改変型βサイモシンペプチド
酸化、もしくは超酸化メチオニン含有βサイモシンペプチド、そのアイソフォーム、そのフラグメント、ラセミ体のサイモシンβ４スルホキシド以外のその単離されたＲ鏡像異性体もしくはその単離されたＳ鏡像異性体、または正常メチオニン含有βサイモシンペプチド、そのアイソフォームもしくはフラグメントのアミノ酸配列の少なくとも１つのメチオニンと置換されるアミノ酸置換基を有する、改変型βサイモシンペプチド、そのアイソフォームまたはフラグメントを含む、組成物およびその組成物を形成するための方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
背景
関連出願の相互参照
本出願は、２００５年１月１４日に出願された、米国仮出願第６０／６４３，６８４号、米国仮出願第６０／６４３，６８６号、米国仮出願第６０／６４３，６８７号および米国仮出願第６０／６４３，６８８号の利益を主張する。
【０００２】
１．技術分野
本開示は、βサイモシンペプチド、それらのアイソフォームおよびフラグメントの分野に関する。
【背景技術】
【０００３】
２．背景技術の説明
サイモシンβ４は、当初、インビトロにおける内皮細胞の遊走および分化の間にアップレギュレートされるタンパク質として同定された。サイモシンβ４は、胸腺から最初に単離され、種々の組織で同定される、４３アミノ酸、４．９ｋＤａの遍在性ポリペプチドである。内皮細胞の分化および遊走、Ｔ細胞の分化、アクチンの隔離および血管新生における役割を含むいくつかの役割がこのタンパク質の役割とされている。
【０００４】
Ｔβ４のアミノ酸配列は、本明細書中に参考として援用される米国特許第４，２９７，２７６号に開示されている。Ｔβ４は、進化を通じて高度に保存されている。実際に、マウス、ラットおよびヒトのＴβ４の間で全体的な相同性がある。
【０００５】
Ｔβ４は、哺乳動物の多くの組織タイプに存在することが見出されており、広く様々な細胞プロセスおよび生理学的プロセスに関連する。そのプロセスは、骨髄細胞のターミナルデオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ活性を誘導する工程、視床下部の黄体形成ホルモン放出ホルモンおよび黄体形成ホルモンの分泌を刺激する工程、マクロファージの遊走を阻害する工程およびマクロファージの抗原提示を促進する工程ならびにインビトロにおいてＴ細胞株の表現型の変更を誘導する工程を含む。
【０００６】
サイモシンβ４スルホキシドは、ＰＣＴ国際公開番号ＷＯ９９／４９８８３に開示されている。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
当該分野において改良型βサイモシンペプチドが必要とされている。
概要
【課題を解決するための手段】
【０００８】
１実施形態によれば、組成物は、酸化、もしくは超酸化改変型正常メチオニン含有βサイモシンペプチド、そのアイソフォーム、そのフラグメント、ラセミ体のサイモシンβ４スルホキシド以外のその単離されたＲ鏡像異性体もしくはその単離されたＳ鏡像異性体を含むか、あるいはその組成物は、正常メチオニン含有βサイモシンペプチド、そのアイソフォームもしくはフラグメントのアミノ酸配列の少なくとも１つのメチオニンと置換されている非メチオニンアミノ酸置換基を有する、改変型βサイモシンペプチド、そのアイソフォームまたはフラグメントを含む。本発明に記載の組成物を形成するための方法もまた開示される。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００９】
詳細な説明
多くのβサイモシンペプチドは、アミノ酸配列内に、インビボおよびインビトロで酸化に供するアミノ酸のメチオニンを含む。このようなβサイモシンペプチドは、本明細書中で「正常メチオニン含有βサイモシンペプチド」と呼ぶこともある。既知のβサイモシンの多くは、メチオニンが６位に存在する。
【００１０】
正常メチオニン含有βサイモシンにおける、アミノ酸であるメチオニン（Ｃ５Ｈ１１ＮＯ２Ｓ）からメチオニンスルホキシド（Ｃ５Ｈ１１ＮＯ３Ｓ）への酸化により、βサイモシンスルホキシドである組成物が生じる。酸化は、任意の好適な方法を利用して達成することができる。例えば、メチオニン含有βサイモシンのスルホキシドへの酸化は、メチオニン含有βサイモシンを過酸化水素に曝露することによって達成することができる。５０体積の過酸化水素を用いたサイモシンβ４の酸化は、本明細書中に参考として援用されるＷＯ９９／４９８８に開示されている。従って、サイモシンβ４を、希過酸化水素によって酸化することができ、ＷＯ９９／４９８８３に開示されるようなサイモシンβ４スルホキシドを形成する。
【００１１】
アミノ酸であるメチオニン（Ｃ５Ｈ１１ＮＯ２Ｓ）のメチオニンスルホキシド（Ｃ５Ｈ１１ＮＯ３Ｓ）への酸化または他の方法によって、インビボおよびインビトロの両方でＴβ４などのメチオニン含有βサイモシンの主な分解経路が説明され得る。
【００１２】
多くのβサイモシンおよびアイソフォームが同定されており、それらは、Ｔβ４の公知のアミノ酸配列に対して約７０％または約７５％または約８０％以上の相同性を有する。そのようなβサイモシンおよびアイソフォームとしては、例えば、Ｔβ４ａｌａ、Ｔβ９、Ｔβ１０、Ｔβ１１、Ｔβ１２、Ｔβ１３、Ｔβ１４およびＴβ１５が挙げられる。
【００１３】
６位にメチオニンを含む代表的なβサイモシンとしては、Ｔβ４、Ｔβ４ａｌａ、Ｔβ４ｘｅｎ、Ｔβ９ｍｅｔ、Ｔβ１０およびＴβ１３が挙げられる。
【００１４】
本発明は、既知のβサイモシン、上で列挙されたようなそれらのアイソフォームおよびフラグメントならびに未だ同定されていない、正常メチオニン含有βサイモシンおよびＴβ４アイソフォームならびにそのフラグメントに適用することができる。
【００１５】
さらに、本開示は、ペプチドの６位以外の位置に１つ以上のメチオニンを正常に有する、既知、または未だ同定されていない、βサイモシン、それらのアイソフォームおよびフラグメントに適用することができる。
【００１６】
特定の実施形態において、メチオニンと置換されるアミノ酸は、中性、非極性、疎水性および／または非酸化型である。このような組成物は、メチオニン含有βサイモシンよりも溶解度が大きいという利点を有する一方で、対応するβサイモシンと実質的に同じか、または異なる活性を有する。
【００１７】
特定の実施形態において、メチオニンと置換されたアミノ酸は、βサイモシンの酸化を阻害し、最も好ましいことには、置換されたβサイモシンの生物学的活性が、対応するメチオニン含有βサイモシンと実質的に同じである。
【００１８】
メチオニン含有βサイモシンペプチド中のメチオニンの置換は、そのペプチドの安定なプロファイルに変化を起こすと見られる。さらに、そのような置換は、ペプチドの予側不可能な新しい特性ならびに予側不可能に変化しない特性を生じると見られる。
【００１９】
非限定的な例として、メチオニン含有βサイモシン中のメチオニンと置換されるアミノ酸は、バリン、イソロイシン、アラニン、フェニルアラニン、プロリンまたはロイシンである。
【００２０】
１つの実施形態において、ロイシンは、Ｔβ４中のメチオニンと置換される。
１つの実施形態によれば、ロイシンがメチオニンと置換されるとき、このβサイモシンペプチドは、Ｔβ４以外である。
【００２１】
１つの態様によれば、メチオニン含有βサイモシン中のメチオニンと置換されるアミノ酸は、ロイシン以外である。この態様のいくつかの実施形態において、メチオニン含有βサイモシン中のメチオニンと置換されるアミノ酸は、バリン、イソロイシン、アラニン、フェニルアラニンまたはプロリンである。
【００２２】
１つの実施形態によれば、メチオニンと置換される好ましいアミノ酸は、バリンまたはイソロイシンである。
【００２３】
別の実施形態によれば、メチオニンと置換される好ましいアミノ酸は、アラニンである。
【００２４】
さらなる実施形態によれば、メチオニンと置換される好ましいアミノ酸は、バリンである。
【００２５】
本発明に記載のアミノ酸置換改変型βサイモシンペプチド、それらのアイソフォームおよびフラグメントは、米国特許第５，５１２，６５６号に開示されている１つの実施例である固相ペプチド合成法などの任意の適切な方法によって提供され得る。
【００２６】
本開示はまた、アミノ酸置換改変型βサイモシンペプチドを形成するための方法に適用することができ、メチオニン含有βサイモシンペプチド、そのアイソフォームまたはフラグメントのアミノ酸配列が、βサイモシンペプチド、そのアイソフォームまたはフラグメント中の少なくとも１つのメチオニンと非メチオニンアミノ酸を置換することによって改変される。その方法は、改変型βサイモシンペプチド、そのアイソフォームまたはフラグメントを形成するために、メチオニン含有βサイモシンペプチド配列、そのアイソフォームまたはフラグメント中の少なくとも１つのメチオニンと非メチオニンアミノ酸を置換する工程を含む。
【００２７】
上で説明したように、Ｔβ４ｌｅｕを含むために、サイモシンβ４が６位のメチオニンと置換されている置換基ロイシンを有してもよい。
【００２８】
メチオニンと置換されるアミノ酸であるロイシンは、Ｔβ４の酸化を阻害する。Ｔβ４ｌｅｕは、Ｔβ４よりも安定性が高いという利点を有する一方で、驚くべきことに、実質的なアクチン結合活性を有する。
【００２９】
Ｔβ４におけるメチオニンのロイシンによる置換はまた、ペプチドの新しい特性を予想外に生じ得る。
【００３０】
Ｔβ４ｌｅｕを形成するための方法が開示され、ここで、Ｔβ４のアミノ酸配列は、Ｔβ４の６位のメチオニンとロイシンアミノ酸を置換することによって改変される。この方法は、Ｔβ４ｌｅｕを形成するために、Ｔβ４配列の６位のメチオニンとロイシンを置換する工程を含む。
【００３１】
本発明に記載のペプチドは、実質的なアクチン結合活性を有し得る。
他のもののうち、抗炎症剤として組成物が利用されてもよい。
【００３２】
１つの実施形態によれば、サイモシンβ４スルホキシド以外の酸化メチオニン含有βサイモシンペプチド、そのアイソフォームまたはフラグメントが、提供される。
【００３３】
βサイモシンスルホキシドペプチドを形成するために、正常メチオニン含有βサイモシンペプチド、そのアイソフォームまたはフラグメントと希過酸化水素などの酸化剤とを接触させる工程を含む改変型βサイモシンスルホキシドを形成するための方法もまた適用することができる。
【００３４】
別の実施形態は、対応するβサイモシンスルホキシドペプチドを形成するために、サイモシンβ４以外の正常メチオニン含有βサイモシンペプチド、そのアイソフォームまたはフラグメントと過酸化水素などの酸化剤とを接触させる工程を含むβサイモシンスルホキシドペプチドを形成する方法である。
【００３５】
本明細書中に含まれる組成物は、非酸化メチオニン含有βサイモシンよりも安定性が高いという利点を有し、対応するβサイモシンと実質的に同じが、または異なる活性を有する。
【００３６】
メチオニン含有βサイモシンペプチドのスルホキシドへの酸化によって、ペプチドの安定プロファイルが変化する。さらに、このような置換によって、ペプチドの特定の新しい特性ならびに特定の変化しない特性が生じ得る。
【００３７】
正常メチオニン含有βサイモシンペプチド中のメチオニンの超酸化によって、ペプチドの安定プロファイルの変化が生じる。さらに、このような置換によって、ペプチドの一定の新しい特性ならびに一定の変化しない特性が生じ得る。
【００３８】
１つの実施形態によれば、超酸化されるβサイモシンペプチドは、Ｔβ４以外である。
βサイモシンスルホキシドを含むメチオニン含有βサイモシンペプチドは、対応するβサイモシンスルホンペプチドを形成するために、過ギ酸または過酢酸によって超酸化され、ここで影響を受けるメチオニンの硫黄原子は、２つの酸素によって完全に酸化される（超酸化される）。
【００３９】
１つの実施形態によれば、Ｔβ４スルホン以外の改変型メチオニン含有βサイモシンスルホンを含む組成物が、提供される。
【００４０】
対応するβサイモシンスルホンペプチドを形成するためにメチオニン含有βサイモシンペプチド、そのスルホキシド、アイソフォームまたはフラグメントと過ギ酸および／または過酢酸などの酸とを接触させる工程を含むβサイモシンスルホンを形成するための方法が含まれる。
【００４１】
別の実施形態によれば、対応するβサイモシンスルホンペプチドを形成するために、サイモシンβ４またはサイモシンβ４スルホキシド以外のメチオニン含有βサイモシンペプチド、そのスルホキシド、アイソフォームまたはフラグメントと過ギ酸および／または過酢酸などの酸とを接触させる工程を含むβサイモシンスルホンペプチドを形成する方法が含まれる。
【００４２】
別の実施形態において、サイモシンβ４および／またはサイモシンβ４スルホキシドは
、サイモシンβ４スルホンを形成するために、過ギ酸または過酢酸によって酸化され、サイモシンβ４の６位のメチオニンの硫黄原子は、２つの酸素によって完全に酸化される（超酸化される）。
【００４３】
他のもののうちサイモシンβ４スルホンが抗炎症剤として利用されてもよい。
Ｔβ４のメチオニル残基におけるチオエーテルがプロキラルであるので、キラル剤によらない酸化（または超酸化）によってスルホキシド（またはスルホン）、すなわちＳ型およびＲ型（「鏡像異性体」）の２つの型が生成される。酸化サイモシンβ４のパートナとなり得るすべての生体分子がキラルであるので、スルホキシド（またはスルホン）のＳ型またはＲ型と形成される複合体は異なる（ジアステレオ異性体）。サイモシンβ４スルホキシド（またはスルホン）の型は、異なる薬力学的かつ薬物動態学的な挙動ならびに生物学的活性を示し得る。従って、サイモシンβ４スルホキシド（またはスルホン）のＳ型およびＲ型は、異なる生物学的作用を有し得る。
【００４４】
アミノ酸解析システムは、酸化サイモシンβ４スルホキシド（またはスルホン）の加水分解（ｈｙｒｏｌｙｓｉｓ）後に、Ｌ−メチオニン（Ｓ）−スルホキシド（またはスルホン）とＬ−メチオニン（Ｒ）−スルホキシド（またはスルホン）とを識別するために使用され得る。例えば、２つの手順が、サイモシンβ４スルホキシド（またはスルホン）の２つの型を単離するために酸化または超酸化後に使用され得る。メチオニンスルホキシド（またはスルホン）の異なる型は、鏡および鏡像として挙動するが、ペプチドの他のアミノ酸残基が不斉の環境を作り出すので、生成されたサイモシンβ４スルホキシド（またはスルホン）は、像と鏡像との対を構成しない。従って、そのそれぞれの型を、ＨＰＬＣ技術によって分離することができる。その型を分離するための代替手順は、サイモシンβ４スルホキシド（またはスルホン）の一方の型を還元するが、他方は還元しない特異的なメチオニンスルホキシド（またはスルホン）レダクターゼの使用であり得る。酵素的な還元型からのサイモシンβ４スルホキシド（またはスルホン）の非還元可能型の分離は、ＨＰＬＣによって実施してもよい。
【００４５】
Ｒ−サイモシンβ４スルホキシド（またはスルホン）を、Ｒ−サイモシンβ４スルホキシド（またはスルホン）およびＳ−サイモシンβ４スルホキシド（またはスルホン）を含む混合物から分離することによって、分離されたＲ−サイモシンβ４スルホキシド（またはスルホン）を含む組成物を形成する方法が本明細書中に開示される。
【００４６】
Ｓ−サイモシンβ４スルホキシド（またはスルホン）を、Ｓ−サイモシンβ４スルホキシド（またはスルホン）およびＲ−サイモシンβ４スルホキシド（またはスルホン）を含む混合物から分離することによって、分離されたＳ−サイモシンβ４スルホキシド（またはスルホン）を含む組成物を形成する方法が本明細書中に開示される。
【００４７】
上で説明したように、多くのβサイモシンおよびそれらのアイソフォームが同定されており、それらは、Ｔβ４の既知のアミノ酸配列に対して約７０％または約７５％または約８０％以上の相同性を有する。このようなβサイモシンおよびアイソフォームとしては、例えば、Ｔβ４ａｌａ、Ｔβ９、Ｔβ１０、Ｔβ１１、Ｔβ１２、Ｔβ１３、Ｔβ１４およびＴβ１５が挙げられる。
【００４８】
上で説明したように、６位にメチオニンを含む代表的なβサイモシンとしては、Ｔβ４、Ｔβ４ａｌａ、Ｔβ４ｘｅｎ、Ｔβ９ｍｅｔ、Ｔβ１０およびＴβ１３が挙げられる。
【００４９】
上で説明したように、上で列挙したような既知のβサイモシンおよびアイソフォームならびに未同定の、メチオニン含有βサイモシン、それらのアイソフォームおよびフラグメントが本明細書中に含まれる。
【００５０】
上で説明したように、既知かまたは未同定の、ペプチド中の６位以外の位置に１つ以上のメチオニンを有するβサイモシン、それらのアイソフォームおよびフラグメントがさらに本明細書中に含まれる。
【００５１】
Ｔβ４と同様に、メチオニン含有βサイモシンのメチオニル残基におけるチオエーテルがプロキラルであるので、キラル剤によらない酸化（または超酸化）によって、Ｓ型およびＲ型（「鏡像異性体」）を含むスルホキシド（またはスルホン）の少なくとも２つの型が生成される。酸化メチオニン含有βサイモシンのパートナとなり得るすべての生体分子がキラルであるので、スルホキシド（またはスルホン）のＳ型またはＲ型と形成される複合体は異なる（ジアステレオ異性体）。βサイモシンスルホキシド（またはスルホン）の異なる型は、異なる薬力学的かつ薬物動態学的な挙動ならびに生物学的活性を示す。従って、βサイモシンスルホキシド（またはスルホン）のＳ型およびＲ型は、異なる生物学的作用を有し得る。
【００５２】
Ｔβ４と同様に、アミノ酸解析システムは、酸化βサイモシンスルホキシド（またはスルホン）の加水分解（ｈｙｒｏｌｙｓｉｓ）後に、Ｌ−メチオニン（Ｓ）−スルホキシド（またはスルホン）とＬ−メチオニン（Ｒ）−スルホキシド（またはスルホン）とを識別するために使用され得る。例えば、少なくとも２つの手順が、βサイモシンスルホキシド（またはスルホン）の異なる型を単離するために酸化（または超酸化）後に使用され得る。メチオニンスルホキシド（またはスルホン）の異なる型は、鏡および鏡像として挙動するが、ペプチドの他のアミノ酸残基が不斉の環境を作り出すので、生成されたβサイモシンスルホキシド（またはスルホン）は、像と鏡像との対を構成しない。従って、その異なる型は、公知のＨＰＬＣ技術によって分離することができる。その異なる型を分離するための代替手順は、サイモシンβ４スルホキシド（またはスルホン）の一方の型を還元するが、他方は還元しない特異的なメチオニンスルホキシド（またはスルホン）レダクターゼの使用であり得る。酵素的な還元型からのβサイモシンスルホキシド（またはスルホン）の非還元可能型の分離は、ＨＰＬＣによって実施することができる。
【００５３】
Ｒ−βサイモシンスルホキシド（またはスルホン）を、Ｒ−βサイモシンスルホキシド（またはスルホン）およびＳ−βサイモシンスルホキシド（またはスルホン）を含む混合物から分離することによって、分離されたＲ−βサイモシンスルホキシド（またはスルホン）を含む組成物を形成する方法が本明細書中に開示される。
【００５４】
Ｓ−βサイモシンスルホキシド（またはスルホン）を、Ｓ−βサイモシンスルホキシド（またはスルホン）およびＲ−βサイモシンβ４スルホキシド（またはスルホン）を含む混合物から分離することによって、分離されたＳ−βサイモシンスルホキシド（またはスルホン）を含む組成物を形成する方法がさらに開示される。
【００５５】
１つの実施形態において、本開示は、本明細書中に説明されるようなペプチドを含む組成物の有効量を投与することによって、被験体の疾患、損傷、傷害および／もしくは創傷または被験体の組織を治療、予防、阻害または低減するための治療方法を提供する。投与工程は、直接的であってもよく、全身性であってもよい。直接投与の例としては、例えば、本明細書中に説明されるようなペプチドを含む、溶液、ローション、軟膏、ゲル、クリーム、ペースト、噴霧液、懸濁液、分散液、ヒドロゲル、軟膏剤または油剤を含む担体と組織とを直接適用または吸入によって接触させる工程を含む。全身性投与としては、例えば、注射用水などの医薬的に許容可能な担体中に本明細書中に説明されるようなペプチドを含む組成物の静脈内、腹腔内、筋肉内注射が挙げられる。被験体は、好ましくは哺乳動物であり、最も好ましくはヒトである。
【００５６】
本明細書中に説明されるような組成物は、任意の適当な有効量で投与され得る。例えば、本明細書中に説明されるような組成物は、約０．０００１〜１，０００，０００マイクログラムの範囲内の用量、より好ましくは約０．１〜５，０００マイクログラムの範囲内の量、最も好ましくは約１〜３０マイクログラムの範囲内で投与され得る。
【００５７】
本明細書中に説明されるような組成物は、毎日、１日おき、１週間おき、１ヶ月おきなどで、投与の１日あたり単回適用または複数回適用（例えば、投与の１日あたり２回、３回、４回または４回以上の適用）で投与され得る。
【００５８】
本開示はまた、医薬的または化粧品的に許容可能な担体中に本明細書中に説明されるような組成物の治療有効量を含む医薬組成物または化粧品組成物を含む。このような担体としては、本明細書中で列挙されたものを含む任意の適当な担体が挙げられる。
【００５９】
本明細書中に説明されたアプローチは、任意の従来の投与技術（これらに限定されないが、例えば、直接投与、局所注射、吸入または全身性投与）を含む、本明細書中に説明されるような組成物の被験体への様々な投与経路または送達を含む。本明細書中に説明されるような組成物を使用するか、またはそれらを含む方法および組成物は、医薬的に許容可能か、または化粧品的に非毒性な賦形剤、添加剤または担体と混合することによって医薬組成物または化粧品組成物に処方され得る。
【実施例１】
【００６０】
Ｔβ４ｖａｌは、例えば、米国特許第５，５１２，６５６号に開示される方法に従う従来の固相ペプチド合成法によって、６位のメチオニンと置換されるバリンとともに生成され、予想外かつ予測不可能な特性を有するペプチドが生じる。
【実施例２】
【００６１】
Ｔβ４ｉｓｏは、従来の固相ペプチド合成法によって、６位のメチオニンと置換されるイソロイシンとともに生成され、予想外かつ予測不可能な特性を有するペプチドが生じる。
【実施例３】
【００６２】
Ｔβ４Ｍ６Ａは、例えば、米国特許第５，５１２，６５６号に開示される方法に従う従来の固相ペプチド合成法によって、６位のメチオニンと置換されるアラニンとともに生成され、予想外かつ予測不可能な特性を有するペプチドが生じる。
【実施例４】
【００６３】
Ｔβ４ｐｈｅは、例えば、米国特許第５，５１２，６５６号に開示される方法に従う従来の固相ペプチド合成法によって、６位のメチオニンと置換されるフェニルアラニン（ｐｈｅｎｙａｌｏｎｉｎｅ）とともに生成され、予想外かつ予測不可能な特性を有するペプチドが生じる。
【実施例５】
【００６４】
Ｔβ４ｐｒｏは、例えば、米国特許第５，５１２，６５６号に開示される方法に従う従来の固相ペプチド合成法によって、６位のメチオニンと置換されるプロリンとともに生成され、予想外かつ予測不可能な特性を有するペプチドが生じる。
【実施例６】
【００６５】
Ｔβ４ｌｅｕは、例えば、米国特許第５，５１２，６５６号に開示される方法に従う従来の固相ペプチド合成法によって、６位のメチオニンと置換されるロイシンとともに生成され、予想外かつ予測不可能な特性を有するペプチドが生じる。
【実施例７】
【００６６】
Ｔβ４ｌｅｕを、本明細書中に説明されるような固相ペプチド合成法によって生成した。
【００６７】
Ｔβ４ｌｅｕのＧ−アクチン結合親和性を測定するために試験を実施し、天然Ｔβ４と比較した。この実験を３つ組で２回繰り返したところ、以下に示される結果であった（３回の実験の平均）：
第１測定：Ｔβ４Ｋｄ＝１．２８μＭ；Ｔβ４ｌｅｕＫｄ＝１．３６μＭ
第２測定：Ｔβ４Ｋｄ＝０．５４μＭ；Ｔβ４ｌｅｕＫｄ＝０．９９μＭ
Ｔβ４のほうが低い値であったのは、そのスルホキシドが原因である。Ｔβ４にＴβ４−スルホキシドを加えたものをアミノ酸解析により測定した。その調製物の約１０％が、Ｇ−アクチンにだけ弱く結合するスルホキシドであった。従って、本試験におけるＴβ４の真の濃度は、もっと低く、遊離Ｔβ４の減少は、非酸化Ｔβ４と比べて大きい。遊離βサイモシンの減少を測定した。Ｇ−アクチンに結合したＴβ４および遊離Ｔβ４を、限外濾過によって分離し、限外濾液中のＴβ４の濃度をＨＰＬＣによって測定した。使用した手順は、Ｈｕｆｆ ｅｔ ａｌ．，ＦＥＰＳ Ｌｅｔｔｅｒｓ，４１４：３９−４４（１９９７）に記載されている。
【００６８】
上記のデータは驚くべきことに、βサイモシンペプチドにおけるメチオニンのアミノ酸置換が、βサイモシンペプチドのＧアクチン結合能力に実質的に悪影響を及ぼさないことを示唆する。
【実施例８】
【００６９】
Ｔβ４スルホンを、濃Ｈ２Ｏ２（３０％）でのＴβ４の処理によってＴβ４のＭｅｔ残基を完全に酸化することによって生成した。
【００７０】
Ｔβ４スルホンの化学的性質を明らかにした。ＨＰＬＣ、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳおよびアミノ酸解析の技術を使用した。ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ解析により、そのペプチドへのＯ２の組み込みに対応するペプチドの分子量が３２Ｄａ増加したことが示された。
【００７１】
Ｔβ４スルホンは、Ｇ−アクチンの結合によって特徴付けられる。Ｔβ４スルホンは、Ｇアクチンと複合体を形成し、その複合体のＫｄ値は、約１０μＭである。従って、その複合体は、Ｔβ４との複合体と比較して安定ではない（１μＭ）が、驚くべきことに、Ｔβ４スルホキシドとの複合体より安定である（２０μＭ）。
【実施例９】
【００７２】
Ｔβ４ａｌａ、Ｔβ４ｘｅｎ、Ｔβ９ｍｅｔ、Ｔβ１０およびＴβ１３を含むβサイモシンは、本明細書中に説明されるような希過酸化水素と接触させることによってスルホキシドに変換され、対応するβサイモシンスルホキシドを形成する。
【実施例１０】
【００７３】
Ｔβ４ａｌａ、Ｔβ４ｘｅｎ、Ｔβ９ｍｅｔ、Ｔβ１０およびＴβ１３を含むβサイモシンは、対応するβサイモシンスルホンペプチドを形成するために、本明細書中に説明されるような、過ギ酸および／または過酢酸とそれらとを接触させることによってβサイモシンスルホンペプチドに変換される。
【実施例１１】
【００７４】
Ｓ型とＲ型の１対１の混合物であるＴβ４スルホキシドは、特異的なメチオニンスルホキシドレダクターゼ（ＭＳＲ−ＡおよびＭＳＲ−Ｂ）によって還元される。この手順によ
って、Ｓ型またはＲ型のいずれかが還元されるが、他方の型は、スルホキシドとして残存する。この手順によって２つのサンプルが得られた：一方のサンプルは、Ｔβ４およびＲ−Ｔβ４スルホキシドの混合物を含み、他方のサンプルは、Ｔβ４およびＳ−Ｔβ４スルホキシドの混合物を含む。２つのサンプルをＨＰＬＣによって分離し、純粋なＳ−Ｔβ４スルホキシドおよびＲ−Ｔβ４スルホキシドを単離した。Ｇ−アクチンとのそれらの複合体の解離定数を決定した。驚くべきことに、それらの複合体の解離定数は、同一であった。（Ｒ／Ｓ）−Ｔβ４スルホキシドまたはＲ−Ｔβ４スルホキシドまたはＳ−Ｔβ４スルホキシドのいずれかとのＧ−アクチンの複合体の安定性は、同一である（Ｋｄ〜２０μＭ）。アクチン−Ｔβ４スルホキシドのＫｄは、約１μＭである。Ｒ−Ｔβ４スルホキシドが、Ｇ−アクチンに結合することによってＳ−Ｔβ４スルホキシド（およびＳ−Ｔβ４スルホキシドからＲ−Ｔβ４スルホキシド）に変換されることは可能である。このラセミ化によって、Ｋｄ値の相違がなくなるだろう。
【実施例１２】
【００７５】
実施例８に従って生成されるＴβ４−スルホンならびに実施例９に従って生成されるβサイモシンスルホキシドおよび実施例１０に従って生成されるβサイモシンスルホンは、それらの各々の単離されたＳ鏡像異性体およびＲ鏡像異性体を形成するために分離される。
【技術分野】
【０００１】
背景
関連出願の相互参照
本出願は、２００５年１月１４日に出願された、米国仮出願第６０／６４３，６８４号、米国仮出願第６０／６４３，６８６号、米国仮出願第６０／６４３，６８７号および米国仮出願第６０／６４３，６８８号の利益を主張する。
【０００２】
１．技術分野
本開示は、βサイモシンペプチド、それらのアイソフォームおよびフラグメントの分野に関する。
【背景技術】
【０００３】
２．背景技術の説明
サイモシンβ４は、当初、インビトロにおける内皮細胞の遊走および分化の間にアップレギュレートされるタンパク質として同定された。サイモシンβ４は、胸腺から最初に単離され、種々の組織で同定される、４３アミノ酸、４．９ｋＤａの遍在性ポリペプチドである。内皮細胞の分化および遊走、Ｔ細胞の分化、アクチンの隔離および血管新生における役割を含むいくつかの役割がこのタンパク質の役割とされている。
【０００４】
Ｔβ４のアミノ酸配列は、本明細書中に参考として援用される米国特許第４，２９７，２７６号に開示されている。Ｔβ４は、進化を通じて高度に保存されている。実際に、マウス、ラットおよびヒトのＴβ４の間で全体的な相同性がある。
【０００５】
Ｔβ４は、哺乳動物の多くの組織タイプに存在することが見出されており、広く様々な細胞プロセスおよび生理学的プロセスに関連する。そのプロセスは、骨髄細胞のターミナルデオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ活性を誘導する工程、視床下部の黄体形成ホルモン放出ホルモンおよび黄体形成ホルモンの分泌を刺激する工程、マクロファージの遊走を阻害する工程およびマクロファージの抗原提示を促進する工程ならびにインビトロにおいてＴ細胞株の表現型の変更を誘導する工程を含む。
【０００６】
サイモシンβ４スルホキシドは、ＰＣＴ国際公開番号ＷＯ９９／４９８８３に開示されている。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
当該分野において改良型βサイモシンペプチドが必要とされている。
概要
【課題を解決するための手段】
【０００８】
１実施形態によれば、組成物は、酸化、もしくは超酸化改変型正常メチオニン含有βサイモシンペプチド、そのアイソフォーム、そのフラグメント、ラセミ体のサイモシンβ４スルホキシド以外のその単離されたＲ鏡像異性体もしくはその単離されたＳ鏡像異性体を含むか、あるいはその組成物は、正常メチオニン含有βサイモシンペプチド、そのアイソフォームもしくはフラグメントのアミノ酸配列の少なくとも１つのメチオニンと置換されている非メチオニンアミノ酸置換基を有する、改変型βサイモシンペプチド、そのアイソフォームまたはフラグメントを含む。本発明に記載の組成物を形成するための方法もまた開示される。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００９】
詳細な説明
多くのβサイモシンペプチドは、アミノ酸配列内に、インビボおよびインビトロで酸化に供するアミノ酸のメチオニンを含む。このようなβサイモシンペプチドは、本明細書中で「正常メチオニン含有βサイモシンペプチド」と呼ぶこともある。既知のβサイモシンの多くは、メチオニンが６位に存在する。
【００１０】
正常メチオニン含有βサイモシンにおける、アミノ酸であるメチオニン（Ｃ５Ｈ１１ＮＯ２Ｓ）からメチオニンスルホキシド（Ｃ５Ｈ１１ＮＯ３Ｓ）への酸化により、βサイモシンスルホキシドである組成物が生じる。酸化は、任意の好適な方法を利用して達成することができる。例えば、メチオニン含有βサイモシンのスルホキシドへの酸化は、メチオニン含有βサイモシンを過酸化水素に曝露することによって達成することができる。５０体積の過酸化水素を用いたサイモシンβ４の酸化は、本明細書中に参考として援用されるＷＯ９９／４９８８に開示されている。従って、サイモシンβ４を、希過酸化水素によって酸化することができ、ＷＯ９９／４９８８３に開示されるようなサイモシンβ４スルホキシドを形成する。
【００１１】
アミノ酸であるメチオニン（Ｃ５Ｈ１１ＮＯ２Ｓ）のメチオニンスルホキシド（Ｃ５Ｈ１１ＮＯ３Ｓ）への酸化または他の方法によって、インビボおよびインビトロの両方でＴβ４などのメチオニン含有βサイモシンの主な分解経路が説明され得る。
【００１２】
多くのβサイモシンおよびアイソフォームが同定されており、それらは、Ｔβ４の公知のアミノ酸配列に対して約７０％または約７５％または約８０％以上の相同性を有する。そのようなβサイモシンおよびアイソフォームとしては、例えば、Ｔβ４ａｌａ、Ｔβ９、Ｔβ１０、Ｔβ１１、Ｔβ１２、Ｔβ１３、Ｔβ１４およびＴβ１５が挙げられる。
【００１３】
６位にメチオニンを含む代表的なβサイモシンとしては、Ｔβ４、Ｔβ４ａｌａ、Ｔβ４ｘｅｎ、Ｔβ９ｍｅｔ、Ｔβ１０およびＴβ１３が挙げられる。
【００１４】
本発明は、既知のβサイモシン、上で列挙されたようなそれらのアイソフォームおよびフラグメントならびに未だ同定されていない、正常メチオニン含有βサイモシンおよびＴβ４アイソフォームならびにそのフラグメントに適用することができる。
【００１５】
さらに、本開示は、ペプチドの６位以外の位置に１つ以上のメチオニンを正常に有する、既知、または未だ同定されていない、βサイモシン、それらのアイソフォームおよびフラグメントに適用することができる。
【００１６】
特定の実施形態において、メチオニンと置換されるアミノ酸は、中性、非極性、疎水性および／または非酸化型である。このような組成物は、メチオニン含有βサイモシンよりも溶解度が大きいという利点を有する一方で、対応するβサイモシンと実質的に同じか、または異なる活性を有する。
【００１７】
特定の実施形態において、メチオニンと置換されたアミノ酸は、βサイモシンの酸化を阻害し、最も好ましいことには、置換されたβサイモシンの生物学的活性が、対応するメチオニン含有βサイモシンと実質的に同じである。
【００１８】
メチオニン含有βサイモシンペプチド中のメチオニンの置換は、そのペプチドの安定なプロファイルに変化を起こすと見られる。さらに、そのような置換は、ペプチドの予側不可能な新しい特性ならびに予側不可能に変化しない特性を生じると見られる。
【００１９】
非限定的な例として、メチオニン含有βサイモシン中のメチオニンと置換されるアミノ酸は、バリン、イソロイシン、アラニン、フェニルアラニン、プロリンまたはロイシンである。
【００２０】
１つの実施形態において、ロイシンは、Ｔβ４中のメチオニンと置換される。
１つの実施形態によれば、ロイシンがメチオニンと置換されるとき、このβサイモシンペプチドは、Ｔβ４以外である。
【００２１】
１つの態様によれば、メチオニン含有βサイモシン中のメチオニンと置換されるアミノ酸は、ロイシン以外である。この態様のいくつかの実施形態において、メチオニン含有βサイモシン中のメチオニンと置換されるアミノ酸は、バリン、イソロイシン、アラニン、フェニルアラニンまたはプロリンである。
【００２２】
１つの実施形態によれば、メチオニンと置換される好ましいアミノ酸は、バリンまたはイソロイシンである。
【００２３】
別の実施形態によれば、メチオニンと置換される好ましいアミノ酸は、アラニンである。
【００２４】
さらなる実施形態によれば、メチオニンと置換される好ましいアミノ酸は、バリンである。
【００２５】
本発明に記載のアミノ酸置換改変型βサイモシンペプチド、それらのアイソフォームおよびフラグメントは、米国特許第５，５１２，６５６号に開示されている１つの実施例である固相ペプチド合成法などの任意の適切な方法によって提供され得る。
【００２６】
本開示はまた、アミノ酸置換改変型βサイモシンペプチドを形成するための方法に適用することができ、メチオニン含有βサイモシンペプチド、そのアイソフォームまたはフラグメントのアミノ酸配列が、βサイモシンペプチド、そのアイソフォームまたはフラグメント中の少なくとも１つのメチオニンと非メチオニンアミノ酸を置換することによって改変される。その方法は、改変型βサイモシンペプチド、そのアイソフォームまたはフラグメントを形成するために、メチオニン含有βサイモシンペプチド配列、そのアイソフォームまたはフラグメント中の少なくとも１つのメチオニンと非メチオニンアミノ酸を置換する工程を含む。
【００２７】
上で説明したように、Ｔβ４ｌｅｕを含むために、サイモシンβ４が６位のメチオニンと置換されている置換基ロイシンを有してもよい。
【００２８】
メチオニンと置換されるアミノ酸であるロイシンは、Ｔβ４の酸化を阻害する。Ｔβ４ｌｅｕは、Ｔβ４よりも安定性が高いという利点を有する一方で、驚くべきことに、実質的なアクチン結合活性を有する。
【００２９】
Ｔβ４におけるメチオニンのロイシンによる置換はまた、ペプチドの新しい特性を予想外に生じ得る。
【００３０】
Ｔβ４ｌｅｕを形成するための方法が開示され、ここで、Ｔβ４のアミノ酸配列は、Ｔβ４の６位のメチオニンとロイシンアミノ酸を置換することによって改変される。この方法は、Ｔβ４ｌｅｕを形成するために、Ｔβ４配列の６位のメチオニンとロイシンを置換する工程を含む。
【００３１】
本発明に記載のペプチドは、実質的なアクチン結合活性を有し得る。
他のもののうち、抗炎症剤として組成物が利用されてもよい。
【００３２】
１つの実施形態によれば、サイモシンβ４スルホキシド以外の酸化メチオニン含有βサイモシンペプチド、そのアイソフォームまたはフラグメントが、提供される。
【００３３】
βサイモシンスルホキシドペプチドを形成するために、正常メチオニン含有βサイモシンペプチド、そのアイソフォームまたはフラグメントと希過酸化水素などの酸化剤とを接触させる工程を含む改変型βサイモシンスルホキシドを形成するための方法もまた適用することができる。
【００３４】
別の実施形態は、対応するβサイモシンスルホキシドペプチドを形成するために、サイモシンβ４以外の正常メチオニン含有βサイモシンペプチド、そのアイソフォームまたはフラグメントと過酸化水素などの酸化剤とを接触させる工程を含むβサイモシンスルホキシドペプチドを形成する方法である。
【００３５】
本明細書中に含まれる組成物は、非酸化メチオニン含有βサイモシンよりも安定性が高いという利点を有し、対応するβサイモシンと実質的に同じが、または異なる活性を有する。
【００３６】
メチオニン含有βサイモシンペプチドのスルホキシドへの酸化によって、ペプチドの安定プロファイルが変化する。さらに、このような置換によって、ペプチドの特定の新しい特性ならびに特定の変化しない特性が生じ得る。
【００３７】
正常メチオニン含有βサイモシンペプチド中のメチオニンの超酸化によって、ペプチドの安定プロファイルの変化が生じる。さらに、このような置換によって、ペプチドの一定の新しい特性ならびに一定の変化しない特性が生じ得る。
【００３８】
１つの実施形態によれば、超酸化されるβサイモシンペプチドは、Ｔβ４以外である。
βサイモシンスルホキシドを含むメチオニン含有βサイモシンペプチドは、対応するβサイモシンスルホンペプチドを形成するために、過ギ酸または過酢酸によって超酸化され、ここで影響を受けるメチオニンの硫黄原子は、２つの酸素によって完全に酸化される（超酸化される）。
【００３９】
１つの実施形態によれば、Ｔβ４スルホン以外の改変型メチオニン含有βサイモシンスルホンを含む組成物が、提供される。
【００４０】
対応するβサイモシンスルホンペプチドを形成するためにメチオニン含有βサイモシンペプチド、そのスルホキシド、アイソフォームまたはフラグメントと過ギ酸および／または過酢酸などの酸とを接触させる工程を含むβサイモシンスルホンを形成するための方法が含まれる。
【００４１】
別の実施形態によれば、対応するβサイモシンスルホンペプチドを形成するために、サイモシンβ４またはサイモシンβ４スルホキシド以外のメチオニン含有βサイモシンペプチド、そのスルホキシド、アイソフォームまたはフラグメントと過ギ酸および／または過酢酸などの酸とを接触させる工程を含むβサイモシンスルホンペプチドを形成する方法が含まれる。
【００４２】
別の実施形態において、サイモシンβ４および／またはサイモシンβ４スルホキシドは
、サイモシンβ４スルホンを形成するために、過ギ酸または過酢酸によって酸化され、サイモシンβ４の６位のメチオニンの硫黄原子は、２つの酸素によって完全に酸化される（超酸化される）。
【００４３】
他のもののうちサイモシンβ４スルホンが抗炎症剤として利用されてもよい。
Ｔβ４のメチオニル残基におけるチオエーテルがプロキラルであるので、キラル剤によらない酸化（または超酸化）によってスルホキシド（またはスルホン）、すなわちＳ型およびＲ型（「鏡像異性体」）の２つの型が生成される。酸化サイモシンβ４のパートナとなり得るすべての生体分子がキラルであるので、スルホキシド（またはスルホン）のＳ型またはＲ型と形成される複合体は異なる（ジアステレオ異性体）。サイモシンβ４スルホキシド（またはスルホン）の型は、異なる薬力学的かつ薬物動態学的な挙動ならびに生物学的活性を示し得る。従って、サイモシンβ４スルホキシド（またはスルホン）のＳ型およびＲ型は、異なる生物学的作用を有し得る。
【００４４】
アミノ酸解析システムは、酸化サイモシンβ４スルホキシド（またはスルホン）の加水分解（ｈｙｒｏｌｙｓｉｓ）後に、Ｌ−メチオニン（Ｓ）−スルホキシド（またはスルホン）とＬ−メチオニン（Ｒ）−スルホキシド（またはスルホン）とを識別するために使用され得る。例えば、２つの手順が、サイモシンβ４スルホキシド（またはスルホン）の２つの型を単離するために酸化または超酸化後に使用され得る。メチオニンスルホキシド（またはスルホン）の異なる型は、鏡および鏡像として挙動するが、ペプチドの他のアミノ酸残基が不斉の環境を作り出すので、生成されたサイモシンβ４スルホキシド（またはスルホン）は、像と鏡像との対を構成しない。従って、そのそれぞれの型を、ＨＰＬＣ技術によって分離することができる。その型を分離するための代替手順は、サイモシンβ４スルホキシド（またはスルホン）の一方の型を還元するが、他方は還元しない特異的なメチオニンスルホキシド（またはスルホン）レダクターゼの使用であり得る。酵素的な還元型からのサイモシンβ４スルホキシド（またはスルホン）の非還元可能型の分離は、ＨＰＬＣによって実施してもよい。
【００４５】
Ｒ−サイモシンβ４スルホキシド（またはスルホン）を、Ｒ−サイモシンβ４スルホキシド（またはスルホン）およびＳ−サイモシンβ４スルホキシド（またはスルホン）を含む混合物から分離することによって、分離されたＲ−サイモシンβ４スルホキシド（またはスルホン）を含む組成物を形成する方法が本明細書中に開示される。
【００４６】
Ｓ−サイモシンβ４スルホキシド（またはスルホン）を、Ｓ−サイモシンβ４スルホキシド（またはスルホン）およびＲ−サイモシンβ４スルホキシド（またはスルホン）を含む混合物から分離することによって、分離されたＳ−サイモシンβ４スルホキシド（またはスルホン）を含む組成物を形成する方法が本明細書中に開示される。
【００４７】
上で説明したように、多くのβサイモシンおよびそれらのアイソフォームが同定されており、それらは、Ｔβ４の既知のアミノ酸配列に対して約７０％または約７５％または約８０％以上の相同性を有する。このようなβサイモシンおよびアイソフォームとしては、例えば、Ｔβ４ａｌａ、Ｔβ９、Ｔβ１０、Ｔβ１１、Ｔβ１２、Ｔβ１３、Ｔβ１４およびＴβ１５が挙げられる。
【００４８】
上で説明したように、６位にメチオニンを含む代表的なβサイモシンとしては、Ｔβ４、Ｔβ４ａｌａ、Ｔβ４ｘｅｎ、Ｔβ９ｍｅｔ、Ｔβ１０およびＴβ１３が挙げられる。
【００４９】
上で説明したように、上で列挙したような既知のβサイモシンおよびアイソフォームならびに未同定の、メチオニン含有βサイモシン、それらのアイソフォームおよびフラグメントが本明細書中に含まれる。
【００５０】
上で説明したように、既知かまたは未同定の、ペプチド中の６位以外の位置に１つ以上のメチオニンを有するβサイモシン、それらのアイソフォームおよびフラグメントがさらに本明細書中に含まれる。
【００５１】
Ｔβ４と同様に、メチオニン含有βサイモシンのメチオニル残基におけるチオエーテルがプロキラルであるので、キラル剤によらない酸化（または超酸化）によって、Ｓ型およびＲ型（「鏡像異性体」）を含むスルホキシド（またはスルホン）の少なくとも２つの型が生成される。酸化メチオニン含有βサイモシンのパートナとなり得るすべての生体分子がキラルであるので、スルホキシド（またはスルホン）のＳ型またはＲ型と形成される複合体は異なる（ジアステレオ異性体）。βサイモシンスルホキシド（またはスルホン）の異なる型は、異なる薬力学的かつ薬物動態学的な挙動ならびに生物学的活性を示す。従って、βサイモシンスルホキシド（またはスルホン）のＳ型およびＲ型は、異なる生物学的作用を有し得る。
【００５２】
Ｔβ４と同様に、アミノ酸解析システムは、酸化βサイモシンスルホキシド（またはスルホン）の加水分解（ｈｙｒｏｌｙｓｉｓ）後に、Ｌ−メチオニン（Ｓ）−スルホキシド（またはスルホン）とＬ−メチオニン（Ｒ）−スルホキシド（またはスルホン）とを識別するために使用され得る。例えば、少なくとも２つの手順が、βサイモシンスルホキシド（またはスルホン）の異なる型を単離するために酸化（または超酸化）後に使用され得る。メチオニンスルホキシド（またはスルホン）の異なる型は、鏡および鏡像として挙動するが、ペプチドの他のアミノ酸残基が不斉の環境を作り出すので、生成されたβサイモシンスルホキシド（またはスルホン）は、像と鏡像との対を構成しない。従って、その異なる型は、公知のＨＰＬＣ技術によって分離することができる。その異なる型を分離するための代替手順は、サイモシンβ４スルホキシド（またはスルホン）の一方の型を還元するが、他方は還元しない特異的なメチオニンスルホキシド（またはスルホン）レダクターゼの使用であり得る。酵素的な還元型からのβサイモシンスルホキシド（またはスルホン）の非還元可能型の分離は、ＨＰＬＣによって実施することができる。
【００５３】
Ｒ−βサイモシンスルホキシド（またはスルホン）を、Ｒ−βサイモシンスルホキシド（またはスルホン）およびＳ−βサイモシンスルホキシド（またはスルホン）を含む混合物から分離することによって、分離されたＲ−βサイモシンスルホキシド（またはスルホン）を含む組成物を形成する方法が本明細書中に開示される。
【００５４】
Ｓ−βサイモシンスルホキシド（またはスルホン）を、Ｓ−βサイモシンスルホキシド（またはスルホン）およびＲ−βサイモシンβ４スルホキシド（またはスルホン）を含む混合物から分離することによって、分離されたＳ−βサイモシンスルホキシド（またはスルホン）を含む組成物を形成する方法がさらに開示される。
【００５５】
１つの実施形態において、本開示は、本明細書中に説明されるようなペプチドを含む組成物の有効量を投与することによって、被験体の疾患、損傷、傷害および／もしくは創傷または被験体の組織を治療、予防、阻害または低減するための治療方法を提供する。投与工程は、直接的であってもよく、全身性であってもよい。直接投与の例としては、例えば、本明細書中に説明されるようなペプチドを含む、溶液、ローション、軟膏、ゲル、クリーム、ペースト、噴霧液、懸濁液、分散液、ヒドロゲル、軟膏剤または油剤を含む担体と組織とを直接適用または吸入によって接触させる工程を含む。全身性投与としては、例えば、注射用水などの医薬的に許容可能な担体中に本明細書中に説明されるようなペプチドを含む組成物の静脈内、腹腔内、筋肉内注射が挙げられる。被験体は、好ましくは哺乳動物であり、最も好ましくはヒトである。
【００５６】
本明細書中に説明されるような組成物は、任意の適当な有効量で投与され得る。例えば、本明細書中に説明されるような組成物は、約０．０００１〜１，０００，０００マイクログラムの範囲内の用量、より好ましくは約０．１〜５，０００マイクログラムの範囲内の量、最も好ましくは約１〜３０マイクログラムの範囲内で投与され得る。
【００５７】
本明細書中に説明されるような組成物は、毎日、１日おき、１週間おき、１ヶ月おきなどで、投与の１日あたり単回適用または複数回適用（例えば、投与の１日あたり２回、３回、４回または４回以上の適用）で投与され得る。
【００５８】
本開示はまた、医薬的または化粧品的に許容可能な担体中に本明細書中に説明されるような組成物の治療有効量を含む医薬組成物または化粧品組成物を含む。このような担体としては、本明細書中で列挙されたものを含む任意の適当な担体が挙げられる。
【００５９】
本明細書中に説明されたアプローチは、任意の従来の投与技術（これらに限定されないが、例えば、直接投与、局所注射、吸入または全身性投与）を含む、本明細書中に説明されるような組成物の被験体への様々な投与経路または送達を含む。本明細書中に説明されるような組成物を使用するか、またはそれらを含む方法および組成物は、医薬的に許容可能か、または化粧品的に非毒性な賦形剤、添加剤または担体と混合することによって医薬組成物または化粧品組成物に処方され得る。
【実施例１】
【００６０】
Ｔβ４ｖａｌは、例えば、米国特許第５，５１２，６５６号に開示される方法に従う従来の固相ペプチド合成法によって、６位のメチオニンと置換されるバリンとともに生成され、予想外かつ予測不可能な特性を有するペプチドが生じる。
【実施例２】
【００６１】
Ｔβ４ｉｓｏは、従来の固相ペプチド合成法によって、６位のメチオニンと置換されるイソロイシンとともに生成され、予想外かつ予測不可能な特性を有するペプチドが生じる。
【実施例３】
【００６２】
Ｔβ４Ｍ６Ａは、例えば、米国特許第５，５１２，６５６号に開示される方法に従う従来の固相ペプチド合成法によって、６位のメチオニンと置換されるアラニンとともに生成され、予想外かつ予測不可能な特性を有するペプチドが生じる。
【実施例４】
【００６３】
Ｔβ４ｐｈｅは、例えば、米国特許第５，５１２，６５６号に開示される方法に従う従来の固相ペプチド合成法によって、６位のメチオニンと置換されるフェニルアラニン（ｐｈｅｎｙａｌｏｎｉｎｅ）とともに生成され、予想外かつ予測不可能な特性を有するペプチドが生じる。
【実施例５】
【００６４】
Ｔβ４ｐｒｏは、例えば、米国特許第５，５１２，６５６号に開示される方法に従う従来の固相ペプチド合成法によって、６位のメチオニンと置換されるプロリンとともに生成され、予想外かつ予測不可能な特性を有するペプチドが生じる。
【実施例６】
【００６５】
Ｔβ４ｌｅｕは、例えば、米国特許第５，５１２，６５６号に開示される方法に従う従来の固相ペプチド合成法によって、６位のメチオニンと置換されるロイシンとともに生成され、予想外かつ予測不可能な特性を有するペプチドが生じる。
【実施例７】
【００６６】
Ｔβ４ｌｅｕを、本明細書中に説明されるような固相ペプチド合成法によって生成した。
【００６７】
Ｔβ４ｌｅｕのＧ−アクチン結合親和性を測定するために試験を実施し、天然Ｔβ４と比較した。この実験を３つ組で２回繰り返したところ、以下に示される結果であった（３回の実験の平均）：
第１測定：Ｔβ４Ｋｄ＝１．２８μＭ；Ｔβ４ｌｅｕＫｄ＝１．３６μＭ
第２測定：Ｔβ４Ｋｄ＝０．５４μＭ；Ｔβ４ｌｅｕＫｄ＝０．９９μＭ
Ｔβ４のほうが低い値であったのは、そのスルホキシドが原因である。Ｔβ４にＴβ４−スルホキシドを加えたものをアミノ酸解析により測定した。その調製物の約１０％が、Ｇ−アクチンにだけ弱く結合するスルホキシドであった。従って、本試験におけるＴβ４の真の濃度は、もっと低く、遊離Ｔβ４の減少は、非酸化Ｔβ４と比べて大きい。遊離βサイモシンの減少を測定した。Ｇ−アクチンに結合したＴβ４および遊離Ｔβ４を、限外濾過によって分離し、限外濾液中のＴβ４の濃度をＨＰＬＣによって測定した。使用した手順は、Ｈｕｆｆ ｅｔ ａｌ．，ＦＥＰＳ Ｌｅｔｔｅｒｓ，４１４：３９−４４（１９９７）に記載されている。
【００６８】
上記のデータは驚くべきことに、βサイモシンペプチドにおけるメチオニンのアミノ酸置換が、βサイモシンペプチドのＧアクチン結合能力に実質的に悪影響を及ぼさないことを示唆する。
【実施例８】
【００６９】
Ｔβ４スルホンを、濃Ｈ２Ｏ２（３０％）でのＴβ４の処理によってＴβ４のＭｅｔ残基を完全に酸化することによって生成した。
【００７０】
Ｔβ４スルホンの化学的性質を明らかにした。ＨＰＬＣ、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳおよびアミノ酸解析の技術を使用した。ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ解析により、そのペプチドへのＯ２の組み込みに対応するペプチドの分子量が３２Ｄａ増加したことが示された。
【００７１】
Ｔβ４スルホンは、Ｇ−アクチンの結合によって特徴付けられる。Ｔβ４スルホンは、Ｇアクチンと複合体を形成し、その複合体のＫｄ値は、約１０μＭである。従って、その複合体は、Ｔβ４との複合体と比較して安定ではない（１μＭ）が、驚くべきことに、Ｔβ４スルホキシドとの複合体より安定である（２０μＭ）。
【実施例９】
【００７２】
Ｔβ４ａｌａ、Ｔβ４ｘｅｎ、Ｔβ９ｍｅｔ、Ｔβ１０およびＴβ１３を含むβサイモシンは、本明細書中に説明されるような希過酸化水素と接触させることによってスルホキシドに変換され、対応するβサイモシンスルホキシドを形成する。
【実施例１０】
【００７３】
Ｔβ４ａｌａ、Ｔβ４ｘｅｎ、Ｔβ９ｍｅｔ、Ｔβ１０およびＴβ１３を含むβサイモシンは、対応するβサイモシンスルホンペプチドを形成するために、本明細書中に説明されるような、過ギ酸および／または過酢酸とそれらとを接触させることによってβサイモシンスルホンペプチドに変換される。
【実施例１１】
【００７４】
Ｓ型とＲ型の１対１の混合物であるＴβ４スルホキシドは、特異的なメチオニンスルホキシドレダクターゼ（ＭＳＲ−ＡおよびＭＳＲ−Ｂ）によって還元される。この手順によ
って、Ｓ型またはＲ型のいずれかが還元されるが、他方の型は、スルホキシドとして残存する。この手順によって２つのサンプルが得られた：一方のサンプルは、Ｔβ４およびＲ−Ｔβ４スルホキシドの混合物を含み、他方のサンプルは、Ｔβ４およびＳ−Ｔβ４スルホキシドの混合物を含む。２つのサンプルをＨＰＬＣによって分離し、純粋なＳ−Ｔβ４スルホキシドおよびＲ−Ｔβ４スルホキシドを単離した。Ｇ−アクチンとのそれらの複合体の解離定数を決定した。驚くべきことに、それらの複合体の解離定数は、同一であった。（Ｒ／Ｓ）−Ｔβ４スルホキシドまたはＲ−Ｔβ４スルホキシドまたはＳ−Ｔβ４スルホキシドのいずれかとのＧ−アクチンの複合体の安定性は、同一である（Ｋｄ〜２０μＭ）。アクチン−Ｔβ４スルホキシドのＫｄは、約１μＭである。Ｒ−Ｔβ４スルホキシドが、Ｇ−アクチンに結合することによってＳ−Ｔβ４スルホキシド（およびＳ−Ｔβ４スルホキシドからＲ−Ｔβ４スルホキシド）に変換されることは可能である。このラセミ化によって、Ｋｄ値の相違がなくなるだろう。
【実施例１２】
【００７５】
実施例８に従って生成されるＴβ４−スルホンならびに実施例９に従って生成されるβサイモシンスルホキシドおよび実施例１０に従って生成されるβサイモシンスルホンは、それらの各々の単離されたＳ鏡像異性体およびＲ鏡像異性体を形成するために分離される。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
酸化、もしくは超酸化（ｓｕｐｅｒｏｘｉｄｉｚｅｄ）改変型正常メチオニン含有βサイモシンペプチド、そのアイソフォーム、そのフラグメント、またはラセミ体のサイモシンβ４スルホキシド以外のその単離されたＲ鏡像異性体もしくはその単離されたＳ鏡像異性体を含むか、あるいは正常メチオニン含有βサイモシンペプチド、そのアイソフォームもしくはフラグメントのアミノ酸配列の少なくとも１つのメチオニンと置換される非メチオニンアミノ酸置換基を有する、改変型βサイモシンペプチド、そのアイソフォームまたはフラグメントを含む、組成物。
【請求項２】
前記正常メチオニン含有βサイモシンペプチドが、Ｔβ４、Ｔβ４ａｌａ、Ｔβ４ｘｅｎ、Ｔβ９ｍｅｔ、Ｔβ１０またはＴβ１３である、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
前記アミノ酸置換基が、ロイシン、バリン、イソロイシン、アラニン、フェニルアラニンまたはプロリンである、請求項１に記載の組成物。
【請求項４】
前記メチオニン含有βサイモシンペプチドが、Ｔβ４である、請求項１に記載の組成物。
【請求項５】
前記アミノ酸置換基が、ロイシン、バリン、イソロイシン、アラニン、フェニルアラニンまたはプロリンである、請求項１に記載の組成物。
【請求項６】
前記アミノ酸置換基が、中性、無極性、疎水性または非酸化型の少なくとも１つである、請求項１に記載の組成物。
【請求項７】
前記アミノ酸置換基が、前記ペプチドの酸化を阻害する、請求項１に記載の組成物。
【請求項８】
Ｔβ４または正常メチオニン含有βサイモシンペプチドのアイソフォームもしくはフラグメント以外のメチオニン含有βサイモシンペプチドのアミノ酸配列の少なくとも１つのメチオニンと置換される、ロイシン以外の非メチオニンアミノ酸置換基を有する、改変型βサイモシンペプチド、そのアイソフォームまたはフラグメントを含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項９】
改変型Ｔβ４アミノ酸配列の６位のメチオニンと置換されるロイシンを有する改変型Ｔβ４アミノ酸配列を含む、ペプチドＴβ４ｌｅｕを含む組成物。
【請求項１０】
改変型メチオニン含有βサイモシンペプチド、そのアイソフォームまたはフラグメントが、スルホキシドである、請求項１に記載の組成物。
【請求項１１】
前記改変型メチオニン含有βサイモシンペプチド、そのアイソフォームまたはフラグメントが、スルホンである、請求項１に記載の組成物。
【請求項１２】
サイモシンβ４スルホンを含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項１３】
Ｔβ４ａｌａスルホン、Ｔβ４ｘｅｎスルホン、Ｔβ４ｍｅｔスルホン、Ｔβ１０スルホンまたはＴβ１３スルホンを含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項１４】
単離されたＲ鏡像異性体を含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項１５】
単離されたＳ鏡像異性体を含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項１６】
サイモシンβ４スルホキシドの単離されたＲ鏡像異性体を含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項１７】
サイモシンβ４スルホキシドの単離されたＳ鏡像異性体を含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項１８】
βサイモシンスルホンペプチドを形成するために正常メチオニン含有βサイモシンペプチドと酸とを接触させる工程を含む、請求項１に記載のβサイモシンスルホンペプチドを形成するための方法。
【請求項１９】
前記酸が、過ギ酸または過酢酸の少なくとも１つを含む、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
単離されたＲ−βサイモシンスルホキシドまたはＲ−βサイモシンスルホンを含む、請求項１に記載の組成物を形成する方法であって、対応するＲ−βサイモシンスルホキシドまたはＲ−βサイモシンスルホンとＳ−βサイモシンスルホキシドまたはＳ−βサイモシンスルホンとの混合物からＲ−βサイモシンスルホキシドまたはＲ−βサイモシンスルホンを分離する工程を含む、方法。
【請求項２１】
単離されたＳ−βサイモシンスルホキシドまたはＳ−βサイモシンスルホンを含む、請求項１に記載の組成物を形成する方法であって、対応するＳ−βサイモシンスルホキシドまたはＳ−βサイモシンスルホンおよびＲ−βサイモシンスルホキシドまたはＲ−βサイモシンスルホンを含む混合物からＳ−βサイモシンスルホキシドまたはＳ−βサイモシンスルホンを分離する工程を含む、方法。
【請求項２２】
請求項１に定義されたような、改変型βサイモシンペプチド、そのアイソフォームまたはフラグメントを形成する方法であって、改変型βサイモシンペプチド、それのアイソフォームまたはフラグメントを形成するために、正常メチオニン含有βサイモシンペプチド、そのアイソフォームまたはフラグメントのアミノ酸配列の少なくとも１つのメチオニンと非メチオニンアミノ酸置換基を置換する工程を含む、方法。
【請求項２３】
前記アミノ酸置換基が、ロイシン、バリン、イソロイシン、アラニン、フェニルアラニンまたはプロリンである、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
ペプチドＴβ４ｌｅｕを形成するために、Ｔβ４の６位のメチオニンをアミノ酸のロイシンに置換する工程を含む、請求項９に定義されたペプチドＴβ４ｌｅｕを形成する方法。
【請求項１】
酸化、もしくは超酸化（ｓｕｐｅｒｏｘｉｄｉｚｅｄ）改変型正常メチオニン含有βサイモシンペプチド、そのアイソフォーム、そのフラグメント、またはラセミ体のサイモシンβ４スルホキシド以外のその単離されたＲ鏡像異性体もしくはその単離されたＳ鏡像異性体を含むか、あるいは正常メチオニン含有βサイモシンペプチド、そのアイソフォームもしくはフラグメントのアミノ酸配列の少なくとも１つのメチオニンと置換される非メチオニンアミノ酸置換基を有する、改変型βサイモシンペプチド、そのアイソフォームまたはフラグメントを含む、組成物。
【請求項２】
前記正常メチオニン含有βサイモシンペプチドが、Ｔβ４、Ｔβ４ａｌａ、Ｔβ４ｘｅｎ、Ｔβ９ｍｅｔ、Ｔβ１０またはＴβ１３である、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
前記アミノ酸置換基が、ロイシン、バリン、イソロイシン、アラニン、フェニルアラニンまたはプロリンである、請求項１に記載の組成物。
【請求項４】
前記メチオニン含有βサイモシンペプチドが、Ｔβ４である、請求項１に記載の組成物。
【請求項５】
前記アミノ酸置換基が、ロイシン、バリン、イソロイシン、アラニン、フェニルアラニンまたはプロリンである、請求項１に記載の組成物。
【請求項６】
前記アミノ酸置換基が、中性、無極性、疎水性または非酸化型の少なくとも１つである、請求項１に記載の組成物。
【請求項７】
前記アミノ酸置換基が、前記ペプチドの酸化を阻害する、請求項１に記載の組成物。
【請求項８】
Ｔβ４または正常メチオニン含有βサイモシンペプチドのアイソフォームもしくはフラグメント以外のメチオニン含有βサイモシンペプチドのアミノ酸配列の少なくとも１つのメチオニンと置換される、ロイシン以外の非メチオニンアミノ酸置換基を有する、改変型βサイモシンペプチド、そのアイソフォームまたはフラグメントを含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項９】
改変型Ｔβ４アミノ酸配列の６位のメチオニンと置換されるロイシンを有する改変型Ｔβ４アミノ酸配列を含む、ペプチドＴβ４ｌｅｕを含む組成物。
【請求項１０】
改変型メチオニン含有βサイモシンペプチド、そのアイソフォームまたはフラグメントが、スルホキシドである、請求項１に記載の組成物。
【請求項１１】
前記改変型メチオニン含有βサイモシンペプチド、そのアイソフォームまたはフラグメントが、スルホンである、請求項１に記載の組成物。
【請求項１２】
サイモシンβ４スルホンを含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項１３】
Ｔβ４ａｌａスルホン、Ｔβ４ｘｅｎスルホン、Ｔβ４ｍｅｔスルホン、Ｔβ１０スルホンまたはＴβ１３スルホンを含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項１４】
単離されたＲ鏡像異性体を含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項１５】
単離されたＳ鏡像異性体を含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項１６】
サイモシンβ４スルホキシドの単離されたＲ鏡像異性体を含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項１７】
サイモシンβ４スルホキシドの単離されたＳ鏡像異性体を含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項１８】
βサイモシンスルホンペプチドを形成するために正常メチオニン含有βサイモシンペプチドと酸とを接触させる工程を含む、請求項１に記載のβサイモシンスルホンペプチドを形成するための方法。
【請求項１９】
前記酸が、過ギ酸または過酢酸の少なくとも１つを含む、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
単離されたＲ−βサイモシンスルホキシドまたはＲ−βサイモシンスルホンを含む、請求項１に記載の組成物を形成する方法であって、対応するＲ−βサイモシンスルホキシドまたはＲ−βサイモシンスルホンとＳ−βサイモシンスルホキシドまたはＳ−βサイモシンスルホンとの混合物からＲ−βサイモシンスルホキシドまたはＲ−βサイモシンスルホンを分離する工程を含む、方法。
【請求項２１】
単離されたＳ−βサイモシンスルホキシドまたはＳ−βサイモシンスルホンを含む、請求項１に記載の組成物を形成する方法であって、対応するＳ−βサイモシンスルホキシドまたはＳ−βサイモシンスルホンおよびＲ−βサイモシンスルホキシドまたはＲ−βサイモシンスルホンを含む混合物からＳ−βサイモシンスルホキシドまたはＳ−βサイモシンスルホンを分離する工程を含む、方法。
【請求項２２】
請求項１に定義されたような、改変型βサイモシンペプチド、そのアイソフォームまたはフラグメントを形成する方法であって、改変型βサイモシンペプチド、それのアイソフォームまたはフラグメントを形成するために、正常メチオニン含有βサイモシンペプチド、そのアイソフォームまたはフラグメントのアミノ酸配列の少なくとも１つのメチオニンと非メチオニンアミノ酸置換基を置換する工程を含む、方法。
【請求項２３】
前記アミノ酸置換基が、ロイシン、バリン、イソロイシン、アラニン、フェニルアラニンまたはプロリンである、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
ペプチドＴβ４ｌｅｕを形成するために、Ｔβ４の６位のメチオニンをアミノ酸のロイシンに置換する工程を含む、請求項９に定義されたペプチドＴβ４ｌｅｕを形成する方法。
【公表番号】特表２００８−５２６９７８（Ｐ２００８−５２６９７８Ａ）
【公表日】平成２０年７月２４日（２００８．７．２４）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００７−５５１３８１（Ｐ２００７−５５１３８１）
【出願日】平成１８年１月１７日（２００６．１．１７）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００６／００１１４１
【国際公開番号】ＷＯ２００６／０７６５２３
【国際公開日】平成１８年７月２０日（２００６．７．２０）
【出願人】（５０３３３４７６９）リジェナークス・バイオファーマスーティカルズ・インコーポレイテッド (16)
【出願人】（５０７２３９５９２）フリードリヒ−アレクサンダー−ウニベルジテート・エアランゲン−ニュルンベルク (7)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２０年７月２４日（２００８．７．２４）
【国際特許分類】
【出願日】平成１８年１月１７日（２００６．１．１７）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００６／００１１４１
【国際公開番号】ＷＯ２００６／０７６５２３
【国際公開日】平成１８年７月２０日（２００６．７．２０）
【出願人】（５０３３３４７６９）リジェナークス・バイオファーマスーティカルズ・インコーポレイテッド (16)
【出願人】（５０７２３９５９２）フリードリヒ−アレクサンダー−ウニベルジテート・エアランゲン−ニュルンベルク (7)
【Ｆターム（参考）】
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