攻撃的及び防御的免疫マーカーのｅｘｖｉｖｏ誘導により宿主免疫機能を特徴付けるための方法
宿主の免疫機能は、攻撃的及び防御的免疫機能関連マーカーの変化を定量化することにより特徴付けることができる。ある方法は、攻撃的及び防御的免疫機能関連マーカーの発現の誘導に基づき、対象体にとって潜在的に有効な療法を特定するために使用することができる。加えて、幾つかの方法は、攻撃的又は防御的免疫応答のいずれか一方を刺激するが、攻撃的又は防御的免疫応答の他方を阻害することを可能にする薬物を特定するために使用することができる。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、２００９年１２月１６日に出願された米国仮出願第６１／２８７，１１４号の利益を主張するものであり、その開示は、参照により本明細書に明示的に組み込まれる。
【０００２】
本開示は、容易に測定が可能であり、宿主の攻撃的又は防御的免疫機能のいずれかに関連するマーカーに関する。より詳しくは、本開示は、感染に対する宿主応答性の予測因子として、及び／又は免疫調節効果について薬物をスクリーニングするための方法として、攻撃的（異物を攻撃する）又は防御的（攻撃的免疫活性を制御する）免疫機能のいずれかと関連する特定のマーカーをｅｘ ｖｉｖｏ誘導すること及びそれらの誘導を測定することに関する。遺伝子誘導に関して生成されるデータは、特定の対象体の発現プロファイルに特異的に適合する治療を特定するために使用することができる。
【背景技術】
【０００３】
免疫系は、まず病原体及び腫瘍細胞を特定し、その後除去することにより、宿主を疾患から防御する一組の多様なタンパク質、細胞、組織、及びプロセスを含む。免疫系の主な役割は、外来性の細胞又は病原体と内因的な細胞を区別すること、言い換えれば「自己」と「非自己」とを区別することである。宿主に内因的な細胞は、クラスＩ主要組織適合遺伝子複合体（ＭＨＣ）の発現により「自己」として認識されると考えられている。クラスＩ ＭＨＣが存在しないか又は発現レベルが低減されたそれら細胞は、損傷した「自己」又は「非自己」細胞として、免疫系により標的とされる場合がある。この見事な系であるにも関わらず、免疫系の障害は、免疫不全、発癌、又は自己免疫を含む疾患に結び付く場合がある。
【０００４】
白血球細胞（ＷＢＣ；白血球）は、免疫系の主要な機能的クラスの細胞である。ＷＢＣには幾つかのサブタイプが存在するが、リンパ球は、免疫系防御機構に不可欠な役割を果たす１つのサブタイプである。ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞は、腫瘍細胞、ウイルス感染細胞、又は損傷した「自己」細胞の識別及び拒絶に関与する特化したタイプの細胞傷害性リンパ球である。細胞傷害性Ｔ細胞は、感染体細胞又は腫瘍細胞の死滅を誘導することが可能な別のリンパ球サブグループである。ＮＫ細胞及び細胞傷害性Ｔ細胞は、多くの場合サイトカイン又は外来性抗原の提示により活性化されると、それらの細胞質から、種々のタンパク質及びプロテアーゼを含有する小顆粒を放出する。
パーフォリン等の特定のタンパク質は、標的細胞の膜に細孔形成を誘導し、グランザイム等のプロテアーゼを細胞に進入させることで、プログラム細胞死プロセス（アポトーシス）を誘導することが可能となる。
【０００５】
外来性細胞又は腫瘍細胞に対する攻撃と同時に、免疫系は、負のフィードバックループも開始させて免疫系の活性を制限し、外来性細胞の除去が成功した後で免疫系を活動停止させ、また過剰応答性及び可能性としてある「自己」の細胞、又は自己免疫の発生に結び付く他の経路の攻撃を回避する。制御性Ｔ細胞は、免疫系の活性化を能動的に抑制し、この役割の重要性は、制御性Ｔ細胞（Ｔ−ｒｅｇ）の遺伝子欠損により重症の自己免疫症候群が引き起こされることから明らかである。骨髄性由来サプレッサー細胞（ＭＤＳＣ）も、免疫ダウンレギュレーションプロセスに関与し、それは、ＭＤＳＣが、標的とされ破壊される細胞の表面上に発現された外来性タンパク質に対する細胞傷害性Ｔ細胞の結合を阻止するためである。この防御的な負のフィードバック系の活性は、系の攻撃的機能を凌駕
する場合があり、それは、腫瘍細胞が探知を逃れ、癌性増殖を発生させる可能性を増加させる場合がある。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
種々の細胞タイプが、外来性細胞に対する積極的な攻撃及び／又は免疫系機能を制限する防御的手段に関与する様式及び能力を知ることで、癌性腫瘍及び／又は自己免疫疾患の発症に対する更なる洞察がもたらされる可能性がある。従って、個体の攻撃的及び防御的免疫機能を両方とも評価する診断検査の必要性が存在する。免疫調節化合物としての効力について薬物を迅速にスクリーニングする必要性、及び個体の免疫機能に基づいてその個体に合った療法を特定する必要性も存在する。
【０００７】
免疫は、良好な健康維持に、及び風邪から生命に関わる疾患にまで及ぶ種々の疾患に対する防御に重大な役割を果たす。免疫学はこの数十年で大きな進歩を見せているが、免疫系がどのように機能するかの理解は、ｉｎ ｖｉｔｒｏ実験又は動物モデルにおける実験に由来している。患者に施されている療法の多くは、これら実験から単純に推定されたものであり、多種多様な患者に常に有効であるとは限らない。臨床的に適用可能な技術により各患者の免疫又は免疫学的健康を特徴付ける方法に対する要求が増大している。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
幾つかの実施形態では、対象体の免疫機能が、攻撃的免疫機能に向けられているか又は防御的免疫機能に向けられているかを決定する方法であって、対象体から白血球を含有する第１及び第２の試料を取得すること；第１の試料を、攻撃的及び防御的免疫機能を両方とも刺激する免疫刺激剤に溶媒中で暴露すること；第２の試料を上記溶媒に暴露すること；上記刺激剤又は溶媒に暴露した後、第１及び第２の試料中の１つ又は複数の攻撃的免疫機能関連ｍＲＮＡの量を定量化し、それにより第１及び第２の試料中で定量化された攻撃的免疫機能関連ｍＲＮＡの量間の比率として攻撃的免疫機能の誘導を定量化すること；上記刺激剤又は溶媒に暴露した後、第１及び第２の試料中の１つ又は複数の防御的免疫機能関連ｍＲＮＡの量を定量化し、それにより第１及び第２の試料中で定量化された防御的免疫機能関連ｍＲＮＡの量間の比率として防御的免疫機能の誘導を定量化することを含み、攻撃的又は防御的免疫が著しくより多く誘導されることにより、対象体の免疫機能がそれぞれ攻撃的又は防御的免疫機能に向けられていることが示される方法を提供する。
【０００９】
幾つかの実施形態では、白血球を含有する試料は、全血試料であり、幾つかの実施形態中で、任意にヘパリン処理されている。幾つかの実施形態では、試料を取得した直後に刺激を生じさせる必要はない。むしろ、全血は、刺激の前に最大約２４時間保存しておくことができる。一実施形態では、保存試料は、室温で保存される。別の実施形態では、保存試料は、冷却された環境で保存される（例えば、室温未満、例えば、約４℃）。
【００１０】
幾つかの実施形態では、これらに限定されないが、組換えインターロイキン−２、フィトヘマグルチニン、抗Ｔ細胞受容体抗体、熱凝集ＩｇＧ、リポ多糖、及びザイモサンの１つ又は複数を含む種々の刺激剤が使用される。幾つかの実施形態では、試料の刺激剤への暴露は、２４時間未満である。幾つかの実施形態では、暴露は、２〜６時間である。一実施形態では、暴露は、約４時間である。
【００１１】
機能的分類を使用して、研究しようとするマーカーを分類することができる。幾つかの実施形態では、１つ又は複数の攻撃的免疫機能関連ｍＲＮＡは、免疫リクルーター機能（ｉｍｍｕｎｅ ｒｅｃｒｕｉｔｅｒ ｆｕｎｃｔｉｏｎ）、免疫キラー機能（ｉｍｍｕｎｅ ｋｉｌｌｅｒ ｆｕｎｃｔｉｏｎ）、又は免疫ヘルパー機能（ｉｍｍｕｎｅ ｈｅｌｐｅｒ ｆｕｎｃｔｉｏｎ）を有するものに分類される。幾つかの実施形態では、１つ又
は複数の攻撃的免疫機能関連ｍＲＮＡは、免疫リクルーター機能を有し、ＣＣＬ２、ＣＣＬ４、ＣＣＬ８、ＣＣＬ２０、ＣＸＣＬ３、ＣＸＣＬ１０、及びインターロイキン８からなる群から選択される。幾つかの実施形態では、１つ又は複数の攻撃的免疫機能関連ｍＲＮＡは、免疫キラー機能を有し、グランザイムＢ、パーフォリン、ＴＮＦＳＦ１、ＴＮＦＳＦ２、ＴＮＦＳＦ５、ＴＮＦＳＦ６、ＴＮＦＳＦ１４、及びＴＮＦＳＦ１５からなる群から選択される。幾つかの実施形態では、１つ又は複数の攻撃的免疫機能関連ｍＲＮＡは、免疫ヘルパー機能を有し、インターロイキン２、インターロイキン４、インターフェロンガンマ及びインターロイキン１７Ａからなる群から選択される。
【００１２】
防御的免疫機能関連ｍＲＮＡは、攻撃的免疫機能の抑制に関連している。幾つかの実施形態では、１つ又は複数の防御的免疫機能関連ｍＲＮＡは、インターロイキン１０、トランスフォーミング成長因子ベータ、ＦｏｘＰ３、ＣＤ２５、アルギナーゼ、ＣＴＬＡ−４、及びＰＤ−１からなる群から選択される。
【００１３】
本明細書に記載の方法は、任意に、対象体が癌を有している場合に使用され、潜在的に有効な抗癌療法を特定するために、対象体の免疫機能が、攻撃的免疫機能に向けられているか又は防御的免疫機能に向けられていると決定される。そのような使用では、対象体の免疫機能が攻撃的免疫機能に向けられていると決定されることにより、癌免疫療法治療計画が有効である可能性が高いことが示される。幾つかの実施形態では、対象体の免疫機能が防御的免疫機能に向けられていると決定されることにより、免疫に基づく作用機序が関与しない抗癌治療計画が有効である可能性が高いことが示される。
【００１４】
幾つかの実施形態では、本明細書で開示された方法を使用して、対象体の免疫機能に基づいて、抗癌療法治療計画の効力を予測し、対象体の免疫機能が攻撃的免疫機能に向けられていると決定されることにより、抗癌免疫療法治療計画が有効である可能性が高いことが示され、対象体の免疫機能が防御的免疫機能に向けられていると決定されることにより、免疫に基づく作用機序が関与しない抗癌治療計画が有効である可能性が高いことが示される。
【００１５】
幾つかの実施形態では、対象体の免疫機能が、攻撃的免疫機能に向けられているか又は防御的免疫機能に向けられているかを決定する方法であって、対象体から白血球を含有する第１及び第２の試料を取得すること；第１の試料を、攻撃的及び防御的免疫機能を両方とも刺激する作用剤に溶媒中で暴露すること；第２の試料を上記溶媒に暴露すること；暴露させた第１及び第２の試料をインキュベートすること；上記作用剤又は溶媒に暴露した後、第１及び第２の試料の各々中の１つ又は複数の防御的免疫機能関連ｍＲＮＡの量を定量化し、それにより防御的免疫機能関連ｍＲＮＡの誘導の量を、第１及び第２の試料中で定量化された量間の比率として定量化すること；上記作用剤又は溶媒に暴露した後、第１及び第２の試料の各々中の１つ又は複数の攻撃的免疫機能関連ｍＲＮＡの量を定量化し、それにより攻撃的免疫機能関連ｍＲＮＡの誘導の量を、第１及び第２の試料中で定量化された量間の比率として定量化すること；防御的免疫機能関連ｍＲＮＡの誘導と攻撃的免疫機能関連ｍＲＮＡの誘導との比率を計算すること；及び計算した比率を対照対象体群に由来する対照比率と比較することを含み、計算した比率が対照比率より著しく増加することにより、対象体の免疫機能が攻撃的免疫機能に向けられており、計算した比率が対照比率より著しく減少することにより、対象体の免疫機能が防御的免疫機能に向けられていることが示される方法が提供される。
【００１６】
幾つかの実施形態では、攻撃的免疫機能関連ｍＲＮＡは、細胞傷害性機能のマーカーをコードするｍＲＮＡを含む。幾つかの実施形態では、防御的免疫機能関連ｍＲＮＡは、例えば、アルギナーゼ又はＦｏｘＰ３等の骨髄由来サプレッサー細胞のマーカーをコードするｍＲＮＡを含む。
【００１７】
幾つかの実施形態では、攻撃的及び防御的免疫機能の両方の刺激因子と共に投与するための薬物を特定し、投与された薬物が、攻撃的又は防御的免疫機能の１つを阻害する方法であって、上記薬物の存在下又は非存在下（上記刺激因子の存在下であってもよく又は非存在下であってもよい）で攻撃的マーカーの発現を測定することにより、全血中の１つ又は複数の攻撃的免疫機能関連マーカーの発現のｉｎ ｖｉｔｒｏ誘導を定量化すること；上記薬物の存在下又は非存在下（上記刺激因子の存在下であってもよく又は非存在下であってもよい）で防御的マーカーの発現を測定することにより、全血中の１つ又は複数の防御的免疫機能関連マーカーの発現のｉｎ ｖｉｔｒｏ誘導を定量化すること；及び上記薬物の存在下又は非存在下での攻撃的免疫機能関連マーカーの誘導と防御的免疫機能関連マーカーの誘導との差異を決定することを含み、攻撃的及び防御的マーカーに対するその正味効果に基づき、上記薬物が、上記刺激因子と共に投与するためのものであると特定される方法が提供される。
【００１８】
幾つかの実施形態では、ｉｎ ｖｉｔｒｏ誘導は、攻撃的及び防御的免疫機能マーカーの１つ又は複数を誘導するのに十分な期間、全血を刺激因子に暴露することを含む。幾つかの実施形態では、攻撃的免疫機能関連マーカーは、ＣＤ１６、グランザイムＢ、ＴＮＦ−アルファ、インターフェロンガンマ、及び腫瘍壊死因子スーパーファミリーのメンバーの１つ又は複数を含み、防御的免疫機能関連マーカーは、ＣＤ２５、ＦｏｘＰ３、ＣＴＬＡ４、ＧＡＲＰ、ＩＬ１７、及びアルギナーゼの１つ又は複数を含む。一実施形態では、攻撃的及び防御的免疫機能の刺激因子は、インターロイキン２である。一実施形態では、攻撃的又は防御的免疫機能を衰えさせる薬物は、薬物が１つ又は複数の防御的免疫機能関連マーカーの発現を誘導するよりも高い程度に、１つ又は複数の攻撃的免疫機能関連マーカーの発現を誘導する（例えば、攻撃的機能を優先的に誘導する）。増加は、任意に、薬物を送達するために使用される溶媒で刺激されている対照試料と比べて決定される。薬物の投与は、任意に、刺激剤の投与の前又は投与と同時である。
【００１９】
幾つかの実施形態では、攻撃的及び防御的免疫機能の両方を特徴付ける方法であって、ヘパリン処理した全血の少なくとも２つの分割量を取得すること；第１の分割量を、攻撃的及び防御的免疫機能を両方とも刺激する作用剤に暴露すること；第２の分割量を作用剤の溶媒に暴露すること；これら分割量を２４時間未満インキュベートすること；ＴＮＦＳＦ、グランザイムＢ、パーフォリン、ＣＤ１６、ＩＮＦガンマ、又は白血球の細胞傷害性機能を表す他の遺伝子をコードする１つ又は複数のｍＲＮＡの量を定量化すること；ＦｏｘＰ３、ＣＤ２５、又は制御性Ｔ細胞のマーカーを表す他の遺伝子をコードする１つ又は複数のｍＲＮＡの量を定量化すること；第１及び第２の分割量の両方において、細胞傷害性機能のマーカーの発現と制御性Ｔ細胞のマーカーの発現との比率を計算すること；及びこれら比率を、対照対象体群に由来する比率と比較することを含む方法が提供される。
【００２０】
この方法は、任意に、ヘパリン処理した全血のさらなる２つの分割量の取得すること；さらなる第１の分割量を、攻撃的及び防御的免疫機能を両方とも刺激する作用剤に暴露すること；さらなる第２の分割量を、作用剤の溶媒に暴露すること；これら分割量を２４時間未満インキュベートすること；アルギナーゼ又は骨髄由来サプレッサー細胞のマーカーを表す他の遺伝子をコードする１つ又は複数のｍＲＮＡの量を定量化すること；第１及び第２の分割量の両方での、細胞傷害性機能のマーカーの発現と骨髄由来サプレッサー細胞のマーカーの発現との比率を計算すること；及びこれら比率を、対照対象体群に由来する比率と比較することを含む。
【図面の簡単な説明】
【００２１】
【図１Ａ】ＩＬ−２刺激後の、種々の免疫マーカーをコードするｍＲＮＡレベルの経時的変化を表す図である。
【図１Ｂ】ＩＬ−２刺激後の、種々の免疫マーカーをコードするｍＲＮＡレベルの経時的変化を表す図である。
【図１Ｃ】ＩＬ−２刺激後の、種々の免疫マーカーをコードするｍＲＮＡレベルの経時的変化を表す図である。
【図１Ｄ】ＩＬ−２刺激後の、種々の免疫マーカーをコードするｍＲＮＡレベルの経時的変化を表す図である。
【図２】ＩＬ−２に対する免疫マーカーの用量反応的誘導を表す図である。「*」は、対照溶媒と比較して、統計的有意差（ｐ＜０．０５）があることを示す。
【図３Ａ】薬物スクリーニングに使用されたデータを表す図である。
【図３Ｂ】薬物スクリーニングに使用されたデータを表す図である。
【図３Ｃ】薬物スクリーニングに使用されたデータを表す図である。
【図３Ｄ】薬物スクリーニングに使用されたデータを表す図である。
【図３Ｅ】薬物スクリーニングに使用されたデータを表す図である。
【図３Ｆ】薬物スクリーニングに使用されたデータを表す図である。
【図３Ｇ】薬物スクリーニングに使用されたデータを表す図である。
【図３Ｈ】薬物スクリーニングに使用されたデータを表す図である。
【図３Ｉ】薬物スクリーニングに使用されたデータを表す図である。
【図３Ｊ】薬物スクリーニングに使用されたデータを表す図である。
【図４Ａ】薬物スクリーニングに使用された攻撃的又は防御的免疫マーカーの誘導に関連するデータを表す図である。
【図４Ｂ】薬物スクリーニングに使用された攻撃的又は防御的免疫マーカーの誘導に関連するデータを表す図である。
【図４Ｃ】薬物スクリーニングに使用された攻撃的又は防御的免疫マーカーの誘導に関連するデータを表す図である。
【図４Ｄ】薬物スクリーニングに使用された攻撃的又は防御的免疫マーカーの誘導に関連するデータを表す図である。
【図４Ｅ】薬物スクリーニングに使用された攻撃的又は防御的免疫マーカーの誘導に関連するデータを表す図である。
【図４Ｆ】薬物スクリーニングに使用された攻撃的又は防御的免疫マーカーの誘導に関連するデータを表す図である。
【図４Ｇ】薬物スクリーニングに使用された攻撃的又は防御的免疫マーカーの誘導に関連するデータを表す図である。
【図４Ｈ】薬物スクリーニングに使用された攻撃的又は防御的免疫マーカーの誘導に関連するデータを表す図である。
【図４Ｉ】薬物スクリーニングに使用された攻撃的又は防御的免疫マーカーの誘導に関連するデータを表す図である。
【図４Ｊ】薬物スクリーニングに使用された攻撃的又は防御的免疫マーカーの誘導に関連するデータを表す図である。
【図５】図５Ａ〜Ｄは、迅速ハイスループットプロトコールを表す図である。
【発明を実施するための形態】
【００２２】
本明細書に記載の幾つかの実施形態では、宿主の攻撃的及び防御的免疫応答をｅｘ ｖｉｖｏで特徴付けする方法が提供される。本明細書で使用される場合、用語「攻撃的」は、感染、外来性病原体、又は腫瘍等に対して開始される全体的免疫応答及びその関連細胞成分を指すものとする。幾つかの場合では、用語「キラー」は、「攻撃的」と同義的に使用される。本明細書で使用される場合、用語「防御的」は、活性化された攻撃的免疫系の活性を制限する役目を果たす全体的免疫応答及びその関連細胞成分を指すものとする。幾つかの場合では、用語「サプレッサー」は、「防御的」と同義的に使用される。
【００２３】
幾つかの実施形態では、本方法には、宿主から末梢全血を収集すること、及び攻撃的又
は防御的免疫応答に関連する一群のマーカーの１つ又は複数を誘導する刺激剤（複数可）を使用することが伴う。幾つかの実施形態では、任意に、単離された白血球を使用してもよい。幾つかの実施形態では、攻撃的又は防御的マーカーの各々の１つ又は複数をコードするｍＲＮＡの測定を使用して、宿主の全体的免疫応答を特徴付ける。更に他の実施形態では、そのような攻撃的又は防御的マーカーの発現の特徴付けを使用して、免疫抑制薬又は抗癌薬（例えば、免疫調節薬）のいずれかとしての潜在的効力について、薬物をスクリーニングする。
【００２４】
免疫系は、異物に対する攻撃を開始するために協調して作用し、それにより感染、腫瘍形成等から宿主を防御する、様々な機能を有する様々な細胞タイプを含む。機能の主な分類には、これらに限定されないが、リクルート機能、キラー機能、サプレッサー（キラーの）機能、及びヘルパー機能、並びに様々な補助機能、例えば、抗原提示、血管新生の制御、疼痛調節等が含まれる。
【００２５】
リクルート機能は、免疫系の適切な機能に不可欠である。感染、腫瘍形成等の事象では、免疫攻撃を適切に認識し、免疫攻撃から宿主を防御するために、免疫細胞は、特に全血、骨髄、及びリンパ系を含む種々の身体部分からリクルートされなければならない。幾つかの実施形態では、ケモカインは、炎症又は腫瘍形成の局所領域に他の免疫細胞をリクルートするように機能する。結局のところ、不要な外来性細胞を死滅又は無力化することができる細胞を宿主が有していたとしても、それら細胞がどこに行って機能すべきかが適切に指示されなければ役立たない。リクルーター機能は、幾つかの実施形態では、ケモカイン又は他の走化性分子により提供される。幾つかの実施形態では、特定のモチーフのケモカインは、他の免疫の分子をリクルートするように機能する。例えば、幾つかの実施形態では、ＣＣＬ−２、ＣＣＬ−４、ＣＣＬ−８、又はＣＣＬ−２０等のＣＣＬ分子は、他の免疫細胞のリクルートに関与する。他の実施形態では、ＣＸＣＬ−３又はＣＸＣＬ−１０等のＣＸＣＬ分子が、関与する。幾つかの実施形態では、Ｃ−Ｃ若しくはＣ−Ｘ−Ｃモチーフであるにせよ、又は別の種類であるにせよ、他のケモカインエフェクターが関与する。
【００２６】
リクルーター細胞が、他のタイプの免疫細胞を適切な位置に移動させると、他のタイプの細胞は、それらの指定の機能を発揮することができ、幾つかの実施形態では、それは標的細胞（複数可）を死滅させることである。幾つかの実施形態では、死滅機能は、標的細胞のアポトーシスを誘導することより実現される。例えば、標的が腫瘍である場合、キラー機能（例えば、アポトーシスに関与するある分子を発現すること）を有する１つ又は複数の細胞が、標的部位にリクルートされる。幾つかの実施形態では、そのようなキラー細胞は、グランザイムＢ、パーフォリン、ＴＮＦＳＦ１（リンホトキシン）、ＴＮＦＳＦ２（ＴＮＦ−アルファ）、ＴＮＦＳＦ５（ＣＤ４０リガンド）、ＴＮＦＳＦ６（Ｆａｓリガンド）、ＴＮＦＳＦ１４（ＬＩＧＨＴ）、ＴＮＦＳＦ１５（ＴＬ１Ａ）、及び／又はＣＤ１６等の分子の１つ又は複数を発現する。そのため、標的部位に対するこれら細胞のリクルートは、標的細胞の破壊をもたらすカスケードを開始させ、従って、攻撃的免疫系の目的、例えば異物又は外来性細胞の破壊及び／又は除去を実現する。
【００２７】
本明細書で考察されているように、防御的免疫系は、攻撃的免疫系の活性を制限するように機能する（例えば、自己免疫疾患に結び付く場合がある攻撃的機能の過剰活性を防止する）一連のシグナル及び分子を含む。防御的機能を有する細胞は、これらに限定されないが、ＩＬ１０、ＴＧＦ−ベータ、（フォークヘッドボックスｐ３）ＦｏｘＰ３、ＣＤ２５、アルギナーゼ、ＣＴＬＡ−４、及び／又はＰＤ−１を含むマーカーにより認識することができる。そのような細胞は、攻撃的免疫系の活性に対する重要なバランスであり、適切な全体的免疫機能を保証するために重要である。
【００２８】
更なる細胞タイプが、攻撃的及び防御的免疫系の両方の機能に関与する。ヘルパーＴ細胞（Ｔｈ細胞）は、免疫系の能力を確立及び最大化するように機能するリンパ球機能のサブグループである。上述の細胞とは異なり、Ｔｈ細胞は、細胞傷害性又は貪食活性を欠如している。しかしながら、Ｔｈ細胞は、細胞傷害性Ｔ細胞（例えば、上述のキラー細胞）等の他の免疫細胞の活性化及び指向性に関与する。Ｔｈ細胞は、他の要因の中でも特に、どの細胞タイプを主に活性化するか、どのサイトカインを産生するか、及びどのタイプの免疫刺激が促進されるかに応じて、２つの主なサブ分類（Ｔｈ１又はＴｈ２）に分類される。例えば、Ｔｈ１細胞は、相手として主にマクロファージと組み、Ｔｈ２細胞は、相手として主にＢ細胞と組む。Ｔｈ１細胞は、インターフェロン−ガンマ、ＴＮＦ−ベータ、及びＩＬ−２を産生し、Ｔｈ２細胞は、ＩＬ１、ＩＬ５、ＩＬ６、ＩＬ１０、及びＩＬ１３を産生する。Ｔｈ細胞のサブセットのマーカーは、公知であり、刺激に応答する、あるＴｈ細胞サブタイプの誘導を特定するために使用することができる。例えば、ＩＬ２又はＩＦＮＧの誘導は、Ｔｈ１細胞による刺激に対する応答を表し、ＩＬ４又はＩＬ１０の誘導は、Ｔｈ２細胞による刺激に対する応答を表す。Ｔｈ１７等の他のサブタイプは、ＩＬ１７等の他のマーカーにより表される（例えば、表５及び６を参照）。
【００２９】
最後に、対象体の免疫状態又は機能を特徴付ける場合、様々な他の機能が研究に有用である。例えば、抗原提示（ＧＭＣＳＦにより測定される）、Ｂ細胞の増殖（ＩＧＨ２により測定される）、血流要求が増加するために腫瘍形成で生じることが多い血管新生（ＶＥＧＦにより測定される）、及び疼痛（ＰＯＭＣにより測定される）である。上述のこれら一般的な分類を使用して、対象体の免疫応答を特徴付けるために全血を刺激することにより生成された解釈データを分類することができ、それは、下記でより詳細に記述されている。
【００３０】
上述の一般的な機能別分類に基づくと、ＮＫ細胞及び細胞傷害性Ｔ細胞の機能等の攻撃的免疫機能は、癌性細胞の破壊、並びに感染及び／又は炎症との戦いに重要である。ＮＫ細胞は、不要な標的細胞並びに正常な内因性細胞の両方を潜在的に死滅させることができるため、２つのタイプの表面受容体：活性化受容体及び阻害受容体を持つ。まとめると、これらの受容体は、ＮＫ細胞の細胞傷害活性の活性バランスを保つ役目を果たし、従って、ＮＫ細胞の細胞傷害活性を制御する。ＮＫ細胞の活性化には、活性化シグナルが必要であり、活性化シグナルには、サイトカイン（インターフェロン等の）、それに対して体液性免疫応答が開始された標的細胞に対するＦｃＲ受容体の活性化、及び／又は種々の活性化ＮＫ細胞表面受容体に結合する外来性リガンドが関与している場合がある。その後、標的細胞は、上述のアポトーシス機序により破壊される。
【００３１】
同様に、細胞傷害性Ｔ細胞も活性化を必要とし、細胞傷害性Ｔ細胞に対する外来性（例えば、非自己）抗原の提示をもたらす２つのシグナルプロセスによると考えられている。細胞傷害性Ｔ細胞は、活性化されると、主にインターロイキン２（ＩＬ−２）、Ｔ細胞の増殖及び分化因子に応答して、クローン増殖を起こす。細胞傷害性Ｔ細胞は、細孔形成及び標的細胞のアポトーシスを誘導する点で、ＮＫ細胞とある程度同様に機能する。
【００３２】
外来性細胞に対する免疫攻撃に加えて、Ｔ−ｒｅｇ及びＭＤＳＣにより緩和されると考えられる防御的免疫機能が発生し、攻撃的免疫機能を阻害する。多くのＴ−ｒｅｇは、胸腺で発生し、フォークヘッドファミリー転写因子ＦｏｘＰ３（フォークヘッドボックスｐ３）を発現する。ＦｏｘＰ３発現は、Ｔ−ｒｅｇ発生及び集団増殖に必要であると考えられ、Ｔ−ｒｅｇの運命を規定する遺伝子プログラムの制御因子でもある可能性がある。多くの疾患状態では、特に癌では、Ｔ−ｒｅｇの数、特にＦｏｘｐ３を発現するＴ−ｒｅｇの数の変化が見出される。例えば、腫瘍を有する患者は、癌性細胞の形成を抑制する身体の能力を阻害するＦｏｘｐ３陽性Ｔ細胞が、局所的に相対的に過剰である。
【００３３】
また、ＭＤＳＣは、防御的免疫応答のエフェクターである。ＭＤＳＣは、攻撃的Ｔ細胞を破壊しないと考えられるが、細胞傷害性Ｔ細胞の挙動の様式を変化させる。ＭＤＳＣは、アミノ酸であるアルギニンを分解するプロテアーゼであるアルギナーゼ（ＡＲＧ）を分泌する。細胞傷害性Ｔ細胞及びＮＫ細胞を含むリンパ球は、活性化のためにアルギニンに間接的に依存する。従って、ＭＤＳＣによるＡＲＧの分泌は、ＮＫ細胞及び細胞傷害性Ｔ細胞の活性化を制限し、それにより防御的免疫応答を促進する。
【００３４】
しかしながら、Ｔ−ｒｅｇ及びＭＤＳＣによるこの自己制限的制御の結果、防御的免疫機能は、局所的組織環境で優勢なスキームになる可能性を有する。結果として、攻撃的免疫機能の刺激（癌ワクチン治療又は適応性免疫療法により発生するような）は、腫瘍細胞を完全に根絶するのに十分なほど機能できない場合がある。結果として、腫瘍細胞は、免疫系を回避し、腫瘍へと悪化する場合がある。
【００３５】
従って、個体の攻撃的及び防御的免疫機能の特徴付けは、攻撃系が優勢であることにより自己免疫が促進される場合があり、防御系が優勢であることにより癌が促進される場合があるため、非常に重要であり得る。更に、攻撃及び防御関連免疫マーカーの発現プロファイルは、抗癌剤又は免疫抑制剤としての効力について、薬物をスクリーニングするのに有用であり得る。
【００３６】
例えば、種々のマーカーの発現プロファイルを使用して、特定の対象体に最も有効であり得る特定の種類の療法を特定することができる。様々なマーカーによる全血の刺激により、どの細胞タイプが特定のタイプの刺激に応答性であるかの決定が可能になる。本明細書で考察されているように、刺激因子には、これらに限定されないが、以下のものが含まれる：ＩＬ２（一般的な細胞性免疫修飾因子）、ＰＨＡ（一般的なＴ細胞修飾因子）、抗Ｔ細胞受容体抗体（Ｔ細胞の特異的刺激因子）、ＨＡＧ（ＦｃＲ受容体を有する白血球の刺激剤）、及びＬＰＳ又はザイモサン（一般的な細菌性免疫応答に関連するトール様受容体の活性化因子）。全血を刺激し、本明細書に記載の一般的な機能別分類（例えば、リクルーター又はキラー）に由来する種々のマーカーの発現誘導を測定するために使用される場合、誘導のパターンを使用して、所与の対象体に特に効果的な潜在的療法を特定することができる。例として、限定はされないが、癌を有する患者に由来する血液の試料が刺激され、攻撃的（例えば、キラー）機能の１つ又は複数のマーカーが増加する場合、これは、免疫療法に基づく癌治療が、この対象体に効果的であり得ることを初期に示唆する。この初期示唆の強度は、他の分類に由来するマーカーの発現レベルに基づいて増大する場合がある。例えば、１つ又は複数の攻撃的マーカーの誘導が、安定的な（例えば、ほとんど又は全く変化しない）サプレッサー機能を伴う場合、免疫系の攻撃的武器の効力を制限することになる防御的機能の増加を供なわずに攻撃的機能が増加することを考慮すると、これは、免疫療法に基づく癌治療が効果的である可能性が高いだろうということを更に示唆する。言い換えれば、発現レベルにより表されるような、攻撃的及び防御的免疫系間の機能の差が増加することは、攻撃的活性の増加を利用する治療が有効であるだろうということを示す。その一方で、例えば、患者の全血の刺激が、攻撃的マーカーの増加並びに防御的マーカーの増加をもたらす場合（例えば、増加にも関わらず、系間の機能に正味の変化がない）、これらの結果は、この対象体には、免疫に基づかない治療がより効果的であり得ることを示唆するだろう。これは、攻撃系及び防御系間の機能に正味の変化が欠如していることにより、両系の機能がアップレギュレートされており、攻撃系が、免疫の基づく治療を特に効果的にするほど優勢ではない可能性が高いことが示唆されるからである。そのような状況では、放射線、外科手術、又は化学療法等の療法が、より効果的であり得る。幾つかの実施形態では、他の機能別分類のマーカーの発現レベルからの追加的情報が、特定のタイプの療法の潜在的効力と関連する他のデータを支持又は否定する場合がある。例えば、攻撃的マーカー発現を増加させ、防御的マーカー発現をほとんど又は全く変化させずに、リクルーターマーカー発現の増加をもたらす癌患者の全血の刺激は、免疫に基づ
く抗癌療法の潜在的効力を更に支持する。これは、リクルーター活性の増加が、攻撃的免疫系の細胞のリクルートを、例えばより迅速に、より多くの数で、及び／又はより長期間にわたって可能にすることにより、攻撃的機能の増加を更に増強する可能性が高いからである。幾つかの実施形態では、機能別分類における発現変化を評価及び使用して、最適な療法を決定し、他の実施形態では、分類内からの個々のマーカーを使用して、潜在的に最適な療法を決定する。
【００３７】
目的マーカーの発現を評価するための方法は、多数利用可能である。例えば、フローサイトメトリー分析は、適切なマーカータンパク質を染色することにより、ＮＫ細胞、細胞傷害性Ｔ細胞、Ｔ−ｒｅｇ、及びＭＤＳＣの特定を可能にすることができる。しかしながら、そのようなアッセイ系では、各細胞の機能を分析することはできない。従って、幾つかの実施形態には、患者の全体的な免疫応答を特徴付けるための診断検査として、攻撃及び防御関連免疫応答ｍＲＮＡのｅｘ ｖｉｖｏ誘導及び測定が伴う。
【００３８】
更に、免疫系活性及び／又は活性のマーカーの発現の決定することに関する多くの先行実験は、単離された白血球調製物で行われている。そのような単離された集団は、全血中に様々なリンパ球があることにより、小サブセットのリンパ球の特定のｍＲＮＡ誘導の検出が妨げられる場合があるため、好ましいことが多い。更に、複数のタイプのリンパ球間の多数の複雑な生化学的相互作用のため、全血調製物を使用すると、誘導及び測定反応が阻害又は修飾される可能性がある。更に、幾つかの実施形態で使用されるＩＬ−２及びザイモサン等の刺激剤は、血漿タンパク質又は血漿因子と相互作用し、それにより誘導活性の減少又は低減を示す場合がある。しかしながら、本明細書に記載の幾つかの実施形態で示されているように使用した場合、全血は、意外にも、攻撃的及び防御的免疫マーカーの両方の特徴付け、及び免疫調節効力に関する薬物のスクリーニングを可能にする、再現性がよく正確で生理学的に関連する結果をもたらす。
【００３９】
幾つかの実施形態では、全血は、哺乳動物、好ましくはヒトから収集される。幾つかの好ましい実施形態では、収集した全血は、収集時にヘパリン処理される。幾つかの実施形態では、収集した全血は、刺激プロトコール（下述）するまで、４℃で保存される。好ましい実施形態では、全血が使用されるが、他の実施形態では、血漿から分離された血液細胞、並びに単離された白血球調製物を使用することができる。
【００４０】
本方法の幾つかの好ましい実施形態では、血液は、少体積（およそ４０〜１００マイクロリットル（μＬ）に等分され、それらの各々は、溶媒で運ばれる刺激剤、又は対照作用剤のいずれかで処理される（つまり、誘導又は刺激される）。幾つかの実施形態では、対照作用剤は、血液試料中でほとんど又は全く応答を誘導しない。ある実施形態では、対照作用剤は、刺激剤を運ぶために使用される溶媒と同じ溶媒である。ある実施形態では、対照作用剤は、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）であり、他の実施形態では、対照作用剤は、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）である。幾つかの実施形態では、組換えＩＬ−２（ｒＩＬ−２）が、攻撃的及び防御的免疫マーカーの両方の刺激剤として使用される。ＩＬ−２は、攻撃的免疫応答を増大させるための作用剤として臨床的に使用されることが多い。しかしながら、この臨床的努力は、ＩＬ−２が同時に防御的免疫系もアップレギュレートすることができるため、幾つかの場合では失敗する。従って、免疫系の両主要部分のより完全な分析を発展させるためには、ある実施形態では、ＩＬ−２は、好ましい刺激剤である。他の実施形態では、ザイモサン、トール様受容体２（ＴＬＲ−２）のリガンドが、攻撃的及び防御的マーカーの両方の刺激剤として使用される。幾つかの実施形態では、他の公知の免疫刺激剤が使用される。更に他の実施形態では、特定の攻撃的及び／又は防御的免疫マーカーを刺激することが知られている作用剤が使用される。
【００４１】
幾つかの実施形態では、刺激剤は、１つ又は複数の攻撃的又は防御的免疫マーカーの発
現を誘導し、誘導は、上記マーカーをコードするｍＲＮＡの量により測定される。攻撃的マーカーには、これらに限定されないが、以下のものが含まれる：ＣＤ１６（ＮＫ細胞の表面マーカー）；グランザイムＢ（速効性アポトーシスの誘導因子）；パーフォリン（細胞を溶解するように機能する細胞溶解性タンパク質）；ＴＮＦＳＦ１（リンホトキシン、標的細胞に対する貪食細胞結合を増強するように機能する）；ＴＮＦＳＦ２（ＴＮＦ−アルファ；遅効性アポトーシスの誘導因子）；ＴＮＦＳＦ５（ＣＤ４０リガンド、抗原提示細胞及びマクロファージを活性化するように作用する）；ＴＮＦＳＦ６（Ｆａｓリガンド、アポトーシスの誘導因子）；ＴＮＦＳＦ１４（ＬＩＧＨＴ；Ｔ細胞増殖及び腫瘍細胞のアポトーシスを誘導する）；ＴＮＦＳＦ１５（アポトーシスの誘導因子）。防御的免疫マーカーには、これらに限定されないが、以下のものが含まれる：ＩＬ１０（Ｔｈ１のダウンレギュレーション因子であるサイトカイン）；ＴＧＦ−ベータ（リンパ球活性化を阻止する）；ＣＤ２５（Ｔ−ｒｅｇの表面マーカー）；ＦｏｘＰ３（Ｔ−ｒｅｇマーカー）；ＣＴＬＡ４（細胞傷害性リンパ球抗原）；ＧＡＲＰ（反復優位型糖タンパク質Ａ（ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ Ａ ｒｅｐｅｔｉｔｉｏｎｓ ｐｒｅｄｏｍｉｎａｎｔ））；ＩＬ１７（Ｔ細胞活性化の推定上の負の制御因子）；ＡＲＧ（アルギナーゼ、ＭＤＳＣのマーカー）；及びＰＤ−１（プログラム死１（ｐｒｏｇｒａｍｍｅｄ ｄｅａｔｈ １）、Ｔ細胞応答の負の制御因子）。
【００４２】
本方法の幾つかの実施形態では、攻撃的又は防御的免疫マーカーの誘導は、血液試料の少分割量を、対照作用剤と三重重複で又は刺激剤と三重重複でのいずれかで混合することにより達成される。その後、攻撃的又は防御的免疫マーカーの誘導が生じるのに十分な期間、混合物を３７℃でインキュベートする。幾つかの実施形態では、インキュベーション時間は、およそ４時間である。ある実施形態では、インキュベーション時間は、４時間を超えていてもよい。幾つかの実施形態では、インキュベーション時間は、およそ２４時間である。ある実施形態では、インキュベーション時間は、４時間未満であってもよい。適切なインキュベーション期間の後、血液試料は全て、詳しく分析するまで−８０℃で保存される。
【００４３】
幾つかの実施形態では、各試料に由来する以前に刺激された小体積の血液を処理して、血液中の１つ又は複数の攻撃的又は防御的免疫マーカーをコードするｍＲＮＡのレベルの測定を可能にする。幾つかの実施形態では、１つ又は複数の攻撃的又は防御的免疫マーカーをコードするｍＲＮＡのレベルは、刺激剤に応答して著しく変化するだろう。これらｍＲＮＡレベルを決定するために、赤血球及び白血球以外の血液成分は、血液試料から除去される。好ましい実施形態では、白血球は、ｍＲＮＡを単離及び増幅するためのデバイスを使用して単離される。このデバイスの実施形態は、米国特許出願第１０／７９６，２９８号、第１１／５２５，５１５号、第１１／３７６，０１８号、第１１／８０３，５９３号、第１１／８０３，５９４号、及び第１１／８０３，６６３号により詳細に記載されており、その各々は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【００４４】
手短に述べると、デバイスについてのある実施形態は、複数の試料送達ウェルを含有する多ウェルプレート、ウェルの真下にある白血球捕捉フィルター、及びフィルターの真下にある、固定されたオリゴ（ｄＴ）を含有するｍＲＮＡ捕捉帯を備える。ある実施形態では、デバイスは、真空圧力が加えられると、血液が、試料送達ウェルから白血球捕捉フィルターを通って吸引され、それにより白血球を捕捉して、非白血球血液成分がフィルターの洗浄により除去されることを可能にするように、ろ過プレートを受容してプレートと箱との密閉を作り出すのに適した真空箱を含有する。他の実施形態では、遠心分離又は陽圧等の、血液試料を試料ウェルから及び白血球捕捉フィルターを通して吸引する他の手段が使用される。デバイスの好ましい実施形態では、白血球は、一緒になって層をなす複数のフィルター膜で捕捉される。幾つかの実施形態では、その後、捕捉された白血球を、溶解緩衝液で溶解し、それにより、ｍＲＮＡが、捕捉された白血球から放出される。その後、
ｍＲＮＡは、オリゴ（ｄＴ）が固定されたｍＲＮＡ捕捉帯にハイブリダイズする。幾つかの実施形態で使用することができる溶解緩衝液の組成物に関する更なる詳細は、米国特許出願第１１／３７６，０１８号に見出すことができ、この文献は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。幾つかの実施形態では、オリゴ（ｄＴ）に固定されたｍＲＮＡからｃＤＮＡが合成される。好ましい実施形態では、その後、ｃＤＮＡは、感染関連マーカーを増幅するために特異的に設計されたプライマーを用いたリアルタイムＰＣＲを使用して増幅される。そのような実施形態で使用されるプライマーは、表１に示されている。幾つかの実施形態で使用されるＰＣＲ反応に関する更なる詳細は、米国特許出願第１１／３７６，０１８号にも見出すことができる。
【００４５】
【表１】
【００４６】
ＰＣＲ反応の完了後、１つ又は複数の攻撃的又は防御的免疫マーカーのｍＲＮＡ（検出されたＰＣＲ増幅ｃＤＮＡの量により表される）が定量化される。ある実施形態では、定量化は、攻撃的又は防御的免疫マーカーをコードするｍＲＮＡの量を基準値と比較することにより計算される。他の実施形態では、基準値は、刺激剤により誘導されない遺伝子、例えばハウスキーピング遺伝子の発現レベルである。あるそのような実施形態では、ベータアクチンを基準値として使用する。当技術分野で周知の多数の他のハウスキーピング遺伝子を基準値として使用することもできる。他の実施形態では、ハウスキーピング遺伝子を修正係数として使用し、従って最終的な比較は、非誘導（対照）試料に由来する同じマーカーと比較した、攻撃的又は防御的免疫マーカーの誘導された発現レベルである。更に他の実施形態では、基準値はゼロであり、従って攻撃的又は防御的免疫マーカーの定量化は、絶対値により表される。幾つかの実施形態では、１つ又は複数の攻撃的免疫マーカーの発現を、１つ又は複数の防御的免疫マーカーと比較した比率が計算される。
【００４７】
他の幾つかの実施形態では、攻撃的又は防御的免疫マーカー発現は、薬物（推定上の抗癌薬又は免疫抑制薬のいずれか）の存在下で、刺激剤の存在下及び非存在下の両方で測定される。そのような実施形態では、発現プロファイルを使用して、効果的な抗癌薬又は効果的な免疫抑制薬としての薬物化合物の効力を予測することができる。幾つかの実施形態では、薬物化合物は、攻撃的免疫マーカーの発現を誘導するが、防御的マーカーの発現は誘導しない可能性があり、その場合は、全体として攻撃的免疫系が促進され、従ってその薬物化合物は、推定上の抗癌治療薬となるだろう。同様に、他の実施形態では、薬物は、１つ又は複数の防御的免疫マーカーを阻害する場合があり、その場合、全体として攻撃的免疫系が促進され、従ってその薬物化合物は、推定上の抗癌治療薬となるだろう。幾つかのそのような実施形態では、防御的免疫マーカーを阻止し、従って防御的免疫成分を低減する薬物は、攻撃的免疫系を刺激することが知られている治療剤（ＩＬ−２等）と共に同時投与し、それにより、攻撃的免疫応答の増強及び腫瘍細胞消失可能性の増加を提供することができる。
【００４８】
対照的に、幾つかの実施形態では、薬物化合物は、防御的免疫マーカーの発現を誘導するが、攻撃的マーカーの発現を誘導しない場合があり、その場合は、全体として防御的免疫系が促進され、従って、その薬物化合物は、推定上の免疫抑制剤となるだろう。同様に、他の実施形態では、薬物は、１つ又は複数の攻撃的免疫マーカーを阻害する場合あり、その場合、全体として防御的免疫系が促進され、従ってその薬物化合物は、推定上の免疫抑制剤となるだろう。
【００４９】
更に他の実施形態では、薬物化合物は、攻撃的又は防御的マーカーのいずれも誘導しなくてもよく、又は両方を誘導してもよい。そのような実施形態では、更なる用量反応試験を実施して、特定の用量又は暴露時間により、薬物が、推定上の抗癌薬又は推定上の免疫抑制剤として分類されるかどうかを決定する。
【実施例】
【００５０】
特定の実施形態が、以下の例を参照して記述されているが、それらは、限定的であることを意図しておらず、むしろ例示的であるとみなされるべきである。
【００５１】
実施例１− 全血試料中の攻撃的及び防御的免疫マーカーの特徴付け
全血試料を健康なヒト成人から収集した。血液試料を、収集して誘導経時的試験用に幾つかの個々のチューブに入れる際に、ヘパリン処理した。その後、各チューブに由来する１８個の等体積分割量を、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）、１００ｎｇ／ｍＬのｒＩＬ−２、又はフィトヘマグルチニン（ＰＨＡ）のいずれかで刺激した。分割量を、３７℃で０、１、２、４、８、又は２０時間インキュベートした。インキュベーション後、試料は、分析するまで−８０℃で保存した。各試料を、三重重複で刺激及び分析した。ベータアクチン、ＩＬ−２、ａ型ＩＬ−２受容体（ＣＤ２５）、及びｂ型ＩＬ−２受容体（ＣＤ１２２）をコードするｍＲＮＡを、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、Ｍｉｔｓｕｈａｓｈｉ Ｍら、Ｃｌｉｎ Ｃｈｅｍ ５２巻：６３４〜６４２頁（２００６年）に記載の方法により測定した。
【００５２】
手短に言えば、９６ウェルろ過プレートを白血球除去膜（Ｌｅｕｋｏｓｏｒｂ；Ｐａｌｌ社製）を用いて構築し、オリゴ（ｄＴ）固定化収集プレートの上に設置した。１５０μＬの５ｍｍｏｌ／Ｌ Ｔｒｉｓ（ｐＨ７．４）を適用して、フィルター膜を湿らせた。１２０ｇで１分間４℃で遠心分離して、Ｔｒｉｓ溶液を膜から除去した後、５０μＬの刺激された全血試料を、各ウェルに適用し、直ちに１２０ｇで２分間４℃で遠心分離した。その後ウェルを、３００μＬのリン酸緩衝生理食塩水で１回洗浄した。２０００ｇで５分間４℃で遠心分離して、生理食塩水を除去した後、１０ｍＬ／Ｌ ２−メルカプトエタノー
ル（Ｂｉｏ−Ｒａｄ社製）、０．５ｇ／Ｌ プロテイナーゼＫ（Ｐｉｅｒｃｅ社製）、０．１ｇ／Ｌ サケ精子ＤＮＡ（５ Ｐｒｉｍｅ Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ／Ｂｒｉｎｋｍａｎ社製）、０．１ｇ／Ｌ大腸菌ｔＲＮＡ（Ｓｉｇｍａ社製）、各５ｎｍｏｌ／Ｌの特異的逆方向プライマー、及び１０10分子／Ｌの合成ＲＮＡ３４（外部対照として）で補完された、６０μＬの溶解緩衝液原液［５ｇ／Ｌ Ｎ−ラウロイルザルコシン、４×標準クエン酸生理食塩水、１０ｍｍｏｌ／Ｌ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．４）、１ｍｍｏｌ／Ｌ ＥＤＴＡ、１ｍＬ／Ｌ ＩＧＥＰＡＬ ＣＡ−６３０（ＮＰ−４０の代替品）、１．７９ｍｏｌ／Ｌ チオシアン酸グアニジン（全てＳｉｇｍａ社製）］をろ過プレートの各ウェルに添加した。その後、プレートを３７℃で１０分間インキュベートし、オリゴ（ｄＴ）固定化収集マイクロプレート（ＧｅｎｅＰｌａｔｅ；ＲＮＡｔｕｒｅ社製）の上に設置し、２０００ｇで５分間４℃で遠心分離した。４℃で一晩保存した後、マイクロプレートを、１００μＬの単純溶解緩衝液で３回洗浄し、その後１５０μＬの洗浄緩衝液［０．５ｍｏｌ／Ｌ ＮａＣｌ、１０ｍｍｏｌ／Ｌ Ｔｒｉｓ（ｐＨ７．４）、１ｍｍｏｌ／Ｌ ＥＤＴＡ］で４℃にて３回洗浄した。
【００５３】
１×逆転写緩衝液［５０ｍＭ ＫＣｌ、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．３）、５．５ｍＭ ＭｇＣｌ2、１ｎＬ／μＬ Ｔｗｅｅｎ ２０］、各１．２５ｍＭのデオキ
シヌクレオシド三リン酸、４ユニットのｒＲＮａｓｉｎ、及び８０ＵのＭＭＬＶ逆転写酵素（Ｐｒｏｍｅｇａ社製；プライマーなし）を含有する３０μＬの緩衝液を添加し、３７℃で２時間インキュベーションすることにより、ｃＤＮＡを各ウェルにて直接合成した。各３０μＬ反応物から、４μＬのｃＤＮＡを、３８４ウェルＰＣＲプレートに直接移し、５μＬのＴａｑＭａｎユニバーサルマスター混合物（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）、及び１μＬの各５μΜ感染関連マーカー又はベータアクチン用順方向及び逆方向プライマー（表１を参照）を添加した。使用したプライマー配列は、上記の表１に示されている。また、ＡＣＴＢ（β−アクチン）用のプライマー配列は、以前に発表されており（Ｍｉｔｓｕｈａｓｈｉ Ｍら、Ｐｈａｒｍ Ｒｅｓ．２５巻：１１１６〜１１２４頁、２００８年）、この文献は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。ＰＣＲは、ＰＲＩＳＭ７９００ＨＴ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）を用いて、９５℃で１０分間を１サイクル、その後９５℃で３０秒間、５５℃で３０秒間、及び６０℃で１分間を４５サイクルさせて実施した。各遺伝子を別々のウェルで増幅した。サイクル閾値（Ｃｔ）、すなわち、ある量のＰＣＲ産物（蛍光に基づく）が生成されたサイクルを、分析ソフトウェア（ＳＤＳ；Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社）を用いて決定した。各ｍＲＮＡのＣｔを、ＡＣＴＢのＣｔで減算してΔＣｔを計算し、％ＡＣＴＢを、２-ΔCt×１００により計算した。
【００５４】
図１Ａに示されているように、全血の刺激は、使用した刺激剤に関わらず、ベータアクチン発現を誘導しない。ＩＬ−２は自己誘導性ではないが、ＰＨＡ、炎症及び免疫応答の既知刺激因子は、ＩＬ−２の発現をロバストに増加させたため、図１Ｂは、刺激アッセイの陽性対照としての役目を果たす。図１Ｃは、防御的免疫マーカーＣＤ２５の誘導が、ｒＩＬ−２又はＰＨＡ（ＩＬ−２の誘導因子）のいずれかによる刺激後に生じることを実証している。これは、ＩＬ−２刺激が、免疫系の攻撃的及び防御的態様の両方に対して示すカスケード効果も実証している。
【００５５】
全血試料の追加分割量を、用量反応試験に使用した。７つの分割量を、１００ｎｇ／ｍＬのｒＩＬ−２で４時間刺激した。インキュベーション後、試料を、分析するまで−８０℃で保存した。各試料を三重重複で刺激して分析した。ベータアクチン、ＩＬ−２、ａ型ＩＬ−２受容体（ＣＤ２５）、ｂ型ＩＬ−２受容体イントロン配列（ＣＤ１２２）、ｂ型ＩＬ−２受容体エクソン配列（ＣＤ１２２）、グランザイムＢ、ＴＮＦ−アルファ、及びインターフェロン−ガンマをコードするｍＲＮＡを、上述の方法に従って測定した。
【００５６】
図２に示されているように、攻撃的及び防御的マーカーは、所与の濃度の刺激剤に対して応答が異なる場合がある。図１に示されている攻撃的マーカーの誘導に対する効果及び時間的経過に基づき、一群の刺激実験用に選択した条件は、１００ｎｇ／ｍＬのｒＩＬ−２による４時間の刺激だった。他の実施形態では、より高いか又はより低い濃度の刺激剤を使用してもよいことが理解されるだろう。同様に、より長いか又はより短い刺激時間、例えば、１〜２時間、２〜４時間、４〜６時間、６〜８時間、８〜１０時間、１０〜１２時間、１２〜１８時間、１８〜２４時間、及びそれらの重複範囲を使用してもよい。
【００５７】
ｒＩＬ−２又はザイモサンによる全血の刺激に応答した、一群の攻撃的又は防御的マーカーの発現の誘導を試験した。ｒＩＬ−２を１００ｎｇ／ｍｌで使用し、ザイモサンを１．５ｍｇ／ｍＬで使用して、基本的に上述のように試料を調製して刺激し、刺激は、３７℃で４時間であった。
【００５８】
表２に示されているように、ｒＩＬ−２による刺激は、この群の試験した攻撃的マーカー全ての増加を、統計的に有意に（Ｐ＜０．０５）誘導した。ＴＮＦα、ＣＤ１６、及びグランザイムＢは、対照試料よりおよそ４〜８倍多く誘導され、ＩＦＮγは、対照試料より２６０倍多く誘導された。またｒＩＬ−２は、幾つかの防御的マーカー、即ちＦｏｘＰ３、ＣＤ２５、ＩＬ１７の増加を統計的に有意に誘導した。ザイモサンは、アルギナーゼの増加を統計的に有意に誘導した。これらの結果は、本明細書で開示されている本発明のある実施形態の方法が、意外にも、単離された白血球調製物が必要であるという当技術分野の提案及び定説とは対照的に、免疫機能の攻撃的及び防御的マーカーの両方の発現増加の検出を可能にすることを実証している。これらのデータは、幾つかの実施形態で使用した刺激条件が、アッセイの検出閾値（バックグラウンドノイズ）を十分に超えて種々の攻撃的及び防御的マーカーの発現を誘導し、個体の攻撃的及び防御的免疫応答を特徴付けるための、迅速で単純な信頼性の高い方法を提供することを示す。
【００５９】
【表２】
【００６０】
実施例２− 薬物スクリーニング法としての攻撃的及び防御的免疫マーカーの誘導
本発明の幾つかの実施形態は、攻撃的又は防御的免疫マーカーの発現を誘導する化合物の能力に基づき、薬物化合物候補をスクリーニングするのに使用される。幾つかの実施形態では、そのような薬物スクリーニングアッセイは、抗癌臨床状況において、ＩＬ−２と共に同時投与することができる化合物を特定する効率を増加させるだろう。そのような化合物は、理想的には防御的免疫マーカーの発現増加を阻止する。従って、ＩＬ−２刺激は、推定上の癌細胞に対する攻撃的免疫応答を誘導し、候補化合物は、ＩＬ−２誘導性の負のフィードバック防御免疫応答を阻止し、それにより、攻撃的応答の自己誘導性ダウンレギュレーションを制限するだろう。このように、攻撃的免疫応答は、防御的免疫応答の欠如（又は低減）により効果的に強化される。
【００６１】
同様に、幾つかの実施形態は、潜在的な免疫抑制化合物についてスクリーニングするのに使用される。潜在的な有効化合物は、攻撃的免疫マーカーの誘導を阻害し、防御的免疫マーカーに効果を及ぼさず（又は増加させず）、それにより、攻撃的システムの活性よりも防御的免疫系の活性を促進する化合物である。そのような応答は、内因性免疫応答の抑制を可能にし、潜在的に、臓器移植患者又は自己免疫疾患に苦しむ患者に利益を提供するだろう。
【００６２】
ある化合物は、攻撃的又は防御的免疫機能を抑制（又は刺激）する効力を示す可能性が高い場合があるが、潜在的な効力は、試験した単一用量で示すことはできないことが認識されるべきである。従って、幾つかの実施形態では、用量反応試験も実施して、第１の用量で限定的な効力を有する潜在的な化合物が、第１の用量より高くともよく又は低くてもよい異なる用量で、効力（攻撃的又は防御的刺激因子としての）を増強するかどうか決定する。
【００６３】
潜在的な化合物をスクリーニングするために、ヘパリン処理した全血を、種々の潜在的免疫阻害化合物（終濃度は全て１０ｍＭ）又は対照溶媒（ＤＭＳＯ）と共に、各処理につき単一のチューブ中で１時間プレインキュベートし、その後ＰＢＳ又はｒＩＬ−２（終濃度は１００ｎｇ／ｍｌ）を用いて、更に４時間三重重複で刺激した。その後ｍＲＮＡを上述のように定量化した。試験した潜在的な免疫阻害剤化合物は、表３に示されている。
【００６４】
【表３】
【００６５】
ベータアクチン発現は、発現アッセイの対照としての役目を果たした。特徴付けられた攻撃的免疫マーカーには、腫瘍壊死因子スーパーファミリー（ＴＮＦＳＦ）１（リンホトキシン）、２（ＴＮＦα）、５（ＣＤ４０Ｌ）、６（ＦａｓＬ）、８（ＣＤ３０Ｌ）、９（ＣＤ１３７Ｌ）、１４（ＬＩＧＨＴ）、及び１５（ＴＬ１Ａ）が含まれていた。特徴付けられたケモカインには、ＣＣＬ２、ＣＣＬ３、ＣＣＬ４、ＣＣＬ８、ＣＣＬ１１、ＣＣＬ２０、ＣＸＣＬ１、ＣＸＣＬ２、ＣＸＣＬ３、ＣＸＣＬ１０が含まれていた。特徴付けられたインターロイキンには、ＩＬ６、ＩＬ８、ＩＬ１０、ＩＬ１７、及びＩＬ２３が含まれていた。特徴付けられた免疫エフェクターには、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＮＦγ、ＣＤ１６、グランザイムＢ、ＣＤ１２２、及びＴＧＦＢ−１が含まれていた。特徴付けられた防御的免疫機能のマーカーには、ＦｏｘＰ３、ＣＴＬＡ４、ＣＤ２５、及びＧＡＲＰ−１が含まれていた。他の攻撃的又は防御的免疫マーカー、並びに他のケモカイン、インターロイキン、又はエフェクター（他の免疫関連マーカーの中でも）は、ある実施形態で試験することができる。
【００６６】
ｒＩｌ−２刺激後の攻撃的及び防御的免疫マーカーのｍＲＮＡ発現データは、表４に示されている。網掛け部分は、増加倍率が２を超えており、並びに統計的ｐ値が０．０５未満であることを表す。選択された免疫機能の攻撃的及び防御的マーカーの発現プロファイル、及びＰＢＳ（白抜き円）又は１００ｎｇ／ｍＬのｒＩＬ−２（黒抜き円）による刺激に対するそれらのｍＲＮＡ発現応答は、図３Ａ〜３Ｊに示されている。全血試料を前処理するために使用された種々の阻害剤化合物は、ｘ軸に列挙されている。このデータから明らかなように、ある攻撃的又は防御的免疫マーカーが阻害剤の存在下で誘導されることは、その化合物が、攻撃的又は防御的免疫のいずれかを促進する可能性があることを示唆する。例えば、図３Ａに示されているように、血液試料をＰＢＳで刺激し、ＴＮＦＳＦ−１
の誘導を測定することでは、著しい発現変化（白抜き円）はもたらされなかった。しかしながら、刺激因子としてのｒＩＬ−２の存在下では、ヤヌスキナーゼ（Ｊａｋ）の阻害剤で処理した試料を除いて、ほとんどの血液試料が、ＴＮＦＳＦ１ ｍＲＮＡ（攻撃的免疫マーカー）の誘導を示す。この試料は、ｒＩＬ−２に応答したＴＮＦＳＦ１の誘導を示さなかった。従って、この化合物は、攻撃的免疫応答を阻止又は低減する可能性を有し、免疫抑制促進化合物として機能する可能性がある。しかしながら、防御的免疫応答の２つのマーカー、ＣＤ２５又はＦｏｘＰ３（それぞれ、図３Ｉ及び３Ｊ）に対する同じ化合物の効果を評価すると、データは、ｒＩＬ−２がこれら防御的マーカーの誘導を阻止することを示す。従って、この一組の実験からは、この特定のＪａｋ阻害剤が、攻撃的又は防御的免疫応答の促進によく適するかどうかは不明確である。この化合物の効力を解明するには、更なる用量反応試験及び／又は追加的な免疫マーカーを用いた試験が必要である。
【００６７】
【表４】
【００６８】
図４Ａ〜４Ｊは、種々の阻害剤化合物の存在下又は非存在下でＰＢＳ又はｒＩＬ−２刺激に応答したＩＦＮγ（図４Ａ〜４Ｂ）、ＴＮＦＳＦ１（図４Ｃ〜４Ｄ）、ＣＤ１６（図
４Ｅ〜４Ｆ）、ＣＤ２５（図４Ｇ〜４Ｈ）、又はＦｏｘＰ３（図４Ｉ〜４Ｊ）の誘導を測定した追加的な実験を示す。これらのデータは、攻撃的マーカーＩＦＮγ及びＴＮＦＳＦ−１の誘導の欠如、及びＦｏｘＰ３、防御関連マーカーの発現誘導により示されるように、Ｊａｋ１が、攻撃的免疫マーカー（つまり、防御促進性）の特異的阻害剤であることを示す。化合物Ｅ０８４も、攻撃的マーカーＩＦＮγ及びＴＮＦＳＦ−１の特異的阻害を実証した。しかしながら、Ｅ０８４は、ＣＤ２５及びＦｏｘＰ３を両方とも誘導し、Ｅ０８４が、防御的免疫応答のより強力な促進因子であり得ることを示唆した。また、本明細書に記載の方法の実施形態は、単一アッセイで、一群の推定上の誘導体化合物と比較したデータを同時に生成することができるという点で、種々の誘導体又は修飾化合物の特徴付けによく適する。更に、上述のデータの明確に異なる特徴に基づき、本明細書に記載の方法の実施形態は、臨床状況で使用される防御特異的（つまり、攻撃促進性）阻害剤化合物の検出に有用である。従って、このアッセイプラットフォームは、攻撃的及び防御的免疫機能の共通の選択的阻害剤の分析／スクリーニングに有用である。
【００６９】
実施例３− テーラーメイド療法を特定するための、攻撃的及び防御的免疫マーカーｍＲＮＡ誘導の使用
末梢血中で循環する成熟白血球は、一般的に定常状態にあり、それらは、炎症、新生物、異物（微生物、移植組織及び装置、薬物、並びにワクチン）の局所病変に移動すると、特異的な様式で完全に活性化される。活性化の特異性は、他の要因の中でも、リクルートされた白血球のタイプ及び局所的刺激因子のタイプに依存する。ｉｎ ｖｉｖｏ白血球応答をｉｎ ｖｉｔｒｏ系でシミュレートするために、この実施例では、未処理の全血を、種々の特異的で一般的な刺激因子に暴露し、白血球応答の多様性を定量化した。種々の白血球応答を、特定のタイプの免疫応答（例えば、体液性免疫、細胞性免疫等）とのそれらの関連性に基づき分類した。
【００７０】
ほとんどのｉｎ ｖｉｔｒｏアッセイでは、白血球を単離し、特定の刺激と共に又は刺激なしで、ある期間（例えば、数日から数週間）培養して、白血球の機能的変化（例えば、タンパク質合成及び分泌、アポトーシス、細胞増殖、表面マーカー変化等）を特定する。しかしながら、そのようなアッセイは複雑であり、費用がかかり、時間がかかるため、日常的な診断検査としての適用可能性は著しく制限を受ける。細胞単離及び培養条件に伴う技術的な困難を克服することを試みた幾つかのプロトコール、例えば、全血を使用して特定の刺激と共に短期間インキュベートとし（典型的には一晩）、その後アデノシン−５’−三リン酸（ＡＴＰ）レベルを定量化するか、又は酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）により種々のサイトカインのレベルを測定すること等が開発された。しかしながら、幅広く多様な白血球機能はＡＴＰ依存性でないため、ＡＴＰレベルを知る有用性は限定されている。更に、典型的なＥＬＩＳＡの検出限界は、ピコモルからフェムトモル（１０11〜１０15個の分子）であり、従って、そのようなプロトコールの感度には制限がある。
【００７１】
対照的に、本明細書で開示された幾つかの実施形態による方法では、白血球機能関連ｍＲＮＡのｅｘ ｖｉｖｏ誘導が測定される。ポリメラーゼ連鎖反応は、単一分子検出までの感度が可能であり、ｍＲＮＡ誘導は、タンパク質合成、及び対応する生物学的変化（ＥＬＩＳＡにより測定されることになるような）より遥かに早期に起るため、ｍＲＮＡレベルの測定は有利である。本明細書で考察されているように、全血を使用することにより、ｉｎ ｖｉｖｏの複雑な細胞間コミュニケーション、並びに白血球と血漿因子及びタンパク質との相互作用が維持される。全血のｍＲＮＡ分析プロトコールは存在しているが、そのような方法は，血液採取時の遺伝子発現のある時点での状況を提供するに過ぎない。対照的に、本明細書で開示された実施形態では、適切な刺激後のｍＲＮＡレベルの変動が分析され、それにより、刺激に対する白血球応答と関連する動的な一連のデータ要素が提供される。
【００７２】
ＰＣＲは、標的遺伝子の単一コピーを検出するのに十分なほど感度が高いが、全血の三重重複分割量中のばらつきの低減に基づき、本明細書で開示された幾つかの実施形態は、特に感度が高い。標準的アッセイでは、ばらつきは、白血球単離、ＲＮＡ精製、ｃＤＮＡ合成からＰＣＲに至るまでの任意のステップで引き起こされ得る。ＰＣＲは増幅に基づく性質を持つため、ＰＣＲ前に導入された微細なばらつきでさえ指数関数的に増加されることになる。更に、単一血液試料からでさえ、刺激因子の数、用量反応性、時間的経過、刺激因子の組合せ、二重重複、又は三重重複等に基づいて多数の分割量が生成される。当技術分野で公知の標準的プロトコールのそのような制限に基づき、本出願人は、ハイスループットアッセイプラットフォームを開発し、それは、本明細書で開示された幾つかの実施形態で使用されている。アッセイプラットフォームに関する更なる情報は、米国特許出願第１０／７９６，２９８号、第１１／５２５，５１５号、第１１／３７６，０１８号、第１１／８０３，５９３号、第１１／８０３，５９４号、及び第１１／８０３，６６３号に見出すことができ、その各々は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【００７３】
材料及び方法
材料
抗Ｔ細胞受容体α／β鎖（ＴＣＲ）モノクローナル抗体（ＩｇＧ１κ）及び対照マウスＩｇＧ１κは、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ社（サンディエゴ、カリフォルニア州、米国）から得た。逆転写酵素、ｄＮＴＰ、及びＲＮａｓｉｎは、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社（カールズバッド、カリフォルニア州、米国）から購入した。他の化学薬品は全て、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社（セントルイス、ミズーリ州、米国）から購入した。免疫複合体（熱凝集ＩｇＧ、ＨＡＧ）は、以前に記述されているように、ヒトＩｇＧを６３℃で１５分間加熱することにより調製した（Ｏｓｔｒｅｉｋｏら、１９８７年）。８ウェルストリップマイクロチューブにて、各１．２μＬのフィトヘマグルチニン−Ｌ（２ｍｇ／ｍｌ）、ＨＡＧ（１０ｍｇ／ｍｌ）、リポ多糖（ＬＰＳ）（０．５ｍｇ／ｍｌ）、ザイモサンＡ（７５ｍｇ／ｍｌ）、組換えインターロイキン２（ｒＩＬ２）（５μｇ／ｍｌ）、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）、抗ＴＣＲ抗体（５０μｇ／ｍｌ）、及び対照ＩｇＧ（５０μｇ／ｍｌ）を、８個のウェルにそれぞれ添加し、使用まで−８０℃で保存した。
【００７４】
血液処理
ヘパリン処理した全血試料は、施設内審査委員会の承認後、Ａｐｅｘ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ（タスティン、カリフォルニア州、米国）から得た。血液収集後の条件を等しくするために、血液試料を、４℃で一晩保存した。翌朝、血液を貯溜容器にデカントし、８ウェルマルチチャネルピペットを使用して、各６０μＬの血液を、上述の対照作用剤又は刺激因子を含有する３つのストリップに分注した（図５Ａ）。この試験に必要な血液量は、１．４４ｍｌ（６０μＬ／ウェル×８つのウェル×３つのストリップ（三重重複））だった。蓋を閉じた後、ストリップを、３７℃で４時間インキュベートし、その後−８０℃で冷凍保存した。幾つかの実施形態では、より大きな体積の又はより小さな体積の血液を使用してもよいことが理解されるだろう（例えば、多数の刺激因子又は白血球活性化関連遺伝子を試験するために増加させてもよい）。２つの分類の患者、この例では、正常な健康（対照）対象体（表５のデータ）及び癌を有する患者（表６のデータ）で試験した。
【００７５】
標的ｍＲＮＡ
標的ｍＲＮＡのｍＲＮＡ配列は、ＧｅｎＢａｎｋから検索した。ＰＣＲプライマーは、Ｐｒｉｍｅｒ Ｅｘｐｒｅｓｓ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（ＡＢＩ）社製、フォスターシティ、カリフォルニア州、米国）により、コード領域内に設計した（表１を参照）。オリゴヌクレオチドは、ＩＤＴ社（コーラルビル、アイオワ州、米国）が合成した。標的ｍＲＮＡ（合計３２個）は、β−アクチン（ＡＣＴＢ）、β２−ミクログロブリン（Ｂ２Ｍ）、グランザイムＢ（ＧＺＢ）、パーフォリン１（ＰＲＦ１）、腫瘍壊死因
子スーパーファミリー（ＴＮＦＳＦ）−１、２、５、１４、及び１５、ＣＣＬケモカイン−２、４、８、及び２０、ＣＸＣＬケモカイン−３及び１０、インターロイキン（ＩＬ）−２、４、６、８、１０、及び１７Ａ、インターフェロン−γ（ＩＦＮＧ）、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭＣＳＦ）、ＣＤ１１ａ、１６、及び２５、トランスフォーミング成長因子ベータ１（ＴＧＦＢ１）、フォークヘッドボックスＰ３（ＦＯＸＰ３）、免疫グロブリン重鎖遺伝子座（ＩＧＨ＠）、アルギナーゼ（ＡＲＧ）、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）、並びにプロオピオメラノコルチン（ＰＯＭＣ）だった。
【００７６】
ｍＲＮＡ分析
５０マイクロリットルの刺激及び冷凍された全血を解凍し、９６ウェル特注ろ過プレートに適用した（図５Ｂ）。フィルター膜で遠心分離することにより、白血球を単離した。幾つかの実施形態では、フィルター膜で白血球を単離するために、他の技術を使用してもよい（例えば、真空、陽圧、及び重力等）。白血球の単離に関する更なる情報は、米国特許出願第１０／７９６，２９８号、第１１／５２５，５１５号、第１１／３７６，０１８号、第１１／８０３，５９３号、第１１／８０３，５９４号、及び第１１／８０３，６６３号に見出すことができ、その各々は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。特異的逆方向プライマーの混合液を含有する６０μＬの溶解緩衝液をろ過プレートに適用し、その結果生じた細胞溶解産物を、ポリ（Ａ）＋ｍＲＮＡ精製用のオリゴ（ｄＴ）固定化マイクロプレートに移した（図５Ｃ）。ｃＤＮＡを、各ウェルの５０μＬ溶液中で直接合成した：液相では特異的プライマーによるｃＤＮＡのプライミング、及び固相ではオリゴ（ｄＴ）によるｃＤＮＡのプライミング。液相又は固相のｃＤＮＡは、ｉＴａｑＳＹＢＲ（Ｂｉｏｒａｄ社製、ハーキュリーズ、カリフォルニア州、米国）を使用して、サーマルサイクラー（それぞれ、ＰＲＩＳＭ７９００、ＡＢＩ社製、及びｉＣｙｃｌｅｒ、Ｂｉｏｒａｄ社製）で、リアルタイムＰＣＲに使用した。ＰＣＲ条件は、９５℃で１０分間、その後６５℃で１分間及び９５℃で３０秒間の５０サイクルだった。ＩＬ２及びＩＬ４の場合、４μＬの未希釈ｃＤＮＡ溶液を、３８４ウェルＰＣＲプレートにて１０μＬの最終体積で使用した。（図５Ｄ）。ＦＯＸＰ３、ＡＲＧ、ＩＦＮＧ、ＧＭＣＳＦ、及びＰＯＭＣの場合、２μＬの未希釈ｃＤＮＡ溶液を、５μＬの最終体積でＰＣＲに使用した。その後、ｃＤＮＡを、３２μＬのＤＮａｓｅ／ＲＮａｓｅフリー水を添加することにより１：２に希釈し、各２μＬのｃＤＮＡを、５μＬの最終体積で、残り２４個の遺伝子（ＩＬ１７Ａ以外）のＰＣＲに使用した。残ったｃＤＮＡを新しいストリップマイクロチューブに移した後、固相ｃＤＮＡを直接使用して、３０μＬのＰＣＲ溶液を添加することによりＩＬ１７Ａを増幅した。融解曲線を常に分析して、ＰＣＲシグナルが単一ＰＣＲ産物に由来したことを確認した。サイクル閾値（Ｃｔ）を、分析ソフトウェア（ＳＤＳ、ＡＢＩ社製）で決定し、統計的ｐ値は、刺激因子及び対照の各々の３つのＣｔ値を使用したｔ検定により計算した。薬物処理した三重重複試料のＣｔから、対照試料の平均Ｃｔ値を個々に減算してΔＣｔを計算し、増加倍率を２＾（−ΔＣｔ）として計算した。
【００７７】
結果及び考察
この例では、６つの異なる刺激因子を（２つの対照と共に）使用した（表５及び６、ｘ軸）。ＰＨＡは、一般的なＴ細胞集団を刺激するために一般的に使用されるレクチンである。ＨＡＧは、ＩｇＧ Ｆｃ受容体（ＦｃγＲ）陽性白血球を刺激する免疫複合体のモデルである。主な細胞性標的が、ＣＤ１６＋ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞である抗体依存性細胞媒介性細胞障害（ＡＤＣＣ）とは異なり、ＨＡＧによる刺激は、ＣＤ１６＋、ＣＤ３２＋、及びＣＤ６４＋細胞を標的とする。ＬＰＳ及びザイモサンは、先天性免疫を分析するためのトール様受容体（ＴＬＲ）を刺激するために一般的に使用される作用剤である。抗ＴＣＲ抗体は、ＣＤ４＋及びＣＤ８＋Ｔ細胞の両方のＴ細胞受容体（α／β鎖）の抗原認識分子に結合するため、普遍的なＴＣＲ抗原として使用される（Ｍｉｔｓｕｈａｓｈｉら、２００８年ｃ）。組換えＩＬ−２は、制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）を含むＩＬ２受容体陽性Ｔ細胞に結合し、多種多様な免疫反応を誘導する。
【００７８】
免疫は、非常に複雑であり、多数の細胞性及び液性因子が互いに相互作用するが、本明細書で開示された幾つかの実施形態のように、有効な個別化された療法を予測するためには、そのような複雑さは、表５及び６に示されている幾つかの機能別分類に単純化することができる。
【００７９】
一般的に、白血球が血中から局所病変に移動するためには、白血球は、まず細胞表面にＣＤ１１ａを発現させ、それが、病変により損傷を受けた内皮細胞上に発現された細胞間接着分子と結合する。表５及び６に示されているように、ＣＤ１１ａ発現増加の検出は、ザイモサンによる全血試料の刺激により検出された。ＣＤ１１ａを発現する白血球が、標的細胞又は分子（例えば、病変の細胞又は分子）と遭遇すると、適切なサブセットの白血球が、病変にリクルートされなければならない。様々な走化性ＣＣＬ及びＣＸＣＬケモカインの発現を分析した。ＣＣＬ２（単球及び好塩基球）、ＣＣＬ４（顆粒球）、ＣＣＬ８（マスト細胞、好酸球、好塩基球、単球、Ｔ細胞、及びＮＫ細胞）、ＣＣＬ２０（リンパ球）、ＣＸＣＬ３（単球）、ＣＸＣＬ８（＝ＩＬ８）（好中球）、及びＣＸＣＬ１０（単球、マクロファージ、Ｔ細胞、ＮＫ細胞、及び樹状細胞）は、それぞれ列挙された細胞タイプの化学誘引物質として知られている。表５及び６に示されているように、各刺激因子は、異なるサブセットのケモカインを誘導したが、それは、個体の走化性及びケモカイン発現プロファイルに基づいて、特定の細胞タイプを利用する（例えば、リクルートする）ための可能な方法を示している。幾つかの実施形態では、個体の走化性及びケモカイン発現プロファイルは、疾患部位で細胞浸潤を発生させる（例えば、適切な免疫細胞を標的部位に送達する）その個体の能力を予測できるようにするデータを提供する。幾つかの実施形態では、そのようなデータは、テーラーメイド治療の効力及び開発の予測に有用である。例えば、癌患者の全血の刺激が、任意の走化性分子又はケモカイン分子の発現を誘導できない場合、その個体は、白血球リクルーター機能が不十分であり得、従って、免疫の基づく治療（例えば、癌免疫療法）の理想的な候補ではないだろう。むしろ、その個体は、より従来的な放射線手法、薬理学的手法、又は外科的手法に対してより良好に応答する可能性が高い。
【００８０】
病変部位にリクルートされると、局所的に浸潤した白血球は、標的細胞を死滅させることを目的とした事象のカスケードも誘導する。アポトーシスの誘導を含む、標的細胞を死滅させるための複数の機序が使用されうる。表５及び６に示されているように、種々の刺激因子によるグランザイム及びパーフォリンｍＲＮＡの誘導（周知のアポトーシス誘導因子）が特定された。ＣＤ１６、ＮＫ細胞の特異的マーカーの発現増加も特定された。腫瘍壊死因子（リガンド）スーパーファミリー（ＴＮＦＳＦ）は、ＴＮＦＳＦ受容体陽性の標的細胞に対するアポトーシスの様々な誘導因子を含む。表５及び６に示されているように、各刺激因子は、異なるメンバーのＴＮＦＳＦを誘導した。従って、幾つかの実施形態では、個体の攻撃的免疫機能に関するデータを使用して、その患者が先天的な抗癌活性を発生させる可能性を特徴付けることができる。また、幾つかの実施形態では、自己免疫疾患の重症度を特徴付けることができる。有利なことには、本明細書で示された方法は、療法を施す前に、患者が特定のタイプの療法に応答する可能性を特徴付けることを可能にする。これは、患者の生存が、できるだけ早期に有効な療法を開始することに依存する状況で、特に有利である。そのため、癌患者が「キラー」分子の発現の誘導をほとんど示さないという事実は、そのような患者が、そのような療法から利益を得る可能性は低いだろうということを示唆し、他の非免疫療法が検討されるべきであることを示唆する。
【００８１】
上記で考察されているように、ヒト免疫は、様々な負の制御因子（本明細書では「防御的免疫マーカー」とも呼ばれる）を有しており、それらには、体液性成分（ＩＬ１０及びＴＧＦＢ１）、及び細胞性成分（Ｔｒｅｇ及び骨髄由来サプレッサー細胞（ＭＤＳＣ））が含まれる。これら制御因子は、誘導時に攻撃的（例えば、キラー）免疫応答の効力を抑
制又は低減する能力を有する。対照的に、それらの発現の低減は、自己免疫疾患の発生を促進する場合がある。従って、負の制御因子の発現及びリクルーター／キラー分子のバランスは、幾つかの実施形態では、所与のタイプの療法の潜在的効力を更に評価するため使用される。表５に示されているように、ＩＬ１０ ｍＲＮＡは、抗ＴＣＲ抗体及びザイモサンにより誘導され、ＴＧＦＢ１ ｍＲＮＡは、ザイモサンにより誘導された。ＦＯＸＰ３及びＣＤ２５ ｍＲＮＡを、Ｔｒｅｇ活性のマーカーとして測定した。刺激因子は、ＦｏｘＰ３を誘導しなかったが、ＣＤ２５は、ＨＡＧを除く全ての刺激因子により誘導された（表５を参照）。アルギナーゼｍＲＮＡは、ＭＳＤＣ機能のマーカーとして測定したが、誘導は表５では検出されなかった。
【００８２】
表６に示されているように、癌を有する患者は、種々の刺激に応答して、より大きな度合いのサプレッサー誘導を示すと考えられた。ザイモサンは、ＴＧＦ−ベータ１を除き、分析した全てのサプレッサーを著しく誘導した。同様に、ＰＨＡは、分析した５つのサプレッサーマーカーのうち３つを誘導した。従って、幾つかの実施形態では、そのようなデータは、疾患の発端を示唆することができ、例えば、サプレッサーの発現の増強は、キラー（例えば、攻撃的）機能の効力低減に寄与し得、従って悪性腫瘍の発生を促進した可能性がある。同様に、サプレッサー機能の増強は、特にキラー機能の増強がない場合、免疫療法が、そのような個体に有効ではないだろうということを示唆する。
【００８３】
主に他のタイプの免疫細胞を活性化及び指図するように機能する種々のサブセットのＴヘルパー細胞のマーカーとして、ＩＬ２（Ｔｈ１）、ＩＦＮＧ（Ｔｈ１）、ＩＬ４（Ｔｈ２）、ＩＬ１０（Ｔｈ２）、及びＩＬ１７（Ｔｈ１７）ｍＲＮＡの誘導を特定した（表５及び６）。これらマーカーの誘導は、複数レベルの免疫系が、単なる攻撃的（例えば、キラー）機能細胞の誘導ではなく、同時にアップレギュレートされる能力があることを示唆する。従って、幾つかの実施形態では、上記で考察され、まとめられた種々の機能別分類の各々の分析を使用して、どのタイプの治療法が有効である可能性が高いかを決定する。例えば、ヘルパー又はリクルーターマーカーの誘導の欠如を伴う攻撃的マーカーのアップレギュレーションは、より大きな活性を有しているものの、攻撃的細胞が、十分に良好に標的とされていないか、又は免疫系の他の部分により十分に良好に支援されていない可能性があることを示唆する。そのような場合、免疫に基づく療法は理想的ではない可能性がある。しかしながら、他の実施形態では、単一分類（又は単一のマーカー）の誘導の強度は、関連する治療計画を受けるのに十分値する可能性がある。
【００８４】
体液性（例えば、抗体媒介性）免疫応答に非常に重要である、種々の外来性分子の同一性を「学習する」免疫系の能力等の、様々な他の機能が免疫系で実行される。顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）は、白血球細胞増殖因子としての機能であり、ＧＭＣＳＦ ｍＲＮＡは、種々の刺激により健常対象体で適度に誘導された（表５）。同様に、ＧＭＣＳＦは、健常対象体より遥かに大きな程度にであったが、癌患者でアップレギュレートされた（表６）。これらデータは、癌患者が、多数の白血球を製作する能力を有する可能性があることを示唆するが、細胞の総数は、有効な免疫機能を保証しない場合があり、むしろ攻撃的及び防御的機能の最終的なバランスが、重要な決定要因である可能性がある。抗原に対する抗体を製作するように機能し、記憶Ｂ細胞へと発達して行くＢ細胞のマーカーとしての、ＩｇＧ重鎖（ＩＧＨ＠）のｍＲＮＡは、健常患者ではザイモサンにより誘導されたが（表５）、癌患者（表６）では誘導されなかった。癌などの多くの病変は、細胞代謝及び組織増殖の速度が速いため、血液供給の増加を必要とする。ＶＥＧＦ発現は、血管新生のマーカーとして試験し、健常患者及び癌患者の両方でザイモサンにより誘導された。疼痛に関連するＰＯＭＣ（エンドルフィン）ｍＲＮＡは、これら対象体では誘導されなかったが、関連実験の他の健常対照対象体では、ＰＯＭＣ ｍＲＮＡがザイモサンにより誘導されることが示されている（データ非表示）。
【００８５】
この例で実証されたように、このハイスループット法は、健常個体及び癌を有する個体（表５）の広範囲な白血球機能を特徴付けるのに十分な程度に感度が高かった（表６）。三重重複の全血分割量を刺激因子及び対照溶媒の両方に使用して、各ｍＲＮＡの各刺激因子に関する統計的結論を導き出すことができた。ＡＣＴＢ及びＢ２Ｍ等の対照遺伝子は、対照個体では誘導されなかったが（例えば、増加倍数＞２）、Ｂ２Ｍは、癌性個体で誘導された。しかしながら、Ｂ２Ｍは、主要組織適合遺伝子複合体の成分であるため、発現の変化がザイモサンによる全血の刺激により誘導されるだろうと考えることは不合理ではない。にもかかわらず、対照遺伝子を使用して、他のｍＲＮＡのＰＣＲ結果を正規化しなかった。実際、本明細書で使用した方法の感度を考慮すると、増加倍数が２倍未満又は０．６倍を超えている場合でさえ、統計的有意差が特定されることが多かった（例えば、表５のｒＩＬ２及びＰＨＡ誘導性ＡＣＴＢ、ＰＨＡ誘導性ＣＣＬ４、ザイモサン誘導性ＣＸＣＬ１０、ＨＡＧ及びザイモサン誘導性ＦＯＸＰ３）。対照的に、幾つかの低コピー数遺伝子（例えば、ＩＬ２、ＩＬ４、ＧＭＣＳＦ、及びＰＯＭＣ）は、大きなばらつきを示し、場合によっては、増加倍数が１０を超えても、有意ではなかった（表５のＴＣＲ誘導性ＧＭＣＳＦ）。従って、表５及び６では、２を超える増加倍数、かつｐ＜０．０５を、陽性結果とみなした（例えば、有意な誘導；暗色背景部分）。種々のマーカーの誘導の度合いは、必ずしも生物学的重要性の度合いと直接結び付くかない場合があり、例えば、低コピー数遺伝子の発現の大きな増加倍数は、豊富な遺伝子の小さな増加倍数と比較して、生物学的な影響はより少ない可能性がある。従って、発現の変化の度合いは、特定の経路の変化の度合いを必ずしも示さない場合があり得るが、これらのデータは、発現のパターンを決定するのに特に有用である。本明細書で開示されているように、幾つかの実施形態では、発現のパターンを使用して、ある分類の白血球機能関連マーカーの発現に基づいて、テーラーメイドの療法又は診断が開発される。ｒＩＬ２等の一般的な免疫機能刺激因子を含め、本明細書で開示された方法により生成されたデータは、他の疾患タイプの中でも、腫瘍学的疾患及び自己免疫疾患に応用可能である。幾つかの実施形態によると、幾つかの実施形態は、前臨床研究、臨床試験の状況での療法の開発、並びに付随する診断の開発に関して、生成されたデータを使用する。
【００８６】
【表５】
【００８７】
【表６】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、２００９年１２月１６日に出願された米国仮出願第６１／２８７，１１４号の利益を主張するものであり、その開示は、参照により本明細書に明示的に組み込まれる。
【０００２】
本開示は、容易に測定が可能であり、宿主の攻撃的又は防御的免疫機能のいずれかに関連するマーカーに関する。より詳しくは、本開示は、感染に対する宿主応答性の予測因子として、及び／又は免疫調節効果について薬物をスクリーニングするための方法として、攻撃的（異物を攻撃する）又は防御的（攻撃的免疫活性を制御する）免疫機能のいずれかと関連する特定のマーカーをｅｘ ｖｉｖｏ誘導すること及びそれらの誘導を測定することに関する。遺伝子誘導に関して生成されるデータは、特定の対象体の発現プロファイルに特異的に適合する治療を特定するために使用することができる。
【背景技術】
【０００３】
免疫系は、まず病原体及び腫瘍細胞を特定し、その後除去することにより、宿主を疾患から防御する一組の多様なタンパク質、細胞、組織、及びプロセスを含む。免疫系の主な役割は、外来性の細胞又は病原体と内因的な細胞を区別すること、言い換えれば「自己」と「非自己」とを区別することである。宿主に内因的な細胞は、クラスＩ主要組織適合遺伝子複合体（ＭＨＣ）の発現により「自己」として認識されると考えられている。クラスＩ ＭＨＣが存在しないか又は発現レベルが低減されたそれら細胞は、損傷した「自己」又は「非自己」細胞として、免疫系により標的とされる場合がある。この見事な系であるにも関わらず、免疫系の障害は、免疫不全、発癌、又は自己免疫を含む疾患に結び付く場合がある。
【０００４】
白血球細胞（ＷＢＣ；白血球）は、免疫系の主要な機能的クラスの細胞である。ＷＢＣには幾つかのサブタイプが存在するが、リンパ球は、免疫系防御機構に不可欠な役割を果たす１つのサブタイプである。ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞は、腫瘍細胞、ウイルス感染細胞、又は損傷した「自己」細胞の識別及び拒絶に関与する特化したタイプの細胞傷害性リンパ球である。細胞傷害性Ｔ細胞は、感染体細胞又は腫瘍細胞の死滅を誘導することが可能な別のリンパ球サブグループである。ＮＫ細胞及び細胞傷害性Ｔ細胞は、多くの場合サイトカイン又は外来性抗原の提示により活性化されると、それらの細胞質から、種々のタンパク質及びプロテアーゼを含有する小顆粒を放出する。
パーフォリン等の特定のタンパク質は、標的細胞の膜に細孔形成を誘導し、グランザイム等のプロテアーゼを細胞に進入させることで、プログラム細胞死プロセス（アポトーシス）を誘導することが可能となる。
【０００５】
外来性細胞又は腫瘍細胞に対する攻撃と同時に、免疫系は、負のフィードバックループも開始させて免疫系の活性を制限し、外来性細胞の除去が成功した後で免疫系を活動停止させ、また過剰応答性及び可能性としてある「自己」の細胞、又は自己免疫の発生に結び付く他の経路の攻撃を回避する。制御性Ｔ細胞は、免疫系の活性化を能動的に抑制し、この役割の重要性は、制御性Ｔ細胞（Ｔ−ｒｅｇ）の遺伝子欠損により重症の自己免疫症候群が引き起こされることから明らかである。骨髄性由来サプレッサー細胞（ＭＤＳＣ）も、免疫ダウンレギュレーションプロセスに関与し、それは、ＭＤＳＣが、標的とされ破壊される細胞の表面上に発現された外来性タンパク質に対する細胞傷害性Ｔ細胞の結合を阻止するためである。この防御的な負のフィードバック系の活性は、系の攻撃的機能を凌駕
する場合があり、それは、腫瘍細胞が探知を逃れ、癌性増殖を発生させる可能性を増加させる場合がある。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
種々の細胞タイプが、外来性細胞に対する積極的な攻撃及び／又は免疫系機能を制限する防御的手段に関与する様式及び能力を知ることで、癌性腫瘍及び／又は自己免疫疾患の発症に対する更なる洞察がもたらされる可能性がある。従って、個体の攻撃的及び防御的免疫機能を両方とも評価する診断検査の必要性が存在する。免疫調節化合物としての効力について薬物を迅速にスクリーニングする必要性、及び個体の免疫機能に基づいてその個体に合った療法を特定する必要性も存在する。
【０００７】
免疫は、良好な健康維持に、及び風邪から生命に関わる疾患にまで及ぶ種々の疾患に対する防御に重大な役割を果たす。免疫学はこの数十年で大きな進歩を見せているが、免疫系がどのように機能するかの理解は、ｉｎ ｖｉｔｒｏ実験又は動物モデルにおける実験に由来している。患者に施されている療法の多くは、これら実験から単純に推定されたものであり、多種多様な患者に常に有効であるとは限らない。臨床的に適用可能な技術により各患者の免疫又は免疫学的健康を特徴付ける方法に対する要求が増大している。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
幾つかの実施形態では、対象体の免疫機能が、攻撃的免疫機能に向けられているか又は防御的免疫機能に向けられているかを決定する方法であって、対象体から白血球を含有する第１及び第２の試料を取得すること；第１の試料を、攻撃的及び防御的免疫機能を両方とも刺激する免疫刺激剤に溶媒中で暴露すること；第２の試料を上記溶媒に暴露すること；上記刺激剤又は溶媒に暴露した後、第１及び第２の試料中の１つ又は複数の攻撃的免疫機能関連ｍＲＮＡの量を定量化し、それにより第１及び第２の試料中で定量化された攻撃的免疫機能関連ｍＲＮＡの量間の比率として攻撃的免疫機能の誘導を定量化すること；上記刺激剤又は溶媒に暴露した後、第１及び第２の試料中の１つ又は複数の防御的免疫機能関連ｍＲＮＡの量を定量化し、それにより第１及び第２の試料中で定量化された防御的免疫機能関連ｍＲＮＡの量間の比率として防御的免疫機能の誘導を定量化することを含み、攻撃的又は防御的免疫が著しくより多く誘導されることにより、対象体の免疫機能がそれぞれ攻撃的又は防御的免疫機能に向けられていることが示される方法を提供する。
【０００９】
幾つかの実施形態では、白血球を含有する試料は、全血試料であり、幾つかの実施形態中で、任意にヘパリン処理されている。幾つかの実施形態では、試料を取得した直後に刺激を生じさせる必要はない。むしろ、全血は、刺激の前に最大約２４時間保存しておくことができる。一実施形態では、保存試料は、室温で保存される。別の実施形態では、保存試料は、冷却された環境で保存される（例えば、室温未満、例えば、約４℃）。
【００１０】
幾つかの実施形態では、これらに限定されないが、組換えインターロイキン−２、フィトヘマグルチニン、抗Ｔ細胞受容体抗体、熱凝集ＩｇＧ、リポ多糖、及びザイモサンの１つ又は複数を含む種々の刺激剤が使用される。幾つかの実施形態では、試料の刺激剤への暴露は、２４時間未満である。幾つかの実施形態では、暴露は、２〜６時間である。一実施形態では、暴露は、約４時間である。
【００１１】
機能的分類を使用して、研究しようとするマーカーを分類することができる。幾つかの実施形態では、１つ又は複数の攻撃的免疫機能関連ｍＲＮＡは、免疫リクルーター機能（ｉｍｍｕｎｅ ｒｅｃｒｕｉｔｅｒ ｆｕｎｃｔｉｏｎ）、免疫キラー機能（ｉｍｍｕｎｅ ｋｉｌｌｅｒ ｆｕｎｃｔｉｏｎ）、又は免疫ヘルパー機能（ｉｍｍｕｎｅ ｈｅｌｐｅｒ ｆｕｎｃｔｉｏｎ）を有するものに分類される。幾つかの実施形態では、１つ又
は複数の攻撃的免疫機能関連ｍＲＮＡは、免疫リクルーター機能を有し、ＣＣＬ２、ＣＣＬ４、ＣＣＬ８、ＣＣＬ２０、ＣＸＣＬ３、ＣＸＣＬ１０、及びインターロイキン８からなる群から選択される。幾つかの実施形態では、１つ又は複数の攻撃的免疫機能関連ｍＲＮＡは、免疫キラー機能を有し、グランザイムＢ、パーフォリン、ＴＮＦＳＦ１、ＴＮＦＳＦ２、ＴＮＦＳＦ５、ＴＮＦＳＦ６、ＴＮＦＳＦ１４、及びＴＮＦＳＦ１５からなる群から選択される。幾つかの実施形態では、１つ又は複数の攻撃的免疫機能関連ｍＲＮＡは、免疫ヘルパー機能を有し、インターロイキン２、インターロイキン４、インターフェロンガンマ及びインターロイキン１７Ａからなる群から選択される。
【００１２】
防御的免疫機能関連ｍＲＮＡは、攻撃的免疫機能の抑制に関連している。幾つかの実施形態では、１つ又は複数の防御的免疫機能関連ｍＲＮＡは、インターロイキン１０、トランスフォーミング成長因子ベータ、ＦｏｘＰ３、ＣＤ２５、アルギナーゼ、ＣＴＬＡ−４、及びＰＤ−１からなる群から選択される。
【００１３】
本明細書に記載の方法は、任意に、対象体が癌を有している場合に使用され、潜在的に有効な抗癌療法を特定するために、対象体の免疫機能が、攻撃的免疫機能に向けられているか又は防御的免疫機能に向けられていると決定される。そのような使用では、対象体の免疫機能が攻撃的免疫機能に向けられていると決定されることにより、癌免疫療法治療計画が有効である可能性が高いことが示される。幾つかの実施形態では、対象体の免疫機能が防御的免疫機能に向けられていると決定されることにより、免疫に基づく作用機序が関与しない抗癌治療計画が有効である可能性が高いことが示される。
【００１４】
幾つかの実施形態では、本明細書で開示された方法を使用して、対象体の免疫機能に基づいて、抗癌療法治療計画の効力を予測し、対象体の免疫機能が攻撃的免疫機能に向けられていると決定されることにより、抗癌免疫療法治療計画が有効である可能性が高いことが示され、対象体の免疫機能が防御的免疫機能に向けられていると決定されることにより、免疫に基づく作用機序が関与しない抗癌治療計画が有効である可能性が高いことが示される。
【００１５】
幾つかの実施形態では、対象体の免疫機能が、攻撃的免疫機能に向けられているか又は防御的免疫機能に向けられているかを決定する方法であって、対象体から白血球を含有する第１及び第２の試料を取得すること；第１の試料を、攻撃的及び防御的免疫機能を両方とも刺激する作用剤に溶媒中で暴露すること；第２の試料を上記溶媒に暴露すること；暴露させた第１及び第２の試料をインキュベートすること；上記作用剤又は溶媒に暴露した後、第１及び第２の試料の各々中の１つ又は複数の防御的免疫機能関連ｍＲＮＡの量を定量化し、それにより防御的免疫機能関連ｍＲＮＡの誘導の量を、第１及び第２の試料中で定量化された量間の比率として定量化すること；上記作用剤又は溶媒に暴露した後、第１及び第２の試料の各々中の１つ又は複数の攻撃的免疫機能関連ｍＲＮＡの量を定量化し、それにより攻撃的免疫機能関連ｍＲＮＡの誘導の量を、第１及び第２の試料中で定量化された量間の比率として定量化すること；防御的免疫機能関連ｍＲＮＡの誘導と攻撃的免疫機能関連ｍＲＮＡの誘導との比率を計算すること；及び計算した比率を対照対象体群に由来する対照比率と比較することを含み、計算した比率が対照比率より著しく増加することにより、対象体の免疫機能が攻撃的免疫機能に向けられており、計算した比率が対照比率より著しく減少することにより、対象体の免疫機能が防御的免疫機能に向けられていることが示される方法が提供される。
【００１６】
幾つかの実施形態では、攻撃的免疫機能関連ｍＲＮＡは、細胞傷害性機能のマーカーをコードするｍＲＮＡを含む。幾つかの実施形態では、防御的免疫機能関連ｍＲＮＡは、例えば、アルギナーゼ又はＦｏｘＰ３等の骨髄由来サプレッサー細胞のマーカーをコードするｍＲＮＡを含む。
【００１７】
幾つかの実施形態では、攻撃的及び防御的免疫機能の両方の刺激因子と共に投与するための薬物を特定し、投与された薬物が、攻撃的又は防御的免疫機能の１つを阻害する方法であって、上記薬物の存在下又は非存在下（上記刺激因子の存在下であってもよく又は非存在下であってもよい）で攻撃的マーカーの発現を測定することにより、全血中の１つ又は複数の攻撃的免疫機能関連マーカーの発現のｉｎ ｖｉｔｒｏ誘導を定量化すること；上記薬物の存在下又は非存在下（上記刺激因子の存在下であってもよく又は非存在下であってもよい）で防御的マーカーの発現を測定することにより、全血中の１つ又は複数の防御的免疫機能関連マーカーの発現のｉｎ ｖｉｔｒｏ誘導を定量化すること；及び上記薬物の存在下又は非存在下での攻撃的免疫機能関連マーカーの誘導と防御的免疫機能関連マーカーの誘導との差異を決定することを含み、攻撃的及び防御的マーカーに対するその正味効果に基づき、上記薬物が、上記刺激因子と共に投与するためのものであると特定される方法が提供される。
【００１８】
幾つかの実施形態では、ｉｎ ｖｉｔｒｏ誘導は、攻撃的及び防御的免疫機能マーカーの１つ又は複数を誘導するのに十分な期間、全血を刺激因子に暴露することを含む。幾つかの実施形態では、攻撃的免疫機能関連マーカーは、ＣＤ１６、グランザイムＢ、ＴＮＦ−アルファ、インターフェロンガンマ、及び腫瘍壊死因子スーパーファミリーのメンバーの１つ又は複数を含み、防御的免疫機能関連マーカーは、ＣＤ２５、ＦｏｘＰ３、ＣＴＬＡ４、ＧＡＲＰ、ＩＬ１７、及びアルギナーゼの１つ又は複数を含む。一実施形態では、攻撃的及び防御的免疫機能の刺激因子は、インターロイキン２である。一実施形態では、攻撃的又は防御的免疫機能を衰えさせる薬物は、薬物が１つ又は複数の防御的免疫機能関連マーカーの発現を誘導するよりも高い程度に、１つ又は複数の攻撃的免疫機能関連マーカーの発現を誘導する（例えば、攻撃的機能を優先的に誘導する）。増加は、任意に、薬物を送達するために使用される溶媒で刺激されている対照試料と比べて決定される。薬物の投与は、任意に、刺激剤の投与の前又は投与と同時である。
【００１９】
幾つかの実施形態では、攻撃的及び防御的免疫機能の両方を特徴付ける方法であって、ヘパリン処理した全血の少なくとも２つの分割量を取得すること；第１の分割量を、攻撃的及び防御的免疫機能を両方とも刺激する作用剤に暴露すること；第２の分割量を作用剤の溶媒に暴露すること；これら分割量を２４時間未満インキュベートすること；ＴＮＦＳＦ、グランザイムＢ、パーフォリン、ＣＤ１６、ＩＮＦガンマ、又は白血球の細胞傷害性機能を表す他の遺伝子をコードする１つ又は複数のｍＲＮＡの量を定量化すること；ＦｏｘＰ３、ＣＤ２５、又は制御性Ｔ細胞のマーカーを表す他の遺伝子をコードする１つ又は複数のｍＲＮＡの量を定量化すること；第１及び第２の分割量の両方において、細胞傷害性機能のマーカーの発現と制御性Ｔ細胞のマーカーの発現との比率を計算すること；及びこれら比率を、対照対象体群に由来する比率と比較することを含む方法が提供される。
【００２０】
この方法は、任意に、ヘパリン処理した全血のさらなる２つの分割量の取得すること；さらなる第１の分割量を、攻撃的及び防御的免疫機能を両方とも刺激する作用剤に暴露すること；さらなる第２の分割量を、作用剤の溶媒に暴露すること；これら分割量を２４時間未満インキュベートすること；アルギナーゼ又は骨髄由来サプレッサー細胞のマーカーを表す他の遺伝子をコードする１つ又は複数のｍＲＮＡの量を定量化すること；第１及び第２の分割量の両方での、細胞傷害性機能のマーカーの発現と骨髄由来サプレッサー細胞のマーカーの発現との比率を計算すること；及びこれら比率を、対照対象体群に由来する比率と比較することを含む。
【図面の簡単な説明】
【００２１】
【図１Ａ】ＩＬ−２刺激後の、種々の免疫マーカーをコードするｍＲＮＡレベルの経時的変化を表す図である。
【図１Ｂ】ＩＬ−２刺激後の、種々の免疫マーカーをコードするｍＲＮＡレベルの経時的変化を表す図である。
【図１Ｃ】ＩＬ−２刺激後の、種々の免疫マーカーをコードするｍＲＮＡレベルの経時的変化を表す図である。
【図１Ｄ】ＩＬ−２刺激後の、種々の免疫マーカーをコードするｍＲＮＡレベルの経時的変化を表す図である。
【図２】ＩＬ−２に対する免疫マーカーの用量反応的誘導を表す図である。「*」は、対照溶媒と比較して、統計的有意差（ｐ＜０．０５）があることを示す。
【図３Ａ】薬物スクリーニングに使用されたデータを表す図である。
【図３Ｂ】薬物スクリーニングに使用されたデータを表す図である。
【図３Ｃ】薬物スクリーニングに使用されたデータを表す図である。
【図３Ｄ】薬物スクリーニングに使用されたデータを表す図である。
【図３Ｅ】薬物スクリーニングに使用されたデータを表す図である。
【図３Ｆ】薬物スクリーニングに使用されたデータを表す図である。
【図３Ｇ】薬物スクリーニングに使用されたデータを表す図である。
【図３Ｈ】薬物スクリーニングに使用されたデータを表す図である。
【図３Ｉ】薬物スクリーニングに使用されたデータを表す図である。
【図３Ｊ】薬物スクリーニングに使用されたデータを表す図である。
【図４Ａ】薬物スクリーニングに使用された攻撃的又は防御的免疫マーカーの誘導に関連するデータを表す図である。
【図４Ｂ】薬物スクリーニングに使用された攻撃的又は防御的免疫マーカーの誘導に関連するデータを表す図である。
【図４Ｃ】薬物スクリーニングに使用された攻撃的又は防御的免疫マーカーの誘導に関連するデータを表す図である。
【図４Ｄ】薬物スクリーニングに使用された攻撃的又は防御的免疫マーカーの誘導に関連するデータを表す図である。
【図４Ｅ】薬物スクリーニングに使用された攻撃的又は防御的免疫マーカーの誘導に関連するデータを表す図である。
【図４Ｆ】薬物スクリーニングに使用された攻撃的又は防御的免疫マーカーの誘導に関連するデータを表す図である。
【図４Ｇ】薬物スクリーニングに使用された攻撃的又は防御的免疫マーカーの誘導に関連するデータを表す図である。
【図４Ｈ】薬物スクリーニングに使用された攻撃的又は防御的免疫マーカーの誘導に関連するデータを表す図である。
【図４Ｉ】薬物スクリーニングに使用された攻撃的又は防御的免疫マーカーの誘導に関連するデータを表す図である。
【図４Ｊ】薬物スクリーニングに使用された攻撃的又は防御的免疫マーカーの誘導に関連するデータを表す図である。
【図５】図５Ａ〜Ｄは、迅速ハイスループットプロトコールを表す図である。
【発明を実施するための形態】
【００２２】
本明細書に記載の幾つかの実施形態では、宿主の攻撃的及び防御的免疫応答をｅｘ ｖｉｖｏで特徴付けする方法が提供される。本明細書で使用される場合、用語「攻撃的」は、感染、外来性病原体、又は腫瘍等に対して開始される全体的免疫応答及びその関連細胞成分を指すものとする。幾つかの場合では、用語「キラー」は、「攻撃的」と同義的に使用される。本明細書で使用される場合、用語「防御的」は、活性化された攻撃的免疫系の活性を制限する役目を果たす全体的免疫応答及びその関連細胞成分を指すものとする。幾つかの場合では、用語「サプレッサー」は、「防御的」と同義的に使用される。
【００２３】
幾つかの実施形態では、本方法には、宿主から末梢全血を収集すること、及び攻撃的又
は防御的免疫応答に関連する一群のマーカーの１つ又は複数を誘導する刺激剤（複数可）を使用することが伴う。幾つかの実施形態では、任意に、単離された白血球を使用してもよい。幾つかの実施形態では、攻撃的又は防御的マーカーの各々の１つ又は複数をコードするｍＲＮＡの測定を使用して、宿主の全体的免疫応答を特徴付ける。更に他の実施形態では、そのような攻撃的又は防御的マーカーの発現の特徴付けを使用して、免疫抑制薬又は抗癌薬（例えば、免疫調節薬）のいずれかとしての潜在的効力について、薬物をスクリーニングする。
【００２４】
免疫系は、異物に対する攻撃を開始するために協調して作用し、それにより感染、腫瘍形成等から宿主を防御する、様々な機能を有する様々な細胞タイプを含む。機能の主な分類には、これらに限定されないが、リクルート機能、キラー機能、サプレッサー（キラーの）機能、及びヘルパー機能、並びに様々な補助機能、例えば、抗原提示、血管新生の制御、疼痛調節等が含まれる。
【００２５】
リクルート機能は、免疫系の適切な機能に不可欠である。感染、腫瘍形成等の事象では、免疫攻撃を適切に認識し、免疫攻撃から宿主を防御するために、免疫細胞は、特に全血、骨髄、及びリンパ系を含む種々の身体部分からリクルートされなければならない。幾つかの実施形態では、ケモカインは、炎症又は腫瘍形成の局所領域に他の免疫細胞をリクルートするように機能する。結局のところ、不要な外来性細胞を死滅又は無力化することができる細胞を宿主が有していたとしても、それら細胞がどこに行って機能すべきかが適切に指示されなければ役立たない。リクルーター機能は、幾つかの実施形態では、ケモカイン又は他の走化性分子により提供される。幾つかの実施形態では、特定のモチーフのケモカインは、他の免疫の分子をリクルートするように機能する。例えば、幾つかの実施形態では、ＣＣＬ−２、ＣＣＬ−４、ＣＣＬ−８、又はＣＣＬ−２０等のＣＣＬ分子は、他の免疫細胞のリクルートに関与する。他の実施形態では、ＣＸＣＬ−３又はＣＸＣＬ−１０等のＣＸＣＬ分子が、関与する。幾つかの実施形態では、Ｃ−Ｃ若しくはＣ−Ｘ−Ｃモチーフであるにせよ、又は別の種類であるにせよ、他のケモカインエフェクターが関与する。
【００２６】
リクルーター細胞が、他のタイプの免疫細胞を適切な位置に移動させると、他のタイプの細胞は、それらの指定の機能を発揮することができ、幾つかの実施形態では、それは標的細胞（複数可）を死滅させることである。幾つかの実施形態では、死滅機能は、標的細胞のアポトーシスを誘導することより実現される。例えば、標的が腫瘍である場合、キラー機能（例えば、アポトーシスに関与するある分子を発現すること）を有する１つ又は複数の細胞が、標的部位にリクルートされる。幾つかの実施形態では、そのようなキラー細胞は、グランザイムＢ、パーフォリン、ＴＮＦＳＦ１（リンホトキシン）、ＴＮＦＳＦ２（ＴＮＦ−アルファ）、ＴＮＦＳＦ５（ＣＤ４０リガンド）、ＴＮＦＳＦ６（Ｆａｓリガンド）、ＴＮＦＳＦ１４（ＬＩＧＨＴ）、ＴＮＦＳＦ１５（ＴＬ１Ａ）、及び／又はＣＤ１６等の分子の１つ又は複数を発現する。そのため、標的部位に対するこれら細胞のリクルートは、標的細胞の破壊をもたらすカスケードを開始させ、従って、攻撃的免疫系の目的、例えば異物又は外来性細胞の破壊及び／又は除去を実現する。
【００２７】
本明細書で考察されているように、防御的免疫系は、攻撃的免疫系の活性を制限するように機能する（例えば、自己免疫疾患に結び付く場合がある攻撃的機能の過剰活性を防止する）一連のシグナル及び分子を含む。防御的機能を有する細胞は、これらに限定されないが、ＩＬ１０、ＴＧＦ−ベータ、（フォークヘッドボックスｐ３）ＦｏｘＰ３、ＣＤ２５、アルギナーゼ、ＣＴＬＡ−４、及び／又はＰＤ−１を含むマーカーにより認識することができる。そのような細胞は、攻撃的免疫系の活性に対する重要なバランスであり、適切な全体的免疫機能を保証するために重要である。
【００２８】
更なる細胞タイプが、攻撃的及び防御的免疫系の両方の機能に関与する。ヘルパーＴ細胞（Ｔｈ細胞）は、免疫系の能力を確立及び最大化するように機能するリンパ球機能のサブグループである。上述の細胞とは異なり、Ｔｈ細胞は、細胞傷害性又は貪食活性を欠如している。しかしながら、Ｔｈ細胞は、細胞傷害性Ｔ細胞（例えば、上述のキラー細胞）等の他の免疫細胞の活性化及び指向性に関与する。Ｔｈ細胞は、他の要因の中でも特に、どの細胞タイプを主に活性化するか、どのサイトカインを産生するか、及びどのタイプの免疫刺激が促進されるかに応じて、２つの主なサブ分類（Ｔｈ１又はＴｈ２）に分類される。例えば、Ｔｈ１細胞は、相手として主にマクロファージと組み、Ｔｈ２細胞は、相手として主にＢ細胞と組む。Ｔｈ１細胞は、インターフェロン−ガンマ、ＴＮＦ−ベータ、及びＩＬ−２を産生し、Ｔｈ２細胞は、ＩＬ１、ＩＬ５、ＩＬ６、ＩＬ１０、及びＩＬ１３を産生する。Ｔｈ細胞のサブセットのマーカーは、公知であり、刺激に応答する、あるＴｈ細胞サブタイプの誘導を特定するために使用することができる。例えば、ＩＬ２又はＩＦＮＧの誘導は、Ｔｈ１細胞による刺激に対する応答を表し、ＩＬ４又はＩＬ１０の誘導は、Ｔｈ２細胞による刺激に対する応答を表す。Ｔｈ１７等の他のサブタイプは、ＩＬ１７等の他のマーカーにより表される（例えば、表５及び６を参照）。
【００２９】
最後に、対象体の免疫状態又は機能を特徴付ける場合、様々な他の機能が研究に有用である。例えば、抗原提示（ＧＭＣＳＦにより測定される）、Ｂ細胞の増殖（ＩＧＨ２により測定される）、血流要求が増加するために腫瘍形成で生じることが多い血管新生（ＶＥＧＦにより測定される）、及び疼痛（ＰＯＭＣにより測定される）である。上述のこれら一般的な分類を使用して、対象体の免疫応答を特徴付けるために全血を刺激することにより生成された解釈データを分類することができ、それは、下記でより詳細に記述されている。
【００３０】
上述の一般的な機能別分類に基づくと、ＮＫ細胞及び細胞傷害性Ｔ細胞の機能等の攻撃的免疫機能は、癌性細胞の破壊、並びに感染及び／又は炎症との戦いに重要である。ＮＫ細胞は、不要な標的細胞並びに正常な内因性細胞の両方を潜在的に死滅させることができるため、２つのタイプの表面受容体：活性化受容体及び阻害受容体を持つ。まとめると、これらの受容体は、ＮＫ細胞の細胞傷害活性の活性バランスを保つ役目を果たし、従って、ＮＫ細胞の細胞傷害活性を制御する。ＮＫ細胞の活性化には、活性化シグナルが必要であり、活性化シグナルには、サイトカイン（インターフェロン等の）、それに対して体液性免疫応答が開始された標的細胞に対するＦｃＲ受容体の活性化、及び／又は種々の活性化ＮＫ細胞表面受容体に結合する外来性リガンドが関与している場合がある。その後、標的細胞は、上述のアポトーシス機序により破壊される。
【００３１】
同様に、細胞傷害性Ｔ細胞も活性化を必要とし、細胞傷害性Ｔ細胞に対する外来性（例えば、非自己）抗原の提示をもたらす２つのシグナルプロセスによると考えられている。細胞傷害性Ｔ細胞は、活性化されると、主にインターロイキン２（ＩＬ−２）、Ｔ細胞の増殖及び分化因子に応答して、クローン増殖を起こす。細胞傷害性Ｔ細胞は、細孔形成及び標的細胞のアポトーシスを誘導する点で、ＮＫ細胞とある程度同様に機能する。
【００３２】
外来性細胞に対する免疫攻撃に加えて、Ｔ−ｒｅｇ及びＭＤＳＣにより緩和されると考えられる防御的免疫機能が発生し、攻撃的免疫機能を阻害する。多くのＴ−ｒｅｇは、胸腺で発生し、フォークヘッドファミリー転写因子ＦｏｘＰ３（フォークヘッドボックスｐ３）を発現する。ＦｏｘＰ３発現は、Ｔ−ｒｅｇ発生及び集団増殖に必要であると考えられ、Ｔ−ｒｅｇの運命を規定する遺伝子プログラムの制御因子でもある可能性がある。多くの疾患状態では、特に癌では、Ｔ−ｒｅｇの数、特にＦｏｘｐ３を発現するＴ−ｒｅｇの数の変化が見出される。例えば、腫瘍を有する患者は、癌性細胞の形成を抑制する身体の能力を阻害するＦｏｘｐ３陽性Ｔ細胞が、局所的に相対的に過剰である。
【００３３】
また、ＭＤＳＣは、防御的免疫応答のエフェクターである。ＭＤＳＣは、攻撃的Ｔ細胞を破壊しないと考えられるが、細胞傷害性Ｔ細胞の挙動の様式を変化させる。ＭＤＳＣは、アミノ酸であるアルギニンを分解するプロテアーゼであるアルギナーゼ（ＡＲＧ）を分泌する。細胞傷害性Ｔ細胞及びＮＫ細胞を含むリンパ球は、活性化のためにアルギニンに間接的に依存する。従って、ＭＤＳＣによるＡＲＧの分泌は、ＮＫ細胞及び細胞傷害性Ｔ細胞の活性化を制限し、それにより防御的免疫応答を促進する。
【００３４】
しかしながら、Ｔ−ｒｅｇ及びＭＤＳＣによるこの自己制限的制御の結果、防御的免疫機能は、局所的組織環境で優勢なスキームになる可能性を有する。結果として、攻撃的免疫機能の刺激（癌ワクチン治療又は適応性免疫療法により発生するような）は、腫瘍細胞を完全に根絶するのに十分なほど機能できない場合がある。結果として、腫瘍細胞は、免疫系を回避し、腫瘍へと悪化する場合がある。
【００３５】
従って、個体の攻撃的及び防御的免疫機能の特徴付けは、攻撃系が優勢であることにより自己免疫が促進される場合があり、防御系が優勢であることにより癌が促進される場合があるため、非常に重要であり得る。更に、攻撃及び防御関連免疫マーカーの発現プロファイルは、抗癌剤又は免疫抑制剤としての効力について、薬物をスクリーニングするのに有用であり得る。
【００３６】
例えば、種々のマーカーの発現プロファイルを使用して、特定の対象体に最も有効であり得る特定の種類の療法を特定することができる。様々なマーカーによる全血の刺激により、どの細胞タイプが特定のタイプの刺激に応答性であるかの決定が可能になる。本明細書で考察されているように、刺激因子には、これらに限定されないが、以下のものが含まれる：ＩＬ２（一般的な細胞性免疫修飾因子）、ＰＨＡ（一般的なＴ細胞修飾因子）、抗Ｔ細胞受容体抗体（Ｔ細胞の特異的刺激因子）、ＨＡＧ（ＦｃＲ受容体を有する白血球の刺激剤）、及びＬＰＳ又はザイモサン（一般的な細菌性免疫応答に関連するトール様受容体の活性化因子）。全血を刺激し、本明細書に記載の一般的な機能別分類（例えば、リクルーター又はキラー）に由来する種々のマーカーの発現誘導を測定するために使用される場合、誘導のパターンを使用して、所与の対象体に特に効果的な潜在的療法を特定することができる。例として、限定はされないが、癌を有する患者に由来する血液の試料が刺激され、攻撃的（例えば、キラー）機能の１つ又は複数のマーカーが増加する場合、これは、免疫療法に基づく癌治療が、この対象体に効果的であり得ることを初期に示唆する。この初期示唆の強度は、他の分類に由来するマーカーの発現レベルに基づいて増大する場合がある。例えば、１つ又は複数の攻撃的マーカーの誘導が、安定的な（例えば、ほとんど又は全く変化しない）サプレッサー機能を伴う場合、免疫系の攻撃的武器の効力を制限することになる防御的機能の増加を供なわずに攻撃的機能が増加することを考慮すると、これは、免疫療法に基づく癌治療が効果的である可能性が高いだろうということを更に示唆する。言い換えれば、発現レベルにより表されるような、攻撃的及び防御的免疫系間の機能の差が増加することは、攻撃的活性の増加を利用する治療が有効であるだろうということを示す。その一方で、例えば、患者の全血の刺激が、攻撃的マーカーの増加並びに防御的マーカーの増加をもたらす場合（例えば、増加にも関わらず、系間の機能に正味の変化がない）、これらの結果は、この対象体には、免疫に基づかない治療がより効果的であり得ることを示唆するだろう。これは、攻撃系及び防御系間の機能に正味の変化が欠如していることにより、両系の機能がアップレギュレートされており、攻撃系が、免疫の基づく治療を特に効果的にするほど優勢ではない可能性が高いことが示唆されるからである。そのような状況では、放射線、外科手術、又は化学療法等の療法が、より効果的であり得る。幾つかの実施形態では、他の機能別分類のマーカーの発現レベルからの追加的情報が、特定のタイプの療法の潜在的効力と関連する他のデータを支持又は否定する場合がある。例えば、攻撃的マーカー発現を増加させ、防御的マーカー発現をほとんど又は全く変化させずに、リクルーターマーカー発現の増加をもたらす癌患者の全血の刺激は、免疫に基づ
く抗癌療法の潜在的効力を更に支持する。これは、リクルーター活性の増加が、攻撃的免疫系の細胞のリクルートを、例えばより迅速に、より多くの数で、及び／又はより長期間にわたって可能にすることにより、攻撃的機能の増加を更に増強する可能性が高いからである。幾つかの実施形態では、機能別分類における発現変化を評価及び使用して、最適な療法を決定し、他の実施形態では、分類内からの個々のマーカーを使用して、潜在的に最適な療法を決定する。
【００３７】
目的マーカーの発現を評価するための方法は、多数利用可能である。例えば、フローサイトメトリー分析は、適切なマーカータンパク質を染色することにより、ＮＫ細胞、細胞傷害性Ｔ細胞、Ｔ−ｒｅｇ、及びＭＤＳＣの特定を可能にすることができる。しかしながら、そのようなアッセイ系では、各細胞の機能を分析することはできない。従って、幾つかの実施形態には、患者の全体的な免疫応答を特徴付けるための診断検査として、攻撃及び防御関連免疫応答ｍＲＮＡのｅｘ ｖｉｖｏ誘導及び測定が伴う。
【００３８】
更に、免疫系活性及び／又は活性のマーカーの発現の決定することに関する多くの先行実験は、単離された白血球調製物で行われている。そのような単離された集団は、全血中に様々なリンパ球があることにより、小サブセットのリンパ球の特定のｍＲＮＡ誘導の検出が妨げられる場合があるため、好ましいことが多い。更に、複数のタイプのリンパ球間の多数の複雑な生化学的相互作用のため、全血調製物を使用すると、誘導及び測定反応が阻害又は修飾される可能性がある。更に、幾つかの実施形態で使用されるＩＬ−２及びザイモサン等の刺激剤は、血漿タンパク質又は血漿因子と相互作用し、それにより誘導活性の減少又は低減を示す場合がある。しかしながら、本明細書に記載の幾つかの実施形態で示されているように使用した場合、全血は、意外にも、攻撃的及び防御的免疫マーカーの両方の特徴付け、及び免疫調節効力に関する薬物のスクリーニングを可能にする、再現性がよく正確で生理学的に関連する結果をもたらす。
【００３９】
幾つかの実施形態では、全血は、哺乳動物、好ましくはヒトから収集される。幾つかの好ましい実施形態では、収集した全血は、収集時にヘパリン処理される。幾つかの実施形態では、収集した全血は、刺激プロトコール（下述）するまで、４℃で保存される。好ましい実施形態では、全血が使用されるが、他の実施形態では、血漿から分離された血液細胞、並びに単離された白血球調製物を使用することができる。
【００４０】
本方法の幾つかの好ましい実施形態では、血液は、少体積（およそ４０〜１００マイクロリットル（μＬ）に等分され、それらの各々は、溶媒で運ばれる刺激剤、又は対照作用剤のいずれかで処理される（つまり、誘導又は刺激される）。幾つかの実施形態では、対照作用剤は、血液試料中でほとんど又は全く応答を誘導しない。ある実施形態では、対照作用剤は、刺激剤を運ぶために使用される溶媒と同じ溶媒である。ある実施形態では、対照作用剤は、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）であり、他の実施形態では、対照作用剤は、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）である。幾つかの実施形態では、組換えＩＬ−２（ｒＩＬ−２）が、攻撃的及び防御的免疫マーカーの両方の刺激剤として使用される。ＩＬ−２は、攻撃的免疫応答を増大させるための作用剤として臨床的に使用されることが多い。しかしながら、この臨床的努力は、ＩＬ−２が同時に防御的免疫系もアップレギュレートすることができるため、幾つかの場合では失敗する。従って、免疫系の両主要部分のより完全な分析を発展させるためには、ある実施形態では、ＩＬ−２は、好ましい刺激剤である。他の実施形態では、ザイモサン、トール様受容体２（ＴＬＲ−２）のリガンドが、攻撃的及び防御的マーカーの両方の刺激剤として使用される。幾つかの実施形態では、他の公知の免疫刺激剤が使用される。更に他の実施形態では、特定の攻撃的及び／又は防御的免疫マーカーを刺激することが知られている作用剤が使用される。
【００４１】
幾つかの実施形態では、刺激剤は、１つ又は複数の攻撃的又は防御的免疫マーカーの発
現を誘導し、誘導は、上記マーカーをコードするｍＲＮＡの量により測定される。攻撃的マーカーには、これらに限定されないが、以下のものが含まれる：ＣＤ１６（ＮＫ細胞の表面マーカー）；グランザイムＢ（速効性アポトーシスの誘導因子）；パーフォリン（細胞を溶解するように機能する細胞溶解性タンパク質）；ＴＮＦＳＦ１（リンホトキシン、標的細胞に対する貪食細胞結合を増強するように機能する）；ＴＮＦＳＦ２（ＴＮＦ−アルファ；遅効性アポトーシスの誘導因子）；ＴＮＦＳＦ５（ＣＤ４０リガンド、抗原提示細胞及びマクロファージを活性化するように作用する）；ＴＮＦＳＦ６（Ｆａｓリガンド、アポトーシスの誘導因子）；ＴＮＦＳＦ１４（ＬＩＧＨＴ；Ｔ細胞増殖及び腫瘍細胞のアポトーシスを誘導する）；ＴＮＦＳＦ１５（アポトーシスの誘導因子）。防御的免疫マーカーには、これらに限定されないが、以下のものが含まれる：ＩＬ１０（Ｔｈ１のダウンレギュレーション因子であるサイトカイン）；ＴＧＦ−ベータ（リンパ球活性化を阻止する）；ＣＤ２５（Ｔ−ｒｅｇの表面マーカー）；ＦｏｘＰ３（Ｔ−ｒｅｇマーカー）；ＣＴＬＡ４（細胞傷害性リンパ球抗原）；ＧＡＲＰ（反復優位型糖タンパク質Ａ（ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ Ａ ｒｅｐｅｔｉｔｉｏｎｓ ｐｒｅｄｏｍｉｎａｎｔ））；ＩＬ１７（Ｔ細胞活性化の推定上の負の制御因子）；ＡＲＧ（アルギナーゼ、ＭＤＳＣのマーカー）；及びＰＤ−１（プログラム死１（ｐｒｏｇｒａｍｍｅｄ ｄｅａｔｈ １）、Ｔ細胞応答の負の制御因子）。
【００４２】
本方法の幾つかの実施形態では、攻撃的又は防御的免疫マーカーの誘導は、血液試料の少分割量を、対照作用剤と三重重複で又は刺激剤と三重重複でのいずれかで混合することにより達成される。その後、攻撃的又は防御的免疫マーカーの誘導が生じるのに十分な期間、混合物を３７℃でインキュベートする。幾つかの実施形態では、インキュベーション時間は、およそ４時間である。ある実施形態では、インキュベーション時間は、４時間を超えていてもよい。幾つかの実施形態では、インキュベーション時間は、およそ２４時間である。ある実施形態では、インキュベーション時間は、４時間未満であってもよい。適切なインキュベーション期間の後、血液試料は全て、詳しく分析するまで−８０℃で保存される。
【００４３】
幾つかの実施形態では、各試料に由来する以前に刺激された小体積の血液を処理して、血液中の１つ又は複数の攻撃的又は防御的免疫マーカーをコードするｍＲＮＡのレベルの測定を可能にする。幾つかの実施形態では、１つ又は複数の攻撃的又は防御的免疫マーカーをコードするｍＲＮＡのレベルは、刺激剤に応答して著しく変化するだろう。これらｍＲＮＡレベルを決定するために、赤血球及び白血球以外の血液成分は、血液試料から除去される。好ましい実施形態では、白血球は、ｍＲＮＡを単離及び増幅するためのデバイスを使用して単離される。このデバイスの実施形態は、米国特許出願第１０／７９６，２９８号、第１１／５２５，５１５号、第１１／３７６，０１８号、第１１／８０３，５９３号、第１１／８０３，５９４号、及び第１１／８０３，６６３号により詳細に記載されており、その各々は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【００４４】
手短に述べると、デバイスについてのある実施形態は、複数の試料送達ウェルを含有する多ウェルプレート、ウェルの真下にある白血球捕捉フィルター、及びフィルターの真下にある、固定されたオリゴ（ｄＴ）を含有するｍＲＮＡ捕捉帯を備える。ある実施形態では、デバイスは、真空圧力が加えられると、血液が、試料送達ウェルから白血球捕捉フィルターを通って吸引され、それにより白血球を捕捉して、非白血球血液成分がフィルターの洗浄により除去されることを可能にするように、ろ過プレートを受容してプレートと箱との密閉を作り出すのに適した真空箱を含有する。他の実施形態では、遠心分離又は陽圧等の、血液試料を試料ウェルから及び白血球捕捉フィルターを通して吸引する他の手段が使用される。デバイスの好ましい実施形態では、白血球は、一緒になって層をなす複数のフィルター膜で捕捉される。幾つかの実施形態では、その後、捕捉された白血球を、溶解緩衝液で溶解し、それにより、ｍＲＮＡが、捕捉された白血球から放出される。その後、
ｍＲＮＡは、オリゴ（ｄＴ）が固定されたｍＲＮＡ捕捉帯にハイブリダイズする。幾つかの実施形態で使用することができる溶解緩衝液の組成物に関する更なる詳細は、米国特許出願第１１／３７６，０１８号に見出すことができ、この文献は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。幾つかの実施形態では、オリゴ（ｄＴ）に固定されたｍＲＮＡからｃＤＮＡが合成される。好ましい実施形態では、その後、ｃＤＮＡは、感染関連マーカーを増幅するために特異的に設計されたプライマーを用いたリアルタイムＰＣＲを使用して増幅される。そのような実施形態で使用されるプライマーは、表１に示されている。幾つかの実施形態で使用されるＰＣＲ反応に関する更なる詳細は、米国特許出願第１１／３７６，０１８号にも見出すことができる。
【００４５】
【表１】
【００４６】
ＰＣＲ反応の完了後、１つ又は複数の攻撃的又は防御的免疫マーカーのｍＲＮＡ（検出されたＰＣＲ増幅ｃＤＮＡの量により表される）が定量化される。ある実施形態では、定量化は、攻撃的又は防御的免疫マーカーをコードするｍＲＮＡの量を基準値と比較することにより計算される。他の実施形態では、基準値は、刺激剤により誘導されない遺伝子、例えばハウスキーピング遺伝子の発現レベルである。あるそのような実施形態では、ベータアクチンを基準値として使用する。当技術分野で周知の多数の他のハウスキーピング遺伝子を基準値として使用することもできる。他の実施形態では、ハウスキーピング遺伝子を修正係数として使用し、従って最終的な比較は、非誘導（対照）試料に由来する同じマーカーと比較した、攻撃的又は防御的免疫マーカーの誘導された発現レベルである。更に他の実施形態では、基準値はゼロであり、従って攻撃的又は防御的免疫マーカーの定量化は、絶対値により表される。幾つかの実施形態では、１つ又は複数の攻撃的免疫マーカーの発現を、１つ又は複数の防御的免疫マーカーと比較した比率が計算される。
【００４７】
他の幾つかの実施形態では、攻撃的又は防御的免疫マーカー発現は、薬物（推定上の抗癌薬又は免疫抑制薬のいずれか）の存在下で、刺激剤の存在下及び非存在下の両方で測定される。そのような実施形態では、発現プロファイルを使用して、効果的な抗癌薬又は効果的な免疫抑制薬としての薬物化合物の効力を予測することができる。幾つかの実施形態では、薬物化合物は、攻撃的免疫マーカーの発現を誘導するが、防御的マーカーの発現は誘導しない可能性があり、その場合は、全体として攻撃的免疫系が促進され、従ってその薬物化合物は、推定上の抗癌治療薬となるだろう。同様に、他の実施形態では、薬物は、１つ又は複数の防御的免疫マーカーを阻害する場合があり、その場合、全体として攻撃的免疫系が促進され、従ってその薬物化合物は、推定上の抗癌治療薬となるだろう。幾つかのそのような実施形態では、防御的免疫マーカーを阻止し、従って防御的免疫成分を低減する薬物は、攻撃的免疫系を刺激することが知られている治療剤（ＩＬ−２等）と共に同時投与し、それにより、攻撃的免疫応答の増強及び腫瘍細胞消失可能性の増加を提供することができる。
【００４８】
対照的に、幾つかの実施形態では、薬物化合物は、防御的免疫マーカーの発現を誘導するが、攻撃的マーカーの発現を誘導しない場合があり、その場合は、全体として防御的免疫系が促進され、従って、その薬物化合物は、推定上の免疫抑制剤となるだろう。同様に、他の実施形態では、薬物は、１つ又は複数の攻撃的免疫マーカーを阻害する場合あり、その場合、全体として防御的免疫系が促進され、従ってその薬物化合物は、推定上の免疫抑制剤となるだろう。
【００４９】
更に他の実施形態では、薬物化合物は、攻撃的又は防御的マーカーのいずれも誘導しなくてもよく、又は両方を誘導してもよい。そのような実施形態では、更なる用量反応試験を実施して、特定の用量又は暴露時間により、薬物が、推定上の抗癌薬又は推定上の免疫抑制剤として分類されるかどうかを決定する。
【実施例】
【００５０】
特定の実施形態が、以下の例を参照して記述されているが、それらは、限定的であることを意図しておらず、むしろ例示的であるとみなされるべきである。
【００５１】
実施例１− 全血試料中の攻撃的及び防御的免疫マーカーの特徴付け
全血試料を健康なヒト成人から収集した。血液試料を、収集して誘導経時的試験用に幾つかの個々のチューブに入れる際に、ヘパリン処理した。その後、各チューブに由来する１８個の等体積分割量を、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）、１００ｎｇ／ｍＬのｒＩＬ−２、又はフィトヘマグルチニン（ＰＨＡ）のいずれかで刺激した。分割量を、３７℃で０、１、２、４、８、又は２０時間インキュベートした。インキュベーション後、試料は、分析するまで−８０℃で保存した。各試料を、三重重複で刺激及び分析した。ベータアクチン、ＩＬ−２、ａ型ＩＬ−２受容体（ＣＤ２５）、及びｂ型ＩＬ−２受容体（ＣＤ１２２）をコードするｍＲＮＡを、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、Ｍｉｔｓｕｈａｓｈｉ Ｍら、Ｃｌｉｎ Ｃｈｅｍ ５２巻：６３４〜６４２頁（２００６年）に記載の方法により測定した。
【００５２】
手短に言えば、９６ウェルろ過プレートを白血球除去膜（Ｌｅｕｋｏｓｏｒｂ；Ｐａｌｌ社製）を用いて構築し、オリゴ（ｄＴ）固定化収集プレートの上に設置した。１５０μＬの５ｍｍｏｌ／Ｌ Ｔｒｉｓ（ｐＨ７．４）を適用して、フィルター膜を湿らせた。１２０ｇで１分間４℃で遠心分離して、Ｔｒｉｓ溶液を膜から除去した後、５０μＬの刺激された全血試料を、各ウェルに適用し、直ちに１２０ｇで２分間４℃で遠心分離した。その後ウェルを、３００μＬのリン酸緩衝生理食塩水で１回洗浄した。２０００ｇで５分間４℃で遠心分離して、生理食塩水を除去した後、１０ｍＬ／Ｌ ２−メルカプトエタノー
ル（Ｂｉｏ−Ｒａｄ社製）、０．５ｇ／Ｌ プロテイナーゼＫ（Ｐｉｅｒｃｅ社製）、０．１ｇ／Ｌ サケ精子ＤＮＡ（５ Ｐｒｉｍｅ Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ／Ｂｒｉｎｋｍａｎ社製）、０．１ｇ／Ｌ大腸菌ｔＲＮＡ（Ｓｉｇｍａ社製）、各５ｎｍｏｌ／Ｌの特異的逆方向プライマー、及び１０10分子／Ｌの合成ＲＮＡ３４（外部対照として）で補完された、６０μＬの溶解緩衝液原液［５ｇ／Ｌ Ｎ−ラウロイルザルコシン、４×標準クエン酸生理食塩水、１０ｍｍｏｌ／Ｌ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．４）、１ｍｍｏｌ／Ｌ ＥＤＴＡ、１ｍＬ／Ｌ ＩＧＥＰＡＬ ＣＡ−６３０（ＮＰ−４０の代替品）、１．７９ｍｏｌ／Ｌ チオシアン酸グアニジン（全てＳｉｇｍａ社製）］をろ過プレートの各ウェルに添加した。その後、プレートを３７℃で１０分間インキュベートし、オリゴ（ｄＴ）固定化収集マイクロプレート（ＧｅｎｅＰｌａｔｅ；ＲＮＡｔｕｒｅ社製）の上に設置し、２０００ｇで５分間４℃で遠心分離した。４℃で一晩保存した後、マイクロプレートを、１００μＬの単純溶解緩衝液で３回洗浄し、その後１５０μＬの洗浄緩衝液［０．５ｍｏｌ／Ｌ ＮａＣｌ、１０ｍｍｏｌ／Ｌ Ｔｒｉｓ（ｐＨ７．４）、１ｍｍｏｌ／Ｌ ＥＤＴＡ］で４℃にて３回洗浄した。
【００５３】
１×逆転写緩衝液［５０ｍＭ ＫＣｌ、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．３）、５．５ｍＭ ＭｇＣｌ2、１ｎＬ／μＬ Ｔｗｅｅｎ ２０］、各１．２５ｍＭのデオキ
シヌクレオシド三リン酸、４ユニットのｒＲＮａｓｉｎ、及び８０ＵのＭＭＬＶ逆転写酵素（Ｐｒｏｍｅｇａ社製；プライマーなし）を含有する３０μＬの緩衝液を添加し、３７℃で２時間インキュベーションすることにより、ｃＤＮＡを各ウェルにて直接合成した。各３０μＬ反応物から、４μＬのｃＤＮＡを、３８４ウェルＰＣＲプレートに直接移し、５μＬのＴａｑＭａｎユニバーサルマスター混合物（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）、及び１μＬの各５μΜ感染関連マーカー又はベータアクチン用順方向及び逆方向プライマー（表１を参照）を添加した。使用したプライマー配列は、上記の表１に示されている。また、ＡＣＴＢ（β−アクチン）用のプライマー配列は、以前に発表されており（Ｍｉｔｓｕｈａｓｈｉ Ｍら、Ｐｈａｒｍ Ｒｅｓ．２５巻：１１１６〜１１２４頁、２００８年）、この文献は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。ＰＣＲは、ＰＲＩＳＭ７９００ＨＴ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）を用いて、９５℃で１０分間を１サイクル、その後９５℃で３０秒間、５５℃で３０秒間、及び６０℃で１分間を４５サイクルさせて実施した。各遺伝子を別々のウェルで増幅した。サイクル閾値（Ｃｔ）、すなわち、ある量のＰＣＲ産物（蛍光に基づく）が生成されたサイクルを、分析ソフトウェア（ＳＤＳ；Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社）を用いて決定した。各ｍＲＮＡのＣｔを、ＡＣＴＢのＣｔで減算してΔＣｔを計算し、％ＡＣＴＢを、２-ΔCt×１００により計算した。
【００５４】
図１Ａに示されているように、全血の刺激は、使用した刺激剤に関わらず、ベータアクチン発現を誘導しない。ＩＬ−２は自己誘導性ではないが、ＰＨＡ、炎症及び免疫応答の既知刺激因子は、ＩＬ−２の発現をロバストに増加させたため、図１Ｂは、刺激アッセイの陽性対照としての役目を果たす。図１Ｃは、防御的免疫マーカーＣＤ２５の誘導が、ｒＩＬ−２又はＰＨＡ（ＩＬ−２の誘導因子）のいずれかによる刺激後に生じることを実証している。これは、ＩＬ−２刺激が、免疫系の攻撃的及び防御的態様の両方に対して示すカスケード効果も実証している。
【００５５】
全血試料の追加分割量を、用量反応試験に使用した。７つの分割量を、１００ｎｇ／ｍＬのｒＩＬ−２で４時間刺激した。インキュベーション後、試料を、分析するまで−８０℃で保存した。各試料を三重重複で刺激して分析した。ベータアクチン、ＩＬ−２、ａ型ＩＬ−２受容体（ＣＤ２５）、ｂ型ＩＬ−２受容体イントロン配列（ＣＤ１２２）、ｂ型ＩＬ−２受容体エクソン配列（ＣＤ１２２）、グランザイムＢ、ＴＮＦ−アルファ、及びインターフェロン−ガンマをコードするｍＲＮＡを、上述の方法に従って測定した。
【００５６】
図２に示されているように、攻撃的及び防御的マーカーは、所与の濃度の刺激剤に対して応答が異なる場合がある。図１に示されている攻撃的マーカーの誘導に対する効果及び時間的経過に基づき、一群の刺激実験用に選択した条件は、１００ｎｇ／ｍＬのｒＩＬ−２による４時間の刺激だった。他の実施形態では、より高いか又はより低い濃度の刺激剤を使用してもよいことが理解されるだろう。同様に、より長いか又はより短い刺激時間、例えば、１〜２時間、２〜４時間、４〜６時間、６〜８時間、８〜１０時間、１０〜１２時間、１２〜１８時間、１８〜２４時間、及びそれらの重複範囲を使用してもよい。
【００５７】
ｒＩＬ−２又はザイモサンによる全血の刺激に応答した、一群の攻撃的又は防御的マーカーの発現の誘導を試験した。ｒＩＬ−２を１００ｎｇ／ｍｌで使用し、ザイモサンを１．５ｍｇ／ｍＬで使用して、基本的に上述のように試料を調製して刺激し、刺激は、３７℃で４時間であった。
【００５８】
表２に示されているように、ｒＩＬ−２による刺激は、この群の試験した攻撃的マーカー全ての増加を、統計的に有意に（Ｐ＜０．０５）誘導した。ＴＮＦα、ＣＤ１６、及びグランザイムＢは、対照試料よりおよそ４〜８倍多く誘導され、ＩＦＮγは、対照試料より２６０倍多く誘導された。またｒＩＬ−２は、幾つかの防御的マーカー、即ちＦｏｘＰ３、ＣＤ２５、ＩＬ１７の増加を統計的に有意に誘導した。ザイモサンは、アルギナーゼの増加を統計的に有意に誘導した。これらの結果は、本明細書で開示されている本発明のある実施形態の方法が、意外にも、単離された白血球調製物が必要であるという当技術分野の提案及び定説とは対照的に、免疫機能の攻撃的及び防御的マーカーの両方の発現増加の検出を可能にすることを実証している。これらのデータは、幾つかの実施形態で使用した刺激条件が、アッセイの検出閾値（バックグラウンドノイズ）を十分に超えて種々の攻撃的及び防御的マーカーの発現を誘導し、個体の攻撃的及び防御的免疫応答を特徴付けるための、迅速で単純な信頼性の高い方法を提供することを示す。
【００５９】
【表２】
【００６０】
実施例２− 薬物スクリーニング法としての攻撃的及び防御的免疫マーカーの誘導
本発明の幾つかの実施形態は、攻撃的又は防御的免疫マーカーの発現を誘導する化合物の能力に基づき、薬物化合物候補をスクリーニングするのに使用される。幾つかの実施形態では、そのような薬物スクリーニングアッセイは、抗癌臨床状況において、ＩＬ−２と共に同時投与することができる化合物を特定する効率を増加させるだろう。そのような化合物は、理想的には防御的免疫マーカーの発現増加を阻止する。従って、ＩＬ−２刺激は、推定上の癌細胞に対する攻撃的免疫応答を誘導し、候補化合物は、ＩＬ−２誘導性の負のフィードバック防御免疫応答を阻止し、それにより、攻撃的応答の自己誘導性ダウンレギュレーションを制限するだろう。このように、攻撃的免疫応答は、防御的免疫応答の欠如（又は低減）により効果的に強化される。
【００６１】
同様に、幾つかの実施形態は、潜在的な免疫抑制化合物についてスクリーニングするのに使用される。潜在的な有効化合物は、攻撃的免疫マーカーの誘導を阻害し、防御的免疫マーカーに効果を及ぼさず（又は増加させず）、それにより、攻撃的システムの活性よりも防御的免疫系の活性を促進する化合物である。そのような応答は、内因性免疫応答の抑制を可能にし、潜在的に、臓器移植患者又は自己免疫疾患に苦しむ患者に利益を提供するだろう。
【００６２】
ある化合物は、攻撃的又は防御的免疫機能を抑制（又は刺激）する効力を示す可能性が高い場合があるが、潜在的な効力は、試験した単一用量で示すことはできないことが認識されるべきである。従って、幾つかの実施形態では、用量反応試験も実施して、第１の用量で限定的な効力を有する潜在的な化合物が、第１の用量より高くともよく又は低くてもよい異なる用量で、効力（攻撃的又は防御的刺激因子としての）を増強するかどうか決定する。
【００６３】
潜在的な化合物をスクリーニングするために、ヘパリン処理した全血を、種々の潜在的免疫阻害化合物（終濃度は全て１０ｍＭ）又は対照溶媒（ＤＭＳＯ）と共に、各処理につき単一のチューブ中で１時間プレインキュベートし、その後ＰＢＳ又はｒＩＬ−２（終濃度は１００ｎｇ／ｍｌ）を用いて、更に４時間三重重複で刺激した。その後ｍＲＮＡを上述のように定量化した。試験した潜在的な免疫阻害剤化合物は、表３に示されている。
【００６４】
【表３】
【００６５】
ベータアクチン発現は、発現アッセイの対照としての役目を果たした。特徴付けられた攻撃的免疫マーカーには、腫瘍壊死因子スーパーファミリー（ＴＮＦＳＦ）１（リンホトキシン）、２（ＴＮＦα）、５（ＣＤ４０Ｌ）、６（ＦａｓＬ）、８（ＣＤ３０Ｌ）、９（ＣＤ１３７Ｌ）、１４（ＬＩＧＨＴ）、及び１５（ＴＬ１Ａ）が含まれていた。特徴付けられたケモカインには、ＣＣＬ２、ＣＣＬ３、ＣＣＬ４、ＣＣＬ８、ＣＣＬ１１、ＣＣＬ２０、ＣＸＣＬ１、ＣＸＣＬ２、ＣＸＣＬ３、ＣＸＣＬ１０が含まれていた。特徴付けられたインターロイキンには、ＩＬ６、ＩＬ８、ＩＬ１０、ＩＬ１７、及びＩＬ２３が含まれていた。特徴付けられた免疫エフェクターには、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＮＦγ、ＣＤ１６、グランザイムＢ、ＣＤ１２２、及びＴＧＦＢ−１が含まれていた。特徴付けられた防御的免疫機能のマーカーには、ＦｏｘＰ３、ＣＴＬＡ４、ＣＤ２５、及びＧＡＲＰ−１が含まれていた。他の攻撃的又は防御的免疫マーカー、並びに他のケモカイン、インターロイキン、又はエフェクター（他の免疫関連マーカーの中でも）は、ある実施形態で試験することができる。
【００６６】
ｒＩｌ−２刺激後の攻撃的及び防御的免疫マーカーのｍＲＮＡ発現データは、表４に示されている。網掛け部分は、増加倍率が２を超えており、並びに統計的ｐ値が０．０５未満であることを表す。選択された免疫機能の攻撃的及び防御的マーカーの発現プロファイル、及びＰＢＳ（白抜き円）又は１００ｎｇ／ｍＬのｒＩＬ−２（黒抜き円）による刺激に対するそれらのｍＲＮＡ発現応答は、図３Ａ〜３Ｊに示されている。全血試料を前処理するために使用された種々の阻害剤化合物は、ｘ軸に列挙されている。このデータから明らかなように、ある攻撃的又は防御的免疫マーカーが阻害剤の存在下で誘導されることは、その化合物が、攻撃的又は防御的免疫のいずれかを促進する可能性があることを示唆する。例えば、図３Ａに示されているように、血液試料をＰＢＳで刺激し、ＴＮＦＳＦ−１
の誘導を測定することでは、著しい発現変化（白抜き円）はもたらされなかった。しかしながら、刺激因子としてのｒＩＬ−２の存在下では、ヤヌスキナーゼ（Ｊａｋ）の阻害剤で処理した試料を除いて、ほとんどの血液試料が、ＴＮＦＳＦ１ ｍＲＮＡ（攻撃的免疫マーカー）の誘導を示す。この試料は、ｒＩＬ−２に応答したＴＮＦＳＦ１の誘導を示さなかった。従って、この化合物は、攻撃的免疫応答を阻止又は低減する可能性を有し、免疫抑制促進化合物として機能する可能性がある。しかしながら、防御的免疫応答の２つのマーカー、ＣＤ２５又はＦｏｘＰ３（それぞれ、図３Ｉ及び３Ｊ）に対する同じ化合物の効果を評価すると、データは、ｒＩＬ−２がこれら防御的マーカーの誘導を阻止することを示す。従って、この一組の実験からは、この特定のＪａｋ阻害剤が、攻撃的又は防御的免疫応答の促進によく適するかどうかは不明確である。この化合物の効力を解明するには、更なる用量反応試験及び／又は追加的な免疫マーカーを用いた試験が必要である。
【００６７】
【表４】
【００６８】
図４Ａ〜４Ｊは、種々の阻害剤化合物の存在下又は非存在下でＰＢＳ又はｒＩＬ−２刺激に応答したＩＦＮγ（図４Ａ〜４Ｂ）、ＴＮＦＳＦ１（図４Ｃ〜４Ｄ）、ＣＤ１６（図
４Ｅ〜４Ｆ）、ＣＤ２５（図４Ｇ〜４Ｈ）、又はＦｏｘＰ３（図４Ｉ〜４Ｊ）の誘導を測定した追加的な実験を示す。これらのデータは、攻撃的マーカーＩＦＮγ及びＴＮＦＳＦ−１の誘導の欠如、及びＦｏｘＰ３、防御関連マーカーの発現誘導により示されるように、Ｊａｋ１が、攻撃的免疫マーカー（つまり、防御促進性）の特異的阻害剤であることを示す。化合物Ｅ０８４も、攻撃的マーカーＩＦＮγ及びＴＮＦＳＦ−１の特異的阻害を実証した。しかしながら、Ｅ０８４は、ＣＤ２５及びＦｏｘＰ３を両方とも誘導し、Ｅ０８４が、防御的免疫応答のより強力な促進因子であり得ることを示唆した。また、本明細書に記載の方法の実施形態は、単一アッセイで、一群の推定上の誘導体化合物と比較したデータを同時に生成することができるという点で、種々の誘導体又は修飾化合物の特徴付けによく適する。更に、上述のデータの明確に異なる特徴に基づき、本明細書に記載の方法の実施形態は、臨床状況で使用される防御特異的（つまり、攻撃促進性）阻害剤化合物の検出に有用である。従って、このアッセイプラットフォームは、攻撃的及び防御的免疫機能の共通の選択的阻害剤の分析／スクリーニングに有用である。
【００６９】
実施例３− テーラーメイド療法を特定するための、攻撃的及び防御的免疫マーカーｍＲＮＡ誘導の使用
末梢血中で循環する成熟白血球は、一般的に定常状態にあり、それらは、炎症、新生物、異物（微生物、移植組織及び装置、薬物、並びにワクチン）の局所病変に移動すると、特異的な様式で完全に活性化される。活性化の特異性は、他の要因の中でも、リクルートされた白血球のタイプ及び局所的刺激因子のタイプに依存する。ｉｎ ｖｉｖｏ白血球応答をｉｎ ｖｉｔｒｏ系でシミュレートするために、この実施例では、未処理の全血を、種々の特異的で一般的な刺激因子に暴露し、白血球応答の多様性を定量化した。種々の白血球応答を、特定のタイプの免疫応答（例えば、体液性免疫、細胞性免疫等）とのそれらの関連性に基づき分類した。
【００７０】
ほとんどのｉｎ ｖｉｔｒｏアッセイでは、白血球を単離し、特定の刺激と共に又は刺激なしで、ある期間（例えば、数日から数週間）培養して、白血球の機能的変化（例えば、タンパク質合成及び分泌、アポトーシス、細胞増殖、表面マーカー変化等）を特定する。しかしながら、そのようなアッセイは複雑であり、費用がかかり、時間がかかるため、日常的な診断検査としての適用可能性は著しく制限を受ける。細胞単離及び培養条件に伴う技術的な困難を克服することを試みた幾つかのプロトコール、例えば、全血を使用して特定の刺激と共に短期間インキュベートとし（典型的には一晩）、その後アデノシン−５’−三リン酸（ＡＴＰ）レベルを定量化するか、又は酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）により種々のサイトカインのレベルを測定すること等が開発された。しかしながら、幅広く多様な白血球機能はＡＴＰ依存性でないため、ＡＴＰレベルを知る有用性は限定されている。更に、典型的なＥＬＩＳＡの検出限界は、ピコモルからフェムトモル（１０11〜１０15個の分子）であり、従って、そのようなプロトコールの感度には制限がある。
【００７１】
対照的に、本明細書で開示された幾つかの実施形態による方法では、白血球機能関連ｍＲＮＡのｅｘ ｖｉｖｏ誘導が測定される。ポリメラーゼ連鎖反応は、単一分子検出までの感度が可能であり、ｍＲＮＡ誘導は、タンパク質合成、及び対応する生物学的変化（ＥＬＩＳＡにより測定されることになるような）より遥かに早期に起るため、ｍＲＮＡレベルの測定は有利である。本明細書で考察されているように、全血を使用することにより、ｉｎ ｖｉｖｏの複雑な細胞間コミュニケーション、並びに白血球と血漿因子及びタンパク質との相互作用が維持される。全血のｍＲＮＡ分析プロトコールは存在しているが、そのような方法は，血液採取時の遺伝子発現のある時点での状況を提供するに過ぎない。対照的に、本明細書で開示された実施形態では、適切な刺激後のｍＲＮＡレベルの変動が分析され、それにより、刺激に対する白血球応答と関連する動的な一連のデータ要素が提供される。
【００７２】
ＰＣＲは、標的遺伝子の単一コピーを検出するのに十分なほど感度が高いが、全血の三重重複分割量中のばらつきの低減に基づき、本明細書で開示された幾つかの実施形態は、特に感度が高い。標準的アッセイでは、ばらつきは、白血球単離、ＲＮＡ精製、ｃＤＮＡ合成からＰＣＲに至るまでの任意のステップで引き起こされ得る。ＰＣＲは増幅に基づく性質を持つため、ＰＣＲ前に導入された微細なばらつきでさえ指数関数的に増加されることになる。更に、単一血液試料からでさえ、刺激因子の数、用量反応性、時間的経過、刺激因子の組合せ、二重重複、又は三重重複等に基づいて多数の分割量が生成される。当技術分野で公知の標準的プロトコールのそのような制限に基づき、本出願人は、ハイスループットアッセイプラットフォームを開発し、それは、本明細書で開示された幾つかの実施形態で使用されている。アッセイプラットフォームに関する更なる情報は、米国特許出願第１０／７９６，２９８号、第１１／５２５，５１５号、第１１／３７６，０１８号、第１１／８０３，５９３号、第１１／８０３，５９４号、及び第１１／８０３，６６３号に見出すことができ、その各々は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【００７３】
材料及び方法
材料
抗Ｔ細胞受容体α／β鎖（ＴＣＲ）モノクローナル抗体（ＩｇＧ１κ）及び対照マウスＩｇＧ１κは、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ社（サンディエゴ、カリフォルニア州、米国）から得た。逆転写酵素、ｄＮＴＰ、及びＲＮａｓｉｎは、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社（カールズバッド、カリフォルニア州、米国）から購入した。他の化学薬品は全て、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社（セントルイス、ミズーリ州、米国）から購入した。免疫複合体（熱凝集ＩｇＧ、ＨＡＧ）は、以前に記述されているように、ヒトＩｇＧを６３℃で１５分間加熱することにより調製した（Ｏｓｔｒｅｉｋｏら、１９８７年）。８ウェルストリップマイクロチューブにて、各１．２μＬのフィトヘマグルチニン−Ｌ（２ｍｇ／ｍｌ）、ＨＡＧ（１０ｍｇ／ｍｌ）、リポ多糖（ＬＰＳ）（０．５ｍｇ／ｍｌ）、ザイモサンＡ（７５ｍｇ／ｍｌ）、組換えインターロイキン２（ｒＩＬ２）（５μｇ／ｍｌ）、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）、抗ＴＣＲ抗体（５０μｇ／ｍｌ）、及び対照ＩｇＧ（５０μｇ／ｍｌ）を、８個のウェルにそれぞれ添加し、使用まで−８０℃で保存した。
【００７４】
血液処理
ヘパリン処理した全血試料は、施設内審査委員会の承認後、Ａｐｅｘ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ（タスティン、カリフォルニア州、米国）から得た。血液収集後の条件を等しくするために、血液試料を、４℃で一晩保存した。翌朝、血液を貯溜容器にデカントし、８ウェルマルチチャネルピペットを使用して、各６０μＬの血液を、上述の対照作用剤又は刺激因子を含有する３つのストリップに分注した（図５Ａ）。この試験に必要な血液量は、１．４４ｍｌ（６０μＬ／ウェル×８つのウェル×３つのストリップ（三重重複））だった。蓋を閉じた後、ストリップを、３７℃で４時間インキュベートし、その後−８０℃で冷凍保存した。幾つかの実施形態では、より大きな体積の又はより小さな体積の血液を使用してもよいことが理解されるだろう（例えば、多数の刺激因子又は白血球活性化関連遺伝子を試験するために増加させてもよい）。２つの分類の患者、この例では、正常な健康（対照）対象体（表５のデータ）及び癌を有する患者（表６のデータ）で試験した。
【００７５】
標的ｍＲＮＡ
標的ｍＲＮＡのｍＲＮＡ配列は、ＧｅｎＢａｎｋから検索した。ＰＣＲプライマーは、Ｐｒｉｍｅｒ Ｅｘｐｒｅｓｓ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（ＡＢＩ）社製、フォスターシティ、カリフォルニア州、米国）により、コード領域内に設計した（表１を参照）。オリゴヌクレオチドは、ＩＤＴ社（コーラルビル、アイオワ州、米国）が合成した。標的ｍＲＮＡ（合計３２個）は、β−アクチン（ＡＣＴＢ）、β２−ミクログロブリン（Ｂ２Ｍ）、グランザイムＢ（ＧＺＢ）、パーフォリン１（ＰＲＦ１）、腫瘍壊死因
子スーパーファミリー（ＴＮＦＳＦ）−１、２、５、１４、及び１５、ＣＣＬケモカイン−２、４、８、及び２０、ＣＸＣＬケモカイン−３及び１０、インターロイキン（ＩＬ）−２、４、６、８、１０、及び１７Ａ、インターフェロン−γ（ＩＦＮＧ）、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭＣＳＦ）、ＣＤ１１ａ、１６、及び２５、トランスフォーミング成長因子ベータ１（ＴＧＦＢ１）、フォークヘッドボックスＰ３（ＦＯＸＰ３）、免疫グロブリン重鎖遺伝子座（ＩＧＨ＠）、アルギナーゼ（ＡＲＧ）、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）、並びにプロオピオメラノコルチン（ＰＯＭＣ）だった。
【００７６】
ｍＲＮＡ分析
５０マイクロリットルの刺激及び冷凍された全血を解凍し、９６ウェル特注ろ過プレートに適用した（図５Ｂ）。フィルター膜で遠心分離することにより、白血球を単離した。幾つかの実施形態では、フィルター膜で白血球を単離するために、他の技術を使用してもよい（例えば、真空、陽圧、及び重力等）。白血球の単離に関する更なる情報は、米国特許出願第１０／７９６，２９８号、第１１／５２５，５１５号、第１１／３７６，０１８号、第１１／８０３，５９３号、第１１／８０３，５９４号、及び第１１／８０３，６６３号に見出すことができ、その各々は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。特異的逆方向プライマーの混合液を含有する６０μＬの溶解緩衝液をろ過プレートに適用し、その結果生じた細胞溶解産物を、ポリ（Ａ）＋ｍＲＮＡ精製用のオリゴ（ｄＴ）固定化マイクロプレートに移した（図５Ｃ）。ｃＤＮＡを、各ウェルの５０μＬ溶液中で直接合成した：液相では特異的プライマーによるｃＤＮＡのプライミング、及び固相ではオリゴ（ｄＴ）によるｃＤＮＡのプライミング。液相又は固相のｃＤＮＡは、ｉＴａｑＳＹＢＲ（Ｂｉｏｒａｄ社製、ハーキュリーズ、カリフォルニア州、米国）を使用して、サーマルサイクラー（それぞれ、ＰＲＩＳＭ７９００、ＡＢＩ社製、及びｉＣｙｃｌｅｒ、Ｂｉｏｒａｄ社製）で、リアルタイムＰＣＲに使用した。ＰＣＲ条件は、９５℃で１０分間、その後６５℃で１分間及び９５℃で３０秒間の５０サイクルだった。ＩＬ２及びＩＬ４の場合、４μＬの未希釈ｃＤＮＡ溶液を、３８４ウェルＰＣＲプレートにて１０μＬの最終体積で使用した。（図５Ｄ）。ＦＯＸＰ３、ＡＲＧ、ＩＦＮＧ、ＧＭＣＳＦ、及びＰＯＭＣの場合、２μＬの未希釈ｃＤＮＡ溶液を、５μＬの最終体積でＰＣＲに使用した。その後、ｃＤＮＡを、３２μＬのＤＮａｓｅ／ＲＮａｓｅフリー水を添加することにより１：２に希釈し、各２μＬのｃＤＮＡを、５μＬの最終体積で、残り２４個の遺伝子（ＩＬ１７Ａ以外）のＰＣＲに使用した。残ったｃＤＮＡを新しいストリップマイクロチューブに移した後、固相ｃＤＮＡを直接使用して、３０μＬのＰＣＲ溶液を添加することによりＩＬ１７Ａを増幅した。融解曲線を常に分析して、ＰＣＲシグナルが単一ＰＣＲ産物に由来したことを確認した。サイクル閾値（Ｃｔ）を、分析ソフトウェア（ＳＤＳ、ＡＢＩ社製）で決定し、統計的ｐ値は、刺激因子及び対照の各々の３つのＣｔ値を使用したｔ検定により計算した。薬物処理した三重重複試料のＣｔから、対照試料の平均Ｃｔ値を個々に減算してΔＣｔを計算し、増加倍率を２＾（−ΔＣｔ）として計算した。
【００７７】
結果及び考察
この例では、６つの異なる刺激因子を（２つの対照と共に）使用した（表５及び６、ｘ軸）。ＰＨＡは、一般的なＴ細胞集団を刺激するために一般的に使用されるレクチンである。ＨＡＧは、ＩｇＧ Ｆｃ受容体（ＦｃγＲ）陽性白血球を刺激する免疫複合体のモデルである。主な細胞性標的が、ＣＤ１６＋ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞である抗体依存性細胞媒介性細胞障害（ＡＤＣＣ）とは異なり、ＨＡＧによる刺激は、ＣＤ１６＋、ＣＤ３２＋、及びＣＤ６４＋細胞を標的とする。ＬＰＳ及びザイモサンは、先天性免疫を分析するためのトール様受容体（ＴＬＲ）を刺激するために一般的に使用される作用剤である。抗ＴＣＲ抗体は、ＣＤ４＋及びＣＤ８＋Ｔ細胞の両方のＴ細胞受容体（α／β鎖）の抗原認識分子に結合するため、普遍的なＴＣＲ抗原として使用される（Ｍｉｔｓｕｈａｓｈｉら、２００８年ｃ）。組換えＩＬ−２は、制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）を含むＩＬ２受容体陽性Ｔ細胞に結合し、多種多様な免疫反応を誘導する。
【００７８】
免疫は、非常に複雑であり、多数の細胞性及び液性因子が互いに相互作用するが、本明細書で開示された幾つかの実施形態のように、有効な個別化された療法を予測するためには、そのような複雑さは、表５及び６に示されている幾つかの機能別分類に単純化することができる。
【００７９】
一般的に、白血球が血中から局所病変に移動するためには、白血球は、まず細胞表面にＣＤ１１ａを発現させ、それが、病変により損傷を受けた内皮細胞上に発現された細胞間接着分子と結合する。表５及び６に示されているように、ＣＤ１１ａ発現増加の検出は、ザイモサンによる全血試料の刺激により検出された。ＣＤ１１ａを発現する白血球が、標的細胞又は分子（例えば、病変の細胞又は分子）と遭遇すると、適切なサブセットの白血球が、病変にリクルートされなければならない。様々な走化性ＣＣＬ及びＣＸＣＬケモカインの発現を分析した。ＣＣＬ２（単球及び好塩基球）、ＣＣＬ４（顆粒球）、ＣＣＬ８（マスト細胞、好酸球、好塩基球、単球、Ｔ細胞、及びＮＫ細胞）、ＣＣＬ２０（リンパ球）、ＣＸＣＬ３（単球）、ＣＸＣＬ８（＝ＩＬ８）（好中球）、及びＣＸＣＬ１０（単球、マクロファージ、Ｔ細胞、ＮＫ細胞、及び樹状細胞）は、それぞれ列挙された細胞タイプの化学誘引物質として知られている。表５及び６に示されているように、各刺激因子は、異なるサブセットのケモカインを誘導したが、それは、個体の走化性及びケモカイン発現プロファイルに基づいて、特定の細胞タイプを利用する（例えば、リクルートする）ための可能な方法を示している。幾つかの実施形態では、個体の走化性及びケモカイン発現プロファイルは、疾患部位で細胞浸潤を発生させる（例えば、適切な免疫細胞を標的部位に送達する）その個体の能力を予測できるようにするデータを提供する。幾つかの実施形態では、そのようなデータは、テーラーメイド治療の効力及び開発の予測に有用である。例えば、癌患者の全血の刺激が、任意の走化性分子又はケモカイン分子の発現を誘導できない場合、その個体は、白血球リクルーター機能が不十分であり得、従って、免疫の基づく治療（例えば、癌免疫療法）の理想的な候補ではないだろう。むしろ、その個体は、より従来的な放射線手法、薬理学的手法、又は外科的手法に対してより良好に応答する可能性が高い。
【００８０】
病変部位にリクルートされると、局所的に浸潤した白血球は、標的細胞を死滅させることを目的とした事象のカスケードも誘導する。アポトーシスの誘導を含む、標的細胞を死滅させるための複数の機序が使用されうる。表５及び６に示されているように、種々の刺激因子によるグランザイム及びパーフォリンｍＲＮＡの誘導（周知のアポトーシス誘導因子）が特定された。ＣＤ１６、ＮＫ細胞の特異的マーカーの発現増加も特定された。腫瘍壊死因子（リガンド）スーパーファミリー（ＴＮＦＳＦ）は、ＴＮＦＳＦ受容体陽性の標的細胞に対するアポトーシスの様々な誘導因子を含む。表５及び６に示されているように、各刺激因子は、異なるメンバーのＴＮＦＳＦを誘導した。従って、幾つかの実施形態では、個体の攻撃的免疫機能に関するデータを使用して、その患者が先天的な抗癌活性を発生させる可能性を特徴付けることができる。また、幾つかの実施形態では、自己免疫疾患の重症度を特徴付けることができる。有利なことには、本明細書で示された方法は、療法を施す前に、患者が特定のタイプの療法に応答する可能性を特徴付けることを可能にする。これは、患者の生存が、できるだけ早期に有効な療法を開始することに依存する状況で、特に有利である。そのため、癌患者が「キラー」分子の発現の誘導をほとんど示さないという事実は、そのような患者が、そのような療法から利益を得る可能性は低いだろうということを示唆し、他の非免疫療法が検討されるべきであることを示唆する。
【００８１】
上記で考察されているように、ヒト免疫は、様々な負の制御因子（本明細書では「防御的免疫マーカー」とも呼ばれる）を有しており、それらには、体液性成分（ＩＬ１０及びＴＧＦＢ１）、及び細胞性成分（Ｔｒｅｇ及び骨髄由来サプレッサー細胞（ＭＤＳＣ））が含まれる。これら制御因子は、誘導時に攻撃的（例えば、キラー）免疫応答の効力を抑
制又は低減する能力を有する。対照的に、それらの発現の低減は、自己免疫疾患の発生を促進する場合がある。従って、負の制御因子の発現及びリクルーター／キラー分子のバランスは、幾つかの実施形態では、所与のタイプの療法の潜在的効力を更に評価するため使用される。表５に示されているように、ＩＬ１０ ｍＲＮＡは、抗ＴＣＲ抗体及びザイモサンにより誘導され、ＴＧＦＢ１ ｍＲＮＡは、ザイモサンにより誘導された。ＦＯＸＰ３及びＣＤ２５ ｍＲＮＡを、Ｔｒｅｇ活性のマーカーとして測定した。刺激因子は、ＦｏｘＰ３を誘導しなかったが、ＣＤ２５は、ＨＡＧを除く全ての刺激因子により誘導された（表５を参照）。アルギナーゼｍＲＮＡは、ＭＳＤＣ機能のマーカーとして測定したが、誘導は表５では検出されなかった。
【００８２】
表６に示されているように、癌を有する患者は、種々の刺激に応答して、より大きな度合いのサプレッサー誘導を示すと考えられた。ザイモサンは、ＴＧＦ−ベータ１を除き、分析した全てのサプレッサーを著しく誘導した。同様に、ＰＨＡは、分析した５つのサプレッサーマーカーのうち３つを誘導した。従って、幾つかの実施形態では、そのようなデータは、疾患の発端を示唆することができ、例えば、サプレッサーの発現の増強は、キラー（例えば、攻撃的）機能の効力低減に寄与し得、従って悪性腫瘍の発生を促進した可能性がある。同様に、サプレッサー機能の増強は、特にキラー機能の増強がない場合、免疫療法が、そのような個体に有効ではないだろうということを示唆する。
【００８３】
主に他のタイプの免疫細胞を活性化及び指図するように機能する種々のサブセットのＴヘルパー細胞のマーカーとして、ＩＬ２（Ｔｈ１）、ＩＦＮＧ（Ｔｈ１）、ＩＬ４（Ｔｈ２）、ＩＬ１０（Ｔｈ２）、及びＩＬ１７（Ｔｈ１７）ｍＲＮＡの誘導を特定した（表５及び６）。これらマーカーの誘導は、複数レベルの免疫系が、単なる攻撃的（例えば、キラー）機能細胞の誘導ではなく、同時にアップレギュレートされる能力があることを示唆する。従って、幾つかの実施形態では、上記で考察され、まとめられた種々の機能別分類の各々の分析を使用して、どのタイプの治療法が有効である可能性が高いかを決定する。例えば、ヘルパー又はリクルーターマーカーの誘導の欠如を伴う攻撃的マーカーのアップレギュレーションは、より大きな活性を有しているものの、攻撃的細胞が、十分に良好に標的とされていないか、又は免疫系の他の部分により十分に良好に支援されていない可能性があることを示唆する。そのような場合、免疫に基づく療法は理想的ではない可能性がある。しかしながら、他の実施形態では、単一分類（又は単一のマーカー）の誘導の強度は、関連する治療計画を受けるのに十分値する可能性がある。
【００８４】
体液性（例えば、抗体媒介性）免疫応答に非常に重要である、種々の外来性分子の同一性を「学習する」免疫系の能力等の、様々な他の機能が免疫系で実行される。顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）は、白血球細胞増殖因子としての機能であり、ＧＭＣＳＦ ｍＲＮＡは、種々の刺激により健常対象体で適度に誘導された（表５）。同様に、ＧＭＣＳＦは、健常対象体より遥かに大きな程度にであったが、癌患者でアップレギュレートされた（表６）。これらデータは、癌患者が、多数の白血球を製作する能力を有する可能性があることを示唆するが、細胞の総数は、有効な免疫機能を保証しない場合があり、むしろ攻撃的及び防御的機能の最終的なバランスが、重要な決定要因である可能性がある。抗原に対する抗体を製作するように機能し、記憶Ｂ細胞へと発達して行くＢ細胞のマーカーとしての、ＩｇＧ重鎖（ＩＧＨ＠）のｍＲＮＡは、健常患者ではザイモサンにより誘導されたが（表５）、癌患者（表６）では誘導されなかった。癌などの多くの病変は、細胞代謝及び組織増殖の速度が速いため、血液供給の増加を必要とする。ＶＥＧＦ発現は、血管新生のマーカーとして試験し、健常患者及び癌患者の両方でザイモサンにより誘導された。疼痛に関連するＰＯＭＣ（エンドルフィン）ｍＲＮＡは、これら対象体では誘導されなかったが、関連実験の他の健常対照対象体では、ＰＯＭＣ ｍＲＮＡがザイモサンにより誘導されることが示されている（データ非表示）。
【００８５】
この例で実証されたように、このハイスループット法は、健常個体及び癌を有する個体（表５）の広範囲な白血球機能を特徴付けるのに十分な程度に感度が高かった（表６）。三重重複の全血分割量を刺激因子及び対照溶媒の両方に使用して、各ｍＲＮＡの各刺激因子に関する統計的結論を導き出すことができた。ＡＣＴＢ及びＢ２Ｍ等の対照遺伝子は、対照個体では誘導されなかったが（例えば、増加倍数＞２）、Ｂ２Ｍは、癌性個体で誘導された。しかしながら、Ｂ２Ｍは、主要組織適合遺伝子複合体の成分であるため、発現の変化がザイモサンによる全血の刺激により誘導されるだろうと考えることは不合理ではない。にもかかわらず、対照遺伝子を使用して、他のｍＲＮＡのＰＣＲ結果を正規化しなかった。実際、本明細書で使用した方法の感度を考慮すると、増加倍数が２倍未満又は０．６倍を超えている場合でさえ、統計的有意差が特定されることが多かった（例えば、表５のｒＩＬ２及びＰＨＡ誘導性ＡＣＴＢ、ＰＨＡ誘導性ＣＣＬ４、ザイモサン誘導性ＣＸＣＬ１０、ＨＡＧ及びザイモサン誘導性ＦＯＸＰ３）。対照的に、幾つかの低コピー数遺伝子（例えば、ＩＬ２、ＩＬ４、ＧＭＣＳＦ、及びＰＯＭＣ）は、大きなばらつきを示し、場合によっては、増加倍数が１０を超えても、有意ではなかった（表５のＴＣＲ誘導性ＧＭＣＳＦ）。従って、表５及び６では、２を超える増加倍数、かつｐ＜０．０５を、陽性結果とみなした（例えば、有意な誘導；暗色背景部分）。種々のマーカーの誘導の度合いは、必ずしも生物学的重要性の度合いと直接結び付くかない場合があり、例えば、低コピー数遺伝子の発現の大きな増加倍数は、豊富な遺伝子の小さな増加倍数と比較して、生物学的な影響はより少ない可能性がある。従って、発現の変化の度合いは、特定の経路の変化の度合いを必ずしも示さない場合があり得るが、これらのデータは、発現のパターンを決定するのに特に有用である。本明細書で開示されているように、幾つかの実施形態では、発現のパターンを使用して、ある分類の白血球機能関連マーカーの発現に基づいて、テーラーメイドの療法又は診断が開発される。ｒＩＬ２等の一般的な免疫機能刺激因子を含め、本明細書で開示された方法により生成されたデータは、他の疾患タイプの中でも、腫瘍学的疾患及び自己免疫疾患に応用可能である。幾つかの実施形態によると、幾つかの実施形態は、前臨床研究、臨床試験の状況での療法の開発、並びに付随する診断の開発に関して、生成されたデータを使用する。
【００８６】
【表５】
【００８７】
【表６】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
対象体の免疫機能が、攻撃的免疫機能に向けられているか又は防御的免疫機能に向けられているかを決定する方法であって、
対象体から白血球を含有する第１及び第２の試料を取得すること、
前記第１の試料を、攻撃的及び防御的免疫機能を両方とも刺激する免疫刺激剤に溶媒中で暴露すること、
前記第２の試料を前記溶媒に暴露すること、
前記刺激剤又は溶媒に暴露した後、前記第１及び第２の試料中の１つ又は複数の攻撃的免疫機能関連ｍＲＮＡの量を定量化し、それにより前記第１及び第２の試料中で定量化された前記攻撃的免疫機能関連ｍＲＮＡの量間の比率として攻撃的免疫機能の誘導を定量化すること、
前記刺激剤又は溶媒に暴露した後、前記第１及び第２の試料中の１つ又は複数の防御的免疫機能関連ｍＲＮＡの量を定量化し、それにより前記第１及び第２の試料中で定量化された前記防御的免疫機能関連ｍＲＮＡの量間の比率として防御的免疫機能の誘導を定量化することを含み、
攻撃的又は防御的免疫の著しくより多くの誘導が、前記対象体の免疫機能がそれぞれ攻撃的又は防御的免疫機能に向けられていることを示す方法。
【請求項２】
前記試料が、ヘパリン処理された全血である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記全血が、室温で又は冷却して１日未満保存される、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記刺激剤が、組換えインターロイキン−２、フィトヘマグルチニン、抗Ｔ細胞受容体抗体、熱凝集ＩｇＧ、リポ多糖、及びザイモサンからなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記暴露が、２４時間未満である、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記暴露が、２〜６時間である、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記暴露が、約４時間である、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記１つ又は複数の攻撃的免疫機能関連ｍＲＮＡが、免疫リクルーター機能、免疫キラー機能、又は免疫ヘルパー機能を有するものに分類される、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
前記１つ又は複数の攻撃的免疫機能関連ｍＲＮＡが、免疫リクルーター機能を有し、ＣＣＬ２、ＣＣＬ４、ＣＣＬ８、ＣＣＬ２０、ＣＸＣＬ３、ＣＸＣＬ１０、及びインターロイキン８からなる群から選択される、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記１つ又は複数の攻撃的免疫機能関連ｍＲＮＡが、免疫キラー機能を有し、グランザイムＢ、パーフォリン、ＴＮＦＳＦ１、ＴＮＦＳＦ２、ＴＮＦＳＦ５、ＴＮＦＳＦ６、ＴＮＦＳＦ１４、及びＴＮＦＳＦ１５からなる群から選択される、請求項８に記載の方法。
【請求項１１】
前記１つ又は複数の攻撃的免疫機能関連ｍＲＮＡが、免疫ヘルパー機能を有し、インターロイキン２、インターロイキン４、インターフェロンガンマ、及びインターロイキン１７Ａからなる群から選択される、請求項８に記載の方法。
【請求項１２】
前記１つ又は複数の防御的免疫機能関連ｍＲＮＡが、攻撃的免疫機能の抑制に関連している、請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
前記１つ又は複数の防御的免疫機能関連ｍＲＮＡが、インターロイキン１０、トランスフォーミング成長因子ベータ、ＦｏｘＰ３、ＣＤ２５、アルギナーゼ、ＣＴＬＡ−４、及びＰＤ−１からなる群から選択される、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記対象体が癌を有しており、潜在的に有効な抗癌療法を特定するために、前記対象体の免疫機能が、攻撃的免疫機能に向けられているか又は防御的免疫機能に向けられていると決定される、請求項１に記載の方法の使用。
【請求項１５】
前記対象体の免疫機能が攻撃的免疫機能に向けられていると決定されることにより、癌免疫療法治療計画が有効である可能性が高いことが示される、請求項１４に記載の使用。
【請求項１６】
前記対象体の免疫機能が防御的免疫機能に向けられていると決定されることにより、免疫に基づく作用機序が関与しない抗癌治療計画が有効である可能性が高いことが示される、請求項１４に記載の使用。
【請求項１７】
対象体の免疫機能に基づき抗癌療法治療計画の効力を予測するための方法であって、
請求項１に記載の方法に従って、対象体の免疫機能が攻撃的免疫機能に向けられているか又は防御的免疫機能に向けられているかを決定することを含み、
前記対象体の免疫機能が攻撃的免疫機能に向けられていると決定されることにより、抗癌免疫療法治療計画が有効である可能性が高いことが示され、
前記対象体の免疫機能が防御的免疫機能に向けられていると決定されることにより、免疫に基づく作用機序が関与しない抗癌治療計画が有効である可能性が高いことが示される方法。
【請求項１８】
対象体の免疫機能が、攻撃的免疫機能に向けられているか又は防御的免疫機能に向けられているかを決定する方法であって、
前記対象体から白血球を含有する第１及び第２の試料を取得すること、
前記第１の試料を、攻撃的及び防御的免疫機能を両方とも刺激する作用剤に溶媒中で暴露すること、
前記第２の試料を前記溶媒に暴露すること、
前記暴露させた第１及び第２の試料をインキュベートすること、
前記作用剤又は溶媒に暴露した後、前記第１及び第２の試料の各々中の１つ又は複数の防御的免疫機能関連ｍＲＮＡの量を定量化し、それにより前記防御的免疫機能関連ｍＲＮＡの誘導の量を、前記第１及び第２の試料中で定量化された量間の比率として決定すること、
前記作用剤又は溶媒に暴露した後、前記第１及び第２の試料の各々中の１つ又は複数の攻撃的免疫機能関連ｍＲＮＡの量を定量化し、それにより前記攻撃的免疫機能関連ｍＲＮＡの誘導の量を、前記第１及び第２の試料中で定量化された量間の比率として決定すること、
前記攻撃的免疫機能関連ｍＲＮＡの誘導と前記防御的免疫機能関連ｍＲＮＡの誘導との比率を計算すること、
前記計算した比率を、対照対象体群に由来する対照比率と比較することを含み、
前記計算した比率が前記対照比率より著しく増加することにより、前記対象体の免疫機能が攻撃的免疫機能に向けられており、前記計算した比率が前記対照比率より著しく減少することにより、前記対象体の免疫機能が防御的免疫機能に向けられていることが示される方法。
【請求項１９】
前記攻撃的免疫機能関連ｍＲＮＡが、細胞傷害性機能のマーカーをコードするｍＲＮＡを含む、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
前記防御的免疫機能関連ｍＲＮＡが、骨髄由来サプレッサー細胞のマーカーをコードするｍＲＮＡを含む、請求項１８に記載の方法。
【請求項２１】
前記ｍＲＮＡが、アルギナーゼをコードする、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
攻撃的及び防御的免疫機能の両方の刺激因子と共に投与するための薬物を特定し、前記投与された薬物が、前記攻撃的又は防御的免疫機能のうちの１つを阻害する方法であって、
前記薬物の存在下又は非存在下で（前記刺激因子の存在下であってもよく又は非存在下であってもよい）前記攻撃的マーカーの発現を測定することにより、全血中の１つ又は複数の攻撃的免疫機能関連マーカーの発現のｉｎ ｖｉｔｒｏ誘導を定量化すること、
前記薬物の存在下又は非存在下で（前記刺激因子の存在下であってもよく又は非存在下であってもよい）前記防御的マーカーの発現を測定することにより、全血中の１つ又は複数の防御的免疫機能関連マーカーの発現のｉｎ ｖｉｔｒｏ誘導を定量化すること、及び
前記薬物の存在下又は非存在下で、前記攻撃的免疫機能関連マーカーの誘導と前記防御的免疫機能関連マーカーの誘導との差異を決定することを含み、前記薬物が、前記攻撃的及び防御的マーカーに対するその正味効果に基づき、前記刺激因子と共に投与するためのものであると特定される方法。
【請求項２３】
前記ｉｎ ｖｉｔｒｏ誘導が、前記攻撃的免疫機能マーカー及び前記防御的免疫機能マーカーの１つ又は複数を誘導するのに十分な時間、前記全血を前記刺激因子に暴露することを含む、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
前記攻撃的免疫機能関連マーカーが、ＣＤ１６、グランザイムＢ、ＴＮＦ−アルファ、インターフェロンガンマ、及び腫瘍壊死因子スーパーファミリーのメンバーの１つ又は複数を含む、請求項２２に記載の方法。
【請求項２５】
前記防御的免疫機能関連マーカーが、ＣＤ２５、ＦｏｘＰ３、ＣＴＬＡ４、ＧＡＲＰ、ＩＬ１７、及びアルギナーゼの１つ又は複数を含む、請求項２２に記載の方法。
【請求項２６】
前記攻撃的及び防御的免疫機能の刺激因子が、インターロイキン２である、請求項２２に記載の方法。
【請求項２７】
前記薬物が１つ又は複数の防御的免疫機能関連マーカーの発現を誘導するよりも高い程度に、前記薬物が、１つ又は複数の攻撃的免疫機能関連マーカーの発現を誘導する、請求項２２に記載の方法。
【請求項２８】
前記１つ又は複数の攻撃的免疫機能関連マーカー及び前記１つ又は複数の防御的免疫機能関連マーカーの前記発現の増加が、対照試料と比べて決定される、請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
前記対照試料が、前記薬物を送達するためにも使用される溶媒で刺激される、請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
前記１つ又は複数の防御的免疫機能関連マーカーの前記発現が、前記対照試料と統計的に差異がなく、前記１つ又は複数の攻撃的免疫機能関連マーカーの前記発現が、前記対照試料と統計的に差異がある、請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
前記薬物の投与が、前記刺激剤の投与の前である、請求項２２に記載の方法。
【請求項３２】
前記薬物の投与が、前記刺激剤の投与と同時である、請求項２２に記載の方法。
【請求項３３】
攻撃的及び防御的免疫機能の両方を特徴付ける方法であって、
ヘパリン処理した全血の少なくとも２つの分割量を取得すること、
前記第１の分割量を、攻撃的及び防御的免疫機能を両方とも刺激する作用剤に暴露すること、
前記第２の分割量を、前記作用剤の溶媒に暴露すること、
これら分割量を２４時間未満インキュベートすること；ＴＮＦＳＦ、グランザイムＢ、パーフォリン、ＣＤ１６、ＩＮＦγ、又は白血球の細胞傷害性機能を表す他の遺伝子をコードする１つ又は複数のｍＲＮＡの量を定量化すること、
ＦｏｘＰ３、ＣＤ２５、又は制御性Ｔ細胞のマーカーを表す他の遺伝子をコードする１つ又は複数のｍＲＮＡの量を定量化すること、
前記第１及び第２の分割量の両方での、前記細胞傷害性機能のマーカーの発現と前記制御性Ｔ細胞のマーカーの発現との比率を計算すること、及び
これら比率を、対照対象体群に由来する比率と比較することを含む方法。
【請求項３４】
ヘパリン処理した全血の２つの追加的な分割量を取得すること、
さらなる前記第１の分割量を、攻撃的及び防御的免疫機能を両方とも刺激する作用剤に暴露すること、
さらなる前記第２の分割量を、前記作用剤の溶媒に暴露すること、
これら分割量を２４時間未満インキュベートすること、
アルギナーゼ又は骨髄由来サプレッサー細胞のマーカーを表す他の遺伝子をコードする１つ又は複数のｍＲＮＡの量を定量化すること、
さらなる前記第１及び第２の分割量の両方において、前記細胞傷害性機能のマーカーの発現と前記骨髄由来サプレッサー細胞のマーカーの発現との比率を計算すること、及び
これら比率を、対照対象体群に由来する比率と比較すること、をさらに含む、請求項３３に記載の方法。
【請求項１】
対象体の免疫機能が、攻撃的免疫機能に向けられているか又は防御的免疫機能に向けられているかを決定する方法であって、
対象体から白血球を含有する第１及び第２の試料を取得すること、
前記第１の試料を、攻撃的及び防御的免疫機能を両方とも刺激する免疫刺激剤に溶媒中で暴露すること、
前記第２の試料を前記溶媒に暴露すること、
前記刺激剤又は溶媒に暴露した後、前記第１及び第２の試料中の１つ又は複数の攻撃的免疫機能関連ｍＲＮＡの量を定量化し、それにより前記第１及び第２の試料中で定量化された前記攻撃的免疫機能関連ｍＲＮＡの量間の比率として攻撃的免疫機能の誘導を定量化すること、
前記刺激剤又は溶媒に暴露した後、前記第１及び第２の試料中の１つ又は複数の防御的免疫機能関連ｍＲＮＡの量を定量化し、それにより前記第１及び第２の試料中で定量化された前記防御的免疫機能関連ｍＲＮＡの量間の比率として防御的免疫機能の誘導を定量化することを含み、
攻撃的又は防御的免疫の著しくより多くの誘導が、前記対象体の免疫機能がそれぞれ攻撃的又は防御的免疫機能に向けられていることを示す方法。
【請求項２】
前記試料が、ヘパリン処理された全血である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記全血が、室温で又は冷却して１日未満保存される、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記刺激剤が、組換えインターロイキン−２、フィトヘマグルチニン、抗Ｔ細胞受容体抗体、熱凝集ＩｇＧ、リポ多糖、及びザイモサンからなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記暴露が、２４時間未満である、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記暴露が、２〜６時間である、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記暴露が、約４時間である、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記１つ又は複数の攻撃的免疫機能関連ｍＲＮＡが、免疫リクルーター機能、免疫キラー機能、又は免疫ヘルパー機能を有するものに分類される、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
前記１つ又は複数の攻撃的免疫機能関連ｍＲＮＡが、免疫リクルーター機能を有し、ＣＣＬ２、ＣＣＬ４、ＣＣＬ８、ＣＣＬ２０、ＣＸＣＬ３、ＣＸＣＬ１０、及びインターロイキン８からなる群から選択される、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記１つ又は複数の攻撃的免疫機能関連ｍＲＮＡが、免疫キラー機能を有し、グランザイムＢ、パーフォリン、ＴＮＦＳＦ１、ＴＮＦＳＦ２、ＴＮＦＳＦ５、ＴＮＦＳＦ６、ＴＮＦＳＦ１４、及びＴＮＦＳＦ１５からなる群から選択される、請求項８に記載の方法。
【請求項１１】
前記１つ又は複数の攻撃的免疫機能関連ｍＲＮＡが、免疫ヘルパー機能を有し、インターロイキン２、インターロイキン４、インターフェロンガンマ、及びインターロイキン１７Ａからなる群から選択される、請求項８に記載の方法。
【請求項１２】
前記１つ又は複数の防御的免疫機能関連ｍＲＮＡが、攻撃的免疫機能の抑制に関連している、請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
前記１つ又は複数の防御的免疫機能関連ｍＲＮＡが、インターロイキン１０、トランスフォーミング成長因子ベータ、ＦｏｘＰ３、ＣＤ２５、アルギナーゼ、ＣＴＬＡ−４、及びＰＤ−１からなる群から選択される、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記対象体が癌を有しており、潜在的に有効な抗癌療法を特定するために、前記対象体の免疫機能が、攻撃的免疫機能に向けられているか又は防御的免疫機能に向けられていると決定される、請求項１に記載の方法の使用。
【請求項１５】
前記対象体の免疫機能が攻撃的免疫機能に向けられていると決定されることにより、癌免疫療法治療計画が有効である可能性が高いことが示される、請求項１４に記載の使用。
【請求項１６】
前記対象体の免疫機能が防御的免疫機能に向けられていると決定されることにより、免疫に基づく作用機序が関与しない抗癌治療計画が有効である可能性が高いことが示される、請求項１４に記載の使用。
【請求項１７】
対象体の免疫機能に基づき抗癌療法治療計画の効力を予測するための方法であって、
請求項１に記載の方法に従って、対象体の免疫機能が攻撃的免疫機能に向けられているか又は防御的免疫機能に向けられているかを決定することを含み、
前記対象体の免疫機能が攻撃的免疫機能に向けられていると決定されることにより、抗癌免疫療法治療計画が有効である可能性が高いことが示され、
前記対象体の免疫機能が防御的免疫機能に向けられていると決定されることにより、免疫に基づく作用機序が関与しない抗癌治療計画が有効である可能性が高いことが示される方法。
【請求項１８】
対象体の免疫機能が、攻撃的免疫機能に向けられているか又は防御的免疫機能に向けられているかを決定する方法であって、
前記対象体から白血球を含有する第１及び第２の試料を取得すること、
前記第１の試料を、攻撃的及び防御的免疫機能を両方とも刺激する作用剤に溶媒中で暴露すること、
前記第２の試料を前記溶媒に暴露すること、
前記暴露させた第１及び第２の試料をインキュベートすること、
前記作用剤又は溶媒に暴露した後、前記第１及び第２の試料の各々中の１つ又は複数の防御的免疫機能関連ｍＲＮＡの量を定量化し、それにより前記防御的免疫機能関連ｍＲＮＡの誘導の量を、前記第１及び第２の試料中で定量化された量間の比率として決定すること、
前記作用剤又は溶媒に暴露した後、前記第１及び第２の試料の各々中の１つ又は複数の攻撃的免疫機能関連ｍＲＮＡの量を定量化し、それにより前記攻撃的免疫機能関連ｍＲＮＡの誘導の量を、前記第１及び第２の試料中で定量化された量間の比率として決定すること、
前記攻撃的免疫機能関連ｍＲＮＡの誘導と前記防御的免疫機能関連ｍＲＮＡの誘導との比率を計算すること、
前記計算した比率を、対照対象体群に由来する対照比率と比較することを含み、
前記計算した比率が前記対照比率より著しく増加することにより、前記対象体の免疫機能が攻撃的免疫機能に向けられており、前記計算した比率が前記対照比率より著しく減少することにより、前記対象体の免疫機能が防御的免疫機能に向けられていることが示される方法。
【請求項１９】
前記攻撃的免疫機能関連ｍＲＮＡが、細胞傷害性機能のマーカーをコードするｍＲＮＡを含む、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
前記防御的免疫機能関連ｍＲＮＡが、骨髄由来サプレッサー細胞のマーカーをコードするｍＲＮＡを含む、請求項１８に記載の方法。
【請求項２１】
前記ｍＲＮＡが、アルギナーゼをコードする、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
攻撃的及び防御的免疫機能の両方の刺激因子と共に投与するための薬物を特定し、前記投与された薬物が、前記攻撃的又は防御的免疫機能のうちの１つを阻害する方法であって、
前記薬物の存在下又は非存在下で（前記刺激因子の存在下であってもよく又は非存在下であってもよい）前記攻撃的マーカーの発現を測定することにより、全血中の１つ又は複数の攻撃的免疫機能関連マーカーの発現のｉｎ ｖｉｔｒｏ誘導を定量化すること、
前記薬物の存在下又は非存在下で（前記刺激因子の存在下であってもよく又は非存在下であってもよい）前記防御的マーカーの発現を測定することにより、全血中の１つ又は複数の防御的免疫機能関連マーカーの発現のｉｎ ｖｉｔｒｏ誘導を定量化すること、及び
前記薬物の存在下又は非存在下で、前記攻撃的免疫機能関連マーカーの誘導と前記防御的免疫機能関連マーカーの誘導との差異を決定することを含み、前記薬物が、前記攻撃的及び防御的マーカーに対するその正味効果に基づき、前記刺激因子と共に投与するためのものであると特定される方法。
【請求項２３】
前記ｉｎ ｖｉｔｒｏ誘導が、前記攻撃的免疫機能マーカー及び前記防御的免疫機能マーカーの１つ又は複数を誘導するのに十分な時間、前記全血を前記刺激因子に暴露することを含む、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
前記攻撃的免疫機能関連マーカーが、ＣＤ１６、グランザイムＢ、ＴＮＦ−アルファ、インターフェロンガンマ、及び腫瘍壊死因子スーパーファミリーのメンバーの１つ又は複数を含む、請求項２２に記載の方法。
【請求項２５】
前記防御的免疫機能関連マーカーが、ＣＤ２５、ＦｏｘＰ３、ＣＴＬＡ４、ＧＡＲＰ、ＩＬ１７、及びアルギナーゼの１つ又は複数を含む、請求項２２に記載の方法。
【請求項２６】
前記攻撃的及び防御的免疫機能の刺激因子が、インターロイキン２である、請求項２２に記載の方法。
【請求項２７】
前記薬物が１つ又は複数の防御的免疫機能関連マーカーの発現を誘導するよりも高い程度に、前記薬物が、１つ又は複数の攻撃的免疫機能関連マーカーの発現を誘導する、請求項２２に記載の方法。
【請求項２８】
前記１つ又は複数の攻撃的免疫機能関連マーカー及び前記１つ又は複数の防御的免疫機能関連マーカーの前記発現の増加が、対照試料と比べて決定される、請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
前記対照試料が、前記薬物を送達するためにも使用される溶媒で刺激される、請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
前記１つ又は複数の防御的免疫機能関連マーカーの前記発現が、前記対照試料と統計的に差異がなく、前記１つ又は複数の攻撃的免疫機能関連マーカーの前記発現が、前記対照試料と統計的に差異がある、請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
前記薬物の投与が、前記刺激剤の投与の前である、請求項２２に記載の方法。
【請求項３２】
前記薬物の投与が、前記刺激剤の投与と同時である、請求項２２に記載の方法。
【請求項３３】
攻撃的及び防御的免疫機能の両方を特徴付ける方法であって、
ヘパリン処理した全血の少なくとも２つの分割量を取得すること、
前記第１の分割量を、攻撃的及び防御的免疫機能を両方とも刺激する作用剤に暴露すること、
前記第２の分割量を、前記作用剤の溶媒に暴露すること、
これら分割量を２４時間未満インキュベートすること；ＴＮＦＳＦ、グランザイムＢ、パーフォリン、ＣＤ１６、ＩＮＦγ、又は白血球の細胞傷害性機能を表す他の遺伝子をコードする１つ又は複数のｍＲＮＡの量を定量化すること、
ＦｏｘＰ３、ＣＤ２５、又は制御性Ｔ細胞のマーカーを表す他の遺伝子をコードする１つ又は複数のｍＲＮＡの量を定量化すること、
前記第１及び第２の分割量の両方での、前記細胞傷害性機能のマーカーの発現と前記制御性Ｔ細胞のマーカーの発現との比率を計算すること、及び
これら比率を、対照対象体群に由来する比率と比較することを含む方法。
【請求項３４】
ヘパリン処理した全血の２つの追加的な分割量を取得すること、
さらなる前記第１の分割量を、攻撃的及び防御的免疫機能を両方とも刺激する作用剤に暴露すること、
さらなる前記第２の分割量を、前記作用剤の溶媒に暴露すること、
これら分割量を２４時間未満インキュベートすること、
アルギナーゼ又は骨髄由来サプレッサー細胞のマーカーを表す他の遺伝子をコードする１つ又は複数のｍＲＮＡの量を定量化すること、
さらなる前記第１及び第２の分割量の両方において、前記細胞傷害性機能のマーカーの発現と前記骨髄由来サプレッサー細胞のマーカーの発現との比率を計算すること、及び
これら比率を、対照対象体群に由来する比率と比較すること、をさらに含む、請求項３３に記載の方法。
【図１Ａ】
【図１Ｂ】
【図１Ｃ】
【図１Ｄ】
【図２】
【図３Ａ】
【図３Ｂ】
【図３Ｃ】
【図３Ｄ】
【図３Ｅ】
【図３Ｆ】
【図３Ｇ】
【図３Ｈ】
【図３Ｉ】
【図３Ｊ】
【図４Ａ】
【図４Ｂ】
【図４Ｃ】
【図４Ｄ】
【図４Ｅ】
【図４Ｆ】
【図４Ｇ】
【図４Ｈ】
【図４Ｉ】
【図４Ｊ】
【図５】
【図１Ｂ】
【図１Ｃ】
【図１Ｄ】
【図２】
【図３Ａ】
【図３Ｂ】
【図３Ｃ】
【図３Ｄ】
【図３Ｅ】
【図３Ｆ】
【図３Ｇ】
【図３Ｈ】
【図３Ｉ】
【図３Ｊ】
【図４Ａ】
【図４Ｂ】
【図４Ｃ】
【図４Ｄ】
【図４Ｅ】
【図４Ｆ】
【図４Ｇ】
【図４Ｈ】
【図４Ｉ】
【図４Ｊ】
【図５】
【公表番号】特表２０１３−５１４０９０（Ｐ２０１３−５１４０９０Ａ）
【公表日】平成２５年４月２５日（２０１３．４．２５）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１２−５４４６３１（Ｐ２０１２−５４４６３１）
【出願日】平成２２年１２月８日（２０１０．１２．８）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２０１０／０５９５５２
【国際公開番号】ＷＯ２０１１／０８４３３３
【国際公開日】平成２３年７月１４日（２０１１．７．１４）
【新規性喪失の例外の表示】特許法第３０条第１項適用申請有り Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｖｏｌｕｍｅ ３６３，Ｉｓｓｕｅ １ Ｄｅｃｅｍｂｅｒ ２０１０，Ｐａｇｅｓ ９５−１００ 掲載日 ２０１０年１０月５日 掲載アドレス ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｓｃｉｅｎｃｅｄｉｒｅｃｔ．ｃｏｍ／ｓｃｉｅｎｃｅ／ｊｏｕｒｎａｌ／００２２１７５９／３６３／１ ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｓｃｉｅｎｃｅｄｉｒｅｃｔ．ｃｏｍ／ｓｃｉｅｎｃｅ／ａｒｔｉｃｌｅ／ｐｉｉ／Ｓ００２２１７５９１０００２９５４
【出願人】（０００００４４５５）日立化成株式会社 (4,649)
【出願人】（５００２９４９５８）ヒタチ ケミカル リサーチ センター インコーポレイテッド (27)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２５年４月２５日（２０１３．４．２５）
【国際特許分類】
【出願日】平成２２年１２月８日（２０１０．１２．８）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２０１０／０５９５５２
【国際公開番号】ＷＯ２０１１／０８４３３３
【国際公開日】平成２３年７月１４日（２０１１．７．１４）
【新規性喪失の例外の表示】特許法第３０条第１項適用申請有り Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｖｏｌｕｍｅ ３６３，Ｉｓｓｕｅ １ Ｄｅｃｅｍｂｅｒ ２０１０，Ｐａｇｅｓ ９５−１００ 掲載日 ２０１０年１０月５日 掲載アドレス ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｓｃｉｅｎｃｅｄｉｒｅｃｔ．ｃｏｍ／ｓｃｉｅｎｃｅ／ｊｏｕｒｎａｌ／００２２１７５９／３６３／１ ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｓｃｉｅｎｃｅｄｉｒｅｃｔ．ｃｏｍ／ｓｃｉｅｎｃｅ／ａｒｔｉｃｌｅ／ｐｉｉ／Ｓ００２２１７５９１０００２９５４
【出願人】（０００００４４５５）日立化成株式会社 (4,649)
【出願人】（５００２９４９５８）ヒタチ ケミカル リサーチ センター インコーポレイテッド (27)
【Ｆターム（参考）】
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