新規なチアゾール誘導体固定化マトリックス、及びその製造方法
【課題】 タンパク質の分析または精製のための低分子化合物が固定化したマトリックスを提供すること。
【解決手段】 タンパク質の分析または精製に有用な、一般式（１）
【化１】
（式中、Ｒ１及びＲ２は水素原子又は置換されていてもよい炭素数１から６のアルキル基を表し、Ａｒは置換されていてもよい芳香族基を表し、ｎは１から１２の整数を表し、Ｍはマトリックスを表す。）で表されるチアゾール誘導体固定化マトリックスを提供するものである。
【解決手段】 タンパク質の分析または精製に有用な、一般式（１）
【化１】
（式中、Ｒ１及びＲ２は水素原子又は置換されていてもよい炭素数１から６のアルキル基を表し、Ａｒは置換されていてもよい芳香族基を表し、ｎは１から１２の整数を表し、Ｍはマトリックスを表す。）で表されるチアゾール誘導体固定化マトリックスを提供するものである。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、タンパク質、特に免疫グロブリンの分析または精製に利用可能なチアゾール誘導体を結合させたマトリックス、及びそれらの製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、医療用タンパク質の需要は拡大しつつあり、その簡便で大規模に実施できる工業的精製技術の確立が切望されている。一般にタンパク質精製技術には、ゲル透過クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィー、およびアフィニティークロマトグラフィーなどのクロマトグラフィー分離技術があるが、医療用タンパク質の精製を工業的に実施する場合には、実験室で用いられるような分離剤や装置を使用したのでは経済性に乏しく、実用的とは言い難い。また、医療用タンパク質を工業的に製造する過程では多種類のタンパク質が混在しているため、上記の中の一つの精製技術を用いて目的とするタンパク質を純粋に得ることは極めて困難である。そのため通常はいくつかの技術を複合させた精製プロセスが採用されている（特許文献１）。
【０００３】
近年、医療用タンパク質の一つである免疫グロブリンを精製するための低分子化合物とそれらが結合したマトリックスが数多く開示されており、スルホン誘導体（特許文献２）、トリアジン誘導体（特許文献３）、メルカプト複素環式化合物（特許文献４）、４−ピリジルエチルチオアルキル誘導体（非特許文献１）などの低分子化合物が結合したマトリックスが知られている。しかしながら、本発明のマトリックスの製造に用いるチアゾール誘導体（１ａ）が免疫グロブリンを精製するための低分子化合物として有用であるとの報告はない。また、特許文献５や非特許文献２に本発明のマトリックスの製造に用いるチアゾール誘導体（１ａ）に類似の化学構造を有するチアゾール誘導体が報告されているものの、これらの文献に記載のチアゾール誘導体の化学構造は、チアゾール環の２位がアミノ基あるいはアルキル基に限定されており、本発明のマトリックスの製造に用いるチアゾール誘導体（１ａ）のように２位にベンゾイルアミノ基が置換した化合物についての記載はない。とりわけ非特許文献２に記載の化合物は、本発明のマトリックスの製造に用いるチアゾール誘導体（１ａ）に類似のチアゾール誘導体ではあるものの、それらの用途はヒスタミンＨ２レセプターアゴニストとしての用途に限定されており、免疫グロブリンを精製するための用途についての記載はない。
【０００４】
なお、特許文献６にはチアゾール環の２位にベンゾイルアミノ基が置換したチアゾール誘導体が記載されているが、これらの化合物のチアゾール環の４位の置換基はカルボニル、５位は無置換にそれぞれ限定されており、それらの用途としては消化管運動改善作用を有する医薬の有効成分に言及されている。更には特許文献６の化合物はマトリックスに固定化されたものではなく、免疫グロブリンを精製するための用途についての記載もない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】ＷＯ２００４／０８７７６１号
【特許文献２】米国特許４６９６９８０号
【特許文献３】米国特許６１１７９９６号
【特許文献４】特許第３８４４４９６号
【特許文献５】ＷＯ１９９１／１０６５６号
【特許文献６】ＷＯ１９９８／１７６５４号
【特許文献７】ＷＯ１９８９／１０３６０号
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Ｂｉｏｓｅｐａｒａｔｉｏｎ，９（４），２１１−２２１，２０００
【非特許文献２】Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，３５（１７），３２３９−３２４６，１９９２
【非特許文献３】はじめてのリガンドカップリングハンドブック、アマシャムバイオサイエンス株式会社刊、２００５
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明が解決しようとする課題は、タンパク質、特に免疫グロブリンの分析または精製に有用なチアゾール誘導体を固定化したマトリックス、及びそれらの製造方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者は、上記課題を解決すべく鋭意検討を重ねた結果、本発明の下記一般式（１）で示されるチアゾール誘導体固定化マトリックスが、タンパク質、特に免疫グロブリンの簡便な分析または精製を可能にすることを見出し、本発明を完成するに至った。
【０００９】
本発明は、一般式（１）
【００１０】
【化１】
（式中、Ｒ１及びＲ２は水素原子又は置換されていてもよい炭素数１から６のアルキル基を表し、Ａｒは置換されていてもよい芳香族基を表し、ｎは１から１２の整数を表し、Ｍはマトリックスを表す。）で表されるチアゾール誘導体固定化マトリックスに関するものである。
【００１１】
また本発明は、一般式（１）
【００１２】
【化２】
（式中、Ｒ１、Ｒ２、Ａｒ、ｎ及びＭは前記と同じ意味を表す。）においてＭのマトリックスがビニルポリマー、アガロース、キトサン、デキストラン、セルロース、シリカ、ポリスチレンのいずれかであることを特徴とする、チアゾール誘導体固定化マトリックスに関するものである。
【００１３】
また本発明は、一般式（１ａ）
【００１４】
【化３】
（式中、Ｒ１、Ｒ２、Ａｒ及びｎは前記と同じ意味を表し、Ｒ３はアミノ基又はアンモニウム塩を表す。）で示されるチアゾール誘導体と、活性化基含有マトリックスとを反応させることを特徴とする、一般式（１）
【００１５】
【化４】
（式中、Ｒ１、Ｒ２、Ａｒ、ｎ及びＭは前記と同じ意味を表す。）で示されるチアゾール誘導体固定化マトリックスの製造方法に関するものである。
【００１６】
また本発明は、一般式（１）
【００１７】
【化５】
（式中、Ｒ１、Ｒ２、Ａｒ、ｎ及びＭは前記と同じ意味を表す。）で示されるチアゾール誘導体固定化マトリックスを使用し、タンパク質の分析または精製を行なう方法に関するものである。
【００１８】
以下、本発明をさらに詳細に説明する。
【００１９】
本発明のチアゾール誘導体固定化マトリックス（１）及び前記固定化マトリックスの製造に用いるチアゾール誘導体（１ａ）における、Ｒ１、Ｒ２及びＡｒで表される置換基、並びにＲ３で表されるアンモニウム塩（Ｚ−Ｈ３＋Ｎ）の定義を以下に示す。
【００２０】
Ｒ１及びＲ２で表される炭素数１から６のアルキル基としては、直鎖状もしくは分枝状のいずれであってもよく、メチル基、エチル基、プロピル基、イソプロピル基、ブチル基、イソブチル基、ｓｅｃ−ブチル基、ｔｅｒｔ−ブチル基、ペンチル基、イソアミル基、ネオペンチル基、２−ペンチル基、３−ペンチル基、ｔｅｒｔ−ペンチル基、ヘキシル基、イソヘキシル基、２−ヘキシル基、３−ヘキシル基を例示することができる。また、これらの炭素数１から６のアルキル基はハロゲン原子等で置換されていてもよく、さらに具体的にはジフルオロメチル基、トリフルオロメチル基、２，２，２−トリフルオロエチル基、パーフルオロブチル基、ヒドロキシメチル基、カルボキシメチル基、４−モルホリノカルボニルメチル基等を例示することができる。特に本発明の固定化マトリックスの製造に用いるチアゾール誘導体としては、免疫グロブリンの分析または精製において良好な性能を示す点で、Ｒ１はメチル基が好ましく、Ｒ２は水素原子が好ましい。
【００２１】
Ｒ３で表されるアンモニウム塩はＺ−Ｈ３＋Ｎ（Ｚ−は共役塩基を表す。）で表され、具体的にはＣｌ−Ｈ３＋Ｎ、Ｂｒ−Ｈ３＋Ｎ、Ｆ−Ｈ３＋Ｎ、Ｉ−Ｈ３＋Ｎ、ＮＯ３−Ｈ３＋Ｎ、１／２（ＳＯ４２−）Ｈ３＋Ｎ、１／３（ＰＯ４３−）Ｈ３＋Ｎ、ＣＨ３ＳＯ３−Ｈ３＋Ｎ、４−ＣＨ３Ｃ６Ｈ４ＳＯ３−Ｈ３＋Ｎ、ＣＨ３ＣＯＯ−Ｈ３＋Ｎ、ＣＦ３ＣＯＯ−Ｈ３＋Ｎ等を例示することができるが、マトリックスへの固定化の反応性や操作性に優れている点で、Ｃｌ−Ｈ３＋Ｎ又はＢｒ−Ｈ３＋Ｎが好ましい。
【００２２】
Ａｒで表される芳香族基は特に制限はないが、フラン−２−イル基、フリル基、チエニル基、チオフェン−３−イル基、ピロール−２−イル基、ピロール−３−イル基、ピラゾール−３−イル基、ピラゾール−４−イル基、イソチアゾール−３−イル基、イソチアゾール−４−イル基、イソキサゾール−３−イル基、イソキサゾール−４−イル基、イミダゾール−２−イル基、イミダゾール−４−イル基、イミダゾール−５−イル基、オキサゾール−２−イル基、オキサゾール−４−イル基、オキサゾール−５−イル基、チアゾール−２−イル基、チアゾール−４−イル基、チアゾール−５−イル基、１，２，４−トリアゾール−３−イル基、フェニル基、２−ピリジル基、３−ピリジル基、４−ピリジル基、２−ピリミジル基、４−ピリミジル基、５−ピリミジル基、１，２，４−トリアジン−３−イル基、１，２，４−トリアジン−５−イル基、１，２，４−トリアジン−６−イル基、ベンゾジオキソラン−３−イル基、ベンゾフラン−２−イル基、ベンゾフラン−３−イル基、ベンゾフラン−４−イル基、ベンゾフラン−５−イル基、ベンゾフラン−６−イル基、ベンゾフラン−７−イル基、ベンゾチオフェン−２−イル基、ベンゾチオフェン−３−イル基、ベンゾチオフェン−４−イル基、ベンゾチオフェン−５−イル基、ベンゾチオフェン−６−イル基、ベンゾチオフェン−７−イル基、インドール−２−イル基、インドール−３−イル基、インドール−４−イル基、インドール−５−イル基、インドール−６−イル基、インドール−７−イル基、ベンゾチアゾール−２−イル基、ベンゾチアゾール−４−イル基、ベンゾチアゾール−５−イル基、ベンゾチアゾール−６−イル基、ベンゾチアゾール−７−イル基、インダゾール−３−イル基、インダゾール−４−イル基、インダゾール−５−イル基、インダゾール−６−イル基、インダゾール−７−イル基、ベンズイソキサゾール−３−イル基、ベンズイソキサゾール−４−イル基、ベンズイソキサゾール−５−イル基、ベンズイソキサゾール−６−イル基、ベンズイソキサゾール−７−イル基、ナフタレン−１−イル基、ナフタレン−２−イル基、キノリン−２−イル基、キノリン−３−イル基、キノリン−４−イル基、キノリン−５−イル基、キノリン−６−イル基、キノリン−７−イル基、キノリン−８−イル基、キノキサリニル基、キノキサリン−５−イル基、キノキサリン−６−イル基、キナゾリニル基、キナゾリン−４−イル基、キナゾリン−５−イル基、キナゾリン−６−イル基、キナゾリン−７−イル基、キナゾリン−８−イル基、ベンゾオキサジン−５−イル基、ベンゾオキサジン−６−イル基、ベンゾオキサジン−７−イル基、ベンゾオキサジン−８−イル基、ベンゾチアジン−５−イル基、ベンゾチアジン−６−イル基、ベンゾチアジン−７−イル基、ベンゾチアジン−８−イル基、１，３−ベンゾジオキソール−４−イル基、１，３−ベンゾジオキソール−５−イル基、１，３−ベンゾジオキソール−６−イル基、１，３−ベンゾジオキソール−７−イル基、アントラセン−１−イル基を例示できる。特に、免疫グロブリンの分析または精製において良好な性能を示す点で、Ａｒはフェニル基、２−ピリジル基、３−ピリジル基あるいは４−ピリジル基が好ましい。
【００２３】
Ａｒで表される置換されていてもよい芳香族基の置換基としては、特に制限はないが、ハロゲン原子、置換されていてもよい炭素数１から６のアルキル基、置換されていてもよい炭素数１から１２のアルコキシ基、置換されていてもよい炭素数３から８のシクロアルコキシ基、置換されていてもよい炭素数３から６のアルケニルオキシ基、置換されていてもよい炭素数３から６のアルキニルオキシ基、置換されていてもよい炭素数１から６のアシルオキシ基、置換されていてもよい炭素数１から６のアルキルチオ基、置換されていてもよい炭素数１から６のアルキルスルフィニル基、置換されていてもよい炭素数１から６のアルキルスルホニル基、置換されていてもよい炭素数１から１２のアルコキシカルボニル基、カルボキシル基、ニトロ基、置換されていてもよいアミノ基、水酸基又はシアノ基が好ましい。
【００２４】
ハロゲン原子としては、フッ素原子、塩素原子、臭素原子あるいはヨウ素原子を例示することができる。
【００２５】
置換されていてもよい炭素数１から６のアルキル基としては、直鎖状、分枝状もしくは環状のいずれであってもよく、メチル基、エチル基、シクロプロピル基、プロピル基、イソプロピル基、シクロプロピル基、ブチル基、イソブチル基、ｓｅｃ−ブチル基、ｔｅｒｔ−ブチル基、ペンチル基、イソアミル基、ネオペンチル基、２−ペンチル基、３−ペンチル基、２−メチルブチル基、ｔｅｒｔ−ペンチル基、ヘキシル基、イソヘキシル基、２−ヘキシル基、３−ヘキシル基を例示することができる。また、これらの炭素数１から６のアルキル基はハロゲン原子、炭素数３から８のシクロアルキル基、炭素数１から６のアルコキシ基、炭素数１から６のアルコキシカルボニル基、カルボキシ基、アシル基、置換されていてもよい芳香族基で１個以上置換されていてもよく、さらに具体的には２−クロロエチル基、３−クロロプロピル基、ジフルオロメチル基、３−フルオロプロピル基、メトキシメチル基、２−エトキシエチル基、シクロプロピルメチル基、シクロペンチルメチル基、シクロヘキシルメチル基、２−メチルチオエチル基、２−エチルチオエチル基、２−アリルチオエチル基、２−プロパルギルチオエチル基、２−ベンジルチオエチル基、２−（２−クロロベンジル）チオエチル基、２−（２，４−ジクロロベンジル）チオエチル基、２−メチルスルフィニルエチル基、２−メチルスルホニルエチル基、エトキシメチル基、２−メトキシエチル基、２−クロロエトキシメチル基、メトキシカルボニルメチル基、エトキシカルボニルメチル基、１−メトキシカルボニルエチル基、１−エトキシカルボニルエチル基、２−エトキシカルボニルエチル基、カルボキシメチル基、アセトニル基、１−アセチルエチル基、３−アセチルプロピル基、フェナシル基、４−クロロフェナシル基、２，４−ジフルオロフェナシル基、４−メチルフェナシル基、４−イソプロピルフェナシル基、４−イソブチルフェナシル基、４−シクロヘキシルフェナシル基、４−シアノフェナシル基、４−ニトロフェナシル基、チエニル基、２−（チオフェン−２−イル）エチル基、２−（チオフェン−３−イル）エチル基、フルフリル基、（５−メチルフラン−２−イル）メチル基、（５−エチルフラン−２−イル）メチル基、（５−クロロフラン−２−イル）メチル基、２−（５−フルオロフラン−２−イル）エチル基、テトラヒドロフルフリル基、２−ピリジルメチル基、３−ピリジルメチル基、４−ピリジルメチル基、２−（ピリジン−２−イル）エチル基、２−（ピリジン−３−イル）エチル基、２−（ピリジン−４−イル）エチル基、３−（ピリジン−２−イル）プロピル基、３−（ピリジン−３−イル）プロピル基、３−（ピリジン−４−イル）プロピル基を例示することができる。
【００２６】
置換されていてもよい炭素数１から１２のアルコキシ基としては、直鎖状もしくは分枝状のいずれであってもよく、メトキシ基、エトキシ基、プロピルオキシ基、イソプロピルオキシ基、ブトキシ基、イソブチルオキシ基、ｓｅｃ−ブチルオキシ基、ｔｅｒｔ−ブトキシ基、ペンチルオキシ基、イソアミルオキシ基、ネオペンチルオキシ基、２−ペンチルオキシ基、３−ペンチルオキシ基、ｔｅｒｔ−ペンチルオキシ基、ヘキシルオキシ基、イソヘキシルオキシ基、２−ヘキシルオキシ基、３−ヘキシルオキシ基、デセニルオキシ基を例示することができる。また、これらのアルコキシ基はハロゲン原子、炭素数３から８のシクロアルキル基、炭素数１から６のアルコキシ基、炭素数１から６のアルコキシカルボニル基、カルボキシ基、アシル基、置換されていてもよい芳香族基等で１個以上置換されていてもよく、さらに具体的には２−クロロエトキシ基、３−クロロプロピルオキシ基、ジフルオロメトキシ基、４−トリフルオロメトキシ基、３−フルオロプロピルオキシ基、シクロプロピルメトキシ基、シクロペンチルメトキシ基、シクロヘキシルメトキシ基、２−メチルチオエトキシ基、２−エチルチオエトキシ基、２−アリルチオエトキシ基、２−プロパルギルチオエトキシ基、２−ベンジルチオエトキシ基、２−（２−クロロベンジル）チオエトキシ基、２−（２，４−ジクロロベンジル）チオエトキシ基、２−メチルスルフィニルエトキシ基、２−メチルスルホニルエトキシ基、メトキシメトキシ基、エトキシメトキシ基、２−メトキシエトキシ基、２−クロロエトキシメトキシ基、メトキシカルボニルメトキシ基、エトキシカルボニルメトキシ基、１−メトキシカルボニルエトキシ基、１−エトキシカルボニルエトキシ基、２−エトキシカルボニルエトキシ基、カルボキシメトキシ基、１−アセチルエトキシ基、３−アセチルプロポキシ基、２−ピリジルメトキシ基、３−ピリジルメトキシ基、４−ピリジルメトキシ基、２−（ピリジン−２−イル）エトキシ基、２−（ピリジン−３−イル）エトキシ基、２−（ピリジン−４−イル）エトキシ基、３−（ピリジン−２−イル）プロポキシ基、３−（ピリジン−３−イル）プロポキシ基、ベンジルオキシ基を例示することができる。
【００２７】
置換されていてもよい炭素数３から８のシクロアルコキシ基としては、シクロプロピルオキシ基、シクロブチルオキシ基、シクロペンチルオキシ基、２−メチルシクロブチルオキシ基、シクロヘキシルオキシ基、２−メチルシクロペンチルオキシ基、３−メチルシクロペンチルオキシ基、４−メチルシクロペンチルオキシ基、シクロオクチルオキシ基を例示することができる。
【００２８】
置換されていてもよい炭素数３から６のアルケニルオキシ基としては、アリルオキシ基、２−メチル−２−プロペニルオキシ基、２−ブテニルオキシ基、１−ブテン−３−イルオキシ基、３−ブテニルオキシ基、４−ペンテニルオキシ基、５−ヘキセニルオキシ基を例示することができる。また、これらの炭素数３から６のアルケニルオキシ基はハロゲン原子等で置換されていてもよく、３，３−ジフルオロアリルオキシ基、３，３−ジクロロアリルオキシ基、３，３−ジブロモアリルオキシ基を例示することができる。
【００２９】
置換されていてもよい炭素数３から６のアルキニルオキシ基としては、プロパルギルオキシ基、１−ブチン−３−イルオキシ基、２−ブチニルオキシ基、３−ブチニルオキシ基、２−ペンチニルオキシ基、３−ペンチニルオキシ基、４−ペンチニルオキシ基、２−ヘキシニルオキシ基、３−ヘキシニルオキシ基、４−ヘキシニルオキシ基、５−ヘキシニルオキシ基を例示することができる。また、これらの置換されていてもよい炭素数３から６のアルキニルオキシ基はハロゲン原子等で置換されていてもよく、４，４，４−トリフルオロブチン−２−イル基等を例示することができる。
【００３０】
置換されていてもよいアシルオキシ基としては、アセトキシ基、プロピオニルオキシ基を例示することができる。また、これらの置換されていてもよいアシルオキシ基はハロゲン原子等で置換されていてもよく、トリフルオロアセトキシ基や２，２，２−トリフルオロプロピオニルオキシ基等を例示することができる。
【００３１】
置換されていてもよい炭素数１から６のアルキルチオ基としては、メチルチオ基、エチルチオ基、プロピルチオ基、イソプロピルチオ基、ブチルチオ基、イソブチルチオ基、ｓｅｃ−ブチルチオ基、ペンチルチオ基、イソアミルチオ基、ネオペンチルチオ基、２−ペンチルチオ基、３−ペンチルチオ基、２−メチルブチルチオ基、ヘキシルチオ基、イソヘキシルチオ基、３−メチルペンチルチオ基、２−メチルペンチルチオ基を例示することができる。また、これらのアルキルチオ基はハロゲン原子、炭素数３から８のシクロアルキル基等で一個以上置換されていてもよく、さらに具体的には２−クロロエチルチオ基、３−クロロプロピルチオ基、ジフルオロメチルチオ基、３−フルオロプロピルチオ基、シクロプロピルメチルチオ基、シクロペンチルメチルチオ基、シクロヘキシルメチルチオ基を例示することができる。
【００３２】
置換されていてもよい炭素数１から６のアルキルスルフィニル基としては、メチルスルフィニル基、エチルスルフィニル基、プロピルスルフィニル基、イソプロピルスルフィニル基、ブチルスルフィニル基、イソブチルスルフィニル基、ｓｅｃ−ブチルスルフィニル基、ペンチルスルフィニル基、イソアミルスルフィニル基、ネオペンチルスルフィニル基、２−ペンチルスルフィニル基、３−ペンチルスルフィニル基、２−メチルブチルスルフィニル基、ヘキシルスルフィニル基、イソヘキシルスルフィニル基、３−メチルペンチルスルフィニル基、２−メチルペンチルスルフィニル基を例示することができる。また、これらのアルキルスルフィニル基はハロゲン原子、炭素数３から８のシクロアルキル基等で一個以上置換されていてもよく、さらに具体的には２−クロロエチルスルフィニル基、３−クロロプロピルスルフィニル基、ジフルオロメチルスルフィニル基、３−フルオロプロピルスルフィニル基、シクロプロピルメチルスルフィニル基、シクロペンチルメチルスルフィニル基、シクロヘキシルメチルスルフィニル基を例示することができる。
【００３３】
置換されていてもよい炭素数１から６のアルキルスルホニル基としては、メチルスルホニル基、エチルスルホニル基、プロピルスルホニル基、イソプロピルスルホニル基、ブチルスルホニル基、イソブチルスルホニル基、ｓｅｃ−ブチルスルホニル基、ペンチルスルホニル基、イソアミルスルホニル基、ネオペンチルスルホニル基、２−ペンチルスルホニル基、３−ペンチルスルホニル基、２−メチルブチルスルホニル基、ヘキシルスルホニル基、イソヘキシルスルホニル基、３−メチルペンチルスルホニル基、２−メチルペンチルスルホニル基を例示することができる。また、これらのアルキルスルホニル基はハロゲン原子、炭素数３から８のシクロアルキル基で一個以上置換されていてもよく、さらに具体的には２−クロロエチルスルホニル基、３−クロロプロピルスルホニル基、ジフルオロメチルスルホニル基、３−フルオロプロピルスルホニル基、シクロプロピルメチルスルホニル基、シクロペンチルメチルスルホニル基、シクロヘキシルメチルスルホニル基を例示することができる。
【００３４】
置換されていてもよい炭素数１から１２のアルコキシカルボニル基としては、メトキシカルボニル基、エトキシカルボニル基、プロポキシカルボニル基、ブトキシカルボニル基、ヘキシルオキシカルボニル基、ドデシルオキシカルボニル基、ベンジルオキシカルボニル基、ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル基を例示することができる。また、これらのアルコキシカルボニル基はハロゲン原子等で一個以上置換されていてもよく、さらに具体的にはトリフルオロメトキシカルボニル基、２，２，２−トリフルオロエトキシカルボニル基等を例示することができる。
【００３５】
置換されていてもよいアミノ基としては、メチルアミノ基、ジメチルアミノ基、エチルアミノ基、Ｎ−エチル−Ｎ−メチルアミノ基、ジエチルアミノ基、Ｎ−メチル−Ｎ−プロピルアミノ基、Ｎ−エチル−Ｎ−プロピルアミノ基、２，２，２−トリフルオロエチルアミノ基、ジプロピルアミノ基、イソプロピルアミノ基、Ｎ−メチル−Ｎ−イソプロピルアミノ基、ブチルアミノ基、Ｎ−ブチル−Ｎ−メチルアミノ基、イソブチルアミノ基、ｓｅｃ−ブチルアミノ基、ペンチルアミノ基、イソアミルアミノ基、ネオペンチルアミノ基、２−ペンチルアミノ基、３−ペンチルアミノ基、２−メチルブチルアミノ基、ヘキシルアミノ基、イソヘキシルアミノ基、４−メチルペンチルアミノ基、ベンゼンスルホニルアミノ基、Ｎ−ベンゼンスルホニル−Ｎ−メチルアミノ基、ｐ−トルエンスルホニルアミノ基、４−クロロベンゼンスルホニルアミノ基、４−ニトロベンゼンスルホニルアミノ基、メチルスルホニルアミノ基、クロロメチルスルホニルアミノ基、トリフルオロメチルスルホニルアミノ基、Ｎ−メチルスルホニル−Ｎ−メチルアミノ基、Ｎ−メチルスルホニル−Ｎ−エチルアミノ基、Ｎ−メチルスルホニル−Ｎ−プロピルアミノ基、エチルスルホニルアミノ基、Ｎ−エチルスルホニル−Ｎ−メチルアミノ基、Ｎ−エチルスルホニル−Ｎ−エチルアミノ基、メトキシカルボニルアミノ基、エトキシカルボニルアミノ基を例示することができる。
【００３６】
Ａｒで表される置換されていてもよい芳香族基としては、特に制限はないが、フラン−２−イル基、５−ブロモフラン−２−イル基、５−メチルフラン−２−イル基、フリル基、チエニル基、５−クロロチエニル基、５−ブロモチエニル基、５−メチルチエニル基、５−メトキシチエニル基、５−エトキシチエニル基、チオフェン−３−イル基、５−メチルチオフェン−３−イル基、５−メトキシチオフェン−３−イル基、５−エトキシチオフェン−３−イル基、１−メチルピロール−２−イル基、１−メチルピロール−３−イル基、１−エチルピラゾール−３−イル基、ピラゾール−２−イル基、３−エトキシ−１−メチルピラゾール−２−イル基、１−エチル−４−メトキシピラゾール−３−イル基、イソチアゾール−３−イル基、５−メトキシイソチアゾール−３−イル基、イソチアゾール−４−イル基、イソキサゾール−３−イル基、イソキサゾール−４−イル基、１−メチルイミダゾール−２−イル基、１−メチルイミダゾール−４−イル基、１−メチルイミダゾール−５−イル基、オキサゾール−２−イル基、オキサゾール−４−イル基、オキサゾール−５−イル基、チアゾール−２−イル基、３−メトキシチアゾール−２−イル基、４−メトキシチアゾール−２−イル基、チアゾール−４−イル基、チアゾール−５−イル基、１，２，４−トリアゾール−３−イル基、１，２，４−トリアゾール−５−イル基、フェニル基、２−フルオロフェニル基、３−フルオロフェニル基、４−フルオロフェニル基、２，３−ジフルオロフェニル基、３，５−ジフルオロフェニル基、３，４，５−トリフルオロフェニル基、２，３，４，５，６−ペンタフルオロフェニル基、３−フルオロ−４−メチルフェニル基、４−トリフルオロメトキシフェニル基、２−クロロフェニル基、３−クロロフェニル基、４−クロロフェニル基、４−クロロ−３−メチルフェニル基、４−クロロ−３−エチルフェニル基、４−クロロ−３−メトキシフェニル基、４−クロロ−３−エトキシフェニル基、２，３−ジクロロフェニル基、３，５−ジクロロフェニル基、３，４，５−トリクロロフェニル基、３−トリフルオロメチルフェニル基、４−トリフルオロメチルフェニル基、３−ブロモフェニル基、４−ブロモフェニル基、４−ブロモ−３−メチルフェニル基、４−ブロモ−３−エチルフェニル基、４−ブロモ−３−メトキシフェニル基、４−ブロモ−３−エトキシフェニル基、３，５−ジブロモ−４−ヒドロキシフェニル基、３−ヨードフェニル基、４−ヨードフェニル基、４−ヨード−３−メチルフェニル基、４−ヨード−３−エチルフェニル基、４−ヨード−３−メトキシフェニル基、４−ヨード−３−エトキシフェニル基、２−メチルフェニル基、３−メチルフェニル基、４−メチルフェニル基、３，４−ジメチルフェニル基、３，４，５−トリメチルフェニル基、３−ヒドロキシ−４−メチルフェニル基、２−トリフルオロフェニルメチルフェニル基、３−トリフルオロフェニルメチルフェニル基、４−トリフルオロフェニルメチルフェニル基、４−メトキシメチルフェニル基、３，４−ジエトキシフェニル基、３−エチル−４−メチルフェニル基、４−エチル−３−メチルフェニル基、４−エチルフェニル基、３，４−ジエチルフェニル基、４−プロピルフェニル基、４−イソプロピルフェニル基、３−ブチルフェニル基、４−ブチルフェニル基、４−イソブチルフェニル基、４−（ｓｅｃ−ブチル）フェニル基、４−（ｔｅｒｔ−ブチル）フェニル基、４−ペンチルフェニル基、４−イソアミルフェニル基、４−ネオペンチルフェニル基、４−（２−ペンチル）フェニル基、４−（３−ペンチル）フェニル基、４−（２−メチルブチル）フェニル基、４−（ｔｅｒｔ−ペンチル）フェニル基、４−ヘキシルフェニル基、４−イソヘキシルフェニル基、４−（２−クロロエチル）フェニル基、４−（３−クロロプロピル）フェニル基、４−（ジフルオロメチル）フェニル基、４−（３−フルオロプロピル）フェニル基、４−メトキシメチルフェニル基、４−エトキシメチルフェニル基、４−シクロプロピルメチルフェニル基、４−シクロペンチルメチルフェニル基、シクロヘキシルメチルフェニル基、４−（２−メチルチオエチル）フェニル基、４−（２−エチルチオエチル）フェニル基、４−（２−アリルチオエチル）フェニル基、４−（２−プロパルギルチオエチル）フェニル基、４−（２−ベンジルチオエチル）フェニル基、３−メトキシフェニル基、３−メトキシ−４−メチルフェニル基、４−エチル−３−メトキシフェニル基、３−メトキシ−４−プロピルフェニル基、４−メトキシフェニル基、４−メトキシ−３−メトキシフェニル基、３，４−ジメトキシフェニル基、３−エトキシ−４−メトキシフェニル基、４−エトキシ−３−メトキシフェニル基、４−イソプロピルオキシ−３−メトキシフェニル基、３−イソプロピルオキシ−４−メトキシフェニル基、３−エトキシフェニル基、４−エトキシフェニル基、４−エトキシ−３−メチルフェニル基、４−エトキシ−３−エチルフェニル基、４−エトキシ−３−プロピルフェニル基、４−エトキシ−３−イソプロピルフェニル基、４−プロピルオキシフェニル基、４−イソプロピルオキシフェニル基、４−ブトキシフェニル基、４−イソブチルオキシフェニル基、４−（ｓｅｃ−ブチルオキシ）フェニル基、３−（２−クロロエトキシ）フェニル基、３−（２−クロロエトキシ）フェニル基、４−（２−クロロエトキシ）フェニル基、３−（３−クロロプロピルオキシ）フェニル基、４−（３−クロロプロピルオキシ）フェニル基、３−ジフルオロメトキシフェニル基、４−ジフルオロメトキシフェニル基、４−（３−フルオロプロピルオキシフェニル基）、４−シクロプロピルメトキシフェニル基、４−シクロペンチルメトキシ基、４−シクロヘキシルメトキシ基、３−シクロプロピルオキシフェニル基、４−シクロプロピルオキシフェニル基、４−シクロプロピルオキシ−３−メトキシフェニル基、４−シクロプロピルオキシ−３−メチルフェニル基、４−シクロブチルオキシフェニル基、４−シクロペンチルオキシフェニル基、４−（２−メチルシクロブチルオキシ）フェニル基、４−シクロヘキシルオキシフェニル、４−アリルオキシフェニル基、４−（３，３−ジクロロアリルオキシ）フェニル基、４−プロパルギルオキシフェニル基、３−メチル−４−プロパルギルオキシフェニル基、３−エチル−４−プロパルギルオキシフェニル基、３−メトキシ−４−プロパルギルオキシフェニル基、３−エトキシ−４−プロパルギルオキシフェニル基、３−プロポキシ−４−プロパルギルオキシフェニル基、４−（１−ブチン−３−イルオキシ）フェニル基、４−（２−ブチニルオキシ）フェニル基、３−メチルチオフェニル基、４−メチルチオフェニル基、４−メチル−３−メチルチオフェニル基、３−メチル−４−メチルチオフェニル基、４−メトキシ−３−メチルチオフェニル基、３−エトキシ−４−メチルチオフェニル基、４−エトキシ−３−メチルチオフェニル基、３−プロポキシ−４−メチルチオフェニル基、４−エチルチオフェニル基、３−プロピルチオフェニル基、４−イソプロピルチオフェニル基、４−ブチルチオフェニル基、４−イソブチルチオフェニル基、２−（ｓｅｃ−ブチルチオ）フェニル基、２−ペンチルチオフェニル基、２−イソアミルチオフェニル基、４−ネオペンチルチオフェニル基、４−（２−クロロエチルチオ）フェニル基、３−（３−クロロプロピルチオ）フェニル基、ジフルオロメチルチオフェニル基、３−アセトキシフェニル基、４−アセトキシフェニル基、３−メチルスルフィニルフェニル基、４−メチルスルフィニルフェニル基、４−メトキシ−３−メチルスルフィニルフェニル基、３−メトキシ−４−メチルスルフィニルフェニル基、４−エトキシ−３−メチルスルフィニルフェニル基、３−エトキシ−４−メチルスルフィニルフェニル基、４−メチル−３−メチルスルフィニルフェニル基、３−エチル−４−メチルスルフィニルフェニル基、４−（２−クロロエチルスル）フィニルフェニル基、４−（３−クロロプロピルスルフィニル）フェニル基、４−（ジフルオロメチルスルフィニル）フェニル基、３−メチルスルホニルフェニル基、４−メチルスルホニルフェニル基、４−メチル−３−メチルスルホニルフェニル基、４−エチル−３−メチルスルホニルフェニル基、４−メトキシ−３−メチルスルホニルフェニル基、４−エトキシ−３−メチルスルホニルフェニル基、３−メトキシ−４−メチルスルホニルフェニル基、３−エトキシ−４−メチルスルホニルフェニル基、エチルスルホニルフェニル基、プロピルスルホニルフェニル基、イソプロピルスルホニルフェニル基、ブチルスルホニルフェニル基、２−クロロエチルスルホニルフェニル基、３−クロロプロピルスルホニルフェニル基、ジフルオロメチルスルホニルフェニル基、４−カルボキシフェニル基、４−メトキシカルボニルフェニル基、４−エトキシカルボニルフェニル基、３−メチルアミノフェニル基、４−メチルアミノフェニル基、４−メトキシ−３−メチルアミノフェニル基、３−メトキシ−４−メチルアミノフェニル基、４−エトキシ−３−メチルアミノフェニル基、３−エトキシ−４−メチルアミノフェニル基、４−メチル−３−メチルアミノフェニル基、３−メチル−４−メチルアミノフェニル基、４−エチル−３−メチルアミノフェニル基、３−ジメチルアミノフェニル基、４−ジメチルアミノフェニル基、４−メトキシ−３−ジメチルアミノフェニル基、３−メトキシ−４−ジメチルアミノフェニル基、４−エトキシ−３−ジメチルアミノフェニル基、３−エトキシ−４−ジメチルアミノフェニル基、４−メチル−３−ジメチルアミノフェニル基、３−メチル−４−ジメチルアミノフェニル基、４−エチル−３−ジメチルアミノフェニル基、３−メチル−４−ジメチルアミノフェニル基、３−（Ｎ−エチル−Ｎ−メチルアミノ）フェニル基、４−（Ｎ−エチル−Ｎ−メチルアミノ）フェニル基、４−メトキシ−３−（Ｎ−エチル−Ｎ−メチルアミノ）フェニル基、３−メトキシ−４−（Ｎ−エチル−Ｎ−メチルアミノ）フェニル基、４−エトキシ−３−（Ｎ−エチル−Ｎ−メチルアミノ）フェニル基、３−エトキシ−４−（Ｎ−エチル−Ｎ−メチルアミノ）フェニル基、４−メチル−３−（Ｎ−エチル−Ｎ−メチルアミノ）フェニル基、３−メチル−４−（Ｎ−エチル−Ｎ−メチルアミノ）フェニル基、４−エチル−３−（Ｎ−エチル−Ｎ−メチルアミノ）フェニル基、３−メチル−４−（Ｎ−エチル−Ｎ−メチルアミノ）フェニル基、３−ジエチルアミノフェニル基、４−ジエチルアミノフェニル基、４−メトキシ−３−ジエチルアミノフェニル基、３−メトキシ−４−ジエチルアミノフェニル基、４−エトキシ−３−ジエチルアミノフェニル基、３−エトキシ−４−ジエチルアミノフェニル基、４−メチル−３−ジエチルアミノフェニル基、３−メチル−４−ジエチルアミノフェニル基、４−エチル−３−ジエチルアミノフェニル基、４−メチルスルホニルアミノフェニル基、４−トリフルオロメチルスルホニルアミノフェニル基、４−アセチルアミノフェニル基、２−ヒドロキシフェニル基、３−ヒドロキシフェニル基、４−ヒドロキシフェニル基、３−ヒドロキシ−４−メチルフェニル基、３−ヒドロキシ−４−エチルフェニル基、３−ヒドロキシ−４−メトキシフェニル基、４−ヒドロキシ−３−メチルフェニル基、４−ヒドロキシ−３−エチルフェニル基、４−ヒドロキシ−３−メトキシフェニル基、２−シアノフェニル基、３−シアノフェニル基、４−シアノフェニル基、２−ニトロフェニル基、３−ニトロフェニル基、３−ニトロ−４−メチルフェニル基、４−ニトロフェニル基、ピリジン−２−イル基、５−クロロピリジン−２−イル基、５−メチルピリジン−２−イル基、５−エチルピリジン−２−イル基、５−メトキシピリジン−２−イル基、５−エトキシピリジン−２−イル基、２，３−ジメチルピリジン−６−イル基、２，３−ジメトキシピリジン−６−イル基、ピリジル−３−イル基、２−クロロピリジン−５−イル基、２−メチルピリジン−５−イル基、２−エチルピリジン−５−イル基、２−メトキシピリジン−５−イル基、２
−エトキシピリジン−５−イル基、２，３−ジメチルピリジン−５−イル基、ピリジル−４−イル基、２−メチルピリジン−４−イル基、２−エチルピリジン−４−イル基、２−メトキシピリジン−４−イル基、２−エトキシピリジン−４−イル基、２−ピリミジル基、５−メチルピリミジン−２−イル基、５−エチルピリミジン−２−イル基、２−エトキシピリジン−５−イル基、２，３−ジメチルピリジン−５−イル基、２−メチルピリジン−４−イル基、２−エチルピリジン−４−イル基、２−メトキシピリジン−４−イル基、２−エトキシピリジン−４−イル基、５−クロロピリミジン−２−イル基、５−ブロモピリミジン−２−イル基、５−メトキシピリミジン−２−イル基、ピリミジル−４−イル基、ピリミジル−５−イル基、１，２，４−トリアジン−３−イル基、１，２，４−トリアジン−５−イル基、１，２，４−トリアジン−６−イル基、ベンゾジオキソラン−３−イル基、ベンゾフラン−２−イル基、ベンゾフラン−３−イル基、ベンゾフラン−４−イル基、ベンゾフラン−５−イル基、ベンゾフラン−６−イル基、ベンゾフラン−７−イル基、ベンゾチオフェン−２−イル基、ベンゾチオフェン−３−イル基、ベンゾチオフェン−４−イル基、ベンゾチオフェン−５−イル基、ベンゾチオフェン−６−イル基、ベンゾチオフェン−７−イル基、１−メチルインドール−２−イル基、ベンゾチアゾール−２−イル基、ベンゾチアゾール−４−イル基、ベンゾチアゾール−５−イル基、ベンゾチアゾール−６−イル基、ベンゾチアゾール−７−イル基、ベンズイソキサゾール−３−イル基、ベンズイソキサゾール−４−イル基、ベンズイソキサゾール−５−イル基、ベンズイソキサゾール−６−イル基、ベンズイソキサゾール−７−イル基、ナフタレン−１−イル基、ナフタレン−２−イル基、キノリン−２−イル基、キノリン−３−イル基、キノリン−４−イル基、キノリン−５−イル基、キノリン−６−イル基、キノリン−７−イル基、キノリン−８−イル基、キノキサリン−５−イル基、キノキサリン−６−イル基、キナゾリン−４−イル基、キナゾリン−５−イル基、キナゾリン−６−イル基、キナゾリン−７−イル基、キナゾリン−８−イル基、ベンゾオキサジン−５−イル基、ベンゾオキサジン−６−イル基、ベンゾオキサジン−７−イル基、ベンゾオキサジン−８−イル基、ベンゾチアジン−５−イル基、ベンゾチアジン−６−イル基、ベンゾチアジン−７−イル基、ベンゾチアジン−８−イル基、１，３−ベンゾジオキソール−４−イル基、１，３−ベンゾジオキソール−５−イル基、１，３−ベンゾジオキソール−６−イル基、１，３−ベンゾジオキソール−７−イル基、アントラセン−１−イル基等を例示することができる。
【００３７】
特に免疫グロブリンの分析または精製において良好な性能を示す点で、Ａｒは４−メチルフェニル基、４−エチルフェニル基、３，４−ジメチルフェニル基、３−エチル−４−メチルフェニル基、４−エチル−３−メチルフェニル基、４−メトキシフェニル基、４−エトキシフェニル基、３，４−ジメトキシフェニル基、３，４−ジエトキシフェニル基、３−エトキシ−４−メトキシフェニル基、４−エトキシ−３−メトキシフェニル基、４−メトキシ−３−メチルフェニル基、４−メチル−３−エトキシフェニル基、４−ジメチルアミノフェニル基、２−メトキシピリジン−５−イル基、２−エトキシピリジン−５−イル基、２，３−ジメチルピリジン−５−イル基、４−ピリジル基、２−メチルピリジン−４−イル基、２−エチルピリジン−４−イル基、２−メトキシピリジン−４−イル基、２−エトキシピリジン−４−イル基、２−クロロピリジン−５−イル基、３−メトキシ−４−メチルフェニル基、３−ヒドロキシ−４−メチルフェニル基、４−メチルチオフェニル基のいずれかが好ましい。
【００３８】
Ｍで表されるマトリックスの材質としては特に限定はなく、例えば、架橋結合アルブミンなどのポリペプチドまたはタンパク質、アガロース、アルギネート、カラゲナン、キチン、セルロース、デキストリン、デキストラン、澱粉などの多糖、ポリアクリルアミド、ポリスチレン、ポリアクロレイン、ポリビニルアルコール、ポリメタクリレート、ポリ（２−ヒドロキシエチルメタクリレート）、ポリウレタンなどの合成高分子、シリカ、ガラス、多孔質珪藻土、アルミナ、ジルコニア、酸化鉄または他の金属酸化物などの無機化合物、上記物質を２つまたはそれ以上任意に組み合わせて構成される共重合体などのマトリックスをあげることができる。さらにそれらは、液相分配で使用されるデキストラン、ポリエチレングリコール、ポリビニルアルコールまたは加水分解澱粉などの水溶性の高分子を包含するマトリックス、またはエマルジョンを形成するのに使用されるペルフルオロデカリンなどの化合物を包含するマトリックスも含まれる。特に、本発明のチアゾール誘導体固定化マトリックス製造におけるマトリックスの材質としては、トヨパール（商品名）（東ソー株式会社製）などのビニルポリマー、アガロース、キトサン、デキストラン、セルロース、シリカ、ポリスチレンが好ましい。
【００３９】
ここでいうビニルポリマーとは、ビニル基などを持ったモノマーをビニル重合して得られたものを指し、モノマーとしてはメタアクリル酸メチル、２−ヒドロキシエチルメタクリレート、アクリルアミド、ビニルエステルなどが含まれる。さらに、ここでいうビニルポリマーとしては前記モノマーを２種類以上用いた共重合体や、架橋したものなどが含まれる。
【００４０】
また、マトリックスは、粒状物または非粒状物、水性溶媒に対して可溶性または不溶性、多孔性または非多孔性、いずれであっても良い。
【００４１】
ｎについては、１から１２の整数から適宜選択することができるが、特に本発明のチアゾール誘導体固定化マトリックスの製造に用いるチアゾール誘導体としては、ｎが３，４又は５が好ましい。
【００４２】
次に、本発明のチアゾール誘導体固定化マトリックスの製造に用いるチアゾール誘導体の製造方法を詳細に説明する。
【００４３】
製造方法１
【００４４】
【化６】
（式中、Ｒ１、Ｒ２、Ａｒ及びｎは前記と同じ意味を表し、Ｒ３はアミノ基又はそのアンモニウム塩を表し、Ｙは脱離基を表す。）
工程１はフタルイミド誘導体（２）をアシルチオウレア誘導体（３）と反応させ、チアゾール誘導体（４）を合成する方法である。フタルイミド誘導体（２）は非特許文献２や特許文献７等を参考に合成することができる。
【００４５】
工程１の反応では、反応は溶媒中で行なうことが好ましく、反応に害を及ぼさない溶媒であれば使用することができ、例えば、ジエチルエーテル、テトラヒドロフラン（以下ＴＨＦ）、１，２−ジメトキシエタン（以下ＤＭＥ）、１，４−ジオキサンなどのエーテル系溶媒、アセトン、メチルエチルケトンなどのケトン系溶媒、酢酸エチル、酢酸ブチルなどのエステル系溶媒、アセトニトリル、プロピオニトリルなどのニトリル類、ベンゼン、トルエン、キシレン、クロロベンゼンなどの芳香族炭化水素系溶媒、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（以下ＤＭＦ）、Ｎ−メチルピロリドン等のアミド系溶媒、メタノール、エタノール等のアルコール系溶媒、ジメチルスルホキシド（以下ＤＭＳＯ）、水あるいはこれらの混合溶媒を用いることができ、収率が良い点でＤＭＦを用いるのが好ましい。反応温度については特に制限はないが、０℃から１５０℃の範囲から適宜選ばれた温度で反応させることにより目的物を得ることができ、収率が良い点で６０℃から１５０℃の範囲で反応させるのが好ましい。本工程では、塩基存在下に行なうこともでき、塩基としては、水素化ナトリウム、ナトリウムアミド、炭酸ナトリウム、炭酸カリウム、ナトリウムメトキシド、ナトリウムエトキシド、カリウム−ｔｅｒｔ−ブトキシド、水酸化ナトリウム、水酸化カリウムなどのアルカリ金属塩基、トリエチルアミン、トリブチルアミン、Ｎ−メチルモルホリン、ピリジン、ジメチルアニリンなどの有機アミン類を用いることができる。塩基の使用量は特に制限はないが、反応基質に対して等量以上用いて反応を実施することにより、収率良く目的物を得ることができる。反応終了後は、通常の後処理操作により目的物を得ることができるが、必要であればカラムクロマトグラフィーあるいは再結晶などの方法により精製することもできる。
【００４６】
工程２はチアゾール誘導体（４）を塩基で処理し、チアゾール誘導体（１ａ）を製造する方法である。塩基としては、水素化ナトリウム、ナトリウムアミド、炭酸ナトリウム、炭酸カリウム、ナトリウムメトキシド、ナトリウムエトキシド、カリウム−ｔｅｒｔ−ブトキシド、水酸化ナトリウム、水酸化カリウムなどのアルカリ金属塩基、メチルアミン、エチルアミン、ジメチルアミンなどの有機アミン類、ヒドラジン類を用いることができる。収率が良い点でヒドラジンあるいはメチルアミンが好ましい。塩基の使用量は反応基質に対して２等量以上用いて反応を実施することにより、収率良く目的物を得ることができる。本反応では、反応は溶媒中で行なうことが好ましく、反応に害を及ぼさない溶媒であれば使用することができ、例えば、ジエチルエーテル、ＴＨＦ、ＤＭＥ、ジオキサンなどのエーテル系溶媒、アセトン、メチルエチルケトンなどのケトン系溶媒、酢酸エチル、酢酸ブチルなどのエステル系溶媒、アセトニトリル、プロピオニトリルなどのニトリル類、ベンゼン、トルエン、キシレン、クロロベンゼンなどの芳香族炭化水素系溶媒、ＤＭＦ、Ｎ−メチルピロリドンなどのアミド系溶媒、メタノール、エタノール、イソプロピルアルコールなどのアルコール系溶媒、ＤＭＳＯ、水あるいはこれらの混合溶媒を用いることができ、収率が良い点や後処理が簡便である点でメタノールやエタノールなどのアルコール系溶媒を用いることが好ましい。反応温度については特に制限はないが、０℃から１５０℃の範囲から適宜選ばれた温度で反応させることにより目的物を得ることができる。反応終了後は、通常の後処理操作により目的物を得ることができるが、必要であればカラムクロマトグラフィーあるいは再結晶などの方法により精製することもできる。また、反応終了後、酸で処理しアンモニウム塩として単離することもできる。反応に害を及ぼさない酸であれば使用することができ、例えば、塩酸、臭化水素酸、フッ酸、硝酸、硫酸、リン酸などの無機酸、メタンスルホン酸やトルエンスルホン酸、トリフルオロ酢酸などの有機酸を用いることができるが、目的物の単離が容易であることから塩酸を用いるのが好ましい。
【００４７】
製造方法２
【００４８】
【化７】
（式中、Ｒ１、Ｒ２、Ａｒ及びｎは前記と同じ意味を表し、Ｗはハロゲン原子を表す。）
製造方法２は２−置換アミノチアゾール誘導体（５）と酸ハロゲン化物（６）を反応させ、チアゾール誘導体（４ａ）を製造する方法である。当該方法の反応では、反応は溶媒中で行なうことが好ましく、反応に害を及ぼさない溶媒であれば使用することができ、例えば、ジクロロメタン、クロロホルム、１，２−ジクロロエタンなどのハロゲン系溶媒、ジエチルエーテル、ＴＨＦ、ＤＭＥ、ジオキサンなどのエーテル系溶媒、アセトン、メチルエチルケトンなどのケトン系溶媒、酢酸エチル、酢酸ブチルなどのエステル系溶媒、アセトニトリル、プロピオニトリルなどのニトリル類、ベンゼン、トルエン、キシレン、クロロベンゼンなどの芳香族炭化水素系溶媒、ＤＭＦ、Ｎ−メチルピロリドンなどのアミド系溶媒、ＤＭＳＯ、水あるいはこれらの混合溶媒を用いることができ、収率が良い点でジクロロメタン、クロロホルム、１，２−ジクロロエタンなどのハロゲン系溶媒を用いるのが好ましい。反応温度については特に制限はないが、０℃から１５０℃の範囲から適宜選ばれた温度で反応させることにより目的物を得ることができ、収率が良い点で０℃から１００℃の範囲で反応させるのが好ましい。本工程では、塩基存在下に行なうこともでき、塩基としては、水素化ナトリウム、ナトリウムアミド、炭酸ナトリウム、炭酸カリウム、ナトリウムメトキシド、ナトリウムエトキシド、カリウム−ｔｅｒｔ−ブトキシド、水酸化ナトリウム、水酸化カリウムなどのアルカリ金属塩基、トリエチルアミン、トリブチルアミン、Ｎ−メチルモルホリン、ピリジン、ジメチルアニリンなどの有機アミン類を用いることができる。塩基の使用量は特に制限はないが、反応基質に対して等量以上用いて反応を実施することにより、収率良く目的物を得ることができる。反応終了後は、通常の後処理操作により目的物を得ることができるが、必要であればカラムクロマトグラフィーあるいは再結晶などにより精製することもできる。当該方法で合成されたチアゾール誘導体（４ａ）は、製造方法１の工程２を経由することによって、チアゾール誘導体（１ａ）へと導くことができる。
【００４９】
次に、本発明のチアゾール誘導体固定化マトリックスの製造方法を詳細に説明する。
【００５０】
製造方法３
【００５１】
【化８】
（式中、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｍ、Ａｒ及びｎは前記と同じ意味を表す。）
製造方法３はチアゾール誘導体（１ａ）と活性化基（活性化基とは、アミノ基あるいはアンモニウム塩と容易に反応できる官能基のことで、例えば、スクシンイミドオキシカルボニル基、ホルミル基、カルボキシル基、２，２，２−トリフルオロエチルスルホニル基（トレシル基）、塩化スルホニル基、トシル基、ビニルスルホニル基、エポキシ基をあげることができる。）含有マトリックスと反応させてチアゾール誘導体固定化マトリックス（１）を製造する方法である。なお、当該方法で用いる活性化基含有マトリックスの活性化基としては、スクシンイミドオキシカルボニル基、ホルミル基、２，２，２−トリフルオロエチルスルホニル基（トレシル基）、エポキシ基、カルボキシル基が特に好ましい。また、当該方法で用いる活性化基含有マトリックスは、活性化基を有しないマトリックスから周知の方法で活性化基を付加することで調製しても良く、ＨｉＴｒａｐ ＮＨＳ−ａｃｔｉｖａｔｅｄ ＨＰ（商品名）（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス株式会社製）、エポキシトヨパール（商品名）、ホルミルトヨパール（商品名）、トレシルトヨパール（商品名）、カルボキシトヨパール（商品名）（以上東ソー株式会社製）、活性化キトパールＫ−６６（商品名）ゲル（富士紡ホールディングス株式会社製）、ＢＩＯＡＣＴ ＥＰＯ（商品名）ゲル（昭和電工株式会社製）、ＰＯＲＯＳ−ＥＰ（商品名）ゲル（アプライドバイオシステムズ株式会社製）、セルファインホルミル（商品名）ゲル（チッソ株式会社製）、Ｐｒｏｆｉｎｉｔｙ Ｅｐｏｘｉｄｅ（商品名）ゲル（バイオラッド株式会社製）、Ｍ．Ｓ．ＧＥＬ Ｅｐｏｘｙ−Ｄ−５０−１０００ＡＷ（商品名、ＡＧＣエスアイテック株式会社製）などのリガンド固定化用担体として市販されているものをそのまま用いても良い。
【００５２】
本反応では、中性あるいは塩基性条件下にて反応させることにより容易に目的物を得ることができる。特に塩基性条件下にて反応を行なうことにより、チアゾール誘導体の固定化率の高いマトリックスを得ることができる。塩基としては、水素化ナトリウム、ナトリウムアミド、炭酸ナトリウム、炭酸カリウム、ナトリウムメトキシド、ナトリウムエトキシド、カリウム−ｔｅｒｔ−ブトキシド、水酸化ナトリウム、水酸化カリウムなどのアルカリ金属塩基、トリエチルアミン、トリブチルアミン、Ｎ−メチルモルホリン、ピリジン、ジメチルアニリンなどの有機アミン類を用いることができる。塩基の使用量は特に制限はないが、反応基質に対して等モル以上用いて反応を実施することにより、目的とするチアゾール誘導体の固定化比率の高いマトリックスを得ることができる。また、溶液のｐＨを保つために緩衝液を加えて反応を行なうこともできる。反応は溶媒中で行なうことが好ましく、反応に害を及ぼさない溶媒であれば使用することができ、例えば、ジエチルエーテル、ＴＨＦ、ＤＭＥ、ジオキサンなどのエーテル系溶媒、アセトン、エチルメチルケトンなどのケトン系溶媒、酢酸エチル、酢酸ブチルなどのエステル系溶媒、アセトニトリル、プロピオニトリルなどのニトリル類、ベンゼン、トルエン、キシレン、クロロベンゼンなどの芳香族炭化水素系溶媒、ＤＭＦ、Ｎ−メチルピロリドンなどのアミド系溶媒、ＤＭＳＯ、水あるいはこれらの混合溶媒を用いることができる。反応温度については特に制限はないが、０℃から１５０℃の範囲から適宜選ばれた温度で反応させることにより、目的とするチアゾール誘導体固定化マトリックスを得ることができる。マトリックス上のチアゾール誘導体の固定化量は、吸光度分析、高速液体クロマトグラフィー、元素分析などの分析法を単独あるいは組み合わせて用いることにより測定できる。
【００５３】
次に、本発明のチアゾール誘導体固定化マトリックスを用いてタンパク質を分析、分離、または単離、精製する方法について説明する。
【００５４】
製造方法３によって得られたチアゾール誘導体固定化マトリックスをカラム管に充填し、溶離液として緩衝液、金属塩の水溶液、アミノ酸溶液、アルコール溶液などの溶液を通液し、タンパク質を分析や分離、及び単離や精製を行なうことができる。この方法で分析、分離、または単離、精製することができるタンパク質としては、血漿タンパク質成分や乳タンパク質成分をあげることができ、天然に存在するものでは血漿中の免疫グロブリン、血清アルブミン、血液凝固因子、ラクトアルブミン、ラクトフェリンを例示できる。また遺伝子組換えタンパク質では前記に加えて、天然には微量しか存在しない、あるいは人工的に設計されたペプチドホルモン、インターフェロン、インターロイキン、成長因子、成長抑制因子、ワクチンを例示できる。特に本発明のチアゾール誘導体固定化マトリックスは、免疫グロブリンの精製に好ましい。通液する緩衝液としては、リン酸緩衝液、クエン酸緩衝液、Ｔｒｉｓ、ＰＩＰＥＳ、ＡＣＥＳ、Ｃｈｏｌａｍｉｎｅ、ＢＥＳ、ＭＯＰＳ、ＴＥＳ、ＨＥＰＥＳを例示でき、金属塩としては硫酸ナトリウム、硫酸カリウム、硫酸リチウム、硫酸マグネシウム、硫酸アンモニウム、クエン酸ナトリウム、クエン酸カリウム、塩化ナトリウム、塩化カリウムを例示でき、アミノ酸としてはグリシン、アルギニン、ベータアラニン、ガンマアミノ酪酸を例示でき、アルコールとしてはエタノール、イソプロピルアルコール、グリセロール、エチレングリコールを例示でき、これらを混合溶媒として用いることもできる。ｐＨは３から１１の範囲内で目的とするタンパク質を分離、単離または精製することができるが、ｐＨは５から９の範囲内で精製することが好ましい。また、ＡＫＴＡｐｒｉｍｅ ｐｌｕｓ（商品名）（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス株式会社製）などのクロマトグラフィー装置を使用して、タンパク質を分析、分離、または単離、精製することもできる。製造方法３によって得られたチアゾール誘導体固定化マトリックスを用いて免疫グロブリン、またはこれらの類縁体、フラグメント、融合体を分析または精製する場合は、硫酸ナトリウムや硫酸アンモニウムを含むリン酸緩衝液を通液し、ｐＨは５から９の範囲で、疎水性相互作用を利用したクロマトグラフィーを実施することが好ましい。ここでいう免疫グロブリンの類縁体とは免疫グロブリンの構造や機能が少なくとも部分的に保持された天然あるいは人工的に作られたタンパク質あるいはタンパク質コンジュゲートを指し、免疫グロブリンのフラグメントとは酵素的な処理あるいは遺伝子工学的な設計によって作製された免疫グロブリンの部分構造を持ったタンパク質を指し、免疫グロブリンの融合体とは各種サイトカインあるいはサイトカイン受容体などの生物活性をもったタンパク質の機能部分を免疫グロブリンの全部または一部と遺伝子工学的に融合させて作製したものを指す。
【００５５】
製造方法３によって得られたチアゾール誘導体固定化マトリックスは、水酸化ナトリウム水溶液、水酸化カリウム水溶液などのアルカリ性水溶液、塩酸水溶液、硫酸水溶液、硝酸水溶液、リン酸水溶液などの酸性水溶液、塩酸グアニジン水溶液、尿素水溶液などのタンパク変性剤水溶液、アルギニンやヒスチジンなどのアミノ酸を含んだ水溶液、ＳＤＳ、Ｔｗｅｅｎなどの界面活性剤水溶液、メタノール、エタノール、イソプロパノール、グリセロール、エチレングリコールなどのアルコール溶液、あるいは、これらを含んだ混合水溶液を用いて洗浄することによって、初期状態に復帰させることができ、繰り返し使用することができる。
【発明の効果】
【００５６】
本発明のチアゾール誘導体固定化マトリックスは、タンパク質、特に免疫グロブリンの分析および精製に有用な耐久性に富む選択的な吸脱着剤となることから医療用タンパク質、特に免疫グロブリンの工業的な精製において極めて有用である。
【図面の簡単な説明】
【００５７】
【図１】チアゾール誘導体固定化ＨｉＴｒａｐカラムを用いた免疫グロブリンのクロマトグラフィー結果（化合物２８６の結果）。
【図２】チアゾール誘導体固定化ＨｉＴｒａｐカラムを用いた免疫グロブリンのクロマトグラフィー結果（化合物３０４の結果）。
【図３】チアゾール誘導体固定化ＨｉＴｒａｐカラムを用いた免疫グロブリンのクロマトグラフィー結果（化合物３２０の結果）。
【図４】チアゾール誘導体固定化ＨｉＴｒａｐカラムを用いた免疫グロブリンのクロマトグラフィー結果（化合物３２９の結果）。
【図５】チアゾール誘導体固定化ＨｉＴｒａｐカラムを用いた免疫グロブリンのクロマトグラフィー結果（化合物３８４の結果）。
【図６】チアゾール誘導体固定化ＨｉＴｒａｐカラムを用いた免疫グロブリンのクロマトグラフィー結果（化合物４２３の結果）
【図７】チアゾール誘導体固定化ＨｉＴｒａｐカラムを用いたウシ血清アルブミンのクロマトグラフィー結果（化合物２８６の結果）
【図８】チアゾール誘導体固定化ＨｉＴｒａｐカラムを用いたウシ血清アルブミンのクロマトグラフィー結果（化合物３０４の結果）
【図９】チアゾール誘導体固定化ＨｉＴｒａｐカラムを用いたウシ血清アルブミンのクロマトグラフィー結果（化合物３２０の結果）
【図１０】チアゾール誘導体固定化ＨｉＴｒａｐカラムを用いたウシ血清アルブミンのクロマトグラフィー結果（化合物３２９の結果）
【図１１】チアゾール誘導体固定化ＨｉＴｒａｐカラムを用いたウシ血清アルブミンのクロマトグラフィー結果（化合物３８４の結果）
【図１２】チアゾール誘導体固定化ＨｉＴｒａｐカラムを用いたウシ血清アルブミンのクロマトグラフィー結果（化合物４２３の結果）
【図１３】化合物２８６固定化ＨｉＴｒａｐカラムを用いたリボヌクレア−ゼＡ、リゾチ−ム、αキモトリプシノ−ゲンＡの混合液のクロマトグラフィー結果
【図１４】化合物２８６固定化ＨｉＴｒａｐカラムを用いたヒト−マウスキメラ抗体のパパイン消化物のクロマトグラフィー結果
【図１５】図１４の画分Ｉ、ＩＩ、ＩＩＩ、ＩＶのＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析の結果
【図１６】化合物２８６固定化エポキシトヨパールゲルを用いた免疫グロブリンのクロマトグラフィー結果
【図１７】化合物２８６固定化エポキシトヨパールゲルを用いたヒト化モノクローナル抗体のクロマトグラフィー結果
【図１８】化合物２８６固定化エポキシトヨパールゲルを用いたウシ血清アルブミンのクロマトグラフィー結果
【図１９】化合物３２９固定化エポキシトヨパールゲルを用いたヒト化モノクローナル抗体のクロマトグラフィー結果
【図２０】化合物３２９固定化エポキシトヨパールゲルを用いたウシ血清アルブミンのクロマトグラフィー結果
【図２１】化合物２８６固定化ホルミルトヨパールゲルを用いたヒト化モノクローナル抗体のクロマトグラフィー結果
【図２２】化合物２８６固定化ホルミルトヨパールゲルを用いたウシ血清アルブミンのクロマトグラフィー結果
【図２３】化合物２８６固定化ＢＩＡＣＯＲＥセンサーチップＣＭ５に各種抗体をアナライトとして流したＢＩＡＣＯＲＥセンサーグラム（Ａ：マウスＩｇＭ、Ｂ：マウスＩｇＧ、Ｃ：ニワトリＩｇＹ、Ｄ：ウシ血清アルブミン）
【発明を実施するための形態】
【００５８】
以下、実施例により本発明をさらに詳細に説明するが、本発明がこれらに限定されるものではない。
【００５９】
実施例１ チアゾール誘導体の合成
（合成例１）
【００６０】
【化９】
６−フタルイミド−１−ヘキサナール（４．９５ｇ，２０．２ｍｍｏｌ）を四塩化炭素（１００ｍＬ）に溶解し臭素（１．０３ｍＬ，２０．２ｍｍｏｌ）の四塩化炭素溶液（１００ｍＬ）を滴下し２時間反応した。反応液を水（１００ｍＬ）、飽和食塩水（１００ｍＬ）で洗浄し無水硫酸マグネシウムで乾燥した後、乾燥剤を濾別し溶媒を減圧留去し油状物を得た。得られた油状物をＤＭＦ（１００ｍＬ）に溶解し、４−メチルベンゾイルチオウレア（５．８７ｇ，２６．３ｍｍｏｌ）を加え、１０時間加熱還流した。反応終了後、反応混合物に１Ｍ塩酸（３００ｍＬ）を加え酢酸エチル（３００ｍＬ）で二回抽出し、有機層を合わせて飽和食塩水（３００ｍＬ）で二回洗浄した。有機層を無水硫酸マグネシウムで乾燥した後、乾燥剤を濾別し溶媒を減圧留去した。得られた混合物をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（ヘキサン：酢酸エチル＝２：１）で精製することによって、４−メチル−Ｎ−［５−｛４−（フタルイミド）ブチル｝チアゾール−２−イル］ベンズアミドの白色固体（０．４２４ｇ，５％）を得た。ｍ．ｐ．２０３から２０５℃；１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３，ＴＭＳ，ｐｐｍ）：δ １．５８から１．８２（ｍ，４Ｈ），２．４４（ｓ，３Ｈ），２．８２（ｔ，Ｊ＝７．５Ｈｚ，２Ｈ），３．７２（ｔ，Ｊ＝７．５Ｈｚ，２Ｈ），６．９７（ｓ，１Ｈ），７．３２（ｄ，Ｊ＝７．５Ｈｚ，２Ｈ），７．６９から７．８６（ｍ，４Ｈ），７．９１（ｄ，Ｊ＝７．５Ｈｚ，２Ｈ）。アミドのプロトンは帰属できなかった。
【００６１】
（合成例２）
【００６２】
【化１０】
２−アミノ−４−メチル−５−｛４−（フタルイミド）ブチル｝チアゾール（０．５０ｇ，１．６６ｍｍｏｌ）のクロロホルム（１０ｍＬ）溶液に、４−メチルベンゾイルクロリド（０．３１ｇ，１．９９ｍｍｏｌ）とトリエチルアミン（１ｍＬ）を加え、２日間撹拌した。反応終了後、反応液を水（１０ｍＬ）で洗浄し、有機層を無水硫酸マグネシウムで乾燥した後、乾燥剤を濾別し溶媒を減圧留去した。得られた混合物をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（酢酸エチル−ヘキサン＝１：２）で精製し、４−メチル−Ｎ−［４−メチル−５−｛４−（フタルイミド）ブチル｝チアゾール−２−イル］ベンズアミドの白色固体（０．４０ｇ，５６％）を得た。ｍ．ｐ．１７８から１８０℃；１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３，ＴＭＳ，ｐｐｍ）：δ １．５８から１．６６（ｍ，４Ｈ），２．２１（ｓ，３Ｈ）， ２．４１（ｓ，３Ｈ），２．７３（ｔ，Ｊ＝７．４Ｈｚ，２Ｈ），３．７２（ｔ，Ｊ＝７．５Ｈｚ，２Ｈ），７．２６（ｄ，Ｊ＝７．５Ｈｚ，２Ｈ），７．７６から７．８６（ｍ，６Ｈ）。アミドのプロトンは帰属できなかった。
【００６３】
（合成例３）
【００６４】
【化１１】
Ｎ−（５−ブロモ−６−オキソヘプチル）フタルイミド（１．３０ｇ，３．８５ｍｍｏｌ）のＤＭＦ（２０ｍＬ）溶液に、Ｎ−（３−アセトキシ−４−メチルベンゾイル）チオウレアを加え、８０℃で７時間反応させた。反応終了後、反応混合物に１Ｍ塩酸（３０ｍＬ）を加え酢酸エチル（５０ｍＬ）で二回抽出し、有機層を合わせて飽和食塩水（３０ｍＬ）で二回洗浄した。有機層を無水硫酸マグネシウムで乾燥した後、乾燥剤を濾別し溶媒を減圧留去した。得られた混合物を自動設定中圧カラムクロマトグラフィーシステム（山善社製；Ｒｆ＝０．３２：ヘキサン／酢酸エチル＝１／１）で精製し、得られた褐色固体を酢酸エチル／ヘキサンの混合溶媒で洗浄することによって、白色固体の３−アセトキシ−４−メチル−Ｎ−［４−メチル−５−｛４−（フタルイミド）ブチル｝チアゾール−２−イル］ベンズアミド（０．８２３ｇ，４９％）を得た。：ｍ．ｐ．１７０から１７２℃；１Ｈ−ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６，ＤＭＳＯ，ｐｐｍ）：δ １．６０から１．６６（ｍ，４Ｈ），２．２０（ｓ，３Ｈ），２．２１（ｓ，３Ｈ），２．３５（ｓ，３Ｈ），２．７２から２．７４（ｍ，２Ｈ），３．５３から３．６４（ｍ，２Ｈ），７．４５（ｄ，Ｊ＝７．５Ｈｚ，１Ｈ），７．７９から７．９３（ｍ，６Ｈ），１２．４（ｂｒ ｓ，１Ｈ）。
【００６５】
（合成例４）
【００６６】
【化１２】
モノテレフタル酸メチルクロリド（１．４１ｇ，７．１０ｍｍｏｌ）のクロロホルム（３０ｍＬ）溶液に、氷冷下にて２−アミノ−４−メチル−５−｛４−（フタルイミド）ブチル｝チアゾール（１．５６ｇ，４．７４ｍｍｏｌ）とトリエチルアミン（１．２０ｍＬ，７．９８ｍｍｏｌ）のクロロホルム（１０ｍＬ）溶液を加え、一晩反応させた。反応終了後、反応混合物を水（２０ｍＬ）、飽和食塩水（２０ｍＬ）で順次洗浄し、有機層を無水硫酸マグネシウムで乾燥した後、乾燥剤を濾別し溶媒を減圧留去した。得られた混合物を自動設定中圧カラムクロマトグラフィーシステム（山善社製；Ｒｆ＝０．１６：ヘキサン／酢酸エチル＝２／１）で精製し、４−メトキシカルボニル−Ｎ−［４−メチル−５−｛４−（フタルイミド）ブチル｝チアゾール−２−イル］ベンズアミドの白色固体（０．８１５ｇ，３３％）を得た。：ｍ．ｐ．１７３から１７４℃；１Ｈ−ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６，ＤＭＳＯ，ｐｐｍ）：δ １．６０から１．６７（ｍ，４Ｈ），２．２２（ｓ，３Ｈ），２．７２（ｔ，Ｊ＝７．５Ｈｚ，２Ｈ），３．６２（ｔ，Ｊ＝７．５Ｈｚ，２Ｈ），３．９０（ｄ，３Ｈ），７．８０から７．９０（ｍ，４Ｈ），８．０６から８．２０（ｍ，４Ｈ），１２．７（ｂｒ ｓ，１Ｈ）。
【００６７】
（合成例５）
【００６８】
【化１３】
２−アミノ−４−メチル−５−｛４−（フタルイミド）ブチル｝チアゾール（１．０ｇ，３．１７ｍｍｏｌ）のクロロホルム（１０ｍＬ）溶液に、３−シアノベンゾイルクロリド（０．７９ｇ，４．７５ｍｍｏｌ）を氷冷下にて加えた。次いでトリエチルアミン（０．７２ｍＬ，４．７９ｍｍｏｌ）のクロロホルム（１０ｍＬ）溶液を滴下し、一晩反応させた。反応終了後、反応混合物を水（２０ｍＬ）、飽和食塩水（２０ｍＬ）で順次洗浄し、有機層を無水硫酸マグネシウムで乾燥した後、乾燥剤を濾別し溶媒を減圧留去した。得られた混合物をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（酢酸エチル／ヘキサン＝１／２）で精製し、３−シアノ−Ｎ−［４−メチル−５−｛４−（フタルイミド）ブチル｝チアゾール−２−イル］ベンズアミドの白色固体（０．５７ｇ，４０％）を得た。ｍ．ｐ．１７０から１７２℃；１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３，ＴＭＳ，ｐｐｍ）：δ １．６９から１．７０（ｍ，４Ｈ），１．９７（ｓ，３Ｈ），２．７４（ｔ，Ｊ＝６．５，２Ｈ），３．７３（ｔ，Ｊ＝６．８，２Ｈ），７．５６（ｄｄ，Ｊ＝８．０ ａｎｄ ８．０Ｈｚ，１Ｈ），７．７１から７．８６（ｍ，５Ｈ），８．０５（ｍ，１Ｈ），８．１６（ｓ，１Ｈ）。アミドのプロトンは帰属できなかった。
【００６９】
（参考例１）
アルゴン雰囲気下、４−メチル−Ｎ−｛５−（４−フタルイミドブチル）チアゾール−２−イル｝ベンズアミド（０．１０５ｇ，０．２５ｍｍｏｌ）とフェロセン（０．０２３ｇ，０．１２５ｍｍｏｌ）に、ＤＭＳＯ（１．５ｍＬ）、３Ｍ−ヨウ化トリフルオロメチル／ＤＭＳＯ溶液（０．２５ｍＬ，０．７５ｍｍｏｌ）、１Ｍ−硫酸／ＤＭＳＯ溶液（０．２５ｍＬ，０．２５ｍｍｏｌ）を加えて撹拌した。この溶液に、室温下で３１％過酸化水素水（７５μＬ，０．７５ｍｍｏｌ）を滴下した。反応終了後、反応溶液を水（２００ｍＬ）にあけ、しばらく撹拌した。クロロホルムで抽出し、得られた有機層を硫酸マグネシウムで乾燥した後、乾燥剤を濾別し溶媒を減圧留去した。残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィーで精製することにより、４−メチル−Ｎ−｛４−トリフルオロメチル−５−（４−フタルイミドブチル）チアゾール−２−イル｝ベンズアミドの白色固体（０．０２３ｇ，１９％）を得た。１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３，ＴＭＳ，ｐｐｍ）：δ １．７９から１．８２（ｍ，４Ｈ），２．４７（ｓ，３Ｈ），３．０１（ｔ，Ｊ＝７．５Ｈｚ，２Ｈ），３．７６（ｔ，Ｊ＝７．５Ｈｚ，２Ｈ），７．３４（ｄ，Ｊ＝７．５Ｈｚ，１Ｈ），７．７２から７．９０（ｍ，６Ｈ），９．３７（ｓ，１Ｈ）；１９Ｆ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３，ＴＭＳ，ｐｐｍ）：−６０．８７。
【００７０】
（合成例６から８１）
合成例１または２の方法に準じて、表１から１２に記載したチアゾール誘導体を得た。
【００７１】
【表１】
【００７２】
【表２】
【００７３】
【表３】
【００７４】
【表４】
【００７５】
【表５】
【００７６】
【表６】
【００７７】
【表７】
【００７８】
【表８】
【００７９】
【表９】
【００８０】
【表１０】
【００８１】
【表１１】
【００８２】
【表１２】
（合成例８２）
【００８３】
【化１４】
４−メチル−Ｎ−｛５−（４−フタルイミドブチル）チアゾール−２−イル｝ベンズアミド（０．６０ｇ，１．４３ｍｍｏｌ）のエタノール（１０ｍＬ）溶液に、ヒドラジン一水和物（０．３５ｍＬ、７．１２ｍｍｏｌ）を室温にて加え、一晩撹拌した。反応終了後、反応溶液を減圧留去し、１Ｍ 塩酸（６ｍＬ）を加えた。析出した固体を濾別し、濾液を酢酸エチルで洗浄し、水層を減圧留去した。得られた固体にエタノールとトルエンを加え共沸し十分に乾燥し、固体を瀘取した。得られた固体を酢酸エチルにて洗浄することによって、４−｛２−（４−メチルベンゾイル）アミノチアゾール−５−イル｝ブチルアミン塩酸塩の白色固体（０．４４ｇ，収率：９５％）を得た。１Ｈ−ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６，ＤＭＳＯ，ｐｐｍ）：δ １．６４から１．６７（ｍ，４Ｈ），２．４０（ｓ，３Ｈ），２．７７から２．８０（ｍ，４Ｈ），７．３２（ｓ，１Ｈ），７．３５（ｄ，Ｊ＝７．５Ｈｚ，２Ｈ），８．０１（ｄ，Ｊ＝７．５Ｈｚ，２Ｈ），８．０７（ｂｒ ｓ，３Ｈ）。アミドのプロトンは帰属できなかった。
【００８４】
（合成例８３）
【００８５】
【化１５】
２−クロロ−Ｎ−［４−メチル−５−｛４−（フタルイミド）ブチル｝チアゾール−２−イル］ベンズアミド（０．２２ｇ，０．４８ｍｍｏｌ）のエタノール（５ｍＬ）溶液に、０．０５Ｍのヒドラジンエタノール溶液（３４ｍＬ）を室温にて加え、一晩撹拌した。反応終了後、反応溶液を減圧留去し、１Ｍ 塩酸（３ｍＬ）を加えた。析出した固体を濾別し、濾液を減圧留去した。得られた固体をエタノール並びに酢酸エチルを用いて固体を洗浄することにより、４−｛２−（２−クロロベンゾイルアミノ）−４−メチルチアゾール−５−イル｝ブチルアミン塩酸塩の褐色固体（０．０５０ｇ，収率：２１％）を得た。１Ｈ−ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６，ＤＭＳＯ，ｐｐｍ）：δ １．４２から１．７７（ｍ，４Ｈ），２．２１（ｓ，３Ｈ），２．６３から２．９２（ｍ，４Ｈ），７．３３から７．６７（ｍ，４Ｈ），７．６８から８．１６（ｍ，３Ｈ）。アミドのプロトンは帰属できなかった。
【００８６】
（合成例８４）
【００８７】
【化１６】
３，４−ジクロロ−Ｎ−［４−メチル−５−｛４−（フタルイミド）ブチル｝チアゾール−２−イル］ベンズアミド（０．２５ｇ，０．５１ｍｍｏｌ）のエタノール（５ｍＬ）溶液に、ヒドラジン一水和物（０．０７ｍＬ，１．５３ｍｍｏｌ）を室温にて加え、一晩撹拌した。反応終了後、反応溶液を留去し、１Ｍ 塩酸（３ｍＬ）を加え、室温で一晩撹拌した。析出した固体を濾別し、濾液を減圧留去した。得られた固体をエタノール並びに酢酸エチルを用いて洗浄することにより、４−｛２−（３，４−ジクロロベンゾイルアミノ）−４−メチルチアゾール−５−イル｝ブチルアミン塩酸塩の白色固体（０．１０ｇ， 収率：５０％）を得た。１Ｈ−ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６，ＤＭＳＯ，ｐｐｍ）：δ １．４６から１．７４（ｍ，４Ｈ），２．２４（ｓ，３Ｈ）， ２．６２から２．９１（ｍ，４Ｈ），７．８２（ｄ，Ｊ＝８．４Ｈｚ，１Ｈ），７．８５から７．９９（ｍ，３Ｈ），８．０３から８．１３（ｍ，１Ｈ），８．０４（ｄｄ，Ｊ＝２．０ ａｎｄ ８．４Ｈｚ，１Ｈ），８．３３（ｄ，Ｊ＝２．０Ｈｚ，１Ｈ）。
【００８８】
（合成例８５）
【００８９】
【化１７】
４−メチル−Ｎ−［４−メチル−５-｛４−（フタルイミド）ブチル｝チアゾール−２−イル］ベンズアミド（０．２３ｇ，０．５３ｍｍｏｌ）のエタノール（５ｍＬ）溶液に、ヒドラジン一水和物（０．２３ｍＬ，５．３０ｍｍｏｌ）を加え３時間還流した。反応終了後、反応溶液を留去し、残渣に１Ｍ 塩酸（５ｍＬ）を加え、撹拌した。析出した固体を濾別し、濾液を減圧留去した。得られた固体をエタノール並びに酢酸エチルを用いて洗浄することにより、４−｛４−メチル−２−（４−メチルベンゾイルアミノ）チアゾール−５−イル｝ブチルアミン塩酸塩の白色固体（０．０４３ｇ，収率：２４％）を得た。１Ｈ−ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６，ＤＭＳＯ，ｐｐｍ）：δ １．５５から１．８０（ｍ，４Ｈ），２．２４（ｓ，３Ｈ），２．３９（ｓ，３Ｈ），２．６４から２．９２（ｍ，４Ｈ），７．３４（ｄ，Ｊ＝８．２Ｈｚ，２Ｈ），７．７８から８．０５（ｍ，３Ｈ），７．９９（ｄ，Ｊ＝８．２Ｈｚ，２Ｈ）。アミドのプロトンは帰属できなかった。
【００９０】
（合成例８６）
【００９１】
【化１８】
４−トリフルオロメチル−Ｎ−［４−メチル−５−｛４−（フタルイミド）ブチル｝チアゾール−２−イル］ベンズアミド（０．３０ｇ，０．６２ｍｍｏｌ）のエタノール（５ｍＬ）溶液に、０．０５Ｍ ヒドラジンエタノール溶液（３０ｍＬ）を室温にて加え、２時間還流した。反応終了後、反応溶液を留去し、１Ｍ 塩酸（３ｍＬ）を加え、室温で２時間撹拌した。析出した固体を濾別し、濾液を減圧留去した。得られた固体をエタノール並びに酢酸エチルを用いて洗浄することにより、４−｛４−メチル−２−（４−トリフルオロメチルベンゾイルアミノ）チアゾール−５−イル｝ブチルアミン塩酸塩の白色固体（０．１０ｇ，収率：４１．７％）を得た。１Ｈ−ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６，ＤＭＳＯ，ｐｐｍ）：δ １．４９から１．７３（ｍ，４Ｈ），２．２４（ｓ，３Ｈ），２．６０から２．９０（ｍ，４Ｈ），７．９１（ｄ，Ｊ＝８．１Ｈｚ，２Ｈ），７．９７から８．１９（ｍ，３Ｈ），８．２６（ｄ，Ｊ＝８．１Ｈｚ，２Ｈ）。アミドのプロトンは帰属できなかった。
【００９２】
（合成例８７）
【００９３】
【化１９】
４−メトキシカルボニル−Ｎ−［４−メチル−５−｛４−（フタルイミド）ブチル｝チアゾール−２−イル］−ベンズアミド（０．５３５ｇ，１．１２ｍｍｏｌ）に０．５Ｍヒドラジンエタノール溶液（１３．５ｍＬ）を加え常温で一晩反応させた。反応終了後、溶液を減圧留去した。残渣に１Ｍ塩酸を加え超音波で懸濁し、セライトを敷いたガラスフィルターで固体を濾別した。濾液を減圧留去し固体を再度析出させ、少量の熱エタノールを加え洗浄することによって、４−［２−｛４−（メトキシカルボニル）ベンゾイルアミノ｝−４−メチルチアゾール−５−イル］ブチルアミン塩酸塩の白色固体（０．３６ｇ，収率：８４％）を得た。１Ｈ−ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６，ＤＭＳＯ，ｐｐｍ）：δ １．６０から１．７０（ｍ，４Ｈ），２．４２（ｓ，３Ｈ），２．７２から２．８０（ｍ，４Ｈ），３．９０（ｓ，３Ｈ），７．９７（ｂｒ ｓ，３Ｈ），８．０７から８．２１（ｍ，４Ｈ）。アミドのプロトンは帰属できなかった。
【００９４】
（合成例８８）
【００９５】
【化２０】
３−アセトキシ−４−メチル−Ｎ−［４−メチル−５−｛４−（フタルイミド）ブチル｝チアゾール−２−イル］ベンズアミド（０．８０ｇ，１．６２ｍｍｏｌ）に０．５Ｍヒドラジンエタノール溶液（１０ｍＬ）を加え常温で一晩反応させた。反応終了後、溶液を減圧留去した後、残渣に１Ｍ塩酸を加え超音波で懸濁し、セライトを敷いたガラスフィルターで固体を濾別した。濾液を減圧留去し固体を再度析出させ、少量の熱エタノールを加え洗浄することによって、４−｛２−（３−ヒドロキシ４−メチルベンゾイルアミノ）−４−メチルチアゾール−５−イル｝ブチルアミン塩酸塩の白色固体（０．４８ｇ，収率：７５％）を得た。１Ｈ−ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６，ＤＭＳＯ，ｐｐｍ）：δ １．６０から１．７０（ｍ，４Ｈ），２．１９（ｓ，３Ｈ），２．２３（ｓ，３Ｈ），２．７２から２．８１（ｍ，４Ｈ），７．２０（ｄ，Ｊ＝７．５Ｈｚ，１Ｈ），７．４４から７．５０（ｍ，２Ｈ），７．９４（ｂｒ ｓ，３Ｈ）９．８０（ｂｒ ｓ，１Ｈ）。アミドのプロトンは帰属できなかった。
【００９６】
（合成例８９）
【００９７】
【化２１】
３−シアノ−Ｎ−［４−メチル−５−｛４−（フタルイミド）ブチル｝チアゾール−２−イル］ベンズアミドに０．５Ｍヒドラジンエタノール溶液（７ｍＬ）を加え常温で一晩反応させた。反応終了後、溶媒を減圧留去し、残渣に１Ｍ塩酸を加え超音波で懸濁し、セライトを敷いたガラスフィルターで濾過した。溶媒を減圧留去し、少量のエタノールを加え溶解した後、酢酸エチルで再沈殿させて精製し、４−｛２−（３−シアノベンゾイルアミノ）−４−メチルチアゾール−５−イル｝ブチルアミン塩酸塩の白色固体（０．２５ｇ，収率：４６％）を得た。１Ｈ−ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６，ＤＭＳＯ，ｐｐｍ）：δ １．６２から１．６５（ｍ，４Ｈ），２．２４（ｓ，３Ｈ），３．４３から３．４６（ｍ，４Ｈ），７．５６（ｄｄ，Ｊ＝８．０ ａｎｄ ８．０Ｈｚ，１Ｈ），８．０５（ｄ，Ｊ＝８．０Ｈｚ，１Ｈ），８．１０から８．２２（ｍ，４Ｈ），８．４９（ｓ，１Ｈ）。アミドのプロトンは帰属できなかった。
【００９８】
（合成例９０から１７９）
合成例８９の方法に準じて、表１３から２６に記載したチアゾール誘導体を得た。
【００９９】
【表１３】
【０１００】
【表１４】
【０１０１】
【表１５】
【０１０２】
【表１６】
【０１０３】
【表１７】
【０１０４】
【表１８】
【０１０５】
【表１９】
【０１０６】
【表２０】
【０１０７】
【表２１】
【０１０８】
【表２２】
【０１０９】
【表２３】
【０１１０】
【表２４】
【０１１１】
【表２５】
【０１１２】
【表２６】
合成例１から８１に例示した方法によって合成した本発明に関わるチアゾール誘導体（４）を表２７から３２にまとめて例示した。
【０１１３】
【化２２】
【０１１４】
【表２７】
【０１１５】
【表２８】
【０１１６】
【表２９】
【０１１７】
【表３０】
【０１１８】
【表３１】
【０１１９】
【表３２】
また、合成例８２から１７９に例示した方法によって合成した本発明に関わるチアゾール誘導体（１ａ）を表３３から４１にまとめて例示した。
【０１２０】
【化２３】
【０１２１】
【表３３】
【０１２２】
【表３４】
【０１２３】
【表３５】
【０１２４】
【表３６】
【０１２５】
【表３７】
【０１２６】
【表３８】
【０１２７】
【表３９】
【０１２８】
【表４０】
【０１２９】
【表４１】
（参考例２）
【０１３０】
【化２４】
化合物２７６（２．５０ｇ，８．６４ｍｍｏｌ）のクロロホルム（５０ｍＬ）溶液にトリエチルアミン（２．５０ｍＬ，１８ｍｍｏｌ）を添加した。次に氷冷下でメタクリル酸クロリド（０．９３ｍＬ，９．５ｍｍｏｌ）を滴下したのち、氷冷下で３０分反応させた。反応終了後、反応混合物にクロロホルム（５０ｍＬ）を追加し、水（１００ｍＬ）、飽和炭酸ナトリウム水溶液（１００ｍＬ）、飽和食塩水（１００ｍＬ）で順次洗浄した。有機層を無水硫酸マグネシウムで乾燥した後、乾燥剤を濾別し溶媒を減圧留去した。得られた混合物をシリカゲルクロマトグラフィー（酢酸エチル／ヘキサン＝１／２（ｖ／ｖ））で精製することで、淡黄色粘性液体の４−メチル−Ｎ−［４−メチル−５−｛３−（２−プロペニルカルボニルアミノ）プロピル｝チアゾール−２−イル］ベンズアミド（１．０７ｇ，３．０ｍｍｏｌ，収率：３５％）を得た。１Ｈ−ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６，ＤＭＳＯ，ｐｐｍ）：δ １．７０から１．８２（ｍ，２Ｈ），１．８７（ｓ，３Ｈ），２．２１（ｓ，３Ｈ），２．３９（ｓ，３Ｈ），２．６８（ｔ，Ｊ＝７．５Ｈｚ，２Ｈ），３．１０から３．２５（ｍ，２Ｈ），５．３２（ｓ，１Ｈ），５．６４（ｓ，１Ｈ），７．３４（ｄ，Ｊ＝８．５Ｈｚ，２Ｈ），７．９０（ｓ，１Ｈ），７．９８（ｄ，Ｊ＝８．５Ｈｚ，２Ｈ）。
【０１３１】
実施例２ チアゾール誘導体のアガロースゲルへの固定化（その１）
チアゾール誘導体を４０μｍｏｌ／ｍＬになるようＤＭＳＯに溶解し、これに等量の０．５Ｍ 塩化ナトリウムを含む０．２Ｍ 炭酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ８．３）を加えて濃度２０μｍｏｌ／ｍＬのチアゾール誘導体溶液を調製した。Ｎ−ヒドロキシスクシニミド（ＮＨＳ）にて活性化されたアガロースゲルであるＨｉＴｒａｐ ＮＨＳ−ａｃｔｉｖａｔｅｄ ＨＰ １ｍＬ（商品名）（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス株式会社製；以下ＨｉＴｒａｐカラムと略記する）に、非特許文献３に記載された方法に従って前記チアゾール誘導体溶液を２ｍＬ通液することによって固定化を行なった。未反応のスクシンイミドオキシカルボニル基のブロッキングは、非特許文献３に記載された方法に従って行なった。固定化量は非特許文献３に記載された方法のうち「Ｂ．酸性条件法」に従って、ＨｉＴｒａｐカラム通液前後のリガンド（チアゾール誘導体）溶液の紫外吸収極大波長（３００ｎｍ付近）における吸光度をＵ−２９００スペクトロフォトメーター（日立製作所製）で測定することにより算出した。当該方法で固定化した各化合物の固定化リガンド密度を表４２に示す。なお、本実施例以降で記載の化合物番号は表３３から４１記載の化合物番号に対応する。
【０１３２】
【表４２】
実施例３ チアゾール誘導体のアガロースゲルへの固定化（その２）
チアゾール誘導体を２０μｍｏｌ／ｍＬ、トリエチルアミンを４０μｍｏｌ／ｍＬ含むＤＭＳＯ溶液を調製した。ＨｉＴｒａｐカラムをＤＭＳＯで置換後、これに前記チアゾール誘導体−トリエチルアミンのＤＭＳＯ溶液を２ｍＬ通液した。一時間放置した後、ＨｉＴｒａｐカラムに３ｍＬのＤＭＳＯを通液して、さらに５ｍＬの０．５Ｍ 塩化ナトリウムを含む０．２Ｍ 炭酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ８．３）を通液した。未反応のスクシンイミドオキシカルボニル基のブロッキングは、非特許文献３に記載された方法に従って行なった。固定化量は非特許文献３に記載された方法のうち「Ｂ．酸性条件法」に従って、ＨｉＴｒａｐカラム通液前後のリガンド（チアゾール誘導体）溶液の紫外吸収極大波長（３００ｎｍ付近）における吸光度をＵ−２９００スペクトロフォトメーター（日立製作所製）で測定することにより算出した。当該方法で固定化した化合物３０４の固定化リガンド密度を表４３に示す。
【０１３３】
【表４３】
実施例４ チアゾール誘導体固定化アガロースゲルを用いたタンパク質の吸脱着（その１）
実施例２あるいは３に記載の方法にて調製したチアゾール誘導体固定化ＨｉＴｒａｐカラムをＡＫＴＡｐｒｉｍｅ ｐｌｕｓ（商品名）（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス株式会社製クロマトグラフィー装置）に取り付け、０．７Ｍ 硫酸ナトリウムを含む１０ｍＭ リン酸ナトリウム−１０ｍＭ クエン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．５）（以下平衡化緩衝液と呼ぶ）を２０ｍＬ通液し平衡化した。ＡＫＴＡｐｒｉｍｅ ｐｌｕｓを流速１ｍＬ／ｍｉｎで自動運転し、平衡化緩衝液を１０ｍＬ通液後、同緩衝液に溶解したヒト血漿由来免疫グロブリン製剤（化血研製、本製剤の免疫グロブリンは免疫グロブリンＧである）０．５ｍｇ（ＯＤ２８０＝０．７）を添加してカラムに通液した。さらに平衡化緩衝液を１０ｍＬ通液後、平衡化緩衝液から１０ｍＭ リン酸ナトリウム−１０ｍＭ クエン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．５）への硫酸ナトリウムに関する直線濃度勾配クロマトグラフィーを行なった。免疫グロブリンのカラムからの溶出は２８０ｎｍにおける吸光度をモニターして検出した。溶出液は１ｍＬずつ分画し、各フラクションの２８０ｎｍにおける吸光度をＵ−２９００スペクトロフォトメーター（日立製作所製）で測定し回収率を算出した。チアゾール誘導体を固定化したＨｉＴｒａｐカラムを用いて行なったクロマトグラフィーの結果を図１から図６に示し、これらのクロマトグラフィーにおける免疫グロブリンの回収率を表４４に示す。いずれのチアゾール誘導体を用いたときも免疫グロブリンは５０％以上の回収率で回収され、チアゾール誘導体固定化ＨｉＴｒａｐカラムによる免疫グロブリンの吸脱着が確認された。特に化合物２８６、３０４、３２９を用いた場合の回収率は９０％以上と極めて高かった。
【０１３４】
【表４４】
それぞれの吸脱着操作後には１００ｍＭ 水酸化ナトリウム水溶液を１０ｍＬ通液してカラムの再生を行なった。前記のチアゾール誘導体固定化ＨｉＴｒａｐカラムはいずれもこの再生処理によって初期状態に復帰させることができ、繰り返し使用によってもその特性は変化しなかった。
【０１３５】
実施例５ チアゾール誘導体固定化アガロースゲルを用いたタンパク質の吸脱着（その２）
実施例２あるいは３に記載の方法にて調製したチアゾール誘導体固定化ＨｉＴｒａｐカラムをＡＫＴＡｐｒｉｍｅ ｐｌｕｓ（商品名）（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス株式会社製クロマトグラフィー装置）に取り付け、前記平衡化緩衝液を２０ｍＬ通液し平衡化した。ＡＫＴＡｐｒｉｍｅ ｐｌｕｓを流速１ｍＬ／ｍｉｎで自動運転し、平衡化緩衝液を１０ｍＬ通液後、同緩衝液に溶解したウシ血清アルブミン（ＳＩＧＭＡ社製）０．５ｍｇ（ＯＤ２８０＝０．３）を添加してカラムに通液した。さらに平衡化緩衝液を１０ｍＬ通液後、平衡化緩衝液から１０ｍＭ リン酸ナトリウム−１０ｍＭ クエン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．５）への硫酸ナトリウムに関する直線濃度勾配クロマトグラフィーを行なった。ウシ血清アルブミンのカラムからの溶出は２８０ｎｍにおける吸光度をモニターして検出した。溶出液は１ｍＬずつ分画し、各フラクションの２８０ｎｍにおける吸光度をＵ−２９００スペクトロフォトメーター（日立製作所製）で測定し回収率を算出した。各種チアゾール誘導体を固定化したＨｉＴｒａｐカラムを用いて行なったクロマトグラフィーの結果を図７から１２に示す。また、これらのクロマトグラフィーにおけるウシ血清アルブミンの回収率を表４５に示す。いずれのチアゾール誘導体を用いたときもウシ血清アルブミンは１０番目の画分までに溶出しており、カラムへの吸着はほとんど見られなかった。また、図１から６に示した免疫グロブリンを通液したときの結果とは大きく異なっていた。よって、本発明のチアゾール誘導体固定化マトリックスを用いることで、試料中の免疫グロブリンとウシ血清アルブミンとの分離が可能であることが示された。
【０１３６】
【表４５】
それぞれの吸脱着操作後には１００ｍＭ 水酸化ナトリウム水溶液を１０ｍＬ通液してカラムの再生を行なった。前記のチアゾール誘導体を固定化ＨｉＴｒａｐカラムはいずれもこの再生処理によって初期状態に復帰させることができ、繰り返し使用によってもその特性は変化しなかった。
【０１３７】
実施例６ チアゾール誘導体固定化アガロースゲルを用いたタンパク質の吸脱着（その３）
実施例２に記載の方法にて調製した化合物２８６を固定化したＨｉＴｒａｐカラムをＡＫＴＡｐｒｉｍｅ ｐｌｕｓ（商品名）（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス株式会社製クロマトグラフィー装置）に取り付け、前記平衡化緩衝液を２０ｍＬ通液し平衡化した。ＡＫＴＡｐｒｉｍｅ ｐｌｕｓを流速１ｍＬ／ｍｉｎで自動運転し、平衡化緩衝液を１０ｍＬ通液後、同緩衝液に溶解したリボヌクレア−ゼＡ、リゾチ−ム、αキモトリプシノ−ゲンＡの混合液（リボヌクレア−ゼＡ ０．１５ｍｇ、リゾチ−ム ０．０３ｍｇ、αキモトリプシノ−ゲンＡ ０．０４ｍｇ）（ＯＤ２８０＝０．２４）を添加してカラムに通液した。さらに平衡化緩衝液を１０ｍＬ通液後、平衡化緩衝液から１０ｍＭ リン酸ナトリウム−１０ｍＭ クエン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．５）への硫酸ナトリウムに関する直線濃度勾配クロマトグラフィーを行なった。タンパク質のカラムからの溶出は２８０ｎｍにおける吸光度の吸光度をモニターして検出した。溶出液は１ｍＬずつ分画し、各フラクションの２８０ｎｍにおける吸光度をＵ−２９００スペクトロフォトメーター（日立製作所製）で測定し回収率を算出した。化合物２８６を固定化したＨｉＴｒａｐカラムを用いて行なったクロマトグラフィーの結果を図１３に示し、このクロマトグラフィーにおけるタンパク質の回収率を表４６に示す。いずれのタンパク質も１０番目の画分以内に溶出しており、免疫グロブリン（２５番目から４５番目までの画分に溶出、図１参照）とは異なる画分となった。このことから、本発明のチアゾール誘導体固定化マトリックスを用いることで、試料中の免疫グロブリンとリボヌクレア−ゼＡ、リゾチ−ム、αキモトリプシノ−ゲンＡとの分離が可能であることが示された。
【０１３８】
【表４６】
吸脱着操作後には１００ｍＭ 水酸化ナトリウム水溶液を１０ｍＬ通液してカラムの再生を行なった。前記のチアゾール誘導体固定化ＨｉＴｒａｐカラムはこの再生処理によって初期状態に復帰させることができ、繰り返し使用によってもその特性は変化しなかった。
【０１３９】
実施例７ チアゾール誘導体固定化アガロースゲルを用いたタンパク質の吸脱着（その４）
ヒト−マウスキメラ抗体であるリツキサン（商品名）（中外製薬株式会社製、１０ｍｇ／ｍＬ）を固定化パパイン（Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ Ｐａｐａｉｎ、ＰＩＥＲＣＥ株式会社製）を用い、同説明書記載の方法で３７℃、１０時間処理することによって、限定加水分解物を得た。
【０１４０】
実施例２に記載の方法にて調製した化合物２８６を固定化したＨｉＴｒａｐカラムをＡＫＴＡｐｒｉｍｅ ｐｌｕｓ（商品名）（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス株式会社製クロマトグラフィー装置）に取り付け、前記平衡化緩衝液を２０ｍＬ通液し平衡化した。ＡＫＴＡｐｒｉｍｅ ｐｌｕｓを流速１ｍＬ／ｍｉｎで自動運転し、平衡化緩衝液を１０ｍＬ通液後、上記パパイン処理抗体を１．２ｍｇ（ＯＤ２８０＝１．７）添加してカラムに通液した。さらに平衡化緩衝液を１０ｍＬ通液後、平衡化緩衝液から１０ｍＭ リン酸ナトリウム−１０ｍＭ クエン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．５）への硫酸ナトリウムに関する直線濃度勾配クロマトグラフィーを行なった。タンパク質のカラムからの溶出は２８０ｎｍにおける吸光度のモニターにより検出し、溶出液は１ｍＬずつ分画した。このクロマトグラフィーの結果を図１４に示す。またこのうち７、２９、３９、４３番目の画分（それぞれＩ、ＩＩ、ＩＩＩ、ＩＶと表記）についてそれぞれ５μＬを還元条件下で１５％アクリルアミドを含むＳＤＳ−ＰＡＧＥにかけ、銀染色試薬（銀染色「第一」（商品名）、第一化学薬品株式会社製）を用いて染色した（図１５）。これにより、ＩはＦａｂ（Ｈ鎖に由来する２７ｋＤａタンパク質とＬ鎖である２７ｋＤａタンパク質より構成される）、ＩＩはＦｃ（Ｈ鎖に由来する３０ｋＤａタンパク質のダイマーで構成される）、ＩＩＩは部分消化抗体（Ｈ鎖である６０ｋＤａタンパク質とＨ鎖に由来する３０ｋＤａタンパク質とＬ鎖である２７ｋＤａタンパク質で構成される）、ＩＶは未消化抗体（Ｈ鎖である６０ｋＤａタンパク質のダイマーとＬ鎖である２７ｋＤａタンパク質のダイマーで構成される）と同定され、抗体に由来する各フラグメントの分離が可能であることが示された。
【０１４１】
実施例８ チアゾール誘導体のビニルポリマーゲルへの固定化（その１）
遠沈管に化合物２８６（１０２ｍｇ、０．３ｍｍｏｌ）を計り取り、１，２−ジメトキシベンゼンのアセトニトリル溶液（１ｍｍｏｌ／ｍＬ）を０．３ｍＬ添加した。次いで、遠沈管にアセトニトリル（１．７ｍＬ）、緩衝液（組成：０．２Ｍ ＮａＨＣＯ３、０．５Ｍ ＮａＣｌ、ｐＨ８．３；８ｍＬ）、トリエチルアミン（９０μＬ、０．６ｍｍｏｌ）を添加して化合物２８６が溶解したことを確認したのち、０．３ｇのエポキシトヨパール（商品名）ゲル（東ソー株式会社製、エポキシ基含量：８０４μｍｏｌ／ｇ（ｇｅｌ））を添加した。上記操作によって得られた混合物の入った遠沈管を内温４０℃に設定した卓上振盪機にセットし、１６５ｒｐｍで１６時間攪拌振盪した。反応終了後、遠沈管にアセトニトリル（５ｍＬ）を添加し、グラスフィルターでトヨパールゲルと反応溶液を分離した。次にグラスフィルター上のトヨパールゲルを洗浄液（組成：ＣＨ３ＣＮ／ＭｅＯＨ／５０ｍＭ ＮＨ４Ｈ２ＰＯ４＝４／１／５；１０ｍＬ）で２回洗浄した。反応溶液と洗浄液を合わせ、高速液体クロマトグラフィー（カラム：東ソー株式会社製 ＴＳＫ−ｇｅｌ ＯＤＳ−８０ＴＭ（商品名）（内径４．６ｍｍ×長さ１５ｃｍ）、溶離液：ＣＨ３ＣＮ／ＭｅＯＨ／５０ｍＭ ＮＨ４Ｈ２ＰＯ４＝４／１／５、流速：１ｍＬ／ｍｉｎ、温度：２５℃、検出：ＵＶ ２５４ｎｍ）にて残存する化合物２８６を定量することによって、エポキシトヨパールに化合物２８６が１２７μｍｏｌ／ｍＬ（ｇｅｌ）固定化されていることを確認した。更に、上記の操作によって得られたトヨパールゲル中の未反応のエポキシ基をブロックするため、得られたトヨパールゲルを遠沈管に入れブロッキング溶液（組成：０．５Ｍ モノエタノールアミン、０．５Ｍ 塩化ナトリウム、ｐＨ８．３（溶媒は水）；５ｍＬ）を添加した。反応溶液が入った遠沈管を、内温４０℃に設定した卓上振盪機にセットし、１６５ｒｐｍで１６時間攪拌振盪することによりゲル中の残存エポキシ基をモノエタノールアミンでブロックした。反応終了後、遠沈管にアセトニトリル（５ｍＬ）を添加し、グラスフィルターにてトヨパールゲルとブロッキング溶液を分離した。次いで、ゲルをエタノール（５ｍＬ）、水（５ｍＬ）でそれぞれ２回ずつ洗浄し、化合物２８６が固定化されたエポキシトヨパールゲルを得た。また、ブロッキング溶液と洗浄液を合わせた溶液中に残存する化合物２８６を高速液体クロマトグラフィーで測定したところ、ブロッキング溶液と洗浄液を合わせた溶液中に化合物２８６は残存していないことが確認された。
【０１４２】
実施例９ チアゾール誘導体のビニルポリマーゲルへの固定化（その２）
遠沈管に化合物３２９（１０７ｍｇ、０．３ｍｍｏｌ）を計り取り、１，２−ジメトキシベンゼンのアセトニトリル溶液（１ｍｍｏｌ／ｍＬ）を０．３ｍＬ添加した。次いで、遠沈管にアセトニトリル（１．７ｍＬ）、０．５Ｍ 水酸化ナトリウム水溶液（２．４ｍＬ）、水（５．６ｍＬ）を添加して化合物３２９が溶解したことを確認したのち、０．３ｇのエポキシトヨパール（商品名）ゲル（東ソー株式会社製、エポキシ基含量：８０４μｍｏｌ／ｇ（ｇｅｌ））を添加した。上記操作によって得られた混合物の入った遠沈管を内温４０℃に設定した卓上振盪機にセットし、１６５ｒｐｍで２４時間攪拌振盪した。反応終了後、遠沈管にアセトニトリル（５ｍＬ）を添加し、グラスフィルターでトヨパールゲルと反応溶液を分離した。次にグラスフィルター上のトヨパールゲルを洗浄液（組成：ＣＨ３ＣＮ／ＭｅＯＨ／５０ｍＭ ＮＨ４Ｈ２ＰＯ４＝４／１／５；１０ｍＬ）で２回洗浄した。反応溶液と洗浄液を合わせ、高速液体クロマトグラフィー（カラム：東ソー株式会社製 ＴＳＫ−ｇｅｌ ＯＤＳ−８０ＴＭ（内径４．６ｍｍ×長さ１５ｃｍ）、溶離液：ＣＨ３ＣＮ／ＭｅＯＨ／５０ｍＭ ＮＨ４Ｈ２ＰＯ４＝４／１／５、流速：１ｍＬ／ｍｉｎ、温度：２５℃、検出：ＵＶ ２５４ｎｍ）にて残存する化合物３２９を定量することによって、エポキシトヨパールに化合物３２９が８１μｍｏｌ／ｍＬ（ｇｅｌ）固定化されていることが確認された。更に、上記の操作によって得られたトヨパールゲル中の未反応のエポキシ基をブロックするため、得られたトヨパールゲルを遠沈管に入れブロッキング溶液（組成：０．５Ｍ モノエタノールアミン、０．５Ｍ 塩化ナトリウム水溶液、ｐＨ８．３（溶媒は水）；５ｍＬ）を添加した。反応溶液が入った遠沈管を、内温４０℃に設定した卓上振盪機にセットし、１６５ｒｐｍで２０時間攪拌振盪することによりゲル中の残存エポキシ基をモノエタノールアミンでブロックした。反応終了後、遠沈管にアセトニトリル（５ｍＬ）を添加し、グラスフィルターにてトヨパールゲルとブロッキング溶液を分離した。次いで、ゲルをエタノール（５ｍＬ）、水（５ｍＬ）でそれぞれ２回ずつ洗浄し、化合物３２９が固定化されたエポキシトヨパールゲルを得た。また、ブロッキング溶液と洗浄液を合わせた溶液中に残存する化合物３２９を高速液体クロマトグラフィーで測定したところ、ブロッキング溶液と洗浄液を合わせた溶液中に化合物３２９は残存していないことが確認された。
【０１４３】
実施例１０ チアゾール誘導体のビニルポリマーゲルへの固定化（その３）
遠沈管に化合物２８６（３０ｍｇ、８８μｍｏｌ）を計り取り、１，２−ジメトキシベンゼンのアセトニトリル溶液（１ｍｍｏｌ／ｍＬ）を０．１ｍＬ添加した。次いで、遠沈管にアセトニトリル（２．４ｍＬ）、緩衝液（組成：０．１Ｍ Ｎａ２ＨＰＯ４−ＮａＨ２ＰＯ４、ｐＨ７．０；２．５ｍＬ）、トリエチルアミン（３０μＬ、０．２ｍｍｏｌ）を添加して化合物２８６が溶解したことを確認したのち、３ｍＬのホルミルトヨパール（商品名）ゲル（東ソー株式会社製、ホルミル基含量：６５μｍｏｌ／ｇ（ｇｅｌ））を添加した。上記操作によって得られた混合物の入った遠沈管を内温２５℃に設定した卓上振盪機にセットし、１６５ｒｐｍで攪拌振盪した。攪拌振盪を開始してから３０分後、遠沈管にボラン−ピリジン複合体（２５０μＬ、２．５ｍｍｏｌ）を添加し、さらに１６５ｒｐｍで２．５時間攪拌振盪した。反応終了後、遠沈管にアセトニトリル（５ｍＬ）を添加し、グラスフィルターでトヨパールゲルと反応溶液を分離した。次にグラスフィルター上のトヨパールゲルを洗浄液（組成：ＣＨ３ＣＮ／ＭｅＯＨ／５０ｍＭ ＮＨ４Ｈ２ＰＯ４＝４／１／５；１０ｍＬ）で２回洗浄した。反応溶液と洗浄液を合わせ、高速液体クロマトグラフィー（カラム：東ソー株式会社製 ＴＳＫ−ｇｅｌ ＯＤＳ−８０ＴＭ（商品名）（内径４．６ｍｍ×長さ１５ｃｍ）、溶離液：ＣＨ３ＣＮ／ＭｅＯＨ／５０ｍＭ ＮＨ４Ｈ２ＰＯ４＝４／１／５、流速：１ｍＬ／ｍｉｎ、温度：２５℃、検出：ＵＶ ２５４ｎｍ）にて残存する化合物２８６を定量することによって、化合物２８６が１９μｍｏｌ／ｍＬ（ｇｅｌ）固定化されたホルミルトヨパールゲルを得た。
【０１４４】
実施例１１ チアゾール誘導体のビニルポリマーゲルへの固定化（その４）
遠沈管に化合物３２０（１１１ｍｇ、０．３ｍｍｏｌ）を計り取り、１，２−ジメトキシベンゼンのアセトニトリル溶液（１ｍｍｏｌ／ｍＬ）を０．３ｍＬ添加した。次いで、遠沈管にアセトニトリル（１．７ｍＬ）、０．５Ｍ 水酸化ナトリウム水溶液（０．６ｍＬ）、水（７．４ｍＬ）を添加して化合物３２０が溶解したことを確認したのち、０．３ｇのエポキシトヨパール（商品名）ゲル（東ソー株式会社製、エポキシ基含量：８０４μｍｏｌ／ｇ（ｇｅｌ））を添加した。上記操作によって得られた混合物の入った遠沈管を内温４０℃に設定した卓上振盪機にセットし、１６５ｒｐｍで２４時間攪拌振盪した。反応終了後、遠沈管にアセトニトリル（５ｍＬ）を添加し、グラスフィルターでトヨパールゲルと反応溶液を分離した。次にグラスフィルター上のトヨパールゲルを洗浄液（組成：ＣＨ３ＣＮ／ＭｅＯＨ／５０ｍＭ ＮＨ４Ｈ２ＰＯ４＝４／１／５；１０ｍＬ）で２回洗浄した。反応溶液と洗浄液を合わせ、高速液体クロマトグラフィー（カラム：東ソー株式会社製 ＴＳＫ−ｇｅｌ ＯＤＳ−８０ＴＭ（商品名）（内径４．６ｍｍ×長さ１５ｃｍ）、溶離液：ＣＨ３ＣＮ／ＭｅＯＨ／５０ｍＭ ＮＨ４Ｈ２ＰＯ４＝４／１／５、流速：１ｍＬ／ｍｉｎ、温度：２５℃、検出：ＵＶ２５４ｎｍ）にて残存する化合物３２０を定量することによって、エポキシトヨパールに化合物３２０が１７６μｍｏｌ／ｍＬ（ｇｅｌ）固定化されていることが確認された。更に、上記の操作によって得られたトヨパールゲル中の未反応のエポキシ基をブロックするため、得られたトヨパールゲルを遠沈管に入れブロッキング溶液（組成：０．５Ｍ モノエタノールアミン、０．５Ｍ 塩化ナトリウム水溶液（溶媒は水）、ｐＨ８．３；５ｍＬ）を添加した。反応溶液が入った遠沈管を、内温４０℃に設定した卓上振盪機にセットし、１６５ｒｐｍで２０時間攪拌振盪することによりゲル中の残存エポキシ基をモノエタノールアミンでブロックした。反応終了後、遠沈管にアセトニトリル（５ｍＬ）を添加し、グラスフィルターにてトヨパールゲルとブロッキング溶液を分離した。次いで、ゲルをエタノール（５ｍＬ）、水（５ｍＬ）でそれぞれ２回ずつ洗浄し、化合物３２０が固定化されたエポキシトヨパールゲルを得た。また、ブロッキング溶液と洗浄液を合わせた溶液中に残存する化合物３２０を高速液体クロマトグラフィーで測定したところ、ブロッキング溶液と洗浄液を合わせた溶液中に化合物３２０は残存していないことが確認された。
【０１４５】
実施例１２ チアゾール誘導体のビニルポリマーゲルへの固定化（その５）
遠沈管に化合物３８４（１１２ｍｇ、０．３ｍｍｏｌ）を計り取り、１，２−ジメトキシベンゼンのアセトニトリル溶液（１ｍｍｏｌ／ｍＬ）を０．３ｍＬ添加した。次いで、遠沈管にアセトニトリル（１．７ｍＬ）、０．５Ｍ 水酸化ナトリウム水溶液（０．９ｍＬ）、水（７．１ｍＬ）を添加して化合物３８４が溶解したことを確認したのち、０．３ｇのエポキシトヨパール（商品名）ゲル（東ソー株式会社製、エポキシ基含量：８０４μｍｏｌ／ｇ（ｇｅｌ））を添加した。上記操作によって得られた混合物の入った遠沈管を内温４０℃に設定した卓上振盪機にセットし、１６５ｒｐｍで２４時間攪拌振盪した。反応終了後、遠沈管にアセトニトリル（５ｍＬ）を添加し、グラスフィルターでトヨパールゲルと反応溶液を分離した。次にグラスフィルター上のトヨパールゲルを洗浄液（組成：ＣＨ３ＣＮ／ＭｅＯＨ／５０ｍＭ ＮＨ４Ｈ２ＰＯ４＝４／１／５；１０ｍＬ）で２回洗浄した。反応溶液と洗浄液を合わせ、高速液体クロマトグラフィー（カラム：東ソー株式会社製 ＴＳＫ−ｇｅｌ ＯＤＳ−８０ＴＭ（商品名）（内径４．６ｍｍ×長さ１５ｃｍ）、溶離液：ＣＨ３ＣＮ／ＭｅＯＨ／５０ｍＭ ＮＨ４Ｈ２ＰＯ４＝４／１／５、流速：１ｍＬ／ｍｉｎ、温度：２５℃、検出：ＵＶ ２５４ｎｍ）にて残存する化合物３８４を定量することによって、エポキシトヨパールに化合物３８４が１２６μｍｏｌ／ｍＬ（ｇｅｌ）固定化されていることが確認された。更に、上記の操作によって得られたトヨパールゲル中の未反応のエポキシ基をブロックするため、得られたトヨパールゲルを遠沈管に入れブロッキング溶液（組成：０．５Ｍ モノエタノールアミン、０．５Ｍ 塩化ナトリウム水溶液、ｐＨ８．３（溶媒は水）；５ｍＬ）を添加した。反応溶液が入った遠沈管を、内温４０℃に設定した卓上振盪機にセットし、１６５ｒｐｍで２０時間攪拌振盪することによりゲル中の残存エポキシ基をモノエタノールアミンでブロックした。反応終了後、遠沈管にアセトニトリル（５ｍＬ）を添加し、グラスフィルターにてトヨパールゲルとブロッキング溶液を分離した。次いで、ゲルをエタノール（５ｍＬ）、水（５ｍＬ）でそれぞれ２回ずつ洗浄し、化合物３８４が固定化されたエポキシトヨパールゲルを得た。また、ブロッキング溶液と洗浄液を合わせた溶液中に残存する化合物３８４を高速液体クロマトグラフィーで測定したところ、ブロッキング溶液と洗浄液を合わせた溶液中に化合物３８４は残存していないことが確認された。
【０１４６】
実施例１３ チアゾール誘導体のビニルポリマーゲルへの固定化（その６）
遠沈管に化合物４２３（１１１ｍｇ、０．３ｍｍｏｌ）を計り取り、１，２−ジメトキシベンゼンのアセトニトリル溶液（１ｍｍｏｌ／ｍＬ）を０．３ｍＬ添加した。次いで、遠沈管にアセトニトリル（１．７ｍＬ）、０．５Ｍ 水酸化ナトリウム水溶液（０．９ｍＬ）、水（７．１ｍＬ）を添加して化合物４２３が溶解したことを確認したのち、０．３ｇのエポキシトヨパール（商品名）ゲル（東ソー株式会社製、エポキシ基含量：８０４μｍｏｌ／ｇ（ｇｅｌ））を添加した。上記操作によって得られた混合物の入った遠沈管を内温４０℃に設定した卓上振盪機にセットし、１６５ｒｐｍで２４時間攪拌振盪した。反応終了後、遠沈管にアセトニトリル（５ｍＬ）を添加し、グラスフィルターでトヨパールゲルと反応溶液を分離した。次にグラスフィルター上のトヨパールゲルを洗浄液（組成：ＣＨ３ＣＮ／ＭｅＯＨ／５０ｍＭ ＮＨ４Ｈ２ＰＯ４＝４／１／５；１０ｍＬ）で２回洗浄した。反応溶液と洗浄液を合わせ、高速液体クロマトグラフィー（カラム：東ソー株式会社製 ＴＳＫ−ｇｅｌ ＯＤＳ−８０ＴＭ（商品名）（内径４．６ｍｍ×長さ１５ｃｍ）、溶離液：ＣＨ３ＣＮ／ＭｅＯＨ／５０ｍＭ ＮＨ４Ｈ２ＰＯ４＝４／１／５、流速：１ｍＬ／ｍｉｎ、温度：２５℃、検出：ＵＶ ２５４ｎｍ）にて残存する化合物４２３を定量することによって、エポキシトヨパールに化合物４２３が１１４μｍｏｌ／ｍＬ（ｇｅｌ）固定化されていることが確認された。更に、上記の操作によって得られたトヨパールゲル中の未反応のエポキシ基をブロックするため、得られたトヨパールゲルを遠沈管に入れブロッキング溶液（組成：０．５Ｍ モノエタノールアミン、０．５Ｍ 塩化ナトリウム水溶液、ｐＨ８．３（溶媒は水）；５ｍＬ）を添加した。反応溶液が入った遠沈管を、内温４０℃に設定した卓上振盪機にセットし、１６５ｒｐｍで２０時間攪拌振盪することによりゲル中の残存エポキシ基をモノエタノールアミンでブロックした。反応終了後、遠沈管にアセトニトリル（５ｍＬ）を添加し、グラスフィルターにてトヨパールゲルとブロッキング溶液を分離した。次いで、ゲルをエタノール（５ｍＬ）、水（５ｍＬ）でそれぞれ２回ずつ洗浄し、化合物４２３が固定化されたエポキシトヨパールゲルを得た。また、ブロッキング溶液と洗浄液を合わせた溶液中に残存する化合物４２３を高速液体クロマトグラフィーで測定したところ、ブロッキング溶液と洗浄液を合わせた溶液中に化合物４２３は残存していないことが確認された。
【０１４７】
実施例１４ チアゾール誘導体のビニルポリマーゲルへの固定化（その７）
遠沈管に化合物２８３（９４ｍｇ、０．３ｍｍｏｌ）を計り取り、１，２−ジメトキシベンゼンのアセトニトリル溶液（１ｍｍｏｌ／ｍＬ）を０．３ｍＬ添加した。次いで、遠沈管にアセトニトリル（１．７ｍＬ）、緩衝液（組成：０．２Ｍ ＮａＨＣＯ３、０．５Ｍ ＮａＣｌ、ｐＨ８．３；８ｍＬ）、トリエチルアミン（９０μＬ、０．６ｍｍｏｌ）を添加して化合物２８３が溶解したことを確認したのち、０．３ｇのエポキシトヨパール（商品名）ゲル（東ソー株式会社製、エポキシ基含量：８０４μｍｏｌ／ｇ（ｇｅｌ））を添加した。上記操作によって得られた混合物の入った遠沈管を内温４０℃に設定した卓上振盪機にセットし、１６５ｒｐｍで１６時間攪拌振盪した。反応終了後、遠沈管にアセトニトリル（５ｍＬ）を添加し、グラスフィルターでトヨパールゲルと反応溶液を分離した。次にグラスフィルター上のトヨパールゲルを洗浄液（組成：ＣＨ３ＣＮ／ＭｅＯＨ／５０ｍＭ ＮＨ４Ｈ２ＰＯ４＝４／１／５；１０ｍＬ）で２回洗浄した。反応溶液と洗浄液を合わせ、高速液体クロマトグラフィー（カラム：東ソー株式会社製 ＴＳＫ−ｇｅｌ ＯＤＳ−８０ＴＭ（商品名）（内径４．６ｍｍ×長さ１５ｃｍ）、溶離液：ＣＨ３ＣＮ／ＭｅＯＨ／５０ｍＭ ＮＨ４Ｈ２ＰＯ４＝４／１／５、流速：１ｍＬ／ｍｉｎ、温度：２５℃、検出：ＵＶ ２５４ｎｍ）にて残存する化合物２８３を定量することによって、エポキシトヨパールに化合物２８３が１０２μｍｏｌ／ｍＬ（ｇｅｌ）固定化されていることが確認された。更に、上記の操作によって得られたトヨパールゲル中の未反応のエポキシ基をブロックするため、得られたトヨパールゲルを遠沈管に入れブロッキング溶液（組成：０．５Ｍ モノエタノールアミン、０．５Ｍ 塩化ナトリウム水溶液、ｐＨ８．３（溶媒は水）；５ｍＬ）を添加した。反応溶液が入った遠沈管を、内温４０℃に設定した卓上振盪機にセットし、１６５ｒｐｍで１６時間攪拌振盪することによりゲル中の残存エポキシ基をモノエタノールアミンでブロックした。反応終了後、遠沈管にアセトニトリル（５ｍＬ）を添加し、グラスフィルターにてトヨパールゲルとブロッキング溶液を分離した。次いで、ゲルをエタノール（５ｍＬ）、水（５ｍＬ）でそれぞれ２回ずつ洗浄し、化合物２８３が固定化されたエポキシトヨパールゲルを得た。また、ブロッキング溶液と洗浄液を合わせた溶液中に残存する化合物２８３を高速液体クロマトグラフィーで測定したところ、ブロッキング溶液と洗浄液を合わせた溶液中に化合物２８３は残存していないことが確認された。
【０１４８】
実施例１５ チアゾール誘導体のビニルポリマーゲルへの固定化（その８）
遠沈管に化合物２８４（９８ｍｇ、０．３ｍｍｏｌ）を計り取り、１，２−ジメトキシベンゼンのアセトニトリル溶液（１ｍｍｏｌ／ｍＬ）を０．３ｍＬ添加した。次いで、遠沈管にアセトニトリル（１．７ｍＬ）、緩衝液（組成：０．２Ｍ ＮａＨＣＯ３、０．５Ｍ ＮａＣｌ、ｐＨ８．３；８ｍＬ）、トリエチルアミン（９０μＬ、０．６ｍｍｏｌ）を添加して化合物２８４が溶解したことを確認したのち、０．３ｇのエポキシトヨパール（商品名）ゲル（東ソー株式会社製、エポキシ基含量：８０４μｍｏｌ／ｇ（ｇｅｌ））を添加した。上記操作によって得られた混合物の入った遠沈管を内温４０℃に設定した卓上振盪機にセットし、１６５ｒｐｍで１６時間攪拌振盪した。反応終了後、遠沈管にアセトニトリル（５ｍＬ）を添加し、グラスフィルターでトヨパールゲルと反応溶液を分離した。次にグラスフィルター上のトヨパールゲルを洗浄液（組成：ＣＨ３ＣＮ／ＭｅＯＨ／５０ｍＭ ＮＨ４Ｈ２ＰＯ４＝４／１／５；１０ｍＬ）で２回洗浄した。反応溶液と洗浄液を合わせ、高速液体クロマトグラフィー（カラム：東ソー株式会社製 ＴＳＫ−ｇｅｌ ＯＤＳ−８０ＴＭ（商品名）（内径４．６ｍｍ×長さ１５ｃｍ）、溶離液：ＣＨ３ＣＮ／ＭｅＯＨ／５０ｍＭ ＮＨ４Ｈ２ＰＯ４＝４／１／５、流速：１ｍＬ／ｍｉｎ、温度：２５℃、検出：ＵＶ ２５４ｎｍ）にて残存する化合物２８４を定量することによって、エポキシトヨパールに化合物２８４が１１７μｍｏｌ／ｍＬ（ｇｅｌ）固定化されていることが確認された。更に、上記の操作によって得られたトヨパールゲル中の未反応のエポキシ基をブロックするため、得られたトヨパールゲルを遠沈管に入れブロッキング溶液（組成：０．５Ｍ モノエタノールアミン、０．５Ｍ 塩化ナトリウム水溶液、ｐＨ８．３（溶媒は水）；５ｍＬ）を添加した。反応溶液が入った遠沈管を、内温４０℃に設定した卓上振盪機にセットし、１６５ｒｐｍで１６時間攪拌振盪することによりゲル中の残存エポキシ基をモノエタノールアミンでブロックした。反応終了後、遠沈管にアセトニトリル（５ｍＬ）を添加し、グラスフィルターにてトヨパールゲルとブロッキング溶液を分離した。次いで、ゲルをエタノール（５ｍＬ）、水（５ｍＬ）でそれぞれ２回ずつ洗浄し、化合物２８４が固定化されたエポキシトヨパールゲルを得た。また、ブロッキング溶液と洗浄液を合わせた溶液中に残存する化合物２８４を高速液体クロマトグラフィーで測定したところ、ブロッキング溶液と洗浄液を合わせた溶液中に化合物２８４は残存していないことが確認された。
【０１４９】
実施例１６ チアゾール誘導体のビニルポリマーゲルへの固定化（その９）
遠沈管に化合物２９２（１９１ｍｇ、０．５ｍｍｏｌ）を計り取り、１，２−ジメトキシベンゼンのアセトニトリル溶液（１ｍｍｏｌ／ｍＬ）を０．５ｍＬ添加した。次いで、遠沈管にアセトニトリル（１．５ｍＬ）、緩衝液（組成：０．２Ｍ ＮａＨＣＯ３、０．５Ｍ ＮａＣｌ、ｐＨ８．３；４ｍＬ）、トリエチルアミン（１４０μＬ、１．０ｍｍｏｌ）を添加して化合物２９２が溶解したことを確認したのち、０．３ｇのエポキシトヨパール（商品名）ゲル（東ソー株式会社製；エポキシ基含量：８０４μｍｏｌ／ｇ（ｇｅｌ））を添加した。上記操作によって得られた混合物の入った遠沈管を内温４０℃に設定した卓上振盪機にセットし、１６５ｒｐｍで１６時間攪拌振盪した。反応終了後、遠沈管にアセトニトリル（５ｍＬ）を添加し、グラスフィルターでトヨパールゲルと反応溶液を分離した。次にグラスフィルター上のトヨパールゲルを洗浄液（組成：ＣＨ３ＣＮ／ＭｅＯＨ／５０ｍＭ ＮＨ４Ｈ２ＰＯ４＝４／１／５；１０ｍＬ）で２回洗浄した。反応溶液と洗浄液を合わせ、高速液体クロマトグラフィー（カラム：東ソー株式会社製 ＴＳＫ−ｇｅｌ ＯＤＳ−８０ＴＭ（商品名）（内径４．６ｍｍ×長さ１５ｃｍ）、溶離液：ＣＨ３ＣＮ／ＭｅＯＨ／５０ｍＭ ＮＨ４Ｈ２ＰＯ４＝４／１／５、流速：１ｍＬ／ｍｉｎ、温度：２５℃、検出：ＵＶ ２５４ｎｍ）にて残存する化合物２９２を定量することによって、エポキシトヨパールに化合物２９２が５６μｍｏｌ／ｍＬ（ｇｅｌ）固定化されていることが確認された。更に、上記の操作によって得られたトヨパールゲル中の未反応のエポキシ基をブロックするため、得られたトヨパールゲルを遠沈管に入れブロッキング溶液（組成：０．５Ｍ モノエタノールアミン、０．５Ｍ 塩化ナトリウム水溶液、ｐＨ８．３（溶媒は水）；５ｍＬ）を添加した。反応溶液が入った遠沈管を、内温４０℃に設定した卓上振盪機にセットし、１６５ｒｐｍで１６時間攪拌振盪することによりゲル中の残存エポキシ基をモノエタノールアミンでブロックした。反応終了後、遠沈管にアセトニトリル（５ｍＬ）を添加し、グラスフィルターにてトヨパールゲルとブロッキング溶液を分離した。次いで、ゲルをエタノール（５ｍＬ）、水（５ｍＬ）でそれぞれ２回ずつ洗浄し、化合物２９２が固定化されたエポキシトヨパールゲルを得た。また、ブロッキング溶液と洗浄液を合わせた溶液中に残存する化合物２９２を高速液体クロマトグラフィーで測定したところ、ブロッキング溶液と洗浄液を合わせた溶液中に化合物２９２は残存していないことが確認された。
【０１５０】
実施例１７ チアゾール誘導体のビニルポリマーゲルへの固定化（その１０）
遠沈管に化合物３６４（１９３ｍｇ、０．５ｍｍｏｌ）を計り取り、１，２−ジメトキシベンゼンのアセトニトリル溶液（１ｍｍｏｌ／ｍＬ）を０．５ｍＬ添加した。次いで、遠沈管にアセトニトリル（１．５ｍＬ）、緩衝液（組成：０．２Ｍ ＮａＨＣＯ３、０．５Ｍ ＮａＣｌ、ｐＨ８．３；８ｍＬ）、トリエチルアミン（１４０μＬ、１．０ｍｍｏｌ）を添加して化合物３６４が溶解したことを確認したのち、０．３ｇのエポキシトヨパール（商品名）ゲル（東ソー株式会社製、エポキシ基含量：８０４μｍｏｌ／ｇ（ｇｅｌ））を添加した。上記操作によって得られた混合物の入った遠沈管を内温４０℃に設定した卓上振盪機にセットし、１６５ｒｐｍで１６時間攪拌振盪した。反応終了後、遠沈管にアセトニトリル（５ｍＬ）を添加し、グラスフィルターでトヨパールゲルと反応溶液を分離した。次にグラスフィルター上のトヨパールゲルを洗浄液（組成：ＣＨ３ＣＮ／ＭｅＯＨ／５０ｍＭ ＮＨ４Ｈ２ＰＯ４＝４／１／５；１０ｍＬ）で２回洗浄した。反応溶液と洗浄液を合わせ、高速液体クロマトグラフィー（カラム：東ソー株式会社製 ＴＳＫ−ｇｅｌ ＯＤＳ−８０ＴＭ（商品名）（内径４．６ｍｍ×長さ１５ｃｍ）、溶離液：ＣＨ３ＣＮ／ＭｅＯＨ／５０ｍＭ ＮＨ４Ｈ２ＰＯ４＝４／１／５、流速：１ｍＬ／ｍｉｎ、温度：２５℃、検出：ＵＶ ２５４ｎｍ）にて残存する化合物３６４を定量することによって、エポキシトヨパールに化合物３６４が２５７μｍｏｌ／ｍＬ（ｇｅｌ）固定化されていることが確認された。更に、上記の操作によって得られたトヨパールゲル中の未反応のエポキシ基をブロックするため、得られたトヨパールゲルを遠沈管に入れブロッキング溶液（組成：０．５Ｍ モノエタノールアミン、０．５Ｍ 塩化ナトリウム水溶液、ｐＨ８．３（溶媒は水）；５ｍＬ）を添加した。反応溶液が入った遠沈管を、内温４０℃に設定した卓上振盪機にセットし、１６５ｒｐｍで１６時間攪拌振盪することによりゲル中の残存エポキシ基をモノエタノールアミンでブロックした。反応終了後、遠沈管にアセトニトリル（５ｍＬ）を添加し、グラスフィルターにてトヨパールゲルとブロッキング溶液を分離した。次いで、ゲルをエタノール（５ｍＬ）、水（５ｍＬ）でそれぞれ２回ずつ洗浄し、化合物３６４が固定化されたエポキシトヨパールゲルを得た。また、ブロッキング溶液と洗浄液を合わせた溶液中に残存する化合物３６４を高速液体クロマトグラフィーで測定したところ、ブロッキング溶液と洗浄液を合わせた溶液中に化合物３６４は残存していないことが確認された。
【０１５１】
実施例１８ チアゾール誘導体のビニルポリマーゲルへの固定化（その１１）
遠沈管に化合物２８６（１０２ｍｇ、０．３ｍｍｏｌ）を計り取り、１，２−ジメトキシベンゼンのアセトニトリル溶液（１ｍｍｏｌ／ｍＬ）を０．３ｍＬ添加した。次いで、遠沈管にアセトニトリル（１．７ｍＬ）、緩衝液（組成：０．２Ｍ ＮａＨＣＯ３、０．５Ｍ ＮａＣｌ、ｐＨ８．３；４ｍＬ）、トリエチルアミン（９０μＬ、０．６ｍｍｏｌ）を添加して化合物２８６が溶解したことを確認したのち、０．３ｇのトレシルトヨパール（商品名）ゲル（東ソー株式会社製）を添加した。上記操作によって得られた混合物の入った遠沈管を内温４０℃に設定した卓上振盪機にセットし、１６５ｒｐｍで１６時間攪拌振盪した。反応終了後、遠沈管にアセトニトリル（５ｍＬ）を添加し、グラスフィルターでトヨパールゲルと反応溶液を分離した。次にグラスフィルター上のトヨパールゲルを洗浄液（組成：ＣＨ３ＣＮ／ＭｅＯＨ／５０ｍＭ ＮＨ４Ｈ２ＰＯ４＝４／１／５；１０ｍＬ）で２回洗浄した。反応溶液と洗浄液を合わせ、高速液体クロマトグラフィー（カラム：東ソー株式会社製 ＴＳＫ−ｇｅｌ ＯＤＳ−８０ＴＭ（商品名）（内径４．６ｍｍ×長さ１５ｃｍ）、溶離液：ＣＨ３ＣＮ／ＭｅＯＨ／５０ｍＭ ＮＨ４Ｈ２ＰＯ４＝４／１／５、流速：１ｍＬ／ｍｉｎ、温度：２５℃、検出：ＵＶ ２５４ｎｍ）にて残存する化合物２８６を定量することによって、トレシルトヨパールに化合物２８６が９４μｍｏｌ／ｍＬ（ｇｅｌ）固定化されていることが確認された。更に、上記の操作によって得られたトヨパールゲル中の未反応のトレシル基をブロックするため、得られたトヨパールゲルを遠沈管に入れブロッキング溶液（組成：０．５Ｍ トリスヒドロキシメチルアミノメタン塩酸塩、０．５Ｍ 塩化ナトリウム水溶液、ｐＨ８．３；５ｍＬ）を添加した。反応溶液が入った遠沈管を、内温４０℃に設定した卓上振盪機にセットし、１６５ｒｐｍで１６時間攪拌振盪することによりゲル中の残存トレシル基をトリスヒドロキシメチルアミノメタンでブロックした。反応終了後、遠沈管にアセトニトリル（５ｍＬ）を添加し、グラスフィルターにてトヨパールゲルとブロッキング溶液を分離した。次いで、ゲルをエタノール（５ｍＬ）、水（５ｍＬ）でそれぞれ２回ずつ洗浄し、化合物２８６が固定化されたトレシルトヨパールゲルを得た。また、ブロッキング溶液と洗浄液を合わせた溶液中に残存する化合物２８６を高速液体クロマトグラフィーで測定したところ、ブロッキング溶液と洗浄液を合わせた溶液中に化合物２８６は残存していないことが確認された。
【０１５２】
実施例１９ チアゾール誘導体のビニルポリマーゲルへの固定化（その１２）
遠沈管に化合物３２９（３０ｍｇ、８４μｍｏｌ）を計り取り、１，２−ジメトキシベンゼンのアセトニトリル溶液（１ｍｍｏｌ／ｍＬ）を０．１ｍＬ添加した。次いで、遠沈管にアセトニトリル（２．４ｍＬ）、緩衝液（組成：０．１Ｍ Ｎａ２ＨＰＯ４−ＮａＨ２ＰＯ４、ｐＨ７．０；２．５ｍＬ）、トリエチルアミン（３０μＬ、０．２ｍｍｏｌ）を添加して化合物３２９が溶解したことを確認したのち、３ｍＬのホルミルトヨパール（商品名）ゲル（東ソー株式会社製、ホルミル基含量：６５μｍｏｌ／ｍＬ（ｇｅｌ））を添加した。上記操作によって得られた混合物の入った遠沈管を内温２５℃に設定した卓上振盪機にセットし、１６５ｒｐｍで攪拌振盪した。攪拌振盪を開始してから３０分後、遠沈管にボラン−ピリジン複合体（２５０μＬ、２．５ｍｍｏｌ）を添加し、さらに１６５ｒｐｍで２．５時間攪拌振盪した。反応終了後、遠沈管にアセトニトリル（５ｍＬ）を添加し、グラスフィルターでトヨパールゲルと反応溶液を分離した。次にグラスフィルター上のトヨパールゲルを洗浄液（組成：ＣＨ３ＣＮ／ＭｅＯＨ／５０ｍＭ ＮＨ４Ｈ２ＰＯ４＝４／１／５；１０ｍＬ）で２回洗浄した。反応溶液と洗浄液を合わせ、高速液体クロマトグラフィー（カラム：東ソー株式会社製 ＴＳＫ−ｇｅｌ ＯＤＳ−８０ＴＭ（商品名）（内径４．６ｍｍ×長さ１５ｃｍ）、溶離液：ＣＨ３ＣＮ／ＭｅＯＨ／５０ｍＭ ＮＨ４Ｈ２ＰＯ４＝４／１／５、流速：１ｍＬ／ｍｉｎ、温度：２５℃、検出：ＵＶ ２５４ｎｍ）にて残存する化合物３２９を定量し、化合物３２９が１４μｍｏｌ／ｍＬ（ｇｅｌ）固定化されたホルミルトヨパールゲルを得た。
【０１５３】
実施例２０ チアゾール誘導体のビニルポリマーゲルへの固定化（その１３）
遠沈管に化合物２８６（１７０ｍｇ、０．５ｍｍｏｌ）を計り取り、１，２−ジメトキシベンゼンのアセトニトリル溶液（１ｍｍｏｌ／ｍＬ）を０．５ｍＬ添加した。次いで、遠沈管にアセトニトリル（１．５ｍＬ）、緩衝液（組成：０．２Ｍ ＮａＨＣＯ３、０．５Ｍ ＮａＣｌ、ｐＨ８．３；８ｍＬ）、トリエチルアミン（１４０μＬ、１．０ｍｍｏｌ）を添加して化合物２８６が溶解したことを確認したのち、０．３ｇのエポキシトヨパール（商品名）ゲル（東ソー株式会社製、エポキシ基含量：８０４μｍｏｌ／ｇ（ｇｅｌ））を添加した。上記操作によって得られた混合物の入った遠沈管を内温４０℃に設定した卓上振盪機にセットし、１６５ｒｐｍで６３時間攪拌振盪した。反応終了後、遠沈管にアセトニトリル（５ｍＬ）を添加し、グラスフィルターでトヨパールゲルと反応溶液を分離した。次にグラスフィルター上のトヨパールゲルを洗浄液（組成：ＣＨ３ＣＮ／ＭｅＯＨ／５０ｍＭ ＮＨ４Ｈ２ＰＯ４＝４／１／５；１０ｍＬ）で２回洗浄した。反応溶液と洗浄液を合わせ、高速液体クロマトグラフィー（カラム：東ソー株式会社製 ＴＳＫ−ｇｅｌ ＯＤＳ−８０ＴＭ（商品名）（内径４．６ｍｍ×長さ１５ｃｍ）、溶離液：ＣＨ３ＣＮ／ＭｅＯＨ／５０ｍＭ ＮＨ４Ｈ２ＰＯ４＝４／１／５、流速：１ｍＬ／ｍｉｎ、温度：２５℃、検出：ＵＶ ２５４ｎｍ）にて残存する化合物２８６を定量することによって、エポキシトヨパールに化合物２８６が１６７μｍｏｌ／ｍＬ（ｇｅｌ）固定化されたことを確認した。この化合物２８６固定化エポキシトヨパールゲル中の窒素原子含有量及び硫黄原子含有量を測定したところ、窒素原子が１．２重量％、硫黄原子が０．８９重量％含まれることを確認した。
【０１５４】
実施例２１ チアゾール誘導体のビニルポリマーゲルへの固定化（その１４）
遠沈管に化合物３５８（１３４ｍｇ、０．４ｍｍｏｌ）を計り取り、１，２−ジメトキシベンゼンのアセトニトリル溶液（１ｍｍｏｌ／ｍＬ）を０．４ｍＬ添加した。次いで、遠沈管に１，４−ジオキサン（１０ｍＬ）、トリエチルアミン（１２０μＬ、０．９ｍｍｏｌ）を添加して化合物３５８が溶解したことを確認したのち、２．５ｍＬのトヨパールＣＭ−６５０Ｓ（商品名）ゲル（東ソー株式会社製；イオン交換容量：０．１ｍｏｌ／Ｌ（ｇｅｌ））と１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩（１５４ｍｇ、０．８ｍｍｏｌ）を添加した。上記操作によって得られた混合物の入った遠沈管を内温２５℃に設定した卓上振盪機にセットし、１６５ｒｐｍで１４時間攪拌振盪した。反応終了後、グラスフィルターでトヨパールゲルと反応溶液を分離した。次にグラスフィルター上のトヨパールゲルを１，４−ジオキサン（１０ｍＬ）で２回洗浄したのち、洗浄液（組成：０．０５％トリフルオロ酢酸含有ＣＨ３ＣＮ／０．０５％トリフルオロ酢酸水溶液＝４５／５５；１０ｍＬ）で２回洗浄した。反応溶液と洗浄液を合わせ、高速液体クロマトグラフィー（カラム：東ソー株式会社製 ＴＳＫ−ｇｅｌ ＯＤＳ−８０ＴＭ（商品名）（内径４．６ｍｍ×長さ１５ｃｍ）、溶離液：０．０５％トリフルオロ酢酸含有ＣＨ３ＣＮ／０．０５％トリフルオロ酢酸水溶液、流速：１ｍＬ／ｍｉｎ、温度：２５℃、検出：ＵＶ２５４ｎｍ）にて残存する化合物３５８を定量し、化合物３５８が１６μｍｏｌ／ｍＬ（ｇｅｌ）固定化されたトヨパールＣＭ−６５０Ｓゲルを得た。
【０１５５】
実施例２２ チアゾール誘導体固定化ビニルポリマーゲルを用いたタンパク質の吸脱着（その１）
実施例８に記載の方法にて調製した化合物２８６固定化エポキシトヨパールゲル１ｍＬをＴＲＩＣＯＲＮカラム（商品名）（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス株式会社製）に充填し、ＡＫＴＡｐｒｉｍｅ ｐｌｕｓ（商品名）（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス株式会社製クロマトグラフィー装置）に取り付け、前記平衡化緩衝液を２０ｍＬ通液し平衡化した。ＡＫＴＡｐｒｉｍｅ ｐｌｕｓを流速１ｍＬ／ｍｉｎで自動運転し、平衡化緩衝液を１０ｍＬ通液後、同緩衝液に溶解したウヒト血漿由来免疫グロブリン製剤（化血研製）０．５ｍｇ（ＯＤ２８０＝０．７）を添加してカラムに通液した。さらに平衡化緩衝液を１０ｍＬ通液後、平衡化緩衝液から１０ｍＭ リン酸ナトリウム−１０ｍＭ クエン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．５）への硫酸ナトリウムに関する直線濃度勾配クロマトグラフィーを行なった。免疫グロブリンのカラムからの溶出は２８０ｎｍにおける吸光度をモニターして検出した。溶出液は１ｍＬずつ分画し、各フラクションの２８０ｎｍにおける吸光度をＵ−２９００スペクトロフォトメーター（日立製作所製）で測定し回収率を算出した。化合物２８６固定化エポキシトヨパールゲルを用いて行なったクロマトグラフィーの結果を図１６に示し、このクロマトグラフィーにおける免疫グロブリンの回収率を表４７に示す。免疫グロブリンはＨｉＴｒａｐカラムを用いたとき（図１参照）よりもいくぶん幅広く２０番目から５０番目までの画分に溶出していた。
【０１５６】
【表４７】
吸脱着操作後には１００ｍＭ 水酸化ナトリウムを１０ｍＬ通液してカラムの再生を行なった。化合物２８６固定化エポキシトヨパールゲルはこの再生処理によって初期状態に復帰させることができ、繰り返し使用によってもその特性は変化しなかった。
【０１５７】
実施例２３ チアゾール誘導体固定化ビニルポリマーゲルを用いたタンパク質の吸脱着（その２）
実施例８に記載の方法にて調製した化合物２８６固定化エポキシトヨパールゲル１ｍＬをＴＲＩＣＯＲＮカラム（商品名）（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス株式会社製）に充填し、ＡＫＴＡｐｒｉｍｅ ｐｌｕｓ（商品名）（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス株式会社製クロマトグラフィー装置）に取り付け、０．７Ｍ 硫酸ナトリウム、１０ｍＭ リン酸ナトリウム−１０ｍＭ クエン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．５）を２０ｍＬ通液し平衡化した。ＡＫＴＡｐｒｉｍｅ ｐｌｕｓを流速１ｍＬ／ｍｉｎで自動運転し、平衡化緩衝液を１０ｍＬ通液後、同緩衝液に溶解したヒト化モノクローナル抗体０．５ｍｇ（ＯＤ２８０＝０．７）を添加した。さらに平衡化緩衝液を１０ｍＬ通液後、１０ｍＭ リン酸ナトリウム−１０ｍＭ クエン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．５）を用いた硫酸ナトリウムの濃度勾配クロマトグラフィーを行なった。ヒト化モノクローナル抗体のカラムからの溶出は２８０ｎｍにおける吸光度のモニターにより検出した。溶出液は１ｍＬずつ分画し、各フラクションの２８０ｎｍにおける吸光度をＵ−２９００スペクトロフォトメーター（日立製作所製）で測定し回収率を算出した。化合物２８６固定化エポキシトヨパールゲルを用いて行なったクロマトグラフィーの結果を図１７に示し、このクロマトグラフィーにおけるヒト化モノクローナル抗体の回収率を表４８に示す。ヒト化モノクローナル抗体は３０番目から４５番目までの画分に溶出し、免疫グロブリン（図１６参照）と比べていくぶん後ろの位置で溶出していた。
【０１５８】
【表４８】
吸脱着操作後には１００ｍＭ 水酸化ナトリウムを１０ｍＬ通液してカラムの再生を行なった。化合物２８６固定化エポキシトヨパールゲルはこの再生処理によって初期状態に復帰させることができ、繰り返し使用によってもその特性は変化しなかった。
【０１５９】
実施例２４ チアゾール誘導体固定化ビニルポリマーゲルを用いたタンパク質の吸脱着（その３）
実施例８に記載の方法にて調製した化合物２８６固定化エポキシトヨパールゲル１ｍＬをＴＲＩＣＯＲＮカラム（商品名）（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス株式会社製）に充填し、ＡＫＴＡｐｒｉｍｅ ｐｌｕｓ（商品名）（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス株式会社製クロマトグラフィー装置）に取り付け、０．７Ｍ 硫酸ナトリウム、１０ｍＭ リン酸ナトリウム−１０ｍＭ クエン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．５）を２０ｍＬ通液し平衡化した。ＡＫＴＡｐｒｉｍｅ ｐｌｕｓを流速１ｍＬ／ｍｉｎで自動運転し、平衡化緩衝液を１０ｍＬ通液後、同緩衝液に溶解したウシ血清アルブミン０．５ｍｇ（ＯＤ２８０＝０．３）を添加した。さらに平衡化緩衝液を１０ｍＬ通液後、１０ｍＭ リン酸ナトリウム−１０ｍＭ クエン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．５）を用いた硫酸ナトリウムの濃度勾配クロマトグラフィーを行なった。ウシ血清アルブミンのカラムからの溶出は２８０ｎｍにおける吸光度のモニターにより検出した。溶出液は１ｍＬずつ分画し、各フラクションの２８０ｎｍにおける吸光度をＵ−２９００スペクトロフォトメーター（日立製作所製）で測定し回収率を算出した。化合物２８６固定化エポキシトヨパールゲルを用いて行なったクロマトグラフィーの結果を図１８に示し、このクロマトグラフィーにおけるウシ血清アルブミンの回収率を表４９に示す。ウシ血清アルブミンは１０番目の画分までに溶出し、これは免疫グロブリン（図１６参照）とは異なる画分であり、ＨｉＴｒａｐカラムを用いたとき（図１及び図７参照）と同様な結果になった。このことから、チアゾール誘導体と固定化するマトリックスをアガロースからトヨパールに変更しても同様な免疫グロブリンの分離性能を有していることが示された。
【０１６０】
【表４９】
吸脱着操作後には１００ｍＭ 水酸化ナトリウムを１０ｍＬ通液してカラムの再生を行なった。化合物２８６固定化エポキシトヨパールゲルはこの再生処理によって初期状態に復帰させることができ、繰り返し使用によってもその特性は変化しなかった。
【０１６１】
実施例２５ チアゾール誘導体固定化ビニルポリマーゲルを用いたタンパク質の吸脱着（その４）
実施例９に記載の方法にて調製した化合物３２９固定化エポキシトヨパールゲルをＴＲＩＣＯＲＮカラム（商品名）（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス株式会社製）に充填し、ＡＫＴＡｐｒｉｍｅ ｐｌｕｓ（商品名）（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス株式会社製クロマトグラフィー装置）に取り付け、０．７Ｍ 硫酸ナトリウム、１０ｍＭ リン酸ナトリウム−１０ｍＭ クエン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．５）を２０ｍＬ通液し平衡化した。ＡＫＴＡｐｒｉｍｅ ｐｌｕｓを流速１ｍＬ／ｍｉｎで自動運転し、平衡化緩衝液を１０ｍＬ通液後、同緩衝液に溶解したヒト化モノクローナル抗体０．５ｍｇ（ＯＤ２８０＝０．７）を添加した。さらに平衡化緩衝液を１０ｍＬ通液後、１０ｍＭ リン酸ナトリウム−１０ｍＭ クエン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．５）を用いた硫酸ナトリウムの濃度勾配クロマトグラフィーを行なった。ヒト化モノクローナル抗体のカラムからの溶出は２８０ｎｍにおける吸光度のモニターにより検出した。溶出液は１ｍＬずつ分画し、各フラクションの２８０ｎｍにおける吸光度をＵ−２９００スペクトロフォトメーター（日立製作所製）で測定し回収率を算出した。化合物３２９固定化エポキシトヨパールゲルを用いて行なったクロマトグラフィーの結果を図１９に示し、このクロマトグラフィーのヒト化モノクローナル抗体の回収率を表５０に示す。ヒト化モノクローナル抗体は３０番目から４５番目までの画分に溶出と、化合物２８６をチアゾール誘導体として用いたとき（図１７参照）と同じ画分の位置で溶出していた。
【０１６２】
【表５０】
吸脱着操作後には１００ｍＭ 水酸化ナトリウムを１０ｍＬ通液してカラムの再生を行なった。化合物３２９固定化エポキシトヨパールゲルはこの再生処理によって初期状態に復帰させることができ、繰り返し使用によってもその特性は変化しなかった。
【０１６３】
実施例２６ チアゾール誘導体固定化ビニルポリマーゲルを用いたタンパク質の吸脱着（その５）
実施例９に記載の方法にて調製した化合物３２９固定化エポキシトヨパールゲルをＴＲＩＣＯＲＮカラム（商品名）（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス株式会社製）に充填し、ＡＫＴＡｐｒｉｍｅ ｐｌｕｓ（商品名）（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス株式会社製クロマトグラフィー装置）に取り付け、０．７Ｍ 硫酸ナトリウム、１０ｍＭ リン酸ナトリウム−１０ｍＭ クエン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．５）を２０ｍＬ通液し平衡化した。ＡＫＴＡｐｒｉｍｅ ｐｌｕｓを流速１ｍＬ／ｍｉｎで自動運転し、平衡化緩衝液を１０ｍＬ通液後、同緩衝液に溶解したウシ血清アルブミン０．５ｍｇ（ＯＤ２８０＝０．３）を添加した。さらに平衡化緩衝液を１０ｍＬ通液後、１０ｍＭ リン酸ナトリウム−１０ｍＭ クエン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．５）を用いた硫酸ナトリウムの濃度勾配クロマトグラフィーを行なった。ウシ血清アルブミンのカラムからの溶出は２８０ｎｍにおける吸光度のモニターにより検出した。溶出液は１ｍＬずつ分画し、各フラクションの２８０ｎｍにおける吸光度をＵ−２９００スペクトロフォトメーター（日立製作所製）で測定し回収率を算出した。化合物３２９固定化エポキシトヨパールゲルを用いて行なったクロマトグラフィーの結果を図２０に示し、このクロマトグラフィーのウシ血清アルブミンの回収率を表５１に示す。ウシ血清アルブミンは１０番目の画分までに溶出し、これはヒト化モノクローナル抗体（図１９参照）とは異なる画分であり、化合物２８６をチアゾール誘導体として用いたとき（図１８参照）と同様な結果になった。このことから、チアゾール誘導体を化合物２８６から化合物３２９に変更しても同様なタンパク質の分離性能を有していることが示された。
【０１６４】
【表５１】
吸脱着操作後には１００ｍＭ 水酸化ナトリウムを１０ｍＬ通液してカラムの再生を行なった。化合物３２９固定化エポキシトヨパールゲルはこの再生処理によって初期状態に復帰させることができ、繰り返し使用によってもその特性は変化しなかった。
【０１６５】
実施例２７ チアゾール誘導体固定化ビニルポリマーゲルを用いたタンパク質の吸脱着（その６）
実施例１０に記載の方法にて調製した化合物２８６固定化ホルミルトヨパールゲルを１ｍＬ ＴＲＩＣＯＲＮカラム（商品名）（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス株式会社製）に充填し、ＡＫＴＡｐｒｉｍｅ ｐｌｕｓ（商品名）（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス株式会社製クロマトグラフィー装置）に取り付け、０．７Ｍ 硫酸ナトリウム、１０ｍＭ リン酸ナトリウム−１０ｍＭ クエン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．５）を２０ｍＬ通液し平衡化した。ＡＫＴＡｐｒｉｍｅ ｐｌｕｓを流速１ｍＬ／ｍｉｎで自動運転し、平衡化緩衝液を１０ｍＬ通液後、同緩衝液に溶解したヒト化モノクローナル抗体０．５ｍｇ（ＯＤ２８０＝０．８）を添加した。さらに平衡化緩衝液を１０ｍＬ通液後、１０ｍＭ リン酸ナトリウム−１０ｍＭ クエン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．５）を用いた硫酸ナトリウムの濃度勾配クロマトグラフィーを行なった。ヒト化モノクローナル抗体のカラムからの溶出は２８０ｎｍにおける吸光度のモニターにより検出した。溶出液は１ｍＬずつ分画し、各フラクションの２８０ｎｍにおける吸光度をＵ−２９００スペクトロフォトメーター（日立製作所製）で測定し回収率を算出した。化合物２８６固定化ホルミルトヨパールゲルを用いて行なったクロマトグラフィーの結果を図２１に示し、このクロマトグラフィーのヒト化モノクローナル抗体の回収率を表５２に示す。ヒト化モノクローナル抗体は３０番目から４５番目までの画分に溶出と、エポキシトヨパールをチアゾール誘導体の固定化に用いたとき（図１７参照）と同じ画分の位置で溶出していた。
【０１６６】
【表５２】
吸脱着操作後には１００ｍＭ 水酸化ナトリウムを１０ｍＬ通液してカラムの再生を行なった。化合物２８６固定化ホルミルトヨパールゲルはこの再生処理によって初期状態に復帰させることができ、繰り返し使用によってもその特性は変化しなかった。
【０１６７】
実施例２８ チアゾール誘導体固定化ビニルポリマーゲルを用いたタンパク質の吸脱着（その７）
実施例１０に記載の方法にて調製した化合物２８６固定化ホルミルトヨパールゲルをＴＲＩＣＯＲＮカラム（商品名）（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス株式会社製）に充填し、ＡＫＴＡｐｒｉｍｅ ｐｌｕｓ（商品名）（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス株式会社製クロマトグラフィー装置）に取り付け、０．７Ｍ 硫酸ナトリウム、１０ｍＭ リン酸ナトリウム−１０ｍＭ クエン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．５）を２０ｍＬ通液し平衡化した。ＡＫＴＡｐｒｉｍｅ ｐｌｕｓを流速１ｍＬ／ｍｉｎで自動運転し、平衡化緩衝液を１０ｍＬ通液後、同緩衝液に溶解したウシ血清アルブミン０．５ｍｇ（ＯＤ２８０＝０．３）を添加した。さらに平衡化緩衝液を１０ｍＬ通液後、１０ｍＭ リン酸ナトリウム−１０ｍＭ クエン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．５）を用いた硫酸ナトリウムの濃度勾配クロマトグラフィーを行なった。ウシ血清アルブミンのカラムからの溶出は２８０ｎｍにおける吸光度のモニターにより検出した。溶出液は１ｍＬずつ分画し、各フラクションの２８０ｎｍにおける吸光度をＵ−２９００スペクトロフォトメーター（日立製作所製）で測定し回収率を算出した。化合物２８６固定化ホルミルトヨパールゲルを用いて行なったクロマトグラフィーの結果を図２２に示し、このクロマトグラフィーのウシ血清アルブミンの回収率を表５３に示す。ウシ血清アルブミンは１０番目の画分までに溶出し、これはヒト化モノクローナル抗体（図２１参照）とは異なる画分であり、エポキシトヨパールをチアゾール誘導体の固定化に用いたとき（図１８参照）と同様な結果になった。このことから、チアゾール誘導体の固定化に用いるマトリックスの有する活性化基をエポキシ基からホルミル基に変更しても同様なタンパク質の分離性能を有していることが示された。
【０１６８】
【表５３】
吸脱着操作後には１００ｍＭ 水酸化ナトリウムを１０ｍＬ通液してカラムの再生を行なった。化合物２８６固定化ホルミルトヨパールゲルはこの再生処理によって初期状態に復帰させることができ、繰り返し使用によってもその特性は変化しなかった。
【０１６９】
実施例２９ チアゾール誘導体のキトサンゲルへの固定化
水で洗浄した５ｍＬの活性化キトパールＫ−６６（商品名）ゲル（富士紡ホールディングス株式会社製；スクシンイミドオキシカルボニル基含量：１５μｍｏｌ／ｍＬ（ｇｅｌ））を遠沈管に計り取り、これにＤＭＳＯを１０ｍＬ添加した。次に化合物２８６のＤＭＳＯ溶液（０．２５Ｍ）を９００μＬ、１Ｍの１，２−ジメトキシベンゼンのアセトニトリル溶液を２２５μＬ、トリエチルアミンを６８μＬ、順次添加した。上記操作によって得られた混合物の入った遠沈管を内温４０℃に設定した卓上振盪機にセットし、１６５ｒｐｍで３時間攪拌振盪した。反応終了後、グラスフィルターでキトパールゲルと反応溶液を分離し、グラスフィルター上のキトパールゲルをジメチルスルホキシド（５ｍＬ）、洗浄液（組成：ＣＨ３ＣＮ／ＭｅＯＨ／５０ｍＭ ＮＨ４Ｈ２ＰＯ４＝４／１／５；１５ｍＬ）で洗浄した。反応溶液と洗浄液を合わせ、高速液体クロマトグラフィー（カラム：東ソー株式会社製 ＴＳＫ−ｇｅｌ ＯＤＳ−８０ＴＭ（商品名）（内径４．６ｍｍ×長さ１５ｃｍ）、溶離液：ＣＨ３ＣＮ／ＭｅＯＨ／５０ｍＭ ＮＨ４Ｈ２ＰＯ４＝４／１／５、流速：１ｍＬ／ｍｉｎ、温度：２５℃、検出：ＵＶ ２５４ｎｍ）にて残存する化合物２８６を定量し、化合物２８６が５．０μｍｏｌ／ｍＬ（ｇｅｌ）固定化されているキトパールゲルを得た。
【０１７０】
実施例３０ チアゾール誘導体のビニルポリマーゲルへの固定化（その１５）
遠沈管に化合物２８６（１０２ｍｇ、０．３ｍｍｏｌ）を計り取り、１，２−ジメトキシベンゼンのアセトニトリル溶液（１ｍｍｏｌ／ｍＬ）を０．３ｍＬ添加した。次いで、遠沈管にアセトニトリル（１．７ｍＬ）、１Ｍ 水酸化ナトリウム水溶液（１．２ｍＬ）、水（６．８ｍＬ）を添加して化合物２８６が溶解したことを確認したのち、０．５ｇのＢＩＯＡＣＴ−ＥＰＯ（商品名）ゲル（昭和電工株式会社製、エポキシ基含量：２００μｍｏｌ／ｇ（ｇｅｌ））を添加した。上記操作によって得られた混合物の入った遠沈管を内温４０℃に設定した卓上振盪機にセットし、１６５ｒｐｍで４３時間攪拌振盪した。反応終了後、遠沈管にアセトニトリル（５ｍＬ）を添加し、グラスフィルターでＢＩＯＡＣＴ−ＥＰＯゲルと反応溶液を分離した。次にグラスフィルター上のＢＩＯＡＣＴ−ＥＰＯゲルを洗浄液（組成：０．０５％トリフルオロ酢酸含有ＣＨ３ＣＮ／０．０５％トリフルオロ酢酸水溶液＝１／１；１０ｍＬ）で２回洗浄した。反応溶液と洗浄液を合わせ、高速液体クロマトグラフィー（カラム：東ソー株式会社製 ＴＳＫ−ｇｅｌ ＯＤＳ−８０ＴＭ（内径４．６ｍｍ×長さ１５ｃｍ）、溶離液：０．０５％トリフルオロ酢酸含有ＣＨ３ＣＮ／０．０５％トリフルオロ酢酸水溶液＝１／１、流速：１ｍＬ／ｍｉｎ、温度：２５℃、検出：ＵＶ ２５４ｎｍ）にて残存する化合物２８６を定量することによって、ＢＩＯＡＣＴ−ＥＰＯゲルに化合物２８６が４６μｍｏｌ／ｍＬ（ｇｅｌ）固定化されていることが確認された。更に、上記の操作によって得られたＢＩＯＡＣＴ−ＥＰＯゲル中の未反応のエポキシ基をブロックするため、得られたＢＩＯＡＣＴ−ＥＰＯゲルを遠沈管に入れブロッキング溶液（組成：アセトニトリル；２ｍＬ、０．５Ｍ モノエタノールアミン、０．５Ｍ 塩化ナトリウム水溶液、ｐＨ８．３（溶媒は水）；４ｍＬ）を添加した。反応溶液が入った遠沈管を、内温４０℃に設定した卓上振盪機にセットし、１６５ｒｐｍで２３時間攪拌振盪することによりゲル中の残存エポキシ基をモノエタノールアミンでブロックした。反応終了後、遠沈管にアセトニトリル（５ｍＬ）を添加し、グラスフィルターにてＢＩＯＡＣＴ−ＥＰＯゲルとブロッキング溶液を分離した。次いで、ゲルをエタノール（５ｍＬ）、水（５ｍＬ）でそれぞれ２回ずつ洗浄することで、化合物２８６が固定化されたＢＩＯＡＣＴ−ＥＰＯゲルを得た。また、ブロッキング溶液と洗浄液を合わせた溶液中に残存する化合物２８６を高速液体クロマトグラフィーで測定したところ、ブロッキング溶液と洗浄液を合わせた溶液中に化合物２８６は残存していないことが確認された。
【０１７１】
実施例３１ チアゾール誘導体のスチレン−ジビニルベンゼン共重合体ゲルへの固定化
遠沈管に化合物２８６（１０２ｍｇ、０．３ｍｍｏｌ）を計り取り、１，２−ジメトキシベンゼンのアセトニトリル溶液（１ｍｍｏｌ／ｍＬ）を０．３ｍＬ添加した。次いで、遠沈管にアセトニトリル（１．７ｍＬ）、１Ｍ 水酸化ナトリウム水溶液（１．２ｍＬ）、水（６．８ｍＬ）を添加して化合物２８６が溶解したことを確認したのち、０．３ｇのＰＯＲＯＳ−ＥＰ（商品名）ゲル（アプライドバイオシステムズジャパン株式会社製、エポキシ基含量：非開示）を添加した。上記操作によって得られた混合物の入った遠沈管を内温４０℃に設定した卓上振盪機にセットし、１６５ｒｐｍで３６時間攪拌振盪した。反応終了後、遠沈管にアセトニトリル（５ｍＬ）を添加し、グラスフィルターでＰＯＲＯＳ−ＥＰゲルと反応溶液を分離した。次にグラスフィルター上のＰＯＲＯＳ−ＥＰゲルを洗浄液（組成：０．０５％トリフルオロ酢酸含有ＣＨ３ＣＮ／０．０５％トリフルオロ酢酸水溶液＝１／１；１０ｍＬ）で２回洗浄した。反応溶液と洗浄液を合わせ、高速液体クロマトグラフィー（カラム：東ソー株式会社製 ＴＳＫ−ｇｅｌ ＯＤＳ−８０ＴＭ（内径４．６ｍｍ×長さ１５ｃｍ）、溶離液：０．０５％トリフルオロ酢酸含有ＣＨ３ＣＮ／０．０５％トリフルオロ酢酸水溶液＝１／１、流速：１ｍＬ／ｍｉｎ、温度：２５℃、検出：ＵＶ ２５４ｎｍ）にて残存する化合物２８６を定量することによって、ＰＯＲＯＳ−ＥＰゲルに化合物２８６が９１μｍｏｌ／ｍＬ（ｇｅｌ）固定化されていることが確認された。更に、上記の操作によって得られたＰＯＲＯＳ−ＥＰゲル中の未反応のエポキシ基をブロックするため、得られたＰＯＲＯＳ−ＥＰゲルを遠沈管に入れブロッキング溶液（組成：アセトニトリル；２ｍＬ、０．５Ｍ モノエタノールアミン、０．５Ｍ 塩化ナトリウム水溶液、ｐＨ８．３（溶媒は水）；４ｍＬ）を添加した。反応溶液が入った遠沈管を、内温４０℃に設定した卓上振盪機にセットし、１６５ｒｐｍで６時間攪拌振盪することによりゲル中の残存エポキシ基をモノエタノールアミンでブロックした。反応終了後、遠沈管にアセトニトリル（５ｍＬ）を添加し、グラスフィルターにてＰＯＲＯＳ−ＥＰゲルとブロッキング溶液を分離した。次いで、ゲルをエタノール（５ｍＬ）、水（５ｍＬ）でそれぞれ２回ずつ洗浄することで、化合物２８６が固定化されたＰＯＲＯＳ−ＥＰゲルを得た。また、ブロッキング溶液と洗浄液を合わせた溶液中に残存する化合物２８６を高速液体クロマトグラフィーで測定したところ、ブロッキング溶液と洗浄液を合わせた溶液中に化合物２８６は残存していないことが確認された。
【０１７２】
実施例３２ チアゾール誘導体のセンサーチップへの固定化
化合物２８６を４ｍｇ／ｍＬになるようにＤＭＳＯに溶解し、これを１０ｍＭホウ酸−１Ｍ ＮａＣｌ緩衝液（ｐＨ８．５）で８倍に希釈して０．５ｍｇ／ｍＬ濃度の化合物溶液を調製した。ＢＩＡＣＯＲＥセンサーチップＣＭ５（商品名、ＧＥヘルスケアバイオサイエンス株式会社製）をＢＩＡＣＯＲＥ２０００（商品名、ＧＥヘルスケアバイオサイエンス株式会社製）に装着し、ＢＩＡＣＯＲＥアミンカップリングキット（商品名、ＧＥヘルスケアバイオサイエンス株式会社製）を用いてセンサーチップＣＭ５上のカルボキシメチルデキストランをＮ−ヒドロキシスクシニミド（ＮＨＳ）で活性化した。これに前記０．５ｍｇ／ｍＬ濃度の化合物２８６溶液を２５℃で５分間接触させることにより固定化を行なった。その後１Ｍ モノエタノールアミン水溶液を用いて未反応のスクシンイミドオキシカルボニル基のブロッキングを行なった。一連の固定化過程はセンサーチップＣＭ５表面のＳＰＲ共鳴単位（ＲＵ）の増加によってモニタリングした。
【０１７３】
実施例３３ ＢＩＡＣＯＲＥ（商品名）を用いた親和性解析
実施例３２によって調製したリガンド−マトリックス複合体（化合物２８６を固定化したセンサーチップＣＭ５）に対して、ＨＢＳ−ＥＰ緩衝液（組成：１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．４），０．１５Ｍ ＮａＣｌ，３ｍＭ ＥＤＴＡ，０．００５％ ＳＰ２０）で希釈したマウスＩｇＭ（１０μｇ／ｍＬ、試料Ａ）、マウスＩｇＧ（３２０μｇ／ｍＬ、試料Ｂ）、ニワトリＩｇＹ（４００μｇ／ｍＬ、試料Ｃ）、ウシ血清アルブミン（３２０μｇ／ｍＬ、試料Ｄ）をそれぞれ１２０秒間通液（結合相）し、その後２８０秒間ＨＢＳ−ＥＰ緩衝液で置換（解離相）して親和性を解析した。またそれぞれの分析終了ごとに１０ｍＭ水酸化ナトリウムを８０秒間通液してセンサーチップＣＭ５の再生を行った。化合物２８６を固定化したセンサーチップＣＭ５のセンサーグラムを図２３に示す。また解離時間２４０秒後の残存ＲＵを表５４に示す。
【０１７４】
【表５４】
図２３及び表５４より、マウスＩｇＭ（試料Ａ）が他の試料（試料Ｂ、Ｃ、Ｄ）と比較し、化合物２８６を固定化したセンサーチップＣＭ５に対する親和性が高いことが示された。よって、化合物２８６を固定化したデキストランゲルが、マウスＩｇＭを特異的に吸着することが判明した。
【０１７５】
実施例３４ チアゾール誘導体のセルロースゲルへの固定化
０．１Ｍ Ｎ−シクロヘキシル−２−アミノエタンスルホン酸緩衝液（ｐＨ９．０）／アセトニトリル＝１／１の混合液を調製し、これを溶媒として、化合物４８６と水酸化ナトリウムとをそれぞれ４１ｍＭとなるように加えた。遠沈管に３．０ｍＬのセルファインホルミル（商品名）ゲル（チッソ株式会社製、ホルミル基を１０から１５μｍｏｌ／ｍＬ含有）をとり、そこに前記の化合物４８６を含んだ溶液を５ｍＬ加え、卓上振盪機を用いて、３０分間、２５℃、１６０ｒｐｍで振盪した後、ボラン−ピリジン複合体（０．１７ｍＬ、１．７ｍｍｏｌ）を添加し、同じ条件で１６時間振盪した。反応混合物をグラスフィルターで濾過し、アセトニトリル５ｍＬで１回、次いで、洗浄液（アセトニトリル／水／トリフルオロ酢酸＝４５／５５／０．０５）で５ｍＬずつ４回洗浄した。これらのろ液と洗浄液をあわせ、高速液体クロマトグラフィー（カラム：東ソー株式会社製 ＴＳＫ−ｇｅｌ ＯＤＳ−８０ＴＭ（内径４．６ｍｍ×長さ１５ｃｍ）、溶離液：洗浄液と同じ組成、流速：１ｍＬ／ｍｉｎ、温度：２５℃、検出：ＵＶ ２５４ｎｍ）にて残存する化合物４８６を定量することによって、セルファインホルミルゲルに化合物４８６が５μｍｏｌ／ｍＬ（ｇｅｌ）固定化されたことを確認した。
【０１７６】
実施例３５ チアゾール誘導体のアクリルアミド−ビニル共重合体ゲルへの固定化
０．１Ｍ Ｎ−シクロヘキシル−２−アミノエタンスルホン酸緩衝液（ｐＨ９．０）／アセトニトリル＝１／１の混合溶媒に、化合物４８６と水酸化ナトリウムとをそれぞれ４１ｍＭとなるように加えた。遠沈管に０．３ｇのＰｒｏｆｉｎｉｔｙ Ｅｐｏｘｉｄｅ（商品名）ゲル（バイオラッド株式会社製、エポキシ基を５０から１３２μｍｏｌ／ｇ含有）をとり、そこに前記の化合物４８６を含んだ溶液を５ｍＬ加え、卓上振盪機を用いて、１５時間、４０℃、１６０ｒｐｍで振盪した。反応混合物をグラスフィルターで濾過し、アセトニトリル５ｍＬで１回、次いで、洗浄液（アセトニトリル／水／トリフルオロ酢酸＝４５／５５／０．０５）で５ｍＬずつ４回洗浄した。これらのろ液と洗浄液をあわせ、高速液体クロマトグラフィー（カラム：東ソー株式会社製 ＴＳＫ−ｇｅｌ ＯＤＳ−８０ＴＭ（内径４．６ｍｍ×長さ１５ｃｍ）、溶離液：洗浄液と同じ組成、流速：１ｍＬ／ｍｉｎ、温度：２５℃、検出：ＵＶ ２５４ｎｍ）にて残存する化合物４８６を定量することによって、Ｐｒｏｆｉｎｉｔｙ Ｅｐｏｘｉｄｅゲルに化合物４８６が４μｍｏｌ／ｍＬ（ｇｅｌ）固定化されたことを確認した。
【０１７７】
実施例３６ チアゾール誘導体のシリカゲルへの固定化
２−ヒドロキシ−３−［４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジニル］プロパンスルホン酸緩衝液（０．１Ｍ、ｐＨ８．０）／アセトニトリル＝１／１の混合溶媒に、化合物４８６と水酸化ナトリウムとをそれぞれ４１ｍＭとなるように加えた。遠沈管に１．３ｇのＭ．Ｓ．ＧＥＬ Ｅｐｏｘｙ−Ｄ−５０−１０００ＡＷ（商品名、ＡＧＣエスアイテック株式会社製、エポキシ基を７３μｍｏｌ／ｇ含有）をとり、そこに、６．１ｍＬの前記の溶液を加え、卓上振盪機を用いて、４日間、４０℃、１６０ｒｐｍで振盪した。反応混合物をグラスフィルターで濾過し、アセトニトリル５ｍＬで１回、次いで、洗浄液（アセトニトリル／水／トリフルオロ酢酸＝４５／５５／０．０５）で５ｍＬずつ４回洗浄した。これらのろ液と洗浄液をあわせ、高速液体クロマトグラフィー（カラム：東ソー株式会社製 ＴＳＫ−ｇｅｌ ＯＤＳ−８０ＴＭ（内径４．６ｍｍ×長さ１５ｃｍ）、溶離液：洗浄液と同じ組成、流速：１ｍＬ／ｍｉｎ、温度：２５℃、検出：ＵＶ ２５４ｎｍ）にて残存する化合物４８６を定量することによって、Ｍ．Ｓ．ＧＥＬ Ｅｐｏｘｙ−Ｄ−５０−１０００ＡＷに化合物４８６が２２μｍｏｌ／ｍＬ（ｇｅｌ）固定化されたことを確認した。
【０１７８】
実施例３７ ４−メチル−Ｎ−［４−メチル−５−｛３−（２−プロペニルカルボニルアミノ）プロピル｝チアゾール−２−イル］ベンズアミドのポリスチレンビーズへの固定化（その１）
２００ｍＬのナス型フラスコに塩化銅（Ｉ）（１５９ｍｇ，１．６１ｍｍｏｌ）、ペンタメチルジエチレントリアミン（４１９ｍｇ，２．４２ｍｍｏｌ）、メタノール（１９．５ｍＬ）、及び２−ヒドロキシエチルメタクリレート（１９．５ｍＬ，１６１ｍｍｏｌ）を順次添加し、室温で撹拌して反応混合物が均一に溶解したことを確認した。次に反応溶液に１．４ｇのクロロメチル化ポリスチレンビーズ（渡辺化学工業株式会社製、クロロメチル基含量：１．１５ｍｅｑ／ｇ）を添加し、凍結脱気により反応溶液中の溶存酸素を除去したのち、反応容器を４０℃で１２時間撹拌した。反応終了後、ポリスチレンビーズと反応溶液を分離し、ポリスチレンビーズをメタノール（２００ｍＬ）で２回洗浄した後、エタノール／５％アンモニア水＝９／１（ｖ／ｖ）（１Ｌ）で３回洗浄した。洗浄終了後、ポリスチレンビーズと洗浄液を分離した後、真空乾燥することで淡青色をしたポリ（２−ヒドロキシエチルメタクリレート）修飾ポリスチレンビーズ（１８．４ｇ、グラフト率：１２００％）を得た。なおここでグラフト率は、
グラフト率＝（反応後のポリスチレンビーズ重量−反応前のポリスチレンビーズ重量）／（反応前のポリスチレンビーズ重量）
と定義する。
【０１７９】
次に５０ｍＬのナス型フラスコに塩化銅（Ｉ）（２２ｍｇ，０．２２ｍｍｏｌ）、１，４，８，１１−テトラメチル−１，４，８，１１−テトラアザテトラデカン（５６ｍｇ，０．２２ｍｍｏｌ）、参考例２で合成した４−メチル−Ｎ−［４−メチル−５−｛３−（２−プロペニルカルボニルアミノ）プロピル｝チアゾール−２−イル］ベンズアミド（５２５ｍｇ，１．４７ｍｍｏｌ）、及び２−ブタノン／２−プロパノール＝７／３（ｖ／ｖ）の混合溶媒（３ｍＬ）を順次添加し、室温で撹拌して反応混合物が均一に溶解したことを確認した。次に反応溶液に２．５ｇのポリ（２−ヒドロキシエチルメタクリレート）修飾ポリスチレンビーズを添加し、凍結脱気により反応溶液中の溶存酸素を除去したのち、反応容器を６０℃で６３時間撹拌した。反応終了後、ポリスチレンビーズと反応溶液を分離し、エタノール（３００ｍＬ）で２回、エタノール／５％アンモニア水＝９／１（ｖ／ｖ）（３００ｍＬ）で２回、ＤＭＦ（２００ｍＬ）で１回洗浄した。洗浄終了後、ポリスチレンビーズと洗浄液を分離した後、真空乾燥することでチアゾール誘導体が結合した薄茶色のポリ（２−ヒドロキシエチルメタクリレート）修飾ポリスチレンビーズ（２．６１ｇ）を得た。得られたポリスチレンビーズの重量増加分から計算した結果、グラフト鎖末端にチアゾール誘導体が平均２分子結合しており、その当量は０．１２ｍｅｑ／ｇであると見積られた。ＦＴ−ＩＲ，ν（ｃｍ−１，ｒｅｆｌｅｃｔ）：３４４０（ｂｒ，Ｏ−Ｈ），２９４９（ｗ），１７２０（ｓ，Ｃ＝Ｏ），１６３７（ｗ，Ｃ＝Ｏ），１４５０（ｍ），１２４３（ｍ），１１４９（ｓ），１０７４（ｓ）。
【０１８０】
実施例３８ ４−メチル−Ｎ−［４−メチル−５−｛３−（２−プロペニルカルボニルアミノ）プロピル｝チアゾール−２−イル］ベンズアミドのポリスチレンビーズへの固定化（その２）
２００ｍＬのナス型フラスコに塩化銅（Ｉ）（５００ｍｇ，５．０ｍｍｏｌ）、ペンタメチルジエチレントリアミン（１．３０ｇ，７．５ｍｍｏｌ）、２−プロパノール（２２ｍＬ）、及びアクリルアミド水溶液（組成：１７．８ｇ／２２ｍＬ；２５０ｍｍｏｌ）を順次添加し、室温で撹拌して反応混合物が均一に溶解したことを確認した。次に反応溶液に５．０ｇのクロロメチル化ポリスチレンビーズ（株式会社ペプチド研究所製、クロロメチル基含量：０．９７ｍｅｑ／ｇ）を添加し、凍結脱気により反応溶液中の溶存酸素を除去したのち、反応容器を８０℃で１８時間撹拌した。反応終了後、ポリスチレンビーズと反応溶液を分離し、ポリスチレンビーズをエタノール（１５０ｍＬ）で洗浄した後、エタノール／５％アンモニア水＝９／１（ｖ／ｖ）（２００ｍＬ）で２回洗浄した。洗浄終了後、ポリスチレンビーズと洗浄液を分離した後、真空乾燥することで淡青色をしたポリアクリルアミド修飾ポリスチレンビーズ（１２．３ｇ、グラフト率：１４６％）を得た。なおここでグラフト率は
グラフト率＝（反応後のポリスチレンビーズ重量−反応前のポリスチレンビーズ重量）／（反応前のポリスチレンビーズ重量）
と定義する。
【０１８１】
次に５０ｍＬのナス型フラスコに塩化銅（Ｉ）（６０ｍｇ，０．６０ｍｍｏｌ）、トリス（２−（ジメチルアミノ）エチル）アミン（２０８ｍｇ，０．９ｍｍｏｌ）、参考例２で合成した４−メチル−Ｎ−［４−メチル−５−｛３−（２−プロペニルカルボニルアミノ）プロピル｝チアゾール−２−イル］ベンズアミド（１．０７ｇ，３．０ｍｍｏｌ）、及び２−プロパノール／水＝２／１（ｖ／ｖ）の混合溶媒（３ｍＬ）を順次添加し、室温で撹拌して反応混合物が均一に溶解したことを確認した。次に反応溶液に１．５ｇのポリアクリルアミド修飾ポリスチレンビーズを添加し、凍結脱気により反応溶液中の溶存酸素を除去したのち、反応容器を８０℃で８７時間撹拌した。反応終了後、反応溶液にエタノール（３０ｍＬ）及び５％アンモニア水（５ｍＬ）を添加し、室温で１時間撹拌した。次にポリスチレンビーズと反応溶液を分離し、エタノール／５％アンモニア水＝９／１（ｖ／ｖ）（５０ｍＬ）で２回、ＤＭＦ（２５０ｍＬ）で１回洗浄した。洗浄終了後、ポリスチレンビーズと洗浄液を分離した後、真空乾燥することでチアゾール誘導体が結合した薄緑色のポリアクリルアミド修飾ポリスチレンビーズ（１．８４ｇ）を得た。得られたポリスチレンビーズの重量増加分から計算した結果、グラフト鎖末端にチアゾール誘導体が平均２分子結合しており、その当量は０．５２ｍｅｑ／ｇであると見積られた。ＦＴ−ＩＲ，ν（ｃｍ−１，ｒｅｆｌｅｃｔ）：３３３６（ｂｒ），２９２２（ｍ），１６５４（ｓ，Ｃ＝Ｏ），１６００（ｍ），１４９２（ｍ），１４５０（ｍ），１０２８（ｗ），７５６（ｍ），６９８（ｓ）。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、タンパク質、特に免疫グロブリンの分析または精製に利用可能なチアゾール誘導体を結合させたマトリックス、及びそれらの製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、医療用タンパク質の需要は拡大しつつあり、その簡便で大規模に実施できる工業的精製技術の確立が切望されている。一般にタンパク質精製技術には、ゲル透過クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィー、およびアフィニティークロマトグラフィーなどのクロマトグラフィー分離技術があるが、医療用タンパク質の精製を工業的に実施する場合には、実験室で用いられるような分離剤や装置を使用したのでは経済性に乏しく、実用的とは言い難い。また、医療用タンパク質を工業的に製造する過程では多種類のタンパク質が混在しているため、上記の中の一つの精製技術を用いて目的とするタンパク質を純粋に得ることは極めて困難である。そのため通常はいくつかの技術を複合させた精製プロセスが採用されている（特許文献１）。
【０００３】
近年、医療用タンパク質の一つである免疫グロブリンを精製するための低分子化合物とそれらが結合したマトリックスが数多く開示されており、スルホン誘導体（特許文献２）、トリアジン誘導体（特許文献３）、メルカプト複素環式化合物（特許文献４）、４−ピリジルエチルチオアルキル誘導体（非特許文献１）などの低分子化合物が結合したマトリックスが知られている。しかしながら、本発明のマトリックスの製造に用いるチアゾール誘導体（１ａ）が免疫グロブリンを精製するための低分子化合物として有用であるとの報告はない。また、特許文献５や非特許文献２に本発明のマトリックスの製造に用いるチアゾール誘導体（１ａ）に類似の化学構造を有するチアゾール誘導体が報告されているものの、これらの文献に記載のチアゾール誘導体の化学構造は、チアゾール環の２位がアミノ基あるいはアルキル基に限定されており、本発明のマトリックスの製造に用いるチアゾール誘導体（１ａ）のように２位にベンゾイルアミノ基が置換した化合物についての記載はない。とりわけ非特許文献２に記載の化合物は、本発明のマトリックスの製造に用いるチアゾール誘導体（１ａ）に類似のチアゾール誘導体ではあるものの、それらの用途はヒスタミンＨ２レセプターアゴニストとしての用途に限定されており、免疫グロブリンを精製するための用途についての記載はない。
【０００４】
なお、特許文献６にはチアゾール環の２位にベンゾイルアミノ基が置換したチアゾール誘導体が記載されているが、これらの化合物のチアゾール環の４位の置換基はカルボニル、５位は無置換にそれぞれ限定されており、それらの用途としては消化管運動改善作用を有する医薬の有効成分に言及されている。更には特許文献６の化合物はマトリックスに固定化されたものではなく、免疫グロブリンを精製するための用途についての記載もない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】ＷＯ２００４／０８７７６１号
【特許文献２】米国特許４６９６９８０号
【特許文献３】米国特許６１１７９９６号
【特許文献４】特許第３８４４４９６号
【特許文献５】ＷＯ１９９１／１０６５６号
【特許文献６】ＷＯ１９９８／１７６５４号
【特許文献７】ＷＯ１９８９／１０３６０号
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Ｂｉｏｓｅｐａｒａｔｉｏｎ，９（４），２１１−２２１，２０００
【非特許文献２】Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，３５（１７），３２３９−３２４６，１９９２
【非特許文献３】はじめてのリガンドカップリングハンドブック、アマシャムバイオサイエンス株式会社刊、２００５
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明が解決しようとする課題は、タンパク質、特に免疫グロブリンの分析または精製に有用なチアゾール誘導体を固定化したマトリックス、及びそれらの製造方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者は、上記課題を解決すべく鋭意検討を重ねた結果、本発明の下記一般式（１）で示されるチアゾール誘導体固定化マトリックスが、タンパク質、特に免疫グロブリンの簡便な分析または精製を可能にすることを見出し、本発明を完成するに至った。
【０００９】
本発明は、一般式（１）
【００１０】
【化１】
（式中、Ｒ１及びＲ２は水素原子又は置換されていてもよい炭素数１から６のアルキル基を表し、Ａｒは置換されていてもよい芳香族基を表し、ｎは１から１２の整数を表し、Ｍはマトリックスを表す。）で表されるチアゾール誘導体固定化マトリックスに関するものである。
【００１１】
また本発明は、一般式（１）
【００１２】
【化２】
（式中、Ｒ１、Ｒ２、Ａｒ、ｎ及びＭは前記と同じ意味を表す。）においてＭのマトリックスがビニルポリマー、アガロース、キトサン、デキストラン、セルロース、シリカ、ポリスチレンのいずれかであることを特徴とする、チアゾール誘導体固定化マトリックスに関するものである。
【００１３】
また本発明は、一般式（１ａ）
【００１４】
【化３】
（式中、Ｒ１、Ｒ２、Ａｒ及びｎは前記と同じ意味を表し、Ｒ３はアミノ基又はアンモニウム塩を表す。）で示されるチアゾール誘導体と、活性化基含有マトリックスとを反応させることを特徴とする、一般式（１）
【００１５】
【化４】
（式中、Ｒ１、Ｒ２、Ａｒ、ｎ及びＭは前記と同じ意味を表す。）で示されるチアゾール誘導体固定化マトリックスの製造方法に関するものである。
【００１６】
また本発明は、一般式（１）
【００１７】
【化５】
（式中、Ｒ１、Ｒ２、Ａｒ、ｎ及びＭは前記と同じ意味を表す。）で示されるチアゾール誘導体固定化マトリックスを使用し、タンパク質の分析または精製を行なう方法に関するものである。
【００１８】
以下、本発明をさらに詳細に説明する。
【００１９】
本発明のチアゾール誘導体固定化マトリックス（１）及び前記固定化マトリックスの製造に用いるチアゾール誘導体（１ａ）における、Ｒ１、Ｒ２及びＡｒで表される置換基、並びにＲ３で表されるアンモニウム塩（Ｚ−Ｈ３＋Ｎ）の定義を以下に示す。
【００２０】
Ｒ１及びＲ２で表される炭素数１から６のアルキル基としては、直鎖状もしくは分枝状のいずれであってもよく、メチル基、エチル基、プロピル基、イソプロピル基、ブチル基、イソブチル基、ｓｅｃ−ブチル基、ｔｅｒｔ−ブチル基、ペンチル基、イソアミル基、ネオペンチル基、２−ペンチル基、３−ペンチル基、ｔｅｒｔ−ペンチル基、ヘキシル基、イソヘキシル基、２−ヘキシル基、３−ヘキシル基を例示することができる。また、これらの炭素数１から６のアルキル基はハロゲン原子等で置換されていてもよく、さらに具体的にはジフルオロメチル基、トリフルオロメチル基、２，２，２−トリフルオロエチル基、パーフルオロブチル基、ヒドロキシメチル基、カルボキシメチル基、４−モルホリノカルボニルメチル基等を例示することができる。特に本発明の固定化マトリックスの製造に用いるチアゾール誘導体としては、免疫グロブリンの分析または精製において良好な性能を示す点で、Ｒ１はメチル基が好ましく、Ｒ２は水素原子が好ましい。
【００２１】
Ｒ３で表されるアンモニウム塩はＺ−Ｈ３＋Ｎ（Ｚ−は共役塩基を表す。）で表され、具体的にはＣｌ−Ｈ３＋Ｎ、Ｂｒ−Ｈ３＋Ｎ、Ｆ−Ｈ３＋Ｎ、Ｉ−Ｈ３＋Ｎ、ＮＯ３−Ｈ３＋Ｎ、１／２（ＳＯ４２−）Ｈ３＋Ｎ、１／３（ＰＯ４３−）Ｈ３＋Ｎ、ＣＨ３ＳＯ３−Ｈ３＋Ｎ、４−ＣＨ３Ｃ６Ｈ４ＳＯ３−Ｈ３＋Ｎ、ＣＨ３ＣＯＯ−Ｈ３＋Ｎ、ＣＦ３ＣＯＯ−Ｈ３＋Ｎ等を例示することができるが、マトリックスへの固定化の反応性や操作性に優れている点で、Ｃｌ−Ｈ３＋Ｎ又はＢｒ−Ｈ３＋Ｎが好ましい。
【００２２】
Ａｒで表される芳香族基は特に制限はないが、フラン−２−イル基、フリル基、チエニル基、チオフェン−３−イル基、ピロール−２−イル基、ピロール−３−イル基、ピラゾール−３−イル基、ピラゾール−４−イル基、イソチアゾール−３−イル基、イソチアゾール−４−イル基、イソキサゾール−３−イル基、イソキサゾール−４−イル基、イミダゾール−２−イル基、イミダゾール−４−イル基、イミダゾール−５−イル基、オキサゾール−２−イル基、オキサゾール−４−イル基、オキサゾール−５−イル基、チアゾール−２−イル基、チアゾール−４−イル基、チアゾール−５−イル基、１，２，４−トリアゾール−３−イル基、フェニル基、２−ピリジル基、３−ピリジル基、４−ピリジル基、２−ピリミジル基、４−ピリミジル基、５−ピリミジル基、１，２，４−トリアジン−３−イル基、１，２，４−トリアジン−５−イル基、１，２，４−トリアジン−６−イル基、ベンゾジオキソラン−３−イル基、ベンゾフラン−２−イル基、ベンゾフラン−３−イル基、ベンゾフラン−４−イル基、ベンゾフラン−５−イル基、ベンゾフラン−６−イル基、ベンゾフラン−７−イル基、ベンゾチオフェン−２−イル基、ベンゾチオフェン−３−イル基、ベンゾチオフェン−４−イル基、ベンゾチオフェン−５−イル基、ベンゾチオフェン−６−イル基、ベンゾチオフェン−７−イル基、インドール−２−イル基、インドール−３−イル基、インドール−４−イル基、インドール−５−イル基、インドール−６−イル基、インドール−７−イル基、ベンゾチアゾール−２−イル基、ベンゾチアゾール−４−イル基、ベンゾチアゾール−５−イル基、ベンゾチアゾール−６−イル基、ベンゾチアゾール−７−イル基、インダゾール−３−イル基、インダゾール−４−イル基、インダゾール−５−イル基、インダゾール−６−イル基、インダゾール−７−イル基、ベンズイソキサゾール−３−イル基、ベンズイソキサゾール−４−イル基、ベンズイソキサゾール−５−イル基、ベンズイソキサゾール−６−イル基、ベンズイソキサゾール−７−イル基、ナフタレン−１−イル基、ナフタレン−２−イル基、キノリン−２−イル基、キノリン−３−イル基、キノリン−４−イル基、キノリン−５−イル基、キノリン−６−イル基、キノリン−７−イル基、キノリン−８−イル基、キノキサリニル基、キノキサリン−５−イル基、キノキサリン−６−イル基、キナゾリニル基、キナゾリン−４−イル基、キナゾリン−５−イル基、キナゾリン−６−イル基、キナゾリン−７−イル基、キナゾリン−８−イル基、ベンゾオキサジン−５−イル基、ベンゾオキサジン−６−イル基、ベンゾオキサジン−７−イル基、ベンゾオキサジン−８−イル基、ベンゾチアジン−５−イル基、ベンゾチアジン−６−イル基、ベンゾチアジン−７−イル基、ベンゾチアジン−８−イル基、１，３−ベンゾジオキソール−４−イル基、１，３−ベンゾジオキソール−５−イル基、１，３−ベンゾジオキソール−６−イル基、１，３−ベンゾジオキソール−７−イル基、アントラセン−１−イル基を例示できる。特に、免疫グロブリンの分析または精製において良好な性能を示す点で、Ａｒはフェニル基、２−ピリジル基、３−ピリジル基あるいは４−ピリジル基が好ましい。
【００２３】
Ａｒで表される置換されていてもよい芳香族基の置換基としては、特に制限はないが、ハロゲン原子、置換されていてもよい炭素数１から６のアルキル基、置換されていてもよい炭素数１から１２のアルコキシ基、置換されていてもよい炭素数３から８のシクロアルコキシ基、置換されていてもよい炭素数３から６のアルケニルオキシ基、置換されていてもよい炭素数３から６のアルキニルオキシ基、置換されていてもよい炭素数１から６のアシルオキシ基、置換されていてもよい炭素数１から６のアルキルチオ基、置換されていてもよい炭素数１から６のアルキルスルフィニル基、置換されていてもよい炭素数１から６のアルキルスルホニル基、置換されていてもよい炭素数１から１２のアルコキシカルボニル基、カルボキシル基、ニトロ基、置換されていてもよいアミノ基、水酸基又はシアノ基が好ましい。
【００２４】
ハロゲン原子としては、フッ素原子、塩素原子、臭素原子あるいはヨウ素原子を例示することができる。
【００２５】
置換されていてもよい炭素数１から６のアルキル基としては、直鎖状、分枝状もしくは環状のいずれであってもよく、メチル基、エチル基、シクロプロピル基、プロピル基、イソプロピル基、シクロプロピル基、ブチル基、イソブチル基、ｓｅｃ−ブチル基、ｔｅｒｔ−ブチル基、ペンチル基、イソアミル基、ネオペンチル基、２−ペンチル基、３−ペンチル基、２−メチルブチル基、ｔｅｒｔ−ペンチル基、ヘキシル基、イソヘキシル基、２−ヘキシル基、３−ヘキシル基を例示することができる。また、これらの炭素数１から６のアルキル基はハロゲン原子、炭素数３から８のシクロアルキル基、炭素数１から６のアルコキシ基、炭素数１から６のアルコキシカルボニル基、カルボキシ基、アシル基、置換されていてもよい芳香族基で１個以上置換されていてもよく、さらに具体的には２−クロロエチル基、３−クロロプロピル基、ジフルオロメチル基、３−フルオロプロピル基、メトキシメチル基、２−エトキシエチル基、シクロプロピルメチル基、シクロペンチルメチル基、シクロヘキシルメチル基、２−メチルチオエチル基、２−エチルチオエチル基、２−アリルチオエチル基、２−プロパルギルチオエチル基、２−ベンジルチオエチル基、２−（２−クロロベンジル）チオエチル基、２−（２，４−ジクロロベンジル）チオエチル基、２−メチルスルフィニルエチル基、２−メチルスルホニルエチル基、エトキシメチル基、２−メトキシエチル基、２−クロロエトキシメチル基、メトキシカルボニルメチル基、エトキシカルボニルメチル基、１−メトキシカルボニルエチル基、１−エトキシカルボニルエチル基、２−エトキシカルボニルエチル基、カルボキシメチル基、アセトニル基、１−アセチルエチル基、３−アセチルプロピル基、フェナシル基、４−クロロフェナシル基、２，４−ジフルオロフェナシル基、４−メチルフェナシル基、４−イソプロピルフェナシル基、４−イソブチルフェナシル基、４−シクロヘキシルフェナシル基、４−シアノフェナシル基、４−ニトロフェナシル基、チエニル基、２−（チオフェン−２−イル）エチル基、２−（チオフェン−３−イル）エチル基、フルフリル基、（５−メチルフラン−２−イル）メチル基、（５−エチルフラン−２−イル）メチル基、（５−クロロフラン−２−イル）メチル基、２−（５−フルオロフラン−２−イル）エチル基、テトラヒドロフルフリル基、２−ピリジルメチル基、３−ピリジルメチル基、４−ピリジルメチル基、２−（ピリジン−２−イル）エチル基、２−（ピリジン−３−イル）エチル基、２−（ピリジン−４−イル）エチル基、３−（ピリジン−２−イル）プロピル基、３−（ピリジン−３−イル）プロピル基、３−（ピリジン−４−イル）プロピル基を例示することができる。
【００２６】
置換されていてもよい炭素数１から１２のアルコキシ基としては、直鎖状もしくは分枝状のいずれであってもよく、メトキシ基、エトキシ基、プロピルオキシ基、イソプロピルオキシ基、ブトキシ基、イソブチルオキシ基、ｓｅｃ−ブチルオキシ基、ｔｅｒｔ−ブトキシ基、ペンチルオキシ基、イソアミルオキシ基、ネオペンチルオキシ基、２−ペンチルオキシ基、３−ペンチルオキシ基、ｔｅｒｔ−ペンチルオキシ基、ヘキシルオキシ基、イソヘキシルオキシ基、２−ヘキシルオキシ基、３−ヘキシルオキシ基、デセニルオキシ基を例示することができる。また、これらのアルコキシ基はハロゲン原子、炭素数３から８のシクロアルキル基、炭素数１から６のアルコキシ基、炭素数１から６のアルコキシカルボニル基、カルボキシ基、アシル基、置換されていてもよい芳香族基等で１個以上置換されていてもよく、さらに具体的には２−クロロエトキシ基、３−クロロプロピルオキシ基、ジフルオロメトキシ基、４−トリフルオロメトキシ基、３−フルオロプロピルオキシ基、シクロプロピルメトキシ基、シクロペンチルメトキシ基、シクロヘキシルメトキシ基、２−メチルチオエトキシ基、２−エチルチオエトキシ基、２−アリルチオエトキシ基、２−プロパルギルチオエトキシ基、２−ベンジルチオエトキシ基、２−（２−クロロベンジル）チオエトキシ基、２−（２，４−ジクロロベンジル）チオエトキシ基、２−メチルスルフィニルエトキシ基、２−メチルスルホニルエトキシ基、メトキシメトキシ基、エトキシメトキシ基、２−メトキシエトキシ基、２−クロロエトキシメトキシ基、メトキシカルボニルメトキシ基、エトキシカルボニルメトキシ基、１−メトキシカルボニルエトキシ基、１−エトキシカルボニルエトキシ基、２−エトキシカルボニルエトキシ基、カルボキシメトキシ基、１−アセチルエトキシ基、３−アセチルプロポキシ基、２−ピリジルメトキシ基、３−ピリジルメトキシ基、４−ピリジルメトキシ基、２−（ピリジン−２−イル）エトキシ基、２−（ピリジン−３−イル）エトキシ基、２−（ピリジン−４−イル）エトキシ基、３−（ピリジン−２−イル）プロポキシ基、３−（ピリジン−３−イル）プロポキシ基、ベンジルオキシ基を例示することができる。
【００２７】
置換されていてもよい炭素数３から８のシクロアルコキシ基としては、シクロプロピルオキシ基、シクロブチルオキシ基、シクロペンチルオキシ基、２−メチルシクロブチルオキシ基、シクロヘキシルオキシ基、２−メチルシクロペンチルオキシ基、３−メチルシクロペンチルオキシ基、４−メチルシクロペンチルオキシ基、シクロオクチルオキシ基を例示することができる。
【００２８】
置換されていてもよい炭素数３から６のアルケニルオキシ基としては、アリルオキシ基、２−メチル−２−プロペニルオキシ基、２−ブテニルオキシ基、１−ブテン−３−イルオキシ基、３−ブテニルオキシ基、４−ペンテニルオキシ基、５−ヘキセニルオキシ基を例示することができる。また、これらの炭素数３から６のアルケニルオキシ基はハロゲン原子等で置換されていてもよく、３，３−ジフルオロアリルオキシ基、３，３−ジクロロアリルオキシ基、３，３−ジブロモアリルオキシ基を例示することができる。
【００２９】
置換されていてもよい炭素数３から６のアルキニルオキシ基としては、プロパルギルオキシ基、１−ブチン−３−イルオキシ基、２−ブチニルオキシ基、３−ブチニルオキシ基、２−ペンチニルオキシ基、３−ペンチニルオキシ基、４−ペンチニルオキシ基、２−ヘキシニルオキシ基、３−ヘキシニルオキシ基、４−ヘキシニルオキシ基、５−ヘキシニルオキシ基を例示することができる。また、これらの置換されていてもよい炭素数３から６のアルキニルオキシ基はハロゲン原子等で置換されていてもよく、４，４，４−トリフルオロブチン−２−イル基等を例示することができる。
【００３０】
置換されていてもよいアシルオキシ基としては、アセトキシ基、プロピオニルオキシ基を例示することができる。また、これらの置換されていてもよいアシルオキシ基はハロゲン原子等で置換されていてもよく、トリフルオロアセトキシ基や２，２，２−トリフルオロプロピオニルオキシ基等を例示することができる。
【００３１】
置換されていてもよい炭素数１から６のアルキルチオ基としては、メチルチオ基、エチルチオ基、プロピルチオ基、イソプロピルチオ基、ブチルチオ基、イソブチルチオ基、ｓｅｃ−ブチルチオ基、ペンチルチオ基、イソアミルチオ基、ネオペンチルチオ基、２−ペンチルチオ基、３−ペンチルチオ基、２−メチルブチルチオ基、ヘキシルチオ基、イソヘキシルチオ基、３−メチルペンチルチオ基、２−メチルペンチルチオ基を例示することができる。また、これらのアルキルチオ基はハロゲン原子、炭素数３から８のシクロアルキル基等で一個以上置換されていてもよく、さらに具体的には２−クロロエチルチオ基、３−クロロプロピルチオ基、ジフルオロメチルチオ基、３−フルオロプロピルチオ基、シクロプロピルメチルチオ基、シクロペンチルメチルチオ基、シクロヘキシルメチルチオ基を例示することができる。
【００３２】
置換されていてもよい炭素数１から６のアルキルスルフィニル基としては、メチルスルフィニル基、エチルスルフィニル基、プロピルスルフィニル基、イソプロピルスルフィニル基、ブチルスルフィニル基、イソブチルスルフィニル基、ｓｅｃ−ブチルスルフィニル基、ペンチルスルフィニル基、イソアミルスルフィニル基、ネオペンチルスルフィニル基、２−ペンチルスルフィニル基、３−ペンチルスルフィニル基、２−メチルブチルスルフィニル基、ヘキシルスルフィニル基、イソヘキシルスルフィニル基、３−メチルペンチルスルフィニル基、２−メチルペンチルスルフィニル基を例示することができる。また、これらのアルキルスルフィニル基はハロゲン原子、炭素数３から８のシクロアルキル基等で一個以上置換されていてもよく、さらに具体的には２−クロロエチルスルフィニル基、３−クロロプロピルスルフィニル基、ジフルオロメチルスルフィニル基、３−フルオロプロピルスルフィニル基、シクロプロピルメチルスルフィニル基、シクロペンチルメチルスルフィニル基、シクロヘキシルメチルスルフィニル基を例示することができる。
【００３３】
置換されていてもよい炭素数１から６のアルキルスルホニル基としては、メチルスルホニル基、エチルスルホニル基、プロピルスルホニル基、イソプロピルスルホニル基、ブチルスルホニル基、イソブチルスルホニル基、ｓｅｃ−ブチルスルホニル基、ペンチルスルホニル基、イソアミルスルホニル基、ネオペンチルスルホニル基、２−ペンチルスルホニル基、３−ペンチルスルホニル基、２−メチルブチルスルホニル基、ヘキシルスルホニル基、イソヘキシルスルホニル基、３−メチルペンチルスルホニル基、２−メチルペンチルスルホニル基を例示することができる。また、これらのアルキルスルホニル基はハロゲン原子、炭素数３から８のシクロアルキル基で一個以上置換されていてもよく、さらに具体的には２−クロロエチルスルホニル基、３−クロロプロピルスルホニル基、ジフルオロメチルスルホニル基、３−フルオロプロピルスルホニル基、シクロプロピルメチルスルホニル基、シクロペンチルメチルスルホニル基、シクロヘキシルメチルスルホニル基を例示することができる。
【００３４】
置換されていてもよい炭素数１から１２のアルコキシカルボニル基としては、メトキシカルボニル基、エトキシカルボニル基、プロポキシカルボニル基、ブトキシカルボニル基、ヘキシルオキシカルボニル基、ドデシルオキシカルボニル基、ベンジルオキシカルボニル基、ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル基を例示することができる。また、これらのアルコキシカルボニル基はハロゲン原子等で一個以上置換されていてもよく、さらに具体的にはトリフルオロメトキシカルボニル基、２，２，２−トリフルオロエトキシカルボニル基等を例示することができる。
【００３５】
置換されていてもよいアミノ基としては、メチルアミノ基、ジメチルアミノ基、エチルアミノ基、Ｎ−エチル−Ｎ−メチルアミノ基、ジエチルアミノ基、Ｎ−メチル−Ｎ−プロピルアミノ基、Ｎ−エチル−Ｎ−プロピルアミノ基、２，２，２−トリフルオロエチルアミノ基、ジプロピルアミノ基、イソプロピルアミノ基、Ｎ−メチル−Ｎ−イソプロピルアミノ基、ブチルアミノ基、Ｎ−ブチル−Ｎ−メチルアミノ基、イソブチルアミノ基、ｓｅｃ−ブチルアミノ基、ペンチルアミノ基、イソアミルアミノ基、ネオペンチルアミノ基、２−ペンチルアミノ基、３−ペンチルアミノ基、２−メチルブチルアミノ基、ヘキシルアミノ基、イソヘキシルアミノ基、４−メチルペンチルアミノ基、ベンゼンスルホニルアミノ基、Ｎ−ベンゼンスルホニル−Ｎ−メチルアミノ基、ｐ−トルエンスルホニルアミノ基、４−クロロベンゼンスルホニルアミノ基、４−ニトロベンゼンスルホニルアミノ基、メチルスルホニルアミノ基、クロロメチルスルホニルアミノ基、トリフルオロメチルスルホニルアミノ基、Ｎ−メチルスルホニル−Ｎ−メチルアミノ基、Ｎ−メチルスルホニル−Ｎ−エチルアミノ基、Ｎ−メチルスルホニル−Ｎ−プロピルアミノ基、エチルスルホニルアミノ基、Ｎ−エチルスルホニル−Ｎ−メチルアミノ基、Ｎ−エチルスルホニル−Ｎ−エチルアミノ基、メトキシカルボニルアミノ基、エトキシカルボニルアミノ基を例示することができる。
【００３６】
Ａｒで表される置換されていてもよい芳香族基としては、特に制限はないが、フラン−２−イル基、５−ブロモフラン−２−イル基、５−メチルフラン−２−イル基、フリル基、チエニル基、５−クロロチエニル基、５−ブロモチエニル基、５−メチルチエニル基、５−メトキシチエニル基、５−エトキシチエニル基、チオフェン−３−イル基、５−メチルチオフェン−３−イル基、５−メトキシチオフェン−３−イル基、５−エトキシチオフェン−３−イル基、１−メチルピロール−２−イル基、１−メチルピロール−３−イル基、１−エチルピラゾール−３−イル基、ピラゾール−２−イル基、３−エトキシ−１−メチルピラゾール−２−イル基、１−エチル−４−メトキシピラゾール−３−イル基、イソチアゾール−３−イル基、５−メトキシイソチアゾール−３−イル基、イソチアゾール−４−イル基、イソキサゾール−３−イル基、イソキサゾール−４−イル基、１−メチルイミダゾール−２−イル基、１−メチルイミダゾール−４−イル基、１−メチルイミダゾール−５−イル基、オキサゾール−２−イル基、オキサゾール−４−イル基、オキサゾール−５−イル基、チアゾール−２−イル基、３−メトキシチアゾール−２−イル基、４−メトキシチアゾール−２−イル基、チアゾール−４−イル基、チアゾール−５−イル基、１，２，４−トリアゾール−３−イル基、１，２，４−トリアゾール−５−イル基、フェニル基、２−フルオロフェニル基、３−フルオロフェニル基、４−フルオロフェニル基、２，３−ジフルオロフェニル基、３，５−ジフルオロフェニル基、３，４，５−トリフルオロフェニル基、２，３，４，５，６−ペンタフルオロフェニル基、３−フルオロ−４−メチルフェニル基、４−トリフルオロメトキシフェニル基、２−クロロフェニル基、３−クロロフェニル基、４−クロロフェニル基、４−クロロ−３−メチルフェニル基、４−クロロ−３−エチルフェニル基、４−クロロ−３−メトキシフェニル基、４−クロロ−３−エトキシフェニル基、２，３−ジクロロフェニル基、３，５−ジクロロフェニル基、３，４，５−トリクロロフェニル基、３−トリフルオロメチルフェニル基、４−トリフルオロメチルフェニル基、３−ブロモフェニル基、４−ブロモフェニル基、４−ブロモ−３−メチルフェニル基、４−ブロモ−３−エチルフェニル基、４−ブロモ−３−メトキシフェニル基、４−ブロモ−３−エトキシフェニル基、３，５−ジブロモ−４−ヒドロキシフェニル基、３−ヨードフェニル基、４−ヨードフェニル基、４−ヨード−３−メチルフェニル基、４−ヨード−３−エチルフェニル基、４−ヨード−３−メトキシフェニル基、４−ヨード−３−エトキシフェニル基、２−メチルフェニル基、３−メチルフェニル基、４−メチルフェニル基、３，４−ジメチルフェニル基、３，４，５−トリメチルフェニル基、３−ヒドロキシ−４−メチルフェニル基、２−トリフルオロフェニルメチルフェニル基、３−トリフルオロフェニルメチルフェニル基、４−トリフルオロフェニルメチルフェニル基、４−メトキシメチルフェニル基、３，４−ジエトキシフェニル基、３−エチル−４−メチルフェニル基、４−エチル−３−メチルフェニル基、４−エチルフェニル基、３，４−ジエチルフェニル基、４−プロピルフェニル基、４−イソプロピルフェニル基、３−ブチルフェニル基、４−ブチルフェニル基、４−イソブチルフェニル基、４−（ｓｅｃ−ブチル）フェニル基、４−（ｔｅｒｔ−ブチル）フェニル基、４−ペンチルフェニル基、４−イソアミルフェニル基、４−ネオペンチルフェニル基、４−（２−ペンチル）フェニル基、４−（３−ペンチル）フェニル基、４−（２−メチルブチル）フェニル基、４−（ｔｅｒｔ−ペンチル）フェニル基、４−ヘキシルフェニル基、４−イソヘキシルフェニル基、４−（２−クロロエチル）フェニル基、４−（３−クロロプロピル）フェニル基、４−（ジフルオロメチル）フェニル基、４−（３−フルオロプロピル）フェニル基、４−メトキシメチルフェニル基、４−エトキシメチルフェニル基、４−シクロプロピルメチルフェニル基、４−シクロペンチルメチルフェニル基、シクロヘキシルメチルフェニル基、４−（２−メチルチオエチル）フェニル基、４−（２−エチルチオエチル）フェニル基、４−（２−アリルチオエチル）フェニル基、４−（２−プロパルギルチオエチル）フェニル基、４−（２−ベンジルチオエチル）フェニル基、３−メトキシフェニル基、３−メトキシ−４−メチルフェニル基、４−エチル−３−メトキシフェニル基、３−メトキシ−４−プロピルフェニル基、４−メトキシフェニル基、４−メトキシ−３−メトキシフェニル基、３，４−ジメトキシフェニル基、３−エトキシ−４−メトキシフェニル基、４−エトキシ−３−メトキシフェニル基、４−イソプロピルオキシ−３−メトキシフェニル基、３−イソプロピルオキシ−４−メトキシフェニル基、３−エトキシフェニル基、４−エトキシフェニル基、４−エトキシ−３−メチルフェニル基、４−エトキシ−３−エチルフェニル基、４−エトキシ−３−プロピルフェニル基、４−エトキシ−３−イソプロピルフェニル基、４−プロピルオキシフェニル基、４−イソプロピルオキシフェニル基、４−ブトキシフェニル基、４−イソブチルオキシフェニル基、４−（ｓｅｃ−ブチルオキシ）フェニル基、３−（２−クロロエトキシ）フェニル基、３−（２−クロロエトキシ）フェニル基、４−（２−クロロエトキシ）フェニル基、３−（３−クロロプロピルオキシ）フェニル基、４−（３−クロロプロピルオキシ）フェニル基、３−ジフルオロメトキシフェニル基、４−ジフルオロメトキシフェニル基、４−（３−フルオロプロピルオキシフェニル基）、４−シクロプロピルメトキシフェニル基、４−シクロペンチルメトキシ基、４−シクロヘキシルメトキシ基、３−シクロプロピルオキシフェニル基、４−シクロプロピルオキシフェニル基、４−シクロプロピルオキシ−３−メトキシフェニル基、４−シクロプロピルオキシ−３−メチルフェニル基、４−シクロブチルオキシフェニル基、４−シクロペンチルオキシフェニル基、４−（２−メチルシクロブチルオキシ）フェニル基、４−シクロヘキシルオキシフェニル、４−アリルオキシフェニル基、４−（３，３−ジクロロアリルオキシ）フェニル基、４−プロパルギルオキシフェニル基、３−メチル−４−プロパルギルオキシフェニル基、３−エチル−４−プロパルギルオキシフェニル基、３−メトキシ−４−プロパルギルオキシフェニル基、３−エトキシ−４−プロパルギルオキシフェニル基、３−プロポキシ−４−プロパルギルオキシフェニル基、４−（１−ブチン−３−イルオキシ）フェニル基、４−（２−ブチニルオキシ）フェニル基、３−メチルチオフェニル基、４−メチルチオフェニル基、４−メチル−３−メチルチオフェニル基、３−メチル−４−メチルチオフェニル基、４−メトキシ−３−メチルチオフェニル基、３−エトキシ−４−メチルチオフェニル基、４−エトキシ−３−メチルチオフェニル基、３−プロポキシ−４−メチルチオフェニル基、４−エチルチオフェニル基、３−プロピルチオフェニル基、４−イソプロピルチオフェニル基、４−ブチルチオフェニル基、４−イソブチルチオフェニル基、２−（ｓｅｃ−ブチルチオ）フェニル基、２−ペンチルチオフェニル基、２−イソアミルチオフェニル基、４−ネオペンチルチオフェニル基、４−（２−クロロエチルチオ）フェニル基、３−（３−クロロプロピルチオ）フェニル基、ジフルオロメチルチオフェニル基、３−アセトキシフェニル基、４−アセトキシフェニル基、３−メチルスルフィニルフェニル基、４−メチルスルフィニルフェニル基、４−メトキシ−３−メチルスルフィニルフェニル基、３−メトキシ−４−メチルスルフィニルフェニル基、４−エトキシ−３−メチルスルフィニルフェニル基、３−エトキシ−４−メチルスルフィニルフェニル基、４−メチル−３−メチルスルフィニルフェニル基、３−エチル−４−メチルスルフィニルフェニル基、４−（２−クロロエチルスル）フィニルフェニル基、４−（３−クロロプロピルスルフィニル）フェニル基、４−（ジフルオロメチルスルフィニル）フェニル基、３−メチルスルホニルフェニル基、４−メチルスルホニルフェニル基、４−メチル−３−メチルスルホニルフェニル基、４−エチル−３−メチルスルホニルフェニル基、４−メトキシ−３−メチルスルホニルフェニル基、４−エトキシ−３−メチルスルホニルフェニル基、３−メトキシ−４−メチルスルホニルフェニル基、３−エトキシ−４−メチルスルホニルフェニル基、エチルスルホニルフェニル基、プロピルスルホニルフェニル基、イソプロピルスルホニルフェニル基、ブチルスルホニルフェニル基、２−クロロエチルスルホニルフェニル基、３−クロロプロピルスルホニルフェニル基、ジフルオロメチルスルホニルフェニル基、４−カルボキシフェニル基、４−メトキシカルボニルフェニル基、４−エトキシカルボニルフェニル基、３−メチルアミノフェニル基、４−メチルアミノフェニル基、４−メトキシ−３−メチルアミノフェニル基、３−メトキシ−４−メチルアミノフェニル基、４−エトキシ−３−メチルアミノフェニル基、３−エトキシ−４−メチルアミノフェニル基、４−メチル−３−メチルアミノフェニル基、３−メチル−４−メチルアミノフェニル基、４−エチル−３−メチルアミノフェニル基、３−ジメチルアミノフェニル基、４−ジメチルアミノフェニル基、４−メトキシ−３−ジメチルアミノフェニル基、３−メトキシ−４−ジメチルアミノフェニル基、４−エトキシ−３−ジメチルアミノフェニル基、３−エトキシ−４−ジメチルアミノフェニル基、４−メチル−３−ジメチルアミノフェニル基、３−メチル−４−ジメチルアミノフェニル基、４−エチル−３−ジメチルアミノフェニル基、３−メチル−４−ジメチルアミノフェニル基、３−（Ｎ−エチル−Ｎ−メチルアミノ）フェニル基、４−（Ｎ−エチル−Ｎ−メチルアミノ）フェニル基、４−メトキシ−３−（Ｎ−エチル−Ｎ−メチルアミノ）フェニル基、３−メトキシ−４−（Ｎ−エチル−Ｎ−メチルアミノ）フェニル基、４−エトキシ−３−（Ｎ−エチル−Ｎ−メチルアミノ）フェニル基、３−エトキシ−４−（Ｎ−エチル−Ｎ−メチルアミノ）フェニル基、４−メチル−３−（Ｎ−エチル−Ｎ−メチルアミノ）フェニル基、３−メチル−４−（Ｎ−エチル−Ｎ−メチルアミノ）フェニル基、４−エチル−３−（Ｎ−エチル−Ｎ−メチルアミノ）フェニル基、３−メチル−４−（Ｎ−エチル−Ｎ−メチルアミノ）フェニル基、３−ジエチルアミノフェニル基、４−ジエチルアミノフェニル基、４−メトキシ−３−ジエチルアミノフェニル基、３−メトキシ−４−ジエチルアミノフェニル基、４−エトキシ−３−ジエチルアミノフェニル基、３−エトキシ−４−ジエチルアミノフェニル基、４−メチル−３−ジエチルアミノフェニル基、３−メチル−４−ジエチルアミノフェニル基、４−エチル−３−ジエチルアミノフェニル基、４−メチルスルホニルアミノフェニル基、４−トリフルオロメチルスルホニルアミノフェニル基、４−アセチルアミノフェニル基、２−ヒドロキシフェニル基、３−ヒドロキシフェニル基、４−ヒドロキシフェニル基、３−ヒドロキシ−４−メチルフェニル基、３−ヒドロキシ−４−エチルフェニル基、３−ヒドロキシ−４−メトキシフェニル基、４−ヒドロキシ−３−メチルフェニル基、４−ヒドロキシ−３−エチルフェニル基、４−ヒドロキシ−３−メトキシフェニル基、２−シアノフェニル基、３−シアノフェニル基、４−シアノフェニル基、２−ニトロフェニル基、３−ニトロフェニル基、３−ニトロ−４−メチルフェニル基、４−ニトロフェニル基、ピリジン−２−イル基、５−クロロピリジン−２−イル基、５−メチルピリジン−２−イル基、５−エチルピリジン−２−イル基、５−メトキシピリジン−２−イル基、５−エトキシピリジン−２−イル基、２，３−ジメチルピリジン−６−イル基、２，３−ジメトキシピリジン−６−イル基、ピリジル−３−イル基、２−クロロピリジン−５−イル基、２−メチルピリジン−５−イル基、２−エチルピリジン−５−イル基、２−メトキシピリジン−５−イル基、２
−エトキシピリジン−５−イル基、２，３−ジメチルピリジン−５−イル基、ピリジル−４−イル基、２−メチルピリジン−４−イル基、２−エチルピリジン−４−イル基、２−メトキシピリジン−４−イル基、２−エトキシピリジン−４−イル基、２−ピリミジル基、５−メチルピリミジン−２−イル基、５−エチルピリミジン−２−イル基、２−エトキシピリジン−５−イル基、２，３−ジメチルピリジン−５−イル基、２−メチルピリジン−４−イル基、２−エチルピリジン−４−イル基、２−メトキシピリジン−４−イル基、２−エトキシピリジン−４−イル基、５−クロロピリミジン−２−イル基、５−ブロモピリミジン−２−イル基、５−メトキシピリミジン−２−イル基、ピリミジル−４−イル基、ピリミジル−５−イル基、１，２，４−トリアジン−３−イル基、１，２，４−トリアジン−５−イル基、１，２，４−トリアジン−６−イル基、ベンゾジオキソラン−３−イル基、ベンゾフラン−２−イル基、ベンゾフラン−３−イル基、ベンゾフラン−４−イル基、ベンゾフラン−５−イル基、ベンゾフラン−６−イル基、ベンゾフラン−７−イル基、ベンゾチオフェン−２−イル基、ベンゾチオフェン−３−イル基、ベンゾチオフェン−４−イル基、ベンゾチオフェン−５−イル基、ベンゾチオフェン−６−イル基、ベンゾチオフェン−７−イル基、１−メチルインドール−２−イル基、ベンゾチアゾール−２−イル基、ベンゾチアゾール−４−イル基、ベンゾチアゾール−５−イル基、ベンゾチアゾール−６−イル基、ベンゾチアゾール−７−イル基、ベンズイソキサゾール−３−イル基、ベンズイソキサゾール−４−イル基、ベンズイソキサゾール−５−イル基、ベンズイソキサゾール−６−イル基、ベンズイソキサゾール−７−イル基、ナフタレン−１−イル基、ナフタレン−２−イル基、キノリン−２−イル基、キノリン−３−イル基、キノリン−４−イル基、キノリン−５−イル基、キノリン−６−イル基、キノリン−７−イル基、キノリン−８−イル基、キノキサリン−５−イル基、キノキサリン−６−イル基、キナゾリン−４−イル基、キナゾリン−５−イル基、キナゾリン−６−イル基、キナゾリン−７−イル基、キナゾリン−８−イル基、ベンゾオキサジン−５−イル基、ベンゾオキサジン−６−イル基、ベンゾオキサジン−７−イル基、ベンゾオキサジン−８−イル基、ベンゾチアジン−５−イル基、ベンゾチアジン−６−イル基、ベンゾチアジン−７−イル基、ベンゾチアジン−８−イル基、１，３−ベンゾジオキソール−４−イル基、１，３−ベンゾジオキソール−５−イル基、１，３−ベンゾジオキソール−６−イル基、１，３−ベンゾジオキソール−７−イル基、アントラセン−１−イル基等を例示することができる。
【００３７】
特に免疫グロブリンの分析または精製において良好な性能を示す点で、Ａｒは４−メチルフェニル基、４−エチルフェニル基、３，４−ジメチルフェニル基、３−エチル−４−メチルフェニル基、４−エチル−３−メチルフェニル基、４−メトキシフェニル基、４−エトキシフェニル基、３，４−ジメトキシフェニル基、３，４−ジエトキシフェニル基、３−エトキシ−４−メトキシフェニル基、４−エトキシ−３−メトキシフェニル基、４−メトキシ−３−メチルフェニル基、４−メチル−３−エトキシフェニル基、４−ジメチルアミノフェニル基、２−メトキシピリジン−５−イル基、２−エトキシピリジン−５−イル基、２，３−ジメチルピリジン−５−イル基、４−ピリジル基、２−メチルピリジン−４−イル基、２−エチルピリジン−４−イル基、２−メトキシピリジン−４−イル基、２−エトキシピリジン−４−イル基、２−クロロピリジン−５−イル基、３−メトキシ−４−メチルフェニル基、３−ヒドロキシ−４−メチルフェニル基、４−メチルチオフェニル基のいずれかが好ましい。
【００３８】
Ｍで表されるマトリックスの材質としては特に限定はなく、例えば、架橋結合アルブミンなどのポリペプチドまたはタンパク質、アガロース、アルギネート、カラゲナン、キチン、セルロース、デキストリン、デキストラン、澱粉などの多糖、ポリアクリルアミド、ポリスチレン、ポリアクロレイン、ポリビニルアルコール、ポリメタクリレート、ポリ（２−ヒドロキシエチルメタクリレート）、ポリウレタンなどの合成高分子、シリカ、ガラス、多孔質珪藻土、アルミナ、ジルコニア、酸化鉄または他の金属酸化物などの無機化合物、上記物質を２つまたはそれ以上任意に組み合わせて構成される共重合体などのマトリックスをあげることができる。さらにそれらは、液相分配で使用されるデキストラン、ポリエチレングリコール、ポリビニルアルコールまたは加水分解澱粉などの水溶性の高分子を包含するマトリックス、またはエマルジョンを形成するのに使用されるペルフルオロデカリンなどの化合物を包含するマトリックスも含まれる。特に、本発明のチアゾール誘導体固定化マトリックス製造におけるマトリックスの材質としては、トヨパール（商品名）（東ソー株式会社製）などのビニルポリマー、アガロース、キトサン、デキストラン、セルロース、シリカ、ポリスチレンが好ましい。
【００３９】
ここでいうビニルポリマーとは、ビニル基などを持ったモノマーをビニル重合して得られたものを指し、モノマーとしてはメタアクリル酸メチル、２−ヒドロキシエチルメタクリレート、アクリルアミド、ビニルエステルなどが含まれる。さらに、ここでいうビニルポリマーとしては前記モノマーを２種類以上用いた共重合体や、架橋したものなどが含まれる。
【００４０】
また、マトリックスは、粒状物または非粒状物、水性溶媒に対して可溶性または不溶性、多孔性または非多孔性、いずれであっても良い。
【００４１】
ｎについては、１から１２の整数から適宜選択することができるが、特に本発明のチアゾール誘導体固定化マトリックスの製造に用いるチアゾール誘導体としては、ｎが３，４又は５が好ましい。
【００４２】
次に、本発明のチアゾール誘導体固定化マトリックスの製造に用いるチアゾール誘導体の製造方法を詳細に説明する。
【００４３】
製造方法１
【００４４】
【化６】
（式中、Ｒ１、Ｒ２、Ａｒ及びｎは前記と同じ意味を表し、Ｒ３はアミノ基又はそのアンモニウム塩を表し、Ｙは脱離基を表す。）
工程１はフタルイミド誘導体（２）をアシルチオウレア誘導体（３）と反応させ、チアゾール誘導体（４）を合成する方法である。フタルイミド誘導体（２）は非特許文献２や特許文献７等を参考に合成することができる。
【００４５】
工程１の反応では、反応は溶媒中で行なうことが好ましく、反応に害を及ぼさない溶媒であれば使用することができ、例えば、ジエチルエーテル、テトラヒドロフラン（以下ＴＨＦ）、１，２−ジメトキシエタン（以下ＤＭＥ）、１，４−ジオキサンなどのエーテル系溶媒、アセトン、メチルエチルケトンなどのケトン系溶媒、酢酸エチル、酢酸ブチルなどのエステル系溶媒、アセトニトリル、プロピオニトリルなどのニトリル類、ベンゼン、トルエン、キシレン、クロロベンゼンなどの芳香族炭化水素系溶媒、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（以下ＤＭＦ）、Ｎ−メチルピロリドン等のアミド系溶媒、メタノール、エタノール等のアルコール系溶媒、ジメチルスルホキシド（以下ＤＭＳＯ）、水あるいはこれらの混合溶媒を用いることができ、収率が良い点でＤＭＦを用いるのが好ましい。反応温度については特に制限はないが、０℃から１５０℃の範囲から適宜選ばれた温度で反応させることにより目的物を得ることができ、収率が良い点で６０℃から１５０℃の範囲で反応させるのが好ましい。本工程では、塩基存在下に行なうこともでき、塩基としては、水素化ナトリウム、ナトリウムアミド、炭酸ナトリウム、炭酸カリウム、ナトリウムメトキシド、ナトリウムエトキシド、カリウム−ｔｅｒｔ−ブトキシド、水酸化ナトリウム、水酸化カリウムなどのアルカリ金属塩基、トリエチルアミン、トリブチルアミン、Ｎ−メチルモルホリン、ピリジン、ジメチルアニリンなどの有機アミン類を用いることができる。塩基の使用量は特に制限はないが、反応基質に対して等量以上用いて反応を実施することにより、収率良く目的物を得ることができる。反応終了後は、通常の後処理操作により目的物を得ることができるが、必要であればカラムクロマトグラフィーあるいは再結晶などの方法により精製することもできる。
【００４６】
工程２はチアゾール誘導体（４）を塩基で処理し、チアゾール誘導体（１ａ）を製造する方法である。塩基としては、水素化ナトリウム、ナトリウムアミド、炭酸ナトリウム、炭酸カリウム、ナトリウムメトキシド、ナトリウムエトキシド、カリウム−ｔｅｒｔ−ブトキシド、水酸化ナトリウム、水酸化カリウムなどのアルカリ金属塩基、メチルアミン、エチルアミン、ジメチルアミンなどの有機アミン類、ヒドラジン類を用いることができる。収率が良い点でヒドラジンあるいはメチルアミンが好ましい。塩基の使用量は反応基質に対して２等量以上用いて反応を実施することにより、収率良く目的物を得ることができる。本反応では、反応は溶媒中で行なうことが好ましく、反応に害を及ぼさない溶媒であれば使用することができ、例えば、ジエチルエーテル、ＴＨＦ、ＤＭＥ、ジオキサンなどのエーテル系溶媒、アセトン、メチルエチルケトンなどのケトン系溶媒、酢酸エチル、酢酸ブチルなどのエステル系溶媒、アセトニトリル、プロピオニトリルなどのニトリル類、ベンゼン、トルエン、キシレン、クロロベンゼンなどの芳香族炭化水素系溶媒、ＤＭＦ、Ｎ−メチルピロリドンなどのアミド系溶媒、メタノール、エタノール、イソプロピルアルコールなどのアルコール系溶媒、ＤＭＳＯ、水あるいはこれらの混合溶媒を用いることができ、収率が良い点や後処理が簡便である点でメタノールやエタノールなどのアルコール系溶媒を用いることが好ましい。反応温度については特に制限はないが、０℃から１５０℃の範囲から適宜選ばれた温度で反応させることにより目的物を得ることができる。反応終了後は、通常の後処理操作により目的物を得ることができるが、必要であればカラムクロマトグラフィーあるいは再結晶などの方法により精製することもできる。また、反応終了後、酸で処理しアンモニウム塩として単離することもできる。反応に害を及ぼさない酸であれば使用することができ、例えば、塩酸、臭化水素酸、フッ酸、硝酸、硫酸、リン酸などの無機酸、メタンスルホン酸やトルエンスルホン酸、トリフルオロ酢酸などの有機酸を用いることができるが、目的物の単離が容易であることから塩酸を用いるのが好ましい。
【００４７】
製造方法２
【００４８】
【化７】
（式中、Ｒ１、Ｒ２、Ａｒ及びｎは前記と同じ意味を表し、Ｗはハロゲン原子を表す。）
製造方法２は２−置換アミノチアゾール誘導体（５）と酸ハロゲン化物（６）を反応させ、チアゾール誘導体（４ａ）を製造する方法である。当該方法の反応では、反応は溶媒中で行なうことが好ましく、反応に害を及ぼさない溶媒であれば使用することができ、例えば、ジクロロメタン、クロロホルム、１，２−ジクロロエタンなどのハロゲン系溶媒、ジエチルエーテル、ＴＨＦ、ＤＭＥ、ジオキサンなどのエーテル系溶媒、アセトン、メチルエチルケトンなどのケトン系溶媒、酢酸エチル、酢酸ブチルなどのエステル系溶媒、アセトニトリル、プロピオニトリルなどのニトリル類、ベンゼン、トルエン、キシレン、クロロベンゼンなどの芳香族炭化水素系溶媒、ＤＭＦ、Ｎ−メチルピロリドンなどのアミド系溶媒、ＤＭＳＯ、水あるいはこれらの混合溶媒を用いることができ、収率が良い点でジクロロメタン、クロロホルム、１，２−ジクロロエタンなどのハロゲン系溶媒を用いるのが好ましい。反応温度については特に制限はないが、０℃から１５０℃の範囲から適宜選ばれた温度で反応させることにより目的物を得ることができ、収率が良い点で０℃から１００℃の範囲で反応させるのが好ましい。本工程では、塩基存在下に行なうこともでき、塩基としては、水素化ナトリウム、ナトリウムアミド、炭酸ナトリウム、炭酸カリウム、ナトリウムメトキシド、ナトリウムエトキシド、カリウム−ｔｅｒｔ−ブトキシド、水酸化ナトリウム、水酸化カリウムなどのアルカリ金属塩基、トリエチルアミン、トリブチルアミン、Ｎ−メチルモルホリン、ピリジン、ジメチルアニリンなどの有機アミン類を用いることができる。塩基の使用量は特に制限はないが、反応基質に対して等量以上用いて反応を実施することにより、収率良く目的物を得ることができる。反応終了後は、通常の後処理操作により目的物を得ることができるが、必要であればカラムクロマトグラフィーあるいは再結晶などにより精製することもできる。当該方法で合成されたチアゾール誘導体（４ａ）は、製造方法１の工程２を経由することによって、チアゾール誘導体（１ａ）へと導くことができる。
【００４９】
次に、本発明のチアゾール誘導体固定化マトリックスの製造方法を詳細に説明する。
【００５０】
製造方法３
【００５１】
【化８】
（式中、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｍ、Ａｒ及びｎは前記と同じ意味を表す。）
製造方法３はチアゾール誘導体（１ａ）と活性化基（活性化基とは、アミノ基あるいはアンモニウム塩と容易に反応できる官能基のことで、例えば、スクシンイミドオキシカルボニル基、ホルミル基、カルボキシル基、２，２，２−トリフルオロエチルスルホニル基（トレシル基）、塩化スルホニル基、トシル基、ビニルスルホニル基、エポキシ基をあげることができる。）含有マトリックスと反応させてチアゾール誘導体固定化マトリックス（１）を製造する方法である。なお、当該方法で用いる活性化基含有マトリックスの活性化基としては、スクシンイミドオキシカルボニル基、ホルミル基、２，２，２−トリフルオロエチルスルホニル基（トレシル基）、エポキシ基、カルボキシル基が特に好ましい。また、当該方法で用いる活性化基含有マトリックスは、活性化基を有しないマトリックスから周知の方法で活性化基を付加することで調製しても良く、ＨｉＴｒａｐ ＮＨＳ−ａｃｔｉｖａｔｅｄ ＨＰ（商品名）（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス株式会社製）、エポキシトヨパール（商品名）、ホルミルトヨパール（商品名）、トレシルトヨパール（商品名）、カルボキシトヨパール（商品名）（以上東ソー株式会社製）、活性化キトパールＫ−６６（商品名）ゲル（富士紡ホールディングス株式会社製）、ＢＩＯＡＣＴ ＥＰＯ（商品名）ゲル（昭和電工株式会社製）、ＰＯＲＯＳ−ＥＰ（商品名）ゲル（アプライドバイオシステムズ株式会社製）、セルファインホルミル（商品名）ゲル（チッソ株式会社製）、Ｐｒｏｆｉｎｉｔｙ Ｅｐｏｘｉｄｅ（商品名）ゲル（バイオラッド株式会社製）、Ｍ．Ｓ．ＧＥＬ Ｅｐｏｘｙ−Ｄ−５０−１０００ＡＷ（商品名、ＡＧＣエスアイテック株式会社製）などのリガンド固定化用担体として市販されているものをそのまま用いても良い。
【００５２】
本反応では、中性あるいは塩基性条件下にて反応させることにより容易に目的物を得ることができる。特に塩基性条件下にて反応を行なうことにより、チアゾール誘導体の固定化率の高いマトリックスを得ることができる。塩基としては、水素化ナトリウム、ナトリウムアミド、炭酸ナトリウム、炭酸カリウム、ナトリウムメトキシド、ナトリウムエトキシド、カリウム−ｔｅｒｔ−ブトキシド、水酸化ナトリウム、水酸化カリウムなどのアルカリ金属塩基、トリエチルアミン、トリブチルアミン、Ｎ−メチルモルホリン、ピリジン、ジメチルアニリンなどの有機アミン類を用いることができる。塩基の使用量は特に制限はないが、反応基質に対して等モル以上用いて反応を実施することにより、目的とするチアゾール誘導体の固定化比率の高いマトリックスを得ることができる。また、溶液のｐＨを保つために緩衝液を加えて反応を行なうこともできる。反応は溶媒中で行なうことが好ましく、反応に害を及ぼさない溶媒であれば使用することができ、例えば、ジエチルエーテル、ＴＨＦ、ＤＭＥ、ジオキサンなどのエーテル系溶媒、アセトン、エチルメチルケトンなどのケトン系溶媒、酢酸エチル、酢酸ブチルなどのエステル系溶媒、アセトニトリル、プロピオニトリルなどのニトリル類、ベンゼン、トルエン、キシレン、クロロベンゼンなどの芳香族炭化水素系溶媒、ＤＭＦ、Ｎ−メチルピロリドンなどのアミド系溶媒、ＤＭＳＯ、水あるいはこれらの混合溶媒を用いることができる。反応温度については特に制限はないが、０℃から１５０℃の範囲から適宜選ばれた温度で反応させることにより、目的とするチアゾール誘導体固定化マトリックスを得ることができる。マトリックス上のチアゾール誘導体の固定化量は、吸光度分析、高速液体クロマトグラフィー、元素分析などの分析法を単独あるいは組み合わせて用いることにより測定できる。
【００５３】
次に、本発明のチアゾール誘導体固定化マトリックスを用いてタンパク質を分析、分離、または単離、精製する方法について説明する。
【００５４】
製造方法３によって得られたチアゾール誘導体固定化マトリックスをカラム管に充填し、溶離液として緩衝液、金属塩の水溶液、アミノ酸溶液、アルコール溶液などの溶液を通液し、タンパク質を分析や分離、及び単離や精製を行なうことができる。この方法で分析、分離、または単離、精製することができるタンパク質としては、血漿タンパク質成分や乳タンパク質成分をあげることができ、天然に存在するものでは血漿中の免疫グロブリン、血清アルブミン、血液凝固因子、ラクトアルブミン、ラクトフェリンを例示できる。また遺伝子組換えタンパク質では前記に加えて、天然には微量しか存在しない、あるいは人工的に設計されたペプチドホルモン、インターフェロン、インターロイキン、成長因子、成長抑制因子、ワクチンを例示できる。特に本発明のチアゾール誘導体固定化マトリックスは、免疫グロブリンの精製に好ましい。通液する緩衝液としては、リン酸緩衝液、クエン酸緩衝液、Ｔｒｉｓ、ＰＩＰＥＳ、ＡＣＥＳ、Ｃｈｏｌａｍｉｎｅ、ＢＥＳ、ＭＯＰＳ、ＴＥＳ、ＨＥＰＥＳを例示でき、金属塩としては硫酸ナトリウム、硫酸カリウム、硫酸リチウム、硫酸マグネシウム、硫酸アンモニウム、クエン酸ナトリウム、クエン酸カリウム、塩化ナトリウム、塩化カリウムを例示でき、アミノ酸としてはグリシン、アルギニン、ベータアラニン、ガンマアミノ酪酸を例示でき、アルコールとしてはエタノール、イソプロピルアルコール、グリセロール、エチレングリコールを例示でき、これらを混合溶媒として用いることもできる。ｐＨは３から１１の範囲内で目的とするタンパク質を分離、単離または精製することができるが、ｐＨは５から９の範囲内で精製することが好ましい。また、ＡＫＴＡｐｒｉｍｅ ｐｌｕｓ（商品名）（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス株式会社製）などのクロマトグラフィー装置を使用して、タンパク質を分析、分離、または単離、精製することもできる。製造方法３によって得られたチアゾール誘導体固定化マトリックスを用いて免疫グロブリン、またはこれらの類縁体、フラグメント、融合体を分析または精製する場合は、硫酸ナトリウムや硫酸アンモニウムを含むリン酸緩衝液を通液し、ｐＨは５から９の範囲で、疎水性相互作用を利用したクロマトグラフィーを実施することが好ましい。ここでいう免疫グロブリンの類縁体とは免疫グロブリンの構造や機能が少なくとも部分的に保持された天然あるいは人工的に作られたタンパク質あるいはタンパク質コンジュゲートを指し、免疫グロブリンのフラグメントとは酵素的な処理あるいは遺伝子工学的な設計によって作製された免疫グロブリンの部分構造を持ったタンパク質を指し、免疫グロブリンの融合体とは各種サイトカインあるいはサイトカイン受容体などの生物活性をもったタンパク質の機能部分を免疫グロブリンの全部または一部と遺伝子工学的に融合させて作製したものを指す。
【００５５】
製造方法３によって得られたチアゾール誘導体固定化マトリックスは、水酸化ナトリウム水溶液、水酸化カリウム水溶液などのアルカリ性水溶液、塩酸水溶液、硫酸水溶液、硝酸水溶液、リン酸水溶液などの酸性水溶液、塩酸グアニジン水溶液、尿素水溶液などのタンパク変性剤水溶液、アルギニンやヒスチジンなどのアミノ酸を含んだ水溶液、ＳＤＳ、Ｔｗｅｅｎなどの界面活性剤水溶液、メタノール、エタノール、イソプロパノール、グリセロール、エチレングリコールなどのアルコール溶液、あるいは、これらを含んだ混合水溶液を用いて洗浄することによって、初期状態に復帰させることができ、繰り返し使用することができる。
【発明の効果】
【００５６】
本発明のチアゾール誘導体固定化マトリックスは、タンパク質、特に免疫グロブリンの分析および精製に有用な耐久性に富む選択的な吸脱着剤となることから医療用タンパク質、特に免疫グロブリンの工業的な精製において極めて有用である。
【図面の簡単な説明】
【００５７】
【図１】チアゾール誘導体固定化ＨｉＴｒａｐカラムを用いた免疫グロブリンのクロマトグラフィー結果（化合物２８６の結果）。
【図２】チアゾール誘導体固定化ＨｉＴｒａｐカラムを用いた免疫グロブリンのクロマトグラフィー結果（化合物３０４の結果）。
【図３】チアゾール誘導体固定化ＨｉＴｒａｐカラムを用いた免疫グロブリンのクロマトグラフィー結果（化合物３２０の結果）。
【図４】チアゾール誘導体固定化ＨｉＴｒａｐカラムを用いた免疫グロブリンのクロマトグラフィー結果（化合物３２９の結果）。
【図５】チアゾール誘導体固定化ＨｉＴｒａｐカラムを用いた免疫グロブリンのクロマトグラフィー結果（化合物３８４の結果）。
【図６】チアゾール誘導体固定化ＨｉＴｒａｐカラムを用いた免疫グロブリンのクロマトグラフィー結果（化合物４２３の結果）
【図７】チアゾール誘導体固定化ＨｉＴｒａｐカラムを用いたウシ血清アルブミンのクロマトグラフィー結果（化合物２８６の結果）
【図８】チアゾール誘導体固定化ＨｉＴｒａｐカラムを用いたウシ血清アルブミンのクロマトグラフィー結果（化合物３０４の結果）
【図９】チアゾール誘導体固定化ＨｉＴｒａｐカラムを用いたウシ血清アルブミンのクロマトグラフィー結果（化合物３２０の結果）
【図１０】チアゾール誘導体固定化ＨｉＴｒａｐカラムを用いたウシ血清アルブミンのクロマトグラフィー結果（化合物３２９の結果）
【図１１】チアゾール誘導体固定化ＨｉＴｒａｐカラムを用いたウシ血清アルブミンのクロマトグラフィー結果（化合物３８４の結果）
【図１２】チアゾール誘導体固定化ＨｉＴｒａｐカラムを用いたウシ血清アルブミンのクロマトグラフィー結果（化合物４２３の結果）
【図１３】化合物２８６固定化ＨｉＴｒａｐカラムを用いたリボヌクレア−ゼＡ、リゾチ−ム、αキモトリプシノ−ゲンＡの混合液のクロマトグラフィー結果
【図１４】化合物２８６固定化ＨｉＴｒａｐカラムを用いたヒト−マウスキメラ抗体のパパイン消化物のクロマトグラフィー結果
【図１５】図１４の画分Ｉ、ＩＩ、ＩＩＩ、ＩＶのＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析の結果
【図１６】化合物２８６固定化エポキシトヨパールゲルを用いた免疫グロブリンのクロマトグラフィー結果
【図１７】化合物２８６固定化エポキシトヨパールゲルを用いたヒト化モノクローナル抗体のクロマトグラフィー結果
【図１８】化合物２８６固定化エポキシトヨパールゲルを用いたウシ血清アルブミンのクロマトグラフィー結果
【図１９】化合物３２９固定化エポキシトヨパールゲルを用いたヒト化モノクローナル抗体のクロマトグラフィー結果
【図２０】化合物３２９固定化エポキシトヨパールゲルを用いたウシ血清アルブミンのクロマトグラフィー結果
【図２１】化合物２８６固定化ホルミルトヨパールゲルを用いたヒト化モノクローナル抗体のクロマトグラフィー結果
【図２２】化合物２８６固定化ホルミルトヨパールゲルを用いたウシ血清アルブミンのクロマトグラフィー結果
【図２３】化合物２８６固定化ＢＩＡＣＯＲＥセンサーチップＣＭ５に各種抗体をアナライトとして流したＢＩＡＣＯＲＥセンサーグラム（Ａ：マウスＩｇＭ、Ｂ：マウスＩｇＧ、Ｃ：ニワトリＩｇＹ、Ｄ：ウシ血清アルブミン）
【発明を実施するための形態】
【００５８】
以下、実施例により本発明をさらに詳細に説明するが、本発明がこれらに限定されるものではない。
【００５９】
実施例１ チアゾール誘導体の合成
（合成例１）
【００６０】
【化９】
６−フタルイミド−１−ヘキサナール（４．９５ｇ，２０．２ｍｍｏｌ）を四塩化炭素（１００ｍＬ）に溶解し臭素（１．０３ｍＬ，２０．２ｍｍｏｌ）の四塩化炭素溶液（１００ｍＬ）を滴下し２時間反応した。反応液を水（１００ｍＬ）、飽和食塩水（１００ｍＬ）で洗浄し無水硫酸マグネシウムで乾燥した後、乾燥剤を濾別し溶媒を減圧留去し油状物を得た。得られた油状物をＤＭＦ（１００ｍＬ）に溶解し、４−メチルベンゾイルチオウレア（５．８７ｇ，２６．３ｍｍｏｌ）を加え、１０時間加熱還流した。反応終了後、反応混合物に１Ｍ塩酸（３００ｍＬ）を加え酢酸エチル（３００ｍＬ）で二回抽出し、有機層を合わせて飽和食塩水（３００ｍＬ）で二回洗浄した。有機層を無水硫酸マグネシウムで乾燥した後、乾燥剤を濾別し溶媒を減圧留去した。得られた混合物をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（ヘキサン：酢酸エチル＝２：１）で精製することによって、４−メチル−Ｎ−［５−｛４−（フタルイミド）ブチル｝チアゾール−２−イル］ベンズアミドの白色固体（０．４２４ｇ，５％）を得た。ｍ．ｐ．２０３から２０５℃；１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３，ＴＭＳ，ｐｐｍ）：δ １．５８から１．８２（ｍ，４Ｈ），２．４４（ｓ，３Ｈ），２．８２（ｔ，Ｊ＝７．５Ｈｚ，２Ｈ），３．７２（ｔ，Ｊ＝７．５Ｈｚ，２Ｈ），６．９７（ｓ，１Ｈ），７．３２（ｄ，Ｊ＝７．５Ｈｚ，２Ｈ），７．６９から７．８６（ｍ，４Ｈ），７．９１（ｄ，Ｊ＝７．５Ｈｚ，２Ｈ）。アミドのプロトンは帰属できなかった。
【００６１】
（合成例２）
【００６２】
【化１０】
２−アミノ−４−メチル−５−｛４−（フタルイミド）ブチル｝チアゾール（０．５０ｇ，１．６６ｍｍｏｌ）のクロロホルム（１０ｍＬ）溶液に、４−メチルベンゾイルクロリド（０．３１ｇ，１．９９ｍｍｏｌ）とトリエチルアミン（１ｍＬ）を加え、２日間撹拌した。反応終了後、反応液を水（１０ｍＬ）で洗浄し、有機層を無水硫酸マグネシウムで乾燥した後、乾燥剤を濾別し溶媒を減圧留去した。得られた混合物をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（酢酸エチル−ヘキサン＝１：２）で精製し、４−メチル−Ｎ−［４−メチル−５−｛４−（フタルイミド）ブチル｝チアゾール−２−イル］ベンズアミドの白色固体（０．４０ｇ，５６％）を得た。ｍ．ｐ．１７８から１８０℃；１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３，ＴＭＳ，ｐｐｍ）：δ １．５８から１．６６（ｍ，４Ｈ），２．２１（ｓ，３Ｈ）， ２．４１（ｓ，３Ｈ），２．７３（ｔ，Ｊ＝７．４Ｈｚ，２Ｈ），３．７２（ｔ，Ｊ＝７．５Ｈｚ，２Ｈ），７．２６（ｄ，Ｊ＝７．５Ｈｚ，２Ｈ），７．７６から７．８６（ｍ，６Ｈ）。アミドのプロトンは帰属できなかった。
【００６３】
（合成例３）
【００６４】
【化１１】
Ｎ−（５−ブロモ−６−オキソヘプチル）フタルイミド（１．３０ｇ，３．８５ｍｍｏｌ）のＤＭＦ（２０ｍＬ）溶液に、Ｎ−（３−アセトキシ−４−メチルベンゾイル）チオウレアを加え、８０℃で７時間反応させた。反応終了後、反応混合物に１Ｍ塩酸（３０ｍＬ）を加え酢酸エチル（５０ｍＬ）で二回抽出し、有機層を合わせて飽和食塩水（３０ｍＬ）で二回洗浄した。有機層を無水硫酸マグネシウムで乾燥した後、乾燥剤を濾別し溶媒を減圧留去した。得られた混合物を自動設定中圧カラムクロマトグラフィーシステム（山善社製；Ｒｆ＝０．３２：ヘキサン／酢酸エチル＝１／１）で精製し、得られた褐色固体を酢酸エチル／ヘキサンの混合溶媒で洗浄することによって、白色固体の３−アセトキシ−４−メチル−Ｎ−［４−メチル−５−｛４−（フタルイミド）ブチル｝チアゾール−２−イル］ベンズアミド（０．８２３ｇ，４９％）を得た。：ｍ．ｐ．１７０から１７２℃；１Ｈ−ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６，ＤＭＳＯ，ｐｐｍ）：δ １．６０から１．６６（ｍ，４Ｈ），２．２０（ｓ，３Ｈ），２．２１（ｓ，３Ｈ），２．３５（ｓ，３Ｈ），２．７２から２．７４（ｍ，２Ｈ），３．５３から３．６４（ｍ，２Ｈ），７．４５（ｄ，Ｊ＝７．５Ｈｚ，１Ｈ），７．７９から７．９３（ｍ，６Ｈ），１２．４（ｂｒ ｓ，１Ｈ）。
【００６５】
（合成例４）
【００６６】
【化１２】
モノテレフタル酸メチルクロリド（１．４１ｇ，７．１０ｍｍｏｌ）のクロロホルム（３０ｍＬ）溶液に、氷冷下にて２−アミノ−４−メチル−５−｛４−（フタルイミド）ブチル｝チアゾール（１．５６ｇ，４．７４ｍｍｏｌ）とトリエチルアミン（１．２０ｍＬ，７．９８ｍｍｏｌ）のクロロホルム（１０ｍＬ）溶液を加え、一晩反応させた。反応終了後、反応混合物を水（２０ｍＬ）、飽和食塩水（２０ｍＬ）で順次洗浄し、有機層を無水硫酸マグネシウムで乾燥した後、乾燥剤を濾別し溶媒を減圧留去した。得られた混合物を自動設定中圧カラムクロマトグラフィーシステム（山善社製；Ｒｆ＝０．１６：ヘキサン／酢酸エチル＝２／１）で精製し、４−メトキシカルボニル−Ｎ−［４−メチル−５−｛４−（フタルイミド）ブチル｝チアゾール−２−イル］ベンズアミドの白色固体（０．８１５ｇ，３３％）を得た。：ｍ．ｐ．１７３から１７４℃；１Ｈ−ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６，ＤＭＳＯ，ｐｐｍ）：δ １．６０から１．６７（ｍ，４Ｈ），２．２２（ｓ，３Ｈ），２．７２（ｔ，Ｊ＝７．５Ｈｚ，２Ｈ），３．６２（ｔ，Ｊ＝７．５Ｈｚ，２Ｈ），３．９０（ｄ，３Ｈ），７．８０から７．９０（ｍ，４Ｈ），８．０６から８．２０（ｍ，４Ｈ），１２．７（ｂｒ ｓ，１Ｈ）。
【００６７】
（合成例５）
【００６８】
【化１３】
２−アミノ−４−メチル−５−｛４−（フタルイミド）ブチル｝チアゾール（１．０ｇ，３．１７ｍｍｏｌ）のクロロホルム（１０ｍＬ）溶液に、３−シアノベンゾイルクロリド（０．７９ｇ，４．７５ｍｍｏｌ）を氷冷下にて加えた。次いでトリエチルアミン（０．７２ｍＬ，４．７９ｍｍｏｌ）のクロロホルム（１０ｍＬ）溶液を滴下し、一晩反応させた。反応終了後、反応混合物を水（２０ｍＬ）、飽和食塩水（２０ｍＬ）で順次洗浄し、有機層を無水硫酸マグネシウムで乾燥した後、乾燥剤を濾別し溶媒を減圧留去した。得られた混合物をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（酢酸エチル／ヘキサン＝１／２）で精製し、３−シアノ−Ｎ−［４−メチル−５−｛４−（フタルイミド）ブチル｝チアゾール−２−イル］ベンズアミドの白色固体（０．５７ｇ，４０％）を得た。ｍ．ｐ．１７０から１７２℃；１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３，ＴＭＳ，ｐｐｍ）：δ １．６９から１．７０（ｍ，４Ｈ），１．９７（ｓ，３Ｈ），２．７４（ｔ，Ｊ＝６．５，２Ｈ），３．７３（ｔ，Ｊ＝６．８，２Ｈ），７．５６（ｄｄ，Ｊ＝８．０ ａｎｄ ８．０Ｈｚ，１Ｈ），７．７１から７．８６（ｍ，５Ｈ），８．０５（ｍ，１Ｈ），８．１６（ｓ，１Ｈ）。アミドのプロトンは帰属できなかった。
【００６９】
（参考例１）
アルゴン雰囲気下、４−メチル−Ｎ−｛５−（４−フタルイミドブチル）チアゾール−２−イル｝ベンズアミド（０．１０５ｇ，０．２５ｍｍｏｌ）とフェロセン（０．０２３ｇ，０．１２５ｍｍｏｌ）に、ＤＭＳＯ（１．５ｍＬ）、３Ｍ−ヨウ化トリフルオロメチル／ＤＭＳＯ溶液（０．２５ｍＬ，０．７５ｍｍｏｌ）、１Ｍ−硫酸／ＤＭＳＯ溶液（０．２５ｍＬ，０．２５ｍｍｏｌ）を加えて撹拌した。この溶液に、室温下で３１％過酸化水素水（７５μＬ，０．７５ｍｍｏｌ）を滴下した。反応終了後、反応溶液を水（２００ｍＬ）にあけ、しばらく撹拌した。クロロホルムで抽出し、得られた有機層を硫酸マグネシウムで乾燥した後、乾燥剤を濾別し溶媒を減圧留去した。残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィーで精製することにより、４−メチル−Ｎ−｛４−トリフルオロメチル−５−（４−フタルイミドブチル）チアゾール−２−イル｝ベンズアミドの白色固体（０．０２３ｇ，１９％）を得た。１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３，ＴＭＳ，ｐｐｍ）：δ １．７９から１．８２（ｍ，４Ｈ），２．４７（ｓ，３Ｈ），３．０１（ｔ，Ｊ＝７．５Ｈｚ，２Ｈ），３．７６（ｔ，Ｊ＝７．５Ｈｚ，２Ｈ），７．３４（ｄ，Ｊ＝７．５Ｈｚ，１Ｈ），７．７２から７．９０（ｍ，６Ｈ），９．３７（ｓ，１Ｈ）；１９Ｆ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３，ＴＭＳ，ｐｐｍ）：−６０．８７。
【００７０】
（合成例６から８１）
合成例１または２の方法に準じて、表１から１２に記載したチアゾール誘導体を得た。
【００７１】
【表１】
【００７２】
【表２】
【００７３】
【表３】
【００７４】
【表４】
【００７５】
【表５】
【００７６】
【表６】
【００７７】
【表７】
【００７８】
【表８】
【００７９】
【表９】
【００８０】
【表１０】
【００８１】
【表１１】
【００８２】
【表１２】
（合成例８２）
【００８３】
【化１４】
４−メチル−Ｎ−｛５−（４−フタルイミドブチル）チアゾール−２−イル｝ベンズアミド（０．６０ｇ，１．４３ｍｍｏｌ）のエタノール（１０ｍＬ）溶液に、ヒドラジン一水和物（０．３５ｍＬ、７．１２ｍｍｏｌ）を室温にて加え、一晩撹拌した。反応終了後、反応溶液を減圧留去し、１Ｍ 塩酸（６ｍＬ）を加えた。析出した固体を濾別し、濾液を酢酸エチルで洗浄し、水層を減圧留去した。得られた固体にエタノールとトルエンを加え共沸し十分に乾燥し、固体を瀘取した。得られた固体を酢酸エチルにて洗浄することによって、４−｛２−（４−メチルベンゾイル）アミノチアゾール−５−イル｝ブチルアミン塩酸塩の白色固体（０．４４ｇ，収率：９５％）を得た。１Ｈ−ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６，ＤＭＳＯ，ｐｐｍ）：δ １．６４から１．６７（ｍ，４Ｈ），２．４０（ｓ，３Ｈ），２．７７から２．８０（ｍ，４Ｈ），７．３２（ｓ，１Ｈ），７．３５（ｄ，Ｊ＝７．５Ｈｚ，２Ｈ），８．０１（ｄ，Ｊ＝７．５Ｈｚ，２Ｈ），８．０７（ｂｒ ｓ，３Ｈ）。アミドのプロトンは帰属できなかった。
【００８４】
（合成例８３）
【００８５】
【化１５】
２−クロロ−Ｎ−［４−メチル−５−｛４−（フタルイミド）ブチル｝チアゾール−２−イル］ベンズアミド（０．２２ｇ，０．４８ｍｍｏｌ）のエタノール（５ｍＬ）溶液に、０．０５Ｍのヒドラジンエタノール溶液（３４ｍＬ）を室温にて加え、一晩撹拌した。反応終了後、反応溶液を減圧留去し、１Ｍ 塩酸（３ｍＬ）を加えた。析出した固体を濾別し、濾液を減圧留去した。得られた固体をエタノール並びに酢酸エチルを用いて固体を洗浄することにより、４−｛２−（２−クロロベンゾイルアミノ）−４−メチルチアゾール−５−イル｝ブチルアミン塩酸塩の褐色固体（０．０５０ｇ，収率：２１％）を得た。１Ｈ−ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６，ＤＭＳＯ，ｐｐｍ）：δ １．４２から１．７７（ｍ，４Ｈ），２．２１（ｓ，３Ｈ），２．６３から２．９２（ｍ，４Ｈ），７．３３から７．６７（ｍ，４Ｈ），７．６８から８．１６（ｍ，３Ｈ）。アミドのプロトンは帰属できなかった。
【００８６】
（合成例８４）
【００８７】
【化１６】
３，４−ジクロロ−Ｎ−［４−メチル−５−｛４−（フタルイミド）ブチル｝チアゾール−２−イル］ベンズアミド（０．２５ｇ，０．５１ｍｍｏｌ）のエタノール（５ｍＬ）溶液に、ヒドラジン一水和物（０．０７ｍＬ，１．５３ｍｍｏｌ）を室温にて加え、一晩撹拌した。反応終了後、反応溶液を留去し、１Ｍ 塩酸（３ｍＬ）を加え、室温で一晩撹拌した。析出した固体を濾別し、濾液を減圧留去した。得られた固体をエタノール並びに酢酸エチルを用いて洗浄することにより、４−｛２−（３，４−ジクロロベンゾイルアミノ）−４−メチルチアゾール−５−イル｝ブチルアミン塩酸塩の白色固体（０．１０ｇ， 収率：５０％）を得た。１Ｈ−ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６，ＤＭＳＯ，ｐｐｍ）：δ １．４６から１．７４（ｍ，４Ｈ），２．２４（ｓ，３Ｈ）， ２．６２から２．９１（ｍ，４Ｈ），７．８２（ｄ，Ｊ＝８．４Ｈｚ，１Ｈ），７．８５から７．９９（ｍ，３Ｈ），８．０３から８．１３（ｍ，１Ｈ），８．０４（ｄｄ，Ｊ＝２．０ ａｎｄ ８．４Ｈｚ，１Ｈ），８．３３（ｄ，Ｊ＝２．０Ｈｚ，１Ｈ）。
【００８８】
（合成例８５）
【００８９】
【化１７】
４−メチル−Ｎ−［４−メチル−５-｛４−（フタルイミド）ブチル｝チアゾール−２−イル］ベンズアミド（０．２３ｇ，０．５３ｍｍｏｌ）のエタノール（５ｍＬ）溶液に、ヒドラジン一水和物（０．２３ｍＬ，５．３０ｍｍｏｌ）を加え３時間還流した。反応終了後、反応溶液を留去し、残渣に１Ｍ 塩酸（５ｍＬ）を加え、撹拌した。析出した固体を濾別し、濾液を減圧留去した。得られた固体をエタノール並びに酢酸エチルを用いて洗浄することにより、４−｛４−メチル−２−（４−メチルベンゾイルアミノ）チアゾール−５−イル｝ブチルアミン塩酸塩の白色固体（０．０４３ｇ，収率：２４％）を得た。１Ｈ−ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６，ＤＭＳＯ，ｐｐｍ）：δ １．５５から１．８０（ｍ，４Ｈ），２．２４（ｓ，３Ｈ），２．３９（ｓ，３Ｈ），２．６４から２．９２（ｍ，４Ｈ），７．３４（ｄ，Ｊ＝８．２Ｈｚ，２Ｈ），７．７８から８．０５（ｍ，３Ｈ），７．９９（ｄ，Ｊ＝８．２Ｈｚ，２Ｈ）。アミドのプロトンは帰属できなかった。
【００９０】
（合成例８６）
【００９１】
【化１８】
４−トリフルオロメチル−Ｎ−［４−メチル−５−｛４−（フタルイミド）ブチル｝チアゾール−２−イル］ベンズアミド（０．３０ｇ，０．６２ｍｍｏｌ）のエタノール（５ｍＬ）溶液に、０．０５Ｍ ヒドラジンエタノール溶液（３０ｍＬ）を室温にて加え、２時間還流した。反応終了後、反応溶液を留去し、１Ｍ 塩酸（３ｍＬ）を加え、室温で２時間撹拌した。析出した固体を濾別し、濾液を減圧留去した。得られた固体をエタノール並びに酢酸エチルを用いて洗浄することにより、４−｛４−メチル−２−（４−トリフルオロメチルベンゾイルアミノ）チアゾール−５−イル｝ブチルアミン塩酸塩の白色固体（０．１０ｇ，収率：４１．７％）を得た。１Ｈ−ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６，ＤＭＳＯ，ｐｐｍ）：δ １．４９から１．７３（ｍ，４Ｈ），２．２４（ｓ，３Ｈ），２．６０から２．９０（ｍ，４Ｈ），７．９１（ｄ，Ｊ＝８．１Ｈｚ，２Ｈ），７．９７から８．１９（ｍ，３Ｈ），８．２６（ｄ，Ｊ＝８．１Ｈｚ，２Ｈ）。アミドのプロトンは帰属できなかった。
【００９２】
（合成例８７）
【００９３】
【化１９】
４−メトキシカルボニル−Ｎ−［４−メチル−５−｛４−（フタルイミド）ブチル｝チアゾール−２−イル］−ベンズアミド（０．５３５ｇ，１．１２ｍｍｏｌ）に０．５Ｍヒドラジンエタノール溶液（１３．５ｍＬ）を加え常温で一晩反応させた。反応終了後、溶液を減圧留去した。残渣に１Ｍ塩酸を加え超音波で懸濁し、セライトを敷いたガラスフィルターで固体を濾別した。濾液を減圧留去し固体を再度析出させ、少量の熱エタノールを加え洗浄することによって、４−［２−｛４−（メトキシカルボニル）ベンゾイルアミノ｝−４−メチルチアゾール−５−イル］ブチルアミン塩酸塩の白色固体（０．３６ｇ，収率：８４％）を得た。１Ｈ−ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６，ＤＭＳＯ，ｐｐｍ）：δ １．６０から１．７０（ｍ，４Ｈ），２．４２（ｓ，３Ｈ），２．７２から２．８０（ｍ，４Ｈ），３．９０（ｓ，３Ｈ），７．９７（ｂｒ ｓ，３Ｈ），８．０７から８．２１（ｍ，４Ｈ）。アミドのプロトンは帰属できなかった。
【００９４】
（合成例８８）
【００９５】
【化２０】
３−アセトキシ−４−メチル−Ｎ−［４−メチル−５−｛４−（フタルイミド）ブチル｝チアゾール−２−イル］ベンズアミド（０．８０ｇ，１．６２ｍｍｏｌ）に０．５Ｍヒドラジンエタノール溶液（１０ｍＬ）を加え常温で一晩反応させた。反応終了後、溶液を減圧留去した後、残渣に１Ｍ塩酸を加え超音波で懸濁し、セライトを敷いたガラスフィルターで固体を濾別した。濾液を減圧留去し固体を再度析出させ、少量の熱エタノールを加え洗浄することによって、４−｛２−（３−ヒドロキシ４−メチルベンゾイルアミノ）−４−メチルチアゾール−５−イル｝ブチルアミン塩酸塩の白色固体（０．４８ｇ，収率：７５％）を得た。１Ｈ−ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６，ＤＭＳＯ，ｐｐｍ）：δ １．６０から１．７０（ｍ，４Ｈ），２．１９（ｓ，３Ｈ），２．２３（ｓ，３Ｈ），２．７２から２．８１（ｍ，４Ｈ），７．２０（ｄ，Ｊ＝７．５Ｈｚ，１Ｈ），７．４４から７．５０（ｍ，２Ｈ），７．９４（ｂｒ ｓ，３Ｈ）９．８０（ｂｒ ｓ，１Ｈ）。アミドのプロトンは帰属できなかった。
【００９６】
（合成例８９）
【００９７】
【化２１】
３−シアノ−Ｎ−［４−メチル−５−｛４−（フタルイミド）ブチル｝チアゾール−２−イル］ベンズアミドに０．５Ｍヒドラジンエタノール溶液（７ｍＬ）を加え常温で一晩反応させた。反応終了後、溶媒を減圧留去し、残渣に１Ｍ塩酸を加え超音波で懸濁し、セライトを敷いたガラスフィルターで濾過した。溶媒を減圧留去し、少量のエタノールを加え溶解した後、酢酸エチルで再沈殿させて精製し、４−｛２−（３−シアノベンゾイルアミノ）−４−メチルチアゾール−５−イル｝ブチルアミン塩酸塩の白色固体（０．２５ｇ，収率：４６％）を得た。１Ｈ−ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６，ＤＭＳＯ，ｐｐｍ）：δ １．６２から１．６５（ｍ，４Ｈ），２．２４（ｓ，３Ｈ），３．４３から３．４６（ｍ，４Ｈ），７．５６（ｄｄ，Ｊ＝８．０ ａｎｄ ８．０Ｈｚ，１Ｈ），８．０５（ｄ，Ｊ＝８．０Ｈｚ，１Ｈ），８．１０から８．２２（ｍ，４Ｈ），８．４９（ｓ，１Ｈ）。アミドのプロトンは帰属できなかった。
【００９８】
（合成例９０から１７９）
合成例８９の方法に準じて、表１３から２６に記載したチアゾール誘導体を得た。
【００９９】
【表１３】
【０１００】
【表１４】
【０１０１】
【表１５】
【０１０２】
【表１６】
【０１０３】
【表１７】
【０１０４】
【表１８】
【０１０５】
【表１９】
【０１０６】
【表２０】
【０１０７】
【表２１】
【０１０８】
【表２２】
【０１０９】
【表２３】
【０１１０】
【表２４】
【０１１１】
【表２５】
【０１１２】
【表２６】
合成例１から８１に例示した方法によって合成した本発明に関わるチアゾール誘導体（４）を表２７から３２にまとめて例示した。
【０１１３】
【化２２】
【０１１４】
【表２７】
【０１１５】
【表２８】
【０１１６】
【表２９】
【０１１７】
【表３０】
【０１１８】
【表３１】
【０１１９】
【表３２】
また、合成例８２から１７９に例示した方法によって合成した本発明に関わるチアゾール誘導体（１ａ）を表３３から４１にまとめて例示した。
【０１２０】
【化２３】
【０１２１】
【表３３】
【０１２２】
【表３４】
【０１２３】
【表３５】
【０１２４】
【表３６】
【０１２５】
【表３７】
【０１２６】
【表３８】
【０１２７】
【表３９】
【０１２８】
【表４０】
【０１２９】
【表４１】
（参考例２）
【０１３０】
【化２４】
化合物２７６（２．５０ｇ，８．６４ｍｍｏｌ）のクロロホルム（５０ｍＬ）溶液にトリエチルアミン（２．５０ｍＬ，１８ｍｍｏｌ）を添加した。次に氷冷下でメタクリル酸クロリド（０．９３ｍＬ，９．５ｍｍｏｌ）を滴下したのち、氷冷下で３０分反応させた。反応終了後、反応混合物にクロロホルム（５０ｍＬ）を追加し、水（１００ｍＬ）、飽和炭酸ナトリウム水溶液（１００ｍＬ）、飽和食塩水（１００ｍＬ）で順次洗浄した。有機層を無水硫酸マグネシウムで乾燥した後、乾燥剤を濾別し溶媒を減圧留去した。得られた混合物をシリカゲルクロマトグラフィー（酢酸エチル／ヘキサン＝１／２（ｖ／ｖ））で精製することで、淡黄色粘性液体の４−メチル−Ｎ−［４−メチル−５−｛３−（２−プロペニルカルボニルアミノ）プロピル｝チアゾール−２−イル］ベンズアミド（１．０７ｇ，３．０ｍｍｏｌ，収率：３５％）を得た。１Ｈ−ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６，ＤＭＳＯ，ｐｐｍ）：δ １．７０から１．８２（ｍ，２Ｈ），１．８７（ｓ，３Ｈ），２．２１（ｓ，３Ｈ），２．３９（ｓ，３Ｈ），２．６８（ｔ，Ｊ＝７．５Ｈｚ，２Ｈ），３．１０から３．２５（ｍ，２Ｈ），５．３２（ｓ，１Ｈ），５．６４（ｓ，１Ｈ），７．３４（ｄ，Ｊ＝８．５Ｈｚ，２Ｈ），７．９０（ｓ，１Ｈ），７．９８（ｄ，Ｊ＝８．５Ｈｚ，２Ｈ）。
【０１３１】
実施例２ チアゾール誘導体のアガロースゲルへの固定化（その１）
チアゾール誘導体を４０μｍｏｌ／ｍＬになるようＤＭＳＯに溶解し、これに等量の０．５Ｍ 塩化ナトリウムを含む０．２Ｍ 炭酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ８．３）を加えて濃度２０μｍｏｌ／ｍＬのチアゾール誘導体溶液を調製した。Ｎ−ヒドロキシスクシニミド（ＮＨＳ）にて活性化されたアガロースゲルであるＨｉＴｒａｐ ＮＨＳ−ａｃｔｉｖａｔｅｄ ＨＰ １ｍＬ（商品名）（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス株式会社製；以下ＨｉＴｒａｐカラムと略記する）に、非特許文献３に記載された方法に従って前記チアゾール誘導体溶液を２ｍＬ通液することによって固定化を行なった。未反応のスクシンイミドオキシカルボニル基のブロッキングは、非特許文献３に記載された方法に従って行なった。固定化量は非特許文献３に記載された方法のうち「Ｂ．酸性条件法」に従って、ＨｉＴｒａｐカラム通液前後のリガンド（チアゾール誘導体）溶液の紫外吸収極大波長（３００ｎｍ付近）における吸光度をＵ−２９００スペクトロフォトメーター（日立製作所製）で測定することにより算出した。当該方法で固定化した各化合物の固定化リガンド密度を表４２に示す。なお、本実施例以降で記載の化合物番号は表３３から４１記載の化合物番号に対応する。
【０１３２】
【表４２】
実施例３ チアゾール誘導体のアガロースゲルへの固定化（その２）
チアゾール誘導体を２０μｍｏｌ／ｍＬ、トリエチルアミンを４０μｍｏｌ／ｍＬ含むＤＭＳＯ溶液を調製した。ＨｉＴｒａｐカラムをＤＭＳＯで置換後、これに前記チアゾール誘導体−トリエチルアミンのＤＭＳＯ溶液を２ｍＬ通液した。一時間放置した後、ＨｉＴｒａｐカラムに３ｍＬのＤＭＳＯを通液して、さらに５ｍＬの０．５Ｍ 塩化ナトリウムを含む０．２Ｍ 炭酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ８．３）を通液した。未反応のスクシンイミドオキシカルボニル基のブロッキングは、非特許文献３に記載された方法に従って行なった。固定化量は非特許文献３に記載された方法のうち「Ｂ．酸性条件法」に従って、ＨｉＴｒａｐカラム通液前後のリガンド（チアゾール誘導体）溶液の紫外吸収極大波長（３００ｎｍ付近）における吸光度をＵ−２９００スペクトロフォトメーター（日立製作所製）で測定することにより算出した。当該方法で固定化した化合物３０４の固定化リガンド密度を表４３に示す。
【０１３３】
【表４３】
実施例４ チアゾール誘導体固定化アガロースゲルを用いたタンパク質の吸脱着（その１）
実施例２あるいは３に記載の方法にて調製したチアゾール誘導体固定化ＨｉＴｒａｐカラムをＡＫＴＡｐｒｉｍｅ ｐｌｕｓ（商品名）（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス株式会社製クロマトグラフィー装置）に取り付け、０．７Ｍ 硫酸ナトリウムを含む１０ｍＭ リン酸ナトリウム−１０ｍＭ クエン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．５）（以下平衡化緩衝液と呼ぶ）を２０ｍＬ通液し平衡化した。ＡＫＴＡｐｒｉｍｅ ｐｌｕｓを流速１ｍＬ／ｍｉｎで自動運転し、平衡化緩衝液を１０ｍＬ通液後、同緩衝液に溶解したヒト血漿由来免疫グロブリン製剤（化血研製、本製剤の免疫グロブリンは免疫グロブリンＧである）０．５ｍｇ（ＯＤ２８０＝０．７）を添加してカラムに通液した。さらに平衡化緩衝液を１０ｍＬ通液後、平衡化緩衝液から１０ｍＭ リン酸ナトリウム−１０ｍＭ クエン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．５）への硫酸ナトリウムに関する直線濃度勾配クロマトグラフィーを行なった。免疫グロブリンのカラムからの溶出は２８０ｎｍにおける吸光度をモニターして検出した。溶出液は１ｍＬずつ分画し、各フラクションの２８０ｎｍにおける吸光度をＵ−２９００スペクトロフォトメーター（日立製作所製）で測定し回収率を算出した。チアゾール誘導体を固定化したＨｉＴｒａｐカラムを用いて行なったクロマトグラフィーの結果を図１から図６に示し、これらのクロマトグラフィーにおける免疫グロブリンの回収率を表４４に示す。いずれのチアゾール誘導体を用いたときも免疫グロブリンは５０％以上の回収率で回収され、チアゾール誘導体固定化ＨｉＴｒａｐカラムによる免疫グロブリンの吸脱着が確認された。特に化合物２８６、３０４、３２９を用いた場合の回収率は９０％以上と極めて高かった。
【０１３４】
【表４４】
それぞれの吸脱着操作後には１００ｍＭ 水酸化ナトリウム水溶液を１０ｍＬ通液してカラムの再生を行なった。前記のチアゾール誘導体固定化ＨｉＴｒａｐカラムはいずれもこの再生処理によって初期状態に復帰させることができ、繰り返し使用によってもその特性は変化しなかった。
【０１３５】
実施例５ チアゾール誘導体固定化アガロースゲルを用いたタンパク質の吸脱着（その２）
実施例２あるいは３に記載の方法にて調製したチアゾール誘導体固定化ＨｉＴｒａｐカラムをＡＫＴＡｐｒｉｍｅ ｐｌｕｓ（商品名）（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス株式会社製クロマトグラフィー装置）に取り付け、前記平衡化緩衝液を２０ｍＬ通液し平衡化した。ＡＫＴＡｐｒｉｍｅ ｐｌｕｓを流速１ｍＬ／ｍｉｎで自動運転し、平衡化緩衝液を１０ｍＬ通液後、同緩衝液に溶解したウシ血清アルブミン（ＳＩＧＭＡ社製）０．５ｍｇ（ＯＤ２８０＝０．３）を添加してカラムに通液した。さらに平衡化緩衝液を１０ｍＬ通液後、平衡化緩衝液から１０ｍＭ リン酸ナトリウム−１０ｍＭ クエン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．５）への硫酸ナトリウムに関する直線濃度勾配クロマトグラフィーを行なった。ウシ血清アルブミンのカラムからの溶出は２８０ｎｍにおける吸光度をモニターして検出した。溶出液は１ｍＬずつ分画し、各フラクションの２８０ｎｍにおける吸光度をＵ−２９００スペクトロフォトメーター（日立製作所製）で測定し回収率を算出した。各種チアゾール誘導体を固定化したＨｉＴｒａｐカラムを用いて行なったクロマトグラフィーの結果を図７から１２に示す。また、これらのクロマトグラフィーにおけるウシ血清アルブミンの回収率を表４５に示す。いずれのチアゾール誘導体を用いたときもウシ血清アルブミンは１０番目の画分までに溶出しており、カラムへの吸着はほとんど見られなかった。また、図１から６に示した免疫グロブリンを通液したときの結果とは大きく異なっていた。よって、本発明のチアゾール誘導体固定化マトリックスを用いることで、試料中の免疫グロブリンとウシ血清アルブミンとの分離が可能であることが示された。
【０１３６】
【表４５】
それぞれの吸脱着操作後には１００ｍＭ 水酸化ナトリウム水溶液を１０ｍＬ通液してカラムの再生を行なった。前記のチアゾール誘導体を固定化ＨｉＴｒａｐカラムはいずれもこの再生処理によって初期状態に復帰させることができ、繰り返し使用によってもその特性は変化しなかった。
【０１３７】
実施例６ チアゾール誘導体固定化アガロースゲルを用いたタンパク質の吸脱着（その３）
実施例２に記載の方法にて調製した化合物２８６を固定化したＨｉＴｒａｐカラムをＡＫＴＡｐｒｉｍｅ ｐｌｕｓ（商品名）（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス株式会社製クロマトグラフィー装置）に取り付け、前記平衡化緩衝液を２０ｍＬ通液し平衡化した。ＡＫＴＡｐｒｉｍｅ ｐｌｕｓを流速１ｍＬ／ｍｉｎで自動運転し、平衡化緩衝液を１０ｍＬ通液後、同緩衝液に溶解したリボヌクレア−ゼＡ、リゾチ−ム、αキモトリプシノ−ゲンＡの混合液（リボヌクレア−ゼＡ ０．１５ｍｇ、リゾチ−ム ０．０３ｍｇ、αキモトリプシノ−ゲンＡ ０．０４ｍｇ）（ＯＤ２８０＝０．２４）を添加してカラムに通液した。さらに平衡化緩衝液を１０ｍＬ通液後、平衡化緩衝液から１０ｍＭ リン酸ナトリウム−１０ｍＭ クエン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．５）への硫酸ナトリウムに関する直線濃度勾配クロマトグラフィーを行なった。タンパク質のカラムからの溶出は２８０ｎｍにおける吸光度の吸光度をモニターして検出した。溶出液は１ｍＬずつ分画し、各フラクションの２８０ｎｍにおける吸光度をＵ−２９００スペクトロフォトメーター（日立製作所製）で測定し回収率を算出した。化合物２８６を固定化したＨｉＴｒａｐカラムを用いて行なったクロマトグラフィーの結果を図１３に示し、このクロマトグラフィーにおけるタンパク質の回収率を表４６に示す。いずれのタンパク質も１０番目の画分以内に溶出しており、免疫グロブリン（２５番目から４５番目までの画分に溶出、図１参照）とは異なる画分となった。このことから、本発明のチアゾール誘導体固定化マトリックスを用いることで、試料中の免疫グロブリンとリボヌクレア−ゼＡ、リゾチ−ム、αキモトリプシノ−ゲンＡとの分離が可能であることが示された。
【０１３８】
【表４６】
吸脱着操作後には１００ｍＭ 水酸化ナトリウム水溶液を１０ｍＬ通液してカラムの再生を行なった。前記のチアゾール誘導体固定化ＨｉＴｒａｐカラムはこの再生処理によって初期状態に復帰させることができ、繰り返し使用によってもその特性は変化しなかった。
【０１３９】
実施例７ チアゾール誘導体固定化アガロースゲルを用いたタンパク質の吸脱着（その４）
ヒト−マウスキメラ抗体であるリツキサン（商品名）（中外製薬株式会社製、１０ｍｇ／ｍＬ）を固定化パパイン（Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ Ｐａｐａｉｎ、ＰＩＥＲＣＥ株式会社製）を用い、同説明書記載の方法で３７℃、１０時間処理することによって、限定加水分解物を得た。
【０１４０】
実施例２に記載の方法にて調製した化合物２８６を固定化したＨｉＴｒａｐカラムをＡＫＴＡｐｒｉｍｅ ｐｌｕｓ（商品名）（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス株式会社製クロマトグラフィー装置）に取り付け、前記平衡化緩衝液を２０ｍＬ通液し平衡化した。ＡＫＴＡｐｒｉｍｅ ｐｌｕｓを流速１ｍＬ／ｍｉｎで自動運転し、平衡化緩衝液を１０ｍＬ通液後、上記パパイン処理抗体を１．２ｍｇ（ＯＤ２８０＝１．７）添加してカラムに通液した。さらに平衡化緩衝液を１０ｍＬ通液後、平衡化緩衝液から１０ｍＭ リン酸ナトリウム−１０ｍＭ クエン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．５）への硫酸ナトリウムに関する直線濃度勾配クロマトグラフィーを行なった。タンパク質のカラムからの溶出は２８０ｎｍにおける吸光度のモニターにより検出し、溶出液は１ｍＬずつ分画した。このクロマトグラフィーの結果を図１４に示す。またこのうち７、２９、３９、４３番目の画分（それぞれＩ、ＩＩ、ＩＩＩ、ＩＶと表記）についてそれぞれ５μＬを還元条件下で１５％アクリルアミドを含むＳＤＳ−ＰＡＧＥにかけ、銀染色試薬（銀染色「第一」（商品名）、第一化学薬品株式会社製）を用いて染色した（図１５）。これにより、ＩはＦａｂ（Ｈ鎖に由来する２７ｋＤａタンパク質とＬ鎖である２７ｋＤａタンパク質より構成される）、ＩＩはＦｃ（Ｈ鎖に由来する３０ｋＤａタンパク質のダイマーで構成される）、ＩＩＩは部分消化抗体（Ｈ鎖である６０ｋＤａタンパク質とＨ鎖に由来する３０ｋＤａタンパク質とＬ鎖である２７ｋＤａタンパク質で構成される）、ＩＶは未消化抗体（Ｈ鎖である６０ｋＤａタンパク質のダイマーとＬ鎖である２７ｋＤａタンパク質のダイマーで構成される）と同定され、抗体に由来する各フラグメントの分離が可能であることが示された。
【０１４１】
実施例８ チアゾール誘導体のビニルポリマーゲルへの固定化（その１）
遠沈管に化合物２８６（１０２ｍｇ、０．３ｍｍｏｌ）を計り取り、１，２−ジメトキシベンゼンのアセトニトリル溶液（１ｍｍｏｌ／ｍＬ）を０．３ｍＬ添加した。次いで、遠沈管にアセトニトリル（１．７ｍＬ）、緩衝液（組成：０．２Ｍ ＮａＨＣＯ３、０．５Ｍ ＮａＣｌ、ｐＨ８．３；８ｍＬ）、トリエチルアミン（９０μＬ、０．６ｍｍｏｌ）を添加して化合物２８６が溶解したことを確認したのち、０．３ｇのエポキシトヨパール（商品名）ゲル（東ソー株式会社製、エポキシ基含量：８０４μｍｏｌ／ｇ（ｇｅｌ））を添加した。上記操作によって得られた混合物の入った遠沈管を内温４０℃に設定した卓上振盪機にセットし、１６５ｒｐｍで１６時間攪拌振盪した。反応終了後、遠沈管にアセトニトリル（５ｍＬ）を添加し、グラスフィルターでトヨパールゲルと反応溶液を分離した。次にグラスフィルター上のトヨパールゲルを洗浄液（組成：ＣＨ３ＣＮ／ＭｅＯＨ／５０ｍＭ ＮＨ４Ｈ２ＰＯ４＝４／１／５；１０ｍＬ）で２回洗浄した。反応溶液と洗浄液を合わせ、高速液体クロマトグラフィー（カラム：東ソー株式会社製 ＴＳＫ−ｇｅｌ ＯＤＳ−８０ＴＭ（商品名）（内径４．６ｍｍ×長さ１５ｃｍ）、溶離液：ＣＨ３ＣＮ／ＭｅＯＨ／５０ｍＭ ＮＨ４Ｈ２ＰＯ４＝４／１／５、流速：１ｍＬ／ｍｉｎ、温度：２５℃、検出：ＵＶ ２５４ｎｍ）にて残存する化合物２８６を定量することによって、エポキシトヨパールに化合物２８６が１２７μｍｏｌ／ｍＬ（ｇｅｌ）固定化されていることを確認した。更に、上記の操作によって得られたトヨパールゲル中の未反応のエポキシ基をブロックするため、得られたトヨパールゲルを遠沈管に入れブロッキング溶液（組成：０．５Ｍ モノエタノールアミン、０．５Ｍ 塩化ナトリウム、ｐＨ８．３（溶媒は水）；５ｍＬ）を添加した。反応溶液が入った遠沈管を、内温４０℃に設定した卓上振盪機にセットし、１６５ｒｐｍで１６時間攪拌振盪することによりゲル中の残存エポキシ基をモノエタノールアミンでブロックした。反応終了後、遠沈管にアセトニトリル（５ｍＬ）を添加し、グラスフィルターにてトヨパールゲルとブロッキング溶液を分離した。次いで、ゲルをエタノール（５ｍＬ）、水（５ｍＬ）でそれぞれ２回ずつ洗浄し、化合物２８６が固定化されたエポキシトヨパールゲルを得た。また、ブロッキング溶液と洗浄液を合わせた溶液中に残存する化合物２８６を高速液体クロマトグラフィーで測定したところ、ブロッキング溶液と洗浄液を合わせた溶液中に化合物２８６は残存していないことが確認された。
【０１４２】
実施例９ チアゾール誘導体のビニルポリマーゲルへの固定化（その２）
遠沈管に化合物３２９（１０７ｍｇ、０．３ｍｍｏｌ）を計り取り、１，２−ジメトキシベンゼンのアセトニトリル溶液（１ｍｍｏｌ／ｍＬ）を０．３ｍＬ添加した。次いで、遠沈管にアセトニトリル（１．７ｍＬ）、０．５Ｍ 水酸化ナトリウム水溶液（２．４ｍＬ）、水（５．６ｍＬ）を添加して化合物３２９が溶解したことを確認したのち、０．３ｇのエポキシトヨパール（商品名）ゲル（東ソー株式会社製、エポキシ基含量：８０４μｍｏｌ／ｇ（ｇｅｌ））を添加した。上記操作によって得られた混合物の入った遠沈管を内温４０℃に設定した卓上振盪機にセットし、１６５ｒｐｍで２４時間攪拌振盪した。反応終了後、遠沈管にアセトニトリル（５ｍＬ）を添加し、グラスフィルターでトヨパールゲルと反応溶液を分離した。次にグラスフィルター上のトヨパールゲルを洗浄液（組成：ＣＨ３ＣＮ／ＭｅＯＨ／５０ｍＭ ＮＨ４Ｈ２ＰＯ４＝４／１／５；１０ｍＬ）で２回洗浄した。反応溶液と洗浄液を合わせ、高速液体クロマトグラフィー（カラム：東ソー株式会社製 ＴＳＫ−ｇｅｌ ＯＤＳ−８０ＴＭ（内径４．６ｍｍ×長さ１５ｃｍ）、溶離液：ＣＨ３ＣＮ／ＭｅＯＨ／５０ｍＭ ＮＨ４Ｈ２ＰＯ４＝４／１／５、流速：１ｍＬ／ｍｉｎ、温度：２５℃、検出：ＵＶ ２５４ｎｍ）にて残存する化合物３２９を定量することによって、エポキシトヨパールに化合物３２９が８１μｍｏｌ／ｍＬ（ｇｅｌ）固定化されていることが確認された。更に、上記の操作によって得られたトヨパールゲル中の未反応のエポキシ基をブロックするため、得られたトヨパールゲルを遠沈管に入れブロッキング溶液（組成：０．５Ｍ モノエタノールアミン、０．５Ｍ 塩化ナトリウム水溶液、ｐＨ８．３（溶媒は水）；５ｍＬ）を添加した。反応溶液が入った遠沈管を、内温４０℃に設定した卓上振盪機にセットし、１６５ｒｐｍで２０時間攪拌振盪することによりゲル中の残存エポキシ基をモノエタノールアミンでブロックした。反応終了後、遠沈管にアセトニトリル（５ｍＬ）を添加し、グラスフィルターにてトヨパールゲルとブロッキング溶液を分離した。次いで、ゲルをエタノール（５ｍＬ）、水（５ｍＬ）でそれぞれ２回ずつ洗浄し、化合物３２９が固定化されたエポキシトヨパールゲルを得た。また、ブロッキング溶液と洗浄液を合わせた溶液中に残存する化合物３２９を高速液体クロマトグラフィーで測定したところ、ブロッキング溶液と洗浄液を合わせた溶液中に化合物３２９は残存していないことが確認された。
【０１４３】
実施例１０ チアゾール誘導体のビニルポリマーゲルへの固定化（その３）
遠沈管に化合物２８６（３０ｍｇ、８８μｍｏｌ）を計り取り、１，２−ジメトキシベンゼンのアセトニトリル溶液（１ｍｍｏｌ／ｍＬ）を０．１ｍＬ添加した。次いで、遠沈管にアセトニトリル（２．４ｍＬ）、緩衝液（組成：０．１Ｍ Ｎａ２ＨＰＯ４−ＮａＨ２ＰＯ４、ｐＨ７．０；２．５ｍＬ）、トリエチルアミン（３０μＬ、０．２ｍｍｏｌ）を添加して化合物２８６が溶解したことを確認したのち、３ｍＬのホルミルトヨパール（商品名）ゲル（東ソー株式会社製、ホルミル基含量：６５μｍｏｌ／ｇ（ｇｅｌ））を添加した。上記操作によって得られた混合物の入った遠沈管を内温２５℃に設定した卓上振盪機にセットし、１６５ｒｐｍで攪拌振盪した。攪拌振盪を開始してから３０分後、遠沈管にボラン−ピリジン複合体（２５０μＬ、２．５ｍｍｏｌ）を添加し、さらに１６５ｒｐｍで２．５時間攪拌振盪した。反応終了後、遠沈管にアセトニトリル（５ｍＬ）を添加し、グラスフィルターでトヨパールゲルと反応溶液を分離した。次にグラスフィルター上のトヨパールゲルを洗浄液（組成：ＣＨ３ＣＮ／ＭｅＯＨ／５０ｍＭ ＮＨ４Ｈ２ＰＯ４＝４／１／５；１０ｍＬ）で２回洗浄した。反応溶液と洗浄液を合わせ、高速液体クロマトグラフィー（カラム：東ソー株式会社製 ＴＳＫ−ｇｅｌ ＯＤＳ−８０ＴＭ（商品名）（内径４．６ｍｍ×長さ１５ｃｍ）、溶離液：ＣＨ３ＣＮ／ＭｅＯＨ／５０ｍＭ ＮＨ４Ｈ２ＰＯ４＝４／１／５、流速：１ｍＬ／ｍｉｎ、温度：２５℃、検出：ＵＶ ２５４ｎｍ）にて残存する化合物２８６を定量することによって、化合物２８６が１９μｍｏｌ／ｍＬ（ｇｅｌ）固定化されたホルミルトヨパールゲルを得た。
【０１４４】
実施例１１ チアゾール誘導体のビニルポリマーゲルへの固定化（その４）
遠沈管に化合物３２０（１１１ｍｇ、０．３ｍｍｏｌ）を計り取り、１，２−ジメトキシベンゼンのアセトニトリル溶液（１ｍｍｏｌ／ｍＬ）を０．３ｍＬ添加した。次いで、遠沈管にアセトニトリル（１．７ｍＬ）、０．５Ｍ 水酸化ナトリウム水溶液（０．６ｍＬ）、水（７．４ｍＬ）を添加して化合物３２０が溶解したことを確認したのち、０．３ｇのエポキシトヨパール（商品名）ゲル（東ソー株式会社製、エポキシ基含量：８０４μｍｏｌ／ｇ（ｇｅｌ））を添加した。上記操作によって得られた混合物の入った遠沈管を内温４０℃に設定した卓上振盪機にセットし、１６５ｒｐｍで２４時間攪拌振盪した。反応終了後、遠沈管にアセトニトリル（５ｍＬ）を添加し、グラスフィルターでトヨパールゲルと反応溶液を分離した。次にグラスフィルター上のトヨパールゲルを洗浄液（組成：ＣＨ３ＣＮ／ＭｅＯＨ／５０ｍＭ ＮＨ４Ｈ２ＰＯ４＝４／１／５；１０ｍＬ）で２回洗浄した。反応溶液と洗浄液を合わせ、高速液体クロマトグラフィー（カラム：東ソー株式会社製 ＴＳＫ−ｇｅｌ ＯＤＳ−８０ＴＭ（商品名）（内径４．６ｍｍ×長さ１５ｃｍ）、溶離液：ＣＨ３ＣＮ／ＭｅＯＨ／５０ｍＭ ＮＨ４Ｈ２ＰＯ４＝４／１／５、流速：１ｍＬ／ｍｉｎ、温度：２５℃、検出：ＵＶ２５４ｎｍ）にて残存する化合物３２０を定量することによって、エポキシトヨパールに化合物３２０が１７６μｍｏｌ／ｍＬ（ｇｅｌ）固定化されていることが確認された。更に、上記の操作によって得られたトヨパールゲル中の未反応のエポキシ基をブロックするため、得られたトヨパールゲルを遠沈管に入れブロッキング溶液（組成：０．５Ｍ モノエタノールアミン、０．５Ｍ 塩化ナトリウム水溶液（溶媒は水）、ｐＨ８．３；５ｍＬ）を添加した。反応溶液が入った遠沈管を、内温４０℃に設定した卓上振盪機にセットし、１６５ｒｐｍで２０時間攪拌振盪することによりゲル中の残存エポキシ基をモノエタノールアミンでブロックした。反応終了後、遠沈管にアセトニトリル（５ｍＬ）を添加し、グラスフィルターにてトヨパールゲルとブロッキング溶液を分離した。次いで、ゲルをエタノール（５ｍＬ）、水（５ｍＬ）でそれぞれ２回ずつ洗浄し、化合物３２０が固定化されたエポキシトヨパールゲルを得た。また、ブロッキング溶液と洗浄液を合わせた溶液中に残存する化合物３２０を高速液体クロマトグラフィーで測定したところ、ブロッキング溶液と洗浄液を合わせた溶液中に化合物３２０は残存していないことが確認された。
【０１４５】
実施例１２ チアゾール誘導体のビニルポリマーゲルへの固定化（その５）
遠沈管に化合物３８４（１１２ｍｇ、０．３ｍｍｏｌ）を計り取り、１，２−ジメトキシベンゼンのアセトニトリル溶液（１ｍｍｏｌ／ｍＬ）を０．３ｍＬ添加した。次いで、遠沈管にアセトニトリル（１．７ｍＬ）、０．５Ｍ 水酸化ナトリウム水溶液（０．９ｍＬ）、水（７．１ｍＬ）を添加して化合物３８４が溶解したことを確認したのち、０．３ｇのエポキシトヨパール（商品名）ゲル（東ソー株式会社製、エポキシ基含量：８０４μｍｏｌ／ｇ（ｇｅｌ））を添加した。上記操作によって得られた混合物の入った遠沈管を内温４０℃に設定した卓上振盪機にセットし、１６５ｒｐｍで２４時間攪拌振盪した。反応終了後、遠沈管にアセトニトリル（５ｍＬ）を添加し、グラスフィルターでトヨパールゲルと反応溶液を分離した。次にグラスフィルター上のトヨパールゲルを洗浄液（組成：ＣＨ３ＣＮ／ＭｅＯＨ／５０ｍＭ ＮＨ４Ｈ２ＰＯ４＝４／１／５；１０ｍＬ）で２回洗浄した。反応溶液と洗浄液を合わせ、高速液体クロマトグラフィー（カラム：東ソー株式会社製 ＴＳＫ−ｇｅｌ ＯＤＳ−８０ＴＭ（商品名）（内径４．６ｍｍ×長さ１５ｃｍ）、溶離液：ＣＨ３ＣＮ／ＭｅＯＨ／５０ｍＭ ＮＨ４Ｈ２ＰＯ４＝４／１／５、流速：１ｍＬ／ｍｉｎ、温度：２５℃、検出：ＵＶ ２５４ｎｍ）にて残存する化合物３８４を定量することによって、エポキシトヨパールに化合物３８４が１２６μｍｏｌ／ｍＬ（ｇｅｌ）固定化されていることが確認された。更に、上記の操作によって得られたトヨパールゲル中の未反応のエポキシ基をブロックするため、得られたトヨパールゲルを遠沈管に入れブロッキング溶液（組成：０．５Ｍ モノエタノールアミン、０．５Ｍ 塩化ナトリウム水溶液、ｐＨ８．３（溶媒は水）；５ｍＬ）を添加した。反応溶液が入った遠沈管を、内温４０℃に設定した卓上振盪機にセットし、１６５ｒｐｍで２０時間攪拌振盪することによりゲル中の残存エポキシ基をモノエタノールアミンでブロックした。反応終了後、遠沈管にアセトニトリル（５ｍＬ）を添加し、グラスフィルターにてトヨパールゲルとブロッキング溶液を分離した。次いで、ゲルをエタノール（５ｍＬ）、水（５ｍＬ）でそれぞれ２回ずつ洗浄し、化合物３８４が固定化されたエポキシトヨパールゲルを得た。また、ブロッキング溶液と洗浄液を合わせた溶液中に残存する化合物３８４を高速液体クロマトグラフィーで測定したところ、ブロッキング溶液と洗浄液を合わせた溶液中に化合物３８４は残存していないことが確認された。
【０１４６】
実施例１３ チアゾール誘導体のビニルポリマーゲルへの固定化（その６）
遠沈管に化合物４２３（１１１ｍｇ、０．３ｍｍｏｌ）を計り取り、１，２−ジメトキシベンゼンのアセトニトリル溶液（１ｍｍｏｌ／ｍＬ）を０．３ｍＬ添加した。次いで、遠沈管にアセトニトリル（１．７ｍＬ）、０．５Ｍ 水酸化ナトリウム水溶液（０．９ｍＬ）、水（７．１ｍＬ）を添加して化合物４２３が溶解したことを確認したのち、０．３ｇのエポキシトヨパール（商品名）ゲル（東ソー株式会社製、エポキシ基含量：８０４μｍｏｌ／ｇ（ｇｅｌ））を添加した。上記操作によって得られた混合物の入った遠沈管を内温４０℃に設定した卓上振盪機にセットし、１６５ｒｐｍで２４時間攪拌振盪した。反応終了後、遠沈管にアセトニトリル（５ｍＬ）を添加し、グラスフィルターでトヨパールゲルと反応溶液を分離した。次にグラスフィルター上のトヨパールゲルを洗浄液（組成：ＣＨ３ＣＮ／ＭｅＯＨ／５０ｍＭ ＮＨ４Ｈ２ＰＯ４＝４／１／５；１０ｍＬ）で２回洗浄した。反応溶液と洗浄液を合わせ、高速液体クロマトグラフィー（カラム：東ソー株式会社製 ＴＳＫ−ｇｅｌ ＯＤＳ−８０ＴＭ（商品名）（内径４．６ｍｍ×長さ１５ｃｍ）、溶離液：ＣＨ３ＣＮ／ＭｅＯＨ／５０ｍＭ ＮＨ４Ｈ２ＰＯ４＝４／１／５、流速：１ｍＬ／ｍｉｎ、温度：２５℃、検出：ＵＶ ２５４ｎｍ）にて残存する化合物４２３を定量することによって、エポキシトヨパールに化合物４２３が１１４μｍｏｌ／ｍＬ（ｇｅｌ）固定化されていることが確認された。更に、上記の操作によって得られたトヨパールゲル中の未反応のエポキシ基をブロックするため、得られたトヨパールゲルを遠沈管に入れブロッキング溶液（組成：０．５Ｍ モノエタノールアミン、０．５Ｍ 塩化ナトリウム水溶液、ｐＨ８．３（溶媒は水）；５ｍＬ）を添加した。反応溶液が入った遠沈管を、内温４０℃に設定した卓上振盪機にセットし、１６５ｒｐｍで２０時間攪拌振盪することによりゲル中の残存エポキシ基をモノエタノールアミンでブロックした。反応終了後、遠沈管にアセトニトリル（５ｍＬ）を添加し、グラスフィルターにてトヨパールゲルとブロッキング溶液を分離した。次いで、ゲルをエタノール（５ｍＬ）、水（５ｍＬ）でそれぞれ２回ずつ洗浄し、化合物４２３が固定化されたエポキシトヨパールゲルを得た。また、ブロッキング溶液と洗浄液を合わせた溶液中に残存する化合物４２３を高速液体クロマトグラフィーで測定したところ、ブロッキング溶液と洗浄液を合わせた溶液中に化合物４２３は残存していないことが確認された。
【０１４７】
実施例１４ チアゾール誘導体のビニルポリマーゲルへの固定化（その７）
遠沈管に化合物２８３（９４ｍｇ、０．３ｍｍｏｌ）を計り取り、１，２−ジメトキシベンゼンのアセトニトリル溶液（１ｍｍｏｌ／ｍＬ）を０．３ｍＬ添加した。次いで、遠沈管にアセトニトリル（１．７ｍＬ）、緩衝液（組成：０．２Ｍ ＮａＨＣＯ３、０．５Ｍ ＮａＣｌ、ｐＨ８．３；８ｍＬ）、トリエチルアミン（９０μＬ、０．６ｍｍｏｌ）を添加して化合物２８３が溶解したことを確認したのち、０．３ｇのエポキシトヨパール（商品名）ゲル（東ソー株式会社製、エポキシ基含量：８０４μｍｏｌ／ｇ（ｇｅｌ））を添加した。上記操作によって得られた混合物の入った遠沈管を内温４０℃に設定した卓上振盪機にセットし、１６５ｒｐｍで１６時間攪拌振盪した。反応終了後、遠沈管にアセトニトリル（５ｍＬ）を添加し、グラスフィルターでトヨパールゲルと反応溶液を分離した。次にグラスフィルター上のトヨパールゲルを洗浄液（組成：ＣＨ３ＣＮ／ＭｅＯＨ／５０ｍＭ ＮＨ４Ｈ２ＰＯ４＝４／１／５；１０ｍＬ）で２回洗浄した。反応溶液と洗浄液を合わせ、高速液体クロマトグラフィー（カラム：東ソー株式会社製 ＴＳＫ−ｇｅｌ ＯＤＳ−８０ＴＭ（商品名）（内径４．６ｍｍ×長さ１５ｃｍ）、溶離液：ＣＨ３ＣＮ／ＭｅＯＨ／５０ｍＭ ＮＨ４Ｈ２ＰＯ４＝４／１／５、流速：１ｍＬ／ｍｉｎ、温度：２５℃、検出：ＵＶ ２５４ｎｍ）にて残存する化合物２８３を定量することによって、エポキシトヨパールに化合物２８３が１０２μｍｏｌ／ｍＬ（ｇｅｌ）固定化されていることが確認された。更に、上記の操作によって得られたトヨパールゲル中の未反応のエポキシ基をブロックするため、得られたトヨパールゲルを遠沈管に入れブロッキング溶液（組成：０．５Ｍ モノエタノールアミン、０．５Ｍ 塩化ナトリウム水溶液、ｐＨ８．３（溶媒は水）；５ｍＬ）を添加した。反応溶液が入った遠沈管を、内温４０℃に設定した卓上振盪機にセットし、１６５ｒｐｍで１６時間攪拌振盪することによりゲル中の残存エポキシ基をモノエタノールアミンでブロックした。反応終了後、遠沈管にアセトニトリル（５ｍＬ）を添加し、グラスフィルターにてトヨパールゲルとブロッキング溶液を分離した。次いで、ゲルをエタノール（５ｍＬ）、水（５ｍＬ）でそれぞれ２回ずつ洗浄し、化合物２８３が固定化されたエポキシトヨパールゲルを得た。また、ブロッキング溶液と洗浄液を合わせた溶液中に残存する化合物２８３を高速液体クロマトグラフィーで測定したところ、ブロッキング溶液と洗浄液を合わせた溶液中に化合物２８３は残存していないことが確認された。
【０１４８】
実施例１５ チアゾール誘導体のビニルポリマーゲルへの固定化（その８）
遠沈管に化合物２８４（９８ｍｇ、０．３ｍｍｏｌ）を計り取り、１，２−ジメトキシベンゼンのアセトニトリル溶液（１ｍｍｏｌ／ｍＬ）を０．３ｍＬ添加した。次いで、遠沈管にアセトニトリル（１．７ｍＬ）、緩衝液（組成：０．２Ｍ ＮａＨＣＯ３、０．５Ｍ ＮａＣｌ、ｐＨ８．３；８ｍＬ）、トリエチルアミン（９０μＬ、０．６ｍｍｏｌ）を添加して化合物２８４が溶解したことを確認したのち、０．３ｇのエポキシトヨパール（商品名）ゲル（東ソー株式会社製、エポキシ基含量：８０４μｍｏｌ／ｇ（ｇｅｌ））を添加した。上記操作によって得られた混合物の入った遠沈管を内温４０℃に設定した卓上振盪機にセットし、１６５ｒｐｍで１６時間攪拌振盪した。反応終了後、遠沈管にアセトニトリル（５ｍＬ）を添加し、グラスフィルターでトヨパールゲルと反応溶液を分離した。次にグラスフィルター上のトヨパールゲルを洗浄液（組成：ＣＨ３ＣＮ／ＭｅＯＨ／５０ｍＭ ＮＨ４Ｈ２ＰＯ４＝４／１／５；１０ｍＬ）で２回洗浄した。反応溶液と洗浄液を合わせ、高速液体クロマトグラフィー（カラム：東ソー株式会社製 ＴＳＫ−ｇｅｌ ＯＤＳ−８０ＴＭ（商品名）（内径４．６ｍｍ×長さ１５ｃｍ）、溶離液：ＣＨ３ＣＮ／ＭｅＯＨ／５０ｍＭ ＮＨ４Ｈ２ＰＯ４＝４／１／５、流速：１ｍＬ／ｍｉｎ、温度：２５℃、検出：ＵＶ ２５４ｎｍ）にて残存する化合物２８４を定量することによって、エポキシトヨパールに化合物２８４が１１７μｍｏｌ／ｍＬ（ｇｅｌ）固定化されていることが確認された。更に、上記の操作によって得られたトヨパールゲル中の未反応のエポキシ基をブロックするため、得られたトヨパールゲルを遠沈管に入れブロッキング溶液（組成：０．５Ｍ モノエタノールアミン、０．５Ｍ 塩化ナトリウム水溶液、ｐＨ８．３（溶媒は水）；５ｍＬ）を添加した。反応溶液が入った遠沈管を、内温４０℃に設定した卓上振盪機にセットし、１６５ｒｐｍで１６時間攪拌振盪することによりゲル中の残存エポキシ基をモノエタノールアミンでブロックした。反応終了後、遠沈管にアセトニトリル（５ｍＬ）を添加し、グラスフィルターにてトヨパールゲルとブロッキング溶液を分離した。次いで、ゲルをエタノール（５ｍＬ）、水（５ｍＬ）でそれぞれ２回ずつ洗浄し、化合物２８４が固定化されたエポキシトヨパールゲルを得た。また、ブロッキング溶液と洗浄液を合わせた溶液中に残存する化合物２８４を高速液体クロマトグラフィーで測定したところ、ブロッキング溶液と洗浄液を合わせた溶液中に化合物２８４は残存していないことが確認された。
【０１４９】
実施例１６ チアゾール誘導体のビニルポリマーゲルへの固定化（その９）
遠沈管に化合物２９２（１９１ｍｇ、０．５ｍｍｏｌ）を計り取り、１，２−ジメトキシベンゼンのアセトニトリル溶液（１ｍｍｏｌ／ｍＬ）を０．５ｍＬ添加した。次いで、遠沈管にアセトニトリル（１．５ｍＬ）、緩衝液（組成：０．２Ｍ ＮａＨＣＯ３、０．５Ｍ ＮａＣｌ、ｐＨ８．３；４ｍＬ）、トリエチルアミン（１４０μＬ、１．０ｍｍｏｌ）を添加して化合物２９２が溶解したことを確認したのち、０．３ｇのエポキシトヨパール（商品名）ゲル（東ソー株式会社製；エポキシ基含量：８０４μｍｏｌ／ｇ（ｇｅｌ））を添加した。上記操作によって得られた混合物の入った遠沈管を内温４０℃に設定した卓上振盪機にセットし、１６５ｒｐｍで１６時間攪拌振盪した。反応終了後、遠沈管にアセトニトリル（５ｍＬ）を添加し、グラスフィルターでトヨパールゲルと反応溶液を分離した。次にグラスフィルター上のトヨパールゲルを洗浄液（組成：ＣＨ３ＣＮ／ＭｅＯＨ／５０ｍＭ ＮＨ４Ｈ２ＰＯ４＝４／１／５；１０ｍＬ）で２回洗浄した。反応溶液と洗浄液を合わせ、高速液体クロマトグラフィー（カラム：東ソー株式会社製 ＴＳＫ−ｇｅｌ ＯＤＳ−８０ＴＭ（商品名）（内径４．６ｍｍ×長さ１５ｃｍ）、溶離液：ＣＨ３ＣＮ／ＭｅＯＨ／５０ｍＭ ＮＨ４Ｈ２ＰＯ４＝４／１／５、流速：１ｍＬ／ｍｉｎ、温度：２５℃、検出：ＵＶ ２５４ｎｍ）にて残存する化合物２９２を定量することによって、エポキシトヨパールに化合物２９２が５６μｍｏｌ／ｍＬ（ｇｅｌ）固定化されていることが確認された。更に、上記の操作によって得られたトヨパールゲル中の未反応のエポキシ基をブロックするため、得られたトヨパールゲルを遠沈管に入れブロッキング溶液（組成：０．５Ｍ モノエタノールアミン、０．５Ｍ 塩化ナトリウム水溶液、ｐＨ８．３（溶媒は水）；５ｍＬ）を添加した。反応溶液が入った遠沈管を、内温４０℃に設定した卓上振盪機にセットし、１６５ｒｐｍで１６時間攪拌振盪することによりゲル中の残存エポキシ基をモノエタノールアミンでブロックした。反応終了後、遠沈管にアセトニトリル（５ｍＬ）を添加し、グラスフィルターにてトヨパールゲルとブロッキング溶液を分離した。次いで、ゲルをエタノール（５ｍＬ）、水（５ｍＬ）でそれぞれ２回ずつ洗浄し、化合物２９２が固定化されたエポキシトヨパールゲルを得た。また、ブロッキング溶液と洗浄液を合わせた溶液中に残存する化合物２９２を高速液体クロマトグラフィーで測定したところ、ブロッキング溶液と洗浄液を合わせた溶液中に化合物２９２は残存していないことが確認された。
【０１５０】
実施例１７ チアゾール誘導体のビニルポリマーゲルへの固定化（その１０）
遠沈管に化合物３６４（１９３ｍｇ、０．５ｍｍｏｌ）を計り取り、１，２−ジメトキシベンゼンのアセトニトリル溶液（１ｍｍｏｌ／ｍＬ）を０．５ｍＬ添加した。次いで、遠沈管にアセトニトリル（１．５ｍＬ）、緩衝液（組成：０．２Ｍ ＮａＨＣＯ３、０．５Ｍ ＮａＣｌ、ｐＨ８．３；８ｍＬ）、トリエチルアミン（１４０μＬ、１．０ｍｍｏｌ）を添加して化合物３６４が溶解したことを確認したのち、０．３ｇのエポキシトヨパール（商品名）ゲル（東ソー株式会社製、エポキシ基含量：８０４μｍｏｌ／ｇ（ｇｅｌ））を添加した。上記操作によって得られた混合物の入った遠沈管を内温４０℃に設定した卓上振盪機にセットし、１６５ｒｐｍで１６時間攪拌振盪した。反応終了後、遠沈管にアセトニトリル（５ｍＬ）を添加し、グラスフィルターでトヨパールゲルと反応溶液を分離した。次にグラスフィルター上のトヨパールゲルを洗浄液（組成：ＣＨ３ＣＮ／ＭｅＯＨ／５０ｍＭ ＮＨ４Ｈ２ＰＯ４＝４／１／５；１０ｍＬ）で２回洗浄した。反応溶液と洗浄液を合わせ、高速液体クロマトグラフィー（カラム：東ソー株式会社製 ＴＳＫ−ｇｅｌ ＯＤＳ−８０ＴＭ（商品名）（内径４．６ｍｍ×長さ１５ｃｍ）、溶離液：ＣＨ３ＣＮ／ＭｅＯＨ／５０ｍＭ ＮＨ４Ｈ２ＰＯ４＝４／１／５、流速：１ｍＬ／ｍｉｎ、温度：２５℃、検出：ＵＶ ２５４ｎｍ）にて残存する化合物３６４を定量することによって、エポキシトヨパールに化合物３６４が２５７μｍｏｌ／ｍＬ（ｇｅｌ）固定化されていることが確認された。更に、上記の操作によって得られたトヨパールゲル中の未反応のエポキシ基をブロックするため、得られたトヨパールゲルを遠沈管に入れブロッキング溶液（組成：０．５Ｍ モノエタノールアミン、０．５Ｍ 塩化ナトリウム水溶液、ｐＨ８．３（溶媒は水）；５ｍＬ）を添加した。反応溶液が入った遠沈管を、内温４０℃に設定した卓上振盪機にセットし、１６５ｒｐｍで１６時間攪拌振盪することによりゲル中の残存エポキシ基をモノエタノールアミンでブロックした。反応終了後、遠沈管にアセトニトリル（５ｍＬ）を添加し、グラスフィルターにてトヨパールゲルとブロッキング溶液を分離した。次いで、ゲルをエタノール（５ｍＬ）、水（５ｍＬ）でそれぞれ２回ずつ洗浄し、化合物３６４が固定化されたエポキシトヨパールゲルを得た。また、ブロッキング溶液と洗浄液を合わせた溶液中に残存する化合物３６４を高速液体クロマトグラフィーで測定したところ、ブロッキング溶液と洗浄液を合わせた溶液中に化合物３６４は残存していないことが確認された。
【０１５１】
実施例１８ チアゾール誘導体のビニルポリマーゲルへの固定化（その１１）
遠沈管に化合物２８６（１０２ｍｇ、０．３ｍｍｏｌ）を計り取り、１，２−ジメトキシベンゼンのアセトニトリル溶液（１ｍｍｏｌ／ｍＬ）を０．３ｍＬ添加した。次いで、遠沈管にアセトニトリル（１．７ｍＬ）、緩衝液（組成：０．２Ｍ ＮａＨＣＯ３、０．５Ｍ ＮａＣｌ、ｐＨ８．３；４ｍＬ）、トリエチルアミン（９０μＬ、０．６ｍｍｏｌ）を添加して化合物２８６が溶解したことを確認したのち、０．３ｇのトレシルトヨパール（商品名）ゲル（東ソー株式会社製）を添加した。上記操作によって得られた混合物の入った遠沈管を内温４０℃に設定した卓上振盪機にセットし、１６５ｒｐｍで１６時間攪拌振盪した。反応終了後、遠沈管にアセトニトリル（５ｍＬ）を添加し、グラスフィルターでトヨパールゲルと反応溶液を分離した。次にグラスフィルター上のトヨパールゲルを洗浄液（組成：ＣＨ３ＣＮ／ＭｅＯＨ／５０ｍＭ ＮＨ４Ｈ２ＰＯ４＝４／１／５；１０ｍＬ）で２回洗浄した。反応溶液と洗浄液を合わせ、高速液体クロマトグラフィー（カラム：東ソー株式会社製 ＴＳＫ−ｇｅｌ ＯＤＳ−８０ＴＭ（商品名）（内径４．６ｍｍ×長さ１５ｃｍ）、溶離液：ＣＨ３ＣＮ／ＭｅＯＨ／５０ｍＭ ＮＨ４Ｈ２ＰＯ４＝４／１／５、流速：１ｍＬ／ｍｉｎ、温度：２５℃、検出：ＵＶ ２５４ｎｍ）にて残存する化合物２８６を定量することによって、トレシルトヨパールに化合物２８６が９４μｍｏｌ／ｍＬ（ｇｅｌ）固定化されていることが確認された。更に、上記の操作によって得られたトヨパールゲル中の未反応のトレシル基をブロックするため、得られたトヨパールゲルを遠沈管に入れブロッキング溶液（組成：０．５Ｍ トリスヒドロキシメチルアミノメタン塩酸塩、０．５Ｍ 塩化ナトリウム水溶液、ｐＨ８．３；５ｍＬ）を添加した。反応溶液が入った遠沈管を、内温４０℃に設定した卓上振盪機にセットし、１６５ｒｐｍで１６時間攪拌振盪することによりゲル中の残存トレシル基をトリスヒドロキシメチルアミノメタンでブロックした。反応終了後、遠沈管にアセトニトリル（５ｍＬ）を添加し、グラスフィルターにてトヨパールゲルとブロッキング溶液を分離した。次いで、ゲルをエタノール（５ｍＬ）、水（５ｍＬ）でそれぞれ２回ずつ洗浄し、化合物２８６が固定化されたトレシルトヨパールゲルを得た。また、ブロッキング溶液と洗浄液を合わせた溶液中に残存する化合物２８６を高速液体クロマトグラフィーで測定したところ、ブロッキング溶液と洗浄液を合わせた溶液中に化合物２８６は残存していないことが確認された。
【０１５２】
実施例１９ チアゾール誘導体のビニルポリマーゲルへの固定化（その１２）
遠沈管に化合物３２９（３０ｍｇ、８４μｍｏｌ）を計り取り、１，２−ジメトキシベンゼンのアセトニトリル溶液（１ｍｍｏｌ／ｍＬ）を０．１ｍＬ添加した。次いで、遠沈管にアセトニトリル（２．４ｍＬ）、緩衝液（組成：０．１Ｍ Ｎａ２ＨＰＯ４−ＮａＨ２ＰＯ４、ｐＨ７．０；２．５ｍＬ）、トリエチルアミン（３０μＬ、０．２ｍｍｏｌ）を添加して化合物３２９が溶解したことを確認したのち、３ｍＬのホルミルトヨパール（商品名）ゲル（東ソー株式会社製、ホルミル基含量：６５μｍｏｌ／ｍＬ（ｇｅｌ））を添加した。上記操作によって得られた混合物の入った遠沈管を内温２５℃に設定した卓上振盪機にセットし、１６５ｒｐｍで攪拌振盪した。攪拌振盪を開始してから３０分後、遠沈管にボラン−ピリジン複合体（２５０μＬ、２．５ｍｍｏｌ）を添加し、さらに１６５ｒｐｍで２．５時間攪拌振盪した。反応終了後、遠沈管にアセトニトリル（５ｍＬ）を添加し、グラスフィルターでトヨパールゲルと反応溶液を分離した。次にグラスフィルター上のトヨパールゲルを洗浄液（組成：ＣＨ３ＣＮ／ＭｅＯＨ／５０ｍＭ ＮＨ４Ｈ２ＰＯ４＝４／１／５；１０ｍＬ）で２回洗浄した。反応溶液と洗浄液を合わせ、高速液体クロマトグラフィー（カラム：東ソー株式会社製 ＴＳＫ−ｇｅｌ ＯＤＳ−８０ＴＭ（商品名）（内径４．６ｍｍ×長さ１５ｃｍ）、溶離液：ＣＨ３ＣＮ／ＭｅＯＨ／５０ｍＭ ＮＨ４Ｈ２ＰＯ４＝４／１／５、流速：１ｍＬ／ｍｉｎ、温度：２５℃、検出：ＵＶ ２５４ｎｍ）にて残存する化合物３２９を定量し、化合物３２９が１４μｍｏｌ／ｍＬ（ｇｅｌ）固定化されたホルミルトヨパールゲルを得た。
【０１５３】
実施例２０ チアゾール誘導体のビニルポリマーゲルへの固定化（その１３）
遠沈管に化合物２８６（１７０ｍｇ、０．５ｍｍｏｌ）を計り取り、１，２−ジメトキシベンゼンのアセトニトリル溶液（１ｍｍｏｌ／ｍＬ）を０．５ｍＬ添加した。次いで、遠沈管にアセトニトリル（１．５ｍＬ）、緩衝液（組成：０．２Ｍ ＮａＨＣＯ３、０．５Ｍ ＮａＣｌ、ｐＨ８．３；８ｍＬ）、トリエチルアミン（１４０μＬ、１．０ｍｍｏｌ）を添加して化合物２８６が溶解したことを確認したのち、０．３ｇのエポキシトヨパール（商品名）ゲル（東ソー株式会社製、エポキシ基含量：８０４μｍｏｌ／ｇ（ｇｅｌ））を添加した。上記操作によって得られた混合物の入った遠沈管を内温４０℃に設定した卓上振盪機にセットし、１６５ｒｐｍで６３時間攪拌振盪した。反応終了後、遠沈管にアセトニトリル（５ｍＬ）を添加し、グラスフィルターでトヨパールゲルと反応溶液を分離した。次にグラスフィルター上のトヨパールゲルを洗浄液（組成：ＣＨ３ＣＮ／ＭｅＯＨ／５０ｍＭ ＮＨ４Ｈ２ＰＯ４＝４／１／５；１０ｍＬ）で２回洗浄した。反応溶液と洗浄液を合わせ、高速液体クロマトグラフィー（カラム：東ソー株式会社製 ＴＳＫ−ｇｅｌ ＯＤＳ−８０ＴＭ（商品名）（内径４．６ｍｍ×長さ１５ｃｍ）、溶離液：ＣＨ３ＣＮ／ＭｅＯＨ／５０ｍＭ ＮＨ４Ｈ２ＰＯ４＝４／１／５、流速：１ｍＬ／ｍｉｎ、温度：２５℃、検出：ＵＶ ２５４ｎｍ）にて残存する化合物２８６を定量することによって、エポキシトヨパールに化合物２８６が１６７μｍｏｌ／ｍＬ（ｇｅｌ）固定化されたことを確認した。この化合物２８６固定化エポキシトヨパールゲル中の窒素原子含有量及び硫黄原子含有量を測定したところ、窒素原子が１．２重量％、硫黄原子が０．８９重量％含まれることを確認した。
【０１５４】
実施例２１ チアゾール誘導体のビニルポリマーゲルへの固定化（その１４）
遠沈管に化合物３５８（１３４ｍｇ、０．４ｍｍｏｌ）を計り取り、１，２−ジメトキシベンゼンのアセトニトリル溶液（１ｍｍｏｌ／ｍＬ）を０．４ｍＬ添加した。次いで、遠沈管に１，４−ジオキサン（１０ｍＬ）、トリエチルアミン（１２０μＬ、０．９ｍｍｏｌ）を添加して化合物３５８が溶解したことを確認したのち、２．５ｍＬのトヨパールＣＭ−６５０Ｓ（商品名）ゲル（東ソー株式会社製；イオン交換容量：０．１ｍｏｌ／Ｌ（ｇｅｌ））と１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩（１５４ｍｇ、０．８ｍｍｏｌ）を添加した。上記操作によって得られた混合物の入った遠沈管を内温２５℃に設定した卓上振盪機にセットし、１６５ｒｐｍで１４時間攪拌振盪した。反応終了後、グラスフィルターでトヨパールゲルと反応溶液を分離した。次にグラスフィルター上のトヨパールゲルを１，４−ジオキサン（１０ｍＬ）で２回洗浄したのち、洗浄液（組成：０．０５％トリフルオロ酢酸含有ＣＨ３ＣＮ／０．０５％トリフルオロ酢酸水溶液＝４５／５５；１０ｍＬ）で２回洗浄した。反応溶液と洗浄液を合わせ、高速液体クロマトグラフィー（カラム：東ソー株式会社製 ＴＳＫ−ｇｅｌ ＯＤＳ−８０ＴＭ（商品名）（内径４．６ｍｍ×長さ１５ｃｍ）、溶離液：０．０５％トリフルオロ酢酸含有ＣＨ３ＣＮ／０．０５％トリフルオロ酢酸水溶液、流速：１ｍＬ／ｍｉｎ、温度：２５℃、検出：ＵＶ２５４ｎｍ）にて残存する化合物３５８を定量し、化合物３５８が１６μｍｏｌ／ｍＬ（ｇｅｌ）固定化されたトヨパールＣＭ−６５０Ｓゲルを得た。
【０１５５】
実施例２２ チアゾール誘導体固定化ビニルポリマーゲルを用いたタンパク質の吸脱着（その１）
実施例８に記載の方法にて調製した化合物２８６固定化エポキシトヨパールゲル１ｍＬをＴＲＩＣＯＲＮカラム（商品名）（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス株式会社製）に充填し、ＡＫＴＡｐｒｉｍｅ ｐｌｕｓ（商品名）（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス株式会社製クロマトグラフィー装置）に取り付け、前記平衡化緩衝液を２０ｍＬ通液し平衡化した。ＡＫＴＡｐｒｉｍｅ ｐｌｕｓを流速１ｍＬ／ｍｉｎで自動運転し、平衡化緩衝液を１０ｍＬ通液後、同緩衝液に溶解したウヒト血漿由来免疫グロブリン製剤（化血研製）０．５ｍｇ（ＯＤ２８０＝０．７）を添加してカラムに通液した。さらに平衡化緩衝液を１０ｍＬ通液後、平衡化緩衝液から１０ｍＭ リン酸ナトリウム−１０ｍＭ クエン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．５）への硫酸ナトリウムに関する直線濃度勾配クロマトグラフィーを行なった。免疫グロブリンのカラムからの溶出は２８０ｎｍにおける吸光度をモニターして検出した。溶出液は１ｍＬずつ分画し、各フラクションの２８０ｎｍにおける吸光度をＵ−２９００スペクトロフォトメーター（日立製作所製）で測定し回収率を算出した。化合物２８６固定化エポキシトヨパールゲルを用いて行なったクロマトグラフィーの結果を図１６に示し、このクロマトグラフィーにおける免疫グロブリンの回収率を表４７に示す。免疫グロブリンはＨｉＴｒａｐカラムを用いたとき（図１参照）よりもいくぶん幅広く２０番目から５０番目までの画分に溶出していた。
【０１５６】
【表４７】
吸脱着操作後には１００ｍＭ 水酸化ナトリウムを１０ｍＬ通液してカラムの再生を行なった。化合物２８６固定化エポキシトヨパールゲルはこの再生処理によって初期状態に復帰させることができ、繰り返し使用によってもその特性は変化しなかった。
【０１５７】
実施例２３ チアゾール誘導体固定化ビニルポリマーゲルを用いたタンパク質の吸脱着（その２）
実施例８に記載の方法にて調製した化合物２８６固定化エポキシトヨパールゲル１ｍＬをＴＲＩＣＯＲＮカラム（商品名）（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス株式会社製）に充填し、ＡＫＴＡｐｒｉｍｅ ｐｌｕｓ（商品名）（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス株式会社製クロマトグラフィー装置）に取り付け、０．７Ｍ 硫酸ナトリウム、１０ｍＭ リン酸ナトリウム−１０ｍＭ クエン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．５）を２０ｍＬ通液し平衡化した。ＡＫＴＡｐｒｉｍｅ ｐｌｕｓを流速１ｍＬ／ｍｉｎで自動運転し、平衡化緩衝液を１０ｍＬ通液後、同緩衝液に溶解したヒト化モノクローナル抗体０．５ｍｇ（ＯＤ２８０＝０．７）を添加した。さらに平衡化緩衝液を１０ｍＬ通液後、１０ｍＭ リン酸ナトリウム−１０ｍＭ クエン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．５）を用いた硫酸ナトリウムの濃度勾配クロマトグラフィーを行なった。ヒト化モノクローナル抗体のカラムからの溶出は２８０ｎｍにおける吸光度のモニターにより検出した。溶出液は１ｍＬずつ分画し、各フラクションの２８０ｎｍにおける吸光度をＵ−２９００スペクトロフォトメーター（日立製作所製）で測定し回収率を算出した。化合物２８６固定化エポキシトヨパールゲルを用いて行なったクロマトグラフィーの結果を図１７に示し、このクロマトグラフィーにおけるヒト化モノクローナル抗体の回収率を表４８に示す。ヒト化モノクローナル抗体は３０番目から４５番目までの画分に溶出し、免疫グロブリン（図１６参照）と比べていくぶん後ろの位置で溶出していた。
【０１５８】
【表４８】
吸脱着操作後には１００ｍＭ 水酸化ナトリウムを１０ｍＬ通液してカラムの再生を行なった。化合物２８６固定化エポキシトヨパールゲルはこの再生処理によって初期状態に復帰させることができ、繰り返し使用によってもその特性は変化しなかった。
【０１５９】
実施例２４ チアゾール誘導体固定化ビニルポリマーゲルを用いたタンパク質の吸脱着（その３）
実施例８に記載の方法にて調製した化合物２８６固定化エポキシトヨパールゲル１ｍＬをＴＲＩＣＯＲＮカラム（商品名）（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス株式会社製）に充填し、ＡＫＴＡｐｒｉｍｅ ｐｌｕｓ（商品名）（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス株式会社製クロマトグラフィー装置）に取り付け、０．７Ｍ 硫酸ナトリウム、１０ｍＭ リン酸ナトリウム−１０ｍＭ クエン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．５）を２０ｍＬ通液し平衡化した。ＡＫＴＡｐｒｉｍｅ ｐｌｕｓを流速１ｍＬ／ｍｉｎで自動運転し、平衡化緩衝液を１０ｍＬ通液後、同緩衝液に溶解したウシ血清アルブミン０．５ｍｇ（ＯＤ２８０＝０．３）を添加した。さらに平衡化緩衝液を１０ｍＬ通液後、１０ｍＭ リン酸ナトリウム−１０ｍＭ クエン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．５）を用いた硫酸ナトリウムの濃度勾配クロマトグラフィーを行なった。ウシ血清アルブミンのカラムからの溶出は２８０ｎｍにおける吸光度のモニターにより検出した。溶出液は１ｍＬずつ分画し、各フラクションの２８０ｎｍにおける吸光度をＵ−２９００スペクトロフォトメーター（日立製作所製）で測定し回収率を算出した。化合物２８６固定化エポキシトヨパールゲルを用いて行なったクロマトグラフィーの結果を図１８に示し、このクロマトグラフィーにおけるウシ血清アルブミンの回収率を表４９に示す。ウシ血清アルブミンは１０番目の画分までに溶出し、これは免疫グロブリン（図１６参照）とは異なる画分であり、ＨｉＴｒａｐカラムを用いたとき（図１及び図７参照）と同様な結果になった。このことから、チアゾール誘導体と固定化するマトリックスをアガロースからトヨパールに変更しても同様な免疫グロブリンの分離性能を有していることが示された。
【０１６０】
【表４９】
吸脱着操作後には１００ｍＭ 水酸化ナトリウムを１０ｍＬ通液してカラムの再生を行なった。化合物２８６固定化エポキシトヨパールゲルはこの再生処理によって初期状態に復帰させることができ、繰り返し使用によってもその特性は変化しなかった。
【０１６１】
実施例２５ チアゾール誘導体固定化ビニルポリマーゲルを用いたタンパク質の吸脱着（その４）
実施例９に記載の方法にて調製した化合物３２９固定化エポキシトヨパールゲルをＴＲＩＣＯＲＮカラム（商品名）（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス株式会社製）に充填し、ＡＫＴＡｐｒｉｍｅ ｐｌｕｓ（商品名）（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス株式会社製クロマトグラフィー装置）に取り付け、０．７Ｍ 硫酸ナトリウム、１０ｍＭ リン酸ナトリウム−１０ｍＭ クエン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．５）を２０ｍＬ通液し平衡化した。ＡＫＴＡｐｒｉｍｅ ｐｌｕｓを流速１ｍＬ／ｍｉｎで自動運転し、平衡化緩衝液を１０ｍＬ通液後、同緩衝液に溶解したヒト化モノクローナル抗体０．５ｍｇ（ＯＤ２８０＝０．７）を添加した。さらに平衡化緩衝液を１０ｍＬ通液後、１０ｍＭ リン酸ナトリウム−１０ｍＭ クエン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．５）を用いた硫酸ナトリウムの濃度勾配クロマトグラフィーを行なった。ヒト化モノクローナル抗体のカラムからの溶出は２８０ｎｍにおける吸光度のモニターにより検出した。溶出液は１ｍＬずつ分画し、各フラクションの２８０ｎｍにおける吸光度をＵ−２９００スペクトロフォトメーター（日立製作所製）で測定し回収率を算出した。化合物３２９固定化エポキシトヨパールゲルを用いて行なったクロマトグラフィーの結果を図１９に示し、このクロマトグラフィーのヒト化モノクローナル抗体の回収率を表５０に示す。ヒト化モノクローナル抗体は３０番目から４５番目までの画分に溶出と、化合物２８６をチアゾール誘導体として用いたとき（図１７参照）と同じ画分の位置で溶出していた。
【０１６２】
【表５０】
吸脱着操作後には１００ｍＭ 水酸化ナトリウムを１０ｍＬ通液してカラムの再生を行なった。化合物３２９固定化エポキシトヨパールゲルはこの再生処理によって初期状態に復帰させることができ、繰り返し使用によってもその特性は変化しなかった。
【０１６３】
実施例２６ チアゾール誘導体固定化ビニルポリマーゲルを用いたタンパク質の吸脱着（その５）
実施例９に記載の方法にて調製した化合物３２９固定化エポキシトヨパールゲルをＴＲＩＣＯＲＮカラム（商品名）（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス株式会社製）に充填し、ＡＫＴＡｐｒｉｍｅ ｐｌｕｓ（商品名）（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス株式会社製クロマトグラフィー装置）に取り付け、０．７Ｍ 硫酸ナトリウム、１０ｍＭ リン酸ナトリウム−１０ｍＭ クエン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．５）を２０ｍＬ通液し平衡化した。ＡＫＴＡｐｒｉｍｅ ｐｌｕｓを流速１ｍＬ／ｍｉｎで自動運転し、平衡化緩衝液を１０ｍＬ通液後、同緩衝液に溶解したウシ血清アルブミン０．５ｍｇ（ＯＤ２８０＝０．３）を添加した。さらに平衡化緩衝液を１０ｍＬ通液後、１０ｍＭ リン酸ナトリウム−１０ｍＭ クエン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．５）を用いた硫酸ナトリウムの濃度勾配クロマトグラフィーを行なった。ウシ血清アルブミンのカラムからの溶出は２８０ｎｍにおける吸光度のモニターにより検出した。溶出液は１ｍＬずつ分画し、各フラクションの２８０ｎｍにおける吸光度をＵ−２９００スペクトロフォトメーター（日立製作所製）で測定し回収率を算出した。化合物３２９固定化エポキシトヨパールゲルを用いて行なったクロマトグラフィーの結果を図２０に示し、このクロマトグラフィーのウシ血清アルブミンの回収率を表５１に示す。ウシ血清アルブミンは１０番目の画分までに溶出し、これはヒト化モノクローナル抗体（図１９参照）とは異なる画分であり、化合物２８６をチアゾール誘導体として用いたとき（図１８参照）と同様な結果になった。このことから、チアゾール誘導体を化合物２８６から化合物３２９に変更しても同様なタンパク質の分離性能を有していることが示された。
【０１６４】
【表５１】
吸脱着操作後には１００ｍＭ 水酸化ナトリウムを１０ｍＬ通液してカラムの再生を行なった。化合物３２９固定化エポキシトヨパールゲルはこの再生処理によって初期状態に復帰させることができ、繰り返し使用によってもその特性は変化しなかった。
【０１６５】
実施例２７ チアゾール誘導体固定化ビニルポリマーゲルを用いたタンパク質の吸脱着（その６）
実施例１０に記載の方法にて調製した化合物２８６固定化ホルミルトヨパールゲルを１ｍＬ ＴＲＩＣＯＲＮカラム（商品名）（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス株式会社製）に充填し、ＡＫＴＡｐｒｉｍｅ ｐｌｕｓ（商品名）（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス株式会社製クロマトグラフィー装置）に取り付け、０．７Ｍ 硫酸ナトリウム、１０ｍＭ リン酸ナトリウム−１０ｍＭ クエン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．５）を２０ｍＬ通液し平衡化した。ＡＫＴＡｐｒｉｍｅ ｐｌｕｓを流速１ｍＬ／ｍｉｎで自動運転し、平衡化緩衝液を１０ｍＬ通液後、同緩衝液に溶解したヒト化モノクローナル抗体０．５ｍｇ（ＯＤ２８０＝０．８）を添加した。さらに平衡化緩衝液を１０ｍＬ通液後、１０ｍＭ リン酸ナトリウム−１０ｍＭ クエン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．５）を用いた硫酸ナトリウムの濃度勾配クロマトグラフィーを行なった。ヒト化モノクローナル抗体のカラムからの溶出は２８０ｎｍにおける吸光度のモニターにより検出した。溶出液は１ｍＬずつ分画し、各フラクションの２８０ｎｍにおける吸光度をＵ−２９００スペクトロフォトメーター（日立製作所製）で測定し回収率を算出した。化合物２８６固定化ホルミルトヨパールゲルを用いて行なったクロマトグラフィーの結果を図２１に示し、このクロマトグラフィーのヒト化モノクローナル抗体の回収率を表５２に示す。ヒト化モノクローナル抗体は３０番目から４５番目までの画分に溶出と、エポキシトヨパールをチアゾール誘導体の固定化に用いたとき（図１７参照）と同じ画分の位置で溶出していた。
【０１６６】
【表５２】
吸脱着操作後には１００ｍＭ 水酸化ナトリウムを１０ｍＬ通液してカラムの再生を行なった。化合物２８６固定化ホルミルトヨパールゲルはこの再生処理によって初期状態に復帰させることができ、繰り返し使用によってもその特性は変化しなかった。
【０１６７】
実施例２８ チアゾール誘導体固定化ビニルポリマーゲルを用いたタンパク質の吸脱着（その７）
実施例１０に記載の方法にて調製した化合物２８６固定化ホルミルトヨパールゲルをＴＲＩＣＯＲＮカラム（商品名）（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス株式会社製）に充填し、ＡＫＴＡｐｒｉｍｅ ｐｌｕｓ（商品名）（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス株式会社製クロマトグラフィー装置）に取り付け、０．７Ｍ 硫酸ナトリウム、１０ｍＭ リン酸ナトリウム−１０ｍＭ クエン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．５）を２０ｍＬ通液し平衡化した。ＡＫＴＡｐｒｉｍｅ ｐｌｕｓを流速１ｍＬ／ｍｉｎで自動運転し、平衡化緩衝液を１０ｍＬ通液後、同緩衝液に溶解したウシ血清アルブミン０．５ｍｇ（ＯＤ２８０＝０．３）を添加した。さらに平衡化緩衝液を１０ｍＬ通液後、１０ｍＭ リン酸ナトリウム−１０ｍＭ クエン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．５）を用いた硫酸ナトリウムの濃度勾配クロマトグラフィーを行なった。ウシ血清アルブミンのカラムからの溶出は２８０ｎｍにおける吸光度のモニターにより検出した。溶出液は１ｍＬずつ分画し、各フラクションの２８０ｎｍにおける吸光度をＵ−２９００スペクトロフォトメーター（日立製作所製）で測定し回収率を算出した。化合物２８６固定化ホルミルトヨパールゲルを用いて行なったクロマトグラフィーの結果を図２２に示し、このクロマトグラフィーのウシ血清アルブミンの回収率を表５３に示す。ウシ血清アルブミンは１０番目の画分までに溶出し、これはヒト化モノクローナル抗体（図２１参照）とは異なる画分であり、エポキシトヨパールをチアゾール誘導体の固定化に用いたとき（図１８参照）と同様な結果になった。このことから、チアゾール誘導体の固定化に用いるマトリックスの有する活性化基をエポキシ基からホルミル基に変更しても同様なタンパク質の分離性能を有していることが示された。
【０１６８】
【表５３】
吸脱着操作後には１００ｍＭ 水酸化ナトリウムを１０ｍＬ通液してカラムの再生を行なった。化合物２８６固定化ホルミルトヨパールゲルはこの再生処理によって初期状態に復帰させることができ、繰り返し使用によってもその特性は変化しなかった。
【０１６９】
実施例２９ チアゾール誘導体のキトサンゲルへの固定化
水で洗浄した５ｍＬの活性化キトパールＫ−６６（商品名）ゲル（富士紡ホールディングス株式会社製；スクシンイミドオキシカルボニル基含量：１５μｍｏｌ／ｍＬ（ｇｅｌ））を遠沈管に計り取り、これにＤＭＳＯを１０ｍＬ添加した。次に化合物２８６のＤＭＳＯ溶液（０．２５Ｍ）を９００μＬ、１Ｍの１，２−ジメトキシベンゼンのアセトニトリル溶液を２２５μＬ、トリエチルアミンを６８μＬ、順次添加した。上記操作によって得られた混合物の入った遠沈管を内温４０℃に設定した卓上振盪機にセットし、１６５ｒｐｍで３時間攪拌振盪した。反応終了後、グラスフィルターでキトパールゲルと反応溶液を分離し、グラスフィルター上のキトパールゲルをジメチルスルホキシド（５ｍＬ）、洗浄液（組成：ＣＨ３ＣＮ／ＭｅＯＨ／５０ｍＭ ＮＨ４Ｈ２ＰＯ４＝４／１／５；１５ｍＬ）で洗浄した。反応溶液と洗浄液を合わせ、高速液体クロマトグラフィー（カラム：東ソー株式会社製 ＴＳＫ−ｇｅｌ ＯＤＳ−８０ＴＭ（商品名）（内径４．６ｍｍ×長さ１５ｃｍ）、溶離液：ＣＨ３ＣＮ／ＭｅＯＨ／５０ｍＭ ＮＨ４Ｈ２ＰＯ４＝４／１／５、流速：１ｍＬ／ｍｉｎ、温度：２５℃、検出：ＵＶ ２５４ｎｍ）にて残存する化合物２８６を定量し、化合物２８６が５．０μｍｏｌ／ｍＬ（ｇｅｌ）固定化されているキトパールゲルを得た。
【０１７０】
実施例３０ チアゾール誘導体のビニルポリマーゲルへの固定化（その１５）
遠沈管に化合物２８６（１０２ｍｇ、０．３ｍｍｏｌ）を計り取り、１，２−ジメトキシベンゼンのアセトニトリル溶液（１ｍｍｏｌ／ｍＬ）を０．３ｍＬ添加した。次いで、遠沈管にアセトニトリル（１．７ｍＬ）、１Ｍ 水酸化ナトリウム水溶液（１．２ｍＬ）、水（６．８ｍＬ）を添加して化合物２８６が溶解したことを確認したのち、０．５ｇのＢＩＯＡＣＴ−ＥＰＯ（商品名）ゲル（昭和電工株式会社製、エポキシ基含量：２００μｍｏｌ／ｇ（ｇｅｌ））を添加した。上記操作によって得られた混合物の入った遠沈管を内温４０℃に設定した卓上振盪機にセットし、１６５ｒｐｍで４３時間攪拌振盪した。反応終了後、遠沈管にアセトニトリル（５ｍＬ）を添加し、グラスフィルターでＢＩＯＡＣＴ−ＥＰＯゲルと反応溶液を分離した。次にグラスフィルター上のＢＩＯＡＣＴ−ＥＰＯゲルを洗浄液（組成：０．０５％トリフルオロ酢酸含有ＣＨ３ＣＮ／０．０５％トリフルオロ酢酸水溶液＝１／１；１０ｍＬ）で２回洗浄した。反応溶液と洗浄液を合わせ、高速液体クロマトグラフィー（カラム：東ソー株式会社製 ＴＳＫ−ｇｅｌ ＯＤＳ−８０ＴＭ（内径４．６ｍｍ×長さ１５ｃｍ）、溶離液：０．０５％トリフルオロ酢酸含有ＣＨ３ＣＮ／０．０５％トリフルオロ酢酸水溶液＝１／１、流速：１ｍＬ／ｍｉｎ、温度：２５℃、検出：ＵＶ ２５４ｎｍ）にて残存する化合物２８６を定量することによって、ＢＩＯＡＣＴ−ＥＰＯゲルに化合物２８６が４６μｍｏｌ／ｍＬ（ｇｅｌ）固定化されていることが確認された。更に、上記の操作によって得られたＢＩＯＡＣＴ−ＥＰＯゲル中の未反応のエポキシ基をブロックするため、得られたＢＩＯＡＣＴ−ＥＰＯゲルを遠沈管に入れブロッキング溶液（組成：アセトニトリル；２ｍＬ、０．５Ｍ モノエタノールアミン、０．５Ｍ 塩化ナトリウム水溶液、ｐＨ８．３（溶媒は水）；４ｍＬ）を添加した。反応溶液が入った遠沈管を、内温４０℃に設定した卓上振盪機にセットし、１６５ｒｐｍで２３時間攪拌振盪することによりゲル中の残存エポキシ基をモノエタノールアミンでブロックした。反応終了後、遠沈管にアセトニトリル（５ｍＬ）を添加し、グラスフィルターにてＢＩＯＡＣＴ−ＥＰＯゲルとブロッキング溶液を分離した。次いで、ゲルをエタノール（５ｍＬ）、水（５ｍＬ）でそれぞれ２回ずつ洗浄することで、化合物２８６が固定化されたＢＩＯＡＣＴ−ＥＰＯゲルを得た。また、ブロッキング溶液と洗浄液を合わせた溶液中に残存する化合物２８６を高速液体クロマトグラフィーで測定したところ、ブロッキング溶液と洗浄液を合わせた溶液中に化合物２８６は残存していないことが確認された。
【０１７１】
実施例３１ チアゾール誘導体のスチレン−ジビニルベンゼン共重合体ゲルへの固定化
遠沈管に化合物２８６（１０２ｍｇ、０．３ｍｍｏｌ）を計り取り、１，２−ジメトキシベンゼンのアセトニトリル溶液（１ｍｍｏｌ／ｍＬ）を０．３ｍＬ添加した。次いで、遠沈管にアセトニトリル（１．７ｍＬ）、１Ｍ 水酸化ナトリウム水溶液（１．２ｍＬ）、水（６．８ｍＬ）を添加して化合物２８６が溶解したことを確認したのち、０．３ｇのＰＯＲＯＳ−ＥＰ（商品名）ゲル（アプライドバイオシステムズジャパン株式会社製、エポキシ基含量：非開示）を添加した。上記操作によって得られた混合物の入った遠沈管を内温４０℃に設定した卓上振盪機にセットし、１６５ｒｐｍで３６時間攪拌振盪した。反応終了後、遠沈管にアセトニトリル（５ｍＬ）を添加し、グラスフィルターでＰＯＲＯＳ−ＥＰゲルと反応溶液を分離した。次にグラスフィルター上のＰＯＲＯＳ−ＥＰゲルを洗浄液（組成：０．０５％トリフルオロ酢酸含有ＣＨ３ＣＮ／０．０５％トリフルオロ酢酸水溶液＝１／１；１０ｍＬ）で２回洗浄した。反応溶液と洗浄液を合わせ、高速液体クロマトグラフィー（カラム：東ソー株式会社製 ＴＳＫ−ｇｅｌ ＯＤＳ−８０ＴＭ（内径４．６ｍｍ×長さ１５ｃｍ）、溶離液：０．０５％トリフルオロ酢酸含有ＣＨ３ＣＮ／０．０５％トリフルオロ酢酸水溶液＝１／１、流速：１ｍＬ／ｍｉｎ、温度：２５℃、検出：ＵＶ ２５４ｎｍ）にて残存する化合物２８６を定量することによって、ＰＯＲＯＳ−ＥＰゲルに化合物２８６が９１μｍｏｌ／ｍＬ（ｇｅｌ）固定化されていることが確認された。更に、上記の操作によって得られたＰＯＲＯＳ−ＥＰゲル中の未反応のエポキシ基をブロックするため、得られたＰＯＲＯＳ−ＥＰゲルを遠沈管に入れブロッキング溶液（組成：アセトニトリル；２ｍＬ、０．５Ｍ モノエタノールアミン、０．５Ｍ 塩化ナトリウム水溶液、ｐＨ８．３（溶媒は水）；４ｍＬ）を添加した。反応溶液が入った遠沈管を、内温４０℃に設定した卓上振盪機にセットし、１６５ｒｐｍで６時間攪拌振盪することによりゲル中の残存エポキシ基をモノエタノールアミンでブロックした。反応終了後、遠沈管にアセトニトリル（５ｍＬ）を添加し、グラスフィルターにてＰＯＲＯＳ−ＥＰゲルとブロッキング溶液を分離した。次いで、ゲルをエタノール（５ｍＬ）、水（５ｍＬ）でそれぞれ２回ずつ洗浄することで、化合物２８６が固定化されたＰＯＲＯＳ−ＥＰゲルを得た。また、ブロッキング溶液と洗浄液を合わせた溶液中に残存する化合物２８６を高速液体クロマトグラフィーで測定したところ、ブロッキング溶液と洗浄液を合わせた溶液中に化合物２８６は残存していないことが確認された。
【０１７２】
実施例３２ チアゾール誘導体のセンサーチップへの固定化
化合物２８６を４ｍｇ／ｍＬになるようにＤＭＳＯに溶解し、これを１０ｍＭホウ酸−１Ｍ ＮａＣｌ緩衝液（ｐＨ８．５）で８倍に希釈して０．５ｍｇ／ｍＬ濃度の化合物溶液を調製した。ＢＩＡＣＯＲＥセンサーチップＣＭ５（商品名、ＧＥヘルスケアバイオサイエンス株式会社製）をＢＩＡＣＯＲＥ２０００（商品名、ＧＥヘルスケアバイオサイエンス株式会社製）に装着し、ＢＩＡＣＯＲＥアミンカップリングキット（商品名、ＧＥヘルスケアバイオサイエンス株式会社製）を用いてセンサーチップＣＭ５上のカルボキシメチルデキストランをＮ−ヒドロキシスクシニミド（ＮＨＳ）で活性化した。これに前記０．５ｍｇ／ｍＬ濃度の化合物２８６溶液を２５℃で５分間接触させることにより固定化を行なった。その後１Ｍ モノエタノールアミン水溶液を用いて未反応のスクシンイミドオキシカルボニル基のブロッキングを行なった。一連の固定化過程はセンサーチップＣＭ５表面のＳＰＲ共鳴単位（ＲＵ）の増加によってモニタリングした。
【０１７３】
実施例３３ ＢＩＡＣＯＲＥ（商品名）を用いた親和性解析
実施例３２によって調製したリガンド−マトリックス複合体（化合物２８６を固定化したセンサーチップＣＭ５）に対して、ＨＢＳ−ＥＰ緩衝液（組成：１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．４），０．１５Ｍ ＮａＣｌ，３ｍＭ ＥＤＴＡ，０．００５％ ＳＰ２０）で希釈したマウスＩｇＭ（１０μｇ／ｍＬ、試料Ａ）、マウスＩｇＧ（３２０μｇ／ｍＬ、試料Ｂ）、ニワトリＩｇＹ（４００μｇ／ｍＬ、試料Ｃ）、ウシ血清アルブミン（３２０μｇ／ｍＬ、試料Ｄ）をそれぞれ１２０秒間通液（結合相）し、その後２８０秒間ＨＢＳ−ＥＰ緩衝液で置換（解離相）して親和性を解析した。またそれぞれの分析終了ごとに１０ｍＭ水酸化ナトリウムを８０秒間通液してセンサーチップＣＭ５の再生を行った。化合物２８６を固定化したセンサーチップＣＭ５のセンサーグラムを図２３に示す。また解離時間２４０秒後の残存ＲＵを表５４に示す。
【０１７４】
【表５４】
図２３及び表５４より、マウスＩｇＭ（試料Ａ）が他の試料（試料Ｂ、Ｃ、Ｄ）と比較し、化合物２８６を固定化したセンサーチップＣＭ５に対する親和性が高いことが示された。よって、化合物２８６を固定化したデキストランゲルが、マウスＩｇＭを特異的に吸着することが判明した。
【０１７５】
実施例３４ チアゾール誘導体のセルロースゲルへの固定化
０．１Ｍ Ｎ−シクロヘキシル−２−アミノエタンスルホン酸緩衝液（ｐＨ９．０）／アセトニトリル＝１／１の混合液を調製し、これを溶媒として、化合物４８６と水酸化ナトリウムとをそれぞれ４１ｍＭとなるように加えた。遠沈管に３．０ｍＬのセルファインホルミル（商品名）ゲル（チッソ株式会社製、ホルミル基を１０から１５μｍｏｌ／ｍＬ含有）をとり、そこに前記の化合物４８６を含んだ溶液を５ｍＬ加え、卓上振盪機を用いて、３０分間、２５℃、１６０ｒｐｍで振盪した後、ボラン−ピリジン複合体（０．１７ｍＬ、１．７ｍｍｏｌ）を添加し、同じ条件で１６時間振盪した。反応混合物をグラスフィルターで濾過し、アセトニトリル５ｍＬで１回、次いで、洗浄液（アセトニトリル／水／トリフルオロ酢酸＝４５／５５／０．０５）で５ｍＬずつ４回洗浄した。これらのろ液と洗浄液をあわせ、高速液体クロマトグラフィー（カラム：東ソー株式会社製 ＴＳＫ−ｇｅｌ ＯＤＳ−８０ＴＭ（内径４．６ｍｍ×長さ１５ｃｍ）、溶離液：洗浄液と同じ組成、流速：１ｍＬ／ｍｉｎ、温度：２５℃、検出：ＵＶ ２５４ｎｍ）にて残存する化合物４８６を定量することによって、セルファインホルミルゲルに化合物４８６が５μｍｏｌ／ｍＬ（ｇｅｌ）固定化されたことを確認した。
【０１７６】
実施例３５ チアゾール誘導体のアクリルアミド−ビニル共重合体ゲルへの固定化
０．１Ｍ Ｎ−シクロヘキシル−２−アミノエタンスルホン酸緩衝液（ｐＨ９．０）／アセトニトリル＝１／１の混合溶媒に、化合物４８６と水酸化ナトリウムとをそれぞれ４１ｍＭとなるように加えた。遠沈管に０．３ｇのＰｒｏｆｉｎｉｔｙ Ｅｐｏｘｉｄｅ（商品名）ゲル（バイオラッド株式会社製、エポキシ基を５０から１３２μｍｏｌ／ｇ含有）をとり、そこに前記の化合物４８６を含んだ溶液を５ｍＬ加え、卓上振盪機を用いて、１５時間、４０℃、１６０ｒｐｍで振盪した。反応混合物をグラスフィルターで濾過し、アセトニトリル５ｍＬで１回、次いで、洗浄液（アセトニトリル／水／トリフルオロ酢酸＝４５／５５／０．０５）で５ｍＬずつ４回洗浄した。これらのろ液と洗浄液をあわせ、高速液体クロマトグラフィー（カラム：東ソー株式会社製 ＴＳＫ−ｇｅｌ ＯＤＳ−８０ＴＭ（内径４．６ｍｍ×長さ１５ｃｍ）、溶離液：洗浄液と同じ組成、流速：１ｍＬ／ｍｉｎ、温度：２５℃、検出：ＵＶ ２５４ｎｍ）にて残存する化合物４８６を定量することによって、Ｐｒｏｆｉｎｉｔｙ Ｅｐｏｘｉｄｅゲルに化合物４８６が４μｍｏｌ／ｍＬ（ｇｅｌ）固定化されたことを確認した。
【０１７７】
実施例３６ チアゾール誘導体のシリカゲルへの固定化
２−ヒドロキシ−３−［４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジニル］プロパンスルホン酸緩衝液（０．１Ｍ、ｐＨ８．０）／アセトニトリル＝１／１の混合溶媒に、化合物４８６と水酸化ナトリウムとをそれぞれ４１ｍＭとなるように加えた。遠沈管に１．３ｇのＭ．Ｓ．ＧＥＬ Ｅｐｏｘｙ−Ｄ−５０−１０００ＡＷ（商品名、ＡＧＣエスアイテック株式会社製、エポキシ基を７３μｍｏｌ／ｇ含有）をとり、そこに、６．１ｍＬの前記の溶液を加え、卓上振盪機を用いて、４日間、４０℃、１６０ｒｐｍで振盪した。反応混合物をグラスフィルターで濾過し、アセトニトリル５ｍＬで１回、次いで、洗浄液（アセトニトリル／水／トリフルオロ酢酸＝４５／５５／０．０５）で５ｍＬずつ４回洗浄した。これらのろ液と洗浄液をあわせ、高速液体クロマトグラフィー（カラム：東ソー株式会社製 ＴＳＫ−ｇｅｌ ＯＤＳ−８０ＴＭ（内径４．６ｍｍ×長さ１５ｃｍ）、溶離液：洗浄液と同じ組成、流速：１ｍＬ／ｍｉｎ、温度：２５℃、検出：ＵＶ ２５４ｎｍ）にて残存する化合物４８６を定量することによって、Ｍ．Ｓ．ＧＥＬ Ｅｐｏｘｙ−Ｄ−５０−１０００ＡＷに化合物４８６が２２μｍｏｌ／ｍＬ（ｇｅｌ）固定化されたことを確認した。
【０１７８】
実施例３７ ４−メチル−Ｎ−［４−メチル−５−｛３−（２−プロペニルカルボニルアミノ）プロピル｝チアゾール−２−イル］ベンズアミドのポリスチレンビーズへの固定化（その１）
２００ｍＬのナス型フラスコに塩化銅（Ｉ）（１５９ｍｇ，１．６１ｍｍｏｌ）、ペンタメチルジエチレントリアミン（４１９ｍｇ，２．４２ｍｍｏｌ）、メタノール（１９．５ｍＬ）、及び２−ヒドロキシエチルメタクリレート（１９．５ｍＬ，１６１ｍｍｏｌ）を順次添加し、室温で撹拌して反応混合物が均一に溶解したことを確認した。次に反応溶液に１．４ｇのクロロメチル化ポリスチレンビーズ（渡辺化学工業株式会社製、クロロメチル基含量：１．１５ｍｅｑ／ｇ）を添加し、凍結脱気により反応溶液中の溶存酸素を除去したのち、反応容器を４０℃で１２時間撹拌した。反応終了後、ポリスチレンビーズと反応溶液を分離し、ポリスチレンビーズをメタノール（２００ｍＬ）で２回洗浄した後、エタノール／５％アンモニア水＝９／１（ｖ／ｖ）（１Ｌ）で３回洗浄した。洗浄終了後、ポリスチレンビーズと洗浄液を分離した後、真空乾燥することで淡青色をしたポリ（２−ヒドロキシエチルメタクリレート）修飾ポリスチレンビーズ（１８．４ｇ、グラフト率：１２００％）を得た。なおここでグラフト率は、
グラフト率＝（反応後のポリスチレンビーズ重量−反応前のポリスチレンビーズ重量）／（反応前のポリスチレンビーズ重量）
と定義する。
【０１７９】
次に５０ｍＬのナス型フラスコに塩化銅（Ｉ）（２２ｍｇ，０．２２ｍｍｏｌ）、１，４，８，１１−テトラメチル−１，４，８，１１−テトラアザテトラデカン（５６ｍｇ，０．２２ｍｍｏｌ）、参考例２で合成した４−メチル−Ｎ−［４−メチル−５−｛３−（２−プロペニルカルボニルアミノ）プロピル｝チアゾール−２−イル］ベンズアミド（５２５ｍｇ，１．４７ｍｍｏｌ）、及び２−ブタノン／２−プロパノール＝７／３（ｖ／ｖ）の混合溶媒（３ｍＬ）を順次添加し、室温で撹拌して反応混合物が均一に溶解したことを確認した。次に反応溶液に２．５ｇのポリ（２−ヒドロキシエチルメタクリレート）修飾ポリスチレンビーズを添加し、凍結脱気により反応溶液中の溶存酸素を除去したのち、反応容器を６０℃で６３時間撹拌した。反応終了後、ポリスチレンビーズと反応溶液を分離し、エタノール（３００ｍＬ）で２回、エタノール／５％アンモニア水＝９／１（ｖ／ｖ）（３００ｍＬ）で２回、ＤＭＦ（２００ｍＬ）で１回洗浄した。洗浄終了後、ポリスチレンビーズと洗浄液を分離した後、真空乾燥することでチアゾール誘導体が結合した薄茶色のポリ（２−ヒドロキシエチルメタクリレート）修飾ポリスチレンビーズ（２．６１ｇ）を得た。得られたポリスチレンビーズの重量増加分から計算した結果、グラフト鎖末端にチアゾール誘導体が平均２分子結合しており、その当量は０．１２ｍｅｑ／ｇであると見積られた。ＦＴ−ＩＲ，ν（ｃｍ−１，ｒｅｆｌｅｃｔ）：３４４０（ｂｒ，Ｏ−Ｈ），２９４９（ｗ），１７２０（ｓ，Ｃ＝Ｏ），１６３７（ｗ，Ｃ＝Ｏ），１４５０（ｍ），１２４３（ｍ），１１４９（ｓ），１０７４（ｓ）。
【０１８０】
実施例３８ ４−メチル−Ｎ−［４−メチル−５−｛３−（２−プロペニルカルボニルアミノ）プロピル｝チアゾール−２−イル］ベンズアミドのポリスチレンビーズへの固定化（その２）
２００ｍＬのナス型フラスコに塩化銅（Ｉ）（５００ｍｇ，５．０ｍｍｏｌ）、ペンタメチルジエチレントリアミン（１．３０ｇ，７．５ｍｍｏｌ）、２−プロパノール（２２ｍＬ）、及びアクリルアミド水溶液（組成：１７．８ｇ／２２ｍＬ；２５０ｍｍｏｌ）を順次添加し、室温で撹拌して反応混合物が均一に溶解したことを確認した。次に反応溶液に５．０ｇのクロロメチル化ポリスチレンビーズ（株式会社ペプチド研究所製、クロロメチル基含量：０．９７ｍｅｑ／ｇ）を添加し、凍結脱気により反応溶液中の溶存酸素を除去したのち、反応容器を８０℃で１８時間撹拌した。反応終了後、ポリスチレンビーズと反応溶液を分離し、ポリスチレンビーズをエタノール（１５０ｍＬ）で洗浄した後、エタノール／５％アンモニア水＝９／１（ｖ／ｖ）（２００ｍＬ）で２回洗浄した。洗浄終了後、ポリスチレンビーズと洗浄液を分離した後、真空乾燥することで淡青色をしたポリアクリルアミド修飾ポリスチレンビーズ（１２．３ｇ、グラフト率：１４６％）を得た。なおここでグラフト率は
グラフト率＝（反応後のポリスチレンビーズ重量−反応前のポリスチレンビーズ重量）／（反応前のポリスチレンビーズ重量）
と定義する。
【０１８１】
次に５０ｍＬのナス型フラスコに塩化銅（Ｉ）（６０ｍｇ，０．６０ｍｍｏｌ）、トリス（２−（ジメチルアミノ）エチル）アミン（２０８ｍｇ，０．９ｍｍｏｌ）、参考例２で合成した４−メチル−Ｎ−［４−メチル−５−｛３−（２−プロペニルカルボニルアミノ）プロピル｝チアゾール−２−イル］ベンズアミド（１．０７ｇ，３．０ｍｍｏｌ）、及び２−プロパノール／水＝２／１（ｖ／ｖ）の混合溶媒（３ｍＬ）を順次添加し、室温で撹拌して反応混合物が均一に溶解したことを確認した。次に反応溶液に１．５ｇのポリアクリルアミド修飾ポリスチレンビーズを添加し、凍結脱気により反応溶液中の溶存酸素を除去したのち、反応容器を８０℃で８７時間撹拌した。反応終了後、反応溶液にエタノール（３０ｍＬ）及び５％アンモニア水（５ｍＬ）を添加し、室温で１時間撹拌した。次にポリスチレンビーズと反応溶液を分離し、エタノール／５％アンモニア水＝９／１（ｖ／ｖ）（５０ｍＬ）で２回、ＤＭＦ（２５０ｍＬ）で１回洗浄した。洗浄終了後、ポリスチレンビーズと洗浄液を分離した後、真空乾燥することでチアゾール誘導体が結合した薄緑色のポリアクリルアミド修飾ポリスチレンビーズ（１．８４ｇ）を得た。得られたポリスチレンビーズの重量増加分から計算した結果、グラフト鎖末端にチアゾール誘導体が平均２分子結合しており、その当量は０．５２ｍｅｑ／ｇであると見積られた。ＦＴ−ＩＲ，ν（ｃｍ−１，ｒｅｆｌｅｃｔ）：３３３６（ｂｒ），２９２２（ｍ），１６５４（ｓ，Ｃ＝Ｏ），１６００（ｍ），１４９２（ｍ），１４５０（ｍ），１０２８（ｗ），７５６（ｍ），６９８（ｓ）。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
一般式（１）
【化１】
（式中、Ｒ１及びＲ２は水素原子又は置換されていてもよい炭素数１から６のアルキル基を表し、Ａｒは置換されていてもよい芳香族基を表し、ｎは１から１２の整数を表し、Ｍはマトリックスを表す。）で表されるチアゾール誘導体固定化マトリックス。
【請求項２】
Ａｒの置換基が、ハロゲン原子、置換されていてもよい炭素数１から６のアルキル基、置換されていてもよい炭素数１から１２のアルコキシ基、置換されていてもよい炭素数３から８のシクロアルコキシ基、置換されていてもよい炭素数３から６のアルケニルオキシ基、置換されていてもよい炭素数３から６のアルキニルオキシ基、置換されていてもよい炭素数１から６のアシルオキシ基、置換されていてもよい炭素数１から６のアルキルチオ基、置換されていてもよい炭素数１から６のアルキルスルフィニル基、置換されていてもよい炭素数１から６のアルキルスルホニル基、置換されていてもよい炭素数１から１２のアルコキシカルボニル基、カルボキシル基、ニトロ基、置換されていてもよいアミノ基、水酸基又はシアノ基である請求項１に記載のチアゾール誘導体固定化マトリックス。
【請求項３】
Ａｒが、ハロゲン原子、置換されていてもよい炭素数１から６のアルキル基、置換されていてもよい炭素数１から１２のアルコキシ基、置換されていてもよい炭素数３から８のシクロアルコキシ基、置換されていてもよい炭素数３から６のアルケニルオキシ基、置換されていてもよい炭素数３から６のアルキニルオキシ基、置換されていてもよい炭素数１から６のアシルオキシ基、置換されていてもよい炭素数１から６のアルキルチオ基、置換されていてもよい炭素数１から６のアルキルスルフィニル基、置換されていてもよい炭素数１から６のアルキルスルホニル基、置換されていてもよい炭素数１から１２のアルコキシカルボニル基、カルボキシル基、ニトロ基、置換されていてもよいアミノ基、水酸基又はシアノ基から選ばれた１つ以上の置換基で置換されていてもよい芳香族基である請求項１に記載のチアゾール誘導体固定化マトリックス。
【請求項４】
一般式（１）
【化２】
（式中、Ｒ１、Ｒ２、Ａｒ、ｎ及びＭは前記と同じ意味を表す。）においてＭのマトリックスがビニルポリマー、アガロース、キトサン、デキストラン、セルロース、シリカ、ポリスチレンのいずれかであることを特徴とする、請求項１から３に記載のチアゾール誘導体固定化マトリックス。
【請求項５】
一般式（１ａ）
【化３】
（式中、Ｒ１、Ｒ２、Ａｒ及びｎは前記と同じ意味を表し、Ｒ３はアミノ基又はアンモニウム塩を表す。）で示されるチアゾール誘導体と、活性化基含有マトリックスとを反応させることを特徴とする、一般式（１）
【化４】
（式中、Ｒ１、Ｒ２、Ａｒ、ｎ及びＭは前記と同じ意味を表す。）で示されるチアゾール誘導体固定化マトリックスの製造方法。
【請求項６】
活性化基含有マトリックスの活性化基がスクシンイミドオキシカルボニル基、エポキシ基、ホルミル基、２，２，２−トリフルオロエチルスルホニル基、カルボキシル基のいずれかであることを特徴とする請求項５に記載のチアゾール誘導体固定化マトリックスの製造方法。
【請求項７】
一般式（１）
【化５】
（式中、Ｒ１、Ｒ２、Ａｒ、ｎ及びＭは前記と同じ意味を表す。）で示されるチアゾール誘導体固定化マトリックスを使用し、タンパク質の分析または精製を行なう方法。
【請求項８】
タンパク質が免疫グロブリン、またはこれらの類縁体、フラグメント、融合体であることを特徴とする、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
免疫グロブリンが免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）であることを特徴とする、請求項８に記載の方法。
【請求項１】
一般式（１）
【化１】
（式中、Ｒ１及びＲ２は水素原子又は置換されていてもよい炭素数１から６のアルキル基を表し、Ａｒは置換されていてもよい芳香族基を表し、ｎは１から１２の整数を表し、Ｍはマトリックスを表す。）で表されるチアゾール誘導体固定化マトリックス。
【請求項２】
Ａｒの置換基が、ハロゲン原子、置換されていてもよい炭素数１から６のアルキル基、置換されていてもよい炭素数１から１２のアルコキシ基、置換されていてもよい炭素数３から８のシクロアルコキシ基、置換されていてもよい炭素数３から６のアルケニルオキシ基、置換されていてもよい炭素数３から６のアルキニルオキシ基、置換されていてもよい炭素数１から６のアシルオキシ基、置換されていてもよい炭素数１から６のアルキルチオ基、置換されていてもよい炭素数１から６のアルキルスルフィニル基、置換されていてもよい炭素数１から６のアルキルスルホニル基、置換されていてもよい炭素数１から１２のアルコキシカルボニル基、カルボキシル基、ニトロ基、置換されていてもよいアミノ基、水酸基又はシアノ基である請求項１に記載のチアゾール誘導体固定化マトリックス。
【請求項３】
Ａｒが、ハロゲン原子、置換されていてもよい炭素数１から６のアルキル基、置換されていてもよい炭素数１から１２のアルコキシ基、置換されていてもよい炭素数３から８のシクロアルコキシ基、置換されていてもよい炭素数３から６のアルケニルオキシ基、置換されていてもよい炭素数３から６のアルキニルオキシ基、置換されていてもよい炭素数１から６のアシルオキシ基、置換されていてもよい炭素数１から６のアルキルチオ基、置換されていてもよい炭素数１から６のアルキルスルフィニル基、置換されていてもよい炭素数１から６のアルキルスルホニル基、置換されていてもよい炭素数１から１２のアルコキシカルボニル基、カルボキシル基、ニトロ基、置換されていてもよいアミノ基、水酸基又はシアノ基から選ばれた１つ以上の置換基で置換されていてもよい芳香族基である請求項１に記載のチアゾール誘導体固定化マトリックス。
【請求項４】
一般式（１）
【化２】
（式中、Ｒ１、Ｒ２、Ａｒ、ｎ及びＭは前記と同じ意味を表す。）においてＭのマトリックスがビニルポリマー、アガロース、キトサン、デキストラン、セルロース、シリカ、ポリスチレンのいずれかであることを特徴とする、請求項１から３に記載のチアゾール誘導体固定化マトリックス。
【請求項５】
一般式（１ａ）
【化３】
（式中、Ｒ１、Ｒ２、Ａｒ及びｎは前記と同じ意味を表し、Ｒ３はアミノ基又はアンモニウム塩を表す。）で示されるチアゾール誘導体と、活性化基含有マトリックスとを反応させることを特徴とする、一般式（１）
【化４】
（式中、Ｒ１、Ｒ２、Ａｒ、ｎ及びＭは前記と同じ意味を表す。）で示されるチアゾール誘導体固定化マトリックスの製造方法。
【請求項６】
活性化基含有マトリックスの活性化基がスクシンイミドオキシカルボニル基、エポキシ基、ホルミル基、２，２，２−トリフルオロエチルスルホニル基、カルボキシル基のいずれかであることを特徴とする請求項５に記載のチアゾール誘導体固定化マトリックスの製造方法。
【請求項７】
一般式（１）
【化５】
（式中、Ｒ１、Ｒ２、Ａｒ、ｎ及びＭは前記と同じ意味を表す。）で示されるチアゾール誘導体固定化マトリックスを使用し、タンパク質の分析または精製を行なう方法。
【請求項８】
タンパク質が免疫グロブリン、またはこれらの類縁体、フラグメント、融合体であることを特徴とする、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
免疫グロブリンが免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）であることを特徴とする、請求項８に記載の方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図１６】
【図１７】
【図１８】
【図１９】
【図２０】
【図２１】
【図２２】
【図２３】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図１６】
【図１７】
【図１８】
【図１９】
【図２０】
【図２１】
【図２２】
【図２３】
【公開番号】特開２００９−２４４２５２（Ｐ２００９−２４４２５２Ａ）
【公開日】平成２１年１０月２２日（２００９．１０．２２）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００９−７０９４（Ｐ２００９−７０９４）
【出願日】平成２１年１月１５日（２００９．１．１５）
【出願人】（０００１７３７６２）財団法人相模中央化学研究所 (151)
【出願人】（０００００３３００）東ソー株式会社 (1,901)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２１年１０月２２日（２００９．１０．２２）
【国際特許分類】
【出願日】平成２１年１月１５日（２００９．１．１５）
【出願人】（０００１７３７６２）財団法人相模中央化学研究所 (151)
【出願人】（０００００３３００）東ソー株式会社 (1,901)
【Ｆターム（参考）】
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