新規シクロデキストリン誘導体
本発明の誘導体は、糖鎖とスペーサーアームとからなる分岐を有するシクロデキストリン誘導体であって、ａ）糖鎖が、スペーサーアームの末端に位置し、ガラクトース、グルコース、マンノース及びシアル酸から選択される１個以上の糖を含み、ｂ）スペーサーアームが、糖鎖及びシクロデキストリンの間に位置し、少なくとも２個の置換又は非置換のヘキサン酸単位を含む骨格を有し、ｃ）分岐が、シクロデキストリンの環を構成するグルコース１分子あたり１個存在すること、を特徴とする。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
本発明は、新規なシクロデキストリン誘導体に関する。さらに詳しくは、医薬品工業の分野で有用な新規な分岐シクロデキストリン誘導体、その製造方法およびその用途に関する。
【背景技術】
標的指向性薬物送達システム（ターゲッティングＤＤＳ）は、作用させるべき標的に薬剤を効率よく特異的に送達する、いわゆるミサイル療法に有用であり、これまでも研究がされてきている。ターゲッティングＤＤＳのための薬物キャリアには、標的を特異的に認識する機能を有する部分と薬物を輸送する機能を有する部分とが必要である。
標的の認識機能を担う部分として、糖鎖を利用することが研究されている。糖鎖は、細胞認識に重要な役割を果たしており、いくつかの細胞には糖特異的なレセプターが存在することが知られている。たとえば、肝実質細胞はガラクトース残基、クッパー細胞はマンノース残基およびグルコース残基をそれぞれ認識するレセプターをその表面に有している。これらの糖残基を有する物質は、それぞれのレセプターに結合し、エンドサイトーシスによって肝実質細胞またはクッパー細胞内に特異的に取り込まれる。また、インフルエンザウイルスは、シアル酸を末端に有する糖鎖を認識するレセプター（ヘマグルチニン）を表面に有しており、そのような糖鎖（を有する細胞）に特異的に結合する。
糖鎖による認識は、ターゲッティングＤＤＳにおいて実際に有用であることがわかっている。たとえば、未修飾のスーパーオキシドジスムターゼ（ＳＯＤ）をマウスに投与すると肝臓中にはほとんど蓄積されないのに対し、ＳＯＤをマンノースまたはガラクトースで修飾したものを投与すると、それぞれ肝非実質細胞および肝実質細胞に特異的に送達され、投与後１０分の時点で投与量の約６０〜８０％近くが肝臓に検出される（参考文献１）。
一方、薬物の輸送を担う部分としては、薬物を取り込んで錯体化合物を形成する様々な化合物（包接化合物）が検討されている。
シクロデキストリン（以下、「ＣＤ」と略称することがある）は、そのような包接化合物の１つであり、Ｄ−グルコピラノースがα−１，４結合したドーナツ形状を有する非還元性の環状オリゴ糖であって、外側が親水性、内部空洞が疎水性を示す。グルコピラノース分子が６、７、８個からなるものをそれぞれα−、β−、γ−ＣＤと呼ぶ。ＣＤは、物質の化学的安定化、溶解性の改善、液状物質の粉体化等の用途に利用されており、医薬品工業においても種々の目的で利用されているが、特に、ターゲッティングＤＤＳのための薬物キャリアとしては、その疎水性空洞に医薬化合物をゲスト分子として立体選択的に包接することができること、生体に対して毒性がなく、抗原性も低いこと、等の利点を有する。
したがって、糖鎖で修飾したＣＤを用いる、糖−タンパクの相互作用を利用したターゲッティングＤＤＳが検討されてきた。
たとえば、
（式中、「Ｍａｎ」はマンノース、「ＧｌｃＮＡｃ」はＮ−アセチル−Ｄ−グルコサミンを表す。以下も同じ）
の糖鎖を有するＣＤ（以下「Ｍ６ＣＤ」という）、および
の糖鎖を有するＣＤ（以下「Ｍ７ＣＤ」という）を合成し、薬物の包接および固定化コンカナバリンＡ（ＣｏｎＡ）による認識について調べたところ、共に非常に高い薬物包接能およびタンパク認識能を有していた。
しかし、これらの分岐糖鎖を有するＣＤは、鶏卵（卵白オブアルブミン）からの天然オリゴ糖鎖アスパラギンの調製を必要とするため、大量に製造することが困難であり、薬物キャリアとしての実用化は実際上不可能である。
そのため、天然物由来糖鎖を使用せずに合成によって作製された糖鎖を有するＣＤも検討されている（参考文献２、表２参照）。近年は複数の糖鎖を有する糖クラスター型ＣＤが合成されており、ガラクトース鎖を７本有するβ−ＣＤ（ヘプタＧａｌ−β−ＣＤ）は、ガラクトース鎖を１本有するもの（モノＧａｌ−β−ＣＤ）と比べて、薬物包接能およびレクチンとの結合能の両方において向上した。また、アームの長さを変えた一連のガラクトース鎖２本を有するＣＤを合成して調べると、アームが長い方がレクチンとの結合能が良かった。
しかし、これらの合成ＣＤは、いずれも、薬物包接能およびレクチンとの結合能の両方において天然糖鎖を有するＣＤには及ばなかった。
参考文献１：
橋田充、「ドラッグデリバリーシステム」、東京化学同人（１９９５）
参考文献２：
服部憲治郎および稲津敏行、「糖鎖クラスターシクロデキストリンの合成およびレクチンタンパクと医薬品に対する二重認識について」、有機合成化学協会誌、Ｖｏｌ．５９，Ｎｏ．８（２００１）ｐｐ．７４２−７５４
【発明の開示】
本発明は、天然物由来の糖鎖を有するＭ６ＣＤおよびＭ７ＣＤに匹敵する高い標的タンパク認識能および薬物結合能を兼ね備え、容易に大量に製造可能な、新規ＣＤ誘導体およびその製造方法、ならびにこれらの化合物の標的指向性薬物送達キャリアとしての用途を提供することを目的とする。
本発明者は、上記の課題を解決するために鋭意研究した結果、特定の構造の新規シクロデキストリン誘導体を開発し、本発明を完成した。
本発明のシクロデキストリン誘導体は、糖鎖とスペーサーアームとからなる分岐を有するシクロデキストリン誘導体であって、
ａ） 糖鎖が、スペーサーアームの末端に位置し、ガラクトース、グルコース、マンノースおよびシアル酸から選択される１個以上の糖を含み、
ｂ） スペーサーアームが、糖鎖およびシクロデキストリンの間に位置し、少なくとも２個の置換または非置換のヘキサン酸単位を含む骨格を有し、
ｃ） 分岐が、シクロデキストリンの環を構成するグルコース１分子あたり１個存在すること
を特徴とする。
スペーサーアームは、好ましくは２〜５個のアミノヘキサン酸単位を含む骨格を有し、さらに好ましくはグルコノ−〔ＮＨ（ＣＨ２）５ＣＯ〕ｎ−ＮＨ−または（ＣＨ２）３−Ｓ−（ＣＨ２）２−ＣＯ〔ＮＨ（ＣＨ２）５ＣＯ〕ｎ−ＮＨ−（式中、ｎは２〜５の整数を表す）で示される基である。
糖鎖は、好ましくはガラクトシル基、グルコシル基、マンノシル基またはシアル酸基（シアリル基）である。
特に好ましくは、本発明の誘導体は、ヘキサキス（６−ガラクトシルグルコノ−アミド−（ヘキサン酸アミド）ｎ）−α−シクロデキストリン、ヘプタキス（６−ガラクトシルグルコノ−アミド−（ヘキサン酸アミド）ｎ）−β−シクロデキストリン、オクタキス（６−ガラクトシルグルコノ−アミド−（ヘキサン酸アミド）ｎ）−γ−シクロデキストリン（ここで、ｎは２〜５の整数を表す。以下も同じ）；
ヘキサキス（６−グルコシルグルコノ−アミド−（ヘキサン酸アミド）ｎ）−α−シクロデキストリン、ヘプタキス（６−グルコシルグルコノ−アミド−（ヘキサン酸アミド）ｎ）−β−シクロデキストリン、オクタキス（６−グルコシルグルコノ−アミド−（ヘキサン酸アミド）ｎ）−γ−シクロデキストリン；
ヘキサキス（６−マンノシルプロピルチオエチル−アミド−（ヘキサン酸アミド）ｎ）−α−シクロデキストリン、ヘプタキス（６−マンノシルプロピルチオエチル−アミド−（ヘキサン酸アミド）ｎ）−β−シクロデキストリン、オクタキス（６−マンノシルプロピルチオエチル−アミド−（ヘキサン酸アミド）ｎ）−γ−シクロデキストリン；
ヘキサキス（６−シアル酸プロピルチオエチル−アミド−（ヘキサン酸アミド）ｎ）−α−シクロデキストリン、ヘプタキス（６−シアル酸プロピルチオエチル−アミド−（ヘキサン酸アミド）ｎ）−β−シクロデキストリン、およびオクタキス（６−シアル酸プロピルチオエチル−アミド−（ヘキサン酸アミド）ｎ）−γ−シクロデキストリンである。
また、本発明は、上記のシクロデキストリン誘導体の製造方法を提供する。本発明の方法は、ガラクトース、グルコース、マンノースおよびシアル酸から選択される１個以上の糖を含む糖鎖またはこの糖鎖と官能基を有する側鎖とを含む糖鎖ユニットと、官能基を有する側鎖とシクロデキストリンとを含むシクロデキストリンユニットまたは官能基を有するシクロデキストリンとを、縮合剤の存在下または非存在下で反応させることを特徴とする。
具体的には、糖鎖ユニットと、シクロデキストリンユニットとを、縮合剤の存在下または非存在下で反応させる；糖鎖とシクロデキストリンユニットとを、縮合剤の存在下または非存在下で反応させる；または、糖鎖ユニットと官能基を有するシクロデキストリンとを、縮合剤の存在下または非存在下で反応させることができる。
また、本発明の方法において、官能基を有する側鎖は、本発明のＣＤ誘導体のスペーサーアームを構成する。
本発明は、上記のような本発明のシクロデキストリン誘導体を含む標的指向性薬物キャリアをも提供する。
さらに、本発明は、本発明のシクロデキストリン誘導体と、薬物とを含む標的指向性薬物をも提供する。
本発明によれば、天然糖鎖を結合したＭ６ＣＤに匹敵する非常に高い糖鎖認識相互作用および薬物との包接相互作用を示す新規なＣＤ誘導体化合物およびその製造方法が提供される。また、本発明によれば、Ｍ６ＣＤに匹敵する非常に高い標的指向性および薬物との包接相互作用を有する薬物キャリア、および効率よく薬物が包接された糖鎖認識による非常に高い標的指向性を有する薬物も提供される。
本発明のＣＤ誘導体は、安全性が高く、標的指向性および薬物包接能の両方が極めて高いので、所定の薬物を効率的に包接し、途中で薬物を放出することなく確実に特異的に標的部位まで輸送し、そこで糖特異的レセプターを介して薬物を標的細胞内に特異的に取り込ませることができる。したがって、本発明のＣＤ誘導体は、ターゲッティングＤＤＳにおける利用性が非常に高い。
しかも、本発明の化合物は、有機合成反応によって合成することができ、多大な時間と労力を必要とする困難な天然糖鎖の調製を必要としない。したがって、本発明のＣＤ誘導体は、容易に大量に供給することができ、実用性が高い。
【図面の簡単な説明】
図１は、実施例１の本発明のシクロデキストリン誘導体ヘプタキス（６−Ｇａｌ−ｃａｐ２）−β−ＣＤの合成手順の概略を示す図である。図１Ａは糖鎖ユニットの合成、図１ＢはＣＤユニットの合成、図１Ｃは各ユニットの組立の概略を示す。
図２は、従来のシクロデキストリン誘導体および本発明の誘導体のタンパク認識能および薬物包接能を比較する図である。図２Ａ〜Ｆは、各化合物を説明する図である。
図２Ａ：実施例１の本発明のシクロデキストリン誘導体ヘプタキス（６−Ｇａｌ−ｃａｐ２）−β−ＣＤ（化合物「Ｉ」）；
図２Ｂ：比較例のシクロデキストリン誘導体ヘプタキス（６−Ｇａｌ−ｃａｐ１）−β−ＣＤ（化合物「ａ」）；
図２Ｃ：ヘプタキス（Ｇａｌ）−β−ＣＤ（化合物「ｂ」）；
図２Ｄ：ビス（Ｇａｌ−ｃａｐ５）−β−ＣＤ（化合物「ｃ」）；
図２Ｅ：Ｍ６ＣＤ（化合物「ｄ」）；および
図２Ｆ：Ｍ７ＣＤ（化合物「ｅ」）。
図２Ｇは、図２Ａ〜Ｆの化合物およびβ−ＣＤ（化合物「ｆ」）について、ｘ軸を薬物との包接会合定数Ｋａの対数とし、ｙ軸をレクチンとの糖鎖認識会合定数Ｋａの対数として、それぞれの値をプロットした二次元マップである。
発明を実施するための形態
シクロデキストリン誘導体
本発明のシクロデキストリン誘導体を構成する成分は、基本的には、糖鎖、スペーサーアーム、およびシクロデキストリンである。
シクロデキストリン
本発明のシクロデキストリン誘導体の合成に用いられるシクロデキストリンは、シクロデキストリンの基本骨格を有している限り、特に限定されない。一般的には、α−ＣＤ、β−ＣＤおよびγ−ＣＤが挙げられる。これらのＣＤは環を構成しているグルコピラノースの数が異なり（α：６個；β：７個；γ：８個）、したがってその空洞径も異なる（α：０．４５ｎｍ；β：０．７０ｎｍ；γ：０．８５ｎｍ）。たとえば、α−ＣＤは、ベンゼン環が充分に入る大きさであり、トリクレン、パークレン等を包接することができる。また、β−ＣＤは、ナフタレン環が入る大きさであり、γ−ＣＤはアントラセンやナフタレン環２個が入る大きさである。したがって、包接すべき薬物の分子サイズを考慮して最適の空洞径を有するＣＤを当業者が適宜選択することができる。
また、薬物の包接能の点からは、糖鎖分岐の数、すなわちＣＤ構成グルコピラノース分子の数が多い方が好ましい。入手の容易性の点からは、α−ＣＤ、β−ＣＤおよびγ−ＣＤが好ましい。
糖鎖
本発明のＣＤを修飾するための糖鎖は、特定の標的によって特異的に認識されるものであれば、特に限定されない。糖は、少なくとも１個存在すればよく、２個以上であってもよい。本明細書においては、「糖鎖」という用語は、糖が２個以上連結している場合に加えて、１個の場合も含む。
糖鎖を構成する糖は、未修飾であっても修飾されていてもよい。好ましくは、ガラクトース、グルコース、マンノース、シアル酸；ガラクトサミン、グルコサミン、マンノサミンなどのアミノ糖から選択される。合成の容易さの点からは、ガラクトース、グルコース、マンノースおよびシアル酸が好ましい。糖鎖が２個以上の糖を含む場合、それらの糖は同じ種類であっても異なる種類であってもよい。
また、糖鎖は、直鎖であっても分岐鎖であってもよい。
入手の容易性および合成の容易性の点から、好ましくは糖１〜６個の糖鎖であり、さらに好ましくは糖１〜４個の糖鎖であり、より好ましくは糖１〜４個の直鎖状の糖鎖であり、最も好ましい糖鎖は単糖、すなわちガラクトシル基、グルコシル基、マンノシル基およびシアル酸基である。
スペーサーアーム
本発明のＣＤ誘導体において使用されるスペーサーアームは、糖鎖およびＣＤの間に位置してこの両者を接続しており、一般的には糖鎖の還元末端の糖のＣ４の炭素原子とＣＤを構成するグルコース分子のＣ６位の炭素原子との間の部分を指す。スペーサーアームは、少なくとも２個の置換または非置換のヘキサン酸単位〔−（ＣＨ２）５−ＣＯ−〕を含む骨格を有していればよい。
スペーサーアームは、好ましくは、２〜５個のヘキサン酸単位〔−（ＣＨ２）５−ＣＯ−〕ｎまたはアミノヘキサン酸単位〔−ＮＨ−（ＣＨ２）５−ＣＯ−〕ｎ（式中、ｎは２〜５の整数を表す）を含む骨格を有する。
スペーサーアームは、合成の容易さの点から、特に好ましくはグルコノ−〔ＮＨ（ＣＨ２）５ＣＯ〕ｎ−ＮＨ−または（ＣＨ２）３−Ｓ−（ＣＨ２）２−ＣＯ〔ＮＨ（ＣＨ２）５ＣＯ〕ｎ−ＮＨ−（式中、ｎは２〜５の整数を表す）で示される基である。
スペーサーアームの骨格は、置換または非置換の、たとえばヘキサン酸（カプロン酸と同義である）、アミノエタノール、アミノエタンチオール、ポリエチレングリコール（ポリオキシエチレンと同義である）、ポリプロピレングリコール、オクタエチレングリコール、ビスエポキシアルキレン、ジアミノアルキレン、ジカルボキシアルキレン、無水コハク酸等に由来する基またはそれらの組み合わせによって構成される。
スペーサーアームの長さは、薬物を送達する標的の細胞表面タンパク等の大きさと関連するが、ＣＤに結合したスペーサーアームが溶液中で外側に開いた形態において向かい合う糖鎖（の末端）間の距離が標的タンパクの直径（標的タンパクが二量体の場合は２ヵ所の結合部位間の距離）に近いものが好ましい。したがって、長い糖鎖を選択する場合、スペーサーアームは相対的に短いものであることができる。
スペーサーアームは、骨格中に炭素以外の原子を含んでいてもよい。その場合、窒素、イオウ、酸素等が好ましい。
スペーサーアームの骨格上に存在していてもよい置換基としては、アルキル基、アリール基、フェニレン基、アミド基、アミノ基、ケトン基、水酸基、チオール基、カルボキシル基等の基が挙げられるが、置換基の大きさ、種類、数は、スペーサーアーム部分の柔軟性を妨げない限り、特に限定されない。
分岐
分岐は、糖鎖とスペーサーアームとからなる。分岐は、ＣＤの環を構成するグルコース分子の数と同じ数、すなわち、ＣＤの環を構成するグルコース１分子あたり１個、存在する。
ＣＤ上の分岐の存在位置は、特に限定されず、一級側（すなわちグルコピラノース環のＣ６位）であっても二級側（グルコピラノース環のＣ３位）であってもよい。反応性の高さおよび合成の容易さの点からは、一般的には一級側が好ましい。
したがって、本発明の特に好ましいＣＤ誘導体の具体例としては、
ヘキサキス（６−ガラクトシルグルコノ−アミド−（ヘキサン酸アミド）ｎ）−α−シクロデキストリン、ヘプタキス（６−ガラクトシルグルコノ−アミド−（ヘキサン酸アミド）ｎ）−β−シクロデキストリン、オクタキス（６−ガラクトシルグルコノ−アミド−（ヘキサン酸アミド）ｎ）−γ−シクロデキストリン（ここで、ｎは２〜５の整数を表す。以下も同じ）；
ヘキサキス（６−グルコシルグルコノ−アミド−（ヘキサン酸アミド）ｎ）−α−シクロデキストリン、ヘプタキス（６−グルコシルグルコノ−アミド−（ヘキサン酸アミド）ｎ）−β−シクロデキストリン、オクタキス（６−グルコシルグルコノ−アミド−（ヘキサン酸アミド）ｎ）−γ−シクロデキストリン；
ヘキサキス（６−マンノシルプロピルチオエチル−アミド−（ヘキサン酸アミド）ｎ）−α−シクロデキストリン、ヘプタキス（６−マンノシルプロピルチオエチル−アミド−（ヘキサン酸アミド）ｎ）−β−シクロデキストリン、オクタキス（６−マンノシルプロピルチオエチル−アミド−（ヘキサン酸アミド）ｎ）−γ−シクロデキストリン；
ヘキサキス（６−シアル酸プロピルチオエチル−アミド−（ヘキサン酸アミド）ｎ）−α−シクロデキストリン、ヘプタキス（６−シアル酸プロピルチオエチル−アミド−（ヘキサン酸アミド）ｎ）−β−シクロデキストリン、およびオクタキス（６−シアル酸プロピルチオエチル−アミド−（ヘキサン酸アミド）ｎ）−γ−シクロデキストリン
が挙げられる。これらは以下の式を有する。
（式中、ｒは、６，７または８を表し；Ｘは、ガラクトシル−グルコノ−（ＮＨ（ＣＨ２）５ＣＯ）ｎＮＨ−、グルコシル−グルコノ−（ＮＨ（ＣＨ２）５ＣＯ）ｎＮＨ−、マンノシル−（ＣＨ２）３Ｓ（ＣＨ２）２ＣＯ（ＮＨ（ＣＨ２）５ＣＯ）ｎＮＨ−またはシアル酸−（ＣＨ２）３Ｓ（ＣＨ２）２ＣＯ（ＮＨ（ＣＨ２）５ＣＯ）ｎＮＨ−を表し；ｎは、２〜５の整数を表す。）
合成の容易さの点から最も好ましいのは、上記の式でｎ＝２の化合物、すなわち、ヘキサキス（６−ガラクトシルグルコノ−アミド−（ヘキサン酸アミド）２）−α−シクロデキストリン、ヘプタキス（６−ガラクトシルグルコノ−アミド−（ヘキサン酸アミド）２）−β−シクロデキストリン、オクタキス（６−ガラクトシルグルコノ−アミド−（ヘキサン酸アミド）２）−γ−シクロデキストリン；
ヘキサキス（６−グルコシルグルコノ−アミド−（ヘキサン酸アミド）２）−α−シクロデキストリン、ヘプタキス（６−グルコシルグルコノ−アミド−（ヘキサン酸アミド）２）−β−シクロデキストリン、オクタキス（６−グルコシルグルコノ−アミド−（ヘキサン酸アミド）２）−γ−シクロデキストリン；
ヘキサキス（６−マンノシルプロピルチオエチル−アミド−（ヘキサン酸アミド）２）−α−シクロデキストリン、ヘプタキス（６−マンノシルプロピルチオエチル−アミド−（ヘキサン酸アミド）２）−β−シクロデキストリン、オクタキス（６−マンノシルプロピルチオエチル−アミド−（ヘキサン酸アミド）２）−γ−シクロデキストリン；
ヘキサキス（６−シアル酸プロピルチオエチル−アミド−（ヘキサン酸アミド）２）−α−シクロデキストリン、ヘプタキス（６−シアル酸プロピルチオエチル−アミド−（ヘキサン酸アミド）２）−β−シクロデキストリン、オクタキス（６−シアル酸プロピルチオエチル−アミド−（ヘキサン酸アミド）２）−γ−シクロデキストリンである。
ｎ＝２〜５の化合物は、標的タンパク認識能の点から最も好ましい。
製造方法
本発明のＣＤ誘導体の製造方法は、ガラクトース、グルコース、マンノースおよびシアル酸から選択される１個以上の糖を含む糖鎖またはこの糖鎖と官能基を有する側鎖とを含む糖鎖ユニットと、官能基を有する側鎖とＣＤとを含むＣＤユニットまたは官能基を有するＣＤとを、縮合剤の存在下または非存在下で反応させることを特徴とする。
具体的には、本発明の方法においては、（１）糖鎖ユニットと、シクロデキストリンユニットとを、縮合剤の存在下または非存在下で反応させる；（２）糖鎖と、ＣＤユニットとを、縮合剤の存在下または非存在下で反応させる；または、（３）糖鎖ユニットと、官能基を有するＣＤとを、縮合剤の存在下または非存在下で反応させることができる。
糖鎖ユニットは、グルコース、ガラクトース、マンノースおよびシアル酸から選択される１個以上の糖からなる糖鎖と、官能基を有する側鎖とを有する。
糖鎖ユニットに含まれる糖鎖は、本発明のＣＤ誘導体について説明したとおりである。糖鎖の非還元性末端をガラクトースにする場合はラクトース（乳糖）、グルコースにする場合はマルトース（麦芽糖）を糖鎖の材料として用い、その還元末端を酸化してラクトン環を形成させ、このラクトン環の反応性を利用して側鎖と結合させると合成が容易である。この場合、原料二糖の還元末端側のグルコースはグルコノ基となって糖鎖ユニットの側鎖の一部を形成し、最終的にはスペーサーアームの一部となる。
また、糖鎖の非還元性末端をマンノースまたはシアル酸にする場合は、それぞれの糖から公知の方法によって糖鎖ユニットを合成することができる。たとえばマンノースをアリルアルコールに溶解し、酸触媒を加えて窒素気流下９７℃で還流してアリルマンノシドを製造し、これを糖鎖ユニットとして用いることができる。さらに側鎖を延長するには、たとえばアリルマンノシドにメルカプトプロピオン酸を付加することができる。
官能基を有する側鎖については後述する。
ＣＤもまた、本発明のＣＤ誘導体について説明したとおりである。上記（１）および（２）のタイプの反応においては、ＣＤ環を構成する各グルコピラノース分子に、官能基を有する側鎖を導入して製造したＣＤユニットを用いる。また、上記（３）のタイプの反応においては、ＣＤ環を構成する各グルコピラノース分子に、官能基を直接導入したものを用いる。ＣＤへの官能基を有する側鎖または官能基の導入方法は、公知である。
糖鎖ユニットの官能基を有する側鎖および／またはＣＤユニットの官能基を有する側鎖は、上記（１）〜（３）の反応の結果として、本発明のＣＤ誘導体のスペーサーアームを構築する。したがって、これらの側鎖は、糖鎖ユニットに含まれる側鎖であっても、また、ＣＤに存在する側鎖であっても、既に記載した本発明のＣＤ誘導体のスペーサーアームと基本的に同様の骨格を有する。
上記（１）のタイプの反応を行う場合、糖鎖ユニットに含まれる側鎖およびＣＤ上に存在する側鎖が、それぞれスペーサーアームの一部を構成し、合成後にスペーサーアームの全体を構成する。また、上記（２）のタイプの反応を行う場合はＣＤユニットに含まれる側鎖が、また、上記（３）のタイプの反応を行う場合は糖鎖ユニットに含まれる側鎖が、それぞれスペーサーアームの全体を構成するのに充分な長さおよび構造を有する。
したがって、当業者は、官能基を有する側鎖が糖鎖ユニットに含まれる側鎖であっても、ＣＤユニットに含まれる側鎖であっても、スペーサーアームについて既に記載した説明に基づいて、それぞれの場合に適切な側鎖の長さおよび構造ならびに側鎖の組み合わせを適宜選択することができる。
具体的には、これらの側鎖は、糖鎖ユニットに含まれるかＣＤユニットに含まれるかにかかわらず、スペーサーアームの全部または一部を構成する脂肪族炭化水素に基づく骨格を有する。側鎖は、好ましくは置換または非置換のヘキサン酸単位〔−（ＣＨ２）５−ＣＯ−〕ｎを含む骨格を有し、さらに好ましくはアミノヘキサン酸単位〔−ＮＨ−（ＣＨ２）５−ＣＯ−〕ｎ（式中、ｎは２〜５の整数を表す）を含む骨格を有する。上記式中のｎは、上記（１）のタイプの反応の場合は１〜５、上記（２）または（３）のタイプの反応の場合は２〜５である。また、これらの側鎖は、末端に反応のための官能基を有する。
側鎖に存在する官能基、および／または官能基を有するＣＤの官能基は、エーテル基、チオエーテル基、アミノ基、カルボキシル基、アジド基、ｐ−トルエンスルホニル基、エポキシド基、不飽和基、チオール基、アセトキシ基、フェノキシ基、およびヨウ素、臭素および塩素のハロゲン基からそれぞれ選択される。
上記（１）〜（３）のタイプの反応において使用しうる縮合剤としては、ジシクロヘキシルカルボジイミド（以下「ＤＣＣ」という）や水溶性カルボジイミド（以下「ＷＳＣ」という）等の当業界で公知の縮合剤が挙げられる。当業者は、選択した官能基や反応溶媒の種類に応じて適切な縮合剤を選択することができる。たとえば、上記（１）および上記（３）のタイプの反応において糖鎖ユニットの側鎖の末端の官能基がカルボキシル基であり、ＣＤユニットの側鎖またはＣＤ上の官能基がアミノ基である場合のように、カルボキシル基とアミノ基とを反応させる場合、Ｋｕｎｉｓｈｉｍａら（Ｋｕｎｉｓｈｉｍａ ｅｔ ａｌ．，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ（１９９９）５５，ｐｐ．１３１５９−１３１７０）により開発された新規縮合剤４−（４，６−ジメトキシ−１，３，５−トリアジン−２−イル）−４−メチルモルホリニウムクロリド（以下「ＤＭＴ−ＭＭ」という）を用いることが効率の点で好ましい。ＤＭＴ−ＭＭは、カルボン酸と反応して活性エステルを生成し、その後アミンと反応してアミド結合を生成する。反応はエタノール、メタノール、ｉ−プロパノール、水等の様々な溶媒中で進行し、かつ定量的に反応が進行するという報告があり、注目されている。
上記（１）のタイプの反応は、縮合剤の非存在下で行うこともできる。たとえば、糖鎖の還元末端のグルコースを酸化していったんラクトビオン酸にし、その後環化してラクトン環にしたものを用いることができる。また、糖鎖ユニットとＣＤユニットとの間で、それぞれの側鎖上のチオール基とハロゲン基との間での反応、チオール基と二重結合基との反応なども可能である。
上記（２）のタイプの反応は、縮合剤の非存在下でも、糖鎖を、直接、ＣＤユニットの側鎖に存在する官能基と反応させ、結合させることができる。たとえば、シアル酸のカルボン酸の反応性を利用して、縮合剤の存在下でＣＤユニットの側鎖上の官能基と反応させることができるが、縮合剤の非存在下ではカルボン酸を無水物または酸クロリドにしておけばよい。また、ガラクトサミン、グルコサミンまたはマンノサミンのようなアミノ糖を用いる場合は、これらを、側鎖上に導入したカルボン酸基と反応させることができる。
また、上記（３）のタイプの反応も、縮合剤の非存在下で行うことができる。たとえば、糖鎖ユニットに官能基としてチオール基を導入し、ＣＤにヨウ素のようなハロゲン基を導入して、両者をアルカリ雰囲気中で反応させることができる。
本発明の誘導体の製造は、すべて室温で行うことができる。反応溶媒としては、化合物の溶解性に応じてジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）、水、メタノール、Ｎ−メチルピロリジノン（ＮＭＰ）を使用することができる。側鎖の設計、縮合剤の選択および反応溶媒の選択は、すべて当業者が適宜行うことができる。
たとえば、上記（１）および（３）の場合、反応溶媒としてカルボン酸と等しいモル当量のトリエチルアミンを使用し、縮合剤として５倍モル当量のＤＭＴ−ＭＭを使用することができる。
具体的には、たとえば以下のようにして合成することができる。まず、所望の糖鎖と６−アミノヘキサン酸とを縮合させ、糖鎖とヘキサン酸とがアミド結合した糖鎖ユニットを形成する。一方、ＣＤ（たとえばβ−ＣＤ）の１級水酸基をアミノ基で置換したものを６−アミノヘキサン酸で修飾し、ＣＤを構成するグルコピラノース分子の数と同数の６−アミノヘキサンアミドの分岐を有するＣＤ〔たとえばヘプタキス（６−アミノ）−β−ＣＤ〕を作製する。上記の糖鎖ユニットと分岐ＣＤとを一緒にして縮合反応により結合させ、本発明のＣＤ誘導体を作製する。
合成されたＣＤの構造確認および精製は、当業界で公知の通常の方法によって行うことができる。
標的指向性薬物キャリア
本発明の標的指向性薬物キャリアは、本発明のシクロデキストリン誘導体を含むことを特徴とする。本発明の標的指向性薬物キャリアは、シクロデキストリン誘導体に存在する糖鎖によって、その標的が異なる。標的は、たとえば肝細胞、クッパー細胞、インフルエンザウイルス等である。
標的指向性薬物キャリアは、水、エタノール、エチレングリコール、プロピレングリコール、リン酸塩、ＮａＣｌ等の無機塩類等を含んでいてもよい。
標的指向性薬物
本発明の標的指向性薬物は、本発明のシクロデキストリン誘導体と薬物とを含む。本発明の標的指向性薬物において、薬物は、シクロデキストリン分子に包接されている。
本発明のシクロデキストリン誘導体に包接させるべき薬物としては、抗がん剤、肝疾患治療剤、免疫系に作用する薬剤、抗ウイルス剤等が挙げられるが、これらに限定されない。標的に作用させるべき薬物を適宜選択し、その選択した薬物に適合する空洞径を有するシクロデキストリン誘導体を製造し、使用することができる。
薬物等のゲスト分子を本発明のシクロデキストリン誘導体と包接させる方法は、当業界で公知のいかなる方法であってもよい。たとえば、水溶液中で本発明のシクロデキストリン誘導体（ホスト）とゲスト分子を接触させることによりゲスト分子を包接させ、この溶液を凍結乾燥、噴霧乾燥等の方法によって乾燥させて乾燥物を得ることができる。
このような糖修飾ＣＤの薬物包接体は、使用時に生理食塩水等に溶解して静脈注射することができる。また、他の投与形態、たとえば腸溶性製剤の形態に製剤化することもできる。このような製剤化の方法は公知である。
以下、本発明を実施例により具体的に説明するが、本発明はそれらに限定されるものではない。
以下の合成および生成物確認の実験においては、必要に応じて次の装置を使用した：
レーザーイオン化飛行時間型質量分析装置（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ）：Ｖｏｙａｇｅｒ ＤＥ Ｐｒｏ−Ｔ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ製）
超伝導ＦＴ−ＮＭＲ装置：ＪＮＭ−Ｌａｍｂｄａ５００（日本電子製）
二重収束質量分析装置：ＳＸ１０２Ａ（日本電子製）
分析ＨＰＬＣ：Ｌ−６０００（日立製）、ＵＶ−９７５（日本分光製）
分取ＨＰＬＣ：ＨＬＣ−８０７０（東ソー製）
実施例１．ヘプタキス（６−ガラクトシルグルコノ−アミド−ヘキサン酸アミド−ヘキサン酸アミド−β−ＣＤ〔ヘプタキス（６−Ｇａｌ−ｃａｐ２）−β−ＣＤ〕の合成
以下の手順でヘプタキス（６−Ｇａｌ−ｃａｐ２）−β−ＣＤを合成した。合成スキームの概略を図１に示す。
１） 糖鎖の合成
Ｋｏｂａｙａｓｈｉらの報告（Ｋｏｂａｙａｓｈｉ ｅｔ ａｌ．，Ｐｏｌｙｍ．Ｊ．（１９９８）３０，ｐｐ．６５３−６５８）にしたがってラクトノラクトンを合成した。簡単に説明すると、ラクトースを、ヨウ素のメタノール溶液に加え、これに４５℃で４％ＫＯＨメタノール溶液を滴下して、還元末端を酸化させたカルボン酸カリウム塩を生成させ、冷却して結晶化させた。イオン交換樹脂（アンバーライト Ａｍｂｅｒｌｉｔｅ ＩＲ−１２０Ｂ、ローム・アンド・ハース社製、オルガノ（株）より入手可能）によってカリウムを除去し、エバポレーターを用いてエタノール／メタノールによって脱水、開環させ、ラクトノラクトンを得た。
２） 糖鎖ユニットの作製
このラクトノラクトンを、エバポレーターを用いてエタノール／メタノールによって共沸させたものと、２当量の６−アミノヘキサン酸とを、窒素気流下で６０℃のジメチルホルムアミド（以下「ＤＭＦ」という）中に溶解させ、一夜（約１２時間）反応させた。これをイオン交換樹脂（ＣＭ−Ｓｅｐｈａｄｅｘ、Ｃ２５、ファルマシア製、ＳＩＧＭＡ社より入手可能）に供して未反応の６−アミノヘキサン酸を除去し、ガラクトシルグルコノ−アミド−ヘキサン酸（以下「Ｇａｌ−ｃａｐ１−ＯＨ」ということがある）を得た。
Ｇａｌ−ｃａｐ１−ＯＨはメタノールに溶解するが、一方、原料中のラクトビオン酸（ラクトノラクトンの開環生成物）は溶解しない。このことを利用して、メタノール抽出によって精製を行った。さらに、残存するラクトビオン酸をメタノール−酢酸エチル混合溶媒（１：１．５（ｖ／ｖ））で沈殿させ、溶解物としてＧａｌ−ｃａｐ１−ＯＨを得た。収率は６８％であった。薄層クロマトグラフィ（ＴＬＣ）によるＲｆ値は０．４７（展開溶媒ブタノール：エタノール：水＝５：４：３）であり、ワンスポットであることが確認された。
３） 縮合剤の合成
アミド結合生成反応の縮合剤として使用するために、ＤＭＴ−ＭＭをＫｕｎｉｓｈｉｍａら（１９９９）の方法にしたがって合成した。簡単に説明すると、ビーカーに１．１当量の２−クロロ−２，６−ジメトキシ−１，３，５−トリアジン（以下「ＣＤＭＴ」という）を入れ、ＴＨＦ６０ｍｌを加えて溶解した後、１当量のＮ−メチルモルホリン（以下「ＮＭＭ」という）を加え、室温で３０分撹拌した。生成した白色の沈殿物をろ過し、ＴＨＦで洗浄して生成物を得た。収率は９５％であった。
合成確認として、ＦＡＢ−ＭＳを測定したところ、Ｋｕｎｉｓｈｉｍａら（１９９９）に記載された値と一致したので、目的の化合物が合成されたことがわかった。
４） ヘプタキス（６−アミノ−ヘキサン酸アミド）−β−ＣＤの合成
側鎖を有するＣＤとしてヘプタキス（６−アミノ−ヘキサン酸アミド）−β−ＣＤを合成するため、まずヘプタキス（６−アミノ）−β−ＣＤを合成し、これをヘプタキス（６−Ｂｏｃ−ヘキサン酸アミド）−β−ＣＤとして、最後に脱Ｂｏｃ化して目的の化合物を得た。
最初に、ヘプタキス（６−アミノ）−β−ＣＤを、Ｐｅｔｅｒ Ｒ．Ａｓｈｔｏｎらの報告（Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．（１９９６）６１，ｐｐ．９０３−９０８）に従って合成した。具体的には、ＤＭＦ中に２ｇのヘプタキス（６−アジト）−β−ＣＤおよび６．３６ｇのトリフェニルフォスフィン（以下「ＴＰＰ」という）を入れ、室温にて１時間撹拌した後、２５％のアンモニア水を８．４ｍｌ加え、さらに１８時間撹拌した。
この溶液を、ロータリーエバポレーターによって濃縮し乾固させた。その後、この固形物にエタノールを適量加えて懸濁して洗浄し、洗液はろ過して除去した。ろ物を０．１Ｍの塩酸中に溶解させ、不溶物をろ過して取り除き、ろ液をロータリーエバポレーターで濃縮し、乾燥させた。収率は４２％であった。
合成物は、１３Ｃ−ＮＭＲおよびＴＯＦ−ＭＳによって確認した。１３Ｃ−ＮＭＲにおいては、Ｃ６位の炭素のシグナルがシフトしていることが確認できた。この塩酸塩を希ＮａＯＨ溶液にて中和して、遊離のアミン生成物について分析した。ＴＯＦ−ＭＳにおいては、分子量１１２７に対し、ｍ／ｚ：１１２７［Ｍ］＋にピークを観測できたので、目的の化合物が合成されていることが確認された。
ＤＭＦに上記で作製した１当量のヘプタキス（６−アミノ）−β−ＣＤおよび８当量のＢｏｃヘキサン酸をそれぞれ加え、溶解した後、４０当量の縮合剤ＤＭＴ−ＭＭを加え、室温で２４時間反応させた。反応後、エバポレーターにて濃縮し、水を加え、生成物を沈殿させた。ろ液を除去後、ろ物をメタノールに溶解させ乾固した。ＨＰＬＣで精製し、ヘプタキス（６−Ｂｏｃ−ヘキサン酸アミド）−β−ＣＤを得た。
次に、精製したヘプタキス（６−Ｂｏｃ−ヘキサン酸アミド）−β−ＣＤにＴＦＡを加え、氷冷下で２時間撹拌し、脱Ｂｏｃ化反応を行った。収率４１％であった。
ＴＯＦ−ＭＳを測定したところ、生成物の分子量１９１９に対し、ｍ／ｚ：１９２０［Ｍ＋Ｈ］＋、１９４２［Ｍ＋Ｎａ］＋、１９５８［Ｍ＋Ｋ］＋のみにピークを観測できたので、目的の化合物が合成されていることが確認された。
５） ヘプタキス（６−Ｇａｌ−ｃａｐ２）−β−ＣＤの合成
ＮＭＰ−Ｈ２Ｏ混合溶媒に、上記のように調製した８当量のヘプタキス（６−アミノ−ヘキサン酸アミド）−β−ＣＤ、１当量のＧａｌ−ｃａｐ１−ＯＨ、８当量のトリエチルアミン（以下「ＴＥＡ」という）をそれぞれ加えて溶解した後、４０当量の縮合剤ＤＭＴ−ＭＭを加え、室温で４８時間反応させた。反応後、エバポレーターにて濃縮し、氷冷アセトン中へ滴下し、沈殿させた。その後、ろ過を行い、ろ液を除去後、ろ物を水に溶解させた。
精製は、まずＣＭ−Ｓｅｐｈａｄｅｘ（Ｃ２５、ファルマシア製、ＳＩＧＭＡ社より入手可能）にて未反応のアミノ基を有するＣＤ誘導体を除去後、トヨパールＨＷ−４０Ｆカラム（４．２ｃｍ×４６ｃｍ；東ソー製）を用いたゲルろ過（溶出液は水）を行った。最後に分析ＨＰＬＣにて単離を確認した。収率は３０％であった。
比較例１． ヘプタキス（６−ガラクトシルグルコノ−アミド−ヘキサン酸アミド）−β−ＣＤ〔ヘプタキス（６−Ｇａｌ−ｃａｐ１）−β−ＣＤ〕の合成
ＮＭＰ−Ｈ２Ｏ混合溶媒に、実施例１と同様に調製した１当量のヘプタキス（６−アミノ）−β−ＣＤ、実施例１と同様に調製した８当量のＧａｌ−ｃａｐ１−ＯＨ、８当量のＴＥＡをそれぞれ加えて溶解した後、４０当量の縮合剤ＤＭＴ−ＭＭを加え、室温で４８時間反応させた。反応後、エバポレーターにて濃縮し、氷冷アセトン中へ滴下し、沈殿させた。その後、ろ過を行い、ろ液を除去後、ろ物を水に溶解させた。
精製は、まずＣＭ−Ｓｅｐｈａｄｅｘ（Ｃ２５、ファルマシア製、ＳＩＧＭＡ社より入手可能）にて未反応のアミノ基を有するＣＤ誘導体を除去後、トヨパールＨＷ−４０Ｆカラム（４．２ｃｍ×４６ｃｍ；東ソー製）を用いたゲルろ過（溶出液は水）を行った。最後に分析ＨＰＬＣにて単離を確認した。収率は３１％であった。
試験例１．レクチン認識能の評価
標的タンパク認識能の評価は、標的タンパクとしてピーナツレクチン（ＰＮＡ）を使用し、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）法で行った。ＳＰＲ光学バイオセンサーとして、ＩＡｓｙｓ（Ｔｈｅｒｍｏ製）を使用し、得られたデータは、付属のソフトウェアＦＡＳＴｆｉｔにより解析した。
１） ＰＮＡの固定化
ＰＮＡ（４量体）の固定化は、今多（東京工芸大学大学院、工学研究科、工業化学専攻博士論文（１９９７））および保田（東京工芸大学大学院、工学研究科、工業化学専攻修士論文（１９９９））の報告を参考に行った。
まず、ＳＰＲ光学バイオセンサーキュベット表面上のアミノシラン基にレクチンタンパクのアミノ基と反応させるためのリンカー剤として、ビス（スルホスクシンイミジル）スベレート（ＢＳ３）（１ｍＭ−ＢＳ３／１０ｍＭ−リン酸緩衝溶液（ＰＢＳ）、ｐＨ６．５）を予め反応させた。これを、レスポンスが変化しにくくなるまで複数回繰り返し、無水酢酸−酢酸溶液（混合容積比１：１）を加えることで未反応の活性アミノシラン基を不活性化させ、ブロッキングした。
ブロッキング後、ｐＨ５．３の１０ｍＭ−酢酸緩衝溶液に置換し、その後、２００μＬのＰＮＡ溶液（１ｍｇ ＰＮＡ／１０ｍＭ−酢酸緩衝溶液、ｐＨ５．３）をキュベットに加え、反応させた。次に、１Ｍ−エタノールアミン水溶液、ｐＨ８．５を加え、コハク酸アミドエステル基のブロッキングを不活性化させた。レスポンス（Ｒ）＝６００ａｒｃ ｓｅｃで１ｎｇ／ｍｍ２で、１ｎｍ２あたり１本のアミノシラン基が存在する。ＰＮＡのレスポンスの変化量は約１７６０ｓであったので、固定化率は約１．６％と算出された。
２） 測定
１ｍＭ−ＣａＣｌ２、１ｍＭ−ＭｇＣｌ２、１００ｍＭ−ＮａＣｌを含有する１０ｍＭ−酢酸緩衝溶液、ｐＨ５．３中に、（０．２〜１）×１０−５Ｍの範囲で６点の濃度に変化させた試験対象の各ＣＤを含む溶液１００μＬを、ＰＮＡを固定化したキュベットに入れて、既述の相互作用解析装置（ＳＰＲ光学バイオセンサー）を用いて各ＣＤと固定化ＰＮＡとの相互作用を測定した。測定温度は２５．０℃であり、所要時間はレスポンスが飽和に達するまでの５〜３０分であった。
３） 結果
上記のように測定したＰＮＡに対する本発明のＣＤ誘導体ヘプタキス（６−Ｇａｌ−ｃａｐ２）−β−ＣＤおよび比較例のＣＤ誘導体ヘプタキス（６−Ｇａｌ−ｃａｐ１）−β−ＣＤの会合挙動の解析結果を表１に示す。参考のため、公知文献に記載された他のＣＤ誘導体についての類似の測定値も併せて示す。
ヘキサン酸単位１個分のスペーサーアームを有する比較例のＣＤ誘導体のＫａを１とすると、ヘキサン酸単位２個分のスペーサーアームを有する本発明のＣＤ誘導体のＫａはその約５４倍高い会合能を有しており、本発明の誘導体は、従来のＣＤ誘導体の中で比較的認識能が高いものと比較しても、非常に認識能が高いことが判明した。
試験例２． 薬物の包接能力の測定
薬物として抗生物質であるドキソルビシン（Ｄｏｘｏｒｕｂｉｃｉｎ；「ＤＸＲ」）を用い、試験例１と同様の方法で本発明の誘導体の包接能を調べた。
１） ＤＸＲの固定化
ＤＸＲの光学バイオセンサーキュベット表面への固定化は、薬物を溶解させる緩衝溶液としてｐＨの異なるものを用いたことを除き、上述したレクチンの固定化と同様の操作方法で行った。
キュベット表面のアミノシラン基にＤＸＲのアミノ基と反応させるためのリンカー剤として、１ｍＭ−ＢＳ３／１０ｍＭ−ＰＢＳ、ｐＨ６．５を反応させた。これを、光学バイオセンサーのレスポンスが変化しなくなるまで数回繰り返し、無水酢酸−酢酸溶液（混合容積比１：１）を加えることで未反応のアミノシラン基を不活性化させ、ブロッキングした。
ブロッキング後、ｐＨ５．３の１０ｍＭ−酢酸緩衝溶液に置換し、ＤＸＲ溶液（２ｍｇ ＤＸＲ／１０ｍＭ−酢酸緩衝溶液、ｐＨ５．３）を加え、反応させた。その後、キュベット上のバックグラウンドの影響を考慮し、１Ｍ−エタノールアミン水溶液、ｐＨ８．５でコハク酸アミドエステル基のブロッキングを行った。ＤＸＲのレスポンスの変化量は約５５ ａｒｃ ｓｅｃであったので、Ｒ＝６００ ａｒｃ ｓｅｃのとき１ｎｇ／ｍｍ２で１ｎｍ２あたり１本のアミノシラン基が存在しているものとして、固定化率はアミノシラン基の約９．６％と算出された。
２） 測定
上記で作製したＤＸＲ固定化キュベットを用い、試験例１と同様にしてＤＸＲと各ＣＤとの相互作用を測定した。但し、試験対象のＣＤの濃度は、（０．２〜１）×１０−４Ｍの範囲であった。
３） 結果
上記のように測定したＤＸＲに対する本発明のＣＤ誘導体ヘプタキス（６−Ｇａｌ−ｃａｐ２）−β−ＣＤおよび比較例のＣＤ誘導体ヘプタキス（６−Ｇａｌ−ｃａｐ１）−β−ＣＤの会合挙動の解析結果を表２に示す。参考のため、公知文献に記載された他のＣＤ誘導体についての類似の測定値も併せて示す。
比較例のＣＤ誘導体のＫａと比較して、本発明のＣＤ誘導体の会合能は約１６倍に増大していた。また、その他の公知のＣＤ誘導体は、比較例のＣＤ誘導体よりも劣っているため、本発明のＣＤ誘導体は、従来の合成糖鎖を有するＣＤ誘導体と比べ、非常に優れた薬物包接能を有することが判明した。
表２に掲載したＭ６ＣＤおよびＭ７ＣＤについてのデータは、薬物としてＣＤに包接され易いコール酸を用いて得られたものであり、また、Ｍ６ＣＤおよびＭ７ＣＤにはＦｍｏｃ基が存在するために疎水場が形成され易いという点で、本発明のＣＤ誘導体等とは測定条件が異なっている。これらの相違点を考慮すると、Ｍ６ＣＤおよびＭ７ＣＤの薬物（ＤＸＲ）包接能は、これらのデータの１０分の１程度と見積もられる。その結果、本発明のＣＤ誘導体は、薬物包接能においても、これらの天然糖鎖を有するＣＤと同等と解釈される。
試験例３． 二次元マップによる各種糖鎖分岐ＣＤの二重認識の評価
公知のシクロデキストリン誘導体および本発明の化合物の薬物包接能およびレクチン結合能を評価するために、表１および表２に示した値をもとにして、ｘ軸を薬物との包接会合定数Ｋａの対数とし、ｙ軸をレクチンとの糖鎖認識会合定数Ｋａの対数として、β−ＣＤ、公知のいくつかの糖鎖修飾β−ＣＤ、および本発明のＣＤ誘導体をプロットした二次元マップを作成した（図２Ｇ）。
未修飾のβ−ＣＤ（「ｆ」）は、薬物に対するｌｏｇ Ｋａは３程度であるが、糖を有さないためレクチンに対しては０である。従来公知のガラクトース鎖を有するＣＤ（「ａ」〜「ｃ」；図２Ｂ〜Ｄ）は、薬物に対するｌｏｇ Ｋａが３〜５程度、レクチンに対するｌｏｇ Ｋａが４〜６程度の領域にプロットされている。マップ上の一番右上に存在するＭ６ＣＤ（「ｄ」；図２Ｅ）およびＭ７ＣＤ（「ｅ」；図２Ｆ）は、それぞれマンノース６残基および７残基とＮ−アセチル−Ｄ−グルコサミン２残基とからなる天然糖鎖を有しており、従来調べられた中では、レクチンおよび薬物に対し最高の会合能を有している。
実施例１で合成したヘプタキス（６−Ｇａｌ−ｃａｐ２）−β−ＣＤ（「Ｉ」；図２Ａ）は、レクチンに対する会合能はＭ６ＣＤおよびＭ７ＣＤと同程度であり、薬物に対する会合能も同程度と解釈される。したがって、本発明によれば、合成によって天然糖鎖を有するＣＤに匹敵する非常に高いタンパク認識能および薬物包接能を有するＣＤ誘導体が得られる。
この出願は、平成１５年３月２７日出願の日本特許出願、特願２００３−８７１９２に基づくものであり、特願２００３−８７１９２の明細書および特許請求の範囲に記載された内容は、すべてこの出願明細書に包含される。
【技術分野】
本発明は、新規なシクロデキストリン誘導体に関する。さらに詳しくは、医薬品工業の分野で有用な新規な分岐シクロデキストリン誘導体、その製造方法およびその用途に関する。
【背景技術】
標的指向性薬物送達システム（ターゲッティングＤＤＳ）は、作用させるべき標的に薬剤を効率よく特異的に送達する、いわゆるミサイル療法に有用であり、これまでも研究がされてきている。ターゲッティングＤＤＳのための薬物キャリアには、標的を特異的に認識する機能を有する部分と薬物を輸送する機能を有する部分とが必要である。
標的の認識機能を担う部分として、糖鎖を利用することが研究されている。糖鎖は、細胞認識に重要な役割を果たしており、いくつかの細胞には糖特異的なレセプターが存在することが知られている。たとえば、肝実質細胞はガラクトース残基、クッパー細胞はマンノース残基およびグルコース残基をそれぞれ認識するレセプターをその表面に有している。これらの糖残基を有する物質は、それぞれのレセプターに結合し、エンドサイトーシスによって肝実質細胞またはクッパー細胞内に特異的に取り込まれる。また、インフルエンザウイルスは、シアル酸を末端に有する糖鎖を認識するレセプター（ヘマグルチニン）を表面に有しており、そのような糖鎖（を有する細胞）に特異的に結合する。
糖鎖による認識は、ターゲッティングＤＤＳにおいて実際に有用であることがわかっている。たとえば、未修飾のスーパーオキシドジスムターゼ（ＳＯＤ）をマウスに投与すると肝臓中にはほとんど蓄積されないのに対し、ＳＯＤをマンノースまたはガラクトースで修飾したものを投与すると、それぞれ肝非実質細胞および肝実質細胞に特異的に送達され、投与後１０分の時点で投与量の約６０〜８０％近くが肝臓に検出される（参考文献１）。
一方、薬物の輸送を担う部分としては、薬物を取り込んで錯体化合物を形成する様々な化合物（包接化合物）が検討されている。
シクロデキストリン（以下、「ＣＤ」と略称することがある）は、そのような包接化合物の１つであり、Ｄ−グルコピラノースがα−１，４結合したドーナツ形状を有する非還元性の環状オリゴ糖であって、外側が親水性、内部空洞が疎水性を示す。グルコピラノース分子が６、７、８個からなるものをそれぞれα−、β−、γ−ＣＤと呼ぶ。ＣＤは、物質の化学的安定化、溶解性の改善、液状物質の粉体化等の用途に利用されており、医薬品工業においても種々の目的で利用されているが、特に、ターゲッティングＤＤＳのための薬物キャリアとしては、その疎水性空洞に医薬化合物をゲスト分子として立体選択的に包接することができること、生体に対して毒性がなく、抗原性も低いこと、等の利点を有する。
したがって、糖鎖で修飾したＣＤを用いる、糖−タンパクの相互作用を利用したターゲッティングＤＤＳが検討されてきた。
たとえば、
（式中、「Ｍａｎ」はマンノース、「ＧｌｃＮＡｃ」はＮ−アセチル−Ｄ−グルコサミンを表す。以下も同じ）
の糖鎖を有するＣＤ（以下「Ｍ６ＣＤ」という）、および
の糖鎖を有するＣＤ（以下「Ｍ７ＣＤ」という）を合成し、薬物の包接および固定化コンカナバリンＡ（ＣｏｎＡ）による認識について調べたところ、共に非常に高い薬物包接能およびタンパク認識能を有していた。
しかし、これらの分岐糖鎖を有するＣＤは、鶏卵（卵白オブアルブミン）からの天然オリゴ糖鎖アスパラギンの調製を必要とするため、大量に製造することが困難であり、薬物キャリアとしての実用化は実際上不可能である。
そのため、天然物由来糖鎖を使用せずに合成によって作製された糖鎖を有するＣＤも検討されている（参考文献２、表２参照）。近年は複数の糖鎖を有する糖クラスター型ＣＤが合成されており、ガラクトース鎖を７本有するβ−ＣＤ（ヘプタＧａｌ−β−ＣＤ）は、ガラクトース鎖を１本有するもの（モノＧａｌ−β−ＣＤ）と比べて、薬物包接能およびレクチンとの結合能の両方において向上した。また、アームの長さを変えた一連のガラクトース鎖２本を有するＣＤを合成して調べると、アームが長い方がレクチンとの結合能が良かった。
しかし、これらの合成ＣＤは、いずれも、薬物包接能およびレクチンとの結合能の両方において天然糖鎖を有するＣＤには及ばなかった。
参考文献１：
橋田充、「ドラッグデリバリーシステム」、東京化学同人（１９９５）
参考文献２：
服部憲治郎および稲津敏行、「糖鎖クラスターシクロデキストリンの合成およびレクチンタンパクと医薬品に対する二重認識について」、有機合成化学協会誌、Ｖｏｌ．５９，Ｎｏ．８（２００１）ｐｐ．７４２−７５４
【発明の開示】
本発明は、天然物由来の糖鎖を有するＭ６ＣＤおよびＭ７ＣＤに匹敵する高い標的タンパク認識能および薬物結合能を兼ね備え、容易に大量に製造可能な、新規ＣＤ誘導体およびその製造方法、ならびにこれらの化合物の標的指向性薬物送達キャリアとしての用途を提供することを目的とする。
本発明者は、上記の課題を解決するために鋭意研究した結果、特定の構造の新規シクロデキストリン誘導体を開発し、本発明を完成した。
本発明のシクロデキストリン誘導体は、糖鎖とスペーサーアームとからなる分岐を有するシクロデキストリン誘導体であって、
ａ） 糖鎖が、スペーサーアームの末端に位置し、ガラクトース、グルコース、マンノースおよびシアル酸から選択される１個以上の糖を含み、
ｂ） スペーサーアームが、糖鎖およびシクロデキストリンの間に位置し、少なくとも２個の置換または非置換のヘキサン酸単位を含む骨格を有し、
ｃ） 分岐が、シクロデキストリンの環を構成するグルコース１分子あたり１個存在すること
を特徴とする。
スペーサーアームは、好ましくは２〜５個のアミノヘキサン酸単位を含む骨格を有し、さらに好ましくはグルコノ−〔ＮＨ（ＣＨ２）５ＣＯ〕ｎ−ＮＨ−または（ＣＨ２）３−Ｓ−（ＣＨ２）２−ＣＯ〔ＮＨ（ＣＨ２）５ＣＯ〕ｎ−ＮＨ−（式中、ｎは２〜５の整数を表す）で示される基である。
糖鎖は、好ましくはガラクトシル基、グルコシル基、マンノシル基またはシアル酸基（シアリル基）である。
特に好ましくは、本発明の誘導体は、ヘキサキス（６−ガラクトシルグルコノ−アミド−（ヘキサン酸アミド）ｎ）−α−シクロデキストリン、ヘプタキス（６−ガラクトシルグルコノ−アミド−（ヘキサン酸アミド）ｎ）−β−シクロデキストリン、オクタキス（６−ガラクトシルグルコノ−アミド−（ヘキサン酸アミド）ｎ）−γ−シクロデキストリン（ここで、ｎは２〜５の整数を表す。以下も同じ）；
ヘキサキス（６−グルコシルグルコノ−アミド−（ヘキサン酸アミド）ｎ）−α−シクロデキストリン、ヘプタキス（６−グルコシルグルコノ−アミド−（ヘキサン酸アミド）ｎ）−β−シクロデキストリン、オクタキス（６−グルコシルグルコノ−アミド−（ヘキサン酸アミド）ｎ）−γ−シクロデキストリン；
ヘキサキス（６−マンノシルプロピルチオエチル−アミド−（ヘキサン酸アミド）ｎ）−α−シクロデキストリン、ヘプタキス（６−マンノシルプロピルチオエチル−アミド−（ヘキサン酸アミド）ｎ）−β−シクロデキストリン、オクタキス（６−マンノシルプロピルチオエチル−アミド−（ヘキサン酸アミド）ｎ）−γ−シクロデキストリン；
ヘキサキス（６−シアル酸プロピルチオエチル−アミド−（ヘキサン酸アミド）ｎ）−α−シクロデキストリン、ヘプタキス（６−シアル酸プロピルチオエチル−アミド−（ヘキサン酸アミド）ｎ）−β−シクロデキストリン、およびオクタキス（６−シアル酸プロピルチオエチル−アミド−（ヘキサン酸アミド）ｎ）−γ−シクロデキストリンである。
また、本発明は、上記のシクロデキストリン誘導体の製造方法を提供する。本発明の方法は、ガラクトース、グルコース、マンノースおよびシアル酸から選択される１個以上の糖を含む糖鎖またはこの糖鎖と官能基を有する側鎖とを含む糖鎖ユニットと、官能基を有する側鎖とシクロデキストリンとを含むシクロデキストリンユニットまたは官能基を有するシクロデキストリンとを、縮合剤の存在下または非存在下で反応させることを特徴とする。
具体的には、糖鎖ユニットと、シクロデキストリンユニットとを、縮合剤の存在下または非存在下で反応させる；糖鎖とシクロデキストリンユニットとを、縮合剤の存在下または非存在下で反応させる；または、糖鎖ユニットと官能基を有するシクロデキストリンとを、縮合剤の存在下または非存在下で反応させることができる。
また、本発明の方法において、官能基を有する側鎖は、本発明のＣＤ誘導体のスペーサーアームを構成する。
本発明は、上記のような本発明のシクロデキストリン誘導体を含む標的指向性薬物キャリアをも提供する。
さらに、本発明は、本発明のシクロデキストリン誘導体と、薬物とを含む標的指向性薬物をも提供する。
本発明によれば、天然糖鎖を結合したＭ６ＣＤに匹敵する非常に高い糖鎖認識相互作用および薬物との包接相互作用を示す新規なＣＤ誘導体化合物およびその製造方法が提供される。また、本発明によれば、Ｍ６ＣＤに匹敵する非常に高い標的指向性および薬物との包接相互作用を有する薬物キャリア、および効率よく薬物が包接された糖鎖認識による非常に高い標的指向性を有する薬物も提供される。
本発明のＣＤ誘導体は、安全性が高く、標的指向性および薬物包接能の両方が極めて高いので、所定の薬物を効率的に包接し、途中で薬物を放出することなく確実に特異的に標的部位まで輸送し、そこで糖特異的レセプターを介して薬物を標的細胞内に特異的に取り込ませることができる。したがって、本発明のＣＤ誘導体は、ターゲッティングＤＤＳにおける利用性が非常に高い。
しかも、本発明の化合物は、有機合成反応によって合成することができ、多大な時間と労力を必要とする困難な天然糖鎖の調製を必要としない。したがって、本発明のＣＤ誘導体は、容易に大量に供給することができ、実用性が高い。
【図面の簡単な説明】
図１は、実施例１の本発明のシクロデキストリン誘導体ヘプタキス（６−Ｇａｌ−ｃａｐ２）−β−ＣＤの合成手順の概略を示す図である。図１Ａは糖鎖ユニットの合成、図１ＢはＣＤユニットの合成、図１Ｃは各ユニットの組立の概略を示す。
図２は、従来のシクロデキストリン誘導体および本発明の誘導体のタンパク認識能および薬物包接能を比較する図である。図２Ａ〜Ｆは、各化合物を説明する図である。
図２Ａ：実施例１の本発明のシクロデキストリン誘導体ヘプタキス（６−Ｇａｌ−ｃａｐ２）−β−ＣＤ（化合物「Ｉ」）；
図２Ｂ：比較例のシクロデキストリン誘導体ヘプタキス（６−Ｇａｌ−ｃａｐ１）−β−ＣＤ（化合物「ａ」）；
図２Ｃ：ヘプタキス（Ｇａｌ）−β−ＣＤ（化合物「ｂ」）；
図２Ｄ：ビス（Ｇａｌ−ｃａｐ５）−β−ＣＤ（化合物「ｃ」）；
図２Ｅ：Ｍ６ＣＤ（化合物「ｄ」）；および
図２Ｆ：Ｍ７ＣＤ（化合物「ｅ」）。
図２Ｇは、図２Ａ〜Ｆの化合物およびβ−ＣＤ（化合物「ｆ」）について、ｘ軸を薬物との包接会合定数Ｋａの対数とし、ｙ軸をレクチンとの糖鎖認識会合定数Ｋａの対数として、それぞれの値をプロットした二次元マップである。
発明を実施するための形態
シクロデキストリン誘導体
本発明のシクロデキストリン誘導体を構成する成分は、基本的には、糖鎖、スペーサーアーム、およびシクロデキストリンである。
シクロデキストリン
本発明のシクロデキストリン誘導体の合成に用いられるシクロデキストリンは、シクロデキストリンの基本骨格を有している限り、特に限定されない。一般的には、α−ＣＤ、β−ＣＤおよびγ−ＣＤが挙げられる。これらのＣＤは環を構成しているグルコピラノースの数が異なり（α：６個；β：７個；γ：８個）、したがってその空洞径も異なる（α：０．４５ｎｍ；β：０．７０ｎｍ；γ：０．８５ｎｍ）。たとえば、α−ＣＤは、ベンゼン環が充分に入る大きさであり、トリクレン、パークレン等を包接することができる。また、β−ＣＤは、ナフタレン環が入る大きさであり、γ−ＣＤはアントラセンやナフタレン環２個が入る大きさである。したがって、包接すべき薬物の分子サイズを考慮して最適の空洞径を有するＣＤを当業者が適宜選択することができる。
また、薬物の包接能の点からは、糖鎖分岐の数、すなわちＣＤ構成グルコピラノース分子の数が多い方が好ましい。入手の容易性の点からは、α−ＣＤ、β−ＣＤおよびγ−ＣＤが好ましい。
糖鎖
本発明のＣＤを修飾するための糖鎖は、特定の標的によって特異的に認識されるものであれば、特に限定されない。糖は、少なくとも１個存在すればよく、２個以上であってもよい。本明細書においては、「糖鎖」という用語は、糖が２個以上連結している場合に加えて、１個の場合も含む。
糖鎖を構成する糖は、未修飾であっても修飾されていてもよい。好ましくは、ガラクトース、グルコース、マンノース、シアル酸；ガラクトサミン、グルコサミン、マンノサミンなどのアミノ糖から選択される。合成の容易さの点からは、ガラクトース、グルコース、マンノースおよびシアル酸が好ましい。糖鎖が２個以上の糖を含む場合、それらの糖は同じ種類であっても異なる種類であってもよい。
また、糖鎖は、直鎖であっても分岐鎖であってもよい。
入手の容易性および合成の容易性の点から、好ましくは糖１〜６個の糖鎖であり、さらに好ましくは糖１〜４個の糖鎖であり、より好ましくは糖１〜４個の直鎖状の糖鎖であり、最も好ましい糖鎖は単糖、すなわちガラクトシル基、グルコシル基、マンノシル基およびシアル酸基である。
スペーサーアーム
本発明のＣＤ誘導体において使用されるスペーサーアームは、糖鎖およびＣＤの間に位置してこの両者を接続しており、一般的には糖鎖の還元末端の糖のＣ４の炭素原子とＣＤを構成するグルコース分子のＣ６位の炭素原子との間の部分を指す。スペーサーアームは、少なくとも２個の置換または非置換のヘキサン酸単位〔−（ＣＨ２）５−ＣＯ−〕を含む骨格を有していればよい。
スペーサーアームは、好ましくは、２〜５個のヘキサン酸単位〔−（ＣＨ２）５−ＣＯ−〕ｎまたはアミノヘキサン酸単位〔−ＮＨ−（ＣＨ２）５−ＣＯ−〕ｎ（式中、ｎは２〜５の整数を表す）を含む骨格を有する。
スペーサーアームは、合成の容易さの点から、特に好ましくはグルコノ−〔ＮＨ（ＣＨ２）５ＣＯ〕ｎ−ＮＨ−または（ＣＨ２）３−Ｓ−（ＣＨ２）２−ＣＯ〔ＮＨ（ＣＨ２）５ＣＯ〕ｎ−ＮＨ−（式中、ｎは２〜５の整数を表す）で示される基である。
スペーサーアームの骨格は、置換または非置換の、たとえばヘキサン酸（カプロン酸と同義である）、アミノエタノール、アミノエタンチオール、ポリエチレングリコール（ポリオキシエチレンと同義である）、ポリプロピレングリコール、オクタエチレングリコール、ビスエポキシアルキレン、ジアミノアルキレン、ジカルボキシアルキレン、無水コハク酸等に由来する基またはそれらの組み合わせによって構成される。
スペーサーアームの長さは、薬物を送達する標的の細胞表面タンパク等の大きさと関連するが、ＣＤに結合したスペーサーアームが溶液中で外側に開いた形態において向かい合う糖鎖（の末端）間の距離が標的タンパクの直径（標的タンパクが二量体の場合は２ヵ所の結合部位間の距離）に近いものが好ましい。したがって、長い糖鎖を選択する場合、スペーサーアームは相対的に短いものであることができる。
スペーサーアームは、骨格中に炭素以外の原子を含んでいてもよい。その場合、窒素、イオウ、酸素等が好ましい。
スペーサーアームの骨格上に存在していてもよい置換基としては、アルキル基、アリール基、フェニレン基、アミド基、アミノ基、ケトン基、水酸基、チオール基、カルボキシル基等の基が挙げられるが、置換基の大きさ、種類、数は、スペーサーアーム部分の柔軟性を妨げない限り、特に限定されない。
分岐
分岐は、糖鎖とスペーサーアームとからなる。分岐は、ＣＤの環を構成するグルコース分子の数と同じ数、すなわち、ＣＤの環を構成するグルコース１分子あたり１個、存在する。
ＣＤ上の分岐の存在位置は、特に限定されず、一級側（すなわちグルコピラノース環のＣ６位）であっても二級側（グルコピラノース環のＣ３位）であってもよい。反応性の高さおよび合成の容易さの点からは、一般的には一級側が好ましい。
したがって、本発明の特に好ましいＣＤ誘導体の具体例としては、
ヘキサキス（６−ガラクトシルグルコノ−アミド−（ヘキサン酸アミド）ｎ）−α−シクロデキストリン、ヘプタキス（６−ガラクトシルグルコノ−アミド−（ヘキサン酸アミド）ｎ）−β−シクロデキストリン、オクタキス（６−ガラクトシルグルコノ−アミド−（ヘキサン酸アミド）ｎ）−γ−シクロデキストリン（ここで、ｎは２〜５の整数を表す。以下も同じ）；
ヘキサキス（６−グルコシルグルコノ−アミド−（ヘキサン酸アミド）ｎ）−α−シクロデキストリン、ヘプタキス（６−グルコシルグルコノ−アミド−（ヘキサン酸アミド）ｎ）−β−シクロデキストリン、オクタキス（６−グルコシルグルコノ−アミド−（ヘキサン酸アミド）ｎ）−γ−シクロデキストリン；
ヘキサキス（６−マンノシルプロピルチオエチル−アミド−（ヘキサン酸アミド）ｎ）−α−シクロデキストリン、ヘプタキス（６−マンノシルプロピルチオエチル−アミド−（ヘキサン酸アミド）ｎ）−β−シクロデキストリン、オクタキス（６−マンノシルプロピルチオエチル−アミド−（ヘキサン酸アミド）ｎ）−γ−シクロデキストリン；
ヘキサキス（６−シアル酸プロピルチオエチル−アミド−（ヘキサン酸アミド）ｎ）−α−シクロデキストリン、ヘプタキス（６−シアル酸プロピルチオエチル−アミド−（ヘキサン酸アミド）ｎ）−β−シクロデキストリン、およびオクタキス（６−シアル酸プロピルチオエチル−アミド−（ヘキサン酸アミド）ｎ）−γ−シクロデキストリン
が挙げられる。これらは以下の式を有する。
（式中、ｒは、６，７または８を表し；Ｘは、ガラクトシル−グルコノ−（ＮＨ（ＣＨ２）５ＣＯ）ｎＮＨ−、グルコシル−グルコノ−（ＮＨ（ＣＨ２）５ＣＯ）ｎＮＨ−、マンノシル−（ＣＨ２）３Ｓ（ＣＨ２）２ＣＯ（ＮＨ（ＣＨ２）５ＣＯ）ｎＮＨ−またはシアル酸−（ＣＨ２）３Ｓ（ＣＨ２）２ＣＯ（ＮＨ（ＣＨ２）５ＣＯ）ｎＮＨ−を表し；ｎは、２〜５の整数を表す。）
合成の容易さの点から最も好ましいのは、上記の式でｎ＝２の化合物、すなわち、ヘキサキス（６−ガラクトシルグルコノ−アミド−（ヘキサン酸アミド）２）−α−シクロデキストリン、ヘプタキス（６−ガラクトシルグルコノ−アミド−（ヘキサン酸アミド）２）−β−シクロデキストリン、オクタキス（６−ガラクトシルグルコノ−アミド−（ヘキサン酸アミド）２）−γ−シクロデキストリン；
ヘキサキス（６−グルコシルグルコノ−アミド−（ヘキサン酸アミド）２）−α−シクロデキストリン、ヘプタキス（６−グルコシルグルコノ−アミド−（ヘキサン酸アミド）２）−β−シクロデキストリン、オクタキス（６−グルコシルグルコノ−アミド−（ヘキサン酸アミド）２）−γ−シクロデキストリン；
ヘキサキス（６−マンノシルプロピルチオエチル−アミド−（ヘキサン酸アミド）２）−α−シクロデキストリン、ヘプタキス（６−マンノシルプロピルチオエチル−アミド−（ヘキサン酸アミド）２）−β−シクロデキストリン、オクタキス（６−マンノシルプロピルチオエチル−アミド−（ヘキサン酸アミド）２）−γ−シクロデキストリン；
ヘキサキス（６−シアル酸プロピルチオエチル−アミド−（ヘキサン酸アミド）２）−α−シクロデキストリン、ヘプタキス（６−シアル酸プロピルチオエチル−アミド−（ヘキサン酸アミド）２）−β−シクロデキストリン、オクタキス（６−シアル酸プロピルチオエチル−アミド−（ヘキサン酸アミド）２）−γ−シクロデキストリンである。
ｎ＝２〜５の化合物は、標的タンパク認識能の点から最も好ましい。
製造方法
本発明のＣＤ誘導体の製造方法は、ガラクトース、グルコース、マンノースおよびシアル酸から選択される１個以上の糖を含む糖鎖またはこの糖鎖と官能基を有する側鎖とを含む糖鎖ユニットと、官能基を有する側鎖とＣＤとを含むＣＤユニットまたは官能基を有するＣＤとを、縮合剤の存在下または非存在下で反応させることを特徴とする。
具体的には、本発明の方法においては、（１）糖鎖ユニットと、シクロデキストリンユニットとを、縮合剤の存在下または非存在下で反応させる；（２）糖鎖と、ＣＤユニットとを、縮合剤の存在下または非存在下で反応させる；または、（３）糖鎖ユニットと、官能基を有するＣＤとを、縮合剤の存在下または非存在下で反応させることができる。
糖鎖ユニットは、グルコース、ガラクトース、マンノースおよびシアル酸から選択される１個以上の糖からなる糖鎖と、官能基を有する側鎖とを有する。
糖鎖ユニットに含まれる糖鎖は、本発明のＣＤ誘導体について説明したとおりである。糖鎖の非還元性末端をガラクトースにする場合はラクトース（乳糖）、グルコースにする場合はマルトース（麦芽糖）を糖鎖の材料として用い、その還元末端を酸化してラクトン環を形成させ、このラクトン環の反応性を利用して側鎖と結合させると合成が容易である。この場合、原料二糖の還元末端側のグルコースはグルコノ基となって糖鎖ユニットの側鎖の一部を形成し、最終的にはスペーサーアームの一部となる。
また、糖鎖の非還元性末端をマンノースまたはシアル酸にする場合は、それぞれの糖から公知の方法によって糖鎖ユニットを合成することができる。たとえばマンノースをアリルアルコールに溶解し、酸触媒を加えて窒素気流下９７℃で還流してアリルマンノシドを製造し、これを糖鎖ユニットとして用いることができる。さらに側鎖を延長するには、たとえばアリルマンノシドにメルカプトプロピオン酸を付加することができる。
官能基を有する側鎖については後述する。
ＣＤもまた、本発明のＣＤ誘導体について説明したとおりである。上記（１）および（２）のタイプの反応においては、ＣＤ環を構成する各グルコピラノース分子に、官能基を有する側鎖を導入して製造したＣＤユニットを用いる。また、上記（３）のタイプの反応においては、ＣＤ環を構成する各グルコピラノース分子に、官能基を直接導入したものを用いる。ＣＤへの官能基を有する側鎖または官能基の導入方法は、公知である。
糖鎖ユニットの官能基を有する側鎖および／またはＣＤユニットの官能基を有する側鎖は、上記（１）〜（３）の反応の結果として、本発明のＣＤ誘導体のスペーサーアームを構築する。したがって、これらの側鎖は、糖鎖ユニットに含まれる側鎖であっても、また、ＣＤに存在する側鎖であっても、既に記載した本発明のＣＤ誘導体のスペーサーアームと基本的に同様の骨格を有する。
上記（１）のタイプの反応を行う場合、糖鎖ユニットに含まれる側鎖およびＣＤ上に存在する側鎖が、それぞれスペーサーアームの一部を構成し、合成後にスペーサーアームの全体を構成する。また、上記（２）のタイプの反応を行う場合はＣＤユニットに含まれる側鎖が、また、上記（３）のタイプの反応を行う場合は糖鎖ユニットに含まれる側鎖が、それぞれスペーサーアームの全体を構成するのに充分な長さおよび構造を有する。
したがって、当業者は、官能基を有する側鎖が糖鎖ユニットに含まれる側鎖であっても、ＣＤユニットに含まれる側鎖であっても、スペーサーアームについて既に記載した説明に基づいて、それぞれの場合に適切な側鎖の長さおよび構造ならびに側鎖の組み合わせを適宜選択することができる。
具体的には、これらの側鎖は、糖鎖ユニットに含まれるかＣＤユニットに含まれるかにかかわらず、スペーサーアームの全部または一部を構成する脂肪族炭化水素に基づく骨格を有する。側鎖は、好ましくは置換または非置換のヘキサン酸単位〔−（ＣＨ２）５−ＣＯ−〕ｎを含む骨格を有し、さらに好ましくはアミノヘキサン酸単位〔−ＮＨ−（ＣＨ２）５−ＣＯ−〕ｎ（式中、ｎは２〜５の整数を表す）を含む骨格を有する。上記式中のｎは、上記（１）のタイプの反応の場合は１〜５、上記（２）または（３）のタイプの反応の場合は２〜５である。また、これらの側鎖は、末端に反応のための官能基を有する。
側鎖に存在する官能基、および／または官能基を有するＣＤの官能基は、エーテル基、チオエーテル基、アミノ基、カルボキシル基、アジド基、ｐ−トルエンスルホニル基、エポキシド基、不飽和基、チオール基、アセトキシ基、フェノキシ基、およびヨウ素、臭素および塩素のハロゲン基からそれぞれ選択される。
上記（１）〜（３）のタイプの反応において使用しうる縮合剤としては、ジシクロヘキシルカルボジイミド（以下「ＤＣＣ」という）や水溶性カルボジイミド（以下「ＷＳＣ」という）等の当業界で公知の縮合剤が挙げられる。当業者は、選択した官能基や反応溶媒の種類に応じて適切な縮合剤を選択することができる。たとえば、上記（１）および上記（３）のタイプの反応において糖鎖ユニットの側鎖の末端の官能基がカルボキシル基であり、ＣＤユニットの側鎖またはＣＤ上の官能基がアミノ基である場合のように、カルボキシル基とアミノ基とを反応させる場合、Ｋｕｎｉｓｈｉｍａら（Ｋｕｎｉｓｈｉｍａ ｅｔ ａｌ．，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ（１９９９）５５，ｐｐ．１３１５９−１３１７０）により開発された新規縮合剤４−（４，６−ジメトキシ−１，３，５−トリアジン−２−イル）−４−メチルモルホリニウムクロリド（以下「ＤＭＴ−ＭＭ」という）を用いることが効率の点で好ましい。ＤＭＴ−ＭＭは、カルボン酸と反応して活性エステルを生成し、その後アミンと反応してアミド結合を生成する。反応はエタノール、メタノール、ｉ−プロパノール、水等の様々な溶媒中で進行し、かつ定量的に反応が進行するという報告があり、注目されている。
上記（１）のタイプの反応は、縮合剤の非存在下で行うこともできる。たとえば、糖鎖の還元末端のグルコースを酸化していったんラクトビオン酸にし、その後環化してラクトン環にしたものを用いることができる。また、糖鎖ユニットとＣＤユニットとの間で、それぞれの側鎖上のチオール基とハロゲン基との間での反応、チオール基と二重結合基との反応なども可能である。
上記（２）のタイプの反応は、縮合剤の非存在下でも、糖鎖を、直接、ＣＤユニットの側鎖に存在する官能基と反応させ、結合させることができる。たとえば、シアル酸のカルボン酸の反応性を利用して、縮合剤の存在下でＣＤユニットの側鎖上の官能基と反応させることができるが、縮合剤の非存在下ではカルボン酸を無水物または酸クロリドにしておけばよい。また、ガラクトサミン、グルコサミンまたはマンノサミンのようなアミノ糖を用いる場合は、これらを、側鎖上に導入したカルボン酸基と反応させることができる。
また、上記（３）のタイプの反応も、縮合剤の非存在下で行うことができる。たとえば、糖鎖ユニットに官能基としてチオール基を導入し、ＣＤにヨウ素のようなハロゲン基を導入して、両者をアルカリ雰囲気中で反応させることができる。
本発明の誘導体の製造は、すべて室温で行うことができる。反応溶媒としては、化合物の溶解性に応じてジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）、水、メタノール、Ｎ−メチルピロリジノン（ＮＭＰ）を使用することができる。側鎖の設計、縮合剤の選択および反応溶媒の選択は、すべて当業者が適宜行うことができる。
たとえば、上記（１）および（３）の場合、反応溶媒としてカルボン酸と等しいモル当量のトリエチルアミンを使用し、縮合剤として５倍モル当量のＤＭＴ−ＭＭを使用することができる。
具体的には、たとえば以下のようにして合成することができる。まず、所望の糖鎖と６−アミノヘキサン酸とを縮合させ、糖鎖とヘキサン酸とがアミド結合した糖鎖ユニットを形成する。一方、ＣＤ（たとえばβ−ＣＤ）の１級水酸基をアミノ基で置換したものを６−アミノヘキサン酸で修飾し、ＣＤを構成するグルコピラノース分子の数と同数の６−アミノヘキサンアミドの分岐を有するＣＤ〔たとえばヘプタキス（６−アミノ）−β−ＣＤ〕を作製する。上記の糖鎖ユニットと分岐ＣＤとを一緒にして縮合反応により結合させ、本発明のＣＤ誘導体を作製する。
合成されたＣＤの構造確認および精製は、当業界で公知の通常の方法によって行うことができる。
標的指向性薬物キャリア
本発明の標的指向性薬物キャリアは、本発明のシクロデキストリン誘導体を含むことを特徴とする。本発明の標的指向性薬物キャリアは、シクロデキストリン誘導体に存在する糖鎖によって、その標的が異なる。標的は、たとえば肝細胞、クッパー細胞、インフルエンザウイルス等である。
標的指向性薬物キャリアは、水、エタノール、エチレングリコール、プロピレングリコール、リン酸塩、ＮａＣｌ等の無機塩類等を含んでいてもよい。
標的指向性薬物
本発明の標的指向性薬物は、本発明のシクロデキストリン誘導体と薬物とを含む。本発明の標的指向性薬物において、薬物は、シクロデキストリン分子に包接されている。
本発明のシクロデキストリン誘導体に包接させるべき薬物としては、抗がん剤、肝疾患治療剤、免疫系に作用する薬剤、抗ウイルス剤等が挙げられるが、これらに限定されない。標的に作用させるべき薬物を適宜選択し、その選択した薬物に適合する空洞径を有するシクロデキストリン誘導体を製造し、使用することができる。
薬物等のゲスト分子を本発明のシクロデキストリン誘導体と包接させる方法は、当業界で公知のいかなる方法であってもよい。たとえば、水溶液中で本発明のシクロデキストリン誘導体（ホスト）とゲスト分子を接触させることによりゲスト分子を包接させ、この溶液を凍結乾燥、噴霧乾燥等の方法によって乾燥させて乾燥物を得ることができる。
このような糖修飾ＣＤの薬物包接体は、使用時に生理食塩水等に溶解して静脈注射することができる。また、他の投与形態、たとえば腸溶性製剤の形態に製剤化することもできる。このような製剤化の方法は公知である。
以下、本発明を実施例により具体的に説明するが、本発明はそれらに限定されるものではない。
以下の合成および生成物確認の実験においては、必要に応じて次の装置を使用した：
レーザーイオン化飛行時間型質量分析装置（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ）：Ｖｏｙａｇｅｒ ＤＥ Ｐｒｏ−Ｔ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ製）
超伝導ＦＴ−ＮＭＲ装置：ＪＮＭ−Ｌａｍｂｄａ５００（日本電子製）
二重収束質量分析装置：ＳＸ１０２Ａ（日本電子製）
分析ＨＰＬＣ：Ｌ−６０００（日立製）、ＵＶ−９７５（日本分光製）
分取ＨＰＬＣ：ＨＬＣ−８０７０（東ソー製）
実施例１．ヘプタキス（６−ガラクトシルグルコノ−アミド−ヘキサン酸アミド−ヘキサン酸アミド−β−ＣＤ〔ヘプタキス（６−Ｇａｌ−ｃａｐ２）−β−ＣＤ〕の合成
以下の手順でヘプタキス（６−Ｇａｌ−ｃａｐ２）−β−ＣＤを合成した。合成スキームの概略を図１に示す。
１） 糖鎖の合成
Ｋｏｂａｙａｓｈｉらの報告（Ｋｏｂａｙａｓｈｉ ｅｔ ａｌ．，Ｐｏｌｙｍ．Ｊ．（１９９８）３０，ｐｐ．６５３−６５８）にしたがってラクトノラクトンを合成した。簡単に説明すると、ラクトースを、ヨウ素のメタノール溶液に加え、これに４５℃で４％ＫＯＨメタノール溶液を滴下して、還元末端を酸化させたカルボン酸カリウム塩を生成させ、冷却して結晶化させた。イオン交換樹脂（アンバーライト Ａｍｂｅｒｌｉｔｅ ＩＲ−１２０Ｂ、ローム・アンド・ハース社製、オルガノ（株）より入手可能）によってカリウムを除去し、エバポレーターを用いてエタノール／メタノールによって脱水、開環させ、ラクトノラクトンを得た。
２） 糖鎖ユニットの作製
このラクトノラクトンを、エバポレーターを用いてエタノール／メタノールによって共沸させたものと、２当量の６−アミノヘキサン酸とを、窒素気流下で６０℃のジメチルホルムアミド（以下「ＤＭＦ」という）中に溶解させ、一夜（約１２時間）反応させた。これをイオン交換樹脂（ＣＭ−Ｓｅｐｈａｄｅｘ、Ｃ２５、ファルマシア製、ＳＩＧＭＡ社より入手可能）に供して未反応の６−アミノヘキサン酸を除去し、ガラクトシルグルコノ−アミド−ヘキサン酸（以下「Ｇａｌ−ｃａｐ１−ＯＨ」ということがある）を得た。
Ｇａｌ−ｃａｐ１−ＯＨはメタノールに溶解するが、一方、原料中のラクトビオン酸（ラクトノラクトンの開環生成物）は溶解しない。このことを利用して、メタノール抽出によって精製を行った。さらに、残存するラクトビオン酸をメタノール−酢酸エチル混合溶媒（１：１．５（ｖ／ｖ））で沈殿させ、溶解物としてＧａｌ−ｃａｐ１−ＯＨを得た。収率は６８％であった。薄層クロマトグラフィ（ＴＬＣ）によるＲｆ値は０．４７（展開溶媒ブタノール：エタノール：水＝５：４：３）であり、ワンスポットであることが確認された。
３） 縮合剤の合成
アミド結合生成反応の縮合剤として使用するために、ＤＭＴ−ＭＭをＫｕｎｉｓｈｉｍａら（１９９９）の方法にしたがって合成した。簡単に説明すると、ビーカーに１．１当量の２−クロロ−２，６−ジメトキシ−１，３，５−トリアジン（以下「ＣＤＭＴ」という）を入れ、ＴＨＦ６０ｍｌを加えて溶解した後、１当量のＮ−メチルモルホリン（以下「ＮＭＭ」という）を加え、室温で３０分撹拌した。生成した白色の沈殿物をろ過し、ＴＨＦで洗浄して生成物を得た。収率は９５％であった。
合成確認として、ＦＡＢ−ＭＳを測定したところ、Ｋｕｎｉｓｈｉｍａら（１９９９）に記載された値と一致したので、目的の化合物が合成されたことがわかった。
４） ヘプタキス（６−アミノ−ヘキサン酸アミド）−β−ＣＤの合成
側鎖を有するＣＤとしてヘプタキス（６−アミノ−ヘキサン酸アミド）−β−ＣＤを合成するため、まずヘプタキス（６−アミノ）−β−ＣＤを合成し、これをヘプタキス（６−Ｂｏｃ−ヘキサン酸アミド）−β−ＣＤとして、最後に脱Ｂｏｃ化して目的の化合物を得た。
最初に、ヘプタキス（６−アミノ）−β−ＣＤを、Ｐｅｔｅｒ Ｒ．Ａｓｈｔｏｎらの報告（Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．（１９９６）６１，ｐｐ．９０３−９０８）に従って合成した。具体的には、ＤＭＦ中に２ｇのヘプタキス（６−アジト）−β−ＣＤおよび６．３６ｇのトリフェニルフォスフィン（以下「ＴＰＰ」という）を入れ、室温にて１時間撹拌した後、２５％のアンモニア水を８．４ｍｌ加え、さらに１８時間撹拌した。
この溶液を、ロータリーエバポレーターによって濃縮し乾固させた。その後、この固形物にエタノールを適量加えて懸濁して洗浄し、洗液はろ過して除去した。ろ物を０．１Ｍの塩酸中に溶解させ、不溶物をろ過して取り除き、ろ液をロータリーエバポレーターで濃縮し、乾燥させた。収率は４２％であった。
合成物は、１３Ｃ−ＮＭＲおよびＴＯＦ−ＭＳによって確認した。１３Ｃ−ＮＭＲにおいては、Ｃ６位の炭素のシグナルがシフトしていることが確認できた。この塩酸塩を希ＮａＯＨ溶液にて中和して、遊離のアミン生成物について分析した。ＴＯＦ−ＭＳにおいては、分子量１１２７に対し、ｍ／ｚ：１１２７［Ｍ］＋にピークを観測できたので、目的の化合物が合成されていることが確認された。
ＤＭＦに上記で作製した１当量のヘプタキス（６−アミノ）−β−ＣＤおよび８当量のＢｏｃヘキサン酸をそれぞれ加え、溶解した後、４０当量の縮合剤ＤＭＴ−ＭＭを加え、室温で２４時間反応させた。反応後、エバポレーターにて濃縮し、水を加え、生成物を沈殿させた。ろ液を除去後、ろ物をメタノールに溶解させ乾固した。ＨＰＬＣで精製し、ヘプタキス（６−Ｂｏｃ−ヘキサン酸アミド）−β−ＣＤを得た。
次に、精製したヘプタキス（６−Ｂｏｃ−ヘキサン酸アミド）−β−ＣＤにＴＦＡを加え、氷冷下で２時間撹拌し、脱Ｂｏｃ化反応を行った。収率４１％であった。
ＴＯＦ−ＭＳを測定したところ、生成物の分子量１９１９に対し、ｍ／ｚ：１９２０［Ｍ＋Ｈ］＋、１９４２［Ｍ＋Ｎａ］＋、１９５８［Ｍ＋Ｋ］＋のみにピークを観測できたので、目的の化合物が合成されていることが確認された。
５） ヘプタキス（６−Ｇａｌ−ｃａｐ２）−β−ＣＤの合成
ＮＭＰ−Ｈ２Ｏ混合溶媒に、上記のように調製した８当量のヘプタキス（６−アミノ−ヘキサン酸アミド）−β−ＣＤ、１当量のＧａｌ−ｃａｐ１−ＯＨ、８当量のトリエチルアミン（以下「ＴＥＡ」という）をそれぞれ加えて溶解した後、４０当量の縮合剤ＤＭＴ−ＭＭを加え、室温で４８時間反応させた。反応後、エバポレーターにて濃縮し、氷冷アセトン中へ滴下し、沈殿させた。その後、ろ過を行い、ろ液を除去後、ろ物を水に溶解させた。
精製は、まずＣＭ−Ｓｅｐｈａｄｅｘ（Ｃ２５、ファルマシア製、ＳＩＧＭＡ社より入手可能）にて未反応のアミノ基を有するＣＤ誘導体を除去後、トヨパールＨＷ−４０Ｆカラム（４．２ｃｍ×４６ｃｍ；東ソー製）を用いたゲルろ過（溶出液は水）を行った。最後に分析ＨＰＬＣにて単離を確認した。収率は３０％であった。
比較例１． ヘプタキス（６−ガラクトシルグルコノ−アミド−ヘキサン酸アミド）−β−ＣＤ〔ヘプタキス（６−Ｇａｌ−ｃａｐ１）−β−ＣＤ〕の合成
ＮＭＰ−Ｈ２Ｏ混合溶媒に、実施例１と同様に調製した１当量のヘプタキス（６−アミノ）−β−ＣＤ、実施例１と同様に調製した８当量のＧａｌ−ｃａｐ１−ＯＨ、８当量のＴＥＡをそれぞれ加えて溶解した後、４０当量の縮合剤ＤＭＴ−ＭＭを加え、室温で４８時間反応させた。反応後、エバポレーターにて濃縮し、氷冷アセトン中へ滴下し、沈殿させた。その後、ろ過を行い、ろ液を除去後、ろ物を水に溶解させた。
精製は、まずＣＭ−Ｓｅｐｈａｄｅｘ（Ｃ２５、ファルマシア製、ＳＩＧＭＡ社より入手可能）にて未反応のアミノ基を有するＣＤ誘導体を除去後、トヨパールＨＷ−４０Ｆカラム（４．２ｃｍ×４６ｃｍ；東ソー製）を用いたゲルろ過（溶出液は水）を行った。最後に分析ＨＰＬＣにて単離を確認した。収率は３１％であった。
試験例１．レクチン認識能の評価
標的タンパク認識能の評価は、標的タンパクとしてピーナツレクチン（ＰＮＡ）を使用し、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）法で行った。ＳＰＲ光学バイオセンサーとして、ＩＡｓｙｓ（Ｔｈｅｒｍｏ製）を使用し、得られたデータは、付属のソフトウェアＦＡＳＴｆｉｔにより解析した。
１） ＰＮＡの固定化
ＰＮＡ（４量体）の固定化は、今多（東京工芸大学大学院、工学研究科、工業化学専攻博士論文（１９９７））および保田（東京工芸大学大学院、工学研究科、工業化学専攻修士論文（１９９９））の報告を参考に行った。
まず、ＳＰＲ光学バイオセンサーキュベット表面上のアミノシラン基にレクチンタンパクのアミノ基と反応させるためのリンカー剤として、ビス（スルホスクシンイミジル）スベレート（ＢＳ３）（１ｍＭ−ＢＳ３／１０ｍＭ−リン酸緩衝溶液（ＰＢＳ）、ｐＨ６．５）を予め反応させた。これを、レスポンスが変化しにくくなるまで複数回繰り返し、無水酢酸−酢酸溶液（混合容積比１：１）を加えることで未反応の活性アミノシラン基を不活性化させ、ブロッキングした。
ブロッキング後、ｐＨ５．３の１０ｍＭ−酢酸緩衝溶液に置換し、その後、２００μＬのＰＮＡ溶液（１ｍｇ ＰＮＡ／１０ｍＭ−酢酸緩衝溶液、ｐＨ５．３）をキュベットに加え、反応させた。次に、１Ｍ−エタノールアミン水溶液、ｐＨ８．５を加え、コハク酸アミドエステル基のブロッキングを不活性化させた。レスポンス（Ｒ）＝６００ａｒｃ ｓｅｃで１ｎｇ／ｍｍ２で、１ｎｍ２あたり１本のアミノシラン基が存在する。ＰＮＡのレスポンスの変化量は約１７６０ｓであったので、固定化率は約１．６％と算出された。
２） 測定
１ｍＭ−ＣａＣｌ２、１ｍＭ−ＭｇＣｌ２、１００ｍＭ−ＮａＣｌを含有する１０ｍＭ−酢酸緩衝溶液、ｐＨ５．３中に、（０．２〜１）×１０−５Ｍの範囲で６点の濃度に変化させた試験対象の各ＣＤを含む溶液１００μＬを、ＰＮＡを固定化したキュベットに入れて、既述の相互作用解析装置（ＳＰＲ光学バイオセンサー）を用いて各ＣＤと固定化ＰＮＡとの相互作用を測定した。測定温度は２５．０℃であり、所要時間はレスポンスが飽和に達するまでの５〜３０分であった。
３） 結果
上記のように測定したＰＮＡに対する本発明のＣＤ誘導体ヘプタキス（６−Ｇａｌ−ｃａｐ２）−β−ＣＤおよび比較例のＣＤ誘導体ヘプタキス（６−Ｇａｌ−ｃａｐ１）−β−ＣＤの会合挙動の解析結果を表１に示す。参考のため、公知文献に記載された他のＣＤ誘導体についての類似の測定値も併せて示す。
ヘキサン酸単位１個分のスペーサーアームを有する比較例のＣＤ誘導体のＫａを１とすると、ヘキサン酸単位２個分のスペーサーアームを有する本発明のＣＤ誘導体のＫａはその約５４倍高い会合能を有しており、本発明の誘導体は、従来のＣＤ誘導体の中で比較的認識能が高いものと比較しても、非常に認識能が高いことが判明した。
試験例２． 薬物の包接能力の測定
薬物として抗生物質であるドキソルビシン（Ｄｏｘｏｒｕｂｉｃｉｎ；「ＤＸＲ」）を用い、試験例１と同様の方法で本発明の誘導体の包接能を調べた。
１） ＤＸＲの固定化
ＤＸＲの光学バイオセンサーキュベット表面への固定化は、薬物を溶解させる緩衝溶液としてｐＨの異なるものを用いたことを除き、上述したレクチンの固定化と同様の操作方法で行った。
キュベット表面のアミノシラン基にＤＸＲのアミノ基と反応させるためのリンカー剤として、１ｍＭ−ＢＳ３／１０ｍＭ−ＰＢＳ、ｐＨ６．５を反応させた。これを、光学バイオセンサーのレスポンスが変化しなくなるまで数回繰り返し、無水酢酸−酢酸溶液（混合容積比１：１）を加えることで未反応のアミノシラン基を不活性化させ、ブロッキングした。
ブロッキング後、ｐＨ５．３の１０ｍＭ−酢酸緩衝溶液に置換し、ＤＸＲ溶液（２ｍｇ ＤＸＲ／１０ｍＭ−酢酸緩衝溶液、ｐＨ５．３）を加え、反応させた。その後、キュベット上のバックグラウンドの影響を考慮し、１Ｍ−エタノールアミン水溶液、ｐＨ８．５でコハク酸アミドエステル基のブロッキングを行った。ＤＸＲのレスポンスの変化量は約５５ ａｒｃ ｓｅｃであったので、Ｒ＝６００ ａｒｃ ｓｅｃのとき１ｎｇ／ｍｍ２で１ｎｍ２あたり１本のアミノシラン基が存在しているものとして、固定化率はアミノシラン基の約９．６％と算出された。
２） 測定
上記で作製したＤＸＲ固定化キュベットを用い、試験例１と同様にしてＤＸＲと各ＣＤとの相互作用を測定した。但し、試験対象のＣＤの濃度は、（０．２〜１）×１０−４Ｍの範囲であった。
３） 結果
上記のように測定したＤＸＲに対する本発明のＣＤ誘導体ヘプタキス（６−Ｇａｌ−ｃａｐ２）−β−ＣＤおよび比較例のＣＤ誘導体ヘプタキス（６−Ｇａｌ−ｃａｐ１）−β−ＣＤの会合挙動の解析結果を表２に示す。参考のため、公知文献に記載された他のＣＤ誘導体についての類似の測定値も併せて示す。
比較例のＣＤ誘導体のＫａと比較して、本発明のＣＤ誘導体の会合能は約１６倍に増大していた。また、その他の公知のＣＤ誘導体は、比較例のＣＤ誘導体よりも劣っているため、本発明のＣＤ誘導体は、従来の合成糖鎖を有するＣＤ誘導体と比べ、非常に優れた薬物包接能を有することが判明した。
表２に掲載したＭ６ＣＤおよびＭ７ＣＤについてのデータは、薬物としてＣＤに包接され易いコール酸を用いて得られたものであり、また、Ｍ６ＣＤおよびＭ７ＣＤにはＦｍｏｃ基が存在するために疎水場が形成され易いという点で、本発明のＣＤ誘導体等とは測定条件が異なっている。これらの相違点を考慮すると、Ｍ６ＣＤおよびＭ７ＣＤの薬物（ＤＸＲ）包接能は、これらのデータの１０分の１程度と見積もられる。その結果、本発明のＣＤ誘導体は、薬物包接能においても、これらの天然糖鎖を有するＣＤと同等と解釈される。
試験例３． 二次元マップによる各種糖鎖分岐ＣＤの二重認識の評価
公知のシクロデキストリン誘導体および本発明の化合物の薬物包接能およびレクチン結合能を評価するために、表１および表２に示した値をもとにして、ｘ軸を薬物との包接会合定数Ｋａの対数とし、ｙ軸をレクチンとの糖鎖認識会合定数Ｋａの対数として、β−ＣＤ、公知のいくつかの糖鎖修飾β−ＣＤ、および本発明のＣＤ誘導体をプロットした二次元マップを作成した（図２Ｇ）。
未修飾のβ−ＣＤ（「ｆ」）は、薬物に対するｌｏｇ Ｋａは３程度であるが、糖を有さないためレクチンに対しては０である。従来公知のガラクトース鎖を有するＣＤ（「ａ」〜「ｃ」；図２Ｂ〜Ｄ）は、薬物に対するｌｏｇ Ｋａが３〜５程度、レクチンに対するｌｏｇ Ｋａが４〜６程度の領域にプロットされている。マップ上の一番右上に存在するＭ６ＣＤ（「ｄ」；図２Ｅ）およびＭ７ＣＤ（「ｅ」；図２Ｆ）は、それぞれマンノース６残基および７残基とＮ−アセチル−Ｄ−グルコサミン２残基とからなる天然糖鎖を有しており、従来調べられた中では、レクチンおよび薬物に対し最高の会合能を有している。
実施例１で合成したヘプタキス（６−Ｇａｌ−ｃａｐ２）−β−ＣＤ（「Ｉ」；図２Ａ）は、レクチンに対する会合能はＭ６ＣＤおよびＭ７ＣＤと同程度であり、薬物に対する会合能も同程度と解釈される。したがって、本発明によれば、合成によって天然糖鎖を有するＣＤに匹敵する非常に高いタンパク認識能および薬物包接能を有するＣＤ誘導体が得られる。
この出願は、平成１５年３月２７日出願の日本特許出願、特願２００３−８７１９２に基づくものであり、特願２００３−８７１９２の明細書および特許請求の範囲に記載された内容は、すべてこの出願明細書に包含される。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
糖鎖とスペーサーアームとからなる分岐を有するシクロデキストリン誘導体であって、
ａ） 糖鎖が、スペーサーアームの末端に位置し、ガラクトース、グルコース、マンノースおよびシアル酸から選択される１個以上の糖を含み、
ｂ） スペーサーアームが、糖鎖およびシクロデキストリンの間に位置し、少なくとも２個の置換または非置換のヘキサン酸単位を含む骨格を有し、
ｃ） 分岐が、シクロデキストリンの環を構成するグルコース１分子あたり１個存在すること
を特徴とするシクロデキストリン誘導体。
【請求項２】
スペーサーアームが、２〜５個のアミノヘキサン酸単位を含む骨格を有する、請求項１記載のシクロデキストリン誘導体。
【請求項３】
スペーサーアームが、グルコノ−〔ＮＨ（ＣＨ２）５ＣＯ〕ｎ−ＮＨ−または（ＣＨ２）３−Ｓ−（ＣＨ２）２−ＣＯ〔ＮＨ（ＣＨ２）５ＣＯ〕ｎ−ＮＨ−（式中、ｎは２〜５の整数を表す）で示される基である、請求項２記載のシクロデキストリン誘導体。
【請求項４】
糖鎖が、ガラクトシル基、グルコシル基、マンノシル基またはシアル酸基である、請求項１〜３のいずれか１項記載のシクロデキストリン誘導体。
【請求項５】
ヘキサキス（６−ガラクトシルグルコノ−アミド−（ヘキサン酸アミド）ｎ）−α−シクロデキストリン、ヘプタキス（６−ガラクトシルグルコノ−アミド−（ヘキサン酸アミド）ｎ）−β−シクロデキストリン、オクタキス（６−ガラクトシルグルコノ−アミド−（ヘキサン酸アミド）ｎ）−γ−シクロデキストリン（ここで、ｎは２〜５の整数を表す。以下も同じ）；
ヘキサキス（６−グルコシルグルコノ−アミド−（ヘキサン酸アミド）ｎ）−α−シクロデキストリン、ヘプタキス（６−グルコシルグルコノ−アミド−（ヘキサン酸アミド）ｎ）−β−シクロデキストリン、オクタキス（６−グルコシルグルコノ−アミド−（ヘキサン酸アミド）ｎ）−γ−シクロデキストリン；
ヘキサキス（６−マンノシルプロピルチオエチル−アミド−（ヘキサン酸アミド）ｎ）−α−シクロデキストリン、ヘプタキス（６−マンノシルプロピルチオエチル−アミド−（ヘキサン酸アミド）ｎ）−β−シクロデキストリン、オクタキス（６−マンノシルプロピルチオエチル−アミド−（ヘキサン酸アミド）ｎ）−γ−シクロデキストリン；
ヘキサキス（６−シアル酸プロピルチオエチル−アミド−（ヘキサン酸アミド）ｎ）−α−シクロデキストリン、ヘプタキス（６−シアル酸プロピルチオエチル−アミド−（ヘキサン酸アミド）ｎ）−β−シクロデキストリン、およびオクタキス（６−シアル酸プロピルチオエチル−アミド−（ヘキサン酸アミド）ｎ）−γ−シクロデキストリン
のいずれかである、請求項４記載のシクロデキストリン誘導体。
【請求項６】
請求項１〜５のいずれか１項記載のシクロデキストリンの製造方法であって、ガラクトース、グルコース、マンノースおよびシアル酸から選択される１個以上の糖を含む糖鎖またはこの糖鎖と官能基を有する側鎖とを含む糖鎖ユニットと、官能基を有する側鎖とシクロデキストリンとを含むシクロデキストリンユニットまたは官能基を有するシクロデキストリンとを、縮合剤の存在下または非存在下で反応させることを特徴とする方法。
【請求項７】
糖鎖ユニットと、シクロデキストリンユニットとを、縮合剤の存在下または非存在下で反応させる、請求項６記載の方法。
【請求項８】
糖鎖と、シクロデキストリンユニットとを、縮合剤の存在下または非存在下で反応させる、請求項６記載の方法。
【請求項９】
糖鎖ユニットと、官能基を有するシクロデキストリンとを、縮合剤の存在下または非存在下で反応させる、請求項６記載の方法。
【請求項１０】
側鎖および／またはシクロデキストリンの前記官能基が、エーテル基、チオエーテル基、アミノ基、カルボキシル基、アジド基、ｐ−トルエンスルホニル基、エポキシド基、不飽和基、チオール基、およびヨウ素、臭素および塩素のハロゲン基から選択される、請求項６〜９のいずれか１項記載の方法。
【請求項１１】
糖鎖ユニットの官能基を有する側鎖および／またはシクロデキストリンユニットの官能基を有する側鎖が、置換または非置換のヘキサン酸単位を含む骨格を有する、請求項６〜１０のいずれか１項記載の方法。
【請求項１２】
糖鎖ユニットの官能基を有する側鎖および／またはシクロデキストリンユニットの官能基を有する側鎖が、１〜５個のアミノヘキサン酸単位を含む骨格を有する、請求項６〜１１のいずれか１項記載の方法。
【請求項１３】
請求項１〜５のいずれか１項記載のシクロデキストリン誘導体を含む標的指向性薬物キャリア。
【請求項１４】
請求項１〜５のいずれか１項記載のシクロデキストリン誘導体と、薬物とを含む標的指向性薬物。
【請求項１】
糖鎖とスペーサーアームとからなる分岐を有するシクロデキストリン誘導体であって、
ａ） 糖鎖が、スペーサーアームの末端に位置し、ガラクトース、グルコース、マンノースおよびシアル酸から選択される１個以上の糖を含み、
ｂ） スペーサーアームが、糖鎖およびシクロデキストリンの間に位置し、少なくとも２個の置換または非置換のヘキサン酸単位を含む骨格を有し、
ｃ） 分岐が、シクロデキストリンの環を構成するグルコース１分子あたり１個存在すること
を特徴とするシクロデキストリン誘導体。
【請求項２】
スペーサーアームが、２〜５個のアミノヘキサン酸単位を含む骨格を有する、請求項１記載のシクロデキストリン誘導体。
【請求項３】
スペーサーアームが、グルコノ−〔ＮＨ（ＣＨ２）５ＣＯ〕ｎ−ＮＨ−または（ＣＨ２）３−Ｓ−（ＣＨ２）２−ＣＯ〔ＮＨ（ＣＨ２）５ＣＯ〕ｎ−ＮＨ−（式中、ｎは２〜５の整数を表す）で示される基である、請求項２記載のシクロデキストリン誘導体。
【請求項４】
糖鎖が、ガラクトシル基、グルコシル基、マンノシル基またはシアル酸基である、請求項１〜３のいずれか１項記載のシクロデキストリン誘導体。
【請求項５】
ヘキサキス（６−ガラクトシルグルコノ−アミド−（ヘキサン酸アミド）ｎ）−α−シクロデキストリン、ヘプタキス（６−ガラクトシルグルコノ−アミド−（ヘキサン酸アミド）ｎ）−β−シクロデキストリン、オクタキス（６−ガラクトシルグルコノ−アミド−（ヘキサン酸アミド）ｎ）−γ−シクロデキストリン（ここで、ｎは２〜５の整数を表す。以下も同じ）；
ヘキサキス（６−グルコシルグルコノ−アミド−（ヘキサン酸アミド）ｎ）−α−シクロデキストリン、ヘプタキス（６−グルコシルグルコノ−アミド−（ヘキサン酸アミド）ｎ）−β−シクロデキストリン、オクタキス（６−グルコシルグルコノ−アミド−（ヘキサン酸アミド）ｎ）−γ−シクロデキストリン；
ヘキサキス（６−マンノシルプロピルチオエチル−アミド−（ヘキサン酸アミド）ｎ）−α−シクロデキストリン、ヘプタキス（６−マンノシルプロピルチオエチル−アミド−（ヘキサン酸アミド）ｎ）−β−シクロデキストリン、オクタキス（６−マンノシルプロピルチオエチル−アミド−（ヘキサン酸アミド）ｎ）−γ−シクロデキストリン；
ヘキサキス（６−シアル酸プロピルチオエチル−アミド−（ヘキサン酸アミド）ｎ）−α−シクロデキストリン、ヘプタキス（６−シアル酸プロピルチオエチル−アミド−（ヘキサン酸アミド）ｎ）−β−シクロデキストリン、およびオクタキス（６−シアル酸プロピルチオエチル−アミド−（ヘキサン酸アミド）ｎ）−γ−シクロデキストリン
のいずれかである、請求項４記載のシクロデキストリン誘導体。
【請求項６】
請求項１〜５のいずれか１項記載のシクロデキストリンの製造方法であって、ガラクトース、グルコース、マンノースおよびシアル酸から選択される１個以上の糖を含む糖鎖またはこの糖鎖と官能基を有する側鎖とを含む糖鎖ユニットと、官能基を有する側鎖とシクロデキストリンとを含むシクロデキストリンユニットまたは官能基を有するシクロデキストリンとを、縮合剤の存在下または非存在下で反応させることを特徴とする方法。
【請求項７】
糖鎖ユニットと、シクロデキストリンユニットとを、縮合剤の存在下または非存在下で反応させる、請求項６記載の方法。
【請求項８】
糖鎖と、シクロデキストリンユニットとを、縮合剤の存在下または非存在下で反応させる、請求項６記載の方法。
【請求項９】
糖鎖ユニットと、官能基を有するシクロデキストリンとを、縮合剤の存在下または非存在下で反応させる、請求項６記載の方法。
【請求項１０】
側鎖および／またはシクロデキストリンの前記官能基が、エーテル基、チオエーテル基、アミノ基、カルボキシル基、アジド基、ｐ−トルエンスルホニル基、エポキシド基、不飽和基、チオール基、およびヨウ素、臭素および塩素のハロゲン基から選択される、請求項６〜９のいずれか１項記載の方法。
【請求項１１】
糖鎖ユニットの官能基を有する側鎖および／またはシクロデキストリンユニットの官能基を有する側鎖が、置換または非置換のヘキサン酸単位を含む骨格を有する、請求項６〜１０のいずれか１項記載の方法。
【請求項１２】
糖鎖ユニットの官能基を有する側鎖および／またはシクロデキストリンユニットの官能基を有する側鎖が、１〜５個のアミノヘキサン酸単位を含む骨格を有する、請求項６〜１１のいずれか１項記載の方法。
【請求項１３】
請求項１〜５のいずれか１項記載のシクロデキストリン誘導体を含む標的指向性薬物キャリア。
【請求項１４】
請求項１〜５のいずれか１項記載のシクロデキストリン誘導体と、薬物とを含む標的指向性薬物。
【国際公開番号】ＷＯ２００４／０８５４８７
【国際公開日】平成１６年１０月７日（２００４．１０．７）
【発行日】平成１８年６月２９日（２００６．６．２９）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００５−５０４０１８（Ｐ２００５−５０４０１８）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＪＰ２００４／００３６７０
【国際出願日】平成１６年３月１８日（２００４．３．１８）
【出願人】（８０１００００３８）よこはまティーエルオー株式会社 (31)
【Ｆターム（参考）】
【国際公開日】平成１６年１０月７日（２００４．１０．７）
【発行日】平成１８年６月２９日（２００６．６．２９）
【国際特許分類】
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＪＰ２００４／００３６７０
【国際出願日】平成１６年３月１８日（２００４．３．１８）
【出願人】（８０１００００３８）よこはまティーエルオー株式会社 (31)
【Ｆターム（参考）】
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