新規な塩基対形成スキームの使用による非特異的ハイブリダイゼーションの減少
【課題】核酸ハイブリダイゼーションアッセイにおいてバックグラウンドノイズを減少し、そして分析物の検出および定量の精度を増加すること。
【解決手段】複数のアッセイ成分を用いる、サンプル中の核酸分析物を検出するための核酸ハイブリダイゼーションアッセイであって、該複数のアッセイ成分の各々は、少なくとも１つのハイブリダイズするオリゴヌクレオチドセグメントを含有し、少なくとも１つのハイブリダイズするオリゴヌクレオチドセグメント中に、A-TおよびG-C塩基対が形成される条件下でアデノシン(A)、チミジン(T)、シチジン(C)、グアノシン(G)、またはウリジン(U)と効果的には塩基対を形成しない第１のヌクレオチド単位を取り込ませる工程を包含する改良がされている、核酸ハイブリダイゼーションアッセイ。
【解決手段】複数のアッセイ成分を用いる、サンプル中の核酸分析物を検出するための核酸ハイブリダイゼーションアッセイであって、該複数のアッセイ成分の各々は、少なくとも１つのハイブリダイズするオリゴヌクレオチドセグメントを含有し、少なくとも１つのハイブリダイズするオリゴヌクレオチドセグメント中に、A-TおよびG-C塩基対が形成される条件下でアデノシン(A)、チミジン(T)、シチジン(C)、グアノシン(G)、またはウリジン(U)と効果的には塩基対を形成しない第１のヌクレオチド単位を取り込ませる工程を包含する改良がされている、核酸ハイブリダイゼーションアッセイ。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、一般的に、核酸化学およびハイブリダイゼーションアッセイに関する。より詳細には、本発明は、核酸ハイブリダイゼーションアッセイにおいて、主に非特異的ハイブリダイゼーションに由来するバックグラウンドノイズを最小限に抑えることにより、より標的依存性のシグナルを生成する方法に関する。本発明はまた、アンチセンスおよびアプタマー治療学ならびに薬物発見における適用を有する。
【背景技術】
【０００２】
核酸ハイブリダイゼーションアッセイは、一般的に、遺伝学的研究、生物医学的研究および臨床診断に使用される。基礎的な核酸ハイブリダイゼーションアッセイにおいて、一本鎖分析物の核酸は標識一本鎖核酸プローブとハイブリダイズし、そして得られた標識二本鎖が検出される。精度を高め、異質物質から検出するための二本鎖の分離を容易にし、および／または検出されるシグナルを増幅するために、この基本的スキームの変形が開発された。
【０００３】
本発明は、任意の核酸ハイブリダイゼーションアッセイにおいて生じるバックグランドノイズを減少する方法に関する。一般に、現在開示されている技術が抱えているバックグランドノイズは、所定のアッセイにおいて使用される種々のポリヌクレオチド成分の所望されない相互作用（すなわち、分析物の存在または量に対応しないシグナルを生じる相互作用）が原因である。本発明は、多くのアッセイ形態と結合するのに有用であり、ここで多様なハイブリダイゼーション工程が行われて、ポリヌクレオチド分析物の存在または量と相関する検出可能なシグナルが生成される。
【０００４】
このようなアッセイの１つは、共同で譲渡された特許文献１(Urdeaら、この開示は本明細書中に参考として援用される)に詳細に記載されている。このアッセイは、ポリヌクレオチド分析物を固体の支持体に結合するように設計された二部捕獲システムと、検出可能な標識を検出または定量しようとするポリヌクレオチド分析物に結合するように設計された二部標識システムとの使用を包含する。二部捕獲システムは、固体の支持体に結合した捕獲プローブと、捕獲プローブのセグメントおよびポリヌクレオチド分析物のセグメントの両方にハイブリダイズする捕獲エキステンダー分子との使用を包含する。二部標識システムは、ポリヌクレオチド分析物のセグメントにハイブリダイズする標識エキステンダー分子と、標識エキステンダー分子にハイブリダイズし、そして検出可能な標識を含みまたは検出可能な標識に結合する標識プローブとの使用を包含する。このようなシステムの有用性は、分析物の存在と相関する様式で標識が検出されるためには、多くのハイブリダイゼーション工程が存在しなくてはならず、この場合、２つの異なったハイブリダイゼーション反応が分析物「捕獲」のために生じなければならず、同様に、２つの異なったハイブリダイゼーション反応が分析物標識のために生じなければならない。しかし、検出可能なシグナルが分析物の存在または量に相関しない様式で生成され得る多くの方法が残されたままであり、これらについて以下に詳しく述べる。
【０００５】
本発明が有用であるアッセイの別の例は、共同で譲渡された特許文献２(Urdeaら、この開示は本明細書中に参考として援用される)に記載のシグナル増幅方法である。この方法では、シグナルは、増幅マルチマー（標識エキステンダーに特異的にハイブリダイズする第１のセグメント、および標識プローブに特異的にハイブリダイズする多数の同一の第２のセグメントを含有するように構築されたポリヌクレオチド）の使用により増幅される。増幅の程度は、理論上、第２のセグメントの反復数に比例する。マルチマーは、直鎖状または分枝状のどちらかであり得る。分枝状マルチマーはフォークまたは櫛の形状であり得、櫛型のマルチマーが好ましい。
核酸ハイブリダイゼーションアッセイにおける干渉バックグラウンドシグナルの問題を解決するための１つのアプローチは、共同で譲渡された特許文献３により提供される。そこには、検出可能なシグナルを誘発するために少なくとも２つの捕獲エキステンダーおよび/または２つ以上の標識エキステンダーが分析物に結合しなければならないことが記載される。バックグラウンドノイズをさらに減少するために、多成分複合体の形成に好都合な条件下でアッセイを行う。
【０００６】
別のアプローチは、ハイブリダイゼーションアッセイにおいてシグナルの標的依存性を増大することを提示しており、このことは特許文献４(発明者Hellerら)に記載されている。この参考文献は、近接するプローブ間でエネルギーの非放射性伝達が生じる相同的ハイブリダイゼーションアッセイについて記載しており；２つの異なった事象が、産生される標的生成シグナルについて生じなければならず、これが検出の精度を増強する。
本発明はまた、ハイブリダイゼーションアッセイにおけるポリヌクレオチド分析物の検出および定量の精度を増大することが意図される。本発明は、標的の非存在下で生じるシグナル産生の発生率を減少することによって、このようなアッセイの感度および特異性の両方を増強し、そして現在用いられているアッセイの構成に比べて時間またはコストのいずれをも増大しない。
【０００７】
本発明の目的、すなわち、核酸ハイブリダイゼーションアッセイにおいてバックグラウンドノイズを減少し、そして分析物の検出および定量の精度を増加することは、部分的に、「非天然」水素結合パターンにより塩基対を形成するヌクレオシド変異体の使用によって達成されている。本明細書において、「非天然」塩基対は、アデノシン（Ａ）、チミジン（Ｔ）、シチジン（Ｃ）、グアノシン（Ｇ）、またはウリジン（Ｕ）以外のヌクレオチド単位（ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｉｃ ｕｎｉｔ）の間で形成される塩基対である。このような非天然ヌクレオシド塩基対の１つは、イソシトシン（イソＣ）およびイソグアニン（イソＧ）の間で形成される。イソＣおよびイソＧは、標準の結合構造（すなわち、ワトソン-クリックの塩基対）で塩基対を形成し得るが、以下に示すような、シトシン（Ｃ）のグアニン（Ｇ）への結合に関与する水素結合とは別の水素結合を含む：
【０００８】
【化３】
非特許文献１は、イソＣ*イソＧ塩基対の構造および安定性を研究するために、分子メカニクス、分子ダイナミクスおよび自由エネルギー摂動計算を適用した。非特許文献２は、DNAテンプレート中の修飾イソＣが、転写されるRNA産物中へのイソＧアナログの取り込みを指示する方法を記載している。非特許文献３は、イソＣおよびイソＧの間に形成される塩基対が、DNAポリメラーゼおよびRNAポリメラーゼにより、DNAおよびRNA中に取り込まれ得る条件を検討した。
【０００９】
DNAオリゴマーに新しい塩基対を導入することにより、ハイブリダイゼーションをより正確に制御する可能性を提供する。
【特許文献１】米国特許第４，８６８，１０５号明細書
【特許文献２】米国特許第５，１２４，２４６号明細書
【特許文献３】国際公開第９５／１６０５５号パンフレット
【特許文献４】欧州特許公開公開第７０，６８５号明細書
【非特許文献１】Ｌｅａｃｈら、「Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．」、１９９２年、第１１４号、ｐ．３６７５−３６８３
【非特許文献２】Ｔｏｒら、「Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．」、１９９３、第１１５号、ｐ．４４６１−４４６７
【非特許文献３】Ｓｗｉｔｚｅｒら、「Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ」、１９９３、第３２号、ｐ．１０４８９−１０４９６
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
本発明の目的は、核酸ハイブリダイゼーションアッセイにおいてバックグラウンドノイズを減少し、そして分析物の検出および定量の精度を増加することである。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明は、以下を提供する。
（項目１）
複数のアッセイ成分を用いる、サンプル中の核酸分析物を検出するための核酸ハイブリダイゼーションアッセイであって、該複数のアッセイ成分の各々は、少なくとも１つのハイブリダイズするオリゴヌクレオチドセグメントを含有し、
少なくとも１つのハイブリダイズするオリゴヌクレオチドセグメント中に、A-TおよびG-C塩基対が形成される条件下でアデノシン(A)、チミジン(T)、シチジン(C)、グアノシン(G)、またはウリジン(U)と効果的には塩基対を形成しない第１のヌクレオチド単位を取り込ませる工程を包含する改良がされている、核酸ハイブリダイゼーションアッセイ。
（項目２）
前記第１のヌクレオチド単位が、第２の相補的なヌクレオチド単位と塩基対を形成し得る、項目１に記載の方法。
（項目３）
前記第１および第２のヌクレオチド単位が、以下からなる相補的塩基対の群から交換可能に選択される項目２に記載の方法：
【００１２】
【化４】
【００１３】
【化５−１】
および
【００１４】
【化５−２】
ここでＲは、ポリヌクレオチドに取り込まれたときに、該第１および第２のヌクレオチド単位に、相補的なヌクレオチド単位との塩基対を形成させ得る骨格であり、そしてＲ'は水素、メチル、a-またはb-プロピニル、臭素、フッ素、あるいはヨウ素である。
（項目４）
複数のアッセイ成分を用いる、サンプル中の核酸分析物を検出するための核酸ハイブリダイゼーションアッセイであって、該複数のアッセイ成分の各々は少なくとも１つのハイブリダイズするオリゴヌクレオチドセグメントを含有し、
アッセイストリンジェンシーが、Tm1ハイブリッド複合体を選択的に不安定化するように制御され得る、Tm1ハイブリッド複合体およびTm2ハイブリッド複合体を取り込ませる工程を包含する改良がされている、核酸ハイブリダイゼーションアッセイ。
（項目５）
複数のアッセイ成分を用いる、サンプル中の核酸分析物を検出するための液相サンドイッチハイブリダイゼーションアッセイであって、該複数のアッセイ成分の各々は少なくとも１つのハイブリダイズするオリゴヌクレオチドセグメントを含有し、該アッセイは、(a)該分析物を固体支持体に直接的または間接的に結合させる工程、(b)該分析物を標識する工程、および(c)分析物会合標識の存在を検出する工程を包含し、
少なくとも１つのハイブリダイズするオリゴヌクレオチドセグメント中に、A-TおよびG-C塩基対が形成される条件下でアデノシン(A)、チミジン(T)、シチジン(C)、グアノシン(G)、またはウリジン(U)と効果的には塩基対形成しない第１のヌクレオチド単位を取り込ませる工程を包含する改良がされている、液相サンドイッチハイブリダイゼーションアッセイ。
（項目６）
複数のアッセイ成分を用いる、サンプル中の核酸分析物を検出するための液相サンドイッチハイブリダイゼーションアッセイであって、該複数のアッセイ成分の各々は少なくとも１つのハイブリダイズするオリゴヌクレオチドセグメントを含有し、該アッセイは、(a)該分析物を固体支持体に直接的または間接的に結合させる工程、(b)該分析物を標識する工程、および(c)分析物に会合した標識の存在を検出する工程を包含し、
アッセイストリンジェンシーが、Tm1ハイブリッド複合体を選択的に不安定化するように制御され得る、Tm1ハイブリッド複合体およびTm2ハイブリッド複合体の取り込みを包含する改良がされている、液相サンドイッチハイブリダイゼーションアッセイ。
（項目７）
以下の構造式を有する化合物を合成する方法であって、
【００１５】
【化６】
ここで、R1は、水素、ヒドロキシル、スルフヒドリル、ハロゲノ、アミノ、アルキル、アリル、および-OR2(ここでR2はアルキル、アリル、シリル、またはリン酸塩である)からなる群から選択され：
a) 以下の構造式
【００１６】
【化７】
を有する化合物を、3'および5'ヒドロキシル基の両方を保護するのに適切な試薬と反応させる工程；
b) 工程(a)の産物を、O6-オキシ部分を求核置換を受けやすい官能基に変換するのに適切な試薬と反応させ、それにより官能基化O6部分を産生する工程；
c) 工程(b)の産物の2-アミノ基を酸化する工程；
d) 工程(c)の産物を、該官能基化したO6部分を置換する求核試薬と反応させる工程；
e) 工程(d)の産物を、該保護された3'および5'ヒドロキシル基を脱保護するのに適切な試薬と反応させる工程
を包含する方法。
（項目８）
以下を包含する2'-デオキシ-イソグアノシンを合成する方法：
a) 2'-デオキシグアノシンをt-ブチルジメチルシリル(TBDMS)クロライドと反応させることにより、2'-デオキシグアノシンを3',5'-O-(t-ブチルジメチルシリル)2-2'-デオキシグアノシンに変換する工程；
b) 3',5'-O-TBDMS2-2'-デオキシグアノシンを4-トルエンスルホニルクロライドと反応させることにより、3',5'-O-TBDMS2-2'-デオキシグアノシンをO6-(4-トルエンスルホニル)-3',5'-O-TBDMS2-2'-デオキシグアノシンに変換する工程；
c) O6-(4-トルエンスルホニル)-3',5'-O-TBDMS2-2'-デオキシグアノシンをフェノールで処理することにより、該O6-(4-トルエンスルホニル)基を置換して、O6-(4-(メチルチオ)フェニル)-3',5'-O-TBDMS2-2'-デオキシグアノシンを得る工程；
d) 中性条件下でO6-(4-(メチルチオ)フェニル)-3',5'-O-TBDMS2-2'-デオキシグアノシンを亜硝酸t-ブチルで処理することにより、該O6-(4-(メチルチオ)フェニル)-3',5'-O-TBDMS2-2'-デオキシグアノシンの2-アミノ基をオキシ官能基に酸化して、O6-(4-(メチルチオ)フェニル)-3',5'-O-TBDMS2-2'-デオキシキサントシンを得る工程；および
e) 高温で該O6-(4-(メチルチオ)フェニル)-3',5'-O-TBDMS2-2'-デオキシキサントシンのO2-(4-(メチルチオ)フェニル)基を水酸化アンモニウムで置換し、3',5'-O-TBDMS2-2'-デオキシ-イソグアノシンを得る工程。
（項目９）
サンプル中の核酸分析物を検出するためのキットであって、少なくとも１つのハイブリダイズするオリゴヌクレオチドプローブ、該分析物とハイブリッド複合体を形成し得るプローブのセグメント、および該ハイブリッド複合体を検出するための手段を含み、ここで該少なくとも１つのハイブリダイズするオリゴヌクレオチドプローブは、A-TおよびG-C塩基対が形成される条件下で、アデノシン(A)、チミジン(T)、シチジン(C)、グアノシン(G)、またはウリジン(U)と効果的には塩基対を形成しない第１のヌクレオチド単位を含有する、キット。
（項目１０）
以下を含有する項目９に記載のキット：
(a) 捕獲プローブのセットであって、ここで該捕獲プローブは、A-TおよびG-C塩基対が形成される条件下で、A、T、C、G、またはUと効果的には塩基対を形成しない第１のヌクレオチド単位を含有する、捕獲プローブのセット；
(b) 第１および第２のハイブリダイズするオリゴヌクレオチドセグメントを含有する捕獲エクステンダー分子のセットであって、ここで該第１のハイブリダイズするオリゴヌクレオチドセグメントは該捕獲プローブとハイブリッド複合体を形成し得、そして該第２のハイブリダイズするオリゴヌクレオチドセグメントは該核酸分析物の予め決定されたセグメントとハイブリッド複合体を形成し得る、捕獲エクステンダー分子のセット；
(c) 第３および第４のハイブリダイズするオリゴヌクレオチドセグメントを含有する標識エクステンダー分子であって、ここで該第３のハイブリダイズするオリゴヌクレオチドセグメントは、該捕獲エクステンダー分子のセットが結合するもの以外の核酸分析物のセグメントとハイブリッド複合体を形成し得る、捕獲エクステンダー分子；
(d) 第５および第６のハイブリダイズするオリゴヌクレオチドセグメントを含有する随意のプレアンプリファイヤー分子であって、ここで該ハイブリダイズするオリゴヌクレオチドセグメントは、A-TおよびG-C塩基対が形成される条件下で、A、T、C、G、またはUと効果的には塩基対を形成しない第１のヌクレオチド単位を含有し、そして該プレアンプリファイヤー分子は、該標識エクステンダー分子および複数の増幅マルチマーとハイブリッド複合体を形成し得る、プレアンプリファイヤー分子；
(e) 第７および第８のハイブリダイズするオリゴヌクレオチドセグメントを含有する増幅マルチマーであって、ここで該ハイブリダイズするオリゴヌクレオチドセグメントは、A-TおよびG-C塩基対が形成される条件下で、A、T、C、G、またはUと効果的には塩基対を形成しない第１のヌクレオチド単位を含有し、そして該増幅マルチマーは、該標識エクステンダー分子またはプレアンプリファイヤー分子、および複数の同一のオリゴヌクレオチドサブユニットとハイブリッド複合体を形成し得る、増幅マルチマー；および
(f) 標識を含有する標識プローブであって、該同一のオリゴヌクレオチドサブユニットとハイブリッド複合体を形成するように設計され、そして直接的または間接的に検出可能なシグナルを提供する、標識プローブ。
（項目１１）
アプタマーとして有用なオリゴヌクレオチドであって、複数の相補的塩基対を含有する分子内オリゴヌクレオチドハイブリッド複合体を含有し、該塩基対の少なくとも１つが、A-TおよびG-C塩基対を通常形成する条件下で、アデノシン(A)、チミジン(T)、シチジン(C)、グアノシン(G)、またはウリジン(U)と効果的には塩基対を形成しない相補的な非天然ヌクレオチド単位を含有し、ここで該非天然ヌクレオチド単位は、該塩基対の特異性が該アプタマーの二次構造の維持には必要とされないオリゴヌクレオチドセグメント内に含有される、オリゴヌクレオチド。
（項目１２）
以下の工程を包含するアプタマーを調製するための方法：
(a) 標的分子を提供する工程；
(b) 該標的分子とオリゴヌクレオチドのランダマープールとを、該オリゴヌクレオチドが該標的分子に結合するのに好都合な条件下で接触させる工程；
(c) 該標的分子に結合し、そしてオリゴヌクレオチド-標的複合体を形成する該オリゴヌクレオチドを、該標的分子に結合しない該オリゴヌクレオチドから分離する工程：
(d) 該オリゴヌクレオチド-標的複合体から該オリゴヌクレオチドを解離させる工程；
(e) ポリメラーゼ連鎖反応を用いて該オリゴヌクレオチドを増幅する工程；
(f) 少なくとも１回(b)から(e)の工程を繰り返し、最終的なアプタマー構築物を形成する工程；および
(g) 該最終アプタマー構築物中の１つ以上のヌクレオチド単位を、A-TおよびG-C塩基対を通常形成する条件下で、アデノシン(A)、チミジン(T)、シチジン(C)、グアノシン(G)、またはウリジン(U)と効果的には塩基対を形成しない非天然ヌクレオチド単位で置換する工程。
（項目１３）
第１および第２のハイブリダイズするセグメントを含有するアンチセンス分子であって、ここで該第１のハイブリダイズするセグメントは標的オリゴヌクレオチドとハイブリッド複合体を形成し得、そして該第２のセグメントは、A-TおよびG-C塩基対を形成する条件下で、アデノシン(A)、チミジン(T)、シチジン(C)、グアノシン(G)、またはウリジン(U)と効果的には塩基対を形成しない少なくとも１つのヌクレオチド単位を含有し、そして第２のアンチセンス分子とハイブリッド複合体を形成し得る、アンチセンス分子。
【００１７】
（発明の要旨）
本発明は、サンプル中の核酸分析物を検出するための方法およびキットを提供する。一般的に、本方法は、インサイチュハイブリダイゼーション、サザン、ノーザン、ドットブロットなどの核酸ハイブリダイゼーションアッセイおよびポリメラーゼ連鎖反応アッセイにおける改良を示す。詳細には、本方法は、分析物を固体の支持体に結合させる工程、分析物を標識する工程、および支持体上の標識の存在を検出する工程を包含する液相サンドイッチハイブリダイゼーションアッセイにおける改良を示す。好ましい方法は、分析物−プローブ複合体におけるより顕著な標識の結合を可能にする増幅マルチマーの使用を包含し、アッセイの感度および特異性を増強する。
【００１８】
本発明の第１の局面において、塩基対を形成し得、かつアデノシン（Ａ）、チミジン（Ｔ）、シチジン（Ｃ）、グアノシン（Ｇ）、またはウリジン（Ｕ）以外である１つまたはそれ以上のヌクレオチド単位が、核酸ハイブリダイゼーションアッセイ成分の標的にハイブリダイズしないオリゴヌクレオチドセグメント（すなわち「普遍」セグメント）に取り込まれるアッセイが提供される。このようなヌクレオチド単位の使用は、普遍セグメントの間の結合特異性を増大する独特の塩基対形成スキームを生じさせる。
【００１９】
本発明の関連する局面において、Ａ、Ｔ、Ｃ、Ｇ、またはＵ以外の第２のヌクレオチド単位と塩基対を形成し得る、Ａ、Ｔ、Ｃ、Ｇ、またはＵ以外の少なくとも１つの第１のヌクレオチド単位が、アッセイ成分の核酸配列中に取り込まれるアッセイが提供される。この核酸配列は、標的分析物以外のアッセイ成分中に存在する核酸配列に相補的である。このような２つのヌクレオチド単位の間に形成される塩基対の例として、以下の構造（I）〜（IV）が挙げられる：
【００２０】
【化８】
および
【００２１】
【化９】
ここで、Ｒは、ポリヌクレオチドに取り込まれた場合、塩基が相補的ヌクレオチド単位と塩基対を形成することが可能な骨格を示し、そしてＲ’は、例えば、水素、メチル、α-またはβ-プロピニル、臭素、フッ素、ヨウ素などである。このようなヌクレオチド単位をこのようないわゆる「普遍」配列（すなわち、標的分析物へのハイブリダイゼーションに関与しない配列）に取り込ませることにより、非特異的ハイブリダイゼーションの可能性は、著しく減少する。１つの好ましい実施態様において、式（I）に示したように、第１および第２のヌクレオチド単位は、イソシチジンおよびイソグアノシンから交換可能に構成される。
【００２２】
本発明の関連した局面において、分析物および支持体に結合した捕獲プローブの間に形成される複合体（１つまたはそれ以上の異なった捕獲エキステンダー分子、および/または標識エキステンダーおよびアンプリファイヤーまたはプレアンプリファイヤーにより媒介される）の融解温度Tm1が、標識プローブおよびアンプリファイヤーの間に形成される複合体の融解温度Tm2よりも顕著に低いアッセイを提供する。この局面において、アッセイは、最初に全てのハイブリッド複合体の形成に好都合な条件下で行われる。次いで、この条件をアッセイの過程の間に改変して、Tm1ハイブリッド複合体を不安定にする。
【００２３】
本発明はさらに、前記の技術のそれぞれを組合せたハイブリダイゼーションアッセイを実行する方法を包含する。すなわち、このアッセイでは、Ａ、Ｔ、Ｇ、Ｃ、またはＵ以外のヌクレオチド単位がアッセイ成分の普遍セグメント中に取り込まれ、そしてTm1ハイブリッド複合体の融解温度がTm2ハイブリッド複合体の融解温度よりも顕著に低い。
【００２４】
さらなる局面において、本発明はイソグアノシンまたは2'-デオキシ-イソグアノシンを合成するための新規な方法を包含する。
【００２５】
最後に、本発明は、本明細書および特許請求の範囲に記載のアッセイを実行するために必要な試薬を含むキットを包含する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２６】
（発明の詳細な説明）
（定義および術語）
本発明を開示し、そして詳細に記載する前に、本発明が、特定のアッセイ形式、物質、または試薬に限定されず、そしてもちろん変化し得ることを理解すべきである。本明細書中で使用した用語は、特定の実施態様のみを記載することが目的であり、そして限定されることを意図しないということもまた理解すべきである。
【００２７】
この明細書および以下の特許請求の範囲では、以下の意味を有すると定義される数多くの用語を参照する：
本明細書中で使用する用語「ポリヌクレオチド」および「オリゴヌクレオチド」は、ポリデオキシリボヌクレオチド（2-デオキシ-D-リボースを含有する）、ポリリボヌクレオチド（D-リボースを含有する）、プリンまたはピリミジン塩基のN-またはC-グリコシドである任意の他のタイプのポリヌクレオチド、ならびに非ヌクレオチド骨格（例えば、ポリアミド（例えば、ペプチド核酸(PNA)）およびポリモルホリノ（polymorpholino）（Anti-Virals,Inc.(Corvallis,Oregon)からNeugeneTMポリマーとして市販されている）を含有する他のポリマー、ならびに合成の配列特異的核酸ポリマー（DNAおよびRNAに見出されるような塩基の対合または塩基のスタッキング(stacking)が可能となる形状でヌクレオチドを含有するポリマーを提供する）を総称する。用語「ポリヌクレオチド」および「オリゴヌクレオチド」との間の長さの区別を意図せず、これらの用語は交換可能に使用される。これらの用語は、分子の一次構造のみに言及する。従って、これらの用語は、２本鎖および１本鎖のDNA、ならびに２本鎖および１本鎖のRNA、DNA:RNAハイブリッド、ならびにPNAおよびDNAまたはRNAの間のハイブリッドを包含し、そしてまた公知のタイプの改変体（例えば、当該分野で公知の標識、メチル化、「キャップ」、１またはそれ以上の天然に存在するヌクレオチドのアナログでの置換）、ヌクレオチド内の改変体（例えば、非荷電結合（例えば、メチルホスホネート、ホスホトリエステル、ホスホラミデート、カルバメートなど）および負の荷電結合（例えば、ホスホロチオエート（phosphorothioate)、ホスホロジチオエート（phosphorodithioate)など）および正の荷電結合（例えば、アミノアルキルホスホラミデート、アミノアルキルホスホトリエステル）を有する改変体、ペンダント部分（例えば、タンパク質（ヌクレアーゼ、毒素、抗体、シグナルペプチド、ポリ-L-リジンなどを包含する））を含有する改変体、挿入物（例えば、アクリジン、ソラレンなど）を有する改変体、キレート剤（例えば、金属、放射性金属、ホウ素、酸化力のある金属など）を含有する改変体、アルキル化剤を含有する改変体、改変した結合を有する改変体（例えば、α−アノマー核酸など）、およびポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドの改変しない形態を包含する。
【００２８】
本明細書中で使用される用語「ヌクレオシド」および「ヌクレオチド」は、公知のプリン塩基およびピリミジン塩基のみならず、改変した他の複素環式の塩基もまた含有する部分を包含することが認識される。これらの改変体は、メチル化プリン、またはメチル化ピリミジン、アシル化プリンまたはアシル化ピリミジン、あるいは他の複素環を包含する。改変したヌクレオシドまたはヌクレオチドはまた、糖部分に対する改変体（例えば、ここでは１またはそれ以上の水酸基がハロゲン、脂肪基で置換されるか、またはエーテル、アミンなどとして官能基化される）を包含する。用語「ヌクレオチド単位」は、ヌクレオシドおよびヌクレオチドを包含することが意図される。
【００２９】
さらに、ヌクレオチド単位の改変は、それぞれの相補的なピリミジンまたはプリンとの水素結合を形成するプリン塩基またはピリミジン塩基において官能基を再配列し、付加し、置換するか、さもなければ変更することを包含する。得られた改変ヌクレオチド単位は、Ａ、Ｔ、Ｃ、Ｇ、またはＵ以外の他のこのような改変ヌクレオチド単位と塩基対を形成し得る。標準のＡ-ＴおよびＧ-Ｃ塩基対は、それぞれ、チミジンのN3-HおよびC4-オキシとアデノシンのN1およびC6-NH2との間、そしてそれぞれ、シチジンのC2-オキシ、N3およびC4-NH2とグアノシンのC2-NH2、N1-HおよびC6-オキシの間との水素結合の形成が可能な条件下で形成する。従って、例えばグアノシン（2-アミノ-6-オキシ-9-β-D-リボフラノシル-プリン）を改変して、イソグアノシン（2-オキシ-6-アミノ-9-β-D-リボフラノシル-プリン）を形成し得る。このような改変はシトシンと標準の塩基対をもはや効果的に形成しないヌクレオシド塩基を生じる。しかし、シトシン（1-β-D-リボフラノシル-2-オキシ-4-アミノ-ピリミジン）の改変によるイソシトシン（1-β-D-リボフラノシル-2-アミノ-4-オキシ-ピリミジン）の形成は、グアノシンと効果的な塩基対を形成しないが、イソグアノシンと塩基対を形成する改変ヌクレオチドを生じる。イソシトシンはＳｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）から入手可能であり；イソシチジンはＳｗｉｚｅｒら（（１９９３）、前出）、およびその中で引用される参考文献に記載の方法により調製され得る；2'-デオキシ-5-メチル-イソシチジンは、Ｔｏｒら（（１９９３）、前出）、およびその中で引用される参考文献で記載される方法により調製され得る；そしてイソグアニンヌクレオチドは、Ｓｗｉｚｅｒら（前出）、およびＭａｎｔｓｃｈら（（１９９３）Ｂｉｏｃｈｅｍ．１４：５５９３−５６０１）に記載の方法、または以下に詳細に記載する方法により調製され得る。構造（II）で描写した非天然塩基対（κおよびπという）は、Ｐｉｃｃｉｒｉｌｌｉら（（１９９０）Ｎａｔｕｒｅ ３４３：３３−３７）に記載の方法により合成され得る。この方法は、2,6-ジアミノピリミジンおよびその相補体（1-メチルピラゾロ[4,3]-ピリミジン-5,7-(4H,6H)-ジオン）の合成法である。独特な塩基対を形成する他のこのような改変ヌクレオチド単位は、Ｌｅａｃｈら（（１９９２）Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１１４：３６７５−３６８３）およびＳｗｉｚｅｒら（前出）に記載されているか、もしくは当業者には自明である。
用語「ポリヌクレオチド分析物」は、標的ヌクレオチド配列を含有する１本鎖または２本鎖の核酸分子をいう。分析物核酸は、種々の供給源（例えば、生物学的液体または固体、食料品、環境物質など）に由来し得、そして種々の手段（例えば、プロテイナーゼK/SDS、カオトロピック塩など）によるハイブリダイゼーション解析のために調製され得る。用語「ポリヌクレオチド分析物」は、本明細書中では用語「分析物」、「分析物核酸」、「標的」および「標的分子」と交換可能に使用される。
【００３０】
本明細書中で使用される用語「標的領域」または「標的ヌクレオチド配列」は、標的分子内に含有されるプローブ結合領域をいう。用語「標的配列」は、所望の条件下でプローブが安定なハイブリッドを形成する配列をいう。
【００３１】
本明細書中で使用される用語「プローブ」は、上で定義したようにポリヌクレオチドを含有する構造をいい、これは、標的分析物に存在する核酸配列に相補的な核酸配列を含有する。プローブのポリヌクレオチド領域は、DNA、および／またはRNA、および／または合成ヌクレオチドアナログから形成され得る。
【００３２】
結合配列は、安定なハイブリッドを提供するために完全な相補性を有する必要はないことが理解される。多くの場合、塩基の約10％未満が適合していなくても、４またはそれ以上のヌクレオチドのループを無視して、安定なハイブリッドが形成される。従って、本明細書中で使用される用語「相補的な」は、アッセイ条件下でその「相補体」と安定な２本鎖を形成するオリゴヌクレオチド（一般に約90％またはそれ以上の相同性がある）をいう。
【００３３】
用語「核酸マルチマー」または「増幅マルチマー」は、本明細書中では、同じ反復１本鎖オリゴヌクレオチドセグメント、または異なる１本鎖ポリヌクレオチドセグメントの直鎖ポリマーまたは分枝鎖ポリマーをいうために使用される。これらは、それぞれ標識プローブが結合し得る領域を含有し、すなわち、標識プローブ内に含有される核酸配列に相補的な核酸配列を含有する；オリゴヌクレオチドセグメントは、RNA、DNA、改変されたヌクレオチドまたはそれらの組み合わせで構成され得る。セグメントの少なくとも１つは、標識プローブに特異的に結合することを可能にする配列、長さ、および組成を有する；さらに、セグメントの少なくとも１つは、標識エキステンダーまたは標識プレアンプリファイヤーに特異的に結合することを可能にする配列、長さ、および組成を有する。代表的には、このようなセグメントは約15〜50、好ましくは15〜30のヌクレオチドを含有し、そして約20％〜約80％の範囲のGC含量を有する。マルチマー内のオリゴヌクレオチドセグメントの総数は、通常約３〜1000の範囲、さらに代表的には、約10〜100の範囲、そして最も代表的には約50である。マルチマーのオリゴヌクレオチドセグメントは、ホスホジエステル結合を通して、または挿入した結合物質（例えば、核酸、アミノ酸、炭水化物、またはポリオール架橋）を通して、または核酸鎖または改変核酸鎖を架橋することが可能な他の架橋物質を通して互いに直接共有結合し得る。あるいは、マルチマーは、オリゴヌクレオチドセグメントから構成され得る。これは、共有結合しないが、他のいくつかの様式（例えば、ハイブリダイゼーションを通して）で結合している。このようなマルチマーは、例えば、Nilsenらの米国特許第5,175,270号に記載されている。結合部位（単数または複数）は、セグメントの末端（通常の3'-5'方向またはランダムな方向）、および／または鎖内の１またはそれ以上の内部のヌクレオチドであり得る。直鎖のマルチマーでは、個々のセグメントは、末端と末端が結合して直鎖状ポリマーを形成する。分枝マルチマーの１つのタイプでは、３またはそれ以上のオリゴヌクレオチドセグメントが、起点から発して分枝状構造を形成する。起点は、別のヌクレオチドセグメント、または少なくとも３つのセグメントが共有結合し得るような多官能分子であり得る。別のタイプでは、１またはそれ以上のペンダントオリゴヌクレオチドセグメントを有するオリゴヌクレオチドセグメント骨格が存在する。これらの後者のタイプのマルチマーは、「フォーク様」、「櫛様」、または「フォーク様」と「櫛様」との組み合わせの構造であり、ここでは、「櫛様」マルチマーは、本明細書において好ましいマルチマーであり、骨格から伸長する多数の側鎖を有する直鎖状の骨格を有するポリヌクレオチドである。ペンダントセグメントは、通常、オリゴヌクレオチドが結合し得るか、さもなければ付着し得るに適切な官能基を有する、改変されたヌクレオチドまたは他の有機部分から垂れ下がり得る。マルチマーは、全体が直鎖状、全体が分枝状、または直鎖状の部分と分枝状の部分との組み合わせであり得る。代表的には、マルチマーには少なくとも２つの分枝点、より好ましくは少なくとも３つの分枝点、より好ましくは約５〜30の範囲の分枝点が存在するが、しかし、いくつかの実施態様ではより多数であり得る。マルチマーは、２本鎖配列からなる１またはそれ以上のセグメントを包含し得る。マルチマー合成および特定のマルチマーの構造に関するさらなる情報は、Urdeaらの共同所有する米国特許第5,124,246号に見出される。
PCT公開第WO92/02526号は、櫛型分枝マルチマーを記載し、これは、特に本方法との組み合わせに好ましく、そしてこれは、直鎖状の骨格およびペンダント側鎖で構成される；骨格は、分析物に結合する分析物核酸または核酸に特異的なハイブリダイゼーション部位を提供するセグメントを含み、一方、ペンダント側鎖は標識されたプローブに特異的なハイブリダイゼーション部位を提供するセグメントの反復を含む。
上記の、「プレアンプリファイヤー」分子もまた使用され得、これは、標識エキステンダー分子と増幅マルチマーとの間の架橋部分として働く。このようにして、より多くのアンプリファイヤーと、従ってより多くの標識が、任意の与えられた標的−プローブ複合体に結合する。プレアンプリファイヤー分子は、直鎖状または分枝状であり得、そして代表的には約30〜約3000の範囲のヌクレオチドを含有し得る。本明細書中の好ましい実施態様では、プレアンプリファイヤー分子は、少なくとも２つの異なる標識エキステンダー分子に結合するので、アッセイの全体の精度が増大する（すなわち、なぜなら、再び、複数のハイブリダイゼーション事象が、プローブ−標的複合体の形成に必要とされるからである）。
【００３４】
本明細書中で使用される「生物学的サンプル」は、個体から単離した組織または液体サンプルをいい、例えば、血漿、血清、髄液、精液、リンパ液、皮膚、呼吸管、腸管、および尿生殖路の外部分泌物、涙、唾液、乳、血球、腫瘍、器官、およびインビトロの細胞培養成分(constituent)のサンプル（細胞培養培地で細胞を増殖させて得られる馴化培地、おそらくウイルスに感染した細胞、組換え細胞、および細胞成分(component)を包含するがそれに限定されない）もまた包含するが、それに限定されない。本方法の好ましい使用は、以下の核酸の検出および／または定量においてである：(a)ウイルスの核酸、例えば、Ｂ型肝炎ウイルス(「HBV」)、Ｃ型肝炎ウイルス(「HCV」)、Ｄ型肝炎ウイルス(「HDV」)、ヒト免疫不全ウイルス(「HIV」)、およびヘルペス科のウイルス（帯状ヘルペス（水痘）、単純ヘルペスＩおよびII型ウイルス、サイトメガロウイルス、エプスタイン−バーウイルス、および最近単離されたヘルペスVI型ウイルスを包含する）由来のウイルス核酸、および(b)細菌の核酸、例えば、クラミジア、ミコバクテリウム属結核菌などの細菌の核酸；および（ｃ）多数の目的のヒト配列。
【００３５】
本明細書中で使用される用語「非特異的ハイブリダイゼーション」は、選択された第２のポリヌクレオチドのセグメントにハイブリダイズすることを意図された第１のポリヌクレオチドのセグメントが、第３のポリヌクレオチドにもハイブリダイズするような出来事をいうために使用され、これは、誤った結果の引き金となる。すなわち、標的分析物は存在しないのに標識が検出され得る状況を生じる。用語「ハイブリダイズする」の使用は、非ワトソン-クリック塩基対形成を除外することを意味しない。
【００３６】
本明細書中で使用される用語「非特異的結合」は、ここで、ポリヌクレオチドが、支持体に結合したポリヌクレオチドへの水素結合を含まない相互作用（直接または間接のいずれでも）を通して固体支持体または他のアッセイ成分に結合するような出来事をいうために使用される。
【００３７】
ここで、図１に表した好ましい実施態様に関しては、以下の用語をそこに示したハイブリダイゼーションアッセイに適用する。（図１では、普遍配列は明瞭な太線で示されていることに注目のこと）
「標識エキステンダー分子(LE)」は、本明細書中で「標識エキステンダー」ともいい、分析物ポリヌクレオチドおよび増幅マルチマー(「AMP」)に相補的な領域を含有する。プレアンプリファイヤーを使用する場合（図では示さず）、標識エキステンダー分子は、増幅マルチマーに直接よりもむしろこの中間種に結合する。プレアンプリファイヤーおよびアンプリファイヤーのどちらも使用しない場合、標識エキステンダー分子は、標識プローブ(「LP」)内の配列に直接結合する。従って、標識エキステンダー分子は、分析物ポリヌクレオチドの配列に相補的な第１の核酸配列L-1と、標識プローブ、増幅マルチマーまたはプレアンプリファイヤーのセグメントM-1に相補的なマルチマー認識配列L-2とを有する第２の普遍領域を有する１本鎖ポリヌクレオチド鎖である。
【００３８】
「標識プローブ(LP)」は、標識エキステンダー、または増幅マルチマーをアッセイに用いる場合には、このマルチマーの反復オリゴヌクレオチドセグメントのいずれかに結合するように設計される。LPは、標識を含有するか、または標識に結合するような構造であるかのいずれかである。従って、LPは、マルチマーの反復オリゴヌクレオチドセグメント内に存在する核酸配列M-2に相補的な核酸配列L-3を包含し、そして、直接的または間接的に検出可能なシグナルを提供する標識に結合するか、または結合するような構造である。
【００３９】
「捕獲エキステンダー分子(CE)」はまた、本明細書中で「捕獲エキステンダー」ともいい、分析物ポリヌクレオチドおよび捕獲プローブに結合し、これは次に固体支持体に結合する。従って、捕獲エキステンダー分子は、核酸配列C-1（これは、分析物の配列に相補的である）を含む第１のポリヌクレオチド配列領域と、捕獲プローブ認識配列C-2を有する第２の非相補的領域とを有する１本鎖ポリヌクレオチド鎖である。配列C-1およびL-1は、それぞれが分析物の物理的に区別される配列に相補的である、同一でない、非相補的な配列である。
【００４０】
「捕獲プローブ（CP）」は、捕獲エキステンダーおよび固体支持体に結合する。従って、図１に示されるように、捕獲プローブは、C-2配列に相補的な核酸配列C-3を有し、そして固体支持体に共有結合する（または共有結合し得る）。
【００４１】
一般に、図１に示したシステムを使用して行われる液相ハイブリダイゼーションアッセイは、以下のように進行する。１本鎖分析物核酸を、捕獲エキステンダーおよび標識エキステンダーとともにハイブリダイゼーション条件下でインキュベートする。得られた生成物は、捕獲エキステンダーおよび標識エキステンダーに結合した分析物ポリヌクレオチドの核酸複合体である。続いて、この複合体を、ハイブリダイズする条件下で、その表面に結合した捕獲プローブを有する固相に添加し得る；しかし、本発明の好ましい実施態様では、最初のインキュベーションを、支持体に結合した捕獲プローブの存在下で実施する。得られた生成物は、捕獲エキステンダー分子および捕獲プローブを通して固相に結合した複合体を含む。次いで、結合した複合体を有する固相は、未結合の物質から分離される。次いで、増幅マルチマー、好ましくは上記のような櫛型マルチマーを、ハイブリダイゼーション条件下で必要に応じて固相−分析物−プローブ複合体に添加し、LEにこのマルチマーをハイブリダイズさせる；プレアンプリファイヤープローブを使用する場合には、この固相−分析物−プローブ複合体を、増幅マルチマーと共に、または好ましくは、増幅マルチマーとのインキュベーションの前に、プレアンプリファイヤーとともにインキュベートする。次いで、得られた固相複合体を、洗浄によりいずれの未結合のプレアンプリファイヤーおよび／またはマルチマーからも分離する。次いで、LEにハイブリダイズし得るか、あるいは増幅マルチマーを使用した場合には、マルチマーの反復オリゴヌクレオチドセグメントにハイブリダイズし得る条件下で標識化プローブを添加する。次いで、得られた固相標識された核酸複合体を洗浄し、未結合の標識されたオリゴヌクレオチドを除去し、そして解読する。図１に表した構成物は、必ずしも正確な拡大率で描かれる必要はなく、そして使用する場合には、増幅マルチマーは（上記で説明したように）図に示したよりもずっと多数の反復オリゴヌクレオチドセグメント（これらはそれぞれ標識プローブに結合するように設計される）を含有することが注目されるべきである。
本方法の第１の焦点は、バックグランドノイズの供給源を排除することであり、これは、捕獲プローブおよび捕獲エキステンダー分子と、標識プローブ、標識エキステンダー分子、およびアンプリファイヤーとの相互作用を最小限にして、支持体に結合した捕獲プローブに、誤った部分が結合する可能性を減少させることによる。
【００４２】
相補的オリゴヌクレオチド配列の間のハイブリダイゼーションは、そこに含まれるプリンおよびピリミジンヌクレオチドの安定な塩基対を形成する能力が前提条件とされる。５つの天然に存在するヌクレオチド、アデノシン（Ａ）、グアノシン（Ｇ）、チミジン（Ｔ）、シチジン（Ｃ）、およびウリジン（Ｕ）は、プリン-ピリミジン塩基対Ｇ-ＣおよびＡ-Ｔ（Ｕ）を形成する。Ｇ-Ｃ塩基対の結合エネルギーは、Ａ-Ｔ塩基対の結合エネルギーよりも大きく、これは以下に示すように、後者の２つの水素結合部分に対して、前者の３つの水素結合部分の存在によるものである：
【００４３】
【化１０】
および
【００４４】
【化１１】
従って、従来の液相核酸サンドイッチアッセイでは、上記に詳細に説明されるように、オリゴヌクレオチド分子は、他のアッセイ成分または標的分析物中の核酸配列に相補的であり、それゆえそのような核酸配列にハイブリダイズする核酸配列を含有するように設計されている。本発明の方法は、独特の塩基対を形成し得るアッセイ成分の普遍オリゴヌクレオチドセグメント中に、非天然ヌクレオチド単位を取り込ませることにより、非特異的ハイブリダイゼーションを減少する。さらに、本発明の方法は、標的分析物の存在および/または量に関連する検出可能な標識されたアッセイ成分を、非特異的に結合し、そしてアッセイのバックグラウンドノイズに寄与するアッセイ成分から分離することにより、アッセイ成分の非特異的結合の寄与を減少する。
【００４５】
本発明の第１の実施態様では、独特の塩基対を形成し得るＡ、Ｔ、Ｃ、Ｇ、およびＵ以外のヌクレオチド単位が、標的分析物特異的でないアッセイ成分のハイブリダイズしているオリゴヌクレオチドセグメント中に取り込まれ、そしてそれゆえ標的-特異的プローブ配列または無関係の非標的核酸配列と安定なハイブリッドを形成しにくいハイブリダイゼーションアッセイを提供する。従って、図１に示すように、例えばこのようなヌクレオチド単位は、相補的核酸配列C-2/C-3、L-2/M-1、およびL-3/M-2に取り込まれ得る。標的分析物の核酸セグメントに相補的なアッセイ成分のハイブリダイズしているオリゴヌクレオチドセグメントは、天然に存在するヌクレオチド（すなわちＡ、Ｔ、Ｃ、ＧまたはＵ）から構築される。ヌクレオチド単位を含有するオリゴヌクレオチドセグメントは、天然に存在するヌクレオチドの約15％〜約100％をヌクレオチド単位対応物に置換することにより構築され得る。好ましくは、オリゴヌクレオチド中の３または４毎の塩基が、独特の塩基対を形成し得るヌクレオチド単位で置換される。置換したヌクレオチド単位の割合が増加するにつれて、非特異的ハイブリダイゼーションが付随して減少することは、当業者に自明である。しかし、完全な置換には、普遍配列間の非特異的ハイブリダイゼーションを排除するのに十分な配列の多様性を維持するために、少なくとも２つの新しい塩基対が必要である。
【００４６】
本発明の別の実施態様では、標的非依存的シグナル産生の現象は、C-2/C-3ハイブリッドまたはL-2/M-1ハイブリッドの融解温度Tm1が、L-3/M-2ハイブリッドの融解温度Tm2よりも十分に低いように形成されたハイブリダイゼーションアッセイを提供することにより取り組まれる。この方法は、融解温度Tm1が融解温度Tm2よりも少なくとも約５℃低い、好ましくは少なくとも約10℃低い、より好ましくは少なくとも約20℃低いようなハイブリッド複合体の設計および構築に基づく。
【００４７】
この安定性の差異は、最初にTm1およびTm2のハイブリッド複合体の形成に好都合なストリンジェントな条件下でアッセイを行うことにより開発される。ストリンジェンシーは、標的分析物の捕獲プローブからの物理的分離またはアンプリファイヤー結合標識プローブの標的からの物理的分離を結果として提供するアッセイの引き続く工程で変更される。ストリンジェンシーは熱力学の変数であるパラメーターを変更することにより制御され得る。このような変数は、当該分野で周知であり、そしてホルムアミド濃度、塩濃度、カオトロピック塩の濃度、pH（水素イオン濃度）、有機溶媒含有量、および温度を含む。好ましいストリンジェンシーの制御手段は、pHおよび塩濃度である：１つのアッセイ工程は、捕獲プローブ/捕獲エキステンダーの間で形成されるハイブリッド複合体を不安定にするか、または標識エキステンダー/アンプリファイヤー（またはプレアンプリファイヤー）の間に形成されるハイブリッドを不安定にするpHまたは塩濃度で行われる。ストリンジェンシーに影響を及ぼす好ましい工程は、基質の添加である。従って、好ましい実施態様では、ハイブリダイゼーションアッセイは、全てのアッセイ成分間で形成されるハイブリッド複合体の安定性に好都合な条件下で行われ、そしてその後、標識基質の添加に伴い、標識プローブが標識エキステンダーまたはアンプリファイヤーから放出されない条件でストリンジェンシーは変更され、捕獲プローブ/捕獲エキステンダー、または標識エキステンダー/アンプリファイヤー（プレアンプリファイヤー）などのハイブリッド複合体を不安定にする。
【００４８】
本発明の別の実施態様は、上記の本発明の実施態様が達成され得る１つの手段が、Tm1ハイブリッド複合体を形成する相補的ヌクレオチド配列がTm2ハイブリッド複合体を形成するヌクレオチド配列よりも短いようなハイブリダイゼーションアッセイを作製することによるものであることを示す。より短い相補的ヌクレオチド配列に伴い、その中の配列の多様性の機会が減少することは当業者に理解される。しかし、この多様性は、非天然塩基対（例えばイソＣ-イソＧ塩基対）を相補的配列中に取り込ませることにより、維持され得る。
【００４９】
Tm1とTm2との間の温度差が大きいほど、バックグラウンドノイズの除去におけるこの技術の「有効性」が大きいことは、当業者に容易に理解される。従って、当業者は、10℃未満の温度差、５℃未満の温度差さえもまた、たとえわずかな程度でもバックグラウンドノイズを減少させることを認識する。
【００５０】
非天然ヌクレオチド単位がハイブリダイズしているオリゴヌクレオチド配列中に取り込まれ、標的分析物とのハイブリダイゼーションの特異性を増加するという本発明に開示される方法は、種々の応用における有用性を提供する。
【００５１】
基本の液相核酸サンドイッチアッセイまたは増幅した液相核酸サンドイッチアッセイでは、多数の捕獲プローブが固体表面に付着される。多くの場合、非特異的結合に利用可能な表面領域は、例えばサケ精子または子ウシ胸腺由来のDNAと共にその表面をインキュベートすることにより制御される。しかし、このDNAの存在は、アッセイ成分の固体支持体への非特異的ハイブリダイゼーションの可能性を増大し、そしてそれゆえ、バックグラウンドノイズを増大する。非天然塩基を含む合成DNAでのこれらの天然DNAの置換は、非特異的ハイブリダイゼーションおよび非特異的結合を最小にする。
【００５２】
好ましくは、これらのポリヌクレオチドは、当業者に周知の方法により、ヌクレオチドの混合物で短いオリゴヌクレオチドを３’テーリングすることにより調製される。あるいは、非天然ヌクレオチドを含有する短いほぼランダムな配列のオリゴヌクレオチドが互いに連結され、ポリヌクレオチドが形成される。この目的のために、分岐したDNAが、好都合に用いられ得る。例えば、ブロック配列-TNVN-F-TNVN-J-TNVN-（ここでFはイソＣであり、そしてJはイソＧである）が調製され、そして化学的に連結されてポリマーを形成する。酵素的３’テーリングアプローチの使用におけるこのアプローチを用いることの利点は、ホモポリマー/ホモオリゴマーの排除である。
【００５３】
非天然ヌクレオチド単位を含有するハイブリダイズするオリゴヌクレオチドの構築が有用性を提供する別の応用は、アンチセンス化合物の設計における応用である。アンチセンス化合物は例えば、Ｃｈｉｎｇら（（１９８９）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８６：１０００６−１００１０）、Ｂｒｏｄｅｒら（（１９９０）Ａｎｎ．Ｉｎｔ．Ｍｅｄ．１１３：６０４−６１８）、Ｌｏｒｅａｕら（（１９９０ ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔｅｒｓ ２７４：５３−５６）、およびPCT公報第WO91/11535号、第WO91/09865号、第WO91/04753号、第WO90/13641号、第WO91/13080号、および第WO91/06629号により説明されている。アンチセンス化合物は、特定のタンパク質の産出をになうmRNAに結合し、そしてmRNAの産生を無効にするか、または阻害するオリゴヌクレオチドである。従来のアンチセンス分子は、一般に、種々のオリゴヌクレオチド種と反応し得る。しかし、その長さ（一般に30ヌクレオチド単位までのオリゴヌクレオチド配列）のために、このようなアンチセンス分子には非標的種との非特異的ハイブリダイゼーションに関連する問題が存在する。１つの解決手段は、多彩なプローブおよび標的の間のハイブリダイゼーションの短い配列を用いることであり；全ての複合体を強固にするために、Ｄｉｓｔｅｆａｎｏら（（１９９２）Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１１４：１００６−１００７）に記載のように、プローブの間の短い「２量体化領域（dimerization region）」が用いられる。２量体化領域は、非天然ヌクレオチド単位を含有する相補的配列を伴う末尾を有し、それにより非標的分析物への非特異的ハイブリダイゼーションを増大することなく、標的分析物への高度に効率的かつ特異的な結合を提供するように設計され得る。この観念を、２本鎖DNA標的とともに図２に図解する。
【００５４】
図２に説明したように、鎖の置換は２本鎖DNAを引き離すために用いられ得る。超ヘリックスのストレス下のAT-リッチなプロモーター配列は、S1ヌクレアーゼ感受性であり、従って、既に部分的に１本鎖であり、このタイプのアンチジーン（antigene）応用のための特に好ましい部位である。短いオリゴヌクレオチドは特異性を最大化するために使用される；標的へのこれらの結合エネルギーは、互いに連結してオリゴヌクレオチドのネットワークを形成することにより増強される。
【００５５】
この構造物において、標的の非存在下で安定な塩基対を形成しない短い普遍配列は、イソＣおよびイソＧを含有し、プローブのヒトの配列との非特異的ハイブリダイゼーションを制限する。プローブ１、２および３の標的への結合において、普遍配列は、その有効濃度が顕著に増加するほど十分に、近密に接近している。次いで、普遍配列が対をなし、結合の強さをさらに増大する。RNA標的もまた、このアプローチに関連して用いられる。
【００５６】
Ｇｏｌｄらの米国特許第5,270,163号、Ｔｕｅｒｋら（（１９９０）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４９：５０５−５１０）、Ｓｚｏｓｔａｋら（（１９９０）Ｎａｔｕｒｅ ３４６：８１８−８２２）、およびＪｏｙｃｅ（（１９８９）Ｇｅｎｅ ８２：８３−８７）に記載のSELEX手順は、所望の標的分子を、その形状によって認識し、そして結合するRNAまたはDNA配列を選択するために使用され得る。用語「アプタマー」（または核酸抗体）は、本明細書において、このような１本鎖または２本鎖DNAあるいは１本鎖RNA分子をいうのに用いられる。例えば、PCT公報第WO92/14843号、第WO91/19813号、および第WO92/05285号を参照のこと（これらの開示は本明細書中に参考として援用される）。「標的分析物」とは区別される「標的分子」は、タンパク質、多糖類、オリゴヌクレオチド、または他の高分子などの重合体、および薬物、代謝物、毒素などの小分子を含み、アプタマーはそれに結合するように設計される。
【００５７】
SELEX手順において、ｎマー（好ましくは、ランダム化したヌクレオチド配列、それによってオリゴヌクレオチドの「ランダマープール（ｒａｎｄｏｍｅｒ ｐｏｏｌ）」を形成している）が２つのポリメラーゼ連鎖反応（PCR）プライマーに隣接しているオリゴヌクレオチドが構築される。次いで、この構築物を、オリゴヌクレオチドの標的分子への結合に好都合な条件下で標的分子に接触する。標的分子に結合するこれらのオリゴヌクレオチドは：（a）濾過、遠心分離、クロマトグラフィーなどの従来の方法を用いて、標的分子に結合しないオリゴヌクレオチドから分離され；（b）標的分子から解離され；そして（c）従来のPCR技術を用いて増幅され、リガンドリッチなオリゴヌクレオチドのプールを形成する。さらに、所望の結合親和性、特異性、またはその両方を有するアプタマーが達成されるまで、結合、分離、解離および増幅の繰り返しが行われる。次いで、同定された最終的なアプタマー配列が、化学的にまたはインビトロの転写により調製され得る。このようなアプタマーを調製する場合、選択された塩基対が非天然塩基対で置換され、アプタマーがヒト核酸にハイブリダイズする可能性を減少する。
【００５８】
本発明は、SELEXの少なくとも２つの一般的な方法において用いられ得る。第１に、イソdGおよびイソdCは、ランダマーDNA配列プール中の配列中に含まれ得る。タンパク質または他の重要な生物分子を認識し得る可能なランダマーの構造の数は、従来の４つのヌクレオチドＡ、Ｔ、ＧおよびＣよりも６以上のヌクレオチドからDNA鎖を合成することにより増加する。これは次に、標的分子に対してより強い親和性および/または特異性で結合する配列を同定する機会を改善する。
【００５９】
SELEXにおいて、選択される保存されたオリゴヌクレオチドは、細胞の配列への所望されないハイブリダイゼーションを有し得る。この非特異的ハイブリダイゼーションは、選択プロセスにおいて非天然塩基を用いることにより減少され得る。ヒトRNAおよびDNAポリメラーゼには認識されないが、一定のファージまたは細菌のポリメラーゼには認識されるヌクレオチドは、この応用において特に有用である。
【００６０】
SELEXプロセスにおける本発明の第２の使用法は、非特異的ハイブリダイゼーションを最小化した最終的なアプタマー構築物の調製における使用である。例えば、予め決定された結合親和性、特異性、または他の標的分子認識特性を示すアプタマーが、SELEXプロセスを用いて、RNAまたはDNA配列のプールから選択される。これらの標的分子認識特性は、分子間オリゴヌクレオチドハイブリッド複合体の形成により部分的に維持されるアプタマーの２次構造によって決定される。アプタマーの２次構造の解明において、所定の分子間ハイブリッド複合体中の塩基対の特異性が、アプタマーの２次構造の維持、それ故、標的分子認識および結合特性の維持に高度に好ましいことは当業者に自明であり、すなわち、好ましくはＧ-ＣまたはＡ-Ｔである塩基対が存在する。これらの分子内ハイブリッド複合体中（例えば、ステムループの塩基対形成部分）に他の塩基対が存在し、これは、アプタマーの２次構造を改変することなく任意の相補的ヌクレオチド対（本明細書中ではＮ-Ｎ’塩基対という）により置換され得る。
【００６１】
最終的なアプタマー構築物における選択されたＮ-Ｎ’塩基対ならびにＧ-ＣおよびＣ-Ｇ塩基対の、イソＧ-イソＣまたはイソＣ-イソＧへの単一の置換は、非標的オリゴヌクレオチド配列への非特異的ハイブリダイゼーションを減少する。イソＣ-イソＧ塩基対はＣ-Ｇ塩基対と等エネルギーであるので、分子の基本的形状およびヘアピンの強度は非常に似ている。得られる配列がＣ-ＧよりもＡ-ＵまたはＵ-Ａに強い優先度を示す塩基対を置換するために、Ａ-Ｕと等エネルギーの塩基対が望ましい。これらの置換は、細胞のRNAおよびDNA配列への所望されないハイブリダイゼーションの可能性を制限することにより、標的分子に対してより特異的なアプタマーを作製することにおいて効果を有する。
【００６２】
基本的なプロセスにおいて、選択された塩基対はイソＣ-イソＧまたはイソＧ-イソＣ塩基対で置換される。最終的な構築物において、イソＣ-イソＧ塩基対はリボヌクレオチドまたはデオキシリボヌクレオチドを含む。キメラのアプタマー（リボヌクレオチドおよびデオキシリボヌクレオチドの両方からなる）分子は合成的に作製され得る。あるいは、リボ-イソGTPおよびリボ-イソCTP（適切な２’保護を有する）が、イソＣおよびイソＧを含有するDNAテンプレートのインビトロ転写によるアプタマーの調製に使用され得る。
【００６３】
本発明が有用性を提供し得る他の応用は、ハイブリダイゼーションアッセイ中、およびポリメラーゼ連鎖反応（PCR）アッセイ中の非特異的結合の減少における、インサイチュハイブリダイゼーションを含む。
【００６４】
インサイチュハイブリダイゼーションは、標的分析物の単一分子を検出するのに十分な感受性を欠いている。インサイチュPCR（例えば、Ｂａｇａｓｒａら、（１９９３）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ １５８：１３１−１４５）は、この感受性の必要性を達成するために開発された；しかし、定量はPCR法ほど正確ではない。代替法は、標的分子と結合する複数の標識エキステンダープローブを使用する。標識エキステンダーは、プレアンプリファイヤーまたはアンプリファイヤーのいずれかを結合する。使用される場合、プレアンプリファイヤーは標識エキステンダーおよびアンプリファイヤーを架橋する。アンプリファイヤーは標識されたプローブ（好ましくはルミネッセンス（感受性が十分高い場合には蛍光）により検出される）を結合する。上記のように、普遍配列L-2/M-1およびM-2/L-3は、ヒト配列への所望されないハイブリダイゼーションを減少するようにイソＣおよびイソＧを最適には15〜30％の間で含有する短いオリゴヌクレオチドからなる。第４の塩基対は、これらの配列中の天然塩基の主張をさらに減少するために使用され得る。
【００６５】
上記に示したように、非特異的結合ならびに非特異的ハイブリダイゼーションは、非天然塩基対の使用により減少され得る。６〜８の異なるヌクレオチドからなるランダムなポリマーまたはほぼランダムなブロックコポリマーが、ポリヌクレオチドに対して高い親和性を有する細胞成分へのアンプリファイヤーおよび標識されたプローブの非特異的な結合を減少するために使用され得る。従って、非特異的結合は、一般的に行われるような子ウシまたはサケ由来の天然配列を導入することによる非特異的ハイブリダイゼーションの増加の危険性なしに、減少される。
【００６６】
当業者は、固体の支持体へのプローブの非特異的ハイブリダイゼーションおよび非特異的結合を減少するために、同じストラテジーが、ドットブロット、サザーンおよびノーザンなどのブロットアッセイに適用され得ることを理解する。
【００６７】
本発明はまた、PCRおよび他の指数関数的な増幅技術におけるいくつかの使用を提供する。例えば、ネステッド（nested）PCRでは、標的分析物は最初に増幅され、次いで数千倍に希釈された後、１つのプライマーの５’突出部を捕獲のために使用し、他方のプライマーの突出部を標識のために使用することが一般的である。ポリメラーゼにより判読不可能なスペーサーは、突出部が１本鎖のままで残るように挿入される（例えば、Ｎｅｗｔｏｎら（１９９３）Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄ．Ｒｅｓ．２１：１１５５−１１６２を参照のこと）。これらの５’突出部中の一般的な配列は、非標的におけるプライミングの頻度を減少するために改変された塩基対を含有するように調製され得る。実際、５’突出部の最初の塩基におけるイソdCまたはイソdGの存在は、現在使用されるスペーサーの代わりに使用され得る；ポリメラーゼはイソdCまたはイソdGを判読し得ない。なぜならば、ポリメラーゼは、それの代わりに配置するイソdGTPまたはイソdCTPを有さないからである。ポリメラーゼは、プライマー中にイソdGを検出した場合、低い頻度でポリマー中にＴを配置し得るので、５’突出部における最初の塩基としてイソＣを使用することが好ましい。
【実施例】
【００６８】
（実験）
本発明の実施には、他に示さない限り、当該分野の技術範囲内である、合成有機化学、生化学、分子生物学などの従来技術を使用する。このような技術は文献に詳細に説明されている。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ、ＦｒｉｔｓｃｈおよびＭａｎｉａｔｉｓ、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、第２版（１９８９）；Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ（Ｍ．Ｊ．Ｇａｉｔ編、１９８４）；Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ（Ｂ．Ｄ．ＨａｍｅｓおよびＳ．Ｊ．Ｈｉｇｇｉｎｓ編、１９８４）；およびシリーズ、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．）を参照のこと。
【００６９】
本明細書に記載される（上記および下記の両方）全ての特許、特許出願、および刊行物は、本明細書中で参考として援用される。
【００７０】
本発明は、その好ましい特定の実施態様と共に記述されるが、上記記述および以下の実施例は、本発明の範囲を説明することを意図し、そして本発明の範囲を限定しないということが理解されるべきである。本発明の範囲内の他の局面、利点、および改変は、本発明が属する分野の当業者に明らかである。
【００７１】
以下の実施例において、使用した数（例えば、量、温度など）に関して正確さを確保するために努力がなされたが、いくつかの実験誤差および偏差が考慮されるべきである。温度は常に℃であり、そして他に示さない限り、圧力は大気圧であるか、またはほぼ大気圧である。
【００７２】
（イソグアノシンまたは2'-デオキシ-イソグアノシンの合成）
イソグアノシンまたは2'-デオキシ-イソグアノシンの合成のための手順は、ほとんど報告されていない。例えば、2'-デオキシ-イソグアノシンは：１）塩基性条件下で直接光分解により2'-デオキシアデノシン-(N1-オキシド）を介して2'-デオキシアデノシンから合成される（Switzerら(1993)、前出）；２）塩基性条件下で直接光分解により2-クロロ-2'-デオキシアデノシンから合成される（Ｓｅｅｌａら（１９９２）Ｈｅｌｖ．Ｃｈｉｍ．Ａｃｔａ ７５：２２９８−２３０６）；および３）6-アミノ-1-(2'-デオキシ-β-D-エリトロペントフラノシル)-1H-イミダゾール-4-カルボニトリル[AICA 2'-デオキシヌクレオシド]（これをベンゾイルイソシアネートと反応させ、続いてアンモニアと処理してピリミジン環の環生成を行う）から化学的経路により合成される（Ｋａｚｉｍｉｅｒｃｚｕｋら（１９９１）Ｈｅｌｖ．Ｃｈｉｍ．Ａｃｔａ ７４：１７４２−１７４８）。
【００７３】
しかし、2'-デオキシアデノシン-(N1-オキシド）の2'-デオキシ-イソ-グアノシンへの光分解変換は、容易にスケールアップし難いので、容易に入手可能な2'-デオキシリボヌクレオシド出発物質から2'-デオキシ-イソグアノシンへの簡便な化学的経路を開発した。
【００７４】
特定の「変換可能」2'-デオキシグアノシン誘導体（例えば、O6-フェニル-2'-デオキシグアノシン）を介する、2'-デオキシグアノシンの2,6-ジアミノプリンヌクレオシドおよびN6-アルキル-2,6-ジアミノプリンヌクレオシドへのいくつかの変換手順が記載されている（ＭａｃＭｉｌｌａｎら（１９９１）Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ ４７：２６０３−２６１６；Ｇａｏら（１９９２）Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．５７：６９５４−６９５９；およびＸｕら（１９９２）Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ ４８：１７２９−１７４０）。さらに、Ｆａｔｈｉら（１９９０）Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔｅｒｓ ３１：３１９−３２2は、2'-デオキシグアノシンの無水トリフルオロ酢酸／ピリジンでの処理、続いてインサイチュでのフェノールでの置換を含む手順を用いるO6-フェニル-2'-デオキシグアノシンの簡便な合成を記載した。あるいは、2'-デオキシグアノシンへのO6-フェニル部分の導入が、Ｒｅｅｓｅら（１９８４）Ｊ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．Ｐｅｒｋｉｎ Ｔｒａｎｓ．Ｉ、1263-1271により記載されており、ここで中間体O6-(4-トルエンスルホニル)-2'-デオキシグアノシンをトリメチルアミン、続いてフェノールで処理してO6-(4-トルエンスルホニル）を置換し、O6-フェニル-2'-デオキシグアノシンを得た。イソグアノシン様化合物を、S酸化により（2-(メチルスルホニル)-6-アミノ-ピラゾロピリミジンリボヌクレオシドを生成する）2-(メチルメルカプト)-6-アミノ-ピラゾロピリミジンリボヌクレオシドから産生し、続いてNaOHで置換してイソグアノシンアナログを得た（Ｃｏｔｔａｍら（１９８３）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ １１：８７１−８８２）。
【００７５】
亜硝酸アルキルを用いるグアノシンおよび2'-デオキシグアノシン中の2-アミノ基の変換が記載されている。これらは、ラジカル反応における2-ハロへの変換（Ｎａｉｒら（１９８２）Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ６７０−６７２）、および2-(メチルメルカプト)-6-クロロ-プリンリボヌクレオシドへの変換（Ｔｒｉｖｅｄｉ（１９９１）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、Ｔｏｗｎｓｅｎｄら（編）Ｗｉｌｅｙ Ｉｎｔｅｒ−Ｓｃｉｅｎｃｅ、パート４、２６９−２７３）を包含する。O6-(p-ニトロフェニルエチル)-3',5'-O-ジ-t-ブチル-ジメチルシラン-2'-デオキシグアノシンを新鮮な（neat）亜硝酸ペンチルで酸化することにより、O6-(p-ニトロフェニルエチル)-3',5'-O-ジ-TBDMS-2'-デオキシキサントシンが得られることが報告されている（Ｓｔｅｉｎｂｒｅｃｈｅｒら（１９９３）Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．Ｅｎｇｌ．３２：４０４−４０６）。
【００７６】
2'-デオキシ-イソグアノシンの合成手順は、Ｓｅｅｌａら（１９９４）Ｈｅｌｖ．Ｃｈｉｍ．Ａｃｔａ ７７：６２２−３０に記載されている。第１工程において、2'-デオキシグアノシンを2-アミノ-2'-デオキシアデノシンに変換した。第２工程において、亜硝酸ナトリウムで2-アミノ基をジアゾ化することにより、2-アミノ-2'-デオキシアデノシンを脱アミノ化し、2'-デオキシ-イソグアノシンを得た。
【００７７】
以下の構造式
【００７８】
【化１２】
（ここで、R1は、水素、ヒドロキシル、スルフヒドリル、ハロゲノ、アミノ、アルキル、アリルおよび-OR2からなる群から選択され、ここでR2はアルキル、アリル、シリル、またはホスフェートである）を有する化合物を合成するための本明細書に開示および請求される方法は：
ａ）以下の構造式
【００７９】
【化１３】
を有する化合物を、3'および5'の両方のヒドロキシル基を保護するに適切な試薬と反応させる工程；
ｂ）工程（ａ）の産物を、O6-オキシ部分を求核置換を受けやすい官能基に変換するのに適切な試薬と反応させ、それにより官能基化O6部分を生成する工程；
ｃ）工程（ｂ）の産物の2-アミノ基を酸化する工程；
ｄ）工程（ｃ）の産物を求核試薬と反応させ、官能基化O6部分を置換する工程；および
ｅ）工程（ｄ）の産物を、保護された3'および5'ヒドロキシル基を脱保護するのに適切な試薬と反応させる工程。
【００８０】
グアノシンまたは2'-デオキシグアノシンの、それぞれイソグアノシンまたは2'-デオキシ-イソグアノシンへの変換は、適切な試薬（例えば、TBDMS、塩化ベンゾイル、無水酢酸など）を用いて糖部分のヒドロキシル基を保護することにより達成され得る。前述したように、糖部分のヒドロキシル基のうちの１つまたはそれ以上が、ハロゲン、脂肪族基により置換され得るか、またはエーテル、アミンなどに官能基化され得る。産物は単離され、そしてO6が適切な求核試薬により置換され得るように修飾される。このような置換可能基の例としては、例えば、CH3-S-C6H4-O6-、C6H5-SO2-O6-、C6H5-O6-、4-ニトロ-C6H4-O6-、2,4,6-トリニトロ-C6H2-O6などが挙げられる。次いで、2-アミノ基が、亜硝酸アルキル、または当該分野で公知の他の適切な試薬（Nairら(1982)、前出；Trevidi(1991)、前出；またはSteinbrecherら(1993)、前出を参照のこと）を用いて、オキシ官能基に変換される。産物を適切な求核試薬（例えば、NH4OH、または末端-NH2、-SH、-COOHなどを含む他のアミノアルキル、アミノアリール、アミノへテロアルキル、アミノヘテロアリール）と反応させ、それにより修飾O6脱離基を置換する。保護されたヒドロキシル基の脱保護は、例えば、塩基またはフッ素で処理することにより達成され得る。
【００８１】
以下の考察において、O6-(4-メチルチオフェニル）は、典型的な置換可能基として役立つ。しかし、その使用は、特定の実施態様を記載するためのみであり、限定されることは意図しない。
【００８２】
N6-アルキル化イソグアノシン誘導体は、アルキルアミンを求核試薬として用いることにより容易に合成され得る。例えば、ヘキサンジアミンがO6-(4-メチルチオフェニル）を置換するために使用され、N6-(6-アミノヘキシル)-イソグアノシンを形成し得る。アミノヘキシル基の保護（例えば、トリフルオロアセトアミド誘導体として）およびそれに続くホスホラミダイト試薬への変換により、官能基化可能イソグアノシンアナログが提供される。このアナログは、さらなる合成後の誘導体化のためにオリゴヌクレオチド中の任意の所望の位置に取り込まれ得る。従って、選択されたイソグアノシン／イソシチジン塩基対のイソグアノシン部分を特異的に標識することが可能である。O6-(4-メチルチオフェニル）基を適切に末端化された（terminated）求核試薬（例えば、-COOH、-SH、-NH2など）で単純に置換することにより、任意の所望の官能性を有するイソグアノシンの一連のN6-誘導体を合成することも可能であり、誘導体が容易に調製され得る。
【００８３】
さらに、O2-(4-メチルチオフェニル)-2'-デオキシキサントシン、その完全に保護されたホスホラミダイト形態（O2-(4-メチルチオフェニル)-5'-O-DMT-3'O-(BCE-ジイソプロピルホスホラミダイト)-2'-デオキシキサントシン）は、オリゴヌクレオチドへの取り込み後の変換可能誘導体として使用され得る。アルキルジアミン、または他の官能基化アルキルアミンでO2-(4-メチルチオフェニル)-2'-デオキシキサントシンからO2-(4-メチルチオフェニル）を合成後置換することにより、N6-(アミノアルキル)-2'-デオキシ-イソグアノシン含有オリゴヌクレオチドが産生される。誘導体化イソグアノシンは、官能基化イソグアノシン残基で標識または他のレポーター分子を特異的に導入するための部位として役立ち得る。
【００８４】
（合成アプローチの概略）
スキーム１に示すように、2'-デオキシ-イソグアノシンの合成を、2'-デオキシグアノシンから以下のような５工程で行った：
１）2'-デオキシグアノシンの3',5'-O-(t-ブチルジメチルシリル)2-2'-デオキシグアノシンへの変換（および再結晶による精製）（Ｏｇｉｌｖｉｅら（１９７３）Ｃａｎ．Ｊ．Ｃｈｅｍ．５１：３７９９−３８０７）；
２）O6-(4-トルエンスルホニル)-3',5'-O-TBDMS2-2'-デオキシグアノシンへの変換；
３）O6-(4-(メチルチオ)フェニル)-3',5'-O-TBDMS2-2'-デオキシグアノシンを得るためのReeseの手順を用いる、適切なフェノール（例えば、4-(メチルチオ)フェノールまたはペンタクロロフェノール（phentachlorophenyl））でのO6における4-トルエンスルホニル基の置換（Reeseら(1984)、前出）；
４）O6-(4-(メチルチオ)フェニル)-3',5'-O-TBDMS2-2'-デオキシキサントシンを得るための中性条件下で亜硝酸tert-ブチルを用いる2-アミノ基のオキシ官能基への酸化（Steinbrecherら(1993)、前出）；および
５）3',5'-O-TBDMS2-2'-デオキシ-イソグアノシンを得るための高温でのO2-(4-メチルチオフェニル）基の水酸化アンモニウムでの置換。
【００８５】
グアノシンからのイソグアノシンの合成は、同様の反応スキームを用いて達成され得る。
【００８６】
【化１４】
【００８７】
【化１５】
【００８８】
【化１６】
得られた物質は、刊行されている光分解経路（Switzerら(1993)、前出）により調製した基準試料と全ての点（TLC、HPLC、UV、およびNMR）で同一であった。
【００８９】
（イソシチジンまたは2'-デオキシ-イソシチジン誘導体の調製）
イソシチジンまたは2'-デオキシ-イソシチジンの誘導体が調製され得る。ここでグリコシド結合は、オリゴヌクレオチド合成の間、希酸への曝露に対して安定化されている。N2-アミジン誘導体は、2'-デオキシアデノシンについて例えば、ＭｃＢｒｉｄｅら（１９８６）Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１０８：２０４０−２０４８、Ｆｒｏｅｈｌｅｒら（１９８３）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１１：８０３１−８０３６およびＰｕｄｌｏら（１９９４）Ｂｉｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔｔ．４：１０２５−１０２８により記載されている。N2-(N,N-ジ(X)ホルムアミジノ)-2'-デオキシ-イソシチジンを以下の手順により合成した。本明細書に例示されるように、Ｘはn-ブチルである。しかし、Ｘは、C2-C10アルキル、アリール、ヘテロアルキル、ヘテロアルキルなどでもよい。
【００９０】
N-ジ-n-ブチルホルムアミドジメチルアセタールを、McBrideら(1986)、前出、Froehlerら(1983)、前出、およびPudloら(1994)、前出に記載のようにN,N-メチルホルムアミドジメチルアセタールとジ-n-ブチルアミンとのアミノ交換反応により合成した。10mmoleの2'-デオキシ-5-メチル-イソシチジンを100mlのメタノールに懸濁し、そして10mmoleのN,N-ジ-n-ブチルホルムアミドジメチルアセタールを添加した。室温で２時間撹拌後、透明な溶液が得られた。塩化メチレン中の10％メタノールを用いて展開したシリカ60Hの薄層クロマトグラフィー分析は、出発物質が完全に消費されたことを示した。水（10ml）を添加して過剰の試薬を分解し、そして溶媒を減圧下で除去して3.8gの粗N2-(N,N-ジブチルホルムアミジノ)-2'-デオキシ-イソシチジンを得た。この誘導体は、オリゴヌクレオチドへの取り込みのために5'-O-DMT-N2-(N,N-ジブチルホルムアミジノ)-2'-デオキシ-イソシチジンに直接変換され得る。
【００９１】
他のイソシチジン誘導体が調製され得、これは、検出可能な標識がオリゴヌクレオチドの特定の位置に取り込まれ得ることにより官能基化可能な置換基を提供する。例えば、5-アルキル化2'-デオキシウリジン誘導体（例えば、5-[N-(6-トリフルオロアセチルアミノヘキシル)-3-(E)アクリルアミド]-2'-デオキシウリジン）は、Ｒｕｔｈ（１９９１） Ｏｌｉｇｏｄｅｏｘｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ ｗｉｔｈ Ｒｅｐｏｒｔｅｒ Ｇｒｏｕｐｓ Ａｔｔａｃｈｅｄ ｔｏ ｔｈｅ Ｂａｓｅ、Ｅｃｋｓｔｅｉｎ（編）Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ ａｎｄ Ａｎａｌｏｇｕｅｓ、ＩＲＬ ｐｒｅｓｓ、２５５−２８２頁により記載されている。このような5位誘導体は、塩基対ハイブリダイゼーションパターンを妨害しないことが見出されている。Ruthにより記載される化学を使用して5-[N-(6-トリフルオロアセチルアミノヘキシル)-3-(E)アクリルアミド]-2'-デオキシ-イソシチジンを合成し、それにより選択されたイソグアノシン＊イソシチジン塩基対で検出可能に標識され得る官能基化イソシチジンを提供し得る。
【００９２】
イソシチジンおよび2'-デオキシ-イソシチジンのこれらおよび他の5位誘導体は、塩基対形成に対してさらなる安定化を提供する。このような誘導体としては、5-β-プロピニル（Ｆｒｏｅｈｌｅｒら（１９９３）Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔ．３４：１００３−１００６を参照のこと）、5-β-プロペニルあるいは他の5-アルキルイソシチジン、または2'-デオキシ-イソシチジン誘導体が挙げられる。
【００９３】
本発明に従って核酸ハイブリダイゼーションアッセイを実施するためのキットは、パッケージされた組合わせ中に、少なくとも１つのハイブリダイズするオリゴヌクレオチドプローブ、分析物とハイブリッド複合体を形成し得るセグメント、およびハイブリッド複合体を検出する手段を含み、ここで少なくとも１つのハイブリダイズするオリゴヌクレオチドプローブは、A-TおよびG-C塩基対が形成される条件下で、アデノシン（Ａ）、チミジン（Ｔ）、シチジン（Ｃ）、グアノシン（Ｇ）またはウリジン（Ｕ）と有効に塩基対を形成しない第１のヌクレオチド単位を含む。この試薬は、代表的にはキット中の別々の容器内にある。このキットはまた、分析物を変性させるための変性剤、ハイブリダイゼーション緩衝液、洗浄溶液、酵素基質、ネガティブコントロールおよびポジティブコントロール、ならびにアッセイを実施するための指導書を含み得る。
【００９４】
本発明のポリヌクレオチドは、同一人に譲渡された米国特許出願第07/813,588号に詳細に記載されているように、固相直接オリゴヌクレオチド合成、酵素的連結法、および液相化学合成の組合わせを用いてアセンブルされ得る。
【００９５】
オリゴヌクレオチドの全ての化学合成は、自動DNA合成機（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ／Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ Ｄｉｖｉｓｉｏｎ ｍｏｄｅｌ ３８０Ｂ）で行われ得る。PHOSTELTM試薬（DMT-O-CH2CH2-(SO2)-CH2CH2-O-P(N(iPr)2)(-O-CH2CH2CN)、ここでDMTはジメトキシトリチルであり、そしてiPrはイソプロピルである）を用いる5'-リン酸化を含むβ-シアノエチル型のホスホラミダイト化学を使用した。他に示さない限り、標準の製造者プロトコルを使用した。
【００９６】
（実施例１）
（標的特異的エキステンダー配列の一般的アッセイ成分との非特異的ハイブリダイゼーションにより生じるアッセイバックグラウンドノイズ）
アッセイバックグラウンドノイズが、標的特異的エキステンダー配列の一般的アッセイ成分との交差ハイブリダイゼーションによりどのように生じ得るかを決定するために、表１、２、および３に示すような捕獲エキステンダーおよび標識エキステンダーのプールを用いて増幅DNAハイブリダイゼーションアッセイを行い、M13ファージを定量した。
【００９７】
【化１７】
【００９８】
【化１８】
【００９９】
【化１９】
例示目的のために、空白は、3'非標的結合領域を各プローブの標的結合領域から分離する。
【０１００】
実質的にPCT公報第WO95/16055号に記載のようにアッセイを行った。簡潔に述べれば、捕獲エキステンダーの非標的結合領域に相補的な捕獲プローブを含むマイクロタイターウェル中で、63℃にて一晩ハイブリダイゼーション後、プレートを室温で10分間冷却し、0.1xSSC（15mM NaCl；1.5mMクエン酸ナトリウム；pH7.0）、0.1％ドデシル硫酸ナトリウムを含む緩衝液で２回洗浄した。標識エキステンダーの3'非標的結合領域に相補的な15x 3（各々３つのアルカリホスファターゼプローブ結合部位を有する15の「枝（arm）」）分枝DNAアンプリファイヤー（100fm）をウェルに添加し、そして53℃にて30分間インキュベーションを続け、その後プレートを上記のように冷却および洗浄した。アルカリホスファターゼプローブ（200fm）をウェルに添加し、そして53℃にて15分間さらにインキュベートした後、プレートを上記のように再び冷却および洗浄した。0.1xSSC緩衝液を用いてさらなる３回の洗浄を行った。20分後、ジオキセタンホスフェート基質溶液Lumiphos 530（Lumigen）中で、Chiron luminometerでシグナルを検出した。結果を表４に示す。
【０１０１】
【化２０】
プールＢ捕獲エキステンダーの添加は、正味のシグナルを増加させないが、ノイズを約100倍に増加させる。関与する配列のコンピューター分析により、プールＢの捕獲エキステンダー#8は、分枝DNAアンプリファイヤー（9マーオリゴ(dA)--オリゴ(dT)を含む）のT20--LLA2配列との広範囲にわたる相同性を有し、一方、プールＢの捕獲エキステンダー#9は、分枝DNAアンプリファイヤーのBLA3c配列との広範囲にわたる相同性を有することが示された。
【０１０２】
本発明は、ハイブリダイゼーション依存アッセイバックグラウンドノイズの問題を検討する。「天然の」ヌクレオベースと安定な塩基対を形成しないヌクレオチドにより中断されるヌクレオチド配列が構成され、それによりこのような配列の天然の配列とのハイブリダイゼーションが阻害される。理想的には、普遍配列中の３塩基ごとまたは４塩基ごとの塩基は、Ａ、Ｃ、Ｇ、またはＴ(Ｕ）と対形成しない改変ヌクレオチドである。Ｃ*Ｇ塩基対と等エネルギーの塩基対を使用することにより、普遍配列長を減少させることもできる。統計学的議論は、これがまた、普遍配列間、および普遍配列とサンプル中の非標的配列との間、ならびに普遍配列とエキステンダープローブ中の標的特異的配列との間の望ましくない交差ハイブリダイゼーションの頻度を減少させるはずであることを示す。安定なハイブリッドを形成する多座結合に応じて、普遍配列長をさらに減少させ得る（WO95/16055を参照のこと）。全ての普遍配列は、少なくとも６つ、好ましくは８つのヌクレオチドを用いて設計される：捕獲プローブ、捕獲エキステンダーテール、標識エキステンダーテール、アンプリファイヤー、標識プローブ、およびプレアンプリファイヤー（適用可能な場合）。
【０１０３】
（実施例２）
（イソＣ-イソＧ塩基対の特異性および強度）
イソＣ-イソＧ塩基対の特異性および強度を決定するために、熱融解分析を以下のオリゴヌクレオチドに対して行った：
１）5'(L) CA CCA CTT TCT CC(T)3' （配列番号25）；
２）5'(L) CA CFA CTT TCT CC(T)3' （配列番号26）；
３）3'(T) GT GGT GAA AGA GG 5' （配列番号27）；
４）3'(T) GT GJT GAA AGA GG 5' （配列番号28）；および
５）5' CA CTA CTT TCT CC(T)3' （配列番号29）。
【０１０４】
これらのオリゴヌクレオチドのコアハイブリッドは、13のヌクレオチドからなる。塩基対形成に関与しないヌクレオチドを括弧内に示す。Ｌは１級アミンであり、ＦはイソＣであり、ＪはイソＧである。熱融解分析を、3xSSC（0.45M NaCl、0.045Mクエン酸ナトリウム）、pH7.9中、Cary 3E分光光度計で行った。一緒にインキュベートした２つのオリゴヌクレオチドの各々は、約1.5μMで存在した。Tmを、dA260/dT対温度プロットにおける最大値として計算した。表４に示す結果は、イソＣ*イソＧ塩基対が天然のＣ*Ｇ塩基対と等エネルギーであることを示す。
【０１０５】
【化２１】
従って、ほぼ等モルのＣ、Ｇ、イソＣ、イソＧ、Ａ、およびＴを含む普遍配列は、ほぼ等比でＡ、Ｔ、Ｃ、Ｇのみを含む配列よりも短くなり得る。これは、サンプル中の天然の非標的配列、ならびにＡ、Ｔ(Ｕ）、Ｃ、およびＧからなるようにより強制されるか、あるいはより強制されないLEおよびCE標的結合配列との交差反応性の潜在能力を制限する。
【０１０６】
このデータはまた、イソＣ＊イソＧ塩基対の特異性を示す。イソＣ＊ＧおよびイソＧ＊Ｃ対はミスマッチとして挙動する。古典的には、不安定化の℃はミスマッチのパーセントにより近似される。従って、Tmの約7.5℃の変化により、13のヌクレオチドにおいて１つのミスマッチ（7.5％ミスマッチ）が生じることが予想される。Ｃ＊ＧまたはイソＣ＊イソＧマッチがミスマッチと比較される場合に観察される８℃の変化は、Ａ、Ｔ、Ｃ、およびＧコードとの平均ミスマッチにおいて生じる変化と同様である。
【０１０７】
イソＧは、少なくとも２つの互変異性体（ケトおよびエノール）で存在する。ケト形は、水性溶媒中で好ましく、そしてエノールは、有機溶媒中で好ましい（Ｓｅｐｉｏｌら（１９７６）Ｚｅｉｔｓｃｈｒｉｆｔ ｆｕｅｒ Ｎａｔｕｒｆｏｒｓｃｈｕｎｇ ３１Ｃ：３６１−３７０）。イソＧエノール互変異性体は、原則として、dTと２つの水素結合を形成し得、Ａ＊Ｔ塩基対と同様になる。エノール互変異性体がハイブリダイゼーション緩衝液中に有意なレベルで存在する場合、イソＣ＊イソＧ塩基対の特異性は制限される。しかし、イソＧ＊Ｔミスマッチにおいて観察されたTmは、実質的に他のミスマッチと同じ53℃であった。
【０１０８】
これらのデータは、エノール互変異性体は、3X SSC（pH7.9）中に非常に低い濃度で存在するか、あるいは存在する場合、イソＣ-イソＧハイブリッドよりも７〜８℃低いTmを有するハイブリッドを依然として形成するという結論を支持する。Ｇ＊Ｔミスマッチを有するコントロールは、約49℃のTmを有していた。これは、平均Ｇ＊Ｔミスペアに予想されるよりも幾分低いが、イソＧ-Ｔミスペアに近い。
【０１０９】
当業者は、Ｃ＊Ｇと等エネルギーであるかは別として、さらに別の塩基対形成の組合わせ（すなわち、８つの塩基、４つの対）を有することは、普遍配列中の塩基対形成の特異性をさらに改善することを理解する。この場合、普遍配列からＡ、Ｔ、Ｃ、およびＧをほとんど削除し得る。しかし、これらの塩基の小さな主張（representation）を有することが可能な普遍配列のライブラリーの多様性を増し、普遍配列自身の中で可能な限り相互作用しない普遍配列を設計し得る。
【０１１０】
例えば、４塩基コードを用いて、１つの3マー交差ハイブリッドさえ有しない普遍15マーの２つの対のみを設計し得る。すなわち、15マー配列の第３の対を加えて、少なくともある３つのヌクレオチド交差ハイブリッドが存在しなければならない。６塩基コードを用いて、１つの3マーWatson-Crick型交差ハイブリッドさえ有しない15マー配列の８つの対を設計し得る。８塩基コードを用いて、15マーの19のこのような対を設計し得る。
【０１１１】
（実施例３）
（イソC*イソG塩基対合に対するpHの効果）
イソC*イソG塩基対の挙動をpHの関数として調べるために、Tm分析を、実施例２において提供されたオリゴヌクレオチドに対して行った。相補的なイソC*イソG塩基対(それぞれ、配列２および４)およびC*G塩基対(それぞれ、配列１および３)を含むオリゴヌクレオチドのTmに対するpHの効果を、0.5M塩および約1.5μMオリゴヌクレオチドで測定した(ｎ＝２または３)。結果を表５に示す。
【０１１２】
【化２２】
一般的に、オリゴヌクレオチドハイブリッドは、pH５およびpH10で安定である。pH５未満では、ＣおよびＡはプロトンを付加されるようになり、一方、pH10を超えると、ＧおよびＴはイミノのプロトンを失い始める。従って、pH５未満およびpH10を超えると、核酸ハイブリッドは安定性の減少を示す。表２のデータは、イソC*イソG塩基対が正常な酸安定性を有することを示す。しかし、イソG*イソCハイブリッドおよびG*Cハイブリッドは、共に、1.6単位のpH上昇に対して−９℃のTmの異常な変化を示す。このことは、おそらく、これらのハイブリッドの非常に短い長さによるものである。
【０１１３】
理論的には、Goldらの米国特許第5,270,163号、Tuerkら(1990)Science 249:505-510、Szostakら(1990)Nature 346:818-822およびJoyce(1989)Gene 82:83-87に記載のSELEXプロトコルを使用して、なお高いpHに感受性を有するハイブリッドを選択し得る。ここで、DNAまたはRNAランドマー(randomer)の集団が、中性pHでの結合について、および中程度のアルカリ性pHまたは中程度の酸性pHでの標的配列からの解離について選択される。増幅後、選択プロセスは、反復して繰り返される。最後の反復後、望ましいpH感受性を示すオリゴマーが、クローン化および配列決定される。これらの配列を合成し、そして直接的な競合アッセイにおいて最良の実施物(performer)が選択される。
【０１１４】
マイルドな塩基における不安定性を、現在の増幅DNAアッセイ方式において利用してアッセイのバックグランドノイズを減少させ得る。最終工程において、使用する基質緩衝液は、代表的には、pH9.5〜10.5である。適切な塩基不安定性を有する捕捉プローブを用いて、標的が表面から外され、そして別のウェルにおいて検出され得る。バックグランドはそのまま残される。WO95/16055に開示される方法によって、支持体に結合する捕捉エキステンダーを最少化することは、捕捉エキステンダーを介して捕捉プローブに非特異的に結合する分子の遊離によって引き起こされるバックグランドノイズを減少させる。
【０１１５】
非特異的に結合したアンプリファイヤーにハイブリダイズしたアルカリホスファターゼプローブの遊離は望ましくないので、好ましくは、捕捉プローブ−捕捉エキステンダーハイブリッドは、アンプリファイヤーと標識プローブとのハイブリッドおよびアンプリファイヤーと標識エキステンダーとのハイブリッドよりもかなり大きな塩基不安定性(すなわち、所定のpHでより高いTm)を有するように選択される。あるいは、図１のL-2/M-2ハイブリッドは、塩基不安定性ハイブリッド(base-labile hybrid)であり得る。いずれの場合においても、M-2/L-3ハイブリッドは、最も安定であるはずである；そうでなければ、非特異的に結合したアンプリファイヤーにハイブリダイズした標識プローブは遊離される。
【０１１６】
上記のように、遊離した標的を新しいウェルに移して読み取ることも考えられ得る。しかし、遊離した溶液をそれが生じたウェルで読み取ることが望ましい。このことは、さらなるピペッティング工程を回避し、さらなる液体移動工程に関連する不正確さを排除する。下記のように、ウェル移動を回避し得るいくつかの方法がある。
【０１１７】
アッセイの特異性をさらに増強するために、標的の特異的遊離を、表面上のバックグランドをマスクする工程と組み合わせ得る。この場合、別の支持体へ移すことは不必要である。例えば、固体支持体の表面を、標識プローブのインヒビター、および/あるいは種々の発光インヒビター、吸収剤、またはクエンチャー(quencher)でコートし得る。現在使用される１つの表面コーティングはポリ(phe-lys)である。フェニルアラニンは、特に好ましい酵素標識であるアルカリホスファターゼの公知のインヒビターである。ポリマーペプチドコーティングには、アルカリホスファターゼの他のインヒビター(例えば、トリプトファンおよびシステイン)が含まれ得る。発光インヒビターの例は、低い量子収率を有する化合物(すなわち、脱リン酸化ジオキセタンとの衝突によって励起された後、好ましくは光よりむしろ熱を発する任意の化合物)を含む。
【０１１８】
別のウェルへの遊離標的の移動を回避するために、遊離した溶液をさらに選択的に検出する少なくとも２つの他の簡便な方法が存在する。標的に関連するシグナルを、視覚化試薬に接近不可能な固相を作製することによるか、または固相支持体上で生じるシグナル発生反応をマスクすることによって溶液中で読み取り得る。固相をその後の視覚化工程から単離することは、水より重い不混和性オイルを反応容器に加えることによってなされ得る。このオイルは、容器の底部を覆う一方で、目的の溶液が上部に浮かび上がることを可能にする。視覚測定または反射率測定による簡単な比色分析検出については、不透明な物質をこのオイルに加えて視覚化のための中性バックグランドとして作用させる。
【０１１９】
化学ルミネッセンス検出のためには、オイルを光学的に不透明な物質で満たし得る。二酸化チタンのような白色固体を使用した場合、浮遊水相から発せられる光を、検出のために容器から上方に反射させる。オイル中に溶解した濃い色の固体または色素分子もまた、静止相をマスクするために使用され得る。オイル溶液が、視覚化試薬から固相を完全に単離しない場合でさえ、懸濁された固体または溶解した色素は、表面からのこの光の伝達をブロックする。
【０１２０】
静止相を、表面近くで生じる反応からの発光をブロックする色素で着色することもまた可能である。これは、不透明なウェル内に含まれる固相として着色ビーズを用いる場合に特に好都合である。
【０１２１】
（実施例４）
（中性およびアルカリ性pHでのイソC*イソG塩基対に対する塩の効果）
イソC*イソG塩基対の挙動を塩濃度の関数として調べるために、Tm分析を、実施例２において提供されたオリゴヌクレオチドに対して行った。相補的なイソC*イソG塩基対(それぞれ、配列２および４)およびC*G塩基対(それぞれ、配列１および３)を含むオリゴヌクレオチドのTmに対する塩濃度の効果を、pH7.9または9.5で約1.5μMオリゴヌクレオチドで測定した(ｎ＝３)。結果を表６に示す。
【０１２２】
古典的には、ポリヌクレオチドは、塩濃度の各対数変化に対して約16〜17℃のTmの変化を示す。オリゴヌクレオチドは、しばしば、塩依存性のいくらかの減少を示す。イソC*イソGハイブリッドについて計算される、pH7.9での塩の１対数変化あたりのTmにおける10〜11℃の変化は、13マーについて予想される変化に近い。しかし、pH9.5では、塩の１対数変化あたりの、イソC*イソGハイブリッドについてはわずか約３℃の変化であり、そしてC*Gハイブリッドについては５℃の変化であり、驚くほど低かった。
【０１２３】
これもまた、標的の特異的遊離に利用され得る。一般に、低い塩が、標的の特異的遊離に使用される。不運にも、しばしば、バックグランドのかなりの画分もまた遊離される。
【０１２４】
【化２３】
中程度にアルカリ性のpHでのイソC*イソG塩基対の融解の塩非依存性のために、塩の低下およびpHの増大から得られるさらなる利点はない。従って、遊離のために高い塩(アルカリホスファターゼにとっても好ましい)を使用し、そしてバックグランドの遊離を最少化し得る。
【０１２５】
実施例３に説明したように、SELEX手順を使用して、任意に選択されたpHでの融解において塩非依存性の増強を示すDNAまたはRNA配列を見出し得る。
【０１２６】
（実施例５）
（ハイブリダイゼーションに対する塩基対ミスマッチの効果）
前記の実施例は、イソGを有するオリゴマーが、イソCを含むその相補体と特異的に塩基対合することを示した。イソG含有オリゴマーは、単一のイソG*TまたはイソG*Cミスマッチを含む別のオリゴマーにハイブリダイズする場合、約７〜８℃だけ不安定になる。代表的には、Tmが10℃変化するごとに結合が約10倍減少する。
【０１２７】
13マーハイブリッドの結合に対する、２つの塩基のミスマッチの効果を、表７に示すプローブを使用して評価した。
【０１２８】
【化２４】
１Ｆ＝イソC、Ｊ＝イソG、ALK.PHOS＝アルカリホスファターゼ、およびＸ＝固体支持体への付着用のアミン含有スペーサー配列。
【０１２９】
標識プローブ32(アルカリホスファターゼオリゴヌクレオチド結合体)を、記載(Ｕｒｄｅａら、（１９８８）Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１６：４９３７−４９５５)のように作製した。標識プローブ32を、コントロールプローブ30とハイブリダイズさせてアルカリホスファターゼ−プローブ30*32を作製した。標識プローブ32を、改変プローブ31とハイブリダイズさせてイソC,イソG-アルカリホスファターゼ−プローブ31*32を作製した。
【０１３０】
プローブ35(捕捉プローブ)を、記載(PCT公開第WO93/13224号、この開示は本明細書中で参考として援用される)のようにマイクロタイターウェルに結合させて、ハイブリダイゼーション用の固体支持体を作製した。プローブ34(捕捉エキステンダー)をプローブ35とハイブリダイズさせた。この捕捉エキステンダーは、アルカリホスファターゼ−プローブ30*32に相補的であり、そしてアルカリホスファターゼ−プローブ31*32に部分的に相補的である。プローブ33は、捕捉エキステンダーと結合し得、そしていずれのアルカリホスファターゼプローブの結合をもブロックし得る「コンペティマー」である。
【０１３１】
以下のインキュベーションを、約1.0MのNaCl中、30分間53℃にて行った：
(１)１pmoleの固定したプローブ35を含むウェル中、250fmoleのプローブ34；
(２)１pmoleの固定したプローブ35を含むウェル中、250fmoleのプローブ34および５pmoleのプローブ33；
(３)１pmoleの固定したプローブ35を含むウェル中、５pmoleのプローブ33；および
(４)緩衝液のみ。
【０１３２】
実施例１に規定されるように、0.1×SSC、0.1％SDSでの２回の洗浄後、上記第１のインキュベーション物のそれぞれを、以下のそれぞれと共に、同じ条件下で第２の15分間のインキュベーションに曝した：
(１)25fmoleのプローブ30および500attomoleのプローブ32；
(２)25fmoleのプローブ31および500attomoleのプローブ32；
(３)500attomoleのプローブ32；および
(４)緩衝液のみ。
【０１３３】
プレートを、上記のように２回洗浄し、そして10mM MgCl2、１mM ZnCl2、0.1％Brij-35を補充した同じ緩衝液で３回洗浄した。Lumiphos Plus(Lumigen)とともに25分間のインキュベーションした後、プレートをChiron luminometerで読み取った。
【０１３４】
形成し得るハイブリッドを図３に示す。ここで、Ｚ(本明細書中では、イソCおよびイソGとして例示される)は、非天然のヌクレオチドを表す。プローブ33(コンペティマー)は、捕捉エキステンダーと21塩基対を形成し得、そして理論的には、両方のアルカリホスファターゼプローブが結合するのをブロックし得る。改変プローブ*標識プローブ(31*32)は、捕捉エキステンダーにハイブリダイズし、11塩基対および２つのミスマッチ(例えば、G*イソC、イソG*T)を形成し得る。コントロールプローブ*標識プローブ(30*32)は、捕捉エキステンダーと13塩基対を形成し得る。
【０１３５】
表８に示されるように、捕捉エキステンダー(34)は、コントロールプローブ*標識プローブ(30*32)と強力なハイブリッドを形成する(サンプル１＝399相対光単位(RLU))。捕捉エキステンダーと20倍モル過剰のコンペティマーとのプレインキュベーション(サンプル２)は、このバックグランドノイズを約10倍減少させた(30RLU)。改変プローブ*標識プローブ(31*32)は、捕捉エキステンダーと、コントロールプローブ*標識プローブ(30*32)より40倍弱いハイブリダイゼーションを示す(サンプル３＝９RLU)。２つのミスマッチは、ハイブリダイゼーションにおける40倍の変化を説明した。このことは、２つのミスマッチについて予想されていた通りである。この２つのミスマッチのそれぞれは、７〜８℃だけTmを不安定にする(参考、７×８＝56倍)。コンペティマーおよびミスマッチアルカリホスファターゼプローブの使用(サンプル４＝0.4RLU)は、バックグランドノイズを約1000倍減少させた。サンプル５はコントロールであり、本質的にはバックグランドノイズを有さない(0.1RLU)。このことは予想された通りである。なぜなら、標識プローブ32は、捕捉エキステンダーと検出可能な相同性を有さないからである。
【０１３６】
【化２５】
ハイブリダイゼーションアッセイにおいて、すべての捕捉エキステンダーについてコンペティマーを使用することは実施不可能である。なぜなら、代表的には、１アッセイあたり、５〜10の捕捉エキステンダーが存在するからである。さらに、この実施例は、コンペティマーとのプレインキュベーションが、普遍配列において15％の塩基置換(イソC,イソGでの、例えば、13塩基のうちの２塩基)を単純に使用する場合と同程度には効果的でなかったことを示す。30％の塩基置換(10塩基中３塩基)の使用は、さもなければ完全に塩基対合した相補体の非特異的ハイブリダイゼーションを約1000倍減少させることが予想される(30％のミスマッチは、約30℃のTm変化に等しい；Tmが10℃変化するごとに結合は約10倍減少する)。
【０１３７】
（実施例６）
（2'-デオキシ-イソグアノシンの化学合成）
2'-デオキシグアノシンからの2'-デオキシ-イソグアノシンの合成を、以下の手順によって達成した。
【０１３８】
工程１。2'-デオキシグアノシン一水和物(50mmole)およびイミダゾール(200mmole)を、500mLのジメチルホルムアミド(DMF)を用いるコエバポレーションにより乾燥させ、そして残留物を500mLのDMFに溶解した。この溶液にt-ブチルジメチルシリルクロライド(150mmole)を加え、そして反応混合物を室温で撹拌しながら18時間放置した。メタノール(30mL)を加え、そして25分後、溶媒を減圧下で除去した。溶媒をエバポレーションにより除去し、そして残留物を１LのCH2Cl2に溶解し、１Lの５％NaHCO3および１Lの80％飽和NaClで洗浄し、有機相をNa2SO4で乾燥させ、濾過し、そしてエバポレートして乾燥させて粗生成物(30グラム)を得た。この粗生成物を２Lの温エタノールに直接溶解した。20℃までゆっくりと冷却し、その後４℃で20時間保存して純粋な3',5'-TBDMS2-2'-デオキシグアノシンを生成した(65％収率)。
【０１３９】
工程２。3',5'-TBDMS2-2'-デオキシグアノシン(12mmole)を、トリエチルアミン(150mmole)およびN,N-ジメチルアミノピリジン(100mg)を含む125mLのCH2Cl2に懸濁した。０℃の4-トルエンスルホニルクロライド(40mmole)を加え、そして反応混合物を室温で20時間撹拌した。その時点で、すべての固体物質を溶解して淡い黄色の溶液を得た。反応を、50mLの５％NaHCO3を用いて１時間撹拌させてクエンチした。反応混合物を300mLのCH2Cl2で希釈し、300mLの５％NaHCO3および300mLの80％飽和NaClで洗浄し、有機相をNa2SO4で乾燥させ、濾過し、そしてエバポレートして乾燥させて粗生成物を得た(8.9グラム)。１％〜４％のメタノール/CH2Cl2グラジエントを用いるシリカゲルフラッシュクロマトグラフィーにより、7.95グラムの純粋なO6-(4-トルエンスルホニル)-3',5'-O-TBDMS2-2'-デオキシグアノシン(11mmole)を得た。
【０１４０】
工程３。12グラムのO6-(4-トルエンスルホニル)-3',5'-O-TBDMS2-2'-デオキシグアノシン(17mmole)を300mLのCH3CNに懸濁した。次いで、メチルピロリジン(17mL)を加え、そして懸濁物を１時間撹拌して明澄な溶液を得た。TLC分析は、すべての出発物質がベースライン物質(base line material)に変換されたことを示した。11グラムの4-(メチルチオ)フェノール(85mmole)を加え、溶液を60時間撹拌した。少容量までのエバポレーション後、600mLの酢酸エチルを加えた。この溶液を、３×400mLの0.3M NaOHおよび400mLの80％飽和NaClを用いて抽出し、有機相をNa2SO4で乾燥させ、濾過し、そしてエバポレートして乾燥させて11.55グラムの粗生成物を得た。４％〜５％のメタノール/CH2Cl2グラジエントを用いるシリカゲルフラッシュクロマトグラフィーにより、8.16グラムのO6-(4-(メチルチオ)フェニル)-3',5'-O-TBDMS2-2'-デオキシグアノシン(11mmole)を得た。
【０１４１】
工程４。４グラムのO6-(4-(メチルチオ)フェニル)-3',5'-O-TBDMS2-2'-デオキシグアノシン(6.5mmole)を、０℃で65mLのCH2Cl2に溶解し、そして6.5mLの亜硝酸tert-ブチルを滴下して加えた。溶液を室温まで加温し、そして気体を混合物から放出した(N2)。40分後、TLC分析が出発物質の完全な消費および新たなより緩慢な移動スポットの出現を示したとき、過剰の亜硝酸t-ブチルを、減圧下で２×100mLのトルエンを用いるコエバポレーションによって除去した。粗生成物の残留物を、４％〜５％のメタノール/CH2Cl2グラジエントを用いるシリカゲルフラッシュクロマトグラフィーにより精製して、2.75グラムのO6-(4-(メチルチオ)フェニル)-3',5'-O-TBDMS2-2'-デオキシキサントシン(4.45mmole)を得た。
【０１４２】
工程５。精製したすべての2.75グラムのO6-(4-(メチルチオ)フェニル)-3',5'-O-TBDMS2-2'-デオキシキサントシン(4.45mmole)を、50mLのメタノールに溶解した。濃水酸化アンモニウム水溶液(50mL)を加え、そして混合物を、堅く密封したボンベ中で100℃にて４時間加熱した。冷却後、溶媒を、減圧下でエタノールとのコエバポレーションによって除去して、1.8グラムの粗生成物を得た(3.6mmole)。温エタノールからの再結晶化による精製によって、純粋な3',5'-O-TBDMS2-2'-デオキシ-イソグアノシンのサンプルを得た。この物質は、すべての点(UV、TLC、NMR、およびMS)で、公開された光分解経路(Switzerら、(1993)、前出)によって調製されたサンプルと同一であった。
【０１４３】
（実施例７）
（アンプリファイヤーおよびアルカリホスファターゼプローブと捕捉エキステンダーとの非特異的ハイブリダイゼーションの制御）
Ａ．イソC,イソG bDNA ampおよびイソC,イソG apプローブの構築。
【０１４４】
15部位の櫛様増幅マルチマー(amp)を、PCT公開第WO92/02526号に以前に記載されたように構築した。アームを、記載のように12ヌクレオチドリンカーおよびT4 DNAリガーゼを使用してこの櫛に連結した。アルカリホスファターゼ(ap)プローブを、米国特許第5,124,246号に記載のように、アミノ官能性を含むオリゴヌクレオチドから構築した。配列は以下の通りであった：
【０１４５】
【化２６】
Ｂ．捕捉エキステンダー(CE)配列の調製。
【０１４６】
TNF-α、インターロイキン２(IL-2)、IL-4、IL-6およびγインターフェロン(IFNγ)標的に対する捕捉エキステンダーを、標準的なホスホルアミダイト法によって調製した。試験した捕捉エキステンダー配列は、以下の通りであった：
【０１４７】
【化２７】
Ｃ．CEとampとの間ならびにCEとapとの間の非特異的ハイブリダイゼーション(NSH)を測定するための手順。
【０１４８】
合計100フェムトモルの個々の捕捉エキステンダープローブ、または合計100フェムトモルの各捕捉エキステンダーからなるプールを、マイクロウェルにおいて１時間、53℃にてインキュベートした。洗浄液Ａ(0.1×SSC、0.1％SDS)を用いて２回洗浄した後、ウェルを、アンプリファイヤー希釈液＋/−WO95/16055に記載の非イソC,イソG ampまたは前出の実施例7Aに記載のイソC,イソG amp中で30分間インキュベートした。洗浄液Ａでの２回のさらなる洗浄後、ウェルを、WO95/16055に記載の非イソC,イソG apプローブまたは前出の実施例7Aに記載のイソC,イソG apプローブのいずれかを含むamp希釈液(５×SSC、50％プロティナーゼＫ消化ウマ血清)中で15分間インキュベートした。
【０１４９】
以下の定義を使用した：AP NSB＝CEが存在しない場合のapプローブのバックグランド。Amp NSB＝(CEが存在しない場合のampおよびapプローブのバックグランド)−(ap NSB)。AP NSH＝(ampを含まないCEサンプルのRLU)−(ap NSB)。AMP NSH＝(CEサンプルのRLU)−(AP NSH)−(AMP NSB)−(AP NSB)。
Ｄ．結果。
【０１５０】
５つの個々のCEプローブを、バックグランド非特異的ハイブリダイゼーションについて、１ウェルあたり100fmを用いて試験した。結果を下記の表に示す。
【０１５１】
【化２８】
CEプローブ(AP-NSBおよびAMP-NSB)の非存在下での非特異的結合バックグランドは、すべてのampおよびapプローブに関して無視できる(＜＝１RLU)。３つのエキステンダーは、このampプローブと強い(＞10RLU)交差反応性を示す。これはイソC,イソG ampでは見られない。１つのプローブが、このAPプローブと６RLUの交差反応性を示し、これはイソC,イソG APプローブでは見られない。すべての場合において、イソC,イソGプローブを用いるNSHは無視できる。1.0未満のRLU値は、NSBに対して有意でないと考えられる。
【０１５２】
CEプローブの５つのプールを、同じ分子との非特異的ハイブリダイゼーションバックグランドについて試験した。結果を以下に示す。
【０１５３】
【化２９】
また、すべてのampおよびapプローブのNSBは、NSHと比較して無視できる。５つのプールのうちの４つのプールが、2.3RLUから34.9RLUまでの範囲の有意なamp NSHを示す。一方、CEプールは、いずれも、イソC,イソG ampと有意なNSH(＜１)を有さない。２つのプールは、apプローブと有意なNSHを有するが、どのプールもイソC,イソG apプローブとの有意な相互作用を有さない。この実験において、合計30のCE配列を、交差反応性についてスクリーニングした。
【０１５４】
新規な塩基対をハイブリダイゼーションアッセイ方式に組み込む能力を有する当業者は、ampリーダー配列のイソC,イソGリーダー配列での置換により、本実施例で使用したイソC,イソG ampのより低いNSH値が生じると予想されることを理解する。
Ｅ．イソC,イソG ampおよびapとのIL-2およびIL-6の完全な用量応答曲線。
【０１５５】
完全な用量応答曲線を、IL-2およびIL-6 mRNAについてヒト細胞系列希釈物をアッセイすることによって作成した。検出限界を、Δ＝０の細胞数として計算した。Δを、以下の通りに定義する：ポジティブRLU−２標準偏差−(ネガティブRLU＋２標準偏差)。結果を以下の表に示す。
【０１５６】
【化３０】
感受性は、現在の分子(天然の配列を有する)の代わりにイソC/G ampおよびapを使用することによって、IL-2アッセイでは12.6倍、そしてIL-6アッセイでは３倍改善された。天然配列でのノイズが大きければ大きいほど、アッセイはより改善される。
【０１５７】
従って、液相サンドイッチハイブリダイゼーションアッセイにおいてより標的依存性の信号を作成するための新規な方法を開示する。さらに、2'-デオキシ-イソグアノシンを合成する新規な方法を開示する。本発明の好ましい実施態様がいくらか詳細に記載されるが、添付の請求の範囲に規定されるのような本発明の精神および範囲を逸脱することなく、自明な変形がなされ得ることが理解される。
【図面の簡単な説明】
【０１５８】
【図１】図１は、先行技術の液相サンドイッチハイブリダイゼーションアッセイを示す。太線は普遍配列を示す。
【図２】図２は、プローブの２本鎖DNAへの結合方法を描写する。太線は普遍配列を示す。
【図３】図３は、非天然ヌクレオチド含有プローブおよび非特異的ハイブリダイゼーションをブロックするコンペティマー（competimer）の使用法を描く。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、一般的に、核酸化学およびハイブリダイゼーションアッセイに関する。より詳細には、本発明は、核酸ハイブリダイゼーションアッセイにおいて、主に非特異的ハイブリダイゼーションに由来するバックグラウンドノイズを最小限に抑えることにより、より標的依存性のシグナルを生成する方法に関する。本発明はまた、アンチセンスおよびアプタマー治療学ならびに薬物発見における適用を有する。
【背景技術】
【０００２】
核酸ハイブリダイゼーションアッセイは、一般的に、遺伝学的研究、生物医学的研究および臨床診断に使用される。基礎的な核酸ハイブリダイゼーションアッセイにおいて、一本鎖分析物の核酸は標識一本鎖核酸プローブとハイブリダイズし、そして得られた標識二本鎖が検出される。精度を高め、異質物質から検出するための二本鎖の分離を容易にし、および／または検出されるシグナルを増幅するために、この基本的スキームの変形が開発された。
【０００３】
本発明は、任意の核酸ハイブリダイゼーションアッセイにおいて生じるバックグランドノイズを減少する方法に関する。一般に、現在開示されている技術が抱えているバックグランドノイズは、所定のアッセイにおいて使用される種々のポリヌクレオチド成分の所望されない相互作用（すなわち、分析物の存在または量に対応しないシグナルを生じる相互作用）が原因である。本発明は、多くのアッセイ形態と結合するのに有用であり、ここで多様なハイブリダイゼーション工程が行われて、ポリヌクレオチド分析物の存在または量と相関する検出可能なシグナルが生成される。
【０００４】
このようなアッセイの１つは、共同で譲渡された特許文献１(Urdeaら、この開示は本明細書中に参考として援用される)に詳細に記載されている。このアッセイは、ポリヌクレオチド分析物を固体の支持体に結合するように設計された二部捕獲システムと、検出可能な標識を検出または定量しようとするポリヌクレオチド分析物に結合するように設計された二部標識システムとの使用を包含する。二部捕獲システムは、固体の支持体に結合した捕獲プローブと、捕獲プローブのセグメントおよびポリヌクレオチド分析物のセグメントの両方にハイブリダイズする捕獲エキステンダー分子との使用を包含する。二部標識システムは、ポリヌクレオチド分析物のセグメントにハイブリダイズする標識エキステンダー分子と、標識エキステンダー分子にハイブリダイズし、そして検出可能な標識を含みまたは検出可能な標識に結合する標識プローブとの使用を包含する。このようなシステムの有用性は、分析物の存在と相関する様式で標識が検出されるためには、多くのハイブリダイゼーション工程が存在しなくてはならず、この場合、２つの異なったハイブリダイゼーション反応が分析物「捕獲」のために生じなければならず、同様に、２つの異なったハイブリダイゼーション反応が分析物標識のために生じなければならない。しかし、検出可能なシグナルが分析物の存在または量に相関しない様式で生成され得る多くの方法が残されたままであり、これらについて以下に詳しく述べる。
【０００５】
本発明が有用であるアッセイの別の例は、共同で譲渡された特許文献２(Urdeaら、この開示は本明細書中に参考として援用される)に記載のシグナル増幅方法である。この方法では、シグナルは、増幅マルチマー（標識エキステンダーに特異的にハイブリダイズする第１のセグメント、および標識プローブに特異的にハイブリダイズする多数の同一の第２のセグメントを含有するように構築されたポリヌクレオチド）の使用により増幅される。増幅の程度は、理論上、第２のセグメントの反復数に比例する。マルチマーは、直鎖状または分枝状のどちらかであり得る。分枝状マルチマーはフォークまたは櫛の形状であり得、櫛型のマルチマーが好ましい。
核酸ハイブリダイゼーションアッセイにおける干渉バックグラウンドシグナルの問題を解決するための１つのアプローチは、共同で譲渡された特許文献３により提供される。そこには、検出可能なシグナルを誘発するために少なくとも２つの捕獲エキステンダーおよび/または２つ以上の標識エキステンダーが分析物に結合しなければならないことが記載される。バックグラウンドノイズをさらに減少するために、多成分複合体の形成に好都合な条件下でアッセイを行う。
【０００６】
別のアプローチは、ハイブリダイゼーションアッセイにおいてシグナルの標的依存性を増大することを提示しており、このことは特許文献４(発明者Hellerら)に記載されている。この参考文献は、近接するプローブ間でエネルギーの非放射性伝達が生じる相同的ハイブリダイゼーションアッセイについて記載しており；２つの異なった事象が、産生される標的生成シグナルについて生じなければならず、これが検出の精度を増強する。
本発明はまた、ハイブリダイゼーションアッセイにおけるポリヌクレオチド分析物の検出および定量の精度を増大することが意図される。本発明は、標的の非存在下で生じるシグナル産生の発生率を減少することによって、このようなアッセイの感度および特異性の両方を増強し、そして現在用いられているアッセイの構成に比べて時間またはコストのいずれをも増大しない。
【０００７】
本発明の目的、すなわち、核酸ハイブリダイゼーションアッセイにおいてバックグラウンドノイズを減少し、そして分析物の検出および定量の精度を増加することは、部分的に、「非天然」水素結合パターンにより塩基対を形成するヌクレオシド変異体の使用によって達成されている。本明細書において、「非天然」塩基対は、アデノシン（Ａ）、チミジン（Ｔ）、シチジン（Ｃ）、グアノシン（Ｇ）、またはウリジン（Ｕ）以外のヌクレオチド単位（ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｉｃ ｕｎｉｔ）の間で形成される塩基対である。このような非天然ヌクレオシド塩基対の１つは、イソシトシン（イソＣ）およびイソグアニン（イソＧ）の間で形成される。イソＣおよびイソＧは、標準の結合構造（すなわち、ワトソン-クリックの塩基対）で塩基対を形成し得るが、以下に示すような、シトシン（Ｃ）のグアニン（Ｇ）への結合に関与する水素結合とは別の水素結合を含む：
【０００８】
【化３】
非特許文献１は、イソＣ*イソＧ塩基対の構造および安定性を研究するために、分子メカニクス、分子ダイナミクスおよび自由エネルギー摂動計算を適用した。非特許文献２は、DNAテンプレート中の修飾イソＣが、転写されるRNA産物中へのイソＧアナログの取り込みを指示する方法を記載している。非特許文献３は、イソＣおよびイソＧの間に形成される塩基対が、DNAポリメラーゼおよびRNAポリメラーゼにより、DNAおよびRNA中に取り込まれ得る条件を検討した。
【０００９】
DNAオリゴマーに新しい塩基対を導入することにより、ハイブリダイゼーションをより正確に制御する可能性を提供する。
【特許文献１】米国特許第４，８６８，１０５号明細書
【特許文献２】米国特許第５，１２４，２４６号明細書
【特許文献３】国際公開第９５／１６０５５号パンフレット
【特許文献４】欧州特許公開公開第７０，６８５号明細書
【非特許文献１】Ｌｅａｃｈら、「Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．」、１９９２年、第１１４号、ｐ．３６７５−３６８３
【非特許文献２】Ｔｏｒら、「Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．」、１９９３、第１１５号、ｐ．４４６１−４４６７
【非特許文献３】Ｓｗｉｔｚｅｒら、「Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ」、１９９３、第３２号、ｐ．１０４８９−１０４９６
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
本発明の目的は、核酸ハイブリダイゼーションアッセイにおいてバックグラウンドノイズを減少し、そして分析物の検出および定量の精度を増加することである。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明は、以下を提供する。
（項目１）
複数のアッセイ成分を用いる、サンプル中の核酸分析物を検出するための核酸ハイブリダイゼーションアッセイであって、該複数のアッセイ成分の各々は、少なくとも１つのハイブリダイズするオリゴヌクレオチドセグメントを含有し、
少なくとも１つのハイブリダイズするオリゴヌクレオチドセグメント中に、A-TおよびG-C塩基対が形成される条件下でアデノシン(A)、チミジン(T)、シチジン(C)、グアノシン(G)、またはウリジン(U)と効果的には塩基対を形成しない第１のヌクレオチド単位を取り込ませる工程を包含する改良がされている、核酸ハイブリダイゼーションアッセイ。
（項目２）
前記第１のヌクレオチド単位が、第２の相補的なヌクレオチド単位と塩基対を形成し得る、項目１に記載の方法。
（項目３）
前記第１および第２のヌクレオチド単位が、以下からなる相補的塩基対の群から交換可能に選択される項目２に記載の方法：
【００１２】
【化４】
【００１３】
【化５−１】
および
【００１４】
【化５−２】
ここでＲは、ポリヌクレオチドに取り込まれたときに、該第１および第２のヌクレオチド単位に、相補的なヌクレオチド単位との塩基対を形成させ得る骨格であり、そしてＲ'は水素、メチル、a-またはb-プロピニル、臭素、フッ素、あるいはヨウ素である。
（項目４）
複数のアッセイ成分を用いる、サンプル中の核酸分析物を検出するための核酸ハイブリダイゼーションアッセイであって、該複数のアッセイ成分の各々は少なくとも１つのハイブリダイズするオリゴヌクレオチドセグメントを含有し、
アッセイストリンジェンシーが、Tm1ハイブリッド複合体を選択的に不安定化するように制御され得る、Tm1ハイブリッド複合体およびTm2ハイブリッド複合体を取り込ませる工程を包含する改良がされている、核酸ハイブリダイゼーションアッセイ。
（項目５）
複数のアッセイ成分を用いる、サンプル中の核酸分析物を検出するための液相サンドイッチハイブリダイゼーションアッセイであって、該複数のアッセイ成分の各々は少なくとも１つのハイブリダイズするオリゴヌクレオチドセグメントを含有し、該アッセイは、(a)該分析物を固体支持体に直接的または間接的に結合させる工程、(b)該分析物を標識する工程、および(c)分析物会合標識の存在を検出する工程を包含し、
少なくとも１つのハイブリダイズするオリゴヌクレオチドセグメント中に、A-TおよびG-C塩基対が形成される条件下でアデノシン(A)、チミジン(T)、シチジン(C)、グアノシン(G)、またはウリジン(U)と効果的には塩基対形成しない第１のヌクレオチド単位を取り込ませる工程を包含する改良がされている、液相サンドイッチハイブリダイゼーションアッセイ。
（項目６）
複数のアッセイ成分を用いる、サンプル中の核酸分析物を検出するための液相サンドイッチハイブリダイゼーションアッセイであって、該複数のアッセイ成分の各々は少なくとも１つのハイブリダイズするオリゴヌクレオチドセグメントを含有し、該アッセイは、(a)該分析物を固体支持体に直接的または間接的に結合させる工程、(b)該分析物を標識する工程、および(c)分析物に会合した標識の存在を検出する工程を包含し、
アッセイストリンジェンシーが、Tm1ハイブリッド複合体を選択的に不安定化するように制御され得る、Tm1ハイブリッド複合体およびTm2ハイブリッド複合体の取り込みを包含する改良がされている、液相サンドイッチハイブリダイゼーションアッセイ。
（項目７）
以下の構造式を有する化合物を合成する方法であって、
【００１５】
【化６】
ここで、R1は、水素、ヒドロキシル、スルフヒドリル、ハロゲノ、アミノ、アルキル、アリル、および-OR2(ここでR2はアルキル、アリル、シリル、またはリン酸塩である)からなる群から選択され：
a) 以下の構造式
【００１６】
【化７】
を有する化合物を、3'および5'ヒドロキシル基の両方を保護するのに適切な試薬と反応させる工程；
b) 工程(a)の産物を、O6-オキシ部分を求核置換を受けやすい官能基に変換するのに適切な試薬と反応させ、それにより官能基化O6部分を産生する工程；
c) 工程(b)の産物の2-アミノ基を酸化する工程；
d) 工程(c)の産物を、該官能基化したO6部分を置換する求核試薬と反応させる工程；
e) 工程(d)の産物を、該保護された3'および5'ヒドロキシル基を脱保護するのに適切な試薬と反応させる工程
を包含する方法。
（項目８）
以下を包含する2'-デオキシ-イソグアノシンを合成する方法：
a) 2'-デオキシグアノシンをt-ブチルジメチルシリル(TBDMS)クロライドと反応させることにより、2'-デオキシグアノシンを3',5'-O-(t-ブチルジメチルシリル)2-2'-デオキシグアノシンに変換する工程；
b) 3',5'-O-TBDMS2-2'-デオキシグアノシンを4-トルエンスルホニルクロライドと反応させることにより、3',5'-O-TBDMS2-2'-デオキシグアノシンをO6-(4-トルエンスルホニル)-3',5'-O-TBDMS2-2'-デオキシグアノシンに変換する工程；
c) O6-(4-トルエンスルホニル)-3',5'-O-TBDMS2-2'-デオキシグアノシンをフェノールで処理することにより、該O6-(4-トルエンスルホニル)基を置換して、O6-(4-(メチルチオ)フェニル)-3',5'-O-TBDMS2-2'-デオキシグアノシンを得る工程；
d) 中性条件下でO6-(4-(メチルチオ)フェニル)-3',5'-O-TBDMS2-2'-デオキシグアノシンを亜硝酸t-ブチルで処理することにより、該O6-(4-(メチルチオ)フェニル)-3',5'-O-TBDMS2-2'-デオキシグアノシンの2-アミノ基をオキシ官能基に酸化して、O6-(4-(メチルチオ)フェニル)-3',5'-O-TBDMS2-2'-デオキシキサントシンを得る工程；および
e) 高温で該O6-(4-(メチルチオ)フェニル)-3',5'-O-TBDMS2-2'-デオキシキサントシンのO2-(4-(メチルチオ)フェニル)基を水酸化アンモニウムで置換し、3',5'-O-TBDMS2-2'-デオキシ-イソグアノシンを得る工程。
（項目９）
サンプル中の核酸分析物を検出するためのキットであって、少なくとも１つのハイブリダイズするオリゴヌクレオチドプローブ、該分析物とハイブリッド複合体を形成し得るプローブのセグメント、および該ハイブリッド複合体を検出するための手段を含み、ここで該少なくとも１つのハイブリダイズするオリゴヌクレオチドプローブは、A-TおよびG-C塩基対が形成される条件下で、アデノシン(A)、チミジン(T)、シチジン(C)、グアノシン(G)、またはウリジン(U)と効果的には塩基対を形成しない第１のヌクレオチド単位を含有する、キット。
（項目１０）
以下を含有する項目９に記載のキット：
(a) 捕獲プローブのセットであって、ここで該捕獲プローブは、A-TおよびG-C塩基対が形成される条件下で、A、T、C、G、またはUと効果的には塩基対を形成しない第１のヌクレオチド単位を含有する、捕獲プローブのセット；
(b) 第１および第２のハイブリダイズするオリゴヌクレオチドセグメントを含有する捕獲エクステンダー分子のセットであって、ここで該第１のハイブリダイズするオリゴヌクレオチドセグメントは該捕獲プローブとハイブリッド複合体を形成し得、そして該第２のハイブリダイズするオリゴヌクレオチドセグメントは該核酸分析物の予め決定されたセグメントとハイブリッド複合体を形成し得る、捕獲エクステンダー分子のセット；
(c) 第３および第４のハイブリダイズするオリゴヌクレオチドセグメントを含有する標識エクステンダー分子であって、ここで該第３のハイブリダイズするオリゴヌクレオチドセグメントは、該捕獲エクステンダー分子のセットが結合するもの以外の核酸分析物のセグメントとハイブリッド複合体を形成し得る、捕獲エクステンダー分子；
(d) 第５および第６のハイブリダイズするオリゴヌクレオチドセグメントを含有する随意のプレアンプリファイヤー分子であって、ここで該ハイブリダイズするオリゴヌクレオチドセグメントは、A-TおよびG-C塩基対が形成される条件下で、A、T、C、G、またはUと効果的には塩基対を形成しない第１のヌクレオチド単位を含有し、そして該プレアンプリファイヤー分子は、該標識エクステンダー分子および複数の増幅マルチマーとハイブリッド複合体を形成し得る、プレアンプリファイヤー分子；
(e) 第７および第８のハイブリダイズするオリゴヌクレオチドセグメントを含有する増幅マルチマーであって、ここで該ハイブリダイズするオリゴヌクレオチドセグメントは、A-TおよびG-C塩基対が形成される条件下で、A、T、C、G、またはUと効果的には塩基対を形成しない第１のヌクレオチド単位を含有し、そして該増幅マルチマーは、該標識エクステンダー分子またはプレアンプリファイヤー分子、および複数の同一のオリゴヌクレオチドサブユニットとハイブリッド複合体を形成し得る、増幅マルチマー；および
(f) 標識を含有する標識プローブであって、該同一のオリゴヌクレオチドサブユニットとハイブリッド複合体を形成するように設計され、そして直接的または間接的に検出可能なシグナルを提供する、標識プローブ。
（項目１１）
アプタマーとして有用なオリゴヌクレオチドであって、複数の相補的塩基対を含有する分子内オリゴヌクレオチドハイブリッド複合体を含有し、該塩基対の少なくとも１つが、A-TおよびG-C塩基対を通常形成する条件下で、アデノシン(A)、チミジン(T)、シチジン(C)、グアノシン(G)、またはウリジン(U)と効果的には塩基対を形成しない相補的な非天然ヌクレオチド単位を含有し、ここで該非天然ヌクレオチド単位は、該塩基対の特異性が該アプタマーの二次構造の維持には必要とされないオリゴヌクレオチドセグメント内に含有される、オリゴヌクレオチド。
（項目１２）
以下の工程を包含するアプタマーを調製するための方法：
(a) 標的分子を提供する工程；
(b) 該標的分子とオリゴヌクレオチドのランダマープールとを、該オリゴヌクレオチドが該標的分子に結合するのに好都合な条件下で接触させる工程；
(c) 該標的分子に結合し、そしてオリゴヌクレオチド-標的複合体を形成する該オリゴヌクレオチドを、該標的分子に結合しない該オリゴヌクレオチドから分離する工程：
(d) 該オリゴヌクレオチド-標的複合体から該オリゴヌクレオチドを解離させる工程；
(e) ポリメラーゼ連鎖反応を用いて該オリゴヌクレオチドを増幅する工程；
(f) 少なくとも１回(b)から(e)の工程を繰り返し、最終的なアプタマー構築物を形成する工程；および
(g) 該最終アプタマー構築物中の１つ以上のヌクレオチド単位を、A-TおよびG-C塩基対を通常形成する条件下で、アデノシン(A)、チミジン(T)、シチジン(C)、グアノシン(G)、またはウリジン(U)と効果的には塩基対を形成しない非天然ヌクレオチド単位で置換する工程。
（項目１３）
第１および第２のハイブリダイズするセグメントを含有するアンチセンス分子であって、ここで該第１のハイブリダイズするセグメントは標的オリゴヌクレオチドとハイブリッド複合体を形成し得、そして該第２のセグメントは、A-TおよびG-C塩基対を形成する条件下で、アデノシン(A)、チミジン(T)、シチジン(C)、グアノシン(G)、またはウリジン(U)と効果的には塩基対を形成しない少なくとも１つのヌクレオチド単位を含有し、そして第２のアンチセンス分子とハイブリッド複合体を形成し得る、アンチセンス分子。
【００１７】
（発明の要旨）
本発明は、サンプル中の核酸分析物を検出するための方法およびキットを提供する。一般的に、本方法は、インサイチュハイブリダイゼーション、サザン、ノーザン、ドットブロットなどの核酸ハイブリダイゼーションアッセイおよびポリメラーゼ連鎖反応アッセイにおける改良を示す。詳細には、本方法は、分析物を固体の支持体に結合させる工程、分析物を標識する工程、および支持体上の標識の存在を検出する工程を包含する液相サンドイッチハイブリダイゼーションアッセイにおける改良を示す。好ましい方法は、分析物−プローブ複合体におけるより顕著な標識の結合を可能にする増幅マルチマーの使用を包含し、アッセイの感度および特異性を増強する。
【００１８】
本発明の第１の局面において、塩基対を形成し得、かつアデノシン（Ａ）、チミジン（Ｔ）、シチジン（Ｃ）、グアノシン（Ｇ）、またはウリジン（Ｕ）以外である１つまたはそれ以上のヌクレオチド単位が、核酸ハイブリダイゼーションアッセイ成分の標的にハイブリダイズしないオリゴヌクレオチドセグメント（すなわち「普遍」セグメント）に取り込まれるアッセイが提供される。このようなヌクレオチド単位の使用は、普遍セグメントの間の結合特異性を増大する独特の塩基対形成スキームを生じさせる。
【００１９】
本発明の関連する局面において、Ａ、Ｔ、Ｃ、Ｇ、またはＵ以外の第２のヌクレオチド単位と塩基対を形成し得る、Ａ、Ｔ、Ｃ、Ｇ、またはＵ以外の少なくとも１つの第１のヌクレオチド単位が、アッセイ成分の核酸配列中に取り込まれるアッセイが提供される。この核酸配列は、標的分析物以外のアッセイ成分中に存在する核酸配列に相補的である。このような２つのヌクレオチド単位の間に形成される塩基対の例として、以下の構造（I）〜（IV）が挙げられる：
【００２０】
【化８】
および
【００２１】
【化９】
ここで、Ｒは、ポリヌクレオチドに取り込まれた場合、塩基が相補的ヌクレオチド単位と塩基対を形成することが可能な骨格を示し、そしてＲ’は、例えば、水素、メチル、α-またはβ-プロピニル、臭素、フッ素、ヨウ素などである。このようなヌクレオチド単位をこのようないわゆる「普遍」配列（すなわち、標的分析物へのハイブリダイゼーションに関与しない配列）に取り込ませることにより、非特異的ハイブリダイゼーションの可能性は、著しく減少する。１つの好ましい実施態様において、式（I）に示したように、第１および第２のヌクレオチド単位は、イソシチジンおよびイソグアノシンから交換可能に構成される。
【００２２】
本発明の関連した局面において、分析物および支持体に結合した捕獲プローブの間に形成される複合体（１つまたはそれ以上の異なった捕獲エキステンダー分子、および/または標識エキステンダーおよびアンプリファイヤーまたはプレアンプリファイヤーにより媒介される）の融解温度Tm1が、標識プローブおよびアンプリファイヤーの間に形成される複合体の融解温度Tm2よりも顕著に低いアッセイを提供する。この局面において、アッセイは、最初に全てのハイブリッド複合体の形成に好都合な条件下で行われる。次いで、この条件をアッセイの過程の間に改変して、Tm1ハイブリッド複合体を不安定にする。
【００２３】
本発明はさらに、前記の技術のそれぞれを組合せたハイブリダイゼーションアッセイを実行する方法を包含する。すなわち、このアッセイでは、Ａ、Ｔ、Ｇ、Ｃ、またはＵ以外のヌクレオチド単位がアッセイ成分の普遍セグメント中に取り込まれ、そしてTm1ハイブリッド複合体の融解温度がTm2ハイブリッド複合体の融解温度よりも顕著に低い。
【００２４】
さらなる局面において、本発明はイソグアノシンまたは2'-デオキシ-イソグアノシンを合成するための新規な方法を包含する。
【００２５】
最後に、本発明は、本明細書および特許請求の範囲に記載のアッセイを実行するために必要な試薬を含むキットを包含する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２６】
（発明の詳細な説明）
（定義および術語）
本発明を開示し、そして詳細に記載する前に、本発明が、特定のアッセイ形式、物質、または試薬に限定されず、そしてもちろん変化し得ることを理解すべきである。本明細書中で使用した用語は、特定の実施態様のみを記載することが目的であり、そして限定されることを意図しないということもまた理解すべきである。
【００２７】
この明細書および以下の特許請求の範囲では、以下の意味を有すると定義される数多くの用語を参照する：
本明細書中で使用する用語「ポリヌクレオチド」および「オリゴヌクレオチド」は、ポリデオキシリボヌクレオチド（2-デオキシ-D-リボースを含有する）、ポリリボヌクレオチド（D-リボースを含有する）、プリンまたはピリミジン塩基のN-またはC-グリコシドである任意の他のタイプのポリヌクレオチド、ならびに非ヌクレオチド骨格（例えば、ポリアミド（例えば、ペプチド核酸(PNA)）およびポリモルホリノ（polymorpholino）（Anti-Virals,Inc.(Corvallis,Oregon)からNeugeneTMポリマーとして市販されている）を含有する他のポリマー、ならびに合成の配列特異的核酸ポリマー（DNAおよびRNAに見出されるような塩基の対合または塩基のスタッキング(stacking)が可能となる形状でヌクレオチドを含有するポリマーを提供する）を総称する。用語「ポリヌクレオチド」および「オリゴヌクレオチド」との間の長さの区別を意図せず、これらの用語は交換可能に使用される。これらの用語は、分子の一次構造のみに言及する。従って、これらの用語は、２本鎖および１本鎖のDNA、ならびに２本鎖および１本鎖のRNA、DNA:RNAハイブリッド、ならびにPNAおよびDNAまたはRNAの間のハイブリッドを包含し、そしてまた公知のタイプの改変体（例えば、当該分野で公知の標識、メチル化、「キャップ」、１またはそれ以上の天然に存在するヌクレオチドのアナログでの置換）、ヌクレオチド内の改変体（例えば、非荷電結合（例えば、メチルホスホネート、ホスホトリエステル、ホスホラミデート、カルバメートなど）および負の荷電結合（例えば、ホスホロチオエート（phosphorothioate)、ホスホロジチオエート（phosphorodithioate)など）および正の荷電結合（例えば、アミノアルキルホスホラミデート、アミノアルキルホスホトリエステル）を有する改変体、ペンダント部分（例えば、タンパク質（ヌクレアーゼ、毒素、抗体、シグナルペプチド、ポリ-L-リジンなどを包含する））を含有する改変体、挿入物（例えば、アクリジン、ソラレンなど）を有する改変体、キレート剤（例えば、金属、放射性金属、ホウ素、酸化力のある金属など）を含有する改変体、アルキル化剤を含有する改変体、改変した結合を有する改変体（例えば、α−アノマー核酸など）、およびポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドの改変しない形態を包含する。
【００２８】
本明細書中で使用される用語「ヌクレオシド」および「ヌクレオチド」は、公知のプリン塩基およびピリミジン塩基のみならず、改変した他の複素環式の塩基もまた含有する部分を包含することが認識される。これらの改変体は、メチル化プリン、またはメチル化ピリミジン、アシル化プリンまたはアシル化ピリミジン、あるいは他の複素環を包含する。改変したヌクレオシドまたはヌクレオチドはまた、糖部分に対する改変体（例えば、ここでは１またはそれ以上の水酸基がハロゲン、脂肪基で置換されるか、またはエーテル、アミンなどとして官能基化される）を包含する。用語「ヌクレオチド単位」は、ヌクレオシドおよびヌクレオチドを包含することが意図される。
【００２９】
さらに、ヌクレオチド単位の改変は、それぞれの相補的なピリミジンまたはプリンとの水素結合を形成するプリン塩基またはピリミジン塩基において官能基を再配列し、付加し、置換するか、さもなければ変更することを包含する。得られた改変ヌクレオチド単位は、Ａ、Ｔ、Ｃ、Ｇ、またはＵ以外の他のこのような改変ヌクレオチド単位と塩基対を形成し得る。標準のＡ-ＴおよびＧ-Ｃ塩基対は、それぞれ、チミジンのN3-HおよびC4-オキシとアデノシンのN1およびC6-NH2との間、そしてそれぞれ、シチジンのC2-オキシ、N3およびC4-NH2とグアノシンのC2-NH2、N1-HおよびC6-オキシの間との水素結合の形成が可能な条件下で形成する。従って、例えばグアノシン（2-アミノ-6-オキシ-9-β-D-リボフラノシル-プリン）を改変して、イソグアノシン（2-オキシ-6-アミノ-9-β-D-リボフラノシル-プリン）を形成し得る。このような改変はシトシンと標準の塩基対をもはや効果的に形成しないヌクレオシド塩基を生じる。しかし、シトシン（1-β-D-リボフラノシル-2-オキシ-4-アミノ-ピリミジン）の改変によるイソシトシン（1-β-D-リボフラノシル-2-アミノ-4-オキシ-ピリミジン）の形成は、グアノシンと効果的な塩基対を形成しないが、イソグアノシンと塩基対を形成する改変ヌクレオチドを生じる。イソシトシンはＳｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）から入手可能であり；イソシチジンはＳｗｉｚｅｒら（（１９９３）、前出）、およびその中で引用される参考文献に記載の方法により調製され得る；2'-デオキシ-5-メチル-イソシチジンは、Ｔｏｒら（（１９９３）、前出）、およびその中で引用される参考文献で記載される方法により調製され得る；そしてイソグアニンヌクレオチドは、Ｓｗｉｚｅｒら（前出）、およびＭａｎｔｓｃｈら（（１９９３）Ｂｉｏｃｈｅｍ．１４：５５９３−５６０１）に記載の方法、または以下に詳細に記載する方法により調製され得る。構造（II）で描写した非天然塩基対（κおよびπという）は、Ｐｉｃｃｉｒｉｌｌｉら（（１９９０）Ｎａｔｕｒｅ ３４３：３３−３７）に記載の方法により合成され得る。この方法は、2,6-ジアミノピリミジンおよびその相補体（1-メチルピラゾロ[4,3]-ピリミジン-5,7-(4H,6H)-ジオン）の合成法である。独特な塩基対を形成する他のこのような改変ヌクレオチド単位は、Ｌｅａｃｈら（（１９９２）Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１１４：３６７５−３６８３）およびＳｗｉｚｅｒら（前出）に記載されているか、もしくは当業者には自明である。
用語「ポリヌクレオチド分析物」は、標的ヌクレオチド配列を含有する１本鎖または２本鎖の核酸分子をいう。分析物核酸は、種々の供給源（例えば、生物学的液体または固体、食料品、環境物質など）に由来し得、そして種々の手段（例えば、プロテイナーゼK/SDS、カオトロピック塩など）によるハイブリダイゼーション解析のために調製され得る。用語「ポリヌクレオチド分析物」は、本明細書中では用語「分析物」、「分析物核酸」、「標的」および「標的分子」と交換可能に使用される。
【００３０】
本明細書中で使用される用語「標的領域」または「標的ヌクレオチド配列」は、標的分子内に含有されるプローブ結合領域をいう。用語「標的配列」は、所望の条件下でプローブが安定なハイブリッドを形成する配列をいう。
【００３１】
本明細書中で使用される用語「プローブ」は、上で定義したようにポリヌクレオチドを含有する構造をいい、これは、標的分析物に存在する核酸配列に相補的な核酸配列を含有する。プローブのポリヌクレオチド領域は、DNA、および／またはRNA、および／または合成ヌクレオチドアナログから形成され得る。
【００３２】
結合配列は、安定なハイブリッドを提供するために完全な相補性を有する必要はないことが理解される。多くの場合、塩基の約10％未満が適合していなくても、４またはそれ以上のヌクレオチドのループを無視して、安定なハイブリッドが形成される。従って、本明細書中で使用される用語「相補的な」は、アッセイ条件下でその「相補体」と安定な２本鎖を形成するオリゴヌクレオチド（一般に約90％またはそれ以上の相同性がある）をいう。
【００３３】
用語「核酸マルチマー」または「増幅マルチマー」は、本明細書中では、同じ反復１本鎖オリゴヌクレオチドセグメント、または異なる１本鎖ポリヌクレオチドセグメントの直鎖ポリマーまたは分枝鎖ポリマーをいうために使用される。これらは、それぞれ標識プローブが結合し得る領域を含有し、すなわち、標識プローブ内に含有される核酸配列に相補的な核酸配列を含有する；オリゴヌクレオチドセグメントは、RNA、DNA、改変されたヌクレオチドまたはそれらの組み合わせで構成され得る。セグメントの少なくとも１つは、標識プローブに特異的に結合することを可能にする配列、長さ、および組成を有する；さらに、セグメントの少なくとも１つは、標識エキステンダーまたは標識プレアンプリファイヤーに特異的に結合することを可能にする配列、長さ、および組成を有する。代表的には、このようなセグメントは約15〜50、好ましくは15〜30のヌクレオチドを含有し、そして約20％〜約80％の範囲のGC含量を有する。マルチマー内のオリゴヌクレオチドセグメントの総数は、通常約３〜1000の範囲、さらに代表的には、約10〜100の範囲、そして最も代表的には約50である。マルチマーのオリゴヌクレオチドセグメントは、ホスホジエステル結合を通して、または挿入した結合物質（例えば、核酸、アミノ酸、炭水化物、またはポリオール架橋）を通して、または核酸鎖または改変核酸鎖を架橋することが可能な他の架橋物質を通して互いに直接共有結合し得る。あるいは、マルチマーは、オリゴヌクレオチドセグメントから構成され得る。これは、共有結合しないが、他のいくつかの様式（例えば、ハイブリダイゼーションを通して）で結合している。このようなマルチマーは、例えば、Nilsenらの米国特許第5,175,270号に記載されている。結合部位（単数または複数）は、セグメントの末端（通常の3'-5'方向またはランダムな方向）、および／または鎖内の１またはそれ以上の内部のヌクレオチドであり得る。直鎖のマルチマーでは、個々のセグメントは、末端と末端が結合して直鎖状ポリマーを形成する。分枝マルチマーの１つのタイプでは、３またはそれ以上のオリゴヌクレオチドセグメントが、起点から発して分枝状構造を形成する。起点は、別のヌクレオチドセグメント、または少なくとも３つのセグメントが共有結合し得るような多官能分子であり得る。別のタイプでは、１またはそれ以上のペンダントオリゴヌクレオチドセグメントを有するオリゴヌクレオチドセグメント骨格が存在する。これらの後者のタイプのマルチマーは、「フォーク様」、「櫛様」、または「フォーク様」と「櫛様」との組み合わせの構造であり、ここでは、「櫛様」マルチマーは、本明細書において好ましいマルチマーであり、骨格から伸長する多数の側鎖を有する直鎖状の骨格を有するポリヌクレオチドである。ペンダントセグメントは、通常、オリゴヌクレオチドが結合し得るか、さもなければ付着し得るに適切な官能基を有する、改変されたヌクレオチドまたは他の有機部分から垂れ下がり得る。マルチマーは、全体が直鎖状、全体が分枝状、または直鎖状の部分と分枝状の部分との組み合わせであり得る。代表的には、マルチマーには少なくとも２つの分枝点、より好ましくは少なくとも３つの分枝点、より好ましくは約５〜30の範囲の分枝点が存在するが、しかし、いくつかの実施態様ではより多数であり得る。マルチマーは、２本鎖配列からなる１またはそれ以上のセグメントを包含し得る。マルチマー合成および特定のマルチマーの構造に関するさらなる情報は、Urdeaらの共同所有する米国特許第5,124,246号に見出される。
PCT公開第WO92/02526号は、櫛型分枝マルチマーを記載し、これは、特に本方法との組み合わせに好ましく、そしてこれは、直鎖状の骨格およびペンダント側鎖で構成される；骨格は、分析物に結合する分析物核酸または核酸に特異的なハイブリダイゼーション部位を提供するセグメントを含み、一方、ペンダント側鎖は標識されたプローブに特異的なハイブリダイゼーション部位を提供するセグメントの反復を含む。
上記の、「プレアンプリファイヤー」分子もまた使用され得、これは、標識エキステンダー分子と増幅マルチマーとの間の架橋部分として働く。このようにして、より多くのアンプリファイヤーと、従ってより多くの標識が、任意の与えられた標的−プローブ複合体に結合する。プレアンプリファイヤー分子は、直鎖状または分枝状であり得、そして代表的には約30〜約3000の範囲のヌクレオチドを含有し得る。本明細書中の好ましい実施態様では、プレアンプリファイヤー分子は、少なくとも２つの異なる標識エキステンダー分子に結合するので、アッセイの全体の精度が増大する（すなわち、なぜなら、再び、複数のハイブリダイゼーション事象が、プローブ−標的複合体の形成に必要とされるからである）。
【００３４】
本明細書中で使用される「生物学的サンプル」は、個体から単離した組織または液体サンプルをいい、例えば、血漿、血清、髄液、精液、リンパ液、皮膚、呼吸管、腸管、および尿生殖路の外部分泌物、涙、唾液、乳、血球、腫瘍、器官、およびインビトロの細胞培養成分(constituent)のサンプル（細胞培養培地で細胞を増殖させて得られる馴化培地、おそらくウイルスに感染した細胞、組換え細胞、および細胞成分(component)を包含するがそれに限定されない）もまた包含するが、それに限定されない。本方法の好ましい使用は、以下の核酸の検出および／または定量においてである：(a)ウイルスの核酸、例えば、Ｂ型肝炎ウイルス(「HBV」)、Ｃ型肝炎ウイルス(「HCV」)、Ｄ型肝炎ウイルス(「HDV」)、ヒト免疫不全ウイルス(「HIV」)、およびヘルペス科のウイルス（帯状ヘルペス（水痘）、単純ヘルペスＩおよびII型ウイルス、サイトメガロウイルス、エプスタイン−バーウイルス、および最近単離されたヘルペスVI型ウイルスを包含する）由来のウイルス核酸、および(b)細菌の核酸、例えば、クラミジア、ミコバクテリウム属結核菌などの細菌の核酸；および（ｃ）多数の目的のヒト配列。
【００３５】
本明細書中で使用される用語「非特異的ハイブリダイゼーション」は、選択された第２のポリヌクレオチドのセグメントにハイブリダイズすることを意図された第１のポリヌクレオチドのセグメントが、第３のポリヌクレオチドにもハイブリダイズするような出来事をいうために使用され、これは、誤った結果の引き金となる。すなわち、標的分析物は存在しないのに標識が検出され得る状況を生じる。用語「ハイブリダイズする」の使用は、非ワトソン-クリック塩基対形成を除外することを意味しない。
【００３６】
本明細書中で使用される用語「非特異的結合」は、ここで、ポリヌクレオチドが、支持体に結合したポリヌクレオチドへの水素結合を含まない相互作用（直接または間接のいずれでも）を通して固体支持体または他のアッセイ成分に結合するような出来事をいうために使用される。
【００３７】
ここで、図１に表した好ましい実施態様に関しては、以下の用語をそこに示したハイブリダイゼーションアッセイに適用する。（図１では、普遍配列は明瞭な太線で示されていることに注目のこと）
「標識エキステンダー分子(LE)」は、本明細書中で「標識エキステンダー」ともいい、分析物ポリヌクレオチドおよび増幅マルチマー(「AMP」)に相補的な領域を含有する。プレアンプリファイヤーを使用する場合（図では示さず）、標識エキステンダー分子は、増幅マルチマーに直接よりもむしろこの中間種に結合する。プレアンプリファイヤーおよびアンプリファイヤーのどちらも使用しない場合、標識エキステンダー分子は、標識プローブ(「LP」)内の配列に直接結合する。従って、標識エキステンダー分子は、分析物ポリヌクレオチドの配列に相補的な第１の核酸配列L-1と、標識プローブ、増幅マルチマーまたはプレアンプリファイヤーのセグメントM-1に相補的なマルチマー認識配列L-2とを有する第２の普遍領域を有する１本鎖ポリヌクレオチド鎖である。
【００３８】
「標識プローブ(LP)」は、標識エキステンダー、または増幅マルチマーをアッセイに用いる場合には、このマルチマーの反復オリゴヌクレオチドセグメントのいずれかに結合するように設計される。LPは、標識を含有するか、または標識に結合するような構造であるかのいずれかである。従って、LPは、マルチマーの反復オリゴヌクレオチドセグメント内に存在する核酸配列M-2に相補的な核酸配列L-3を包含し、そして、直接的または間接的に検出可能なシグナルを提供する標識に結合するか、または結合するような構造である。
【００３９】
「捕獲エキステンダー分子(CE)」はまた、本明細書中で「捕獲エキステンダー」ともいい、分析物ポリヌクレオチドおよび捕獲プローブに結合し、これは次に固体支持体に結合する。従って、捕獲エキステンダー分子は、核酸配列C-1（これは、分析物の配列に相補的である）を含む第１のポリヌクレオチド配列領域と、捕獲プローブ認識配列C-2を有する第２の非相補的領域とを有する１本鎖ポリヌクレオチド鎖である。配列C-1およびL-1は、それぞれが分析物の物理的に区別される配列に相補的である、同一でない、非相補的な配列である。
【００４０】
「捕獲プローブ（CP）」は、捕獲エキステンダーおよび固体支持体に結合する。従って、図１に示されるように、捕獲プローブは、C-2配列に相補的な核酸配列C-3を有し、そして固体支持体に共有結合する（または共有結合し得る）。
【００４１】
一般に、図１に示したシステムを使用して行われる液相ハイブリダイゼーションアッセイは、以下のように進行する。１本鎖分析物核酸を、捕獲エキステンダーおよび標識エキステンダーとともにハイブリダイゼーション条件下でインキュベートする。得られた生成物は、捕獲エキステンダーおよび標識エキステンダーに結合した分析物ポリヌクレオチドの核酸複合体である。続いて、この複合体を、ハイブリダイズする条件下で、その表面に結合した捕獲プローブを有する固相に添加し得る；しかし、本発明の好ましい実施態様では、最初のインキュベーションを、支持体に結合した捕獲プローブの存在下で実施する。得られた生成物は、捕獲エキステンダー分子および捕獲プローブを通して固相に結合した複合体を含む。次いで、結合した複合体を有する固相は、未結合の物質から分離される。次いで、増幅マルチマー、好ましくは上記のような櫛型マルチマーを、ハイブリダイゼーション条件下で必要に応じて固相−分析物−プローブ複合体に添加し、LEにこのマルチマーをハイブリダイズさせる；プレアンプリファイヤープローブを使用する場合には、この固相−分析物−プローブ複合体を、増幅マルチマーと共に、または好ましくは、増幅マルチマーとのインキュベーションの前に、プレアンプリファイヤーとともにインキュベートする。次いで、得られた固相複合体を、洗浄によりいずれの未結合のプレアンプリファイヤーおよび／またはマルチマーからも分離する。次いで、LEにハイブリダイズし得るか、あるいは増幅マルチマーを使用した場合には、マルチマーの反復オリゴヌクレオチドセグメントにハイブリダイズし得る条件下で標識化プローブを添加する。次いで、得られた固相標識された核酸複合体を洗浄し、未結合の標識されたオリゴヌクレオチドを除去し、そして解読する。図１に表した構成物は、必ずしも正確な拡大率で描かれる必要はなく、そして使用する場合には、増幅マルチマーは（上記で説明したように）図に示したよりもずっと多数の反復オリゴヌクレオチドセグメント（これらはそれぞれ標識プローブに結合するように設計される）を含有することが注目されるべきである。
本方法の第１の焦点は、バックグランドノイズの供給源を排除することであり、これは、捕獲プローブおよび捕獲エキステンダー分子と、標識プローブ、標識エキステンダー分子、およびアンプリファイヤーとの相互作用を最小限にして、支持体に結合した捕獲プローブに、誤った部分が結合する可能性を減少させることによる。
【００４２】
相補的オリゴヌクレオチド配列の間のハイブリダイゼーションは、そこに含まれるプリンおよびピリミジンヌクレオチドの安定な塩基対を形成する能力が前提条件とされる。５つの天然に存在するヌクレオチド、アデノシン（Ａ）、グアノシン（Ｇ）、チミジン（Ｔ）、シチジン（Ｃ）、およびウリジン（Ｕ）は、プリン-ピリミジン塩基対Ｇ-ＣおよびＡ-Ｔ（Ｕ）を形成する。Ｇ-Ｃ塩基対の結合エネルギーは、Ａ-Ｔ塩基対の結合エネルギーよりも大きく、これは以下に示すように、後者の２つの水素結合部分に対して、前者の３つの水素結合部分の存在によるものである：
【００４３】
【化１０】
および
【００４４】
【化１１】
従って、従来の液相核酸サンドイッチアッセイでは、上記に詳細に説明されるように、オリゴヌクレオチド分子は、他のアッセイ成分または標的分析物中の核酸配列に相補的であり、それゆえそのような核酸配列にハイブリダイズする核酸配列を含有するように設計されている。本発明の方法は、独特の塩基対を形成し得るアッセイ成分の普遍オリゴヌクレオチドセグメント中に、非天然ヌクレオチド単位を取り込ませることにより、非特異的ハイブリダイゼーションを減少する。さらに、本発明の方法は、標的分析物の存在および/または量に関連する検出可能な標識されたアッセイ成分を、非特異的に結合し、そしてアッセイのバックグラウンドノイズに寄与するアッセイ成分から分離することにより、アッセイ成分の非特異的結合の寄与を減少する。
【００４５】
本発明の第１の実施態様では、独特の塩基対を形成し得るＡ、Ｔ、Ｃ、Ｇ、およびＵ以外のヌクレオチド単位が、標的分析物特異的でないアッセイ成分のハイブリダイズしているオリゴヌクレオチドセグメント中に取り込まれ、そしてそれゆえ標的-特異的プローブ配列または無関係の非標的核酸配列と安定なハイブリッドを形成しにくいハイブリダイゼーションアッセイを提供する。従って、図１に示すように、例えばこのようなヌクレオチド単位は、相補的核酸配列C-2/C-3、L-2/M-1、およびL-3/M-2に取り込まれ得る。標的分析物の核酸セグメントに相補的なアッセイ成分のハイブリダイズしているオリゴヌクレオチドセグメントは、天然に存在するヌクレオチド（すなわちＡ、Ｔ、Ｃ、ＧまたはＵ）から構築される。ヌクレオチド単位を含有するオリゴヌクレオチドセグメントは、天然に存在するヌクレオチドの約15％〜約100％をヌクレオチド単位対応物に置換することにより構築され得る。好ましくは、オリゴヌクレオチド中の３または４毎の塩基が、独特の塩基対を形成し得るヌクレオチド単位で置換される。置換したヌクレオチド単位の割合が増加するにつれて、非特異的ハイブリダイゼーションが付随して減少することは、当業者に自明である。しかし、完全な置換には、普遍配列間の非特異的ハイブリダイゼーションを排除するのに十分な配列の多様性を維持するために、少なくとも２つの新しい塩基対が必要である。
【００４６】
本発明の別の実施態様では、標的非依存的シグナル産生の現象は、C-2/C-3ハイブリッドまたはL-2/M-1ハイブリッドの融解温度Tm1が、L-3/M-2ハイブリッドの融解温度Tm2よりも十分に低いように形成されたハイブリダイゼーションアッセイを提供することにより取り組まれる。この方法は、融解温度Tm1が融解温度Tm2よりも少なくとも約５℃低い、好ましくは少なくとも約10℃低い、より好ましくは少なくとも約20℃低いようなハイブリッド複合体の設計および構築に基づく。
【００４７】
この安定性の差異は、最初にTm1およびTm2のハイブリッド複合体の形成に好都合なストリンジェントな条件下でアッセイを行うことにより開発される。ストリンジェンシーは、標的分析物の捕獲プローブからの物理的分離またはアンプリファイヤー結合標識プローブの標的からの物理的分離を結果として提供するアッセイの引き続く工程で変更される。ストリンジェンシーは熱力学の変数であるパラメーターを変更することにより制御され得る。このような変数は、当該分野で周知であり、そしてホルムアミド濃度、塩濃度、カオトロピック塩の濃度、pH（水素イオン濃度）、有機溶媒含有量、および温度を含む。好ましいストリンジェンシーの制御手段は、pHおよび塩濃度である：１つのアッセイ工程は、捕獲プローブ/捕獲エキステンダーの間で形成されるハイブリッド複合体を不安定にするか、または標識エキステンダー/アンプリファイヤー（またはプレアンプリファイヤー）の間に形成されるハイブリッドを不安定にするpHまたは塩濃度で行われる。ストリンジェンシーに影響を及ぼす好ましい工程は、基質の添加である。従って、好ましい実施態様では、ハイブリダイゼーションアッセイは、全てのアッセイ成分間で形成されるハイブリッド複合体の安定性に好都合な条件下で行われ、そしてその後、標識基質の添加に伴い、標識プローブが標識エキステンダーまたはアンプリファイヤーから放出されない条件でストリンジェンシーは変更され、捕獲プローブ/捕獲エキステンダー、または標識エキステンダー/アンプリファイヤー（プレアンプリファイヤー）などのハイブリッド複合体を不安定にする。
【００４８】
本発明の別の実施態様は、上記の本発明の実施態様が達成され得る１つの手段が、Tm1ハイブリッド複合体を形成する相補的ヌクレオチド配列がTm2ハイブリッド複合体を形成するヌクレオチド配列よりも短いようなハイブリダイゼーションアッセイを作製することによるものであることを示す。より短い相補的ヌクレオチド配列に伴い、その中の配列の多様性の機会が減少することは当業者に理解される。しかし、この多様性は、非天然塩基対（例えばイソＣ-イソＧ塩基対）を相補的配列中に取り込ませることにより、維持され得る。
【００４９】
Tm1とTm2との間の温度差が大きいほど、バックグラウンドノイズの除去におけるこの技術の「有効性」が大きいことは、当業者に容易に理解される。従って、当業者は、10℃未満の温度差、５℃未満の温度差さえもまた、たとえわずかな程度でもバックグラウンドノイズを減少させることを認識する。
【００５０】
非天然ヌクレオチド単位がハイブリダイズしているオリゴヌクレオチド配列中に取り込まれ、標的分析物とのハイブリダイゼーションの特異性を増加するという本発明に開示される方法は、種々の応用における有用性を提供する。
【００５１】
基本の液相核酸サンドイッチアッセイまたは増幅した液相核酸サンドイッチアッセイでは、多数の捕獲プローブが固体表面に付着される。多くの場合、非特異的結合に利用可能な表面領域は、例えばサケ精子または子ウシ胸腺由来のDNAと共にその表面をインキュベートすることにより制御される。しかし、このDNAの存在は、アッセイ成分の固体支持体への非特異的ハイブリダイゼーションの可能性を増大し、そしてそれゆえ、バックグラウンドノイズを増大する。非天然塩基を含む合成DNAでのこれらの天然DNAの置換は、非特異的ハイブリダイゼーションおよび非特異的結合を最小にする。
【００５２】
好ましくは、これらのポリヌクレオチドは、当業者に周知の方法により、ヌクレオチドの混合物で短いオリゴヌクレオチドを３’テーリングすることにより調製される。あるいは、非天然ヌクレオチドを含有する短いほぼランダムな配列のオリゴヌクレオチドが互いに連結され、ポリヌクレオチドが形成される。この目的のために、分岐したDNAが、好都合に用いられ得る。例えば、ブロック配列-TNVN-F-TNVN-J-TNVN-（ここでFはイソＣであり、そしてJはイソＧである）が調製され、そして化学的に連結されてポリマーを形成する。酵素的３’テーリングアプローチの使用におけるこのアプローチを用いることの利点は、ホモポリマー/ホモオリゴマーの排除である。
【００５３】
非天然ヌクレオチド単位を含有するハイブリダイズするオリゴヌクレオチドの構築が有用性を提供する別の応用は、アンチセンス化合物の設計における応用である。アンチセンス化合物は例えば、Ｃｈｉｎｇら（（１９８９）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８６：１０００６−１００１０）、Ｂｒｏｄｅｒら（（１９９０）Ａｎｎ．Ｉｎｔ．Ｍｅｄ．１１３：６０４−６１８）、Ｌｏｒｅａｕら（（１９９０ ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔｅｒｓ ２７４：５３−５６）、およびPCT公報第WO91/11535号、第WO91/09865号、第WO91/04753号、第WO90/13641号、第WO91/13080号、および第WO91/06629号により説明されている。アンチセンス化合物は、特定のタンパク質の産出をになうmRNAに結合し、そしてmRNAの産生を無効にするか、または阻害するオリゴヌクレオチドである。従来のアンチセンス分子は、一般に、種々のオリゴヌクレオチド種と反応し得る。しかし、その長さ（一般に30ヌクレオチド単位までのオリゴヌクレオチド配列）のために、このようなアンチセンス分子には非標的種との非特異的ハイブリダイゼーションに関連する問題が存在する。１つの解決手段は、多彩なプローブおよび標的の間のハイブリダイゼーションの短い配列を用いることであり；全ての複合体を強固にするために、Ｄｉｓｔｅｆａｎｏら（（１９９２）Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１１４：１００６−１００７）に記載のように、プローブの間の短い「２量体化領域（dimerization region）」が用いられる。２量体化領域は、非天然ヌクレオチド単位を含有する相補的配列を伴う末尾を有し、それにより非標的分析物への非特異的ハイブリダイゼーションを増大することなく、標的分析物への高度に効率的かつ特異的な結合を提供するように設計され得る。この観念を、２本鎖DNA標的とともに図２に図解する。
【００５４】
図２に説明したように、鎖の置換は２本鎖DNAを引き離すために用いられ得る。超ヘリックスのストレス下のAT-リッチなプロモーター配列は、S1ヌクレアーゼ感受性であり、従って、既に部分的に１本鎖であり、このタイプのアンチジーン（antigene）応用のための特に好ましい部位である。短いオリゴヌクレオチドは特異性を最大化するために使用される；標的へのこれらの結合エネルギーは、互いに連結してオリゴヌクレオチドのネットワークを形成することにより増強される。
【００５５】
この構造物において、標的の非存在下で安定な塩基対を形成しない短い普遍配列は、イソＣおよびイソＧを含有し、プローブのヒトの配列との非特異的ハイブリダイゼーションを制限する。プローブ１、２および３の標的への結合において、普遍配列は、その有効濃度が顕著に増加するほど十分に、近密に接近している。次いで、普遍配列が対をなし、結合の強さをさらに増大する。RNA標的もまた、このアプローチに関連して用いられる。
【００５６】
Ｇｏｌｄらの米国特許第5,270,163号、Ｔｕｅｒｋら（（１９９０）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４９：５０５−５１０）、Ｓｚｏｓｔａｋら（（１９９０）Ｎａｔｕｒｅ ３４６：８１８−８２２）、およびＪｏｙｃｅ（（１９８９）Ｇｅｎｅ ８２：８３−８７）に記載のSELEX手順は、所望の標的分子を、その形状によって認識し、そして結合するRNAまたはDNA配列を選択するために使用され得る。用語「アプタマー」（または核酸抗体）は、本明細書において、このような１本鎖または２本鎖DNAあるいは１本鎖RNA分子をいうのに用いられる。例えば、PCT公報第WO92/14843号、第WO91/19813号、および第WO92/05285号を参照のこと（これらの開示は本明細書中に参考として援用される）。「標的分析物」とは区別される「標的分子」は、タンパク質、多糖類、オリゴヌクレオチド、または他の高分子などの重合体、および薬物、代謝物、毒素などの小分子を含み、アプタマーはそれに結合するように設計される。
【００５７】
SELEX手順において、ｎマー（好ましくは、ランダム化したヌクレオチド配列、それによってオリゴヌクレオチドの「ランダマープール（ｒａｎｄｏｍｅｒ ｐｏｏｌ）」を形成している）が２つのポリメラーゼ連鎖反応（PCR）プライマーに隣接しているオリゴヌクレオチドが構築される。次いで、この構築物を、オリゴヌクレオチドの標的分子への結合に好都合な条件下で標的分子に接触する。標的分子に結合するこれらのオリゴヌクレオチドは：（a）濾過、遠心分離、クロマトグラフィーなどの従来の方法を用いて、標的分子に結合しないオリゴヌクレオチドから分離され；（b）標的分子から解離され；そして（c）従来のPCR技術を用いて増幅され、リガンドリッチなオリゴヌクレオチドのプールを形成する。さらに、所望の結合親和性、特異性、またはその両方を有するアプタマーが達成されるまで、結合、分離、解離および増幅の繰り返しが行われる。次いで、同定された最終的なアプタマー配列が、化学的にまたはインビトロの転写により調製され得る。このようなアプタマーを調製する場合、選択された塩基対が非天然塩基対で置換され、アプタマーがヒト核酸にハイブリダイズする可能性を減少する。
【００５８】
本発明は、SELEXの少なくとも２つの一般的な方法において用いられ得る。第１に、イソdGおよびイソdCは、ランダマーDNA配列プール中の配列中に含まれ得る。タンパク質または他の重要な生物分子を認識し得る可能なランダマーの構造の数は、従来の４つのヌクレオチドＡ、Ｔ、ＧおよびＣよりも６以上のヌクレオチドからDNA鎖を合成することにより増加する。これは次に、標的分子に対してより強い親和性および/または特異性で結合する配列を同定する機会を改善する。
【００５９】
SELEXにおいて、選択される保存されたオリゴヌクレオチドは、細胞の配列への所望されないハイブリダイゼーションを有し得る。この非特異的ハイブリダイゼーションは、選択プロセスにおいて非天然塩基を用いることにより減少され得る。ヒトRNAおよびDNAポリメラーゼには認識されないが、一定のファージまたは細菌のポリメラーゼには認識されるヌクレオチドは、この応用において特に有用である。
【００６０】
SELEXプロセスにおける本発明の第２の使用法は、非特異的ハイブリダイゼーションを最小化した最終的なアプタマー構築物の調製における使用である。例えば、予め決定された結合親和性、特異性、または他の標的分子認識特性を示すアプタマーが、SELEXプロセスを用いて、RNAまたはDNA配列のプールから選択される。これらの標的分子認識特性は、分子間オリゴヌクレオチドハイブリッド複合体の形成により部分的に維持されるアプタマーの２次構造によって決定される。アプタマーの２次構造の解明において、所定の分子間ハイブリッド複合体中の塩基対の特異性が、アプタマーの２次構造の維持、それ故、標的分子認識および結合特性の維持に高度に好ましいことは当業者に自明であり、すなわち、好ましくはＧ-ＣまたはＡ-Ｔである塩基対が存在する。これらの分子内ハイブリッド複合体中（例えば、ステムループの塩基対形成部分）に他の塩基対が存在し、これは、アプタマーの２次構造を改変することなく任意の相補的ヌクレオチド対（本明細書中ではＮ-Ｎ’塩基対という）により置換され得る。
【００６１】
最終的なアプタマー構築物における選択されたＮ-Ｎ’塩基対ならびにＧ-ＣおよびＣ-Ｇ塩基対の、イソＧ-イソＣまたはイソＣ-イソＧへの単一の置換は、非標的オリゴヌクレオチド配列への非特異的ハイブリダイゼーションを減少する。イソＣ-イソＧ塩基対はＣ-Ｇ塩基対と等エネルギーであるので、分子の基本的形状およびヘアピンの強度は非常に似ている。得られる配列がＣ-ＧよりもＡ-ＵまたはＵ-Ａに強い優先度を示す塩基対を置換するために、Ａ-Ｕと等エネルギーの塩基対が望ましい。これらの置換は、細胞のRNAおよびDNA配列への所望されないハイブリダイゼーションの可能性を制限することにより、標的分子に対してより特異的なアプタマーを作製することにおいて効果を有する。
【００６２】
基本的なプロセスにおいて、選択された塩基対はイソＣ-イソＧまたはイソＧ-イソＣ塩基対で置換される。最終的な構築物において、イソＣ-イソＧ塩基対はリボヌクレオチドまたはデオキシリボヌクレオチドを含む。キメラのアプタマー（リボヌクレオチドおよびデオキシリボヌクレオチドの両方からなる）分子は合成的に作製され得る。あるいは、リボ-イソGTPおよびリボ-イソCTP（適切な２’保護を有する）が、イソＣおよびイソＧを含有するDNAテンプレートのインビトロ転写によるアプタマーの調製に使用され得る。
【００６３】
本発明が有用性を提供し得る他の応用は、ハイブリダイゼーションアッセイ中、およびポリメラーゼ連鎖反応（PCR）アッセイ中の非特異的結合の減少における、インサイチュハイブリダイゼーションを含む。
【００６４】
インサイチュハイブリダイゼーションは、標的分析物の単一分子を検出するのに十分な感受性を欠いている。インサイチュPCR（例えば、Ｂａｇａｓｒａら、（１９９３）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ １５８：１３１−１４５）は、この感受性の必要性を達成するために開発された；しかし、定量はPCR法ほど正確ではない。代替法は、標的分子と結合する複数の標識エキステンダープローブを使用する。標識エキステンダーは、プレアンプリファイヤーまたはアンプリファイヤーのいずれかを結合する。使用される場合、プレアンプリファイヤーは標識エキステンダーおよびアンプリファイヤーを架橋する。アンプリファイヤーは標識されたプローブ（好ましくはルミネッセンス（感受性が十分高い場合には蛍光）により検出される）を結合する。上記のように、普遍配列L-2/M-1およびM-2/L-3は、ヒト配列への所望されないハイブリダイゼーションを減少するようにイソＣおよびイソＧを最適には15〜30％の間で含有する短いオリゴヌクレオチドからなる。第４の塩基対は、これらの配列中の天然塩基の主張をさらに減少するために使用され得る。
【００６５】
上記に示したように、非特異的結合ならびに非特異的ハイブリダイゼーションは、非天然塩基対の使用により減少され得る。６〜８の異なるヌクレオチドからなるランダムなポリマーまたはほぼランダムなブロックコポリマーが、ポリヌクレオチドに対して高い親和性を有する細胞成分へのアンプリファイヤーおよび標識されたプローブの非特異的な結合を減少するために使用され得る。従って、非特異的結合は、一般的に行われるような子ウシまたはサケ由来の天然配列を導入することによる非特異的ハイブリダイゼーションの増加の危険性なしに、減少される。
【００６６】
当業者は、固体の支持体へのプローブの非特異的ハイブリダイゼーションおよび非特異的結合を減少するために、同じストラテジーが、ドットブロット、サザーンおよびノーザンなどのブロットアッセイに適用され得ることを理解する。
【００６７】
本発明はまた、PCRおよび他の指数関数的な増幅技術におけるいくつかの使用を提供する。例えば、ネステッド（nested）PCRでは、標的分析物は最初に増幅され、次いで数千倍に希釈された後、１つのプライマーの５’突出部を捕獲のために使用し、他方のプライマーの突出部を標識のために使用することが一般的である。ポリメラーゼにより判読不可能なスペーサーは、突出部が１本鎖のままで残るように挿入される（例えば、Ｎｅｗｔｏｎら（１９９３）Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄ．Ｒｅｓ．２１：１１５５−１１６２を参照のこと）。これらの５’突出部中の一般的な配列は、非標的におけるプライミングの頻度を減少するために改変された塩基対を含有するように調製され得る。実際、５’突出部の最初の塩基におけるイソdCまたはイソdGの存在は、現在使用されるスペーサーの代わりに使用され得る；ポリメラーゼはイソdCまたはイソdGを判読し得ない。なぜならば、ポリメラーゼは、それの代わりに配置するイソdGTPまたはイソdCTPを有さないからである。ポリメラーゼは、プライマー中にイソdGを検出した場合、低い頻度でポリマー中にＴを配置し得るので、５’突出部における最初の塩基としてイソＣを使用することが好ましい。
【実施例】
【００６８】
（実験）
本発明の実施には、他に示さない限り、当該分野の技術範囲内である、合成有機化学、生化学、分子生物学などの従来技術を使用する。このような技術は文献に詳細に説明されている。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ、ＦｒｉｔｓｃｈおよびＭａｎｉａｔｉｓ、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、第２版（１９８９）；Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ（Ｍ．Ｊ．Ｇａｉｔ編、１９８４）；Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ（Ｂ．Ｄ．ＨａｍｅｓおよびＳ．Ｊ．Ｈｉｇｇｉｎｓ編、１９８４）；およびシリーズ、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．）を参照のこと。
【００６９】
本明細書に記載される（上記および下記の両方）全ての特許、特許出願、および刊行物は、本明細書中で参考として援用される。
【００７０】
本発明は、その好ましい特定の実施態様と共に記述されるが、上記記述および以下の実施例は、本発明の範囲を説明することを意図し、そして本発明の範囲を限定しないということが理解されるべきである。本発明の範囲内の他の局面、利点、および改変は、本発明が属する分野の当業者に明らかである。
【００７１】
以下の実施例において、使用した数（例えば、量、温度など）に関して正確さを確保するために努力がなされたが、いくつかの実験誤差および偏差が考慮されるべきである。温度は常に℃であり、そして他に示さない限り、圧力は大気圧であるか、またはほぼ大気圧である。
【００７２】
（イソグアノシンまたは2'-デオキシ-イソグアノシンの合成）
イソグアノシンまたは2'-デオキシ-イソグアノシンの合成のための手順は、ほとんど報告されていない。例えば、2'-デオキシ-イソグアノシンは：１）塩基性条件下で直接光分解により2'-デオキシアデノシン-(N1-オキシド）を介して2'-デオキシアデノシンから合成される（Switzerら(1993)、前出）；２）塩基性条件下で直接光分解により2-クロロ-2'-デオキシアデノシンから合成される（Ｓｅｅｌａら（１９９２）Ｈｅｌｖ．Ｃｈｉｍ．Ａｃｔａ ７５：２２９８−２３０６）；および３）6-アミノ-1-(2'-デオキシ-β-D-エリトロペントフラノシル)-1H-イミダゾール-4-カルボニトリル[AICA 2'-デオキシヌクレオシド]（これをベンゾイルイソシアネートと反応させ、続いてアンモニアと処理してピリミジン環の環生成を行う）から化学的経路により合成される（Ｋａｚｉｍｉｅｒｃｚｕｋら（１９９１）Ｈｅｌｖ．Ｃｈｉｍ．Ａｃｔａ ７４：１７４２−１７４８）。
【００７３】
しかし、2'-デオキシアデノシン-(N1-オキシド）の2'-デオキシ-イソ-グアノシンへの光分解変換は、容易にスケールアップし難いので、容易に入手可能な2'-デオキシリボヌクレオシド出発物質から2'-デオキシ-イソグアノシンへの簡便な化学的経路を開発した。
【００７４】
特定の「変換可能」2'-デオキシグアノシン誘導体（例えば、O6-フェニル-2'-デオキシグアノシン）を介する、2'-デオキシグアノシンの2,6-ジアミノプリンヌクレオシドおよびN6-アルキル-2,6-ジアミノプリンヌクレオシドへのいくつかの変換手順が記載されている（ＭａｃＭｉｌｌａｎら（１９９１）Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ ４７：２６０３−２６１６；Ｇａｏら（１９９２）Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．５７：６９５４−６９５９；およびＸｕら（１９９２）Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ ４８：１７２９−１７４０）。さらに、Ｆａｔｈｉら（１９９０）Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔｅｒｓ ３１：３１９−３２2は、2'-デオキシグアノシンの無水トリフルオロ酢酸／ピリジンでの処理、続いてインサイチュでのフェノールでの置換を含む手順を用いるO6-フェニル-2'-デオキシグアノシンの簡便な合成を記載した。あるいは、2'-デオキシグアノシンへのO6-フェニル部分の導入が、Ｒｅｅｓｅら（１９８４）Ｊ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．Ｐｅｒｋｉｎ Ｔｒａｎｓ．Ｉ、1263-1271により記載されており、ここで中間体O6-(4-トルエンスルホニル)-2'-デオキシグアノシンをトリメチルアミン、続いてフェノールで処理してO6-(4-トルエンスルホニル）を置換し、O6-フェニル-2'-デオキシグアノシンを得た。イソグアノシン様化合物を、S酸化により（2-(メチルスルホニル)-6-アミノ-ピラゾロピリミジンリボヌクレオシドを生成する）2-(メチルメルカプト)-6-アミノ-ピラゾロピリミジンリボヌクレオシドから産生し、続いてNaOHで置換してイソグアノシンアナログを得た（Ｃｏｔｔａｍら（１９８３）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ １１：８７１−８８２）。
【００７５】
亜硝酸アルキルを用いるグアノシンおよび2'-デオキシグアノシン中の2-アミノ基の変換が記載されている。これらは、ラジカル反応における2-ハロへの変換（Ｎａｉｒら（１９８２）Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ６７０−６７２）、および2-(メチルメルカプト)-6-クロロ-プリンリボヌクレオシドへの変換（Ｔｒｉｖｅｄｉ（１９９１）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、Ｔｏｗｎｓｅｎｄら（編）Ｗｉｌｅｙ Ｉｎｔｅｒ−Ｓｃｉｅｎｃｅ、パート４、２６９−２７３）を包含する。O6-(p-ニトロフェニルエチル)-3',5'-O-ジ-t-ブチル-ジメチルシラン-2'-デオキシグアノシンを新鮮な（neat）亜硝酸ペンチルで酸化することにより、O6-(p-ニトロフェニルエチル)-3',5'-O-ジ-TBDMS-2'-デオキシキサントシンが得られることが報告されている（Ｓｔｅｉｎｂｒｅｃｈｅｒら（１９９３）Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．Ｅｎｇｌ．３２：４０４−４０６）。
【００７６】
2'-デオキシ-イソグアノシンの合成手順は、Ｓｅｅｌａら（１９９４）Ｈｅｌｖ．Ｃｈｉｍ．Ａｃｔａ ７７：６２２−３０に記載されている。第１工程において、2'-デオキシグアノシンを2-アミノ-2'-デオキシアデノシンに変換した。第２工程において、亜硝酸ナトリウムで2-アミノ基をジアゾ化することにより、2-アミノ-2'-デオキシアデノシンを脱アミノ化し、2'-デオキシ-イソグアノシンを得た。
【００７７】
以下の構造式
【００７８】
【化１２】
（ここで、R1は、水素、ヒドロキシル、スルフヒドリル、ハロゲノ、アミノ、アルキル、アリルおよび-OR2からなる群から選択され、ここでR2はアルキル、アリル、シリル、またはホスフェートである）を有する化合物を合成するための本明細書に開示および請求される方法は：
ａ）以下の構造式
【００７９】
【化１３】
を有する化合物を、3'および5'の両方のヒドロキシル基を保護するに適切な試薬と反応させる工程；
ｂ）工程（ａ）の産物を、O6-オキシ部分を求核置換を受けやすい官能基に変換するのに適切な試薬と反応させ、それにより官能基化O6部分を生成する工程；
ｃ）工程（ｂ）の産物の2-アミノ基を酸化する工程；
ｄ）工程（ｃ）の産物を求核試薬と反応させ、官能基化O6部分を置換する工程；および
ｅ）工程（ｄ）の産物を、保護された3'および5'ヒドロキシル基を脱保護するのに適切な試薬と反応させる工程。
【００８０】
グアノシンまたは2'-デオキシグアノシンの、それぞれイソグアノシンまたは2'-デオキシ-イソグアノシンへの変換は、適切な試薬（例えば、TBDMS、塩化ベンゾイル、無水酢酸など）を用いて糖部分のヒドロキシル基を保護することにより達成され得る。前述したように、糖部分のヒドロキシル基のうちの１つまたはそれ以上が、ハロゲン、脂肪族基により置換され得るか、またはエーテル、アミンなどに官能基化され得る。産物は単離され、そしてO6が適切な求核試薬により置換され得るように修飾される。このような置換可能基の例としては、例えば、CH3-S-C6H4-O6-、C6H5-SO2-O6-、C6H5-O6-、4-ニトロ-C6H4-O6-、2,4,6-トリニトロ-C6H2-O6などが挙げられる。次いで、2-アミノ基が、亜硝酸アルキル、または当該分野で公知の他の適切な試薬（Nairら(1982)、前出；Trevidi(1991)、前出；またはSteinbrecherら(1993)、前出を参照のこと）を用いて、オキシ官能基に変換される。産物を適切な求核試薬（例えば、NH4OH、または末端-NH2、-SH、-COOHなどを含む他のアミノアルキル、アミノアリール、アミノへテロアルキル、アミノヘテロアリール）と反応させ、それにより修飾O6脱離基を置換する。保護されたヒドロキシル基の脱保護は、例えば、塩基またはフッ素で処理することにより達成され得る。
【００８１】
以下の考察において、O6-(4-メチルチオフェニル）は、典型的な置換可能基として役立つ。しかし、その使用は、特定の実施態様を記載するためのみであり、限定されることは意図しない。
【００８２】
N6-アルキル化イソグアノシン誘導体は、アルキルアミンを求核試薬として用いることにより容易に合成され得る。例えば、ヘキサンジアミンがO6-(4-メチルチオフェニル）を置換するために使用され、N6-(6-アミノヘキシル)-イソグアノシンを形成し得る。アミノヘキシル基の保護（例えば、トリフルオロアセトアミド誘導体として）およびそれに続くホスホラミダイト試薬への変換により、官能基化可能イソグアノシンアナログが提供される。このアナログは、さらなる合成後の誘導体化のためにオリゴヌクレオチド中の任意の所望の位置に取り込まれ得る。従って、選択されたイソグアノシン／イソシチジン塩基対のイソグアノシン部分を特異的に標識することが可能である。O6-(4-メチルチオフェニル）基を適切に末端化された（terminated）求核試薬（例えば、-COOH、-SH、-NH2など）で単純に置換することにより、任意の所望の官能性を有するイソグアノシンの一連のN6-誘導体を合成することも可能であり、誘導体が容易に調製され得る。
【００８３】
さらに、O2-(4-メチルチオフェニル)-2'-デオキシキサントシン、その完全に保護されたホスホラミダイト形態（O2-(4-メチルチオフェニル)-5'-O-DMT-3'O-(BCE-ジイソプロピルホスホラミダイト)-2'-デオキシキサントシン）は、オリゴヌクレオチドへの取り込み後の変換可能誘導体として使用され得る。アルキルジアミン、または他の官能基化アルキルアミンでO2-(4-メチルチオフェニル)-2'-デオキシキサントシンからO2-(4-メチルチオフェニル）を合成後置換することにより、N6-(アミノアルキル)-2'-デオキシ-イソグアノシン含有オリゴヌクレオチドが産生される。誘導体化イソグアノシンは、官能基化イソグアノシン残基で標識または他のレポーター分子を特異的に導入するための部位として役立ち得る。
【００８４】
（合成アプローチの概略）
スキーム１に示すように、2'-デオキシ-イソグアノシンの合成を、2'-デオキシグアノシンから以下のような５工程で行った：
１）2'-デオキシグアノシンの3',5'-O-(t-ブチルジメチルシリル)2-2'-デオキシグアノシンへの変換（および再結晶による精製）（Ｏｇｉｌｖｉｅら（１９７３）Ｃａｎ．Ｊ．Ｃｈｅｍ．５１：３７９９−３８０７）；
２）O6-(4-トルエンスルホニル)-3',5'-O-TBDMS2-2'-デオキシグアノシンへの変換；
３）O6-(4-(メチルチオ)フェニル)-3',5'-O-TBDMS2-2'-デオキシグアノシンを得るためのReeseの手順を用いる、適切なフェノール（例えば、4-(メチルチオ)フェノールまたはペンタクロロフェノール（phentachlorophenyl））でのO6における4-トルエンスルホニル基の置換（Reeseら(1984)、前出）；
４）O6-(4-(メチルチオ)フェニル)-3',5'-O-TBDMS2-2'-デオキシキサントシンを得るための中性条件下で亜硝酸tert-ブチルを用いる2-アミノ基のオキシ官能基への酸化（Steinbrecherら(1993)、前出）；および
５）3',5'-O-TBDMS2-2'-デオキシ-イソグアノシンを得るための高温でのO2-(4-メチルチオフェニル）基の水酸化アンモニウムでの置換。
【００８５】
グアノシンからのイソグアノシンの合成は、同様の反応スキームを用いて達成され得る。
【００８６】
【化１４】
【００８７】
【化１５】
【００８８】
【化１６】
得られた物質は、刊行されている光分解経路（Switzerら(1993)、前出）により調製した基準試料と全ての点（TLC、HPLC、UV、およびNMR）で同一であった。
【００８９】
（イソシチジンまたは2'-デオキシ-イソシチジン誘導体の調製）
イソシチジンまたは2'-デオキシ-イソシチジンの誘導体が調製され得る。ここでグリコシド結合は、オリゴヌクレオチド合成の間、希酸への曝露に対して安定化されている。N2-アミジン誘導体は、2'-デオキシアデノシンについて例えば、ＭｃＢｒｉｄｅら（１９８６）Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１０８：２０４０−２０４８、Ｆｒｏｅｈｌｅｒら（１９８３）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１１：８０３１−８０３６およびＰｕｄｌｏら（１９９４）Ｂｉｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔｔ．４：１０２５−１０２８により記載されている。N2-(N,N-ジ(X)ホルムアミジノ)-2'-デオキシ-イソシチジンを以下の手順により合成した。本明細書に例示されるように、Ｘはn-ブチルである。しかし、Ｘは、C2-C10アルキル、アリール、ヘテロアルキル、ヘテロアルキルなどでもよい。
【００９０】
N-ジ-n-ブチルホルムアミドジメチルアセタールを、McBrideら(1986)、前出、Froehlerら(1983)、前出、およびPudloら(1994)、前出に記載のようにN,N-メチルホルムアミドジメチルアセタールとジ-n-ブチルアミンとのアミノ交換反応により合成した。10mmoleの2'-デオキシ-5-メチル-イソシチジンを100mlのメタノールに懸濁し、そして10mmoleのN,N-ジ-n-ブチルホルムアミドジメチルアセタールを添加した。室温で２時間撹拌後、透明な溶液が得られた。塩化メチレン中の10％メタノールを用いて展開したシリカ60Hの薄層クロマトグラフィー分析は、出発物質が完全に消費されたことを示した。水（10ml）を添加して過剰の試薬を分解し、そして溶媒を減圧下で除去して3.8gの粗N2-(N,N-ジブチルホルムアミジノ)-2'-デオキシ-イソシチジンを得た。この誘導体は、オリゴヌクレオチドへの取り込みのために5'-O-DMT-N2-(N,N-ジブチルホルムアミジノ)-2'-デオキシ-イソシチジンに直接変換され得る。
【００９１】
他のイソシチジン誘導体が調製され得、これは、検出可能な標識がオリゴヌクレオチドの特定の位置に取り込まれ得ることにより官能基化可能な置換基を提供する。例えば、5-アルキル化2'-デオキシウリジン誘導体（例えば、5-[N-(6-トリフルオロアセチルアミノヘキシル)-3-(E)アクリルアミド]-2'-デオキシウリジン）は、Ｒｕｔｈ（１９９１） Ｏｌｉｇｏｄｅｏｘｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ ｗｉｔｈ Ｒｅｐｏｒｔｅｒ Ｇｒｏｕｐｓ Ａｔｔａｃｈｅｄ ｔｏ ｔｈｅ Ｂａｓｅ、Ｅｃｋｓｔｅｉｎ（編）Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ ａｎｄ Ａｎａｌｏｇｕｅｓ、ＩＲＬ ｐｒｅｓｓ、２５５−２８２頁により記載されている。このような5位誘導体は、塩基対ハイブリダイゼーションパターンを妨害しないことが見出されている。Ruthにより記載される化学を使用して5-[N-(6-トリフルオロアセチルアミノヘキシル)-3-(E)アクリルアミド]-2'-デオキシ-イソシチジンを合成し、それにより選択されたイソグアノシン＊イソシチジン塩基対で検出可能に標識され得る官能基化イソシチジンを提供し得る。
【００９２】
イソシチジンおよび2'-デオキシ-イソシチジンのこれらおよび他の5位誘導体は、塩基対形成に対してさらなる安定化を提供する。このような誘導体としては、5-β-プロピニル（Ｆｒｏｅｈｌｅｒら（１９９３）Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔ．３４：１００３−１００６を参照のこと）、5-β-プロペニルあるいは他の5-アルキルイソシチジン、または2'-デオキシ-イソシチジン誘導体が挙げられる。
【００９３】
本発明に従って核酸ハイブリダイゼーションアッセイを実施するためのキットは、パッケージされた組合わせ中に、少なくとも１つのハイブリダイズするオリゴヌクレオチドプローブ、分析物とハイブリッド複合体を形成し得るセグメント、およびハイブリッド複合体を検出する手段を含み、ここで少なくとも１つのハイブリダイズするオリゴヌクレオチドプローブは、A-TおよびG-C塩基対が形成される条件下で、アデノシン（Ａ）、チミジン（Ｔ）、シチジン（Ｃ）、グアノシン（Ｇ）またはウリジン（Ｕ）と有効に塩基対を形成しない第１のヌクレオチド単位を含む。この試薬は、代表的にはキット中の別々の容器内にある。このキットはまた、分析物を変性させるための変性剤、ハイブリダイゼーション緩衝液、洗浄溶液、酵素基質、ネガティブコントロールおよびポジティブコントロール、ならびにアッセイを実施するための指導書を含み得る。
【００９４】
本発明のポリヌクレオチドは、同一人に譲渡された米国特許出願第07/813,588号に詳細に記載されているように、固相直接オリゴヌクレオチド合成、酵素的連結法、および液相化学合成の組合わせを用いてアセンブルされ得る。
【００９５】
オリゴヌクレオチドの全ての化学合成は、自動DNA合成機（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ／Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ Ｄｉｖｉｓｉｏｎ ｍｏｄｅｌ ３８０Ｂ）で行われ得る。PHOSTELTM試薬（DMT-O-CH2CH2-(SO2)-CH2CH2-O-P(N(iPr)2)(-O-CH2CH2CN)、ここでDMTはジメトキシトリチルであり、そしてiPrはイソプロピルである）を用いる5'-リン酸化を含むβ-シアノエチル型のホスホラミダイト化学を使用した。他に示さない限り、標準の製造者プロトコルを使用した。
【００９６】
（実施例１）
（標的特異的エキステンダー配列の一般的アッセイ成分との非特異的ハイブリダイゼーションにより生じるアッセイバックグラウンドノイズ）
アッセイバックグラウンドノイズが、標的特異的エキステンダー配列の一般的アッセイ成分との交差ハイブリダイゼーションによりどのように生じ得るかを決定するために、表１、２、および３に示すような捕獲エキステンダーおよび標識エキステンダーのプールを用いて増幅DNAハイブリダイゼーションアッセイを行い、M13ファージを定量した。
【００９７】
【化１７】
【００９８】
【化１８】
【００９９】
【化１９】
例示目的のために、空白は、3'非標的結合領域を各プローブの標的結合領域から分離する。
【０１００】
実質的にPCT公報第WO95/16055号に記載のようにアッセイを行った。簡潔に述べれば、捕獲エキステンダーの非標的結合領域に相補的な捕獲プローブを含むマイクロタイターウェル中で、63℃にて一晩ハイブリダイゼーション後、プレートを室温で10分間冷却し、0.1xSSC（15mM NaCl；1.5mMクエン酸ナトリウム；pH7.0）、0.1％ドデシル硫酸ナトリウムを含む緩衝液で２回洗浄した。標識エキステンダーの3'非標的結合領域に相補的な15x 3（各々３つのアルカリホスファターゼプローブ結合部位を有する15の「枝（arm）」）分枝DNAアンプリファイヤー（100fm）をウェルに添加し、そして53℃にて30分間インキュベーションを続け、その後プレートを上記のように冷却および洗浄した。アルカリホスファターゼプローブ（200fm）をウェルに添加し、そして53℃にて15分間さらにインキュベートした後、プレートを上記のように再び冷却および洗浄した。0.1xSSC緩衝液を用いてさらなる３回の洗浄を行った。20分後、ジオキセタンホスフェート基質溶液Lumiphos 530（Lumigen）中で、Chiron luminometerでシグナルを検出した。結果を表４に示す。
【０１０１】
【化２０】
プールＢ捕獲エキステンダーの添加は、正味のシグナルを増加させないが、ノイズを約100倍に増加させる。関与する配列のコンピューター分析により、プールＢの捕獲エキステンダー#8は、分枝DNAアンプリファイヤー（9マーオリゴ(dA)--オリゴ(dT)を含む）のT20--LLA2配列との広範囲にわたる相同性を有し、一方、プールＢの捕獲エキステンダー#9は、分枝DNAアンプリファイヤーのBLA3c配列との広範囲にわたる相同性を有することが示された。
【０１０２】
本発明は、ハイブリダイゼーション依存アッセイバックグラウンドノイズの問題を検討する。「天然の」ヌクレオベースと安定な塩基対を形成しないヌクレオチドにより中断されるヌクレオチド配列が構成され、それによりこのような配列の天然の配列とのハイブリダイゼーションが阻害される。理想的には、普遍配列中の３塩基ごとまたは４塩基ごとの塩基は、Ａ、Ｃ、Ｇ、またはＴ(Ｕ）と対形成しない改変ヌクレオチドである。Ｃ*Ｇ塩基対と等エネルギーの塩基対を使用することにより、普遍配列長を減少させることもできる。統計学的議論は、これがまた、普遍配列間、および普遍配列とサンプル中の非標的配列との間、ならびに普遍配列とエキステンダープローブ中の標的特異的配列との間の望ましくない交差ハイブリダイゼーションの頻度を減少させるはずであることを示す。安定なハイブリッドを形成する多座結合に応じて、普遍配列長をさらに減少させ得る（WO95/16055を参照のこと）。全ての普遍配列は、少なくとも６つ、好ましくは８つのヌクレオチドを用いて設計される：捕獲プローブ、捕獲エキステンダーテール、標識エキステンダーテール、アンプリファイヤー、標識プローブ、およびプレアンプリファイヤー（適用可能な場合）。
【０１０３】
（実施例２）
（イソＣ-イソＧ塩基対の特異性および強度）
イソＣ-イソＧ塩基対の特異性および強度を決定するために、熱融解分析を以下のオリゴヌクレオチドに対して行った：
１）5'(L) CA CCA CTT TCT CC(T)3' （配列番号25）；
２）5'(L) CA CFA CTT TCT CC(T)3' （配列番号26）；
３）3'(T) GT GGT GAA AGA GG 5' （配列番号27）；
４）3'(T) GT GJT GAA AGA GG 5' （配列番号28）；および
５）5' CA CTA CTT TCT CC(T)3' （配列番号29）。
【０１０４】
これらのオリゴヌクレオチドのコアハイブリッドは、13のヌクレオチドからなる。塩基対形成に関与しないヌクレオチドを括弧内に示す。Ｌは１級アミンであり、ＦはイソＣであり、ＪはイソＧである。熱融解分析を、3xSSC（0.45M NaCl、0.045Mクエン酸ナトリウム）、pH7.9中、Cary 3E分光光度計で行った。一緒にインキュベートした２つのオリゴヌクレオチドの各々は、約1.5μMで存在した。Tmを、dA260/dT対温度プロットにおける最大値として計算した。表４に示す結果は、イソＣ*イソＧ塩基対が天然のＣ*Ｇ塩基対と等エネルギーであることを示す。
【０１０５】
【化２１】
従って、ほぼ等モルのＣ、Ｇ、イソＣ、イソＧ、Ａ、およびＴを含む普遍配列は、ほぼ等比でＡ、Ｔ、Ｃ、Ｇのみを含む配列よりも短くなり得る。これは、サンプル中の天然の非標的配列、ならびにＡ、Ｔ(Ｕ）、Ｃ、およびＧからなるようにより強制されるか、あるいはより強制されないLEおよびCE標的結合配列との交差反応性の潜在能力を制限する。
【０１０６】
このデータはまた、イソＣ＊イソＧ塩基対の特異性を示す。イソＣ＊ＧおよびイソＧ＊Ｃ対はミスマッチとして挙動する。古典的には、不安定化の℃はミスマッチのパーセントにより近似される。従って、Tmの約7.5℃の変化により、13のヌクレオチドにおいて１つのミスマッチ（7.5％ミスマッチ）が生じることが予想される。Ｃ＊ＧまたはイソＣ＊イソＧマッチがミスマッチと比較される場合に観察される８℃の変化は、Ａ、Ｔ、Ｃ、およびＧコードとの平均ミスマッチにおいて生じる変化と同様である。
【０１０７】
イソＧは、少なくとも２つの互変異性体（ケトおよびエノール）で存在する。ケト形は、水性溶媒中で好ましく、そしてエノールは、有機溶媒中で好ましい（Ｓｅｐｉｏｌら（１９７６）Ｚｅｉｔｓｃｈｒｉｆｔ ｆｕｅｒ Ｎａｔｕｒｆｏｒｓｃｈｕｎｇ ３１Ｃ：３６１−３７０）。イソＧエノール互変異性体は、原則として、dTと２つの水素結合を形成し得、Ａ＊Ｔ塩基対と同様になる。エノール互変異性体がハイブリダイゼーション緩衝液中に有意なレベルで存在する場合、イソＣ＊イソＧ塩基対の特異性は制限される。しかし、イソＧ＊Ｔミスマッチにおいて観察されたTmは、実質的に他のミスマッチと同じ53℃であった。
【０１０８】
これらのデータは、エノール互変異性体は、3X SSC（pH7.9）中に非常に低い濃度で存在するか、あるいは存在する場合、イソＣ-イソＧハイブリッドよりも７〜８℃低いTmを有するハイブリッドを依然として形成するという結論を支持する。Ｇ＊Ｔミスマッチを有するコントロールは、約49℃のTmを有していた。これは、平均Ｇ＊Ｔミスペアに予想されるよりも幾分低いが、イソＧ-Ｔミスペアに近い。
【０１０９】
当業者は、Ｃ＊Ｇと等エネルギーであるかは別として、さらに別の塩基対形成の組合わせ（すなわち、８つの塩基、４つの対）を有することは、普遍配列中の塩基対形成の特異性をさらに改善することを理解する。この場合、普遍配列からＡ、Ｔ、Ｃ、およびＧをほとんど削除し得る。しかし、これらの塩基の小さな主張（representation）を有することが可能な普遍配列のライブラリーの多様性を増し、普遍配列自身の中で可能な限り相互作用しない普遍配列を設計し得る。
【０１１０】
例えば、４塩基コードを用いて、１つの3マー交差ハイブリッドさえ有しない普遍15マーの２つの対のみを設計し得る。すなわち、15マー配列の第３の対を加えて、少なくともある３つのヌクレオチド交差ハイブリッドが存在しなければならない。６塩基コードを用いて、１つの3マーWatson-Crick型交差ハイブリッドさえ有しない15マー配列の８つの対を設計し得る。８塩基コードを用いて、15マーの19のこのような対を設計し得る。
【０１１１】
（実施例３）
（イソC*イソG塩基対合に対するpHの効果）
イソC*イソG塩基対の挙動をpHの関数として調べるために、Tm分析を、実施例２において提供されたオリゴヌクレオチドに対して行った。相補的なイソC*イソG塩基対(それぞれ、配列２および４)およびC*G塩基対(それぞれ、配列１および３)を含むオリゴヌクレオチドのTmに対するpHの効果を、0.5M塩および約1.5μMオリゴヌクレオチドで測定した(ｎ＝２または３)。結果を表５に示す。
【０１１２】
【化２２】
一般的に、オリゴヌクレオチドハイブリッドは、pH５およびpH10で安定である。pH５未満では、ＣおよびＡはプロトンを付加されるようになり、一方、pH10を超えると、ＧおよびＴはイミノのプロトンを失い始める。従って、pH５未満およびpH10を超えると、核酸ハイブリッドは安定性の減少を示す。表２のデータは、イソC*イソG塩基対が正常な酸安定性を有することを示す。しかし、イソG*イソCハイブリッドおよびG*Cハイブリッドは、共に、1.6単位のpH上昇に対して−９℃のTmの異常な変化を示す。このことは、おそらく、これらのハイブリッドの非常に短い長さによるものである。
【０１１３】
理論的には、Goldらの米国特許第5,270,163号、Tuerkら(1990)Science 249:505-510、Szostakら(1990)Nature 346:818-822およびJoyce(1989)Gene 82:83-87に記載のSELEXプロトコルを使用して、なお高いpHに感受性を有するハイブリッドを選択し得る。ここで、DNAまたはRNAランドマー(randomer)の集団が、中性pHでの結合について、および中程度のアルカリ性pHまたは中程度の酸性pHでの標的配列からの解離について選択される。増幅後、選択プロセスは、反復して繰り返される。最後の反復後、望ましいpH感受性を示すオリゴマーが、クローン化および配列決定される。これらの配列を合成し、そして直接的な競合アッセイにおいて最良の実施物(performer)が選択される。
【０１１４】
マイルドな塩基における不安定性を、現在の増幅DNAアッセイ方式において利用してアッセイのバックグランドノイズを減少させ得る。最終工程において、使用する基質緩衝液は、代表的には、pH9.5〜10.5である。適切な塩基不安定性を有する捕捉プローブを用いて、標的が表面から外され、そして別のウェルにおいて検出され得る。バックグランドはそのまま残される。WO95/16055に開示される方法によって、支持体に結合する捕捉エキステンダーを最少化することは、捕捉エキステンダーを介して捕捉プローブに非特異的に結合する分子の遊離によって引き起こされるバックグランドノイズを減少させる。
【０１１５】
非特異的に結合したアンプリファイヤーにハイブリダイズしたアルカリホスファターゼプローブの遊離は望ましくないので、好ましくは、捕捉プローブ−捕捉エキステンダーハイブリッドは、アンプリファイヤーと標識プローブとのハイブリッドおよびアンプリファイヤーと標識エキステンダーとのハイブリッドよりもかなり大きな塩基不安定性(すなわち、所定のpHでより高いTm)を有するように選択される。あるいは、図１のL-2/M-2ハイブリッドは、塩基不安定性ハイブリッド(base-labile hybrid)であり得る。いずれの場合においても、M-2/L-3ハイブリッドは、最も安定であるはずである；そうでなければ、非特異的に結合したアンプリファイヤーにハイブリダイズした標識プローブは遊離される。
【０１１６】
上記のように、遊離した標的を新しいウェルに移して読み取ることも考えられ得る。しかし、遊離した溶液をそれが生じたウェルで読み取ることが望ましい。このことは、さらなるピペッティング工程を回避し、さらなる液体移動工程に関連する不正確さを排除する。下記のように、ウェル移動を回避し得るいくつかの方法がある。
【０１１７】
アッセイの特異性をさらに増強するために、標的の特異的遊離を、表面上のバックグランドをマスクする工程と組み合わせ得る。この場合、別の支持体へ移すことは不必要である。例えば、固体支持体の表面を、標識プローブのインヒビター、および/あるいは種々の発光インヒビター、吸収剤、またはクエンチャー(quencher)でコートし得る。現在使用される１つの表面コーティングはポリ(phe-lys)である。フェニルアラニンは、特に好ましい酵素標識であるアルカリホスファターゼの公知のインヒビターである。ポリマーペプチドコーティングには、アルカリホスファターゼの他のインヒビター(例えば、トリプトファンおよびシステイン)が含まれ得る。発光インヒビターの例は、低い量子収率を有する化合物(すなわち、脱リン酸化ジオキセタンとの衝突によって励起された後、好ましくは光よりむしろ熱を発する任意の化合物)を含む。
【０１１８】
別のウェルへの遊離標的の移動を回避するために、遊離した溶液をさらに選択的に検出する少なくとも２つの他の簡便な方法が存在する。標的に関連するシグナルを、視覚化試薬に接近不可能な固相を作製することによるか、または固相支持体上で生じるシグナル発生反応をマスクすることによって溶液中で読み取り得る。固相をその後の視覚化工程から単離することは、水より重い不混和性オイルを反応容器に加えることによってなされ得る。このオイルは、容器の底部を覆う一方で、目的の溶液が上部に浮かび上がることを可能にする。視覚測定または反射率測定による簡単な比色分析検出については、不透明な物質をこのオイルに加えて視覚化のための中性バックグランドとして作用させる。
【０１１９】
化学ルミネッセンス検出のためには、オイルを光学的に不透明な物質で満たし得る。二酸化チタンのような白色固体を使用した場合、浮遊水相から発せられる光を、検出のために容器から上方に反射させる。オイル中に溶解した濃い色の固体または色素分子もまた、静止相をマスクするために使用され得る。オイル溶液が、視覚化試薬から固相を完全に単離しない場合でさえ、懸濁された固体または溶解した色素は、表面からのこの光の伝達をブロックする。
【０１２０】
静止相を、表面近くで生じる反応からの発光をブロックする色素で着色することもまた可能である。これは、不透明なウェル内に含まれる固相として着色ビーズを用いる場合に特に好都合である。
【０１２１】
（実施例４）
（中性およびアルカリ性pHでのイソC*イソG塩基対に対する塩の効果）
イソC*イソG塩基対の挙動を塩濃度の関数として調べるために、Tm分析を、実施例２において提供されたオリゴヌクレオチドに対して行った。相補的なイソC*イソG塩基対(それぞれ、配列２および４)およびC*G塩基対(それぞれ、配列１および３)を含むオリゴヌクレオチドのTmに対する塩濃度の効果を、pH7.9または9.5で約1.5μMオリゴヌクレオチドで測定した(ｎ＝３)。結果を表６に示す。
【０１２２】
古典的には、ポリヌクレオチドは、塩濃度の各対数変化に対して約16〜17℃のTmの変化を示す。オリゴヌクレオチドは、しばしば、塩依存性のいくらかの減少を示す。イソC*イソGハイブリッドについて計算される、pH7.9での塩の１対数変化あたりのTmにおける10〜11℃の変化は、13マーについて予想される変化に近い。しかし、pH9.5では、塩の１対数変化あたりの、イソC*イソGハイブリッドについてはわずか約３℃の変化であり、そしてC*Gハイブリッドについては５℃の変化であり、驚くほど低かった。
【０１２３】
これもまた、標的の特異的遊離に利用され得る。一般に、低い塩が、標的の特異的遊離に使用される。不運にも、しばしば、バックグランドのかなりの画分もまた遊離される。
【０１２４】
【化２３】
中程度にアルカリ性のpHでのイソC*イソG塩基対の融解の塩非依存性のために、塩の低下およびpHの増大から得られるさらなる利点はない。従って、遊離のために高い塩(アルカリホスファターゼにとっても好ましい)を使用し、そしてバックグランドの遊離を最少化し得る。
【０１２５】
実施例３に説明したように、SELEX手順を使用して、任意に選択されたpHでの融解において塩非依存性の増強を示すDNAまたはRNA配列を見出し得る。
【０１２６】
（実施例５）
（ハイブリダイゼーションに対する塩基対ミスマッチの効果）
前記の実施例は、イソGを有するオリゴマーが、イソCを含むその相補体と特異的に塩基対合することを示した。イソG含有オリゴマーは、単一のイソG*TまたはイソG*Cミスマッチを含む別のオリゴマーにハイブリダイズする場合、約７〜８℃だけ不安定になる。代表的には、Tmが10℃変化するごとに結合が約10倍減少する。
【０１２７】
13マーハイブリッドの結合に対する、２つの塩基のミスマッチの効果を、表７に示すプローブを使用して評価した。
【０１２８】
【化２４】
１Ｆ＝イソC、Ｊ＝イソG、ALK.PHOS＝アルカリホスファターゼ、およびＸ＝固体支持体への付着用のアミン含有スペーサー配列。
【０１２９】
標識プローブ32(アルカリホスファターゼオリゴヌクレオチド結合体)を、記載(Ｕｒｄｅａら、（１９８８）Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１６：４９３７−４９５５)のように作製した。標識プローブ32を、コントロールプローブ30とハイブリダイズさせてアルカリホスファターゼ−プローブ30*32を作製した。標識プローブ32を、改変プローブ31とハイブリダイズさせてイソC,イソG-アルカリホスファターゼ−プローブ31*32を作製した。
【０１３０】
プローブ35(捕捉プローブ)を、記載(PCT公開第WO93/13224号、この開示は本明細書中で参考として援用される)のようにマイクロタイターウェルに結合させて、ハイブリダイゼーション用の固体支持体を作製した。プローブ34(捕捉エキステンダー)をプローブ35とハイブリダイズさせた。この捕捉エキステンダーは、アルカリホスファターゼ−プローブ30*32に相補的であり、そしてアルカリホスファターゼ−プローブ31*32に部分的に相補的である。プローブ33は、捕捉エキステンダーと結合し得、そしていずれのアルカリホスファターゼプローブの結合をもブロックし得る「コンペティマー」である。
【０１３１】
以下のインキュベーションを、約1.0MのNaCl中、30分間53℃にて行った：
(１)１pmoleの固定したプローブ35を含むウェル中、250fmoleのプローブ34；
(２)１pmoleの固定したプローブ35を含むウェル中、250fmoleのプローブ34および５pmoleのプローブ33；
(３)１pmoleの固定したプローブ35を含むウェル中、５pmoleのプローブ33；および
(４)緩衝液のみ。
【０１３２】
実施例１に規定されるように、0.1×SSC、0.1％SDSでの２回の洗浄後、上記第１のインキュベーション物のそれぞれを、以下のそれぞれと共に、同じ条件下で第２の15分間のインキュベーションに曝した：
(１)25fmoleのプローブ30および500attomoleのプローブ32；
(２)25fmoleのプローブ31および500attomoleのプローブ32；
(３)500attomoleのプローブ32；および
(４)緩衝液のみ。
【０１３３】
プレートを、上記のように２回洗浄し、そして10mM MgCl2、１mM ZnCl2、0.1％Brij-35を補充した同じ緩衝液で３回洗浄した。Lumiphos Plus(Lumigen)とともに25分間のインキュベーションした後、プレートをChiron luminometerで読み取った。
【０１３４】
形成し得るハイブリッドを図３に示す。ここで、Ｚ(本明細書中では、イソCおよびイソGとして例示される)は、非天然のヌクレオチドを表す。プローブ33(コンペティマー)は、捕捉エキステンダーと21塩基対を形成し得、そして理論的には、両方のアルカリホスファターゼプローブが結合するのをブロックし得る。改変プローブ*標識プローブ(31*32)は、捕捉エキステンダーにハイブリダイズし、11塩基対および２つのミスマッチ(例えば、G*イソC、イソG*T)を形成し得る。コントロールプローブ*標識プローブ(30*32)は、捕捉エキステンダーと13塩基対を形成し得る。
【０１３５】
表８に示されるように、捕捉エキステンダー(34)は、コントロールプローブ*標識プローブ(30*32)と強力なハイブリッドを形成する(サンプル１＝399相対光単位(RLU))。捕捉エキステンダーと20倍モル過剰のコンペティマーとのプレインキュベーション(サンプル２)は、このバックグランドノイズを約10倍減少させた(30RLU)。改変プローブ*標識プローブ(31*32)は、捕捉エキステンダーと、コントロールプローブ*標識プローブ(30*32)より40倍弱いハイブリダイゼーションを示す(サンプル３＝９RLU)。２つのミスマッチは、ハイブリダイゼーションにおける40倍の変化を説明した。このことは、２つのミスマッチについて予想されていた通りである。この２つのミスマッチのそれぞれは、７〜８℃だけTmを不安定にする(参考、７×８＝56倍)。コンペティマーおよびミスマッチアルカリホスファターゼプローブの使用(サンプル４＝0.4RLU)は、バックグランドノイズを約1000倍減少させた。サンプル５はコントロールであり、本質的にはバックグランドノイズを有さない(0.1RLU)。このことは予想された通りである。なぜなら、標識プローブ32は、捕捉エキステンダーと検出可能な相同性を有さないからである。
【０１３６】
【化２５】
ハイブリダイゼーションアッセイにおいて、すべての捕捉エキステンダーについてコンペティマーを使用することは実施不可能である。なぜなら、代表的には、１アッセイあたり、５〜10の捕捉エキステンダーが存在するからである。さらに、この実施例は、コンペティマーとのプレインキュベーションが、普遍配列において15％の塩基置換(イソC,イソGでの、例えば、13塩基のうちの２塩基)を単純に使用する場合と同程度には効果的でなかったことを示す。30％の塩基置換(10塩基中３塩基)の使用は、さもなければ完全に塩基対合した相補体の非特異的ハイブリダイゼーションを約1000倍減少させることが予想される(30％のミスマッチは、約30℃のTm変化に等しい；Tmが10℃変化するごとに結合は約10倍減少する)。
【０１３７】
（実施例６）
（2'-デオキシ-イソグアノシンの化学合成）
2'-デオキシグアノシンからの2'-デオキシ-イソグアノシンの合成を、以下の手順によって達成した。
【０１３８】
工程１。2'-デオキシグアノシン一水和物(50mmole)およびイミダゾール(200mmole)を、500mLのジメチルホルムアミド(DMF)を用いるコエバポレーションにより乾燥させ、そして残留物を500mLのDMFに溶解した。この溶液にt-ブチルジメチルシリルクロライド(150mmole)を加え、そして反応混合物を室温で撹拌しながら18時間放置した。メタノール(30mL)を加え、そして25分後、溶媒を減圧下で除去した。溶媒をエバポレーションにより除去し、そして残留物を１LのCH2Cl2に溶解し、１Lの５％NaHCO3および１Lの80％飽和NaClで洗浄し、有機相をNa2SO4で乾燥させ、濾過し、そしてエバポレートして乾燥させて粗生成物(30グラム)を得た。この粗生成物を２Lの温エタノールに直接溶解した。20℃までゆっくりと冷却し、その後４℃で20時間保存して純粋な3',5'-TBDMS2-2'-デオキシグアノシンを生成した(65％収率)。
【０１３９】
工程２。3',5'-TBDMS2-2'-デオキシグアノシン(12mmole)を、トリエチルアミン(150mmole)およびN,N-ジメチルアミノピリジン(100mg)を含む125mLのCH2Cl2に懸濁した。０℃の4-トルエンスルホニルクロライド(40mmole)を加え、そして反応混合物を室温で20時間撹拌した。その時点で、すべての固体物質を溶解して淡い黄色の溶液を得た。反応を、50mLの５％NaHCO3を用いて１時間撹拌させてクエンチした。反応混合物を300mLのCH2Cl2で希釈し、300mLの５％NaHCO3および300mLの80％飽和NaClで洗浄し、有機相をNa2SO4で乾燥させ、濾過し、そしてエバポレートして乾燥させて粗生成物を得た(8.9グラム)。１％〜４％のメタノール/CH2Cl2グラジエントを用いるシリカゲルフラッシュクロマトグラフィーにより、7.95グラムの純粋なO6-(4-トルエンスルホニル)-3',5'-O-TBDMS2-2'-デオキシグアノシン(11mmole)を得た。
【０１４０】
工程３。12グラムのO6-(4-トルエンスルホニル)-3',5'-O-TBDMS2-2'-デオキシグアノシン(17mmole)を300mLのCH3CNに懸濁した。次いで、メチルピロリジン(17mL)を加え、そして懸濁物を１時間撹拌して明澄な溶液を得た。TLC分析は、すべての出発物質がベースライン物質(base line material)に変換されたことを示した。11グラムの4-(メチルチオ)フェノール(85mmole)を加え、溶液を60時間撹拌した。少容量までのエバポレーション後、600mLの酢酸エチルを加えた。この溶液を、３×400mLの0.3M NaOHおよび400mLの80％飽和NaClを用いて抽出し、有機相をNa2SO4で乾燥させ、濾過し、そしてエバポレートして乾燥させて11.55グラムの粗生成物を得た。４％〜５％のメタノール/CH2Cl2グラジエントを用いるシリカゲルフラッシュクロマトグラフィーにより、8.16グラムのO6-(4-(メチルチオ)フェニル)-3',5'-O-TBDMS2-2'-デオキシグアノシン(11mmole)を得た。
【０１４１】
工程４。４グラムのO6-(4-(メチルチオ)フェニル)-3',5'-O-TBDMS2-2'-デオキシグアノシン(6.5mmole)を、０℃で65mLのCH2Cl2に溶解し、そして6.5mLの亜硝酸tert-ブチルを滴下して加えた。溶液を室温まで加温し、そして気体を混合物から放出した(N2)。40分後、TLC分析が出発物質の完全な消費および新たなより緩慢な移動スポットの出現を示したとき、過剰の亜硝酸t-ブチルを、減圧下で２×100mLのトルエンを用いるコエバポレーションによって除去した。粗生成物の残留物を、４％〜５％のメタノール/CH2Cl2グラジエントを用いるシリカゲルフラッシュクロマトグラフィーにより精製して、2.75グラムのO6-(4-(メチルチオ)フェニル)-3',5'-O-TBDMS2-2'-デオキシキサントシン(4.45mmole)を得た。
【０１４２】
工程５。精製したすべての2.75グラムのO6-(4-(メチルチオ)フェニル)-3',5'-O-TBDMS2-2'-デオキシキサントシン(4.45mmole)を、50mLのメタノールに溶解した。濃水酸化アンモニウム水溶液(50mL)を加え、そして混合物を、堅く密封したボンベ中で100℃にて４時間加熱した。冷却後、溶媒を、減圧下でエタノールとのコエバポレーションによって除去して、1.8グラムの粗生成物を得た(3.6mmole)。温エタノールからの再結晶化による精製によって、純粋な3',5'-O-TBDMS2-2'-デオキシ-イソグアノシンのサンプルを得た。この物質は、すべての点(UV、TLC、NMR、およびMS)で、公開された光分解経路(Switzerら、(1993)、前出)によって調製されたサンプルと同一であった。
【０１４３】
（実施例７）
（アンプリファイヤーおよびアルカリホスファターゼプローブと捕捉エキステンダーとの非特異的ハイブリダイゼーションの制御）
Ａ．イソC,イソG bDNA ampおよびイソC,イソG apプローブの構築。
【０１４４】
15部位の櫛様増幅マルチマー(amp)を、PCT公開第WO92/02526号に以前に記載されたように構築した。アームを、記載のように12ヌクレオチドリンカーおよびT4 DNAリガーゼを使用してこの櫛に連結した。アルカリホスファターゼ(ap)プローブを、米国特許第5,124,246号に記載のように、アミノ官能性を含むオリゴヌクレオチドから構築した。配列は以下の通りであった：
【０１４５】
【化２６】
Ｂ．捕捉エキステンダー(CE)配列の調製。
【０１４６】
TNF-α、インターロイキン２(IL-2)、IL-4、IL-6およびγインターフェロン(IFNγ)標的に対する捕捉エキステンダーを、標準的なホスホルアミダイト法によって調製した。試験した捕捉エキステンダー配列は、以下の通りであった：
【０１４７】
【化２７】
Ｃ．CEとampとの間ならびにCEとapとの間の非特異的ハイブリダイゼーション(NSH)を測定するための手順。
【０１４８】
合計100フェムトモルの個々の捕捉エキステンダープローブ、または合計100フェムトモルの各捕捉エキステンダーからなるプールを、マイクロウェルにおいて１時間、53℃にてインキュベートした。洗浄液Ａ(0.1×SSC、0.1％SDS)を用いて２回洗浄した後、ウェルを、アンプリファイヤー希釈液＋/−WO95/16055に記載の非イソC,イソG ampまたは前出の実施例7Aに記載のイソC,イソG amp中で30分間インキュベートした。洗浄液Ａでの２回のさらなる洗浄後、ウェルを、WO95/16055に記載の非イソC,イソG apプローブまたは前出の実施例7Aに記載のイソC,イソG apプローブのいずれかを含むamp希釈液(５×SSC、50％プロティナーゼＫ消化ウマ血清)中で15分間インキュベートした。
【０１４９】
以下の定義を使用した：AP NSB＝CEが存在しない場合のapプローブのバックグランド。Amp NSB＝(CEが存在しない場合のampおよびapプローブのバックグランド)−(ap NSB)。AP NSH＝(ampを含まないCEサンプルのRLU)−(ap NSB)。AMP NSH＝(CEサンプルのRLU)−(AP NSH)−(AMP NSB)−(AP NSB)。
Ｄ．結果。
【０１５０】
５つの個々のCEプローブを、バックグランド非特異的ハイブリダイゼーションについて、１ウェルあたり100fmを用いて試験した。結果を下記の表に示す。
【０１５１】
【化２８】
CEプローブ(AP-NSBおよびAMP-NSB)の非存在下での非特異的結合バックグランドは、すべてのampおよびapプローブに関して無視できる(＜＝１RLU)。３つのエキステンダーは、このampプローブと強い(＞10RLU)交差反応性を示す。これはイソC,イソG ampでは見られない。１つのプローブが、このAPプローブと６RLUの交差反応性を示し、これはイソC,イソG APプローブでは見られない。すべての場合において、イソC,イソGプローブを用いるNSHは無視できる。1.0未満のRLU値は、NSBに対して有意でないと考えられる。
【０１５２】
CEプローブの５つのプールを、同じ分子との非特異的ハイブリダイゼーションバックグランドについて試験した。結果を以下に示す。
【０１５３】
【化２９】
また、すべてのampおよびapプローブのNSBは、NSHと比較して無視できる。５つのプールのうちの４つのプールが、2.3RLUから34.9RLUまでの範囲の有意なamp NSHを示す。一方、CEプールは、いずれも、イソC,イソG ampと有意なNSH(＜１)を有さない。２つのプールは、apプローブと有意なNSHを有するが、どのプールもイソC,イソG apプローブとの有意な相互作用を有さない。この実験において、合計30のCE配列を、交差反応性についてスクリーニングした。
【０１５４】
新規な塩基対をハイブリダイゼーションアッセイ方式に組み込む能力を有する当業者は、ampリーダー配列のイソC,イソGリーダー配列での置換により、本実施例で使用したイソC,イソG ampのより低いNSH値が生じると予想されることを理解する。
Ｅ．イソC,イソG ampおよびapとのIL-2およびIL-6の完全な用量応答曲線。
【０１５５】
完全な用量応答曲線を、IL-2およびIL-6 mRNAについてヒト細胞系列希釈物をアッセイすることによって作成した。検出限界を、Δ＝０の細胞数として計算した。Δを、以下の通りに定義する：ポジティブRLU−２標準偏差−(ネガティブRLU＋２標準偏差)。結果を以下の表に示す。
【０１５６】
【化３０】
感受性は、現在の分子(天然の配列を有する)の代わりにイソC/G ampおよびapを使用することによって、IL-2アッセイでは12.6倍、そしてIL-6アッセイでは３倍改善された。天然配列でのノイズが大きければ大きいほど、アッセイはより改善される。
【０１５７】
従って、液相サンドイッチハイブリダイゼーションアッセイにおいてより標的依存性の信号を作成するための新規な方法を開示する。さらに、2'-デオキシ-イソグアノシンを合成する新規な方法を開示する。本発明の好ましい実施態様がいくらか詳細に記載されるが、添付の請求の範囲に規定されるのような本発明の精神および範囲を逸脱することなく、自明な変形がなされ得ることが理解される。
【図面の簡単な説明】
【０１５８】
【図１】図１は、先行技術の液相サンドイッチハイブリダイゼーションアッセイを示す。太線は普遍配列を示す。
【図２】図２は、プローブの２本鎖DNAへの結合方法を描写する。太線は普遍配列を示す。
【図３】図３は、非天然ヌクレオチド含有プローブおよび非特異的ハイブリダイゼーションをブロックするコンペティマー（competimer）の使用法を描く。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
複数のアッセイ成分を用いる、サンプル中の核酸分析物を検出するための核酸ハイブリダイゼーションアッセイであって、該複数のアッセイ成分の各々は、少なくとも１つのハイブリダイズするオリゴヌクレオチドセグメントを含有し、
少なくとも１つのハイブリダイズするオリゴヌクレオチドセグメント中に、A-TおよびG-C塩基対が形成される条件下でアデノシン(A)、チミジン(T)、シチジン(C)、グアノシン(G)、またはウリジン(U)と効果的には塩基対を形成しない第１のヌクレオチド単位を取り込ませる工程を包含する改良がされている、核酸ハイブリダイゼーションアッセイ。
【請求項２】
複数のアッセイ成分を用いる、サンプル中の核酸分析物を検出するための核酸ハイブリダイゼーションアッセイであって、該複数のアッセイ成分の各々は少なくとも１つのハイブリダイズするオリゴヌクレオチドセグメントを含有し、
アッセイストリンジェンシーが、Tm1ハイブリッド複合体を選択的に不安定化するように制御され得る、Tm1ハイブリッド複合体およびTm2ハイブリッド複合体を取り込ませる工程を包含する改良がされている、核酸ハイブリダイゼーションアッセイ。
【請求項３】
複数のアッセイ成分を用いる、サンプル中の核酸分析物を検出するための液相サンドイッチハイブリダイゼーションアッセイであって、該複数のアッセイ成分の各々は少なくとも１つのハイブリダイズするオリゴヌクレオチドセグメントを含有し、該アッセイは、(a)該分析物を固体支持体に直接的または間接的に結合させる工程、(b)該分析物を標識する工程、および(c)分析物に会合した標識の存在を検出する工程を包含し、
アッセイストリンジェンシーが、Tm1ハイブリッド複合体を選択的に不安定化するように制御され得る、Tm1ハイブリッド複合体およびTm2ハイブリッド複合体の取り込みを包含する改良がされている、液相サンドイッチハイブリダイゼーションアッセイ。
【請求項４】
以下の構造式を有する化合物を合成する方法であって、
【化１】
ここで、R1は、水素、ヒドロキシル、スルフヒドリル、ハロゲノ、アミノ、アルキル、アリル、および-OR2(ここでR2はアルキル、アリル、シリル、またはリン酸塩である)からなる群から選択され：
a) 以下の構造式
【化２】
を有する化合物を、3'および5'ヒドロキシル基の両方を保護するのに適切な試薬と反応させる工程；
b) 工程(a)の産物を、O6-オキシ部分を求核置換を受けやすい官能基に変換するのに適切な試薬と反応させ、それにより官能基化O6部分を産生する工程；
c) 工程(b)の産物の2-アミノ基を酸化する工程；
d) 工程(c)の産物を、該官能基化したO6部分を置換する求核試薬と反応させる工程；
e) 工程(d)の産物を、該保護された3'および5'ヒドロキシル基を脱保護するのに適切な試薬と反応させる工程
を包含する方法。
【請求項５】
以下を包含する2'-デオキシ-イソグアノシンを合成する方法：
a) 2'-デオキシグアノシンをt-ブチルジメチルシリル(TBDMS)クロライドと反応させることにより、2'-デオキシグアノシンを3',5'-O-(t-ブチルジメチルシリル)2-2'-デオキシグアノシンに変換する工程；
b) 3',5'-O-TBDMS2-2'-デオキシグアノシンを4-トルエンスルホニルクロライドと反応させることにより、3',5'-O-TBDMS2-2'-デオキシグアノシンをO6-(4-トルエンスルホニル)-3',5'-O-TBDMS2-2'-デオキシグアノシンに変換する工程；
c) O6-(4-トルエンスルホニル)-3',5'-O-TBDMS2-2'-デオキシグアノシンをフェノールで処理することにより、該O6-(4-トルエンスルホニル)基を置換して、O6-(4-(メチルチオ)フェニル)-3',5'-O-TBDMS2-2'-デオキシグアノシンを得る工程；
d) 中性条件下でO6-(4-(メチルチオ)フェニル)-3',5'-O-TBDMS2-2'-デオキシグアノシンを亜硝酸t-ブチルで処理することにより、該O6-(4-(メチルチオ)フェニル)-3',5'-O-TBDMS2-2'-デオキシグアノシンの2-アミノ基をオキシ官能基に酸化して、O6-(4-(メチルチオ)フェニル)-3',5'-O-TBDMS2-2'-デオキシキサントシンを得る工程；および
e) 高温で該O6-(4-(メチルチオ)フェニル)-3',5'-O-TBDMS2-2'-デオキシキサントシンのO2-(4-(メチルチオ)フェニル)基を水酸化アンモニウムで置換し、3',5'-O-TBDMS2-2'-デオキシ-イソグアノシンを得る工程。
【請求項６】
アプタマーとして有用なオリゴヌクレオチドであって、複数の相補的塩基対を含有する分子内オリゴヌクレオチドハイブリッド複合体を含有し、該塩基対の少なくとも１つが、A-TおよびG-C塩基対を通常形成する条件下で、アデノシン(A)、チミジン(T)、シチジン(C)、グアノシン(G)、またはウリジン(U)と効果的には塩基対を形成しない相補的な非天然ヌクレオチド単位を含有し、ここで該非天然ヌクレオチド単位は、該塩基対の特異性が該アプタマーの二次構造の維持には必要とされないオリゴヌクレオチドセグメント内に含有される、オリゴヌクレオチド。
【請求項７】
以下の工程を包含するアプタマーを調製するための方法：
(a) 標的分子を提供する工程；
(b) 該標的分子とオリゴヌクレオチドのランダマープールとを、該オリゴヌクレオチドが該標的分子に結合するのに好都合な条件下で接触させる工程；
(c) 該標的分子に結合し、そしてオリゴヌクレオチド-標的複合体を形成する該オリゴヌクレオチドを、該標的分子に結合しない該オリゴヌクレオチドから分離する工程：
(d) 該オリゴヌクレオチド-標的複合体から該オリゴヌクレオチドを解離させる工程；
(e) ポリメラーゼ連鎖反応を用いて該オリゴヌクレオチドを増幅する工程；
(f) 少なくとも１回(b)から(e)の工程を繰り返し、最終的なアプタマー構築物を形成する工程；および
(g) 該最終アプタマー構築物中の１つ以上のヌクレオチド単位を、A-TおよびG-C塩基対を通常形成する条件下で、アデノシン(A)、チミジン(T)、シチジン(C)、グアノシン(G)、またはウリジン(U)と効果的には塩基対を形成しない非天然ヌクレオチド単位で置換する工程。
【請求項８】
第１および第２のハイブリダイズするセグメントを含有するアンチセンス分子であって、ここで該第１のハイブリダイズするセグメントは標的オリゴヌクレオチドとハイブリッド複合体を形成し得、そして該第２のセグメントは、A-TおよびG-C塩基対を形成する条件下で、アデノシン(A)、チミジン(T)、シチジン(C)、グアノシン(G)、またはウリジン(U)と効果的には塩基対を形成しない少なくとも１つのヌクレオチド単位を含有し、そして第２のアンチセンス分子とハイブリッド複合体を形成し得る、アンチセンス分子。
【請求項１】
複数のアッセイ成分を用いる、サンプル中の核酸分析物を検出するための核酸ハイブリダイゼーションアッセイであって、該複数のアッセイ成分の各々は、少なくとも１つのハイブリダイズするオリゴヌクレオチドセグメントを含有し、
少なくとも１つのハイブリダイズするオリゴヌクレオチドセグメント中に、A-TおよびG-C塩基対が形成される条件下でアデノシン(A)、チミジン(T)、シチジン(C)、グアノシン(G)、またはウリジン(U)と効果的には塩基対を形成しない第１のヌクレオチド単位を取り込ませる工程を包含する改良がされている、核酸ハイブリダイゼーションアッセイ。
【請求項２】
複数のアッセイ成分を用いる、サンプル中の核酸分析物を検出するための核酸ハイブリダイゼーションアッセイであって、該複数のアッセイ成分の各々は少なくとも１つのハイブリダイズするオリゴヌクレオチドセグメントを含有し、
アッセイストリンジェンシーが、Tm1ハイブリッド複合体を選択的に不安定化するように制御され得る、Tm1ハイブリッド複合体およびTm2ハイブリッド複合体を取り込ませる工程を包含する改良がされている、核酸ハイブリダイゼーションアッセイ。
【請求項３】
複数のアッセイ成分を用いる、サンプル中の核酸分析物を検出するための液相サンドイッチハイブリダイゼーションアッセイであって、該複数のアッセイ成分の各々は少なくとも１つのハイブリダイズするオリゴヌクレオチドセグメントを含有し、該アッセイは、(a)該分析物を固体支持体に直接的または間接的に結合させる工程、(b)該分析物を標識する工程、および(c)分析物に会合した標識の存在を検出する工程を包含し、
アッセイストリンジェンシーが、Tm1ハイブリッド複合体を選択的に不安定化するように制御され得る、Tm1ハイブリッド複合体およびTm2ハイブリッド複合体の取り込みを包含する改良がされている、液相サンドイッチハイブリダイゼーションアッセイ。
【請求項４】
以下の構造式を有する化合物を合成する方法であって、
【化１】
ここで、R1は、水素、ヒドロキシル、スルフヒドリル、ハロゲノ、アミノ、アルキル、アリル、および-OR2(ここでR2はアルキル、アリル、シリル、またはリン酸塩である)からなる群から選択され：
a) 以下の構造式
【化２】
を有する化合物を、3'および5'ヒドロキシル基の両方を保護するのに適切な試薬と反応させる工程；
b) 工程(a)の産物を、O6-オキシ部分を求核置換を受けやすい官能基に変換するのに適切な試薬と反応させ、それにより官能基化O6部分を産生する工程；
c) 工程(b)の産物の2-アミノ基を酸化する工程；
d) 工程(c)の産物を、該官能基化したO6部分を置換する求核試薬と反応させる工程；
e) 工程(d)の産物を、該保護された3'および5'ヒドロキシル基を脱保護するのに適切な試薬と反応させる工程
を包含する方法。
【請求項５】
以下を包含する2'-デオキシ-イソグアノシンを合成する方法：
a) 2'-デオキシグアノシンをt-ブチルジメチルシリル(TBDMS)クロライドと反応させることにより、2'-デオキシグアノシンを3',5'-O-(t-ブチルジメチルシリル)2-2'-デオキシグアノシンに変換する工程；
b) 3',5'-O-TBDMS2-2'-デオキシグアノシンを4-トルエンスルホニルクロライドと反応させることにより、3',5'-O-TBDMS2-2'-デオキシグアノシンをO6-(4-トルエンスルホニル)-3',5'-O-TBDMS2-2'-デオキシグアノシンに変換する工程；
c) O6-(4-トルエンスルホニル)-3',5'-O-TBDMS2-2'-デオキシグアノシンをフェノールで処理することにより、該O6-(4-トルエンスルホニル)基を置換して、O6-(4-(メチルチオ)フェニル)-3',5'-O-TBDMS2-2'-デオキシグアノシンを得る工程；
d) 中性条件下でO6-(4-(メチルチオ)フェニル)-3',5'-O-TBDMS2-2'-デオキシグアノシンを亜硝酸t-ブチルで処理することにより、該O6-(4-(メチルチオ)フェニル)-3',5'-O-TBDMS2-2'-デオキシグアノシンの2-アミノ基をオキシ官能基に酸化して、O6-(4-(メチルチオ)フェニル)-3',5'-O-TBDMS2-2'-デオキシキサントシンを得る工程；および
e) 高温で該O6-(4-(メチルチオ)フェニル)-3',5'-O-TBDMS2-2'-デオキシキサントシンのO2-(4-(メチルチオ)フェニル)基を水酸化アンモニウムで置換し、3',5'-O-TBDMS2-2'-デオキシ-イソグアノシンを得る工程。
【請求項６】
アプタマーとして有用なオリゴヌクレオチドであって、複数の相補的塩基対を含有する分子内オリゴヌクレオチドハイブリッド複合体を含有し、該塩基対の少なくとも１つが、A-TおよびG-C塩基対を通常形成する条件下で、アデノシン(A)、チミジン(T)、シチジン(C)、グアノシン(G)、またはウリジン(U)と効果的には塩基対を形成しない相補的な非天然ヌクレオチド単位を含有し、ここで該非天然ヌクレオチド単位は、該塩基対の特異性が該アプタマーの二次構造の維持には必要とされないオリゴヌクレオチドセグメント内に含有される、オリゴヌクレオチド。
【請求項７】
以下の工程を包含するアプタマーを調製するための方法：
(a) 標的分子を提供する工程；
(b) 該標的分子とオリゴヌクレオチドのランダマープールとを、該オリゴヌクレオチドが該標的分子に結合するのに好都合な条件下で接触させる工程；
(c) 該標的分子に結合し、そしてオリゴヌクレオチド-標的複合体を形成する該オリゴヌクレオチドを、該標的分子に結合しない該オリゴヌクレオチドから分離する工程：
(d) 該オリゴヌクレオチド-標的複合体から該オリゴヌクレオチドを解離させる工程；
(e) ポリメラーゼ連鎖反応を用いて該オリゴヌクレオチドを増幅する工程；
(f) 少なくとも１回(b)から(e)の工程を繰り返し、最終的なアプタマー構築物を形成する工程；および
(g) 該最終アプタマー構築物中の１つ以上のヌクレオチド単位を、A-TおよびG-C塩基対を通常形成する条件下で、アデノシン(A)、チミジン(T)、シチジン(C)、グアノシン(G)、またはウリジン(U)と効果的には塩基対を形成しない非天然ヌクレオチド単位で置換する工程。
【請求項８】
第１および第２のハイブリダイズするセグメントを含有するアンチセンス分子であって、ここで該第１のハイブリダイズするセグメントは標的オリゴヌクレオチドとハイブリッド複合体を形成し得、そして該第２のセグメントは、A-TおよびG-C塩基対を形成する条件下で、アデノシン(A)、チミジン(T)、シチジン(C)、グアノシン(G)、またはウリジン(U)と効果的には塩基対を形成しない少なくとも１つのヌクレオチド単位を含有し、そして第２のアンチセンス分子とハイブリッド複合体を形成し得る、アンチセンス分子。
【図１】
【図２】
【図３】
【図２】
【図３】
【公開番号】特開２００６−２１７９２５（Ｐ２００６−２１７９２５Ａ）
【公開日】平成１８年８月２４日（２００６．８．２４）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００６−１３０８６９（Ｐ２００６−１３０８６９）
【出願日】平成１８年５月９日（２００６．５．９）
【分割の表示】特願平８−５０８９７５の分割
【原出願日】平成７年８月３０日（１９９５．８．３０）
【出願人】（５０００９５３３３）バイエル コーポレイション (8)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成１８年８月２４日（２００６．８．２４）
【国際特許分類】
【出願日】平成１８年５月９日（２００６．５．９）
【分割の表示】特願平８−５０８９７５の分割
【原出願日】平成７年８月３０日（１９９５．８．３０）
【出願人】（５０００９５３３３）バイエル コーポレイション (8)
【Ｆターム（参考）】
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