染色体に基くプラットホーム
【課題】プラットホーム人工染色体への異種核酸の導入方法を提供すること。
【解決手段】プラットホーム人工染色体への異種核酸の導入方法であって、
(ａ)少なくとも第一組換え部位を含む人工染色体および少なくとも第二組換え部位および異種核酸を含むベクターを混合し、
(ｂ)第一および第二組換え部位間の組換えが行なわれる条件下、生じた混合物を、少なくとも一つの組換えタンパク質の存在下でインキュベーションし、それによって異種核酸を人工染色体へ導入する
工程を含む方法を提供する。
【解決手段】プラットホーム人工染色体への異種核酸の導入方法であって、
(ａ)少なくとも第一組換え部位を含む人工染色体および少なくとも第二組換え部位および異種核酸を含むベクターを混合し、
(ｂ)第一および第二組換え部位間の組換えが行なわれる条件下、生じた混合物を、少なくとも一つの組換えタンパク質の存在下でインキュベーションし、それによって異種核酸を人工染色体へ導入する
工程を含む方法を提供する。
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
１個または複数のａｔｔ部位を含む真核生物染色体であって、
ａｔｔ部位が染色体にとって異種のものであり、そして
ａｔｔ部位がラムダ・インテグラーゼの存在下での位置指定組込みを可能にする
真核生物染色体。
【請求項２】
ａｔｔ部位が、ａｔｔＰおよびａｔｔＢまたはａｔｔＬおよびａｔｔＲ、またはその変異型から成る群から選択される、請求項１記載の真核生物染色体。
【請求項３】
人工染色体である、請求項１記載の真核生物染色体。
【請求項４】
人工染色体発現系(ＡＣｅｓ)である、請求項１記載の真核生物染色体。
【請求項５】
主にヘテロクロマチンである、請求項４記載の真核生物染色体。
【請求項６】
約３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％または９５％以下の割合でユークロマチンを含む人工染色体である、請求項１記載の染色体。
【請求項７】
植物染色体である、請求項１記載の染色体。
【請求項８】
動物染色体である、請求項１記載の染色体。
【請求項９】
植物人工染色体である、請求項７記載の染色体。
【請求項１０】
動物人工染色体である、請求項８記載の染色体。
【請求項１１】
哺乳類染色体である、請求項８記載の染色体。
【請求項１２】
哺乳類人工染色体である、請求項１１記載の染色体。
【請求項１３】
人工染色体発現系(ＡＣｅｓ)である、請求項６記載の染色体。
【請求項１４】
リコンビナーゼ触媒による組換えに関与する１個または複数の部位を含むプラットホーム人工染色体発現系(ＡＣｅｓ)。
【請求項１５】
一部位を含む、請求項１４記載のＡＣｅｓ。
【請求項１６】
主にヘテロクロマチンである、請求項１４記載のＡＣｅｓ。
【請求項１７】
約３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％または９５％以下の割合でユークロマチンを含む、請求項１４記載のＡＣｅｓ。
【請求項１８】
植物ＡＣｅｓである、請求項１４記載のＡＣｅｓ。
【請求項１９】
動物ＡＣｅｓである、請求項１４記載のＡＣｅｓ。
【請求項２０】
魚、昆虫、爬虫類、両生類、蛛形類または哺乳類ＡＣｅｓから選択される、請求項１４記載のＡＣｅｓ。
【請求項２１】
魚ＡＣｅｓである、請求項１４記載のＡＣｅｓ。
【請求項２２】
リコンビナーゼおよび部位(複数も可)が、バクテリオファージＰ１のＣｒｅ／ｌｏｘ系、ラムダファージのｉｎｔ／ａｔｔ系、酵母のＦＬＰ／ＦＲＴ系、ファージＭｕのＧｉｎ／ｇｉｘリコンビナーゼ系、Ｃｉｎリコンビナーゼ系、エシェリキア・コリ(E.coli)のＰｉｎリコンビナーゼ系、ｐＳＲ１プラスミドのＲ／ＲＳ系、またはそれらの任意の組合わせに由来する、請求項１４記載の人工染色体発現系(ＡＣｅｓ)。
【請求項２３】
異種核酸を染色体へ導入する方法であって、
染色体および核酸分子における部位間の組換えを促進するリコンビナーゼの存在下、異種核酸および組換え部位を共に含む核酸分子と請求項１または１４のいずれかに記載の染色体を接触させることを含む方法。
【請求項２４】
リコンビナーゼが、Ｃｒｅ、Ｇｉｎ、Ｃｉｎ、Ｐｉｎ、ＦＬＰ、ファージインテグラーゼおよびｐＳＲ１プラスミドからのＲから成る群から選択される、請求項２３記載の方法。
【請求項２５】
核酸分子が、治療的タンパク質、アンチセンス核酸をコード化するか、または人工染色体を含む、請求項２３記載の方法。
【請求項２６】
核酸分子が、酵母人工染色体(ＹＡＣ)、細菌性人工染色体(ＢＡＣ)または昆虫人工染色体(ＩＡＣ)を含む、請求項２５記載の方法。
【請求項２７】
請求項１記載の染色体および同族組換え部位を含む第一ベクターを含む組み合わせであって、同族組換え部位が、染色体へ遺伝子操作により組込まれた部位との組換え部位である、組み合わせ。
【請求項２８】
さらにリコンビナーゼをコード化する核酸を含み、核酸が第二ベクターまたは第一ベクター、または誘導性プロモーター下のＡＣｅｓにある、請求項２７記載の組み合わせ。
【請求項２９】
リコンビナーゼおよび部位が、バクテリオファージＰ１のＣｒｅ／ｌｏｘ系、ラムダファージのｉｎｔ／ａｔｔ系、酵母のＦＬＰ／ＦＲＴ系、ファージＭｕのＧｉｎ／ｇｉｘリコンビナーゼ系、エシェリキア・コリ(E.coli)のＰｉｎリコンビナーゼ系、ｐＳＲ１プラスミドのＲ／ＲＳ系、またはそれらの任意の組合わせに由来する、請求項２８記載の組み合わせ。
【請求項３０】
ベクターがプラスミドｐＣＸＬａｍＩｎｔＲである、請求項２８記載の組み合わせ。
【請求項３１】
ベクターがプラスミドｐＤｓＲｅｄＮ１−ａｔｔＢである、請求項２７記載の組み合わせ。
【請求項３２】
請求項２７記載の組み合わせおよび所望により染色体への異種核酸導入についての使用説明書を含んでいてもよい、キット。
【請求項３３】
プラットホーム人工染色体への異種核酸の導入方法であって、
(ａ)少なくとも第一組換え部位を含む人工染色体および少なくとも第二組換え部位および異種核酸を含むベクターを混合し、
(ｂ)第一および第二組換え部位間の組換えが行なわれる条件下、生じた混合物を、少なくとも一つの組換えタンパク質の存在下でインキュベーションし、それによって異種核酸を人工染色体へ導入する
工程を含む方法。
【請求項３４】
人工染色体がＡＣｅｓである、請求項３３記載の方法。
【請求項３５】
混合工程(ａ)をエクスビボ細胞で実施する、請求項３３記載の方法。
【請求項３６】
混合工程(ａ)をインビトロ反応混合物中において細胞外的に実施する、請求項３３記載の方法。
【請求項３７】
少なくとも一つの組換えタンパク質が、バクテリオファージ・ラムダ、ｐｈｉ８０、Ｐ２２、Ｐ２、１８６、Ｐ４およびＰ１から成る群から選択されたバクテリオファージによりコード化される、請求項３３記載の方法。
【請求項３８】
少なくとも一つの組換えタンパク質が、バクテリオファージ・ラムダまたはその突然変異体によりコード化される、請求項３７記載の方法。
【請求項３９】
少なくとも一つの組換えタンパク質が、Ｉｎｔ、ＩＨＦ、Ｘｉｓ、Ｃｒｅ、ｙδ、Ｔｎ３リゾルベース、Ｈｉｎ、Ｇｉｎ、ＣｉｎおよびＦｌｐから成る群から選択される、請求項３３記載の方法。
【請求項４０】
組換え部位が、ａｔｔおよびｌｏｘＰ部位から成る群から選択される、請求項３３記載の方法。
【請求項４１】
第一および／または第二組換え部位が、１個またはそれ以上の停止コドンを除去する少なくとも１つの突然変異を含む、請求項３３記載の方法。
【請求項４２】
第一および／または第二組換え部位が、ヘアピン形成を回避する少なくとも一つの突然変異を含む、請求項３３記載の方法。
【請求項４３】
第一および第二組換え部位が、配列番号４１〜５６：
【化１】
および対応するまたは相補的ＤＮＡまたはＲＮＡ配列、
(ただし、Ｒ＝ＡまたはＧ、Ｋ＝ＧまたはＴ／Ｕ、Ｙ＝ＣまたはＴ／Ｕ、Ｗ＝ＡまたはＴ／Ｕ、Ｎ＝ＡまたはＣまたはＧまたはＴ／Ｕ、Ｓ＝ＣまたはＧ、およびＢ＝ＣまたはＧまたはＴ／Ｕ)、
から成る群から選択される少なくとも第一核酸配列を含み、
コア領域が１個またはそれ以上の読み枠において停止コドンを含まない、
請求項３３記載の方法。
【請求項４４】
第一および／または第二組換え部位が、組換え特異性を高める少なくとも１個の突然変異を含む突然変異ａｔｔ組換え部位、それと相補的なＤＮＡ配列、およびそれに対応するＲＮＡ配列から成る群から選択される少なくとも第一核酸配列を含む、請求項３３記載の方法。
【請求項４５】
第二部位を含むベクターがさらに少なくとも１個の選択マーカーをコード化する、請求項３３記載の方法。
【請求項４６】
マーカーが、プロモーター非随伴マーカーであって、組換え時、プロモーターの制御下にあり、それによって発現される、請求項４５記載の方法。
【請求項４７】
第一組換え部位がａｔｔＰであり、組換え前にはセンス配向である、請求項４６記載の方法。
【請求項４８】
選択マーカーが、抗生物質耐性遺伝子および検出可能タンパク質から成る群から選択され、検出可能タンパク質が、色素原性、蛍光性であるか、または抗体により結合され、ＦＡＣｓ選別され得るものである、請求項４６記載の方法。
【請求項４９】
選択マーカーが、緑色蛍光タンパク質(ＧＦＰ)、赤色蛍光タンパク質(ＲＦＰ)、青色蛍光タンパク質(ＢＦＰ)、およびエシェリキア・コリ(E.coli)ヒスチジノールデヒドロゲナーゼ(ｈｉｓＤ)から成る群から選択される、請求項４８記載の方法。
【請求項５０】
請求項１記載の染色体を含む細胞。
【請求項５１】
細胞が核供与細胞である、請求項５０記載の細胞。
【請求項５２】
細胞が幹細胞である、請求項５０記載の細胞。
【請求項５３】
幹細胞がヒトのものであり、間葉幹細胞、造血幹細胞、成人幹細胞および胚性幹細胞から成る群から選択される、請求項５２記載の幹細胞。
【請求項５４】
細胞が哺乳類のものである、請求項５０記載の細胞。
【請求項５５】
哺乳類が、ヒト、霊長類、ウシ、ブタ、ウサギ、ヤギ、ヒツジ、マウス、ラット、モルモット、ハムスター、ネコ、イヌおよびウマから成る群から選択される、請求項５４記載の細胞。
【請求項５６】
細胞が植物細胞である、請求項５０記載の細胞。
【請求項５７】
請求項１４記載のプラットホームＡＣｅｓを含む細胞。
【請求項５８】
細胞が核供与細胞である、請求項５７記載の細胞。
【請求項５９】
細胞が幹細胞である、請求項５７記載の細胞。
【請求項６０】
幹細胞が、ヒトのものであり、間葉幹細胞、造血幹細胞、成人幹細胞および胚性幹細胞から成る群から選択される、請求項５９記載の幹細胞。
【請求項６１】
人工染色体を含むヒト間葉細胞。
【請求項６２】
人工染色体がＡＣｅｓである、請求項６１記載のヒト間葉細胞。
【請求項６３】
ＡＣｅｓがプラットホームＡＣｅｓである、請求項６２記載のヒト間葉細胞。
【請求項６４】
請求項６３記載の間葉細胞への異種核酸の導入方法であって、
(ａ)プラットホーム−ＡＣｅｓが第一組換え部位を有する請求項６３記載の細胞へ、少なくとも第二組換え部位および異種核酸を含むベクターを導入し、
(ｂ)第一および第二組換え部位間の組換えが行なわれる条件下、少なくとも一つの組換えタンパク質の存在下で生成した混合物をインキュベーションし、それによって異種核酸を間葉細胞内のプラットホームＡＣｅｓへ導入する
手順を含む方法。
【請求項６５】
野生型ラムダ−ｉｎｔＲの１７４位にグルタミン酸からアルギニンへの変化を含むラムダ−ｉｎｔＲムテイン。
【請求項６６】
ラムダ−ｉｎｔＲムテインが配列番号３７を含む、請求項６５記載のラムダ−ｉｎｔＲムテイン。
【請求項６７】
プロモーター非随伴マーカーが異種核酸の転写的に下流であり、異種核酸が異種タンパク質をコード化し、そして発現レベルの選択マーカーが発現レベルの異種タンパク質に転写的に結合されている、請求項４６記載の方法。
【請求項６８】
選択マーカーおよび異種核酸が、それらの間におけるＩＲＥＳの存在により転写的に結合されている、請求項６７記載の方法。
【請求項６９】
選択マーカーが、抗生物質耐性遺伝子および検出可能タンパク質から成る群から選択され、検出可能タンパク質が色素原性または蛍光性である、請求項６８記載の方法。
【請求項７０】
選択マーカーが、緑色蛍光タンパク質(ＧＦＰ)、赤色蛍光タンパク質(ＲＦＰ)、青色蛍光タンパク質(ＢＦＰ)、およびエシェリキア・コリ(E.coli)ヒスチジノールデヒドロゲナーゼから成る群から選択される、請求項６９記載の方法。
【請求項７１】
さらに異種タンパク質を発現させ、異種タンパク質を単離することを含む、請求項６７記載の方法。
【請求項７２】
プラットホーム−ＡＣｅｓを胚細胞へ導入することを含む、トランスジェニック動物の製造方法。
【請求項７３】
胚細胞が幹細胞である、請求項７２記載の方法。
【請求項７４】
胚細胞が胚にある、請求項７２記載の方法。
【請求項７５】
プラットホーム−ＡＣｅｓが、治療的生成物をコード化する異種核酸を含む、請求項７２記載の方法。
【請求項７６】
トランスジェニック動物が、魚、昆虫、爬虫類、両生類、蛛形類または哺乳類である、請求項７２記載の方法。
【請求項７７】
ＡＣｅｓが、細胞融合、担体系による脂質仲介トランスフェクション、マイクロインジェクション、ミクロセル融合、エレクトロポレーション、微粒子銃または直接ＤＮＡ導入により導入される、請求項７２記載の方法。
【請求項７８】
請求項７２記載の方法により製造されたトランスジェニック動物。
【請求項７９】
内性染色体全体に無作為に組込まれた様々な異種組換え部位を含む、ＡＣｅｓのライブラリー作成に有用なセルライン。
【請求項８０】
ゲノムのランダム部分を含むＡＣｅｓのライブラリーの作成方法であって、細胞染色体ＤＮＡ内の様々な異種組換え部位へ、およびそこからのＡＣｅｓの位置特異的染色体アーム交換を促進する条件下、１個またはそれ以上のＡＣｅｓを請求項７９記載のセルラインに導入し、様々なＡＣｅｓを単離することにより、多様なＡＣｅｓがその中のゲノムの異なる部分を有するＡＣｅｓのライブラリーを製造することを含む方法。
【請求項８１】
ゲノムスクリーニングに有用な細胞のライブラリーであって、各細胞がそこの染色体核酸の相互限定的部分を有するＡＣｅｓを含む、様々な細胞を含むライブラリー。
【請求項８２】
ライブラリーの細胞が、ＡＣｅｓ内の染色体核酸とは異なる種に由来する、請求項８１記載の細胞のライブラリー。
【請求項８３】
１種またはそれ以上のセルラインの製造方法であって、
ａ）選択された細胞種の内性染色体ＤＮＡへ様々な異種組換え部位を組込み、
ｂ）細胞内性染色体ＤＮＡ内に組込まれた様々な異種組換え部位へ、およびそこからのＡＣｅｓの位置特異的染色体アーム交換を促進する条件下様々なＡＣｅｓを導入し、
ｃ）様々なＡＣｅｓを単離することにより、様々なＡＣｅｓがそこの内性染色体ＤＮＡの相互限定的部分を有するＡＣｅｓのライブラリーを製造し、
ｄ）工程ｃ）の単離された様々なＡＣｅｓを様々な細胞へ導入することにより、細胞のライブラリーを作製し、
ｅ）相互限定的なＡＣｅｓをそこに有する異なる細胞を選択し、異なる細胞をクローン細胞培養物へクローン的に拡張または分化させることにより、１種またはそれ以上のセルラインを作製する
工程を含む方法。
【請求項８４】
組換え部位をもつ核酸分子がＰＣＲ産物である、請求項２３記載の方法。
【請求項８５】
リコンビナーゼがタンパク質であり、組換え事象がインビトロで生じる、請求項２３記載の方法。
【請求項８６】
ベクターが、第二組換え部位を含むＰＣＲ産物である、請求項３３記載の方法。
【請求項８７】
ムテインがさらに核局在性についてのアミノ酸シグナルを含む、請求項６５記載のラムダ−ｉｎｔＲムテイン。
【請求項８８】
ムテインがさらにタンパク質精製のためのエピトープ標識を含む、請求項６５記載のラムダ−ｉｎｔＲムテイン。
【請求項８９】
配列番号１２８を含む修飾鉄誘導プロモーター。
【請求項９０】
請求項８９のプロモーターを含むプラスミドまたは発現カセット。
【請求項９１】
組換え用の認識部位、および
ベクターを増幅可能な染色体領域へターゲッティングするヌクレオチド配列
を含むベクター。
【請求項９２】
増幅可能な領域がヘテロクロマチン核酸を含む、請求項９１記載のベクター。
【請求項９３】
増幅可能な領域がｒＤＮＡを含む、請求項９１記載のベクター。
【請求項９４】
ｒＤＮＡが遺伝子間スペーサーを含む、請求項９３記載のベクター。
【請求項９５】
さらに、いかなるプロモーターとも機能し得るように結合されてはいない選択マーカーをコード化する核酸を含む、請求項９１記載のベクター。
【請求項９６】
染色体が哺乳類染色体である、請求項９１記載のベクター。
【請求項９７】
染色体が植物染色体である、請求項９１記載のベクター。
【請求項９８】
植物細胞であり、ＡＣｅｓプラットホームがＭＡＣである、請求項５７記載の細胞。
【請求項９９】
ＭＡＣが、植物から誘導されたヌクレオチドの転写調節配列を含む、請求項９８記載の植物細胞。
【請求項１００】
調節配列が、プロモーター、ターミネーター、エンハンサー、サイレンサーおよび転写因子結合部位から成る群から選択される、請求項９９記載の植物細胞。
【請求項１０１】
動物細胞であり、ＡＣｅｓプラットホームが植物人工染色体(ＰＡＣ)である、請求項５７記載の細胞。
【請求項１０２】
哺乳類細胞である、請求項１０１記載の細胞。
【請求項１０３】
ＭＡＣが、植物から誘導されたヌクレオチドの転写調節配列を含む、請求項９８記載の細胞。
【請求項１０４】
ＰＡＣが、動物から誘導されたヌクレオチドの転写調節配列を含む、請求項１０２記載の細胞。
【請求項１０５】
調節配列が、プロモーター、ターミネーター、エンハンサー、サイレンサーおよび転写因子結合部位から成る群から選択される、請求項１０４記載の細胞。
【請求項１０６】
請求項９１記載のベクターを細胞に導入し、
細胞を成長させ、そして
１個またはそれ以上の反復領域を含む人工染色体を含む細胞を選択する
ことを含む方法。
【請求項１０７】
ベクターの十分な部分が細胞における染色体へ組込まれることにより、染色体ＤＮＡが増幅される、請求項１０６記載の方法。
【請求項１０８】
人工染色体がＡＣｅｓである、請求項１０６記載の方法。
【請求項１０９】
リポーターＡＣｅｓを含む細胞を、試験化合物または既知化合物と接触させ、ただし
リポーターＡＣｅｓは１個または複数のリポーター構築物を含み、
リポーター構築物は、試験または既知化合物に応答する調節領域と機能し得るように結合されたリポーター遺伝子を含むものとし、そして
リポーターからのシグナル出力の増加または減少を検出することを含み、ただし、シグナルの変化は調節領域に対する試験または既知化合物の活性の指標であるものとする、
スクリーニング方法。
【請求項１１０】
リポーターが、シグナル伝達経路における遺伝子の発現を制御するプロモーターに機能し得るように結合されており、それによってシグナルの活性化または低減化が、試験化合物により経路が活性化またはダウンレギュレーションされたことを示すものである、請求項１０９記載の方法。
【請求項１１１】
構築物におけるリポーターが、薬剤耐性をコード化または蛍光タンパク質をコード化する、請求項１０９記載の方法。
【請求項１１２】
蛍光タンパク質が、赤色、緑色および青色蛍光タンパク質から成る群から選択される、請求項１１１記載の方法。
【請求項１１３】
ＡＣｅｓが、各々異なるリポーターを伴う、複数のリポーター結合構築物を含み、それにより試験化合物により影響される経路(複数も可)が解明され得る、請求項１０９記載の方法。
【請求項１１４】
リポーターが、ＤＮＡ損傷に応答して転写調節されるプロモーターに機能し得るように結合されており、試験化合物が遺伝子毒性物質である、請求項１０９記載の方法。
【請求項１１５】
ＤＮＡ損傷がアポトーシス、壊死または細胞周期摂動により誘導される、請求項１１４記載の方法。
【請求項１１６】
未知化合物をスクリーニングすることにより、それらが遺伝子毒性物質であるか否かを評価する、請求項１１４記載の方法。
【請求項１１７】
プロモーターがシトクロムＰ４５０プロファイルプロモーターである、請求項１１４記載の方法。
【請求項１１８】
細胞がトランスジェニック動物に存し、毒性を動物において評価する、請求項１１４記載の方法。
【請求項１１９】
細胞が患者細胞標本であって、その患者は罹患しており、
調節領域が薬剤または薬剤摂取法によりターゲッティングされるものであり、
方法が特定患者に関する病気の処置の有効性を評価するものである、
請求項１０９記載の方法。
【請求項１２０】
細胞が腫瘍細胞である、請求項１１９記載の方法。
【請求項１２１】
細胞が幹細胞または始原細胞であり、リポーターの発現が細胞で発現された調節領域に機能し得るように結合されていることにより、幹細胞または始原細胞が同定される、請求項１０９記載の方法。
【請求項１２２】
細胞が動物に存し、全身イメージングを含むことにより、動物におけるリポーターの発現をモニターする方法である、請求項１０９記載の方法。
【請求項１２３】
リポーター構築物が試験または既知化合物に応答する調節領域と機能し得るように結合されたリポーター遺伝子を含む、１個または複数のリポーター構築物を含むリポーターＡＣｅｓ。
【請求項１】
１個または複数のａｔｔ部位を含む真核生物染色体であって、
ａｔｔ部位が染色体にとって異種のものであり、そして
ａｔｔ部位がラムダ・インテグラーゼの存在下での位置指定組込みを可能にする
真核生物染色体。
【請求項２】
ａｔｔ部位が、ａｔｔＰおよびａｔｔＢまたはａｔｔＬおよびａｔｔＲ、またはその変異型から成る群から選択される、請求項１記載の真核生物染色体。
【請求項３】
人工染色体である、請求項１記載の真核生物染色体。
【請求項４】
人工染色体発現系(ＡＣｅｓ)である、請求項１記載の真核生物染色体。
【請求項５】
主にヘテロクロマチンである、請求項４記載の真核生物染色体。
【請求項６】
約３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％または９５％以下の割合でユークロマチンを含む人工染色体である、請求項１記載の染色体。
【請求項７】
植物染色体である、請求項１記載の染色体。
【請求項８】
動物染色体である、請求項１記載の染色体。
【請求項９】
植物人工染色体である、請求項７記載の染色体。
【請求項１０】
動物人工染色体である、請求項８記載の染色体。
【請求項１１】
哺乳類染色体である、請求項８記載の染色体。
【請求項１２】
哺乳類人工染色体である、請求項１１記載の染色体。
【請求項１３】
人工染色体発現系(ＡＣｅｓ)である、請求項６記載の染色体。
【請求項１４】
リコンビナーゼ触媒による組換えに関与する１個または複数の部位を含むプラットホーム人工染色体発現系(ＡＣｅｓ)。
【請求項１５】
一部位を含む、請求項１４記載のＡＣｅｓ。
【請求項１６】
主にヘテロクロマチンである、請求項１４記載のＡＣｅｓ。
【請求項１７】
約３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％または９５％以下の割合でユークロマチンを含む、請求項１４記載のＡＣｅｓ。
【請求項１８】
植物ＡＣｅｓである、請求項１４記載のＡＣｅｓ。
【請求項１９】
動物ＡＣｅｓである、請求項１４記載のＡＣｅｓ。
【請求項２０】
魚、昆虫、爬虫類、両生類、蛛形類または哺乳類ＡＣｅｓから選択される、請求項１４記載のＡＣｅｓ。
【請求項２１】
魚ＡＣｅｓである、請求項１４記載のＡＣｅｓ。
【請求項２２】
リコンビナーゼおよび部位(複数も可)が、バクテリオファージＰ１のＣｒｅ／ｌｏｘ系、ラムダファージのｉｎｔ／ａｔｔ系、酵母のＦＬＰ／ＦＲＴ系、ファージＭｕのＧｉｎ／ｇｉｘリコンビナーゼ系、Ｃｉｎリコンビナーゼ系、エシェリキア・コリ(E.coli)のＰｉｎリコンビナーゼ系、ｐＳＲ１プラスミドのＲ／ＲＳ系、またはそれらの任意の組合わせに由来する、請求項１４記載の人工染色体発現系(ＡＣｅｓ)。
【請求項２３】
異種核酸を染色体へ導入する方法であって、
染色体および核酸分子における部位間の組換えを促進するリコンビナーゼの存在下、異種核酸および組換え部位を共に含む核酸分子と請求項１または１４のいずれかに記載の染色体を接触させることを含む方法。
【請求項２４】
リコンビナーゼが、Ｃｒｅ、Ｇｉｎ、Ｃｉｎ、Ｐｉｎ、ＦＬＰ、ファージインテグラーゼおよびｐＳＲ１プラスミドからのＲから成る群から選択される、請求項２３記載の方法。
【請求項２５】
核酸分子が、治療的タンパク質、アンチセンス核酸をコード化するか、または人工染色体を含む、請求項２３記載の方法。
【請求項２６】
核酸分子が、酵母人工染色体(ＹＡＣ)、細菌性人工染色体(ＢＡＣ)または昆虫人工染色体(ＩＡＣ)を含む、請求項２５記載の方法。
【請求項２７】
請求項１記載の染色体および同族組換え部位を含む第一ベクターを含む組み合わせであって、同族組換え部位が、染色体へ遺伝子操作により組込まれた部位との組換え部位である、組み合わせ。
【請求項２８】
さらにリコンビナーゼをコード化する核酸を含み、核酸が第二ベクターまたは第一ベクター、または誘導性プロモーター下のＡＣｅｓにある、請求項２７記載の組み合わせ。
【請求項２９】
リコンビナーゼおよび部位が、バクテリオファージＰ１のＣｒｅ／ｌｏｘ系、ラムダファージのｉｎｔ／ａｔｔ系、酵母のＦＬＰ／ＦＲＴ系、ファージＭｕのＧｉｎ／ｇｉｘリコンビナーゼ系、エシェリキア・コリ(E.coli)のＰｉｎリコンビナーゼ系、ｐＳＲ１プラスミドのＲ／ＲＳ系、またはそれらの任意の組合わせに由来する、請求項２８記載の組み合わせ。
【請求項３０】
ベクターがプラスミドｐＣＸＬａｍＩｎｔＲである、請求項２８記載の組み合わせ。
【請求項３１】
ベクターがプラスミドｐＤｓＲｅｄＮ１−ａｔｔＢである、請求項２７記載の組み合わせ。
【請求項３２】
請求項２７記載の組み合わせおよび所望により染色体への異種核酸導入についての使用説明書を含んでいてもよい、キット。
【請求項３３】
プラットホーム人工染色体への異種核酸の導入方法であって、
(ａ)少なくとも第一組換え部位を含む人工染色体および少なくとも第二組換え部位および異種核酸を含むベクターを混合し、
(ｂ)第一および第二組換え部位間の組換えが行なわれる条件下、生じた混合物を、少なくとも一つの組換えタンパク質の存在下でインキュベーションし、それによって異種核酸を人工染色体へ導入する
工程を含む方法。
【請求項３４】
人工染色体がＡＣｅｓである、請求項３３記載の方法。
【請求項３５】
混合工程(ａ)をエクスビボ細胞で実施する、請求項３３記載の方法。
【請求項３６】
混合工程(ａ)をインビトロ反応混合物中において細胞外的に実施する、請求項３３記載の方法。
【請求項３７】
少なくとも一つの組換えタンパク質が、バクテリオファージ・ラムダ、ｐｈｉ８０、Ｐ２２、Ｐ２、１８６、Ｐ４およびＰ１から成る群から選択されたバクテリオファージによりコード化される、請求項３３記載の方法。
【請求項３８】
少なくとも一つの組換えタンパク質が、バクテリオファージ・ラムダまたはその突然変異体によりコード化される、請求項３７記載の方法。
【請求項３９】
少なくとも一つの組換えタンパク質が、Ｉｎｔ、ＩＨＦ、Ｘｉｓ、Ｃｒｅ、ｙδ、Ｔｎ３リゾルベース、Ｈｉｎ、Ｇｉｎ、ＣｉｎおよびＦｌｐから成る群から選択される、請求項３３記載の方法。
【請求項４０】
組換え部位が、ａｔｔおよびｌｏｘＰ部位から成る群から選択される、請求項３３記載の方法。
【請求項４１】
第一および／または第二組換え部位が、１個またはそれ以上の停止コドンを除去する少なくとも１つの突然変異を含む、請求項３３記載の方法。
【請求項４２】
第一および／または第二組換え部位が、ヘアピン形成を回避する少なくとも一つの突然変異を含む、請求項３３記載の方法。
【請求項４３】
第一および第二組換え部位が、配列番号４１〜５６：
【化１】
および対応するまたは相補的ＤＮＡまたはＲＮＡ配列、
(ただし、Ｒ＝ＡまたはＧ、Ｋ＝ＧまたはＴ／Ｕ、Ｙ＝ＣまたはＴ／Ｕ、Ｗ＝ＡまたはＴ／Ｕ、Ｎ＝ＡまたはＣまたはＧまたはＴ／Ｕ、Ｓ＝ＣまたはＧ、およびＢ＝ＣまたはＧまたはＴ／Ｕ)、
から成る群から選択される少なくとも第一核酸配列を含み、
コア領域が１個またはそれ以上の読み枠において停止コドンを含まない、
請求項３３記載の方法。
【請求項４４】
第一および／または第二組換え部位が、組換え特異性を高める少なくとも１個の突然変異を含む突然変異ａｔｔ組換え部位、それと相補的なＤＮＡ配列、およびそれに対応するＲＮＡ配列から成る群から選択される少なくとも第一核酸配列を含む、請求項３３記載の方法。
【請求項４５】
第二部位を含むベクターがさらに少なくとも１個の選択マーカーをコード化する、請求項３３記載の方法。
【請求項４６】
マーカーが、プロモーター非随伴マーカーであって、組換え時、プロモーターの制御下にあり、それによって発現される、請求項４５記載の方法。
【請求項４７】
第一組換え部位がａｔｔＰであり、組換え前にはセンス配向である、請求項４６記載の方法。
【請求項４８】
選択マーカーが、抗生物質耐性遺伝子および検出可能タンパク質から成る群から選択され、検出可能タンパク質が、色素原性、蛍光性であるか、または抗体により結合され、ＦＡＣｓ選別され得るものである、請求項４６記載の方法。
【請求項４９】
選択マーカーが、緑色蛍光タンパク質(ＧＦＰ)、赤色蛍光タンパク質(ＲＦＰ)、青色蛍光タンパク質(ＢＦＰ)、およびエシェリキア・コリ(E.coli)ヒスチジノールデヒドロゲナーゼ(ｈｉｓＤ)から成る群から選択される、請求項４８記載の方法。
【請求項５０】
請求項１記載の染色体を含む細胞。
【請求項５１】
細胞が核供与細胞である、請求項５０記載の細胞。
【請求項５２】
細胞が幹細胞である、請求項５０記載の細胞。
【請求項５３】
幹細胞がヒトのものであり、間葉幹細胞、造血幹細胞、成人幹細胞および胚性幹細胞から成る群から選択される、請求項５２記載の幹細胞。
【請求項５４】
細胞が哺乳類のものである、請求項５０記載の細胞。
【請求項５５】
哺乳類が、ヒト、霊長類、ウシ、ブタ、ウサギ、ヤギ、ヒツジ、マウス、ラット、モルモット、ハムスター、ネコ、イヌおよびウマから成る群から選択される、請求項５４記載の細胞。
【請求項５６】
細胞が植物細胞である、請求項５０記載の細胞。
【請求項５７】
請求項１４記載のプラットホームＡＣｅｓを含む細胞。
【請求項５８】
細胞が核供与細胞である、請求項５７記載の細胞。
【請求項５９】
細胞が幹細胞である、請求項５７記載の細胞。
【請求項６０】
幹細胞が、ヒトのものであり、間葉幹細胞、造血幹細胞、成人幹細胞および胚性幹細胞から成る群から選択される、請求項５９記載の幹細胞。
【請求項６１】
人工染色体を含むヒト間葉細胞。
【請求項６２】
人工染色体がＡＣｅｓである、請求項６１記載のヒト間葉細胞。
【請求項６３】
ＡＣｅｓがプラットホームＡＣｅｓである、請求項６２記載のヒト間葉細胞。
【請求項６４】
請求項６３記載の間葉細胞への異種核酸の導入方法であって、
(ａ)プラットホーム−ＡＣｅｓが第一組換え部位を有する請求項６３記載の細胞へ、少なくとも第二組換え部位および異種核酸を含むベクターを導入し、
(ｂ)第一および第二組換え部位間の組換えが行なわれる条件下、少なくとも一つの組換えタンパク質の存在下で生成した混合物をインキュベーションし、それによって異種核酸を間葉細胞内のプラットホームＡＣｅｓへ導入する
手順を含む方法。
【請求項６５】
野生型ラムダ−ｉｎｔＲの１７４位にグルタミン酸からアルギニンへの変化を含むラムダ−ｉｎｔＲムテイン。
【請求項６６】
ラムダ−ｉｎｔＲムテインが配列番号３７を含む、請求項６５記載のラムダ−ｉｎｔＲムテイン。
【請求項６７】
プロモーター非随伴マーカーが異種核酸の転写的に下流であり、異種核酸が異種タンパク質をコード化し、そして発現レベルの選択マーカーが発現レベルの異種タンパク質に転写的に結合されている、請求項４６記載の方法。
【請求項６８】
選択マーカーおよび異種核酸が、それらの間におけるＩＲＥＳの存在により転写的に結合されている、請求項６７記載の方法。
【請求項６９】
選択マーカーが、抗生物質耐性遺伝子および検出可能タンパク質から成る群から選択され、検出可能タンパク質が色素原性または蛍光性である、請求項６８記載の方法。
【請求項７０】
選択マーカーが、緑色蛍光タンパク質(ＧＦＰ)、赤色蛍光タンパク質(ＲＦＰ)、青色蛍光タンパク質(ＢＦＰ)、およびエシェリキア・コリ(E.coli)ヒスチジノールデヒドロゲナーゼから成る群から選択される、請求項６９記載の方法。
【請求項７１】
さらに異種タンパク質を発現させ、異種タンパク質を単離することを含む、請求項６７記載の方法。
【請求項７２】
プラットホーム−ＡＣｅｓを胚細胞へ導入することを含む、トランスジェニック動物の製造方法。
【請求項７３】
胚細胞が幹細胞である、請求項７２記載の方法。
【請求項７４】
胚細胞が胚にある、請求項７２記載の方法。
【請求項７５】
プラットホーム−ＡＣｅｓが、治療的生成物をコード化する異種核酸を含む、請求項７２記載の方法。
【請求項７６】
トランスジェニック動物が、魚、昆虫、爬虫類、両生類、蛛形類または哺乳類である、請求項７２記載の方法。
【請求項７７】
ＡＣｅｓが、細胞融合、担体系による脂質仲介トランスフェクション、マイクロインジェクション、ミクロセル融合、エレクトロポレーション、微粒子銃または直接ＤＮＡ導入により導入される、請求項７２記載の方法。
【請求項７８】
請求項７２記載の方法により製造されたトランスジェニック動物。
【請求項７９】
内性染色体全体に無作為に組込まれた様々な異種組換え部位を含む、ＡＣｅｓのライブラリー作成に有用なセルライン。
【請求項８０】
ゲノムのランダム部分を含むＡＣｅｓのライブラリーの作成方法であって、細胞染色体ＤＮＡ内の様々な異種組換え部位へ、およびそこからのＡＣｅｓの位置特異的染色体アーム交換を促進する条件下、１個またはそれ以上のＡＣｅｓを請求項７９記載のセルラインに導入し、様々なＡＣｅｓを単離することにより、多様なＡＣｅｓがその中のゲノムの異なる部分を有するＡＣｅｓのライブラリーを製造することを含む方法。
【請求項８１】
ゲノムスクリーニングに有用な細胞のライブラリーであって、各細胞がそこの染色体核酸の相互限定的部分を有するＡＣｅｓを含む、様々な細胞を含むライブラリー。
【請求項８２】
ライブラリーの細胞が、ＡＣｅｓ内の染色体核酸とは異なる種に由来する、請求項８１記載の細胞のライブラリー。
【請求項８３】
１種またはそれ以上のセルラインの製造方法であって、
ａ）選択された細胞種の内性染色体ＤＮＡへ様々な異種組換え部位を組込み、
ｂ）細胞内性染色体ＤＮＡ内に組込まれた様々な異種組換え部位へ、およびそこからのＡＣｅｓの位置特異的染色体アーム交換を促進する条件下様々なＡＣｅｓを導入し、
ｃ）様々なＡＣｅｓを単離することにより、様々なＡＣｅｓがそこの内性染色体ＤＮＡの相互限定的部分を有するＡＣｅｓのライブラリーを製造し、
ｄ）工程ｃ）の単離された様々なＡＣｅｓを様々な細胞へ導入することにより、細胞のライブラリーを作製し、
ｅ）相互限定的なＡＣｅｓをそこに有する異なる細胞を選択し、異なる細胞をクローン細胞培養物へクローン的に拡張または分化させることにより、１種またはそれ以上のセルラインを作製する
工程を含む方法。
【請求項８４】
組換え部位をもつ核酸分子がＰＣＲ産物である、請求項２３記載の方法。
【請求項８５】
リコンビナーゼがタンパク質であり、組換え事象がインビトロで生じる、請求項２３記載の方法。
【請求項８６】
ベクターが、第二組換え部位を含むＰＣＲ産物である、請求項３３記載の方法。
【請求項８７】
ムテインがさらに核局在性についてのアミノ酸シグナルを含む、請求項６５記載のラムダ−ｉｎｔＲムテイン。
【請求項８８】
ムテインがさらにタンパク質精製のためのエピトープ標識を含む、請求項６５記載のラムダ−ｉｎｔＲムテイン。
【請求項８９】
配列番号１２８を含む修飾鉄誘導プロモーター。
【請求項９０】
請求項８９のプロモーターを含むプラスミドまたは発現カセット。
【請求項９１】
組換え用の認識部位、および
ベクターを増幅可能な染色体領域へターゲッティングするヌクレオチド配列
を含むベクター。
【請求項９２】
増幅可能な領域がヘテロクロマチン核酸を含む、請求項９１記載のベクター。
【請求項９３】
増幅可能な領域がｒＤＮＡを含む、請求項９１記載のベクター。
【請求項９４】
ｒＤＮＡが遺伝子間スペーサーを含む、請求項９３記載のベクター。
【請求項９５】
さらに、いかなるプロモーターとも機能し得るように結合されてはいない選択マーカーをコード化する核酸を含む、請求項９１記載のベクター。
【請求項９６】
染色体が哺乳類染色体である、請求項９１記載のベクター。
【請求項９７】
染色体が植物染色体である、請求項９１記載のベクター。
【請求項９８】
植物細胞であり、ＡＣｅｓプラットホームがＭＡＣである、請求項５７記載の細胞。
【請求項９９】
ＭＡＣが、植物から誘導されたヌクレオチドの転写調節配列を含む、請求項９８記載の植物細胞。
【請求項１００】
調節配列が、プロモーター、ターミネーター、エンハンサー、サイレンサーおよび転写因子結合部位から成る群から選択される、請求項９９記載の植物細胞。
【請求項１０１】
動物細胞であり、ＡＣｅｓプラットホームが植物人工染色体(ＰＡＣ)である、請求項５７記載の細胞。
【請求項１０２】
哺乳類細胞である、請求項１０１記載の細胞。
【請求項１０３】
ＭＡＣが、植物から誘導されたヌクレオチドの転写調節配列を含む、請求項９８記載の細胞。
【請求項１０４】
ＰＡＣが、動物から誘導されたヌクレオチドの転写調節配列を含む、請求項１０２記載の細胞。
【請求項１０５】
調節配列が、プロモーター、ターミネーター、エンハンサー、サイレンサーおよび転写因子結合部位から成る群から選択される、請求項１０４記載の細胞。
【請求項１０６】
請求項９１記載のベクターを細胞に導入し、
細胞を成長させ、そして
１個またはそれ以上の反復領域を含む人工染色体を含む細胞を選択する
ことを含む方法。
【請求項１０７】
ベクターの十分な部分が細胞における染色体へ組込まれることにより、染色体ＤＮＡが増幅される、請求項１０６記載の方法。
【請求項１０８】
人工染色体がＡＣｅｓである、請求項１０６記載の方法。
【請求項１０９】
リポーターＡＣｅｓを含む細胞を、試験化合物または既知化合物と接触させ、ただし
リポーターＡＣｅｓは１個または複数のリポーター構築物を含み、
リポーター構築物は、試験または既知化合物に応答する調節領域と機能し得るように結合されたリポーター遺伝子を含むものとし、そして
リポーターからのシグナル出力の増加または減少を検出することを含み、ただし、シグナルの変化は調節領域に対する試験または既知化合物の活性の指標であるものとする、
スクリーニング方法。
【請求項１１０】
リポーターが、シグナル伝達経路における遺伝子の発現を制御するプロモーターに機能し得るように結合されており、それによってシグナルの活性化または低減化が、試験化合物により経路が活性化またはダウンレギュレーションされたことを示すものである、請求項１０９記載の方法。
【請求項１１１】
構築物におけるリポーターが、薬剤耐性をコード化または蛍光タンパク質をコード化する、請求項１０９記載の方法。
【請求項１１２】
蛍光タンパク質が、赤色、緑色および青色蛍光タンパク質から成る群から選択される、請求項１１１記載の方法。
【請求項１１３】
ＡＣｅｓが、各々異なるリポーターを伴う、複数のリポーター結合構築物を含み、それにより試験化合物により影響される経路(複数も可)が解明され得る、請求項１０９記載の方法。
【請求項１１４】
リポーターが、ＤＮＡ損傷に応答して転写調節されるプロモーターに機能し得るように結合されており、試験化合物が遺伝子毒性物質である、請求項１０９記載の方法。
【請求項１１５】
ＤＮＡ損傷がアポトーシス、壊死または細胞周期摂動により誘導される、請求項１１４記載の方法。
【請求項１１６】
未知化合物をスクリーニングすることにより、それらが遺伝子毒性物質であるか否かを評価する、請求項１１４記載の方法。
【請求項１１７】
プロモーターがシトクロムＰ４５０プロファイルプロモーターである、請求項１１４記載の方法。
【請求項１１８】
細胞がトランスジェニック動物に存し、毒性を動物において評価する、請求項１１４記載の方法。
【請求項１１９】
細胞が患者細胞標本であって、その患者は罹患しており、
調節領域が薬剤または薬剤摂取法によりターゲッティングされるものであり、
方法が特定患者に関する病気の処置の有効性を評価するものである、
請求項１０９記載の方法。
【請求項１２０】
細胞が腫瘍細胞である、請求項１１９記載の方法。
【請求項１２１】
細胞が幹細胞または始原細胞であり、リポーターの発現が細胞で発現された調節領域に機能し得るように結合されていることにより、幹細胞または始原細胞が同定される、請求項１０９記載の方法。
【請求項１２２】
細胞が動物に存し、全身イメージングを含むことにより、動物におけるリポーターの発現をモニターする方法である、請求項１０９記載の方法。
【請求項１２３】
リポーター構築物が試験または既知化合物に応答する調節領域と機能し得るように結合されたリポーター遺伝子を含む、１個または複数のリポーター構築物を含むリポーターＡＣｅｓ。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【公開番号】特開２００９−１７８８４（Ｐ２００９−１７８８４Ａ）
【公開日】平成２１年１月２９日（２００９．１．２９）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００８−２０７９５８（Ｐ２００８−２０７９５８）
【出願日】平成２０年８月１２日（２００８．８．１２）
【分割の表示】特願２００３−５００２２８（Ｐ２００３−５００２２８）の分割
【原出願日】平成１４年５月３０日（２００２．５．３０）
【出願人】（５０３０５１２１３）クロモス・モレキユラー・システムズ・インコーポレーテツド (3)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２１年１月２９日（２００９．１．２９）
【国際特許分類】
【出願日】平成２０年８月１２日（２００８．８．１２）
【分割の表示】特願２００３−５００２２８（Ｐ２００３−５００２２８）の分割
【原出願日】平成１４年５月３０日（２００２．５．３０）
【出願人】（５０３０５１２１３）クロモス・モレキユラー・システムズ・インコーポレーテツド (3)
【Ｆターム（参考）】
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