星状細胞の増殖の誘導方法およびそのための組成物
【課題】 神経細胞の増殖を誘導しうる方法および組成物等を提供する等。神経細胞ならびに神経組織の再生、および神経欠損の修復に適した方法、および組成物を提供する。
【解決手段】 星状細胞の増殖の誘導方法であって、ＢＭＰ−２、ＢＭＰ−４、ＢＭＰ−５、ＢＭＰ−６、ＢＭＰ−７、ＢＭＰ−２／６ヘテロダイマー、およびＢＭＰ−２／７ヘテロダイマーからなる群より選択される骨形態形成蛋白の存在下で適当な細胞を培養することを含む、方法、ならびにかかる骨形態形成蛋白を含む、星状細胞の増殖を誘導する組成物。
【解決手段】 星状細胞の増殖の誘導方法であって、ＢＭＰ−２、ＢＭＰ−４、ＢＭＰ−５、ＢＭＰ−６、ＢＭＰ−７、ＢＭＰ−２／６ヘテロダイマー、およびＢＭＰ−２／７ヘテロダイマーからなる群より選択される骨形態形成蛋白の存在下で適当な細胞を培養することを含む、方法、ならびにかかる骨形態形成蛋白を含む、星状細胞の増殖を誘導する組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、神経細胞の増殖および神経組織の再生のための骨形態形成蛋白（ＢＭＰｓ）の医薬的使用に関する。より詳細には、本発明は、ＢＭＰｓの使用に関し、好ましくは、神経細胞または神経組織の退化、死滅もしくは外傷を含む、中枢ならびに末梢神経系疾患、および機械的ならびに外傷性疾患の治療のためのＢＭＰ−２ないしＢＭＰ１０の使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
骨形態形成蛋白２ないし１０は、形質転換増殖因子−β（ＴＧＦ−β）のスーパーファミリーのメンバーである。もともと、ＢＭＰｓは、インビボにおいて骨形成を誘導しうる骨形成蛋白として発見された。最初は、形質転換性増殖因子は、組織培養における哺乳動物細胞の表現型の形質転換、すなわち、インビボにおける正常な細胞の増殖から腫瘍的な細胞の増殖への変化に従来より関連している現象を誘導する能力に基づいて同定された。
【０００３】
星状細胞は、神経系において見いだされるグリア細胞の１タイプであり、軸索誘導、神経突起の成長の刺激、ニューロン形態形成ならびに移動において機能を有する。さらに星状細胞は、血管内皮血液−脳関門の誘導およびニューロンへの血液の輸送にも関与している。星状細胞は、細胞骨格の中間体フィラメント蛋白、極めて特異的な星状細胞マーカーであるグリア原線維酸性蛋白（ＧＦＡＰ）を発現する。
【０００４】
位置および形態によって、２つのタイプの星状細胞が従来より記載されていた。原形質星状細胞は、典型的に、灰白質において見いだされ、厚く非常に枝分かれした突起を有するが、線維性星状細胞は白質において見いだされ、長く真っすぐな突起を有する。視神経から単離された星状細胞は、そのＧＦＡＰおよび表面マーカーＡ２Ｂ５に対する染色を根拠にして１型および２型として抗原のごとく記載されていた。２種の異なる発生系統に由来するため、分裂時期において、１型星状細胞はＧＦＡＰのみに関して染色されるが、２型星状細胞はＡ２Ｂ５およびＧＦＡＰの両方に関して染色される。星状細胞は軸索成長のための誘導的環境を提供し、そのことは神経再生の重要な態様である。よって、星状細胞の生存および分化は、神経細胞および組織が生存し再生する能力において重要な因子である。シルバー（Silver）ら,米国特許第５,２０２,１２０号には活性化星状細胞を用いて軸索の再生を促進する方法が記載されている（特許文献１）。しかしながら、この方法は、自己由来の移植によるような星状細胞の供給を必要とすることにおいて不利である。
【特許文献１】シルバー（Silver）ら,米国特許第５,２０２,１２０号
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
神経細胞の増殖を誘導しうる方法および組成物を提供することが本発明の１の課題である。神経細胞ならびに神経組織の再生、および神経欠損の修復に適した方法および組成物を提供することが本発明のもう１つの課題である。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
１の具体例において、本発明は、哺乳動物の神経の枯渇、損傷もしくは欠損部位に、医薬上許容される担体と混合された有効量の組み換え型ヒト・ＢＭＰ（ｒｈＢＭＰ）を投与することを特徴とする、神経細胞の増殖を誘導する方法を提供する。好ましくは、ＢＭＰは、ＢＭＰ−２、ＢＭＰ−４、ＢＭＰ−５、ＢＭＰ−６、ＢＭＰ−７ならびにＢＭＰ−２／６およびＢＭＰ−２／７のヘテロダイマーからなる群より選択される。
【０００７】
もう１つの具体例において、本発明は、神経欠損、神経損傷または神経状態を有する哺乳動物を治療する方法であって、該哺乳動物の神経の枯渇、欠損もしくは損傷部位に、適当なマトリックスに配合された神経再生量のｒｈＢＭＰを投与することを特徴とする方法を含む。好ましくは、ＢＭＰは、ＢＭＰ−２、ＢＭＰ−４、ＢＭＰ−５、ＢＭＰ−６、ＢＭＰ−７ならびにＢＭＰ−２／６およびＢＭＰ−２／７のヘテロダイマーからなる群より選択される。ＢＭＰ−２、ＢＭＰ−４ならびにＢＭＰ−２／６およびＢＭＰ−２／７ヘテロダイマーが最も好ましい。
【０００８】
好ましい具体例において、本発明は、神経代替のためのデバイスを含む。好ましくは、該デバイスは、所望位置および所望方向にＢＭＰを維持して神経組織の再生を可能にすることのできるマトリックスまたは担体を使用する。ＢＭＰはマトリックス上に吸着される。マトリックスは、当該分野で知られたいかなる適当な担持材料からできていてもよい。好ましくは、マトリックスは、コラーゲン、フィブリン組織接着物質、および正常神経内膜鞘成分からなる群より選択される適当な材料を含む。これらの成分は、ラミニン、ヒアルロン酸およびバーシカンを含むコンドロイチン硫酸プロテオグリカン類を包含する。トナ（Tona）ら,ジャーナル・オブ・ヒストケミストリー・アンド・サイトケミストリー（J.Histchemistry and Cytochemistry）,第４１巻：５９３〜５９９頁(１９９３年)。最も好ましい具体例においては、マトリックスは架橋コラーゲンを含む。コラーゲンはいかなる適当な形態であってもよいが、好ましくは、スポンジ形態である。コラーゲンを神経組織の再生に適した形態に成型してもよい。ＢＭＰ吸着マトリックスを、マトリックスおよびＢＭＰの入った人工神経代替容器に用いてもよい。好ましくは、人工神経代替容器は、開口したシラスティック管のごとき管状もしくはステント（stent）の形態である。
【発明の効果】
【０００９】
本発明によれば、神経細胞の増殖を誘導しうる方法および組成物が提供される。また、神経細胞ならびに神経組織の再生、および神経欠損の修復に適した方法および組成物も提供される。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１０】
驚くべきことに、本発明者らは、ＢＭＰｓ、特に、ＢＭＰ−２、ＢＭＰ−４ならびにＢＭＰ−２／６およびＢＭＰ−２／７のヘテロダイマーを用いて神経再生を促進できることを見いだした。通常は、神経細胞は傷害後に増殖し、顕微外科的手法を用いる生理学的修復は、最適なケアにもかかわらず、しばしば、不完全な機能をもたらす。神経組織は、修復の前に新たな血管形成されるようにならなくてはならない。しかしながら、神経においては、新たな血管形成は他の生物学的システムにおいてよりもずっと遅くに起こり、初期の軸索修復を遅らせ、しばしば、回復不可能で時間依存性の運動端板萎縮を起こりやすくする。さらに、早く形成する線維性の瘢痕組織は、自然に起こる神経再生の成功を妨げるかもしれない。したがって、神経修復を促進または加速するためのＢＭＰｓの使用は、ＢＭＰｓを使用しなければ起こり得ない神経の修復の改善方法を提供する。
【００１１】
ＢＭＰｓのＤＮＡ配列は知られており、以下のごとく記載されている。ＢＭＰ−２（時々ＢＭＰ−２Ａと呼ばれる）およびＢＭＰ−４（時々ＢＭＰ−２Ｂと呼ばれる）,米国特許第５,０１３,６４９号；ＢＭＰ−３,米国特許第５,１１６,７３８号；ＢＭＰ−５,米国特許第５,１０６,７４８号；ＢＭＰ−６,米国特許第５,１８７,０７６号；ＢＭＰ−７,米国特許第５,１４１,９０５号；ＢＭＰ−８,ＰＣＴ公開ＷＯ９３／００４３２；ＢＭＰ−９,１９９１年６月２５日出願の第０７／７２０,５９０号ＢＭＰ−１０,１９９３年５月１２日出願の第０８／０６１,６９５号。ヘテロダイマーは、１９９２年４月７日出願の米国特許出願第０７／７８７,４９６号に記載されている。参照により上記文献の開示をすべて本明細書に取り入れる。
【００１２】
適当な形質転換宿主細胞においてＢＭＰコードしているＤＮＡ配列を発現することにより、ｒｈＢＭＰ−２のごとき組み換え型ヒト・ＢＭＰを本発明方法に使用するために製造することができる。例えば、既知方法を用いて、ＢＭＰ−２をコードするＤＮＡをｐＥＤ（カウフマン（Kaufman）ら,ヌクレイック・アシッズ・リサーチ（Nucleic Acids Res.）,第１９巻,４４８４〜４４９０頁（１９９１年））のごとき発現ベクターに結合し、宿主細胞中に形質転換し、蛋白発現を誘導し最大とすることができる。もちろん、ＢＭＰの対立変異種をコードするＤＮＡ配列を用いることができるのと同様に、ヒト・ＢＭＰコードしている縮重ＤＮＡ配列を用いてもｒｈＢＭＰ製造することができる。
【００１３】
いかなる適当な発現ベクターを用いても、本発明に使用されるｒｈＢＭＰ−２のごときｒｈＢＭＰ製造することができる。哺乳動物での発現には、ｐＥＤのほかにも、ｐＥＦ−ＢＯＳ（ミズシマ（Mizushima）ら,ヌクレイック・アシッズ・リサーチ,第１８巻,５３２２頁（１９９０年））；ｐＸＭ、ｐＪＬ３ならびにｐＪＬ４（ゴフ（Gough）ら,ＥＭＢＯ Ｊ.第４巻,６４５〜６５３頁（１９８５年））；およびｐＭＴ２（ｐＭＴ２−ＶＷＦ由来、ＡＴＣＣ番号６７１２２；ＰＣＴ／ＵＳ８７／０００３３参照）のごとき多くの発現ベクターが知られている。酵母、昆虫および細菌細胞における使用に適した発現ベクターも知られている。かかる発現ベクターの構築および使用は十分に当業者のレベル内にある。ｒｈＢＭＰ−２のごとき組み換え型ＢＭＰを、異なるＢＭＰ由来のプロペプチドに作動可能に結合した成熟ＢＭＰをコードするキメラＤＮＡ配列を用いて製造してもよい。例えば、米国特許第５,１６８,０５０号参照、その開示を参照により本明細書に取り入れる。
【００１４】
本発明に有用なＢＭＰｓの製造に適した宿主細胞は、例えば、チャイニーズハムスター・卵巣（ＣＨＯ）細胞、サル・ＣＯＳ細胞、マウス・３Ｔ３細胞、マウス・Ｌ細胞、ＮＳＯ（ガルフル（Galfre）およびミルステイン（Milstein）,メソッズ・イン・エンザイモロジー（Methods in Enzymology）第７３巻,３〜４６頁（１９８１年））のごときミエローマ細胞等のような哺乳動物細胞を包含する。ＢＭＰコードするＤＮＡ配列で酵母、昆虫および細菌細胞を形質転換し、既知方法を用いて蛋白発現の誘導および増幅を行うことにより、ｒｈＢＭＰを製造してもよい。細菌細胞において生産される場合、骨形態形成蛋白を可溶化することが必要である。
【００１５】
本発明に使用するために、組み換え法により製造されたｒｈＢＭＰ−２のごときＢＭＰを、培地または細胞抽出液から精製しなければならない。市販の蛋白濃縮フィルター、例えば、アミコン（Amicon）社またはミリポア（Millipore）社のペリコン（Pellicon）限界濾過ユニットを用いてｒｈＢＭＰを含んでいる培地または細胞抽出液を濃縮してもよい。濃縮工程の次に、ゲル濾過媒体のごとき精製マトリックスに濃縮物を適用する。別法として、アニオン交換樹脂、例えば、垂下したジエチルアミノエチル（ＤＥＡＥ）基を有するマトリックスまたは基材を用いてもよい。マトリックスは、アクリルアミド、アガロース、デキストラン、セルロースまたは蛋白精製に通常使用される他のタイプのものであってよい。別法として、カチオン交換工程を用いることができる。適当なカチオン交換体は、スルホプロピルまたはカルボキシメチル基を含む種々の不溶性マトリックスを包含する。さらに培養上清からのＢＭＰの精製は、レクチン−アガロース、ヘパリン−トヨパール（登録商標）もしくはトバクロムブルー３ＧＡセファロース（登録商標）のごときアフィニティー樹脂による、またはフェニルエーテル、ブチルエーテルもしくはプロピルエーテルのごとき樹脂を用いる疎水性相互作用クロマトグラフィーによる、あるいは免疫アフィニティークロマトグラフィーによる、１またはそれ以上のカラム工程を包含する。最終的に、疎水性ＲＰ−ＨＰＬＣ媒体、例えば、垂下したメチルもしくは他の脂肪族基を有するシリカゲルを用いる１またはそれ以上の逆相高品質液体クロマトグラフィー（ＲＰ−ＨＰＬＣ）工程を用いて、本発明に使用するためにさらにＢＭＰを精製することができる。上記精製工程のいくつかまたはすべてをいろいろと組み合わせて用いて実質的に均一な単離組み換え型蛋白を提供することができる。
【００１６】
ｒｈＢＭＰ−２のごときＢＭＰｓを、種々の症状における医師によるインビボでの哺乳動物の治療のための本発明方法に用いることができる。これらの症状は、末梢神経傷害、末梢ニューロパシーならびに局在性ニューロパシーのごとき末梢神経系の疾患、およびアルツハイマー症、パーキンソン症、ハンチントン症、筋萎縮性側索硬化症ならびにシャイ−ドレーガー（Shy-Drager）症候群のごとき中枢神経系疾患を包含する。本発明により治療されうるさらなる症状は、脊髄疾患、頭部外傷ならびに卒中のごとき脳血管疾患のような機械的および外傷性疾患を包含する。ＢＭＰｓを用いて神経細胞および神経組織の再生を促進し、かかる疾患の治癒を促進または加速することができる。
【００１７】
本発明方法によれば、ｒｈＢＭＰ−２のごときＢＭＰをそれのみ投与してもよく、他のＢＭＰｓと組み合わせて投与してもよく、あるいは他の療法と組み合わせて投与してもよい。例えば、神経の疾患の治療において、ｒｈＢＭＰ−２を、サイトカイン、リンホカイン、増殖因子、またはコロニー刺激因子と有効に組み合わせてもよい。本発明方法によりＢＭＰと組み合わせて使用する代表的なサイトカイン、リンホカイン、増殖因子およびコロニー刺激因子は、ＥＧＦ、ＦＧＦ、インターロイキン１ないし１２、Ｍ−ＣＳＦ、Ｇ−ＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦ、幹細胞因子、エリスロポエチン等を包含するが、これらに限定しない。さらに、ＢＭＰｓを、ＣＮＴＦ、ＬＩＦ、ＩＬ−６およびインスリン様増殖因子［ＩＧＦｓ］のごとき神経栄養性因子と組み合わせてもよい。さらに、通常は神経環境に見いだされる蛋白を、本発明によりＢＭＰｓに添加してもよい。これらは、ラミニン、ヒアルロン酸、およびバーシカンを含むコンドロイチン硫酸プロテオグリカン類を包含してもよい。
【００１８】
所望位置に所望方向でＢＭＰを維持しうるマトリックスを用いて本発明ＢＭＰｓを投与して神経組織の再生を可能にしてもよい。好ましくは、ＢＭＰをマトリックス上に吸着させてもよい。マトリックスは、当該分野で知られたいかなる適当な材料からできていてもよい。かかる材料は、コラーゲン、フィブリン組織接着物質、およびラミニン、ヒアルロン酸、バーシカンを包含するコンドロイチン硫酸プロテオグリカン類を包含する、正常神経内膜鞘成分から選択される適当な材料を包含する。好ましくは、マトリックスは多孔性であり、神経組織の再生に必要な細胞の流入、移動、分化および増殖を可能にするものであってよい。１の好ましい具体例において、マトリックスは架橋コラーゲンを含む。コラーゲンはいかなる適当な形態であってもよいが、好ましくは、スポンジの形態である。コラーゲンを神経組織の再生に適した形状に成型してもよい。もう１つの好ましい具体例において、マトリックスは、乳酸ポリマー（ＰＬＡ）、グリコール酸ポリマー（ＰＧＡ）、および乳酸とグリコール酸のコポリマー（ＰＬＧＡ）のごとき生分解性粒子を含む。マトリックスは、フィブリンまたは静脈移植片のごとき、神経組織の形成を促進する材料からなっていてもよい。
【００１９】
次いで、好ましくは、開口したシラスティック管のごとき管状もしくはステント（stent）の形態である人工神経代替容器にＢＭＰが吸着した材料を適用する。人工神経代替容器は、一定の位置にＢＭＰが吸着した容器を保持して神経組織の再生を可能にするいかなる材料からなっていてもよい。１の具体例において、自己由来の静脈移植片を神経代替容器として用いてもよい。人工神経代替容器は、ポリマーのごとき再吸収可能な材料からなっていてもよい。いくつかの好ましい具体例において、マトリックスは人工神経代替容器としても役立つ。
【００２０】
本発明方法に適した医薬組成物は、ＢＭＰのほかに、医薬上許容される担体、希釈剤、充填剤、塩、緩衝剤、安定化剤、および／または当該分野で知られた他の物質を含有していてもよい。用語「医薬上許容される」は、活性成分の生物学的活性の有効性を妨害しない無毒の物質を意味する。担体または他の物質の特性は投与経路に依存するであろう。
【００２１】
本発明方法におけるｒｈＢＭＰ−２のごときＢＭＰの投与を、種々の慣用的方法で行うことができる。神経組織の再生、神経欠損または神経損傷の治療には、ＢＭＰの局所投与が好ましい。最も好ましい投与モードにおいては、ＢＭＰは生体適合性マトリックスに吸着され、人工神経代替容器に適用される。好ましくは、生体適合性マトリックスはコラーゲンからできており、スポンジ、シートもしくはマット、または密に充填された粒子の形態であってもよい。人工神経代替容器は管またはステントの形態であってもよい。人工神経代替容器に適する他の材料は、当業者に明らかであろう。好ましい具体例において、人工神経代替容器は、ＢＭＰが吸着したマトリックスの入った開口したシラスティック管を含む。もう１つの好ましい具体例において、人工神経代替容器は自己由来の静脈移植片を含む。いくつかの好ましい具体例において、同じ材料がマトリックスおよび人工神経代替容器の両方として役立ちうる。
【００２２】
本発明方法において有用なＢＭＰの量は、治療すべき症状の性質ならびに重さ、および患者が受けていた以前の治療の性質に依存するであろう。結局は、各患者を治療するＢＭＰ量を担当医が決定するであろう。本発明の種々の医薬組成物は、体重１ｋｇあたり約０.１μｇないし約１００ｍｇ、好ましくは約０.１μｇないし１００μｇを含有すべきであると考えられる。担当医が薬剤の作用を変化させる種々の因子、例えば、患者の状態、体重、性別および食事、症状の重さ、投与期間ならびに方法、および他の臨床的因子を考慮して実際の投与規則が決定されよう。
【００２３】
本発明治療方法の実施に際して、治療上有効量のＢＭＰを、かかる症状を有する哺乳動物に投与する。用語「治療上有効量」は、有意な患者に対する利益、すなわち、慢性症状の治癒または治癒速度の増加を示すに十分な本発明方法の各化合物の総量を意味する。例えば、神経再生量の骨形態形成蛋白は、適当なマトリックス担体に吸着され、神経損傷、欠損もしくは枯渇部位に移植された場合に神経組織の再生および／または神経損傷、欠損もしくは枯渇の改善を可能にする蛋白の量である。個体に活性成分のみを投与する場合、該用語はその成分のみについていう。組み合わせて投与する場合、混合、順次または同時に投与する場合であっても、該用語は、治療効果を生じる活性成分を合わせた量をいう。本発明方法の実施のための、治療上有効なＢＭＰ用量は、１回の投与につき体重１ｋｇあたり約０.１μｇないし約１００ｍｇの範囲であると考えられる。一般的には、最初は用量の最低量で投与を開始し、あらかじめ選択しておいた期間中、正の効果が得られるまで用量を増加させていく。次いで、考えられるすべての不利な効果が考慮されつつ、用量に対応した効果の増大が限界に達するまで用量が増加させられるであろう。
【００２４】
本発明方法を用いる静脈投与による治療期間は、治療すべき疾患の重さおよび個々の患者の状態ならびに固有の応答に依存して変更されるであろう。ＢＭＰの各適用期間は連続投与では１２ないし２４時間の範囲であろうと考えられる。結局、担当医が、本発明方法を用いる治療の適当な期間を決定するであろう。
【００２５】
本発明方法によれば、医薬上許容される担体と混合された神経再生量のｒｈＢＭＰ−２のごときＢＭＰを投与することにより、哺乳動物において神経再生を行うことができる。本発明の目的のためには、ｒｈＢＭＰ−２のごときＢＭＰの神経再生量は、神経の再生を引き起こすに必要な蛋白量である。神経組織の重量または体積により神経再生を測定することができる。ＢＭＰを発現するように形質転換された適当な宿主細胞を患者に投与して神経細胞または組織の増殖もしくは生存を改善してもよい。
【００２６】
以下の実施例は本発明の説明であり、何ら限定的なものではない。
【００２７】
ＢＭＰの非経口処方は、パイロジェン不含の非経口的に許容される水溶液の形態であろう。かかる非経口的に許容される蛋白溶液のｐＨ、等張性、安定性等については当業者の範囲内である。好ましい非経口処方は、ＢＭＰに加えて、注射用塩化ナトリウム、注射用リンゲル溶液、注射用デキストロース、注射用デキストロースならびに塩化ナトリウム、注射用乳酸リンゲル溶液のごとき等張性担体、または当該分野で知られた他の担体を含有するべきである。本発明医薬組成物は、安定化剤、保存料、緩衝剤、抗酸化剤、または当業者に知られた他の添加物を含有していてもよい。
【００２８】
局所的に投与する場合、本発明ＢＭＰは、パイロジェン不含の局所的に許容される、軟膏、クリーム、ローション、泡もしくはゲルのごとき液体または半固体処方であってもよい。処方に用いるかかる局所用標品は当該分野の技術の範囲内である。
【実施例１】
【００２９】
実施例Ｉ. 神経細胞に対するＢＭＰの効果
実施例ＩＡ. 細胞の培養
Ｂａｌｂ ｃ／ＳＦＭＥ（無血清マウス胚）細胞をアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（American Type Culture Collection）（ＣＲＬ９３９２）から得て、以前に記載（サカイ（Sakai）ら,ＰＮＡＳ：ＵＳＡ,第８７巻：８３７８〜８３８２頁（１９９０年））されているように、ウシ・インスリン１０μｇ／ｍｌ（イーライ・リリー（Eli Lilly）社製）、ヒト・トランスフェリン２５μｇ／ｍｌ（コラボレイティブ・リサーチ（Collaborative Research）社製）、ヒト・高密度リポ蛋白２０μｇ／ｍｌ（シグマ（Sigma）社製）、ヒト・上皮増成長子１００ｎｇ／ｍｌ（ペプロテック（PeproTech）社製）、ウシ・血漿フィブロネクチン２０μｇ／ｍｌ（ギブコ（GIBCO）社製）、亜セレン酸ナトリウム１０ｎＭ（ギブコ）、ペニシリン−ストレプトマイシン（１０Ｕ／ｍｌ）、Ｌ−グルタミン（４ｍＭ）および４−（２−ヒドロキシエチル）ピペラジンエタンスルホン酸１５ｍＭ（ｐＨ７.４）を含有するＤＭＥ／Ｆ１２（１：１）培地中で増殖させた。
【００３０】
体積比１：２のトリプシン／ＥＤＴＡおよび大豆トリプシンインヒビター（１ｍｇ／ｍｌ）を用いて細胞を継代し、１９代から５０代の間において使用した。特に断らないかぎり、コウルター・ダイアグノスティクス・カウンター（Coulter Diagnostics counter）で細胞を計数した。
【００３１】
実施例ＩＢ. 増殖および分化因子：
使用したすべての組み換え型ヒト・蛋白は９０％以上の純度であった。ＥＧＦをペプロテック（ニュージャージー州）から購入した。組み換え型ヒト・アクチビン−Ａはヘレン・ニュー（Helen New）から親切にも譲り受けた。ＴＧＦ−β１をＲ＆Ｄシステムズから購入した。ＢＭＰｓを、ジェネテイックス・インスティテュートにおいて数ステップの精製工程によりＣＨＯならし培地から精製した。
【００３２】
実施例ＩＣ. 分化の研究：
すべての免疫蛍光およびＦＡＣＳ分析については、特に断らないかぎり、細胞を２.５ｘ１０４個／ｃｍ２でプレーティングし、１６〜２０時間目にＢＭＰ−２を示された濃度および期間において添加した。
【００３３】
実施例ＩＤ. 生存の研究：
ＥＧＦ不含培地で細胞を２回洗浄し、次いで、種々の増殖因子を補足した同じ培地中に０.８〜１ｘ１０５個／ｃｍ２の密度でプレーティングした。これらの増殖因子は、ＢＭＰ−２、ＢＭＰ−４、ＢＭＰ−５、ＢＭＰ−６、ＢＭＰ−７、ＢＭＰ−２／６ヘテロダイマー、ＢＭＰ−２／７ヘテロダイマーおよびＴＧＦ−β１を包含する。４４〜４８時間目に、血球計数板を用いる２系のトリパンブルー色素排除法により生存のパーセント値および細胞数を決定し、最少でも１試料あたり４００個の細胞を計数した。細胞の増殖がいくつかの条件下で見られたので、終点において全細胞数で全生細胞数を割ったものとして生存のパーセント値を計算した。
【００３４】
実施例ＩＥ. 免疫蛍光抗体染色：
４ウェルのガラスまたはプラスティックチャンバースライド（ラブテック（Lab Tek）社製）中の細胞から培地を除去し、Ｃａ２＋,Ｍｇ２＋不含ＰＢＳ（ＣＭＦ）で２回洗浄した。抗体Ａ２Ｂ５（ベーリンガー−マンハイム（Boehringer-Mannheim）社製）を用いる表面染色用に、まず細胞を４％パラホルムアルデヒドで１０分間固定し、ＰＢＳで洗浄し、次いで、１％ウサギ・血清とともにＰＢＳ中でインキュベーションして非特異的結合をブロックした。抗体をＰＢＳ中１％ウサギ・血清で希釈し、１時間インキュベーションし、次いで、細胞をＰＢＳ中１％ウサギ・血清で洗浄してからビオチン化ウサギ・抗マウス抗体、次いで、ストレプトアビジン−ＦＩＴＣ（ザイムド（Zymed）社製）抱合体で検出を行った。ＦＧＡＰに関するさらなる二重染色実験または単一の内部染色用に、細胞をアセトン／メタノール（５０：５０）中、−２０℃で１０分間固定した。ＰＢＳ中０.２％Triton X-100および第２段階の試薬に応じて１％ヤギもしくはウサギいずれかの血清で透過性付与およびブロッキングを行った。第１の抗体は、示されたように、ウサギ・ポリクローナル（１：２００）またはマウス・モノクローナル（５μｇ／ｍｌ）のいずれかであり、それぞれＰＢＳ中の１％のヤギもしくはウサギいずれかの血清中に希釈し、次いで、１時間インキュベーションした。第２のビオチン化抗体（ザイムド社製）ならびにスレプトアビジンフィコエリスリン（ＰＥ）（ザイムド社製）または抱合体となった抗ＩｇＧ１−ＰＥ抗体（ザイムド社製）のいずれかを用いて検出を行った。蛍光光学機器を装備したツァイス社のアクシオフォト（Zeiss Axiophot）またはオリンパス（Olympus）社のＢＨ２−ＲＦＣ顕微鏡のいずれかを用いて細胞を試験し、エクタクローム（Ektachrome）１６００ＡＳＡフィルムで写真を取った。
【００３５】
実施例ＩＦ. ＦＡＣＳ分析
これらの実験のために、細胞をＰＢＳで１回、次いで、ＥＤＴＡ／塩で１回洗浄してから、ＥＤＴＡ／塩とともに室温で２０分インキュベーションした。次いで、ゆるやかにプレート表面上をピペッティングすることにより細胞を取った。プレートをＥＤＴＡ／塩で洗浄し、細胞と一緒にして、次いで、遠心分離し、ＰＢＳで１回以上洗浄し、次いで、計数した。各抗体インキュベーションに１ｘ１０６個の細胞を用いた。４℃におけるＡ２Ｂ５表面染色のために、まず細胞プレートを５０μｌの熱不活性化ウサギ・血清とともにインキュベーションして非特異的結合をブロックし、次いで、１％ウサギ・血清／ＰＢＳ中に５μｇ／ｍｌとなるよう希釈されたＡ２Ｂ５抗体（ベーリンガー−マンハイム社製）または対照クラスの特異的ＩｇＭとともに１時間インキュベーションした。直接抱合した抗ＩｇＭ−ＰＥ（ザイムド社製）を用いて検出を行った。ＧＦＡＰに対するさらなる二重染色実験または単一内部染色のために、細胞を０.２５％パラホルムアルデヒド中、４℃で１時間固定し、遠心分離し、次いで、ＰＢＳ／アザイド中０.２％ツイン２０ １ｍｌ中に再懸濁し、３７℃で１５分インキュベーションした。２％熱不活性化ウサギ・血清／ＰＢＳ１ｍｌを添加し、細胞を遠心分離した。ペレット５０μｌのウサギ・血清中に再懸濁し、次いで、第１の抗体およびクラス特異的対照をＰＢＳ中１％ウサギ・血清１００μｌ中に５μｇ／ｍｌとなるよう希釈した。直接抱合した抗ＩｇＧ１−ＦＩＴＣ抗体（ザイムド,フィッシャー・バイオテック（Zymed,Fisher Biotech）社製）を用いて最終的な検出を行った。細胞を、ＰＢＳ／アザイド中１％ウサギ・血清、０.２％ツイン２０で洗浄し、次いで、ＰＢＳで洗浄し、さらに最終的に１％パラホルムアルデヒド中に再懸濁した。蛍光励起用に１５ｍＷの４８８ｎｍ空冷式アルゴンイオンレーザーを用いるＦＡＣＳｃａｎ（カリフォルニア州サン・ホセのベクトン・デイキンソン（Becton Dickinson）によりＦＡＣＳ分析を行った。蛍光エミッションを標準的なＦＡＣＳｃａｎ配列（５３０ｎｍ（ＦＩＴＣ ,５８５ｎｍ（ＰＥ）および＞６５０ｎｍ（赤色蛍光））において測定した。
【００３６】
データを得て、ＬＹＳＹＳ IIソフトウェア（カリフォルニア州サン・ホセのベツトン・デイキンソン社製）を用いるヒューレット・パッカード（Hewlett Packard）社製３４０Ｃコンピューターシステムにより分析した。イソタイプ対照を各試料に対して行い、ゲートを単染色実験用にセットして多くとも３％の細胞を含むようにした。
【００３７】
実施例ＩＧ. ウェスタン分析
２系の６ウェルデイッシュに細胞を２.５ｘ１０４個／ｃｍ２となるようプレーティングし、１６時間目に適当なＢＭＰまたはＴＧＦ−β１を１、１０および１００ｎｇ／ｍｌとなるよう添加した。４４時間後、細胞を収穫した。１のウェルをトリプシン処理して計数し、２つ目のウェルをＰＢＳで洗浄し、１ｍＭのＰｅｆａｂｌｏｃ（ベーリンガー−マンハイムから購入した水溶性プロテアーゼインヒビター）を含有する氷冷したＰＢＳ中に細胞を掻き取り、４００ｘＧで遠心分離した。１〜２容の０.１％Triton X-100、１ｍＭ Ｐｅｆａｂｌｏｃ、０.１２５Ｍ Ｔｒｉｓ 塩基,ｐＨ６.８、２５０Ｕ／ｍｌのＤＮＡｓｅを細胞ペレットに添加し、混合した。最後に、０.５％ＳＤＳおよび２０ｍＭ ＤＴＴをそれぞれに添加した。２系のウェルの細胞計数値に基づき、各条件下での５ｘ１０５個の細胞を含む等価な体積を、１２％の１ｍｍのレムリ（Laemmli）ミニゲル（ノベックス（Novex）社製）の各レーンに負荷した。１０および１００ｎｇのウシ・ＧＦＡＰも負荷した。電気泳動後、０.４５ミクロンのニトロセルロース膜に対して０.０５％ＳＤＳ存在下で３００ｍＡで１時間、ゲルからの移行を行った。ブロットを風乾し、１％ＫＯＨで固定し、ＴＢＳ（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ,５００ｍＭ ＮａＣｌ,ｐＨ８.５）中０.５％ツイン２０で洗浄しブロッキングし、次いで、１：１０００希釈のＧＦＡＰ抗血清（ＢＴＩ）中で一晩インキュベーションした。ＴＢＳ中０.５％ツイン２０中で洗浄した後、ブロットを１：３０００希釈のヤギ・抗ウサギＨＲＰ中で１時間インキュベーションし、次いで、エンハンスト・ケミルミネッセンス（Enhanced Chemiliminescence）（アマーシャム（Amersham）社のキット）により現像した。簡単に説明すると、ブロットをＴＢＳ−ツイン２０中、次いで、ＴＢＳ中で洗浄し、試薬ＡおよびＢの１：１混合物中で１分間インキュベーションし、次いで、フィルムに曝露し、現像した。
【００３８】
結果
ＴＧＦ−β１または血清でのＳＦＭＥ細胞の処理は、星状細胞特異的分化マーカーＧＦＡＰ（サカイ（Sakai）ら,上記文献）の発現を伴った明確な形態学的変化を生じた。ＴＧＦ−β１処理は、両端に細胞質突起を有する長くて両端に突起を有し、ＧＦＡＰに関して染まる細胞タイプを生じた。対照的に、ウシ胎児血清（ＦＣＳ）処理した細胞はサイズが長く、高度に分枝したフィラメントネットワークを有し、ＦＧＡＰに関して非常に強く染まった。
【００３９】
１０ｎｇ／ｍｌのＢＭＰ−２、４、５、６、７およびＢＭＰ−２／６ならびに２／７ヘテロダイマーでのＳＦＭＥ細胞の処理は、ＧＦＡＰの発現を伴うその外観における劇的な形態学的変化を生じた。細胞は、培養中の初期の星状細胞に典型的な多くの長い細胞質突起を獲得した。総体的には、ＢＭＰｓおよびウシ・血清に関連して観察されたＧＦＡＰ染色の強度は、ＴＧＦ−β１に関して観察された強度よりもずっと強かった。ＢＭＰ−２およびＢＭＰ−２／７ヘテロダイマーは、ウシ・血清を用いた場合に見られるような大型の形態を有する細胞タイプを誘導したが、ＢＭＰ−７は、性質がより繊維状である形態を誘導した。これらの形態は、誘導された細胞タイプの表現型の相違（タイプ１対タイプ２星状細胞）またはＧＦＡＰもしくは他の細胞骨格蛋白の種々のレベルのいずれかを反映している可能性がある。対照細胞は線維芽細胞様の外観を有し、ＧＦＡＰに関して染まらない。
【００４０】
ＢＭＰにより誘導されたＧＦＡＰ発現レベルを正確に測定し、ＴＦＧ−βの活性とＢＭＰの活性を比較するために、蛍光活性化細胞ソーティングによる定量的アッセイを確立した。それぞれ１０ｎｇ／ｍｌのＢＭＰ、ＴＧＦ−β１およびアクチビン（Activin）ならびに１０％子ウシ・血清で細胞を処理した。応答している集団のパーセント値および平均蛍光強度によりデータを分析した。
【００４１】
応答している集団のパーセント値はＧＦＡＰを発現している細胞数を反映し、発現レベルとは無関係である。ＢＭＰ−２、４、５、６、７、２／６ヘテロダイマーならびに２／７ヘテロダイマー、ＴＧＦ−βおよび子ウシ・血清は、対照と比較すると、ＧＦＡＰの発現を有意に誘導する。ＴＧＦ−βスーパーファミリーのもう１つのメンバーであるアクチビンは効果がない。ＢＭＰ−２／６ならびに２／７ヘテロダイマーはこのパラメーターにおいて最も有効であり、約６５ないし７２％の応答レベルを生じる。ＢＭＰ−２、４、ＴＧＦ−β１およびウシ胎児血清での処理は、約５３ないし５８％の応答細胞を生じる。ＢＭＰ−５、６および７での処理は、約３０ないし４０％の応答細胞を生じる。
【００４２】
平均蛍光強度（ＭＦＩ）はＧＦＡＰ発現レベルを示す。平均蛍光が高いほど、ＧＦＡＰ発現レベルが大きい。ＢＭＰ−２／６および２／７ヘテロダイマーにより誘導された細胞は、ＴＧＦ−β１により誘導された細胞の約８倍の平均蛍光を有する。ＢＭＰ−２、４、５、６および７により誘導された細胞は、子ウシ血清により誘導された細胞の約２〜４倍の平均蛍光を有する。ＴＧＦ−βおよび子ウシ血清はすべて対照よりも有意に高い値を与える。
【００４３】
ＢＭＰｓおよびＴＧＦ−β１がＧＦＡＰ誘導する能力を比較するために、ＢＭＰ−２、ＢＭＰ−６、ＢＭＰ−２／６ヘテロダイマーおよびＴＧＦ−β１を０〜１０ｎｇ／ｍｌの濃度範囲において試験し、ＦＡＣＳアッセイをＧＦＡＰ発現の定量のために用いた。各因子がＧＦＡＰ平均蛍光値５（対照値０.５の１０倍）を与えた濃度を用いて相対活性を比較した。ＴＧＦ−β１と比較した相対活性に関しては、ＢＭＰ−２／６ヘテロダイマーは約１８倍活性があり、ＢＭＰ−２およびＢＭＰ−６は約３〜４倍活性があった。ＢＭＰ−２およびＢＭＰ−２／６は０〜０.０８ｎｇ／ｍｌの範囲の検出可能なＧＦＡＰのレベルを誘導したが、ＴＧＦ−β１での最初の検出可能なＧＦＡＰの増加は０.４〜２ｎｇ／ｍｌの範囲である。
【００４４】
さらにウェスタン分析によってもＢＭＰｓへの曝露後のＳＦＭＥ細胞により生産された高レベルのＧＦＡＰが確認された。ＢＭＰまたはＴＧＦ−β１処理細胞抽出物において、検出に用いたポリクローナルＧＦＡＰ抗体は、５２ｋＤのウシ・ＧＦＡＰ標準よりもわずかに下側を泳動する４０〜５０ｋＤの範囲の蛋白を特異的に認識する。観察された広い分子量範囲は、おそらく、蛋白分解の結果であろう。１〜１００ｎｇ／ｍｌのＢＭＰ−２およびＢＭＰ−６処理による蛋白レベルの用量依存的増加があった。ＴＧＦ−β処理により誘導されたＧＦＡＰは、１０ｎｇ／ｍｌの用量で最大となり、わずか１ｎｇ／ｍｌのＢＭＰ−２により誘導されたＧＦＡＰとほぼ同じである。このレベルは１００ｎｇ／ｍｌの用量においてさえも上昇しなかった。ＢＭＰｓはＴＧＦ−β１よりも高レベルのＧＦＡＰを誘導した。
【００４５】
ＢＭＰｓでのＳＦＭＥ細胞の処理は、「線維芽細胞様」細胞の２種の独特なＧＦＡＰ陽性形態への変換を引き起こす。一方のほとんど突起がなく大型で平らな細胞タイプは星状細胞の原形質タイプを思わせ、もう一方の非常に長い細胞質突起を有するタイプは線維状星状細胞の特徴を示す。
【００４６】
これらの細胞を、Ａ２Ｂ５およびＧＦＡＰに関する二重免疫蛍光抗体染色によりさらに特徴づけた。ＢＭＰ−２／６集団において、タイプ１およびタイプ２の両方の星状細胞系細胞が存在した。ＧＦＡＰに関して染まるがＡ２Ｂ５に関しては染まらない細胞の大多数はタイプ１の星状細胞系であったが、Ａ２Ｂ５およびＧＦＡＰの両方に関して染まる細胞はタイプ２の星状細胞系であった。対照細胞はその表面上のＡ２Ｂ５に関して染まったが、ＧＦＡＰに関しては染まらなかった。
【００４７】
免疫蛍光染色により可視化された細胞集団を定量するために、我々は、二重染色ＦＡＣＳ分析を用いた。表１のデータを、少なくとも３回の実験の平均値±標準偏差として表す。対照細胞は約３７％がＡ２Ｂ５陽性であった。対照細胞は星状細胞系マーカーに関して染色陽性でなかった。ＢＭＰ−２、６および２／６により処理された細胞はＡ２Ｂ５に関してのみ染まらなかったが、２種の星状細胞系の集団からなっていた。ＧＦＡＰのみに関しては６０％以上が陽性であり、それらはタイプ１の系統であって、さらに約１８％がＡ２Ｂ５およびＧＦＡＰに関して陽性であることが示され、これらはタイプ２の系統であることが示された。ＴＧＦ−β１処理も、同様の規模の集団のタイプ２系統細胞（約１４％）を生じたが、タイプ１系統の細胞のうち約４０％の集団だけが陽性であった。さらに、Ａ２Ｂ５に関してのみ染まる細胞の小さな集団（約７％）が残っていた。総体的に、ＢＭＰｓまたはＴＧＦ−β１でのＳＦＭＥ細胞の処理は、Ａ２Ｂ５／ＧＦＡＰ集団においては完全には説明できるとはいえないＡ２Ｂ５の発現の消失を引き起こした。
【表１】
【００４８】
ＳＦＭＥ細胞生存に関する研究
ＳＦＭＥ細胞の生存にはＥＧＦが必要であり、ＦＧＦおよびＴＧＦ−βのごとき他の因子でそれを代替することはできない。ＥＧＦ、ＳＦＭＥ細胞をＢＭＰ−２、７、２／７ヘテロダイマー、ＴＧＦ−β１およびアクチビンで処理した。アクチビンは、Ｐ１９細胞に関する神経細胞生存分子であることが示されている。シューバート（Schubert）ら,ネイチャー（Nature）第３４４巻：８６８〜８７０頁（１９９０年）。４８時間後、ＥＧＦ不存在下においては約３０％の生存細胞が存在し、全体として細胞数が減少した。ＥＧＦ添加は約９５％の細胞生存率を引き起こし、細胞数は５倍に増加した。ＢＭＰ−２、ＢＭＰ−７およびＢＭＰ−２／７ヘテロダイマーで処理された細胞は、接種密度の約７０〜８０％の細胞数を維持した。しかしながら、細胞は増殖しなかった。ＢＭＰ−２で処理された細胞は、生存したのみならず分化したようであった。その生存率は約８０〜８５％であった。ＴＧＦ−β１またはアクチビンいずれかで細胞を処理すると、生存率は１０％未満で、細胞数は少なくとも１０倍の減少となった。高濃度のＴＧＦ−β１は生存率を増加させなかった。
【実施例２】
【００４９】
実施例II. ＢＭＰ−２を用いる哺乳動物における末梢神経の再生
Ａ. コラーゲンスポンジの調製
コラーゲンスポンジ（Collastat（登録商標）,ビタフォア・ウーンド・ヒーリング,インコーポレイテッド（Vitaphore Wound Healing,Inc.）社製）を約２ｘ２ｘ１８ｍｍの寸法に切り、滅菌ガラス容器中で蒸留水にて十分に洗浄し、凍結乾燥し、エチレンオキサイドで滅菌し、ＢＭＰ−２添加前に脱気した。
【００５０】
４５％アセトニトリル,０.１％トリフルオロ酢酸中の０.５μｇのＢＭＰ−２をスポンジ中に均等に分散させた。次いで、これらのスポンジをチューブに入れ、液体窒素中で凍結し、凍結乾燥した。ＢＭＰ−２を含まない４５％アセトニトリル,０.１％トリフルオロ酢酸バッファーを用いる以外は同様にして対照移植物を調製した。
【００５１】
凍結乾燥後、ＢＭＰ−２を負荷したスポンジおよび滅菌対照スポンジを、約１.６ｘ２０ｍｍの寸法の滅菌した開口シラスティック管中に入れた。すべての操作を滅菌条件下で行った。外科手術の前に手術室内で移植物の両端の余分な管を除去した。
【００５２】
６匹のルイス・ラット（Lewis Rat）の坐骨神経を切断した。内径１.６ｍｍｘ長さ１７ｍｍの開口したシラステイックまたは生分解性ステントを挿入した。ステントにはｒｈＢＭＰ−２を含むコラーゲンマトリックス担体または含まないコラーゲンマトリックス担体が入っていた。コラーゲンマトリックス担体はコラーゲンスポンジ（Collastat）（約１.５ｍｍ ｘ １５ｍｍ）からなっていた。坐骨神経が切断され再付着を防止するために後方に結束された動物は正の対照として役立った。手術されていない後ろ足はエイジ（age）を合わせた負の対照として役立った。
【００５３】
ステントを顕微鏡下で適用し、坐骨神経の切断された神経末端と吻合した。神経末端をステントの各末端において１ｍｍ挿入し、１５ｍｍのギャップを残した。移植後、６、８および１２週目に、電気的な機能の回復について動物を試験した。機能回復の程度を調べるための正確で信頼性および再現性のある方法を提供する、複合的筋肉作動電位（ＣＭＡＰ）を調べた。振幅および潜伏時間はエイジ依存的であり、再発達した軸索／運動端板の数に直接比例する。
【００５４】
移植後１２週目に、病理学的試験のために動物を屠殺した。染色にはＨ＆Ｅ、銀、ルクソール−ファストブルー（Luxol-fast blue）およびＳ１００を用いた。ステント中に近位、中央部、遠位エレメントに対して先入観のない定量を行った。数匹のラットの皮下組織内におかれたステントは染色のための対照として役立った。
【００５５】
結果は、デバイス１個につきCollastatスポンジに沈着した０.５μｇのＢＭＰ−２で１２週間治療した６匹の動物のうち４匹において、１５ｍｍの神経の欠損を越えた良好な神経の再生を示した。ＢＭＰ−２を用いなかった対照は、１５ｍｍの神経の欠損を越えた増殖を示さなかった。
【産業上の利用可能性】
【００５６】
本発明は、医薬の分野、特に神経細胞の再生に関連する医薬の分野において利用可能である。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、神経細胞の増殖および神経組織の再生のための骨形態形成蛋白（ＢＭＰｓ）の医薬的使用に関する。より詳細には、本発明は、ＢＭＰｓの使用に関し、好ましくは、神経細胞または神経組織の退化、死滅もしくは外傷を含む、中枢ならびに末梢神経系疾患、および機械的ならびに外傷性疾患の治療のためのＢＭＰ−２ないしＢＭＰ１０の使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
骨形態形成蛋白２ないし１０は、形質転換増殖因子−β（ＴＧＦ−β）のスーパーファミリーのメンバーである。もともと、ＢＭＰｓは、インビボにおいて骨形成を誘導しうる骨形成蛋白として発見された。最初は、形質転換性増殖因子は、組織培養における哺乳動物細胞の表現型の形質転換、すなわち、インビボにおける正常な細胞の増殖から腫瘍的な細胞の増殖への変化に従来より関連している現象を誘導する能力に基づいて同定された。
【０００３】
星状細胞は、神経系において見いだされるグリア細胞の１タイプであり、軸索誘導、神経突起の成長の刺激、ニューロン形態形成ならびに移動において機能を有する。さらに星状細胞は、血管内皮血液−脳関門の誘導およびニューロンへの血液の輸送にも関与している。星状細胞は、細胞骨格の中間体フィラメント蛋白、極めて特異的な星状細胞マーカーであるグリア原線維酸性蛋白（ＧＦＡＰ）を発現する。
【０００４】
位置および形態によって、２つのタイプの星状細胞が従来より記載されていた。原形質星状細胞は、典型的に、灰白質において見いだされ、厚く非常に枝分かれした突起を有するが、線維性星状細胞は白質において見いだされ、長く真っすぐな突起を有する。視神経から単離された星状細胞は、そのＧＦＡＰおよび表面マーカーＡ２Ｂ５に対する染色を根拠にして１型および２型として抗原のごとく記載されていた。２種の異なる発生系統に由来するため、分裂時期において、１型星状細胞はＧＦＡＰのみに関して染色されるが、２型星状細胞はＡ２Ｂ５およびＧＦＡＰの両方に関して染色される。星状細胞は軸索成長のための誘導的環境を提供し、そのことは神経再生の重要な態様である。よって、星状細胞の生存および分化は、神経細胞および組織が生存し再生する能力において重要な因子である。シルバー（Silver）ら,米国特許第５,２０２,１２０号には活性化星状細胞を用いて軸索の再生を促進する方法が記載されている（特許文献１）。しかしながら、この方法は、自己由来の移植によるような星状細胞の供給を必要とすることにおいて不利である。
【特許文献１】シルバー（Silver）ら,米国特許第５,２０２,１２０号
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
神経細胞の増殖を誘導しうる方法および組成物を提供することが本発明の１の課題である。神経細胞ならびに神経組織の再生、および神経欠損の修復に適した方法および組成物を提供することが本発明のもう１つの課題である。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
１の具体例において、本発明は、哺乳動物の神経の枯渇、損傷もしくは欠損部位に、医薬上許容される担体と混合された有効量の組み換え型ヒト・ＢＭＰ（ｒｈＢＭＰ）を投与することを特徴とする、神経細胞の増殖を誘導する方法を提供する。好ましくは、ＢＭＰは、ＢＭＰ−２、ＢＭＰ−４、ＢＭＰ−５、ＢＭＰ−６、ＢＭＰ−７ならびにＢＭＰ−２／６およびＢＭＰ−２／７のヘテロダイマーからなる群より選択される。
【０００７】
もう１つの具体例において、本発明は、神経欠損、神経損傷または神経状態を有する哺乳動物を治療する方法であって、該哺乳動物の神経の枯渇、欠損もしくは損傷部位に、適当なマトリックスに配合された神経再生量のｒｈＢＭＰを投与することを特徴とする方法を含む。好ましくは、ＢＭＰは、ＢＭＰ−２、ＢＭＰ−４、ＢＭＰ−５、ＢＭＰ−６、ＢＭＰ−７ならびにＢＭＰ−２／６およびＢＭＰ−２／７のヘテロダイマーからなる群より選択される。ＢＭＰ−２、ＢＭＰ−４ならびにＢＭＰ−２／６およびＢＭＰ−２／７ヘテロダイマーが最も好ましい。
【０００８】
好ましい具体例において、本発明は、神経代替のためのデバイスを含む。好ましくは、該デバイスは、所望位置および所望方向にＢＭＰを維持して神経組織の再生を可能にすることのできるマトリックスまたは担体を使用する。ＢＭＰはマトリックス上に吸着される。マトリックスは、当該分野で知られたいかなる適当な担持材料からできていてもよい。好ましくは、マトリックスは、コラーゲン、フィブリン組織接着物質、および正常神経内膜鞘成分からなる群より選択される適当な材料を含む。これらの成分は、ラミニン、ヒアルロン酸およびバーシカンを含むコンドロイチン硫酸プロテオグリカン類を包含する。トナ（Tona）ら,ジャーナル・オブ・ヒストケミストリー・アンド・サイトケミストリー（J.Histchemistry and Cytochemistry）,第４１巻：５９３〜５９９頁(１９９３年)。最も好ましい具体例においては、マトリックスは架橋コラーゲンを含む。コラーゲンはいかなる適当な形態であってもよいが、好ましくは、スポンジ形態である。コラーゲンを神経組織の再生に適した形態に成型してもよい。ＢＭＰ吸着マトリックスを、マトリックスおよびＢＭＰの入った人工神経代替容器に用いてもよい。好ましくは、人工神経代替容器は、開口したシラスティック管のごとき管状もしくはステント（stent）の形態である。
【発明の効果】
【０００９】
本発明によれば、神経細胞の増殖を誘導しうる方法および組成物が提供される。また、神経細胞ならびに神経組織の再生、および神経欠損の修復に適した方法および組成物も提供される。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１０】
驚くべきことに、本発明者らは、ＢＭＰｓ、特に、ＢＭＰ−２、ＢＭＰ−４ならびにＢＭＰ−２／６およびＢＭＰ−２／７のヘテロダイマーを用いて神経再生を促進できることを見いだした。通常は、神経細胞は傷害後に増殖し、顕微外科的手法を用いる生理学的修復は、最適なケアにもかかわらず、しばしば、不完全な機能をもたらす。神経組織は、修復の前に新たな血管形成されるようにならなくてはならない。しかしながら、神経においては、新たな血管形成は他の生物学的システムにおいてよりもずっと遅くに起こり、初期の軸索修復を遅らせ、しばしば、回復不可能で時間依存性の運動端板萎縮を起こりやすくする。さらに、早く形成する線維性の瘢痕組織は、自然に起こる神経再生の成功を妨げるかもしれない。したがって、神経修復を促進または加速するためのＢＭＰｓの使用は、ＢＭＰｓを使用しなければ起こり得ない神経の修復の改善方法を提供する。
【００１１】
ＢＭＰｓのＤＮＡ配列は知られており、以下のごとく記載されている。ＢＭＰ−２（時々ＢＭＰ−２Ａと呼ばれる）およびＢＭＰ−４（時々ＢＭＰ−２Ｂと呼ばれる）,米国特許第５,０１３,６４９号；ＢＭＰ−３,米国特許第５,１１６,７３８号；ＢＭＰ−５,米国特許第５,１０６,７４８号；ＢＭＰ−６,米国特許第５,１８７,０７６号；ＢＭＰ−７,米国特許第５,１４１,９０５号；ＢＭＰ−８,ＰＣＴ公開ＷＯ９３／００４３２；ＢＭＰ−９,１９９１年６月２５日出願の第０７／７２０,５９０号ＢＭＰ−１０,１９９３年５月１２日出願の第０８／０６１,６９５号。ヘテロダイマーは、１９９２年４月７日出願の米国特許出願第０７／７８７,４９６号に記載されている。参照により上記文献の開示をすべて本明細書に取り入れる。
【００１２】
適当な形質転換宿主細胞においてＢＭＰコードしているＤＮＡ配列を発現することにより、ｒｈＢＭＰ−２のごとき組み換え型ヒト・ＢＭＰを本発明方法に使用するために製造することができる。例えば、既知方法を用いて、ＢＭＰ−２をコードするＤＮＡをｐＥＤ（カウフマン（Kaufman）ら,ヌクレイック・アシッズ・リサーチ（Nucleic Acids Res.）,第１９巻,４４８４〜４４９０頁（１９９１年））のごとき発現ベクターに結合し、宿主細胞中に形質転換し、蛋白発現を誘導し最大とすることができる。もちろん、ＢＭＰの対立変異種をコードするＤＮＡ配列を用いることができるのと同様に、ヒト・ＢＭＰコードしている縮重ＤＮＡ配列を用いてもｒｈＢＭＰ製造することができる。
【００１３】
いかなる適当な発現ベクターを用いても、本発明に使用されるｒｈＢＭＰ−２のごときｒｈＢＭＰ製造することができる。哺乳動物での発現には、ｐＥＤのほかにも、ｐＥＦ−ＢＯＳ（ミズシマ（Mizushima）ら,ヌクレイック・アシッズ・リサーチ,第１８巻,５３２２頁（１９９０年））；ｐＸＭ、ｐＪＬ３ならびにｐＪＬ４（ゴフ（Gough）ら,ＥＭＢＯ Ｊ.第４巻,６４５〜６５３頁（１９８５年））；およびｐＭＴ２（ｐＭＴ２−ＶＷＦ由来、ＡＴＣＣ番号６７１２２；ＰＣＴ／ＵＳ８７／０００３３参照）のごとき多くの発現ベクターが知られている。酵母、昆虫および細菌細胞における使用に適した発現ベクターも知られている。かかる発現ベクターの構築および使用は十分に当業者のレベル内にある。ｒｈＢＭＰ−２のごとき組み換え型ＢＭＰを、異なるＢＭＰ由来のプロペプチドに作動可能に結合した成熟ＢＭＰをコードするキメラＤＮＡ配列を用いて製造してもよい。例えば、米国特許第５,１６８,０５０号参照、その開示を参照により本明細書に取り入れる。
【００１４】
本発明に有用なＢＭＰｓの製造に適した宿主細胞は、例えば、チャイニーズハムスター・卵巣（ＣＨＯ）細胞、サル・ＣＯＳ細胞、マウス・３Ｔ３細胞、マウス・Ｌ細胞、ＮＳＯ（ガルフル（Galfre）およびミルステイン（Milstein）,メソッズ・イン・エンザイモロジー（Methods in Enzymology）第７３巻,３〜４６頁（１９８１年））のごときミエローマ細胞等のような哺乳動物細胞を包含する。ＢＭＰコードするＤＮＡ配列で酵母、昆虫および細菌細胞を形質転換し、既知方法を用いて蛋白発現の誘導および増幅を行うことにより、ｒｈＢＭＰを製造してもよい。細菌細胞において生産される場合、骨形態形成蛋白を可溶化することが必要である。
【００１５】
本発明に使用するために、組み換え法により製造されたｒｈＢＭＰ−２のごときＢＭＰを、培地または細胞抽出液から精製しなければならない。市販の蛋白濃縮フィルター、例えば、アミコン（Amicon）社またはミリポア（Millipore）社のペリコン（Pellicon）限界濾過ユニットを用いてｒｈＢＭＰを含んでいる培地または細胞抽出液を濃縮してもよい。濃縮工程の次に、ゲル濾過媒体のごとき精製マトリックスに濃縮物を適用する。別法として、アニオン交換樹脂、例えば、垂下したジエチルアミノエチル（ＤＥＡＥ）基を有するマトリックスまたは基材を用いてもよい。マトリックスは、アクリルアミド、アガロース、デキストラン、セルロースまたは蛋白精製に通常使用される他のタイプのものであってよい。別法として、カチオン交換工程を用いることができる。適当なカチオン交換体は、スルホプロピルまたはカルボキシメチル基を含む種々の不溶性マトリックスを包含する。さらに培養上清からのＢＭＰの精製は、レクチン−アガロース、ヘパリン−トヨパール（登録商標）もしくはトバクロムブルー３ＧＡセファロース（登録商標）のごときアフィニティー樹脂による、またはフェニルエーテル、ブチルエーテルもしくはプロピルエーテルのごとき樹脂を用いる疎水性相互作用クロマトグラフィーによる、あるいは免疫アフィニティークロマトグラフィーによる、１またはそれ以上のカラム工程を包含する。最終的に、疎水性ＲＰ−ＨＰＬＣ媒体、例えば、垂下したメチルもしくは他の脂肪族基を有するシリカゲルを用いる１またはそれ以上の逆相高品質液体クロマトグラフィー（ＲＰ−ＨＰＬＣ）工程を用いて、本発明に使用するためにさらにＢＭＰを精製することができる。上記精製工程のいくつかまたはすべてをいろいろと組み合わせて用いて実質的に均一な単離組み換え型蛋白を提供することができる。
【００１６】
ｒｈＢＭＰ−２のごときＢＭＰｓを、種々の症状における医師によるインビボでの哺乳動物の治療のための本発明方法に用いることができる。これらの症状は、末梢神経傷害、末梢ニューロパシーならびに局在性ニューロパシーのごとき末梢神経系の疾患、およびアルツハイマー症、パーキンソン症、ハンチントン症、筋萎縮性側索硬化症ならびにシャイ−ドレーガー（Shy-Drager）症候群のごとき中枢神経系疾患を包含する。本発明により治療されうるさらなる症状は、脊髄疾患、頭部外傷ならびに卒中のごとき脳血管疾患のような機械的および外傷性疾患を包含する。ＢＭＰｓを用いて神経細胞および神経組織の再生を促進し、かかる疾患の治癒を促進または加速することができる。
【００１７】
本発明方法によれば、ｒｈＢＭＰ−２のごときＢＭＰをそれのみ投与してもよく、他のＢＭＰｓと組み合わせて投与してもよく、あるいは他の療法と組み合わせて投与してもよい。例えば、神経の疾患の治療において、ｒｈＢＭＰ−２を、サイトカイン、リンホカイン、増殖因子、またはコロニー刺激因子と有効に組み合わせてもよい。本発明方法によりＢＭＰと組み合わせて使用する代表的なサイトカイン、リンホカイン、増殖因子およびコロニー刺激因子は、ＥＧＦ、ＦＧＦ、インターロイキン１ないし１２、Ｍ−ＣＳＦ、Ｇ−ＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦ、幹細胞因子、エリスロポエチン等を包含するが、これらに限定しない。さらに、ＢＭＰｓを、ＣＮＴＦ、ＬＩＦ、ＩＬ−６およびインスリン様増殖因子［ＩＧＦｓ］のごとき神経栄養性因子と組み合わせてもよい。さらに、通常は神経環境に見いだされる蛋白を、本発明によりＢＭＰｓに添加してもよい。これらは、ラミニン、ヒアルロン酸、およびバーシカンを含むコンドロイチン硫酸プロテオグリカン類を包含してもよい。
【００１８】
所望位置に所望方向でＢＭＰを維持しうるマトリックスを用いて本発明ＢＭＰｓを投与して神経組織の再生を可能にしてもよい。好ましくは、ＢＭＰをマトリックス上に吸着させてもよい。マトリックスは、当該分野で知られたいかなる適当な材料からできていてもよい。かかる材料は、コラーゲン、フィブリン組織接着物質、およびラミニン、ヒアルロン酸、バーシカンを包含するコンドロイチン硫酸プロテオグリカン類を包含する、正常神経内膜鞘成分から選択される適当な材料を包含する。好ましくは、マトリックスは多孔性であり、神経組織の再生に必要な細胞の流入、移動、分化および増殖を可能にするものであってよい。１の好ましい具体例において、マトリックスは架橋コラーゲンを含む。コラーゲンはいかなる適当な形態であってもよいが、好ましくは、スポンジの形態である。コラーゲンを神経組織の再生に適した形状に成型してもよい。もう１つの好ましい具体例において、マトリックスは、乳酸ポリマー（ＰＬＡ）、グリコール酸ポリマー（ＰＧＡ）、および乳酸とグリコール酸のコポリマー（ＰＬＧＡ）のごとき生分解性粒子を含む。マトリックスは、フィブリンまたは静脈移植片のごとき、神経組織の形成を促進する材料からなっていてもよい。
【００１９】
次いで、好ましくは、開口したシラスティック管のごとき管状もしくはステント（stent）の形態である人工神経代替容器にＢＭＰが吸着した材料を適用する。人工神経代替容器は、一定の位置にＢＭＰが吸着した容器を保持して神経組織の再生を可能にするいかなる材料からなっていてもよい。１の具体例において、自己由来の静脈移植片を神経代替容器として用いてもよい。人工神経代替容器は、ポリマーのごとき再吸収可能な材料からなっていてもよい。いくつかの好ましい具体例において、マトリックスは人工神経代替容器としても役立つ。
【００２０】
本発明方法に適した医薬組成物は、ＢＭＰのほかに、医薬上許容される担体、希釈剤、充填剤、塩、緩衝剤、安定化剤、および／または当該分野で知られた他の物質を含有していてもよい。用語「医薬上許容される」は、活性成分の生物学的活性の有効性を妨害しない無毒の物質を意味する。担体または他の物質の特性は投与経路に依存するであろう。
【００２１】
本発明方法におけるｒｈＢＭＰ−２のごときＢＭＰの投与を、種々の慣用的方法で行うことができる。神経組織の再生、神経欠損または神経損傷の治療には、ＢＭＰの局所投与が好ましい。最も好ましい投与モードにおいては、ＢＭＰは生体適合性マトリックスに吸着され、人工神経代替容器に適用される。好ましくは、生体適合性マトリックスはコラーゲンからできており、スポンジ、シートもしくはマット、または密に充填された粒子の形態であってもよい。人工神経代替容器は管またはステントの形態であってもよい。人工神経代替容器に適する他の材料は、当業者に明らかであろう。好ましい具体例において、人工神経代替容器は、ＢＭＰが吸着したマトリックスの入った開口したシラスティック管を含む。もう１つの好ましい具体例において、人工神経代替容器は自己由来の静脈移植片を含む。いくつかの好ましい具体例において、同じ材料がマトリックスおよび人工神経代替容器の両方として役立ちうる。
【００２２】
本発明方法において有用なＢＭＰの量は、治療すべき症状の性質ならびに重さ、および患者が受けていた以前の治療の性質に依存するであろう。結局は、各患者を治療するＢＭＰ量を担当医が決定するであろう。本発明の種々の医薬組成物は、体重１ｋｇあたり約０.１μｇないし約１００ｍｇ、好ましくは約０.１μｇないし１００μｇを含有すべきであると考えられる。担当医が薬剤の作用を変化させる種々の因子、例えば、患者の状態、体重、性別および食事、症状の重さ、投与期間ならびに方法、および他の臨床的因子を考慮して実際の投与規則が決定されよう。
【００２３】
本発明治療方法の実施に際して、治療上有効量のＢＭＰを、かかる症状を有する哺乳動物に投与する。用語「治療上有効量」は、有意な患者に対する利益、すなわち、慢性症状の治癒または治癒速度の増加を示すに十分な本発明方法の各化合物の総量を意味する。例えば、神経再生量の骨形態形成蛋白は、適当なマトリックス担体に吸着され、神経損傷、欠損もしくは枯渇部位に移植された場合に神経組織の再生および／または神経損傷、欠損もしくは枯渇の改善を可能にする蛋白の量である。個体に活性成分のみを投与する場合、該用語はその成分のみについていう。組み合わせて投与する場合、混合、順次または同時に投与する場合であっても、該用語は、治療効果を生じる活性成分を合わせた量をいう。本発明方法の実施のための、治療上有効なＢＭＰ用量は、１回の投与につき体重１ｋｇあたり約０.１μｇないし約１００ｍｇの範囲であると考えられる。一般的には、最初は用量の最低量で投与を開始し、あらかじめ選択しておいた期間中、正の効果が得られるまで用量を増加させていく。次いで、考えられるすべての不利な効果が考慮されつつ、用量に対応した効果の増大が限界に達するまで用量が増加させられるであろう。
【００２４】
本発明方法を用いる静脈投与による治療期間は、治療すべき疾患の重さおよび個々の患者の状態ならびに固有の応答に依存して変更されるであろう。ＢＭＰの各適用期間は連続投与では１２ないし２４時間の範囲であろうと考えられる。結局、担当医が、本発明方法を用いる治療の適当な期間を決定するであろう。
【００２５】
本発明方法によれば、医薬上許容される担体と混合された神経再生量のｒｈＢＭＰ−２のごときＢＭＰを投与することにより、哺乳動物において神経再生を行うことができる。本発明の目的のためには、ｒｈＢＭＰ−２のごときＢＭＰの神経再生量は、神経の再生を引き起こすに必要な蛋白量である。神経組織の重量または体積により神経再生を測定することができる。ＢＭＰを発現するように形質転換された適当な宿主細胞を患者に投与して神経細胞または組織の増殖もしくは生存を改善してもよい。
【００２６】
以下の実施例は本発明の説明であり、何ら限定的なものではない。
【００２７】
ＢＭＰの非経口処方は、パイロジェン不含の非経口的に許容される水溶液の形態であろう。かかる非経口的に許容される蛋白溶液のｐＨ、等張性、安定性等については当業者の範囲内である。好ましい非経口処方は、ＢＭＰに加えて、注射用塩化ナトリウム、注射用リンゲル溶液、注射用デキストロース、注射用デキストロースならびに塩化ナトリウム、注射用乳酸リンゲル溶液のごとき等張性担体、または当該分野で知られた他の担体を含有するべきである。本発明医薬組成物は、安定化剤、保存料、緩衝剤、抗酸化剤、または当業者に知られた他の添加物を含有していてもよい。
【００２８】
局所的に投与する場合、本発明ＢＭＰは、パイロジェン不含の局所的に許容される、軟膏、クリーム、ローション、泡もしくはゲルのごとき液体または半固体処方であってもよい。処方に用いるかかる局所用標品は当該分野の技術の範囲内である。
【実施例１】
【００２９】
実施例Ｉ. 神経細胞に対するＢＭＰの効果
実施例ＩＡ. 細胞の培養
Ｂａｌｂ ｃ／ＳＦＭＥ（無血清マウス胚）細胞をアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（American Type Culture Collection）（ＣＲＬ９３９２）から得て、以前に記載（サカイ（Sakai）ら,ＰＮＡＳ：ＵＳＡ,第８７巻：８３７８〜８３８２頁（１９９０年））されているように、ウシ・インスリン１０μｇ／ｍｌ（イーライ・リリー（Eli Lilly）社製）、ヒト・トランスフェリン２５μｇ／ｍｌ（コラボレイティブ・リサーチ（Collaborative Research）社製）、ヒト・高密度リポ蛋白２０μｇ／ｍｌ（シグマ（Sigma）社製）、ヒト・上皮増成長子１００ｎｇ／ｍｌ（ペプロテック（PeproTech）社製）、ウシ・血漿フィブロネクチン２０μｇ／ｍｌ（ギブコ（GIBCO）社製）、亜セレン酸ナトリウム１０ｎＭ（ギブコ）、ペニシリン−ストレプトマイシン（１０Ｕ／ｍｌ）、Ｌ−グルタミン（４ｍＭ）および４−（２−ヒドロキシエチル）ピペラジンエタンスルホン酸１５ｍＭ（ｐＨ７.４）を含有するＤＭＥ／Ｆ１２（１：１）培地中で増殖させた。
【００３０】
体積比１：２のトリプシン／ＥＤＴＡおよび大豆トリプシンインヒビター（１ｍｇ／ｍｌ）を用いて細胞を継代し、１９代から５０代の間において使用した。特に断らないかぎり、コウルター・ダイアグノスティクス・カウンター（Coulter Diagnostics counter）で細胞を計数した。
【００３１】
実施例ＩＢ. 増殖および分化因子：
使用したすべての組み換え型ヒト・蛋白は９０％以上の純度であった。ＥＧＦをペプロテック（ニュージャージー州）から購入した。組み換え型ヒト・アクチビン−Ａはヘレン・ニュー（Helen New）から親切にも譲り受けた。ＴＧＦ−β１をＲ＆Ｄシステムズから購入した。ＢＭＰｓを、ジェネテイックス・インスティテュートにおいて数ステップの精製工程によりＣＨＯならし培地から精製した。
【００３２】
実施例ＩＣ. 分化の研究：
すべての免疫蛍光およびＦＡＣＳ分析については、特に断らないかぎり、細胞を２.５ｘ１０４個／ｃｍ２でプレーティングし、１６〜２０時間目にＢＭＰ−２を示された濃度および期間において添加した。
【００３３】
実施例ＩＤ. 生存の研究：
ＥＧＦ不含培地で細胞を２回洗浄し、次いで、種々の増殖因子を補足した同じ培地中に０.８〜１ｘ１０５個／ｃｍ２の密度でプレーティングした。これらの増殖因子は、ＢＭＰ−２、ＢＭＰ−４、ＢＭＰ−５、ＢＭＰ−６、ＢＭＰ−７、ＢＭＰ−２／６ヘテロダイマー、ＢＭＰ−２／７ヘテロダイマーおよびＴＧＦ−β１を包含する。４４〜４８時間目に、血球計数板を用いる２系のトリパンブルー色素排除法により生存のパーセント値および細胞数を決定し、最少でも１試料あたり４００個の細胞を計数した。細胞の増殖がいくつかの条件下で見られたので、終点において全細胞数で全生細胞数を割ったものとして生存のパーセント値を計算した。
【００３４】
実施例ＩＥ. 免疫蛍光抗体染色：
４ウェルのガラスまたはプラスティックチャンバースライド（ラブテック（Lab Tek）社製）中の細胞から培地を除去し、Ｃａ２＋,Ｍｇ２＋不含ＰＢＳ（ＣＭＦ）で２回洗浄した。抗体Ａ２Ｂ５（ベーリンガー−マンハイム（Boehringer-Mannheim）社製）を用いる表面染色用に、まず細胞を４％パラホルムアルデヒドで１０分間固定し、ＰＢＳで洗浄し、次いで、１％ウサギ・血清とともにＰＢＳ中でインキュベーションして非特異的結合をブロックした。抗体をＰＢＳ中１％ウサギ・血清で希釈し、１時間インキュベーションし、次いで、細胞をＰＢＳ中１％ウサギ・血清で洗浄してからビオチン化ウサギ・抗マウス抗体、次いで、ストレプトアビジン−ＦＩＴＣ（ザイムド（Zymed）社製）抱合体で検出を行った。ＦＧＡＰに関するさらなる二重染色実験または単一の内部染色用に、細胞をアセトン／メタノール（５０：５０）中、−２０℃で１０分間固定した。ＰＢＳ中０.２％Triton X-100および第２段階の試薬に応じて１％ヤギもしくはウサギいずれかの血清で透過性付与およびブロッキングを行った。第１の抗体は、示されたように、ウサギ・ポリクローナル（１：２００）またはマウス・モノクローナル（５μｇ／ｍｌ）のいずれかであり、それぞれＰＢＳ中の１％のヤギもしくはウサギいずれかの血清中に希釈し、次いで、１時間インキュベーションした。第２のビオチン化抗体（ザイムド社製）ならびにスレプトアビジンフィコエリスリン（ＰＥ）（ザイムド社製）または抱合体となった抗ＩｇＧ１−ＰＥ抗体（ザイムド社製）のいずれかを用いて検出を行った。蛍光光学機器を装備したツァイス社のアクシオフォト（Zeiss Axiophot）またはオリンパス（Olympus）社のＢＨ２−ＲＦＣ顕微鏡のいずれかを用いて細胞を試験し、エクタクローム（Ektachrome）１６００ＡＳＡフィルムで写真を取った。
【００３５】
実施例ＩＦ. ＦＡＣＳ分析
これらの実験のために、細胞をＰＢＳで１回、次いで、ＥＤＴＡ／塩で１回洗浄してから、ＥＤＴＡ／塩とともに室温で２０分インキュベーションした。次いで、ゆるやかにプレート表面上をピペッティングすることにより細胞を取った。プレートをＥＤＴＡ／塩で洗浄し、細胞と一緒にして、次いで、遠心分離し、ＰＢＳで１回以上洗浄し、次いで、計数した。各抗体インキュベーションに１ｘ１０６個の細胞を用いた。４℃におけるＡ２Ｂ５表面染色のために、まず細胞プレートを５０μｌの熱不活性化ウサギ・血清とともにインキュベーションして非特異的結合をブロックし、次いで、１％ウサギ・血清／ＰＢＳ中に５μｇ／ｍｌとなるよう希釈されたＡ２Ｂ５抗体（ベーリンガー−マンハイム社製）または対照クラスの特異的ＩｇＭとともに１時間インキュベーションした。直接抱合した抗ＩｇＭ−ＰＥ（ザイムド社製）を用いて検出を行った。ＧＦＡＰに対するさらなる二重染色実験または単一内部染色のために、細胞を０.２５％パラホルムアルデヒド中、４℃で１時間固定し、遠心分離し、次いで、ＰＢＳ／アザイド中０.２％ツイン２０ １ｍｌ中に再懸濁し、３７℃で１５分インキュベーションした。２％熱不活性化ウサギ・血清／ＰＢＳ１ｍｌを添加し、細胞を遠心分離した。ペレット５０μｌのウサギ・血清中に再懸濁し、次いで、第１の抗体およびクラス特異的対照をＰＢＳ中１％ウサギ・血清１００μｌ中に５μｇ／ｍｌとなるよう希釈した。直接抱合した抗ＩｇＧ１−ＦＩＴＣ抗体（ザイムド,フィッシャー・バイオテック（Zymed,Fisher Biotech）社製）を用いて最終的な検出を行った。細胞を、ＰＢＳ／アザイド中１％ウサギ・血清、０.２％ツイン２０で洗浄し、次いで、ＰＢＳで洗浄し、さらに最終的に１％パラホルムアルデヒド中に再懸濁した。蛍光励起用に１５ｍＷの４８８ｎｍ空冷式アルゴンイオンレーザーを用いるＦＡＣＳｃａｎ（カリフォルニア州サン・ホセのベクトン・デイキンソン（Becton Dickinson）によりＦＡＣＳ分析を行った。蛍光エミッションを標準的なＦＡＣＳｃａｎ配列（５３０ｎｍ（ＦＩＴＣ ,５８５ｎｍ（ＰＥ）および＞６５０ｎｍ（赤色蛍光））において測定した。
【００３６】
データを得て、ＬＹＳＹＳ IIソフトウェア（カリフォルニア州サン・ホセのベツトン・デイキンソン社製）を用いるヒューレット・パッカード（Hewlett Packard）社製３４０Ｃコンピューターシステムにより分析した。イソタイプ対照を各試料に対して行い、ゲートを単染色実験用にセットして多くとも３％の細胞を含むようにした。
【００３７】
実施例ＩＧ. ウェスタン分析
２系の６ウェルデイッシュに細胞を２.５ｘ１０４個／ｃｍ２となるようプレーティングし、１６時間目に適当なＢＭＰまたはＴＧＦ−β１を１、１０および１００ｎｇ／ｍｌとなるよう添加した。４４時間後、細胞を収穫した。１のウェルをトリプシン処理して計数し、２つ目のウェルをＰＢＳで洗浄し、１ｍＭのＰｅｆａｂｌｏｃ（ベーリンガー−マンハイムから購入した水溶性プロテアーゼインヒビター）を含有する氷冷したＰＢＳ中に細胞を掻き取り、４００ｘＧで遠心分離した。１〜２容の０.１％Triton X-100、１ｍＭ Ｐｅｆａｂｌｏｃ、０.１２５Ｍ Ｔｒｉｓ 塩基,ｐＨ６.８、２５０Ｕ／ｍｌのＤＮＡｓｅを細胞ペレットに添加し、混合した。最後に、０.５％ＳＤＳおよび２０ｍＭ ＤＴＴをそれぞれに添加した。２系のウェルの細胞計数値に基づき、各条件下での５ｘ１０５個の細胞を含む等価な体積を、１２％の１ｍｍのレムリ（Laemmli）ミニゲル（ノベックス（Novex）社製）の各レーンに負荷した。１０および１００ｎｇのウシ・ＧＦＡＰも負荷した。電気泳動後、０.４５ミクロンのニトロセルロース膜に対して０.０５％ＳＤＳ存在下で３００ｍＡで１時間、ゲルからの移行を行った。ブロットを風乾し、１％ＫＯＨで固定し、ＴＢＳ（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ,５００ｍＭ ＮａＣｌ,ｐＨ８.５）中０.５％ツイン２０で洗浄しブロッキングし、次いで、１：１０００希釈のＧＦＡＰ抗血清（ＢＴＩ）中で一晩インキュベーションした。ＴＢＳ中０.５％ツイン２０中で洗浄した後、ブロットを１：３０００希釈のヤギ・抗ウサギＨＲＰ中で１時間インキュベーションし、次いで、エンハンスト・ケミルミネッセンス（Enhanced Chemiliminescence）（アマーシャム（Amersham）社のキット）により現像した。簡単に説明すると、ブロットをＴＢＳ−ツイン２０中、次いで、ＴＢＳ中で洗浄し、試薬ＡおよびＢの１：１混合物中で１分間インキュベーションし、次いで、フィルムに曝露し、現像した。
【００３８】
結果
ＴＧＦ−β１または血清でのＳＦＭＥ細胞の処理は、星状細胞特異的分化マーカーＧＦＡＰ（サカイ（Sakai）ら,上記文献）の発現を伴った明確な形態学的変化を生じた。ＴＧＦ−β１処理は、両端に細胞質突起を有する長くて両端に突起を有し、ＧＦＡＰに関して染まる細胞タイプを生じた。対照的に、ウシ胎児血清（ＦＣＳ）処理した細胞はサイズが長く、高度に分枝したフィラメントネットワークを有し、ＦＧＡＰに関して非常に強く染まった。
【００３９】
１０ｎｇ／ｍｌのＢＭＰ−２、４、５、６、７およびＢＭＰ−２／６ならびに２／７ヘテロダイマーでのＳＦＭＥ細胞の処理は、ＧＦＡＰの発現を伴うその外観における劇的な形態学的変化を生じた。細胞は、培養中の初期の星状細胞に典型的な多くの長い細胞質突起を獲得した。総体的には、ＢＭＰｓおよびウシ・血清に関連して観察されたＧＦＡＰ染色の強度は、ＴＧＦ−β１に関して観察された強度よりもずっと強かった。ＢＭＰ−２およびＢＭＰ−２／７ヘテロダイマーは、ウシ・血清を用いた場合に見られるような大型の形態を有する細胞タイプを誘導したが、ＢＭＰ−７は、性質がより繊維状である形態を誘導した。これらの形態は、誘導された細胞タイプの表現型の相違（タイプ１対タイプ２星状細胞）またはＧＦＡＰもしくは他の細胞骨格蛋白の種々のレベルのいずれかを反映している可能性がある。対照細胞は線維芽細胞様の外観を有し、ＧＦＡＰに関して染まらない。
【００４０】
ＢＭＰにより誘導されたＧＦＡＰ発現レベルを正確に測定し、ＴＦＧ−βの活性とＢＭＰの活性を比較するために、蛍光活性化細胞ソーティングによる定量的アッセイを確立した。それぞれ１０ｎｇ／ｍｌのＢＭＰ、ＴＧＦ−β１およびアクチビン（Activin）ならびに１０％子ウシ・血清で細胞を処理した。応答している集団のパーセント値および平均蛍光強度によりデータを分析した。
【００４１】
応答している集団のパーセント値はＧＦＡＰを発現している細胞数を反映し、発現レベルとは無関係である。ＢＭＰ−２、４、５、６、７、２／６ヘテロダイマーならびに２／７ヘテロダイマー、ＴＧＦ−βおよび子ウシ・血清は、対照と比較すると、ＧＦＡＰの発現を有意に誘導する。ＴＧＦ−βスーパーファミリーのもう１つのメンバーであるアクチビンは効果がない。ＢＭＰ−２／６ならびに２／７ヘテロダイマーはこのパラメーターにおいて最も有効であり、約６５ないし７２％の応答レベルを生じる。ＢＭＰ−２、４、ＴＧＦ−β１およびウシ胎児血清での処理は、約５３ないし５８％の応答細胞を生じる。ＢＭＰ−５、６および７での処理は、約３０ないし４０％の応答細胞を生じる。
【００４２】
平均蛍光強度（ＭＦＩ）はＧＦＡＰ発現レベルを示す。平均蛍光が高いほど、ＧＦＡＰ発現レベルが大きい。ＢＭＰ−２／６および２／７ヘテロダイマーにより誘導された細胞は、ＴＧＦ−β１により誘導された細胞の約８倍の平均蛍光を有する。ＢＭＰ−２、４、５、６および７により誘導された細胞は、子ウシ血清により誘導された細胞の約２〜４倍の平均蛍光を有する。ＴＧＦ−βおよび子ウシ血清はすべて対照よりも有意に高い値を与える。
【００４３】
ＢＭＰｓおよびＴＧＦ−β１がＧＦＡＰ誘導する能力を比較するために、ＢＭＰ−２、ＢＭＰ−６、ＢＭＰ−２／６ヘテロダイマーおよびＴＧＦ−β１を０〜１０ｎｇ／ｍｌの濃度範囲において試験し、ＦＡＣＳアッセイをＧＦＡＰ発現の定量のために用いた。各因子がＧＦＡＰ平均蛍光値５（対照値０.５の１０倍）を与えた濃度を用いて相対活性を比較した。ＴＧＦ−β１と比較した相対活性に関しては、ＢＭＰ−２／６ヘテロダイマーは約１８倍活性があり、ＢＭＰ−２およびＢＭＰ−６は約３〜４倍活性があった。ＢＭＰ−２およびＢＭＰ−２／６は０〜０.０８ｎｇ／ｍｌの範囲の検出可能なＧＦＡＰのレベルを誘導したが、ＴＧＦ−β１での最初の検出可能なＧＦＡＰの増加は０.４〜２ｎｇ／ｍｌの範囲である。
【００４４】
さらにウェスタン分析によってもＢＭＰｓへの曝露後のＳＦＭＥ細胞により生産された高レベルのＧＦＡＰが確認された。ＢＭＰまたはＴＧＦ−β１処理細胞抽出物において、検出に用いたポリクローナルＧＦＡＰ抗体は、５２ｋＤのウシ・ＧＦＡＰ標準よりもわずかに下側を泳動する４０〜５０ｋＤの範囲の蛋白を特異的に認識する。観察された広い分子量範囲は、おそらく、蛋白分解の結果であろう。１〜１００ｎｇ／ｍｌのＢＭＰ−２およびＢＭＰ−６処理による蛋白レベルの用量依存的増加があった。ＴＧＦ−β処理により誘導されたＧＦＡＰは、１０ｎｇ／ｍｌの用量で最大となり、わずか１ｎｇ／ｍｌのＢＭＰ−２により誘導されたＧＦＡＰとほぼ同じである。このレベルは１００ｎｇ／ｍｌの用量においてさえも上昇しなかった。ＢＭＰｓはＴＧＦ−β１よりも高レベルのＧＦＡＰを誘導した。
【００４５】
ＢＭＰｓでのＳＦＭＥ細胞の処理は、「線維芽細胞様」細胞の２種の独特なＧＦＡＰ陽性形態への変換を引き起こす。一方のほとんど突起がなく大型で平らな細胞タイプは星状細胞の原形質タイプを思わせ、もう一方の非常に長い細胞質突起を有するタイプは線維状星状細胞の特徴を示す。
【００４６】
これらの細胞を、Ａ２Ｂ５およびＧＦＡＰに関する二重免疫蛍光抗体染色によりさらに特徴づけた。ＢＭＰ−２／６集団において、タイプ１およびタイプ２の両方の星状細胞系細胞が存在した。ＧＦＡＰに関して染まるがＡ２Ｂ５に関しては染まらない細胞の大多数はタイプ１の星状細胞系であったが、Ａ２Ｂ５およびＧＦＡＰの両方に関して染まる細胞はタイプ２の星状細胞系であった。対照細胞はその表面上のＡ２Ｂ５に関して染まったが、ＧＦＡＰに関しては染まらなかった。
【００４７】
免疫蛍光染色により可視化された細胞集団を定量するために、我々は、二重染色ＦＡＣＳ分析を用いた。表１のデータを、少なくとも３回の実験の平均値±標準偏差として表す。対照細胞は約３７％がＡ２Ｂ５陽性であった。対照細胞は星状細胞系マーカーに関して染色陽性でなかった。ＢＭＰ−２、６および２／６により処理された細胞はＡ２Ｂ５に関してのみ染まらなかったが、２種の星状細胞系の集団からなっていた。ＧＦＡＰのみに関しては６０％以上が陽性であり、それらはタイプ１の系統であって、さらに約１８％がＡ２Ｂ５およびＧＦＡＰに関して陽性であることが示され、これらはタイプ２の系統であることが示された。ＴＧＦ−β１処理も、同様の規模の集団のタイプ２系統細胞（約１４％）を生じたが、タイプ１系統の細胞のうち約４０％の集団だけが陽性であった。さらに、Ａ２Ｂ５に関してのみ染まる細胞の小さな集団（約７％）が残っていた。総体的に、ＢＭＰｓまたはＴＧＦ−β１でのＳＦＭＥ細胞の処理は、Ａ２Ｂ５／ＧＦＡＰ集団においては完全には説明できるとはいえないＡ２Ｂ５の発現の消失を引き起こした。
【表１】
【００４８】
ＳＦＭＥ細胞生存に関する研究
ＳＦＭＥ細胞の生存にはＥＧＦが必要であり、ＦＧＦおよびＴＧＦ−βのごとき他の因子でそれを代替することはできない。ＥＧＦ、ＳＦＭＥ細胞をＢＭＰ−２、７、２／７ヘテロダイマー、ＴＧＦ−β１およびアクチビンで処理した。アクチビンは、Ｐ１９細胞に関する神経細胞生存分子であることが示されている。シューバート（Schubert）ら,ネイチャー（Nature）第３４４巻：８６８〜８７０頁（１９９０年）。４８時間後、ＥＧＦ不存在下においては約３０％の生存細胞が存在し、全体として細胞数が減少した。ＥＧＦ添加は約９５％の細胞生存率を引き起こし、細胞数は５倍に増加した。ＢＭＰ−２、ＢＭＰ−７およびＢＭＰ−２／７ヘテロダイマーで処理された細胞は、接種密度の約７０〜８０％の細胞数を維持した。しかしながら、細胞は増殖しなかった。ＢＭＰ−２で処理された細胞は、生存したのみならず分化したようであった。その生存率は約８０〜８５％であった。ＴＧＦ−β１またはアクチビンいずれかで細胞を処理すると、生存率は１０％未満で、細胞数は少なくとも１０倍の減少となった。高濃度のＴＧＦ−β１は生存率を増加させなかった。
【実施例２】
【００４９】
実施例II. ＢＭＰ−２を用いる哺乳動物における末梢神経の再生
Ａ. コラーゲンスポンジの調製
コラーゲンスポンジ（Collastat（登録商標）,ビタフォア・ウーンド・ヒーリング,インコーポレイテッド（Vitaphore Wound Healing,Inc.）社製）を約２ｘ２ｘ１８ｍｍの寸法に切り、滅菌ガラス容器中で蒸留水にて十分に洗浄し、凍結乾燥し、エチレンオキサイドで滅菌し、ＢＭＰ−２添加前に脱気した。
【００５０】
４５％アセトニトリル,０.１％トリフルオロ酢酸中の０.５μｇのＢＭＰ−２をスポンジ中に均等に分散させた。次いで、これらのスポンジをチューブに入れ、液体窒素中で凍結し、凍結乾燥した。ＢＭＰ−２を含まない４５％アセトニトリル,０.１％トリフルオロ酢酸バッファーを用いる以外は同様にして対照移植物を調製した。
【００５１】
凍結乾燥後、ＢＭＰ−２を負荷したスポンジおよび滅菌対照スポンジを、約１.６ｘ２０ｍｍの寸法の滅菌した開口シラスティック管中に入れた。すべての操作を滅菌条件下で行った。外科手術の前に手術室内で移植物の両端の余分な管を除去した。
【００５２】
６匹のルイス・ラット（Lewis Rat）の坐骨神経を切断した。内径１.６ｍｍｘ長さ１７ｍｍの開口したシラステイックまたは生分解性ステントを挿入した。ステントにはｒｈＢＭＰ−２を含むコラーゲンマトリックス担体または含まないコラーゲンマトリックス担体が入っていた。コラーゲンマトリックス担体はコラーゲンスポンジ（Collastat）（約１.５ｍｍ ｘ １５ｍｍ）からなっていた。坐骨神経が切断され再付着を防止するために後方に結束された動物は正の対照として役立った。手術されていない後ろ足はエイジ（age）を合わせた負の対照として役立った。
【００５３】
ステントを顕微鏡下で適用し、坐骨神経の切断された神経末端と吻合した。神経末端をステントの各末端において１ｍｍ挿入し、１５ｍｍのギャップを残した。移植後、６、８および１２週目に、電気的な機能の回復について動物を試験した。機能回復の程度を調べるための正確で信頼性および再現性のある方法を提供する、複合的筋肉作動電位（ＣＭＡＰ）を調べた。振幅および潜伏時間はエイジ依存的であり、再発達した軸索／運動端板の数に直接比例する。
【００５４】
移植後１２週目に、病理学的試験のために動物を屠殺した。染色にはＨ＆Ｅ、銀、ルクソール−ファストブルー（Luxol-fast blue）およびＳ１００を用いた。ステント中に近位、中央部、遠位エレメントに対して先入観のない定量を行った。数匹のラットの皮下組織内におかれたステントは染色のための対照として役立った。
【００５５】
結果は、デバイス１個につきCollastatスポンジに沈着した０.５μｇのＢＭＰ−２で１２週間治療した６匹の動物のうち４匹において、１５ｍｍの神経の欠損を越えた良好な神経の再生を示した。ＢＭＰ−２を用いなかった対照は、１５ｍｍの神経の欠損を越えた増殖を示さなかった。
【産業上の利用可能性】
【００５６】
本発明は、医薬の分野、特に神経細胞の再生に関連する医薬の分野において利用可能である。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
星状細胞の増殖の誘導方法であって、ＢＭＰ−２、ＢＭＰ−４、ＢＭＰ−５、ＢＭＰ−６、ＢＭＰ−７、ＢＭＰ−２／６ヘテロダイマー、およびＢＭＰ−２／７ヘテロダイマーからなる群より選択される骨形態形成蛋白の存在下で適当な細胞を培養することを含む、方法。
【請求項２】
細胞がマトリックスにおいて培養される、請求項１記載の方法。
【請求項３】
マトリックスが、コラーゲン、フィブリン組織接着剤、ラミニン、ヒアルロン酸、およびコンドロイチン硫酸プロテオグリカン類からなる群より選択されるものである、請求項２記載の方法。
【請求項４】
マトリックスがコラーゲンを含むものである、請求項３記載の方法。
【請求項５】
コラーゲンがスポンジ形態である、請求項４記載の方法。
【請求項６】
骨形態形成蛋白がＢＭＰ−２である、請求項１記載の方法。
【請求項７】
星状細胞の増殖を誘導するための医薬組成物であって、ＢＭＰ−２、ＢＭＰ−４、ＢＭＰ−５、ＢＭＰ−６、ＢＭＰ−７、およびＢＭＰ−２／６ヘテロダイマー、およびＢＭＰ−２／７ヘテロダイマーからなる群より選択される骨形態形成蛋白を有効量含む、医薬組成物。
【請求項８】
骨形態形成蛋白が適当なマトリックスに吸着されている、請求項７記載の医薬組成物。
【請求項９】
マトリックスがスポンジ形態のコラーゲンを含むものである、請求項８記載の医薬組成物。
【請求項１０】
マトリックスが人工神経代替容器内に含まれている、請求項８記載の医薬組成物。
【請求項１１】
人工神経代替容器が開口したシラスティック管を含むものである、請求項１０記載の医薬組成物。
【請求項１２】
骨形態形成蛋白がＢＭＰ−２である、請求項７記載の医薬組成物。
【請求項１３】
骨形態形成蛋白がＢＭＰ−２である、請求項１１記載の医薬組成物。
【請求項１】
星状細胞の増殖の誘導方法であって、ＢＭＰ−２、ＢＭＰ−４、ＢＭＰ−５、ＢＭＰ−６、ＢＭＰ−７、ＢＭＰ−２／６ヘテロダイマー、およびＢＭＰ−２／７ヘテロダイマーからなる群より選択される骨形態形成蛋白の存在下で適当な細胞を培養することを含む、方法。
【請求項２】
細胞がマトリックスにおいて培養される、請求項１記載の方法。
【請求項３】
マトリックスが、コラーゲン、フィブリン組織接着剤、ラミニン、ヒアルロン酸、およびコンドロイチン硫酸プロテオグリカン類からなる群より選択されるものである、請求項２記載の方法。
【請求項４】
マトリックスがコラーゲンを含むものである、請求項３記載の方法。
【請求項５】
コラーゲンがスポンジ形態である、請求項４記載の方法。
【請求項６】
骨形態形成蛋白がＢＭＰ−２である、請求項１記載の方法。
【請求項７】
星状細胞の増殖を誘導するための医薬組成物であって、ＢＭＰ−２、ＢＭＰ−４、ＢＭＰ−５、ＢＭＰ−６、ＢＭＰ−７、およびＢＭＰ−２／６ヘテロダイマー、およびＢＭＰ−２／７ヘテロダイマーからなる群より選択される骨形態形成蛋白を有効量含む、医薬組成物。
【請求項８】
骨形態形成蛋白が適当なマトリックスに吸着されている、請求項７記載の医薬組成物。
【請求項９】
マトリックスがスポンジ形態のコラーゲンを含むものである、請求項８記載の医薬組成物。
【請求項１０】
マトリックスが人工神経代替容器内に含まれている、請求項８記載の医薬組成物。
【請求項１１】
人工神経代替容器が開口したシラスティック管を含むものである、請求項１０記載の医薬組成物。
【請求項１２】
骨形態形成蛋白がＢＭＰ−２である、請求項７記載の医薬組成物。
【請求項１３】
骨形態形成蛋白がＢＭＰ−２である、請求項１１記載の医薬組成物。
【公開番号】特開２００７−１３００２７（Ｐ２００７−１３００２７Ａ）
【公開日】平成１９年５月３１日（２００７．５．３１）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００７−２４５２３（Ｐ２００７−２４５２３）
【出願日】平成１９年２月２日（２００７．２．２）
【分割の表示】特願２００４−２６８７３０（Ｐ２００４−２６８７３０）の分割
【原出願日】平成６年８月１９日（１９９４．８．１９）
【出願人】（５０１４１８２１４）ジェネティクス インスティテュート，エルエルシー (35)
【出願人】（５０００３３６３４）ザ・ボード・オブ・トラスティーズ・オブ・ザ・ユニバーシティ・オブ・イリノイ (21)
【氏名又は名称原語表記】ＴＨＥ ＢＯＡＲＤ ＯＦ ＴＲＵＳＴＥＥＳ ＯＦ ＴＨＥ ＵＮＩＶＥＲＳＩＴＹ ＯＦ ＩＬＬＩＮＯＩＳ
【住所又は居所原語表記】５０６ Ｓｏｕｔｈ Ｗｒｉｇｈｔ Ｓｔｒｅｅｔ， Ｕｒｂａｎａ， ＩＬ ６１８０１
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成１９年５月３１日（２００７．５．３１）
【国際特許分類】
【出願日】平成１９年２月２日（２００７．２．２）
【分割の表示】特願２００４−２６８７３０（Ｐ２００４−２６８７３０）の分割
【原出願日】平成６年８月１９日（１９９４．８．１９）
【出願人】（５０１４１８２１４）ジェネティクス インスティテュート，エルエルシー (35)
【出願人】（５０００３３６３４）ザ・ボード・オブ・トラスティーズ・オブ・ザ・ユニバーシティ・オブ・イリノイ (21)
【氏名又は名称原語表記】ＴＨＥ ＢＯＡＲＤ ＯＦ ＴＲＵＳＴＥＥＳ ＯＦ ＴＨＥ ＵＮＩＶＥＲＳＩＴＹ ＯＦ ＩＬＬＩＮＯＩＳ
【住所又は居所原語表記】５０６ Ｓｏｕｔｈ Ｗｒｉｇｈｔ Ｓｔｒｅｅｔ， Ｕｒｂａｎａ， ＩＬ ６１８０１
【Ｆターム（参考）】
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