時間分解蛍光測定装置、及び方法
【課題】時間分解蛍光測定装置において、測定対象物から発せられた蛍光の検出効率を向上させる。
【解決手段】測定対象物３０には、励起光が照射される。蛍光検出手段２４は、測定対象物３０から発せられた蛍光を検出する。蛍光検出手段２４は、複数の検出器が所定方向に一列に配列された検出器群を有する。光学素子２３は、蛍光が蛍光検出手段２４に入射するまでの間の光路中に配置される。光学素子２３は、励起光が測定対象物３０に照射された後、時間経過と共に蛍光が検出器群の複数の検出器のうちの異なる検出器で検出されるように、蛍光の進行方向を変化させる。ＰＣ２６は、検出器群での蛍光の検出結果に基づいて、蛍光寿命を算出する。
【解決手段】測定対象物３０には、励起光が照射される。蛍光検出手段２４は、測定対象物３０から発せられた蛍光を検出する。蛍光検出手段２４は、複数の検出器が所定方向に一列に配列された検出器群を有する。光学素子２３は、蛍光が蛍光検出手段２４に入射するまでの間の光路中に配置される。光学素子２３は、励起光が測定対象物３０に照射された後、時間経過と共に蛍光が検出器群の複数の検出器のうちの異なる検出器で検出されるように、蛍光の進行方向を変化させる。ＰＣ２６は、検出器群での蛍光の検出結果に基づいて、蛍光寿命を算出する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、時間分解蛍光測定装置及び方法に関し、更に詳しくは、時間領域測定法、特に時間ゲート法を用いて蛍光を測定する時間分解蛍光測定装置及び方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
蛍光を発する物質に可視光や紫外光を照射すると、蛍光が発することが知られている。蛍光を発する物質にパルス幅が短い光を照射すると、その照射後、ピコ秒からナノ秒オーダーにわたって蛍光が観察される。一般的に、この蛍光の発光強度は光照射直後で最大となり、その後、指数関数的に減衰していく。この指数関数における減衰定数が、蛍光寿命と呼ばれる。蛍光寿命を顕微鏡下で観測し、２次元的にマッピングを行う手法をＦＬＩＭ（Fluorescence Lifetime Imaging Microscopy）と呼ぶ。
【０００３】
ここで、蛍光寿命の特徴は、時間という定量性に優れた指標を基準にできることである。蛍光の特性を、蛍光の発光強度で定量化することもできるが、蛍光の発光強度は、蛍光を発する物質の濃度、退色、励起光の波長、強度、集光効率、検出器の感度、観測試料中での光の減衰、光学系の透過率など様々な要因による影響を受ける。一方、蛍光寿命は、測定条件に依存して変化し得る蛍光の発光強度とは異なり、蛍光を発する物質に固有な値となることから、定量的な議論が可能となる。蛍光寿命は、その分子の構造や電子状態に関し重要な情報を与えるほか、周囲の環境（イオン濃度、ｐＨ、酸素濃度、屈折率、粘性、温度など）に関する情報も提供する。
【０００４】
蛍光寿命を観測する方法は、大きく分けて２つある。１つは、パルス状の光を励起光に用いる時間領域測定法（time-domain measurement）であり、もう１つは、正弦波状に強度変調した光を励起光に用いる周波数領域測定法（frequency-domain measurement）である。時間領域測定法では、短パルスレーザを試料に入射し、その時間応答を高速な検出器で観測する。時間領域測定法における代表的な観測方法として、時間相関単一光子計数法（time-correlated single photon counting：ＴＣＳＰＣ）や、イメージインテンシファイア付きＣＣＤを用いた時間ゲート法、ストリークカメラを用い、時空間変換によってスペクトルと時間波形を一度に観測する手法が挙げられる。これらの方法に、アレイタイプの高感度検出器やスキャナミラーを組み合わせることで、蛍光寿命のマッピング、つまりイメージングが可能となる。
【０００５】
時間ゲート法では、蛍光発光の減衰曲線を時間軸方向にいくつかのウィンドウに分割し、パルス光を試料に照射した後、測定すべきウィンドウ（時間領域）に応じた遅延時間で検出器を一瞬だけオンにする。複数のウィンドウで蛍光の検出を行い、各ウィンドウ内の積分発光強度の値を時間に対してプロットし、積分発光強度が単一指数関数的に減衰すると仮定して蛍光寿命を求める。時間ゲート法は、時間相関単一光子計数法に比べ、測定時間を短縮できる。しかし、例えば時間領域を４分割したと仮定した場合、４つのウィンドウのそれぞれにおいて積分発光強度を求めるためには、同一の測定箇所に対して最低でも４回測定を行うことが必要である。このため、例えば細胞などの時々刻々と変化するサンプルに対して、同一時刻での蛍光寿命測定は困難であった。また、何度もパルス光を照射することで蛍光物質の退色が生じ、また、測定箇所が細胞であれば細胞が損傷するなどの問題もあった。
【０００６】
上記問題点に対し、特許文献１には、１度の励起光で単一蛍光減衰曲線の２つのウィンドウにおける積分発光強度を測定する方法が開示されている。引用文献１に記載の時間分解イメージング装置は、分離光学系と、遅延光学系と、合成光学系とを有する。分離光学系は、測定対象で発生した蛍光を、第１の光と第２の光とに分離して出力する。第１の光は遅延光学系を介して合成光学系に出力され、第２の光はそのまま合成光学系に出力される。遅延光学系は、第１の光に対して、第２の光の光路長に比して長い光路長を設定する。合成光学系は、分離光学系が出力する第２の光、及び遅延光学系を通った第１の光それぞれが形成する測定対象の像を、結像面上の互いに重ならない領域に合成し、合成した像を撮像部に出力する。第１の光は遅延光学系で遅延が与えられた分だけ遅れるため、撮像部において第１の光と第２の光とを同時刻に撮像することで、２つの時間領域における積分発光強度を測定することができる。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】特開平９−４３１４６号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
ここで、時間ゲート法では、ウィンドウ幅に対応する時間だけ検出器がオンにされ、検出器がオンされたときに入射された蛍光は検出器で検出されるものの、それ以外の時間領域の蛍光は検出器で検出されることはない。このことは、励起光に対する蛍光の検出効率を下げる要因となっている。特許文献１においても、分離された第１の光及び第２の光は、それぞれウィンドウ幅の分しか撮像部において撮像されず、ウィンドウ外の時間領域における蛍光が撮像部で撮影されることはないため、励起光に対する蛍光の検出効率を向上させることはできない。
【０００９】
本発明は、上記に鑑み、測定対象物から発せられた蛍光の検出効率を向上できる時間分解蛍光測定装置及び方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
上記目的を達成するために、本発明は、所定の波長を有する光を励起光として測定対象物に照射する光照射手段と、前記測定対象物から発せられる蛍光を検出する蛍光検出手段であって、複数の検出器が所定の方向に沿って一列に配列された検出器群を有する蛍光検出手段と、前記蛍光が前記蛍光検出手段に入射するまでの間の光路中に配置され、前記励起光が前記測定対象物に照射された後、時間経過と共に前記蛍光が前記検出器群の複数の検出器のうちの異なる検出器で検出されるように、前記蛍光の進行方向を変化させる光学素子と、前記検出器群での蛍光の検出結果に基づいて、蛍光寿命を算出する蛍光寿命算出手段とを備えたことを特徴とする時間分解蛍光測定装置を提供する。
【００１１】
本発明の時間分解蛍光測定装置では、前記蛍光寿命算出手段が、前記複数の検出器での蛍光の検出結果に基づいて複数の時間領域のそれぞれにおける蛍光発光強度を求め、該求められた蛍光発光強度に基づいて前記蛍光寿命を算出する構成を採用できる。
【００１２】
前記蛍光寿命算出手段は、前記複数の検出器のうちの、求めるべき蛍光発光強度の時間領域に対応した１以上の検出器での蛍光の検出結果に基づいて、各時間領域における蛍光発光強度を求めてもよい。
【００１３】
前記光学素子は、前記蛍光の測定期間にわたって、前記蛍光の進行方向を、前記一列に配列された複数の検出器の一端側から他端側へ連続的に変化させてもよい。
【００１４】
前記光学素子には、弾性変位可能に支持され、第１の方向及びこれとは逆方向の第２の方向へ変位可能な可動部と、該可動部へ前記第１の方向の物理的作用力を加える第１の駆動源と、前記可動部へ前記第２の方向の物理的作用力を加える第２の駆動源とを含む電気機器素子を用いることができる。
【００１５】
前記励起光は、点光源とすることができる。この場合、前記蛍光検出器手段は、前記測定対象物の前記励起光が照射された箇所から発せられる蛍光を、前記検出器群の複数の検出器で検出することができる。
【００１６】
上記に代えて、前記励起光にライン光源を用いてもよ。その場合、前記蛍光検出手段は、前記測定対象物の前記励起光が照射された１行×ｍ列（ｍは２以上の整数）の領域に対応した複数の検出器群を含み、前記測定対象物の前記励起光が照射された１行のｍ列の領域から発せられる蛍光のそれぞれを、前記複数の検出器群のうちの対応する検出器群で検出することができる。
【００１７】
更に上記に代えて、前記励起光に面光源を用いてもよい。その場合、前記蛍光検出手段が、前記測定対象物の前記励起光が照射されたｎ行×ｍ列（ｎ、ｍはそれぞれ２以上の整数）の領域に対応して、それぞれが１行×ｍ列の領域に対応した複数の検出器群をｎセット有し、前記光学素子は、前記測定対象領域の励起光が照射された各行のｍ列の領域から発せられた蛍光を、前記蛍光検出手段の対応するセットの複数の検出器群に向けて出射し、前記蛍光検出手段は、前記測定対象物の前記励起光が照射された各行のｍ列の領域から発せられる蛍光のそれぞれを、前記対応するセットの複数の検出器群のうちの対応する検出器群で検出すればよい。
【００１８】
前記蛍光検出手段は、ゲート機能を有するイメージインテンシファイアと電荷撮像素子とを含んでいてよい。
【００１９】
本発明の時間分解蛍光測定装置は、前記励起光を前記測定対象物の表面上で走査する走査手段と、前記走査された励起光の各位置に対応する前記蛍光の発光強度、及び前記算出された蛍光寿命の少なくとも一方の分布を表す蛍光画像を生成する蛍光画像生成手段とを更に備える構成とすることができる。
【００２０】
前記走査手段は、前記測定対象物の表面上に加えて、前記測定対象物上の前記励起光の集光位置を深さ方向にも走査し、前記蛍光画像生成手段は、前記蛍光画像を３次元情報として生成することができる。
【００２１】
本発明は、本発明の時間分解蛍光測定装置を備えたことを特徴とする顕微鏡システムを提供する。
【００２２】
また本発明は、本発明の時間分解蛍光測定装置を備えたことを特徴とする内視鏡ファイバプローブシステムを提供する。
【００２３】
本発明は、更に、所定の波長を有する光を励起光として測定対象物に照射するステップと、前記励起光が前記測定対象物に照射された後、前記測定対象物から発せられる蛍光が、時間経過と共に所定の方向に沿って一列に配列された複数の検出器のうちの異なる検出器で検出されるように、前記蛍光の進行方向を変化させるステップと、前記複数の検出器における蛍光の検出結果に基づいて、蛍光寿命を算出するステップとを有することを特徴とする時間分解蛍光測定方法を提供する。
【発明の効果】
【００２４】
本発明の時間分解蛍光測定装置及び方法では、測定対象物から発せられた蛍光の検出に際して、蛍光が時間経過と共に所定の方向に沿って一列に配列された複数の検出器のうちの異なる検出器で検出されるように、蛍光の進行方向を変化させる。このようにすることで、例えば測定期間にわたって蛍光を順次に異なる検出器で検出することができ、励起光に対する蛍光の検出効率を高めることができきる。
【図面の簡単な説明】
【００２５】
【図１】本発明の一実施形態の時間分解蛍光測定装置を示すブロック図。
【図２】蛍光寿命測定の動作手順を示すフローチャート。
【図３】（ａ）及び（ｂ）は、ＭＥＭＳミラーとＣＣＤとを模式的に示す図。
【図４】ＤＭＤの基本構造を示す斜視図。
【図５】（ａ）及び（ｂ）は、ＤＭＤの基本動作原理を示す断面図。
【図６】駆動信号を供給したときの時間と回転角との関係を示すグラフ。
【図７】ライン光源の励起光が照射された場合の光学素子と蛍光検出手段とを模式的に示す斜視図。
【図８】面光源の励起光が照射された場合の光学素子と蛍光検出手段とを模式的に示す斜視図。
【図９】顕微鏡システムを示すブロック図。
【図１０】内視鏡プローブシステムを示すブロック図。
【図１１】内視鏡プローブの断面を示す斜視図。
【発明を実施するための形態】
【００２６】
以下、図面を参照し、本発明の実施の形態を詳細に説明する。図１は、本発明の一実施形態の時間分解蛍光測定装置を示す。時間分解蛍光測定装置１０は、レーザ光源１１、パルスピッカー１２、ミラー１３、２１、ビームスプリッター１４、励起光検出手段１５、非線形光学結晶１６、ダイクロイックミラー１７、対物レンズ１８、励起光除去フィルター１９、分光器２０、集光レンズ２２、光学素子２３、蛍光検出手段２４、光学素子制御手段２５、及びコンピュータ（ＰＣ：Personal Computer）２６を備える。
【００２７】
時間分解蛍光測定装置１０は、時間ゲート法を用いて蛍光寿命を求める。すなわち、蛍光発光の減衰曲線を数分割のウィンドウ（時間領域）に分割し、励起光としてパルス光を試料に照射した後、複数のウィンドウにおいて蛍光発光強度を検出し、各ウィンドウ内の蛍光発光強度の値（積分値）を時間に対してプロットし、積分発光強度が指数関数的に減衰すると仮定して蛍光寿命を求める。なお、測定対象の光は、測定対象物から発せられた蛍光のみに限定されるわけではなく、それと類似した特徴を持つ光、例えばりん光でもよい。つまり、時間分解蛍光測定装置１０を用いてりん光の寿命を求めてもよい。
【００２８】
レーザ光源１１は、試料である測定対象物３０に照射される所定波長の励起光を生成する。レーザ光源１１には、例えばＴｉＳａレーザなどを用いることができる。レーザ光源１１は、パルス的なレーザ光を生成する。レーザ光源１１は、例えばピコ秒からフェムト秒のパルス時間であるパルス光をパルス励起光として生成する。パルスピッカー１２は、例えばレーザ光源１１が周期的に生成するパルス励起光を所定の割合で間引く。パルスピッカー１２がパルス励起光を間引くことで、測定対象物３０に所望の周期でパルス励起光を照射できる。レーザ光源１１がパルス励起光を生成する周期が所望の周期となっている場合、パルスピッカー１２は省いてもよい。
【００２９】
ビームスプリッター１４は、パルス励起光の一部を反射し、残りを透過する。励起光検出手段１５は、ビームスプリッター１４で反射した光を検出する。励起光検出手段１５にはフォトダイオードなどを用いることができる。非線形光学結晶１６は、ビームスプリッター１４を透過した光を入射し、入射光の波長の第２高調波又は第３高調波を発生する。ダイクロイックミラー１７は、励起光の波長帯域の光を透過し、測定対象物３０から発せられた蛍光の波長帯域の光を反射する。
【００３０】
対物レンズ１８は、ダイクロイックミラー１７を透過した励起光を、測定対象物３０上の所望の箇所に集光する。また、対物レンズ１８は、測定対象物３０の励起光が照射された箇所で発生した蛍光を、励起光とは逆向きに入射し、平行光化して出射する。励起光除去フィルター１９及び分光器２０は、入射光から、励起光の波長帯域の光を除去する。集光レンズ２３は、入射光を光学素子２３上に集光する。
【００３１】
蛍光検出手段２４は、測定対象物３０から発せられる蛍光を検出する。蛍光検出手段２４は、複数の検出器が所定の方向に沿って一列に配列された検出器群を有する。光学素子２３は、励起光が測定対象物３０に照射された後、時間経過と共に蛍光が検出器群の複数の検出器のうちの異なる検出器で検出されるように、蛍光の進行方向を変化させる。光学素子制御手段２５は、光学素子２３を駆動制御する。ＰＣ２６は、蛍光検出手段２４の駆動、及び光学素子制御手段２５に対する制御指示などを行う。また、ＰＣ２６は、蛍光検出手段２４の検出器群での蛍光の検出結果に基づいて、蛍光寿命を算出する。
【００３２】
励起光照射から蛍光寿命算出までの一連の動作について説明する。レーザ光源１１から出射したパルス励起光は、ミラー１３で反射して進行方向を変え、ビームスプリッター１４に入射して一部が反射し、残りがビームスプリッター１４を透過する。ビームスプリッター１４を透過した光は、測定対象物３０に照射される励起光となる。一方、ビームスプリッター１４で反射した光は、励起光が照射された旨を検出するために使用される。励起光検出手段１５は、ビームスプリッター１４で反射した光を検出し、励起光が検出された旨を表す信号をＰＣ２６に伝達する。ＰＣ２６は、励起光が検出された旨を表す信号を受け取ると、蛍光検出手段２４における蛍光の検出を開始させる。
【００３３】
ビームスプリッター１４を透過した励起光は、非線形光学結晶１６に入射する。非線形光学結晶１６は、入射光の波長の第２高調波又は第３高調波を発生する。非線形光学結晶１６を出射した励起光は、ダイクロイックミラー１７に入射する。ダイクロイックミラー１７は、励起光の波長（波長帯域）の光を対物レンズ１８側に透過する。ダイクロイックミラー１７を透過した励起光は、対物レンズ１８により、測定対象物３０の所望の箇所に集光される。なお、レーザ光源１１から対物レンズ１８に至る光路に配置された各部は、励起光を測定対象物３０に照射する励起光照射手段に相当する。
【００３４】
測定対象物３０の励起光が照射された箇所では、蛍光が発生する。測定対象物３０から発せされた蛍光は、対物レンズ１８を励起光とは逆向きに通り、平行光としてダイクロイックミラー１７に入射する。ダイクロイックミラー１７は入射した蛍光を反射し、その反射光は、励起光除去フィルター１９及び分光器２０に入射して、必要な波長のみが取りだされる。分光器２０に代えて、ローパスフィルターやバンドパスフィルターを用いてもよい。必要な波長成分が取り出された蛍光は、ミラー２１で反射して方向を変え、集光レンズ２２により、光学素子２３上に集光される。集光レンズ２２を用いずに、蛍光を、平行光として光学素子２３に照射してもよい。
【００３５】
光学素子２３は、例えば微小ミラーとして構成される。微小ミラーには、半導体プロセスにて作成されたＭＥＮＳ（Micro Electro Mechanical Systems）ミラーを好適に用いることができる。光学素子２３には、例えば、弾性変位可能に支持され、所定の方向及びそれとは逆方向へ変位可能な可動部と、可動部へ所定方向の物理的作用力を加える第１の駆動源と、所定方向とは逆方向の物理的作用力を加える第２の駆動源とを含む電気機器素子を用いることができる。可動部の上面には反射ミラーが形成される。可動部を駆動する物理的作用力には、静電気力又は電磁力を用いることができる。光学素子制御手段２５は、光学素子２３における可動部（反射ミラー）の駆動を制御する。
【００３６】
光学素子２３を反射した蛍光は、蛍光を検出する蛍光検出手段２４に入射する。蛍光検出手段２４は、複数の検出器が所定の方向に沿って一列に配列された検出器群を含んでいる。蛍光検出手段２４には、電荷撮像素子（ＣＣＤイメージセンサ：Charge Coupled Device Image Sensor）を用いることができる。この場合、ＣＣＤを構成する各画素が、各検出器に対応する。蛍光検出手段２４は、ＣＣＤに加えて、ゲート機能付きのイメージインテンシファイアを有していてもよい。蛍光検出手段２４は、測定対象物３０から発せられた蛍光を、１つ又は複数の波長の蛍光として検出してもよい。蛍光検出手段２４の前段にマイクロレンズ又はマイクロレンズアレイを設け、各検出器に、測定対象物３０から発せられた蛍光を平行光又は収束光として入射してもよい。
【００３７】
ＰＣ２６は、励起光検出手段１５から励起光を検出した旨の信号を受け取ると、光学素子制御手段２５を介して、光学素子２３の反射ミラーを回転変位させる。光学素子２３は、反射ミラーが回転変位することで、反射ミラー面で反射して蛍光検出手段２４へ向かう蛍光の進行方向（反射方向）を変化させる。光学素子２３は、時間経過と共に、測定対象物３０から発せられた蛍光が、蛍光検出手段２４の検出器群を構成する複数の検出器のうちの異なる検出器で検出されるように、蛍光の進行方向を変化させる。言い換えれば、蛍光検出手段２４は、検出器群において、時間が進むに連れて順次に異なる検出器で蛍光を検出する。光学素子２３は、例えば、蛍光の測定期間にわたって、一列に配列された複数の検出器の一端側から他端側へ、蛍光の進行方向を連続的に変化させる。
【００３８】
蛍光検出手段２４の各検出器は、検出した蛍光の発光強度に応じた電気信号を出力する。蛍光検出手段２４では、光学素子２３が回転変位することで測定対象物３０から発せされた蛍光が順次に異なる検出器で検出されるため、各検出器で検出される蛍光の発光強度は、蛍光が１つの検出器を横切る時間幅における蛍光発光強度の積分値を表す。ＰＣ２６は、蛍光寿命算出手段としても機能し、蛍光検出手段２４の検出器群で検出された蛍光の検出結果に基づいて、蛍光寿命を算出する。より詳細には、ＰＣ２６は、検出器群を構成する複数の検出器での蛍光の検出結果に基づいて、複数の時間領域のそれぞれにおける蛍光発光強度の積分値を求め、それらに基づいて蛍光減衰曲線と蛍光寿命とを求める。
【００３９】
図２は、蛍光寿命測定の動作手順を示す。レーザ光源１１は、パルス励起光を出射する（ステップＳ１）。このパルス励起光は、必要に応じてパルスピッカー１２で間引かれた後、ミラー１３で反射してビームスプリッター１４に入射する。ビームスプリッター１４はパルス励起光の一部を反射し、残りを測定対象物３０方向に透過する。ビームスプリッター１４を透過した励起光は、非線形光学結晶１６及びダイクロイックミラー１７を通り、対物レンズ１８により測定対象物３０の所望の箇所に集光される。このとき測定対象物３０に照射される励起光は点光源であるとする。
【００４０】
測定対象物３０の励起光が照射された箇所では蛍光が発生する（ステップＳ２）。この蛍光は、対物レンズ１８を逆向きに通り、ダイクロイックミラー１７で反射し、励起光除去フィルター１９及び分光器２０を通って励起光の成分が除去される。測定対象物３０から発せられた蛍光は、不所望な成分が除去された後、ミラー２１で反射して向きを変え、集光レンズ２２により光学素子２３の反射ミラー面上に集光される。
【００４１】
一方、ビームスプリッター１４で反射した励起パルス光の一部は励起光検出手段１５に入射し、励起光検出手段１５は、励起光が照射された旨を検出する（ステップＳ３）。励起光検出手段１５は、ＰＣ２６に励起光照射を検出した旨を通知し、ＰＣ２６は、光学素子制御手段２５に対して、光学素子２３における反射ミラーの回転変位を指示する。光学素子制御手段２５は、光学素子２３の可動部に対して信号を与え、可動部を回転変位させる。可動部が回転変位することで、光学素子２３は、測定対象物３０から発せられる蛍光の反射方向を、時間経過と共に変化させる（ステップＳ４）。蛍光の進行方向が時間経過と共に変化することで、測定対象物３０から発せられた蛍光は、時間軸に対して１次元アレイ状に配列された複数の検出器上を移動していき、各検出器は、相互に異なる時間領域の蛍光を検出する。
【００４２】
ＰＣ２６は、蛍光検出手段２４における蛍光の検出結果を演算処理し、蛍光減衰曲線と蛍光寿命の値とを計算する（ステップＳ５）。ＰＣ２６は、ステップＳ５において、検出器群を構成する複数の検出器での蛍光の検出結果に基づいて、複数の時間領域のそれぞれにおける蛍光発光強度の積分値を求める。その際、ＰＣ２６は、例えば複数の検出器のうちの、求めるべき蛍光発光強度の時間領域に対応した１以上の検出器での蛍光の検出結果に基づいて、各時間領域における蛍光発光強度を求めることができる。ＰＣ２６は、各ウィンドウ内の積分発光強度を時間軸に対してプロットし、積分発光強度が指数関数的に減衰すると仮定して蛍光寿命を求める。
【００４３】
ＰＣ２６は、例えば検出器群を構成する検出器の数が１００個で、蛍光減衰特性を求める際に使用するウィンドウ（時間領域）の数が５つであるとき、計１００個の検出器を隣接する２０個の検出器ずつグループ化し、各グループ２０個の検出器で検出された蛍光発光強度の和を、各ウィンドウにおける蛍光発光強度の積分値としてもよい。検出器群を構成する検出器の数が多いほど、蛍光減衰特性を求める際のウィンドウ分割数を増やすことができる。ウィンドウ分割数を増やすことで、多成分解析も可能となる。
【００４４】
続いて、光学素子２３として用いるＭＥＮＳミラーとその周辺について説明する。図３（ａ）及び（ｂ）は、光学素子であるＭＥＭＳミラー５１と、蛍光検出手段であるＣＣＤ５２とを模式的に示す。静電駆動のＭＥＭＳミラー５１は、ミラー裏に備えられた可動電極と、その下部に位置する固定電極との間に働く静電力に応じて回転変位する。図３（ａ）は、静電力が供給されない状態を示しており、このとき可動ミラーはフラットな状態であるとする。可動ミラーを励起光と同期して駆動すると、図３（ｂ）に示すように、可動ミラーが初期状態に対して所定方向に傾く。
【００４５】
ＣＣＤ５２では、ＭＥＭＳミラーを中心とする円弧に沿って、画素（検出器）が一列に配列されている。蛍光の測定期間にわたって、可動ミラーを回転変位させることで、測定対象物３０から発せられた蛍光は、時間軸に対応して画素が１次元的に配列されたＣＣＤ５２の別々の画素で検出されることになる。なお、可動ミラーをフラットな状態から所定方向に傾けるのに代えて、初期状態で可動ミラーが所定方向とは逆の方向に傾いており、その状態から所定方向へ傾けることとしてもよい。
【００４６】
ＭＥＭＳミラー５１における可動ミラーの回転角を１０°とし、可動ミラーがフラットの状態から下部に接触するまでの時間を２μｓｅｃとする。つまり、可動ミラーは、２μｓｅｃの間に、回転角度を１０°だけ変化させるものとする。蛍光測定する時間軸を２００ｎｓｅｃとすると、２００ｎｓｅｃの間に可動ミラーが回転変位する角度は、１０°×（２００ｎｓｅｃ／２μｓｅｃ）＝１°となる。一次元アレイ状のＣＣＤ５２の画素数を２０００画素とし、１画素のサイズを１０μｍとすると、ＣＣＤ５２の蛍光検出面の長さは２０００×１０μｍ＝２０ｍｍとなる。ＭＥＭＳミラー５１とＣＣＤ５２との好適な距離ｒは、円弧の関係（２πｒ×（１／３６０）＝２０ｍｍ）から、およそ１．１ｍと求まる。言い換えれば、ＣＣＤ５２をＭＥＭＳミラー５１からおよそ１．１ｍ離れた位置に配置することで、測定期間２００ｎｓｅｃの間に回転角１°で進行方向が変化する蛍光を２０ｍｍのＣＣＤで検出できる。
【００４７】
ＣＣＤ５２の１０画素を時間ゲート法の１ウィドウに対応させると、ウィンドウ数は、２０００画素／１０画素＝２００ウィンドウとなる。１ウィンドウ時間幅は、トータルの測定時間幅が２００ｎｓｅｃであるので、２００ｎｓｅｃ／２００ウィンドウ＝１ｎｓｅｃとなる。つまり、時間ゲート法の時間分解能は、１ｎｓｅｃとなる。ＣＣＤの１００画素を時間ゲート法の１ウィンドウに対応させた場合は、時間分解能は１０ｎｓｅｃで、ウィンドウ数は２０となる。ＣＣＤ５２の何画素を時間ゲート法の１ウィンドウに対応させるかに応じて、ウィンドウの数及び時間分解能を任意に設定することが可能である。なお、ＣＣＤにおいて画素が可動ミラーを中心とする円弧に沿って配列されていない場合、例えばＣＣＤが平面の場合は、ＭＥＳミラー表面からの距離差に応じて検出画素を補正すればよい。
【００４８】
次いで、ＭＥＭＳミラーの構成について説明する。ＭＥＭＳミラーは、半導体プロセス等を用いて作製された微小サイズのミラーの総称として用いている。本実施形態において、ＭＥＭＳミラーとして好適に用いることができるＤＭＤ素子（Digital Micro-mirror Device）について説明する。ＤＭＤは、米国ＴＩ社（Texas Instrument）が１９８７年に発明し、１９９６年に量産化した２次元光変調用のミラーアレイデバイスである。以下に、ＤＭＤの基本的な構造と動作原理とを説明する。
【００４９】
図４は、ＤＭＤの基本構造を示す。ＤＭＤ６０は、Ｓｉ基板６１に形成されたＣＭＯＳ（Complementary Metal Oxide Semiconductor）の駆動回路上に、１辺が１０μｍ〜１３μｍのミラー６２が２次元に配列された構造である。２次元配列されたミラーのうちの１つを、測定対象物３０（図１）の一点から発せられた蛍光の進行方向を変化させる微小ミラーとして用いる。ミラー６２は、薄膜サーフェースＭＥＭＳ技術により形成された回転自在な構造であり、静電駆動により±１０ｄｅｇ〜１２ｄｅｇの傾斜変位が可能である。
【００５０】
Ｓｉ基板６１上には、１画素ごとにＣＭＯＳプロセスによる１ｂｉｔのＳＲＡＭ（Static Random Access Memory）回路が形成されている。このＳＲＡＭには、ミラー６２の変位の方向を定めるデータが書き込まれる。ＳＲＡＭ回路の上部には、第１電極と第２電極とが絶縁層を介して形成され、各々はＳＲＡＭ回路の出力に接続される。第１電極及び第２電極には、それぞれＳＲＡＭ回路に書き込まれたデータ及びその相補データに対応するアドレス電圧Ｖａ１及びＶａ２が供給される。
【００５１】
また、Ｓｉ基板６１上にはランディングパッドが形成されている。それらの上部に空隙を介して両端が支持されたヒンジ６３と称される梁が形成される。ヒンジ６３上にはヨーク６４と称される剛性のある膜が形成され、ヨーク６４の上に支柱を介して剛性のあるミラー６２が形成されている。ミラー６２は、ヒンジ６３により、ヨーク６４と一体に弾性捩れ可能となっている。第１電極、第２電極、ヨーク６４、及びミラー６２は、ヒンジ軸に対して対称に配置され、従って、ヨーク６４及びミラー６２は、ヒンジ軸のねじれ弾性により左右の回転（傾斜）が可能となる。
【００５２】
ミラー６２及びヨーク６４が傾斜すると、ヨーク６４の端部がランディングパッドに接触し、ミラー６２及びヨーク６４はそれ以上傾斜しない。ランディングパッドは、ストッパとして機能する。ヒンジ６３、ヨーク６４、ミラー６２、及びランディングパッドは、Ａｌ又はＡｌ合金で形成され、電気的に同電位である。ヒンジ６３、ヨーク６４、ミラー６２、及びランディングパッドには、バイアス電圧Ｖｂが供給される。
【００５３】
図５（ａ）及び（ｂ）は、ＤＭＤの基本動作原理を示す。可動部６７を構成するヨーク６４／ミラー６２には、バイアス電圧Ｖｂが供給される。一方、駆動信号、すなわち可動部６７（ミラー６２）の回転方向に応じたデータがＳＲＡＭ回路に書込まれると、第１電極６５及び第２電極６６には、アドレス電圧Ｖａ１、Ｖａ２が供給される。アドレス電圧Ｖａ１とＶａ２は、デジタル電圧で互いに相補的である。ここで、ΔＶ１＝｜Ｖｂ−Ｖａ１｜とし、ΔＶ２＝｜Ｖｂ−Ｖａ２｜とすると、ΔＶ１、ΔＶ２の値に従って、画素電極（第１電極６５及び第２電極６６）と、対向する可動部６７との間に静電気力（回転に対しては静電トルク）が発生する。ΔＶ１＞ΔＶ２のとき、可動部６７は、図５（ａ）に示すように第１電極６５に向かって傾斜する。逆に、ΔＶ１＜ΔＶ２のときは、可動部６７は、図５（ｂ）に示すように第２電極６６に向って傾斜する。
【００５４】
実際のＤＭＤは、電源ＯＮの状態で可動部６７がどちらか一方に傾き、ΔＶ１とΔＶ２との関係に応じて、可動部６７が初期状態とは反対側に傾くか、或いは初期状態と同じ側に傾く。反対側に傾く動作をＣＲＯＳＳ動作といい、同じ側に傾く動作をＳＴＡＹ動作と呼ぶ。図６は、駆動信号を供給したときの時間と回転角との関係を示す。図６において、ＣＲＯＳＳ動作における時間と回転角との関係を実線で示し、ＳＴＡＹ動作における時間と回転角との関係を点線で示す。ΔＶ１又はΔＶ２による静電トルクがヒンジ弾性トルクに比べて十分に大きい場合（ｐｕｌｌ−ｉｎトルク以上）、可動部６７はランディングパッドに接触して停止し、回転角度が決定される。
【００５５】
本実施形態では、測定対象物３０から発せされた蛍光が蛍光検出手段２４に入射するまでの間の光路中に光学素子２３を配置し、光学素子２３を用いて、時間経過と共に蛍光検出手段２４に向かう蛍光の進行方向を変化させる。蛍光検出手段２４は、測定対象物３０から発せられた蛍光を、時間経過と共に検出器群を構成する複数の検出器のうちの異なる検出器で順次に検出する。本実施形態では、複数の検出器が時間軸に対して一次元的に配置された検出器群において、測定期間にわたって、蛍光が順次に異なる検出器で検出される。このため、蛍光検出手段２４において、無駄なく測定対象物３０から発せられた蛍光を検出でき、励起光に対する蛍光の検出効率を高めることができきる。
【００５６】
また、通常の時間ゲート法において、例えば３つのウィンドウで積分蛍光発光強度を求めるためには、励起光パルスを最低でも３回照射する必要があった。特許文献１に記載の技術では、励起光パルスの照射回数を半分に減らすことはできるものの、それでも最低限２つの励起光パルスの照射が必要となっていた。本実施形態では、検出器群が３以上の検出器を有するとき、最低限１回の励起光パルス照射で、３以上のウィンドウにおいて積分蛍光発光強度を求めることができ、複数回の励起光パルス照射が必要であった従来技術に比して、測定時間を短縮することができる。本実施形態では、最低１つの励起光パルスで測定を完了できるため、細胞などの時々刻々と変化する試料の同一時刻での蛍光寿命測定が可能である。また、１パルス又は少ないパルス数で測定が可能であるため、光退色の影響を抑えることができる。
【００５７】
本実施形態では、最大で、蛍光検出手段２４において検出器群を構成する検出器の数の分のウィンドウで、積分蛍光発光強度を求めることができる。その場合、１つの検出器での蛍光検出結果が、１つのウィンドウでの積分蛍光発光強度に対応する。いくつかの検出器をまとめて１ウィンドウに対応させ、隣接する１以上の検出器での蛍光検出結果を合算してもよい。検出器群を構成する検出器の数が多いほど、時間ゲート法におけるウィンドウの数を増やすことができ、蛍光減衰曲線をフィッティングする点の数を増やして、解析の精度を向上することができる。また、蛍光減衰曲線のフィッティング数を増やすことで、多成分の解析も可能となる。
【００５８】
時間分解蛍光測定装置１０は、図１に示す構成に加えて、測定対象物３０上で励起光の照射位置を走査する走査手段を有していてもよい。走査手段は、測定対象物３０の表面上で、例えば点光源である励起光の照射位置を互いに直交するｘ方向とｙ方向との２方向に走査する。走査手段には、例えばガルバノミラー、ポリゴンミラー、レゾナントミラー、ピエゾステージなどを用いることができる。ＰＣ２６（蛍光寿命算出手段）は、走査された各位置において、蛍光発光強度（減衰特性）と蛍光寿命とを求める。
【００５９】
ＰＣ２６は、蛍光寿命算出手段としての機能に加えて、走査された励起光の各位置に対応する蛍光の発光強度の分布を表す蛍光画像を生成する蛍光画像生成手段として機能してもよい。ＰＣ２６は、蛍光発光強度に代えて、走査された各位置に対応して算出された蛍光寿命の分布を表す画像を蛍光画像として生成してもよい。または、ＰＣ２６は、発光強度と蛍光寿命の双方の分布を表す画像を蛍光画像として生成してもよい。ＰＣ２６は、生成した蛍光画像を、例えばディスプレイなどの表示装置に表示する。
【００６０】
上記の走査手段は、測定対象物３０の表面だけでなく、測定対象物３０に対する励起光の集光位置を深さ方向に走査してもよい。深さ方向の走査には、ピエゾステージ又は集光レンズ（対物レンズ１８）を用いることができる。蛍光寿命測定手段は、測定対象物の表面上の各位置だけではなく、深さ方向に走査された各位置についても、蛍光発光強度（減衰特性）と蛍光寿命とを求めればよい。また、蛍光画像生成手段は、測定対象物３０の表面上の２方向に深さ方向を加えて、蛍光画像を３次元情報として生成すればよい。
【００６１】
上記実施形態の説明では、光学素子２３に静電駆動のＭＥＭＳ素子を用いる例を説明したが、光学素子２３に、駆動力が電磁力のＭＥＭＳ素子、例えば電磁スキャナを用いることも可能である。電磁駆動は、スキャナ素子で一般に用いられている。電磁駆動の場合、可動部に電流を流すと、電流の向きと永久磁石の磁力の方向とによりローレンツ力が発生し、可動部を駆動させる。電流の流れる向きを交互にすることで、可動部を回転振動させることができる。
【００６２】
上記実施形態の説明では、励起光として点光源を想定しており、測定対象物３０の一点（１つの微小領域）に励起光を照射し、その微小領域から発せられた蛍光を、光学素子２３を介して蛍光検出手段２４で検出するものとして説明した。これに代えて、ライン光源を用い、一度に測定対象物３０の複数の箇所に励起光を照射することも可能である。その場合も、測定対象物３０の励起光が照射された各微小領域（１ライン上の各地点）から発せられた蛍光が蛍光検出手段２４で検出される仕組みは、上記実施形態で説明したものと同様である。
【００６３】
ライン光源を用いる場合、光学素子２３は、測定対象物３０の１ラインの励起光が照射された箇所から発せられた蛍光を、時間経過と共に蛍光の進行方向を変化させつつ、蛍光検出手段２４に向けて出射すればよい。また、蛍光検出手段２４は、励起光が照射される１ラインの各地点に対応した数の検出器群を有していればよい。例えば蛍光検出手段２４は、測定対象物３０の励起光（ライン光）が照射された１行×ｍ列の微小領域に対応して、ｍ個の検出器群を有していればよい。各検出器群では、複数の検出器が一列に配列されており、その検出器群を複数並べて配置するため、複数の検出器は、蛍光検出手段２４において２次元配列で配列されることになる。
【００６４】
図７は、ライン光源の励起光が照射された場合の光学素子２３と蛍光検出手段２４とを示す。光学素子２３は、例えばＭＥＭＳミラーアレイ５３として構成される。ＭＥＭＳミラーアレイ５３にＤＭＤ６０（図４）を用いた場合、ＤＭＤ６０は、例えば２次元配列されたミラーの１行（１行を構成する各画素）を用いて、測定対象物３０のライン光が照射された部分（１行×ｍ列の微小領域）から発せられた蛍光を反射すればよい。ＤＭＤの１行を構成する各画素には、同じ駆動信号（ＳＲＡＭに記憶させるデータ）を、同じタイミングで供給すればよい。画素ごとに独立に駆動が可能なＭＥＭＳミラーアレイ５３に代えて、励起光の１ラインに対応した長さ、例えば図７における画素５つ分の長さを有する１枚のＭＥＭＳミラーを用いてもよい。
【００６５】
蛍光検出手段２４は、例えば画素が２次元配列されたＣＣＤアレイ５４として構成される。ＣＣＤアレイ５４の２次元配列された画素のうち、ＭＥＭＳミラーアレイ５３におけるミラーの回転変位の方向に対応した方向に沿って配列された複数の画素が、測定対象物３０の一点（１つの微小領域）に対応した検出器群を構成する。ＣＣＤアレイ５４では、この検出器群が、ＭＥＭＳミラーアレイ５３の画素の配列方向に対応した方向に並べられている。ＣＣＤアレイ５４は、測定対象物３０の励起光が照射された１行×ｍ列の微小領域から発せられる蛍光のそれぞれを、ｍ個の検出器群のうちの対応する検出器群で検出する。
【００６６】
測定対象物３０に対し、励起光をライン光として照射するとで、測定対象物の１ラインを一括で励起することができ、１ラインから発せられた蛍光をＭＥＭＳミラーアレイ５３に一度に入射することができる。ＭＥＭＳミラーアレイ５３は、１ラインから発せられた蛍光を、時間経過と共に蛍光の進行方向を変化させつつ、ＣＣＤアレイ５４に向けて出射（反射）する。蛍光検出手段２４として２次元アレイ状のＣＣＤアレイ５４を用いれば、１ラインからの蛍光を時間分解して検出することが可能となる。ライン光を用いる場合、ライン励起光を試料表面の１方向に走査することで、イメージングが可能となる。
【００６７】
測定対象物３０に照射する励起光は、面光源であってもよい。面光源を励起光として照射する場合、蛍光検出手段２４は、測定対象物３０の励起光が照射されるｎ行×ｍ列の微小領域に対応して、それぞれが１行×ｍ列の領域に対応した複数の検出器群をｎセット有していればよい。また、光学素子２３は、測定対象物３０の励起光が照射された各行のｍ列の微小領域から発せられた蛍光を、蛍光検出手段２４の対応するセットの複数の検出器群に向けて反射（出射）すればよい。蛍光検出手段２４は、測定対象物３０の励起光が照射された各行のｍ列の領域から発せられる蛍光のそれぞれを、対応するセットの複数の検出器群のうちの対応する検出器群で検出する。
【００６８】
図８は、面光源の励起光が照射された場合の光学素子２３と蛍光検出手段２４とを示す。光学素子２３は、例えばＭＥＭＳミラーが２次元配列されたＭＥＭＳミラーアレイ５５として構成される。ＭＥＭＳミラーアレイ５５にはＤＭＤ６０（図４）を用いることができる。蛍光検出手段２４は、例えば画素が２次元配列されたＣＣＤアレイ５６として構成される。ＣＣＤアレイ５６は、図７に示すＣＣＤアレイ５４が、ｎ個（ｎセット）連結されたものでよい。図７に示すＣＣＤアレイ５４は、測定対象物３０の励起光が照射された１行に対応した複数の検出器群を含んでおり、ＣＣＤアレイ５６は、その１行に対応した複数の検出器群をｎセット有している。
【００６９】
ＭＥＭＳミラーアレイ５５（ＤＭＤ）の１行を構成する各画素には、同じ駆動信号（ＳＲＡＭに記憶させるデータ）を、同じタイミングで供給すればよい。ＤＭＤの各行には、相互に異なるタイミングで駆動信号を供給する。各行に駆動信号を供給するタイミングは、測定対象物３０の励起光が照射された各行から発せられた蛍光が、ＣＣＤアレイ５６の対応するセットの複数の検出器群に向けて出射されるように調整しておく。ＣＣＤアレイ５６は、測定対象物３０の励起光が照射された各行のｍ列の微小領域から発せられる蛍光のそれぞれを、対応するセットの複数の検出器群のうちの対応する検出器群で検出する。面光源を用いて測定対象物３０を一括励起し、測定対象物３０の励起光が照射された領域から発せられた蛍光を蛍光検出手段２４で検出することで、励起光を測定対象物３０上を走査することなく、一括で蛍光画像が取得可能である。
【００７０】
例えば、図８において、ＣＣＤアレイ５６の第１セット（第１受光部）を構成する画素は測定対象物３０の第１行の領域に対応し、第２セット（第２受光部）を構成する画素は測定対象物３０の第２行の領域に対応し、第３セット（第３受光部）を構成する画素は測定対象物３０の第３行の領域に対応する。第１受光部は、第１行の５つの微小領域に対応した５つの検出器群を有し、第２受光部は、第２行の５つの微小領域に対応した５つの検出器群を有し、第３受光部は、第３行の５つの微小領域に対応した５つの検出器群を有する。
【００７１】
ＭＥＭＳミラーアレイ５５の第１行から第３行に、互いにタイミングをずらして駆動信号が供給されることで、測定対象物３０の第１行の各領域から発せられた蛍光は第１受光部で検出され、測定対象物３０の第２行の各領域から発せられた蛍光は第２受光部で検出され、測定対象物３０の第３行の各領域から発せられた蛍光は第３受光部で検出される。各受光部では、測定対象物３０の対応する各行の５列の微小領域から発せられる蛍光のそれぞれを、各受光部を構成する５つの検出器群のうちの対応する検出器群で検出する。例えば第１行から第３行の第１列の微小領域から発せられた蛍光は、それぞれ、第１受光部の第１列の微小領域に対応した検出器群、第２受光部の第１列に対応した検出器群、及び第３受光部の第１列に対応した検出器群で検出される。
【００７２】
次いで、上記の時間分解蛍光計測装置を組み込んだ顕微鏡システムを説明する。図９は、顕微鏡システムを示す。顕微鏡システム１００の構成は、図１に示す時間分解蛍光測定装置１０を構成する手段のうちの一部が顕微鏡１０１に組み込まれている点を除けば、基本的に時間分解蛍光測定装置１０の構成と同様である。
【００７３】
レーザ光源１１から出射したパルス励起光は、必要に応じてパルスピッカー１２で所望の繰り返し周波数に間引かれ、ミラー１３を介してビームスプリッター１４に入射し、２つの光に分離される。分離された光のうちの一方は、ビームスプリッター１４で反射して励起光検出手段１５に向かう。分離された光の他方は非線形光学結晶１６に入射し、非線形光学結晶１６により入射波長の第２高調波又は第３高調波が発生する。
【００７４】
非線形光学結晶１６により第２高調波又は第３高調波が発生した励起光は、顕微鏡１０１に導入される。導入された励起光は、励起フィルター１０２を介してダイクロイックミラー１７に入射し、ダイクロイックミラー１７を透過して、対物レンズ１８により、測定対象物３０の所望の箇所に照射される。測定対象物３０から発せられた蛍光は、対物レンズ１８により平行光化され、ダイクロイックミラー１７を透過する。ダイクロイックミラー１７を透過した光は、励起光除去フィルター１９を通り、ミラー１０３で反射して、顕微鏡１０１の外部に出射する。
【００７５】
顕微鏡１０１から出射した光は、分光器２０で分光され、ミラー２１で反射し、集光レンズ２２を経て、収束光として光学素子２３に入射する。光学素子２３は、時間経過と共に、測定対象物３０から発せられた蛍光が、蛍光検出手段２４の検出器群を構成する複数の検出器のうちの異なる検出器で検出されるように、蛍光の進行方向を変化させる。蛍光検出手段２４は、検出器群において、時間が進むに連れて順次に異なる検出器で蛍光を検出する。ＰＣ２６は、蛍光検出手段２４の検出器群で検出された蛍光の検出結果に基づいて、蛍光寿命を算出する。
【００７６】
励起光に点光源を用いる場合、励起光を、ガルバノミラー、ポリゴンミラー、レゾナントミラー、ピエゾステージなどの走査手段を用いて測定対象物３０の表面上を２次元走査すれば、２次元的に蛍光減衰曲線を得ることができ、蛍光寿命の２次元画像情報を得ることができる。励起光にライン光源を用いる場合、励起光を１方向に走査することで、蛍光寿命の２次元画像情報を得ることができる。励起光に面光源を用いる場合、走査手段を用いなくても、蛍光寿命の２次元画像を得ることができる。表面上の２方向に加えて、測定対象物３０に励起光を集光する集光レンズ又はピエゾステージにより深さ方向（Ｚ軸方向）にも走査を行うことで、３次元画像情報を得ることができる。
【００７７】
引き続き、上記の時間分解蛍光計測装置を組み込んだ内視鏡プローブシステムを説明する。図１０は、内視鏡プローブシステムを示す。内視鏡プローブシステム２００の構成は、図１に示す時間分解蛍光測定装置１０を構成する手段のうちの一部が内視鏡プローブ装置２０１に組み込まれている点を除けば、基本的に時間分解蛍光測定装置１０の構成と同様である。
【００７８】
レーザ光源１１から出射したパルス励起光は、必要に応じてパルスピッカー１２で所望の繰り返し周波数に間引かれ、ミラー１３を介してビームスプリッター１４に入射し、２つの光に分離される。分離された光のうちの一方は、ビームスプリッター１４で反射して励起光検出手段１５に向かう。分離された光の他方は非線形光学結晶１６に入射し、非線形光学結晶１６により入射波長の第２高調波又は第３高調波が発生する。
【００７９】
非線形光学結晶１６により第２高調波又は第３高調波が発生した励起光は、内視鏡プローブ装置２０１に導入される。導入された励起光は、励起フィルター２０２を介してダイクロイックミラー１７に入射し、ダイクロイックミラー１７を透過する。ダイクロイックミラー１７を透過した励起光は、光ファイバ２０３を介して内視鏡プローブ２０４に導かれ、内視鏡プローブ２０４の先端から測定対象物３０の所望の箇所に照射される。測定対象物３０から発せられた蛍光は、内視鏡プローブ２０４を逆向きに通り、光ファイバ２０３を経てダイクロイックミラー１７に入射する。
【００８０】
図１１は、内視鏡プローブ２０４の断面を示す。内視鏡プローブ２０４は、内視鏡の鉗子口を通して、測定対象物３０である患部へと到達する。内視鏡プローブ２０４は、中央に形成された光ファイバ２０６と、周囲に形成された複数の光ファイバ２０７とを有する。中央に形成された光ファイバ２０６は、励起光を測定対象物３０（図１０）まで導光する入射用として機能する。周囲に形成された複数の光ファイバ２０７は、測定対象物３０から発せられた蛍光を受光し、光ファイバ２０３側へ導光するための受光用として機能する。
【００８１】
図１０に戻り、光ファイバ２０３側からダイクロイックミラー１７に入射した光は、励起光除去フィルター１９を通り、ミラー２０５で反射して、内視鏡プローブ装置２０１の外部に出射する。内視鏡プローブ装置２０１から出射した光は、分光器２０で分光され、ミラー２１で反射し、集光レンズ２２を経て、収束光として光学素子２３に入射する。光学素子２３は、時間経過と共に、測定対象物３０から発せられた蛍光が、蛍光検出手段２４の検出器群を構成する複数の検出器のうちの異なる検出器で検出されるように、蛍光の進行方向を変化させる。蛍光検出手段２４は、検出器群において、時間が進むに連れて順次に異なる検出器で蛍光を検出する。ＰＣ２６は、蛍光検出手段２４の検出器群で検出された蛍光の検出結果に基づいて、蛍光寿命を算出する。
【００８２】
励起光に点光源を用いる場合、励起光を、内視鏡先端に設けたＭＥＭＳスキャナミラーなどの走査手段を用いて測定対象物３０の表面上を２次元走査すれば、２次元的に蛍光減衰曲線を得ることができ、蛍光寿命の２次元画像情報を得ることができる。また、ファイバハンドルなどで、測定対象物３０からの信号を２次元的に受光することで、２次元的に蛍光減衰曲線を得てもよい。励起光にライン光源を用いる場合、励起光を１方向に走査することで、蛍光寿命の２次元画像情報を得ることができる。励起光に面光源を用いる場合、走査手段を用いなくても、蛍光寿命の２次元画像を得ることができる。表面上の２方向に加えて、測定対象物３０に励起光を集光する集光レンズなどにより深さ方向（Ｚ軸方向）にも走査を行うことで、３次元画像情報を得ることができる。
【００８３】
以下、実施例を説明する。ＤＭＳＯ（dimethyl sulfoxide）を溶媒とし、Pd meso-Tetra（4 carboxyphenyl) porphineを溶かして５．０×１０−４ｍｏｌ／Ｌの溶液を作った。この溶液を、１０ｍｍ角の密閉可能な石英セルに適量入れ、窒素バブリングにより溶存酸素を除去した後に石英セルに蓋をし、励起波長を４０５ｎｍ、蛍光波長を６９７ｎｍとして、時間分解蛍光測定装置１０（図１）を用いて蛍光寿命測定を行った。試料から発する光はりん光であり、その減衰曲線を５ｍｓｅｃ程度の時間範囲で測定した。
【００８４】
光学素子２３には、回転角が±１０°、駆動周波数が１００Ｈｚのスキャナ素子を用いた。また、蛍光検出手段２４には、画素数が２０００画素、１画素サイズが１０μｍの１次元アレイ状ＣＣＤを用いた。スキャナ素子が−１０°から＋１０°まで駆動する時間は５ｍｓｅｃであり、この時間は蛍光減衰曲線の測定時間とほぼ等しい。ＣＣＤの１００画素を時間ゲート法の１ウィンドウに対応させると、５ｍｓｅｃ×（１００画素／２０００画素）＝２５０μｓｅｃとなり、時間ゲート法の時間分解能は２５０μｓｅｃとなる。
【００８５】
上記の装置を用い、時間ゲート法によるPd meso-Tetra(4 carboxyphenyl) porphineのりん光寿命測定を行った。ＣＣＤの１００画素が１ウィンドウに対応するため、ウィンドウ数は２０となる。時間軸に対して２０点のプロットが得られ、この２０点をフィッティングすることで、Pd meso-Tetra(4 carboxyphenyl) porphineのりん光寿命はおよそ６９０μｓｅｃと求められた。
【００８６】
以上、本発明をその好適な実施形態に基づいて説明したが、本発明の時間分解蛍光測定装置及び方法は、上記実施形態にのみ限定されるものではなく、上記実施形態の構成から種々の修正及び変更を施したものも、本発明の範囲に含まれる。
【符号の説明】
【００８７】
１０：時間分解蛍光測定装置
１１：レーザ光源
１２：パルスピッカー
１３、２１：ミラー
１４：ビームスプリッター
１５：励起光検出手段
１６：非線形光学結晶
１７：ダイクロイックミラー
１８：対物レンズ
１９：励起光除去フィルター
２０：分光器
２２：集光レンズ
２３：光学素子
２４：蛍光検出手段
２５：光学素子制御手段
２６：コンピュータ（ＰＣ）
３０：測定対象物
５１：ＭＥＭＳミラー
５２：ＣＣＤ
５３、５５：ＭＥＭＳミラーアレイ
５４、５６：ＣＣＤアレイ
６０：ＤＭＤ
６１：基板
６２：ミラー
６３：ヒンジ
６４：ヨーク
６５：第１電極
６６：第２電極
６７：可動部
１００：顕微鏡システム
１０１：顕微鏡
１０２：励起フィルター
１０３：ミラー
２００：内視鏡プローブシステム
２０１：内視鏡プローブ装置
２０２：励起フィルター
２０３：光ファイバ
２０４：内視鏡プローブ
２０５：ミラー
２０６、２０７：光ファイバ
【技術分野】
【０００１】
本発明は、時間分解蛍光測定装置及び方法に関し、更に詳しくは、時間領域測定法、特に時間ゲート法を用いて蛍光を測定する時間分解蛍光測定装置及び方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
蛍光を発する物質に可視光や紫外光を照射すると、蛍光が発することが知られている。蛍光を発する物質にパルス幅が短い光を照射すると、その照射後、ピコ秒からナノ秒オーダーにわたって蛍光が観察される。一般的に、この蛍光の発光強度は光照射直後で最大となり、その後、指数関数的に減衰していく。この指数関数における減衰定数が、蛍光寿命と呼ばれる。蛍光寿命を顕微鏡下で観測し、２次元的にマッピングを行う手法をＦＬＩＭ（Fluorescence Lifetime Imaging Microscopy）と呼ぶ。
【０００３】
ここで、蛍光寿命の特徴は、時間という定量性に優れた指標を基準にできることである。蛍光の特性を、蛍光の発光強度で定量化することもできるが、蛍光の発光強度は、蛍光を発する物質の濃度、退色、励起光の波長、強度、集光効率、検出器の感度、観測試料中での光の減衰、光学系の透過率など様々な要因による影響を受ける。一方、蛍光寿命は、測定条件に依存して変化し得る蛍光の発光強度とは異なり、蛍光を発する物質に固有な値となることから、定量的な議論が可能となる。蛍光寿命は、その分子の構造や電子状態に関し重要な情報を与えるほか、周囲の環境（イオン濃度、ｐＨ、酸素濃度、屈折率、粘性、温度など）に関する情報も提供する。
【０００４】
蛍光寿命を観測する方法は、大きく分けて２つある。１つは、パルス状の光を励起光に用いる時間領域測定法（time-domain measurement）であり、もう１つは、正弦波状に強度変調した光を励起光に用いる周波数領域測定法（frequency-domain measurement）である。時間領域測定法では、短パルスレーザを試料に入射し、その時間応答を高速な検出器で観測する。時間領域測定法における代表的な観測方法として、時間相関単一光子計数法（time-correlated single photon counting：ＴＣＳＰＣ）や、イメージインテンシファイア付きＣＣＤを用いた時間ゲート法、ストリークカメラを用い、時空間変換によってスペクトルと時間波形を一度に観測する手法が挙げられる。これらの方法に、アレイタイプの高感度検出器やスキャナミラーを組み合わせることで、蛍光寿命のマッピング、つまりイメージングが可能となる。
【０００５】
時間ゲート法では、蛍光発光の減衰曲線を時間軸方向にいくつかのウィンドウに分割し、パルス光を試料に照射した後、測定すべきウィンドウ（時間領域）に応じた遅延時間で検出器を一瞬だけオンにする。複数のウィンドウで蛍光の検出を行い、各ウィンドウ内の積分発光強度の値を時間に対してプロットし、積分発光強度が単一指数関数的に減衰すると仮定して蛍光寿命を求める。時間ゲート法は、時間相関単一光子計数法に比べ、測定時間を短縮できる。しかし、例えば時間領域を４分割したと仮定した場合、４つのウィンドウのそれぞれにおいて積分発光強度を求めるためには、同一の測定箇所に対して最低でも４回測定を行うことが必要である。このため、例えば細胞などの時々刻々と変化するサンプルに対して、同一時刻での蛍光寿命測定は困難であった。また、何度もパルス光を照射することで蛍光物質の退色が生じ、また、測定箇所が細胞であれば細胞が損傷するなどの問題もあった。
【０００６】
上記問題点に対し、特許文献１には、１度の励起光で単一蛍光減衰曲線の２つのウィンドウにおける積分発光強度を測定する方法が開示されている。引用文献１に記載の時間分解イメージング装置は、分離光学系と、遅延光学系と、合成光学系とを有する。分離光学系は、測定対象で発生した蛍光を、第１の光と第２の光とに分離して出力する。第１の光は遅延光学系を介して合成光学系に出力され、第２の光はそのまま合成光学系に出力される。遅延光学系は、第１の光に対して、第２の光の光路長に比して長い光路長を設定する。合成光学系は、分離光学系が出力する第２の光、及び遅延光学系を通った第１の光それぞれが形成する測定対象の像を、結像面上の互いに重ならない領域に合成し、合成した像を撮像部に出力する。第１の光は遅延光学系で遅延が与えられた分だけ遅れるため、撮像部において第１の光と第２の光とを同時刻に撮像することで、２つの時間領域における積分発光強度を測定することができる。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】特開平９−４３１４６号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
ここで、時間ゲート法では、ウィンドウ幅に対応する時間だけ検出器がオンにされ、検出器がオンされたときに入射された蛍光は検出器で検出されるものの、それ以外の時間領域の蛍光は検出器で検出されることはない。このことは、励起光に対する蛍光の検出効率を下げる要因となっている。特許文献１においても、分離された第１の光及び第２の光は、それぞれウィンドウ幅の分しか撮像部において撮像されず、ウィンドウ外の時間領域における蛍光が撮像部で撮影されることはないため、励起光に対する蛍光の検出効率を向上させることはできない。
【０００９】
本発明は、上記に鑑み、測定対象物から発せられた蛍光の検出効率を向上できる時間分解蛍光測定装置及び方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
上記目的を達成するために、本発明は、所定の波長を有する光を励起光として測定対象物に照射する光照射手段と、前記測定対象物から発せられる蛍光を検出する蛍光検出手段であって、複数の検出器が所定の方向に沿って一列に配列された検出器群を有する蛍光検出手段と、前記蛍光が前記蛍光検出手段に入射するまでの間の光路中に配置され、前記励起光が前記測定対象物に照射された後、時間経過と共に前記蛍光が前記検出器群の複数の検出器のうちの異なる検出器で検出されるように、前記蛍光の進行方向を変化させる光学素子と、前記検出器群での蛍光の検出結果に基づいて、蛍光寿命を算出する蛍光寿命算出手段とを備えたことを特徴とする時間分解蛍光測定装置を提供する。
【００１１】
本発明の時間分解蛍光測定装置では、前記蛍光寿命算出手段が、前記複数の検出器での蛍光の検出結果に基づいて複数の時間領域のそれぞれにおける蛍光発光強度を求め、該求められた蛍光発光強度に基づいて前記蛍光寿命を算出する構成を採用できる。
【００１２】
前記蛍光寿命算出手段は、前記複数の検出器のうちの、求めるべき蛍光発光強度の時間領域に対応した１以上の検出器での蛍光の検出結果に基づいて、各時間領域における蛍光発光強度を求めてもよい。
【００１３】
前記光学素子は、前記蛍光の測定期間にわたって、前記蛍光の進行方向を、前記一列に配列された複数の検出器の一端側から他端側へ連続的に変化させてもよい。
【００１４】
前記光学素子には、弾性変位可能に支持され、第１の方向及びこれとは逆方向の第２の方向へ変位可能な可動部と、該可動部へ前記第１の方向の物理的作用力を加える第１の駆動源と、前記可動部へ前記第２の方向の物理的作用力を加える第２の駆動源とを含む電気機器素子を用いることができる。
【００１５】
前記励起光は、点光源とすることができる。この場合、前記蛍光検出器手段は、前記測定対象物の前記励起光が照射された箇所から発せられる蛍光を、前記検出器群の複数の検出器で検出することができる。
【００１６】
上記に代えて、前記励起光にライン光源を用いてもよ。その場合、前記蛍光検出手段は、前記測定対象物の前記励起光が照射された１行×ｍ列（ｍは２以上の整数）の領域に対応した複数の検出器群を含み、前記測定対象物の前記励起光が照射された１行のｍ列の領域から発せられる蛍光のそれぞれを、前記複数の検出器群のうちの対応する検出器群で検出することができる。
【００１７】
更に上記に代えて、前記励起光に面光源を用いてもよい。その場合、前記蛍光検出手段が、前記測定対象物の前記励起光が照射されたｎ行×ｍ列（ｎ、ｍはそれぞれ２以上の整数）の領域に対応して、それぞれが１行×ｍ列の領域に対応した複数の検出器群をｎセット有し、前記光学素子は、前記測定対象領域の励起光が照射された各行のｍ列の領域から発せられた蛍光を、前記蛍光検出手段の対応するセットの複数の検出器群に向けて出射し、前記蛍光検出手段は、前記測定対象物の前記励起光が照射された各行のｍ列の領域から発せられる蛍光のそれぞれを、前記対応するセットの複数の検出器群のうちの対応する検出器群で検出すればよい。
【００１８】
前記蛍光検出手段は、ゲート機能を有するイメージインテンシファイアと電荷撮像素子とを含んでいてよい。
【００１９】
本発明の時間分解蛍光測定装置は、前記励起光を前記測定対象物の表面上で走査する走査手段と、前記走査された励起光の各位置に対応する前記蛍光の発光強度、及び前記算出された蛍光寿命の少なくとも一方の分布を表す蛍光画像を生成する蛍光画像生成手段とを更に備える構成とすることができる。
【００２０】
前記走査手段は、前記測定対象物の表面上に加えて、前記測定対象物上の前記励起光の集光位置を深さ方向にも走査し、前記蛍光画像生成手段は、前記蛍光画像を３次元情報として生成することができる。
【００２１】
本発明は、本発明の時間分解蛍光測定装置を備えたことを特徴とする顕微鏡システムを提供する。
【００２２】
また本発明は、本発明の時間分解蛍光測定装置を備えたことを特徴とする内視鏡ファイバプローブシステムを提供する。
【００２３】
本発明は、更に、所定の波長を有する光を励起光として測定対象物に照射するステップと、前記励起光が前記測定対象物に照射された後、前記測定対象物から発せられる蛍光が、時間経過と共に所定の方向に沿って一列に配列された複数の検出器のうちの異なる検出器で検出されるように、前記蛍光の進行方向を変化させるステップと、前記複数の検出器における蛍光の検出結果に基づいて、蛍光寿命を算出するステップとを有することを特徴とする時間分解蛍光測定方法を提供する。
【発明の効果】
【００２４】
本発明の時間分解蛍光測定装置及び方法では、測定対象物から発せられた蛍光の検出に際して、蛍光が時間経過と共に所定の方向に沿って一列に配列された複数の検出器のうちの異なる検出器で検出されるように、蛍光の進行方向を変化させる。このようにすることで、例えば測定期間にわたって蛍光を順次に異なる検出器で検出することができ、励起光に対する蛍光の検出効率を高めることができきる。
【図面の簡単な説明】
【００２５】
【図１】本発明の一実施形態の時間分解蛍光測定装置を示すブロック図。
【図２】蛍光寿命測定の動作手順を示すフローチャート。
【図３】（ａ）及び（ｂ）は、ＭＥＭＳミラーとＣＣＤとを模式的に示す図。
【図４】ＤＭＤの基本構造を示す斜視図。
【図５】（ａ）及び（ｂ）は、ＤＭＤの基本動作原理を示す断面図。
【図６】駆動信号を供給したときの時間と回転角との関係を示すグラフ。
【図７】ライン光源の励起光が照射された場合の光学素子と蛍光検出手段とを模式的に示す斜視図。
【図８】面光源の励起光が照射された場合の光学素子と蛍光検出手段とを模式的に示す斜視図。
【図９】顕微鏡システムを示すブロック図。
【図１０】内視鏡プローブシステムを示すブロック図。
【図１１】内視鏡プローブの断面を示す斜視図。
【発明を実施するための形態】
【００２６】
以下、図面を参照し、本発明の実施の形態を詳細に説明する。図１は、本発明の一実施形態の時間分解蛍光測定装置を示す。時間分解蛍光測定装置１０は、レーザ光源１１、パルスピッカー１２、ミラー１３、２１、ビームスプリッター１４、励起光検出手段１５、非線形光学結晶１６、ダイクロイックミラー１７、対物レンズ１８、励起光除去フィルター１９、分光器２０、集光レンズ２２、光学素子２３、蛍光検出手段２４、光学素子制御手段２５、及びコンピュータ（ＰＣ：Personal Computer）２６を備える。
【００２７】
時間分解蛍光測定装置１０は、時間ゲート法を用いて蛍光寿命を求める。すなわち、蛍光発光の減衰曲線を数分割のウィンドウ（時間領域）に分割し、励起光としてパルス光を試料に照射した後、複数のウィンドウにおいて蛍光発光強度を検出し、各ウィンドウ内の蛍光発光強度の値（積分値）を時間に対してプロットし、積分発光強度が指数関数的に減衰すると仮定して蛍光寿命を求める。なお、測定対象の光は、測定対象物から発せられた蛍光のみに限定されるわけではなく、それと類似した特徴を持つ光、例えばりん光でもよい。つまり、時間分解蛍光測定装置１０を用いてりん光の寿命を求めてもよい。
【００２８】
レーザ光源１１は、試料である測定対象物３０に照射される所定波長の励起光を生成する。レーザ光源１１には、例えばＴｉＳａレーザなどを用いることができる。レーザ光源１１は、パルス的なレーザ光を生成する。レーザ光源１１は、例えばピコ秒からフェムト秒のパルス時間であるパルス光をパルス励起光として生成する。パルスピッカー１２は、例えばレーザ光源１１が周期的に生成するパルス励起光を所定の割合で間引く。パルスピッカー１２がパルス励起光を間引くことで、測定対象物３０に所望の周期でパルス励起光を照射できる。レーザ光源１１がパルス励起光を生成する周期が所望の周期となっている場合、パルスピッカー１２は省いてもよい。
【００２９】
ビームスプリッター１４は、パルス励起光の一部を反射し、残りを透過する。励起光検出手段１５は、ビームスプリッター１４で反射した光を検出する。励起光検出手段１５にはフォトダイオードなどを用いることができる。非線形光学結晶１６は、ビームスプリッター１４を透過した光を入射し、入射光の波長の第２高調波又は第３高調波を発生する。ダイクロイックミラー１７は、励起光の波長帯域の光を透過し、測定対象物３０から発せられた蛍光の波長帯域の光を反射する。
【００３０】
対物レンズ１８は、ダイクロイックミラー１７を透過した励起光を、測定対象物３０上の所望の箇所に集光する。また、対物レンズ１８は、測定対象物３０の励起光が照射された箇所で発生した蛍光を、励起光とは逆向きに入射し、平行光化して出射する。励起光除去フィルター１９及び分光器２０は、入射光から、励起光の波長帯域の光を除去する。集光レンズ２３は、入射光を光学素子２３上に集光する。
【００３１】
蛍光検出手段２４は、測定対象物３０から発せられる蛍光を検出する。蛍光検出手段２４は、複数の検出器が所定の方向に沿って一列に配列された検出器群を有する。光学素子２３は、励起光が測定対象物３０に照射された後、時間経過と共に蛍光が検出器群の複数の検出器のうちの異なる検出器で検出されるように、蛍光の進行方向を変化させる。光学素子制御手段２５は、光学素子２３を駆動制御する。ＰＣ２６は、蛍光検出手段２４の駆動、及び光学素子制御手段２５に対する制御指示などを行う。また、ＰＣ２６は、蛍光検出手段２４の検出器群での蛍光の検出結果に基づいて、蛍光寿命を算出する。
【００３２】
励起光照射から蛍光寿命算出までの一連の動作について説明する。レーザ光源１１から出射したパルス励起光は、ミラー１３で反射して進行方向を変え、ビームスプリッター１４に入射して一部が反射し、残りがビームスプリッター１４を透過する。ビームスプリッター１４を透過した光は、測定対象物３０に照射される励起光となる。一方、ビームスプリッター１４で反射した光は、励起光が照射された旨を検出するために使用される。励起光検出手段１５は、ビームスプリッター１４で反射した光を検出し、励起光が検出された旨を表す信号をＰＣ２６に伝達する。ＰＣ２６は、励起光が検出された旨を表す信号を受け取ると、蛍光検出手段２４における蛍光の検出を開始させる。
【００３３】
ビームスプリッター１４を透過した励起光は、非線形光学結晶１６に入射する。非線形光学結晶１６は、入射光の波長の第２高調波又は第３高調波を発生する。非線形光学結晶１６を出射した励起光は、ダイクロイックミラー１７に入射する。ダイクロイックミラー１７は、励起光の波長（波長帯域）の光を対物レンズ１８側に透過する。ダイクロイックミラー１７を透過した励起光は、対物レンズ１８により、測定対象物３０の所望の箇所に集光される。なお、レーザ光源１１から対物レンズ１８に至る光路に配置された各部は、励起光を測定対象物３０に照射する励起光照射手段に相当する。
【００３４】
測定対象物３０の励起光が照射された箇所では、蛍光が発生する。測定対象物３０から発せされた蛍光は、対物レンズ１８を励起光とは逆向きに通り、平行光としてダイクロイックミラー１７に入射する。ダイクロイックミラー１７は入射した蛍光を反射し、その反射光は、励起光除去フィルター１９及び分光器２０に入射して、必要な波長のみが取りだされる。分光器２０に代えて、ローパスフィルターやバンドパスフィルターを用いてもよい。必要な波長成分が取り出された蛍光は、ミラー２１で反射して方向を変え、集光レンズ２２により、光学素子２３上に集光される。集光レンズ２２を用いずに、蛍光を、平行光として光学素子２３に照射してもよい。
【００３５】
光学素子２３は、例えば微小ミラーとして構成される。微小ミラーには、半導体プロセスにて作成されたＭＥＮＳ（Micro Electro Mechanical Systems）ミラーを好適に用いることができる。光学素子２３には、例えば、弾性変位可能に支持され、所定の方向及びそれとは逆方向へ変位可能な可動部と、可動部へ所定方向の物理的作用力を加える第１の駆動源と、所定方向とは逆方向の物理的作用力を加える第２の駆動源とを含む電気機器素子を用いることができる。可動部の上面には反射ミラーが形成される。可動部を駆動する物理的作用力には、静電気力又は電磁力を用いることができる。光学素子制御手段２５は、光学素子２３における可動部（反射ミラー）の駆動を制御する。
【００３６】
光学素子２３を反射した蛍光は、蛍光を検出する蛍光検出手段２４に入射する。蛍光検出手段２４は、複数の検出器が所定の方向に沿って一列に配列された検出器群を含んでいる。蛍光検出手段２４には、電荷撮像素子（ＣＣＤイメージセンサ：Charge Coupled Device Image Sensor）を用いることができる。この場合、ＣＣＤを構成する各画素が、各検出器に対応する。蛍光検出手段２４は、ＣＣＤに加えて、ゲート機能付きのイメージインテンシファイアを有していてもよい。蛍光検出手段２４は、測定対象物３０から発せられた蛍光を、１つ又は複数の波長の蛍光として検出してもよい。蛍光検出手段２４の前段にマイクロレンズ又はマイクロレンズアレイを設け、各検出器に、測定対象物３０から発せられた蛍光を平行光又は収束光として入射してもよい。
【００３７】
ＰＣ２６は、励起光検出手段１５から励起光を検出した旨の信号を受け取ると、光学素子制御手段２５を介して、光学素子２３の反射ミラーを回転変位させる。光学素子２３は、反射ミラーが回転変位することで、反射ミラー面で反射して蛍光検出手段２４へ向かう蛍光の進行方向（反射方向）を変化させる。光学素子２３は、時間経過と共に、測定対象物３０から発せられた蛍光が、蛍光検出手段２４の検出器群を構成する複数の検出器のうちの異なる検出器で検出されるように、蛍光の進行方向を変化させる。言い換えれば、蛍光検出手段２４は、検出器群において、時間が進むに連れて順次に異なる検出器で蛍光を検出する。光学素子２３は、例えば、蛍光の測定期間にわたって、一列に配列された複数の検出器の一端側から他端側へ、蛍光の進行方向を連続的に変化させる。
【００３８】
蛍光検出手段２４の各検出器は、検出した蛍光の発光強度に応じた電気信号を出力する。蛍光検出手段２４では、光学素子２３が回転変位することで測定対象物３０から発せされた蛍光が順次に異なる検出器で検出されるため、各検出器で検出される蛍光の発光強度は、蛍光が１つの検出器を横切る時間幅における蛍光発光強度の積分値を表す。ＰＣ２６は、蛍光寿命算出手段としても機能し、蛍光検出手段２４の検出器群で検出された蛍光の検出結果に基づいて、蛍光寿命を算出する。より詳細には、ＰＣ２６は、検出器群を構成する複数の検出器での蛍光の検出結果に基づいて、複数の時間領域のそれぞれにおける蛍光発光強度の積分値を求め、それらに基づいて蛍光減衰曲線と蛍光寿命とを求める。
【００３９】
図２は、蛍光寿命測定の動作手順を示す。レーザ光源１１は、パルス励起光を出射する（ステップＳ１）。このパルス励起光は、必要に応じてパルスピッカー１２で間引かれた後、ミラー１３で反射してビームスプリッター１４に入射する。ビームスプリッター１４はパルス励起光の一部を反射し、残りを測定対象物３０方向に透過する。ビームスプリッター１４を透過した励起光は、非線形光学結晶１６及びダイクロイックミラー１７を通り、対物レンズ１８により測定対象物３０の所望の箇所に集光される。このとき測定対象物３０に照射される励起光は点光源であるとする。
【００４０】
測定対象物３０の励起光が照射された箇所では蛍光が発生する（ステップＳ２）。この蛍光は、対物レンズ１８を逆向きに通り、ダイクロイックミラー１７で反射し、励起光除去フィルター１９及び分光器２０を通って励起光の成分が除去される。測定対象物３０から発せられた蛍光は、不所望な成分が除去された後、ミラー２１で反射して向きを変え、集光レンズ２２により光学素子２３の反射ミラー面上に集光される。
【００４１】
一方、ビームスプリッター１４で反射した励起パルス光の一部は励起光検出手段１５に入射し、励起光検出手段１５は、励起光が照射された旨を検出する（ステップＳ３）。励起光検出手段１５は、ＰＣ２６に励起光照射を検出した旨を通知し、ＰＣ２６は、光学素子制御手段２５に対して、光学素子２３における反射ミラーの回転変位を指示する。光学素子制御手段２５は、光学素子２３の可動部に対して信号を与え、可動部を回転変位させる。可動部が回転変位することで、光学素子２３は、測定対象物３０から発せられる蛍光の反射方向を、時間経過と共に変化させる（ステップＳ４）。蛍光の進行方向が時間経過と共に変化することで、測定対象物３０から発せられた蛍光は、時間軸に対して１次元アレイ状に配列された複数の検出器上を移動していき、各検出器は、相互に異なる時間領域の蛍光を検出する。
【００４２】
ＰＣ２６は、蛍光検出手段２４における蛍光の検出結果を演算処理し、蛍光減衰曲線と蛍光寿命の値とを計算する（ステップＳ５）。ＰＣ２６は、ステップＳ５において、検出器群を構成する複数の検出器での蛍光の検出結果に基づいて、複数の時間領域のそれぞれにおける蛍光発光強度の積分値を求める。その際、ＰＣ２６は、例えば複数の検出器のうちの、求めるべき蛍光発光強度の時間領域に対応した１以上の検出器での蛍光の検出結果に基づいて、各時間領域における蛍光発光強度を求めることができる。ＰＣ２６は、各ウィンドウ内の積分発光強度を時間軸に対してプロットし、積分発光強度が指数関数的に減衰すると仮定して蛍光寿命を求める。
【００４３】
ＰＣ２６は、例えば検出器群を構成する検出器の数が１００個で、蛍光減衰特性を求める際に使用するウィンドウ（時間領域）の数が５つであるとき、計１００個の検出器を隣接する２０個の検出器ずつグループ化し、各グループ２０個の検出器で検出された蛍光発光強度の和を、各ウィンドウにおける蛍光発光強度の積分値としてもよい。検出器群を構成する検出器の数が多いほど、蛍光減衰特性を求める際のウィンドウ分割数を増やすことができる。ウィンドウ分割数を増やすことで、多成分解析も可能となる。
【００４４】
続いて、光学素子２３として用いるＭＥＮＳミラーとその周辺について説明する。図３（ａ）及び（ｂ）は、光学素子であるＭＥＭＳミラー５１と、蛍光検出手段であるＣＣＤ５２とを模式的に示す。静電駆動のＭＥＭＳミラー５１は、ミラー裏に備えられた可動電極と、その下部に位置する固定電極との間に働く静電力に応じて回転変位する。図３（ａ）は、静電力が供給されない状態を示しており、このとき可動ミラーはフラットな状態であるとする。可動ミラーを励起光と同期して駆動すると、図３（ｂ）に示すように、可動ミラーが初期状態に対して所定方向に傾く。
【００４５】
ＣＣＤ５２では、ＭＥＭＳミラーを中心とする円弧に沿って、画素（検出器）が一列に配列されている。蛍光の測定期間にわたって、可動ミラーを回転変位させることで、測定対象物３０から発せられた蛍光は、時間軸に対応して画素が１次元的に配列されたＣＣＤ５２の別々の画素で検出されることになる。なお、可動ミラーをフラットな状態から所定方向に傾けるのに代えて、初期状態で可動ミラーが所定方向とは逆の方向に傾いており、その状態から所定方向へ傾けることとしてもよい。
【００４６】
ＭＥＭＳミラー５１における可動ミラーの回転角を１０°とし、可動ミラーがフラットの状態から下部に接触するまでの時間を２μｓｅｃとする。つまり、可動ミラーは、２μｓｅｃの間に、回転角度を１０°だけ変化させるものとする。蛍光測定する時間軸を２００ｎｓｅｃとすると、２００ｎｓｅｃの間に可動ミラーが回転変位する角度は、１０°×（２００ｎｓｅｃ／２μｓｅｃ）＝１°となる。一次元アレイ状のＣＣＤ５２の画素数を２０００画素とし、１画素のサイズを１０μｍとすると、ＣＣＤ５２の蛍光検出面の長さは２０００×１０μｍ＝２０ｍｍとなる。ＭＥＭＳミラー５１とＣＣＤ５２との好適な距離ｒは、円弧の関係（２πｒ×（１／３６０）＝２０ｍｍ）から、およそ１．１ｍと求まる。言い換えれば、ＣＣＤ５２をＭＥＭＳミラー５１からおよそ１．１ｍ離れた位置に配置することで、測定期間２００ｎｓｅｃの間に回転角１°で進行方向が変化する蛍光を２０ｍｍのＣＣＤで検出できる。
【００４７】
ＣＣＤ５２の１０画素を時間ゲート法の１ウィドウに対応させると、ウィンドウ数は、２０００画素／１０画素＝２００ウィンドウとなる。１ウィンドウ時間幅は、トータルの測定時間幅が２００ｎｓｅｃであるので、２００ｎｓｅｃ／２００ウィンドウ＝１ｎｓｅｃとなる。つまり、時間ゲート法の時間分解能は、１ｎｓｅｃとなる。ＣＣＤの１００画素を時間ゲート法の１ウィンドウに対応させた場合は、時間分解能は１０ｎｓｅｃで、ウィンドウ数は２０となる。ＣＣＤ５２の何画素を時間ゲート法の１ウィンドウに対応させるかに応じて、ウィンドウの数及び時間分解能を任意に設定することが可能である。なお、ＣＣＤにおいて画素が可動ミラーを中心とする円弧に沿って配列されていない場合、例えばＣＣＤが平面の場合は、ＭＥＳミラー表面からの距離差に応じて検出画素を補正すればよい。
【００４８】
次いで、ＭＥＭＳミラーの構成について説明する。ＭＥＭＳミラーは、半導体プロセス等を用いて作製された微小サイズのミラーの総称として用いている。本実施形態において、ＭＥＭＳミラーとして好適に用いることができるＤＭＤ素子（Digital Micro-mirror Device）について説明する。ＤＭＤは、米国ＴＩ社（Texas Instrument）が１９８７年に発明し、１９９６年に量産化した２次元光変調用のミラーアレイデバイスである。以下に、ＤＭＤの基本的な構造と動作原理とを説明する。
【００４９】
図４は、ＤＭＤの基本構造を示す。ＤＭＤ６０は、Ｓｉ基板６１に形成されたＣＭＯＳ（Complementary Metal Oxide Semiconductor）の駆動回路上に、１辺が１０μｍ〜１３μｍのミラー６２が２次元に配列された構造である。２次元配列されたミラーのうちの１つを、測定対象物３０（図１）の一点から発せられた蛍光の進行方向を変化させる微小ミラーとして用いる。ミラー６２は、薄膜サーフェースＭＥＭＳ技術により形成された回転自在な構造であり、静電駆動により±１０ｄｅｇ〜１２ｄｅｇの傾斜変位が可能である。
【００５０】
Ｓｉ基板６１上には、１画素ごとにＣＭＯＳプロセスによる１ｂｉｔのＳＲＡＭ（Static Random Access Memory）回路が形成されている。このＳＲＡＭには、ミラー６２の変位の方向を定めるデータが書き込まれる。ＳＲＡＭ回路の上部には、第１電極と第２電極とが絶縁層を介して形成され、各々はＳＲＡＭ回路の出力に接続される。第１電極及び第２電極には、それぞれＳＲＡＭ回路に書き込まれたデータ及びその相補データに対応するアドレス電圧Ｖａ１及びＶａ２が供給される。
【００５１】
また、Ｓｉ基板６１上にはランディングパッドが形成されている。それらの上部に空隙を介して両端が支持されたヒンジ６３と称される梁が形成される。ヒンジ６３上にはヨーク６４と称される剛性のある膜が形成され、ヨーク６４の上に支柱を介して剛性のあるミラー６２が形成されている。ミラー６２は、ヒンジ６３により、ヨーク６４と一体に弾性捩れ可能となっている。第１電極、第２電極、ヨーク６４、及びミラー６２は、ヒンジ軸に対して対称に配置され、従って、ヨーク６４及びミラー６２は、ヒンジ軸のねじれ弾性により左右の回転（傾斜）が可能となる。
【００５２】
ミラー６２及びヨーク６４が傾斜すると、ヨーク６４の端部がランディングパッドに接触し、ミラー６２及びヨーク６４はそれ以上傾斜しない。ランディングパッドは、ストッパとして機能する。ヒンジ６３、ヨーク６４、ミラー６２、及びランディングパッドは、Ａｌ又はＡｌ合金で形成され、電気的に同電位である。ヒンジ６３、ヨーク６４、ミラー６２、及びランディングパッドには、バイアス電圧Ｖｂが供給される。
【００５３】
図５（ａ）及び（ｂ）は、ＤＭＤの基本動作原理を示す。可動部６７を構成するヨーク６４／ミラー６２には、バイアス電圧Ｖｂが供給される。一方、駆動信号、すなわち可動部６７（ミラー６２）の回転方向に応じたデータがＳＲＡＭ回路に書込まれると、第１電極６５及び第２電極６６には、アドレス電圧Ｖａ１、Ｖａ２が供給される。アドレス電圧Ｖａ１とＶａ２は、デジタル電圧で互いに相補的である。ここで、ΔＶ１＝｜Ｖｂ−Ｖａ１｜とし、ΔＶ２＝｜Ｖｂ−Ｖａ２｜とすると、ΔＶ１、ΔＶ２の値に従って、画素電極（第１電極６５及び第２電極６６）と、対向する可動部６７との間に静電気力（回転に対しては静電トルク）が発生する。ΔＶ１＞ΔＶ２のとき、可動部６７は、図５（ａ）に示すように第１電極６５に向かって傾斜する。逆に、ΔＶ１＜ΔＶ２のときは、可動部６７は、図５（ｂ）に示すように第２電極６６に向って傾斜する。
【００５４】
実際のＤＭＤは、電源ＯＮの状態で可動部６７がどちらか一方に傾き、ΔＶ１とΔＶ２との関係に応じて、可動部６７が初期状態とは反対側に傾くか、或いは初期状態と同じ側に傾く。反対側に傾く動作をＣＲＯＳＳ動作といい、同じ側に傾く動作をＳＴＡＹ動作と呼ぶ。図６は、駆動信号を供給したときの時間と回転角との関係を示す。図６において、ＣＲＯＳＳ動作における時間と回転角との関係を実線で示し、ＳＴＡＹ動作における時間と回転角との関係を点線で示す。ΔＶ１又はΔＶ２による静電トルクがヒンジ弾性トルクに比べて十分に大きい場合（ｐｕｌｌ−ｉｎトルク以上）、可動部６７はランディングパッドに接触して停止し、回転角度が決定される。
【００５５】
本実施形態では、測定対象物３０から発せされた蛍光が蛍光検出手段２４に入射するまでの間の光路中に光学素子２３を配置し、光学素子２３を用いて、時間経過と共に蛍光検出手段２４に向かう蛍光の進行方向を変化させる。蛍光検出手段２４は、測定対象物３０から発せられた蛍光を、時間経過と共に検出器群を構成する複数の検出器のうちの異なる検出器で順次に検出する。本実施形態では、複数の検出器が時間軸に対して一次元的に配置された検出器群において、測定期間にわたって、蛍光が順次に異なる検出器で検出される。このため、蛍光検出手段２４において、無駄なく測定対象物３０から発せられた蛍光を検出でき、励起光に対する蛍光の検出効率を高めることができきる。
【００５６】
また、通常の時間ゲート法において、例えば３つのウィンドウで積分蛍光発光強度を求めるためには、励起光パルスを最低でも３回照射する必要があった。特許文献１に記載の技術では、励起光パルスの照射回数を半分に減らすことはできるものの、それでも最低限２つの励起光パルスの照射が必要となっていた。本実施形態では、検出器群が３以上の検出器を有するとき、最低限１回の励起光パルス照射で、３以上のウィンドウにおいて積分蛍光発光強度を求めることができ、複数回の励起光パルス照射が必要であった従来技術に比して、測定時間を短縮することができる。本実施形態では、最低１つの励起光パルスで測定を完了できるため、細胞などの時々刻々と変化する試料の同一時刻での蛍光寿命測定が可能である。また、１パルス又は少ないパルス数で測定が可能であるため、光退色の影響を抑えることができる。
【００５７】
本実施形態では、最大で、蛍光検出手段２４において検出器群を構成する検出器の数の分のウィンドウで、積分蛍光発光強度を求めることができる。その場合、１つの検出器での蛍光検出結果が、１つのウィンドウでの積分蛍光発光強度に対応する。いくつかの検出器をまとめて１ウィンドウに対応させ、隣接する１以上の検出器での蛍光検出結果を合算してもよい。検出器群を構成する検出器の数が多いほど、時間ゲート法におけるウィンドウの数を増やすことができ、蛍光減衰曲線をフィッティングする点の数を増やして、解析の精度を向上することができる。また、蛍光減衰曲線のフィッティング数を増やすことで、多成分の解析も可能となる。
【００５８】
時間分解蛍光測定装置１０は、図１に示す構成に加えて、測定対象物３０上で励起光の照射位置を走査する走査手段を有していてもよい。走査手段は、測定対象物３０の表面上で、例えば点光源である励起光の照射位置を互いに直交するｘ方向とｙ方向との２方向に走査する。走査手段には、例えばガルバノミラー、ポリゴンミラー、レゾナントミラー、ピエゾステージなどを用いることができる。ＰＣ２６（蛍光寿命算出手段）は、走査された各位置において、蛍光発光強度（減衰特性）と蛍光寿命とを求める。
【００５９】
ＰＣ２６は、蛍光寿命算出手段としての機能に加えて、走査された励起光の各位置に対応する蛍光の発光強度の分布を表す蛍光画像を生成する蛍光画像生成手段として機能してもよい。ＰＣ２６は、蛍光発光強度に代えて、走査された各位置に対応して算出された蛍光寿命の分布を表す画像を蛍光画像として生成してもよい。または、ＰＣ２６は、発光強度と蛍光寿命の双方の分布を表す画像を蛍光画像として生成してもよい。ＰＣ２６は、生成した蛍光画像を、例えばディスプレイなどの表示装置に表示する。
【００６０】
上記の走査手段は、測定対象物３０の表面だけでなく、測定対象物３０に対する励起光の集光位置を深さ方向に走査してもよい。深さ方向の走査には、ピエゾステージ又は集光レンズ（対物レンズ１８）を用いることができる。蛍光寿命測定手段は、測定対象物の表面上の各位置だけではなく、深さ方向に走査された各位置についても、蛍光発光強度（減衰特性）と蛍光寿命とを求めればよい。また、蛍光画像生成手段は、測定対象物３０の表面上の２方向に深さ方向を加えて、蛍光画像を３次元情報として生成すればよい。
【００６１】
上記実施形態の説明では、光学素子２３に静電駆動のＭＥＭＳ素子を用いる例を説明したが、光学素子２３に、駆動力が電磁力のＭＥＭＳ素子、例えば電磁スキャナを用いることも可能である。電磁駆動は、スキャナ素子で一般に用いられている。電磁駆動の場合、可動部に電流を流すと、電流の向きと永久磁石の磁力の方向とによりローレンツ力が発生し、可動部を駆動させる。電流の流れる向きを交互にすることで、可動部を回転振動させることができる。
【００６２】
上記実施形態の説明では、励起光として点光源を想定しており、測定対象物３０の一点（１つの微小領域）に励起光を照射し、その微小領域から発せられた蛍光を、光学素子２３を介して蛍光検出手段２４で検出するものとして説明した。これに代えて、ライン光源を用い、一度に測定対象物３０の複数の箇所に励起光を照射することも可能である。その場合も、測定対象物３０の励起光が照射された各微小領域（１ライン上の各地点）から発せられた蛍光が蛍光検出手段２４で検出される仕組みは、上記実施形態で説明したものと同様である。
【００６３】
ライン光源を用いる場合、光学素子２３は、測定対象物３０の１ラインの励起光が照射された箇所から発せられた蛍光を、時間経過と共に蛍光の進行方向を変化させつつ、蛍光検出手段２４に向けて出射すればよい。また、蛍光検出手段２４は、励起光が照射される１ラインの各地点に対応した数の検出器群を有していればよい。例えば蛍光検出手段２４は、測定対象物３０の励起光（ライン光）が照射された１行×ｍ列の微小領域に対応して、ｍ個の検出器群を有していればよい。各検出器群では、複数の検出器が一列に配列されており、その検出器群を複数並べて配置するため、複数の検出器は、蛍光検出手段２４において２次元配列で配列されることになる。
【００６４】
図７は、ライン光源の励起光が照射された場合の光学素子２３と蛍光検出手段２４とを示す。光学素子２３は、例えばＭＥＭＳミラーアレイ５３として構成される。ＭＥＭＳミラーアレイ５３にＤＭＤ６０（図４）を用いた場合、ＤＭＤ６０は、例えば２次元配列されたミラーの１行（１行を構成する各画素）を用いて、測定対象物３０のライン光が照射された部分（１行×ｍ列の微小領域）から発せられた蛍光を反射すればよい。ＤＭＤの１行を構成する各画素には、同じ駆動信号（ＳＲＡＭに記憶させるデータ）を、同じタイミングで供給すればよい。画素ごとに独立に駆動が可能なＭＥＭＳミラーアレイ５３に代えて、励起光の１ラインに対応した長さ、例えば図７における画素５つ分の長さを有する１枚のＭＥＭＳミラーを用いてもよい。
【００６５】
蛍光検出手段２４は、例えば画素が２次元配列されたＣＣＤアレイ５４として構成される。ＣＣＤアレイ５４の２次元配列された画素のうち、ＭＥＭＳミラーアレイ５３におけるミラーの回転変位の方向に対応した方向に沿って配列された複数の画素が、測定対象物３０の一点（１つの微小領域）に対応した検出器群を構成する。ＣＣＤアレイ５４では、この検出器群が、ＭＥＭＳミラーアレイ５３の画素の配列方向に対応した方向に並べられている。ＣＣＤアレイ５４は、測定対象物３０の励起光が照射された１行×ｍ列の微小領域から発せられる蛍光のそれぞれを、ｍ個の検出器群のうちの対応する検出器群で検出する。
【００６６】
測定対象物３０に対し、励起光をライン光として照射するとで、測定対象物の１ラインを一括で励起することができ、１ラインから発せられた蛍光をＭＥＭＳミラーアレイ５３に一度に入射することができる。ＭＥＭＳミラーアレイ５３は、１ラインから発せられた蛍光を、時間経過と共に蛍光の進行方向を変化させつつ、ＣＣＤアレイ５４に向けて出射（反射）する。蛍光検出手段２４として２次元アレイ状のＣＣＤアレイ５４を用いれば、１ラインからの蛍光を時間分解して検出することが可能となる。ライン光を用いる場合、ライン励起光を試料表面の１方向に走査することで、イメージングが可能となる。
【００６７】
測定対象物３０に照射する励起光は、面光源であってもよい。面光源を励起光として照射する場合、蛍光検出手段２４は、測定対象物３０の励起光が照射されるｎ行×ｍ列の微小領域に対応して、それぞれが１行×ｍ列の領域に対応した複数の検出器群をｎセット有していればよい。また、光学素子２３は、測定対象物３０の励起光が照射された各行のｍ列の微小領域から発せられた蛍光を、蛍光検出手段２４の対応するセットの複数の検出器群に向けて反射（出射）すればよい。蛍光検出手段２４は、測定対象物３０の励起光が照射された各行のｍ列の領域から発せられる蛍光のそれぞれを、対応するセットの複数の検出器群のうちの対応する検出器群で検出する。
【００６８】
図８は、面光源の励起光が照射された場合の光学素子２３と蛍光検出手段２４とを示す。光学素子２３は、例えばＭＥＭＳミラーが２次元配列されたＭＥＭＳミラーアレイ５５として構成される。ＭＥＭＳミラーアレイ５５にはＤＭＤ６０（図４）を用いることができる。蛍光検出手段２４は、例えば画素が２次元配列されたＣＣＤアレイ５６として構成される。ＣＣＤアレイ５６は、図７に示すＣＣＤアレイ５４が、ｎ個（ｎセット）連結されたものでよい。図７に示すＣＣＤアレイ５４は、測定対象物３０の励起光が照射された１行に対応した複数の検出器群を含んでおり、ＣＣＤアレイ５６は、その１行に対応した複数の検出器群をｎセット有している。
【００６９】
ＭＥＭＳミラーアレイ５５（ＤＭＤ）の１行を構成する各画素には、同じ駆動信号（ＳＲＡＭに記憶させるデータ）を、同じタイミングで供給すればよい。ＤＭＤの各行には、相互に異なるタイミングで駆動信号を供給する。各行に駆動信号を供給するタイミングは、測定対象物３０の励起光が照射された各行から発せられた蛍光が、ＣＣＤアレイ５６の対応するセットの複数の検出器群に向けて出射されるように調整しておく。ＣＣＤアレイ５６は、測定対象物３０の励起光が照射された各行のｍ列の微小領域から発せられる蛍光のそれぞれを、対応するセットの複数の検出器群のうちの対応する検出器群で検出する。面光源を用いて測定対象物３０を一括励起し、測定対象物３０の励起光が照射された領域から発せられた蛍光を蛍光検出手段２４で検出することで、励起光を測定対象物３０上を走査することなく、一括で蛍光画像が取得可能である。
【００７０】
例えば、図８において、ＣＣＤアレイ５６の第１セット（第１受光部）を構成する画素は測定対象物３０の第１行の領域に対応し、第２セット（第２受光部）を構成する画素は測定対象物３０の第２行の領域に対応し、第３セット（第３受光部）を構成する画素は測定対象物３０の第３行の領域に対応する。第１受光部は、第１行の５つの微小領域に対応した５つの検出器群を有し、第２受光部は、第２行の５つの微小領域に対応した５つの検出器群を有し、第３受光部は、第３行の５つの微小領域に対応した５つの検出器群を有する。
【００７１】
ＭＥＭＳミラーアレイ５５の第１行から第３行に、互いにタイミングをずらして駆動信号が供給されることで、測定対象物３０の第１行の各領域から発せられた蛍光は第１受光部で検出され、測定対象物３０の第２行の各領域から発せられた蛍光は第２受光部で検出され、測定対象物３０の第３行の各領域から発せられた蛍光は第３受光部で検出される。各受光部では、測定対象物３０の対応する各行の５列の微小領域から発せられる蛍光のそれぞれを、各受光部を構成する５つの検出器群のうちの対応する検出器群で検出する。例えば第１行から第３行の第１列の微小領域から発せられた蛍光は、それぞれ、第１受光部の第１列の微小領域に対応した検出器群、第２受光部の第１列に対応した検出器群、及び第３受光部の第１列に対応した検出器群で検出される。
【００７２】
次いで、上記の時間分解蛍光計測装置を組み込んだ顕微鏡システムを説明する。図９は、顕微鏡システムを示す。顕微鏡システム１００の構成は、図１に示す時間分解蛍光測定装置１０を構成する手段のうちの一部が顕微鏡１０１に組み込まれている点を除けば、基本的に時間分解蛍光測定装置１０の構成と同様である。
【００７３】
レーザ光源１１から出射したパルス励起光は、必要に応じてパルスピッカー１２で所望の繰り返し周波数に間引かれ、ミラー１３を介してビームスプリッター１４に入射し、２つの光に分離される。分離された光のうちの一方は、ビームスプリッター１４で反射して励起光検出手段１５に向かう。分離された光の他方は非線形光学結晶１６に入射し、非線形光学結晶１６により入射波長の第２高調波又は第３高調波が発生する。
【００７４】
非線形光学結晶１６により第２高調波又は第３高調波が発生した励起光は、顕微鏡１０１に導入される。導入された励起光は、励起フィルター１０２を介してダイクロイックミラー１７に入射し、ダイクロイックミラー１７を透過して、対物レンズ１８により、測定対象物３０の所望の箇所に照射される。測定対象物３０から発せられた蛍光は、対物レンズ１８により平行光化され、ダイクロイックミラー１７を透過する。ダイクロイックミラー１７を透過した光は、励起光除去フィルター１９を通り、ミラー１０３で反射して、顕微鏡１０１の外部に出射する。
【００７５】
顕微鏡１０１から出射した光は、分光器２０で分光され、ミラー２１で反射し、集光レンズ２２を経て、収束光として光学素子２３に入射する。光学素子２３は、時間経過と共に、測定対象物３０から発せられた蛍光が、蛍光検出手段２４の検出器群を構成する複数の検出器のうちの異なる検出器で検出されるように、蛍光の進行方向を変化させる。蛍光検出手段２４は、検出器群において、時間が進むに連れて順次に異なる検出器で蛍光を検出する。ＰＣ２６は、蛍光検出手段２４の検出器群で検出された蛍光の検出結果に基づいて、蛍光寿命を算出する。
【００７６】
励起光に点光源を用いる場合、励起光を、ガルバノミラー、ポリゴンミラー、レゾナントミラー、ピエゾステージなどの走査手段を用いて測定対象物３０の表面上を２次元走査すれば、２次元的に蛍光減衰曲線を得ることができ、蛍光寿命の２次元画像情報を得ることができる。励起光にライン光源を用いる場合、励起光を１方向に走査することで、蛍光寿命の２次元画像情報を得ることができる。励起光に面光源を用いる場合、走査手段を用いなくても、蛍光寿命の２次元画像を得ることができる。表面上の２方向に加えて、測定対象物３０に励起光を集光する集光レンズ又はピエゾステージにより深さ方向（Ｚ軸方向）にも走査を行うことで、３次元画像情報を得ることができる。
【００７７】
引き続き、上記の時間分解蛍光計測装置を組み込んだ内視鏡プローブシステムを説明する。図１０は、内視鏡プローブシステムを示す。内視鏡プローブシステム２００の構成は、図１に示す時間分解蛍光測定装置１０を構成する手段のうちの一部が内視鏡プローブ装置２０１に組み込まれている点を除けば、基本的に時間分解蛍光測定装置１０の構成と同様である。
【００７８】
レーザ光源１１から出射したパルス励起光は、必要に応じてパルスピッカー１２で所望の繰り返し周波数に間引かれ、ミラー１３を介してビームスプリッター１４に入射し、２つの光に分離される。分離された光のうちの一方は、ビームスプリッター１４で反射して励起光検出手段１５に向かう。分離された光の他方は非線形光学結晶１６に入射し、非線形光学結晶１６により入射波長の第２高調波又は第３高調波が発生する。
【００７９】
非線形光学結晶１６により第２高調波又は第３高調波が発生した励起光は、内視鏡プローブ装置２０１に導入される。導入された励起光は、励起フィルター２０２を介してダイクロイックミラー１７に入射し、ダイクロイックミラー１７を透過する。ダイクロイックミラー１７を透過した励起光は、光ファイバ２０３を介して内視鏡プローブ２０４に導かれ、内視鏡プローブ２０４の先端から測定対象物３０の所望の箇所に照射される。測定対象物３０から発せられた蛍光は、内視鏡プローブ２０４を逆向きに通り、光ファイバ２０３を経てダイクロイックミラー１７に入射する。
【００８０】
図１１は、内視鏡プローブ２０４の断面を示す。内視鏡プローブ２０４は、内視鏡の鉗子口を通して、測定対象物３０である患部へと到達する。内視鏡プローブ２０４は、中央に形成された光ファイバ２０６と、周囲に形成された複数の光ファイバ２０７とを有する。中央に形成された光ファイバ２０６は、励起光を測定対象物３０（図１０）まで導光する入射用として機能する。周囲に形成された複数の光ファイバ２０７は、測定対象物３０から発せられた蛍光を受光し、光ファイバ２０３側へ導光するための受光用として機能する。
【００８１】
図１０に戻り、光ファイバ２０３側からダイクロイックミラー１７に入射した光は、励起光除去フィルター１９を通り、ミラー２０５で反射して、内視鏡プローブ装置２０１の外部に出射する。内視鏡プローブ装置２０１から出射した光は、分光器２０で分光され、ミラー２１で反射し、集光レンズ２２を経て、収束光として光学素子２３に入射する。光学素子２３は、時間経過と共に、測定対象物３０から発せられた蛍光が、蛍光検出手段２４の検出器群を構成する複数の検出器のうちの異なる検出器で検出されるように、蛍光の進行方向を変化させる。蛍光検出手段２４は、検出器群において、時間が進むに連れて順次に異なる検出器で蛍光を検出する。ＰＣ２６は、蛍光検出手段２４の検出器群で検出された蛍光の検出結果に基づいて、蛍光寿命を算出する。
【００８２】
励起光に点光源を用いる場合、励起光を、内視鏡先端に設けたＭＥＭＳスキャナミラーなどの走査手段を用いて測定対象物３０の表面上を２次元走査すれば、２次元的に蛍光減衰曲線を得ることができ、蛍光寿命の２次元画像情報を得ることができる。また、ファイバハンドルなどで、測定対象物３０からの信号を２次元的に受光することで、２次元的に蛍光減衰曲線を得てもよい。励起光にライン光源を用いる場合、励起光を１方向に走査することで、蛍光寿命の２次元画像情報を得ることができる。励起光に面光源を用いる場合、走査手段を用いなくても、蛍光寿命の２次元画像を得ることができる。表面上の２方向に加えて、測定対象物３０に励起光を集光する集光レンズなどにより深さ方向（Ｚ軸方向）にも走査を行うことで、３次元画像情報を得ることができる。
【００８３】
以下、実施例を説明する。ＤＭＳＯ（dimethyl sulfoxide）を溶媒とし、Pd meso-Tetra（4 carboxyphenyl) porphineを溶かして５．０×１０−４ｍｏｌ／Ｌの溶液を作った。この溶液を、１０ｍｍ角の密閉可能な石英セルに適量入れ、窒素バブリングにより溶存酸素を除去した後に石英セルに蓋をし、励起波長を４０５ｎｍ、蛍光波長を６９７ｎｍとして、時間分解蛍光測定装置１０（図１）を用いて蛍光寿命測定を行った。試料から発する光はりん光であり、その減衰曲線を５ｍｓｅｃ程度の時間範囲で測定した。
【００８４】
光学素子２３には、回転角が±１０°、駆動周波数が１００Ｈｚのスキャナ素子を用いた。また、蛍光検出手段２４には、画素数が２０００画素、１画素サイズが１０μｍの１次元アレイ状ＣＣＤを用いた。スキャナ素子が−１０°から＋１０°まで駆動する時間は５ｍｓｅｃであり、この時間は蛍光減衰曲線の測定時間とほぼ等しい。ＣＣＤの１００画素を時間ゲート法の１ウィンドウに対応させると、５ｍｓｅｃ×（１００画素／２０００画素）＝２５０μｓｅｃとなり、時間ゲート法の時間分解能は２５０μｓｅｃとなる。
【００８５】
上記の装置を用い、時間ゲート法によるPd meso-Tetra(4 carboxyphenyl) porphineのりん光寿命測定を行った。ＣＣＤの１００画素が１ウィンドウに対応するため、ウィンドウ数は２０となる。時間軸に対して２０点のプロットが得られ、この２０点をフィッティングすることで、Pd meso-Tetra(4 carboxyphenyl) porphineのりん光寿命はおよそ６９０μｓｅｃと求められた。
【００８６】
以上、本発明をその好適な実施形態に基づいて説明したが、本発明の時間分解蛍光測定装置及び方法は、上記実施形態にのみ限定されるものではなく、上記実施形態の構成から種々の修正及び変更を施したものも、本発明の範囲に含まれる。
【符号の説明】
【００８７】
１０：時間分解蛍光測定装置
１１：レーザ光源
１２：パルスピッカー
１３、２１：ミラー
１４：ビームスプリッター
１５：励起光検出手段
１６：非線形光学結晶
１７：ダイクロイックミラー
１８：対物レンズ
１９：励起光除去フィルター
２０：分光器
２２：集光レンズ
２３：光学素子
２４：蛍光検出手段
２５：光学素子制御手段
２６：コンピュータ（ＰＣ）
３０：測定対象物
５１：ＭＥＭＳミラー
５２：ＣＣＤ
５３、５５：ＭＥＭＳミラーアレイ
５４、５６：ＣＣＤアレイ
６０：ＤＭＤ
６１：基板
６２：ミラー
６３：ヒンジ
６４：ヨーク
６５：第１電極
６６：第２電極
６７：可動部
１００：顕微鏡システム
１０１：顕微鏡
１０２：励起フィルター
１０３：ミラー
２００：内視鏡プローブシステム
２０１：内視鏡プローブ装置
２０２：励起フィルター
２０３：光ファイバ
２０４：内視鏡プローブ
２０５：ミラー
２０６、２０７：光ファイバ
【特許請求の範囲】
【請求項１】
所定の波長を有する光を励起光として測定対象物に照射する光照射手段と、
前記測定対象物から発せられる蛍光を検出する蛍光検出手段であって、複数の検出器が所定の方向に沿って一列に配列された検出器群を有する蛍光検出手段と、
前記蛍光が前記蛍光検出手段に入射するまでの間の光路中に配置され、前記励起光が前記測定対象物に照射された後、時間経過と共に前記蛍光が前記検出器群の複数の検出器のうちの異なる検出器で検出されるように、前記蛍光の進行方向を変化させる光学素子と、
前記検出器群での蛍光の検出結果に基づいて、蛍光寿命を算出する蛍光寿命算出手段とを備えたことを特徴とする時間分解蛍光測定装置。
【請求項２】
前記蛍光寿命算出手段が、前記複数の検出器での蛍光の検出結果に基づいて複数の時間領域のそれぞれにおける蛍光発光強度を求め、該求められた蛍光発光強度に基づいて前記蛍光寿命を算出するものであることを特徴とする請求項１に記載の時間分解蛍光測定装置。
【請求項３】
前記蛍光寿命算出手段が、前記複数の検出器のうちの、求めるべき蛍光発光強度の時間領域に対応した１以上の検出器での蛍光の検出結果に基づいて、各時間領域における蛍光発光強度を求めるものであることを特徴とする請求項２に記載の時間分解蛍光測定装置。
【請求項４】
前記光学素子が、前記蛍光の測定期間にわたって、前記蛍光の進行方向を、前記一列に配列された複数の検出器の一端側から他端側へ連続的に変化させるものであることを特徴とする請求項１から３何れかに記載の時間分解蛍光測定装置。
【請求項５】
前記光学素子が、弾性変位可能に支持され、第１の方向及びこれとは逆方向の第２の方向へ変位可能な可動部と、該可動部へ前記第１の方向の物理的作用力を加える第１の駆動源と、前記可動部へ前記第２の方向の物理的作用力を加える第２の駆動源とを含む電気機器素子であることを特徴とする請求項１から４何れかに記載の時間分解蛍光測定装置。
【請求項６】
前記励起光が点光源であることを特徴とする請求項１から５何れかに記載の時間分解蛍光測定装置。
【請求項７】
前記蛍光検出器手段が、前記測定対象物の前記励起光が照射された箇所から発せられる蛍光を、前記検出器群の複数の検出器で検出するものであることを特徴とする請求項６に記載の時間分解蛍光測定装置。
【請求項８】
前記励起光がライン光源であることを特徴とする請求項１から５何れかに記載の時間分解蛍光測定装置。
【請求項９】
前記蛍光検出手段が、前記測定対象物の前記励起光が照射された１行×ｍ列（ｍは２以上の整数）の領域に対応した複数の検出器群を含み、前記測定対象物の前記励起光が照射された１行のｍ列の領域から発せられる蛍光のそれぞれを、前記複数の検出器群のうちの対応する検出器群で検出するものであることを特徴とする請求項８に記載の時間分解蛍光測定装置。
【請求項１０】
前記励起光が面光源であることを特徴とする請求項１から５何れかに記載の時間分解蛍光測定装置。
【請求項１１】
前記蛍光検出手段が、前記測定対象物の前記励起光が照射されたｎ行×ｍ列（ｎ、ｍはそれぞれ２以上の整数）の領域に対応して、それぞれが１行×ｍ列の領域に対応した複数の検出器群をｎセット有し、
前記光学素子が、前記測定対象領域の励起光が照射された各行のｍ列の領域から発せられた蛍光を、前記蛍光検出手段の対応するセットの複数の検出器群に向けて出射し、
前記蛍光検出手段が、前記測定対象物の前記励起光が照射された各行のｍ列の領域から発せられる蛍光のそれぞれを、前記対応するセットの複数の検出器群のうちの対応する検出器群で検出するものであることを特徴とする請求項１０に記載の時間分解蛍光測定装置。
【請求項１２】
前記蛍光検出手段が、ゲート機能を有するイメージインテンシファイアと電荷撮像素子とを含むことを特徴とする請求項１から１１何れかに記載の時間分解蛍光測定装置。
【請求項１３】
前記励起光を前記測定対象物の表面上で走査する走査手段と、
前記走査された励起光の各位置に対応する前記蛍光の発光強度、及び前記算出された蛍光寿命の少なくとも一方の分布を表す蛍光画像を生成する蛍光画像生成手段とを更に備えたことを特徴とする請求項１から１２何れかに記載の時間分解蛍光測定装置。
【請求項１４】
前記走査手段が、前記測定対象物の表面上に加えて、前記測定対象物上の前記励起光の集光位置を深さ方向にも走査し、前記蛍光画像生成手段が、前記蛍光画像を３次元情報として生成するものであることを特徴とする請求項１３に記載の時間分解蛍光測定装置。
【請求項１５】
請求項１から１４何れかに記載の時間分解蛍光測定装置を備えたことを特徴とする顕微鏡システム。
【請求項１６】
請求項１から１４何れかに記載の時間分解蛍光測定装置を備えたことを特徴とする内視鏡ファイバプローブシステム。
【請求項１７】
所定の波長を有する光を励起光として測定対象物に照射するステップと、
前記励起光が前記測定対象物に照射された後、前記測定対象物から発せられる蛍光が、時間経過と共に所定の方向に沿って一列に配列された複数の検出器のうちの異なる検出器で検出されるように、前記蛍光の進行方向を変化させるステップと、
前記複数の検出器における蛍光の検出結果に基づいて、蛍光寿命を算出するステップとを有することを特徴とする時間分解蛍光測定方法。
【請求項１】
所定の波長を有する光を励起光として測定対象物に照射する光照射手段と、
前記測定対象物から発せられる蛍光を検出する蛍光検出手段であって、複数の検出器が所定の方向に沿って一列に配列された検出器群を有する蛍光検出手段と、
前記蛍光が前記蛍光検出手段に入射するまでの間の光路中に配置され、前記励起光が前記測定対象物に照射された後、時間経過と共に前記蛍光が前記検出器群の複数の検出器のうちの異なる検出器で検出されるように、前記蛍光の進行方向を変化させる光学素子と、
前記検出器群での蛍光の検出結果に基づいて、蛍光寿命を算出する蛍光寿命算出手段とを備えたことを特徴とする時間分解蛍光測定装置。
【請求項２】
前記蛍光寿命算出手段が、前記複数の検出器での蛍光の検出結果に基づいて複数の時間領域のそれぞれにおける蛍光発光強度を求め、該求められた蛍光発光強度に基づいて前記蛍光寿命を算出するものであることを特徴とする請求項１に記載の時間分解蛍光測定装置。
【請求項３】
前記蛍光寿命算出手段が、前記複数の検出器のうちの、求めるべき蛍光発光強度の時間領域に対応した１以上の検出器での蛍光の検出結果に基づいて、各時間領域における蛍光発光強度を求めるものであることを特徴とする請求項２に記載の時間分解蛍光測定装置。
【請求項４】
前記光学素子が、前記蛍光の測定期間にわたって、前記蛍光の進行方向を、前記一列に配列された複数の検出器の一端側から他端側へ連続的に変化させるものであることを特徴とする請求項１から３何れかに記載の時間分解蛍光測定装置。
【請求項５】
前記光学素子が、弾性変位可能に支持され、第１の方向及びこれとは逆方向の第２の方向へ変位可能な可動部と、該可動部へ前記第１の方向の物理的作用力を加える第１の駆動源と、前記可動部へ前記第２の方向の物理的作用力を加える第２の駆動源とを含む電気機器素子であることを特徴とする請求項１から４何れかに記載の時間分解蛍光測定装置。
【請求項６】
前記励起光が点光源であることを特徴とする請求項１から５何れかに記載の時間分解蛍光測定装置。
【請求項７】
前記蛍光検出器手段が、前記測定対象物の前記励起光が照射された箇所から発せられる蛍光を、前記検出器群の複数の検出器で検出するものであることを特徴とする請求項６に記載の時間分解蛍光測定装置。
【請求項８】
前記励起光がライン光源であることを特徴とする請求項１から５何れかに記載の時間分解蛍光測定装置。
【請求項９】
前記蛍光検出手段が、前記測定対象物の前記励起光が照射された１行×ｍ列（ｍは２以上の整数）の領域に対応した複数の検出器群を含み、前記測定対象物の前記励起光が照射された１行のｍ列の領域から発せられる蛍光のそれぞれを、前記複数の検出器群のうちの対応する検出器群で検出するものであることを特徴とする請求項８に記載の時間分解蛍光測定装置。
【請求項１０】
前記励起光が面光源であることを特徴とする請求項１から５何れかに記載の時間分解蛍光測定装置。
【請求項１１】
前記蛍光検出手段が、前記測定対象物の前記励起光が照射されたｎ行×ｍ列（ｎ、ｍはそれぞれ２以上の整数）の領域に対応して、それぞれが１行×ｍ列の領域に対応した複数の検出器群をｎセット有し、
前記光学素子が、前記測定対象領域の励起光が照射された各行のｍ列の領域から発せられた蛍光を、前記蛍光検出手段の対応するセットの複数の検出器群に向けて出射し、
前記蛍光検出手段が、前記測定対象物の前記励起光が照射された各行のｍ列の領域から発せられる蛍光のそれぞれを、前記対応するセットの複数の検出器群のうちの対応する検出器群で検出するものであることを特徴とする請求項１０に記載の時間分解蛍光測定装置。
【請求項１２】
前記蛍光検出手段が、ゲート機能を有するイメージインテンシファイアと電荷撮像素子とを含むことを特徴とする請求項１から１１何れかに記載の時間分解蛍光測定装置。
【請求項１３】
前記励起光を前記測定対象物の表面上で走査する走査手段と、
前記走査された励起光の各位置に対応する前記蛍光の発光強度、及び前記算出された蛍光寿命の少なくとも一方の分布を表す蛍光画像を生成する蛍光画像生成手段とを更に備えたことを特徴とする請求項１から１２何れかに記載の時間分解蛍光測定装置。
【請求項１４】
前記走査手段が、前記測定対象物の表面上に加えて、前記測定対象物上の前記励起光の集光位置を深さ方向にも走査し、前記蛍光画像生成手段が、前記蛍光画像を３次元情報として生成するものであることを特徴とする請求項１３に記載の時間分解蛍光測定装置。
【請求項１５】
請求項１から１４何れかに記載の時間分解蛍光測定装置を備えたことを特徴とする顕微鏡システム。
【請求項１６】
請求項１から１４何れかに記載の時間分解蛍光測定装置を備えたことを特徴とする内視鏡ファイバプローブシステム。
【請求項１７】
所定の波長を有する光を励起光として測定対象物に照射するステップと、
前記励起光が前記測定対象物に照射された後、前記測定対象物から発せられる蛍光が、時間経過と共に所定の方向に沿って一列に配列された複数の検出器のうちの異なる検出器で検出されるように、前記蛍光の進行方向を変化させるステップと、
前記複数の検出器における蛍光の検出結果に基づいて、蛍光寿命を算出するステップとを有することを特徴とする時間分解蛍光測定方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図４】
【図２】
【図３】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図４】
【公開番号】特開２０１２−１３２７４２（Ｐ２０１２−１３２７４２Ａ）
【公開日】平成２４年７月１２日（２０１２．７．１２）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１０−２８４１０５（Ｐ２０１０−２８４１０５）
【出願日】平成２２年１２月２１日（２０１０．１２．２１）
【出願人】（３０６０３７３１１）富士フイルム株式会社 (25,513)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２４年７月１２日（２０１２．７．１２）
【国際特許分類】
【出願日】平成２２年１２月２１日（２０１０．１２．２１）
【出願人】（３０６０３７３１１）富士フイルム株式会社 (25,513)
【Ｆターム（参考）】
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