本発明は、標的遺伝子発現を下方制御する修飾ｓｉＲＮＡ化合物、かかる化合物を含む薬学的組成物、ならびに前記遺伝子と関連する様々な疾患もしくは状態、および／またはかかる疾患もしくは状態と関連する症状の発生または重症度を治療および／または防止する方法に関する。

【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は、２００９年１１月２６日に出願された米国特許仮出願第６１／２６４６６８号、２０１０年１月１７日に出願された同第６１／２９５７２１号、および２０１０年８月９日に出願された同第６１／３７２０７２号の利益を主張し、当該出願は、全ての目的のために、参照することによってその全体が本明細書に組み込まれる。

本発明は、修飾ｓｉＲＮＡ化合物、それを含む薬学的組成物、および遺伝子発現の阻害のためのその使用方法に関する。本化合物および組成物は、標的遺伝子のノックダウン活性を含む有益な特性を示し、疾患もしくは状態およびまたはかかる疾患もしくは状態に随伴する症状に苦しんでいる、あるいは遺伝子発現が悪影響を与える疾患もしくは状態にかかる危険性がある、対象の治療に有用である。
【背景技術】
【０００２】
本発明の譲受人の、参照することによってその全体が本明細書に組み込まれる、ＰＣＴ特許公開ＷＯ第２００８／１０４９７８号およびＷＯ第２００９／０４４３９２号は、新規のｓｉＲＮＡ構造を開示する。
【０００３】
ノックダウン活性の増強、安定性の増加、およびまたはオフターゲット効果の軽減を示す、活性かつ有効なｓｉＲＮＡ治療剤の必要がある。
【発明の概要】
【０００４】
本明細書に開示される二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）化合物は、例えば、活性を増加し、安定性を増加し、免疫原性を軽減し、ＲＩＳＣ複合体中への取り込みを強化し、かつまたは毒性を最小化し得る、構造および修飾を有し、ｓｉＲＮＡの新規の修飾は、標的遺伝子発現を防止または軽減するのに有用な二本鎖ＲＮＡに有益に適用される。
【０００５】
遺伝子発現の下方制御に有用な二本鎖（二重鎖）オリゴヌクレオチド化合物が、本明細書に提供される。本開示は、部分的には、センス鎖および相補的なアンチセンス鎖を含み、アンチセンス鎖の５′末端ヌクレオチドと標的ＲＮＡのヌクレオチドとの間にミスマッチを有する、二本鎖核酸分子が、標的遺伝子を下方制御する際に強力な活性を示すという予想外の観察に基づいている。好ましい実施形態において、本ｄｓＲＮＡは、シチジンまたはグアニンの代わりというよりもむしろ、アンチセンス鎖の１位（５′末端）で置換される、アデノシン、デオキシアデノシン、ウリジン、デオキシウリジン、リボチミジン、またはチミジンを含む。
【０００６】
一態様によれば、以下に説明される構造（Ａ）を有する修飾二本鎖核酸分子が提供され、
（Ａ）５′ Ｎ^１−（Ｎ）ｘ−Ｚ ３′（アンチセンス鎖）
３′ Ｚ′−Ｎ^２−（Ｎ′）ｙ−ｚ′′ ５′（センス鎖）
式中、Ｎ^２、Ｎ、およびＮ′のそれぞれが、非修飾もしくは修飾リボヌクレオチド、または非従来的部分であり、
（Ｎ）ｘおよび（Ｎ′）ｙのそれぞれが、それぞれの連続するＮまたはＮ′が、共有結合によって隣接するＮまたはＮ′と連結するオリゴヌクレオチドであり、
ｘおよびｙのそれぞれは、独立して、１７〜３９の整数であり、
（Ｎ′）ｙの配列は、（Ｎ）ｘの配列に相補性があり、（Ｎ）ｘは、標的ＲＮＡの連続する配列に相補性があり、
Ｎ^１は、（Ｎ）ｘに共有結合し、該標的ＲＮＡとミスマッチするか、または前記標的ＲＮＡに相補的なＤＮＡ部分であり、
Ｎ^１は、天然もしくは修飾された、ウリジン、デオキシリボウリジン、リボチミジン、デオキシリボチミジン、アデノシン、またはデオキシアデノシンから成る群から選択される部分であり、式中、ｚ′′は、存在してもしなくてもよいが、存在する場合は、Ｎ^２−（Ｎ′）ｙの５′末端に共有結合するキャッピング部分であり、
ＺおよびＺ′のそれぞれは、独立して、存在するか、あるいは存在しないが、存在する場合は、独立して、それが存在する鎖の３′末端に共有結合する１〜５個の連続するヌクレオチド、連続する非ヌクレオチド部分、またはその組み合わせである。
【０００７】
いくつかの実施形態において、（Ｎ′）ｙの配列は、（Ｎ）ｘの配列に対して完全に相補的である。種々の実施形態において、Ｎ^２−（Ｎ′）ｙの配列は、Ｎ^１−（Ｎ）ｘの配列に対して相補的である。いくつかの実施形態において、（Ｎ）ｘは、標的ＲＮＡの約１７個〜約３９個の連続するヌクレオチドに対して完全に相補的であるアンチセンスを含む。他の実施形態において、（Ｎ）ｘは、標的ＲＮＡの約１７個〜約３９個の連続するヌクレオチドに対して実質的に相補的であるアンチセンスを含む。
【０００８】
いくつかの実施形態において、Ｎ^１およびＮ^２は、ワトソンクリック塩基対を形成する。いくつかの実施形態において、Ｎ^１およびＮ^２は、非ワトソンクリック塩基対を形成する。いくつかの実施形態において、塩基対は、リボヌクレオチドとデオキシリボヌクレオチドとの間に形成される。
【０００９】
いくつかの実施形態において、ｘ＝ｙ＝１８、ｘ＝ｙ＝１９、またはｘ＝ｙ＝２０である。好ましい実施形態において、ｘ＝ｙ＝１８である。
【００１０】
いくつかの実施形態において、Ｎ^１は、（Ｎ）ｘに共有結合し、該標的ＲＮＡとミスマッチする。種々の実施形態において、Ｎ^１は、（Ｎ）ｘに共有結合して、該標的ＲＮＡに対して相補的なＤＮＡ部分である。
【００１１】
いくつかの実施形態において、アンチセンス鎖の１位のウリジンは、アデノシン、デオキシアデノシン、デオキシウリジン、リボチミジン、またはデオキシチミジンから選択されるＮ^１で置換される。種々の実施形態において、Ｎ^１は、アデノシン、デオキシアデノシン、またはデオキシウリジンから選択される。
【００１２】
いくつかの実施形態において、アンチセンス鎖の１位のグアノシンは、アデノシン、デオキシアデノシン、ウリジン、デオキシウリジン、リボチミジン、またはデオキシチミジンから選択されるＮ^１で置換される。種々の実施形態において、Ｎ^１は、アデノシン、デオキシアデノシン、ウリジン、またはデオキシウリジンから選択される。
【００１３】
いくつかの実施形態において、アンチセンス鎖の１位のシチジンは、アデノシン、デオキシアデノシン、ウリジン、デオキシウリジン、リボチミジン、またはデオキシチミジンから選択されるＮ^１で置換される。種々の実施形態において、Ｎ^１は、アデノシン、デオキシアデノシン、ウリジン、またはデオキシウリジンから選択される。
【００１４】
いくつかの実施形態において、アンチセンス鎖の１位のアデノシンは、デオキシアデノシン、デオキシウリジン、リボチミジン、またはデオキシチミジンから選択されるＮ^１で置換される。種々の実施形態において、Ｎ^１は、デオキシアデノシンまたはデオキシウリジンから選択される。
【００１５】
いくつかの実施形態において、Ｎ^１およびＮ^２は、ウリジンまたはデオキシウリジンとアデノシンまたはデオキシアデノシンとの間で塩基対を形成する。他の実施形態において、Ｎ^１およびＮ^２は、デオキシウリジンとアデノシンとの間で塩基対を形成する。
【００１６】
いくつかの実施形態において、二本鎖核酸分子は、ｓｉＲＮＡ、ｓｉＮＡ、またはｍｉＲＮＡである。

下表は、Ｎ１および対応するＮ２の例を提供する。
表１
【表１】

【００１７】
構造（Ａ）のいくつかの実施形態において、Ｎ^１は、ウリジンまたはアデノシンを含む。構造（Ａ）のある実施形態において、Ｎ^２は、２′ＯＭｅ糖修飾リボヌクレオチドを含む。構造（Ａ）のいくつかの実施形態において、Ｎ^１は、２′ＯＭｅ糖修飾リボウリジンを含み、Ｎ^２は、アデノシンまたは修飾アデノシンを含む。構造（Ａ）のいくつかの実施形態において、Ｎ^１は、アデノシンを含み、Ｎ^２は、リボウリジンまたは修飾リボウリジンを含む。
【００１８】
いくつかの実施形態において、ＺおよびＺ′は存在しない。他の実施形態において、ＺまたはＺ′のうちの１つが存在する。
【００１９】
いくつかの実施形態において、ＮおよびＮ′のそれぞれは、非修飾リボヌクレオチドである。いくつかの実施形態において、ＮまたはＮ′のうちの少なくとも１つは、化学的に修飾されたリボヌクレオチドまたは非従来的部分を含む。いくつかの実施形態において、非従来的部分は、ミラーヌクレオチド、脱塩基リボース部分、および脱塩基デオキシリボース部分から選択される。いくつかの実施形態において、非従来的部分は、ミラーヌクレオチド、好ましくは、Ｌ−ＤＮＡ部分である。いくつかの実施形態において、ＮまたはＮ′のうちの少なくとも１つは、２′ＯＭｅ糖修飾リボヌクレオチドを含む。
【００２０】
いくつかの実施形態において、（Ｎ′）ｙの配列は、（Ｎ）ｘの配列に対して完全に相補的である。他の実施形態において、（Ｎ′）ｙの配列は、（Ｎ）ｘの配列に対して実質的に相補的である。
【００２１】
いくつかの実施形態において、（Ｎ）ｘは、標的ｍＲＮＡの約１７個〜約３９個の連続するヌクレオチドに対して完全に相補的であるアンチセンス配列を含む。他の実施形態において、（Ｎ）ｘは、標的ｍＲＮＡの約１７個〜約３９個の連続するヌクレオチドに対して実質的に相補的であるアンチセンスを含む。いくつかの実施形態において、ｘ＝ｙ＝１８である。
【００２２】
ある好ましい実施形態によれば、修飾ヌクレオチドが、糖部分、塩基部分、またはヌクレオチド間連結部分において修飾を有する１つ以上の修飾ヌクレオチドを含む、ｓｉＲＮＡ化合物が、提供される。
【００２３】
構造（Ａ）モチーフは、哺乳動物または非哺乳動物遺伝子に対して任意のオリゴヌクレオチド対（センス鎖およびアンチセンス鎖）とともに有用である。いくつかの実施形態において、哺乳動物遺伝子は、ヒト遺伝子である。
【００２４】
いくつかの実施形態において、構造（Ａ）を有する修飾ｓｉＲＮＡ化合物は、対照化合物、すなわち、ｓｉＲＮＡ化合物と比較して、活性の増強（例えば、ＩＣ５０の減少、ノックダウンの増加、残留ｍＲＮＡの減少）を含む有益な特性を示し、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、標的ｍＲＮＡのヌクレオチド配列に対して完全に相補的である（５′末端ヌクレオチド塩基対、例えば、Ａ−Ｕ、Ｕ−Ａ、Ｃ−Ｇ、Ｇ−Ｃを含む）。いくつかの実施形態において、活性は、対照化合物と比較して、少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも２５％またはそれ以上増強される。
【００２５】
別の態様において、本発明は、センス鎖およびアンチセンス鎖から成る二本鎖ＲＮＡ分子を生成する方法を提供し、本方法は、

ａ）標的ＲＮＡの連続する１７〜２５個のヌクレオチド配列を選択し、該標的ｍＲＮＡの該連続する１７〜２５個のヌクレオチド配列に対して相補性を含むアンチセンス鎖を合成するステップであって、アンチセンス鎖の５′末端ヌクレオチドは、ウリジン、修飾ウリジン、リボチミジン、デオキシリボチミジン、アデノシン、修飾アデノシン、デオキシアデノシン、または修飾デオキシアデノシンで置換されるが、但し、ｒＧ：ｒＵのゆらぎは、アンチセンス鎖の５′末端ヌクレオチドと標的ｍＲＮＡの３′末端ヌクレオチドとの間に生成されないことを条件とする、ステップと、

ｂ）アンチセンス鎖に対して相補性を有する１７〜２５個のヌクレオチドのセンス鎖を合成するステップであって、該センス鎖の３′末端ヌクレオチドは、該ガイド鎖の５′末端ヌクレオチドとのワトソンクリック塩基対を形成する、ステップと、

ｃ）アンチセンスおよびセンス鎖をアニーリングし、それによって、二本鎖ＲＮＡ分子を生成するステップと、を含む。
【００２６】
一態様によれば、本発明は、非修飾二本鎖ＲＮＡ分子と比較して、ＲＮＡｉ活性の増強を示す、センス鎖およびアンチセンス鎖から成る二本鎖ＲＮＡ分子を生成する方法を提供し、本方法は、

ａ）標的ｍＲＮＡの連続する１７〜２５個のヌクレオチド配列を選択し、該標的ｍＲＮＡの該連続する１７〜２５個のヌクレオチド配列を含むセンス鎖を合成するステップであって、該３′末端ヌクレオチドは、アデノシン、修飾アデノシン、デオキシアデノシン、または修飾デオキシアデノシンで置換される、ステップと、

ｂ）該センス鎖に対して相補性を有する１７〜２５個のヌクレオチドのアンチセンス鎖を合成するステップであって、該５′末端ヌクレオチドは、リボウリジン、修飾リボウリジン、デオキシリボウリジン、または修飾デオキシリボウリジン、およびパッセンジャー鎖の３′末端ヌクレオチドとの塩基対を含む、ステップと、

ｃ）該センス鎖を該アンチセンス鎖にアニーリングし、
それによって、増強したＲＮＡｉ活性を有する二本鎖ＲＮＡ分子を生成する、ステップと、を含む。いくつかの実施形態において、修飾二本鎖ＲＮＡ分子は、非修飾ｓｉＲＮＡ二重鎖、すなわち、標的ｍＲＮＡに対して完全な一致を有する二重鎖と比較して、ＲＮＡｉ活性の増強を示す。
【００２７】
別の態様によれば、本発明は、非修飾二本鎖ＲＮＡ分子と比較して、ＲＮＡｉ活性の増強を示す、センス鎖およびアンチセンス鎖から成る修飾二本鎖ＲＮＡ分子を生成する方法を提供し、本方法は、

ａ）標的ｍＲＮＡの連続する１７〜２５個のヌクレオチド配列を選択し、該標的ｍＲＮＡの該連続する１７〜２５個のヌクレオチド配列を含むセンス鎖を合成するステップであって、該３′末端ヌクレオチドは、アデノシン、修飾アデノシン、デオキシアデノシン、または修飾デオキシアデノシンで置換される、ステップと、

ｂ）該センス鎖に対して相補性を有する１７〜２５個のヌクレオチドのアンチセンス鎖を合成するステップであって、該５′末端ヌクレオチドは、リボウリジン、修飾リボウリジン、デオキシリボウリジン、または修飾デオキシリボウリジン、およびセンス鎖の３′末端ヌクレオチドとの塩基対を含む、ステップと、

ｃ）該センス鎖を該アンチセンス鎖にアニーリングし、

それによって、増強したＲＮＡｉ活性を有する二本鎖ＲＮＡ分子を生成するステップと、を含む。
【００２８】
いくつかの実施形態において、ステップａ）は、標的細胞において、標的ＲＮＡの連続する１７〜２５個のヌクレオチド、または１７個、１８個、１９個、２０個、２１個、２２個、２３個、２４個、もしくは２５個のヌクレオチド配列を選択するステップを含み、ここで、３′末端ヌクレオチドは、アデノシン以外である。
【００２９】
別の態様において、哺乳動物または非哺乳動物遺伝子発現を示すのに有効な量の、構造（Ａ）に従う化合物、および薬学的に許容される担体を含む、薬学的組成物が提供される。いくつかの実施形態において、哺乳動物遺伝子は、ヒト遺伝子である。いくつかの実施形態において、非哺乳動物遺伝子は、哺乳動物疾患、好ましくは、ヒト疾患に関与する。
【００３０】
必要とする対象において、疾患または状態の発生または重症度を治療または防止するため、および／または疾患または状態の危険性または重症度を軽減するための方法をさらに提供し、疾患または状態および／またはそれと関連する症状および／または危険性は、哺乳動物または非哺乳動物遺伝子の発現と関連する。好ましい実施形態において、対象は、ヒト対象である。
【００３１】
いくつかの実施形態において、疾患または状態は、聴力損失、急性腎不全（ＡＲＦ）、腎臓移植後の臓器機能障害（ＤＧＦ）、緑内障、眼虚血状態（前部虚血性視神経症、加齢性黄斑変性症（ＡＭＤ）、虚血性視神経障害（ＩＯＮ）およびドライアイ症候群を含む）、急性呼吸促迫症候群（ＡＲＤＳ）、ならびに他の急性肺および呼吸器傷害、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）、一次移植不全、虚血再灌流傷害、再灌流傷害、再灌流浮腫、同種移植片機能不全、肺の再移植応答および／または臓器移植後、特に、肺移植、臓器移植（肺、肝臓、心臓、膵臓、および腎臓移植を含む）の移植後の一次移植機能不全（ＰＧＤ）、腎毒性および神経毒性、脊髄損傷、脳損傷、神経変性疾患もしくは状態、褥瘡、口腔粘膜炎、繊維性疾患（肝線維症、肺線維症を含む）、ならびに癌等の群から選択される。かかる方法は、予防的または治療的に有効な量の１つ以上のかかる化合物を、かかる治療を必要とする哺乳動物に投与することを含み、これは、少なくとも１つのかかる遺伝子の発現または活性を阻害または軽減する。
【００３２】
現在説明されている化合物、方法、物質、および例は、例示的のみのものであり、限定することを意図するものではなく、本明細書に記載のものと類似または同等の物質および方法は、本発明の実践または試験において使用することができる。本発明の他の特性および利点は、以下の詳細な説明および特許請求の範囲から明らかであろう。
【図面の簡単な説明】
【００３３】
【図１】本明細書に提供されるｄｓＲＮＡ分子の略図である。一実施形態において、アンチセンス鎖の５′末端ＧまたはＣヌクレオチドは、Ｕ、ｄＵ、ｒＡ、ｄＡ、ｒＴ、ｄＴで置換されるか、あるいはアンチセンス鎖の５′末端Ｕヌクレオチドは、ｄＵ、ｒＡ、ｄＡ、ｒＴ、ｄＴで置換されるか、あるいはアンチセンス鎖の５′末端Ａヌクレオチドは、Ｕ、ｄＵ、ｄＡ、ｒＴ、ｄＴで置換される。一実施形態において、アンチセンス鎖の５′末端ヌクレオチドは、標的ｍＲＮＡとミスマッチする。別の実施形態において、アンチセンス鎖の５′末端ヌクレオチドは、標的ｍＲＮＡに対して相補的なデオキシリボヌクレオチドである。
【図２】１９位（アンチセンスの１位）で、個々に、４つのリボヌクレオチドを含むように修飾された標的に対する、アンチセンス鎖の１位に異なるヌクレオチドを有するｄｓＲＮＡ分子の活性（残りの残留標的の割合（％））の棒グラフを示す。
【図３】同上
【図４】同上
【図５】同上
【図６】同上
【図７】同上
【図８】同上
【図９】同上
【図１０】同上
【発明を実施するための形態】
【００３４】
本発明は、概して、様々な遺伝子の発現を下方制御するオリゴヌクレオチド化合物、特に、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、具体的には、修飾ｓｉＲＮＡ化合物、ならびに薬学的組成物の調製および様々な病状に苦しんでいる対象の治療における、これらの修飾ｓｉＲＮＡ化合物の使用に関する。
【００３５】
本化合物および組成物は、標的遺伝子の強力なノックダウン活性を含む有益な特性を示し、疾患もしくは状態およびまたはかかる疾患もしくは状態に随伴する症状に苦しんでいる、あるいは遺伝子発現が悪影響を与える疾患もしくは状態にかかる危険性がある、対象の治療に有用である。
【００３６】
したがって、ある態様において、遺伝子発現を下方制御するのに有用な修飾ｓｉＲＮＡ化合物、およびそれを含む薬学的組成物が提供される。
【００３７】
別の態様において、本発明は、微小血管疾患、眼疾患もしくは障害、聴覚障害（聴力損失を含む）、呼吸器系（肺を含む）疾患、神経変性疾患もしくは障害、脊髄損傷、脳損傷 血管形成およびアポトーシス関連状態に苦しんでいる、またはこれらにかかりやすい対象の治療法を提供し、これには、該対象に、遺伝子の発現を下方制御するのに十分な量の哺乳動物もしくは非哺乳動物遺伝子を標的にする少なくとも１つの低分子干渉ＲＮＡを含む薬学的組成物を投与することを含む。
【００３８】
ある実施形態において、対象化合物は、とりわけ、呼吸器疾患、微小血管疾患、または眼疾患の治療のために、標的遺伝子の発現を阻害するのに有用である。特に、治療すべき疾患および状態は、ＡＲＤＳ；ＣＯＰＤ；ＡＬＩ；肺気腫；糖尿病性ニューロパシー、ネフロパシー、および網膜症；ＤＭＥおよび他の糖尿病状態；緑内障；ＡＭＤ；ＢＭＴ網膜症；脳卒中を含む虚血状態；ＯＩＳ；パーキンソン病、アルツハイマー病、ＡＬＳ等の神経変性障害；腎障害：ＡＲＦ、ＤＧＦ、移植片拒絶反応；聴覚障害；脊髄損傷；口腔粘膜炎；癌、ドライアイ症候群、ならびに褥瘡である。
【００３９】
定義
便宜上、本明細書、実施例、および特許請求の範囲で用いられる特定の用語を、本明細書において説明する。
【００４０】
本明細書で使用される場合、単数形「ａ」、「ａｎ」、および「ｔｈｅ」は、文脈が別途明示しない限り、複数形を含むことに留意されたい。本発明の態様または実施形態が、マーカッシュ群または他の代替の群に関して記載される場合、当業者は、本発明が、それによって、任意の個々の要素または群の要素の亜群に関しても記載されていることを認識するであろう。
【００４１】
「阻害剤」は、遺伝子の発現またはこのような遺伝子の産物の活性を、所望の生物学的または生理学的な効果を達成するのに十分な程度まで（部分的または完全に）減少させることができる化合物である。本明細書で使用する「阻害剤」という用語は、ｓｉＲＮＡ阻害剤を指す。「ｓｉＲＮＡ阻害剤」は、遺伝子の発現またはこのような遺伝子の産物の活性を、所望の生物学的または生理学的な効果を達成するのに十分な程度まで減少させることができる化合物である。本明細書で使用する「ｓｉＲＮＡ阻害剤」という用語は、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｓｉＮＡ、合成ｓｈＲＮＡ、およびｍｉＲＮＡのうちの１つ以上を指す。阻害はまた、下方制御、またはＲＮＡｉについてはサイレンシング、と称されてもよい。
【００４２】
本明細書で使用する「阻害する」という用語は、遺伝子の発現またはこのような遺伝子の産物の活性を、所望の生物学的または生理学的な効果を達成するのに十分な程度まで減少させることを指す。阻害は、完全または部分的のいずれかである。
【００４３】
本明細書で使用される場合、標的遺伝子の「阻害」という用語は、遺伝子発現（転写もしくは翻訳）または標的遺伝子の産物のポリペプチド活性の阻害を意味する。本明細書で使用する「遺伝子の産物」とは、ＲＮＡの転写またはポリペプチド等の遺伝子の産物を指す。「ＲＮＡの転写」、「ｍＲＮＡポリヌクレオチド配列」、「ｍＲＮＡ配列」、および「ｍＲＮＡ」という用語は、交換可能に使用される。
【００４４】
本明細書で使用される場合、「ポリヌクレオチド」および「核酸」という用語は、交換可能に使用されてもよく、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）およびリボ核酸（ＲＮＡ）を含むヌクレオチドを指す。この用語は、ヌクレオチドの類似体から作られるＲＮＡまたはＤＮＡのいずれかの類似体を均等物として含むことも理解されたい。本開示全体を通して、ｍＲＮＡ配列は、対応する遺伝子を表すものとして記載される。
【００４５】
「オリゴヌクレオチド」または「オリゴマー」は、約２〜約５０個のヌクレオチドのデオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチド配列を指す。それぞれのＤＮＡまたはＲＮＡヌクレオチドは、独立して、天然もしくは合成、およびまたは修飾もしくは非修飾であってもよい。修飾は、糖部分、塩基部分、およびまたはオリゴヌクレオチドにおけるヌクレオチド間の連結に対する変更を含む。本発明の化合物は、デオキシリボヌクレオチド、リボヌクレオチド、修飾デオキシリボヌクレオチド、修飾リボヌクレオチド、ヌクレオチド類似体、修飾ヌクレオチド類似体、非従来的および脱塩基部分、ならびにこれらの組み合わせを含む、分子を包含する。
【００４６】
実質的に相補的であるとは、別の配列に対する約８４％を超える相補性を指す。例えば、１９個の塩基対から成る二重鎖領域において、１つのミスマッチは、９４．７％の相補性をもたらし、２つのミスマッチは、約８９．５％の相補性をもたらし、３つのミスマッチは、約８４．２％の相補性をもたらし、該二重鎖領域を実質的に相補性にする。したがって、実質的に同一であるとは、別の配列に対する約８４％を超える同一性を指す。
【００４７】
「ヌクレオチド」とは、天然もしくは合成、および修飾もしくは非修飾であり得る、デオキシリボヌクレオチドおよびリボヌクレオチドを包含することを意味する。ヌクレオチドには、合成、天然に生じる、および天然に生じない、公知のヌクレオチド類似体が含まれる。かかる類似体の例としては、ホスホロチオエート、ホスホラミダイト、メチルホスホネート、キラル−メチルホスホネート、２′−Ｏ−メチルリボヌクレオチド、およびペプチド核酸（ＰＮＡ）が含まれるが、これらに限定されない。修飾は、糖部分、塩基部分、およびまたはオリゴリボヌクレオチドにおけるリボヌクレオチド間の連結に対する変更を含む。本明細書で使用される場合、「リボヌクレオチド」という用語は、合成、天然に生じる、および転々に生じない、天然および合成、非修飾および修飾リボヌクレオチドおよびリボヌクレオチド類似体を包含する。修飾は、糖部分、塩基部分、および／またはオリゴヌクレオチドにおけるリボヌクレオチド間の連結に対する変更を含む。
【００４８】
ヌクレオチドは、天然に生じるまたは合成的に修飾される塩基から選択される。天然に生じる塩基には、アデニン、グアニン、シトシン、チミン、およびウラシルが含まれる。ヌクレオチドの修飾された塩基には、イノシン、キサンチン、ヒポキサンチン、２−アミノアデニン、６−メチル、２−プロピル、および他のアルキルアデニン類、５−ハロウラシル、５−ハロシトシン、６−アザシトシンおよび６−アザチミン、擬似ウラシル、デオキシ擬似ウラシル、４−チオウラシル、リボ−２−チオウリジン、リボ−４−チオウリジン、８−ハロアデニン、８−アミノアデニン、８−チオールアデニン、８−チオアルキルアデニン類、８−ヒドロキシルアデニンおよび他の８−置換アデニン類、８−ハログアニン類、８−アミノグアニン、８−チオールグアニン、８−チオアルキルグアニン類、８−ヒドロキシルグアニンおよび他の置換グアニン類、他のアザおよびデアザアデニン類、他のアザおよびデアザグアニン類、５−メチルリボウリジン、５−トリフルオロメチルウラシル、５−メチルリボシトシン、ならびに５−トリフルオロシトシンが含まれる。いくつかの実施形態において、オリゴマーにおける１つ以上のヌクレオチドは、イノシンで置換される。
【００４９】
いくつかの実施形態において、ｓｉＲＮＡ化合物は、糖修飾、塩基修飾、またはヌクレオチド間連結修飾を有するリボヌクレオチドから成る群から選択される少なくとも１つの修飾リボヌクレオチドをさらに含み、ＤＮＡ、ならびにＬＮＡ（ロックされた核酸）、ＥＮＡ（エチレン架橋核酸）、ＰＮＡ（ペプチド核酸）、アラビノシド、ホスホノカルボキシレート、またはホスフィノカルボキシレートヌクレオチド（ＰＡＣＥヌクレオチド）、または６炭素糖を有するヌクレオチド等の修飾ヌクレオチドを含有し得る。
【００５０】
修飾デオキシリボヌクレオチドには、例えば、５′末端位置（位置番号１）におけるヌクレオチドとして有用であり得る５′ＯＭｅ ＤＮＡ（５−メチル−デオキシリボグアノシン−３′−ホスフェート）；ＰＡＣＥ（デオキシリボアデノシン３′ホスホノアセテート、デオキシリボシチジン３′ホスホノアセテート、デオキシリボグアノシン３′ホスホノアセテート、デオキシリボチミジン３′ホスホノアセテート）が含まれる。
【００５１】
架橋核酸には、ＬＮＡ（２′−Ｏ，４′−Ｃ−メチレン架橋核酸アデノシン３′モノホスフェート、２′−Ｏ，４′−Ｃ−メチレン架橋核酸５−メチル−シチジン３′モノホスフェート、２′−Ｏ，４′−Ｃ−メチレン架橋核酸グアノシン３′モノホスフェート、５−メチル−ウリジン（またはチミジン）３′モノホスフェート）；およびＥＮＡ（２′−Ｏ，４′−Ｃ−エチレン架橋核酸アデノシン３′モノホスフェート、２′−Ｏ，４′−Ｃ−エチレン架橋核酸５−メチル−シチジン３′モノホスフェート、２′−Ｏ，４′−Ｃ−エチレン架橋核酸グアノシン３′モノホスフェート、５−メチル−ウリジン（またはチミジン）３′モノホスフェート）が含まれる。
【００５２】
ヌクレオチド／オリゴヌクレオチドのすべての類似体、またはその修飾は、本発明で用いられるが、但し、該類似体または修飾は、例えば、ヌクレオチド／オリゴヌクレオチドの機能等の特性に実質的に悪影響を及ぼさない。許容される修飾には、糖部分の修飾、塩基部分の修飾、ヌクレオチド間連結における修飾、およびこれらの組み合わせが含まれる。
【００５３】
糖修飾には、糖残基の２′部分における修飾が含まれ、とりわけ、欧州特許ＥＰ第０ ５８６ ５２０ Ｂ１号またはＥＰ第０ ６１８ ９２５ Ｂ１号に記載されるような、アミノ、フルオロ、アルコキシ（例えば、メトキシ）、アルキル、アミノ、フルオロ、クロロ、ブロモ、ＣＮ、ＣＦ、イミダゾール、カルボキシレート、チオエート、Ｃ１〜Ｃ１０低級アルキル、置換低級アルキル、アルカリル、もしくはアラルキル、ＯＣＦ_３、ＯＣＮ、Ｏ−、Ｓ−、もしくはＮ−アルキル；Ｏ−、Ｓ−、もしくはＮ−アルケニル；ＳＯＣＨ_３；ＳＯ_２ＣＨ_３；ＯＮＯ_２；ＮＯ_２、Ｎ_３；ヘテロシクロアルキル；ヘテロシクロアルカリル；アミノアルキルアミノ；ポリアルキルアミノもしくは置換シリルを包含する。
【００５４】
一実施形態において、修飾ｓｉＲＮＡ化合物は、糖部分上の２′修飾（「２′糖修飾」）を含む少なくとも１個のリボヌクレオチドを含む。ある実施形態において、ｓｉＲＮＡ化合物は、２′Ｏ−アルキルまたは２′−フルオロまたは２′Ｏ−アリル、またはあらゆる他の２′修飾、任意に、交互の位置に含む。他の安定化する修飾もまた可能である（例えば、末端修飾）。いくつかの実施形態において、好ましい２′Ｏ−アルキルは、２′Ｏ−メチル（メトキシ）糖修飾である。
【００５５】
いくつかの実施形態において、オリゴヌクレオチドの骨格が修飾され、ホスフェート−Ｄ−リボース実体を含むが、チオホスフェート−Ｄ−リボース実体、トリエステル、チオエート、２′−５′架橋骨格（５′−２′とも称され得る）、ＰＡＣＥ等も含有し得る。
【００５６】
本明細書で使用される場合、「非対合ヌクレオチド類似体」という用語は、６デスアミノアデノシン（ネブラリン）、４−Ｍｅ−インドール、３−ニトロピロール、５−ニトロインドール、Ｄｓ、Ｐａ、Ｎ３−ＭｅリボＵ、Ｎ３−ＭｅリボＴ、Ｎ３−Ｍｅ ｄＣ、Ｎ３−Ｍｅ−ｄＴ、Ｎ１−Ｍｅ−ｄＧ、Ｎ１−Ｍｅ−ｄＡ、Ｎ３−エチル−ｄＣ、Ｎ３−Ｍｅ ｄＣが含まれるが、これらに限定されない、非塩基対合部分を含むヌクレオチド類似体を意味する。いくつかの実施形態において、非塩基対合ヌクレオチド類似体は、リボヌクレオチドである。他の実施形態において、非塩基対合ヌクレオチド類似体は、デオキシリボヌクレオチドである。加えて、１つ以上のヌクレオチドの構造が、本質的に変更されており、治療的または実験的試薬としてより良好に適している、ポリヌクレオチドの類似体を調製することができる。ヌクレオチド類似体の例は、ＤＮＡ（またはＲＮＡ）中のデオキシリボース（またはリボース）リン酸骨格が、ペプチド中で見出されるものに類似のポリアミド骨格で置き換えられる、ペプチド核酸（ＰＮＡ）である。ＰＮＡ類似体は、酵素による分解に対して耐性であること、ならびにインビボおよびインビトロにおいて安定性を増強することを示している。他の修飾には、ポリマー骨格、環状骨格、非環状骨格、チオホスフェート−Ｄ−リボース骨格、トリエステル骨格、チオエート骨格、２′−５′架橋骨格、人工核酸、モルホリノ核酸、グリコール核酸（ＧＮＡ）、トレオース核酸（ＴＮＡ）、アラビノシド、およびミラーヌクレオシド（例えば、ベータ−Ｄ−デオキシリボヌクレオシドの代わりにベータ−Ｌ−デオキシリボヌクレオシド）が含まれる。ＬＮＡヌクレオチドを含むｓｉＲＮＡ化合物の例は、Ｅｌｍｅｎら（ＮＡＲ ２００５，３３（１）：４３９−４４７）に開示されている。
【００５７】
いくつかの実施形態において、本発明の化合物は、１つ以上の逆位ヌクレオチド、例えば、逆位チミジンまたは逆位アデノシンを用いて合成される（例えば、Ｔａｋｅｉ，ｅｔ ａｌ，２００２，ＪＢＣ ２７７（２６）：２３８００−０６を参照のこと）。
【００５８】
他の修飾には、キャッピング部分としても知られている３′末端修飾が含まれる。かかる末端修飾は、ヌクレオチド、修飾ヌクレオチド、脂質、ペプチド、糖、および逆位脱塩基部分から選択される。かかる修飾は、例えば、センスおよび／またはアンチセンス鎖の３′末端で組み込まれる。
【００５９】
本発明において「脱塩基ヌクレオチド」または「脱塩基ヌクレオチド類似体」と称されることもあるものは、より正確には、擬似ヌクレオチドまたは非従来的部分と称される。ヌクレオチドは、リボースまたはデオキシリボース糖、リン酸、および塩基（ＤＮＡ中ではアデニン、グアニン、チミン、またはシトシン；ＲＮＡ中ではアデニン、グアニン、ウラシル、またはシトシン）から成る、核酸の単量体単位である。修飾ヌクレオチドは、糖、リン酸、およびまたは塩基のうちの１つ以上の修飾を含む。脱塩基擬似ヌクレオチドは塩基を欠き、したがって、厳密にはヌクレオチドではない。
【００６０】
本明細書で使用される「キャッピング部分」という用語には、脱塩基リボース部分、脱塩基デオキシリボース部分、ならびに２′Ｏアルキル修飾を含む修飾脱塩基リボースおよび脱塩基デオキシリボース部分；逆位脱塩基リボースおよび脱塩基デオキシリボース部分およびそれらの修飾；Ｃ６−イミノ−Ｐｉ；Ｌ−ＤＮＡおよびＬ−ＲＮＡを含むミラーヌクレオチド；５′Ｏ−Ｍｅヌクレオチド；および４′，５′−メチレンヌクレオチドを含むヌクレオチド類似体；１−（β−Ｄ−エリスロフラノシル）ヌクレオチド；４′−チオヌクレオチド、炭素環式ヌクレオチド；５′−アミノ−アルキルホスフェート；１，３−ジアミノ−２−プロピルホスフェート、３−アミノプロピルホスフェート；６−アミノヘキシルホスフェート；１２−アミノドデシルホスフェート；ヒドロキシプロピルホスフェート；１，５−アンヒドロヘキシトールヌクレオチド；アルファ−ヌクレオチド；スレオ−ペントフラノシルヌクレオチド；非環状３′，４′−セコヌクレオチド；３，４−ジヒドロキシブチルヌクレオチド；３，５−ジヒドロキシペンチルヌクレオチド、５′−５′−逆位脱塩基部分；１，４−ブタンジオールホスフェート；５′−アミノ；ならびに架橋および非架橋メチルホスホネートおよび５′−メルカプト部分が含まれる。
【００６１】
ある好ましいキャッピング部分は、脱塩基リボースまたは脱塩基デオキシリボース部分；逆位脱塩基リボースまたは脱塩基デオキシリボース部分；Ｃ６−アミノ−Ｐｉ；Ｌ−ＤＮＡおよびＬ−ＲＮＡを含むミラーヌクレオチドである。
【００６２】
「炭化水素部分」またはその誘導体とは、直鎖もしくは分枝鎖アルキル部分およびそれ自体の部分、またはさらに、アルコール類、リン酸ジエステル、ホスホロチオエート、ホスホノアセテートを含む官能基を含み、これには、アミン、カルボン酸、エステル類、アミド類、アルデヒド類も含まれる。「炭化水素部分」および「アルキル部分」は、交換可能に使用される。
【００６３】
「末端官能基」には、ハロゲン基、アルコール基、アミン基、カルボキシル基、エステル基、アミド基、アルデヒド基、ケトン基、エーテル基が含まれる。
【００６４】
本明細書で使用する「非従来的部分」という用語は、脱塩基リボース部分、脱塩基デオキシリボース部分、デオキシリボヌクレオチド、修飾デオキシリボヌクレオチド、ミラーヌクレオチド、非塩基対合ヌクレオチド類似体、および２′−５′ヌクレオチド間リン酸結合によって隣接するヌクレオチドに連結するヌクレオチド；ロックされた核酸（ＬＮＡ）およびエチレン架橋核酸（ＥＮＡ）を含む架橋核酸を指す。
【００６５】
脱塩基デオキシリボース部分には、例えば、脱塩基デオキシリボース−３′−ホスフェート；１，２−ジデオキシ−Ｄ−リボフラノース−３−ホスフェート；１，４−アンヒドロ−２−デオキシ−Ｄ−リビトール−３−ホスフェートが含まれる。
【００６６】
逆位脱塩基デオキシリボース部分には、逆位デオキシリボ脱塩基、３′，５′逆位デオキシ脱塩基５′−ホスフェートが含まれる。
【００６７】
「ミラー」ヌクレオチドは、天然に生じるかまたは一般に用いられるヌクレオチドと逆のキラリティーを有するヌクレオチド、すなわち、天然に生じる（Ｄ−ヌクレオチド）の鏡像（Ｌ−ヌクレオチド）であり、ミラーリボヌクレオチドの場合にはＬ−ＲＮＡ、および「スピーゲルマー（ｓｐｉｅｇｅｌｍｅｒ）」とも称される。ヌクレオチドは、リボヌクレオチドまたはデオキシリボヌクレオチドであり得、少なくとも１つの糖、塩基、または骨格修飾をさらに含み得る。米国特許第６，５８６，２３８号を参照のこと、また、米国特許第６，６０２，８５８号は、少なくとも１つのＬ−ヌクレオチド置換を含む核酸触媒を開示する。ミラーヌクレオチドには、例えば、Ｌ−ＤＮＡ（Ｌ−デオキシリボアデノシン−３′−ホスフェート（ミラーｄＡ）、Ｌ−デオキシリボシチジン−３′−ホスフェート（ミラーｄＣ）、Ｌ−デオキシリボグアノシン−３′−ホスフェート（ミラーｄＧ）、Ｌ−デオキシリボチミジン−３′−ホスフェート（ミラーｄＴ）およびＬ−ＲＮＡ（Ｌ−リボアデノシン−３′−ホスフェート（ミラーｒＡ）、Ｌ−リボシチジン−３′−ホスフェート（ミラーｒＣ）、Ｌ−リボグアノシン−３′−ホスフェート（ミラーｒＧ）、Ｌ−リボウリジン−３′−ホスフェート（ミラーｄＵ）が含まれる。
【００６８】
一態様によれば、本発明は、非修飾リボヌクレオチド、修飾リボヌクレオチド、および／または非従来的部分を含む、阻害修飾ｓｉＲＮＡ化合物を提供する。いくつかの実施形態において、修飾ｓｉＲＮＡ化合物は、糖修飾、塩基修飾、およびヌクレオチド間連結修飾から成る群から選択される少なくとも１つの修飾ヌクレオチドを含み、ＬＮＡ（ロックされた核酸）等の修飾ヌクレオチドを含み得、これには、ＥＮＡ（エチレン架橋核酸；ＰＮＡ（ペプチド核酸）；アラビノシド；ＰＡＣＥ（ホスホノアセテートおよびその誘導体）、または脱塩基リボース部分、脱塩基デオキシリボース部分、修飾もしくは非修飾デオキシリボヌクレオチド、ミラーヌクレオチド、ならびに２′−５′ヌクレオチド間リン酸結合によって隣接するヌクレオチドに連結するヌクレオチドから選択される６炭素糖もしくは非従来的部分を有するヌクレオチドが含まれる。いくつかの実施形態において、修飾リボヌクレオチドは、２′ＯＭｅ糖修飾リボヌクレオチドである。いくつかの実施形態において、ｓｉＲＮＡは、化合物の３′末端で平滑末端化される、すなわち、ｓｉＲＮＡは、センスまたはパッセンジャー鎖の３′末端およびアンチセンスまたはガイド鎖の５′末端によって定義される末端上で平滑末端化される。
【００６９】
他の実施形態において、２つの鎖のうちの少なくとも１つは、３′末端で少なくとも１つのヌクレオチドの３′オーバーハングを有し、該オーバーハングは、少なくとも１つのデオキシリボヌクレオチドを含む。鎖のうちの少なくとも１つは、任意に、３′末端で少なくとも１つのヌクレオチドのオーバーハングを含む。該オーバーハングは、約１個〜約５個のヌクレオチドから成る。
【００７０】
種々の実施形態において、該オーバーハングは、独立して、ヌクレオチド、非ヌクレオチド、およびこれらの組み合わせから選択される。ある実施形態において、それぞれのオーバーハングは、存在する場合、独立して、リボヌクレオチド、デオキシリボヌクレオチド、脱塩基デオキシリボース部分、脱塩基デオキシリボース部分、Ｃ３−アミノ−Ｐｉ、Ｃ４−アミノ−Ｐｉ、Ｃ５−アミノ−Ｐｉ、Ｃ６−アミノ−Ｐｉ、ミラーヌクレオチドから選択される。
【００７１】
いくつかの実施形態において、Ｚおよび／またはＺ′のそれぞれは、独立して、Ｃ２、Ｃ３、Ｃ４、Ｃ５、またはＣ６アルキル部分、任意に、プロパノール（Ｃ３−ＯＨ）、プロパンジオール、およびプロパンジオールのリン酸ジエステル誘導体（「Ｃ３Ｐｉ」）を含む、Ｃ３［プロパン、−（ＣＨ２）_３−］部分またはその誘導体が含まれる。好ましい実施形態において、Ｚおよび／またはＺ′のそれぞれは、２つの炭化水素部分を含み、いくつかの実施例において、Ｃ３Ｐｉ−Ｃ３ＯＨまたはＣ３Ｐｉ−Ｃ３Ｐｉである。それぞれのＣ３は、共有結合、好ましくはリンをベースとする結合によって、隣接するＣ３に対して、共有結合的に共役している。いくつかの実施形態において、リンをベースとする結合は、ホスホロチオエート、ホスホノアセテート、またはリン酸ジエステル結合である。
【００７２】
特定の実施形態において、ｘ＝ｙ＝１９であり、Ｚは、Ｃ３−Ｃ３を含む。いくつかの実施形態において、Ｃ３−Ｃ３オーバーハングは、共有結合、例えば、リン酸ジエステル結合によって、（Ｎ）ｘまたは（Ｎ′）ｙの３′末端に共有結合する。いくつかの実施形態において、第１のＣ３と第２のＣ３との間の結合は、リン酸ジエステル結合である。いくつかの実施形態において、３′非ヌクレオチドオーバーハングは、Ｃ３Ｐｉ−Ｃ３Ｐｉである。いくつかの実施形態において、３′非ヌクレオチドオーバーハングは、Ｃ３Ｐｉ−Ｃ３Ｐｓである。いくつかの実施形態において、３′非ヌクレオチドオーバーハングは、Ｃ３Ｐｉ−Ｃ３ＯＨである（ＯＨは、ヒドロキシである）。いくつかの実施形態において、３′非ヌクレオチドオーバーハングは、Ｃ３Ｐｉ−Ｃ３ＯＨである。
【００７３】
種々の実施形態において、アルキル部分は、末端ヒドロキシル基、末端アミノ基、または末端ホスフェート基を含む、Ｃ３アルキル、Ｃ４アルキル、Ｃ５アルキル、またはＣ６アルキル部分を含むアルキル誘導体を含む。いくつかの実施形態において、アルキル部分は、Ｃ３アルキル部分またはＣ３アルキル誘導体部分である。いくつかの実施形態において、Ｃ３アルキル部分は、プロパノール、プロピルホスファート、プロピルホスホロチオエート、またはこれらの組み合わせを含む。
【００７４】
Ｃ３アルキル部分は、リン酸ジエステル結合によって、（Ｎ′）ｙの３′末端および／または（Ｎ）ｘの３′末端に共有結合している。いくつかの実施形態において、アルキル部分は、プロパノール、プロピルホスファート、またはプロピルホスホロチオエートを含む。
いくつかの実施形態において、ＺおよびＺ′のそれぞれは、独立して、プロパノール、プロピルホスファート、プロピルホスホロチオエート、これらの組み合わせ、またはこれらの複数の組み合わせ、特に、２もしくは３個の共有結合しているプロパノール、プロピルホスファート、プロピルホスホロチオエート、これらの組み合わせから選択される。
いくつかの実施形態において、ＺおよびＺ′のそれぞれは、独立して、プロピルホスファート、プロピルホスホロチオエート、プロピルホスホプロパノール；プロピルホスホプロピルホスホロチオエート；プロピルホスホプロピルホスファート；（プロピルホスファート）_３、（プロピルホスファート）_２−プロパノール、（プロピルホスファート）_２−プロピルホスホロチオエートから選択される。任意のプロパンまたはプロパノールの共役した部分は、ＺまたはＺ′に含まれ得る。
【００７５】
例示的な３′末端非ヌクレオチド部分の構造は、以下の通りである。
【化１】

【００７６】
さらなる実施形態において、Ｚおよび／またはＺ′のそれぞれは、脱塩基部分と非修飾デオキシリボヌクレオチドもしくはリボヌクレオチドの組み合わせ、または炭化水素部分と非修飾デオキシリボヌクレオチドもしくはリボヌクレオチドの組み合わせ、または脱塩基部分（デオキシリボもしくはリボ）と炭化水素部分の組み合わせを含む。かかる実施形態において、Ｚおよび／またはＺ′のそれぞれは、Ｃ３Ｐｉ−ｒＡｂまたはＣ３Ｐｉ−ｄＡｂを含む。
【００７７】
ＲＮＡ二重鎖の長さは、約１８〜約４０リボヌクレオチド、好ましくは、１９〜２３リボヌクレオチドである。いくつかの実施形態において、それぞれの鎖の長さ（オリゴマー）は、独立して、約１８〜約４０塩基、好ましくは、１８〜２３塩基、およびより好ましくは、１９、２０、もしくは２１リボヌクレオチドから成る群から選択される。
【００７８】
いくつかの実施形態において、修飾ｓｉＲＮＡ化合物および標的核酸のアンチセンス鎖間の相補性は、完全である。他の実施形態において、修飾ｓｉＲＮＡ化合物および標的核酸のアンチセンス鎖は、実質的に相補的である、すなわち、該アンチセンス鎖と標的核酸との間に１つ、２つ、または３つまでのミスマッチを有する。
【００７９】
ある実施形態において、本発明の修飾ｓｉＲＮＡ化合物のアンチセンス鎖とセンス鎖との間の相補性は、完全である。いくつかの実施形態において、該鎖は、実質的に相補的である、すなわち、該アンチセンス鎖と該センス鎖との間に１つ、２つ、または３つまでのミスマッチを有する。
【００８０】
本発明のｓｉＲＮＡ化合物は、標的ｍＲＮＡのヌクレオチドとミスマッチするアンチセンス鎖の５′末端で、共有結合する末端部分を有する。種々の実施形態において、アンチセンス鎖の５′末端での部分は、リボウリジン、デオキシリボウリジン、修飾リボウリジン、修飾デオキシリボウリジン、擬似ウラシル、デオキシ擬似ウラシル、デオキシリボチミジン、修飾デオキシリボチミジン、リボシトシン、修飾リボシトシン、デオキシリボシトシン、修飾デオキシリボシトシン、５−メチルリボシトシン、修飾５−メチルリボシトシン、５−メチルリボウリジン、リボ−２−チオウリジン、リボ−４−チオウリジン、脱塩基リボース部分、および脱塩基デオキシリボース部分から成る群から選択される。
【００８１】
いくつかの実施形態において、本発明の修飾ｓｉＲＮＡ化合物は、５′末端ヌクレオチドを含むアンチセンス鎖が、標的ｍＲＮＡの連続する配列に対して完全に相補的である、ｓｉＲＮＡ化合物と比較して、活性の増強を示す。
【００８２】
本発明のｓｉＲＮＡ構造は、哺乳動物および非哺乳動物遺伝子発現を阻害または軽減するのに有用な二本鎖ＲＮＡに有益に適用する。
【００８３】
ｓｉＲＮＡオリゴヌクレオチド
一態様において、本発明は、以下に説明される構造（Ａ）を有する化合物を提供し、
（Ａ） ５′ Ｎ^１−（Ｎ）ｘ−Ｚ ３′（アンチセンス鎖）
３′ Ｚ′−Ｎ^２−（Ｎ′）ｙ−ｚ′′ ５′（センス鎖）
式中、Ｎ^２、Ｎ、およびＮ′のそれぞれが、非修飾もしくは修飾リボヌクレオチド、または非従来的部分であり、

（Ｎ）ｘおよび（Ｎ′）ｙのそれぞれは、それぞれの連続するＮまたはＮ′が、共有結合によって隣接するＮまたはＮ′と連結するオリゴヌクレオチドであり、

ｘおよびｙのそれぞれは、独立して、１７〜３９の整数であり、

（Ｎ′）ｙの配列は、（Ｎ）ｘの配列に相補性があり、（Ｎ）ｘは、標的ＲＮＡの連続する配列に相補性があり、

Ｎ^１は、（Ｎ）ｘに共有結合し、該標的ＲＮＡとミスマッチするか、または該標的ＲＮＡに相補的なＤＮＡ部分であり、

Ｎ^１は、天然もしくは修飾された、ウリジン、デオキシリボウリジン、リボチミジン、デオキシリボチミジン、アデノシン、またはデオキシアデノシンから成る群から選択される部分であり、式中、Ｚ′′は、存在してもしなくてもよいが、存在する場合は、Ｎ^２−（Ｎ′）ｙの５′末端に共有結合するキャッピング部分であり、

ＺおよびＺ′のそれぞれは、独立して、存在するか、あるいは存在しないが、存在する場合は、独立して、それが存在する鎖の３′末端に共有結合する１〜５個の連続するヌクレオチド、連続する非ヌクレオチド部分、またはそれらの組み合わせである。
【００８４】
いくつかの実施形態において、Ｎ^１は、（Ｎ）ｘに共有結合し、該標的ＲＮＡとミスマッチする。
【００８５】
種々の実施形態において、Ｎ^１は、（Ｎ）ｘに共有結合し、該標的ＲＮＡに対して相補的なＤＮＡ部分である。
【００８６】
いくつかの実施形態において、Ｎ^１およびＮ^２は、ワトソンクリック塩基対を一緒に形成する。他の実施形態において、Ｎ^１およびＮ^２は、非ワトソンクリック塩基対を一緒に形成する。
【００８７】
いくつかの実施形態において、ｘ＝ｙ＝１８である。他の実施形態において、ｘ＝ｙ＝１９である。なお他の実施形態において、ｘ＝ｙ＝２０である。好ましい実施形態において、ｘ＝ｙ＝１８である。
【００８８】
いくつかの実施形態において、Ｎ^１は、修飾リボシトシンまたは修飾リボウリジンである。Ｎ^１のある実施形態において、修飾リボシトシンまたは修飾リボウリジンは、５−メチルリボシトシン、修飾５−メチルリボシトシン、５−メチルリボウリジン、リボ−２−チオウリジン、およびリボ−４−チオウリジンを含む群から選択される。
【００８９】
ある実施形態において、Ｎ^１は、リボシトシン、修飾リボシトシン、デオキシリボシトシン、修飾デオキシリボシトシン、５−メチルリボシトシン、および修飾５−メチルリボシトシンから成る群から選択される。他の実施形態において、Ｎ^１は、リボウリジン、デオキシリボウリジン、修飾リボウリジン、修飾デオキシリボウリジン、擬似ウラシル、デオキシ擬似ウラシル、５−メチルリボウリジン、リボ−２−チオウリジン、およびリボ−４−チオウリジンから成る群から選択される。いくつかの実施形態において、Ｎ^１は、デオキシリボチミジンまたは修飾デオキシリボチミジンである。
【００９０】
いくつかの実施形態において、Ｎ^２は、修飾リボヌクレオチドまたは非修飾リボヌクレオチドである。ある実施形態において、Ｎ^２は、リボグアニン、修飾リボグアニン、デオキシグアニン、修飾デオキシグアニン、リボウリジン、修飾リボウリジン、デオキシリボウリジン、修飾デオキシリボウリジン、アデノシン、修飾アデノシン、デオキシアデノシン、修飾デオキシアデノシン、リボシトシン、修飾リボシトシン、デオキシリボシトシン、および修飾デオキシリボシトシンから成る群から選択される。
【００９１】
いくつかの実施形態において、Ｎ２は、リボグアニン、修飾リボグアニン、デオキシグアニン、リボウリジン、デオキシリボウリジン、アデノシン、デオキシアデノシン、リボシトシン、およびデオキシリボシトシンから成る群から選択される。他の実施形態において、Ｎ２は、リボウリジン、修飾リボウリジン、デオキシリボウリジン、修飾デオキシリボウリジン、アデノシン、修飾アデノシン、デオキシアデノシン、修飾デオキシアデノシン、リボシトシン、修飾リボシトシン、デオキシリボシトシン、および修飾デオキシリボシトシンから成る群から選択される。なお他の実施形態において、Ｎ２は、リボウリジン、修飾リボウリジン、デオキシリボウリジン、修飾デオキシリボウリジン、アデノシン、修飾アデノシン、デオキシアデノシン、修飾デオキシアデノシン、リボシトシン、修飾リボシトシン、デオキシリボシトシン、および修飾デオキシリボシトシンから成る群から選択される。
【００９２】
ある実施形態において、Ｎ^１は、リボシトシン、修飾リボシトシン、デオキシリボシトシン、修飾デオキシリボシトシン、５−メチルリボシトシン、および修飾５−メチルリボシトシンから成る群から選択され、Ｎ^２は、リボグアニン、修飾リボグアニン、デオキシグアニン、リボウリジン、デオキシリボウリジン、アデノシン、デオキシアデノシン、リボシトシン、およびデオキシリボシトシンから成る群から選択される。
【００９３】
いくつかの実施形態において、Ｎ^１は、リボウリジン、デオキシリボウリジン、修飾リボウリジン、修飾デオキシリボウリジン、擬似ウラシル、デオキシ擬似ウラシル、５−メチルリボウリジン、リボ−２−チオウリジン、およびリボ−４−チオウリジンから成る群から選択され、Ｎ^２は、リボウリジン、修飾リボウリジン、デオキシリボウリジン、修飾デオキシリボウリジン、アデノシン、修飾アデノシン、デオキシアデノシン、修飾デオキシアデノシン、リボシトシン、修飾リボシトシン、デオキシリボシトシン、および修飾デオキシリボシトシンから成る群から選択される。
【００９４】
ある実施形態において、Ｎ^１は、デオキシリボチミジンまたは修飾デオキシリボチミジンであり、Ｎ^２は、リボウリジン、修飾リボウリジン、デオキシリボウリジン、修飾デオキシリボウリジン、アデノシン、修飾アデノシン、デオキシアデノシン、修飾デオキシアデノシン、リボシトシン、修飾リボシトシン、デオキシリボシトシン、および修飾デオキシリボシトシンから成る群から選択される。
【００９５】
構造（Ａ）のいくつかの実施形態において、Ｎ^１は、２′ＯＭｅ糖修飾リボウリジンまたは２′ＯＭｅ糖修飾リボシトシンである。構造（Ａ）のある実施形態において、Ｎ^２は、２′ＯＭｅ糖修飾リボヌクレオチドを含む。
【００９６】
いくつかの実施形態において、ＺおよびＺ′は存在しない。他の実施形態において、ＺまたはＺ′のうちの１つが存在する。
【００９７】
種々の実施形態において、ＺおよびＺ′は、独立して、ヌクレオチド、非ヌクレオチド、およびこれらの組み合わせから選択される。ある実施形態において、ＺおよびＺ′のそれぞれは、存在する場合、独立して、リボヌクレオチド、デオキシリボヌクレオチド、脱塩基デオキシリボース部分、脱塩基デオキシリボース部分、Ｃ３−アミノ−Ｐｉ、Ｃ４−アミノ−Ｐｉ、Ｃ５−アミノ−Ｐｉ、Ｃ６−アミノ−Ｐｉ、ミラーヌクレオチドから選択される。いくつかの実施形態において、Ｚが存在する。他の実施形態において、Ｚ′が存在する。さらなる実施形態において、ＺおよびＺ′の双方が存在する。いくつかの実施形態において、ＺおよびＺ′が存在し、これらは同一である。さらなる実施形態において、ＺおよびＺ′が存在し、これらは異なる。いくつかの実施形態において、ＺおよびＺ′は、独立して、１つ、２つ、３つ、４つ、もしくは５つの非ヌクレオチド部分であるか、または２つ、３つ、４つ、もしくは５つの非ヌクレオチド部分およびヌクレオチドの組み合わせである。いくつかの実施形態において、ＺおよびＺ′のそれぞれは、リン酸ジエステル結合によって、ｓｉＲＮＡ鎖の３′末端に共有結合する２つの非ヌクレオチド部分を含む。いくつかの実施形態において、ＺおよびＺ′が存在し、それぞれの１つは、独立して、１つ以上のアルキル部分およびまたはその誘導体を含む。いくつかの実施形態において、Ｎ^２は、リボアデノシンを含み、Ｎ^１は、ウリジン（リボウリジン）を含む。
【００９８】
非ヌクレオチド部分は、脱塩基部分、逆位脱塩基部分、アルキル部分、またはその誘導体、および無機ホスフェードから成る群から選択される。いくつかの実施形態において、非ヌクレオチド部分は、アルキル部分またはその誘導体である。いくつかの実施形態において、アルキル部分は、アルコールを含む末端官能基、末端アミン、末端ホスフェード、または末端ホスホロチオエート部分を含む。
【００９９】
いくつかの実施形態において、Ｚが存在し、脱塩基部分、逆位脱塩基部分、炭化水素部分、またはその誘導体、および無機ホスフェードから成る群から選択される、１つ以上の非ヌクレオチド部分を含む。いくつかの実施形態において、Ｚが存在し、１つ以上のアルキル部分およびまたはその誘導体を含む。
【０１００】
さらなる実施形態において、Ｚ′が存在し、脱塩基部分、逆位脱塩基部分、炭化水素部分、および無機ホスフェードから成る群から選択される、１つ以上の非ヌクレオチド部分を含む。いくつかの実施形態において、Ｚ′が存在し、１つ以上のアルキル部分およびまたはその誘導体を含む。
【０１０１】
さらなる実施形態において、ｘ＝ｙ＝１８であり、ＺあるいはＺ′のいずれかが存在し、独立して、２つの非ヌクレオチド部分を含む。
【０１０２】
さらなる実施形態において、ｘ＝ｙ＝１８であり、ＺおよびＺ′が存在し、それぞれ、独立して、２つの非ヌクレオチド部分を含む。
【０１０３】
いくつかの実施形態において、ＺおよびＺ′のそれぞれは、脱塩基部分、例えば、デオキシリボ脱塩基部分（「ｄＡｂ」として本明細書で称される）またはリボ脱塩基部分（「ｒＡｂ」として本明細書で称される）を含む。いくつかの実施形態において、Ｚおよび／またはＺ′のそれぞれは、２つの共有結合する脱塩基部分を含み、これは、例えば、ｄＡｂ−ｄＡｂまたはｒＡｂ−ｒＡｂまたはｄＡｂ−ｒＡｂまたはｒＡｂ−ｄＡｂである。それぞれの部分は、共有結合、好ましくは、リンをベースとする結合によって、隣接する部分に対して、共有結合的に共役している。いくつかの実施形態において、リンをベースとする結合は、ホスホロチオエート、ホスホノアセテート、またはリン酸ジエステル結合である。
【０１０４】
いくつかの実施形態において、Ｚおよび／またはＺ′のそれぞれは、独立して、アルキル部分、任意に、プロパン［（ＣＨ２）_３］部分、またはその誘導体を含み、これには、プロパノール（Ｃ３−ＯＨ）およびプロパンジオールのホスホ誘導体（「Ｃ３−３′Ｐｉ」）が含まれる。いくつかの実施形態において、Ｚおよび／またはＺ′のそれぞれは、２つの炭化水素部分を含み、いくつかの実施例において、これは、Ｃ３−Ｃ３である。それぞれのＣ３は、共有結合、好ましくは、リンをベースとする結合によって、隣接するＣ３に対して、共有結合的に共役している。いくつかの実施形態において、リンをベースとする結合は、ホスホロチオエート、ホスホノアセテート、またはリン酸ジエステル結合である。
【０１０５】
特定の実施形態において、ｘ＝ｙ＝１８であり、Ｚは、Ｃ３Ｐｉ−Ｃ３ＯＨまたはＣ３Ｐｉ−Ｃ３Ｐｉを含む。特定の実施形態において、ｘ＝ｙ＝１８であり、Ｚは、Ｃ３Ｐｉ−Ｃ３ＯＨまたはＣ３Ｐｉ−Ｃ３Ｐｉを含む。いくつかの実施形態において、Ｃ３−Ｃ３オーバーハングは、共有結合、例えば、リン酸ジエステル結合によって、（Ｎ）ｘまたは（Ｎ′）ｙの３′末端に共有結合する。いくつかの実施形態において、第１のＣ３と第２のＣ３との間の結合は、リン酸ジエステル結合である。
【０１０６】
種々の実施形態において、アルキル部分は、末端ヒドロキシル基、末端アミノ基、末端ホスフェート基を含む、Ｃ３アルキルからＣ６アルキル部分である。いくつかの実施形態において、アルキル部分は、Ｃ３アルキル部分である。いくつかの実施形態において、Ｃ３アルキル部分は、プロパノール、プロピルホスファート、プロピルホスホロチオエート、またはこれらの組み合わせを含む。
【０１０７】
Ｃ３アルキル部分は、リン酸ジエステル結合によって、（Ｎ′）ｙの３′末端およびまたは（Ｎ）ｘの３′末端に共有結合している。いくつかの実施形態において、アルキル部分は、プロパノール、プロピルホスファート、またはプロピルホスホロチオエートを含む。
【０１０８】
いくつかの実施形態において、ＺおよびＺ′のそれぞれは、独立して、プロパノール、プロピルホスフェード、プロピルホスホロチオエート、これらの組み合わせ、またはこれらの複数の組み合わせから選択される。
【０１０９】
いくつかの実施形態において、ＺおよびＺ′のそれぞれは、独立して、プロピルホスファート、プロピルホスホロチオエート、プロピルホスホプロパノール；プロピルホスホプロピルホスホロチオエート；プロピルホスホプロピルホスファート；（プロピルホスファート）_３、（プロピルホスファート）_２−プロパノール、（プロピルホスファート）_２−プロピルホスホロチオエートから選択される。任意のプロパンまたはプロパノールの共役した部分は、ＺまたはＺ′に含まれ得る。
【０１１０】
さらなる実施形態において、Ｚおよび／またはＺ′のそれぞれは、脱塩基部分と非修飾デオキシリボヌクレオチドもしくはリボヌクレオチドの組み合わせ、または炭化水素部分と非修飾デオキシリボヌクレオチドもしくはリボヌクレオチドの組み合わせ、または脱塩基部分（デオキシリボもしくはリボ）と炭化水素部分の組み合わせを含む。かかる実施形態において、Ｚおよび／またはＺ′のそれぞれは、Ｃ３−ｒＡｂまたはＣ３−ｄＡｂを含む。
【０１１１】
好ましい実施形態において、ｘ＝ｙ＝１８であり、Ｚ′が存在せず、Ｚは存在し、かつリン酸ジエステル結合によって互いに共有結合する２つのアルキル部分を含み、Ｎ^２は、リボアデノシンを含み、Ｎ^１は、ウリジンを含む。
【０１１２】
いくつかの実施形態において、ＮおよびＮ′は、非修飾ヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態において、ＮまたはＮ′のうちの少なくとも１つは、化学的に修飾されたリボヌクレオチドまたは非従来的部分を含む。いくつかの実施形態において、非従来的部分は、ミラーヌクレオチド、脱塩基リボース部分、脱塩基デオキシリボース部分、デオキシリボヌクレオチド、修飾デオキシリボヌクレオチド、ミラーヌクレオチド、非塩基対ヌクレオチド類似体、架橋核酸、および２′−５′ヌクレオチド間リン酸結合によって隣接するヌクレオチドに連結するヌクレオチドから成る群から選択される。いくつかの実施形態において、非従来的部分は、ミラーヌクレオチド、好ましくは、Ｌ−ＤＮＡ部分である。いくつかの実施形態において、ＮまたはＮ′のうちの少なくとも１つは、糖、塩基、またはリンカーのうちの１つ以上で修飾される。ある実施形態において、ＮまたはＮ′のうちの少なくとも１つは、２′ＯＭｅ糖修飾リボヌクレオチドを含む。
【０１１３】
ある実施形態において、（Ｎ）ｘおよび（Ｎ′）ｙは、完全に相補的である。他の実施形態において、（Ｎ）ｘおよび（Ｎ′）ｙは、実質的に相補的である。ある実施形態において、（Ｎ）ｘは、標的配列に対して完全に相補的である。他の実施形態において、（Ｎ）ｘは、標的配列に対して実質的に相補的である。ある好ましい実施形態によれば、本発明は、修飾ヌクレオチドが、糖部分、塩基部分、またはヌクレオチド間結合部分において修飾を有する、１つ以上の修飾ヌクレオチドを含む修飾ｓｉＲＮＡ化合物を提供する。
【０１１４】
構造（Ａ）に従う化合物のある実施形態において、（Ｎ）_ｘおよび（Ｎ′）_ｙのそれぞれにおいて、交互に現れるリボヌクレオチドは、２′−ＯＭｅ糖修飾リボヌクレオチドである。構造（Ａ）のいくつかの実施形態において、（Ｎ）ｘにおいて、ヌクレオチドは、非修飾であるか、または（Ｎ）ｘは、交互に現れる２′ＯＭｅ糖修飾リボヌクレオチドおよび非修飾リボヌクレオチドを含み、Ｎ^１−（Ｎ）ｘの中央の位置に位置するリボヌクレオチドは、修飾または非修飾であり、好ましくは非修飾であり、（Ｎ′）ｙは、末端または末端から２番目の位置において、１つの修飾ヌクレオチドをさらに含む非修飾リボヌクレオチドを含む。
【０１１５】
特定の実施形態において、ｘ＝ｙ＝１８であり、Ｎ^１は、２′ＯＭｅ糖修飾リボヌクレオチドを含み、（Ｎ）ｘは、２′ＯＭｅ糖修飾リボヌクレオチドを含み、Ｎ^１−（Ｎ）ｘの中央位置に位置するリボヌクレオチドは、非修飾である。いくつかの実施形態において、（Ｎ′）ｙの５′および３′末端のいずれか、または両方にある少なくとも１つのヌクレオチドは、２′−５′リン酸ジエステル結合によって連結される。いくつかの実施形態において、Ｎ^１は、２′−５′リン酸ジエステル結合によって（Ｎ）ｘの５′末端に連結される。いくつかの実施形態において、（Ｎ′）ｙの５′および３′末端のいずれか、または両方にある少なくとも１つのヌクレオチドは、２′−５′リン酸ジエステル結合によって連結される。いくつかの実施形態において、Ｎ^２は、２′−５′リン酸ジエステル結合によって（Ｎ）ｙの３′末端に連結される。ある実施形態において、ｘ＝ｙ＝１８であり、（Ｎ）ｘにおいて、ヌクレオチドは、修飾リボヌクレオチドと非修飾リボヌクレオチドとの間で交互に現れ、それぞれの修飾リボヌクレオチドは、２′ＯＭｅ糖修飾リボヌクレオチドおよび非修飾であるＮ^１−（Ｎ）ｘの中央位置で位置するリボヌクレオチドであり、Ｎ^２は、２′−５′リン酸ジエステル結合によって（Ｎ）ｙの３′末端に連結され、（Ｎ′）ｙの３′末端で少なくとも２つのヌクレオチドは、２つの２′−５′リン酸ジエステル結合によって連結される。他の好ましい実施形態において、ｘ＝ｙ＝１８であり、（Ｎ）ｘにおいて、ヌクレオチドは、修飾リボヌクレオチドと非修飾リボヌクレオチドとの間で交互に現れ、それぞれの修飾リボヌクレオチドは、２′ＯＭｅ糖修飾リボヌクレオチドおよび非修飾であるＮ^１−（Ｎ）ｘの中央位置で位置するリボヌクレオチドであり、（Ｎ′）ｙの５′末端で少なくとも３つの連続するヌクレオチドは、３つの２′−５′リン酸ジエステル結合によって連結される。さらなる実施形態において、Ｎ^２−（Ｎ）ｙの中央位置に位置するヌクレオチド、すなわち、１０位のヌクレオチドは、２′ＯＭｅ糖修飾リボヌクレオチドである。別の好ましい実施形態において、（Ｎ）ｘにおいて、ヌクレオチドは、２′−ＯＭｅ糖修飾リボヌクレオチドと非修飾リボヌクレオチドとの間に交互に現れ、（Ｎ′）ｙにおいて、５′末端で４つの連続するヌクレオチドは、３つの２′−５′リン酸ジエステル結合によって連結され、５′末端ヌクレオチドまたは５′末端で２つもしくは３つの連続するヌクレオチドは、３′−ＯＭｅ糖修飾を含む。
【０１１６】
ある好ましい実施形態において、ｘ＝ｙ＝１８であり、（Ｎ′）ｙにおいて、少なくとも１つの位置におけるヌクレオチドは、ミラーヌクレオチド、デオキシリボヌクレオチド、および２′−５′ヌクレオチド間連結によって隣接するヌクレオチドに連結するヌクレオチドを含む。
【０１１７】
ある実施形態において、ｘ＝ｙ＝１８であり、（Ｎ′）ｙは、ミラーヌクレオチドを含む。種々の実施形態において、ミラーヌクレオチドは、Ｌ−ＤＮＡヌクレオチドである。ある実施形態において、Ｌ−ＤＮＡは、Ｌ−デオキシリボシチジンである。いくつかの実施形態において、（Ｎ′）ｙは、１７位にＬ−ＤＮＡを含む。他の実施形態において、（Ｎ′）ｙは、１６位および１７位にＬ−ＤＮＡを含む。ある実施形態において、（Ｎ′）ｙは、１位に、ならびに１６位および１７位のうちの１つまたは両方に、Ｌ−ＤＮＡヌクレオチドを含む。
【０１１８】
なお他の実施形態において、（Ｎ′）ｙは、１４位にＤＮＡ、ならびに１６位および１７位のうちの１つまたは両方に、Ｌ−ＤＮＡヌクレオチドを含む。その構造において、１位は、さらに、Ｌ−ＤＮＡまたは脱塩基非従来的部分を含み得る。
【０１１９】
ｘ＝ｙ＝２０である他の実施形態において、上で考察された（Ｎ′）ｙに対する修飾は、１４位、１５位、１６位、１７位の代わりに、１７位、１８位、１９位、２０位上である。１６位および１７位のうちの１つまたは両方における修飾は、２０量体については、１８位または１９位のうちの１つまたは両方である。１８量体における全ての修飾は、２０量体よび２２量体に同様に適応される。
【０１２０】
Ｎ^２−（Ｎ′）ｙの様々な実施形態によれば、Ｎ^２は、２′−５′リン酸ジエステル結合によって（Ｎ）ｙの３′末端に連結され、（Ｎ′）ｙにおいて、３′末端での１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、または１３個の連続するリボヌクレオチドは、２′−５′ヌクレオチド間結合によって結合される。一実施形態において、Ｎ^２は、２′−５′リン酸ジエステル結合によって（Ｎ）ｙの３′末端に連結され、（Ｎ′）ｙの３′末端における３つの連続するヌクレオチドは、３つの２′−５′リン酸ジエステル結合に連結され、２′−５′リン酸ジエステル結合を形成する２′−５′ヌクレオチドのうちの１つ以上は、さらに、３′−ＯＭｅ糖修飾を含む。いくつかの実施形態において、Ｎ^２は、２′−ＯＭｅ糖修飾を含む。さらなる実施形態において、（Ｎ′）ｙの３′末端ヌクレオチドは、２′−ＯＭｅ糖修飾を含む。ある実施形態において、ｘ＝ｙ＝１８であり、（Ｎ′）ｙにおいて、１４位、１５位、１６位、１７位、および１８位における２つまたは３つの連続するヌクレオチドは、２′−５′ヌクレオチド間結合によって隣接するヌクレオチドに連結するヌクレオチドを含む。種々の実施形態において、２′−５′ヌクレオチド間結合を形成するヌクレオチドは、３′デオキシリボースヌクレオチドまたは３′メトキシヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態において、（Ｎ′）ｙにおいて、１６位および１７位におけるヌクレオチドは、２′−５′ヌクレオチド間結合によって連結される。他の実施形態において、（Ｎ′）ｙにおいて、１５〜１６位、１６〜１７位、または１５〜１７位におけるヌクレオチドは、２′−５′ヌクレオチド間結合によって連結される。
【０１２１】
ある実施形態において、（Ｎ′）ｙは、２位にＬ−ＤＮＡ、および１５〜１６位、１６〜１７位、または１５〜１７位における２′−５′ヌクレオチド間結合を含む。
【０１２２】
一実施形態において、３′末端ヌクレオチド、または（Ｎ′）ｙの３′末端における２つもしくは３つの連続するヌクレオチドは、Ｌ−デオキシリボヌクレオチドである。
【０１２３】
他の実施形態において、Ｎ^２−（Ｎ′）ｙにおいて、Ｎ^２は、２′糖修飾ヌクレオチドであり、（Ｎ′）ｙ（Ｎ′）ｙにおいて、いずれの末端における１_、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、または１３個の連続するリボヌクレオチド、または５′および３′末端のそれぞれにおける１〜７個の修飾ヌクレオチドは、独立して、２′糖修飾ヌクレオチドである。いくつかの実施形態において、２′糖修飾は、アミノ、フルオロ、アルコキシ、またはアルキル部分の存在を含む。ある実施形態において、２′糖修飾は、メトキシ部分（２′−ＯＭｅ）を含む。一連の実施形態において、（Ｎ′）ｙの５′末端における３つ、４つ、または５つの連続するヌクレオチドは、２′−ＯＭｅ修飾を含む。別の実施形態において、Ｎ^２および（Ｎ′）ｙの３′末端における２つの連続するヌクレオチドは、２′−ＯＭｅ修飾を含む。
【０１２４】
いくつかの実施形態において、（Ｎ′）ｙにおいて、いずれの末端における１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、または１３個の連続するリボヌクレオチド、または５′末端および３′末端のそれぞれにおける１〜７個の修飾ヌクレオチドは、独立して、二環式ヌクレオチドである。種々の実施形態において、二環式ヌクレオチドは、ロックされた核酸（ＬＮＡ）であるか、またはＬＮＡ種であり、例えば、２′−Ｏ、４′−Ｃ−エチレン−架橋核酸（ＥＮＡ）は、ＬＮＡ種である。
【０１２５】
種々の実施形態において、（Ｎ′）ｙは、５′末端において、または３′末端および５′末端の両方において、修飾ヌクレオチドを含む。
【０１２６】
いくつかの実施形態において、（Ｎ′）ｙの５′末端における少なくとも２つのヌクレオチドは、Ｐ−エトキシ骨格修飾で連結される。いくつかの実施形態において、（Ｎ′）ｙの３′末端におけるＮ^２は、Ｐ−エトキシ骨格修飾で連結される。ある実施形態において、ｘ＝ｙ＝１８であり、（Ｎ）ｘにおいて、ヌクレオチドは、修飾リボヌクレオチドと非修飾リボヌクレオチドとの間で交互に現れ、それぞれの修飾リボヌクレオチドは、２′ＯＭｅ糖修飾リボヌクレオチド、および非修飾であるＮ^１−（Ｎ）ｘの中央位置で位置するリボヌクレオチドであり、Ｎ１は、２′ＯＭｅ糖修飾リボヌクレオチドであり、３′末端における３つの連続するヌクレオチドは、２つのＰ−エトキシ骨格修飾によって連結されるか、または（Ｎ′）ｙの５′末端における４つの連続するヌクレオチドは、３つのＰ−エトキシ骨格修飾によって連結される。さらなる実施形態において、（Ｎ′）ｙの３′末端におけるＮ^２は、Ｐ−エトキシ骨格修飾によって連結される。
【０１２７】
いくつかの実施形態において、（Ｎ′）ｙにおいて、５′末端および３′末端のそれぞれにおける１、２、３、４、５、６、または７個の連続するリボヌクレオチドは、独立して、ミラーヌクレオチド、２′−５′リン酸ジエステル結合によって連結されるヌクレオチド、２′糖修飾ヌクレオチド、または二環式ヌクレオチドである。一実施形態において、（Ｎ′）ｙの５′末端および３′末端における修飾は、同一である。一実施形態において、（Ｎ′）ｙの５′末端における４つの連続するヌクレオチドは、３つの２′−５′リン酸ジエステル結合は、（Ｎ′）ｙの３′末端における２つもしくは３つの連続するヌクレオチドは、２つの２′−５′リン酸ジエステル結合によって連結される。さらなる実施形態において、（Ｎ′）ｙの３′末端におけるＮ^２は、２′−５′リン酸ジエステル結合によって（Ｎ′）ｙの３′末端において連結される。別の実施形態において、（Ｎ′）ｙの５′末端における修飾は、（Ｎ′）ｙの３′末端における修飾とは異なる。１つの特定の実施形態において、（Ｎ′）ｙの５′末端における修飾ヌクレオチドは、ミラーヌクレオチドであり、（Ｎ′）ｙの３′末端における修飾ヌクレオチドは、２′−５′リン酸ジエステル結合によって連結される。別の特定の実施形態において、（Ｎ′）ｙの５′末端における３つの連続するヌクレオチドは、ＬＮＡヌクレオチドであり、（Ｎ′）ｙの３′末端における２つの連続するヌクレオチドは、２つの２′−５′リン酸ジエステル結合によって連結される。（Ｎ）ｘにおいて、ヌクレオチドは、２′ＯＭｅ糖修飾リボヌクレオチドと非修飾リボヌクレオチドとの間で交互に現れ、Ｎ^１−（Ｎ）ｘの中央に位置するリボヌクレオチドは、非修飾である。
【０１２８】
種々の実施形態において、Ｎ^２は、２′−５′リン酸ジエステル結合によって（Ｎ′）ｙの３′末端において連結され、（Ｎ′）ｘの３′末端における２つもしくは３つの連続するヌクレオチドは、１つもしくは２つの２′−５′リン酸ジエステル結合によって連結される。いくつかの実施形態において、Ｎ^２は、２′−５′リン酸ジエステル結合によって（Ｎ′）ｙの３′末端において連結され、（Ｎ′）ｘの３′末端における２つもしくは３つの連続するヌクレオチドは、１つもしくは２つの２′−５′リン酸ジエステル結合によって連結され、３′末端における１つもしくは２つもしくは３つの連続するヌクレオチドは、３′−ＯＭｅ糖修飾を含む。さらなる実施形態において、Ｎ^２は、３′−ＯＭｅ糖修飾を含む。
【０１２９】
別の実施形態において、本発明は、ｘ＝ｙ＝１８であり、（Ｎ）ｘにおいて、ヌクレオチドが、修飾リボヌクレオチドと非修飾リボヌクレオチドとの間で交互に現れる、化合物を提供し、それぞれの修飾リボヌクレオチドは、２′ＯＭｅ糖修飾リボヌクレオチド、および非修飾であるＮ^１−（Ｎ）ｘの中央で位置するリボヌクレオチドであり、（Ｎ′）ｙの３′末端における２つのヌクレオチドは、２つの２′−５′リン酸ジエステル結合によって連結され、（Ｎ′）ｙの５′末端における３つのヌクレオチドは、ＥＮＡ等のＬＮＡである。さらなる実施形態において、Ｎ^２は、２′−５′リン酸ジエステル結合によって、（Ｎ′）ｙの３′末端において連結される。
【０１３０】
別の実施形態において、（Ｎ′）ｙの５′末端における５つの連続するヌクレオチドは、２′ＯＭｅ糖修飾を含み、（Ｎ′）ｙの３′末端における２つの連続するヌクレオチドは、Ｌ−ＤＮＡである。
【０１３１】
なお別の実施形態において、本発明は、ｘ＝ｙ＝１８であり、（Ｎ）ｘが非修飾リボヌクレオチドからなり、（Ｎ′）ｙの３′末端における２つの連続するヌクレオチドは、２′−５′リン酸ジエステル結合によって連結され、（Ｎ′）ｙの５′末端における３つの連続するヌクレオチドは、ＥＮＡ等のＬＮＡである、化合物を提供する。さらなる実施形態において、Ｎ^２は、２′−５′リン酸ジエステル結合によって、（Ｎ′）ｙの３′末端において連結される。
【０１３２】
他の実施形態によれば、（Ｎ′）ｙにおいて、５′末端もしくは３′末端ヌクレオチド、またはいずれかの末端における２、３、４、５、もしくは６つの連続するヌクレオチド、または５′末端および３′末端のそれぞれにおける１〜４つのヌクレオチドは、独立して、ホスホノカルボキシレートまたはホスホノカルボキシレートヌクレオチド（ＰＡＣＥヌクレオチド）である。いくつかの実施形態において、ＰＡＣＥヌクレオチドは、デオキシリボヌクレオチドである。いくつかの好ましい実施形態において、（Ｎ′）ｙにおいて、５′末端および３′末端のそれぞれにおける１つもしくは２つの連続するヌクレオチドは、ＰＡＣＥヌクレオチドである。
【０１３３】
いくつかの実施形態において、本発明の修飾ｓｉＲＮＡ化合物の鎖はいずれも、３′末端および５′末端においてリン酸化されてない。他の実施形態において、センス鎖およびアンチセンス鎖は、３′末端でリン酸化されている。なお別の実施形態において、アンチセンス鎖は、切断可能なリン酸基または切断可能でないリン酸基を用いて末端の５′末端位置においてリン酸化されている。なお別の実施形態において、アンチセンスおよびセンス鎖のいずれかまたは両方は、切断可能なリン酸基または切断可能でないリン酸基を用いて３′末端位置においてリン酸化されている。
【０１３４】
構造（Ａ）は、哺乳動物または非哺乳動物遺伝子に対して任意のオリゴヌクレオチド対（センス鎖およびアンチセンス鎖）とともに有用である。いくつかの実施形態において、哺乳動物遺伝子は、ヒト遺伝子である。オリゴヌクレオチド配列対の例は、本発明の譲渡人が譲り受けたＰＣＴ特許公開ＷＯ第２００６／０２３５４４号、ＷＯ第２００７／０８４６８４号、ＷＯ第２００８／０５０３２９号、ＷＯ第２００７／１４１７９６号、ＷＯ第２００９／０４４３９２号、ＷＯ第２００８／１０６１０２号、ＷＯ第２００８／１５２６３６号、ＷＯ第２００９／００１３５９号、ＷＯ第２００９／０９０６３９号に提供されており、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【０１３５】
別途指示がない限り、本明細書に考察される構造の好ましい実施形態において、それぞれの連続するＮとＮ′との間の共有結合は、リン酸ジエステル結合である。別途指示がない限り、本明細書に考察される構造の好ましい実施形態において、Ｎ^１と（Ｎ）ｘとの間およびＮ^２と（Ｎ′）ｙとの間の共有結合は、リン酸ジエステル結合である。いくつかの実施形態において、共有結合のうちの少なくとも１つは、ホスホロチオエート結合である。
【０１３６】
上記の構造の全てについて、いくつかの実施形態において、（Ｎ）ｘのオリゴヌクレオチド配列は、（Ｎ′）ｙのオリゴヌクレオチド配列に対して完全に相補的である。他の実施形態において、アンチセンス鎖およびセンス鎖は、実質的に相補的である。ある実施形態において、（Ｎ）ｘは、哺乳動物ｍＲＮＡまたは微生物ＲＮＡまたはウイルスＲＮＡに対して完全に相補的である。他の実施形態において、（Ｎ）ｘは、哺乳動物ｍＲＮＡまたは微生物ＲＮＡまたはウイルスＲＮＡに対して実質的に相補的である。
【０１３７】
いくつかの実施形態において、構造（Ａ）を有する修飾ｓｉＲＮＡ化合物は、ｓｉＲＮＡ化合物と比較して、少なくとも増強した活性を含む有益な特性を示し、Ｎ^１は、標的ｍＲＮＡ中のヌクレオチドに対して相補的である。
【０１３８】
本発明は、さらに、哺乳動物または非哺乳動物遺伝子発現を阻害するのに有効な量で、構造（Ａ）に従う本発明の化合物、および薬学的に許容される担体を含む薬学的組成物、ならびに本明細書に開示される疾患および障害のうちのいずれか１つを治療擦るためのその使用を提供する。いくつかの実施形態において、哺乳動物遺伝子は、ヒト遺伝子である。いくつかの実施形態において、非哺乳動物遺伝子は、哺乳動物疾患、好ましくは、ヒト疾患に関与する。
【０１３９】
本発明は、さらに、本明細書に開示される疾患もしくは状態のうちのいずれか１つの発生もしくは重症度を治療または防止するための方法、またはそれを必要とする対象における、本明細書に開示される疾患もしくは状態の危険性もしくは重症度を軽減するための方法に関し、それに随伴する疾患もしくは状態および／または症状もしくは危険性は、哺乳動物または非哺乳動物遺伝子の発現と関連する。好ましい実施形態において、対象は、ヒト対象である。
【０１４０】
ｓｉＲＮＡ合成
公開および特許アルゴリズムを用いて、潜在的なｓｉＲＮＡのセンスおよびアンチセンス配列を生成し、ｓｉＲＮＡのＮ^１および／またはＮ^２を置換して、構造（Ａ）に従う修飾ｓｉＲＮＡ化合物を生成する。
【０１４１】
上記の明細書に従うｓｉＲＮＡ分子は、本明細書に記載されるように、基本的に調製される。本発明の修飾ｓｉＲＮＡ化合物は、リボ核酸（またはデオキシリボ核酸）オリゴヌクレオチドの合成のために、当技術分野で公知である方法のいずれかによって合成される。合成は、一般に、市販品である合成装置（とりわけ、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓから入手可能である）において行われる。オリゴヌクレオチド合成は、例えば、Ｂｅａｕｃａｇｅ ａｎｄ Ｉｙｅｒ，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ １９９２；４８：２２２３−２３１１、Ｂｅａｕｃａｇｅ ａｎｄ Ｉｙｅｒ，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ １９９３；４９：６１２３−６１９４、およびＣａｒｕｔｈｅｒｓ，ｅｔ．ａｌ，Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．１９８７；１５４： ２８７−３１３に記載されており、チオエートの合成は、とりわけ、Ｅｃｋｓｔｅｉｎ，Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１９８５；５４：３６７−４０２に記載されており、ＲＮＡ分子の合成は、Ｓｐｒｏａｔ， ｉｎ Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ ２００５ ｅｄｉｔｅｄ ｂｙ Ｈｅｒｄｅｗｉｊｎ Ｐ．； Ｋａｐ．２： １７−３１に記載されており、それぞれの下流プロセスは、とりわけ、Ｐｉｎｇｏｕｄ ｅｔ ａｌ，ｉｎ ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ １９８９ ｅｄｉｔｅｄ ｂｙ Ｏｌｉｖｅｒ Ｒ．Ｗ．Ａ．；Ｋａｐ． ７：１８３−２０８に記載されている。
【０１４２】
他の合成手順は、当技術分野で既知であり、例えば、Ｕｓｍａｎ ｅｔ ａｌ，１９８７，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ，１０９，７８４５、Ｓｃａｒｉｎｇｅ ｅｔ ａｌ，１９９０，ＮＡＲ．，１８，５４３３、Ｗｉｎｃｏｔｔ ｅｔ ａｌ，１９９５，ＮＡＲ．２３，２６７７−２６８４、およびＷｉｎｃｏｔｔ ｅｔ ａｌ，１９９７，Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ．Ｂｉｏ．，７４，５９に記載される手順は、５′端でのジメトキシトリチルおよび３′端でのホスホラミダイト等の一般的な核酸の保護およびカップリング基を利用し得る。修飾（例えば、２′−Ｏ−メチル化）ヌクレオチドおよび非修飾ヌクレオチドは、所望により組み込まれる。
【０１４３】
いくつかの実施形態において、本発明のオリゴヌクレオチドは、別々に合成し、合成後に、例えば、ライゲーション（Ｍｏｏｒｅ ｅｔ ａｌ．，１９９２，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５６，９９２３、Ｄｒａｐｅｒらの国際特許公開ＷＯ第９３／２３５６９号、Ｓｈａｂａｒｏｖａ ｅｔ ａｌ，１９９１，ＮＡＲ １９，４２４７、Ｂｅｌｌｏｎ ｅｔ ａｌ，１９９７，Ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅｓ & Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ，１６，９５１、Ｂｅｌｌｏｎ ｅｔ ａｌ，１９９７，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍ．８，２０４）、または合成および／または脱保護後のハイブリダイゼーション等によって一緒に連結される。
【０１４４】
化学的に合成した断片のオーバーラップペアは、当技術分野で公知の方法を用いて連結することができる（例えば、米国特許第６，１２１，４２６号を参照のこと）。鎖は、別々に合成し、チューブ中で互いにアニーリングされる。次いで、二本鎖ｓｉＲＮＡは、アニールしなかった一本鎖のオリゴヌクレオチド（例えば、そのうちの一方の過剰のため）からＨＰＬＣで分離される。本発明の修飾ｓｉＲＮＡ化合物に関して、２つまたはそれ以上のかかる配列を合成し、本発明で使用するために一緒に連結することができる。
【０１４５】
本発明のｓｉＲＮＡ化合物は、標的ｍＲＮＡのヌクレオチドとミスマッチするアンチセンス鎖の５′末端で、共有結合する末端部分を有する。種々の実施形態において、アンチセンス鎖の５′末端における部分は、リボウリジン、デオキシリボウリジン、修飾リボウリジン、修飾デオキシリボウリジン、擬似ウラシル、デオキシ擬似ウラシル、デオキシリボチミジン、修飾デオキシリボチミジン、リボシトシン、修飾リボシトシン、デオキシリボシトシン、修飾デオキシリボシトシン、５−メチルリボシトシン、修飾５−メチルリボシトシン、５−メチルリボウリジン、リボ−２−チオウリジン、リボ−４−チオウリジン、脱塩基リボース部分、および脱塩基デオキシリボース部分から成る群から選択され、センス鎖の３′末端における部分は、リボヌクレオチドまたは修飾リボヌクレオチドまたは非従来的部分から選択される。本発明のｓｉＲＮＡ構造は、哺乳動物および非哺乳動物遺伝子発現を阻害または軽減するのに有用な二本鎖ＲＮＡに有益に適用する。
【０１４６】
薬学的組成物
本発明の化合物が原末（ｒａｗ ｃｈｅｍｉｃａｌ）として投与される可能性があるが、それらが薬学的組成物として存在することが好ましい。したがって、本発明は、１つ以上の本発明の修飾ｓｉＲＮＡ化合物、および薬学的に許容される担体を含む、薬学的組成物を提供する。いくつかの実施形態において、薬学的組成物は、２つ以上の本発明の修飾ｓｉＲＮＡ化合物を含む。
【０１４７】
本発明は、さらに、標的遺伝子を阻害するのに有効な量の１つ以上の本発明の化合物に共有結合するか、または共有結合しない本発明の少なくとも１つの化合物、および薬学的に許容する担体を含む薬学的組成物を提供する。いくつかの実施形態において、修飾ｓｉＲＮＡ化合物は、細胞内で内因性の細胞の複合体でプロセスされ、１つ以上の本発明のオリゴリボヌクレオチドを産生する。
【０１４８】
本発明は、さらに、哺乳動物の標的遺伝子の細胞における発現を下方制御するのに有効な量で、薬学的に許容される担体および１つ以上の本発明の修飾ｓｉＲＮＡ化合物を含む薬学的組成物を提供し、該化合物は、標的ｍＲＮＡの配列に対して実質的に相補的な配列を含む。
【０１４９】
いくつかの実施形態において、本発明に従う修飾ｓｉＲＮＡ化合物は、薬学的組成物における主な活性成分である。他の実施形態において、本発明に従う修飾ｓｉＲＮＡ化合物は、２つ以上のｓｉＲＮＡを含有する薬学的組成物の活性成分の１つであり、該薬学的組成物は、さらに、１つ以上の標的遺伝子を標的とする１つ以上のｓｉＲＮＡ化合物から成る。
【０１５０】
本発明はまた、薬学的組成物を調製するプロセスを提供し、これには、
１つ以上の本発明の二本鎖の修飾ｓｉＲＮＡ化合物を提供することと、該化合物を薬学的に許容される担体と混合することと、を含む。
好ましい実施形態において、薬学的組成物の調製のために使用される修飾ｓｉＲＮＡ化合物は、薬学的に有効な用量で担体と混合される。いくつかの実施形態において、本発明の修飾ｓｉＲＮＡ化合物は、ステロイドまたは脂質または別の適切な分子、例えば、コレステロールと共役される。
【０１５１】
ＲＮＡ干渉
ＲＮＡｉ事象に関する多くのＰＣＴ出願が最近、公開されている。これらには、ＰＣＴ公開ＷＯ第００／４４８９５号、ＰＣＴ公開ＷＯ第００／４９０３５号、ＰＣＴ公開ＷＯ第００／６３３６４号、ＰＣＴ公開ＷＯ第０１／３６６４１号、ＰＣＴ公開ＷＯ第０１／３６６４６号、ＰＣＴ公開ＷＯ第９９／３２６１９号、ＰＣＴ公開ＷＯ第００／４４９１４号、ＰＣＴ公開ＷＯ第０１／２９０５８号、およびＰＣＴ公開ＷＯ第０１／７５１６４号が含まれる。
【０１５２】
ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）は、ｄｓＲＮＡ種が細胞質タンパク質複合体内に入る能力に基づき、次いで、相補的細胞ＲＮＡに対して標的化され、それを特異的に分解する。ＲＮＡ干渉応答は、一般的には相補的誘発性サイレンシング複合体（ＲＩＳＣ）と称される、ｓｉＲＮＡを含有するエンドヌクレアーゼ複合体を特長とし、これは、ｓｉＲＮＡ二重鎖のアンチセンス鎖に対して相補的な配列を有する一本鎖ＲＮＡの切断を媒介する。標的ＲＮＡの切断は、ｓｉＲＮＡ二重鎖のアンチセンス鎖に対して相補的な領域の中央で起こり得る（Ｅｌｂａｓｈｉｒ ｅｔ ａｌ，Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ．，２００１，１５（２）：１８８−２００）。より詳細には、より長いｄｓＲＮＡは、ＩＩＩ型ＲＮＡｓｅ（ＤＩＣＥＲ、ＤＲＯＳＨＡ等；Ｂｅｒｎｓｔｅｉｎ ｅｔ ａｌ，Ｎａｔｕｒｅ，２００１，４０９（６８１８）：３６３−６、Ｌｅｅ ｅｔ ａｌ，Ｎａｔｕｒｅ，２００３，４２５（６９５６）：４１５−９）によって、短い（１７〜２９ｂｐ）ｄｓＲＮＡ断片（短期阻害性ＲＮＡ「ｓｉＲＮＡ」とも称される）へと消化される。ＲＩＳＣタンパク質複合体は、これらの断片および相補的ｍＲＮＡを認識する。プロセス全体は、標的ｍＲＮＡのエンドヌクレアーゼ切断という結果となる（ＭｃＭａｎｕｓ & Ｓｈａｒｐ， Ｎａｔｕｒｅ Ｒｅｖ Ｇｅｎｅｔ， ２００２， ３（１０）：７３７−４７、Ｐａｄｄｉｓｏｎ & Ｈａｎｎｏｎ， Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ．２００３， ５（３）：２１７−２４）。（これらの用語および提案された機構のさらなる情報には、例えば、Ｂｅｒｎｓｔｅｉｎ ｅｔ ａｌ，ＲＮＡ ２００１，７（１１）：１５０９−２１、Ｎｉｓｈｉｋｕｒａ，Ｃｅｌｌ ２００１，１０７（４）：４１５−８、およびＰＣＴ公開ＷＯ第０１／３６６４６号を参照のこと）。
【０１５３】
既知の遺伝子に対応するｓｉＲＮＡの選択および合成は、幅広く報告されている；例えば、Ｕｉ−Ｔｅｉ ｅｔ ａｌ．， Ｊ Ｂｉｏｍｅｄ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２００６； ２００６： ６５０５２、Ｃｈａｌｋ ｅｔ ａｌ， ＢＢＲＣ．２００４， ３１９（１）： ２６４−７４、Ｓｉｏｕｄ & Ｌｅｉｒｄａｌ， Ｍｅｔ．Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ； ２００４， ２５２：４５７−６９、Ｌｅｖｅｎｋｏｖａ ｅｔ ａｌ， Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍ．２００４， ２０（３）：４３０−２、Ｕｉ−Ｔｅｉ ｅｔ ａｌ， Ｎｕｃ．Ａｃｉｄ Ｒｅｓ． ２００４， ３２（３）：９３６−４８を参照のこと。修飾ｓｉＲＮＡの使用、およびその産生の例には、Ｂｒａａｓｃｈ ｅｔ ａｌ， Ｂｉｏｃｈｅｍ．， ２００３， ４２（２６）：７９６７−７５、Ｃｈｉｕ ｅｔ ａｌ， ＲＮＡ， ２００３， ９（９）：１０３４−４８、ＰＣＴ公開ＷＯ第２００４／０１５１０７号（Ａｔｕｇｅｎ）、ＷＯ第０２／４４３２１号（Ｔｕｓｃｈｌ ｅｔ ａｌ）、および米国特許第５，８９８，０３１号および同第６，１０７，０９４号を参照のこと。
【０１５４】
ｓｉＲＮＡおよびＲＮＡ干渉
ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）とは、二本鎖（ｄｓ）ＲＮＡ依存性の遺伝子特異的な転写後サイレンシングに関与する現象である。この現象を研究し、哺乳動物細胞を実験的に操作した初期の試みは、長いｄｓＲＮＡ分子に応答して活性化された、活性のある、非特異的な抗ウイルス防御機構によって妨げられた（Ｇｉｌ ｅｔ ａｌ．Ａｐｏｐｔｏｓｉｓ，２０００．５：１０７−１１４）。後に、２１個のヌクレオチドのＲＮＡの合成二重鎖が、哺乳動物細胞において一般的な抗ウイルス防御機構を刺激せずに遺伝子特異的ＲＮＡｉを媒介できることが発見された（Ｅｌｂａｓｈｉｒ ｅｔ ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ ２００１，４１１：４９４−４９８およびＣａｐｌｅｎ ｅｔ ａｌ．ＰＮＡＳ ＵＳＡ ２００１，９８：９７４２−９７４７を参照のこと）。その結果、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）は、遺伝子機能を理解する試みにおける強力なツールとなっている。
【０１５５】
哺乳動物におけるＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）は、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）（Ｆｉｒｅ ｅｔ ａｌ，Ｎａｔｕｒｅ １９９８，３９１：８０６）またはマイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）（Ａｍｂｒｏｓ，Ｎａｔｕｒｅ ２００４，４３１（７００６）：３５０−３５５、Ｂａｒｒｅｌ，Ｃｅｌｌ ２００４，１１６（２）：２８１−９７）によって媒介される。植物における対応するプロセスは、一般的に特異的転写後遺伝子サイレンシング（ＰＴＧＳ）またはＲＮＡサイレンシングと称され、真菌ではクエリング（ｑｕｅｌｌｉｎｇ）とも称される。
【０１５６】
ｓｉＲＮＡとは、その内因性（細胞性）対応物の遺伝子／ｍＲＮＡの発現を下方制御またはサイレンシングする（防止する）、二本鎖ＲＮＡまたは修飾ＲＮＡ分子である。ＲＮＡ干渉の機構を以下に詳述する。
【０１５７】
いくつかの研究により、ｓｉＲＮＡ治療剤が、哺乳動物およびヒトのどちらにおいてもインビボで有効であることが明らかとなっている。Ｂｉｔｋｏらは、呼吸器合胞体ウイルス（ＲＳＶ）ムクレオカプシドのＮ遺伝子に向けられた特異的ｓｉＲＮＡ分子が、鼻腔内投与した場合にマウスの治療に有効であることを示している（Ｎａｔ．Ｍｅｄ．２００５，１１（１）：５０−５５）。ｓｉＲＮＡ治療剤を論じている最新の総説が入手可能である（Ｂａｒｉｋ，ｅｔ ａｌ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｍｅｄ ２００５，８３：７６４−７７３、Ｄａｌｌａｓ ａｎｄ Ｖｌａｓｓｏｖ，Ｍｅｄ．Ｓｃｉ．Ｍｏｎｉｔｏｒ ２００６，１２（４）：ＲＡ６７−７４、Ｃｈａｋｒａｂｏｒｔｙ，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｄｒｕｇ Ｔａｒｇｅｔｓ ２００７，８（３）：４６９−８２、Ｄｙｋｘｈｏｏｒｎ ｅｔ ａｌ，Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ２００６．１３：５４１−５５２）。
【０１５８】
Ｍｕｃｋｅ（ＩＤｒｕｇｓ ２００７ １０（１）：３７−４１）は、眼疾患、例えば、加齢性黄斑変性症（ＡＭＤ）および緑内障を治療するための、様々な標的に対するｓｉＲＮＡを含む最新の治療剤の総説を提示する。
【０１５９】
ｓｉＲＮＡ構造
既知の遺伝子に対応するｓｉＲＮＡの選択および合成は、幅広く報告されている（例えば、Ｕｉ−Ｔｅｉ ｅｔ ａｌ， Ｊ Ｂｉｏｍｅｄ Ｂｉｏｔｅｃｈ．２００６； ２００６： ６５０５２、Ｃｈａｌｋ ｅｔ ａｌ， ＢＢＲＣ．２００４， ３１９（１）： ２６４−７４、Ｓｉｏｕｄ & Ｌｅｉｒｄａｌ， Ｍｅｔ．Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ； ２００４， ２５２：４５７−６９、Ｌｅｖｅｎｋｏｖａ ｅｔ ａｌ， Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍ．２００４， ２０（３）：４３０−２、Ｕｉ−Ｔｅｉ ｅｔ ａｌ， ＮＡＲ．２００４， ３２（３）：９３６−４８、Ｄｅ Ｐａｕｌａ ｅｔ ａｌ， ＲＮＡ ２００７， １３：４３１−５６を参照のこと）。
【０１６０】
修飾ｓｉＲＮＡの使用、およびその産生の例には、例えば、Ｂｒａａｓｃｈ ｅｔ ａｌ， Ｂｉｏｃｈｅｍ．２００３， ４２（２６）：７９６７−７５、Ｃｈｉｕ ｅｔ ａｌ， ＲＮＡ， ２００３， ９（９）：１０３４−４８、ＰＣＴ公開ＷＯ第２００４／０１５１０７号（ａｔｕｇｅｎ ＡＧ）およびＷＯ第０２／４４３２１号（Ｔｕｓｃｈｌ ｅｔ ａｌ）を参照のこと。米国特許第５，８９８，０３１号および同第６，１０７，０９４号は、化学的に修飾されたオリゴマーを記載している。米国特許公開第２００５／００８０２４６号および同第２００５／００４２６４７号は、それぞれ、交互に現れるモチーフを有するオリゴマー化合物および化学的に修飾されたヌクレオシド間結合を有するｄｓＲＮＡ化合物に関する。
【０１６１】
他の修飾が開示されている。５′−リン酸部分の含有は、ショウジョウバエ胚においてｓｉＲＮＡの活性を増強することが示され（Ｂｏｕｔｌａ，ｅｔ ａｌ．，Ｃｕｒｒ．Ｂｉｏｌ．２００１，１１：１７７６−１７８０）、ヒトＨｅＬａ細胞中でのｓｉＲＮＡ機能に必要である（Ｓｃｈｗａｒｚ ｅｔ ａｌ，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ，２００２，１０：５３７−４８）。Ａｍａｒｚｇｕｉｏｕｉら（ＮＡＲ， ２００３， ３１（２）：５８９−９５）は、ｓｉＲＮＡ活性が２′−Ｏ−メチル修飾の位置に依存することを示している。Ｈｏｌｅｎら（ＮＡＲ．２００３，３１（９）：２４０１−０７）は、少数の２′−Ｏ−メチル修飾ヌクレオシドを有するｓｉＲＮＡは、野生型と比較して良好な活性を与えたが、２′−Ｏ−メチル修飾ヌクレオシドの数が増加するにつれて活性が低下したことを報告している。ＣｈｉｕおよびＲａｎａ（ＲＮＡ．２００３，９： １０３４−４８）は、センスまたはアンチセンス鎖中に２′−Ｏ−メチル修飾ヌクレオシドを取り込むことで（完全に修飾された鎖）、非修飾ｓｉＲＮＡと比較してｓｉＲＮＡ活性が激しく低下したことを記載している。２′−Ｏ−メチル基をアンチセンス鎖上の５′末端に配置することにより、活性が大幅に制限されたが、一方で、アンチセンスの３′末端およびセンス鎖の両末端に配置することは許容されたことが報告されている（Ｃｚａｕｄｅｒｎａ ｅｔ ａｌ， ＮＡＲ．２００３， ３１（１１）：２７０５−１６、ＷＯ第２００４／０１５１０７号）。本発明の分子は、安定性があり、活性であり、様々な疾患を治療するための薬学的組成物の調製に有用であるという利点を提供する。
【０１６２】
本発明の譲渡人の、参照することによってその全体が本明細書に組み込まれる、ＰＣＴ特許公開第ＷＯ第２００８／１０４９７８号およびＷＯ第２００９／０４４３９２号は、新規のｓｉＲＮＡ構造を開示する。
【０１６３】
本発明の譲渡人の、ＰＣＴ公開ＷＯ第２００８／０５０３２９号および米国特許出願第１１／９７８，０８９号は、アポトーシス促進遺伝子の阻害剤に関し、これは、参照によりその全体が組み込まれる。
【０１６４】
ＰＣＴ特許公開ＷＯ第２００４／１１１１９１号およびＷＯ第２００５／００１０４３号は、ＲＮＡｉを増強するための方法に関する。
【０１６５】
本発明は、対照と比較して、標的遺伝子の発現を少なくとも２０％、３０％、４０％、または５０％下方制御する方法を提供し、本方法には、標的遺伝子のｍＲＮＡ転写物を、１つ以上の本発明の化合物と接触させることが含まれる。
【０１６６】
さらに、本発明は、哺乳動物における標的遺伝子の発現を、対照と比較して少なくとも２０％、３０％、４０％、または５０％下方制御する方法を提供し、本方法には、１つ以上の本発明の化合物を哺乳動物に投与することが含まれる。本発明の好ましい実施形態において、哺乳動物は、ヒトである。
【０１６７】
種々の実施形態において、構造（Ａ）の二本鎖核酸分子は、標的遺伝子の発現を下方制御し、標的遺伝子の発現の下方制御は、遺伝子機能の下方制御（例えば、とりわけ、ネイティブ遺伝子／ポリペプチドの既知の相互作用を用いた酵素アッセイまたは結合アッセイによって検査し得る）、遺伝子のポリペプチド産物の下方制御（例えば、とりわけ、ウエスタンブロッティング、ＥＬＩＳＡ、または免疫沈降によって検査し得る）、および遺伝子のｍＲＮＡ発現の下方制御（例えば、とりわけ、ノーザンブロッティング、定量的ＲＴ−ＰＣＲ、インサイチュハイブリダイゼーション、またはマイクロアレイハイブリダイゼーションによって検査し得る）を含む群から選択される。
【０１６８】
送達
本発明の修飾ｓｉＲＮＡ化合物は、化合物それ自体として（すなわち、裸のｓｉＲＮＡ）または薬学的に許容される塩として投与され、単独で、または１つ以上の薬学的に許容される担体、溶媒、希釈剤、アジュバント、およびビヒクルと組み合わせて、活性成分として投与される。いくつかの実施形態において、本発明のｓｉＲＮＡ分子は、担体または希釈剤で調製される裸分子（ｎａｋｅｄ ｍｏｌｅｃｕｌｅ）の直接の適用によって標的組織に送達される。
【０１６９】
「裸のｓｉＲＮＡ」という用語は、ウイルス性の配列、ウイルス性の粒子、リポソーム製剤、リポフェクチン、または沈殿剤等を含む、細胞への進入を補助、促進（ｐｒｏｍｏｔｅ）、または増進（ｆａｃｉｌｉｔａｔｅ）するように作用する送達ビヒクルを全く含まないｓｉＲＮＡ分子を指す。例えば、ＰＢＳ中のｓｉＲＮＡは、「裸のｓｉＲＮＡ」である。
【０１７０】
薬学的に許容される担体、溶媒、希釈剤、賦形剤、アジュバント、およびビヒクル、ならびに移植担体とは、一般に、本発明の活性修飾ｓｉＲＮＡ化合物と反応しない、不活性かつ無毒性な固体または液体の充填剤、希釈剤、またはカプセル封入物質を指し、これらにはリポソームおよびミクロスフェアが含まれる。例えば、本発明のｓｉＲＮＡ化合物は、ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）、ＰＥＩ誘導体、例えば、分枝ＰＥＩのオレイン酸およびステアリン酸修飾誘導体、キトサン、またはポリ（乳酸−コ−グリコール酸）（ＰＬＧＡ）を用いて製剤化され得る。例えば、リポソーム、マイクロスフェア、またはナノスフェア中の組成物の製剤化により、安定性を増強し、吸収性をもたらし得る。
【０１７１】
さらに、本組成物は、ペルフルオロカーボン（ＰＦＣ）、例えば、臭化ペルフルオロオクチル（ペルフルブロン）等の人口酸素担体を含み得る。
【０１７２】
本発明に有用な送達系の例には、米国特許第５，２２５，１８２号、第５，１６９，３８３号、第５，１６７，６１６号、第４，９５９，２１７号、第４，９２５，６７８号、第４，４８７，６０３号、第４，４８６，１９４号、第４，４４７，２３３号、第４，４４７，２２４号、第４，４３９，１９６号、および第４，４７５，１９６号が含まれる。多くのこのような移植、送達系、および分子は、当業者に周知である。本発明の１つの特定の実施形態において、局所および経皮製剤が選択される。
【０１７３】
したがって、いくつかの実施形態において、本発明のｓｉＲＮＡ分子は、リポソーム製剤およびリポフェクチン製剤中等で送達され、当業者に周知の方法によって調製することができる。かかる方法は、例えば、米国特許第５，５９３，９７２号、第５，５８９，４６６号、および第５，５８０，８５９号に記載されており、これらは、参照によって本明細書に組み込まれる。
【０１７４】
哺乳動物細胞内への増強および改善されたｓｉＲＮＡの送達を具体的に目的とする送達系が、開発されている（例えば、Ｓｈｅｎ ｅｔ ａｌ ＦＥＢＳ Ｌｅｔ．５３９： １１１−１１４ （２００３）、Ｘｉａ ｅｔ ａｌ， Ｎａｔ． Ｂｉｏｔｅｃｈ． ２０：１００６−１０１０ （２００２）、Ｒｅｉｃｈ ｅｔ ａｌ， Ｍｏｌ．Ｖｉｓｉｏｎ ９：２１０−２１６ （２００３）、Ｓｏｒｅｎｓｅｎ ｅｔ ａｌ， Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． ３２７：７６１−７６６ （２００３）、Ｌｅｗｉｓ ｅｔ ａｌ， Ｎａｔ． Ｇｅｎ． ３２：１０７−１０８ （２００２）、およびＳｉｍｅｏｎｉ ｅｔ ａｌ，ＮＡＲ３１，１１：２７１７−２７２４（２００３））。ｓｉＲＮＡは、最近、霊長類における遺伝子発現の阻害での使用が成功している（詳細については、例えば、Ｔｏｌｅｎｔｉｎｏ ｅｔ ａｌ．，Ｒｅｔｉｎａ ２００４．２４（１）： １３２−１３８を参照のこと）。
【０１７５】
本発明の化合物の送達を改善するためのさらなる製剤は、非製剤化化合物、コレステロールに共有結合する化合物、および標的抗体に結合する化合物を含むことができる（Ｓｏｎｇ ｅｔ ａｌ， Ａｎｔｉｂｏｄｙ ｍｅｄｉａｔｅｄ ｉｎ ｖｉｖｏ ｄｅｌｉｖｅｒｙ ｏｆ ｓｍａｌｌ ｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇ ＲＮＡｓ ｖｉａ ｃｅｌｌ−ｓｕｒｆａｃｅ ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ， Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２００５． ２３（６）：７０９−１７）。コレステロール共役ｓｉＲＮＡ（および他のステロイドおよび脂質共役ｓｉＲＮＡ）は、送達のために使用することができる（例えば、Ｓｏｕｔｓｃｈｅｋ ｅｔ ａｌ Ｎａｔｕｒｅ．２００４． ４３２： １７３−１７７、およびＬｏｒｅｎｚ ｅｔ ａｌ．Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔｔ．２００４．１４：４９７５−４９７７を参照のこと）。
【０１７６】
裸のｓｉＲＮＡまたは本発明の化学的に修飾されたｓｉＲＮＡを含む薬学的組成物は、個々の患者の臨床状態、治療すべき疾患、投与の部位および方法、投与のスケジュール、患者の年齢、性別、体重ならびに医療従事者に知られている他の要素を考慮して、良好な医療行為に従って、投与および投薬する。
【０１７７】
本明細書の目的のための「治療上有効な用量」は、当技術分野で知られているそのような検討事項によって決定される。用量は、生存率の改善もしくはより迅速な回復、または症状の改善もしくは排除、および当業者によって適切な手段によって選択される他の指標が含まれるが、これらに限定されない、改善を達成するために有効なものでなければならない。本発明のｓｉＲＮＡは、単回投与または複数回投与で投与することができる。
【０１７８】
通常、ヒトにおける化合物の活性用量は、１日につき体重１ｋｇあたり１ｎｇ／ｋｇ〜約２０〜１００ｍｇ／ｋｇの範囲、好ましくは１日につき体重１ｋｇあたり約０．０１ｍｇ〜約２〜１０ｍｇ／ｋｇ、単回投与または１日１回または１日２回もしくは３回の用量のレジメンで、１〜４週間またはそれより長い期間である。
【０１７９】
本発明の修飾ｓｉＲＮＡ化合物は、従来の投与経路のうちのいずれかによって投与することができる。修飾ｓｉＲＮＡ化合物は、経口、皮下、または非経口投与され、これには、静脈内、動脈内、筋肉内、腹腔内、眼球内、耳、トランス鼓室（ｔｒａｎｓｔｙｍｐａｎｉｃ）および鼻腔内の投与、気管内点滴注入および気管内吸入、同様に輸液技術が含まれる。化合物の移植も有用である。
【０１８０】
液体形態は、侵襲的投与、例えば、注射、または局所（ｔｏｐｉｃａｌ）もしくは局部的（ｌｏｃａｌ）もしくは非侵襲的投与用に調製される。注射という用語には、皮下、経皮、静脈内、筋肉内、くも膜下腔内、眼球内、および他の非経口投与経路（が含まれる。液体組成物には、有機共溶媒、水性もしくは油性の懸濁液、食用油を用いた乳濁液、および同様の製薬ビヒクルを用いた、ならびに用いない、水溶液が含まれる。特定の実施形態において、投与は、静脈内投与を含む。
【０１８１】
いくつかの実施形態において、本発明の化合物は、非侵襲的投与用に製剤化される。いくつかの実施形態において、本発明の化合物は、耳への局所投与用の点耳剤として製剤化される。いくつかの実施形態において、本発明の化合物は、眼の表面への局所投与用の点眼剤として製剤化される。本発明の化合物の投与におけるさらなる情報は、Ｔｏｌｅｎｔｉｎｏ ｅｔ ａｌ．， Ｒｅｔｉｎａ ２００４． ２４：１３２−１３８、およびＲｅｉｃｈ ｅｔ ａｌ．， Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｖｉｓｉｏｎ， ２００３． ９：２１０−２１６に見出すことができる。加えて、ある実施形態において、本発明の治療で用いる組成物は、例えば、鼻腔内投与用に、エアロゾルとして形成される。ある実施形態において、本発明の治療で用いる組成物は、例えば、鼻腔内点滴注入用の点鼻剤として形成される。
【０１８２】
本発明の治療組成物は、好ましくは、これらの組成物／化合物を含有するエアロゾルの吸入によって、または該組成物の鼻腔内もしくは気管内点滴注入によって、肺に投与される。薬学的組成物の肺送達におけるさらなる情報については、Ｗｅｉｓｓ ｅｔ ａｌ．，Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ １９９９．１０：２２８７−２２９３、Ｄｅｎｓｍｏｒｅ ｅｔ ａｌ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｔｈｅｒａｐｙ １９９９．１：１８０−１８８、Ｇａｕｔａｍ ｅｔ ａｌ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｔｈｅｒａｐｙ ２００１．３：５５１−５５６、およびＳｈａｈｉｗａｌａ & Ｍｉｓｒａ，ＡＡＰＳ ＰｈａｒｍＳｃｉＴｅｃｈ ２００４．２４；６（３）：Ｅ４８２−６を参照のこと。さらに、ｓｉＲＮＡのための呼吸器製剤は、米国特許出願第２００４／００６３６５４号に記載されている。ｓｉＲＮＡのための呼吸器製剤は、米国特許出願第２００４／００６３６５４号に記載されている。
【０１８３】
ある実施形態において、経口組成物（錠剤、懸濁液、溶液等）は、口腔粘膜炎の治療のためのマウスウォッシュに適している経口組成物等の口腔への局部的送達に有効であり得る。
【０１８４】
特定の実施形態において、本発明の修飾ｓｉＲＮＡ化合物は、腎臓疾患、例えば、急性腎不全（ＡＲＦ）、臓器移植後臓器機能障害（ＤＧＦ）、および糖尿病性網膜症等の治療における、腎臓への送達のための静脈内投与用に製剤化される。腎臓の近位細管中の標的細胞への本発明に従う修飾ｓｉＲＮＡ化合物の送達は、特に、ＡＲＦおよびＤＧＦの治療に有効であることに留意されたい。
【０１８５】
脳への化合物の送達は、とりわけ、脳外科的移植、血液脳関門分裂、脂質媒介性輸送、担体媒介性流入もしくは流出、血漿タンパク質媒介性輸送、受容体媒介性トランスサイトーシス、吸収性媒介性トランスサイトーシス、血液脳関門での神経ペプチド輸送、および薬物標的のための遺伝的に改変する「トロイの木馬」等の幾つかの方法によって達成される。上記の方法は、例えば、“Ｂｒａｉｎ Ｄｒｕｇ Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ：ｔｈｅ ｆｕｔｕｒｅ ｏｆ ｂｒａｉｎ ｄｒｕｇ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ”，Ｗ．Ｍ． Ｐａｒｄｒｉｄｇｅ， Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ， Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ， ＵＫ （２００１）に記載されるように、行われる。
【０１８６】
加えて、ある実施形態において、本発明の治療で用いる組成物は、例えば、鼻腔内投与用のエアロゾルとして形成される。
【０１８７】
ＣＮＳ疾患の治療用の鼻腔内送達は、例えば、米国特許出願公開第２００６００３９８９号およびＰＣＴ出願公開ＷＯ第２００４／００２４０２号およびＷＯ第２００５／１０２２７５号に記載されるような、ガランタミンおよび様々な塩およびガランタミンの誘導体等のアセチルコリンエステラーゼ阻害剤を用いて達成している。例えば、点鼻剤の鼻腔内点滴注入によるＣＮＳ疾患の治療のための核酸の鼻腔内送達は、例えば、ＰＣＴ出願公開ＷＯ第２００７／１０７７８９号に記載されている。
【０１８８】
治療方法
一態様において、本発明は、標的遺伝子発現と関連する疾患に苦しんでいる対象を治療する方法に関し、本方法は、対象に、治療有効量の本発明の修飾ｓｉＲＮＡ化合物を投与することを含む。好ましい実施形態において、治療すべき対象は、温血動物であり、特に、ヒトを含む哺乳動物である。
【０１８９】
「対象を治療する」とは、対象に、疾患と関連する症状を改善する、重症度を軽減するか、もしくは該疾患を治す、該疾患の進行を遅延させる、該疾患が発生するのを防止する、または該疾患の発症を遅らせるのに有用な治療物質を投与することを指す。「治療」とは、治療上の治療および予防的（ｐｒｏｐｈｙｌａｃｔｉｃ）または予防的（ｐｒｅｖｅｎｔａｔｉｖｅ）な手段の両方を指し、その目的は、障害を防止する、該障害の発症を遅延させるか、あるいは障害の症状を軽減することである。治療を必要とするものは、既に疾患または状態を経験しているもの、疾患または状態を有する傾向にあるもの、および疾患または状態が防止されるものが含まれる。本発明の化合物は、疾患または状態が発症する前、その間、またはその後に投与する。
【０１９０】
「治療上有効な用量」とは、生存率の改善もしくはより迅速な回復、または症状の改善もしくは排除、疾患の発症の遅延、疾患の進行の遅延、および当業者によって適切な決定手段によって選択される他の指標が含まれるが、これらに限定されない、対象またはその生理学的系の改善を達成するために有効な、薬学的化合物または組成物の量を指す。
【０１９１】
「呼吸器疾患」とは、とりわけ、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）、肺気腫、慢性気管支炎、喘息、および肺癌を含む、全てのタイプの肺疾患が含まれるが、これらに限定されない、呼吸器系の状態、疾患、または症候群を指す。肺気腫および慢性気管支炎は、ＣＯＰＤの一部として、または独立して、発生し得る。種々の実施形態において、本発明は、一次移植不全、虚血再灌流傷害、再灌流傷害、再灌流浮腫、同種移植片機能不全、肺の再移植応答および／または臓器移植後、特に、肺移植の一次移植機能不全（ＰＧＤ）を防止または治療するのに有用な方法および組成物を、それを必要とする対象に提供する。
【０１９２】
「微小血管疾患」とは、微小毛細血管およびリンパ管に影響を及ぼす任意の状態、特に、血管攣縮性疾患、脈管炎疾患、およびリンパ管閉塞性疾患を指す。微小血管疾患の例には、とりわけ、眼の障害、例えば、一過性黒内障（塞栓性またはＳＬＥ続発性）、抗リン脂質抗体症候群（ａｐｌａ ｓｙｎｄｒｏｍｅ）、Ｐｒｏｔ ＣＳおよびＡＴＩＩＩ欠乏症、静注薬使用に起因する微小血管病変、タンパク異常血症、側頭動脈炎、虚血性視神経障害（ＩＯＮ）、前部虚血性視神経症（ＡＩＯＮ）、（原発性または自己免疫疾患に続発性の）視神経炎、緑内障、フォンヒッペル・リンダウ症候群、角膜疾患、角膜移植拒絶反応白内障（ｃｏｒｎｅａｌ ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ ｒｅｊｅｃｔｉｏｎ ｃａｔａｒａｃｔｓ）、イールズ病、霜状分枝血管炎、輪状バックリング手術（ｅｎｃｉｒｃｌｉｎｇ ｂｕｃｋｌｉｎｇ ｏｐｅｒａｔｉｏｎ）、毛様体扁平部炎を含むブドウ膜炎、脈絡膜黒色腫、脈絡膜血管腫、視神経形成不全；網膜の状態、例えば、網膜動脈閉塞、網膜静脈閉塞、未熟児網膜症、ＨＩＶ網膜症、プルチャーの網膜症、全身性血管炎および自己免疫疾患の網膜症、糖尿病性網膜症、高血圧性網膜症、放射線網膜症、網膜動脈分枝閉塞または網膜静脈分枝閉塞、特発性網膜血管炎、動脈瘤、視神経網膜炎、網膜塞栓形成、急性網膜壊死、バードショット網膜脈絡膜症（ｂｉｒｄｓｈｏｔ ｒｅｔｉｎｏｃｈｏｒｏｉｄｏｐａｔｈｙ）、長期的網膜剥離；全身性の状態、例えば、真性糖尿病、糖尿病性網膜症（ＤＲ）、糖尿病関連微小血管病変（本明細書中に詳述されるような）、過粘稠度症候群、大動脈弓症候群および眼虚血症候群、頚動脈海綿静脈洞瘻、多発性硬化症、全身性エリテマトーデス、ＳＳ−Ａ自己抗体を伴う細動脈炎、急性多病巣性出血性血管炎（ａｃｕｔｅ ｍｕｌｔｉｆｏｃａｌ ｈｅｍｏｒｒｈａｇｉｃ ｖａｓｃｕｌｉｔｉｓ）、感染に起因する血管炎、ベーチェット病に起因する血管炎、サルコイドーシス、凝固障害、ニューロパシー、ネフロパシー、腎臓の微小血管疾患、ならびに虚血性微小血管状態が挙げられる。
【０１９３】
微小血管障害は、血管新生的要素を含み得る。「血管新生障害」という用語は、血管の形成（新生血管形成）が患者に有害である状態を指す。眼の新生血管形成の例には、網膜疾患（糖尿病性網膜症、糖尿病性黄斑浮腫、慢性緑内障、網膜剥離、および鎌状赤血球網膜症）；虹彩血管新生（ｒｕｂｅｏｓｉｓ ｉｒｉｔｉｓ）；増殖性硝子体網膜症；炎症性疾患；慢性ブドウ膜炎；腫瘍（網膜芽腫、偽神経膠腫、および黒色腫）；フックス紅彩異色性虹彩毛様体炎（Ｆｕｃｈｓ’ｈｅｔｅｒｏｃｈｒｏｍｉｃ ｉｒｉｄｏｃｙｃｌｉｔｉｓ）；新生血管緑内障；角膜血管新生（虹彩の炎症性、移植、および発達性の形成不全）；水晶体切除術と併せた硝子体切除術後の新生血管形成、血管疾患（網膜虚血、脈絡膜血管不全、脈絡膜血栓、および頸動脈虚血）；視神経の新生血管形成；ならびに眼の穿通または挫傷性の（ｃｏｎｔｕｓｉｖｅ）眼外傷に起因する新生血管形成が含まれる。種々の実施形態において、これら全ての血管新生状態は、本発明の化合物および薬学的組成物を用いて治療される。
【０１９４】
「眼の疾患」とは、脈絡膜血管新生（ＣＮＶ）、滲出型および萎縮型加齢性黄斑変性症、眼ヒストプラスマ症候群、網膜色素線条症（ａｎｇｉｏｄ ｓｔｒｅａｋｓ）、ブルッフ膜における破裂、近視性変性、眼腫瘍、網膜変性疾患、および網膜静脈閉塞症（ＲＶＯ）を含むいずれかの状態が含まれるが、これらに限定されない、眼の状態、疾患、または症候群を指す。種々の実施形態において、本明細書中に示される定義の下では、微小血管障害および眼疾患のいずれか、またはその両方とされている、ＤＲ等の本明細書中に開示される状態は、本発明の方法に従って治療される。
【０１９５】
より具体的には、本発明は、成人呼吸促迫症候群（ＡＲＤＳ）；慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）；急性肺傷害（ＡＬＩ）；気腫；糖尿病性ニューロパシー、ネフロパシー、および網膜症；糖尿病性黄斑浮腫（ＤＭＥ）および他の糖尿病性状態；緑内障；加齢性黄斑変性（ＡＭＤ）；骨髄移植（ＢＭＴ）網膜症；虚血性状態；眼の虚血性症候群（ＯＩＳ）；腎障害：急性腎不全（ＡＲＦ）、臓器移植後臓器機能障害（ＤＧＦ）、移植拒絶反応；聴覚障害（聴覚損失を含む）；脊髄損傷；口腔粘膜炎；ドライアイ症候群および褥瘡；虚血性または低酸素状態から生じる神経障害、例えば高血圧、高血圧性脳血管疾患、血栓または塞栓の場合に起こるような−血管の狭窄または閉塞、血管腫、血液疾患（ｂｌｏｏｄ ｄｙｓｃｒａｓｉａｓ）、心停止または心不全を含む心機能不全のいずれかの形態、全身性低血圧；脳卒中、中枢神経系の疾患、障害、および損傷（てんかん、脊髄損傷、脳損傷が含まれるが、これらに限定されない）、ならびに神経変性障害（パーキンソン病、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ、ルーゲーリック病）、アルツハイマー病、ハンチントン病および他のいずれかの疾患により誘導される認知症（例えば、ＨＩＶ関連認知症）が含まれるが、これらに限定されない）に罹患しているか、またはこれらに感受性である対象の治療において有用な方法および組成物を提供する。
【０１９６】
本発明は、癌の治療に有用な化合物、組成物、および方法に関する。「癌」および「癌性」という用語は、一般に、非制御の細胞増殖によって特徴付けられる、哺乳動物における生理学的状態を指すか、あるいは記載する。癌の例としては、癌腫、リンパ腫、芽細胞腫、肉腫、および白血病またはリンパ性悪性腫瘍が含まれるが、これらに限定されない。このような癌の他の例には、腎臓癌（ｋｉｄｎｅｙ ｏｒ ｒｅｎａｌ ｃａｎｃｅｒ）、乳癌、結腸癌、直腸癌、結腸直腸癌、肺癌（小細胞肺癌、非小細胞肺癌、肺の腺癌、および肺の扁平上皮癌を含む）、扁平上皮癌（例えば、扁平上皮細胞癌）、子宮頸癌、卵巣癌、前立腺癌、肝臓癌、膀胱癌、腹膜の癌、肝細胞癌、胃癌（ｇａｓｔｒｉｃ ｏｒ ｓｔｏｍａｃｈ ｃａｎｃｅｒ）（消化管癌、消化管間質腫瘍（ＧＩＳＴ）を含む）、膵臓癌、頭頸部癌、グリア芽腫、網膜芽細胞腫、星状細胞腫、莢膜細胞腫、男化腫瘍、肝癌、非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）を含む血液悪性腫瘍、多発性骨髄腫および急性の血液系悪性腫瘍、子宮内膜もしくは子宮カルチノーマ、子宮内膜症、線維肉腫、絨毛膜癌、唾液腺カルチノーマ、外陰部癌、甲状腺癌、食道カルチノーマ、肝癌、肛門部のカルチノーマ、陰茎カルチノーマ、上咽頭癌、喉頭のカルチノーマ、カポシ肉腫、メラノーマ、皮膚カルチノーマ、シュワン腫、乏突起細胞腫、神経芽細胞腫、横紋筋肉腫、骨原性肉種、平滑筋肉腫、尿路カルチノーマ、甲状腺カルチノーマ、ウィルムス腫瘍、ならびにＢ細胞リンパ腫（低級／濾胞性非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）；小リンパ球（ＳＬ）ＮＨＬ；中級／濾胞性ＮＨＬ；中級びまん性ＮＨＬ；高級免疫芽細胞性ＮＨＬ；高級リンパ芽球性ＮＨＬ；高級小非分割細胞ＮＨＬ；バルキー疾患ＮＨＬ；外套細胞リンパ腫；エイズ関連リンパ腫；およびワルデンストロームのマクログロブリン病を含む）；慢性リンパ球性白血病（ＣＬＬ）；急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）；へアリー細胞白血病；慢性骨髄芽球性白血病；および移植後リンパ増殖性疾患（ＰＴＬＤ）、ならびに母斑症、浮腫（脳腫瘍と関連するもの等）、およびメイグス症候群と関係している異常な血管性増殖が含まれる。本明細書で使用される「腫瘍」とは、悪性または良性に関わらず、全ての腫瘍形成細胞成長および増殖、および全ての前癌性および癌性細胞および組織を意味する。
【０１９７】
線維性疾患には、肝線維症、肝硬変、肺線維症（ＩＬＦを含む）を含む肺の線維症、任意の状態から起因する腎臓の線維症（例えば、ＥＳＲＤを含むＣＫＤ）、腹膜線維症、慢性肝障害、原線維発生（ｆｉｂｒｉｌｌｏｇｅｎｅｓｉｓ）、他の臓器における線維症、偶発性および医原性（手術）の全ての可能な皮膚損傷のタイプと関連する異常な瘢痕化（ケロイド）；硬皮症；心臓線維症、緑内障濾過手術の失敗；および腸管癒着症が含まれる。
【０１９８】
さらに、本発明は、対照と比較して、標的遺伝子の発現を少なくとも２０％、３０％、４０％、または５０％下方制御する方法を提供し、本方法は、標的ｍＲＮＡを、１つ以上の本発明の修飾ｓｉＲＮＡ化合物と接触させることを含む。種々の実施形態において、本発明の修飾ｓｉＲＮＡ化合物は、標的遺伝子を下方制御し、この下方制御は、遺伝子機能の下方制御、ポリペプチドの下方制御、およびｍＲＮＡ発現の下方制御を含む群から選択される。
【０１９９】
本発明は、対照と比較して、標的遺伝子の発現を少なくとも２０％、３０％、または４０％、好ましくは、５０％、６０％、または７０％、さらに好ましくは７５％、８０％、または９０％阻害する方法を提供し、本方法は、標的遺伝子のｍＲＮＡ転写物を、１つ以上の本発明の修飾ｓｉＲＮＡ化合物と接触させることを含む。
【０２００】
一実施形態において、本発明の修飾ｓｉＲＮＡ化合物は、標的遺伝子ポリペプチドを阻害し、この阻害は、機能の阻害（例えば、、とりわけ、ネイティブ遺伝子／ポリペプチドの既知の相互作用を用いた酵素アッセイまたは結合アッセイによって検査される）、標的タンパク質の阻害（例えば、とりわけ、ウエスタンブロッティング、ＥＬＩＳＡ、または免疫沈降によって検査される）、および標的ｍＲＮＡ発現の阻害（例えば、とりわけ、ノーザンブロッティング、定量的ＲＴ−ＰＣＲ、インサイチュハイブリダイゼーション、またはマイクロアレイハイブリダイゼーションによって検査される）を含む群から選択される。
【０２０１】
さらなる実施形態において、本発明は、哺乳動物または非哺乳動物標的遺伝子の上昇したレベルを伴う任意の疾患または障害に苦しんでいるまたは影響を受けやすい対象を治療する方法を提供し、本方法は、対象に、本発明の修飾ｓｉＲＮＡ化合物または組成物を治療上有効な用量で投与し、それによって対象を治療することを含む。
【０２０２】
本発明は、哺乳動物標的遺伝子の発現を下方制御する化合物、特に、哺乳動物標的遺伝子の発現の阻害が、有益である、以下の疾患または状態の治療の際に、構造（Ａ）に従う修飾ＲＮＡ化合物の使用に関する。ＡＲＤＳ；ＣＯＰＤ；ＡＬＩ；肺気腫；糖尿病性ニューロパシー、ネフロパシー、および網膜症；ＤＭＥおよび他の糖尿病状態；緑内障；ＡＭＤ；ＢＭＴ網膜症；脳卒中を含む虚血状態；ＯＩＳ；パーキンソン病、アルツハイマー病、ＡＬＳ等の神経変性障害；腎障害：ＡＲＦ、ＤＧＦ、移植片拒絶反応；聴覚障害；脊髄損傷；口腔粘膜炎；造血および固形腫瘍癌を含む癌、ドライアイ症候群、ならびに褥瘡である。別の実施形態において、本発明の化合物は、移植前の臓器保存および／または貯蔵に有用である。
【０２０３】
「毒物への曝露」とは、毒物を哺乳動物に使用可能にするか、または哺乳動物と接触させることを意味する。毒物は、神経系に対して毒性であり得る。毒物への曝露は、直接投与、例えば、植物、医薬品、もしくは治療剤（例えば、化学療法剤）の摂取もしくは投与により、偶発的な混入により、または環境曝露、例えば、空気中もしくは水の曝露により起こり得る。
【０２０４】
他の実施形態において、本発明の化学的に修飾されたｓｉＲＮＡ化合物および方法は、対象における他の疾患および状態の発生または重症度を治療または防止するのに有用である。これらの疾患および状態としては、脳卒中および脳卒中様の状況（例えば、脳、腎臓、心臓の不全）、神経細胞死、再灌流を伴うか伴わない脳損傷、慢性変性疾患、例えば、神経変性疾患（アルツハイマー病、パーキンソン病、ハンチントン病を含む）、多発性硬化症、球脊髄性筋萎縮症（ｓｐｉｎｏｂｕｌｂａｒ ａｔｒｏｐｈｙ）、プリオン病、および外傷性脳損傷（ＴＢＩ）に起因するアポトーシスが含まれるが、これらに限定されない。追加の実施形態において、本発明の化合物および方法は、神経保護、およびまたは脳保護を提供することを対象とする。
【０２０５】
制限することなく、標的遺伝子は、ｐ５３（ＴＰ５３）、ＴＰ５３ＢＰ２、ＬＲＤＤ、ＣＹＢＡ、ＡＴＦ３、ＣＡＳＰ２（カスパーゼ２）、ＮＯＸ３、ＨＲＫ；Ｃ１ＱＢＰ、ＢＮＩＰ３、ＭＡＰＫ８；Ｒａｃ１、ＧＳＫ３Ｂ、ＣＤ３８、ＳＴＥＡＰ４、ＢＭＰ２ａ；ＧＪＡ１、ＴＹＲＯＢＰ、ＣＴＧＦ、ＳＰＰ１、ＲＴＮ４Ｒ、ＡＮＸＡ２、ＲＨＯＡ、ＤＵＯＸ１、ＳＬＣ５Ａ１、ＳＬＣ２Ａ２、ＡＫＲ１Ｂ１、ＳＯＲＤ、ＳＬＣ２Ａ１、ＭＭＥ、ＮＲＦ２、ＳＲＭ、ＲＥＤＤ２（ＲＴＰ８０１Ｌ）、ＲＥＤＤ１（ＲＴＰ８０１）、ＮＯＸ４、ＭＹＣ、ＰＬＫ１、ＥＳＰＬ１、ＨＴＲＡ２、ＫＥＡＰ１、ｐ６６、ＺＮＨＩＴ１、ＬＧＡＬＳ３、ＣＹＢＢ（ＮＯＸ２）、ＮＯＸ１、ＮＯＸＯ１、ＡＤＲＢ１、ＨＩ９５、ＡＲＦ１、ＡＳＰＰ１、ＳＯＸ９、ＦＡＳ、ＦＡＳＬＧ、ヒトＭＬＬ、ＡＦ９、ＣＴＳＤ、ＣＡＰＮＳ１、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＨＥＳ１、ＨＥＳ５、ＣＤＫ１Ｂ、ＩＤ１、ＩＤ２、ＩＤ３、ＣＤＫ２Ａ、カスパーゼ１、カスパーゼ３、カスパーゼ４、カスパーゼ５、カスパーゼ６、カスパーゼ７、カスパーゼ８、カスパーゼ９、カスパーゼ１０、カスパーゼ１２、カスパーゼ１４、Ａｐａｆ−１、Ｎｏｄ１、Ｎｏｄ２、Ｉｐａｆ、ＤＥＦＣＡＰ、ＲＡＩＤＤ、ＲＩＣＫ、Ｂｃｌ１０、ＡＳＣ、ＴＵＣＡＮ、ＡＲＣ、ＣＬＡＲＰ、ＦＡＤＤ、ＤＥＤＤ、ＤＥＤＤ２、クリオピリン、ＰＹＣ１、パイリン、ＴＲＡＤＤ、ＵＮＣ５ａ、ＵＮＣ５ｂ、ＵＮＣ５ｃ、ＺＵＤ、ｐ８４Ｎ５、ＬＲＤＤ、ＣＤＫ１、ＣＤＫ２、ＣＤＫ４、ＣＤＫ５、ＣＤＫ９、ＰＩＴＳＬＲＥ Ａ、ＣＨＫ２、ＬＡＴＳ１、Ｐｒｋ、ＭＡＰ４Ｋ１、ＭＡＰ４Ｋ２、ＳＴＫ４、ＳＬＫ、ＧＳＫ３アルファ、ＧＳＫ３ベータ、ＭＥＫＫ１、ＭＡＰ３Ｋ５（Ａｓｋ１）、ＭＡＰ３Ｋ７、ＭＡＰ３Ｋ８、ＭＡＰ３Ｋ９、ＭＡＰ３Ｋ１０、ＭＡＰ３Ｋ１１、ＭＡＰ３Ｋ１２、ＤＲＰ−１、ＭＫＫ６、ｐ３８、ＪＮＫ３、ＤＡＰＫ１、ＤＲＡＫ１、ＤＲＡＫ２、ＩＲＡＫ、ＲＩＰ、ＲＩＰ３、ＲＩＰ５、ＰＫＲ、ＩＲＥ１、ＭＳＫ１、ＰＫＣアルファ、ＰＫＣベータ、ＰＫＣデルタ、ＰＫＣイプシロン、ＰＫＣイータ、ＰＫＣミュー、ＰＫＣシータ、ＰＫＣゼータ、ＣＡＭＫ２Ａ、ＨＩＰＫ２、ＬＫＢ１、ＢＴＫ、ｃ−Ｓｒｃ、ＦＹＮ、Ｌｃｋ、ＡＢＬ２、ＺＡＰ７０、ＴｒｋＡ、ＴｒｋＣ、ＭＹＬＫ、ＦＧＦＲ２、ＥｐｈＡ２、ＡＡＴＹＫ、ｃ−Ｍｅｔ、ＲＥＴ、ＰＲＫＡＡ２、ＰＬＡ２Ｇ２Ａ、ＳＭＰＤ１、ＳＭＰＤ２、ＳＰＰ１、ＦＡＮ、ＰＬＣＧ２、ＩＰ６Ｋ２、ＰＴＥＮ、ＳＨＩＰ、ＡＩＦ、ＡＭＩＤ、チトクロムｃ、Ｓｍａｃ、ＨｔｒＡ２、ＴＳＡＰ６、ＤＡＰ−１、ＦＥＭ−１、ＤＡＰ−３、グランザイムＢ、ＤＩＯ−１、ＤＡＸＸ、ＣＡＤ、ＣＩＤＥ−Ａ、ＣＩＤＥ−Ｂ、Ｆｓｐ２７、Ａｐｅｌ、ＥＲＣＣ２、ＥＲＣＣ３、ＢＡＰ３１、Ｂｉｔ１、ＡＥＳ、ハンチンチン、ＨＩＰ１、ｈＳｉｒ２、ＰＨＡＰ１、ＧＡＤＤ４５ｂ、ＧＡＤＤ３４、ＲＡＤ２１、ＭＳＨ６、ＡＤＡＲ、ＭＢＤ４、ＷＷ４５、ＡＴＭ、ｍＴＯＲ、ＴＩＰ４９、ジユビキチン／ＦＡＴ１０、ＦＡＦ１、ｐ１９３、Ｓｃｙｔｈｅ／ＢＡＴ３、Ａｍｉｄａ、ＩＧＦＢＰ−３、ＴＤＡＧ５１、ＭＣＧ１０、ＰＡＣＴ、ｐ５２／ＲＡＰ、ＡＬＧ２、ＡＬＧ３、プレセネリン−１、ＰＳＡＰ、ＡＩＰ１／Ａｌｉｘ、ＥＳ１８、ｍｄａ−７、ｐｌ４ＡＲＦ、ＡＮＴ１、ｐ３３ＩＮＧｌ、ｐ３３ＩＮＧ２、ｐ５３ＡＩＰｌ、ｐ５３ＤＩＮＰｌ、ＭＧＣ３５０８３、ＮＲＡＧＥ、ＧＲＩＭ１９、リポカリン２、グリコデリンＡ、ＮＡＤＥ、ポリミン、ＳＴＡＧ１、ＤＡＢ２、ガレクチン−７、ガレクチン−９、ＳＰＲＣ、ＦＬＪ２１９０８、ＷＷＯＸ、ＸＫ、ＤＫＫ−１、Ｆｚｄ１、Ｆｚｄ２、ＳＡＲＰ２、アキシン１、ＲＧＳ３、ＤＶＬ１、ＮＦｋＢ２、ＩｋＢアルファ、ＮＦ−ＡＴＣ１、ＮＦ−ＡＴＣ２、ＮＦ−ＡＴＣ４、ｚＯ／ＺＮＦ３１９、Ｅｇｒｌ、Ｅｇｒ２、Ｅｇｒ３、Ｓｐ１、ＴＩＥＧ、ＷＴ１、Ｚａｃｌ、イカルス、ＺＮＦ１４８、ＺＫ１／ＺＮＦ４４３、ＺＮＦ２７４、ＷＩＧ１、ＨＩＶＥＰ１、ＨＩＶＥＰ３、Ｆｌｉｚｌ、ＺＰＲ９、ＧＡＴ Ａ３、ＴＲ３、ＰＰＡＲＧ、ＣＳＭＦ、ＲＸＲａ、ＲＡＲａ、ＲＡＲｂ、ＲＡＲｇ、Ｔ３Ｒａ、Ｅｒベータ、ＶＤＲ、ＧＲ／ＧＣＣＲ、ｐ５３、ｐ７３アルファ、ｐ６３（ヒト［ｔａアルファ、ｔａベータ、ｔａガンマ、ｄａアルファ、ａベータ、ｄａガンマ］、５３ＢＰ２、ＡＳＰＰ１、Ｅ２Ｆ１、Ｅ２Ｆ２、Ｅ２Ｆ３、ＨＩＦ１アルファ、ＴＣＦ４、ｃ−Ｍｙｃ、Ｍａｘ、Ｍａｄ、ＭＩＴＦ、Ｉｄ２、Ｉｄ３、Ｉｄ４、ｃ−Ｊｕｎ、ｃ−Ｆｏｓ、ＡＴＦ３、ＮＦ−ＩＬ６、ＣＨＯＰ、ＮＲＦ１、ｃ−Ｍａｆ、Ｂａｃｈ２、Ｍｓｘ２、Ｃｓｘ、Ｈｏｘａ５、Ｅｔｓ−１、ＰＵ１／Ｓｐｉ１、Ｅｔｓ−２、ＥＬＫ１、ＴＥＬ１、ｃ−Ｍｙｂ、ＴＢＸ５、ＩＲＦ１、ＩＲＦ３、ＩＲＦ４、ＩＲＦ９、ＡＰ−２アルファ、ＦＫＨＲ、ＦＯＸＯ１Ａ、ＦＫＨＲＬ１、ＦＯＸＯ３ａ、ＡＦＸ１、ＭＬＬＴ７、Ｔｉｐ６０、ＢＴＧ１、ＡＵＦ１、ＨＮＲＰＤ、ＴＩＡ１、ＮＤＧ１、ＰＣＢＰ４、ＭＣＧ１０、ＦＸＲ２、ＴＮＦＲ２、ＬＴｂＲ、ＣＤ４０、ＣＤ２７、ＣＤ３０、４−１ＢＢ、ＴＮＦＲＳＦ１９、ＸＥＤＡＲ、Ｆｎ１４、ＯＰＧ、ＤｃＲ３、ＦＡＳ、ＴＮＦＲ１、ＷＳＬ−１、ｐ７５ＮＴＲ、ＤＲ４、ＤＲ５、ＤＲ６、ＥＤＡＲ、ＴＮＦアルファ、ＦＡＳリガンド、ＴＲＡＩＬ、リンフォトキシンアルファ、リンフォトキシンベータ、４−１ＢＢＬ、ＲＡＮＫＬ、ＴＬ１、ＴＷＥＡＫ、ＬＩＧＨＴ、ＡＰＲＩＬ、ＩＬ−１−アルファ、ＩＬ−１−ベータ、ＩＬ−１８、ＦＧＦ８、ＩＬ−２、ＩＬ−２１、ＩＬ−５、ＩＬ−４、ＩＬ−６、ＬＩＦ、ＩＬ−１２、ＩＬ−７、ＩＬ−１０、ＩＬ−１９、ＩＬ−２４、ＩＦＮアルファ、ＩＦＮベータ、ＩＦＮガンマ、Ｍ−ＣＳＦ、プロラクチン、ＴＬＲ２、ＴＬＲ３、ＴＬＲ４、ＭｙＤ８８、ＴＲＩＦ、ＲＩＧ−１、ＣＤ１４、ＴＣＲアルファ、ＣＤ３ガンマ、ＣＤ８、ＣＤ４、ＣＤ７、ＣＤ１９、ＣＤ２８、ＣＴＬＡ４、ＳＥＭＡ３Ａ、ＳＥＭＡ３Ｂ、ＨＬＡ−Ａ、ＨＬＡ−Ｂ、ＨＬＡ−Ｌ、ＨＬＡ−Ｄｍアルファ、ＣＤ２２、ＣＤ３３、ＣＡＬＬ、ＤＣＣ、ＩＣＡＭ１、ＩＣＡＭ３、ＣＤ６６ａ、ＰＶＲ、ＣＤ４７、ＣＤ２、Ｔｈｙ−１、ＳＩＲＰａ１、ＣＤ５、Ｅ−カドヘリン、ＩＴＧＡＭ、ＩＴＧＡＶ、ＣＤ１８、ＩＴＧＢ３、ＣＤ９、ＩｇＥ Ｆｃ Ｒベータ、ＣＤ８２、ＣＤ８１、ＰＥＲＰ、ＣＤ２４、ＣＤ６９、ＫＬＲＤ１、ガレクチン１、Ｂ４ＧＡＬＴ１、Ｃｌｑアルファ、Ｃ５Ｒ１、ＭｌＰ１アルファ、ＭｌＰ１ベータ、ＲＡＮＴＥＳ、ＳＤＦ１、ＸＣＬ１、ＣＣＣＫＲ５、ＯＩＡＳ／ＯＡＳ１、ＩＮＤＯ、ＭｘＡ、ＩＦＩ１６、ＡＩＭ２、ｉＮＯＳ、ＨＢ−ＥＧＦ、ＨＧＦ、ＭＩＦ、ＴＲＡＦ３、ＴＲＡＦ４、ＴＲＡＦ６、ＰＡＲ−４、ＩＫＫガンマ、ＦＩＰ２、ＴＸＢＰ１５１、ＦＬＡＳＨ、ＴＲＦ１、ＩＥＸ−１Ｓ、Ｄｏｋ１、ＢＬＮＫ、ＣＩＮ８５、Ｂｉｆ−１、ＨＥＦ１、Ｖａｖ１、ＲａｓＧＲＰ１、ＰＯＳＨ、Ｒａｃ１、ＲｈｏＡ、ＲｈｏＢ、ＲｈｏＣ、ＡＬＧ４、ＳＰＰ１、ＴＲＩＰ、ＳＩＶＡ、ＴＲＡＢＩＤ、ＴＳＣ−２２、ＢＲＣＡ１、ＢＡＲＤ１、５３ＢＰ１、ＭＤＣ１、Ｍｄｍ４、Ｓｉａｈ−１、Ｓｉａｈ−２、ＲｏＲｅｔ、ＴＲＩＭ３５、ＰＭＬ、ＲＦＷＤ１、ＤＩＰ１、Ｓｏｃｓ１、ＰＡＲＣ、ＵＳＰ７、ＣＹＬＤ、ＳＥＲＰＩＮＨ１（ＨＳＰ４７）から成る群から選択される。他の有用な標的遺伝子は、微生物起源の遺伝子である。
【０２０６】
併用療法
本明細書に開示される疾患を治療する方法には、本明細書に開示される修飾二本鎖核酸分子を、修飾ｓｉＲＮＡ化合物の薬理学的特性を改善する物質、または本明細書で上述された疾患および障害（微小血管障害、眼の疾患および状態（例えば黄斑変性症）、難聴（聴覚損失を含む）、呼吸器障害、腎臓障害、臓器移植、神経変性障害、脊髄損傷、脳損傷、血管新生関連状態、およびアポトーシス関連状態を含む）のいずれかに罹患しているか、あるいは感受性である対象の治療において有効であることが公知であるさらなる化合物と、併用してまたは組み合わせて投与することを含む。
【０２０７】
したがって、本発明は、別の態様において、本発明の治療のための修飾ｓｉＲＮＡ化合物と、少なくとも１つのさらなる治療活性薬剤との組み合わせを含む薬学的組成物を提供する。「と併用して」または「と組み合わせて」とは、前に、同時に、または後に、を意味する。したがって、このような組み合わせの個々の構成要素は、同じか、または別々の薬学的製剤から、順次または同時のいずれかで投与される。
【０２０８】
修飾ｓｉＲＮＡ化合物および本明細書に記載される療法と併用して、微小血管障害、眼の疾患および状態（例えば黄斑変性症）、難聴（聴覚損失を含む）、呼吸器障害、腎臓障害、臓器移植、神経変性障害（例えば脊髄損傷）、血管新生関連状態およびアポトーシス関連状態を治療するための公知の治療を含む併用療法は、本発明の一部であると見なされる。
【０２０９】
したがって、本発明の別の態様において、さらなる薬学的に有効な化合物は、本発明の薬学的組成物と併用して投与される。加えて、本発明の修飾ｓｉＲＮＡ化合物は、かかる状態を治療するための第２の治療活性化合物との補助的療法としての使用のための医薬品の調製において使用される。本発明の化学的に修飾されたｓｉＲＮＡ化合物と組み合わせた使用のために公知の第２の治療剤の適切な用量は、当業者により容易に理解される。
【０２１０】
いくつかの実施形態において、上で言及された組み合わせは、単一の薬学的製剤の形態での使用について示される。
【０２１１】
本発明に従う薬学的に活性なｓｉＲＮＡ共役体のうちのいずれか１つを含む薬学的組成物の投与は、医療従事者によって決定されるような、静脈内、動脈内、皮下、腹腔内、または脳室内を含む、多くの公知の投与経路のいずれかによって行なわれる。特殊化された製剤を使用して、経口で、または吸入により、または鼻腔内点滴注入により、組成物を投与することは可能である。いくつかの実施形態において、本発明の化合物は、点耳剤、点眼剤、皮膚製剤、経皮製剤等を含む局所性投与用に製剤化される。
【０２１２】
「と併用して」とは、さらなる薬学的に有効な化合物を、本発明の化合物または薬学的組成物の投与前、その投与と同時に、またはその投与の後に投与することを意味する。したがって、上で言及されるこのような組み合わせの個々の要素を、同じか、または別々の薬学的製剤から、順次または同時のいずれかで投与することができる。本発明の修飾ｓｉＲＮＡ化合物の場合のように、第２の治療剤は、任意の適切な経路、例えば、経口、頬腔、吸入、舌下、直腸、膣、経尿道、鼻腔、局所、耳、眼球、局所、経皮（ｐｅｒｃｕｔａｎｅｏｕｓ）（すなわち、経皮性（ｔｒａｎｓｄｅｒｍａｌ））、または非経口（静脈内、筋内、皮下、および冠動脈内を含む）投与により、投与することができる。
【０２１３】
いくつかの実施形態において、本発明の修飾ｓｉＲＮＡ化合物および第２の治療剤は、同じ経路により、単一の組成物か、２つ以上の異なる薬学的組成物としてのいずれかで提供されて、投与される。しかしながら、他の実施形態において、本発明の修飾ｓｉＲＮＡ化合物および第２の治療剤のための異なる投与経路が、可能であるか、または好ましい。当業者は、単独でも、組み合わせのどちらでも、各治療剤についての投与の最良の形態を認識する。
【０２１４】
種々の実施形態において、本発明の修飾ｓｉＲＮＡ化合物は、薬学的組成物における主な活性成分である。
【０２１５】
別の態様において、本発明は、本明細書に記述される疾患および状態のいずれかの治療のための、２つ以上のｓｉＲＮＡ分子を含む薬学的組成物を提供する。いくつかの実施形態において、２つ以上のｓｉＲＮＡ分子または該分子を含む製剤は、等しい活性またはそうでなければ有益な活性を生じる量で薬学的組成物において混合される。ある実施形態において、２つ以上のｓｉＲＮＡ分子は、共有結合または非共有結合であるか、または２〜１００、好ましくは、２〜５０、または２〜３０個のヌクレオチドの長さの範囲の核酸リンカーにより一緒に結合されている。
【０２１６】
いくつかの実施形態において、本発明の薬学的組成物は、１つ以上のさらなる遺伝子を標的とする、１つ以上のさらなるｓｉＲＮＡ分子をさらに含む。いくつかの実施形態において、該さらなる遺伝子の同時阻害は、本明細書に開示される疾患の治療に、相加的または相乗的な効果をもたらす。
【０２１７】
本発明に従う治療レジメンは、本明細書において開示される状態の有害事象からの患者の機能的回復が改善されるように、または障害の発症を遅らせるように、投与様式、投与のタイミング、および投薬量の観点から実行される。
【０２１８】
本発明は、例示的な様式において記載されており、使用される用語は、限定ではなく、本来の説明の言葉の範疇にあることを意図されることを理解されたい。
【０２１９】
本発明の改変および変形が、上記の教示を考慮すれば可能である。したがって、添付の特許請求の範囲の範囲内で、本発明が、特定的に記載される以外の方法で実行され得ることを理解されたい。
【０２２０】
本発明は、実施例を参照して以下で詳細に説明されるが、それらに限定するとは解釈されるべきではない。
【０２２１】
本明細書におけるいずれの文献の引用も、そのような文献が関連する従来技術または本出願のいずれかの請求項の特許性に対して考慮される材料であると是認することを意図されない。いずれの文献の内容または日付に関する記述も、出願時に出願人に入手可能な情報に基づくものであり、上記記述の正確性に関する是認を構成するものではない。
【実施例】
【０２２２】
当業者は、さらに詳述することなく、前述の説明を使用して、本発明を完全に利用することができると考えられる。したがって、以下の好ましい特定の実施形態は、例示としてのみ解釈されるべきであり、特許請求される本発明を多少なりとも制限するものではない。
【０２２３】
当該技術分野で知られる標準的な分子生物学プロトコルは、本明細書に具体的に記載されず、概して、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ， Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｃｌｏｎｉｎｇ： Ａ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｍａｎｕａｌ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇｓ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ， Ｎｅｗ−Ｙｏｒｋ （１９８９， １９９２）、およびＡｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ， Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ， Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ， Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ， Ｍａｒｙｌａｎｄ （１９８８）、およびＡｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ， Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ， Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ， Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ， Ｍａｒｙｌａｎｄ （１９８９）、およびＰｅｒｂａｌ， Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ， Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ & Ｓｏｎｓ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ （１９８８）、およびＷａｔｓｏｎ ｅｔ ａｌ， Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ＤＮＡ， Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｂｏｏｋｓ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、およびＢｉｒｒｅｎ ｅｔ ａｌ （ｅｄｓ） Ｇｅｎｏｍｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ Ｓｅｒｉｅｓ， Ｖｏｌｓ． １−４ Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ （１９９８）に本質的に従い、米国特許第 ４，６６６，８２８号、同第４，６８３，２０２号、同第４，８０１，５３１号、同第５，１９２，６５９号、および同第５，２７２，０５７号に記載され、参照することによって本明細書に組み込まれる方法論に従う。ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）は、概して、ＰＣＲ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ： Ａ Ｇｕｉｄｅ Ｔｏ Ｍｅｔｈｏｄｓ Ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ， Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ， Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ， ＣＡ （１９９０）にあるように行われた。フローサイトメトリーと組み合わせた原位置（細胞内）ＰＣＲは、特定のＤＮＡおよびｍＲＮＡ配列を含有する細胞の検出に有用である（Ｔｅｓｔｏｎｉ ｅｔ ａｌ， Ｂｌｏｏｄ １９９６， ８７：３８２２）。ＲＴ−ＰＣＲを実施する方法も、当該技術分野でよく知られている。
【０２２４】
実施例１．標的遺伝子に対するｓｉＲＮＡの配列の生成および修飾ｓｉＲＮＡ化合物の産生

独自のアルゴリズム、および任意の遺伝子、任意で本明細書で開示されるアポトーシスを促進する遺伝子の知られている配列を使用して、多数の可能性のあるｓｉＲＮＡのｔ１９−ｍｅｒの配列を生成した。このアルゴリズムに加えて、１９−ｍｅｒの配列の５′および／または３′延長によって、いくつかの２３−ｍｅｒのオリゴマー配列を生成した。本方法を使用して生成されたアンチセンス鎖配列は、標的ｍＲＮＡ配列の一区分に完全または実質的に相補的である。いくつかの実施形態において、本アンチセンス配列は、対応するｍＲＮＡ配列の一区分に完全に相補的である。本発明の修飾ｓｉＲＮＡ化合物を生成するために、アンチセンス鎖の５′末端位置のヌクレオチド（Ｎ）ｘ（１位、Ｎ^１）を、構造（Ａ）の実施形態の二本鎖核酸分子を生成するように置換した。他の実施例では、アンチセンス鎖の５′末端位置のヌクレオチド（Ｎ）ｘ、およびセンス鎖の３′末端位置のヌクレオチド（Ｎ′）ｙを、構造（Ａ）の実施形態の二本鎖核酸分子を生成するように置換した。
【０２２５】
表Ａは、いくつかの実施例で使用された化合物のセンス鎖およびアンチセンス鎖のヌクレオチド配列を提供する。表Ａ１は、構造（Ａ）の実施形態に従う修飾ｓｉＲＮＡ化合物を提供するように、記載のように生成された、例示的な二本鎖核酸分子を提供する。本明細書に示される化合物は、限定的であることを意図しておらず、本明細書に記載される二本鎖核酸分子を特定するために、いかなる標的ＲＮＡが使用されてもよい。表Ａ２は、比較試験のために生成された修飾ｓｉＲＮＡ化合物を提供する。表Ａ１およびＡ２の修飾ｓｉＲＮＡ化合物は、ＴＬＲ２（ヒトｔｏｌｌ様受容体２（ＴＬＲ２）、ｍＲＮＡ、ｇｉ｜６８１６０９５６｜ｒｅｆ｜ＮＭ＿００３２６４．３｜、配列番号４）遺伝子、ならびにＣＡＰＮＳ１（カルパイン、小サブユニット１変異体、ｇｉ｜５１５９９１５２｜ｒｅｆ｜ＮＭ＿００１７４９．２｜、配列番号１、またはカルパイン、小サブユニット１変異体２、ｇｉ｜５１５９９１５０｜ｒｅｆ］ＮＭ＿００１００３９６２．１１、配列番号２）遺伝子を標的とする。さらなる化合物は、ヒトＲｈｏＡ ｍＲＮＡ（ｒａｓ相同体遺伝子ファミリー、メンバーＡ（ＲｈｏＡ）、ｍＲＮＡ、ｇｉ｜５０５９３００５ ｜ｒｅｆ｜ＮＭ＿００１６６４．２１、配列番号３）を標的とする。哺乳動物標的遺伝子のｍＲＮＡ配列は、例えば、ＮＣＢＩウェブサイト［ｈｔｔｐ ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／］で入手可能である。

表Ａ
【表２】


表Ａ１：本発明の例示的なＴＬＲ２二本鎖分子
【表３】


表Ａ１（続き）
【表４】


表Ａ２：比較試験のために合成された化合物
【表５】

【０２２６】
表Ａ３は、以下に、表Ａ１およびＡ２のｓｉＲＮＡオリゴヌクレオチドの調製に利用された、修飾ヌクレオチド／非従来的部分のコードを提供する。
表Ａ３：本明細書の表で使用された修飾ヌクレオチド／非従来的部分のコード
【表６】

【０２２７】
実施例２：修飾ｓｉＲＮＡ化合物のインビトロ試験

ｓｉＲＮＡ活性を試験するためのプロトコル
【０２２８】
本発明に従う修飾ｓｉＲＮＡ化合物を、以下のように活性について試験する。６ウェルプレートに、ウェルあたり約１×１０^５個のラットＲＥＦ５２（ＴＬＲ２のｓｉＲＮＡ活性のため）、または０．６×１０^５個のヒトＰＣ３細胞（ＣＡＰＮＳ１のｓｉＲＮＡ活性のため）を播種した（３０〜７０％集密）。約２４時間のインキュベーション後、細胞に、ＴＬＲ２ ｄｓＲＮＡについては１〜４０ｎＭの最終濃度、およびＣＡＰＮＳ１ ｄｓＲＮＡについては５〜４０ｎＭの最終濃度で、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（商標）２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎｅ）を使用して、ｄｓＲＮＡオリゴ（以下の表Ａ４およびＡ５を参照）を形質移入した。

表Ａ４：ＴＬＲ２＿１６ ｓｉＲＮＡ化合物（配列番号６および１１）
【表７】


表Ａ５：ＣＡＰＮＳ１＿２３ ｓｉＲＮＡ化合物（配列番号５および１０）
【表８】

【０２２９】
細胞形質移入の効率性の正の対照として、ＲＥＤＤ１４−Ｃｙ３．５を標識したオリゴを使用した。ｓｉＲＮＡ活性の負の対照として、スクランブル（ＣＮＬ）オリゴを使用した（１．２の項で言及したものと同じ濃度）。形質移入の効率性を、細胞形質移入の２４時間後、蛍光顕微鏡検査で試験した。
【０２３０】
ｓｉＲＮＡ試料調製：それぞれの形質移入したウェルについて、３μＬのＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ２０００試薬を２５０μＬの無血清培地中に希釈し、５分間室温でインキュベートした。
【０２３１】
ｓｉＲＮＡ分子は以下のように調製した。

ｓｉＲＮＡ使用液：

ＲＥＤＤ１４−Ｃｙ３．５原液１．５×１０^６ｎＭ（ＰＢＳで１０μΜの最終濃度になるように１：１５０に希釈）

ＣＮＬ原液１．６×１０^６ｎＭ（ＰＢＳで１０μΜの最終濃度になるように１：１６０に希釈）

標的遺伝子原液１００μΜ（ＰＢＳで１０μΜの最終濃度になるように１：１０に希釈）

試料を、上述（１．２および１．４の項）のように、ＴＬＲ２、ＣＡＰＮＳ１、およびＣＮＬ ｓｉＲＮＡオリゴについては最終濃度、ならびにウェルあたり２ｍＬの最終容量に計算される、２５０ ＤＭＥＭ培地中で２０ｎＭのＲＥＤＤ１４−Ｃｙ３．５ ｓｉＲＮＡに希釈した。Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（商標）２０００をｓｉＲＮＡと合わせ（１：１容量）、試料を穏やかに混合し、室温で２０分間インキュベートした。
【０２３２】
形質移入：Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ／ｓｉＲＮＡ複合体を細胞に添加し（ウェルあたり５００μＬ）、そのプレートを前後に揺動させた（各ウェルに２ｍＬの最終容量）。細胞を、ＣＯ_２インキュベーター中３７℃でインキュベートした。
【０２３３】
ｑＰＣＲによるｍＲＮＡレベルの定量化：細胞形質移入の４８時間後、細胞を回収し、ＲＮＡを、ＥＺ−ＲＮＡ（商標）キット［Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ（＃２０−４１０−１００）を使用して単離した。ｃＤＮＡ合成を実施し、ｍＲＮＡレベルをｑＰＣＲによって測定した。測定されたｍＲＮＡの数量を、参照遺伝子であるペプチジルプロリルイソメラーゼＡ（シクロフィリンＡ、ＣｙｃｌｏＡ）のｍＲＮＡ数量に対して正規化した。
【０２３４】
ｓｉＲＮＡ活性結果：
ＴＬＲ２＿１６ ｓｉＲＮＡ活性：ＴＬＲ２＿１６ ｓｉＲＮＡ形質移入後の、内因性遺伝子を発現するＲＥＦ５２細胞中のラットＴＬＲ２発現のｑＰＣＲ分析（表Ａ６のデータは、残留（対照−非形質移入細胞の％）ラットＴＬＲ２発現を示す。

表Ａ６
【表８】

【０２３５】
最も活性な化合物は、標的ｍＲＮＡに対するアンチセンスミスマッチおよび完全に相補的な二重鎖を有するＴＬＲ２＿１６＿Ｓ９３８であった。ＴＬＲ２＿１６＿Ｓ９３８では、Ｎ^１＝Ｕであり、Ｎ^２＝Ａであり、Ｎ^１は、標的ｍＲＮＡ中のＣとミスマッチする。

ＣＡＰＮＳ１＿２３ ｓｉＲＮＡ活性

ＣＡＰＮＳ１＿２３ ｓｉＲＮＡ形質移入後の、内因性遺伝子を発現するヒトＰＣ−３細胞中のＣＡＰＮＳ１発現のｑＰＣＲ分析（表Ａ７のデータは、ＰＣ−３細胞中の残留（対照−非形質移入細胞の％）ヒトＣＡＰＮＳ１発現を示す。

表Ａ７
【表９】

【０２３６】
最も活性な化合物は、標的ｍＲＮＡに対するアンチセンスミスマッチおよび完全に相補的な二重鎖を有するＣＡＰＮＳ１＿２３＿Ｓ９３８であった。ＣＡＰＮＳ１＿２３＿Ｓ９３８では、Ｎ^１＝Ｕであり、Ｎ^２＝Ａであり、Ｎ^１は、標的ｍＲＮＡ中のＣとミスマッチする。
【０２３７】
構造（Ａ）の構造に従う試験化合物は、アンチセンス鎖が標的ｍＲＮＡと完全に相補的である対照化合物より、少なくとも１０％より活性である。

二本鎖ＲＮＡ分子のオンターゲットおよびオフターゲット試験
【０２３８】
本研究の目的は、対照（非修飾）および試験（化学的に修飾）二本鎖核酸分子のオンターゲット活性および可能性のあるオフターゲット活性を評価することであった。
【０２３９】
ｓｉＲＮＡ分子の２本の鎖は、標的遺伝子ｍＲＮＡに対してセンスおよびアンチセンスである構成を持つ配列を有する。細胞内では、ガイド鎖（ＧＳ）として知られるｓｉＲＮＡのアンチセンス鎖が、ＲＮＡ誘導サイレンシング複合体（ＲＩＳＣ）の中に取り込まれ、標的ｍＲＮＡ中の相補的配列へとＲＮＡｉ機構をガイドするように機能する。パッセンジャー鎖（ＰＳ）として知られるセンス鎖が破壊される。ＧＳと標的ｍＲＮＡとの間に正確な相補性が存在する場合、後者はＲＩＳＣのＲＮａｓｅＨ様スライサー活性によって切断される。
【０２４０】
場合によっては、ｓｉＲＮＡ分子は、転写物が、３′−ＵＴＲ内のＧＳシード領域（２〜８位のヌクレオチド［５′>３′］）に対する相補性を有する、意図されない遺伝子を下方制御することができる。理論に拘束されることを望むものではないが、このオフターゲット効果は、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）による標的サイレンシングのものと類似の機構によって媒介される場合がある。ｓｉＲＮＡの別の種類のオフターゲット活性は、ＲＩＳＣの中へのセンス鎖（ＰＳ）の取り込みによって生じる場合がある。合成ｓｉＲＮＡの意図されないオフターゲット効果は、ｓｉＲＮＡ二重鎖内の初期ｓｉＲＮＡ配列の化学修飾により、軽減または抑止することができる。試験分子はそれに応じて設計された。
【０２４１】
試験分子を、ｐｓｉＣＨＥＣＫ（商標）（Ｐｒｏｍｅｇａ）のプラスミド構築物を使用する「ガイドシード配列およびパッセンジャー鎖に基づく活性アッセイ」で、オンターゲット活性（標的ｍＲＮＡに対する活性）およびオフターゲット活性（標的ｍＲＮＡ以外のｍＲＮＡに対する活性）の双方について評価した。試験分子および対照分子の活性を、完全標的配列（試験分子のＧＳまたはＰＳのいずれかの１９塩基配列全体に完全に相補的なヌクレオチド配列）、またはシード標的配列（試験分子のＧＳまたはＰＳのいずれかのヌクレオチド１〜８［５′>３′］に相補的な配列）のいずれかに対して試験した。
【０２４２】
試験分子は、少なくとも非修飾対照ｓｉＲＮＡに対してと同程度、ＧＳ完全標的部位に対して活性であった。試験分子がＰＳ完全標的部位に対して不活性である一方で、対照の非修飾ｓｉＲＮＡは、同一部位に対する活性を示した。双方のｓｉＲＮＡが、ＧＳシード標的配列部位およびＰＳシード標的配列部位に対して不活性であった。
【０２４３】
ガイド鎖（ＧＳ）は、ＲＩＳＣ複合体に進入し、標的ＲＮＡのサイレンシングをガイドすることができる、二本鎖ＲＮＡのアンチセンス鎖を指す。
【０２４４】
パッセンジャー鎖（ＰＳ）は、二本鎖ＲＮＡのセンス鎖を指す。
【０２４５】
シード配列は、ＧＳのヌクレオチド２〜８（５′>３′）を指し、オフターゲット認識に関係する。
【０２４６】
ＣＭ（完全マッチ）は、二本鎖ＲＮＡ分子のガイド鎖と完全に相補的なヌクレオチド配列を有する合成ＤＮＡ断片を指す。このＤＮＡ断片は、レポーター遺伝子の３′ＵＴＲでクローン化され、ＲＮＡサイレンシングの標的として機能する （Ｃａｓｔａｎｏｔｔｏ & Ｒｏｓｓｉ（２００９）． Ｎａｔｕｒｅ， ２２：４２６−３３）。
【０２４７】
ＳＭ（シードマッチ）は、試験分子ｓｉＲＮＡのガイド鎖のヌクレオチド１〜８（５′>３′）に対する完全な相補性を持つヌクレオチド配列を有する、合成ＤＮＡ断片を指す（最初のヌクレオチド＋シード）。このＤＮＡ断片は、レポーター遺伝子の３′ＵＴＲでクローン化され、シードに基づく「オフターゲット」サイレンシングに対する標的として機能する。
【０２４８】
ｐｓｉＣＨＥＣＫ（商標）システムは、標的配列の発現レベルにおける変化をモニタリングすることにより、標的化およびオフターゲット効果を誘発する、ＧＳ（アンチセンス）およびＰＳ（センス鎖）の評価を可能にする。各試験分子のＧＳおよびＰＳ鎖の標的活性および可能性のあるオフターゲット活性の評価のために、４つのｐｓｉＣＨＥＣＫ（商標）−２に基づく（Ｐｒｏｍｅｇａ）構築物を調製した。構築物のそれぞれにおいて、試験分子のＰＳまたはＧＳの、完全標的またはシード標的配列のいずれかの、１つのコピーまたは３つのコピーを、３′−ＵＴＲ領域内のウミシイタケルシフェラーゼ翻訳停止コドンの下流に位置する複数のクローン部位にクローン化した。得られたベクターを以下のように命名した。

１−完全標的配列の１つのコピーまたは３つのコピーを含有する、ＧＳ−ＣＭ（ガイド鎖（ｇｕｉｄｅ ｓｔｒａｎｄ）、完全マッチ（ｃｏｍｐｌｅｔｅ−ｍａｔｃｈ））ベクター（試験分子のＧＳの１９塩基配列全体に完全に相補的なヌクレオチド配列）、

２−完全標的配列の１つのコピーまたは３つのコピーを含有する、ＰＳ−ＣＭ（パッセンジャー鎖（ｐａｓｓｅｎｇｅｒ ｓｔｒａｎｄ）、完全マッチ（ｃｏｍｐｌｅｔｅ−ｍａｔｃｈ））ベクター（試験分子のＰＳの１９塩基配列全体に完全に相補的なヌクレオチド配列）、

３−シード領域標的配列の１つのコピーまたは３つのコピーを含有する、ＧＳ−ＳＭ（ガイド鎖（ｇｕｉｄｅ ｓｔｒａｎｄ）、シードマッチ（ｓｅｅｄ−ｍａｔｃｈ））ベクター（試験分子のＧＳのヌクレオチド１〜８に相補的な配列）、

４−シード領域標的配列の１つのコピーまたは３つのコピーを含有する、ＰＳ−ＳＭ（パッセンジャー鎖（ｐａｓｓｅｎｇｅｒ ｓｔｒａｎｄ）、シードマッチ（ｓｅｅｄ−ｍａｔｃｈ））ベクター（試験分子のＰＳのヌクレオチド１〜８に相補的な配列）。
【０２４９】
標的配列は、１９位（アンチセンスの１位）にヌクレオチド置換があるなしに関わらず、ウミシイタケルシフェラーゼレポーター遺伝子のコード領域の下流でクローン化された。これらの配列のうちのいずれかに対する試験分子のＲＮＡｉまたはシードによって媒介される活性は、融合ｍＲＮＡ（ＧＳ）の切断およびその後の分解、または翻訳阻害（ＰＳ）のいずれかをもたらす。双方の場合において、タンパク質発現が減弱される。
【０２５０】
試験分子ＧＳおよびＰＳのシードおよび完全標的部位のクローン化
該当する標的の単一コピーを、レポーターｍＲＮＡ、すなわちｐｓｉＣＨＥＣＫ（商標）−２（Ｐｒｏｍｅｇａ）ベクター中のウミシイタケルシフェラーゼの３′ＵＴＲにクローン化した。このベクターには複数のクローン化部位がある。使用された典型的なクローン化部位は、ＸｈｏＩおよびＮｏｔＩである。ベクターは、標準的な分子生物学技術を使用してクローン化するために調製された。ＣＭおよびＳＭの各鎖を化学的に合成し、１００℃で加熱し、室温に冷却することによってアニーリングした。連結は、標準的な分子生物学技術を使用して３時間行った。連結したプラスミドを、大腸菌ＤＨ５ａ細胞に形質転換した。

得られたコロニーを、関連するプライマーを使用するコロニーＰＣＲによって、プラスミド構築物の存在についてスクリーニングした。プラスミド（ベクター）のそれぞれを１つの陽性コロニーから精製し、その配列を検証した。
【０２５１】
ベクターのヒトＨｅＬａ細胞への形質移入。
１０ｃｍ皿あたり、約１．３〜２×１０^６個のヒトＨｅＬａ細胞（ＡＴＣＣ、カタログ番号ＣＣＬ−２）を接種した。次いで、細胞を３７±１℃、５％のＣＯ_２で２４時間インキュベートした。成長培地を、接種後１日に、８ｍＬの新しく調製された成長培地と交換した。それぞれの細胞を含有するプレートに、以下のように、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（商標）２０００試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用して、ベクターのうちの１つを形質移入した。

エッペンドルフチューブ内で、１５μＬのＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（商標）２０００試薬を１０００μＬのＤＭＥＭ培地に希釈し、室温（ＲＴ）で５分間インキュベートした。第２のエッペンドルフチューブ内で、ベクターを、１０００μＬのＤＭＥＭ培地中で１５μｇの最終濃度に達するように希釈した。希釈したＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（商標）２０００試薬を、希釈したＤＮＡベクター試料と穏やかに混合し、２０〜４０分間室温でインキュベートした。インキュベーション後、ＤＮＡ／Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（商標）２０００を、（２０００μＬの最終容量に達するように）細胞に添加した このプレートを穏やかに揺動させた。プレートを、３７±１℃および５％のＣＯ_２で５時間インキュベートした。５時間のインキュベーション後、細胞を、８０μＬの成長培地中、ウェルあたり５×１０^３個の細胞の最終濃度で、９６ウェルプレートに再度播種した。１６時間後、細胞に、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（商標）２０００を使用して、試験または対照分子を形質移入した。以下に記載するように、各ｓｉＲＮＡ濃度の二重の形質移入を行った。

Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（商標）２０００は、１７０個のウェルに十分であるように余分に調製した：８５μＬのＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（商標）２０００を３４００μＬ（３．４ｍＬ）のＤＭＥＭ培地と混合し、５分間室温でインキュベートした。
【０２５２】
試験および対照分子の使用液の調製：種々の濃度の使用液を、１０μΜの原液を希釈することにより調製した。この希釈系列は、１００μＬのＤＭＥＭ形質移入培地中０．００９５ｎＭ〜１００ｎＭ（０．００９５、０．０１９、０．０３９、０．０７、０．１５、０．３１、０．６２５、１．２５、２．５、５．０、２０．０、１００．０）の範囲の最終形質移入濃度を生成するように調製された。
【０２５３】
希釈したＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ２０００の１００μＬのアリコートを、１００μＬの希釈した試験分子または対照分子の使用液（上記）のそれぞれと穏やかに混合し、混合物を２０〜４０分間室温でインキュベートした。インキュベーション後、２０μＬのｓｉＲＮＡ／Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（商標）２０００混合物を、細胞（８０μＬの上記の細胞培養培地と予備インキュベートした）にさらに添加した。このプレートを穏やかに揺動させた。細胞を、３７±１℃および５％のＣＯ_２で４８時間インキュベートした。
【０２５４】
形質移入細胞中のウミシイタケルシフェラーゼ活性の判定
ｐｓｉＣＨＥＣＫ（商標）−２ベクターによって、ウミシイタケルシフェラーゼレポーター遺伝子に融合させた標的配列の発現における変化をモニタリングすることができる。試験／対照分子標的配列を、ウミシイタケルシフェラーゼの３′−非翻訳領域（３′−ＵＴＲ）にクローン化する。したがって、ウミシイタケルシフェラーゼ活性の減少の測定は、活性をモニタリングする簡便な方法を提供する。さらに、ｐｓｉＣＨＥＣＫ（商標）−２ベクターは、異なるプロモーターの下で転写される、第２のレポーター遺伝子であるホタルルシフェラーゼを含有し、これは、ウミシイタケルシフェラーゼ発現の正規化を可能にする。
【０２５５】
試験または対照分子の形質移入の４８時間後、ウミシイタケおよびホタルルシフェラーゼ活性を、製造業者の以下の手順に従いＤｕａｌ−Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ（登録商標）Ａｓｓａｙキット（Ｐｒｏｍｅｇａ）を使用して、ｓｉＲＮＡを形質移入した試料のそれぞれにおいて測定した。
培地を細胞から完全に除去し、次いで、細胞を、４０μＬ／ウェルの１Ｘルシフェラーゼ溶解液の添加により溶解した。次いで、プレートを凍結（−８０℃）させ、室温で解凍した。細胞溶解液を数回ピペットで取ることにより懸濁させて、各試料の１２．５μＬのアリコートを別個の９６ウェルプレートに移した。５０μＬのルシフェラーゼ基質（ＬＡＲＩＩ）を各抽出物に添加し、ホタルルシフェラーゼ活性を、Ａｂｓｏｒｂａｎｃｅ，Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ａｎｄ Ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ Ｒｅａｄｅｒ（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ、Ｖｉｃｔｏｒ（商標）１２４０）によって測定した。５０μＬのＳｔｏｐ&Ｇｌｏ試薬を試料のそれぞれに添加し、ウミシイタケルシフェラーゼ活性をすぐに測定した。各試料についてウミシイタケルシフェラーゼ活性値をホタルルシフェラーゼ活性値で割り（正規化）、最後にウミシイタケルシフェラーゼ活性を、試験または対照分子の不在下で、対応するｐｓｉＣＨＥＣＫ（商標）−２プラスミドを形質移入した細胞中で得られた正規化値に対する、試験試料中の正規化された活性値の割合として表した。
【０２５６】
ＩＣ５０の計算
ＧＳ＿ＣＭ部位に対する試験および対照分子活性ＩＣ５０値は、種々の最終ｓｉＲＮＡ濃度で得られた活性結果を使用して、用量反応曲線を構築することによって判定した。用量反応曲線は、形質移入ｓｉＲＮＡ濃度の対数に対するウミシイタケルシフェラーゼ活性の相対的正規化値をプロットすることにより構築した。曲線は、最良のＳ字形曲線を測定されたデータに当てはめることによって計算した。Ｓ字形当てはめのための方法は、３点曲線当てはめと呼ばれる。
【数１】

式中、
Ｙは、残留カスパーゼ２ ｍＲＮＡ反応であり、
Ｘは、形質移入ｓｉＲＮＡ濃度の対数であり、
Ｂｏｔは、底部プラトーでのＹ値であり、
ＬｏｇＩＣ５０は、Ｙが底部プラトーと頂部プラトーとの中間にある時のＸ値であり、ＨｉｌｌＳｌｏｐｅは、曲線の勾配である。
【０２５７】
結果
二本鎖ＲＮＡ分子鎖の各鎖の可能性のあるオフターゲット活性の評価のために、ｐｓｉＣＨＥＣＫ（Ｐｒｏｍｅｇａ）プラスミド構築物を使用する、「ガイドシード配列およびパッセンジャー鎖に基づく活性アッセイ」を用いた。ウミシイタケ活性の測定は、二本鎖ＲＮＡ活性をモニタリングする簡便な方法を提供する。
【０２５８】
標的ウミシイタケルシフェラーゼタンパク質活性の測定
４つの標的配列（ＧＳ−ＣＭ、ガイド鎖完全マッチ；ＧＳ−ＳＭ、ガイド鎖シードマッチ；ＰＳ−ＣＭ、パッセンジャー鎖完全マッチ；およびＰＳ−ＳＭ、パッセンジャー鎖シードマッチ）に対する試験分子および対照分子の双方の活性を、種々の濃度の分子を形質移入した細胞中のウミシイタケルシフェラーゼレポータータンパク質の相対的活性を測定することにより、タンパク質レベルで評価した。それぞれのアッセイを３回繰り返した。ＧＳ−ＣＭ標的部位に対する試験分子活性のＩＣ５０値を、濃度反応プロットを構築することにより判定した。
【０２５９】
試験分子および対照分子の双方が、用量反応で標的ＧＳ−ＣＭ部位に対して活性であった。
【０２６０】
双方のｓｉＲＮＡが、ＧＳ−ＳＭおよびＰＳ−ＳＭ部位に対して不活性であった。
【０２６１】
以下の図２〜１０および表２〜１０は、リボヌクレオチド、アデノシン（ＡもしくはｒＡ）、シチジン（ＣもしくはｒＣ）、グアノシン（ＧもしくはｒＧ）、リボチミジン（ｒＴ、また５′メチルウリジン）、およびウリジン（ＵもしくはｒＵ）、またはデオキシアデノシン（ｄＡ）、デオキシチジン（ｄＣ）、デオキグアノシン（ｄＧ）、チミジン（ｄＴ）、およびデオキシウリジン（ｄＵ）、あるいは２′Ｏメチル化アデノシン（ｍＡ）、２′Ｏメチル化シチジン（ｍＣ）、２′Ｏメチル化グアノシン（ｍＧ）、２′Ｏメチル化ウリジン（ｍＵ）のうちの１つを組み込むように、１９位（アンチセンスの１位に相当）に置換を有する標的配列の完全マッチを標的とする二本鎖分子の残留標的によって測定される活性を示す。「１ｓｔ ｐｏｓ ＡＳ」は、アンチセンス鎖の１位（５′末端ヌクレオチド）を指す。

表２：ＴＬＲ２＿１６ ｓｉＲＮＡ（双方の鎖上で交互の２′−ＯＭｅで平滑末端化）
【表１０】

【０２６２】
表２に示されるデータは、図２に提示される。アンチセンス鎖の１位のメチル化ヌクレオチドは、塩基対合に関わりなく標的ノックダウンの減少を示す。

表３：Ｃ３−Ｃ３オーバーハングまたはｄＴｄＴオーバーハングで修飾されないＴＬＲ２＿３７ ｓｉＲＮＡ
【表１１】

【０２６３】
表３のデータは、図３に提示される。表３および図３は、アンチセンスの１位の２′ＯＭｅリボヌクレオチドが、標的のマッチ位置のヌクレオチドに関わらず、ｓｉＲＮＡ活性を減少させることを示す。

表４：Ｃ３−Ｃ３オーバーハングまたはｄＴｄＴオーバーハングで修飾されないＴＬＲ２＿３７ ｓｉＲＮＡ
【表１２】

【０２６４】
表４のデータは、図４に提示される。表４および図４は、以下であることを示す。

１． 最大活性を有するｓｉＲＮＡは、アンチセンスの１位のＵ（ｄＵまたはｄＴ）が標的中のＣとミスマッチするか、標的中のＡとミスマッチする時に観察される。

２． ｓｉＲＮＡのアンチセンスの１位のＵ（またはｄＵもしくはｄＴ）が、標的中のＵとミスマッチする場合、ｓｉＲＮＡ活性が減少する。

３． アンチセンスの１位のＵが標的中のＧとゆらぎ対合する場合、ｓｉＲＮＡ活性が減少する。

表５ ＴＬＲ２＿３７ ｓｉＲＮＡ（ｄＴｄＴオーバーハングで修飾されない）−０．０４ｎＭ
【表１３】

【０２６５】
表５のデータは、図５に提示される。表５および図５は、以下のことを示す。

１． アンチセンスの１位のＵは、マッチしたＡミスマッチしたＣで、ミスマッチしたＵまたはゆらぎ対合したＧとよりも良好な結果を出した。

２． アンチセンスの１位のＧは、マッチ標的位置の全ての可能性のあるヌクレオチドで、同様の結果を示し、ミスマッチまたはゆらぎ対合は活性を改善しなかった。

表６：ＴＬＲ２＿４６ ｓｉＲＮＡ（Ｃ３−Ｃ３またはｄＴｄＴオーバーハングで修飾されない）
【表１４】

【０２６６】
表６のデータは、図６に提示される。表６および図６は、ＵのｍＵとの置換が活性を減少させることを示す。

表７ ＴＬＲ２＿４６ ｓｉＲＮＡ（ｄＴｄＴオーバーハングで修飾されない）
【表１５】

【０２６７】
表７のデータは、図７に提示される。表７および図７は、マッチする標的位置のヌクレオチドの種類に関わらず、アンチセンスの１位のＵが、より良好なＫＤ（ノックダウン）を生成したことを示す。全ての場合、ガイド鎖の１位のｓｉＲＮＡと標的との間の相補性、またはミスマッチ、あるいはゆらぎ対合にかかわらないことを意味する。
表８ ＲＨＯＡ＿６１ ｓｉＲＮＡ（非修飾／Ｃ３−Ｃ３またはｄＴｄＴオーバーハング）
【表１６】

【０２６８】
表８のデータは、図８に提示される。

表９ ＲＨＯＡ＿６１ ｓｉＲＮＡ（非修飾／Ｃ３−Ｃ３またはｄＴｄＴオーバーハング）
【表１７】

【０２６９】
表９のデータは、図９に提示される。表９および図９は、アンチセンスの１位にＵを持つｓｉＲＮＡが、標的のマッチ位置のヌクレオチドに関わらず（マッチ、ミスマッチ、ゆらぎ）、その１位にＧを持つものよりも活性であることを示す。この結果は、ｓｉＲＮＡ中にＧおよび標的中にＵを有することが、ｓｉＲＮＡ中にＵおよび標的中にＧを有することと等しくないため、ゆらぎ塩基対合によって説明することはできない。
表１０ ＲｈｏＡ＿６１ ｓｉＲＮＡ（ｄＴｄＴオーバーハングで修飾されない）
【表１８】

【０２７０】
表１０のデータは、図１０に提示される。
【０２７１】
実施例３：急性腎不全（ＡＲＦ）のモデル系
ＡＲＦは、数日以内に生じる腎機能の迅速な悪化によって特徴付けられる臨床症候群である。理論に拘束されるものではないが、急性腎傷害は、大規模な心臓手術等の大手術を受けている患者における腎虚血再灌流傷害等の腎虚血再灌流傷害の結果であり得る。ＡＲＦの主な特徴は、糸球体濾過率（ＧＦＲ）の急激な低下であり、それは窒素廃棄物（尿素、クレアチニン）の貯留をもたらす。最近の研究は、ＡＲＦのほとんどのヒト症例において、腎組織におけるアポトーシスが顕著であることを支持する。アポトーシス細胞死の主な部位は、遠位ネフロンである。虚血性傷害の初期相中、アクチン細胞骨格の完全性の欠如は、刷子縁の欠如、細胞接着斑の欠如、およびその後の根底の基層からの細胞の遊離化を伴う、上皮扁平化をもたらす。

虚血再灌流誘発性ＡＲＦの動物モデルにおける虚血再灌流傷害を治療する際の有効性について、本発明の化合物を試験する。
【０２７２】
実施例４：褥瘡または圧迫潰瘍のモデル系
糖尿病性潰瘍を含む褥瘡または圧迫潰瘍は、持続的な（通常、ベッドまたは車椅子からの）圧迫が身体の弱い部分、特に殿部、腰、および踵の皮膚への循環を遮断するとき発症する、損傷した皮膚および組織の領域である。十分な血流の不足は、罹患した組織の虚血性壊死および潰瘍をもたらす。褥瘡は、感覚の障害もしくは欠如を有する、または衰弱した、痩せ衰えた、麻痺した、もしくは長く寝たきりの患者において最も頻繁に生じる。仙骨、座節、大転子、外側果、および踵を覆う組織が特に影響を受けやすいが、患者の状況に応じて他の部位が含まれる場合もある。
【０２７３】
とりわけ、Ｒｅｉｄ ｅｔ ａｌ，Ｊ Ｓｕｒｇ．Ｒｅｓ．１１６：１７２−１８０，２００４に記載されるマウスモデルにおける、またはＭｕｓｔｏｅ ｅｔ ａｌ，ＪＣＩ，１９９１．８７（２）：６９４−７０３、Ａｈｎ ａｎｄ Ｍｕｓｔｏｅ，Ａｎｎ ＰＩ Ｓｕｒｇ，１９９１．２４（１）： １７−２３によって記載されるウサギモデルにおける、褥瘡、潰瘍、および類似した創傷を治療する際の有効性について、本発明の化合物を試験する。
【０２７４】
実施例５：慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）のモデル系
慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）は、主に、末端細気管支の遠位にある末梢気腔の永久的破壊である、肺気腫によって特徴付けられる。肺気腫はまた、細気管支および肺胞構造における、マクロファージおよび好中球等の炎症性細胞の蓄積によっても特徴付けられる。肺気腫および慢性気管支炎は、ＣＯＰＤの一部として、または独立して生じる可能性がある。
【０２７５】
とりわけ、次の通り開示されるモデル等の動物モデルにおける、ＣＯＰＤ／肺気腫／慢性気管支炎を治療する際の有効性について、本発明の化合物を試験する：
Ｓｔａｒｃｈｅｒ ａｎｄ Ｗｉｌｌｉａｍｓ，１９８９．Ｌａｂ． Ａｎｉｍａｌｓ，２３：２３４−２４０； Ｐｅｎｇ，ｅｔ ａｌ，２００４．、Ａｍ Ｊ Ｒｅｓｐｉｒ Ｃｒｉｔ Ｃａｒｅ Ｍｅｄ，１６９： １２４５−１２５１、Ｊｅｙａｓｅｅｌａｎ ｅｔ ａｌ，２００４．Ｉｎｆｅｃｔ． Ｉｍｍｕｎｏｌ，７２： ７２４７−５６。さらなるモデルは、本出願の譲渡人に譲渡されるＰＣＴ特許公開ＷＯ第２００６／０２３５４４号に記載され、当該出願は、これにより参照によって本明細書に組み込まれる。
【０２７６】
実施例６：脊髄損傷のモデル系
脊髄損傷、または脊髄症は、感覚および／または可動性の欠如をもたらす脊髄の障害である。脊髄損傷の２つの一般的なタイプは、外傷および疾患に起因する。外傷的損傷は、とりわけ、自動車事故、落下、銃撃、飛込み事故、ならびにポリオ、二分脊椎、腫瘍、およびフリードライヒ失調症を含む、脊髄を侵し得る疾患に起因する可能性がある。
【０２７７】
ｓｉＲＮＡを脊髄挫傷後の脊髄中に、および損傷していないラットに注射する。矢状凍結切片を生成し、取り込みがニューロン、アストログリア、オリゴデンドログリア、および／またはマクロファージ／ミクログリアにおいて生じたのかを決定するために、４つの異なる群の抗体を使用して免疫染色を行う。ニューロンに対するマーカーには、ＮｅｕＮ、またはＧＡＰ４３が含まれ、アストログリアおよび潜在的な神経幹細胞に対するマーカーには、ＧＦＡＰ、ネスチン、またはビメンチンが含まれ、オリゴデンドログリアに対するマーカーには、ＮＧ２またはＡＰＣが含まれ、マクロファージ／ミクログリアに対するマーカーには、ＥＤＩまたはＩｂａ−１が含まれる（Ｈａｓｅｇａｗａ ｅｔ ａｌ．，２００５．Ｅｘｐ Ｎｅｕｒｏｌ １９３：３９４−４１０）。
【０２７８】
ラットに、２つの異なる用量のｓｉＲＮＡ（１μｇ／μＬ、１０μｇ／μＬ）を注射し、１日および３日間放置した後、屠殺する。結果は、脊髄損傷標的遺伝子に対するｓｉＲＮＡが運動ニューロン回復を増加させることを示す。
【０２７９】
実施例７：緑内障のモデル系
例えば、Ｐｅａｓｅ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｇｌａｕｃｏｍａ，２００６，１５（６）：５１２−９（Ｍａｎｏｍｅｔｒｉｃ ｃａｌｉｂｒａｔｉｏｎ ａｎｄ ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ ｏｆ ＴｏｎｏＬａｂ ａｎｄ ＴｏｎｏＰｅｎ ｔｏｎｏｍｅｔｅｒｓ ｉｎ ｒａｔｓ ｗｉｔｈ ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ ｇｌａｕｃｏｍａ ａｎｄ ｉｎ ｎｏｒｍａｌ ｍｉｃｅ）によって記載される、動物モデルにおける緑内障を治療または予防する際の有効性について、本発明の化合物を試験する。
【０２８０】
実施例７Ａ：虚血性視神経症（ＩＯＮ）のモデル系

視神経挫滅損傷のプロトコルを使用して、成熟Ｗｉｓｔａｒラットにおける虚血性視神経症に対する動物モデルを確立した。視神経挫滅の７日前、逆行性トレーサフルオロゴールド（２％、Ｆｌｕｏｒｏｃｈｒｏｍｅ，Ｅｎｇｌｅｗｏｏｄ，ＣＯ）の上丘への適用によって、網膜神経節細胞（ＲＧＣ）を選択的に標識する。蛍光トレーサの注射後１週間以内に全てのＲＧＣの完全なおよび特異的な標識化をもたらす、ＲＧＣ軸索に沿った逆行性輸送によって、トレーサを輸送する。逆行性トレーシングの７日後、動物を視神経挫滅損傷に供する。眼窩上アプローチを通じて眼窩視神経を曝露し、視神経内の全ての軸索を、鉗子を用いて１０秒間挫滅することによって、篩板から２ｍｍ横切した。神経挫滅に際して、２０μｇ／５μＬの単回用量の試験修飾したｓｉＲＮＡ化合物のＰＢＳを、ガラスマイクロピペットを使用して、神経頭の２ｍｍ前の硝子体中に微量注射する。
【０２８１】
視神経挫滅の７日後、平坦に封入した網膜上のフルオロゴールド標識化ＲＧＣを数えることによって、ＲＧＣの生存を決定する。視神経挫の１週間後、４％パラホルムアルデヒドを用いて実験動物を経心腔的に灌流する。両方の網膜を解剖し、さらに３０分間固定し、神経節細胞層定量化のためにガラススライド上に平坦に封入する。各網膜中の１６個の異なる領域における蛍光ＲＧＣの数を数え、視神経挫滅損傷を全く受けなかったラットから得た試料、または視神経挫滅損傷と共に、ＰＢＳ、対照ｓｉＲＮＡ、もしくはＧＦＰ ｓｉＲＮＡを注射したラットから得た試料と比較したＲＧＣの生存の割合を決定する。染色ＲＧＣの食作用後に、フルオロゴールドを組み込んだ可能性があるミクログリア細胞を、それらの特徴的な形態によって識別し、定量分析から除外した。
【０２８２】
眼の近くの視神経を横切することによってＲＧＣの全集団を軸索切断した、視神経軸索切断の別のモデルを利用する。（Ｃｈｅｎｇ Ｌ，ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．２００２；２２：３９７７−３９８６）。
【０２８３】
実施例８：ラットにおける肺移植後の虚血／再灌流損傷のモデル系
例えば、Ｍｉｚｏｂｕｃｈｉ ｅｔ ａｌ．，２００４．Ｊ．Ｈｅａｒｔ Ｌｕｎｇ Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ，２３：８８９−９３、Ｈｕａｎｇ，ｅｔ ａｌ，１９９５．Ｊ．Ｈｅａｒｔ Ｌｕｎｇ Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ． １４： Ｓ４９、Ｍａｔｓｕｍｕｒａ，ｅｔ ａｌ，１９９５．Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ ５９： １５０９−１５１７、Ｗｉｌｋｅｓ，ｅｔ ａｌ，１９９９．Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ ６７：８９０−８９６、Ｎａｋａ，ｅｔ ａｌ，１９９６．Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，７９： ７７３−７８３によって記載される実験動物モデルのうちの１つ以上における肺移植後の虚血／再灌流損傷または低酸素性損傷を治療する際の有効性について、本発明の化合物を試験する。
【０２８４】
実施例９：急性呼吸窮迫症候群のモデル系
とりわけ、Ｃｈｅｎ ｅｔ ａｌ （Ｊ Ｂｉｏｍｅｄ Ｓｃｉ．２００３；１０（６ Ｐｔ １）：５８８−９２によって記載される動物モデルにおける急性呼吸窮迫症候群を治療する際の有効性について、本発明の化合物を試験する。ＣＹＢＡ、ＨＲＫ、ＢＮＩＰ３、ＭＡＰＫ８、ＭＡＰＫ１４、ＲＡＣ１、ＧＳＫ３Ｂ、Ｐ２ＲＸ７、ＴＲＰＭ２、ＰＡＲＧ、ＳＰＰ１、およびＤＵＯＸ１を含む遺伝子を標的とする修飾ｓｉＲＮＡ化合物を、この動物モデルにおいて試験した。
【０２８５】
実施例１０：聴力損失病態のモデル系
（ｉ）カルボプラチン誘発性またはシスプラチン誘発性蝸牛有毛細胞死のチンチラモデル
食塩水中の特異的ｓｉＲＮＡを各動物の左耳に直接投与することによって、チンチラを前処置する。プラセボとして、食塩水を各動物の右耳に与える。本発明の特異的修飾ｓｉＲＮＡ化合物の投与の２日後、動物をカルボプラチン（７５ｍｇ／ｋｇ腹腔内）またはシスプラチン（３０分間にわたる１３ｍｇ／ｋｇの腹腔内注入）で処置する。チンチラの（カルボプラチン処置の２週間後の）屠殺後、左耳（ｓｉＲＮＡ処置）および右耳（食塩水処置）における、内有毛細胞（ＩＨＣ）および外有毛細胞（ＯＨＣ）の死細胞の％を算出する。内有毛細胞（ＩＨＣ）および外有毛細胞（ＯＨＣ）の死細胞の％は、左耳（ｓｉＲＮＡ処置）において、右耳（食塩水処置）におけるそれらよりも低いことが算出される。

（ｉｉ）音響誘発性蝸牛有毛細胞死のチンチラモデル
【０２８６】
音響外傷モデルにおける特異的ｓｉＲＮＡの活性をチンチラにおいて研究する。動物を、４ｋＨｚを中心とするオクターブバンドの騒音に１０５ｄＢで２．５時間曝露する。騒音曝露されたチンチラの左耳を、約１０μＬの食塩水中３０μｇのｓｉＲＮＡで前処置（音響外傷の４８時間前）し、右耳をビヒクル（食塩水）で前処置する。化合物活動電位（ＣＡＰ）は、蝸牛殻から伝達される神経活性を測定するための簡便かつ確実な電気生理学的方法である。クリックまたはトーンバースト等の音刺激が突然に作動されたとき生成される局所電場電位を検出するために、蝸牛殻の底部近くに電極を置くことによって、ＣＡＰを記録する。各耳の機能状態を査定する。具体的には、ｓｉＲＮＡ処置された耳における閾値が、無処置（食塩水）の耳よりも低い（良い）かどうかを決定するために、音響外傷の２．５週間後に、円窓から記録した化合物活動電位の平均閾値を決定する。加えて、内有毛細胞および外有毛細胞減少のレベルを、ｓｉＲＮＡ処置された耳および対照耳において決定する。
【０２８７】
類似したモデルをマウスおよびラットにおいて使用する。ＢＮＩＰ３、ＣＡＰＮＳ、ＨＥＳ１、ＨＥＳ５、ＮＯＸ３、ＩＤ１−３、ＨＲＫ、ＡＳＰＰ２（ＴＰ５３ＢＰ）、ＣＡＳＰ２、ＲＡＣ１、ＨＴＲＡ２、ＣＤＫＮ１Ｂを含む遺伝子を標的とする修飾ｓｉＲＮＡ化合物を、聴力損失および聴力再生の、これらのおよび他の動物モデルにおいて試験する。
【０２８８】
実施例１１．骨関節炎（ＯＡ）の動物モデル
コラーゲン誘発関節炎（ＣＩＡ）：マウスにおけるＣＩＡは、Ｔｒｅｎｔｈａｍ ｅｔ ａｌ．（１９７７．Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１４６： ８５７−８６８）に記載される。アジュバント誘発関節炎（ＡＡ）：ＡＡは、Ｋｏｎｇ ｅｔ ａｌ，（１９９９．Ｎａｔｕｒｅ，４０２：３０４−３０８）に記載される。半月板切除モデルは、Ｈａｎ ｅｔ ａｌ，（１９９９．Ｎａｇｏｙａ Ｊ Ｍｅｄ Ｓｃｉ ６２（３−４）： １１５−２６）に記載される。
【０２８９】
当該技術分野で既知のインビトロモデルに加えて、上のモデルのうちの１つ以上を使用して、軟骨細胞増殖、最終分化、および関節炎の発症等のＯＡに関連する異なるパラメータに及ぼす、ＳＳＰ１に対するｓｉＲＮＡ等の異なるｓｉＲＮＡ阻害剤の効果を評価する。アポトーシス促進性遺伝子、特にＳＳＰ１を対象とする修飾ｓｉＲＮＡ化合物を、修飾ｓｉＲＮＡ化合物がＯＡを治療および／または予防することを示し、したがってこの病態を治療するために使用され得るこれらの動物モデルにおいて試験する。
【０２９０】
実施例１２：移植関連急性腎傷害についてのラットモデル系
温虚血−試験ラットにおいて、左腎摘除を行い、続いて４５分間の温腎移植片保存期間をもたらす自家移植を行う。自家移植後、同じ動物に対して右腎摘除を行う。腎移植片（ドナー処置を模倣する）の採集前（「前」）、もしくは腎自家移植（レシピエント処置を模倣する）後のいずれかに、または採集前および移植後の両方（ドナーおよびレシピエント処置の組み合わせ）（「前−後」）で、標的に対する化学的修飾ｓｉＲＮＡを、大腿静脈を介して静脈投与する。
【０２９１】
冷虚血−ドナー動物に対して左腎摘除を行い、続いて採集した腎臓の冷保存（氷上）を５時間の期間行う。期間の終了時に、レシピエントラットに両側腎摘除を受けさせ、続いて冷保存された腎移植片の移植を行うことになる。温虚血の総時間（外科手術を含む）は、約３０分である。化学修飾ｓｉＲＮＡを、腎臓採集前（「前」）のドナー動物に、または移植の１５分（「１５分後」）もしくは４時間（「４時間後」）後のレシピエント動物に、大腿静脈を介して静脈投与する。
【０２９２】
移植後の腎機能を改善させる際の本発明の修飾ｓｉＲＮＡ化合物の有効性を査定するために、移植後１、２、および７日目に、温および冷虚血モデルの両方において血清クレアチニンレベルを測定する。
【０２９３】
当業者であれば、日常的な実験のみを使用して、本明細書に記載される本発明の具体的な実施形態の等価物を認識するか、または確認することができるであろう。かかる等価物は、次の特許請求の範囲によって包含されることが意図される。

【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下に記載される構造（Ａ）を有する二本鎖核酸分子であって、
（Ａ） ５′ Ｎ^１−（Ｎ）ｘ−Ｚ ３′（アンチセンス鎖）
３′ Ｚ′−Ｎ^２−（Ｎ′）ｙ−ｚ′′ ５′（センス鎖）
式中、Ｎ^２、Ｎ、およびＮ′のそれぞれは、非修飾もしくは修飾リボヌクレオチド、または非従来的部分であり、
（Ｎ）ｘおよび（Ｎ′）ｙのそれぞれは、それぞれの連続するＮまたはＮ′が、共有結合によって隣接するＮまたはＮ′と連結するオリゴヌクレオチドであり、
ｘおよびｙのそれぞれは、独立して、１７〜３９の整数であり、
前記（Ｎ′）ｙの配列は、（Ｎ）ｘの配列に対して相補性があり、（Ｎ）ｘは、標的ＲＮＡの連続する配列に対して相補性があり、
Ｎ^１は、（Ｎ）ｘに共有結合して、前記標的ＲＮＡとミスマッチするか、または前記標的ＲＮＡに相補的なＤＮＡヌクレオチドであり、
Ｎ^１は、天然もしくは修飾された、ウリジン、デオキシリボウリジン、リボチミジン、デオキシリボチミジン、アデノシン、またはデオキシアデノシンから成る群から選択される部分であり、式中、ｚ′′は、存在してもしなくてもよいが、存在する場合は、Ｎ^２−（Ｎ′）ｙの５′末端に共有結合するキャッピング部分であり、
ＺおよびＺ′のそれぞれは、独立して、存在するか、あるいは存在しないが、存在する場合は、独立して、それが存在する鎖の３′末端に共有結合する１〜５個の連続するヌクレオチド、連続する非ヌクレオチド部分、またはそれらの組み合わせである、二本鎖核酸分子。
【請求項２】
前記（Ｎ′）ｙの配列は、前記（Ｎ）ｘの配列に対して完全に相補的である、請求項１に記載の二本鎖核酸分子。
【請求項３】
前記Ｎ^２−（Ｎ′）ｙの配列は、前記Ｎ^１−（Ｎ）ｘの配列に対して相補的である、請求項１に記載の二本鎖核酸分子。
【請求項４】
（Ｎ）ｘは、標的ＲＮＡの約１７個〜約３９個の連続するヌクレオチドに対して完全に相補的であるアンチセンスを含む、請求項１に記載の二本鎖核酸分子。
【請求項５】
（Ｎ）ｘは、標的ＲＮＡの約１７個〜約３９個の連続するヌクレオチドに対して実質的に相補的であるアンチセンスを含む、請求項１に記載の二本鎖核酸分子。
【請求項６】
Ｎ^１およびＮ^２は、ワトソンクリック塩基対を形成する、請求項１に記載の二本鎖核酸分子。
【請求項７】
Ｎ^１およびＮ^２は、非ワトソンクリック塩基対を形成する、請求項１に記載の二本鎖核酸分子。
【請求項８】
ｘ＝ｙ＝１８、ｘ＝ｙ＝１９、またはｘ＝ｙ＝２０である、請求項１〜７のいずれか１項に記載の二本鎖核酸分子。
【請求項９】
ｘ＝ｙ＝１８である、請求項８に記載の二本鎖核酸分子。
【請求項１０】
Ｎ^１は、（Ｎ）ｘに共有結合し、前記標的ＲＮＡとミスマッチする、請求項１〜９のいずれか１項に記載の二本鎖核酸分子。
【請求項１１】
Ｎ^１は、（Ｎ）ｘに共有結合し、前記標的ＲＮＡに対して相補的なＤＮＡ部分である、請求項１〜９のいずれか１項に記載の二本鎖核酸分子。
【請求項１２】
Ｎ^１は、アデノシン、デオキシアデノシン、デオキシウリジン、リボチミジン、またはデオキシチミジンから選択され、前記標的ＲＮＡの対合ヌクレオチドのヌクレオチドは、アデノシンである、請求項１〜９のいずれか１項に記載の二本鎖核酸分子。
【請求項１３】
Ｎ^１は、アデノシン、デオキシアデノシン、またはデオキシウリジンから選択される、請求項１２に記載の二本鎖核酸分子。
【請求項１４】
Ｎ^１は、アデノシン、デオキシアデノシン、ウリジン、デオキシウリジン、リボチミジン、またはデオキシチミジンから選択され、前記標的ＲＮＡの対合ヌクレオチドのヌクレオチドは、シチジンである、請求項１〜９のいずれか１項に記載の二本鎖核酸分子。
【請求項１５】
Ｎ^１は、アデノシン、デオキシアデノシン、ウリジン、またはデオキシウリジンから選択される、請求項１４に記載の二本鎖核酸分子。
【請求項１６】
Ｎ^１は、アデノシン、デオキシアデノシン、ウリジン、デオキシウリジン、リボチミジン、またはデオキシチミジンから選択され、前記標的ＲＮＡの対合ヌクレオチドのヌクレオチドは、グアノシンである、請求項１〜９のいずれか１項に記載の二本鎖核酸分子。
【請求項１７】
Ｎ^１は、アデノシン、デオキシアデノシン、ウリジン、またはデオキシウリジンから選択される、請求項１６に記載の二本鎖核酸分子。
【請求項１８】
Ｎ^１は、デオキシアデノシン、デオキシウリジン、リボチミジン、またはデオキシチミジンから選択され、前記標的ＲＮＡの対合ヌクレオチドのヌクレオチドは、ウリジンである、請求項１〜９のいずれか１項に記載の二本鎖核酸分子。
【請求項１９】
Ｎ^１は、デオキシアデノシンまたはデオキシウリジンから選択される、請求項１８に記載の二本鎖核酸分子。
【請求項２０】
Ｎ^１およびＮ^２は、ウリジンまたはデオキシウリジンと、アデノシンまたはデオキシアデノシンとの間で塩基対を形成する、請求項１〜９のいずれか１項に記載の二本鎖酸性分子。
【請求項２１】
Ｎ^１およびＮ^２は、デオキシウリジンとアデノシンとの間で塩基対を形成する、請求項１〜９のいずれか１項に記載の二本鎖酸性分子。
【請求項２２】
Ｚ′′が、存在する、請求項１〜２１のいずれか１項に記載の二本鎖酸性分子。
【請求項２３】
ＺおよびＺ′が、存在しない、請求項１〜２２のいずれか１項に記載の二本鎖核酸分子。
【請求項２４】
ＺまたはＺ′のうちの１つが存在する、請求項１〜２２のいずれか１項に記載の二本鎖核酸分子。
【請求項２５】
ＺまたはＺ′は、非ヌクレオチド部分を含む、請求項１〜２２のいずれか１項に記載の二本鎖核酸分子。
【請求項２６】
ＮまたはＮ′のうちの少なくとも１つは、２′ＯＭｅ糖修飾リボヌクレオチドを含む、請求項１〜２５のいずれか１項に記載の二本鎖核酸分子。
【請求項２７】
Ｎは、単一の交互の非修飾リボヌクレオチドと２′ＯＭｅ糖修飾リボヌクレオチドとを含む、請求項２６に記載の二本鎖核酸分子。
【請求項２８】
Ｎ^２は２′ＯＭｅ糖修飾リボヌクレオチドを含む、請求項１〜２７のいずれか１項に記載の二本鎖核酸分子。
【請求項２９】
前記二本鎖核酸分子は、ｓｉＲＮＡ、ｓｉＮＡ、またはｍｉＲＮＡである、請求項１〜２８のいずれか１項に記載の二本鎖核酸分子。
【請求項３０】
ｘ＝ｙ＝１８であり、Ｚ′は存在せず、Ｚは存在し、かつリン酸ジエステル結合によって互いに共有結合している２つのアルキル部分を含み、Ｎ^２はアデノシンを含み、Ｎ^１はウリジンを含む、請求項１に記載の二本鎖核酸分子。
【請求項３１】
ｘ＝ｙ＝１８であり、Ｚ′は存在せず、Ｚは存在し、かつリン酸ジエステル結合によって互いに共有結合している２つのアルキル部分を含み、Ｎ^２はウリジンまたはデオキシウリジンを含み、Ｎ^１はアデノシンを含む、請求項１に記載の二本鎖核酸分子。
【請求項３２】
前記標的ＲＮＡは哺乳動物遺伝子のｍＲＮＡである、請求項１〜３１のいずれか１項に記載の二本鎖核酸分子。
【請求項３３】
前記標的ＲＮＡはヒト遺伝子のｍＲＮＡである、請求項３２に記載の二本鎖核酸分子。
【請求項３４】
療法で用いる、請求項１〜３３のいずれか１項に記載の二本鎖核酸分子。
【請求項３５】
請求項１〜３４のいずれか１項に記載の少なくとも１つの二本鎖核酸分子、および薬学的に許容される担体を含む、薬学的組成物。
【請求項３６】
疾患または状態の発生または重症度の治療または防止を必要とする対象において、疾患または状態の発生または重症度を治療または防止するための方法であって、前記対象に、前記疾患または前記状態の発病を防止、治療、または遅延させるのに有効な量で、請求項１〜３３のいずれか１項に記載の二本鎖核酸分子または請求項３５に記載の薬学的組成物を投与することを含み、それに随伴する前記疾患または前記状態および／または症状は、聴力損失、急性腎不全（ＡＲＦ）、腎臓移植後の臓器機能障害（ＤＧＦ）、緑内障、眼虚血状態（非動脈炎性虚血性視神経症（ＮＡＩＯＮ）、前部虚血性視神経症、加齢性黄斑変性症（ＡＭＤ）、虚血性視神経障害（ＩＯＮ）およびドライアイ症候群を含む）、急性呼吸促迫症候群（ＡＲＤＳ）および他の急性肺および呼吸器傷害、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）、一次移植不全、虚血再灌流傷害、再灌流傷害、再灌流浮腫、同種移植片機能不全、肺の再移植応答および／または臓器移植後、特に、肺移植、臓器移植（肺、肝臓、心臓、膵臓、および腎臓移植を含む）の移植後の一次移植機能不全（ＰＧＤ）、腎毒性および神経毒性、脊髄損傷、脳損傷、神経変性疾患もしくは状態、褥瘡、口腔粘膜炎、繊維性疾患、ならびに癌から成る群から選択される、方法。
【請求項３７】
センス鎖およびアンチセンス鎖から成る二本鎖ＲＮＡ分子を生成する方法であって、
ａ）標的ＲＮＡの連続する１７〜２５個のヌクレオチド配列を選択し、前記標的ｍＲＮＡの前記連続する１７〜２５個のヌクレオチド配列に対して相補性を含むアンチセンス鎖を合成するステップであって、前記アンチセンス鎖の５′末端ヌクレオチドは、ウリジン、修飾ウリジン、リボチミジン、デオキシリボチミジン、アデノシン、修飾アデノシン、デオキシアデノシン、または修飾デオキシアデノシンで置換されるが、但し、ｒＧ：ｒＵ鎖オリゴヌクレオチドおよび前記標的ｍＲＮＡの３′末端ヌクレオチドという条件である、ステップと、
ｂ）前記アンチセンス鎖に対して相補性を有する１７〜２５個のヌクレオチドのセンス鎖を合成するステップであって、前記センス鎖の３′末端ヌクレオチドは、前記アンチセンス鎖の５′末端ヌクレオチドとのワトソンクリック塩基対を形成する、ステップと、
ｃ）前記センスおよびアンチセンス鎖をアニーリングし、それによって、二本鎖ＲＮＡ分子を生成するステップと、を含む、方法。
【請求項３８】
非修飾ｓｉＲＮＡ二重鎖と比較して、ＲＮＡｉ活性の増強を示す、センス鎖およびアンチセンス鎖から成る修飾ｓｉＲＮＡ二重鎖を生成する方法であって、
ａ）標的ｍＲＮＡの連続する１７〜２５個のヌクレオチド配列を選択し、前記標的ｍＲＮＡの前記連続する１７〜２５個のヌクレオチド配列を含むセンス鎖を合成するステップであって、３′末端ヌクレオチドは、アデノシン、修飾アデノシン、デオキシアデノシン、または修飾デオキシアデノシンで置換される、ステップと、
ｂ）前記センス鎖に対して相補性を有する１７〜２５個のヌクレオチドのアンチセンス鎖を合成するステップであって、５′末端ヌクレオチドは、リボウリジン、修飾リボウリジン、デオキシリボウリジン、または修飾デオキシリボウリジン、およびパッセンジャー鎖の３′末端ヌクレオチドとの塩基対を含む、ステップと、
ｃ）前記センス鎖を前記アンチセンス鎖にアニーリングし、
それによって、増強したＲＮＡｉ活性を有するｓｉＲＮＡ二重鎖を生成するステップと、を含む、方法。
【請求項３９】
前記３′末端ヌクレオチドは、アデノシン以外である、請求項３７または３８に記載の方法。

【図１】

【図２】

【図３】

【図４】

【図５】

【図６】

【図７】

【図８】

【図９】

【図１０】

【公表番号】特表２０１３−５１１９９０（Ｐ２０１３−５１１９９０Ａ）
【公表日】平成２５年４月１１日（２０１３．４．１１）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１２−５４１２１１（Ｐ２０１２−５４１２１１）
【出願日】平成２２年１１月２５日（２０１０．１１．２５）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２０１０／０５８１２３
【国際公開番号】ＷＯ２０１１／０６６４７５
【国際公開日】平成２３年６月３日（２０１１．６．３）
【出願人】（５０９２９４０７０）クォーク　ファーマシューティカルズ　インコーポレーティッド (8)
【氏名又は名称原語表記】ＱＵＡＲＫ　ＰＨＡＲＭＡＣＥＵＴＩＣＡＬＳ，ＩＮＣ．
【住所又は居所原語表記】６５０１　Ｄｕｍｂａｒｔｏｎ　Ｃｉｒｃｌｅ，Ｆｒｅｍｏｎｔ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ　Ｕ．Ｓ．Ａ．
【Ｆターム（参考）】