改変タンパク分解性切断部位を有するHCV多エピトープ融合抗原およびその使用
改変HCV多エピトープ融合抗原(MEFA)が記述される。このタンパク質は、HCV NS3プロテアーゼによるMEFAのタンパク分解性切断が阻害されるようにするための改変配列を含む。改変MEFAを含むHCVイムノアッセイも記述される。このMEFAは、HCV NS3タンパク分解性切断部位を含むHCVヘリカーゼドメインからの少なくとも1つのエピトープ及びHCV NS3タンパク分解性切断部位を含むNS4領域からの少なくとも1つのエピトープを含み、これらのHCV NS3のタンパク分解性切断部位は、変異のない対応するMEFAのタンパク分解性切断と比較してNS3による改変MEFAのタンパク分解性切断が阻害されるように変異されている。さらに、この改変MEFAは、HCV感染個体からの生物学的サンプル中に存在する抗HCV抗体と特異的に反応する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
(関連出願の引用)
本出願は、米国特許法第119条(e)(1)に基づき、米国仮特許出願第60/621,790号(2004年10月25日出願);同第60/621,502号(2004年10月22日出願);同第60/618,390号(2004年10月12日出願);および同第60/604,858号(2004年8月27日出願)の優先権を主張する。上記出願の全ては、本明細書中でその全体が参考として援用される。
【0002】
(技術分野)
本発明は、概して、C型肝炎ウイルス(HCV)構築物及びその使用方法に関する。より詳細には、本発明は、NS3によるMEFAのタンパク分解性切断を阻害するための改変アミノ酸配列を有する、複数のHCVエピトープを含む免疫原性HCV多エピトープ融合抗原(MEFA)に関する。このタンパク質は、HCV感染を診断するためのイムノアッセイにおいて有用である。
【背景技術】
【0003】
(発明の背景)
HCVは、約3010個のアミノ酸をコードする約9.5kbの一本鎖プラスセンスRNAゲノムを有するエンベロープウイルスである(非特許文献1;非特許文献2)。HCVポリタンパク質は宿主及びウイルスのプロテアーゼによりプロセシングされて、いくつかの成熟タンパク質:コア(core)タンパク質(C)、エンベロープ糖タンパク質(E1及びE2)、及び6つの非構造タンパク質(NS2、NS3、NS4a、NS4b、NS5a、NS5b)(非特許文献3;非特許文献4)となる。NS3は3つの酵素活性を有する630アミノ酸のタンパク質である:N−末端の約180アミノ酸はセリンプロテアーゼ機能を提供し、残るC末端ドメインはヘリカーゼ及びNTPase活性の両方を有する(非特許文献5;非特許文献6;非特許文献7)。NS3プロテアーゼはNS3/4a、NS4a/4b、NS4b/5a及びNS5a/5b接合部位における切断に関与する(非特許文献8)。NS4aは約54アミノ酸を含み、NS3プロテアーゼの補因子として作用し、ポリタンパク質のプロセシングに不可欠である(非特許文献9)。
【0004】
HCVは輸血及び地域感染型の非A非B型ウイルス性肝炎に関連する主要な病原因子である(非特許文献10;非特許文献11;非特許文献12)。HCVは現在、世界人口の約3%に発症している。これらの者の70%がHCV慢性感染症を患い、それはしばしば肝硬変及び肝細胞癌へと進行する(非特許文献13;非特許文献14)。輸血後のHCVの出現率は、血液ドナーの中でのHCV抗体に関する慣用的なスクリーニングの実施以来、徐々に減少してきている(非特許文献15)。血液スクリーニングのための、及び、症状のある患者におけるHCV感染の診断のための、これらのアッセイの実績ある実用性にもかかわらず、アッセイ性能の向上へむけた重要な挑戦が残っている。そのような挑戦には、血清反応陰性の時期の短縮、免疫抑制患者からのHCVサンプルの検出の改善、及び、異なるHCV遺伝子型特異的なエピトープに対する抗体を検出するアッセイ感度の向上を含む。
【0005】
HCV感染の血清診断のためのいくつかのアッセイが開発されている。例えば、非特許文献11;非特許文献12;非特許文献16;非特許文献17;非特許文献18;非特許文献19;Chien,D.Y.,特許文献1;Valenzuelaら,特許文献2;及びKashiwakumaら,特許文献3参照。
【0006】
現在認可されているHCV ELISA抗体試験は、主に線状エピトープを含有する組換えタンパク質を用いる。例えば、コア(C22−3)、NS3及びNS4領域(C200)及びNS5からの3つの組換えHCVタンパク質が、市販のHCVアッセイのひとつにおいて使用されている(非特許文献20)。本明細書中でその全体が参考として援用される特許文献4は、多エピトープ融合抗原(MEFA)と組み合わせたNS3/4a高次構造エピトープを用いたイムノアッセイを記載している。HCV MEFAの記載については、例えば、非特許文献21;特許文献2;特許文献4;特許文献5;特許文献6;及び特許文献7参照。これらの試薬を用いたアッセイは、初期のHCVセロコンバージョンを検出するための感度及び信頼できる方法を提供する。酵母において発現され、特許文献4に記載される非変性条件下で精製されるNS3/4aは、プロテアーゼ機能及びヘリカーゼ機能の両方を含む。この方法で精製されたNS3/4aは天然の高次構造を保存しているため、初期セロコンバージョン抗体検出においてc200又はc33c抗原よりも感度が高いことが見出されている。抗原としてNS3/4a及びMEFA7.1を用いる抗体アッセイにおいて、セロコンバージョン抗体は現在認可されているHCVアッセイよりも2〜14日間早く検出される。しかしながら、NS3/4タンパク質はNS3プロテアーゼ活性によって自己加水分解を受け、また、MEFA7.1を切断する。
【0007】
特許文献8及び特許文献9、及び同所有者の仮特許出願第60/604,858号は、タンパク質分解活性の低減を伴う変異されたNS3プロテアーゼドメインを含むHCVタンパク質を記載する。しかしながら、十分な患者のケアを提供するため、並びに血液及び血液製剤又は親密な個人的接触によるHCVの感染を予防するための、高感度で正確な診断的及び予測的なツールへの需要が未だに残っている。
【特許文献1】国際公開第94/01778号パンフレット
【特許文献2】国際公開第97/44469号パンフレット
【特許文献3】米国特許第5,871,904号明細書
【特許文献4】米国特許第6,632,601号明細書
【特許文献5】米国特許第6,514,731号明細書
【特許文献6】米国特許第6,428,792号明細書
【特許文献7】米国特許出願公開第20040142321号明細書
【特許文献8】国際公開第04/00547号パンフレット
【特許文献9】国際公開第01/38360号パンフレット
【非特許文献1】Chooら,Proc.Natl.Acad.Sci USA,1991年,第88巻,p.2451−2455
【非特許文献2】Takamizawaら,J.Virol.,1991年,第65巻,p.1105−1113
【非特許文献3】HijikataらProc.Natl.Acad.Sci.USA,1993年,第90巻,p.10773−10777
【非特許文献4】Grakouiら,J Virol.,1993年,第67巻,p.1385−1395
【非特許文献5】Bartenschlagerら,J Virol.,1993年,第67巻,p.3835−3844
【非特許文献6】Kimら,Biochem.Biophys.Res.Commun.,1995年,第215巻,p.160−166
【非特許文献7】Preugschatら,J.Biol.Chem.,1996年,第271巻,p.24449−24457
【非特許文献8】Grakouiら,J.Virol.,1993年,第67巻,p.2832−2843
【非特許文献9】Faillaら,J.Virol.,1994年,第68巻,p.3753−3760
【非特許文献10】Alterら,N.Engl.J.Med.,1989年,第321巻,p.1494−1500
【非特許文献11】Chooら,Science,1989年,第244巻,p.359−362
【非特許文献12】Kuoら,Science,1989年,第244巻,p.362−364
【非特許文献13】Bruixら,Lancet,1989年,第2巻,p.1004−1006
【非特許文献14】Saitoら,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,1990年,第87巻,p.6547−6549
【非特許文献15】Pillonelら,Transfusion,2002年,第42巻,p.980−988
【非特許文献16】Chooら,Br.Med.Bull.1990年,第46巻,p.423−441
【非特許文献17】Ebelingら,Lancet,1990年,第335巻,p.982−983
【非特許文献18】van der Poelら,Lancet,1990年,第335巻,p.558−560
【非特許文献19】van der Poelら,Lancet,1991年,第337巻,p.317−319
【非特許文献20】Uyttendaeleら,Vox Sang.,1994年,第66巻,p.122−129
【非特許文献21】Chienら、J.Clin.Microbiol.,1999年,第37巻,p.1393−1397
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【0008】
(発明の要旨)
本発明は、NS3プロテアーゼに対する変異された切断部位を有するMEFAがHCV感染を検出可能であることを見出したことに部分的に基づく。この改変HCV MEFAは免疫反応性であり、HCV NS3プロテアーゼによるタンパク分解性切断をより受けにくい。すなわち、このMEFAは、NS3タンパク質分解活性を有するHCVポリペプチド等の付加的なHCVポリペプチドと組み合わせて、イムノアッセイに使用することができる。本発明の1つの代表的な実施形態において、改変MEFAは、イムノアッセイ固体支持体上でNS3/4a高次構造エピトープと組み合わせて使用される。本発明のMEFAはイムノアッセイ成分の製造中に分解せず、従ってHCVアッセイ中で使用するための、よりすぐれた試薬を提供する。
【0009】
MEFAの使用は、基質の単位面積あたりのより多くのエピトープを可能にすることによって、マスキングの問題の減少、選択性向上、及び抗体検出感度の向上という利点を提供する。本明細書中で記載するアッセイを、HCVにおいて公知の6つの遺伝子型のいずれかにより引き起こされるHCV感染を検出するために使用することができる。
【0010】
したがって、1実施形態において、本発明は、改変HCV多エピトープ融合抗原(MEFA)であって、そのMEFAは、HCV NS3タンパク分解性切断部位を含むHCVヘリカーゼドメインからの少なくとも1つのエピトープ及びHCV NS3タンパク分解性切断部位を含むNS4領域からの少なくとも1つのエピトープを含み、そのヘリカーゼドメインエピトープ及びNS4エピトープ中に存在するHCV NS3のタンパク分解性切断部位は、変異のない対応するMEFAのタンパク分解性切断と比較してNS3によるMEFAのタンパク分解性切断が阻害されるように変異されており、さらに、その改変MEFAは、HCV感染個体からの生物学的サンプル中に存在する抗HCV抗体と特異的に反応するものである、改変MEFAに関する。
【0011】
特定の実施形態において、切断部位への変異は、HCV−1配列に対して番号付けされた1428位、1429位、1455位及び1456位に見られる天然のアミノ酸の置換等の、それぞれの部位における少なくとも1個のアミノ酸の置換を含む。他の実施形態において、改変MEFAは、HCV−1配列に対して番号付けされた1657位及び1658位に見られる、天然のアミノ酸のNS3/4a接合部における置換を含む。
【0012】
なおさらなる実施形態において、NS4領域からのエピトープは5−1−1であり、HCV−1配列に対して番号付けされた1711位及び1712位に見られる、天然のアミノ酸の置換を含む。特定の実施形態において、MEFAはHCV株1、2及び3それぞれからの3つの5−1−1エピトープを含み、ここで、HCV−1配列に対して番号付けされた、5−1−1エピトープのそれぞれにおける1711位及び1712位に見られる天然のアミノ酸のそれぞれは置換されている。
【0013】
さらなる実施形態において、MEFAは、HCV−1の配列に対して番号付けされた1428位、1429位、1455位、1456位、1657位及び1658位に見られる天然のアミノ酸の置換を有する、HCV−1に対して番号付けされた1193位〜1658位のアミノ酸に対応する連続するアミノ酸配列を含み、このMEFAは、HCV株1、2及び3それぞれからの3つの5−1−1エピトープをさらに含み、ここで、5−1−1エピトープのそれぞれは、HCV−1の配列に対して番号付けされた1711位及び1712位に見られる天然のアミノ酸のそれぞれに置換を有する、HCV−1に対して番号付けされた1689位〜1735位のアミノ酸に対応する連続するアミノ酸配列を含む。
【0014】
さらなる実施形態において、MEFAは、配列番号4に示される連続するアミノ酸配列に対して少なくとも80%の(例えば少なくとも90%、又は少なくとも98%)配列同一性を有するアミノ酸配列、あるいはそれに対して少なくとも80%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、但しここで、配列番号4の466位、467位、493位、494位、695位、696位、721位、722位、770位、771位、819位及び820位にあるアミノ酸は、MEFAのNS3タンパク分解性切断を阻害する変異を維持する。特定の実施形態において、MEFAは、配列番号4に示される連続するアミノ酸配列を含む。なおさらなる実施形態において、このMEFAは、配列番号4に示される連続するアミノ酸配列からなる。
【0015】
さらなる実施形態において、本発明は、上述の改変MEFAを含むイムノアッセイ固体支持体に関する。さらなる実施形態において、このイムノアッセイ固体支持体は、少なくとも1つのHCV NS3/4a高次構造エピトープをさらに含み、ここで、このNS3/4a高次構造エピトープは、HCV感染個体からの生物学的サンプル中に存在する抗HCV抗体と特異的に反応する。
【0016】
特定の実施形態において、このNS3/4a高次構造エピトープは、配列番号6に示される連続するアミノ酸配列に対して、少なくとも80%(例えば、少なくとも90%、又は少なくとも98%)の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。特定の実施形態において、このNS3/4a高次構造エピトープは、配列番号6に示される連続するアミノ酸配列を含む。他の実施形態において、このNS3/4a高次構造エピトープは、配列番号6に示される連続するアミノ酸配列からなる。
【0017】
さらなる実施形態において、本発明は、生物学的サンプル中のC型肝炎ウイルス(HCV)感染を検出する方法に関する。この方法は以下を包含する:
(a)上述のイムノアッセイ固体支持体を提供する工程;
(b)HCV抗体が生物学的サンプル中に存在する場合、その抗体をMEFAと、NS3/4a高次構造エピトープが存在する場合にはこのNS3/4a高次構造エピトープとに結合させて第1の免疫複合体を形成させる条件下で、その生物学的サンプルを固体支持体と結合させる工程;
(c)複合体形成条件下で、工程(b)からの固体支持体に、検出可能に標識された抗体を添加する工程であって、ここで、その標識化抗体が免疫複合体と反応性である工程;及び
(d)検出可能に標識された抗体と第1の免疫複合体との間で形成される第2の免疫複合体が存在する場合、この第2の免疫複合体を、生物学的サンプルにおけるHCV感染の指標として検出する工程。
【0018】
なおさらなる実施形態において、本発明は、上述のイムノアッセイ固体支持体を含む免疫診断検査キット及びその免疫診断検査を実施するための説明書に関する。
【0019】
さらなる実施形態において、本発明は、上述の改変MEFAにのコード配列を含むポリヌクレオチドと、このポリヌクレオチド及び制御エレメントを含む組換えベクターであって、この制御エレメントがそのコード配列が宿主細胞中で転写され翻訳され得るようにこのポリヌクレオチドに作動可能に連結されている組換えベクターとに関する。さらなる実施形態において、本発明は、この組換えベクターを用いて形質転換された宿主細胞に関する。なおさらなる実施形態において、本発明は以下を含む組換えMEFAの製造方法に関する:
(a)上述の宿主細胞の集団を準備する工程;及び
(b)組換えベクター中に存在するコード配列によってコードされている多エピトープ融合抗原が発現される条件下で、この細胞の集団を培養する工程。
【0020】
なおさらなる実施形態において、本発明は以下を包含するイムノアッセイ固体支持体の製造方法に関する:
(a)固体支持体を提供する工程;及び
(b)固体支持体に、上述の少なくとも1つの改変MEFAを結合させる工程。
【0021】
特定の実施形態において、本発明はさらに、HCV NS3/4a高次構造エピトープを上記固体支持体の別々の位置へと結合させることを含み、ここでこの高次構造エピトープは、HCV感染個体からの生物学的サンプル中に存在する抗HCV抗体と特異的に反応する。特定の実施形態において、このNS3/4a高次構造エピトープは、配列番号6に示される連続するアミノ酸配列に対して、少なくとも80%(例えば、少なくとも90%、又は少なくとも98%)の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。特定の実施形態において、このNS3/4a高次構造エピトープは、配列番号6に示される連続するアミノ酸配列を含む。他の実施形態において、このNS3/4a高次構造エピトープは、配列番号6に示される連続するアミノ酸配列からなる。
【0022】
これらの及びその他の本発明の態様は、以下の詳細な説明及び添付の図面を参照して明らかになるであろう。さらに、特定の手順又は組成をより詳細に記載する種々の参照文献が本明細書中に示され、それらの全体は本明細書中で参考として援用される。
【0023】
(発明の詳細な説明)
本発明の実施は、特に明記されない限り、当該分野の当業者の技術の範囲内の従来の化学的方法、生物化学的方法、組換えDNA技術による方法および免疫学的方法を使用する。このような技術は、文献中に完全に説明されている。例えば、Fundamental Virology,第2版,第I巻および第II巻(B.N.FieldsおよびD.M.Knipe編);Handbook of Experimental Immunology,第I巻〜第IV巻(D.M.WeirおよびC.C.Blackwell編,Blackwell Scientific Publications);T.E.Creighton,Proteins:Structures and Molecular Properties(W.H.Freeman and Company,1993);A.L.Lehninger,Biochemistry(Worth Publishers,Inc.,最新版);Sambrookら、Molecular Cloning:A Laboratory Manual(第2版、1989年);Methods In Enzymology(S.ColowickおよびN.Kaplan編、Academic Press,Inc.)を参照のこと。
【0024】
本明細書中に引用される全ての刊行物、特許および特許出願は、前出および後出を問わず、本明細書によってその全体が参考として援用される。
【0025】
本明細書および添付の特許請求の範囲で使用される、単数形「a」、「an」、および「the」には、文脈中で明らかに別のものを示さない限り、複数形が含まれることに留意しなければならない。したがって、例えば、「抗原(an antigen)」という言及には、2種以上のこのような抗原の混合物が含まれる、などである。
【0026】
以下のアミノ酸の略語は、本明細書を通して使用される:
アラニン:Ala(A) アルギニン:Arg(R)
アスパラギン:Asn(N) アスパラギン酸:Asp(D)
システイン:Cys(C) グルタミン:Gln(Q)
グルタミン酸:Glu(E) グリシン:Gly(G)
ヒスチジン:His(H) イソロイシン:Ile(I)
ロイシン:Leu(L) リジン:Lys(K)
メチオニン:Met(M) フェニルアラニン:Phe(F)
プロリン:Pro(P) セリン:Ser(S)
トレオニン:Thr(T) トリプトファン:Trp(W)
チロシン:Tyr(Y) バリン:Val(V)。
【0027】
(I.定義)
本発明の記載において、以下の用語が使用され、そして以下で示すように定義されることが意図される。
【0028】
用語「含む(comprising)」は、「含む(including)」および「構成する(consisting)」を包含し、例えば、Xを「含む(comprising)」組成物は、Xのみから構成されてもよく、または何かをさらに含んでもよい(例えば、X+Y)。
【0029】
用語「実質的に」は、「完全に」を排除するものではなく、例えば、Yを「実質的に含まない」組成物は、Yを全く含まなくてもよい。必要である場合、語「実質的に」は、本発明の定義から割愛され得る。
【0030】
用語「ポリペプチド」および「タンパク質」とは、アミノ酸残基のポリマーをいい、産物の長さの下限に制限されない。したがって、ペプチド、オリゴペプチド、ダイマー、および多量体などは、この定義の範囲内に含まれる。全長タンパク質およびそのフラグメントの両方は、この定義に含まれる。この用語はまた、ポリペプチドの発現後改変(例えば、グリコシル化、アセチル化、およびリン酸化など)を含む。さらに、本発明の目的のために、「ポリペプチド」とは、タンパク質が所望の活性を保持する限り、天然の配列の改変(例えば、欠失、付加、および置換(一般に、本質的に保存的である))を含むタンパク質をいう。これらの改変は部位特異的変異誘発による意図的なものであっても、タンパク質を産生する宿主の変異またはPCR増幅に起因するエラーなどによる偶発的なものであってもよい。
【0031】
HCVポリペプチドは、HCVポリタンパク質に由来する、上に定義されるようなポリペプチドである。このポリペプチドは、物理的にHCVに由来することを必要とせず、合成的または組換え的に産生され得る。さらに、このポリペプチドは、種々のHCV株および単離物(例えば、HCVの株1、株2、株3、株4、株5もしくは株6に由来する単離物のいずれかであるが、これらに限定されない)のいずれかに由来し得る。これらの株の間の多くの保存領域および可変領域が公知であり、そして一般的に、これらの領域に由来するエピトープのアミノ酸配列は、2つの配列が並列された場合に、高度の配列相同性(例えば、30%を超える(好ましくは、40%を超える)アミノ酸配列相同性)を有する。従って、例えば、用語「NS3/4a」ポリペプチドとは、種々のHCV株のいずれかに由来する天然のNS3/4a、ならびに以下でさらに定義されるようなNS3/4aアナログ、NS3/4aムテインおよびNS3/4a免疫原性フラグメントをいう。これらの株の多くの完全な遺伝子型は、公知である。例えば、米国特許第6,150,087号およびGenBank登録番号AJ238800および同AJ238799を参照されたい。
【0032】
HCVポリタンパク質に「由来する」ポリペプチドは、参照HCVポリタンパク質の1つ以上の領域もしくは領域の部分の配列を含むポリペプチドを意図する。代表的には、ポリペプチドは、エピトープを含む領域もしくは領域の部分からなり、一般に、以下で規定する参照ポリペプチドに実質的に相同なアミノ酸配列を有する。従って、用語「由来する」は、分子の元来の供給源を同定するために使用されるが、この分子が作製される方法(例えば、化学合成による方法もしくは組換え手段による方法であり得る)を限定することを意味しない。
【0033】
用語「アナログ」および「ムテイン」とは、所望の活性(例えば、本明細書中で記載されるアッセイにおける免疫反応性)を保持する、参照分子の生物学的に活性な誘導体、またはこのような誘導体のフラグメントをいう。一般的に、用語「アナログ」とは、天然の分子に対する1個以上のアミノ酸の付加、置換(一般的に本質的に保存的であるか、または改変MEFAの場合においては、NS3タンパク分解性切断部位において一般的に本質的に非保存的である)および/または欠失を(これらの改変が免疫原性活性を破壊しない限り)含む、天然のポリペプチド配列および構造を有する化合物をいう。用語「ムテイン」とは、1種以上のアミノ酸様分子(アミノ分子および/またはイミノ分子のみを含む化合物、1種以上のアミノ酸のアナログ(例えば、非天然アミノ酸などが挙げられる)を含むポリペプチド、置換された連結を有するポリペプチド、ならびに当該分野で公知の他の改変(環状分子および分枝状分子などの、天然に存在する分子および天然に存在しない(例えば合成の)分子の両方)が挙げられるが、これらに限定されない)を有するポリペプチドをいう。この用語はまた、1種以上のN置換グリシン残基(「ペプトイド」)および他の合成アミノ酸もしくは合成ペプチドを含む分子をも含む。(例えば、ペプトイドの記載について、米国特許第5,831,005号;同第5,877,278号;および同第5,977,301号;Nguyenら,Chem Biol.(2000)7:463−473;ならびにSimonら,Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1992)89:9367−9371を参照されたい。)好ましくは、アナログまたはムテインは、少なくとも天然の分子と同一の免疫活性を有する。ポリペプチドアナログおよびムテインを作製するための方法は、当該分野で公知であり、そして以下にさらに記載される。
【0034】
上記で説明される通り、アナログは、一般的に、天然において保存的な置換(すなわち、その側鎖において関連するアミノ酸のファミリー内で起こる置換)を含む。具体的には、アミノ酸は、一般的に、以下の4つのファミリーに分類される:(1)酸性−−アスパラギン酸およびグルタミン酸;(2)塩基性−−リジン、アルギニン、ヒスチジン;(3)非極性−−アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン;および(4)非荷電極性−−グリシン、アスパラギン、グルタミン、システイン、セリン、トレオニン、チロシン。フェニルアラニン、トリプトファン、チロシンは、ときとして、芳香族アミノ酸として分類される。例えば、ロイシンのイソロイシンまたはバリンとの単独置換、アスパラギン酸のグルタミン酸との単独置換、トレオニンのセリンとの単独置換、または同様の、構造的に関連するアミノ酸によるアミノ酸の保存的置換は、生物学的活性に大きな影響を与えないことが合理的に予測可能である。例えば、目的のポリペプチドは、この分子の所望の機能がインタクトなままである限り、約5〜10個までの保存的アミノ酸置換もしくは非保存的アミノ酸置換、またはさらに約15〜25個までの保存的アミノ酸置換もしくは非保存的アミノ酸置換、または5〜25の間の任意の整数の保存的アミノ酸置換もしくは非保存的アミノ酸置換を含み得る。当業者は、当該分野で周知のHopp/WoodsプロットおよびKyte−Doolittleプロットを参照することにより、目的の分子の変化を許容し得る領域を容易に決定し得る。
【0035】
用語「多エピトープ融合抗原」もしくは「MEFA」は、本明細書中で使用される場合、多数のウイルス抗原が、天然に存在しない、1つの連続したアミノ酸の鎖として編成されているポリペプチドを意図する。本明細書中で使用される場合、MEFAは、HCV抗原に限定される。HCV抗原は、ペプチド結合によって互いに直接接続してもよく、または介在するアミノ酸配列によって分離されてもよい。融合抗原はまた、HCVポリタンパク質に対して外因性である配列をも含み得る。さらに、存在するHCV配列は、多数のHCVの遺伝子型および/または多数のHCVの単離物に由来し得る。本発明のイムノアッセイにおける使用のための改変され得る特定のMEFAの例は、例えば、国際出願公開第97/44469号、米国特許第6,514,731号、同第6,428,792号および同第6,632,601号(これらの全ては本明細書中で参考として援用される)において詳述されており、さらに以下で説明される。
【0036】
「改変MEFA」は、1つ以上のNS3タンパク分解性切断部位において、天然に存在するHCV抗原配列に対する(MEFA上のNS3のプロテアーゼ活性が阻害されるような)変異を有する、上で定義したようなMEFAを意味する。改変MEFAは、したがって、親の非改変MEFAと比較して、NS3プロテアーゼによるタンパク分解性切断に対して感受性がより低い。改変MEFAは、ヘリカーゼドメインに由来する少なくとも1種の改変エピトープ(好ましくはNS4a/NS4bおよび/またはNS5aに由来するエピトープ)を含む。「改変エピトープ」により、天然に存在するアミノ酸配列と比較して、エピトープ内の1つ以上のNS3タンパク分解性切断部位が変異され、それによってNS3プロテアーゼによるMEFAのタンパク分解性切断が阻害されることを意味する。改変MEFAに存在するこの変異は、天然の分子と比較して1つ以上のアミノ酸の付加、置換(一般的に天然において非保存的である)および/または欠失を含み得、ここで、NS3タンパク分解性切断に対する感受性は、低下させられるかまたは削除される。目的のMEFAのタンパク分解性切断を測定する方法は、当該分野で公知であり、これは、目的のMEFAをNS3タンパク分解性活性を有することが既知であるタンパク質(例えば以下でさらに議論されそして図13A〜図13Dに示されるNS3/4a高次構造抗原)と共にインキュベートする工程、およびこのMEFAを切断についてモニタリングする工程を包含する。このアッセイは、実施例において詳細に記載される。
【0037】
「フラグメント」は、インタクトな全長ポリペプチド配列および構造の、一部のみからなるポリペプチドを意図する。フラグメントは、天然のポリペプチドのC末端の欠失、および/またはN末端の欠失を含み得る。特定のHCVタンパク質の「免疫原性フラグメント」は、一般的に、エピトープを規定する全長分子の少なくとも約5〜10個の連続するアミノ酸残基、好ましくは全長分子の少なくとも約15〜25個の連続するアミノ酸残基、最も好ましくは全長分子の少なくとも約20〜50個またはそれより多くの連続したアミノ酸残基、あるいは5個のアミノ酸と全長配列との間の任意の整数の連続したアミノ酸残基を含むが、但しここで、目的のフラグメントは、本明細書中に記載されるアッセイにおいて免疫反応性を保持することが条件である。例えば、好ましい免疫原性フラグメントとしては、以下が挙げられるが、これらに限定されない:例えば、ポリタンパク質の10〜45、10〜53、67〜88および120〜130のアミノ酸を含むHCVコアのフラグメント、エピトープ5−1−1(ウイルスゲノムのNS4a/NS4b領域内)、ならびに図1で示されるポリタンパク質の任意の領域(例えば、HCVポリタンパク質のE1領域、E2領域、NS3領域(例えばNS3領域由来のc33cポリペプチド)、NS4領域(例えばNS3/NS4領域由来のc100ポリペプチド)、NS3/4a領域およびNS5領域であるが、これらに限定されない)に由来する規定のエピトープ、ならびにHCVポリタンパク質から同定された任意の種々の他のエピトープ。例えば、Chienら,Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1992)89:10011−10015;Chienら,J.Gastroent.Hepatol.(1993)8:S33−39;Chienら,国際出願公開第93/00365号;Chien,D.Y.,国際出願公開第94/01778号;米国特許第6,150,087号および同第6,121,020号(これら全ては、本明細書中でその全体が参考として援用される)を参照されたい。
【0038】
本明細書中で使用される場合、用語「エピトープ」とは、少なくとも約3〜5個、好ましくは約5〜10個または15個、および約1,000個以下(またはその間の任意の整数)のアミノ酸のポリペプチド配列であって、それ自体の配列またはより長い配列の一部を規定し、このような配列に対する応答において産生される抗体に結合する配列をいう。フラグメントの長さの決定的な上限は存在せず、このフラグメントは、タンパク質配列のほぼ全長を含んでもよく、HCVポリタンパク質由来の2種以上のエピトープを含む融合タンパク質ですら含んでもよい。本発明で使用するためのエピトープは、由来する親タンパク質の一部の正確な配列を有するポリペプチドに限定されない。実際、ウイルスゲノムは、常に不安定な状態であり、単離物の間で比較的高い可変性を示す、いくつかの可変ドメインを含む。したがって、用語「エピトープ」は、天然の配列と同一の配列、ならびに欠失、付加、および置換(一般的に、本質的に保存的である)のような天然の配列に対する改変を包含する。
【0039】
エピトープを含む所与のポリペプチドの領域は、当該分野で周知の多くのエピトープマッピング技術を使用して同定することができる。例えば、Epitope Mapping Protocols in Methods in Molecular Biology、第66巻(Glenn E.Morris,編、1996)、Humana Press、Totowa、New Jerseyを参照のこと。例えば、線状エピトープは、例えば、固体支持体上で多数のペプチド(タンパク質分子の一部に対応するペプチド)を同時に合成し、そしてこれらのペプチドが依然として支持体に結合している間に、これらのペプチドと抗体とを反応させることによって決定され得る。このような技術は当該分野で公知であり、そして例えば、米国特許第4,708,871号;Geysenら、(1984)、Proc.Natl.Acad.Sci.USA 81:3998−4002;Geysenら、(1985)、Proc.Natl.Acad.Sci.USA 82:178−182;Geysenら、(1986)、Molec.Immunol.23:709−715(これら全ては、本明細書中でその全体が参考として援用される)に記載される。このような技術を使用して、多くのHCVのエピトープが、同定されている。例えば、Chienら、Viral Hepatitis and Liver Disease(1994)pp.320−324、および以下をさらに参照されたい。同様に、高次構造エピトープは、例えば、X線結晶学および二次元核磁気共鳴によるようなアミノ酸の空間的高次構造の決定によって容易に同定される。例えば、Epitope Mapping Protocols、前出を参照のこと。タンパク質の抗原性領域はまた、標準的な抗原性プロットおよびハイドロパシープロット(例えば、Oxford Molecular Groupから利用可能なOmigaバージョン1.0ソフトウェアプログラムを使用して計算したもの)を使用して同定され得る。このコンピュータプログラムは、抗原性プロフィールを決定するためにHopp/Woods法(Hoppら、Proc.Natl.Acad.Sci USA(1981)、78:3824−3828)を使用し、そしてハイドロパシープロットを決定するためにKyte−Doolittle技術(Kyteら、J.Mol.Biol.(1982)、157:105−132)を使用する。
【0040】
本明細書中で使用される場合、用語「高次構造エピトープ」とは、全長天然タンパク質内のエピトープをコードするアミノ酸配列に対して天然のままである構造的特徴を有する、全長タンパク質の一部分、またはこれらのアナログもしくはムテインをいう。天然の構造的特徴としては、グリコシル化および三次元構造が挙げられるが、これらに限定されない。エピトープ規定配列の長さは、これらエピトープが抗原の三次元形状(例えば、折りたたみ)によって形成されると考えられるので、広範な変動に供され得る。従って、エピトープを規定するアミノ酸は、比較的少ない数であり得るが、分子の長さに沿って(またはダイマーの場合などは、異なる分子上にすら)広範に散在し、折りたたみを介して正確なエピトープ高次構造となる。エピトープを規定する残基の間の抗原の部分は、エピトープの高次構造の構成に重要ではない場合がある。例えば、これらの介在性配列の欠失もしくは置換は、エピトープの高次構造に重要な配列(例えば、ジスルフィド結合に関与するシステイン、グリコシル化部位など)が維持されている場合、高次構造エピトープに影響を及ぼさない場合がある。
【0041】
例えばNS3/4a領域内に存在する、高次構造エピトープは、上で議論している方法を使用して容易に同定される。さらに、所与のポリペプチドにおける高次構造エピトープが存在するかもしくは存在しないかは、抗体(この高次構造エピトープに対するポリクローナル血清もしくはモノクローナル抗体)による目的の抗原のスクリーニング、ならびにその反応性をこの抗原の変性型(存在する場合でも、線状エピトープしか有さない)に対する反応性と比較する工程を介して、容易に決定され得る。ポリクローナル抗体を使用するこのようなスクリーニングにおいて、ポリクローナル血清を最初に変性抗原で吸収させ、そして目的の抗原に対する抗体を有するか否かを調べることは、有利であり得る。さらに、NS3/4aの場合、天然の高次構造を保存する分子は、また、プロテアーゼ酵素活性をも有し、必要に応じてヘリカーゼ酵素活性をも有する。このような活性は、以下にさらに記載されるような酵素アッセイを使用して検出され得る。
【0042】
好ましくは、高次構造エピトープは、組換えによって産生され、そしてエピトープの所望の構造特徴を保存する条件下で(例えば、エピトープの変性を伴わずに)エピトープを抽出可能である細胞において発現される。そのような細胞としては、細菌細胞、酵母細胞、昆虫細胞および哺乳動物細胞が挙げられる。HCVポリタンパク質に由来する組換え高次構造エピトープの発現および単離は、例えば、国際出願公開第96/04301号、同第94/01778号、同第95/33053号、同第92/08734号(これらの出願は、本明細書中でその全体が参考として援用される)に記載される。あるいは、抗原を発現し、そしてこのタンパク質を回収後さらに復元することが可能である。また、化学的合成が、「天然の」抗原の高次構造エピトープと交差反応する高次構造抗原ミミトープ(mimitope)を提供し得ることもまた、理解される。
【0043】
「抗体」は、抗原に存在する目的のエピトープに特異的に結合する分子を意図する。「特異的に結合する」は、抗体が、エピトープを認識し、そして「鍵と鍵穴(lock and key)」型の相互作用においてエピトープと相互作用し、抗原と抗体との間に複合体を形成することを意味する。これは、抗体と例えば試験基質との間に生じ得る非特異的結合とは対照的である。従って、例えば、HCVコア抗体は、HCVコアタンパク質に特異的に結合する分子であり、HCV NS3/4a抗体は、HCV NS3/4aタンパク質のエピトープに特異的に結合する分子である、などである。同様に、目的の抗原は、抗体がこの抗原に存在するエピトープに「特異的に結合する」場合、この抗体と「特異的に反応する」。用語「抗体」は、本明細書中で使用される場合、ポリクローナル調製物およびモノクローナル調製物の両方から得られる抗体、ならびに以下を包含する:ハイブリッド(キメラ)抗体分子(例えば、Winterら(1991)Nature 349:293−299;および米国特許第4,816,567号を参照);F(ab’)2およびF(ab)フラグメント;Fv分子(非共有結合性ヘテロダイマー、例えば、Inbarら(1972)Proc Natl Acad Sci USA 69:2659−2662;およびEhrlichら(1980)Biochem 19:4091−4096を参照);単鎖Fv分子(sFv)(例えば、Hustonら(1988)Proc Natl Acad Sci USA 85:5879−5883を参照);二量体抗体フラグメント構築物および三量体抗体フラグメント構築物;ミニボディ(minibody)(例えば、Packら(1992)Biochem 31:1579−1584;Cumberら(1992)J Immunology 149B:120−126を参照);ヒト化抗体分子(例えば、Riechmannら(1988)Nature 332:323−327;Verhoeyanら(1988)Science 239:1534−1536;および英国特許出願公開第2,276,169号(1994年9月21日公開)を参照);ならびに、このような分子から得られた、親抗体分子の免疫学的結合特性を保持している任意の機能的フラグメント。
【0044】
本明細書中で使用される場合、用語「モノクローナル抗体」は、均一な抗体集団を有する抗体組成物をいう。この用語は、抗体の種もしくは供給源に関して限定されず、作製された様式によっても限定されないことが意図される。従って、この用語は、マウスハイブリドーマから得られた抗体、ならびにマウスハイブリドーマではなくヒトハイブリドーマを用いて得られたヒトモノクローナル抗体を、包含する。例えば、Coteら,Monclonal Antibodies and Cancer Therapy,Alan R.Liss,1985,p.77を参照されたい。
【0045】
ポリペプチドに関する場合、「単離された」により、指定の分子が、この分子が天然において見出される生物全体から分離されて独立しているか、または他の同種の生物学的高分子の実質的に非存在下で存在していることが、意味される。ポリヌクレオチドに関する用語「単離された」は、通常天然で伴っている配列全体または一部を有さない核酸分子であるか、または天然に存在する通りの配列であるがそれと結合する異種配列を有する配列であるか、あるいは染色体から分離された分子である。
【0046】
「等価な抗原決定基」は、HCVの株1、株2、株3のような異なるHCVの亜種または株に由来する抗原決定基を意味する。より具体的には、エピトープは、公知であり(例えば、HCV−1ポリタンパク質配列に対して番号付けられたおよそ1694〜1735位に存在する「5−1−1」、図1を参照のこと)、そしてこのようなエピトープは、株1と、株2と、株3との間で変動する。従って、3つの異なる株に由来するエピトープ5−1−1は、等価な抗原決定基であり、従って、その配列が同一でなくとも、「コピー」である。一般に、等価な抗原決定基のアミノ酸配列は、2つの配列が並列される場合、高度な(例えば、30%より大きく、好ましくは40%より大きい)配列相同性を有する。
【0047】
「相同性」とは、2つのポリヌクレオチド部分または2つのポリペプチド部分の間の類似性の%をいう。2つのDNA配列または2つのポリペプチド配列は、定義した分子の長さにわたって、これらの配列が少なくとも約50%、好ましくは少なくとも約75%、より好ましくは少なくとも約80〜85%、好ましくは少なくとも約90%、および最も好ましくは少なくとも約95%〜98%の配列類似性を示す場合、互いに「実質的に相同」である。本明細書中で使用される場合、実質的に相同とはまた、特定のDNA配列またはポリペプチド配列に対する完全な同一性を示す配列をもいう。
【0048】
一般的に、「同一性」とは、それぞれ、2つのポリヌクレオチド配列または2つのポリペプチド配列の正確なヌクレオチド対ヌクレオチドまたはアミノ酸対アミノ酸の対応をいう。%同一性は、配列を並列することによって2つの分子(参照配列と参照配列に対する%同一性が未知である配列と)の間の配列情報を直接比較する工程、並列された2つの配列間の正確な適合の数を計数する工程、参照配列の長さで除算する工程、およびこの結果に100を掛ける工程によって決定され得る。
【0049】
容易に利用可能なコンピュータープログラム(例えば、ペプチド分析用のSmith and Watermanの局所的相同性アルゴリズム(Advances in Appl.Math.2:482−489,1981)に適合させたALIGN(Dayhoff,M.O.,Atlas of Protein Sequence and Structure,M.O.Dayhoff編、第5補遺,3:353−358,National biomedical Research Foundation、Washington、DC))が、相同性および同一性の分析を補助するために使用され得る。ヌクレオチド配列の相同性を決定するためのプログラムは、Wisconsin Sequence Analysis Package,Version 8(Genetics Computer Group,Madison,WIから利用可能)で利用可能である(例えば、やはりSmith and Watermanアルゴリズムに依存するBESTFITプログラム、FASTAプログラム、およびGAPプログラム)。これらのプログラムは、製造者によって推奨され、かつ上記で言及したWisconsin Sequence Analysis Packageに記載される初期設定のパラメータを使用して容易に利用される。例えば、参照配列に対する特定のヌクレオチド配列の%相同性は、初期設定のスコアリング表およびヌクレオチド上の6つの位置でのギャップペナルティを使用したSmith and Watermanの相同性アルゴリズムを使用して決定され得る。
【0050】
本発明に関連して%相同性を確立する別の方法は、エディンバラ大学が著作権を有し、John F.CollinsおよびShane S.Sturrokによって開発され、そしてIntelliGenetics,Inc.(Mountain View,CA)から販売されているMPSRCHプログラムパッケージを使用することである。このパッケージ一式から、スコアリング表のために初期設定のパラメータ(例えば、12のギャップオープンペナルティ、1のギャップ伸長ペナルティ、および6のギャップ)を使用するSmith−Watermanアルゴリズムが、使用され得る。作成されたデータからの「適合」値は、「配列相同性」を反映する。配列間の同一性または類似性の%を計算するための他の適切なプログラムは、一般的に、当該分野で公知であり、例えば、別のアラインメントプログラムは、初期設定のパラメータを使用したBLASTである。例えば、BLASTNおよびBLASTPは、以下の初期設定のパラメータを使用して使用され得る:遺伝コード=標準;フィルタ=なし;鎖=両方;カットオフ=60;期待値=10;行列=BLOSUM62;記載=50配列;分類=ハイスコア;データベース=非重複、GenBank+EMBL+DDBJ+PDB+GenBank CDS翻訳物+Swiss protein+Spupdate+PIR。これらのプログラムの詳細は、容易に利用できる。
【0051】
あるいは、相同性は、相同領域間で安定な二重鎖を形成する条件下でのポリヌクレオチドのハイブリダイゼーション、その後の一本鎖特異的ヌクレアーゼによる消化、および消化フラグメントのサイズ決定によって決定され得る。実質的に相同なDNA配列は、例えば、特定の系について規定したストリンジェントな条件下でのサザンハイブリダイゼーション実験で同定され得る。適切なハイブリダイゼーション条件の定義は、当業者の範囲内である。例えば、Sambrookら、前出;DNA Cloning、前出;Nucleic Acid Hybridization、前出を参照のこと。
【0052】
「コード配列」または選択されたポリペプチドを「コードする」配列は、適切な調節配列の制御下においた場合に、インビトロまたはインビボで転写(DNAの場合)され、そしてポリペプチドに翻訳(mRNAの場合)される核酸分子である。コード配列の境界は、5’(アミノ)末端の開始コドンおよび3’(カルボキシ)末端の翻訳終止コドンによって決定される。転写終結配列は、コード配列に対して3’側に配置され得る。
【0053】
「作動可能に連結された」とは、そのように記載される構成要素がその所望の機能を発揮するように構成されるエレメントの配置をいう。したがって、コード配列に作動可能に連結された所与のプロモーターは、適切な転写因子などが存在する場合に、コード配列の発現を達成し得る。プロモーターは、その発現を指向するように機能する限り、コード配列に隣接する必要はない。したがって、例えば、翻訳されないが転写される介在配列は、転写されたイントロンがそうであるように、プロモーター配列とコード配列との間に存在し得るので、プロモーター配列は、なおコード配列に「作動可能に連結された」と見なされ得る。
【0054】
核酸分子を記載するために本明細書中で使用される場合、「組換え体」は、ゲノム起源、cDNA起源、ウイルス起源、半合成起源、または合成起源のポリヌクレオチドを意味し、このポリヌクレオチドは、その起源または操作ゆえに、天然において結合するポリヌクレオチドの全体または一部と結合しない。タンパク質またはポリペプチドに関して使用される場合、用語「組換え体」は、組換えポリヌクレオチドの発現によって産生されたポリペプチドを意味する。一般的に、目的の遺伝子は、クローニングされ、次いで、以下でさらに記載されるように、形質転換された生物中で発現される。宿主生物は、発現条件下で外来遺伝子を発現して、タンパク質を産生する。
【0055】
「制御エレメント」とは、それが連結されるコード配列の発現を補助するポリヌクレオチド配列をいう。この用語は、プロモーター、転写終結配列、上流調節ドメイン、ポリアデニル化シグナル、非翻訳領域(5’−UTRおよび3’−UTR、ならびに、適切な場合、リーダー配列およびエンハンサーが含まれる)を包含し、これらは、宿主細胞におけるコード配列の転写および翻訳を共同して提供する。
【0056】
本明細書中で使用される場合、「プロモーター」は、宿主細胞中でRNAポリメラーゼに結合し、そしてそこに作動可能に連結された下流(3’方向)コード配列の転写を開始し得るDNA調節領域である。本発明の目的のために、プロモーター配列は、バックグラウンドを超える検出可能なレベルで目的の遺伝子の転写を開始するために必要な、最小数の塩基またはエレメントを含む。プロモーター配列内に、転写開始部位およびRNAポリメラーゼの結合を担うタンパク質結合ドメイン(共通配列)が存在する。真核生物プロモーターは、しばしば「TATA」ボックスおよび「CAT」ボックスを含むが、常にこれらを含むわけではない。
【0057】
RNAポリメラーゼがプロモーター配列に結合し、そしてコード配列をmRNAに転写する場合、制御配列は、細胞中のコード配列の「転写を指示し」、その後、このmRNAは、コード配列によってコードされたポリペプチドに翻訳される。
【0058】
「発現カセット」または「発現構築物」とは、目的の配列または遺伝子の発現を指向し得る集合(assembly)をいう。発現カセットは、上に記載されるような制御エレメント(例えば、目的の配列または遺伝子に(これらの転写を指示するように)作動可能に連結されたプロモーター)を含み、多くの場合、またポリアデニル化配列をも含む。本発明の特定の実施形態では、本明細書中に記載される発現カセットは、プラスミド構築物内に含まれ得る。発現カセットの構成要素に加えて、プラスミド構築物はまた、1つ以上の選択可能なマーカー、プラスミド構築物を一本鎖DNAとして存在させるシグナル(例えば、M13複製起点)、少なくとも1つのマルチクローニングサイト、および「哺乳動物」の複製起点(例えば、SV40またはアデノウイルスの複製起点)を含み得る。
【0059】
本明細書中で使用される場合、「形質転換」とは、宿主細胞への外因性ポリヌクレオチドの挿入をいい、挿入のために使用した方法(例えば、直接取り込み、トランスフェクション、および感染などによる形質転換)を問わない。特定のトランスフェクション法については、以下をさらに参照のこと。外因性ポリヌクレオチドは、非組み込みベクター(例えば、エピソーム)として維持され得るか、または宿主ゲノム内に組み込まれ得る。
【0060】
「宿主細胞」は、外因性DNA配列によって、形質転換されている細胞であるか、または形質転換可能な細胞である。
【0061】
本明細書中で使用される場合、「生物学的サンプル」は、被験体から単離された組織もしくは液体のサンプルをいい、通常、被験体によって産生された抗体を含む。このような抗体を含む代表的なサンプルは、当該分野で公知であり、血液、血漿、血清、糞便、尿、骨髄、胆汁、脊髄液、リンパ液、皮膚のサンプル、皮膚、気道、腸および生殖器官の分泌物、涙、唾液、乳汁、血球、器官、生検ならびにまたインビトロ細胞培養構成物(培養培地中の細胞および組織の増殖から得られた馴化培地(例えば組換え細胞および細胞構成要素)が挙げられるが、これらに限定されない)のサンプルが挙げられるが、これらに限定されない。
【0062】
「固体支持体」は、本発明のイムノアッセイにおいて使用されるHCVポリペプチドが、共有結合的に結合するか、または非共有結合的手段(例えば、疎水性吸着)によって結合する、固体マトリックスを意図する。
【0063】
「免疫学的に反応性である」または「免疫反応性である」は、目的の抗原が、HCV感染個体由来の生物学的サンプル中に存在する抗HCV抗体に特異的に反応することを意味する。
【0064】
「免疫原性」とは、目的の抗原が、個体に投与された場合に免疫応答を誘発することを意図する。
【0065】
「免疫複合体」とは、抗体が抗原上のエピトープに結合する場合に形成される結合物(combination)を意図する。
【0066】
本明細書中で使用される場合、用語「標識」および「検出可能な標識」とは、検出の可能な分子をいい、放射性同位体、蛍光剤(fluorescer)、化学発光剤(chemiluminescer)、酵素、酵素基質、酵素補因子、酵素インヒビター、発色団、蛍光ナノ粒子、色素、金属イオン、金属ゾル、リガンド(例えば、ビオチン、アビジン、ストレプトアビジン、もしくはハプテン)などが挙げられるが、これらに限定されない。用語「蛍光剤」とは、検出可能な範囲の蛍光を示すことの可能な基質もしくはその部分をいう。本発明の下で使用され得る標識の特定の例としては、西洋ワサビペルオキシダーゼ(HRP)、フルオレセイン、FITC、ローダミン、ダンシル、ウンベリフェロン、ジメチルアクリジニウムエステル(DMAE)、テキサスレッド、ルミノール、NADPHおよびα−β−ガラクトシダーゼが挙げられるが、これらに限定されない。
【発明を実施するための最良の形態】
【0067】
(II.発明を実施する形態)
本発明を詳細に説明する前に、本発明は特定の処方物または処理パラメータに制限されず、当然に変更可能であることが理解されるべきである。本明細書中で使用される専門用語は、本発明の特定の実施形態を記載することのみを目的とし、本発明を制限することを意図しないことがまた、理解されるべきである。
【0068】
本明細書中に記載のものに類似するか、またはそれらと等価な多数の組成物および方法が、本発明の実施に使用され得るが、好ましい材料および方法は、本明細書中に記載される。
【0069】
上述のように、本発明は、HCV NS3プロテアーゼによる改変MEFAのタンパク分解性切断が阻害されるような改変NS3プロテアーゼ切断部位を有する新規なHCV MEFAの発見に基づく。かかる改変MEFAは、初期HCV感染を正確に検出するための診断方法において特に有用である。この改変MEFAは、例えば、HCVの主要線状エピトープであるコア、E1、E2、NS3、NS4、5−1−1、c100−3及びNS5配列のような多数の免疫優勢なエピトープのような、同一又は異なるHCV遺伝子型及び単離物のいずれかに由来する種々のHCVポリペプチドを含む。
【0070】
改変MEFAはイムノアッセイにおいて単独で、又はその他のHCV抗原、好ましくは、HCVポリタンパク質のNS3/4a領域に由来する高度に免疫原性の高次構造エピトープと組み合わせて用いられ得る。このイムノアッセイはHCVセロコンバージョンの初期段階の間におけるHCV感染を検出するために用いられ得、それにより検出の正確性を向上させ、誤った結果の発生率を低減させる。この方法は、限定されるものではないが、例えば、HCV抗原を結合させる固体支持体を用いるアッセイ様式のような、以下に記載するいくつかのアッセイ様式のいずれかを用いて、単回のアッセイで簡便に実践することができる。
【0071】
本発明のさらなる理解のために、改変MEFA、HCV高次構造NS3/4aエピトープ、並びに、これらのタンパク質の製造及びこれらのタンパク質の使用方法に関して、より詳細な考察が以下に提供される。
【0072】
(HCV MEFA)
HCV株のゲノムは、ポリタンパク質へと転写される約9,000〜12,000ヌクレオチドの単一のオープンリーディングフレームを含む。図1及び表1に示すように、HCVポリタンパク質は切断の際に少なくとも10の異なる産物を以下の順で生じる:NH2−コア−E1−E2−p7−NS2−NS3−NS4a−NS4b−NS5a−NS5b−COOH。このコアポリペプチドはHCV−1に対して番号付けされた1位〜191位に生じる(HCV−1ゲノムに関して、Chooら(1991)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 88:2451−2455参照)。このポリペプチドはさらに処理されておよそ1〜173のアミノ酸を伴うHCVポリペプチドを生産する。エンベロープポリペプチドであるE1及びE2は、およそ192位〜383位及びおよそ384位〜746位にそれぞれ生じる。P7ドメインはおよそ747位〜809位に見出される。NS2はタンパク質分解活性を有する内在性膜タンパク質であり、ポリタンパク質のおよそ810位〜1026位に見出される。NS2は、NS3(およそ1027位〜1657位に見出される)と組み合わさって、NS2−NS3のsissle結合を切断し、これは次に、NS3のN末端を作り出し、またセリンプロテアーゼ活性及びRNAヘリカーゼ活性の両方を含む大きなポリタンパク質を放出する。およそ1027位〜1207位に見出されるNS3プロテアーゼは、残りのポリタンパク質を処理するために役割を果たす。ヘリカーゼ活性はおよそ1193位〜1657位(「ヘリカーゼドメイン」)に見出される。NS3はNS3補因子(NS4a、およそ1658位〜1711位に見出される)、2つのタンパク質(およそ1712位〜1972位に見出されるNS4b、及びおよそ1973位〜2420位に見出されるNS5a)ならびにRNA依存性RNAポリメラーゼ(およそ2421位〜3011位に見出されるNS5b)を遊離させる。ポリタンパク質の成熟の終結は、NS3セリンプロテアーゼにより触媒されるNS3−NS4a接合部における自己触媒切断によって開始される。
【0073】
【表1】
*HCV−1に対して番号付けされたもの。Chooら(1991)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 88:2451−2455参照。
【0074】
コア、NS2、p7、E1、E2、NS3、NS4、NS5a、NS5bの遺伝子及びポリペプチドを含む、HCVポリタンパク質の種々の領域の核酸配列及びアミノ酸配列を含む、多数のHCV株及び単離物の核酸配列及びアミノ酸配列が決定されている。
【0075】
HCV−1単離物について記載する刊行物としては、Chooら(1990)Brit.Med.Bull.46:423−441;Chooら(1991)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 88:2451−2455及びHanら(1991)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 88:1711−1715が挙げられる。HCV単離物HC−J1及びHC−J4はOkamotoら(1991)Japan J.Exp.Med.60:167−177に記載されている。HCV単離物HCT18〜、HCT23、Th、HCT27、EC1及びEC10はWeinerら(1991)Virol.180:842−848に記載されている。HCV単離物Pt−1、HCV−K1及びHCV−K2はEnomotoら(1990)Biochem.Biophys.Res.Commun.170:1021−1025に記載されている。HCV単離物A、C、D及びEはTsukiyama−Koharaら(1991)Virus Genes 5:243−254に記載されている。単離物HCV J1.1はKuboら(1989)Japan.Nucl.Acids Res.17:10367−10372;Takeuchiら(1990)Gene 91:287−291;Takeuchiら(1990)J.Gen.Virol.71:3027−3033;及びTakeuchiら(1990)Nucl.Acids Res.18:4626に記載されている。2種類の別個の単離物HCV−J及びBKの完全コード配列が、それぞれ、Katoら、(1990)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 87:9524−9528及びTakamizawaら、(1991)J.Virol.65:1105−1113に記載されている。
【0076】
上記に説明されるように、本発明は、HCV検出のためのイムノアッセイに用いるための改変多エピトープ融合抗原(MEFA)に関する。この改変MEFAは、図1及び表1に示され、さらに以下に記載されるような種々のHCVウイルス領域のいずれかに由来する多数のHCVエピトープを含む。通常、改変MEFAは、HCVポリタンパク質における少なくとも3つの異なる領域、より代表的には、HCVポリタンパク質の4〜10の領域からの、例えばHCVポリタンパク質の5〜8(例えば5、6、7、8)の領域に由来する、少なくとも3つのエピトープ、好ましくは3〜25又はそれ以上のエピトープ(例えば、少なくとも5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19又は20あるいはそれ以上のエピトープ(例えば10〜20のエピトープ)を含む。改変MEFAは、ヘリカーゼドメインからの少なくとも1つの改変エピトープ及び好ましくはNS4a/NS4b及び/又はNS5aからのエピトープを含む。改変MEFAはまた、MEFAの組換え発現を助ける配列のような非HCV配列(以下にさらに記述するスーパーオキシドジスムターゼ配列が挙げられる)を含み得る。
【0077】
改変MEFAにおいては、多数のHCV抗原が一本の連続したアミノ酸鎖として配列されており、この鎖はその状態で天然に存在しない。したがって、エピトープの直線的順序は、それらが存在するゲノム中でのこれらエピトープの直線的順序とは異なる。本明細書中で使用するための改変MEFAの配列はの直線的順序は、好ましくは、最適な抗原性のために並べられる。好ましくは、エピトープは、2以上のHCV株、例えば、2、3、4、5、6以上の株に由来し、それにより、単一アッセイにおいて多数のHCV株を検出する能力が付与される。さらに、MEFA中に存在するポリペプチドは、免疫診断が使用される特定の地理的領域における特定のウイルス固有種に基づいて選択することができる。このようなMEFAが様々な状況においてHCV感染を診断するための有効な手段を提供することは容易に理解される。さらに、改変MEFAの使用は、NS3プロテアーゼによるMEFAのタンパク分解性切断を生じないことを確認し、したがって、HCVイムノアッセイにおいて使用するためのより良い試薬が提供される。
【0078】
本発明の改変MEFAは、NS3による改変MEFAの切断が阻害されるように、NS3タンパク分解性切断部位において変異されている。NS3タンパク分解性切断部位は、NS3/4a、NS4a/4b、NS4b/5a及びNs5a/5b接合部位において見られる(Grakouiら、J.Virol.(1993)67:2832−2843)。したがって、表1を参照すると、これらの部位は、それぞれ、HCV−1ポリタンパク質配列に対して番号付けされたアミノ酸の1657位/1658位、1711位/1712位、1972位/1973位及び2420位/2421位に存在する。さらに、切断部位は、HCV−1ポリタンパク質配列に対して番号付けされた1428位/1429位及び1455位/1456位にあるNS3のヘリカーゼドメイン内にも存在する。改変のためのさらなる部位は、例えば、De Francecoら、Antivir.Ther.(1998)3:99−109;並びにSchechter及びBerger,Biochim.Biophys.Res.Commun.(1967)27:157−162に記載されているようなHCV NS3プロテアーゼの公知の構造及び機能に基づいて、当業者によって決定され得る。
【0079】
NS3タンパク分解性切断部位の全て又はそのいくつかを欠失することにより、MEFAは改変され得る。あるいは、NS3プロテアーゼによるタンパク分解性切断は、タンパク分解性切断部位内のアミノ酸の置換により、その部位がNS3プロテアーゼのための基質として機能しないように、阻害され得る。最終的に、NS3プロテアーゼが作用しないようにタンパク分解性切断部位が改変されるアミノ酸付加もまた、タンパク質分解活性を阻害するために機能し得る。タンパク分解性切断に影響を及ぼさないさらなる改変は、必ずしも必要ではないが、本発明のMEFA中に見られるエピトープ中に存在していてもよい。改変MEFAの用途に沿う場合、プロテアーゼ切断部位を除去する任意の改変が、そのように改変されたMEFAの免疫反応性に影響を及ぼするべきではないことは明らかであろう。
【0080】
したがって、例えば、上記の1以上の部位における1以上のアミノ酸(例えば、これらのアミノ酸のうちの1つ、2つ、3つ、4つ、5つ、6つ、7つ、8つ、又は全て)を、NS3プロテアーゼによるタンパク分解性切断を抑制するために置換又は欠失させることができる。あるいは、NS3プロテアーゼによるMEFAの切断を阻害するためにこれらの切断部位に付加することができる。
【0081】
好ましい実施形態においては、MEFA中に存在する全てのタンパク分解性切断部位における各アミノ酸が、NS3プロテアーゼによる切断を防ぐために改変されている。したがって、MEFAがヘリカーゼドメイン中の切断部位に広がる1以上のエピトープ、(NS3/4a接合部、NS4a/NS4b接合部等)を含む場合、その部位を規定するアミノ酸は置換されているか又は改変されている。ヘリカーゼドメイン中の部位の具体的な置換としては、通常、HCV−1ポリタンパク質の1428位に存在する、アミノ酸LeuのThrとの置換;通常、HCV−1ポリタンパク質の1429位に存在する、ProのSerとの置換;通常、HCV−1ポリタンパク質の1455位に存在する、LeuのAsnとの置換;及び、通常、HCV−1ポリタンパク質の1456位に存在する、ProのThrとの置換が挙げられる。NS3/4a接合部における具体的な置換としては、通常、HCV−1ポリタンパク質の1657位に存在するLeuのThrとの置換;及び、通常、HCV−1ポリタンパク質の1658位に存在するProのSerとの置換が挙げられる。これらの位置の上記アミノ酸はHCV−1配列を参照しており、対応するアミノ酸がNS3によるMEFAのタンパク分解性切断を阻害するように機能するアミノ酸と置換されている場合、これらの位置に同じアミノ酸を含んでいても又は含んでいなくてもよい、その他のHCV遺伝子型のいずれかのヘリカーゼドメイン及びNS3/4aドメインからのエピトープをも、MEFAは含んでいてもよいことを理解すべきである。
【0082】
さらに、これらの部位におけるその他の適当なアミノ酸改変は、例えば、De Francecoら、Antivir.Ther.(1998)3(第3補遺):99−109;並びにSchechter及びBerger,Biochim.Biophys.Res.Commun.(1967)27:157−162に記載されているようなHCV NS3プロテアーゼの公知の構造及び機能に基づいて、当業者によって容易に決定され得る。特に、NS3プロテアーゼがセリンプロテアーゼであり、そのタンパク質分解メカニズムは標的とされるペプチド結合のセリンによる求核攻撃に基づくものであることが公知である。セリン、ヒスチジン及びアスパラギン酸の整列された側鎖は、多くのセリンプロテアーゼに共通の触媒性三連構造を構築する。セリンプロテアーゼの活性部位は、ポリペプチド基質が結合する裂け目として形作られる。Schechter及びBerger(Schechter及びBerger,Biochim.Biophys.Res.Commun.(1967)27:157−162)は、ポリペプチド基質(Pi、・・・、P3、P2、P1、P1’、P2’、P3’、・・・、Pj)のN末端からC末端の標識アミノ酸残基及びそれらの各結合サブサイト(Si、・・・、S3、S2、S1、S1’、S2’、S3’、・・・、Sj)を標識化し、そして切断が、P1とP1’との間で触媒されることを見出した。NS3プロテアーゼはキモトリプシン様の折り畳み構造を取り、非常に長いペプチド基質(P6〜P4’)に対する要件と一致する、非常に長い、溶媒に曝露される基質結合部位を含む。NS3プロテアーゼは基質P1の位置のシステイン残基に対して選択性を有する。したがって、上述の及び当技術分野において既知の構造及び機能に基づいて、NS3プロテアーゼに対するタンパク分解性切断を妨害し、それによって、切断されにくいMEFAを産生するように機能するその他のアミノ酸の置換、付加及び欠失を、当業者は容易に決定することができる。
【0083】
MEFA中に存在する場合、5−1−1エピトープ中に見られる、NS4a/4b接合部における具体的な置換としては、通常、HCV−1ポリタンパク質の1711位に存在するProのCysとの置換、並びに、通常、HCV−1ポリタンパク質の1712位に存在するIleのSerとの置換が挙げられる。5−1−1エピトープは、HCV−1ポリタンパク質配列に対して番号付けされた、およそ1694位〜1735位に見られる。これらの位置の上記アミノ酸はHCV−1配列を参照しており、対応するアミノ酸がNS3によるMEFAのタンパク分解性切断を阻害するように機能するアミノ酸と置換されている場合、これらの位置に同じアミノ酸を含んでいても又は含んでいなくてもよい、その他のHCV遺伝子型のいずれかの5−1−1ドメインからのエピトープをMEFAは含んでいてもよく、好ましくは含むことを理解すべきである。例えば、HCV−3の1711位及び1712位における天然のアミノ酸は、HCV−1において見られるものと同じである。HCV−2の1711位にあるアミノ酸は、HCV−1及びHCV−3のそれと同じである。しかしながら、HCV−2の1712位に存在するアミノ酸はAlaである。このAlaは、NS3によるMEFAのタンパク分解性切断を阻害するために、例えば、Ileと置換され得る。さらに、これらの部位におけるその他の適当なアミノ酸改変は、例えば、De Francecoら、Antivir.Ther.(1998)3:99−109;並びにSchechter及びBerger,Biochim.Biophys.Res.Commun.(1967)27:157−162に記載されているようなHCV NS3プロテアーゼの既知の構造及び機能に基づいて、当業者によって容易に決定され得る。
【0084】
上述のとおり、本発明のMEFAは、NS3及びNS4a領域由来の少なくとも1以上のエピトープ(直線的又は高次構造的のいずれか)、例えば、NS3のヘリカーゼ及び/又はプロテアーゼ領域由来のものを含んでもよい。したがって、MEFAは、1以上のHCV単離物からのNS3/4a領域由来の多数の免疫ドミナントエピトープを含んでもよい。多数のNS3/4aエピトープが多エピトープ融合体に用いられる場合、それらは、同一又は異なるエピトープであってもよい。あるいは、融合抗原は、NS3/4a領域由来の1以上のエピトープ、並びに、限定するものではないが、HCVコア、E1、E2、P7、NS4b、NS5a及びNS5b配列のようなその他のHCV領域からの主要な直線的エピトープを含み得る。
【0085】
NS3/4a領域由来のエピトープを含むポリペプチドは、限定するものでないが、NS3、NS4a及びNS3/4a領域の全て又は一部を含むポリペプチドを含み、NS3のヘリカーゼ及び/又はプロテアーゼドメインからのエピトープを含んでもよい。これらの領域からの多数のエピトープが公知であり、例えば、限定するものではないが、c33c領域、c200領域及びc100領域由来の抗原、並びに、c25のようなNS3エピトープを含む融合タンパク質が挙げられる。これら及びその他のNS3エピトープは、本発明のMEFAにおいて有用であり、当技術分野において公知であり、例えば、Houghtonら、米国特許第5,350,671号;Chienら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1992)89:10011−10015;Chienら、J.Gastroent.Hepatol.(1993)8:S33−39;Chienら、国際公開第93/00365号;Chien,D.Y.,国際公開第94/01778号;及び米国特許第6,346,375号及び米国特許第6,150,087号に記載されており、これらの開示は本明細書中で参考としてその全体が援用される。
【0086】
さらに、5−1−1として知られる抗原決定基は部分的にNS4a領域(図1参照)内に存在しており、本発明のアッセイにおいて使用するためのMEFAにおいて特に有用である。5−1−1エピトープは、HCV−1ポリタンパク質配列に対して番号付けされたおよそ1694位〜1735位に見られる。この抗原決定基はHCV−1、HCV−2及びHCV−3上に異なる形態として現れる。したがって、本発明の好ましい実施形態においては、これらの形態をとる5−1−1の全てが本発明のイムノアッセイにおいて使用される多エピトープ融合抗原において現れる。
【0087】
改変MEFAは種々のHCV単離物のいずれかのコア領域からのエピトープを含むこともできる。この領域は、HCV−1に対して番号付けされた、HCVポリタンパク質のアミノ酸1位〜191位に存在する。全長タンパク質、そのフラグメント(例えば、アミノ酸1〜150、例えば、アミノ酸1〜130、1〜120、例えば、アミノ酸1〜121、1〜122、1〜123等)又は全長タンパク質のエピトープを含むより小さなフラグメントのいずれかが、本発明のMEFA中に存在し得、例えば、それらのエピトープは、アミノ酸9〜32、10〜53、10〜45、39〜42、64〜88、67〜84、67〜88、120〜130の間に見られるか、或いは、コアエピトープのいずれかは、例えば、Houghtonら、米国特許第5,350,671号;Chienら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1992)89:10011−10015;Chienら、J.Gastroent.Hepatol.(1993)8:S33−39;Chienら、国際公開第93/00365号;Chien,D.Y.,国際公開第94/01778号;並びに米国特許第6,280,927号及び米国特許第6,150,087号に示されている。これらの開示は参考として本明細書中でその全体が援用される。さらに、国際公開第99/63941号に記載されるようなポリタンパク質のコア領域におけるフレームシフトから得られるタンパク質を使用しても良い。
【0088】
同様に、HCV E1及び/又はE2領域からのポリペプチドは改変MEFAに使用することができる。E2は複数種存在し(Spaeteら,Virol.(1992)188:819−830;Selbyら,J.Virol.(1996)70:5177−5182;Grakouiら,J.Virol.(1993)67:1385−1395;Tomeiら,J.Virol.(1993)67:4017−4026)、クリッピング及びタンパク分解はE2ポリペプチドのN−末端及びC−末端で生じ得る。したがって、本明細書中で使用するためのE2ポリペプチドは、全長又はN−末端及び/若しくはC−末端を切断された免疫原性タンパク質、例えば、全長HCV−1ポリタンパク質に対して番号付けされた、アミノ酸405〜661を有するタンパク質(例えば、400、401、402・・・〜661、例えば、405〜444、383又は384〜661、383又は384〜715、383又は384〜746、383又は384〜749或いは383又は384〜809、或いは383又は384から661〜809の間の任意のC末端まで)を含んでもよい。MEFAにおいて使用するためのさらなるHCVエピトープは、E2の超可変領域に由来するエピトープ、例えば、アミノ酸384〜414若しくは390〜410に広がる領域、又はこの領域からの共通配列であるGly−Ser−Ala−Ala−Arg−Thr−Thr−Ser−Gly−Phe−Val−Ser−Leu−Phe−Ala−Pro−Gly−Ala−Lys−Gln−Asn(配列番号7)を含み、これは、1型HCVゲノムのアミノ酸390〜410に対する共通配列を表す。本発明のMEFA中に存在する代表的E2エピトープは、アミノ酸384〜414に広がるハイブリッドエピトープを含み得る。このようなハイブリッドE2エピトープは、第2の株からの共通配列と融合される、共通配列を表すアミノ酸390〜410を含み得る。あるいは、このE2エピトープはアミノ酸390〜444に広がるハイブリッドエピトープを含んでもよい。このようなハイブリッドE2エピトープは、例えば、HCV E2のアミノ酸411〜444に対する天然のアミノ酸配列へと融合される、上述したような共通配列を表すアミノ酸390〜410を含み得る。
【0089】
さらに、改変MEFAは、アミノ酸303〜320を含むE1エピトープ等のHCVポリタンパク質のアミノ酸192〜326、192〜330、192〜333、192〜360、192〜363、192〜383、又は192から326〜383の間の任意のC末端までを含むエピトープ等のE1ポリペプチドを含んでもよい。
【0090】
上述のとおり、抗原は種々のHCV株に由来し得る。複数のHCVウイルス株が公知であり、これらの株いずれかに由来するエピトープは融合タンパク質として使用することができる。任意の所定の有機体の種は、個々の有機体の間で互いに異なり、さらに、ウイルス等の特定の有機体は多数の異なる株を有し得ることが周知である。例えば、上述のとおり、HCVは少なくとも6つの遺伝子型を含む。これらの各遺伝子型は同等の抗原決定基を含む。より具体的には、それぞれの株は、ウイルスの全ての株に存在するが、ウイルス株同士でわずかに異なる多くの抗原決定基を含む。例えば、HCVは、5−1−1として知られる抗原決定基を含む(図1参照)。上述のとおり、この特定の抗原決定基は異なる形態HCV−1、HCV−2及びHCV−3として現れる。したがって、本発明の好ましい実施形態において、これらの5−1−1形態の全てが、本発明のイムノアッセイにおいて使用される多エピトープ融合抗原上に現れる。同様に、異なるHCV株のコア領域からの同等の抗原決定基も存在し得る。通常、同等の抗原決定基はアミノ酸配列に関して高度の相同性を有し、相同性の程度は、整列させた際に、通常30%以上、好ましくは40%以上である。本発明の複数コピーのエピトープは、正に同一エピトープのコピーである複数コピーを含むことができる。
【0091】
図8は本明細書中で「MEFA7.2」と呼ばれる代表的な改変MEFAを示す。しかしながら、HCVゲノム由来のその他のエピトープも本発明の改変MEFAにおける用途を見いだすであろうことを理解すべきである。MEFA7.2をテンプレートとして形成された親MEFAは「MEFA7.1」であった。MEFA7.1のマップ並びに対応するMEFA7.1のDNA配列及びアミノ酸配列をそれぞれ図4及び5A〜5Fに示す。MEFA7.1は米国特許第6,632,601号に詳細に記載されており、当該文献は参考として本明細書中でその全体が援用される。MEFA7.1及びMEFA7.2のアミノ酸配列の比較を、2つの構築物の間の違いを太字で注記して、図10A〜10Bに示す。全ての相違は上述のタンパク分解性切断部位において生じている。したがって、MEFA配列に対して番号付けされた変異は、図10A〜10Bの466位、467位、493位、494位、695位、696位、721位、722位、770位、771位、819位及び820位において生じている。これらのアミノ酸位置は、それぞれ、HCV−1ポリタンパク質配列に対して番号付けされた1428位、1429位、1455位、1456位、1657位、1658位、1711位、1712位、1711位、1712位、1711位及び1712位に相当する(3回の5−1−1の反復による)。
【0092】
MEFA7.2のDNA配列及び対応するアミノ酸配列を図9A〜9Fに示す。MEFA7.2の一般構造式を図8に示し、これは以下の通りである:hSOD−E1(タイプ1)−E2 HVR共通(タイプ1a)−E2 HVR共通(タイプ1及び2)−変異ヘリカーゼ(タイプ1)−変異5−1−1(タイプ1)−変異5−1−1(タイプ3)−変異5−1−1(タイプ2)−c100(タイプ1)−NS5(タイプ1)−NS5(タイプ1)−コアエピトープ(タイプ1+2)−コアエピトープ(タイプ1+2)。このMEFAは、HCV−1に対して番号付けされた以下のアミノ酸配列を含む(アミノ酸の番号付けは、アミノ酸#1がコア領域のコード配列によってコードされる第1のメチオニンである、Chooら(1991)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 88:2451−2455に示されている番号表示に従い、以下に示す):スーパーオキシドジスムターゼ(SOD、タンパク質の組換え発現を促進するために使用される)のアミノ酸1〜156;E1領域由来のポリタンパク質のアミノ酸303〜320;HCV−1aE2の超可変領域に対する共通配列を表す、ポリタンパク質のアミノ酸390〜410;HCV−1及びHCV−2のE2超可変領域に対する共通配列を表す、領域E2由来のポリタンパク質のアミノ酸384〜414;ポリタンパク質の対応するアミノ酸1428、1429、1455、1456、1657及び1658(図9A〜9Fに示されたMEFA配列に対して番号付けされたアミノ酸466、467、493、494、695及び696)に変異を有する、ヘリカーゼを規定するHCV−1ポリタンパク質のアミノ酸1193〜1658;5−1−1からのエピトープの3つのコピー、アミノ酸1689〜1735(HCV−1からの1つ、HCV−3からの1つ及びHCV−2からの1つ)、これらのコピーは、3つの異なるHCVウイルス株からの同等の抗原決定基であり、これらのコピーそれぞれが、ポリタンパク質の対応する1711及び1712のアミノ酸(図9A〜9Fに示されるMEFA配列に対して番号付けされたアミノ酸721、722、770、771、819及び820)に変異を有する;HCV−1のHCVポリペプチドc100、ポリタンパク質のアミノ酸1901〜1936;HCV−1のNS5領域からのエピトープの2つの正確なコピー、それぞれがHCVポリタンパク質のアミノ酸2278〜2313を有する;並びに、コア領域からのいくつかの2コピーのエピトープ(HCV−1からの1つ及びHCV−2からの1つ)、これらのコピーはHCV−1のアミノ酸9〜32、39〜42及び64〜88並びにHCV−2の67〜84によって表される同等の抗原決定基である。
【0093】
表2は本明細書中の図9A〜9Fに関連する種々のエピトープのアミノ酸の位置を示す。
【0094】
【表2】
従って、ひとつの特定の改変MEFAが、MEFA7.2によって表される。MEFA7.2に対する実質的な相同性を示すMEFAも、上述のように意図される。このようなMEFAは、タンパク分解性切断部位に対する少なくとも1つの改変を有し、好ましくはタンパク分解性切断部位に対する全ての改変が維持され、且つそのMEFAが免疫反応性を有し、従って本明細書中に記載するようなHCV免疫診断において有用である限り、分子の全長に渡って少なくとも約50%、好ましくは少なくとも約75%、より好ましくは少なくとも約80%〜85%、好ましくは少なくとも約90%、及び最も好ましくは少なくとも約95%〜98%の配列同一性を示す配列を有し得る。
【0095】
上記に説明したように、MEFA7.1をテンプレートとして用いてMEFA7.2を作製した。しかしながら、多数のその他の公知のMEFAが、NS3によるタンパク分解性切断の感受性を低減したさらなる改変MEFAを提供するために上述のように改変され得る。本明細書中に記載の改変され得るMEFAとしては、MEFA−3、MEFA−5及びMEFA−6が挙げられ、これらは、図12A、12B及び12Cにそれぞれ示され、国際公開第01/96875号、同第01/09609号、同第97/44469号及び米国特許第6,514,731号及び同第6,428,792号(本明細書中にその全体が参考として援用される)中に記載される。例えば、MEFA6のエピトープ配列の配置はMEFA7.2に類似する。しかしながら、MEFA7.2は、E2超可変(HVR)領域及びE2 HVR 1+2共通配列を組み込む。さらに、NS3のヘリカーゼ領域全体が、MEFA7.2中に含まれる。すなわち、MEFA7.2は分子量約120kDaを有し、MEFA6よりも大きいと考えられる。しかしながら、酵母における発現レベルはMEFA6のものに類似し、95%を超える純度で精製することができ、測定可能である。
【0096】
改変MEFAは単独で使用されるか、又は好ましくは、MEFAに関して上述される任意のHCV免疫原性タンパク質のような別のHCV抗原と組み合わせて使用される。好ましい実施形態において、改変MEFAは、HCVウイルスを検出するためのイムノアッセイにおいて、HCV NS3/4aエピトープ、好ましくは高次構造エピトープと組み合わせて用いられる。したがって、図2に示される本発明の1実施形態において、MEFA7.2及びNS3/4aエピトープを用いて迅速捕捉リガンドイムノアッセイ(rapid capture ligand immunoassay)が実行される。サンプルは、固体支持体上に存在し得る抗原と、以下に記載するように組み合わされる。サンプルがHCVに感染している場合、固体支持体上に存在するそれらのエピトープに対するHCV抗体は、固体支持体成分へと結合する。検出は、抗原/抗体複合体のメンバーへの検出可能なマーカー(図2中に示す西洋ワサビペルオキシダーゼ(HRP)等)の結合による。結合は、共有的な手段により、又は、(例えば標準的なサンドイッチアッセイにおいて)検出可能に標識された抗体もしくは既知の抗原のその後の結合により、あるいは反応産物が検出可能な酵素反応によるものであり得る。検出可能なマーカーは、限定されるものではないが、発色団、抗体、抗原、酵素、その切断産物が検出可能である酵素反応性化合物、ローダミン、又はローダミン誘導体、ビオチン、アビジン、ストレプトアビジン、蛍光化合物、ジメチルアクリジニウムエステル(DMAE,Ciba Corning Diagnostics Corp.)のような化学発光化合物、それらのマーカーの誘導体及び/又は組み合わせを含む。存在するヒトIgG分子を検出可能な、検出可能に標識された抗ヒト抗体を簡便に使用できる。あるいは、検出可能に標識されたHCV抗原、例えば、NS3/4a又はMEFAを使用することができる。
【0097】
(HCV NS3/4a高次構造エピトープ)
上記に説明したように、本発明の改変MEFAをNS3/4a領域からのエピトープと組み合わせてイムノアッセイに使用することが特に好ましい。HCVポリタンパク質のNS3/4a領域は記述されており、そのタンパク質のアミノ酸配列及び全体構造は、例えば、Yaoら,Structure(November 1999)7:1353−1363;Saliら,Biochem.(1998)37:3392−3401;及びBartenschlager,R.,J.Viral Hepat.(1999)6:165−181中に開示されている。また、Dasmahapatraら,米国特許第5,843,752号も参照(本明細書中にその全体が参考として援用される)。本発明のイムノアッセイは、NS3/4a遺伝子産物により通常呈されるプロテアーゼ酵素活性の保存、及び必要に応じてヘリカーゼ酵素活性の保存により、ならびに/又は、HCV−1感染被験体からの生物学的サンプル中の抗体と抗原との免疫反応性の維持、及び抗原変性の際のエピトープにおける免疫反応性喪失により証明されるように、天然のHCV粒子又は、その感染産物中に見いだされるような高次構造で存在するNS3/4a領域由来の少なくとも1つの高次構造エピトープを利用し得る。例えば、高次構造エピトープは、加熱、強酸又は強塩基へのpHの変化、又はジチオスレイトール(DTT)もしくは適切な界面活性剤等のような公知の有機変性剤の添加により破壊することができる。例えば、Protein Purification Methods,a practical approach(E.L.V.Harris及びS.Angal編,IRL Press)及び上記のように処理されなかった産物と比較した変性産物を参照されたい。
【0098】
プロテアーゼ活性及びヘリカーゼ活性は、当技術分野において周知の標準的酵素アッセイを用いて測定しても良い。例えば、プロテアーゼ活性は、当技術分野において周知であるアッセイを用いて測定しても良い。例えば、Takeshitaら,Anal.Biochem.(1997)247:242−246;Kakiuchiら,J.Biochem.(1997)122:749−755;Saliら,Biochemistry(1998)37:3392−3401;Choら,J.Virol.Meth.(1998)72:109−115;Cerretaniら,Anal.Biochem.(1999)266:192−197;Zhangら,Anal.Biochem.(1999)270:268−275;Kakiuchiら,J.Virol.Meth.(1999)80:77−84;Fowlerら,J.Biomol.Screen.(2000)5:153−158;及びKimら,Anal.Biochem.(2000)284:42−48を参照されたい。プロテアーゼ活性を試験するための特に便利なアッセイを以下の実施例において示す。
【0099】
同様に、ヘリカーゼ活性アッセイは当技術分野において周知であり、NS3/4aエピトープのヘリカーゼ活性は、例えばHsuら,Biochem.Biophys.Res.Commun.(1998)253:594−599中に記載のELISAアッセイ;Kyonoら,Anal.Biochem.(1998)257:120−126中に記載のシンチレーション近傍アッセイシステム;例えば、Hichamら,Antiviral Res.(2000)46:181−193及びKwongら,Methods Mol.Med.(2000)24:97−116中に記載の高スループットスクリーニングアッセイ;ならびにその他の本技術分野で公知のアッセイにより決定できる。例えば、Khuら,J.Virol.(2001)75:205−214;Utamaら,Virology(2000)273:316−324;Paoliniら,J.Gen.Virol.(2000)81:1335−1345;Preugschatら,Biochemistry(2000)39:5174−5183;Preugschatら,Methods Mol.Med.(1998)19:353−364;及びHessonら,Biochemistry(2000)39:2619−2625参照。
【0100】
高次構造NS3/4aエピトープが用いられる場合、抗原の長さは、免疫反応性の高次構造エピトープを維持するのに十分である。しばしば、使用される抗原を含むポリペプチドはほとんど完全長であるが、ポリペプチドを例えば、溶解性を向上させるため、又は分泌を改善するために、短縮することもできる。通常、NS3/4a中に見いだされる高次構造エピトープは組換えポリペプチドとして細胞中で発現され、このポリペプチドは所望の形態において、以下に記載のエピトープを提供する。
【0101】
NS3/4aポリペプチドに対する代表的なアミノ酸配列を図13A〜13Dに示す。図13A〜13Dの2位〜686位に示されるアミノ酸配列はHCV−1における1027位〜1711位のアミノ酸に相当する。Metをコードする開始コドン(ATG)を1位に示す。さらに、HCV−1の1428位に通常存在するThr(図13における403位のアミノ酸)がProへと変異し、HCV−1の1429位に通常存在するSer(図13における404位のアミノ酸)がIleへと変異している。このNS3/4a高次構造エピトープを本明細書中で「NS3/4a PI」及び「NS3NS4a PI」と称する。しかしながら、その天然の高次構造を保持し又は回復させる方法を用いてエピトープが生成される限り、N−末端のMetを有するかもしくは有しない天然の配列、N−末端のMetを有するかもしくは有しない示されるアナログ(すなわち、「PI」アナログ)、又はその他のアナログ及びフラグメントのいずれかを本発明のアッセイにおいて使用することができる。Dasmahapatraら,米国特許第5,843,752号及びZhangら,米国特許第5,990,276号参照、両者はNS3/4aのアナログを記載する。
【0102】
NS3/4aのNS3プロテアーゼは、HCV−1に対して番号付けされたおよそ1027位〜1207位(図13の2位〜182位)に見出される。NS3プロテアーゼの構造及び活性部位は公知である。例えば、De Francescoら,Antivir.Ther.(1998)3:99−109;Kochら,Biochemistry(2001)40:631−640参照。通常耐容性のある天然の配列に対する変化は、この分子の活性部位の外側に存在する。特に、図13の1〜又は2〜155のアミノ酸をほとんど置換しないか、又は保存的な置換のみを有するように維持することが望ましい。155位より後ろに存在するアミノ酸は、より大きな変化に耐える。さらに、NS3/4a配列のフラグメントを使用する場合、これらのフラグメントは通常、N−末端のMetを有する又は有しない少なくとも1〜又は2〜155のアミノ酸、好ましくは1〜又は2〜175のアミノ酸及び、最も好ましくは1〜又は2〜182のアミノ酸を含む。ヘリカーゼドメインは、HCV−1のおよそ1193位〜1657位(図13における207位〜632位)において見出される。したがって、ヘリカーゼ活性が所望される場合には、分子のこの部分はほとんど変化しない又は保存的な変化のみを有して保持されるであろう。当業者は、NS3/4aの公知の構造に基づいて、変化に耐えるその他の領域を容易に決定することができる。
【0103】
上記に説明したように、限定されるものではないが、c33c領域、c200領域、c100領域及び5−1−1領域、並びにc25のようなNS3エピトープを含む融合タンパク質由来の抗原を含む、NS3/4a由来のエピトープを含む多数の抗原が公知である。
【0104】
その他のHCV領域からの、これら及び種々のその他のHCVエピトープの記述に関しては、例えば、Houghtonら、米国特許第5,350,671号;Chienら,Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1992)89:10011−10015;Chienら,J.Gastroent.Hepatol.(1993)8:S33−39;Chienら,国際公開第93/00365号;Chien,D.Y.,国際公開第94/01778号;及び米国特許第6,280,927号及び同第6,150,087号を参照(本明細書中にそれらの全体が参考として援用される)。
【0105】
(HCV抗原の生産)
上記に説明したように、本発明の分子は通常組換え的に生産される。したがって、本発明と共に使用するためのHCV抗原をコードするポリヌクレオチドは標準的な分子生物学の技法を用いて製造可能である。例えば、上記の分子をコードするポリヌクレオチド配列を、組換え手法を用いて(例えばその遺伝子を発現している細胞からのcDNAライブラリー及びゲノムライブラリーのスクリーニングによって、又はその遺伝子を含むことが知られているベクターからの遺伝子を抽出することによって)得ることができる。さらに、所望の遺伝子を、Houghtonら,米国特許第5,350,671号のような当該技術分野において記載される技法を用いてウイルスの核酸分子から直接的に単離することができる。目的の遺伝子をクローニングするのではなく、合成的に生産することもできる。分子は特定の配列のために、適切なコドンを用いて設計され得る。次いで、完全な配列が、標準的な方法により調製されるオーバーラップしたオリゴヌクレオチドから組み立てられ、完全なコード配列へと組み立てられる。例えば、Edge(1981)Nature 292:756;Nambairら(1984)Science 223:1299;及びJayら(1984)J.Biol.Chem.259:6311参照。
【0106】
従って、好適な場合に、部位特異的突然変異誘発技術及びポリメラーゼ連鎖反応(PCR)技術のような当該技術分野で公知の種々のオリゴヌクレオチド合成技術を用いて、特定のヌクレオチド配列を、所望の配列を保持するベクターから得てもよく、又は、完全にもしくは部分的に合成してもよい。例えば、Sambrook(前出)を参照。特に、所望の配列をコードするヌクレオチド配列を得るための1つの方法は、従来の自動化ポリヌクレオチド合成装置で製造されるオーバーラップした合成オリゴヌクレオチドの相補的なセットを、アニーリングし、次いで適切なDNAリガーゼにより連結して、連結されたヌクレオチド配列をPCRを介して増幅することによる。例えば、Jayaramanら(1991)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 88:4084−4088参照。さらに、オリゴヌクレオチド指向型合成(Jonesら(1986)Nature 54:75−82)、予め存在するヌクレオチド領域のオリゴヌクレオチド特異的突然変異誘発(Riechmannら(1988)Nature 332:323−327及びVerhoeyenら(1988)Science 239:1534−1536)、及び、T4 DNAポリメラーゼ(Queenら(1989)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86:10029−10033)を用いたギャップオリゴヌクレオチドの酵素的埋め合わせ(enzymatic filling−in)が、タンパク分解性切断部位の変化及び/又はプロテアーゼに対する感受性の低減を分子にもたらす本発明の下で使用され得る。
【0107】
MEFAの製造方法は当業者に公知であり、例えば、米国特許第6,428,792号;同第6,514,731号;同第6,632,601号;同第6,797,809号中に記載されており、その開示は本明細書中にその全体が参考として援用される。手短に言えば、MEFA中で使用するための所望のエピトープをコードするDNAを合成的に製造するか、又は同じものを含むベクターから上述のように入手する。所定の順序でエピトープをコードする配列を連結し、MEFAの設計における改変を助けることによって本発明の有用性を増加させることができるようにするために、固有の制限酵素部位を導入することができる。制限酵素部位及びクローニング方法の選択は、組換えDNA技術における通常の技術を有する者により容易に決定される。好ましくは、エピトープ接合部(クローニングによってエピトープ間に作られたアミノ酸配列)は非特異的エピトープを生じない。非特異的エピトープは、例えば、天然にはHCVエピトープに隣接して存在しない非HCV配列である。非特異的エピトープは、試験サンプル中の抗体に結合し得、偽陽性のアッセイ結果をもたらし得る。接合部配列によるMEFAとの非特異的な相互作用を回避するため、接合部をコードするDNA配列は、例えば、変異アミノ酸配列との非特異的な相互作用が低減され、エピトープフラグメントのクローニングが可能となるように変異され得る。ヌクレオチド配列は次いで発現カセット内に配置され、好適な宿主がこのカセットを用いて形質転換される。宿主は、この配列を発現して、MEFAを提供し得る。次いで、産生されたMEFAを、例えばアフィニティークロマトグラフィーによって精製する。このプロセスは、所定のエピトープの複数のコピーが存在することによってある程度効率化される。
【0108】
HCV変異体のような所望のヌクレオチド配列の変異体又は類似体を製造する方法は周知である。例えば、Dasmahapatraら,米国特許第5,843,752号及びZhangら,米国特許第5,990,276号参照。イムノアッセイにおける使用のためのHCV抗原の変異体又はアナログは、目的のポリペプチドをコードする配列の一部を欠損させることにより、配列を挿入することにより、及び/又はその配列内の1以上のヌクレオチドを置換することにより調製され得る。部位特異的突然変異誘発などのようなヌクレオチド配列を改変するための技法は当業者に周知である。例えば、Sambrookら、前出;Kunkel,T.A.(1985)Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1985)82:448;Geisselsoderら(1987)BioTechniques 5:786;ZollerおよびSmith(1983)Methods Enzymol.100:468;Dalbie− McFarlandら(1982)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 79:6409参照。
【0109】
ひとたびコード配列が調製されるか又は単離されると、このような配列は任意の好適なベクター又はレプリコンへとクローニング可能である。多数のクローニングベクターが当業者に公知であり、適切なクローニングベクターの選定はその選択の問題である。好適なベクターは、限定されるものではないが、プラスミド、ファージ、トランスポゾン、コスミド、クロモソーム又は適切な制御エレメントと組み合わせたときに複製可能なウイルスを含む。
【0110】
次いで、コード配列を、発現のために用いられる系に依存して、好適な制御エレメントの制御下に置く。すなわち、このコード配列を、プロモーター、(細菌性発現のための)リボソーム結合部位及び、必要に応じて目的のDNA配列が好適な形質転換体によりRNAへと転写されるためのオペレーターの制御下に置くことができる。コード配列は、翻訳後プロセシングにおいて宿主によって後に除去され得るシグナルペプチド又はリーダー配列を含んでもよく、又は含まなくてもよい。例えば、米国特許第4,431,739号;同第4,425,437号;同第4,338,397号参照。
【0111】
制御配列に加えて、宿主細胞の成育に関する配列の発現の調節を可能にする調節配列を加えることが望ましい場合がある。調節配列は当業者に公知であり、その例には、化学的又は物理的刺激(調節化合物を含む)に対して応答して遺伝子の発現が作動する又は作動が切れることをもたらすものを含む。その他のタイプの調節エレメントには、ベクター中に存在するものもある。例えば、エンハンサーエレメントは、本明細書中で、構築物の発現レベルを増加させることができる。例としてはSV40初期遺伝子エンハンサー(Dijkemaら(1985)EMBO J.4:761)、ラウス肉腫ウイルスのロングターミナルリピート(LTR)由来のエンハンサー/プロモーター(Gormanら(1982)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 79:6777)、及びCMVイントロンA配列(米国特許第5,688,688号)中に含まれるエレメントのようなヒトCMV由来のエレメント(Boshartら(1985)Cell 41:521)を含む。発現カセットはさらに、好適な宿主細胞における自己複製のための複製起点、1以上の選択マーカー、1以上の制限酵素部位、高コピー数に関する潜在力及び強力なプロモーターを含み得る。
【0112】
好適な調節配列を伴うベクター中に特定のコード配列が配置され、その制御配列に対してコード配列の位置及び向きが、そのコード配列が制御配列の「制御」下で転写される(すなわち、制御配列の位置でDNA分子に結合するRNAポリメラーゼがコード配列を転写する)ような位置および向きであるように、発現ベクターを構築する。目的の分子をコードする配列の改変は、この目的を達成することが所望され得る。例えば、いくつかの場合においては、それが適切な向きで制御配列へと連結される(すなわちリーディングフレームを維持する)ように、その配列を改変することが必要であり得る。制御配列及びその他の調節配列は、ベクターへの挿入前にコード配列へと連結され得る。あるいは、コード配列を、すでに制御配列及び適切な制限部位を有する発現ベクターへと直接的にクローニングしてもよい。
【0113】
分子は、広範な系において発現させられ得、これらの系としては、昆虫発現系、哺乳類発現系、細菌発現系、ウイルス発現系及び酵母発現系が挙げられ、これらは全て、当技術分野において周知である。例えば、バキュロウイルス系のような昆虫細胞発現系は当業者に公知であり、例えば、SummersおよびSmith,Texas Agricultural Experiment Station Bulletin No.1555(1987)中に記載されている。バキュロウイルス/昆虫細胞発現系に関する材料及び方法は、キットの形態で、特にInvitrogen,San Diego、カリフォルニアから市販されている(「MaxBac」キット)。同様に、細菌及び哺乳類の細胞発現系は当技術分野において周知であり、例えば、Sambrookら(前出)において記載されている。酵母の発現系も当技術分野において公知であり、例えば、Yeast Genetic Engineering(Barrら,編,1989)Butterworths,London中に記載されている。
【0114】
上記の系と共に使用するための多数の好適な宿主細胞もまた公知である。例えば、哺乳類の細胞株が当該分野で公知であり、限定されるものではないが、例えば、チャイニーズハムスター卵巣(CHO)細胞、HeLa細胞、ベビーハムスター腎臓(BHK)細胞、サル腎臓細胞(COS)、ヒト胚腎臓細胞、ヒト肝細胞癌腫細胞(例えばHep G2)、Madin−Darbyウシ腎臓(「MDBK」)細胞などの、American Type Culture Collection(ATCC)から入手可能な不死化細胞株を含む。同様に、E.coli、Bacillus subtilis及びStreptococcus spp.のような細菌宿主も、本発明の発現構築物による用途を見出すであろう。本発明において有用な酵母宿主としては、特に、Saccharomyces cerevisiae、Candida albicans、Candida maltosa、Hansenula polymorpha、Kluyveromyces fragilis、Kluyveromyces lactis、Pichia guillerimondii、Pichia pastoris、Schizosaccharomyces pombe及びYarrowia lipolyticaが挙げられる。バキュロウイルス発現ベクターと共に使用する昆虫細胞としては、特に、Aedes aegypti、Autographa californica、Bombyx mori、Drosophila melanogaster、Spodoptera frugiperda及びTrichoplusia niを含む。
【0115】
目的のヌクレオチド配列を含む核酸分子は、当技術分野において周知の種々の遺伝子送達技術を用いて宿主細胞ゲノムへと安定的に組み込まれ得るか、又は好適な宿主細胞中の安定なエピソーム成分上に保持され得る。例えば、米国特許第5,399,346号を参照されたい。
【0116】
上記で説明したように、組換え発現を助けるために、MEFAのコード配列を別の配列に融合し得る(例えば、50kDaのE.coliマルトース結合タンパク質をコードする配列との融合物、酵母スーパーオキシドジスムターゼ(SOD)をコードする配列又はそれらのフラグメントとの融合物、あるいはユビキチンをコードする配列との融合物)。ヒトSODのヌクレオチド配列及びアミノ酸配列は公知であり、Hallewellら、米国特許第5,710,033号中で報告されている。
【0117】
発現系及び選択される宿主に依存して、上述の発現ベクターにより形質転換された成育中の宿主細胞によって、タンパク質が発現する条件下で分子が生産される。発現されたタンパク質は次いで宿主細胞から単離され、精製される。発現系がタンパク質を生育培地へと分泌する場合、その産物を培地から直接精製することができる。それが分泌されない場合には、細胞溶解液から単離できる。好適な生育条件及び回収方法は当該分野の技術範囲内である。
【0118】
上述の種々の融合において使用される抗原を含む種々のHCV抗原の組換え生産が記述されている。例えば、国際公開第94/01778号、同第93/00365号、同04/00547号及び同01/38360号;米国特許第5,350,671号、同第5,683,864号、同第6,346,375号、同第6,150,087号、同第6,514,731号、同第6,428,792号及び同第6,632,601号;Chienら,J.Gastroent.Hepatol.(1993)8:S33−39;Chien,D.Y.,国際公開第94/01778号;Chienら,Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1992)89:10011−10015を参照(全ての開示は、その全体が、本明細書中に参考として援用される)。
【0119】
(免疫診断アッセイ)
一旦産生されると、HCV抗原は、抗体を検出するために既知の抗原を使用する実質的に任意のアッセイ形式において使用され得る。これらの全てのアッセイに共通する特徴は、抗原が、HCV抗体を含むことが疑われる身体の成分と、この抗原がこの成分中に存在する任意のこのような抗体に結合することを可能にする条件下で、接触させられることである。このような条件は、代表的に、生理学的な温度、pHおよびイオン強度であり、過剰な抗原を用いる。この抗原と標本とのインキュベーションの次に、抗原からなる免疫複合体の検出が行われる。
【0120】
イムノアッセイの設計は、大きな変動に供され得、そして多くの形式が、当該分野で公知である。例えば、プロトコールは、固体支持体を使用してもよく、または免疫沈降を使用してもよい。ほとんどのアッセイは、標識化抗体もしくは標識化ポリペプチドの使用を包含する;例えば、この標識は、上で詳しく考察した通り、酵素分子、蛍光分子、化学発光分子、放射活性分子もしくは色素分子であり得る。免疫複合体からのシグナルを増幅するアッセイもまた、公知である。このアッセイの例は、ビオチンおよびアビジンを使用するアッセイ、ならびに酵素標識化イムノアッセイおよび酵素媒介型イムノアッセイ(例えば、ELISAアッセイ)である。
【0121】
このイムノアッセイは、限定されないが、異種形式でも同種形式でもよく、そして標準型でも競合型でもよい。異種形式において、抗原が、代表的に、固体マトリックスもしくは固体支持体に結合し、インキュベーション後に、サンプルからの抗原抗体結合体の分離を容易にする。本発明の目的のために、固体支持体は、可溶性マトリックスである任意の材料であり得、そして剛性もしくは半剛性の表面を有し得る。例示的な固体支持体としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない:ニトロセルロースのような基質(例えば、膜もしくはマイクロタイターウェル形態);塩化ポリビニル(例えば、シートもしくはマイクロタイタープレート);ポリスチレンラテックス(例えば、ビーズもしくはマイクロタイターウェル);フッ化ポリビニリジン;ジアゾ化紙;ナイロン膜;活性型ビーズ、磁気応答ビーズなど。具体的な支持体としては、プレート、ペレット、ディスク、キャピラリー、中空ファイバー、針、ピン、固体ファイバー、セルロースビーズ、穴あきガラス(pore−glass)ビーズ、シリカゲル、必要に応じてジビニルベンゼンに架橋したポリスチレンビーズ、グラフト共重合ビーズ、ポリアクリルアミドビーズ、ラテックスビーズ、必要に応じてN−N’−ビス−アクリロイルエチレンジアミンに架橋したジメチルアクリルアミドビーズ、および疎水性ポリマーでコーティングしたガラス粒子が挙げられる。
【0122】
所望される場合、上記固体支持体に添加されるべき分子は、スチレン部分もしくはアクリレート部分を作製するように容易に官能性付与され得、それによって、この分子のポリスチレン、ポリアクリレートもしくは他のポリマー(例えば、ポリイミド、ポリアクリルアミド、ポリエチレン、ポリビニル、ポリジアセチレン、ポリフェニレン−ビニレン、ポリペプチド、多糖類、ポリスルホン、ポリピロール、ポリイミダゾール、ポリチオフェン、ポリエーテル、エポキシ、石英ガラス、シリカゲル、シロキサン、ポリリン酸塩、ヒドロゲル、アガロース、セルロースなどへの組み込みを可能にする。
【0123】
上記抗原は、固体支持体に直接固定される必要はなく、間接的に(例えば、別の結合分子を介して)結合されてもよい。例えば、この抗原に結合する既知の抗体は、ビオチン化され得、そしてストレプトアビジンもしくはアビジンでコーティングされた固体支持体と合わせられ得る。目的の抗原(例えば、MEFAもしくはNS3/4a高次構造エピトープ)が、ビオチン化抗体への結合によって固体支持体に結合される。あるいは、目的の抗原は、ビオチン化され得、そしてストレプトアビジンもしくはアビジンでコーティングされた固体支持体と合わせられ得る。
【0124】
1種より多くのHCV抗原(例えば、改変MEFAおよび高次構造NS3/4aエピトープ)がアッセイにおいて使用される場合、これらの抗原は、同じ固体支持体上もしくはこのアッセイにおいて合わせられ得る異なる固体支持体上で提供され得る。したがって、例えば、これらの抗原は、別個の実態として、例えば、1枚のプレート上に存在してもよく、または、例えば、目的のアッセイにおける使用のために一緒に加えられる個々の微小ビーズ上に存在してもよい。
【0125】
1つの状況において、図2で示すように、固体支持体は、最初に、例えばHCV MEFA7.2およびNS3/4aのようなHCV抗原(本明細書中で、集合的に「固相成分」と呼ぶ)と、この分子が十分に固体支持体に固定化されるような適切な結合条件下で反応させられる。時々、支持体への固定化は、最初により良い固相結合特性を有するタンパク質へ抗原とカップリングすることによって増強され得る。適切なカップリングタンパク質としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない:ウシ血清アルブミン(BSA)を含む血清アルブミン、キーホールリンペットヘモシアニン、免疫グロブリン分子、サイログロブリン、オボアルブミン、および当業者に公知の他のアルブミン。分子を支持体に結合するために使用され得る他の試薬としては、多糖類、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、ポリマー性アミノ酸、アミノ酸コポリマーなどが挙げられる。そのような分子およびこれらの分子の抗原へのカップリングの方法は、当業者に周知である。例えば、Brinkley,M.A.(1992)Bioconjugate Chem.3:2−13;Hashidaら(1984)J.Appl.Biochem.6:56−63;ならびにAnjaneyuluおよびStaros(1987)International J.of Peptide and Protein Res.30:117−124を参照されたい。
【0126】
固体支持体を固相成分と反応させた後、任意の非固定化固相成分は、洗浄によって支持体から除去され、次いで、この支持体に結合した成分は、HCV抗体(本明細書中で集合的に「リガンド分子」と呼ぶ)を含むことが疑われる生物学的サンプルと、適切な結合条件下で接触させられる。HCV抗体がサンプル中に存在する場合、これらは、その固体支持体上でHCV抗原と複合体を形成する。任意の非結合リガンド分子を除去するための洗浄の後、検出可能に標識化された抗体(例えば、抗HCV抗体上のエピトープを認識する抗外因性抗体(例えば、抗ヒト抗体))が、添加される。これらの抗体は、複合体形成に起因して結合する。
【0127】
別のアッセイ形式が、図3に示される。このアッセイ形式は、当該分野で周知であり、ビオチン標識化抗体(改変MEFAおよび、必要な場合NS3/4a(例えば、NS3/4a高次構造エピトープ)と結合する)と反応させられるストレプトアビジンコーティングされた固体支持体を用いる。このサンプルは、適切な結合条件下で加えられる。HCV抗体がサンプル中に存在する場合、これらは、HCV抗原と複合体を形成する。任意の非結合リガンド分子を除去するための洗浄の後、上述のように、検出可能に標識化された抗体が添加される。
【0128】
同種形式において、試験サンプルは、溶液中の抗原の組み合わせと共にインキュベートされる。例えば、これは、形成された任意の抗原−抗体複合体を沈殿する条件下であり得る。同種アッセイのための標準形式および競合形式の両方が、当該分野で公知である。
【0129】
標準形式において、抗体−抗原複合体を形成するHCV抗体の量が、直接モニタリングされる。これは、抗HCV抗体上のエピトープを認識する標識化抗外因性抗体(例えば、抗ヒト抗体)が、複合体形成に起因して結合するか否かを決定することによって、達成され得る。競合形式において、サンプル中のHCV抗体の量は、複合体中の既知の量の標識化抗体(または他の競合性リガンド)の結合における競合作用をモニタリングすることによって推定される。
【0130】
より詳細には、抗HCV抗体(または、競合アッセイにおいては、競合性抗体の量)を含んで形成される複合体が、その形式に依存して、多くの公知の技術のいずれかによって検出される。例えば、その複合体中の未標識化HCV抗体は、標識(例えば、酵素標識)と複合体化した抗外因性Igの結合体を用いて検出され得る。免疫沈降アッセイ形式もしくは凝集アッセイ形式において、HCV抗原と抗体との間の反応は、ネットワークを形成し、このネットワークは、溶液もしくは懸濁液から沈殿し、そして沈殿物の可視の層もしくは薄膜を形成する。抗HCV抗体が試験標本中に存在しない場合、可視の沈殿物は形成されない。
【0131】
代替の実施形態において、NS3/4aもしくは改変MEFAが、サンドイッチ型アッセイ形式において検出薬剤として使用され得る。サンドイッチアッセイは、当該分野で周知である。
【0132】
上述のアッセイ試薬(結合した抗体および抗原を有するイムノアッセイ固体支持体、ならびに捕獲したサンプルと反応させられる抗体および抗原を含む)は、上述のイムノアッセイを実施するために、適切な指示書および他の必要な試薬と共にキット中で提供され得る。このキットは、抗原の組み合わせ(既に固体マトリックスに結合しているか、またはそれら抗原をマトリックスに結合するための試薬と別個であるかのいずれか)、コントロール抗体処方物(ポジティブおよび/またはネガティブ)、標識がシグナルを直接産生しない場合にアッセイ形式が同一のシグナル発生試薬(例えば酵素基質)を必要とする場合は標識化抗体を、通常、別個の容器において含む。アッセイを実施するための指示書(例えば、書類、テープ、VCR、CD−ROMなど)が、通常、キット中に含まれる。このキットはまた、使用される特定のイムノアッセイに依存して、他の梱包された試薬および材料(すなわち、洗浄緩衝液など)を含み得る。上述のもののような種々のイムノアッセイが、これらのキットを用いて実施され得る。
【実施例】
【0133】
(III.実施例)
以下は、本発明を実施するための特定の実施形態の例である。これらの例は、例示のみの目的で提供され、そして本発明の範囲を限定することをいかなるようにも意図しない。
【0134】
使用される数値(例えば、量、温度など)に関して正確さを期するために努力がなされているが、無論、ある程度の実験誤差および偏差は許容される。
【0135】
(実施例1)
(MEFA 7.1及びMEFA 7.2の構築)
以下の実施例は、複数のHCVエピトープのポリタンパク質カセットの調製を説明する。複数のエピトープカセットから発現するこのポリタンパク質を、本明細書中では多エピトープ融合抗原(MEFA)と称する。好ましくは、エピトープが繰り返される場所においては、余分なコピーは同じ向きに直列して配列される。エピトープとして使用されるウイルスのコード配列のこの領域は、わずかに変化し得かつ抗原活性をなお保持することが理解され、そのアミノ酸の指定番号付けは株ごとに相違し得ることが理解される。従って、繰り返しエピトープは株の配列バリエーション及び/又は番号付けの指定により、アミノ酸配列中で互いに異なり得る。好ましくは、MEFA内の繰り返しエピトープのアミノ酸配列は、アミノ酸レベルで少なくとも30%相同であり、より好ましくは、アミノ酸レベルで少なくとも40%相同である。
【0136】
固有の制限酵素部位を、キメラ抗原の設計における改変を手助けすることにより、予め決められた順序でエピトープを連結するように、本発明の有用性を高めるように、導入した。制限酵素切断部位及びクローニング手法の選択は、組換えDNA技法の分野の当業者により容易に決定される。好ましくは、エピトープ接合部(クローニングによりエピトープの間に作り出されるアミノ酸配列)は、非特異的エピトープを生じない。非特異的エピトープは、例えば、天然にはHCVエピトープに隣接して存在しない非HCV配列である。非特異的エピトープは、試験サンプル中の抗体と結合して偽陽性のアッセイ結果をもたらす場合がある。好ましくは、多エピトープ融合タンパク質を、エピトープ接合部において生じるこのような配列による偽陽性の結果について試験する。接合部配列による、MEFAとの非特異的な相互作用を回避するため、接合部をコードするDNA配列を、例えば、変異アミノ酸配列との非特異的な相互作用を減少させ、エピトープフラグメントのクローニングが可能になるように変異させることができる。
【0137】
例えば、MEFA 7.1及びMEFA 7.2の図解をそれぞれ示す図4及び図8において示すように、主要エピトープを直列配置で含有するコードヌクレオチド配列のクローニングによってHCV MEFA 7.1及びHCV MEFA 7.2の発現カセットを構築した。主要エピトープは抗体反応の頻度及びエピトープに対する反応強度(力価)に基づいて選択された(Chein,D.Y.ら(1994)Viral Hepatitis and Liver Disease,pp.320−324)。PCR増幅により、又は合成オリゴヌクレオチドによって、HCVエピトープをコードする種々のDNAセグメントが構築された。MEFA7.2の各セグメント中のアミノ酸は上記の表2及び図9A−9F中で示される。完全なHCV−1アミノ酸配列(3011個のアミノ酸)がChooら,(1991)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 88:2451−2455(本明細書中でその全体が参考として援用される)により決定される。HCVと結合し得るオリゴヌクレオチドは米国特許第5,350,671号中に記載される(本明細書中でその全体が参考として援用される)。本発明のエピトープにおけるアミノ酸の番号付けは、別に特定されない限り、Chooら(前出)により提供される番号付け指定に従う。この番号付けにおいて、アミノ酸番号1は、コア領域のコード配列によりコードされる第1番目のメチオニンである。例えば、NS5からの1つのエピトープセグメントがHCVポリタンパク質の2278〜2313のアミノ酸により表される。E1領域からのエピトープはHCV−1ポリタンパク質と比較して番号付けされた303〜320のアミノ酸により表される。
【0138】
MEFA 7.1及びMEFA 7.2は各々HCV−1、HCV−2及びHCV−3からのエピトープを含み、単回のアッセイでウイルスの複数タイプの検出を可能にする。HCV血清型の決定方法は国際公開第96/27153号中に見出され、本明細書中でその全体が参考として援用される。例えば、5−1−1領域からのエピトープはHCVの血清型間で異なることが見出されている。本明細書中で記載されるMEFA中に存在する、HCV型特異的な5−1−1エピトープのそれぞれのコピーは、試験生物学的サンプル中に存在し得る任意のHCV型の結合を可能にする。
【0139】
MEFA構築物を、酵母における自己複製のための2μ配列ならびに選択可能なマーカーとしての酵母遺伝子leu2−d及びURA3を含む酵母の発現ベクターpBS24.1を用いて、Saccharomyces cerevisiae中での発現のために遺伝子操作した。細菌におけるプラスミド複製に必要とされるβ−ラクタマーゼ遺伝子及びColE1複製起点もまた、この発現ベクター中に存在していた。MEFA 7についての酵母発現ベクターであるps.MEFA7を最初に構築した。次いで、MEFA7.1抗原をコードするプラスミドであるps.MEFA7.1を作り出すために、HCVコアエピトープに関するコード領域においてプラスミドを改変した。最終的に、アミノ酸の1428位/1429位、1455位/1456位、1657位/1658位及び1711位/1712位に存在するNS3タンパク分解性切断部位(5−1−1エピトープ中で3つの繰り返しとして存在する)を変異させることにより、MEFA7.2抗原を作出した。
【0140】
特に、図6A〜6Dに示すように、MEFA 7についての酵母発現プラスミドを以下のように構築した。まず、ADH2/GAPDHハイブリッドプロモーター、hSOD(ヒトSOD、アミノ酸1〜156)、その後に続くE1エピトープ(アミノ酸303〜320、HCV1株)をコードする1896bpのBamHI/HindIIIフラグメントを、国際公開第97/44469号中に記載されたMEFA 6(図12C)をコードする発現プラスミドであるps.MEFA6から単離した。次に、E2 HVR1a共通エピトープ(アミノ酸390〜410、HCV−1)、E2 HVR1+2共通エピトープ(アミノ酸384〜414、HCV1+2)及びヘリカーゼドメインの5’末端(アミノ酸1193〜1229、HCV−1)のコード配列を含む269bpのHindIII/SphI合成DNAフラグメントを作製した。ヘリカーゼドメイン(アミノ酸1230〜1651、HCV−1)の残りの部分をコードする1264bpのSphI/EclXIフラグメントを、pTac5/HelIプラスミドプラスミドDNAからゲル精製した。HindIII/SphI合成DNAフラグメント及びSphI/EclXIの1264bpのフラグメントを、ベクターpSP72new.HindIII/EclXIベクターへと連結し、pSP72new.HindIII/EclXI/e2.ヘリカーゼを生産した。このベクターはPromega(Madison,ウイスコンシン州)から市販されているpSP72由来のE.coliベクターであった(GenBank/ΕMBL登録番号X65332)。特に、いくつかのMΕFA 7エピトープをサブクローニングすることを容易にするために、pSP72のSphI部位とBglII部位との間に、合成オリゴを介して新たなマルチクローニングサイト(MCS)ポリリンカーを導入した。pSP72newと称するこの新たなプラスミドを、MCS中に唯一の部位を有するHindIII及びEclXI(EagIとしても知られる)で消化した。次いで、それを脱リン酸化してゲル精製した。
【0141】
E.coli HB101コンピテント細胞をこのプラスミドを用いて形質転換し、100μg/ml アンピシリンを含むLuria寒天プレート上にプレート培養した。所望のクローンを、ミニプレップDNA分析を用いて同定した。配列確認後、このプラスミドpSP72new.HindIII/EclXI/e2.ヘリカーゼサブクローン#4をHindIII及びEclXI(EagI)で消化し、1534bpのフラグメントを生成させた。このHindIII/EclXIフラグメントをゲル精製し、ヘリカーゼドメインの最後のアミノ酸(アミノ酸1651〜1658、HCV−1)をコードするEclXI/SphIオリゴヌクレオチドと共に、pGEM7 HindIII/SphIベクターへと連結した。HB101コンピテント細胞を形質転換し、Luriaアンピシリン(100μg/ml)上にプレート培養した。所望のクローンの同定及び配列確認後、pGEM7HindIII/SphIサブクローン#9をHindIII及びSphIで消化し、ゲル精製された1560bpのフラグメントを生成させた(図6A参照)。
【0142】
MEFA 7の3’末端部分を組み立てるために、以下の工程を実行した。HCV−1、HCV−3及びHCV−2(この順番で)からの5−1−1エピトープ(アミノ酸1689〜1735)を、国際公開第97/44469号中に441bpのSphI/AvaIフラグメントとして記載されたMEFA 6をコードする発現プラスミドであるps.MEFA6からゲル単離した。このフラグメントを、c100エピトープ(アミノ酸1901〜1936)をコードする合成AvaI/XbaIオリゴヌクレオチドと共に、pSP72new.SphI/XbaIベクターへと連結した。HB101形質転換、クローン同定及び配列確認後に、pSP72newSXiサブクローン#6をXbaI及びNotIを用いて消化し、pSP72newXbaI/NotIベクターを調製した。さらに、NS5エピトープ(アミノ酸2278〜2313、HCV−1)の2回繰り返しをコードする221bpのXbaI/NcoIフラグメントをps.MEFA6から単離した。このXba/NcoIフラグメントを、HCV−1のコアエピトープの第1番目のアミノ酸をコードするNcoI/NotIオリゴヌクレオチド、9位のLysがArgへと変化し、11位のAsnがThrへと変化したアミノ酸9〜17と共に、上記で調製されたpSP72newXbaI/NotIベクターへと連結した。HB101形質転換体を分析し、それらのプラスミドDNAを配列解析した。pSP72newSX/XNi#3と名付けたサブクローンをNotI/SalIを用いて消化し、続くサブクローニングのためのベクターを調製した(図6B参照)。
【0143】
MEFA 7の3’末端の組み立てを完成するために、コアエピトープをコードする配列の2回繰り返しを、HCV−1からのアミノ酸9〜53、加えてこのコア領域の2つの遺伝子型に特異的なエピトープ(アミノ酸64〜88、HCV−1及びアミノ酸67〜84、HCV−2)と共に、NotI−SalI消化したpSP72newSX/XNiサブクローン#3へと以下のようにサブクローニングした。まず、コアエピトープのアミノ酸18〜51をコードする92bpのNotI/XmnIフラグメントを、pd.Core191RTクローン#20から単離した。プラスミドpd.Core191RTは、pBS24.1 BamHI−SalI酵母発現ベクターへと、ADH2/GAPDHプロモーターのための1365bpのBamHI−NcoIフラグメント及び、アミノ酸9がLysからArgへと変異し、アミノ酸11がAsnからThrへと変化したHCV−1コアの最初の191アミノ酸をコードする615bpのNcoI−SalIフラグメントを連結することによって構築した。この615bpのNcoI−SalIフラグメントは、上記と同じ2つの変異を伴うアミノ酸1〜191についてのコア配列がクローニングされたE.coli発現ベクターに由来する。
【0144】
92bpのNotI/XmnIフラグメントを、pSP72newNot/Kpnベクター、及び、完全コアエピトープの3’末端をコードするXmnI/KpnIオリゴヌクレオチドと連結した。陽性クローンの配列確認後、pSP72newNKiサブクローン#4をNotI及びKpnIを用いて消化し、224bpのフラグメントをゲル単離した。このNotI/KpnIフラグメントを、上述のコアエピトープの完全繰り返しをコードする284bpのオリゴヌクレオチド(KpnI−SalI末端)と共に、上述のpSP72newSX/XNi NotI/SalIベクターへと連結した。HB101形質転換、クローン同定及び配列確認後、pSP72newSX/XN/NSiサブクローン#18をSphI及びSalIを用いて消化し、1317bpのフラグメントをゲル単離した(図6C参照)。
【0145】
最後に、上述した以下のフラグメントを、pBS24.1 BamHI/SalI酵母発現ベクターへと連結し、ps.MEFA7(図6D参照)を作製した:
1896bpのBamHI/HindIIIフラグメント(図6A)
1560bpのHindIII/SphIフラグメント(図6A)
1317bpのSphI/SalIフラグメント(図6C)
S.cerevisiae株AD3をps.MEFA7を用いて形質転換し、単一の形質転換体を、培地中のグルコース枯渇後の発現についてチェックした。組換えタンパク質は、酵母中で高レベルで発現した(クーマシーブルー染色により検出した)。特に酵母細胞は、酢酸リチウムプロトコールを用いて、MEFA発現プラスミドで形質転換した。Ura−の形質転換体を画線培養して単コロニーを得、プラスミドのコピー数を増加させるためにLeu−/8%グルコースプレート上へと移植した。Leu−の出発培養物を24時間、30℃で生育させ、次いでYEPD(酵母エキスバクトトリプトン2%グルコース)培地中で1:20に希釈した。細胞を48時間、30℃で生育させ、回収した。MEFA 7組換え抗原の発現を試験するために、細胞のアリコートを溶解緩衝液(10mMのTris−Cl pH 7.5、1mMのEDTA、10mMのDTT)中でグラスビーズを用いて溶解した。溶解液を高速で遠心分離した。上清及び不溶性のペレットをSDSタンパク質ゲル上で分析した。MEFA 7は不溶性沈殿画分中に高度に濃縮された。
【0146】
MEFA 7抗原は以下のように精製した。MEFA 7を発現しているS.cerevisiae細胞を上述のように回収した。この細胞を溶解緩衝液(50mMのTris、0.15MのNaCl、1mMのEDTA、1mMのPMSF、pH 8.0)中に懸濁し、ダイノミル(Dyno−Mill)(Wab Willy A.Bachofon、Basel、スイス)又はグラスビーズを用いた相当する装置中で溶解させた。溶解液を低速条件(3,000〜5,000rpm、15分間)で遠心分離し、不溶性タンパク質画分を含むペレットを、溶解緩衝液中の尿素濃度を増加させながら(1M、2M、3M)洗浄した。0.1NのNaCl、4Mの尿素を含む溶解緩衝液を用いて、遠心分離のペレットからタンパク質を可溶化した。細胞残渣を3,000〜5,000rpm、15分間の低速遠心分離によって除去した。6NのHClを用いて上清をpH8.0に合わせ、これらの条件下で不溶性のタンパク質を沈殿させた。
【0147】
沈殿を遠心分離によって除去し、上清を2.3%のSDS、50mMのDTT、pH8.0に調整し、3分間煮沸した。混合物中のタンパク質を、0.1%のSDS、1mMのEDTAを含有し、pH7.4に調整したリン酸緩衝化生理食塩水中で、Pharmacia Sephacryl S−400上でのゲル濾過により分画した。MEFA 7を含むカラム溶出画分を回収し、プールし、Amicon YM−30膜上で濃縮した。プールされた画分を、同一のカラム及び条件を用いてゲル濾過を繰り返した。
【0148】
試験アッセイにおけるMEFA 7の分析の間に、検出結合体として使用されたモノクローナル抗体がコアエピトープ(アミノ酸33〜38)の特異的な配列と反応することが見いだされた。従って、ps.MEFA7.1を、コアエピトープ領域からのアミノ酸33〜38を除去するように設計した。
【0149】
MEFA7.1のための酵母発現ベクターは以下のように作製した。まず、ps.MEFA7の3’末端におけるコアエピトープの2回繰り返しを改変した。それを行うために、第1のコアエピトープ繰り返し(HCV−1のアミノ酸9〜32、39〜42及び64〜88、及びHCV−2のアミノ酸67〜82)をコードする206bpのNcoI/KpnI合成フラグメント、ならびにHCV−2のアミノ酸83および84、その後に第2のコアエピトープ繰り返し(HCV−1のアミノ酸9〜32、39〜42及び64〜88、及びHCV−2のアミノ酸67〜84)をコードする233bpのKpnI/SalI合成フラグメントを、それぞれpSP72new.NcoI/KpnIベクター及びpSP72new.KpnI/SalIベクターへとサブクローニングした。HB101形質転換、クローン同定及び配列確認後、pSP72newNKiクローン#21をNcoI及びKpnIを用いて消化して206bpのNcoI/KpnIフラグメントを単離し、pSP72newNSiクローン#32をKpnI及びSalIを用いて消化して、233bpのKpnI/SalIフラグメントを単離した。
【0150】
プラスミドps.MEFA7.1は、以下のフラグメントを、pBS24.1 BamHI/SalI酵母発現ベクターへと連結することにより組み立てた(図7参照):
ps.MEFA7について上述された1896bpのBamHI/HindIIIフラグメント;
ps.MEFA7について上述された1560bpのHindIII/SphIフラグメント;
ps.MEFA7から単離された、5−1−1エピトープ、c100エピトープ及びNS5エピトープをコードする776bpのSphI/NcoIフラグメント;
206bpのNcoI/KpnIフラグメント;
233bpのKpnI/SalIフラグメント。
【0151】
S.cerevisiae株AD3をps.MEFA7.1を用いて形質転換し、単一の形質転換体を、上述のように、培地中のグルコース枯渇後の発現についてチェックした。組換えタンパク質は、酵母中で高レベルで発現した(クーマシーブルー染色により検出した)。
【0152】
MEFA7.1抗原は以下のように精製した。MEFA7.1を発現しているS.cerevisiae細胞を上述のように回収した。この細胞を溶解緩衝液(50mMのTris、0.15MのNaCl、1mMのEDTA、pH 8.0)中に懸濁し、ダイノミル(Dyno−Mill)(Wab Willy A.Bachofen、Basel、スイス)又はグラスビーズを用いた相当する装置中で溶解させた。溶解液をJA−10ローター中、10,000rpm、30分間で遠心分離し、不溶性タンパク質画分を含むペレットを、溶解緩衝液中の尿素濃度を増加させながら(1M、2M、3M)洗浄した。0.1NのNaCl、4Mの尿素、50mMのDTTを含む溶解緩衝液を用いて、遠心分離のペレットからタンパク質を可溶化した。細胞残渣をJA−14ローター中、14,000rpm、20分間の遠心分離によって除去した。6NのHClを用いて上清をpH8.0に合わせ、これらの条件下で不溶性のタンパク質を沈殿させた。
【0153】
沈殿をJA−14ローター中、14,000rpm、20分間の遠心分離によって除去し、上清を2.3%のSDSに調整し、沸騰水中で70〜75℃に加熱し、次いで室温にさました。混合物中のタンパク質を、0.1%のSDS、1mMのEDTAを含有し、pH7.4に調整したPBS中で、Pharmacia Sephacryl S−400HR上でのゲル濾過により分画した。MEFA7.1を含むカラム溶出画分を回収し、プールし、Amicon YM−30膜上で濃縮した。プールされた画分を、同一のカラム及び条件の下でゲル濾過を繰り返した。プールされたゲル濾過画分を2.3%のSDS、50mMのDTTに調整し、上述のように加温/冷却した。このプールを、第1のゲル濾過工程と同様の条件下で、Pharmacia Sephacryl S−300 HRカラム上の第2のゲル濾過工程に供した。
【0154】
MEFA7.2についての酵母発現ベクターを以下のように作製した。この大きな多エピトープ融合抗原のクローニングを容易にするために、この分子を3つの制限フラグメントへと分割した。第1番目に、1896bpのBamΗI−HindIIIフラグメントをps_mefa7.1(上述)からゲル精製した。このフラグメントはADH2/GAPDHプロモーター、ヒトSOD及びHCV−1のE1エピトープをコードしていた。
【0155】
次のフラグメントである、E2 HVR−1a共通、E2 HCV1+2共通、及びヘリカーゼドメイン(プロテアーゼ切断部位をなくすためのアミノ酸1428、1429、1455、1456、1657及び1658における変異を伴う、HCV−1、アミノ酸1193〜1658)をコードする1560bpのHindIII−SphIフラグメントを、pGEM7ベクターへとサブクローニングした。特に、そのコード配列は、1428位、1455位及び1657位におけるそれぞれの天然のアミノ酸がロイシンに置換され、また、1429位、1456位及び1658位におけるそれぞれの天然のアミノ酸がプロリンに置換されるように変異された。従って、上記の組のそれぞれにおける変異は本明細書中で「LP」と称される。このサブクローンは、pGEM7 HindIII/SphIサブクローン#9(「pGEM7/HSi#9」と称し上述される)から以下のように得られた:(1)1560bpのHindIII−SphI挿入物を含むpGΕM7HindIII/SphIサブクローン#9をSacII+SphIを用いて消化し、脱リン酸化して、ゲル精製し、それにより3つのプロテアーゼ切断部位が配置された721bpのヘリカーゼを除去した。(2)最初の2箇所のLP変異を含むヘリカーゼの266bpのSacII−BglI部分をクローニングするために、合成オリゴを使用した。このクローニングを助けるために、オリゴは5’−末端及び3’−末端においてそれぞれEcoRI及びSalI部位を含んだ。このオリゴを、pUC19 EcoRI−SalIベクターへとクローニングした。HB101形質転換及び陽性コロニーの配列確認後に、pUC19 mefaSB#5を増幅して266bpのSacII−BglIフラグメントをゲル精製した。(3)429bpのBglI−EagIフラグメントを、pGEM7HindIII/SphIサブクローン#9からゲル精製した。ヘリカーゼのこの領域には変異が存在しない。(4)3番目の変異を含むヘリカーゼの26bpのEagI−SphI部分を完成させるために2つの付加的なオリゴを使用した。(5)266bpのSacII−BglIフラグメント、429bpのBglI−EagIフラグメント及び、これらの2つのオリゴをpGEM7HindIII/SphIサブクローン#9ベクターへと連結した。得られたpGEM7/SacII−EagI−SphI#6(図11A)と名付けられたΗB101クローンのひとつから、1560bpのHindIII/SphIフラグメントをMEFA7.2のためにゲル精製した。
【0156】
MEFA7.2にとって必要とされる3番目の制限フラグメントである、それぞれがプロテアーゼ切断部位におけるPI変異、C100エピトープ、2つののNS5エピトープ、及び2つのコアエピトープを有する、ΗCV1、2、3についての5−1−1ドメインをコードする1215bpのSphI−SalIフラグメントを以下のようにサブクローニングした:(1)ΗCV−1についての5−1−1 PIエピトープを、合成オリゴと共にpUC19 EcoRI−SalIベクターへとクローニングした。このオリゴは、EcoRIクローニング部位及びSalIクローニング部位にそれぞれ隣接したSphI部位及びNruI部位を含んでいた。HB101形質転換及び陽性クローンの配列確認後、pUC19 mefaSN#16を増幅し、147bpのSphI−NruI挿入物をゲル精製した。(2)HCV−3及びHCV−2についての5−1−1 PI、C100、及びNS5繰り返しをコードする629bpのNruI−NcoIフラグメントを、ps.mefa13#12(米国特許第6,630,298号(本明細書中にその全体が援用される)に記載される)からゲル精製した。(3)コアエピトープの2回の繰り返しをコードする439bpのNcoI−SalIフラグメントをps.mefa7.1#15からゲル精製した。(4)147bpのSphI−NruIフラグメント、629bpのNruI−NcoIフラグメント、及び439bpのNcoI−SalIフラグメントをpGEM5 SphI−SalIベクターへと連結した。得られたクローンのひとつであるpGEM5 SphI−SalI.mefa.7.2#62(図11B)から、1215bpのSphI−SalI挿入物をゲル単離した。
【0157】
最終的に、1869bpのBamHI−HindIIIフラグメント、1560bpのHindIII−SphIフラグメント及び1215bpのSphI−SalIフラグメントを、BamΗI−SalI pBS24.1酵母発現ベクターへと連結した。HB101形質転換及びミニスクリーン分析後、2つの陽性クローンが正確な大きさのBamHI−SalI挿入物を有することが見いだされた。プラスミドDNAを、ps.mefa7.2#3及びps.mefa7.2#42について増幅した(図11C)。
【0158】
S.cerevisiae株AD3を、Invitrogen Easy Comp Sc transformation kit(Invitrogen,San Diego、カリフォルニア)を使用して、ps.MEFA7.2で形質転換した。Ura−の形質転換体を画線培養して単コロニーを得、プラスミドのコピー数を増加させるためにLeu‐/8%グルコースプレート上へと移植した。Leu−の出発培養物を24時間、30℃で生育させ、次いでYEPD(酵母エキスバクトトリプトン2%グルコース)培地中で1:20に希釈した。細胞を48時間、30℃で生育させ、回収した。組換えタンパク質の発現を試験するために、細胞のアリコートを溶解緩衝液(10mMのTris−Cl pH 7.5、1mMのEDTA、10mMのDTT)中でグラスビーズを用いて溶解した。溶解液を高速遠心分離により清澄にした。不溶性のペレット画分をSDSタンパク質ゲルのクーマシー染色により分析した。120kDaのMEFA7.2タンパク質が高度に発現された。
【0159】
MEFAの存在は、上記MEFAのそれぞれがヒトSODのアミノ酸1〜156を含むので、SDS−PAGE(4〜20%のTris−グリシンゲル)及びh−SODに対するモノクローナル抗体を用いたウェスタンブロットを用いて確認した。
【0160】
MEFA7.2に関するDNA配列及び対応するアミノ酸配列を図9A〜9Fに示す。
【0161】
(実施例2)
(NS3/4aPIの生産)
NS3/4aPIは、通常1428位及び1429位に存在し、プロテアーゼの推定自己加水分解部位を除去するアミノ酸の変異を伴う、完全長NS3NS4aタンパク質(アミノ酸1027〜1711)である。米国特許第6,630,298号及び第6,632,601号を参照されたい。このエピトープは図13A〜13Dに特定される配列を有し、403位(HCV−1完全長配列のアミノ酸1428)及び404位(HCV−1完全長配列のアミノ酸1429)において天然の配列と異なっている。具体的には、天然の配列の1428位において通常ThrであるものがProへと変異し、天然の配列の1429位において通常SerであるものがIleへと変異している。この分子は「NS3/4aPI」と称された。この分子はまた、本明細書中で「NS3NS4a PI」とも呼ばれる。
【0162】
本明細書中でその全体が参考として援用される米国特許第6,632,601号に記載されたように、NS3/4aPIを生産し、酵母中で発現させた。NS3/4aPIタンパク質の存在は、NS3プロテアーゼドメインに対するポリクローナル抗体及び、NS4 5−1−1エピトープに対するモノクローナル抗体を用いたウェスタンブロットにより確認した。NS3/4aエピトープのプロテアーゼ活性は、MEFA7.1を基質として用い、以下にさらに記載するように実証した。
【0163】
(実施例3)
(MEFA 7.1及びMEFA 7.2におけるNS3/4aPIのタンパク分解性切断活性)
改変MEFAであるMEFA 7.2がタンパク分解性切断を受けないことを確認するために、以下の実験を行った。MEFA 7.1及びMEFA 7.2をそれぞれ、上述のように製造したNS3/4aPIと共に、室温にて30分間インキュベートした。タンパク質ゲルサンプルを調製し、4〜20% Tris−グリシンSDS−PAGE上で泳動して、クーマシーブルーを用いてゲルを染色した。さらに、hSODに対する抗体を用いてウェスタンブロットを行った。上述の通り、MEFA 7.1及びMEFA 7.2の両方がhSODと融合した。結果を図14A(SDS−PAGE)及び14B(ウェスタンブロット)中に示す。これで見られるように、NS3/4aはMEFA 7.1(レーン5、図14A及び図14B)を分解した。一方、MEFA7.2は、全く分解を示さなかった(レーン6、図14A及び図14B)。したがって、NS3タンパク分解性切断部位はMEFA 7.2中で首尾よく変異されていた。
【0164】
(実施例4)
(モノクローナル抗体及びポリクローナル抗体結合アッセイ)
HCV特異的組換えコア抗原、E1抗原、E2抗原、NS3抗原、NS4抗原、及びNS5抗原に対し惹起したモノクローナル抗体及びポリクローナル抗体を、抗原性の評価及びMEFA 7.1、MEFA 7.2及びNS3/4a PIにエピトープを曝すために使用した。精製MEFA又はNS3/4a PIをPBS(pH7.4)中で最適なコーティング濃度に希釈し、Costar high binding plates(Corning Inc.、Corning、ニューヨーク)上にコーティングした。線状エピトープ又は高次構造エピトープのいずれかに対する抗体を適宜希釈して、プレートへと添加した。37℃、1時間のインキュベーション後、そのプレートを洗浄し、西洋ワサビペルオキシダーゼ(HRP)と結合体化させたヤギ抗マウスIgG又はヤギ抗ウサギIgGと共に、1時間、37℃でインキュベートした。最後に、H2O2及び基質であるo−フェニレンジアミンジヒドロクロリド(OPD)を含有する発色緩衝液をウェルに添加し、492nm及び620nmにおける吸光度(O.D.)をプレートリーダーを用いて測定した。
【0165】
表3に示すように、試験されたエピトープに特異的な各々の抗体はMEFA 7.1及びMEFA 7.2の両方と反応し、(i)MEFA上の全ての主要エピトープが露出し、従って検出のために接近可能であること、及び(ii)MEFA7.2中のアミノ酸変異が線状エピトープの露出を変化させないことを示した。
【0166】
(実施例5)
(MEFA及びNS3/4aPIを用いたイムノアッセイ)
NS3のC33c抗原及びC22コア抗原は非常に免疫原性であり、C33c及びC22に対する抗体は初期セロコンバージョンパネルにおいて見出されている(Chienら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1992)89:10011−10015)。従って、セロコンバージョン感度を調べるために、HCV−1に感染したヒト血液サンプルの十分に特性が明らかにされた市販のC33c及びC22のパネルを用いて、イムノアッセイにおけるこの抗原の性能を試験した。以下の表に示すPHVパネルを、Boston Biomedica,Inc.、West Bridgewater、MA(BBI);Bioclinical Partners、Franklin、MA(BCP);及びNorth American Biologies,Inc.、BocoRatan、FL(NABI)から購入した。アッセイは、以下のように行った。
【0167】
HCV抗原をイムノアッセイのために以下のようにプレート上にコーティングした。HCVコーティング緩衝液(50mMのNa3PO4、pH7.0、2mMのEDTA及び0.1%のクロロアセタミド)を0.22μのフィルターユニットを通過させて濾過した。次いで以下の試薬を順にこのHCVコーティング緩衝液に加え、添加を行うごとに攪拌した:2μg/mlのスルフヒドリル改変BSA(10mg/ml溶液(Bayer Corp.Pentex、Kankakee、イリノイ)から);5mMのDTT(1M溶液(Sigma、St.Louis、ミズーリ)から);0.45μg/mlのNS3/4a(タンパク質濃度0.3mg/ml);0.375μg/mlのNS3.4aPI、MEFA 7.1又はMEFA 7.2(タンパク質濃度1mg/ml)。最後の溶液を室温で15分間攪拌した。
【0168】
200μlの上記溶液を、Costar high binding平底プレート(Corning Inc.、Corning、ニューヨーク)の各ウェルへと添加し、このプレートを室温にて16時間インキュベートした。次いでプレートを洗浄緩衝液(1×PBS、0.1%のTWEEN−20)で洗浄し、軽く叩いて乾燥させ、285μlのOrtho Post−Coat Buffer(1×PBS、pH7.4、1%のBSA、3%のスクロース)を添加した。プレートを少なくとも1時間インキュベートし、軽く叩いて、2〜8℃で一晩乾燥させた。このプレートを乾燥剤と共に袋に入れ、後の使用のために4℃にて保管した。
【0169】
HCVアッセイは以下のように行った。200μlの試料希釈緩衝液(1g/lのカゼイン、100mg/lの組換えヒトSOD、1g/lのクロロアセタミド、10g/lのBSA、500mg/lの酵母エキス、0.366g/lのEDTA、1.162g/lのKPO4、5ml/lのTween−20、29.22g/lのNaCl、1.627g/lのNaPO4、1%のSDS)を、コーティングしたプレートに添加した。次いで20μlのサンプルを添加した。これを37℃で、1時間インキュベートした。プレートを洗浄緩衝液(1×PBS、pH7.4、0.1%のTween−20)で洗浄した。200μlの結合体溶液(Enhanced SAVeバルク結合体希釈液(Ortho−Clinical Diagnostics、Raritan、ニュージャージー)を用いたORTHO HCV 3.0 ELISA Test System中で1:22,000に希釈されたマウス抗ヒトIgG−HRPなどのマウス抗ヒトIgG−HRP)を添加し、60分間、37℃でインキュベートした。これを上記のように洗浄し、200μlの基質溶液(1錠のOPD/10ml)を添加した。このOPDの錠剤は、西洋ワサビペルオキシダーゼ反応の発色進行のためのo−フェニレンジアミンジヒドロクロリド及び過酸化水素を含有する。これを30分間、室温にて暗所でインキュベートした。50μlの4NのH2SO4を加えることにより反応を停止し、コントロールとしての690nmにおける吸光度に対し、492nmでプレートを読み取った。カットオフ値を0.6000+3つの陰性コントロール血清の平均シグナル(O.D.)に設定した。1.0以上のS/CO値(カットオフ比を超えるシグナルのO.D.)のサンプルを陽性と考え、1.0を下回るものを陰性と考えた。
【0170】
このイムノアッセイを用いた結果を、市販の抗−HCV ELISAキットを用いて得られるものと比較した。特に、Abbott PRISMアッセイ(Abbott Laboratories,Abbott Park、イリノイ)は、市販の、抗体をベースとした検出アッセイである。製造者の説明書を使用してこのアッセイを実行した。ORTHO HCV Version 3.0 ELISA Test System(HCV 3.0)(Ortho Clinical Diagnostics、Raritan、ニュージャージー)は、抗体をベースとした検出アッセイである。製造者の説明書を使用してアッセイを実行した。Pasteur MONOLISA抗−HCV Plus Version 2アッセイ(Sanofi Diagnostics Pasteur、Marnes−la−Coquette、フランス)は、抗体をベースとした検出アッセイである。製造者の説明書を使用してこのアッセイを実行した。
【0171】
結果を表4に示す。試験したパネルについて、MEFA 7.1単独及びMEFA 7.2単独は非常に類似の免疫反応性を有し、いずれもセロコンバージョンパネルPHV913中のC22タイプ抗体及びPHV904及びPHV914パネルにおける後期採血中のC33cタイプ抗体を検出した(表4)。NS3/4a PIは、一方で、PHV904及びPHV914パネルの初期採血中のC33cタイプ抗体を検出した(表4)。従って、MEFA 7.1又はMEFA 7.2及びNS3/4a PIの組み合わせは、初期セロコンバージョンサンプル中のC22及びC33cに対する抗体を検出した。その検出は、C33c及びC22タイプ抗体における現在認可されたOrtho HCV 3.0及びAbbott Prismアッセイよりも、それぞれ2日間及び12日間先行した。
【0172】
全部で17の市販のHCVセロコンバージョンパネルを試験した。抗C33cタイプパネルに関して、新たな抗原は、9パネルのうち9つにおいて、Ortho 3.0およびAbbott Prismよりも2日間〜14日間先行した。抗C22(コア)タイプパネルに関して、新たな抗原は、8パネルのうち3つにおいてOrtho HCV 3.0よりも、また8パネルのうち2つにおいてAbbott Prismよりも、2日間〜5日間先行した。残りのパネルは同等であった。新たなアッセイと認可されたアッセイとの間で同等の性能を示す5つの抗コアパネルの中で、3パネルは抗体陰性から抗体陽性へと変化する間に長い採血間隔を有したことが重要視されるべきである:PHV 909(28日間)、PHV 911(11日間)、及びSC−0010(7日間)。表6を参照されたい。採血間隔の長さによって、これらの3パネルを用いて新アッセイと認可されたアッセイとの間のセロコンバージョン感度を比較することは困難であった。
【0173】
遺伝子型希釈感度もまた、この抗原を用いて、これら市販のアッセイに対して比較した。3つの全てのイムノアッセイを同時に行った。表5に示すように、連続的に希釈したHCV遺伝子型1〜6の全てが、HCV 3.0又はMonolisa Ver.2 Pasteurと比較して、MEFA 7.1およびNS3/4a PIを用いたELISAアッセイにおいて強く検出された。別個の実験においては、MEFA 7.1又はNS3/4a PIを単独で用いて遺伝子型希釈感度を比較した。
【0174】
まとめると、NS3/4a PI及びMEFA 7.1又はMEFA 7.2を利用するHCV抗体アッセイは、初期のセロコンバージョン検出及び種々の遺伝子型サンプルの検出の両方において、より優れた感度を達成した。アッセイの特異性は現在認可されたアッセイに匹敵した。両方の抗原は高度に精製され、製品の開発にとって好適な量で生産された。ひとたびNS3/4a PI及びMEFA 7.1又はMEFA 7.2が固相上にコーティングされると、それらは顕著に安定であった。融合タンパク質の免疫反応性はこれらの試験においては影響を受けないように見えた(表4及び表5)が、MEFA 7.1は複数のNS3/4a PIプロテアーゼ切断部位を有し、抗原をコーティングする間にいくつかのフラグメントへと分解された(図14A及び図14B)。改良されたMEFA 7.2は、NS3/4a PIの存在下では損なわれず(図14A及び図14B)、露出したエピトープ及び免疫反応性は、MEFA 7.1と非常に類似している(表3、表4及び表5)。これらのデータは、初期のセロコンバージョンサンプルにおける検出感度の増大がMEFA 7.1及びMEFA 7.2中の複数のエピトープに由来することを証明する;MEFA融合タンパク質それ自体の全体的な構造は、MEFA 7.2中で損なわれていない状態、又はMEFA 7.1中で分解したもののいずれかにおいて、初期のセロコンバージョン検出においてはほとんど影響がない。しかし、MEFAの完全性を維持することがイムノアッセイ成分の製造をより効果的なものとする。
【0175】
このように、新規な改変MEFA及び検出アッセイにおけるその使用が開示された。上述から、本発明の具体的態様が説明を目的として本明細書中に記載されているが、その精神及び範囲を逸脱しない多様な改変が行われ得ることが理解されるであろう。
【0176】
(表3. 露出したHCVエピトープについてのMEFA 7.1及びMEFA 7.2のELISA分析)
【0177】
【表3】
(表4. HCVセロコンバージョン検出の比較)
【0178】
【表4】
AQ:K
a S/COが1以上を陽性とし、太字で示す。カットオフ値は、材料及び方法に示すように計算する。
b MEFA 7.1又はMEFA 7.2と組み合わせたNS3NS4aPIを用いた検出が、現在認可されたアッセイによる検出よりも先行する日数。
【0179】
(表5. HCV遺伝子型希釈感度の比較)
【0180】
【表5】
AQ:L aND、測定なし
(表6. 17のセロコンバージョンパネルの試験のまとめ)
【0181】
【表6】
a HCVパネル供給元により提供されたデータ。
b 現在認可されているアッセイである、Ortho HCV Version 3.0 ELISA Test System又はAbbott PRISMに対する、NS3NS4a PIと組み合わせたMEFA 7.1を用いたアッセイ感度の比較。
c 抗体陰性から抗体陽性へと変化する間の採血間隔:PHV 909については28日間、PHV 911については11日間、そしてSC−0010パネルについては7日間。
【図面の簡単な説明】
【0182】
【図1】図1は、HCVゲノムを図示したものであり、本発明のアッセイ試薬(タンパク質及び抗体)が由来するポリタンパク質の種々の領域を示す。
【図2】図2は、HCV抗原が固体支持体上に固定化されている、本発明に従う改変MEFAを用いた代表的イムノアッセイの概略図である。
【図3】図3は、ストレプトアビジンによってコーティングされた固体支持体と共に改変MEFAを用いる代表的イムノアッセイ様式の概略図である。
【図4】図4は、MEFA7.1を図示したものである。
【図5】図5A〜5F(配列番号1及び配列番号2)は、MEFA7.1のDNA及び対応するアミノ酸配列を示す。
【図6A】図6A〜6Dは、psMEFA7の構築の図である。
【図6B】図6A〜6Dは、psMEFA7の構築の図である。
【図6C】図6A〜6Dは、psMEFA7の構築の図である。
【図6D】図6A〜6Dは、psMEFA7の構築の図である。
【図7】図7は、psMEFA7.1の構築の図である。
【図8】図8は、MEFA7.2を図示したものである。
【図9】図9A〜9F(配列番号3及び配列番号4)は、MEFA7.2のDNA及び対応するアミノ酸配列を示す。
【図10A】図10A〜10Bは、MEFA7.1(配列番号2)とMEFA7.2(配列番号4)との間のアミノ酸配列の比較を示す。異なる点を太字で示す。
【図10B】図10A〜10Bは、MEFA7.1(配列番号2)とMEFA7.2(配列番号4)との間のアミノ酸配列の比較を示す。異なる点を太字で示す。
【図11A】図11A〜11Cは、ps.mefa7.2の構築の図である。
【図11B】図11A〜11Cは、ps.mefa7.2の構築の図である。
【図11C】図11A〜11Cは、ps.mefa7.2の構築の図である。
【図12】図12A〜12Cは、本発明のイムノアッセイに用いるために改変し得る代表的なMEFAを示す。図12AはMEFA3を図示したものである。図12BはMEFA5を図示したものである。図12CはMEFA6を図示したものである。
【図13】図13A〜13D(配列番号5及び配列番号6)は、本明細書中で「NS3/4a PI」と名付けた、本発明のアッセイに使用するための代表的なNS3/4a高次構造抗原のDNA及び対応するアミノ酸配列を示す。図13A〜13Dにおける403位及び404位のアミノ酸は、HCV−1の天然のアミノ酸配列におけるThrに対するPro及びSerに対するIleの置換を表す。
【図14】図14A及び14Bは、NS3/4a PIのプロテアーゼ活性並びにMEFA7.1及びMEFA7.2に及ぼすその影響を示す。図14AはSDS−PAGEゲルを示し、図14Bはウェスタンブロットを示す。
【技術分野】
【0001】
(関連出願の引用)
本出願は、米国特許法第119条(e)(1)に基づき、米国仮特許出願第60/621,790号(2004年10月25日出願);同第60/621,502号(2004年10月22日出願);同第60/618,390号(2004年10月12日出願);および同第60/604,858号(2004年8月27日出願)の優先権を主張する。上記出願の全ては、本明細書中でその全体が参考として援用される。
【0002】
(技術分野)
本発明は、概して、C型肝炎ウイルス(HCV)構築物及びその使用方法に関する。より詳細には、本発明は、NS3によるMEFAのタンパク分解性切断を阻害するための改変アミノ酸配列を有する、複数のHCVエピトープを含む免疫原性HCV多エピトープ融合抗原(MEFA)に関する。このタンパク質は、HCV感染を診断するためのイムノアッセイにおいて有用である。
【背景技術】
【0003】
(発明の背景)
HCVは、約3010個のアミノ酸をコードする約9.5kbの一本鎖プラスセンスRNAゲノムを有するエンベロープウイルスである(非特許文献1;非特許文献2)。HCVポリタンパク質は宿主及びウイルスのプロテアーゼによりプロセシングされて、いくつかの成熟タンパク質:コア(core)タンパク質(C)、エンベロープ糖タンパク質(E1及びE2)、及び6つの非構造タンパク質(NS2、NS3、NS4a、NS4b、NS5a、NS5b)(非特許文献3;非特許文献4)となる。NS3は3つの酵素活性を有する630アミノ酸のタンパク質である:N−末端の約180アミノ酸はセリンプロテアーゼ機能を提供し、残るC末端ドメインはヘリカーゼ及びNTPase活性の両方を有する(非特許文献5;非特許文献6;非特許文献7)。NS3プロテアーゼはNS3/4a、NS4a/4b、NS4b/5a及びNS5a/5b接合部位における切断に関与する(非特許文献8)。NS4aは約54アミノ酸を含み、NS3プロテアーゼの補因子として作用し、ポリタンパク質のプロセシングに不可欠である(非特許文献9)。
【0004】
HCVは輸血及び地域感染型の非A非B型ウイルス性肝炎に関連する主要な病原因子である(非特許文献10;非特許文献11;非特許文献12)。HCVは現在、世界人口の約3%に発症している。これらの者の70%がHCV慢性感染症を患い、それはしばしば肝硬変及び肝細胞癌へと進行する(非特許文献13;非特許文献14)。輸血後のHCVの出現率は、血液ドナーの中でのHCV抗体に関する慣用的なスクリーニングの実施以来、徐々に減少してきている(非特許文献15)。血液スクリーニングのための、及び、症状のある患者におけるHCV感染の診断のための、これらのアッセイの実績ある実用性にもかかわらず、アッセイ性能の向上へむけた重要な挑戦が残っている。そのような挑戦には、血清反応陰性の時期の短縮、免疫抑制患者からのHCVサンプルの検出の改善、及び、異なるHCV遺伝子型特異的なエピトープに対する抗体を検出するアッセイ感度の向上を含む。
【0005】
HCV感染の血清診断のためのいくつかのアッセイが開発されている。例えば、非特許文献11;非特許文献12;非特許文献16;非特許文献17;非特許文献18;非特許文献19;Chien,D.Y.,特許文献1;Valenzuelaら,特許文献2;及びKashiwakumaら,特許文献3参照。
【0006】
現在認可されているHCV ELISA抗体試験は、主に線状エピトープを含有する組換えタンパク質を用いる。例えば、コア(C22−3)、NS3及びNS4領域(C200)及びNS5からの3つの組換えHCVタンパク質が、市販のHCVアッセイのひとつにおいて使用されている(非特許文献20)。本明細書中でその全体が参考として援用される特許文献4は、多エピトープ融合抗原(MEFA)と組み合わせたNS3/4a高次構造エピトープを用いたイムノアッセイを記載している。HCV MEFAの記載については、例えば、非特許文献21;特許文献2;特許文献4;特許文献5;特許文献6;及び特許文献7参照。これらの試薬を用いたアッセイは、初期のHCVセロコンバージョンを検出するための感度及び信頼できる方法を提供する。酵母において発現され、特許文献4に記載される非変性条件下で精製されるNS3/4aは、プロテアーゼ機能及びヘリカーゼ機能の両方を含む。この方法で精製されたNS3/4aは天然の高次構造を保存しているため、初期セロコンバージョン抗体検出においてc200又はc33c抗原よりも感度が高いことが見出されている。抗原としてNS3/4a及びMEFA7.1を用いる抗体アッセイにおいて、セロコンバージョン抗体は現在認可されているHCVアッセイよりも2〜14日間早く検出される。しかしながら、NS3/4タンパク質はNS3プロテアーゼ活性によって自己加水分解を受け、また、MEFA7.1を切断する。
【0007】
特許文献8及び特許文献9、及び同所有者の仮特許出願第60/604,858号は、タンパク質分解活性の低減を伴う変異されたNS3プロテアーゼドメインを含むHCVタンパク質を記載する。しかしながら、十分な患者のケアを提供するため、並びに血液及び血液製剤又は親密な個人的接触によるHCVの感染を予防するための、高感度で正確な診断的及び予測的なツールへの需要が未だに残っている。
【特許文献1】国際公開第94/01778号パンフレット
【特許文献2】国際公開第97/44469号パンフレット
【特許文献3】米国特許第5,871,904号明細書
【特許文献4】米国特許第6,632,601号明細書
【特許文献5】米国特許第6,514,731号明細書
【特許文献6】米国特許第6,428,792号明細書
【特許文献7】米国特許出願公開第20040142321号明細書
【特許文献8】国際公開第04/00547号パンフレット
【特許文献9】国際公開第01/38360号パンフレット
【非特許文献1】Chooら,Proc.Natl.Acad.Sci USA,1991年,第88巻,p.2451−2455
【非特許文献2】Takamizawaら,J.Virol.,1991年,第65巻,p.1105−1113
【非特許文献3】HijikataらProc.Natl.Acad.Sci.USA,1993年,第90巻,p.10773−10777
【非特許文献4】Grakouiら,J Virol.,1993年,第67巻,p.1385−1395
【非特許文献5】Bartenschlagerら,J Virol.,1993年,第67巻,p.3835−3844
【非特許文献6】Kimら,Biochem.Biophys.Res.Commun.,1995年,第215巻,p.160−166
【非特許文献7】Preugschatら,J.Biol.Chem.,1996年,第271巻,p.24449−24457
【非特許文献8】Grakouiら,J.Virol.,1993年,第67巻,p.2832−2843
【非特許文献9】Faillaら,J.Virol.,1994年,第68巻,p.3753−3760
【非特許文献10】Alterら,N.Engl.J.Med.,1989年,第321巻,p.1494−1500
【非特許文献11】Chooら,Science,1989年,第244巻,p.359−362
【非特許文献12】Kuoら,Science,1989年,第244巻,p.362−364
【非特許文献13】Bruixら,Lancet,1989年,第2巻,p.1004−1006
【非特許文献14】Saitoら,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,1990年,第87巻,p.6547−6549
【非特許文献15】Pillonelら,Transfusion,2002年,第42巻,p.980−988
【非特許文献16】Chooら,Br.Med.Bull.1990年,第46巻,p.423−441
【非特許文献17】Ebelingら,Lancet,1990年,第335巻,p.982−983
【非特許文献18】van der Poelら,Lancet,1990年,第335巻,p.558−560
【非特許文献19】van der Poelら,Lancet,1991年,第337巻,p.317−319
【非特許文献20】Uyttendaeleら,Vox Sang.,1994年,第66巻,p.122−129
【非特許文献21】Chienら、J.Clin.Microbiol.,1999年,第37巻,p.1393−1397
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【0008】
(発明の要旨)
本発明は、NS3プロテアーゼに対する変異された切断部位を有するMEFAがHCV感染を検出可能であることを見出したことに部分的に基づく。この改変HCV MEFAは免疫反応性であり、HCV NS3プロテアーゼによるタンパク分解性切断をより受けにくい。すなわち、このMEFAは、NS3タンパク質分解活性を有するHCVポリペプチド等の付加的なHCVポリペプチドと組み合わせて、イムノアッセイに使用することができる。本発明の1つの代表的な実施形態において、改変MEFAは、イムノアッセイ固体支持体上でNS3/4a高次構造エピトープと組み合わせて使用される。本発明のMEFAはイムノアッセイ成分の製造中に分解せず、従ってHCVアッセイ中で使用するための、よりすぐれた試薬を提供する。
【0009】
MEFAの使用は、基質の単位面積あたりのより多くのエピトープを可能にすることによって、マスキングの問題の減少、選択性向上、及び抗体検出感度の向上という利点を提供する。本明細書中で記載するアッセイを、HCVにおいて公知の6つの遺伝子型のいずれかにより引き起こされるHCV感染を検出するために使用することができる。
【0010】
したがって、1実施形態において、本発明は、改変HCV多エピトープ融合抗原(MEFA)であって、そのMEFAは、HCV NS3タンパク分解性切断部位を含むHCVヘリカーゼドメインからの少なくとも1つのエピトープ及びHCV NS3タンパク分解性切断部位を含むNS4領域からの少なくとも1つのエピトープを含み、そのヘリカーゼドメインエピトープ及びNS4エピトープ中に存在するHCV NS3のタンパク分解性切断部位は、変異のない対応するMEFAのタンパク分解性切断と比較してNS3によるMEFAのタンパク分解性切断が阻害されるように変異されており、さらに、その改変MEFAは、HCV感染個体からの生物学的サンプル中に存在する抗HCV抗体と特異的に反応するものである、改変MEFAに関する。
【0011】
特定の実施形態において、切断部位への変異は、HCV−1配列に対して番号付けされた1428位、1429位、1455位及び1456位に見られる天然のアミノ酸の置換等の、それぞれの部位における少なくとも1個のアミノ酸の置換を含む。他の実施形態において、改変MEFAは、HCV−1配列に対して番号付けされた1657位及び1658位に見られる、天然のアミノ酸のNS3/4a接合部における置換を含む。
【0012】
なおさらなる実施形態において、NS4領域からのエピトープは5−1−1であり、HCV−1配列に対して番号付けされた1711位及び1712位に見られる、天然のアミノ酸の置換を含む。特定の実施形態において、MEFAはHCV株1、2及び3それぞれからの3つの5−1−1エピトープを含み、ここで、HCV−1配列に対して番号付けされた、5−1−1エピトープのそれぞれにおける1711位及び1712位に見られる天然のアミノ酸のそれぞれは置換されている。
【0013】
さらなる実施形態において、MEFAは、HCV−1の配列に対して番号付けされた1428位、1429位、1455位、1456位、1657位及び1658位に見られる天然のアミノ酸の置換を有する、HCV−1に対して番号付けされた1193位〜1658位のアミノ酸に対応する連続するアミノ酸配列を含み、このMEFAは、HCV株1、2及び3それぞれからの3つの5−1−1エピトープをさらに含み、ここで、5−1−1エピトープのそれぞれは、HCV−1の配列に対して番号付けされた1711位及び1712位に見られる天然のアミノ酸のそれぞれに置換を有する、HCV−1に対して番号付けされた1689位〜1735位のアミノ酸に対応する連続するアミノ酸配列を含む。
【0014】
さらなる実施形態において、MEFAは、配列番号4に示される連続するアミノ酸配列に対して少なくとも80%の(例えば少なくとも90%、又は少なくとも98%)配列同一性を有するアミノ酸配列、あるいはそれに対して少なくとも80%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、但しここで、配列番号4の466位、467位、493位、494位、695位、696位、721位、722位、770位、771位、819位及び820位にあるアミノ酸は、MEFAのNS3タンパク分解性切断を阻害する変異を維持する。特定の実施形態において、MEFAは、配列番号4に示される連続するアミノ酸配列を含む。なおさらなる実施形態において、このMEFAは、配列番号4に示される連続するアミノ酸配列からなる。
【0015】
さらなる実施形態において、本発明は、上述の改変MEFAを含むイムノアッセイ固体支持体に関する。さらなる実施形態において、このイムノアッセイ固体支持体は、少なくとも1つのHCV NS3/4a高次構造エピトープをさらに含み、ここで、このNS3/4a高次構造エピトープは、HCV感染個体からの生物学的サンプル中に存在する抗HCV抗体と特異的に反応する。
【0016】
特定の実施形態において、このNS3/4a高次構造エピトープは、配列番号6に示される連続するアミノ酸配列に対して、少なくとも80%(例えば、少なくとも90%、又は少なくとも98%)の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。特定の実施形態において、このNS3/4a高次構造エピトープは、配列番号6に示される連続するアミノ酸配列を含む。他の実施形態において、このNS3/4a高次構造エピトープは、配列番号6に示される連続するアミノ酸配列からなる。
【0017】
さらなる実施形態において、本発明は、生物学的サンプル中のC型肝炎ウイルス(HCV)感染を検出する方法に関する。この方法は以下を包含する:
(a)上述のイムノアッセイ固体支持体を提供する工程;
(b)HCV抗体が生物学的サンプル中に存在する場合、その抗体をMEFAと、NS3/4a高次構造エピトープが存在する場合にはこのNS3/4a高次構造エピトープとに結合させて第1の免疫複合体を形成させる条件下で、その生物学的サンプルを固体支持体と結合させる工程;
(c)複合体形成条件下で、工程(b)からの固体支持体に、検出可能に標識された抗体を添加する工程であって、ここで、その標識化抗体が免疫複合体と反応性である工程;及び
(d)検出可能に標識された抗体と第1の免疫複合体との間で形成される第2の免疫複合体が存在する場合、この第2の免疫複合体を、生物学的サンプルにおけるHCV感染の指標として検出する工程。
【0018】
なおさらなる実施形態において、本発明は、上述のイムノアッセイ固体支持体を含む免疫診断検査キット及びその免疫診断検査を実施するための説明書に関する。
【0019】
さらなる実施形態において、本発明は、上述の改変MEFAにのコード配列を含むポリヌクレオチドと、このポリヌクレオチド及び制御エレメントを含む組換えベクターであって、この制御エレメントがそのコード配列が宿主細胞中で転写され翻訳され得るようにこのポリヌクレオチドに作動可能に連結されている組換えベクターとに関する。さらなる実施形態において、本発明は、この組換えベクターを用いて形質転換された宿主細胞に関する。なおさらなる実施形態において、本発明は以下を含む組換えMEFAの製造方法に関する:
(a)上述の宿主細胞の集団を準備する工程;及び
(b)組換えベクター中に存在するコード配列によってコードされている多エピトープ融合抗原が発現される条件下で、この細胞の集団を培養する工程。
【0020】
なおさらなる実施形態において、本発明は以下を包含するイムノアッセイ固体支持体の製造方法に関する:
(a)固体支持体を提供する工程;及び
(b)固体支持体に、上述の少なくとも1つの改変MEFAを結合させる工程。
【0021】
特定の実施形態において、本発明はさらに、HCV NS3/4a高次構造エピトープを上記固体支持体の別々の位置へと結合させることを含み、ここでこの高次構造エピトープは、HCV感染個体からの生物学的サンプル中に存在する抗HCV抗体と特異的に反応する。特定の実施形態において、このNS3/4a高次構造エピトープは、配列番号6に示される連続するアミノ酸配列に対して、少なくとも80%(例えば、少なくとも90%、又は少なくとも98%)の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。特定の実施形態において、このNS3/4a高次構造エピトープは、配列番号6に示される連続するアミノ酸配列を含む。他の実施形態において、このNS3/4a高次構造エピトープは、配列番号6に示される連続するアミノ酸配列からなる。
【0022】
これらの及びその他の本発明の態様は、以下の詳細な説明及び添付の図面を参照して明らかになるであろう。さらに、特定の手順又は組成をより詳細に記載する種々の参照文献が本明細書中に示され、それらの全体は本明細書中で参考として援用される。
【0023】
(発明の詳細な説明)
本発明の実施は、特に明記されない限り、当該分野の当業者の技術の範囲内の従来の化学的方法、生物化学的方法、組換えDNA技術による方法および免疫学的方法を使用する。このような技術は、文献中に完全に説明されている。例えば、Fundamental Virology,第2版,第I巻および第II巻(B.N.FieldsおよびD.M.Knipe編);Handbook of Experimental Immunology,第I巻〜第IV巻(D.M.WeirおよびC.C.Blackwell編,Blackwell Scientific Publications);T.E.Creighton,Proteins:Structures and Molecular Properties(W.H.Freeman and Company,1993);A.L.Lehninger,Biochemistry(Worth Publishers,Inc.,最新版);Sambrookら、Molecular Cloning:A Laboratory Manual(第2版、1989年);Methods In Enzymology(S.ColowickおよびN.Kaplan編、Academic Press,Inc.)を参照のこと。
【0024】
本明細書中に引用される全ての刊行物、特許および特許出願は、前出および後出を問わず、本明細書によってその全体が参考として援用される。
【0025】
本明細書および添付の特許請求の範囲で使用される、単数形「a」、「an」、および「the」には、文脈中で明らかに別のものを示さない限り、複数形が含まれることに留意しなければならない。したがって、例えば、「抗原(an antigen)」という言及には、2種以上のこのような抗原の混合物が含まれる、などである。
【0026】
以下のアミノ酸の略語は、本明細書を通して使用される:
アラニン:Ala(A) アルギニン:Arg(R)
アスパラギン:Asn(N) アスパラギン酸:Asp(D)
システイン:Cys(C) グルタミン:Gln(Q)
グルタミン酸:Glu(E) グリシン:Gly(G)
ヒスチジン:His(H) イソロイシン:Ile(I)
ロイシン:Leu(L) リジン:Lys(K)
メチオニン:Met(M) フェニルアラニン:Phe(F)
プロリン:Pro(P) セリン:Ser(S)
トレオニン:Thr(T) トリプトファン:Trp(W)
チロシン:Tyr(Y) バリン:Val(V)。
【0027】
(I.定義)
本発明の記載において、以下の用語が使用され、そして以下で示すように定義されることが意図される。
【0028】
用語「含む(comprising)」は、「含む(including)」および「構成する(consisting)」を包含し、例えば、Xを「含む(comprising)」組成物は、Xのみから構成されてもよく、または何かをさらに含んでもよい(例えば、X+Y)。
【0029】
用語「実質的に」は、「完全に」を排除するものではなく、例えば、Yを「実質的に含まない」組成物は、Yを全く含まなくてもよい。必要である場合、語「実質的に」は、本発明の定義から割愛され得る。
【0030】
用語「ポリペプチド」および「タンパク質」とは、アミノ酸残基のポリマーをいい、産物の長さの下限に制限されない。したがって、ペプチド、オリゴペプチド、ダイマー、および多量体などは、この定義の範囲内に含まれる。全長タンパク質およびそのフラグメントの両方は、この定義に含まれる。この用語はまた、ポリペプチドの発現後改変(例えば、グリコシル化、アセチル化、およびリン酸化など)を含む。さらに、本発明の目的のために、「ポリペプチド」とは、タンパク質が所望の活性を保持する限り、天然の配列の改変(例えば、欠失、付加、および置換(一般に、本質的に保存的である))を含むタンパク質をいう。これらの改変は部位特異的変異誘発による意図的なものであっても、タンパク質を産生する宿主の変異またはPCR増幅に起因するエラーなどによる偶発的なものであってもよい。
【0031】
HCVポリペプチドは、HCVポリタンパク質に由来する、上に定義されるようなポリペプチドである。このポリペプチドは、物理的にHCVに由来することを必要とせず、合成的または組換え的に産生され得る。さらに、このポリペプチドは、種々のHCV株および単離物(例えば、HCVの株1、株2、株3、株4、株5もしくは株6に由来する単離物のいずれかであるが、これらに限定されない)のいずれかに由来し得る。これらの株の間の多くの保存領域および可変領域が公知であり、そして一般的に、これらの領域に由来するエピトープのアミノ酸配列は、2つの配列が並列された場合に、高度の配列相同性(例えば、30%を超える(好ましくは、40%を超える)アミノ酸配列相同性)を有する。従って、例えば、用語「NS3/4a」ポリペプチドとは、種々のHCV株のいずれかに由来する天然のNS3/4a、ならびに以下でさらに定義されるようなNS3/4aアナログ、NS3/4aムテインおよびNS3/4a免疫原性フラグメントをいう。これらの株の多くの完全な遺伝子型は、公知である。例えば、米国特許第6,150,087号およびGenBank登録番号AJ238800および同AJ238799を参照されたい。
【0032】
HCVポリタンパク質に「由来する」ポリペプチドは、参照HCVポリタンパク質の1つ以上の領域もしくは領域の部分の配列を含むポリペプチドを意図する。代表的には、ポリペプチドは、エピトープを含む領域もしくは領域の部分からなり、一般に、以下で規定する参照ポリペプチドに実質的に相同なアミノ酸配列を有する。従って、用語「由来する」は、分子の元来の供給源を同定するために使用されるが、この分子が作製される方法(例えば、化学合成による方法もしくは組換え手段による方法であり得る)を限定することを意味しない。
【0033】
用語「アナログ」および「ムテイン」とは、所望の活性(例えば、本明細書中で記載されるアッセイにおける免疫反応性)を保持する、参照分子の生物学的に活性な誘導体、またはこのような誘導体のフラグメントをいう。一般的に、用語「アナログ」とは、天然の分子に対する1個以上のアミノ酸の付加、置換(一般的に本質的に保存的であるか、または改変MEFAの場合においては、NS3タンパク分解性切断部位において一般的に本質的に非保存的である)および/または欠失を(これらの改変が免疫原性活性を破壊しない限り)含む、天然のポリペプチド配列および構造を有する化合物をいう。用語「ムテイン」とは、1種以上のアミノ酸様分子(アミノ分子および/またはイミノ分子のみを含む化合物、1種以上のアミノ酸のアナログ(例えば、非天然アミノ酸などが挙げられる)を含むポリペプチド、置換された連結を有するポリペプチド、ならびに当該分野で公知の他の改変(環状分子および分枝状分子などの、天然に存在する分子および天然に存在しない(例えば合成の)分子の両方)が挙げられるが、これらに限定されない)を有するポリペプチドをいう。この用語はまた、1種以上のN置換グリシン残基(「ペプトイド」)および他の合成アミノ酸もしくは合成ペプチドを含む分子をも含む。(例えば、ペプトイドの記載について、米国特許第5,831,005号;同第5,877,278号;および同第5,977,301号;Nguyenら,Chem Biol.(2000)7:463−473;ならびにSimonら,Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1992)89:9367−9371を参照されたい。)好ましくは、アナログまたはムテインは、少なくとも天然の分子と同一の免疫活性を有する。ポリペプチドアナログおよびムテインを作製するための方法は、当該分野で公知であり、そして以下にさらに記載される。
【0034】
上記で説明される通り、アナログは、一般的に、天然において保存的な置換(すなわち、その側鎖において関連するアミノ酸のファミリー内で起こる置換)を含む。具体的には、アミノ酸は、一般的に、以下の4つのファミリーに分類される:(1)酸性−−アスパラギン酸およびグルタミン酸;(2)塩基性−−リジン、アルギニン、ヒスチジン;(3)非極性−−アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン;および(4)非荷電極性−−グリシン、アスパラギン、グルタミン、システイン、セリン、トレオニン、チロシン。フェニルアラニン、トリプトファン、チロシンは、ときとして、芳香族アミノ酸として分類される。例えば、ロイシンのイソロイシンまたはバリンとの単独置換、アスパラギン酸のグルタミン酸との単独置換、トレオニンのセリンとの単独置換、または同様の、構造的に関連するアミノ酸によるアミノ酸の保存的置換は、生物学的活性に大きな影響を与えないことが合理的に予測可能である。例えば、目的のポリペプチドは、この分子の所望の機能がインタクトなままである限り、約5〜10個までの保存的アミノ酸置換もしくは非保存的アミノ酸置換、またはさらに約15〜25個までの保存的アミノ酸置換もしくは非保存的アミノ酸置換、または5〜25の間の任意の整数の保存的アミノ酸置換もしくは非保存的アミノ酸置換を含み得る。当業者は、当該分野で周知のHopp/WoodsプロットおよびKyte−Doolittleプロットを参照することにより、目的の分子の変化を許容し得る領域を容易に決定し得る。
【0035】
用語「多エピトープ融合抗原」もしくは「MEFA」は、本明細書中で使用される場合、多数のウイルス抗原が、天然に存在しない、1つの連続したアミノ酸の鎖として編成されているポリペプチドを意図する。本明細書中で使用される場合、MEFAは、HCV抗原に限定される。HCV抗原は、ペプチド結合によって互いに直接接続してもよく、または介在するアミノ酸配列によって分離されてもよい。融合抗原はまた、HCVポリタンパク質に対して外因性である配列をも含み得る。さらに、存在するHCV配列は、多数のHCVの遺伝子型および/または多数のHCVの単離物に由来し得る。本発明のイムノアッセイにおける使用のための改変され得る特定のMEFAの例は、例えば、国際出願公開第97/44469号、米国特許第6,514,731号、同第6,428,792号および同第6,632,601号(これらの全ては本明細書中で参考として援用される)において詳述されており、さらに以下で説明される。
【0036】
「改変MEFA」は、1つ以上のNS3タンパク分解性切断部位において、天然に存在するHCV抗原配列に対する(MEFA上のNS3のプロテアーゼ活性が阻害されるような)変異を有する、上で定義したようなMEFAを意味する。改変MEFAは、したがって、親の非改変MEFAと比較して、NS3プロテアーゼによるタンパク分解性切断に対して感受性がより低い。改変MEFAは、ヘリカーゼドメインに由来する少なくとも1種の改変エピトープ(好ましくはNS4a/NS4bおよび/またはNS5aに由来するエピトープ)を含む。「改変エピトープ」により、天然に存在するアミノ酸配列と比較して、エピトープ内の1つ以上のNS3タンパク分解性切断部位が変異され、それによってNS3プロテアーゼによるMEFAのタンパク分解性切断が阻害されることを意味する。改変MEFAに存在するこの変異は、天然の分子と比較して1つ以上のアミノ酸の付加、置換(一般的に天然において非保存的である)および/または欠失を含み得、ここで、NS3タンパク分解性切断に対する感受性は、低下させられるかまたは削除される。目的のMEFAのタンパク分解性切断を測定する方法は、当該分野で公知であり、これは、目的のMEFAをNS3タンパク分解性活性を有することが既知であるタンパク質(例えば以下でさらに議論されそして図13A〜図13Dに示されるNS3/4a高次構造抗原)と共にインキュベートする工程、およびこのMEFAを切断についてモニタリングする工程を包含する。このアッセイは、実施例において詳細に記載される。
【0037】
「フラグメント」は、インタクトな全長ポリペプチド配列および構造の、一部のみからなるポリペプチドを意図する。フラグメントは、天然のポリペプチドのC末端の欠失、および/またはN末端の欠失を含み得る。特定のHCVタンパク質の「免疫原性フラグメント」は、一般的に、エピトープを規定する全長分子の少なくとも約5〜10個の連続するアミノ酸残基、好ましくは全長分子の少なくとも約15〜25個の連続するアミノ酸残基、最も好ましくは全長分子の少なくとも約20〜50個またはそれより多くの連続したアミノ酸残基、あるいは5個のアミノ酸と全長配列との間の任意の整数の連続したアミノ酸残基を含むが、但しここで、目的のフラグメントは、本明細書中に記載されるアッセイにおいて免疫反応性を保持することが条件である。例えば、好ましい免疫原性フラグメントとしては、以下が挙げられるが、これらに限定されない:例えば、ポリタンパク質の10〜45、10〜53、67〜88および120〜130のアミノ酸を含むHCVコアのフラグメント、エピトープ5−1−1(ウイルスゲノムのNS4a/NS4b領域内)、ならびに図1で示されるポリタンパク質の任意の領域(例えば、HCVポリタンパク質のE1領域、E2領域、NS3領域(例えばNS3領域由来のc33cポリペプチド)、NS4領域(例えばNS3/NS4領域由来のc100ポリペプチド)、NS3/4a領域およびNS5領域であるが、これらに限定されない)に由来する規定のエピトープ、ならびにHCVポリタンパク質から同定された任意の種々の他のエピトープ。例えば、Chienら,Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1992)89:10011−10015;Chienら,J.Gastroent.Hepatol.(1993)8:S33−39;Chienら,国際出願公開第93/00365号;Chien,D.Y.,国際出願公開第94/01778号;米国特許第6,150,087号および同第6,121,020号(これら全ては、本明細書中でその全体が参考として援用される)を参照されたい。
【0038】
本明細書中で使用される場合、用語「エピトープ」とは、少なくとも約3〜5個、好ましくは約5〜10個または15個、および約1,000個以下(またはその間の任意の整数)のアミノ酸のポリペプチド配列であって、それ自体の配列またはより長い配列の一部を規定し、このような配列に対する応答において産生される抗体に結合する配列をいう。フラグメントの長さの決定的な上限は存在せず、このフラグメントは、タンパク質配列のほぼ全長を含んでもよく、HCVポリタンパク質由来の2種以上のエピトープを含む融合タンパク質ですら含んでもよい。本発明で使用するためのエピトープは、由来する親タンパク質の一部の正確な配列を有するポリペプチドに限定されない。実際、ウイルスゲノムは、常に不安定な状態であり、単離物の間で比較的高い可変性を示す、いくつかの可変ドメインを含む。したがって、用語「エピトープ」は、天然の配列と同一の配列、ならびに欠失、付加、および置換(一般的に、本質的に保存的である)のような天然の配列に対する改変を包含する。
【0039】
エピトープを含む所与のポリペプチドの領域は、当該分野で周知の多くのエピトープマッピング技術を使用して同定することができる。例えば、Epitope Mapping Protocols in Methods in Molecular Biology、第66巻(Glenn E.Morris,編、1996)、Humana Press、Totowa、New Jerseyを参照のこと。例えば、線状エピトープは、例えば、固体支持体上で多数のペプチド(タンパク質分子の一部に対応するペプチド)を同時に合成し、そしてこれらのペプチドが依然として支持体に結合している間に、これらのペプチドと抗体とを反応させることによって決定され得る。このような技術は当該分野で公知であり、そして例えば、米国特許第4,708,871号;Geysenら、(1984)、Proc.Natl.Acad.Sci.USA 81:3998−4002;Geysenら、(1985)、Proc.Natl.Acad.Sci.USA 82:178−182;Geysenら、(1986)、Molec.Immunol.23:709−715(これら全ては、本明細書中でその全体が参考として援用される)に記載される。このような技術を使用して、多くのHCVのエピトープが、同定されている。例えば、Chienら、Viral Hepatitis and Liver Disease(1994)pp.320−324、および以下をさらに参照されたい。同様に、高次構造エピトープは、例えば、X線結晶学および二次元核磁気共鳴によるようなアミノ酸の空間的高次構造の決定によって容易に同定される。例えば、Epitope Mapping Protocols、前出を参照のこと。タンパク質の抗原性領域はまた、標準的な抗原性プロットおよびハイドロパシープロット(例えば、Oxford Molecular Groupから利用可能なOmigaバージョン1.0ソフトウェアプログラムを使用して計算したもの)を使用して同定され得る。このコンピュータプログラムは、抗原性プロフィールを決定するためにHopp/Woods法(Hoppら、Proc.Natl.Acad.Sci USA(1981)、78:3824−3828)を使用し、そしてハイドロパシープロットを決定するためにKyte−Doolittle技術(Kyteら、J.Mol.Biol.(1982)、157:105−132)を使用する。
【0040】
本明細書中で使用される場合、用語「高次構造エピトープ」とは、全長天然タンパク質内のエピトープをコードするアミノ酸配列に対して天然のままである構造的特徴を有する、全長タンパク質の一部分、またはこれらのアナログもしくはムテインをいう。天然の構造的特徴としては、グリコシル化および三次元構造が挙げられるが、これらに限定されない。エピトープ規定配列の長さは、これらエピトープが抗原の三次元形状(例えば、折りたたみ)によって形成されると考えられるので、広範な変動に供され得る。従って、エピトープを規定するアミノ酸は、比較的少ない数であり得るが、分子の長さに沿って(またはダイマーの場合などは、異なる分子上にすら)広範に散在し、折りたたみを介して正確なエピトープ高次構造となる。エピトープを規定する残基の間の抗原の部分は、エピトープの高次構造の構成に重要ではない場合がある。例えば、これらの介在性配列の欠失もしくは置換は、エピトープの高次構造に重要な配列(例えば、ジスルフィド結合に関与するシステイン、グリコシル化部位など)が維持されている場合、高次構造エピトープに影響を及ぼさない場合がある。
【0041】
例えばNS3/4a領域内に存在する、高次構造エピトープは、上で議論している方法を使用して容易に同定される。さらに、所与のポリペプチドにおける高次構造エピトープが存在するかもしくは存在しないかは、抗体(この高次構造エピトープに対するポリクローナル血清もしくはモノクローナル抗体)による目的の抗原のスクリーニング、ならびにその反応性をこの抗原の変性型(存在する場合でも、線状エピトープしか有さない)に対する反応性と比較する工程を介して、容易に決定され得る。ポリクローナル抗体を使用するこのようなスクリーニングにおいて、ポリクローナル血清を最初に変性抗原で吸収させ、そして目的の抗原に対する抗体を有するか否かを調べることは、有利であり得る。さらに、NS3/4aの場合、天然の高次構造を保存する分子は、また、プロテアーゼ酵素活性をも有し、必要に応じてヘリカーゼ酵素活性をも有する。このような活性は、以下にさらに記載されるような酵素アッセイを使用して検出され得る。
【0042】
好ましくは、高次構造エピトープは、組換えによって産生され、そしてエピトープの所望の構造特徴を保存する条件下で(例えば、エピトープの変性を伴わずに)エピトープを抽出可能である細胞において発現される。そのような細胞としては、細菌細胞、酵母細胞、昆虫細胞および哺乳動物細胞が挙げられる。HCVポリタンパク質に由来する組換え高次構造エピトープの発現および単離は、例えば、国際出願公開第96/04301号、同第94/01778号、同第95/33053号、同第92/08734号(これらの出願は、本明細書中でその全体が参考として援用される)に記載される。あるいは、抗原を発現し、そしてこのタンパク質を回収後さらに復元することが可能である。また、化学的合成が、「天然の」抗原の高次構造エピトープと交差反応する高次構造抗原ミミトープ(mimitope)を提供し得ることもまた、理解される。
【0043】
「抗体」は、抗原に存在する目的のエピトープに特異的に結合する分子を意図する。「特異的に結合する」は、抗体が、エピトープを認識し、そして「鍵と鍵穴(lock and key)」型の相互作用においてエピトープと相互作用し、抗原と抗体との間に複合体を形成することを意味する。これは、抗体と例えば試験基質との間に生じ得る非特異的結合とは対照的である。従って、例えば、HCVコア抗体は、HCVコアタンパク質に特異的に結合する分子であり、HCV NS3/4a抗体は、HCV NS3/4aタンパク質のエピトープに特異的に結合する分子である、などである。同様に、目的の抗原は、抗体がこの抗原に存在するエピトープに「特異的に結合する」場合、この抗体と「特異的に反応する」。用語「抗体」は、本明細書中で使用される場合、ポリクローナル調製物およびモノクローナル調製物の両方から得られる抗体、ならびに以下を包含する:ハイブリッド(キメラ)抗体分子(例えば、Winterら(1991)Nature 349:293−299;および米国特許第4,816,567号を参照);F(ab’)2およびF(ab)フラグメント;Fv分子(非共有結合性ヘテロダイマー、例えば、Inbarら(1972)Proc Natl Acad Sci USA 69:2659−2662;およびEhrlichら(1980)Biochem 19:4091−4096を参照);単鎖Fv分子(sFv)(例えば、Hustonら(1988)Proc Natl Acad Sci USA 85:5879−5883を参照);二量体抗体フラグメント構築物および三量体抗体フラグメント構築物;ミニボディ(minibody)(例えば、Packら(1992)Biochem 31:1579−1584;Cumberら(1992)J Immunology 149B:120−126を参照);ヒト化抗体分子(例えば、Riechmannら(1988)Nature 332:323−327;Verhoeyanら(1988)Science 239:1534−1536;および英国特許出願公開第2,276,169号(1994年9月21日公開)を参照);ならびに、このような分子から得られた、親抗体分子の免疫学的結合特性を保持している任意の機能的フラグメント。
【0044】
本明細書中で使用される場合、用語「モノクローナル抗体」は、均一な抗体集団を有する抗体組成物をいう。この用語は、抗体の種もしくは供給源に関して限定されず、作製された様式によっても限定されないことが意図される。従って、この用語は、マウスハイブリドーマから得られた抗体、ならびにマウスハイブリドーマではなくヒトハイブリドーマを用いて得られたヒトモノクローナル抗体を、包含する。例えば、Coteら,Monclonal Antibodies and Cancer Therapy,Alan R.Liss,1985,p.77を参照されたい。
【0045】
ポリペプチドに関する場合、「単離された」により、指定の分子が、この分子が天然において見出される生物全体から分離されて独立しているか、または他の同種の生物学的高分子の実質的に非存在下で存在していることが、意味される。ポリヌクレオチドに関する用語「単離された」は、通常天然で伴っている配列全体または一部を有さない核酸分子であるか、または天然に存在する通りの配列であるがそれと結合する異種配列を有する配列であるか、あるいは染色体から分離された分子である。
【0046】
「等価な抗原決定基」は、HCVの株1、株2、株3のような異なるHCVの亜種または株に由来する抗原決定基を意味する。より具体的には、エピトープは、公知であり(例えば、HCV−1ポリタンパク質配列に対して番号付けられたおよそ1694〜1735位に存在する「5−1−1」、図1を参照のこと)、そしてこのようなエピトープは、株1と、株2と、株3との間で変動する。従って、3つの異なる株に由来するエピトープ5−1−1は、等価な抗原決定基であり、従って、その配列が同一でなくとも、「コピー」である。一般に、等価な抗原決定基のアミノ酸配列は、2つの配列が並列される場合、高度な(例えば、30%より大きく、好ましくは40%より大きい)配列相同性を有する。
【0047】
「相同性」とは、2つのポリヌクレオチド部分または2つのポリペプチド部分の間の類似性の%をいう。2つのDNA配列または2つのポリペプチド配列は、定義した分子の長さにわたって、これらの配列が少なくとも約50%、好ましくは少なくとも約75%、より好ましくは少なくとも約80〜85%、好ましくは少なくとも約90%、および最も好ましくは少なくとも約95%〜98%の配列類似性を示す場合、互いに「実質的に相同」である。本明細書中で使用される場合、実質的に相同とはまた、特定のDNA配列またはポリペプチド配列に対する完全な同一性を示す配列をもいう。
【0048】
一般的に、「同一性」とは、それぞれ、2つのポリヌクレオチド配列または2つのポリペプチド配列の正確なヌクレオチド対ヌクレオチドまたはアミノ酸対アミノ酸の対応をいう。%同一性は、配列を並列することによって2つの分子(参照配列と参照配列に対する%同一性が未知である配列と)の間の配列情報を直接比較する工程、並列された2つの配列間の正確な適合の数を計数する工程、参照配列の長さで除算する工程、およびこの結果に100を掛ける工程によって決定され得る。
【0049】
容易に利用可能なコンピュータープログラム(例えば、ペプチド分析用のSmith and Watermanの局所的相同性アルゴリズム(Advances in Appl.Math.2:482−489,1981)に適合させたALIGN(Dayhoff,M.O.,Atlas of Protein Sequence and Structure,M.O.Dayhoff編、第5補遺,3:353−358,National biomedical Research Foundation、Washington、DC))が、相同性および同一性の分析を補助するために使用され得る。ヌクレオチド配列の相同性を決定するためのプログラムは、Wisconsin Sequence Analysis Package,Version 8(Genetics Computer Group,Madison,WIから利用可能)で利用可能である(例えば、やはりSmith and Watermanアルゴリズムに依存するBESTFITプログラム、FASTAプログラム、およびGAPプログラム)。これらのプログラムは、製造者によって推奨され、かつ上記で言及したWisconsin Sequence Analysis Packageに記載される初期設定のパラメータを使用して容易に利用される。例えば、参照配列に対する特定のヌクレオチド配列の%相同性は、初期設定のスコアリング表およびヌクレオチド上の6つの位置でのギャップペナルティを使用したSmith and Watermanの相同性アルゴリズムを使用して決定され得る。
【0050】
本発明に関連して%相同性を確立する別の方法は、エディンバラ大学が著作権を有し、John F.CollinsおよびShane S.Sturrokによって開発され、そしてIntelliGenetics,Inc.(Mountain View,CA)から販売されているMPSRCHプログラムパッケージを使用することである。このパッケージ一式から、スコアリング表のために初期設定のパラメータ(例えば、12のギャップオープンペナルティ、1のギャップ伸長ペナルティ、および6のギャップ)を使用するSmith−Watermanアルゴリズムが、使用され得る。作成されたデータからの「適合」値は、「配列相同性」を反映する。配列間の同一性または類似性の%を計算するための他の適切なプログラムは、一般的に、当該分野で公知であり、例えば、別のアラインメントプログラムは、初期設定のパラメータを使用したBLASTである。例えば、BLASTNおよびBLASTPは、以下の初期設定のパラメータを使用して使用され得る:遺伝コード=標準;フィルタ=なし;鎖=両方;カットオフ=60;期待値=10;行列=BLOSUM62;記載=50配列;分類=ハイスコア;データベース=非重複、GenBank+EMBL+DDBJ+PDB+GenBank CDS翻訳物+Swiss protein+Spupdate+PIR。これらのプログラムの詳細は、容易に利用できる。
【0051】
あるいは、相同性は、相同領域間で安定な二重鎖を形成する条件下でのポリヌクレオチドのハイブリダイゼーション、その後の一本鎖特異的ヌクレアーゼによる消化、および消化フラグメントのサイズ決定によって決定され得る。実質的に相同なDNA配列は、例えば、特定の系について規定したストリンジェントな条件下でのサザンハイブリダイゼーション実験で同定され得る。適切なハイブリダイゼーション条件の定義は、当業者の範囲内である。例えば、Sambrookら、前出;DNA Cloning、前出;Nucleic Acid Hybridization、前出を参照のこと。
【0052】
「コード配列」または選択されたポリペプチドを「コードする」配列は、適切な調節配列の制御下においた場合に、インビトロまたはインビボで転写(DNAの場合)され、そしてポリペプチドに翻訳(mRNAの場合)される核酸分子である。コード配列の境界は、5’(アミノ)末端の開始コドンおよび3’(カルボキシ)末端の翻訳終止コドンによって決定される。転写終結配列は、コード配列に対して3’側に配置され得る。
【0053】
「作動可能に連結された」とは、そのように記載される構成要素がその所望の機能を発揮するように構成されるエレメントの配置をいう。したがって、コード配列に作動可能に連結された所与のプロモーターは、適切な転写因子などが存在する場合に、コード配列の発現を達成し得る。プロモーターは、その発現を指向するように機能する限り、コード配列に隣接する必要はない。したがって、例えば、翻訳されないが転写される介在配列は、転写されたイントロンがそうであるように、プロモーター配列とコード配列との間に存在し得るので、プロモーター配列は、なおコード配列に「作動可能に連結された」と見なされ得る。
【0054】
核酸分子を記載するために本明細書中で使用される場合、「組換え体」は、ゲノム起源、cDNA起源、ウイルス起源、半合成起源、または合成起源のポリヌクレオチドを意味し、このポリヌクレオチドは、その起源または操作ゆえに、天然において結合するポリヌクレオチドの全体または一部と結合しない。タンパク質またはポリペプチドに関して使用される場合、用語「組換え体」は、組換えポリヌクレオチドの発現によって産生されたポリペプチドを意味する。一般的に、目的の遺伝子は、クローニングされ、次いで、以下でさらに記載されるように、形質転換された生物中で発現される。宿主生物は、発現条件下で外来遺伝子を発現して、タンパク質を産生する。
【0055】
「制御エレメント」とは、それが連結されるコード配列の発現を補助するポリヌクレオチド配列をいう。この用語は、プロモーター、転写終結配列、上流調節ドメイン、ポリアデニル化シグナル、非翻訳領域(5’−UTRおよび3’−UTR、ならびに、適切な場合、リーダー配列およびエンハンサーが含まれる)を包含し、これらは、宿主細胞におけるコード配列の転写および翻訳を共同して提供する。
【0056】
本明細書中で使用される場合、「プロモーター」は、宿主細胞中でRNAポリメラーゼに結合し、そしてそこに作動可能に連結された下流(3’方向)コード配列の転写を開始し得るDNA調節領域である。本発明の目的のために、プロモーター配列は、バックグラウンドを超える検出可能なレベルで目的の遺伝子の転写を開始するために必要な、最小数の塩基またはエレメントを含む。プロモーター配列内に、転写開始部位およびRNAポリメラーゼの結合を担うタンパク質結合ドメイン(共通配列)が存在する。真核生物プロモーターは、しばしば「TATA」ボックスおよび「CAT」ボックスを含むが、常にこれらを含むわけではない。
【0057】
RNAポリメラーゼがプロモーター配列に結合し、そしてコード配列をmRNAに転写する場合、制御配列は、細胞中のコード配列の「転写を指示し」、その後、このmRNAは、コード配列によってコードされたポリペプチドに翻訳される。
【0058】
「発現カセット」または「発現構築物」とは、目的の配列または遺伝子の発現を指向し得る集合(assembly)をいう。発現カセットは、上に記載されるような制御エレメント(例えば、目的の配列または遺伝子に(これらの転写を指示するように)作動可能に連結されたプロモーター)を含み、多くの場合、またポリアデニル化配列をも含む。本発明の特定の実施形態では、本明細書中に記載される発現カセットは、プラスミド構築物内に含まれ得る。発現カセットの構成要素に加えて、プラスミド構築物はまた、1つ以上の選択可能なマーカー、プラスミド構築物を一本鎖DNAとして存在させるシグナル(例えば、M13複製起点)、少なくとも1つのマルチクローニングサイト、および「哺乳動物」の複製起点(例えば、SV40またはアデノウイルスの複製起点)を含み得る。
【0059】
本明細書中で使用される場合、「形質転換」とは、宿主細胞への外因性ポリヌクレオチドの挿入をいい、挿入のために使用した方法(例えば、直接取り込み、トランスフェクション、および感染などによる形質転換)を問わない。特定のトランスフェクション法については、以下をさらに参照のこと。外因性ポリヌクレオチドは、非組み込みベクター(例えば、エピソーム)として維持され得るか、または宿主ゲノム内に組み込まれ得る。
【0060】
「宿主細胞」は、外因性DNA配列によって、形質転換されている細胞であるか、または形質転換可能な細胞である。
【0061】
本明細書中で使用される場合、「生物学的サンプル」は、被験体から単離された組織もしくは液体のサンプルをいい、通常、被験体によって産生された抗体を含む。このような抗体を含む代表的なサンプルは、当該分野で公知であり、血液、血漿、血清、糞便、尿、骨髄、胆汁、脊髄液、リンパ液、皮膚のサンプル、皮膚、気道、腸および生殖器官の分泌物、涙、唾液、乳汁、血球、器官、生検ならびにまたインビトロ細胞培養構成物(培養培地中の細胞および組織の増殖から得られた馴化培地(例えば組換え細胞および細胞構成要素)が挙げられるが、これらに限定されない)のサンプルが挙げられるが、これらに限定されない。
【0062】
「固体支持体」は、本発明のイムノアッセイにおいて使用されるHCVポリペプチドが、共有結合的に結合するか、または非共有結合的手段(例えば、疎水性吸着)によって結合する、固体マトリックスを意図する。
【0063】
「免疫学的に反応性である」または「免疫反応性である」は、目的の抗原が、HCV感染個体由来の生物学的サンプル中に存在する抗HCV抗体に特異的に反応することを意味する。
【0064】
「免疫原性」とは、目的の抗原が、個体に投与された場合に免疫応答を誘発することを意図する。
【0065】
「免疫複合体」とは、抗体が抗原上のエピトープに結合する場合に形成される結合物(combination)を意図する。
【0066】
本明細書中で使用される場合、用語「標識」および「検出可能な標識」とは、検出の可能な分子をいい、放射性同位体、蛍光剤(fluorescer)、化学発光剤(chemiluminescer)、酵素、酵素基質、酵素補因子、酵素インヒビター、発色団、蛍光ナノ粒子、色素、金属イオン、金属ゾル、リガンド(例えば、ビオチン、アビジン、ストレプトアビジン、もしくはハプテン)などが挙げられるが、これらに限定されない。用語「蛍光剤」とは、検出可能な範囲の蛍光を示すことの可能な基質もしくはその部分をいう。本発明の下で使用され得る標識の特定の例としては、西洋ワサビペルオキシダーゼ(HRP)、フルオレセイン、FITC、ローダミン、ダンシル、ウンベリフェロン、ジメチルアクリジニウムエステル(DMAE)、テキサスレッド、ルミノール、NADPHおよびα−β−ガラクトシダーゼが挙げられるが、これらに限定されない。
【発明を実施するための最良の形態】
【0067】
(II.発明を実施する形態)
本発明を詳細に説明する前に、本発明は特定の処方物または処理パラメータに制限されず、当然に変更可能であることが理解されるべきである。本明細書中で使用される専門用語は、本発明の特定の実施形態を記載することのみを目的とし、本発明を制限することを意図しないことがまた、理解されるべきである。
【0068】
本明細書中に記載のものに類似するか、またはそれらと等価な多数の組成物および方法が、本発明の実施に使用され得るが、好ましい材料および方法は、本明細書中に記載される。
【0069】
上述のように、本発明は、HCV NS3プロテアーゼによる改変MEFAのタンパク分解性切断が阻害されるような改変NS3プロテアーゼ切断部位を有する新規なHCV MEFAの発見に基づく。かかる改変MEFAは、初期HCV感染を正確に検出するための診断方法において特に有用である。この改変MEFAは、例えば、HCVの主要線状エピトープであるコア、E1、E2、NS3、NS4、5−1−1、c100−3及びNS5配列のような多数の免疫優勢なエピトープのような、同一又は異なるHCV遺伝子型及び単離物のいずれかに由来する種々のHCVポリペプチドを含む。
【0070】
改変MEFAはイムノアッセイにおいて単独で、又はその他のHCV抗原、好ましくは、HCVポリタンパク質のNS3/4a領域に由来する高度に免疫原性の高次構造エピトープと組み合わせて用いられ得る。このイムノアッセイはHCVセロコンバージョンの初期段階の間におけるHCV感染を検出するために用いられ得、それにより検出の正確性を向上させ、誤った結果の発生率を低減させる。この方法は、限定されるものではないが、例えば、HCV抗原を結合させる固体支持体を用いるアッセイ様式のような、以下に記載するいくつかのアッセイ様式のいずれかを用いて、単回のアッセイで簡便に実践することができる。
【0071】
本発明のさらなる理解のために、改変MEFA、HCV高次構造NS3/4aエピトープ、並びに、これらのタンパク質の製造及びこれらのタンパク質の使用方法に関して、より詳細な考察が以下に提供される。
【0072】
(HCV MEFA)
HCV株のゲノムは、ポリタンパク質へと転写される約9,000〜12,000ヌクレオチドの単一のオープンリーディングフレームを含む。図1及び表1に示すように、HCVポリタンパク質は切断の際に少なくとも10の異なる産物を以下の順で生じる:NH2−コア−E1−E2−p7−NS2−NS3−NS4a−NS4b−NS5a−NS5b−COOH。このコアポリペプチドはHCV−1に対して番号付けされた1位〜191位に生じる(HCV−1ゲノムに関して、Chooら(1991)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 88:2451−2455参照)。このポリペプチドはさらに処理されておよそ1〜173のアミノ酸を伴うHCVポリペプチドを生産する。エンベロープポリペプチドであるE1及びE2は、およそ192位〜383位及びおよそ384位〜746位にそれぞれ生じる。P7ドメインはおよそ747位〜809位に見出される。NS2はタンパク質分解活性を有する内在性膜タンパク質であり、ポリタンパク質のおよそ810位〜1026位に見出される。NS2は、NS3(およそ1027位〜1657位に見出される)と組み合わさって、NS2−NS3のsissle結合を切断し、これは次に、NS3のN末端を作り出し、またセリンプロテアーゼ活性及びRNAヘリカーゼ活性の両方を含む大きなポリタンパク質を放出する。およそ1027位〜1207位に見出されるNS3プロテアーゼは、残りのポリタンパク質を処理するために役割を果たす。ヘリカーゼ活性はおよそ1193位〜1657位(「ヘリカーゼドメイン」)に見出される。NS3はNS3補因子(NS4a、およそ1658位〜1711位に見出される)、2つのタンパク質(およそ1712位〜1972位に見出されるNS4b、及びおよそ1973位〜2420位に見出されるNS5a)ならびにRNA依存性RNAポリメラーゼ(およそ2421位〜3011位に見出されるNS5b)を遊離させる。ポリタンパク質の成熟の終結は、NS3セリンプロテアーゼにより触媒されるNS3−NS4a接合部における自己触媒切断によって開始される。
【0073】
【表1】
*HCV−1に対して番号付けされたもの。Chooら(1991)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 88:2451−2455参照。
【0074】
コア、NS2、p7、E1、E2、NS3、NS4、NS5a、NS5bの遺伝子及びポリペプチドを含む、HCVポリタンパク質の種々の領域の核酸配列及びアミノ酸配列を含む、多数のHCV株及び単離物の核酸配列及びアミノ酸配列が決定されている。
【0075】
HCV−1単離物について記載する刊行物としては、Chooら(1990)Brit.Med.Bull.46:423−441;Chooら(1991)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 88:2451−2455及びHanら(1991)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 88:1711−1715が挙げられる。HCV単離物HC−J1及びHC−J4はOkamotoら(1991)Japan J.Exp.Med.60:167−177に記載されている。HCV単離物HCT18〜、HCT23、Th、HCT27、EC1及びEC10はWeinerら(1991)Virol.180:842−848に記載されている。HCV単離物Pt−1、HCV−K1及びHCV−K2はEnomotoら(1990)Biochem.Biophys.Res.Commun.170:1021−1025に記載されている。HCV単離物A、C、D及びEはTsukiyama−Koharaら(1991)Virus Genes 5:243−254に記載されている。単離物HCV J1.1はKuboら(1989)Japan.Nucl.Acids Res.17:10367−10372;Takeuchiら(1990)Gene 91:287−291;Takeuchiら(1990)J.Gen.Virol.71:3027−3033;及びTakeuchiら(1990)Nucl.Acids Res.18:4626に記載されている。2種類の別個の単離物HCV−J及びBKの完全コード配列が、それぞれ、Katoら、(1990)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 87:9524−9528及びTakamizawaら、(1991)J.Virol.65:1105−1113に記載されている。
【0076】
上記に説明されるように、本発明は、HCV検出のためのイムノアッセイに用いるための改変多エピトープ融合抗原(MEFA)に関する。この改変MEFAは、図1及び表1に示され、さらに以下に記載されるような種々のHCVウイルス領域のいずれかに由来する多数のHCVエピトープを含む。通常、改変MEFAは、HCVポリタンパク質における少なくとも3つの異なる領域、より代表的には、HCVポリタンパク質の4〜10の領域からの、例えばHCVポリタンパク質の5〜8(例えば5、6、7、8)の領域に由来する、少なくとも3つのエピトープ、好ましくは3〜25又はそれ以上のエピトープ(例えば、少なくとも5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19又は20あるいはそれ以上のエピトープ(例えば10〜20のエピトープ)を含む。改変MEFAは、ヘリカーゼドメインからの少なくとも1つの改変エピトープ及び好ましくはNS4a/NS4b及び/又はNS5aからのエピトープを含む。改変MEFAはまた、MEFAの組換え発現を助ける配列のような非HCV配列(以下にさらに記述するスーパーオキシドジスムターゼ配列が挙げられる)を含み得る。
【0077】
改変MEFAにおいては、多数のHCV抗原が一本の連続したアミノ酸鎖として配列されており、この鎖はその状態で天然に存在しない。したがって、エピトープの直線的順序は、それらが存在するゲノム中でのこれらエピトープの直線的順序とは異なる。本明細書中で使用するための改変MEFAの配列はの直線的順序は、好ましくは、最適な抗原性のために並べられる。好ましくは、エピトープは、2以上のHCV株、例えば、2、3、4、5、6以上の株に由来し、それにより、単一アッセイにおいて多数のHCV株を検出する能力が付与される。さらに、MEFA中に存在するポリペプチドは、免疫診断が使用される特定の地理的領域における特定のウイルス固有種に基づいて選択することができる。このようなMEFAが様々な状況においてHCV感染を診断するための有効な手段を提供することは容易に理解される。さらに、改変MEFAの使用は、NS3プロテアーゼによるMEFAのタンパク分解性切断を生じないことを確認し、したがって、HCVイムノアッセイにおいて使用するためのより良い試薬が提供される。
【0078】
本発明の改変MEFAは、NS3による改変MEFAの切断が阻害されるように、NS3タンパク分解性切断部位において変異されている。NS3タンパク分解性切断部位は、NS3/4a、NS4a/4b、NS4b/5a及びNs5a/5b接合部位において見られる(Grakouiら、J.Virol.(1993)67:2832−2843)。したがって、表1を参照すると、これらの部位は、それぞれ、HCV−1ポリタンパク質配列に対して番号付けされたアミノ酸の1657位/1658位、1711位/1712位、1972位/1973位及び2420位/2421位に存在する。さらに、切断部位は、HCV−1ポリタンパク質配列に対して番号付けされた1428位/1429位及び1455位/1456位にあるNS3のヘリカーゼドメイン内にも存在する。改変のためのさらなる部位は、例えば、De Francecoら、Antivir.Ther.(1998)3:99−109;並びにSchechter及びBerger,Biochim.Biophys.Res.Commun.(1967)27:157−162に記載されているようなHCV NS3プロテアーゼの公知の構造及び機能に基づいて、当業者によって決定され得る。
【0079】
NS3タンパク分解性切断部位の全て又はそのいくつかを欠失することにより、MEFAは改変され得る。あるいは、NS3プロテアーゼによるタンパク分解性切断は、タンパク分解性切断部位内のアミノ酸の置換により、その部位がNS3プロテアーゼのための基質として機能しないように、阻害され得る。最終的に、NS3プロテアーゼが作用しないようにタンパク分解性切断部位が改変されるアミノ酸付加もまた、タンパク質分解活性を阻害するために機能し得る。タンパク分解性切断に影響を及ぼさないさらなる改変は、必ずしも必要ではないが、本発明のMEFA中に見られるエピトープ中に存在していてもよい。改変MEFAの用途に沿う場合、プロテアーゼ切断部位を除去する任意の改変が、そのように改変されたMEFAの免疫反応性に影響を及ぼするべきではないことは明らかであろう。
【0080】
したがって、例えば、上記の1以上の部位における1以上のアミノ酸(例えば、これらのアミノ酸のうちの1つ、2つ、3つ、4つ、5つ、6つ、7つ、8つ、又は全て)を、NS3プロテアーゼによるタンパク分解性切断を抑制するために置換又は欠失させることができる。あるいは、NS3プロテアーゼによるMEFAの切断を阻害するためにこれらの切断部位に付加することができる。
【0081】
好ましい実施形態においては、MEFA中に存在する全てのタンパク分解性切断部位における各アミノ酸が、NS3プロテアーゼによる切断を防ぐために改変されている。したがって、MEFAがヘリカーゼドメイン中の切断部位に広がる1以上のエピトープ、(NS3/4a接合部、NS4a/NS4b接合部等)を含む場合、その部位を規定するアミノ酸は置換されているか又は改変されている。ヘリカーゼドメイン中の部位の具体的な置換としては、通常、HCV−1ポリタンパク質の1428位に存在する、アミノ酸LeuのThrとの置換;通常、HCV−1ポリタンパク質の1429位に存在する、ProのSerとの置換;通常、HCV−1ポリタンパク質の1455位に存在する、LeuのAsnとの置換;及び、通常、HCV−1ポリタンパク質の1456位に存在する、ProのThrとの置換が挙げられる。NS3/4a接合部における具体的な置換としては、通常、HCV−1ポリタンパク質の1657位に存在するLeuのThrとの置換;及び、通常、HCV−1ポリタンパク質の1658位に存在するProのSerとの置換が挙げられる。これらの位置の上記アミノ酸はHCV−1配列を参照しており、対応するアミノ酸がNS3によるMEFAのタンパク分解性切断を阻害するように機能するアミノ酸と置換されている場合、これらの位置に同じアミノ酸を含んでいても又は含んでいなくてもよい、その他のHCV遺伝子型のいずれかのヘリカーゼドメイン及びNS3/4aドメインからのエピトープをも、MEFAは含んでいてもよいことを理解すべきである。
【0082】
さらに、これらの部位におけるその他の適当なアミノ酸改変は、例えば、De Francecoら、Antivir.Ther.(1998)3(第3補遺):99−109;並びにSchechter及びBerger,Biochim.Biophys.Res.Commun.(1967)27:157−162に記載されているようなHCV NS3プロテアーゼの公知の構造及び機能に基づいて、当業者によって容易に決定され得る。特に、NS3プロテアーゼがセリンプロテアーゼであり、そのタンパク質分解メカニズムは標的とされるペプチド結合のセリンによる求核攻撃に基づくものであることが公知である。セリン、ヒスチジン及びアスパラギン酸の整列された側鎖は、多くのセリンプロテアーゼに共通の触媒性三連構造を構築する。セリンプロテアーゼの活性部位は、ポリペプチド基質が結合する裂け目として形作られる。Schechter及びBerger(Schechter及びBerger,Biochim.Biophys.Res.Commun.(1967)27:157−162)は、ポリペプチド基質(Pi、・・・、P3、P2、P1、P1’、P2’、P3’、・・・、Pj)のN末端からC末端の標識アミノ酸残基及びそれらの各結合サブサイト(Si、・・・、S3、S2、S1、S1’、S2’、S3’、・・・、Sj)を標識化し、そして切断が、P1とP1’との間で触媒されることを見出した。NS3プロテアーゼはキモトリプシン様の折り畳み構造を取り、非常に長いペプチド基質(P6〜P4’)に対する要件と一致する、非常に長い、溶媒に曝露される基質結合部位を含む。NS3プロテアーゼは基質P1の位置のシステイン残基に対して選択性を有する。したがって、上述の及び当技術分野において既知の構造及び機能に基づいて、NS3プロテアーゼに対するタンパク分解性切断を妨害し、それによって、切断されにくいMEFAを産生するように機能するその他のアミノ酸の置換、付加及び欠失を、当業者は容易に決定することができる。
【0083】
MEFA中に存在する場合、5−1−1エピトープ中に見られる、NS4a/4b接合部における具体的な置換としては、通常、HCV−1ポリタンパク質の1711位に存在するProのCysとの置換、並びに、通常、HCV−1ポリタンパク質の1712位に存在するIleのSerとの置換が挙げられる。5−1−1エピトープは、HCV−1ポリタンパク質配列に対して番号付けされた、およそ1694位〜1735位に見られる。これらの位置の上記アミノ酸はHCV−1配列を参照しており、対応するアミノ酸がNS3によるMEFAのタンパク分解性切断を阻害するように機能するアミノ酸と置換されている場合、これらの位置に同じアミノ酸を含んでいても又は含んでいなくてもよい、その他のHCV遺伝子型のいずれかの5−1−1ドメインからのエピトープをMEFAは含んでいてもよく、好ましくは含むことを理解すべきである。例えば、HCV−3の1711位及び1712位における天然のアミノ酸は、HCV−1において見られるものと同じである。HCV−2の1711位にあるアミノ酸は、HCV−1及びHCV−3のそれと同じである。しかしながら、HCV−2の1712位に存在するアミノ酸はAlaである。このAlaは、NS3によるMEFAのタンパク分解性切断を阻害するために、例えば、Ileと置換され得る。さらに、これらの部位におけるその他の適当なアミノ酸改変は、例えば、De Francecoら、Antivir.Ther.(1998)3:99−109;並びにSchechter及びBerger,Biochim.Biophys.Res.Commun.(1967)27:157−162に記載されているようなHCV NS3プロテアーゼの既知の構造及び機能に基づいて、当業者によって容易に決定され得る。
【0084】
上述のとおり、本発明のMEFAは、NS3及びNS4a領域由来の少なくとも1以上のエピトープ(直線的又は高次構造的のいずれか)、例えば、NS3のヘリカーゼ及び/又はプロテアーゼ領域由来のものを含んでもよい。したがって、MEFAは、1以上のHCV単離物からのNS3/4a領域由来の多数の免疫ドミナントエピトープを含んでもよい。多数のNS3/4aエピトープが多エピトープ融合体に用いられる場合、それらは、同一又は異なるエピトープであってもよい。あるいは、融合抗原は、NS3/4a領域由来の1以上のエピトープ、並びに、限定するものではないが、HCVコア、E1、E2、P7、NS4b、NS5a及びNS5b配列のようなその他のHCV領域からの主要な直線的エピトープを含み得る。
【0085】
NS3/4a領域由来のエピトープを含むポリペプチドは、限定するものでないが、NS3、NS4a及びNS3/4a領域の全て又は一部を含むポリペプチドを含み、NS3のヘリカーゼ及び/又はプロテアーゼドメインからのエピトープを含んでもよい。これらの領域からの多数のエピトープが公知であり、例えば、限定するものではないが、c33c領域、c200領域及びc100領域由来の抗原、並びに、c25のようなNS3エピトープを含む融合タンパク質が挙げられる。これら及びその他のNS3エピトープは、本発明のMEFAにおいて有用であり、当技術分野において公知であり、例えば、Houghtonら、米国特許第5,350,671号;Chienら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1992)89:10011−10015;Chienら、J.Gastroent.Hepatol.(1993)8:S33−39;Chienら、国際公開第93/00365号;Chien,D.Y.,国際公開第94/01778号;及び米国特許第6,346,375号及び米国特許第6,150,087号に記載されており、これらの開示は本明細書中で参考としてその全体が援用される。
【0086】
さらに、5−1−1として知られる抗原決定基は部分的にNS4a領域(図1参照)内に存在しており、本発明のアッセイにおいて使用するためのMEFAにおいて特に有用である。5−1−1エピトープは、HCV−1ポリタンパク質配列に対して番号付けされたおよそ1694位〜1735位に見られる。この抗原決定基はHCV−1、HCV−2及びHCV−3上に異なる形態として現れる。したがって、本発明の好ましい実施形態においては、これらの形態をとる5−1−1の全てが本発明のイムノアッセイにおいて使用される多エピトープ融合抗原において現れる。
【0087】
改変MEFAは種々のHCV単離物のいずれかのコア領域からのエピトープを含むこともできる。この領域は、HCV−1に対して番号付けされた、HCVポリタンパク質のアミノ酸1位〜191位に存在する。全長タンパク質、そのフラグメント(例えば、アミノ酸1〜150、例えば、アミノ酸1〜130、1〜120、例えば、アミノ酸1〜121、1〜122、1〜123等)又は全長タンパク質のエピトープを含むより小さなフラグメントのいずれかが、本発明のMEFA中に存在し得、例えば、それらのエピトープは、アミノ酸9〜32、10〜53、10〜45、39〜42、64〜88、67〜84、67〜88、120〜130の間に見られるか、或いは、コアエピトープのいずれかは、例えば、Houghtonら、米国特許第5,350,671号;Chienら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1992)89:10011−10015;Chienら、J.Gastroent.Hepatol.(1993)8:S33−39;Chienら、国際公開第93/00365号;Chien,D.Y.,国際公開第94/01778号;並びに米国特許第6,280,927号及び米国特許第6,150,087号に示されている。これらの開示は参考として本明細書中でその全体が援用される。さらに、国際公開第99/63941号に記載されるようなポリタンパク質のコア領域におけるフレームシフトから得られるタンパク質を使用しても良い。
【0088】
同様に、HCV E1及び/又はE2領域からのポリペプチドは改変MEFAに使用することができる。E2は複数種存在し(Spaeteら,Virol.(1992)188:819−830;Selbyら,J.Virol.(1996)70:5177−5182;Grakouiら,J.Virol.(1993)67:1385−1395;Tomeiら,J.Virol.(1993)67:4017−4026)、クリッピング及びタンパク分解はE2ポリペプチドのN−末端及びC−末端で生じ得る。したがって、本明細書中で使用するためのE2ポリペプチドは、全長又はN−末端及び/若しくはC−末端を切断された免疫原性タンパク質、例えば、全長HCV−1ポリタンパク質に対して番号付けされた、アミノ酸405〜661を有するタンパク質(例えば、400、401、402・・・〜661、例えば、405〜444、383又は384〜661、383又は384〜715、383又は384〜746、383又は384〜749或いは383又は384〜809、或いは383又は384から661〜809の間の任意のC末端まで)を含んでもよい。MEFAにおいて使用するためのさらなるHCVエピトープは、E2の超可変領域に由来するエピトープ、例えば、アミノ酸384〜414若しくは390〜410に広がる領域、又はこの領域からの共通配列であるGly−Ser−Ala−Ala−Arg−Thr−Thr−Ser−Gly−Phe−Val−Ser−Leu−Phe−Ala−Pro−Gly−Ala−Lys−Gln−Asn(配列番号7)を含み、これは、1型HCVゲノムのアミノ酸390〜410に対する共通配列を表す。本発明のMEFA中に存在する代表的E2エピトープは、アミノ酸384〜414に広がるハイブリッドエピトープを含み得る。このようなハイブリッドE2エピトープは、第2の株からの共通配列と融合される、共通配列を表すアミノ酸390〜410を含み得る。あるいは、このE2エピトープはアミノ酸390〜444に広がるハイブリッドエピトープを含んでもよい。このようなハイブリッドE2エピトープは、例えば、HCV E2のアミノ酸411〜444に対する天然のアミノ酸配列へと融合される、上述したような共通配列を表すアミノ酸390〜410を含み得る。
【0089】
さらに、改変MEFAは、アミノ酸303〜320を含むE1エピトープ等のHCVポリタンパク質のアミノ酸192〜326、192〜330、192〜333、192〜360、192〜363、192〜383、又は192から326〜383の間の任意のC末端までを含むエピトープ等のE1ポリペプチドを含んでもよい。
【0090】
上述のとおり、抗原は種々のHCV株に由来し得る。複数のHCVウイルス株が公知であり、これらの株いずれかに由来するエピトープは融合タンパク質として使用することができる。任意の所定の有機体の種は、個々の有機体の間で互いに異なり、さらに、ウイルス等の特定の有機体は多数の異なる株を有し得ることが周知である。例えば、上述のとおり、HCVは少なくとも6つの遺伝子型を含む。これらの各遺伝子型は同等の抗原決定基を含む。より具体的には、それぞれの株は、ウイルスの全ての株に存在するが、ウイルス株同士でわずかに異なる多くの抗原決定基を含む。例えば、HCVは、5−1−1として知られる抗原決定基を含む(図1参照)。上述のとおり、この特定の抗原決定基は異なる形態HCV−1、HCV−2及びHCV−3として現れる。したがって、本発明の好ましい実施形態において、これらの5−1−1形態の全てが、本発明のイムノアッセイにおいて使用される多エピトープ融合抗原上に現れる。同様に、異なるHCV株のコア領域からの同等の抗原決定基も存在し得る。通常、同等の抗原決定基はアミノ酸配列に関して高度の相同性を有し、相同性の程度は、整列させた際に、通常30%以上、好ましくは40%以上である。本発明の複数コピーのエピトープは、正に同一エピトープのコピーである複数コピーを含むことができる。
【0091】
図8は本明細書中で「MEFA7.2」と呼ばれる代表的な改変MEFAを示す。しかしながら、HCVゲノム由来のその他のエピトープも本発明の改変MEFAにおける用途を見いだすであろうことを理解すべきである。MEFA7.2をテンプレートとして形成された親MEFAは「MEFA7.1」であった。MEFA7.1のマップ並びに対応するMEFA7.1のDNA配列及びアミノ酸配列をそれぞれ図4及び5A〜5Fに示す。MEFA7.1は米国特許第6,632,601号に詳細に記載されており、当該文献は参考として本明細書中でその全体が援用される。MEFA7.1及びMEFA7.2のアミノ酸配列の比較を、2つの構築物の間の違いを太字で注記して、図10A〜10Bに示す。全ての相違は上述のタンパク分解性切断部位において生じている。したがって、MEFA配列に対して番号付けされた変異は、図10A〜10Bの466位、467位、493位、494位、695位、696位、721位、722位、770位、771位、819位及び820位において生じている。これらのアミノ酸位置は、それぞれ、HCV−1ポリタンパク質配列に対して番号付けされた1428位、1429位、1455位、1456位、1657位、1658位、1711位、1712位、1711位、1712位、1711位及び1712位に相当する(3回の5−1−1の反復による)。
【0092】
MEFA7.2のDNA配列及び対応するアミノ酸配列を図9A〜9Fに示す。MEFA7.2の一般構造式を図8に示し、これは以下の通りである:hSOD−E1(タイプ1)−E2 HVR共通(タイプ1a)−E2 HVR共通(タイプ1及び2)−変異ヘリカーゼ(タイプ1)−変異5−1−1(タイプ1)−変異5−1−1(タイプ3)−変異5−1−1(タイプ2)−c100(タイプ1)−NS5(タイプ1)−NS5(タイプ1)−コアエピトープ(タイプ1+2)−コアエピトープ(タイプ1+2)。このMEFAは、HCV−1に対して番号付けされた以下のアミノ酸配列を含む(アミノ酸の番号付けは、アミノ酸#1がコア領域のコード配列によってコードされる第1のメチオニンである、Chooら(1991)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 88:2451−2455に示されている番号表示に従い、以下に示す):スーパーオキシドジスムターゼ(SOD、タンパク質の組換え発現を促進するために使用される)のアミノ酸1〜156;E1領域由来のポリタンパク質のアミノ酸303〜320;HCV−1aE2の超可変領域に対する共通配列を表す、ポリタンパク質のアミノ酸390〜410;HCV−1及びHCV−2のE2超可変領域に対する共通配列を表す、領域E2由来のポリタンパク質のアミノ酸384〜414;ポリタンパク質の対応するアミノ酸1428、1429、1455、1456、1657及び1658(図9A〜9Fに示されたMEFA配列に対して番号付けされたアミノ酸466、467、493、494、695及び696)に変異を有する、ヘリカーゼを規定するHCV−1ポリタンパク質のアミノ酸1193〜1658;5−1−1からのエピトープの3つのコピー、アミノ酸1689〜1735(HCV−1からの1つ、HCV−3からの1つ及びHCV−2からの1つ)、これらのコピーは、3つの異なるHCVウイルス株からの同等の抗原決定基であり、これらのコピーそれぞれが、ポリタンパク質の対応する1711及び1712のアミノ酸(図9A〜9Fに示されるMEFA配列に対して番号付けされたアミノ酸721、722、770、771、819及び820)に変異を有する;HCV−1のHCVポリペプチドc100、ポリタンパク質のアミノ酸1901〜1936;HCV−1のNS5領域からのエピトープの2つの正確なコピー、それぞれがHCVポリタンパク質のアミノ酸2278〜2313を有する;並びに、コア領域からのいくつかの2コピーのエピトープ(HCV−1からの1つ及びHCV−2からの1つ)、これらのコピーはHCV−1のアミノ酸9〜32、39〜42及び64〜88並びにHCV−2の67〜84によって表される同等の抗原決定基である。
【0093】
表2は本明細書中の図9A〜9Fに関連する種々のエピトープのアミノ酸の位置を示す。
【0094】
【表2】
従って、ひとつの特定の改変MEFAが、MEFA7.2によって表される。MEFA7.2に対する実質的な相同性を示すMEFAも、上述のように意図される。このようなMEFAは、タンパク分解性切断部位に対する少なくとも1つの改変を有し、好ましくはタンパク分解性切断部位に対する全ての改変が維持され、且つそのMEFAが免疫反応性を有し、従って本明細書中に記載するようなHCV免疫診断において有用である限り、分子の全長に渡って少なくとも約50%、好ましくは少なくとも約75%、より好ましくは少なくとも約80%〜85%、好ましくは少なくとも約90%、及び最も好ましくは少なくとも約95%〜98%の配列同一性を示す配列を有し得る。
【0095】
上記に説明したように、MEFA7.1をテンプレートとして用いてMEFA7.2を作製した。しかしながら、多数のその他の公知のMEFAが、NS3によるタンパク分解性切断の感受性を低減したさらなる改変MEFAを提供するために上述のように改変され得る。本明細書中に記載の改変され得るMEFAとしては、MEFA−3、MEFA−5及びMEFA−6が挙げられ、これらは、図12A、12B及び12Cにそれぞれ示され、国際公開第01/96875号、同第01/09609号、同第97/44469号及び米国特許第6,514,731号及び同第6,428,792号(本明細書中にその全体が参考として援用される)中に記載される。例えば、MEFA6のエピトープ配列の配置はMEFA7.2に類似する。しかしながら、MEFA7.2は、E2超可変(HVR)領域及びE2 HVR 1+2共通配列を組み込む。さらに、NS3のヘリカーゼ領域全体が、MEFA7.2中に含まれる。すなわち、MEFA7.2は分子量約120kDaを有し、MEFA6よりも大きいと考えられる。しかしながら、酵母における発現レベルはMEFA6のものに類似し、95%を超える純度で精製することができ、測定可能である。
【0096】
改変MEFAは単独で使用されるか、又は好ましくは、MEFAに関して上述される任意のHCV免疫原性タンパク質のような別のHCV抗原と組み合わせて使用される。好ましい実施形態において、改変MEFAは、HCVウイルスを検出するためのイムノアッセイにおいて、HCV NS3/4aエピトープ、好ましくは高次構造エピトープと組み合わせて用いられる。したがって、図2に示される本発明の1実施形態において、MEFA7.2及びNS3/4aエピトープを用いて迅速捕捉リガンドイムノアッセイ(rapid capture ligand immunoassay)が実行される。サンプルは、固体支持体上に存在し得る抗原と、以下に記載するように組み合わされる。サンプルがHCVに感染している場合、固体支持体上に存在するそれらのエピトープに対するHCV抗体は、固体支持体成分へと結合する。検出は、抗原/抗体複合体のメンバーへの検出可能なマーカー(図2中に示す西洋ワサビペルオキシダーゼ(HRP)等)の結合による。結合は、共有的な手段により、又は、(例えば標準的なサンドイッチアッセイにおいて)検出可能に標識された抗体もしくは既知の抗原のその後の結合により、あるいは反応産物が検出可能な酵素反応によるものであり得る。検出可能なマーカーは、限定されるものではないが、発色団、抗体、抗原、酵素、その切断産物が検出可能である酵素反応性化合物、ローダミン、又はローダミン誘導体、ビオチン、アビジン、ストレプトアビジン、蛍光化合物、ジメチルアクリジニウムエステル(DMAE,Ciba Corning Diagnostics Corp.)のような化学発光化合物、それらのマーカーの誘導体及び/又は組み合わせを含む。存在するヒトIgG分子を検出可能な、検出可能に標識された抗ヒト抗体を簡便に使用できる。あるいは、検出可能に標識されたHCV抗原、例えば、NS3/4a又はMEFAを使用することができる。
【0097】
(HCV NS3/4a高次構造エピトープ)
上記に説明したように、本発明の改変MEFAをNS3/4a領域からのエピトープと組み合わせてイムノアッセイに使用することが特に好ましい。HCVポリタンパク質のNS3/4a領域は記述されており、そのタンパク質のアミノ酸配列及び全体構造は、例えば、Yaoら,Structure(November 1999)7:1353−1363;Saliら,Biochem.(1998)37:3392−3401;及びBartenschlager,R.,J.Viral Hepat.(1999)6:165−181中に開示されている。また、Dasmahapatraら,米国特許第5,843,752号も参照(本明細書中にその全体が参考として援用される)。本発明のイムノアッセイは、NS3/4a遺伝子産物により通常呈されるプロテアーゼ酵素活性の保存、及び必要に応じてヘリカーゼ酵素活性の保存により、ならびに/又は、HCV−1感染被験体からの生物学的サンプル中の抗体と抗原との免疫反応性の維持、及び抗原変性の際のエピトープにおける免疫反応性喪失により証明されるように、天然のHCV粒子又は、その感染産物中に見いだされるような高次構造で存在するNS3/4a領域由来の少なくとも1つの高次構造エピトープを利用し得る。例えば、高次構造エピトープは、加熱、強酸又は強塩基へのpHの変化、又はジチオスレイトール(DTT)もしくは適切な界面活性剤等のような公知の有機変性剤の添加により破壊することができる。例えば、Protein Purification Methods,a practical approach(E.L.V.Harris及びS.Angal編,IRL Press)及び上記のように処理されなかった産物と比較した変性産物を参照されたい。
【0098】
プロテアーゼ活性及びヘリカーゼ活性は、当技術分野において周知の標準的酵素アッセイを用いて測定しても良い。例えば、プロテアーゼ活性は、当技術分野において周知であるアッセイを用いて測定しても良い。例えば、Takeshitaら,Anal.Biochem.(1997)247:242−246;Kakiuchiら,J.Biochem.(1997)122:749−755;Saliら,Biochemistry(1998)37:3392−3401;Choら,J.Virol.Meth.(1998)72:109−115;Cerretaniら,Anal.Biochem.(1999)266:192−197;Zhangら,Anal.Biochem.(1999)270:268−275;Kakiuchiら,J.Virol.Meth.(1999)80:77−84;Fowlerら,J.Biomol.Screen.(2000)5:153−158;及びKimら,Anal.Biochem.(2000)284:42−48を参照されたい。プロテアーゼ活性を試験するための特に便利なアッセイを以下の実施例において示す。
【0099】
同様に、ヘリカーゼ活性アッセイは当技術分野において周知であり、NS3/4aエピトープのヘリカーゼ活性は、例えばHsuら,Biochem.Biophys.Res.Commun.(1998)253:594−599中に記載のELISAアッセイ;Kyonoら,Anal.Biochem.(1998)257:120−126中に記載のシンチレーション近傍アッセイシステム;例えば、Hichamら,Antiviral Res.(2000)46:181−193及びKwongら,Methods Mol.Med.(2000)24:97−116中に記載の高スループットスクリーニングアッセイ;ならびにその他の本技術分野で公知のアッセイにより決定できる。例えば、Khuら,J.Virol.(2001)75:205−214;Utamaら,Virology(2000)273:316−324;Paoliniら,J.Gen.Virol.(2000)81:1335−1345;Preugschatら,Biochemistry(2000)39:5174−5183;Preugschatら,Methods Mol.Med.(1998)19:353−364;及びHessonら,Biochemistry(2000)39:2619−2625参照。
【0100】
高次構造NS3/4aエピトープが用いられる場合、抗原の長さは、免疫反応性の高次構造エピトープを維持するのに十分である。しばしば、使用される抗原を含むポリペプチドはほとんど完全長であるが、ポリペプチドを例えば、溶解性を向上させるため、又は分泌を改善するために、短縮することもできる。通常、NS3/4a中に見いだされる高次構造エピトープは組換えポリペプチドとして細胞中で発現され、このポリペプチドは所望の形態において、以下に記載のエピトープを提供する。
【0101】
NS3/4aポリペプチドに対する代表的なアミノ酸配列を図13A〜13Dに示す。図13A〜13Dの2位〜686位に示されるアミノ酸配列はHCV−1における1027位〜1711位のアミノ酸に相当する。Metをコードする開始コドン(ATG)を1位に示す。さらに、HCV−1の1428位に通常存在するThr(図13における403位のアミノ酸)がProへと変異し、HCV−1の1429位に通常存在するSer(図13における404位のアミノ酸)がIleへと変異している。このNS3/4a高次構造エピトープを本明細書中で「NS3/4a PI」及び「NS3NS4a PI」と称する。しかしながら、その天然の高次構造を保持し又は回復させる方法を用いてエピトープが生成される限り、N−末端のMetを有するかもしくは有しない天然の配列、N−末端のMetを有するかもしくは有しない示されるアナログ(すなわち、「PI」アナログ)、又はその他のアナログ及びフラグメントのいずれかを本発明のアッセイにおいて使用することができる。Dasmahapatraら,米国特許第5,843,752号及びZhangら,米国特許第5,990,276号参照、両者はNS3/4aのアナログを記載する。
【0102】
NS3/4aのNS3プロテアーゼは、HCV−1に対して番号付けされたおよそ1027位〜1207位(図13の2位〜182位)に見出される。NS3プロテアーゼの構造及び活性部位は公知である。例えば、De Francescoら,Antivir.Ther.(1998)3:99−109;Kochら,Biochemistry(2001)40:631−640参照。通常耐容性のある天然の配列に対する変化は、この分子の活性部位の外側に存在する。特に、図13の1〜又は2〜155のアミノ酸をほとんど置換しないか、又は保存的な置換のみを有するように維持することが望ましい。155位より後ろに存在するアミノ酸は、より大きな変化に耐える。さらに、NS3/4a配列のフラグメントを使用する場合、これらのフラグメントは通常、N−末端のMetを有する又は有しない少なくとも1〜又は2〜155のアミノ酸、好ましくは1〜又は2〜175のアミノ酸及び、最も好ましくは1〜又は2〜182のアミノ酸を含む。ヘリカーゼドメインは、HCV−1のおよそ1193位〜1657位(図13における207位〜632位)において見出される。したがって、ヘリカーゼ活性が所望される場合には、分子のこの部分はほとんど変化しない又は保存的な変化のみを有して保持されるであろう。当業者は、NS3/4aの公知の構造に基づいて、変化に耐えるその他の領域を容易に決定することができる。
【0103】
上記に説明したように、限定されるものではないが、c33c領域、c200領域、c100領域及び5−1−1領域、並びにc25のようなNS3エピトープを含む融合タンパク質由来の抗原を含む、NS3/4a由来のエピトープを含む多数の抗原が公知である。
【0104】
その他のHCV領域からの、これら及び種々のその他のHCVエピトープの記述に関しては、例えば、Houghtonら、米国特許第5,350,671号;Chienら,Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1992)89:10011−10015;Chienら,J.Gastroent.Hepatol.(1993)8:S33−39;Chienら,国際公開第93/00365号;Chien,D.Y.,国際公開第94/01778号;及び米国特許第6,280,927号及び同第6,150,087号を参照(本明細書中にそれらの全体が参考として援用される)。
【0105】
(HCV抗原の生産)
上記に説明したように、本発明の分子は通常組換え的に生産される。したがって、本発明と共に使用するためのHCV抗原をコードするポリヌクレオチドは標準的な分子生物学の技法を用いて製造可能である。例えば、上記の分子をコードするポリヌクレオチド配列を、組換え手法を用いて(例えばその遺伝子を発現している細胞からのcDNAライブラリー及びゲノムライブラリーのスクリーニングによって、又はその遺伝子を含むことが知られているベクターからの遺伝子を抽出することによって)得ることができる。さらに、所望の遺伝子を、Houghtonら,米国特許第5,350,671号のような当該技術分野において記載される技法を用いてウイルスの核酸分子から直接的に単離することができる。目的の遺伝子をクローニングするのではなく、合成的に生産することもできる。分子は特定の配列のために、適切なコドンを用いて設計され得る。次いで、完全な配列が、標準的な方法により調製されるオーバーラップしたオリゴヌクレオチドから組み立てられ、完全なコード配列へと組み立てられる。例えば、Edge(1981)Nature 292:756;Nambairら(1984)Science 223:1299;及びJayら(1984)J.Biol.Chem.259:6311参照。
【0106】
従って、好適な場合に、部位特異的突然変異誘発技術及びポリメラーゼ連鎖反応(PCR)技術のような当該技術分野で公知の種々のオリゴヌクレオチド合成技術を用いて、特定のヌクレオチド配列を、所望の配列を保持するベクターから得てもよく、又は、完全にもしくは部分的に合成してもよい。例えば、Sambrook(前出)を参照。特に、所望の配列をコードするヌクレオチド配列を得るための1つの方法は、従来の自動化ポリヌクレオチド合成装置で製造されるオーバーラップした合成オリゴヌクレオチドの相補的なセットを、アニーリングし、次いで適切なDNAリガーゼにより連結して、連結されたヌクレオチド配列をPCRを介して増幅することによる。例えば、Jayaramanら(1991)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 88:4084−4088参照。さらに、オリゴヌクレオチド指向型合成(Jonesら(1986)Nature 54:75−82)、予め存在するヌクレオチド領域のオリゴヌクレオチド特異的突然変異誘発(Riechmannら(1988)Nature 332:323−327及びVerhoeyenら(1988)Science 239:1534−1536)、及び、T4 DNAポリメラーゼ(Queenら(1989)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86:10029−10033)を用いたギャップオリゴヌクレオチドの酵素的埋め合わせ(enzymatic filling−in)が、タンパク分解性切断部位の変化及び/又はプロテアーゼに対する感受性の低減を分子にもたらす本発明の下で使用され得る。
【0107】
MEFAの製造方法は当業者に公知であり、例えば、米国特許第6,428,792号;同第6,514,731号;同第6,632,601号;同第6,797,809号中に記載されており、その開示は本明細書中にその全体が参考として援用される。手短に言えば、MEFA中で使用するための所望のエピトープをコードするDNAを合成的に製造するか、又は同じものを含むベクターから上述のように入手する。所定の順序でエピトープをコードする配列を連結し、MEFAの設計における改変を助けることによって本発明の有用性を増加させることができるようにするために、固有の制限酵素部位を導入することができる。制限酵素部位及びクローニング方法の選択は、組換えDNA技術における通常の技術を有する者により容易に決定される。好ましくは、エピトープ接合部(クローニングによってエピトープ間に作られたアミノ酸配列)は非特異的エピトープを生じない。非特異的エピトープは、例えば、天然にはHCVエピトープに隣接して存在しない非HCV配列である。非特異的エピトープは、試験サンプル中の抗体に結合し得、偽陽性のアッセイ結果をもたらし得る。接合部配列によるMEFAとの非特異的な相互作用を回避するため、接合部をコードするDNA配列は、例えば、変異アミノ酸配列との非特異的な相互作用が低減され、エピトープフラグメントのクローニングが可能となるように変異され得る。ヌクレオチド配列は次いで発現カセット内に配置され、好適な宿主がこのカセットを用いて形質転換される。宿主は、この配列を発現して、MEFAを提供し得る。次いで、産生されたMEFAを、例えばアフィニティークロマトグラフィーによって精製する。このプロセスは、所定のエピトープの複数のコピーが存在することによってある程度効率化される。
【0108】
HCV変異体のような所望のヌクレオチド配列の変異体又は類似体を製造する方法は周知である。例えば、Dasmahapatraら,米国特許第5,843,752号及びZhangら,米国特許第5,990,276号参照。イムノアッセイにおける使用のためのHCV抗原の変異体又はアナログは、目的のポリペプチドをコードする配列の一部を欠損させることにより、配列を挿入することにより、及び/又はその配列内の1以上のヌクレオチドを置換することにより調製され得る。部位特異的突然変異誘発などのようなヌクレオチド配列を改変するための技法は当業者に周知である。例えば、Sambrookら、前出;Kunkel,T.A.(1985)Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1985)82:448;Geisselsoderら(1987)BioTechniques 5:786;ZollerおよびSmith(1983)Methods Enzymol.100:468;Dalbie− McFarlandら(1982)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 79:6409参照。
【0109】
ひとたびコード配列が調製されるか又は単離されると、このような配列は任意の好適なベクター又はレプリコンへとクローニング可能である。多数のクローニングベクターが当業者に公知であり、適切なクローニングベクターの選定はその選択の問題である。好適なベクターは、限定されるものではないが、プラスミド、ファージ、トランスポゾン、コスミド、クロモソーム又は適切な制御エレメントと組み合わせたときに複製可能なウイルスを含む。
【0110】
次いで、コード配列を、発現のために用いられる系に依存して、好適な制御エレメントの制御下に置く。すなわち、このコード配列を、プロモーター、(細菌性発現のための)リボソーム結合部位及び、必要に応じて目的のDNA配列が好適な形質転換体によりRNAへと転写されるためのオペレーターの制御下に置くことができる。コード配列は、翻訳後プロセシングにおいて宿主によって後に除去され得るシグナルペプチド又はリーダー配列を含んでもよく、又は含まなくてもよい。例えば、米国特許第4,431,739号;同第4,425,437号;同第4,338,397号参照。
【0111】
制御配列に加えて、宿主細胞の成育に関する配列の発現の調節を可能にする調節配列を加えることが望ましい場合がある。調節配列は当業者に公知であり、その例には、化学的又は物理的刺激(調節化合物を含む)に対して応答して遺伝子の発現が作動する又は作動が切れることをもたらすものを含む。その他のタイプの調節エレメントには、ベクター中に存在するものもある。例えば、エンハンサーエレメントは、本明細書中で、構築物の発現レベルを増加させることができる。例としてはSV40初期遺伝子エンハンサー(Dijkemaら(1985)EMBO J.4:761)、ラウス肉腫ウイルスのロングターミナルリピート(LTR)由来のエンハンサー/プロモーター(Gormanら(1982)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 79:6777)、及びCMVイントロンA配列(米国特許第5,688,688号)中に含まれるエレメントのようなヒトCMV由来のエレメント(Boshartら(1985)Cell 41:521)を含む。発現カセットはさらに、好適な宿主細胞における自己複製のための複製起点、1以上の選択マーカー、1以上の制限酵素部位、高コピー数に関する潜在力及び強力なプロモーターを含み得る。
【0112】
好適な調節配列を伴うベクター中に特定のコード配列が配置され、その制御配列に対してコード配列の位置及び向きが、そのコード配列が制御配列の「制御」下で転写される(すなわち、制御配列の位置でDNA分子に結合するRNAポリメラーゼがコード配列を転写する)ような位置および向きであるように、発現ベクターを構築する。目的の分子をコードする配列の改変は、この目的を達成することが所望され得る。例えば、いくつかの場合においては、それが適切な向きで制御配列へと連結される(すなわちリーディングフレームを維持する)ように、その配列を改変することが必要であり得る。制御配列及びその他の調節配列は、ベクターへの挿入前にコード配列へと連結され得る。あるいは、コード配列を、すでに制御配列及び適切な制限部位を有する発現ベクターへと直接的にクローニングしてもよい。
【0113】
分子は、広範な系において発現させられ得、これらの系としては、昆虫発現系、哺乳類発現系、細菌発現系、ウイルス発現系及び酵母発現系が挙げられ、これらは全て、当技術分野において周知である。例えば、バキュロウイルス系のような昆虫細胞発現系は当業者に公知であり、例えば、SummersおよびSmith,Texas Agricultural Experiment Station Bulletin No.1555(1987)中に記載されている。バキュロウイルス/昆虫細胞発現系に関する材料及び方法は、キットの形態で、特にInvitrogen,San Diego、カリフォルニアから市販されている(「MaxBac」キット)。同様に、細菌及び哺乳類の細胞発現系は当技術分野において周知であり、例えば、Sambrookら(前出)において記載されている。酵母の発現系も当技術分野において公知であり、例えば、Yeast Genetic Engineering(Barrら,編,1989)Butterworths,London中に記載されている。
【0114】
上記の系と共に使用するための多数の好適な宿主細胞もまた公知である。例えば、哺乳類の細胞株が当該分野で公知であり、限定されるものではないが、例えば、チャイニーズハムスター卵巣(CHO)細胞、HeLa細胞、ベビーハムスター腎臓(BHK)細胞、サル腎臓細胞(COS)、ヒト胚腎臓細胞、ヒト肝細胞癌腫細胞(例えばHep G2)、Madin−Darbyウシ腎臓(「MDBK」)細胞などの、American Type Culture Collection(ATCC)から入手可能な不死化細胞株を含む。同様に、E.coli、Bacillus subtilis及びStreptococcus spp.のような細菌宿主も、本発明の発現構築物による用途を見出すであろう。本発明において有用な酵母宿主としては、特に、Saccharomyces cerevisiae、Candida albicans、Candida maltosa、Hansenula polymorpha、Kluyveromyces fragilis、Kluyveromyces lactis、Pichia guillerimondii、Pichia pastoris、Schizosaccharomyces pombe及びYarrowia lipolyticaが挙げられる。バキュロウイルス発現ベクターと共に使用する昆虫細胞としては、特に、Aedes aegypti、Autographa californica、Bombyx mori、Drosophila melanogaster、Spodoptera frugiperda及びTrichoplusia niを含む。
【0115】
目的のヌクレオチド配列を含む核酸分子は、当技術分野において周知の種々の遺伝子送達技術を用いて宿主細胞ゲノムへと安定的に組み込まれ得るか、又は好適な宿主細胞中の安定なエピソーム成分上に保持され得る。例えば、米国特許第5,399,346号を参照されたい。
【0116】
上記で説明したように、組換え発現を助けるために、MEFAのコード配列を別の配列に融合し得る(例えば、50kDaのE.coliマルトース結合タンパク質をコードする配列との融合物、酵母スーパーオキシドジスムターゼ(SOD)をコードする配列又はそれらのフラグメントとの融合物、あるいはユビキチンをコードする配列との融合物)。ヒトSODのヌクレオチド配列及びアミノ酸配列は公知であり、Hallewellら、米国特許第5,710,033号中で報告されている。
【0117】
発現系及び選択される宿主に依存して、上述の発現ベクターにより形質転換された成育中の宿主細胞によって、タンパク質が発現する条件下で分子が生産される。発現されたタンパク質は次いで宿主細胞から単離され、精製される。発現系がタンパク質を生育培地へと分泌する場合、その産物を培地から直接精製することができる。それが分泌されない場合には、細胞溶解液から単離できる。好適な生育条件及び回収方法は当該分野の技術範囲内である。
【0118】
上述の種々の融合において使用される抗原を含む種々のHCV抗原の組換え生産が記述されている。例えば、国際公開第94/01778号、同第93/00365号、同04/00547号及び同01/38360号;米国特許第5,350,671号、同第5,683,864号、同第6,346,375号、同第6,150,087号、同第6,514,731号、同第6,428,792号及び同第6,632,601号;Chienら,J.Gastroent.Hepatol.(1993)8:S33−39;Chien,D.Y.,国際公開第94/01778号;Chienら,Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1992)89:10011−10015を参照(全ての開示は、その全体が、本明細書中に参考として援用される)。
【0119】
(免疫診断アッセイ)
一旦産生されると、HCV抗原は、抗体を検出するために既知の抗原を使用する実質的に任意のアッセイ形式において使用され得る。これらの全てのアッセイに共通する特徴は、抗原が、HCV抗体を含むことが疑われる身体の成分と、この抗原がこの成分中に存在する任意のこのような抗体に結合することを可能にする条件下で、接触させられることである。このような条件は、代表的に、生理学的な温度、pHおよびイオン強度であり、過剰な抗原を用いる。この抗原と標本とのインキュベーションの次に、抗原からなる免疫複合体の検出が行われる。
【0120】
イムノアッセイの設計は、大きな変動に供され得、そして多くの形式が、当該分野で公知である。例えば、プロトコールは、固体支持体を使用してもよく、または免疫沈降を使用してもよい。ほとんどのアッセイは、標識化抗体もしくは標識化ポリペプチドの使用を包含する;例えば、この標識は、上で詳しく考察した通り、酵素分子、蛍光分子、化学発光分子、放射活性分子もしくは色素分子であり得る。免疫複合体からのシグナルを増幅するアッセイもまた、公知である。このアッセイの例は、ビオチンおよびアビジンを使用するアッセイ、ならびに酵素標識化イムノアッセイおよび酵素媒介型イムノアッセイ(例えば、ELISAアッセイ)である。
【0121】
このイムノアッセイは、限定されないが、異種形式でも同種形式でもよく、そして標準型でも競合型でもよい。異種形式において、抗原が、代表的に、固体マトリックスもしくは固体支持体に結合し、インキュベーション後に、サンプルからの抗原抗体結合体の分離を容易にする。本発明の目的のために、固体支持体は、可溶性マトリックスである任意の材料であり得、そして剛性もしくは半剛性の表面を有し得る。例示的な固体支持体としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない:ニトロセルロースのような基質(例えば、膜もしくはマイクロタイターウェル形態);塩化ポリビニル(例えば、シートもしくはマイクロタイタープレート);ポリスチレンラテックス(例えば、ビーズもしくはマイクロタイターウェル);フッ化ポリビニリジン;ジアゾ化紙;ナイロン膜;活性型ビーズ、磁気応答ビーズなど。具体的な支持体としては、プレート、ペレット、ディスク、キャピラリー、中空ファイバー、針、ピン、固体ファイバー、セルロースビーズ、穴あきガラス(pore−glass)ビーズ、シリカゲル、必要に応じてジビニルベンゼンに架橋したポリスチレンビーズ、グラフト共重合ビーズ、ポリアクリルアミドビーズ、ラテックスビーズ、必要に応じてN−N’−ビス−アクリロイルエチレンジアミンに架橋したジメチルアクリルアミドビーズ、および疎水性ポリマーでコーティングしたガラス粒子が挙げられる。
【0122】
所望される場合、上記固体支持体に添加されるべき分子は、スチレン部分もしくはアクリレート部分を作製するように容易に官能性付与され得、それによって、この分子のポリスチレン、ポリアクリレートもしくは他のポリマー(例えば、ポリイミド、ポリアクリルアミド、ポリエチレン、ポリビニル、ポリジアセチレン、ポリフェニレン−ビニレン、ポリペプチド、多糖類、ポリスルホン、ポリピロール、ポリイミダゾール、ポリチオフェン、ポリエーテル、エポキシ、石英ガラス、シリカゲル、シロキサン、ポリリン酸塩、ヒドロゲル、アガロース、セルロースなどへの組み込みを可能にする。
【0123】
上記抗原は、固体支持体に直接固定される必要はなく、間接的に(例えば、別の結合分子を介して)結合されてもよい。例えば、この抗原に結合する既知の抗体は、ビオチン化され得、そしてストレプトアビジンもしくはアビジンでコーティングされた固体支持体と合わせられ得る。目的の抗原(例えば、MEFAもしくはNS3/4a高次構造エピトープ)が、ビオチン化抗体への結合によって固体支持体に結合される。あるいは、目的の抗原は、ビオチン化され得、そしてストレプトアビジンもしくはアビジンでコーティングされた固体支持体と合わせられ得る。
【0124】
1種より多くのHCV抗原(例えば、改変MEFAおよび高次構造NS3/4aエピトープ)がアッセイにおいて使用される場合、これらの抗原は、同じ固体支持体上もしくはこのアッセイにおいて合わせられ得る異なる固体支持体上で提供され得る。したがって、例えば、これらの抗原は、別個の実態として、例えば、1枚のプレート上に存在してもよく、または、例えば、目的のアッセイにおける使用のために一緒に加えられる個々の微小ビーズ上に存在してもよい。
【0125】
1つの状況において、図2で示すように、固体支持体は、最初に、例えばHCV MEFA7.2およびNS3/4aのようなHCV抗原(本明細書中で、集合的に「固相成分」と呼ぶ)と、この分子が十分に固体支持体に固定化されるような適切な結合条件下で反応させられる。時々、支持体への固定化は、最初により良い固相結合特性を有するタンパク質へ抗原とカップリングすることによって増強され得る。適切なカップリングタンパク質としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない:ウシ血清アルブミン(BSA)を含む血清アルブミン、キーホールリンペットヘモシアニン、免疫グロブリン分子、サイログロブリン、オボアルブミン、および当業者に公知の他のアルブミン。分子を支持体に結合するために使用され得る他の試薬としては、多糖類、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、ポリマー性アミノ酸、アミノ酸コポリマーなどが挙げられる。そのような分子およびこれらの分子の抗原へのカップリングの方法は、当業者に周知である。例えば、Brinkley,M.A.(1992)Bioconjugate Chem.3:2−13;Hashidaら(1984)J.Appl.Biochem.6:56−63;ならびにAnjaneyuluおよびStaros(1987)International J.of Peptide and Protein Res.30:117−124を参照されたい。
【0126】
固体支持体を固相成分と反応させた後、任意の非固定化固相成分は、洗浄によって支持体から除去され、次いで、この支持体に結合した成分は、HCV抗体(本明細書中で集合的に「リガンド分子」と呼ぶ)を含むことが疑われる生物学的サンプルと、適切な結合条件下で接触させられる。HCV抗体がサンプル中に存在する場合、これらは、その固体支持体上でHCV抗原と複合体を形成する。任意の非結合リガンド分子を除去するための洗浄の後、検出可能に標識化された抗体(例えば、抗HCV抗体上のエピトープを認識する抗外因性抗体(例えば、抗ヒト抗体))が、添加される。これらの抗体は、複合体形成に起因して結合する。
【0127】
別のアッセイ形式が、図3に示される。このアッセイ形式は、当該分野で周知であり、ビオチン標識化抗体(改変MEFAおよび、必要な場合NS3/4a(例えば、NS3/4a高次構造エピトープ)と結合する)と反応させられるストレプトアビジンコーティングされた固体支持体を用いる。このサンプルは、適切な結合条件下で加えられる。HCV抗体がサンプル中に存在する場合、これらは、HCV抗原と複合体を形成する。任意の非結合リガンド分子を除去するための洗浄の後、上述のように、検出可能に標識化された抗体が添加される。
【0128】
同種形式において、試験サンプルは、溶液中の抗原の組み合わせと共にインキュベートされる。例えば、これは、形成された任意の抗原−抗体複合体を沈殿する条件下であり得る。同種アッセイのための標準形式および競合形式の両方が、当該分野で公知である。
【0129】
標準形式において、抗体−抗原複合体を形成するHCV抗体の量が、直接モニタリングされる。これは、抗HCV抗体上のエピトープを認識する標識化抗外因性抗体(例えば、抗ヒト抗体)が、複合体形成に起因して結合するか否かを決定することによって、達成され得る。競合形式において、サンプル中のHCV抗体の量は、複合体中の既知の量の標識化抗体(または他の競合性リガンド)の結合における競合作用をモニタリングすることによって推定される。
【0130】
より詳細には、抗HCV抗体(または、競合アッセイにおいては、競合性抗体の量)を含んで形成される複合体が、その形式に依存して、多くの公知の技術のいずれかによって検出される。例えば、その複合体中の未標識化HCV抗体は、標識(例えば、酵素標識)と複合体化した抗外因性Igの結合体を用いて検出され得る。免疫沈降アッセイ形式もしくは凝集アッセイ形式において、HCV抗原と抗体との間の反応は、ネットワークを形成し、このネットワークは、溶液もしくは懸濁液から沈殿し、そして沈殿物の可視の層もしくは薄膜を形成する。抗HCV抗体が試験標本中に存在しない場合、可視の沈殿物は形成されない。
【0131】
代替の実施形態において、NS3/4aもしくは改変MEFAが、サンドイッチ型アッセイ形式において検出薬剤として使用され得る。サンドイッチアッセイは、当該分野で周知である。
【0132】
上述のアッセイ試薬(結合した抗体および抗原を有するイムノアッセイ固体支持体、ならびに捕獲したサンプルと反応させられる抗体および抗原を含む)は、上述のイムノアッセイを実施するために、適切な指示書および他の必要な試薬と共にキット中で提供され得る。このキットは、抗原の組み合わせ(既に固体マトリックスに結合しているか、またはそれら抗原をマトリックスに結合するための試薬と別個であるかのいずれか)、コントロール抗体処方物(ポジティブおよび/またはネガティブ)、標識がシグナルを直接産生しない場合にアッセイ形式が同一のシグナル発生試薬(例えば酵素基質)を必要とする場合は標識化抗体を、通常、別個の容器において含む。アッセイを実施するための指示書(例えば、書類、テープ、VCR、CD−ROMなど)が、通常、キット中に含まれる。このキットはまた、使用される特定のイムノアッセイに依存して、他の梱包された試薬および材料(すなわち、洗浄緩衝液など)を含み得る。上述のもののような種々のイムノアッセイが、これらのキットを用いて実施され得る。
【実施例】
【0133】
(III.実施例)
以下は、本発明を実施するための特定の実施形態の例である。これらの例は、例示のみの目的で提供され、そして本発明の範囲を限定することをいかなるようにも意図しない。
【0134】
使用される数値(例えば、量、温度など)に関して正確さを期するために努力がなされているが、無論、ある程度の実験誤差および偏差は許容される。
【0135】
(実施例1)
(MEFA 7.1及びMEFA 7.2の構築)
以下の実施例は、複数のHCVエピトープのポリタンパク質カセットの調製を説明する。複数のエピトープカセットから発現するこのポリタンパク質を、本明細書中では多エピトープ融合抗原(MEFA)と称する。好ましくは、エピトープが繰り返される場所においては、余分なコピーは同じ向きに直列して配列される。エピトープとして使用されるウイルスのコード配列のこの領域は、わずかに変化し得かつ抗原活性をなお保持することが理解され、そのアミノ酸の指定番号付けは株ごとに相違し得ることが理解される。従って、繰り返しエピトープは株の配列バリエーション及び/又は番号付けの指定により、アミノ酸配列中で互いに異なり得る。好ましくは、MEFA内の繰り返しエピトープのアミノ酸配列は、アミノ酸レベルで少なくとも30%相同であり、より好ましくは、アミノ酸レベルで少なくとも40%相同である。
【0136】
固有の制限酵素部位を、キメラ抗原の設計における改変を手助けすることにより、予め決められた順序でエピトープを連結するように、本発明の有用性を高めるように、導入した。制限酵素切断部位及びクローニング手法の選択は、組換えDNA技法の分野の当業者により容易に決定される。好ましくは、エピトープ接合部(クローニングによりエピトープの間に作り出されるアミノ酸配列)は、非特異的エピトープを生じない。非特異的エピトープは、例えば、天然にはHCVエピトープに隣接して存在しない非HCV配列である。非特異的エピトープは、試験サンプル中の抗体と結合して偽陽性のアッセイ結果をもたらす場合がある。好ましくは、多エピトープ融合タンパク質を、エピトープ接合部において生じるこのような配列による偽陽性の結果について試験する。接合部配列による、MEFAとの非特異的な相互作用を回避するため、接合部をコードするDNA配列を、例えば、変異アミノ酸配列との非特異的な相互作用を減少させ、エピトープフラグメントのクローニングが可能になるように変異させることができる。
【0137】
例えば、MEFA 7.1及びMEFA 7.2の図解をそれぞれ示す図4及び図8において示すように、主要エピトープを直列配置で含有するコードヌクレオチド配列のクローニングによってHCV MEFA 7.1及びHCV MEFA 7.2の発現カセットを構築した。主要エピトープは抗体反応の頻度及びエピトープに対する反応強度(力価)に基づいて選択された(Chein,D.Y.ら(1994)Viral Hepatitis and Liver Disease,pp.320−324)。PCR増幅により、又は合成オリゴヌクレオチドによって、HCVエピトープをコードする種々のDNAセグメントが構築された。MEFA7.2の各セグメント中のアミノ酸は上記の表2及び図9A−9F中で示される。完全なHCV−1アミノ酸配列(3011個のアミノ酸)がChooら,(1991)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 88:2451−2455(本明細書中でその全体が参考として援用される)により決定される。HCVと結合し得るオリゴヌクレオチドは米国特許第5,350,671号中に記載される(本明細書中でその全体が参考として援用される)。本発明のエピトープにおけるアミノ酸の番号付けは、別に特定されない限り、Chooら(前出)により提供される番号付け指定に従う。この番号付けにおいて、アミノ酸番号1は、コア領域のコード配列によりコードされる第1番目のメチオニンである。例えば、NS5からの1つのエピトープセグメントがHCVポリタンパク質の2278〜2313のアミノ酸により表される。E1領域からのエピトープはHCV−1ポリタンパク質と比較して番号付けされた303〜320のアミノ酸により表される。
【0138】
MEFA 7.1及びMEFA 7.2は各々HCV−1、HCV−2及びHCV−3からのエピトープを含み、単回のアッセイでウイルスの複数タイプの検出を可能にする。HCV血清型の決定方法は国際公開第96/27153号中に見出され、本明細書中でその全体が参考として援用される。例えば、5−1−1領域からのエピトープはHCVの血清型間で異なることが見出されている。本明細書中で記載されるMEFA中に存在する、HCV型特異的な5−1−1エピトープのそれぞれのコピーは、試験生物学的サンプル中に存在し得る任意のHCV型の結合を可能にする。
【0139】
MEFA構築物を、酵母における自己複製のための2μ配列ならびに選択可能なマーカーとしての酵母遺伝子leu2−d及びURA3を含む酵母の発現ベクターpBS24.1を用いて、Saccharomyces cerevisiae中での発現のために遺伝子操作した。細菌におけるプラスミド複製に必要とされるβ−ラクタマーゼ遺伝子及びColE1複製起点もまた、この発現ベクター中に存在していた。MEFA 7についての酵母発現ベクターであるps.MEFA7を最初に構築した。次いで、MEFA7.1抗原をコードするプラスミドであるps.MEFA7.1を作り出すために、HCVコアエピトープに関するコード領域においてプラスミドを改変した。最終的に、アミノ酸の1428位/1429位、1455位/1456位、1657位/1658位及び1711位/1712位に存在するNS3タンパク分解性切断部位(5−1−1エピトープ中で3つの繰り返しとして存在する)を変異させることにより、MEFA7.2抗原を作出した。
【0140】
特に、図6A〜6Dに示すように、MEFA 7についての酵母発現プラスミドを以下のように構築した。まず、ADH2/GAPDHハイブリッドプロモーター、hSOD(ヒトSOD、アミノ酸1〜156)、その後に続くE1エピトープ(アミノ酸303〜320、HCV1株)をコードする1896bpのBamHI/HindIIIフラグメントを、国際公開第97/44469号中に記載されたMEFA 6(図12C)をコードする発現プラスミドであるps.MEFA6から単離した。次に、E2 HVR1a共通エピトープ(アミノ酸390〜410、HCV−1)、E2 HVR1+2共通エピトープ(アミノ酸384〜414、HCV1+2)及びヘリカーゼドメインの5’末端(アミノ酸1193〜1229、HCV−1)のコード配列を含む269bpのHindIII/SphI合成DNAフラグメントを作製した。ヘリカーゼドメイン(アミノ酸1230〜1651、HCV−1)の残りの部分をコードする1264bpのSphI/EclXIフラグメントを、pTac5/HelIプラスミドプラスミドDNAからゲル精製した。HindIII/SphI合成DNAフラグメント及びSphI/EclXIの1264bpのフラグメントを、ベクターpSP72new.HindIII/EclXIベクターへと連結し、pSP72new.HindIII/EclXI/e2.ヘリカーゼを生産した。このベクターはPromega(Madison,ウイスコンシン州)から市販されているpSP72由来のE.coliベクターであった(GenBank/ΕMBL登録番号X65332)。特に、いくつかのMΕFA 7エピトープをサブクローニングすることを容易にするために、pSP72のSphI部位とBglII部位との間に、合成オリゴを介して新たなマルチクローニングサイト(MCS)ポリリンカーを導入した。pSP72newと称するこの新たなプラスミドを、MCS中に唯一の部位を有するHindIII及びEclXI(EagIとしても知られる)で消化した。次いで、それを脱リン酸化してゲル精製した。
【0141】
E.coli HB101コンピテント細胞をこのプラスミドを用いて形質転換し、100μg/ml アンピシリンを含むLuria寒天プレート上にプレート培養した。所望のクローンを、ミニプレップDNA分析を用いて同定した。配列確認後、このプラスミドpSP72new.HindIII/EclXI/e2.ヘリカーゼサブクローン#4をHindIII及びEclXI(EagI)で消化し、1534bpのフラグメントを生成させた。このHindIII/EclXIフラグメントをゲル精製し、ヘリカーゼドメインの最後のアミノ酸(アミノ酸1651〜1658、HCV−1)をコードするEclXI/SphIオリゴヌクレオチドと共に、pGEM7 HindIII/SphIベクターへと連結した。HB101コンピテント細胞を形質転換し、Luriaアンピシリン(100μg/ml)上にプレート培養した。所望のクローンの同定及び配列確認後、pGEM7HindIII/SphIサブクローン#9をHindIII及びSphIで消化し、ゲル精製された1560bpのフラグメントを生成させた(図6A参照)。
【0142】
MEFA 7の3’末端部分を組み立てるために、以下の工程を実行した。HCV−1、HCV−3及びHCV−2(この順番で)からの5−1−1エピトープ(アミノ酸1689〜1735)を、国際公開第97/44469号中に441bpのSphI/AvaIフラグメントとして記載されたMEFA 6をコードする発現プラスミドであるps.MEFA6からゲル単離した。このフラグメントを、c100エピトープ(アミノ酸1901〜1936)をコードする合成AvaI/XbaIオリゴヌクレオチドと共に、pSP72new.SphI/XbaIベクターへと連結した。HB101形質転換、クローン同定及び配列確認後に、pSP72newSXiサブクローン#6をXbaI及びNotIを用いて消化し、pSP72newXbaI/NotIベクターを調製した。さらに、NS5エピトープ(アミノ酸2278〜2313、HCV−1)の2回繰り返しをコードする221bpのXbaI/NcoIフラグメントをps.MEFA6から単離した。このXba/NcoIフラグメントを、HCV−1のコアエピトープの第1番目のアミノ酸をコードするNcoI/NotIオリゴヌクレオチド、9位のLysがArgへと変化し、11位のAsnがThrへと変化したアミノ酸9〜17と共に、上記で調製されたpSP72newXbaI/NotIベクターへと連結した。HB101形質転換体を分析し、それらのプラスミドDNAを配列解析した。pSP72newSX/XNi#3と名付けたサブクローンをNotI/SalIを用いて消化し、続くサブクローニングのためのベクターを調製した(図6B参照)。
【0143】
MEFA 7の3’末端の組み立てを完成するために、コアエピトープをコードする配列の2回繰り返しを、HCV−1からのアミノ酸9〜53、加えてこのコア領域の2つの遺伝子型に特異的なエピトープ(アミノ酸64〜88、HCV−1及びアミノ酸67〜84、HCV−2)と共に、NotI−SalI消化したpSP72newSX/XNiサブクローン#3へと以下のようにサブクローニングした。まず、コアエピトープのアミノ酸18〜51をコードする92bpのNotI/XmnIフラグメントを、pd.Core191RTクローン#20から単離した。プラスミドpd.Core191RTは、pBS24.1 BamHI−SalI酵母発現ベクターへと、ADH2/GAPDHプロモーターのための1365bpのBamHI−NcoIフラグメント及び、アミノ酸9がLysからArgへと変異し、アミノ酸11がAsnからThrへと変化したHCV−1コアの最初の191アミノ酸をコードする615bpのNcoI−SalIフラグメントを連結することによって構築した。この615bpのNcoI−SalIフラグメントは、上記と同じ2つの変異を伴うアミノ酸1〜191についてのコア配列がクローニングされたE.coli発現ベクターに由来する。
【0144】
92bpのNotI/XmnIフラグメントを、pSP72newNot/Kpnベクター、及び、完全コアエピトープの3’末端をコードするXmnI/KpnIオリゴヌクレオチドと連結した。陽性クローンの配列確認後、pSP72newNKiサブクローン#4をNotI及びKpnIを用いて消化し、224bpのフラグメントをゲル単離した。このNotI/KpnIフラグメントを、上述のコアエピトープの完全繰り返しをコードする284bpのオリゴヌクレオチド(KpnI−SalI末端)と共に、上述のpSP72newSX/XNi NotI/SalIベクターへと連結した。HB101形質転換、クローン同定及び配列確認後、pSP72newSX/XN/NSiサブクローン#18をSphI及びSalIを用いて消化し、1317bpのフラグメントをゲル単離した(図6C参照)。
【0145】
最後に、上述した以下のフラグメントを、pBS24.1 BamHI/SalI酵母発現ベクターへと連結し、ps.MEFA7(図6D参照)を作製した:
1896bpのBamHI/HindIIIフラグメント(図6A)
1560bpのHindIII/SphIフラグメント(図6A)
1317bpのSphI/SalIフラグメント(図6C)
S.cerevisiae株AD3をps.MEFA7を用いて形質転換し、単一の形質転換体を、培地中のグルコース枯渇後の発現についてチェックした。組換えタンパク質は、酵母中で高レベルで発現した(クーマシーブルー染色により検出した)。特に酵母細胞は、酢酸リチウムプロトコールを用いて、MEFA発現プラスミドで形質転換した。Ura−の形質転換体を画線培養して単コロニーを得、プラスミドのコピー数を増加させるためにLeu−/8%グルコースプレート上へと移植した。Leu−の出発培養物を24時間、30℃で生育させ、次いでYEPD(酵母エキスバクトトリプトン2%グルコース)培地中で1:20に希釈した。細胞を48時間、30℃で生育させ、回収した。MEFA 7組換え抗原の発現を試験するために、細胞のアリコートを溶解緩衝液(10mMのTris−Cl pH 7.5、1mMのEDTA、10mMのDTT)中でグラスビーズを用いて溶解した。溶解液を高速で遠心分離した。上清及び不溶性のペレットをSDSタンパク質ゲル上で分析した。MEFA 7は不溶性沈殿画分中に高度に濃縮された。
【0146】
MEFA 7抗原は以下のように精製した。MEFA 7を発現しているS.cerevisiae細胞を上述のように回収した。この細胞を溶解緩衝液(50mMのTris、0.15MのNaCl、1mMのEDTA、1mMのPMSF、pH 8.0)中に懸濁し、ダイノミル(Dyno−Mill)(Wab Willy A.Bachofon、Basel、スイス)又はグラスビーズを用いた相当する装置中で溶解させた。溶解液を低速条件(3,000〜5,000rpm、15分間)で遠心分離し、不溶性タンパク質画分を含むペレットを、溶解緩衝液中の尿素濃度を増加させながら(1M、2M、3M)洗浄した。0.1NのNaCl、4Mの尿素を含む溶解緩衝液を用いて、遠心分離のペレットからタンパク質を可溶化した。細胞残渣を3,000〜5,000rpm、15分間の低速遠心分離によって除去した。6NのHClを用いて上清をpH8.0に合わせ、これらの条件下で不溶性のタンパク質を沈殿させた。
【0147】
沈殿を遠心分離によって除去し、上清を2.3%のSDS、50mMのDTT、pH8.0に調整し、3分間煮沸した。混合物中のタンパク質を、0.1%のSDS、1mMのEDTAを含有し、pH7.4に調整したリン酸緩衝化生理食塩水中で、Pharmacia Sephacryl S−400上でのゲル濾過により分画した。MEFA 7を含むカラム溶出画分を回収し、プールし、Amicon YM−30膜上で濃縮した。プールされた画分を、同一のカラム及び条件を用いてゲル濾過を繰り返した。
【0148】
試験アッセイにおけるMEFA 7の分析の間に、検出結合体として使用されたモノクローナル抗体がコアエピトープ(アミノ酸33〜38)の特異的な配列と反応することが見いだされた。従って、ps.MEFA7.1を、コアエピトープ領域からのアミノ酸33〜38を除去するように設計した。
【0149】
MEFA7.1のための酵母発現ベクターは以下のように作製した。まず、ps.MEFA7の3’末端におけるコアエピトープの2回繰り返しを改変した。それを行うために、第1のコアエピトープ繰り返し(HCV−1のアミノ酸9〜32、39〜42及び64〜88、及びHCV−2のアミノ酸67〜82)をコードする206bpのNcoI/KpnI合成フラグメント、ならびにHCV−2のアミノ酸83および84、その後に第2のコアエピトープ繰り返し(HCV−1のアミノ酸9〜32、39〜42及び64〜88、及びHCV−2のアミノ酸67〜84)をコードする233bpのKpnI/SalI合成フラグメントを、それぞれpSP72new.NcoI/KpnIベクター及びpSP72new.KpnI/SalIベクターへとサブクローニングした。HB101形質転換、クローン同定及び配列確認後、pSP72newNKiクローン#21をNcoI及びKpnIを用いて消化して206bpのNcoI/KpnIフラグメントを単離し、pSP72newNSiクローン#32をKpnI及びSalIを用いて消化して、233bpのKpnI/SalIフラグメントを単離した。
【0150】
プラスミドps.MEFA7.1は、以下のフラグメントを、pBS24.1 BamHI/SalI酵母発現ベクターへと連結することにより組み立てた(図7参照):
ps.MEFA7について上述された1896bpのBamHI/HindIIIフラグメント;
ps.MEFA7について上述された1560bpのHindIII/SphIフラグメント;
ps.MEFA7から単離された、5−1−1エピトープ、c100エピトープ及びNS5エピトープをコードする776bpのSphI/NcoIフラグメント;
206bpのNcoI/KpnIフラグメント;
233bpのKpnI/SalIフラグメント。
【0151】
S.cerevisiae株AD3をps.MEFA7.1を用いて形質転換し、単一の形質転換体を、上述のように、培地中のグルコース枯渇後の発現についてチェックした。組換えタンパク質は、酵母中で高レベルで発現した(クーマシーブルー染色により検出した)。
【0152】
MEFA7.1抗原は以下のように精製した。MEFA7.1を発現しているS.cerevisiae細胞を上述のように回収した。この細胞を溶解緩衝液(50mMのTris、0.15MのNaCl、1mMのEDTA、pH 8.0)中に懸濁し、ダイノミル(Dyno−Mill)(Wab Willy A.Bachofen、Basel、スイス)又はグラスビーズを用いた相当する装置中で溶解させた。溶解液をJA−10ローター中、10,000rpm、30分間で遠心分離し、不溶性タンパク質画分を含むペレットを、溶解緩衝液中の尿素濃度を増加させながら(1M、2M、3M)洗浄した。0.1NのNaCl、4Mの尿素、50mMのDTTを含む溶解緩衝液を用いて、遠心分離のペレットからタンパク質を可溶化した。細胞残渣をJA−14ローター中、14,000rpm、20分間の遠心分離によって除去した。6NのHClを用いて上清をpH8.0に合わせ、これらの条件下で不溶性のタンパク質を沈殿させた。
【0153】
沈殿をJA−14ローター中、14,000rpm、20分間の遠心分離によって除去し、上清を2.3%のSDSに調整し、沸騰水中で70〜75℃に加熱し、次いで室温にさました。混合物中のタンパク質を、0.1%のSDS、1mMのEDTAを含有し、pH7.4に調整したPBS中で、Pharmacia Sephacryl S−400HR上でのゲル濾過により分画した。MEFA7.1を含むカラム溶出画分を回収し、プールし、Amicon YM−30膜上で濃縮した。プールされた画分を、同一のカラム及び条件の下でゲル濾過を繰り返した。プールされたゲル濾過画分を2.3%のSDS、50mMのDTTに調整し、上述のように加温/冷却した。このプールを、第1のゲル濾過工程と同様の条件下で、Pharmacia Sephacryl S−300 HRカラム上の第2のゲル濾過工程に供した。
【0154】
MEFA7.2についての酵母発現ベクターを以下のように作製した。この大きな多エピトープ融合抗原のクローニングを容易にするために、この分子を3つの制限フラグメントへと分割した。第1番目に、1896bpのBamΗI−HindIIIフラグメントをps_mefa7.1(上述)からゲル精製した。このフラグメントはADH2/GAPDHプロモーター、ヒトSOD及びHCV−1のE1エピトープをコードしていた。
【0155】
次のフラグメントである、E2 HVR−1a共通、E2 HCV1+2共通、及びヘリカーゼドメイン(プロテアーゼ切断部位をなくすためのアミノ酸1428、1429、1455、1456、1657及び1658における変異を伴う、HCV−1、アミノ酸1193〜1658)をコードする1560bpのHindIII−SphIフラグメントを、pGEM7ベクターへとサブクローニングした。特に、そのコード配列は、1428位、1455位及び1657位におけるそれぞれの天然のアミノ酸がロイシンに置換され、また、1429位、1456位及び1658位におけるそれぞれの天然のアミノ酸がプロリンに置換されるように変異された。従って、上記の組のそれぞれにおける変異は本明細書中で「LP」と称される。このサブクローンは、pGEM7 HindIII/SphIサブクローン#9(「pGEM7/HSi#9」と称し上述される)から以下のように得られた:(1)1560bpのHindIII−SphI挿入物を含むpGΕM7HindIII/SphIサブクローン#9をSacII+SphIを用いて消化し、脱リン酸化して、ゲル精製し、それにより3つのプロテアーゼ切断部位が配置された721bpのヘリカーゼを除去した。(2)最初の2箇所のLP変異を含むヘリカーゼの266bpのSacII−BglI部分をクローニングするために、合成オリゴを使用した。このクローニングを助けるために、オリゴは5’−末端及び3’−末端においてそれぞれEcoRI及びSalI部位を含んだ。このオリゴを、pUC19 EcoRI−SalIベクターへとクローニングした。HB101形質転換及び陽性コロニーの配列確認後に、pUC19 mefaSB#5を増幅して266bpのSacII−BglIフラグメントをゲル精製した。(3)429bpのBglI−EagIフラグメントを、pGEM7HindIII/SphIサブクローン#9からゲル精製した。ヘリカーゼのこの領域には変異が存在しない。(4)3番目の変異を含むヘリカーゼの26bpのEagI−SphI部分を完成させるために2つの付加的なオリゴを使用した。(5)266bpのSacII−BglIフラグメント、429bpのBglI−EagIフラグメント及び、これらの2つのオリゴをpGEM7HindIII/SphIサブクローン#9ベクターへと連結した。得られたpGEM7/SacII−EagI−SphI#6(図11A)と名付けられたΗB101クローンのひとつから、1560bpのHindIII/SphIフラグメントをMEFA7.2のためにゲル精製した。
【0156】
MEFA7.2にとって必要とされる3番目の制限フラグメントである、それぞれがプロテアーゼ切断部位におけるPI変異、C100エピトープ、2つののNS5エピトープ、及び2つのコアエピトープを有する、ΗCV1、2、3についての5−1−1ドメインをコードする1215bpのSphI−SalIフラグメントを以下のようにサブクローニングした:(1)ΗCV−1についての5−1−1 PIエピトープを、合成オリゴと共にpUC19 EcoRI−SalIベクターへとクローニングした。このオリゴは、EcoRIクローニング部位及びSalIクローニング部位にそれぞれ隣接したSphI部位及びNruI部位を含んでいた。HB101形質転換及び陽性クローンの配列確認後、pUC19 mefaSN#16を増幅し、147bpのSphI−NruI挿入物をゲル精製した。(2)HCV−3及びHCV−2についての5−1−1 PI、C100、及びNS5繰り返しをコードする629bpのNruI−NcoIフラグメントを、ps.mefa13#12(米国特許第6,630,298号(本明細書中にその全体が援用される)に記載される)からゲル精製した。(3)コアエピトープの2回の繰り返しをコードする439bpのNcoI−SalIフラグメントをps.mefa7.1#15からゲル精製した。(4)147bpのSphI−NruIフラグメント、629bpのNruI−NcoIフラグメント、及び439bpのNcoI−SalIフラグメントをpGEM5 SphI−SalIベクターへと連結した。得られたクローンのひとつであるpGEM5 SphI−SalI.mefa.7.2#62(図11B)から、1215bpのSphI−SalI挿入物をゲル単離した。
【0157】
最終的に、1869bpのBamHI−HindIIIフラグメント、1560bpのHindIII−SphIフラグメント及び1215bpのSphI−SalIフラグメントを、BamΗI−SalI pBS24.1酵母発現ベクターへと連結した。HB101形質転換及びミニスクリーン分析後、2つの陽性クローンが正確な大きさのBamHI−SalI挿入物を有することが見いだされた。プラスミドDNAを、ps.mefa7.2#3及びps.mefa7.2#42について増幅した(図11C)。
【0158】
S.cerevisiae株AD3を、Invitrogen Easy Comp Sc transformation kit(Invitrogen,San Diego、カリフォルニア)を使用して、ps.MEFA7.2で形質転換した。Ura−の形質転換体を画線培養して単コロニーを得、プラスミドのコピー数を増加させるためにLeu‐/8%グルコースプレート上へと移植した。Leu−の出発培養物を24時間、30℃で生育させ、次いでYEPD(酵母エキスバクトトリプトン2%グルコース)培地中で1:20に希釈した。細胞を48時間、30℃で生育させ、回収した。組換えタンパク質の発現を試験するために、細胞のアリコートを溶解緩衝液(10mMのTris−Cl pH 7.5、1mMのEDTA、10mMのDTT)中でグラスビーズを用いて溶解した。溶解液を高速遠心分離により清澄にした。不溶性のペレット画分をSDSタンパク質ゲルのクーマシー染色により分析した。120kDaのMEFA7.2タンパク質が高度に発現された。
【0159】
MEFAの存在は、上記MEFAのそれぞれがヒトSODのアミノ酸1〜156を含むので、SDS−PAGE(4〜20%のTris−グリシンゲル)及びh−SODに対するモノクローナル抗体を用いたウェスタンブロットを用いて確認した。
【0160】
MEFA7.2に関するDNA配列及び対応するアミノ酸配列を図9A〜9Fに示す。
【0161】
(実施例2)
(NS3/4aPIの生産)
NS3/4aPIは、通常1428位及び1429位に存在し、プロテアーゼの推定自己加水分解部位を除去するアミノ酸の変異を伴う、完全長NS3NS4aタンパク質(アミノ酸1027〜1711)である。米国特許第6,630,298号及び第6,632,601号を参照されたい。このエピトープは図13A〜13Dに特定される配列を有し、403位(HCV−1完全長配列のアミノ酸1428)及び404位(HCV−1完全長配列のアミノ酸1429)において天然の配列と異なっている。具体的には、天然の配列の1428位において通常ThrであるものがProへと変異し、天然の配列の1429位において通常SerであるものがIleへと変異している。この分子は「NS3/4aPI」と称された。この分子はまた、本明細書中で「NS3NS4a PI」とも呼ばれる。
【0162】
本明細書中でその全体が参考として援用される米国特許第6,632,601号に記載されたように、NS3/4aPIを生産し、酵母中で発現させた。NS3/4aPIタンパク質の存在は、NS3プロテアーゼドメインに対するポリクローナル抗体及び、NS4 5−1−1エピトープに対するモノクローナル抗体を用いたウェスタンブロットにより確認した。NS3/4aエピトープのプロテアーゼ活性は、MEFA7.1を基質として用い、以下にさらに記載するように実証した。
【0163】
(実施例3)
(MEFA 7.1及びMEFA 7.2におけるNS3/4aPIのタンパク分解性切断活性)
改変MEFAであるMEFA 7.2がタンパク分解性切断を受けないことを確認するために、以下の実験を行った。MEFA 7.1及びMEFA 7.2をそれぞれ、上述のように製造したNS3/4aPIと共に、室温にて30分間インキュベートした。タンパク質ゲルサンプルを調製し、4〜20% Tris−グリシンSDS−PAGE上で泳動して、クーマシーブルーを用いてゲルを染色した。さらに、hSODに対する抗体を用いてウェスタンブロットを行った。上述の通り、MEFA 7.1及びMEFA 7.2の両方がhSODと融合した。結果を図14A(SDS−PAGE)及び14B(ウェスタンブロット)中に示す。これで見られるように、NS3/4aはMEFA 7.1(レーン5、図14A及び図14B)を分解した。一方、MEFA7.2は、全く分解を示さなかった(レーン6、図14A及び図14B)。したがって、NS3タンパク分解性切断部位はMEFA 7.2中で首尾よく変異されていた。
【0164】
(実施例4)
(モノクローナル抗体及びポリクローナル抗体結合アッセイ)
HCV特異的組換えコア抗原、E1抗原、E2抗原、NS3抗原、NS4抗原、及びNS5抗原に対し惹起したモノクローナル抗体及びポリクローナル抗体を、抗原性の評価及びMEFA 7.1、MEFA 7.2及びNS3/4a PIにエピトープを曝すために使用した。精製MEFA又はNS3/4a PIをPBS(pH7.4)中で最適なコーティング濃度に希釈し、Costar high binding plates(Corning Inc.、Corning、ニューヨーク)上にコーティングした。線状エピトープ又は高次構造エピトープのいずれかに対する抗体を適宜希釈して、プレートへと添加した。37℃、1時間のインキュベーション後、そのプレートを洗浄し、西洋ワサビペルオキシダーゼ(HRP)と結合体化させたヤギ抗マウスIgG又はヤギ抗ウサギIgGと共に、1時間、37℃でインキュベートした。最後に、H2O2及び基質であるo−フェニレンジアミンジヒドロクロリド(OPD)を含有する発色緩衝液をウェルに添加し、492nm及び620nmにおける吸光度(O.D.)をプレートリーダーを用いて測定した。
【0165】
表3に示すように、試験されたエピトープに特異的な各々の抗体はMEFA 7.1及びMEFA 7.2の両方と反応し、(i)MEFA上の全ての主要エピトープが露出し、従って検出のために接近可能であること、及び(ii)MEFA7.2中のアミノ酸変異が線状エピトープの露出を変化させないことを示した。
【0166】
(実施例5)
(MEFA及びNS3/4aPIを用いたイムノアッセイ)
NS3のC33c抗原及びC22コア抗原は非常に免疫原性であり、C33c及びC22に対する抗体は初期セロコンバージョンパネルにおいて見出されている(Chienら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1992)89:10011−10015)。従って、セロコンバージョン感度を調べるために、HCV−1に感染したヒト血液サンプルの十分に特性が明らかにされた市販のC33c及びC22のパネルを用いて、イムノアッセイにおけるこの抗原の性能を試験した。以下の表に示すPHVパネルを、Boston Biomedica,Inc.、West Bridgewater、MA(BBI);Bioclinical Partners、Franklin、MA(BCP);及びNorth American Biologies,Inc.、BocoRatan、FL(NABI)から購入した。アッセイは、以下のように行った。
【0167】
HCV抗原をイムノアッセイのために以下のようにプレート上にコーティングした。HCVコーティング緩衝液(50mMのNa3PO4、pH7.0、2mMのEDTA及び0.1%のクロロアセタミド)を0.22μのフィルターユニットを通過させて濾過した。次いで以下の試薬を順にこのHCVコーティング緩衝液に加え、添加を行うごとに攪拌した:2μg/mlのスルフヒドリル改変BSA(10mg/ml溶液(Bayer Corp.Pentex、Kankakee、イリノイ)から);5mMのDTT(1M溶液(Sigma、St.Louis、ミズーリ)から);0.45μg/mlのNS3/4a(タンパク質濃度0.3mg/ml);0.375μg/mlのNS3.4aPI、MEFA 7.1又はMEFA 7.2(タンパク質濃度1mg/ml)。最後の溶液を室温で15分間攪拌した。
【0168】
200μlの上記溶液を、Costar high binding平底プレート(Corning Inc.、Corning、ニューヨーク)の各ウェルへと添加し、このプレートを室温にて16時間インキュベートした。次いでプレートを洗浄緩衝液(1×PBS、0.1%のTWEEN−20)で洗浄し、軽く叩いて乾燥させ、285μlのOrtho Post−Coat Buffer(1×PBS、pH7.4、1%のBSA、3%のスクロース)を添加した。プレートを少なくとも1時間インキュベートし、軽く叩いて、2〜8℃で一晩乾燥させた。このプレートを乾燥剤と共に袋に入れ、後の使用のために4℃にて保管した。
【0169】
HCVアッセイは以下のように行った。200μlの試料希釈緩衝液(1g/lのカゼイン、100mg/lの組換えヒトSOD、1g/lのクロロアセタミド、10g/lのBSA、500mg/lの酵母エキス、0.366g/lのEDTA、1.162g/lのKPO4、5ml/lのTween−20、29.22g/lのNaCl、1.627g/lのNaPO4、1%のSDS)を、コーティングしたプレートに添加した。次いで20μlのサンプルを添加した。これを37℃で、1時間インキュベートした。プレートを洗浄緩衝液(1×PBS、pH7.4、0.1%のTween−20)で洗浄した。200μlの結合体溶液(Enhanced SAVeバルク結合体希釈液(Ortho−Clinical Diagnostics、Raritan、ニュージャージー)を用いたORTHO HCV 3.0 ELISA Test System中で1:22,000に希釈されたマウス抗ヒトIgG−HRPなどのマウス抗ヒトIgG−HRP)を添加し、60分間、37℃でインキュベートした。これを上記のように洗浄し、200μlの基質溶液(1錠のOPD/10ml)を添加した。このOPDの錠剤は、西洋ワサビペルオキシダーゼ反応の発色進行のためのo−フェニレンジアミンジヒドロクロリド及び過酸化水素を含有する。これを30分間、室温にて暗所でインキュベートした。50μlの4NのH2SO4を加えることにより反応を停止し、コントロールとしての690nmにおける吸光度に対し、492nmでプレートを読み取った。カットオフ値を0.6000+3つの陰性コントロール血清の平均シグナル(O.D.)に設定した。1.0以上のS/CO値(カットオフ比を超えるシグナルのO.D.)のサンプルを陽性と考え、1.0を下回るものを陰性と考えた。
【0170】
このイムノアッセイを用いた結果を、市販の抗−HCV ELISAキットを用いて得られるものと比較した。特に、Abbott PRISMアッセイ(Abbott Laboratories,Abbott Park、イリノイ)は、市販の、抗体をベースとした検出アッセイである。製造者の説明書を使用してこのアッセイを実行した。ORTHO HCV Version 3.0 ELISA Test System(HCV 3.0)(Ortho Clinical Diagnostics、Raritan、ニュージャージー)は、抗体をベースとした検出アッセイである。製造者の説明書を使用してアッセイを実行した。Pasteur MONOLISA抗−HCV Plus Version 2アッセイ(Sanofi Diagnostics Pasteur、Marnes−la−Coquette、フランス)は、抗体をベースとした検出アッセイである。製造者の説明書を使用してこのアッセイを実行した。
【0171】
結果を表4に示す。試験したパネルについて、MEFA 7.1単独及びMEFA 7.2単独は非常に類似の免疫反応性を有し、いずれもセロコンバージョンパネルPHV913中のC22タイプ抗体及びPHV904及びPHV914パネルにおける後期採血中のC33cタイプ抗体を検出した(表4)。NS3/4a PIは、一方で、PHV904及びPHV914パネルの初期採血中のC33cタイプ抗体を検出した(表4)。従って、MEFA 7.1又はMEFA 7.2及びNS3/4a PIの組み合わせは、初期セロコンバージョンサンプル中のC22及びC33cに対する抗体を検出した。その検出は、C33c及びC22タイプ抗体における現在認可されたOrtho HCV 3.0及びAbbott Prismアッセイよりも、それぞれ2日間及び12日間先行した。
【0172】
全部で17の市販のHCVセロコンバージョンパネルを試験した。抗C33cタイプパネルに関して、新たな抗原は、9パネルのうち9つにおいて、Ortho 3.0およびAbbott Prismよりも2日間〜14日間先行した。抗C22(コア)タイプパネルに関して、新たな抗原は、8パネルのうち3つにおいてOrtho HCV 3.0よりも、また8パネルのうち2つにおいてAbbott Prismよりも、2日間〜5日間先行した。残りのパネルは同等であった。新たなアッセイと認可されたアッセイとの間で同等の性能を示す5つの抗コアパネルの中で、3パネルは抗体陰性から抗体陽性へと変化する間に長い採血間隔を有したことが重要視されるべきである:PHV 909(28日間)、PHV 911(11日間)、及びSC−0010(7日間)。表6を参照されたい。採血間隔の長さによって、これらの3パネルを用いて新アッセイと認可されたアッセイとの間のセロコンバージョン感度を比較することは困難であった。
【0173】
遺伝子型希釈感度もまた、この抗原を用いて、これら市販のアッセイに対して比較した。3つの全てのイムノアッセイを同時に行った。表5に示すように、連続的に希釈したHCV遺伝子型1〜6の全てが、HCV 3.0又はMonolisa Ver.2 Pasteurと比較して、MEFA 7.1およびNS3/4a PIを用いたELISAアッセイにおいて強く検出された。別個の実験においては、MEFA 7.1又はNS3/4a PIを単独で用いて遺伝子型希釈感度を比較した。
【0174】
まとめると、NS3/4a PI及びMEFA 7.1又はMEFA 7.2を利用するHCV抗体アッセイは、初期のセロコンバージョン検出及び種々の遺伝子型サンプルの検出の両方において、より優れた感度を達成した。アッセイの特異性は現在認可されたアッセイに匹敵した。両方の抗原は高度に精製され、製品の開発にとって好適な量で生産された。ひとたびNS3/4a PI及びMEFA 7.1又はMEFA 7.2が固相上にコーティングされると、それらは顕著に安定であった。融合タンパク質の免疫反応性はこれらの試験においては影響を受けないように見えた(表4及び表5)が、MEFA 7.1は複数のNS3/4a PIプロテアーゼ切断部位を有し、抗原をコーティングする間にいくつかのフラグメントへと分解された(図14A及び図14B)。改良されたMEFA 7.2は、NS3/4a PIの存在下では損なわれず(図14A及び図14B)、露出したエピトープ及び免疫反応性は、MEFA 7.1と非常に類似している(表3、表4及び表5)。これらのデータは、初期のセロコンバージョンサンプルにおける検出感度の増大がMEFA 7.1及びMEFA 7.2中の複数のエピトープに由来することを証明する;MEFA融合タンパク質それ自体の全体的な構造は、MEFA 7.2中で損なわれていない状態、又はMEFA 7.1中で分解したもののいずれかにおいて、初期のセロコンバージョン検出においてはほとんど影響がない。しかし、MEFAの完全性を維持することがイムノアッセイ成分の製造をより効果的なものとする。
【0175】
このように、新規な改変MEFA及び検出アッセイにおけるその使用が開示された。上述から、本発明の具体的態様が説明を目的として本明細書中に記載されているが、その精神及び範囲を逸脱しない多様な改変が行われ得ることが理解されるであろう。
【0176】
(表3. 露出したHCVエピトープについてのMEFA 7.1及びMEFA 7.2のELISA分析)
【0177】
【表3】
(表4. HCVセロコンバージョン検出の比較)
【0178】
【表4】
AQ:K
a S/COが1以上を陽性とし、太字で示す。カットオフ値は、材料及び方法に示すように計算する。
b MEFA 7.1又はMEFA 7.2と組み合わせたNS3NS4aPIを用いた検出が、現在認可されたアッセイによる検出よりも先行する日数。
【0179】
(表5. HCV遺伝子型希釈感度の比較)
【0180】
【表5】
AQ:L aND、測定なし
(表6. 17のセロコンバージョンパネルの試験のまとめ)
【0181】
【表6】
a HCVパネル供給元により提供されたデータ。
b 現在認可されているアッセイである、Ortho HCV Version 3.0 ELISA Test System又はAbbott PRISMに対する、NS3NS4a PIと組み合わせたMEFA 7.1を用いたアッセイ感度の比較。
c 抗体陰性から抗体陽性へと変化する間の採血間隔:PHV 909については28日間、PHV 911については11日間、そしてSC−0010パネルについては7日間。
【図面の簡単な説明】
【0182】
【図1】図1は、HCVゲノムを図示したものであり、本発明のアッセイ試薬(タンパク質及び抗体)が由来するポリタンパク質の種々の領域を示す。
【図2】図2は、HCV抗原が固体支持体上に固定化されている、本発明に従う改変MEFAを用いた代表的イムノアッセイの概略図である。
【図3】図3は、ストレプトアビジンによってコーティングされた固体支持体と共に改変MEFAを用いる代表的イムノアッセイ様式の概略図である。
【図4】図4は、MEFA7.1を図示したものである。
【図5】図5A〜5F(配列番号1及び配列番号2)は、MEFA7.1のDNA及び対応するアミノ酸配列を示す。
【図6A】図6A〜6Dは、psMEFA7の構築の図である。
【図6B】図6A〜6Dは、psMEFA7の構築の図である。
【図6C】図6A〜6Dは、psMEFA7の構築の図である。
【図6D】図6A〜6Dは、psMEFA7の構築の図である。
【図7】図7は、psMEFA7.1の構築の図である。
【図8】図8は、MEFA7.2を図示したものである。
【図9】図9A〜9F(配列番号3及び配列番号4)は、MEFA7.2のDNA及び対応するアミノ酸配列を示す。
【図10A】図10A〜10Bは、MEFA7.1(配列番号2)とMEFA7.2(配列番号4)との間のアミノ酸配列の比較を示す。異なる点を太字で示す。
【図10B】図10A〜10Bは、MEFA7.1(配列番号2)とMEFA7.2(配列番号4)との間のアミノ酸配列の比較を示す。異なる点を太字で示す。
【図11A】図11A〜11Cは、ps.mefa7.2の構築の図である。
【図11B】図11A〜11Cは、ps.mefa7.2の構築の図である。
【図11C】図11A〜11Cは、ps.mefa7.2の構築の図である。
【図12】図12A〜12Cは、本発明のイムノアッセイに用いるために改変し得る代表的なMEFAを示す。図12AはMEFA3を図示したものである。図12BはMEFA5を図示したものである。図12CはMEFA6を図示したものである。
【図13】図13A〜13D(配列番号5及び配列番号6)は、本明細書中で「NS3/4a PI」と名付けた、本発明のアッセイに使用するための代表的なNS3/4a高次構造抗原のDNA及び対応するアミノ酸配列を示す。図13A〜13Dにおける403位及び404位のアミノ酸は、HCV−1の天然のアミノ酸配列におけるThrに対するPro及びSerに対するIleの置換を表す。
【図14】図14A及び14Bは、NS3/4a PIのプロテアーゼ活性並びにMEFA7.1及びMEFA7.2に及ぼすその影響を示す。図14AはSDS−PAGEゲルを示し、図14Bはウェスタンブロットを示す。
【特許請求の範囲】
【請求項1】
改変C型肝炎ウイルス(HCV)多エピトープ融合抗原(MEFA)であって、該MEFAは、HCV NS3タンパク分解性切断部位を含むHCVヘリカーゼドメインからの少なくとも1つのエピトープ及びHCV NS3タンパク分解性切断部位を含むNS4領域からの少なくとも1つのエピトープを含み、該ヘリカーゼドメインエピトープ及び該NS4エピトープ中に存在する該HCV NS3のタンパク分解性切断部位は、NS3による改変MEFAのタンパク分解性切断が該変異を欠く対応するMEFAのタンパク分解性切断と比較して阻害されるように変異されており、さらに、該改変MEFAは、HCV感染個体からの生物学的サンプル中に存在する抗HCV抗体と特異的に反応する、改変MEFA。
【請求項2】
前記切断部位への前記変異が、該部位のそれぞれにおける少なくとも1個のアミノ酸の置換を含む、請求項1に記載の改変MEFA。
【請求項3】
前記HCVヘリカーゼドメインからの前記エピトープが、HCV−1配列に対して番号付けされた1428位、1429位、1455位及び1456位に見出される、天然のアミノ酸の置換を含む、請求項2に記載の改変MEFA。
【請求項4】
HCV−1配列に対して番号付けされた1657位及び1658位に見出される、天然のアミノ酸のNS3/4a接合部における置換をさらに含む、請求項3に記載の改変MEFA。
【請求項5】
前記NS4領域からの前記エピトープが、5−1−1であり、且つ、HCV−1配列に対して番号付けされた1711位及び1712位に見出される、天然のアミノ酸の置換を含む、請求項4に記載の改変MEFA。
【請求項6】
前記MEFAが、HCV株1、2及び3それぞれからの3つの5−1−1エピトープを含み、HCV−1配列に対して番号付けされた、該5−1−1エピトープのそれぞれにおける1711位及び1712位に見出される天然のアミノ酸のそれぞれが置換されている、請求項5に記載の改変MEFA。
【請求項7】
前記MEFAは、HCV−1の配列に対して番号付けされた1428位、1429位、1455位、1456位、1657位及び1658位に見出される天然のアミノ酸の置換を有する、HCV−1に対して番号付けされた1193位〜1658位のアミノ酸に対応する連続するアミノ酸配列を含み、該MEFAは、HCV株1、2及び3それぞれからの3つの5−1−1エピトープをさらに含み、該5−1−1エピトープのそれぞれが、HCV−1の配列に対して番号付けされた1711位及び1712位に見出される天然のアミノ酸のそれぞれに置換を有する、HCV−1に対して番号付けされた1689位〜1735位のアミノ酸に対応する連続するアミノ酸配列を含む、請求項1に記載の改変MEFA。
【請求項8】
前記MEFAが、配列番号4に示される連続するアミノ酸配列に対して少なくとも80%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、但し、配列番号4の466位、467位、493位、494位、695位、696位、721位、722位、770位、771位、819位及び820位にある前記アミノ酸が、該MEFAのNS3によるタンパク分解性切断を阻害する前記変異を維持する、請求項7に記載の改変MEFA。
【請求項9】
前記MEFAが、配列番号4に示される連続するアミノ酸配列に対して少なくとも90%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項8に記載の改変MEFA。
【請求項10】
前記MEFAが、配列番号4に示される連続するアミノ酸配列に対して少なくとも98%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項8に記載の改変MEFA。
【請求項11】
前記MEFAが、配列番号4に示される連続するアミノ酸配列を含む、請求項8に記載の改変MEFA。
【請求項12】
前記MEFAが、配列番号4に示される連続するアミノ酸配列からなる、請求項8に記載の改変MEFA。
【請求項13】
請求項1〜12のいずれか1項に記載の改変MEFAを含むイムノアッセイ固体支持体。
【請求項14】
少なくとも1つのHCV NS3/4a高次構造エピトープをさらに含み、該NS3/4a高次構造エピトープが、HCV感染個体からの生物学的サンプル中に存在する抗HCV抗体と特異的に反応する、請求項13に記載のイムノアッセイ固体支持体。
【請求項15】
前記NS3/4a高次構造エピトープが、配列番号6に示される連続するアミノ酸配列に対して少なくとも80%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項13に記載のイムノアッセイ固体支持体。
【請求項16】
前記NS3/4a高次構造エピトープが、配列番号6に示される連続するアミノ酸配列に対して少なくとも90%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項13に記載のイムノアッセイ固体支持体。
【請求項17】
前記NS3/4a高次構造エピトープが、配列番号6に示される連続するアミノ酸配列に対して少なくとも98%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項13に記載のイムノアッセイ固体支持体。
【請求項18】
前記NS3/4a高次構造エピトープが、配列番号6に示される連続するアミノ酸配列を含む、請求項13に記載のイムノアッセイ固体支持体。
【請求項19】
前記NS3/4a高次構造エピトープが、配列番号6に示される連続するアミノ酸配列からなる、請求項13に記載のイムノアッセイ固体支持体。
【請求項20】
生物学的サンプルにおけるC型肝炎ウイルス(HCV)感染を検出する方法であって、
(a)請求項13〜19のいずれか1項に記載のイムノアッセイ固体支持体を提供する工程;
(b)HCV抗体が該生物学的サンプル中に存在する場合、該抗体を前記MEFAと、前記NS3/4a高次構造エピトープが存在する場合には該NS3/4a高次構造エピトープとに結合させて、第1の免疫複合体を形成させる条件下で、該生物学的サンプルを該固体支持体と結合させる工程;
(c)複合体形成条件下で、工程(b)からの該固体支持体に、検出可能に標識された抗体を添加する工程であって、ここで、該標識化抗体が該免疫複合体と反応性である、工程;
(d)該検出可能に標識された抗体と該第1の免疫複合体との間で形成される第2の免疫複合体が存在する場合、該第2の免疫複合体を、該生物学的サンプルにおけるHCV感染の指標として検出する工程;
を包含する、方法。
【請求項21】
請求項13〜19のいずれか1項に記載のイムノアッセイ固体支持体、及び免疫診断検査を実施するための説明書、を含む免疫診断検査キット。
【請求項22】
請求項1〜12のいずれか1項に記載の改変MEFAに対するコード配列を含むポリヌクレオチド。
【請求項23】
(a)請求項22に記載のポリヌクレオチド;及び
(b)前記コード配列が宿主細胞中で転写され翻訳され得るように、該ポリヌクレオチドと作動可能に連結されている制御エレメント;
を含む組換えベクター。
【請求項24】
請求項23に記載の組換えベクターを用いて形質転換された宿主細胞。
【請求項25】
(a)請求項24に記載の宿主細胞の集団を提供する工程;及び
(b)前記組換えベクター中に存在する前記コード配列によってコードされている前記多エピトープ融合抗原が発現される条件下で、前記細胞の集団を培養する工程;
を包含する組換えMEFAの製造方法。
【請求項26】
(a)固体支持体を提供する工程;及び
(b)前記固体支持体に、請求項1〜12のいずれか1項に記載の少なくとも1つの改変MEFAを結合させる工程;
を包含するイムノアッセイ固体支持体の製造方法。
【請求項27】
HCV NS3/4a高次構造エピトープを前記固体支持体の別々の位置へと結合させる工程をさらに包含し、該高次構造エピトープが、HCV感染個体からの生物学的サンプル中に存在する抗HCV抗体と特異的に反応する、請求項26に記載の方法。
【請求項28】
前記NS3/4a高次構造エピトープが、配列番号6に示される連続するアミノ酸配列に対して少なくとも80%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項27に記載の方法。
【請求項29】
前記NS3/4a高次構造エピトープが、配列番号6に示される連続するアミノ酸配列に対して少なくとも90%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項27に記載の方法。
【請求項30】
前記NS3/4a高次構造エピトープが、配列番号6に示される連続するアミノ酸配列に対して少なくとも98%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項27に記載の方法。
【請求項31】
前記NS3/4a高次構造エピトープが、配列番号6に示される連続するアミノ酸配列を含む、請求項27に記載の方法。
【請求項32】
前記NS3/4a高次構造エピトープが、配列番号6に示される連続するアミノ酸配列からなる、請求項27に記載の方法。
【請求項1】
改変C型肝炎ウイルス(HCV)多エピトープ融合抗原(MEFA)であって、該MEFAは、HCV NS3タンパク分解性切断部位を含むHCVヘリカーゼドメインからの少なくとも1つのエピトープ及びHCV NS3タンパク分解性切断部位を含むNS4領域からの少なくとも1つのエピトープを含み、該ヘリカーゼドメインエピトープ及び該NS4エピトープ中に存在する該HCV NS3のタンパク分解性切断部位は、NS3による改変MEFAのタンパク分解性切断が該変異を欠く対応するMEFAのタンパク分解性切断と比較して阻害されるように変異されており、さらに、該改変MEFAは、HCV感染個体からの生物学的サンプル中に存在する抗HCV抗体と特異的に反応する、改変MEFA。
【請求項2】
前記切断部位への前記変異が、該部位のそれぞれにおける少なくとも1個のアミノ酸の置換を含む、請求項1に記載の改変MEFA。
【請求項3】
前記HCVヘリカーゼドメインからの前記エピトープが、HCV−1配列に対して番号付けされた1428位、1429位、1455位及び1456位に見出される、天然のアミノ酸の置換を含む、請求項2に記載の改変MEFA。
【請求項4】
HCV−1配列に対して番号付けされた1657位及び1658位に見出される、天然のアミノ酸のNS3/4a接合部における置換をさらに含む、請求項3に記載の改変MEFA。
【請求項5】
前記NS4領域からの前記エピトープが、5−1−1であり、且つ、HCV−1配列に対して番号付けされた1711位及び1712位に見出される、天然のアミノ酸の置換を含む、請求項4に記載の改変MEFA。
【請求項6】
前記MEFAが、HCV株1、2及び3それぞれからの3つの5−1−1エピトープを含み、HCV−1配列に対して番号付けされた、該5−1−1エピトープのそれぞれにおける1711位及び1712位に見出される天然のアミノ酸のそれぞれが置換されている、請求項5に記載の改変MEFA。
【請求項7】
前記MEFAは、HCV−1の配列に対して番号付けされた1428位、1429位、1455位、1456位、1657位及び1658位に見出される天然のアミノ酸の置換を有する、HCV−1に対して番号付けされた1193位〜1658位のアミノ酸に対応する連続するアミノ酸配列を含み、該MEFAは、HCV株1、2及び3それぞれからの3つの5−1−1エピトープをさらに含み、該5−1−1エピトープのそれぞれが、HCV−1の配列に対して番号付けされた1711位及び1712位に見出される天然のアミノ酸のそれぞれに置換を有する、HCV−1に対して番号付けされた1689位〜1735位のアミノ酸に対応する連続するアミノ酸配列を含む、請求項1に記載の改変MEFA。
【請求項8】
前記MEFAが、配列番号4に示される連続するアミノ酸配列に対して少なくとも80%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、但し、配列番号4の466位、467位、493位、494位、695位、696位、721位、722位、770位、771位、819位及び820位にある前記アミノ酸が、該MEFAのNS3によるタンパク分解性切断を阻害する前記変異を維持する、請求項7に記載の改変MEFA。
【請求項9】
前記MEFAが、配列番号4に示される連続するアミノ酸配列に対して少なくとも90%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項8に記載の改変MEFA。
【請求項10】
前記MEFAが、配列番号4に示される連続するアミノ酸配列に対して少なくとも98%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項8に記載の改変MEFA。
【請求項11】
前記MEFAが、配列番号4に示される連続するアミノ酸配列を含む、請求項8に記載の改変MEFA。
【請求項12】
前記MEFAが、配列番号4に示される連続するアミノ酸配列からなる、請求項8に記載の改変MEFA。
【請求項13】
請求項1〜12のいずれか1項に記載の改変MEFAを含むイムノアッセイ固体支持体。
【請求項14】
少なくとも1つのHCV NS3/4a高次構造エピトープをさらに含み、該NS3/4a高次構造エピトープが、HCV感染個体からの生物学的サンプル中に存在する抗HCV抗体と特異的に反応する、請求項13に記載のイムノアッセイ固体支持体。
【請求項15】
前記NS3/4a高次構造エピトープが、配列番号6に示される連続するアミノ酸配列に対して少なくとも80%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項13に記載のイムノアッセイ固体支持体。
【請求項16】
前記NS3/4a高次構造エピトープが、配列番号6に示される連続するアミノ酸配列に対して少なくとも90%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項13に記載のイムノアッセイ固体支持体。
【請求項17】
前記NS3/4a高次構造エピトープが、配列番号6に示される連続するアミノ酸配列に対して少なくとも98%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項13に記載のイムノアッセイ固体支持体。
【請求項18】
前記NS3/4a高次構造エピトープが、配列番号6に示される連続するアミノ酸配列を含む、請求項13に記載のイムノアッセイ固体支持体。
【請求項19】
前記NS3/4a高次構造エピトープが、配列番号6に示される連続するアミノ酸配列からなる、請求項13に記載のイムノアッセイ固体支持体。
【請求項20】
生物学的サンプルにおけるC型肝炎ウイルス(HCV)感染を検出する方法であって、
(a)請求項13〜19のいずれか1項に記載のイムノアッセイ固体支持体を提供する工程;
(b)HCV抗体が該生物学的サンプル中に存在する場合、該抗体を前記MEFAと、前記NS3/4a高次構造エピトープが存在する場合には該NS3/4a高次構造エピトープとに結合させて、第1の免疫複合体を形成させる条件下で、該生物学的サンプルを該固体支持体と結合させる工程;
(c)複合体形成条件下で、工程(b)からの該固体支持体に、検出可能に標識された抗体を添加する工程であって、ここで、該標識化抗体が該免疫複合体と反応性である、工程;
(d)該検出可能に標識された抗体と該第1の免疫複合体との間で形成される第2の免疫複合体が存在する場合、該第2の免疫複合体を、該生物学的サンプルにおけるHCV感染の指標として検出する工程;
を包含する、方法。
【請求項21】
請求項13〜19のいずれか1項に記載のイムノアッセイ固体支持体、及び免疫診断検査を実施するための説明書、を含む免疫診断検査キット。
【請求項22】
請求項1〜12のいずれか1項に記載の改変MEFAに対するコード配列を含むポリヌクレオチド。
【請求項23】
(a)請求項22に記載のポリヌクレオチド;及び
(b)前記コード配列が宿主細胞中で転写され翻訳され得るように、該ポリヌクレオチドと作動可能に連結されている制御エレメント;
を含む組換えベクター。
【請求項24】
請求項23に記載の組換えベクターを用いて形質転換された宿主細胞。
【請求項25】
(a)請求項24に記載の宿主細胞の集団を提供する工程;及び
(b)前記組換えベクター中に存在する前記コード配列によってコードされている前記多エピトープ融合抗原が発現される条件下で、前記細胞の集団を培養する工程;
を包含する組換えMEFAの製造方法。
【請求項26】
(a)固体支持体を提供する工程;及び
(b)前記固体支持体に、請求項1〜12のいずれか1項に記載の少なくとも1つの改変MEFAを結合させる工程;
を包含するイムノアッセイ固体支持体の製造方法。
【請求項27】
HCV NS3/4a高次構造エピトープを前記固体支持体の別々の位置へと結合させる工程をさらに包含し、該高次構造エピトープが、HCV感染個体からの生物学的サンプル中に存在する抗HCV抗体と特異的に反応する、請求項26に記載の方法。
【請求項28】
前記NS3/4a高次構造エピトープが、配列番号6に示される連続するアミノ酸配列に対して少なくとも80%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項27に記載の方法。
【請求項29】
前記NS3/4a高次構造エピトープが、配列番号6に示される連続するアミノ酸配列に対して少なくとも90%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項27に記載の方法。
【請求項30】
前記NS3/4a高次構造エピトープが、配列番号6に示される連続するアミノ酸配列に対して少なくとも98%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項27に記載の方法。
【請求項31】
前記NS3/4a高次構造エピトープが、配列番号6に示される連続するアミノ酸配列を含む、請求項27に記載の方法。
【請求項32】
前記NS3/4a高次構造エピトープが、配列番号6に示される連続するアミノ酸配列からなる、請求項27に記載の方法。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5A】
【図5B】
【図5C】
【図5D】
【図5E】
【図5F】
【図6A】
【図6B】
【図6C】
【図6D】
【図7】
【図8】
【図9A】
【図9B】
【図9C】
【図9D】
【図9E】
【図9F】
【図10A】
【図10B】
【図11A】
【図11B】
【図11C】
【図12】
【図13A】
【図13B】
【図13C】
【図13D】
【図14】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5A】
【図5B】
【図5C】
【図5D】
【図5E】
【図5F】
【図6A】
【図6B】
【図6C】
【図6D】
【図7】
【図8】
【図9A】
【図9B】
【図9C】
【図9D】
【図9E】
【図9F】
【図10A】
【図10B】
【図11A】
【図11B】
【図11C】
【図12】
【図13A】
【図13B】
【図13C】
【図13D】
【図14】
【公表番号】特表2008−515391(P2008−515391A)
【公表日】平成20年5月15日(2008.5.15)
【国際特許分類】
【出願番号】特願2007−530138(P2007−530138)
【出願日】平成17年8月26日(2005.8.26)
【国際出願番号】PCT/US2005/030324
【国際公開番号】WO2006/033768
【国際公開日】平成18年3月30日(2006.3.30)
【出願人】(506175828)カイロン コーポレーション (7)
【Fターム(参考)】
【公表日】平成20年5月15日(2008.5.15)
【国際特許分類】
【出願日】平成17年8月26日(2005.8.26)
【国際出願番号】PCT/US2005/030324
【国際公開番号】WO2006/033768
【国際公開日】平成18年3月30日(2006.3.30)
【出願人】(506175828)カイロン コーポレーション (7)
【Fターム(参考)】
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