、ジイソプロピルエチルアミン３．９４ｍｍｏｌ（０．６８８ｍｌ）を加えた。混合物を、室温で２４時間撹拌した。混合物を、硫酸一水素カリウムの１Ｍ溶液に注ぎ、酢酸エチルで抽出して、硫酸ナトリウム上で乾燥した。蒸発ののち、残留油を酢酸エチルに溶解させ、石油エーテルの添加により沈殿させた。これにより、６１６ｍｇの白色固体が得られた。
【００８４】
実施例８： １アミノ，１（２，４−ジメトキシフェニル），２（４−メチルベンジルチオ）エタンの生成
２'，４'−ジメトキシ２（４'メチルベンジルチオ）アセトフェノン０．５２６ｍｍｏｌ（１６６ｍｇ）とアミノオキシ酢酸１．５９ｍｍｏｌ（３４５ｍｇ）を、６ｍｌのＴＭＯＦに溶解させ、室温で、０．０３４ｍｌのメタンスルホン酸を触媒として加えた。３１時間後、溶剤を蒸発させてから、酢酸エチルに取込み、１Ｍの硫酸一水素カリウムで洗浄して、硫酸ナトリウム上で乾燥した。次に、粗製物をシリカゲルクロマトグラフィーによって精製し、１２６ｍｇ（収率６１％）のオキシム複合体を得た。この１２６ｍｇのオキシム複合体０．３２４ｍｍｏｌを、１．５ｍｌのＴＨＦに溶解させた。次に、０．９７３ｍｌの１Ｍ ＢＨ３／ＴＨＦ複合体を添加した。
【００８５】
５４時間後、出発材料がまだ存在していたので、０．５ｍｌの１Ｍ ＢＨ３／ＴＨＦ複合体を添加した。３日後（合計６日の反応）、３ｍｌの水を添加し、１ｍｌの１０Ｎ水酸化ナトリウムを加えた。混合物を、１時間還流させた。次に、混合物を、酢酸エチル（４×）で抽出し、硫酸ナトリウム上で乾燥した。次に、最終生成物（４３ｍｇ）を、シリカゲルクロマトグラフィーによって精製した。
【００８６】
実施例９： Ｎα １−（２，４−ジメトキシフェニル）２−メルカプトエタングリシン−ペプチドの生成
標準的な結合手順により、配列 Ｓ−Ｙ−Ｒ−Ｆ−Ｌ−ポリマー の樹脂束縛ペプチド０．１ｍｍｏｌに、ブロモ酢酸を結合させた。結合の後、樹脂をＤＭＳＯで洗浄した。次に、１アミノ，１（２'，４'−ジメトキシフェニル），２（４−メチルベンジルチオ）エタン３６ｍｇ（０．１２ｍｍｏｌ）を、０．３ｍｌのＤＭＳＯと０．０２５ｍｌのジイソプロピルエチルアミンに溶解させたものを、加えた。混合物を一晩放置して反応を進行させた。標準的なＨＦ手順により、ペプチドを開裂させ、脱保護した。粗製開裂生成物のＨＰＬＣにより、全生成物の４２％が所望の生成物（ＭＷ ９３８）であることがわかった。ｎ−アルキルエタンチオール基はＨＦ中で９２％が安定であった。
【００８７】
実施例１０： Ｃ末端ＳＤＦ１−アラニン−チオエステルとＮ末端Ｎα（２−メルカプトベンジル）グリシン−ペプチドとのＡｌａ−Ｇｌｙ化学的ライゲーション
６員転位ライゲーション（６−ｍｅｍｂｅｒ ｒｅａｒｒａｎｇｅｍｅｎｔ ｌｉｇａｔｉｏｎ）のために、ＳＤＦ１−αのＣ末端Ａｌａチオエステルフラグメント（ＭＷ ４４２９）１ｍｇと、ＳＤＦ１−αのＮ末端Ｎα（２−メルカプトベンジル）グリシンフラグメント（ＭＷ ２０７９）０．６ｍｇとを、１００μｌの６Ｍグアニジニウム緩衝液（ｐＨ７．０）に溶解させ、１μｌのチオフェノールを加えた。室温（〜２５℃）で、２日経過したあと、所望のライゲーション生成物（ＭＷ ５４７２）の形成を、ＥＳ−ＭＳによって確認した。次に、反応混合物を、さらに２４時間、４０℃に定温放置し、所望のライゲーション生成物の収率を、ＨＰＬＣ積分（ｉｎｔｅｇｒａｔｉｏｎ）によって測定した、生成物と非反応Ｃ末端フラグメントとの比にもとづいて決定した。観測された収率は、約４０％であった。
【００８８】
実施例１１： Ｃ末端ＳＤＦ１−アラニン−チオエステルとＮ末端Ｎα １−（４−メトキシフェニル）２−メルカプトエタングリシン−ペプチドとのＡｌａ−Ｇｌｙ化学的ライゲーション
５員転位ライゲーションのために、ＳＤＦ１のＣ末端アラニン−チオエステルフラグメント（ＭＷ ４４２９）１ｍｇと、Ｎα １−（４−メトキシフェニル）２−メルカプトエタン基を有するＮ末端グリシンを有するＮ末端ペプチドモデル（ＭＷ ２１２２）１ｍｇとを、１００μｌの６Ｍグアニジニウム緩衝液（ｐＨ７．０）［及び１μｌのチオフェノール］に溶解させた。反応混合物を、室温（〜２５℃）で、定温放置し、ライゲーション反応を調べた。８時間後、所望のライゲーション生成物（ＭＷ ５５１５）の形成を、ＥＳ−ＭＳによって確認した。３日後、生成物と非反応Ｎ末端フラグメントとの比にもとづく所望のライゲーション生成物の収率は、約４５％であった。室温で３日経過したあと、さらに２４時間、４０℃に定温放置したあとでは、収率は、６５％であった。室温で３日経過したあと、さらに４８時間、４０℃に定温放置したあと、収率は、約７０％に上昇した。
【００８９】
５員転位ライゲーションのために、ＳＤＦ１−αのＣ末端Ａｌａチオエステルフラグメント（ＭＷ ４４２９）０．５ｍｇと、Ｎα １−（４−メトキシフェニル）２−メルカプトエタン基を有するＮ末端グリシンを有するＮ末端フラグメント（ＭＷ ２１２２）０．５ｍｇとを、１００μｌの６Ｍグアニジニウム緩衝液（ｐＨ８．２）及び１μｌのチオフェノールに溶解させた。次に、反応混合物を、室温（〜２５℃）で、定温放置し、６時間後、さらに１μｌのチオフェノールを加えた。２４時間後、所望の生成物の収率は、約６０％であった。
【００９０】
実施例１２： Ｃ末端グリシン−チオエステルとＮ末端Ｎα−（２−メルカプトベンジル）グリシン−ペプチドとのＧｌｙ−Ｇｌｙ化学的ライゲーション
６員転位ライゲーションのために、デカマー（ｄｅｃａｍｅｒ）モデルペプチドのＣ末端Ｇｌｙチオエステルフラグメント（ＭＷ １３５７）３．５ｍｇと、３ ＨｉｓＤｎｐを有するモデルペプチドのＮ末端Ｎα（２−メルカプトベンジル）グリシンフラグメント（ＭＷ ２０７９）２ｍｇとを、２００μｌの６Ｍグアニジニウム緩衝液（ｐＨ７．９）に溶解させ、２μｌのチオフェノールを添加した。混合物を、３３℃で、６０時間、定温放置した。所望のライゲーション生成物（ＭＷ ２６３１）の形成を、ＥＳ−ＭＳによって確認した。生成物と非反応Ｎ末端フラグメントとの比にもとづく実測収率は、約４０％であった。
【００９１】
Ｃ末端グリシン−チオエステルペプチドとＮα １−（４−メトキシフェニル）２−メルカプトエタングリシン−ペプチドとの化学的ライゲーション
５員転位ライゲーションのために、Ｃ末端Ｇｌｙチオエステルフラグメント（ＭＷ １３５７）２ｍｇと、Ｎα １−（４−メトキシフェニル）２−メルカプトエタン基を有する、３ ＨｉｓＤｎｐを有するモデルペプチドのＮ末端フラグメント（ＭＷ ２１２２）２．５ｍｇとを、１μｌのチオフェノールを含む１００μｌの６Ｍグアニジニウム緩衝液（ｐＨ７．０）に溶解させた。反応混合物を、室温（〜２５℃）で、定温放置し、ライゲーション反応を調べた。定温放置の３及び８時間後、所望のライゲーション生成物（ＭＷ ２６７５．９）の形成を、ＥＳ−ＭＳによって確認した。２４時間後、生成物と非反応Ｎ末端フラグメントとの比にもとづく所望のライゲーション生成物の収率は、約４０％であった。次に、固体の炭酸水素ナトリウムを添加することにより、ｐＨを、８．２に上昇させてから、反応混合物を、さらに２４時間定温放置し、収率８８％を得た。
【００９２】
実施例１３： Ｌａｒｃ−アラニン−チオエステルとＮα １−，（４−メトキシフェニル）２−メルカプトエタングリシン−ペプチドとのＡｌａ−Ｇｌｙ化学的ライゲーション
マウスのＬａｒｃ １−３１ Ａｌａ Ｃ末端ペプチドチオエステル３ｍｇ（ＭＷ ３６０９）と、モデルペプチドＮα １−，（４−メトキシフェニル）２−メルカプトエタングリシン−Ｓ−Ｙ−Ｒ−Ｆ−Ｌ １ｍｇ（ＭＷ ９０８）とを、０．１５ｍｌの６ｍｏｌグアニジニウム緩衝液（ｐＨ８．２）及び０．０３ｍｌのチオフェノールに溶解させた。ペプチドチオエステルの消費から見積もって、一晩の撹拌の後、ライゲーションは、８１％完了し、４０時間後、９２％完了した。予想されるライゲーション生成物は、４３１２Ｄａであり、実際は４３１２Ｄａであった。
【００９３】
実施例１４： Ｌａｒｃ１−３１−アラニン−チオエステルとＮα １−（２，４−ジメトキシフェニル）２−メルカプトエタングリシン−ペプチドとのＡｌａ−Ｇｌｙ化学的ライゲーション
マウスのＬａｒｃ １−３１ Ａｌａ Ｃ末端ペプチドチオエステル３ｍｇ（ＭＷ ３６０９）と、モデルペプチドＮα １−（２，４−ジメトキシフェニル）２−メルカプトエタングリシン−Ｓ−Ｙ−Ｒ−Ｆ−Ｌ １ｍｇ（ＭＷ ９３８）とを、０．１５ｍｌの６ｍｏｌグアニジニウム緩衝液（ｐＨ８．２）及び０．０３ｍｌのチオフェノールに溶解させた。ペプチドチオエステルの消費から見積もって、一晩の撹拌の後、ライゲーションは７３％完了し、４０時間後、８５％完了した。計算予想されるライゲーション生成物の質量と実験によるそれとは、ともに４３４２Ｄａであった。
【００９４】
実施例１５： Ｃ末端トリペプチドグリシン−チオエステルとＮ末端Ｎα−１−（２，４−ジメトキシフェニル）２−メルカプトエタングリシン−ペプチドとのＧｌｙ−Ｇｌｙ化学的ライゲーション
ペプチドフラグメントＦＧＧ−チオエステル０．８ｍｇと、モデルペプチドＮα １−（２，４−ジメトキシフェニル）２−メルカプトエタングリシン−Ｓ−Ｙ−Ｒ−Ｆ−Ｌ １ｍｇ（ＭＷ ９３８）とを、０．１ｍｌの６Ｍグアニジニウム緩衝液（ｐＨ８．２）及び０．０２ｍｌのチオフェノールに溶解させた。一晩の撹拌の後、反応は実質的に完了した。計算予想されるライゲーション生成物の質量と実験によるそれとは、それぞれ１１９９．４Ｄａ及び１１９５．５Ｄａであった。
【００９５】
実施例１６： １−（２，４−ジメトキシフェニル）２−メルカプトエタンのライゲーション生成物からの除去
実施例１５の精製ライゲーション生成物１ｍｇを、０．９５ｍｌのＴＦＡ及び０．０２５ｍｌの水及び０．０２５ｍｌのＴＩＳに溶解させた。１時間後、溶剤を蒸発させ、水／アセトニトリルの５０％溶液を添加し、混合物を凍結乾燥させた。ＨＰＬＣによれば、開裂は９５％よりも多く完了していた。計算予想される質量と実験によるそれとは、１００３Ｄａであった。
【００９６】
実施例１７： Ｃ末端トリペプチドグリシン−チオエステルとＮ末端Ｎα １−，（４−メトキシフェニル）２−メルカプトエタングリシン−ペプチドとのＧｌｙ−Ｇｌｙ化学的ライゲーション
トリペプチドペプチドフラグメントチオエステル、ＦＧＧ−チオエステル１．６ｍｇと、モデルペプチドＮα １−（４−メトキシフェニル）２−メルカプトエタングリシン−Ｓ−Ｙ−Ｒ−Ｆ−Ｌ ２ｍｇ（ＭＷ ９０８）とを、０．２ｍｌの６Ｍグアニジニウム緩衝液（ｐＨ８．２）及び０．０４ｍｌのチオフェノールに溶解させた。一晩の撹拌の後、反応は実質的に完了した。予想されるライゲーション生成物のＭＷは、１１６９．４Ｄａであり、実際は１１６９．５Ｄａであった。
【００９７】
実施例１８： ライゲーション後の１−（，４−メトキシフェニル）２−メルカプトエタン基の除去
実施例１７の精製ライゲーション生成物を、−２℃で、１時間、ＨＦ ｐクレゾールで処理した。ＨＦを蒸発させた後、ライゲーション生成物をエーテルによって、沈殿させた。粗製ペプチドを、０．１％ ＴＦＡを含む水／アセトニトリル５０％溶液に取込み、ＨＰＬＣ上に噴射した。＞８０％の主ピークは、開裂ペプチドに関して予想される分子量を示した（予想質量１００３Ｄａ、実際１００３Ｄａ）。
【００９８】
実施例１９： Ｃ末端ヒスチジン−チオエステルとＮ末端Ｎα １−（２，４−ジメトキシフェニル）２−メルカプトエタングリシン−ペプチドとのＨｉｓ−Ｇｌｙ化学的ライゲーション
ペプチドフラグメントＴＢＰ−Ａ １−６７ ＣαＨｉｓチオエステル４ｍｇと、モデルペプチドＮα １−（２，４−ジメトキシフェニル）２−メルカプトエタングリシン−Ｓ−Ｙ−Ｒ−Ｆ−Ｌ １ｍｇ（ＭＷ ９３８）とを、０．１ｍｌの６Ｍグアニジニウム緩衝液（ｐＨ８．２）及び０．０２ｍｌのチオフェノールに溶解させた。一晩の撹拌の後、ペプチドチオエステルの消費から見積もって、反応は８７％完了した。予想されるライゲーション生成物の分子量は、９２２０Ｄａであり、実際は、９２２０Ｄａであった。
【００９９】
実施例２０： ライゲーション後の１−（２，４−ジメトキシフェニル）２−メルカプトエタン基の除去
Ｈ−Ｇライゲーション後の精製ペプチドフラグメント２ｍｇを、０．９５ｍｌのＴＦＡ及び０．０２５ｍｌの水及び０．０２５ｍｌのＴＩＳに溶解させた。１時間後、溶剤を蒸発させ、残留物に水／アセトニトリルの５０％溶液を添加し、混合物を凍結乾燥させた。ＨＰＬＣによれば、開裂は９０％よりも多く完了していた。予想されるＭＷは９０２３Ｄａであり、実際は９０２４Ｄａであった。
【０１００】
実施例２１： 拡張天然型化学的ライゲーションによるシトクロムｂ５６２の合成
３ｍｇ（０．４μｍｏｌ）のシトクロム１−６３ Ｃ末端チオエステル（ＭＷ ７３４９）と１．５ｍｇ（０．３μｍｏｌ）のＮ末端Ｎα １−，（４−メトキシフェニル）２−メルカプトエタングリシンシトクロムｂ５６２残基６４−１０６（ＭＷ ４９７０）を、触媒としての０．００２ｍｌのチオフェノールとともに、０．１ｍｌの６Ｍグアニジニウムライゲーション緩衝液（ｐＨ７）に、溶解させた。図５Ａを参照されたい。２４時間後、０．０２５ｍｌの２−メルカプトエタノールを混合物に添加し、そのまま４５分間反応を進行させた。その後、１５ｍｇのＴＣＥＰを添加し、３０分の撹拌ののち、ライゲーション混合物を半分離ＨＰＬＣにかけた。漏出物（ｂｒｅａｋ ｔｈｒｏｕｇｈ）を溶離し、混合物を脱塩してから、ライゲーション混合物のすべての成分を、６５％Ｂの傾斜まで傾けて溶離し、単一のバイアルに集めた。脱塩された物質の分析ＨＰＬＣによれば、ライゲーションは、Ｃ末端ペプチドの消費にもとづく見積もりでは、９０％よりも多く完了していた。このＨＰＬＣは、二つの主ピーク（ジアステレオマー）を示し、計算質量と予想質量は１１，９４６Ｄａであった。図５Ｂと６Ａを参照されたい。
【０１０１】
シトクロムｂ５６２（１−１０６）のアミノ酸配列は下記の通りである。
【０１０２】
実施例２２： ライゲーションシトクロムｂ５６２残基１−１０６からの１−，（４−メトキシフェニル）２−メルカプトエタン基の除去と、天然たんぱく質の生成
次に、脱塩した溶液を、１−，（４−メトキシフェニル）２−メルカプトエタン基の除去に先立って、凍結乾燥した。凍結乾燥した物質を、−２℃で、１時間、ＨＦ ９５％ ５％アニソールと１ｍｍｏｌのシステイン（１２１ｍｇ）で処理した。標準的手順により、ＨＦを蒸発させてから、１００ｍｌの５０％緩衝液Ｂを添加し、混合物を凍結乾燥した。次に、混合物を半分離ＨＰＬＣによって精製し、２ｍｇの精製単一ピーク天然シトクロム１−１０６（５６％の精製後収率）を得た。計算質量及び実際の質量は１１，７８０Ｄａであった。図６Ｂ及び７Ａを参照されたい。
【０１０３】
野生型のシトクロムｂ５６２の類似体も、同じやり方で合成した。これを、Ｓｌｍ７ ｃｙｔ ｂ５６２で示す。このＳｌｍ７ ｃｙｔ ｂ５６２突然変異体は、位置７のメチオニンをセレノメチオニン（メチオニンのイオウをそれより低位の同種のセレニウムで置き換えたもの）で置き換えている点が野生型と異なる。円偏光二色性分光分析を行い、大きなαらせん成分が、アポ野生型ｂ５６２とアポＳｌｍ ｂ５６２との両方に含まれていることを示した（データ示さず）。ＥＳＭＳによっても、アポ野生型ｂ５６２とアポＳｌｍ ｂ５６２との両方が予想される分子質量を有することが示された（データ示さず）。これらのアポたんぱく質を、ヘムによって再構成し（室温で、ヘムｐＨ７ ＮａＰｉによって一晩）、得られたたんぱく質をイオン交換ＦＰＬＣによって精製した（ＦＰＬＣ精製リソースＱ、トリスＨＣＬ ｐＨ８、ＮａＣｌ勾配）。たとえば、図７Ｂを参照されたい。ヘム再構成たんぱく質のＵＶによって見ることのできる（光）スペクトルは、Ｆｅに対するイオウまたはセレンの配位に一致することがわかった（データ示さず）。非配位アイソスターノルロイシン（ｎｏｎ−ｃｏｏｒｄｉｎａｔｉｎｇ ｉｓｏｔｅｒｅ ｎｏｒｌｅｕｃｉｎｅ）によるｃｙｔ ｂ５６２突然変異体も、同じやり方で生成した。これから、合成シトクロムを、拡張天然型化学的ライゲーションによって生成し、そのヘム活性部位を再構成して、生物物理学的方法で完全に特性決定した。それによると、この実施例は、さらに、初期の天然型化学的ライゲーション法に対して適当なシステインを欠くペプチド及びたんぱく質を、拡張天然型化学的ライゲーション法で生成し、また非標準的なアミノ酸を導入することができる、ということを示した。たとえば、多くのｃｙｔ ｂ５６２突然変異体の折りたたみと反応性とを調べたが、天然にはない軸配位子はまだ調べていない。拡張天然型化学的ライゲーションとともに、使用できる非天然アミノ酸の莫大な量の配列を使用して、これら及びその他のたんぱく質の性質を系統的に調節できるはずである。
【０１０４】
実施例２３： ＭＣＰ １−３５−リシン−チオエステルと、Ｎα １−，（４−メトキシフェニル）２−メルカプトエタングリシン−ペプチドとのＬｙｓ−Ｇｌｙ化学的ライゲーション
３ｍｇのＭＣＰ １−３５ Ｌｙｓ Ｃ末端ペプチドチオエステルと１ｍｇのモデルペプチドＮα １−，（４−メトキシフェニル）２−メルカプトエタングリシン−Ｓ−Ｙ−Ｒ−Ｆ−Ｌ（ＭＷ ９０８）を、０．１５ｍｌの６Ｍグアニジニウム緩衝液（ｐＨ７）に溶解させ、トリエチルアミンと０．０３ｍｌのトリフェノールとの添加によってｐＨ７．２に調節した。一晩の撹拌の後、ライゲーションは、ペプチドチオエステルの消費から見積もって、６９％完了しており、４０時間後、７６％が完了していた。予想されるライゲーション生成物は４８９３Ｄａであり、実際は、４８９３Ｄａｗであった。
【０１０５】
実施例２４： ライゲーション後の１−（，４−メトキシフェニル）２−メルカプトエタン基の除去
実施例２３（Ｌｙｓ−Ｇｌｙライゲーション）の凍結乾燥脱塩粗製物を、１ｍｇのＴＦＡ、２５μｌのエタンジチオール、５０μｌのＴＩＳに溶解させた。次に、１５０μｌのブロモトリメチルシランを添加した。反応を、室温（"ｒｔ"）で２時間進行させた。混合物の揮発性成分を真空中で蒸発させ、残留油を６Ｍのグアニジニウム緩衝液ｐＨ７．５に取込んだ。有機物質をＣＨＣｌ３で抽出した。ＨＰＬＣはもはや出発物質を示さず、したがって補助基の除去がうまくいったことを示している。天然配列の場合に予想される質量は４７２６Ｄａであり、実際は４７２５Ｄａであった。
【０１０６】
実施例２５： ＧＳＹＲＦＬペプチドに対するライゲーションの比較検討
実施例１３〜２０及び２４のＧＳＹＲＦＬペプチドに対する５員転位ライゲーションの比較検討を、下記の表Ｖにまとめて示す。
【０１０７】
【表５】
【０１０８】
実施例２６： ＢｏｃグリシンＮ−１（４'−メトキシフェニル），２（４'−メチルベンジルチオ）エタンの生成
４'−メトキシ ２（４'メチルベンジルチオ）アセトフェノン２ｍｍｏｌ（５７２ｍｇ）と、グリシンエチルエステルＨＣｌ塩２ｍｍｏｌ（１３９．５ｍｇ）とを、１５ｍｌのＤＣＭ中に懸濁させた。ＤＩＥＡ ６ｍｍｏｌ（１ｇ）をゆっくりと添加し、窒素雰囲気で、１ｍｌの四塩化チタン（１Ｍ溶液）を添加した。
【０１０９】
反応を室温で２日間進行させた。次に、ナトリウムシアノボロヒドリド６ｍｍｏｌ（０．４ｇ）を２．５ｍｌの無水メタノールに溶解させたものを、添加した。ＴＬＣによれば、約４０％の少量の新しい生成物が生じており、これは、精製したあと、ＮＭＲにより、Ｎ−１（４−メトキシフェニル），２（４−メチルベンジルチオ）エタングリシンエチルエステルと確認された。
【０１１０】
次に、１ｍｍｏｌ（３７４ｍｇ）のＮ−１（４−メトキシフェニル），２（４−メチルベンジルチオ）エタングリシンエチルエステルを、２ｍｌのＴＨＦに溶解させ、得られる溶液に、２ｍｍｏｌ（８３ｍｇ）のＬｉＯＨ水和物を添加した。一晩の撹拌の後、エステルは完全に加水分解されていた。ＴＨＦを真空中で除去し、生成物を２ｍｌのＤＭＦに取込み、５ｍｍｏｌ（１．１ｇ）のジブチルジカーボネートを添加し、最後に、３ｍｍｏｌ（０．４５ｍｌ）のＤＩＥＡを加えた。一晩の反応の後、希釈したＨＣｌ水溶液を添加し、最終生成物を酢酸エチル（３×）によって抽出した。
【０１１１】
以上、本発明を十分に説明したが、本発明の趣旨及び特許請求の範囲を逸脱することなく前記実施形態には多くの変形及び変更を加えることができることは、当業者には容易に理解しうるであろう。
【図面の簡単な説明】
【０１１２】
【図１】本発明におけるペプチドの拡張天然型化学的ライゲーションを説明する図である。
【図２】本発明における他のペプチドの拡張天然型化学的ライゲーションを説明する図である。
【図３】本発明における多要素の拡張天然型化学的ライゲーション法を説明する図である。
【図４】二つの異なる１−フェニル−２−メルカプトエチル補助基を使用する、本発明のライゲーション方策の概要を示す図である。
【図５Ａ】Ｎα−１−（４−メトキシフェニル）−２−メルカプトエチル補助基を使用する、実施例２１で述べるようなシトクロムｂ５６２に対するライゲーション反応に関する、分析高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）の結果を示す図であり、時刻＝０におけるライゲーション反応の状態を示す。
【図５Ｂ】図５Ａと同様な図であり、反応を一晩進行させたあとのライゲーションの状態を示す。
【図６Ａ】Ｎα−｛１−（４−メトキシフェニル）２−メルカプトエタノ｝改質Ｎ末端セグメントとの拡張天然型化学的ライゲーションを使用することによって生成されたライゲーション生成物シトクロムｂ５６２残基１−１０６の再構成エレクトロスプレー（ｒｅｃｏｎｓｔｒｕｃｔｅｄ ｅｌｅｃｔｒｏｓｐｒａｙ）質量分析（ＭＳ）の結果を示す図であり、ライゲーション部位に除去できるＮα−｛１−（４−メトキシフェニル）２−メルカプトエタノ｝基を有する初期ライゲーション生成物のＭＳ再構成を示す。
【図６Ｂ】図６Ａと同様な図であり、ライゲーション部位に天然アミド結合を生成させるためにＮα−｛１−（４−メトキシフェニル）２−メルカプトエタノ｝基を除去するフッ化水素（ＨＦ）処理後のライゲーション生成物のＭＳ再構成を示す。
【図７Ａ】図６Ｂに示す直鎖状シトクロムｂ５６２物質の代表的な分析ＨＰＬＣの結果を示す図である。
【図７Ｂ】折りたたみ（ｆｏｌｄｉｎｇ）後の該物質のイオン交換クロマトグラムを示す図である。
【技術分野】
【０００１】
本出願は、米国仮（ｐｒｏｖｉｓｉｏｎａｌ）特許出願第６０／２３１，３３９号（２０００年９月８日出願）に基づく優先権を主張するものである。
【０００２】
本発明は、部分的に、国立衛生研究所（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ）ポストドクター特別研究員補助金（Ｐｏｓｔｄｏｃｔｏｒａｌ Ｆｅｌｌｏｗｓｈｉｐ ｇｒａｎｔ）ＧＮ１９０４０２による援助を受けてなされたものである。合衆国政府は、一部の権利を保有しうる。
【０００３】
本発明は、幅広い範囲のペプチド、ポリペプチド、その他のポリマー、及びその他の分子のアミド結合によるライゲーションを可能にする天然型化学的ライゲーション（ｎａｔｉｖｅ ｃｈｅｍｉｃａｌ ｌｉｇａｔｉｏｎ）技術の拡張のための方法及び組成物に関する。
【背景技術】
【０００４】
化学的ライゲーションは、第一の化学要素と第二の化学要素との間に選択的共有結合を形成させることを含む。第一及び第二の成分上に存在するそれぞれ一意性の相互反応性官能基を、ライゲーション反応を化学選択性とするために使用することができる。たとえば、ペプチド及びポリペプチドの化学的ライゲーションは、ペプチドまたはポリペプチドセグメントを有する、両立する一意性の相互反応性Ｃ末端及びＮ末端アミノ酸残基の化学選択反応を含む。いくつかの異なる化学反応がこの目的のために使用されており、その例として、天然型化学的ライゲーション（Ｄａｗｓｏｎ，ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ（１９９４）２６６：７７６−７７９；Ｋｅｎｔ ｅｔ．ａｌ．，ＷＯ９６／３４８７８；Ｋｅｎｔ ｅｔ．ａｌ．，ＷＯ９８／２８４３４）、オキシム生成化学的ライゲーション（Ｒｏｓｅ，ｅｔ．ａｌ．，Ｊ．Ａｍｅｒ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．（１９９４）１１６：３０−３４）、チオエステル生成ライゲーション（Ｓｃｈｎｏｌｚｅｒ，ｅｔ．ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ（１９９２）２５６：２２１−２２５）、チオエーテル生成ライゲーション（Ｅｎｇｌｅｂｒｅｔｓｅｎ，ｅｔ．ａｌ．，Ｔｅｔ．Ｌｅｔｔｓ．（１９９５）３６（４８）：８８７１−８８７４）、ヒドラゾン生成ライゲーション（Ｇａｅｒｔｎｅｒ，ｅｔ．ａｌ．，Ｂｉｏｃｏｎｊ．Ｃｈｅｍ．（１９９４）５（４）：３３３−３３８）、ならびにチアゾリジン生成ライゲーション及びオキサゾリジン生成ライゲーション（Ｚｈａｎｇ，ｅｔ．ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（１９９８）９５（１６）：９１８４−９１８９；Ｔａｍ，ｅｔ．ａｌ．，ＷＯ９５／００８４６；米国特許第５，５８９，３５６号明細書）がある。
【０００５】
これらの方法のうち、天然型化学的ライゲーション法のみがライゲーション部位に天然アミド（すなわち、ペプチド）結合を有するライゲーション生成物を与える。初期の天然型化学的ライゲーション法（Ｄａｗｓｏｎ ｅｔ．ａｌ．，前記；及びＷＯ９６／３４８７８）は、ライゲーション部位に天然アミド結合を生成するための強力な方法であることがわかっている。天然型化学的ライゲーションは、Ｃ末端αカルボキシチオエステル成分を有する第一のペプチドまたはポリペプチドセグメントとＮ末端システイン残基を有する第二のペプチドまたはポリペプチドとの間の化学選択反応を含む。チオール交換反応により、チオエステル結合初期中間体が生成され、この中間体は、自発的に転位して、ライゲーション部位に天然アミド結合を与え、一方、システイン側鎖チオールを再生させる。初期の天然型化学的ライゲーション法の主要な欠点は、この方法が、Ｎ末端システインを必要とするということ、すなわちこの方法が、ライゲーション部位にシステインを有するペプチド及びポリペプチドセグメントの結合を可能にするだけであるということ、である。
【０００６】
この欠点にもかかわらず、システインではないＮ末端アミノ酸とのペプチドの天然型化学的ライゲーションが提案されている（ＷＯ９８／２８４３４）。この方法においては、ライゲーションは、Ｃ末端αカルボキシチオエステルを有する第一のペプチドまたはポリペプチドセグメントと、式 ＨＳ−ＣＨ2−ＣＨ2−Ｏ−ＮＨ−［ペプチド］ で表されるＮ末端Ｎ−｛チオール置換補助｝基を有する第二のペプチドまたはポリペプチドセグメントとを使用して実施される。ライゲーションの後、Ｎ−｛チオール置換補助｝基は、ＨＳ−ＣＨ2−ＣＨ2−Ｏ−補助基を開裂してライゲーション部位に天然アミド結合を生成させることによって、除去される。この方法における一つの制限は、メルカプトエトキシ補助基の使用がグリシン残基においてのみアミド結合を首尾よく生じさせうる、ということである。そのため、開裂において、第二のペプチドまたはポリペプチドセグメントのＮ置換アミノ酸の位置にグリシン残基が生じるライゲーション生成物が作られる。したがって、前記方法の実施が適当であるのは、反応のライゲーション生成物が前記位置にグリシン残基を有することが望ましい場合だけであり、とにかく、ライゲーション収率、前駆体の安定性、Ｏ結合補助基の除去能力に関して問題が起こりうる。他の補助基、たとえばＨＳＣＨ2ＣＨ2ＮＨ−［ペプチド］も、グリシン残基におけるライゲーションための反応を制限することなしに使用できるが、そのような補助基は、ライゲーション生成物から除去することができない。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
したがって、必要なことは、有効な容易に除去できるチオール含有補助基によって、天然型化学的ライゲーションを、いろいろな種類のアミノ酸残基、ペプチド、ポリペプチド、ポリマー、及びその他の分子、にまで拡張し、かつそのような分子をライゲーション部位における天然アミド結合によって結合する、幅広く適用できる強力な化学的ライゲーション法である。本発明は、これら及びその他の要望に応えるものである。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明は、拡張天然型化学的ライゲーションに関係する方法と組成物とにかかわる。本発明の拡張天然型化学的ライゲーション法は、
Ｎ置換アミド結合初期ライゲーション生成物であって、
式
Ｊ１−Ｃ（Ｏ）−Ｎ（Ｃ１（Ｒ１）−Ｃ２−ＳＨ）−Ｊ２ Ｉ
または
Ｊ１−Ｃ（Ｏ）−Ｎ（Ｃ１（Ｒ１）−Ｃ２（Ｒ２）−Ｃ３（Ｒ３）−ＳＨ）
−Ｊ２ ＩＩ
を有し、
これらの式において、
Ｊ１が、それぞれ個別に、随意に保護された一つ以上のアミノ酸側鎖を有するペプチドもしくはポリペプチド、またはそのようなペプチドもしくはポリペプチドの成分、ポリマー、染料、好適に官能基を有する（ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌｉｚｅｄ）表面、リンカーもしくは検出可能なマーカー、または化学的ペプチド合成もしくは拡張天然型化学的ライゲーションに適合する任意の他の化学成分であり、
Ｒ１、Ｒ２、及びＲ３が、それぞれ個別に、Ｃ１に複合したＨまたは電子供与基であるが、ただし前記Ｒ１、Ｒ２、及びＲ３のうち少なくとも一つがＣ１に複合した前記電子供与基から成り、
Ｊ２が、それぞれ個別に、随意に保護された一つ以上のアミノ酸側鎖を有するペプチドもしくはポリペプチド、またはそのようなペプチドもしくはポリペプチドの成分、ポリマー、染料、好適に官能基を有する表面、リンカーもしくは検出可能なマーカー、または化学的ペプチド合成もしくは拡張天然型化学的ライゲーションに適合する任意の他の化学成分である、
Ｎ置換アミド結合初期ライゲーション生成物、
を生成させることから成る。
【０００９】
ライゲーション生成物は、
式 Ｊ１−Ｃ（Ｏ）ＳＲ のカルボキシルチオエステルから成る第一の要素を、
式
ＨＳ−Ｃ２−Ｃ１（Ｒ１）−ＨＮ−Ｊ２ ＩＩＩ
または
ＨＳ−Ｃ３（Ｒ３）−Ｃ２（Ｒ２）−Ｃ１（Ｒ１）−ＨＮ−Ｊ２ ＩＶ
を有し、これらの式において、Ｊ２、Ｒ１、Ｒ２、及びＲ３は、前記のとおりである、酸安定なＮ置換２または３炭素鎖アミノアルキルまたはアリールチオールから成る第二の要素に、結合させ、
その後、随意に、２または３炭素鎖アルキルまたはアリールチオールを、Ｎ置換アミド結合ライゲーション生成物から除去する、
プロセスによって生成される。好ましい実施形態においては、そのような開裂は、ペプチドに適合する開裂条件下でＣ１に共鳴安定化陽イオンを生成させることによって促進される。Ｎからのアルキルまたはアリールチオール鎖の除去により、
式
Ｊ１−Ｃ（Ｏ）−ＨＮ−Ｊ２ Ｖ
を有し、この式において、Ｊ１、Ｊ２、Ｒ１、Ｒ２、及びＲ３が前記のとおりである最終ライゲーション生成物が得られる。
【００１０】
本発明は、また、前記のような拡張天然型化学的ライゲーションを実施するための組成物及び該組成物を収容するカートリッジ及びキットにも関する。この組成物は、完全保護、部分保護、または完全非保護の酸安定なＮ置換，好ましくはＮα置換，２または３炭素鎖アミノアルキルまたはアリールチオールであって、
式
ＳＸ２−Ｃ２−Ｃ１（Ｒ１）−Ｘ１Ｎ−ＣＨ（Ｚ２）−Ｃ（Ｏ）−Ｊ２
ＶＩ
または
ＳＸ２−Ｃ３（Ｒ３）−Ｃ２（Ｒ２）−Ｃ１（Ｒ１）−Ｘ１Ｎ―ＣＨ
（Ｚ２）−Ｃ（Ｏ）−Ｊ２ ＶＩＩ
を有する。これらの式において、Ｘ１は、Ｈまたはアミノ保護基、Ｘ２は、Ｈまたはチオール保護基、Ｊ２、Ｒ１、Ｒ２、及びＲ３は前記のとおりであり、Ｚ２は、化学的ペプチド合成または拡張天然型化学的ライゲーションに適合する任意の化学成分（単なる例示として、たとえば、アミノ酸側鎖）である。本発明は、また、実質的にラセミ混合物またはジアステレオマーを含まない本発明の前記化合物のキラル形にも関する。
【００１１】
本発明は、さらに、前記の完全保護、部分保護、または完全非保護のＮ置換２または３炭素鎖アミノアルキルまたはアリールチオールの、溶液相及び固相での生成法にも関する。これらの化合物を生成する方法には、固相ペプチド合成法に適合するＮα保護、Ｎアルキル化、Ｓ保護、アミノアルキルまたはアリール−チオールアミノ酸前駆体のハロゲン仲介アミノアルキル化、還元アミノ化、及び生成が含まれる。
【００１２】
カルボキシチオエステル要素のＪ１成分は、該カルボキシチオエステルと拡張天然型化学的ライゲーションのための反応条件とに適合する任意の化学成分から成ることができ、また本発明のＮ置換要素は、単独で提供することができ、あるいはいろいろな化学成分、たとえばアミノ酸、ペプチド、ポリペプチド、核酸、または他の化学成分（たとえば、染料、ハプテン、炭水化物、脂質、固体支持体、生体適合性のポリマーもしくは他のポリマー、その他）と結合させることができる。本発明の拡張天然型化学的ライゲーション法は、強力であり、中性に近いｐＨとある範囲の温度との条件下で水性の系で実施することができる。本発明のＮ置換要素を生成する方法も強力なものであり、これらの新しい化合物を得るためのいろいろな合成経路により、予想外の高い収率で純粋の生成物を与える。本発明のＮα保護、Ｎアルキル化、Ｓ保護、アミノアルキルまたはアリール−チオールアミノ酸前駆体は、通常のペプチド合成及び他の有機合成方策を使用する、高速の自動合成のために特に有効である。さらに、本発明の保護されたＮ置換要素は、化学的ライゲーションの用途を多要素のライゲーション法まで拡張するものであり、たとえば、多重ライゲーション法たとえば三つ以上のセグメントのライゲーション法または収束的（ｃｏｎｖｅｒｇｅｎｔ）ライゲーション合成法によって、ポリペプチドを生成する場合の、多要素のライゲーション法まで拡張するものである。たとえば、本発明の方法と組成物は、カルボキシチオエステルとＮ置換要素との第一の対を使用して所望の分子の第一の部分を合成し、またカルボキシチオエステルとＮ置換要素との別の対を使用して該分子の別の部分を合成することを可能にするものである。次に、そのようにして合成されたそれぞれのライゲーション生成物を、結合させて（適当な脱保護及び／または改質の後）所望の分子を生成させることができる。
【００１３】
したがって、本発明の方法と組成物は、天然型化学的ライゲーションの範囲を大いに拡張するものであり、また本発明の出発、中間、及び最終生成物は、広範囲の用途を有する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１４】
本発明は、拡張天然型化学的ライゲーションに関係する方法と組成物にかかわる。一般に、この方法は、カルボキシルチオエステル、好ましくはα−カルボキシルチオエステル、から成る第一の要素を、酸安定なＮ置換、好ましくはＮα置換、２または３炭素鎖アミノアルキルまたはアリールチオールから成る第二の要素と結合させることを含む。第一の要素のカルボキシチオエステルと第二の要素のＮ置換２または３炭素鎖アルキルまたはアリールチオールのチオールとの間の化学選択的反応が、チオエステル結合中間体を介して進行し、初期ライゲーション生成物に変化する。もっと詳しく言うと、ＣＯＳＲチオエステル要素とアミノアルキルチオール要素との間で起こるチオール交換により、チオエステル結合中間ライゲーション生成物が生じ、該生成物は、５員環または６員環中間体を通過する自発転位の後、
式
Ｊ１−Ｃ（Ｏ）−Ｎ（Ｃ１（Ｒ１）−Ｃ２−ＳＨ）−Ｊ２ Ｉ
または
Ｊ１−Ｃ（Ｏ）−Ｎ（Ｃ１（Ｒ１）−Ｃ２（Ｒ２）−Ｃ３（Ｒ３）−ＳＨ）
−Ｊ２ ＩＩ
を有する第一のアミド結合ライゲーション生成物を生じる。これらの式において、Ｊ１、Ｊ２、Ｒ１、Ｒ２、及びＲ３は上で定義したものである。
【００１５】
ライゲーション部位にあるＮ置換２または３炭素鎖アルキルまたはアリールチオール［ＨＳ−Ｃ２−Ｃ１（Ｒ１）−］または［ＨＳ−Ｃ３（Ｒ３）−Ｃ２（Ｒ２）−Ｃ１（Ｒ１）−］は、ペプチドに適合する条件下で、生成物の損傷なしで、除去されやすく、
式
Ｊ１−Ｃ（Ｏ）−ＨＮ−Ｊ２ Ｖ
を有する最終ライゲーション生成物を生じる。この式において、Ｊ１、Ｊ２、Ｒ１、Ｒ２、及びＲ３は、上で定義したものである。この最終ライゲーション生成物はライゲーション部位に天然アミド結合を有する。
【００１６】
さらに詳しく言うと、本発明の拡張天然型化学的ライゲーション法は、（ｉ）式 Ｊ１−Ｃ（Ｏ）ＳＲ を有するα−カルボキシルチオエステルから成る第一の要素と、（ｉｉ）酸安定なＮ置換２または３炭素鎖アミノアルキルまたはアリールチオールから成る第二の要素であって、
式
Ｊ１−Ｃ（Ｏ）−Ｎ（Ｃ１（Ｒ１）−Ｃ２−ＳＨ）−Ｊ２ Ｉ
または
Ｊ１−Ｃ（Ｏ）−Ｎ（Ｃ１（Ｒ１）−Ｃ２（Ｒ２）−Ｃ３（Ｒ３）−ＳＨ）
−Ｊ２ ＩＩ
を有する第二の要素との化学的ライゲーションから成る。これらの式において、Ｊ１、Ｊ２、Ｒ１、Ｒ２、及びＲ３は、上で定義したものである。
【００１７】
Ｒ１、Ｒ２、及びＲ３基は、ペプチドに適合する開裂条件下で、Ｎ−Ｃ１結合の開裂を容易にするように選択する。たとえば、電子供与基を、特にＣ１に複合させる場合、Ｃ１に開裂を容易にする共鳴安定化陽イオンを生成させるために使用することができる。この化学的ライゲーション反応は、好ましくは、賦形剤（ｅｘｃｉｐｉｅｎｔ）としてチオール触媒を含み、水性または有機−水性混合条件下で、中性付近のｐＨ条件で実施される。第一の要素と第二の要素との化学的ライゲーションは、自発転位してＮ置換アミド結合ライゲーション生成物を生じる５員環または６員環を通じて進行させることができる。第一及び第二の要素がペプチドまたはポリペプチドである場合、Ｎ置換アミド結合ライゲーション生成物は、
式
Ｊ１−Ｃ（Ｏ）−Ｎａ（Ｃ１（Ｒ１）−Ｃ２−ＳＨ）−ＣＨ（Ｚ２）
−Ｃ（Ｏ）−Ｊ２ ＶＩＩＩ
または
Ｊ１−Ｃ（Ｏ）−Ｎａ（Ｃ１（Ｒ１）−Ｃ２（Ｒ２）−Ｃ３（Ｒ３）
−ＳＨ）−ＣＨ（Ｚ２）−Ｃ（Ｏ）−Ｊ２ ＩＸ
を有する。これらの式において、Ｊ１、Ｊ２、及びＲ１、Ｒ２、Ｒ３、及びＺ２は、上で定義したものである。
【００１８】
Ｎ置換アミド結合ライゲーション生成物の複合電子供与基Ｒ１、Ｒ２、及びＲ３は、Ｎ置換アミド結合ライゲーション生成物からの、Ｎ−Ｃ１結合の開裂及び２または３炭素鎖アルキルまたはアリールチオールの除去を容易にする。ペプチドに適合する開裂条件下でのＮのアルキルまたはアリールチオール鎖の除去により、ライゲーション部位に天然アミド結合を有するライゲーション生成物が生じる。第一及び第二の要素がペプチドまたはポリペプチドである場合、ライゲーション生成物は、
式
Ｊ１−ＣＯＮａＨ−ＣＨ（Ｚ２）−Ｃ（Ｏ）−Ｊ２ Ｘ
を有する。
【００１９】
本発明は、従来の化学的ライゲーション法に比して、多くの利点を与える。そのような利点のうちいくつかは、本発明のＮ置換２または３炭素鎖アルキルまたはアリールチオール要素の精密に調整された性質に関係する。第一に、結合されていないＮ置換要素は、酸性条件に対して安定であり、それによって強力な合成と安定した貯蔵とが行われる。第二に、該要素は、カルボキシチオエステル要素と選択的に反応して、ライゲーション部位にＮ置換アミド結合を有する初期ライゲーション生成物を生じる。第三に、初期ライゲーション生成物のライゲーション部位のＮα位置にある再生アルキルまたはアリールチオール成分は、非保護、部分保護、または完全保護ペプチド、ポリペプチド、またはその他の成分に十分に適合する条件下で、選択的に除去することができる。すなわち、アルキルまたはアリールチオール成分を、所望のライゲーション生成物に損傷を与えることなく、除去することができる。この選択的開裂反応は、ライゲーションのために選択した特定のＮ置換アルキルまたはアリールチオール成分に応じた、標準的なペプチド適合性の開裂条件下、たとえば酸性、光分解、または還元性条件下で、容易に実施することができる。したがって、本発明のもう一つの利点は、ライゲーション要素の残留部分上の一つ以上の基（存在する場合）を、意図する最終用途に応じて、非保護、部分保護、または完全保護とすることができる、ということである。さらに、与えられた、カルボキシルチオエステル及びＮ置換２または３炭素鎖アルキルまたはアリールチオールの化学選択的性質と溶解度特性との下で、ライゲーション反応は、室温付近において、水性条件下で、ｐＨ７付近で、高速かつ正確に実施して、高い生成物収率を得ることができる。したがって、本発明においては、穏やかな条件下で、部分または完全非保護ペプチド、ポリペプチド、またはその他のポリマーのライゲーションが非常に柔軟に行われる。
【００２０】
本発明のＮ置換２炭素鎖アルキルまたはアリールチオール要素を有するペプチド要素の場合、この化合物は、下記の表Ｉに示すように、
式
ＨＳ−Ｃ２−Ｃ１（Ｒ１）−ＮＨａ−ＣＨ（Ｚ２）−Ｃ（Ｏ）−Ｊ２
ＸＩ
を有する。Ｊ２及びＲ２は、前記のものであり、Ｚ２は、Ｎ置換アミノ酸に適合する任意の側鎖基、たとえばアミノ酸の側鎖、である。Ｒ１は、好ましくは、Ｃ１に対するオルトまたはパラ位置において電子供与基で置換されたフェニル基、またはピコリル基（非置換、またはＣ１に対するオルトまたはパラ位置においてヒドロキシルまたはチオールで置換されたもの）である。
【００２１】
【表１】
【００２２】
オルトまたはパラ位置のフェニル及びピコリル電子供与置換基Ｒ１'、Ｒ３'、及びＲ５'の配置は、ライゲーション後のＮ−Ｃ１結合の開裂を容易にするためのＣ１炭素への電子的複合を維持するのに必要である。Ｒ１'、Ｒ３'、及びＲ５'として好ましい電子供与基の例としては、強力な電子供与基たとえばメトキシ（−ＯＣＨ3）、チオール（−ＳＨ）、ヒドロキシル（−ＯＨ）、メチルチオ（−ＳＣＨ3）、及び中程度の電子供与体（ｄｏｎａｔｏｒ）たとえばメチル（−ＣＨ3）、エチル（−ＣＨ2−ＣＨ3）、プロピル（−ＣＨ2−ＣＨ2−ＣＨ3）、イソプロピル（−ＣＨ2（ＣＨ3）3）がある。ただし、Ｒ１'、Ｒ３'、及びＲ５'の任意のものまたはすべてをＨとすることができる。一般的な観察結果によれば、強力な電子供与基は、２炭素鎖アルキルまたはアリールチオールの、ライゲーション後の開裂に対する敏感性を高める。Ｒ１'、Ｒ３'、またはＲ５'置換基として単一の電子供与基が存在する場合、ライゲーション反応は高速で進行しうるが、開裂はゆっくりであり、あるいはより厳しい開裂条件が必要である。Ｒ１'、Ｒ３'、またはＲ５'置換基として、二つ以上の電子供与基が存在する場合、ライゲーション反応はゆっくりでありうるが、開裂は高速であり、あるいはより厳しくない開裂条件が必要である。したがって、条件に応じて特定の電子供与基を選択することができる。
【００２３】
本発明のもう一つの実施形態は、Ｎ置換２炭素鎖化合物に関する。該化合物は、Ｒ１'及びＲ５'位置にＲ１の置換基としてチオールを含む。Ｃ１に複合した電子供与基に加えて、これらの位置の一つまたは両方にチオールを導入することにより、Ｒ１基に仲介される６員環を通過して結合する化合物が生じる（また、Ｎα−２炭素鎖アルキルチオールの場合５員環を通過する）。また、この導入により、αカルボキシチオエステルとの反応のために使用できるチオールの局所濃度も増大し、構造的条件に関してさらに適当なライゲーションを良くできる立体配座が与えられる。
【００２４】
本発明のＮα置換３炭素鎖アルキルまたはアリールチオール要素に関して述べると、この化合物は、下記の表ＩＩに示す式 ＨＳ−Ｃ３（Ｒ３）−Ｃ２（Ｒ２）−Ｃ１（Ｒ１）−ＮＨα−ＣＨ（Ｚ２）−Ｃ（Ｏ）−Ｊ２ を有している。
【００２５】
【表２】
【００２６】
前述のように、Ｊ２は、化学的ペプチド合成または拡張天然型化学的ライゲーションに適合する任意の化学成分とすることができ、Ｚ２は、Ｎ置換アミノ酸に適合する任意の側鎖基たとえばアミノ酸の側鎖である。Ｒ１が水素でない場合、Ｒ２とＲ３は水素であり、Ｒ１は、非置換の、またはより好ましくはＣ１に対するオルトもしくはパラ位置において電子供与基で置換されたフェニル成分であるか、またはピコリル（非置換、またはＣ１に対するオルトもしくはパラ位置においてヒドロキシルもしくはチオールで置換されたもの）である。Ｒ２とＲ３が水素でない場合、Ｒ１は水素であり、Ｒ３とＲ２は、Ｃ１に対するオルトもしくはパラ位置において電子供与基で置換されたベンジル基であるか、またはピコリル（非置換、またはＣ１に対するオルトもしくはパラ位置においてヒドロキシルもしくはチオールで置換されたもの）である。
【００２７】
Ｎ置換２炭素鎖化合物の場合と同様に、オルトまたはパラ位置のフェニル及びピコリル電子供与置換基Ｒ１'、Ｒ３'、及びＲ５'の配置は、ライゲーション後のＮα−Ｃ１結合の確かな開裂のためのＣ１炭素への電子的複合を維持するのに必要である。しかし、Ｒ２及びＲ３がＣ２及びＣ３を有するベンジル基である場合、Ｒ１'とＲ３'のうち少なくとも一つが強力な電子供与基であり、このとき、Ｒ１'またはＲ３'がメトキシ（−ＯＣＨ3）、チオール（−ＳＨ）、ヒドロキシル（−ＯＨ）、及びチオメチル（−ＳＣＨ3）から選択される。Ｒ２とＲ３が水素であるＮ置換３炭素鎖チオールの場合、Ｒ１はフェニルまたはピコリル基から成り、このときＲ１'、Ｒ３'、及びＲ５'は、強力もしくは中程度の電子供与基またはこれらの組合せを含む。Ｎ置換２炭素鎖アルキルまたはアリールチオールの場合と同様に、強力な電子供与基は、３炭素鎖アルキルまたはアリールチオールの、ライゲーション後の開裂に対する敏感性を高める。したがって、条件に応じて特定の電子供与基またはその組合せを選択することができる。
【００２８】
本発明のＮ置換３炭素鎖化合物は、Ｎ置換２炭素鎖化合物の場合と同様に、問題の構造における置換に使用できる場合、Ｒ１'及びＲ５'位置におけるＲ１の置換基として、チオールを含むことができる。この場合も、電子供与チオール基はＣ１に複合しており、前記位置へのこの基の導入により、この化合物は、６員環形成ライゲーション現象への二つの経路を有することができる。また、この導入により、αカルボキシチオエステルとの反応のために使用できるチオールの局所濃度も増大し、構造的条件に関してさらに適当なライゲーションを良くできる配列が与えられる
【００２９】
本発明のＮ末端Ｎ置換２または３炭素鎖アルキルまたはアリールチオールアミノ酸の合成は、ここでたとえば方法Ｉ及び方法ＩＩ、ならびに実施例に述べるようにして、当業者に公知の標準的な有機化学技術を用いて、実施することができる。たとえば、"Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，Ｒｅａｃｔｉｏｎｓ，Ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ，ａｎｄ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ，"４thＥｄｉｔｉｏｎ，Ｊ．Ｍａｒｃｈ（Ｅｄ．），Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ＮＹ，１９９２；"Ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎｓ，Ａ Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ Ｇｒｏｕｐ ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎｓ，"Ｒ．Ｌａｒｏｃｋ（Ｅｄ．），ＶＣＨ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ＮＹ，１９８９，を参照されたい。これらのアミノ酸は、溶液中において、ポリマー支持合成により、またはこれらの組合せによって合成することができる。好ましい方法においては、Ｎα保護Ｎアルキル化Ｓ保護アミノアルキルまたはアリールチオールアミノ酸前駆体を使用する。合成のために使用する反応物質は商業的供給源のどこからでも得ることができる。また、十分に理解されるように、出発要素及びいろいろな中間体たとえばそれぞれのアミノ酸誘導体は、キットその他に入れて、あとからの使用のために保存することができる。
【００３０】
本発明のＮ末端Ｎα置換２または３炭素鎖アルキルまたはアリールチオールアミノ酸の生成においては、保護基法が使用される。いろいろな合成方策において使用するのに好ましい保護基（ＰＧ）は、一般に、固相ペプチド合成（"ＳＰＰＳ"）に適合するものである。場合によっては、いろいろな条件下で除去できる直交（ｏｒｔｈｏｇｏｎａｌ）保護基の使用も必要になる。多くのそのような保護基が公知であり、ここでの目的のために適当である（たとえば、"Ｐｒｏｔｅｃｔｉｎｇ Ｇｒｏｕｐｓ ｉｎ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ"３ｒｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｔ．Ｗ．Ｇｒｅｅｎｅ ａｎｄ Ｐ．Ｇ．Ｍ．Ｗｕｔｓ，Ｅｄｓ．，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，１９９９；ＮｏｖａＢｉｏｃｈｅｍ． Ｃａｔａｌｏｇ ２０００；"Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ Ｐｅｐｔｉｄｅｓ，Ａ Ｕｓｅｒ'ｓ Ｇｕｉｄｅ，"Ｇ．Ａ．Ｇｒａｎｔ，Ｅｄ．，Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ ＆ Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ＮＹ，１９９２；"Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｃｈｅｍｔｅｃｈ Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎａｌ ＆ Ｓｏｌｉｄ Ｐｈａｓｅ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，"Ｗ．Ｄ．．Ｂｅｎｎｅｔ，Ｊ．Ｗ．Ｃｈｒｉｓｔｅｎｓｅｎ，Ｌ．Ｋ．Ｈａｍａｋｅｒ，Ｍ．Ｌ．Ｐｅｔｅｒｓｏｎ，Ｍ．Ｒ．Ｒｈｏｄｅｓ，ａｎｄ Ｈ．Ｈ．Ｓａｎｅｉｉ，Ｅｄｓ．，Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｃｈｅｍｔｅｃｈ，１９９８；"Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ｏｆ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，２ｎｄ ｅｄ．，"Ｍ．Ｂｏｄａｎｓｚｋｙ，Ｅｄ．，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ，１９９３；"Ｔｈｅ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，２ｎｄ ｅｄ．，"Ｍ．Ｂｏｄａｎｓｚｋｙ ａｎｄ Ａ．Ｂｏｄａｎｓｚｋｙ，Ｅｄｓ．，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ，１９９４；"Ｐｒｏｔｅｃｔｉｎｇ Ｇｒｏｕｐｓ，"Ｐ．Ｊ．Ｋｏｃｉｅｎｓｋｉ，Ｅｄ．，Ｇｅｏｒｇ Ｔｈｉｅｍｅ Ｖｅｒｌａｇ，Ｓｔｕｔｔｇａｒｔ，Ｇｅｒｍａｎｙ，１９９４，を参照されたい）。イオウ成分の場合、適当な保護基の単なる例示としては、ベンジル、４−メチルベンジル、４−メトキシベンジル、トリチル（ｔｒｉｔｙｌ）、Ａｃｍ、ＴＡＣＡＭ、キサンチル（ｘａｎｔｈｙｌ）、ジスルフィド誘導体、ピコリル、及びフェナシル（ｐｈｅｎａｃｙｌ）がある。
【００３１】
もっと詳しく言うと、Ｎα置換２または３炭素鎖アルキルまたはアリールチオールは、方法Ｉ（Ｎα置換前駆体の固相生成）、方法ＩＩ（Ｎα置換前駆体の溶液相生成）にしたがって生成することができる。方法Ｉの場合、Ｎα置換２または３炭素鎖アルキルまたはアリールチオールは、ポリマー支持有機合成の標準的方法により、固相上で直接に集成されるが、一方、方法ＩＩのＮα保護、Ｎアルキル化、Ｓ保護、アミノアルキルまたはアリールチオールアミノ酸前駆体は、標準的な結合手順により、樹脂に結合される。方法Ｉの場合、Ｘは、水素であり、Ｒ１及びＲ２は、前記のもので、保護または非保護成分として予備生成させるかまたは樹脂上で合成することができ、Ｊ２は、好ましくはＸ−ＣＨ（Ｒ）−Ｊ２−樹脂の形にハロゲンに結合させる。この式で、Ｒは、ハロゲンまたはその他の側鎖である。容易に理解しうるように、たとえばβもしくはγアミノ酸または類似の分子の合成において、たとえば、ハロゲンＸとＪ２−樹脂とが複数の炭素によって分離される場合には、Ｊ２はいろいろな基とすることができる。グリオキサル成分（ＨＣ（Ｏ）−Ｃ（Ｏ）−Ｊ２−樹脂）が使用される場合、生成される側鎖Ｒは水素である。方法ＩＩの場合、Ｘは、ハロゲンであり、Ｒ１及びＲ２は、前記のもので、保護または非保護成分として予備生成させるかまたは溶液中もしくは樹脂上で合成することができ、ここで、Ｒは、ハロゲンまたはその他の側鎖である。グリオキサル酸成分（ＨＣ（Ｏ）−Ｃ（Ｏ）−ＯＨ）が使用される場合、生成される側鎖Ｒは水素である。前記のことから、方法ＩとＩＩが、３炭素鎖アルキルまたはアリールチオールの合成に使用することができるということは明らかであろう。ラセミまたはジアステレオマー生成物が生じる場合、拡張天然型化学的ライゲーションに使用する前に、これらを標準的な方法によって分離することが必要になりうる。
【００３２】
【化９】
【００３３】
【化１０】
【００３４】
本発明の拡張天然型化学的ライゲーション法のために使用する第一の要素のカルボキシチオエステル成分について述べると、この化合物は式 Ｊ１−ＣＯ−ＳＲ を有する。より好ましいカルボキシチオエステル要素は、式 Ｊ１−ＮＨ−Ｃ（Ｚ１）−ＣＯ−ＳＲ のα−カルボキシルチオエステルアミノ酸から成る。基Ｊ１は、化学選択反応に適合する任意の化学成分、たとえば保護もしくは非保護アミノ酸、ペプチド、ポリペプチド、その他のポリマー、染料、リンカー、その他とすることができる。Ｚ１は、αＣＯ−ＳＲチオエステルに適合する任意の側鎖基たとえばアミノ酸の側鎖である。Ｒは、チオエステル基に適合する任意の基であり、たとえば単なる例示として、アリール、ベンジル、及びアルキル基がある。Ｒの例としては、３−カルボキシ−４−ニトロフェニルチオエステル、ベンジルチオエステル、及びメルカプトプロピオン酸ロイシンチオエステルがある（たとえば、Ｄａｗｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ（１９９４）２６６：７７６−７７９；Ｃａｎｎｅ ｅｔ ａｌ．Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔ．（１９９５）３６：１２１７−１２２０；Ｋｅｎｔ，ｅｔ ａｌ．，ＷＯ９６／３４８７８；Ｋｅｎｔ，ｅｔ ａｌ．，ＷＯ９８／２８４３４；Ｉｎｇｅｎｉｔｏ ｅｔ ａｌ．，ＪＡＣＳ（１９９９）１２１（４９）：１１３６９−１１３７４；Ｈａｃｋｅｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．（１９９９）９６：１００６８−１００７３，を参照されたい）。その他の例としては、インテイン（ｉｎｔｅｉｎ）仲介生物学的方法によって生成できる、ジチオトレイトール、またはアルキルもしくはアリールチオエステルがあり、これらも公知である（たとえば、Ｃｈｏｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅ（１９９７）１９２：２７７−２８１；Ｃｈｏｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．（１９９８）２６：５１０９−５１１５：Ｅｖａｎｓ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉｅｎｃｅ（１９９８）７：２２５６−２２６４；Ｃｏｔｔｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ＆ Ｂｉｏｌｏｇｙ（１９９９）６（９）：２４７−２５６，を参照されたい）。
【００３５】
αカルボキシチオエステルは、当業者に公知の標準的な技術に従い、化学的または生物学的方法、たとえばここで述べる方法たとえば実施例に含まれるもの、によって生成することができる。化学的合成の場合、α−カルボキシチオエステルペプチドは、溶液中またはチオエステル生成樹脂によって生成することができる。その技術は公知である（たとえば、Ｄａｗｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，前記；Ｃａｎｎｅ ｅｔ ａｌ．，前記；Ｈａｃｋｅｎｇ ｅｔ ａｌ．，前記；Ｈｏｊｏ Ｈ，Ａｉｍｏｔｏ，Ｓ．（１９９１）Ｂｕｌｌ Ｃｈｅｍ Ｓｏｃ Ｊｐｎ ６４：１１１−１１７を参照されたい）。たとえば、化学合成チオエステルペプチドは、対応するペプチドα−チオ酸から作ることができ、α−チオ酸は、チオエステル樹脂上または溶液中で合成することができるが、樹脂法が好ましい。ペプチド−α−チオ酸は、対応する３−カルボキシ−４−ニトロフェニルチオエステル、対応するベンジルエステル、またはいろいろなアルキルチオエステルの任意のものに転化させることができる。これらのチオエステルは、すべて、ライゲーション反応のために十分な離脱基を与え、３−カルボキシ−４−ニトロフェニルチオエステルのほうが対応するベンジルチオエステルよりもやや大きな反応速度を示し、ベンジルチオエステルは、アルキルチオエステルよりも反応性が大きくなりうる。別の例として、トリチル会合（ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ）メルカプトプロピオン酸（ｍｅｒｃａｐｔｏｐｒｏｐｒｉｏｎｉｃ ａｃｉｄ）ロイシンチオエステル生成樹脂を、Ｃ末端チオエステルの生成のために使用することができる（Ｈａｃｋｅｎｇ ｅｔ ａｌ．，前記）。Ｃ末端チオエステル合成は、３−カルボキシプロパンスルホンアミド安全捕捉（ｓａｆｅｔｙ ｃａｔｃｈ）リンカーを使用し、ジアゾメタンまたはヨードアセトニトリルによる活性化の後、適当なチオールによる置換を行うことによっても、実現することができる（Ｉｎｇｅｎｉｔｏ ｅｔ ａｌ．，前記；Ｓｈｉｎ ｅｔ ａｌ．，（１９９９）Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，１２１，１１６８４−１１６８９）。
【００３６】
ペプチドまたはポリペプチドＣ末端α−カルボキシエステルも、生物学的方法によって生成することができる。たとえば、インテイン発現系（ｉｎｔｅｉｎ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｓｙｓｔｅｍ）を、標識、たとえば親和性標識、あり、またはなしで使用して、Ｃ末端チオエステルペプチドまたはポリペプチドセグメントを生成するのに適当なチオールの存在下で、"インテイン"たんぱく質スプライシング要素の誘導できる自己開裂活性を使用することができる。特に、インテインは、Ｃ末端チオエステルを有するペプチドセグメントを生成するチオールたとえばＤＴＴ、β−メルカプトエタノール、β−メルカプトエタンスルホン酸、またはシステインの存在下で、独特の自己開裂を引起こす。たとえば、Ｃｈｏｎｇ ｅｔ ａｌ．，（１９９７）前記；Ｃｈｏｎｇ ｅｔ ａｌ．，（１９９８）前記；Ｅｖａｎｓ ｅｔ ａｌ．，前記；及びＣｏｔｔｏｎ ｅｔ ａｌ．，前記、を参照されたい。
【００３７】
図１は、ペプチドの拡張天然型化学的ライゲーションを仲介する能力を示すことによって、本発明を説明するものであり、同じ方法は、任意の適当な分子のライゲーションの実施のために使用することができる。図示されているように、第一の要素は、式 Ｊ１−ＨＮ−ＣＨ（Ｚ１）−αＣＯ−ＳＲ のα−カルボキシルチオエステルを有し、第二の要素は、式 ＨＳ−Ｃ２−Ｃ１（Ｒ１）−ＮＨα−ＣＨ（Ｚ２）−Ｃ（Ｏ）−Ｊ２ のＮ末端の酸安定なＮα置換２炭素鎖アルキルまたはアリールチオールを有する。要素Ｊ１及びＪ２は、化学選択的ライゲーション反応に適合する任意の化学成分たとえば保護または非保護アミノ酸、ペプチド、ポリペプチド、その他のポリマー、染料、リンカー、その他とすることができる。Ｚ１は、αＣＯ−ＳＲチオエステルに適合する任意の側鎖基、たとえばアミノ酸の保護または非保護側鎖である。Ｚ２は、Ｎα置換アミノ酸に適合する任意の側鎖基、たとえばアミノ酸の保護または非保護側鎖である。Ｒ１は、Ｃ１に対する好ましくはオルトまたはパラ位置において電子供与基で置換されたベンジル成分（Ｃ１に関して述べる場合にはベンジルであり、他の場合にはフェニルである）、またはピコリル（ｐｉｃｏｌｙｌ）（非置換、またはＣ１に対するオルトまたはパラ位置においてヒドロキシルまたはチオールで置換されたもの）である。
【００３８】
チオール交換が、αＣＯＳＲチオエステル要素とアミノＮ−｛アルキルチオール｝要素との間で起こる。この交換により、チオエステル結合中間ライゲーション生成物が生じ、この生成物は、５員環中間体を通過する自発転位の後、式 Ｊ１−ＨＮ−ＣＨ（Ｚ１）−Ｃ（Ｏ）−Ｎα（Ｃ１（Ｒ１）−Ｃ２−ＳＨ）−ＣＨ（Ｚ２）−Ｃ（Ｏ）−Ｊ２ の第一のライゲーション生成物を生じ、この生成物はライゲーション部位に除去できるＮα置換２炭素鎖アルキルまたはアリールチオール［ＨＳ−Ｃ２−Ｃ１（Ｒ１）−］を有する。ライゲーション部位のこのＮα置換２炭素鎖アルキルまたはアリールチオール［ＨＳ−Ｃ２−Ｃ１（Ｒ１）−］は、ペプチドに適合する条件下で、除去しやすく、式 Ｊ１−ＨＮ−ＣＨ（Ｚ１）−ＣＯ−ＮＨ−ＣＨ（Ｚ２）−ＣＯ−Ｊ２ の最終ライゲーション生成物を生じ、この生成物はライゲーション部位に天然アミド結合を有する。
【００３９】
図２は、ペプチドの拡張天然型化学的ライゲーションを仲介する能力を示すことによって、本発明を説明するものであり、同じ方法は任意の適当な分子のライゲーションの実施のために使用することができる。図示されているように、第一の要素は、式 Ｊ１−ＨＮ−ＣＨ（Ｚ１）−αＣＯ−ＳＲ のα−カルボキシルチオエステルを有し、第二の要素は、式 ＨＳ−Ｃ３（Ｒ３）−Ｃ２（Ｒ２）−Ｃ１（Ｒ１）−ＮＨα−ＣＨ（Ｚ２）−Ｃ（Ｏ）−Ｊ２ の酸安定なＮα置換３炭素鎖アルキルまたはアリールチオールを有する。要素Ｊ１及びＪ２は、化学選択的ライゲーション反応に適合する任意の化学成分たとえば保護または非保護アミノ酸、ペプチド、ポリペプチド、その他のポリマー、染料、リンカー、その他とすることができる。Ｚ１は、αＣＯ−ＳＲチオエステルに適合する任意の側鎖基、たとえばアミノ酸の保護または非保護側鎖である。Ｚ２は、Ｎα置換アミノ酸に適合する任意の側鎖基、たとえばアミノ酸の保護または非保護側鎖である。Ｒ１が水素でない場合、Ｒ２とＲ３は水素であり、Ｒ１は、非置換の、またはＣ１に対するオルトまたはパラ位置において電子供与基で置換されたフェニル成分、ピコリル（非置換、またはＣ１に対するオルトまたはパラ位置においてヒドロキシルまたはチオールで置換されたもの）、メタンチオール、またはスルホキシメチルである。Ｒ２とＲ３が水素でない場合、Ｒ１は水素であり、Ｒ３とＲ２は、Ｃ１に対するオルトまたはパラ位置において電子供与基で置換されたベンジル基、またはピコリル（非置換、またはＣ１に対するオルトまたはパラ位置においてヒドロキシルまたはチオールで置換されたもの）である。
【００４０】
チオール交換が、ＣＯＳＲチオエステル要素とアミノアルキルチオール要素との間で起こる。この交換により、チオエステル結合中間ライゲーション生成物が生じ、この生成物は、６員環中間体を通過する自発転位の後、式 Ｊ１−ＨＮ−ＣＨ（Ｚ１）−Ｃ（Ｏ）−Ｎα（Ｃ１−Ｃ２（Ｒ２）−Ｃ３（Ｒ３）−ＳＨ）−ＣＨ（Ｚ２）−Ｊ２ の第一のライゲーション生成物を生じ、この生成物はライゲーション部位に除去できるＮα置換３炭素鎖アルキルまたはアリールチオール［ＨＳ−Ｃ３（Ｒ３）−Ｃ２（Ｒ２）−Ｃ１（Ｒ１）−］を有する。ライゲーション部位のこのＮα置換３炭素鎖アリールチオール［ＨＳ−Ｃ３（Ｒ３）−Ｃ２（Ｒ２）−Ｃ１（Ｒ１）−］は、ペプチドに適合する条件下で、除去しやすく、式 Ｊ１−ＨＮ−ＣＨ（Ｚ１）−ＣＯ−ＮＨ−ＣＨ（Ｚ２）−ＣＯ−Ｊ２ の最終ライゲーション生成物を生じ、この生成物はライゲーション部位に天然アミド結合を有する。
【００４１】
図３は多要素の拡張天然型化学的ライゲーション法を示す。図１に示すような式 ＨＳ−Ｃ２−Ｃ１（Ｒ１）−Ｎα（ＰＧ１）−ＣＨ（Ｚ２）−Ｃ（Ｏ）−Ｊ２ のＮα保護Ｎ末端ポリペプチドＮα置換２炭素鎖アルキルまたはアリールチオールを有するポリペプチドα−カルボキシルチオエステルが、Ｎ末端Ｃｙｓ残基を含むペプチドと反応する。Ｒ１は、非置換のフェニル、もしくは好ましくはＣ１に対するオルトまたはパラ位置において電子供与基で置換されたフェニル、またはピコリル（非置換、またはＣ１に対するオルトまたはパラ位置においてヒドロキシルもしくはチオールで置換されたもの）である。保護基（ＰＧ１）は、任意の適当な保護基，たとえばアルキルカルボニル保護基（たとえば、ベンジルオキシカルボニル（Ｚ）、Ｂｏｃ、Ｂｐｏｃ、Ｆｍｏｃ、その他）、トリフェニルメチル保護基（Ｔｒｔ）、２−ニトロフェニルスルフェニル保護基（Ｎｐｓ）、その他とすることができる。この保護基は第一のライゲーション反応後に除去される。
【００４２】
第一の天然型化学的ライゲーション反応は、図１に示すような式 ＨＳ−Ｃ２−Ｃ１（Ｒ１）−Ｎα（ＰＧ１）−ＣＨ（Ｚ２）−Ｃ（Ｏ）−Ｊ２ のＮα保護Ｎ末端ポリペプチドＮα置換２炭素鎖アルキルまたはアリールチオールを有するポリペプチドα−カルボキシルチオエステルと、Ｎ末端Ｃｙｓ−ペプチドとの間で行われ、式 ＨＳ−Ｃ２−Ｃ１（Ｒ１）−Ｎα（ＰＧ１）−ＣＨ（Ｚ２）−Ｃ（Ｏ）−ペプチド２−ペプチド３ の第一ライゲーション生成物を与える。次に、保護基ＰＧ１が除去され、式 ＨＳ−Ｃ２−Ｃ１（Ｒ１）−Ｎα（Ｈ）−ＣＨ（Ｚ２）−Ｃ（Ｏ）−ペプチド２−ペプチド３ のライゲーション生成物が与えられる。次に、この生成物は第三のチオエステル含有要素と反応させられる。ＣＯＳＲチオエステル要素とアミノＮ−｛アルキルチオール｝要素との間で、チオール交換が行われる。この交換により、チオエステル結合中間ライゲーション生成物が生じ、該生成物は、５員環中間体を通過する自発転位の後、式 ペプチド１−Ｃ（Ｏ）−Ｎα（Ｃ１（Ｒ１）−Ｃ２−ＳＨ）−ＣＨ（Ｚ２）−Ｃ（Ｏ）ペプチド２−Ｃｙｓ−ペプチド３ の第二のライゲーション生成物を生じ、該生成物は、第二のライゲーション部位に除去できるＮα置換２炭素鎖アルキルまたはアリールチオール［ＨＳ−Ｃ２−Ｃ１（Ｒ１）−］を有する。第二のライゲーション部位のこのＮα置換２炭素鎖アルキルまたはアリールチオール［ＨＳ−Ｃ２−Ｃ１（Ｒ１）−］は、ペプチドに適合する条件下で、除去されやすく、第一及び第二のライゲーション部位に天然アミド結合を有する、式 ペプチド１−Ｃ（Ｏ）−ＮαＨ−ＣＨ（Ｚ２）−Ｃ（Ｏ）ペプチド２−Ｃｙｓ−ペプチド３ の最終ライゲーション生成物を生じる。
【００４３】
図１、２、及び３に示すように、第一のカルボキシチオエステル要素を有する本発明のＮ置換２または３炭素鎖アルキルまたはアリールチオール要素は、ライゲーション部位にＮ置換アミド結合を有するライゲーション生成物を生じる。反応のライゲーション条件は、Ｎ置換２または３炭素鎖アルキルまたはアリールチオール成分とのチオエステルの選択的反応性が維持されるように、選択される。好ましい実施形態の場合、ライゲーション反応は、ｐＨ６〜８、好ましくはｐＨ６．５〜７．５、を有する緩衝液中で実施される。この緩衝液は水性、有機、またはこれらの混合物とすることができる。ライゲーション反応は、また、一つ以上の触媒及び／または一つ以上の還元剤、脂質、界面活性剤、その他の変性剤または可溶化剤、ならびにその他を含むことができる。好ましい触媒の例としては、チオール及びホスフィン含有成分たとえばチオフェノール、ベンジルメルカプタン、ＴＣＥＰ、及びアルキルホスフィンがある。変性剤及び／または可溶化剤の例としては、グアニジニウム、尿素の水溶液もしくは尿素を有機溶剤たとえばＴＦＥ、ＨＦＩＰ、ＤＭＦ、ＮＭＰに溶解させたもの、アセトニトリルと水との混合物、またはアセトニトリルをグアニジニウムと尿素との水溶液と混合したもの、がある。温度も、ライゲーション反応の速度の調節のために使用することができる。温度は、通常５〜５５℃、好ましくは１５〜４０℃、とする。一例として、ライゲーション反応は、６Ｍのグアニジニウム中に２％のチオフェノールを含むｐＨ６．８〜７．８の反応系において、十分に進行する。
【００４４】
Ｎ置換２炭素鎖アルキルまたはアリールチオールの場合、ライゲーション現象は、ＣＯＳＲチオエステル要素とアミノアルキルチオール要素との間で起こるチオール交換によって生じる。この交換によりチオエステル結合中間ライゲーション生成物が生じ、該生成物は、５員環中間体を通過する自発転位の後、式 Ｊ１−ＨＮ−ＣＨ（Ｚ１）−Ｃ（Ｏ）−Ｎα（Ｃ１（Ｒ１）−Ｃ２−ＳＨ）−ＣＨ（Ｚ２）−Ｊ２ を有する第一のライゲーション生成物を生じ、この生成物は、ライゲーション部位に除去できるＮ置換２炭素鎖アルキルまたはアリールチオール［ＨＳ−Ｃ２−Ｃ１（Ｒ１）−］を有する。ここで、置換基は前記のとおりである。ライゲーション部位にあるＮ置換２炭素鎖アルキルまたはアリールチオール［ＨＳ−Ｃ２−Ｃ１（Ｒ１）−］は、ペプチドに適合する条件下で除去されやすく、ライゲーション部位に天然アミド結合を有する、式 Ｊ１−ＨＮ−ＣＨ（Ｚ１）−ＣＯ−ＮＨ−ＣＨ（Ｚ２）−ＣＯ−Ｊ２ の最終ライゲーション生成物を生じる。
【００４５】
Ｎ置換３炭素鎖アリールまたはアルキルチオールの場合、ＣＯＳＲチオエステル要素とアミノアルキルチオール要素との間のチオール交換によって、チオエステル結合中間ライゲーション生成物が生じ、該生成物は、６員環中間体を通過する自発転位の後、式 Ｊ１−ＨＮ−ＣＨ（Ｚ１）−Ｃ（Ｏ）−Ｎα（Ｃ１−Ｃ２（Ｒ２）−Ｃ３（Ｒ３）−ＳＨ）−ＣＨ（Ｚ２）−Ｊ２ を有する第一のライゲーション生成物を生じ、この生成物は、ライゲーション部位に除去できるＮ置換３炭素鎖アルキルまたはアリールチオール［ＨＳ−Ｃ３（Ｒ３）−Ｃ２（Ｒ２）−Ｃ１（Ｒ１）−］を有する。ライゲーション部位にあるＮ置換３炭素鎖アリールチオール［ＨＳ−Ｃ３（Ｒ３）−Ｃ２（Ｒ２）−Ｃ１（Ｒ１）−］は、ペプチドに適合する条件下で除去されやすく、ライゲーション部位に天然アミド結合を有する、式 Ｊ１−ＨＮ−ＣＨ（Ｚ１）−ＣＯ−ＮＨ−ＣＨ（Ｚ２）−ＣＯ−Ｊ２ の最終ライゲーション生成物を生じる。
【００４６】
Ｎ置換アルキルまたはアリールチオール基の除去は、好ましくは、Ｎ−Ｃ１結合の開裂を促進する酸性条件下で実施し、ライゲーション部位に安定化された非置換アミド結合を生じるようにする。"ペプチドに適合する開裂条件"という言葉は、ペプチドに適合し、またライゲーション生成物からのＮ結合アルキルまたはアリールチオール成分の開裂に適した物理化学的条件を意味するものとする。ペプチドに適合する開裂条件は、一般に、使用するＮαアルキルまたはアリールチオール成分に合わせて選択する。これらの成分は、定型的な周知の方法によって容易に誘導することができる（たとえば、"Ｐｒｏｔｅｃｔｉｎｇ Ｇｒｏｕｐｓ ｉｎ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ"３ｒｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｔ．Ｗ．Ｇｒｅｅｎｅ ａｎｄ Ｐ．Ｇ．Ｍ．Ｗｕｔｓ，Ｅｄｓ．，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，１９９９；ＮｏｖａＢｉｏｃｈｅｍ． Ｃａｔａｌｏｇ ２０００；"Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ Ｐｅｐｔｉｄｅｓ，Ａ Ｕｓｅｒ'ｓ Ｇｕｉｄｅ，"Ｇ．Ａ．Ｇｒａｎｔ，Ｅｄ．，Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ ＆ Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ＮＹ，１９９２；"Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｃｈｅｍｔｅｃｈ Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎａｌ ＆ Ｓｏｌｉｄ Ｐｈａｓｅ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，"Ｗ．Ｄ．．Ｂｅｎｎｅｔ，Ｊ．Ｗ．Ｃｈｒｉｓｔｅｎｓｅｎ，Ｌ．Ｋ．Ｈａｍａｋｅｒ，Ｍ．Ｌ．Ｐｅｔｅｒｓｏｎ，Ｍ．Ｒ．Ｒｈｏｄｅｓ，ａｎｄ Ｈ．Ｈ．Ｓａｎｅｉｉ，Ｅｄｓ．，Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｃｈｅｍｔｅｃｈ，１９９８；"Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ｏｆ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，２ｎｄ ｅｄ．，"Ｍ．Ｂｏｄａｎｓｚｋｙ，Ｅｄ．，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ，１９９３；"Ｔｈｅ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，２ｎｄ ｅｄ．，"Ｍ．Ｂｏｄａｎｓｚｋｙ ａｎｄ Ａ．Ｂｏｄａｎｓｚｋｙ，Ｅｄｓ．，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ，１９９４；"Ｐｒｏｔｅｃｔｉｎｇ Ｇｒｏｕｐｓ，"Ｐ．Ｊ．Ｋｏｃｉｅｎｓｋｉ，Ｅｄ．，Ｇｅｏｒｇ Ｔｈｉｅｍｅ Ｖｅｒｌａｇ，Ｓｔｕｔｔｇａｒｔ，Ｇｅｒｍａｎｙ，１９９４，を参照されたい）。
【００４７】
たとえば、Ｒ１'、Ｒ２'、またはＲ３'置換基が、メトキシ、ヒドロキシル、チオールまたはチオメチル、メチル、及びその他から成る場合、除去のためのより汎用的な方法は、ペプチド合成化学において一般的な酸性開裂条件を含む。この条件は、強酸性条件下または水−酸の条件下で、還元剤及び／またはスカベンジャー系（たとえば、酸、たとえば無水フッ化水素（ＨＦ）、トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）、またはトリフルオロメタンスルホン酸（ＴＦＭＳＡ）、その他）ありまたはなしで、Ｎ−Ｃ１結合を開裂させることを含む。それぞれの酸性開裂系は、所定の構造のためにアリールまたはアルキルチオール成分を除去するために、Ｎα−Ｃ１結合の開裂が最適化されるように選択することができる。そのような条件は、周知であり、ペプチドの完全性を維持するのに適合したものである。開裂のための別の方法においては、ペプチドまたはポリへプチド配列にトリプトファンが存在する場合にチオールスカベンジャーを使用し、トリプトファン側鎖と遊離したアリールまたはアルキルチオール成分との反応が起こらないようにする。チオールスカベンジャーの例としては、エタンジオール、システイン、β−メルカプトエタノール、及びチオクレゾールがある。したがって、本発明の別の実施形態は、アリールまたはアルキルチオール成分を除去するためにＮ−Ｃ１結合を開裂させる場合に、チオールスカベンジャーの添加を含むものである。
【００４８】
その他の特別の開裂条件は、ピコリル基が置換基である場合、光または還元開裂条件を含む。一例として、Ｒ１、またはＲ２及びＲ３置換基がピコリル成分から成る場合、光分解（たとえば、紫外線）、亜鉛／酢酸または電解還元を、標準的な手順に従う開裂に使用することができる。Ｎ置換２炭素鎖チオールのＲ１がＲ１にあるチオメタンから成る場合、水銀（ＩＩ）またはＨＦ開裂が使用できる。この開裂系は、また、第一または第二のライゲーション要素が他の保護基を有する場合、固体支持体からの同時開裂のため、及び／または脱保護反応物質として、使用することができる。たとえば、Ｎ−ピコリル基は、活性化亜鉛（〜０．５ｇ／ｍｌ）を含む１０％酢酸／水溶液にポリペプチドを溶解させることによって除去することができる。チオメタン基たとえば２−メルカプト，１−メチルスルフィニルエタン基（ＨＳ−Ｃ２−Ｃ１（Ｓ（Ｏ）−ＣＨ３）−Ｎα）は、ライゲーションの後、還元及び水銀、メルカプタン仲介開裂によって除去することができる。一例として、メチルスルフィニルエタン基は、チオメタン形への還元のために、Ｎ−メチルメルカプトアセトアミド（ＭＭＡ）を含む３％酢酸水溶液にポリペプチドを溶解させ（たとえば、０．５ｍｌの酢酸／水と０．０５ｍｌのＭＭＡとに１ｍｇのポリペプチド）、一晩の反応後、混合物を凍結乾燥（ｆｒｅｅｚｉｎｇ ａｎｄ ｌｙｏｐｈｉｌｉｚａｔｉｏｎ）することによって除去することができる。その後、還元された補助基を、酢酸水銀（Ｈｇ（ＯＡＣ）2）を含む３％水溶液中で（たとえば、水に０．５ｍｌの酢酸を加えた溶液に１０ｍｇのＨｇ（ＯＡＣ）2を添加したものに、約１時間）処理してから、β−メルカプトエタノール（たとえば、０．２ｍｌのβメルカプトエタノール）を添加することによって、除去することができる。次に、生成物を、標準的な方法たとえば逆相ＨＰＬＣ（ＲＰＨＰＬＣ）によって精製することができる。
【００４９】
容易に理解しうるであろうが、開裂系には、一つ以上の触媒及び／または賦形剤、たとえば一つ以上のスカベンジャー、界面活性剤、溶剤、金属、その他をも使用することができる。一般に、特定スカベンジャーの選択は存在するアミノ酸に応じてなされる。たとえば、スカベンジャーの存在は、開裂時に生じるカルボニウムイオンがある種のアミノ酸（たとえば、Ｍｅｔ、Ｃｙｓ、Ｔｒｐ、及びＴｙｒ）に対して及ぼしうる損傷効果を抑えるために、使用することができる。その他の添加剤たとえば界面活性剤、ポリマー、塩、有機溶剤、その他も、溶解度を調節して開裂を改善するために使用することができる。レドックス系を調節する触媒その他の化学物質も、有効なものでありうる。また、容易に理解しうるように、いろいろな他の物理−化学的条件たとえば緩衝系、ｐＨ、及び温度を通常のように調節して、所定の開裂系を最適化することができる。
【００５０】
本発明は、また、保護された形の、本発明のＮα置換２または３炭素鎖アルキルまたはアリールチオールを与える。これらの化合物は、自動ペプチド合成ならびに直交及び収束（ｏｒｔｈｏｇｏｎａｌ ａｎｄ ｃｏｎｖｅｒｇｅｎｔ）ライゲーション法において、特に有用である。これらの化合物は、下記の表ＩＩＩ及び表ＩＶに示す、式 （ＰＧ２）Ｓ−Ｃ２−Ｃ１（Ｒ１）−Ｎα（ＰＧ１）−ＣＨ（Ｚ２）−Ｃ（Ｏ）−Ｊ２ または （ＰＧ２）Ｓ−Ｃ３（Ｒ３）−Ｃ２（Ｒ２）−Ｃ１（Ｒ１）−Ｎα（ＰＧ１）−ＣＨ（Ｚ２）−Ｃ（Ｏ）−Ｊ２ の、完全保護、部分保護、または完全非保護酸安定Ｎα置換２または３炭素鎖アミノアルキルまたはアリールチオールから成る。特に、Ｒ１、Ｒ２、及びＲ３のうち一つ以上がＣ１に複合した電子供与基を有し、該基は、Ｎα置換アミノアルキルまたはアリールチオールの、Ｎα置換アミドアルキルまたはアリールチオールへの転化の後、Ｃ１において共鳴安定陽イオンを形成することができ、該イオンはペプチドに適合する開裂条件下でＮα−Ｃ１結合の開裂を促進する。ＰＧ１及びＰＧ２は保護基であって、これらは個別または組合せで存在し、あるいは存在しない場合もあり、同じかまたは異なるものであることができる。ここで、Ｚ２は、化学的ペプチド合成または拡張天然型化学的ライゲーションに適合する任意の化学成分であり、またここで、Ｊ２は、化学的ペプチド合成または拡張天然型化学的ライゲーションに適合する任意の化学成分である。
【００５１】
ＰＧ１（またはＸ１）は、アミンを保護するための基である。ＰＧ２（またはＸ２）は、チオールを保護するための基である。多くのそのような保護基が公知であり、ここでの目的のために適当である（たとえば、"Ｐｒｏｔｅｃｔｉｎｇ Ｇｒｏｕｐｓ ｉｎ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ"３ｒｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｔ．Ｗ．Ｇｒｅｅｎｅ ａｎｄ Ｐ．Ｇ．Ｍ．Ｗｕｔｓ，Ｅｄｓ．，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，１９９９；ＮｏｖａＢｉｏｃｈｅｍ． Ｃａｔａｌｏｇ ２０００；"Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ Ｐｅｐｔｉｄｅｓ，Ａ Ｕｓｅｒ'ｓ Ｇｕｉｄｅ，"Ｇ．Ａ．Ｇｒａｎｔ，Ｅｄ．，Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ ＆ Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ＮＹ，１９９２；"Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｃｈｅｍｔｅｃｈ Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎａｌ ＆ Ｓｏｌｉｄ Ｐｈａｓｅ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，"Ｗ．Ｄ．．Ｂｅｎｎｅｔ，Ｊ．Ｗ．Ｃｈｒｉｓｔｅｎｓｅｎ，Ｌ．Ｋ．Ｈａｍａｋｅｒ，Ｍ．Ｌ．Ｐｅｔｅｒｓｏｎ，Ｍ．Ｒ．Ｒｈｏｄｅｓ，ａｎｄ Ｈ．Ｈ．Ｓａｎｅｉｉ，Ｅｄｓ．，Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｃｈｅｍｔｅｃｈ，１９９８；"Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ｏｆ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，２ｎｄ ｅｄ．，"Ｍ．Ｂｏｄａｎｓｚｋｙ，Ｅｄ．，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ，１９９３；"Ｔｈｅ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，２ｎｄ ｅｄ．，"Ｍ．Ｂｏｄａｎｓｚｋｙ ａｎｄ Ａ．Ｂｏｄａｎｓｚｋｙ，Ｅｄｓ．，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ，１９９４；"Ｐｒｏｔｅｃｔｉｎｇ Ｇｒｏｕｐｓ，"Ｐ．Ｊ．Ｋｏｃｉｅｎｓｋｉ，Ｅｄ．，Ｇｅｏｒｇ Ｔｈｉｅｍｅ Ｖｅｒｌａｇ，Ｓｔｕｔｔｇａｒｔ，Ｇｅｒｍａｎｙ，１９９４，を参照されたい）。
【００５２】
【表３】
【００５３】
ＰＧ１及びＸ１として好ましい保護基の単なる例示としては、［Ｂｏｃ（ｔ−ブチルカルバメート）、Ｔｒｏｃ（２，２，２，−トリクロロエチルカルバメート）、Ｆｍｏｃ（９−フルオレニルメチルカルバメート）、Ｂｒ−ＺまたはＣｌ−Ｚ（Ｂｒ−またはＣｌ−ベンジルカルバメート）、Ｄｄｅ（４，４，−ジメチル−２，６−ジオキソシクロエクス１−イリデン）、ＭｓＺ（４−メチルスルフィニルベンジルカルバメート）、Ｍｓｃ（２−メチルスルホエチルカルバメート）、Ｎｓｃ（４−ニトロフェニルエチルスルホニル−エチルオキシカルボニル）がある。好ましいＰＧ１及びＸ１保護基は、"Ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ Ｇｒｏｕｐｓ ｉｎ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，"Ｇｒｅｅｎ ａｎｄ Ｗｕｔｓ，Ｔｈｉｒｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ，（１９９９）から選択され、もっとも好ましいのはＦｍｏｃ及びＮｓｃである。ＰＧ２として好ましい保護基の単なる例示としては、［Ａｃｍ（アセトアミドメチル）、ＭｅＯＢｚｌまたはＭｏｂ（ｐ−メトキシベンジル）、ＭｅＢｚｌ（ｐ−メチルベンジル）、Ｔｒｔ（トリチル）、Ｘａｎ（キサンテニル）、ｔＢｕｔｈｉｏ（ｓ−ｔ−ブチル）、Ｍｍｔ（ｐ−メトキシトリチル）、２または４ピコリル（２または４ピリジル）］、Ｆｍ（９−フルオレニルメチル）、ｔＢｕ（ｔ−ブチル）、Ｔａｃａｍ（トリメチルアセトアミドメチル）］がある。好ましい保護基ＰＧ２及びＸ２は、"Ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ Ｇｒｏｕｐｓ ｉｎ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，"Ｇｒｅｅｎ ａｎｄ Ｗｕｔｓ，Ｔｈｉｒｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ，（１９９９），から選択され、もっとも好ましいのは、Ａｃｍ、Ｍｏｂ、ＭｅＢｚｌ、ピコリルである。
【００５４】
直交保護法は、異なる化学的機構によって除去される二つ以上の種または基を含み、したがって任意の順序で、他の種の存在下で、除去することができる。直交法は相当に穏やかな全体的条件の可能性を与える。選択性を、反応速度ではなく、化学的性質の違いにもとづいて実現できるからである。
【００５５】
【表４】
【００５６】
本発明の保護された形のＮα置換２または３炭素鎖アルキルまたはアリールチオールは、前記の方法ＩまたはＩＩにしたがって生成することができる。
【００５７】
図４は、二つの異なる１−フェニル−２−メルカプトエチル補助基を使用する、本発明のライゲーション方策の概要を示す。
【００５８】
図５Ａ及び５Ｂは、Ｎα−１−（４−メトキシフェニル）−２−メルカプトエチル補助基を使用する、実施例２１で述べるようなシトクロムｂ５６２に対するライゲーション反応に関する、分析高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）の結果を示す。図５Ａは、時刻＝０におけるライゲーション反応の状態を示す。図５Ｂは、反応を一晩進行させたあとのライゲーションの状態を示す。また、図５Ｂに示されているように、Ｎα−１−（４−メトキシフェニル）−２−メルカプトエチル補助基のＣ１の非キラル中心から生じる二つのライゲーション生成物が観察される。
【００５９】
図６Ａ及び６Ｂは、Ｎα−｛１−（４−メトキシフェニル）２−メルカプトエタノ｝改質Ｎ末端セグメントとの拡張天然型化学的ライゲーションを使用することによって生成されたライゲーション生成物シトクロムｂ５６２残基１−１０６の再構成エレクトロスプレー（ｒｅｃｏｎｓｔｒｕｃｔｅｄ ｅｌｅｃｔｒｏｓｐｒａｙ）質量分析（ＭＳ）の結果を示す。Ｃ末端αチオエステルを有するシトクロムｂ５６２残基１−６３が、Ｎ末端Ｎα−｛１−（４−メトキシフェニル）２−メルカプトエタノ｝グリシンを有するシトクロムｂ５６２残基６４−１０６と結合している。図６Ａは、ライゲーション部位に除去できるＮα−｛１−（４−メトキシフェニル）２−メルカプトエタノ｝基を有する初期ライゲーション生成物のＭＳ再構成を示す。図６Ｂは、ライゲーション部位に天然アミド結合を生成させるためにＮα−｛１−（４−メトキシフェニル）２−メルカプトエタノ｝基を除去するフッ化水素（ＨＦ）処理後のライゲーション生成物のＭＳ再構成を示す。測定された質量は、１１９４８±１Ｄａ（ＨＦ処理前）及び１１７８１±１Ｄａ（ＨＦ処理後）であって、損失は１６７±２Ｄａであり、これは、１−（４−メトキシフェニル）２−メルカプトエタノ補助基の除去に関して予想される１６６Ｄａの損失とよく一致している。
【００６０】
図７Ａ及び７Ｂは、図６Ｂに示す直鎖状シトクロムｂ５６２物質の代表的な分析ＨＰＬＣの結果（図７Ａ）、及び折りたたみ（ｆｏｌｄｉｎｇ）後の該物質のイオン交換クロマトグラム（図７Ｂ）を示す。
【００６１】
本発明の化合物は、いろいろな手段のいずれか、たとえばハロゲン仲介アミノアルキル化、還元アミノ化によって、また固相または溶液アミノ酸またはペプチド合成法に適合する、Ｎα保護、Ｎアルキル化、Ｓ保護、アミノアルキルまたはアリールチオールアミノ酸前駆体を用いることによって生成することができる。必要な場合には、許容されるキラル純度の化合物を与えるために、生成されるラセミ混合物またはジアステレオマーの分離を、標準的な方法によって実施することができる。
【００６２】
上述のように、場合によっては、許容されるキラル純度のＮα置換２または３炭素鎖アルキルまたはアリールチオールが好ましい。実施例２１及び図５Ｂに示すように、シトクロムｂ５６２の生成におけるＮα−１−（４−メトキシフェニル）−２−メルカプトエチル補助基の使用により、精製プロファイルの重なった二つのライゲーション生成物（ジアステレオマー）が生じた。Ｎα補助基の除去により、単一の主生成物が生じるが、小さなパーセンテージの欠失（ｄｅｌｅｔｉｏｎ）と副反応生成物とが最終生成物に存在し、これは好ましくないと思われる。たとえば、ｃｙｔ ｂ５６２の合成に使用するＮα−１−（４−メトキシフェニル）−２−メルカプトエチル補助基の合成に使用される実施例４〜６に述べるような還元アミノ化合成法の場合、必ず、キラル中心Ｃ１に二つのエピマーの生成がもたらされる。必要な場合、前記のように、許容されるキラル純度の化合物を与えるために、生成されるラセミ混合物及びジアステレオマーの分離を、標準的な方法によって実施することができる。
【００６３】
許容されるキラル純度の本発明のＮα補助基を得るための標準的な方法は、（１）キラルクロマトグラフィー、（２）キラル合成、（３）共有ジアステレオマー抱合体の使用、及び（４）鏡像体的に純粋なキラル補助基を与えるための結晶化または他の通常の分離法、である。（たとえば、Ａｈｕｊａ，Ｓａｔｉｎｄｅｒ．'Ｃｈｉｒａｌ ｓｅｐａｒａｔｉｏｎｓ．Ａｎ ｏｖｅｒｖｉｅｗ．'ＡＣＳ Ｓｙｍｐ．Ｓｅｒ．（１９９１），４７１（Ｃｈｉｒａｌ Ｓｅｐ．Ｌｉｑ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ．），１−２６；Ｃｏｌｌｅｔ，Ａｎｄｒｅ．"Ｓｅｐａｒａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ Ｅｎａｎｔｉｏｍｅｒｓ ｂｙ Ｃｒｙｓｔａｌｌｉｚａｔｉｏｎ Ｍｅｔｈｏｄｓ，"Ｉｎ：Ｅｎａｎｔｉｏｍｅｒ（１９９９）４：１５７−１７２；Ｌｏｐａｔａ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｃｈｅｍ．Ｒｅｓ．Ｍｉｎｉｐｐｒｉｎｔ（１９８４）１０：２９３０−２９６２；Ｌｏｐａｔａ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｃｈｅｍ．Ｒｅｓ．（１９８４）１０：２９５３−２９７３；Ａｈｕｊａ，Ｓａｔｉｎｄｅｒ．'Ｃｈｉｒａｌ ｓｅｐａｒａｔｉｏｎｓ ａｎｄ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：ａｎ ｏｖｅｒｖｉｅｗ．'Ｃｈｉｒａｌ Ｓｅｐ．（１９９７），１−７；Ｃｈｉｒａｌ Ｓｅｐａｒａｔｉｏｎｓ：Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ａｎｄ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ．Ａｈｕｊａ Ｓａｔｉｎｄｅｒ；Ｅｄｉｔｏｒ．ＵＳＡ．（１９９７），３４９ｐｐ．Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒ：（ＡＣＳ，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，Ｄ．Ｃ．）を参照されたい）。これらの標準的な方法のやり方はすべて、許容されるキラル純度の化合物を得るために、ラセミ混合物またはジアステレオマーの分離に使用することができる。たとえば、結晶化を、鏡像体（鏡像異性体）の光学的分離のために使用することができる。キラルクロマトグラフィーの場合、周知のように、ラセミ混合物を、キラル媒質を使用する分離（ｐｒｅｐａｒａｔｉｖｅ）クロマトグラフィーによって、キラル的に純粋な鏡像体に分離することができる。たとえば、キラルＮα補助基の全体的合成のための還元アミノ化法によって生成されるラセミ混合物を使用して、キラル的に純粋な形のそれぞれの鏡像体を生成することができる。これは、たとえば、下にアミノ酸補助基に関して示すように、なされる（ここでＲは、たとえば、アミノ酸側鎖である）。
【化１１】
【００６４】
どちらか一方の鏡像体をキラル的に純粋の形で得ることができ、あるいは両方をキラル的に純粋の形で得ることができる。どちらの鏡像体も、キラル的に純粋な補助基で改質した要素たとえばペプチドセグメント（すなわち、二つのキラル的に純粋なエピマー）の生成に使用することができ、これらの要素は、他のエピマー及び不純物の存在による妨害なしで厳重に精製することができる。両方の鏡像体を使用するという何らかの備えがなされない限り、補助基の全量の５０％が無駄になるということに注意されたい。このとき、たとえば、二つのキラル的に純粋な補助基で改質されたペプチドセグメントを、別々のＥＮＣＬ反応に使用して、キラル的に純粋な補助基で改質されたライゲーション生成物の混合物を得ることができる。分離精製の後、補助基をエピマーライゲーション生成物から除去し（個別に、または化合させたあと）、同じ天然構造のライゲーション生成物を得る。その後、これを精製する。
【００６５】
キラル合成の場合、好ましい方法においては、鏡像体的に純粋なキラル出発材料を使用する。これを、下にパラ−メトキシフェニル置換Ｎα−２炭素補助基に関して示す。
【化１２】
得られるキラル的に純粋な前駆体化合物を、次に、どちらかの保護された（Ｎ置換）アミノ酸を作るために使用することができる。すなわち、下記のようである。
【化１３】
または、前記化合物を、直接に'サブモノマー'ペプトイド（ｐｅｐｔｏｉｄ）法で使用して、ポリマー支持体上に補助基で改質したペプチドを生成させることができる。すなわち、下記のようである。
【化１４】
その後の脱保護／開裂により、キラル的に純粋な形の補助基改質ペプチドセグメントが得られる。すなわち、下記のようである。
【化１５】
たとえば、本発明のキラル的に純粋なＮα補助基を、容易に得られるキラリティー既知のパラ置換フェニルグリシンから作ることができる。この場合、キラリティーが既知なので、得られる補助基のキラリティーとキラル純度をあらかじめ見積もることができる。
【００６６】
あるいは、別の好ましい実施形態では、非対称還元を使用して補助基を生成させる鏡像体選択合成を使用する。たとえば、下記のようである。
【化１６】
非対称還元は、Ｎα補助基改質アミノ酸を生成させるための鏡像体選択合成にも使用することができる。たとえば、グリシンの場合、下記のようである。
【化１７】
適当に実施された非対称合成の場合、一つの鏡像体が他の鏡像体に対してかなり過剰に生成されるが、それでもかなりの量の他の鏡像体が存在すると予想される。後者は、純粋な形の主要鏡像体を得るためのキラル精製ステップにより処理することができる。鏡像体選択合成法の主要な利点は、キラルクロマトグラフィー分離が容易であり、また大量の材料が廃棄（浪費）されない、ということである。
【００６７】
もう一つの好ましい標準的方法は、共有ジアステレオマー抱合体を使用する分離である。一般に、この方法では、たとえば下記のように、キラルアミノ酸（たとえば、Ａｌａ）を使用して、ラセミ補助基混合物を改質し、また標準的な（非キラル）クロマトグラフィー法により生成されたジアステレオマーを分離する。たとえば、ラセミ補助基１を、第二のキラル中心の共有取り込みにより、ジアステレオマーの混合物に転化させることができる。すなわち、下記のようである。
【化１８】
この場合、ラセミ混合物は、ＳＮ求核反応（反転（ｉｎｖｅｒｓｉｏｎ）を伴う）によって、（Ｒ）２−Ｂｒ−プロピオン酸と反応し、示されている一対のジアステレオマーを生成する。ここでは、実際に、Ｎ結合キラルチオール含有補助基によって、Ｌ−Ａｌａを生成させた。
【００６８】
一般に、これら二つの化合物は、ジアステレオマーとしては、非キラル（ａｃｈｒａｌ）クロマトグラフィー条件下で、異なるクロマトグラフィー挙動を示し、したがって実用的な分離条件下で分離して、純粋のエピマーを別々に得ることができる。Ｎα成分の適当な保護の後、それぞれの化合物を使用して、非保護または部分保護された、Ｎ末端Ａｌａ残基を有する、キラル的に純粋の補助基で改質されたペプチドセグメントを生成させることができる。
【００６９】
本発明の保護されたＮα置換要素は、通常のペプチド合成を使用する高速自動合成及びその他の有機合成法において、特に有効である。また、これらの要素は、化学的ライゲーションの使用を多要素ライゲーション法にまで拡張するものであり、たとえば、直交ライゲーション法、たとえば三つ以上のセグメントのライゲーション法または収束ライゲーション合成法、が関与するポリペプチドの生成の場合にまで拡張するものである。
【００７０】
たとえば、本発明の拡張天然型化学的ライゲーション法と組成物とは、求核物質に対して安定なチオエステル生成法及びチオエステル安全捕捉（ｓａｆｅｔｙ ｃａｔｃｈ）法と組合わせて、たとえば本願と同時係属中のＰＣＴ出願番号［未付与］明細書（２００１年８月３１日出願）、及び米国仮特許出願第６０／２２９，２９５号明細書（２０００年９月１日出願）に記載されているオルトチオロエステル及びカルボキシエステルチオールとともに、使用することができる。なお、これらの明細書は、参照により本明細書に組み込まれるものとする。簡単に言えば、求核物質に対して安定なチオエステル生成化合物は、オルトチオロエステルまたはカルボキシエステルチオールから成り、これらの化合物は、有機合成、たとえばペプチドチオエステル、ポリペプチドチオエステル、及びその他のポリマーチオエステルの生成、において幅広い用途を有する。求核物質に対して安定なチオエステル生成化合物は、強力な求核物質（たとえば、Ｆｍｏｃ ＳＰＰＳによって生成されたペプチドまたはポリペプチド）が使用される条件下で生成される前駆体から活性化チオエステルを生成させる場合、また意図する特定のライゲーションまたは複合反応を導くための両立する選択保護法が必要な（または、その使用により利益を受ける）多段階ライゲーションまたは複合法の場合に、特に有用である。求核物質に対して安定なオルトチオロエステルは、式 Ｘ−Ｃ（ＯＲ'）2−Ｓ−Ｒ を有し、ここでＸは、意図する標的分子であり、随意に一つ以上の求核物質によって開裂することのできる保護基を有し、Ｒ'は、非求核開裂条件下で除去することのできる求核物質に対して安定な保護基であり、Ｒは、オルトチオロエステル−Ｃ（ＯＲ'）−Ｓ−に適合する任意の基である。求核物質に対して安定なオルトチオロエステルチオエステル生成樹脂も存在し、これは、式 Ｘ−Ｃ（ＯＲ'）2−Ｓ−Ｒ−リンカー−樹脂 または Ｘ−Ｃ（（ＯＲ1'−リンカー−樹脂（ＯＲ2'））−ＳＲ を有する。ここで、Ｘ、Ｒ'、及びＲは、前記のとおりであり、リンカーと樹脂は、固相有機合成で使用するのに適当な求核物質に対して安定な任意のリンカーと樹脂、たとえば、後で開裂のために求核物質に対して不安定なリンカーに転化させることのできる安全捕捉リンカーである。求核物質に対して安定なオルトチオロエステルは、いろいろな非求核条件たとえば酸加水分解条件によって、活性チオエステルに転化させることができる。求核物質に対して安定なカルボキシエステルチオールは、式 Ｘ−Ｃ（Ｏ）−Ｏ−ＣＨ（Ｒ''）−（ＣＨ2）n−Ｓ−Ｒ''' を有し、ここでＸは、求核物質に対して不安定な保護基を一つ以上有する、意図する標的分子であり、Ｒ''は、非求核物質に対して安定な基であり、ｎは、１または２であり、ｎ＝１が好ましく、Ｒ'''は、水素、保護基、または、非求核条件下で除去できる、樹脂または保護基に結合した、酸もしくは還元不安定なリンカーもしくは安全捕捉リンカーである。求核物質に対して安定なカルボキシエステルチオール基材のチオエステル生成樹脂も存在して、式 Ｘ−Ｃ（Ｏ）−Ｏ−ＣＨ（Ｒ''）−（ＣＨ2）n−Ｓ−リンカー−樹脂 または Ｘ−Ｃ（Ｏ）−Ｏ−ＣＨ（Ｒ''−リンカー−樹脂）−（ＣＨ2）n−Ｓ−Ｒ''' を有し、これらの式において、Ｘ、Ｒ''、ｎ、及びＲ'''は、前記のものであり、リンカー及び樹脂は、固相有機合成での使用に適した求核物質に対して安定な任意のリンカー及び樹脂である。この求核物質に対して安定なカルボキシエステルチオールは、チオール触媒、たとえばチオフェノール、の添加により、活性チオエステルに転化させることができる。したがって、本発明の拡張天然型化学的ライゲーション法と組成物は、多セグメントの収束ライゲーション法において使用することができる。このとき、標的化合物の一端が本発明の保護または非保護Ｎα−２または３炭素鎖アルキルまたはアリールチオールを有することができ、他端が活性チオエステルへの後続の転化とライゲーションとのためのオルトチオロエステルまたはカルボキシエステルチオール成分を有することができる。
【００７１】
やはり容易に理解しうるであろうが、本発明のＮα−２または３炭素鎖アルキルまたはアリールチオールは、他のライゲーション法、たとえば天然型化学的ライゲーション（Ｄａｗｓｏｎ ｅｔ．ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ（１９９４）２６６：７７６−７７９；Ｋｅｎｔ ｅｔ．ａｌ．，ＷＯ ９６／３４８７８）、拡張された一般化学的ライゲーション（Ｋｅｎｔ ｅｔ．ａｌ．，ＷＯ９８／２８４３４）、オキシム生成化学的ライゲーション（Ｒｏｓｅ ｅｔ．ａｌ．，Ｊ．Ａｍｅｒ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ，（１９９４）１１６：３０−３３）、チオエステル生成ライゲーション（Ｓｃｈｎｏｌｚｏｒ，ｅｔ．ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ（１９９２）２５６：２２１−２２５）、チオエーテル生成化学的ライゲーション（Ｅｎｇｌｅｂｒｅｔｓｅｎ，ｅｔ．ａｌ．，Ｔｅｔ．Ｌｅｔｔｓ．（１９９５）３６（４８）：８８７１−８８７４）、ヒドラゾン生成ライゲーション（Ｇａｅｒｔｎｅｒ，ｅｔ．ａｌ．，Ｂｉｏｃｏｎｊ．Ｃｈｅｍ．（１９９４）５（４）：３３３−３３８）、ならびにチアゾリジン生成ライゲーション及びオキサゾリジン生成ライゲーション（Ｚｈａｎｇ，ｅｔ．ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（１９９８）９５（１６）：９１８４−９１８９；Ｔａｍ ｅｔ．ａｌ．，ＷＯ９５／００８４６）、または他の方法（Ｙａｎ，Ｌ．Ｚ．ａｎｄ Ｄａｗｓｏｎ，Ｐ．Ｅ．，"Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｏｆ Ｐｅｐｔｉｄｅｓ ａｎｄ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｗｉｔｈｏｕｔ Ｃｙｓｔｅｉｎｅ Ｒｅｓｉｄｕｅｓ ｂｙ Ｎａｔｉｖｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｌｉｇａｔｉｏｎ Ｃｏｍｂｉｎｅｄ ｗｉｔｈ Ｄｅｓｕｌｆｕｒｉｚａｔｉｏｎ，"Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．２００１，１２３，５２６−５３３（参照により本明細書に組み込むものとする。）；Ｇｉｅｓｅｌｎａｎ ｅｔ．ａｌ．，Ｏｒｇ．Ｌｅｔｔ．２００１ ３（９）：１３３１−１３３４；Ｓａｘｏｎ，Ｅ．ｅｔ．ａｌ．，"Ｔｒａｃｅｌｅｓｓ" Ｓｔａｕｄｉｎｇｅｒ Ｌｉｇａｔｉｏｎ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｃｈｅｍｏｓｅｌｅｃｔｉｖｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｏｆ Ａｍｉｄｅ Ｂｏｎｄｓ．Ｏｒｇ．Ｌｅｔｔ．２０００，２，２１４１−２１４３）と組合せて、使用することができる。さらに、本発明で意図するのは、本発明のＮα−２または３炭素鎖アルキルまたはアリールチオールにおいてチオールイオウをセレンで置換することである。
【００７２】
本発明の方法と組成物は、多くの用途を有する。本発明の方法と組成物は、特に、ペプチド、ポリペプチド、及びその他のポリマーのライゲーションに有効である。実質的にすべてのアミノ酸、たとえば天然に産するアミノ酸及び非天然のアミノ酸及び誘導体において天然型化学的ライゲーションを実行しうる能力により、適正なシステインライゲーション部位を欠く標的に対する天然型化学的ライゲーションの範囲が拡大される。本発明は、また、ペプチドまたはポリペプチドセグメントのほか、ポリマー成分を、Ｎα置換アミド結合または全部天然のアミド結合を有するリンカーによってライゲーション部位に結合するのが望ましい場合に、そのような成分のライゲーションにも使用することができる。本発明は、また、発現たんぱく質ライゲーション（ＥＰＬ）用のいろいろな種類のペプチド標識の生成にも使用することができる。たとえば、ＥＰＬ生成チオエステルポリペプチドは、意図する最終用途に応じて、Ｎα置換アルキルもしくはアリールチオールアミド結合または完全に天然のアミド結合により、いろいろな種類のペプチドに結合させることができる。本発明は、また、システインを有しないペプチドまたはポリペプチドの場合でも、環化点（ｃｙｃｌｉｚａｔｉｏｎ ｐｏｉｎｔ）に天然アミド結合を有するいろいろな環状ペプチド及びポリペプチドの生成に使用することができる。これは、たとえば、大部分の環状ペプチド、たとえば産業標準規格に従って生成される抗生物質及びその他の薬剤、は、環化（すなわち、頭から尾まで）ライゲーション部位に天然アミド結合を形成するのに使用できるシステイン残基を有しないので、重要である。
【００７３】
本明細書で挙げるすべての公刊物及び特許明細書は、それぞれの公刊物及び特許明細書が個別に参照により本明細書に組み込まれると述べるのと同様に、参照により本明細書に組み込まれるものとする。
【００７４】
（実施例）
下記の生成法と実施例は、当業者が、本発明をより明瞭に理解し、本発明を実施できるようにするために示すものである。これらは、本発明の権利範囲を限定するものと解釈してはならない。これらは、単に、本発明の説明のために、代表例を示すものと解釈すべきである。
【００７５】
【００７６】
実施例１： 共通の材料と方法
ペプチドは、標準的な手順（Ｈａｃｋｅｎｇ ｅｔ．ａｌ．，前記；Ｓｃｈｎｏｌｚｅｒ ｅｔ．ａｌ．，（１９９２）Ｉｎｔ．Ｊ．Ｐｅｐｔ．Ｐｒｏｔ．Ｒｅｓ．，４０：１８０−１９３；Ｋｅｎｔ，Ｓ．Ｂ．Ｈ．（１９８８）Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．５７，９５７−９８４）に従い、ＰＡＭ樹脂またはチオエステル生成樹脂上でのＢｏｃ化学作用のためのその場中和／ＨＢＴＵ活性化手順により、ＳＰＰＳによって、改造ＡＢＩ４３０Ａペプチド合成装置を使用して段階的に合成した。鎖集成の後、５％のｐ−クレゾールを含む無水フッ酸（ＨＦ）による処理によって、ペプチドを脱保護すると同時に開裂させ、それから凍結乾燥して、分離ＨＰＬＣによって精製した。Ｂｏｃ保護アミノ酸は、Ｐｅｐｔｉｄｅｓ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ ａｎｄ Ｍｉｄｗｅｓｔ Ｂｉｏｔｅｃｈから入手した。トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）は、Ｈａｌｏｃａｒｂｏｎから購入した。その他の化学薬品は、ＦｌｕｋａまたはＡｌｄｒｉｃｈから購入した。分析及び分離ＨＰＬＣは、２１４ｎｍ ＵＶ検出を使用するＲａｉｎｉｎ ＨＰＬＣシステムにより、Ｖｙｄａｃ Ｃ４分析剤または分離剤を用いて、実施した。ペプチド及びたんぱく質の質量分析は、Ｓｃｉｅｘ ＡＰＩ−Ｉエレクトロスプレー質量分析計によって実施した。
【００７７】
実施例２： ２（４'メトキシベンジルチオ）ベンジルブロミドの合成
２−ヒドロキシメチルチオフェノール（１０ｍｍｏｌ １．４ｇ）を、室温で、１０ｍｌのＤＦＭ中で、１０ｍｍｏｌの４−メトキシベンジルクロリド及び１．７５ｍｌのＤＩＥＡと反応させた。この反応を１０分で終わらせた。ｐＨ３の５０ｍｌの水を添加した。生成物を酢酸エチルで抽出し、硫酸ナトリウム上で乾燥させた。次に、得られた粗製油（ｃｒｕｄｅ ｏｉｌ）を、２０ｍｌのＴＨＦで、１１ｍｍｏｌの四臭化炭素（３．６４ｇ）及び１１ｍｍｏｌのトリフェニルホスフィン（２．８８ｇ）と反応させた。一晩の反応の後、ＴＨＦを蒸発させた。生成物を、移動相としてヘキサン／酢酸エチル（６／１）を使用して、シリカゲルクロマトグラフィーによって精製した。１．８ｇが採取された。
【００７８】
実施例３： Ｎα（２−メルカプトベンジル）グリシン−ペプチドの生成
Ｎ末端Ｂｏｃ保護Ａｌａを有する樹脂に束縛されたペプチド（７８ｍｇ）に、純粋の（ｎｅａｔ）ＴＦＡを添加し、Ｂｏｃ基を除去した。標準的な化学手順を使用し、ＢｏｃグリシンＯスクシンイミドを、樹脂に結合させた。結合が完了したあと、Ｂｏｃ基を除去してから、樹脂を、ＤＭＦに１０％のジイソプロピルエチルアミンを溶解させた溶液で２回洗浄して、中和した。次に、樹脂をＤＭＦとＤＭＳＯで洗浄した。次に、０．２ｍｌのＤＭＳＯと０．０１ｍｌのジイソプロピルエチルアミンに、９ｍｇの２（４'メトキシベンジルチオ）ベンジルブロミドを添加した。この混合物を、室温で１２時間反応させた。標準的な手順により、ＨＦ条件下で、ペプチドを開裂させ、脱保護した。正しい質量２，０７９Ｄａのピークが、全ペプチド物質の約１２％（ＨＰＬＣによって測定）に存在した。この正しいペプチドを、標準的な半分離（ｓｅｍｉ−ｐｒｅｐａｒａｔｉｖｅ）ＨＰＬＣによって精製した。
【００７９】
実施例４： ４'−メトキシ２（４'メチルベンジルチオ）アセトフェノンの生成
４−メチルベンジルメルカプタン４ｍｍｏｌ（０．５４２ｍｌ）と、４'メトキシ２ブロモアセトフェノン４ｍｍｏｌ（９１６．３ｍｇ）を、４ｍｌのＤＭＦに溶解させた。次に、ジイソプロピルエチルアミン４ｍｍｏｌ（０．７ｍｌ）を添加した。この混合物を室温で１時間撹拌した。混合物を希塩酸に注ぎ、酢酸エチルによって抽出してから、硫酸ナトリウム上で乾燥した。油（ｏｉｌ）を、酢酸エチルに溶解させ、石油エーテルの添加によって沈殿させた。４５０ｍｇの白色固体が採取された。
【００８０】
実施例５： １アミノ，１（４−メトキシフェニル），２（４−メチルベンジルチオ）エタンの生成
４'−メトキシ２（４'メチルベンジルチオ）アセトフェノン１．４４ｍｍｏｌ（４１１ｍｇ）とアミノオキシ酢酸４．３ｍｍｏｌ（９４１ｍｇ）を、２０ｍｌのＴＭＯＦに溶解させ、０．０４７ｍｌのメタンスルホン酸を、触媒として、室温で添加した。４８時間後、溶剤を蒸発させ、残留物を酢酸エチルで採取し、１Ｍの硫酸一水素カリウムで洗浄し、硫酸ナトリウム上で乾燥した。粗製物を、シリカゲルクロマトグラフィーによって精製し、２００ｍｇのオキシム複合体を得た。この２００ｍｇのオキシム複合体０．５５６ｍｍｏｌを、２ｍｌのＴＨＦに溶解させてから、１．６７ｍｌの１Ｍ ＢＨ３／ＴＨＦ複合体を添加した。２７時間後、出発材料は残っていなかった。３ｍｌの水を添加し、また１．５ｍｌの１０Ｎ水酸化ナトリウムを添加した。混合物を１時間還流させた（ｒｅｆｌｕｘｅｄ）。次に、混合物を、酢酸エチル（４×）で抽出し、硫酸ナトリウム上で乾燥した。次に、最終生成物（４０ｍｇ）を、シリカゲルクロマトグラフィーによって精製した。
【００８１】
実施例６： Ｎα １−（４−メトキシフェニル）２−メルカプトエタングリシン−ペプチドの生成
Ｎ末端Ｂｏｃ保護Ａｌａを有する、樹脂に束縛されたモデルペプチド（７８ｇ）に、純粋のＴＦＡを加えて、Ｂｏｃ基を除去した。標準的な化学的手順に従って、ブロモ酢酸を樹脂に結合させた。次に、１アミノ，１（４−メトキシフェニル），２（４−メチルベンジルチオ）エタン１７ｍｇを、０．０１０ｍｌのジイソプロピルエチルアミンを含む０．３ｍｌのＤＭＳＯに溶解させたものを、樹脂に加えた。一晩の反応ののち、樹脂を洗浄し、標準的なＨＦ手順により、ペプチドを開裂させ、脱保護した。次に、半分離ＨＰＬＣにより、所望の生成物を生成した。
【００８２】
別のＮα １−（４−メトキシフェニル）２−メルカプトエタングリシン−ペプチドの生成
標準的な結合手順により、配列 Ｓ−Ｙ−Ｒ−Ｆ−Ｌ−ポリマー のモデルペプチド樹脂０．１ｍｍｏｌに、ブロモ酢酸を結合させた。結合の後、樹脂をＤＭＳＯで洗浄した。次に、１アミノ，１（４−メトキシフェニル），２（４−メチルベンジルチオ）エタン３２．５ｍｇ（０．１２ｍｍｏｌ）を０．３ｍｌのＤＭＳＯと０．０２５ｍｌのジイソプロピルエチルアミンに溶解させたものを、加えた。混合物を一晩放置して反応を進行させた。標準的なＨＦ手順により、ペプチドを開裂させ、脱保護した。粗製開裂生成物のＨＰＬＣにより、全生成物の６０％が所望の生成物（ＭＷ ２，１２２）であることがわかった。ｎ−アルキルエタンチオール基はＨＦ中で９７％が安定であった。
【００８３】
実施例７： ２'，４'−ジメトキシ２（４'メチルベンジルチオ）アセトフェノンの生成
４−メチルベンジルメルカプタン３．９４ｍｍｏｌ（０．５３４ｍｌ）と２'，４'ジメトキシ２−ブロモアセトフェノン３．８６ｍｍｏｌ（１ｇ）を、４ｍｌのＤＭＦに溶解させた。次に、ジイソプロピルエチルアミン３．９４ｍｍｏｌ（０．６８８ｍｌ）を加えた。混合物を、室温で２４時間撹拌した。混合物を、硫酸一水素カリウムの１Ｍ溶液に注ぎ、酢酸エチルで抽出して、硫酸ナトリウム上で乾燥した。蒸発ののち、残留油を酢酸エチルに溶解させ、石油エーテルの添加により沈殿させた。これにより、６１６ｍｇの白色固体が得られた。
【００８４】
実施例８： １アミノ，１（２，４−ジメトキシフェニル），２（４−メチルベンジルチオ）エタンの生成
２'，４'−ジメトキシ２（４'メチルベンジルチオ）アセトフェノン０．５２６ｍｍｏｌ（１６６ｍｇ）とアミノオキシ酢酸１．５９ｍｍｏｌ（３４５ｍｇ）を、６ｍｌのＴＭＯＦに溶解させ、室温で、０．０３４ｍｌのメタンスルホン酸を触媒として加えた。３１時間後、溶剤を蒸発させてから、酢酸エチルに取込み、１Ｍの硫酸一水素カリウムで洗浄して、硫酸ナトリウム上で乾燥した。次に、粗製物をシリカゲルクロマトグラフィーによって精製し、１２６ｍｇ（収率６１％）のオキシム複合体を得た。この１２６ｍｇのオキシム複合体０．３２４ｍｍｏｌを、１．５ｍｌのＴＨＦに溶解させた。次に、０．９７３ｍｌの１Ｍ ＢＨ３／ＴＨＦ複合体を添加した。
【００８５】
５４時間後、出発材料がまだ存在していたので、０．５ｍｌの１Ｍ ＢＨ３／ＴＨＦ複合体を添加した。３日後（合計６日の反応）、３ｍｌの水を添加し、１ｍｌの１０Ｎ水酸化ナトリウムを加えた。混合物を、１時間還流させた。次に、混合物を、酢酸エチル（４×）で抽出し、硫酸ナトリウム上で乾燥した。次に、最終生成物（４３ｍｇ）を、シリカゲルクロマトグラフィーによって精製した。
【００８６】
実施例９： Ｎα １−（２，４−ジメトキシフェニル）２−メルカプトエタングリシン−ペプチドの生成
標準的な結合手順により、配列 Ｓ−Ｙ−Ｒ−Ｆ−Ｌ−ポリマー の樹脂束縛ペプチド０．１ｍｍｏｌに、ブロモ酢酸を結合させた。結合の後、樹脂をＤＭＳＯで洗浄した。次に、１アミノ，１（２'，４'−ジメトキシフェニル），２（４−メチルベンジルチオ）エタン３６ｍｇ（０．１２ｍｍｏｌ）を、０．３ｍｌのＤＭＳＯと０．０２５ｍｌのジイソプロピルエチルアミンに溶解させたものを、加えた。混合物を一晩放置して反応を進行させた。標準的なＨＦ手順により、ペプチドを開裂させ、脱保護した。粗製開裂生成物のＨＰＬＣにより、全生成物の４２％が所望の生成物（ＭＷ ９３８）であることがわかった。ｎ−アルキルエタンチオール基はＨＦ中で９２％が安定であった。
【００８７】
実施例１０： Ｃ末端ＳＤＦ１−アラニン−チオエステルとＮ末端Ｎα（２−メルカプトベンジル）グリシン−ペプチドとのＡｌａ−Ｇｌｙ化学的ライゲーション
６員転位ライゲーション（６−ｍｅｍｂｅｒ ｒｅａｒｒａｎｇｅｍｅｎｔ ｌｉｇａｔｉｏｎ）のために、ＳＤＦ１−αのＣ末端Ａｌａチオエステルフラグメント（ＭＷ ４４２９）１ｍｇと、ＳＤＦ１−αのＮ末端Ｎα（２−メルカプトベンジル）グリシンフラグメント（ＭＷ ２０７９）０．６ｍｇとを、１００μｌの６Ｍグアニジニウム緩衝液（ｐＨ７．０）に溶解させ、１μｌのチオフェノールを加えた。室温（〜２５℃）で、２日経過したあと、所望のライゲーション生成物（ＭＷ ５４７２）の形成を、ＥＳ−ＭＳによって確認した。次に、反応混合物を、さらに２４時間、４０℃に定温放置し、所望のライゲーション生成物の収率を、ＨＰＬＣ積分（ｉｎｔｅｇｒａｔｉｏｎ）によって測定した、生成物と非反応Ｃ末端フラグメントとの比にもとづいて決定した。観測された収率は、約４０％であった。
【００８８】
実施例１１： Ｃ末端ＳＤＦ１−アラニン−チオエステルとＮ末端Ｎα １−（４−メトキシフェニル）２−メルカプトエタングリシン−ペプチドとのＡｌａ−Ｇｌｙ化学的ライゲーション
５員転位ライゲーションのために、ＳＤＦ１のＣ末端アラニン−チオエステルフラグメント（ＭＷ ４４２９）１ｍｇと、Ｎα １−（４−メトキシフェニル）２−メルカプトエタン基を有するＮ末端グリシンを有するＮ末端ペプチドモデル（ＭＷ ２１２２）１ｍｇとを、１００μｌの６Ｍグアニジニウム緩衝液（ｐＨ７．０）［及び１μｌのチオフェノール］に溶解させた。反応混合物を、室温（〜２５℃）で、定温放置し、ライゲーション反応を調べた。８時間後、所望のライゲーション生成物（ＭＷ ５５１５）の形成を、ＥＳ−ＭＳによって確認した。３日後、生成物と非反応Ｎ末端フラグメントとの比にもとづく所望のライゲーション生成物の収率は、約４５％であった。室温で３日経過したあと、さらに２４時間、４０℃に定温放置したあとでは、収率は、６５％であった。室温で３日経過したあと、さらに４８時間、４０℃に定温放置したあと、収率は、約７０％に上昇した。
【００８９】
５員転位ライゲーションのために、ＳＤＦ１−αのＣ末端Ａｌａチオエステルフラグメント（ＭＷ ４４２９）０．５ｍｇと、Ｎα １−（４−メトキシフェニル）２−メルカプトエタン基を有するＮ末端グリシンを有するＮ末端フラグメント（ＭＷ ２１２２）０．５ｍｇとを、１００μｌの６Ｍグアニジニウム緩衝液（ｐＨ８．２）及び１μｌのチオフェノールに溶解させた。次に、反応混合物を、室温（〜２５℃）で、定温放置し、６時間後、さらに１μｌのチオフェノールを加えた。２４時間後、所望の生成物の収率は、約６０％であった。
【００９０】
実施例１２： Ｃ末端グリシン−チオエステルとＮ末端Ｎα−（２−メルカプトベンジル）グリシン−ペプチドとのＧｌｙ−Ｇｌｙ化学的ライゲーション
６員転位ライゲーションのために、デカマー（ｄｅｃａｍｅｒ）モデルペプチドのＣ末端Ｇｌｙチオエステルフラグメント（ＭＷ １３５７）３．５ｍｇと、３ ＨｉｓＤｎｐを有するモデルペプチドのＮ末端Ｎα（２−メルカプトベンジル）グリシンフラグメント（ＭＷ ２０７９）２ｍｇとを、２００μｌの６Ｍグアニジニウム緩衝液（ｐＨ７．９）に溶解させ、２μｌのチオフェノールを添加した。混合物を、３３℃で、６０時間、定温放置した。所望のライゲーション生成物（ＭＷ ２６３１）の形成を、ＥＳ−ＭＳによって確認した。生成物と非反応Ｎ末端フラグメントとの比にもとづく実測収率は、約４０％であった。
【００９１】
Ｃ末端グリシン−チオエステルペプチドとＮα １−（４−メトキシフェニル）２−メルカプトエタングリシン−ペプチドとの化学的ライゲーション
５員転位ライゲーションのために、Ｃ末端Ｇｌｙチオエステルフラグメント（ＭＷ １３５７）２ｍｇと、Ｎα １−（４−メトキシフェニル）２−メルカプトエタン基を有する、３ ＨｉｓＤｎｐを有するモデルペプチドのＮ末端フラグメント（ＭＷ ２１２２）２．５ｍｇとを、１μｌのチオフェノールを含む１００μｌの６Ｍグアニジニウム緩衝液（ｐＨ７．０）に溶解させた。反応混合物を、室温（〜２５℃）で、定温放置し、ライゲーション反応を調べた。定温放置の３及び８時間後、所望のライゲーション生成物（ＭＷ ２６７５．９）の形成を、ＥＳ−ＭＳによって確認した。２４時間後、生成物と非反応Ｎ末端フラグメントとの比にもとづく所望のライゲーション生成物の収率は、約４０％であった。次に、固体の炭酸水素ナトリウムを添加することにより、ｐＨを、８．２に上昇させてから、反応混合物を、さらに２４時間定温放置し、収率８８％を得た。
【００９２】
実施例１３： Ｌａｒｃ−アラニン−チオエステルとＮα １−，（４−メトキシフェニル）２−メルカプトエタングリシン−ペプチドとのＡｌａ−Ｇｌｙ化学的ライゲーション
マウスのＬａｒｃ １−３１ Ａｌａ Ｃ末端ペプチドチオエステル３ｍｇ（ＭＷ ３６０９）と、モデルペプチドＮα １−，（４−メトキシフェニル）２−メルカプトエタングリシン−Ｓ−Ｙ−Ｒ−Ｆ−Ｌ １ｍｇ（ＭＷ ９０８）とを、０．１５ｍｌの６ｍｏｌグアニジニウム緩衝液（ｐＨ８．２）及び０．０３ｍｌのチオフェノールに溶解させた。ペプチドチオエステルの消費から見積もって、一晩の撹拌の後、ライゲーションは、８１％完了し、４０時間後、９２％完了した。予想されるライゲーション生成物は、４３１２Ｄａであり、実際は４３１２Ｄａであった。
【００９３】
実施例１４： Ｌａｒｃ１−３１−アラニン−チオエステルとＮα １−（２，４−ジメトキシフェニル）２−メルカプトエタングリシン−ペプチドとのＡｌａ−Ｇｌｙ化学的ライゲーション
マウスのＬａｒｃ １−３１ Ａｌａ Ｃ末端ペプチドチオエステル３ｍｇ（ＭＷ ３６０９）と、モデルペプチドＮα １−（２，４−ジメトキシフェニル）２−メルカプトエタングリシン−Ｓ−Ｙ−Ｒ−Ｆ−Ｌ １ｍｇ（ＭＷ ９３８）とを、０．１５ｍｌの６ｍｏｌグアニジニウム緩衝液（ｐＨ８．２）及び０．０３ｍｌのチオフェノールに溶解させた。ペプチドチオエステルの消費から見積もって、一晩の撹拌の後、ライゲーションは７３％完了し、４０時間後、８５％完了した。計算予想されるライゲーション生成物の質量と実験によるそれとは、ともに４３４２Ｄａであった。
【００９４】
実施例１５： Ｃ末端トリペプチドグリシン−チオエステルとＮ末端Ｎα−１−（２，４−ジメトキシフェニル）２−メルカプトエタングリシン−ペプチドとのＧｌｙ−Ｇｌｙ化学的ライゲーション
ペプチドフラグメントＦＧＧ−チオエステル０．８ｍｇと、モデルペプチドＮα １−（２，４−ジメトキシフェニル）２−メルカプトエタングリシン−Ｓ−Ｙ−Ｒ−Ｆ−Ｌ １ｍｇ（ＭＷ ９３８）とを、０．１ｍｌの６Ｍグアニジニウム緩衝液（ｐＨ８．２）及び０．０２ｍｌのチオフェノールに溶解させた。一晩の撹拌の後、反応は実質的に完了した。計算予想されるライゲーション生成物の質量と実験によるそれとは、それぞれ１１９９．４Ｄａ及び１１９５．５Ｄａであった。
【００９５】
実施例１６： １−（２，４−ジメトキシフェニル）２−メルカプトエタンのライゲーション生成物からの除去
実施例１５の精製ライゲーション生成物１ｍｇを、０．９５ｍｌのＴＦＡ及び０．０２５ｍｌの水及び０．０２５ｍｌのＴＩＳに溶解させた。１時間後、溶剤を蒸発させ、水／アセトニトリルの５０％溶液を添加し、混合物を凍結乾燥させた。ＨＰＬＣによれば、開裂は９５％よりも多く完了していた。計算予想される質量と実験によるそれとは、１００３Ｄａであった。
【００９６】
実施例１７： Ｃ末端トリペプチドグリシン−チオエステルとＮ末端Ｎα １−，（４−メトキシフェニル）２−メルカプトエタングリシン−ペプチドとのＧｌｙ−Ｇｌｙ化学的ライゲーション
トリペプチドペプチドフラグメントチオエステル、ＦＧＧ−チオエステル１．６ｍｇと、モデルペプチドＮα １−（４−メトキシフェニル）２−メルカプトエタングリシン−Ｓ−Ｙ−Ｒ−Ｆ−Ｌ ２ｍｇ（ＭＷ ９０８）とを、０．２ｍｌの６Ｍグアニジニウム緩衝液（ｐＨ８．２）及び０．０４ｍｌのチオフェノールに溶解させた。一晩の撹拌の後、反応は実質的に完了した。予想されるライゲーション生成物のＭＷは、１１６９．４Ｄａであり、実際は１１６９．５Ｄａであった。
【００９７】
実施例１８： ライゲーション後の１−（，４−メトキシフェニル）２−メルカプトエタン基の除去
実施例１７の精製ライゲーション生成物を、−２℃で、１時間、ＨＦ ｐクレゾールで処理した。ＨＦを蒸発させた後、ライゲーション生成物をエーテルによって、沈殿させた。粗製ペプチドを、０．１％ ＴＦＡを含む水／アセトニトリル５０％溶液に取込み、ＨＰＬＣ上に噴射した。＞８０％の主ピークは、開裂ペプチドに関して予想される分子量を示した（予想質量１００３Ｄａ、実際１００３Ｄａ）。
【００９８】
実施例１９： Ｃ末端ヒスチジン−チオエステルとＮ末端Ｎα １−（２，４−ジメトキシフェニル）２−メルカプトエタングリシン−ペプチドとのＨｉｓ−Ｇｌｙ化学的ライゲーション
ペプチドフラグメントＴＢＰ−Ａ １−６７ ＣαＨｉｓチオエステル４ｍｇと、モデルペプチドＮα １−（２，４−ジメトキシフェニル）２−メルカプトエタングリシン−Ｓ−Ｙ−Ｒ−Ｆ−Ｌ １ｍｇ（ＭＷ ９３８）とを、０．１ｍｌの６Ｍグアニジニウム緩衝液（ｐＨ８．２）及び０．０２ｍｌのチオフェノールに溶解させた。一晩の撹拌の後、ペプチドチオエステルの消費から見積もって、反応は８７％完了した。予想されるライゲーション生成物の分子量は、９２２０Ｄａであり、実際は、９２２０Ｄａであった。
【００９９】
実施例２０： ライゲーション後の１−（２，４−ジメトキシフェニル）２−メルカプトエタン基の除去
Ｈ−Ｇライゲーション後の精製ペプチドフラグメント２ｍｇを、０．９５ｍｌのＴＦＡ及び０．０２５ｍｌの水及び０．０２５ｍｌのＴＩＳに溶解させた。１時間後、溶剤を蒸発させ、残留物に水／アセトニトリルの５０％溶液を添加し、混合物を凍結乾燥させた。ＨＰＬＣによれば、開裂は９０％よりも多く完了していた。予想されるＭＷは９０２３Ｄａであり、実際は９０２４Ｄａであった。
【０１００】
実施例２１： 拡張天然型化学的ライゲーションによるシトクロムｂ５６２の合成
３ｍｇ（０．４μｍｏｌ）のシトクロム１−６３ Ｃ末端チオエステル（ＭＷ ７３４９）と１．５ｍｇ（０．３μｍｏｌ）のＮ末端Ｎα １−，（４−メトキシフェニル）２−メルカプトエタングリシンシトクロムｂ５６２残基６４−１０６（ＭＷ ４９７０）を、触媒としての０．００２ｍｌのチオフェノールとともに、０．１ｍｌの６Ｍグアニジニウムライゲーション緩衝液（ｐＨ７）に、溶解させた。図５Ａを参照されたい。２４時間後、０．０２５ｍｌの２−メルカプトエタノールを混合物に添加し、そのまま４５分間反応を進行させた。その後、１５ｍｇのＴＣＥＰを添加し、３０分の撹拌ののち、ライゲーション混合物を半分離ＨＰＬＣにかけた。漏出物（ｂｒｅａｋ ｔｈｒｏｕｇｈ）を溶離し、混合物を脱塩してから、ライゲーション混合物のすべての成分を、６５％Ｂの傾斜まで傾けて溶離し、単一のバイアルに集めた。脱塩された物質の分析ＨＰＬＣによれば、ライゲーションは、Ｃ末端ペプチドの消費にもとづく見積もりでは、９０％よりも多く完了していた。このＨＰＬＣは、二つの主ピーク（ジアステレオマー）を示し、計算質量と予想質量は１１，９４６Ｄａであった。図５Ｂと６Ａを参照されたい。
【０１０１】
シトクロムｂ５６２（１−１０６）のアミノ酸配列は下記の通りである。
【０１０２】
実施例２２： ライゲーションシトクロムｂ５６２残基１−１０６からの１−，（４−メトキシフェニル）２−メルカプトエタン基の除去と、天然たんぱく質の生成
次に、脱塩した溶液を、１−，（４−メトキシフェニル）２−メルカプトエタン基の除去に先立って、凍結乾燥した。凍結乾燥した物質を、−２℃で、１時間、ＨＦ ９５％ ５％アニソールと１ｍｍｏｌのシステイン（１２１ｍｇ）で処理した。標準的手順により、ＨＦを蒸発させてから、１００ｍｌの５０％緩衝液Ｂを添加し、混合物を凍結乾燥した。次に、混合物を半分離ＨＰＬＣによって精製し、２ｍｇの精製単一ピーク天然シトクロム１−１０６（５６％の精製後収率）を得た。計算質量及び実際の質量は１１，７８０Ｄａであった。図６Ｂ及び７Ａを参照されたい。
【０１０３】
野生型のシトクロムｂ５６２の類似体も、同じやり方で合成した。これを、Ｓｌｍ７ ｃｙｔ ｂ５６２で示す。このＳｌｍ７ ｃｙｔ ｂ５６２突然変異体は、位置７のメチオニンをセレノメチオニン（メチオニンのイオウをそれより低位の同種のセレニウムで置き換えたもの）で置き換えている点が野生型と異なる。円偏光二色性分光分析を行い、大きなαらせん成分が、アポ野生型ｂ５６２とアポＳｌｍ ｂ５６２との両方に含まれていることを示した（データ示さず）。ＥＳＭＳによっても、アポ野生型ｂ５６２とアポＳｌｍ ｂ５６２との両方が予想される分子質量を有することが示された（データ示さず）。これらのアポたんぱく質を、ヘムによって再構成し（室温で、ヘムｐＨ７ ＮａＰｉによって一晩）、得られたたんぱく質をイオン交換ＦＰＬＣによって精製した（ＦＰＬＣ精製リソースＱ、トリスＨＣＬ ｐＨ８、ＮａＣｌ勾配）。たとえば、図７Ｂを参照されたい。ヘム再構成たんぱく質のＵＶによって見ることのできる（光）スペクトルは、Ｆｅに対するイオウまたはセレンの配位に一致することがわかった（データ示さず）。非配位アイソスターノルロイシン（ｎｏｎ−ｃｏｏｒｄｉｎａｔｉｎｇ ｉｓｏｔｅｒｅ ｎｏｒｌｅｕｃｉｎｅ）によるｃｙｔ ｂ５６２突然変異体も、同じやり方で生成した。これから、合成シトクロムを、拡張天然型化学的ライゲーションによって生成し、そのヘム活性部位を再構成して、生物物理学的方法で完全に特性決定した。それによると、この実施例は、さらに、初期の天然型化学的ライゲーション法に対して適当なシステインを欠くペプチド及びたんぱく質を、拡張天然型化学的ライゲーション法で生成し、また非標準的なアミノ酸を導入することができる、ということを示した。たとえば、多くのｃｙｔ ｂ５６２突然変異体の折りたたみと反応性とを調べたが、天然にはない軸配位子はまだ調べていない。拡張天然型化学的ライゲーションとともに、使用できる非天然アミノ酸の莫大な量の配列を使用して、これら及びその他のたんぱく質の性質を系統的に調節できるはずである。
【０１０４】
実施例２３： ＭＣＰ １−３５−リシン−チオエステルと、Ｎα １−，（４−メトキシフェニル）２−メルカプトエタングリシン−ペプチドとのＬｙｓ−Ｇｌｙ化学的ライゲーション
３ｍｇのＭＣＰ １−３５ Ｌｙｓ Ｃ末端ペプチドチオエステルと１ｍｇのモデルペプチドＮα １−，（４−メトキシフェニル）２−メルカプトエタングリシン−Ｓ−Ｙ−Ｒ−Ｆ−Ｌ（ＭＷ ９０８）を、０．１５ｍｌの６Ｍグアニジニウム緩衝液（ｐＨ７）に溶解させ、トリエチルアミンと０．０３ｍｌのトリフェノールとの添加によってｐＨ７．２に調節した。一晩の撹拌の後、ライゲーションは、ペプチドチオエステルの消費から見積もって、６９％完了しており、４０時間後、７６％が完了していた。予想されるライゲーション生成物は４８９３Ｄａであり、実際は、４８９３Ｄａｗであった。
【０１０５】
実施例２４： ライゲーション後の１−（，４−メトキシフェニル）２−メルカプトエタン基の除去
実施例２３（Ｌｙｓ−Ｇｌｙライゲーション）の凍結乾燥脱塩粗製物を、１ｍｇのＴＦＡ、２５μｌのエタンジチオール、５０μｌのＴＩＳに溶解させた。次に、１５０μｌのブロモトリメチルシランを添加した。反応を、室温（"ｒｔ"）で２時間進行させた。混合物の揮発性成分を真空中で蒸発させ、残留油を６Ｍのグアニジニウム緩衝液ｐＨ７．５に取込んだ。有機物質をＣＨＣｌ３で抽出した。ＨＰＬＣはもはや出発物質を示さず、したがって補助基の除去がうまくいったことを示している。天然配列の場合に予想される質量は４７２６Ｄａであり、実際は４７２５Ｄａであった。
【０１０６】
実施例２５： ＧＳＹＲＦＬペプチドに対するライゲーションの比較検討
実施例１３〜２０及び２４のＧＳＹＲＦＬペプチドに対する５員転位ライゲーションの比較検討を、下記の表Ｖにまとめて示す。
【０１０７】
【表５】
【０１０８】
実施例２６： ＢｏｃグリシンＮ−１（４'−メトキシフェニル），２（４'−メチルベンジルチオ）エタンの生成
４'−メトキシ ２（４'メチルベンジルチオ）アセトフェノン２ｍｍｏｌ（５７２ｍｇ）と、グリシンエチルエステルＨＣｌ塩２ｍｍｏｌ（１３９．５ｍｇ）とを、１５ｍｌのＤＣＭ中に懸濁させた。ＤＩＥＡ ６ｍｍｏｌ（１ｇ）をゆっくりと添加し、窒素雰囲気で、１ｍｌの四塩化チタン（１Ｍ溶液）を添加した。
【０１０９】
反応を室温で２日間進行させた。次に、ナトリウムシアノボロヒドリド６ｍｍｏｌ（０．４ｇ）を２．５ｍｌの無水メタノールに溶解させたものを、添加した。ＴＬＣによれば、約４０％の少量の新しい生成物が生じており、これは、精製したあと、ＮＭＲにより、Ｎ−１（４−メトキシフェニル），２（４−メチルベンジルチオ）エタングリシンエチルエステルと確認された。
【０１１０】
次に、１ｍｍｏｌ（３７４ｍｇ）のＮ−１（４−メトキシフェニル），２（４−メチルベンジルチオ）エタングリシンエチルエステルを、２ｍｌのＴＨＦに溶解させ、得られる溶液に、２ｍｍｏｌ（８３ｍｇ）のＬｉＯＨ水和物を添加した。一晩の撹拌の後、エステルは完全に加水分解されていた。ＴＨＦを真空中で除去し、生成物を２ｍｌのＤＭＦに取込み、５ｍｍｏｌ（１．１ｇ）のジブチルジカーボネートを添加し、最後に、３ｍｍｏｌ（０．４５ｍｌ）のＤＩＥＡを加えた。一晩の反応の後、希釈したＨＣｌ水溶液を添加し、最終生成物を酢酸エチル（３×）によって抽出した。
【０１１１】
以上、本発明を十分に説明したが、本発明の趣旨及び特許請求の範囲を逸脱することなく前記実施形態には多くの変形及び変更を加えることができることは、当業者には容易に理解しうるであろう。
【図面の簡単な説明】
【０１１２】
【図１】本発明におけるペプチドの拡張天然型化学的ライゲーションを説明する図である。
【図２】本発明における他のペプチドの拡張天然型化学的ライゲーションを説明する図である。
【図３】本発明における多要素の拡張天然型化学的ライゲーション法を説明する図である。
【図４】二つの異なる１−フェニル−２−メルカプトエチル補助基を使用する、本発明のライゲーション方策の概要を示す図である。
【図５Ａ】Ｎα−１−（４−メトキシフェニル）−２−メルカプトエチル補助基を使用する、実施例２１で述べるようなシトクロムｂ５６２に対するライゲーション反応に関する、分析高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）の結果を示す図であり、時刻＝０におけるライゲーション反応の状態を示す。
【図５Ｂ】図５Ａと同様な図であり、反応を一晩進行させたあとのライゲーションの状態を示す。
【図６Ａ】Ｎα−｛１−（４−メトキシフェニル）２−メルカプトエタノ｝改質Ｎ末端セグメントとの拡張天然型化学的ライゲーションを使用することによって生成されたライゲーション生成物シトクロムｂ５６２残基１−１０６の再構成エレクトロスプレー（ｒｅｃｏｎｓｔｒｕｃｔｅｄ ｅｌｅｃｔｒｏｓｐｒａｙ）質量分析（ＭＳ）の結果を示す図であり、ライゲーション部位に除去できるＮα−｛１−（４−メトキシフェニル）２−メルカプトエタノ｝基を有する初期ライゲーション生成物のＭＳ再構成を示す。
【図６Ｂ】図６Ａと同様な図であり、ライゲーション部位に天然アミド結合を生成させるためにＮα−｛１−（４−メトキシフェニル）２−メルカプトエタノ｝基を除去するフッ化水素（ＨＦ）処理後のライゲーション生成物のＭＳ再構成を示す。
【図７Ａ】図６Ｂに示す直鎖状シトクロムｂ５６２物質の代表的な分析ＨＰＬＣの結果を示す図である。
【図７Ｂ】折りたたみ（ｆｏｌｄｉｎｇ）後の該物質のイオン交換クロマトグラムを示す図である。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｎ置換アミド化合物であって、
式
Ｊ１−Ｃ（Ｏ）−Ｎ（Ｃ１（Ｒ１）−Ｃ２−ＳＨ）−Ｊ２ Ｉ
または
Ｊ１−Ｃ（Ｏ）−Ｎ（Ｃ１（Ｒ１）−Ｃ２（Ｒ２）−Ｃ３（Ｒ３）−ＳＨ）
−Ｊ２ ＩＩ
を有し、
これらの式において、
Ｊ１及びＪ２が、それぞれ個別に、随意に保護された一つ以上のアミノ酸側鎖を有するペプチドもしくはポリペプチド、またはそのようなペプチドもしくはポリペプチドの成分、ポリマー、染料、官能基を有する表面、リンカーもしくは検出可能なマーカーであり、
Ｒ１、Ｒ２、及びＲ３が、それぞれ個別に、共有結合によってＣ１に複合したＨまたは電子供与基であり、置換された、あるいは置換されていない、フェニル；置換されていない、あるいは、オルソ位置あるいはパラ位置でヒドロキシルあるいはチオールで置換された、ピコリル；メタンエチオル、スルホキシメチル、メトキシ、チオール、ヒドロキシル、メチルチオ、メチル、エチル、プロピル、及びイソプロピルから成る群から選択され、
Ｃ２及びＣ３は炭素であるが、
ただし前記Ｒ１、Ｒ２、及びＲ３のうち少なくとも一つが、Ｃ１に複合した前記電子供与基から成る、
ことを特徴とするＮ置換アミド化合物。
【請求項２】
当該式Ｉを有することを特徴とする請求項１に記載のＮ置換アミド化合物。
【請求項３】
Ｃ１（Ｒ１）が、下記のＡ、Ｂ、及びＣ
【化１】
から成る群から選択され、
これらの式において、
Ｒ１'、Ｒ３'、及びＲ５'が、同じかまたは異なることのできる電子供与基から成り、水素、メトキシ、チオール、ヒドロキシル、メチルチオ、メチル、エチル、プロピル、及びイソプロピルから成る群から選択される、
ことを特徴とする請求項２に記載のＮ置換アミド化合物。
【請求項４】
当該式ＩＩを有することを特徴とする請求項１に記載のＮ置換アミド化合物。
【請求項５】
Ｃ１（Ｒ１）−Ｃ２（Ｒ２）−Ｃ３（Ｒ３）が、下記のＤ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ及びＩ
【化２】
から成る群から選択され、
これらの式において、
Ｒ１'、Ｒ３'、及びＲ５'のうち一つ以上が、同じかまたは異なることのできる電子供与基から成り、メトキシ、チオール、ヒドロキシル、メチルチオ、メチル、エチル、プロピル、及びイソプロピルから成る群から選択される、
ことを特徴とする請求項４に記載のＮ置換アミド化合物。
【請求項６】
当該置換されたＮが、Ｎα置換アミドであることを特徴とする請求項１から５の中のいずれか１つに記載のＮ置換アミド化合物。
【請求項７】
Ｒ１'、Ｒ３'、及びＲ５'のうち少なくとも一つが、メトキシ（−ＯＣＨ3）、チオール（−ＳＨ）、ヒドロキシル（−ＯＨ）、及びチオメチル（−ＳＣＨ3）から成る群から選択されることを特徴とする請求項３または５に記載のＮ置換アミド化合物。
【請求項８】
Ｒ１'、Ｒ３'、及びＲ５'のうち少なくとも一つが、メチル（−ＣＨ3）、エチル（−ＣＨ2−ＣＨ3）、プロピル（−ＣＨ2−ＣＨ2−ＣＨ3）、及びイソプロピル（−ＣＨ2（ＣＨ3）3）から成ることを特徴とする請求項３または５に記載のＮ置換アミド化合物。
【請求項９】
Ｊ１が、一つ以上の随意に保護されたアミノ酸側鎖を有するペプチドもしくはポリペプチドであるか、またはそのようなペプチドもしくはポリペプチドの成分であることを特徴とする請求項１、２、または４に記載のＮ置換アミド化合物。
【請求項１０】
Ｊ１が、ポリマーであることを特徴とする請求項１、２、または４に記載のＮ置換アミド化合物。
【請求項１１】
Ｊ２が、一つ以上の随意に保護されたアミノ酸側鎖を有するペプチドもしくはポリペプチドであるか、またはそのようなペプチドもしくはポリペプチドの成分であることを特徴とする請求項１、２、または４に記載のＮ置換アミド化合物。
【請求項１２】
Ｊ２が、ポリマー、染料、官能基を有する表面、リンカーもしくは検出可能なマーカー、または化学的ペプチド合成もしくは拡張天然型化学的ライゲーションに適合する任意の他の化学成分であることを特徴とする請求項１、２、または４に記載のＮ置換アミド化合物。
【請求項１３】
酸安定なＮ置換２または３炭素鎖アミノアルキルまたはアリールチオール化合物であって、
式
ＨＳ−Ｃ２−Ｃ１（Ｒ１）−ＨＮ−Ｊ２ ＩＩＩ
または
ＨＳ−Ｃ３（Ｒ３）−Ｃ２（Ｒ２）−Ｃ１（Ｒ１）−ＨＮ−Ｊ２ ＩＶ
を有し、
これらの式において、
Ｊ１及びＪ２が、それぞれ個別に、随意に保護された一つ以上のアミノ酸側鎖を有するペプチドもしくはポリペプチド、またはそのようなペプチドもしくはポリペプチドの成分、ポリマー、染料、官能基を有する表面、リンカーもしくは検出可能なマーカー、または化学的ペプチド合成もしくは拡張天然型化学的ライゲーションに適合する任意の他の化学成分であり、
Ｒ１、Ｒ２、及びＲ３が、それぞれ個別に、共有結合によってＣ１に複合したＨまたは電子供与基であり、置換された、あるいは置換されていない、フェニル；置換された、あるいは置換されていない、ピコリル；メタンエチオル、スルホキシメチル、メトキシ、チオール、ヒドロキシル、メチルチオ、メチル、エチル、プロピル、及びイソプロピルから成る群から選択されるが、
ただしＲ１、Ｒ２、及びＲ３のうち少なくとも一つが、共有結合によってＣ１に複合した電子供与基から成る、
ことを特徴とする酸安定なＮ置換２または３炭素鎖アミノアルキルまたはアリールチオール化合物。
【請求項１４】
当該化合物が式ＩＩＩを有することを特徴とする請求項１３に記載の酸安定なＮ置換化合物。
【請求項１５】
Ｃ１（Ｒ１）が、下記のＡ、Ｂ、及びＣ
【化３】
から成る群から選択され、
これらの式において、
Ｒ１'、Ｒ３'、及びＲ５'のうち一つ以上が、同じかまたは異なることのできる電子供与基から成り、置換された、あるいは置換されていない、フェニル；置換された、あるいは置換されていない、ピコリル；メタンエチオル、スルホキシメチル、メトキシ、チオール、ヒドロキシル、メチルチオ、メチル、エチル、プロピル、及びイソプロピルから成る群から選択される、
ことを特徴とする請求項１４に記載の酸安定なＮ置換化合物。
【請求項１６】
当該化合物が式ＩＶを有することを特徴とする請求項１３に記載の酸安定なＮ置換化合物。
【請求項１７】
Ｃ３（Ｒ３）−Ｃ２（Ｒ２）−Ｃ１（Ｒ１）が、下記のＤ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ及びＩ
【化４】
から成る群から選択され、
これらの式において、
Ｒ１'、Ｒ３'、及びＲ５'のうち一つ以上が、同じかまたは異なることのできる電子供与基から成り、置換された、あるいは置換されていない、フェニル；置換された、あるいは置換されていない、ピコリル；メタンエチオル、スルホキシメチル、メトキシ、チオール、ヒドロキシル、メチルチオ、メチル、エチル、プロピル、及びイソプロピルから成る群から選択される、
ことを特徴とする請求項１６に記載の酸安定なＮ置換化合物。
【請求項１８】
当該置換ＮがＮα置換化合物であることを特徴とする請求項１３から１７の中のいずれか１つに記載の酸安定なＮ置換化合物。
【請求項１９】
Ｒ１'、Ｒ３'、及びＲ５'のうち少なくとも一つが、メトキシ（−ＯＣＨ3）、チオール（−ＳＨ）、ヒドロキシル（−ＯＨ）、及びチオメチル（−ＳＣＨ3）から成る群から選択されることを特徴とする請求項１５または１７に記載の酸安定なＮ置換化合物。
【請求項２０】
中程度の電子供与基が、メチル（−ＣＨ3）、エチル（−ＣＨ2−ＣＨ3）、プロピル（−ＣＨ2−ＣＨ2−ＣＨ3）、及びイソプロピル（−ＣＨ2（ＣＨ3）3）から成ることを特徴とする請求項１５または１７に記載の酸安定なＮ置換化合物。
【請求項２１】
Ｊ２が、一つ以上の随意に保護されたアミノ酸側鎖を有するペプチドもしくはポリペプチドであるか、またはそのようなペプチドもしくはポリペプチドの成分であることを特徴とする請求項１３、１４、または１６に記載の酸安定なＮ置換化合物。
【請求項２２】
Ｊ２が、ポリマー、染料、官能基を有する表面、リンカーもしくは検出可能なマーカー、または化学的ペプチド合成もしくは拡張天然型化学的ライゲーションに適合する任意の他の化学成分であることを特徴とする請求項１３、１４、または１６に記載の酸安定なＮ置換化合物。
【請求項２３】
Ｎ置換アミド化合物であって、
式
Ｊ１−Ｃ（Ｏ）−Ｎ（Ｃ１（Ｒ１）−Ｃ２−ＳＨ）−Ｊ２ Ｉ
または
Ｊ１−Ｃ（Ｏ）−Ｎ（Ｃ１（Ｒ１）−Ｃ２（Ｒ２）−Ｃ３（Ｒ３）−ＳＨ）
−Ｊ２ ＩＩ
を有し、
これらの式において、
Ｊ１及びＪ２が、それぞれ個別に、随意に保護された一つ以上のアミノ酸側鎖を有するペプチドもしくはポリペプチド、またはそのようなペプチドもしくはポリペプチドの成分、ポリマー、染料、官能基を有する表面、リンカーもしくは検出可能なマーカーであり、
Ｒ１、Ｒ２、及びＲ３が、それぞれ個別に、共有結合によってＣ１に複合したＨまたは電子供与基であり、置換された、あるいは置換されていない、フェニル；置換されていない、あるいは、オルソ位置あるいはパラ位置でヒドロキシルあるいはチオールで置換された、ピコリル；メタンエチオル、スルホキシメチル、メトキシ、チオール、ヒドロキシル、メチルチオ、メチル、エチル、プロピル、及びイソプロピルから成る群から選択され、
式 Ｊ１−Ｃ（Ｏ）ＳＲ のα−カルボキシルチオエステルから成る第一の要素を、
式
ＨＳ−Ｃ２−Ｃ１（Ｒ１）−ＨＮ−Ｊ２ ＩＩＩ
または
ＨＳ−Ｃ３（Ｒ３）−Ｃ２（Ｒ２）−Ｃ１（Ｒ１）−ＨＮ−Ｊ２ ＩＶ
を有する酸安定なＮ置換２または３炭素鎖アミノアルキルまたはアリールチオールから成る第二の要素と結合するプロセスによって生成され、
式ＩＩＩ及びＩＶにおいて、
Ｒ１、Ｒ２、及びＲ３が、それぞれ個別に、共有結合によってＣ１に複合したＨまたは電子供与基であり、置換された、あるいは置換されていない、フェニル；置換された、あるいは置換されていない、ピコリル；メタンエチオル、スルホキシメチル、メトキシ、チオール、ヒドロキシル、メチルチオ、メチル、エチル、プロピル、及びイソプロピルから成る群から選択されるが、ただしＲ１、Ｒ２、及びＲ３のうち少なくとも一つが、共有結合によってＣ１に複合した電子供与基から成る、
ことを特徴とするＮ置換アミド化合物。
【請求項２４】
当該酸安定なＮ置換化合物が、式ＩＩＩを有することを特徴とする請求項２３に記載のＮ置換アミド化合物。
【請求項２５】
当該酸安定なＮ置換化合物のＣ１（Ｒ１）が、下記のＡ、Ｂ、及びＣ
【化５】
から成る群から選択され、
これらの式において、
Ｒ１'、Ｒ３'、及びＲ５'のうち一つ以上が、同じかまたは異なることのできる電子供与基から成り、置換された、あるいは置換されていない、フェニル；置換された、あるいは置換されていない、ピコリル；メタンエチオル、スルホキシメチル、メトキシ、チオール、ヒドロキシル、メチルチオ、メチル、エチル、プロピル、及びイソプロピルから成る群から選択される、
ことを特徴とする請求項２４に記載のＮ置換アミド化合物。
【請求項２６】
当該酸安定なＮ置換化合物が、前記式ＩＶを有することを特徴とする請求項２３に記載のＮ置換アミド化合物。
【請求項２７】
Ｃ１（Ｒ１）−Ｃ２（Ｒ２）−Ｃ３（Ｒ３）が、下記のＤ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ及びＩ
【化６】
から成る群から選択され、
これらの式において、Ｒ１'、Ｒ３'、及びＲ５'のうち一つ以上が、同じかまたは異なることのできる電子供与基から成り、置換された、あるいは置換されていない、フェニル；置換された、あるいは置換されていない、ピコリル；メタンエチオル、スルホキシメチル、メトキシ、チオール、ヒドロキシル、メチルチオ、メチル、エチル、プロピル、及びイソプロピルから成る群から選択される、
ことを特徴とする請求項２６に記載のＮ置換アミド化合物。
【請求項２８】
当該置換Ｎが、Ｎα置換化合物であることを特徴とする請求項２３から２６の中のいずれか１つに記載のＮ置換アミド化合物。
【請求項２９】
Ｒ１'、Ｒ３'、及びＲ５'のうち少なくとも一つが、メトキシ（−ＯＣＨ3）、チオール（−ＳＨ）、ヒドロキシル（−ＯＨ）、及びチオメチル（−ＳＣＨ3）から成る群から選択されることを特徴とする請求項２５または２７に記載のＮ置換アミド化合物。
【請求項３０】
Ｒ１'、Ｒ３'、及びＲ５'のうち少なくとも一つが、メチル（−ＣＨ3）、エチル（−ＣＨ2−ＣＨ3）、プロピル（−ＣＨ2−ＣＨ2−ＣＨ3）、及びイソプロピル（−ＣＨ2（ＣＨ3）3）から成る群から選択されることを特徴とする請求項２５または２７に記載のＮ置換アミド化合物。
【請求項３１】
Ｊ１が、一つ以上の随意に保護されたアミノ酸側鎖を有するペプチドもしくはポリペプチドであるか、またはそのようなペプチドもしくはポリペプチドの成分であることを特徴とする請求項２３、２４、または２６に記載のＮ置換アミド化合物。
【請求項３２】
Ｊ２が、一つ以上の随意に保護されたアミノ酸側鎖を有するペプチドもしくはポリペプチドであるか、またはそのようなペプチドもしくはポリペプチドの成分であることを特徴とする請求項２３、２４、または２６に記載のＮ置換アミド化合物。
【請求項３３】
Ｊ２が、ポリマー、染料、官能基を有する表面、リンカーもしくは検出可能なマーカーであることを特徴とする請求項２３、２４、または２６に記載のＮ置換アミド化合物。
【請求項３４】
式
Ｊ１−Ｃ（Ｏ）−ＨＮ−Ｊ２ Ｖ
を有し、
この式において、
Ｊ１及びＪ２が、それぞれ個別に、随意に保護された一つ以上のアミノ酸側鎖を有するペプチドもしくはポリペプチド、またはそのようなペプチドもしくはポリペプチドの成分、ポリマー、染料、官能基を有する表面、リンカーもしくは検出可能なマーカーである、
化合物を生成する方法であって、
ステップ（Ａ） 式 Ｊ１−Ｃ（Ｏ）ＳＲ のα−カルボキシルチオエステルから成る第一の要素を、
式
ＨＳ−Ｃ２−Ｃ１（Ｒ１）−ＨＮ−Ｊ２ ＩＩＩ
を有する酸安定なＮ置換２または３炭素鎖アミノアルキルまたはアリールチオールから成る第二の要素と結合させて、
式
Ｊ１−Ｃ（Ｏ）−Ｎ（Ｃ１（Ｒ１）−Ｃ２−ＳＨ）−Ｊ２ Ｉ
を有するＮ置換アミド結合ライゲーション生成物を生成し、
式ＩＩＩにおいて、
Ｒ１は共有結合によってＣ１に複合した電子供与基であり、置換された、あるいは置換されていない、フェニル；置換されていない、あるいは、オルソ位置あるいはパラ位置でヒドロキシルあるいはチオールで置換された、ピコリル；メタンエチオル、スルホキシメチル、メトキシ、チオール、ヒドロキシル、メチルチオ、メチル、エチル、プロピル、及びイソプロピルから成る群から選択され、
ステップ（Ｂ） 前記２炭素鎖アルキルまたはアリールチオールを、前記Ｎ置換アミド結合ライゲーション生成物から、Ｎα−Ｃ１結合の開裂によって除去する、
各ステップから成る、
ことを特徴とする方法。
【請求項３５】
式
Ｊ１−Ｃ（Ｏ）−ＨＮ−Ｊ２ Ｖ
を有し、
この式において、
Ｊ１及びＪ２が、それぞれ個別に、随意に保護された一つ以上のアミノ酸側鎖を有するペプチドもしくはポリペプチド、またはそのようなペプチドもしくはポリペプチドの成分、ポリマー、染料、官能基を有する表面、リンカーもしくは検出可能なマーカー、または化学的ペプチド合成もしくは拡張天然型化学的ライゲーションに適合する任意の他の化学成分である、
化合物を生成する方法であって、
ステップ（Ａ） 式 Ｊ１−Ｃ（Ｏ）ＳＲ のα−カルボキシルチオエステルから成る第一の要素を、
式
ＨＳ−Ｃ３（Ｒ３）−Ｃ２（Ｒ２）−Ｃ１（Ｒ１）−ＨＮ−Ｊ２ ＩＶ
を有する酸安定なＮ置換２または３炭素鎖アミノアルキルまたはアリールチオールから成る第二の要素と結合させて、
式
Ｊ１−Ｃ（Ｏ）−Ｎ（Ｃ１（Ｒ１）−Ｃ２（Ｒ２）−Ｃ３（Ｒ３）−ＳＨ）
−Ｊ２ ＩＩ
を有するＮ置換アミド結合ライゲーション生成物を生成し、
式ＩＶにおいて、
Ｒ１、Ｒ２、及びＲ３が、それぞれ個別に、Ｃ１に複合したＨまたは電子供与基であり、ただし、Ｒ１、Ｒ２、及びＲ３が、共有結合によってＣ１に複合した電子供与基から成り、置換された、あるいは置換されていない、フェニル；置換されていない、あるいは、オルソ位置あるいはパラ位置でヒドロキシルあるいはチオールで置換された、ピコリル；メタンエチオル、スルホキシメチル、メトキシ、チオール、ヒドロキシル、メチルチオ、メチル、エチル、プロピル、及びイソプロピルから成る群から選択され、
ステップ（Ｂ） 前記３炭素鎖アルキルまたはアリールチオールを、前記Ｎ置換アミド結合ライゲーション生成物から、Ｎα−Ｃ１結合の開裂によって除去する、
各ステップから成る、
ことを特徴とする方法。
【請求項３６】
当該酸安定なＮ置換化合物のＣ１（Ｒ１）が、下記のＡ、Ｂ、及びＣ
【化７】
から成る群から選択され、
これらの式において、
Ｒ１'、Ｒ３'、及びＲ５'のうち一つ以上が、同じかまたは異なることのできる電子供与基から成り、置換された、あるいは置換されていない、フェニル；置換された、あるいは置換されていない、ピコリル；メタンエチオル、スルホキシメチル、メトキシ、チオール、ヒドロキシル、メチルチオ、メチル、エチル、プロピル、及びイソプロピルから成る群から選択される
ことを特徴とする請求項３４に記載の方法。
【請求項３７】
当該酸安定なＮ置換化合物のＣ１（Ｒ１）−Ｃ２（Ｒ２）−Ｃ３（Ｒ３）が、下記のＤ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ及びＩ
【化８】
から成る群から選択され、
これらの式において、Ｒ１'、Ｒ３'、及びＲ５'のうち一つ以上が、同じかまたは異なることのできる電子供与基から成り、置換された、あるいは置換されていない、フェニル；置換された、あるいは置換されていない、ピコリル；メタンエチオル、スルホキシメチル、メトキシ、チオール、ヒドロキシル、メチルチオ、メチル、エチル、プロピル、及びイソプロピルから成る群から選択される、
ことを特徴とする請求項３５に記載の方法。
【請求項３８】
当該Ｎ置換化合物が、Ｎα置換化合物であることを特徴とする請求項３４から３７の中のいずれか１つに記載の方法。
【請求項３９】
Ｒ１'、Ｒ３'、及びＲ５'のうち少なくとも一つが、メトキシ（−ＯＣＨ3）、チオール（−ＳＨ）、ヒドロキシル（−ＯＨ）、及びチオメチル（−ＳＣＨ3）から成る群から選択されることを特徴とする請求項３６または３７に記載の方法。
【請求項４０】
Ｒ１'、Ｒ３'、及びＲ５'のうち少なくとも一つが、メチル（−ＣＨ3）、エチル（−ＣＨ2−ＣＨ3）、プロピル（−ＣＨ2−ＣＨ2−ＣＨ3）、及びイソプロピル（−ＣＨ2（ＣＨ3）3）から成る群から選択されることを特徴とする請求項３６または３７に記載の方法。
【請求項４１】
Ｊ１が、一つ以上の随意に保護されたアミノ酸側鎖を有するペプチドもしくはポリペプチド、またはそのようなペプチドまたはポリペプチドの成分であることを特徴とする請求項３６または３７に記載の方法。
【請求項４２】
Ｊ２が、一つ以上の随意に保護されたアミノ酸側鎖を有するペプチドもしくはポリペプチドであるか、またはそのようなペプチドもしくはポリペプチドの成分であることを特徴とする請求項３６または３７に記載の方法。
【請求項４３】
Ｊ２が、ポリマー、染料、官能基を有する表面、リンカーもしくは検出可能なマーカーであることを特徴とする請求項３６または３７に記載の方法。
【請求項４４】
当該化合物が溶液中で合成されることを特徴とする請求項３６または３７に記載の方法。
【請求項４５】
当該化合物が、固体支持体に固定されて合成されることを特徴とする請求項３６または３７に記載の方法。
【請求項１】
Ｎ置換アミド化合物であって、
式
Ｊ１−Ｃ（Ｏ）−Ｎ（Ｃ１（Ｒ１）−Ｃ２−ＳＨ）−Ｊ２ Ｉ
または
Ｊ１−Ｃ（Ｏ）−Ｎ（Ｃ１（Ｒ１）−Ｃ２（Ｒ２）−Ｃ３（Ｒ３）−ＳＨ）
−Ｊ２ ＩＩ
を有し、
これらの式において、
Ｊ１及びＪ２が、それぞれ個別に、随意に保護された一つ以上のアミノ酸側鎖を有するペプチドもしくはポリペプチド、またはそのようなペプチドもしくはポリペプチドの成分、ポリマー、染料、官能基を有する表面、リンカーもしくは検出可能なマーカーであり、
Ｒ１、Ｒ２、及びＲ３が、それぞれ個別に、共有結合によってＣ１に複合したＨまたは電子供与基であり、置換された、あるいは置換されていない、フェニル；置換されていない、あるいは、オルソ位置あるいはパラ位置でヒドロキシルあるいはチオールで置換された、ピコリル；メタンエチオル、スルホキシメチル、メトキシ、チオール、ヒドロキシル、メチルチオ、メチル、エチル、プロピル、及びイソプロピルから成る群から選択され、
Ｃ２及びＣ３は炭素であるが、
ただし前記Ｒ１、Ｒ２、及びＲ３のうち少なくとも一つが、Ｃ１に複合した前記電子供与基から成る、
ことを特徴とするＮ置換アミド化合物。
【請求項２】
当該式Ｉを有することを特徴とする請求項１に記載のＮ置換アミド化合物。
【請求項３】
Ｃ１（Ｒ１）が、下記のＡ、Ｂ、及びＣ
【化１】
から成る群から選択され、
これらの式において、
Ｒ１'、Ｒ３'、及びＲ５'が、同じかまたは異なることのできる電子供与基から成り、水素、メトキシ、チオール、ヒドロキシル、メチルチオ、メチル、エチル、プロピル、及びイソプロピルから成る群から選択される、
ことを特徴とする請求項２に記載のＮ置換アミド化合物。
【請求項４】
当該式ＩＩを有することを特徴とする請求項１に記載のＮ置換アミド化合物。
【請求項５】
Ｃ１（Ｒ１）−Ｃ２（Ｒ２）−Ｃ３（Ｒ３）が、下記のＤ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ及びＩ
【化２】
から成る群から選択され、
これらの式において、
Ｒ１'、Ｒ３'、及びＲ５'のうち一つ以上が、同じかまたは異なることのできる電子供与基から成り、メトキシ、チオール、ヒドロキシル、メチルチオ、メチル、エチル、プロピル、及びイソプロピルから成る群から選択される、
ことを特徴とする請求項４に記載のＮ置換アミド化合物。
【請求項６】
当該置換されたＮが、Ｎα置換アミドであることを特徴とする請求項１から５の中のいずれか１つに記載のＮ置換アミド化合物。
【請求項７】
Ｒ１'、Ｒ３'、及びＲ５'のうち少なくとも一つが、メトキシ（−ＯＣＨ3）、チオール（−ＳＨ）、ヒドロキシル（−ＯＨ）、及びチオメチル（−ＳＣＨ3）から成る群から選択されることを特徴とする請求項３または５に記載のＮ置換アミド化合物。
【請求項８】
Ｒ１'、Ｒ３'、及びＲ５'のうち少なくとも一つが、メチル（−ＣＨ3）、エチル（−ＣＨ2−ＣＨ3）、プロピル（−ＣＨ2−ＣＨ2−ＣＨ3）、及びイソプロピル（−ＣＨ2（ＣＨ3）3）から成ることを特徴とする請求項３または５に記載のＮ置換アミド化合物。
【請求項９】
Ｊ１が、一つ以上の随意に保護されたアミノ酸側鎖を有するペプチドもしくはポリペプチドであるか、またはそのようなペプチドもしくはポリペプチドの成分であることを特徴とする請求項１、２、または４に記載のＮ置換アミド化合物。
【請求項１０】
Ｊ１が、ポリマーであることを特徴とする請求項１、２、または４に記載のＮ置換アミド化合物。
【請求項１１】
Ｊ２が、一つ以上の随意に保護されたアミノ酸側鎖を有するペプチドもしくはポリペプチドであるか、またはそのようなペプチドもしくはポリペプチドの成分であることを特徴とする請求項１、２、または４に記載のＮ置換アミド化合物。
【請求項１２】
Ｊ２が、ポリマー、染料、官能基を有する表面、リンカーもしくは検出可能なマーカー、または化学的ペプチド合成もしくは拡張天然型化学的ライゲーションに適合する任意の他の化学成分であることを特徴とする請求項１、２、または４に記載のＮ置換アミド化合物。
【請求項１３】
酸安定なＮ置換２または３炭素鎖アミノアルキルまたはアリールチオール化合物であって、
式
ＨＳ−Ｃ２−Ｃ１（Ｒ１）−ＨＮ−Ｊ２ ＩＩＩ
または
ＨＳ−Ｃ３（Ｒ３）−Ｃ２（Ｒ２）−Ｃ１（Ｒ１）−ＨＮ−Ｊ２ ＩＶ
を有し、
これらの式において、
Ｊ１及びＪ２が、それぞれ個別に、随意に保護された一つ以上のアミノ酸側鎖を有するペプチドもしくはポリペプチド、またはそのようなペプチドもしくはポリペプチドの成分、ポリマー、染料、官能基を有する表面、リンカーもしくは検出可能なマーカー、または化学的ペプチド合成もしくは拡張天然型化学的ライゲーションに適合する任意の他の化学成分であり、
Ｒ１、Ｒ２、及びＲ３が、それぞれ個別に、共有結合によってＣ１に複合したＨまたは電子供与基であり、置換された、あるいは置換されていない、フェニル；置換された、あるいは置換されていない、ピコリル；メタンエチオル、スルホキシメチル、メトキシ、チオール、ヒドロキシル、メチルチオ、メチル、エチル、プロピル、及びイソプロピルから成る群から選択されるが、
ただしＲ１、Ｒ２、及びＲ３のうち少なくとも一つが、共有結合によってＣ１に複合した電子供与基から成る、
ことを特徴とする酸安定なＮ置換２または３炭素鎖アミノアルキルまたはアリールチオール化合物。
【請求項１４】
当該化合物が式ＩＩＩを有することを特徴とする請求項１３に記載の酸安定なＮ置換化合物。
【請求項１５】
Ｃ１（Ｒ１）が、下記のＡ、Ｂ、及びＣ
【化３】
から成る群から選択され、
これらの式において、
Ｒ１'、Ｒ３'、及びＲ５'のうち一つ以上が、同じかまたは異なることのできる電子供与基から成り、置換された、あるいは置換されていない、フェニル；置換された、あるいは置換されていない、ピコリル；メタンエチオル、スルホキシメチル、メトキシ、チオール、ヒドロキシル、メチルチオ、メチル、エチル、プロピル、及びイソプロピルから成る群から選択される、
ことを特徴とする請求項１４に記載の酸安定なＮ置換化合物。
【請求項１６】
当該化合物が式ＩＶを有することを特徴とする請求項１３に記載の酸安定なＮ置換化合物。
【請求項１７】
Ｃ３（Ｒ３）−Ｃ２（Ｒ２）−Ｃ１（Ｒ１）が、下記のＤ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ及びＩ
【化４】
から成る群から選択され、
これらの式において、
Ｒ１'、Ｒ３'、及びＲ５'のうち一つ以上が、同じかまたは異なることのできる電子供与基から成り、置換された、あるいは置換されていない、フェニル；置換された、あるいは置換されていない、ピコリル；メタンエチオル、スルホキシメチル、メトキシ、チオール、ヒドロキシル、メチルチオ、メチル、エチル、プロピル、及びイソプロピルから成る群から選択される、
ことを特徴とする請求項１６に記載の酸安定なＮ置換化合物。
【請求項１８】
当該置換ＮがＮα置換化合物であることを特徴とする請求項１３から１７の中のいずれか１つに記載の酸安定なＮ置換化合物。
【請求項１９】
Ｒ１'、Ｒ３'、及びＲ５'のうち少なくとも一つが、メトキシ（−ＯＣＨ3）、チオール（−ＳＨ）、ヒドロキシル（−ＯＨ）、及びチオメチル（−ＳＣＨ3）から成る群から選択されることを特徴とする請求項１５または１７に記載の酸安定なＮ置換化合物。
【請求項２０】
中程度の電子供与基が、メチル（−ＣＨ3）、エチル（−ＣＨ2−ＣＨ3）、プロピル（−ＣＨ2−ＣＨ2−ＣＨ3）、及びイソプロピル（−ＣＨ2（ＣＨ3）3）から成ることを特徴とする請求項１５または１７に記載の酸安定なＮ置換化合物。
【請求項２１】
Ｊ２が、一つ以上の随意に保護されたアミノ酸側鎖を有するペプチドもしくはポリペプチドであるか、またはそのようなペプチドもしくはポリペプチドの成分であることを特徴とする請求項１３、１４、または１６に記載の酸安定なＮ置換化合物。
【請求項２２】
Ｊ２が、ポリマー、染料、官能基を有する表面、リンカーもしくは検出可能なマーカー、または化学的ペプチド合成もしくは拡張天然型化学的ライゲーションに適合する任意の他の化学成分であることを特徴とする請求項１３、１４、または１６に記載の酸安定なＮ置換化合物。
【請求項２３】
Ｎ置換アミド化合物であって、
式
Ｊ１−Ｃ（Ｏ）−Ｎ（Ｃ１（Ｒ１）−Ｃ２−ＳＨ）−Ｊ２ Ｉ
または
Ｊ１−Ｃ（Ｏ）−Ｎ（Ｃ１（Ｒ１）−Ｃ２（Ｒ２）−Ｃ３（Ｒ３）−ＳＨ）
−Ｊ２ ＩＩ
を有し、
これらの式において、
Ｊ１及びＪ２が、それぞれ個別に、随意に保護された一つ以上のアミノ酸側鎖を有するペプチドもしくはポリペプチド、またはそのようなペプチドもしくはポリペプチドの成分、ポリマー、染料、官能基を有する表面、リンカーもしくは検出可能なマーカーであり、
Ｒ１、Ｒ２、及びＲ３が、それぞれ個別に、共有結合によってＣ１に複合したＨまたは電子供与基であり、置換された、あるいは置換されていない、フェニル；置換されていない、あるいは、オルソ位置あるいはパラ位置でヒドロキシルあるいはチオールで置換された、ピコリル；メタンエチオル、スルホキシメチル、メトキシ、チオール、ヒドロキシル、メチルチオ、メチル、エチル、プロピル、及びイソプロピルから成る群から選択され、
式 Ｊ１−Ｃ（Ｏ）ＳＲ のα−カルボキシルチオエステルから成る第一の要素を、
式
ＨＳ−Ｃ２−Ｃ１（Ｒ１）−ＨＮ−Ｊ２ ＩＩＩ
または
ＨＳ−Ｃ３（Ｒ３）−Ｃ２（Ｒ２）−Ｃ１（Ｒ１）−ＨＮ−Ｊ２ ＩＶ
を有する酸安定なＮ置換２または３炭素鎖アミノアルキルまたはアリールチオールから成る第二の要素と結合するプロセスによって生成され、
式ＩＩＩ及びＩＶにおいて、
Ｒ１、Ｒ２、及びＲ３が、それぞれ個別に、共有結合によってＣ１に複合したＨまたは電子供与基であり、置換された、あるいは置換されていない、フェニル；置換された、あるいは置換されていない、ピコリル；メタンエチオル、スルホキシメチル、メトキシ、チオール、ヒドロキシル、メチルチオ、メチル、エチル、プロピル、及びイソプロピルから成る群から選択されるが、ただしＲ１、Ｒ２、及びＲ３のうち少なくとも一つが、共有結合によってＣ１に複合した電子供与基から成る、
ことを特徴とするＮ置換アミド化合物。
【請求項２４】
当該酸安定なＮ置換化合物が、式ＩＩＩを有することを特徴とする請求項２３に記載のＮ置換アミド化合物。
【請求項２５】
当該酸安定なＮ置換化合物のＣ１（Ｒ１）が、下記のＡ、Ｂ、及びＣ
【化５】
から成る群から選択され、
これらの式において、
Ｒ１'、Ｒ３'、及びＲ５'のうち一つ以上が、同じかまたは異なることのできる電子供与基から成り、置換された、あるいは置換されていない、フェニル；置換された、あるいは置換されていない、ピコリル；メタンエチオル、スルホキシメチル、メトキシ、チオール、ヒドロキシル、メチルチオ、メチル、エチル、プロピル、及びイソプロピルから成る群から選択される、
ことを特徴とする請求項２４に記載のＮ置換アミド化合物。
【請求項２６】
当該酸安定なＮ置換化合物が、前記式ＩＶを有することを特徴とする請求項２３に記載のＮ置換アミド化合物。
【請求項２７】
Ｃ１（Ｒ１）−Ｃ２（Ｒ２）−Ｃ３（Ｒ３）が、下記のＤ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ及びＩ
【化６】
から成る群から選択され、
これらの式において、Ｒ１'、Ｒ３'、及びＲ５'のうち一つ以上が、同じかまたは異なることのできる電子供与基から成り、置換された、あるいは置換されていない、フェニル；置換された、あるいは置換されていない、ピコリル；メタンエチオル、スルホキシメチル、メトキシ、チオール、ヒドロキシル、メチルチオ、メチル、エチル、プロピル、及びイソプロピルから成る群から選択される、
ことを特徴とする請求項２６に記載のＮ置換アミド化合物。
【請求項２８】
当該置換Ｎが、Ｎα置換化合物であることを特徴とする請求項２３から２６の中のいずれか１つに記載のＮ置換アミド化合物。
【請求項２９】
Ｒ１'、Ｒ３'、及びＲ５'のうち少なくとも一つが、メトキシ（−ＯＣＨ3）、チオール（−ＳＨ）、ヒドロキシル（−ＯＨ）、及びチオメチル（−ＳＣＨ3）から成る群から選択されることを特徴とする請求項２５または２７に記載のＮ置換アミド化合物。
【請求項３０】
Ｒ１'、Ｒ３'、及びＲ５'のうち少なくとも一つが、メチル（−ＣＨ3）、エチル（−ＣＨ2−ＣＨ3）、プロピル（−ＣＨ2−ＣＨ2−ＣＨ3）、及びイソプロピル（−ＣＨ2（ＣＨ3）3）から成る群から選択されることを特徴とする請求項２５または２７に記載のＮ置換アミド化合物。
【請求項３１】
Ｊ１が、一つ以上の随意に保護されたアミノ酸側鎖を有するペプチドもしくはポリペプチドであるか、またはそのようなペプチドもしくはポリペプチドの成分であることを特徴とする請求項２３、２４、または２６に記載のＮ置換アミド化合物。
【請求項３２】
Ｊ２が、一つ以上の随意に保護されたアミノ酸側鎖を有するペプチドもしくはポリペプチドであるか、またはそのようなペプチドもしくはポリペプチドの成分であることを特徴とする請求項２３、２４、または２６に記載のＮ置換アミド化合物。
【請求項３３】
Ｊ２が、ポリマー、染料、官能基を有する表面、リンカーもしくは検出可能なマーカーであることを特徴とする請求項２３、２４、または２６に記載のＮ置換アミド化合物。
【請求項３４】
式
Ｊ１−Ｃ（Ｏ）−ＨＮ−Ｊ２ Ｖ
を有し、
この式において、
Ｊ１及びＪ２が、それぞれ個別に、随意に保護された一つ以上のアミノ酸側鎖を有するペプチドもしくはポリペプチド、またはそのようなペプチドもしくはポリペプチドの成分、ポリマー、染料、官能基を有する表面、リンカーもしくは検出可能なマーカーである、
化合物を生成する方法であって、
ステップ（Ａ） 式 Ｊ１−Ｃ（Ｏ）ＳＲ のα−カルボキシルチオエステルから成る第一の要素を、
式
ＨＳ−Ｃ２−Ｃ１（Ｒ１）−ＨＮ−Ｊ２ ＩＩＩ
を有する酸安定なＮ置換２または３炭素鎖アミノアルキルまたはアリールチオールから成る第二の要素と結合させて、
式
Ｊ１−Ｃ（Ｏ）−Ｎ（Ｃ１（Ｒ１）−Ｃ２−ＳＨ）−Ｊ２ Ｉ
を有するＮ置換アミド結合ライゲーション生成物を生成し、
式ＩＩＩにおいて、
Ｒ１は共有結合によってＣ１に複合した電子供与基であり、置換された、あるいは置換されていない、フェニル；置換されていない、あるいは、オルソ位置あるいはパラ位置でヒドロキシルあるいはチオールで置換された、ピコリル；メタンエチオル、スルホキシメチル、メトキシ、チオール、ヒドロキシル、メチルチオ、メチル、エチル、プロピル、及びイソプロピルから成る群から選択され、
ステップ（Ｂ） 前記２炭素鎖アルキルまたはアリールチオールを、前記Ｎ置換アミド結合ライゲーション生成物から、Ｎα−Ｃ１結合の開裂によって除去する、
各ステップから成る、
ことを特徴とする方法。
【請求項３５】
式
Ｊ１−Ｃ（Ｏ）−ＨＮ−Ｊ２ Ｖ
を有し、
この式において、
Ｊ１及びＪ２が、それぞれ個別に、随意に保護された一つ以上のアミノ酸側鎖を有するペプチドもしくはポリペプチド、またはそのようなペプチドもしくはポリペプチドの成分、ポリマー、染料、官能基を有する表面、リンカーもしくは検出可能なマーカー、または化学的ペプチド合成もしくは拡張天然型化学的ライゲーションに適合する任意の他の化学成分である、
化合物を生成する方法であって、
ステップ（Ａ） 式 Ｊ１−Ｃ（Ｏ）ＳＲ のα−カルボキシルチオエステルから成る第一の要素を、
式
ＨＳ−Ｃ３（Ｒ３）−Ｃ２（Ｒ２）−Ｃ１（Ｒ１）−ＨＮ−Ｊ２ ＩＶ
を有する酸安定なＮ置換２または３炭素鎖アミノアルキルまたはアリールチオールから成る第二の要素と結合させて、
式
Ｊ１−Ｃ（Ｏ）−Ｎ（Ｃ１（Ｒ１）−Ｃ２（Ｒ２）−Ｃ３（Ｒ３）−ＳＨ）
−Ｊ２ ＩＩ
を有するＮ置換アミド結合ライゲーション生成物を生成し、
式ＩＶにおいて、
Ｒ１、Ｒ２、及びＲ３が、それぞれ個別に、Ｃ１に複合したＨまたは電子供与基であり、ただし、Ｒ１、Ｒ２、及びＲ３が、共有結合によってＣ１に複合した電子供与基から成り、置換された、あるいは置換されていない、フェニル；置換されていない、あるいは、オルソ位置あるいはパラ位置でヒドロキシルあるいはチオールで置換された、ピコリル；メタンエチオル、スルホキシメチル、メトキシ、チオール、ヒドロキシル、メチルチオ、メチル、エチル、プロピル、及びイソプロピルから成る群から選択され、
ステップ（Ｂ） 前記３炭素鎖アルキルまたはアリールチオールを、前記Ｎ置換アミド結合ライゲーション生成物から、Ｎα−Ｃ１結合の開裂によって除去する、
各ステップから成る、
ことを特徴とする方法。
【請求項３６】
当該酸安定なＮ置換化合物のＣ１（Ｒ１）が、下記のＡ、Ｂ、及びＣ
【化７】
から成る群から選択され、
これらの式において、
Ｒ１'、Ｒ３'、及びＲ５'のうち一つ以上が、同じかまたは異なることのできる電子供与基から成り、置換された、あるいは置換されていない、フェニル；置換された、あるいは置換されていない、ピコリル；メタンエチオル、スルホキシメチル、メトキシ、チオール、ヒドロキシル、メチルチオ、メチル、エチル、プロピル、及びイソプロピルから成る群から選択される
ことを特徴とする請求項３４に記載の方法。
【請求項３７】
当該酸安定なＮ置換化合物のＣ１（Ｒ１）−Ｃ２（Ｒ２）−Ｃ３（Ｒ３）が、下記のＤ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ及びＩ
【化８】
から成る群から選択され、
これらの式において、Ｒ１'、Ｒ３'、及びＲ５'のうち一つ以上が、同じかまたは異なることのできる電子供与基から成り、置換された、あるいは置換されていない、フェニル；置換された、あるいは置換されていない、ピコリル；メタンエチオル、スルホキシメチル、メトキシ、チオール、ヒドロキシル、メチルチオ、メチル、エチル、プロピル、及びイソプロピルから成る群から選択される、
ことを特徴とする請求項３５に記載の方法。
【請求項３８】
当該Ｎ置換化合物が、Ｎα置換化合物であることを特徴とする請求項３４から３７の中のいずれか１つに記載の方法。
【請求項３９】
Ｒ１'、Ｒ３'、及びＲ５'のうち少なくとも一つが、メトキシ（−ＯＣＨ3）、チオール（−ＳＨ）、ヒドロキシル（−ＯＨ）、及びチオメチル（−ＳＣＨ3）から成る群から選択されることを特徴とする請求項３６または３７に記載の方法。
【請求項４０】
Ｒ１'、Ｒ３'、及びＲ５'のうち少なくとも一つが、メチル（−ＣＨ3）、エチル（−ＣＨ2−ＣＨ3）、プロピル（−ＣＨ2−ＣＨ2−ＣＨ3）、及びイソプロピル（−ＣＨ2（ＣＨ3）3）から成る群から選択されることを特徴とする請求項３６または３７に記載の方法。
【請求項４１】
Ｊ１が、一つ以上の随意に保護されたアミノ酸側鎖を有するペプチドもしくはポリペプチド、またはそのようなペプチドまたはポリペプチドの成分であることを特徴とする請求項３６または３７に記載の方法。
【請求項４２】
Ｊ２が、一つ以上の随意に保護されたアミノ酸側鎖を有するペプチドもしくはポリペプチドであるか、またはそのようなペプチドもしくはポリペプチドの成分であることを特徴とする請求項３６または３７に記載の方法。
【請求項４３】
Ｊ２が、ポリマー、染料、官能基を有する表面、リンカーもしくは検出可能なマーカーであることを特徴とする請求項３６または３７に記載の方法。
【請求項４４】
当該化合物が溶液中で合成されることを特徴とする請求項３６または３７に記載の方法。
【請求項４５】
当該化合物が、固体支持体に固定されて合成されることを特徴とする請求項３６または３７に記載の方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５Ａ】
【図５Ｂ】
【図６Ａ】
【図６Ｂ】
【図７Ａ】
【図７Ｂ】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５Ａ】
【図５Ｂ】
【図６Ａ】
【図６Ｂ】
【図７Ａ】
【図７Ｂ】
【公開番号】特開２００８−１５０３９３（Ｐ２００８−１５０３９３Ａ）
【公開日】平成２０年７月３日（２００８．７．３）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００８−２５９０７（Ｐ２００８−２５９０７）
【出願日】平成２０年２月６日（２００８．２．６）
【分割の表示】特願２００２−５２５１７７（Ｐ２００２−５２５１７７）の分割
【原出願日】平成１３年９月７日（２００１．９．７）
【出願人】（５０１０８４２７１）グリフォン セラピューティクス，インコーポレーテッド (4)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２０年７月３日（２００８．７．３）
【国際特許分類】
【出願日】平成２０年２月６日（２００８．２．６）
【分割の表示】特願２００２−５２５１７７（Ｐ２００２−５２５１７７）の分割
【原出願日】平成１３年９月７日（２００１．９．７）
【出願人】（５０１０８４２７１）グリフォン セラピューティクス，インコーポレーテッド (4)
【Ｆターム（参考）】
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