本発明は、組織の新脈管形成を調節する必要がある対象において当該調節をする為の方法に関係し、該方法は該対象に、RIKEN cDNA 9430020K01、Agtrl1、Apelin、Stabilin 1、Stabilin 2、TNFaip8l1、TNFaip8、及びFGD5、並びにそれらのホモログからなる群から選ばれる遺伝子を含む分離された核酸分子；該遺伝子によりコードされた又はこれら遺伝子のホモログによりコードされた遺伝子産物、及びその機能的断片；該遺伝子の遺伝子産物若しくはその機能的断片又はこれら遺伝子のホモログによりコードされた遺伝子産物若しくはその機能的断片に対して向けられた抗体又はその誘導体、該誘導体は好ましくはscFv断片、Fab断片、キメラ抗体、二重機能的抗体、細胞内抗体、及び抗体から誘導された他の分子である；該遺伝子及びそのホモログの遺伝子又はｍＲＮＡ遺伝子産物とストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で結合することができるアンチセンス分子、特にはアンチセンスＲＮＡ若しくはアンチセンスオリゴデオキシヌクレオチド、RNAi分子（siRNA又はmiRNA)又はリボザイム；該遺伝子及びそのホモログの遺伝子産物の生物学的活性を干渉する小分子、及び、該遺伝子及びそのホモログと相互作用することができる（グリコール）タンパク質、ホルモン、及び他の生物学的に活性な化合物から選ばれる化合物又は化合物の組み合わせの治療的に有効な量を投与することを含む。

【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、新脈管形成を調節することができる物の分野にある。より特には、本発明は、新脈管形成を調節することができる遺伝子産物に関し、及び、該遺伝子産物又はそれらの産生に干渉し、そして、それにより新脈管形成を刺激し又は阻害する化合物に関する。また、本発明は、該開示された化合物を、心臓血管疾患、脳血管疾患、及び末梢動脈疾患を包含する疾病、並びに、ガン及び糖尿病を含む（がこれらに限定されない）病理学的新脈管形成により特徴付けられる疾患の治療において使用する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
発生中の胚において、原始的な脈管ネットワークが、脈管形成（Vasculogenesis）と呼ばれるプロセスにおいて中胚葉細胞のインシチュ分化により確立される。脈管形成（前駆幹細胞からの血管のデノボ形成）は、成人においても起こりえ、そして、脈管前駆細胞の動員及び分化、例えば骨髄から活発な脈管成長の部位へ、を含む。胚における新規脈管の生成及び成体における新血管新生を含む全てのより後のプロセスは、血管新生と呼ばれるプロセスにおける既存脈管系からの新たな毛細血管の発芽及び分裂により、主に支配される（Pepper et al., Enzyme & Protein, 1996 49:138-162; Breier et al., Dev. Dyn. 1995 204:228-239; Risau, Nature, 1997 386:671-674）が、循環する及び局在の幹細胞及び前駆細胞により媒介される脈管形成によっても支配される。新脈管形成(Neovascularisation)は、脈管形成及び脈管治癒が媒介される（新）血管新生及び脈管形成のプロセスとして定義される。新血管新生は、胚発生及び正常組織の成長、修復、及び再生に関与するだけでなく、雌の生殖サイクル、妊娠の確立及び維持にも関与し、創傷及び骨折の修復にも関与する。動脈形成（平滑筋細胞を含む大口径脈管の形成）は、新脈管形成プロセスの連続であると考えられている。このように、成体において、新たな脈管の形成は、血管新生、脈管形成、及び動脈形成（本明細書以下で、まとめて新脈管形成と呼ばれる）の相乗的プロセスである。
【０００３】
正常な生理学的プロセスとしての血管形成及び脈管形成（新脈管形成）に加えて、異常な新脈管形成が、多くの病理学的プロセス、特には腫瘍成長及び転移、及び、血管増殖、特には微小脈管系の血管増殖が増加される他の状態、例えば糖尿病性網膜症、乾癬、及び関節症など、に関与する。新脈管形成の阻害は、これらの病理学的プロセスの予防又は緩和において有用である。他方、新脈管形成の促進は、例えば組織又は器官の移植に続く、脈管形成が確立され又は拡大されるべき状況、又は、例えば冠動脈性心疾患、虚血性脳血管疾患、末梢(狭窄)動脈疾患、及び閉塞性血栓血管炎などの、組織虚血及び／又は梗塞において血管周囲循環及び／又は側副循環の確立を刺激すべき状況において望ましい。新たな血管形成の３つのプロセス−血管形成、脈管形成、及び動脈形成（まとめて「新血管形成」）−の全てが、虚血及び梗塞への応答において役割を果たす。
【０００４】
新脈管形成プロセスは、非常に複雑であり、及び、細胞周期における内皮細胞の維持、細胞外マトリックスの分解、周囲組織の遊走及び侵入、そして最後には、管形成を含む。該複雑な新脈管形成プロセスの下に横たわる分子メカニズムは、理解されているとは言い難い。
【０００５】
非常に多くの生理学的及び病理学的プロセスにおける新脈管形成の重要な役割の故に、新脈管形成の制御に関与する因子が、広範に調査されてきた。多くの成長因子が、新脈管形成の制御に関与することが示されてきており、これらは、線維芽細胞成長因子（ＦＧＦ）、血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）、肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）を含む。
【０００６】
新脈管形成を調節することができる因子が当技術分野において知られている。特定のファミリーの内皮細胞特異的増殖因子、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）、及びそれらの対応する受容体が、内皮細胞増殖及び分化の刺激に及び分化した細胞のいくつかの機能に主に関与すると考えられている。これらの因子は、ＰＤＧＦ／ＶＥＧＦファミリーのメンバーであり、そして、主に内皮受容体チロシンキナーゼ（RTKs、Flt/Flk、KDR）を介して作用するとみえる。
【０００７】
しかしながら、当技術分野において、新脈管形成を調節する追加の因子についてのニーズがある。新脈管形成を調節する新規化合物を提供することが、本発明の目的である。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明は、脈管の形成及び動脈の修復の制御に関与する遺伝子の同定に基づく。これらの遺伝子の遺伝子産物は、対象の組織における新たな脈管の形成を誘発し又は阻害する為に用いられうる。また、該遺伝子又は遺伝子産物に干渉する化合物も、脈管形成及び動脈修復を刺激する為に、又は異常な又は望ましくない新脈管形成（糖尿病性網膜症、炎症性新血管形成、アテローム性動脈硬化性プラーク安定化、又は腫瘍血管新生）を妨げて疾患進行を停止する為に用いられうる。これらの遺伝子及びそれらの産物は、身体の及び炎症の脈管損傷に続く生理学的動脈修復応答にも関与し、プラーク破綻及び心筋梗塞へのアテローム性動脈硬化進行及びアテローム性動脈硬化性プラーク不安定性を調節することが示された。
【０００９】
それ故に、本発明は、第一の局面において、組織の新脈管形成の調節が必要である対象において組織の新血管形成を調節する為の方法を提供し、該方法は、該対象に、
- RIKEN cDNA 9430020K01、Agtrl1、Apelin、Stabilin 1、Stabilin 2、TNFaip8l1、TNFaip8、及びFGD5、並びにそれらのホモログからなる群から選ばれる遺伝子を含む分離された核酸分子;
- RIKEN cDNA 9430020K01、Agtrl1、Apelin、Stabilin 1、Stabilin 2、TNFaip8l1、TNFaip8、及びFGD5からなる群から選択される遺伝子によりコードされる遺伝子産物、又はこれらの遺伝子のホモログによりコードされる遺伝子産物、並びにそれらの機能的断片;
- RIKEN cDNA 9430020K01、Agtrl1、Apelin、Stabilin 1、Stabilin 2、TNFaip8l1、TNFaip8、及びFGD5からなる群から選ばれる遺伝子の遺伝子産物若しくはその機能的断片又はこれらの遺伝子のホモログによりコードされた遺伝子産物若しくはその機能的断片に対して向けられた抗体又はその誘導体、但し該誘導体は好ましくはscFv断片、Fab断片、キメラ抗体、二重機能的抗体（bifunctional antibody）、細胞内抗体（intrabody）、及び抗体から得られた他の分子から選ばれたものである;
- RIKEN cDNA 9430020K01、Agtrl1、Apelin、Stabilin 1、Stabilin 2、TNFaip8l1、TNFaip8、及びFGD5、並びにこれらのホモログからなる群から選ばれる遺伝子又は該遺伝子のmRNA遺伝子産物とストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で結合することができるアンチセンス分子、特にはアンチセンスＲＮＡ又はアンチセンスオリゴデオキシヌクレオチド、ＲＮＡｉ分子（siRNA又はmiRNA）、又はリボザイム;
- RIKEN cDNA 9430020K01、Agtrl1、Apelin、Stabilin 1、Stabilin 2、TNFaip8l1、TNFaip8、及びFGD5、並びにそれらのホモログからなる群から選ばれる遺伝子の遺伝子産物の生物学的活性を干渉する小分子、及び、
- RIKEN cDNA 9430020K01、Agtrl1、Apelin、Stabilin 1、Stabilin 2、TNFaip8l1、TNFaip8、及びFGD5、並びにこれらのホモログからなる群から選ばれる遺伝子又は遺伝子産物と相互作用することができる（グリコール）タンパク質、ホルモン、及び他の生物学的に活性な化合物
から選ばれる化合物又は化合物の組み合わせの治療的に有効な量を投与することを含む。
【００１０】
好ましくは、本発明の方法は、組織の新脈管形成を調節する必要がある対象において当該調節をする為の方法に関係し、該方法は該対象に、
-遺伝子RIKEN cDNA 9430020K01及びそのホモログを含む分離された核酸分子;
-遺伝子RIKEN cDNA 9430020K01によりコードされた又はこの遺伝子のホモログによりコードされた遺伝子産物、及びこれらの機能的断片;
- RIKEN cDNA 9430020K01の遺伝子産物若しくはその機能的断片又はこの遺伝子のホモログによりコードされた遺伝子産物若しくはその機能的断片に対して向けられた抗体又はその誘導体、但し該誘導体は好ましくはscFv断片、Fab断片、キメラ抗体、二重機能的抗体、細胞内抗体、及び抗体から得られた他の分子である;
-遺伝子RIKEN cDNA 9430020K01及びそのホモログの遺伝子又はmRNA遺伝子産物に、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で結合することができるアンチセンス分子、特にはアンチセンスＲＮＡ又はアンチセンスオリゴデオキシヌクレオチド、RNAi分子（siRNA又はmiRNA);
-遺伝子RIKEN cDNA 9430020K01又はそのホモログの遺伝子産物の生物学的活性を干渉する小分子、及び
-遺伝子RIKEN cDNA 9430020K01又はそのホモログと又はその遺伝子産物と相互作用することができる（グリコール）タンパク質、ホルモン、及び他の生物学的に活性な化合物、
から選ばれる化合物又は化合物の組み合わせの治療的に有効な量を投与することを含み、ここで該遺伝子ホモログは、該遺伝子の配列と少なくとも60%の配列同一性を有する。
【００１１】
好ましい実施態様において、組織の新血管形成が必要な対象における該調節の為の方法は、
- 心臓血管疾患を患うリスクを処置し又は緩和し又は予防する、身体的損傷（ステント留置術、医療的介入）に続く動脈治癒を改善する、アテローム性動脈硬化症を処置し又は緩和し又は予防する、アテローム性動脈硬化性プラーク形成を処置し又は緩和し又は予防する、プラーク不安定化（脆弱なプラークの形成及び破綻）を処置し又は緩和し又は予防する；ガン、特には腫瘍血管新生を処置し又は緩和し又は予防する；糖尿病性網膜症又は網膜の網膜症又は漏出性又は過剰透過性の脈管を結果する増大した、異常な、未成熟な、加速された、及び／又は非協調的な脈管成長に関連したいずれかの状態を処置し又は緩和し又は予防する;
- 動脈の再構築及び動脈の完全性／過剰透過性を誘発する為の処置;
- 化合物、グラフト、及び／又はデバイス（バルブ、脈管グラフト、脈管内プロテーゼ、脈管内ステント）の、それらへの血栓形成のリスクを減少する為の、再内皮化（re-endothelialisation）を刺激する為の処置
の為のものである。
【００１２】
他の局面において、本発明は、上記定義されたとおりの少なくとも１つの化合物の治療的に有効な量と、医薬的に許容できる添加物、キャリア、又は希釈剤とを含む医薬組成物を提供する。
【００１３】
好ましくは、上記で定義されたとおりの該医薬組成物中の該化合物は：
- RIKEN cDNA 9430020K01及びそのホモログからなる群から選ばれる遺伝子を含む分離された核酸分子;
-遺伝子RIKEN cDNA 9430020K01によりコードされる又はこの遺伝子のホモログによりコードされる遺伝子産物、並びにその機能的断片;
-遺伝子RIKEN cDNA 9430020K01の遺伝子産物若しくはその機能的断片又はこの遺伝子のホモログによりコードされる遺伝子産物若しくはその機能的断片に対して向けられた抗体又はその誘導体、但し該誘導体は好ましくscFv断片、Fab断片、キメラ抗体、二重機能的抗体、細胞内抗体、及び抗体から得られた他の分子からなる群から選ばれたものである;
- RIKEN cDNA 9430020K01及びそのホモログからなる群から選ばれる遺伝子又は該遺伝子のmRNA遺伝子産物とストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で結合することができるアンチセンス分子、特にはアンチセンスＲＮＡ又はアンチセンスオリゴデオキシヌクレオチド、RNAi分子(siRNA又はmiRNA)又はリボザイム;
- RIKEN cDNA 9430020K01及びそのホモログからなる群から選ばれる遺伝子の遺伝子産物の生物学的活性を干渉する小分子
- RIKEN cDNA 9430020K01及びそのホモログからなる群から選ばれる遺伝子又は遺伝子産物と相互作用することができる（グリコール）タンパク質、ホルモン、及び他の生物学的に活性な化合物
である。
【００１４】
他の局面において、本発明は、対象を処置する方法であって、該対象に、治療的に有効な量の上記で定義されたとおりの該医薬組成物を投与することを含む前記方法を提供する。この処置は、適切には、
- 心臓血管疾患を患うリスクの処置又は緩和又は予防、身体的損傷（ステント留置術、医療的介入）に続く動脈治癒を改善する、アテローム性動脈硬化症の処置又は緩和又は予防、アテローム性動脈硬化性プラーク形成の処置又は緩和又は予防、プラーク不安定化（脆弱なプラークの形成及び破綻）の処置又は緩和又は予防；ガン、特には腫瘍血管新生の処置又は緩和又は予防；糖尿病性網膜症又は網膜の網膜症又は漏出性又は過剰透過性の血管を結果する増大した、異常な、未成熟な、加速された、及び／又は非協調的な脈管成長に関連したいずれかの状態の処置又は緩和又は予防;
- 動脈の再構築及び動脈の完全性／過剰透過性を誘発する為の処置;
- 化合物、グラフト、及び／又はデバイス（バルブ、脈管グラフト、脈管内プロテーゼ、脈管内ステント）の、それらに形成される血栓のリスクを減少する為の、再内皮化（re-endothelialisation）を刺激する為の処置
の為に必要とされる。
【００１５】
他の局面において、本発明は、
- 心臓血管疾患を患うリスクの処置又は緩和又は予防、身体的損傷（ステント留置術、医療的介入）に続く動脈治癒を改善する、アテローム性動脈硬化症の処置又は緩和又は予防、アテローム性動脈硬化性プラーク形成の処置又は緩和又は予防、プラーク不安定化（脆弱なプラークの形成及び破綻）の処置又は緩和又は予防；ガン、特には腫瘍血管新生の処置又は緩和又は予防；糖尿病性網膜症又は網膜の網膜症又は漏出性又は過剰透過性の脈管を結果する増大した、異常な、未成熟な、加速された、及び／又は非協調的な脈管成長に関連したいずれかの状態の処置又は緩和又は予防;
- 動脈の再構築及び動脈の完全性／過剰透過性を誘発する為の処置;
- 化合物、グラフト、及び／又はデバイス（バルブ、脈管グラフト、脈管内プロテーゼ、脈管内ステント）の、それらへの血栓形成のリスクを減少する為の、再内皮化（re-endothelialisation）を刺激する為の処置
における、医薬としての使用の為の、
- RIKEN cDNA 9430020K01、Agtrl1、Apelin、Stabilin 1、Stabilin 2、TNFaip8l1、TNFaip8、及びFGD5、並びにそれらのホモログからなる群から選ばれる遺伝子を含む分離された核酸分子;
- RIKEN cDNA 9430020K01、Agtrl1、Apelin、Stabilin 1、Stabilin 2、TNFaip8l1、TNFaip8、及びFGD5からなる群から選択される遺伝子によりコードされる遺伝子産物、又はこれらの遺伝子のホモログによりコードされる遺伝子産物、並びにそれらの機能的断片;
- RIKEN cDNA 9430020K01、Agtrl1、Apelin、Stabilin 1、Stabilin 2、TNFaip8l1、TNFaip8、及びFGD5からなる群から選ばれる遺伝子の遺伝子産物若しくはその機能的断片又はこれらの遺伝子のホモログによりコードされた遺伝子産物若しくはその機能的断片に対して向けられた抗体又はその誘導体、但し該誘導体は好ましくはscFv断片、Fab断片、キメラ抗体、二重機能的抗体（bifunctional antibody）、細胞内抗体（intrabody）、及び抗体に由来する他の分子から選ばれたものである;
- RIKEN cDNA 9430020K01、Agtrl1、Apelin、Stabilin 1、Stabilin 2、TNFaip8l1、TNFaip8、及びFGD5、並びにこれらのホモログからなる群から選ばれる遺伝子又は遺伝子のmRNA遺伝子産物とストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で結合することができるアンチセンス分子、特にはアンチセンスＲＮＡ又はアンチセンスオリゴデオキシヌクレオチド、ＲＮＡｉ分子（siRNA又はmiRNA）、又はリボザイム;
- RIKEN cDNA 9430020K01、Agtrl1、Apelin、Stabilin 1、Stabilin 2、TNFaip8l1、TNFaip8、及びFGD5、並びにこれらのホモログからなる群から選ばれる遺伝子の遺伝子産物の生物学的活性を干渉する小分子、及び、
- RIKEN cDNA 9430020K01、Agtrl1、Apelin、Stabilin 1、Stabilin 2、TNFaip8l1、TNFaip8、及びFGD5及びこれらのホモログからなる群から選ばれる遺伝子又は遺伝子産物にと相互作用することができる（グリコール）タンパク質、ホルモン、及び他の生物学的に活性な化合物
を提供する。
【００１６】
他の局面において、本発明は、図11、13、及び15-20のいずれか１つと少なくとも60%の配列同一性を有する配列を含む分離された核酸分子を提供する。図11(配列ID NO:1)は、マウスRIKEN cDNA 9430020K01遺伝子の配列を提供する。この遺伝子の機能はこれまで知られていなかった。本発明者らは、この遺伝子についての産業的な用途を提供する最初の者である。また、本明細書内に示された他の遺伝子の産業的な用途が提供される。
【００１７】
他の局面において、本発明は、医薬としての使用の為の、上記で定義されたとおりの分離された核酸分子の遺伝子産物又は上記で定義されたとおりの核酸分子を含むベクターを提供する。
【００１８】
好ましくは、上記で定義されたとおりの該遺伝子産物又はベクターは、減少した再脈管形成を患う患者の処置における使用の為のものである。好ましくは、該使用は、心臓血管虚血性疾患、脳血管虚血性疾患、及び／又は末梢動脈疾患を患う患者を処置する為であり、並びに固形腫瘍形成及び転移形成の進行を減衰する、及び、細胞増殖抑制治療の有効性を促進する。
【００１９】
特に好ましい実施態様において、上記で定義されたとおりの本発明の（治療的）化合物は、心臓血管疾患を患うリスクの処置又は緩和又は予防、身体的損傷（ステント留置術、医療的介入）に続く動脈治癒を改善する、アテローム性動脈硬化症の処置又は緩和又は予防、アテローム性動脈硬化性プラーク形成の処置又は緩和又は予防、プラーク不安定化（脆弱なプラークの形成及び破綻）の処置又は緩和又は予防；ガン、特には腫瘍血管新生の処置又は緩和又は予防；糖尿病性網膜症又は網膜の網膜症又は漏出性又は過剰透過性の血管を結果する増大した、異常な、未成熟な、加速された、及び／又は非協調的な脈管成長に関連したいずれかの状態の処置又は緩和又は予防; 動脈の再構築及び動脈の完全性／過剰透過性を誘発する為の処置; 及び／又は、化合物、グラフト、及び／又はデバイス（バルブ、脈管グラフト、脈管内プロテーゼ、脈管内ステント）の、それらに形成される血栓のリスクを減少する為の、再内皮化（re-endothelialisation）を刺激する為の処置における使用の為のものである。
【図面の簡単な説明】
【００２０】
【図１】種々の成体マウス組織におけるRIKEN cDNA 9430020K01遺伝子の発現パターンを示す図である。
【図２】受精後の種々の日での胚のマウス発生の間のRIKEN cDNA 9430020K01遺伝子の発現レベルを示す図である。
【図３】実施例１において記載されたとおりのHUVEC細胞の継代培養後３時間での２Ｄマトリゲル分析の結果を示す図である。（Ａ）生理食塩水により処理された対照（ネットワークを示す）；（Ｂ）sham（ニセ）の／スクランブルされたsiRNAにより処理された対照（ネットワークを示す）；（Ｃ）RIKEN cDNA 9430020K01の標的とされたサイレンシング（単層を示す）。RIKEN cDNA 9430020K01のノックダウンは、細胞培養物における２Ｄマトリゲル新毛細血管ベッドの発達の不全を結果する。細胞は、対照条件（Ａ、Ｂ）において見られたとおりの細胞の整列化及び管の形成を示さなかった。
【図４】実施例１において記載されたとおりの、5-2.5-1ng/mlの濃度におけるsiRNAトランスフェクションの９６時間後の、HUVECにおけるRIKEN cDNA 9430020K01 mRNA発現を示す図である。
【図５】実施例１において記載されたとおりのRIKEN cDNA 9430020K01 RNA発現のsiRNAノックダウンの有効性を示す図である。Ａ：24-48-72-96時間で測定された、スクランブルされた標的なしのsiRNA及び対照と比較した、特定の標的のあるsiRNAを用いる。スクランブルされたsiRNA（実線）；siRNA無し（太い縞の線）及びRIK943を標的とするsiRNA（短い縞の線）による、時間にわたるＨＵＶＥＣ細胞の数（細胞増殖を示す）。RIK943サイレンシングは、結果として、細胞培養物における内皮細胞増殖の抑制をもたらす。0時間での相対的な細胞増殖、細胞の数が１００％でセットされた。（Ｂ−Ｄ）子マウスの目におけるRIKEN cDNA 9430020K01に対して向けられた混合物としての３つのsiRNAの注入。siRNAの濃度は、5 ng/mlであった。（Ａ）siRNAの注入後のマウスの網膜からの試料のｑＰＣＲにより測定されたときインビボでのRIK943 mRNA発現の下方制御。Ｙ軸は、ｑＰＣＲにより測定されたときの相対的なＲＮＡ発現レベル（０時間で、発現は１００％にセットされる）を示す。暗い灰色のバー（右）は、siRNA RIK943を表す、明るい灰色のバー（左）は、shamのsiRNA（対照）を表す。（Ｃ）ＳＥＭ顕微鏡写真が、RIK943の下方制御（右）が、対照（左）と比べて、新生児マウスの目における網膜脈管形成の完全な喪失を結果することを示す。（Ｄ）RIK943ノックダウン後の新生児マウスにおける、RIK943のサイレンシングの、分岐の数に対する（左のグラフ）、網膜脈管の数に対する（中央のグラフ）、及び、形成された網膜脈管の合計の管長さに対する（右のグラフ）効果の定量。バー表示は、図５Ｂと同じである。
【図６】実施例１の増殖アッセイの結果を示す図である。RIKEN cDNA 9430020K01遺伝子に対して特異的にターゲティングするｓｉＲＮＡにさらされたＨＵＶＥＣ細胞培養物の増殖は、shamの阻害（ターゲティングしないｓｉＲＮＡ）及び陰性対照と比較して、強く阻害される。Ｙ軸は細胞の数を示し、Ｘ軸は100,000のｓｉＲＮＡにより処理された細胞の継代培養後の時間を示す。
【図７Ａ】ヨウ化プロピジウム（ＰＩ）細胞周期アッセイの結果を示す図である。ＨＵＶＥＣは、実施例１の特異的なターゲッティングのｓｉＲＮＡにさらされると、Ｇ１期における細胞周期停止を経験する。Ｙ軸は、フローサイトメトリーにより測定されたときの、G1/Go期にある細胞を示す。
【図７Ｂ】ヨウ化プロピジウム（ＰＩ）細胞周期アッセイの結果を示す図である。ＨＵＶＥＣは、実施例１の特異的なターゲッティングのｓｉＲＮＡにさらされると、Ｇ１期における細胞周期停止を経験する。Ｙ軸は、フローサイトメトリーにより測定されたときの、S/M/G2期にある細胞（Ｂ）の％を示す。
【図８Ａ】実施例１において記載されるとおり、特異的なｓｉＲＮＡにさらされた細胞（ＨＵＶＥＣ）の数が、陰性対照又はターゲティングしないｓｉＲＮＡ（sham）による阻害と比較して、アポトーシス的になることを示す図である。Ｙ軸は、フローサイトメトリーにより測定されたときの、細胞培養物中の生存細胞（Ａ）の相対的な数を示す。
【図８Ｂ】実施例１において記載されるとおり、特異的なｓｉＲＮＡにさらされた細胞（ＨＵＶＥＣ）の数が、陰性対照又はターゲティングしないｓｉＲＮＡ（sham）による阻害と比較して、アポトーシス的になることを示す図である。Ｙ軸は、フローサイトメトリーにより測定されたときの、アポトーシス前細胞（Ｂ）の相対的な数を示す。
【図８Ｃ】実施例１において記載されるとおり、特異的なｓｉＲＮＡにさらされた細胞（ＨＵＶＥＣ）の数が、陰性対照又はターゲティングしないｓｉＲＮＡ（sham）による阻害と比較して、アポトーシス的になることを示す図である。Ｙ軸は、フローサイトメトリーにより測定されたときの、アポトーシス細胞（Ｃ）の相対的な数を示す。
【図９】実施例１において記載されるとおり、標的の無いｓｉＲＮＡによる処理にさらされたＨＵＶＥＣ及び陰性対照と比較した、特異的なRIKEN cDNA 9430020K01を標的とするｓｉＲＮＡにさらされたＨＵＶＥＣに対する、７２時間後の、遊走アッセイの結果を示す図である。特異的にRIKEN cDNA 9430020K01を標的とするｓｉＲＮＡにさらされたＨＵＶＥＣが、有意に減少された遊走活性を示した。
【図１０】ヒトＥＣにおけるFGD5の機能を示す図である。上のパネルは、shamのアデノウィルスにより処理された群を示し、下のパネルは、ＦＧＤ５アデノウィルスをトランスフェクトされた群を示す。カラムは、インビトロでの被覆されたビーズのフィブリンゲルアッセイにおけるtip及びstalk細胞の形成に対する（ＥＣはファロイジン染色により可視化された）（Ａ）、インビボでのマトリゲルにおける新規脈管形成に対する（Ｂ）、及びインビボでの被覆されたビーズ上のＥＣ増殖（ヘマトキシリン／エオシン染色された凍結切片）（Ｃ）に対するＦＧＤ５過剰発現の効果を示す。
【図１１−１】下線付加されたフォワードプライマー及びリバースプライマーの配列を有する配列ID NO:1を示す図である。
【図１１−２】下線付加されたフォワードプライマー及びリバースプライマーの配列を有する配列ID NO:1を示す図である。
【図１２】配列ID NO:1（RIKEN cDNA 9430020K01）によりコードされたタンパク質のアミノ酸配列を示す図である。
【図１３−１】マウスＦＧＤ５のヌクレオチド配列(genbankアクセス番号NM_172731.2)を示す図である。
【図１３−２】マウスＦＧＤ５のヌクレオチド配列(genbankアクセス番号NM_172731.2)を示す図である。
【図１４】RIKEN cDNA 9430020K01によりコードされたマウスタンパク質とそのヒトのホモログのアラインメントを示す図である。
【図１５】マウスTnfaip8 (genbankアクセス番号NM_134131.1)のヌクレオチド配列を示す図である。
【図１６】マウスTnfaip8l1 (genbankアクセス番号NM_025566.3)のヌクレオチド配列を示す図である。
【図１７】マウスAgtrl1 (genbankアクセス番号NM_011784.3)のヌクレオチド配列を示す図である。
【図１８】マウスApelin (genbankアクセス番号NM_013912)のヌクレオチド配列を示す図である。
【図１９−１】マウスStabilin 1 (genbankアクセス番号NM_138672.2)のヌクレオチド配列を示す図である。
【図１９−２】マウスStabilin 1 (genbankアクセス番号NM_138672.2)のヌクレオチド配列を示す図である。
【図２０−１】マウスStabilin 2 (genbankアクセス番号NM_138673.2)のヌクレオチド配列を示す図である。
【図２０−２】マウスStabilin 2 (genbankアクセス番号NM_138673.2)のヌクレオチド配列を示す図である。
【図２１】マウスモデルにおける虚血後の特定の前駆細胞動員を示す図である。（Ａ）心筋梗塞後の続く３日、特異的にcKit+/Flk+内皮前駆細胞が心臓において増加され、一方で、（Ｂ）Sca+/Flk+細胞数は、心筋梗塞後心臓組織において変化しなかった。後肢の虚血３日後、特異的にSca+/Flk+細胞が虚血の骨格筋において増加するが（Ｄ）、cKit+/Flk+レベルは変化しない（Ｃ）。すなわち、cKit+/Flk1+内皮前駆細胞（これは、急性心筋梗塞に続く（修復）応答に関与する）が、心筋梗塞の後に循環から特異的に動員されるが、後肢の虚血後に動員されない。
【図２２】マウスモデルにおける虚血後のEPC（内皮前駆細胞）でのAgtrl-1発現及びapelin発現／レベルを示す図である（実施例２参照）。（Ａ）平均のAgtrl-1発現は、cKit+/Flk+（これは高い発現を示す）を除き、種々のサブ集団において、相対的に低い。循環するapelinのレベル（Agtrl-1についての天然のリガンド）は、心筋梗塞後上方制御されるが、後肢の虚血後は上方制御されない（Ｂ）。虚血の心臓におけるapelinのｍＲＮＡ及びタンパク質レベルは、心筋梗塞後に増加する（Ｃ及びＥ）が、後肢の虚血後は増加しない（Ｄ及びＦ）。すなわち、Agtrl1は、（急性心筋梗塞に続く（修復）応答に関与する）cKit+/Flk1+内皮前駆細胞において特異的に発現され、及び、急性心筋梗塞に続き、apelin (Agtrl1のリガンド)が、循環において、並びに、心筋において、タンパク質レベルで及びｍＲＮＡレベルで上方制御される。
【図２３】マウスにおけるapelin注入後のＥＰＣ動員を示す図である（実施例２参照）。Apelinの全身注入が、骨髄において（Ａ）及び血液において（Ｃ）、cKit+/Flk+内皮前駆細胞の数を増加する。Apelin注入は、これらの組織：Ｂ（骨髄）及びＤ（血液）、におけるSca+/Flk+細胞の数を変化させなかった。すなわち、apelinの全身注入は、骨髄並びに循環におけるcKit+/Flk1+の数を特異的に刺激する。
【図２４】心筋梗塞そしてapelin処置後の、左室（ＬＶ）機能を示す図である（実施例２参照）。ＭＩ（心筋梗塞）の誘発の２週間後の未処理（Ａ）、ＰＢＳ（Ｂ）、及びapelinにより処理された（Ｃ）マウスの心エコー画像。Apelin処理は、左心室の短縮率（Fractional Shortening）を他の群（Ｄ）と比較して改善し、左心室及び心臓拡張における変化は無く（Ｅ）、これは収縮期の間のより良い収縮を示した。この実験の結果は、Apelinによる全身処理が、急性心筋梗塞の後の心臓機能を改善することである。
【図２５】ＭＩそしてapelin処理後の瘢痕形成を示す図である（実施例２参照）。ＭＩの誘発後２週間での、未処理（Ａ）、ＰＢＳ（Ｂ）、及びapelin処理された（Ｃ）マウスのMassonトリクロム染色。Apelin処理は、他の群と比較して、境界域（Ｄ）の心筋厚を増大し、及び、梗塞長（Ｅ）を減少する。すなわち、apelin注入は、心筋梗塞後の梗塞サイズを減少する。
【図２６】心筋梗塞そしてapelinr処理後の再血管形成を示す図である（実施例２参照）。MIの誘発後２週間での、未処理（A）、PBS(B)、及びapelin処理（C）のマウスのLectin染色。毛細血管密度が、PBS又は未処理の動物と比べて、apelinによって処理された動物において増加した（D）。すなわち、apelin注入は、心筋梗塞に続く新規脈管形成を刺激する。
【図２７Ａ】FGD5が内皮細胞において特異的に発現されることを示す図である（実施例３参照）。（A）8.5dpcから16.5dpcのc57/bl6マウスの胚発生の間のFGD5発現、Flk1+及びFlk1-の細胞のqPCRにより分析された。FGD5発現は、Flk1+細胞において全ての時点で上方制御された。
【図２７Ｂ】FGD5が内皮細胞において特異的に発現されることを示す図である（実施例３参照）。（B）ゼブラフィッシュ幼生の、２４時間での、ホールマウントin situハイブリダイゼーションは、背部大動脈、セグメント間脈管、及び後主静脈を含む、脈管系におけるFGD5の発現を明らかにした。
【図２７Ｃ】FGD5が内皮細胞において特異的に発現されることを示す図である（実施例３参照）。（C）成熟C57/bl6マウスの種々の組織におけるFGD5発現のｑPCR分析（N=6動物）。値は平均±SEMを表す。*P<0,05 大動脈対種々の組織における発現。
【図２７Ｄ−１】FGD5が内皮細胞において特異的に発現されることを示す図である（実施例３参照）。（D）他のFGDファミリーメンバー（FRG、FGD1、FGD2、FGD3、FGD4、及びFGD6）のｑPCR分析及び血管特異的CD31又はeNOSのパターン（N=4動物）。値は平均±SEMを表す。*P<0,05 動脈対種々の組織における発現。
【図２７Ｄ−２】FGD5が内皮細胞において特異的に発現されることを示す図である（実施例３参照）。（D）他のFGDファミリーメンバー（FRG、FGD1、FGD2、FGD3、FGD4、及びFGD6）のｑPCR分析及び血管特異的CD31又はeNOSのパターン（N=4動物）。値は平均±SEMを表す。*P<0,05 動脈対種々の組織における発現。
【図２７Ｅ】FGD5が内皮細胞において特異的に発現されることを示す図である（実施例３参照）。（E）非関連細胞タイプ（Hela、肉腫）と比較した、ヒト内皮細胞（HUVEC、HAEC）を含む、初代細胞系列のｑPCR分析。３つの別々の実験から得られたデータ。*P<0,05 HUVEC及びHAEC対ｈｅｌａ及び肉腫細胞。値は平均±SEMを表す。
【図２７Ｆ】FGD5が内皮細胞において特異的に発現されることを示す図である（実施例３参照）。（Ｆ）成熟C57/bl6マウスの心筋の免疫組織学的染色は、内皮細胞マーカーIsolectin IB4(赤のCy-3シグナル)とFGD5タンパク質(緑のFITCシグナル)の共局在化を示した。400X倍率。
【図２７Ｇ】FGD5が内皮細胞において特異的に発現されることを示す図である（実施例３参照）。（Ｇ）成熟C57/bl6マウスから得られた大動脈の低温切片の免疫組織学的染色。FGD5が、内皮及び外膜において検出される(緑のFITCシグナル)。FITCシグナルは、同形の対照とのインキュベーション後に観察されなかった。650X倍率。(*)は内腔領域を示す。
【図２８−１】FGD5が、インビトロ及びエクスビボで血管新生を阻害することを示す図である（実施例３を参照）。（Ａ）FGD5サイレンシング又はshamのsiRNAトランスフェクション後の標準的２ＤMatrigelチューブ形成アッセイにおけるＨＵＶＥＣの代表的な管形成。ＨＵＶＥＣは、Calcein-AM取り込みにより可視化された。400X倍率。該Matrigelアッセイの定量分析は、対照及びsham処理されたＨＵＶＥＣと比較した、（Ｂ）合計管長、（Ｃ）管の数、及び（Ｄ）分岐の数に対するFGD5ノックダウン(FGD5KD)の効果を示す(N=6の個々の実験)。値は平均±SEMを表す。*P<0,05 FGD5KD対対照及びshamのsiRNA、#P<0,10 FGD5KD対対照及びshamのsiRNA。
【図２８−２】FGD5が、インビトロ及びエクスビボで血管新生を阻害することを示す図である（実施例３を参照）。（Ｅ）Ad-FGD5又はshamアデノウィルス（Sham Ad）を用いたFGD5過剰発現に続く標準的matrigelアッセイにおけるＨＵＶＥＣの代表的管形成。ＨＵＶＥＣが、Calcein-AM取り込みを用いて可視化された。400X倍率。該Matrigelアッセイの定量的分析は、対照及びshamアデノウィルスをトランスフェクトされたＨＵＶＥＣと比較し、(F)合計の管の長さ、(G)管の数、及び(H)分岐の数に対するFGD5過剰発現の効果を示す（Ｎ＝６の個別の実験）。値は平均±SEMを表す。*P<0,05 Ad-FGD5対対照及びshamのアデノウィルス。
【図２８−３】FGD5が、インビトロ及びエクスビボで血管新生を阻害することを示す図である（実施例３を参照）。（Ｉ）代表的な顕微鏡写真が、Ad-FGD5又はshamのアデノウィルスをトランスフェクトされた大動脈リングを埋め込まれたmatrigelの微小脈管出芽を示す。400X倍率。（Ｊ）大動脈リングアッセイの定量的分析は、微小脈管面積に対するFGD5過剰発現の効果を示す（N=8の個々の大動脈外植片）。値は平均±SEMを表す。*P<0,05 Ad-FGD5対shamのアデノウィルス。
【図２８−４】FGD5が、インビトロ及びエクスビボで血管新生を阻害することを示す図である（実施例３を参照）。（Ｋ）FGD5発現が、被覆されたビーズアッセイにおける微小脈管出芽を妨げる。マトリゲル中のＨＵＶＥＣにより覆われたcytodexビーズの代表的な微小脈管出芽。ＨＵＶＥＣは、Ad-FGD5によりトランスフェクトされ、そして、トランスフェクトされていない対照及びshamのアデノウィルス処理された対照と比較された。650X倍率。（Ｌ）トランスフェクトされていない群、shamのウィルスをトランスフェクトされた群、及びAd-FGD5をトランスフェクトされた群のファロイジン染色された微小脈管ネットワーク（Texasレッド蛍光シグナル）の代表的な顕微鏡写真。６５０×倍率。
【図２８−５】FGD5が、インビトロ及びエクスビボで血管新生を阻害することを示す図である（実施例３を参照）。顕微鏡写真の定量的分析は、（Ｍ）ビーズ当たりの相対的な出芽面積、及び、（Ｎ）複数の出芽を有するビーズの数に対するFGD5過剰発現の効果を示す。
【図２８−６】FGD5が、インビトロ及びエクスビボで血管新生を阻害することを示す図である（実施例３を参照）。（Ｏ）トルイジンブルー染色が、形成された管における管腔形成に対するFGD5の効果を示す。650X倍率。（Ｐ）顕微鏡写真の定量的分析は、トランスフェクトされていない対照及びshamのアデノウィルスをトランスフェクトされた対照と比較した、管腔形成を有するビーズの数に対するAd-FGD5過剰発現の効果を示す（N=6の別々の実験、実験当たり群当たり２０ビーズの分析）。値は平均±SEMを表す。*P<0,05 対対照及びshamのアデノウィルス。†P<0,05 対対照。
【図２９−１】FGD5がインビボで血管新生を阻害することを示す図である（実施例３参照）。（Ａ）８日目での免疫欠損SCIDマウスにおけるＨＵＶＥＣにより覆われたcytodexビーズを含む、皮下に植えられたマトリゲルプラグの代表的な肉眼写真。ＨＵＶＥＣは、Ad-FGD5をトランスフェクトされた、shamのアデノウィルスをトランスフェクトされた、又はトランスフェクトされていないものであった（対照）。20X倍率。（Ｂ）shamのアデノウィルス及びAd-FGD5群のマトリゲルプラグの代表的な肉眼写真、これにおいてAd-FGD5群から得られたプラグ内の赤血球の蓄積の欠如が明らかである。50X倍率。（Ｃ）組織学的ヘマトキシリン／エオシン染色が、shamのアデノウィルスをトランスフェクトされたHUVECに対して、Ad-FGD5をトランスフェクトされたHUVECにより覆われたビーズ上のＨＵＶＥＣの蓄積の低下を示す。400X倍率。（Ｄ）顕微鏡写真の定量的分析が、sham Adenovirusをトランスフェクトされたもの及びトランスフェクトされていない対照に対する、Ad-FGD5をトランスフェクトされたものにおける、細胞表面（ビーズ当たりmm²）に対するFGD5の効果を示す。
【図２９−２】FGD5がインビボで血管新生を阻害することを示す図である（実施例３参照）。（Ｅ）免疫組織学的染色が、cytodexビーズを囲むCD31/Cy3+ ECの蓄積を明らかにし、（Ｆ）これは青い蛍光DAPIシグナルとともに共局在化した。cytodexビーズの輪郭が、自動蛍光により可視化された。650X倍率。（Ｇ）細胞−ビーズのプラグデータの定量的分析が、FGD5の、Ad-FGD5群対shamのアデノウィルスをトランスフェクトされた群及びトランスフェクトされていない対照におけるビーズmm²当たりのCD31+表面積に対する効果を示す（N=群当たり8の動物、動物当たり20ビーズが分析された）。値は平均±SEMを表す。*P<0.05 対対照及びshamアデノウィルス群。
【図２９−３】FGD5がインビボで血管新生を阻害することを示す図である（実施例３参照）。（Ｈ）ホールマウントイソレクチンＩＢ４染色（緑のFITCシグナル）により可視化された発達する網膜脈管系の代表的な顕微鏡写真。Ad-FGD5注入は、shamのアデノウィルス対照と比較したときに、脈管発達を厳しく妨げた。400X倍率。（Ｉ）高倍率(650X)顕微鏡写真は、管の崩壊及び短くなった芽を示す。（Ｊ）ホールマウントCD31免疫組織学的染色（赤のCy-3シグナル）が同様のパターンを示す。倍率700X。
【図２９−４】FGD5がインビボで血管新生を阻害することを示す図である（実施例３参照）。（Ｋ）Ad-FGD5を注入された網膜におけるFGD5発現のｑＰＣＲ評価、注入後３日、shamウィルスを注入された対照と比較された。我々の実験の脈管面積の定量化は、FGD5過剰発現が、（L）管の数、（M）分岐の数、（N）合計管長さ（μｍ）における減少を誘発した一方で、（O）平均管長さ（μｍ）における効果は観察されなかったことを示す(N=32の子)。値は平均±SEMを表す。*P<0,05 対shamウィルスを注入された目。
【図２９−５】FGD5がインビボで血管新生を阻害することを示す図である（実施例３参照）。（P）ad-FGD5又はshamアデノウィルスをトランスフェクトされた網膜における%Flk1+細胞のフローサイトメトリー評価、注入後３日。赤のヒストグラフが、アイソタイプの対照を表し、青のヒストグラフがFlk1+シグナルを示す。（Q）棒グラフが、生存（7AAD-）細胞集団中のFlk1+細胞のパーセントを示す。（R）死んだ細胞（7AAD+）のパーセント、アポトーシス細胞(Annexin V+)のパーセント、及び生存細胞（7AAD-/Annexin V-）のパーセントのドットブロットグラフ。（S）Flk1+集団中のアポトーシスAnnexin V+細胞の百分率の定量（N=6のマウスから得られたデータ）。*P<0,05 対shamアデノウィルスをトランスフェクトされたもの。出生後の野生型c57/bl6マウスにおける網膜の脈管発達の間の内因性FGD5機能の評価は、KDR+内皮細胞におけるFGD5の特異的な内因的発現が、開裂したcaspase 3の高レベルと相関することを示した。
【図２９−６】FGD5がインビボで血管新生を阻害することを示す図である（実施例３参照）。出生後３、８、１４日後でのマウス網膜のフローサイトメトリー評価は、（T）１４日目でのKDR-細胞と比較したときの、FGD5+であるKDR+細胞の百分率における特異的な増加、及び（U）８日目からのKDR-集団と比較したときの、KDR+集団における開裂caspase 3+細胞の有意な増加を示した。
【図２９−７】FGD5がインビボで血管新生を阻害することを示す図である（実施例３参照）。（V）出生後３、８、及び１４日目でのマウス網膜におけるKDR+細胞集団におけるFGD5及び開裂したcaspase 3シグナルを示すドットブロットグラフ、染色対照におけるシグナルを示すニセ（mock）を伴う。
【図２９−８】FGD5がインビボで血管新生を阻害することを示す図である（実施例３参照）。（W）KDR+細胞集団において、有意により高い数のFGD5+細胞が、FGD5-細胞と比較したときに、開裂したcaspase 3+であった。（X）FGD5の平均強度（MI）レベルは、KDR-細胞と比較したときに、KDR+細胞において有意により高く、そして、網膜脈管発達の間に徐々に増加した。（Y）FGD5のMIFレベルも、開裂caspase 3-の細胞と比較したときに、開裂caspase 3+の細胞集団において、より高かった。*P<0.05、それぞれの評価された時点についてN=8。脈管系のマウス網膜発達の間の内因性FGD5のsiRNAにより媒介されたサイレンシングは、結果として、過剰な出芽の持続をもたらした。
【図２９Ｚ−１】FGD5がインビボで血管新生を阻害することを示す図である（実施例３参照）。（Z）ホールマウントイソレクチンIB4染色（緑のFITCシグナル）により可視化された発達する網膜脈管系の代表的な顕微鏡写真。SiFGD5注入が、結果として、sishamを注入された対照と比較したときに、分岐した管の剪定の欠如により過度の出芽の持続及び静脈及び動脈の乏しい分化をもたらした。500X倍率。我々の実験の脈管面積の定量は、FGD5サイレンシングが、分岐及び管の数、並びに合計管長さ（μｍ）の増加を誘発する一方で、平均管長さ（μｍ）における減少が観察された（N=18の子）。値は平均±SEMを表す。*P<0,05 対sishamを注入された目。
【図２９Ｚ−２】FGD5がインビボで血管新生を阻害することを示す図である（実施例３参照）。（Z）ホールマウントイソレクチンIB4染色（緑のFITCシグナル）により可視化された発達する網膜脈管系の代表的な顕微鏡写真。SiFGD5注入が、結果として、sishamを注入された対照と比較したときに、分岐した管の剪定の欠如により過度の出芽の持続及び静脈及び動脈の乏しい分化をもたらした。500X倍率。我々の実験の脈管面積の定量は、FGD5サイレンシングが、分岐及び管の数、並びに合計管長さ（μｍ）の増加を誘発する一方で、平均管長さ（μｍ）における減少が観察された（N=18の子）。値は平均±SEMを表す。*P<0,05 対sishamを注入された目。
【図３０−１】FGD5が、EC増殖を阻害し、及び、細胞死を誘発する（実施例３を参照）。（Ａ）shamのアデノウィルスをトランスフェクトされた（白い四角）、又はトランスフェクトされていない対照（黒い丸）と比較した、Ad-FGD5（黒い三角）をトランスフェクトされたＨＵＶＥＣの数。（Ｂ）グラフは、ＦＧＤ５の、ＨＵＶＥＣ中における3-(4,5-ジメチルチアゾール-2-イル)-2,5-ジフェニルテトラソディウムブロミド(MTT)プロセシングに対する効果を示す。（Ｃ）対照siRNAにより処理されたもの又は処理されていない対照と比較した、ＦＧＤ５を標的とするsiRNAにより処理されたＨＵＶＥＣの細胞数、トランスフェクション後３日目（データは、４つの別々の実験から三重に得られた）。値は平均±SEMを表す。*P<0,05 対shamアデノウィルス/shamのsiRNA及び処理されていない対照。（Ｄ）Ad-FGD5若しくはshamウィルスをトランスフェクトされたＨＵＶＥＣ、又はトランスフェクトされていない細胞におけるアポトーシスのフローサイトメトリー評価。
【図３０−２】FGD5が、EC増殖を阻害し、及び、細胞死を誘発する（実施例３を参照）。（Ｅ）Annexin V+の細胞の合計パーセンテージの定量（データは、４つの異なる実験から得られた）。*P<0,05 対shamアデノウィルスをトランスフェクトされた細胞。Ad-FGD5及びshamアデノウィルスをトランスフェクトされたHUVECにおけるｐ５３レベル（Ｆ）及びp21CIP1レベル（Ｇ）の代表的なウェスタンブロット分析。グラフは、バンド密度におけるLicor定量された差異を示す（データは、３つの別の実験から得られた。値は平均±SEMを示す）。*P<0,05 対shamアデノウィルスをトランスフェクトされた細胞。
【図３０Ｈ】FGD5が、EC増殖を阻害し、及び、細胞死を誘発する（実施例３を参照）。（Ｈ）適切な対照と比較した、ＦＧＤ５過剰発現及びサイレンシング後のＮｏｔｃｈシグナル伝達経路遺伝子のＲＮＡ発現のｑＰＣＲ分析（データは、６つの別の実験から二重に得られた）。値は平均±SEMを表す。*P<0,05 対sham siRNA又はshamアデノウィルス処理された細胞。
【図３１−１】Hey1が、FGD5により誘発されたp53依存性アポトーシスを媒介する（実施例３参照）。（Ａ）ＨＵＶＥＣの数、sham virus、Ad-FGD5、Ad-FGD5とsiRNA Hey1、Ad-FGD5とsham siRNA、及びShamウィルスとsham siRNAにより処理された群に続く３日目でのＨＵＶＥＣの数。*P<0,05 対shamウィルス及び対照。‡P<0,05 対Ad-FGD5とsiRNA Hey1。†P<0,05 対Ad-FGD5及びAd-FGD5とsiRNA Hey1。代表的イムノブロットと対応するグラフが、試験された群における（Ｂ）ｐ５３及び（Ｃ）p21CIP1バンド密度の定量を示す。*P<0,05 対対照、shamウィルス、及びAd-FGD5とsiRNA Hey1ノックダウン (データは、４つの異なる実験から二重に得られた)。値は平均±SEMを表す。
【図３１−２】Hey1が、FGD5により誘発されたp53依存性アポトーシスを媒介する（実施例３参照）。（Ｄ）shamウィルス、Ad-FGD5、及びAd-FGD5とsiRNA Hey1をトランスフェクトされたＨＵＶＥＣにおけるアポトーシスのフローサイトメトリー分析。死細胞はPI+であり、アポトーシス細胞はAnnexin V+であり、及び生存細胞はPI-/Annexin V-である。(E) Annexin V+細胞の百分率の定量。*P<0,05 対Ad-FGD5とsiRNA Hey1、shamアデノウィルス、及び対照 (データは、４つの異なる実験から得られた)。平均±SEMの値が示される。
【図３１Ｆ】Hey1が、FGD5により誘発されたp53依存性アポトーシスを媒介する（実施例３参照）。(F)処理されていないHUVEC、及びshamアデノウィルス、Ad-FGD5、又はAd-FGD5とsiRNA Hey1をトランスフェクトされたＨＵＶＥＣの細胞周期分布の分析。示された領域は、左から右に、サブG1、G1、及びS+G2画分をそれぞれ表す。
【図３１Ｇ】Hey1が、FGD5により誘発されたp53依存性アポトーシスを媒介する（実施例３参照）。（Ｇ）種々の実験群におけるサブG1、G1、及びS+G2画分にある細胞の百分率の定量（データは、４つの別の実験から二重に得られた）。値は平均±SEMを表す。*P<0,05 対Ad-FGD5とsiRNA Hey1ノックダウン、shamウィルス、及び対照。
【図３１Ｈ】Hey1が、FGD5により誘発されたp53依存性アポトーシスを媒介する（実施例３参照）。（Ｈ）代表的な顕微鏡写真が、マトリゲル中のcytodexビーズ上に被覆されたＨＵＶＥＣの、ファロイジン染色された微小血管出芽（Texasレッド蛍光シグナル）を示す。HUVECsが、Ad-FGD5、又はAd-FGD5とsiRNA Hey1をトランスフェクトされ、そして、shamウィルス処理された対照と比較された。600X倍率。
【図３１Ｉ】Hey1が、FGD5により誘発されたp53依存性アポトーシスを媒介する（実施例３参照）。（Ｉ）ビーズ当たりの相対的な出芽面積の分析が、FGD5過剰発現細胞におけるHey1ノックダウンの効果を示す。（N=3の別々の実験、１群当たり１実験当たり２０のビーズの分析）。値は平均±SEMを表す。*P<0,05 対shamウィルス。#P<0,05 対Ad-FGD5。
【図３１Ｊ】Hey1が、FGD5により誘発されたp53依存性アポトーシスを媒介する（実施例３参照）。（Ｊ）ドットブロットグラフが、shamウィルス、Ad-FGD5、及びAd-FGD5とsiRNA p53をトランスフェクトされたＨＵＶＥＣにおけるアポトーシスを示す。
【図３１Ｋ】Hey1が、FGD5により誘発されたp53依存性アポトーシスを媒介する（実施例３参照）。（Ｋ）Annexin V+細胞の百分率の定量。*P<0,05 対shamウィルス、及びFGD5とsiRNA p53 (データは、４つの異なる実験から得られた)。値は平均±SEMを表す。
【図３１Ｌ】Hey1が、FGD5により誘発されたp53依存性アポトーシスを媒介する（実施例３参照）。（Ｌ）マトリゲル中のcytodexビーズ上に覆われたＨＵＶＥＣの代表的な微小血管出芽。ＨＵＶＥＣは、Ad-FGD5又はAd-FGD5とsiRNA p53をトランスフェクトされ、そして、shamウィルス処理された対照と比較された。650X倍率。
【図３１Ｍ】Hey1が、FGD5により誘発されたp53依存性アポトーシスを媒介する（実施例３参照）。（Ｍ）ビーズ当たりの相対的出芽面積についてのＦＧＤ５過剰発現細胞におけるｐ５３ノックダウンの効果の定量的分析（N=3 別々の実験、実験当たり群当たり２０のビーズの分析）。値は平均±SEMを表す。*P<0,05 対shamウィルス。 #P<0,05 対FGD5とsiRNA p53。
【図３２−１】ＦＧＤ５がcdc42に結合しそして活性化する（実施例３参照）。（Ａ）ＨＵＶＥＣにおけるＦＧＤ５発現に続くcdc42、rac1、及びRhoAのタンパク質レベルのウェスタンブロット分析。（Ｂ）FGD5過剰発現ＨＵＶＥＣから得られた細胞溶解物におけるＦＧＤ５の共免疫沈降（ＩＰ）。試料のウェスタンブロット分析は、cdc42の選択的沈降を示したが、Rac1又はRhoAの選択的沈降を示さず、一方で、マウスＩｇＧアイソタイプを用いたＩＰは、有効な沈降を示さなかった。３つの異なる実験からの代表的ウェスタンブロット試料が示される。
【図３２−２】ＦＧＤ５がcdc42に結合しそして活性化する（実施例３参照）。Sham Ad又はAd-FGD5をトランスフェクトされたHUVECからの細胞溶解物におけるＧＴＰを結合したスモールＧタンパク質の化学発光測定が、血清活性化に応答した、(C)GTP-Rho-A、(D)GTP-Rac1、及び(E)GTP-cdc42のレベルを示す（データは４つの別々の実験から２重に得られた）。値は平均±SEMを表す。*P<0,05 対shamウィルス。
【図３２−３】ＦＧＤ５がcdc42に結合しそして活性化する（実施例３参照）。（Ｆ）３つの異なる実験の代表的な顕微鏡写真、ＨＵＶＥＣの細胞質におけるＦＧＤ５の核周囲の局在化を示す（赤の蛍光シグナル；核は青のＤＡＰＩにより染色された）。ＦＧＤ５シグナルは、cdc42（緑の蛍光シグナル）と共局在する。1000X倍率。（Ｇ）ＦＧＤ５（赤いシグナル）は、接着斑マーカーザイキシン（緑のシグナル）と共局在しない。1000X倍率。
【発明を実施するための形態】
【００２１】
発明の詳細な説明
【００２２】
用語
【００２３】
語「新脈管形成（neovascularisation）」は、本明細書内において用いられたときに、脈管形成及び血管新生の組み合わせられたプロセスの両方をいう。既存のものからの血管の発達をいう語「血管新生」と対照的に、「脈管形成（vasculogenesis）」は、既存血管がない場合の血管の形成である。脈管形成は、最初、胚発生の間にだけ起こると考えられていた、現在はこのプロセスは成体の有機体においても起こることが知られているけれども。脈管形成は、局所的な合図（例えば増殖因子及び細胞外マトリックス）に応答した内皮前駆細胞（血管芽細胞）の遊走及び分化並びに新血管（血管樹）の形成を含む。これらの血管樹は、次に、血管新生を通じて、剪定され及び延長される。循環する内皮前駆細胞（幹細胞の誘導体）が、程度は変わるが、新脈管形成に寄与すると知られている。
【００２４】
語「虚血性心臓血管又は脳血管事象」又は短い「虚血性事象」は、本明細書において用いられるときに、器官又は組織への血液供給の妨害をいう。虚血性事象はしばしば血栓の結果でありえ、そして、アテローム性動脈硬化狭窄を有する患者において、塞栓がアテローム性動脈硬化症病変から除去されるときに、最もしばしば引き起こされる。その結果の狭窄、又はこの障害物に起因する動脈又は他の脈管の狭窄化若しくは閉塞が、結果として、非常に多くの悪い状態をもたらし、その多くが対象にとって重度の結果を有する。虚血性心臓血管又は脳血管事象は、本明細書内において言及されたときに、卒中／一過性虚血性発作又は脳血管発作、心筋梗塞、心筋虚血（狭心症）、心筋虚血に伴ういずれかの心筋症（例えば症候性大動脈狭窄、HOCM）、脳出血、周辺（不安定）狭心症（peripheral(unstable) angina pectoris）、間歇性跛行（末梢アテローム性動脈硬化症動脈疾患）、及び他の血管において生じる主な異常を包含するが、これらに限定されない。語「血管において生じる異常」は、冠状動脈及び脳血管事象並びに末梢血管疾患への言及を含む。語「虚血性心臓血管又は脳血管事象」は、しばしば、語「心臓血管、脳血管、及び末梢動脈疾患」（本明細書においてまとめて「心臓血管疾患」と呼ばれる）により広範に包含される病状の急性期である。そのような疾患は、脳血管疾患及びまた末梢動脈疾患を包含する。
【００２５】
語「虚血」は、本明細書内において用いられるときに、血液供給の完全な又は相対的な不足、又は、器官、体の部分、又は組織への不十分な血流をいう。相対的な不足は、血液供給（酸素運搬）と血液要求（組織による酸素消費）との間の不一致をいう。概して血管内の要因に起因する、血液供給の制限は、最もしばしば、血栓塞栓症（血栓）又はアテローム性動脈硬化（脂質を含むプラークが動脈の管腔を塞ぐ）により血管の狭窄又は閉塞により引き起こされるが、これらに限定されない。虚血は、組織の損傷又は機能不全を結果としてもたらす。心筋の虚血は、狭心症をもたらし、及び本明細書内において、虚血性心臓疾患と呼ばれる。
【００２６】
語「心臓血管疾患」（CVD）は、一般に、動脈瘤、狭心症、不整脈、アテローム性動脈硬化症、心筋症、脳血管障害（脳卒中）、脳血管疾患、先天性心疾患、うっ血性心不全、冠状動脈性心臓病（CHD）（冠動脈疾患（CAD）、虚血性心疾患、又はアテローム性動脈硬化性心疾患とも呼ばれる）、拡張型心筋症、拡張機能障害、心内膜炎、心不全、高血圧（高い血圧）、肥大型心筋症、心筋梗塞（心臓発作）、心筋炎、末梢血管疾患、小血管疾患、及び静脈血栓塞栓症を含む、心臓及び循環系に影響する多くの疾患を言う。本明細書内において用いられるときに、語「心臓血管疾患」は、虚血；身体的損傷（血管内膜切除（endartiectomie）、バルーン血管形成）に起因する又は慢性損傷（アテローム性動脈硬化症を含む）の結果としての動脈損傷（内皮系統への損傷）；心筋損傷（心筋壊死）；及び筋壊死への言及を含む。一般に、新脈管形成応答を引き起こすいずれかの生理学的又は病態生理学的状態が、語「心臓血管疾患」により、本明細書内において用いられるときに、包含される。
【００２７】
語「病理学的新脈管形成」は、新脈管形成の望ましくない状態をいう。該語は、器官又は組織における望ましくない新脈管形成、例えば腫瘍における新脈管形成又は糖尿病を患う患者における網膜及び他の血管床における新血管の病理学的形成における新脈管形成をいうがこれらに限定されない。該語は、（アテローム性動脈硬化性プラーク新脈管形成に基づく）アテローム性動脈硬化性プラークの不安定化もいう。
【００２８】
語「ポリペプチド」、「ペプチド」、及び「タンパク質」は、アミノ酸残基のポリマーをいうために、本明細書内において交換可能に用いられる。該語は、１又はそれより多くのアミノ酸残基が、対応する天然に生じるアミノ酸のアナログ又は模倣物であるアミノ酸ポリマーにあてはまり、及び、天然に生じるアミノ酸ポリマーにあてはまる。ポリペプチドは、例えば糖タンパク質を形成する為の炭水化物残基の付加により、修正されてよい。語「ポリペプチド」、「ペプチド」、及び「タンパク質」は、糖タンパク質及び任意の他の修飾を含むタンパク質、並びに、非糖タンパク質及び別に修飾されていないタンパク質を包含する。
【００２９】
タンパク質又は遺伝子の「発現に影響する」及び「発現を調節する」という語は、本明細書内において用いられるときに、該発現を制御する、コントロールする、ブロックする、阻害する、刺激する、増強する、活性化する、模倣する、バイパスする、正しくする、除去する、及び／又は置換すると理解されるべきであり、より一般的な用語では、該発現に、例えばそのタンパク質をコードする遺伝子及び／又はその遺伝子産物それ自体の発現に影響を及ぼすことにより、干渉すると理解されるべきである。
【００３０】
語「対象」又は「患者」は、本明細書内において交換可能に用いられ、そして、有機体；哺乳動物（例えばヒト、非ヒト霊長類、マウス、ブタ、ウシ、ヤギ、ネコ、ウサギ、ラット、モルモット、ハムスター、ウマ、サル、ヒツジ、又は他の非ヒト哺乳動物；及び、他の非哺乳動物（例えば非哺乳動物脊椎動物、例えばトリ（例えばニワトリ又はダック）、両生類、及び魚、及び非哺乳動物無脊椎動物を含む）を含むが、これらに限定されない。
【００３１】
語「相同な」は、本明細書内において用いられるときに、２つのポリペプチドの間の又は２つの核酸分子の間の配列類似性又は配列同一性をいう。該２つの比較される配列の両方における位置が、同じ塩基又はアミノ酸のモノマーサブユニットにより占められる場合、例えばもし２つのDNA分子のそれぞれにおける位置がアデニンにより占められるならば、そのときはこれら分子はその位置で相同である。２つの配列の間の相同性の百分率は、比較された位置の数により割り算された、該２つの配列により共有されるマッチする又は相同な位置の数×１００の関数である。相同配列（本明細書内において「ホモログ」と呼ばれる）は、好ましくは、互いに、50、60、70、80、90、95、96、97、98、99、99.5％超、又はそれより多くの％の配列同一性を有する。本明細書内において与えられる遺伝子及びそれらの配列は、マウスフォームである。当業者は、任意の哺乳類のホモログ、好ましくはヒトのホモログが、ここに含まれることが明らかに意図されることを理解するであろう。
【００３２】
語「配列同一性」は、任意の或る核酸配列又はアミノ酸配列と標的核酸配列又は標的アミノ酸配列、それぞれの間の類似性の程度をいう。類似性の程度は、配列同一性のパーセントとして表される。配列同一性のパーセントは、整列された核酸配列におけるマッチした位置の数を決定し、整列されたヌクレオチドの総数によりマッチした位置の数を割り、そして１００をかけることにより計算される。マッチした位置は、同一のヌクレオチドが整列された核酸配列における同じ位置で現れる位置をいう。配列同一性のパーセントは、任意のアミノ酸配列についても決定されうる。配列同一性のパーセントを決定する為に、クエリー核酸又はアミノ酸配列が、BLASTN version 2.0.14及びBLASTP version 2.0.14を含むBLASTZの独立型バージョン（stand-alone version）からのBLAST 2 Sequences（Bl2seq）プログラムを用いて、データベース核酸又はアミノ酸配列と比較される。このBLASTZの独立型バージョンは、米国政府の国立生物工学情報センターのウェブサイト（(World Wide Web at "ncbi" dot "nlm" dot "nih" dot "gov"）から得られる。Bl2seqプログラムをどのように使用するかを説明する指示は、BLASTZに付随するreadmeファイルに見られる。
【００３３】
語「医薬的に許容できるキャリア」は、治療剤、例えば抗体又はポリペプチド、遺伝子、及び他の治療剤、の投与の為のキャリアをいう。該語は、組成物を受け取る個体に有害な抗体の産生をそれ自体は誘発しない任意の医薬的キャリアをいい、これは過度の毒性無く投与されうる。適切なキャリアは、大きな、ゆっくりと代謝される巨大分子、例えばタンパク質、ポリサッカライド、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、ポリマーのアミノ酸、アミノ酸コポリマー、及び不活性なウィルス粒子など、でありうる。そのようなキャリアは、当技術分野の当業者に周知である。
【００３４】
治療的組成物中の医薬的に許容できるキャリアは、液、例えば水、生理食塩水、グリセロール、及びエタノールなど、を含みうる。追加的に、補助物質、例えば湿潤剤又は乳化剤、ｐH緩衝性物質、及び同様物など、がそのようなビヒクル中に存在しうる。典型的には、該治療組成物は、液状の溶液又は分散物として注入可能なものとして調製され、注入の前の液状ビヒクル中の溶液又は懸濁物に適した固形物としても調製されうる。リポソームが、医薬的に許容できるキャリアの定義内に包含される。
【００３５】
語「治療的に有効な量」は、本明細書内において用いられるときに、目的の疾患又は状態を処置し、改善し、又は予防するための治療剤の量、又は検出可能な治療的又は予防的効果を示すための治療剤の量をいう。その効果は、例えば、化学的マーカー又は抗原レベルにより検出されうる。治療的効果は、身体的症状の減少、例えば減少した体温、も包含する。対象のための正確な有効量は、該対象のサイズ及び健康状態、該状態の性質及び程度、並びに投与の為に選択された治療剤又は治療剤の組み合わせに依存するであろう。すなわち、正確な有効量を予め特定することは有用でない。しかしながら、或る状況の為の有効量は、通常の実験により決定されることができ、そして、臨床医の判断の範囲内である。特に、本発明の組成物は、対象における心臓血管事象又は脳血管事象及び／又は付随する生物学的又は身体的兆候の発生を処置し、改善し、又は予防する為に用いられうる。
【００３６】
本発明の目的の為に、有効用量は、投与される個体において、ポリヌクレオチド、ポリペプチド、又は抗体の組成物の約0.01mg/kg〜50mg/kg又は0.05mg/kg〜約10mg/kgであろう。
【００３７】
語「機能的断片」は、機能的変異体又は機能的誘導体であるタンパク質の短くされたバージョンをいう。タンパク質の「機能的変異体」又は「機能的誘導体」は、そのアミノ酸配列が元のタンパク質のアミノ酸配列から、１又はそれより多くのアミノ酸残基の置換、欠失、及び／又は付加であって、そのアミノ酸配列における変化にもかかわらず、該機能的変異体又は誘導体が、当技術分野の当業者にとって検出可能である元のタンパク質の生物学的活性の少なくとも１つを少なくとも一部維持するような上記置換、欠失、及び／又は付加によって得られるタンパク質である。機能的変異体は、一般に、それが得られるタンパク質と、少なくとも50%の相同であり、(好ましくはアミノ酸配列が少なくとも50%同一である)、有利には少なくとも70%相同であり、さらにより有利には少なくとも90%相同である。機能的変異体は、タンパク質のいずれかの機能的な部分であってもよく、本件における該機能は特には新脈管形成を調節する能力であるが、これに限定されない。好ましくは、アミノ酸配列は、保存的置換によって主に又は保存的置換によってだけ、天然タンパク質配列と異なる。より好ましくは、該タンパク質は、天然タンパク質配列と70%又はそれより多く、80%又はそれより多く、90%又はそれより多くの、さらにより好ましくは95%又はそれより多くの配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、最適にはそれらの配列との100%同一性を有するアミノ酸配列を含む。「機能的」は、本明細書内において用いられるときに、哺乳類において機能的であること、好ましくはヒト患者において機能的であることを意味する。
【００３８】
語「抗体」は、抗原結合性ペプチドへの言及を含み、及び、抗体、モノクローナル抗体をいい、完全なイムノグロブリン若しくは抗体又はイムノグロブリン分子の任意の機能的断片をいう。そのようなペプチドの例は、完全抗体分子、抗体断片、例えばFab、F(ab')2、相補性決定領域(CDR)、VL(軽鎖可変領域)、VH(重鎖可変領域)、及びそれらの任意の組み合わせ、又は抗体ペプチドの任意の他の機能的部分を包含する。語「抗体」は、イムノグロブリン遺伝子又は複数のイムノグロブリン遺伝子により実質的にコードされるポリペプチド、又は分析物（抗原）と特異的に結合し及び認識するその断片をいう。しかしながら、種々の抗体断片が無傷抗体の消化の観点で規定されうる一方で、当業者は、そのような断片が化学的に又は組み替えDNA方法論を用いることによってデノボで合成されうることを理解するであろう。すなわち、語「抗体」は、本明細書内において用いられるときに、抗体断片、例えばシングル鎖Fv、キメラ抗体(すなわち異なる種からの定常領域及び可変領域を含む)、ヒト化抗体(すなわち、非ヒト源からの相補性決定領域(CDR)を含む)、及びヘテロ結合抗体(例えば、二重特異的抗体)を包含する。
【００３９】
語「誘発する」又は「刺激する」は、本明細書内において新脈管形成の文脈において用いられるときに、新血管の改善された成長をいい、及び、脈管構造の奇形を防ぐことへの言及を包含する。
【００４０】
好ましい実施態様の説明
【００４１】
RIKEN cDNA 9430020K01遺伝子の遺伝子産物
【００４２】
RIKEN cDNA 9430020K01遺伝子が、マウス胚形成の間の脈管発達の種々のステージのゲノムワイドスクリーニングの際に発見され、これは既知のクローン並びに完全に未知であり且つ文書化されていないクローンを同定した（ESTクローン又はRIKENクローンと称される）。これらの候補遺伝子のいくつかは、両生類オルソログを有さなかった、そして、分離されたヒト大動脈及び高度に脈管形成された組織における遺伝子発現レベルを、他の無関係の器官に対して、ｑPCRによって比較することにより、それらの脈管系特異的発現によって、さらに選択された（図１参照）。次に、内皮特異的発現が、内皮初代細胞系列、より特にはHUVECを用いて、及びインビボでマウスにおいてさらに分析された。9430020K01Rikが、発達中のマウスにおける新脈管形成の間に上方制御され（図２参照）、及び、脈管ネットワークにおいて専ら発現された。
【００４３】
RIKEN cDNA 9430020K01遺伝子産物が、今まで知られている最も強力な顕著な新脈管形成制御遺伝子（産物）、VEGFファミリー、と比較したときの、同様のもしくはより強力な新脈管形成、すなわち新たな脈管の形成、を誘発する為の純然たる能力により選択された。
【００４４】
Agtrl1/Apelin遺伝子の遺伝子産物
【００４５】
Agtrl1遺伝子は、Gタンパク質に結合したレセプター遺伝子ファミリーのメンバーをコードする。該コードされたタンパク質は、アデニレートシクラーゼ活性を阻害するapelinレセプター（APJレセプターとしても知られている）であり、そして、その既知の機能の一つが、それが、高血圧的効果を発揮することによるアンジオテンシンIIの血圧作用に対する対抗制御的役割（a counter-regulatory role）を果たすことである。オルタナティブスプライシングから結果する２つの転写物変異体が同定され、その両方が本明細書内に示されている。Apelinは、該レセプターのタンパク質リガンドである。
【００４６】
Agtrl1が、トランスクリプトームワイドスクリーニングにおいて、胚の脈管形成のレギュレーターとして同定された。ゼブラフィッシュ幼生のホールマウント（whole mount）インシチュデータが、受精後12時間（hpf）以降Agtrl1の脈管系特異的発現を示した。Agtrl-1ノックダウンが、ゼブラフィッシュ幼生における血管奇形成を結果すると分かった。モルホリノにより媒介されたAgtrl-1サイレンシングも、注入されていない幼生と比較して、Fli::gfpミュータントにおいて心臓及び血管の奇形を結果した。アノーテーション「Agtrl1/apelin」は、本明細書内において用いられるときに、該レセプター及びそのリガンドの組合せをいい、そして、リガンドにより媒介されたレセプター活性化への言及を含む。Agtrl1/apelinが、特定のEPC集団の動員を制御することが発見された。Agtrl1は、内皮細胞において及びcKit+/Flk+ EPC集団において特異的に発現された。Agtrl1特異的リガンドapelinの注入は、骨髄及び血液におけるcKit+/Flk+のEPC集団を増加した。
【００４７】
心臓虚血後のapelinタンパク質及びRNAレベルの特異的な制御が研究され、そして、apelinが、心筋虚血（MI）後、虚血組織において、タンパク質レベル及びRNAレベルの両方において増加されるが、後肢虚血（HLI）４日後には増加されないことが発見された。
【００４８】
さらに、Agtrl1が、EPC動員を成体有機体においてMIに応答して制御することが発見された。cKit+/Flk+/Agtrl1+のEPCの増加が、MI後の虚血組織において見られたが、HLIにおいて見られなかった一方で、apelinの局所的注入は、cKit+/Flk+のEPCを、HLIにおける虚血組織に補充する。
【００４９】
Stabilin1及び2遺伝子の遺伝子産物
Stabilin1及び2は、マウス及びゼブラフィッシュの内皮細胞内張りにおいて（Stabilin 2）及びゼブラフィッシュのリンパ向性（lymphogenic）内張りにおいてインビボで特異的に発現される遺伝子産物である。ゼブラフィッシュ幼生におけるモルホリノにより媒介された遺伝子サイレンシングは、異常側枝形成を伴うセグメント間脈管形成の奇形を結果した。すなわち、本明細書内で言及されるstabilin類は、新脈管形成を誘発する特性を示す。
【００５０】
TNFaip8l1遺伝子の遺伝子産物
【００５１】
プロテイン８様１を誘発可能な腫瘍壊死因子α（TNFaip8l1）は、マウス及びゼブラフィッシュの内皮細胞内張りにおいて特異的に発現される。該タンパク質は、デスエフェクタードメイン（DED）を有し、これはカスパーゼにより媒介されるアポトーシスの阻害を示唆する。ゼブラフィッシュ幼生におけるモルホリノにより媒介された遺伝子サイレンシングは、異常な側枝形成を伴うセグメント間脈管形成の奇形を結果した。ヒト臍帯脈管内皮細胞（HUVEC）におけるこの遺伝子のインビトロノックダウンは、同様の効果を示した。TNFaip8l1についてサイレンシングされたHUVECは、サイレンシングされていない細胞と比べて、より少ない増殖及び遊走を示し、及び、管ネットワークをより少なく形成することができると分かった（新脈管形成の間の内皮の全ての基本的な機能）。これらの効果は、該サイレンシングされた細胞におけるアポトーシスの誘導により引き起こされると分かった。従って、TNFaip8l1は、抗アポトーシス機能性を示す。今、機能的な血行力学的関連血管床における未成熟漏出性新毛細血管血管床から、無関係の機能的でない毛細血管の除去及び既存脈管の成熟により、TNFaip8l1遺伝子が、脈管剪定（vascular pruning）、脈管の成熟及び再構築に関与することが発見された。TNFaip8l1遺伝子発現は、脈管剪定及び脈管成熟（反応性脈管形成、炎症、腫瘍新脈管形成、及び虚血性新脈管形成）をネガティブに制御する。TNFaip8l1遺伝子又はその遺伝子産物のサイレンシングは、虚血組織において、内皮細胞生存を誘発し及び新脈管の形成を促進し、そしてすなわち、虚血性疾患の単剤治療又は補助的治療として用いられうる。それ故に、本発明に従う該医薬組成物において、TNFaip8l1の遺伝子産物をブロックすることができる分子を含めることが有利である。
【００５２】
TNFaip8遺伝子の遺伝子産物
【００５３】
腫瘍壊死因子α誘発可能タンパク質８（TNFaip8）は、マウス及びゼブラフィッシュの内皮細胞内張りにおいて特異的に発現される。該タンパク質は、デスエフェクタードメイン（DED）を含み、これは、カスパーゼにより媒介されるアポトーシスの阻害を示唆する。ゼブラフィッシュ幼生におけるモルホリノにより媒介された遺伝子サイレンシングは、異常側枝形成を伴うセグメント間脈管形成の奇形を結果した。ヒト臍帯脈管内皮細胞（HUVEC）におけるこの遺伝子のインビトロノックダウンは、同様の効果を示した。TNFaip8についてサイレンシングされたHUVECは、サイレンシングされていない細胞と比較して、より少ない増殖及び遊走を示し、及び、管ネットワークをより少なく形成することができると分かった（新脈管形成の間の内皮の全ての基本的機能）。これらの効果は、サイレンシングされた細胞におけるアポトーシスの誘発により引き起こされると分かった。それ故に、TNFaip8は、抗アポトーシス機能性を示す。今、機能的血行力学的関連脈管床における未成熟漏出性新毛細血管血管床から、無関係な機能的でない毛細血管の除去及び既存脈管の成熟により、TNFaip8遺伝子が脈管剪定、脈管成熟及び再構築に関与することが発見された。TNFaip8遺伝子発現は、脈管剪定及び脈管成熟をネガティブに制御する（反応性脈管形成、炎症、腫瘍新脈管形成、及び虚血性新脈管形成）。TNFaip8遺伝子又はその遺伝子産物のサイレンシングは、虚血性組織において内皮細胞生存を誘発し、及び、新脈管の形成を促進し、すなわち、虚血性疾患についての単剤治療又は補助治療として用いられうる。それ故に、本発明に従う該医薬組成物に、TNFaip8の遺伝子産物をブロックすることができる分子を含めることが有利である。
【００５４】
FGD5遺伝子の遺伝子産物
【００５５】
FGD5は、精力的なスクリーニング後に選択された遺伝子である。脈管系におけるFGD5の特異的な時間的且つ空間的発現が、発達するゼブラフィッシュにおけるホールマウントインシチュハイブリダイゼーションによって及びFlk1+マウス血管芽細胞におけるｑPCR及びゲノムワイドマイクロアレイ分析によって同定され、一方で、ｑPCR分析は、成体C57bl/6マウスにおける他の器官に対して大動脈及び頸動脈における増加したFGD5発現を示した。加えて、高いFGD5発現レベルが、関連しない細胞系列と比較して、初代ヒト内皮細胞（EC）において検出された。これらのデータは、FGD5が、成熟EC及び内皮前駆細胞において主に発現されることを示す。FGD５遺伝子は、すなわち、内皮特異的な機能を有する。siRNAトランスフェクションによるFGD5発現のノックダウンは、２DマトリゲルにおいてインビトロでヒトECの新規脈管を形成する能力を有意に増した一方で、FGD５ｃDNA発現性ベクターのアデノウィルストランスフェクションは、新規脈管形成を阻害した。同様の効果が、エクスビボの大動脈リング新脈管形成アッセイにおいて観察され、これにおいて、C57bl/6マウスから分離された大動脈セグメントにおけるFGD５のｃDNAの過剰発現が、毛細血管構造の出芽を妨げた。加えて、sephadexビーズ上で増殖された、FGD５アデノウィルスをトランスフェクトされたECが、sham（ニセのもの）をトランスフェクトされた対照と比較して、インビトロフィブリンゲル環境において、stalk及びtip細胞の形成における重度の阻害を示した（図１０A）。SCIDマウスにおける、FGD5を形質導入されたヒトECにより被覆されたsephadexビーズとのマトリゲルミックスのインビボでの皮下注入が、マトリゲルプラグにおいて、shamウィルスをトランスフェクトされたECを有するビーズを受け取った動物と比較して、新規脈管の形成をブロックし（図１０B）、及び、EC増殖をブロックした（図１０C）。FGD５のこの阻害機能は、EC生存に対するその効果により説明され、というのも、ＦＧＤ５過剰発現は、フローサイトメトリー評価においてannexin V+細胞のパーセンテージの上昇により示されるアポトーシスを誘発し、一方で、該遺伝子のｓｉＲＮＡノックダウンはannexin V+細胞（アポトーシス細胞及びプレアポトーシス細胞）の数を減少したからである。ＦＧＤ５は、ウェスタンブロット分析により示されるとおり、ＥＣ増殖を阻害し、及び、P53-P21により媒介された細胞周期停止をアクティブにすることによりインビトロでアポトーシスを誘発した。さらなる研究は、Ｐ５３誘発が、ＦＧＤ５による共転写因子HEY1の制御に依存的であり、そして、ＨＥＹ１経路のｓｉＲＮＡブロックが、ＥＣにおけるFGD5表現型を消し去ったことを示した。ＦＧＤ５を介したＨＥＹ１上方制御は、レセプターnotch1/4及びそれらのリガンドＤＬＬ４の増加した発現と関連付けられ、これはnotch1/4シグナル伝達カスケードを介したＨＥＹ１の転写活性化を指し示す。
【００５６】
ＦＧＤ５は、新規脈管の形成の見込みある遺伝子制御因子であり、これは成熟した及び前駆の内皮細胞において特異的に発現される。ＦＧＤ５は、早期の脈管剪定の見込みある制御因子であり、なぜならそれは、notchシグナル伝達カスケードにおけるＨＥＹ１共転写因子を介し細胞周期停止及びp53-p21媒介性アポトーシスを誘発するからである。
【００５７】
理論にとらわれることなく、我々は、この遺伝子が、脈管再構築、剪定、成熟、及び脈管安定化において重要な役割を果たすと考える。ＦＧＤ５遺伝子は、サイレンシングの際の新規毛細血管形成の促進とともに、ＥＣ選択、毛細血管剪定、及びＥＣ生存の促進における顕著に見込みある遺伝子であると示された。加えて、マトリゲルプラグにおける細胞懸濁物中のＦＧＤ５の過剰発現が、腫瘍脈管形成を強力に防ぐ（図１０Ｂ／Ｃにおいて示されるとおり）。すなわちＦＧＤ５遺伝子産物は、本明細書内において言及されるときに、新脈管形成を阻害する。
【００５８】
マウス及び発達するゼブラフィッシュモデル研究における遺伝子ＦＧＤ５の発現は、内皮前駆細胞及び成熟ＥＣに制限されることが発見された。本発明の実施態様において、該局面は、他の細胞及び組織においても用いられ及び発現されうる。インビトロ及びインビボでの機能獲得及び喪失（gain and loss-of-function）アッセイは、ＦＧＤ５が後期脈管再構築に関与して、余分な脈管構造を除去することを実証した。我々の研究は、ＦＧＤ５が、その直接の標的ｃｄｃ４２に結合し及び活性化するＲｈｏグアニン−ヌクレオチド交換因子として機能し、そして、内皮細胞においてＨｅｙ１依存性のｐ５３媒介アポトーシスを促進することを示す。これらの発見は、ＦＧＤ５を、内皮細胞除去による後期脈管発達の間の脈管剪定の新規の、重要な制御因子として同定する。ＦＧＤ５及びその遺伝子産物の治療的使用方法の実施態様のより多くの詳細が、実施例３に提供される。
【００５９】
本発明の化合物
【００６０】
本発明は、他の局面において、新脈管形成を（誘発又は阻害により）調節することができる化合物を提供する。本発明のこの実施態様は、とりわけ、HUVECにおけるRIKEN cDNA 9430020K01のノックダウンにおいて、細胞培養物はＧ１期における細胞周期停止により細胞増殖を顕著に阻害するという発見に基づく。また、付随して、より多くのアポトーシスが、RIKEN cDNA 9430020K01をサイレンシングされた内皮細胞において同定された。一致して、ＨＵＶＥＣによる２Ｄマトリゲルアッセイにおける管形成が、RIKEN cDNA 9430020K01ノックダウンにより有意に減衰された一方で、ＨＵＶＥＣの遊走が減少された。
【００６１】
RIKEN cDNA 9430020K01の遺伝子機能が、マウス網膜モデルにおいて評価された。RIKEN cDNA 9430020K01のノックダウン及び過剰発現が、出生直後１日目でのC57bl/6子マウスの網膜におけるｓｈＲＮＡ及びｃＤＮＡ発現ベクターのレンチウィルス感染により誘発された。RIKEN cDNA 9430020K01遺伝子は、マウス発生における胚の脈管形成の間、脈管系において特異的に発現される。RIKEN cDNA 9430020K01のノックダウンは、インビボでの網膜において、ＥＣの細胞増殖を妨げ及びアポトーシスを増加する。
【００６２】
同様の実験が、本明細書内に記載された他の遺伝子及び遺伝子産物について実施された。これらの他の遺伝子及び遺伝子産物について、該遺伝子又は遺伝子産物が新脈管形成プロセスを調節する様式に依存して、同様の又は反対の効果が、上記で示されたとおり観察された。
【００６３】
それ故に、本発明は、新脈管形成を（誘発又は阻害により）調節することにおける使用の為の以下の化合物又は化合物の組み合わせを提供する：
- RIKEN cDNA 9430020K01、Agtrl1、Apelin、Stabilin 1、Stabilin 2、TNFaip8l1、TNFaip8、及びFGD5、並びにそれらのホモログからなる群から選ばれる遺伝子を含む分離された核酸分子;
- RIKEN cDNA 9430020K01、Agtrl1、Apelin、Stabilin 1、Stabilin 2、TNFaip8l1、TNFaip8、及びFGD5からなる群から選ばれる遺伝子によりコードされる又はこれらの遺伝子のホモログによりコードされる遺伝子産物、及びこれらの機能的断片;
- RIKEN cDNA 9430020K01、Agtrl1、Apelin、Stabilin 1、Stabilin 2、TNFaip8l1、TNFaip8、及びFGD5からなる群から選ばれる遺伝子の遺伝子産物若しくはその機能的断片又はこれらの遺伝子のホモログによりコードされる遺伝子産物若しくはその機能的断片に対して向けられた抗体又はその誘導体、但し該誘導体は好ましくはscFv断片、Fab断片、キメラ抗体、二重機能的抗体、細胞内抗体、及び抗体に由来する他の分子からなる群から選ばれたものである;
- RIKEN cDNA 9430020K01、Agtrl1、Apelin、Stabilin 1、Stabilin 2、TNFaip8l1、TNFaip8、及びFGD5並びにこれらのホモログからなる群から選ばれる遺伝子又は該遺伝子のｍＲＮＡ遺伝子産物に、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で結合することができるアンチセンス分子、特にはアンチセンスRNA若しくはアンチセンスオリゴデオキシヌクレオチド、RNAi分子(siRNA又はmiRNA)又はリボザイム;
- RIKEN cDNA 9430020K01、Agtrl1、Apelin、Stabilin 1、Stabilin 2、TNFaip8l1、TNFaip8、及びFGD5並びにこれらのホモログからなる群から選ばれる遺伝子の遺伝子産物の生物学的活性を干渉する小分子、及び
- RIKEN cDNA 9430020K01、Agtrl1、Apelin、Stabilin 1、Stabilin 2、TNFaip8l1、TNFaip8、及びFGD5、並びにこれらのホモログからなる群から選ばれる遺伝子と又はこれらの遺伝子産物と相互作用することができる（グリコール）タンパク質、ホルモン、及び他の生物学的に活性な化合物。
【００６４】
当技術分野の当業者は、RIKEN cDNA 9430020K01、Agtrl1、Apelin、Stabilin 1、及びStabilin 2の発現が、新脈管形成を誘発し又は刺激する為に、増加されなければならないことを理解するであろう。同様に、これらの遺伝子産物の治療的投与は、新脈管形成を刺激するであろう。化合物、例えば抗体、アンチセンス分子、及び、これらの遺伝子の遺伝子産物の生物学的活性に干渉する小分子などは、新脈管形成を阻害することにおける使用の為に必要とされる。
【００６５】
当技術分野の当業者は、TNFaip8l1、TNFaip8、及びFGD5の発現が、新脈管形成を誘発し又は刺激する為に、減少されなければならないことを理解するであろう。同様に、これら遺伝子の遺伝子産物の治療的投与は、新脈管形成を阻害するであろう。化合物、例えば抗体、アンチセンス分子、及び、これらの遺伝子の遺伝子産物の生物学的活性に干渉する小分子など、は新脈管形成を誘発し又は刺激することにおける使用の為に必要とされる。
【００６６】
それ故に、本発明は、治療化合物として、本明細書内に記載された新脈管形成調節性遺伝子のポリペプチド遺伝子産物に対して向けられた抗体又はその誘導体（例えばscFv断片、Fab断片、キメラ抗体、二重機能的抗体、細胞内抗体、及び抗体から得られた他の分子）を提供する。本発明の抗体は、例えばリガンド−レセプター相互作用又はタンパク質の酵素機能が妨害されるように、タンパク質の機能に干渉する効果を有する。非常に適切なブロッキング抗体はデンドリマーである。そのようなデンドリマーは、該ポリペプチド遺伝子産物の凝集を結果しうる。本明細書内において、レセプターアンタゴニストも一般に想定される。
【００６７】
本発明はさらに、治療化合物として、本明細書内に記載された新脈管形成調節性遺伝子の遺伝子又はｍＲＮＡと、ストリンジェントな条件下で結合するアンチセンス分子、特にはアンチセンスＲＮＡ若しくはアンチセンスオリゴデオキシヌクレオチド、モルホリノ、ＲＮＡｉ分子、又はリボザイムを提供する。
【００６８】
好ましくは、本発明の上記化合物は医薬として用いられる。本発明の医薬は、病理学的新脈管形成の処置又は予防の為に適切に用いられうる。
【００６９】
他の局面において、本発明はさらに、本発明に従う化合物及び、上記で説明されたとおりの適切な添加物、キャリア、又は希釈剤を含む、新脈管形成を阻害する為の医薬組成物を提供する。
【００７０】
好ましくは、本発明に従う新脈管形成を阻害する為の医薬組成物はさらに、TNFaip8l1、TNFaip8、及び／若しくはFGD5から選ばれる少なくとも１つの遺伝子産物、並びに／又は、
- RIKEN cDNA 9430020K01、Agtrl1、Apelin、Stabilin 1、及びStabilin 2から選ばれる遺伝子の遺伝子産物に対して向けられた抗体又はその誘導体、但し該誘導体は好ましくはscFv断片、Fab断片、キメラ抗体、二重機能的抗体、細胞内抗体、抗体から得られた他の分子、及び該遺伝子産物のアンタゴニストからなる群から選ばれたものである;
- RIKEN cDNA 9430020K01、Agtrl1、Apelin、 Stabilin 1、及びStabilin 2から選ばれる遺伝子の遺伝子産物の生物学的活性に干渉する小分子;
- RIKEN cDNA 9430020K01、Agtrl1、Apelin、Stabilin 1、及びStabilin 2から選ばれる遺伝子又は遺伝子のｍＲＮＡとストリンジェントな条件下で結合するアンチセンス分子、特にはアンチセンスＲＮＡ若しくはアンチセンスオリゴデオキシヌクレオチド、ＲＮＡｉ分子又はリボザイム
から選ばれる化合物を含む。
【００７１】
本発明は、
- RIKEN cDNA 9430020K01、Agtrl1、Apelin、Stabilin 1、Stabilin 2、TNFaip8l1、TNFaip8、及びFGD5のいずれか一つによりコードされるレセプターに結合するリガンド;
- RIKEN cDNA 9430020K01、Agtrl1、Apelin、Stabilin 1、Stabilin 2、TNFaip8l1、TNFaip8、及びFGD5のいずれか一つによりコードされる遺伝子産物のアゴニスト; 及び／又は
-哺乳動物細胞においてRIKEN cDNA 9430020K01、Agtrl1、Apelin、Stabilin 1、Stabilin 2、TNFaip8l1、TNFaip8、及び／又はFGD5のいずれか一つの過剰発現の為のベクター構築物であって、RIKEN cDNA 9430020K01、Agtrl1、Apelin、Stabilin 1、Stabilin 2、TNFaip8l1、TNFaip8、及びFGD5のいずれか一つをコードするコーディング核酸配列であって、哺乳動物細胞においてコーディング核酸配列の発現を駆動するプロモータと操作可能に連結された前記コーディング核酸配列、及び当該コーディング配列に操作可能に連結された転写終結配列を含む前記構築物;
及び
医薬的に許容できるキャリア
を含む医薬組成物を提供する。
【００７２】
代替的な第二の局面において、本発明は、
- RIKEN cDNA 9430020K01、Agtrl1、Apelin、Stabilin 1、Stabilin 2、TNFaip8l1、TNFaip8、及び／又はFGD5に特異的に結合するタンパク質、RIKEN cDNA 9430020K01、Agtrl1、Apelin、Stabilin 1、Stabilin 2、TNFaip8l1、TNFaip8、及び／又はFGD5のアンタゴニスト、RIKEN cDNA 9430020K01、Agtrl1、Apelin、Stabilin 1、Stabilin 2、TNFaip8l1、TNFaip8、及び／又はFGD5アゴニストスカベンジング化合物（agonist scavenging compound）、抗体、又は小分子インヒビター; 及び／又は
- RIKEN cDNA 9430020K01、Agtrl1、Apelin、Stabilin 1、Stabilin 2、TNFaip8l1、TNFaip8、及び／又はFGD5遺伝子産物をコードする遺伝子又はその転写物をＲＮＡ干渉によりサイレンシングする為のベクター構築物であって、RIKEN cDNA 9430020K01、Agtrl1、Apelin、Stabilin 1、Stabilin 2、TNFaip8l1、TNFaip8、及び／又はFGD5をコードする遺伝子又はその転写物をＲＮＡ干渉によりサイレンシングすることができるshRNA、siRNA、又はmiRNA分子をコードする前記コーディング核酸配列であって、哺乳動物細胞においてコーディング核酸配列の発現を駆動するプロモーターと操作可能に連結された前記コーディング核酸配列、及び該コーディング配列と操作可能に連結された転写終結配列を含む前記構築物;
及び
医薬的に許容できるキャリア
を含む医薬組成物を提供する。
【００７３】
以下の実施例において例示された化合物が、本発明の化合物の適切な実施態様である。
【００７４】
医療用途
【００７５】
本発明は、新脈管形成を誘発し又は刺激する為の方法であって、それが必要な対象において、遺伝子RIKEN cDNA 9430020K01、Agtrl1、Apelin、Stabilin 1、及びStabilin 2から選ばれる遺伝子又は遺伝子産物の活性を活性化し、増大させ、及び／又は、発現を増加すること、及び／又は、遺伝子TNFaip8l1、TNFaip8、及びFGD5から選ばれる遺伝子又は遺伝子産物の活性を妨害し、阻害し、及び／又は、発現を阻害することを含む前記方法を提供する。
【００７６】
好ましい実施態様において、遺伝子RIKEN cDNA 9430020K01、Agtrl1、Apelin、Stabilin 1、及びStabilin 2から選ばれる遺伝子又は遺伝子産物の活性を活性化し、増加し、及び／又は、発現を増加するステップは、
-遺伝子RIKEN cDNA 9430020K01、Agtrl1、Apelin、Stabilin 1、及びStabilin 2から選ばれる遺伝子又は遺伝子の産物を、遺伝子RIKEN cDNA 9430020K01、Agtrl1、Apelin、Stabilin 1、及びStabilin 2から選ばれる遺伝子又は遺伝子の産物に結合するリガンド又は遺伝子RIKEN cDNA 9430020K01、Agtrl1、Apelin、Stabilin 1、及びStabilin 2から選ばれる遺伝子又は遺伝子の産物のアゴニストの治療的に有効な量と接触させること、及び／又は
-遺伝子RIKEN cDNA 9430020K01、Agtrl1、Apelin、Stabilin 1、及びStabilin 2から選ばれる遺伝子を該対象の細胞において過剰発現させること、
により実施される。
【００７７】
代替的な好ましい実施態様において、遺伝子TNFaip8l1、TNFaip8、及びFGD5から選ばれる遺伝子又は遺伝子産物の活性をブロックし、阻害し、及び／又は、発現を阻害するステップは、
-遺伝子TNFaip8l1、TNFaip8、及び／又はFGD5から選ばれる遺伝子又は遺伝子産物を、TNFaip8l1、TNFaip8、及び／又はFGD5に特異的に結合するタンパク質、TNFaip8l1、TNFaip8、及び／又はFGD5のアンタゴニスト、TNFaip8l1、TNFaip8、及び／又はFGD5のアゴニストスカベンジング化合物、抗体、又は小分子インヒビターの治療的に有効な量と接触させること、及び／又は
- TNFaip8l1、TNFaip8、及び／又はFGD5をコードする遺伝子を、RNA干渉(RNAi)を用いてサイレンシングすること
により実施される。
【００７８】
本発明はまた、新脈管形成を阻害し又は防ぐ為の方法であって、それが必要な対象において、遺伝子TNFaip8l1、TNFaip8、及びFGD5から選ばれる遺伝子又は遺伝子産物の活性を活性化し、増加し、及び／又は、発現を増加すること、及び／又は、遺伝子RIKEN cDNA 9430020K01、Agtrl1、Apelin、Stabilin 1、及びStabilin 2から選ばれる遺伝子又は遺伝子産物の活性をブロックし、阻害し、及び／又は、発現を阻害することを含む前記方法を提供する。
【００７９】
好ましい実施態様において、遺伝子TNFaip8l1、TNFaip8、及びFGD5から選ばれる遺伝子又は遺伝子産物の活性を活性化し、増加し、及び／又は、発現を増加するステップは、
-遺伝子TNFaip8l1、TNFaip8、及びFGD5から選ばれる遺伝子又は遺伝子の産物を、遺伝子TNFaip8l1、TNFaip8、及びFGD5から選ばれる遺伝子又は遺伝子の産物に結合するリガンド又は遺伝子TNFaip8l1、TNFaip8、及びFGD5から選ばれる遺伝子又は遺伝子産物のアゴニストの治療的に有効な量と接触させること、及び／又は
-遺伝子TNFaip8l1、TNFaip8、及びFGD5から選ばれる遺伝子を該対象の細胞において過剰発現させること
により実施される。
【００８０】
代替的な好ましい実施態様において、遺伝子RIKEN cDNA 9430020K01、Agtrl1、Apelin、Stabilin 1、及び Stabilin 2から選ばれる遺伝子又は遺伝子産物を妨害し、活性を阻害し、及び／又は、発現を阻害するステップは、
-遺伝子RIKEN cDNA 9430020K01、Agtrl1、Apelin、Stabilin 1、及びStabilin 2から選ばれる遺伝子又は遺伝子産物を、RIKEN cDNA 9430020K01、Agtrl1、Apelin、Stabilin 1、及び／又はStabilin 2に特異的に結合するタンパク質、RIKEN cDNA 9430020K01、Agtrl1、Apelin、Stabilin 1、及び／又はStabilin 2のアンタゴニスト、RIKEN cDNA 9430020K01、Agtrl1、Apelin、Stabilin 1、及び／又はStabilin 2のアゴニストスカベンジング化合物、抗体、又は小分子インヒビターの治療的に有効な量と接触させること、及び／又は
- RIKEN cDNA 9430020K01、Agtrl1、Apelin、Stabilin 1、及びStabilin 2をコードする遺伝子をRNA干渉(RNAi)を用いてサイレンシングすること、
により実施される。
【００８１】
本明細書内において定義されたとおりの遺伝子産物及び化合物は、治療的適用の為に必要とされる。本発明は、虚血性の心臓疾患、ＣＮＳ及び末梢後肢疾患における、並びに、腫瘍学的疾患（例えば腫瘍）及び糖尿病における、該化合物の治療的使用方法を提供する。
【００８２】
該遺伝子産物及び化合物のいくつかは、脈管形成促進効果を有し、そして、それ故に、局所的及び循環する内皮前駆細胞を刺激して、新規動脈を生成すること及び（アテローム性動脈硬化症の、未成熟の、又は過度に浸透性の）既存動脈の機能不全の修復を刺激することができる。これは、心臓血管虚血性疾患の治療又は、例えば限定された標的脈管、高い同時罹患率、又は小血管の疾患（とりわけ）の故に、従来の治療について現在受け入れ可能でない患者にとっての最終的な解決を可能にする。
【００８３】
より特には、本発明の脈管形成促進性遺伝子産物は、疾患への生理学的応答の適切な活性化を刺激し、十分な脈管修復応答をもたらすことに役立ちうる。好ましい遺伝子産物は、ポリヌクレオチド（ＤＮＡ、ＲＮＡ、又は合成ヌクレオチド）及びポリペプチドを包含する。好ましいポリヌクレオチドはＲＮＡを包含する。本発明はまた、医薬としての、本明細書内において同定されたとおりの遺伝子を含み又はその遺伝子産物の機能的断片をコードする核酸配列を含むベクターを含む。該ベクターは、遺伝子治療において適切に用いられることができ、これにおいて、本明細書内において同定された遺伝子は、標的細胞における適切なベクターからの定方向の（directed）発現に続き、それらの野生型カウンターパートの機能を模倣するドミナントネガティブ型の設計の為に用いられる。
【００８４】
該遺伝子産物は、それらの抗脈管形成効果のために用いられてよく、そして、それ故に、脈管の形成を阻害することができる。血管新生の阻害は、これらの病理学的プロセスを防ぎ又は緩和することにおいて有用であり、及び／又は、組織化されていない過剰透過性の動脈血管床（腫瘍血管新生及び炎症性新脈管形成を含む）を、薬物療法及び介入について、より受け入れ可能な脈管完全性を有する構造化された血管樹へ再構築する。
【００８５】
それ故に、脈管形成促進性遺伝子産物は、より低い程度の新脈管形成により特徴づけられる疾患を患う対象の処置の為に適切に用いられうる。そのような低い程度の新脈管形成は、該疾患に冒された特定の器官において又は器官の一部において起こりうる。この文脈において、語「低い」は、健康なヒトにおけるその同じ器官又は器官の一部の新脈管形成の程度よりも低いことを意味する。好ましい実施態様において、該対象は、心臓血管疾患を患う。新たな脈管の形成（新脈管形成）を促進することを目的とした治療は、障害の起きた（虚血の）心筋（又は脳血管）組織を救出し、進行中の虚血性損傷（梗塞サイズの減少とともに）及び後の心筋の有害な再構築を減衰し、最終的に、心筋機能の長期保存（及び心疾患の予防、脳血管アクシデントの減少、又は跛行の病状及び虚血性潰瘍を緩和する）をもたらす。理論にとらわれることなく、内皮前駆細胞（ＥＰＣ）は心筋梗塞の発症後７〜１０日後にだけ上方制御されるけれど、内皮前駆細胞（ＥＰＣ）が、虚血の際に、例えば心筋梗塞（ＡＭＩ）及び心不全（ＣＨＦ）において、動員されると考えられる。本発明の脈管形成性遺伝子産物は、新たな脈管の形成に関与するだけでなく、これらのＥＰＣの脈管修復応答の開始においても関与する。それ故に、関連する細胞集団における及び虚血の部位での局所的な、これらの脈管形成性遺伝子産物の発現（責任冠状動脈における注入又は静脈内注入）が、これらのＡＭＩ又はＣＨＦ患者の予後及びアウトカムを改善すると考えられる。
【００８６】
本発明の化合物及び組成物は、身体損傷後の脈管回復を改善する為に、未成熟脈管の成熟を改善し並びに脈管透過性を減少する為に、及び、アテローム性動脈硬化症のプラーク安定性を修正する為に、及び固形腫瘍における脈管形成を調節する為に用いられうる。プラーク安定性の改善は、急性心筋梗塞又は脳血管事象を予防する局面において用いられてよく、及び、治療モデルによって、脈管形成を増大し又は減少することにより得られうる。腫瘍における脈管形成の調節は、ガン増殖を遅らせる為の脈管形成の予防又は阻害を含んでよく、他の実施態様において、ガンが薬剤により接近可能にする為に、ガンにおける脈管形成の刺激も含みうる。
【００８７】
他の局面において、本発明は、対象を処置する方法であって、該対象に本発明の医薬組成物を心臓血管疾患（のリスク）を減少する為に有効な量で投与することを含む前記方法を提供する。該医薬組成物は、局所的経路、腸内経路、非経口経路、経皮投与、経粘膜経路、バッカル経路（歯肉線付近の頬を通じて吸収される）、吸入経路、又は大槽内経路を用いて又は膣坐剤を介してなどにより投与されうる。
【００８８】
本発明はさらに、対象を処置する方法であって、該対象に、本発明に従う新脈管形成を阻害する為の医薬組成物を、病理学的新脈管形成（のリスク）を減少する為に有効な量で投与することを含む前記方法を提供する。
【００８９】
本発明はさらに、対象を処置する方法であって、該対象に、本発明に従う新脈管形成を刺激する為の医薬組成物を、新脈管形成を誘発する為に有効な量で、好ましくは新脈管形成及び脈管再構築及び成熟を誘発し／調節する為に、例えば組織又は臓器移植後に（これらに限定されない）、又は、組織虚血又は梗塞（心臓血管虚血性疾患、脳血管疾患、及び末梢動脈疾患を含む）、及び閉塞性血栓血管炎、腫瘍血管新生、腫瘍転移、腫瘍治療反応性、脈管透過化及び転移、及び糖尿病性網膜症における、血管周囲及び／又は側副血行循環の確立を刺激する為に有効な量で、投与することを含む前記方法を提供する。
【００９０】
好ましい実施態様において、該対象は、心臓血管疾患を患っている。新たな脈管の形成、再構築、又は成熟（新脈管形成）を促進することを目的とした治療は、障害のある（虚血性）心筋又は脳血管組織を助け、進行中の虚血性損傷（梗塞サイズ又はＣＶＡの減少とともに）及び後の心筋の有害な再構築を減衰し、最終的に心筋機能の長期保存（及び心不全の予防）をもたらす。理論にとらわれることなく、内皮前駆細胞（ＥＰＣ）は心筋梗塞の発症後７〜１０日後にだけ上方制御されるが、これら細胞が虚血性心筋梗塞（ＡＭＩ）及び心不全（ＣＨＦ）の際に動員されると考えられる。本発明の血管形成性遺伝子産物は、新たな脈管形成においてだけでなく、これらＥＰＣの脈管修復応答の開始においても関与する。それ故に、関連細胞集団における又は虚血の部位での局所的な、これらの脈管形成性遺伝子産物の発現（責任冠状動脈における注入又は静脈内注入）が、これらのＡＭＩ又はＣＨＦ患者の予後及びアウトカムを改善すると考えられる。
【００９１】
すなわち、本発明は、ヒトの処置方法であって、該ヒトに、本発明に従う新脈管形成を誘発する為の医薬組成物を、心臓血管疾患、脳血管疾患、及び末梢動脈疾患を患うリスクを緩和し又は予防する為に、並びに腫瘍学的な患者に投与することを含む前記方法を提供する。
【００９２】
以下の実施例に例示された方法が、本発明の方法の適切な実施態様である。
【００９３】
医薬組成物
【００９４】
上記化合物は、少なくとも１つの医薬的に許容できる添加物、例えば医薬的に許容できるキャリア、許容できる塩、乳化剤、又は保存料などをさらに含む、新脈管形成を刺激する為の医薬組成物中に適切に含まれる。
【００９５】
好ましくは、新脈管形成を刺激する為の該医薬組成物は、RIKEN cDNA 9430020K01、Agtrl1、Apelin、Stabilin 1、Stabilin 2、TNFaip8l1、TNFaip8、及び／又はFGD5から選ばれる少なくとも１つの遺伝子産物をさらに含む。アンジオテンシンレセプター２様１(Agtrl1)は、脈管系に限定された発現を示した遺伝子である。加えて、その後のゼブラフィッシュにおけるAgtrl1を標的とするモルホリノ注入による機能喪失（loss-of-function）研究が、心臓血管系の奇形を結果した。Agtrl1についての成体C57bl/6マウスにおける哺乳動物関連性が、フローサイトメトリーにより実証された：Agtrl1は、成熟ＥＣにおいて高度に発現され、及び、cKit+/Flk1+細胞、循環するＥＰＣの集団、においても検出された。この細胞集団は、心筋虚血後の虚血領域において増加された(P<0.001)が、後肢虚血後は増加されなかった。Apelin（Agtrl1の内因性リガンド）の産生も、心筋の梗塞領域において３倍だけ増大され(P<0.01)、及び、apelinの全身注入は、血液循環へのcKit+/Flk1+EPC動員を２倍だけ増加した(P<0.05)。虚血心筋におけるApelinの注入は、この特定の集団の増加したホーミングを、及び、虚血組織の新脈管形成における２倍増加を結果し(P<0.01)、その結果、心臓機能を改善し及び瘢痕化を減少した。これらの発見は、虚血の心臓組織への応答における増加したapelinレベルが、Agtrl1+のＥＰＣにとっての特異的な化学的誘因物質として作用でき、梗塞した領域への遊走を刺激し及び次に新脈管形成及び心筋修復を促進したことをはじめて示す。それ故に、Agtrl1及び／又はApelinを治療的に活性な化合物として含む医薬組成物により、心臓血管疾患の処置において特に有利である。
【００９６】
該遺伝子産物又は該ベクターを、RIKEN cDNA 9430020K01、Agtrl1、Apelin、Stabilin 1、Stabilin 2、TNFaip8l1、TNFaip8、及び／又はFGD5の群から選ばれる遺伝子の産物の発現をブロックすることができる分子であるインヒビターと組み合わせることも有利である。これらの遺伝子は、国際公開第2009/075566号パンフレット、国際公開第2009/075579号パンフレット、国際公開第2009/075565号パンフレット、及び国際公開第2009/075578号パンフレットに記載されている。当業者は、当技術分野において既知の技術を用いて、そのようなインヒビターを、国際公開第2009/075566号パンフレット、国際公開第2009/075579号パンフレット、国際公開第2009/075565号パンフレット、及び国際公開第2009/075578号パンフレットにおいて与えられた配列情報に基づき作ることができる。この局面の一つの実施態様において、該インヒビターは、そのバイオマーカーをコードする遺伝子の発現産物に対して向けられた抗体及び／又は抗体誘導体である。治療抗体は例えば、細胞膜上に配置された遺伝子発現産物に対して有用であり、及び医薬組成物に含まれうる。また、抗体は、細胞内の、例えば細胞質の、遺伝子産物、例えばＲＮＡ、ポリペプチド、又は酵素に、これらの産物の活性を調節する為に、標的化されうる。好ましくは、そのような抗体は、細胞内抗体の形にあり、標的細胞の内側で、好ましくはプラーク形成性細胞（Ｔ細胞、内皮細胞、及び平滑筋細胞を包含する）、又は、アテローム性動脈硬化病変において見られる細胞、例えば白血球、マクロファージ、泡沫細胞、樹状細胞、及びマスト細胞並びにＴ細胞など、の内側で産生される。加えて、抗体は、それらに連結された少なくとも１つの毒性化合物の標的細胞への送達の為に用いられうる。
【００９７】
本発明の好ましい実施態様において、該インヒビターは、RIKEN cDNA 9430020K01、Agtrl1、Apelin、Stabilin 1、Stabilin 2、TNFaip8l1、TNFaip8、及び／又はFGD5をコードする遺伝子のタンパク質発現産物の活性を調節し又はその機能を干渉することができる小分子である。加えて、小分子は、少なくとも１つの連結された毒性化合物の該標的細胞への送達の為にも用いられうる。
【００９８】
阻害の種々レベルで、核酸は、RIKEN cDNA 9430020K01、Agtrl1、Apelin、Stabilin 1、Stabilin 2、TNFaip8l1、TNFaip8、及び／又はFGD5から転写されたｍＲＮＡを破壊することによりタンパク質の産生をブロックする為に用いられうる。これは、アンチセンス薬剤、リボザイム、により、又はＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）により達成されうる。疾患プロセスにおけるこの早期段階で作用することにより、これらの薬剤は、疾患を引き起こすタンパク質の産生を防ぐ。本発明は、RIKEN cDNA 9430020K01、Agtrl1、Apelin、Stabilin 1、Stabilin 2、TNFaip8l1、TNFaip8、及び／又はFGD5に対して向けられたアンチセンス薬剤、例えばアンチセンスＲＮＡ及びアンチセンスオリゴデオキシヌクレオチド、リボザイム及びＲＮＡｉ分子に関する。
【００９９】
リボザイム
【０１００】
トランス開裂する触媒的ＲＮＡ（trans-cleaving catalytic RNA、リボザイム）は、エンドリボヌクレアーゼ活性を有するＲＮＡ分子である。リボザイムは、特定の標的について特異的に設計されており、及び、標的メッセージは特異的なヌクレオチド配列を含まなければならない。それらは、細胞のＲＮＡのバックグラウンドにおいて、任意のＲＮＡ種を部位特異的に開裂する為に改変される。該開裂事象は、該ｍＲＮＡを不安定にし、そして、タンパク質発現を防ぐ。重要なことに、リボザイムは、表現型効果を決定することにより、インビトロ又はインビボの文脈において未知の機能の遺伝子の機能を決定する目的で、未知の機能の遺伝子の発現を阻害する為に用いられうる。
【０１０１】
ひとつの一般に用いれるリボザイムモチーフはハンマーヘッドであり、これのための基質配列要求は最小である。ハンマーヘッドリボザイムの設計は、リボザイムの治療的使用におけるように、当技術分野で周知である。リボザイムは、例えば、米国特許第5,254,678号明細書に記載されたとおりに調製され及び用いられうる。HIV-I RNAのリボザイム開裂が、米国特許第5,144,019号明細書に記載されている；リボザイムを用いたＲＮＡ開裂の方法は、米国特許第5,116,742号明細書に記載されている；及びリボザイムの特異性を増加する為の方法が、米国特許第5,225,337号明細書に記載されている。ハンマーヘッド構造又はヘアピン構造のリボザイム断片の調製及び使用方法も、当技術分野で知られている。リボザイムは、また、ローリングトランスクリプション（rolling transcription）により作られうる。
【０１０２】
リボザイムのハイブリダイズする領域は、分岐構造として修正され又は調製されうる。リボザイムの基本的構造は、当技術分野の当業者によく知られた様式で化学的に変化されてもよく、及び、化学的に合成されたリボザイムが、モノマーのユニットにより修正された合成オリゴヌクレオチド誘導体として投与されうる。治療の文脈において、リポソームにより媒介されたリボザイム送達が、細胞の取り込みを改善する。
【０１０３】
リボザイムの治療的及び機能的なゲノム適用は、阻害されるべき遺伝子のコーディング配列の一部の知見を要求する。すなわち、多くの遺伝子について、核酸配列が、有効なリボザイムを構築する為に十分な配列を提供する。標的開裂部位は、標的配列中において選択され、及びリボザイムは、該開裂部位に隣接する5'及び3'ヌクレオチド配列に基づき構築される。レトロウィルスベクターは、該標的コーディング配列のｍＲＮＡを標的とする単量体及び多量体のハンマーヘッドリボザイムを発現する為に改変される。これらの単量体及び多量体リボザイムは、インビトロで、該標的ｍＲＮＡを開裂する能力について試験される。細胞株は、該リボザイムを発現するレトロウィルスベクターを安定に形質導入され、そして、該形質導入が、ノザンブロット分析及び逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）により確認される。該細胞は、標的ｍＲＮＡの不活性化について、疾患マーカーの発現の減少又は該標的ｍＲＮＡの遺伝子産物の減少のような指標によりスクリーニングされる。
【０１０４】
アンチセンス
【０１０５】
アンチセンスポリヌクレオチドは、ＲＮＡに特異的に結合する為に設計され、その結果ＲＮＡ−ＤＮＡ又はＲＮＡ−ＲＮＡハイブリッドの形成をもたらし、ＤＮＡの複製、逆転写、又はメッセンジャーＲＮＡ翻訳の停止をともなう。選択された配列に基づくアンチセンスポリヌクレオチドは、対応する遺伝子の発現を阻害しうる。
【０１０６】
アンチセンスポリヌクレオチドは、典型的には、細胞内で、転写鎖としてアンチセンス鎖を含むアンチセンス構築物からの発現により生成される。アンチセンスポリヌクレオチドは、対応するｍＲＮＡに結合し及び／又はその翻訳を阻害するであろう。それ自体として、アンチセンスは、癌遺伝子の発現を阻害する為に治療的に用いられうる。
【０１０７】
アンチセンスＲＮＡ又はアンチセンスオリゴデオキシヌクレオチド（アンチセンスＯＤＮ）はいずれも、インビトロで合成的に又は組み換えＤＮＡ技術により用いられ及び調製されうる。両方の方法が、当技術分野の当業者の範囲内に十分にある。ＯＤＮは、完全なアンチセンスＲＮＡより小さく、そしてそれ故に、それらが、より容易に標的細胞に入ることができるという利点を有する。ＤＮＡｓｅによるそれらの消化を回避する為に、ＯＤＮ及びアンチセンスＲＮＡは化学的に修飾されうる。所望の標的細胞を標的とする為に、該分子は、標的細胞上に見られるレセプターのリガンドに、又は、標的細胞の表面の分子に対して向けられた抗体に連結されうる。
【０１０８】
アンチセンスＲＮＡは、ロックド核酸（ＬＮＡ）への言及を含む。
【０１０９】
ＲＮＡｉ
【０１１０】
RNAiは、遺伝子の転写産物を特異的に標的とする為の相同な二本鎖ＲＮＡの導入をいい、結果としてヌル又は低形質の表現型をもたらす。ＲＮＡ干渉は、イニシエーションステップ及びエフェクターステップを要求する。最初のステップにおいて、インプット二本鎖（ｄｓ）ＲＮＡが、ヌクレオチド「ガイド配列」へと処理される。これらは、一本鎖又は二本鎖でありうる。該ガイドＲＮＡが、（ＲＮＡにより誘発されたサイレンシング複合体（ＲＩＳＣ）と呼ばれる）ヌクレアーゼ複合体へ組み込まれ、これが第二のエフェクターステップにおいて、塩基対相互作用を通じて該ガイドＲＮＡにより認識されるｍＲＮＡを破壊する為に作用する。ＲＮＡｉ分子は、すなわち、標的遺伝子の発現をサイレンシングすることにおける非常に強力な二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）である。本発明は、本発明のバイオマーカーをコードする遺伝子に相補的であるｄｓＲＮＡを提供する。
【０１１１】
ｄｓＲＮＡの、その自身の配列に対応する遺伝子の発現を抑制する能力は、転写後遺伝子サイレンシング又はＰＴＧＳとも呼ばれる。細胞の細胞質内に正常にみられる唯一のＲＮＡ分子は、一本鎖ｍＲＮＡの分子である。もし細胞が二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）の分子を見つけたならば、それは、酵素を用いて、それらを、一般に２１塩基対を有する断片（約２ターンの二重らせん）へと切断する。次に、それぞれの断片のその二本鎖が、それがｍＲＮＡの分子の相補的センス配列に結合することができるようにアンチセンス鎖にさらすのに十分に分離される。これは、該ｍＲＮＡのその領域における切断を誘発し、すなわち、ポリペプチドへ翻訳されるその能力を破壊する。特定の遺伝子に対応するｄｓＲＮＡの導入は、その遺伝子の細胞の内因的発現をノックアウトするであろう。これは、選ばれた時間に、特に組織において行われうる。ｄｓＲＮＡ断片を単に導入することのあり得る不利点は、遺伝子発現が一時的にだけ減少されることである。しかしながら、より恒久的な解決が、該細胞に、抑制されるべき遺伝子に対応するｄｓＲＮＡを連続的に合成できるＤＮＡベクターを導入することにより提供される。
【０１１２】
ＲＮＡｉ分子は、当技術分野の当業者に周知の方法により調製される。一般に、本発明のバイオマーカーをコードする遺伝子の少なくとも１つの配列と実質的に相同であり且つ該遺伝子の転写産物（の一部）と部分的に又は完全に二本鎖（ｄｓ）ＲＮＡを形成することができる１又はそれより多くの転写物を形成することができるヌクレオチド配列を含む分離された核酸配列が、ＲＮＡｉ分子として機能するであろう。該二本鎖領域は、10〜250、好ましくは10〜100、より好ましくは20〜50ヌクレオチド長のオーダーにありうる。
【０１１３】
ＲＮＡｉ分子は、好ましくは、形質導入された宿主細胞中の組み換えベクターから発現され、造血幹細胞がそれに非常に適している。
【０１１４】
ＲＮＡｉ分子の例はsiRNA及びmiRNAを包含する。
【０１１５】
抗体及び誘導体
【０１１６】
本発明において用いられる抗体は、鳥及び哺乳動物を包含する任意の動物（例えば、ヒト、マウス、ロバ、ヒツジ、ウサギ、ヤギ、モルモット、ラクダ、ウマ、又はニワトリ）起源からのものであってよい。好ましくは、本発明の抗体は、ヒトの又はヒト化モノクローナル抗体である。本明細書内において用いられるときに、「ヒト」抗体は、ヒトイムノグロブリンのアミノ酸配列を有する抗体を包含し、且つ、ヒトイムノグロブリンライブラリー（ヒトイムノグロブリン配列に相同であるイムノグロブリン配列の合成ライブラリーを含むがこれらに限定されない）から又はヒト遺伝子からの抗体を発現するマウスから分離された抗体を包含する。
【０１１７】
ヒトにおけるインビボでの治療的又は診断的使用方法及びインビトロでの検出アッセイを含むいくつかの使用方法にとって、ヒト抗体又はキメラ抗体を用いることが好ましい。完全ヒト抗体は、ヒト対象の治療的処置にとって特に望ましい。ヒト抗体は、上記で記載されたファージディスプレイ方法を含む当技術分野で既知の種々の方法により、ヒトイムノグロブリン配列又はヒトイムノグロブリン配列に相同な合成配列から得られた抗体ライブラリーを用いて作られうる。米国特許第4,444,887号及び第4,716,111号明細書、及び、国際公開第98/46645号パンフレット、国際公開第98/50433号パンフレット、国際公開第98/24893号パンフレット、及び国際公開第98/16654号パンフレットも参照されたい。それらのそれぞれが、そっくりそのまま引用することにより本明細書内に組み込まれる。
【０１１８】
本発明の方法とともに用いられるべき抗体は、修飾された誘導体、すなわち任意のタイプの分子の該抗体への共有結合により修飾された誘導体を包含する。加えて、該誘導体は、１又はそれより多くの非古典的アミノ酸を有しうる。
【０１１９】
本発明のいくつかの実施態様において、本発明ともに用いられるべき抗体は、修飾されていない抗体と比べたときに、哺乳動物における、好ましくはヒトにおける延長された半減期を有する。増加されたインビボでの半減期を有する抗体又はその抗原結合性断片は、当技術分野の当業者に既知の技術により生成されうる（例えば国際公開第97/34631号パンフレットを参照）。
【０１２０】
いくつかの実施態様において、本発明の方法とともに用いられるべき抗体は、一本鎖抗体である。一本鎖抗体の設計及び構築は当技術分野で周知である。
【０１２１】
いくつかの実施態様において、本発明とともに用いられるべき抗体は、細胞内エピトープに結合する、すなわち細胞内抗体である。細胞内抗体は、抗原に免疫特異的に結合することができる抗体の少なくとも一部を含み、及び、好ましくは、その分泌についてコードする配列を有さない。そのような抗体は、その抗原に細胞内で結合するであろう。一つの実施態様において、該細胞内抗体は、一本鎖Fv ("sFv")を含む。さらなる実施態様において、該細胞内抗体は、好ましくは、操作可能な分泌配列をコードせず、すなわち、該細胞内にとどまる。
【０１２２】
細胞内抗体の生成は、当業者に周知であり、例えば米国特許第6,004,940号明細書、米国特許第6,072,036号明細書、及び米国特許第5,965,371号明細書に記載されており、これらはそっくりそのまま引用することにより本明細書内に組み込まれる。
【０１２３】
ひとつの実施態様において、細胞内抗体は、細胞質において発現される。他の実施態様において、細胞内抗体は、種々の細胞内位置に局在化される。そのような実施態様において、特定の局在化配列が、特定の位置へ該細胞内抗体を向ける為の、ヌクレオチド内ポリペプチドへ結合されうる。
【０１２４】
本発明の方法とともに用いられるべき抗体又はその断片は、抗体の合成の為の当技術分野において既知の任意の方法により、特には化学的合成により又は、好ましくは、組み換え発現技術により、製造されうる。
【０１２５】
モノクローナル抗体は、ハイブリドーマ技術、組み換え技術、及びファージディスプレイ技術又はそれらの組み合わせを含む、当技術分野で既知の広くさまざまな技術を用いて調製されうる。例えば、モノクローナル抗体は、当技術分野で既知のものを含むハイブリドーマ技術を用いて製造されうる。本発明の抗体を作る為に用いられうるファージディスプレイ方法の例は、国際公開第97/13844号パンフレット並びに米国特許第5,580,717号、第5,821,047号、第5,571,698号、第5,780,225号、及び第5,969,108号明細書に開示されたものを包含し、これらはそれぞれそっくりそのまま引用することにより本明細書内に組み込まれる。
【０１２６】
上記文献に記載されたとおり、ファージ選択後、該ファージからの抗体コーディング領域が分離され、そして、全体抗体（ヒト抗体を含む）を生成する為に、又は任意の他の所望の抗体結合性断片を生成する為に用いられ、そして、任意の望ましい宿主（哺乳動物細胞、昆虫細胞、植物細胞、酵母、及びバクテリアを含む）において、例えば以下に記載されるとおりに、発現されうる。当技術分野で既知の方法、例えば国際公開第92/22324号パンフレットに開示されたものなど、を用いた、Fab、Fab'、及びF(ab')2断片を組み換え的に製造する為の技術も採用されうる。
【０１２７】
治療的に有用なIgG、IgA、IgM、及びIgE抗体を製造することも可能である。ヒト抗体及びヒトモノクローナル抗体を製造する為の技術の詳細な議論及びそのような抗体を製造する為のプロトコールについて、例えば国際公開第98/24893号パンフレットを参照されたい。本明細書内で引用された全ての文献が、そっくりそのまま引用することにより本明細書内に組み込まれる。加えて、会社、例えばMedarex, Inc. (Princeton, NJ)、Abgenix, Inc. (Freemont、CA)、及びGenpharm (San Jose, CA)などが、上記で記載されたものに類似の技術を用いて、選択された抗原に対して向けられたヒト抗体を提供する為に従事しうる。
【０１２８】
該抗体、それらの誘導体又はアナログ（例えば本発明の抗体の重鎖若しくは軽鎖又はその一部又は本発明の一本鎖抗体）を製造する為に用いられる組み換え発現は、該抗体をコードするポリヌクレオチドを含む発現ベクターの構築及び該ベクターの適切な宿主細胞における又はインビボでさえの発現を要求する。いったん本発明の抗体分子又は抗体の重鎖若しくは軽鎖又はその一部（好ましくは重鎖若しくは軽鎖可変ドメインを含むが必ずしも必要でない）をコードするポリヌクレオチドが得られると、該抗体分子の製造の為のベクターは、当技術分野で周知の技術を用いて組み換えＤＮＡ技術により製造されうる。すなわち、抗体をコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドを発現することによりタンパク質を調製する為の方法が本明細書内に記載される。当技術分野の当業者に周知である方法が、抗体をコードする配列及び適切な転写及び翻訳制御シグナルを含む発現ベクターを構築する為に用いられうる。これらの方法は、例えば、インビトロ組み換えＤＮＡ技術、合成技術、及びインビボ遺伝子組み換えを包含する。すなわち、本発明は、プロモーターと操作可能に連結された、本発明の抗体分子、抗体の重鎖若しくは軽鎖、抗体の重鎖若しくは軽鎖可変ドメイン、又はその一部、又は重鎖若しくは軽鎖のＣＤＲをコードするヌクレオチド配列を含む複製可能なベクターを提供する。そのようなベクターは、該抗体分子の定常領域をコードするヌクレオチド配列を含んでよく（例えば国際公開第86/05807号パンフレット、国際公開第89/01036号パンフレット、及び米国特許第5,122,464号明細書を参照）、そして、該抗体の可変ドメインが、重鎖全体、軽鎖全体、又は重鎖及び軽鎖両方の全体の発現の為にそのようなベクターにクローン化されうる。
【０１２９】
該発現ベクターは、慣用の技術により宿主細胞に移され、そして、該トランスフェクトされた細胞が次に慣用の技術により培養されて、本発明の抗体を生産する。すなわち、本発明は、異種プロモーターと操作可能に連結された、本発明の抗体又はその断片、又はその重鎖若しくは軽鎖、又はその一部、又は本発明の一本鎖抗体をコードするポリヌクレオチドを含む宿主細胞を含む。二本鎖抗体の発現の為の好ましい実施態様において、重鎖及び軽鎖をコードする複数のベクターが、完全イムノグロブリン分子の発現の為に、該宿主細胞において、以下に詳述されるとおり、共発現されうる。
【０１３０】
種々の宿主発現ベクターシステムは、本明細書内で定義されたとおりの抗体分子を発現する為に利用されうる。
【０１３１】
哺乳動物宿主細胞において、多くのウィルスに基づく発現システムが利用されうる。アデノウィルスが発現ベクターとして用いられる場合、関心のある該抗体コーディング配列が、アデノウィルス転写／翻訳制御複合体、例えば後期プロモーター及び三成分リーダー配列（tripartite leader sequence）など、と連結されうる。このキメラ遺伝子が、次に、アデノウィルスゲノム中に、インビトロ又はインビボの組み換えにより挿入されうる。該ウィルスゲノムの非必須領域（例えば領域El又はE3）内における挿入が、生存可能であり且つ感染した宿主において該抗体分子を発現することができる組み換えウィルスを結果するであろう。特定の開始シグナルもまた、挿入された抗体コーディング配列の効率的な翻訳の為に要求されうる。これらのシグナルは、ATG開始コドン及び隣接配列を包含する。さらに、該開始コドンは、挿入全体の翻訳を確実にする為に、該所望のコーディング配列のリーディングフレームと同調（in phase）していなければならない。これらの外因性翻訳制御シグナル及び開始コドンは、天然の及び合成の、種々の起源のものであってよい。発現の効率は、適切な転写エンハンサーエレメント、転写ターミネーターなどの含入により増大されうる。
【０１３２】
いったん本発明の方法とともに用いられるべき抗体分子が組み換え発現により製造されると、それはイムノグロブリン分子の精製の為の当技術分野で既知の任意の方法により、例えばクロマトグラフィー（例えばイオン交換、アフィニティー、特にはプロテインＡ後特異的抗原についてのアフィニティー、及びサイジングカラムクロマトグラフィー（sizing column chromatography））、遠心、異なる溶解度により、又はタンパク質精製の為の任意の他の標準的技術により、精製されうる。さらに、本発明の抗体又はその断片は、本明細書内に記載された又は精製を容易にするための当技術分野で既知の異種ポリペプチド配列と連結されうる。
【０１３３】
上記で述べられたとおり、さらなる局面に従い、本発明は、治療における使用の為の、上記定義されたとおりの抗体を提供する。
【０１３４】
治療的処置の為に、抗体は、インビトロで製造され、そして、その必要がある対象に施与されうる。該抗体は、対象に、任意の適切な経路により投与されてよく、好ましくはそのような経路に適合した医薬組成物の形で、且つ、意図された処置にとって有効である用量で、投与されうる。疾患の進行の速度を減少する為に又は疾患状態を排除する為に要求される該抗体の治療的に有効な用量は、当業者により容易に決定されうる。
【０１３５】
代わりに、抗体は、該対象それ自体により、上記で記載されえたとおりのインビボ抗体製造方法論を用いることによって、産生されうる。適切には、そのようなインビボ製造の為に用いられるベクターは、ウィルスベクターであり、好ましくは本明細書内で言及された特異的標的細胞についての標的細胞選択性を有するウィルスベクターである。
【０１３６】
それ故に、さらなる局面に従い、本発明は、上記定義されたとおりの抗体を、該治療効果を達成する為の対象の処置における使用の為の医薬の製造において使用する方法を提供する。該処置は、該医薬の、所望の治療効果を達成する為に十分な用量での投与を含む。該処置は、該抗体の繰り返しの投与を含みうる。
【０１３７】
さらなる局面に従い、本発明は、ヒトの処置の方法であって、上記定義されたとおりの抗体の、所望の治療効果を達成する為に十分な用量での投与を含む前記方法を提供する。該治療効果は、心臓血管事象又は脳血管事象を患うことのリスクの緩和又は予防でありうる。
【０１３８】
診断的及び治療的抗体が、好ましくは、キナーゼ又はホスファターゼのターゲティングの為のそれら夫々の適用において用いられ、これらはしばしば細胞の表面でレセプター分子と結合される。それ自体として、これらのレセプター分子と結合することができる抗体は、それらの、該キナーゼ又はホスファターゼに対する活性調節性効果をそれぞれのレセプターに結合することにより発揮しうる。また、トランスポータータンパク質も、該抗体が、細胞外に存在するときに、それらの活性調節性効果を発揮することができるであろうという同じ理由の故に、有利に標的とされうる。上記標的は、シグナル伝達分子と一緒に、より効果的な治療及びより容易な診断がそれにより可能であるので、本発明の抗体使用方法にとっての好ましい標的を代表する。
【０１３９】
該診断抗体は、適切には、変化したタンパク質レベル又はそれにおける構造的変化の決定の為のアッセイにおいて、遺伝子産物の、好ましくはタンパク質の定性的及び定量的検出の為に用いられうる。例えば、細胞内の、細胞抽出物における、上清中の、体液中のタンパク質レベルが、例えば免疫染色された標的細胞のフローサイトメトリー的評価により、好ましくは血液中の又は該血液中に存在する内皮前駆細胞（ＥＰＣ）若しくは多形核白血球（ＰＭＮ）におけるタンパク質レベルが決定されうる。代わりに、定量的タンパク質アッセイ、例えばELISA又はRIA、ウェスタンブロッティング、及び画像化技術（例えば共焦点レーザースキャニング顕微鏡を用いる）が、本明細書内に記載されたとおりの抗体とあわせて、心臓血管事象又は脳血管事象についての増加したリスクの診断の為に、用いられうる。
【０１４０】
送達方法
【０１４１】
いったん処方されると、本発明の医薬組成物は、（１）対象に直接に投与され、（２）対象から得られた細胞にエクスビボで送達され、又は（３）組み換えタンパク質の発現の為にインビトロで送達されうる。
【０１４２】
該組成物の直接の送達は一般的に、皮下の、腹膜内の、静脈内の、又は筋肉内の注入により達成されるであろうし、又は、組織の間質空間に送達されるであろう。該組成物は、プラーク又は病変に投与されてもよい。他の投与様式は、局所投与、経口投与、カテーテル投与、及び肺投与、坐剤、経皮施与、針、及びパーティクルガン又は皮下噴射器を包含する。投与処置は、一回投与スケジュール又は複数回投与スケジュールでありうる。
【０１４３】
形質転換された細胞の対象へのエクスビボ送達及び再埋め込みの為の方法は、当業者に知られており、及び、国際公開第93/14778号パンフレットに記載されている。エクスビボ適用において有用な細胞の例は、例えば、幹細胞、特には造血細胞、リンパ細胞、マクロファージ、樹状細胞、又は腫瘍細胞を含む。
【０１４４】
一般に、エクスビボ適用及びインビトロ適用の両方の為の核酸の送達は、例えば、ウィルスを含むベクターを用いた遺伝子治療、デキストランにより媒介されたトランスフェクション、リン酸カルシウム沈降、polybrene（商標）により媒介されたトランスフェクション、プロトプラスト融合、エレクトロポレーション、ポリヌクレオチド（類）のリポソーム内の封入、及び該ＤＮＡの核への直接的マイクロインジェクションにより達成されてよく、これらはすべて当技術分野で周知である。
【０１４５】
種々の方法が、該治療的組成物を、体内の特定の部位に直接に投与する為に用いられる。例えば、標的場所は局在化され、そして、該治療組成物が該標的に直接に注入される。代わりに、標的場所に従事する動脈が同定され、そして、該組成物を該標的場所へ直接に送達する為に、該治療的組成物がそのような動脈に注入される。該アンチセンス組成物は、例えば該組成物の局所的施与により、アテローム性動脈硬化症病変の表面に直接に投与される。Ｘ線イメージングが、上記送達方法のいくつかにおいて助ける為に用いられる。
【０１４６】
アンチセンスポリヌクレオチド、サブゲノミックポリヌクレオチド、又は抗体を含む治療組成物の特定の組織への、レセプターにより媒介された標的化された送達も用いられる。レセプターにより媒介されたＤＮＡ送達技術は当技術分野で周知である。好ましくは、本発明の抗体を含む治療的組成物のレセプター媒介の標的化送達が、該抗体を特定の組織に送達する為に用いられる。
【０１４７】
アンチセンス、リボザイム、又はＲＮＡｉのポリヌクレオチドを含む医薬組成物が、約100ng〜約200mgのポリンヌクレオチドの範囲で遺伝子治療プロトコルにおいて局所的投与の為に投与される。約500ng〜約50mg、約1μg〜約2mg、約5μg〜約500μg、及び約20μg〜約100μgのポリヌクレオチドの濃度範囲も、遺伝子治療プロトコルの間に用いられうる。作用の方法及び形質転換及び発現の効率などのファクターが、該ポリヌクレオチドの最終的な効率にとって要求される用量に影響するであろう考慮要素である。より大きな発現がより広い組織領域にわたって望まれる場合、投与の逐次的プロトコルにおいてより多くの量のポリヌクレオチド又は再投与された同量が、又は、例えばアテローム性動脈硬化症部位の、種々の隣接する又は近くの組織部分へのいくつかの投与が、ポジティブな治療的アウトカムをもたらすために要求されうる。すべての場合において、臨床試験における通常の実験が、最適な治療的効果の為の特定の範囲を決定するであろう。遺伝子治療ベクター、特にはレトロウィルスベクターのより完全な説明が、U.S.Ser.No.08/869,309に含まれており、これは明確に本明細書内に組み込まれる。
【０１４８】
診断方法
【０１４９】
本明細書内で同定された遺伝子及び遺伝子産物は、新脈管形成プロセスに関連し、そして、それ故に、診断目的に適している。本発明は、それ故に、その実施態様として、対象における心臓血管疾患、好ましくは動脈損傷又は心筋損傷に関連した心臓血管疾患、さらにより好ましくは虚血に関連した心臓血管疾患の診断又は予後診断の方法も提供する。そのような方法は、該対象の循環流体の試料における、好ましくは該試料中の内皮前駆細胞（ＥＰＣ）における、健康な対照に関して、RIKEN cDNA 9430020K01、Agtrl1、Apelin、Stabilin 1、Stabilin 2、TNFaip8l1、TNFaip8、及びFGD5並びにこれらのヒトのホモログからなる群から選ばれる少なくとも１つの遺伝子、さらにより好ましくは少なくとも2、3、4、5、6、7、又は全ての遺伝子の遺伝子発現レベルの増加又は減少を検出する工程を含む。非常に適切には、該遺伝子発現レベルの該増加又は減少は、ｍＲＮＡ又はタンパク質の、すなわち該１以上の遺伝子の発現産物の検出により検出される。すなわち、本明細書内で同定された遺伝子及び遺伝子産物が、患者における心臓血管疾患の診断又は予後診断の為のバイオマーカーとして用いられることができ、該バイオマーカーは、RIKEN cDNA 9430020K01、Agtrl1、Apelin、Stabilin 1、Stabilin 2、TNFaip8l1、TNFaip8、及びFGD5からなる群から選ばれる遺伝子の発現産物を含み、その発現は脈管形成の間に制御される。該バイオマーカーの発現は、健康な対照の対象において観察された値に関して、上方制御された又は下方制御された発現産物であってよく、及び、例えば血管新生と比較して、脈管形成の間に上方制御され又は下方制御されうる。すなわち、該バイオマーカーは、本明細書内において同定された遺伝子のタンパク質又はＲＮＡ分子発現産物であってよく、又は、タンパク質プロファイル又はＲＮＡプロファイルでありうる。対象における虚血の該診断又は予後診断の為の該バイオマーカーの使用が、明確に考慮される。代わりに、該バイオマーカーが、サロゲートエンドポイントマーカー（surrogate end-point markers）として、本明細書内に記載された治療方法の有効性を決定する為に用いられうる。RIKEN cDNA 9430020K01、Agtrl1、Apelin、Stabilin 1、Stabilin 2、TNFaip8l1、TNFaip8、及びFGD5から選ばれる１つの遺伝子の発現が測定されうるが、好ましくはそれらの少なくとも2、3、4、5、6、7、又は全ての遺伝子の発現の組み合わせが、言及された遺伝子についての遺伝子発現のプロファイルを提供する為に決定される。
【０１５０】
本発明はさらに、対象における虚血の診断又は予後診断の為の方法を意図し及び提供し、該方法は、該対象の血液における、上記で記載されたとおりのバイオマーカーを検出することを含む。そのような方法は、適切には、マイクロアレイ（特には固形支持体に結合した上記で定義されたとおりの少なくとも２つのバイオマーカーに特異的に結合する特異的な結合性バートナーを含む）を用いることにより、タンデムマススペクトロメトリー（ＭＳ−ＭＳ）を用いることにより、ＭＡＬＤＩ−ＦＴマススペクトロメトリーにより、MALDI-FT-ICRマススペクトロメトリー、MALDI Triple-quadマススペクトロメトリー、又はイムノアッセイにより、実施されうる。
【０１５１】
本発明に従う診断方法を実施する為のキット又はパーツもまた、本明細書内において想定される。そのようなキットは、上記で定義されたとおりの少なくとも１つのバイオマーカー、又は、該バイオマーカーに特異的に結合する特異的な結合性パートナーを含み、パーツの該キットは、任意的に、さらに、以下の１以上を含む：
- 少なくとも１つの参照試料又は対照試料;
- 該バイオマーカーについての参照値についての情報;
- 該特異的な結合性パートナーに結合することができる少なくとも１つの試験化合物;
- 該バイオマーカーと該特異的結合性パートナーとの間の結合を検出する為の少なくとも１つの検出可能マーカー。
【０１５２】
バイオマーカーに特異的に結合する診断試薬は、抗体又は、該バイオマーカーにストリンジェントな条件下で特異的にハイブリダイズする核酸分子を包含する。当業者は、特異的な結合性パートナーを用いることによって、タンパク質バイオマーカーのｍＲＮＡを検出する種々の方法をよく知っている。
【０１５３】
本明細書内で言及された全ての文献が、そっくりそのまま引用することにより本明細書内に組み込まれる。
【０１５４】
本発明は今、以下に記載された実験の部においてさらに説明される。
【０１５５】
実施例
【実施例１】
【０１５６】
RIKEN cDNA 9430020K01遺伝子発現に関する治療方法
【０１５７】
マウス及びゼブラフィッシュの胚の脈管発達の（ＲＮＡマイクロアレイ分析を用いた）ゲノムワイドな分析を通じて、私たちは、動脈発達に関与する2000+の遺伝子を同定した。具体的には、Affymetrixチップによるマウス発生の間のFlk1+の細胞におけるＲＮＡ発現プロファイルのゲノムワイドなマイクロアレイ分析により、私達は、脈管形成が優勢である時間枠の間に特異的に上方制御される遺伝子を同定した。種を超えた（trans-species）アプローチを用いて、私達はさらに、マウス及びゼブラフィッシュにおける発生中の血管樹におけるこれらの候補遺伝子の発現、及び、若いマウス及びブタモデルにおける虚血の間のそれらの上方制御を選択し及び評価した。最後に、個々のクローンの誘発された発現が、安定虚血性冠状動脈疾患及び急性冠状動脈症候群を認められた患者から得られた血液試料の循環するＰＭＬのサブセットにおけるｑＰＣＲ分析により確かめられた。
【０１５８】
脈管の発達及び修復におけるこれらの新たに同定された制御遺伝子が、細胞培養物研究、マウス及びゼブラフィッシュゲノミクスの使用により、及び、末梢動脈虚血、心筋虚血、急性心筋梗塞、アテローム性動脈硬化症発達（脆弱なプラーク発達を含む）、リンパ管形成（lymphangiogenesis）、網膜血管障害、及び腫瘍血管新生のいくつかの動物モデルにおいてさらに研究される。これらの脈管形成遺伝子の発現プロファイルはまた、明らかな末梢動脈疾患、心筋虚血（適切な抗虚血治療有り／無し）、急性心筋梗塞、心不全を有する患者及び経皮冠動脈治療介入（バルーン血管形成、ステント留置術）により処置された患者を含む、心臓血管疾患を有する選ばれた患者において、提案されたカスタマイズされたマイクロアレイ技術を用いて研究される。
【０１５９】
マウス胚形成の間の脈管発生の種々のステージのゲノムワイドなスクリーニングが、既知の並びに完全に未知且つ記録されていないクローン（ＥＳＴクローン又はRIKENクローンと称される）を同定した。これらの候補遺伝子のいくつかは、両生類のオルトログを有さず、及び、他の無関係な器官に対して、分離されたヒト大動脈及び高度に脈管形成した組織における遺伝子発現レベルをｑＰＣＲによって比較することにより、それらの脈管構造に特異的な発現によりさらに選択された。RIKEN cDNA 9430020K01遺伝子の発現は、マウスの種々の器官において決定された。ｑＰＣＲにより確立された発現は、高度に脈管形成した組織、例えば肺、大動脈、及び頸動脈において、無関係な器官、例えば腎臓、肝臓、脳、目、心臓、及び骨格筋などと比べて、高かった（図１参照）。
【０１６０】
次に、内皮特異的発現が、内皮初代細胞系（Human Umbilical Venous Endothelial Cell(HUVEC)）を用いて及びマウスにおいてインビボでさらに分析された。RIKEN cDNA 9430020K01は、発生中のマウスにおいて脈管形成の間上方制御され、及び、脈管ネットワークにおいて専ら発現された。HUVEC細胞培養物において、RIKEN cDNA 9430020K01のノックダウンは、細胞増殖を、Ｇ１期における細胞周期停止により、顕著に阻害した。また、付随して、より多くのアポトーシスが、RIKEN cDNA 9430020K01をサイレンシングされた内皮細胞において同定された。一致して、ＨＵＶＥＣによる２Ｄマトリゲルアッセイにおけるチューブ形成が、RIKEN cDNA 9430020K01ノックダウンにより有意に減衰された一方で、ＨＵＶＥＣの遊走が減少された。次に、RIKEN cDNA 9430020K01の遺伝子機能が、マウス網膜モデルにおいて評価された。RIKEN cDNA 9430020K01のノックダウン及び過剰発現が、出生直後１日目での、C57bl/6子マウスの網膜におけるshRNA及びｃＤＮＡ発現ベクターのレンチウィルス感染により誘発される。網膜の免疫組織学的評価が、脈管出芽を研究するために実施された。RIKEN cDNA 9430020K01のノックダウンは、細胞増殖を妨げ、及び、インビボでの網膜におけるＥＣにおけるアポトーシスを増加する。
【０１６１】
この特定の遺伝子産物が、今までに既知の最も強力なホールマーク新脈管形成制御遺伝子（産物）、ＶＥＧＦファミリー、と比較して、同等にもしくはより強力に新脈管形成、すなわち新たな脈管の形成、を誘発する為の該同定されたクローンの真の能力により選択された。この特定の遺伝子産物は、今まで完全に未知であり機能又は発現パターンについて記録されていない。
【０１６２】
HUVECの構成
【０１６３】
HUVECが、１チューブのHUVECの量で、２つの１５ｃｍプレートについて、それぞれ１０ｍｌの０．１％ゼラチンを有する２つの１５ｃｍプレートを覆うことにより調製された。次に、ゼラチンが除去され、そして、３０分間室温で乾燥された。次に、20mlのEGM-2培地が添加された。１チューブのＨＵＶＥＣが、液体窒素から、３７℃で解凍され、そして、１ｍｌのＨＵＶＥＣが、１５ｍｌチューブ中の３ｍｌのEGM-2培地に添加された。２ｍｌの細胞懸濁物が、１５ｃｍプレートに添加され、そして、３７℃、5%CO₂に置かれた。培地が６時間後に新しくされた。
【０１６４】
ＨＵＶＥＣが、10 mlの0.1%ゼラチンを有するプレートをコーティングすることにより継代された。次に、該ゼラチンが除去され、そして、３０分間室温で乾燥された。つぎに、20 mlのEGM-2培地が該プレートに添加される。該培地が次に除去され、そして、該プレートがＰＢＳにより洗浄される。ＨＵＶＥＣはトリプシン処理される。細胞が、ＥＧＭ−２培地に懸濁され、そして、５分間遠心される。そのペレットが、次に、プレート上のEGM-2において再懸濁され、そして、３７℃で5%CO₂において培養される。
【０１６５】
ＨＵＶＥＣにおけるRIKEN cDNA 9430020K01遺伝子発現の阻害の効果を確立する為に、３つの異なる実験処置レジメが確立された：
１．RIKEN cDNA 9430020K01遺伝子に対する特異的siRNAによるトランスフェクション
２．ターゲティングしないsiRNA（sham）によるトランスフェクション、及び
３．陰性対照
【０１６６】
レジメ１は、

を有する３つの異なるsiRNAの混合物による5-2.5-1ng/mlの濃度でのトランスフェクションからなった。（図５参照）
【０１６７】
これらのレジメに曝露されたＨＵＶＥＣの試料が、第一の曝露後最大で１２０時間までの種々の時点で採られた。
【０１６８】
標的とされた遺伝子のサイレンシングが、感染したＨＵＶＥＣにおけるＲＴ−ＱＰＣＲにより、

を有するフォワードプライマー及び

を有するリバースプライマーを用いて確かめられ、157 bpの産物を結果した。
【０１６９】
増殖アッセイが行なわれて、ＨＵＶＥＣの該３つの異なるレジメへの曝露後１〜５日目でトリパンブルーを用いて、死細胞の数を数えた（図８Ａ参照）。加えて、Ｇ１期及びＧ２期にある細胞の数が、ヨウ化プロピジウム染色を用いたＦＡＣＳ分析により確立された（図７Ａ及びＢ参照）。
【０１７０】
アポトーシス細胞の数が、Annexin V-FITC Apoptosis Detection Kit I (BD Pharmingen（商標）カタログナンバー556547、ロット: 18354)を用いて決定された（図８Ｂ及びＣ参照）。
【０１７１】
RIKEN cDNA 9430020K01遺伝子の阻害の、管を形成するＨＵＶＥＣの能力に対する効果が、当技術分野で知られているとおりの２Ｄマトリゲル（管形成）アッセイにより、Calcein-AM染色を用いて、決定された（図３参照）。
【実施例２】
【０１７２】
Agtrl1/Apelin発現に関する治療方法
【０１７３】
材料及び方法
【０１７４】
全ての実験は、施設（エラスムス大学医療センター、ロッテルダム、オランダ）及び国のガイドラインに従い実施された。
【０１７５】
動物
【０１７６】
メスのC57BL/6Jマウス(8週齢)が、Jackson Laboratory(Bar Harbor、メイン州、米国)から得られ、そして、無作為に実験群に割り当てられた。
【０１７７】
インビボモデルにおいて用いられたApelinは、Sigma(Apelin-13 トリフルオロ酢酸塩; A6469-1mg)から得られた。
【０１７８】
手術手順
【０１７９】
マウス（１２週齢）が秤量され、４％イソフルランにより鎮静され、挿管され、そして、麻酔の為の約2.5%イソフルランを有するO₂-N₂O (1:2、体積/体積)により圧力制御されて換気された。ApelinのＥＰＣ動員に対する効果を試験する為に、動物が、実験期間の間、Apelin 400ng/kg/分で皮下に埋め込まれた浸透圧ミニポンプにより処置された（Alzet、モデル1003D、Durect Corp、オランダ）。対照として、ＰＢＳが注入された。ＥＰＣ動員が、Ａｐｅｌｉｎ又はＰＢＳのふくらはぎ筋肉又は左心室への直接の注入により試験された。動物が、３日後に犠牲にされ、そして、組織が、次の分析の為に回収された。
【０１８０】
ＭＩが、標準的な手順を用いて、左前下降冠状動脈（ＬＡＤ）の7-0シルク縫合糸(B. Braun、Aesculap AG&CO.KG、Tuttlingen、ドイツ)による恒久的ライゲーションにより誘発された。ＨＬＩが、大腿動脈の6-0シルク縫合糸(B. Braun)による恒久的なライゲーションにより誘発された。shamの動物は、虚血の誘発無く、手術を受けた。ＭＩ後のＡｐｅｌｉｎの効果を試験する為に、動物は、ＭＩの誘発直後にＡｐｅｌｉｎ若しくはＰＢＳの注入を受け又は注入受けなかった。動物は、３日目で又は２週目で犠牲にされた。犠牲にされるときに、血行動態測定が、前に記載されたとおりの麻酔下で実施された。簡潔に言うと、短軸及び長軸像M-mode LV心エコー検査法（ALOKA、Prosound SSD-4000; 日本）が実施され、そして、拡張末期でのLV直径（LVEDD）及び収縮末期でのLV直径（LVESD）が測定され、そして、短縮率（fractional shortening）が計算された。組織が、次の分析の為に回収された。それぞれの実験の終わりに、隔膜を含む左心室重量（ＬＶＷ）、脛骨長（ＴＬ）、及び肺液重量が決定された。
【０１８１】
ＱＰＣＲ及びタンパク質分析
【０１８２】
ｍＲＮＡレベルが、新たに分離された左心室及びふくらはぎ筋肉から決定された。ＲＮＡは、ＲＮｅａｓｙキット（Ｑｉａｇｅｎ、オランダ）を用いて抽出された。量及び質が、nanodrop及びAgilent 2100 Bioanalyzer電気泳動(Agilent Technologies、英国)の助けを受けて確認された。分離されたＲＮＡはｃＤＮＡへと逆転写された（Iscript、Biorad、オランダ）。ｑＰＣＲが、iCycler iQ Detection system (Bio-Rad、オランダ)におけるsybrgreenシグナルのリアルタイム蛍光評価により実施された。ＡｐｅｌｉｎのｍＲＮＡレベルが分析され、そして、ハウスキーピング遺伝子HPRTについて規準化された。
【０１８３】
タンパク質レベルが、新たに分離された左心室、ふくらはぎ筋肉、及び血漿から評価された。４０ｍｇの組織がホモジナイズされ、0.1mol/lの酢酸中で１０分間ボイルされ、そして次に、15000rpmで10分間遠心され、そして上清がBradford Assayにより合計タンパク質濃度を定量する為に用いられた。等量の合計タンパク質（300μg/ml）が、Apelin-12 EIAキット（Phoenix pharmaceutical、米国）において、製造者の処方に従い用いられた。
【０１８４】
フローサイトメトリー
【０１８５】
細胞分析が、ＢＭ、血液、心室、及び骨格筋について実施された。ＢＭ及び血液の単核細胞懸濁物が、密度遠心及び次のＲＰＭＩにおける洗浄により得られた。心室及び骨格筋の細胞懸濁物が、ホモジナイゼーション及び次の４０ｍｍ細胞こし器（Falcon）での洗浄により分離された。分離された細胞が、Flk(ビオチンを結合した、BD Biosciences、ベルギー)、cKit(APC-Cy7を結合した、eBiosciences、英国)、Sca-1(APCを結合した、eBiosciences、英国)、及びAgtrl-1(LifeSpan Biosciences、シアトル、米国)に対する抗体により染色された。LIN+(Ter119、B220、CD11b、GR1、CD3、CD4、及びCD8、PEを結合した、Biosciences)細胞を排除する為の抗体（Ter119、B220、CD11b、GR1、CD3、CD4、及びCD8、全てeBiosciencesから）が、同様に含まれた。細胞は、該抗体混合物と１５分間４℃でインキュベートされた。洗浄後、細胞がヤギ抗ウサギAlexa 488 (Invitrogen)及びストレプトアビジンPE-Cy7 (eBiosciences)と、１５分間４℃でインキュベートされた。7AAD (BD biosciences、ベルギー)が、細胞死を評価する為に添加された。フローサイトメトリー分析が、FACSCanto (BD biosciences、ベルギー)の使用により実施され、そして次のデータ分析が、分析システム（Flowjo）により実施された。
【０１８６】
組織学的分析
【０１８７】
左心室がパラフィンに埋め込まれた。左心室を埋め込まれたパラフィンが、５ｍｍ片に長手方向に切断され、Masson'sトリクロムにより染色されて、梗塞サイズを決定した。毛細血管密度が、レクチン染色により評価された。簡潔には、切片が、脱ろうされ、水和され、そして、5%BSAにより１５分間ブロッキングされた。切片が、ＰＢＳ中で洗浄され、そして、BSからのレクチン（HRPを結合された、Ｓｉｇｍａ）と、さらなる１２０分間インキュベートされた。ＰＢＳ中での洗浄後、切片がｎｉＤＡＢにより３分間処理された。さらなる洗浄後、切片が、nuclear fast redにより対比染色され、そして、カバースリップされた。データ分析が、市販の画像分析システム（Impak C、Clemex Technologies、カナダ）を用いて実施された。
【０１８８】
統計的分析
【０１８９】
データは、適切な場合に、対にされていないスチューデントＴ検定又は一要因ＡＮＯＶＡを用いて分析された。有意性は、P<0.05である場合に認められた。データは平均±SEMとして提示される。
【０１９０】
ゼブラフィッシュ手順（及びモルホリノの手順）
【０１９１】
ゼブラフィッシュ
【０１９２】
ゼブラフィッシュは、標準的な飼育条件下で、Hubrecht Instituteで維持された。用いられたトランスジェニック系列は、Tg(kdr-l:GFP)^s843(Jinら, 2005)及びTg(fli1:neGFP)^y7(Romanら、2002)であった。
【０１９３】
Agtrl1bのTILLING
【０１９４】
ランダムにＥＮＵ突然変異されたF₁-ゼブラフィッシュのライブラリーが、agtrl1b遺伝子における変異について、ＤＮＡリシークエンシング(Wienholds、2002)によりスクリーニングされた。ＳＮＰについてのフィルタリング後、２６のＥＮＵ誘発された変異が検出され、そのうち一つが最初の膜貫通ドメイン直後の未成熟終止(W54Stop)をもたらした。該同定されたF₁キャリアフィッシュ（agtrl1b^hu4145）が、所望のトランスジェニックバックグラウンドへと交雑され、そして、いくつかの世代の間繁殖させられて（最大でF₅）、何らかの望ましくないバックグラウンド変異を除去した。ＴＩＬＬＩＮＧの為に用いられたプライマーは、

であった。
【０１９５】
モルホリノ注入
【０１９６】
silent heart（SIH）に対するモルホリノ（ＭＯ）（5'-CATGTTTGCTCTGATCTGACACGCA-3') (Sehnertら、2002)が、Gene Tools（Gene Tools、LLC、Philomath、米国）から得られ、そして、0.2%フェノールレッドを有する水中に希釈された。１細胞期胚が、１ｎｌの最大量を有する１ｎｇのＭＯを注入された。
【０１９７】
この実施例に記載された研究の結果が図２１〜２６に提示される。
【０１９８】
図２１において、急性心筋梗塞後、特異的にcKit+/Flk1+内皮前駆細胞が、循環中に動員される一方で、後肢虚血後は、特にSca1+/Flk1+細胞が循環中に動員されることが分かる。
【０１９９】
図２２において、虚血後、Agtrl1がcKit+/Flk1+内皮前駆細胞（急性心筋梗塞後の（修復）応答に関与する）において特異的に発現されること、及び、急性心筋梗塞後、apelin（Agtrl1のリガンド）が、循環において並びに心筋において、タンパク質及びmRNAレベルについて制御されることが分かる。
【０２００】
Apelinの全身的注入が、cKit+/Flk+内皮前駆細胞の数を、骨髄及び血液において増加する一方で、apelin注入は、Sca+/Flk+細胞の数をこれらの組織において変化させない（図２３）。従って、apelinの全身注入は、骨髄並びに循環において、cKit+/Flk1+の数を刺激する。
【０２０１】
Apelin処置は、左心室の短縮率を改善し、そして、収縮期の間のより良い収縮を結果としてもたらした（図２４）。それ故に、apelinにより全身的処置が、急性心筋梗塞後の心臓機能全体を改善するであろうことが結論付けられる。
【０２０２】
MIそしてapelin処置後の瘢痕形成についての研究は、apelin処置が、境界領域の心筋厚を増大させ、そして、梗塞長を減少することを示し（図２５）、そしてそれ故に、apelin注入が、心筋梗塞後の梗塞長を減少すると示される。さらに、apelin注入は、心筋梗塞後の新たな脈管の形成を刺激する（図２６）。Apelinの上記治療効果は、明確に、本発明の局面として同定される。
【実施例３】
【０２０３】
FGD５発現に関する治療方法
【０２０４】
材料及び方法
【０２０５】
マウス胚からのFlk+及びFlk-細胞の分離
【０２０６】
10〜15dpcのFVB/Nマウス胚が、回収され、単独細胞の懸濁物を得る為にPBS/10% FCS/0.12% collagenase type I（Sigma C-0130、オランダ）において消化された。単独細胞懸濁物が、1:50 Flk-1 PEマウス抗体(BD bioscience、オランダ)及び1:100 Hoechstにより標識化され、そして、Flk+/Hoechst-細胞について、>90%純度の為にFACS Divaセルソーターを用いてソートされた。細胞が、RLTバッファー中に溶解され、そして、ｐPCR分析の為に処理された。
【０２０７】
定量的PCR及びウェスタンブロット分析
【０２０８】
RNAｅａｓｙキット（Qiagen、オランダ）を用いてC57bl/6マウスからの種々の組織又は初代培養物から分離されたＲＮＡが、キャピラリー電気泳動（Agilent 2100 Bioanalyzer、Agilent Technologies, オランダ）により質及び量について確認され、そして、ｃＤＮＡへ逆転写された。ｑＰＣＲ反応は、iCycler iQ Detection System (Bio-Rad、オランダ)を用いたsybergreenシグナルのリアルタイム蛍光評価により実施された。ｑＰＣＲ分析は、マウスのFRG、FGD1-6、eNOS、及びCD31について、並びに、ヒトのVEGFR1/2、Notch1/4、DLL4、jagged1、ephrin B2/B4、NRP1/2、p53 及びHey1について実施された。標的遺伝子ｍＲＮＡ発現レベルは、ハウスキーピング遺伝子（マウス試料においてヒポキサンチングアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（Hprt1）、及び、ヒト試料においてβアクチンに関して報告される（プライマー配列は表１及び２において与えられる）。ウェスタンブロット分析について、細胞培養物及び組織試料が、NP40バッファー中に溶解され、そして、SDS-PAGEウェスタンブロット及び、1:1000ラット抗p21^CIP1、抗p53抗体(Abcam、英国)、1:500ウサギ抗cdc42、抗Rac1、及び抗-RhoA抗体(Abcam、英国)、及び1:500マウス抗FGD5抗体(Bioscience、オランダ)を用いて分析された。タンパク質のバンドは、Li-Cor検出システム(Westburg、オランダ)を用いて、前に記載されたとおりに(Cheng et al. 2009. Circulation 119, 3017-3027)可視化された。
【０２０９】
【表１】

【０２１０】
【表２】

【０２１１】
組織学的分析
【０２１２】
マウス左心室、及び大動脈／頸動脈が、ＯＣＴ（Sakura Finetek、オランダ）に埋め込まれ、そして、液体窒素中で瞬間凍結された。５μｍの凍結切片が、Alexa-fluor結合イソレクチンIB4(1:500、Invitrogen、オランダ)及び1:100マウス抗FGD5 (Bioscience、オランダ)を用いて二重染色され、FITC/ローダミン標識された抗マウスIgG抗体検出(1:500、Invitrogen、オランダ)、及び、ブロッキングの為のヤギFAB抗マウスIgG (H+L) (Jackson Immunoresearch Labs、米国)が続いた。
【０２１３】
初代細胞培養物の状態
【０２１４】
ペニシリン／ストレプトマイシンを有するＥＧＭ２培地（bullet kit及び２％FCSを補われたＥＢＭ２培地）(Lonza、オランダ)中の初代ヒト臍帯静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ、Lonza、オランダ）が、ゼラチンにより覆われたプレート上で、37℃/5%CO₂で培養された。３〜５継代の細胞培養物だけが、実験を通じて用いられた。免疫組織学的染色の為に、ＨＵＶＥＣが、カバースリップ上で増殖され、そして、氷冷アセトン中で５分間固定され、続いて0.1%tritonX/PBSによる透過化、そして1:100マウス抗FGD5 (Bioscience、オランダ)により染色され、そして、シグナルのTSA-増幅(Roche、オランダ)が行なわれた。この後に、1:500ウサギ抗cdc42 (Abcam、英国)又はラット抗Zyxin (1:500、Abcam、英国)とのインキュベーション、そして1:500FITC標識された抗ウサギ/ラットIgG抗体(Invitrogen、オランダ)を用いた検出が行なわれた。カバースリップは、Vectashield/DAPI (Brunschwig、オランダ)を用いて標本を載せられ、そして、蛍光顕微鏡(Carl Zeiss Inc.、オランダ)により画像化された。
【０２１５】
細胞培養物中の遺伝子移行及びｓｉＲＮＡノックダウン
【０２１６】
市販のpAd/CMV/V5ゲートウェイシステム (Invitrogen、オランダ)が、製造者の推奨に従い、要求された組み換えアデノウィルスベクターを生成する為に用いられ、そして、アデノウィルス粒子アセンブリーの為に293細胞にトランスフェクトされた。ウィルス粒子は、細胞溶解物から回収され、そして、ウィルス力価がウィルスプラークアッセイにより決定された。ΔE1/E3-shamアデノウィルス（sham adenovirus）が、全ての研究において、対照アデノウィルスとして用いられた（Sham Ad）。サブコンフルエントなＨＵＶＥＣ培養物が、EGM2/0.2%FCSにおいて、２時間３７℃／5%CO₂ (moi100)で感染され、その結果、４８時間でＨＵＶＥＣにおいて>90%の形質転換効率をもたらした（Invitrogen、オランダ）。標的とした遺伝子のノックダウンは、それぞれの遺伝子のｍＲＮＡに対して向けられた４つのｓｉＲＮＡ配列の混合物（Smartpool、Dharmacon、オランダ）の、50-60%サブコンフルエントＨＵＶＥＣ培養物におけるトランスファーにより達成された（実験に含める３日前）。対照として、細胞が、4つのターゲティングしないスクランブルｓｉＲＮＡの混合物(Dharmacon、オランダ)をトランスフェクトされた。>80%のｓｉＲＮＡ形質転換効率が、FITC標識されたsiRNA (siglow、Dharmacon、オランダ)により確認されたときに、７２時間で達成された。十分な過剰発現又はノックダウンが、形質転換後２及び３日目でのｑＰＣＲ及びウェスタンブロット分析により確認された。
【０２１７】
インビトロ及びエクスビボの血管新生アッセイ
【０２１８】
管形成アッセイ：ＨＵＶＥＣが、200μlのEGM2培地中3×10⁴細胞/mlの密度で、96ウェルプレート中において、血清低減Matrigel(BD Biosciences、オランダ)上にプレートされ、そして24時間インキュベートされた。生存細胞が、製造者のプロトコルに従いCalcein-AM(BD Biosciences、オランダ)取り込み及び蛍光顕微鏡により可視化された。コーティングされたビーズアッセイ：ＨＵＶＥＣのトリプシン処理されたシングル細胞懸濁物（トランスフェクション後２４時間）が、４時間、Cytodexマイクロキャリアビーズ(Sigma、オランダ)と共インキュベートされた。ＥＧＭ２培地中でビーズ当たり４００細胞の割合で、前に記載されたとおり（Sainson et al. 2008. Blood 111、4997-5007）、ＨＵＶＥＣによりコーティングされたマイクロビーズが、６ウェルプレートに移され、そして、一晩インキュベートされ、次に、付着していない細胞を除去する為に２回洗浄された。コーティングされたマイクロビーズが、1μgトロンビン(R&D Systems、英国)を補われた2.5%のヒトフィブリノーゲン/mlのEGM2(Calbiochem、オランダ)中に再懸濁され、１２ウェルプレート中に蒔かれた。凝固したフィブリノーゲンゲルが、20ng/mlのbFGFを有する１ｍｌのＥＧＭ２培地により覆われ、そして、６日目でローダミン−ファロイジン染色（Invitrogen、オランダ）又はトルイジンブルー染色により可視化された。内皮出芽のエクスビボ分析：C57bl/6マウスの大動脈が回収され、２ｍｍ厚さセグメントに切断され、そして、９６ウェルプレート中の血清低減Matrigel(BD Biosciences、オランダ)中に置かれた。埋め込まれた大動脈セグメントが、次に、ウェル当たり200μlのEGM2培地により４日間インキュベートされ、次に、位相差顕微鏡により評価された。管形成アッセイの定量：Angiosys分析ソフトウェア（Angiosystems、英国）が、平均の管長さ及び合計の管長さ、並びに管及び分岐の数を決定する為に用いられた。被覆されたビーズの定量及び大動脈リングアッセイ：データ分析は、市販の画像分析システムを用いて実施された（Impak C、Clemex Technologies、カナダ）。
【０２１９】
マウス網膜血管新生モデル
【０２２０】
３日齢のC57bl/6の子マウスが、氷上に置くことにより麻酔された。３３ゲージの針を用いて、0.5μlのAd-FGD5 (5x10⁷ pfu)が、左の硝子体内に注入され、及び、0.5 μlのshamのアデノウィルス(5x10⁷ pfu)が、右目に注入された。FGD5サイレンシング実験について、マウスFGD5を標的とする100nmolのaccell siRNAが、左において、および、ターゲティングしていない100nmolのスクランブルaccell siRNAが、右において、硝子体内に注入された(Dharmacon、オランダ)。３日目で、子マウスが犠牲にされ、そして、網膜が、ローダミン/FITCイソレクチンIB4(1:200)、ウサギ抗NG2抗体(1:200、Millipore、オランダ)、又はラット抗CD31抗体(1:500、R&D Systems、オランダ)、続いてAlexafluor標識化抗ウサギ/マウス二次抗体(1:500、Invitrogen、オランダ)により染色された。十分な導入遺伝子発現が、ｑＰＣＲ分析により確認された。網膜ＥＣのフローサイトメトリー評価について、網膜が、PBS/10%FCS中の0.12%コラゲナーゼタイプI(Sigma C-0130、オランダ)において15分間ホモジナイズされ、3ミクロンメッシュ(BD Biosciences、オランダ)を通じてろ過され、そして、1:50PE-標識されたマウス抗Flk1抗体により染色され、次にAnnexin V及びPI染色された。Flk1+集団におけるアポトーシス細胞又は死細胞のパーセンテージが、フローサイトメトリー(FACScanto、BD Biosciences、オランダ)により定量された。
【０２２１】
インビボのコーティングされたビーズのアッセイ
【０２２２】
成熟ＳＣＩＤマウス（１０〜１５週齢）が、皮下に、2.5ng/mlフィブリノーゲン及び20ng/mlヒトbFGFを補われた、300μlのMatrigel中の７００ビーズ(ビーズ当たり400のHUVEC)を注入された。それぞれの動物について、１のshamのウィルス及び１のＦＧＤ５過剰発現ＥＣを被覆されたビーズプラグが、脇腹に埋め込まれた。８日目で、固形化したMatrigelプラグが回収され、洗浄され、4%PFA/PBS中に固定化され、そしてＯＣＴ(Sakura Finetek、オランダ)に埋め込まれた。5μmの凍結切片が、ヘマトキシリン/エオシン染色により、又はラット抗CD31(1:500)及びローダミン標識された抗ラットIgG二次抗体 (1:500、R&D Systems、オランダ)により染色された。核の%及びCD31+細胞の%の定量について、データ分析が、市販の画像分析システム(Impak C、Clemex Technologies、カナダ)を用いて実施された。
【０２２３】
細胞増殖、アポトーシス、及び細胞周期の分析
【０２２４】
トランスフェクトされたＨＵＶＥＣが、EGM2/0.2%FCSにおける１２時間の血清除去により、G₀/G₁期に同期された。細胞増殖評価の為に、細胞が、回収され、そして、血球計算板（トリパンブルーネガティブ）を用いて、種々の時点で定量された。細胞代謝評価の為の3-(4,5-ジメチルチアゾール-2-イル)-2,5-ジフェニルテトラソディウムブロミド(MTT)取り込み実験が、製造者のプロトコル(ATCC、米国)に従い実施された。細胞周期分析：細胞が活性化後０、４、及び１２時間で回収され、そして70%エタノール/PBS中で15分間氷上で固定され、ヨウ化プロピジウムにより染色され(PI 1:300)、そしてフローサイトメトリーにより分析された。アポトーシス分析：細胞が活性化後０、４、及び１２時間で回収され、Annexin V アポトーシス検出キット(BD Biosciences、オランダ)を用いてAnnexin V及びPIシグナルについて染色され、続いてフローサイトメトリー(FACScanto、BD Biosciences、オランダ)による試料の分析が行なわれた。
【０２２５】
スモールＧタンパク質（Small G protein）活性化アッセイ及びＦＧＤ５−タンパク質複合体共免疫沈降
【０２２６】
GTP-RhoA、Rac1、及びcdc42の活性化レベルが、G-lisa検出システム(Tebu-Bio、オランダ)を用いて測定された。FGD5-タンパク質複合体共免疫沈降について、マグネチックビーズ(Dynabeads、Invitrogen、オランダ)が2.5μgの抗FGD5抗体 (Bioscience、オランダ)によりコーティングされそして架橋され、次に一晩4℃でトランスフェクトされたHUVECのタンパク質細胞溶解物と共免疫沈降された(100μlのインキュベーションバッファーの量の50μgの合計タンパク質)。ビーズが洗浄され、そして、該タンパク質試料が、溶出バッファー(Invitrogen、オランダ)により溶出され、次にウェスタンブロットにより分析された。
【０２２７】
結果
【０２２８】
マウス発生の間のFlk1+内皮血管芽細胞から分離されたRNA転写物のゲノムワイド発現プロファイリングが、早期胚発生の間のFLk1+血管芽細胞において特異的に上方制御された約2000の遺伝子の一つとして、FYVE、RhoGEF、及びPH domain-containing 5(FGD5)を同定した。Rhoグアニンヌクレオチド交換因子(GEF)のＦＧＤファミリーメンバーは、FGD1-6並びにFGD1-related cdc42-GEF(GRF)を含み、及び、Dblホモロジー(DH)ドメイン、FYVEドメイン、及びプレクストリンホモロジー(PH)ドメインを共有する。FGD5中のＤＨドメインの存在は、cdc42、Rac1、及びRhoAを含むスモールＧＴＰアーゼの結合及び活性化を予測する。実際に、FGD1、FGD4、及びFRGも、インビトロで線維芽細胞及び内皮細胞において不活性GDP結合cdc42を活性GTP結合cdc42に転化することにより、cdc42制御活性を発揮することが示し、cdc42を介して、アクチン細胞骨格アセンブリー、糸状仮足形成、及びJNK経路活性化を調節することが示されている。しかしながら、FGD5の基本的な機能は未知である。ここに、私たちは、脈管発達におけるFGD5の潜在的な制御役割及び分子機能を明確にしようとした。
【０２２９】
FGD5は、マウス及びゼブラフィッシュの発生の間の内皮前駆細胞において、及び完全に分化したＥＣにおいて特異的に発現される。
【０２３０】
FGD5は、マイクロアレイ分析及び続くｑＰＣＲ検証により示されたとおり、マウスにおける胚発生の間にFlk1+血管芽細胞集団において特異的に発現された。FGD5mRNAは、脈管構造の大部分が確立される9dpcから15dpcまで、Flk1+前駆細胞において優勢に発現された（図２７Ａ）。発生中の血管樹におけるＦＧＤ５の特異的な脈管発現はまた、ゼブラフィッシュ幼生においてホールマウントインシチュハイブリダイゼーションにより検出された：FGD5 mRNA発現は、背部大動脈、後主静脈、及び、体節間動脈に局在化された（図２７Ｂ）。ｑＰＣＲ分析を用いて、成熟C57/bl6マウスにおけるFGD5発現が、心臓、骨格筋、腎臓、肝臓、眼、及び脳の組織と比較したときに、大血管において優勢に発現され（図２７Ｃ）、eNOS及びCD31を含む内皮特異的マーカーの発現プロファイルを密接に模倣する一方で、他のＦＧＤファミリーメンバーは、より遍在的な発現パターンを示した（図２７Ｄ）。インビトロで、ＦＧＤ５は、無関係な細胞(Hela及び肉腫細胞、図27E)と比較したときに、ヒト動脈及び静脈の初代ＥＣ（ＨＵＶＥＣ及びＨＡＥＣ）において特異的に発現され、種々の種及び発生期における内皮特異的発現を強調する。免疫組織学的研究は、心筋の微小血管系において及び大動脈を含む大血管の内皮内張りにおいて、ＦＧＤ５のＥＣにおける選択的発現を実証した（図２７Ｆ、Ｇ）。これらの発見はさらに、公の遺伝子発現データベース（NCBI、Gene Expression Omnibus）の分析により確認された。これらのデータは、FGD5を、胚の脈管発達の間のＥＣにおいて及び成体の脈管系において特異的に発現されるＦＧＤファミリーの優勢なアイソフォームとして区別する。
【０２３１】
ＦＧＤ５は、ヒト内皮細胞培養物において血管新生を阻害する。
【０２３２】
培養されたＥＣ（ＨＵＶＥＣ）におけるＦＧＤ５機能が、FGD5を標的とするsiRNAのトランスフェクションによる又はヒトFGD5 cDNAをコードする組み換えアデノウィルスによる機能獲得及び喪失研究によって評価された。2Dマトリゲル管形成アッセイにおいて、siRNAにより媒介されたFGD5サイレンシングが、管長さ、分枝の数、及び増殖出芽の分岐の増加を結果した一方で（図２８Ａ〜Ｄ）、ＦＧＤ５過剰発現は、管、枝、及び分岐の減衰された成長を誘発し（図２Ｅ〜Ｈ）、自然の脈管再構築の間の過剰な毛細血管の、酸素供給により誘発された剪定におけるＦＧＤ５の役割を示唆する。同様に、エクスビボマウス大動脈リングアッセイにおいて、アデノウィルスにより媒介されたＦＧＤ５過剰発現は、shamのウィルスを形質導入されたリングと比較して、微小血管系の外方成長（outgrowth）を有意に減少した（図２８Ｉ、Ｊ）。加えて、血管新生のためのＨＵＶＥＣ被覆されたcytodexビーズを用いて確立されたモデルにおいて、ＦＧＤ５過剰発現が、shamのウィルスをトランスフェクトされた対照と比較し、毛細血管様構造の出芽を阻害した（図２８Ｋ〜Ｐ）。ＤＡＰＩ染色が用いられたときに、該アッセイの開始でのビーズへ付着した生存細胞の同程度の数を確認した。
【０２３３】
ＦＧＤ５はインビボの血管新生を減少する。
【０２３４】
インビボでの血管新生におけるＦＧＤ５の役割の評価を拡張する為に、Ad-FGD5又はshamのアデノウィルスを形質導入されたHUVECにより覆われたビーズが、マトリゲル中に懸濁され、そして、免疫欠損ＳＣＩＤマウスに皮下注射により注入された。移植後８日で回収されたマトリゲルプラグは、Ad-FGD5プラグにおけるプラグ脈管形成における減衰を明らかにする一方で、shamのプラグは、広範な新毛細血管ネットワークを示し（図２９Ａ、Ｂ）、及び、CD31+細胞のビーズ周囲の外方成長の増加を示した（図２９Ｃ〜Ｇ）。同様に、出生後網膜血管新生の間、ＦＧＤ５機能が、完全長マウスＦＧＤ５（ｍＦＧＤ５）ｃＤＮＡをコードするアデノウィルスベクターを用いて評価された（図２９Ｋ）。硝子体内注入によるアデノウィルスによるｍＦＧＤ５過剰発現(0.5x10⁷pfu)が、発生中のマウスの目における網膜脈管ネットワークを減少し（図２９Ｈ）、これは表面血管系における脈管構造の切断により引き起こされた（図２９Ｉ、Ｊ）：コンピュータ支援の画像分析が、合計脈管管長さ、及び新毛細血管の分岐及び管の数における減少を同定し（図２９Ｌ〜Ｏ）、ｍＦＧＤ５過剰発現が脈管密度を有意に減少することを示唆する。Ad-mFGD5又はshamのアデノウィルスの単回の硝子体内注入後のトランスフェクトされた網膜のフローサイトメトリー分析により示されるとおり、マウス網膜床におけるｍＦＧＤ５過剰発現が、%Flk1+細胞の減少(P,Q)及びFLK1+細胞集団におけるアポトーシスの増加(R,S)に関連付けられた。これらのデータは、網膜脈管ネットワークの発達における顕著な役割をＦＧＤ５が果たすことを示し、脈管成長に対する抑制機能又は脈管再構築の間の余剰新毛細血管の除去における剪定機能を示す。フローサイトメトリー分析による網膜脈管系発達の間の内因性ＦＧＤ５の発現レベルの評価は、FGD5+細胞集団におけるFLK1+（内皮）細胞のパーセンテージの有意な増加を示しており、これは開裂したカスパーゼ3+(アポトーシス)細胞フラクションにおけるFLK1+細胞の増加と一致した（図２９Ｔ、Ｕ）。より重要なことに、FLK1+細胞集団において、開裂カスパーゼ３シグナルが、評価された種々の時点の全てで、ＦＧＤ５発現と関連付けられた（図２９Ｒ、Ｓ）。加えて、ＦＧＤ５の高い平均強度（ＭＩ）レベルが、FLk1+且つ開裂カスパーゼ3+集団と関連付けられた(図29V,W)。総合して、これらのデータは、内因性の高いＦＧＤ５レベルが、ＥＣアポトーシスと関連付けられることの証拠を提供する。ｓｉＲＮＡにより媒介されたＦＧＤ５ノックダウンがさらに我々の発見を確認した。というのも、FGD5阻害が、脈管再構築プロセスの間に正常には除去された過剰分枝及び管構造の持続を結果したからである(図29V-Z)。
【０２３５】
ＦＧＤ５は、内皮細胞における増殖を阻害し及びアポトーシスを誘発する。
【０２３６】
ＦＧＤ５の観察された抗血管新生効果が、ＥＣ増殖率の変化に起因しうる。ＦＧＤ５を発現するＨＵＶＥＣは、shamのウィルスをトランスフェクトされた対照と比較したときに、減少した細胞増殖率をインビトロで示した（図３０Ａ、Ｂ）。対照的に、ｓｉＲＮＡにより媒介されたＦＧＤノックダウンＨＵＶＥＣは、スクランブル（scrambled）ｓｉＲＮＡの対照と比べて、細胞増殖の増加を示した（図３０Ｃ）。次に、私たちは、Annexin V/ヨウ化プロピジウムのフローサイトメトリー評価を用いて、ＦＧＤ５のアポトーシスに対する効果を分析した。ＦＧＤ５過剰発現は、ＥＣにおいてアポトーシスを促進し（図３０Ｄ、Ｅ）、及び、p53及びp21^CIP1タンパク質レベルの上方制御と関連付けられた(図30F、G)。これらのデータは、ＦＧＤ５が、脈管剪定をもたらすp53依存性アポトーシス及びp21^CIP1に関連した細胞周期停止に関与しうることを示す。
【０２３７】
ＦＧＤ５により誘発されたアポトーシスは、Hey1-p53制御経路を介して媒介される。
【０２３８】
ＦＧＤ５により媒介された脈管剪定に関与する下流シグナル伝達カスケードをさらに解明する為に、詳細に明らかにされた血管新生モジュレーターについての遺伝子発現プロファイルが、ｑＰＣＲにより決定された。初代ＥＣ培養物におけるＦＧＤ５ノックダウン又は過剰発現は、VEGFA、Jagged1、NRP1、NRP2、ephrinB2、及びephB4のｍＲＮＡ発現レベルを変化させなかった。対照的に、ＦＧＤ５ノックダウンは、VEGFR1/Flt1を抑制し、及び、VEGFR2/KDR/Flk1発現を促進した（血管新生促進状態）一方で、ＦＧＤ５過剰発現すると、VEGFR1 mRNAレベルが選ばれ、VEGFR2が減少された(抗血管新生状態、図30H)。加えて、ＦＧＤ５ノックダウンは、Notch1及び4、並びにDLL4を含むＮｏｔｃｈ経路遺伝子の上方制御と関連付けられた（図３０Ｈ）。興味深いことに、Hey1（Notchシグナル伝達経路の下流転写制御因子の一つ）が、ＦＧＤ５のノックダウンにより著しく下方制御された (図30 H)。
【０２３９】
Hey1過剰発現は、以前に、p53媒介のアポトーシスを誘発すると示された。これは、Hey1が、ＦＧＤ５誘発のアポトーシス応答をＥＣにおいて媒介しうることを示唆するだろう。ＦＧＤ５を発現するＨＵＶＥＣにおけるHey1ノックダウンが、ＦＧＤ５による増殖阻害を正常化し（図３１Ａ）、p53及びp21^CIP1上方制御を減少し(図31B、C)、及び、ＥＣをＦＧＤ５により誘発されたアポトーシスから救う（図31D、E)一方で、スクランブルｓｉＲＮＡとの共トランスフェクションは、効果を有さなかった。フローサイトメトリー分析を用いたヨウ化プロピジウム支援の評価は、ＦＧＤ５がsub-G₁アポトーシスフラクションを促進する一方で(図31 F、G)、S+G₂/G₁割合が減少したことを示唆し(sham及びFGD5ウィルスをそれぞれ形質導入されたHUVECについての、20/64=0.31と8/45=0.17の比較)、これはGolgi細胞周期停止を示唆する（図31F,G）。この細胞増殖抑制効果は、ＦＧＤ５過剰発現するＥＣにおけるHey1ノックダウンにより回復された（図３１F,G）。同様に、インビトロのコーティングされたビーズのアッセイは、毛細血管外方成長のＦＧＤ５阻害も、付随するHey1サイレンシングにより回復されうることを示した（図31H、I）。
【０２４０】
ＦＧＤ５により誘発されたアポトーシスはp53を介して媒介された。というのも、フローサイトメトリーによって示されるとおり（図３１Ｊ、Ｋ）、及び該コーティングされたビーズアッセイにおけるＦＧＤ５過剰発現の増殖阻害効果が無効にされたとおり（図３１Ｌ、Ｍ）、ＦＧＤ５過剰発現ＨＵＶＥＣのｐ５３を標的とするｓｉＲＮＡによる共トランスフェクションが、ＥＣにおいてアポトーシスを誘発しなかったからである。これらのデータは、後期新血管新生の間のＦＧＤ５についてのアポトーシス促進機能を支持し、及び、Hey1-p53シグナル伝達カスケードがＥＣにおける、ＦＧＤ媒介のプログラムされた細胞死の誘発において必須であることを示す。
【０２４１】
ＦＧＤ５はｃｄｃ４２に結合し及び活性化する。
【０２４２】
ＦＧＤ５の直接のタンパク質標的を決定する為に、私たちは、FGD5のDbl-ホモロジー(DH)ドメイン及びPHドメインがスモールGTPasesに結合し及び活性化できるかどうかを評価した。HUVEC中のFGD5-トランス遺伝子発現は、shamの対照と比較したときに、合計のcdc42、Rac1、又はRhoAタンパク質レベルに影響しなかった（図３２Ａ）。FGD5過剰発現ＨＵＶＥＣのタンパク質ライセート中のＦＧＤ５に対する抗体を用いた共免疫沈降（ＩＰ）が、cdc42を、ＦＧＤ５の選択的タンパク質結合性パートナーとして同定し（図３２Ｂ）、一方で、cdc42-FGD5結合が、GEF活性アッセイにおいてcdc42の特異的活性化をもたらした（図３２Ｃ〜Ｅ）。加えて、蛍光顕微鏡が、内因性FGD5が、ＥＣの細胞質内の核周辺部位で、cdc42と共局在することを示した（図３２Ｆ、Ｇ）。以前の研究は、FGD1、FGD4、及びFRGによるcdc42活性化を、培養された線維芽細胞におけるGTPを結合したcdc42への転化により実証した。同様に、FGD1及びcdc42の共局在化が、Hela細胞のGolgi複合体において観察された。該種々のＦＧＤメンバーによるcdc42 GEF活性のこの保存は、オーバーラップする機能によるタンパク質ファミリーにおける余剰を示唆すると思われるが、ＥＣにおけるＦＧＤ５の特異的な発現は、脈管形成におけるこの特定のＦＧＤメンバーについてのユニークな役割を示す。
【０２４３】
以前の研究は、自然の加齢の間の全身的なcdc42活性の増加を示した。トランスジェニックマウス系列における構成的に高められたcdc42-GTPレベルは、ＤＮＡ修復欠如、加速した細胞老化、及び増加したｐ５３依存性アポトーシスを伴う早期老化をもたらした。同様に、細胞培養物におけるcdc42活性化は以前に細胞老化、及びアポトーシスと関連付けられ、一方で造血幹細胞におけるcdc42欠失が細胞周期進行のp21^CIP1制御の欠失により、増殖を促進した。私たちのデータは、cdc42活性とp53媒介アポトーシスの間の直接的な関連性を、Hey1媒介性p53依存性細胞死をもたらす、ECにおけるcdc42-GTPへのFGD5媒介cdc42活性化として確認する。脈管発達の間、脈管叢が、脈管剪定（異常な新毛細血管を除去する為の活発なＥＣアポトーシスにより主に媒介されるプロセス）によって再組織化される。以前に、EphB4/ephrinB2、FasL-Fas、thrombospondin 1、angiostatin、及びendostatinを含む多くの遺伝子が、アポトーシス促進的刺激をＥＣへ与えることにより、血管新生における阻害機能を示すと同定された。脈管ネットワークの再構築の観点において、ＦＧＤ５は、この特定のプロセスにおいて重要なＥＣ選択的役割を果たすことができ、標的としたアポトーシスの誘発によって余剰な新脈管の脈管剪定に寄与する。

【特許請求の範囲】
【請求項１】
組織の新脈管形成の調節が必要である対象において当該調節をする為の方法であって、当該対象に、
RIKEN cDNA 9430020K01、Agtrl1、Apelin、Stabilin 1、Stabilin 2、TNFaip8l1、TNFaip8、及びFGD5、並びにそれらのホモログからなる群から選ばれる遺伝子を含む分離された核酸分子;
RIKEN cDNA 9430020K01、Agtrl1、Apelin、Stabilin 1、Stabilin 2、TNFaip8l1、TNFaip8、及びFGD5からなる群から選択される遺伝子により又はこれらの遺伝子のホモログによりコードされる遺伝子産物、並びにそれらの機能的断片;
RIKEN cDNA 9430020K01、Agtrl1、Apelin、Stabilin 1、Stabilin 2、TNFaip8l1、TNFaip8、及びFGD5からなる群から選ばれる遺伝子の遺伝子産物若しくはその機能的断片又はこれらの遺伝子のホモログによりコードされた遺伝子産物若しくはその機能的断片に対して向けられた抗体又はその誘導体、但し該誘導体は好ましくはscFv断片、Fab断片、キメラ抗体、二重機能的抗体、細胞内抗体、及び抗体から得られた他の分子から選ばれたものである;
RIKEN cDNA 9430020K01、Agtrl1、Apelin、Stabilin 1、Stabilin 2、TNFaip8l1、TNFaip8、及びFGD5、並びにこれらのホモログからなる群から選ばれる遺伝子又は該遺伝子のmRNA遺伝子産物とストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で結合することができるアンチセンス分子、特にはアンチセンスＲＮＡ又はアンチセンスオリゴデオキシヌクレオチド、ＲＮＡｉ分子（siRNA又はmiRNA）、又はリボザイム;
RIKEN cDNA 9430020K01、Agtrl1、Apelin、Stabilin 1、Stabilin 2、TNFaip8l1、TNFaip8、及びFGD5並びにそれらのホモログからなる群から選ばれる遺伝子の遺伝子産物の生物学的活性を干渉する小分子、及び、
RIKEN cDNA 9430020K01、Agtrl1、Apelin、Stabilin 1、Stabilin 2、TNFaip8l1、TNFaip8、及びFGD5、並びにこれらのホモログからなる群から選ばれる遺伝子と、又はその遺伝子産物と相互作用することができる（グリコール）タンパク質、ホルモン、及び他の生物学的に活性な化合物
から選ばれる化合物又は化合物の組み合わせの治療的に有効な量を投与することを含み、
該遺伝子ホモログが、該遺伝子の配列と少なくとも６０％の配列同一性を有する、
前記方法。
【請求項２】
新脈管形成を調節する為の前記方法が、
心臓血管疾患（心臓血管及び脳血管虚血性疾患及び末梢動脈疾患を包含する）を患うリスクを処置し又は緩和し又は予防する、身体的損傷（ステント留置術、医療的介入）の後の動脈治癒を改善する、アテローム性動脈硬化症を処置し又は緩和し又は予防する、アテローム性動脈硬化性プラーク形成を処置し又は緩和し又は予防する、プラーク不安定化（脆弱なプラークの形成及び破綻）を処置し又は緩和し又は予防する；ガン、特には腫瘍血管新生、を処置し又は緩和し又は予防する；糖尿病性網膜症又は網膜の網膜症又は漏出性又は過剰透過性脈管をもたらす増大した、異常な、未成熟な、加速された、及び／又は非協調的な脈管成長に関連したいずれかの状態を処置し又は緩和し又は予防する;
動脈の再構築並びに動脈の完全性及び／又は過剰透過性を誘発する為の処置;及び／又は
化合物、グラフト、及び／又はデバイス（バルブ、脈管グラフト、脈管内プロテーゼ、脈管内ステント）の、それらへの血栓形成のリスクを減少する為の、再内皮化（re-endothelialisation）を刺激する為の処置
の為の方法である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
請求項１に定義されたとおりの少なくとも１つの化合物の治療的に有効な量と、医薬的に許容できる添加物、キャリア、又は希釈剤とを含む医薬組成物。
【請求項４】
該化合物が、
RIKEN cDNA 9430020K01及びそのホモログからなる群から選ばれる遺伝子を含む分離された核酸分子;
遺伝子RIKEN cDNA 9430020K01によりコードされる又はこの遺伝子のホモログによりコードされる遺伝子産物、並びにその機能的断片;
遺伝子RIKEN cDNA 9430020K01の遺伝子産物若しくはその機能的断片又はこの遺伝子のホモログによりコードされる遺伝子産物若しくはその機能的断片に対して向けられた抗体又はその誘導体、但し該誘導体は好ましくscFv断片、Fab断片、キメラ抗体、二重機能的抗体、細胞内抗体、及び抗体から得られた他の分子からなる群から選ばれたものである;
RIKEN cDNA 9430020K01及びそのホモログからなる群から選ばれる遺伝子又は該遺伝子のmRNA遺伝子産物とストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で結合することができるアンチセンス分子、特にはアンチセンスＲＮＡ又はアンチセンスオリゴデオキシヌクレオチド、RNAi分子(siRNA又はmiRNA)又はリボザイム;
RIKEN cDNA 9430020K01及びそのホモログからなる群から選ばれる遺伝子の遺伝子産物の生物学的活性を干渉する小分子、又は
RIKEN cDNA 9430020K01及びそのホモログからなる群から選ばれる遺伝子又は遺伝子産物と相互作用することができる（グリコール）タンパク質、ホルモン、及び他の生物学的に活性な化合物
であり、
該遺伝子ホモログが、該遺伝子の配列と少なくとも６０％の配列同一性を有する、
請求項３の記載の医薬組成物。
【請求項５】
対象を処置する方法であって、該対象に、請求項３又は４の医薬組成物の治療的に有効な量を投与することを含む前記方法。
【請求項６】
該処置が、
心臓血管疾患を患うリスクの処置又は緩和又は予防、身体的損傷（ステント留置術、医療的介入）の後の動脈治癒の改善、アテローム性動脈硬化症の処置又は緩和又は予防、アテローム性動脈硬化性プラーク形成の処置又は緩和又は予防、プラーク不安定化（脆弱なプラークの形成及び破綻）の処置又は緩和又は予防；ガン、特には腫瘍血管新生、の処置又は緩和又は予防；糖尿病性網膜症又は網膜の網膜症又は漏出性又は過剰透過性の脈管をもたらす増大した、異常な、未成熟な、加速された、及び／又は非協調的な脈管成長に関連したいずれかの状態の処置又は緩和又は予防;
動脈の再構築及び動脈の完全性／過剰透過性を誘発する為の処置;
化合物、グラフト、及び／又はデバイス（バルブ、脈管グラフト、脈管内プロテーゼ、脈管内ステント）の、それらへの血栓形成のリスクを減少する為の、再内皮化（re-endothelialisation）を刺激する為の処置
を含む、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
心臓血管疾患を患うリスクの処置又は緩和又は予防、身体的損傷（ステント留置術、医療的介入）の後の動脈治癒の改善、アテローム性動脈硬化症の処置又は緩和又は予防、アテローム性動脈硬化性プラーク形成の処置又は緩和又は予防、プラーク不安定化（脆弱なプラークの形成及び破綻）の処置又は緩和又は予防；ガン、特には腫瘍血管新生、の処置又は緩和又は予防；糖尿病性網膜症又は網膜の網膜症又は漏出性又は過剰透過性の脈管をもたらす増大した、異常な、未成熟な、加速された、及び／又は非協調的な脈管成長に関連したいずれかの状態の処置又は緩和又は予防;
動脈の再構築及び動脈の完全性／過剰透過性を誘発する為の処置;及び／又は
化合物、グラフト、及び／又はデバイス（バルブ、脈管グラフト、脈管内プロテーゼ、脈管内ステント）の、それらへの血栓形成のリスクを減少する為の、再内皮化（re-endothelialisation）を刺激する為の処置
における、
医薬としての使用の為の、
RIKEN cDNA 9430020K01、Agtrl1、Apelin、Stabilin 1、Stabilin 2、TNFaip8l1、TNFaip8、及びFGD5、並びにそれらのホモログからなる群から選ばれる遺伝子を含む分離された核酸分子;
RIKEN cDNA 9430020K01、Agtrl1、Apelin、Stabilin 1、Stabilin 2、TNFaip8l1、TNFaip8、及びFGD5からなる群から選択される遺伝子によりコードされる又はこれらの遺伝子のホモログによりコードされる遺伝子産物、並びにそれらの機能的断片;
RIKEN cDNA 9430020K01、Agtrl1、Apelin、Stabilin 1、Stabilin 2、TNFaip8l1、TNFaip8、及びFGD5からなる群から選ばれる遺伝子の遺伝子産物若しくはその機能的断片又はこれらの遺伝子のホモログによりコードされた遺伝子産物若しくはその機能的断片に対して向けられた抗体又はその誘導体、但し該誘導体は好ましくはscFv断片、Fab断片、キメラ抗体、二重機能的抗体、細胞内抗体、及び抗体から得られた他の分子から選ばれたものである;
- RIKEN cDNA 9430020K01、Agtrl1、Apelin、Stabilin 1、Stabilin 2、TNFaip8l1、TNFaip8、及びFGD5、並びにこれらのホモログからなる群から選ばれる遺伝子又は該遺伝子のmRNA遺伝子産物とストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で結合することができるアンチセンス分子、特にはアンチセンスＲＮＡ又はアンチセンスオリゴデオキシヌクレオチド、ＲＮＡｉ分子（siRNA又はmiRNA）、又はリボザイム;
- RIKEN cDNA 9430020K01、Agtrl1、Apelin、Stabilin 1、Stabilin 2、TNFaip8l1、TNFaip8、及びFGD5並びにそのホモログからなる群から選ばれる遺伝子の遺伝子産物の生物学的活性を干渉する小分子、及び、
- RIKEN cDNA 9430020K01、Agtrl1、Apelin、Stabilin 1、Stabilin 2、TNFaip8l1、TNFaip8、及びFGD5及びこれらのホモログからなる群から選ばれる遺伝子と又はその遺伝子産物と相互作用することができる（グリコール）タンパク質、ホルモン、及び他の生物学的に活性な化合物
から選ばれる化合物。
【請求項８】
図１１、１３、及び１５〜２０のいずれか一つに記載されたとおりの配列と少なくとも６０％の配列同一性を有する配列を含む分離された核酸分子。
【請求項９】
医薬としての使用の為の、請求項８に記載の分離された核酸分子の遺伝子産物又は請求項８に記載の該核酸分子を含むベクター。
【請求項１０】
心臓血管疾患を患うリスクの処置又は緩和又は予防、身体的損傷（ステント留置術、医療的介入）の後の動脈治癒の改善、アテローム性動脈硬化症の処置又は緩和又は予防、アテローム性動脈硬化性プラーク形成の処置又は緩和又は予防、プラーク不安定化（脆弱なプラークの形成及び破綻）の処置又は緩和又は予防；ガン、特には腫瘍血管新生、の処置又は緩和又は予防；糖尿病性網膜症又は網膜の網膜症又は漏出性若しくは過剰透過性の脈管をもたらす増大した、異常な、未成熟な、加速された、及び／又は非協調的な脈管成長に関連したいずれかの状態の処置又は緩和又は予防;
動脈の再構築及び動脈の完全性／過剰透過性を誘発する為の処置;
化合物、グラフト、及び／又はデバイス（バルブ、脈管グラフト、脈管内プロテーゼ、脈管内ステント）の、それらへの血栓形成のリスクを減少する為の、再内皮化（re-endothelialisation）を刺激する為の処置
における使用の為の、請求項９に記載の遺伝子産物又はベクター。

【図１】

【図２】

【図３Ａ】

【図３Ｂ】

【図３Ｃ】

【図４】

【図５Ａ】

【図５Ｂ】

【図５Ｃ】

【図５Ｄ】

【図６】

【図７Ａ】

【図７Ｂ】

【図８Ａ】

【図８Ｂ】

【図８Ｃ】

【図９】

【図１０】

【図１１−１】

【図１１−２】

【図１２】

【図１３−１】

【図１３−２】

【図１４】

【図１５】

【図１６】

【図１７】

【図１８】

【図１９−１】

【図１９−２】

【図２０−１】

【図２０−２】

【図２１】

【図２２】

【図２３】

【図２４】

【図２５】

【図２６】

【図２７Ａ】

【図２７Ｂ】

【図２７Ｃ】

【図２７Ｄ−１】

【図２７Ｄ−２】

【図２７Ｅ】


【図２７Ｆ】

【図２７Ｇ】

【図２８−１】

【図２８−２】

【図２８−３】

【図２８−４】

【図２８−５】

【図２８−６】

【図２９−１】

【図２９−２】

【図２９−３】

【図２９−４】

【図２９−５】

【図２９−６】

【図２９−７】

【図２９−８】

【図２９Ｚ−１】

【図２９Ｚ−２】

【図３０−１】

【図３０−２】

【図３０Ｈ】

【図３１−１】

【図３１−２】

【図３１Ｆ】

【図３１Ｇ】

【図３１Ｈ】

【図３１Ｉ】

【図３１Ｊ】

【図３１Ｋ】

【図３１Ｌ】

【図３１Ｍ】

【図３２−１】

【図３２−２】

【図３２−３】

【公表番号】特表２０１３−５０９８７４（Ｐ２０１３−５０９８７４Ａ）
【公表日】平成２５年３月２１日（２０１３．３．２１）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１２−５３７８３２（Ｐ２０１２−５３７８３２）
【出願日】平成２２年１１月４日（２０１０．１１．４）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＮＬ２０１０／０５０７３６
【国際公開番号】ＷＯ２０１１／０５６０７３
【国際公開日】平成２３年５月１２日（２０１１．５．１２）
【出願人】（５０５０５５７８９）エラスムス　ユニバーシティ　メディカル　センター　ロッテルダム (6)
【Ｆターム（参考）】