新規連鎖球菌抗原
【課題】
治療および／または予防用ワクチン成分として有用な肺炎連鎖球菌病原の新規タンパク質抗原を提供すること。
【解決手段】
配列番号２、４、６、８、１０、１４、１６、５５〜７５、７７〜７９、８１、８３またはそのフラグメント、類似体または誘導体から選択される配列を有する第二のポリペプチドに少なくとも７０％または少なくとも９５％の同一性を有するポリペプチドをエンコードする単離体ポリヌクレオチドを提供することにより、上記課題を解決する。
治療および／または予防用ワクチン成分として有用な肺炎連鎖球菌病原の新規タンパク質抗原を提供すること。
【解決手段】
配列番号２、４、６、８、１０、１４、１６、５５〜７５、７７〜７９、８１、８３またはそのフラグメント、類似体または誘導体から選択される配列を有する第二のポリペプチドに少なくとも７０％または少なくとも９５％の同一性を有するポリペプチドをエンコードする単離体ポリヌクレオチドを提供することにより、上記課題を解決する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は抗原に関し、より詳しくは、治療および／または予防用ワクチン成分として有用な肺炎連鎖球菌（Streptococcus pneumoniae）病原のタンパク質抗原に関する。
【背景技術】
【０００２】
肺炎連鎖球菌（S. pneumoniae）はヒト、取分け乳児、初老の免疫無防備状態者における疾患の重要な作因である。肺炎連鎖球菌は菌血症／敗血症、肺炎、髄膜炎などの浸襲性疾患患者から多くの場合単離されるバクテリアであり、世界中で高い罹患率と死亡率を有している。適切な抗生物質療法をもってしてさえ、肺炎球菌感染症は今なお多くの死を招いている。抗菌剤類の出現が全体として肺炎球菌疾患の死亡率を低下させはしたが、耐性肺炎球菌体の存在が今日世界の主要な問題となっている。有効な肺炎球菌ワクチンは肺炎連鎖球菌（S. pneumoniae）と関連する罹患率と死亡率に大きな衝撃を与えることができるに違いない。かかるワクチンはまた乳児と幼児の中耳炎の予防に有用となる可能性がある。
【０００３】
肺炎球菌ワクチン開発の努力は主に肺炎球菌の莢膜多糖に免疫応答を生じさせることに集中している。８０種を超える肺炎球菌莢膜血清型が抗原性の差に基づき同定されている。現在入手可能な肺炎球菌ワクチンは、最も頻繁に疾患の原因となる２３種の莢膜多糖を含んでなるが、ある種莢膜多糖の免疫原性が弱いこと、血清型が多様であること、および経時的に、地理的に、また年齢群により血清型の分布に差のあることなどと主として関連する重要な欠点がある。特に、既存のワクチンと現在開発中の莢膜接合ワクチンはすべての血清型に対し幼児を守りきれないということが、他の肺炎連鎖球菌（S. pneumoniae）成分の評価に駆り立てている。莢膜多糖の免疫原性を改善することはできるが、血清型の特異性がなお多糖をベースとするワクチンの主たる限界となっている。抗原性を保持した免疫原性肺炎球菌タンパク質抗原をそれ自体または他の成分と組合わせて使用することが、タンパク質をベースとする肺炎球菌ワクチンの可能性を提供する。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
発明の名称“肺炎連鎖球菌抗原およびワクチン（Streptococcus pneumoniae antigen and vaccines）”として１９９８年５月７日に公開されたＰＣＴ公開番号ＷＯ９８／１８９３０はある種のポリペプチドを記載し、抗原として請求している。しかし、これらのポリペプチドの生物活性については何ら報告がない。
【０００５】
従って、連鎖球菌感染症の予防および／治療用ワクチン成分として使用し得る連鎖球菌抗原について不適切な面についてはなお必要性が残されている。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
一側面によると、本発明は配列番号２、４、６、８、１０、１４、１６、５５〜７５、７７〜７９、８１、８３またはそのフラグメント、類似体または誘導体から選択される配列を含んでなる第二のポリペプチドに少なくとも７０％の同一性を有するポリペプチドをエンコードする単離体ポリヌクレオチドを提供する。
【０００７】
他の側面によると、発現制御領域に操作可能に結合した本発明ポリヌクレオチドを含んでなるベクター、並びに当該ベクターを移入した宿主細胞および当該宿主細胞を発現に適した条件下に培養することを含んでなるポリペプチドの製造法が提供される。
さらに他の側面においては、本発明のポリヌクレオチドがエンコードする新規のポリペプチドが提供される。
【図面の簡単な説明】
【０００８】
【図１】図１はＢＶＨ−３遺伝子のＤＮＡ配列である；配列番号１。
【図２】図２はＢＶＨ−３タンパク質のアミノ酸配列である；配列番号２。
【図３】図３はＢＶＨ−１１遺伝子のＤＮＡ配列である；配列番号３。
【図４】図４はＢＶＨ−１１タンパク質のアミノ酸配列である；配列番号４。
【図５】図５はＢＶＨ−２８遺伝子のＤＮＡ配列である；配列番号５。
【図６】図６はＢＶＨ−２８タンパク質のアミノ酸配列である；配列番号６。
【図７】図７はＢＶＨ−３Ａ遺伝子のＤＮＡ配列であり、ＢＶＨ−３の５’末端に相当する；配列番号７。
【図８】図８はＢＶＨ−３Ａタンパク質のアミノ酸配列である；配列番号８。
【図９】図９はＢＶＨ−３Ｂ遺伝子のＤＮＡ配列であり、ＢＶＨ−３の３’末端に相当する；配列番号９。
【図１０】図１０はＢＶＨ−３Ｂタンパク質のアミノ酸配列である；配列番号１０。
【図１１−１】図１１−１はマックベクター（MacVector）配列分析ソフトウエア（バージョン６.５）からのプログラム・クラスタル（Clustal）Ｗを使用して、ＷＵ２、ＲＸ１、ＪＮＲ.７／８７、ＳＰ６４、Ｐ４２４１およびＡ６６肺炎連鎖球菌（S. pneumoniae）株から予測されるＢＶＨ−３オープンリーディングフレームのアミノ酸配列を比較描出したものである。整列させた配列の下に共通列があるが、記号＊および・はそれぞれアミノ酸残基が同一または類似であることを示す。
【図１１−２】図１１−２はマックベクター（MacVector）配列分析ソフトウエア（バージョン６.５）からのプログラム・クラスタル（Clustal）Ｗを使用して、ＷＵ２、ＲＸ１、ＪＮＲ.７／８７、ＳＰ６４、Ｐ４２４１およびＡ６６肺炎連鎖球菌（S. pneumoniae）株から予測されるＢＶＨ−３オープンリーディングフレームのアミノ酸配列を比較描出したものである。整列させた配列の下に共通列があるが、記号＊および・はそれぞれアミノ酸残基が同一または類似であることを示す。
【図１２−１】図１２−１はマックベクター（MacVector）配列分析ソフトウエア（バージョン６.５）からのプログラム・クラスタル（Clustal）Ｗを使用して、ＷＵ２、ＲＸ１、ＪＮＲ.７／８７、ＳＰ６４、Ｐ４２４１、Ａ６６およびＳＰ６３肺炎連鎖球菌（S. pneumoniae）株から予測されるＢＶＨ−１１オープンリーディングフレームのアミノ酸配列を比較描出したものである。整列させた配列の下に共通列があるが、記号＊および・はそれぞれアミノ酸残基が同一または類似であることを示す。
【図１２−２】図１２−２はマックベクター（MacVector）配列分析ソフトウエア（バージョン６.５）からのプログラム・クラスタル（Clustal）Ｗを使用して、ＷＵ２、ＲＸ１、ＪＮＲ.７／８７、ＳＰ６４、Ｐ４２４１、Ａ６６およびＳＰ６３肺炎連鎖球菌（S. pneumoniae）株から予測されるＢＶＨ−１１オープンリーディングフレームのアミノ酸配列を比較描出したものである。整列させた配列の下に共通列があるが、記号＊および・はそれぞれアミノ酸残基が同一または類似であることを示す。
【図１２−３】図１２−３はマックベクター（MacVector）配列分析ソフトウエア（バージョン６.５）からのプログラム・クラスタル（Clustal）Ｗを使用して、ＷＵ２、ＲＸ１、ＪＮＲ.７／８７、ＳＰ６４、Ｐ４２４１、Ａ６６およびＳＰ６３肺炎連鎖球菌（S. pneumoniae）株から予測されるＢＶＨ−１１オープンリーディングフレームのアミノ酸配列を比較描出したものである。整列させた配列の下に共通列があるが、記号＊および・はそれぞれアミノ酸残基が同一または類似であることを示す。
【図１２−４】図１２−４はマックベクター（MacVector）配列分析ソフトウエア（バージョン６.５）からのプログラム・クラスタル（Clustal）Ｗを使用して、ＷＵ２、ＲＸ１、ＪＮＲ.７／８７、ＳＰ６４、Ｐ４２４１、Ａ６６およびＳＰ６３肺炎連鎖球菌（S. pneumoniae）株から予測されるＢＶＨ−１１オープンリーディングフレームのアミノ酸配列を比較描出したものである。整列させた配列の下に共通列があるが、記号＊および・はそれぞれアミノ酸残基が同一または類似であることを示す。
【図１３】図１３は種々の肺炎連鎖球菌（S. pneumoniae）株から予測されるＢＶＨ−１１タンパク質のアミノ酸配列を比較描出したものである。同一性（Ｉ）および類似性（Ｓ）の度合いはマックベクター（MacVector）配列分析ソフトウエア（バージョン６.５）からのプログラム・クラスタル（Clustal）Ｗを使用して決定した。
【図１４−１】図１４−１は完全ＢＶＨ−３遺伝子を含むＤＮＡ配列である（ヌクレオチド１７７７〜４８９６にオープンリーディングフレーム“ＯＲＦ”）；配列番号１１。
【図１４−２】図１４−２は完全ＢＶＨ−３遺伝子を含むＤＮＡ配列である（ヌクレオチド１７７７〜４８９６にオープンリーディングフレーム“ＯＲＦ”）；配列番号１１。
【図１５】図１５は完全ＢＶＨ−１１遺伝子を含むＤＮＡ配列である（ヌクレオチド４５〜２５６７にＯＲＦ）；配列番号１２。
【図１６】図１６は完全ＢＶＨ−１１−２遺伝子を含むＤＮＡ配列である（ヌクレオチド１１４〜２６３０にＯＲＦ）；配列番号１３。
【図１７】図１７はＢＶＨ−１１−２タンパク質のアミノ酸配列である；配列番号１４。
【図１８】図１８はＳＰ６３ ＢＶＨ−３遺伝子のＤＮＡ配列である；配列番号１５。
【図１９】図１９はＳＰ６３ ＢＶＨ−３タンパク質のアミノ酸配列である；配列番号１６。
【図２０】図２０はＢＶＨ−３Ｍタンパク質のアミノ酸配列である；配列番号５５。
【図２１】図２１はＢＶＨ−３ＡＤタンパク質のアミノ酸配列である；配列番号５６。
【図２２】図２２はＬ−ＢＶＨ−３−ＡＤタンパク質のアミノ酸配列である；配列番号５７。
【図２３】図２３はＮＥＷ１２タンパク質のアミノ酸配列である；配列番号５８。
【図２４】図２４はＢＶＨ−３Ｃタンパク質のアミノ酸配列である；配列番号５９。
【図２５】図２５はＢＶＨ−１１Ｍタンパク質のアミノ酸配列である；配列番号６０。
【図２６】図２６はＢＶＨ−１１Ａタンパク質のアミノ酸配列である；配列番号６１。
【図２７】図２７はＢＶＨ−１１Ｂ（Ｎｅｗ１３とも呼称）タンパク質のアミノ酸配列である；配列番号６２。
【図２８】図２８はＢＶＨ−１１Ｃタンパク質のアミノ酸配列である；配列番号６３。
【図２９】図２９はＮＥＷ１タンパク質のアミノ酸配列である；配列番号６４。
【図３０】図３０はＮＥＷ２タンパク質のアミノ酸配列である；配列番号６５。
【図３１】図３１はＮＥＷ３タンパク質のアミノ酸配列である；配列番号６６。
【図３２】図３２はＮＥＷ４タンパク質のアミノ酸配列である；配列番号６７。
【図３３】図３３はＮＥＷ５タンパク質のアミノ酸配列である；配列番号６８。
【図３４】図３４はＮＥＷ６タンパク質のアミノ酸配列である；配列番号６９。
【図３５】図３５はＮＥＷ７タンパク質のアミノ酸配列である；配列番号７０。
【図３６】図３６はＮＥＷ８タンパク質のアミノ酸配列である；配列番号７１。
【図３７】図３７はＮＥＷ９タンパク質のアミノ酸配列である；配列番号７２。
【図３８】図３８はＢＶＨ−１１−２Ｍタンパク質のアミノ酸配列である；配列番号７３。
【図３９】図３９はＮＥＷ１０タンパク質のアミノ酸配列である；配列番号７４。
【図４０】図４０はＮＥＷ１１タンパク質のアミノ酸配列である；配列番号７５。
【図４１】図４１はＮＥＷ２１遺伝子のＤＮＡ配列である；配列番号７６。
【図４２】図４２はＮＥＷ１４タンパク質のアミノ酸配列である；配列番号７７。
【図４３】図４３はＮＥＷ１５タンパク質のアミノ酸配列である；配列番号７８。
【図４４】図４４はＮＥＷ１６タンパク質のアミノ酸配列である；配列番号７９。
【図４５】図４５はＧＢＳ ＢＶＨ−７１遺伝子のＤＮＡ配列である；配列番号８０。
【図４６】図４６はＧＢＳ ＢＶＨ−７１タンパク質のアミノ酸配列である；配列番号８１。
【図４７】図４７はＧＡＳ ＢＶＨ−７１遺伝子のＤＮＡ配列である；配列番号８２。
【図４８】図４８はＧＡＳ ＢＶＨ−７１タンパク質のアミノ酸配列である；配列番号８３。
【発明を実施するための形態】
【０００９】
一側面によると、本発明は配列番号２、４、６、８、１０、１４、１６、５５〜７５、７７〜７９、８１、８３またはそのフラグメント、類似体または誘導体から選択される配列を含んでなる第二のポリペプチドに少なくとも７０％の同一性を有するポリペプチドをエンコードする単離体ポリヌクレオチドを提供する。
【００１０】
一側面によると、本発明は配列番号２、４、６、８、１０、１４、１６、５５〜７５、７７〜７９、８１、８３またはそのフラグメント、類似体または誘導体から選択される配列を含んでなる第二のポリペプチドに少なくとも９５％の同一性を有するポリペプチドをエンコードする単離体ポリヌクレオチドを提供する。
【００１１】
一側面によると、本発明は配列番号２、４、８、１０、１４、１６、５５〜７５、７７〜７９、８１、８３またはそのフラグメント、類似体または誘導体から選択される配列を含んでなる第二のポリペプチドに少なくとも７０％の同一性を有するポリペプチドをエンコードする単離体ポリヌクレオチドを提供する。
【００１２】
一側面によると、本発明は配列番号２、４、１０、１４、１６、５５〜７５、７７〜７９、８１、８３またはそのフラグメント、類似体または誘導体から選択される配列を含んでなる第二のポリペプチドに少なくとも７０％の同一性を有するポリペプチドをエンコードする単離体ポリヌクレオチドを提供する。
【００１３】
一側面によると、本発明は配列番号２、４、８、１０、１４、１６、５５〜７５、７７〜７９またはそのフラグメント、類似体または誘導体から選択される配列を含んでなる第二のポリペプチドに少なくとも７０％の同一性を有するポリペプチドをエンコードする単離体ポリヌクレオチドを提供する。
【００１４】
一側面によると、本発明は配列番号２、８、１０、１６、５５、５６、５７、５８、５９、６４、６５、６６、７８またはそのフラグメント、類似体または誘導体から選択される配列を含んでなる第二のポリペプチドに少なくとも７０％の同一性を有するポリペプチドをエンコードする単離体ポリヌクレオチドを提供する。
【００１５】
一側面によると、本発明は配列番号２、８、１０、１６、５５、５６、５７、５９、６４、６５、６６、７８またはそのフラグメント、類似体または誘導体から選択される配列を含んでなる第二のポリペプチドに少なくとも７０％の同一性を有するポリペプチドをエンコードする単離体ポリヌクレオチドを提供する。
【００１６】
一側面によると、本発明は配列番号４、１４、５８、６０、６１、６２、６３、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７７、７９またはそのフラグメント、類似体または誘導体から選択される配列を含んでなる第二のポリペプチドに少なくとも７０％の同一性を有するポリペプチドをエンコードする単離体ポリヌクレオチドを提供する。
【００１７】
一側面によると、本発明は配列番号４、１４、６０、６１、６２、６３、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７７、７９またはそのフラグメント、類似体または誘導体から選択される配列を含んでなる第二のポリペプチドに少なくとも７０％の同一性を有するポリペプチドをエンコードする単離体ポリヌクレオチドを提供する。
【００１８】
一側面によると、本発明は配列番号２、４、１０、１４、１６、５５〜７５、７７〜７９またはそのフラグメント、類似体または誘導体から選択される配列を含んでなる第二のポリペプチドに少なくとも７０％の同一性を有するポリペプチドをエンコードする単離体ポリヌクレオチドを提供する。
【００１９】
一側面によると、本発明は配列番号１０、５５〜７５、７７、７８、７９またはそのフラグメント、類似体または誘導体から選択される配列を含んでなる第二のポリペプチドに少なくとも７０％の同一性を有するポリペプチドをエンコードする単離体ポリヌクレオチドを提供する。
【００２０】
一側面によると、本発明は配列番号５５〜７５、７７、７８、７９またはそのフラグメント、類似体または誘導体から選択される配列を含んでなる第二のポリペプチドに少なくとも７０％の同一性を有するポリペプチドをエンコードする単離体ポリヌクレオチドを提供する。
【００２１】
一側面によると、本発明は配列番号２、４、６、８、１０またはそのフラグメント、類似体または誘導体から選択される配列を含んでなる第二のポリペプチドに少なくとも７０％の同一性を有するポリペプチドをエンコードする単離体ポリヌクレオチドを提供する。
【００２２】
一側面によると、本発明は配列番号２、４、１０、１４、１６またはそのフラグメント、類似体または誘導体から選択される配列を含んでなる第二のポリペプチドに少なくとも７０％の同一性を有するポリペプチドをエンコードする単離体ポリヌクレオチドを提供する。
【００２３】
一側面によると、本発明は配列番号２、４、１４、１６またはそのフラグメント、類似体または誘導体から選択される配列を含んでなる第二のポリペプチドに少なくとも７０％の同一性を有するポリペプチドをエンコードする単離体ポリヌクレオチドを提供する。
【００２４】
一側面によると、本発明は配列番号２の配列またはそのフラグメント、類似体または誘導体を含んでなる第二のポリペプチドに少なくとも７０％の同一性を有するポリペプチドをエンコードする単離体ポリヌクレオチドを提供する。
【００２５】
一側面によると、本発明は配列番号４の配列またはそのフラグメント、類似体または誘導体を含んでなる第二のポリペプチドに少なくとも７０％の同一性を有するポリペプチドをエンコードする単離体ポリヌクレオチドを提供する。
【００２６】
一側面によると、本発明は配列番号１０の配列またはそのフラグメント、類似体または誘導体を含んでなる第二のポリペプチドに少なくとも７０％の同一性を有するポリペプチドをエンコードする単離体ポリヌクレオチドを提供する。
【００２７】
一側面によると、本発明は配列番号１４の配列またはそのフラグメント、類似体または誘導体を含んでなる第二のポリペプチドに少なくとも７０％の同一性を有するポリペプチドをエンコードする単離体ポリヌクレオチドを提供する。
【００２８】
一側面によると、本発明は配列番号１６の配列またはそのフラグメント、類似体または誘導体を含んでなる第二のポリペプチドに少なくとも７０％の同一性を有するポリペプチドをエンコードする単離体ポリヌクレオチドを提供する。
【００２９】
一側面によると、本発明は配列番号５８の配列またはそのフラグメント、類似体または誘導体を含んでなる第二のポリペプチドに少なくとも７０％の同一性を有するポリペプチドをエンコードする単離体ポリヌクレオチドを提供する。
【００３０】
一側面によると、本発明は配列番号６０の配列またはそのフラグメント、類似体または誘導体を含んでなる第二のポリペプチドに少なくとも７０％の同一性を有するポリペプチドをエンコードする単離体ポリヌクレオチドを提供する。
【００３１】
一側面によると、本発明は配列番号６２の配列またはそのフラグメント、類似体または誘導体を含んでなる第二のポリペプチドに少なくとも７０％の同一性を有するポリペプチドをエンコードする単離体ポリヌクレオチドを提供する。
【００３２】
一側面によると、本発明は配列番号６４の配列またはそのフラグメント、類似体または誘導体を含んでなる第二のポリペプチドに少なくとも７０％の同一性を有するポリペプチドをエンコードする単離体ポリヌクレオチドを提供する。
【００３３】
一側面によると、本発明は配列番号６７の配列またはそのフラグメント、類似体または誘導体を含んでなる第二のポリペプチドに少なくとも７０％の同一性を有するポリペプチドをエンコードする単離体ポリヌクレオチドを提供する。
【００３４】
一側面によると、本発明は配列番号６８の配列またはそのフラグメント、類似体または誘導体を含んでなる第二のポリペプチドに少なくとも７０％の同一性を有するポリペプチドをエンコードする単離体ポリヌクレオチドを提供する。
【００３５】
一側面によると、本発明は配列番号６９の配列またはそのフラグメント、類似体または誘導体を含んでなる第二のポリペプチドに少なくとも７０％の同一性を有するポリペプチドをエンコードする単離体ポリヌクレオチドを提供する。
【００３６】
一側面によると、本発明は配列番号７２の配列またはそのフラグメント、類似体または誘導体を含んでなる第二のポリペプチドに少なくとも７０％の同一性を有するポリペプチドをエンコードする単離体ポリヌクレオチドを提供する。
【００３７】
一側面によると、本発明は配列番号７４またはそのフラグメント、類似体または誘導体の配列を含んでなる第二のポリペプチドに少なくとも７０％の同一性を有するポリペプチドをエンコードする単離体ポリヌクレオチドを提供する。
【００３８】
一側面によると、本発明は配列番号７７の配列またはそのフラグメント、類似体または誘導体を含んでなる第二のポリペプチドに少なくとも７０％の同一性を有するポリペプチドをエンコードする単離体ポリヌクレオチドを提供する。
【００３９】
一側面によると、本発明は配列番号２、４、６、８、１０またはそのフラグメント、類似体または誘導体から選択されるアミノ酸配列により特徴づけられるポリペプチドに関する。
【００４０】
一側面によると、本発明は配列番号２、４、６、８、１０、１４、１６、５５〜７５、７７〜７９、８１、８３またはそのフラグメント、類似体または誘導体から選択されるアミノ酸配列により特徴づけられるポリペプチドに関する。
【００４１】
一側面によると、本発明は配列番号２、４、８、１０、１４、１６、５５〜７５、７７〜７９、８１、８３またはそのフラグメント、類似体または誘導体から選択されるアミノ酸配列により特徴づけられるポリペプチドに関する。
【００４２】
一側面によると、本発明は配列番号２、４、１０、１４、１６、５５〜７５、７７〜７９、８１、８３またはそのフラグメント、類似体または誘導体から選択されるアミノ酸配列により特徴づけられるポリペプチドに関する。
【００４３】
一側面によると、本発明は配列番号２、４、８、１０、１４、１６、５５〜７５、７７〜７９またはそのフラグメント、類似体または誘導体から選択されるアミノ酸配列により特徴づけられるポリペプチドに関する。
【００４４】
一側面によると、本発明は配列番号２、４、１０、１４、１６、５５〜７５、７７〜７９またはそのフラグメント、類似体または誘導体から選択されるアミノ酸配列により特徴づけられるポリペプチドに関する。
【００４５】
一側面によると、本発明は配列番号２、４、１０、１４、１６またはそのフラグメント、類似体または誘導体から選択されるアミノ酸配列により特徴づけられるポリペプチドに関する。
【００４６】
一側面によると、本発明は配列番号２またはそのフラグメント、類似体または誘導体から選択されるアミノ酸配列により特徴づけられるポリペプチドに関する。
【００４７】
一側面によると、本発明は配列番号４の配列またはそのフラグメント、類似体または誘導体を含んでなるアミノ酸配列により特徴づけられるポリペプチドに関する。
【００４８】
一側面によると、本発明は配列番号１０またはそのフラグメント、類似体または誘導体の配列を含んでなるアミノ酸配列により特徴づけられるポリペプチドに関する。
【００４９】
一側面によると、本発明は配列番号１４の配列またはそのフラグメント、類似体または誘導体を含んでなるアミノ酸配列により特徴づけられるポリペプチドに関する。
【００５０】
一側面によると、本発明は配列番号１６の配列またはそのフラグメント、類似体または誘導体を含んでなるアミノ酸配列により特徴づけられるポリペプチドに関する。
【００５１】
一側面によると、本発明は配列番号１０、５５〜７５、７７、７８、７９またはそのフラグメント、類似体または誘導体から選択されるアミノ酸配列により特徴づけられるポリペプチドに関する。
【００５２】
一側面によると、本発明は配列番号１０、５８、６０、６２、６４、６７、６８、６９、７２、７４、７７またはそのフラグメント、類似体または誘導体から選択されるアミノ酸配列により特徴づけられるポリペプチドに関する。
【００５３】
一側面によると、本発明は配列番号１０、５８、６０、６２、６４、６７、６８、６９、７２、７４、７７またはそのフラグメント、類似体または誘導体から選択されるアミノ酸配列により特徴づけられるポリペプチドに関する。
【００５４】
一側面によると、本発明は配列番号１０、５８、６０、６２、６４、６７、６８、６９、７２、７４、７７またはそのフラグメント、類似体または誘導体から選択されるアミノ酸配列により特徴づけられるポリペプチドに関する。
【００５５】
一側面によると、本発明は配列番号１０、６２、６４、６７、６８、７４、７７またはそのフラグメント、類似体または誘導体から選択されるアミノ酸配列により特徴づけられるポリペプチドに関する。
【００５６】
一側面によると、本発明は配列番号５８の配列またはそのフラグメント、類似体または誘導体を含んでなるアミノ酸配列により特徴づけられるポリペプチドに関する。
【００５７】
一側面によると、本発明は配列番号６２またはそのフラグメント、類似体または誘導体の配列を含んでなるアミノ酸配列により特徴づけられるポリペプチドに関する。
【００５８】
一側面によると、本発明は配列番号６４の配列またはそのフラグメント、類似体または誘導体を含んでなるアミノ酸配列により特徴づけられるポリペプチドに関する。
【００５９】
一側面によると、本発明は配列番号６７の配列またはそのフラグメント、類似体または誘導体を含んでなるアミノ酸配列により特徴づけられるポリペプチドに関する。
【００６０】
一側面によると、本発明は配列番号６８の配列またはそのフラグメント、類似体または誘導体を含んでなるアミノ酸配列により特徴づけられるポリペプチドに関する。
【００６１】
一側面によると、本発明は配列番号７４の配列またはそのフラグメント、類似体または誘導体を含んでなるアミノ酸配列により特徴づけられるポリペプチドに関する。
【００６２】
一側面によると、本発明は配列番号７７の配列またはそのフラグメント、類似体または誘導体を含んでなるアミノ酸配列により特徴づけられるポリペプチドに関する。
【００６３】
さらなる態様において、本発明はまた本出願に記載の１種またはそれ以上のポリペプチド、またはそのフラグメント、類似体または誘導体を含んでなるキメラ・ポリペプチドに関する。
【００６４】
さらなる態様において、本発明はまた本発明の図面に定義した１種またはそれ以上のポリペプチド、またはそのフラグメント、類似体または誘導体を含んでなるキメラ・ポリペプチドに関する。
【００６５】
さらなる態様において、本発明はまた配列番号２、４、６、８、１０、１４、１６、５５〜７５、７７〜７９、８１、８３から選択される１種またはそれ以上のポリペプチド、またはそのフラグメント、類似体または誘導体を含んでなるキメラ・ポリペプチドに関する；ただし、該ポリペプチドまたはそのフラグメント、類似体または誘導体はキメラ・ポリペプチドを形成するように結合する。
【００６６】
さらなる態様において、該キメラ・ポリペプチドは配列番号１０、５８、６０、６２、６４、６７、６８、６９、７２、７４、７７から選択される１種またはそれ以上のポリペプチド、またはそのフラグメント、類似体または誘導体を含んでなる；ただし、該ポリペプチドまたはそのフラグメント、類似体または誘導体はキメラ・ポリペプチドを形成するように結合する。
【００６７】
さらなる態様において、該キメラ・ポリペプチドは配列番号１０、５８、６０、６２、６４、６７、６８、７４、７７から選択される１種またはそれ以上のポリペプチド、またはそのフラグメント、類似体または誘導体を含んでなる；ただし、該ポリペプチドまたはそのフラグメント、類似体または誘導体はキメラ・ポリペプチドを形成するように結合する。
【００６８】
さらなる態様において、該キメラ・ポリペプチドは配列番号１０、６２、６４、６７、６８、７４、７７から選択される１種またはそれ以上のポリペプチド、またはそのフラグメント、類似体または誘導体を含んでなる；ただし、該ポリペプチドまたはそのフラグメント、類似体または誘導体はキメラ・ポリペプチドを形成するように結合する。
【００６９】
さらなる態様において、該キメラ・ポリペプチドは２ないし５個のポリペプチドを含んでなる。
さらなる態様において、該キメラ・ポリペプチドは２ないし４個のポリペプチドを含んでなる。
さらなる態様において、該キメラ・ポリペプチドは２ないし３個のポリペプチドを含んでなる。
さらなる態様において、該キメラ・ポリペプチドは２個のポリペプチドを含んでなる。
【００７０】
さらなる態様においては、式（Ｉ）：
Ａ−(Ｂ)ｍ−(Ｃ)ｎ−Ｄ （Ｉ）
ただし、
ｍは０または１である；
ｎは０または１である；
Ａは配列番号２、４、６、８、１０、１４、１６、５５〜７５、７７〜７９、８１、８３またはそのフラグメント、類似体または誘導体から選択される；
Ｂは配列番号２、４、６、８、１０、１４、１６、５５〜７５、７７〜７９、８１、８３またはそのフラグメント、類似体または誘導体から選択される；
Ｃは配列番号２、４、６、８、１０、１４、１６、５５〜７５、７７〜７９、８１、８３またはそのフラグメント、類似体または誘導体から選択される；および
Ｄは配列番号２、４、６、８、１０、１４、１６、５５〜７５、７７〜７９、８１、８３またはそのフラグメント、類似体または誘導体から選択される；
で示されるキメラ・ポリペプチドが提供される。
【００７１】
さらなる態様において、
Ａは配列番号１０、５８、６０、６２、６４、６７、６８、６９、７２、７４、７７またはそのフラグメント、類似体または誘導体から選択される；
Ｂは配列番号１０、５８、６０、６２、６４、６７、６８、６９、７２、７４、７７またはそのフラグメント、類似体または誘導体から選択される；
Ｃは配列番号１０、５８、６０、６２、６４、６７、６８、６９、７２、７４、７７またはそのフラグメント、類似体または誘導体から選択される；および
Ｄは配列番号１０、５８、６０、６２、６４、６７、６８、６９、７２、７４、７７またはそのフラグメント、類似体または誘導体から選択される。
【００７２】
さらなる態様において、
Ａは配列番号１０、５８、６０、６２、６４、６７、６８、７４、７７またはそのフラグメント、類似体または誘導体から選択される；
Ｂは配列番号１０、５８、６０、６２、６４、６７、６８、７４、７７またはそのフラグメント、類似体または誘導体から選択される；
Ｃは配列番号１０、５８、６０、６２、６４、６７、６８、７４、７７またはそのフラグメント、類似体または誘導体から選択される；および
Ｄは配列番号１０、５８、６０、６２、６４、６７、６８、７４、７７またはそのフラグメント、類似体または誘導体から選択される。
【００７３】
一態様において、本発明のキメラ・ポリペプチドは独立してまたは組み合わさって以下の態様が存在するものを含んでなる。
さらなる態様において、Ａは配列番号１０、５８、６２、６４、６７、６８、７４、７７であるか、またはそのフラグメント、類似体または誘導体である。
【００７４】
さらなる態様において、Ａは配列番号１０であるか、またはそのフラグメント、類似体または誘導体である。
さらなる態様において、Ａは配列番号５８であるか、またはそのフラグメント、類似体または誘導体である。
さらなる態様において、Ａは配列番号６２であるか、またはそのフラグメント、類似体または誘導体である。
さらなる態様において、Ａは配列番号６４であるか、またはそのフラグメント、類似体または誘導体である。
さらなる態様において、Ａは配列番号６７であるか、またはそのフラグメント、類似体または誘導体である。
さらなる態様において、Ａは配列番号６８であるか、またはそのフラグメント、類似体または誘導体である。
さらなる態様において、Ａは配列番号７４であるか、またはそのフラグメント、類似体または誘導体である。
さらなる態様において、Ａは配列番号７７であるか、またはそのフラグメント、類似体または誘導体である。
【００７５】
さらなる態様において、Ｂは配列番号１０、５８、６２、６４、６７、６８、７４、７７であるか、またはそのフラグメント、類似体または誘導体である。
さらなる態様において、Ｂは配列番号１０であるか、またはそのフラグメント、類似体または誘導体である。
さらなる態様において、Ｂは配列番号５８であるか、またはそのフラグメント、類似体または誘導体である。
さらなる態様において、Ｂは配列番号６４であるか、またはそのフラグメント、類似体または誘導体である。
さらなる態様において、Ｂは配列番号６４であるか、またはそのフラグメント、類似体または誘導体である。
さらなる態様において、Ｂは配列番号６７であるか、またはそのフラグメント、類似体または誘導体である。
さらなる態様において、Ｂは配列番号６８であるか、またはそのフラグメント、類似体または誘導体である。
さらなる態様において、Ｂは配列番号７４であるか、またはそのフラグメント、類似体または誘導体である。
さらなる態様において、Ｂは配列番号７７であるか、またはそのフラグメント、類似体または誘導体である。
【００７６】
さらなる態様において、Ｃは配列番号１０、５８、６２、６４、６７、６８、７４、７７であるか、またはそのフラグメント、類似体または誘導体である。
さらなる態様において、Ｃは配列番号１０であるか、またはそのフラグメント、類似体または誘導体である。
さらなる態様において、Ｃは配列番号５８であるか、またはそのフラグメント、類似体または誘導体である。
さらなる態様において、Ｃは配列番号６２であるか、またはそのフラグメント、類似体または誘導体である。
さらなる態様において、Ｃは配列番号６４であるか、またはそのフラグメント、類似体または誘導体である。
さらなる態様において、Ｃは配列番号６７であるか、またはそのフラグメント、類似体または誘導体である。
さらなる態様において、Ｃは配列番号６８であるか、またはそのフラグメント、類似体または誘導体である。
さらなる態様において、Ｃは配列番号７４であるか、またはそのフラグメント、類似体または誘導体である。
さらなる態様において、Ｃは配列番号７７であるか、またはそのフラグメント、類似体または誘導体である。
【００７７】
さらなる態様において、Ｄは配列番号１０、５８、６２、６４、６７、６８、７４、７７であるか、またはそのフラグメント、類似体または誘導体である。
さらなる態様において、Ｄは配列番号１０であるか、またはそのフラグメント、類似体または誘導体である。
さらなる態様において、Ｄは配列番号５８であるか、またはそのフラグメント、類似体または誘導体である。
さらなる態様において、Ｄは配列番号６２であるか、またはそのフラグメント、類似体または誘導体である。
さらなる態様において、Ｄは配列番号６４であるか、またはそのフラグメント、類似体または誘導体である。
さらなる態様において、Ｄは配列番号６７であるか、またはそのフラグメント、類似体または誘導体である。
さらなる態様において、Ｄは配列番号６８であるか、またはそのフラグメント、類似体または誘導体である。
さらなる態様において、Ｄは配列番号７４であるか、またはそのフラグメント、類似体または誘導体である。
さらなる態様において、Ｄは配列番号７７であるか、またはそのフラグメント、類似体または誘導体である。
【００７８】
さらなる態様において、ｍは０である。
さらなる態様において、ｎは０である。
さらなる態様において、ｍおよびｎは０である。
さらなる態様において、ｍおよびｎは０であり、Ａは配列番号６４であるか、またはそのフラグメント、類似体または誘導体であり、Ｂは配列番号６２であるか、またはそのフラグメント、類似体または誘導体である。
さらなる態様において、ｍおよびｎは０であり、Ａは配列番号６２であるか、またはそのフラグメント、類似体または誘導体であり、Ｂは配列番号６４であるか、またはそのフラグメント、類似体または誘導体である。
【００７９】
本発明においては、ポリペプチドおよびキメラ・ポリペプチドをエンコードするヌクレオチドはすべて本発明の範囲内のものである。
さらなる態様において、本発明によるポリペプチドまたはキメラ・ポリペプチドは抗原性である。
さらなる態様において、本発明によるポリペプチドまたはキメラ・ポリペプチドは個体に免疫応答を誘発し得る。
さらなる態様において、本発明はまた上記定義の本発明ポリペプチドまたはキメラ・ポリペプチドに対し結合特異性を有する抗体を生成させ得るポリペプチドに関する。
【００８０】
“結合特異性を有する”抗体とは、本来選択されたペプチドを含むサンプル、例えば、生体サンプル中の選択されたペプチドを認識し、それに結合するが、他の分子は実質的に認識せず、また結合しない抗体である。特異的な結合は選択されたペプチドを抗原として用いるＥＬＩＳＡアッセイにより測定することができる。
【００８１】
特に定義しない限り、本明細書で使用する技術用語および科学用語はすべて本発明の技術分野で当業者が一般に理解するものと同じ意味を有する。本明細書に引用する刊行物、特許出願、特許、および他の参考文献はすべてその全文を参照により本明細書の一部とする。矛盾のある場合には、定義も含め、本明細書が優先する。さらに、材料、方法、例示などは単なる説明であって、制限しようとするものではない。
【００８２】
本明細書にて使用する場合、本発明ポリペプチドの“フラグメント”、“誘導体”または“類似体”とは、１個またはそれ以上のアミノ酸残基が保存または非保存アミノ酸残基（好ましく保存）により置換されており、かつ、天然であっても非天然であってもよいポリペプチドを包含する。一態様において、本発明ポリペプチドの誘導体および類似体は図面に示した配列またはそのフラグメントと約７０％の同一性を有するものとする。すなわち、該残基の７０％が同一である。さらなる態様において、ポリペプチドの相同性は８０％を超える。さらなる態様において、ポリペプチドの相同性は８５％を超える。さらなる態様において、ポリペプチドの相同性は９０％を超える。さらなる態様において、ポリペプチドの相同性は９５％を超える。さらなる態様において、ポリペプチドの相同性は９９％を超える。さらなる態様において、本発明ポリペプチドの誘導体および類似体は約２０個未満のアミノ酸残基の置換、修飾または欠失を有し、好ましくはその個数が１０個未満である。好適な置換は技術上保存として周知のもの、すなわち、置換された残基が疎水性、サイズ、電荷または官能基などの理化学的性質を分け持つものである。
【００８３】
本発明によると、本発明のポリペプチドはポリペプチドおよびキメラ・ポリペプチドの両方を包含する。
さらに包含されるポリペプチドは、該ポリペプチドの生物学的または薬理学的性質を変える他の化合物が融合しているもの、すなわち、半減期を増大させるポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、精製をし易くするリーダーまたは分泌アミノ酸配列、プレプロ−およびプロ−配列、および（多）糖類の融合したものである。
【００８４】
さらに、アミノ酸領域が多型性であることが判明している場合には、異なる連鎖球菌株の異なるエピトープをより有効に模倣するために、１個以上の特定アミノ酸を変更することが望ましい。
【００８５】
さらに、本発明のポリペプチドは末端−ＮＨ２アシル化（例えば、アセチル化、またはチオグリコール酸のアミド化、末端カルボキシのアミド化、例えば、アンモニアまたはメチルアミンによるアミド化）により修飾して、安定性を備わせ、支持体または他の分子に連結または結合する疎水性を増大させることができる。
【００８６】
さらに期待されるのは、該ポリペプチドのフラグメント、類似体および誘導体のヘテロおよびホモ・ポリペプチド・マルチマーである。これらのポリマー形状は、例えば、アビジン／ビオチン、グルタルアルデヒドまたはジメチル−スーパーイミデートなどの架橋剤で架橋した１個以上のポリペプチドを包含する。かかるポリマー形状はまた組換えＤＮＡ技法により生成させたマルチシストロンｍＲＮＡから生じた２個以上の縦列または逆方向の隣接配列を含むポリペプチドを包含する。好ましくは、本発明ポリペプチドのフラグメント、類似体および誘導体は少なくとも１個の抗原性領域、すなわち、少なくとも１個のエピトープを含んでなる。
【００８７】
抗原性ポリマー（すなわち、合成マルチマー）の形成を達成するために、ビスハロアセチル基、ハロゲン化ニトロアリールなどを有するポリペプチドを利用してもよく、その場合、該試薬はチオ基に特異的である。従って、異なるペプチドの２個のメルカプト基間の連結は単結合であってもよいし、あるいは少なくとも２個の炭素原子、一般には少なくとも４個であるが１６個以下であり、通常約１４個以下の炭素原子の連結基から構成されていてもよい。
【００８８】
特定の態様において、本発明ポリペプチドのフラグメント、類似体および誘導体はメチオニン（Ｍｅｔ）の開始残基を含まない。好ましくは、ポリペプチドはリーダーまたは分泌配列（シグナル配列）を含んでいない。本発明ポリペプチドのシグナル部分は確立された分子生物学技法に従い決定することができる。一般に、対象となるポリペプチドは連鎖球菌培養物から単離し、次いで配列決定して成熟タンパク質の開始残基、従って成熟ポリペプチドの配列を決めてもよい。
【００８９】
他の側面によると、１種またはそれ以上の本発明連鎖球菌ポリペプチドを含んでなり、医薬的に許容し得る担体、賦形剤またはアジュバントと混合したワクチン組成物が提供される。適切なアジュバントは油、すなわち、フロインド完全または不完全アジュバント；塩類、すなわち、ＡlＫ(ＳＯ４)２、ＡlＮa(ＳＯ４)２、ＡlＮＨ４(ＳＯ４)２、シリカ、カオリン、炭素ポリヌクレオチド、すなわち、ポリＩＣおよびポリＡＵなどを包含する。好適なアジュバントはＱuilＡまたはＡｌヒドロゲルを包含する。本発明のワクチンは注射、迅速注入、鼻咽頭吸収、皮膚吸収により非経口投与するか、または口腔もしくは経口により投与することができる。医薬的に許容し得る担体としては破傷風トキソイドも包含する。
【００９０】
本発明のワクチン組成物は以下に記載の連鎖球菌感染症および／または連鎖球菌感染が介在する疾患および症状の治療または予防に使用する（P.R. Murray (Ed. in chief), E.J. Baron, M.A. Pfaller, F.C. Tenover and R.H. Yolken, Manual of Clinical Microbiology, ASM press, Washington D.C., sixth edition, 1995, 1482p; 出典明示により本明細書の一部とする）。一態様において、本発明のワクチン組成物は髄膜炎、中耳炎、菌血症または肺炎の治療または予防に使用される。一態様において、本発明のワクチン組成物は連鎖球菌感染症および／または連鎖球菌感染、特に、肺炎連鎖球菌（S. pneumoniae）、Ａ群連鎖球菌（化膿菌、pyogenes）、Ｂ群連鎖球菌（ＧＢＳまたはアガラクチエ、agalactiae）、ディスガラクチエ（dysgalactiae）、ユベリス（uberis）、ノカルディア（nocardia）、並びにスタヒロコッカス・アウレウス（Staphylococcus aureus）が介在する疾患および症状の治療または予防に使用する。さらなる態様において、連鎖球菌感染症は肺炎連鎖球菌（S. pneumoniae）の感染である。
【００９１】
特定の態様において、ワクチンは乳児、初老の免疫無防備状態個体など、連鎖球菌感染の危険性のある個体に投与する。
本出願にて使用する場合、“個体”という用語は哺乳動物を包含する。さらなる態様において、哺乳動物はヒトである。
【００９２】
ワクチン組成物は、好ましくは、約０.０１〜１００μｇ／ｋｇ（抗原／体重）の投与単位形状、より好ましくは０.０１〜１０μｇ／ｋｇ、最も好ましくは０.１〜１μｇ／ｋｇの形状で、約１週間ないし６週間の免疫間隔で１〜３回投与する。
【００９３】
他の側面によると、配列番号２、４、６、８、１０、１４、１６、５５〜７５、７７〜７９、８１、８３またはそのフラグメント、類似体または誘導体から選択されるアミノ酸配列により特徴づけられるポリペプチドをエンコードするポリヌクレオチドが提供される。
【００９４】
一態様において、ポリヌクレオチドは本発明のポリペプチドをエンコードし、オープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を含んでいてもよい配列番号１、３、５、７、９、１１、１２、１３、１５、７６、８０、８２に示したポリヌクレオチドである。図面に示したポリヌクレオチド配列は縮重コドンにより変化していてもよいが、それでもなお本発明のポリペプチドをエンコードしていることが認められよう。従って、本発明はさらに配列間で５０％の同一性を有する上記のポリヌクレオチド配列（またはその相補配列）にハイブリダイズするポリヌクレオチドを提供する。一態様において、配列間の同一性は少なくとも７０％である。一態様において、配列間の同一性は少なくとも７５％である。一態様において、配列間の同一性は少なくとも８０％である。一態様において、配列間の同一性は少なくとも８５％である。一態様において、配列間の同一性は少なくとも９０％である。さらなる態様において、ポリヌクレオチドは緊縮条件下、すなわち、少なくとも９５％の同一性をもつ条件下でハイブリダイズし得る。さらなる態様において、同一性は９７％を超える。
【００９５】
さらなる態様において、ポリヌクレオチドは本発明のポリペプチドをエンコードする配列番号１、３、７、９、１１、１２、１３、１５、７６、８０、８２に示したポリヌクレオチドである。
【００９６】
さらなる態様において、ポリヌクレオチドは本発明のポリペプチドをエンコードし、オープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を含んでいてもよい配列番号１、３、９、１１、１２、１３、１５、７６、８０、８２に示したポリヌクレオチドである。
【００９７】
さらなる態様において、ポリヌクレオチドは本発明のポリペプチドをエンコードし、オープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を含んでいてもよい配列番号１、３、９、１１、１２、１３、１５、７６に示したポリヌクレオチドである。
【００９８】
さらなる態様において、ポリヌクレオチドは本発明のポリペプチドをエンコードし、オープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を含んでいてもよい配列番号１、３、７、９、１１、１２、１３、１５、７６に示したポリヌクレオチドである。
【００９９】
さらなる態様において、ポリヌクレオチドは本発明のポリペプチドをエンコードし、オープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を含んでいてもよい配列番号１、７、９、１１、１５、７６に示したポリヌクレオチドである。
【０１００】
さらなる態様において、ポリヌクレオチドは本発明のポリペプチドをエンコードし、オープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を含んでいてもよい配列番号１、９、１１、１５、７６に示したポリヌクレオチドである。
【０１０１】
さらなる態様において、ポリヌクレオチドは本発明のポリペプチドをエンコードし、オープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を含んでいてもよい配列番号１、７、９、１１に示したポリヌクレオチドである。
【０１０２】
さらなる態様において、ポリヌクレオチドは本発明のポリペプチドをエンコードする配列番号１に示したポリヌクレオチドである。
さらなる態様において、ポリヌクレオチドは本発明のポリペプチドをエンコードする配列番号７に示したポリヌクレオチドである。
さらなる態様において、ポリヌクレオチドは本発明のポリペプチドをエンコードする配列番号９に示したポリヌクレオチドである。
さらなる態様において、ポリヌクレオチドは本発明のポリペプチドをエンコードする配列番号１１に示したポリヌクレオチドである。
さらなる態様において、ポリヌクレオチドは本発明のポリペプチドをエンコードする配列番号１５に示したポリヌクレオチドである。
【０１０３】
さらなる態様において、ポリヌクレオチドは本発明のポリペプチドをエンコードする配列番号３、１２、１３、７６に示したポリヌクレオチドである。
さらなる態様において、ポリヌクレオチドは本発明のポリペプチドをエンコードする配列番号３に示したポリヌクレオチドである。
さらなる態様において、ポリヌクレオチドは本発明のポリペプチドをエンコードする配列番号１２に示したポリヌクレオチドである。
さらなる態様において、ポリヌクレオチドは本発明のポリペプチドをエンコードする配列番号１３に示したポリヌクレオチドである。
さらなる態様において、ポリヌクレオチドは本発明のポリペプチドをエンコードする配列番号７６に示したポリヌクレオチドである。
【０１０４】
当業者が容易に認識するように、ポリヌクレオチドはＤＮＡおよびＲＮＡ両方を包含する。
本発明はまた本出願に記載したポリヌクレオチドに相補的なポリヌクレオチドをも包含する。
【０１０５】
さらなる側面において、本発明のポリペプチド、またはフラグメント、類似体または誘導体をエンコードするポリヌクレオチドはＤＮＡ免疫化法に使用し得る。すなわち、該ポリヌクレオチドは、注射により複製発現可能であり、その結果生体内で抗原性ポリペプチドを生じるベクター内に取込み得るものである。例えば、ポリペプチドは真核細胞内で機能的なＣＭＶプロモーターの制御下にプラスミドベクターに取込み得る。好ましくは、該ベクターは筋肉内に注射する。
【０１０６】
他の側面によると、組換え技法により、宿主細胞において当該ポリペプチドをエンコードするポリヌクレオチドを発現させ、発現したポリペプチド産物を回収することによる本発明ポリペプチドの製造法が提供される。別法として、該ポリペプチドは確立された合成化学技法に従い、すなわち、オリゴペプチドを液相または固相合成し、それを結合して完全なポリペプチドを製造することができる（ブロック連結反応）。
【０１０７】
ポリヌクレオチドおよびポリペプチドの入手および評価の一般的方法は以下の文献に記載されている：Sambrook et al., 分子クローニング：実験室マニュアル、第２版、Cold Spring Harbor, N.Y., 1989；分子生物学における最新プロトコール、編者：Ausubel F.M. et al., John Wiley and Sons, Inc. New York；ＰＣＲクローニング・プロトコール、分子クローニングから遺伝子工学まで、編者：White B.A., Humana Press, Totowa, New Jersey, 1997, 490 pages; タンパク質精製、原理と実際、Scopes R.K., Springer-Verlag, New York, 3rd Edition, 1993, 380 pages; 免疫学における最新プロトコール、Edited by Coligan J.E. et al., John Wiley & Sons Inc., New York; これらは出典明示により本明細書の一部とする。
【０１０８】
組換え生産のために、該ポリペプチドをエンコードするベクターを宿主細胞に移入し、次いで、プロモーター活性化、形質転換体選択または遺伝子増幅に適するように改変した栄養培地中で培養する。
【０１０９】
適切なベクターは選択した宿主中で生存複製可能なベクターであり、染色体、非染色体および合成ＤＮＡ配列、例えば、バクテリアプラスミド、ファージＤＮＡ、バキュロウイルス、酵母プラスミド、プラスミドとファージＤＮＡを組合わせて誘導したベクターなどを包含する。ポリペプチド配列はベクターの適切な部位に取込むことができるが、その際には制限酵素を使用し、プロモーター、リボソーム結合部位（コンセンサス領域またはシャイン・ダルガルノ配列）、および必要によりオペレーター（制御要素）を含んでなる発現制御領域に操作可能に結合するようにする。発現制御領域の個々の要素は所定の宿主とベクターに適したものを確立された分子生物学の原理に従って選択することができる（Sambrook et al., 分子クローニング：実験室マニュアル、第２版、Cold Spring Harbor, N.Y., 1989；分子生物学における最新プロトコール、編者：Ausubel F.M. et al., John Wiley and Sons, Inc. New York；出典明示により本明細書の一部とする）。適切なプロモーターはＬＴＲまたはＳＶ４０プロモーター、大腸菌ｌａｃ、ｔａｃまたはｔｒｐプロモーターおよびファージ・ラムダＰＬプロモーターなどであるが、これらに限定されるものではない。ベクターは、好ましくは複製開始点並びに選択マーカー、すなわち、アンピシリン耐性遺伝子を組入れている。適切なバクテリアベクターは、ｐＥＴ、ｐＱＥ７０、ｐＱＥ６０、ｐＱＥ−９、ｐｂｓ、ｐＤ１０ファージスクリプト、ｐｓｉＸ１７４、ブルースクリプトＳＫ、ｐｂｓｋｓ、ｐＮＨ８Ａ、ｐＮＨ１６ａ、ｐＮＨ１８Ａ、ｐＮＨ４６Ａ、ｐｔｒｃ９９ａ、ｐＫＫ２２３−３、ｐＫＫ２３３−３、ｐＤＲ５４０、ｐＲＩＴ５および真核ベクターｐブルーバックIII、ｐＷＬＮＥＯ、ｐＳＶ２ＣＡＴ、ｐＯＧ４４、ｐＸＴ１、ｐＳＧ、ｐＳＶＫ３、ｐＢＰＶ、ｐＭＳＧおよびｐＳＶＬなどである。宿主細胞は細菌性のもの、すなわち、大腸菌（E. coli）、枯草菌（Bacillus subtilis）、ストレプトマイセス（Streptomyces）；真菌性のもの、すなわち、アスペルギルス・ニガー（Aspergillus niger）、アスペルギルス・ニズリンス（Aspergillus nidulins）；酵母、すなわち、サッカロミセス（Saccharomyces)；または真核性、すなわち、ＣＨＯ、ＣＯＳであってもよい。
【０１１０】
培養物中でのポリペプチドの発現にもとづき、細胞は一般に遠心分離により収穫し、次いで物理的または化学的手段（もし発現されたポリペプチドが培地に分泌されなければ）により破砕し、得られる粗製の抽出物を保持し、対象のポリペプチドを単離する。培地または溶菌液からポリペプチドを精製するには、ポリペプチドの性質に従って確立された技法により、すなわち、硫安沈殿またはエタノール沈殿、酸抽出、アニオンまたはカチオン交換クロマトグラフィー、ホスホセルロースクロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー、およびレクチンクロマトグラフィーなどを使用する。最終の精製はＨＰＬＣにより達成し得る。
【０１１１】
該ポリペプチドはリーダー配列または分泌配列を付けて、または付けずに発現することができる。前者の場合、リーダーは翻訳後プロセシングにより除去してもよい（参照：ＵＳ４，４３１，７３９；ＵＳ４，４２５，４３７；およびＵＳ４，３３８，３９７；出典明示により本明細書の一部とする）し、または発現されたポリペプチドを精製した後に化学的に除去してもよい。
【０１１２】
さらなる側面によると、本発明の連鎖球菌ポリペプチドは連鎖球菌感染症、特に肺炎連鎖球菌（S. pneumoniae）感染の診断テストに使用することができる。例えば、生物サンプル中の連鎖球菌菌体の検出など数種の診断方法が可能であるが、以下の手法により実施する：
ａ）患者から生物サンプルを入手すること；
ｂ）本発明の連鎖球菌ポリペプチドと反応し得る抗体またはそのフラグメントを該生物サンプルとインキュベートし、混合物を形成すること；そして
ｃ）連鎖球菌の存在を示す特異的に結合した混合物中の抗体またはフラグメントを検出すること。
【０１１３】
別法として、連鎖球菌抗原に特異的な抗体を含むかまたは含む疑いのある生物サンプルについての当該抗体の検出は以下のように実施することができる：
ａ）患者から生物サンプルを入手すること；
ｂ）１種以上の本発明連鎖球菌ポリペプチドまたはそのフラグメントを該生物サンプルとインキュベートし、混合物を形成すること；そして
ｃ）連鎖球菌に特異的な抗体の存在を示す特異的に結合した混合物中の抗原またはフラグメントを検出すること。
【０１１４】
この診断テスト法は幾つかの形態を取ることが可能であり、その方法は免疫学的テスト法、例えば、酵素結合抗体免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）、放射免疫アッセイまたはラテックス凝集アッセイなどであって、該タンパク質に特異的な抗体が生体中に存在するかどうかを測定する実質的な方法であることは当業者の認めるところである。
【０１１５】
本発明のポリペプチドをエンコードするＤＮＡ配列は、連鎖球菌を含むと疑われる生物サンプルについて、かかるバクテリアの存在を検出する際に使用するＤＮＡプローブの設計にも使用することができる。本発明の検出方法は以下の工程を含んでなる：
ａ）患者から生物サンプルを入手すること；
ｂ）本発明ポリペプチドまたはそのフラグメントをエンコードするＤＮＡ配列をもつ１種以上のＤＮＡプローブを該生物サンプルとインキュベートし、混合物を形成すること；そして
ｃ）連鎖球菌の存在を示す特異的に結合した混合物中のＤＮＡプローブを検出すること。
【０１１６】
本発明のＤＮＡプローブは、連鎖球菌感染を診断する方法として、サンプル中の循環系連鎖球菌、すなわち、肺炎連鎖球菌（S. pneumoniae）核酸を、例えば、ポリメラーゼ連鎖反応を用い検出するためにも使用することができる。該プローブは常套の技法を用いて合成して、固相に固定化してもよいし、あるいは検出可能なラベルで標識してもよい。これに適用するための好適なＤＮＡプローブは本発明肺炎連鎖球菌の少なくとも約６個の連接したヌクレオチドに相補的な配列をもつオリゴマーである。
【０１１７】
患者の連鎖球菌を検出するもう一つの診断方法は以下の工程を含んでなる：
ａ）本発明のポリペプチドと反応し得る抗体またはそのフラグメントを検出可能なラベルで標識すること；
ｂ）標識した抗体または標識したフラグメントを該患者に投与すること；および
ｃ）連鎖球菌の存在を示す特異的に結合した患者における標識抗体または標識フラグメントを検出すること。
【０１１８】
本発明のさらなる側面は、連鎖球菌感染の診断用および、特に治療用の特異抗体を産生するために免疫原として本発明の連鎖球菌ポリペプチドを使用することである。適切な抗体は適当なスクリーニング法を用い、例えば、テストモデルにおいて連鎖球菌に対し受動的に防御する特定抗体の能力を測定することにより決定することができる。動物モデルの一例としては、本明細書の実施例に記載したマウスのモデルである。該抗体は全抗体であっても、その抗原結合フラグメントであってもよく、また免疫グロブリンのどの分類のものでもよい。該抗体またはフラグメントは動物起源、特に、哺乳動物起源のもの、より具体的にはマウス、ラットまたはヒト起源のものである。それは天然の抗体またはそのフラグメントであり、あるいは要すれば、組換え抗体または抗体フラグメントであってもよい。組換え抗体または抗体フラグメントという用語は、それらの抗体または抗体フラグメントが分子生物学の技法により製造されたものであることを意味する。該抗体または抗体フラグメントはポリクローナルであるか、または好ましくはモノクローナルである。それは肺炎連鎖球菌ポリペプチドと関連する多くのエピトープに特異的であってもよいが、好ましくは１個のエピトープに対して特異的である。
【０１１９】
本発明の範囲を制限するものではないが、本発明はまたＢＶＨ−３、ＢＶＨ−１１、ＢＶＨ−１１−２、ＢＶＨ−２８およびＢＶＨ−７１と命名した新規の抗原にも関する。本発明はまたＢＶＨ−３、ＢＶＨ−１１、ＢＶＨ−１１−２、ＢＶＨ−２８およびＢＶＨ−７１と命名した新規の抗原のフラグメントを含んでなる切断型ポリペプチドにも関する。本発明はまたＢＶＨ−３、ＢＶＨ−１１、ＢＶＨ−１１−２、ＢＶＨ−２８およびＢＶＨ−７１と命名した新規の抗原のフラグメントを含んでなるキメラ・ポリペプチドにも関する。下記の参照表は本発明抗原間の関係を要約した表である。
【表１】
【表２】
【実施例】
【０１２０】
実施例１
本実施例では肺炎連鎖球菌（S. pneumoniae）遺伝子のクローニングについて説明する。
肺炎連鎖球菌（S. pneumoniae）遺伝子ＢＶＨ−３（配列番号１）のコーディング領域および肺炎連鎖球菌（S. pneumoniae）遺伝子ＢＶＨ−２８（配列番号５）のコーディング領域は、血清型６肺炎連鎖球菌（S. pneumoniae）株ＳＰ６４のゲノムＤＮＡから、制限部位ＢglII（ＡＧＡＴＣＴ）およびＸbaＩ（ＴＣＴＡＧＡ）の付加用塩基エクステンションを含むオリゴ体を用い、ＰＣＲ（ＤＮＡサーマル・サイクラー・ジーンアンプＰＣＲシステム２４００、パーキン・エルマー（Perkin Elmer）、サンホセ（San Jose)、ＣＡ）により増幅した。ＰＣＲ産物はキアクイック（QIAquick）ゲル抽出キット（キアゲン（QIAgen）、チャッツウオース（Chatsworth)、ＣＡ）を用いてアガロースゲルから精製し、ＢglII−ＸbaＩ（ファルマシア（Pharmacia）カナダ・インク、バイデフルフ（Baie d'Urfe)、カナダ）で消化し、フェノール／クロロホルムで抽出し、エタノールで沈殿させた。スーパーリンカーベクターｐＳＬ３０１（インビトロゲン（Invitrogen）、サンジエゴ、ＣＡ）をＢglIIとＸbaＩで消化し、キアクイック（QIAquick）ゲル抽出キット（キアゲン（QIAgen）、チャッツウオース（Chatsworth)、ＣＡ）を用いてアガロースゲルから精製した。ＢglII−ＸbaＩゲノムＤＮＡフラグメントをＢglII−ＸbaＩ ｐＳＬ３０１ベクターに連結した。連結した生成物をシマニス（Simanis）の方法（Hanahan, D. ＤＮＡクローニング、D.M. Glover (ed), pp. 109-134）に従い、大腸菌株ＤＨ５ａ［ｆ８０ lacＺ ＤＭ１５ endＡ１recＡ１ hsdＲ１７（ｒＫ−ｍＫ＋）supＥ４４ thi−１１− gyrＡ９６ relＡ１ Ｄ（lacＺＹＡ−argＦ）Ｕ１６９］（ギブコ（Gibco）ＢＲＬ、ゲイサースバーグ（Gaithersburg）、ＭＤ）に形質転換した。ＢＶＨ−３またはＢＶＨ−２８のいずれかの遺伝子を含む組換えｐＳＬ３０１プラスミド（ｒｐＳＬ３０１）をキアゲン（QIAgen）キット（チャッツウオース（Chatsworth)、ＣＡ）により精製し、ＤＮＡ挿入片はヌクレオチド配列分析（タック・ダイ・デオキシ・ターミネーター・サイクル配列決定キット、ＡＢＩ、フォスター・シティ、ＣＡ）により確認した。組換えｒｐＳＬ３０１（ｒｐＳＬ３０１）を制限酵素ＢglII（ＡＧＡＴＣＴ）およびＸhoＩ（ＣＴＣＧＡＧ）により消化した。ＤＮＡフラグメントＢglII−ＸhoＩはキアクイック（QIAquick）ゲル抽出キット（キアゲン（QIAgen）、チャッツウオース（Chatsworth)、ＣＡ）を用いて精製した。チオレドキシン−Ｈｉｓタグ配列を含むｐＥＴ−３２ｃ（＋）発現ベクター（ノバゲン（Novagen）、マジソン、ＷＩ）をＢamＨＩ（ＧＧＡＴＣＣ）およびＸhoＩで消化し、ゲルはキアクイック（QIAquick）ゲル抽出キット（キアゲン（QIAgen）、チャッツウオース（Chatsworth)、ＣＡ）を用いて抽出した。ＢglII−ＸhoＩＤＮＡフラグメントをＢamＨＩ−ＸhoＩｐＥＴ−３２ｃ（＋）ベクターに連結してチオレドキシン−Ｈｉｓタグ−ＢＶＨ−３またはチオレドキシン−Ｈｉｓタグ−ＢＶＨ−２８融合タンパク質用のコーディング配列を創製した。連結した生成物をシマニス（Simanis）の方法（Hanahan, D. ＤＮＡクローニング、1985、D.M. Glover (ed), pp. 109-135）に従い、大腸菌株ＤＨ５ａ［ｆ８０ lacＺ ＤＭ１５ endＡ１recＡ１ hsdＲ１７（ｒＫ−ｍＫ＋）supＥ４４ thi−１１− gyrＡ９６ relＡ１ Ｄ（lacＺＹＡ−argＦ）Ｕ１６９］（ギブコ（Gibco）ＢＲＬ、ゲイサースバーグ（Gaithersburg）、ＭＤ）に形質転換した。組換えｐＥＴ−３２ｃ（＋）プラスミドはキアゲン（QIAgen）キット（チャッツウオース（Chatsworth)、ＣＡ）により精製し、チオレドキシン−ＨｉｓタグとＤＮＡ挿入片の融合部位でのヌクレオチド配列はＤＮＡ配列決定法（タック・ダイ・デオキシ・ターミネーター・サイクル配列決定キット、ＡＢＩ、フォスター・シティ、ＣＡ）により証明した。
【０１２１】
実施例２
本実施例ではＣＭＶプラスミドｐＣＭＶ−ＧＨにおける肺炎連鎖球菌（S. pneumoniae）タンパク質遺伝子のクローニングについて説明する。
肺炎連鎖球菌（S. pneumoniae）タンパク質のＤＮＡコーディング領域をヒト成長ホルモン（ｈＧＨ）遺伝子の下流位相に挿入した；該ｈＧＨ遺伝子はプラスミドベクターｐＣＭＶ−ＧＨのサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーターの転写制御下にあった（Tang et al., Nature, 1992, 356: 152)。ＣＭＶプロモーターは大腸菌細胞内では機能しないプラスミドとするが、真核細胞内プラスミドの管轄下では活性である。該ベクターはアンピシリン耐性遺伝子をも併合していた。
【０１２２】
ＢＶＨ−３遺伝子（配列番号１）とＢＶＨ−２８遺伝子（配列番号５）のコーディング領域は、制限酵素ＢglII（ＡＧＡＴＣＴ）およびＸbaＩ（ＴＣＴＡＧＡ）を用いてｒｐＳＬ３０１（実施例１参照）から得た。消化産物はキアクイック（QIAquick）ゲル抽出キット（キアゲン（QIAgen）、チャッツウオース（Chatsworth)、ＣＡ）を用いてアガロースゲルから精製した。融合タンパク質を創製するために、ヒト成長ホルモンを含むｐＣＭＶ−ＧＨベクター（テキサス大学（ダラス、テキサス）生化学部門、ジョンストン（Dr. Stephen A. Johnston）研究室）をＢglIIおよびＸbaＩで消化し、キアクイック（QIAquick）ゲル抽出キット（キアゲン（QIAgen）、チャッツウオース（Chatsworth)、ＣＡ）を用いてアガロースゲルから精製した。ＢglII−ＸbaＩ ＤＮＡフラグメントをＢglII−ＸbaＩ ｐＣＭＶ−ＧＨベクターに連結し、ＣＭＶプロモーターの制御下にｈＧＨ−ＢＶＨ−３またはｈＧＨ−ＢＶＨ−２８融合タンパク質を創製した。連結した生成物をシマニス（Simanis）の方法（Hanahan, D. ＤＮＡクローニング、1985、D.M. Glover (ed), pp. 109-135）に従い、大腸菌株ＤＨ５ａ［ｆ８０ lacＺ ＤＭ１５ endＡ１recＡ１ hsdＲ１７（ｒＫ−ｍＫ＋）supＥ４４ thi−１１− gyrＡ９６ relＡ１ Ｄ（lacＺＹＡ−argＦ）Ｕ１６９］（ギブコ（Gibco）ＢＲＬ、ゲイサースバーグ（Gaithersburg）、ＭＤ）に形質転換した。組換えｐＣＭＶプラスミドはキアゲン（QIAgen）キット（キアゲン、チャッツウオース（Chatsworth)、ＣＡ）により精製した。
【０１２３】
ＢＶＨ−１１遺伝子（配列番号３）のコーディング領域は、血清型６肺炎連鎖球菌（S. pneumoniae）株ＳＰ６４のゲノムＤＮＡから、制限部位ＢglII（ＡＧＡＴＣＴ）およびＨindIII（ＡＡＧＣＴＴ）の付加用塩基エクステンションを含むオリゴ体を用い、ＰＣＲ（ＤＮＡサーマル・サイクラー・ジーンアンプＰＣＲシステム２４００、パーキン・エルマー（Perkin Elmer）、サンホセ（San Jose)、ＣＡ）により増幅した。ＰＣＲ産物はキアクイック（QIAquick）ゲル抽出キット（キアゲン（QIAgen）、チャッツウオース（Chatsworth)、ＣＡ）を用いてアガロースゲルから精製し、制限酵素（ファルマシア（Pharmacia）カナダ・インク、バイデフルフ（Baie d'Urfe)、カナダ）で消化し、フェノール／クロロホルムで抽出し、エタノールで沈殿させた。該ｐＣＭＶ−ＧＨベクター（テキサス大学（ダラス、テキサス）生化学部門、ジョンストン（Dr. Stephen A. Johnston）研究室）をＢglIIおよびＨindIIIで消化し、キアクイック（QIAquick）ゲル抽出キット（キアゲン（QIAgen）、チャッツウオース（Chatsworth)、ＣＡ）を用いてアガロースゲルから精製した。ＢglII−ＨindIII ＤＮＡフラグメントをＢglII−ＨindIII ｐＣＭＶ−ＧＨベクターに連結し、ＣＭＶプロモーターの制御下にｈＧＨ−ＢＶＨ−１１融合タンパク質を創製した。連結した生成物をシマニス（Simanis）の方法（Hanahan, D. ＤＮＡクローニング、1985、D.M. Glover (ed), pp. 109-135）に従い、大腸菌株ＤＨ５ａ［ｆ８０ lacＺ ＤＭ１５ endＡ１recＡ１ hsdＲ１７（ｒＫ−ｍＫ＋）supＥ４４ thi−１１− gyrＡ９６ relＡ１ Ｄ（lacＺＹＡ−argＦ）Ｕ１６９］（ギブコ（Gibco）ＢＲＬ、ゲイサースバーグ（Gaithersburg）、ＭＤ）に形質転換した。組換えｐＣＭＶプラスミドはキアゲン（QIAgen）キット（キアゲン、チャッツウオース（Chatsworth)、ＣＡ）により精製し、ＤＮＡ挿入片のヌクレオチド配列はＤＮＡ配列決定法により証明した。
【０１２４】
実施例３
本実施例では肺炎連鎖球菌（S. pneumoniae）抗原に対する免疫応答を引出すためにＤＮＡを使用することについて説明する。
メスＢＡＬＢ／ｃマウス（チャールズ・リバー（Charles River)、セントコンスタント（St-Constant）、ケベック、カナダ）８匹を１群とし、ＢＶＨ−３、ＢＶＨ−１１またはＢＶＨ−２８遺伝子を含む組換えｐＣＭＶ−ＧＨ１００μｇにより、顆粒球−マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）発現プラスミドｐＣＭＶ−ＧＨ−ＧＭ−ＣＳＦ（テキサス大学（ダラス、テキサス）生化学部門、ジョンストン（Dr. Stephen A. Johnston）研究室）５０μｇの存在下、２−ないし３−週間間隔で５０μｌを３回筋肉注射し、免疫した。対照として、一群のマウスにはｐＣＭＶ−ＧＨ−ＧＭ−ＣＳＦ５０μｇの存在下、ｐＣＭＶ−ＧＨを１００μｇ注射した。血液サンプルは各免疫化に先立ち、また３回目の注射７日後に眼窩から採取し、血清抗体応答はコーティング抗原としてチオレドキシン−Ｈｉｓ・Ｔａｇ−肺炎連鎖球菌（S. pneumoniae）融合タンパク質を用い、ＥＬＩＳＡにより測定した。ＢＶＨ−３、ＢＶＨ−１１またはＢＶＨ−２８肺炎連鎖球菌（S. pneumoniae）タンパク質をエンコードする組換えプラスミドｐＣＭＶ−ＧＨによるＤＮＡ免疫化は、それぞれの組換えタンパク質に対し反応する抗体を誘発した。吸光度値がバックグランド値の０.１以上であった最大血清希釈と定義される相互の抗体価は、４×１０３以上であった。
【０１２５】
実施例４
本実施例では組換え肺炎連鎖球菌（S. pneumoniae）タンパク質の産生と精製につき説明する。
配列番号１、配列番号３または配列番号５に相当するＢＶＨ−３、ＢＶＨ−１１またはＢＶＨ−２８遺伝子を含む組換えｐＥＴプラスミドをエレクトロポレーション（ジーン・パルサーII装置、バイオ−ラッド（ＢＩＯ−ＲＡＤ）ラボ、ミッシソウガ（Mississauga）、カナダ）により大腸菌株ＡＤ４９４（ＤＥ３）（Ｄara−leu７６９７ ＤlacＸ７４ ＤphoＡ ＰvuII phoＲ ＤmalＦ３ Ｆ'［lac＋（lacＩｑ）pro］trxＢ：：Ｋan）（ノバゲン（Novagen)、マジソン、ＷＩ）に形質転換した。本大腸菌株では、融合タンパク質の発現を制御するＴ７プロモーターがＴ７ＲＮＡポリメラーゼ（１ＤＥ３プロファージ上に存在）により特異的に認識されるが、該ポリメラーゼの遺伝子はイソプロピル−β−ｄ−チオ−ガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）により誘導し得るｌａｃプロモーターの制御下にある。形質転換体ＡＤ４９４（ＤＥ３）／rpＥＴは、１ｍｌ当たりアンピシリン（シグマ−アルドリッチ（Sigma-Aldrich）カナダ株式会社、オークビル（Oakville)、カナダ）１００μｇを含むＬＢブロス（ペプトン１０ｇ／Ｌ、酵母エキス５ｇ／Ｌ、ＮａＣｌ１０ｇ／Ｌ）中で、Ａ６００が０.６の値に達するまで、２５０ｒｐｍの攪拌下に３７℃で増殖させた。チオレドキシン−Ｈｉｓ・Ｔａｇ−ＢＶＨ−３、チオレドキシン−Ｈｉｓ・Ｔａｇ−ＢＶＨ−１１またはチオレドキシン−Ｈｉｓ・Ｔａｇ−ＢＶＨ−２８融合タンパク質の産生を誘導するために、最終濃度１ｍＭのＩＰＴＧの存在下にさらに２時間培養した。培養物１００ｍｌから誘導された細胞は遠心によりペレットとし、−７０℃で凍結した。
【０１２６】
ＩＰＴＧ誘導ＡＤ４９４（ＤＥ３）／rpＥＴの可溶性細胞質フラクションから融合タンパク質を精製するには、Ｈｉｓ結合金属キレート化樹脂に固定化した二価カチオン（Ｎｉ２＋）に結合するＨｉｓ・Ｔａｇ配列（６個の連続的ヒスチジン残基）の性質に基づくアフィニティ・クロマトグラフィーにより実施した。簡単に説明すると、ＩＰＴＧにより誘導した培養物１００ｍＬから得たペレット状細胞を、リン酸バッファー５００ｍＭ−ＮａＣｌ溶液（ＰＢＳ）（ｐＨ７.１）に再懸濁し、超音波処理、２０,０００×ｇで２０分間遠心して破片を除去した。上清を濾取し（０.２２μｍ孔径の膜）、ハイトラップ（HiTrap; 登録商標）１ｍＬのキレート化プレパック常用カラム（ファルマシアバイオテック（Pharmacia Biotech）、バイデフルフ（Baie d'Urfe)、カナダ）に載せた。チオレドキシン−Ｈｉｓ・Ｔａｇ−肺炎連鎖球菌（S. pneumoniae）融合タンパク質は１Ｍイミダゾール／５００ｍＭ−ＮａＣｌ−ＰＢＳ（ｐＨ７.１）により溶出した。サンプルから塩とイミダゾールを除去するために４℃でＰＢＳに対し透析した。大腸菌の可溶性フラクションから得られた融合タンパク質量はマイクロＢＣＡ（ピアース（Pierce）、ロックフォード、イリノイ）により評価した。
【０１２７】
実施例５
本実施例では免疫化による致死性連鎖球菌感染症に対するマウスの防御について説明する。
メスＢＡＬＢ／ｃマウス（チャールス・リバー）８匹の群につき、キルＡ（QuilA）アジュバント（セダーレーン（Cedarlane）ラボラトリー株式会社、ホーンバイ、カナダ）１５μｇの存在下にアフィニティ精製チオレドキシン−Ｈｉｓ・Ｔａｇ−ＢＶＨ−３融合タンパク質により、または対照としてＰＢＳ中キルＡ（QuilA）アジュバントのみにより、３週間間隔で３回皮下注射免疫した。血液サンプルは各免疫化に先立ち１日目、２２日目および４３日目、また３回目の注射７日後（５０日目）に眼窩洞から採取した。１週間後、マウスに３型肺炎連鎖球菌（S. pneumoniae）株ＷＵ２約１０６ＣＦＵをチャレンジした。肺炎連鎖球菌（S. pneumoniae）植菌サンプルをチョコレート寒天平板上に塗付し、ＣＦＵを決定し、チャレンジ用量を確認した。チャレンジ後１４日間と１４日目に死亡例を記録し、生存マウスは犠牲にして、その血液サンプルは肺炎連鎖球菌（S. pneumoniae）菌体の存在について試験した。生存データを表１に示す。
【０１２８】
チャレンジ前の血清は、肺炎連鎖球菌（S. pneumoniae）と反応する抗体が存在するか否かについて標準的免疫検定法により分析した。ＥＬＩＳＡおよび免疫ブロットでは、大腸菌により調製した組換え肺炎連鎖球菌（S. pneumoniae）タンパク質での免疫化が、組換えおよび本来の連鎖球菌タンパク質両方と反応する抗体を誘導することを示した。
表１：組換えＢＶＨ−３タンパク質が介在する防御
【表３】
【０１２９】
ＢＶＨ−３組換えタンパク質で免疫したマウスはすべて感染に対しても生存したが、アジュバントのみを投与した対照マウスに生存したものはなかった。マウス両群間の生存には有意差があった（Ｐ＜０.０００１、生存曲線の非パラメトリック分析用のログ・タンク検定；Ｐ＝０.０００２、フイッシャーの完全検定）。生存マウスからの血液培養はチャレンジ後１４日目に陰性であった。
【０１３０】
実施例６
本実施例では、多様な肺炎連鎖球菌（S. pneumoniae）株からのＢＶＨ−３およびＢＶＨ−１１遺伝子のクローニング、およびこれら遺伝子の分子保存性について記載する。
ＢＶＨ−３またはＢＶＨ−１１の異なる領域に及ぶＤＮＡプローブにより、種々の肺炎連鎖球菌（S. pneumoniae）単離体からの染色体ＤＮＡを分析した結果、ＢＶＨ−３遺伝子のコピーが１種とＢＶＨ−１１遺伝子のコピーが２種存在することが明らかになった。ＢＶＨ−１１遺伝子のコピー２種は一致せず、これらの遺伝子を任意にＢＶＨ−１１（配列番号１２；ヌクレオチド４５〜２５６７にＯＲＦ）およびＢＶＨ−１１−２（配列番号１３；ヌクレオチド１１４〜２６３０にＯＲＦ）と命名した。
【０１３１】
ＢＶＨ−３およびＢＶＨ−１１のコーディング領域最初のアミノ酸は、シグナルペプチドとしても知られるリーダー配列の特性を有する。リポタンパク質改変／プロセッシング部位の共通シグナルペプチダーゼ開裂部位Ｌ−Ｘ−Ｘ−Ｃが配列内に存在した。肺炎連鎖球菌（S. pneumoniae）ＳＰ６４からの成熟ＢＶＨ−３、ＢＶＨ−１１およびＢＶＨ−１１−２タンパク質は、それぞれ１０１９個、８２１個および８１９個のアミノ酸を有する。成熟ＢＶＨ−３、命名したＢＶＨ−３Ｍ（ヌクレオチド１８３７〜４８９６；配列番号１１）、ＢＶＨ−１１Ｍ（ヌクレオチド１０２〜２５６７；配列番号１２）、およびＢＶＨ−１１−２Ｍ（ヌクレオチド１７１〜２６３０；配列番号１３）をコードする肺炎連鎖球菌（S. pneumoniae）遺伝子の領域は、６種または７種の肺炎連鎖球菌（S. pneumoniae）株ゲノムＤＮＡからＰＣＲ（ＤＮＡサーマル・サイクラー・ジーンアンプＰＣＲシステム２４００、パーキン・エルマー（Perkin Elmer）、サンホセ（San Jose)、ＣＡ）により増幅した。血清型６の肺炎連鎖球菌（S. pneumoniae）ＳＰ６４および血清型９のＳＰ６３臨床分離株はケベック州立衛生研究所（セントアンデベレブ（Sainte-Anne-de-Bellevue)）より提供された；血清型４株ＪＮＲ.７／８７はアンドリュー・カミリー（Andrew Camilli）（タフト大学、医学部、ボストン）より提供された；Ｒｘ１株、２型株Ｄ３９の非莢膜化誘導体、および３型株Ａ６６とＷＵ２はブリルズ（David E. Briles）（アラバマ大学、バーミンガム）より提供された；また、３型臨床分離株Ｐ４２４１はラヴァル（Laval）大学施療センター、伝染病学センター（セントホイ（Sainte-Foy)）より提供された。
【０１３２】
制限部位付加のための塩基エクステンションを含むオリゴヌクレオチド・プライマー・セット、ＯＣＲＲ４７９−ＯＣＲＲ４８０、ＨＡＭＪ１６０−ＯＣＲＲ４８８およびＨＡＭＪ１６０−ＨＡＭＪ１８６は、それぞれＢＶＨ−３、ＢＶＨ−１１およびＢＶＨ−１１−２遺伝子の増幅に用いたが、例外として、ＳＰ６４株からのＢＶＨ−１１遺伝子ではＨＡＭＪ４８７およびＯＣＲＲ４８８からなるプライマー・セットを用いた。プライマー配列は下記に掲載する（表２）。ＰＣＲ産物はキアクイック（QIAquick）ゲル抽出キット（キアゲン（QIAgen）、チャッツウオース（Chatsworth)、ＣＡ）を用いてアガロースゲルから精製し、ＢglII−ＸbaＩまたはＢglII−ＨindIII（ファルマシア（Pharmacia）カナダ・インク、バイデフルフ（Baie d'Urfe)、カナダ）で消化した。消化物はキアクイック（QIAquick）ＰＣＲ精製キット（キアゲン（QIAgen）、チャッツウオース（Chatsworth)、ＣＡ）を用いて精製した。ＰＣＲ産物はＢglII−ＸbaＩまたはＢglII−ＨindIII ｐＳＬ３０１ベクターに結合した。結合産物はシマニス（Simanis）の方法（Hanahan, D. ＤＮＡクローニング、D.M. Glover (ed), pp. 109-134）に従い、大腸菌株ＤＨ５α［Ф８０ lacＺ ΔＭ１５ endＡ１ recＡ１ hsdＲ１７（ｒＫ−ｍＫ＋）supＥ４４ thi−１λ− gyrＡ９６ relＡ１ Δ（lacＺＹＡ−argＦ）Ｕ１６９］（ギブコ（Gibco）ＢＲＬ、ゲイサースバーグ（Gaithersburg）、ＭＤ）に形質転換した。
【０１３３】
ＢＶＨ−３、ＢＶＨ−１１またはＢＶＨ−１１−２を含む組換えｐＳＬ３０１プラスミド（rｐＳＬ３０１）はキアゲン（QIAgen）キット（チャッツウオース（Chatsworth)、ＣＡ）を用いて精製し、ＤＮＡ挿入断片の配列決定を実施した（タック・ダイ・デオキシ・ターミネーター・サイクル配列決定キット、ＡＢＩ、フォスター・シティ、ＣＡ）。図１１および１２は、それぞれＢＶＨ−３から確立した共通配列と、ＢＶＨ−１１の推定アミノ酸配列を描出する。ＢＶＨ−３タンパク質配列を比較すると、すべての株について配列の同一性が９９〜１００％であることが明らかとなるが、例外として、血清型９のＳＰ６３株からのＢＶＨ−３（配列番号１５および配列番号１６）は肺炎連鎖球菌（S. pneumoniae）ＳＰ６４のＢＶＨ−３’タンパク質配列上残基２４４〜４２０に相当する１７７個のアミノ酸を欠失している。さらなる血清型９株の配列を分析すると、ＢＶＨ−３分子は４株の内３株が同じ欠失を有し、この３株が肺炎連鎖球菌（S. pneumoniae）血清型９クローンのメンバーであることを示唆している。
【０１３４】
７種の肺炎連鎖球菌（S. pneumoniae）から得た１３種のＢＶＨ−１１ヌクレオチド配列を比較すると、これらヌクレオチド配列が非常によく似ていることが判明した。予測されたＢＶＨ−１１タンパク質配列を重ねて整列させ、コンピューター分析（マックベクター（MacVector）、クラスタル（Clustal）Ｗ１.４）するとこれらの配列は８３４個のアミノ酸鎖上、７５％が同一であり、８２％が相同性であると判明した。対ごとに整列すると、８０〜１００％一致することが判明した（図１３）。これらの配列は体制全体で非常によく似ていることを示した。これらタンパク質の一次配列における可変性は、該タンパク質のＣ−末端部分の最終１２５アミノ酸に殆ど限定される。この領域が一つのドメインを構成する。このドメインを精査すると、配列が２群になることが判明した。図１３から最初の９種の配列が一つの群に属し、最後の４種の配列がもう一方の群に属する。この１３種のタンパク質のドメイン配列を比較すると、３９％の同一性値が得られる（マックベクター（MacVector）、クラスタル（Clustal）Ｗ１.４）。同一群に属する配列を比較すると、同一性値は９２％を超えて増大した。
【０１３５】
実施例７
本実施例は、ＢＶＨ−３およびＢＶＨ−１１遺伝子の部分の相同性を示す。
ＢＶＨ−３およびＢＶＨ−１１遺伝子に由来するＤＮＡプローブによる分子分析は、ＢＶＨ−３およびＢＶＨ−１１に関連があることを指摘した。ドットブロットハイブリダイゼーション試験において、ＢＨＶ−３またはＢＶＨ−１１遺伝子配列のいずれかからなるＤＮＡプローブが、ＢＶＨ−３およびＢＶＨ−１１遺伝子の両方にハイブリダイズし、故に、このことは、ＢＶＨ−３およびＢＶＨ−１１遺伝子が、相同配列を持つことを指摘している。配列の比較によって、該ＯＲＦおよびタンパク質は、それぞれ４３および３３％の同一性を有することが明らかとなった。より詳しい試験によって、ＢＶＨ−３におけるアミノ酸１ないし２２５におよびＢＶＨ−１１における１ないし２２８に対応する領域は、ＤＮＡおよびタンパク質レベルで、それぞれ７３および７５％の同一性を有することが明らかとなった。これに対し、ＢＶＨ−３からのアミノ酸２２６ないし１０３９およびＢＶＨ−１１からのアミノ酸２２９ないし８４０に対応する３’領域は、ＤＮＡおよびタンパク質レベルで、それぞれ３４および２２％の同一性しかなかった。そしてＢＶＨ−３およびＢＶＨ−１１遺伝子の５’末端は、高度に保存された配列を含むようであり、一方、該遺伝子の残りの部分は、高度に分岐していた。これらの結果は、ＢＨＶ−３およびＢＶＨ−１１が、保存領域に存在する配列によって仲介される類似の機能を有しており、一方、ＢＶＨ−３およびＢＶＨ−１１特異的機能が、分岐領域における配列によって媒介されているようであることを示唆している。
【０１３６】
実施例８
本実施例は、切断ＢＶＨ−３、ＢＶＨ−１１およびＢＶＨ−１１−２遺伝子の、ポリメラーゼ連鎖反応(ＰＣＲ)によるクローニング、および切断ＢＶＨ−３およびＢＶＨ−１１分子の発現を記載する。
遺伝子フラグメントを、改変されたオリゴヌクレオチドの組を使用してＰＣＲによって増幅し、肺炎連鎖球菌(S. pneumoniae)株 SP64からのＢＶＨ−３(配列番号１および配列番号１１)、ＢＶＨ−１１(配列番号３および配列番号１２)またはＢＶＨ−１１−２(配列番号１３)遺伝子に渡るフラグメントを増幅した。各プライマーは、５’末端に制限エンドヌクレアーゼ部位を有し、それによって消化されたプラスミドベクターへの増幅産物の、方向性のインフレームのクローニングが可能となった(表２および３)。ＰＣＲ増幅産物を制限エンドヌクレアーゼによって消化し、ｐＳＬ３０１(実施例１参照)、ｐＣＭＶ−ＧＨ(実施例２参照)またはｐＥＴ(Novagen, Madison, WI)発現ベクターのいずれかの線形化されたプラスミド(同様に消化され、または矛盾しない粘着末端を生じる酵素で消化された)にライゲートした。組み換えｐＳＬ３０１および組み換えｐＣＭＶ−ＧＨプラスミドを、ｐＥＴ発現ベクターにおけるインフレームのクローニングのために、制限酵素で消化した。クローンを、切断ＢＶＨ−３またはＢＶＨ−１１分子の発現のために、E. coli BL21(λDE3)またはAD494(λDE3)へ導入する前に、最初に、E. coli DH5αにおいて安定化した。
【０１３７】
得られた各プラスミド構築物を、ヌクレオチド配列分析によって確認した。組換えタンパク質を、チオレドキシンおよびＨｉｓ・ＴａｇとのＮ末端融合として、またはＨｉｓタグとのＣ末端融合として発現させた。発現された組み換えタンパク質を、Ｈｉｓ結合金属キレート化樹脂(QIAgen, Chatsworth, CA)を使用して、超音波処理したＩＰＴＧ誘導E. coli培養物の遠心分離から得られた上精分画から精製した。生じた遺伝子産物を、表３に列挙する。シグナル配列を含むＮ末端領域に対応する遺伝子産物を、Lipidatedタンパク質またはリポタンパク質(Ｌ−タンパク質)と命名する。シグナル配列を欠いたＮ末端領域に対応する遺伝子産物を、シグナル配列を欠いたタンパク質として同定する（ｗ／ｏ ｓｓ)。
【０１３８】
【表４】
【表５】
【表６】
【０１３９】
【表７】
【表８】
【０１４０】
実施例９
本実施例は、モノクローナル抗体(Ｍａｂｓ)の単離およびＢＶＨ−３、ＢＶＨ−１１およびＢＶＨ−１１−２タンパク質エピトープを特徴付けるＭａｂｓの使用を記載する。
メスのＢＡＬＢ／ｃマウス(Charles River)を、１５μｇのQuilアジュバント(Cedarlane Lanboratories Ltd, Hornby, Canada)の存在下、肺炎連鎖球菌(肺炎連鎖球菌(S. pneumoniae)) 株 SP64からの、ＢＶＨ−３、ＢＶＨ−１１またはＢＶＨ−１１−２遺伝子産物によって皮下に免疫化した。１セットのマウス(融合実験１)を第１日および第１４日に２５μｇのアフィニティー精製チオレドキシン−Ｈｉｓ・Ｔａｇ−ＢＶＨ−３Ｍ融合タンパク質で免疫化した。マウスの第二の群(融合実験２)を、２５μｇのアフィニティー精製チオレドキシン−Ｈｉｓ・Ｔａｇ−ＢＶＨ−１１Ｍで３週間間隔で３回免疫化した。マウスの第３の群(融合実験３)を、２５μｇのアフィニティー精製チオレドキシンＨｉｓ・Ｔａｇ−ＢＶＨ−１１−２Ｍ融合タンパク質で第１日および第１５日に免疫化した。
【０１４１】
マウスの第４の群(融合実験４)を、２５μｇのアフィニティー精製チオレドキシン−Ｈｉｓ・Ｔａｇ−ＢＶＨ−１１−Ｂ融合タンパク質で第１日に免疫化し、第１６日におよび第３７日にＰＢＳ中の組み換えＢＶＨ−１１Ｂで静脈内注射によって追加免疫化した。融合の３ないし４日前に、マウスを、２５μｇの、ＰＢＳ単独中に懸濁されたそれぞれの抗原で静脈内に注射した。ハイブリドーマを、先にJ. Hamel et al. [J. Med. Microbiol., 23, pp163-170(1987)]によって記載されたように、非分泌性ＳＰ２／０ミエローマ細胞と脾臓細胞の融合によって生成した。ハイブリドーマの培養物上清を、まず、精製組換えタンパク質または熱で殺した肺炎連鎖球菌(S. pneumoniae)細胞の懸濁の製剤でコートしたプレートを使用して、Hamel et al.(前掲)によって記載の方法に従い酵素結合イムノアッセイによってスクリーニングした。次に、抗原の変化によるＥＬＩＳＡ反応に基づき選択された陽性のハイブリドーマを、限界希釈法によってクローニングし、増幅し(expand)、凍結した。
【０１４２】
ハイブリドーマを、Ｍａｂｓによって認識されるエピトープを特徴付けるために、ＢＶＨ−３およびＢＶＨ−１１遺伝子産物に対する、ＥＬＩＳＡまたはウェスタンイムノブロッティングによって試験した。ＢＶＨ−３およびＢＶＨ−１１は、６つのＭａｂｓ(Ｈ３−１−Ｆ９、Ｈ３−１−Ｄ４、Ｈ３−１−Ｈ１２、Ｈ１１−１−Ｅ７、Ｈ１１−１−Ｈ１０およびＨ１１−１．１−Ｇ１１)との共通のエピトープを有し、両方のタンパク質と反応性を示した(表４)。肺炎連鎖球菌(S. pneumoniae) SP64からのＢＶＨ−１１およびＢＶＨ−１１−２分子は、ＢＶＨ−１１およびＢＶＨ−１１−２の組換えタンパク質の両方と反応性の、ＢＶＨ−３には存在しない、Ｍａｂｓ(３Ａ１、１３Ｃ１１、１０Ｈ１０、１Ｄ８、１０Ｇ９、１０Ａ２、３Ｅ８、１０Ｄ７、２Ｈ７および６Ｈ７)との共通のエピトープを有する(表５)。
【０１４３】
【表９】
【０１４４】
【表１０】
【０１４５】
Ｍａｂｓの免疫反応性試験から得られた結果(表４および表５)は、それぞれの遺伝子配列から演繹されたタンパク質配列と一致する。実際、ＢＶＨ−３およびＢＶＨ−１１分子と交差反応性のＭａｂｓは、保存領域に対応するＢＶＨ−３Ｃタンパク質を認識し、ＢＶＨ−１１およびＢＶＨ−１１−２特異的Ｍａｂｓは、これらの分子の様々な部分に位置するエピトープと反応性であった。ＢＶＨ−３およびＢＶＨ−１１、並びにＢＶＨ−１１およびＢＶＨ−１１−２を、Ｍａｂｓとの反応性によって区別できる。
【０１４６】
実施例１０
本実施例は、肺炎連鎖球菌(S. pneumoniae)によるＢＶＨ−３およびＢＶＨ−１１遺伝子産物の同時発現を示す。
標準的ウェスタンブロット法を、ＢＶＨ−３およびＢＶＨ−１１遺伝子のどちらが肺炎連鎖球菌(S. pneumoniae)において発現されたか調査するために使用した。肺炎連鎖球菌(S. pneumoniae)株 SP64およびSP63を、チョコレートアガープレート上で、終夜３７℃で５％のＣＯ２中で成長させ、バクテリアをＰＢＳ中に懸濁し、５６℃２０分で熱で殺した。抗体の調製のために、肺炎連鎖球菌(S. pneumoniae)の懸濁を、ＳＤＳおよび２−メルカプトエタノールを含む試料バッファーで、１００℃で５分間処理した。肺炎球菌性タンパク質抗体を、Laemmli[Nature, 227, pp. 680-685(1970)]の方法に従って、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動によって分離した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥの後、該タンパク質を、ゲルからニトロセルロースペーパーに、Towbin[Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 76, pp. 4350-4354(1979)]の方法によって電気泳動的に移し、マウス抗血清またはモノクローナル抗体で探索した。
【０１４７】
抗体と反応性の抗原の検出を、接合抗マウス免疫グロブリンおよび色基質を使用する間接酵素イムノアッセイによって実施した。組み換えＢＶＨ−３に対して産生された抗血清を、肺炎連鎖球菌(S. pneumoniae)SP64抗原に対して試験したとき、１２７ｋＤａおよび９９ｋＤａの明白な分子量を有する二つの反応バンドを検出した。Ｍａｂｓ Ｈ３−１−Ｆ９、Ｈ３−１−Ｄ４、Ｈ３−１−Ｈ１２、Ｈ１１−１−Ｅ７、Ｈ１１−１−Ｈ１０およびＨ−１１−１．１−Ｇ１１をそれぞれ免疫学的プローブとして使用したとき、同じ明白な分子量を有するバンドも検出された。これに対して、ＢＶＨ−３分子に特異的なＭａｂｓは、１２７ｋＤａのバンドのみを検出し、ＢＶＨ−１１に特異的なＭａｂｓは、９９ｋＤａのバンドのみを検出し、故に、１２７および９９ｋＤａのバンドの同一性をＢＶＨ−３およびＢＶＨ−１１としてそれぞれ確認した。これらの試験は、ＢＶＨ−３およびＢＶＨ−１１タンパク質は、肺炎連鎖球菌(S. pneumoniae)に同時に存在する証拠を提供している。さらに、この結果は、ＢＶＨ−３およびＢＶＨ−１１が、両方のタンパク質に共通するエピトープ、並びにいずれかのタンパク質に限られるエピトープを有するという先の観察結果と矛盾しない。
【０１４８】
肺炎連鎖球菌(S. pneumoniae)SP64において、成熟ＢＶＨ−３、ＢＶＨ−１１およびＢＶＨ−１１−２は、それぞれ、１１２．５ｋＤａ、９２．４ｋＤａ、および９１．７ｋＤａの予想された分子量を有する、１０１９、８２１および８１９アミノ酸のタンパク質である。配列から予想された分子量およびＳＤＳ−ＰＡＧＥに基づき算出された分子量の間に不一致があるが、ＢＶＨ−３は、その高分子量によってＢＶＨ−１１から区別できる。さらに、肺炎連鎖球菌(S. pneumoniae)株 SP63からのＢＶＨ−３分子は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにおける１１２ｋＤａの明白な分子量を有し、これに対して、SP64 株のＢＶＨ−３は１２７ｋＤａである。このデータは、肺炎連鎖球菌(S. pneumoniae)株 SP63のＢＶＨ−３における１７７アミノ酸残基に及ぶ欠失と矛盾しない。
【０１４９】
実施例１１
本実施例は、組み換えＢＶＨ−３またはＢＶＨ−１１遺伝子産物でワクチン注射された、マウスの実験的な感染における、付与された防御を記載する。
７または８匹のメスのＢＡＬＢ／ｃマウス(Charles River)の群を、アフィニティー精製チオレドキシン−Ｈｉｓ・Ｔａｇ−ＢＶＨ−３Ｍ融合タンパク質、アフィニティー精製チオレドキシン−Ｈｉｓ・Ｔａｇ−ＢＶＨ−１１Ｍ融合タンパク質または、コントロールとして、ＰＢＳ中のQuilAアジュバント単独のいずれかで３週間間隔で３回皮下に免疫化した。
【０１５０】
第３の免疫化に続いて１２ないし１４日間、マウスを肺炎連鎖球菌(S. pneumoniae) WU2 株で静脈内に、またはP4241 株で鼻腔内にチャレンジした。肺炎連鎖球菌(S. pneumoniae)チャレンジ接種菌の試料を、チョコレートアガープレート上に置き、ＣＦＵを測定し、チャレンジ用量を確認した。該チャレンジ用量は、およそ１０６ＣＦＵであった。死亡を、チャレンジ後１４日の期間および第１４日に記録し、生存マウスを屠殺し、血液試料を肺炎連鎖球菌(S. pneumoniae)微生物の存在について試験した。該生存データを表６および７に示す。
【０１５１】
【表１１】
【０１５２】
【表１２】
【０１５３】
組み換えＢＶＨ−３ＭまたはＢＶＨ−１１Ｍタンパク質で免疫化されたすべてのマウスが、WU2での感染に対して生存したが、一方、アジュバント単独を与えられたコントロールのマウスは、生存しなかった。１匹を除いた、組み換えＢＶＨ−３ＭまたはＢＶＨ−１１Ｍタンパク質で免疫化されたすべてのマウスが、Ｐ４２４１での感染に対して生存したが、一方、アジュバント単独を与えられたコントロールのマウスは、１匹しか生存しなかった。生存マウスからのすべての血球培養物は、チャレンジ後の第１４日において陰性であった。これらの結果は、ＢＶＨ−３ＭおよびＢＶＨ−１１Ｍの両方が、マウスにおいて防御的な抗肺炎球菌免疫応答を誘発することを明白に指摘している。これらのタンパク質が、肺炎連鎖球菌(S. pneumoniae)分離菌の中で高度に保存されている事実は、ＢＶＨ−３およびＢＶＨ−１１の不偏的なワクチン候補としての可能性を強調している。実際、血清群６ 肺炎連鎖球菌(S. pneumoniae) 株 SP64からのＢＶＨ−３およびＢＶＨ−１１タンパク質は、様々な莢膜血清型株での肺炎球菌感染に対する防御を誘発した。
【０１５４】
理想的には、肺炎球菌性疾患に対して防御することのできるワクチンは、髄膜炎、中耳炎、菌血症および肺炎に対して防御し得る。ＢＶＨ−３およびＢＶＨ−１１は、致死の全身性および肺炎感染型に対して防御性があった。故に、ヒトにおいて、ＢＶＨ−３およびＢＶＨ１１タンパク質に基づくワクチンが、莢膜血清型に関係なく実質的にすべての肺炎連鎖球菌(S. pneumoniae)によって引き起こされる広いスペクトルの疾患の発病率を減少させ得ることを示唆している。
【０１５５】
表６および表７からのデータは、ＢＶＨ−３およびＢＶＨ−１１の両方が、肺炎連鎖球菌(S. pneumoniae)の防御誘発分子であったことを明白に示している。しかし、防御が、ＢＶＨ−３およびＢＶＨ−１１分子に共有されない特異的配列によって仲介されることができるか否かは、知られていなかった。メスのＢＡＬＢ／Ｃマウス(Charles River)の群を、１５μｇのQuilAアジュバント(Cedarlane Laboratories Ltd, Hornby, Canada)の存在下、アフィニティー精製チオレドキシン−Ｈｉｓ・Ｔａｇ−ＢＶＨ−３ＡＤ、−ＢＶＨ−３Ｂまたは−ＢＶＨ−３Ｃ融合タンパク質のいずれかによって、３週間間隔で３回、皮下に免疫化した。コントロールのマウスを、ＰＢＳ中のQuilAアジュバント単独、またはQuilAの存在下、アフィニティー精製チオレドキシン−Ｈｉｓ・Ｔａｇもしくはチオレドキシン−Ｈｉｓ・Ｔａｇ−融合タンパク質(Ｈｉｓ−Ｔｈｉｏ)で免疫化した。
【０１５６】
ＮＥＷ４、ＮＥＷ５、ＮＥＷ６、ＮＥＷ７、ＮＥＷ８、ＮＥＷ９、ＮＥＷ１０、ＮＥＷ１１、ＮＥＷ１４およびＢＶＨ−１１Ｂと命名した切断タンパク質の組の防御能を測定するために、メスのＢＡＬＢ／ｃマウス(Charles River)の群を、１５μｇのQuialAアジュバントの存在下、２５μｇのアフィニティー精製Ｈｉｓ・Ｔａｇ−融合タンパク質のいずれかで、３週間間隔で２回、皮下に免疫化した。最後の免疫化に続いて１０ないし１４日、マウスを毒性肺炎連鎖球菌(S. pneumoniae)でチャレンジした。我々の結果は、ＢＶＨ−３Ｂ(アミノ酸５１２−１０３９からなる切断ＢＶＨ−３分子)が、マウス毒性株 WU2およびP4241に対する防御を誘発したことを指摘している。
【０１５７】
同様に、ＢＶＨ−１１Ｂ、ＮＥＷ４およびＮＥＷ５分子(それぞれアミノ酸３５４−８４０、アミノ酸２８６−８４０およびアミノ酸２８６−７１３からなる３つの切断ＢＶＨ−１１分子)は、WU2での実験的な静脈内チャレンジおよびP4241での鼻腔内チャレンジに対する防御を誘発した。さらに、ＢＶＨ−１１−２分子からのアミノ酸２７２−８３８およびアミノ酸２２７−６９９からなるＮＥＷ１０およびＮＥＷ１４でのワクチン接種も、肺炎球菌株による死亡に対して防御をもたらした。これらの結果は、肺炎連鎖球菌(S. pneumoniae) SP64 ＢＶＨ−１１およびＢＶＨ−１１−２タンパク質配列におけるアミノ酸２８６−７１３およびアミノ酸２７２−６９９からの４２８アミノ酸を含む領域が、それぞれ防御的エピトープを含むことを指摘している。この領域は、１３のＢＶＨ−１１タンパク質配列の間に全体的な９１％同一性および９４％相同性を有し、高度に保存されている。
【０１５８】
【表１３】
【０１５９】
実施例１２
本実施例は、ＢＶＨ−１１のカルボキシル末端領域へのＣ’末端での融合におけるＢＶＨ−３のカルボキシル末端に対応するキメラ・ポリペプチドをエンコードするキメラ遺伝子のクローニングおよび発現並びにキメラ・ポリペプチドによるワクチン接種の後に観察された付加的な防御を記載した。
ＢＶＨ−３およびＢＶＨ−１１は、肺炎連鎖球菌(S. pneumoniae)に同時に存在する、血清的に別の分子であることは、前記で記載した研究から明白である。マウスの免疫学的研究は、両方のタンパク質が、よいワクチン候補であることを指摘している。これらのタンパク質は、血清型に関係なく、すべての肺炎球菌に対して防御を提供する可能性を有する。二つのタンパク質は、エピトープおよび配列を共有するとしても、それらは、異なる性質を有し、異なる生物学的機能を提供し得る。故に、二つのタンパク質に対する免疫化は、それぞれによって個別に分け与えられるものよりもより高いレベルの防御を提供し得る。これを試験するために、全長または切断ＢＶＨ−３およびＢＶＨ−１１を組み合わせまたは結合して投与するいくつかの達成方法が、探求されることができる。ここに、我々は、ＢＶＨ−３−ＢＶＨ−１１融合遺伝子の遺伝子操作およびＮＥＷ１２と称するタンパク質 (それぞれ配列番号７６および配列番号５８)、並びにＮＥＷ１２タンパク質のワクチンとしての可能な使用を記載する。
【０１６０】
遺伝子の３’末端に対応するＢＶＨ−３およびＢＶＨ−１１遺伝子フラグメントを、改変されたオリゴヌクレオチドの組を使用してＰＣＲによって増幅し、それぞれ肺炎連鎖球菌(S. pneumoniae) 株 SP64 ＢＶＨ−３およびＢＶＨ−１１遺伝子からの、ヌクレオチド１４１４ないし３１１７(配列番号１)およびヌクレオチド１０６０ないし２５２０(配列番号３)に渡るフラグメントを増幅した。使用したプライマー、ＨＡＭＪ２７８およびＨＡＭＪ２７９；ＨＡＭＪ２８２およびＨＡＭＪ２８３は、５’末端に制限エンドヌクレアーゼ部位を有し、それによって増幅産物の消化されたｐＥＴ２１ｂ(＋)プラスミドベクター(表２)への直接的なインフレームなクローニングが可能となった。ＰＣＲ増幅産物を制限エンドヌクレアーゼによって消化し、同様に消化した線形化されたプラスミドｐＥＴ２１ｂ(＋)ベクターにライゲートした。得られたプラスミド構築物を、ヌクレチド配列分析によって確認した。ＮｄｅＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ ＢＶＨ−３ ＰＣＲ産物を含む組換えｐＥＴ２１ｂ(＋)プラスミドを、ＢＶＨ−１１遺伝子フラグメントを含む組み換えｐＥＴ２１(＋)ベクターから得られたＨｉｎｄＩＩＩ−ＮｏｔＩ ＤＮＡフラグメントのインフレームのクローニングのために、制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩおよびＮｏｔＩでの消化によって線形化した。キメラ肺炎球菌タンパク質分子の発現のためにE.coli BL21(λDE3)に導入する前に、クローンを最初にE. coli DH5αにおいて安定化した。ＮＥＷ１２と称する組換えキメラペプチドを、Ｈｉｓ−タグとのＣ末端融合として発現させた。発現した組み換えＮＥＷ１２タンパク質を、Ｈｉｓ結合金属キレート化樹脂(QIAgen, Chatsworth, CA)を使用して、超音波処理ＩＰＴＧ誘導E. coli培養物の遠心分離から得られた上清分画から精製した。
【０１６１】
前記記載の同じ方法によって、Ｎｅｗ１およびＮｅｗ４、Ｎｅｗ１およびＮｅｗ５、Ｎｅｗ１およびＮｅｗ１０、またはＮｅｗ１およびＮｅｗ１４の同時発現の結果として、他のキメラ・ポリペプチドを構築することが可能である。該構築物は、Ｎｅｗ１と、Ｎｅｗ４、Ｎｅｗ５、Ｎｅｗ１０、ＢＶＨ−１１ＢまたはＮｅｗ１４の上流または下流へのものであることができる。ＢＶＨ−３、ＢＶＨ−１１またはＢＶＨ−１１−２のいずれかの遺伝子の二つのフラグメントより多い同時発現の結果として、他のキメラペプチドを構築することもできる。
【０１６２】
８匹のメスのＢＡＬＢ／ｃマウス(Charles River)の群を、１５μｇのQuilAアジュバントの存在下、２５μｇのアフィニティー精製Ｈｉｓ・Ｔａｇ−融合ＮＥＷ１、ＢＶＨ−１１ＢまたはＮＥＷ１２タンパク質のいずれかで、３週間間隔で２回皮下に免疫化した。最後の免疫化に続いて１０ないし１４日、マウスを毒性肺炎連鎖球菌(S. pneumoniae)でチャレンジした。前に示したように、それぞれＢＶＨ−３タンパク質からのアミノ酸４７２ないし１０３９およびＢＶＨ−１１タンパク質からのアミノ酸３５４−８４０を含む、ＮＥＷ１およびＢＶＨ−１１Ｂ分子は、防御免疫反応を誘発することのできるタンパク質の一部に対応した。
【０１６３】
キメラ・ポリペプチドが、それぞれの対応するものについて見られるものと比較して、有意に防御を向上させることができるかどうか決定するために、チャレンジ用量を、ＮＥＷ１およびＢＶＨ−１１Ｂ分子によって防御が期待されないように、調節した。興味深いことに、該キメラＮＥＷ１２タンパク質は、マウス毒性株WU2およびP4241に対する防御を誘発した。ＮＥＷ１２で免疫化した８匹のうち７匹のマウスが、チャレンジの10日後なお生存し、一方、ＮＥＷ１、ＢＶＨ−１１Ｂ、ＢＶＨ−３Ｍまたはアジュバント単独で免疫化した３２匹のマウスのうち２８匹が、チャレンジ後５日までに死亡した。故に、ＮＥＷ１２でのマウスのワクチン接種は、WU2チャレンジに対する最高の程度の防御を提供した。これらの結果は、キメラ・ポリペプチドでの免疫化およびあるいはＢＶＨ−３およびＢＶＨ−１１遺伝子産物の組み合わせが、ＢＶＨ−３またはＢＶＨ−１１抗原単独の投与によって取得されたものに付加的な防御を提供することのできることを指摘している。
【０１６４】
【表１４】
【０１６５】
実施例１３
本実施例は、S.pneumoniaeのほかの連鎖球菌種における付加的なＢＶＨ−３およびＢＶＨ−１１関連配列の同定を示す。
ＢＶＨ−３、ＢＶＨ−１１およびＢＶＨ−１１−２は、共通配列を共に有する関連するタンパク質のファミリーであることを前記で示した。相同性の探索を、これらの遺伝子の保存領域からのヌクレオチド配列で実施し、ＦＡＳＴＡを使用して、GenBankおよびＥＭＢＬ配列と比較した。最も有意な相同性が、Ｂ群連鎖球菌またはＧＢＳとも称されるS. agalactiaeにおける未知の機能の算出された９２ｋＤａのタンパク質(配列番号８１)をコードする２．４６９ｋｂの遺伝子との間に観察された。これらの遺伝子をＢＶＨ−７１と命名した。ＧＢＳのものと９９．２％の同一性および９９．５％の類似性を示すタンパク質も、Ａ群連鎖球菌またはＧＡＳとも称されるS. pyogenesにおいて同定した(配列番号８３)。ＢＶＨ−７１配列の５’領域(配列番号８０および配列番号８２)は、ヌクレオチド１ないし７１７におよび、それぞれＢＶＨ−３(ヌクレオチド１ないし６７５)およびＢＶＨ−１１(ヌクレオチド１ないし６８４)遺伝子の保存領域と５８および６０％の同一性を示した。
【０１６６】
ＧＢＳおよびＧＡＳのＢＶＨ−７１オープンリーディングフレームの翻訳された配列の最初の２３９アミノ酸は、それぞれ、ＢＶＨ−３およびＢＶＨ−１１の最初の２２５および２２８アミノ酸と５１および５４％の同一性があった。構造上の類似性に加えて、連鎖球菌のＢＶＨ−３、ＢＶＨ−１１およびＢＶＨ−７１タンパク質は、抗原性エピトープも共有している。９７ｋＤａのバンドが、ＢＶＨ−３およびＢＶＨ−１１保存領域と反応性のあるＭａｂｓ Ｈ１１−１．１−Ｇ１１を使用して、ＧＡＳまたはＧＢＳ全細胞のウェスタンブロットにおいて明らかになった。同様に、ＧＡＳおよびＧＢＳ組み換えＢＶＨ−７１タンパク質をウェスタンイムノブロット分析において検出した。
これらの結果は、ＢＶＨ−７１、ＢＶＨ−３およびＢＶＨ−１１タンパク質が、同様の機能を共有していることを指摘している。我々の結果は、ＢＶＨ−７１タンパク質を、抗連鎖球菌のタンパク質ワクチン構成成分として使用できることも示唆している。さらなる実施態様において、ＢＶＨ−７１タンパク質を、抗ＧＡＳまたは抗ＧＢＳワクチンのタンパク質ワクチン構成成分として使用できる。
【技術分野】
【０００１】
本発明は抗原に関し、より詳しくは、治療および／または予防用ワクチン成分として有用な肺炎連鎖球菌（Streptococcus pneumoniae）病原のタンパク質抗原に関する。
【背景技術】
【０００２】
肺炎連鎖球菌（S. pneumoniae）はヒト、取分け乳児、初老の免疫無防備状態者における疾患の重要な作因である。肺炎連鎖球菌は菌血症／敗血症、肺炎、髄膜炎などの浸襲性疾患患者から多くの場合単離されるバクテリアであり、世界中で高い罹患率と死亡率を有している。適切な抗生物質療法をもってしてさえ、肺炎球菌感染症は今なお多くの死を招いている。抗菌剤類の出現が全体として肺炎球菌疾患の死亡率を低下させはしたが、耐性肺炎球菌体の存在が今日世界の主要な問題となっている。有効な肺炎球菌ワクチンは肺炎連鎖球菌（S. pneumoniae）と関連する罹患率と死亡率に大きな衝撃を与えることができるに違いない。かかるワクチンはまた乳児と幼児の中耳炎の予防に有用となる可能性がある。
【０００３】
肺炎球菌ワクチン開発の努力は主に肺炎球菌の莢膜多糖に免疫応答を生じさせることに集中している。８０種を超える肺炎球菌莢膜血清型が抗原性の差に基づき同定されている。現在入手可能な肺炎球菌ワクチンは、最も頻繁に疾患の原因となる２３種の莢膜多糖を含んでなるが、ある種莢膜多糖の免疫原性が弱いこと、血清型が多様であること、および経時的に、地理的に、また年齢群により血清型の分布に差のあることなどと主として関連する重要な欠点がある。特に、既存のワクチンと現在開発中の莢膜接合ワクチンはすべての血清型に対し幼児を守りきれないということが、他の肺炎連鎖球菌（S. pneumoniae）成分の評価に駆り立てている。莢膜多糖の免疫原性を改善することはできるが、血清型の特異性がなお多糖をベースとするワクチンの主たる限界となっている。抗原性を保持した免疫原性肺炎球菌タンパク質抗原をそれ自体または他の成分と組合わせて使用することが、タンパク質をベースとする肺炎球菌ワクチンの可能性を提供する。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
発明の名称“肺炎連鎖球菌抗原およびワクチン（Streptococcus pneumoniae antigen and vaccines）”として１９９８年５月７日に公開されたＰＣＴ公開番号ＷＯ９８／１８９３０はある種のポリペプチドを記載し、抗原として請求している。しかし、これらのポリペプチドの生物活性については何ら報告がない。
【０００５】
従って、連鎖球菌感染症の予防および／治療用ワクチン成分として使用し得る連鎖球菌抗原について不適切な面についてはなお必要性が残されている。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
一側面によると、本発明は配列番号２、４、６、８、１０、１４、１６、５５〜７５、７７〜７９、８１、８３またはそのフラグメント、類似体または誘導体から選択される配列を含んでなる第二のポリペプチドに少なくとも７０％の同一性を有するポリペプチドをエンコードする単離体ポリヌクレオチドを提供する。
【０００７】
他の側面によると、発現制御領域に操作可能に結合した本発明ポリヌクレオチドを含んでなるベクター、並びに当該ベクターを移入した宿主細胞および当該宿主細胞を発現に適した条件下に培養することを含んでなるポリペプチドの製造法が提供される。
さらに他の側面においては、本発明のポリヌクレオチドがエンコードする新規のポリペプチドが提供される。
【図面の簡単な説明】
【０００８】
【図１】図１はＢＶＨ−３遺伝子のＤＮＡ配列である；配列番号１。
【図２】図２はＢＶＨ−３タンパク質のアミノ酸配列である；配列番号２。
【図３】図３はＢＶＨ−１１遺伝子のＤＮＡ配列である；配列番号３。
【図４】図４はＢＶＨ−１１タンパク質のアミノ酸配列である；配列番号４。
【図５】図５はＢＶＨ−２８遺伝子のＤＮＡ配列である；配列番号５。
【図６】図６はＢＶＨ−２８タンパク質のアミノ酸配列である；配列番号６。
【図７】図７はＢＶＨ−３Ａ遺伝子のＤＮＡ配列であり、ＢＶＨ−３の５’末端に相当する；配列番号７。
【図８】図８はＢＶＨ−３Ａタンパク質のアミノ酸配列である；配列番号８。
【図９】図９はＢＶＨ−３Ｂ遺伝子のＤＮＡ配列であり、ＢＶＨ−３の３’末端に相当する；配列番号９。
【図１０】図１０はＢＶＨ−３Ｂタンパク質のアミノ酸配列である；配列番号１０。
【図１１−１】図１１−１はマックベクター（MacVector）配列分析ソフトウエア（バージョン６.５）からのプログラム・クラスタル（Clustal）Ｗを使用して、ＷＵ２、ＲＸ１、ＪＮＲ.７／８７、ＳＰ６４、Ｐ４２４１およびＡ６６肺炎連鎖球菌（S. pneumoniae）株から予測されるＢＶＨ−３オープンリーディングフレームのアミノ酸配列を比較描出したものである。整列させた配列の下に共通列があるが、記号＊および・はそれぞれアミノ酸残基が同一または類似であることを示す。
【図１１−２】図１１−２はマックベクター（MacVector）配列分析ソフトウエア（バージョン６.５）からのプログラム・クラスタル（Clustal）Ｗを使用して、ＷＵ２、ＲＸ１、ＪＮＲ.７／８７、ＳＰ６４、Ｐ４２４１およびＡ６６肺炎連鎖球菌（S. pneumoniae）株から予測されるＢＶＨ−３オープンリーディングフレームのアミノ酸配列を比較描出したものである。整列させた配列の下に共通列があるが、記号＊および・はそれぞれアミノ酸残基が同一または類似であることを示す。
【図１２−１】図１２−１はマックベクター（MacVector）配列分析ソフトウエア（バージョン６.５）からのプログラム・クラスタル（Clustal）Ｗを使用して、ＷＵ２、ＲＸ１、ＪＮＲ.７／８７、ＳＰ６４、Ｐ４２４１、Ａ６６およびＳＰ６３肺炎連鎖球菌（S. pneumoniae）株から予測されるＢＶＨ−１１オープンリーディングフレームのアミノ酸配列を比較描出したものである。整列させた配列の下に共通列があるが、記号＊および・はそれぞれアミノ酸残基が同一または類似であることを示す。
【図１２−２】図１２−２はマックベクター（MacVector）配列分析ソフトウエア（バージョン６.５）からのプログラム・クラスタル（Clustal）Ｗを使用して、ＷＵ２、ＲＸ１、ＪＮＲ.７／８７、ＳＰ６４、Ｐ４２４１、Ａ６６およびＳＰ６３肺炎連鎖球菌（S. pneumoniae）株から予測されるＢＶＨ−１１オープンリーディングフレームのアミノ酸配列を比較描出したものである。整列させた配列の下に共通列があるが、記号＊および・はそれぞれアミノ酸残基が同一または類似であることを示す。
【図１２−３】図１２−３はマックベクター（MacVector）配列分析ソフトウエア（バージョン６.５）からのプログラム・クラスタル（Clustal）Ｗを使用して、ＷＵ２、ＲＸ１、ＪＮＲ.７／８７、ＳＰ６４、Ｐ４２４１、Ａ６６およびＳＰ６３肺炎連鎖球菌（S. pneumoniae）株から予測されるＢＶＨ−１１オープンリーディングフレームのアミノ酸配列を比較描出したものである。整列させた配列の下に共通列があるが、記号＊および・はそれぞれアミノ酸残基が同一または類似であることを示す。
【図１２−４】図１２−４はマックベクター（MacVector）配列分析ソフトウエア（バージョン６.５）からのプログラム・クラスタル（Clustal）Ｗを使用して、ＷＵ２、ＲＸ１、ＪＮＲ.７／８７、ＳＰ６４、Ｐ４２４１、Ａ６６およびＳＰ６３肺炎連鎖球菌（S. pneumoniae）株から予測されるＢＶＨ−１１オープンリーディングフレームのアミノ酸配列を比較描出したものである。整列させた配列の下に共通列があるが、記号＊および・はそれぞれアミノ酸残基が同一または類似であることを示す。
【図１３】図１３は種々の肺炎連鎖球菌（S. pneumoniae）株から予測されるＢＶＨ−１１タンパク質のアミノ酸配列を比較描出したものである。同一性（Ｉ）および類似性（Ｓ）の度合いはマックベクター（MacVector）配列分析ソフトウエア（バージョン６.５）からのプログラム・クラスタル（Clustal）Ｗを使用して決定した。
【図１４−１】図１４−１は完全ＢＶＨ−３遺伝子を含むＤＮＡ配列である（ヌクレオチド１７７７〜４８９６にオープンリーディングフレーム“ＯＲＦ”）；配列番号１１。
【図１４−２】図１４−２は完全ＢＶＨ−３遺伝子を含むＤＮＡ配列である（ヌクレオチド１７７７〜４８９６にオープンリーディングフレーム“ＯＲＦ”）；配列番号１１。
【図１５】図１５は完全ＢＶＨ−１１遺伝子を含むＤＮＡ配列である（ヌクレオチド４５〜２５６７にＯＲＦ）；配列番号１２。
【図１６】図１６は完全ＢＶＨ−１１−２遺伝子を含むＤＮＡ配列である（ヌクレオチド１１４〜２６３０にＯＲＦ）；配列番号１３。
【図１７】図１７はＢＶＨ−１１−２タンパク質のアミノ酸配列である；配列番号１４。
【図１８】図１８はＳＰ６３ ＢＶＨ−３遺伝子のＤＮＡ配列である；配列番号１５。
【図１９】図１９はＳＰ６３ ＢＶＨ−３タンパク質のアミノ酸配列である；配列番号１６。
【図２０】図２０はＢＶＨ−３Ｍタンパク質のアミノ酸配列である；配列番号５５。
【図２１】図２１はＢＶＨ−３ＡＤタンパク質のアミノ酸配列である；配列番号５６。
【図２２】図２２はＬ−ＢＶＨ−３−ＡＤタンパク質のアミノ酸配列である；配列番号５７。
【図２３】図２３はＮＥＷ１２タンパク質のアミノ酸配列である；配列番号５８。
【図２４】図２４はＢＶＨ−３Ｃタンパク質のアミノ酸配列である；配列番号５９。
【図２５】図２５はＢＶＨ−１１Ｍタンパク質のアミノ酸配列である；配列番号６０。
【図２６】図２６はＢＶＨ−１１Ａタンパク質のアミノ酸配列である；配列番号６１。
【図２７】図２７はＢＶＨ−１１Ｂ（Ｎｅｗ１３とも呼称）タンパク質のアミノ酸配列である；配列番号６２。
【図２８】図２８はＢＶＨ−１１Ｃタンパク質のアミノ酸配列である；配列番号６３。
【図２９】図２９はＮＥＷ１タンパク質のアミノ酸配列である；配列番号６４。
【図３０】図３０はＮＥＷ２タンパク質のアミノ酸配列である；配列番号６５。
【図３１】図３１はＮＥＷ３タンパク質のアミノ酸配列である；配列番号６６。
【図３２】図３２はＮＥＷ４タンパク質のアミノ酸配列である；配列番号６７。
【図３３】図３３はＮＥＷ５タンパク質のアミノ酸配列である；配列番号６８。
【図３４】図３４はＮＥＷ６タンパク質のアミノ酸配列である；配列番号６９。
【図３５】図３５はＮＥＷ７タンパク質のアミノ酸配列である；配列番号７０。
【図３６】図３６はＮＥＷ８タンパク質のアミノ酸配列である；配列番号７１。
【図３７】図３７はＮＥＷ９タンパク質のアミノ酸配列である；配列番号７２。
【図３８】図３８はＢＶＨ−１１−２Ｍタンパク質のアミノ酸配列である；配列番号７３。
【図３９】図３９はＮＥＷ１０タンパク質のアミノ酸配列である；配列番号７４。
【図４０】図４０はＮＥＷ１１タンパク質のアミノ酸配列である；配列番号７５。
【図４１】図４１はＮＥＷ２１遺伝子のＤＮＡ配列である；配列番号７６。
【図４２】図４２はＮＥＷ１４タンパク質のアミノ酸配列である；配列番号７７。
【図４３】図４３はＮＥＷ１５タンパク質のアミノ酸配列である；配列番号７８。
【図４４】図４４はＮＥＷ１６タンパク質のアミノ酸配列である；配列番号７９。
【図４５】図４５はＧＢＳ ＢＶＨ−７１遺伝子のＤＮＡ配列である；配列番号８０。
【図４６】図４６はＧＢＳ ＢＶＨ−７１タンパク質のアミノ酸配列である；配列番号８１。
【図４７】図４７はＧＡＳ ＢＶＨ−７１遺伝子のＤＮＡ配列である；配列番号８２。
【図４８】図４８はＧＡＳ ＢＶＨ−７１タンパク質のアミノ酸配列である；配列番号８３。
【発明を実施するための形態】
【０００９】
一側面によると、本発明は配列番号２、４、６、８、１０、１４、１６、５５〜７５、７７〜７９、８１、８３またはそのフラグメント、類似体または誘導体から選択される配列を含んでなる第二のポリペプチドに少なくとも７０％の同一性を有するポリペプチドをエンコードする単離体ポリヌクレオチドを提供する。
【００１０】
一側面によると、本発明は配列番号２、４、６、８、１０、１４、１６、５５〜７５、７７〜７９、８１、８３またはそのフラグメント、類似体または誘導体から選択される配列を含んでなる第二のポリペプチドに少なくとも９５％の同一性を有するポリペプチドをエンコードする単離体ポリヌクレオチドを提供する。
【００１１】
一側面によると、本発明は配列番号２、４、８、１０、１４、１６、５５〜７５、７７〜７９、８１、８３またはそのフラグメント、類似体または誘導体から選択される配列を含んでなる第二のポリペプチドに少なくとも７０％の同一性を有するポリペプチドをエンコードする単離体ポリヌクレオチドを提供する。
【００１２】
一側面によると、本発明は配列番号２、４、１０、１４、１６、５５〜７５、７７〜７９、８１、８３またはそのフラグメント、類似体または誘導体から選択される配列を含んでなる第二のポリペプチドに少なくとも７０％の同一性を有するポリペプチドをエンコードする単離体ポリヌクレオチドを提供する。
【００１３】
一側面によると、本発明は配列番号２、４、８、１０、１４、１６、５５〜７５、７７〜７９またはそのフラグメント、類似体または誘導体から選択される配列を含んでなる第二のポリペプチドに少なくとも７０％の同一性を有するポリペプチドをエンコードする単離体ポリヌクレオチドを提供する。
【００１４】
一側面によると、本発明は配列番号２、８、１０、１６、５５、５６、５７、５８、５９、６４、６５、６６、７８またはそのフラグメント、類似体または誘導体から選択される配列を含んでなる第二のポリペプチドに少なくとも７０％の同一性を有するポリペプチドをエンコードする単離体ポリヌクレオチドを提供する。
【００１５】
一側面によると、本発明は配列番号２、８、１０、１６、５５、５６、５７、５９、６４、６５、６６、７８またはそのフラグメント、類似体または誘導体から選択される配列を含んでなる第二のポリペプチドに少なくとも７０％の同一性を有するポリペプチドをエンコードする単離体ポリヌクレオチドを提供する。
【００１６】
一側面によると、本発明は配列番号４、１４、５８、６０、６１、６２、６３、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７７、７９またはそのフラグメント、類似体または誘導体から選択される配列を含んでなる第二のポリペプチドに少なくとも７０％の同一性を有するポリペプチドをエンコードする単離体ポリヌクレオチドを提供する。
【００１７】
一側面によると、本発明は配列番号４、１４、６０、６１、６２、６３、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７７、７９またはそのフラグメント、類似体または誘導体から選択される配列を含んでなる第二のポリペプチドに少なくとも７０％の同一性を有するポリペプチドをエンコードする単離体ポリヌクレオチドを提供する。
【００１８】
一側面によると、本発明は配列番号２、４、１０、１４、１６、５５〜７５、７７〜７９またはそのフラグメント、類似体または誘導体から選択される配列を含んでなる第二のポリペプチドに少なくとも７０％の同一性を有するポリペプチドをエンコードする単離体ポリヌクレオチドを提供する。
【００１９】
一側面によると、本発明は配列番号１０、５５〜７５、７７、７８、７９またはそのフラグメント、類似体または誘導体から選択される配列を含んでなる第二のポリペプチドに少なくとも７０％の同一性を有するポリペプチドをエンコードする単離体ポリヌクレオチドを提供する。
【００２０】
一側面によると、本発明は配列番号５５〜７５、７７、７８、７９またはそのフラグメント、類似体または誘導体から選択される配列を含んでなる第二のポリペプチドに少なくとも７０％の同一性を有するポリペプチドをエンコードする単離体ポリヌクレオチドを提供する。
【００２１】
一側面によると、本発明は配列番号２、４、６、８、１０またはそのフラグメント、類似体または誘導体から選択される配列を含んでなる第二のポリペプチドに少なくとも７０％の同一性を有するポリペプチドをエンコードする単離体ポリヌクレオチドを提供する。
【００２２】
一側面によると、本発明は配列番号２、４、１０、１４、１６またはそのフラグメント、類似体または誘導体から選択される配列を含んでなる第二のポリペプチドに少なくとも７０％の同一性を有するポリペプチドをエンコードする単離体ポリヌクレオチドを提供する。
【００２３】
一側面によると、本発明は配列番号２、４、１４、１６またはそのフラグメント、類似体または誘導体から選択される配列を含んでなる第二のポリペプチドに少なくとも７０％の同一性を有するポリペプチドをエンコードする単離体ポリヌクレオチドを提供する。
【００２４】
一側面によると、本発明は配列番号２の配列またはそのフラグメント、類似体または誘導体を含んでなる第二のポリペプチドに少なくとも７０％の同一性を有するポリペプチドをエンコードする単離体ポリヌクレオチドを提供する。
【００２５】
一側面によると、本発明は配列番号４の配列またはそのフラグメント、類似体または誘導体を含んでなる第二のポリペプチドに少なくとも７０％の同一性を有するポリペプチドをエンコードする単離体ポリヌクレオチドを提供する。
【００２６】
一側面によると、本発明は配列番号１０の配列またはそのフラグメント、類似体または誘導体を含んでなる第二のポリペプチドに少なくとも７０％の同一性を有するポリペプチドをエンコードする単離体ポリヌクレオチドを提供する。
【００２７】
一側面によると、本発明は配列番号１４の配列またはそのフラグメント、類似体または誘導体を含んでなる第二のポリペプチドに少なくとも７０％の同一性を有するポリペプチドをエンコードする単離体ポリヌクレオチドを提供する。
【００２８】
一側面によると、本発明は配列番号１６の配列またはそのフラグメント、類似体または誘導体を含んでなる第二のポリペプチドに少なくとも７０％の同一性を有するポリペプチドをエンコードする単離体ポリヌクレオチドを提供する。
【００２９】
一側面によると、本発明は配列番号５８の配列またはそのフラグメント、類似体または誘導体を含んでなる第二のポリペプチドに少なくとも７０％の同一性を有するポリペプチドをエンコードする単離体ポリヌクレオチドを提供する。
【００３０】
一側面によると、本発明は配列番号６０の配列またはそのフラグメント、類似体または誘導体を含んでなる第二のポリペプチドに少なくとも７０％の同一性を有するポリペプチドをエンコードする単離体ポリヌクレオチドを提供する。
【００３１】
一側面によると、本発明は配列番号６２の配列またはそのフラグメント、類似体または誘導体を含んでなる第二のポリペプチドに少なくとも７０％の同一性を有するポリペプチドをエンコードする単離体ポリヌクレオチドを提供する。
【００３２】
一側面によると、本発明は配列番号６４の配列またはそのフラグメント、類似体または誘導体を含んでなる第二のポリペプチドに少なくとも７０％の同一性を有するポリペプチドをエンコードする単離体ポリヌクレオチドを提供する。
【００３３】
一側面によると、本発明は配列番号６７の配列またはそのフラグメント、類似体または誘導体を含んでなる第二のポリペプチドに少なくとも７０％の同一性を有するポリペプチドをエンコードする単離体ポリヌクレオチドを提供する。
【００３４】
一側面によると、本発明は配列番号６８の配列またはそのフラグメント、類似体または誘導体を含んでなる第二のポリペプチドに少なくとも７０％の同一性を有するポリペプチドをエンコードする単離体ポリヌクレオチドを提供する。
【００３５】
一側面によると、本発明は配列番号６９の配列またはそのフラグメント、類似体または誘導体を含んでなる第二のポリペプチドに少なくとも７０％の同一性を有するポリペプチドをエンコードする単離体ポリヌクレオチドを提供する。
【００３６】
一側面によると、本発明は配列番号７２の配列またはそのフラグメント、類似体または誘導体を含んでなる第二のポリペプチドに少なくとも７０％の同一性を有するポリペプチドをエンコードする単離体ポリヌクレオチドを提供する。
【００３７】
一側面によると、本発明は配列番号７４またはそのフラグメント、類似体または誘導体の配列を含んでなる第二のポリペプチドに少なくとも７０％の同一性を有するポリペプチドをエンコードする単離体ポリヌクレオチドを提供する。
【００３８】
一側面によると、本発明は配列番号７７の配列またはそのフラグメント、類似体または誘導体を含んでなる第二のポリペプチドに少なくとも７０％の同一性を有するポリペプチドをエンコードする単離体ポリヌクレオチドを提供する。
【００３９】
一側面によると、本発明は配列番号２、４、６、８、１０またはそのフラグメント、類似体または誘導体から選択されるアミノ酸配列により特徴づけられるポリペプチドに関する。
【００４０】
一側面によると、本発明は配列番号２、４、６、８、１０、１４、１６、５５〜７５、７７〜７９、８１、８３またはそのフラグメント、類似体または誘導体から選択されるアミノ酸配列により特徴づけられるポリペプチドに関する。
【００４１】
一側面によると、本発明は配列番号２、４、８、１０、１４、１６、５５〜７５、７７〜７９、８１、８３またはそのフラグメント、類似体または誘導体から選択されるアミノ酸配列により特徴づけられるポリペプチドに関する。
【００４２】
一側面によると、本発明は配列番号２、４、１０、１４、１６、５５〜７５、７７〜７９、８１、８３またはそのフラグメント、類似体または誘導体から選択されるアミノ酸配列により特徴づけられるポリペプチドに関する。
【００４３】
一側面によると、本発明は配列番号２、４、８、１０、１４、１６、５５〜７５、７７〜７９またはそのフラグメント、類似体または誘導体から選択されるアミノ酸配列により特徴づけられるポリペプチドに関する。
【００４４】
一側面によると、本発明は配列番号２、４、１０、１４、１６、５５〜７５、７７〜７９またはそのフラグメント、類似体または誘導体から選択されるアミノ酸配列により特徴づけられるポリペプチドに関する。
【００４５】
一側面によると、本発明は配列番号２、４、１０、１４、１６またはそのフラグメント、類似体または誘導体から選択されるアミノ酸配列により特徴づけられるポリペプチドに関する。
【００４６】
一側面によると、本発明は配列番号２またはそのフラグメント、類似体または誘導体から選択されるアミノ酸配列により特徴づけられるポリペプチドに関する。
【００４７】
一側面によると、本発明は配列番号４の配列またはそのフラグメント、類似体または誘導体を含んでなるアミノ酸配列により特徴づけられるポリペプチドに関する。
【００４８】
一側面によると、本発明は配列番号１０またはそのフラグメント、類似体または誘導体の配列を含んでなるアミノ酸配列により特徴づけられるポリペプチドに関する。
【００４９】
一側面によると、本発明は配列番号１４の配列またはそのフラグメント、類似体または誘導体を含んでなるアミノ酸配列により特徴づけられるポリペプチドに関する。
【００５０】
一側面によると、本発明は配列番号１６の配列またはそのフラグメント、類似体または誘導体を含んでなるアミノ酸配列により特徴づけられるポリペプチドに関する。
【００５１】
一側面によると、本発明は配列番号１０、５５〜７５、７７、７８、７９またはそのフラグメント、類似体または誘導体から選択されるアミノ酸配列により特徴づけられるポリペプチドに関する。
【００５２】
一側面によると、本発明は配列番号１０、５８、６０、６２、６４、６７、６８、６９、７２、７４、７７またはそのフラグメント、類似体または誘導体から選択されるアミノ酸配列により特徴づけられるポリペプチドに関する。
【００５３】
一側面によると、本発明は配列番号１０、５８、６０、６２、６４、６７、６８、６９、７２、７４、７７またはそのフラグメント、類似体または誘導体から選択されるアミノ酸配列により特徴づけられるポリペプチドに関する。
【００５４】
一側面によると、本発明は配列番号１０、５８、６０、６２、６４、６７、６８、６９、７２、７４、７７またはそのフラグメント、類似体または誘導体から選択されるアミノ酸配列により特徴づけられるポリペプチドに関する。
【００５５】
一側面によると、本発明は配列番号１０、６２、６４、６７、６８、７４、７７またはそのフラグメント、類似体または誘導体から選択されるアミノ酸配列により特徴づけられるポリペプチドに関する。
【００５６】
一側面によると、本発明は配列番号５８の配列またはそのフラグメント、類似体または誘導体を含んでなるアミノ酸配列により特徴づけられるポリペプチドに関する。
【００５７】
一側面によると、本発明は配列番号６２またはそのフラグメント、類似体または誘導体の配列を含んでなるアミノ酸配列により特徴づけられるポリペプチドに関する。
【００５８】
一側面によると、本発明は配列番号６４の配列またはそのフラグメント、類似体または誘導体を含んでなるアミノ酸配列により特徴づけられるポリペプチドに関する。
【００５９】
一側面によると、本発明は配列番号６７の配列またはそのフラグメント、類似体または誘導体を含んでなるアミノ酸配列により特徴づけられるポリペプチドに関する。
【００６０】
一側面によると、本発明は配列番号６８の配列またはそのフラグメント、類似体または誘導体を含んでなるアミノ酸配列により特徴づけられるポリペプチドに関する。
【００６１】
一側面によると、本発明は配列番号７４の配列またはそのフラグメント、類似体または誘導体を含んでなるアミノ酸配列により特徴づけられるポリペプチドに関する。
【００６２】
一側面によると、本発明は配列番号７７の配列またはそのフラグメント、類似体または誘導体を含んでなるアミノ酸配列により特徴づけられるポリペプチドに関する。
【００６３】
さらなる態様において、本発明はまた本出願に記載の１種またはそれ以上のポリペプチド、またはそのフラグメント、類似体または誘導体を含んでなるキメラ・ポリペプチドに関する。
【００６４】
さらなる態様において、本発明はまた本発明の図面に定義した１種またはそれ以上のポリペプチド、またはそのフラグメント、類似体または誘導体を含んでなるキメラ・ポリペプチドに関する。
【００６５】
さらなる態様において、本発明はまた配列番号２、４、６、８、１０、１４、１６、５５〜７５、７７〜７９、８１、８３から選択される１種またはそれ以上のポリペプチド、またはそのフラグメント、類似体または誘導体を含んでなるキメラ・ポリペプチドに関する；ただし、該ポリペプチドまたはそのフラグメント、類似体または誘導体はキメラ・ポリペプチドを形成するように結合する。
【００６６】
さらなる態様において、該キメラ・ポリペプチドは配列番号１０、５８、６０、６２、６４、６７、６８、６９、７２、７４、７７から選択される１種またはそれ以上のポリペプチド、またはそのフラグメント、類似体または誘導体を含んでなる；ただし、該ポリペプチドまたはそのフラグメント、類似体または誘導体はキメラ・ポリペプチドを形成するように結合する。
【００６７】
さらなる態様において、該キメラ・ポリペプチドは配列番号１０、５８、６０、６２、６４、６７、６８、７４、７７から選択される１種またはそれ以上のポリペプチド、またはそのフラグメント、類似体または誘導体を含んでなる；ただし、該ポリペプチドまたはそのフラグメント、類似体または誘導体はキメラ・ポリペプチドを形成するように結合する。
【００６８】
さらなる態様において、該キメラ・ポリペプチドは配列番号１０、６２、６４、６７、６８、７４、７７から選択される１種またはそれ以上のポリペプチド、またはそのフラグメント、類似体または誘導体を含んでなる；ただし、該ポリペプチドまたはそのフラグメント、類似体または誘導体はキメラ・ポリペプチドを形成するように結合する。
【００６９】
さらなる態様において、該キメラ・ポリペプチドは２ないし５個のポリペプチドを含んでなる。
さらなる態様において、該キメラ・ポリペプチドは２ないし４個のポリペプチドを含んでなる。
さらなる態様において、該キメラ・ポリペプチドは２ないし３個のポリペプチドを含んでなる。
さらなる態様において、該キメラ・ポリペプチドは２個のポリペプチドを含んでなる。
【００７０】
さらなる態様においては、式（Ｉ）：
Ａ−(Ｂ)ｍ−(Ｃ)ｎ−Ｄ （Ｉ）
ただし、
ｍは０または１である；
ｎは０または１である；
Ａは配列番号２、４、６、８、１０、１４、１６、５５〜７５、７７〜７９、８１、８３またはそのフラグメント、類似体または誘導体から選択される；
Ｂは配列番号２、４、６、８、１０、１４、１６、５５〜７５、７７〜７９、８１、８３またはそのフラグメント、類似体または誘導体から選択される；
Ｃは配列番号２、４、６、８、１０、１４、１６、５５〜７５、７７〜７９、８１、８３またはそのフラグメント、類似体または誘導体から選択される；および
Ｄは配列番号２、４、６、８、１０、１４、１６、５５〜７５、７７〜７９、８１、８３またはそのフラグメント、類似体または誘導体から選択される；
で示されるキメラ・ポリペプチドが提供される。
【００７１】
さらなる態様において、
Ａは配列番号１０、５８、６０、６２、６４、６７、６８、６９、７２、７４、７７またはそのフラグメント、類似体または誘導体から選択される；
Ｂは配列番号１０、５８、６０、６２、６４、６７、６８、６９、７２、７４、７７またはそのフラグメント、類似体または誘導体から選択される；
Ｃは配列番号１０、５８、６０、６２、６４、６７、６８、６９、７２、７４、７７またはそのフラグメント、類似体または誘導体から選択される；および
Ｄは配列番号１０、５８、６０、６２、６４、６７、６８、６９、７２、７４、７７またはそのフラグメント、類似体または誘導体から選択される。
【００７２】
さらなる態様において、
Ａは配列番号１０、５８、６０、６２、６４、６７、６８、７４、７７またはそのフラグメント、類似体または誘導体から選択される；
Ｂは配列番号１０、５８、６０、６２、６４、６７、６８、７４、７７またはそのフラグメント、類似体または誘導体から選択される；
Ｃは配列番号１０、５８、６０、６２、６４、６７、６８、７４、７７またはそのフラグメント、類似体または誘導体から選択される；および
Ｄは配列番号１０、５８、６０、６２、６４、６７、６８、７４、７７またはそのフラグメント、類似体または誘導体から選択される。
【００７３】
一態様において、本発明のキメラ・ポリペプチドは独立してまたは組み合わさって以下の態様が存在するものを含んでなる。
さらなる態様において、Ａは配列番号１０、５８、６２、６４、６７、６８、７４、７７であるか、またはそのフラグメント、類似体または誘導体である。
【００７４】
さらなる態様において、Ａは配列番号１０であるか、またはそのフラグメント、類似体または誘導体である。
さらなる態様において、Ａは配列番号５８であるか、またはそのフラグメント、類似体または誘導体である。
さらなる態様において、Ａは配列番号６２であるか、またはそのフラグメント、類似体または誘導体である。
さらなる態様において、Ａは配列番号６４であるか、またはそのフラグメント、類似体または誘導体である。
さらなる態様において、Ａは配列番号６７であるか、またはそのフラグメント、類似体または誘導体である。
さらなる態様において、Ａは配列番号６８であるか、またはそのフラグメント、類似体または誘導体である。
さらなる態様において、Ａは配列番号７４であるか、またはそのフラグメント、類似体または誘導体である。
さらなる態様において、Ａは配列番号７７であるか、またはそのフラグメント、類似体または誘導体である。
【００７５】
さらなる態様において、Ｂは配列番号１０、５８、６２、６４、６７、６８、７４、７７であるか、またはそのフラグメント、類似体または誘導体である。
さらなる態様において、Ｂは配列番号１０であるか、またはそのフラグメント、類似体または誘導体である。
さらなる態様において、Ｂは配列番号５８であるか、またはそのフラグメント、類似体または誘導体である。
さらなる態様において、Ｂは配列番号６４であるか、またはそのフラグメント、類似体または誘導体である。
さらなる態様において、Ｂは配列番号６４であるか、またはそのフラグメント、類似体または誘導体である。
さらなる態様において、Ｂは配列番号６７であるか、またはそのフラグメント、類似体または誘導体である。
さらなる態様において、Ｂは配列番号６８であるか、またはそのフラグメント、類似体または誘導体である。
さらなる態様において、Ｂは配列番号７４であるか、またはそのフラグメント、類似体または誘導体である。
さらなる態様において、Ｂは配列番号７７であるか、またはそのフラグメント、類似体または誘導体である。
【００７６】
さらなる態様において、Ｃは配列番号１０、５８、６２、６４、６７、６８、７４、７７であるか、またはそのフラグメント、類似体または誘導体である。
さらなる態様において、Ｃは配列番号１０であるか、またはそのフラグメント、類似体または誘導体である。
さらなる態様において、Ｃは配列番号５８であるか、またはそのフラグメント、類似体または誘導体である。
さらなる態様において、Ｃは配列番号６２であるか、またはそのフラグメント、類似体または誘導体である。
さらなる態様において、Ｃは配列番号６４であるか、またはそのフラグメント、類似体または誘導体である。
さらなる態様において、Ｃは配列番号６７であるか、またはそのフラグメント、類似体または誘導体である。
さらなる態様において、Ｃは配列番号６８であるか、またはそのフラグメント、類似体または誘導体である。
さらなる態様において、Ｃは配列番号７４であるか、またはそのフラグメント、類似体または誘導体である。
さらなる態様において、Ｃは配列番号７７であるか、またはそのフラグメント、類似体または誘導体である。
【００７７】
さらなる態様において、Ｄは配列番号１０、５８、６２、６４、６７、６８、７４、７７であるか、またはそのフラグメント、類似体または誘導体である。
さらなる態様において、Ｄは配列番号１０であるか、またはそのフラグメント、類似体または誘導体である。
さらなる態様において、Ｄは配列番号５８であるか、またはそのフラグメント、類似体または誘導体である。
さらなる態様において、Ｄは配列番号６２であるか、またはそのフラグメント、類似体または誘導体である。
さらなる態様において、Ｄは配列番号６４であるか、またはそのフラグメント、類似体または誘導体である。
さらなる態様において、Ｄは配列番号６７であるか、またはそのフラグメント、類似体または誘導体である。
さらなる態様において、Ｄは配列番号６８であるか、またはそのフラグメント、類似体または誘導体である。
さらなる態様において、Ｄは配列番号７４であるか、またはそのフラグメント、類似体または誘導体である。
さらなる態様において、Ｄは配列番号７７であるか、またはそのフラグメント、類似体または誘導体である。
【００７８】
さらなる態様において、ｍは０である。
さらなる態様において、ｎは０である。
さらなる態様において、ｍおよびｎは０である。
さらなる態様において、ｍおよびｎは０であり、Ａは配列番号６４であるか、またはそのフラグメント、類似体または誘導体であり、Ｂは配列番号６２であるか、またはそのフラグメント、類似体または誘導体である。
さらなる態様において、ｍおよびｎは０であり、Ａは配列番号６２であるか、またはそのフラグメント、類似体または誘導体であり、Ｂは配列番号６４であるか、またはそのフラグメント、類似体または誘導体である。
【００７９】
本発明においては、ポリペプチドおよびキメラ・ポリペプチドをエンコードするヌクレオチドはすべて本発明の範囲内のものである。
さらなる態様において、本発明によるポリペプチドまたはキメラ・ポリペプチドは抗原性である。
さらなる態様において、本発明によるポリペプチドまたはキメラ・ポリペプチドは個体に免疫応答を誘発し得る。
さらなる態様において、本発明はまた上記定義の本発明ポリペプチドまたはキメラ・ポリペプチドに対し結合特異性を有する抗体を生成させ得るポリペプチドに関する。
【００８０】
“結合特異性を有する”抗体とは、本来選択されたペプチドを含むサンプル、例えば、生体サンプル中の選択されたペプチドを認識し、それに結合するが、他の分子は実質的に認識せず、また結合しない抗体である。特異的な結合は選択されたペプチドを抗原として用いるＥＬＩＳＡアッセイにより測定することができる。
【００８１】
特に定義しない限り、本明細書で使用する技術用語および科学用語はすべて本発明の技術分野で当業者が一般に理解するものと同じ意味を有する。本明細書に引用する刊行物、特許出願、特許、および他の参考文献はすべてその全文を参照により本明細書の一部とする。矛盾のある場合には、定義も含め、本明細書が優先する。さらに、材料、方法、例示などは単なる説明であって、制限しようとするものではない。
【００８２】
本明細書にて使用する場合、本発明ポリペプチドの“フラグメント”、“誘導体”または“類似体”とは、１個またはそれ以上のアミノ酸残基が保存または非保存アミノ酸残基（好ましく保存）により置換されており、かつ、天然であっても非天然であってもよいポリペプチドを包含する。一態様において、本発明ポリペプチドの誘導体および類似体は図面に示した配列またはそのフラグメントと約７０％の同一性を有するものとする。すなわち、該残基の７０％が同一である。さらなる態様において、ポリペプチドの相同性は８０％を超える。さらなる態様において、ポリペプチドの相同性は８５％を超える。さらなる態様において、ポリペプチドの相同性は９０％を超える。さらなる態様において、ポリペプチドの相同性は９５％を超える。さらなる態様において、ポリペプチドの相同性は９９％を超える。さらなる態様において、本発明ポリペプチドの誘導体および類似体は約２０個未満のアミノ酸残基の置換、修飾または欠失を有し、好ましくはその個数が１０個未満である。好適な置換は技術上保存として周知のもの、すなわち、置換された残基が疎水性、サイズ、電荷または官能基などの理化学的性質を分け持つものである。
【００８３】
本発明によると、本発明のポリペプチドはポリペプチドおよびキメラ・ポリペプチドの両方を包含する。
さらに包含されるポリペプチドは、該ポリペプチドの生物学的または薬理学的性質を変える他の化合物が融合しているもの、すなわち、半減期を増大させるポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、精製をし易くするリーダーまたは分泌アミノ酸配列、プレプロ−およびプロ−配列、および（多）糖類の融合したものである。
【００８４】
さらに、アミノ酸領域が多型性であることが判明している場合には、異なる連鎖球菌株の異なるエピトープをより有効に模倣するために、１個以上の特定アミノ酸を変更することが望ましい。
【００８５】
さらに、本発明のポリペプチドは末端−ＮＨ２アシル化（例えば、アセチル化、またはチオグリコール酸のアミド化、末端カルボキシのアミド化、例えば、アンモニアまたはメチルアミンによるアミド化）により修飾して、安定性を備わせ、支持体または他の分子に連結または結合する疎水性を増大させることができる。
【００８６】
さらに期待されるのは、該ポリペプチドのフラグメント、類似体および誘導体のヘテロおよびホモ・ポリペプチド・マルチマーである。これらのポリマー形状は、例えば、アビジン／ビオチン、グルタルアルデヒドまたはジメチル−スーパーイミデートなどの架橋剤で架橋した１個以上のポリペプチドを包含する。かかるポリマー形状はまた組換えＤＮＡ技法により生成させたマルチシストロンｍＲＮＡから生じた２個以上の縦列または逆方向の隣接配列を含むポリペプチドを包含する。好ましくは、本発明ポリペプチドのフラグメント、類似体および誘導体は少なくとも１個の抗原性領域、すなわち、少なくとも１個のエピトープを含んでなる。
【００８７】
抗原性ポリマー（すなわち、合成マルチマー）の形成を達成するために、ビスハロアセチル基、ハロゲン化ニトロアリールなどを有するポリペプチドを利用してもよく、その場合、該試薬はチオ基に特異的である。従って、異なるペプチドの２個のメルカプト基間の連結は単結合であってもよいし、あるいは少なくとも２個の炭素原子、一般には少なくとも４個であるが１６個以下であり、通常約１４個以下の炭素原子の連結基から構成されていてもよい。
【００８８】
特定の態様において、本発明ポリペプチドのフラグメント、類似体および誘導体はメチオニン（Ｍｅｔ）の開始残基を含まない。好ましくは、ポリペプチドはリーダーまたは分泌配列（シグナル配列）を含んでいない。本発明ポリペプチドのシグナル部分は確立された分子生物学技法に従い決定することができる。一般に、対象となるポリペプチドは連鎖球菌培養物から単離し、次いで配列決定して成熟タンパク質の開始残基、従って成熟ポリペプチドの配列を決めてもよい。
【００８９】
他の側面によると、１種またはそれ以上の本発明連鎖球菌ポリペプチドを含んでなり、医薬的に許容し得る担体、賦形剤またはアジュバントと混合したワクチン組成物が提供される。適切なアジュバントは油、すなわち、フロインド完全または不完全アジュバント；塩類、すなわち、ＡlＫ(ＳＯ４)２、ＡlＮa(ＳＯ４)２、ＡlＮＨ４(ＳＯ４)２、シリカ、カオリン、炭素ポリヌクレオチド、すなわち、ポリＩＣおよびポリＡＵなどを包含する。好適なアジュバントはＱuilＡまたはＡｌヒドロゲルを包含する。本発明のワクチンは注射、迅速注入、鼻咽頭吸収、皮膚吸収により非経口投与するか、または口腔もしくは経口により投与することができる。医薬的に許容し得る担体としては破傷風トキソイドも包含する。
【００９０】
本発明のワクチン組成物は以下に記載の連鎖球菌感染症および／または連鎖球菌感染が介在する疾患および症状の治療または予防に使用する（P.R. Murray (Ed. in chief), E.J. Baron, M.A. Pfaller, F.C. Tenover and R.H. Yolken, Manual of Clinical Microbiology, ASM press, Washington D.C., sixth edition, 1995, 1482p; 出典明示により本明細書の一部とする）。一態様において、本発明のワクチン組成物は髄膜炎、中耳炎、菌血症または肺炎の治療または予防に使用される。一態様において、本発明のワクチン組成物は連鎖球菌感染症および／または連鎖球菌感染、特に、肺炎連鎖球菌（S. pneumoniae）、Ａ群連鎖球菌（化膿菌、pyogenes）、Ｂ群連鎖球菌（ＧＢＳまたはアガラクチエ、agalactiae）、ディスガラクチエ（dysgalactiae）、ユベリス（uberis）、ノカルディア（nocardia）、並びにスタヒロコッカス・アウレウス（Staphylococcus aureus）が介在する疾患および症状の治療または予防に使用する。さらなる態様において、連鎖球菌感染症は肺炎連鎖球菌（S. pneumoniae）の感染である。
【００９１】
特定の態様において、ワクチンは乳児、初老の免疫無防備状態個体など、連鎖球菌感染の危険性のある個体に投与する。
本出願にて使用する場合、“個体”という用語は哺乳動物を包含する。さらなる態様において、哺乳動物はヒトである。
【００９２】
ワクチン組成物は、好ましくは、約０.０１〜１００μｇ／ｋｇ（抗原／体重）の投与単位形状、より好ましくは０.０１〜１０μｇ／ｋｇ、最も好ましくは０.１〜１μｇ／ｋｇの形状で、約１週間ないし６週間の免疫間隔で１〜３回投与する。
【００９３】
他の側面によると、配列番号２、４、６、８、１０、１４、１６、５５〜７５、７７〜７９、８１、８３またはそのフラグメント、類似体または誘導体から選択されるアミノ酸配列により特徴づけられるポリペプチドをエンコードするポリヌクレオチドが提供される。
【００９４】
一態様において、ポリヌクレオチドは本発明のポリペプチドをエンコードし、オープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を含んでいてもよい配列番号１、３、５、７、９、１１、１２、１３、１５、７６、８０、８２に示したポリヌクレオチドである。図面に示したポリヌクレオチド配列は縮重コドンにより変化していてもよいが、それでもなお本発明のポリペプチドをエンコードしていることが認められよう。従って、本発明はさらに配列間で５０％の同一性を有する上記のポリヌクレオチド配列（またはその相補配列）にハイブリダイズするポリヌクレオチドを提供する。一態様において、配列間の同一性は少なくとも７０％である。一態様において、配列間の同一性は少なくとも７５％である。一態様において、配列間の同一性は少なくとも８０％である。一態様において、配列間の同一性は少なくとも８５％である。一態様において、配列間の同一性は少なくとも９０％である。さらなる態様において、ポリヌクレオチドは緊縮条件下、すなわち、少なくとも９５％の同一性をもつ条件下でハイブリダイズし得る。さらなる態様において、同一性は９７％を超える。
【００９５】
さらなる態様において、ポリヌクレオチドは本発明のポリペプチドをエンコードする配列番号１、３、７、９、１１、１２、１３、１５、７６、８０、８２に示したポリヌクレオチドである。
【００９６】
さらなる態様において、ポリヌクレオチドは本発明のポリペプチドをエンコードし、オープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を含んでいてもよい配列番号１、３、９、１１、１２、１３、１５、７６、８０、８２に示したポリヌクレオチドである。
【００９７】
さらなる態様において、ポリヌクレオチドは本発明のポリペプチドをエンコードし、オープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を含んでいてもよい配列番号１、３、９、１１、１２、１３、１５、７６に示したポリヌクレオチドである。
【００９８】
さらなる態様において、ポリヌクレオチドは本発明のポリペプチドをエンコードし、オープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を含んでいてもよい配列番号１、３、７、９、１１、１２、１３、１５、７６に示したポリヌクレオチドである。
【００９９】
さらなる態様において、ポリヌクレオチドは本発明のポリペプチドをエンコードし、オープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を含んでいてもよい配列番号１、７、９、１１、１５、７６に示したポリヌクレオチドである。
【０１００】
さらなる態様において、ポリヌクレオチドは本発明のポリペプチドをエンコードし、オープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を含んでいてもよい配列番号１、９、１１、１５、７６に示したポリヌクレオチドである。
【０１０１】
さらなる態様において、ポリヌクレオチドは本発明のポリペプチドをエンコードし、オープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を含んでいてもよい配列番号１、７、９、１１に示したポリヌクレオチドである。
【０１０２】
さらなる態様において、ポリヌクレオチドは本発明のポリペプチドをエンコードする配列番号１に示したポリヌクレオチドである。
さらなる態様において、ポリヌクレオチドは本発明のポリペプチドをエンコードする配列番号７に示したポリヌクレオチドである。
さらなる態様において、ポリヌクレオチドは本発明のポリペプチドをエンコードする配列番号９に示したポリヌクレオチドである。
さらなる態様において、ポリヌクレオチドは本発明のポリペプチドをエンコードする配列番号１１に示したポリヌクレオチドである。
さらなる態様において、ポリヌクレオチドは本発明のポリペプチドをエンコードする配列番号１５に示したポリヌクレオチドである。
【０１０３】
さらなる態様において、ポリヌクレオチドは本発明のポリペプチドをエンコードする配列番号３、１２、１３、７６に示したポリヌクレオチドである。
さらなる態様において、ポリヌクレオチドは本発明のポリペプチドをエンコードする配列番号３に示したポリヌクレオチドである。
さらなる態様において、ポリヌクレオチドは本発明のポリペプチドをエンコードする配列番号１２に示したポリヌクレオチドである。
さらなる態様において、ポリヌクレオチドは本発明のポリペプチドをエンコードする配列番号１３に示したポリヌクレオチドである。
さらなる態様において、ポリヌクレオチドは本発明のポリペプチドをエンコードする配列番号７６に示したポリヌクレオチドである。
【０１０４】
当業者が容易に認識するように、ポリヌクレオチドはＤＮＡおよびＲＮＡ両方を包含する。
本発明はまた本出願に記載したポリヌクレオチドに相補的なポリヌクレオチドをも包含する。
【０１０５】
さらなる側面において、本発明のポリペプチド、またはフラグメント、類似体または誘導体をエンコードするポリヌクレオチドはＤＮＡ免疫化法に使用し得る。すなわち、該ポリヌクレオチドは、注射により複製発現可能であり、その結果生体内で抗原性ポリペプチドを生じるベクター内に取込み得るものである。例えば、ポリペプチドは真核細胞内で機能的なＣＭＶプロモーターの制御下にプラスミドベクターに取込み得る。好ましくは、該ベクターは筋肉内に注射する。
【０１０６】
他の側面によると、組換え技法により、宿主細胞において当該ポリペプチドをエンコードするポリヌクレオチドを発現させ、発現したポリペプチド産物を回収することによる本発明ポリペプチドの製造法が提供される。別法として、該ポリペプチドは確立された合成化学技法に従い、すなわち、オリゴペプチドを液相または固相合成し、それを結合して完全なポリペプチドを製造することができる（ブロック連結反応）。
【０１０７】
ポリヌクレオチドおよびポリペプチドの入手および評価の一般的方法は以下の文献に記載されている：Sambrook et al., 分子クローニング：実験室マニュアル、第２版、Cold Spring Harbor, N.Y., 1989；分子生物学における最新プロトコール、編者：Ausubel F.M. et al., John Wiley and Sons, Inc. New York；ＰＣＲクローニング・プロトコール、分子クローニングから遺伝子工学まで、編者：White B.A., Humana Press, Totowa, New Jersey, 1997, 490 pages; タンパク質精製、原理と実際、Scopes R.K., Springer-Verlag, New York, 3rd Edition, 1993, 380 pages; 免疫学における最新プロトコール、Edited by Coligan J.E. et al., John Wiley & Sons Inc., New York; これらは出典明示により本明細書の一部とする。
【０１０８】
組換え生産のために、該ポリペプチドをエンコードするベクターを宿主細胞に移入し、次いで、プロモーター活性化、形質転換体選択または遺伝子増幅に適するように改変した栄養培地中で培養する。
【０１０９】
適切なベクターは選択した宿主中で生存複製可能なベクターであり、染色体、非染色体および合成ＤＮＡ配列、例えば、バクテリアプラスミド、ファージＤＮＡ、バキュロウイルス、酵母プラスミド、プラスミドとファージＤＮＡを組合わせて誘導したベクターなどを包含する。ポリペプチド配列はベクターの適切な部位に取込むことができるが、その際には制限酵素を使用し、プロモーター、リボソーム結合部位（コンセンサス領域またはシャイン・ダルガルノ配列）、および必要によりオペレーター（制御要素）を含んでなる発現制御領域に操作可能に結合するようにする。発現制御領域の個々の要素は所定の宿主とベクターに適したものを確立された分子生物学の原理に従って選択することができる（Sambrook et al., 分子クローニング：実験室マニュアル、第２版、Cold Spring Harbor, N.Y., 1989；分子生物学における最新プロトコール、編者：Ausubel F.M. et al., John Wiley and Sons, Inc. New York；出典明示により本明細書の一部とする）。適切なプロモーターはＬＴＲまたはＳＶ４０プロモーター、大腸菌ｌａｃ、ｔａｃまたはｔｒｐプロモーターおよびファージ・ラムダＰＬプロモーターなどであるが、これらに限定されるものではない。ベクターは、好ましくは複製開始点並びに選択マーカー、すなわち、アンピシリン耐性遺伝子を組入れている。適切なバクテリアベクターは、ｐＥＴ、ｐＱＥ７０、ｐＱＥ６０、ｐＱＥ−９、ｐｂｓ、ｐＤ１０ファージスクリプト、ｐｓｉＸ１７４、ブルースクリプトＳＫ、ｐｂｓｋｓ、ｐＮＨ８Ａ、ｐＮＨ１６ａ、ｐＮＨ１８Ａ、ｐＮＨ４６Ａ、ｐｔｒｃ９９ａ、ｐＫＫ２２３−３、ｐＫＫ２３３−３、ｐＤＲ５４０、ｐＲＩＴ５および真核ベクターｐブルーバックIII、ｐＷＬＮＥＯ、ｐＳＶ２ＣＡＴ、ｐＯＧ４４、ｐＸＴ１、ｐＳＧ、ｐＳＶＫ３、ｐＢＰＶ、ｐＭＳＧおよびｐＳＶＬなどである。宿主細胞は細菌性のもの、すなわち、大腸菌（E. coli）、枯草菌（Bacillus subtilis）、ストレプトマイセス（Streptomyces）；真菌性のもの、すなわち、アスペルギルス・ニガー（Aspergillus niger）、アスペルギルス・ニズリンス（Aspergillus nidulins）；酵母、すなわち、サッカロミセス（Saccharomyces)；または真核性、すなわち、ＣＨＯ、ＣＯＳであってもよい。
【０１１０】
培養物中でのポリペプチドの発現にもとづき、細胞は一般に遠心分離により収穫し、次いで物理的または化学的手段（もし発現されたポリペプチドが培地に分泌されなければ）により破砕し、得られる粗製の抽出物を保持し、対象のポリペプチドを単離する。培地または溶菌液からポリペプチドを精製するには、ポリペプチドの性質に従って確立された技法により、すなわち、硫安沈殿またはエタノール沈殿、酸抽出、アニオンまたはカチオン交換クロマトグラフィー、ホスホセルロースクロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー、およびレクチンクロマトグラフィーなどを使用する。最終の精製はＨＰＬＣにより達成し得る。
【０１１１】
該ポリペプチドはリーダー配列または分泌配列を付けて、または付けずに発現することができる。前者の場合、リーダーは翻訳後プロセシングにより除去してもよい（参照：ＵＳ４，４３１，７３９；ＵＳ４，４２５，４３７；およびＵＳ４，３３８，３９７；出典明示により本明細書の一部とする）し、または発現されたポリペプチドを精製した後に化学的に除去してもよい。
【０１１２】
さらなる側面によると、本発明の連鎖球菌ポリペプチドは連鎖球菌感染症、特に肺炎連鎖球菌（S. pneumoniae）感染の診断テストに使用することができる。例えば、生物サンプル中の連鎖球菌菌体の検出など数種の診断方法が可能であるが、以下の手法により実施する：
ａ）患者から生物サンプルを入手すること；
ｂ）本発明の連鎖球菌ポリペプチドと反応し得る抗体またはそのフラグメントを該生物サンプルとインキュベートし、混合物を形成すること；そして
ｃ）連鎖球菌の存在を示す特異的に結合した混合物中の抗体またはフラグメントを検出すること。
【０１１３】
別法として、連鎖球菌抗原に特異的な抗体を含むかまたは含む疑いのある生物サンプルについての当該抗体の検出は以下のように実施することができる：
ａ）患者から生物サンプルを入手すること；
ｂ）１種以上の本発明連鎖球菌ポリペプチドまたはそのフラグメントを該生物サンプルとインキュベートし、混合物を形成すること；そして
ｃ）連鎖球菌に特異的な抗体の存在を示す特異的に結合した混合物中の抗原またはフラグメントを検出すること。
【０１１４】
この診断テスト法は幾つかの形態を取ることが可能であり、その方法は免疫学的テスト法、例えば、酵素結合抗体免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）、放射免疫アッセイまたはラテックス凝集アッセイなどであって、該タンパク質に特異的な抗体が生体中に存在するかどうかを測定する実質的な方法であることは当業者の認めるところである。
【０１１５】
本発明のポリペプチドをエンコードするＤＮＡ配列は、連鎖球菌を含むと疑われる生物サンプルについて、かかるバクテリアの存在を検出する際に使用するＤＮＡプローブの設計にも使用することができる。本発明の検出方法は以下の工程を含んでなる：
ａ）患者から生物サンプルを入手すること；
ｂ）本発明ポリペプチドまたはそのフラグメントをエンコードするＤＮＡ配列をもつ１種以上のＤＮＡプローブを該生物サンプルとインキュベートし、混合物を形成すること；そして
ｃ）連鎖球菌の存在を示す特異的に結合した混合物中のＤＮＡプローブを検出すること。
【０１１６】
本発明のＤＮＡプローブは、連鎖球菌感染を診断する方法として、サンプル中の循環系連鎖球菌、すなわち、肺炎連鎖球菌（S. pneumoniae）核酸を、例えば、ポリメラーゼ連鎖反応を用い検出するためにも使用することができる。該プローブは常套の技法を用いて合成して、固相に固定化してもよいし、あるいは検出可能なラベルで標識してもよい。これに適用するための好適なＤＮＡプローブは本発明肺炎連鎖球菌の少なくとも約６個の連接したヌクレオチドに相補的な配列をもつオリゴマーである。
【０１１７】
患者の連鎖球菌を検出するもう一つの診断方法は以下の工程を含んでなる：
ａ）本発明のポリペプチドと反応し得る抗体またはそのフラグメントを検出可能なラベルで標識すること；
ｂ）標識した抗体または標識したフラグメントを該患者に投与すること；および
ｃ）連鎖球菌の存在を示す特異的に結合した患者における標識抗体または標識フラグメントを検出すること。
【０１１８】
本発明のさらなる側面は、連鎖球菌感染の診断用および、特に治療用の特異抗体を産生するために免疫原として本発明の連鎖球菌ポリペプチドを使用することである。適切な抗体は適当なスクリーニング法を用い、例えば、テストモデルにおいて連鎖球菌に対し受動的に防御する特定抗体の能力を測定することにより決定することができる。動物モデルの一例としては、本明細書の実施例に記載したマウスのモデルである。該抗体は全抗体であっても、その抗原結合フラグメントであってもよく、また免疫グロブリンのどの分類のものでもよい。該抗体またはフラグメントは動物起源、特に、哺乳動物起源のもの、より具体的にはマウス、ラットまたはヒト起源のものである。それは天然の抗体またはそのフラグメントであり、あるいは要すれば、組換え抗体または抗体フラグメントであってもよい。組換え抗体または抗体フラグメントという用語は、それらの抗体または抗体フラグメントが分子生物学の技法により製造されたものであることを意味する。該抗体または抗体フラグメントはポリクローナルであるか、または好ましくはモノクローナルである。それは肺炎連鎖球菌ポリペプチドと関連する多くのエピトープに特異的であってもよいが、好ましくは１個のエピトープに対して特異的である。
【０１１９】
本発明の範囲を制限するものではないが、本発明はまたＢＶＨ−３、ＢＶＨ−１１、ＢＶＨ−１１−２、ＢＶＨ−２８およびＢＶＨ−７１と命名した新規の抗原にも関する。本発明はまたＢＶＨ−３、ＢＶＨ−１１、ＢＶＨ−１１−２、ＢＶＨ−２８およびＢＶＨ−７１と命名した新規の抗原のフラグメントを含んでなる切断型ポリペプチドにも関する。本発明はまたＢＶＨ−３、ＢＶＨ−１１、ＢＶＨ−１１−２、ＢＶＨ−２８およびＢＶＨ−７１と命名した新規の抗原のフラグメントを含んでなるキメラ・ポリペプチドにも関する。下記の参照表は本発明抗原間の関係を要約した表である。
【表１】
【表２】
【実施例】
【０１２０】
実施例１
本実施例では肺炎連鎖球菌（S. pneumoniae）遺伝子のクローニングについて説明する。
肺炎連鎖球菌（S. pneumoniae）遺伝子ＢＶＨ−３（配列番号１）のコーディング領域および肺炎連鎖球菌（S. pneumoniae）遺伝子ＢＶＨ−２８（配列番号５）のコーディング領域は、血清型６肺炎連鎖球菌（S. pneumoniae）株ＳＰ６４のゲノムＤＮＡから、制限部位ＢglII（ＡＧＡＴＣＴ）およびＸbaＩ（ＴＣＴＡＧＡ）の付加用塩基エクステンションを含むオリゴ体を用い、ＰＣＲ（ＤＮＡサーマル・サイクラー・ジーンアンプＰＣＲシステム２４００、パーキン・エルマー（Perkin Elmer）、サンホセ（San Jose)、ＣＡ）により増幅した。ＰＣＲ産物はキアクイック（QIAquick）ゲル抽出キット（キアゲン（QIAgen）、チャッツウオース（Chatsworth)、ＣＡ）を用いてアガロースゲルから精製し、ＢglII−ＸbaＩ（ファルマシア（Pharmacia）カナダ・インク、バイデフルフ（Baie d'Urfe)、カナダ）で消化し、フェノール／クロロホルムで抽出し、エタノールで沈殿させた。スーパーリンカーベクターｐＳＬ３０１（インビトロゲン（Invitrogen）、サンジエゴ、ＣＡ）をＢglIIとＸbaＩで消化し、キアクイック（QIAquick）ゲル抽出キット（キアゲン（QIAgen）、チャッツウオース（Chatsworth)、ＣＡ）を用いてアガロースゲルから精製した。ＢglII−ＸbaＩゲノムＤＮＡフラグメントをＢglII−ＸbaＩ ｐＳＬ３０１ベクターに連結した。連結した生成物をシマニス（Simanis）の方法（Hanahan, D. ＤＮＡクローニング、D.M. Glover (ed), pp. 109-134）に従い、大腸菌株ＤＨ５ａ［ｆ８０ lacＺ ＤＭ１５ endＡ１recＡ１ hsdＲ１７（ｒＫ−ｍＫ＋）supＥ４４ thi−１１− gyrＡ９６ relＡ１ Ｄ（lacＺＹＡ−argＦ）Ｕ１６９］（ギブコ（Gibco）ＢＲＬ、ゲイサースバーグ（Gaithersburg）、ＭＤ）に形質転換した。ＢＶＨ−３またはＢＶＨ−２８のいずれかの遺伝子を含む組換えｐＳＬ３０１プラスミド（ｒｐＳＬ３０１）をキアゲン（QIAgen）キット（チャッツウオース（Chatsworth)、ＣＡ）により精製し、ＤＮＡ挿入片はヌクレオチド配列分析（タック・ダイ・デオキシ・ターミネーター・サイクル配列決定キット、ＡＢＩ、フォスター・シティ、ＣＡ）により確認した。組換えｒｐＳＬ３０１（ｒｐＳＬ３０１）を制限酵素ＢglII（ＡＧＡＴＣＴ）およびＸhoＩ（ＣＴＣＧＡＧ）により消化した。ＤＮＡフラグメントＢglII−ＸhoＩはキアクイック（QIAquick）ゲル抽出キット（キアゲン（QIAgen）、チャッツウオース（Chatsworth)、ＣＡ）を用いて精製した。チオレドキシン−Ｈｉｓタグ配列を含むｐＥＴ−３２ｃ（＋）発現ベクター（ノバゲン（Novagen）、マジソン、ＷＩ）をＢamＨＩ（ＧＧＡＴＣＣ）およびＸhoＩで消化し、ゲルはキアクイック（QIAquick）ゲル抽出キット（キアゲン（QIAgen）、チャッツウオース（Chatsworth)、ＣＡ）を用いて抽出した。ＢglII−ＸhoＩＤＮＡフラグメントをＢamＨＩ−ＸhoＩｐＥＴ−３２ｃ（＋）ベクターに連結してチオレドキシン−Ｈｉｓタグ−ＢＶＨ−３またはチオレドキシン−Ｈｉｓタグ−ＢＶＨ−２８融合タンパク質用のコーディング配列を創製した。連結した生成物をシマニス（Simanis）の方法（Hanahan, D. ＤＮＡクローニング、1985、D.M. Glover (ed), pp. 109-135）に従い、大腸菌株ＤＨ５ａ［ｆ８０ lacＺ ＤＭ１５ endＡ１recＡ１ hsdＲ１７（ｒＫ−ｍＫ＋）supＥ４４ thi−１１− gyrＡ９６ relＡ１ Ｄ（lacＺＹＡ−argＦ）Ｕ１６９］（ギブコ（Gibco）ＢＲＬ、ゲイサースバーグ（Gaithersburg）、ＭＤ）に形質転換した。組換えｐＥＴ−３２ｃ（＋）プラスミドはキアゲン（QIAgen）キット（チャッツウオース（Chatsworth)、ＣＡ）により精製し、チオレドキシン−ＨｉｓタグとＤＮＡ挿入片の融合部位でのヌクレオチド配列はＤＮＡ配列決定法（タック・ダイ・デオキシ・ターミネーター・サイクル配列決定キット、ＡＢＩ、フォスター・シティ、ＣＡ）により証明した。
【０１２１】
実施例２
本実施例ではＣＭＶプラスミドｐＣＭＶ−ＧＨにおける肺炎連鎖球菌（S. pneumoniae）タンパク質遺伝子のクローニングについて説明する。
肺炎連鎖球菌（S. pneumoniae）タンパク質のＤＮＡコーディング領域をヒト成長ホルモン（ｈＧＨ）遺伝子の下流位相に挿入した；該ｈＧＨ遺伝子はプラスミドベクターｐＣＭＶ−ＧＨのサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーターの転写制御下にあった（Tang et al., Nature, 1992, 356: 152)。ＣＭＶプロモーターは大腸菌細胞内では機能しないプラスミドとするが、真核細胞内プラスミドの管轄下では活性である。該ベクターはアンピシリン耐性遺伝子をも併合していた。
【０１２２】
ＢＶＨ−３遺伝子（配列番号１）とＢＶＨ−２８遺伝子（配列番号５）のコーディング領域は、制限酵素ＢglII（ＡＧＡＴＣＴ）およびＸbaＩ（ＴＣＴＡＧＡ）を用いてｒｐＳＬ３０１（実施例１参照）から得た。消化産物はキアクイック（QIAquick）ゲル抽出キット（キアゲン（QIAgen）、チャッツウオース（Chatsworth)、ＣＡ）を用いてアガロースゲルから精製した。融合タンパク質を創製するために、ヒト成長ホルモンを含むｐＣＭＶ−ＧＨベクター（テキサス大学（ダラス、テキサス）生化学部門、ジョンストン（Dr. Stephen A. Johnston）研究室）をＢglIIおよびＸbaＩで消化し、キアクイック（QIAquick）ゲル抽出キット（キアゲン（QIAgen）、チャッツウオース（Chatsworth)、ＣＡ）を用いてアガロースゲルから精製した。ＢglII−ＸbaＩ ＤＮＡフラグメントをＢglII−ＸbaＩ ｐＣＭＶ−ＧＨベクターに連結し、ＣＭＶプロモーターの制御下にｈＧＨ−ＢＶＨ−３またはｈＧＨ−ＢＶＨ−２８融合タンパク質を創製した。連結した生成物をシマニス（Simanis）の方法（Hanahan, D. ＤＮＡクローニング、1985、D.M. Glover (ed), pp. 109-135）に従い、大腸菌株ＤＨ５ａ［ｆ８０ lacＺ ＤＭ１５ endＡ１recＡ１ hsdＲ１７（ｒＫ−ｍＫ＋）supＥ４４ thi−１１− gyrＡ９６ relＡ１ Ｄ（lacＺＹＡ−argＦ）Ｕ１６９］（ギブコ（Gibco）ＢＲＬ、ゲイサースバーグ（Gaithersburg）、ＭＤ）に形質転換した。組換えｐＣＭＶプラスミドはキアゲン（QIAgen）キット（キアゲン、チャッツウオース（Chatsworth)、ＣＡ）により精製した。
【０１２３】
ＢＶＨ−１１遺伝子（配列番号３）のコーディング領域は、血清型６肺炎連鎖球菌（S. pneumoniae）株ＳＰ６４のゲノムＤＮＡから、制限部位ＢglII（ＡＧＡＴＣＴ）およびＨindIII（ＡＡＧＣＴＴ）の付加用塩基エクステンションを含むオリゴ体を用い、ＰＣＲ（ＤＮＡサーマル・サイクラー・ジーンアンプＰＣＲシステム２４００、パーキン・エルマー（Perkin Elmer）、サンホセ（San Jose)、ＣＡ）により増幅した。ＰＣＲ産物はキアクイック（QIAquick）ゲル抽出キット（キアゲン（QIAgen）、チャッツウオース（Chatsworth)、ＣＡ）を用いてアガロースゲルから精製し、制限酵素（ファルマシア（Pharmacia）カナダ・インク、バイデフルフ（Baie d'Urfe)、カナダ）で消化し、フェノール／クロロホルムで抽出し、エタノールで沈殿させた。該ｐＣＭＶ−ＧＨベクター（テキサス大学（ダラス、テキサス）生化学部門、ジョンストン（Dr. Stephen A. Johnston）研究室）をＢglIIおよびＨindIIIで消化し、キアクイック（QIAquick）ゲル抽出キット（キアゲン（QIAgen）、チャッツウオース（Chatsworth)、ＣＡ）を用いてアガロースゲルから精製した。ＢglII−ＨindIII ＤＮＡフラグメントをＢglII−ＨindIII ｐＣＭＶ−ＧＨベクターに連結し、ＣＭＶプロモーターの制御下にｈＧＨ−ＢＶＨ−１１融合タンパク質を創製した。連結した生成物をシマニス（Simanis）の方法（Hanahan, D. ＤＮＡクローニング、1985、D.M. Glover (ed), pp. 109-135）に従い、大腸菌株ＤＨ５ａ［ｆ８０ lacＺ ＤＭ１５ endＡ１recＡ１ hsdＲ１７（ｒＫ−ｍＫ＋）supＥ４４ thi−１１− gyrＡ９６ relＡ１ Ｄ（lacＺＹＡ−argＦ）Ｕ１６９］（ギブコ（Gibco）ＢＲＬ、ゲイサースバーグ（Gaithersburg）、ＭＤ）に形質転換した。組換えｐＣＭＶプラスミドはキアゲン（QIAgen）キット（キアゲン、チャッツウオース（Chatsworth)、ＣＡ）により精製し、ＤＮＡ挿入片のヌクレオチド配列はＤＮＡ配列決定法により証明した。
【０１２４】
実施例３
本実施例では肺炎連鎖球菌（S. pneumoniae）抗原に対する免疫応答を引出すためにＤＮＡを使用することについて説明する。
メスＢＡＬＢ／ｃマウス（チャールズ・リバー（Charles River)、セントコンスタント（St-Constant）、ケベック、カナダ）８匹を１群とし、ＢＶＨ−３、ＢＶＨ−１１またはＢＶＨ−２８遺伝子を含む組換えｐＣＭＶ−ＧＨ１００μｇにより、顆粒球−マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）発現プラスミドｐＣＭＶ−ＧＨ−ＧＭ−ＣＳＦ（テキサス大学（ダラス、テキサス）生化学部門、ジョンストン（Dr. Stephen A. Johnston）研究室）５０μｇの存在下、２−ないし３−週間間隔で５０μｌを３回筋肉注射し、免疫した。対照として、一群のマウスにはｐＣＭＶ−ＧＨ−ＧＭ−ＣＳＦ５０μｇの存在下、ｐＣＭＶ−ＧＨを１００μｇ注射した。血液サンプルは各免疫化に先立ち、また３回目の注射７日後に眼窩から採取し、血清抗体応答はコーティング抗原としてチオレドキシン−Ｈｉｓ・Ｔａｇ−肺炎連鎖球菌（S. pneumoniae）融合タンパク質を用い、ＥＬＩＳＡにより測定した。ＢＶＨ−３、ＢＶＨ−１１またはＢＶＨ−２８肺炎連鎖球菌（S. pneumoniae）タンパク質をエンコードする組換えプラスミドｐＣＭＶ−ＧＨによるＤＮＡ免疫化は、それぞれの組換えタンパク質に対し反応する抗体を誘発した。吸光度値がバックグランド値の０.１以上であった最大血清希釈と定義される相互の抗体価は、４×１０３以上であった。
【０１２５】
実施例４
本実施例では組換え肺炎連鎖球菌（S. pneumoniae）タンパク質の産生と精製につき説明する。
配列番号１、配列番号３または配列番号５に相当するＢＶＨ−３、ＢＶＨ−１１またはＢＶＨ−２８遺伝子を含む組換えｐＥＴプラスミドをエレクトロポレーション（ジーン・パルサーII装置、バイオ−ラッド（ＢＩＯ−ＲＡＤ）ラボ、ミッシソウガ（Mississauga）、カナダ）により大腸菌株ＡＤ４９４（ＤＥ３）（Ｄara−leu７６９７ ＤlacＸ７４ ＤphoＡ ＰvuII phoＲ ＤmalＦ３ Ｆ'［lac＋（lacＩｑ）pro］trxＢ：：Ｋan）（ノバゲン（Novagen)、マジソン、ＷＩ）に形質転換した。本大腸菌株では、融合タンパク質の発現を制御するＴ７プロモーターがＴ７ＲＮＡポリメラーゼ（１ＤＥ３プロファージ上に存在）により特異的に認識されるが、該ポリメラーゼの遺伝子はイソプロピル−β−ｄ−チオ−ガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）により誘導し得るｌａｃプロモーターの制御下にある。形質転換体ＡＤ４９４（ＤＥ３）／rpＥＴは、１ｍｌ当たりアンピシリン（シグマ−アルドリッチ（Sigma-Aldrich）カナダ株式会社、オークビル（Oakville)、カナダ）１００μｇを含むＬＢブロス（ペプトン１０ｇ／Ｌ、酵母エキス５ｇ／Ｌ、ＮａＣｌ１０ｇ／Ｌ）中で、Ａ６００が０.６の値に達するまで、２５０ｒｐｍの攪拌下に３７℃で増殖させた。チオレドキシン−Ｈｉｓ・Ｔａｇ−ＢＶＨ−３、チオレドキシン−Ｈｉｓ・Ｔａｇ−ＢＶＨ−１１またはチオレドキシン−Ｈｉｓ・Ｔａｇ−ＢＶＨ−２８融合タンパク質の産生を誘導するために、最終濃度１ｍＭのＩＰＴＧの存在下にさらに２時間培養した。培養物１００ｍｌから誘導された細胞は遠心によりペレットとし、−７０℃で凍結した。
【０１２６】
ＩＰＴＧ誘導ＡＤ４９４（ＤＥ３）／rpＥＴの可溶性細胞質フラクションから融合タンパク質を精製するには、Ｈｉｓ結合金属キレート化樹脂に固定化した二価カチオン（Ｎｉ２＋）に結合するＨｉｓ・Ｔａｇ配列（６個の連続的ヒスチジン残基）の性質に基づくアフィニティ・クロマトグラフィーにより実施した。簡単に説明すると、ＩＰＴＧにより誘導した培養物１００ｍＬから得たペレット状細胞を、リン酸バッファー５００ｍＭ−ＮａＣｌ溶液（ＰＢＳ）（ｐＨ７.１）に再懸濁し、超音波処理、２０,０００×ｇで２０分間遠心して破片を除去した。上清を濾取し（０.２２μｍ孔径の膜）、ハイトラップ（HiTrap; 登録商標）１ｍＬのキレート化プレパック常用カラム（ファルマシアバイオテック（Pharmacia Biotech）、バイデフルフ（Baie d'Urfe)、カナダ）に載せた。チオレドキシン−Ｈｉｓ・Ｔａｇ−肺炎連鎖球菌（S. pneumoniae）融合タンパク質は１Ｍイミダゾール／５００ｍＭ−ＮａＣｌ−ＰＢＳ（ｐＨ７.１）により溶出した。サンプルから塩とイミダゾールを除去するために４℃でＰＢＳに対し透析した。大腸菌の可溶性フラクションから得られた融合タンパク質量はマイクロＢＣＡ（ピアース（Pierce）、ロックフォード、イリノイ）により評価した。
【０１２７】
実施例５
本実施例では免疫化による致死性連鎖球菌感染症に対するマウスの防御について説明する。
メスＢＡＬＢ／ｃマウス（チャールス・リバー）８匹の群につき、キルＡ（QuilA）アジュバント（セダーレーン（Cedarlane）ラボラトリー株式会社、ホーンバイ、カナダ）１５μｇの存在下にアフィニティ精製チオレドキシン−Ｈｉｓ・Ｔａｇ−ＢＶＨ−３融合タンパク質により、または対照としてＰＢＳ中キルＡ（QuilA）アジュバントのみにより、３週間間隔で３回皮下注射免疫した。血液サンプルは各免疫化に先立ち１日目、２２日目および４３日目、また３回目の注射７日後（５０日目）に眼窩洞から採取した。１週間後、マウスに３型肺炎連鎖球菌（S. pneumoniae）株ＷＵ２約１０６ＣＦＵをチャレンジした。肺炎連鎖球菌（S. pneumoniae）植菌サンプルをチョコレート寒天平板上に塗付し、ＣＦＵを決定し、チャレンジ用量を確認した。チャレンジ後１４日間と１４日目に死亡例を記録し、生存マウスは犠牲にして、その血液サンプルは肺炎連鎖球菌（S. pneumoniae）菌体の存在について試験した。生存データを表１に示す。
【０１２８】
チャレンジ前の血清は、肺炎連鎖球菌（S. pneumoniae）と反応する抗体が存在するか否かについて標準的免疫検定法により分析した。ＥＬＩＳＡおよび免疫ブロットでは、大腸菌により調製した組換え肺炎連鎖球菌（S. pneumoniae）タンパク質での免疫化が、組換えおよび本来の連鎖球菌タンパク質両方と反応する抗体を誘導することを示した。
表１：組換えＢＶＨ−３タンパク質が介在する防御
【表３】
【０１２９】
ＢＶＨ−３組換えタンパク質で免疫したマウスはすべて感染に対しても生存したが、アジュバントのみを投与した対照マウスに生存したものはなかった。マウス両群間の生存には有意差があった（Ｐ＜０.０００１、生存曲線の非パラメトリック分析用のログ・タンク検定；Ｐ＝０.０００２、フイッシャーの完全検定）。生存マウスからの血液培養はチャレンジ後１４日目に陰性であった。
【０１３０】
実施例６
本実施例では、多様な肺炎連鎖球菌（S. pneumoniae）株からのＢＶＨ−３およびＢＶＨ−１１遺伝子のクローニング、およびこれら遺伝子の分子保存性について記載する。
ＢＶＨ−３またはＢＶＨ−１１の異なる領域に及ぶＤＮＡプローブにより、種々の肺炎連鎖球菌（S. pneumoniae）単離体からの染色体ＤＮＡを分析した結果、ＢＶＨ−３遺伝子のコピーが１種とＢＶＨ−１１遺伝子のコピーが２種存在することが明らかになった。ＢＶＨ−１１遺伝子のコピー２種は一致せず、これらの遺伝子を任意にＢＶＨ−１１（配列番号１２；ヌクレオチド４５〜２５６７にＯＲＦ）およびＢＶＨ−１１−２（配列番号１３；ヌクレオチド１１４〜２６３０にＯＲＦ）と命名した。
【０１３１】
ＢＶＨ−３およびＢＶＨ−１１のコーディング領域最初のアミノ酸は、シグナルペプチドとしても知られるリーダー配列の特性を有する。リポタンパク質改変／プロセッシング部位の共通シグナルペプチダーゼ開裂部位Ｌ−Ｘ−Ｘ−Ｃが配列内に存在した。肺炎連鎖球菌（S. pneumoniae）ＳＰ６４からの成熟ＢＶＨ−３、ＢＶＨ−１１およびＢＶＨ−１１−２タンパク質は、それぞれ１０１９個、８２１個および８１９個のアミノ酸を有する。成熟ＢＶＨ−３、命名したＢＶＨ−３Ｍ（ヌクレオチド１８３７〜４８９６；配列番号１１）、ＢＶＨ−１１Ｍ（ヌクレオチド１０２〜２５６７；配列番号１２）、およびＢＶＨ−１１−２Ｍ（ヌクレオチド１７１〜２６３０；配列番号１３）をコードする肺炎連鎖球菌（S. pneumoniae）遺伝子の領域は、６種または７種の肺炎連鎖球菌（S. pneumoniae）株ゲノムＤＮＡからＰＣＲ（ＤＮＡサーマル・サイクラー・ジーンアンプＰＣＲシステム２４００、パーキン・エルマー（Perkin Elmer）、サンホセ（San Jose)、ＣＡ）により増幅した。血清型６の肺炎連鎖球菌（S. pneumoniae）ＳＰ６４および血清型９のＳＰ６３臨床分離株はケベック州立衛生研究所（セントアンデベレブ（Sainte-Anne-de-Bellevue)）より提供された；血清型４株ＪＮＲ.７／８７はアンドリュー・カミリー（Andrew Camilli）（タフト大学、医学部、ボストン）より提供された；Ｒｘ１株、２型株Ｄ３９の非莢膜化誘導体、および３型株Ａ６６とＷＵ２はブリルズ（David E. Briles）（アラバマ大学、バーミンガム）より提供された；また、３型臨床分離株Ｐ４２４１はラヴァル（Laval）大学施療センター、伝染病学センター（セントホイ（Sainte-Foy)）より提供された。
【０１３２】
制限部位付加のための塩基エクステンションを含むオリゴヌクレオチド・プライマー・セット、ＯＣＲＲ４７９−ＯＣＲＲ４８０、ＨＡＭＪ１６０−ＯＣＲＲ４８８およびＨＡＭＪ１６０−ＨＡＭＪ１８６は、それぞれＢＶＨ−３、ＢＶＨ−１１およびＢＶＨ−１１−２遺伝子の増幅に用いたが、例外として、ＳＰ６４株からのＢＶＨ−１１遺伝子ではＨＡＭＪ４８７およびＯＣＲＲ４８８からなるプライマー・セットを用いた。プライマー配列は下記に掲載する（表２）。ＰＣＲ産物はキアクイック（QIAquick）ゲル抽出キット（キアゲン（QIAgen）、チャッツウオース（Chatsworth)、ＣＡ）を用いてアガロースゲルから精製し、ＢglII−ＸbaＩまたはＢglII−ＨindIII（ファルマシア（Pharmacia）カナダ・インク、バイデフルフ（Baie d'Urfe)、カナダ）で消化した。消化物はキアクイック（QIAquick）ＰＣＲ精製キット（キアゲン（QIAgen）、チャッツウオース（Chatsworth)、ＣＡ）を用いて精製した。ＰＣＲ産物はＢglII−ＸbaＩまたはＢglII−ＨindIII ｐＳＬ３０１ベクターに結合した。結合産物はシマニス（Simanis）の方法（Hanahan, D. ＤＮＡクローニング、D.M. Glover (ed), pp. 109-134）に従い、大腸菌株ＤＨ５α［Ф８０ lacＺ ΔＭ１５ endＡ１ recＡ１ hsdＲ１７（ｒＫ−ｍＫ＋）supＥ４４ thi−１λ− gyrＡ９６ relＡ１ Δ（lacＺＹＡ−argＦ）Ｕ１６９］（ギブコ（Gibco）ＢＲＬ、ゲイサースバーグ（Gaithersburg）、ＭＤ）に形質転換した。
【０１３３】
ＢＶＨ−３、ＢＶＨ−１１またはＢＶＨ−１１−２を含む組換えｐＳＬ３０１プラスミド（rｐＳＬ３０１）はキアゲン（QIAgen）キット（チャッツウオース（Chatsworth)、ＣＡ）を用いて精製し、ＤＮＡ挿入断片の配列決定を実施した（タック・ダイ・デオキシ・ターミネーター・サイクル配列決定キット、ＡＢＩ、フォスター・シティ、ＣＡ）。図１１および１２は、それぞれＢＶＨ−３から確立した共通配列と、ＢＶＨ−１１の推定アミノ酸配列を描出する。ＢＶＨ−３タンパク質配列を比較すると、すべての株について配列の同一性が９９〜１００％であることが明らかとなるが、例外として、血清型９のＳＰ６３株からのＢＶＨ−３（配列番号１５および配列番号１６）は肺炎連鎖球菌（S. pneumoniae）ＳＰ６４のＢＶＨ−３’タンパク質配列上残基２４４〜４２０に相当する１７７個のアミノ酸を欠失している。さらなる血清型９株の配列を分析すると、ＢＶＨ−３分子は４株の内３株が同じ欠失を有し、この３株が肺炎連鎖球菌（S. pneumoniae）血清型９クローンのメンバーであることを示唆している。
【０１３４】
７種の肺炎連鎖球菌（S. pneumoniae）から得た１３種のＢＶＨ−１１ヌクレオチド配列を比較すると、これらヌクレオチド配列が非常によく似ていることが判明した。予測されたＢＶＨ−１１タンパク質配列を重ねて整列させ、コンピューター分析（マックベクター（MacVector）、クラスタル（Clustal）Ｗ１.４）するとこれらの配列は８３４個のアミノ酸鎖上、７５％が同一であり、８２％が相同性であると判明した。対ごとに整列すると、８０〜１００％一致することが判明した（図１３）。これらの配列は体制全体で非常によく似ていることを示した。これらタンパク質の一次配列における可変性は、該タンパク質のＣ−末端部分の最終１２５アミノ酸に殆ど限定される。この領域が一つのドメインを構成する。このドメインを精査すると、配列が２群になることが判明した。図１３から最初の９種の配列が一つの群に属し、最後の４種の配列がもう一方の群に属する。この１３種のタンパク質のドメイン配列を比較すると、３９％の同一性値が得られる（マックベクター（MacVector）、クラスタル（Clustal）Ｗ１.４）。同一群に属する配列を比較すると、同一性値は９２％を超えて増大した。
【０１３５】
実施例７
本実施例は、ＢＶＨ−３およびＢＶＨ−１１遺伝子の部分の相同性を示す。
ＢＶＨ−３およびＢＶＨ−１１遺伝子に由来するＤＮＡプローブによる分子分析は、ＢＶＨ−３およびＢＶＨ−１１に関連があることを指摘した。ドットブロットハイブリダイゼーション試験において、ＢＨＶ−３またはＢＶＨ−１１遺伝子配列のいずれかからなるＤＮＡプローブが、ＢＶＨ−３およびＢＶＨ−１１遺伝子の両方にハイブリダイズし、故に、このことは、ＢＶＨ−３およびＢＶＨ−１１遺伝子が、相同配列を持つことを指摘している。配列の比較によって、該ＯＲＦおよびタンパク質は、それぞれ４３および３３％の同一性を有することが明らかとなった。より詳しい試験によって、ＢＶＨ−３におけるアミノ酸１ないし２２５におよびＢＶＨ−１１における１ないし２２８に対応する領域は、ＤＮＡおよびタンパク質レベルで、それぞれ７３および７５％の同一性を有することが明らかとなった。これに対し、ＢＶＨ−３からのアミノ酸２２６ないし１０３９およびＢＶＨ−１１からのアミノ酸２２９ないし８４０に対応する３’領域は、ＤＮＡおよびタンパク質レベルで、それぞれ３４および２２％の同一性しかなかった。そしてＢＶＨ−３およびＢＶＨ−１１遺伝子の５’末端は、高度に保存された配列を含むようであり、一方、該遺伝子の残りの部分は、高度に分岐していた。これらの結果は、ＢＨＶ−３およびＢＶＨ−１１が、保存領域に存在する配列によって仲介される類似の機能を有しており、一方、ＢＶＨ−３およびＢＶＨ−１１特異的機能が、分岐領域における配列によって媒介されているようであることを示唆している。
【０１３６】
実施例８
本実施例は、切断ＢＶＨ−３、ＢＶＨ−１１およびＢＶＨ−１１−２遺伝子の、ポリメラーゼ連鎖反応(ＰＣＲ)によるクローニング、および切断ＢＶＨ−３およびＢＶＨ−１１分子の発現を記載する。
遺伝子フラグメントを、改変されたオリゴヌクレオチドの組を使用してＰＣＲによって増幅し、肺炎連鎖球菌(S. pneumoniae)株 SP64からのＢＶＨ−３(配列番号１および配列番号１１)、ＢＶＨ−１１(配列番号３および配列番号１２)またはＢＶＨ−１１−２(配列番号１３)遺伝子に渡るフラグメントを増幅した。各プライマーは、５’末端に制限エンドヌクレアーゼ部位を有し、それによって消化されたプラスミドベクターへの増幅産物の、方向性のインフレームのクローニングが可能となった(表２および３)。ＰＣＲ増幅産物を制限エンドヌクレアーゼによって消化し、ｐＳＬ３０１(実施例１参照)、ｐＣＭＶ−ＧＨ(実施例２参照)またはｐＥＴ(Novagen, Madison, WI)発現ベクターのいずれかの線形化されたプラスミド(同様に消化され、または矛盾しない粘着末端を生じる酵素で消化された)にライゲートした。組み換えｐＳＬ３０１および組み換えｐＣＭＶ−ＧＨプラスミドを、ｐＥＴ発現ベクターにおけるインフレームのクローニングのために、制限酵素で消化した。クローンを、切断ＢＶＨ−３またはＢＶＨ−１１分子の発現のために、E. coli BL21(λDE3)またはAD494(λDE3)へ導入する前に、最初に、E. coli DH5αにおいて安定化した。
【０１３７】
得られた各プラスミド構築物を、ヌクレオチド配列分析によって確認した。組換えタンパク質を、チオレドキシンおよびＨｉｓ・ＴａｇとのＮ末端融合として、またはＨｉｓタグとのＣ末端融合として発現させた。発現された組み換えタンパク質を、Ｈｉｓ結合金属キレート化樹脂(QIAgen, Chatsworth, CA)を使用して、超音波処理したＩＰＴＧ誘導E. coli培養物の遠心分離から得られた上精分画から精製した。生じた遺伝子産物を、表３に列挙する。シグナル配列を含むＮ末端領域に対応する遺伝子産物を、Lipidatedタンパク質またはリポタンパク質(Ｌ−タンパク質)と命名する。シグナル配列を欠いたＮ末端領域に対応する遺伝子産物を、シグナル配列を欠いたタンパク質として同定する（ｗ／ｏ ｓｓ)。
【０１３８】
【表４】
【表５】
【表６】
【０１３９】
【表７】
【表８】
【０１４０】
実施例９
本実施例は、モノクローナル抗体(Ｍａｂｓ)の単離およびＢＶＨ−３、ＢＶＨ−１１およびＢＶＨ−１１−２タンパク質エピトープを特徴付けるＭａｂｓの使用を記載する。
メスのＢＡＬＢ／ｃマウス(Charles River)を、１５μｇのQuilアジュバント(Cedarlane Lanboratories Ltd, Hornby, Canada)の存在下、肺炎連鎖球菌(肺炎連鎖球菌(S. pneumoniae)) 株 SP64からの、ＢＶＨ−３、ＢＶＨ−１１またはＢＶＨ−１１−２遺伝子産物によって皮下に免疫化した。１セットのマウス(融合実験１)を第１日および第１４日に２５μｇのアフィニティー精製チオレドキシン−Ｈｉｓ・Ｔａｇ−ＢＶＨ−３Ｍ融合タンパク質で免疫化した。マウスの第二の群(融合実験２)を、２５μｇのアフィニティー精製チオレドキシン−Ｈｉｓ・Ｔａｇ−ＢＶＨ−１１Ｍで３週間間隔で３回免疫化した。マウスの第３の群(融合実験３)を、２５μｇのアフィニティー精製チオレドキシンＨｉｓ・Ｔａｇ−ＢＶＨ−１１−２Ｍ融合タンパク質で第１日および第１５日に免疫化した。
【０１４１】
マウスの第４の群(融合実験４)を、２５μｇのアフィニティー精製チオレドキシン−Ｈｉｓ・Ｔａｇ−ＢＶＨ−１１−Ｂ融合タンパク質で第１日に免疫化し、第１６日におよび第３７日にＰＢＳ中の組み換えＢＶＨ−１１Ｂで静脈内注射によって追加免疫化した。融合の３ないし４日前に、マウスを、２５μｇの、ＰＢＳ単独中に懸濁されたそれぞれの抗原で静脈内に注射した。ハイブリドーマを、先にJ. Hamel et al. [J. Med. Microbiol., 23, pp163-170(1987)]によって記載されたように、非分泌性ＳＰ２／０ミエローマ細胞と脾臓細胞の融合によって生成した。ハイブリドーマの培養物上清を、まず、精製組換えタンパク質または熱で殺した肺炎連鎖球菌(S. pneumoniae)細胞の懸濁の製剤でコートしたプレートを使用して、Hamel et al.(前掲)によって記載の方法に従い酵素結合イムノアッセイによってスクリーニングした。次に、抗原の変化によるＥＬＩＳＡ反応に基づき選択された陽性のハイブリドーマを、限界希釈法によってクローニングし、増幅し(expand)、凍結した。
【０１４２】
ハイブリドーマを、Ｍａｂｓによって認識されるエピトープを特徴付けるために、ＢＶＨ−３およびＢＶＨ−１１遺伝子産物に対する、ＥＬＩＳＡまたはウェスタンイムノブロッティングによって試験した。ＢＶＨ−３およびＢＶＨ−１１は、６つのＭａｂｓ(Ｈ３−１−Ｆ９、Ｈ３−１−Ｄ４、Ｈ３−１−Ｈ１２、Ｈ１１−１−Ｅ７、Ｈ１１−１−Ｈ１０およびＨ１１−１．１−Ｇ１１)との共通のエピトープを有し、両方のタンパク質と反応性を示した(表４)。肺炎連鎖球菌(S. pneumoniae) SP64からのＢＶＨ−１１およびＢＶＨ−１１−２分子は、ＢＶＨ−１１およびＢＶＨ−１１−２の組換えタンパク質の両方と反応性の、ＢＶＨ−３には存在しない、Ｍａｂｓ(３Ａ１、１３Ｃ１１、１０Ｈ１０、１Ｄ８、１０Ｇ９、１０Ａ２、３Ｅ８、１０Ｄ７、２Ｈ７および６Ｈ７)との共通のエピトープを有する(表５)。
【０１４３】
【表９】
【０１４４】
【表１０】
【０１４５】
Ｍａｂｓの免疫反応性試験から得られた結果(表４および表５)は、それぞれの遺伝子配列から演繹されたタンパク質配列と一致する。実際、ＢＶＨ−３およびＢＶＨ−１１分子と交差反応性のＭａｂｓは、保存領域に対応するＢＶＨ−３Ｃタンパク質を認識し、ＢＶＨ−１１およびＢＶＨ−１１−２特異的Ｍａｂｓは、これらの分子の様々な部分に位置するエピトープと反応性であった。ＢＶＨ−３およびＢＶＨ−１１、並びにＢＶＨ−１１およびＢＶＨ−１１−２を、Ｍａｂｓとの反応性によって区別できる。
【０１４６】
実施例１０
本実施例は、肺炎連鎖球菌(S. pneumoniae)によるＢＶＨ−３およびＢＶＨ−１１遺伝子産物の同時発現を示す。
標準的ウェスタンブロット法を、ＢＶＨ−３およびＢＶＨ−１１遺伝子のどちらが肺炎連鎖球菌(S. pneumoniae)において発現されたか調査するために使用した。肺炎連鎖球菌(S. pneumoniae)株 SP64およびSP63を、チョコレートアガープレート上で、終夜３７℃で５％のＣＯ２中で成長させ、バクテリアをＰＢＳ中に懸濁し、５６℃２０分で熱で殺した。抗体の調製のために、肺炎連鎖球菌(S. pneumoniae)の懸濁を、ＳＤＳおよび２−メルカプトエタノールを含む試料バッファーで、１００℃で５分間処理した。肺炎球菌性タンパク質抗体を、Laemmli[Nature, 227, pp. 680-685(1970)]の方法に従って、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動によって分離した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥの後、該タンパク質を、ゲルからニトロセルロースペーパーに、Towbin[Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 76, pp. 4350-4354(1979)]の方法によって電気泳動的に移し、マウス抗血清またはモノクローナル抗体で探索した。
【０１４７】
抗体と反応性の抗原の検出を、接合抗マウス免疫グロブリンおよび色基質を使用する間接酵素イムノアッセイによって実施した。組み換えＢＶＨ−３に対して産生された抗血清を、肺炎連鎖球菌(S. pneumoniae)SP64抗原に対して試験したとき、１２７ｋＤａおよび９９ｋＤａの明白な分子量を有する二つの反応バンドを検出した。Ｍａｂｓ Ｈ３−１−Ｆ９、Ｈ３−１−Ｄ４、Ｈ３−１−Ｈ１２、Ｈ１１−１−Ｅ７、Ｈ１１−１−Ｈ１０およびＨ−１１−１．１−Ｇ１１をそれぞれ免疫学的プローブとして使用したとき、同じ明白な分子量を有するバンドも検出された。これに対して、ＢＶＨ−３分子に特異的なＭａｂｓは、１２７ｋＤａのバンドのみを検出し、ＢＶＨ−１１に特異的なＭａｂｓは、９９ｋＤａのバンドのみを検出し、故に、１２７および９９ｋＤａのバンドの同一性をＢＶＨ−３およびＢＶＨ−１１としてそれぞれ確認した。これらの試験は、ＢＶＨ−３およびＢＶＨ−１１タンパク質は、肺炎連鎖球菌(S. pneumoniae)に同時に存在する証拠を提供している。さらに、この結果は、ＢＶＨ−３およびＢＶＨ−１１が、両方のタンパク質に共通するエピトープ、並びにいずれかのタンパク質に限られるエピトープを有するという先の観察結果と矛盾しない。
【０１４８】
肺炎連鎖球菌(S. pneumoniae)SP64において、成熟ＢＶＨ−３、ＢＶＨ−１１およびＢＶＨ−１１−２は、それぞれ、１１２．５ｋＤａ、９２．４ｋＤａ、および９１．７ｋＤａの予想された分子量を有する、１０１９、８２１および８１９アミノ酸のタンパク質である。配列から予想された分子量およびＳＤＳ−ＰＡＧＥに基づき算出された分子量の間に不一致があるが、ＢＶＨ−３は、その高分子量によってＢＶＨ−１１から区別できる。さらに、肺炎連鎖球菌(S. pneumoniae)株 SP63からのＢＶＨ−３分子は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにおける１１２ｋＤａの明白な分子量を有し、これに対して、SP64 株のＢＶＨ−３は１２７ｋＤａである。このデータは、肺炎連鎖球菌(S. pneumoniae)株 SP63のＢＶＨ−３における１７７アミノ酸残基に及ぶ欠失と矛盾しない。
【０１４９】
実施例１１
本実施例は、組み換えＢＶＨ−３またはＢＶＨ−１１遺伝子産物でワクチン注射された、マウスの実験的な感染における、付与された防御を記載する。
７または８匹のメスのＢＡＬＢ／ｃマウス(Charles River)の群を、アフィニティー精製チオレドキシン−Ｈｉｓ・Ｔａｇ−ＢＶＨ−３Ｍ融合タンパク質、アフィニティー精製チオレドキシン−Ｈｉｓ・Ｔａｇ−ＢＶＨ−１１Ｍ融合タンパク質または、コントロールとして、ＰＢＳ中のQuilAアジュバント単独のいずれかで３週間間隔で３回皮下に免疫化した。
【０１５０】
第３の免疫化に続いて１２ないし１４日間、マウスを肺炎連鎖球菌(S. pneumoniae) WU2 株で静脈内に、またはP4241 株で鼻腔内にチャレンジした。肺炎連鎖球菌(S. pneumoniae)チャレンジ接種菌の試料を、チョコレートアガープレート上に置き、ＣＦＵを測定し、チャレンジ用量を確認した。該チャレンジ用量は、およそ１０６ＣＦＵであった。死亡を、チャレンジ後１４日の期間および第１４日に記録し、生存マウスを屠殺し、血液試料を肺炎連鎖球菌(S. pneumoniae)微生物の存在について試験した。該生存データを表６および７に示す。
【０１５１】
【表１１】
【０１５２】
【表１２】
【０１５３】
組み換えＢＶＨ−３ＭまたはＢＶＨ−１１Ｍタンパク質で免疫化されたすべてのマウスが、WU2での感染に対して生存したが、一方、アジュバント単独を与えられたコントロールのマウスは、生存しなかった。１匹を除いた、組み換えＢＶＨ−３ＭまたはＢＶＨ−１１Ｍタンパク質で免疫化されたすべてのマウスが、Ｐ４２４１での感染に対して生存したが、一方、アジュバント単独を与えられたコントロールのマウスは、１匹しか生存しなかった。生存マウスからのすべての血球培養物は、チャレンジ後の第１４日において陰性であった。これらの結果は、ＢＶＨ−３ＭおよびＢＶＨ−１１Ｍの両方が、マウスにおいて防御的な抗肺炎球菌免疫応答を誘発することを明白に指摘している。これらのタンパク質が、肺炎連鎖球菌(S. pneumoniae)分離菌の中で高度に保存されている事実は、ＢＶＨ−３およびＢＶＨ−１１の不偏的なワクチン候補としての可能性を強調している。実際、血清群６ 肺炎連鎖球菌(S. pneumoniae) 株 SP64からのＢＶＨ−３およびＢＶＨ−１１タンパク質は、様々な莢膜血清型株での肺炎球菌感染に対する防御を誘発した。
【０１５４】
理想的には、肺炎球菌性疾患に対して防御することのできるワクチンは、髄膜炎、中耳炎、菌血症および肺炎に対して防御し得る。ＢＶＨ−３およびＢＶＨ−１１は、致死の全身性および肺炎感染型に対して防御性があった。故に、ヒトにおいて、ＢＶＨ−３およびＢＶＨ１１タンパク質に基づくワクチンが、莢膜血清型に関係なく実質的にすべての肺炎連鎖球菌(S. pneumoniae)によって引き起こされる広いスペクトルの疾患の発病率を減少させ得ることを示唆している。
【０１５５】
表６および表７からのデータは、ＢＶＨ−３およびＢＶＨ−１１の両方が、肺炎連鎖球菌(S. pneumoniae)の防御誘発分子であったことを明白に示している。しかし、防御が、ＢＶＨ−３およびＢＶＨ−１１分子に共有されない特異的配列によって仲介されることができるか否かは、知られていなかった。メスのＢＡＬＢ／Ｃマウス(Charles River)の群を、１５μｇのQuilAアジュバント(Cedarlane Laboratories Ltd, Hornby, Canada)の存在下、アフィニティー精製チオレドキシン−Ｈｉｓ・Ｔａｇ−ＢＶＨ−３ＡＤ、−ＢＶＨ−３Ｂまたは−ＢＶＨ−３Ｃ融合タンパク質のいずれかによって、３週間間隔で３回、皮下に免疫化した。コントロールのマウスを、ＰＢＳ中のQuilAアジュバント単独、またはQuilAの存在下、アフィニティー精製チオレドキシン−Ｈｉｓ・Ｔａｇもしくはチオレドキシン−Ｈｉｓ・Ｔａｇ−融合タンパク質(Ｈｉｓ−Ｔｈｉｏ)で免疫化した。
【０１５６】
ＮＥＷ４、ＮＥＷ５、ＮＥＷ６、ＮＥＷ７、ＮＥＷ８、ＮＥＷ９、ＮＥＷ１０、ＮＥＷ１１、ＮＥＷ１４およびＢＶＨ−１１Ｂと命名した切断タンパク質の組の防御能を測定するために、メスのＢＡＬＢ／ｃマウス(Charles River)の群を、１５μｇのQuialAアジュバントの存在下、２５μｇのアフィニティー精製Ｈｉｓ・Ｔａｇ−融合タンパク質のいずれかで、３週間間隔で２回、皮下に免疫化した。最後の免疫化に続いて１０ないし１４日、マウスを毒性肺炎連鎖球菌(S. pneumoniae)でチャレンジした。我々の結果は、ＢＶＨ−３Ｂ(アミノ酸５１２−１０３９からなる切断ＢＶＨ−３分子)が、マウス毒性株 WU2およびP4241に対する防御を誘発したことを指摘している。
【０１５７】
同様に、ＢＶＨ−１１Ｂ、ＮＥＷ４およびＮＥＷ５分子(それぞれアミノ酸３５４−８４０、アミノ酸２８６−８４０およびアミノ酸２８６−７１３からなる３つの切断ＢＶＨ−１１分子)は、WU2での実験的な静脈内チャレンジおよびP4241での鼻腔内チャレンジに対する防御を誘発した。さらに、ＢＶＨ−１１−２分子からのアミノ酸２７２−８３８およびアミノ酸２２７−６９９からなるＮＥＷ１０およびＮＥＷ１４でのワクチン接種も、肺炎球菌株による死亡に対して防御をもたらした。これらの結果は、肺炎連鎖球菌(S. pneumoniae) SP64 ＢＶＨ−１１およびＢＶＨ−１１−２タンパク質配列におけるアミノ酸２８６−７１３およびアミノ酸２７２−６９９からの４２８アミノ酸を含む領域が、それぞれ防御的エピトープを含むことを指摘している。この領域は、１３のＢＶＨ−１１タンパク質配列の間に全体的な９１％同一性および９４％相同性を有し、高度に保存されている。
【０１５８】
【表１３】
【０１５９】
実施例１２
本実施例は、ＢＶＨ−１１のカルボキシル末端領域へのＣ’末端での融合におけるＢＶＨ−３のカルボキシル末端に対応するキメラ・ポリペプチドをエンコードするキメラ遺伝子のクローニングおよび発現並びにキメラ・ポリペプチドによるワクチン接種の後に観察された付加的な防御を記載した。
ＢＶＨ−３およびＢＶＨ−１１は、肺炎連鎖球菌(S. pneumoniae)に同時に存在する、血清的に別の分子であることは、前記で記載した研究から明白である。マウスの免疫学的研究は、両方のタンパク質が、よいワクチン候補であることを指摘している。これらのタンパク質は、血清型に関係なく、すべての肺炎球菌に対して防御を提供する可能性を有する。二つのタンパク質は、エピトープおよび配列を共有するとしても、それらは、異なる性質を有し、異なる生物学的機能を提供し得る。故に、二つのタンパク質に対する免疫化は、それぞれによって個別に分け与えられるものよりもより高いレベルの防御を提供し得る。これを試験するために、全長または切断ＢＶＨ−３およびＢＶＨ−１１を組み合わせまたは結合して投与するいくつかの達成方法が、探求されることができる。ここに、我々は、ＢＶＨ−３−ＢＶＨ−１１融合遺伝子の遺伝子操作およびＮＥＷ１２と称するタンパク質 (それぞれ配列番号７６および配列番号５８)、並びにＮＥＷ１２タンパク質のワクチンとしての可能な使用を記載する。
【０１６０】
遺伝子の３’末端に対応するＢＶＨ−３およびＢＶＨ−１１遺伝子フラグメントを、改変されたオリゴヌクレオチドの組を使用してＰＣＲによって増幅し、それぞれ肺炎連鎖球菌(S. pneumoniae) 株 SP64 ＢＶＨ−３およびＢＶＨ−１１遺伝子からの、ヌクレオチド１４１４ないし３１１７(配列番号１)およびヌクレオチド１０６０ないし２５２０(配列番号３)に渡るフラグメントを増幅した。使用したプライマー、ＨＡＭＪ２７８およびＨＡＭＪ２７９；ＨＡＭＪ２８２およびＨＡＭＪ２８３は、５’末端に制限エンドヌクレアーゼ部位を有し、それによって増幅産物の消化されたｐＥＴ２１ｂ(＋)プラスミドベクター(表２)への直接的なインフレームなクローニングが可能となった。ＰＣＲ増幅産物を制限エンドヌクレアーゼによって消化し、同様に消化した線形化されたプラスミドｐＥＴ２１ｂ(＋)ベクターにライゲートした。得られたプラスミド構築物を、ヌクレチド配列分析によって確認した。ＮｄｅＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ ＢＶＨ−３ ＰＣＲ産物を含む組換えｐＥＴ２１ｂ(＋)プラスミドを、ＢＶＨ−１１遺伝子フラグメントを含む組み換えｐＥＴ２１(＋)ベクターから得られたＨｉｎｄＩＩＩ−ＮｏｔＩ ＤＮＡフラグメントのインフレームのクローニングのために、制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩおよびＮｏｔＩでの消化によって線形化した。キメラ肺炎球菌タンパク質分子の発現のためにE.coli BL21(λDE3)に導入する前に、クローンを最初にE. coli DH5αにおいて安定化した。ＮＥＷ１２と称する組換えキメラペプチドを、Ｈｉｓ−タグとのＣ末端融合として発現させた。発現した組み換えＮＥＷ１２タンパク質を、Ｈｉｓ結合金属キレート化樹脂(QIAgen, Chatsworth, CA)を使用して、超音波処理ＩＰＴＧ誘導E. coli培養物の遠心分離から得られた上清分画から精製した。
【０１６１】
前記記載の同じ方法によって、Ｎｅｗ１およびＮｅｗ４、Ｎｅｗ１およびＮｅｗ５、Ｎｅｗ１およびＮｅｗ１０、またはＮｅｗ１およびＮｅｗ１４の同時発現の結果として、他のキメラ・ポリペプチドを構築することが可能である。該構築物は、Ｎｅｗ１と、Ｎｅｗ４、Ｎｅｗ５、Ｎｅｗ１０、ＢＶＨ−１１ＢまたはＮｅｗ１４の上流または下流へのものであることができる。ＢＶＨ−３、ＢＶＨ−１１またはＢＶＨ−１１−２のいずれかの遺伝子の二つのフラグメントより多い同時発現の結果として、他のキメラペプチドを構築することもできる。
【０１６２】
８匹のメスのＢＡＬＢ／ｃマウス(Charles River)の群を、１５μｇのQuilAアジュバントの存在下、２５μｇのアフィニティー精製Ｈｉｓ・Ｔａｇ−融合ＮＥＷ１、ＢＶＨ−１１ＢまたはＮＥＷ１２タンパク質のいずれかで、３週間間隔で２回皮下に免疫化した。最後の免疫化に続いて１０ないし１４日、マウスを毒性肺炎連鎖球菌(S. pneumoniae)でチャレンジした。前に示したように、それぞれＢＶＨ−３タンパク質からのアミノ酸４７２ないし１０３９およびＢＶＨ−１１タンパク質からのアミノ酸３５４−８４０を含む、ＮＥＷ１およびＢＶＨ−１１Ｂ分子は、防御免疫反応を誘発することのできるタンパク質の一部に対応した。
【０１６３】
キメラ・ポリペプチドが、それぞれの対応するものについて見られるものと比較して、有意に防御を向上させることができるかどうか決定するために、チャレンジ用量を、ＮＥＷ１およびＢＶＨ−１１Ｂ分子によって防御が期待されないように、調節した。興味深いことに、該キメラＮＥＷ１２タンパク質は、マウス毒性株WU2およびP4241に対する防御を誘発した。ＮＥＷ１２で免疫化した８匹のうち７匹のマウスが、チャレンジの10日後なお生存し、一方、ＮＥＷ１、ＢＶＨ−１１Ｂ、ＢＶＨ−３Ｍまたはアジュバント単独で免疫化した３２匹のマウスのうち２８匹が、チャレンジ後５日までに死亡した。故に、ＮＥＷ１２でのマウスのワクチン接種は、WU2チャレンジに対する最高の程度の防御を提供した。これらの結果は、キメラ・ポリペプチドでの免疫化およびあるいはＢＶＨ−３およびＢＶＨ−１１遺伝子産物の組み合わせが、ＢＶＨ−３またはＢＶＨ−１１抗原単独の投与によって取得されたものに付加的な防御を提供することのできることを指摘している。
【０１６４】
【表１４】
【０１６５】
実施例１３
本実施例は、S.pneumoniaeのほかの連鎖球菌種における付加的なＢＶＨ−３およびＢＶＨ−１１関連配列の同定を示す。
ＢＶＨ−３、ＢＶＨ−１１およびＢＶＨ−１１−２は、共通配列を共に有する関連するタンパク質のファミリーであることを前記で示した。相同性の探索を、これらの遺伝子の保存領域からのヌクレオチド配列で実施し、ＦＡＳＴＡを使用して、GenBankおよびＥＭＢＬ配列と比較した。最も有意な相同性が、Ｂ群連鎖球菌またはＧＢＳとも称されるS. agalactiaeにおける未知の機能の算出された９２ｋＤａのタンパク質(配列番号８１)をコードする２．４６９ｋｂの遺伝子との間に観察された。これらの遺伝子をＢＶＨ−７１と命名した。ＧＢＳのものと９９．２％の同一性および９９．５％の類似性を示すタンパク質も、Ａ群連鎖球菌またはＧＡＳとも称されるS. pyogenesにおいて同定した(配列番号８３)。ＢＶＨ−７１配列の５’領域(配列番号８０および配列番号８２)は、ヌクレオチド１ないし７１７におよび、それぞれＢＶＨ−３(ヌクレオチド１ないし６７５)およびＢＶＨ−１１(ヌクレオチド１ないし６８４)遺伝子の保存領域と５８および６０％の同一性を示した。
【０１６６】
ＧＢＳおよびＧＡＳのＢＶＨ−７１オープンリーディングフレームの翻訳された配列の最初の２３９アミノ酸は、それぞれ、ＢＶＨ−３およびＢＶＨ−１１の最初の２２５および２２８アミノ酸と５１および５４％の同一性があった。構造上の類似性に加えて、連鎖球菌のＢＶＨ−３、ＢＶＨ−１１およびＢＶＨ−７１タンパク質は、抗原性エピトープも共有している。９７ｋＤａのバンドが、ＢＶＨ−３およびＢＶＨ−１１保存領域と反応性のあるＭａｂｓ Ｈ１１−１．１−Ｇ１１を使用して、ＧＡＳまたはＧＢＳ全細胞のウェスタンブロットにおいて明らかになった。同様に、ＧＡＳおよびＧＢＳ組み換えＢＶＨ−７１タンパク質をウェスタンイムノブロット分析において検出した。
これらの結果は、ＢＶＨ−７１、ＢＶＨ−３およびＢＶＨ−１１タンパク質が、同様の機能を共有していることを指摘している。我々の結果は、ＢＶＨ−７１タンパク質を、抗連鎖球菌のタンパク質ワクチン構成成分として使用できることも示唆している。さらなる実施態様において、ＢＶＨ−７１タンパク質を、抗ＧＡＳまたは抗ＧＢＳワクチンのタンパク質ワクチン構成成分として使用できる。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号２、４、６、８、１０、１４、１６、５５〜７５、７７〜７９、８１、８３またはそのフラグメント、類似体または誘導体から選択される配列を有する第二のポリペプチドに少なくとも７０％の同一性を有するポリペプチドをエンコードする単離体ポリヌクレオチド。
【請求項２】
当該ポリヌクレオチドが該第二のポリペプチドに少なくとも９５％の同一性を有するポリペプチドをエンコードする請求項１記載のポリヌクレオチド。
【請求項３】
配列番号２、４、６、８、１０、１４、１６、５５〜７５、７７〜７９、８１、８３またはそのフラグメント、類似体または誘導体から選択される配列を有するポリペプチドに対し結合特異性を有する抗体を生成し得るポリペプチドをエンコードする単離体ポリヌクレオチド。
【請求項４】
請求項１記載のポリヌクレオチドに相補的である単離体ポリヌクレオチド。
【請求項５】
請求項３記載のポリヌクレオチドに相補的である単離体ポリヌクレオチド。
【請求項６】
当該ポリヌクレオチドがＤＮＡである請求項１記載のポリヌクレオチド。
【請求項７】
当該ポリヌクレオチドがＤＮＡである請求項３記載のポリヌクレオチド。
【請求項８】
当該ポリヌクレオチドがＲＮＡである請求項１記載のポリヌクレオチド。
【請求項９】
当該ポリヌクレオチドがＲＮＡである請求項３記載のポリヌクレオチド。
【請求項１０】
請求項１記載のポリヌクレオチドを含んでなるベクターであって、当該ＤＮＡが発現制御領域に操作可能に結合しているベクター。
【請求項１１】
請求項３記載のポリヌクレオチドを含んでなるベクターであって、当該ＤＮＡが発現制御領域に操作可能に結合しているベクター。
【請求項１２】
請求項１０記載のベクターを移入した宿主細胞。
【請求項１３】
請求項１１記載のベクターを移入した宿主細胞。
【請求項１４】
ポリペプチドの製造法であって、当該ポリペプチドの発現に適した条件下に請求項１２記載の宿主細胞を培養することを特徴とする方法。
【請求項１５】
ポリペプチドの製造法であって、当該ポリペプチドの発現に適した条件下に請求項１３記載の宿主細胞を培養することを特徴とする方法。
【請求項１６】
配列番号２、４、６、８、１０、１４、１６、５５〜７５、７７〜７９、８１、８３またはそのフラグメント、類似体または誘導体から選択されるアミノ酸配列を有する第二のポリペプチドに少なくとも７０％の同一性を有する単離体ポリペプチド。
【請求項１７】
配列番号２、４、６、８、１０、１４、１６、５５〜７５、７７〜７９、８１、８３またはそのフラグメント、類似体または誘導体から選択される配列を有する第二のポリペプチドに対し結合特異性を有する抗体を生成し得る単離体ポリペプチド。
【請求項１８】
配列番号２、４、６、８、１０、１４、１６、５５〜７５、７７〜７９、８１、８３またはそのフラグメント、類似体または誘導体から選択されるアミノ酸配列を有する単離体ポリペプチド。
【請求項１９】
請求項１８記載のポリペプチドであって、そのＮ−末端Ｍｅｔ残基が欠失している単離体ポリペプチド。
【請求項２０】
請求項１８記載のポリペプチドであって、その分泌アミノ酸残基が欠失している単離体ポリペプチド。
【請求項２１】
配列番号２、４、６、８、１０、１４、１６、５５〜７５、７７〜７９、８１、８３から選択される１種またはそれ以上のポリペプチド、またはそのフラグメント、類似体または誘導体を含んでなるキメラ・ポリペプチドであって、該ポリペプチドまたはそのフラグメント、類似体または誘導体がキメラ・ポリペプチドを形成するように結合しているキメラ・ポリペプチド。
【請求項２２】
配列番号１０、５８、６０、６２、６４、６７、６８、６９、７２、７４、７７から選択される１種またはそれ以上のポリペプチド、またはそのフラグメント、類似体または誘導体を含んでなるキメラ・ポリペプチドであって、該ポリペプチドまたはそのフラグメント、類似体または誘導体がキメラ・ポリペプチドを形成するように結合しているキメラ・ポリペプチド。
【請求項２３】
式（Ｉ）：
Ａ−(Ｂ)ｍ−(Ｃ)ｎ−Ｄ （Ｉ）
ただし、
ｍは０または１である；
ｎは０または１である；
Ａは配列番号２、４、６、８、１０、１４、１６、５５〜７５、７７〜７９、８１、８３またはそのフラグメント、類似体または誘導体から選択される；
Ｂは配列番号２、４、６、８、１０、１４、１６、５５〜７５、７７〜７９、８１、８３またはそのフラグメント、類似体または誘導体から選択される；
Ｃは配列番号２、４、６、８、１０、１４、１６、５５〜７５、７７〜７９、８１、８３またはそのフラグメント、類似体または誘導体から選択される；および
Ｄは配列番号２、４、６、８、１０、１４、１６、５５〜７５、７７〜７９、８１、８３またはそのフラグメント、類似体または誘導体から選択される；
で示されるキメラ・ポリペプチド。
【請求項２４】
式（Ｉ）：
Ａ−(Ｂ)ｍ−(Ｃ)ｎ−Ｄ （Ｉ）
ただし、
ｍは０または１である；
ｎは０または１である；
Ａは配列番号１０、５８、６０、６２、６４、６７、６８、６９、７２、７４、７７またはそのフラグメント、類似体または誘導体から選択される；
Ｂは配列番号１０、５８、６０、６２、６４、６７、６８、６９、７２、７４、７７またはそのフラグメント、類似体または誘導体から選択される；
Ｃは配列番号１０、５８、６０、６２、６４、６７、６８、６９、７２、７４、７７またはそのフラグメント、類似体または誘導体から選択される；および
Ｄは配列番号１０、５８、６０、６２、６４、６７、６８、６９、７２、７４、７７またはそのフラグメント、類似体または誘導体から選択される；
で示されるキメラ・ポリペプチド。
【請求項２５】
請求項１６ないし２４のいずれかに記載のポリペプチドおよび医薬的に許容し得る担体、賦形剤またはアジュバントを含んでなるワクチン組成物。
【請求項２６】
髄膜炎、中耳炎、菌血症または肺炎の感染に罹患する可能性のある個体における髄膜炎、中耳炎、菌血症または肺炎の治療的または予防的処置方法であって、請求項２５に記載の組成物の治療量または予防量を当該個体に投与することを特徴とする方法。
【請求項２７】
連鎖球菌感染に罹患する可能性のある個体における連鎖球菌による細菌感染の治療的または予防的処置方法であって、請求項２５に記載の組成物の治療量または予防量を当該個体に投与することを特徴とする方法。
【請求項２８】
当該個体が哺乳動物である請求項２６に記載の方法。
【請求項２９】
当該個体がヒトである請求項２７に記載の方法。
【請求項３０】
当該細菌感染が肺炎連鎖球菌（S. pneumoniae）、Ａ群連鎖球菌（化膿菌、pyogenes）、Ｂ群連鎖球菌（ＧＢＳまたはアガラクチエ、agalactiae）、ディスガラクチエ（dysgalactiae）、ユベリス（uberis）、ノカルディア（nocardia）またはスタヒロコッカス・アウレウス（Staphylococcus aureus）である請求項２２に記載の方法。
【請求項３１】
当該細菌感染が肺炎連鎖球菌（S. pneumoniae）によるものである請求項２６に記載の方法。
【請求項３２】
連鎖球菌感染症に罹患する可能性のあるまたは感染している動物において、該組成物の治療量または予防量を当該動物に投与することを含んでなる連鎖球菌感染症の予防的または治療的処置のための請求項２５記載のワクチン組成物の使用。
【請求項１】
配列番号２、４、６、８、１０、１４、１６、５５〜７５、７７〜７９、８１、８３またはそのフラグメント、類似体または誘導体から選択される配列を有する第二のポリペプチドに少なくとも７０％の同一性を有するポリペプチドをエンコードする単離体ポリヌクレオチド。
【請求項２】
当該ポリヌクレオチドが該第二のポリペプチドに少なくとも９５％の同一性を有するポリペプチドをエンコードする請求項１記載のポリヌクレオチド。
【請求項３】
配列番号２、４、６、８、１０、１４、１６、５５〜７５、７７〜７９、８１、８３またはそのフラグメント、類似体または誘導体から選択される配列を有するポリペプチドに対し結合特異性を有する抗体を生成し得るポリペプチドをエンコードする単離体ポリヌクレオチド。
【請求項４】
請求項１記載のポリヌクレオチドに相補的である単離体ポリヌクレオチド。
【請求項５】
請求項３記載のポリヌクレオチドに相補的である単離体ポリヌクレオチド。
【請求項６】
当該ポリヌクレオチドがＤＮＡである請求項１記載のポリヌクレオチド。
【請求項７】
当該ポリヌクレオチドがＤＮＡである請求項３記載のポリヌクレオチド。
【請求項８】
当該ポリヌクレオチドがＲＮＡである請求項１記載のポリヌクレオチド。
【請求項９】
当該ポリヌクレオチドがＲＮＡである請求項３記載のポリヌクレオチド。
【請求項１０】
請求項１記載のポリヌクレオチドを含んでなるベクターであって、当該ＤＮＡが発現制御領域に操作可能に結合しているベクター。
【請求項１１】
請求項３記載のポリヌクレオチドを含んでなるベクターであって、当該ＤＮＡが発現制御領域に操作可能に結合しているベクター。
【請求項１２】
請求項１０記載のベクターを移入した宿主細胞。
【請求項１３】
請求項１１記載のベクターを移入した宿主細胞。
【請求項１４】
ポリペプチドの製造法であって、当該ポリペプチドの発現に適した条件下に請求項１２記載の宿主細胞を培養することを特徴とする方法。
【請求項１５】
ポリペプチドの製造法であって、当該ポリペプチドの発現に適した条件下に請求項１３記載の宿主細胞を培養することを特徴とする方法。
【請求項１６】
配列番号２、４、６、８、１０、１４、１６、５５〜７５、７７〜７９、８１、８３またはそのフラグメント、類似体または誘導体から選択されるアミノ酸配列を有する第二のポリペプチドに少なくとも７０％の同一性を有する単離体ポリペプチド。
【請求項１７】
配列番号２、４、６、８、１０、１４、１６、５５〜７５、７７〜７９、８１、８３またはそのフラグメント、類似体または誘導体から選択される配列を有する第二のポリペプチドに対し結合特異性を有する抗体を生成し得る単離体ポリペプチド。
【請求項１８】
配列番号２、４、６、８、１０、１４、１６、５５〜７５、７７〜７９、８１、８３またはそのフラグメント、類似体または誘導体から選択されるアミノ酸配列を有する単離体ポリペプチド。
【請求項１９】
請求項１８記載のポリペプチドであって、そのＮ−末端Ｍｅｔ残基が欠失している単離体ポリペプチド。
【請求項２０】
請求項１８記載のポリペプチドであって、その分泌アミノ酸残基が欠失している単離体ポリペプチド。
【請求項２１】
配列番号２、４、６、８、１０、１４、１６、５５〜７５、７７〜７９、８１、８３から選択される１種またはそれ以上のポリペプチド、またはそのフラグメント、類似体または誘導体を含んでなるキメラ・ポリペプチドであって、該ポリペプチドまたはそのフラグメント、類似体または誘導体がキメラ・ポリペプチドを形成するように結合しているキメラ・ポリペプチド。
【請求項２２】
配列番号１０、５８、６０、６２、６４、６７、６８、６９、７２、７４、７７から選択される１種またはそれ以上のポリペプチド、またはそのフラグメント、類似体または誘導体を含んでなるキメラ・ポリペプチドであって、該ポリペプチドまたはそのフラグメント、類似体または誘導体がキメラ・ポリペプチドを形成するように結合しているキメラ・ポリペプチド。
【請求項２３】
式（Ｉ）：
Ａ−(Ｂ)ｍ−(Ｃ)ｎ−Ｄ （Ｉ）
ただし、
ｍは０または１である；
ｎは０または１である；
Ａは配列番号２、４、６、８、１０、１４、１６、５５〜７５、７７〜７９、８１、８３またはそのフラグメント、類似体または誘導体から選択される；
Ｂは配列番号２、４、６、８、１０、１４、１６、５５〜７５、７７〜７９、８１、８３またはそのフラグメント、類似体または誘導体から選択される；
Ｃは配列番号２、４、６、８、１０、１４、１６、５５〜７５、７７〜７９、８１、８３またはそのフラグメント、類似体または誘導体から選択される；および
Ｄは配列番号２、４、６、８、１０、１４、１６、５５〜７５、７７〜７９、８１、８３またはそのフラグメント、類似体または誘導体から選択される；
で示されるキメラ・ポリペプチド。
【請求項２４】
式（Ｉ）：
Ａ−(Ｂ)ｍ−(Ｃ)ｎ−Ｄ （Ｉ）
ただし、
ｍは０または１である；
ｎは０または１である；
Ａは配列番号１０、５８、６０、６２、６４、６７、６８、６９、７２、７４、７７またはそのフラグメント、類似体または誘導体から選択される；
Ｂは配列番号１０、５８、６０、６２、６４、６７、６８、６９、７２、７４、７７またはそのフラグメント、類似体または誘導体から選択される；
Ｃは配列番号１０、５８、６０、６２、６４、６７、６８、６９、７２、７４、７７またはそのフラグメント、類似体または誘導体から選択される；および
Ｄは配列番号１０、５８、６０、６２、６４、６７、６８、６９、７２、７４、７７またはそのフラグメント、類似体または誘導体から選択される；
で示されるキメラ・ポリペプチド。
【請求項２５】
請求項１６ないし２４のいずれかに記載のポリペプチドおよび医薬的に許容し得る担体、賦形剤またはアジュバントを含んでなるワクチン組成物。
【請求項２６】
髄膜炎、中耳炎、菌血症または肺炎の感染に罹患する可能性のある個体における髄膜炎、中耳炎、菌血症または肺炎の治療的または予防的処置方法であって、請求項２５に記載の組成物の治療量または予防量を当該個体に投与することを特徴とする方法。
【請求項２７】
連鎖球菌感染に罹患する可能性のある個体における連鎖球菌による細菌感染の治療的または予防的処置方法であって、請求項２５に記載の組成物の治療量または予防量を当該個体に投与することを特徴とする方法。
【請求項２８】
当該個体が哺乳動物である請求項２６に記載の方法。
【請求項２９】
当該個体がヒトである請求項２７に記載の方法。
【請求項３０】
当該細菌感染が肺炎連鎖球菌（S. pneumoniae）、Ａ群連鎖球菌（化膿菌、pyogenes）、Ｂ群連鎖球菌（ＧＢＳまたはアガラクチエ、agalactiae）、ディスガラクチエ（dysgalactiae）、ユベリス（uberis）、ノカルディア（nocardia）またはスタヒロコッカス・アウレウス（Staphylococcus aureus）である請求項２２に記載の方法。
【請求項３１】
当該細菌感染が肺炎連鎖球菌（S. pneumoniae）によるものである請求項２６に記載の方法。
【請求項３２】
連鎖球菌感染症に罹患する可能性のあるまたは感染している動物において、該組成物の治療量または予防量を当該動物に投与することを含んでなる連鎖球菌感染症の予防的または治療的処置のための請求項２５記載のワクチン組成物の使用。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１−１】
【図１１−２】
【図１２−１】
【図１２−２】
【図１２−３】
【図１２−４】
【図１３】
【図１４−１】
【図１４−２】
【図１５】
【図１６】
【図１７】
【図１８】
【図１９】
【図２０】
【図２１】
【図２２】
【図２３】
【図２４】
【図２５】
【図２６】
【図２７】
【図２８】
【図２９】
【図３０】
【図３１】
【図３２】
【図３３】
【図３４】
【図３５】
【図３６】
【図３７】
【図３８】
【図３９】
【図４０】
【図４１】
【図４２】
【図４３】
【図４４】
【図４５】
【図４６】
【図４７】
【図４８】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１−１】
【図１１−２】
【図１２−１】
【図１２−２】
【図１２−３】
【図１２−４】
【図１３】
【図１４−１】
【図１４−２】
【図１５】
【図１６】
【図１７】
【図１８】
【図１９】
【図２０】
【図２１】
【図２２】
【図２３】
【図２４】
【図２５】
【図２６】
【図２７】
【図２８】
【図２９】
【図３０】
【図３１】
【図３２】
【図３３】
【図３４】
【図３５】
【図３６】
【図３７】
【図３８】
【図３９】
【図４０】
【図４１】
【図４２】
【図４３】
【図４４】
【図４５】
【図４６】
【図４７】
【図４８】
【公開番号】特開２０１０−１４２２４６（Ｐ２０１０−１４２２４６Ａ）
【公開日】平成２２年７月１日（２０１０．７．１）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１０−２６５２１（Ｐ２０１０−２６５２１）
【出願日】平成２２年２月９日（２０１０．２．９）
【分割の表示】特願２０００−５９１１９０（Ｐ２０００−５９１１９０）の分割
【原出願日】平成１１年１２月２０日（１９９９．１２．２０）
【出願人】（５０５３３０５９４）アイディ・バイオメディカル・コーポレイション (2)
【氏名又は名称原語表記】ＩＤ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２２年７月１日（２０１０．７．１）
【国際特許分類】
【出願日】平成２２年２月９日（２０１０．２．９）
【分割の表示】特願２０００−５９１１９０（Ｐ２０００−５９１１９０）の分割
【原出願日】平成１１年１２月２０日（１９９９．１２．２０）
【出願人】（５０５３３０５９４）アイディ・バイオメディカル・コーポレイション (2)
【氏名又は名称原語表記】ＩＤ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ
【Ｆターム（参考）】
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