改良された抗体分子を含有する製剤
【課題】改変された抗IL6レセプター抗体を含有する安定な高濃度液体製剤の提供。
【解決手段】ヒト化抗IL-6レセプターIgG1抗体であるトシリズマブの可変領域および定常領域のアミノ酸配列を改変することで、抗原中和能を増強させつつ、薬物動態を向上させた第2世代の抗体、及びヒスチジン緩衝液および／またはクエン酸緩衝液にアルギニン等の塩基性アミノ酸、ショ糖またはトレハロースなどの糖質、さらに界面活性剤を含むこと安定化した、投与頻度を少なくし持続的に治療効果を発揮し、且つ、免疫原性、安全性、物理化学的性質（安定性および均一性）を向上した製剤。
【解決手段】ヒト化抗IL-6レセプターIgG1抗体であるトシリズマブの可変領域および定常領域のアミノ酸配列を改変することで、抗原中和能を増強させつつ、薬物動態を向上させた第2世代の抗体、及びヒスチジン緩衝液および／またはクエン酸緩衝液にアルギニン等の塩基性アミノ酸、ショ糖またはトレハロースなどの糖質、さらに界面活性剤を含むこと安定化した、投与頻度を少なくし持続的に治療効果を発揮し、且つ、免疫原性、安全性、物理化学的性質（安定性および均一性）を向上した製剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ポリペプチドおよび／または抗体を含有する製剤、特に、改変された抗IL6レセプター抗体を含有する安定な高濃度液体製剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、様々な抗体製剤が開発され実際に使用されている。これらの製剤の多くは、静脈注射に使用されている。皮下投与では1回の投与当たりの抗体量が大きく（約100 mg〜200 mg）、皮下注射のための容量は一般に制限されるため、皮下注射用の抗体含有製剤を設計するためには、液体中の抗体濃度を増加させることが必要である。
【０００３】
高濃度の抗体を含有する溶液では、不溶性凝集物および／または可溶性凝集物の形成を含む、望ましくない分解が起こる。それらの不溶性凝集物および可溶性凝集物は、抗体分子の会合により、液体状態において形成される可能性が高い。液体製剤が長期間貯蔵された場合、アスパラギン残基の脱アミドにより、抗体分子の生理活性が失われるか、または低下することがある。凍結および融解のサイクルも、分解された抗体分子および凝集した抗体分子の形成を引き起こす。
【０００４】
製剤を長期間貯蔵した後でも、活性成分の低減が抑えられている、安定化された製剤を提供するため、様々な概念が提唱されている。そのような製剤は、緩衝溶液中に活性成分および様々な添加剤を溶解させることにより得られる。長期保管中の二量体形成および脱アミド化が阻害されており、安定であり、かつ皮下投与において使用するのに適当な、高濃度抗体含有製剤を提供する必要がある。
【０００５】
抗体は血漿中での安定性が高く、副作用も少ないことから医薬として注目されている。中でもIgG型の抗体医薬は多数上市されており、現在も数多くの抗体医薬が開発されている（非特許文献1、非特許文献2）。IL-6は様々な自己免疫疾患、炎症性疾患、悪性腫瘍等に関与するサイトカインであり（非特許文献3）、ヒト化抗IL-6レセプターIgG1抗体であるトシリズマブはIL-6レセプターに特異的に結合する。トシリズマブはIL-6の生物学的作用を中和することで、関節リウマチ等のIL-6が関連する疾患の治療薬として利用可能であると考えられている（特許文献1〜3、非特許文献4）。トシリズマブは、日本においてはキャッスルマン病および関節リウマチの治療薬として承認されている（非特許文献5）。
【０００６】
トシリズマブなどのヒト化抗体は第1世代の抗体医薬であり、第1世代の抗体医薬を改良して効力、利便性、およびコストを改善した第2世代の抗体医薬が現在開発されている。第2世代の抗体医薬に適用可能な技術として様々な技術が開発されており、エフェクター機能、抗原結合能、薬物動態、安定性を向上させる、あるいは、免疫原性リスクを低減させる技術等が報告されている。効力を増強させる、あるいは、投与量を低減させる方法として、IgG抗体のFc領域のアミノ酸置換により抗体依存性細胞障害活性（ADCC活性）や補体依存性細胞障害活性（CDC活性）を増強させる技術が報告されている（非特許文献6）。また、抗原結合能、抗原中和能を増強させる技術として、アフィニティーマチュレーション技術（非特許文献7）が報告されており、可変領域の相補性決定領域（CDR）などのアミノ酸に変異を導入することで抗原への結合活性を増強することが可能である。抗原結合能の増強によりインビトロの生物活性を向上させる、あるいは投与量を低減することが可能であり、さらにインビボでの効力を向上させることも可能である（非特許文献8）。現在、抗RSV抗体の第1世代薬であるパリビズマブより優れた効果を発揮するとされるモタビズマブ（アフィニティーマチュレーションにより作製）の臨床試験が行われている（非特許文献9）。抗IL-6レセプター抗体においてはアフィニティーが約0.05 nMの抗体（すなわち、トシリズマブよりアフィニティーが強いとされる）が報告されているが（特許文献4）、0.05 nMより強いアフィニティーを有するヒト抗体あるいはヒト化抗体あるいはキメラ抗体の報告は無い。
【０００７】
現在の抗体医薬が抱える問題として、投与タンパク量が非常に多いことによる高い製造コストが挙げられる。ヒト化抗IL-6レセプターIgG1抗体であるトシリズマブにおいても投与量は8 mg/kg/月程度の静脈内注射が想定されている（非特許文献4）。また投与形態については、慢性的な自己免疫疾患の場合は皮下投与製剤が望ましいとされている。一般的に皮下投与製剤は高濃度製剤であることが必要であり、IgGタイプの抗体製剤の場合、安定性等の点から一般的には100 mg/mL程度の製剤が限度であると考えられる（非特許文献10）。持続的な治療効果を発揮できるよう抗体の血漿中半減期を長くすることで投与タンパク量を小さくし、高い安定性を付与することによって、長い投与間隔での皮下投与を可能にし、低コスト且つ利便性の高い第2世代の抗体医薬を提供することが可能である。
【０００８】
抗体の薬物動態にはFcRnが大きく関与しており、抗体のアイソタイプ間の血漿中半減期の違いに関しては、IgG1およびIgG2が最も血漿中半減期に優れ、IgG3およびIgG4がそれより劣ることが知られている（非特許文献11）。血漿中半減期に優れるIgG1およびIgG2の抗体の血漿中半減期をさらに向上させる方法として、FcRnへの結合を増強する定常領域のアミノ酸置換が報告されている（非特許文献12、13）。また、免疫原性の観点からは定常領域よりも可変領域のアミノ酸置換により血漿中半減期をさらに向上させるほうが望ましいが（特許文献5）、これまで可変領域を改変することによりIL-6レセプター抗体の血漿中半減期を向上させた報告は無い。
【０００９】
バイオ医薬を開発するにあたってもう一つの重要な問題は免疫原性である。一般的にマウス抗体はヒト化することによって免疫原性が低減される。ヒト化する際のテンプレートフレームワークに生殖系配列を用いることにより、免疫原性のリスクはさらに軽減できるとされている（非特許文献14）。しかしながら、完全ヒト抗TNF抗体であるアダリムマブであっても13〜17％と高頻度で免疫原性が出現し、免疫原性が出現した患者においては治療効果の低減が見られている（非特許文献15、16）。ヒト抗体であってもCDRにT細胞エピトープが存在する可能性があり、CDR上のT細胞エピトープが免疫原性の原因となっている可能性がある。T細胞エピトープをインシリコあるいはインビボで予測する方法が報告されているが（非特許文献17、18）、これらの方法を用いて予測されるT細胞エピトープを除去することで、免疫原性リスクを低減することが可能であると考えられる（非特許文献19）。
【００１０】
ヒト化抗IL-6レセプターIgG1抗体であるトシリズマブは、マウスPM1抗体をヒト化したIgG1抗体である。H鎖、L鎖それぞれNEW、REIのヒト配列をテンプレートフレームワークとして用いてCDRグラフティングが行われているが、活性保持に重要なアミノ酸として5アミノ酸がマウス配列としてフレームワークに残存している（非特許文献20）。これまでヒト化抗体であるトシリズマブのフレームワークに残存するマウス配列を活性を低下させること無く完全ヒト化した報告は無い。また、トシリズマブのCDR配列はマウス配列であり、アダリムマブ同様、CDRにT細胞エピトープが存在する可能性があり、免疫原性のリスクは否定できない。トシリズマブの臨床試験において、有効量である8 mg/kgにおいて抗トシリズマブ抗体の出現は認められていないが、4 mg/kgおよび2 mg/kgにおいては該抗体が認められている（特許文献6）。このことから、トシリズマブの免疫原性については改善の余地があると考えられる。しかしながら、アミノ酸置換によりトシリズマブの免疫原性リスクを低減することに関する報告は無かった。
【００１１】
トシリズマブのアイソタイプはIgG1であるが、アイソタイプの違いはすなわち定常領域の配列の違いであり、定常領域の配列はエフェクター機能、薬物動態、物性等に大きく影響を与えると考えられていることから、抗体医薬の開発にとって定常領域の配列の選択は極めて重要である（非特許文献11）。近年、抗体医薬の安全性が非常に重要視されており、TGN1412のPhaseI臨床試験で見られた重大な副作用の原因の一つとして、抗体のFc部分とFcγレセプターの相互作用（エフェクター機能）が考えられている（非特許文献21）。抗原の生物学的作用を中和することが目的の抗体医薬においては、ADCC等のエフェクター機能に重要なFcγレセプターへの結合は不必要であり、副作用の点から考えるとFcγレセプターへの結合はむしろ好ましくない可能性も考えられる。Fcγレセプターへの結合を低下させる方法としては、IgG抗体のアイソタイプをIgG1からIgG2あるいはIgG4に変える方法があるが（非特許文献22）、FcγレセプターIへの結合および薬物動態の観点からはIgG4よりはIgG2が望ましいと考えられる（非特許文献11）。トシリズマブのアイソタイプはIgG1であり、IL-6レセプター中和抗体であることから、ADCC等のエフェクター機能は必要とせず副作用の可能性を考えた場合、アイソタイプはIgG2が望ましい可能性も考えられる。
【００１２】
一方、抗体医薬を開発するにあたり、そのタンパク質の物理化学的性質、中でも均一性と安定性は極めて重要であり、IgG2アイソタイプは、ヒンジ領域のジスルフィド結合に由来する有意な不均一性が存在することが報告されている（非特許文献23）。ジスルフィド結合に由来する目的物質/関連物質の不均一性の製造間差を維持しつつ医薬として大量に製造することは容易ではなくコスト増につながる。したがって、可能な限り単一物質であることが望まれる。さらに抗体重鎖のC末端配列の不均一性として、C末端アミノ酸のリジン残基の欠損、および、C末端の二つのアミノ酸であるグリシン、リジン両方の欠損によるC末端カルボキシル基のアミド化が報告されている（非特許文献24）。IgG2アイソタイプの抗体を医薬として開発する上には高い安定性を維持しつつこれらの不均一性が低減されていることが望ましい。利便性に優れた安定な高濃度の皮下投与製剤を作製するためには、安定性が高いだけでなく、血漿中半減期に関してもトシリズマブのアイソタイプであるIgG1よりも優れていることが望ましい。しかしながら、これまでにIgG2アイソタイプの定常領域の抗体に関する不均一性が低減され、高い安定性を有し、IgG1アイソタイプの定常領域の抗体よりも優れた血漿中半減期を有する定常領域の配列の報告はない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１３】
【特許文献１】WO 92/19759
【特許文献２】WO 96/11020
【特許文献３】WO 96/12503
【特許文献４】WO 2007/143168
【特許文献５】WO 2007/114319
【特許文献６】WO 2004/096273
【非特許文献】
【００１４】
【非特許文献１】Janice M Reichert, Clark J Rosensweig, Laura B Faden & Matthew C Dewitz, Monoclonal antibody successes in the clinic, Nature Biotechnology 23, 1073 - 1078 (2005)
【非特許文献２】Pavlou AK, Belsey MJ., The therapeutic antibodies market to 2008., Eur J Pharm Biopharm. 2005 Apr;59(3):389-96.
【非特許文献３】Nishimoto N, Kishimoto T., Interleukin 6: from bench to bedside., Nat Clin Pract Rheumatol. 2006 Nov;2(11):619-26.
【非特許文献４】Maini RN, Taylor PC, Szechinski J, Pavelka K, Broll J, Balint G, Emery P, Raemen F, Petersen J, Smolen J, Thomson D, Kishimoto T; CHARISMA Study Group., Double-blind randomized controlled clinical trial of the interleukin-6 receptor antagonist, Tocilizumab, in European patients with rheumatoid arthritis who had an incomplete response to methotrexate., Arthritis Rheum. 2006 Sep;54(9):2817-29
【非特許文献５】Nishimoto N, Kanakura Y, Aozasa K, Johkoh T, Nakamura M, Nakano S, Nakano N, Ikeda Y, Sasaki T, Nishioka K, Hara M, Taguchi H, Kimura Y, Kato Y, Asaoku H, Kumagai S, Kodama F, Nakahara H, Hagihara K, Yoshizaki K, Kishimoto T. Humanized anti-interleukin-6 receptor antibody treatment of multicentric Castleman disease. Blood. 2005 Oct 15;106(8):2627-32.
【非特許文献６】Kim SJ, Park Y, Hong HJ., Antibody engineering for the development of therapeutic antibodies., Mol Cells. 2005 Aug 31;20(1):17-29. Review.
【非特許文献７】Rothe A, Hosse RJ, Power BE. Ribosome display for improved biotherapeutic molecules. Expert Opin Biol Ther. 2006 Feb;6(2):177-87.
【非特許文献８】Rajpal A, Beyaz N, Haber L, Cappuccilli G, Yee H, Bhatt RR, Takeuchi T, Lerner RA, Crea R., A general method for greatly improving the affinity of antibodies by using combinatorial libraries., Proc Natl Acad Sci U S A. 2005 Jun 14;102(24):8466-71. Epub 2005 Jun 6.
【非特許文献９】Wu H, Pfarr DS, Johnson S, Brewah YA, Woods RM, Patel NK, White WI, Young JF, Kiener PA. Development of Motavizumab, an Ultra-potent Antibody for the Prevention of Respiratory Syncytial Virus Infection in the Upper and Lower Respiratory Tract. J Mol Biol. 2007, 368, 652-665
【非特許文献１０】Shire SJ, Shahrokh Z, Liu J. Challenges in the development of high protein concentration formulations. J Pharm Sci. 2004 Jun;93(6):1390-402.
【非特許文献１１】Salfeld JG. Isotype selection in antibody engineering.Nat Biotechnol. 2007 Dec;25(12):1369-72.
【非特許文献１２】Hinton PR, Xiong JM, Johlfs MG, Tang MT, Keller S, Tsurushita N., An engineered human IgG1 antibody with longer serum half-life., J Immunol. 2006 Jan 1;176(1):346-56
【非特許文献１３】Ghetie V, Popov S, Borvak J, Radu C, Matesoi D, Medesan C, Ober RJ, Ward ES., Increasing the serum persistence of an IgG fragment by random mutagenesis., Nat Biotechnol. 1997 Jul;15(7):637-40
【非特許文献１４】Hwang WY, Almagro JC, Buss TN, Tan P, Foote J. Use of human germline genes in a CDR homology-based approach to antibody humanization.Methods. 2005 May;36(1):35-42
【非特許文献１５】Bartelds GM, Wijbrandts CA, Nurmohamed MT, Stapel S, Lems WF, Aarden L, Dijkmans BA, Tak P, Wolbink GJ. Clinical response to adalimumab: The relationship with anti-adalimumab antibodies and serum adalimumab concentrations in rheumatoid arthritis. Ann Rheum Dis. 2007 Mar 9; [Epub ahead of print]
【非特許文献１６】Bender NK, Heilig CE, Droll B, Wohlgemuth J, Armbruster FP, Heilig B. Immunogenicity, efficacy and adverse events of adalimumab in RA patients. Rheumatol Int. 2007 Jan;27(3):269-74.
【非特許文献１７】Van Walle I, Gansemans Y, Parren PW, Stas P, Lasters I. Immunogenicity screening in protein drug development.Expert Opin Biol Ther. 2007 Mar;7(3):405-18.
【非特許文献１８】Jones TD, Phillips WJ, Smith BJ, Bamford CA, Nayee PD, Baglin TP, Gaston JS, Baker MP. Identification and removal of a promiscuous CD4+ T cell epitope from the C1 domain of factor VIII. J Thromb Haemost. 2005 May;3(5):991-1000.
【非特許文献１９】Chirino AJ, Ary ML, Marshall SA. Minimizing the immunogenicity of protein therapeutics. Drug Discov Today. 2004 Jan 15;9(2):82-90.
【非特許文献２０】Sato K, Tsuchiya M, Saldanha J, Koishihara Y, Ohsugi Y, Kishimoto T, Bendig MM. Reshaping a human antibody to inhibit the interleukin 6-dependent tumor cell growth. Cancer Res. 1993 Feb 15;53(4):851-6.
【非特許文献２１】Strand V, Kimberly R, Isaacs JD. Biologic therapies in rheumatology: lessons learned future directions. Nat Rev Drug Discov. 2007 Jan;6(1):75-92.
【非特許文献２２】Gessner JE, Heiken H, Tamm A, Schmidt RE. The IgG Fc receptor family. Ann Hematol. 1998 Jun;76(6):231-48.
【非特許文献２３】Dillon TM, Ricci MS, Vezina C, Flynn GC, Liu YD, Rehder DS, Plant M, Henkle B, Li Y, Deechongkit S, Varnum B, Wypych J, Balland A, Bondarenko PV. Structural and functional characterization of disulfide isoforms of the human IgG2 subclass. J Biol Chem. 2008 Jun 6;283(23):16206-15.
【非特許文献２４】Johnson KA, Paisley-Flango K, Tangarone BS, Porter TJ, Rouse JC. Cation exchange-HPLC and mass spectrometry reveal C-terminal amidation of an IgG1 heavy chain. Anal Biochem. 2007 Jan 1;360(1):75-83.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１５】
本発明の目的は、ヒト化抗IL-6レセプターIgG1抗体であるトシリズマブの可変領域および定常領域のアミノ酸配列を改変することで、抗原中和能を増強させつつ、薬物動態を向上させることで投与頻度を少なくし持続的に治療効果を発揮し、且つ、免疫原性、安全性、物理化学的性質（安定性および均一性）を向上させ、トシリズマブより優れた第2世代の分子からなる製剤（以下本明細書では、「薬剤」または「医薬組成物」と記載する場合もある）を提供することにある。
【００１６】
さらに、本発明は、長期保管または複数回の凍結／融解サイクルの間の二量体化および脱アミドが阻害されており、安定であり、かつ、好ましくは、皮下投与において使用するのに適当な、高濃度ポリペプチドおよび／または抗体含有製剤を提供する。
【００１７】
前記の問題を解決するために精力的な研究を実施し、安定剤としてアミノ酸アルギニンまたはその塩を溶液に添加することにより、安定な高濃度ポリペプチドおよび／または抗体含有製剤を得られることを発見した。
【００１８】
以下、本発明を詳細に説明する。第1世代のヒト化抗IL-6レセプターIgG1抗体トシリズマブより優れている第2世代の分子を鑑みて、安定な製剤を得ることに研究の焦点を置いた。その結果、当該抗体に関して、本発明者らは、トシリズマブの可変領域において、抗原への結合能（アフィニティー）を改良するCDR変異を複数発見した。このことにより、本発明者らは、そのような変異の組み合わせにより大幅にアフィニティーを向上させることに成功した。また本発明者らは、可変領域配列の等電点を低下させる改変を導入することで薬物動態を向上させることに成功した。また本発明者らは、抗原であるIL-6レセプターへの結合にpH依存性を付与することで1分子の抗体で複数回抗原を中和することを可能にし、薬物動態を向上させることに成功した。また本発明者らは、トシリズマブのフレームワークに残存するマウス由来の配列を完全ヒト化し、可変領域においてインシリコで予測されたT細胞エピトープペプチドの数を低減させることで、免疫原性リスクを低減させることに成功した。さらに本発明者らは、トシリズマブの定常領域において、安全性を向上させるためにFcγレセプターへの結合をIgG1よりも低下させ、IgG1よりも薬物動態を向上させ、さらにIgG2のヒンジ領域のジスルフィド結合に由来する不均一性およびH鎖C末端に由来する不均一性を、安定性を低下させることなく低減させた、新規な定常領域配列を見出すことに成功した。これらCDR領域アミノ酸配列の改変、可変領域アミノ酸配列の改変、定常領域アミノ酸配列の改変を適切に組み合わせることでトシリズマブより優れた第2世代の分子の創製に成功した。
【００１９】
本発明は、ヒト化抗IL-6レセプターIgG1抗体であるトシリズマブの可変領域および定常領域のアミノ酸配列の改変により、より優れた抗原（IL-6レセプター）への結合能を有し、より優れた薬物動態を有し、より優れた安全性および物性（安定性、均一性）を有し、かつ免疫原性リスクが低減された、ヒト化抗IL-6レセプターIgG抗体からなる製剤、並びに、それらの医薬組成物の製造方法に関する。より具体的には、下記〔1〕〜〔27〕を提供するものである。
〔1〕（a）配列番号：1（VH4-M73のCDR1）の配列を含むCDR1、配列番号：2（VH4-M73のCDR2）の配列を含むCDR2、および配列番号：3（VH4-M73のCDR3）の配列を含むCDR3を含む、ポリペプチド；
（b）配列番号：4（VH3-M73のCDR1）の配列を含むCDR1、配列番号：5（VH3-M73のCDR2）の配列を含むCDR2、および配列番号：6（VH3-M73のCDR3）の配列を含むCDR3を含む、ポリペプチド；
（c）配列番号：7（VH5-M83のCDR1）の配列を含むCDR1、配列番号：8（VH5-M83のCDR2）の配列を含むCDR2、および配列番号：9（VH5-M83のCDR3）の配列を含むCDR3を含む、ポリペプチド；
（d）配列番号：10（VL1のCDR1）の配列を含むCDR1、配列番号：11（VL1のCDR2）の配列を含むCDR2、および配列番号：12（VL1のCDR3）の配列を含むCDR3を含む、ポリペプチド；
（e）配列番号：13（VL3のCDR1）の配列を含むCDR1、配列番号：14（VL3のCDR2）の配列を含むCDR2、および配列番号：15（VL3のCDR3）の配列を含むCDR3を含む、ポリペプチド；ならびに
（f）配列番号：16（VL5のCDR1）の配列を含むCDR1、配列番号：17（VL5のCDR2）の配列を含むCDR2、および配列番号：18（VL5のCDR3）の配列を含むCDR3を含む、ポリペプチド
より選択される少なくとも一つのポリペプチドを含む、製剤。
〔2〕（a）配列番号：1（VH4-M73のCDR1）の配列を含むCDR1、配列番号：2（VH4-M73のCDR2）の配列を含むCDR2、および配列番号：3（VH4-M73のCDR3）の配列を含むCDR3を含む重鎖可変領域、ならびに配列番号：10（VL1のCDR1）の配列を含むCDR1、配列番号：11（VL1のCDR2）の配列を含むCDR2、および配列番号：12（VL1のCDR3）の配列を含むCDR3を含む軽鎖可変領域を含む、抗体；
（b）配列番号：4（VH3-M73のCDR1）の配列を含むCDR1、配列番号：5（VH3-M73のCDR2）の配列を含むCDR2、および配列番号：6（VH3-M73のCDR3）の配列を含むCDR3を含む重鎖可変領域、ならびに配列番号：13（VL3のCDR1）の配列を含むCDR1、配列番号：14（VL3のCDR2）の配列を含むCDR2、および配列番号：15（VL3のCDR3）の配列を含むCDR3を含む軽鎖可変領域を含む、抗体；
（c）配列番号：7（VH5-M83のCDR1）の配列を含むCDR1、配列番号：8（VH5-M83のCDR2）の配列を含むCDR2、および配列番号：9（VH5-M83のCDR3）の配列を含むCDR3を含む重鎖可変領域、ならびに配列番号：16（VL5のCDR1）の配列を含むCDR1、配列番号：17（VL5のCDR2）の配列を含むCDR2、および配列番号：18（VL5のCDR3）の配列を含むCDR3を含む軽鎖可変領域を含む、抗体；
（d）配列番号：19（VH4-M73の可変領域）の配列を含む重鎖可変領域および配列番号：22（VL1の可変領域）の配列を含む軽鎖可変領域を含む、抗体；
（e）配列番号：20（VH3-M73の可変領域）の配列を含む重鎖可変領域および配列番号：23（VL3の可変領域）の配列を含む軽鎖可変領域を含む、抗体；
（f）配列番号：21（VH5-M83の可変領域）の配列を含む重鎖可変領域および配列番号：24（VL5の可変領域）の配列を含む軽鎖可変領域を含む、抗体；
（g）配列番号：25（VH4-M73）の配列を含む重鎖および配列番号：28（VL1）の配列を含む軽鎖を含む、抗体；
（h）配列番号：26（VH3-M73）の配列を含む重鎖および配列番号：29（VL3）の配列を含む軽鎖を含む、抗体；ならびに
（i）配列番号：27（VH5-M83）の配列を含む重鎖および配列番号：30（VL5）の配列を含む軽鎖を含む、抗体
より選択される少なくとも一つの抗体を含む、製剤。
〔3〕ヒスチジン緩衝液および／またはクエン酸緩衝液を含む、〔1〕または〔2〕に記載の安定な製剤。
〔4〕少なくとも一つの塩基性アミノ酸を含む、〔1〕〜〔3〕のいずれか一項記載の安定な製剤。
〔5〕1〜500mMのヒスチジン緩衝液および／またはクエン酸緩衝液、1〜1500mMの少なくとも一つの塩基性アミノ酸、1〜200mg/mLの抗体、ならびに1〜400mMの糖質を含む、〔1〕〜〔4〕のいずれか一項記載の安定な製剤。
〔6〕塩基性アミノ酸がアルギニンである、〔4〕または〔5〕に記載の製剤。
〔7〕糖質がショ糖またはトレハロースである、〔5〕または〔6〕に記載の製剤。
〔8〕界面活性剤をさらに含む、〔1〕〜〔7〕のいずれか一項記載の製剤。
〔9〕少なくとも10 mg/mlの量のポリペプチドおよび／または抗体を含有する、〔1〕〜〔8〕のいずれか一項記載の製剤。
〔10〕少なくとも50 mg/mlの量のポリペプチドおよび／または抗体を含有する、〔1〕〜〔9〕のいずれか一項記載の製剤。
〔11〕少なくとも80 mg/mlの量のポリペプチドおよび／または抗体を含有する、〔1〕〜〔10〕のいずれか一項記載の製剤。
〔12〕240 mg/ml以下の量のポリペプチドおよび／または抗体を含有する、〔1〕〜〔11〕のいずれか一項記載の製剤。
〔13〕4.5〜7.0の範囲のpHを有する、〔1〕〜〔12〕のいずれか一項記載の製剤。
〔14〕5.5〜6.6の範囲のpHを有する、〔13〕に記載の製剤。
〔15〕液体である、〔1〕〜〔14〕のいずれか一項記載の製剤。
〔16〕調製の間に凍結乾燥に供されていない、〔15〕に記載の製剤。
〔17〕ポリペプチド分子および／または抗体分子の二量体化が低下している、〔1〕〜〔16〕のいずれか一項記載の製剤。
〔18〕ポリペプチド分子および／または抗体分子の二量体化が阻害されている、〔1〕〜〔17〕のいずれか一項記載の製剤。
〔19〕皮下投与用の〔1〕〜〔18〕のいずれか一項記載の製剤。
〔20〕少なくとも一つの塩基性アミノ酸を添加する工程を含む、抗体を含有する溶液を安定化する方法であって、抗体が、
（a）配列番号：1（VH4-M73のCDR1）の配列を含むCDR1、配列番号：2（VH4-M73のCDR2）の配列を含むCDR2、および配列番号：3（VH4-M73のCDR3）の配列を含むCDR3を含む重鎖可変領域、ならびに配列番号：10（VL1のCDR1）の配列を含むCDR1、配列番号：11（VL1のCDR2）の配列を含むCDR2、および配列番号：12（VL1のCDR3）の配列を含むCDR3を含む軽鎖可変領域を含む、抗体；
（b）配列番号：4（VH3-M73のCDR1）の配列を含むCDR1、配列番号：5（VH3-M73のCDR2）の配列を含むCDR2、および配列番号：6（VH3-M73のCDR3）の配列を含むCDR3を含む重鎖可変領域、ならびに配列番号：13（VL3のCDR1）の配列を含むCDR1、配列番号：14（VL3のCDR2）の配列を含むCDR2、および配列番号：15（VL3のCDR3）の配列を含むCDR3を含む軽鎖可変領域を含む、抗体；
（c）配列番号：7（VH5-M83のCDR1）の配列を含むCDR1、配列番号：8（VH5-M83のCDR2）の配列を含むCDR2、および配列番号：9（VH5-M83のCDR3）の配列を含むCDR3を含む重鎖可変領域、ならびに配列番号：16（VL5のCDR1）の配列を含むCDR1、配列番号：17（VL5のCDR2）の配列を含むCDR2、および配列番号：18（VL5のCDR3）の配列を含むCDR3を含む軽鎖可変領域を含む、抗体；
（d）配列番号：19（VH4-M73の可変領域）の配列を含む重鎖可変領域および配列番号：22（VL1の可変領域）の配列を含む軽鎖可変領域を含む、抗体；
（e）配列番号：20（VH3-M73の可変領域）の配列を含む重鎖可変領域および配列番号：23（VL3の可変領域）の配列を含む軽鎖可変領域を含む、抗体；
（f）配列番号：21（VH5-M83の可変領域）の配列を含む重鎖可変領域および配列番号：24（VL5の可変領域）の配列を含む軽鎖可変領域を含む、抗体；
（g）配列番号：25（VH4-M73）の配列を含む重鎖および配列番号：28（VL1）の配列を含む軽鎖を含む、抗体；
（h）配列番号：26（VH3-M73）の配列を含む重鎖および配列番号：29（VL3）の配列を含む軽鎖を含む、抗体；ならびに
（i）配列番号：27（VH5-M83）の配列を含む重鎖および配列番号：30（VL5）の配列を含む軽鎖を含む、抗体
より選択される少なくとも一つの抗体である、方法。
〔21〕少なくとも一つの塩基性アミノ酸を添加する工程を含む、抗体を含有する溶液の凍結／融解サイクルの間、抗体を安定化する方法であって、抗体が、
（a）配列番号：1（VH4-M73のCDR1）の配列を含むCDR1、配列番号：2（VH4-M73のCDR2）の配列を含むCDR2、および配列番号：3（VH4-M73のCDR3）の配列を含むCDR3を含む重鎖可変領域、ならびに配列番号：10（VL1のCDR1）の配列を含むCDR1、配列番号：11（VL1のCDR2）の配列を含むCDR2、および配列番号：12（VL1のCDR3）の配列を含むCDR3を含む軽鎖可変領域を含む、抗体；
（b）配列番号：4（VH3-M73のCDR1）の配列を含むCDR1、配列番号：5（VH3-M73のCDR2）の配列を含むCDR2、および配列番号：6（VH3-M73のCDR3）の配列を含むCDR3を含む重鎖可変領域、ならびに配列番号：13（VL3のCDR1）の配列を含むCDR1、配列番号：14（VL3のCDR2）の配列を含むCDR2、および配列番号：15（VL3のCDR3）の配列を含むCDR3を含む軽鎖可変領域を含む、抗体；
（c）配列番号：7（VH5-M83のCDR1）の配列を含むCDR1、配列番号：8（VH5-M83のCDR2）の配列を含むCDR2、および配列番号：9（VH5-M83のCDR3）の配列を含むCDR3を含む重鎖可変領域、ならびに配列番号：16（VL5のCDR1）の配列を含むCDR1、配列番号：17（VL5のCDR2）の配列を含むCDR2、および配列番号：18（VL5のCDR3）の配列を含むCDR3を含む軽鎖可変領域を含む、抗体；
（d）配列番号：19（VH4-M73の可変領域）の配列を含む重鎖可変領域および配列番号：22（VL1の可変領域）の配列を含む軽鎖可変領域を含む、抗体；
（e）配列番号：20（VH3-M73の可変領域）の配列を含む重鎖可変領域および配列番号：23（VL3の可変領域）の配列を含む軽鎖可変領域を含む、抗体；
（f）配列番号：21（VH5-M83の可変領域）の配列を含む重鎖可変領域および配列番号：24（VL5の可変領域）の配列を含む軽鎖可変領域を含む、抗体；
（g）配列番号：25（VH4-M73）の配列を含む重鎖および配列番号：28（VL1）の配列を含む軽鎖を含む、抗体；
（h）配列番号：26（VH3-M73）の配列を含む重鎖および配列番号：29（VL3）の配列を含む軽鎖を含む、抗体；ならびに
（i）配列番号：27（VH5-M83）の配列を含む重鎖および配列番号：30（VL5）の配列を含む軽鎖を含む、抗体
より選択される少なくとも一つの抗体である、方法。
【００２０】
上記のヒト化抗IL-6レセプターIgG抗体は、増強された効力および向上された薬物動態を有し；従って、より少ない投与頻度で、長時間治療効果を発揮することができる。
【図面の簡単な説明】
【００２１】
【図１】トシリズマブのIL-6レセプターへのアフィニティーを向上させる変異部位のリストである。トシリズマブのHCDR2配列を配列番号：81；HCDR2の変異後配列（上段）を配列番号：82；HCDR2の変異後配列（下段）を配列番号：83；トシリズマブのHCDR3配列を配列番号：84；HCDR3の変異後配列（上段）を配列番号：85；HCDR3の変異後配列（下段）を配列番号：86；トシリズマブのLCDR1配列を配列番号：87；LCDR1の変異後配列（上段）を配列番号：88；LCDR1の変異後配列（下段）を配列番号：89；トシリズマブのLCDR3配列を配列番号：90；LCDR3の変異後配列（上段）を配列番号：91；LCDR3の変異後配列（下段）を配列番号：92に示す。
【図２】トシリズマブおよびRDC-23のBaF/gp130における中和活性を示すグラフである。
【図３】トシリズマブのIL-6レセプターへの結合を大きく低下させることなく、可変領域の等電点を低下させることができる変異部位のリストである。図中の星印は、等電点には影響しないが、ヒト配列への変換のために変異させられた部位である。トシリズマブのHFR1配列を配列番号：93；HFR1の変異後配列を配列番号：94；トシリズマブのHCDR1配列を配列番号：95；HCDR1の変異後配列を配列番号：96；トシリズマブのHFR2配列を配列番号：97；HFR2の変異後配列を配列番号：98；トシリズマブのHCDR2配列を配列番号：81；HCDR2の変異後配列を配列番号：99；トシリズマブのHFR4配列を配列番号：100；HFR4の変異後配列を配列番号：101；トシリズマブのLFR1配列を配列番号：102；LFR1の変異後配列を配列番号：103；トシリズマブのLCDR1配列を配列番号：87；LCDR1の変異後配列を配列番号：104；トシリズマブのLFR2配列を配列番号：105；LFR2の変異後配列を配列番号：106；トシリズマブのLCDR2配列を配列番号：107；LCDR2の変異後配列を配列番号：108および109；トシリズマブのLFR3配列を配列番号：110；LFR3の変異後配列を配列番号：111；トシリズマブのLFR4配列を配列番号：112；LFR4の変異後配列を配列番号：113に示す。
【図４】トシリズマブおよびH53/L28のBaF/gp130における中和活性を示すグラフである。
【図５】マウスにおける静脈内投与後のトシリズマブおよびH53/L28の血漿中濃度の推移を示すグラフである。
【図６】マウスにおける皮下投与後のトシリズマブおよびH53/L28の血漿中濃度の推移を示すグラフである。
【図７】IgG分子が、エンドソーム内で膜型抗原から解離することにより、他の抗原に再結合し得ることを示す模式図である。
【図８】トシリズマブのIL-6レセプターへの結合にpH依存性（pH7.4で結合し、pH5.8で解離する）を付与することができる変異部位のリストである。トシリズマブのHFR1配列を配列番号：93；HFR1の変異後配列を配列番号：114；トシリズマブのHCDR1配列を配列番号：95；HCDR1の変異後配列を配列番号：115；トシリズマブのLCDR1配列を配列番号：87；LCDR1の変異後配列を配列番号：116；トシリズマブのLCDR2配列を配列番号：107；LCDR2の変異後配列を配列番号：117に示す。
【図９】トシリズマブおよびH3pI/L73のBaF/gp130における中和活性を示すグラフである。
【図１０】カニクイザルにおける静脈内投与後のトシリズマブおよびH3pI/L73の血漿中濃度の推移を示すグラフである。
【図１１】ヒトIL-6レセプタートランスジェニックマウスにおける静脈内投与後のトシリズマブおよびH3pI/L73の血漿中濃度の推移を示すグラフである。
【図１２】陽イオン交換クロマトグラフィーによる、トシリズマブ、トシリズマブΔK、およびトシリズマブΔGKのC末端に由来する不均一性の評価の結果を示す図である。
【図１３】陽イオン交換クロマトグラフィーによる、トシリズマブ-IgG1、トシリズマブ-IgG2、およびトシリズマブ-SKSCのジスルフィド結合に由来する不均一性の評価の結果を示す図である。
【図１４】示差走査熱量測定（DSC）により得られたトシリズマブ-IgG1、トシリズマブ-IgG2、およびトシリズマブ-SKSCの変性曲線、ならびに各FabドメインのTm値を示す図である。
【図１５】ヒトFcRnトランスジェニックマウスにおける静脈内投与後のトシリズマブ-IgG1、トシリズマブ-M44、トシリズマブ-M58、およびトシリズマブ-M73の血漿中濃度の推移を示すグラフである。
【図１６】トシリズマブ、対照、およびFv5-M83のBaF/gp130における中和活性を示す図である。
【図１７】トシリズマブ、Fv3-M73、およびFv4-M73のBaF/gp130における中和活性を示すグラフである。
【図１８】カニクイザルにおける静脈内投与後のトシリズマブ、対照、Fv3-M73、Fv4-M73、およびFv5-M83の血漿中濃度の推移を示すグラフである。
【図１９】カニクイザルにおける静脈内投与後のトシリズマブ、対照、Fv3-M73、Fv4-M73、およびFv5-M83のCRP濃度の推移を示すグラフである。
【図２０】カニクイザルにおけるトシリズマブ、対照、Fv3-M73、Fv4-M73、およびFv5-M83の静脈内投与後の遊離可溶型IL-6レセプターの割合の推移（％）を示すグラフである。
【図２１】異なる製剤（A〜D）における抗体Fv4-M73の高分子量成分（HMW）の形成の違いを経時的に示すグラフである。
【図２２】アルギニンの存在下または非存在下における、異なるpH値、緩衝液種、NaCl濃度での、2つの時点（25℃）における抗体Fv4-M73の高分子量成分（ΔHMW：初期値からの増加分）の形成の違いを示すグラフである。
【図２３】アルギニンの存在下または非存在下における、異なるpH値、緩衝液種、NaCl濃度での、一つの時点（25℃）における抗体Fv4-M73の高分子量成分（HMW）の形成の違いを示すグラフである。
【図２４】アルギニンの存在下または非存在下における、異なるpH値、緩衝液種、NaCl濃度での、3つの異なる時点（40℃）における抗体Fv4-M73の高分子量成分（ΔHMW：初期値からの増加分）の形成の違いを示すグラフである。
【図２５】アルギニンの存在下または非存在下における、異なるpH値、緩衝液種、NaCl濃度での、一つの時点（40℃）における抗体Fv4-M73の高分子量成分（HMW）の形成の違いを示すグラフである。
【図２６】アルギニンの存在下または非存在下における、異なるpH値、緩衝液種、NaCl濃度での、3つの異なる時点（40℃）における抗体Fv4-M73の低分子量成分（ΔLMW：初期値からの増加分）の形成の違いを示すグラフである。
【図２７】異なるpH値の下で貯蔵された抗体Fv4-M73の溶液を用いて実施された陰イオン交換クロマトグラフィーの結果を示す図である。
【図２８】3つの異なるpH値、NaClの異なる濃度、アルギニン、2つの異なる緩衝液種の下で貯蔵された抗体Fv4-M73の溶液を用いて実施された陰イオン交換クロマトグラフィーの結果を示す図である。
【図２９】2つの異なる凍結／融解サイクルの数、NaClの異なる濃度、アルギニン、2つの異なる緩衝液種についての抗体Fv4-M73の高分子量成分（ΔHMW：初期値からの増加分）の形成の違いを示すグラフである。
【図３０】4つの異なる製剤（E〜H）について、3つの異なる時点（40℃および25℃）の抗体Fv4-M73の高分子量成分（ΔHMW：初期値からの増加分）の形成の違いを示すグラフである。
【図３１】2つの異なる凍結／融解サイクルの数および4つの異なる製剤（E〜H）の抗体Fv4-M73の高分子量成分（ΔHMW：初期値からの増加分）の形成の違いを示すグラフである。
【図３２】6つの異なる製剤について、5℃における3ヶ月後および6ヶ月後の抗体Fv4-M73の高分子量成分（ΔHMW：初期値からの増加分）の形成の違いを示すグラフである。
【図３３】6つの異なる製剤について、-20℃における3ヶ月後および6ヶ月後の抗体Fv4-M73の高分子量成分（ΔHMW：初期値からの増加分）の形成の違いを示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００２２】
本発明は、
（a）配列番号：1（VH4-M73のCDR1）の配列を含むCDR1、配列番号：2（VH4-M73のCDR2）の配列を含むCDR2、および配列番号：3（VH4-M73のCDR3）の配列を含むCDR3を含むポリペプチド；
（b）配列番号：4（VH3-M73のCDR1）の配列を含むCDR1、配列番号：5（VH3-M73のCDR2）の配列を含むCDR2、および配列番号：6（VH3-M73のCDR3）の配列を含むCDR3を含むポリペプチド；
（c）配列番号：7（VH5-M83のCDR1）の配列を含むCDR1、配列番号：8（VH5-M83のCDR2）の配列を含むCDR2、および配列番号：9（VH5-M83のCDR3）の配列を含むCDR3を含むポリペプチド；
（d）配列番号：10（VL1のCDR1）の配列を含むCDR1、配列番号：11（VL1のCDR2）の配列を含むCDR2、および配列番号：12（VL1のCDR3）の配列を含むCDR3を含むポリペプチド；
（e）配列番号：13（VL3のCDR1）の配列を含むCDR1、配列番号：14（VL3のCDR2）の配列を含むCDR2、および配列番号：15（VL3のCDR3）の配列を含むCDR3を含むポリペプチド；ならびに
（f）配列番号：16（VL5のCDR1）の配列を含むCDR1、配列番号：17（VL5のCDR2）の配列を含むCDR2、および配列番号：18（VL5のCDR3）の配列を含むCDR3を含むポリペプチド
より選択される少なくとも一つのポリペプチドを含む製剤を提供する。
【００２３】
本発明のポリペプチドおよび抗体は、常法に従って製剤化され得る（例えば、Remington's Pharmaceutical Science, latest edition, Mark Publishing Company, Easton, USAを参照のこと）。
【００２４】
本発明において使用されるような「製剤」、「薬剤」、および「医薬組成物」とは、直接、または再構成の後、ヒトなどの動物に投与するのに適しているよう調製されている、活性成分としてポリペプチドおよび／または抗体を含有する液体または固体の製剤を意味する。必要に応じて、製剤は、医薬品として許容される担体および／または添加剤を含有してもよい。例えば、界面活性剤（例えば、PEG、ツイーン（Tween）、プルロニック（Pluronic））、賦形剤、酸化防止剤（例えば、アスコルビン酸、メチオニン）、着色剤、着香剤、保存剤、安定剤、緩衝剤、キレート剤（例えば、EDTA）、懸濁化剤、等張化剤、結合剤、崩壊剤、滑沢剤、流動性促進剤、および矯味剤。
【００２５】
本発明に係るポリペプチドおよび／または抗体を含有する製剤は、好ましくは、安定剤としてHSA（ヒト血清アルブミン）、ゼラチン等のタンパク質を含有しない。
【００２６】
本発明に係るポリペプチドおよび／または抗体を含有する製剤は、好ましくは、10 mg/mL以上、好ましくは50 mg/mL以上、より好ましくは80 mg/mL以上の高濃度でポリペプチドおよび／または抗体を含有する液体の製剤である。濃度は、10〜240 mg/mLであり、10 mg/mLであってもよいし、または、より好ましくは50 mg/mL、さらに好ましくは100〜200 mg/mLであってもよい。
【００２７】
本発明に係る液体の製剤は、好ましくは、凍結乾燥工程を実施することなく作製される。
【００２８】
本発明において使用され得る緩衝剤は、所望の範囲でpHを調整することができ、かつ医薬品として許容されるものである。本発明に係る高濃度ポリペプチドおよび／または抗体含有製剤において、製剤のpHは、好ましくは4.5〜7、より好ましくは5.5〜6.6である。これらの緩衝剤は当業者に公知であり、その例には、リン酸塩（ナトリウムまたはカリウム）および炭酸水素ナトリウムなどの無機塩；クエン酸塩（ナトリウムまたはカリウム）、酢酸ナトリウム、およびコハク酸ナトリウムなどの有機酸；ならびにリン酸、炭酸、クエン酸、コハク酸、リンゴ酸、およびグルコン酸などの酸が含まれる。さらに、トリス緩衝液、MESおよびMOPSなどのグッド緩衝液、ヒスチジン（例えば、ヒスチジン塩酸塩）ならびにグリシンを使用することもできる。本発明に係る高濃度ポリペプチドおよび／または抗体含有製剤において、緩衝液は、好ましくは、ヒスチジン緩衝液またはクエン酸緩衝液であり、ヒスチジン緩衝液が特に好ましい。緩衝溶液の濃度は、一般に、1〜500 mM、好ましくは5〜100 mM、より好ましくは、10〜20 mMである。ヒスチジン緩衝液が使用される場合、緩衝溶液は、好ましくは5〜25 mM、より好ましくは10〜20 mMの濃度でヒスチジンを含有する。
【００２９】
本発明に係る製剤は、さらに界面活性剤を含有してもよい。界面活性剤の典型例には、非イオン性界面活性剤、例えば、モノカプリル酸ソルビタン、モノラウリン酸ソルビタン、およびモノパルミチン酸ソルビタンなどのソルビタン脂肪酸エステル；モノカプリル酸グリセロール、モノミリスチン酸グリセロール、およびモノステアリン酸グリセロールなどのグリセリン脂肪酸エステル；モノステアリン酸デカグリセリル、ジステアリン酸デカグリセリル、およびモノリノール酸デカグリセリルなどのポリグリセロール脂肪酸エステル；モノラウリン酸ポリオキシエチレンソルビタン、モノオレイン酸ポリオキシエチレンソルビタン、モノステアリン酸ポリオキシエチレンソルビタン、モノパルミチン酸ポリオキシエチレンソルビタン、トリオレイン酸ポリオキシエチレンソルビタン、およびトリステアリン酸ポリオキシエチレンソルビタンなどのポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル；テトラステアリン酸ポリオキシエチレンソルビトールおよびテトラオレイン酸ポリオキシエチレンソルビトールなどのポリオキシエチレンソルビトール脂肪酸エステル；モノステアリン酸ポリオキシエチレングリセリルなどのポリオキシエチレングリセリン脂肪酸エステル；ジステアリン酸ポリエチレングリコールなどのポリエチレングリコール脂肪酸エステル；ポリオキシエチレンラウリルエーテルなどのポリオキシエチレンアルキルエーテル；ポリオキシエチレンポリオキシプロピレングリコールエーテル、ポリオキシエチレンポリオキシプロピレンプロピルエーテル、およびポリオキシエチレンポリオキシプロピレンセチルエーテルなどのポリオキシエチレンポリオキシプロピレンアルキルエーテル；ポリオキシエチレンノニルフェニルエーテルなどのポリオキシエチレンアルキルフェニルエーテル；ポリオキシエチレンヒマシ油およびポリオキシエチレン硬化ヒマシ油（ポリオキシエチレン水素化ヒマシ油）などのポリオキシエチレン硬化ヒマシ油；ポリオキシエチレンソルビトールミツロウなどのポリオキシエチレンミツロウ誘導体；ポリオキシエチレンラノリンなどのポリオキシエチレンラノリン誘導体；ポリオキシエチレン脂肪酸アミド、例えば、ポリオキシエチレンオクタデカンアミドなどの6〜18のHLBを有する界面活性剤；陰イオン性界面活性剤、例えば、セチル硫酸ナトリウム、ラウリル硫酸ナトリウム、およびオレイル硫酸ナトリウムなどのC10〜C18アルキル基を有するアルキル硫酸塩；ポリオキシエチレンラウリル硫酸ナトリウムなどの、添加されたエチレンオキシド単位の平均モル数が2〜4であり、アルキル基の炭素原子の数が10〜18であるポリオキシエチレンアルキルエーテル硫酸塩；スルホコハク酸ラウリルナトリウムなどのC8〜C18アルキル基を有するスルホコハク酸アルキル塩；レシチンおよびグリセロリン脂質などの天然の界面活性剤；スフィンゴミエリンなどのスフィンゴリン脂質；ならびにC12〜C18脂肪酸のショ糖エステルが含まれる。これらの界面活性剤は、個別に本発明の製剤に添加されてもよいし、または、これらの界面活性剤のうちの2つ以上が組み合わされて添加されてもよい。
【００３０】
好ましい界面活性剤は、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステルおよびポリオキシエチレンポリオキシプロピレンアルキルエーテルであり、特に好ましいのは、ポリソルベート20、21、40、60、65、80、81、および85、ならびにプルロニック型界面活性剤であり、最も好ましいのは、ポリソルベート20および80、ならびにプルロニックF-68（ポロキサマー（Poloxamer）188）である。
【００３１】
本発明に係る抗体製剤に添加される界面活性剤の量は、一般に、0.0001〜10％(w/v)であり、好ましくは0.001〜5％、より好ましくは0.005〜3％である。
【００３２】
本発明に係る製剤は、さらに、アルギニンなどの酸性アミノ酸のみならず、メチオニン、グリシン、アラニン、フェニルアラニン、トリプトファン、セリン、トレオニン、アスパラギン、グルタミン等のアミノ酸を安定剤として含有してもよい。
【００３３】
本発明に係る抗体含有製剤または抗体含有溶液製剤において、凍結／融解サイクルの間の二量体の形成は、糖質（例えば、糖）を添加することにより阻害され得る。使用され得る糖には、非還元オリゴ糖、例えば、ショ糖およびトレハロースなどの非還元二糖、またはラフィノースなどの非還元三糖が含まれ、特に好ましいのは、非還元オリゴ糖である。好ましい非還元オリゴ糖は、非還元二糖であり、より好ましくはショ糖およびトレハロースである。
【００３４】
本発明に係る抗体含有製剤または抗体含有溶液製剤において、長期保管中の多量体および分解生成物の形成は、糖質（例えば、糖）を添加することにより阻害され得る。使用され得る糖には、マンニトールおよびソルビトールなどの糖アルコール；ならびに非還元オリゴ糖、例えば、ショ糖およびトレハロースなどの非還元二糖、またはラフィノースなどの非還元三糖が含まれ、その中でも非還元オリゴ糖が特に好ましい。好ましい非還元オリゴ糖は、非還元二糖であり、より好ましくはショ糖およびトレハロースである。
【００３５】
糖は、0.1〜500 mg/mL、好ましくは10〜300 mg/mL、より好ましくは25〜100 mg/mLで添加されるべきである。
【００３６】
もう一つの局面において、本発明に係る製剤は、好ましくは、以下の成分から実質的に構成される:
（A）修飾された抗IL-6レセプター抗体；
（B）塩基性アミノ酸（例えば、アルギニン、ヒスチジン、および／またはリジン）；
（C）緩衝剤（例えば、ヒスチジンまたはクエン酸塩）。
【００３７】
目的に応じて、糖質（例えば、糖）および／または界面活性剤が製剤に含まれていてもよい。
【００３８】
安定剤として、メチオニン、グリシン、アラニン、フェニルアラニン、トリプトファン、セリン、トレオニン、アスパラギン、グルタミン等のアミノ酸が含まれていてもよい。
【００３９】
本明細書において「から実質的に構成される」という用語は、製剤に通常添加される成分以外の成分が含有されていないことを意味し、ここで、製剤に通常添加される成分とは、懸濁化剤、可溶化剤、等張化剤、保存剤、吸着阻害剤、希釈剤、媒体、pH調整剤、無痛化（soothing）剤、硫黄含有還元剤、および酸化防止剤などのような、任意の付加的成分である。
【００４０】
懸濁化剤の例には、メチルセルロース、ポリソルベート80、ヒドロキシエチルセルロース、アラビアゴム、粉末トラガカント、カルボキシメチルセルロースナトリウム、およびモノラウリン酸ポリオキシエチレンソルビタンが含まれる。
【００４１】
可溶化剤の例には、ポリオキシエチレン水素化ヒマシ油、ポリソルベート80、ニコチンアミド、モノラウリン酸ポリオキシエチレンソルビタン、マクロゴール、およびヒマシ油脂肪酸エチルエステルが含まれる。
【００４２】
等張化剤の例には、塩化ナトリウム、塩化カリウム、および塩化カルシウムが含まれる。
【００４３】
保存剤の例には、p-ヒドロキシ安息香酸メチル、p-ヒドロキシ安息香酸エチル、ソルビン酸、フェノール、クレゾール、およびクロロクレゾールが含まれる。
【００４４】
吸着阻害剤の例には、ヒト血清アルブミン、レシチン、デキストラン、エチレンオキシド-プロピレンオキシドコポリマー、ヒドロキシプロピルセルロース、メチルセルロース、ポリオキシエチレン水素化ヒマシ油、およびポリエチレングリコールが含まれる。
【００４５】
硫黄含有還元剤の例には、N-アセチルシステイン、N-アセチルホモシステイン、チオクト酸、チオジグリコール、チオエタノールアミン、チオグリセロール、チオソルビトール、チオグリコール酸およびその塩、チオ硫酸ナトリウム、グルタチオン、およびC1〜C7チオアルカンなどの、スルフヒドリル基を有する化合物が含まれる。
【００４６】
酸化防止剤の例には、エリソルビン酸、ジブチルヒドロキシトルエン、ブチルヒドロキシアニソール、αトコフェロール、酢酸トコフェロール、L-アスコルビン酸およびその塩、パルミチン酸L-アスコルビル、ステアリン酸L-アスコルビル、亜硫酸水素ナトリウム、亜硫酸ナトリウム、没食子酸トリアミル、没食子酸プロピル、ならびにエチレンジアミン四酢酸二ナトリウム（EDTA）、ピロリン酸ナトリウム、およびメタリン酸ナトリウムなどのキレート剤が含まれる。
【００４７】
しかしながら、炎症性疾患を含むIL-6関連疾患の予防または処置のために使用され得る本発明に係る製剤（薬剤、医薬組成物）は、上記に限定されず、その他の従来の担体を適切に含有してもよい。特に、例としては、軽質無水ケイ酸、乳糖、結晶セルロース、マンニトール、デンプン、カルメロースカルシウム、カルメロースナトリウム、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ポリビニルアセタールジエチルアミノアセテート、ポリビニルピロリドン、ゼラチン、中鎖脂肪酸トリグリセリド、ポリオキシエチレン水素化ヒマシ油60、ショ糖、カルボキシメチルセルロース、コーンスターチ、および無機塩が含まれる。それらは、その他の低分子量ポリペプチド；血清アルブミン、ゼラチン、および免疫グロブリンなどのタンパク質；ならびにアミノ酸も含有してよい。注射用に水性溶液を調製する場合、抗IL-6レセプター抗体を、例えば、生理食塩水、グルコース、またはその他の佐剤を含有する等張溶液に溶解させる。佐剤には、例えば、D-ソルビトール、D-マンノース、D-マンニトール、および塩化ナトリウムが含まれる。さらに、適切な可溶化剤、例えば、アルコール（エタノール等）、多価アルコール（プロピレングリコール、PEG等）、および非イオン性界面活性剤（ポリソルベート80およびHCO-50）を組み合わせてもよい。
【００４８】
必要であれば、ポリペプチドは、マイクロカプセル（ヒドロキシセルロース、ゼラチン、ポリ(メタクリル酸メチル)等で作成されたマイクロカプセル）に封入されてもよいし、またはコロイド薬物送達系（リポソーム、アルブミンマイクロスフェア、マイクロエマルジョン、ナノ粒子、ナノカプセル等）にされてもよい（例えば、"Remington's Pharmaceutical Science 16th edition", Oslo Ed. (1980)を参照のこと）。さらに、徐放剤として薬剤を調製する方法が公知であり、これらの方法は本ポリペプチドに適用され得る（Langer et al., J. Biomed. Mater. Res. (1981) 15: 167-277；Langer, Chem. Tech. (1982) 12: 98-105；米国特許第3,773,919号；欧州特許出願（EP）第58,481号；Sidman et al., Biopolymers (1983) 22:547-56；EP第133,988号）。さらに、ヒアルロニダーゼを薬剤に添加または混合することにより、皮下投与用の液体容量を増加させることができる（例えば、WO 2004/078140を参照のこと）。
【００４９】
本発明の医薬組成物は、経口投与されてもよいし、非経口投与されてもよいが、好ましくは、非経口投与される。特に、組成物は、注射により、または経皮的に患者に投与される。注射には、例えば、静脈内注射、筋肉内注射、または皮下注射等による全身投与および局所投与が含まれる。組成物は、特に、筋肉内注射により、処置の部位に、または部位の末梢に局所的に注射され得る。経皮剤形には、例えば、軟膏剤、ゲル、クリーム、湿布、およびパッチが含まれ、これらは、局所投与または全身投与され得る。さらに、投与方法は、患者の年齢および症状に応じて適切に選択され得る。投与される用量は、各投与について、例えば、体重1kg当たり0.0001 mg〜100 mg活性成分の範囲より選択され得る。または、組成物がヒト患者に投与される場合、例えば、活性成分は、毎患者について、体重1 kg当たり0.001〜1000 mgの範囲より選択され得る。単一の投与用量は、好ましくは、例えば、約0.01〜50 mg/kg体重の本発明の抗体を含有する。しかしながら、本発明の抗体の用量は、これらの用量に限定はされない。
【００５０】
下記実施例の結果から明らかなように、本発明によれば、１または複数の塩基性アミノ酸（アルギニン、ヒスチジン、および／もしくはリジン、好ましくはアルギニン）、または他のアミノ酸と組み合わせられた塩基性アミノ酸を製剤に添加することにより、長期保管または凍結／融解の間の抗体の二量体化および脱アミドが低い、安定な製剤を得ることができる。
【００５１】
高濃度抗体含有製剤の貯蔵寿命安定性を評価するため、本発明者らは、サイズ排除クロマトグラフィー試験および陰イオン交換クロマトグラフィー試験を実施することにより、様々な添加剤の効果を研究した。その結果、アミノ酸アルギニンを含有する緩衝溶液に高濃度の抗体を溶解させた溶液においては、付加的なアルギニンを含まない溶液よりも、二量体の量が低いことが見出された。これらの結果は、アルギニンが、抗体二量体化を阻害するための安定剤として有効であることを示す。
【００５２】
従って、安定剤としてアルギニンを添加することにより、抗体の二量体化が低下している安定な抗体製剤を提供することができる。
【００５３】
本発明の一つの態様は、緩衝溶液中に抗体およびアルギニンを含有することを特徴とする安定な抗体含有製剤である。
【００５４】
本発明において使用されるアルギニンとしては、任意のアルギニン化合物それ自体、それらの誘導体、およびそれらの塩が使用され得る。L-アルギニンおよびその塩が好ましい。
【００５５】
本発明の製剤がアルギニンを含む場合、アルギニンの濃度は、好ましくは1〜1500 mM、より好ましくは50〜1000 mM、より好ましくは50〜200 mMである。
【００５６】
本発明においてポリペプチドは特に限定されないが、ヒトIL-6レセプターへの結合活性を有する抗原結合物質であることが好ましい。抗原結合物質の好ましい例として、抗体の重鎖可変領域（VH）、抗体の軽鎖可変領域（VL）、抗体の重鎖、抗体の軽鎖、抗体などを挙げることができる。
【００５７】
上述の(a)〜(f)のポリペプチドにおいて、(a)〜(c)のポリペプチドの好ましい例として抗体の重鎖可変領域を挙げることができ、(d)〜(f)のポリペプチドの好ましい例として抗体の軽鎖可変領域を挙げることができる。
【００５８】
これらの可変領域は抗ヒトIL-6レセプター抗体の一部として使用され得る。これらの可変領域が用いられた抗ヒトIL-6レセプター抗体は優れた結合活性、優れた薬物動態、優れた安全性、低下した免疫原性、および／または優れた物性を有する。本発明において、優れた薬物動態、あるいは、薬物動態の向上とは、抗体を生体内に投与した際の血漿中濃度の経時変化から算出される薬物動態パラメーターの一つである「クリアランス（CL）」の減少、「濃度曲線下面積（AUC）」の増大、「平均滞留時間」の増大、「血漿中半減期（t1/2）」の増大、のいずれかを意味する。本発明において、優れた物理化学的性質あるいは物理化学的性質の向上とは、特に限定されないが、安定性の向上、不均一性の低減などを意味する。
【００５９】
CDRと連結されるヒト抗体のフレームワーク領域(FR)は、CDRが良好な抗原結合部位を形成するものが選択される。本発明の可変領域に用いられるFRは特に限定されず、如何なるFRが用いられていてもよいが、ヒト由来のFRが用いられることが好ましい。ヒト由来のFRは天然配列を有するFRが用いられてもよいし、必要に応じ、CDRが適切な抗原結合部位を形成するように、天然配列を有するフレームワーク領域の１または複数のアミノ酸を置換、欠失、付加および／または挿入等してもよい。たとえば、アミノ酸を置換したFRを用いた抗体の抗原への結合活性を測定し評価することによって所望の性質を有する変異FR配列が選択できる（Sato, K. et al., Cancer Res.（1993）53, 851-856）。
【００６０】
また、上述のCDR配列において１または複数のアミノ酸を置換、欠失、付加および／または挿入等してもよい。１または複数のアミノ酸の置換、欠失、付加および／または挿入後のCDR配列は、結合活性、中和活性、安定性、免疫原性および／または薬物動態において改変前のCDR配列と同等の活性を有していることが好ましい。置換、欠失、付加および／または挿入されるアミノ酸の数は特に限定されないが、好ましくは一つのCDRにつき3アミノ酸以内、さらに好ましくは2アミノ酸以内、より好ましくは1アミノ酸である。
【００６１】
１または複数のアミノ酸残基を目的の他のアミノ酸に置換する方法としては、例えば、部位特異的変異誘発法（Hashimoto-Gotoh, T, Mizuno, T, Ogasahara, Y, and Nakagawa, M. (1995) An oligodeoxyribonucleotide-directed dual amber method for site-directed mutagenesis. Gene 152, 271-275、Zoller, MJ, and Smith, M.(1983) Oligonucleotide-directed mutagenesis of DNA fragments cloned into M13 vectors.Methods Enzymol. 100, 468-500、Kramer,W, Drutsa,V, Jansen,HW, Kramer,B, Pflugfelder,M, and Fritz,HJ(1984) The gapped duplex DNA approach to oligonucleotide-directed mutation construction. Nucleic Acids Res. 12, 9441-9456、Kramer W, and Fritz HJ(1987) Oligonucleotide-directed construction of mutations via gapped duplex DNA Methods. Enzymol. 154, 350-367、Kunkel,TA(1985) Rapid and efficient site-specific mutagenesis without phenotypic selection.Proc Natl Acad Sci U. S. A. 82, 488-492）が挙げられる。該方法を用いて、抗体の所望のアミノ酸を目的の他のアミノ酸に置換することができる。また、他のアミノ酸に置換する方法としては、フレームワークシャッフリング（Mol Immunol. 2007 Apr;44(11):3049-60）およびCDR repair（US2006/0122377）等のライブラリー技術を用いることにより、適切なフレームワークおよびCDRにアミノ酸置換することも可能である。
【００６２】
さらに、本発明は以下より選択される少なくとも一つの抗体を含む製剤を提供する。
(a) 配列番号：1（VH4-M73のCDR1）の配列を有するCDR1、配列番号：2（VH4-M73のCDR2）の配列を有するCDR2、および配列番号：3（VH4-M73のCDR3）の配列を有するCDR3を含む重鎖可変領域、ならびに配列番号：10（VL1のCDR1）の配列を有するCDR1、配列番号：11（VL1のCDR2）の配列を有するCDR2、および配列番号：12（VL1のCDR3）の配列を有するCDR3を含む軽鎖可変領域を含む抗体、
(b) 配列番号：4（VH3-M73のCDR1）の配列を有するCDR1、配列番号：5（VH3-M73のCDR2）の配列を有するCDR2、および配列番号：6（VH3-M73のCDR3）の配列を有するCDR3を含む重鎖可変領域、ならびに配列番号：13（VL3のCDR1）の配列を有するCDR1、配列番号：14（VL3のCDR2）の配列を有するCDR2、および配列番号：15（VL3のCDR3）の配列を有するCDR3を含む軽鎖可変領域を含む抗体、
(c) 配列番号：7（VH5-M83のCDR1）の配列を有するCDR1、配列番号：8（VH5-M83のCDR2）の配列を有するCDR2、および配列番号：9（VH5-M83のCDR3）の配列を有するCDR3を含む重鎖可変領域、ならびに配列番号：16（VL5のCDR1）の配列を有するCDR1、配列番号：17（VL5のCDR2）の配列を有するCDR2、および配列番号：18（VL5のCDR3）の配列を有するCDR3を含む軽鎖可変領域を含む抗体、
（d）配列番号：19（VH4-M73の可変領域）の配列を含む重鎖可変領域および配列番号：22（VL1の可変領域）の配列を含む軽鎖可変領域を含む抗体、
（e）配列番号：20（VH3-M73の可変領域）の配列を含む重鎖可変領域および配列番号：23（VL3の可変領域）の配列を含む軽鎖可変領域を含む抗体、
（f）配列番号：21（VH5-M83の可変領域）の配列を含む重鎖可変領域および配列番号：24（VL5の可変領域）の配列を含む軽鎖可変領域を含む抗体、
（g）配列番号：25（VH4-M73）の配列を含む重鎖および配列番号：28（VL1）の配列を含む軽鎖を含む抗体、
（h）配列番号：26（VH3-M73）の配列を含む重鎖および配列番号：29（VL3）の配列を含む軽鎖を含む抗体、ならびに
（i）配列番号：27（VH5-M83）の配列を含む重鎖および配列番号：30（VL5）の配列を含む軽鎖を含む抗体。
【００６３】
上述の抗体は優れた結合活性、優れた薬物動態、優れた安全性、低下した免疫原性、および／または優れた物理化学的性質を有する抗ヒトIL-6レセプター抗体として使用され得る。
【００６４】
本発明のCDRと連結されるヒト抗体のフレームワーク領域は、CDRが良好な抗原結合部位を形成するものが選択される。本発明の可変領域に用いられるFRは特に限定されず、如何なるFRが用いられていてもよいが、ヒト由来のFRが用いられることが好ましい。ヒト由来のFRは天然配列を有するFRが用いられてもよいし、必要に応じ、CDRが適切な抗原結合部位を形成するように、天然配列を有するフレームワーク領域の１または複数のアミノ酸を置換、欠失、付加および／または挿入等してもよい。たとえば、アミノ酸を置換したFRを用いた抗体の抗原への結合活性を測定し評価することによって所望の性質を有する変異FR配列が選択できる（Sato, K. et al., Cancer Res.（1993）53, 851-856）。
【００６５】
また、本発明の抗体で用いられる定常領域は特に限定されず、如何なる定常領域が用いられてもよい。本発明の抗体で用いられる定常領域の好ましい例としては、ヒト由来の定常領域（IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、Cκ、Cλ由来の定常領域など）を挙げることができる。ヒト由来の定常領域は１または複数のアミノ酸が置換、欠失、付加および／または挿入されていてもよい。例えば、ヒト由来の定常領域の好ましい例として、重鎖定常領域の場合には配列番号：31（VH4-M73の定常領域）のアミノ酸配列を有する定常領域、配列番号：32（VH3-M73の定常領域）のアミノ酸配列を有する定常領域、配列番号：33（VH5-M83の定常領域）のアミノ酸配列を有する定常領域を挙げることができ、軽鎖定常領域の場合には配列番号：34（VL1）のアミノ酸配列を有する定常領域、配列番号：35（VL3）のアミノ酸配列を有する定常領域、配列番号：36（VL5）のアミノ酸配列を有する定常領域を挙げることができる。
【００６６】
また、上述のCDR配列において１または複数のアミノ酸を置換、欠失、付加および／または挿入等してもよい。１または複数のアミノ酸の置換、欠失、付加および／または挿入後のCDR配列は、結合活性、中和活性、安定性、免疫原性および／または薬物動態において改変前のCDR配列と同等の活性を有していることが好ましい。置換、欠失、付加および／または挿入されるアミノ酸の数は特に限定されないが、好ましくは一つのCDRにつき3アミノ酸以内、さらに好ましくは2アミノ酸以内、より好ましくは1アミノ酸である。
【００６７】
これらの抗体の対応する可変領域は抗ヒトIL-6レセプターと反応する分子の一部として使用され得る。これらの可変領域は１または複数（例えば5アミノ酸以内、好ましくは3アミノ酸以内）のアミノ酸が置換、欠失、付加および／または挿入していてもよい。１または複数のアミノ酸残基を目的の他のアミノ酸に置換する方法としては、例えば、上述の方法を挙げることができる。
【００６８】
また本発明は、上述の可変領域を含むポリペプチドを含む。
【００６９】
これらの抗体の対応する重鎖および軽鎖は抗ヒトIL-6レセプターと反応する分子の一部として使用され得る。これらの重鎖および軽鎖が用いられた抗ヒトIL-6レセプター抗体は優れた結合活性、優れた薬物動態、優れた安全性、低下した免疫原性、および／または優れた物理化学的性質を有する。
【００７０】
これらの重鎖または軽鎖は、１または複数（例えば10アミノ酸以内、好ましくは5アミノ酸以内、さらに好ましくは3アミノ酸以内）のアミノ酸が置換、欠失、付加および／または挿入していてもよい。１または複数のアミノ酸残基を目的の他のアミノ酸に置換する方法としては、例えば、上述の方法を用いることが可能である。
【００７１】
１または複数のアミノ酸の置換、欠失、付加および／または挿入は可変領域において行われてもよいし、定常領域において行われてもよいし、または可変領域と定常領域の両方において行われてもよい。
【００７２】
本発明はまた、上述の重鎖および軽鎖を含むポリペプチドを含む。
【００７３】
本発明の抗体は、ヒト化（humanized）抗体であることが好ましい。
【００７４】
ヒト化抗体は、再構成（reshaped）ヒト抗体とも称され、これは、ヒト以外の哺乳動物由来の相補性決定領域（CDR）をヒト抗体のCDRへ移植したものであり、その一般的な遺伝子組換え手法も知られている（欧州特許出願公開番号EP 125023号公報、WO 96/02576 号公報参照）。
【００７５】
具体的には、例えば目的のCDRと目的のフレームワーク領域（FR）とを連結するように設計したDNA配列を、CDRおよびFR両方の末端領域にオーバーラップする部分を有するように作製した数個のオリゴヌクレオチドをプライマーとして用いてPCR法により合成する（WO98/13388号公報に記載の方法を参照）。得られたDNAをヒト抗体定常領域もしくはヒト抗体定常領域改変体をコードするDNAと連結し、次いでこれを発現ベクターに組み込んで、このベクターを宿主に導入し産生させることにより得られる（欧州特許出願公開番号EP 239400、国際特許出願公開番号WO 96/02576参照）。
【００７６】
CDRと連結されるヒト抗体のフレームワーク領域は、CDRが良好な抗原結合部位を形成するものが選択される。必要に応じ、抗体の可変領域におけるフレームワーク領域のアミノ酸を置換、欠失、付加および／または挿入等してもよい。
【００７７】
ヒト化抗体の定常領域には、ヒト抗体定常領域またはヒト抗体定常領域において１または複数のアミノ酸が置換、欠失、付加および／または挿入したヒト抗体定常領域改変体を用いることができる。
【００７８】
例えばH鎖では、Cγ1、Cγ2、Cγ3、Cγ4、Cμ、Cδ、Cα1、Cα2、Cεを、L鎖ではCκ、Cλを使用することができる。Cκのアミノ酸配列を配列番号：38に、当該アミノ酸配列をコードする塩基配列を配列番号：37に示す。Cγ1のアミノ酸配列を配列番号：40に、当該アミノ酸配列をコードする塩基配列を配列番号：39に示す。Cγ2のアミノ酸配列を配列番号：42に、当該アミノ酸配列をコードする塩基配列を配列番号：41に示す。Cγ4のアミノ酸配列を配列番号：44に、当該アミノ酸配列をコードする塩基配列を配列番号：43に示す。
【００７９】
また、抗体またはその産生の安定性を向上するために、ヒト抗体C領域を修飾してもよい。ヒト化の際に用いられるヒト抗体は、IgG、IgM、IgA、IgE、IgDなど如何なるアイソタイプのヒト抗体でもよいが、本発明においてはIgGを用いることが好ましい。IgGとしては、IgG1、IgG2、IgG3、IgG4などを用いることが可能である。
【００８０】
なお、ヒト化抗体を作製した後に、可変領域（例えば、CDR、FR）や定常領域中のアミノ酸を他のアミノ酸で置換、欠失、付加および／または挿入等してもよく、本発明のヒト化抗体には、そのようなアミノ酸置換等されたヒト化抗体も含まれる。
【００８１】
本発明の抗体には、IL-6レセプターへの結合活性および／または中和活性を有する限り、IgGに代表される二価抗体だけでなく、一価抗体、若しくはIgMに代表される多価抗体も含まれる。本発明の多価抗体には、全て同じ抗原結合部位を有する多価抗体、または、一部もしくは全て異なる抗原結合部位を有する多価抗体が含まれる。本発明の抗体は、抗体の全長分子に限らず、IL-6レセプタータンパク質に結合する限り、低分子化抗体またはその修飾物であってもよい。
【００８２】
低分子化抗体は、全長抗体（例えば全長IgG等）の一部分が欠損している抗体断片を含む抗体であり、IL-6レセプターへの結合活性および／または中和活性を有する限り特に限定されない。本発明において低分子化抗体は、全長抗体の一部分を含む限り特に限定されないが、VHまたはVLを含んでいることが好ましく、特に好ましくはVHとVLの両方を含む低分子化抗体である。また、本発明の低分子化抗体の他の好ましい例として、抗体のCDRを含む低分子化抗体を挙げることができる。低分子化抗体に含まれるCDRは抗体の6つのCDR全てが含まれていてもよいし、一部のCDRが含まれていてもよい。
【００８３】
本発明における低分子化抗体は、全長抗体よりも分子量が小さくなることが好ましいが、例えば、二量体、三量体、四量体などの多量体を形成すること等もあり、全長抗体よりも分子量が大きくなることもある。
【００８４】
抗体断片の具体例としては、例えば、Fab、Fab'、F(ab')2、Fvなどを挙げることができる。また、低分子化抗体の具体例としては、例えば、Fab、Fab'、F(ab')2、Fv、scFv（single chain Fv）、ダイアボディー、sc(Fv)2（single chain (Fv)2）などを挙げることができる。これら抗体の多量体（例えば、二量体、三量体、四量体、ポリマー）も、本発明の低分子化抗体に含まれる。
【００８５】
抗体断片は、例えば、抗体を酵素で処理して抗体断片を生成させることによって得ることができる。抗体断片を生成する酵素として、例えばパパイン、ペプシン、あるいはプラスミンなどが公知である。あるいは、これら抗体断片をコードする遺伝子を構築し、これを発現ベクターに導入した後、適当な宿主細胞で発現させることができる（例えば、Co, M.S. et al., J. Immunol.（1994）152, 2968-2976、Better, M. & Horwitz, A. H. Methods in Enzymology（1989）178, 476-496、Pluckthun, A. & Skerra, A. Methods in Enzymology（1989）178, 476-496、Lamoyi, E., Methods in Enzymology（1989）121, 652-663、Rousseaux, J. et al., Methods in Enzymology（1989）121, 663-669、Bird, R. E. et al., TIBTECH（1991）9, 132-137参照）。
【００８６】
消化酵素は、抗体断片の特定の位置を切断し、次のような特定の構造の抗体断片を与える。このような酵素的に得られた抗体断片に対して、遺伝子工学的手法を利用すると、抗体の任意の部分を欠失させることができる。
【００８７】
上述の消化酵素を用いた場合に得られる抗体断片は以下のとおりである。
パパイン消化：F(ab)2またはFab
ペプシン消化：F(ab')2またはFab'
プラスミン消化：Facb
【００８８】
本発明における低分子化抗体は、IL-6レセプターへの結合活性および／または中和活性を有する限り、任意の領域を欠失した抗体断片を含むことができる。
【００８９】
「ダイアボディー」は、遺伝子融合により構築された二価（bivalent）の抗体断片を指す（Holliger P et al., 1993, Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90: 6444-6448 (1993)、EP404,097号、WO93/11161号等）。ダイアボディーは、2本のポリペプチド鎖から構成される二量体である。通常、二量体を構成するポリペプチド鎖は、各々、同じ鎖中でVLおよびVHがリンカーにより結合されている。ダイアボディーにおけるリンカーは、一般に、VLとVHが互いに結合できない位に短い。具体的には、リンカーを構成するアミノ酸残基は、例えば、5残基程度である。そのため、同一ポリペプチド鎖上にコードされるVLとVHとは、単鎖可変領域フラグメントを形成できず、別の単鎖可変領域フラグメントと二量体を形成する。その結果、ダイアボディーは2つの抗原結合部位を有することとなる。
【００９０】
scFv抗体は、VHおよびVLをリンカー等で結合して一本鎖ポリペプチドにした抗体である(Huston, J. S. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. (1988) 85, 5879-5883、 Plueckthun「The Pharmacology of Monoclonal Antibodies」Vol.113, eds., Resenburg および Moore編, Springer Verlag, New York, pp.269-315, (1994))。scFvにおけるH鎖V領域およびL鎖V領域は、本明細書に記載されたいずれの抗体由来であってもよい。V領域を連結するペプチドリンカーには、特に制限はない。例えば3から25残基程度からなる任意の一本鎖ペプチドをリンカーとして用いることができる。具体的には、たとえば後述のペプチドリンカー等を用いることができる。
【００９１】
両鎖のV領域は、例えば上記のようなPCR法によって連結することができる。PCR法によるV領域の連結のために、まず次のDNAのうち、全部あるいは所望の部分アミノ酸配列をコードするDNAが鋳型として利用される。
抗体のH鎖またはH鎖V領域をコードするDNA配列、および
抗体のL鎖またはL鎖V領域をコードするDNA配列。
【００９２】
増幅すべきDNAの両端の配列に対応する配列を有するプライマーの一対を用いたPCR法によって、H鎖とL鎖のV領域をコードするDNAがそれぞれ増幅される。次いで、ペプチドリンカー部分をコードするDNAを用意する。ペプチドリンカーをコードするDNAもPCRを利用して合成することができる。このとき利用するプライマーの5'側に、別に合成された各V領域の増幅産物と連結できる塩基配列を付加しておく。次いで、［H鎖V領域DNA］−［ペプチドリンカーDNA］−［L鎖V領域DNA］の各DNAと、アセンブリーPCR用のプライマーを利用してPCR反応を行う。
【００９３】
アセンブリーPCR用のプライマーは、［H鎖V領域DNA］の5'側にアニールするプライマーと、［L鎖V領域DNA］の3'側にアニールするプライマーとの組み合わせからなる。すなわちアセンブリーPCR用プライマーとは、合成すべきscFvの全長配列をコードするDNAを増幅することができるプライマーセットである。一方［ペプチドリンカーDNA］には各V領域DNAと連結できる塩基配列が付加されている。その結果、これらのDNAが連結され、さらにアセンブリーPCR用のプライマーによって、最終的にscFvの全長が増幅産物として生成される。一旦scFvをコードするDNAが作製されると、それらのDNAを含有する発現ベクター、および該発現ベクターにより形質転換された組換え細胞が常法に従って取得できる。また、その結果得られる組換え細胞を培養して該scFvをコードするDNAを発現させることにより、該scFvが取得できる。
【００９４】
結合されるVHとVLの順序は特に限定されず、どのような順序で並べられていてもよく、例えば、以下のような配置を挙げることができる。
［VH］リンカー［VL］
［VL］リンカー［VH］
【００９５】
sc(Fv)2は、2つのVHおよび2つのVLをリンカー等で結合して一本鎖にした低分子化抗体である（Hudson et al., 1999, J Immunol. Methods；231：177-189）。sc(Fv)2は、例えば、scFvをリンカーで結ぶことによって作製できる。
【００９６】
また2つのVHおよび2つのVLが、一本鎖ポリペプチドのN末端側を基点としてVH、VL、VH、VL（［VH］リンカー［VL］リンカー［VH］リンカー［VL］）の順に並んでいることを特徴とする抗体が好ましいが、2つのVHと2つのVLの順序は特に上記配置に限定されず、どのような順序で並べられていてもよい。例えば以下のような配置も挙げることができる。
［VL］リンカー［VH］リンカー［VH］リンカー［VL］
［VH］リンカー［VL］リンカー［VL］リンカー［VH］
［VH］リンカー［VH］リンカー［VL］リンカー［VL］
［VL］リンカー［VL］リンカー［VH］リンカー［VH］
［VL］リンカー［VH］リンカー［VL］リンカー［VH］
【００９７】
低分子抗体中のVHまたはVLのアミノ酸配列は、置換、欠失、付加および／または挿入されていてもよい。さらに、VHとVLを会合させた場合に、抗原結合活性を有する限り、一部を欠損させてもよいし、他のポリペプチドを付加してもよい。また、可変領域はキメラ化やヒト化されていてもよい。
【００９８】
本発明において、抗体の可変領域を結合するリンカーは、遺伝子工学により導入し得る任意のペプチドリンカー、または合成化合物リンカー、例えば、Protein Engineering, 9(3), 299-305, 1996に開示されるリンカーを用いることができる。
【００９９】
本発明において好ましいリンカーはペプチドリンカーである。ペプチドリンカーの長さは特に限定されず、目的に応じて当業者が適宜選択することが可能であるが、通常、1〜100アミノ酸、好ましくは3〜50アミノ酸、更に好ましくは5〜30アミノ酸、特に好ましくは12〜18アミノ酸（例えば、15アミノ酸）である。
【０１００】
ペプチドリンカーのアミノ酸配列としては、例えば、以下のような配列を挙げることができる。
Ser
Gly Ser
Gly Gly Ser
Ser Gly Gly
Gly Gly Gly Ser（配列番号：45）
Ser Gly Gly Gly（配列番号：46）
Gly Gly Gly Gly Ser（配列番号：47）
Ser Gly Gly Gly Gly（配列番号：48）
Gly Gly Gly Gly Gly Ser（配列番号：49）
Ser Gly Gly Gly Gly Gly（配列番号：50）
Gly Gly Gly Gly Gly Gly Ser（配列番号：51）
Ser Gly Gly Gly Gly Gly Gly（配列番号：52）
(Gly Gly Gly Gly Ser（配列番号：47）)n
(Ser Gly Gly Gly Gly（配列番号：48）)n
［nは1以上の整数である］等を挙げることができる。
【０１０１】
ペプチドリンカーのアミノ酸配列は、目的に応じて当業者が適宜選択することができる。たとえば上記のペプチドリンカーの長さを決定する「n」は、通常1〜5、好ましくは1〜3、より好ましくは1または2である。
【０１０２】
合成化合物リンカー（化学架橋剤）は、ペプチドの架橋に通常用いられている架橋剤、例えば、N-ヒドロキシスクシンイミド（NHS）ジスクシンイミジルスベレート（DSS）、ビス（スルホスクシンイミジル）スベレート（BS3）、ジチオビス（スクシンイミジルプロピオネート）（DSP）、ジチオビス（スルホスクシンイミジルプロピオネート）（DTSSP）、エチレングリコールビス（スクシンイミジルスクシネート）（EGS）、エチレングリコールビス（スルホスクシンイミジルスクシネート）（スルホ−EGS）、ジスクシンイミジル酒石酸塩（DST）、ジスルホスクシンイミジル酒石酸塩（スルホ−DST）、ビス［2-（スクシンイミドオキシカルボニルオキシ）エチル］スルホン（BSOCOES）、ビス［2-（スルホスクシンイミドオキシカルボニルオキシ）エチル］スルホン（スルホ−BSOCOES）などであり、これらの架橋剤は市販されている。
【０１０３】
4つの抗体可変領域を結合する場合には、通常、3つのリンカーが必要となる。複数のリンカーは、同じでもよいし、異なるリンカーを用いることもできる。
【０１０４】
本発明の抗体には、抗体のアミノ酸配列に1または複数個のアミノ酸残基が付加された抗体も含まれる。また、これら抗体と他のペプチドまたはタンパク質とが融合した融合タンパク質も含まれる。融合タンパク質を作製する方法は、抗体をコードするポリヌクレオチドと他のペプチドまたはポリペプチドをコードするポリヌクレオチドをフレームが一致するように連結してこのDNAを発現ベクターに導入し、このベクターを宿主で発現させればよく、当業者に公知の手法を用いることができる。本発明の抗体との融合に付される他のペプチドまたはポリペプチドとしては、例えば、FLAG（Hopp, T. P. et al., BioTechnology 6, 1204-1210(1988) ）、6個のHis（ヒスチジン）残基からなる6×His、10×His、インフルエンザ凝集素（HA）、ヒトc-mycの断片、VSV-GPの断片、p18HIVの断片、T7-tag、HSV-tag、E-tag、SV40T抗原の断片、lck tag、α-tubulinの断片、B-tag、プロテインCの断片等の公知のペプチドを使用することができる。また、本発明の抗体との融合に付される他のポリペプチドとしては、例えば、GST（グルタチオン−S−トランスフェラーゼ）、HA（インフルエンザ凝集素）、免疫グロブリン定常領域、β−ガラクトシダーゼ、MBP（マルトース結合タンパク質）等が挙げられる。市販されているこれらペプチドまたはポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを、本発明に記載の抗体をコードするポリヌクレオチドと融合させ、そのように得られた融合ポリヌクレオチドを発現させることにより、融合ポリペプチドを調製することができる。
【０１０５】
また本発明に記載の抗体は、ポリエチレングリコール（PEG）やヒアルロン酸などの高分子物質、放射性物質、蛍光物質、発光物質、酵素、トキシン等の各種分子と結合したコンジュゲート抗体でもよい。このようなコンジュゲート抗体は、得られた抗体に化学的な修飾を施すことによって得ることができる。なお、抗体の修飾方法はこの分野においてすでに確立されている（例えば、US 5,057,313、US 5,156,840）。本発明における「抗体」にはこれらのコンジュゲート抗体も包含される。
【０１０６】
また本発明の抗体には、糖鎖が改変された抗体も包含される。
【０１０７】
さらに、本発明で使用される抗体は二重特異性抗体（bispecific antibody）であってもよい。二重特異性抗体とは、異なるエピトープを認識する可変領域を同一の抗体分子内に有する抗体を言う。本発明において、二重特異性抗体はIL-6レセプター分子上の異なるエピトープを認識する二重特異性抗体であってもよいし、一方の抗原結合部位がIL-6レセプターを認識し、他方の抗原結合部位が他の物質を認識する二重特異性抗体とすることもできる。IL-6レセプターを認識する本発明の抗体からなる二重特異性抗体の他方の抗原結合部位が結合する抗原としては、例えば、IL-6, TNFα, TNFR1, TNFR2, CD80, CD86, CD28, CD20, CD19, IL-1α, IL-β, IL-1R, RANKL, RANK, IL-17, IL-17R, IL-23, IL-23R, IL-15, IL-15R, BlyS, リンホトキシンα, リンホトキシンβ, LIGHTリガンド, LIGHT, VLA-4, CD25, IL-12, IL-12R, CD40, CD40L, BAFF, CD52, CD22, IL-32, IL-21, IL-21R, GM-CSF, GM-CSFR, M-CSF, M-CSFR, IFN-α, VEGF, VEGFR, EGF, EGFR, CCR5, APRIL, APRILRなどが挙げられる。
【０１０８】
二重特異性抗体を製造するための方法は公知である。たとえば、認識抗原が異なる2種類の抗体を結合させて、二重特異性抗体を作製することができる。結合させる抗体は、それぞれがH鎖とL鎖を有する1／2分子であっても良いし、H鎖のみからなる1／4分子であっても良い。あるいは、異なるモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマを融合させて、二重特異性抗体産生融合細胞を作製することもできる。さらに、遺伝子工学的手法により二重特異性抗体が作製できる。
【０１０９】
本発明において用いられる抗体は、後述する抗体を産生する細胞や宿主あるいは精製方法により、アミノ酸配列、分子量、等電点または糖鎖の有無や形態などが異なり得る。しかしながら、得られた抗体が、本発明に記載の抗体と同等の機能を有している限り、本発明に含まれると見なされる。例えば、抗体を原核細胞、例えば大腸菌で発現させた場合、元の抗体のアミノ酸配列のN末端にメチオニン残基が付加される。本発明に記載の抗体はこのような抗体も包含する。
【０１１０】
本発明の抗IL-6レセプター抗体などのポリペプチドは当業者に公知の方法により製造することが可能である。
【０１１１】
例えば、得られた抗IL-6レセプター抗体の配列を基に、当業者に公知の遺伝子組換え技術を用いて抗IL-6レセプター抗体を作製することが可能である。具体的には、IL-6レセプターを認識する抗体の配列を基に、この抗体をコードするポリヌクレオチドを構築し、これを発現ベクターに導入した後、適当な宿主細胞で発現させることで抗IL-6レセプター抗体を作製することが可能である（例えば、Co, M. S. et al., J. Immunol. (1994) 152, 2968-2976 ; Better, M. and Horwitz, A. H., Methods Enzymol. (1989) 178, 476-496 ; Pluckthun, A. and Skerra, A., Methods Enzymol. (1989) 178, 497-515 ; Lamoyi, E., Methods Enzymol. (1986) 121, 652-663 ; Rousseaux, J. et al., Methods Enzymol. (1986) 121, 663-669 ; Bird, R. E. and Walker, B. W., Trends Biotechnol. (1991) 9, 132-137参照）。
【０１１２】
従って、本発明は、本発明のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドが導入されたベクターを含む宿主細胞を培養する工程を含む、（i）本発明のポリペプチド、または（ii）本発明のポリペプチドをコードする遺伝子によりコードされたポリペプチドを作製する方法を提供する。
【０１１３】
より具体的には、本発明は、
（a）本発明のポリペプチドをコードする遺伝子が導入されたベクターを含む宿主細胞を培養する工程；および
（b）前記遺伝子によりコードされたポリペプチドを得る工程
を含む、本発明のポリペプチドを作製する方法を提供する。
【０１１４】
ベクターの例としては、M13系ベクター、pUC系ベクター、pBR322、pBluescript、pCR-Scriptなどが挙げられる。また、cDNAのサブクローニング、切り出しを目的とした場合、上記ベクターの他に、例えば、pGEM-T、pDIRECT、pT7などが挙げられる。本発明に記載の抗体を生産する目的においてベクターを使用する場合には、特に、発現ベクターが有用である。発現ベクターとしては、例えば、大腸菌での発現を目的とした場合は、ベクターが大腸菌で増幅されるような特徴を持つほかに、宿主をJM109、DH5α、HB101、XL1-Blueなどの大腸菌とした場合においては、大腸菌で効率よく発現できるようなプロモーター、例えば、lacZプロモーター（Ward et al., Nature (1989) 341, 544-546；FASEB J. (1992) 6, 2422-2427）、araBプロモーター（Better et al., Science (1988) 240, 1041-1043）、またはT7プロモーターなどを持っていることが不可欠である。このようなベクターとしては、上記ベクターの他にpGEX-5X-1（Pharmacia）、「QIAexpress system」（Quiagen）、pEGFP、またはpET(この場合、宿主はT7 RNAポリメラーゼを発現しているBL21が好ましい)などが挙げられる。
【０１１５】
また、発現プラスミドのベクターには、抗体分泌のためのシグナル配列が含まれていてもよい。抗体分泌のためのシグナル配列としては、大腸菌のペリプラズムに産生させる場合、pelBシグナル配列（Lei, S. P. et al., J. Bacteriol. (1987) 169, 4379）を使用すればよい。宿主細胞へのベクターの導入は、例えば塩化カルシウム法、エレクトロポレーション法を用いて行うことができる。
【０１１６】
大腸菌以外にも、例えば、本発明に記載の抗体を製造するためのベクターとしては、哺乳動物由来の発現ベクター（例えば、pcDNA3（Invitrogen）や、pEF-BOS (Nucleic Acids. Res. 1990, 18(17),p5322)、pEF、pCDM8）、昆虫細胞由来の発現ベクター（例えば「Bac-to-BAC baculovirus expression system」（Gibco-BRL）、pBacPAK8）、植物由来の発現ベクター（例えばpMH1、pMH2）、動物ウィルス由来の発現ベクター（例えば、pHSV、pMV、pAdexLcw）、レトロウィルス由来の発現ベクター（例えば、pZIPneo）、酵母由来の発現ベクター（例えば、「Pichia Expression Kit」（Invitrogen）、pNV11、SP-Q01）、枯草菌由来の発現ベクター（例えば、pPL608、pKTH50）が挙げられる。
【０１１７】
CHO細胞、COS細胞、NIH3T3細胞等の動物細胞での発現を目的とした場合には、発現プラスミドのベクターが細胞内で発現させるために必要なプロモーター、例えばSV40プロモーター（Mulligan et al., Nature (1979) 277, 108）、MMLV-LTRプロモーター、EF1αプロモーター（Mizushima et al., Nucleic Acids Res. (1990) 18, 5322）、CMVプロモーターなどを持っていることが不可欠であり、細胞への形質転換を選択するための遺伝子（例えば、薬剤（ネオマイシン、G418など）により判別できるような薬剤耐性遺伝子）を有すればさらに好ましい。このような特性を有するベクターとしては、例えば、pMAM、pDR2、pBK-RSV、pBK-CMV、pOPRSV、pOP13などが挙げられる。
【０１１８】
さらに、遺伝子を安定的に発現させ、かつ、細胞内での遺伝子のコピー数の増幅を目的とする場合には、核酸合成経路を欠損したCHO細胞にそれを相補するDHFR遺伝子を有するベクター（例えば、pSV2-dhfr（「Molecular Cloning 2nd edition」 Cold Spring Harbor Laboratory Press, (1989)）など）を導入し、メトトレキセート（MTX）により増幅させる方法が挙げられ、また、遺伝子の一過性の発現を目的とする場合には、SV40 T抗原を発現する遺伝子を染色体上に持つCOS細胞を用いてSV40の複製起点を持つベクター（pcDなど）で形質転換する方法が挙げられる。複製開始点としては、また、ポリオーマウィルス、アデノウィルス、ウシパピローマウィルス（BPV）等の由来のものを用いることもできる。さらに、宿主細胞系で遺伝子コピー数増幅のため、発現ベクターは選択マーカーとして、アミノグリコシドトランスフェラーゼ（APH）遺伝子、チミジンキナーゼ（TK）遺伝子、大腸菌キサンチングアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（Ecogpt）遺伝子、ジヒドロ葉酸還元酵素（dhfr）遺伝子等を含むことができる。
【０１１９】
これにより得られた本発明に記載の抗体は、宿主細胞内または細胞外（培地など）から単離し、実質的に純粋で均一な抗体として精製することができる。抗体の分離、精製は、通常の抗体の精製で使用されている分離、精製方法を使用すればよく、何ら限定されるものではない。例えば、クロマトグラフィーカラム、フィルター、限外濾過、塩析、溶媒沈殿、溶媒抽出、蒸留、免疫沈降、SDS-ポリアクリルアミドゲル電気泳動、等電点電気泳動法、透析、再結晶等を適宜選択し、組み合わせることで、抗体を分離および精製することができる。
【０１２０】
クロマトグラフィーとしては、例えばアフィニティークロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、疎水性クロマトグラフィー、ゲル濾過、逆相クロマトグラフィー、吸着クロマトグラフィー等が挙げられる（Strategies for Protein Purification and Characterization: A Laboratory Course Manual. Ed Daniel R. Marshak et al., Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1996）。これらのクロマトグラフィーは、液相クロマトグラフィー、例えばHPLC、FPLC等の液相クロマトグラフィーを用いて行うことができる。アフィニティークロマトグラフィーに用いるカラムとしては、プロテインAカラム、プロテインGカラムが挙げられる。例えば、プロテインAを用いたカラムとして、Hyper D, POROS, Sepharose FF（GE Amersham Biosciences）等が挙げられる。本発明は、これらの精製方法を用いて高度に精製された抗体も包含する。
【０１２１】
得られた抗体のIL-6レセプターに対する結合活性の測定は、当業者に公知の方法により行うことが可能である。例えば、抗体の抗原結合活性を測定する方法として、ELISA（酵素結合免疫吸着検定法）、EIA（酵素免疫測定法）、RIA（放射免疫測定法）あるいは蛍光抗体法を用いることができる。例えば、酵素免疫測定法を用いる場合、抗原をコーティングしたプレートに、抗体を含む試料、例えば、抗体産生細胞の培養上清や精製抗体を加える。アルカリフォスファターゼ等の酵素で標識した二次抗体を添加し、プレートをインキュベートし、洗浄した後、p-ニトロフェニル燐酸などの酵素基質を加えて吸光度を測定することで抗原結合活性を評価することができる。
【０１２２】
医薬組成物
本発明は、上述のポリペプチドを有効成分として含有する医薬組成物を提供する。本発明の医薬組成物はIL-6が関連する関節リウマチなどの疾患に用いることが可能である。即ち本発明は、上述の抗体を有効成分とする関節リウマチなどの疾患の治療剤も提供する。対象となる疾患の好ましい例として、関節リウマチ、若年性特発性関節炎、全身型若年性特発性関節炎、キャッスルマン病、全身性エリテマトーデス（SLE）、ループス腎炎、クローン病、lymphoma、潰瘍性大腸炎、貧血、血管炎、川崎病、Still病、アミロイドーシス、多発性硬化症、移植、加齢黄斑変性症、強直性脊椎炎、乾癬、乾癬性関節炎、慢性閉塞性肺疾患（COPD）、IgA 腎症、変形性関節症、喘息、糖尿病性腎症、GVHD、子宮内膜症、肝炎(NASH)、心筋梗塞、動脈硬化、セプシス、骨粗しょう症、糖尿病、多発性骨髄腫、前立腺癌、腎癌、B-cell non-Hodgkin's、膵癌、肺癌、食道癌、大腸癌、癌悪液質、癌神経浸潤、心筋梗塞、近視性脈絡膜血管新生、特発性脈絡膜血管新生、ぶどう膜炎、慢性甲状腺炎、遅延性過敏症、接触性皮膚炎、アトピー性皮膚炎、中皮腫、多発性筋炎、皮膚筋炎、汎ぶどう膜炎、前部ぶどう膜炎、中間部ぶどう膜炎、強膜炎、角膜炎、眼窩炎症、視神経炎、糖尿病網膜症、増殖硝子体網膜症、ドライアイ、術後炎症等が挙げられるが、これらに限定されることはない。
【０１２３】
「抗IL-6レセプター抗体を有効成分として含有する」とは、抗IL-6レセプター抗体を活性成分の少なくとも一つとして含むという意味であり、その含有率を制限するものではない。また、本発明の医薬組成物は、上述のポリペプチドと合わせて他の有効成分を含有してもよい。
【０１２４】
なお、本発明の医薬組成物は治療目的だけでなく、予防目的で用いられてもよい。
【０１２５】
本発明において、アミノ酸配列に含有されているアミノ酸は、翻訳後修飾されていてもよい。例えば、ピログルタミル化によるN末端グルタミン（Gln）残基のピログルタミン酸（pGlu）残基への修飾は、当業者に周知である。当然、そのような翻訳後修飾されたアミノ酸は、本発明におけるアミノ酸配列に含まれる。
【０１２６】
本発明に係る抗体に結合する糖鎖は、任意の構造のものであり得る。297位（EUナンバリング）の糖鎖は、任意の糖鎖構造のものであってよく（好ましくは、フコシル化糖鎖）、またはその位置に糖鎖が存在しなくてもよい（例えば、これは、大腸菌において抗体を作製することにより、または糖鎖が297位（EUナンバリング）に結合しないような改変を導入することにより、達成され得る）。
【０１２７】
なお本明細書において引用された全ての先行技術文献は、参照として本明細書に組み入れられる。
【実施例】
【０１２８】
以下本発明を実施例により説明するが、本発明はこれらに制限されると理解されるものではない。
【０１２９】
[実施例1] トシリズマブのIL-6レセプターへの親和性を向上する可変領域変異箇所の同定
トシリズマブ（H鎖 WT-IgG1／配列番号：53、L鎖 WT-κ／配列番号：54）のIL-6レセプターへの親和性を向上させるために、CDR配列に変異を導入したライブラリーを作製し検討した。CDRに変異を導入したライブラリーをスクリーニングした結果、IL-6レセプターへの親和性を向上する変異を見出し、それらを図1にまとめた。これらの変異を組み合わせた高親和性トシリズマブの例として、RDC-23（H鎖RDC23H-IgG1／配列番号：55、L鎖 RDC-23L-κ／配列番号：56）が挙げられる。RDC-23の可溶型IL-6レセプターへのアフィニティーおよびBaF/gp130による生物活性をトシリズマブと比較した（方法は参考例参照）。
【０１３０】
アフィニティーを測定した結果を表1に示した。BaF/gp130による生物活性（IL-6最終濃度 30 ng/mL）を測定した結果を図2に示した。RDC-23は、トシリズマブと比較して約60倍アフィニティーが向上しており、BaF/gp130の100％阻害濃度として約100倍活性が向上していることが見出された。
【０１３１】
（表１）
【０１３２】
[実施例2] トシリズマブの等電点低下による薬物動態を向上する変異の同定
トシリズマブの薬物動態を向上させるために、IL-6レセプターへの結合を大きく低下させることなく可変領域の等電点を低下することができる変異箇所の検討を行った。トシリズマブの立体構造モデルから推察された可変領域変異箇所をスクリーニングした結果、IL-6レセプターへの結合を大きく低下させることなく可変領域の等電点を低下することできる変異箇所を見出し、それらを図3にまとめた。これらの変異を組み合わせた等電点低下トシリズマブの例として、H53/L28（H鎖 H53-IgG1／配列番号：57、L鎖 L28-κ／配列番号：58）が挙げられる。H53/L28の可溶型IL-6レセプターへのアフィニティー、BaF/gp130による生物活性、等電点、および、マウスにおける薬物動態をトシリズマブと比較した（方法は参考例参照）。
【０１３３】
アフィニティーを測定した結果を表2に示した。BaF/gp130による生物活性（IL-6最終濃度 30 ng/mL）を測定した結果を図4に示した。H53/L28は、トシリズマブと比較して約6倍アフィニティーが向上しており、BaF/gp130の100％阻害濃度として数倍程度活性が向上していることが示された。
【０１３４】
（表２）
【０１３５】
当業者に公知の等電点電気泳動により等電点を測定した結果、トシリズマブの等電点は約9.3であり、H53/L28の等電点は約6.5〜6.7であり、H53/L28はトシリズマブと比較して等電点が約2.7低下した。また、可変領域VH/VLの理論等電点をGENETYX(GENETYX CORPORATION)により計算したところ、トシリズマブの理論等電点は9.20であり、H53/L28の理論等電点は4.52であり、H53/L28はトシリズマブと比較して等電点が約4.7低下した。
【０１３６】
等電点を低下させた改変抗体H53/L28の薬物動態を評価するために、トシリズマブとH53/L28の正常マウスにおける薬物動態の比較を行った。トシリズマブおよびH53/L28をマウス（C57BL/6J、日本チャールズリバー）に1 mg/kgで静脈内（IV）および皮下（SC）に単回投与し血漿中濃度推移を評価した。トシリズマブおよびH53/L28の静脈内投与後の血漿中濃度の経時変化を図5に、皮下投与後の血漿中濃度の経時変化を図6に示し、WinNonlin（Pharsight）により得られた薬物動態学的パラメーター（クリアランス（CL）、半減期(T1/2)）を表3に示した。H53/L28の静脈内投与後の血漿中半減期(T1/2)はトシリズマブの約1.3倍に延長し、クリアランスが約1.7倍低下した。H53/L28の皮下投与後のT1/2はトシリズマブの約2倍に延長し、クリアランスが約2.1倍低下した。このようにアミノ酸置換によりトシリズマブの等電点を低下させることによって薬物動態を大幅に向上させることが可能であることが見出された。
【０１３７】
（表３）
【０１３８】
[実施例3] トシリズマブの免疫原性を低下する変異箇所の同定
可変領域に存在するT細胞エピトープによる免疫原性リスクを低減する変異箇所の同定
トシリズマブの可変領域配列に存在するT細胞エピトープをTEPITOPE（Methods. 2004 Dec;34(4):468-75）を用いて解析を行った。その結果、L鎖CDR2に多くのHLAに結合するT細胞エピトープが存在する（免疫原性リスクが高い配列が存在する）ことが予測された。そこで、TEPITOPE解析においてL鎖CDR2の免疫原性リスクを低減させつつ、安定性、結合活性、中和活性を低下させないアミノ酸置換を検討した。
【０１３９】
スクリーニングの結果、以下のようにトシリズマブのL鎖CDR2（配列番号：59）のL51（Kabatナンバリング、Kabat EA et al., 1991． Sequences of Proteins of Immunological Interest, NIH））のスレオニンをグリシンに、L53のアルギニンをグルタミン酸に置換する（配列番号：60）ことで、安定性、結合活性、中和活性を低下させずに免疫原性リスクを低減できることを見出した。
トシリズマブ L鎖CDR2（配列番号：59）
T細胞エピトープ除去トシリズマブ L鎖CDR2（配列番号：60）
【０１４０】
[実施例4] トシリズマブの可変領域フレームワーク配列の完全ヒト化による免疫原性リスクの低減
トシリズマブの可変領域配列において、H鎖FR1のH27, H28, H29, H30およびH鎖FR3のH71（Kabatナンバリング、Kabat EA et al., 1991． Sequences of Proteins of Immunological Interest, NIH））は、トシリズマブのヒト化の過程において結合活性を維持するためにフレームワーク配列でマウス配列が残存している（Cancer Res. 1993 Feb 15;53(4):851-6）。残存するマウス配列は免疫原性リスクを高める原因となりうるため、トシリズマブの免疫原性リスクをより低下するためにフレームワーク配列を完全ヒト化する検討を行った。
【０１４１】
その結果、トシリズマブのH鎖FR1（配列番号：61）を以下のヒト化 H鎖FR1-A（配列番号：62）に置換することで、また、H鎖FR3（配列番号：63）を以下のヒト化 H鎖FR3（配列番号：64）に置換することで、安定性、結合活性、中和活性を低下させずにトシリズマブの全フレームワークを完全ヒト化できることを見出した。
トシリズマブ H鎖FR1（配列番号：61）
ヒト化 H鎖FR1-A（配列番号：62）（生殖系列 IMGT hVH_4_由来）
トシリズマブ H鎖FR3（配列番号：63）
ヒト化 H鎖FR3（配列番号：64）（Mol. Immunol. 2007, 44(4):412-422由来）
【０１４２】
[実施例5] トシリズマブのIL-6レセプターへのpH依存的結合による薬物動態向上のための変異箇所の同定
トシリズマブの薬物動態を向上させる方法の一つは、1分子のトシリズマブが複数個のIL-6レセプターを繰り返し結合および中和するように分子を改良する方法である。トシリズマブは膜型IL-6レセプターに結合後、膜型IL-6レセプターに結合したままインターナライゼーションによって細胞内のエンドソームに取り込まれ、その後、膜型IL-6レセプターに結合したままライソソームへ移行し共にライソソームにより分解されると考えられている。すなわち、通常、1分子のトシリズマブは1分子ないしは2分子の膜型IL-6レセプターに（1価ないしは2価で）結合し、インターナライズ後、ライソソームで分解されると考えられるため、1分子のトシリズマブは1分子ないしは2分子の膜型IL-6レセプターしか結合および中和できない。
【０１４３】
そこで、トシリズマブの中性条件下での結合を維持しつつ酸性条件下での結合のみを大きく低下させるpH依存的結合トシリズマブを作製することが出来れば、図7に示すとおり、pH依存的結合トシリズマブはエンドソーム内で抗原である膜型IL-6レセプターから解離し、エンドソーム内に存在するFcRnに結合することによって血漿中に戻ることができ、血漿中に戻ったpH依存的結合トシリズマブは再度膜型IL-6レセプターに結合することが可能であると考えた。この血漿中での結合とエンドソーム内での解離を繰り返すことで、1分子のトシリズマブが複数分子のIL-6レセプターを繰り返し結合および中和できると考えられ、これによりトシリズマブと比較してpH依存的結合トシリズマブは薬物動態が向上すると考えられた。
【０１４４】
エンドソーム内の酸性条件下においてトシリズマブがIL-6レセプターから解離するためには、酸性条件下における結合が中性条件下と比較して大幅に弱くなる必要がある。細胞表面ではIL-6レセプターに強く結合して中和する必要があるため、細胞表面のpHであるpH7.4においてはトシリズマブと同等かまたはそれ以上にIL-6レセプターに結合する必要がある。エンドソーム内のpHは一般的にpH5.5〜pH6.0であることが報告されている（Nat Rev Mol Cell Biol. 2004 Feb;5(2):121-32.）ことから、pH5.5〜pH6.0においてIL-6レセプターに弱く結合するように改変されたpH依存的結合トシリズマブであれば、エンドソーム内の酸性条件下においてIL-6レセプターから解離すると考えられる。すなわち、細胞表面のpHであるpH7.4においてはIL-6レセプターに強く結合し、エンドソーム内のpHであるpH5.5〜pH6.0においてIL-6レセプターに弱く結合するように改良されたpH依存的結合トシリズマブであれば、1分子で複数個のIL-6レセプターに結合および中和し、薬物動態を向上することが可能であると考えられた。
【０１４５】
トシリズマブのIL-6レセプターへの結合にpH依存性を付与するには、pKaが6.0〜6.5付近に存在し、中性条件下（pH7.4）と酸性条件下（pH5.5〜pH6.0）との間でプロトンの解離状態が変化するヒスチジン残基をトシリズマブの可変領域に導入する方法が考えられた。そこで、トシリズマブの立体構造モデルから推察された可変領域のヒスチジン導入箇所のスクリーニングを実施した。また、トシリズマブの選択された可変領域配列がランダムにヒスチジンに置換されるように設計されたライブラリーを作製しスクリーニングを実施した。スクリーニングは、pH7.4においてIL-6レセプターに結合し、pH5.5ないしはpH5.8でIL-6レセプターから解離する、あるいは、アフィニティーが低下することを指標に実施した。
【０１４６】
その結果、トシリズマブのIL-6レセプターへの結合にpH依存性（pH7.4で結合し、pH5.8で解離する性質）を付与することができる変異箇所を見出し、それらを図8にまとめた。図8のH27のチロシンからヒスチジンへの置換はCDRではなくH鎖のFR1の変異であるが、H27がヒスチジンの配列はEur. J. Immunol. 1992. 22: 1719-1728に記されているとおり、ヒト配列（配列番号：65）として存在するため、以下のフレームワークを用いることで実施例4と合わせて完全ヒト化することが可能である。
【０１４７】
ヒト化H鎖FR1-B（配列番号：65）
これらの変異を組み合わせたpH依存的結合トシリズマブの例として、H3pI/L73（H鎖 H3pI-IgG1／配列番号：66、L鎖 L73-κ／配列番号：67）が挙げられる。H3pI/L73のpH7.4における可溶型IL-6レセプターへのアフィニティー、pH7.4とpH5.8における膜型IL-6レセプターからの解離速度、BaF/gp130による生物活性、および、カニクイザルおよびヒトIL-6レセプタートランスジェニックマウスにおける薬物動態をトシリズマブと比較した（方法は参考例参照）。
【０１４８】
pH7.4における可溶型IL-6レセプターへのアフィニティーを測定した結果を表4に示した。BaF/gp130による生物活性（IL-6最終濃度30 ng/ml）を測定した結果を図9に示した。H3pI/L73は、トシリズマブと比較してほぼ同等のpH7.4における可溶型IL-6レセプターへのアフィニティーおよびBaF/gp130の活性を有していることが示された。
【０１４９】
（表４）
【０１５０】
トシリズマブおよびH3pI/L73のpH7.4とpH5.8における膜型IL-6レセプターへ解離速度を測定した結果を表5に示した。H3pI/L73は、pH5.8における解離速度が速くなり、トシリズマブと比較して膜型IL-6レセプターからの解離速度のpH依存性が約2.6倍向上していることが示された。
【０１５１】
（表５）
【０１５２】
トシリズマブおよびH3pI/L73をカニクイザルに1 mg/kgで静脈内に単回投与し血漿中濃度の経時変化を評価した。トシリズマブおよびH3pI/L73の静脈内投与後の血漿中濃度の経時変化を図10に示した。その結果、H3pI/L73はトシリズマブと比較してカニクイザルにおいて大幅に薬物動態が向上した。
【０１５３】
トシリズマブおよびH3pI/L73をヒトIL-6レセプタートランスジェニックマウス（hIL-6R tgマウス、Proc Natl Acad Sci U S A. 1995 May 23;92(11):4862-6）に25 mg/kgで静脈内に単回投与し血漿中濃度の経時変化を評価した。トシリズマブおよびH3pI/L73の静脈内投与後の血漿中濃度の経時変化を図11に示した。その結果、H3pI/L73はトシリズマブと比較してヒトIL-6レセプタートランスジェニックマウスにおいて大幅に薬物動態が向上した。
【０１５４】
pH依存的結合トシリズマブであるH3pI/L73は、カニクイザルおよびヒトIL-6レセプタートランスジェニックマウスにおいてトシリズマブと比較して薬物動態が大幅に向上したことから、pH7.4で抗原に結合し、pH5.8で抗原から解離する性質を付与することにより、1分子で複数のIL-6レセプターに結合および中和することが可能であると考えられた。また、IL-6レセプターへの結合にH3pI/L73よりもさらに強いpH依存性を付与することに薬物動態がさらに向上することが可能であると考えられた。
【０１５５】
[実施例6] トシリズマブの定常領域の最適化
トシリズマブのH鎖C末端の不均一性の低減
IgG抗体のH鎖C末端配列の不均一性として、C末端アミノ酸のリジン残基の欠損、および、C末端の2つのアミノ酸であるグリシン、リジン両方の欠損によるC末端カルボキシル基のアミド化が報告されている（Anal Biochem. 2007 Jan 1;360(1):75-83.）。トシリズマブにおいても、その主成分は塩基配列上存在するC末端アミノ酸のリジンが翻訳後修飾により欠損した配列であるが、リジンが残存している副成分およびグリシン、リジン両方の欠損によるC末端カルボキシル基のアミド化された副成分も不均一性に寄与する。目的物質/関連物質の不均一性の製造間差を維持しつつ医薬として大量に製造することは容易ではなくコスト増につながる。可能な限り単一物質であることが望まれ、抗体を医薬として開発する上にはこれらの不均一性が低減されていることが望ましい。よって医薬として開発する上ではH鎖C末端の不均一性は存在しないことが望ましい。
【０１５６】
C末端アミノ酸の不均一性を低減させることを目的にC末端アミノ酸の改変を行った。その結果、トシリズマブのH鎖定常領域のC末端のリジンおよびグリシンを塩基配列上あらかじめ欠損させることで、C末端に由来する不均一性を回避することが可能であることが見出された。トシリズマブ、C末端のリジン欠損トシリズマブ（トシリズマブΔK、H鎖 WT-IgG1ΔK／配列番号：68、L鎖 WT-κ／配列番号：54）、および、C末端のリジンおよびグリシン欠損トシリズマブ（トシリズマブΔGK、H鎖 WT-IgG1ΔGK／配列番号：69、L鎖 WT-κ／配列番号：54）の不均一性の評価を陽イオン交換クロマトグラフィーにより実施した。カラムとしてはProPac WCX-10, 4×250 mm (Dionex) を使用し、移動相Aは25 mmol/L MES/NaOH, pH 6.1、移動相Bは25 mmol/L MES/NaOH, 250 mmol/L NaCl, pH 6.1を使用し、適切な流量および勾配を用いて実施した。陽イオン交換クロマトグラフィーによる評価を行った結果を図12に示した。その結果、H鎖定常領域のC末端のリジンだけでなく、H鎖定常領域のC末端のリジンおよびグリシン両方をヌクレオチド配列上であらかじめ欠損させることで、初めてC末端アミノ酸の不均一性を低減可能であることが見出された。ヒト抗体定常領域IgG1、IgG2、IgG4において、C末端配列はいずれもEUナンバリング（Sequences of proteins of immunological interest, NIH Publication No.91-3242 を参照）447番目がリジン、446番目がグリシンになっていることから、本検討で見出されたC末端アミノ酸の不均一性を低減させる方法はIgG2定常領域とIgG4定常領域、あるいはそれらの改変体にも適用可能であると考えられた。
【０１５７】
トシリズマブのIgG2アイソタイプのジスルフィド結合由来の不均一性の低減
トシリズマブのアイソタイプはIgG1であるが、トシリズマブは中和抗体であることから、免疫原性や副作用を考慮した場合、Fcγレセプターへの結合は好ましくない可能性が考えられる。Fcγレセプターへの結合を低下させる方法としては、IgG抗体のアイソタイプをIgG1からIgG2あるいはIgG4に変える方法が考えられ（Ann Hematol. 1998 Jun;76(6):231-48.）、FcγレセプターIへの結合および薬物動態の観点からはIgG4よりはIgG2が望ましいと考えられた（Nat Biotechnol. 2007 Dec;25(12):1369-72）。一方、抗体を医薬として開発するにあたり、そのタンパク質の物理化学的性質、中でも均一性と安定性は極めて重要であり、IgG2アイソタイプは、ヒンジ領域のジスルフィド結合に由来する不均一性が極めて多いことが報告されている（J Biol Chem. 2008 Jun 6;283(23):16206-15.）。ジスルフィド結合に由来する目的物質/関連物質の不均一性の製造間差を維持しつつ医薬として大量に製造することは容易ではなくコスト増につながり、可能な限り単一物質であることが望まれる。よってIgG2アイソタイプの抗体を医薬として開発する上で、安定性を低下させることなくジスルフィド結合由来の不均一性を低減することが望ましい。
【０１５８】
IgG2アイソタイプの不均一性を低減することを目的に各種改変体を検討した結果、IgG2定常領域配列のうち、H鎖のCH1ドメインに存在するEUナンバリング131番目のシステインと133番目のアルギニンをそれぞれセリンとリジンに置換し、さらにH鎖の上流のヒンジに存在するEUナンバリング219番目のシステインをセリンに置換した定常領域であるWT-SKSC（配列番号：70）によって、安定性を低下させることなく不均一性を低減できることが見出された。トシリズマブ-IgG1（H鎖 WT-IgG1／配列番号：53、L鎖 WT-κ／配列番号：54）、トシリズマブ-IgG2（H鎖 WT-IgG2／配列番号：71、L鎖 WT-κ／配列番号：54）、および、トシリズマブ-SKSC（H鎖 WT-SKSC／配列番号：70、L鎖 WT-κ／配列番号：54）を調製し、不均一性および安定性の評価を行った。不均一性の評価は陽イオン交換クロマトグラフィーにより実施した。カラムとしてProPac WCX-10 (Dionex)を用い、移動相Aとして20 mM 酢酸ナトリウム, pH5.0、移動相Bとして20 mM 酢酸ナトリウム, 1 M NaCl, pH5.0を使用し、適切な流量および勾配を用いて実施した。陽イオン交換クロマトグラフィーによる評価を行った結果を図13に示した。安定性の評価は、示走差査型熱量測定（DSC）（VP-DSC、Microcal）による熱変性中間温度（Tm値）の評価により実施した。20 mM 酢酸ナトリウム, 150 mM NaCl, pH6.0におけるDSC測定結果とFabドメインのTm値を図14に示した。
【０１５９】
その結果、トシリズマブ-IgG1と比較してトシリズマブ-IgG2は著しく不均一性が増大するが、トシリズマブ-SKSCにすることによって不均一性は大幅に低減できることが見出された。また、トシリズマブ-IgG1と比較してトシリズマブ-IgG2はDSCにおけるFabドメインの熱変性ピークにおいてヘテロ成分によると考えられる安定性の低い、すなわちTmの低いショルダーピーク（Fab*）の成分が認められるが、トシリズマブ-SKSCにすることによってヘテロ成分によると考えられるTm値の低いショルダーピークは消失し、トシリズマブ-IgG1およびトシリズマブ-IgG2のFabドメインと同等の約94℃のTm値を示したことから、トシリズマブ-SKSCは高い安定性を有していることが見出された。
【０１６０】
トシリズマブの薬物動態を向上するする定常領域変異箇所の同定
上述のとおり、トシリズマブのアイソタイプであるIgG1から、Fcγレセプターへの結合性を低減させ、かつ高い安定性を維持したまま、C末端の不均一性を低減し、かつIgG2アイソタイプの定常領域を有する抗体の不均一性を低減することが可能であることが見出された。さらに、薬物動態に関してもトシリズマブのアイソタイプであるIgG1よりも優れた定常領域であることが望ましい。
【０１６１】
IgG1アイソタイプの定常領域の抗体よりも優れた血漿中半減期を有する定常領域を見出すために、高い安定性を有しIgG2アイソタイプの定常領域の抗体に関する上述の不均一性が低減されたトシリズマブ-SKSCに対して、薬物動態を向上させることを目的に変異箇所をスクリーニングした結果、WT-SKSCに対して、EUナンバリング137番目のグルタミン酸をグリシンに138番目のセリンをグリシンに、268番ヒスチジンをグルタミンに、355番アルギニンをグルタミンに、419番グルタミンをグルタミン酸に置換し、これに加えてH鎖C末端の不均一性を低減するために446番目のグリシンおよび447番目のリジンを欠損させたWT-M58（配列番号：72（アミノ酸配列））を見出した。さらに、一方、IgG1に対して、434番目のアスパラギンをアラニンに置換したWT-M44（配列番号：73（アミノ酸配列））を作製した。さらにM44に対してH鎖C末端の不均一性を低減するために446番目のグリシンおよび447番目のリジンを欠損させたWT-M83（配列番号：74（アミノ酸配列））を作製した。また、WT-M58に対して、434番目のアスパラギンをアラニンに置換したWT-M73（配列番号：75（アミノ酸配列））を作製した。
【０１６２】
トシリズマブ-M44（H鎖 WT-M44／配列番号：73、L鎖 WT-κ／配列番号：54）、トシリズマブ-M58（H鎖 WT-M58／配列番号：72、L鎖 WT-κ／配列番号：54）およびトシリズマブ-M73（H鎖 WT-M73／配列番号：75、L鎖 WT-κ／配列番号：54）を調製し、ヒトFcRnへのアフィニティーおよびヒトFcRnトランスジェニックマウスによる薬物動態の評価を行った（方法は参考例参照）。
【０１６３】
トシリズマブ-IgG1、トシリズマブ-M44、トシリズマブ-M58およびトシリズマブ-M73のヒトFcRnへの結合性の評価をBiacoreにより行った結果、表6に示すとおり、トシリズマブ-M44、トシリズマブ-M58およびトシリズマブ-M73の結合性はトシリズマブ-IgG1よりもそれぞれ約2.7倍、約1.4倍および約3.8倍程度優れていた。
【０１６４】
（表６）
【０１６５】
トシリズマブ-IgG1、トシリズマブ-M44、トシリズマブ-M58およびトシリズマブ-M73のヒトFcRnトランスジェニックマウスにおける薬物動態の評価を行った結果を図15に示した。図15に示すとおり、トシリズマブ-M44、トシリズマブ-M58およびトシリズマブ-M73はいずれもトシリズマブ-IgG1と比較して薬物動態が向上することが見出された。その薬物動態の向上効果はヒトFcRnへの結合能と相関した。なかでもトシリズマブ-M73に関しては、トシリズマブ-IgG1と比較して28日後の血漿中濃度が約16倍向上していたことから、ヒトにおいてもM73の定常領域を有する抗体はIgG1の定常領域を有する抗体と比較して大幅に薬物動態が向上すると考えられた。
【０１６６】
[実施例7] PK/PDが向上した完全ヒト化IL-6レセプター抗体の作製
上記実施例で見出されたトシリズマブの可変領域および定常領域の変異を複数組み合わせたトシリズマブ改変体を作製し、各種スクリーニングを実施した結果、完全ヒト化IL-6レセプター抗体として、Fv3-M73（H鎖 VH4-M73／配列番号：25、L鎖 VL1-κ／配列番号：28）、Fv4-M73（H鎖 VH3-M73／配列番号：26、L鎖 VL3-κ／配列番号：29）、Fv5-M83（H鎖 VH5-M83／配列番号：27、L鎖 VL5-κ／配列番号：30）を見出した。
【０１６７】
作製したFv3-M73、Fv4-M73、およびFv5-M83のIL-6レセプターへのアフィニティーをトシリズマブと比較した（方法は参考例参照）。pH7.4におけるこれらの抗体の可溶型IL-6レセプターへのアフィニティーを測定した結果を表7に示した。また、BaF/gp130の中和活性をトシリズマブおよび対照（参考例の公知の高親和性抗IL-6レセプター抗体、US 2007/0280945におけるVQ8F11-21 hIgG1）と比較した（方法は参考例参照）。これらの抗体のBaF/gp130による生物活性を測定した結果を図16（IL-6最終濃度300 ng/mL：トシリズマブ、対照、Fv5-M83）および図17（IL-6最終濃度30 ng/mL：トシリズマブ、Fv3-M73、Fv4-M73）に示した。表7に示すとおり、Fv3-M73、Fv4-M73は、トシリズマブと比較して2〜3倍程度強いアフィニティーを有し、Fv5-M83はトシリズマブと比較して100倍程度強いアフィニティーを示した（Fv5-M83ではアフィニティーの測定が困難であったため、定常領域をIgG1にしたFv5-IgG1（H鎖 VH5-IgG1／配列番号：76、L鎖 VL5-κ／配列番号：30）を用いてアフィニティーを測定した。定常領域は一般にアフィニティーに影響しないと考えられる）。また、図17に示すとおりFv3-M73、Fv4-M73は、トシリズマブと比較してやや強い活性を示し、図16に示すとおりFv5-M83はトシリズマブと比較して50％阻害濃度として100倍以上の極めて強い活性を有し、且つ、公知の高親和性抗IL-6レセプター抗体である対照と比較しても50％阻害濃度として約10倍程度高い中和活性を示した。
【０１６８】
（表７）
【０１６９】
トシリズマブ、Fv3-M73、および、Fv4-M73のpH7.4とpH5.8における膜型IL-6レセプターからの解離速度を測定した結果を表8に示した（方法は参考例参照）。Fv3-M73およびFv4-M73は、トシリズマブと比較して膜型IL-6レセプターからの解離速度のpH依存性がそれぞれ約11倍および10倍向上していることが示された。実施例5におけるH3pI/L73と比較して、大幅に解離速度のpH依存性が向上していることから、Fv3-M73とFv4-M73の薬物動態はH3pI/L73と比較して大幅に向上していると考えられた。
【０１７０】
（表８）
【０１７１】
トシリズマブ、対照、Fv3-M73、Fv4-M73、およびFv5-M83の等電点を当業者に公知の方法により等電点電気泳動により測定した結果、トシリズマブの等電点は約9.3、対照は約8.4〜8.5、Fv3-M73は約5.7〜5.8、Fv4-M73は約5.6〜5.7、Fv5-M83は5.4〜5.5であり、いずれの抗体もトシリズマブおよび対照と比較して等電点が大幅に低下した。また、可変領域VH/VLの理論等電点をGENETYX(GENETYX CORPORATION)により計算したところ、トシリズマブの理論等電点は9.20、対照は7.79、Fv3-M73は5.49、Fv4-M73は5.01、Fv5-M83は4.27であり、いずれの抗体もトシリズマブおよび対照と比較して等電点が大幅に低下した。実施例2において等電点の低下により薬物動態が向上することが示されていることから、Fv3-M73、Fv4-M73、およびFv5-M83はトシリズマブおよび対照と比較して薬物動態が向上していると考えられた。
【０１７２】
トシリズマブ、Fv3-M73、Fv4-M73、およびFv5-M83の可変領域配列に存在するT細胞エピトープをTEPITOPE（Methods. 2004 Dec;34(4):468-75）を用いて解析を行った。その結果、実施例3に示したとおり、トシリズマブは多くの配列がHLAに結合するT細胞エピトープが存在すると予測されたが、Fv3-M73、Fv4-M73、およびFv5-M83はT細胞エピトープに結合すると予測された配列が大幅に減少した。また、Fv3-M73、Fv4-M73、およびFv5-M83はフレームワークにマウス配列が残存せず完全ヒト化されている。これらのことから、Fv3-M73、Fv4-M73、およびFv5-M83はトシリズマブと比較して大幅に免疫原性リスクが低減されている可能性が示唆された。
【０１７３】
[実施例8] 完全ヒト化IL-6レセプター抗体のサルPK/PD試験
トシリズマブ、対照、Fv3-M73、Fv4-M73、およびFv5-M83をカニクイザルに1 mg/kgで静脈内に単回投与し血漿中濃度の経時変化を評価した（方法は参考例参照）。トシリズマブ、Fv3-M73、Fv4-M73、およびFv5-M83の静脈内投与後の血漿中濃度の経時変化を図18に示した。その結果、Fv3-M73、Fv4-M73、およびFv5-M83はいずれもトシリズマブおよび対照と比較してカニクイザルにおいて大幅に薬物動態が向上した。なかでも、Fv3-M73とFv4-M73の薬物動態はトシリズマブと比較して大幅に向上した。
【０１７４】
カニクイザル膜型IL-6レセプターがどの程度中和されているかの効力を評価するために、抗体投与6日目から18日目(トシリズマブに関しては3日目から10日目)までカニクイザルIL-6 5μg/kgを腰背部に連日皮下投与し、24時間後の各個体のCRP濃度を測定した（方法は参考例参照）。各抗体投与時のCRP濃度の経時変化を図19に示した。カニクイザル可溶型IL-6レセプターがどの程度中和されているかの効力を評価するために、カニクイザル血漿中の非結合型のカニクイザル可溶型IL-6レセプター濃度を測定し、非結合型の可溶型IL-6レセプターの割合を計算した（方法は参考例参照）。各抗体投与時の非結合型の可溶性IL-6レセプターの割合の経時変化を図20に示した。
【０１７５】
Fv3-M73、Fv4-M73、およびFv5-M83はいずれもトシリズマブおよび公知の高親和性抗IL-6レセプター抗体である対照と比較してカニクイザル膜型IL-6レセプターをより持続的に中和し、CRPの増加を長期間抑制した。また、Fv3-M73、Fv4-M73、およびFv5-M83はいずれもトシリズマブおよび対照と比較してカニクイザル可溶型IL-6レセプターをより持続的に中和し、非結合型のカニクイザル可溶型IL-6レセプターの増加を長期間抑制した。これより膜型IL-6レセプターおよび可溶型IL-6レセプターの中和の持続性に関しては、Fv3-M73、Fv4-M73、およびFv5-M83はいずれもトシリズマブおよび対照よりも優れていることが見出された。なかでもFv3-M73とFv4-M73の中和の持続性は極めて優れていた。一方、Fv5-M83のほうがFv3-M73とFv4-M73よりCRPおよび非結合型カニクイザル可溶型IL-6レセプターを低く抑制していることから、Fv5-M83は膜型IL-6レセプターおよび可溶型IL-6レセプターをFv3-M73とFv4-M73および公知の高親和性抗IL-6レセプター抗体である対照よりも強力に中和していると考えられた。これはFv5-M83が対照よりもIL-6レセプターへのアフィニティーが強く、且つ、BaF/gp130における生物活性が強いことがカニクイザルのインビボにおいて反映された結果であると考えられる。
【０１７６】
これらのことから、トシリズマブおよび対照と比較して、Fv3-M73とFv4-M73は抗IL-6レセプター中和抗体として作用の持続性が極めて優れており、投与頻度および投与量を大幅に低減することが可能であり、また、Fv5-M83は抗IL-6レセプター中和抗体として作用の強さに極めて優れており、また作用の持続性にも優れていることが見出された。よってFv3-M73、Fv4-M73、およびFv5-M83はIL-6アンタゴニストとしての医薬として有用であると考えられる。
【０１７７】
[実施例9] Fv4-M73のための安定な緩衝液種の選択
上記のように、Fv4-M73を調製する。実施例6〜7に記載されるように、Fv4-M73は、不均一性、安定性、安全性、および薬物動態の向上のために、非天然の定常領域M73から構成されているため、Fv4-M73の安定性プロファイル（たとえば、最も安定な緩衝液種）は、IgG1などの天然の定常領域から構成された抗体とは異なる可能性がある。天然のIgG1定常領域から構成された抗体は、一般に、ヒスチジン酢酸緩衝液の下で最も安定であることが報告されている（WO/2006/044908）。そこで、Fv4-M73の安定性に対する緩衝液種の効果を試験した。
【０１７８】
Fv4-M73を、6.0のpHを有する（表9に記載されたような）4つの異なる緩衝液製剤で37 mg/mLの最終濃度で製剤化した。試料を、40℃の保存条件の下で、2ヶ月間にわたり、UV検出を伴うサイズ排除クロマトグラフィーおよび陰イオン交換クロマトグラフィーにより分析した。これらの製剤において形成された凝集物の割合（％）を経時的に表示し、図21に示す。凝集物の割合（％）の増加は、抗体の安定性の低下の指標となる。従って、異なる緩衝液の安定化効果を比較するため、割合（％）の増加を指標として使用した。
【０１７９】
図21に示されるように、ヒスチジン-HCl緩衝液を含む製剤（製剤A）およびクエン酸緩衝液を含む製剤（製剤D）が最も安定であり、酢酸緩衝液を含む製剤（製剤C）が最も不安定であった。ヒスチジン-酢酸緩衝液（製剤B）は、ヒスチジン-HCl緩衝液よりわずかに不安定であり、これは、酢酸緩衝液の不安定化効果によるものと考えられる。
【０１８０】
従って、非天然の定常領域を有するFv4-M73は、天然のIgG1抗体のための最も安定な緩衝液種であると報告されているヒスチジン-酢酸緩衝液ではなく、ヒスチジン-HCl緩衝液およびクエン酸緩衝液において最も安定であることが見出された。
【０１８１】
（表９）実施例9において使用された製剤
【０１８２】
方法
サイズ排除クロマトグラフィー（SEC）：抗体の凝集物および断片の存在について抗体製剤をスクリーニングするために、サイズ排除クロマトグラフィーを実施した。試料をサイズ排除G3000 SWXLカラム（TOSOH）に注入した。移動相は、0.5 mL/分の流速で均一濃度で流れる50 mMリン酸ナトリウム、300 mM塩化ナトリウム（pH7.0）とし、溶出したタンパク質を、220 nmにおけるUV吸光度により検出した。検出されたすべてのタンパク質種の相対量を、他の全ての検出されたピークの総面積と比較して、生成物ピークの面積％として報告した。抗体モノマーピークより早く溶出するピークを、凝集物パーセンタイルで記録し、抗体モノマーピークより遅いが緩衝液ピークより早く溶出するピークを、断片パーセンタイルで記録した。
【０１８３】
試料調製:試料を移動相により0.3〜2 mg/mLに希釈し、15マイクロリットルをカラムに注入した。
【０１８４】
陰イオン交換クロマトグラフィー：不均一性の存在について、特に、脱アミド（脱アミドを有するものは、主要ピークの後に酸性成分として溶出する）の存在について、抗体製剤を分析するため、陰イオン交換クロマトグラフィーを実施した。試料を40℃でDEAE-NPRカラム（TOSOH）へ注入した。移動相は、（A）10 mMトリス-HCl（pH7.5）、（B）10 mMトリス-HCl、500 mM塩化ナトリウム（pH7.5）であり、100％移動相A、次いで30分間70％移動相Aおよび30％移動相B、続いて1分間100％移動相Bの勾配で流し、次いで、カラムを洗浄するため1.0 mL/分の流速で4分間維持した。溶出したタンパク質を、280 nmにおけるUV吸光度により検出した。
【０１８５】
試料調製:試料を移動相により0.05〜0.33 mg/mLに希釈し、100マイクロリットルの容量でカラムに注入した。
【０１８６】
[実施例10] 100 mg/mLのFv4-M73の安定性に対するpH、NaCl、およびアルギニン-HClの効果
Fv4-M73を、（表10に記載された）異なる緩衝液製剤で100 mg/mLの最終濃度に製剤化し、25℃および40℃で保存された場合に、2ヶ月間にわたり、UV検出を伴うサイズ排除クロマトグラフィーおよび陰イオン交換クロマトグラフィーにより試料を分析した。また、凍結-融解された試料（-20℃で0.5日間の凍結、室温で30分間の融解）に対しても分析を行った。25℃および40℃での2/4/8週間の保存後の、製剤中に存在する凝集物の割合（％）および凝集物の割合（％）の初期値からの増加分を、図22〜25に示す。凝集物の量の増加は、安定性の低下の指標となる。
【０１８７】
（表１０）実施例10において使用された製剤
【０１８８】
図26に記載された低分子量成分（LMW）は、酸性条件または塩基性条件の下でのヒンジ領域などの脆弱なスポットにおけるペプチド結合の直接加水分解の結果であると考えられる。これは、高温における溶液製剤中のモノクローナル抗体に関して特に一般的である。塩基性条件下で増加した、図27に記載された約22.5分〜26分に溶出した酸性種は、アスパラギン残基の非酵素的脱アミド（抗体の一般的な修飾）の結果であると考えられる。高温で塩基性pHの下で抗体をインキュベートした後、より多くの酸性種が観察されることから、これはモノクローナル抗体の電荷不均一性に関与していることが報告されている。図22〜26の結果を考慮し、Fv4-M73は、凝集物および分解に関して、約5.5〜6.3のpHの溶液において安定であることが見出された。総ピーク面積に対する主要ピークの比率に関して、至適安定性は約5.5〜6.3のpHで観察された（図27〜28）。
【０１８９】
この研究において、20 mM緩衝剤および50 mM NaClを含有する緩衝液（20 mM緩衝液、150 mM NaCl）に100 mM NaClを添加することにより、20 mM緩衝剤および50 mM NaClを含有する緩衝液（20 mM緩衝液、50 mM NaCl）と同等に安定な抗体溶液が得られ、このことから、NaClが安定化効果を有しないことが示唆された。20 mM緩衝剤および50 mM NaClを含有する緩衝液への100 mMアルギニンの添加（20 mM緩衝液、50 mM NaCl、および100 mMアルギニン-HCl）は、凝集物に関して抗体溶液の有意な安定化効果を示し、このことから、アルギニン-HClが有意な安定化効果を有することが示唆された。緩衝剤に関しては、クエン酸緩衝液よりヒスチジン-HCl緩衝液を使用した方が、溶液安定性がわずかに良好であった。
【０１９０】
図29に示されるような凍結-融解試験（「FT」は凍結／融解サイクルの数を示す）に関して、製剤中において、より低いpHまたはより低い塩濃度で、有意な量の凝集物が観察された。20 mM緩衝剤および50 mM NaClを含有する緩衝液への100 mMアルギニンの添加（20 mM緩衝液、50 mM NaCl、100 mMアルギニン-HCl）は、凝集物の形成に関して、100 mM NaClの添加（20 mM緩衝液、150 mM NaCl）より効果的であり、このことから、アルギニン-HClが凍結-融解に対する有意な安定化効果を有することが示唆された。至適安定性は、100 mMアルギニン-HClを含有する約5.0〜6.6の範囲のpHで観察された。
【０１９１】
[実施例11] 100 mg/mLのFv4-M73の安定性に対する糖およびアルギニン-HClの効果
Fv4-M73を、（表11に記載された）異なる緩衝液製剤で100 mg/mLの最終濃度に製剤化し、25℃および40℃で保存し、2ヶ月間にわたり、UV検出を伴うサイズ排除クロマトグラフィーおよび陰イオン交換クロマトグラフィーにより試料を分析した。また、所定の回数の凍結-融解サイクル（-20℃で0.5日間の凍結、室温で30分間の融解）も実施した。製剤に含有されている凝集物の割合（％）の初期値からの増加分を、経時的にプロットし、図30および31に示す。凝集物の量（％）の増加は、安定性の低下の指標となる。
【０１９２】
図30および31に示されるように、製剤FおよびGは、製剤Hより低い安定性を示し、このことから、25℃および40℃で保存された液体条件では、ショ糖およびトレハロースはアルギニン-HClより低い安定化効果を有することが示された。一方、凍結-融解においては、製剤FおよびGは、製剤Hに匹敵するか、またはそれより高い安定性を示したことから、ショ糖またはトレハロースは、凍結-融解においては有意な安定化効果を示すことが示された。
【０１９３】
（表１１）実施例11において使用された製剤
【０１９４】
[実施例12] 200 mg/mLのFv4-M73の安定性；pH、アルギニン-HCl、およびトレハロースの効果
Fv4-M73を、表12に記載されるような6つの異なる製剤で200 mg/mLの最終濃度に製剤化した。
【０１９５】
（表１２）実施例12において使用された製剤
【０１９６】
試料を、3ヶ月間および6ヶ月間、それぞれについて5℃および-20℃でインキュベートした。初期試料、3ヶ月試料、および6ヶ月試料を、実施例9に記載されるようなUV検出を伴うサイズ排除クロマトグラフィーにより分析した。5℃における、3ヶ月後および6ヶ月後のこれらの製剤における凝集物の割合（％）の初期値からの増加分を、図32に示す。-20℃における、3ヶ月後および6ヶ月後のこれらの製剤における凝集物の割合（％）の初期値からの増加分を、図33に示す。
【０１９７】
図32に示されるように、5℃で保存された溶液条件で、Fv4-M73は、明らかに、より低いpHでより安定であり（pH 5.5で最も安定、pH 6.5で最も不安定）、より高いアルギニン濃度でより安定であった（150 mMアルギニン-HClで最も安定、50 mMアルギニン-HClで最も不安定）。50 mMトレハロースの添加は、5℃で保存された溶液条件で、Fv4-M73に対するある程度の安定化効果を示した。抗体医薬品の溶液製剤はしばしば5℃で保存されるため、Fv4-M73のための好ましい溶液製剤は、pH 5.5〜pH 6.0のヒスチジン緩衝液と共に少なくとも100 mMのアルギニン-HClを含有し、必要であれば、追加の安定剤を含有するべきである。
【０１９８】
図33に示されるように、-20℃で保存された凍結条件で、Fv4-M73は、より高いpHでより安定である傾向があり、明らかに、より高いアルギニン濃度でより安定であった（150 mMアルギニン-HClで最も安定、50 mMアルギニン-HClで最も不安定）。50 mMトレハロースの添加は、-20℃で保存された凍結条件で、Fv4-M73に対する有意な安定効果を示した。抗体の原体は、しばしば、-20℃〜-70℃の凍結状態で保存蔵されるが、凍結状態での保管および出荷のコストを考慮すると、-20℃の保存が望ましい。Fv4-M73の-20℃保存のための好ましい原体製剤は、pH 5.5〜pH 6.5のヒスチジン緩衝液および（トレハロースなどの）糖と共に少なくとも100 mMのアルギニン-HClを含有するべきである。
【０１９９】
参考例
組み換え可溶型ヒトIL-6レセプターの調製
抗原であるヒトIL-6レセプターの組み換え可溶型ヒトIL-6レセプターを以下のように調製した。J.Biochem. (1990) 108, 673-676で報告されているN末端側1番目から344番目のアミノ酸配列からなる可溶型ヒトIL-6レセプター（Yamasaki et al., Science (1988) 241, 825-828 (GenBank # X12830)）のCHO細胞定常発現株を作製した。SR344発現CHO細胞から得られた培養上清から、Blue Sepharose 6 FFカラムクロマトグラフィー、SR344に対する特異抗体を固定したカラムによるアフィニティクロマトグラフィー、ゲルろ過カラムクロマトグラフィーの3つのカラムクロマトグラフィーにより、可溶型ヒトIL-6レセプターを精製した。主要ピークとして溶出した画分を最終精製品とした。
【０２００】
組み換え可溶型カニクイザルIL-6レセプター（cIL-6R）の調製
公開されているアカゲザルIL-6レセプター遺伝子配列 (Birney et al., Ensembl 2006, Nucleic Acids Res. 2006 Jan 1;34(Database issue):D556-61.) を元にオリゴDNAプライマーを作製し、カニクイザル膵臓から調製されたcDNAを鋳型とし、プライマーを用いて、PCR法によりカニクイザルIL-6レセプター遺伝子全長をコードするDNA断片を調製した。得られたDNA断片を哺乳動物細胞発現ベクターへ挿入し、これを用いてCHO定常発現株（cyno.sIL-6R産生CHO細胞）を作製した。cyno.sIL-6R産生CHO細胞の培養液をHisTrapカラム（GEヘルスケアバイオサイエンス）で精製後、Amicon Ultra-15 Ultracel-10k（Millipore）を用いて濃縮し、Superdex200pg16/60ゲルろ過カラム（GEヘルスケアバイオサイエンス）でさらに精製を行い、可溶型カニクイザルIL-6レセプター（以下、cIL-6R）の最終精製品とした。
【０２０１】
組み換えカニクイザルIL-6(cIL-6)の調製
カニクイザルIL-6は以下のように調製した。SWISSPROT Accession No.P79341に登録されている212アミノ酸をコードする塩基配列を作成し、哺乳動物細胞発現ベクターにクローニングし、CHO細胞に導入することで定常発現細胞株を作製した（cyno.IL-6産生CHO細胞）。cyno.IL-6産生CHO細胞の培養液をSP-Sepharose/FFカラム（GEヘルスケアバイオサイエンス）で精製後、Amicon Ultra-15 Ultracel-5k（Millipore）を用いて濃縮し、Superdex75pg26/60ゲルろ過カラム（GEヘルスケアバイオサイエンス）でさらに精製を行い、Amicon Ultra-15 Ultracel-5k（Millipore）を用いて濃縮し、カニクイザルIL-6（以下、cIL-6）の最終精製品とした。
【０２０２】
公知の高親和性抗IL-6レセプター抗体の作製
公知の高親和性抗IL-6レセプター抗体として、US 2007/0280945 A1に記載されている高親和性抗IL-6レセプター抗体であるVQ8F11-21 hIgG1（US 2007/0280945 A1, H鎖アミノ酸配列：配列番号：77、L鎖アミノ酸配列：配列番号：78）を発現させるため、哺乳動物細胞発現ベクターを構築した。抗体可変領域については、合成オリゴDNAを組み合わせたPCR法（assembly PCR）により作製し、定常領域についてはIgG1を使用した。Assembly PCR法により抗体可変領域と定常領域を結合させ、哺乳動物発現ベクターへ挿入し、目的のH鎖発現ベクターおよびL鎖発現ベクターを作製した。得られた発現ベクターの塩基配列は当業者に公知の方法で決定した。作製した発現ベクターを用い、発現および精製を行った。発現および精製は実施例1に記載した方法で行い、高親和性抗IL-6レセプター抗体（以降、「対照」と記す）を得た。
【０２０３】
トシリズマブの変異体の作製、発現、および精製
トシリズマブの変異体はQuikChange Site-Directed Mutagenesis Kit（Stratagene）を用いて、添付説明書記載の方法で変異体を作製し、得られたプラスミド断片を哺乳動物細胞発現ベクターに挿入し、目的のH鎖発現ベクターおよびL鎖発現ベクターを作製した。得られた発現ベクターの塩基配列は当業者に公知の方法で決定した。抗体の発現は以下の方法を用いて行った。ヒト胎児腎癌細胞由来HEK293H株（Invitrogen）を10 % ウシ胎児血清 (Invitrogen)を含むDMEM培地(Invitrogen)へ懸濁し、5〜6 × 105個/mLの細胞密度で接着細胞用ディッシュ（直径10 cm, CORNING）の各ディッシュへ10 mLずつプレーティングし、CO2インキュベーター（37℃、5% CO2）内で一昼夜培養した後に、培地を吸引除去し、CHO-S-SFM-II（Invitrogen）培地6.9 mLを添加した。調製したプラスミドをlipofection法により細胞へ導入した。得られた培養上清を回収した後、遠心分離（約2000 g、5分間、室温）して細胞を除去し、さらに0.22μmフィルターMILLEX(R)-GV（Millipore）を通して滅菌して培養上清を得た。得られた培養上清からrProtein A Sepharose（商標）Fast Flow（Amersham Biosciences）を用いて当業者に公知の方法で抗体を精製した。精製抗体濃度は、分光光度計を用いて280 nmでの吸光度を測定した。得られた値からPACE法により算出された吸光係数を用いて抗体濃度を算出した（Protein Science 1995 ; 4 : 2411-2423）。
【０２０４】
ヒトgp130発現BaF3細胞株の樹立
IL-6依存増殖性を示す細胞株を得るために、以下に示すとおり、ヒトgp130を発現したBaF3細胞株の樹立を行った。
【０２０５】
全長ヒトgp130 cDNA（Hibi et al., Cell 1990；63：1149-1157（GenBank # NM_002184））をPCRにより増幅し、pCHOI（Hirata et al., FEBS Letter 1994；356：244-248）のDHFR遺伝子発現部位を除去し、Zeocin耐性遺伝子発現部位を挿入した発現ベクターpCOS2Zeoにクローニングし、pCOS2Zeo/gp130を構築した。全長ヒトIL-6R cDNAをPCRにより増幅し、pcDNA3.1(+)（Invitrogen）にクローニングし、hIL-6R/pcDNA3.1(+)を構築した。
【０２０６】
10μgのpCOS2Zeo/gp130をPBSに懸濁したBaF3細胞（0.8 x 107 cells）に混合し、Gene Pulser（Bio-Rad）を用いて0.33 kV, 950μFDの容量でパルスを加えた。エレクトロポレーション処理により遺伝子導入したBaF3細胞を0.2 ng/mLのマウスインターロイキン-3（Peprotech）、10% ウシ胎児血清（以下FBS、HyClone）を含むRPMI1640培地（Invitrogen）で一昼夜培養し、100 ng/mLのヒトインターロイキン-6（R&D systems）、100 ng/mLのヒトインターロイキン-6可溶性レセプター（R&D systems）および10％ FBSを含むRPMI1640培地を加えて選択し、ヒトgp130発現BaF3細胞株（以下、「BaF3/gp130」）を樹立した。このBaF/gp130は、ヒトインターロイキン-6（R&D systems）および可溶型ヒトIL-6レセプター存在下で増殖することから、抗IL-6レセプター抗体の増殖阻害活性（すなわちIL-6レセプター中和活性）の評価に使用することが可能である。
【０２０７】
ヒトgp130発現BaF3細胞（BaF/gp130）による生物活性評価
IL-6/IL-6レセプター依存性増殖を示すBaF3/gp130を用いて、IL-6レセプター中和活性を評価した。BaF3/gp130を10% FBSを含むRPMI1640培地で3回洗浄した後に、5 x 104 cells/mLとなるように600 ng/mLないしは60 ng/mLのヒトインターロイキン-6（TORAY）（最終濃度は300 ng/mLないしは30 ng/mL）、適当量の可溶型ヒトIL-6レセプターおよび10% FBSを含むRPMI1640培地に懸濁し、96ウェルプレート（CORNING）の各ウェルに50μLずつ分注した。次に、精製した抗体を10% FBSを含むRPMI1640に希釈して、各ウェルに50μLずつ混合した。37℃、5% CO2条件下で、3日間培養し、PBSで2倍に希釈したWST-8試薬（Cell Counting Kit-8、株式会社同仁化学研究所）を20μL/ウェルで加え、直後にSUNRISE CLASSIC（TECAN）を用いて450 nmの吸光度（参照波長620 nm）を測定した。2時間培養した後に、再度450 nmの吸光度（参照波長620 nm）を測定し、2時間の吸光度変化を指標にIL-6レセプター中和活性を評価した。
【０２０８】
Biacoreによる可溶型ヒトIL-6レセプターへの結合評価
Biacore T100（GE Healthcare）を用いて、抗原抗体反応の速度論的解析を行った。センサーチップ上にアミンカップリング法でプロテインAあるいはプロテイン A/Gあるいは抗IgG（γ鎖特異的）F(ab')2を適当量固定化し、次にpH7.4において目的の抗体を結合させ、さらにpH7.4において種々の濃度に調製した可溶型IL-6レセプターを分析物として流し、抗体と可溶型ヒトIL-6レセプターの相互作用を測定した。測定は全て37℃で実施した。測定で得られたセンサーグラムから、動力学的パラメーターである結合速度定数ka（1/Ms）、および解離速度定数kd（1/s）を算出し、その値をもとにKD（M）を算出した。各パラメーターの算出にはBiacore T100 Evaluation Software（GE Healthcare）を用いた。
【０２０９】
Biacoreによる膜型IL-6レセプターへのpH依存的解離評価
Biacore T100（GE Healthcare）を用いてpH5.8, pH7.4における膜型IL-6レセプターへの抗原抗体反応を観測した。センサーチップ上に固定化した可溶型ヒトIL-6レセプターへの結合を測定することで、膜型IL-6レセプターへの結合を評価した。SR344を当業者に公知の方法に従ってビオチン化し、ストレプトアビジンとビオチンの親和性を利用し、ストレプトアビジンを介してビオチン化可溶型ヒトIL-6レセプターをセンサーチップ上に固定化した。測定は全て37℃で実施し、移動相の緩衝液は10 mM MES pH5.8, 150 mM NaCl, 0.05% Tween20とし、そこにpH依存的結合クローンをpH7.4の条件下で注入して可溶型ヒトIL-6レセプターと結合させたのち（注入試料の緩衝液は10 mM MES pH7.4, 150 mM NaCl, 0.05% Tween20）、移動相のpHである5.8で各クローンのpH依存的な解離を観測した。試料濃度を0.25μg/mLとし、10 mM MES pH7.4, 150 mM NaCl, 0.05 % Tween20で結合させ、10 mM MES pH5.8, 150 mM NaCl, 0.05% Tween20で解離させたときのpH5.8における解離相のみBiacore T100 Evaluation Software（GE Healthcare）を用いプロットすることにより、pH5.8における解離速度定数（kd(1/s)）を算出した。同様にまた、試料濃度を0.5μg/mLとし、10 mM MES pH7.4, 150 mM NaCl, 0.05% Tween20で結合させ、10 mM MES pH7.4, 150 mM NaCl, 0.05% Tween20で解離させたときのpH7.4における解離相のみBiacore T100 Evaluation Software（GE Healthcare）を用いプロットすることにより、pH7.4における解離速度定数（kd(1/s)）を算出した。
【０２１０】
ヒトFcRnへの結合評価
FcRnはFcRnとβ2-ミクログロブリンの複合体である。公開されているヒトFcRn遺伝子配列（J. Exp. Med. (1994) 180 (6), 2377-2381）を元に、オリゴDNAプライマーを作製した。ヒトcDNA（Human Placenta Marathon-Ready cDNA, Clontech）を鋳型とし、作製したプライマーを用いPCR法により遺伝子全長をコードするDNA断片を調整した。得られたDNA断片を鋳型に、PCR法によりシグナル領域を含む細胞外領域（Met1-Leu290）をコードするDNA断片を増幅し、動物細胞発現ベクターへ挿入した（ヒトFcRnアミノ酸配列／配列番号：79）。同様に、公開されているヒトβ2-ミクログロブリン遺伝子配列（Proc. Natl. Acad. Sci. USA. (2002) 99 (26), 16899-16903）を元に、オリゴDNAプライマーを作製した。ヒトcDNA（Hu-Placenta Marathon-Ready cDNA, CLONTECH）を鋳型とし、作製したプライマーを用いPCR法により遺伝子全長をコードするDNA断片を調製した。得られたDNA断片を鋳型に、PCR法によりシグナル領域を含むβ2-ミクログロブリン全長（Met1-Met119）をコードするDNA断片を増幅し、哺乳動物細胞発現ベクターへ挿入した（ヒトβ2-ミクログロブリンアミノ酸配列／配列番号：80）。
【０２１１】
可溶型ヒトFcRnの発現は以下の手順で行った。調製したヒトFcRnおよび（ヒトβ2-ミクログロブリンのプラスミドを、10 % ウシ胎児血清 (Invitrogen)を用いたlipofection法により、ヒト胎児腎癌細胞由来HEK293H株（Invitrogen）の細胞へ導入した。得られた培養上清を回収した後、IgG Sepharose 6 Fast Flow（Amersham Biosciences）を用い、（J Immunol. 2002 Nov 1;169(9):5171-80.）の方法に従い精製を行った。その後、HiTrap Q HP（GE Healthcare）により精製を行った。
【０２１２】
マウスにおける抗体血漿中濃度の測定
マウス血漿中抗体濃度測定はELISA法にて当業者に公知の方法で測定した。
【０２１３】
サルPK/PD試験による抗体血漿中濃度、CRP濃度、非結合型可溶型IL-6レセプターの測定
カニクイザル血漿中濃度測定はELISA法にて当業者に公知の方法で測定した。
【０２１４】
CRP濃度はサイアスR CRP（関東化学株式会社）にて、自動分析装置（TBA-120FR、東芝メディカルシステムズ株式会社）を用いて測定した。
【０２１５】
カニクイザル血漿中の非結合型の可溶型カニクイザルIL-6レセプター濃度を以下の通り測定した。カニクイザルの血漿30μLを0.22μmのフィルターカップ（Millipore）において乾燥させた適量のrProtein A Sepharose Fast Flow（GE Healthcare）樹脂に添加することで血漿中に存在する全てのIgG型抗体（カニクイザルIgG、抗ヒトIL-6レセプター抗体および抗ヒトIL-6レセプター抗体-可溶型カニクイザルIL-6レセプター複合体）をプロテインAに吸着させた。その後、高速遠心機でスピンダウンし、パス溶液を回収した。パス溶液にはプロテインAに結合した抗ヒトIL-6レセプター抗体-可溶型カニクイザルIL-6レセプター複合体は含まれないため、プロテインAパス溶液中の可溶型カニクイザルIL-6レセプター濃度を測定することによって、非結合型の可溶型IL-6レセプター濃度を測定可能である。可溶型カニクイザルIL-6レセプター濃度は、上記で作製した可溶型カニクイザルIL-6レセプター（cIL-6R）をスタンダードに用いて、ヒトIL-6レセプター濃度を測定する当業者に公知の方法で測定した。非結合型の可溶型IL-6レセプターの割合は以下の計算式によって計算した。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ポリペプチドおよび／または抗体を含有する製剤、特に、改変された抗IL6レセプター抗体を含有する安定な高濃度液体製剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、様々な抗体製剤が開発され実際に使用されている。これらの製剤の多くは、静脈注射に使用されている。皮下投与では1回の投与当たりの抗体量が大きく（約100 mg〜200 mg）、皮下注射のための容量は一般に制限されるため、皮下注射用の抗体含有製剤を設計するためには、液体中の抗体濃度を増加させることが必要である。
【０００３】
高濃度の抗体を含有する溶液では、不溶性凝集物および／または可溶性凝集物の形成を含む、望ましくない分解が起こる。それらの不溶性凝集物および可溶性凝集物は、抗体分子の会合により、液体状態において形成される可能性が高い。液体製剤が長期間貯蔵された場合、アスパラギン残基の脱アミドにより、抗体分子の生理活性が失われるか、または低下することがある。凍結および融解のサイクルも、分解された抗体分子および凝集した抗体分子の形成を引き起こす。
【０００４】
製剤を長期間貯蔵した後でも、活性成分の低減が抑えられている、安定化された製剤を提供するため、様々な概念が提唱されている。そのような製剤は、緩衝溶液中に活性成分および様々な添加剤を溶解させることにより得られる。長期保管中の二量体形成および脱アミド化が阻害されており、安定であり、かつ皮下投与において使用するのに適当な、高濃度抗体含有製剤を提供する必要がある。
【０００５】
抗体は血漿中での安定性が高く、副作用も少ないことから医薬として注目されている。中でもIgG型の抗体医薬は多数上市されており、現在も数多くの抗体医薬が開発されている（非特許文献1、非特許文献2）。IL-6は様々な自己免疫疾患、炎症性疾患、悪性腫瘍等に関与するサイトカインであり（非特許文献3）、ヒト化抗IL-6レセプターIgG1抗体であるトシリズマブはIL-6レセプターに特異的に結合する。トシリズマブはIL-6の生物学的作用を中和することで、関節リウマチ等のIL-6が関連する疾患の治療薬として利用可能であると考えられている（特許文献1〜3、非特許文献4）。トシリズマブは、日本においてはキャッスルマン病および関節リウマチの治療薬として承認されている（非特許文献5）。
【０００６】
トシリズマブなどのヒト化抗体は第1世代の抗体医薬であり、第1世代の抗体医薬を改良して効力、利便性、およびコストを改善した第2世代の抗体医薬が現在開発されている。第2世代の抗体医薬に適用可能な技術として様々な技術が開発されており、エフェクター機能、抗原結合能、薬物動態、安定性を向上させる、あるいは、免疫原性リスクを低減させる技術等が報告されている。効力を増強させる、あるいは、投与量を低減させる方法として、IgG抗体のFc領域のアミノ酸置換により抗体依存性細胞障害活性（ADCC活性）や補体依存性細胞障害活性（CDC活性）を増強させる技術が報告されている（非特許文献6）。また、抗原結合能、抗原中和能を増強させる技術として、アフィニティーマチュレーション技術（非特許文献7）が報告されており、可変領域の相補性決定領域（CDR）などのアミノ酸に変異を導入することで抗原への結合活性を増強することが可能である。抗原結合能の増強によりインビトロの生物活性を向上させる、あるいは投与量を低減することが可能であり、さらにインビボでの効力を向上させることも可能である（非特許文献8）。現在、抗RSV抗体の第1世代薬であるパリビズマブより優れた効果を発揮するとされるモタビズマブ（アフィニティーマチュレーションにより作製）の臨床試験が行われている（非特許文献9）。抗IL-6レセプター抗体においてはアフィニティーが約0.05 nMの抗体（すなわち、トシリズマブよりアフィニティーが強いとされる）が報告されているが（特許文献4）、0.05 nMより強いアフィニティーを有するヒト抗体あるいはヒト化抗体あるいはキメラ抗体の報告は無い。
【０００７】
現在の抗体医薬が抱える問題として、投与タンパク量が非常に多いことによる高い製造コストが挙げられる。ヒト化抗IL-6レセプターIgG1抗体であるトシリズマブにおいても投与量は8 mg/kg/月程度の静脈内注射が想定されている（非特許文献4）。また投与形態については、慢性的な自己免疫疾患の場合は皮下投与製剤が望ましいとされている。一般的に皮下投与製剤は高濃度製剤であることが必要であり、IgGタイプの抗体製剤の場合、安定性等の点から一般的には100 mg/mL程度の製剤が限度であると考えられる（非特許文献10）。持続的な治療効果を発揮できるよう抗体の血漿中半減期を長くすることで投与タンパク量を小さくし、高い安定性を付与することによって、長い投与間隔での皮下投与を可能にし、低コスト且つ利便性の高い第2世代の抗体医薬を提供することが可能である。
【０００８】
抗体の薬物動態にはFcRnが大きく関与しており、抗体のアイソタイプ間の血漿中半減期の違いに関しては、IgG1およびIgG2が最も血漿中半減期に優れ、IgG3およびIgG4がそれより劣ることが知られている（非特許文献11）。血漿中半減期に優れるIgG1およびIgG2の抗体の血漿中半減期をさらに向上させる方法として、FcRnへの結合を増強する定常領域のアミノ酸置換が報告されている（非特許文献12、13）。また、免疫原性の観点からは定常領域よりも可変領域のアミノ酸置換により血漿中半減期をさらに向上させるほうが望ましいが（特許文献5）、これまで可変領域を改変することによりIL-6レセプター抗体の血漿中半減期を向上させた報告は無い。
【０００９】
バイオ医薬を開発するにあたってもう一つの重要な問題は免疫原性である。一般的にマウス抗体はヒト化することによって免疫原性が低減される。ヒト化する際のテンプレートフレームワークに生殖系配列を用いることにより、免疫原性のリスクはさらに軽減できるとされている（非特許文献14）。しかしながら、完全ヒト抗TNF抗体であるアダリムマブであっても13〜17％と高頻度で免疫原性が出現し、免疫原性が出現した患者においては治療効果の低減が見られている（非特許文献15、16）。ヒト抗体であってもCDRにT細胞エピトープが存在する可能性があり、CDR上のT細胞エピトープが免疫原性の原因となっている可能性がある。T細胞エピトープをインシリコあるいはインビボで予測する方法が報告されているが（非特許文献17、18）、これらの方法を用いて予測されるT細胞エピトープを除去することで、免疫原性リスクを低減することが可能であると考えられる（非特許文献19）。
【００１０】
ヒト化抗IL-6レセプターIgG1抗体であるトシリズマブは、マウスPM1抗体をヒト化したIgG1抗体である。H鎖、L鎖それぞれNEW、REIのヒト配列をテンプレートフレームワークとして用いてCDRグラフティングが行われているが、活性保持に重要なアミノ酸として5アミノ酸がマウス配列としてフレームワークに残存している（非特許文献20）。これまでヒト化抗体であるトシリズマブのフレームワークに残存するマウス配列を活性を低下させること無く完全ヒト化した報告は無い。また、トシリズマブのCDR配列はマウス配列であり、アダリムマブ同様、CDRにT細胞エピトープが存在する可能性があり、免疫原性のリスクは否定できない。トシリズマブの臨床試験において、有効量である8 mg/kgにおいて抗トシリズマブ抗体の出現は認められていないが、4 mg/kgおよび2 mg/kgにおいては該抗体が認められている（特許文献6）。このことから、トシリズマブの免疫原性については改善の余地があると考えられる。しかしながら、アミノ酸置換によりトシリズマブの免疫原性リスクを低減することに関する報告は無かった。
【００１１】
トシリズマブのアイソタイプはIgG1であるが、アイソタイプの違いはすなわち定常領域の配列の違いであり、定常領域の配列はエフェクター機能、薬物動態、物性等に大きく影響を与えると考えられていることから、抗体医薬の開発にとって定常領域の配列の選択は極めて重要である（非特許文献11）。近年、抗体医薬の安全性が非常に重要視されており、TGN1412のPhaseI臨床試験で見られた重大な副作用の原因の一つとして、抗体のFc部分とFcγレセプターの相互作用（エフェクター機能）が考えられている（非特許文献21）。抗原の生物学的作用を中和することが目的の抗体医薬においては、ADCC等のエフェクター機能に重要なFcγレセプターへの結合は不必要であり、副作用の点から考えるとFcγレセプターへの結合はむしろ好ましくない可能性も考えられる。Fcγレセプターへの結合を低下させる方法としては、IgG抗体のアイソタイプをIgG1からIgG2あるいはIgG4に変える方法があるが（非特許文献22）、FcγレセプターIへの結合および薬物動態の観点からはIgG4よりはIgG2が望ましいと考えられる（非特許文献11）。トシリズマブのアイソタイプはIgG1であり、IL-6レセプター中和抗体であることから、ADCC等のエフェクター機能は必要とせず副作用の可能性を考えた場合、アイソタイプはIgG2が望ましい可能性も考えられる。
【００１２】
一方、抗体医薬を開発するにあたり、そのタンパク質の物理化学的性質、中でも均一性と安定性は極めて重要であり、IgG2アイソタイプは、ヒンジ領域のジスルフィド結合に由来する有意な不均一性が存在することが報告されている（非特許文献23）。ジスルフィド結合に由来する目的物質/関連物質の不均一性の製造間差を維持しつつ医薬として大量に製造することは容易ではなくコスト増につながる。したがって、可能な限り単一物質であることが望まれる。さらに抗体重鎖のC末端配列の不均一性として、C末端アミノ酸のリジン残基の欠損、および、C末端の二つのアミノ酸であるグリシン、リジン両方の欠損によるC末端カルボキシル基のアミド化が報告されている（非特許文献24）。IgG2アイソタイプの抗体を医薬として開発する上には高い安定性を維持しつつこれらの不均一性が低減されていることが望ましい。利便性に優れた安定な高濃度の皮下投与製剤を作製するためには、安定性が高いだけでなく、血漿中半減期に関してもトシリズマブのアイソタイプであるIgG1よりも優れていることが望ましい。しかしながら、これまでにIgG2アイソタイプの定常領域の抗体に関する不均一性が低減され、高い安定性を有し、IgG1アイソタイプの定常領域の抗体よりも優れた血漿中半減期を有する定常領域の配列の報告はない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１３】
【特許文献１】WO 92/19759
【特許文献２】WO 96/11020
【特許文献３】WO 96/12503
【特許文献４】WO 2007/143168
【特許文献５】WO 2007/114319
【特許文献６】WO 2004/096273
【非特許文献】
【００１４】
【非特許文献１】Janice M Reichert, Clark J Rosensweig, Laura B Faden & Matthew C Dewitz, Monoclonal antibody successes in the clinic, Nature Biotechnology 23, 1073 - 1078 (2005)
【非特許文献２】Pavlou AK, Belsey MJ., The therapeutic antibodies market to 2008., Eur J Pharm Biopharm. 2005 Apr;59(3):389-96.
【非特許文献３】Nishimoto N, Kishimoto T., Interleukin 6: from bench to bedside., Nat Clin Pract Rheumatol. 2006 Nov;2(11):619-26.
【非特許文献４】Maini RN, Taylor PC, Szechinski J, Pavelka K, Broll J, Balint G, Emery P, Raemen F, Petersen J, Smolen J, Thomson D, Kishimoto T; CHARISMA Study Group., Double-blind randomized controlled clinical trial of the interleukin-6 receptor antagonist, Tocilizumab, in European patients with rheumatoid arthritis who had an incomplete response to methotrexate., Arthritis Rheum. 2006 Sep;54(9):2817-29
【非特許文献５】Nishimoto N, Kanakura Y, Aozasa K, Johkoh T, Nakamura M, Nakano S, Nakano N, Ikeda Y, Sasaki T, Nishioka K, Hara M, Taguchi H, Kimura Y, Kato Y, Asaoku H, Kumagai S, Kodama F, Nakahara H, Hagihara K, Yoshizaki K, Kishimoto T. Humanized anti-interleukin-6 receptor antibody treatment of multicentric Castleman disease. Blood. 2005 Oct 15;106(8):2627-32.
【非特許文献６】Kim SJ, Park Y, Hong HJ., Antibody engineering for the development of therapeutic antibodies., Mol Cells. 2005 Aug 31;20(1):17-29. Review.
【非特許文献７】Rothe A, Hosse RJ, Power BE. Ribosome display for improved biotherapeutic molecules. Expert Opin Biol Ther. 2006 Feb;6(2):177-87.
【非特許文献８】Rajpal A, Beyaz N, Haber L, Cappuccilli G, Yee H, Bhatt RR, Takeuchi T, Lerner RA, Crea R., A general method for greatly improving the affinity of antibodies by using combinatorial libraries., Proc Natl Acad Sci U S A. 2005 Jun 14;102(24):8466-71. Epub 2005 Jun 6.
【非特許文献９】Wu H, Pfarr DS, Johnson S, Brewah YA, Woods RM, Patel NK, White WI, Young JF, Kiener PA. Development of Motavizumab, an Ultra-potent Antibody for the Prevention of Respiratory Syncytial Virus Infection in the Upper and Lower Respiratory Tract. J Mol Biol. 2007, 368, 652-665
【非特許文献１０】Shire SJ, Shahrokh Z, Liu J. Challenges in the development of high protein concentration formulations. J Pharm Sci. 2004 Jun;93(6):1390-402.
【非特許文献１１】Salfeld JG. Isotype selection in antibody engineering.Nat Biotechnol. 2007 Dec;25(12):1369-72.
【非特許文献１２】Hinton PR, Xiong JM, Johlfs MG, Tang MT, Keller S, Tsurushita N., An engineered human IgG1 antibody with longer serum half-life., J Immunol. 2006 Jan 1;176(1):346-56
【非特許文献１３】Ghetie V, Popov S, Borvak J, Radu C, Matesoi D, Medesan C, Ober RJ, Ward ES., Increasing the serum persistence of an IgG fragment by random mutagenesis., Nat Biotechnol. 1997 Jul;15(7):637-40
【非特許文献１４】Hwang WY, Almagro JC, Buss TN, Tan P, Foote J. Use of human germline genes in a CDR homology-based approach to antibody humanization.Methods. 2005 May;36(1):35-42
【非特許文献１５】Bartelds GM, Wijbrandts CA, Nurmohamed MT, Stapel S, Lems WF, Aarden L, Dijkmans BA, Tak P, Wolbink GJ. Clinical response to adalimumab: The relationship with anti-adalimumab antibodies and serum adalimumab concentrations in rheumatoid arthritis. Ann Rheum Dis. 2007 Mar 9; [Epub ahead of print]
【非特許文献１６】Bender NK, Heilig CE, Droll B, Wohlgemuth J, Armbruster FP, Heilig B. Immunogenicity, efficacy and adverse events of adalimumab in RA patients. Rheumatol Int. 2007 Jan;27(3):269-74.
【非特許文献１７】Van Walle I, Gansemans Y, Parren PW, Stas P, Lasters I. Immunogenicity screening in protein drug development.Expert Opin Biol Ther. 2007 Mar;7(3):405-18.
【非特許文献１８】Jones TD, Phillips WJ, Smith BJ, Bamford CA, Nayee PD, Baglin TP, Gaston JS, Baker MP. Identification and removal of a promiscuous CD4+ T cell epitope from the C1 domain of factor VIII. J Thromb Haemost. 2005 May;3(5):991-1000.
【非特許文献１９】Chirino AJ, Ary ML, Marshall SA. Minimizing the immunogenicity of protein therapeutics. Drug Discov Today. 2004 Jan 15;9(2):82-90.
【非特許文献２０】Sato K, Tsuchiya M, Saldanha J, Koishihara Y, Ohsugi Y, Kishimoto T, Bendig MM. Reshaping a human antibody to inhibit the interleukin 6-dependent tumor cell growth. Cancer Res. 1993 Feb 15;53(4):851-6.
【非特許文献２１】Strand V, Kimberly R, Isaacs JD. Biologic therapies in rheumatology: lessons learned future directions. Nat Rev Drug Discov. 2007 Jan;6(1):75-92.
【非特許文献２２】Gessner JE, Heiken H, Tamm A, Schmidt RE. The IgG Fc receptor family. Ann Hematol. 1998 Jun;76(6):231-48.
【非特許文献２３】Dillon TM, Ricci MS, Vezina C, Flynn GC, Liu YD, Rehder DS, Plant M, Henkle B, Li Y, Deechongkit S, Varnum B, Wypych J, Balland A, Bondarenko PV. Structural and functional characterization of disulfide isoforms of the human IgG2 subclass. J Biol Chem. 2008 Jun 6;283(23):16206-15.
【非特許文献２４】Johnson KA, Paisley-Flango K, Tangarone BS, Porter TJ, Rouse JC. Cation exchange-HPLC and mass spectrometry reveal C-terminal amidation of an IgG1 heavy chain. Anal Biochem. 2007 Jan 1;360(1):75-83.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１５】
本発明の目的は、ヒト化抗IL-6レセプターIgG1抗体であるトシリズマブの可変領域および定常領域のアミノ酸配列を改変することで、抗原中和能を増強させつつ、薬物動態を向上させることで投与頻度を少なくし持続的に治療効果を発揮し、且つ、免疫原性、安全性、物理化学的性質（安定性および均一性）を向上させ、トシリズマブより優れた第2世代の分子からなる製剤（以下本明細書では、「薬剤」または「医薬組成物」と記載する場合もある）を提供することにある。
【００１６】
さらに、本発明は、長期保管または複数回の凍結／融解サイクルの間の二量体化および脱アミドが阻害されており、安定であり、かつ、好ましくは、皮下投与において使用するのに適当な、高濃度ポリペプチドおよび／または抗体含有製剤を提供する。
【００１７】
前記の問題を解決するために精力的な研究を実施し、安定剤としてアミノ酸アルギニンまたはその塩を溶液に添加することにより、安定な高濃度ポリペプチドおよび／または抗体含有製剤を得られることを発見した。
【００１８】
以下、本発明を詳細に説明する。第1世代のヒト化抗IL-6レセプターIgG1抗体トシリズマブより優れている第2世代の分子を鑑みて、安定な製剤を得ることに研究の焦点を置いた。その結果、当該抗体に関して、本発明者らは、トシリズマブの可変領域において、抗原への結合能（アフィニティー）を改良するCDR変異を複数発見した。このことにより、本発明者らは、そのような変異の組み合わせにより大幅にアフィニティーを向上させることに成功した。また本発明者らは、可変領域配列の等電点を低下させる改変を導入することで薬物動態を向上させることに成功した。また本発明者らは、抗原であるIL-6レセプターへの結合にpH依存性を付与することで1分子の抗体で複数回抗原を中和することを可能にし、薬物動態を向上させることに成功した。また本発明者らは、トシリズマブのフレームワークに残存するマウス由来の配列を完全ヒト化し、可変領域においてインシリコで予測されたT細胞エピトープペプチドの数を低減させることで、免疫原性リスクを低減させることに成功した。さらに本発明者らは、トシリズマブの定常領域において、安全性を向上させるためにFcγレセプターへの結合をIgG1よりも低下させ、IgG1よりも薬物動態を向上させ、さらにIgG2のヒンジ領域のジスルフィド結合に由来する不均一性およびH鎖C末端に由来する不均一性を、安定性を低下させることなく低減させた、新規な定常領域配列を見出すことに成功した。これらCDR領域アミノ酸配列の改変、可変領域アミノ酸配列の改変、定常領域アミノ酸配列の改変を適切に組み合わせることでトシリズマブより優れた第2世代の分子の創製に成功した。
【００１９】
本発明は、ヒト化抗IL-6レセプターIgG1抗体であるトシリズマブの可変領域および定常領域のアミノ酸配列の改変により、より優れた抗原（IL-6レセプター）への結合能を有し、より優れた薬物動態を有し、より優れた安全性および物性（安定性、均一性）を有し、かつ免疫原性リスクが低減された、ヒト化抗IL-6レセプターIgG抗体からなる製剤、並びに、それらの医薬組成物の製造方法に関する。より具体的には、下記〔1〕〜〔27〕を提供するものである。
〔1〕（a）配列番号：1（VH4-M73のCDR1）の配列を含むCDR1、配列番号：2（VH4-M73のCDR2）の配列を含むCDR2、および配列番号：3（VH4-M73のCDR3）の配列を含むCDR3を含む、ポリペプチド；
（b）配列番号：4（VH3-M73のCDR1）の配列を含むCDR1、配列番号：5（VH3-M73のCDR2）の配列を含むCDR2、および配列番号：6（VH3-M73のCDR3）の配列を含むCDR3を含む、ポリペプチド；
（c）配列番号：7（VH5-M83のCDR1）の配列を含むCDR1、配列番号：8（VH5-M83のCDR2）の配列を含むCDR2、および配列番号：9（VH5-M83のCDR3）の配列を含むCDR3を含む、ポリペプチド；
（d）配列番号：10（VL1のCDR1）の配列を含むCDR1、配列番号：11（VL1のCDR2）の配列を含むCDR2、および配列番号：12（VL1のCDR3）の配列を含むCDR3を含む、ポリペプチド；
（e）配列番号：13（VL3のCDR1）の配列を含むCDR1、配列番号：14（VL3のCDR2）の配列を含むCDR2、および配列番号：15（VL3のCDR3）の配列を含むCDR3を含む、ポリペプチド；ならびに
（f）配列番号：16（VL5のCDR1）の配列を含むCDR1、配列番号：17（VL5のCDR2）の配列を含むCDR2、および配列番号：18（VL5のCDR3）の配列を含むCDR3を含む、ポリペプチド
より選択される少なくとも一つのポリペプチドを含む、製剤。
〔2〕（a）配列番号：1（VH4-M73のCDR1）の配列を含むCDR1、配列番号：2（VH4-M73のCDR2）の配列を含むCDR2、および配列番号：3（VH4-M73のCDR3）の配列を含むCDR3を含む重鎖可変領域、ならびに配列番号：10（VL1のCDR1）の配列を含むCDR1、配列番号：11（VL1のCDR2）の配列を含むCDR2、および配列番号：12（VL1のCDR3）の配列を含むCDR3を含む軽鎖可変領域を含む、抗体；
（b）配列番号：4（VH3-M73のCDR1）の配列を含むCDR1、配列番号：5（VH3-M73のCDR2）の配列を含むCDR2、および配列番号：6（VH3-M73のCDR3）の配列を含むCDR3を含む重鎖可変領域、ならびに配列番号：13（VL3のCDR1）の配列を含むCDR1、配列番号：14（VL3のCDR2）の配列を含むCDR2、および配列番号：15（VL3のCDR3）の配列を含むCDR3を含む軽鎖可変領域を含む、抗体；
（c）配列番号：7（VH5-M83のCDR1）の配列を含むCDR1、配列番号：8（VH5-M83のCDR2）の配列を含むCDR2、および配列番号：9（VH5-M83のCDR3）の配列を含むCDR3を含む重鎖可変領域、ならびに配列番号：16（VL5のCDR1）の配列を含むCDR1、配列番号：17（VL5のCDR2）の配列を含むCDR2、および配列番号：18（VL5のCDR3）の配列を含むCDR3を含む軽鎖可変領域を含む、抗体；
（d）配列番号：19（VH4-M73の可変領域）の配列を含む重鎖可変領域および配列番号：22（VL1の可変領域）の配列を含む軽鎖可変領域を含む、抗体；
（e）配列番号：20（VH3-M73の可変領域）の配列を含む重鎖可変領域および配列番号：23（VL3の可変領域）の配列を含む軽鎖可変領域を含む、抗体；
（f）配列番号：21（VH5-M83の可変領域）の配列を含む重鎖可変領域および配列番号：24（VL5の可変領域）の配列を含む軽鎖可変領域を含む、抗体；
（g）配列番号：25（VH4-M73）の配列を含む重鎖および配列番号：28（VL1）の配列を含む軽鎖を含む、抗体；
（h）配列番号：26（VH3-M73）の配列を含む重鎖および配列番号：29（VL3）の配列を含む軽鎖を含む、抗体；ならびに
（i）配列番号：27（VH5-M83）の配列を含む重鎖および配列番号：30（VL5）の配列を含む軽鎖を含む、抗体
より選択される少なくとも一つの抗体を含む、製剤。
〔3〕ヒスチジン緩衝液および／またはクエン酸緩衝液を含む、〔1〕または〔2〕に記載の安定な製剤。
〔4〕少なくとも一つの塩基性アミノ酸を含む、〔1〕〜〔3〕のいずれか一項記載の安定な製剤。
〔5〕1〜500mMのヒスチジン緩衝液および／またはクエン酸緩衝液、1〜1500mMの少なくとも一つの塩基性アミノ酸、1〜200mg/mLの抗体、ならびに1〜400mMの糖質を含む、〔1〕〜〔4〕のいずれか一項記載の安定な製剤。
〔6〕塩基性アミノ酸がアルギニンである、〔4〕または〔5〕に記載の製剤。
〔7〕糖質がショ糖またはトレハロースである、〔5〕または〔6〕に記載の製剤。
〔8〕界面活性剤をさらに含む、〔1〕〜〔7〕のいずれか一項記載の製剤。
〔9〕少なくとも10 mg/mlの量のポリペプチドおよび／または抗体を含有する、〔1〕〜〔8〕のいずれか一項記載の製剤。
〔10〕少なくとも50 mg/mlの量のポリペプチドおよび／または抗体を含有する、〔1〕〜〔9〕のいずれか一項記載の製剤。
〔11〕少なくとも80 mg/mlの量のポリペプチドおよび／または抗体を含有する、〔1〕〜〔10〕のいずれか一項記載の製剤。
〔12〕240 mg/ml以下の量のポリペプチドおよび／または抗体を含有する、〔1〕〜〔11〕のいずれか一項記載の製剤。
〔13〕4.5〜7.0の範囲のpHを有する、〔1〕〜〔12〕のいずれか一項記載の製剤。
〔14〕5.5〜6.6の範囲のpHを有する、〔13〕に記載の製剤。
〔15〕液体である、〔1〕〜〔14〕のいずれか一項記載の製剤。
〔16〕調製の間に凍結乾燥に供されていない、〔15〕に記載の製剤。
〔17〕ポリペプチド分子および／または抗体分子の二量体化が低下している、〔1〕〜〔16〕のいずれか一項記載の製剤。
〔18〕ポリペプチド分子および／または抗体分子の二量体化が阻害されている、〔1〕〜〔17〕のいずれか一項記載の製剤。
〔19〕皮下投与用の〔1〕〜〔18〕のいずれか一項記載の製剤。
〔20〕少なくとも一つの塩基性アミノ酸を添加する工程を含む、抗体を含有する溶液を安定化する方法であって、抗体が、
（a）配列番号：1（VH4-M73のCDR1）の配列を含むCDR1、配列番号：2（VH4-M73のCDR2）の配列を含むCDR2、および配列番号：3（VH4-M73のCDR3）の配列を含むCDR3を含む重鎖可変領域、ならびに配列番号：10（VL1のCDR1）の配列を含むCDR1、配列番号：11（VL1のCDR2）の配列を含むCDR2、および配列番号：12（VL1のCDR3）の配列を含むCDR3を含む軽鎖可変領域を含む、抗体；
（b）配列番号：4（VH3-M73のCDR1）の配列を含むCDR1、配列番号：5（VH3-M73のCDR2）の配列を含むCDR2、および配列番号：6（VH3-M73のCDR3）の配列を含むCDR3を含む重鎖可変領域、ならびに配列番号：13（VL3のCDR1）の配列を含むCDR1、配列番号：14（VL3のCDR2）の配列を含むCDR2、および配列番号：15（VL3のCDR3）の配列を含むCDR3を含む軽鎖可変領域を含む、抗体；
（c）配列番号：7（VH5-M83のCDR1）の配列を含むCDR1、配列番号：8（VH5-M83のCDR2）の配列を含むCDR2、および配列番号：9（VH5-M83のCDR3）の配列を含むCDR3を含む重鎖可変領域、ならびに配列番号：16（VL5のCDR1）の配列を含むCDR1、配列番号：17（VL5のCDR2）の配列を含むCDR2、および配列番号：18（VL5のCDR3）の配列を含むCDR3を含む軽鎖可変領域を含む、抗体；
（d）配列番号：19（VH4-M73の可変領域）の配列を含む重鎖可変領域および配列番号：22（VL1の可変領域）の配列を含む軽鎖可変領域を含む、抗体；
（e）配列番号：20（VH3-M73の可変領域）の配列を含む重鎖可変領域および配列番号：23（VL3の可変領域）の配列を含む軽鎖可変領域を含む、抗体；
（f）配列番号：21（VH5-M83の可変領域）の配列を含む重鎖可変領域および配列番号：24（VL5の可変領域）の配列を含む軽鎖可変領域を含む、抗体；
（g）配列番号：25（VH4-M73）の配列を含む重鎖および配列番号：28（VL1）の配列を含む軽鎖を含む、抗体；
（h）配列番号：26（VH3-M73）の配列を含む重鎖および配列番号：29（VL3）の配列を含む軽鎖を含む、抗体；ならびに
（i）配列番号：27（VH5-M83）の配列を含む重鎖および配列番号：30（VL5）の配列を含む軽鎖を含む、抗体
より選択される少なくとも一つの抗体である、方法。
〔21〕少なくとも一つの塩基性アミノ酸を添加する工程を含む、抗体を含有する溶液の凍結／融解サイクルの間、抗体を安定化する方法であって、抗体が、
（a）配列番号：1（VH4-M73のCDR1）の配列を含むCDR1、配列番号：2（VH4-M73のCDR2）の配列を含むCDR2、および配列番号：3（VH4-M73のCDR3）の配列を含むCDR3を含む重鎖可変領域、ならびに配列番号：10（VL1のCDR1）の配列を含むCDR1、配列番号：11（VL1のCDR2）の配列を含むCDR2、および配列番号：12（VL1のCDR3）の配列を含むCDR3を含む軽鎖可変領域を含む、抗体；
（b）配列番号：4（VH3-M73のCDR1）の配列を含むCDR1、配列番号：5（VH3-M73のCDR2）の配列を含むCDR2、および配列番号：6（VH3-M73のCDR3）の配列を含むCDR3を含む重鎖可変領域、ならびに配列番号：13（VL3のCDR1）の配列を含むCDR1、配列番号：14（VL3のCDR2）の配列を含むCDR2、および配列番号：15（VL3のCDR3）の配列を含むCDR3を含む軽鎖可変領域を含む、抗体；
（c）配列番号：7（VH5-M83のCDR1）の配列を含むCDR1、配列番号：8（VH5-M83のCDR2）の配列を含むCDR2、および配列番号：9（VH5-M83のCDR3）の配列を含むCDR3を含む重鎖可変領域、ならびに配列番号：16（VL5のCDR1）の配列を含むCDR1、配列番号：17（VL5のCDR2）の配列を含むCDR2、および配列番号：18（VL5のCDR3）の配列を含むCDR3を含む軽鎖可変領域を含む、抗体；
（d）配列番号：19（VH4-M73の可変領域）の配列を含む重鎖可変領域および配列番号：22（VL1の可変領域）の配列を含む軽鎖可変領域を含む、抗体；
（e）配列番号：20（VH3-M73の可変領域）の配列を含む重鎖可変領域および配列番号：23（VL3の可変領域）の配列を含む軽鎖可変領域を含む、抗体；
（f）配列番号：21（VH5-M83の可変領域）の配列を含む重鎖可変領域および配列番号：24（VL5の可変領域）の配列を含む軽鎖可変領域を含む、抗体；
（g）配列番号：25（VH4-M73）の配列を含む重鎖および配列番号：28（VL1）の配列を含む軽鎖を含む、抗体；
（h）配列番号：26（VH3-M73）の配列を含む重鎖および配列番号：29（VL3）の配列を含む軽鎖を含む、抗体；ならびに
（i）配列番号：27（VH5-M83）の配列を含む重鎖および配列番号：30（VL5）の配列を含む軽鎖を含む、抗体
より選択される少なくとも一つの抗体である、方法。
【００２０】
上記のヒト化抗IL-6レセプターIgG抗体は、増強された効力および向上された薬物動態を有し；従って、より少ない投与頻度で、長時間治療効果を発揮することができる。
【図面の簡単な説明】
【００２１】
【図１】トシリズマブのIL-6レセプターへのアフィニティーを向上させる変異部位のリストである。トシリズマブのHCDR2配列を配列番号：81；HCDR2の変異後配列（上段）を配列番号：82；HCDR2の変異後配列（下段）を配列番号：83；トシリズマブのHCDR3配列を配列番号：84；HCDR3の変異後配列（上段）を配列番号：85；HCDR3の変異後配列（下段）を配列番号：86；トシリズマブのLCDR1配列を配列番号：87；LCDR1の変異後配列（上段）を配列番号：88；LCDR1の変異後配列（下段）を配列番号：89；トシリズマブのLCDR3配列を配列番号：90；LCDR3の変異後配列（上段）を配列番号：91；LCDR3の変異後配列（下段）を配列番号：92に示す。
【図２】トシリズマブおよびRDC-23のBaF/gp130における中和活性を示すグラフである。
【図３】トシリズマブのIL-6レセプターへの結合を大きく低下させることなく、可変領域の等電点を低下させることができる変異部位のリストである。図中の星印は、等電点には影響しないが、ヒト配列への変換のために変異させられた部位である。トシリズマブのHFR1配列を配列番号：93；HFR1の変異後配列を配列番号：94；トシリズマブのHCDR1配列を配列番号：95；HCDR1の変異後配列を配列番号：96；トシリズマブのHFR2配列を配列番号：97；HFR2の変異後配列を配列番号：98；トシリズマブのHCDR2配列を配列番号：81；HCDR2の変異後配列を配列番号：99；トシリズマブのHFR4配列を配列番号：100；HFR4の変異後配列を配列番号：101；トシリズマブのLFR1配列を配列番号：102；LFR1の変異後配列を配列番号：103；トシリズマブのLCDR1配列を配列番号：87；LCDR1の変異後配列を配列番号：104；トシリズマブのLFR2配列を配列番号：105；LFR2の変異後配列を配列番号：106；トシリズマブのLCDR2配列を配列番号：107；LCDR2の変異後配列を配列番号：108および109；トシリズマブのLFR3配列を配列番号：110；LFR3の変異後配列を配列番号：111；トシリズマブのLFR4配列を配列番号：112；LFR4の変異後配列を配列番号：113に示す。
【図４】トシリズマブおよびH53/L28のBaF/gp130における中和活性を示すグラフである。
【図５】マウスにおける静脈内投与後のトシリズマブおよびH53/L28の血漿中濃度の推移を示すグラフである。
【図６】マウスにおける皮下投与後のトシリズマブおよびH53/L28の血漿中濃度の推移を示すグラフである。
【図７】IgG分子が、エンドソーム内で膜型抗原から解離することにより、他の抗原に再結合し得ることを示す模式図である。
【図８】トシリズマブのIL-6レセプターへの結合にpH依存性（pH7.4で結合し、pH5.8で解離する）を付与することができる変異部位のリストである。トシリズマブのHFR1配列を配列番号：93；HFR1の変異後配列を配列番号：114；トシリズマブのHCDR1配列を配列番号：95；HCDR1の変異後配列を配列番号：115；トシリズマブのLCDR1配列を配列番号：87；LCDR1の変異後配列を配列番号：116；トシリズマブのLCDR2配列を配列番号：107；LCDR2の変異後配列を配列番号：117に示す。
【図９】トシリズマブおよびH3pI/L73のBaF/gp130における中和活性を示すグラフである。
【図１０】カニクイザルにおける静脈内投与後のトシリズマブおよびH3pI/L73の血漿中濃度の推移を示すグラフである。
【図１１】ヒトIL-6レセプタートランスジェニックマウスにおける静脈内投与後のトシリズマブおよびH3pI/L73の血漿中濃度の推移を示すグラフである。
【図１２】陽イオン交換クロマトグラフィーによる、トシリズマブ、トシリズマブΔK、およびトシリズマブΔGKのC末端に由来する不均一性の評価の結果を示す図である。
【図１３】陽イオン交換クロマトグラフィーによる、トシリズマブ-IgG1、トシリズマブ-IgG2、およびトシリズマブ-SKSCのジスルフィド結合に由来する不均一性の評価の結果を示す図である。
【図１４】示差走査熱量測定（DSC）により得られたトシリズマブ-IgG1、トシリズマブ-IgG2、およびトシリズマブ-SKSCの変性曲線、ならびに各FabドメインのTm値を示す図である。
【図１５】ヒトFcRnトランスジェニックマウスにおける静脈内投与後のトシリズマブ-IgG1、トシリズマブ-M44、トシリズマブ-M58、およびトシリズマブ-M73の血漿中濃度の推移を示すグラフである。
【図１６】トシリズマブ、対照、およびFv5-M83のBaF/gp130における中和活性を示す図である。
【図１７】トシリズマブ、Fv3-M73、およびFv4-M73のBaF/gp130における中和活性を示すグラフである。
【図１８】カニクイザルにおける静脈内投与後のトシリズマブ、対照、Fv3-M73、Fv4-M73、およびFv5-M83の血漿中濃度の推移を示すグラフである。
【図１９】カニクイザルにおける静脈内投与後のトシリズマブ、対照、Fv3-M73、Fv4-M73、およびFv5-M83のCRP濃度の推移を示すグラフである。
【図２０】カニクイザルにおけるトシリズマブ、対照、Fv3-M73、Fv4-M73、およびFv5-M83の静脈内投与後の遊離可溶型IL-6レセプターの割合の推移（％）を示すグラフである。
【図２１】異なる製剤（A〜D）における抗体Fv4-M73の高分子量成分（HMW）の形成の違いを経時的に示すグラフである。
【図２２】アルギニンの存在下または非存在下における、異なるpH値、緩衝液種、NaCl濃度での、2つの時点（25℃）における抗体Fv4-M73の高分子量成分（ΔHMW：初期値からの増加分）の形成の違いを示すグラフである。
【図２３】アルギニンの存在下または非存在下における、異なるpH値、緩衝液種、NaCl濃度での、一つの時点（25℃）における抗体Fv4-M73の高分子量成分（HMW）の形成の違いを示すグラフである。
【図２４】アルギニンの存在下または非存在下における、異なるpH値、緩衝液種、NaCl濃度での、3つの異なる時点（40℃）における抗体Fv4-M73の高分子量成分（ΔHMW：初期値からの増加分）の形成の違いを示すグラフである。
【図２５】アルギニンの存在下または非存在下における、異なるpH値、緩衝液種、NaCl濃度での、一つの時点（40℃）における抗体Fv4-M73の高分子量成分（HMW）の形成の違いを示すグラフである。
【図２６】アルギニンの存在下または非存在下における、異なるpH値、緩衝液種、NaCl濃度での、3つの異なる時点（40℃）における抗体Fv4-M73の低分子量成分（ΔLMW：初期値からの増加分）の形成の違いを示すグラフである。
【図２７】異なるpH値の下で貯蔵された抗体Fv4-M73の溶液を用いて実施された陰イオン交換クロマトグラフィーの結果を示す図である。
【図２８】3つの異なるpH値、NaClの異なる濃度、アルギニン、2つの異なる緩衝液種の下で貯蔵された抗体Fv4-M73の溶液を用いて実施された陰イオン交換クロマトグラフィーの結果を示す図である。
【図２９】2つの異なる凍結／融解サイクルの数、NaClの異なる濃度、アルギニン、2つの異なる緩衝液種についての抗体Fv4-M73の高分子量成分（ΔHMW：初期値からの増加分）の形成の違いを示すグラフである。
【図３０】4つの異なる製剤（E〜H）について、3つの異なる時点（40℃および25℃）の抗体Fv4-M73の高分子量成分（ΔHMW：初期値からの増加分）の形成の違いを示すグラフである。
【図３１】2つの異なる凍結／融解サイクルの数および4つの異なる製剤（E〜H）の抗体Fv4-M73の高分子量成分（ΔHMW：初期値からの増加分）の形成の違いを示すグラフである。
【図３２】6つの異なる製剤について、5℃における3ヶ月後および6ヶ月後の抗体Fv4-M73の高分子量成分（ΔHMW：初期値からの増加分）の形成の違いを示すグラフである。
【図３３】6つの異なる製剤について、-20℃における3ヶ月後および6ヶ月後の抗体Fv4-M73の高分子量成分（ΔHMW：初期値からの増加分）の形成の違いを示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００２２】
本発明は、
（a）配列番号：1（VH4-M73のCDR1）の配列を含むCDR1、配列番号：2（VH4-M73のCDR2）の配列を含むCDR2、および配列番号：3（VH4-M73のCDR3）の配列を含むCDR3を含むポリペプチド；
（b）配列番号：4（VH3-M73のCDR1）の配列を含むCDR1、配列番号：5（VH3-M73のCDR2）の配列を含むCDR2、および配列番号：6（VH3-M73のCDR3）の配列を含むCDR3を含むポリペプチド；
（c）配列番号：7（VH5-M83のCDR1）の配列を含むCDR1、配列番号：8（VH5-M83のCDR2）の配列を含むCDR2、および配列番号：9（VH5-M83のCDR3）の配列を含むCDR3を含むポリペプチド；
（d）配列番号：10（VL1のCDR1）の配列を含むCDR1、配列番号：11（VL1のCDR2）の配列を含むCDR2、および配列番号：12（VL1のCDR3）の配列を含むCDR3を含むポリペプチド；
（e）配列番号：13（VL3のCDR1）の配列を含むCDR1、配列番号：14（VL3のCDR2）の配列を含むCDR2、および配列番号：15（VL3のCDR3）の配列を含むCDR3を含むポリペプチド；ならびに
（f）配列番号：16（VL5のCDR1）の配列を含むCDR1、配列番号：17（VL5のCDR2）の配列を含むCDR2、および配列番号：18（VL5のCDR3）の配列を含むCDR3を含むポリペプチド
より選択される少なくとも一つのポリペプチドを含む製剤を提供する。
【００２３】
本発明のポリペプチドおよび抗体は、常法に従って製剤化され得る（例えば、Remington's Pharmaceutical Science, latest edition, Mark Publishing Company, Easton, USAを参照のこと）。
【００２４】
本発明において使用されるような「製剤」、「薬剤」、および「医薬組成物」とは、直接、または再構成の後、ヒトなどの動物に投与するのに適しているよう調製されている、活性成分としてポリペプチドおよび／または抗体を含有する液体または固体の製剤を意味する。必要に応じて、製剤は、医薬品として許容される担体および／または添加剤を含有してもよい。例えば、界面活性剤（例えば、PEG、ツイーン（Tween）、プルロニック（Pluronic））、賦形剤、酸化防止剤（例えば、アスコルビン酸、メチオニン）、着色剤、着香剤、保存剤、安定剤、緩衝剤、キレート剤（例えば、EDTA）、懸濁化剤、等張化剤、結合剤、崩壊剤、滑沢剤、流動性促進剤、および矯味剤。
【００２５】
本発明に係るポリペプチドおよび／または抗体を含有する製剤は、好ましくは、安定剤としてHSA（ヒト血清アルブミン）、ゼラチン等のタンパク質を含有しない。
【００２６】
本発明に係るポリペプチドおよび／または抗体を含有する製剤は、好ましくは、10 mg/mL以上、好ましくは50 mg/mL以上、より好ましくは80 mg/mL以上の高濃度でポリペプチドおよび／または抗体を含有する液体の製剤である。濃度は、10〜240 mg/mLであり、10 mg/mLであってもよいし、または、より好ましくは50 mg/mL、さらに好ましくは100〜200 mg/mLであってもよい。
【００２７】
本発明に係る液体の製剤は、好ましくは、凍結乾燥工程を実施することなく作製される。
【００２８】
本発明において使用され得る緩衝剤は、所望の範囲でpHを調整することができ、かつ医薬品として許容されるものである。本発明に係る高濃度ポリペプチドおよび／または抗体含有製剤において、製剤のpHは、好ましくは4.5〜7、より好ましくは5.5〜6.6である。これらの緩衝剤は当業者に公知であり、その例には、リン酸塩（ナトリウムまたはカリウム）および炭酸水素ナトリウムなどの無機塩；クエン酸塩（ナトリウムまたはカリウム）、酢酸ナトリウム、およびコハク酸ナトリウムなどの有機酸；ならびにリン酸、炭酸、クエン酸、コハク酸、リンゴ酸、およびグルコン酸などの酸が含まれる。さらに、トリス緩衝液、MESおよびMOPSなどのグッド緩衝液、ヒスチジン（例えば、ヒスチジン塩酸塩）ならびにグリシンを使用することもできる。本発明に係る高濃度ポリペプチドおよび／または抗体含有製剤において、緩衝液は、好ましくは、ヒスチジン緩衝液またはクエン酸緩衝液であり、ヒスチジン緩衝液が特に好ましい。緩衝溶液の濃度は、一般に、1〜500 mM、好ましくは5〜100 mM、より好ましくは、10〜20 mMである。ヒスチジン緩衝液が使用される場合、緩衝溶液は、好ましくは5〜25 mM、より好ましくは10〜20 mMの濃度でヒスチジンを含有する。
【００２９】
本発明に係る製剤は、さらに界面活性剤を含有してもよい。界面活性剤の典型例には、非イオン性界面活性剤、例えば、モノカプリル酸ソルビタン、モノラウリン酸ソルビタン、およびモノパルミチン酸ソルビタンなどのソルビタン脂肪酸エステル；モノカプリル酸グリセロール、モノミリスチン酸グリセロール、およびモノステアリン酸グリセロールなどのグリセリン脂肪酸エステル；モノステアリン酸デカグリセリル、ジステアリン酸デカグリセリル、およびモノリノール酸デカグリセリルなどのポリグリセロール脂肪酸エステル；モノラウリン酸ポリオキシエチレンソルビタン、モノオレイン酸ポリオキシエチレンソルビタン、モノステアリン酸ポリオキシエチレンソルビタン、モノパルミチン酸ポリオキシエチレンソルビタン、トリオレイン酸ポリオキシエチレンソルビタン、およびトリステアリン酸ポリオキシエチレンソルビタンなどのポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル；テトラステアリン酸ポリオキシエチレンソルビトールおよびテトラオレイン酸ポリオキシエチレンソルビトールなどのポリオキシエチレンソルビトール脂肪酸エステル；モノステアリン酸ポリオキシエチレングリセリルなどのポリオキシエチレングリセリン脂肪酸エステル；ジステアリン酸ポリエチレングリコールなどのポリエチレングリコール脂肪酸エステル；ポリオキシエチレンラウリルエーテルなどのポリオキシエチレンアルキルエーテル；ポリオキシエチレンポリオキシプロピレングリコールエーテル、ポリオキシエチレンポリオキシプロピレンプロピルエーテル、およびポリオキシエチレンポリオキシプロピレンセチルエーテルなどのポリオキシエチレンポリオキシプロピレンアルキルエーテル；ポリオキシエチレンノニルフェニルエーテルなどのポリオキシエチレンアルキルフェニルエーテル；ポリオキシエチレンヒマシ油およびポリオキシエチレン硬化ヒマシ油（ポリオキシエチレン水素化ヒマシ油）などのポリオキシエチレン硬化ヒマシ油；ポリオキシエチレンソルビトールミツロウなどのポリオキシエチレンミツロウ誘導体；ポリオキシエチレンラノリンなどのポリオキシエチレンラノリン誘導体；ポリオキシエチレン脂肪酸アミド、例えば、ポリオキシエチレンオクタデカンアミドなどの6〜18のHLBを有する界面活性剤；陰イオン性界面活性剤、例えば、セチル硫酸ナトリウム、ラウリル硫酸ナトリウム、およびオレイル硫酸ナトリウムなどのC10〜C18アルキル基を有するアルキル硫酸塩；ポリオキシエチレンラウリル硫酸ナトリウムなどの、添加されたエチレンオキシド単位の平均モル数が2〜4であり、アルキル基の炭素原子の数が10〜18であるポリオキシエチレンアルキルエーテル硫酸塩；スルホコハク酸ラウリルナトリウムなどのC8〜C18アルキル基を有するスルホコハク酸アルキル塩；レシチンおよびグリセロリン脂質などの天然の界面活性剤；スフィンゴミエリンなどのスフィンゴリン脂質；ならびにC12〜C18脂肪酸のショ糖エステルが含まれる。これらの界面活性剤は、個別に本発明の製剤に添加されてもよいし、または、これらの界面活性剤のうちの2つ以上が組み合わされて添加されてもよい。
【００３０】
好ましい界面活性剤は、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステルおよびポリオキシエチレンポリオキシプロピレンアルキルエーテルであり、特に好ましいのは、ポリソルベート20、21、40、60、65、80、81、および85、ならびにプルロニック型界面活性剤であり、最も好ましいのは、ポリソルベート20および80、ならびにプルロニックF-68（ポロキサマー（Poloxamer）188）である。
【００３１】
本発明に係る抗体製剤に添加される界面活性剤の量は、一般に、0.0001〜10％(w/v)であり、好ましくは0.001〜5％、より好ましくは0.005〜3％である。
【００３２】
本発明に係る製剤は、さらに、アルギニンなどの酸性アミノ酸のみならず、メチオニン、グリシン、アラニン、フェニルアラニン、トリプトファン、セリン、トレオニン、アスパラギン、グルタミン等のアミノ酸を安定剤として含有してもよい。
【００３３】
本発明に係る抗体含有製剤または抗体含有溶液製剤において、凍結／融解サイクルの間の二量体の形成は、糖質（例えば、糖）を添加することにより阻害され得る。使用され得る糖には、非還元オリゴ糖、例えば、ショ糖およびトレハロースなどの非還元二糖、またはラフィノースなどの非還元三糖が含まれ、特に好ましいのは、非還元オリゴ糖である。好ましい非還元オリゴ糖は、非還元二糖であり、より好ましくはショ糖およびトレハロースである。
【００３４】
本発明に係る抗体含有製剤または抗体含有溶液製剤において、長期保管中の多量体および分解生成物の形成は、糖質（例えば、糖）を添加することにより阻害され得る。使用され得る糖には、マンニトールおよびソルビトールなどの糖アルコール；ならびに非還元オリゴ糖、例えば、ショ糖およびトレハロースなどの非還元二糖、またはラフィノースなどの非還元三糖が含まれ、その中でも非還元オリゴ糖が特に好ましい。好ましい非還元オリゴ糖は、非還元二糖であり、より好ましくはショ糖およびトレハロースである。
【００３５】
糖は、0.1〜500 mg/mL、好ましくは10〜300 mg/mL、より好ましくは25〜100 mg/mLで添加されるべきである。
【００３６】
もう一つの局面において、本発明に係る製剤は、好ましくは、以下の成分から実質的に構成される:
（A）修飾された抗IL-6レセプター抗体；
（B）塩基性アミノ酸（例えば、アルギニン、ヒスチジン、および／またはリジン）；
（C）緩衝剤（例えば、ヒスチジンまたはクエン酸塩）。
【００３７】
目的に応じて、糖質（例えば、糖）および／または界面活性剤が製剤に含まれていてもよい。
【００３８】
安定剤として、メチオニン、グリシン、アラニン、フェニルアラニン、トリプトファン、セリン、トレオニン、アスパラギン、グルタミン等のアミノ酸が含まれていてもよい。
【００３９】
本明細書において「から実質的に構成される」という用語は、製剤に通常添加される成分以外の成分が含有されていないことを意味し、ここで、製剤に通常添加される成分とは、懸濁化剤、可溶化剤、等張化剤、保存剤、吸着阻害剤、希釈剤、媒体、pH調整剤、無痛化（soothing）剤、硫黄含有還元剤、および酸化防止剤などのような、任意の付加的成分である。
【００４０】
懸濁化剤の例には、メチルセルロース、ポリソルベート80、ヒドロキシエチルセルロース、アラビアゴム、粉末トラガカント、カルボキシメチルセルロースナトリウム、およびモノラウリン酸ポリオキシエチレンソルビタンが含まれる。
【００４１】
可溶化剤の例には、ポリオキシエチレン水素化ヒマシ油、ポリソルベート80、ニコチンアミド、モノラウリン酸ポリオキシエチレンソルビタン、マクロゴール、およびヒマシ油脂肪酸エチルエステルが含まれる。
【００４２】
等張化剤の例には、塩化ナトリウム、塩化カリウム、および塩化カルシウムが含まれる。
【００４３】
保存剤の例には、p-ヒドロキシ安息香酸メチル、p-ヒドロキシ安息香酸エチル、ソルビン酸、フェノール、クレゾール、およびクロロクレゾールが含まれる。
【００４４】
吸着阻害剤の例には、ヒト血清アルブミン、レシチン、デキストラン、エチレンオキシド-プロピレンオキシドコポリマー、ヒドロキシプロピルセルロース、メチルセルロース、ポリオキシエチレン水素化ヒマシ油、およびポリエチレングリコールが含まれる。
【００４５】
硫黄含有還元剤の例には、N-アセチルシステイン、N-アセチルホモシステイン、チオクト酸、チオジグリコール、チオエタノールアミン、チオグリセロール、チオソルビトール、チオグリコール酸およびその塩、チオ硫酸ナトリウム、グルタチオン、およびC1〜C7チオアルカンなどの、スルフヒドリル基を有する化合物が含まれる。
【００４６】
酸化防止剤の例には、エリソルビン酸、ジブチルヒドロキシトルエン、ブチルヒドロキシアニソール、αトコフェロール、酢酸トコフェロール、L-アスコルビン酸およびその塩、パルミチン酸L-アスコルビル、ステアリン酸L-アスコルビル、亜硫酸水素ナトリウム、亜硫酸ナトリウム、没食子酸トリアミル、没食子酸プロピル、ならびにエチレンジアミン四酢酸二ナトリウム（EDTA）、ピロリン酸ナトリウム、およびメタリン酸ナトリウムなどのキレート剤が含まれる。
【００４７】
しかしながら、炎症性疾患を含むIL-6関連疾患の予防または処置のために使用され得る本発明に係る製剤（薬剤、医薬組成物）は、上記に限定されず、その他の従来の担体を適切に含有してもよい。特に、例としては、軽質無水ケイ酸、乳糖、結晶セルロース、マンニトール、デンプン、カルメロースカルシウム、カルメロースナトリウム、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ポリビニルアセタールジエチルアミノアセテート、ポリビニルピロリドン、ゼラチン、中鎖脂肪酸トリグリセリド、ポリオキシエチレン水素化ヒマシ油60、ショ糖、カルボキシメチルセルロース、コーンスターチ、および無機塩が含まれる。それらは、その他の低分子量ポリペプチド；血清アルブミン、ゼラチン、および免疫グロブリンなどのタンパク質；ならびにアミノ酸も含有してよい。注射用に水性溶液を調製する場合、抗IL-6レセプター抗体を、例えば、生理食塩水、グルコース、またはその他の佐剤を含有する等張溶液に溶解させる。佐剤には、例えば、D-ソルビトール、D-マンノース、D-マンニトール、および塩化ナトリウムが含まれる。さらに、適切な可溶化剤、例えば、アルコール（エタノール等）、多価アルコール（プロピレングリコール、PEG等）、および非イオン性界面活性剤（ポリソルベート80およびHCO-50）を組み合わせてもよい。
【００４８】
必要であれば、ポリペプチドは、マイクロカプセル（ヒドロキシセルロース、ゼラチン、ポリ(メタクリル酸メチル)等で作成されたマイクロカプセル）に封入されてもよいし、またはコロイド薬物送達系（リポソーム、アルブミンマイクロスフェア、マイクロエマルジョン、ナノ粒子、ナノカプセル等）にされてもよい（例えば、"Remington's Pharmaceutical Science 16th edition", Oslo Ed. (1980)を参照のこと）。さらに、徐放剤として薬剤を調製する方法が公知であり、これらの方法は本ポリペプチドに適用され得る（Langer et al., J. Biomed. Mater. Res. (1981) 15: 167-277；Langer, Chem. Tech. (1982) 12: 98-105；米国特許第3,773,919号；欧州特許出願（EP）第58,481号；Sidman et al., Biopolymers (1983) 22:547-56；EP第133,988号）。さらに、ヒアルロニダーゼを薬剤に添加または混合することにより、皮下投与用の液体容量を増加させることができる（例えば、WO 2004/078140を参照のこと）。
【００４９】
本発明の医薬組成物は、経口投与されてもよいし、非経口投与されてもよいが、好ましくは、非経口投与される。特に、組成物は、注射により、または経皮的に患者に投与される。注射には、例えば、静脈内注射、筋肉内注射、または皮下注射等による全身投与および局所投与が含まれる。組成物は、特に、筋肉内注射により、処置の部位に、または部位の末梢に局所的に注射され得る。経皮剤形には、例えば、軟膏剤、ゲル、クリーム、湿布、およびパッチが含まれ、これらは、局所投与または全身投与され得る。さらに、投与方法は、患者の年齢および症状に応じて適切に選択され得る。投与される用量は、各投与について、例えば、体重1kg当たり0.0001 mg〜100 mg活性成分の範囲より選択され得る。または、組成物がヒト患者に投与される場合、例えば、活性成分は、毎患者について、体重1 kg当たり0.001〜1000 mgの範囲より選択され得る。単一の投与用量は、好ましくは、例えば、約0.01〜50 mg/kg体重の本発明の抗体を含有する。しかしながら、本発明の抗体の用量は、これらの用量に限定はされない。
【００５０】
下記実施例の結果から明らかなように、本発明によれば、１または複数の塩基性アミノ酸（アルギニン、ヒスチジン、および／もしくはリジン、好ましくはアルギニン）、または他のアミノ酸と組み合わせられた塩基性アミノ酸を製剤に添加することにより、長期保管または凍結／融解の間の抗体の二量体化および脱アミドが低い、安定な製剤を得ることができる。
【００５１】
高濃度抗体含有製剤の貯蔵寿命安定性を評価するため、本発明者らは、サイズ排除クロマトグラフィー試験および陰イオン交換クロマトグラフィー試験を実施することにより、様々な添加剤の効果を研究した。その結果、アミノ酸アルギニンを含有する緩衝溶液に高濃度の抗体を溶解させた溶液においては、付加的なアルギニンを含まない溶液よりも、二量体の量が低いことが見出された。これらの結果は、アルギニンが、抗体二量体化を阻害するための安定剤として有効であることを示す。
【００５２】
従って、安定剤としてアルギニンを添加することにより、抗体の二量体化が低下している安定な抗体製剤を提供することができる。
【００５３】
本発明の一つの態様は、緩衝溶液中に抗体およびアルギニンを含有することを特徴とする安定な抗体含有製剤である。
【００５４】
本発明において使用されるアルギニンとしては、任意のアルギニン化合物それ自体、それらの誘導体、およびそれらの塩が使用され得る。L-アルギニンおよびその塩が好ましい。
【００５５】
本発明の製剤がアルギニンを含む場合、アルギニンの濃度は、好ましくは1〜1500 mM、より好ましくは50〜1000 mM、より好ましくは50〜200 mMである。
【００５６】
本発明においてポリペプチドは特に限定されないが、ヒトIL-6レセプターへの結合活性を有する抗原結合物質であることが好ましい。抗原結合物質の好ましい例として、抗体の重鎖可変領域（VH）、抗体の軽鎖可変領域（VL）、抗体の重鎖、抗体の軽鎖、抗体などを挙げることができる。
【００５７】
上述の(a)〜(f)のポリペプチドにおいて、(a)〜(c)のポリペプチドの好ましい例として抗体の重鎖可変領域を挙げることができ、(d)〜(f)のポリペプチドの好ましい例として抗体の軽鎖可変領域を挙げることができる。
【００５８】
これらの可変領域は抗ヒトIL-6レセプター抗体の一部として使用され得る。これらの可変領域が用いられた抗ヒトIL-6レセプター抗体は優れた結合活性、優れた薬物動態、優れた安全性、低下した免疫原性、および／または優れた物性を有する。本発明において、優れた薬物動態、あるいは、薬物動態の向上とは、抗体を生体内に投与した際の血漿中濃度の経時変化から算出される薬物動態パラメーターの一つである「クリアランス（CL）」の減少、「濃度曲線下面積（AUC）」の増大、「平均滞留時間」の増大、「血漿中半減期（t1/2）」の増大、のいずれかを意味する。本発明において、優れた物理化学的性質あるいは物理化学的性質の向上とは、特に限定されないが、安定性の向上、不均一性の低減などを意味する。
【００５９】
CDRと連結されるヒト抗体のフレームワーク領域(FR)は、CDRが良好な抗原結合部位を形成するものが選択される。本発明の可変領域に用いられるFRは特に限定されず、如何なるFRが用いられていてもよいが、ヒト由来のFRが用いられることが好ましい。ヒト由来のFRは天然配列を有するFRが用いられてもよいし、必要に応じ、CDRが適切な抗原結合部位を形成するように、天然配列を有するフレームワーク領域の１または複数のアミノ酸を置換、欠失、付加および／または挿入等してもよい。たとえば、アミノ酸を置換したFRを用いた抗体の抗原への結合活性を測定し評価することによって所望の性質を有する変異FR配列が選択できる（Sato, K. et al., Cancer Res.（1993）53, 851-856）。
【００６０】
また、上述のCDR配列において１または複数のアミノ酸を置換、欠失、付加および／または挿入等してもよい。１または複数のアミノ酸の置換、欠失、付加および／または挿入後のCDR配列は、結合活性、中和活性、安定性、免疫原性および／または薬物動態において改変前のCDR配列と同等の活性を有していることが好ましい。置換、欠失、付加および／または挿入されるアミノ酸の数は特に限定されないが、好ましくは一つのCDRにつき3アミノ酸以内、さらに好ましくは2アミノ酸以内、より好ましくは1アミノ酸である。
【００６１】
１または複数のアミノ酸残基を目的の他のアミノ酸に置換する方法としては、例えば、部位特異的変異誘発法（Hashimoto-Gotoh, T, Mizuno, T, Ogasahara, Y, and Nakagawa, M. (1995) An oligodeoxyribonucleotide-directed dual amber method for site-directed mutagenesis. Gene 152, 271-275、Zoller, MJ, and Smith, M.(1983) Oligonucleotide-directed mutagenesis of DNA fragments cloned into M13 vectors.Methods Enzymol. 100, 468-500、Kramer,W, Drutsa,V, Jansen,HW, Kramer,B, Pflugfelder,M, and Fritz,HJ(1984) The gapped duplex DNA approach to oligonucleotide-directed mutation construction. Nucleic Acids Res. 12, 9441-9456、Kramer W, and Fritz HJ(1987) Oligonucleotide-directed construction of mutations via gapped duplex DNA Methods. Enzymol. 154, 350-367、Kunkel,TA(1985) Rapid and efficient site-specific mutagenesis without phenotypic selection.Proc Natl Acad Sci U. S. A. 82, 488-492）が挙げられる。該方法を用いて、抗体の所望のアミノ酸を目的の他のアミノ酸に置換することができる。また、他のアミノ酸に置換する方法としては、フレームワークシャッフリング（Mol Immunol. 2007 Apr;44(11):3049-60）およびCDR repair（US2006/0122377）等のライブラリー技術を用いることにより、適切なフレームワークおよびCDRにアミノ酸置換することも可能である。
【００６２】
さらに、本発明は以下より選択される少なくとも一つの抗体を含む製剤を提供する。
(a) 配列番号：1（VH4-M73のCDR1）の配列を有するCDR1、配列番号：2（VH4-M73のCDR2）の配列を有するCDR2、および配列番号：3（VH4-M73のCDR3）の配列を有するCDR3を含む重鎖可変領域、ならびに配列番号：10（VL1のCDR1）の配列を有するCDR1、配列番号：11（VL1のCDR2）の配列を有するCDR2、および配列番号：12（VL1のCDR3）の配列を有するCDR3を含む軽鎖可変領域を含む抗体、
(b) 配列番号：4（VH3-M73のCDR1）の配列を有するCDR1、配列番号：5（VH3-M73のCDR2）の配列を有するCDR2、および配列番号：6（VH3-M73のCDR3）の配列を有するCDR3を含む重鎖可変領域、ならびに配列番号：13（VL3のCDR1）の配列を有するCDR1、配列番号：14（VL3のCDR2）の配列を有するCDR2、および配列番号：15（VL3のCDR3）の配列を有するCDR3を含む軽鎖可変領域を含む抗体、
(c) 配列番号：7（VH5-M83のCDR1）の配列を有するCDR1、配列番号：8（VH5-M83のCDR2）の配列を有するCDR2、および配列番号：9（VH5-M83のCDR3）の配列を有するCDR3を含む重鎖可変領域、ならびに配列番号：16（VL5のCDR1）の配列を有するCDR1、配列番号：17（VL5のCDR2）の配列を有するCDR2、および配列番号：18（VL5のCDR3）の配列を有するCDR3を含む軽鎖可変領域を含む抗体、
（d）配列番号：19（VH4-M73の可変領域）の配列を含む重鎖可変領域および配列番号：22（VL1の可変領域）の配列を含む軽鎖可変領域を含む抗体、
（e）配列番号：20（VH3-M73の可変領域）の配列を含む重鎖可変領域および配列番号：23（VL3の可変領域）の配列を含む軽鎖可変領域を含む抗体、
（f）配列番号：21（VH5-M83の可変領域）の配列を含む重鎖可変領域および配列番号：24（VL5の可変領域）の配列を含む軽鎖可変領域を含む抗体、
（g）配列番号：25（VH4-M73）の配列を含む重鎖および配列番号：28（VL1）の配列を含む軽鎖を含む抗体、
（h）配列番号：26（VH3-M73）の配列を含む重鎖および配列番号：29（VL3）の配列を含む軽鎖を含む抗体、ならびに
（i）配列番号：27（VH5-M83）の配列を含む重鎖および配列番号：30（VL5）の配列を含む軽鎖を含む抗体。
【００６３】
上述の抗体は優れた結合活性、優れた薬物動態、優れた安全性、低下した免疫原性、および／または優れた物理化学的性質を有する抗ヒトIL-6レセプター抗体として使用され得る。
【００６４】
本発明のCDRと連結されるヒト抗体のフレームワーク領域は、CDRが良好な抗原結合部位を形成するものが選択される。本発明の可変領域に用いられるFRは特に限定されず、如何なるFRが用いられていてもよいが、ヒト由来のFRが用いられることが好ましい。ヒト由来のFRは天然配列を有するFRが用いられてもよいし、必要に応じ、CDRが適切な抗原結合部位を形成するように、天然配列を有するフレームワーク領域の１または複数のアミノ酸を置換、欠失、付加および／または挿入等してもよい。たとえば、アミノ酸を置換したFRを用いた抗体の抗原への結合活性を測定し評価することによって所望の性質を有する変異FR配列が選択できる（Sato, K. et al., Cancer Res.（1993）53, 851-856）。
【００６５】
また、本発明の抗体で用いられる定常領域は特に限定されず、如何なる定常領域が用いられてもよい。本発明の抗体で用いられる定常領域の好ましい例としては、ヒト由来の定常領域（IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、Cκ、Cλ由来の定常領域など）を挙げることができる。ヒト由来の定常領域は１または複数のアミノ酸が置換、欠失、付加および／または挿入されていてもよい。例えば、ヒト由来の定常領域の好ましい例として、重鎖定常領域の場合には配列番号：31（VH4-M73の定常領域）のアミノ酸配列を有する定常領域、配列番号：32（VH3-M73の定常領域）のアミノ酸配列を有する定常領域、配列番号：33（VH5-M83の定常領域）のアミノ酸配列を有する定常領域を挙げることができ、軽鎖定常領域の場合には配列番号：34（VL1）のアミノ酸配列を有する定常領域、配列番号：35（VL3）のアミノ酸配列を有する定常領域、配列番号：36（VL5）のアミノ酸配列を有する定常領域を挙げることができる。
【００６６】
また、上述のCDR配列において１または複数のアミノ酸を置換、欠失、付加および／または挿入等してもよい。１または複数のアミノ酸の置換、欠失、付加および／または挿入後のCDR配列は、結合活性、中和活性、安定性、免疫原性および／または薬物動態において改変前のCDR配列と同等の活性を有していることが好ましい。置換、欠失、付加および／または挿入されるアミノ酸の数は特に限定されないが、好ましくは一つのCDRにつき3アミノ酸以内、さらに好ましくは2アミノ酸以内、より好ましくは1アミノ酸である。
【００６７】
これらの抗体の対応する可変領域は抗ヒトIL-6レセプターと反応する分子の一部として使用され得る。これらの可変領域は１または複数（例えば5アミノ酸以内、好ましくは3アミノ酸以内）のアミノ酸が置換、欠失、付加および／または挿入していてもよい。１または複数のアミノ酸残基を目的の他のアミノ酸に置換する方法としては、例えば、上述の方法を挙げることができる。
【００６８】
また本発明は、上述の可変領域を含むポリペプチドを含む。
【００６９】
これらの抗体の対応する重鎖および軽鎖は抗ヒトIL-6レセプターと反応する分子の一部として使用され得る。これらの重鎖および軽鎖が用いられた抗ヒトIL-6レセプター抗体は優れた結合活性、優れた薬物動態、優れた安全性、低下した免疫原性、および／または優れた物理化学的性質を有する。
【００７０】
これらの重鎖または軽鎖は、１または複数（例えば10アミノ酸以内、好ましくは5アミノ酸以内、さらに好ましくは3アミノ酸以内）のアミノ酸が置換、欠失、付加および／または挿入していてもよい。１または複数のアミノ酸残基を目的の他のアミノ酸に置換する方法としては、例えば、上述の方法を用いることが可能である。
【００７１】
１または複数のアミノ酸の置換、欠失、付加および／または挿入は可変領域において行われてもよいし、定常領域において行われてもよいし、または可変領域と定常領域の両方において行われてもよい。
【００７２】
本発明はまた、上述の重鎖および軽鎖を含むポリペプチドを含む。
【００７３】
本発明の抗体は、ヒト化（humanized）抗体であることが好ましい。
【００７４】
ヒト化抗体は、再構成（reshaped）ヒト抗体とも称され、これは、ヒト以外の哺乳動物由来の相補性決定領域（CDR）をヒト抗体のCDRへ移植したものであり、その一般的な遺伝子組換え手法も知られている（欧州特許出願公開番号EP 125023号公報、WO 96/02576 号公報参照）。
【００７５】
具体的には、例えば目的のCDRと目的のフレームワーク領域（FR）とを連結するように設計したDNA配列を、CDRおよびFR両方の末端領域にオーバーラップする部分を有するように作製した数個のオリゴヌクレオチドをプライマーとして用いてPCR法により合成する（WO98/13388号公報に記載の方法を参照）。得られたDNAをヒト抗体定常領域もしくはヒト抗体定常領域改変体をコードするDNAと連結し、次いでこれを発現ベクターに組み込んで、このベクターを宿主に導入し産生させることにより得られる（欧州特許出願公開番号EP 239400、国際特許出願公開番号WO 96/02576参照）。
【００７６】
CDRと連結されるヒト抗体のフレームワーク領域は、CDRが良好な抗原結合部位を形成するものが選択される。必要に応じ、抗体の可変領域におけるフレームワーク領域のアミノ酸を置換、欠失、付加および／または挿入等してもよい。
【００７７】
ヒト化抗体の定常領域には、ヒト抗体定常領域またはヒト抗体定常領域において１または複数のアミノ酸が置換、欠失、付加および／または挿入したヒト抗体定常領域改変体を用いることができる。
【００７８】
例えばH鎖では、Cγ1、Cγ2、Cγ3、Cγ4、Cμ、Cδ、Cα1、Cα2、Cεを、L鎖ではCκ、Cλを使用することができる。Cκのアミノ酸配列を配列番号：38に、当該アミノ酸配列をコードする塩基配列を配列番号：37に示す。Cγ1のアミノ酸配列を配列番号：40に、当該アミノ酸配列をコードする塩基配列を配列番号：39に示す。Cγ2のアミノ酸配列を配列番号：42に、当該アミノ酸配列をコードする塩基配列を配列番号：41に示す。Cγ4のアミノ酸配列を配列番号：44に、当該アミノ酸配列をコードする塩基配列を配列番号：43に示す。
【００７９】
また、抗体またはその産生の安定性を向上するために、ヒト抗体C領域を修飾してもよい。ヒト化の際に用いられるヒト抗体は、IgG、IgM、IgA、IgE、IgDなど如何なるアイソタイプのヒト抗体でもよいが、本発明においてはIgGを用いることが好ましい。IgGとしては、IgG1、IgG2、IgG3、IgG4などを用いることが可能である。
【００８０】
なお、ヒト化抗体を作製した後に、可変領域（例えば、CDR、FR）や定常領域中のアミノ酸を他のアミノ酸で置換、欠失、付加および／または挿入等してもよく、本発明のヒト化抗体には、そのようなアミノ酸置換等されたヒト化抗体も含まれる。
【００８１】
本発明の抗体には、IL-6レセプターへの結合活性および／または中和活性を有する限り、IgGに代表される二価抗体だけでなく、一価抗体、若しくはIgMに代表される多価抗体も含まれる。本発明の多価抗体には、全て同じ抗原結合部位を有する多価抗体、または、一部もしくは全て異なる抗原結合部位を有する多価抗体が含まれる。本発明の抗体は、抗体の全長分子に限らず、IL-6レセプタータンパク質に結合する限り、低分子化抗体またはその修飾物であってもよい。
【００８２】
低分子化抗体は、全長抗体（例えば全長IgG等）の一部分が欠損している抗体断片を含む抗体であり、IL-6レセプターへの結合活性および／または中和活性を有する限り特に限定されない。本発明において低分子化抗体は、全長抗体の一部分を含む限り特に限定されないが、VHまたはVLを含んでいることが好ましく、特に好ましくはVHとVLの両方を含む低分子化抗体である。また、本発明の低分子化抗体の他の好ましい例として、抗体のCDRを含む低分子化抗体を挙げることができる。低分子化抗体に含まれるCDRは抗体の6つのCDR全てが含まれていてもよいし、一部のCDRが含まれていてもよい。
【００８３】
本発明における低分子化抗体は、全長抗体よりも分子量が小さくなることが好ましいが、例えば、二量体、三量体、四量体などの多量体を形成すること等もあり、全長抗体よりも分子量が大きくなることもある。
【００８４】
抗体断片の具体例としては、例えば、Fab、Fab'、F(ab')2、Fvなどを挙げることができる。また、低分子化抗体の具体例としては、例えば、Fab、Fab'、F(ab')2、Fv、scFv（single chain Fv）、ダイアボディー、sc(Fv)2（single chain (Fv)2）などを挙げることができる。これら抗体の多量体（例えば、二量体、三量体、四量体、ポリマー）も、本発明の低分子化抗体に含まれる。
【００８５】
抗体断片は、例えば、抗体を酵素で処理して抗体断片を生成させることによって得ることができる。抗体断片を生成する酵素として、例えばパパイン、ペプシン、あるいはプラスミンなどが公知である。あるいは、これら抗体断片をコードする遺伝子を構築し、これを発現ベクターに導入した後、適当な宿主細胞で発現させることができる（例えば、Co, M.S. et al., J. Immunol.（1994）152, 2968-2976、Better, M. & Horwitz, A. H. Methods in Enzymology（1989）178, 476-496、Pluckthun, A. & Skerra, A. Methods in Enzymology（1989）178, 476-496、Lamoyi, E., Methods in Enzymology（1989）121, 652-663、Rousseaux, J. et al., Methods in Enzymology（1989）121, 663-669、Bird, R. E. et al., TIBTECH（1991）9, 132-137参照）。
【００８６】
消化酵素は、抗体断片の特定の位置を切断し、次のような特定の構造の抗体断片を与える。このような酵素的に得られた抗体断片に対して、遺伝子工学的手法を利用すると、抗体の任意の部分を欠失させることができる。
【００８７】
上述の消化酵素を用いた場合に得られる抗体断片は以下のとおりである。
パパイン消化：F(ab)2またはFab
ペプシン消化：F(ab')2またはFab'
プラスミン消化：Facb
【００８８】
本発明における低分子化抗体は、IL-6レセプターへの結合活性および／または中和活性を有する限り、任意の領域を欠失した抗体断片を含むことができる。
【００８９】
「ダイアボディー」は、遺伝子融合により構築された二価（bivalent）の抗体断片を指す（Holliger P et al., 1993, Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90: 6444-6448 (1993)、EP404,097号、WO93/11161号等）。ダイアボディーは、2本のポリペプチド鎖から構成される二量体である。通常、二量体を構成するポリペプチド鎖は、各々、同じ鎖中でVLおよびVHがリンカーにより結合されている。ダイアボディーにおけるリンカーは、一般に、VLとVHが互いに結合できない位に短い。具体的には、リンカーを構成するアミノ酸残基は、例えば、5残基程度である。そのため、同一ポリペプチド鎖上にコードされるVLとVHとは、単鎖可変領域フラグメントを形成できず、別の単鎖可変領域フラグメントと二量体を形成する。その結果、ダイアボディーは2つの抗原結合部位を有することとなる。
【００９０】
scFv抗体は、VHおよびVLをリンカー等で結合して一本鎖ポリペプチドにした抗体である(Huston, J. S. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. (1988) 85, 5879-5883、 Plueckthun「The Pharmacology of Monoclonal Antibodies」Vol.113, eds., Resenburg および Moore編, Springer Verlag, New York, pp.269-315, (1994))。scFvにおけるH鎖V領域およびL鎖V領域は、本明細書に記載されたいずれの抗体由来であってもよい。V領域を連結するペプチドリンカーには、特に制限はない。例えば3から25残基程度からなる任意の一本鎖ペプチドをリンカーとして用いることができる。具体的には、たとえば後述のペプチドリンカー等を用いることができる。
【００９１】
両鎖のV領域は、例えば上記のようなPCR法によって連結することができる。PCR法によるV領域の連結のために、まず次のDNAのうち、全部あるいは所望の部分アミノ酸配列をコードするDNAが鋳型として利用される。
抗体のH鎖またはH鎖V領域をコードするDNA配列、および
抗体のL鎖またはL鎖V領域をコードするDNA配列。
【００９２】
増幅すべきDNAの両端の配列に対応する配列を有するプライマーの一対を用いたPCR法によって、H鎖とL鎖のV領域をコードするDNAがそれぞれ増幅される。次いで、ペプチドリンカー部分をコードするDNAを用意する。ペプチドリンカーをコードするDNAもPCRを利用して合成することができる。このとき利用するプライマーの5'側に、別に合成された各V領域の増幅産物と連結できる塩基配列を付加しておく。次いで、［H鎖V領域DNA］−［ペプチドリンカーDNA］−［L鎖V領域DNA］の各DNAと、アセンブリーPCR用のプライマーを利用してPCR反応を行う。
【００９３】
アセンブリーPCR用のプライマーは、［H鎖V領域DNA］の5'側にアニールするプライマーと、［L鎖V領域DNA］の3'側にアニールするプライマーとの組み合わせからなる。すなわちアセンブリーPCR用プライマーとは、合成すべきscFvの全長配列をコードするDNAを増幅することができるプライマーセットである。一方［ペプチドリンカーDNA］には各V領域DNAと連結できる塩基配列が付加されている。その結果、これらのDNAが連結され、さらにアセンブリーPCR用のプライマーによって、最終的にscFvの全長が増幅産物として生成される。一旦scFvをコードするDNAが作製されると、それらのDNAを含有する発現ベクター、および該発現ベクターにより形質転換された組換え細胞が常法に従って取得できる。また、その結果得られる組換え細胞を培養して該scFvをコードするDNAを発現させることにより、該scFvが取得できる。
【００９４】
結合されるVHとVLの順序は特に限定されず、どのような順序で並べられていてもよく、例えば、以下のような配置を挙げることができる。
［VH］リンカー［VL］
［VL］リンカー［VH］
【００９５】
sc(Fv)2は、2つのVHおよび2つのVLをリンカー等で結合して一本鎖にした低分子化抗体である（Hudson et al., 1999, J Immunol. Methods；231：177-189）。sc(Fv)2は、例えば、scFvをリンカーで結ぶことによって作製できる。
【００９６】
また2つのVHおよび2つのVLが、一本鎖ポリペプチドのN末端側を基点としてVH、VL、VH、VL（［VH］リンカー［VL］リンカー［VH］リンカー［VL］）の順に並んでいることを特徴とする抗体が好ましいが、2つのVHと2つのVLの順序は特に上記配置に限定されず、どのような順序で並べられていてもよい。例えば以下のような配置も挙げることができる。
［VL］リンカー［VH］リンカー［VH］リンカー［VL］
［VH］リンカー［VL］リンカー［VL］リンカー［VH］
［VH］リンカー［VH］リンカー［VL］リンカー［VL］
［VL］リンカー［VL］リンカー［VH］リンカー［VH］
［VL］リンカー［VH］リンカー［VL］リンカー［VH］
【００９７】
低分子抗体中のVHまたはVLのアミノ酸配列は、置換、欠失、付加および／または挿入されていてもよい。さらに、VHとVLを会合させた場合に、抗原結合活性を有する限り、一部を欠損させてもよいし、他のポリペプチドを付加してもよい。また、可変領域はキメラ化やヒト化されていてもよい。
【００９８】
本発明において、抗体の可変領域を結合するリンカーは、遺伝子工学により導入し得る任意のペプチドリンカー、または合成化合物リンカー、例えば、Protein Engineering, 9(3), 299-305, 1996に開示されるリンカーを用いることができる。
【００９９】
本発明において好ましいリンカーはペプチドリンカーである。ペプチドリンカーの長さは特に限定されず、目的に応じて当業者が適宜選択することが可能であるが、通常、1〜100アミノ酸、好ましくは3〜50アミノ酸、更に好ましくは5〜30アミノ酸、特に好ましくは12〜18アミノ酸（例えば、15アミノ酸）である。
【０１００】
ペプチドリンカーのアミノ酸配列としては、例えば、以下のような配列を挙げることができる。
Ser
Gly Ser
Gly Gly Ser
Ser Gly Gly
Gly Gly Gly Ser（配列番号：45）
Ser Gly Gly Gly（配列番号：46）
Gly Gly Gly Gly Ser（配列番号：47）
Ser Gly Gly Gly Gly（配列番号：48）
Gly Gly Gly Gly Gly Ser（配列番号：49）
Ser Gly Gly Gly Gly Gly（配列番号：50）
Gly Gly Gly Gly Gly Gly Ser（配列番号：51）
Ser Gly Gly Gly Gly Gly Gly（配列番号：52）
(Gly Gly Gly Gly Ser（配列番号：47）)n
(Ser Gly Gly Gly Gly（配列番号：48）)n
［nは1以上の整数である］等を挙げることができる。
【０１０１】
ペプチドリンカーのアミノ酸配列は、目的に応じて当業者が適宜選択することができる。たとえば上記のペプチドリンカーの長さを決定する「n」は、通常1〜5、好ましくは1〜3、より好ましくは1または2である。
【０１０２】
合成化合物リンカー（化学架橋剤）は、ペプチドの架橋に通常用いられている架橋剤、例えば、N-ヒドロキシスクシンイミド（NHS）ジスクシンイミジルスベレート（DSS）、ビス（スルホスクシンイミジル）スベレート（BS3）、ジチオビス（スクシンイミジルプロピオネート）（DSP）、ジチオビス（スルホスクシンイミジルプロピオネート）（DTSSP）、エチレングリコールビス（スクシンイミジルスクシネート）（EGS）、エチレングリコールビス（スルホスクシンイミジルスクシネート）（スルホ−EGS）、ジスクシンイミジル酒石酸塩（DST）、ジスルホスクシンイミジル酒石酸塩（スルホ−DST）、ビス［2-（スクシンイミドオキシカルボニルオキシ）エチル］スルホン（BSOCOES）、ビス［2-（スルホスクシンイミドオキシカルボニルオキシ）エチル］スルホン（スルホ−BSOCOES）などであり、これらの架橋剤は市販されている。
【０１０３】
4つの抗体可変領域を結合する場合には、通常、3つのリンカーが必要となる。複数のリンカーは、同じでもよいし、異なるリンカーを用いることもできる。
【０１０４】
本発明の抗体には、抗体のアミノ酸配列に1または複数個のアミノ酸残基が付加された抗体も含まれる。また、これら抗体と他のペプチドまたはタンパク質とが融合した融合タンパク質も含まれる。融合タンパク質を作製する方法は、抗体をコードするポリヌクレオチドと他のペプチドまたはポリペプチドをコードするポリヌクレオチドをフレームが一致するように連結してこのDNAを発現ベクターに導入し、このベクターを宿主で発現させればよく、当業者に公知の手法を用いることができる。本発明の抗体との融合に付される他のペプチドまたはポリペプチドとしては、例えば、FLAG（Hopp, T. P. et al., BioTechnology 6, 1204-1210(1988) ）、6個のHis（ヒスチジン）残基からなる6×His、10×His、インフルエンザ凝集素（HA）、ヒトc-mycの断片、VSV-GPの断片、p18HIVの断片、T7-tag、HSV-tag、E-tag、SV40T抗原の断片、lck tag、α-tubulinの断片、B-tag、プロテインCの断片等の公知のペプチドを使用することができる。また、本発明の抗体との融合に付される他のポリペプチドとしては、例えば、GST（グルタチオン−S−トランスフェラーゼ）、HA（インフルエンザ凝集素）、免疫グロブリン定常領域、β−ガラクトシダーゼ、MBP（マルトース結合タンパク質）等が挙げられる。市販されているこれらペプチドまたはポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを、本発明に記載の抗体をコードするポリヌクレオチドと融合させ、そのように得られた融合ポリヌクレオチドを発現させることにより、融合ポリペプチドを調製することができる。
【０１０５】
また本発明に記載の抗体は、ポリエチレングリコール（PEG）やヒアルロン酸などの高分子物質、放射性物質、蛍光物質、発光物質、酵素、トキシン等の各種分子と結合したコンジュゲート抗体でもよい。このようなコンジュゲート抗体は、得られた抗体に化学的な修飾を施すことによって得ることができる。なお、抗体の修飾方法はこの分野においてすでに確立されている（例えば、US 5,057,313、US 5,156,840）。本発明における「抗体」にはこれらのコンジュゲート抗体も包含される。
【０１０６】
また本発明の抗体には、糖鎖が改変された抗体も包含される。
【０１０７】
さらに、本発明で使用される抗体は二重特異性抗体（bispecific antibody）であってもよい。二重特異性抗体とは、異なるエピトープを認識する可変領域を同一の抗体分子内に有する抗体を言う。本発明において、二重特異性抗体はIL-6レセプター分子上の異なるエピトープを認識する二重特異性抗体であってもよいし、一方の抗原結合部位がIL-6レセプターを認識し、他方の抗原結合部位が他の物質を認識する二重特異性抗体とすることもできる。IL-6レセプターを認識する本発明の抗体からなる二重特異性抗体の他方の抗原結合部位が結合する抗原としては、例えば、IL-6, TNFα, TNFR1, TNFR2, CD80, CD86, CD28, CD20, CD19, IL-1α, IL-β, IL-1R, RANKL, RANK, IL-17, IL-17R, IL-23, IL-23R, IL-15, IL-15R, BlyS, リンホトキシンα, リンホトキシンβ, LIGHTリガンド, LIGHT, VLA-4, CD25, IL-12, IL-12R, CD40, CD40L, BAFF, CD52, CD22, IL-32, IL-21, IL-21R, GM-CSF, GM-CSFR, M-CSF, M-CSFR, IFN-α, VEGF, VEGFR, EGF, EGFR, CCR5, APRIL, APRILRなどが挙げられる。
【０１０８】
二重特異性抗体を製造するための方法は公知である。たとえば、認識抗原が異なる2種類の抗体を結合させて、二重特異性抗体を作製することができる。結合させる抗体は、それぞれがH鎖とL鎖を有する1／2分子であっても良いし、H鎖のみからなる1／4分子であっても良い。あるいは、異なるモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマを融合させて、二重特異性抗体産生融合細胞を作製することもできる。さらに、遺伝子工学的手法により二重特異性抗体が作製できる。
【０１０９】
本発明において用いられる抗体は、後述する抗体を産生する細胞や宿主あるいは精製方法により、アミノ酸配列、分子量、等電点または糖鎖の有無や形態などが異なり得る。しかしながら、得られた抗体が、本発明に記載の抗体と同等の機能を有している限り、本発明に含まれると見なされる。例えば、抗体を原核細胞、例えば大腸菌で発現させた場合、元の抗体のアミノ酸配列のN末端にメチオニン残基が付加される。本発明に記載の抗体はこのような抗体も包含する。
【０１１０】
本発明の抗IL-6レセプター抗体などのポリペプチドは当業者に公知の方法により製造することが可能である。
【０１１１】
例えば、得られた抗IL-6レセプター抗体の配列を基に、当業者に公知の遺伝子組換え技術を用いて抗IL-6レセプター抗体を作製することが可能である。具体的には、IL-6レセプターを認識する抗体の配列を基に、この抗体をコードするポリヌクレオチドを構築し、これを発現ベクターに導入した後、適当な宿主細胞で発現させることで抗IL-6レセプター抗体を作製することが可能である（例えば、Co, M. S. et al., J. Immunol. (1994) 152, 2968-2976 ; Better, M. and Horwitz, A. H., Methods Enzymol. (1989) 178, 476-496 ; Pluckthun, A. and Skerra, A., Methods Enzymol. (1989) 178, 497-515 ; Lamoyi, E., Methods Enzymol. (1986) 121, 652-663 ; Rousseaux, J. et al., Methods Enzymol. (1986) 121, 663-669 ; Bird, R. E. and Walker, B. W., Trends Biotechnol. (1991) 9, 132-137参照）。
【０１１２】
従って、本発明は、本発明のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドが導入されたベクターを含む宿主細胞を培養する工程を含む、（i）本発明のポリペプチド、または（ii）本発明のポリペプチドをコードする遺伝子によりコードされたポリペプチドを作製する方法を提供する。
【０１１３】
より具体的には、本発明は、
（a）本発明のポリペプチドをコードする遺伝子が導入されたベクターを含む宿主細胞を培養する工程；および
（b）前記遺伝子によりコードされたポリペプチドを得る工程
を含む、本発明のポリペプチドを作製する方法を提供する。
【０１１４】
ベクターの例としては、M13系ベクター、pUC系ベクター、pBR322、pBluescript、pCR-Scriptなどが挙げられる。また、cDNAのサブクローニング、切り出しを目的とした場合、上記ベクターの他に、例えば、pGEM-T、pDIRECT、pT7などが挙げられる。本発明に記載の抗体を生産する目的においてベクターを使用する場合には、特に、発現ベクターが有用である。発現ベクターとしては、例えば、大腸菌での発現を目的とした場合は、ベクターが大腸菌で増幅されるような特徴を持つほかに、宿主をJM109、DH5α、HB101、XL1-Blueなどの大腸菌とした場合においては、大腸菌で効率よく発現できるようなプロモーター、例えば、lacZプロモーター（Ward et al., Nature (1989) 341, 544-546；FASEB J. (1992) 6, 2422-2427）、araBプロモーター（Better et al., Science (1988) 240, 1041-1043）、またはT7プロモーターなどを持っていることが不可欠である。このようなベクターとしては、上記ベクターの他にpGEX-5X-1（Pharmacia）、「QIAexpress system」（Quiagen）、pEGFP、またはpET(この場合、宿主はT7 RNAポリメラーゼを発現しているBL21が好ましい)などが挙げられる。
【０１１５】
また、発現プラスミドのベクターには、抗体分泌のためのシグナル配列が含まれていてもよい。抗体分泌のためのシグナル配列としては、大腸菌のペリプラズムに産生させる場合、pelBシグナル配列（Lei, S. P. et al., J. Bacteriol. (1987) 169, 4379）を使用すればよい。宿主細胞へのベクターの導入は、例えば塩化カルシウム法、エレクトロポレーション法を用いて行うことができる。
【０１１６】
大腸菌以外にも、例えば、本発明に記載の抗体を製造するためのベクターとしては、哺乳動物由来の発現ベクター（例えば、pcDNA3（Invitrogen）や、pEF-BOS (Nucleic Acids. Res. 1990, 18(17),p5322)、pEF、pCDM8）、昆虫細胞由来の発現ベクター（例えば「Bac-to-BAC baculovirus expression system」（Gibco-BRL）、pBacPAK8）、植物由来の発現ベクター（例えばpMH1、pMH2）、動物ウィルス由来の発現ベクター（例えば、pHSV、pMV、pAdexLcw）、レトロウィルス由来の発現ベクター（例えば、pZIPneo）、酵母由来の発現ベクター（例えば、「Pichia Expression Kit」（Invitrogen）、pNV11、SP-Q01）、枯草菌由来の発現ベクター（例えば、pPL608、pKTH50）が挙げられる。
【０１１７】
CHO細胞、COS細胞、NIH3T3細胞等の動物細胞での発現を目的とした場合には、発現プラスミドのベクターが細胞内で発現させるために必要なプロモーター、例えばSV40プロモーター（Mulligan et al., Nature (1979) 277, 108）、MMLV-LTRプロモーター、EF1αプロモーター（Mizushima et al., Nucleic Acids Res. (1990) 18, 5322）、CMVプロモーターなどを持っていることが不可欠であり、細胞への形質転換を選択するための遺伝子（例えば、薬剤（ネオマイシン、G418など）により判別できるような薬剤耐性遺伝子）を有すればさらに好ましい。このような特性を有するベクターとしては、例えば、pMAM、pDR2、pBK-RSV、pBK-CMV、pOPRSV、pOP13などが挙げられる。
【０１１８】
さらに、遺伝子を安定的に発現させ、かつ、細胞内での遺伝子のコピー数の増幅を目的とする場合には、核酸合成経路を欠損したCHO細胞にそれを相補するDHFR遺伝子を有するベクター（例えば、pSV2-dhfr（「Molecular Cloning 2nd edition」 Cold Spring Harbor Laboratory Press, (1989)）など）を導入し、メトトレキセート（MTX）により増幅させる方法が挙げられ、また、遺伝子の一過性の発現を目的とする場合には、SV40 T抗原を発現する遺伝子を染色体上に持つCOS細胞を用いてSV40の複製起点を持つベクター（pcDなど）で形質転換する方法が挙げられる。複製開始点としては、また、ポリオーマウィルス、アデノウィルス、ウシパピローマウィルス（BPV）等の由来のものを用いることもできる。さらに、宿主細胞系で遺伝子コピー数増幅のため、発現ベクターは選択マーカーとして、アミノグリコシドトランスフェラーゼ（APH）遺伝子、チミジンキナーゼ（TK）遺伝子、大腸菌キサンチングアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（Ecogpt）遺伝子、ジヒドロ葉酸還元酵素（dhfr）遺伝子等を含むことができる。
【０１１９】
これにより得られた本発明に記載の抗体は、宿主細胞内または細胞外（培地など）から単離し、実質的に純粋で均一な抗体として精製することができる。抗体の分離、精製は、通常の抗体の精製で使用されている分離、精製方法を使用すればよく、何ら限定されるものではない。例えば、クロマトグラフィーカラム、フィルター、限外濾過、塩析、溶媒沈殿、溶媒抽出、蒸留、免疫沈降、SDS-ポリアクリルアミドゲル電気泳動、等電点電気泳動法、透析、再結晶等を適宜選択し、組み合わせることで、抗体を分離および精製することができる。
【０１２０】
クロマトグラフィーとしては、例えばアフィニティークロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、疎水性クロマトグラフィー、ゲル濾過、逆相クロマトグラフィー、吸着クロマトグラフィー等が挙げられる（Strategies for Protein Purification and Characterization: A Laboratory Course Manual. Ed Daniel R. Marshak et al., Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1996）。これらのクロマトグラフィーは、液相クロマトグラフィー、例えばHPLC、FPLC等の液相クロマトグラフィーを用いて行うことができる。アフィニティークロマトグラフィーに用いるカラムとしては、プロテインAカラム、プロテインGカラムが挙げられる。例えば、プロテインAを用いたカラムとして、Hyper D, POROS, Sepharose FF（GE Amersham Biosciences）等が挙げられる。本発明は、これらの精製方法を用いて高度に精製された抗体も包含する。
【０１２１】
得られた抗体のIL-6レセプターに対する結合活性の測定は、当業者に公知の方法により行うことが可能である。例えば、抗体の抗原結合活性を測定する方法として、ELISA（酵素結合免疫吸着検定法）、EIA（酵素免疫測定法）、RIA（放射免疫測定法）あるいは蛍光抗体法を用いることができる。例えば、酵素免疫測定法を用いる場合、抗原をコーティングしたプレートに、抗体を含む試料、例えば、抗体産生細胞の培養上清や精製抗体を加える。アルカリフォスファターゼ等の酵素で標識した二次抗体を添加し、プレートをインキュベートし、洗浄した後、p-ニトロフェニル燐酸などの酵素基質を加えて吸光度を測定することで抗原結合活性を評価することができる。
【０１２２】
医薬組成物
本発明は、上述のポリペプチドを有効成分として含有する医薬組成物を提供する。本発明の医薬組成物はIL-6が関連する関節リウマチなどの疾患に用いることが可能である。即ち本発明は、上述の抗体を有効成分とする関節リウマチなどの疾患の治療剤も提供する。対象となる疾患の好ましい例として、関節リウマチ、若年性特発性関節炎、全身型若年性特発性関節炎、キャッスルマン病、全身性エリテマトーデス（SLE）、ループス腎炎、クローン病、lymphoma、潰瘍性大腸炎、貧血、血管炎、川崎病、Still病、アミロイドーシス、多発性硬化症、移植、加齢黄斑変性症、強直性脊椎炎、乾癬、乾癬性関節炎、慢性閉塞性肺疾患（COPD）、IgA 腎症、変形性関節症、喘息、糖尿病性腎症、GVHD、子宮内膜症、肝炎(NASH)、心筋梗塞、動脈硬化、セプシス、骨粗しょう症、糖尿病、多発性骨髄腫、前立腺癌、腎癌、B-cell non-Hodgkin's、膵癌、肺癌、食道癌、大腸癌、癌悪液質、癌神経浸潤、心筋梗塞、近視性脈絡膜血管新生、特発性脈絡膜血管新生、ぶどう膜炎、慢性甲状腺炎、遅延性過敏症、接触性皮膚炎、アトピー性皮膚炎、中皮腫、多発性筋炎、皮膚筋炎、汎ぶどう膜炎、前部ぶどう膜炎、中間部ぶどう膜炎、強膜炎、角膜炎、眼窩炎症、視神経炎、糖尿病網膜症、増殖硝子体網膜症、ドライアイ、術後炎症等が挙げられるが、これらに限定されることはない。
【０１２３】
「抗IL-6レセプター抗体を有効成分として含有する」とは、抗IL-6レセプター抗体を活性成分の少なくとも一つとして含むという意味であり、その含有率を制限するものではない。また、本発明の医薬組成物は、上述のポリペプチドと合わせて他の有効成分を含有してもよい。
【０１２４】
なお、本発明の医薬組成物は治療目的だけでなく、予防目的で用いられてもよい。
【０１２５】
本発明において、アミノ酸配列に含有されているアミノ酸は、翻訳後修飾されていてもよい。例えば、ピログルタミル化によるN末端グルタミン（Gln）残基のピログルタミン酸（pGlu）残基への修飾は、当業者に周知である。当然、そのような翻訳後修飾されたアミノ酸は、本発明におけるアミノ酸配列に含まれる。
【０１２６】
本発明に係る抗体に結合する糖鎖は、任意の構造のものであり得る。297位（EUナンバリング）の糖鎖は、任意の糖鎖構造のものであってよく（好ましくは、フコシル化糖鎖）、またはその位置に糖鎖が存在しなくてもよい（例えば、これは、大腸菌において抗体を作製することにより、または糖鎖が297位（EUナンバリング）に結合しないような改変を導入することにより、達成され得る）。
【０１２７】
なお本明細書において引用された全ての先行技術文献は、参照として本明細書に組み入れられる。
【実施例】
【０１２８】
以下本発明を実施例により説明するが、本発明はこれらに制限されると理解されるものではない。
【０１２９】
[実施例1] トシリズマブのIL-6レセプターへの親和性を向上する可変領域変異箇所の同定
トシリズマブ（H鎖 WT-IgG1／配列番号：53、L鎖 WT-κ／配列番号：54）のIL-6レセプターへの親和性を向上させるために、CDR配列に変異を導入したライブラリーを作製し検討した。CDRに変異を導入したライブラリーをスクリーニングした結果、IL-6レセプターへの親和性を向上する変異を見出し、それらを図1にまとめた。これらの変異を組み合わせた高親和性トシリズマブの例として、RDC-23（H鎖RDC23H-IgG1／配列番号：55、L鎖 RDC-23L-κ／配列番号：56）が挙げられる。RDC-23の可溶型IL-6レセプターへのアフィニティーおよびBaF/gp130による生物活性をトシリズマブと比較した（方法は参考例参照）。
【０１３０】
アフィニティーを測定した結果を表1に示した。BaF/gp130による生物活性（IL-6最終濃度 30 ng/mL）を測定した結果を図2に示した。RDC-23は、トシリズマブと比較して約60倍アフィニティーが向上しており、BaF/gp130の100％阻害濃度として約100倍活性が向上していることが見出された。
【０１３１】
（表１）
【０１３２】
[実施例2] トシリズマブの等電点低下による薬物動態を向上する変異の同定
トシリズマブの薬物動態を向上させるために、IL-6レセプターへの結合を大きく低下させることなく可変領域の等電点を低下することができる変異箇所の検討を行った。トシリズマブの立体構造モデルから推察された可変領域変異箇所をスクリーニングした結果、IL-6レセプターへの結合を大きく低下させることなく可変領域の等電点を低下することできる変異箇所を見出し、それらを図3にまとめた。これらの変異を組み合わせた等電点低下トシリズマブの例として、H53/L28（H鎖 H53-IgG1／配列番号：57、L鎖 L28-κ／配列番号：58）が挙げられる。H53/L28の可溶型IL-6レセプターへのアフィニティー、BaF/gp130による生物活性、等電点、および、マウスにおける薬物動態をトシリズマブと比較した（方法は参考例参照）。
【０１３３】
アフィニティーを測定した結果を表2に示した。BaF/gp130による生物活性（IL-6最終濃度 30 ng/mL）を測定した結果を図4に示した。H53/L28は、トシリズマブと比較して約6倍アフィニティーが向上しており、BaF/gp130の100％阻害濃度として数倍程度活性が向上していることが示された。
【０１３４】
（表２）
【０１３５】
当業者に公知の等電点電気泳動により等電点を測定した結果、トシリズマブの等電点は約9.3であり、H53/L28の等電点は約6.5〜6.7であり、H53/L28はトシリズマブと比較して等電点が約2.7低下した。また、可変領域VH/VLの理論等電点をGENETYX(GENETYX CORPORATION)により計算したところ、トシリズマブの理論等電点は9.20であり、H53/L28の理論等電点は4.52であり、H53/L28はトシリズマブと比較して等電点が約4.7低下した。
【０１３６】
等電点を低下させた改変抗体H53/L28の薬物動態を評価するために、トシリズマブとH53/L28の正常マウスにおける薬物動態の比較を行った。トシリズマブおよびH53/L28をマウス（C57BL/6J、日本チャールズリバー）に1 mg/kgで静脈内（IV）および皮下（SC）に単回投与し血漿中濃度推移を評価した。トシリズマブおよびH53/L28の静脈内投与後の血漿中濃度の経時変化を図5に、皮下投与後の血漿中濃度の経時変化を図6に示し、WinNonlin（Pharsight）により得られた薬物動態学的パラメーター（クリアランス（CL）、半減期(T1/2)）を表3に示した。H53/L28の静脈内投与後の血漿中半減期(T1/2)はトシリズマブの約1.3倍に延長し、クリアランスが約1.7倍低下した。H53/L28の皮下投与後のT1/2はトシリズマブの約2倍に延長し、クリアランスが約2.1倍低下した。このようにアミノ酸置換によりトシリズマブの等電点を低下させることによって薬物動態を大幅に向上させることが可能であることが見出された。
【０１３７】
（表３）
【０１３８】
[実施例3] トシリズマブの免疫原性を低下する変異箇所の同定
可変領域に存在するT細胞エピトープによる免疫原性リスクを低減する変異箇所の同定
トシリズマブの可変領域配列に存在するT細胞エピトープをTEPITOPE（Methods. 2004 Dec;34(4):468-75）を用いて解析を行った。その結果、L鎖CDR2に多くのHLAに結合するT細胞エピトープが存在する（免疫原性リスクが高い配列が存在する）ことが予測された。そこで、TEPITOPE解析においてL鎖CDR2の免疫原性リスクを低減させつつ、安定性、結合活性、中和活性を低下させないアミノ酸置換を検討した。
【０１３９】
スクリーニングの結果、以下のようにトシリズマブのL鎖CDR2（配列番号：59）のL51（Kabatナンバリング、Kabat EA et al., 1991． Sequences of Proteins of Immunological Interest, NIH））のスレオニンをグリシンに、L53のアルギニンをグルタミン酸に置換する（配列番号：60）ことで、安定性、結合活性、中和活性を低下させずに免疫原性リスクを低減できることを見出した。
トシリズマブ L鎖CDR2（配列番号：59）
T細胞エピトープ除去トシリズマブ L鎖CDR2（配列番号：60）
【０１４０】
[実施例4] トシリズマブの可変領域フレームワーク配列の完全ヒト化による免疫原性リスクの低減
トシリズマブの可変領域配列において、H鎖FR1のH27, H28, H29, H30およびH鎖FR3のH71（Kabatナンバリング、Kabat EA et al., 1991． Sequences of Proteins of Immunological Interest, NIH））は、トシリズマブのヒト化の過程において結合活性を維持するためにフレームワーク配列でマウス配列が残存している（Cancer Res. 1993 Feb 15;53(4):851-6）。残存するマウス配列は免疫原性リスクを高める原因となりうるため、トシリズマブの免疫原性リスクをより低下するためにフレームワーク配列を完全ヒト化する検討を行った。
【０１４１】
その結果、トシリズマブのH鎖FR1（配列番号：61）を以下のヒト化 H鎖FR1-A（配列番号：62）に置換することで、また、H鎖FR3（配列番号：63）を以下のヒト化 H鎖FR3（配列番号：64）に置換することで、安定性、結合活性、中和活性を低下させずにトシリズマブの全フレームワークを完全ヒト化できることを見出した。
トシリズマブ H鎖FR1（配列番号：61）
ヒト化 H鎖FR1-A（配列番号：62）（生殖系列 IMGT hVH_4_由来）
トシリズマブ H鎖FR3（配列番号：63）
ヒト化 H鎖FR3（配列番号：64）（Mol. Immunol. 2007, 44(4):412-422由来）
【０１４２】
[実施例5] トシリズマブのIL-6レセプターへのpH依存的結合による薬物動態向上のための変異箇所の同定
トシリズマブの薬物動態を向上させる方法の一つは、1分子のトシリズマブが複数個のIL-6レセプターを繰り返し結合および中和するように分子を改良する方法である。トシリズマブは膜型IL-6レセプターに結合後、膜型IL-6レセプターに結合したままインターナライゼーションによって細胞内のエンドソームに取り込まれ、その後、膜型IL-6レセプターに結合したままライソソームへ移行し共にライソソームにより分解されると考えられている。すなわち、通常、1分子のトシリズマブは1分子ないしは2分子の膜型IL-6レセプターに（1価ないしは2価で）結合し、インターナライズ後、ライソソームで分解されると考えられるため、1分子のトシリズマブは1分子ないしは2分子の膜型IL-6レセプターしか結合および中和できない。
【０１４３】
そこで、トシリズマブの中性条件下での結合を維持しつつ酸性条件下での結合のみを大きく低下させるpH依存的結合トシリズマブを作製することが出来れば、図7に示すとおり、pH依存的結合トシリズマブはエンドソーム内で抗原である膜型IL-6レセプターから解離し、エンドソーム内に存在するFcRnに結合することによって血漿中に戻ることができ、血漿中に戻ったpH依存的結合トシリズマブは再度膜型IL-6レセプターに結合することが可能であると考えた。この血漿中での結合とエンドソーム内での解離を繰り返すことで、1分子のトシリズマブが複数分子のIL-6レセプターを繰り返し結合および中和できると考えられ、これによりトシリズマブと比較してpH依存的結合トシリズマブは薬物動態が向上すると考えられた。
【０１４４】
エンドソーム内の酸性条件下においてトシリズマブがIL-6レセプターから解離するためには、酸性条件下における結合が中性条件下と比較して大幅に弱くなる必要がある。細胞表面ではIL-6レセプターに強く結合して中和する必要があるため、細胞表面のpHであるpH7.4においてはトシリズマブと同等かまたはそれ以上にIL-6レセプターに結合する必要がある。エンドソーム内のpHは一般的にpH5.5〜pH6.0であることが報告されている（Nat Rev Mol Cell Biol. 2004 Feb;5(2):121-32.）ことから、pH5.5〜pH6.0においてIL-6レセプターに弱く結合するように改変されたpH依存的結合トシリズマブであれば、エンドソーム内の酸性条件下においてIL-6レセプターから解離すると考えられる。すなわち、細胞表面のpHであるpH7.4においてはIL-6レセプターに強く結合し、エンドソーム内のpHであるpH5.5〜pH6.0においてIL-6レセプターに弱く結合するように改良されたpH依存的結合トシリズマブであれば、1分子で複数個のIL-6レセプターに結合および中和し、薬物動態を向上することが可能であると考えられた。
【０１４５】
トシリズマブのIL-6レセプターへの結合にpH依存性を付与するには、pKaが6.0〜6.5付近に存在し、中性条件下（pH7.4）と酸性条件下（pH5.5〜pH6.0）との間でプロトンの解離状態が変化するヒスチジン残基をトシリズマブの可変領域に導入する方法が考えられた。そこで、トシリズマブの立体構造モデルから推察された可変領域のヒスチジン導入箇所のスクリーニングを実施した。また、トシリズマブの選択された可変領域配列がランダムにヒスチジンに置換されるように設計されたライブラリーを作製しスクリーニングを実施した。スクリーニングは、pH7.4においてIL-6レセプターに結合し、pH5.5ないしはpH5.8でIL-6レセプターから解離する、あるいは、アフィニティーが低下することを指標に実施した。
【０１４６】
その結果、トシリズマブのIL-6レセプターへの結合にpH依存性（pH7.4で結合し、pH5.8で解離する性質）を付与することができる変異箇所を見出し、それらを図8にまとめた。図8のH27のチロシンからヒスチジンへの置換はCDRではなくH鎖のFR1の変異であるが、H27がヒスチジンの配列はEur. J. Immunol. 1992. 22: 1719-1728に記されているとおり、ヒト配列（配列番号：65）として存在するため、以下のフレームワークを用いることで実施例4と合わせて完全ヒト化することが可能である。
【０１４７】
ヒト化H鎖FR1-B（配列番号：65）
これらの変異を組み合わせたpH依存的結合トシリズマブの例として、H3pI/L73（H鎖 H3pI-IgG1／配列番号：66、L鎖 L73-κ／配列番号：67）が挙げられる。H3pI/L73のpH7.4における可溶型IL-6レセプターへのアフィニティー、pH7.4とpH5.8における膜型IL-6レセプターからの解離速度、BaF/gp130による生物活性、および、カニクイザルおよびヒトIL-6レセプタートランスジェニックマウスにおける薬物動態をトシリズマブと比較した（方法は参考例参照）。
【０１４８】
pH7.4における可溶型IL-6レセプターへのアフィニティーを測定した結果を表4に示した。BaF/gp130による生物活性（IL-6最終濃度30 ng/ml）を測定した結果を図9に示した。H3pI/L73は、トシリズマブと比較してほぼ同等のpH7.4における可溶型IL-6レセプターへのアフィニティーおよびBaF/gp130の活性を有していることが示された。
【０１４９】
（表４）
【０１５０】
トシリズマブおよびH3pI/L73のpH7.4とpH5.8における膜型IL-6レセプターへ解離速度を測定した結果を表5に示した。H3pI/L73は、pH5.8における解離速度が速くなり、トシリズマブと比較して膜型IL-6レセプターからの解離速度のpH依存性が約2.6倍向上していることが示された。
【０１５１】
（表５）
【０１５２】
トシリズマブおよびH3pI/L73をカニクイザルに1 mg/kgで静脈内に単回投与し血漿中濃度の経時変化を評価した。トシリズマブおよびH3pI/L73の静脈内投与後の血漿中濃度の経時変化を図10に示した。その結果、H3pI/L73はトシリズマブと比較してカニクイザルにおいて大幅に薬物動態が向上した。
【０１５３】
トシリズマブおよびH3pI/L73をヒトIL-6レセプタートランスジェニックマウス（hIL-6R tgマウス、Proc Natl Acad Sci U S A. 1995 May 23;92(11):4862-6）に25 mg/kgで静脈内に単回投与し血漿中濃度の経時変化を評価した。トシリズマブおよびH3pI/L73の静脈内投与後の血漿中濃度の経時変化を図11に示した。その結果、H3pI/L73はトシリズマブと比較してヒトIL-6レセプタートランスジェニックマウスにおいて大幅に薬物動態が向上した。
【０１５４】
pH依存的結合トシリズマブであるH3pI/L73は、カニクイザルおよびヒトIL-6レセプタートランスジェニックマウスにおいてトシリズマブと比較して薬物動態が大幅に向上したことから、pH7.4で抗原に結合し、pH5.8で抗原から解離する性質を付与することにより、1分子で複数のIL-6レセプターに結合および中和することが可能であると考えられた。また、IL-6レセプターへの結合にH3pI/L73よりもさらに強いpH依存性を付与することに薬物動態がさらに向上することが可能であると考えられた。
【０１５５】
[実施例6] トシリズマブの定常領域の最適化
トシリズマブのH鎖C末端の不均一性の低減
IgG抗体のH鎖C末端配列の不均一性として、C末端アミノ酸のリジン残基の欠損、および、C末端の2つのアミノ酸であるグリシン、リジン両方の欠損によるC末端カルボキシル基のアミド化が報告されている（Anal Biochem. 2007 Jan 1;360(1):75-83.）。トシリズマブにおいても、その主成分は塩基配列上存在するC末端アミノ酸のリジンが翻訳後修飾により欠損した配列であるが、リジンが残存している副成分およびグリシン、リジン両方の欠損によるC末端カルボキシル基のアミド化された副成分も不均一性に寄与する。目的物質/関連物質の不均一性の製造間差を維持しつつ医薬として大量に製造することは容易ではなくコスト増につながる。可能な限り単一物質であることが望まれ、抗体を医薬として開発する上にはこれらの不均一性が低減されていることが望ましい。よって医薬として開発する上ではH鎖C末端の不均一性は存在しないことが望ましい。
【０１５６】
C末端アミノ酸の不均一性を低減させることを目的にC末端アミノ酸の改変を行った。その結果、トシリズマブのH鎖定常領域のC末端のリジンおよびグリシンを塩基配列上あらかじめ欠損させることで、C末端に由来する不均一性を回避することが可能であることが見出された。トシリズマブ、C末端のリジン欠損トシリズマブ（トシリズマブΔK、H鎖 WT-IgG1ΔK／配列番号：68、L鎖 WT-κ／配列番号：54）、および、C末端のリジンおよびグリシン欠損トシリズマブ（トシリズマブΔGK、H鎖 WT-IgG1ΔGK／配列番号：69、L鎖 WT-κ／配列番号：54）の不均一性の評価を陽イオン交換クロマトグラフィーにより実施した。カラムとしてはProPac WCX-10, 4×250 mm (Dionex) を使用し、移動相Aは25 mmol/L MES/NaOH, pH 6.1、移動相Bは25 mmol/L MES/NaOH, 250 mmol/L NaCl, pH 6.1を使用し、適切な流量および勾配を用いて実施した。陽イオン交換クロマトグラフィーによる評価を行った結果を図12に示した。その結果、H鎖定常領域のC末端のリジンだけでなく、H鎖定常領域のC末端のリジンおよびグリシン両方をヌクレオチド配列上であらかじめ欠損させることで、初めてC末端アミノ酸の不均一性を低減可能であることが見出された。ヒト抗体定常領域IgG1、IgG2、IgG4において、C末端配列はいずれもEUナンバリング（Sequences of proteins of immunological interest, NIH Publication No.91-3242 を参照）447番目がリジン、446番目がグリシンになっていることから、本検討で見出されたC末端アミノ酸の不均一性を低減させる方法はIgG2定常領域とIgG4定常領域、あるいはそれらの改変体にも適用可能であると考えられた。
【０１５７】
トシリズマブのIgG2アイソタイプのジスルフィド結合由来の不均一性の低減
トシリズマブのアイソタイプはIgG1であるが、トシリズマブは中和抗体であることから、免疫原性や副作用を考慮した場合、Fcγレセプターへの結合は好ましくない可能性が考えられる。Fcγレセプターへの結合を低下させる方法としては、IgG抗体のアイソタイプをIgG1からIgG2あるいはIgG4に変える方法が考えられ（Ann Hematol. 1998 Jun;76(6):231-48.）、FcγレセプターIへの結合および薬物動態の観点からはIgG4よりはIgG2が望ましいと考えられた（Nat Biotechnol. 2007 Dec;25(12):1369-72）。一方、抗体を医薬として開発するにあたり、そのタンパク質の物理化学的性質、中でも均一性と安定性は極めて重要であり、IgG2アイソタイプは、ヒンジ領域のジスルフィド結合に由来する不均一性が極めて多いことが報告されている（J Biol Chem. 2008 Jun 6;283(23):16206-15.）。ジスルフィド結合に由来する目的物質/関連物質の不均一性の製造間差を維持しつつ医薬として大量に製造することは容易ではなくコスト増につながり、可能な限り単一物質であることが望まれる。よってIgG2アイソタイプの抗体を医薬として開発する上で、安定性を低下させることなくジスルフィド結合由来の不均一性を低減することが望ましい。
【０１５８】
IgG2アイソタイプの不均一性を低減することを目的に各種改変体を検討した結果、IgG2定常領域配列のうち、H鎖のCH1ドメインに存在するEUナンバリング131番目のシステインと133番目のアルギニンをそれぞれセリンとリジンに置換し、さらにH鎖の上流のヒンジに存在するEUナンバリング219番目のシステインをセリンに置換した定常領域であるWT-SKSC（配列番号：70）によって、安定性を低下させることなく不均一性を低減できることが見出された。トシリズマブ-IgG1（H鎖 WT-IgG1／配列番号：53、L鎖 WT-κ／配列番号：54）、トシリズマブ-IgG2（H鎖 WT-IgG2／配列番号：71、L鎖 WT-κ／配列番号：54）、および、トシリズマブ-SKSC（H鎖 WT-SKSC／配列番号：70、L鎖 WT-κ／配列番号：54）を調製し、不均一性および安定性の評価を行った。不均一性の評価は陽イオン交換クロマトグラフィーにより実施した。カラムとしてProPac WCX-10 (Dionex)を用い、移動相Aとして20 mM 酢酸ナトリウム, pH5.0、移動相Bとして20 mM 酢酸ナトリウム, 1 M NaCl, pH5.0を使用し、適切な流量および勾配を用いて実施した。陽イオン交換クロマトグラフィーによる評価を行った結果を図13に示した。安定性の評価は、示走差査型熱量測定（DSC）（VP-DSC、Microcal）による熱変性中間温度（Tm値）の評価により実施した。20 mM 酢酸ナトリウム, 150 mM NaCl, pH6.0におけるDSC測定結果とFabドメインのTm値を図14に示した。
【０１５９】
その結果、トシリズマブ-IgG1と比較してトシリズマブ-IgG2は著しく不均一性が増大するが、トシリズマブ-SKSCにすることによって不均一性は大幅に低減できることが見出された。また、トシリズマブ-IgG1と比較してトシリズマブ-IgG2はDSCにおけるFabドメインの熱変性ピークにおいてヘテロ成分によると考えられる安定性の低い、すなわちTmの低いショルダーピーク（Fab*）の成分が認められるが、トシリズマブ-SKSCにすることによってヘテロ成分によると考えられるTm値の低いショルダーピークは消失し、トシリズマブ-IgG1およびトシリズマブ-IgG2のFabドメインと同等の約94℃のTm値を示したことから、トシリズマブ-SKSCは高い安定性を有していることが見出された。
【０１６０】
トシリズマブの薬物動態を向上するする定常領域変異箇所の同定
上述のとおり、トシリズマブのアイソタイプであるIgG1から、Fcγレセプターへの結合性を低減させ、かつ高い安定性を維持したまま、C末端の不均一性を低減し、かつIgG2アイソタイプの定常領域を有する抗体の不均一性を低減することが可能であることが見出された。さらに、薬物動態に関してもトシリズマブのアイソタイプであるIgG1よりも優れた定常領域であることが望ましい。
【０１６１】
IgG1アイソタイプの定常領域の抗体よりも優れた血漿中半減期を有する定常領域を見出すために、高い安定性を有しIgG2アイソタイプの定常領域の抗体に関する上述の不均一性が低減されたトシリズマブ-SKSCに対して、薬物動態を向上させることを目的に変異箇所をスクリーニングした結果、WT-SKSCに対して、EUナンバリング137番目のグルタミン酸をグリシンに138番目のセリンをグリシンに、268番ヒスチジンをグルタミンに、355番アルギニンをグルタミンに、419番グルタミンをグルタミン酸に置換し、これに加えてH鎖C末端の不均一性を低減するために446番目のグリシンおよび447番目のリジンを欠損させたWT-M58（配列番号：72（アミノ酸配列））を見出した。さらに、一方、IgG1に対して、434番目のアスパラギンをアラニンに置換したWT-M44（配列番号：73（アミノ酸配列））を作製した。さらにM44に対してH鎖C末端の不均一性を低減するために446番目のグリシンおよび447番目のリジンを欠損させたWT-M83（配列番号：74（アミノ酸配列））を作製した。また、WT-M58に対して、434番目のアスパラギンをアラニンに置換したWT-M73（配列番号：75（アミノ酸配列））を作製した。
【０１６２】
トシリズマブ-M44（H鎖 WT-M44／配列番号：73、L鎖 WT-κ／配列番号：54）、トシリズマブ-M58（H鎖 WT-M58／配列番号：72、L鎖 WT-κ／配列番号：54）およびトシリズマブ-M73（H鎖 WT-M73／配列番号：75、L鎖 WT-κ／配列番号：54）を調製し、ヒトFcRnへのアフィニティーおよびヒトFcRnトランスジェニックマウスによる薬物動態の評価を行った（方法は参考例参照）。
【０１６３】
トシリズマブ-IgG1、トシリズマブ-M44、トシリズマブ-M58およびトシリズマブ-M73のヒトFcRnへの結合性の評価をBiacoreにより行った結果、表6に示すとおり、トシリズマブ-M44、トシリズマブ-M58およびトシリズマブ-M73の結合性はトシリズマブ-IgG1よりもそれぞれ約2.7倍、約1.4倍および約3.8倍程度優れていた。
【０１６４】
（表６）
【０１６５】
トシリズマブ-IgG1、トシリズマブ-M44、トシリズマブ-M58およびトシリズマブ-M73のヒトFcRnトランスジェニックマウスにおける薬物動態の評価を行った結果を図15に示した。図15に示すとおり、トシリズマブ-M44、トシリズマブ-M58およびトシリズマブ-M73はいずれもトシリズマブ-IgG1と比較して薬物動態が向上することが見出された。その薬物動態の向上効果はヒトFcRnへの結合能と相関した。なかでもトシリズマブ-M73に関しては、トシリズマブ-IgG1と比較して28日後の血漿中濃度が約16倍向上していたことから、ヒトにおいてもM73の定常領域を有する抗体はIgG1の定常領域を有する抗体と比較して大幅に薬物動態が向上すると考えられた。
【０１６６】
[実施例7] PK/PDが向上した完全ヒト化IL-6レセプター抗体の作製
上記実施例で見出されたトシリズマブの可変領域および定常領域の変異を複数組み合わせたトシリズマブ改変体を作製し、各種スクリーニングを実施した結果、完全ヒト化IL-6レセプター抗体として、Fv3-M73（H鎖 VH4-M73／配列番号：25、L鎖 VL1-κ／配列番号：28）、Fv4-M73（H鎖 VH3-M73／配列番号：26、L鎖 VL3-κ／配列番号：29）、Fv5-M83（H鎖 VH5-M83／配列番号：27、L鎖 VL5-κ／配列番号：30）を見出した。
【０１６７】
作製したFv3-M73、Fv4-M73、およびFv5-M83のIL-6レセプターへのアフィニティーをトシリズマブと比較した（方法は参考例参照）。pH7.4におけるこれらの抗体の可溶型IL-6レセプターへのアフィニティーを測定した結果を表7に示した。また、BaF/gp130の中和活性をトシリズマブおよび対照（参考例の公知の高親和性抗IL-6レセプター抗体、US 2007/0280945におけるVQ8F11-21 hIgG1）と比較した（方法は参考例参照）。これらの抗体のBaF/gp130による生物活性を測定した結果を図16（IL-6最終濃度300 ng/mL：トシリズマブ、対照、Fv5-M83）および図17（IL-6最終濃度30 ng/mL：トシリズマブ、Fv3-M73、Fv4-M73）に示した。表7に示すとおり、Fv3-M73、Fv4-M73は、トシリズマブと比較して2〜3倍程度強いアフィニティーを有し、Fv5-M83はトシリズマブと比較して100倍程度強いアフィニティーを示した（Fv5-M83ではアフィニティーの測定が困難であったため、定常領域をIgG1にしたFv5-IgG1（H鎖 VH5-IgG1／配列番号：76、L鎖 VL5-κ／配列番号：30）を用いてアフィニティーを測定した。定常領域は一般にアフィニティーに影響しないと考えられる）。また、図17に示すとおりFv3-M73、Fv4-M73は、トシリズマブと比較してやや強い活性を示し、図16に示すとおりFv5-M83はトシリズマブと比較して50％阻害濃度として100倍以上の極めて強い活性を有し、且つ、公知の高親和性抗IL-6レセプター抗体である対照と比較しても50％阻害濃度として約10倍程度高い中和活性を示した。
【０１６８】
（表７）
【０１６９】
トシリズマブ、Fv3-M73、および、Fv4-M73のpH7.4とpH5.8における膜型IL-6レセプターからの解離速度を測定した結果を表8に示した（方法は参考例参照）。Fv3-M73およびFv4-M73は、トシリズマブと比較して膜型IL-6レセプターからの解離速度のpH依存性がそれぞれ約11倍および10倍向上していることが示された。実施例5におけるH3pI/L73と比較して、大幅に解離速度のpH依存性が向上していることから、Fv3-M73とFv4-M73の薬物動態はH3pI/L73と比較して大幅に向上していると考えられた。
【０１７０】
（表８）
【０１７１】
トシリズマブ、対照、Fv3-M73、Fv4-M73、およびFv5-M83の等電点を当業者に公知の方法により等電点電気泳動により測定した結果、トシリズマブの等電点は約9.3、対照は約8.4〜8.5、Fv3-M73は約5.7〜5.8、Fv4-M73は約5.6〜5.7、Fv5-M83は5.4〜5.5であり、いずれの抗体もトシリズマブおよび対照と比較して等電点が大幅に低下した。また、可変領域VH/VLの理論等電点をGENETYX(GENETYX CORPORATION)により計算したところ、トシリズマブの理論等電点は9.20、対照は7.79、Fv3-M73は5.49、Fv4-M73は5.01、Fv5-M83は4.27であり、いずれの抗体もトシリズマブおよび対照と比較して等電点が大幅に低下した。実施例2において等電点の低下により薬物動態が向上することが示されていることから、Fv3-M73、Fv4-M73、およびFv5-M83はトシリズマブおよび対照と比較して薬物動態が向上していると考えられた。
【０１７２】
トシリズマブ、Fv3-M73、Fv4-M73、およびFv5-M83の可変領域配列に存在するT細胞エピトープをTEPITOPE（Methods. 2004 Dec;34(4):468-75）を用いて解析を行った。その結果、実施例3に示したとおり、トシリズマブは多くの配列がHLAに結合するT細胞エピトープが存在すると予測されたが、Fv3-M73、Fv4-M73、およびFv5-M83はT細胞エピトープに結合すると予測された配列が大幅に減少した。また、Fv3-M73、Fv4-M73、およびFv5-M83はフレームワークにマウス配列が残存せず完全ヒト化されている。これらのことから、Fv3-M73、Fv4-M73、およびFv5-M83はトシリズマブと比較して大幅に免疫原性リスクが低減されている可能性が示唆された。
【０１７３】
[実施例8] 完全ヒト化IL-6レセプター抗体のサルPK/PD試験
トシリズマブ、対照、Fv3-M73、Fv4-M73、およびFv5-M83をカニクイザルに1 mg/kgで静脈内に単回投与し血漿中濃度の経時変化を評価した（方法は参考例参照）。トシリズマブ、Fv3-M73、Fv4-M73、およびFv5-M83の静脈内投与後の血漿中濃度の経時変化を図18に示した。その結果、Fv3-M73、Fv4-M73、およびFv5-M83はいずれもトシリズマブおよび対照と比較してカニクイザルにおいて大幅に薬物動態が向上した。なかでも、Fv3-M73とFv4-M73の薬物動態はトシリズマブと比較して大幅に向上した。
【０１７４】
カニクイザル膜型IL-6レセプターがどの程度中和されているかの効力を評価するために、抗体投与6日目から18日目(トシリズマブに関しては3日目から10日目)までカニクイザルIL-6 5μg/kgを腰背部に連日皮下投与し、24時間後の各個体のCRP濃度を測定した（方法は参考例参照）。各抗体投与時のCRP濃度の経時変化を図19に示した。カニクイザル可溶型IL-6レセプターがどの程度中和されているかの効力を評価するために、カニクイザル血漿中の非結合型のカニクイザル可溶型IL-6レセプター濃度を測定し、非結合型の可溶型IL-6レセプターの割合を計算した（方法は参考例参照）。各抗体投与時の非結合型の可溶性IL-6レセプターの割合の経時変化を図20に示した。
【０１７５】
Fv3-M73、Fv4-M73、およびFv5-M83はいずれもトシリズマブおよび公知の高親和性抗IL-6レセプター抗体である対照と比較してカニクイザル膜型IL-6レセプターをより持続的に中和し、CRPの増加を長期間抑制した。また、Fv3-M73、Fv4-M73、およびFv5-M83はいずれもトシリズマブおよび対照と比較してカニクイザル可溶型IL-6レセプターをより持続的に中和し、非結合型のカニクイザル可溶型IL-6レセプターの増加を長期間抑制した。これより膜型IL-6レセプターおよび可溶型IL-6レセプターの中和の持続性に関しては、Fv3-M73、Fv4-M73、およびFv5-M83はいずれもトシリズマブおよび対照よりも優れていることが見出された。なかでもFv3-M73とFv4-M73の中和の持続性は極めて優れていた。一方、Fv5-M83のほうがFv3-M73とFv4-M73よりCRPおよび非結合型カニクイザル可溶型IL-6レセプターを低く抑制していることから、Fv5-M83は膜型IL-6レセプターおよび可溶型IL-6レセプターをFv3-M73とFv4-M73および公知の高親和性抗IL-6レセプター抗体である対照よりも強力に中和していると考えられた。これはFv5-M83が対照よりもIL-6レセプターへのアフィニティーが強く、且つ、BaF/gp130における生物活性が強いことがカニクイザルのインビボにおいて反映された結果であると考えられる。
【０１７６】
これらのことから、トシリズマブおよび対照と比較して、Fv3-M73とFv4-M73は抗IL-6レセプター中和抗体として作用の持続性が極めて優れており、投与頻度および投与量を大幅に低減することが可能であり、また、Fv5-M83は抗IL-6レセプター中和抗体として作用の強さに極めて優れており、また作用の持続性にも優れていることが見出された。よってFv3-M73、Fv4-M73、およびFv5-M83はIL-6アンタゴニストとしての医薬として有用であると考えられる。
【０１７７】
[実施例9] Fv4-M73のための安定な緩衝液種の選択
上記のように、Fv4-M73を調製する。実施例6〜7に記載されるように、Fv4-M73は、不均一性、安定性、安全性、および薬物動態の向上のために、非天然の定常領域M73から構成されているため、Fv4-M73の安定性プロファイル（たとえば、最も安定な緩衝液種）は、IgG1などの天然の定常領域から構成された抗体とは異なる可能性がある。天然のIgG1定常領域から構成された抗体は、一般に、ヒスチジン酢酸緩衝液の下で最も安定であることが報告されている（WO/2006/044908）。そこで、Fv4-M73の安定性に対する緩衝液種の効果を試験した。
【０１７８】
Fv4-M73を、6.0のpHを有する（表9に記載されたような）4つの異なる緩衝液製剤で37 mg/mLの最終濃度で製剤化した。試料を、40℃の保存条件の下で、2ヶ月間にわたり、UV検出を伴うサイズ排除クロマトグラフィーおよび陰イオン交換クロマトグラフィーにより分析した。これらの製剤において形成された凝集物の割合（％）を経時的に表示し、図21に示す。凝集物の割合（％）の増加は、抗体の安定性の低下の指標となる。従って、異なる緩衝液の安定化効果を比較するため、割合（％）の増加を指標として使用した。
【０１７９】
図21に示されるように、ヒスチジン-HCl緩衝液を含む製剤（製剤A）およびクエン酸緩衝液を含む製剤（製剤D）が最も安定であり、酢酸緩衝液を含む製剤（製剤C）が最も不安定であった。ヒスチジン-酢酸緩衝液（製剤B）は、ヒスチジン-HCl緩衝液よりわずかに不安定であり、これは、酢酸緩衝液の不安定化効果によるものと考えられる。
【０１８０】
従って、非天然の定常領域を有するFv4-M73は、天然のIgG1抗体のための最も安定な緩衝液種であると報告されているヒスチジン-酢酸緩衝液ではなく、ヒスチジン-HCl緩衝液およびクエン酸緩衝液において最も安定であることが見出された。
【０１８１】
（表９）実施例9において使用された製剤
【０１８２】
方法
サイズ排除クロマトグラフィー（SEC）：抗体の凝集物および断片の存在について抗体製剤をスクリーニングするために、サイズ排除クロマトグラフィーを実施した。試料をサイズ排除G3000 SWXLカラム（TOSOH）に注入した。移動相は、0.5 mL/分の流速で均一濃度で流れる50 mMリン酸ナトリウム、300 mM塩化ナトリウム（pH7.0）とし、溶出したタンパク質を、220 nmにおけるUV吸光度により検出した。検出されたすべてのタンパク質種の相対量を、他の全ての検出されたピークの総面積と比較して、生成物ピークの面積％として報告した。抗体モノマーピークより早く溶出するピークを、凝集物パーセンタイルで記録し、抗体モノマーピークより遅いが緩衝液ピークより早く溶出するピークを、断片パーセンタイルで記録した。
【０１８３】
試料調製:試料を移動相により0.3〜2 mg/mLに希釈し、15マイクロリットルをカラムに注入した。
【０１８４】
陰イオン交換クロマトグラフィー：不均一性の存在について、特に、脱アミド（脱アミドを有するものは、主要ピークの後に酸性成分として溶出する）の存在について、抗体製剤を分析するため、陰イオン交換クロマトグラフィーを実施した。試料を40℃でDEAE-NPRカラム（TOSOH）へ注入した。移動相は、（A）10 mMトリス-HCl（pH7.5）、（B）10 mMトリス-HCl、500 mM塩化ナトリウム（pH7.5）であり、100％移動相A、次いで30分間70％移動相Aおよび30％移動相B、続いて1分間100％移動相Bの勾配で流し、次いで、カラムを洗浄するため1.0 mL/分の流速で4分間維持した。溶出したタンパク質を、280 nmにおけるUV吸光度により検出した。
【０１８５】
試料調製:試料を移動相により0.05〜0.33 mg/mLに希釈し、100マイクロリットルの容量でカラムに注入した。
【０１８６】
[実施例10] 100 mg/mLのFv4-M73の安定性に対するpH、NaCl、およびアルギニン-HClの効果
Fv4-M73を、（表10に記載された）異なる緩衝液製剤で100 mg/mLの最終濃度に製剤化し、25℃および40℃で保存された場合に、2ヶ月間にわたり、UV検出を伴うサイズ排除クロマトグラフィーおよび陰イオン交換クロマトグラフィーにより試料を分析した。また、凍結-融解された試料（-20℃で0.5日間の凍結、室温で30分間の融解）に対しても分析を行った。25℃および40℃での2/4/8週間の保存後の、製剤中に存在する凝集物の割合（％）および凝集物の割合（％）の初期値からの増加分を、図22〜25に示す。凝集物の量の増加は、安定性の低下の指標となる。
【０１８７】
（表１０）実施例10において使用された製剤
【０１８８】
図26に記載された低分子量成分（LMW）は、酸性条件または塩基性条件の下でのヒンジ領域などの脆弱なスポットにおけるペプチド結合の直接加水分解の結果であると考えられる。これは、高温における溶液製剤中のモノクローナル抗体に関して特に一般的である。塩基性条件下で増加した、図27に記載された約22.5分〜26分に溶出した酸性種は、アスパラギン残基の非酵素的脱アミド（抗体の一般的な修飾）の結果であると考えられる。高温で塩基性pHの下で抗体をインキュベートした後、より多くの酸性種が観察されることから、これはモノクローナル抗体の電荷不均一性に関与していることが報告されている。図22〜26の結果を考慮し、Fv4-M73は、凝集物および分解に関して、約5.5〜6.3のpHの溶液において安定であることが見出された。総ピーク面積に対する主要ピークの比率に関して、至適安定性は約5.5〜6.3のpHで観察された（図27〜28）。
【０１８９】
この研究において、20 mM緩衝剤および50 mM NaClを含有する緩衝液（20 mM緩衝液、150 mM NaCl）に100 mM NaClを添加することにより、20 mM緩衝剤および50 mM NaClを含有する緩衝液（20 mM緩衝液、50 mM NaCl）と同等に安定な抗体溶液が得られ、このことから、NaClが安定化効果を有しないことが示唆された。20 mM緩衝剤および50 mM NaClを含有する緩衝液への100 mMアルギニンの添加（20 mM緩衝液、50 mM NaCl、および100 mMアルギニン-HCl）は、凝集物に関して抗体溶液の有意な安定化効果を示し、このことから、アルギニン-HClが有意な安定化効果を有することが示唆された。緩衝剤に関しては、クエン酸緩衝液よりヒスチジン-HCl緩衝液を使用した方が、溶液安定性がわずかに良好であった。
【０１９０】
図29に示されるような凍結-融解試験（「FT」は凍結／融解サイクルの数を示す）に関して、製剤中において、より低いpHまたはより低い塩濃度で、有意な量の凝集物が観察された。20 mM緩衝剤および50 mM NaClを含有する緩衝液への100 mMアルギニンの添加（20 mM緩衝液、50 mM NaCl、100 mMアルギニン-HCl）は、凝集物の形成に関して、100 mM NaClの添加（20 mM緩衝液、150 mM NaCl）より効果的であり、このことから、アルギニン-HClが凍結-融解に対する有意な安定化効果を有することが示唆された。至適安定性は、100 mMアルギニン-HClを含有する約5.0〜6.6の範囲のpHで観察された。
【０１９１】
[実施例11] 100 mg/mLのFv4-M73の安定性に対する糖およびアルギニン-HClの効果
Fv4-M73を、（表11に記載された）異なる緩衝液製剤で100 mg/mLの最終濃度に製剤化し、25℃および40℃で保存し、2ヶ月間にわたり、UV検出を伴うサイズ排除クロマトグラフィーおよび陰イオン交換クロマトグラフィーにより試料を分析した。また、所定の回数の凍結-融解サイクル（-20℃で0.5日間の凍結、室温で30分間の融解）も実施した。製剤に含有されている凝集物の割合（％）の初期値からの増加分を、経時的にプロットし、図30および31に示す。凝集物の量（％）の増加は、安定性の低下の指標となる。
【０１９２】
図30および31に示されるように、製剤FおよびGは、製剤Hより低い安定性を示し、このことから、25℃および40℃で保存された液体条件では、ショ糖およびトレハロースはアルギニン-HClより低い安定化効果を有することが示された。一方、凍結-融解においては、製剤FおよびGは、製剤Hに匹敵するか、またはそれより高い安定性を示したことから、ショ糖またはトレハロースは、凍結-融解においては有意な安定化効果を示すことが示された。
【０１９３】
（表１１）実施例11において使用された製剤
【０１９４】
[実施例12] 200 mg/mLのFv4-M73の安定性；pH、アルギニン-HCl、およびトレハロースの効果
Fv4-M73を、表12に記載されるような6つの異なる製剤で200 mg/mLの最終濃度に製剤化した。
【０１９５】
（表１２）実施例12において使用された製剤
【０１９６】
試料を、3ヶ月間および6ヶ月間、それぞれについて5℃および-20℃でインキュベートした。初期試料、3ヶ月試料、および6ヶ月試料を、実施例9に記載されるようなUV検出を伴うサイズ排除クロマトグラフィーにより分析した。5℃における、3ヶ月後および6ヶ月後のこれらの製剤における凝集物の割合（％）の初期値からの増加分を、図32に示す。-20℃における、3ヶ月後および6ヶ月後のこれらの製剤における凝集物の割合（％）の初期値からの増加分を、図33に示す。
【０１９７】
図32に示されるように、5℃で保存された溶液条件で、Fv4-M73は、明らかに、より低いpHでより安定であり（pH 5.5で最も安定、pH 6.5で最も不安定）、より高いアルギニン濃度でより安定であった（150 mMアルギニン-HClで最も安定、50 mMアルギニン-HClで最も不安定）。50 mMトレハロースの添加は、5℃で保存された溶液条件で、Fv4-M73に対するある程度の安定化効果を示した。抗体医薬品の溶液製剤はしばしば5℃で保存されるため、Fv4-M73のための好ましい溶液製剤は、pH 5.5〜pH 6.0のヒスチジン緩衝液と共に少なくとも100 mMのアルギニン-HClを含有し、必要であれば、追加の安定剤を含有するべきである。
【０１９８】
図33に示されるように、-20℃で保存された凍結条件で、Fv4-M73は、より高いpHでより安定である傾向があり、明らかに、より高いアルギニン濃度でより安定であった（150 mMアルギニン-HClで最も安定、50 mMアルギニン-HClで最も不安定）。50 mMトレハロースの添加は、-20℃で保存された凍結条件で、Fv4-M73に対する有意な安定効果を示した。抗体の原体は、しばしば、-20℃〜-70℃の凍結状態で保存蔵されるが、凍結状態での保管および出荷のコストを考慮すると、-20℃の保存が望ましい。Fv4-M73の-20℃保存のための好ましい原体製剤は、pH 5.5〜pH 6.5のヒスチジン緩衝液および（トレハロースなどの）糖と共に少なくとも100 mMのアルギニン-HClを含有するべきである。
【０１９９】
参考例
組み換え可溶型ヒトIL-6レセプターの調製
抗原であるヒトIL-6レセプターの組み換え可溶型ヒトIL-6レセプターを以下のように調製した。J.Biochem. (1990) 108, 673-676で報告されているN末端側1番目から344番目のアミノ酸配列からなる可溶型ヒトIL-6レセプター（Yamasaki et al., Science (1988) 241, 825-828 (GenBank # X12830)）のCHO細胞定常発現株を作製した。SR344発現CHO細胞から得られた培養上清から、Blue Sepharose 6 FFカラムクロマトグラフィー、SR344に対する特異抗体を固定したカラムによるアフィニティクロマトグラフィー、ゲルろ過カラムクロマトグラフィーの3つのカラムクロマトグラフィーにより、可溶型ヒトIL-6レセプターを精製した。主要ピークとして溶出した画分を最終精製品とした。
【０２００】
組み換え可溶型カニクイザルIL-6レセプター（cIL-6R）の調製
公開されているアカゲザルIL-6レセプター遺伝子配列 (Birney et al., Ensembl 2006, Nucleic Acids Res. 2006 Jan 1;34(Database issue):D556-61.) を元にオリゴDNAプライマーを作製し、カニクイザル膵臓から調製されたcDNAを鋳型とし、プライマーを用いて、PCR法によりカニクイザルIL-6レセプター遺伝子全長をコードするDNA断片を調製した。得られたDNA断片を哺乳動物細胞発現ベクターへ挿入し、これを用いてCHO定常発現株（cyno.sIL-6R産生CHO細胞）を作製した。cyno.sIL-6R産生CHO細胞の培養液をHisTrapカラム（GEヘルスケアバイオサイエンス）で精製後、Amicon Ultra-15 Ultracel-10k（Millipore）を用いて濃縮し、Superdex200pg16/60ゲルろ過カラム（GEヘルスケアバイオサイエンス）でさらに精製を行い、可溶型カニクイザルIL-6レセプター（以下、cIL-6R）の最終精製品とした。
【０２０１】
組み換えカニクイザルIL-6(cIL-6)の調製
カニクイザルIL-6は以下のように調製した。SWISSPROT Accession No.P79341に登録されている212アミノ酸をコードする塩基配列を作成し、哺乳動物細胞発現ベクターにクローニングし、CHO細胞に導入することで定常発現細胞株を作製した（cyno.IL-6産生CHO細胞）。cyno.IL-6産生CHO細胞の培養液をSP-Sepharose/FFカラム（GEヘルスケアバイオサイエンス）で精製後、Amicon Ultra-15 Ultracel-5k（Millipore）を用いて濃縮し、Superdex75pg26/60ゲルろ過カラム（GEヘルスケアバイオサイエンス）でさらに精製を行い、Amicon Ultra-15 Ultracel-5k（Millipore）を用いて濃縮し、カニクイザルIL-6（以下、cIL-6）の最終精製品とした。
【０２０２】
公知の高親和性抗IL-6レセプター抗体の作製
公知の高親和性抗IL-6レセプター抗体として、US 2007/0280945 A1に記載されている高親和性抗IL-6レセプター抗体であるVQ8F11-21 hIgG1（US 2007/0280945 A1, H鎖アミノ酸配列：配列番号：77、L鎖アミノ酸配列：配列番号：78）を発現させるため、哺乳動物細胞発現ベクターを構築した。抗体可変領域については、合成オリゴDNAを組み合わせたPCR法（assembly PCR）により作製し、定常領域についてはIgG1を使用した。Assembly PCR法により抗体可変領域と定常領域を結合させ、哺乳動物発現ベクターへ挿入し、目的のH鎖発現ベクターおよびL鎖発現ベクターを作製した。得られた発現ベクターの塩基配列は当業者に公知の方法で決定した。作製した発現ベクターを用い、発現および精製を行った。発現および精製は実施例1に記載した方法で行い、高親和性抗IL-6レセプター抗体（以降、「対照」と記す）を得た。
【０２０３】
トシリズマブの変異体の作製、発現、および精製
トシリズマブの変異体はQuikChange Site-Directed Mutagenesis Kit（Stratagene）を用いて、添付説明書記載の方法で変異体を作製し、得られたプラスミド断片を哺乳動物細胞発現ベクターに挿入し、目的のH鎖発現ベクターおよびL鎖発現ベクターを作製した。得られた発現ベクターの塩基配列は当業者に公知の方法で決定した。抗体の発現は以下の方法を用いて行った。ヒト胎児腎癌細胞由来HEK293H株（Invitrogen）を10 % ウシ胎児血清 (Invitrogen)を含むDMEM培地(Invitrogen)へ懸濁し、5〜6 × 105個/mLの細胞密度で接着細胞用ディッシュ（直径10 cm, CORNING）の各ディッシュへ10 mLずつプレーティングし、CO2インキュベーター（37℃、5% CO2）内で一昼夜培養した後に、培地を吸引除去し、CHO-S-SFM-II（Invitrogen）培地6.9 mLを添加した。調製したプラスミドをlipofection法により細胞へ導入した。得られた培養上清を回収した後、遠心分離（約2000 g、5分間、室温）して細胞を除去し、さらに0.22μmフィルターMILLEX(R)-GV（Millipore）を通して滅菌して培養上清を得た。得られた培養上清からrProtein A Sepharose（商標）Fast Flow（Amersham Biosciences）を用いて当業者に公知の方法で抗体を精製した。精製抗体濃度は、分光光度計を用いて280 nmでの吸光度を測定した。得られた値からPACE法により算出された吸光係数を用いて抗体濃度を算出した（Protein Science 1995 ; 4 : 2411-2423）。
【０２０４】
ヒトgp130発現BaF3細胞株の樹立
IL-6依存増殖性を示す細胞株を得るために、以下に示すとおり、ヒトgp130を発現したBaF3細胞株の樹立を行った。
【０２０５】
全長ヒトgp130 cDNA（Hibi et al., Cell 1990；63：1149-1157（GenBank # NM_002184））をPCRにより増幅し、pCHOI（Hirata et al., FEBS Letter 1994；356：244-248）のDHFR遺伝子発現部位を除去し、Zeocin耐性遺伝子発現部位を挿入した発現ベクターpCOS2Zeoにクローニングし、pCOS2Zeo/gp130を構築した。全長ヒトIL-6R cDNAをPCRにより増幅し、pcDNA3.1(+)（Invitrogen）にクローニングし、hIL-6R/pcDNA3.1(+)を構築した。
【０２０６】
10μgのpCOS2Zeo/gp130をPBSに懸濁したBaF3細胞（0.8 x 107 cells）に混合し、Gene Pulser（Bio-Rad）を用いて0.33 kV, 950μFDの容量でパルスを加えた。エレクトロポレーション処理により遺伝子導入したBaF3細胞を0.2 ng/mLのマウスインターロイキン-3（Peprotech）、10% ウシ胎児血清（以下FBS、HyClone）を含むRPMI1640培地（Invitrogen）で一昼夜培養し、100 ng/mLのヒトインターロイキン-6（R&D systems）、100 ng/mLのヒトインターロイキン-6可溶性レセプター（R&D systems）および10％ FBSを含むRPMI1640培地を加えて選択し、ヒトgp130発現BaF3細胞株（以下、「BaF3/gp130」）を樹立した。このBaF/gp130は、ヒトインターロイキン-6（R&D systems）および可溶型ヒトIL-6レセプター存在下で増殖することから、抗IL-6レセプター抗体の増殖阻害活性（すなわちIL-6レセプター中和活性）の評価に使用することが可能である。
【０２０７】
ヒトgp130発現BaF3細胞（BaF/gp130）による生物活性評価
IL-6/IL-6レセプター依存性増殖を示すBaF3/gp130を用いて、IL-6レセプター中和活性を評価した。BaF3/gp130を10% FBSを含むRPMI1640培地で3回洗浄した後に、5 x 104 cells/mLとなるように600 ng/mLないしは60 ng/mLのヒトインターロイキン-6（TORAY）（最終濃度は300 ng/mLないしは30 ng/mL）、適当量の可溶型ヒトIL-6レセプターおよび10% FBSを含むRPMI1640培地に懸濁し、96ウェルプレート（CORNING）の各ウェルに50μLずつ分注した。次に、精製した抗体を10% FBSを含むRPMI1640に希釈して、各ウェルに50μLずつ混合した。37℃、5% CO2条件下で、3日間培養し、PBSで2倍に希釈したWST-8試薬（Cell Counting Kit-8、株式会社同仁化学研究所）を20μL/ウェルで加え、直後にSUNRISE CLASSIC（TECAN）を用いて450 nmの吸光度（参照波長620 nm）を測定した。2時間培養した後に、再度450 nmの吸光度（参照波長620 nm）を測定し、2時間の吸光度変化を指標にIL-6レセプター中和活性を評価した。
【０２０８】
Biacoreによる可溶型ヒトIL-6レセプターへの結合評価
Biacore T100（GE Healthcare）を用いて、抗原抗体反応の速度論的解析を行った。センサーチップ上にアミンカップリング法でプロテインAあるいはプロテイン A/Gあるいは抗IgG（γ鎖特異的）F(ab')2を適当量固定化し、次にpH7.4において目的の抗体を結合させ、さらにpH7.4において種々の濃度に調製した可溶型IL-6レセプターを分析物として流し、抗体と可溶型ヒトIL-6レセプターの相互作用を測定した。測定は全て37℃で実施した。測定で得られたセンサーグラムから、動力学的パラメーターである結合速度定数ka（1/Ms）、および解離速度定数kd（1/s）を算出し、その値をもとにKD（M）を算出した。各パラメーターの算出にはBiacore T100 Evaluation Software（GE Healthcare）を用いた。
【０２０９】
Biacoreによる膜型IL-6レセプターへのpH依存的解離評価
Biacore T100（GE Healthcare）を用いてpH5.8, pH7.4における膜型IL-6レセプターへの抗原抗体反応を観測した。センサーチップ上に固定化した可溶型ヒトIL-6レセプターへの結合を測定することで、膜型IL-6レセプターへの結合を評価した。SR344を当業者に公知の方法に従ってビオチン化し、ストレプトアビジンとビオチンの親和性を利用し、ストレプトアビジンを介してビオチン化可溶型ヒトIL-6レセプターをセンサーチップ上に固定化した。測定は全て37℃で実施し、移動相の緩衝液は10 mM MES pH5.8, 150 mM NaCl, 0.05% Tween20とし、そこにpH依存的結合クローンをpH7.4の条件下で注入して可溶型ヒトIL-6レセプターと結合させたのち（注入試料の緩衝液は10 mM MES pH7.4, 150 mM NaCl, 0.05% Tween20）、移動相のpHである5.8で各クローンのpH依存的な解離を観測した。試料濃度を0.25μg/mLとし、10 mM MES pH7.4, 150 mM NaCl, 0.05 % Tween20で結合させ、10 mM MES pH5.8, 150 mM NaCl, 0.05% Tween20で解離させたときのpH5.8における解離相のみBiacore T100 Evaluation Software（GE Healthcare）を用いプロットすることにより、pH5.8における解離速度定数（kd(1/s)）を算出した。同様にまた、試料濃度を0.5μg/mLとし、10 mM MES pH7.4, 150 mM NaCl, 0.05% Tween20で結合させ、10 mM MES pH7.4, 150 mM NaCl, 0.05% Tween20で解離させたときのpH7.4における解離相のみBiacore T100 Evaluation Software（GE Healthcare）を用いプロットすることにより、pH7.4における解離速度定数（kd(1/s)）を算出した。
【０２１０】
ヒトFcRnへの結合評価
FcRnはFcRnとβ2-ミクログロブリンの複合体である。公開されているヒトFcRn遺伝子配列（J. Exp. Med. (1994) 180 (6), 2377-2381）を元に、オリゴDNAプライマーを作製した。ヒトcDNA（Human Placenta Marathon-Ready cDNA, Clontech）を鋳型とし、作製したプライマーを用いPCR法により遺伝子全長をコードするDNA断片を調整した。得られたDNA断片を鋳型に、PCR法によりシグナル領域を含む細胞外領域（Met1-Leu290）をコードするDNA断片を増幅し、動物細胞発現ベクターへ挿入した（ヒトFcRnアミノ酸配列／配列番号：79）。同様に、公開されているヒトβ2-ミクログロブリン遺伝子配列（Proc. Natl. Acad. Sci. USA. (2002) 99 (26), 16899-16903）を元に、オリゴDNAプライマーを作製した。ヒトcDNA（Hu-Placenta Marathon-Ready cDNA, CLONTECH）を鋳型とし、作製したプライマーを用いPCR法により遺伝子全長をコードするDNA断片を調製した。得られたDNA断片を鋳型に、PCR法によりシグナル領域を含むβ2-ミクログロブリン全長（Met1-Met119）をコードするDNA断片を増幅し、哺乳動物細胞発現ベクターへ挿入した（ヒトβ2-ミクログロブリンアミノ酸配列／配列番号：80）。
【０２１１】
可溶型ヒトFcRnの発現は以下の手順で行った。調製したヒトFcRnおよび（ヒトβ2-ミクログロブリンのプラスミドを、10 % ウシ胎児血清 (Invitrogen)を用いたlipofection法により、ヒト胎児腎癌細胞由来HEK293H株（Invitrogen）の細胞へ導入した。得られた培養上清を回収した後、IgG Sepharose 6 Fast Flow（Amersham Biosciences）を用い、（J Immunol. 2002 Nov 1;169(9):5171-80.）の方法に従い精製を行った。その後、HiTrap Q HP（GE Healthcare）により精製を行った。
【０２１２】
マウスにおける抗体血漿中濃度の測定
マウス血漿中抗体濃度測定はELISA法にて当業者に公知の方法で測定した。
【０２１３】
サルPK/PD試験による抗体血漿中濃度、CRP濃度、非結合型可溶型IL-6レセプターの測定
カニクイザル血漿中濃度測定はELISA法にて当業者に公知の方法で測定した。
【０２１４】
CRP濃度はサイアスR CRP（関東化学株式会社）にて、自動分析装置（TBA-120FR、東芝メディカルシステムズ株式会社）を用いて測定した。
【０２１５】
カニクイザル血漿中の非結合型の可溶型カニクイザルIL-6レセプター濃度を以下の通り測定した。カニクイザルの血漿30μLを0.22μmのフィルターカップ（Millipore）において乾燥させた適量のrProtein A Sepharose Fast Flow（GE Healthcare）樹脂に添加することで血漿中に存在する全てのIgG型抗体（カニクイザルIgG、抗ヒトIL-6レセプター抗体および抗ヒトIL-6レセプター抗体-可溶型カニクイザルIL-6レセプター複合体）をプロテインAに吸着させた。その後、高速遠心機でスピンダウンし、パス溶液を回収した。パス溶液にはプロテインAに結合した抗ヒトIL-6レセプター抗体-可溶型カニクイザルIL-6レセプター複合体は含まれないため、プロテインAパス溶液中の可溶型カニクイザルIL-6レセプター濃度を測定することによって、非結合型の可溶型IL-6レセプター濃度を測定可能である。可溶型カニクイザルIL-6レセプター濃度は、上記で作製した可溶型カニクイザルIL-6レセプター（cIL-6R）をスタンダードに用いて、ヒトIL-6レセプター濃度を測定する当業者に公知の方法で測定した。非結合型の可溶型IL-6レセプターの割合は以下の計算式によって計算した。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
（a）配列番号：1（VH4-M73のCDR1）の配列を含むCDR1、配列番号：2（VH4-M73のCDR2）の配列を含むCDR2、および配列番号：3（VH4-M73のCDR3）の配列を含むCDR3を含む、ポリペプチド；
（b）配列番号：4（VH3-M73のCDR1）の配列を含むCDR1、配列番号：5（VH3-M73のCDR2）の配列を含むCDR2、および配列番号：6（VH3-M73のCDR3）の配列を含むCDR3を含む、ポリペプチド；
（c）配列番号：7（VH5-M83のCDR1）の配列を含むCDR1、配列番号：8（VH5-M83のCDR2）の配列を含むCDR2、および配列番号：9（VH5-M83のCDR3）の配列を含むCDR3を含む、ポリペプチド；
（d）配列番号：10（VL1のCDR1）の配列を含むCDR1、配列番号：11（VL1のCDR2）の配列を含むCDR2、および配列番号：12（VL1のCDR3）の配列を含むCDR3を含む、ポリペプチド；
（e）配列番号：13（VL3のCDR1）の配列を含むCDR1、配列番号：14（VL3のCDR2）の配列を含むCDR2、および配列番号：15（VL3のCDR3）の配列を含むCDR3を含む、ポリペプチド；ならびに
（f）配列番号：16（VL5のCDR1）の配列を含むCDR1、配列番号：17（VL5のCDR2）の配列を含むCDR2、および配列番号：18（VL5のCDR3）の配列を含むCDR3を含む、ポリペプチド
より選択される少なくとも一つのポリペプチドを含む、製剤。
【請求項２】
（a）配列番号：1（VH4-M73のCDR1）の配列を含むCDR1、配列番号：2（VH4-M73のCDR2）の配列を含むCDR2、および配列番号：3（VH4-M73のCDR3）の配列を含むCDR3を含む重鎖可変領域、ならびに配列番号：10（VL1のCDR1）の配列を含むCDR1、配列番号：11（VL1のCDR2）の配列を含むCDR2、および配列番号：12（VL1のCDR3）の配列を含むCDR3を含む軽鎖可変領域を含む、抗体；
（b）配列番号：4（VH3-M73のCDR1）の配列を含むCDR1、配列番号：5（VH3-M73のCDR2）の配列を含むCDR2、および配列番号：6（VH3-M73のCDR3）の配列を含むCDR3を含む重鎖可変領域、ならびに配列番号：13（VL3のCDR1）の配列を含むCDR1、配列番号：14（VL3のCDR2）の配列を含むCDR2、および配列番号：15（VL3のCDR3）の配列を含むCDR3を含む軽鎖可変領域を含む、抗体；
（c）配列番号：7（VH5-M83のCDR1）の配列を含むCDR1、配列番号：8（VH5-M83のCDR2）の配列を含むCDR2、および配列番号：9（VH5-M83のCDR3）の配列を含むCDR3を含む重鎖可変領域、ならびに配列番号：16（VL5のCDR1）の配列を含むCDR1、配列番号：17（VL5のCDR2）の配列を含むCDR2、および配列番号：18（VL5のCDR3）の配列を含むCDR3を含む軽鎖可変領域を含む、抗体；
（d）配列番号：19（VH4-M73の可変領域）の配列を含む重鎖可変領域および配列番号：22（VL1の可変領域）の配列を含む軽鎖可変領域を含む、抗体；
（e）配列番号：20（VH3-M73の可変領域）の配列を含む重鎖可変領域および配列番号：23（VL3の可変領域）の配列を含む軽鎖可変領域を含む、抗体；
（f）配列番号：21（VH5-M83の可変領域）の配列を含む重鎖可変領域および配列番号：24（VL5の可変領域）の配列を含む軽鎖可変領域を含む、抗体；
（g）配列番号：25（VH4-M73）の配列を含む重鎖および配列番号：28（VL1）の配列を含む軽鎖を含む、抗体；
（h）配列番号：26（VH3-M73）の配列を含む重鎖および配列番号：29（VL3）の配列を含む軽鎖を含む、抗体；ならびに
（i）配列番号：27（VH5-M83）の配列を含む重鎖および配列番号：30（VL5）の配列を含む軽鎖を含む、抗体
より選択される少なくとも一つの抗体を含む、製剤。
【請求項３】
ヒスチジン緩衝液および／またはクエン酸緩衝液を含む、請求項1または2記載の安定な製剤。
【請求項４】
少なくとも一つの塩基性アミノ酸を含む、請求項1〜3のいずれか一項記載の安定な製剤。
【請求項５】
1〜500 mMのヒスチジン緩衝液および／またはクエン酸緩衝液、1〜1500 mMの少なくとも一つの塩基性アミノ酸、1〜200 mg/mLの抗体、ならびに1〜400 mMの糖質を含む、請求項1〜4のいずれか一項記載の安定な製剤。
【請求項６】
塩基性アミノ酸がアルギニンである、請求項4または5記載の製剤。
【請求項７】
糖質がショ糖またはトレハロースである、請求項5または6記載の製剤。
【請求項８】
界面活性剤をさらに含む、請求項1〜7のいずれか一項記載の製剤。
【請求項９】
少なくとも10 mg/mlの量のポリペプチドおよび／または抗体を含有する、請求項1〜8のいずれか一項記載の製剤。
【請求項１０】
少なくとも50 mg/mlの量のポリペプチドおよび／または抗体を含有する、請求項1〜9のいずれか一項記載の製剤。
【請求項１１】
少なくとも80 mg/mlの量のポリペプチドおよび／または抗体を含有する、請求項1〜10のいずれか一項記載の製剤。
【請求項１２】
240 mg/ml以下の量のポリペプチドおよび／または抗体を含有する、請求項1〜11のいずれか一項記載の製剤。
【請求項１３】
4.5〜7.0の範囲のpHを有する、請求項1〜12のいずれか一項記載の製剤。
【請求項１４】
5.5〜6.6の範囲のpHを有する、請求項13記載の製剤。
【請求項１５】
溶液である、請求項1〜14のいずれか一項記載の製剤。
【請求項１６】
調製の間に凍結乾燥に供されていない、請求項15記載の製剤。
【請求項１７】
前記ポリペプチド分子および／または抗体分子の二量体化が低減されている、請求項1〜16のいずれか一項記載の製剤。
【請求項１８】
前記ポリペプチド分子および／または抗体分子の二量体化が阻害されている、請求項1〜17のいずれか一項記載の製剤。
【請求項１９】
皮下投与用の請求項1〜18のいずれか一項記載の製剤。
【請求項２０】
少なくとも一つの塩基性アミノ酸を添加する工程を含む、抗体を含有する溶液を安定化する方法であって、該抗体が、
（a）配列番号：1（VH4-M73のCDR1）の配列を含むCDR1、配列番号：2（VH4-M73のCDR2）の配列を含むCDR2、および配列番号：3（VH4-M73のCDR3）の配列を含むCDR3を含む重鎖可変領域、ならびに配列番号：10（VL1のCDR1）の配列を含むCDR1、配列番号：11（VL1のCDR2）の配列を含むCDR2、および配列番号：12（VL1のCDR3）の配列を含むCDR3を含む軽鎖可変領域を含む、抗体；
（b）配列番号：4（VH3-M73のCDR1）の配列を含むCDR1、配列番号：5（VH3-M73のCDR2）の配列を含むCDR2、および配列番号：6（VH3-M73のCDR3）の配列を含むCDR3を含む重鎖可変領域、ならびに配列番号：13（VL3のCDR1）の配列を含むCDR1、配列番号：14（VL3のCDR2）の配列を含むCDR2、および配列番号：15（VL3のCDR3）の配列を含むCDR3を含む軽鎖可変領域を含む、抗体；
（c）配列番号：7（VH5-M83のCDR1）の配列を含むCDR1、配列番号：8（VH5-M83のCDR2）の配列を含むCDR2、および配列番号：9（VH5-M83のCDR3）の配列を含むCDR3を含む重鎖可変領域、ならびに配列番号：16（VL5のCDR1）の配列を含むCDR1、配列番号：17（VL5のCDR2）の配列を含むCDR2、および配列番号：18（VL5のCDR3）の配列を含むCDR3を含む軽鎖可変領域を含む、抗体；
（d）配列番号：19（VH4-M73の可変領域）の配列を含む重鎖可変領域および配列番号：22（VL1の可変領域）の配列を含む軽鎖可変領域を含む、抗体；
（e）配列番号：20（VH3-M73の可変領域）の配列を含む重鎖可変領域および配列番号：23（VL3の可変領域）の配列を含む軽鎖可変領域を含む、抗体；
（f）配列番号：21（VH5-M83の可変領域）の配列を含む重鎖可変領域および配列番号：24（VL5の可変領域）の配列を含む軽鎖可変領域を含む、抗体；
（g）配列番号：25（VH4-M73）の配列を含む重鎖および配列番号：28（VL1）の配列を含む軽鎖を含む、抗体；
（h）配列番号：26（VH3-M73）の配列を含む重鎖および配列番号：29（VL3）の配列を含む軽鎖を含む、抗体；ならびに
（i）配列番号：27（VH5-M83）の配列を含む重鎖および配列番号：30（VL5）の配列を含む軽鎖を含む、抗体
より選択される少なくとも一つの抗体である、方法。
【請求項２１】
少なくとも一つの塩基性アミノ酸を添加する工程を含む、抗体を含有する溶液の凍結／融解サイクルの間、該抗体を安定化する方法であって、該抗体が、
（a）配列番号：1（VH4-M73のCDR1）の配列を含むCDR1、配列番号：2（VH4-M73のCDR2）の配列を含むCDR2、および配列番号：3（VH4-M73のCDR3）の配列を含むCDR3を含む重鎖可変領域、ならびに配列番号：10（VL1のCDR1）の配列を含むCDR1、配列番号：11（VL1のCDR2）の配列を含むCDR2、および配列番号：12（VL1のCDR3）の配列を含むCDR3を含む軽鎖可変領域を含む、抗体；
（b）配列番号：4（VH3-M73のCDR1）の配列を含むCDR1、配列番号：5（VH3-M73のCDR2）の配列を含むCDR2、および配列番号：6（VH3-M73のCDR3）の配列を含むCDR3を含む重鎖可変領域、ならびに配列番号：13（VL3のCDR1）の配列を含むCDR1、配列番号：14（VL3のCDR2）の配列を含むCDR2、および配列番号：15（VL3のCDR3）の配列を含むCDR3を含む軽鎖可変領域を含む、抗体；
（c）配列番号：7（VH5-M83のCDR1）の配列を含むCDR1、配列番号：8（VH5-M83のCDR2）の配列を含むCDR2、および配列番号：9（VH5-M83のCDR3）の配列を含むCDR3を含む重鎖可変領域、ならびに配列番号：16（VL5のCDR1）の配列を含むCDR1、配列番号：17（VL5のCDR2）の配列を含むCDR2、および配列番号：18（VL5のCDR3）の配列を含むCDR3を含む軽鎖可変領域を含む、抗体；
（d）配列番号：19（VH4-M73の可変領域）の配列を含む重鎖可変領域および配列番号：22（VL1の可変領域）の配列を含む軽鎖可変領域を含む、抗体；
（e）配列番号：20（VH3-M73の可変領域）の配列を含む重鎖可変領域および配列番号：23（VL3の可変領域）の配列を含む軽鎖可変領域を含む、抗体；
（f）配列番号：21（VH5-M83の可変領域）の配列を含む重鎖可変領域および配列番号：24（VL5の可変領域）の配列を含む軽鎖可変領域を含む、抗体；
（g）配列番号：25（VH4-M73）の配列を含む重鎖および配列番号：28（VL1）の配列を含む軽鎖を含む、抗体；
（h）配列番号：26（VH3-M73）の配列を含む重鎖および配列番号：29（VL3）の配列を含む軽鎖を含む、抗体；ならびに
（i）配列番号：27（VH5-M83）の配列を含む重鎖および配列番号：30（VL5）の配列を含む軽鎖を含む、抗体
より選択される少なくとも一つの抗体である、方法。
【請求項１】
（a）配列番号：1（VH4-M73のCDR1）の配列を含むCDR1、配列番号：2（VH4-M73のCDR2）の配列を含むCDR2、および配列番号：3（VH4-M73のCDR3）の配列を含むCDR3を含む、ポリペプチド；
（b）配列番号：4（VH3-M73のCDR1）の配列を含むCDR1、配列番号：5（VH3-M73のCDR2）の配列を含むCDR2、および配列番号：6（VH3-M73のCDR3）の配列を含むCDR3を含む、ポリペプチド；
（c）配列番号：7（VH5-M83のCDR1）の配列を含むCDR1、配列番号：8（VH5-M83のCDR2）の配列を含むCDR2、および配列番号：9（VH5-M83のCDR3）の配列を含むCDR3を含む、ポリペプチド；
（d）配列番号：10（VL1のCDR1）の配列を含むCDR1、配列番号：11（VL1のCDR2）の配列を含むCDR2、および配列番号：12（VL1のCDR3）の配列を含むCDR3を含む、ポリペプチド；
（e）配列番号：13（VL3のCDR1）の配列を含むCDR1、配列番号：14（VL3のCDR2）の配列を含むCDR2、および配列番号：15（VL3のCDR3）の配列を含むCDR3を含む、ポリペプチド；ならびに
（f）配列番号：16（VL5のCDR1）の配列を含むCDR1、配列番号：17（VL5のCDR2）の配列を含むCDR2、および配列番号：18（VL5のCDR3）の配列を含むCDR3を含む、ポリペプチド
より選択される少なくとも一つのポリペプチドを含む、製剤。
【請求項２】
（a）配列番号：1（VH4-M73のCDR1）の配列を含むCDR1、配列番号：2（VH4-M73のCDR2）の配列を含むCDR2、および配列番号：3（VH4-M73のCDR3）の配列を含むCDR3を含む重鎖可変領域、ならびに配列番号：10（VL1のCDR1）の配列を含むCDR1、配列番号：11（VL1のCDR2）の配列を含むCDR2、および配列番号：12（VL1のCDR3）の配列を含むCDR3を含む軽鎖可変領域を含む、抗体；
（b）配列番号：4（VH3-M73のCDR1）の配列を含むCDR1、配列番号：5（VH3-M73のCDR2）の配列を含むCDR2、および配列番号：6（VH3-M73のCDR3）の配列を含むCDR3を含む重鎖可変領域、ならびに配列番号：13（VL3のCDR1）の配列を含むCDR1、配列番号：14（VL3のCDR2）の配列を含むCDR2、および配列番号：15（VL3のCDR3）の配列を含むCDR3を含む軽鎖可変領域を含む、抗体；
（c）配列番号：7（VH5-M83のCDR1）の配列を含むCDR1、配列番号：8（VH5-M83のCDR2）の配列を含むCDR2、および配列番号：9（VH5-M83のCDR3）の配列を含むCDR3を含む重鎖可変領域、ならびに配列番号：16（VL5のCDR1）の配列を含むCDR1、配列番号：17（VL5のCDR2）の配列を含むCDR2、および配列番号：18（VL5のCDR3）の配列を含むCDR3を含む軽鎖可変領域を含む、抗体；
（d）配列番号：19（VH4-M73の可変領域）の配列を含む重鎖可変領域および配列番号：22（VL1の可変領域）の配列を含む軽鎖可変領域を含む、抗体；
（e）配列番号：20（VH3-M73の可変領域）の配列を含む重鎖可変領域および配列番号：23（VL3の可変領域）の配列を含む軽鎖可変領域を含む、抗体；
（f）配列番号：21（VH5-M83の可変領域）の配列を含む重鎖可変領域および配列番号：24（VL5の可変領域）の配列を含む軽鎖可変領域を含む、抗体；
（g）配列番号：25（VH4-M73）の配列を含む重鎖および配列番号：28（VL1）の配列を含む軽鎖を含む、抗体；
（h）配列番号：26（VH3-M73）の配列を含む重鎖および配列番号：29（VL3）の配列を含む軽鎖を含む、抗体；ならびに
（i）配列番号：27（VH5-M83）の配列を含む重鎖および配列番号：30（VL5）の配列を含む軽鎖を含む、抗体
より選択される少なくとも一つの抗体を含む、製剤。
【請求項３】
ヒスチジン緩衝液および／またはクエン酸緩衝液を含む、請求項1または2記載の安定な製剤。
【請求項４】
少なくとも一つの塩基性アミノ酸を含む、請求項1〜3のいずれか一項記載の安定な製剤。
【請求項５】
1〜500 mMのヒスチジン緩衝液および／またはクエン酸緩衝液、1〜1500 mMの少なくとも一つの塩基性アミノ酸、1〜200 mg/mLの抗体、ならびに1〜400 mMの糖質を含む、請求項1〜4のいずれか一項記載の安定な製剤。
【請求項６】
塩基性アミノ酸がアルギニンである、請求項4または5記載の製剤。
【請求項７】
糖質がショ糖またはトレハロースである、請求項5または6記載の製剤。
【請求項８】
界面活性剤をさらに含む、請求項1〜7のいずれか一項記載の製剤。
【請求項９】
少なくとも10 mg/mlの量のポリペプチドおよび／または抗体を含有する、請求項1〜8のいずれか一項記載の製剤。
【請求項１０】
少なくとも50 mg/mlの量のポリペプチドおよび／または抗体を含有する、請求項1〜9のいずれか一項記載の製剤。
【請求項１１】
少なくとも80 mg/mlの量のポリペプチドおよび／または抗体を含有する、請求項1〜10のいずれか一項記載の製剤。
【請求項１２】
240 mg/ml以下の量のポリペプチドおよび／または抗体を含有する、請求項1〜11のいずれか一項記載の製剤。
【請求項１３】
4.5〜7.0の範囲のpHを有する、請求項1〜12のいずれか一項記載の製剤。
【請求項１４】
5.5〜6.6の範囲のpHを有する、請求項13記載の製剤。
【請求項１５】
溶液である、請求項1〜14のいずれか一項記載の製剤。
【請求項１６】
調製の間に凍結乾燥に供されていない、請求項15記載の製剤。
【請求項１７】
前記ポリペプチド分子および／または抗体分子の二量体化が低減されている、請求項1〜16のいずれか一項記載の製剤。
【請求項１８】
前記ポリペプチド分子および／または抗体分子の二量体化が阻害されている、請求項1〜17のいずれか一項記載の製剤。
【請求項１９】
皮下投与用の請求項1〜18のいずれか一項記載の製剤。
【請求項２０】
少なくとも一つの塩基性アミノ酸を添加する工程を含む、抗体を含有する溶液を安定化する方法であって、該抗体が、
（a）配列番号：1（VH4-M73のCDR1）の配列を含むCDR1、配列番号：2（VH4-M73のCDR2）の配列を含むCDR2、および配列番号：3（VH4-M73のCDR3）の配列を含むCDR3を含む重鎖可変領域、ならびに配列番号：10（VL1のCDR1）の配列を含むCDR1、配列番号：11（VL1のCDR2）の配列を含むCDR2、および配列番号：12（VL1のCDR3）の配列を含むCDR3を含む軽鎖可変領域を含む、抗体；
（b）配列番号：4（VH3-M73のCDR1）の配列を含むCDR1、配列番号：5（VH3-M73のCDR2）の配列を含むCDR2、および配列番号：6（VH3-M73のCDR3）の配列を含むCDR3を含む重鎖可変領域、ならびに配列番号：13（VL3のCDR1）の配列を含むCDR1、配列番号：14（VL3のCDR2）の配列を含むCDR2、および配列番号：15（VL3のCDR3）の配列を含むCDR3を含む軽鎖可変領域を含む、抗体；
（c）配列番号：7（VH5-M83のCDR1）の配列を含むCDR1、配列番号：8（VH5-M83のCDR2）の配列を含むCDR2、および配列番号：9（VH5-M83のCDR3）の配列を含むCDR3を含む重鎖可変領域、ならびに配列番号：16（VL5のCDR1）の配列を含むCDR1、配列番号：17（VL5のCDR2）の配列を含むCDR2、および配列番号：18（VL5のCDR3）の配列を含むCDR3を含む軽鎖可変領域を含む、抗体；
（d）配列番号：19（VH4-M73の可変領域）の配列を含む重鎖可変領域および配列番号：22（VL1の可変領域）の配列を含む軽鎖可変領域を含む、抗体；
（e）配列番号：20（VH3-M73の可変領域）の配列を含む重鎖可変領域および配列番号：23（VL3の可変領域）の配列を含む軽鎖可変領域を含む、抗体；
（f）配列番号：21（VH5-M83の可変領域）の配列を含む重鎖可変領域および配列番号：24（VL5の可変領域）の配列を含む軽鎖可変領域を含む、抗体；
（g）配列番号：25（VH4-M73）の配列を含む重鎖および配列番号：28（VL1）の配列を含む軽鎖を含む、抗体；
（h）配列番号：26（VH3-M73）の配列を含む重鎖および配列番号：29（VL3）の配列を含む軽鎖を含む、抗体；ならびに
（i）配列番号：27（VH5-M83）の配列を含む重鎖および配列番号：30（VL5）の配列を含む軽鎖を含む、抗体
より選択される少なくとも一つの抗体である、方法。
【請求項２１】
少なくとも一つの塩基性アミノ酸を添加する工程を含む、抗体を含有する溶液の凍結／融解サイクルの間、該抗体を安定化する方法であって、該抗体が、
（a）配列番号：1（VH4-M73のCDR1）の配列を含むCDR1、配列番号：2（VH4-M73のCDR2）の配列を含むCDR2、および配列番号：3（VH4-M73のCDR3）の配列を含むCDR3を含む重鎖可変領域、ならびに配列番号：10（VL1のCDR1）の配列を含むCDR1、配列番号：11（VL1のCDR2）の配列を含むCDR2、および配列番号：12（VL1のCDR3）の配列を含むCDR3を含む軽鎖可変領域を含む、抗体；
（b）配列番号：4（VH3-M73のCDR1）の配列を含むCDR1、配列番号：5（VH3-M73のCDR2）の配列を含むCDR2、および配列番号：6（VH3-M73のCDR3）の配列を含むCDR3を含む重鎖可変領域、ならびに配列番号：13（VL3のCDR1）の配列を含むCDR1、配列番号：14（VL3のCDR2）の配列を含むCDR2、および配列番号：15（VL3のCDR3）の配列を含むCDR3を含む軽鎖可変領域を含む、抗体；
（c）配列番号：7（VH5-M83のCDR1）の配列を含むCDR1、配列番号：8（VH5-M83のCDR2）の配列を含むCDR2、および配列番号：9（VH5-M83のCDR3）の配列を含むCDR3を含む重鎖可変領域、ならびに配列番号：16（VL5のCDR1）の配列を含むCDR1、配列番号：17（VL5のCDR2）の配列を含むCDR2、および配列番号：18（VL5のCDR3）の配列を含むCDR3を含む軽鎖可変領域を含む、抗体；
（d）配列番号：19（VH4-M73の可変領域）の配列を含む重鎖可変領域および配列番号：22（VL1の可変領域）の配列を含む軽鎖可変領域を含む、抗体；
（e）配列番号：20（VH3-M73の可変領域）の配列を含む重鎖可変領域および配列番号：23（VL3の可変領域）の配列を含む軽鎖可変領域を含む、抗体；
（f）配列番号：21（VH5-M83の可変領域）の配列を含む重鎖可変領域および配列番号：24（VL5の可変領域）の配列を含む軽鎖可変領域を含む、抗体；
（g）配列番号：25（VH4-M73）の配列を含む重鎖および配列番号：28（VL1）の配列を含む軽鎖を含む、抗体；
（h）配列番号：26（VH3-M73）の配列を含む重鎖および配列番号：29（VL3）の配列を含む軽鎖を含む、抗体；ならびに
（i）配列番号：27（VH5-M83）の配列を含む重鎖および配列番号：30（VL5）の配列を含む軽鎖を含む、抗体
より選択される少なくとも一つの抗体である、方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図１６】
【図１７】
【図１８】
【図１９】
【図２０】
【図２１】
【図２２】
【図２３】
【図２４】
【図２５】
【図２６】
【図２７】
【図２８】
【図２９】
【図３０】
【図３１】
【図３２】
【図３３】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図１６】
【図１７】
【図１８】
【図１９】
【図２０】
【図２１】
【図２２】
【図２３】
【図２４】
【図２５】
【図２６】
【図２７】
【図２８】
【図２９】
【図３０】
【図３１】
【図３２】
【図３３】
【公開番号】特開２０１１−１７３９１８（Ｐ２０１１−１７３９１８Ａ）
【公開日】平成２３年９月８日（２０１１．９．８）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１１−１０４１７９（Ｐ２０１１−１０４１７９）
【出願日】平成２３年５月９日（２０１１．５．９）
【分割の表示】特願２０１０−５２２５２４（Ｐ２０１０−５２２５２４）の分割
【原出願日】平成２２年３月１９日（２０１０．３．１９）
【出願人】（０００００３３１１）中外製薬株式会社 (228)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２３年９月８日（２０１１．９．８）
【国際特許分類】
【出願日】平成２３年５月９日（２０１１．５．９）
【分割の表示】特願２０１０−５２２５２４（Ｐ２０１０−５２２５２４）の分割
【原出願日】平成２２年３月１９日（２０１０．３．１９）
【出願人】（０００００３３１１）中外製薬株式会社 (228)
【Ｆターム（参考）】
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