新規なファージディスプレイベクター
本発明は、クローニングカセットと、ファージディスプレイカセットと、細菌カセットとを少なくとも含んでなる最小化ファージディスプレイベクターに関し、前記クローニングカセットは、少なくとも抗体の定常ドメインのドメイン内ループに対応する１個のポリペプチドをコードする核酸配列を含んでなる。本発明は、ファージのライブラリーの産生のためのそれらの使用にも関し、それぞれのファージは、結合パートナーを結合する能力についてスクリーニングを行う結合タンパク質をその表面に発現させる。
【発明の詳細な説明】
【発明の背景】
【０００１】
本発明は、モノクローナル抗体のドメインに関する。更に詳細には、本発明は、小型ベクター、およびファージライブラリーの製造のためのそれらの使用に関し、それぞれのファージは、結合パートナーを結合するその能力についてスクリーニングを行う結合タンパク質をその表面に発現する。
【０００２】
ファージディスプレイ法は、タンパク質の相互作用を検討するのに用いられる手法である。この手法は、ファージの表面で目的とする結合タンパク質を発現させ、結合パートナーと複合体を形成するその能力について前記結合タンパク質を選択することに基づいている。この方法の原理は、ファージゲノムの遺伝子組換え、すなわち目的とする結合タンパク質をコードする配列を前記のファージゲノムに挿入することに依存している。配列挿入は、ファージのコートタンパク質複合体を形成するタンパク質をコードする遺伝子に隣接して配置される。前記コートは、極めて一般的に用いられる、例えば、ｐＩＩＩおよびｐＶＩＩＩタンパク質のような様々なタンパク質から構成されている。これらのタンパク質をコードする遺伝子に隣接して目的とする配列を挿入することにより、目的とする結合タンパク質をファージのコートタンパク質に融合させることができる。次いで、ファージ組換体を細菌に感染させ、そのゲノムが複製される。組換えファージゲノムの発現により、スクリーニングを行う結合タンパク質を表面に発現するファージが産生する。スクリーニングの段階中に、結合パートナーとよばれる異なるタンパク質または分子を、目的とする前記タンパク質と接触させる。複合体がファージ表面の結合タンパク質と結合パートナーとの間に形成されると、複合体を精製した後、目的とする結合タンパク質をコードするヌクレオチド配列を組換えファージゲノムから決定することができる。
【０００３】
ファージディスプレイの原理は、１９８５年［Ｓｍｉｔｈ，Ｇ．Ｐ．， １９８５， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２２８， １３１５−１３１７］から始まり、この手法は、ヘルパーファージおよびファージミドベクターとを組合せた抗体断片の選択に応用されている［ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙ，Ｊ．ｅｔ ａｌ．， １９９０， Ｎａｔｕｒｅ ３４８， ５５２−５５４］，［Ｂａｒｂａｓ，Ｃ．Ｆ．ｅｔ ａｌ．， １９９１， ８８， ７９７８−７９８２］，［Ｂｒｅｉｔｌｉｎｇ，Ｆ．ｅｔ ａｌ．， １９９１， Ｇｅｎｅ １０４， １４７−１５３］，［Ｂｕｒｔｏｎ，Ｄ．Ｒ．ｅｔ ａｌ．， １９９１， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． Ｕ． Ｓ． Ａ ８８， １０１３４−１０１３７］， ［Ｃｌａｃｋｓｏｎ，Ｔ．ｅｔａｌ．， １９９１， Ｎａｔｕｒｅ ３５２， ６２４−６２８］， ［Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍ，Ｈ．Ｒ．ｅｔ ａｌ．， １９９１， Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． １９， ４１３３−４１３７］。ファージディスプレイ法は、ファージディスプレイベクターとも呼ばれるファージミドベクターと、目的とする結合タンパク質をその表面上で発現させるファージライブラリーを生成するためのヘルパーファージとの使用を組み合わせている。ファージディスプレイベクターは、目的とする結合タンパク質をコードする配列と、ファージ配列、特に目的とする結合タンパク質と融合させるコートタンパク質をコードする配列とを含んでなる。ファージディスプレイベクターは、ファージゲノムの複製または宿主細胞におけるベクターの保持のための様々な機能的配列からも構成されている。ファージディスプレイベクターは、総てのファージゲノムを含まないが、これは、この方法が、表面に結合タンパク質を発現させるファージを産生するためのヘルパーファージの使用と組み合わされているからである。ヘルパーファージは、ファージディスプレイベクターに含まれていない完全ファージゲノムからタンパク質を補足することによって、ファージディスプレイベクター上でファージゲノムを複製およびパッケージングすることができる。
【０００４】
ここで、バクテリオファージＭ１３ゲノムの全体を含んでなる古典的ファージベクターとは対照的に、ファージミドベクターとも呼ばれるファージディスプレイベクターは、ｇｅｎｅＩＩＩの断片とＭ１３遺伝子間領域を含むＭ１３ゲノムの小部分のみを含んでなることを思い起こさねばならない。
【０００５】
例えば、このようなファージベクターは、古典的には大きなベクター（一般的には６０００塩基対を上回る）であり、特許出願ＷＯ９２／０６２０４号に記載のベクターＭ１３ＩＸ３０、Ｍ１３ＩＸ１１、Ｍ１３ＩＸ３４、Ｍ１３ＩＸ１３またはＭ１３ＩＸ６０、または特許出願ＵＳ６，０５７，０９８号明細書に記載の多価ディスプレイライブラリーを生成する方法に用いられるベクター６６８−４のような任意の誘導ファージベクターからなることができる。
【０００６】
最初のファージミドベクターｐＣＡＮＴＡＢ［Ａｂｒａｈａｍ， Ｒ．ｅｔ ａｌ．，１９９５， Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． Ｍｅｔｈｏｄｓ １８３， １１９−１２５］、［Ｔａｎａｋａ， Ａ．Ｓ． ｅｔ ａｌ．， １９９５，Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｂｉｏｐｈｙｓ． Ｒｅｓ． Ｃｏｍｍｕｎ．２１４， ３８９−３９５］、ｐＨＥＮ［Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍ， Ｈ．Ｒ．ｅｔ ａｌ．， １９９１， Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． １９， ４１３３−４１３７］、［ＷＯ ９２／０１０４７］、ｐＣＯＭＢ［Ｂａｒｂａｓ， Ｃ．Ｆ． ｅｔ ａｌ．， １９９１， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． Ｕ． Ｓ． Ａ ８８， ７９７８−７９８２］、［Ｂｕｒｔｏｎ， Ｄ．Ｒ．ｅｔ ａｌ．， １９９１， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． Ｕ． Ｓ． Ａ ８８， １０１３４−１０１３７］は、利用可能な分子生物学的ツールを用いてその時点で利用可能なクローニングおよび発現ベクターから構築した。この時以来、ファージミドベクターには最適化はほとんど用いられておらず、まれな例はｐＫＭ１９［Ｐａｖｏｎｉ， Ｅ．ｅｔ ａｌ．， ２００７， Ｇｅｎｅ ３９１， １２０−１２９］であり、その構築には、最適化プロモーターとバクテリオファージＭ１３のｇｅｎｅＩＩＩ産物のＣ末端ドメインの使用の利点が考慮されている［Ｂａｒｂａｓ， Ｃ．Ｆ．ｅｔ ａｌ．， １９９１， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． Ｕ． Ｓ． Ａ ８８， ７９７８−７９８２］。
【０００７】
本発明は、クローニングカセット、ファージディスプレイカセットおよび細菌カセットを含んでなるファージディスプレイベクター、およびファージのライブラリーを生成するためのその使用に関し、ライブラリーのそれぞれのメンバーは、その表面上で結合タンパク質を発現させる。下記の説明で明らかになるように、３個のカセットのそれぞれは最適化されて、結合タンパク質のファージディスプレイに好適な機能的ベクターを生成する。
【０００８】
今日まで、この手法が堅牢であると思われていても、目的とするタンパク質の発現レベルに関して不十分な点がある。今日まで用いられてきたこの手法のもう一つの不都合な点は、選択された結合タンパク質の検出および精製である。
【０００９】
本発明は、これらの問題点を解決しようとするものであり、初めての新規かつ自明でない最適化ファージディスプレイベクターについて記載するものである。
【００１０】
第一の態様では、本発明は、クローニングカセットと、ファージディスプレイカセットと、細菌カセットとを少なくとも含んでなり、前記クローニングカセットが、少なくとも抗体の定常ドメインのドメイン内ループに対応するポリペプチドをコードする核酸配列を含んでなる、最小化ファージディスプレイベクターに関する。
【００１１】
本明細書では、疑念を避けるため、「カセット」は、特異的な生物学的および／または生化学的活性を有する特異的核酸配列を含んでなるＤＮＡ断片と考えるべきである。「カセット」、「遺伝子カセット」または「ＤＮＡカセット」という表現は、互換的に用いることができ、同じ意味を有する。
【００１２】
クローニングカセットは、遺伝子のクローニングにおいて活性を有するカセットと考えるべきである。クローニングカセットは、クローニングを行う目的とする１または数個の遺伝子の調節および発現に必要な核酸配列を含む。クローニングカセットは、プロモーターをコードする核酸配列と、終止コドンと、目的とする（複数の）遺伝子の導入に有用なクローニング部位とを少なくとも含んでなり、これらの成分のそれぞれは、互いに作動可能に連結（ｏｐｅｒａｂｌｙ ｌｉｎｋｅｄ）している。
【００１３】
「作動可能に連結した」または「作動可能に挿入した」という用語は、コード配列の発現に必要な調節配列がコード配列に関して適当な位置の核酸分子に置かれ、コード配列を発現させることができるようになっていることを意味する。一例として、プロモーターがコード配列の転写または発現を制御することができるときには、そのプロモーターはコード配列と作動可能に連結している。
【００１４】
ファージディスプレイカセットは、ファージディスプレイ法、更に正確には目的とする（複数の）タンパク質を表面上で発現させるファージライブラリーの産生を目的とするファージディスプレイ法で活性を有するカセットと考えるべきである。ファージディスプレイカセットは、ａ） 複製ベクターによって担持されたｓｓＤＮＡとしてのファージ源を含んでなる複製ベクターを複製することができ、かつ、ｂ） 機能的ファージゲノムの相補性を有する組換えファージを産生するため、ファージの複製源をコードする核酸配列を少なくとも含んでなる。
【００１５】
細菌カセットは、細菌宿主細胞にベクターの増加および保持に必要な（複数の）配列を含むカセットと考えるべきである。従って、細菌カセットは、主として、複製源と選択マーカーとをコードする核酸配列を少なくとも含んでなる。
【００１６】
それらのカセットの組成に関しては、下記で更に詳細に説明する。
【００１７】
しかしながら、当業者に明らかな任意の修飾も本発明に包含されるものと考えるべきであることを理解しなければならない。
【００１８】
「核酸」という用語は、デソキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチドおよび一本鎖または二本鎖形態でのそれらのポリマー（「ポリヌクレオチド」）を表す。特に制限しなければ、この用語は、参照核酸と同様の結合特性を有しておりかつ天然に存在するヌクレオチドと同様に代謝される天然ヌクレオチドの既知の類似体を含む核酸を包含する。他に指示がない限り、特定の核酸配列は、保存的に修飾されたその変異体（例えば、縮退コドン置換（ｄｅｇｅｎｅｒａｔｅ ｃｏｄｏｎ ｓｕｂｓｔｉｔｕｔｉｏｎ））および相補性配列並びに明確に指示された配列も暗黙裡に包含する。具体的には、縮退コドン置換は、１個以上の選択された（または総ての）コドンの３番目の位置が混合塩基（ｍｉｘｅｄ−ｂａｓｅ）および／またはデオキシイノシン残基で置換されている配列を生成することによって実現することができる。
【００１９】
「核酸」、「核酸配列」、「ヌクレオチド配列」または「ヌクレオチド分子」という用語は、遺伝子、遺伝子によってコードされるｃＤＮＡ、ＤＮＡおよびＲＮＡと互換的に用いられることもある。従って、本発明によるクローニングカセットは、抗体の定常ドメインのドメイン内ループに対応する少なくとも１個のポリペプチドをコードする核酸配列を含んでなる。本発明の好ましい態様では、前記核酸配列は、クローニング部位に隣接するクローニングカセットに挿入される。この好ましい挿入局在化により、（完全長の）定常ドメインの挿入の場合には、ｓｃＦｖ抗体断片と定常ドメインから構成される一本鎖抗体を獲得することができる。定常ドメインの存在により、目的とするタンパク質、すなわち一本鎖抗体の機能的発現を向上させることができることが示された。定常ドメインは、ファージディスプレイベクターに挿入された核酸配列から産生される結合タンパク質の検出および精製を向上させることもできる。
【００２０】
「抗体」、「抗体類（ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ）」または「免疫グロブリン」という用語は、最も広義に互換的に用いられ、モノクローナル抗体（例えば、完全長または完全なモノクローナル抗体）、ポリクローナル抗体、多価抗体または多重特異性抗体（例えば、所望な生物活性を示す限り、二重特異性抗体）が挙げられる。
【００２１】
更に詳細には、このような分子は、ジスルフィド結合によって相互連結された少なくとも２本の重（Ｈ）鎖および２本の軽（Ｌ）鎖とを含んでなる糖タンパク質からなっている。それぞれの重鎖は、重鎖可変領域（またはドメイン）（本明細書では、ＨＣＶＲまたはＶＨと略する）と重鎖定常領域とから構成されている。重鎖定常領域は、ＣＨ１、ＣＨ２およびＣＨ３の３つのドメインから構成されている。それぞれの軽鎖は、軽鎖可変領域（本明細書では、ＬＣＶＲまたはＶＬと略する）と、軽鎖定常領域とから構成されている。軽鎖定常領域は、１個のドメイン、ＣＬを含んでなる。ＶＨおよびＶＬ領域は、フレームワーク領域（ＦＲ）と呼ばれる一層保存されている領域が散在している相補性決定領域（ＣＤＲ）と呼ばれる超可変領域に更に細分することができる。それぞれのＶＨおよびＶＬは、下記の順序でアミノ末端からカルボキシ末端まで配置されている３個のＣＤＲと４個のＦＲから構成されている：ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、ＦＲ４。重および軽鎖の可変領域は、抗原と相互作用する結合ドメインを含む。これらの抗体の定常領域は、免疫系の様々な細胞（例えば、エフェクター細胞）と古典的補体系の第一成分（Ｃｌｑ）などの宿主組織または因子への免疫グロブリンの結合を介在することがある。
【００２２】
それらは、本明細書で更に詳細に説明されるように、ある種の抗体断片を包含し、それらは、起源または免疫グロブリンの種類（すなわち、ＩｇＧ、ＩｇＥ、ＩｇＭ、ＩｇＡなど）には無関係に、所望な結合特異性および親和性を示すこともある。
【００２３】
一般的には、特にマウス起源のモノクローナル抗体またはそれらの機能的断片を調製するには、詳細にはマニュアル「抗体（Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ）」（Ｈａｒｌｏｗ ａｎｄ Ｌａｎｅ， 抗体：実験室便覧（Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ）， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ＮＹ， ｐｐ． ７２６， １９８８）に記載されている手法、またはＫｏｈｌｅｒおよびＭｉｌｓｔｅｉｎによって報告されたハイブリドーマからの調製の手法（Ｎａｔｕｒｅ， ２５６：４９５−４９７， １９７５）を参照することができる。
【００２４】
当業者であれば、重鎖は、ガンマ、ミュー、アルファ、デルタまたはイプシロン（γ、μ、α、δ、ε）として分類され、それらには幾つかのサブクラス（例えば、ガンマ１−ガンマ４）があることを理解されるであろう。抗体の「クラス」をそれぞれＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＧまたはＩｇＥとして決定するのは、この鎖の性質である。免疫グロブリンのサブクラス（アイソタイプ）、例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１などは、詳細に特性決定されており、機能的特殊化を付与することが知られている。
【００２５】
軽鎖は、カッパまたはラムダ（κ、λ）として分類される。
【００２６】
軽および重鎖は、両方とも構造的および機能的相同性の領域に分割される。「定常」および「可変」という用語は、機能的に用いられる。これに関して、軽（ＶＬ）および重（ＶＨ）鎖部分の可変ドメインは、抗原認識および特異性を決定することを理解されるであろう。逆に、軽鎖（ＣＬ）および重鎖（ＣＨ１、ＣＨ２もしくはＣＨ３、またはＩｇＭおよびＩｇＥの場合にはＣＨ４）の定常ドメインは、分泌、経胎盤移動性、Ｆｃ受容体結合、補体結合などの重要な生物学的特性を付与する。慣例により、定常領域ドメインのナンバリングは、抗体の抗原結合部位またはアミノ末端からより遠位になると、増加する。
【００２７】
抗体の「定常ドメイン」という表現は、抗原のエピトープを認識することができるあらゆる多様な配列を含む抗体の可変領域と比較して、一方の抗体から同一アイソタイプおよびアロタイプの別の抗体への変異性が全くない抗体領域と理解される。
【００２８】
これらの定常ドメイン、すなわちＣＬ、ＣＨ１、ＣＨ２、ＣＨ３およびＣＨ４のそれぞれに、ジスルフィド結合は約６０アミノ酸のループを形成している。本明細書において、前記ループはドメイン内ループと呼ばれる。
【００２９】
ヒトＩｇＧ ＣＨ１の好ましい場合には、２８種類の考え得るガンマ重鎖であって、それぞれが９７アミノ酸（配列番号１０４〜１３１）のポリペプチドからなる定常ドメインＣＨ１を有するものが存在する。これらの２８種類のドメインのそれぞれは、２６位にシステイン残基と８２位にもう一つのシステイン残基を示し、ジスルフィド橋を形成し、結果としてこれら２個のシステイン間にジスルフィド結合を形成することによって、ドメイン内ループを形成する。
【００３０】
本発明の特定態様では、クローニングカセットは、抗体の重鎖定常ドメインのドメイン内ループに対応する少なくとも１個のポリペプチドをコードする核酸配列を含んでなる。
【００３１】
更に詳細には、重鎖に対する好ましいドメイン内ループは、２６位のシステインと８２位のシステインとの間に含まれるポリペプチドから構成されるＣＨ１ドメイン内ループである。
【００３２】
更に好ましい態様では、クローニングカセットは、抗体の重鎖の定常ドメインに対応する少なくとも１個のポリペプチドをコードする核酸配列を含んでなる。
【００３３】
更に好ましい態様では、抗体の重鎖定常ドメインは、抗体のＣＨ１重鎖定常ドメインである。
【００３４】
当業者には、本発明によって用いられる別の重鎖定常ドメインのドメイン内ループを画定することは明らかであろう。
【００３５】
本発明のもう一つの態様では、クローニングカセットは、抗体の軽鎖定常ドメインのドメイン内ループに対応する少なくとも１個のポリペプチドをコードする核酸配列を含んでなる。
【００３６】
ヒトには、５種類のカッパ鎖があり、それらのそれぞれは、それぞれ２７および８７位における２個のシステイン残基を有する１０７アミノ酸のポリペプチドに対応し、ドメイン内ループ（配列番号９０〜９４）を形成する。
【００３７】
更に詳細には、カッパ軽鎖に対する好ましいドメイン内ループは、２７位のシステイン８７位のシステインの間に含まれるポリペプチドから構成されるドメイン内ループである。
【００３８】
ヒトのラムダ鎖に対しては、９個の異なる形態があり、それらのそれぞれが、それぞれ２７および８６位における２個のシステイン残基を有する１０５アミノ酸のポリペプチドに対応し、ドメイン内ループ（配列番号９５〜１０３）を形成する。
【００３９】
更に詳細には、ラムダ軽鎖に対する好ましいドメイン内ループは、２７位のシステインと８６位のシステインの間に含まれるポリペプチドから構成されるドメイン内ループである。
【００４０】
もう一つの態様では、クローニングカセットは、少なくとも抗体の軽鎖定常ドメインに対応するポリペプチドをコードする核酸配列を含んでなる。
【００４１】
本発明の好ましい態様では、クローニングカセットの定常ドメインは、軽鎖カッパ定常ドメインである。
【００４２】
本発明で用いられるカッパ定常ドメインの源は、優先的にはヒトである。
【００４３】
本発明の最も好ましい態様では、前記クローニングカセットの前記定常ドメインは、Ｃ末端システインが欠失した軽鎖カッパ定常ドメインである。
【００４４】
前記のカッパ定常ドメインは、ファージの表面で発現する一本鎖抗体の二量体化を防止するためのＣ末端システインを欠いており、このような二量体化はカッパ定常ドメイン間で起こり得るものである。実際に、抗体の重および軽鎖の定常ドメインは、軽鎖のＣ末端システインと重鎖定常ドメインにおける非対（ｎｏｎ−ｐａｉｒｅｄ）システインの間にジスルフィド結合を形成することによって集合する。本発明は、ファージの表面に結合タンパク質を提供する。定常ドメインのＣ末端システインを除去しないことにより、一本鎖抗体の二量体化の可能性と親和力の効果による非典型的結合（ｎｏｎ ｒｅｐｒｅｓｅｎｔａｔｉｖｅ ｂｉｎｄｉｎｇ）を生じる。
【００４５】
Ｃ末端システインの除去は、前記二量体化を防止するのに必要であり、従って、一本鎖抗体の二量体化によるｇＩＩＩ融合タンパク質のミスフォールディングまたは凝集の防止に応用される。
【００４６】
本発明のもう一つの好ましい態様では、クローニングカセットの定常ドメインは、軽鎖ラムダ定常ドメインである。
【００４７】
本発明で用いられるラムダ定常ドメインの源は、優先的にはヒトである。
【００４８】
本発明の最も好ましい態様では、前記クローニングカセットの前記定常ドメインは、１０４位のシステインが欠失している軽鎖ラムダ定常ドメインである（配列番号９５〜１０３）。もう一つの態様では、Ｃ末端残基１０４および１０５（システイン−セリン）を欠失することができる（配列番号９５〜１０３）。
【００４９】
今日までに、ファージディスプレイによる提示および選択のための一本鎖定常ドメインに融合した一本鎖Ｆｖの発現は、報告されていない。
【００５０】
本発明のもう一つの特に革新的な態様は、ベクターのサイズである。
【００５１】
大腸菌の形質転換効率は、極めて多様性に富むライブラリーを生成するための制限段階であり、ベクターサイズは形質転換効率に反比例する［Ｓｉｇｕｒｅｔ， Ｖ． ｅｔ ａｌ．， １９９４， Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ１６， ４２２−４２６］。現在報告されているファージディスプレイベクターは、結合パートナー可変ドメインの非存在下において３３９０塩基対を上回りかつ典型的には４５００ｂｐを上回るサイズを示し、ベクターサイズが増加すると、形質転換効率は減少して、得られるライブラリーのサイズが減少するか、または高い多様性を達成するには形質転換を繰り返すことが必要となる。
【００５２】
定常ドメインを全く含まない現在報告されているファージディスプレイベクターのサイズを、下記に示す。
ｐＣＡＮＴＡＢ ５Ｅ ４５２２ｂｐ
ｐＨＥＮ１ ４５２３ｂｐ
ｐＨＥＮ２ ４６１６ｂｐ
【００５３】
他の用いられるＭ１３ファージベクターのサイズも、以下に示す（例えば、ＷＯ９２／０６２０４号を参照）。
Ｍ１３ＩＸ３０ ７４４５ｂｐ
Ｍ１３ＩＸ１１ ７３１７ｂｐ
Ｍ１３ＩＸ３４ ７７２９ｂｐ
Ｍ１３ＩＸ１３ ７５５７ｂｐ
Ｍ１３ＩＸ６０ ８１１８ｂｐ
【００５４】
ファージディスプレイベクターのサイズは、形質転換効率に反比例する。
【００５５】
本発明のもう一つの目的は、宿主細胞の形質転換効率を最適にすることである。この技術的問題は、総ての必要な生物活性を保持したまま本発明のベクターのサイズを減少させることによって解決される。本発明のもう一つの特に創意に富む態様は、前記３種類のカセット中および間における非機能的ヌクレオチドを除去することにより、ファージディスプレイベクターのサイズを最小にしかつ形質転換効率を最適にすることに基づいている。この段階において、前記最小化ファージディスプレイベクターの活性が保存されることは予想されないので、ファージディスプレイベクターのサイズの減少が当業者には明らかではなかったことを理解しなければならない（実施例７参照）。この点の実例として、ここではファージディスプレイベクターが、この手法の誕生以来、すなわち８０年代以来存在しており、前記ファージディスプレイベクターのサイズの減少に関する先行技術がないということが挙げられる。
【００５６】
ベクターにおける非機能的ヌクレオチドの欠失により、一層小さなベクターのライブラリーを生成することができ、宿主細胞に対するストレスを小さくする。このベクターは、また宿主細胞で一層容易に保持される。
【００５７】
これらの欠失により、抗体の定常ドメインのドメイン内ループに対応する少なくとも１個のポリペプチドをコードする核酸配列のサイズを含む３３００塩基対未満の新規なファージディスプレイベクターを生じ、これは上記のように本発明の特徴である。これは、定常ドメインまたはこのような定常ドメインのドメイン内ループ（４５００塩基対を上回る）をコードするこのような核酸配列を含まない従来技術のベクターで観察される通常のサイズよりかなり小さなものである。比較を容易にするため、抗体の定常ドメインのドメイン内ループに対応する少なくとも１個のポリペプチドをコードする核酸配列が全くない本発明によるファージディスプレイベクターのサイズは、３０００塩基対未満であると考えることができる。
【００５８】
一例として、ベクターｐＰＬ１２およびｐＰＬ１４は３２４６塩基対（抗体のドメイン内ループに対応するポリペプチドをコードする核酸配列のない２９２８塩基対に対応する）であり、ｐＰＬ２２は３１０９塩基対（抗体のドメイン内ループに対応するポリペプチドをコードする核酸配列のない２７５１塩基対）であると言うことができる。３１５８塩基対を含んでなるベクターｐＰＬ３１を挙げることもできる。下記の実施例において明確に説明されるこれら４種類のベクターは、本発明によるベクターの非制限的例であることを理解しなければならない。
【００５９】
これら４種類のベクターｐＰＬ１２、ｐＰＬ１４、ｐＰＬ２２およびｐＰＬ３１の配列は、それぞれ配列番号１、５、７および１４８の配列で表される。
【００６０】
今日まで、抗体の定常ドメインのドメイン内ループに対応する少なくとも１個のポリペプチドをコードする核酸配列を含んでなり、かつ、３３００塩基対を上回らない最小化ベクターの使用は、記載も示唆もされていない。
【００６１】
疑念を払拭するため、「最小化ベクター」という表現は、サイズが３３００塩基対以下のベクターと理解しなければならない。
【００６２】
本発明のファージディスプレイベクターは、スクリーニングを行う結合タンパク質を表面に発現させるファージのライブラリーを生じるために用いられる。
【００６３】
「結合タンパク質」は、別のタンパク質または分子と特異的または全般的親和性を有するペプチド鎖である。タンパク質同士は、結合が可能なときには、接触して複合体を形成する。ファージ表面で発現する本発明の結合タンパク質は、好ましくは、抗体、抗体の断片または誘導体、タンパク質またはペプチドであることができる。
【００６４】
ファージディスプレイ法は、従って、本発明の好ましい態様で、抗原のような新規なターゲット分子を結合する特異抗体を決定するためのスクリーニング法として用いることができる。この手法は、特異抗体を生じるための動物免疫化段階を行わずに前記抗体または抗体断片の選択という利点を提示する。目的とする結合タンパク質を発現させるファージは、細菌細胞で直接生じる。
【００６５】
ファージディスプレイベクターのクローニング部位に挿入された核酸配列は、抗体の可変鎖をコードする配列に対応し、ｓｃＦｖ、一本鎖Ｆｖとも呼ばれる抗体の断片を形成し、これは以下において説明する。
【００６６】
本発明による抗体の「機能的断片」とは、可変断片（Ｆｖ）、ｓｃＦｖ（一本鎖に対してｓｃ）、抗原結合性断片（Ｆａｂ）、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆａｂ’、ｓｃＦｖ−Ｆｃ断片もしくはジアボディー(diabodies)、または半減期がポリ（アルキレン）グリコール、例えば、ポリ（エチレン）グリコール（「ＰＥＧ化」）（Ｆｖ−ＰＥＧ、ｓｃＦｖ−ＰＥＧ、Ｆａｂ−ＰＥＧ、Ｆ（ａｂ’）２−ＰＥＧまたはＦａｂ’−ＰＥＧと呼ばれるペジル化断片）（「ポリ（エチレン）グリコールに対しての「ＰＥＧ」）の付加のような化学修飾によって増加し、かつとりわけ由来する抗体の部分的活性さえも一般的に発揮することができる任意の断片、のような抗体断片を示そうとするものである。
【００６７】
好ましくは、前記機能的断片は、それらの断片が由来する抗体の重または軽可変鎖の部分配列から構成されまたは部分配列を含んでなり、前記部分配列は、それが由来する抗体と同じ結合特異性、および十分な親和性、好ましくは少なくともそれが由来する抗体の親和性の１／１００、更に好ましくは少なくとも１／１０を保持するのに十分である。このような機能的断片は、それが由来する抗体の配列の最小限度でも５アミノ酸、好ましくは１０、１５、２５、５０および１００連続アミノ酸を含む。
【００６８】
好ましくは、これらの機能的断片は、Ｆｖ、ｓｃＦｖ、ｓｃＦｖ−Ｆｃ型の断片またはジアボディーであり、これらは一般的には、それらが由来する抗体と同じ結合特異性を有する。もう一つの方法では、本発明に含まれる抗体断片は、当業者に周知の遺伝子組換え技術によって、あるいはＡｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社によって供給されるような自動ペプチド合成装置などによるペプチド合成または遺伝子合成によって得ることもできる。
【００６９】
「一本鎖可変断片」（ｓｃＦｖ）は、前記定義の抗体断片であり、ペプチド結合によって互いに結合している抗体の重および軽鎖の可変領域から構成されている。これらの断片は、天然状態では存在しないが、人工的に構築されている。一本鎖可変断片における重−軽または軽−重可変領域の順序は、結合パートナーの認識や組換えタンパク質の発現に有意な効果を示さないので、可変領域の順序は互換的と考えることができる。可変領域間にシス型（ｃｉｓ）で導入される結合ペプチドは、可変領域を天然抗体に似た三次元配置に配向する働きをする。結合ペプチドの選択は、多くの過程で生じるｓｃＦｖに影響し、ペプチドの長さは、単量体性または多量体性ｓｃＦｖ化合物の形成に影響する。短めの結合ペプチドでは、二量体、三量体または四量体のような多量体性ｓｃＦｖが形成されやすく、１２を上回るアミノ酸での長めの結合ペプチドでは、単量体が形成されやすい。結合ペプチドは、理想的には、発現したｓｃＦｖの折り畳みや結合を制限しないアミノ酸残基からなり、アミノ酸組成は、極性で非イオン化性の小アミノ酸が有利である。
【００７０】
「一本鎖抗体」は、抗体のｓｃＦｖ断片と定常ドメインから構成される結合分子と定義される。従って、一本鎖抗体は、抗原と相互作用する重または軽鎖からの結合ドメインを含む１本の重鎖および１本の軽鎖の可変領域を示す。
【００７１】
本発明による抗体の「誘導体」とは、タンパク質スキャフォールドと、結合能力を保持する目的で元の抗体から選択されるＣＤＲの少なくとも１個とを含んでなる結合タンパク質を意味する。このような化合物は、当業者には周知であり、下記の明細書で更に詳細に説明する。
【００７２】
更に詳細には、本発明による抗体、またはその機能的断片もしくは誘導体の１つは、前記誘導体が、元の抗体のパラトープを保存するように少なくとも１個のＣＤＲがグラフトしているスキャフォールドを含んでなる結合タンパク質からなることを特徴とする。
【００７３】
本発明に記載の６個のＣＤＲ配列の１または数個の配列を、タンパク質スキャフォールド上に提示することができる。この場合には、タンパク質スキャフォールドは、グラフトした（複数の）ＣＤＲの適当な折り畳みを有するタンパク質主鎖を再生することによって、抗原結合パラトープを保持することができる。
【００７４】
当業者であれば、元の抗体から選択される少なくとも１個のＣＤＲをグラフトさせることができるタンパク質スキャフォールドを選択する方法を知っている。更に詳細には、選択を行うには、このようなスキャフォールドが下記のような幾つかの特徴を示すことが知られている（Ｓｋｅｒｒａ Ａ．， Ｊ． Ｍｏｌ． Ｒｅｃｏｇｎ．， １３， ２０００， １６７−１８７）：
系統発生的に保存され、
周知の三次元分子構成を有する確固とした構造（例えば、結晶学またはＮＭＲ）、
サイズが小さく、
翻訳後修飾が全くないかまたは極低い程度であり、
産生、発現および精製が容易である。
【００７５】
このようなタンパク質スキャフォールドは、フィブロネクチンおよび優先的には１０番目のフィブロネクチンＩＩＩ型ドメイン（ＦＮｆｎ１０）、リポカリン、アンチカリン（Ｓｋｅｒｒａ Ａ．， Ｊ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．， ２００１， ７４（４）：２５７−７５）、ブドウ球菌タンパク質のドメインＢのタンパク質Ｚ誘導体、チオレドキシンＡ、または「アンキリン反復」（Ｋｏｈｌ ｅｔ ａｌ．， ＰＮＡＳ， ２００３， ｖｏｌ．１００， Ｎｏ．４， １７００−１７０５）、「アルマジロ反復」、「ロイシン・リッチ反復」もしくは「テトラトリコペプチド反復」などの反復ドメインを有する任意のタンパク質からなる群から選択される構造であるが、制限はない。
【００７６】
毒素（例えば、サソリ、昆虫、植物または軟体動物毒素など）またはニューロン性一酸化窒素シンターゼのタンパク質阻害剤（ＰＩＮ）からのスキャフォールド誘導体の更なる選択も、考慮すべきである。
【００７７】
このようなハイブリッド構築物の非制限的例として、抗−ＣＤ４抗体、すなわち１３Ｂ８．２抗体のＣＤＲ−Ｈ１（重鎖）のＰＩＮの露出したループの１つへの挿入を示すことができる。得られた結合タンパク質の結合特性は、元の抗体と同様のままである（Ｂｅｓ ｅｔ ａｌ．， ＢＢＲＣ ３４３， ２００６， ３３４−３４４）。抗−リゾチームＶＨＨ抗体のＣＤＲ−Ｈ３（重鎖）のネオカルチノスタチンのループへのグラフトを、挙げることもできる（Ｎｉｃａｉｓｅ ｅｔ ａｌ．， ２００４）。
【００７８】
上記のように、このようなタンパク質スキャフォールドは、元の抗体由来の１〜６個のＣＤＲを含んでなることができる。好ましい態様では、制限なしではあるが、当該技術に熟練した者であれば、特に抗体特異性に関係していることが知られている重鎖由来の少なくとも１個のＣＤＲを選択できるだろう。目的とする（複数の）ＣＤＲの選択は、既知の方法で当業者に明らかになるであろう（ＢＥＳ ｅｔ ａｌ．， ＦＥＢＳ ｌｅｔｔｅｒｓ ５０８， ２００１， ６７−７４）。
【００７９】
証拠として、これらの例は制限的なものではなく、既知または報告されている任意の他のスキャフォールドが本明細書に含まれなければならない。
【００８０】
もう一つの態様によれば、本発明によるベクターのクローニングカセットは、プロモーターをコードする核酸配列と、シグナルペプチドをコードする核酸配列とを少なくとも含んでなる。
【００８１】
プロモーターは、メッセンジャーＲＮＡにおける遺伝子配列の転写を開始させることができる核酸配列であり、このような転写は、ＲＮＡポリメラーゼの前記プロモーターへの結合によって開始される。
【００８２】
前記プロモーターをコードする配列は、非制限的例として、Ｌａｃ、Ｔａｃ、Ｔｒｐ、Ｔｅｔ、Ｔ７、ＳＰ６からなる群から選択することができる。
【００８３】
好ましい態様では、本発明の前記クローニングカセットのプロモーターは、Ｌａｃプロモーターである。
【００８４】
「シグナルペプチド」は、目的とする結合タンパク質が細胞で発現した後に、局在化に関するペプチド鎖である。ペプチドシグナル配列は、ベクター上の前記目的とする結合タンパク質をコードする配列に隣接して配置される。一本鎖ＤＮＡ組成物中のファージディスプレイベクターを含むファージキャプシド集合体に目的とする結合タンパク質を正確に組込むには、ペプチドシグナルによる宿主生物のペリプラズム間隙（ｐｅｒｉｐｌａｓｉｍｉｃ ｓｐａｃｅ）に目的とする結合タンパク質をターゲッティングする必要がある。目的とする結合タンパク質の構造は、一本鎖抗体の場合にはジスルフィド結合の形成が必要である。ペリプラズム間隙は酸化的環境であるが、前記一本鎖抗体の構造的折り畳みを行うことができる。
【００８５】
前記シグナルペプチドをコードする配列は、非制限的例として、ｐｅｌＢ、ｇｅｎｅＩＩＩ、ｐｈｏＡ、ｍａｌＥ、ｄｓｂＡをコードする配列からなる群から選択することができる。
【００８６】
好ましい態様では、前記クローニングカセットのシグナルペプチドは、ｐｅｌＢシグナルペプチドである。
【００８７】
もう一つの態様では、本発明によるベクターのクローニングカセットは、更にクローニング部位をコードする核酸配列を含んでなる。
【００８８】
本明細書で用いられる「クローニング部位」という用語は、適合する突出または平滑末端を含む核酸配列のライゲーションによる制限エンドヌクレアーゼ仲介クローニングのための制限部位、相同および伸長「オーバーラップＰＣＲスティッチング（ｏｖｅｒｌａｐ ＰＣＲ ｓｔｉｔｃｈｉｎｇ）」によるインサートＤＮＡのＰＣＲによるクローニングのためのプライミング部位として働く核酸配列の領域、または組換え−交換反応、またはターゲット核酸配列のトランスポゾン介在挿入のためのモザイク末端並びに当該技術分野でよく知られている他の手法によるターゲット核酸配列のリコンビナーゼによる挿入のための組換え部位を含む核酸配列を表す。
【００８９】
好ましい態様では、本発明によるクローニング部位は、少なくとも２つの制限部位を含んでなる。
【００９０】
非制限的例として、配列番号２の配列のクローニングカセットを好ましいクローニングカセットとして挙げることができる。
【００９１】
本発明によって産生しかつ下記に定義されるファージは、その表面に抗体の軽鎖および重鎖、結合ペプチドおよび定常ドメインを含んでなる結合タンパク質を提示する。２個の制限部位は、ベクターに軽および重鎖をコードする配列を挿入することが必要なことがある。
【００９２】
定常ドメイン抗体のドメイン内ループに対応する少なくとも１個のポリペプチドを用いる可変軽および重鎖から構成される一本鎖抗体の形成は、可変軽および重鎖間の結合ペプチドによって導かれる結合によって実現される。
【００９３】
前記結合ペプチドの配列を、ベクターに挿入することができる。それは、本発明で非制限的に例示されているｐＰＬ１２、ｐＰＬ１４、ｐＰＬ２２およびｐＰＬ３１ベクターのようなベクターに既に含まれていることもあり、特異的挿入には、追加の制限部位が必要となることがある。
【００９４】
ファージディスプレイカセットは、Ｍ１３ｇｅｎｅＩＩＩタンパク質をコードする核酸配列の総てまたは一部を含んでなることができる。しかしながら、Ｍ１３ｇｅｎｅＶＩＩ、ＶＩＩＩまたはＩＸタンパク質をコードする核酸配列を用いることもできる。
【００９５】
Ｍ１３ｇｅｎｅＩＩＩタンパク質は、Ｍ１３ファージ由来のタンパク質であり、ファージのキャプシドを形成する複合体の一部である。ｇｅｎｅＩＩＩタンパク質は、分泌されるファージの最末端に配置され、キャプシド中のその量は１個のタンパク質に限定されず、数個から５個までのｇｅｎｅＩＩＩタンパク質を挙げることができる。結合タンパク質をコードする核酸配列は、ベクター上のＭ１３ｇｅｎｅＩＩＩタンパク質をコードする核酸配列に隣接して配置される。翻訳後、結合タンパク質は、このようにしてｇｅｎｅＩＩＩタンパク質に融合する。ファージディスプレイベクター由来の融合タンパク質の発現レベルを調節することによって、ファージゲノム相補性によって提供される野生型ｐＩＩＩと比較して融合タンパク質のコピー数を調節することができる。理想的には、少数の融合タンパク質をそれぞれのファージキャプシドに組込み、提示される結合分子のアビディティー（ａｖｉｄｉｔｙ）を防止する。
【００９６】
好ましい態様では、ベクターは、ファージディスプレイカセットが、少なくとも配列番号１３２または１３３に対応するＭ１３ｇｅｎｅＩＩＩタンパク質のＣ末端ドメインを含んでなる核酸配列を含んでなることを特徴とする。
【００９７】
本発明のもう一つの態様は、Ｍ１３ｇｅｎｅＩＩＩタンパク質のＣ末端配列のみの使用である。この核酸配列は、ファージに付着してコートタンパク質複合体を形成するタンパク質の一部をコードする。
【００９８】
Ｍ１３ｇｅｎｅＩＩＩタンパク質をコードするＣ末端配列は、Ｍ１３ｇｅｎｅＩＩＩタンパク質の野生型の核酸配列（配列番号１３３）を提示する。しかしながら、この核酸配列は、本発明において単一ヌクレオチド突然変異（Ａ３２８Ｇ）に対応する野生型配列（Ｓ１１０Ｇ）由来の単一アミノ酸の突然変異により最適化することができる。前記Ｃ末端Ｍ１３ｇｅｎｅＩＩＩタンパク質の配列は、大腸菌での発現のためのＧｅｎｅａｒｔによって最適化され、配列番号１３２に対応している。
【００９９】
最も好ましい態様では、ファージディスプレイカセットは、少なくとも配列番号１３２に対応するＭ１３ｇｅｎｅＩＩＩタンパク質のＣ末端ドメインを含んでなる最適化した核酸配列を含んでなる。
【０１００】
本発明のもう一つの態様では、本発明によるファージディスプレイカセットは、終止コドンをコードする核酸配列、ファージの複製源をコードする核酸配列、およびカプセル化またはパッケージング配列をコードする核酸配列を含んでなる。
【０１０１】
終止コドンは、３個のヌクレオチドから構成される短い配列であり、ｍＲＮＡ翻訳の終了に関与する。任意のアミノ酸をコードしない３個のヌクレオチドの組み合わせが、ｍＲＮＡのタンパク質へのリボソーム翻訳を終了する。
【０１０２】
本発明の終止コドンの配列は、抗体の定常ドメインのドメイン内ループに対応するポリペプチドをコードする核酸配列と、Ｍ１３ｇｅｎｅＩＩＩタンパク質をコードする核酸配列との間に配置されるべきである。終止コドンの機能は、その翻訳（ｉｎｔｅｒｐｒｅｔａｔｉｏｎ）が選択される細胞株によって異なるので、本発明のファージディスプレイベクターによって形質転換される宿主株によって変化する。
【０１０３】
サプレッサー株の場合には、終止コドンはその株によってアミノ酸として認識される。従って、翻訳は中断されず、翻訳産物は、ｇｅｎｅＩＩＩタンパク質とファージ表面上で発現させた結合分子との融合体である。
【０１０４】
非サプレッサー株の場合には、終止コドンを認識して、翻訳を停止する。従って、翻訳産物は結合分子である。非サプレッサー株は、結合パートナーと複合体形成の目的で一本鎖抗体をスクリーニングし検出した後に結合分子のみを産生するのに用いることができる。それは、ｇｅｎｅＩＩＩタンパク質に結合することなしにファージの表面上に提示される一本鎖抗体の構造の分析に用いることもできる。
【０１０５】
３個の終止コドンが報告されており、３種類のヌクレオチド、すなわちアンバー終止コドン（ＴＡＧ）、オーカー終止コドン（ＴＡＡ）およびオパール終止コドン（ＴＧＡ）から構成されている。
【０１０６】
好ましい態様では、本発明のファージディスプレイカセットの終止コドンはアンバー終止コドンである。
【０１０７】
ファージディスプレイカセットにおける「複製源」は、ファージの複製源であり、完全なファージゲノムの相補性により、ファージ源の配列および一本鎖ＤＮＡとしてベクター上に支持されている目的とする結合タンパク質をコードする配列の複製を開始して、後で組換えファージでカプセル化することができるものである。
【０１０８】
従って、ファージの複製源は、一本鎖ＤＮＡ形態としてのベクターの複製を促進した後、ファージ粒子中にカプセル化することができる。一本鎖ベクターＤＮＡは、完全なファージゲノム相補性により、バクテリオファージキャプシドにカプセル化される。
【０１０９】
本発明のファージの複製源の核酸配列は、好ましくは、５２９位のヌクレオチドＡ（配列番号３）による単一ヌクレオチド、すなわちヌクレオチドＧ（配列番号６）の突然変異を含むＭ１３ファージの非野生型配列であることができる。前記突然変異により、更に多くのファージ粒子が産生される。
【０１１０】
「パッケージングシグナル」は、目的とする結合タンパク質をコードする配列およびファージ源の配列の保護および機能的キャプシドへのパッケージングの調節に関与するファージヌクレオチド配列である。目的とする結合タンパク質をコードする核酸配列を含むファージのゲノムをパッケージするためには、パッケージングシグナルが本発明のファージディスプレイベクターに含まれていることが必要である。相補性に用いられるファージゲノムは、パッケージングシグナルにおいて弱められ、本発明のベクターが優先的にパッケージングされる。
【０１１１】
本発明のパッケージングシグナルの核酸配列は、Ｍ１３ファージの野生型配列であることができるが、好ましくは、単一ヌクレオチドの突然変異、すなわち７８４位のヌクレオチドＡ（配列番号３）によるヌクレオチドＧ（配列番号６）の突然変異を含む。前記突然変異は、Ｍ１３野生型パッケージングシグナルを有する突然変異よりも優れた可溶性の組換えファージおよび目的とするタンパク質を付与する。
【０１１２】
非制限的例としては、配列番号３、６および１４９の配列のファージディスプレイカセットからなる群から選択されるファージディスプレイカセットを挙げることができる。
【０１１３】
本発明のもう一つの態様では、ファージディスプレイベクターの前記細菌カセットは、プロモーターをコードする核酸配列と、正の選択マーカーをコードする核酸配列と複製源をコードする核酸配列とを少なくとも含んでなる。
【０１１４】
本発明による細菌カセットは、プロモーターをコードする核酸配列を含んでなる。前記プロモーターは、正の選択可能マーカーをコードする遺伝子の転写に関与する。
【０１１５】
好ましい態様では、細菌カセットのプロモーターは、β−ラクタマーゼプロモーターであることができる。
【０１１６】
「正の選択マーカー」は、ベクターに導入され、前記ベクターにより形質転換した細菌を選択し、培養において保持するための核酸である。このような核酸配列は、阻害性ＲＮＡのような、遺伝子または任意の代替調節配列であることができる。
【０１１７】
好ましい態様では、前記正の選択マーカーは、アンピシリンまたはクロラムフェニコール耐性遺伝子であることができる。
【０１１８】
形質転換の正の効果を示す宿主細胞、すなわち、ベクターが導入されて、そのままになっている細胞は、抗生物質を含む培地では、選択マーカー遺伝子によって宿主に前記抗生物質耐性が付与されるため、生存し増殖することができるようになる。
【０１１９】
本発明によるベクターは、必要ならば、転写ターミネーターをコードする核酸配列を更に含んでなることができる。
【０１２０】
「転写ターミネーター」は、ｍＲＮＡへの遺伝子、本明細書では正の選択マーカーをコードする遺伝子のＲＮＡポリメラーゼ転写を終了するヌクレオチド配列である。抗体の可変領域、抗体の定常ドメインまたは定常ドメインのドメイン内ループと、Ｍ１３ｇｅｎｅＩＩＩタンパク質とをコードする核酸配列の転写は、クローニングカセットのプロモーターの制御下にある必要がある。従って、選択マーカーの転写は、細菌カセットプロモーターの制御下にあるので、停止される必要がある。
【０１２１】
転写ターミネーターの核酸配列は、優先的に選択可能マーカーをコードする遺伝子に隣接したファージディスプレイベクターに配置される。
【０１２２】
もう一つの態様では、本発明の細菌カセットは、複製源を含んでなる核酸配列を含んでなる。この複製源は、形質転換の後、細菌宿主でベクターを複製することができる。
【０１２３】
非制限的例としては、配列番号４、８および１５０の配列の細菌カセットからなる群から選択される細菌カセットを挙げることができる。
【０１２４】
もう一つの好ましい態様によれば、本発明は、本明細書ではｐＰＬ１２と呼ばれ、配列番号１の核酸配列を含んでなる最小化ファージディスプレイベクターを説明する。
【０１２５】
もう一つの好ましい態様によれば、本発明は、本明細書ではｐＰＬ１４と呼ばれ、配列番号５の核酸配列を含んでなる最小化ファージディスプレイベクターを説明する。
【０１２６】
もう一つの好ましい態様によれば、本発明は、本明細書ではｐＰＬ２２と呼ばれ、配列番号７の核酸配列を含んでなる最小化ファージディスプレイベクターを説明する。
【０１２７】
もう一つの好ましい態様によれば、本発明は、本明細書ではｐＰＬ３１と呼ばれ、配列番号１４８の核酸配列を含んでなる最小化ファージディスプレイベクターを説明する。
【０１２８】
本発明のもう一つの態様は、本発明による最小化ファージディスプレイベクターのライブラリーを工学処理する方法であって、
ａ）本発明の最小化ファージディスプレイベクターに結合タンパク質をコードする核酸配列を挿入し、
ｂ）宿主細胞を前記最小化ファージディスプレイベクターで形質転換する
段階を含んでなることを特徴とする、前記方法である。
【０１２９】
「ファージディスプレイベクターのライブラリー」は本発明によるベクターの集合、または前記ベクターを含む宿主細胞であって、前記ベクターのそれぞれは、ベクター毎に異なる結合タンパク質をコードする配列を含んでなる。
【０１３０】
「宿主細胞」は、発現ベクター上に配置されている目的とする遺伝子の発現に用いられる生物である。前記ベクターは、それ自身で複製することができるが、複製、転写および翻訳のような種々の生物学的反応のための宿主の生物学的材料を必要とする。従って、宿主細胞は、本発明のファージディスプレイベクターがファージゲノム相補性によって結合分子をその表面に発現させるファージのライブラリーを複製および産生する細胞である。
【０１３１】
本発明のファージディスプレイベクターのライブラリーを工学処理する前記方法の段階ａ）は、制限消化、相同組換えまたはＬｉｇａｔｉｏｎ ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｃｌｏｎｉｎｇ法のような当該技術分野で知られている手法で行うことができる。
【０１３２】
前記方法の段階ｂ）は、非制限的例として、化学または熱ショック形質転換によって、または好ましい態様では、電気穿孔によって行うことができる。
【０１３３】
本発明のもう一つの態様は、上記のようにファージの前記ライブラリーの工学処理の方法から得た最小化ファージディスプレイベクターから構成されるライブラリーである。
【０１３４】
好ましい態様では、段階ｂ）の宿主細胞は、大腸菌株ＴＧ１、ＸＬ１−Ｂｌｕｅ、ＸＬ１−Ｂｌｕｅ ＭＲＦ’、Ｋ１２ ＥＲ２７３８細胞からなる群から選択することができる。
【０１３５】
本発明の好ましい実現では、宿主細胞は大腸菌ＴＧ１である。
【０１３６】
本発明のもう一つの態様は、最小化ファージのライブラリーの産生方法であって、前記方法は、前記ベクターのライブラリーを工学処理する２段階と、バクテリオファージタンパク質Ｉ〜ＸＩの相補性によるファージ−結合タンパク質複合体の複製、カプセル化および分泌の追加段階ｃ）とを含んでなる。
【０１３７】
「ファージのライブラリー」は、ファージの集合であって、それぞれがその表面にファージ毎に異なる結合タンパク質を発現させるものである。従って、ファージのライブラリーは、目的とする結合タンパク質を、結合パートナーを用いてスクリーニングすることに使用できる。ファージ、その表面で発現した結合タンパク質および前記結合パートナーの間で複合体を形成することによって、どのファージが目的とする結合タンパク質を発現させるかについて決定することができるようになる。複合体を選択した後、ベクター上の配列を分析して、目的とする結合タンパク質をコードする正確な配列を得る。
【０１３８】
段階ｃ）の相補性は、Ｍ１３ＫＯ７、Ｒ４０８、ＶＣＳＭ１３のような複製およびパッケージングに無能なヘルパーファージの添加によって、またはファージミドベクターの複製および分泌を補足するのに必要なファージタンパク質を発現させることができる宿主細胞の段階ｂ）の形質転換によって達成することができる。
【０１３９】
本発明のもう一つの態様は、上記のようにファージの前記ライブラリーの産生方法から得られるファージから構成されるライブラリーである。
【０１４０】
本発明の更にもう一つの態様は、上記のようにファージのライブラリーの産生方法から得られるファージであって、目的とする結合タンパク質をその表面上に発現させる、前記ファージである。
【０１４１】
本発明は、結合パートナーに特異的な目的とする結合タンパク質のスクリーニングの方法に関するものであって、
ａ）結合パートナーを本発明によるファージのライブラリーと接触させ、
ｂ）目的とする結合タンパク質および結合パートナーによって形成された複合体を選択し、
ｃ）前記の目的とする結合タンパク質をコードする配列をベクターから抽出し、および
ｄ）目的とする結合タンパク質を産生する
段階を含んでなる、方法にも関する。
【０１４２】
結合パートナーは、抗体が選択的に結合することができる合成または天然の分子またはタンパク質である。結合パートナーは、ポリペプチド、多糖類、炭水化物、核酸、脂質、ハプテン、または他の天然に存在するまたは合成化合物であってもよい。
【０１４３】
前記の結合タンパク質をスクリーニングする方法の段階ａ）は、前記結合タンパク質を表面上で発現させるファージのライブラリーに結合パートナーを接触させることによって行うことができる。結合パートナーは、細胞の表面で自然に発現させることができるか、または固定されるもしくは溶液中にいることができる。
【０１４４】
結合タンパク質と結合パートナーによって形成される複合体の選択の段階ｂ）は、非制限的例として、ｐＨ、温度、溶媒、塩濃度、関連する結合パートナーに対する交差反応性および低濃度の利用可能な結合パートナーへの結合によって決定される親和性などの選択基準を用いて行うことができる。所望な条件で結合パートナーに結合タンパク質を保持しない結合複合体は除かれる。
【０１４５】
選択した結合タンパク質をコードする配列の抽出の段階ｃ）は、非制限的例として、宿主細胞の選択したファージ−結合タンパク質複合体による再感染、細胞増殖および選択した結合タンパク質をコードするベクターＤＮＡの回収によって行うことができる。
【０１４６】
選択した結合タンパク質の産生の段階ｄ）は、非制限的例として、ベクターの非サプレッサー細菌宿主細胞への形質転換によって行うことができる。アンバー終止コドンＴＡＧは、このようにして終止コドンとして認識され、結合タンパク質は、可溶性残基として発現する。もう一つの態様では、結合タンパク質の代替発現系への選択的クローニングによって達成することができる。
【０１４７】
本発明は、ベクターのライブラリーを生成するための本発明の最小化ファージディスプレイベクターの使用であって、好ましくは、
ａ）結合タンパク質をコードする核酸配列を本発明の最小化ファージディスプレイベクターに挿入し、
ｂ）宿主細胞を前記ファージディスプレイベクターで形質転換する
段階を含んでなる、使用も包含する。
【０１４８】
本発明は、ファージのライブラリーを生成するための本発明の最小化ファージディスプレイベクターの使用であって、好ましくは、
ａ）結合タンパク質をコードする核酸配列を本発明の最小化ファージディスプレイベクターに挿入し、
ｂ）宿主細胞を前記ファージディスプレイベクターで形質転換し、および
ｃ）バクテリオファージタンパク質Ｉ〜ＸＩの相補性によるファージ−結合タンパク質複合体の複製、カプセル化および分泌の段階
の段階を含んでなる、使用も包含する。
【０１４９】
本発明は、結合パートナーに特異的な結合タンパク質のスクリーニングのための最小化ファージディスプレイベクターの使用を扱うものであって、好ましくは、
ａ）前記結合パートナーを本発明によるファージのライブラリーと接触させ、
ｂ）結合タンパク質と結合パートナーとによって形成した複合体を選択し、
ｃ）前記結合タンパク質をコードする核酸配列を最小化ファージディスプレイベクターから抽出し、および
ｄ）結合タンパク質を産生する
段階を含んでなる、使用である。
【０１５０】
本発明は、また本発明の最小化ファージディスプレイベクターと、特異的プライマーと、サプレッサー細胞株とを少なくとも含むキットを含んでなる。
【０１５１】
「サプレッサー細胞株」とは、終止コドンを認識しアミノ酸をその代わりに挿入するトランスファーＲＮＡを含んでなる細菌株を表すことを目的とする。
【０１５２】
このようなサプレッサー細胞株の非制限的で好ましい例としては、サプレッサー細胞株ＴＧ１、ＸＬ１−ｂｌｕｅ、ＥＲ２７３８、ＥＲ２２６７およびＨＢ１０１を挙げることができる。
【０１５３】
本発明の最も好ましい態様では、キットの特異的プライマーは、配列番号９〜８５の核酸プライマーからなる群から選択される。
【０１５４】
本発明の他の特徴および利点は、実施例および凡例が下記に示されている図の説明において更に明らかになる。
【図面の簡単な説明】
【０１５５】
【図１】明らかなドメイン内ループを有する免疫グロブリン構造。
【図２】それぞれ２７および８７位に、明らかに、２つのシステイン残基を有するヒトカッパ軽鎖の定常ドメインアミノ酸配列。
【図３】それぞれ２７および８６位に、明らかに、２つのシステイン残基を有するヒトラムダ軽鎖の定常ドメインのアミノ酸配列。
【図４】それぞれ２６および８２位に、明らかに２つのシステイン残基を有するガンマ重鎖のヒト定常ドメインＣＨ１のアミノ酸配列。
【図５】ｐＰＬ１２ベクター。
【図６】ｐＰＬ１４ベクター。
【図７】ｐＰＬ２２ベクター。
【図８】大腸菌株ＴＯＰ１０の形質転換効率（ｃｆｕ／ｍｌ）。
【図９】大腸菌株ＴＯＰ１０の形質転換効率（ｃｆｕ／μｇＤＮＡ）。
【図１０】ｐＰＬ１２およびｐＣＡＮＴＡＢの間の一本鎖抗体ファージ産生に対するＩＰＴＧ誘導の効果。
【図１１】産生されたファージ／ｍｌとベクターサイズとの関係。
【図１２】ベクターｐＰＬ１２およびｐＰＬ１４を用いて形質転換し、ヘルパーファージＭ１３ＫＯ７に感染させた大腸菌株ＴＧ１からのファージ産生の比較。
【図１３】ｐＰＬ２０ベクター。
【図１４】ｐＰＬ３１ベクター。
【実施例】
【０１５６】
例１：ベクター構築
ベクターｐＰＬ１２（図５）の構築は、関連する制限酵素を用いる核酸の制限消化後の合成ＤＮＡとＰＣＲ産物との集合、および消化産物のライゲーションによって行った。
【０１５７】
Ｌａｃプロモーター、ｐｅｌＢシグナルペプチド、クローニング部位、連結ペプチド、ヒトカッパ２定常ドメイン、６ヒスチジンタグおよびアンバー終止コドンを含んでなるクローニングカセットは、Ｇｅｎｅａｒｔ ＡＧ（レーゲンスブルク，ドイツ）によって合成された。Ｈｉｎｄ ＩＩＩ制限部位を、ベクター構築を促進するため５’末端に包含した。クローニングカセットを、バクテリオファージＭ１３ｇｅｎｅＩＩＩタンパク質のＣ末端ドメインと融合して合成し、コドン配列を大腸菌宿主での発現のためにＧｅｎｅａｒｔ ＡＧにより最適化した。ＥｃｏＲ Ｉ制限部位を、合成中に終止コドンに続いてバクテリオファージＭ１３ｇｅｎｅＩＩＩタンパク質のＣ末端ドメインの３’末端に導入した。合成したＤＮＡ断片は、１０３２ｂｐ断片からなり、末端にＨｉｎｄ ＩＩＩおよびＥｃｏＲ Ｉ制限部位を有した。この断片のＨｉｎｄ ＩＩＩおよびＥｃｏＲ Ｉによる制限消化により、１０２６ｂｐの生成物を得た。
【０１５８】
ファージディスプレイカセットの残りの部分を、オリゴヌクレオチドプライマーＭ１３ｏｒｉＰＳＡｐａＩおよびＭ１３ｏｒｉＰＳＥｃｏＲＩを用いてファージディスプレイベクターｐＣＡＮＴＡＢ５Ｅ（Ａｍｅｒｓｈａｍ ｌｉｆｅｓｃｉｅｎｃｅｓ）からＰＣＲによって増幅した。
【０１５９】
Ｍ１３ｏｒｉＰＳＡｐａＩ：
５’−ＧＧＧＣＣＣＡＣＧＣＧＣＣＣＴＧＴＡＧＣＧＧＣＧＣＡＴＴＡＡＧ−３’ （配列番号８６）
Ｍ１３ｏｒｉＰＳＥｃｏＲＩ：
５’−ＧＡＡＴＴＣＣＣＧＡＡＡＴＣＧＧＣＡＡＡＡＴＣＣＣＴ−３’ （配列番号８７）
【０１６０】
生成するＰＣＲ産物は、末端にＥｃｏＲ ＩおよびＡｐａ Ｉ制限部位を有する３９３ｂｐ断片であった。この断片をＥｃｏＲ ＩおよびＡｐａ Ｉにより制限消化を行い、３９１ｂｐの産物を得た。
【０１６１】
細菌カセットを、オリゴヌクレオチドプライマーＢｌａＰｒｏＡｐａＩおよびｐＵＣＯｒｉＨｉｎｄＩＩＩを用いてクローニングベクターｐＵＣ１９からＰＣＲによって増幅した。
【０１６２】
ＢｌａＰｒｏＡｐａＩ： ５’−ＧＧＧＣＣＣＡＣＴＴＴＴＣＧＧＧＧＡＡＡＴＧＴＧＣ−３’ （配列番号８８）
ｐＵＣＯｒｉＨｉｎｄＩＩＩ： ５’−ＡＡＧＣＴＴＡＴＣＡＧＧＧＧＡＴＡＡＣＧＣＡＧＧ−３’ （配列番号８９）
【０１６３】
生成するＰＣＲ産物は、末端にＡｐａ ＩおよびＨｉｎｄ ＩＩＩ制限部位を有する１８３５ｂｐ断片であった。この断片をＡｐａ ＩおよびＨｉｎｄ ＩＩＩにより制限消化を行い、１８２９ｂｐの産物を得た。
【０１６４】
３個のＤＮＡ断片１０２６ｂｐ、３９１ｂｐおよび１８２９ｂｐを互いに連結し、適合性突出末端によって配向を確かめ、クローニングカセット（配列番号２）、ファージディスプレイカセット（配列番号３）および細菌カセット（配列番号４）を含んでなる３２４６ｂｐのベクターｐＰＬ１２を生成した。
【０１６５】
ライゲーション産物を、熱ショック形質転換によって大腸菌細胞に形質転換した。生成する正の形質転換体（アンピシリンの存在に耐性）を選択し、プラスミド配列を標準的ＤＮＡシークエンシング法によって確かめた。
【０１６６】
ベクターｐＰＬ１４を、オリゴヌクレオチドプライマーＭ１３ｏｒｉ１ＱｃＳおよびＭ１３ｏｒｉ１ＱｃＡＳ、並びにＭ１３ｏｒｉ２ＱｃＳおよびＭ１３ｏｒｉ２ＱｃＡＳを用いてベクターｐＰＬ１２の部位特定突然変異誘発によって生成した。プライマーカップルＭ１３ｏｒｉ１ＱｃＳおよびＭ１３ｏｒｉ１ＱｃＡＳは、Ａ＞Ｇ突然変異を導入して、ファージディスプレイカセット（配列番号６）の７８４ｂｐ位におけるＭ１３パッケージングシグナルにＭ１３野生型配列を再生する。プライマーカップルＭ１３ｏｒｉ２ＱｃＳおよびＭ１３ｏｒｉ２ＱｃＡＳは、Ａ＞Ｇ突然変異を導入して、ファージディスプレイカセット（配列番号６）の５２９ｂｐ位におけるＭ１３複製源にＭ１３野生型配列を再生する。
【０１６７】
Ｍ１３ｏｒｉ１ＱｃＳ ＣＴＴＧＣＣＡＧＣＧＣＣＣＴＡＧＣＧＣＣＣＧＣＴＣＣ （配列番号１３９）
Ｍ１３ｏｒｉ１ＱｃＡＳ ＣＴＡＧＧＧＣＧＣＴＧＧＣＡＡＧＴＧＴＡＧＣ （配列番号１４０）
Ｍ１３ｏｒｉ２ＱｃＳ ＣＡＡＣＡＣＴＣＡＡＣＣＣＴＡＴＣＴＣＧ （配列番号１４１）
Ｍ１３ｏｒｉ２ＱｃＡＳ ＡＧＧＧＴＴＧＡＧＴＧＴＴＧＴＴＣＣ （配列番号１４２）
【０１６８】
位置特定突然変異誘発は、ベクターｐＰＬ１２ ５０ｎｇを、それぞれ１０μＭの濃度の第一のＭ１３ｏｒｉ１ＱｃＳおよびＭ１３ｏｒｉ１ＱｃＡＳと、それぞれ１０ｍＭのｄＮＴＰ混合物２μｌ、Ｐｆｕ ｕｌｔｒａ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）用１０ｘ濃縮反応緩衝液５μｌとインキュベーションすることによって行い、反応はＨ２Ｏで５０μｌにした。反応混合物を９４°Ｃで３０秒間変性した後、１２サイクルの増幅を９４°Ｃで３０秒間に続いて５５°Ｃで３０秒間および９８°Ｃで３分間行った。反応後、親プラスミドを制限エンドヌクレアーゼＤｐｎ Ｉで処理することによって除去した。消化産物を、熱ショック形質転換によって大腸菌細胞に形質転換した。生成する正の形質転換体（アンピシリンの存在に耐性）を選択し、プラスミド配列を標準的ＤＮＡシークエンシング法によって確かめた。同じ手続きを、正のクローンについてプライマーカップルＭ１３ｏｒｉ２ＱｃＳおよびＭ１３ｏｒｉ２ＱｃＡＳを用いて行い、第二の突然変異を導入した。生成する正の形質転換体（アンピシリンの存在に耐性）を選択し、プラスミド配列を標準的ＤＮＡシークエンシング法によって確かめ、ベクターｐＰＬ１４を得た。
【０１６９】
ベクターｐＰＬ２２を、細菌カセットにおいて余分なヌクレオチド配列を除外した産物を生成するプライマーを用いてｐＰＬ１４のＰＣＲ増幅によって生成した。プライマーｐＰＬ１２ＳｅｎｓｅＡｐａＩおよびｐＰＬ１２ＡｐａＩＡＳを用いるＰＣＲ増幅は、制限エンドヌクレアーゼＡｐａ Ｉで処理すると、再連結（ｒｅｌｉｇａｔｅ）してファージディスプレイカセットと細菌カセットの間に５３ｂｐを欠いている産物を生成するＰＣＲ産物を生じた。ライゲーション産物を、熱ショック形質転換によって大腸菌細胞に形質転換した。生成する正の形質転換体を選択し、プラスミド配列を標準的ＤＮＡシークエンシング法によって確かめた。この材料を、プライマーＳｅｑ１ｓおよびｐＰＬ１２ＨｉｎｄＩＩＩＡＳを用いるＰＣＲ増幅の鋳型として用い、生成するＰＣＲ産物を制限エンドヌクレアーゼＨｉｎｄ ＩＩＩで処理し、再連結した。生成する再連結産物は、細菌カセットとクローニングカセットの間に８４ｂｐを欠いていた。ライゲーション産物を、熱ショック形質転換によって大腸菌細胞に形質転換した。生成する正の形質転換体を選択し、プラスミド配列を標準的ＤＮＡシークエンシング法によって確かめ、ｐＰＬ１２または１４に１３４ｂｐ未満の細菌カセット（配列番号４）を含む新規な細菌カセット（配列番号８）を含んでなる３１０９ｂｐのベクターｐＰＬ２２（配列番号７）を生成した。
【０１７０】
ｐＰＬ１２ＳｅｎｓｅＡｐａＩ
ＧＣＡＴＧＧＧＣＣＣＴＴＣＡＡＡＴＡＴＧＴＡＴＣＣＧＣＴＣＡ（配列番号１４３）
ｐＰＬ１２ＡｐａＩＡＳ
ＧＣＧＣＡＣＡＴＴＴＣＣＣＣＧＡＡＡＡＧ（配列番号１４４）
Ｓｅｑ１ｓ
ＴＴＴＧＣＴＧＧＣＣＴＴＴＴＧＣＴＣＡＣ（配列番号１４５）
ｐＰＬ１２ＨｉｎｄＩＩＩＡＳ
ＧＣＡＴＡＡＧＣＴＴＴＴＴＣＣＡＴＡＧＧＣＴＣＣＧＣＣＣＣＣＣＴＧＡＣ（配列番号１４６）
【０１７１】
例２：ライブラリー生成
結合分子のライブラリーは、下記の方法で生成させることができる。
【０１７２】
ＲＮＡを、適当な宿主、理想的にはヒトリンパ球から抽出する。次いで、所望な結合パートナーをコードするｍＲＮＡを、所望な結合分子の画定した定常領域に相補的なアンチセンスオリゴヌクレオチドを用いてｃＤＮＡに再転写する。
【０１７３】
次いで、所望な結合分子の可変領域を、前記可変領域の５’および３’末端に相補的なセンスおよびアンチセンスオリゴヌクレオチドのパネルを用いるＰＣＲによって増幅する。センスおよびアンチセンスオリゴヌクレオチドは、前記の増幅した可変ドメインの次のクローニングのための特異的制限部位を組込む。適当な制限酵素を用いて増幅した可変ドメインを制限消化した後、生成するＤＮＡ断片を本発明のベクターに連結した後、適合する制限酵素で制限消化することができる。生成した適合性制限部位突出末端により、結合分子の本発明のベクターへの特定クローニングが促進される。本発明のベクターと少なくとも１個の結合分子である生成するライゲーション産物を、次に適当な細菌宿主に形質転換する。
【０１７４】
ＲＮＡ抽出は、好ましくは単離したＢリンパ球で行われるが、同様に単離した単核細胞またはヒト血液から得た細胞の赤血球以外の全細胞個体群（ｔｏｔａｌ ｎｏｎ ｒｅｄ ｂｌｏｏｄ ｃｅｌｌ ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ）で行うこともできる。１００００００個の単離した単核細胞の使用に続いてＲＮｅａｓｙ ｍｉｎｉｐｒｅｐ（ＱＩＡＧＥＮ ＧｍｂＨ）により全ＲＮＡを抽出することにより、ライブラリーの生成に十分なＲＮＡが生成される。
【０１７５】
全ＲＮＡの単離後、ｃＤＮＡ合成をＳｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ ＩＩＩ 逆転写酵素を用いて行うが、他の逆転写酵素を用いることもできる。単離した全ＲＮＡ２μｇを、第一のｓｔｒａｎｄ ｃＤＮＡ合成プライマー（配列番号９、１０および１１）２ｐｍｏｌおよびそれぞれ１０ｍＭの濃度のｄＮＴＰ１μｌと混合し、反応容積を１３μｌとした。
【０１７６】
ＨｕＣｇ ５’−ＴＴＧＡＣＣＡＧＧＣＡＧＣＣＣＡＧＧ−３’ （配列番号９）
ＨｕＣｋ ５’−ＧＧＡＡＧＡＴＧＡＡＧＡＣＡＧＡＴＧＧ−３’ （配列番号１０）
ＨｕＣｌ ５’−ＡＣＧＧＴＧＣＴＣＣＣＴＴＣＡＴＧＣ−３’ （配列番号１１）
【０１７７】
生成する混合物を６５°Ｃに５分間加熱した後、氷冷してオリゴヌクレオチドをＲＮＡ鋳型にアニーリングする。冷却後、５ｘＦｉｒｓｔ−Ｓｔｒａｎｄ Ｂｕｆｆｅｒ（２５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．３、室温）、３７５ｍＭ ＫＣｌ、１５ｍＭ ＭｇＣｌ２）４μｌ、０．１Ｍ ＤＴＴ １μｌ、ＲＮａｓｅＯＵＴ（商標）１μｌ、ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ（商標）ＩＩＩ ＲＴ（２００単位／μｌ）１μｌを加え、反応を５５°Ｃで１時間インキュベーションする。反応混合物を７０°Ｃで１５分間インキュベーションすることによってＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ（商標）酵素を熱不活性化した後、生成するｃＤＮＡを、ライブラリー生成プライマーのパネルを用いる結合分子のＰＣＲによる増幅の鋳型として直接用いることができる。センスおよびアンチセンスオリゴヌクレオチドは、単純な対としてまたは所望な結合分子のセンスまたはアンチセンス配向のいずれか一方または両方を表すプールとして用いられる。免疫グロブリンガンマ鎖可変ドメインの増幅のため、１個または複数のセンスオリゴヌクレオチド（配列番号１２〜３８）を、１個以上のアンチセンスオリゴヌクレオチド（配列番号３９〜４５）と組み合わせて用いる。ＰＣＲ増幅は、Ｐｈｉｒｅ（商標）ＨｏｔＳｔａｒｔＤＮＡポリメラーゼ（Ｆｉｎｎｚｙｍｅｓ）を用いて行われるが、他のＤＮＡポリメラーゼをその代わりに用いることもできる。増幅は、１μｌのｄＮＴＳ（それぞれ１０ｍＭ）、最終濃度がそれぞれ０．５μＭのセンスオリゴヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド、最終濃度がそれぞれ０．５μＭのアンチセンスオリゴヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド、１０μｌ ５ｘＰｈｉｒｅ（商標）Ｒｅａｃｔｉｏｎ緩衝液、０．５〜１μｌ ｃＤＮＡ合成産物および１μｌ Ｐｈｉｒｅ（商標）ＨｏｔＳｔａｒｔＤＮＡポリメラーゼの混合物を調製することによって行われる。増幅は、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ ９７００サーマルサイクラーで、初期変性９８°Ｃｘ３０秒間に続いて９８°Ｃｘ５秒間、６０°Ｃｘ５秒間および７２°Ｃｘ２０秒間を３０サイクル、７２°Ｃで１分間の最終伸長段階のサイクリング条件で行い、反応を４°Ｃに保持した後、−２０°Ｃで保管しまたは利用する。免疫グロブリンカッパまたはラムダ鎖可変ドメインの増幅は、同様に、センスオリゴヌクレオチドをそれぞれ１個以上の選択配列番号４６〜５８または６３〜８０およびアンチセンスオリゴヌクレオチドをそれぞれ配列番号５９〜６２または８１〜８５で置換して行われる。
【０１７８】
その後の制限消化を改良するため、プロテイナーゼＫ（２０ｍｇ／ｍｌ）１μｌをＰＣＲ反応に加え、３７°Ｃで３０分間インキュベーションした後、７０°Ｃで１５分間熱不活性化することができる。この段階では、増幅したＤＮＡの末端に付着したままになって制限消化を妨げることがあるポリメラーゼが効果的に除去される。
【０１７９】
増幅後、可変ドメインを制限酵素の組み合わせで処理し、本発明のベクターへの特異的クローニングを促進する。カッパおよびラムダ可変ドメインおよび本発明のベクターの調製物を、制限エンドヌクレアーゼＳａｌ ＩおよびＭｌｕ Ｉで消化する。制限消化したＤＮＡを、ゲル電気泳動によって望ましくないＤＮＡ断片から精製し、Ｎｕｃｌｅｏｓｐｉｎ Ｅｘｔｒａｃｔ ＩＩ（Ｍａｃｈｅｒｙ Ｎａｇｅｌ）により所望なＤＮＡ断片を単離する。次いで、生成する精製ＤＮＡを連結して、本発明のベクターにおけるカッパまたはラムダ可変ドメインを生成する。次いで、生成するライゲーション産物を、熱ショック形質転換によってコンピテント大腸菌ＴＯＰ１０細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に形質転換する。熱ショックの後、細胞を１００μｇ／ｍｌアンピシリンを含む選択寒天プレートに播種し、組換えベクターを含む細胞だけが生き残るようにする。形質転換細胞は免疫グロブリンカッパまたはラムダ可変ドメインライブラリーを表し、クローニングした可変ドメインに先行する本発明のベクターに終止コドンが存在すると、タンパク質発現を防止し、ベクターが保持される。
【０１８０】
形質転換細胞を選択寒天プレートから回収し、カッパまたはラムダ可変ドメインライブラリーＤＮＡを標準的プラスミド精製手法によって回収する。
【０１８１】
本発明のベクターに存在する免疫グロブリンガンマ鎖可変ドメインおよびカッパまたはラムダ軽鎖可変ドメインライブラリーを、このオリゴヌクレオチドで増幅したラムダ可変ドメインをコードする生殖細胞系にＮｃｏ Ｉ制限部位の存在が同定されているためＳｆｉ ＩおよびＭｆｅ Ｉで制限消化されるＨｕＶＬ９（配列番号７１）で生成したラムダ可変ドメインライブラリーを除き、制限エンドヌクレアーゼＮｃｏ ＩおよびＭｆｅ Ｉで制限消化する。制限消化したＤＮＡを、ゲル電気泳動により望ましくないＤＮＡ断片から精製し、Ｎｕｃｌｅｏｓｐｉｎ Ｅｘｔｒａｃｔ ＩＩ（Ｍａｃｈｅｒｙ Ｎａｇｅｌ）により所望なＤＮＡ断片を単離する。次いで、生成する精製ＤＮＡを連結して、本発明のベクターにおけるガンマまたはカッパまたはラムダ可変ドメインのライブラリーを生成する。次いで、生成するライゲーション産物を、電気穿孔によってコンピテント大腸菌ＸＬ１−Ｂｌｕｅ、ＸＬ１−Ｂｌｕｅ ＭＦＲ’またはＴＧ１スーパーコンピテントセル（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）に形質転換し、形質転換体の最大数を確保し、これが次に生成ライブラリーに存在する様々な結合分子を指示する。多重ライゲーションおよび形質転換を行って、生成する結合分子ライブラリーの多様性を増加させることができる。
【０１８２】
生成する形質転換体は、Ｍ１３ＫＯ７（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）のようなヘルパーファージの添加によって結合分子のライブラリーを提示するファージ粒子を生成させることができ、または２０％グリセロール（ｖ／ｖ）およびグルコースを添加して最終濃度を５％（ｖ／ｖ）とすることによって−８０°Ｃで保管することができる。
【０１８３】
例３：最適化ファージディスプレイベクターの形質転換効率の改良
細菌宿主形質転換効率に対するベクターサイズの減少効果を検討するため、大腸菌ＴＯＰ１０熱ショックコンピテントセルの試験形質転換を行った。同数の細胞を、０．５〜１０ｆｍｏｌｅｓのベクターＤＮＡコピーの範囲で形質転換した。同じＤＮＡ濃度の形質転換では、形質転換されるより小さなベクターが有意に多数のコピーを生成するので、特定数の形質転換したベクター分子を形質転換効率のより正確な表現と考えた。本発明者らのこの考え方は、本発明に記載のベクターに著しく役立つものである。
【０１８４】
細胞を、氷上で０．５、１、２または１０ｆｍｏｌｅｓのｐＰＬ１２またはｐＣＡＮＴＡＢのいずれかと共に３０分間インキュベーションした。４２°Ｃの熱ショックを、正確に４５秒間加えた。次いで、細胞を更に２分間氷上で冷却した。その後、細胞を回収培地でインキュベーションした後、選択寒天プレートで培養した。３７°Ｃで一晩インキュベーションした後、コロニー数を評価した。
【０１８５】
熱ショックによる大腸菌ＴＯＰ１０細胞の形質転換効率は、ｐＰＬ１２ １０ｆｍｏｌｅｓの形質転換が、形質転換細胞１ｍｌ当たりでは、ｐＣＡＮＴＡＢの４．５倍を上回る形質転換体を生じることを示した（図８）。
【０１８６】
形質転換したＤＮＡ１μｇ当たりの形質転換効率は一般的表現であり、それ自体が比較のために測定された。ベクターｐＰＬ１２またはｐＣＡＮＴＡＢのＤＮＡ １μｇ当たりの形質転換効率は、ＤＮＡ濃度が０．５〜１０ｆｍｏｌｅｓで増加するにつれて減少する。ＤＮＡ １μｇ当たりの最高形質転換効率は、最低ＤＮＡ濃度（０．５ｆｍｏｌｅｓ）で達成され、この条件では、ｐＰＬ１２は、ｐＣＡＮＴＡＢの４．５倍を上回るコロニー形成単位（ｃｆｕ）を得た（図９）。
【０１８７】
例４：ファージ粒子への結合ドメイン融合の調節
ファージ粒子に融合した結合ドメインのバックグラウンド発現の程度を決定するため、癌遺伝子ｃＭＥＴに対する抗体の重および軽鎖可変ドメインをｐＰＬ１２およびｐＣＡＮＴＡＢのクローニングカセットでシス型にクローニングした。生成する融合タンパク質は、ｐＰＬ１２ではＭ１３プロテイン３のＣ末端ドメインに融合したｓｃＦｖ−Ｆｃであり、ｐＣＡＮＴＡＢの場合にはバクテリオファージＭ１３コンプリート・プロテイン（ｃｏｍｐｌｅｔｅ ｐｒｏｔｅｉｎ）３に融合したｓｃＦｖであった。
【０１８８】
関連するベクターを含む大腸菌ＴＧ１細胞を、中間対数期まで選択増殖培地でインキュベーションし（ＯＤ６００ｎｍ ０．６）、この時点でヘルパーファージＭ１３ＫＯ７を２０：１の感染多重度で培養物に加えた。ｌａｃプロモーターを、０、１０または１００ｎＭの濃度の擬似アロラクトースであるイソプロピルβ−Ｄ−１−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）を添加することによって誘導した。３０°Ｃで一晩インキュベーションした後、産生したファージを沈澱によって精製し、リン酸緩衝食塩水（ｐＨ７．４）で回収した。次いで、得られたファージを、飽和ポリエチレン９６ウェルプレートに固定した固定化ｃＭＥＴ分子に０．７μｇ／ｍｌの濃度でタイトレーションした。十分に洗浄した後、プロテイン３の全部（ｐＣＡＮＴＡＢ）または部分（ｐＰＬ１２）に融合した機能的結合ドメインを介して保持されているファージを、ファージコートタンパク質のプロテイン８に特異的な抗体であって、比色検出を促進するため西洋ワサビペルオキシダーゼ標識した抗体によって検出した。
【０１８９】
ＩＰＴＧの非存在下では、ｐＰＬ１２は、ｐＣＡＮＴＡＢによって発現したクローンの３．５分の１の結合シグナルを示し（図１０）、ｐＣＡＮＴＡＢによって抑制されない発現のレベルが高くなることを示している。結合ドメイン−プロテイン３融合体の１０または１００ｎＭのＩＰＴＧによる誘導は、２つの発現ベクターからの適合する結合シグナルを生じ、ｐＰＬ１２ベクターからの一層緊密に制御されているが高誘導性なタンパク質発現を示している。ベース発現が低くなれば、ライブラリー個体群において一層毒性の高いクローンの保持が促進されるので、好ましい。
【０１９０】
例５：ベクターサイズに関するファージ産生
感染した大腸菌宿主細胞からのファージの産生に対するベクターサイズの効果を、共に３２４６ｂｐのベクターｐＰＬ１２およびｐＰＬ１４、４５２２ｂｐのｐＣＡＮＴＡＢならびに４７２８ｂｐのｐＰＬ２の比較によって評価した。ベクターｐＰＬ１２およびｐＰＬ１４は、ファージディスプレイカセットの２個のヌクレオチド位置だけが異なっており、ｐＰＬ２は完全長のＭ１３プロテイン３ならびに野生型Ｍ１３源または複製およびパッケージングシグナルを含むが、抗体の定常ドメインを欠いている。
【０１９１】
それぞれのベクターで形質転換した大腸菌ＴＧ１細胞を、選択増殖培地で中間対数期まで増殖させ（ＯＤ６００ｎｍ ０．６）、ヘルパーファージＭ１３ＫＯ７を２０：１の感染多重度で感染させた。一晩増殖した後、産生したファージを沈澱によって増殖培地から回収し、次いでタイトレーションを行い、中間対数期の大腸菌ＴＧ１細胞に感染させた。感染細胞を選択増殖培地に播種し、コロニー形成単位（ファージに感染し、選択的増殖マーカーを発現する細胞）を計数した。ベクターサイズが増加すると、得られたコロニー形成単位の数が増加し、ファージ産生レベルが低くなることが観察された（図１１）。
【０１９２】
いずれも３２４６ｂｐを含んでなる試験した最小ベクターｐＰＬ１２およびｐＰＬ１４は、サイズが４５２２ｂｐであり５．７５ｘ１０１２のコロニー形成単位を産生したｐＣＡＮＴＡＢと比較して、９ｘ１０１２を産生した。産生したコロニー形成単位の差は、ベクターサイズの差にかなり匹敵し、ｐＣＡＮＴＡＢは、ファージ産生が１．５分の１であるｐＰＬ１２の１．４倍も多い。
【０１９３】
例６：ファージディスプレイカセットでの野生型または突然変異体残基の評価
ｐＰＬ１２のファージディスプレイカセットの複製およびパッケージングシグナルのＭ１３源における突然変異体または野生型残基の影響を、ファージディスプレイカセットに野生型残基を含むこと以外、ｐＰＬ１２と同一のベクターｐＰＬ１４と比較することにより評価した。
【０１９４】
ベクターｐＰＬ１２およびｐＰＬ１４で形質転換した大腸菌ＴＧ１細胞を、選択増殖培地で中間対数期（ＯＤ６００ｎｍ ０．６）まで増殖させ、ヘルパーファージＭ１３ＫＯ７を２０：１の感染多重度で感染させた。一晩増殖した後、産生したファージを沈澱によって増殖培地から回収し、次いでタイトレーションを行い、中間対数期の大腸菌ＴＧ１細胞を感染させた。感染細胞を、ベクターを含む細胞を選択するための抗生物質アンピシリン（１００μｇ／ｍｌ）、またはパッケージングしたヘルパーファージＭ１３ＫＯ７に感染した細胞を選択するためのカナマイシン（２５μｇ／ｍｌ）のいずれかを含む選択増殖培地で培養した。アンピシリン耐性を有するファージに感染することによって産生したコロニー形成単位の数を計数し（棒グラフ）、産生したヘルパーファージのコンタミネーションの割合をこの値の割合（三角）として表した（図１２）。
【０１９５】
ベクターｐＰＬ１２は、ｐＰＬ１４の２倍以上のファージ粒子を産生し、ヘルパーファージのコンタミネーション数の半分を含んでいた（ｐＰＬ１４の１．４％に対して０．７％）。ｐＰＬ１２ファージディスプレイカセットのＭ１３源およびパッケージングシグナルにおける非野生型ヌクレオチドは、ｐＰＬ１４に対する差のみであり、ファージ産生の増加およびヘルパーファージゲノムのカプセル化の減少を説明している。
【０１９６】
例７：減少サイズベクターの限界
ベクターｐＰＬ１２のサイズを更に減少させるため、細菌カセットの要素をＰＣＲによって増幅し、選択マーカー遺伝子ｂｌａＲおよび複製の細菌源に隣接する非コードヌクレオチド領域を除去した。選択マーカー遺伝子ｂｌａＲおよびその構成プロモーター領域を、プライマーｂｌａＲＨｉｎｄＩＩＩ（配列番号１３４）およびｂｌａｒＲＢａｍＨＩ（配列番号１３５）を用いてｐＰＬ１２から増幅し、制限エンドヌクレアーゼＨｉｎｄＩＩＩおよびＢａｍＨＩで制限消化の後、９３３ｂｐ断片を得た。複製ｐＭＢ１の細菌源を、プライマーｐＭＢ１ＢａｍＨＩ（配列番号１３６）およびｐＭＢＡｐａＩ（配列番号１３７）を用いてｐＰＬ１２から増幅し、制限エンドヌクレアーゼＢａｍ ＨＩおよびＡｐａ Ｉによる制限消化の後、５９５ｂｐ断片を得た。制限エンドヌクレアーゼＨｉｎｄ ＩＩＩおよびＡｐａ ＩによるｐＰＬ１２の制限消化により、クローニングおよびファージディスプレイカセットを含む１４１７ｂｐの断片を得た。９３３ｂｐ、５９５ｂｐの２つのＤＮＡ断片のライゲーションにより、１５２８ｂｐの新規な細菌カセット（配列番号１３８）を得た。
【０１９７】
新規な細菌カセットとｐＰＬ１２からの１４１７ｂｐ断片のライゲーションにより、２９４５ｂｐのベクターｐＰＬ２０（配列番号１４７、図１３）を得た。複製の細菌源および選択マーカー遺伝子ｂｌａＲに加える制限部位を、選択マーカーｂｌａＲの構成的発現が挿入された結合パートナーのポリシストロン性の読み（ｐｏｌｙｃｉｓｔｒｏｎｉｃ ｒｅａｄ）を引き起こさないように選択した。ライゲーション産物を、熱ショック形質転換によって大腸菌細胞に形質転換した。多数の場合について行った生成構築物の多数の形質転換では、ライゲーションおよび形質転換により繰り返し数百の正のクローンを生じたベクターｐＰＬ１２、ｐＰＬ１４およびｐＰＬ２２とは対照的に形質転換体が得られなかった。
【０１９８】
変異体ｐＰＬ２０の形質転換体を得ることができなかったことは、限界が、抹消されることがあるベクターの非コード領域に存在することを示している。ｐＰＬ２０とｐＰＬ２２の差は、ｐＰＬ２２の複製の細菌源と選択マーカー遺伝子ｂｌａＲの間の１７０ｂｐの領域であり、これは、ｐＰＬ２０では制限エンドヌクレアーゼＢａｍ ＨＩについての６ｂｐの認識部位によって置換された。
【０１９９】
例８：代替の正の選択マーカー
遺伝子クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ｃａｔＲ）についてのオープンリーディングフレームは、β−ラクタマーゼ遺伝子より２０１ｂｐだけ短い。従って、ベクターｐＰＬ１２のサイズは、β−ラクタマーゼをコードする遺伝子を、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼをコードする遺伝子で置換することによって減少させることができる。
【０２００】
ｃａｔＲ遺伝子を、プライマーｆｗＣＡＴｐＰＬ３０ＦｓｐＩおよびｒｅｖＣＡＴｐＰＬ３０ＡｈｄＩを用いてベクターｐＢｅｌｏＢＡＣ１１（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）からＰＣＲによって増幅した。Ｆｓｐ Ｉ制限部位を、プライマーｆｗＣＡＴｐＰＬ３０ＦｓｐＩ（配列番号１５１）に導入し、Ａｈｄ Ｉ部位をプライマーｒｅｖＣＡＴｐＰＬ３０ＡｈｄＩ（配列番号１５２）に導入した。ベクターｐＰＬ１２を、制限酵素Ｓｓｐ ＩおよびＡｈｄ Ｉで消化した。Ｆｓｐ ＩおよびＳｓｐ Ｉは平滑末端カッターであり、ＰＣＲ産物を特異的にクローニングすることができた。配列を、ｃａｔＲ ＯＲＦのシークエンシングによって明らかにした。ｃａｔＲ遺伝子に含まれるＮｃｏ Ｉ部位を、プライマーＦｗｐＰＬ３０ＮｃｏＩＣＡＴｄｅｌ（配列番号１５３）およびＲｅｖｐＰＬ３０ＮｃｏＩＣＡＴｄｅｌ（配列番号１５４）を用いる部位特異的突然変異誘発によるサイレント突然変異の導入によって除去した。
【０２０１】
生成するベクターｐＰＬ３１（配列番号１４８）を、抗体断片の発現について試験した。ｐＰＬ３１からの発現レベルは、ｐＰＬ１２から検出されたものに匹敵した。
【０２０２】
例９：人工的制限部位の生成
人工的制限部位を、ベクターｐＰＬ３１の構築中に導入した。前記制限部位は、ベクターのセンスおよびアンチセンス鎖の両方に対するニッキング酵素Ｎｔ．ＢｂｖＣＩの２個の認識部位を導入することによって生成した。Ｎｔ．ＢｂｖＣＩ部位を、プライマーＦｗＮｂＢｂｖＣＩ１７Ｎｋａｎ（配列番号１５５）およびＲｅｖＮｂＢｂｖＣＩ１７Ｎｋａｎ（配列番号１５６）を用いる関連性のないＤＮＡ断片のＰＣＲ増幅によってベクターに導入した。ＰＣＲ産物を、ファージディスプレイカセットのＥｃｏ ＲＩ部位にクローニングした。Ｎｔ．ＢｂｖＣＩによる開裂および生成するベクターの再連結により、Ｎｔ．ＢｂｖＣＩ部位を含むＤＮＡ配列ＣＣＴＣＡＧＣＧＴＴＣＡＧＡＧＴＴＡＴＧＧＣＴＧＡＧ（配列番号１５７）を生じた。ベクターを酵素Ｎｔ．ＢｂｖＣＩと共にインキュベーションし、１７ｂｐの一本鎖ＤＮＡオーバーハングを有する反対のＤＮＡ鎖に２個のニックを生じる。人工的制限部位は、シークエンシングによって明らかにした。
【０２０３】
新規な人工的制限部位は、次の単離クローンの操作のためのベクターの高度に特異的な開裂および再閉鎖を容易にする。
【発明の背景】
【０００１】
本発明は、モノクローナル抗体のドメインに関する。更に詳細には、本発明は、小型ベクター、およびファージライブラリーの製造のためのそれらの使用に関し、それぞれのファージは、結合パートナーを結合するその能力についてスクリーニングを行う結合タンパク質をその表面に発現する。
【０００２】
ファージディスプレイ法は、タンパク質の相互作用を検討するのに用いられる手法である。この手法は、ファージの表面で目的とする結合タンパク質を発現させ、結合パートナーと複合体を形成するその能力について前記結合タンパク質を選択することに基づいている。この方法の原理は、ファージゲノムの遺伝子組換え、すなわち目的とする結合タンパク質をコードする配列を前記のファージゲノムに挿入することに依存している。配列挿入は、ファージのコートタンパク質複合体を形成するタンパク質をコードする遺伝子に隣接して配置される。前記コートは、極めて一般的に用いられる、例えば、ｐＩＩＩおよびｐＶＩＩＩタンパク質のような様々なタンパク質から構成されている。これらのタンパク質をコードする遺伝子に隣接して目的とする配列を挿入することにより、目的とする結合タンパク質をファージのコートタンパク質に融合させることができる。次いで、ファージ組換体を細菌に感染させ、そのゲノムが複製される。組換えファージゲノムの発現により、スクリーニングを行う結合タンパク質を表面に発現するファージが産生する。スクリーニングの段階中に、結合パートナーとよばれる異なるタンパク質または分子を、目的とする前記タンパク質と接触させる。複合体がファージ表面の結合タンパク質と結合パートナーとの間に形成されると、複合体を精製した後、目的とする結合タンパク質をコードするヌクレオチド配列を組換えファージゲノムから決定することができる。
【０００３】
ファージディスプレイの原理は、１９８５年［Ｓｍｉｔｈ，Ｇ．Ｐ．， １９８５， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２２８， １３１５−１３１７］から始まり、この手法は、ヘルパーファージおよびファージミドベクターとを組合せた抗体断片の選択に応用されている［ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙ，Ｊ．ｅｔ ａｌ．， １９９０， Ｎａｔｕｒｅ ３４８， ５５２−５５４］，［Ｂａｒｂａｓ，Ｃ．Ｆ．ｅｔ ａｌ．， １９９１， ８８， ７９７８−７９８２］，［Ｂｒｅｉｔｌｉｎｇ，Ｆ．ｅｔ ａｌ．， １９９１， Ｇｅｎｅ １０４， １４７−１５３］，［Ｂｕｒｔｏｎ，Ｄ．Ｒ．ｅｔ ａｌ．， １９９１， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． Ｕ． Ｓ． Ａ ８８， １０１３４−１０１３７］， ［Ｃｌａｃｋｓｏｎ，Ｔ．ｅｔａｌ．， １９９１， Ｎａｔｕｒｅ ３５２， ６２４−６２８］， ［Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍ，Ｈ．Ｒ．ｅｔ ａｌ．， １９９１， Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． １９， ４１３３−４１３７］。ファージディスプレイ法は、ファージディスプレイベクターとも呼ばれるファージミドベクターと、目的とする結合タンパク質をその表面上で発現させるファージライブラリーを生成するためのヘルパーファージとの使用を組み合わせている。ファージディスプレイベクターは、目的とする結合タンパク質をコードする配列と、ファージ配列、特に目的とする結合タンパク質と融合させるコートタンパク質をコードする配列とを含んでなる。ファージディスプレイベクターは、ファージゲノムの複製または宿主細胞におけるベクターの保持のための様々な機能的配列からも構成されている。ファージディスプレイベクターは、総てのファージゲノムを含まないが、これは、この方法が、表面に結合タンパク質を発現させるファージを産生するためのヘルパーファージの使用と組み合わされているからである。ヘルパーファージは、ファージディスプレイベクターに含まれていない完全ファージゲノムからタンパク質を補足することによって、ファージディスプレイベクター上でファージゲノムを複製およびパッケージングすることができる。
【０００４】
ここで、バクテリオファージＭ１３ゲノムの全体を含んでなる古典的ファージベクターとは対照的に、ファージミドベクターとも呼ばれるファージディスプレイベクターは、ｇｅｎｅＩＩＩの断片とＭ１３遺伝子間領域を含むＭ１３ゲノムの小部分のみを含んでなることを思い起こさねばならない。
【０００５】
例えば、このようなファージベクターは、古典的には大きなベクター（一般的には６０００塩基対を上回る）であり、特許出願ＷＯ９２／０６２０４号に記載のベクターＭ１３ＩＸ３０、Ｍ１３ＩＸ１１、Ｍ１３ＩＸ３４、Ｍ１３ＩＸ１３またはＭ１３ＩＸ６０、または特許出願ＵＳ６，０５７，０９８号明細書に記載の多価ディスプレイライブラリーを生成する方法に用いられるベクター６６８−４のような任意の誘導ファージベクターからなることができる。
【０００６】
最初のファージミドベクターｐＣＡＮＴＡＢ［Ａｂｒａｈａｍ， Ｒ．ｅｔ ａｌ．，１９９５， Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． Ｍｅｔｈｏｄｓ １８３， １１９−１２５］、［Ｔａｎａｋａ， Ａ．Ｓ． ｅｔ ａｌ．， １９９５，Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｂｉｏｐｈｙｓ． Ｒｅｓ． Ｃｏｍｍｕｎ．２１４， ３８９−３９５］、ｐＨＥＮ［Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍ， Ｈ．Ｒ．ｅｔ ａｌ．， １９９１， Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． １９， ４１３３−４１３７］、［ＷＯ ９２／０１０４７］、ｐＣＯＭＢ［Ｂａｒｂａｓ， Ｃ．Ｆ． ｅｔ ａｌ．， １９９１， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． Ｕ． Ｓ． Ａ ８８， ７９７８−７９８２］、［Ｂｕｒｔｏｎ， Ｄ．Ｒ．ｅｔ ａｌ．， １９９１， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． Ｕ． Ｓ． Ａ ８８， １０１３４−１０１３７］は、利用可能な分子生物学的ツールを用いてその時点で利用可能なクローニングおよび発現ベクターから構築した。この時以来、ファージミドベクターには最適化はほとんど用いられておらず、まれな例はｐＫＭ１９［Ｐａｖｏｎｉ， Ｅ．ｅｔ ａｌ．， ２００７， Ｇｅｎｅ ３９１， １２０−１２９］であり、その構築には、最適化プロモーターとバクテリオファージＭ１３のｇｅｎｅＩＩＩ産物のＣ末端ドメインの使用の利点が考慮されている［Ｂａｒｂａｓ， Ｃ．Ｆ．ｅｔ ａｌ．， １９９１， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． Ｕ． Ｓ． Ａ ８８， ７９７８−７９８２］。
【０００７】
本発明は、クローニングカセット、ファージディスプレイカセットおよび細菌カセットを含んでなるファージディスプレイベクター、およびファージのライブラリーを生成するためのその使用に関し、ライブラリーのそれぞれのメンバーは、その表面上で結合タンパク質を発現させる。下記の説明で明らかになるように、３個のカセットのそれぞれは最適化されて、結合タンパク質のファージディスプレイに好適な機能的ベクターを生成する。
【０００８】
今日まで、この手法が堅牢であると思われていても、目的とするタンパク質の発現レベルに関して不十分な点がある。今日まで用いられてきたこの手法のもう一つの不都合な点は、選択された結合タンパク質の検出および精製である。
【０００９】
本発明は、これらの問題点を解決しようとするものであり、初めての新規かつ自明でない最適化ファージディスプレイベクターについて記載するものである。
【００１０】
第一の態様では、本発明は、クローニングカセットと、ファージディスプレイカセットと、細菌カセットとを少なくとも含んでなり、前記クローニングカセットが、少なくとも抗体の定常ドメインのドメイン内ループに対応するポリペプチドをコードする核酸配列を含んでなる、最小化ファージディスプレイベクターに関する。
【００１１】
本明細書では、疑念を避けるため、「カセット」は、特異的な生物学的および／または生化学的活性を有する特異的核酸配列を含んでなるＤＮＡ断片と考えるべきである。「カセット」、「遺伝子カセット」または「ＤＮＡカセット」という表現は、互換的に用いることができ、同じ意味を有する。
【００１２】
クローニングカセットは、遺伝子のクローニングにおいて活性を有するカセットと考えるべきである。クローニングカセットは、クローニングを行う目的とする１または数個の遺伝子の調節および発現に必要な核酸配列を含む。クローニングカセットは、プロモーターをコードする核酸配列と、終止コドンと、目的とする（複数の）遺伝子の導入に有用なクローニング部位とを少なくとも含んでなり、これらの成分のそれぞれは、互いに作動可能に連結（ｏｐｅｒａｂｌｙ ｌｉｎｋｅｄ）している。
【００１３】
「作動可能に連結した」または「作動可能に挿入した」という用語は、コード配列の発現に必要な調節配列がコード配列に関して適当な位置の核酸分子に置かれ、コード配列を発現させることができるようになっていることを意味する。一例として、プロモーターがコード配列の転写または発現を制御することができるときには、そのプロモーターはコード配列と作動可能に連結している。
【００１４】
ファージディスプレイカセットは、ファージディスプレイ法、更に正確には目的とする（複数の）タンパク質を表面上で発現させるファージライブラリーの産生を目的とするファージディスプレイ法で活性を有するカセットと考えるべきである。ファージディスプレイカセットは、ａ） 複製ベクターによって担持されたｓｓＤＮＡとしてのファージ源を含んでなる複製ベクターを複製することができ、かつ、ｂ） 機能的ファージゲノムの相補性を有する組換えファージを産生するため、ファージの複製源をコードする核酸配列を少なくとも含んでなる。
【００１５】
細菌カセットは、細菌宿主細胞にベクターの増加および保持に必要な（複数の）配列を含むカセットと考えるべきである。従って、細菌カセットは、主として、複製源と選択マーカーとをコードする核酸配列を少なくとも含んでなる。
【００１６】
それらのカセットの組成に関しては、下記で更に詳細に説明する。
【００１７】
しかしながら、当業者に明らかな任意の修飾も本発明に包含されるものと考えるべきであることを理解しなければならない。
【００１８】
「核酸」という用語は、デソキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチドおよび一本鎖または二本鎖形態でのそれらのポリマー（「ポリヌクレオチド」）を表す。特に制限しなければ、この用語は、参照核酸と同様の結合特性を有しておりかつ天然に存在するヌクレオチドと同様に代謝される天然ヌクレオチドの既知の類似体を含む核酸を包含する。他に指示がない限り、特定の核酸配列は、保存的に修飾されたその変異体（例えば、縮退コドン置換（ｄｅｇｅｎｅｒａｔｅ ｃｏｄｏｎ ｓｕｂｓｔｉｔｕｔｉｏｎ））および相補性配列並びに明確に指示された配列も暗黙裡に包含する。具体的には、縮退コドン置換は、１個以上の選択された（または総ての）コドンの３番目の位置が混合塩基（ｍｉｘｅｄ−ｂａｓｅ）および／またはデオキシイノシン残基で置換されている配列を生成することによって実現することができる。
【００１９】
「核酸」、「核酸配列」、「ヌクレオチド配列」または「ヌクレオチド分子」という用語は、遺伝子、遺伝子によってコードされるｃＤＮＡ、ＤＮＡおよびＲＮＡと互換的に用いられることもある。従って、本発明によるクローニングカセットは、抗体の定常ドメインのドメイン内ループに対応する少なくとも１個のポリペプチドをコードする核酸配列を含んでなる。本発明の好ましい態様では、前記核酸配列は、クローニング部位に隣接するクローニングカセットに挿入される。この好ましい挿入局在化により、（完全長の）定常ドメインの挿入の場合には、ｓｃＦｖ抗体断片と定常ドメインから構成される一本鎖抗体を獲得することができる。定常ドメインの存在により、目的とするタンパク質、すなわち一本鎖抗体の機能的発現を向上させることができることが示された。定常ドメインは、ファージディスプレイベクターに挿入された核酸配列から産生される結合タンパク質の検出および精製を向上させることもできる。
【００２０】
「抗体」、「抗体類（ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ）」または「免疫グロブリン」という用語は、最も広義に互換的に用いられ、モノクローナル抗体（例えば、完全長または完全なモノクローナル抗体）、ポリクローナル抗体、多価抗体または多重特異性抗体（例えば、所望な生物活性を示す限り、二重特異性抗体）が挙げられる。
【００２１】
更に詳細には、このような分子は、ジスルフィド結合によって相互連結された少なくとも２本の重（Ｈ）鎖および２本の軽（Ｌ）鎖とを含んでなる糖タンパク質からなっている。それぞれの重鎖は、重鎖可変領域（またはドメイン）（本明細書では、ＨＣＶＲまたはＶＨと略する）と重鎖定常領域とから構成されている。重鎖定常領域は、ＣＨ１、ＣＨ２およびＣＨ３の３つのドメインから構成されている。それぞれの軽鎖は、軽鎖可変領域（本明細書では、ＬＣＶＲまたはＶＬと略する）と、軽鎖定常領域とから構成されている。軽鎖定常領域は、１個のドメイン、ＣＬを含んでなる。ＶＨおよびＶＬ領域は、フレームワーク領域（ＦＲ）と呼ばれる一層保存されている領域が散在している相補性決定領域（ＣＤＲ）と呼ばれる超可変領域に更に細分することができる。それぞれのＶＨおよびＶＬは、下記の順序でアミノ末端からカルボキシ末端まで配置されている３個のＣＤＲと４個のＦＲから構成されている：ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、ＦＲ４。重および軽鎖の可変領域は、抗原と相互作用する結合ドメインを含む。これらの抗体の定常領域は、免疫系の様々な細胞（例えば、エフェクター細胞）と古典的補体系の第一成分（Ｃｌｑ）などの宿主組織または因子への免疫グロブリンの結合を介在することがある。
【００２２】
それらは、本明細書で更に詳細に説明されるように、ある種の抗体断片を包含し、それらは、起源または免疫グロブリンの種類（すなわち、ＩｇＧ、ＩｇＥ、ＩｇＭ、ＩｇＡなど）には無関係に、所望な結合特異性および親和性を示すこともある。
【００２３】
一般的には、特にマウス起源のモノクローナル抗体またはそれらの機能的断片を調製するには、詳細にはマニュアル「抗体（Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ）」（Ｈａｒｌｏｗ ａｎｄ Ｌａｎｅ， 抗体：実験室便覧（Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ）， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ＮＹ， ｐｐ． ７２６， １９８８）に記載されている手法、またはＫｏｈｌｅｒおよびＭｉｌｓｔｅｉｎによって報告されたハイブリドーマからの調製の手法（Ｎａｔｕｒｅ， ２５６：４９５−４９７， １９７５）を参照することができる。
【００２４】
当業者であれば、重鎖は、ガンマ、ミュー、アルファ、デルタまたはイプシロン（γ、μ、α、δ、ε）として分類され、それらには幾つかのサブクラス（例えば、ガンマ１−ガンマ４）があることを理解されるであろう。抗体の「クラス」をそれぞれＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＧまたはＩｇＥとして決定するのは、この鎖の性質である。免疫グロブリンのサブクラス（アイソタイプ）、例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１などは、詳細に特性決定されており、機能的特殊化を付与することが知られている。
【００２５】
軽鎖は、カッパまたはラムダ（κ、λ）として分類される。
【００２６】
軽および重鎖は、両方とも構造的および機能的相同性の領域に分割される。「定常」および「可変」という用語は、機能的に用いられる。これに関して、軽（ＶＬ）および重（ＶＨ）鎖部分の可変ドメインは、抗原認識および特異性を決定することを理解されるであろう。逆に、軽鎖（ＣＬ）および重鎖（ＣＨ１、ＣＨ２もしくはＣＨ３、またはＩｇＭおよびＩｇＥの場合にはＣＨ４）の定常ドメインは、分泌、経胎盤移動性、Ｆｃ受容体結合、補体結合などの重要な生物学的特性を付与する。慣例により、定常領域ドメインのナンバリングは、抗体の抗原結合部位またはアミノ末端からより遠位になると、増加する。
【００２７】
抗体の「定常ドメイン」という表現は、抗原のエピトープを認識することができるあらゆる多様な配列を含む抗体の可変領域と比較して、一方の抗体から同一アイソタイプおよびアロタイプの別の抗体への変異性が全くない抗体領域と理解される。
【００２８】
これらの定常ドメイン、すなわちＣＬ、ＣＨ１、ＣＨ２、ＣＨ３およびＣＨ４のそれぞれに、ジスルフィド結合は約６０アミノ酸のループを形成している。本明細書において、前記ループはドメイン内ループと呼ばれる。
【００２９】
ヒトＩｇＧ ＣＨ１の好ましい場合には、２８種類の考え得るガンマ重鎖であって、それぞれが９７アミノ酸（配列番号１０４〜１３１）のポリペプチドからなる定常ドメインＣＨ１を有するものが存在する。これらの２８種類のドメインのそれぞれは、２６位にシステイン残基と８２位にもう一つのシステイン残基を示し、ジスルフィド橋を形成し、結果としてこれら２個のシステイン間にジスルフィド結合を形成することによって、ドメイン内ループを形成する。
【００３０】
本発明の特定態様では、クローニングカセットは、抗体の重鎖定常ドメインのドメイン内ループに対応する少なくとも１個のポリペプチドをコードする核酸配列を含んでなる。
【００３１】
更に詳細には、重鎖に対する好ましいドメイン内ループは、２６位のシステインと８２位のシステインとの間に含まれるポリペプチドから構成されるＣＨ１ドメイン内ループである。
【００３２】
更に好ましい態様では、クローニングカセットは、抗体の重鎖の定常ドメインに対応する少なくとも１個のポリペプチドをコードする核酸配列を含んでなる。
【００３３】
更に好ましい態様では、抗体の重鎖定常ドメインは、抗体のＣＨ１重鎖定常ドメインである。
【００３４】
当業者には、本発明によって用いられる別の重鎖定常ドメインのドメイン内ループを画定することは明らかであろう。
【００３５】
本発明のもう一つの態様では、クローニングカセットは、抗体の軽鎖定常ドメインのドメイン内ループに対応する少なくとも１個のポリペプチドをコードする核酸配列を含んでなる。
【００３６】
ヒトには、５種類のカッパ鎖があり、それらのそれぞれは、それぞれ２７および８７位における２個のシステイン残基を有する１０７アミノ酸のポリペプチドに対応し、ドメイン内ループ（配列番号９０〜９４）を形成する。
【００３７】
更に詳細には、カッパ軽鎖に対する好ましいドメイン内ループは、２７位のシステイン８７位のシステインの間に含まれるポリペプチドから構成されるドメイン内ループである。
【００３８】
ヒトのラムダ鎖に対しては、９個の異なる形態があり、それらのそれぞれが、それぞれ２７および８６位における２個のシステイン残基を有する１０５アミノ酸のポリペプチドに対応し、ドメイン内ループ（配列番号９５〜１０３）を形成する。
【００３９】
更に詳細には、ラムダ軽鎖に対する好ましいドメイン内ループは、２７位のシステインと８６位のシステインの間に含まれるポリペプチドから構成されるドメイン内ループである。
【００４０】
もう一つの態様では、クローニングカセットは、少なくとも抗体の軽鎖定常ドメインに対応するポリペプチドをコードする核酸配列を含んでなる。
【００４１】
本発明の好ましい態様では、クローニングカセットの定常ドメインは、軽鎖カッパ定常ドメインである。
【００４２】
本発明で用いられるカッパ定常ドメインの源は、優先的にはヒトである。
【００４３】
本発明の最も好ましい態様では、前記クローニングカセットの前記定常ドメインは、Ｃ末端システインが欠失した軽鎖カッパ定常ドメインである。
【００４４】
前記のカッパ定常ドメインは、ファージの表面で発現する一本鎖抗体の二量体化を防止するためのＣ末端システインを欠いており、このような二量体化はカッパ定常ドメイン間で起こり得るものである。実際に、抗体の重および軽鎖の定常ドメインは、軽鎖のＣ末端システインと重鎖定常ドメインにおける非対（ｎｏｎ−ｐａｉｒｅｄ）システインの間にジスルフィド結合を形成することによって集合する。本発明は、ファージの表面に結合タンパク質を提供する。定常ドメインのＣ末端システインを除去しないことにより、一本鎖抗体の二量体化の可能性と親和力の効果による非典型的結合（ｎｏｎ ｒｅｐｒｅｓｅｎｔａｔｉｖｅ ｂｉｎｄｉｎｇ）を生じる。
【００４５】
Ｃ末端システインの除去は、前記二量体化を防止するのに必要であり、従って、一本鎖抗体の二量体化によるｇＩＩＩ融合タンパク質のミスフォールディングまたは凝集の防止に応用される。
【００４６】
本発明のもう一つの好ましい態様では、クローニングカセットの定常ドメインは、軽鎖ラムダ定常ドメインである。
【００４７】
本発明で用いられるラムダ定常ドメインの源は、優先的にはヒトである。
【００４８】
本発明の最も好ましい態様では、前記クローニングカセットの前記定常ドメインは、１０４位のシステインが欠失している軽鎖ラムダ定常ドメインである（配列番号９５〜１０３）。もう一つの態様では、Ｃ末端残基１０４および１０５（システイン−セリン）を欠失することができる（配列番号９５〜１０３）。
【００４９】
今日までに、ファージディスプレイによる提示および選択のための一本鎖定常ドメインに融合した一本鎖Ｆｖの発現は、報告されていない。
【００５０】
本発明のもう一つの特に革新的な態様は、ベクターのサイズである。
【００５１】
大腸菌の形質転換効率は、極めて多様性に富むライブラリーを生成するための制限段階であり、ベクターサイズは形質転換効率に反比例する［Ｓｉｇｕｒｅｔ， Ｖ． ｅｔ ａｌ．， １９９４， Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ１６， ４２２−４２６］。現在報告されているファージディスプレイベクターは、結合パートナー可変ドメインの非存在下において３３９０塩基対を上回りかつ典型的には４５００ｂｐを上回るサイズを示し、ベクターサイズが増加すると、形質転換効率は減少して、得られるライブラリーのサイズが減少するか、または高い多様性を達成するには形質転換を繰り返すことが必要となる。
【００５２】
定常ドメインを全く含まない現在報告されているファージディスプレイベクターのサイズを、下記に示す。
ｐＣＡＮＴＡＢ ５Ｅ ４５２２ｂｐ
ｐＨＥＮ１ ４５２３ｂｐ
ｐＨＥＮ２ ４６１６ｂｐ
【００５３】
他の用いられるＭ１３ファージベクターのサイズも、以下に示す（例えば、ＷＯ９２／０６２０４号を参照）。
Ｍ１３ＩＸ３０ ７４４５ｂｐ
Ｍ１３ＩＸ１１ ７３１７ｂｐ
Ｍ１３ＩＸ３４ ７７２９ｂｐ
Ｍ１３ＩＸ１３ ７５５７ｂｐ
Ｍ１３ＩＸ６０ ８１１８ｂｐ
【００５４】
ファージディスプレイベクターのサイズは、形質転換効率に反比例する。
【００５５】
本発明のもう一つの目的は、宿主細胞の形質転換効率を最適にすることである。この技術的問題は、総ての必要な生物活性を保持したまま本発明のベクターのサイズを減少させることによって解決される。本発明のもう一つの特に創意に富む態様は、前記３種類のカセット中および間における非機能的ヌクレオチドを除去することにより、ファージディスプレイベクターのサイズを最小にしかつ形質転換効率を最適にすることに基づいている。この段階において、前記最小化ファージディスプレイベクターの活性が保存されることは予想されないので、ファージディスプレイベクターのサイズの減少が当業者には明らかではなかったことを理解しなければならない（実施例７参照）。この点の実例として、ここではファージディスプレイベクターが、この手法の誕生以来、すなわち８０年代以来存在しており、前記ファージディスプレイベクターのサイズの減少に関する先行技術がないということが挙げられる。
【００５６】
ベクターにおける非機能的ヌクレオチドの欠失により、一層小さなベクターのライブラリーを生成することができ、宿主細胞に対するストレスを小さくする。このベクターは、また宿主細胞で一層容易に保持される。
【００５７】
これらの欠失により、抗体の定常ドメインのドメイン内ループに対応する少なくとも１個のポリペプチドをコードする核酸配列のサイズを含む３３００塩基対未満の新規なファージディスプレイベクターを生じ、これは上記のように本発明の特徴である。これは、定常ドメインまたはこのような定常ドメインのドメイン内ループ（４５００塩基対を上回る）をコードするこのような核酸配列を含まない従来技術のベクターで観察される通常のサイズよりかなり小さなものである。比較を容易にするため、抗体の定常ドメインのドメイン内ループに対応する少なくとも１個のポリペプチドをコードする核酸配列が全くない本発明によるファージディスプレイベクターのサイズは、３０００塩基対未満であると考えることができる。
【００５８】
一例として、ベクターｐＰＬ１２およびｐＰＬ１４は３２４６塩基対（抗体のドメイン内ループに対応するポリペプチドをコードする核酸配列のない２９２８塩基対に対応する）であり、ｐＰＬ２２は３１０９塩基対（抗体のドメイン内ループに対応するポリペプチドをコードする核酸配列のない２７５１塩基対）であると言うことができる。３１５８塩基対を含んでなるベクターｐＰＬ３１を挙げることもできる。下記の実施例において明確に説明されるこれら４種類のベクターは、本発明によるベクターの非制限的例であることを理解しなければならない。
【００５９】
これら４種類のベクターｐＰＬ１２、ｐＰＬ１４、ｐＰＬ２２およびｐＰＬ３１の配列は、それぞれ配列番号１、５、７および１４８の配列で表される。
【００６０】
今日まで、抗体の定常ドメインのドメイン内ループに対応する少なくとも１個のポリペプチドをコードする核酸配列を含んでなり、かつ、３３００塩基対を上回らない最小化ベクターの使用は、記載も示唆もされていない。
【００６１】
疑念を払拭するため、「最小化ベクター」という表現は、サイズが３３００塩基対以下のベクターと理解しなければならない。
【００６２】
本発明のファージディスプレイベクターは、スクリーニングを行う結合タンパク質を表面に発現させるファージのライブラリーを生じるために用いられる。
【００６３】
「結合タンパク質」は、別のタンパク質または分子と特異的または全般的親和性を有するペプチド鎖である。タンパク質同士は、結合が可能なときには、接触して複合体を形成する。ファージ表面で発現する本発明の結合タンパク質は、好ましくは、抗体、抗体の断片または誘導体、タンパク質またはペプチドであることができる。
【００６４】
ファージディスプレイ法は、従って、本発明の好ましい態様で、抗原のような新規なターゲット分子を結合する特異抗体を決定するためのスクリーニング法として用いることができる。この手法は、特異抗体を生じるための動物免疫化段階を行わずに前記抗体または抗体断片の選択という利点を提示する。目的とする結合タンパク質を発現させるファージは、細菌細胞で直接生じる。
【００６５】
ファージディスプレイベクターのクローニング部位に挿入された核酸配列は、抗体の可変鎖をコードする配列に対応し、ｓｃＦｖ、一本鎖Ｆｖとも呼ばれる抗体の断片を形成し、これは以下において説明する。
【００６６】
本発明による抗体の「機能的断片」とは、可変断片（Ｆｖ）、ｓｃＦｖ（一本鎖に対してｓｃ）、抗原結合性断片（Ｆａｂ）、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆａｂ’、ｓｃＦｖ−Ｆｃ断片もしくはジアボディー(diabodies)、または半減期がポリ（アルキレン）グリコール、例えば、ポリ（エチレン）グリコール（「ＰＥＧ化」）（Ｆｖ−ＰＥＧ、ｓｃＦｖ−ＰＥＧ、Ｆａｂ−ＰＥＧ、Ｆ（ａｂ’）２−ＰＥＧまたはＦａｂ’−ＰＥＧと呼ばれるペジル化断片）（「ポリ（エチレン）グリコールに対しての「ＰＥＧ」）の付加のような化学修飾によって増加し、かつとりわけ由来する抗体の部分的活性さえも一般的に発揮することができる任意の断片、のような抗体断片を示そうとするものである。
【００６７】
好ましくは、前記機能的断片は、それらの断片が由来する抗体の重または軽可変鎖の部分配列から構成されまたは部分配列を含んでなり、前記部分配列は、それが由来する抗体と同じ結合特異性、および十分な親和性、好ましくは少なくともそれが由来する抗体の親和性の１／１００、更に好ましくは少なくとも１／１０を保持するのに十分である。このような機能的断片は、それが由来する抗体の配列の最小限度でも５アミノ酸、好ましくは１０、１５、２５、５０および１００連続アミノ酸を含む。
【００６８】
好ましくは、これらの機能的断片は、Ｆｖ、ｓｃＦｖ、ｓｃＦｖ−Ｆｃ型の断片またはジアボディーであり、これらは一般的には、それらが由来する抗体と同じ結合特異性を有する。もう一つの方法では、本発明に含まれる抗体断片は、当業者に周知の遺伝子組換え技術によって、あるいはＡｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社によって供給されるような自動ペプチド合成装置などによるペプチド合成または遺伝子合成によって得ることもできる。
【００６９】
「一本鎖可変断片」（ｓｃＦｖ）は、前記定義の抗体断片であり、ペプチド結合によって互いに結合している抗体の重および軽鎖の可変領域から構成されている。これらの断片は、天然状態では存在しないが、人工的に構築されている。一本鎖可変断片における重−軽または軽−重可変領域の順序は、結合パートナーの認識や組換えタンパク質の発現に有意な効果を示さないので、可変領域の順序は互換的と考えることができる。可変領域間にシス型（ｃｉｓ）で導入される結合ペプチドは、可変領域を天然抗体に似た三次元配置に配向する働きをする。結合ペプチドの選択は、多くの過程で生じるｓｃＦｖに影響し、ペプチドの長さは、単量体性または多量体性ｓｃＦｖ化合物の形成に影響する。短めの結合ペプチドでは、二量体、三量体または四量体のような多量体性ｓｃＦｖが形成されやすく、１２を上回るアミノ酸での長めの結合ペプチドでは、単量体が形成されやすい。結合ペプチドは、理想的には、発現したｓｃＦｖの折り畳みや結合を制限しないアミノ酸残基からなり、アミノ酸組成は、極性で非イオン化性の小アミノ酸が有利である。
【００７０】
「一本鎖抗体」は、抗体のｓｃＦｖ断片と定常ドメインから構成される結合分子と定義される。従って、一本鎖抗体は、抗原と相互作用する重または軽鎖からの結合ドメインを含む１本の重鎖および１本の軽鎖の可変領域を示す。
【００７１】
本発明による抗体の「誘導体」とは、タンパク質スキャフォールドと、結合能力を保持する目的で元の抗体から選択されるＣＤＲの少なくとも１個とを含んでなる結合タンパク質を意味する。このような化合物は、当業者には周知であり、下記の明細書で更に詳細に説明する。
【００７２】
更に詳細には、本発明による抗体、またはその機能的断片もしくは誘導体の１つは、前記誘導体が、元の抗体のパラトープを保存するように少なくとも１個のＣＤＲがグラフトしているスキャフォールドを含んでなる結合タンパク質からなることを特徴とする。
【００７３】
本発明に記載の６個のＣＤＲ配列の１または数個の配列を、タンパク質スキャフォールド上に提示することができる。この場合には、タンパク質スキャフォールドは、グラフトした（複数の）ＣＤＲの適当な折り畳みを有するタンパク質主鎖を再生することによって、抗原結合パラトープを保持することができる。
【００７４】
当業者であれば、元の抗体から選択される少なくとも１個のＣＤＲをグラフトさせることができるタンパク質スキャフォールドを選択する方法を知っている。更に詳細には、選択を行うには、このようなスキャフォールドが下記のような幾つかの特徴を示すことが知られている（Ｓｋｅｒｒａ Ａ．， Ｊ． Ｍｏｌ． Ｒｅｃｏｇｎ．， １３， ２０００， １６７−１８７）：
系統発生的に保存され、
周知の三次元分子構成を有する確固とした構造（例えば、結晶学またはＮＭＲ）、
サイズが小さく、
翻訳後修飾が全くないかまたは極低い程度であり、
産生、発現および精製が容易である。
【００７５】
このようなタンパク質スキャフォールドは、フィブロネクチンおよび優先的には１０番目のフィブロネクチンＩＩＩ型ドメイン（ＦＮｆｎ１０）、リポカリン、アンチカリン（Ｓｋｅｒｒａ Ａ．， Ｊ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．， ２００１， ７４（４）：２５７−７５）、ブドウ球菌タンパク質のドメインＢのタンパク質Ｚ誘導体、チオレドキシンＡ、または「アンキリン反復」（Ｋｏｈｌ ｅｔ ａｌ．， ＰＮＡＳ， ２００３， ｖｏｌ．１００， Ｎｏ．４， １７００−１７０５）、「アルマジロ反復」、「ロイシン・リッチ反復」もしくは「テトラトリコペプチド反復」などの反復ドメインを有する任意のタンパク質からなる群から選択される構造であるが、制限はない。
【００７６】
毒素（例えば、サソリ、昆虫、植物または軟体動物毒素など）またはニューロン性一酸化窒素シンターゼのタンパク質阻害剤（ＰＩＮ）からのスキャフォールド誘導体の更なる選択も、考慮すべきである。
【００７７】
このようなハイブリッド構築物の非制限的例として、抗−ＣＤ４抗体、すなわち１３Ｂ８．２抗体のＣＤＲ−Ｈ１（重鎖）のＰＩＮの露出したループの１つへの挿入を示すことができる。得られた結合タンパク質の結合特性は、元の抗体と同様のままである（Ｂｅｓ ｅｔ ａｌ．， ＢＢＲＣ ３４３， ２００６， ３３４−３４４）。抗−リゾチームＶＨＨ抗体のＣＤＲ−Ｈ３（重鎖）のネオカルチノスタチンのループへのグラフトを、挙げることもできる（Ｎｉｃａｉｓｅ ｅｔ ａｌ．， ２００４）。
【００７８】
上記のように、このようなタンパク質スキャフォールドは、元の抗体由来の１〜６個のＣＤＲを含んでなることができる。好ましい態様では、制限なしではあるが、当該技術に熟練した者であれば、特に抗体特異性に関係していることが知られている重鎖由来の少なくとも１個のＣＤＲを選択できるだろう。目的とする（複数の）ＣＤＲの選択は、既知の方法で当業者に明らかになるであろう（ＢＥＳ ｅｔ ａｌ．， ＦＥＢＳ ｌｅｔｔｅｒｓ ５０８， ２００１， ６７−７４）。
【００７９】
証拠として、これらの例は制限的なものではなく、既知または報告されている任意の他のスキャフォールドが本明細書に含まれなければならない。
【００８０】
もう一つの態様によれば、本発明によるベクターのクローニングカセットは、プロモーターをコードする核酸配列と、シグナルペプチドをコードする核酸配列とを少なくとも含んでなる。
【００８１】
プロモーターは、メッセンジャーＲＮＡにおける遺伝子配列の転写を開始させることができる核酸配列であり、このような転写は、ＲＮＡポリメラーゼの前記プロモーターへの結合によって開始される。
【００８２】
前記プロモーターをコードする配列は、非制限的例として、Ｌａｃ、Ｔａｃ、Ｔｒｐ、Ｔｅｔ、Ｔ７、ＳＰ６からなる群から選択することができる。
【００８３】
好ましい態様では、本発明の前記クローニングカセットのプロモーターは、Ｌａｃプロモーターである。
【００８４】
「シグナルペプチド」は、目的とする結合タンパク質が細胞で発現した後に、局在化に関するペプチド鎖である。ペプチドシグナル配列は、ベクター上の前記目的とする結合タンパク質をコードする配列に隣接して配置される。一本鎖ＤＮＡ組成物中のファージディスプレイベクターを含むファージキャプシド集合体に目的とする結合タンパク質を正確に組込むには、ペプチドシグナルによる宿主生物のペリプラズム間隙（ｐｅｒｉｐｌａｓｉｍｉｃ ｓｐａｃｅ）に目的とする結合タンパク質をターゲッティングする必要がある。目的とする結合タンパク質の構造は、一本鎖抗体の場合にはジスルフィド結合の形成が必要である。ペリプラズム間隙は酸化的環境であるが、前記一本鎖抗体の構造的折り畳みを行うことができる。
【００８５】
前記シグナルペプチドをコードする配列は、非制限的例として、ｐｅｌＢ、ｇｅｎｅＩＩＩ、ｐｈｏＡ、ｍａｌＥ、ｄｓｂＡをコードする配列からなる群から選択することができる。
【００８６】
好ましい態様では、前記クローニングカセットのシグナルペプチドは、ｐｅｌＢシグナルペプチドである。
【００８７】
もう一つの態様では、本発明によるベクターのクローニングカセットは、更にクローニング部位をコードする核酸配列を含んでなる。
【００８８】
本明細書で用いられる「クローニング部位」という用語は、適合する突出または平滑末端を含む核酸配列のライゲーションによる制限エンドヌクレアーゼ仲介クローニングのための制限部位、相同および伸長「オーバーラップＰＣＲスティッチング（ｏｖｅｒｌａｐ ＰＣＲ ｓｔｉｔｃｈｉｎｇ）」によるインサートＤＮＡのＰＣＲによるクローニングのためのプライミング部位として働く核酸配列の領域、または組換え−交換反応、またはターゲット核酸配列のトランスポゾン介在挿入のためのモザイク末端並びに当該技術分野でよく知られている他の手法によるターゲット核酸配列のリコンビナーゼによる挿入のための組換え部位を含む核酸配列を表す。
【００８９】
好ましい態様では、本発明によるクローニング部位は、少なくとも２つの制限部位を含んでなる。
【００９０】
非制限的例として、配列番号２の配列のクローニングカセットを好ましいクローニングカセットとして挙げることができる。
【００９１】
本発明によって産生しかつ下記に定義されるファージは、その表面に抗体の軽鎖および重鎖、結合ペプチドおよび定常ドメインを含んでなる結合タンパク質を提示する。２個の制限部位は、ベクターに軽および重鎖をコードする配列を挿入することが必要なことがある。
【００９２】
定常ドメイン抗体のドメイン内ループに対応する少なくとも１個のポリペプチドを用いる可変軽および重鎖から構成される一本鎖抗体の形成は、可変軽および重鎖間の結合ペプチドによって導かれる結合によって実現される。
【００９３】
前記結合ペプチドの配列を、ベクターに挿入することができる。それは、本発明で非制限的に例示されているｐＰＬ１２、ｐＰＬ１４、ｐＰＬ２２およびｐＰＬ３１ベクターのようなベクターに既に含まれていることもあり、特異的挿入には、追加の制限部位が必要となることがある。
【００９４】
ファージディスプレイカセットは、Ｍ１３ｇｅｎｅＩＩＩタンパク質をコードする核酸配列の総てまたは一部を含んでなることができる。しかしながら、Ｍ１３ｇｅｎｅＶＩＩ、ＶＩＩＩまたはＩＸタンパク質をコードする核酸配列を用いることもできる。
【００９５】
Ｍ１３ｇｅｎｅＩＩＩタンパク質は、Ｍ１３ファージ由来のタンパク質であり、ファージのキャプシドを形成する複合体の一部である。ｇｅｎｅＩＩＩタンパク質は、分泌されるファージの最末端に配置され、キャプシド中のその量は１個のタンパク質に限定されず、数個から５個までのｇｅｎｅＩＩＩタンパク質を挙げることができる。結合タンパク質をコードする核酸配列は、ベクター上のＭ１３ｇｅｎｅＩＩＩタンパク質をコードする核酸配列に隣接して配置される。翻訳後、結合タンパク質は、このようにしてｇｅｎｅＩＩＩタンパク質に融合する。ファージディスプレイベクター由来の融合タンパク質の発現レベルを調節することによって、ファージゲノム相補性によって提供される野生型ｐＩＩＩと比較して融合タンパク質のコピー数を調節することができる。理想的には、少数の融合タンパク質をそれぞれのファージキャプシドに組込み、提示される結合分子のアビディティー（ａｖｉｄｉｔｙ）を防止する。
【００９６】
好ましい態様では、ベクターは、ファージディスプレイカセットが、少なくとも配列番号１３２または１３３に対応するＭ１３ｇｅｎｅＩＩＩタンパク質のＣ末端ドメインを含んでなる核酸配列を含んでなることを特徴とする。
【００９７】
本発明のもう一つの態様は、Ｍ１３ｇｅｎｅＩＩＩタンパク質のＣ末端配列のみの使用である。この核酸配列は、ファージに付着してコートタンパク質複合体を形成するタンパク質の一部をコードする。
【００９８】
Ｍ１３ｇｅｎｅＩＩＩタンパク質をコードするＣ末端配列は、Ｍ１３ｇｅｎｅＩＩＩタンパク質の野生型の核酸配列（配列番号１３３）を提示する。しかしながら、この核酸配列は、本発明において単一ヌクレオチド突然変異（Ａ３２８Ｇ）に対応する野生型配列（Ｓ１１０Ｇ）由来の単一アミノ酸の突然変異により最適化することができる。前記Ｃ末端Ｍ１３ｇｅｎｅＩＩＩタンパク質の配列は、大腸菌での発現のためのＧｅｎｅａｒｔによって最適化され、配列番号１３２に対応している。
【００９９】
最も好ましい態様では、ファージディスプレイカセットは、少なくとも配列番号１３２に対応するＭ１３ｇｅｎｅＩＩＩタンパク質のＣ末端ドメインを含んでなる最適化した核酸配列を含んでなる。
【０１００】
本発明のもう一つの態様では、本発明によるファージディスプレイカセットは、終止コドンをコードする核酸配列、ファージの複製源をコードする核酸配列、およびカプセル化またはパッケージング配列をコードする核酸配列を含んでなる。
【０１０１】
終止コドンは、３個のヌクレオチドから構成される短い配列であり、ｍＲＮＡ翻訳の終了に関与する。任意のアミノ酸をコードしない３個のヌクレオチドの組み合わせが、ｍＲＮＡのタンパク質へのリボソーム翻訳を終了する。
【０１０２】
本発明の終止コドンの配列は、抗体の定常ドメインのドメイン内ループに対応するポリペプチドをコードする核酸配列と、Ｍ１３ｇｅｎｅＩＩＩタンパク質をコードする核酸配列との間に配置されるべきである。終止コドンの機能は、その翻訳（ｉｎｔｅｒｐｒｅｔａｔｉｏｎ）が選択される細胞株によって異なるので、本発明のファージディスプレイベクターによって形質転換される宿主株によって変化する。
【０１０３】
サプレッサー株の場合には、終止コドンはその株によってアミノ酸として認識される。従って、翻訳は中断されず、翻訳産物は、ｇｅｎｅＩＩＩタンパク質とファージ表面上で発現させた結合分子との融合体である。
【０１０４】
非サプレッサー株の場合には、終止コドンを認識して、翻訳を停止する。従って、翻訳産物は結合分子である。非サプレッサー株は、結合パートナーと複合体形成の目的で一本鎖抗体をスクリーニングし検出した後に結合分子のみを産生するのに用いることができる。それは、ｇｅｎｅＩＩＩタンパク質に結合することなしにファージの表面上に提示される一本鎖抗体の構造の分析に用いることもできる。
【０１０５】
３個の終止コドンが報告されており、３種類のヌクレオチド、すなわちアンバー終止コドン（ＴＡＧ）、オーカー終止コドン（ＴＡＡ）およびオパール終止コドン（ＴＧＡ）から構成されている。
【０１０６】
好ましい態様では、本発明のファージディスプレイカセットの終止コドンはアンバー終止コドンである。
【０１０７】
ファージディスプレイカセットにおける「複製源」は、ファージの複製源であり、完全なファージゲノムの相補性により、ファージ源の配列および一本鎖ＤＮＡとしてベクター上に支持されている目的とする結合タンパク質をコードする配列の複製を開始して、後で組換えファージでカプセル化することができるものである。
【０１０８】
従って、ファージの複製源は、一本鎖ＤＮＡ形態としてのベクターの複製を促進した後、ファージ粒子中にカプセル化することができる。一本鎖ベクターＤＮＡは、完全なファージゲノム相補性により、バクテリオファージキャプシドにカプセル化される。
【０１０９】
本発明のファージの複製源の核酸配列は、好ましくは、５２９位のヌクレオチドＡ（配列番号３）による単一ヌクレオチド、すなわちヌクレオチドＧ（配列番号６）の突然変異を含むＭ１３ファージの非野生型配列であることができる。前記突然変異により、更に多くのファージ粒子が産生される。
【０１１０】
「パッケージングシグナル」は、目的とする結合タンパク質をコードする配列およびファージ源の配列の保護および機能的キャプシドへのパッケージングの調節に関与するファージヌクレオチド配列である。目的とする結合タンパク質をコードする核酸配列を含むファージのゲノムをパッケージするためには、パッケージングシグナルが本発明のファージディスプレイベクターに含まれていることが必要である。相補性に用いられるファージゲノムは、パッケージングシグナルにおいて弱められ、本発明のベクターが優先的にパッケージングされる。
【０１１１】
本発明のパッケージングシグナルの核酸配列は、Ｍ１３ファージの野生型配列であることができるが、好ましくは、単一ヌクレオチドの突然変異、すなわち７８４位のヌクレオチドＡ（配列番号３）によるヌクレオチドＧ（配列番号６）の突然変異を含む。前記突然変異は、Ｍ１３野生型パッケージングシグナルを有する突然変異よりも優れた可溶性の組換えファージおよび目的とするタンパク質を付与する。
【０１１２】
非制限的例としては、配列番号３、６および１４９の配列のファージディスプレイカセットからなる群から選択されるファージディスプレイカセットを挙げることができる。
【０１１３】
本発明のもう一つの態様では、ファージディスプレイベクターの前記細菌カセットは、プロモーターをコードする核酸配列と、正の選択マーカーをコードする核酸配列と複製源をコードする核酸配列とを少なくとも含んでなる。
【０１１４】
本発明による細菌カセットは、プロモーターをコードする核酸配列を含んでなる。前記プロモーターは、正の選択可能マーカーをコードする遺伝子の転写に関与する。
【０１１５】
好ましい態様では、細菌カセットのプロモーターは、β−ラクタマーゼプロモーターであることができる。
【０１１６】
「正の選択マーカー」は、ベクターに導入され、前記ベクターにより形質転換した細菌を選択し、培養において保持するための核酸である。このような核酸配列は、阻害性ＲＮＡのような、遺伝子または任意の代替調節配列であることができる。
【０１１７】
好ましい態様では、前記正の選択マーカーは、アンピシリンまたはクロラムフェニコール耐性遺伝子であることができる。
【０１１８】
形質転換の正の効果を示す宿主細胞、すなわち、ベクターが導入されて、そのままになっている細胞は、抗生物質を含む培地では、選択マーカー遺伝子によって宿主に前記抗生物質耐性が付与されるため、生存し増殖することができるようになる。
【０１１９】
本発明によるベクターは、必要ならば、転写ターミネーターをコードする核酸配列を更に含んでなることができる。
【０１２０】
「転写ターミネーター」は、ｍＲＮＡへの遺伝子、本明細書では正の選択マーカーをコードする遺伝子のＲＮＡポリメラーゼ転写を終了するヌクレオチド配列である。抗体の可変領域、抗体の定常ドメインまたは定常ドメインのドメイン内ループと、Ｍ１３ｇｅｎｅＩＩＩタンパク質とをコードする核酸配列の転写は、クローニングカセットのプロモーターの制御下にある必要がある。従って、選択マーカーの転写は、細菌カセットプロモーターの制御下にあるので、停止される必要がある。
【０１２１】
転写ターミネーターの核酸配列は、優先的に選択可能マーカーをコードする遺伝子に隣接したファージディスプレイベクターに配置される。
【０１２２】
もう一つの態様では、本発明の細菌カセットは、複製源を含んでなる核酸配列を含んでなる。この複製源は、形質転換の後、細菌宿主でベクターを複製することができる。
【０１２３】
非制限的例としては、配列番号４、８および１５０の配列の細菌カセットからなる群から選択される細菌カセットを挙げることができる。
【０１２４】
もう一つの好ましい態様によれば、本発明は、本明細書ではｐＰＬ１２と呼ばれ、配列番号１の核酸配列を含んでなる最小化ファージディスプレイベクターを説明する。
【０１２５】
もう一つの好ましい態様によれば、本発明は、本明細書ではｐＰＬ１４と呼ばれ、配列番号５の核酸配列を含んでなる最小化ファージディスプレイベクターを説明する。
【０１２６】
もう一つの好ましい態様によれば、本発明は、本明細書ではｐＰＬ２２と呼ばれ、配列番号７の核酸配列を含んでなる最小化ファージディスプレイベクターを説明する。
【０１２７】
もう一つの好ましい態様によれば、本発明は、本明細書ではｐＰＬ３１と呼ばれ、配列番号１４８の核酸配列を含んでなる最小化ファージディスプレイベクターを説明する。
【０１２８】
本発明のもう一つの態様は、本発明による最小化ファージディスプレイベクターのライブラリーを工学処理する方法であって、
ａ）本発明の最小化ファージディスプレイベクターに結合タンパク質をコードする核酸配列を挿入し、
ｂ）宿主細胞を前記最小化ファージディスプレイベクターで形質転換する
段階を含んでなることを特徴とする、前記方法である。
【０１２９】
「ファージディスプレイベクターのライブラリー」は本発明によるベクターの集合、または前記ベクターを含む宿主細胞であって、前記ベクターのそれぞれは、ベクター毎に異なる結合タンパク質をコードする配列を含んでなる。
【０１３０】
「宿主細胞」は、発現ベクター上に配置されている目的とする遺伝子の発現に用いられる生物である。前記ベクターは、それ自身で複製することができるが、複製、転写および翻訳のような種々の生物学的反応のための宿主の生物学的材料を必要とする。従って、宿主細胞は、本発明のファージディスプレイベクターがファージゲノム相補性によって結合分子をその表面に発現させるファージのライブラリーを複製および産生する細胞である。
【０１３１】
本発明のファージディスプレイベクターのライブラリーを工学処理する前記方法の段階ａ）は、制限消化、相同組換えまたはＬｉｇａｔｉｏｎ ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｃｌｏｎｉｎｇ法のような当該技術分野で知られている手法で行うことができる。
【０１３２】
前記方法の段階ｂ）は、非制限的例として、化学または熱ショック形質転換によって、または好ましい態様では、電気穿孔によって行うことができる。
【０１３３】
本発明のもう一つの態様は、上記のようにファージの前記ライブラリーの工学処理の方法から得た最小化ファージディスプレイベクターから構成されるライブラリーである。
【０１３４】
好ましい態様では、段階ｂ）の宿主細胞は、大腸菌株ＴＧ１、ＸＬ１−Ｂｌｕｅ、ＸＬ１−Ｂｌｕｅ ＭＲＦ’、Ｋ１２ ＥＲ２７３８細胞からなる群から選択することができる。
【０１３５】
本発明の好ましい実現では、宿主細胞は大腸菌ＴＧ１である。
【０１３６】
本発明のもう一つの態様は、最小化ファージのライブラリーの産生方法であって、前記方法は、前記ベクターのライブラリーを工学処理する２段階と、バクテリオファージタンパク質Ｉ〜ＸＩの相補性によるファージ−結合タンパク質複合体の複製、カプセル化および分泌の追加段階ｃ）とを含んでなる。
【０１３７】
「ファージのライブラリー」は、ファージの集合であって、それぞれがその表面にファージ毎に異なる結合タンパク質を発現させるものである。従って、ファージのライブラリーは、目的とする結合タンパク質を、結合パートナーを用いてスクリーニングすることに使用できる。ファージ、その表面で発現した結合タンパク質および前記結合パートナーの間で複合体を形成することによって、どのファージが目的とする結合タンパク質を発現させるかについて決定することができるようになる。複合体を選択した後、ベクター上の配列を分析して、目的とする結合タンパク質をコードする正確な配列を得る。
【０１３８】
段階ｃ）の相補性は、Ｍ１３ＫＯ７、Ｒ４０８、ＶＣＳＭ１３のような複製およびパッケージングに無能なヘルパーファージの添加によって、またはファージミドベクターの複製および分泌を補足するのに必要なファージタンパク質を発現させることができる宿主細胞の段階ｂ）の形質転換によって達成することができる。
【０１３９】
本発明のもう一つの態様は、上記のようにファージの前記ライブラリーの産生方法から得られるファージから構成されるライブラリーである。
【０１４０】
本発明の更にもう一つの態様は、上記のようにファージのライブラリーの産生方法から得られるファージであって、目的とする結合タンパク質をその表面上に発現させる、前記ファージである。
【０１４１】
本発明は、結合パートナーに特異的な目的とする結合タンパク質のスクリーニングの方法に関するものであって、
ａ）結合パートナーを本発明によるファージのライブラリーと接触させ、
ｂ）目的とする結合タンパク質および結合パートナーによって形成された複合体を選択し、
ｃ）前記の目的とする結合タンパク質をコードする配列をベクターから抽出し、および
ｄ）目的とする結合タンパク質を産生する
段階を含んでなる、方法にも関する。
【０１４２】
結合パートナーは、抗体が選択的に結合することができる合成または天然の分子またはタンパク質である。結合パートナーは、ポリペプチド、多糖類、炭水化物、核酸、脂質、ハプテン、または他の天然に存在するまたは合成化合物であってもよい。
【０１４３】
前記の結合タンパク質をスクリーニングする方法の段階ａ）は、前記結合タンパク質を表面上で発現させるファージのライブラリーに結合パートナーを接触させることによって行うことができる。結合パートナーは、細胞の表面で自然に発現させることができるか、または固定されるもしくは溶液中にいることができる。
【０１４４】
結合タンパク質と結合パートナーによって形成される複合体の選択の段階ｂ）は、非制限的例として、ｐＨ、温度、溶媒、塩濃度、関連する結合パートナーに対する交差反応性および低濃度の利用可能な結合パートナーへの結合によって決定される親和性などの選択基準を用いて行うことができる。所望な条件で結合パートナーに結合タンパク質を保持しない結合複合体は除かれる。
【０１４５】
選択した結合タンパク質をコードする配列の抽出の段階ｃ）は、非制限的例として、宿主細胞の選択したファージ−結合タンパク質複合体による再感染、細胞増殖および選択した結合タンパク質をコードするベクターＤＮＡの回収によって行うことができる。
【０１４６】
選択した結合タンパク質の産生の段階ｄ）は、非制限的例として、ベクターの非サプレッサー細菌宿主細胞への形質転換によって行うことができる。アンバー終止コドンＴＡＧは、このようにして終止コドンとして認識され、結合タンパク質は、可溶性残基として発現する。もう一つの態様では、結合タンパク質の代替発現系への選択的クローニングによって達成することができる。
【０１４７】
本発明は、ベクターのライブラリーを生成するための本発明の最小化ファージディスプレイベクターの使用であって、好ましくは、
ａ）結合タンパク質をコードする核酸配列を本発明の最小化ファージディスプレイベクターに挿入し、
ｂ）宿主細胞を前記ファージディスプレイベクターで形質転換する
段階を含んでなる、使用も包含する。
【０１４８】
本発明は、ファージのライブラリーを生成するための本発明の最小化ファージディスプレイベクターの使用であって、好ましくは、
ａ）結合タンパク質をコードする核酸配列を本発明の最小化ファージディスプレイベクターに挿入し、
ｂ）宿主細胞を前記ファージディスプレイベクターで形質転換し、および
ｃ）バクテリオファージタンパク質Ｉ〜ＸＩの相補性によるファージ−結合タンパク質複合体の複製、カプセル化および分泌の段階
の段階を含んでなる、使用も包含する。
【０１４９】
本発明は、結合パートナーに特異的な結合タンパク質のスクリーニングのための最小化ファージディスプレイベクターの使用を扱うものであって、好ましくは、
ａ）前記結合パートナーを本発明によるファージのライブラリーと接触させ、
ｂ）結合タンパク質と結合パートナーとによって形成した複合体を選択し、
ｃ）前記結合タンパク質をコードする核酸配列を最小化ファージディスプレイベクターから抽出し、および
ｄ）結合タンパク質を産生する
段階を含んでなる、使用である。
【０１５０】
本発明は、また本発明の最小化ファージディスプレイベクターと、特異的プライマーと、サプレッサー細胞株とを少なくとも含むキットを含んでなる。
【０１５１】
「サプレッサー細胞株」とは、終止コドンを認識しアミノ酸をその代わりに挿入するトランスファーＲＮＡを含んでなる細菌株を表すことを目的とする。
【０１５２】
このようなサプレッサー細胞株の非制限的で好ましい例としては、サプレッサー細胞株ＴＧ１、ＸＬ１−ｂｌｕｅ、ＥＲ２７３８、ＥＲ２２６７およびＨＢ１０１を挙げることができる。
【０１５３】
本発明の最も好ましい態様では、キットの特異的プライマーは、配列番号９〜８５の核酸プライマーからなる群から選択される。
【０１５４】
本発明の他の特徴および利点は、実施例および凡例が下記に示されている図の説明において更に明らかになる。
【図面の簡単な説明】
【０１５５】
【図１】明らかなドメイン内ループを有する免疫グロブリン構造。
【図２】それぞれ２７および８７位に、明らかに、２つのシステイン残基を有するヒトカッパ軽鎖の定常ドメインアミノ酸配列。
【図３】それぞれ２７および８６位に、明らかに、２つのシステイン残基を有するヒトラムダ軽鎖の定常ドメインのアミノ酸配列。
【図４】それぞれ２６および８２位に、明らかに２つのシステイン残基を有するガンマ重鎖のヒト定常ドメインＣＨ１のアミノ酸配列。
【図５】ｐＰＬ１２ベクター。
【図６】ｐＰＬ１４ベクター。
【図７】ｐＰＬ２２ベクター。
【図８】大腸菌株ＴＯＰ１０の形質転換効率（ｃｆｕ／ｍｌ）。
【図９】大腸菌株ＴＯＰ１０の形質転換効率（ｃｆｕ／μｇＤＮＡ）。
【図１０】ｐＰＬ１２およびｐＣＡＮＴＡＢの間の一本鎖抗体ファージ産生に対するＩＰＴＧ誘導の効果。
【図１１】産生されたファージ／ｍｌとベクターサイズとの関係。
【図１２】ベクターｐＰＬ１２およびｐＰＬ１４を用いて形質転換し、ヘルパーファージＭ１３ＫＯ７に感染させた大腸菌株ＴＧ１からのファージ産生の比較。
【図１３】ｐＰＬ２０ベクター。
【図１４】ｐＰＬ３１ベクター。
【実施例】
【０１５６】
例１：ベクター構築
ベクターｐＰＬ１２（図５）の構築は、関連する制限酵素を用いる核酸の制限消化後の合成ＤＮＡとＰＣＲ産物との集合、および消化産物のライゲーションによって行った。
【０１５７】
Ｌａｃプロモーター、ｐｅｌＢシグナルペプチド、クローニング部位、連結ペプチド、ヒトカッパ２定常ドメイン、６ヒスチジンタグおよびアンバー終止コドンを含んでなるクローニングカセットは、Ｇｅｎｅａｒｔ ＡＧ（レーゲンスブルク，ドイツ）によって合成された。Ｈｉｎｄ ＩＩＩ制限部位を、ベクター構築を促進するため５’末端に包含した。クローニングカセットを、バクテリオファージＭ１３ｇｅｎｅＩＩＩタンパク質のＣ末端ドメインと融合して合成し、コドン配列を大腸菌宿主での発現のためにＧｅｎｅａｒｔ ＡＧにより最適化した。ＥｃｏＲ Ｉ制限部位を、合成中に終止コドンに続いてバクテリオファージＭ１３ｇｅｎｅＩＩＩタンパク質のＣ末端ドメインの３’末端に導入した。合成したＤＮＡ断片は、１０３２ｂｐ断片からなり、末端にＨｉｎｄ ＩＩＩおよびＥｃｏＲ Ｉ制限部位を有した。この断片のＨｉｎｄ ＩＩＩおよびＥｃｏＲ Ｉによる制限消化により、１０２６ｂｐの生成物を得た。
【０１５８】
ファージディスプレイカセットの残りの部分を、オリゴヌクレオチドプライマーＭ１３ｏｒｉＰＳＡｐａＩおよびＭ１３ｏｒｉＰＳＥｃｏＲＩを用いてファージディスプレイベクターｐＣＡＮＴＡＢ５Ｅ（Ａｍｅｒｓｈａｍ ｌｉｆｅｓｃｉｅｎｃｅｓ）からＰＣＲによって増幅した。
【０１５９】
Ｍ１３ｏｒｉＰＳＡｐａＩ：
５’−ＧＧＧＣＣＣＡＣＧＣＧＣＣＣＴＧＴＡＧＣＧＧＣＧＣＡＴＴＡＡＧ−３’ （配列番号８６）
Ｍ１３ｏｒｉＰＳＥｃｏＲＩ：
５’−ＧＡＡＴＴＣＣＣＧＡＡＡＴＣＧＧＣＡＡＡＡＴＣＣＣＴ−３’ （配列番号８７）
【０１６０】
生成するＰＣＲ産物は、末端にＥｃｏＲ ＩおよびＡｐａ Ｉ制限部位を有する３９３ｂｐ断片であった。この断片をＥｃｏＲ ＩおよびＡｐａ Ｉにより制限消化を行い、３９１ｂｐの産物を得た。
【０１６１】
細菌カセットを、オリゴヌクレオチドプライマーＢｌａＰｒｏＡｐａＩおよびｐＵＣＯｒｉＨｉｎｄＩＩＩを用いてクローニングベクターｐＵＣ１９からＰＣＲによって増幅した。
【０１６２】
ＢｌａＰｒｏＡｐａＩ： ５’−ＧＧＧＣＣＣＡＣＴＴＴＴＣＧＧＧＧＡＡＡＴＧＴＧＣ−３’ （配列番号８８）
ｐＵＣＯｒｉＨｉｎｄＩＩＩ： ５’−ＡＡＧＣＴＴＡＴＣＡＧＧＧＧＡＴＡＡＣＧＣＡＧＧ−３’ （配列番号８９）
【０１６３】
生成するＰＣＲ産物は、末端にＡｐａ ＩおよびＨｉｎｄ ＩＩＩ制限部位を有する１８３５ｂｐ断片であった。この断片をＡｐａ ＩおよびＨｉｎｄ ＩＩＩにより制限消化を行い、１８２９ｂｐの産物を得た。
【０１６４】
３個のＤＮＡ断片１０２６ｂｐ、３９１ｂｐおよび１８２９ｂｐを互いに連結し、適合性突出末端によって配向を確かめ、クローニングカセット（配列番号２）、ファージディスプレイカセット（配列番号３）および細菌カセット（配列番号４）を含んでなる３２４６ｂｐのベクターｐＰＬ１２を生成した。
【０１６５】
ライゲーション産物を、熱ショック形質転換によって大腸菌細胞に形質転換した。生成する正の形質転換体（アンピシリンの存在に耐性）を選択し、プラスミド配列を標準的ＤＮＡシークエンシング法によって確かめた。
【０１６６】
ベクターｐＰＬ１４を、オリゴヌクレオチドプライマーＭ１３ｏｒｉ１ＱｃＳおよびＭ１３ｏｒｉ１ＱｃＡＳ、並びにＭ１３ｏｒｉ２ＱｃＳおよびＭ１３ｏｒｉ２ＱｃＡＳを用いてベクターｐＰＬ１２の部位特定突然変異誘発によって生成した。プライマーカップルＭ１３ｏｒｉ１ＱｃＳおよびＭ１３ｏｒｉ１ＱｃＡＳは、Ａ＞Ｇ突然変異を導入して、ファージディスプレイカセット（配列番号６）の７８４ｂｐ位におけるＭ１３パッケージングシグナルにＭ１３野生型配列を再生する。プライマーカップルＭ１３ｏｒｉ２ＱｃＳおよびＭ１３ｏｒｉ２ＱｃＡＳは、Ａ＞Ｇ突然変異を導入して、ファージディスプレイカセット（配列番号６）の５２９ｂｐ位におけるＭ１３複製源にＭ１３野生型配列を再生する。
【０１６７】
Ｍ１３ｏｒｉ１ＱｃＳ ＣＴＴＧＣＣＡＧＣＧＣＣＣＴＡＧＣＧＣＣＣＧＣＴＣＣ （配列番号１３９）
Ｍ１３ｏｒｉ１ＱｃＡＳ ＣＴＡＧＧＧＣＧＣＴＧＧＣＡＡＧＴＧＴＡＧＣ （配列番号１４０）
Ｍ１３ｏｒｉ２ＱｃＳ ＣＡＡＣＡＣＴＣＡＡＣＣＣＴＡＴＣＴＣＧ （配列番号１４１）
Ｍ１３ｏｒｉ２ＱｃＡＳ ＡＧＧＧＴＴＧＡＧＴＧＴＴＧＴＴＣＣ （配列番号１４２）
【０１６８】
位置特定突然変異誘発は、ベクターｐＰＬ１２ ５０ｎｇを、それぞれ１０μＭの濃度の第一のＭ１３ｏｒｉ１ＱｃＳおよびＭ１３ｏｒｉ１ＱｃＡＳと、それぞれ１０ｍＭのｄＮＴＰ混合物２μｌ、Ｐｆｕ ｕｌｔｒａ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）用１０ｘ濃縮反応緩衝液５μｌとインキュベーションすることによって行い、反応はＨ２Ｏで５０μｌにした。反応混合物を９４°Ｃで３０秒間変性した後、１２サイクルの増幅を９４°Ｃで３０秒間に続いて５５°Ｃで３０秒間および９８°Ｃで３分間行った。反応後、親プラスミドを制限エンドヌクレアーゼＤｐｎ Ｉで処理することによって除去した。消化産物を、熱ショック形質転換によって大腸菌細胞に形質転換した。生成する正の形質転換体（アンピシリンの存在に耐性）を選択し、プラスミド配列を標準的ＤＮＡシークエンシング法によって確かめた。同じ手続きを、正のクローンについてプライマーカップルＭ１３ｏｒｉ２ＱｃＳおよびＭ１３ｏｒｉ２ＱｃＡＳを用いて行い、第二の突然変異を導入した。生成する正の形質転換体（アンピシリンの存在に耐性）を選択し、プラスミド配列を標準的ＤＮＡシークエンシング法によって確かめ、ベクターｐＰＬ１４を得た。
【０１６９】
ベクターｐＰＬ２２を、細菌カセットにおいて余分なヌクレオチド配列を除外した産物を生成するプライマーを用いてｐＰＬ１４のＰＣＲ増幅によって生成した。プライマーｐＰＬ１２ＳｅｎｓｅＡｐａＩおよびｐＰＬ１２ＡｐａＩＡＳを用いるＰＣＲ増幅は、制限エンドヌクレアーゼＡｐａ Ｉで処理すると、再連結（ｒｅｌｉｇａｔｅ）してファージディスプレイカセットと細菌カセットの間に５３ｂｐを欠いている産物を生成するＰＣＲ産物を生じた。ライゲーション産物を、熱ショック形質転換によって大腸菌細胞に形質転換した。生成する正の形質転換体を選択し、プラスミド配列を標準的ＤＮＡシークエンシング法によって確かめた。この材料を、プライマーＳｅｑ１ｓおよびｐＰＬ１２ＨｉｎｄＩＩＩＡＳを用いるＰＣＲ増幅の鋳型として用い、生成するＰＣＲ産物を制限エンドヌクレアーゼＨｉｎｄ ＩＩＩで処理し、再連結した。生成する再連結産物は、細菌カセットとクローニングカセットの間に８４ｂｐを欠いていた。ライゲーション産物を、熱ショック形質転換によって大腸菌細胞に形質転換した。生成する正の形質転換体を選択し、プラスミド配列を標準的ＤＮＡシークエンシング法によって確かめ、ｐＰＬ１２または１４に１３４ｂｐ未満の細菌カセット（配列番号４）を含む新規な細菌カセット（配列番号８）を含んでなる３１０９ｂｐのベクターｐＰＬ２２（配列番号７）を生成した。
【０１７０】
ｐＰＬ１２ＳｅｎｓｅＡｐａＩ
ＧＣＡＴＧＧＧＣＣＣＴＴＣＡＡＡＴＡＴＧＴＡＴＣＣＧＣＴＣＡ（配列番号１４３）
ｐＰＬ１２ＡｐａＩＡＳ
ＧＣＧＣＡＣＡＴＴＴＣＣＣＣＧＡＡＡＡＧ（配列番号１４４）
Ｓｅｑ１ｓ
ＴＴＴＧＣＴＧＧＣＣＴＴＴＴＧＣＴＣＡＣ（配列番号１４５）
ｐＰＬ１２ＨｉｎｄＩＩＩＡＳ
ＧＣＡＴＡＡＧＣＴＴＴＴＴＣＣＡＴＡＧＧＣＴＣＣＧＣＣＣＣＣＣＴＧＡＣ（配列番号１４６）
【０１７１】
例２：ライブラリー生成
結合分子のライブラリーは、下記の方法で生成させることができる。
【０１７２】
ＲＮＡを、適当な宿主、理想的にはヒトリンパ球から抽出する。次いで、所望な結合パートナーをコードするｍＲＮＡを、所望な結合分子の画定した定常領域に相補的なアンチセンスオリゴヌクレオチドを用いてｃＤＮＡに再転写する。
【０１７３】
次いで、所望な結合分子の可変領域を、前記可変領域の５’および３’末端に相補的なセンスおよびアンチセンスオリゴヌクレオチドのパネルを用いるＰＣＲによって増幅する。センスおよびアンチセンスオリゴヌクレオチドは、前記の増幅した可変ドメインの次のクローニングのための特異的制限部位を組込む。適当な制限酵素を用いて増幅した可変ドメインを制限消化した後、生成するＤＮＡ断片を本発明のベクターに連結した後、適合する制限酵素で制限消化することができる。生成した適合性制限部位突出末端により、結合分子の本発明のベクターへの特定クローニングが促進される。本発明のベクターと少なくとも１個の結合分子である生成するライゲーション産物を、次に適当な細菌宿主に形質転換する。
【０１７４】
ＲＮＡ抽出は、好ましくは単離したＢリンパ球で行われるが、同様に単離した単核細胞またはヒト血液から得た細胞の赤血球以外の全細胞個体群（ｔｏｔａｌ ｎｏｎ ｒｅｄ ｂｌｏｏｄ ｃｅｌｌ ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ）で行うこともできる。１００００００個の単離した単核細胞の使用に続いてＲＮｅａｓｙ ｍｉｎｉｐｒｅｐ（ＱＩＡＧＥＮ ＧｍｂＨ）により全ＲＮＡを抽出することにより、ライブラリーの生成に十分なＲＮＡが生成される。
【０１７５】
全ＲＮＡの単離後、ｃＤＮＡ合成をＳｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ ＩＩＩ 逆転写酵素を用いて行うが、他の逆転写酵素を用いることもできる。単離した全ＲＮＡ２μｇを、第一のｓｔｒａｎｄ ｃＤＮＡ合成プライマー（配列番号９、１０および１１）２ｐｍｏｌおよびそれぞれ１０ｍＭの濃度のｄＮＴＰ１μｌと混合し、反応容積を１３μｌとした。
【０１７６】
ＨｕＣｇ ５’−ＴＴＧＡＣＣＡＧＧＣＡＧＣＣＣＡＧＧ−３’ （配列番号９）
ＨｕＣｋ ５’−ＧＧＡＡＧＡＴＧＡＡＧＡＣＡＧＡＴＧＧ−３’ （配列番号１０）
ＨｕＣｌ ５’−ＡＣＧＧＴＧＣＴＣＣＣＴＴＣＡＴＧＣ−３’ （配列番号１１）
【０１７７】
生成する混合物を６５°Ｃに５分間加熱した後、氷冷してオリゴヌクレオチドをＲＮＡ鋳型にアニーリングする。冷却後、５ｘＦｉｒｓｔ−Ｓｔｒａｎｄ Ｂｕｆｆｅｒ（２５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．３、室温）、３７５ｍＭ ＫＣｌ、１５ｍＭ ＭｇＣｌ２）４μｌ、０．１Ｍ ＤＴＴ １μｌ、ＲＮａｓｅＯＵＴ（商標）１μｌ、ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ（商標）ＩＩＩ ＲＴ（２００単位／μｌ）１μｌを加え、反応を５５°Ｃで１時間インキュベーションする。反応混合物を７０°Ｃで１５分間インキュベーションすることによってＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ（商標）酵素を熱不活性化した後、生成するｃＤＮＡを、ライブラリー生成プライマーのパネルを用いる結合分子のＰＣＲによる増幅の鋳型として直接用いることができる。センスおよびアンチセンスオリゴヌクレオチドは、単純な対としてまたは所望な結合分子のセンスまたはアンチセンス配向のいずれか一方または両方を表すプールとして用いられる。免疫グロブリンガンマ鎖可変ドメインの増幅のため、１個または複数のセンスオリゴヌクレオチド（配列番号１２〜３８）を、１個以上のアンチセンスオリゴヌクレオチド（配列番号３９〜４５）と組み合わせて用いる。ＰＣＲ増幅は、Ｐｈｉｒｅ（商標）ＨｏｔＳｔａｒｔＤＮＡポリメラーゼ（Ｆｉｎｎｚｙｍｅｓ）を用いて行われるが、他のＤＮＡポリメラーゼをその代わりに用いることもできる。増幅は、１μｌのｄＮＴＳ（それぞれ１０ｍＭ）、最終濃度がそれぞれ０．５μＭのセンスオリゴヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド、最終濃度がそれぞれ０．５μＭのアンチセンスオリゴヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド、１０μｌ ５ｘＰｈｉｒｅ（商標）Ｒｅａｃｔｉｏｎ緩衝液、０．５〜１μｌ ｃＤＮＡ合成産物および１μｌ Ｐｈｉｒｅ（商標）ＨｏｔＳｔａｒｔＤＮＡポリメラーゼの混合物を調製することによって行われる。増幅は、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ ９７００サーマルサイクラーで、初期変性９８°Ｃｘ３０秒間に続いて９８°Ｃｘ５秒間、６０°Ｃｘ５秒間および７２°Ｃｘ２０秒間を３０サイクル、７２°Ｃで１分間の最終伸長段階のサイクリング条件で行い、反応を４°Ｃに保持した後、−２０°Ｃで保管しまたは利用する。免疫グロブリンカッパまたはラムダ鎖可変ドメインの増幅は、同様に、センスオリゴヌクレオチドをそれぞれ１個以上の選択配列番号４６〜５８または６３〜８０およびアンチセンスオリゴヌクレオチドをそれぞれ配列番号５９〜６２または８１〜８５で置換して行われる。
【０１７８】
その後の制限消化を改良するため、プロテイナーゼＫ（２０ｍｇ／ｍｌ）１μｌをＰＣＲ反応に加え、３７°Ｃで３０分間インキュベーションした後、７０°Ｃで１５分間熱不活性化することができる。この段階では、増幅したＤＮＡの末端に付着したままになって制限消化を妨げることがあるポリメラーゼが効果的に除去される。
【０１７９】
増幅後、可変ドメインを制限酵素の組み合わせで処理し、本発明のベクターへの特異的クローニングを促進する。カッパおよびラムダ可変ドメインおよび本発明のベクターの調製物を、制限エンドヌクレアーゼＳａｌ ＩおよびＭｌｕ Ｉで消化する。制限消化したＤＮＡを、ゲル電気泳動によって望ましくないＤＮＡ断片から精製し、Ｎｕｃｌｅｏｓｐｉｎ Ｅｘｔｒａｃｔ ＩＩ（Ｍａｃｈｅｒｙ Ｎａｇｅｌ）により所望なＤＮＡ断片を単離する。次いで、生成する精製ＤＮＡを連結して、本発明のベクターにおけるカッパまたはラムダ可変ドメインを生成する。次いで、生成するライゲーション産物を、熱ショック形質転換によってコンピテント大腸菌ＴＯＰ１０細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に形質転換する。熱ショックの後、細胞を１００μｇ／ｍｌアンピシリンを含む選択寒天プレートに播種し、組換えベクターを含む細胞だけが生き残るようにする。形質転換細胞は免疫グロブリンカッパまたはラムダ可変ドメインライブラリーを表し、クローニングした可変ドメインに先行する本発明のベクターに終止コドンが存在すると、タンパク質発現を防止し、ベクターが保持される。
【０１８０】
形質転換細胞を選択寒天プレートから回収し、カッパまたはラムダ可変ドメインライブラリーＤＮＡを標準的プラスミド精製手法によって回収する。
【０１８１】
本発明のベクターに存在する免疫グロブリンガンマ鎖可変ドメインおよびカッパまたはラムダ軽鎖可変ドメインライブラリーを、このオリゴヌクレオチドで増幅したラムダ可変ドメインをコードする生殖細胞系にＮｃｏ Ｉ制限部位の存在が同定されているためＳｆｉ ＩおよびＭｆｅ Ｉで制限消化されるＨｕＶＬ９（配列番号７１）で生成したラムダ可変ドメインライブラリーを除き、制限エンドヌクレアーゼＮｃｏ ＩおよびＭｆｅ Ｉで制限消化する。制限消化したＤＮＡを、ゲル電気泳動により望ましくないＤＮＡ断片から精製し、Ｎｕｃｌｅｏｓｐｉｎ Ｅｘｔｒａｃｔ ＩＩ（Ｍａｃｈｅｒｙ Ｎａｇｅｌ）により所望なＤＮＡ断片を単離する。次いで、生成する精製ＤＮＡを連結して、本発明のベクターにおけるガンマまたはカッパまたはラムダ可変ドメインのライブラリーを生成する。次いで、生成するライゲーション産物を、電気穿孔によってコンピテント大腸菌ＸＬ１−Ｂｌｕｅ、ＸＬ１−Ｂｌｕｅ ＭＦＲ’またはＴＧ１スーパーコンピテントセル（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）に形質転換し、形質転換体の最大数を確保し、これが次に生成ライブラリーに存在する様々な結合分子を指示する。多重ライゲーションおよび形質転換を行って、生成する結合分子ライブラリーの多様性を増加させることができる。
【０１８２】
生成する形質転換体は、Ｍ１３ＫＯ７（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）のようなヘルパーファージの添加によって結合分子のライブラリーを提示するファージ粒子を生成させることができ、または２０％グリセロール（ｖ／ｖ）およびグルコースを添加して最終濃度を５％（ｖ／ｖ）とすることによって−８０°Ｃで保管することができる。
【０１８３】
例３：最適化ファージディスプレイベクターの形質転換効率の改良
細菌宿主形質転換効率に対するベクターサイズの減少効果を検討するため、大腸菌ＴＯＰ１０熱ショックコンピテントセルの試験形質転換を行った。同数の細胞を、０．５〜１０ｆｍｏｌｅｓのベクターＤＮＡコピーの範囲で形質転換した。同じＤＮＡ濃度の形質転換では、形質転換されるより小さなベクターが有意に多数のコピーを生成するので、特定数の形質転換したベクター分子を形質転換効率のより正確な表現と考えた。本発明者らのこの考え方は、本発明に記載のベクターに著しく役立つものである。
【０１８４】
細胞を、氷上で０．５、１、２または１０ｆｍｏｌｅｓのｐＰＬ１２またはｐＣＡＮＴＡＢのいずれかと共に３０分間インキュベーションした。４２°Ｃの熱ショックを、正確に４５秒間加えた。次いで、細胞を更に２分間氷上で冷却した。その後、細胞を回収培地でインキュベーションした後、選択寒天プレートで培養した。３７°Ｃで一晩インキュベーションした後、コロニー数を評価した。
【０１８５】
熱ショックによる大腸菌ＴＯＰ１０細胞の形質転換効率は、ｐＰＬ１２ １０ｆｍｏｌｅｓの形質転換が、形質転換細胞１ｍｌ当たりでは、ｐＣＡＮＴＡＢの４．５倍を上回る形質転換体を生じることを示した（図８）。
【０１８６】
形質転換したＤＮＡ１μｇ当たりの形質転換効率は一般的表現であり、それ自体が比較のために測定された。ベクターｐＰＬ１２またはｐＣＡＮＴＡＢのＤＮＡ １μｇ当たりの形質転換効率は、ＤＮＡ濃度が０．５〜１０ｆｍｏｌｅｓで増加するにつれて減少する。ＤＮＡ １μｇ当たりの最高形質転換効率は、最低ＤＮＡ濃度（０．５ｆｍｏｌｅｓ）で達成され、この条件では、ｐＰＬ１２は、ｐＣＡＮＴＡＢの４．５倍を上回るコロニー形成単位（ｃｆｕ）を得た（図９）。
【０１８７】
例４：ファージ粒子への結合ドメイン融合の調節
ファージ粒子に融合した結合ドメインのバックグラウンド発現の程度を決定するため、癌遺伝子ｃＭＥＴに対する抗体の重および軽鎖可変ドメインをｐＰＬ１２およびｐＣＡＮＴＡＢのクローニングカセットでシス型にクローニングした。生成する融合タンパク質は、ｐＰＬ１２ではＭ１３プロテイン３のＣ末端ドメインに融合したｓｃＦｖ−Ｆｃであり、ｐＣＡＮＴＡＢの場合にはバクテリオファージＭ１３コンプリート・プロテイン（ｃｏｍｐｌｅｔｅ ｐｒｏｔｅｉｎ）３に融合したｓｃＦｖであった。
【０１８８】
関連するベクターを含む大腸菌ＴＧ１細胞を、中間対数期まで選択増殖培地でインキュベーションし（ＯＤ６００ｎｍ ０．６）、この時点でヘルパーファージＭ１３ＫＯ７を２０：１の感染多重度で培養物に加えた。ｌａｃプロモーターを、０、１０または１００ｎＭの濃度の擬似アロラクトースであるイソプロピルβ−Ｄ−１−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）を添加することによって誘導した。３０°Ｃで一晩インキュベーションした後、産生したファージを沈澱によって精製し、リン酸緩衝食塩水（ｐＨ７．４）で回収した。次いで、得られたファージを、飽和ポリエチレン９６ウェルプレートに固定した固定化ｃＭＥＴ分子に０．７μｇ／ｍｌの濃度でタイトレーションした。十分に洗浄した後、プロテイン３の全部（ｐＣＡＮＴＡＢ）または部分（ｐＰＬ１２）に融合した機能的結合ドメインを介して保持されているファージを、ファージコートタンパク質のプロテイン８に特異的な抗体であって、比色検出を促進するため西洋ワサビペルオキシダーゼ標識した抗体によって検出した。
【０１８９】
ＩＰＴＧの非存在下では、ｐＰＬ１２は、ｐＣＡＮＴＡＢによって発現したクローンの３．５分の１の結合シグナルを示し（図１０）、ｐＣＡＮＴＡＢによって抑制されない発現のレベルが高くなることを示している。結合ドメイン−プロテイン３融合体の１０または１００ｎＭのＩＰＴＧによる誘導は、２つの発現ベクターからの適合する結合シグナルを生じ、ｐＰＬ１２ベクターからの一層緊密に制御されているが高誘導性なタンパク質発現を示している。ベース発現が低くなれば、ライブラリー個体群において一層毒性の高いクローンの保持が促進されるので、好ましい。
【０１９０】
例５：ベクターサイズに関するファージ産生
感染した大腸菌宿主細胞からのファージの産生に対するベクターサイズの効果を、共に３２４６ｂｐのベクターｐＰＬ１２およびｐＰＬ１４、４５２２ｂｐのｐＣＡＮＴＡＢならびに４７２８ｂｐのｐＰＬ２の比較によって評価した。ベクターｐＰＬ１２およびｐＰＬ１４は、ファージディスプレイカセットの２個のヌクレオチド位置だけが異なっており、ｐＰＬ２は完全長のＭ１３プロテイン３ならびに野生型Ｍ１３源または複製およびパッケージングシグナルを含むが、抗体の定常ドメインを欠いている。
【０１９１】
それぞれのベクターで形質転換した大腸菌ＴＧ１細胞を、選択増殖培地で中間対数期まで増殖させ（ＯＤ６００ｎｍ ０．６）、ヘルパーファージＭ１３ＫＯ７を２０：１の感染多重度で感染させた。一晩増殖した後、産生したファージを沈澱によって増殖培地から回収し、次いでタイトレーションを行い、中間対数期の大腸菌ＴＧ１細胞に感染させた。感染細胞を選択増殖培地に播種し、コロニー形成単位（ファージに感染し、選択的増殖マーカーを発現する細胞）を計数した。ベクターサイズが増加すると、得られたコロニー形成単位の数が増加し、ファージ産生レベルが低くなることが観察された（図１１）。
【０１９２】
いずれも３２４６ｂｐを含んでなる試験した最小ベクターｐＰＬ１２およびｐＰＬ１４は、サイズが４５２２ｂｐであり５．７５ｘ１０１２のコロニー形成単位を産生したｐＣＡＮＴＡＢと比較して、９ｘ１０１２を産生した。産生したコロニー形成単位の差は、ベクターサイズの差にかなり匹敵し、ｐＣＡＮＴＡＢは、ファージ産生が１．５分の１であるｐＰＬ１２の１．４倍も多い。
【０１９３】
例６：ファージディスプレイカセットでの野生型または突然変異体残基の評価
ｐＰＬ１２のファージディスプレイカセットの複製およびパッケージングシグナルのＭ１３源における突然変異体または野生型残基の影響を、ファージディスプレイカセットに野生型残基を含むこと以外、ｐＰＬ１２と同一のベクターｐＰＬ１４と比較することにより評価した。
【０１９４】
ベクターｐＰＬ１２およびｐＰＬ１４で形質転換した大腸菌ＴＧ１細胞を、選択増殖培地で中間対数期（ＯＤ６００ｎｍ ０．６）まで増殖させ、ヘルパーファージＭ１３ＫＯ７を２０：１の感染多重度で感染させた。一晩増殖した後、産生したファージを沈澱によって増殖培地から回収し、次いでタイトレーションを行い、中間対数期の大腸菌ＴＧ１細胞を感染させた。感染細胞を、ベクターを含む細胞を選択するための抗生物質アンピシリン（１００μｇ／ｍｌ）、またはパッケージングしたヘルパーファージＭ１３ＫＯ７に感染した細胞を選択するためのカナマイシン（２５μｇ／ｍｌ）のいずれかを含む選択増殖培地で培養した。アンピシリン耐性を有するファージに感染することによって産生したコロニー形成単位の数を計数し（棒グラフ）、産生したヘルパーファージのコンタミネーションの割合をこの値の割合（三角）として表した（図１２）。
【０１９５】
ベクターｐＰＬ１２は、ｐＰＬ１４の２倍以上のファージ粒子を産生し、ヘルパーファージのコンタミネーション数の半分を含んでいた（ｐＰＬ１４の１．４％に対して０．７％）。ｐＰＬ１２ファージディスプレイカセットのＭ１３源およびパッケージングシグナルにおける非野生型ヌクレオチドは、ｐＰＬ１４に対する差のみであり、ファージ産生の増加およびヘルパーファージゲノムのカプセル化の減少を説明している。
【０１９６】
例７：減少サイズベクターの限界
ベクターｐＰＬ１２のサイズを更に減少させるため、細菌カセットの要素をＰＣＲによって増幅し、選択マーカー遺伝子ｂｌａＲおよび複製の細菌源に隣接する非コードヌクレオチド領域を除去した。選択マーカー遺伝子ｂｌａＲおよびその構成プロモーター領域を、プライマーｂｌａＲＨｉｎｄＩＩＩ（配列番号１３４）およびｂｌａｒＲＢａｍＨＩ（配列番号１３５）を用いてｐＰＬ１２から増幅し、制限エンドヌクレアーゼＨｉｎｄＩＩＩおよびＢａｍＨＩで制限消化の後、９３３ｂｐ断片を得た。複製ｐＭＢ１の細菌源を、プライマーｐＭＢ１ＢａｍＨＩ（配列番号１３６）およびｐＭＢＡｐａＩ（配列番号１３７）を用いてｐＰＬ１２から増幅し、制限エンドヌクレアーゼＢａｍ ＨＩおよびＡｐａ Ｉによる制限消化の後、５９５ｂｐ断片を得た。制限エンドヌクレアーゼＨｉｎｄ ＩＩＩおよびＡｐａ ＩによるｐＰＬ１２の制限消化により、クローニングおよびファージディスプレイカセットを含む１４１７ｂｐの断片を得た。９３３ｂｐ、５９５ｂｐの２つのＤＮＡ断片のライゲーションにより、１５２８ｂｐの新規な細菌カセット（配列番号１３８）を得た。
【０１９７】
新規な細菌カセットとｐＰＬ１２からの１４１７ｂｐ断片のライゲーションにより、２９４５ｂｐのベクターｐＰＬ２０（配列番号１４７、図１３）を得た。複製の細菌源および選択マーカー遺伝子ｂｌａＲに加える制限部位を、選択マーカーｂｌａＲの構成的発現が挿入された結合パートナーのポリシストロン性の読み（ｐｏｌｙｃｉｓｔｒｏｎｉｃ ｒｅａｄ）を引き起こさないように選択した。ライゲーション産物を、熱ショック形質転換によって大腸菌細胞に形質転換した。多数の場合について行った生成構築物の多数の形質転換では、ライゲーションおよび形質転換により繰り返し数百の正のクローンを生じたベクターｐＰＬ１２、ｐＰＬ１４およびｐＰＬ２２とは対照的に形質転換体が得られなかった。
【０１９８】
変異体ｐＰＬ２０の形質転換体を得ることができなかったことは、限界が、抹消されることがあるベクターの非コード領域に存在することを示している。ｐＰＬ２０とｐＰＬ２２の差は、ｐＰＬ２２の複製の細菌源と選択マーカー遺伝子ｂｌａＲの間の１７０ｂｐの領域であり、これは、ｐＰＬ２０では制限エンドヌクレアーゼＢａｍ ＨＩについての６ｂｐの認識部位によって置換された。
【０１９９】
例８：代替の正の選択マーカー
遺伝子クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ｃａｔＲ）についてのオープンリーディングフレームは、β−ラクタマーゼ遺伝子より２０１ｂｐだけ短い。従って、ベクターｐＰＬ１２のサイズは、β−ラクタマーゼをコードする遺伝子を、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼをコードする遺伝子で置換することによって減少させることができる。
【０２００】
ｃａｔＲ遺伝子を、プライマーｆｗＣＡＴｐＰＬ３０ＦｓｐＩおよびｒｅｖＣＡＴｐＰＬ３０ＡｈｄＩを用いてベクターｐＢｅｌｏＢＡＣ１１（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）からＰＣＲによって増幅した。Ｆｓｐ Ｉ制限部位を、プライマーｆｗＣＡＴｐＰＬ３０ＦｓｐＩ（配列番号１５１）に導入し、Ａｈｄ Ｉ部位をプライマーｒｅｖＣＡＴｐＰＬ３０ＡｈｄＩ（配列番号１５２）に導入した。ベクターｐＰＬ１２を、制限酵素Ｓｓｐ ＩおよびＡｈｄ Ｉで消化した。Ｆｓｐ ＩおよびＳｓｐ Ｉは平滑末端カッターであり、ＰＣＲ産物を特異的にクローニングすることができた。配列を、ｃａｔＲ ＯＲＦのシークエンシングによって明らかにした。ｃａｔＲ遺伝子に含まれるＮｃｏ Ｉ部位を、プライマーＦｗｐＰＬ３０ＮｃｏＩＣＡＴｄｅｌ（配列番号１５３）およびＲｅｖｐＰＬ３０ＮｃｏＩＣＡＴｄｅｌ（配列番号１５４）を用いる部位特異的突然変異誘発によるサイレント突然変異の導入によって除去した。
【０２０１】
生成するベクターｐＰＬ３１（配列番号１４８）を、抗体断片の発現について試験した。ｐＰＬ３１からの発現レベルは、ｐＰＬ１２から検出されたものに匹敵した。
【０２０２】
例９：人工的制限部位の生成
人工的制限部位を、ベクターｐＰＬ３１の構築中に導入した。前記制限部位は、ベクターのセンスおよびアンチセンス鎖の両方に対するニッキング酵素Ｎｔ．ＢｂｖＣＩの２個の認識部位を導入することによって生成した。Ｎｔ．ＢｂｖＣＩ部位を、プライマーＦｗＮｂＢｂｖＣＩ１７Ｎｋａｎ（配列番号１５５）およびＲｅｖＮｂＢｂｖＣＩ１７Ｎｋａｎ（配列番号１５６）を用いる関連性のないＤＮＡ断片のＰＣＲ増幅によってベクターに導入した。ＰＣＲ産物を、ファージディスプレイカセットのＥｃｏ ＲＩ部位にクローニングした。Ｎｔ．ＢｂｖＣＩによる開裂および生成するベクターの再連結により、Ｎｔ．ＢｂｖＣＩ部位を含むＤＮＡ配列ＣＣＴＣＡＧＣＧＴＴＣＡＧＡＧＴＴＡＴＧＧＣＴＧＡＧ（配列番号１５７）を生じた。ベクターを酵素Ｎｔ．ＢｂｖＣＩと共にインキュベーションし、１７ｂｐの一本鎖ＤＮＡオーバーハングを有する反対のＤＮＡ鎖に２個のニックを生じる。人工的制限部位は、シークエンシングによって明らかにした。
【０２０３】
新規な人工的制限部位は、次の単離クローンの操作のためのベクターの高度に特異的な開裂および再閉鎖を容易にする。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
クローニングカセットと、ファージディスプレイカセットと、細菌カセットとを少なくとも含んでなる最小化ファージディスプレイベクターであって、クローニングカセットが、少なくとも抗体の定常ドメインのドメイン内ループに対応する１個のポリペプチドをコードする核酸配列を含んでなり、前記最小化ファージディスプレイベクターのサイズが３３００塩基対以下である、最小化ファージディスプレイベクター。
【請求項２】
前記ポリペプチドが、抗体の重鎖定常ドメインのドメイン内ループに対応する、請求項１に記載の最小化ファージディスプレイベクター。
【請求項３】
前記ポリペプチドが、抗体の重鎖定常ドメインに対応する、請求項１に記載の最小化ファージディスプレイベクター。
【請求項４】
前記抗体の重鎖定常ドメインが、抗体のＣＨ１重鎖定常ドメインである、請求項３に記載の最小化ファージディスプレイベクター。
【請求項５】
前記ポリペプチドが、抗体の軽鎖定常ドメインのドメイン内ループに対応する、請求項１に記載の最小化ファージディスプレイベクター。
【請求項６】
前記ポリペプチドが、抗体の軽鎖定常ドメインに対応する、請求項１に記載の最小化ファージディスプレイベクター。
【請求項７】
前記抗体の軽鎖定常ドメインが、軽鎖カッパ定常ドメインである、請求項６に記載の最小化ファージディスプレイベクター。
【請求項８】
前記軽鎖カッパ定常ドメインのＣ末端システインが欠失している、請求項７に記載の最小化ファージディスプレイベクター。
【請求項９】
前記抗体の軽鎖定常ドメインが軽鎖ラムダ定常ドメインである、請求項６に記載の最小化ファージディスプレイベクター。
【請求項１０】
クローニングカセットが、プロモーターをコードする核酸配列と、シグナルペプチドをコードする核酸配列とを少なくとも含んでなる、請求項１〜９のいずれか一項に記載の最小化ファージディスプレイベクター。
【請求項１１】
前記プロモーターが、Ｌａｃ、Ｔａｃ、Ｔｒｐ、Ｔｅｔ、Ｔ７、ＳＰ６からなる群から選択される、請求項１０に記載の最小化ファージディスプレイベクター。
【請求項１２】
前記シグナルペプチドが、ｐｅｌＢ、ｇｅｎｅＩＩＩ、ｐｈｏＡ、ｍａｌＥ、ｄｓｂＡからなる群から選択される、請求項１０に記載の最小化ファージディスプレイベクター。
【請求項１３】
クローニングカセットが、クローニング部位をコードする一個の核酸配列をさらに含んでなる、請求項１０〜１２のいずれか一項に記載の最小化ファージディスプレイベクター。
【請求項１４】
前記クローニング部位が、少なくとも２つの制限部位を含んでなる、請求項１３に記載の最小化ファージディスプレイベクター。
【請求項１５】
ファージディスプレイカセットが、配列番号１３２または１３３に対応するＭ１３ｇｅｎｅＩＩＩタンパク質のＣ末端ドメインを少なくとも含む核酸配列を含んでなる、請求項１〜１４のいずれか一項に記載の最小化ファージディスプレイベクター。
【請求項１６】
ファージディスプレイカセットが、終止コドンをコードする核酸配列と、ファージの複製源をコードする核酸配列と、カプセル化またはパッケージング配列をコードする核酸配列とをさらに含んでなる、請求項１５に記載の最小化ファージディスプレイベクター。
【請求項１７】
前記終止コドンがアンバー終止コドンである、請求項１６に記載の最小化ファージディスプレイベクター。
【請求項１８】
細菌カセットが、プロモーターをコードする核酸配列と、正の選択マーカーをコードする核酸配列と、複製源をコードする核酸配列とを少なくとも含んでなる、請求項１〜１７のいずれか一項に記載の最小化ファージディスプレイベクター。
【請求項１９】
前記プロモーターがβ−ラクタマーゼプロモーターである、請求項１８に記載の最小化ファージディスプレイベクター。
【請求項２０】
前記の正の選択マーカーがアンピシリンまたはクロラムフェニコール耐性遺伝子である、請求項１８または１９に記載の最小化ファージディスプレイベクター。
【請求項２１】
配列番号１の核酸配列を含んでなるｐＰＬ１２にある、請求項１〜２０のいずれか一項に記載の最小化ファージディスプレイベクター。
【請求項２２】
配列番号５の核酸配列を含んでなるｐＰＬ１４にある、請求項１〜２０のいずれか一項に記載の最小化ファージディスプレイベクター。
【請求項２３】
配列番号７の核酸配列を含んでなるｐＰＬ２２にある、請求項１〜２０のいずれか一項に記載の最小化ファージディスプレイベクター。
【請求項２４】
配列番号１４８の核酸配列を含んでなるｐＰＬ３１にある、請求項１〜２０のいずれか一項に記載の最小化ファージディスプレイベクター。
【請求項２５】
ａ）請求項１〜２４のいずれか一項に記載の最小化ファージディスプレイベクターに結合タンパク質をコードする核酸配列を挿入し、および
ｂ）段階ａ）で得た最小化ファージディスプレイベクターを用いて宿主細胞を形質転換する
段階を含んでなる、最小化ファージディスプレイベクターのライブラリーの遺伝子工学による作成方法。
【請求項２６】
前記宿主細胞が、ＴＧ１、ＸＬ１−Ｂｌｕｅ、ＸＬ１−Ｂｌｕｅ ＭＲＦ’、大腸菌Ｋ１２ ＥＲ２７３８細胞からなる群から選択される、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
請求項１〜２３のいずれか一項に記載のおよび／または請求項２５または２６に記載の方法によって得られる最小化ファージディスプレイベクターから構成されているライブラリー。
【請求項２８】
ａ）請求項２５または２６に記載の最小化ファージディスプレイベクターのライブラリーを遺伝子工学により作成し、および
ｂ） バクテリオファージタンパク質Ｉ〜ＸＩの相補性により、ファージ−結合タンパク質複合体を複製し、カプセル化し、分泌する
段階を含んでなる、ファージのライブラリーを産生する方法。
【請求項２９】
請求項２８に記載の方法によって得られるファージから構成されるライブラリー。
【請求項３０】
目的とする結合タンパク質を表面に発現させる、請求項２５または２６に記載の方法によって得られる最小化ファージ。
【請求項３１】
ａ）結合パートナーを請求項２７に記載のファージのライブラリーと接触させ、
ｂ）目的とする結合タンパク質と、結合パートナーとによって形成される複合体を選択し、
ｃ）前記目的とする結合タンパク質をコードする配列をベクターから抽出し、および
ｄ）目的の結合タンパク質を産生する
段階を含んでなる、結合パートナーに特異的な目的の結合タンパク質のスクリーニング方法。
【請求項３２】
ファージディスプレイベクターのライブラリーを生じるための請求項１〜２４のいずれか一項に記載の最小化ファージディスプレイベクターの使用であって、好ましくは、
ａ）結合タンパク質をコードする核酸配列を請求項１〜２４のいずれか一項に記載のファージディスプレイベクターに挿入し、
ｂ）請求項２５または２６に記載の宿主細胞を前記ファージディスプレイベクターで形質転換する
段階を含んでなる、前記使用。
【請求項３３】
ファージのライブラリーを生じるための請求項１〜２４のいずれか一項に記載の最小化ファージディスプレイベクターの使用であって、好ましくは、
ａ）結合タンパク質をコードする核酸配列を請求項１−２４のいずれか一項に記載のファージディスプレイベクターに挿入し、
ｂ）請求項２５または２６に記載の宿主細胞を前記ファージディスプレイベクターで形質転換し、および
ｃ）バクテリオファージタンパク質Ｉ〜ＸＩの相補性によるファージ−結合タンパク質複合体の複製、カプセル化および分泌の段階
を含んでなる、前記使用。
【請求項３４】
結合パートナーに特異的な結合タンパク質のスクリーニングのための請求項１〜２４のいずれか一項に記載の最小化ファージディスプレイベクターの使用であって、好ましくは、
ａ）前記結合パートナーを本発明によるファージのライブラリーと接触させ、
ｂ）結合タンパク質と結合パートナーとによって形成される複合体を選択し、
ｃ）前記結合タンパク質をコードする配列をベクターから抽出し、および
ｄ）結合タンパク質を産生する
段階を含んでなる、前記使用。
【請求項３５】
請求項１〜２４のいずれか一項に記載の最小化ファージディスプレイベクターと、特異的プライマーと、サプレッサー細胞株とを少なくとも含んでなるキット。
【請求項３６】
前記特異的プライマーが、配列番号９〜８５の核酸プライマーからなる群から選択される、請求項３５に記載のキット。
【請求項１】
クローニングカセットと、ファージディスプレイカセットと、細菌カセットとを少なくとも含んでなる最小化ファージディスプレイベクターであって、クローニングカセットが、少なくとも抗体の定常ドメインのドメイン内ループに対応する１個のポリペプチドをコードする核酸配列を含んでなり、前記最小化ファージディスプレイベクターのサイズが３３００塩基対以下である、最小化ファージディスプレイベクター。
【請求項２】
前記ポリペプチドが、抗体の重鎖定常ドメインのドメイン内ループに対応する、請求項１に記載の最小化ファージディスプレイベクター。
【請求項３】
前記ポリペプチドが、抗体の重鎖定常ドメインに対応する、請求項１に記載の最小化ファージディスプレイベクター。
【請求項４】
前記抗体の重鎖定常ドメインが、抗体のＣＨ１重鎖定常ドメインである、請求項３に記載の最小化ファージディスプレイベクター。
【請求項５】
前記ポリペプチドが、抗体の軽鎖定常ドメインのドメイン内ループに対応する、請求項１に記載の最小化ファージディスプレイベクター。
【請求項６】
前記ポリペプチドが、抗体の軽鎖定常ドメインに対応する、請求項１に記載の最小化ファージディスプレイベクター。
【請求項７】
前記抗体の軽鎖定常ドメインが、軽鎖カッパ定常ドメインである、請求項６に記載の最小化ファージディスプレイベクター。
【請求項８】
前記軽鎖カッパ定常ドメインのＣ末端システインが欠失している、請求項７に記載の最小化ファージディスプレイベクター。
【請求項９】
前記抗体の軽鎖定常ドメインが軽鎖ラムダ定常ドメインである、請求項６に記載の最小化ファージディスプレイベクター。
【請求項１０】
クローニングカセットが、プロモーターをコードする核酸配列と、シグナルペプチドをコードする核酸配列とを少なくとも含んでなる、請求項１〜９のいずれか一項に記載の最小化ファージディスプレイベクター。
【請求項１１】
前記プロモーターが、Ｌａｃ、Ｔａｃ、Ｔｒｐ、Ｔｅｔ、Ｔ７、ＳＰ６からなる群から選択される、請求項１０に記載の最小化ファージディスプレイベクター。
【請求項１２】
前記シグナルペプチドが、ｐｅｌＢ、ｇｅｎｅＩＩＩ、ｐｈｏＡ、ｍａｌＥ、ｄｓｂＡからなる群から選択される、請求項１０に記載の最小化ファージディスプレイベクター。
【請求項１３】
クローニングカセットが、クローニング部位をコードする一個の核酸配列をさらに含んでなる、請求項１０〜１２のいずれか一項に記載の最小化ファージディスプレイベクター。
【請求項１４】
前記クローニング部位が、少なくとも２つの制限部位を含んでなる、請求項１３に記載の最小化ファージディスプレイベクター。
【請求項１５】
ファージディスプレイカセットが、配列番号１３２または１３３に対応するＭ１３ｇｅｎｅＩＩＩタンパク質のＣ末端ドメインを少なくとも含む核酸配列を含んでなる、請求項１〜１４のいずれか一項に記載の最小化ファージディスプレイベクター。
【請求項１６】
ファージディスプレイカセットが、終止コドンをコードする核酸配列と、ファージの複製源をコードする核酸配列と、カプセル化またはパッケージング配列をコードする核酸配列とをさらに含んでなる、請求項１５に記載の最小化ファージディスプレイベクター。
【請求項１７】
前記終止コドンがアンバー終止コドンである、請求項１６に記載の最小化ファージディスプレイベクター。
【請求項１８】
細菌カセットが、プロモーターをコードする核酸配列と、正の選択マーカーをコードする核酸配列と、複製源をコードする核酸配列とを少なくとも含んでなる、請求項１〜１７のいずれか一項に記載の最小化ファージディスプレイベクター。
【請求項１９】
前記プロモーターがβ−ラクタマーゼプロモーターである、請求項１８に記載の最小化ファージディスプレイベクター。
【請求項２０】
前記の正の選択マーカーがアンピシリンまたはクロラムフェニコール耐性遺伝子である、請求項１８または１９に記載の最小化ファージディスプレイベクター。
【請求項２１】
配列番号１の核酸配列を含んでなるｐＰＬ１２にある、請求項１〜２０のいずれか一項に記載の最小化ファージディスプレイベクター。
【請求項２２】
配列番号５の核酸配列を含んでなるｐＰＬ１４にある、請求項１〜２０のいずれか一項に記載の最小化ファージディスプレイベクター。
【請求項２３】
配列番号７の核酸配列を含んでなるｐＰＬ２２にある、請求項１〜２０のいずれか一項に記載の最小化ファージディスプレイベクター。
【請求項２４】
配列番号１４８の核酸配列を含んでなるｐＰＬ３１にある、請求項１〜２０のいずれか一項に記載の最小化ファージディスプレイベクター。
【請求項２５】
ａ）請求項１〜２４のいずれか一項に記載の最小化ファージディスプレイベクターに結合タンパク質をコードする核酸配列を挿入し、および
ｂ）段階ａ）で得た最小化ファージディスプレイベクターを用いて宿主細胞を形質転換する
段階を含んでなる、最小化ファージディスプレイベクターのライブラリーの遺伝子工学による作成方法。
【請求項２６】
前記宿主細胞が、ＴＧ１、ＸＬ１−Ｂｌｕｅ、ＸＬ１−Ｂｌｕｅ ＭＲＦ’、大腸菌Ｋ１２ ＥＲ２７３８細胞からなる群から選択される、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
請求項１〜２３のいずれか一項に記載のおよび／または請求項２５または２６に記載の方法によって得られる最小化ファージディスプレイベクターから構成されているライブラリー。
【請求項２８】
ａ）請求項２５または２６に記載の最小化ファージディスプレイベクターのライブラリーを遺伝子工学により作成し、および
ｂ） バクテリオファージタンパク質Ｉ〜ＸＩの相補性により、ファージ−結合タンパク質複合体を複製し、カプセル化し、分泌する
段階を含んでなる、ファージのライブラリーを産生する方法。
【請求項２９】
請求項２８に記載の方法によって得られるファージから構成されるライブラリー。
【請求項３０】
目的とする結合タンパク質を表面に発現させる、請求項２５または２６に記載の方法によって得られる最小化ファージ。
【請求項３１】
ａ）結合パートナーを請求項２７に記載のファージのライブラリーと接触させ、
ｂ）目的とする結合タンパク質と、結合パートナーとによって形成される複合体を選択し、
ｃ）前記目的とする結合タンパク質をコードする配列をベクターから抽出し、および
ｄ）目的の結合タンパク質を産生する
段階を含んでなる、結合パートナーに特異的な目的の結合タンパク質のスクリーニング方法。
【請求項３２】
ファージディスプレイベクターのライブラリーを生じるための請求項１〜２４のいずれか一項に記載の最小化ファージディスプレイベクターの使用であって、好ましくは、
ａ）結合タンパク質をコードする核酸配列を請求項１〜２４のいずれか一項に記載のファージディスプレイベクターに挿入し、
ｂ）請求項２５または２６に記載の宿主細胞を前記ファージディスプレイベクターで形質転換する
段階を含んでなる、前記使用。
【請求項３３】
ファージのライブラリーを生じるための請求項１〜２４のいずれか一項に記載の最小化ファージディスプレイベクターの使用であって、好ましくは、
ａ）結合タンパク質をコードする核酸配列を請求項１−２４のいずれか一項に記載のファージディスプレイベクターに挿入し、
ｂ）請求項２５または２６に記載の宿主細胞を前記ファージディスプレイベクターで形質転換し、および
ｃ）バクテリオファージタンパク質Ｉ〜ＸＩの相補性によるファージ−結合タンパク質複合体の複製、カプセル化および分泌の段階
を含んでなる、前記使用。
【請求項３４】
結合パートナーに特異的な結合タンパク質のスクリーニングのための請求項１〜２４のいずれか一項に記載の最小化ファージディスプレイベクターの使用であって、好ましくは、
ａ）前記結合パートナーを本発明によるファージのライブラリーと接触させ、
ｂ）結合タンパク質と結合パートナーとによって形成される複合体を選択し、
ｃ）前記結合タンパク質をコードする配列をベクターから抽出し、および
ｄ）結合タンパク質を産生する
段階を含んでなる、前記使用。
【請求項３５】
請求項１〜２４のいずれか一項に記載の最小化ファージディスプレイベクターと、特異的プライマーと、サプレッサー細胞株とを少なくとも含んでなるキット。
【請求項３６】
前記特異的プライマーが、配列番号９〜８５の核酸プライマーからなる群から選択される、請求項３５に記載のキット。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【公表番号】特表２０１３−５１１２６８（Ｐ２０１３−５１１２６８Ａ）
【公表日】平成２５年４月４日（２０１３．４．４）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１２−５３９３２４（Ｐ２０１２−５３９３２４）
【出願日】平成２２年１１月１８日（２０１０．１１．１８）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＥＰ２０１０／０６７７２２
【国際公開番号】ＷＯ２０１１／０６１２４４
【国際公開日】平成２３年５月２６日（２０１１．５．２６）
【出願人】（５０００３３４８３）ピエール、ファーブル、メディカマン (73)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２５年４月４日（２０１３．４．４）
【国際特許分類】
【出願日】平成２２年１１月１８日（２０１０．１１．１８）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＥＰ２０１０／０６７７２２
【国際公開番号】ＷＯ２０１１／０６１２４４
【国際公開日】平成２３年５月２６日（２０１１．５．２６）
【出願人】（５０００３３４８３）ピエール、ファーブル、メディカマン (73)
【Ｆターム（参考）】
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