核酸マイクロアレイを用いた解析方法
【課題】スポット間でのプローブ量等の不均一などに由来するデータの変動を検知しうる核酸マイクロアレイを用いた解析方法の提供。
【解決手段】核酸マイクロアレイを用いた解析方法であって、該核酸マイクロアレイが第１のプローブ核酸が固定化されているスポット（Ｘ１）を有し、検体の標識試料核酸（Ａ１）を、スポット（Ｘ１）に固定化された該プローブ核酸とハイブリダイゼーションさせる工程、全てのスポットにおいて、少なくともプローブ核酸の一部にハイブリダイズしうる配列を有し、前記標識試料核酸とは異なる標識で標識されている標識検証核酸（Ｂ）を、スポット（Ｘ１）に付与し、ハイブリダイズさせる工程、スポット（Ｘ１）にハイブリダイズした該標識試料核酸の標識量値（Ｆ１）を測定する工程、及び、スポット（Ｘ１）上にハイブリダイズした該標識検証核酸（Ｂ）の標識量値（Ｆｃ１）を測定する工程を含む解析方法。
【解決手段】核酸マイクロアレイを用いた解析方法であって、該核酸マイクロアレイが第１のプローブ核酸が固定化されているスポット（Ｘ１）を有し、検体の標識試料核酸（Ａ１）を、スポット（Ｘ１）に固定化された該プローブ核酸とハイブリダイゼーションさせる工程、全てのスポットにおいて、少なくともプローブ核酸の一部にハイブリダイズしうる配列を有し、前記標識試料核酸とは異なる標識で標識されている標識検証核酸（Ｂ）を、スポット（Ｘ１）に付与し、ハイブリダイズさせる工程、スポット（Ｘ１）にハイブリダイズした該標識試料核酸の標識量値（Ｆ１）を測定する工程、及び、スポット（Ｘ１）上にハイブリダイズした該標識検証核酸（Ｂ）の標識量値（Ｆｃ１）を測定する工程を含む解析方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、核酸マイクロアレイを用いた解析において、測定値の信頼性を増す方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
染色体を対象にしてゲノムDNAの過剰、欠失、増幅などのコピー数異常を検出する方法として、ゲノムＣＧＨ法があり、Joe Gray, Dan Pinkel, O-P Kallioniemiらによって開発された。一般に５〜１０Ｍｂ以上にわたる大きな領域で染色体異常でないと検出することが出来ない、解析には習熟を要するなど種々の問題点があった（非特許文献１）。
染色体解析が解析可能な解像度より高く、数１０ｋｂ〜数Ｍｂレベルで起きたゲノム構造異常を検出できるツールとして、アレイＣＧＨ法がある(非特許文献２、３)。アレイＣＧＨ法は、ゲノムＤＮＡの断片、例えば、ＢＡＣ(Bacterial Artificial Chromosomes)クローンやＹＡＣ(Yeast Artificial Chromosomes)クローン、ＰＡＣ(P1-derived Artificial Chromosomes)やこれらBAC、YAC、PAC等を基に作成したDNAやオリゴヌクレオチドを基板上にスポットし、固体基板上に配置したアレイを使用する。さらに患者等から採取した検体試料となる異常細胞および、健常人から採取した標準試料となる正常細胞から、標的となるＤＮＡを抽出し、それぞれ異なった標識体(蛍光物質等)で標識し、核酸マイクロアレイ上のプローブと同時に接触させ、ハイブリダイゼーションを介して相互作用させ、相互作用した標的核酸が発する蛍光シグナルをスキャナーなどにより読み取り、正常細胞及び異常細胞由来の標的核酸の信号の強度比を比較することで、遺伝子の相対コピー数を検出する方法である。
【０００３】
核酸マイクロアレイを用いる解析において、検体と標準に対してそれぞれ異なる標識化合物で標識し核酸マイクロアレイに対して同時にハイブリダイゼーションする場合、マイクロアレイのロット間で生じるスポット差（スポット量等）等やハイブリダイゼーションの違いが原因となるデータの差は生じにくい。しかし、標識が異なるため、標識効率の違いや、個々の標識に対する検出系の差などが結果に影響を与えやすく、また一つの検体に対し、常に標準を準備しなければいけないという煩雑さが伴う。標識の差を排除するためには、標準と検体に対し、同一の標識化合物で標識し、複数の核酸マイクロアレイに対して別々にハイブリダイゼーションさせ、それらの間で評価を行う方法を取れば問題とならない。しかしながら、この方法においては、別々の標識を実施した際に、同時にハイブリダイゼーションすることで克服されているスポット差によるデータ変動が再度生じてしまうという問題が発生する。これら問題を解決する方法として、マイクロアレイ上に、補正用内部標準用にスポットを新たに搭載し、アレイ間の差を補正する方法もあるが、個別のスポット間の差異については、補正することができない(例えば特許文献１)。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】特開2004-028695号公報
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】稲澤譲治, 水口真希, 臨床検査, 49, 497-502 (2005).
【非特許文献２】D. Pinkel et. al., Nat. Genet., 20, 207-211 (1998)
【非特許文献３】井本逸勢, 稲澤譲治, 細胞工学, 23, 355-361 (2004).
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明が解決しようとする課題は、核酸マイクロアレイを用いた測定方法を実施する際に、二種類以上標識を用いて検体と標準に標識をする方法における標識間の差がデータに反映してしまう問題および一種類の標識を用いて検体と標準に標識する場合、個々のスポット差がデータに反映してしまう問題を同時に改善する方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
核酸マイクロアレイ測定において、一つの標識を用いて実施する場合のデータ精度向上のひとつの手段として、GeneChipのようにオリゴヌクレオチドプローブをアレイ上で合成し、アレイ間の差をできるだけ低く抑え、また、プローブのいわゆるTm値を同等になるように配列設計して、ハイブリダイゼーションのアレイ関の差を低く抑え、加えて補正スポットを設けることで標識工程上の差も抑制する戦略がとられているが、補正の方法は煩雑であり、特に1スポットに対し複数種の配列を持つ核酸マイクロアレイにおいては、このような戦略で比較することは非常に難しい (例えば特許文献１) 。
【０００８】
そこで、本発明では、アレイ内の全スポットおよび、異なるアレイ間の同様のスポットで実質的に同一の結合能を持つ核酸、すなわち、全てのスポットにおいて、少なくともプローブ核酸の一部にハイブリダイズしうる配列を有する検証核酸を、検体および標準と共存させ、それぞれハイブリダイゼーションを実施し、検証核酸の結合量を検出することで、アレイ基板上に結合しているプローブ核酸のスポット差を検知できることを見出した。さらに、結合量を指標に、スポット差を補正することが可能となり、本発明を完成するに至った。
【０００９】
例えば、一枚目のアレイに対して、標準をＣｙ３で標識したものと、Ｃｙ５で標識した検証核酸を共存させ、ハイブリダイゼーションさせる。一方二枚目のアレイに対して、検体をＣｙ３で標識したものとＣｙ５で標識した検証核酸との混合物をアレイ上のプローブ核酸とハイブリダイゼーションさせる。標準と検体を比較し、差を見る場合に、検証核酸を用いて補正を実施することで、スポット差を消失させる事が可能である。
ここで、Ｃｙ５で標識した検証核酸は同等の配列を持つ核酸であることが望ましく、調製が同じものであることが望ましい。また、スポット差を補正する方法としては、どのような計算方法を用いても論理的に補正できるのであれば、どのような計算方法でもかまわない。望ましくは、標準・検体の蛍光値を検証核酸の標識から得られる蛍光値を用いて比を取り、標準・検体を比較する。
標識検証核酸と標準・検体を同一の溶液に添加し、その溶液量をエタノール沈殿法などによって濃縮することが好ましく、実施できない場合にもできるだけ、核酸濃度を濃縮することが望ましい。
すなわち、本発明は、以下の構成よりなるものである。.
【００１０】
１．
核酸マイクロアレイを用いた解析方法であって、
該核酸マイクロアレイが第１のプローブ核酸が固定化されているスポット（Ｘ１）を有し、
検体の標識試料核酸（Ａ１）を、スポット（Ｘ１）に固定化された該プローブ核酸とハイブリダイゼーションさせる工程、
全てのスポットにおいて、少なくともプローブ核酸の一部にハイブリダイズしうる配列を有し、前記標識試料核酸とは異なる標識で標識されている標識検証核酸（Ｂ）を、スポット（Ｘ１）に付与し、少なくとも前記第１のプローブ核酸とハイブリダイズさせる工程、
スポット（Ｘ１）にハイブリダイズした該標識試料核酸の標識量値（Ｆ１）を測定する工程、及び、
スポット（Ｘ１）上にハイブリダイズした該標識検証核酸（Ｂ）の標識量値（Ｆｃ１）を測定する工程を含むことを特徴とする、解析方法。
２．
該標識試料核酸をハイブリダイゼーションさせる工程と、前記標識検証核酸（Ｂ）をハイブリダイゼーションさせる工程とが同時に行われ、かつ、
該ハイブリダイズした該標識試料核酸の量を測定する工程と、前記ハイブリダイズした検証核酸の量を測定する工程とが同時に行われることを特徴とする、１に記載の解析方法。
３．
前記（Ｆｃ１）に基づき、スポット（Ｘ１）における固定されたプローブ核酸の量を検知し、該検量値により前記（Ｆ１）を補正することを特徴とする、１または２に記載の解析方法。
４．
スポット（Ｘ１）と同じ核酸マイクロアレイ上または異なるアレイ上に存在する、スポット（Ｘ１）に固定化された前記第１のプローブと実質的に同一の配列を有する第ｎのプローブ核酸が固定化されたスポット（Ｘｎ）において、
前記標識試料核酸と同一または異なる標識試料核酸（Ａｎ）を、スポット（Ｘｎ）に固定化された該第ｎのプローブ核酸とハイブリダイゼーションさせる工程、
前記標識検証核酸（Ｂ）を、スポット（Ｘｎ）に付与し、ハイブリダイズさせる工程、
スポット（Ｘｎ）にハイブリダイズした該標識試料核酸の標識量値（Ｆｎ）を測定する工程、及び、
スポット（Ｘｎ）上にハイブリダイズした該標識検証核酸（Ｂ）の標識量値（Ｆｃｎ）を測定する工程、
を含むことを特徴とする、１〜３のいずれかに記載の解析方法。
５．
標識量値（Ｆｃ１）と（Ｆｃｎ）とを対比することでスポット（Ｘ１）とスポット（Ｘｎ）とにおける標識量値の係数を算出する工程を含むことを特徴とする、４に記載の解析方法。
６．
標識試料核酸（Ａ１）と標識試料核酸（Ａｎ）とが異なる試料から得られた核酸を標識したものであることを特徴とする４または５に記載の解析方法。
７．
前記標識検証核酸（Ｂ）をハイブリダイゼーションさせる工程において、更に、標識化合物を結合する前の標識検証核酸（Ｂ）と同一種の未標識核酸が添加されていることを特徴とする１〜６のいずれかの解析方法。
８．
スポット（Ｘｎ）における標識試料核酸（Ａｎ）がハイブリダイズした量に相当する補正標識量値を、下記式（１）を用いて算出することを特徴とする、４〜７のいずれかの解析方法。
式（１） 標識試料核酸（Ａｎ）の補正標識量値＝前記（Ｆｃ１）÷前記（Ｆｃｎ）×第ｎの標識試料核酸（Ａｎ）の標識量値 （ｎは２以上の整数）
９．
標識試料核酸（Ａ１）と標識検証核酸（Ｂ）における標識の少なくとも一方が蛍光によるものであることを特徴とする、１〜８のいずれかの解析方法。
１０．
核酸マイクロアレイとして、ＢＡＣ−ＤＮＡマイクロアレイを使用することを特徴とする、１〜９のいずれかの解析方法。
１１．
複数の同種のスポット（Ｘｎ）が異なる核酸マイクロアレイに存在し、それぞれの核酸マイクロアレイ間のプローブ核酸の配置、プローブ核酸のスポット量が、それぞれの核酸マイクロアレイで異なっていることを特徴とする、１〜１０のいずれかの解析方法。
１２．
標識検証核酸（Ｂ）として、検体の核酸とは異なり、第１及び第ｎのプローブ核酸上の配列を持つ核酸を用いる１〜１１のいずれかの解析方法。
１３．
標識検証核酸（Ｂ）として、反復配列を含む核酸を使用することを特徴とする、１〜１２のいずれかの解析方法。
１４．
標識検証核酸（Ｂ）として、Ｃｏｔ−１ ＤＮＡを使用することを特徴とする、１〜１３のいずれかの解析方法。
１５．
標識検証核酸（Ｂ）として、ベクター由来の核酸を使用することを特徴とする、１〜１２のいずれかの解析方法。
１６．
標識量値（Ｆ１）および（Ｆｃ１）のうち、標識量値（Ｆｃ１）がデジタルデータにより供給されることを特徴とする、１〜１５のいずれかの解析方法。
１７．
５〜１６のいずれかに記載の解析方法における、標識試料核酸（Ａｎ）（ｎは２以上の整数）の標識量値（Ｆｎ）を、標識検証核酸（Ｂ）の標識量値（Ｆｃ１）及び標識量値（Ｆｃｎ）を用いて補正するデータ処理をコンピュータに実行するためのプログラム。
１８．
１７に記載のプログラムを記録したコンピュータ読み取り可能な記録媒体。
１９．
１〜１８の解析方法を用いて、検体間の遺伝子発現量もしくは検体間の遺伝子コピー数を計算する方法。
２０．
プローブ核酸が固定化されているスポットを複数有する核酸マイクロアレイ、及び、該核酸マイクロアレイ上の全てのスポットにおいて少なくとも各プローブ核酸の一部にハイブリダイズしうる配列を有する検証核酸、を含む請求項１〜１９のいずれかの解析方法用のキット。
【発明の効果】
【００１１】
標識を標準と検体とを同じにすることで、標識が異なることによる差を無くすことは可能であるが、更に標識検証核酸（Ｂ）を用いた補正法を用いることによって、核酸マイクロアレイ間でのスポット差を無くすことができ、高精度な核酸マイクロアレイ測定が可能となった。さらに、本発明の補正法を用いることで、実質的に同一のプローブを用いていれば、スポットが異なっていても正しく補正することが出来る。例えば、プローブ核酸のスポット量やそのスポットの配置や個数が異なっていても、更には、ハイブリダイゼーション後のわずかなハイブリ条件における違いについても補正することが可能となる。
補正を実施する際に用いている標識検証核酸（Ｂ）については、標識工程においてある望ましい濃度がより多くすることでより良い結果が得られることも見出した。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】本発明の原理の模式図。模式図では、簡素化のために、検体由来の標識試料核酸の種類が二種類のみの場合について示した。また、スポット数は、核酸マイクロアレイあたり１６個と単純化して示した。Ａ１〜Ａ４およびａ１〜ａ４は実質的に同一のプローブ核酸を示す。以下、Ｂ１〜Ｂ４およびｂ１〜ｂ４の組、Ｃ１〜Ｃ４およびｃ１〜ｃ４の組、Ｄ１〜Ｄ４およびｄ１〜ｄ４の組は、それぞれ同一のプローブ核酸を示す。
【図２】検体として、Ｆｅｍａｌｅ ＤＮＡ、標準としてＭａｌｅ ＤＮＡとを用い、標識検証核酸を用いない場合の核酸マイクロアレイを実施し、比較を行った結果。
【図３】検体として、Ｆｅｍａｌｅ ＤＮＡ、標準としてＭａｌｅ ＤＮＡとを用い、標識検証核酸を用いて、その標識量値を補正した場合の核酸マイクロアレイを実施し、比較を行った結果。
【図４】検体として、Ｆｅｍａｌｅ ＤＮＡ、標準としてＭａｌｅ ＤＮＡとを用い、標識検証核酸を使用し補正を行った場合と、標識検証核酸を使用せずに補正を行わなかった場合との、ＬｏｇＲａｔｉｏ差。
【図５】検体として、Ｆｅｍａｌｅ ＤＮＡ、標準としてＭａｌｅ ＤＮＡとを用い、標識検証核酸を使用し補正を行った場合と、標識検証核酸を使用せずに補正を行わなかった場合との、分散。
【図６】試料として、未精製標識試料核酸Ｃｙ５−Ｆｅｍａｌｅと未精製標識試料核酸Ｃｙ５−Ｍａｌｅとを用い、標識検証核酸として、Ｃｙ３−Ｆｅｍａｌｅを用いて補正した場合の結果。
【図７】蛍光値に偏りが生じてしまった場合の例。（ａ）Ｃｙ３−ＦｅｍａｌｅとＣｙ５−Ｃｏｔ−１ 核酸マイクロアレイ実験後のイメージ図（ｂ）Ｃｙ３−ＭａｌｅとＣｙ５−Ｃｏｔ−１ 核酸マイクロアレイ実験後のイメージ図。
【図８】図７の検体Ｆｅｍａｌｅ、標準Ｍａｌｅとの蛍光値を利用して算出したＬｏｇＲａｔｉｏを染色体順にプロットしたもの。
【図９】図８の結果に対して、補正を行ったもの。
【図１０】検体としてＦｅｍａｌｅ、標準としてＭａｌｅとをそれぞれ試料として場合の結果。
【図１１】図１０よりもより多くのＣｏｔ−１ ＤＮＡ（８倍量）を原料として用い、それを標識することによって得た結果。
【図１２】アレイ１同士で補正を行った結果。
【図１３】アレイ２同士で補正を行った結果。
【図１４】アレイフォーマットが異なっており、補正を行わなかった場合の結果。
【図１５】アレイフォーマットが異なっており、補正を行った場合の結果。
【図１６】標識量値をデジタルデータとして供給した場合の結果。
【図１７】検証核酸としてベクター由来の核酸を用いた場合の結果。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
本発明は、核酸マイクロアレイを用いて核酸を解析する方法であって、
該核酸マイクロアレイが配列（ａ）と相補的なプローブ配列（ａ’）を含む第１のプローブ核酸が固定化されているスポット（Ｘ１）を有し、
検体の標識試料核酸（Ａ１）を、スポット（Ｘ１）に少なくとも固定化された該第１のプローブ核酸とハイブリダイゼーションさせる工程、
全てのスポットにおいて、少なくとも該第１のプローブ核酸の一部にハイブリダイズしうる配列を有し、前記標識試料核酸とは異なる標識で標識されている標識検証核酸（Ｂ）を、スポット（Ｘ１）に付与し、ハイブリダイズさせる工程、
スポット（Ｘ１）にハイブリダイズした該標識試料核酸の標識量値（Ｆ１）を測定する工程、及び、
スポット（Ｘ１）上にハイブリダイズした該標識検証核酸（Ｂ）の標識量値（Ｆｃ１）を測定する工程を含むことを特徴とする、解析方法に関する。
【００１４】
上記解析方法は、好ましくは検体（Ａ）においての配列（ａ）を持つ核酸を核酸マイクロアレイを用いて調べる核酸解析方法であって、
該核酸マイクロアレイが（ａ）と相補的な配列（ａ’）を少なくとも一種類以上含む該第１のプローブ核酸が固定化されているスポット（Ｘ１）を有し、
（Ａ）を標識した試料核酸（Ａ１）と全てのスポットにおいて、少なくとも該第１のプローブ核酸の一部にハイブリダイズしうる配列を有する検証核酸（Ｂ）を（Ａ）とは別の標識で標識した核酸（Ｂ１）を共存させ、スポット（Ｘ１）に固定化された該第１のプローブ核酸とハイブリダイゼーションさせる工程、
更に、標準（Ｃ）を（Ａ）と同様の標識で標識した核酸（Ｃ1）と（Ｂ1）を共存させ、（Ｘ１）と同等の配列を持つスポット(Ｘ1‘)に固定化された該プローブ核酸とハイブリダイゼーションさせる工程、
スポット（Ｘ１）にハイブリダイズした該標識試料核酸の標識量値（Ｆa１）を測定する工程、及び、
スポット（Ｘ１）上にハイブリダイズした該標識検証核酸（Ｂ）の標識量値（Ｆb１）を測定する工程、
スポット（Ｘ１’）にハイブリダイズした該配列（ｃ）を含む核酸の標識量値（Ｆc１）を測定する工程、及び、
スポット（Ｘ１’）上にハイブリダイズした該標識検証核酸（Ｂ）の標識量値（Ｆｂ1’）を測定する工程、
を含むことを特徴とする、核酸解析方法である。
【００１５】
任意のスポット（Ｘ１）における標識量値（Ｆａ１）のみで検出目的とする配列（ａ）の量と（Ｘ１‘）における標識量値（Ｆｃ１）とを比較し、測定を行うのに対して、標識検証核酸（Ｂ）の標識量値（Ｆｂ１、Ｆｂ１’）を補正するために用いれば、当該スポットにおける誤差、例えばプローブ核酸がスポットに固定されている量に起因する誤差を検知することが可能となる。
この標識検証核酸（Ｂ）の標識量値を用いれば、例えば（Ｆｃ１）の設計値との対比から当該スポットの異常を判定することができるし、複数のスポットにおいて標識検証核酸（Ｂ）の標識量値を検証することで、スポット間における誤差を検知することもでき、また、誤差を補正することも可能となる。
【００１６】
本発明は、好ましくは複数配列のプローブ核酸を１箇所スポットした核酸マイクロアレイを用いることができる。
本発明においては、更に好ましくは核酸を含むハイブリダイゼーション溶液として、検体の試料核酸（Ａ）と、全てのスポットにおいて、少なくともプローブ核酸の一部にハイブリダイズしうる配列を有する標識検証核酸（Ｂ）と、を含有する溶液を1つのアレイに用い、次に標準の核酸（Ｃ）と標識検証核酸（Ｂ）を別のアレイに用い、アレイ実験を実施し、検出した標識検証核酸（Ｂ）の標識量値を用いて、（Ａ）の標識量値および（Ｃ）の標識量値を補正し、（Ａ）の標識量値と（Ｃ）の標識量値とを比較することで、（Ａ）の量を確定することができる。ここで、別のアレイは、同種のアレイ、即ち同種のプローブがスポットされているアレイを指す。
【００１７】
ここで、比較や補正を行う対象となるスポットは、特に限定されないが、同種のスポット（同じプローブをスポットしたスポット、即ち、固定化されているプローブ核酸の目的とする配列（ａ’）が同じスポット同士）であることが好ましい。
【００１８】
本発明によって、例えばプローブ核酸の量の違いに起因する標識量値の変化やハイブリダイゼーションにおける差を補正することもできる。なお、本発明で標識量値の用語を用いる際には、標識した核酸とプローブ核酸とのハイブリダイゼーションによって生じた複合体、例えば、二重鎖核酸などの標識化合物から得られた標識量を含むものとする。
【００１９】
マイクロアレイ上のスポットに核酸を標識化した標識試料核酸（Ａ）や標識化した標識検証核酸（Ｂ）を含むハイブリダイゼーション溶液を塗布することで、標識試料核酸（Ａ）や標識検証核酸（Ｂ）をハイブリダイゼーションさせ、標識試料核酸（Ａ）や標識検証核酸（Ｂ）の標識量を検出する工程は、より詳しくは以下の工程（ａ）〜（ｅ）を含むことが好ましい。
（ａ）試料核酸を標識化合物で標識することにより、標識試料核酸（Ａ）を得る工程。
（ｂ）全てのスポットにおいて、少なくともプローブ核酸の一部にハイブリダイズしうる配列を含む検証核酸を工程（ａ）とは異なる標識化合物で標識することにより、標識検証核酸（Ｂ）を得る工程。
（ｃ）工程（ａ）で得られた標識試料核酸（Ａ）、工程（ｂ）で得られた標識検証核酸（Ｂ）、を含むハイブリダイゼーション溶液を調製する工程。
（ｄ）工程（ｃ）で得られたハイブリダイゼーション溶液を、核酸マイクロアレイ上に塗布し、ハイブリダイゼーション溶液中の標識試料核酸（Ａ）および標識検証核酸（Ｂ）とプローブ核酸とをハイブリダイゼーションさせる工程。
（ｅ）工程（ｄ）で得られた核酸マイクロアレイから標識試料核酸（Ａ）と標識検証核酸（Ｂ）のプローブ核酸へのハイブリダイゼーション量をそれぞれ読み取り、標識量値を得る工程。
ここで、工程（ｄ）と工程（ｅ）の間で、ハイブリダイズしたアレイを洗浄液で洗浄する工程をさらに含むことが好ましい。
また、工程（ｃ）において、標識試料核酸（Ａ）、標識検証核酸（Ｂ）を添加する際、同時でも別々に添加してもよい。
また、更に下記工程を含むこともできる。
（ａ”）標識した標準の核酸（Ｃ）を得る工程、
（ｃ”）標識した標準の核酸（Ｃ）と上記（ｂ）工程で得られた標識検証核酸（Ｂ）とを含むハイブリダイゼーション溶液を調製する工程、
（ｄ”）前記（ｄ）工程とは異なる同種のアレイに対してハイブリダイズさせる工程、
（ｅ”）前記（ｄ”）でハイブリダイズした標準の核酸（Ｃ）と標識検証核酸（Ｂ）それぞれの標識量値を得て、検出した標識検証核酸（Ｂ）の標識量値を用いて、（（Ａ）の標識量値および）（Ｃ）の標識量値を補正し、（Ａ）の標識量値と（Ｃ）の標識量値とを比較することで、（Ａ）の量を確定する工程。
【００２０】
ハイブリダイズは、市販のハイブリダイゼーションを行う機器や、温度制御だけのみを行うことができる機器を用いて行うことができる。ハイブリダイゼーションにおける温度は、30℃〜50℃の範囲で行うことが好ましく、35℃〜45℃の範囲で行うことがさらに好ましい。
また、ハイブリダイゼーションの時間は、16〜100時間とすることが好ましく、
24〜80時間以上とすることがより好ましく、40〜72時間とすることがさらに好ましい。
ハイブリダイズ後、適宜洗浄等を行う。洗浄の条件は、回数を増やすほど、洗浄効果が高く、また、洗浄液には、2×SSCや2×SSC/50%ホルムアミド、2×SSC/0.1%SDS、1×SSCなど、イオン強度を調整したものや、解離剤、界面活性剤など、一般的にサザンブロッドやコロニブロッド、ノーザンブロッドなど、ハイブリダイゼーション実験を実施する際に用いられる洗浄液を用いることが可能である。温度としては、15℃〜70℃が好ましく、25℃〜50℃の範囲に設定することがより好ましく、ハイブリ条件と同等の溶液量とする必要がある。
【００２１】
好ましくは、以下の工程（１）または（１’）と、および（２）を含む核酸マイクロアレイ間もしくはハイブリダイゼーション領域間で同一プローブ核酸をスポットしたスポット間の標識量値を補正する方法である。
【００２２】
（１）以下の工程（ａ１）〜（ｆ１）を行うことで、標識試料核酸（Ａ）及び標識検証核酸（Ｂ）がスポット上のプローブ核酸に対してハイブリダイゼーションした核酸マイクロアレイを得る工程。
（ａ１）試料核酸を標識化合物で標識することにより、標識試料核酸（Ａ）を得る工程。
（ｂ１）全てのスポットにおいて、少なくともプローブ核酸の一部にハイブリダイズしうる配列を含む検証核酸を工程（ａ）とは異なる標識化合物で標識することにより、標識検証核酸（Ｂ）を得る工程（検証核酸は、試料核酸と相補的であってもかまわない。）。
（ｃ１）工程（ａ１）で得られた標識試料核酸（Ａ）及び工程（ｂ）で得られた標識検証核酸（Ｂ）を含むハイブリダイゼーション溶液を調製する工程。
（ｄ１）工程（ｃ１）で得られた溶液を核酸マイクロアレイ上に塗布し、ハイブリダイゼーションを行う工程。
（ｅ１）工程（ｄ１）によって得られた核酸マイクロアレイを洗浄液によって洗浄する工程。
（ｆ１）工程（ｅ１）によって得られた核酸マイクロアレイから標識試料核酸（Ａ）と標識検証核酸（Ｂ）のプローブ核酸へのハイブリダイゼーション量をそれぞれ読み取り、標識量値を得る工程。
【００２３】
（１’）以下の工程（ａ１’）〜（ｇ１’）を行うことで、標識試料核酸（Ａ）及び標識検証核酸（Ｂ）が核酸マイクロアレイ上のプローブ核酸に対してハイブリダイゼーションした核酸マイクロアレイを得る工程。
（ａ１’）核酸を標識化合物で標識することにより、標識試料核酸（Ａ）を得る工程。
（ｂ１’） 全てのスポットにおいて、少なくともプローブ核酸の一部にハイブリダイズしうる配列を含む検証核酸を工程（ａ）とは異なる標識化合物で標識することにより、標識検証核酸（Ｂ）を得る工程（検証核酸は、核酸と相補的であってもかまわない）。
（ｃ１’）工程（ｂ１’）で得られた標識検証核酸（Ｂ）を含むハイブリダイゼーション溶液を調製する工程。
（ｄ１’）工程（ａ１’）で得られた標識試料核酸（Ａ）、工程（ｃ１’）で得られた標識検証核酸（Ｂ）を含むハイブリダイゼーション溶液とを混合し、標識試料核酸（Ａ）及び標識検証核酸（Ｂ）を含むハイブリダイゼーション溶液を調製する工程。
（ｅ１’）工程（ｄ１’）で得られた溶液を核酸マイクロアレイ上に塗布し、ハイブリダイゼーションを行う工程。
（ｆ１’）工程（ｅ１’）によって得られた核酸マイクロアレイを洗浄液によって洗浄する工程。
（ｇ１’）工程（ｆ１’）によって得られた核酸マイクロアレイから標識試料核酸（Ａ）と標識検証核酸（Ｂ）のプローブ核酸へのハイブリダイゼーション量をそれぞれ読み取り、標識量値を得る工程。
【００２４】
（２）少なくとも二種の検体から得た核酸に対して、それぞれ工程（１）もしくは（１’）を行い、使用した検体の種類に相当する個数の核酸マイクロアレイもしくは使用した検体の種類に相当する個数のハイブリダイゼーション領域を得、使用した検体由来の標識試料核酸（Ａ）の標識量値の中から少なくとも一種に対して標識検証核酸（Ｂ）の標識量値を用いることによって補正し、検体間の遺伝子発現量もしくは検体の遺伝子コピー数を計算する方法。
ここで、検体の少なくとも１つが既知量である上記標準（Ｃ）であることが好ましい。これにより、他の検体がより正確に測定できる。
【００２５】
本発明の標識量値の補正方法は、より具体的には、第一のスポットに対して標識試料核酸（Ａ１）と標識検証核酸（Ｂ）とを同時にハイブリダイゼーションさせることでそれぞれの標識量値を得、前記スポットとは同一のプローブ核酸をスポットしているが、前記スポットとは異なる第ｎのスポットに対して、前記標識試料核酸（Ａ１）とは異なり、かつ前記標識試料核酸（Ａ１）と標識量値を比較することを目的として調製した標識試料核酸（Ａｎ；ｎは２以上の整数値）と前記標識検証核酸（Ｂ）とを同時にハイブリダイゼーションさせることで標識量値を得、第一のスポットおよび第ｎのスポットに対してハイブリダイゼーションさせることで得たそれぞれの標識検証核酸（Ｂ）の標識量値の比を当該スポット間における係数とし、当該スポットにおいて測定された標識試料核酸（Ａ’）の標識量値に当該係数を乗することにより、第ｎのスポットに対してハイブリダイゼーションさせた標識試料核酸（Ａｎ）の補正された標識量値を得る。
【００２６】
標識試料核酸（Ａ）の標識量値、標識検証核酸（Ｂ）の標識量値の少なくともいずれか一方を同一のプローブ核酸をスポットした複数のスポット間おける平均値もしくは平均値に対する偏差を計算することができる。
具体的には、第一のスポット（Ｘ１）と同じ核酸マイクロアレイ上または異なるアレイ上に存在する、同一の配列（ａ’）を有するプローブ核酸が固定化されたｎ個のスポット（Ｘｎ）において、請求項１〜６のいずれかに記載の方法でｎ個のスポット各々のハイブリダイズした該標識検証核酸（Ｂ）の標識量値を得る工程、
ｎ個の該標識検証核酸（Ｂ）の標識量値から平均値もしくは平均値に対する偏差を行った数値を算出する工程、を含むことが好ましい。
【００２７】
より詳しくは、第１の検体由来の標識試料核酸（Ａ１）と標識検証核酸（Ｂ）とをハイブリダイゼーションした第１のスポットから得られた標識検証核酸（Ｂ）の標識量値をＦｃ１、第ｎ番目の検体由来の標識試料核酸（Ａｎ）と標識検証核酸（Ｂ）の標識量値をＦｃｎとすると、第ｎの標識試料核酸（Ａｎ）に対する補正後の補正標識量値を以下の数式（１）を用いて計算し、補正することが好ましい。
式（１） 第ｎの標識試料核酸（Ａｎ）の補正標識量値＝Ｆｃ１÷Ｆｃｎ×第ｎの標識試料核酸（Ａｎ）の標識量値（ｎは２以上の整数）
【００２８】
本発明の原理を図１を用いて説明する。なお、この図は、本発明の原理を説明するためのもので、非常に簡素化しているので、本発明の要点のみを例として図示したものであり、本発明における上記の範囲のすべてを含むものではなく、この図によって本発明を限定するものではない。
図１では、簡略化のため、二種の検体間でのコピー数解析に核酸マイクロアレイを用いた場合で、一枚のアレイに４種のプローブ試料核酸（Ａ〜Ｄまたはａ〜ｄ）と同一のプローブ核酸１〜４の１６スポットをスポットした二枚の核酸マイクロアレイを想定として模式図を作成した。
【００２９】
検体として細胞１由来の標識試料核酸（Ａ）と標識検証核酸（Ｂ）とハイブリダイゼーション溶液との混合物を核酸マイクロアレイ１上に塗布し、ハイブリダイゼーションさせる。また、標準由来の標識試料核酸（Ａ）と標識検証核酸（Ｂ）とハイブリダイゼーション溶液との混合物を核酸マイクロアレイ２上に塗布し、ハイブリダイゼーションさせる。ハイブリダイゼーション後、洗浄、乾燥工程を経て、核酸マイクロアレイ１、核酸マイクロアレイ２ともに標識量値を読み取る。
【００３０】
核酸マイクロアレイ１上のスポットＡ１に対する標識試料核酸（Ａ）由来の標識量値をＦ１、同スポットＡ１に対する標識検証核酸（Ｂ）由来の標識量値をＦｂ１とする。また、核酸マイクロアレイ２上のスポットａ１に対する標識試料核酸（Ａ）由来の標識量値をＦ２、同スポットａ１に対する標識検証核酸（Ｂ）由来の標識量値をＦｂ２とする。核酸マイクロアレイ２上の標識試料核酸（Ａ）由来の標識量値に対して、補正を行った補正後の標識量値Ｆ２’は、例えば以下の計算式によって計算できる。なお、標識量値は、バックグラウンド標識量値を差し引いても良いし、差し引かなくともよい。
Ｆ２’＝Ｆｂ１／Ｆｂ２×Ｆ２
【００３１】
これをすべてのスポットに対して行うことによって結果を得る。すなわち、核酸マイクロアレイ１上のＡ２スポットと核酸マイクロアレイ２上のａ２スポットの組、核酸マイクロアレイ１上のＢ１スポットと核酸マイクロアレイ２上のｂ２スポット組など、実質的に同一のプローブ核酸を結合させたスポット間の組で、補正を行うことによって、核酸マイクロアレイ２に対するすべてのスポットの補正を行う。次に、核酸マイクロアレイ１と核酸マイクロアレイ２との間で、Ｒａｔｉｏ値を以下の計算式によって計算する。
Ｒａｔｉｏ＝Ｆ２’／Ｆ１
これをすべてのスポットの組に対して計算すると、コピー数を求めることが可能となる。
【００３２】
尚、補正するにあたっては、同種の複数のスポットにおいて測定された標識検証核酸（Ｂ）の標識量値の平均に対する、任意のスポットの標識検証核酸（Ｂ）の標識量値の比を当該スポットにおける係数とし、当該スポットにおいて測定された標識試料核酸（Ａ）の標識量値から当該係数を除することにより、標識試料核酸（Ａ）の補正された標識量値を得ることも好ましい。
【００３３】
本発明では、補正するスポットは実質的に同一のプローブ核酸を結合させたスポット間ならばどの様なスポット同士で補正してもかまわない。例えば、核酸マイクロアレイ間で、位置的に対称なスポット同士での補正、すなわち、図１のＡ１とａ１スポット間やＢ１とｂ１スポット間などをあげることができるし、また、実質的に同一のプローブ核酸を固定化させていれば、位置的に非対称なスポット間の補正も行うこともできる。
さらに、本発明では、プローブ核酸がおおよそ同一であれば、異なった核酸マイクロアレイ同士の補正を行うことができる。異なった核酸マイクロアレイとは、異なった目的で製造された核酸マイクロアレイ、異なったスポットの配置、形状、濃度でスポットされた核酸マイクロアレイのことを言う。
即ち、本発明の方法により補正することで、複数の核酸マイクロアレイ間のプローブ核酸の配置、プローブ核酸のスポット量が、それぞれの核酸マイクロアレイで異なっているような場合でも、評価を行うことが出来る。
【００３４】
標識量値は、数学的処理を行った値でもかまわない。例えば、実質的に同一のプローブ核酸をスポットしたスポット同士から得られた標識量値を平均化する工程を行ってから、補正を行っても良い。また、標識量値として、蛍光値をもちいることが好ましい。
【００３５】
標識量値は、実質的に同一のプローブ核酸をスポットしたスポット同士で計算した平均値を用いることもできる。すなわち、補正前の標識量値に対して平均化処理を行うことも出来る。平均値を用いることによって、データは真値に近づく。また、補正後の標識量値に対して、実質的に同一のプローブ核酸をスポットしたスポット同士から得られた標識量値で平均値を計算することもできる。補正後の標識量値を加工した数値に対して平均化を行うこともできる。この様にすることで、例えば、核酸マイクロアレイに対して補正した標識量値から計算されたＲａｔｉｏ値で、実質的に同一のプローブ核酸をスポットしたスポット同士で平均値を計算すると、データが真値により近づくため、より正確にコピー数を算出することが出来、いわゆる擬陽性の発生を抑制することができ、疾病の診や予防の精度を大幅に向上させることが出来る。
また、実質的に同一種のプローブ核酸群の内、最大値と最小値を除いた平均値を使用することも出来るし、プローブ核酸群の平均標識量からある敷居値を除いたスポットの標識量を使用することも出来る。
【００３６】
標識量値の補正は、種々のコントロールスポットと共に用いることも出来る。例えば、細胞間で比較的発現量が一定しているハウスキーピング遺伝子を核酸マイクロアレイ上にスポットしておき、そのハイブリダイゼーション量を元に、試料間の全体を補正した後、各スポットの補正を本発明の検証核酸を用いる補正方法である。また、増幅・標識化時に内部標準核酸を添加しておき、その内部標準核酸で増幅もしくは標識化を補正した後、本発明の検証核酸による各スポットの補正を行っても良い。
【００３７】
本発明では、三枚以上の複数枚の核酸マイクロアレイ間での補正も可能である。例えば、標準、検体を複数種準備した場合をあげることが出来る。より具体的には、標準における標識試料核酸の標識量値および標識検証核酸の標識量値のデータ、複数の検体それぞれにおける標識試料核酸の標識量値および検証核酸の標識量値のデータを取得し、それぞれの検体の標識量値と標準の標識量値を本発明の方法を用いて補正した後、標準とそれぞれの検体の標識量値の比較を行い、量を計算することができる。この様な方法を行うことによって、標準を用いた核酸マイクロアレイの結果を一種類準備さえしておけば、検体を標的とした核酸マイクロアレイを何種類でも行うことが出来、標準を標識化する工程を検体の種類と同数準備する必要はなく、それだけ工程数が省けると共に、実験時間や診断時間を短縮化することが出来る。また、試薬の必要量を大幅に減らすことが出来、これに伴ってコストを大幅に減らすことが出来る。更に、標準を複数種用いることで、より結果を明確化することができる。
【００３８】
＜核酸マイクロアレイ＞
本発明で言うところの、核酸マイクロアレイとは、固体材料表面（ここで言う、表面とは、3次元的表面も言い、繊維等の表面も含む、すなわち、大きな形状としては、内包されているように見えていたとしても、実質的に表面であれば、ここでは表面と呼ぶ。）にプローブ核酸を結合、固定化させ、並べたものを言う。固体材料としては、一般的に使用されるスライドガラスなどのガラス素材のほか、プラスチック材料、炭素繊維、ゲルやゾル、メンブレン、金属など、プローブ核酸が結合可能な材料であれば良く、特に限定はしない。固体材料の形状も、平面状、突起状物の頂上、粒子状、細管の内部など、特に限定しない。本発明での核酸マイクロアレイは、スポッターなどによって製造されたＤＮＡマイクロアレイや半導体技術によって製造されたＤＮＡチップも含むものとする。
本発明においては、核酸マイクロアレイとして、BAC−DNAアレイ、オリゴヌクレオチドマイクロアレイ、ｃ−DNAマイクロアレイ等を使用することができる。
更に、マイクロアレイのスポットの配置は様々あり、アレイを複数エリアもち、複数の検体を1枚の基盤上で測定できる多検体アレイや、複数のアレイを組み合わせ、多くのスポットを1枚の基盤に再現したタイリングアレイなどがある。
マイクロアレイの形状には、様々有り、3次元構造をなすことにより、反応効率を上げたものや、粒子状に核酸を結合させたもの、テープ上に核酸を結合させたものなどや、CDのような円盤状に核酸を結合させたものなどが上げることもできる。
BAC-DNAアレイについては、BACにマンマリアン等のインサートを導入した状態のDNAを基に作成したものであればなんでも良く、そのものを貼り付けたものでもあり、また、PCR等の増幅技術を用いて増幅しているものも含んでおり、特に限定していない。
【００３９】
＜プローブ核酸＞
プローブ核酸は、予めどの配列が含まれているのか分かっている配列を含む核酸であって、マイクロアレイの場合は一般的にスポット状に複数固定されているものである。
【００４０】
プローブ核酸は、化学合成した核酸、ｃＤＮＡ、ＢＡＣ（Bacterial Artificial Chromosomes）、ＹＡＣ（Yeast Artificial Chromosomes）、ＰＡＣ(P1-derived Artificial Chromosomes)などや、これらのものを遺伝子工学的な手法を用いたりして増幅したものを使用することが出来る。さらに、ＤＮＡやＲＮＡなどの天然型の核酸を化学修飾した核酸をプローブ核酸として使用しても良い。例えば、ＰＮＡ（Peptide Nucleic Acid）、ＢＮＡ（Bridged Nucleic Acid）、メチルホスホネート型ＤＮＡ、ホスホロチオエート型ＤＮＡ、ホスホロアミデート型ＤＮＡ、ボラノホスフェート型ＤＮＡなどを用いることが出来る。また、キメラ型核酸を用いることも出来る。例えば、核酸内にＤＮＡ部分とＲＮＡ部分とが混合したものや天然型核酸と修飾型核酸とが混合したものを使用することが出来る。
プローブ核酸を固体基板上に搭載させる方法は、ＧｅｎｅＣｈｉｐを代表とする光脱離基を結合させたアミダイトモノマーを用い、マスクを使用して、一ヌクレオチドずつ化学合成する方法やインクジェット方式でアミダイトモノマーを固体基板上にスポットし、望んだ配列を化学合成する方法、電極上で溶液のｐＨを変化させそのｐＨ変化を利用して保護基を脱離することにより基板上で核酸を合成する方法、あらかじめ化学合成した核酸を精製し基板上にスポットする方法、スポッターを用いてｃＤＮＡをスポットする方法などを用いることが出来る。スポット方式も、インクジェット方式、ピンアレイ方式などを用いることが出来る。
【００４１】
プローブ核酸の大きさは、10ｂ〜10ｋｂであることが好ましく、更には50ｂ〜5ｋｂであることがより好ましく、100ｂ〜2ｋｂであることがさらに好ましい。
【００４２】
・スポット
核酸マイクロアレイは一般に、実質的に同じ配列を有するプローブ核酸を多量に高い密度で固定化した領域（スポット）を複数有するが、本発明で使用することの出来る、実質的に同一種、同一量のプローブ核酸のスポット数は、１つ以上あれば良く、スポット数によらない。解析の目的に応じて任意に選択することが可能である。
プローブ核酸の固定量は、１スポットあたり、0.8〜5μｇとすることが好ましく、1.0〜2.0μｇのとすることがより好ましい。
スポット形状に制約はないが、円形を好ましく用いることができる。
スポット径に制約はないが、１０μm〜１０００μmが好ましい。
【００４３】
＜検体＞
本発明での検体とは、核酸マイクロアレイを用いて解析したいと考える核酸（試料核酸）又は、核酸を含む細胞等であり、核酸マイクロアレイを用いて解析をしようとするものであれば全てを指し、特に限定するものはない。
例えば、核酸マイクロアレイを用いて、核酸の発現量や存在量、ゲノムの中のコピー数などを測定しようとしている核酸を含有している分析対象あるいは診断などの評価を行おうとしている細胞等のことであるが、同時に組織や、器官、一固体なども含まれ、細胞そのものに限定しているわけではない。
他に、検体として考えられるものとして、合成核酸等の存在量が予め分かっている、又は分かっていないものを使用し、アレイや測定機器の能力等を試験する際にもちいる物も検体として考えることができるし、後述する検証核酸も、測定対象とするのであれば検体と考えることも可能である。
検体は、ある疾患を持っていると考えられうる患者や、動物から取得できる核酸又は、核酸を取得できる細胞等が挙げられ、細胞を包括するものであれば全てを指す。狭義には核酸を指す。例えば、疾患としては、癌、遺伝病、感染症等、核酸になんらかの情報を持ちうると考えられる疾患が全て該当し、他に特に限定するものはない。
更に、癌検体はＬＣＭ（Laser Capture Microdissection）処理を行ったものを用いることもできる。
標準は、上記で検体と比較するために予めある程度の情報を持っている核酸や、核酸を取得することができる細胞や細部を包括するものであれば全てを指す。一般的な存在量と異なっていたとしても、検体を比較し、情報を得られることができれば、標準としてみなすことが可能である。例えば、CNVやなんらかのモザイクを持つ患者において、癌が発症したとして、癌細胞から得られた核酸と癌細胞以外の正常細胞から得られた細胞を比較したとした場合、CNVやなんらかのモザイクについては、相殺されるので標準として用いることになんら障害が無いと考えられる。
また、由来が全く異なる細胞等から取得した核酸についても、比較対象として用いることができれば、標準とみなすことが可能である。
本発明においては、試料核酸として検体から抽出した試料核酸や標準の核酸の何れも用いることができるが、前述のように、検体から抽出した試料核酸と、標準の核酸の双方を別々のアレイに対してハイブリダイズさせることが好ましい。
本発明では、試料核酸としてがん細胞由来の核酸または正常細胞（がん化していない細胞）由来の核酸を用いることが好ましい。
【００４４】
・核酸の精製
本発明では、検体や標準から核酸を調製する際には、精製を行うことが望ましい。標識の際に、様々な副反応が生じると共に、タンパクや脂質、糖など細胞溶解物が標識反応に影響を及ぼし、バックグラウンドノイズに大きな影響を与え、精製を行わなければ、核酸マイクロアレイの測定性能を著しく低下する。
【００４５】
精製工程としては、シリカやセルロース誘導体などの核酸吸着性膜を担持したカートリッジを用いた方法、エタノール沈殿やイソプロパノール沈殿、フェノール−クロロホルム抽出などを用いることが出来る。イオン交換樹脂やオクタデシル基などの疎水性置換基を結合したシリカ担体やサイズ排除効果を示す樹脂を使用した固相抽出カートリッジ、クロマトグラフィーなどによる方法を用いることが出来るこの中で、トリ酢酸セルロースをケン化して調製した核酸吸着性多孔質膜をカートリッジに保持させたＱｕｉｃｋＧｅｎｅシリーズ（富士フイルム株式会社）による精製が好ましい。ＱｕｉｃｋＧｅｎｅシリーズを使用することで、低価格な機械を用いて、半自動的に核酸を調製することが出来るからである。
更に、シリカ系核酸吸着性多孔質膜と比較して非常に薄く、少量での核酸抽出に適しており、他の方法と比較して非常に高濃度の核酸を得ることが出来る。また、少量液量での精製が可能なエタノール沈殿法やイソプロパノール沈殿法と比較して、より高純度の核酸を得ることが出来、少量かつ高濃度の標識核酸を得るのに適した方法である また、フェノール−クロロホルム抽出法やその他の種々の沈殿法を用いた場合、以降の工程に悪影響を及ぼしてしまうことから、検体から核酸を調製する場合、純度向上のため、複数回の精製工程を行うことも出来る。
検体からシリカを主成分とする核酸吸着性膜をカートリッジに固定化させたカラム法によって精製した場合、一般的にその回収液量が多く、得られる核酸の濃度が非常に薄くなってしまう。この問題を解決するためには、エタノール沈澱などで、溶液を全て除去してしまうか、限外濾過カラム等を用いて濃縮することなどが可能である。
【００４６】
本発明では、検体から抽出した核酸の鎖長を断片化する処理を行わないほうが工程が簡単で、処理時間が短いという点で、より好ましいが、酵素処理、超音波処理、機械的破砕処理、化学的処理等を行うことで、検体から抽出した核酸の鎖長を断片化、すなわち、短くすることも出来る。さらに、これらの処理を行った後、精製工程を行うことも、精製工程を省くこともできる。
また、精製工程を行った場合には、本発明では、制限酵素などの核酸分解酵素により、核酸を断片化し、得られた核酸を精製することによって、その精製度が増すと共に、精製時に濃縮工程を組み込むこと、例えば、核酸の溶液量よりもより少量の回収液量で抽出することで、より高純度かつ高濃度の核酸を得ることが出来、標識核酸を得るための効率が良くなることから好適に用いることが出来る。
酵素処理に使用する酵素としては、制限酵素または核酸分解酵素を用いることが好ましい。制限酵素の種類は、複数用いることも可能である。
【００４７】
本発明で言うところの機械的破砕処理とは、一定の方向に対して（但し８の字型の様な運動も含む）、容器に対して往復運動を行うことを言う。この処理を行う際に、ガラス、ステンレスやジルコニアなどのボールを添加するとより処理が進行し、より核酸が切断されるので好適に用いることが出来る。また、超音波処理による切断も出来る。
【００４８】
・サブトラクション法
本発明の方法は、サブトラクション法によって、核酸マイクロアレイ測定の精度を上げることも出来る。サブトラクション法とは、対象遺伝子のコピー数や発現に差がある場合、遺伝子の中に存在する違いを、引き算の要領で差し引きし、効率的に遺伝子を単離する方法である。例えば、ＰＣＲ−Ｓｅｌｅｃｔ法、ＲＤＡ（representational difference analysis）法、ＤｓＤＤ（Duplex-specific Direct Digestion）法等を用いることが出来る。
特に、がん細胞の場合、がん組織の中には、がん細胞と共に多量の正常細胞が含まれており、その結果、がん細胞の場合、核酸マイクロアレイの性能が著しく低下するが、サブトラクション法によって、その性能低下をある程度防ぐことが出来る。
【００４９】
＜標識＞
標識とは、検出可能な物質を核酸に対して結合させる行為であり、検出可能であれば、いかなるものも本発明に組み込むことが出来る。例えば、蛍光物質、無機化合物、酵素、放射性同位元素、色素などを含むことが出来、標識が蛍光によるものであることが好ましい。一つの検体に対し、複数標識することも可能である。
【００５０】
・蛍光物質
蛍光物質としては、特に使用は限定しないが、フルオレセインイソチオシアネート(FITC)、Cy-dye、ALEXA、緑色蛍光タンパク質(GFP, Green Fluorescent Protein)、青色蛍光タンパク(BFP,)、黄色蛍光タンパク(YFP)、赤色蛍光タンパク(RFP)、Acridine、DAPI、Ethidium bromide、SYBR Green、Texas Red、希土類蛍光ラベル剤、TAMRA、ROXなど入手可能または作製可能な物質であれば全て使用でき、好ましくはcy-3、cy-5によって蛍光標識することができる。
無機化合物としては、特に使用する素材は限定しないが、例えば、半導体無機材料で出来た量子ドットを挙げることが出来る。その例としては、シリカ、ＣｄＴｅ、ＺｎＳｅ、ＣｄＳｅのナノ微粒子を挙げることが出来る。この微粒子は、その粒径を変えることで、発する蛍光波長を変化させることが出来、直径２ｎｍでは青色、直径３ｎｍでは緑色、４ｎｍでは黄色、５ｎｍでは赤色となる。この様に、蛍光を検出しても良いし、その粒子の存在を直接検出しても良い。例えば、粒子の存在を直接検出する手段として、ＡＦＭ（原子間力顕微鏡）や電子顕微鏡を用いることが出来る。
さらに、ジゴキシゲニン（Digoxigein：DIG）、ビオチンなども利用することも出来る。ビオチンを利用した例としては、プローブに結合させたビオチンに、アビジンを結合させ、ここにビオチンを結合させたアルカリ性ホスファターゼを結合させ、アルカリ性ホスファターゼの基質であるニトロブルーテトラゾリウムと５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリルリン酸を加えると紫色の発色が見られ検出に使用することが出来る。
また、非酵素的に標識することも出来る。例えば、ULS arrayCGH LabelingKit（Kreatech Biotechnology BV社）なども用いることが出来る。
【００５１】
・直接標識法と間接標識法
標識法は、直接標識法、間接標識法いずれの標識法を本発明では用いても良い。直接標識法とは、例えば、Ｃｙ−ｄｙｅを用いる場合、核酸を一本鎖とし、ここに短鎖核酸をハイブリダイゼーションさせ、Ｃｙ−ｄｙｅを結合させたヌクレオチド誘導体をヌクレオチドとともに混合しておき、一段階で標識核酸を合成する方法である。酵素が非天然型のヌクレオチド誘導体を取り込む際の取り込み効率が天然型のヌクレオチドよりも低いという問題点があるものの、工程が簡便であり、本発明でも好適に用いることが出来る。間接標識法とは、例えば、Ｃｙ−ｄｙｅを用いる場合、核酸を一本鎖とし、ここに短鎖核酸をハイブリダイゼーションさせ、Ｃｙ−ｄｙｅが結合できる置換基を持ったヌクレオチド誘導体、例えば、アミノアリル基を持ったヌクレオチド誘導体と天然型のヌクレオチドとともに混合しておき、最初に、この置換基を持った核酸を合成し、次に、アミノアリル基を介してＣｙ−ｄｙｅを結合させ、標識核酸を得る方法である。この方法は、工程が複雑な反面、アミノアリル基を結合させたヌクレオチド誘導体の立体構造が直説標的法で使用するＣｙ−ｄｙｅを結合させたヌクレオチド誘導体よりも、天然型のヌクレオチドと構造的に近く、標識化合物の取り込み効率が高く、本発明でも好適に用いることが出来る。
【００５２】
本発明では、標識化合物を核酸に導入する方法として、ランダムプライマー法（プライマーエクステンション法）、ニックトランスレーション法、ＰＣＲ（Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ Ｃｈａｉｎ Ｒｅａｃｔｉｏｎ）法、末端標識法などを用いることが出来る。特に、本発明ではランダムプライマー法を好適に用いることが出来る。
ランダムプライマー法は、核酸に対して、数ｂｐ（塩基対）から十数ｂｐのランダムなプライマー核酸をハイブリダイゼーションさせ、ポリメラーゼを用いて、増幅と標識とを同時に行い、標識核酸を合成する方法である。ニックトランスレーション法は、例えば、ＤｎａｓｅＩでニックを入れた二本鎖核酸に、ＤＮＡポリメラーゼを作用させ、ＤＮＡを分解すると同時に、ＤＮＡポリメラーゼ活性により、標識核酸を合成する方法である。ＰＣＲ法は、二種類のプライマーを準備し、そのプライマーを用いてＰＣＲ反応を行うことで、増幅と標識とを同時に行い、標識核酸を得る方法である。末端標識法は、５’末端を標識する方法では、アルカリホスファターゼで脱リン酸化した核酸の５’末端に、Ｔ４ ポリヌクレオチドキナーゼによるリン酸化反応で標識化合物を取り込ませる方法である。３’末端を標識する方法は、ターミナルトランスフェラーゼにより、標識化合物を核酸の３’末端に付加する方法である。
【００５３】
・ダイスワップ法
本発明では、ダイスワップ法を用いることもできる。本発明で言うところのダイスワップ法とは、例えば、一枚目の核酸マイクロアレイに対しては、標準細胞由来の核酸をＣｙ３で検証核酸をＣｙ５で標識した試料をハイブリダイゼーションさせ、二枚目の核酸マイクロアレイに対しては、検体細胞由来の核酸をＣｙ３で検証核酸をＣｙ５で標識した試料でハイブリダイゼーションさせる。一枚目と二枚目の核酸マイクロアレイから得られた蛍光値から比を算出する。次に、三枚目の核酸マイクロアレイに対しては、標準細胞由来の核酸をＣｙ５で検証核酸をＣｙ３で標識した試料をハイブリダイゼーションさせ、四枚目の核酸マイクロアレイに対しては、検体細胞由来の核酸をＣｙ５で検証核酸をＣｙ３で標識した試料でハイブリダイゼーションさせる。三枚目と四枚目の核酸マイクロアレイから得られた蛍光値から比を算出する。この様な方法で、標識化合物による酵素の取り込み効率の異なりを補正する方法である。
【００５４】
・酵素活性の失活
本発明では、標識試料核酸および標識検証核酸として、それらを含む未精製の溶液を使用することも可能である。その様な未精製溶液を用いる場合、それらの溶液中には、酵素などがそのまま残存しており、調製後、溶液中に残存する酵素の活性を失活させておくことが好ましい。これは、例えば、検体由来の標識試料核酸をＣｙ３、標識検証核酸をＣｙ５で標識した場合、両者を含む未精製溶液を混合する工程があり、この混合時に、溶液中に残存する酵素が存在していると、残存した酵素によって標識試料核酸がＣｙ５、標識検証核酸がＣｙ３でさらに標識される可能性があり、データの再現性に影響を与えてしまう可能性があるからである。
本発明では、酵素の失活方法として、酵素の失活が可能な方法であればどの様な方法でもかまわないが、キレート剤を添加する方法、６０℃以上の加熱処理を行うことのいずれか一方もしくは両方を行うことが好ましい。加熱温度は、６０℃以上が好ましく、６３℃以上がさらに好ましい。加熱時間は、１分以上あれば良く、最も好ましくは、６５℃以上で５分間以上の加熱処理を行うことが好ましい。
また、klenow fragmentを用いた標識方法であれば、ボルテックスミキサー等を用いて酵素の活性を失わせることも可能である。
【００５５】
・標識核酸
標識核酸とは、標識化合物が結合した核酸のことを言い、精製していても精製していなくともよい。
【００５６】
・標識核酸を含む精製した溶液
標識核酸を含む精製した溶液とは、標識核酸を含む溶液に対して精製工程を行うことによって得た核酸溶液のことを言う。ここで、精製工程とは、標識処理を行った後の未反応の標識化合物や酵素などを取り除く工程のことであるが、ハイブリダイゼーションに寄与しない核酸や、その後のハイブリダイゼーションに対し影響を与えてしまう生体物質・化学物質を取り除くことも含んでおり、工程の前後で何らかの物質が除かれるのであれば、精製工程とする。
【００５７】
・標識核酸を含む未精製の溶液
標識核酸を含む未精製の溶液とは、検体から抽出した核酸の溶液に対して標識工程を行った後に、精製工程を全く行わずに得た核酸溶液のことである。ここで、精製工程とは、標識処理を行った後の未反応の標識化合物や酵素などを取り除く工程のことであり、核酸の溶液を調製するための精製工程は含めない。精製を行わないので、標識工程によって添加した種々の未反応化合物、例えば、プライマー、酵素、ヌクレオチド、バッファー中に含まれるイオンなどが共存した標識核酸の溶液である。さらに、標識核酸を含む未精製の溶液に対して、共存する酵素を失活させる目的で、加熱やキレート剤添加などの処理を行った後の核酸溶液も本発明では標識核酸を含む未精製の溶液という。
【００５８】
＜検証核酸＞
検証核酸は、対象としている全てのスポットにおいて、少なくともプローブ核酸の一部にハイブリダイズしうる配列を有し、対象としているスポットにおけるハイブリダイズ能力の異常、具体的には該スポットに固定化されているプローブ核酸の量に起因する異常を検知し、更にはプローブ核酸量の異常スポット間のスポット量を補正するために使用する核酸のことである。そのため、検証核酸は、核酸マイクロアレイ上の全スポットに固定化されているプローブ核酸とハイブリダイゼーション可能であればよく、どの様な配列、鎖長でも良い。ここで、全てのスポットとは、同一溶液の検体または標準が反応する可能性がある全スポットを表し、通常は単一の核酸マイクロアレイ上のスポット全てのことであるが、これに限定されない。
また、ハイブリダイゼーションが可能であれば、どの様な核酸でも良く、ＤＮＡやＲＮＡの様な天然型の核酸や、ＤＮＡやＲＮＡなどの天然型の核酸を化学修飾した核酸を使用しても良い。例えば、ＰＮＡ（Peptide Nucleic Acid）、ＢＮＡ（Bridged Nucleic Acid）、メチルホスホネート型ＤＮＡ、ホスホロチオエート型ＤＮＡ、ホスホロアミデート型ＤＮＡ、ボラノホスフェート型ＤＮＡなどを用いることが出来る。また、キメラ型核酸を用いることも出来る。例えば、核酸内にＤＮＡ部分とＲＮＡ部分とが混合したものや天然型核酸と修飾型核酸とが混合したものを使用することが出来る。
標識検証核酸（Ｂ）としては、たとえば、反復配列やベクター、大腸菌のゲノムなど、アレイを作製する上で、全てのスポットに存在すると考えられる核酸配列であれば使用出来、検体の核酸とは異なり、第１及び第ｎのプローブ核酸上の配列を持つ核酸を用いることが好ましい。
ベクターとしては、プラスミド、ＢＡＣ、ＹＡＣ、ＰＡＣ、コスミド、ウィルスなど種種のベクターが上げられ、アレイを作製するときに用いたベクターやこのベクターと同じ配列をもつ核酸であれば何を用いても構わない。
検証核酸として好ましい配列としては、反復配列が挙げられる。反復配列とは、リピート配列ともいい、ある塩基数ごとに制限酵素認識部位のように繰り返し出現する配列であり、短い塩基配列のパターンが何度も繰り返す配列、例えば、ｐｏｌｙ ｄ（ＡＴ）やｐｏｌｙ ｄ（ＧＣ）などや、一単位が数千塩基対に及ぶ長い配列が何度も繰り返す配列などをあげることが出来、ヒト等の高等生物中にはゲノム中に高頻度で出現することが知られている。本発明においては、例えばインビトロジェン社で販売されているＣｏｔ−１ ＤＮＡを好適に用いることが出来る。
例えば、マンマリアンＢＡＣ-ＤＮＡを用いた核酸マイクロアレイの場合には、Ｃｏｔ−１ ＤＮＡを用いることが好ましい。Ｃｏｔ−１ ＤＮＡは、通常、核酸マイクロアレイ測定時にマンマリアン（哺乳類）から得られた検体の反復配列をブロックするために使用される核酸であり、マンマリアンＢＡＣプローブを用いた核酸マイクロアレイの場合、通常そのプローブには反復配列が実質的に多くのＢＡＣプローブに含まれている。
【００５９】
例えば、プローブに繰り返し配列を有するＢＡＣ−ＤＮＡを用いた核酸マイクロアレイの場合、Ｃｏｔ−１ ＤＮＡを添加し、標的核酸およびプローブ核酸上に存在するその反復配列にあらかじめ非特異的にハイブリダイゼーションし、ブロックすることで、ターゲット核酸側に存在する反復配列がプローブ核酸側に存在するプローブ核酸と非特異的にハイブリダイゼーションする事を防止し、特異的なハイブリダイゼーションに由来する蛍光値を選択的に検出できるようにしている。本発明では、そのＣｏｔ−１ ＤＮＡの少なくとも一部を標識化して（好ましくは前記標識検証核酸と同一種の（同一の配列をもつ）未標識の核酸、例えば未標識Ｃｏｔ−１ ＤＮＡとともに）用いることによって、特異的なハイブリダイゼーションの検出感度を高め、かつスポット差を低減させることが可能であることを見出した。
【００６０】
また、プローブ核酸中に共通に存在する核酸配列部分に実質的に相補的な核酸配列を有する、合成オリゴヌクレオチドを検証核酸として用いることもできる。
【００６１】
本発明では、核酸に対して、検証核酸の使用量をモル比で１以上用いることが好ましい。モル比を１以上用いることによって、核酸マイクロアレイの性能が向上するからである。
【００６２】
検証核酸の大きさは、２０ｂｐ以上であることが好ましく、２０ｂｐ〜１Ｍｂｐであることがより好ましく、１００ｂｐ〜５００ｋｂであることがさらに好ましい。
検証核酸の使用量は、検体または標準の核酸に対して、０．５〜２倍モルの範囲とすることが好ましい。
【００６３】
・標識検証核酸（Ｂ）
標識検証核酸（Ｂ）とは、検証核酸に対して標識化合物を結合させた検証核酸のことを言い、精製していても精製しなくても本発明では標識検証核酸と言う。
標識検証核酸（Ｂ）として、検体由来の核酸、正常細胞由来の核酸、反復配列を含む核酸、を使用することもでき、Ｃｏｔ−１ ＤＮＡを使用することがより好ましい。
標識検証核酸（Ｂ）を、試料核酸（Ａ）の１モル倍以上用いることが好ましく、３モル倍以上用いることが更に好ましく、８モル倍以上用いることが最も好ましい。
【００６４】
・標識検証核酸を含む精製した溶液
標識検証核酸を含む精製した溶液とは、標識検証核酸（Ｂ）を含む溶液に対して、精製処理を行うことによって得た、標識検証核酸を含む溶液のことである。ここで、精製工程とは、標識処理を行った後の未反応の標識化合物や酵素などを取り除く工程のことである。
【００６５】
・標識検証核酸を含む未精製の溶液
標識検証核酸を含む未精製の溶液とは、標識検証核酸（Ｂ）を含む溶液に対して、精製処理を行わずに得た標識検証核酸を含む溶液のことである。精製を行わないので、標識工程によって添加した種々の未反応化合物、例えば、プライマー、酵素、ヌクレオチド、バッファー中に含まれるイオンなどが共存した標識検証核酸を含む溶液である。さらに、残存する酵素を失活させる目的で、未精製標識検証核酸を含む溶液に対して、加熱やキレート剤添加などの処理を行った後の核酸も本発明では標識検証核酸を含む未精製の溶液という。
【００６６】
＜ブロッキング剤＞
本発明で言うところのブロッキング剤とは、ハイブリダイゼーション時に非特異ハイブリダイゼーションの検出を低減するためのものであり、ハイブリダイゼーション溶液を調製する際に、標識試料核酸（Ａ）、標識検証核酸（Ｂ）などとともに添加することができる。例えば、核酸マイクロアレイのバックグラウンドノイズを低減させる作用を主として有するｔＲＮＡ（トランスファーＲＮＡ）、変性サケ精子ＤＮＡやｐｏｌｙＡ、ｐｏｌｙ ｄＡ、スキムミルクなどのことであり、一般に販売されているブロッキング剤も用いることができる。
【００６７】
＜ハイブリダイゼーション溶液の組成＞
本発明はハイブリダイゼーション溶液の組成として次のものを使用出来る。例えば、ＢＡＣ−ＤＮＡを用いた核酸マイクロアレイの場合、核酸濃度を高める作用や、粘性を上げることで仕切られていても面積をある程度保持できる機能を持った硫酸デキストラン、核酸の融解温度を下げる作用を持ったホルムアミド、イオン強度を上げることができ、ｐＨを一定に保つための機能を持つ溶液を例として挙げることが出来る。
本発明では、下記の試薬を含む溶液を用いることが好ましい。
排除体積効果を持つ物質として、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ、特開２０００−３２５０９９号公報）やデキストラン硫酸等を使用することが出来る。
融点を低下させる化合物として、ホルムアミド、グリセロール、ホルムアルデヒド、ＤＭＳＯ、ＤＭＦ、ＧｕＳＣＮ、ヨウ素などを使用することが出来る。
イオン強度を調整する溶液としては、SSCのほか、SSPEが一般的に上げられる。他に、MES hybridization bufferなどが用いられる。
【００６８】
＜ハイブリダイゼーション溶液＞
本発明で言うところのハイブリダイゼーション溶液とは、上記試薬やブロッキング剤その他の試薬、標識試料核酸・検証核酸を混入した溶液のことであり、標識試料核酸（Ａ）や標識検証核酸（Ｂ）が核酸マイクロアレイ上のプローブ核酸とのハイブリダイゼーションを好適にする性質を持った溶液のことであり、プローブ核酸と標識試料核酸や標識検証核酸との配列の一致度が高いハイブリダイゼーションを促進し、その一方で、配列の一致度が低いハイブリダイゼーションを抑制する働きを持った溶液のことである。
【００６９】
この他に本発明では、特開２００５−０８７１０９に記載されているように、ハイブリダイゼーション溶液の組成の一つとして、リン脂質、デンハルト溶液（フィコール、ポリビニルピロリドン、ウシ血清アルブミンを主成分とする溶液）、４級アンモニウム塩であるベタイン(Biochemistry 32, 137-144(1993))、ＴＭＡＣ（tetramethyl ammonium chloride）(Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82, 1585-1588 (1985)) 、市販されているハイブリダイゼーション溶液、例えば、ExpressHyb (Clontech)、PerfectHyb (東洋紡績株式会社)、ULTRAhyb(Ambion)などを用いることも出来る。
【００７０】
ハイブリダイゼーション溶液には、界面活性剤を添加することもできる。界面活性剤としては、カチオン性界面活性剤、アニオン性界面活性剤、また、ノニオン性界面活性剤を用いることも出来る。アニオン性界面活性剤として、ドデシル硫酸ナトリウムを用いるのが好ましい。ドデシル硫酸ナトリウムは、バックグラウンドを効率よく抑えることが出来る。他に、Ｎ−ラウリルサルコシド、ラウリル硫酸リチウムなどが用いられている。ノニオン性界面活性剤としては、Ｔｗｅｅｎ（登録商標）やＴｒｉｔｏｎＸ（登録商標）などが知られている。本発明では、これらの界面活性剤を使用することが出来る。
【００７１】
・標識試料核酸（Ａ）、標識検証核酸（Ｂ）を含むハイブリダイゼーション溶液
本発明で言うところの標識試料核酸、標識検証核酸を含むハイブリダイゼーション溶液とは、少なくとも一種の標識試料核酸および少なくとも一種の標識検証核酸が混入したハイブリダイゼーション溶液のことである。
【００７２】
・標識試料核酸（Ａ）、標識検証核酸（Ｂ）、ブロッキング剤を含むハイブリダイゼーション溶液
本発明で言うところの標識試料核酸、標識検証核酸、ブロッキング剤を含むハイブリダイゼーション溶液とは、少なくとも一種の標識試料核酸および少なくとも一種の標識検証核酸および少なくとも一種のブロッキング剤が混入したハイブリダイゼーション溶液のことである。
【００７３】
・種々核酸を含むハイブリダイゼーション溶液の調製
標識試料核酸を含まず、それ以外の核酸を含んだハイブリダイゼーション溶液の調製は、使用者が行っても良いが、アレイなどの提供元が作製し提供してもよい。このハイブリダイゼーション溶液に、標識検証核酸（Ｂ）が入っている場合には、標識検証核酸の濃度や種類、ロット番号などを統一しておくほうが好ましく、使用者は、精度の高い核酸マイクロアレイ実験が容易に行うことが可能となる。
即ち、上述した工程（ａ）で調製した標識試料核酸（Ａ）、工程（ｂ）で調製した標識検証核酸（Ｂ）の少なくともいずれか一つを濃縮もしくは精製することも好ましいし、工程（ｃ）で調製したハイブリダイゼーション溶液を濃縮もしくは精製することも好ましい。
【００７４】
・濃縮
標識試料核酸を含まず、それ以外の核酸を含んだハイブリダイゼーション溶液は、濃縮を行っておくことによって精度が高い核酸マイクロアレイ測定を実施することが可能となる。すなわち、ハイブリダイゼーションを実施する核酸同士がであう確率が高くなり、より精度の高い実験を実施することが可能であると考えられる。
【００７５】
・精製
本発明で言うところの精製とは、抽出、分離、分取と同異義語の意味で使用している。
また、そのための手段として、シリカやセルロース誘導体などの核酸吸着性膜を担持したカートリッジを用いた方法、エタノール沈殿やイソプロパノール沈殿、フェノール−クロロホルム抽出、イオン交換樹脂やオクタデシル基などの疎水性置換基を結合したシリカ担体やサイズ排除効果を示す樹脂を使用した固相抽出カートリッジ、クロマトグラフィーなどによる方法を含むことが出来る。
【００７６】
＜ハイブリダイゼーションを読み取る方法＞
核酸マイクロアレイ上のハイブリダイゼーションを読み取る方法としては標識を測定できる方法であればどんなものでも良く、限定するものではない。
例えば、ラジオアイソトープであればX線フイルムやBASS(富士フイルム株式会社)を用いることができる。
本発明で最も好適に用いられる方法は、蛍光スキャナーを用いる方法である。標識核酸の標識化合物として蛍光物質を用いた場合に好適に用いられる。蛍光スキャナーとしては、例えば、ＦＬＡシリーズ（富士フイルム株式会社）やＧｅｎｅＰｉｘシリーズ（Ａｘｏｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）、LS Reloaded（テカン）、などがあげられ、マイクロアレイを読み込むことができる機器であれば特に限定はしない。
また、標識をしていなくとも核酸を測定でき、補正等の計算を実施することができるのであれば、標識することが必須の要件とはいえない。例えば、SPRシステムで測定することが考えられる。
【００７７】
＜自動化＞
本発明の方法は、すべての工程を手作業で行うこともできるし、部分的に自動化された機械で行うこともできるし、全工程を自動化された機械で行うこともできる。自動化を行うことにより、作業者は煩雑な作業から解放され、人件費を低減し、熟練度の違いによる結果の差異を減少させ、ヒューマンエラーを防ぐことが可能となる。
【００７８】
＜データの提供＞
本発明では、別途標準を予め測定しておき、それを提供することで検体を評価するという手法もとることが可能である。この結果、常時標準を準備しなくとも、検体のみのハイブリダイゼーションを実施することが可能となり、効率よく実験を実施することができるようになる。また検体のデータを標準と考え使用することも可能である。
【００７９】
＜プログラム＞
核酸マイクロアレイ測定を実施し得られたデータを処理する際、効率よく実施ため、プログラムを用いたデータ処理を実施することが可能である。
該プログラムは、通常コンピュータ読み取り可能な記録媒体に記録した形態で提供される。該記録媒体は、コンピュータが読み取り可能なものであれば特に限定されない。本発明の記録媒体は、可搬型または固定型の両方の媒体が含まれ、例えば、コンパクトディスク（ＣＤ）、フレキシブルディスク（ＦＤ）、デジタルビデオディスク（ＤＶＤ）、ハードディスク、半導体メモリ等を挙げることができる。
本発明のプログラムは、上記記録媒体に記録されて流通させることも、コンピュータの記録装置に記録しておき、ネットワークを通じて他のコンピュータに転送する形態で流通させることもできる。
【００８０】
本発明の解析方法用キットは、プローブ核酸が固定化されているスポットを複数有する核酸マイクロアレイ、及び、該核酸マイクロアレイ上の全てのスポットにおいて少なくとも各プローブ核酸の一部にハイブリダイズしうる配列を有する検証核酸、を含む。該検証核酸は、予め標識されていても、ユーザーが使用時に標識を行ってもよい。また、該検証核酸は、イオン強度を調整する成分、界面活性剤等を含むハイブリダイゼーション溶液として提供されることも好ましい。
【実施例】
【００８１】
以下、実施例により本発明を更に詳細に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
尚、特に記載が無い場合、％は質量％を表す。
【００８２】
［比較例１］ 未精製標識核酸を試料とし、検証核酸を用いない場合の核酸マイクロアレイ実験および解析
【００８３】
＜未精製標識核酸の調製＞
１．７ｍＬマイクロチューブ（プラチナチューブ、ビーエム機器株式会社）にＦｅｍａｌｅ ＤＮＡ（Ｐｒｏｍｅｇａ,G1521）を３μＬ（０．７５μｇ）、水（Ｄｉｓｔｉｌｌｅｄ Ｗａｔｅｒ ＤＮＡｓｅ，ＲＮＡｓｅ Ｆｒｅｅ、ＧＩＢＣＯ）を８μＬ、ＢｉｏＰｒｉｍｅ（Ｒ） Ａｒｒａｙ ＣＧＨ Ｇｅｎｏｍｉｃ Ｌａｂｅｌｉｎｇ Ｓｙｓｔｅｍの２．５×Ｒａｎｄｏｍ Ｐｒｉｍｅｒｓ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ（ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を２０μＬ入れ、ＢＬＯＣＫ ＩＮＣＵＢＡＴＯＲ ＢＩ−５３５Ａ（株式会社アステック）上にて、９５℃で５分間熱処理を行った。５分後、マイクロチューブを取り出し、氷上にて１０分間急冷処理を行った。ＢｉｏＰｒｉｍｅ（Ｒ） Ａｒｒａｙ ＣＧＨ Ｇｅｎｏｍｉｃ Ｌａｂｅｌｉｎｇ Ｓｙｓｔｅｍの１０×ｄＣＴＰ Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｍｉｘ（ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を５μＬ、Ｃｙ３−ｄＣＴＰ Ｂｕｌｋ Ｐａｃｋ ２５０ｎｍｏｌ（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス株式会社）を３μＬ、ＢｉｏＰｒｉｍｅ（Ｒ） Ａｒｒａｙ ＣＧＨ Ｇｅｎｏｍｉｃ Ｌａｂｅｌｉｎｇ ＳｙｓｔｅｍのＥｘｏ−Ｋｌｅｎｏｗ Ｆｒａｇｍｅｎｔ（ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を１μＬ添加し、３７℃で２時間ＢＬＯＣＫ ＩＮＣＵＢＡＴＯＲ ＢＩ−５３５Ａにて、標識化反応と共に増幅反応を行った。２時間後、マイクロチューブをインキュベータから取り出し、６５℃に設定したＢＬＯＣＫ ＩＮＣＵＢＡＴＯＲ ＢＩ−５３５Ａにて、加熱処理を行い、反応溶液中に含まれているＥｘｏ−Ｋｌｅｎｏｗ Ｆｒａｇｍｅｎｔを失活させた。
【００８４】
上記操作をＭａｌｅ ＤＮＡ(G1471)に対しても行い、以上の操作にて、二種の未精製標識核酸を得た。なお、Ｍａｌｅ ＤＮＡに対しても、標識化合物として、Ｃｙ３−ｄＣＴＰ（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス株式会社）を用いた。
【００８５】
＜Ｃｏｔ−１ ＤＮＡを含む溶液（溶液A）の調製＞
Ｃｏｔ−１ ＤＮＡ ６５μＬ（６５μｇ、ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を１．７ｍＬマイクロチューブに入れ、３Ｍ酢酸ナトリウム（ｐＨ５．２）を６．５μＬ、−２０℃のエタノールを１６７μＬ添加し、混合後、１０分間−８０℃で放置した。その後、ＴＯＭＹ製遠心機ＭＸ−３００を用いて、１５０００ｒｐｍで３０分間、４℃で遠心を行った。遠心後、沈殿物が遠心チューブの底にたまるので、その沈殿物を吸い込まないように注意しながら、上清を除去した。次に、遠心チューブのフタを開けたまま１０分間放置し、残存するエタノールを除去した。１０分後、２０％ＳＤＳを１８μＬ添加し、３０分間静置した。３０分後、デキストラン硫酸（ＳＩＧＭＡ）を１ｇ、ホルムアミドを５ｍＬ、２０ｘＳＳＣを１ｍＬ混合し、溶解後、水を添加することで液量を７ｍＬとしたもの）を２０μＬ添加し、攪拌することで十分に混合させ、溶液Aを調製した。
なおこの工程は、ユーザーが行うのではなく、キット製造者があらかじめ調製しておくことが好ましい。
【００８６】
＜ハイブリダイゼーション溶液の調製＞
＜未精製標識核酸の調製＞で調製したＦｅｍａｌｅの未精製標識核酸を２０μＬ、実施例１と条件を一致させるために添加した水を２０μＬ、溶液Aを３８μＬ、１．７ｍＬマイクロチューブの中に入れ、十分に攪拌（Ｖｏｒｔｅｘ）処理を行った。また、同様に、＜未精製標識核酸の調製＞で調製したＭａｌｅの未精製標識核酸を２０μＬ、実施例１と条件を一致させるために添加した水を２０μＬ、溶液Aを３８μＬ、１．７ｍＬマイクロチューブの中に入れ、十分に攪拌（Ｖｏｒｔｅｘ）処理を行った。
【００８７】
＜核酸マイクロアレイについて＞
市販のBACクローンを大量培養後、イオン交換カラム（QIAGEN社、Plasmid Midi Kit 100 Cat.No.12145）を用いて抽出・精製しBAC DNAを得た。
その後、BAC DNAを４塩基認識酵素、ＲｓａＩ、ＤｐｎＩ、ＨａｅＩＩＩで消化した後、アダプターを加えてライゲーションをおこなった。
次に、アダプターの一方のオリゴヌクレオチドと同一配列を有するプライマーを用いて、ＰＣＲ法により増幅することにより、長さ１０００〜３０００ｂｐ程度のプローブDNAが得られた。
得られたプローブDNAをＧＥＮＥＳＨＯＴ（日本ガイシ株式会社、名古屋）を使用し、ガラス基板へスポットした。
これにより、ＢＡＣクローンから調製したプローブＤＮＡ８００種をそれぞれ２つずつガラス基板上にスポットした、合計１６００個のスポットを有する核酸マイクロアレイが得られ、以下の実験に用いた。
【００８８】
＜核酸マイクロアレイの前処理＞
ブロッキング溶液（松浪硝子工業株式会社）を約２００ｍＬ、ガラス容器に入れ、そこへ上記核酸マイクロアレイを入れ、２０分間ＳＬＩＤＥ ＷＡＳＨＥＲ，ＳＷ−４（十慈フィールド株式会社）を用いて、スライドガラスを上下に移動させながら、ブロッキング反応を行った。２０分後、核酸マイクロアレイをブロッキング溶液から取り出し、水２００ｍＬを入れた容器の中に入れた。３分間、ＳＬＩＤＥ ＷＡＳＨＥＲを用いて洗浄し、３分後、再び新しい水を２００ｍＬ入れた容器の中に入れ、ＳＬＩＤＥ ＷＡＳＨＥＲを用いて洗浄した。
３分後、エタノールを２００ｍＬ入れた容器の中に移し、再びＳＬＩＤＥ ＷＡＳＨＥＲを用いて洗浄した。３分後、核酸マイクロアレイを取り出し、卓上遠心機スピンドライヤーｍｉｎｉ２３５０（トミー工業株式会社）を用いて遠心を行い、核酸マイクロアレイを乾燥させた。
ブロッキング後、沸騰水に核酸マイクロアレイを２分間浸し、ついで、−２０℃の７０％エタノールに２分間、−２０℃の８５％エタノールに２分間、−２０℃の１００％エタノールに２分間浸し、その後、スピンドライヤーで１分間の遠心を行うことで核酸マイクロアレイを乾燥させた。
【００８９】
＜ハイブリダイゼーション＞
ハイブリダイゼーションは、「アレイCGH診断活用ガイドブック 知っておきたい染色体微細構造異常症」（医薬ジャーナル社）に記載されているプロトコール通りに実施した。具体的には、＜ハイブリダイゼーション溶液の調製＞で調製した二種の試料溶液を、それぞれ７５℃で１６分間熱処理を行った。その後、４２℃で３０分以上熱処理を行った。それぞれの溶液を、一枚ずつ核酸マイクロアレイ上に滴下し、その上にギャップカバーグラス（２４×５０ｍｍ）（松浪硝子工業株式会社）を気泡が入らないように載せた。
この２枚の核酸マイクロアレイをタイトボックスＮｏ．１（蝶プラ工業株式会社）に入れ、そのタイトボックスを３７℃で１６時間、恒温槽（ＨＹＢＲＩＤＩＺＡＴＩＯＮ ＩＮＣＵＢＡＴＯＲ，ＨＢ−８０、タイテック株式会社）中に入れて、ハイブリダイゼーションを行った。なお、核酸マイクロアレイの乾燥を防ぐために、タイトボックスの中にペーパータオル（キムタオル）を入れ、その上に４ｍＬの５０％ホルムアミド／２×ＳＳＣ溶液を添加した。
【００９０】
＜核酸マイクロアレイの洗浄＞
ハイブリダイゼーションを行った後、それぞれの核酸マイクロアレイを２×ＳＳＣの溶液４５ｍＬを入れたスミロンチューブに入れ、カバーグラスが自然に核酸マイクロアレイから剥がれ落ちるまで浸した。次に、カバーグラスが外れたそれぞれの核酸マイクロアレイを、あらかじめ５０℃に加熱した４５ｍＬの５０％ホルムアミド／２×ＳＳＣ（ｐＨ７．０）溶液を入れた５０ｍＬのスミロンチューブ（住友ベークライト株式会社）の中に入れた。これを、ＨＹＢＲＩＤＩＺＡＴＩＯＮ ＩＮＣＵＢＡＴＯＲの中に入れ、５０℃で１分間に３０回転のスピードでステージを揺らし、１５分間洗浄を行った。次に、あらかじめ５０℃に加熱しておいた２×ＳＳＣ／０．１％ＳＤＳ（ｐＨ７．０）溶液を中に入れたスミロンチューブの中に、それぞれの核酸マイクロアレイに入れた。それを、恒温槽の中に入れ、５０℃で１分間に３０回転のスピードでステージを揺らし、３０分間洗浄を行った。次に、４５ｍＬの２×ＳＳＣ溶液を中に入れた５０ｍＬのスミロンチューブの中に、それぞれの核酸マイクロアレイを入れ、室温で１分間に３０回転のスピードでステージを揺らすことで５分間洗浄を行った。洗浄後、スピンドライヤー−Ｍｉｎｉ ＭＯＤＥＬ２３５０で１分間の遠心を行うことで核酸マイクロアレイを乾燥させた。
【００９１】
＜データ取り込み＞
洗浄した二枚のマイクロアレイは、ＧｅｎｅＰｉｘ ４０００Ｂ（Ａｘｏｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）を用いて、スキャニングを行った。
【００９２】
＜データ処理＞
未精製標識核酸Ｃｙ３−Ｆｅｍａｌｅ由来の蛍光値をＦＦ、そのバックグラウンドノイズをＢＦ、未精製標識核酸Ｃｙ３−Ｍａｌｅ由来の蛍光値をＦＭ、そのバックグラウンドノイズをＢＭとすると、そのＬｏｇＲａｔｉｏ値は、
ＬｏｇＲａｔｉｏ＝Ｌｏｇ２｛（ＦＦ−ＢＦ）÷（ＦＭ−ＢＭ）｝を用いて計算した。なお、すべてのスポットについてＬｏｇＲａｔｉｏ値を計算した。
なお、本比較例では、バックグラウンドノイズの値を差し引いたが、差し引かなくてもよい場合もある。
また、ＬｏｇＲａｔｉｏ差として、Ｘ染色体に相当する部分のＬｏｇＲａｔｉｏ値から、常染色体に相当する部分のＬｏｇＲａｔｉｏ値を差し引いたものも計算した。
ＬｏｇＲａｔｉｏ差は、Ｆｅｍａｌｅは２本のＸ染色体、Ｍａｌｅは１本のＸ染色体を持つので、その値は理論上、１．０となる。
【００９３】
＜結果＞
図2に、ＬｏｇＲａｔｉｏのグラフを示した。
【００９４】
［実施例１］ 未精製標識核酸を試料とし、検証核酸として未精製標識Ｃｏｔ−１ ＤＮＡを用いた場合の核酸マイクロアレイ実験および解析
【００９５】
＜未精製標識核酸の調製＞
比較例１の＜未精製標識核酸の調製＞と同様の方法で、Ｆｅｍａｌｅ由来の核酸、Ｍａｌｅ由来の核酸から、それぞれ未精製標識試料核酸を調製した。
【００９６】
＜未精製標識検証核酸の調製＞
１．７ｍＬマイクロチューブ（プラチナチューブ、ビーエム機器株式会社）にＣｏｔ−１ ＤＮＡを０．７５μｇ、水を８μＬ、２．５×Ｒａｎｄｏｍ Ｐｒｉｍｅｒｓ Ｓｏｌｕｔｉｏｎを２０μＬ入れ、ＢＬＯＣＫ ＩＮＣＵＢＡＴＯＲ ＢＩ−５３５Ａ上にて、９５℃で５分間熱処理を行った。５分後、マイクロチューブを取り出し、氷上にて１０分間急冷処理を行った。１０×ｄＣＴＰ Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｍｉｘを５μＬ、Ｃｙ５−ｄＣＴＰ Ｂｕｌｋ Ｐａｃｋ ２５０ｎｍｏｌ（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス株式会社）を３μＬ、Ｅｘｏ−Ｋｌｅｎｏｗ Ｆｒａｇｍｅｎｔを１μＬ添加し、３７℃で２時間ＢＬＯＣＫ ＩＮＣＵＢＡＴＯＲ ＢＩ−５３５Ａにて、標識化反応と共に増幅反応を行った。２時間後、マイクロチューブをインキュベータから取り出し、６５℃に設定したＢＬＯＣＫ ＩＮＣＵＢＡＴＯＲ ＢＩ−５３５Ａにて、加熱処理を行い、反応溶液中に含まれているＥｘｏ−Ｋｌｅｎｏｗ Ｆｒａｇｍｅｎｔを失活させた。
【００９７】
＜溶液Aの調製＞
比較例１と同様の方法で、溶液Aの調製を行った。
【００９８】
＜ハイブリダイゼーション溶液の調製＞
＜未精製標識核酸の調製＞で調製した未精製標識試料核酸Ｃｙ３−Ｆｅｍａｌｅを２０μＬ、＜未精製標識検証核酸の調製＞で調製した未精製標識検証核酸Ｃｙ５−Ｃｏｔ−１ ＤＮＡを２０μＬ、溶液Aを３８μＬ、１．７ｍＬマイクロチューブの中に入れ、十分に攪拌（Ｖｏｒｔｅｘ）処理を行った。また、同様に、＜未精製標識核酸の調製＞で調製した未精製標識試料核酸Ｃｙ３−Ｍａｌｅを２０μＬ、＜未精製標識検証核酸の調製＞で調製した未精製標識検証核酸Ｃｙ５−Ｃｏｔ−１ ＤＮＡを２０μＬ、溶液Aを３８μＬ、１．７ｍＬマイクロチューブの中に入れ、十分に攪拌（Ｖｏｒｔｅｘ）処理を行った。
【００９９】
＜核酸マイクロアレイの前処理＞
比較例１の＜核酸マイクロアレイの前処理＞と同様の方法で行った。
【０１００】
＜ハイブリダイゼーション＞
比較例１の＜ハイブリダイゼーション＞と同様の方法でハイブリダイゼーションを行った。なお、試料としては、未精製標識試料核酸Ｃｙ３−Ｆｅｍａｌｅと未精製標識検証核酸Ｃｙ５−Ｃｏｔ１ ＤＮＡとの混合物、未精製標識試料核酸Ｃｙ３−Ｍａｌｅと未精製標識検証核酸Ｃｙ５−Ｃｏｔ１ ＤＮＡとの混合物の、それぞれ二種を用いた。
【０１０１】
＜核酸マイクロアレイの洗浄＞
比較例１の＜核酸マイクロアレイの洗浄＞と同様の方法で核酸マイクロアレイの洗浄を行った。
【０１０２】
＜データ取り込み＞
洗浄した二枚のマイクロアレイは、ＧｅｎｅＰｉｘ ４０００Ｂ（Ａｘｏｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）を用いて、スキャニングを行った。
【０１０３】
＜データ処理＞
未精製標識試料核酸Ｃｙ３−Ｆｅｍａｌｅ由来の蛍光値をＦＦ、そのバックグラウンドノイズをＢＦ、未精製標識試料核酸Ｃｙ３−Ｆｅｍａｌｅと同時にハイブリダイゼーションさせた未精製標識検証核酸Ｃｙ５−Ｃｏｔ１ ＤＮＡの蛍光値をＦｃ１、そのバックグラウンドノイズをＢｃ１、未精製標識試料核酸Ｃｙ３−Ｍａｌｅ由来の蛍光値をＦＭ、そのバックグラウンドノイズをＢＭ、未精製標識試料核酸Ｃｙ３−Ｍａｌｅと同時にハイブリダイゼーションさせた未精製標識検証核酸Ｃｙ５−Ｃｏｔ１ ＤＮＡの蛍光値をＦｃ２、そのバックグラウンドノイズをＢｃ２とすると、補正後のＭａｌｅ由来の未精製標識試料核酸の蛍光値ＦＭ’は、
ＦＭ’＝（Ｆｃ１−Ｂｃ１）÷（Ｆｃ２−Ｂｃ２）×（ＦＭ−ＢＭ）で計算した。計算は、すべてのスポットに対して行った。なお、補正後のＦｅｍａｌｅ由来の未精製標識試料核酸の蛍光値ＦＦ’を以下の式によって計算しても良い。
ＦＦ’＝（Ｆｃ２−Ｂｃ２）÷（Ｆｃ１−Ｂｃ１）×（ＦＦ−ＢＦ）
【０１０４】
なお、本実施例では、バックグラウンドノイズの値を差し引いたが、差し引かなくてもよい場合もある。
【０１０５】
また、そのＬｏｇＲａｔｉｏ値は、
ＬｏｇＲａｔｉｏ＝Ｌｏｇ2｛（ＦＦ−ＢＦ）／ＦＭ’｝で計算した。計算は、すべてのスポットに対して行った。
なお、ＦＦ’を計算した場合には、
ＬｏｇＲａｔｉｏ＝Ｌｏｇ2｛ＦＦ’／（ＦＭ−ＢＭ）｝を用いて、ＬｏｇＲａｔｉｏ値を計算することができる。
ＬｏｇＲａｔｉｏ差は、比較例１と同様に計算することで得た。
【０１０６】
＜結果＞
図3にＬｏｇＲａｔｉｏのプロットを示した。
比較例１の図2と実施例１の図3とを比較すると、未精製標識検証核酸Ｃｙ５−Ｃｏｔ−１ ＤＮＡによる補正を行ったものは、常染色体のプロットが全体的に0点付近であった。
図4に、ＬｏｇＲａｔｉｏの差をプロットした図を示した。なお、ＬｏｇＲａｔｉｏの差は、比較例１と同様の方法によって求めた。即ち、ＬｏｇＲａｔｉｏ差は、Ｘ染色体部分のＬｏｇＲａｔｉｏの平均値と常染色体部分のＬｏｇＲａｔｉｏの平均値との差から計算した。この差が大きいほど、核酸マイクロアレイ測定としては優れている。補正を行わない場合は、０．３８、補正を行った場合には、０．５５となり、補正を行うことによって、ＬｏｇＲａｔｉｏ差が約０．１７増加した。そもそも、maleとfemaleを比較した際に、X染色体の本数は異なっており、常染色体と差がでるはずである。より差異が明確であれば、コピー数変化をより感度良く捉えることができ、より正しい判断をすることができる。つまり、ＬｏｇＲａｔｉｏの差が大きいということは検証核酸を使用することの有効性を示しているものである。
図5に、Ｆｅｍａｌｅ由来、Ｍａｌｅ由来の常染色体部分に相当する部分の常染色体部分のみについて計算した分散の平均値を示した。補正ありの場合の分散は０．１８９となり、補正なしの分散の０．３１３と比較して数値が非常に小さく、真値に近づいており、検証核酸を使用することの有効性を示している。
【０１０７】
［実施例２］ 未精製標識核酸を試料とし、検証核酸として未精製標識検証核酸を用いた場合の核酸マイクロアレイ実験および解析
【０１０８】
＜未精製標識核酸の調製＞
比較例１と同様の方法で、Ｆｅｍａｌｅ由来の核酸、Ｍａｌｅ由来の核酸から、それぞれ未精製標識試料核酸を調製した。なお、Ｆｅｍａｌｅ、ＭａｌｅともにＣｙ５で標識した。
【０１０９】
＜未精製標識検証核酸の調製＞
本実施例では、Ｆｅｍａｌｅ由来の未精製標識核酸を未精製標識検証核酸として用いた。なお、標識化合物として、Ｃｙ３を使用した。
【０１１０】
＜溶液Aの調製＞
比較例１と同様の方法で、溶液Aの調製を行った。
【０１１１】
＜ハイブリダイゼーション溶液の調製＞
＜未精製標識核酸の調製＞で調製した未精製標識試料核酸Ｃｙ５−Ｆｅｍａｌｅを２０μＬ、＜未精製標識検証核酸の調製＞で調製した未精製標識検証核酸Ｃｙ３−Ｆｅｍａｌｅ ＤＮＡを２０μＬ、溶液Aを３８μＬ、１．７ｍＬマイクロチューブの中に入れ、十分に攪拌（Ｖｏｒｔｅｘ）処理を行った。また、同様に、＜未精製標識核酸の調製＞で調製した未精製標識試料核酸Ｃｙ５−Ｍａｌｅを２０μＬ、＜未精製標識検証核酸の調製＞で調製した未精製標識検証核酸Ｃｙ３−Ｆｅｍａｌｅ ＤＮＡを２０μＬ、溶液Aを３８μＬ、１．７ｍＬマイクロチューブの中に入れ、十分に攪拌（Ｖｏｒｔｅｘ）処理を行った。
【０１１２】
＜核酸マイクロアレイの前処理＞
比較例１の＜核酸マイクロアレイの前処理＞と同様の方法で行った。
【０１１３】
＜ハイブリダイゼーション＞
比較例１の＜ハイブリダイゼーション＞と同様の方法でハイブリダイゼーションを行った。なお、試料としては、未精製標識試料核酸Ｃｙ５−Ｆｅｍａｌｅと未精製標識検証核酸Ｃｙ３−Ｆｅｍａｌｅとの混合物、未精製標識試料核酸Ｃｙ５−Ｍａｌｅと未精製標識検証核酸Ｃｙ３−Ｆｅｍａｌｅとの混合物の、それぞれ二種を用いた。
【０１１４】
＜核酸マイクロアレイの洗浄＞
比較例１の＜核酸マイクロアレイの洗浄＞と同様の方法で行った。
【０１１５】
＜データ取り込み＞
洗浄した二枚のマイクロアレイは、ＧｅｎｅＰｉｘ ４０００Ｂ（Ａｘｏｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）を用いて、スキャニングを行った。
【０１１６】
＜データ処理＞
未精製標識試料核酸Ｃｙ５−Ｆｅｍａｌｅ由来の蛍光値をＦＦ、そのバックグラウンドノイズをＢＦ、未精製標識試料核酸Ｃｙ５−Ｆｅｍａｌｅと同時にハイブリダイゼーションさせた未精製標識検証核酸Ｃｙ３−Ｆｅｍａｌｅ ＤＮＡの蛍光値をＦｃ１、そのバックグラウンドノイズをＢｃ１、未精製標識試料核酸Ｃｙ５−Ｍａｌｅ由来の蛍光値をＦＭ、そのバックグラウンドノイズをＢＭ、未精製標識試料核酸Ｃｙ５−Ｍａｌｅと同時にハイブリダイゼーションさせた未精製標識検証核酸Ｃｙ３−Ｆｅｍａｌｅ ＤＮＡの蛍光値をＦｃ２、そのバックグラウンドノイズをＢｃ２とすると、補正後のＭａｌｅ由来の未精製標識試料核酸の蛍光値ＦＭ’は、
ＦＭ’＝（Ｆｃ１−Ｂｃ１）÷（Ｆｃ２−Ｂｃ２）×（ＦＭ−ＢＭ）で計算した。計算は、すべてのスポットに対して行った。
【０１１７】
なお、本実施例では、バックグラウンドノイズの値を差し引いたが、差し引かなくてもよい場合もある。
【０１１８】
また、そのＬｏｇＲａｔｉｏ値は、
ＬｏｇＲａｔｉｏ＝Ｌｏｇ2｛（ＦＦ−ＢＦ）／ＦＭ’｝で計算した。計算は、すべてのスポットに対して行った。
ＬｏｇＲａｔｉｏ差は、比較例１と同様に計算することで得た。
【０１１９】
＜結果＞
図6にＬｏｇＲａｔｉｏのプロットを示した。
図３の検証核酸を使用しないものと比べて、常染色体、Ｘ染色体の区別がはっきりしており、また、ＬｏｇＲａｔｉｏ値も一定の範囲内に収束しており、本実施例でも検証核酸を使用することの有効性を示している。
【０１２０】
［実施例３］ ＬｏｇＲａｔｉｏが大きくばらついた場合の補正例
【０１２１】
＜未精製標識核酸の調製＞
比較例１と同様の方法で、Ｆｅｍａｌｅ由来の核酸、Ｍａｌｅ由来の核酸から、それぞれ未精製標識試料核酸を調製した。
【０１２２】
＜未精製標識検証核酸の調製＞
Ｃｏｔ−１ ＤＮＡを検証核酸として、実施例１と同様の方法で、未精製標識検証核酸Ｃｙ５−Ｃｏｔ−１ ＤＮＡを調製した。
【０１２３】
＜溶液Aの調製＞
比較例１と同様の方法で、溶液Aの調製を行った。
【０１２４】
＜ハイブリダイゼーション溶液の調製＞
実施例１と同様の方法で未精製標識試料核酸および未精製標識検証核酸を含むハイブリダイゼーション溶液を調製した。すなわち、未精製標識試料核酸Ｃｙ３−Ｆｅｍａｌｅと未精製標識検証核酸Ｃｙ５−Ｃｏｔ−１ ＤＮＡを含むハイブリダイゼーション溶液、および未精製標識試料核酸Ｃｙ３−Ｍａｌｅと未精製標識検証核酸Ｃｙ５−Ｃｏｔ−１
ＤＮＡを含むハイブリダイゼーション溶液を調製した。
【０１２５】
＜核酸マイクロアレイの前処理＞
比較例１の＜核酸マイクロアレイの前処理＞と同様の方法で行った。
なお、核酸マイクロアレイは、ＢＡＣクローンから調製した遺伝子を日本ガイシ株式会社にてスポットした、８００遺伝子を２スポットずつスポットした、１６００スポットのマイクロアレイを使用した。
【０１２６】
＜ハイブリダイゼーション＞
比較例１の＜ハイブリダイゼーション＞と同様の方法でハイブリダイゼーションを行った。なお、試料としては、未精製標識試料核酸Ｃｙ３−Ｆｅｍａｌｅと未精製標識検証核酸Ｃｙ５−Ｃｏｔ−１ ＤＮＡとの混合物、未精製標識試料核酸Ｃｙ３−Ｍａｌｅと未精製標識検証核酸Ｃｙ５−Ｃｏｔ−１ ＤＮＡとの混合物の、それぞれ二種を用いた。
【０１２７】
＜核酸マイクロアレイの洗浄＞
比較例１の＜核酸マイクロアレイの洗浄＞と同様の方法で行った。
【０１２８】
＜データ取り込み＞
洗浄した二枚の核酸マイクロアレイは、ＧｅｎｅＰｉｘ ４０００Ｂ（Ａｘｏｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）を用いて、スキャニングを行った。
【０１２９】
＜データ処理＞
実施例１の＜データ処理＞と同様に行った。
【０１３０】
＜結果＞
本実施例でのスキャン画像を図８に示した。右図の右端の中で縦の列のイメージ画像の濃度が薄くなった。
図8に検証核酸を用いて補正しなかった場合のＬｏｇＲａｔｉｏのプロットを示した。
図9に検証核酸を使用して、蛍光値の補正を行った場合のＬｏｇＲａｔｉｏのプロットを示した。
図8と図9とを比較すると、図8の場合には、図7の右側のイメージ図の右端の縦の列に由来する読み取り標識量の薄さが原因と考えられ、この領域のスポットのLogRatio値が真値から大幅に異なる値を示している。しかし、このデータに対して、検証核酸による補正値を計算式に含めた図9の結果を見ると、見事にそのデータ変動を低減させることに成功している。
この様に、本発明の方法は、データが大きくばらついた際には、特にその威力を発揮する。
【０１３１】
［実施例４］ 標識検証核酸がハイブリダイゼーション溶液に含まれる場合の結果
【０１３２】
＜未精製標識核酸の調製＞
比較例１と同様の方法で、Ｆｅｍａｌｅ由来の核酸、Ｍａｌｅ由来の核酸から、それぞれ未精製標識試料核酸を調製した。なお、標識化合物として、両方とも、Ｃｙ３を使用した。
【０１３３】
＜未精製標識検証核酸の調製＞
Ｃｙ５を標識化合物とし、Ｃｏｔ−１ ＤＮＡを検証核酸として、実施例１と同様の方法で、未精製標識検証核酸Ｃｙ５−Ｃｏｔ−１ ＤＮＡを調製した。
【０１３４】
＜標識検証核酸を含む溶液(溶液B)の調製＞
＜未精製標識検証核酸の調製＞で調製したＣｙ５−Ｃｏｔ−１ ＤＮＡを２０μＬ、Ｃｏｔ−１ ＤＮＡ ６５μＬ（６５μｇ）を１．７ｍＬマイクロチューブに入れ、３Ｍ酢酸ナトリウム（ｐＨ５．２）を８．５μＬ、−２０℃のエタノールを２１８μＬ添加し、混合後、１０分間−８０℃で放置した。その後、ＴＯＭＹ製遠心機ＭＸ−３００を用いて、１５０００ｒｐｍで３０分間、４℃で遠心を行った。遠心後、沈殿物が遠心チューブの底にたまるので、その沈殿物を吸い込まないように注意しながら、上清を除去した。次に、遠心チューブのフタを開けたまま１０分間放置し、残存するエタノールを除去した。１０分後、２０％ＳＤＳを１８μＬ添加し、３０分間静置した。３０分後、デキストラン硫酸（ＳＩＧＭＡ）を１ｇ、ホルムアミドを５ｍＬ、２０ｘＳＳＣを１ｍＬ混合し、溶解後、水を添加することで液量を７ｍＬとしたものを２０μＬ添加し、攪拌することで沈殿物を溶解すると共に、溶液を十分に混合させ、溶液Bを調製した
この工程は、ユーザーが行うのではなく、キット製造者があらかじめ調製しておくことが好ましい。
【０１３５】
＜ハイブリダイゼーション溶液の調製＞
＜未精製標識核酸の調製＞で調製した未精製標識試料核酸Ｃｙ３−Ｆｅｍａｌｅを２０μＬ、溶液Bを５８μＬ、１．７ｍＬマイクロチューブの中に入れ、十分に攪拌（Ｖｏｒｔｅｘ）処理を行った。また、同様に、＜未精製標識核酸の調製＞で調製した未精製標識試料核酸Ｃｙ３−Ｍａｌｅを２０μＬ、溶液Bを５８μＬ、１．７ｍＬマイクロチューブの中に入れ、十分に攪拌（Ｖｏｒｔｅｘ）処理を行った。
【０１３６】
＜核酸マイクロアレイの前処理＞
比較例１の＜核酸マイクロアレイの前処理＞と同様の方法で行った。
【０１３７】
＜ハイブリダイゼーション＞
比較例１の＜ハイブリダイゼーション＞と同様の方法でハイブリダイゼーションを行った。なお、試料としては、未精製標識試料核酸Ｃｙ３−Ｆｅｍａｌｅと未精製標識検証核酸Ｃｙ５−Ｃｏｔ１ ＤＮＡとの混合物、未精製標識試料核酸Ｃｙ３−Ｍａｌｅと未精製標識検証核酸Ｃｙ５−Ｃｏｔ１ ＤＮＡとの混合物の、それぞれ二種を用いた。
【０１３８】
＜核酸マイクロアレイの洗浄＞
比較例１の＜核酸マイクロアレイの洗浄＞と同様の方法で行った。
【０１３９】
＜データ取り込み＞
洗浄した二枚の核酸マイクロアレイは、ＧｅｎｅＰｉｘ ４０００Ｂ（Ａｘｏｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）を用いて、スキャニングを行った。
【０１４０】
＜データ処理＞
実施例１の＜データ処理＞と同様に行った。
【０１４１】
＜結果＞
図１０に本実施例のＬｏｇＲａｔｉｏのプロットを示した。ＬｏｇＲａｔｉｏ差は、０．６４４となり、図５の補正ありの結果（実施例１）、０．５４７と比較して数値が約０．１良くなり、核酸マイクロアレイとしてより性能が良いものとなった。これは、実施例１の場合には、未精製標識検証核酸をそのままハイブリダイゼーション溶液に添加、攪拌したのみであるが、本実施例の場合には、未精製標識検証核酸とハイブリダイゼーション溶液とを混合後、エタノール沈殿、すなわち精製を行っており、精製を行ったことによる効果と、このエタノール沈殿を行うことにより、ハイブリダイゼーション溶液の液量が、実施例１の場合と比較して２０μＬ少ない、すなわち、ハイブリダイゼーション溶液中の核酸濃度増加による効果が原因と考えている。また、分散も、０．１３４となり、図６の補正ありの結果０．１８９と比較して小さくなり、より核酸マイクロアレイとしての性能が良くなった。これも同様の原因が理由と考えている。
【０１４２】
［実施例５］ 標識検証核酸の使用量依存性
【０１４３】
＜未精製標識核酸の調製＞
比較例１と同様の方法で、Ｆｅｍａｌｅ由来の核酸、Ｍａｌｅ由来の核酸から、それぞれ未精製標識試料核酸を調製した。なお、標識化合物として、両方ともＣｙ３を使用した。
【０１４４】
＜未精製標識検証核酸の調製＞
Ｃｙ５を標識化合物とし、Ｃｏｔ−１ ＤＮＡを検証核酸として、実施例１と同様の方法で、未精製標識検証核酸Ｃｙ５−Ｃｏｔ−１ ＤＮＡを調製した。なお、Ｃｏｔ−１ ＤＮＡとして、３μｇのＣｏｔ−１ ＤＮＡを使用した。
【０１４５】
＜標識検証核酸を含む溶液の調製＞
実施例３の＜標識検証核酸を含む溶液の調製＞と同様の方法で行った。
【０１４６】
＜ハイブリダイゼーション溶液の調製＞
実施例３の＜ハイブリダイゼーション溶液の調製＞と同様の方法で行った。
【０１４７】
＜核酸マイクロアレイの前処理＞
比較例１の＜核酸マイクロアレイの前処理＞と同様の方法で行った。
【０１４８】
＜ハイブリダイゼーション＞
実施例３の＜ハイブリダイゼーション＞と同様の方法で行った。
【０１４９】
＜核酸マイクロアレイの洗浄＞
比較例１の＜核酸マイクロアレイの洗浄＞と同様の方法で行った。
【０１５０】
＜データ取り込み＞
洗浄した二枚の核酸マイクロアレイは、ＧｅｎｅＰｉｘ ４０００Ｂ（Ａｘｏｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）を用いて、スキャニングを行った。
【０１５１】
＜データ処理＞
実施例１の＜データ処理＞と同様に行った。
【０１５２】
＜結果＞
図１１に検証核酸を使用して、蛍光値の補正を行った場合のＬｏｇＲａｔｉｏのプロットを示した。図１0と比較して、常染色体がより0に収束している。ＬｏｇＲａｔｉｏ差は、０．６４１となり、０．７５μｇのＣｏｔ−１ ＤＮＡを出発とした未精製標識検証核酸を用いた場合の結果（実施例４）の０．６４４と比較してほぼ同等となった。
【０１５３】
［実施例６］ 異なるアレイフォーマット間の補正
本発明では、アレイ間で製造日、製造方法、製造ロット、プロットパターン、固定化プローブ核酸量などが異なっていても、同種のプローブ核酸を用いていれば、その補正を行うことが出来る。その一例として、アレイ上のプロットパターン、すなわち、アレイフォーマットが異なる場合の実施例を以下に示した。
＜アレイ１＞ アレイ１は、１６個の遺伝子を４つずつスポットした合計６４スポットのアレイである。比較例１などで用いたアレイと同じアレイである。
＜アレイ２＞ アレイ２は、５５０個の遺伝子を３つずつスポットし、二つのハイブリダイゼーション領域を持つ多検体アレイである。なお、アレイ２のハイブリダイゼーションは、ハイブリダイザーを用いてハイブリダイゼーションを行った。
【０１５４】
本実施例では、この２種類のアレイで共通する１０個のプローブ核酸間での検証核酸を用いた比較を行った。１０個のプローブは、20p11.22、20p12.3、20q11.21、21q22.3、22q12.2、Xp11.23、Xq12、Xq13.3、Xq24、Xq26.2である。
試料としてＦｅｍａｌｅ ＤＮＡとＭａｌｅ ＤＮＡとを用い、検証核酸として、Ｃｏｔ−１ ＤＮＡを用い、他の実施例と同様の方法で、試料の標識化、ハイブリダイゼーション、データの取り込みを行った。なお、アレイ２は、多検体アレイであるが、一つのハイブリダイゼーション領域からのデータのみを使用した。また、アレイ１は４つの同一プローブをスポットしているが、比較にはその中の３つを用いた。データは、３点の平均を用い、ＬｏｇＲａｔｉｏを図示することで評価を行った。
【０１５５】
図１２にアレイ１同士、すなわち一枚目のアレイにＣｙ３−Ｆｅｍａｌｅ ＤＮＡとＣｙ５−Ｃｏｔ−１ ＤＮＡを、二枚目のアレイにＣｙ３−Ｍａｌｅ ＤＮＡとＣｙ５−Ｃｏｔ−１ ＤＮＡとをハイブリダイゼーションさせ、本発明の方法によって補正した場合の結果である。図の様に、十分に常染色体部分とＸ染色体部分とが分かれている。
図１３にアレイ２同士、すなわち一枚目のアレイにＣｙ３−Ｆｅｍａｌｅ ＤＮＡとＣｙ５−Ｃｏｔ−１ ＤＮＡを、二枚目のアレイにＣｙ３−Ｍａｌｅ ＤＮＡとＣｙ５−Ｃｏｔ−１ ＤＮＡとをハイブリダイゼーションさせ、本発明の方法によって補正した場合の結果である。図の様に、ここでも、十分に常染色体部分とＸ染色体部分とが分かれている。
図１４にアレイ１とアレイ２とを用い、それらの間同士、すなわち一枚目のアレイにＣｙ３−Ｍａｌｅ ＤＮＡとＣｙ５−Ｃｏｔ−１ ＤＮＡを、二枚目のアレイにＣｙ３−Ｆｅｍａｌｅ ＤＮＡとＣｙ５−Ｃｏｔ−１ ＤＮＡとをハイブリダイゼーションさせ、補正を行わなかった場合の結果である。図の様に、常染色体部分とＸ染色体部分とが全く分かれていない。
図１５にアレイ１とアレイ２とを用い、それらの間同士、すなわち一枚目のアレイにＣｙ３−Ｍａｌｅ ＤＮＡとＣｙ５−Ｃｏｔ−１ ＤＮＡを、二枚目のアレイにＣｙ３−Ｆｅｍａｌｅ ＤＮＡとＣｙ５−Ｃｏｔ−１ ＤＮＡとをハイブリダイゼーションさせ、本発明の方法によって補正した場合の結果である。図の様に、十分に常染色体部分とＸ染色体部分とが分かれている。図１4比較すると、本発明による検証核酸を使用することは、非常に有効な方法であり、たとえ、アレイフォーマットが異なっていたとしても十分に補正を行うことが出来ることを示しているものである。更に、アレイ１は、カバーガラスによる手動での静置ハイブリダイゼーション、アレイ２は、ハイブリダイザーによる攪拌型ハイブリダイゼーションと異なるハイブリダイゼーション条件で行っており、これらの結果は、ハイブリダイゼーション条件が異なっていても、本発明の方法を用いることによって、十分に補正を行うことが出来ることを示しているものである。
【０１５６】
［実施例７］ デジタルデータを提供する形式での核酸マイクロアレイ
［実施例１］と同様の方法で、＜未精製標識核酸の調製＞、＜未精製標識検証核酸の調製＞、＜Ｃｏｔ−１ ＤＮＡを含む溶液の調製＞、＜ハイブリダイゼーション溶液の調製＞、＜核酸マイクロアレイの前処理＞、＜ハイブリダイゼーション＞、＜核酸マイクロアレイの洗浄＞を行った。なお、試料は、デジタルデータ供給用のデータとして、正常細胞由来の核酸を想定したＣｙ３−Ｆｅｍａｌｅ ＤＮＡと標識検証核酸Ｃｙ５−Ｃｏｔ−１ ＤＮＡとを使用し、核酸マイクロアレイ上でこれらの核酸をハイブリダイゼーションし、そこから得られたデータをデジタルデータ供給用のデータとした。このデジタルデータを計算した日と別の日に、異常細胞由来の核酸を想定したＣｙ３−Ｍａｌｅ ＤＮＡと標識検証核酸Ｃｙ５−Ｃｏｔ−１ ＤＮＡ（前記の標識検証核酸Ｃｙ５−Ｃｏｔ−１ ＤＮＡと全く同じものを使用）とを核酸マイクロアレイ（前記の核酸マイクロアレイと同じプローブ、同じプローブ配置をもつもの）上でハイブリダイゼーションし、このデータと前記のデータを用いて、標識検証核酸同士によるＣｙ３−Ｍａｌｅ ＤＮＡの標識量値の補正を［実施例１］の＜データ処理＞に従って補正した。
＜結果＞
結果は図１６に示した。常染色体部分のデータが0点に収束し、Ｘ染色体部分との分離も十分に見られた。
【０１５７】
［実施例８］ 検証核酸としてベクター由来の核酸を用いた場合の核酸マイクロアレイ実験および解析
【０１５８】
＜未精製標識核酸の調製＞
比較例１と同様の方法で、Ｆｅｍａｌｅ由来の核酸、Ｍａｌｅ由来の核酸から、それぞれ未精製標識試料核酸を調製した。なお、Ｆｅｍａｌｅ、ＭａｌｅともにＣｙ３で標識した。
【０１５９】
＜未精製標識検証核酸の調製＞
本実施例では、ベクター由来の核酸を検証核酸として用いた。
＜検証核酸の調整＞
ＲＰＣＩ−１１ ｖｅｃｔｏｒより１クローンを選択し、ＬＢ培地に１００ｍｇ／ｍＬになるようにクロラムフェニコールを添加し、ＢＥ−４３ＦＬ（タイテック社製培養器）を用いて、３７℃で１晩培養した。これをＱＩＡｇｅｎ社のＱＩＡａｍｐ ｍｉｎｉｐｒｅｐ ｋｉｔを用いてＢＡＣを抽出した。抽出したＢＡＣをニッポンジーン社の制限酵素ＮｏｔIを用いて消化し、アガロース電気泳動に供した。７ｋｂ附近の断片を切り出し、ＭＮ社のＮｕｃｌｅｏｓｐｉｎカラムを用いてアガロース中から精製した。これをインビトロジェン社 Ｔ４ ＤＮＡ ｌｉｇａｓｅを用いて、４℃で１晩ｌｉｇａｒｉｏｎを実施し、ｐＢＡＣ１０８Ｌを取得した。
ｐＢＡＣ１０８Ｌをインビトロジェン社 ＤＨ−１０Ｂケミカルコンピテントセルに加え、氷上で３０分静置後、４２℃で３０秒加温し、再度氷上に２分静置した。これにＳＯＣ培地６００μＬ添加し、１００ｍｇ／ｍＬクロラムフェニコール入り、ＬＢ寒天培地にスプレッターを用いて塗布した。３７℃で２晩静置後、生育してきたコロニーをピックアップし、１００ｍｇ／ｍＬクロラムフェニコール入りＬＢ培地に植菌した。これを３７℃で１晩培養後、ＱＩＡｇｅｎ社のＱＩＡｐｒｅｐ ｓｐｉｎ ｍｉｎｉｐｒｅｐ ｋｉｔをいてＢＡＣ ＤＮＡを抽出し、ＢＡＣ ｖｅｃｔｏｒを取得した。これをＣｙ５を使用して標識し、ベクター由来の標識検証核酸を取得した。
【０１６０】
＜溶液Ａの調製＞
比較例１と同様の方法で、溶液Ａの調製を行った。
【０１６１】
＜ハイブリダイゼーション溶液の調製＞
実施例１と同様の方法で調製した未精製標識試料核酸Ｃｙ３−Ｆｅｍａｌｅを２０μＬ、実施例１と同様の方法で調製した未精製標識検証核酸Ｃｙ３−Ｆｅｍａｌｅ ＤＮＡを２０μＬ、溶液Aを３８μＬ、１．７ｍＬマイクロチューブの中に入れ、十分に攪拌（Ｖｏｒｔｅｘ）処理を行った。また、同様に、＜未精製標識核酸の調製＞で調製した未精製標識試料核酸Ｃｙ３−Ｍａｌｅを２０μＬ、＜検証核酸の調整＞で調製したベクター由来の標識検証核酸を２０μＬ、溶液Aを３８μＬ、１．７ｍＬマイクロチューブの中に入れ、十分に攪拌（Ｖｏｒｔｅｘ）処理を行った。
【０１６２】
＜核酸マイクロアレイの前処理＞
比較例１の＜核酸マイクロアレイの前処理＞と同様の方法で行った。
【０１６３】
＜ハイブリダイゼーション＞
比較例１の＜ハイブリダイゼーション＞と同様の方法でハイブリダイゼーションを行った。但し、ハイブリダイゼーション装置としてアロカ社製 HS-300を用いた。また、試料としては、未精製標識試料核酸Ｃｙ３−Ｆｅｍａｌｅと上記ベクター由来の標識検証核酸との混合物、未精製標識試料核酸Ｃｙ３−Ｍａｌｅとベクター由来の標識検証核酸との混合物の、それぞれ二種を用いた。
【０１６４】
＜核酸マイクロアレイの洗浄＞
比較例１の＜核酸マイクロアレイの洗浄＞と同様の方法で行った。
【０１６５】
＜データ取り込み＞
洗浄した二枚のマイクロアレイは、ＧｅｎｅＰｉｘ ４０００Ｂ（Ａｘｏｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）を用いて、スキャニングを行った。
【０１６６】
＜データ処理＞
未精製標識試料核酸Ｃｙ３−Ｆｅｍａｌｅ由来の蛍光値をＦＦ、未精製標識試料核酸Ｃｙ３−Ｆｅｍａｌｅと同時にハイブリダイゼーションさせたベクター由来の標識検証核酸の蛍光値をＦｃ１、未精製標識試料核酸Ｃｙ３−Ｍａｌｅ由来の蛍光値をＦＭ、未精製標識試料核酸Ｃｙ３−Ｍａｌｅと同時にハイブリダイゼーションさせたベクター由来の標識検証核酸の蛍光値をＦｃ２とし、ｌｏｇ２（ＦＭ／Ｆｃ２／ＦＦ×Ｆｃ１）で計算し、プローブの染色体ごとに並べた。また、同じプローブの値については平均化しグラフ化した。
結果を図１７に示す。ｌｏｇ２（ＦＭ／Ｆｃ２／ＦＦ×Ｆｃ１）の数値が常染色体はほぼ±０．２５内に収まり、Ｘ染色体についてはほぼ０．６以上の差となり、高い感度で検出が出来た。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、核酸マイクロアレイを用いた解析において、測定値の信頼性を増す方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
染色体を対象にしてゲノムDNAの過剰、欠失、増幅などのコピー数異常を検出する方法として、ゲノムＣＧＨ法があり、Joe Gray, Dan Pinkel, O-P Kallioniemiらによって開発された。一般に５〜１０Ｍｂ以上にわたる大きな領域で染色体異常でないと検出することが出来ない、解析には習熟を要するなど種々の問題点があった（非特許文献１）。
染色体解析が解析可能な解像度より高く、数１０ｋｂ〜数Ｍｂレベルで起きたゲノム構造異常を検出できるツールとして、アレイＣＧＨ法がある(非特許文献２、３)。アレイＣＧＨ法は、ゲノムＤＮＡの断片、例えば、ＢＡＣ(Bacterial Artificial Chromosomes)クローンやＹＡＣ(Yeast Artificial Chromosomes)クローン、ＰＡＣ(P1-derived Artificial Chromosomes)やこれらBAC、YAC、PAC等を基に作成したDNAやオリゴヌクレオチドを基板上にスポットし、固体基板上に配置したアレイを使用する。さらに患者等から採取した検体試料となる異常細胞および、健常人から採取した標準試料となる正常細胞から、標的となるＤＮＡを抽出し、それぞれ異なった標識体(蛍光物質等)で標識し、核酸マイクロアレイ上のプローブと同時に接触させ、ハイブリダイゼーションを介して相互作用させ、相互作用した標的核酸が発する蛍光シグナルをスキャナーなどにより読み取り、正常細胞及び異常細胞由来の標的核酸の信号の強度比を比較することで、遺伝子の相対コピー数を検出する方法である。
【０００３】
核酸マイクロアレイを用いる解析において、検体と標準に対してそれぞれ異なる標識化合物で標識し核酸マイクロアレイに対して同時にハイブリダイゼーションする場合、マイクロアレイのロット間で生じるスポット差（スポット量等）等やハイブリダイゼーションの違いが原因となるデータの差は生じにくい。しかし、標識が異なるため、標識効率の違いや、個々の標識に対する検出系の差などが結果に影響を与えやすく、また一つの検体に対し、常に標準を準備しなければいけないという煩雑さが伴う。標識の差を排除するためには、標準と検体に対し、同一の標識化合物で標識し、複数の核酸マイクロアレイに対して別々にハイブリダイゼーションさせ、それらの間で評価を行う方法を取れば問題とならない。しかしながら、この方法においては、別々の標識を実施した際に、同時にハイブリダイゼーションすることで克服されているスポット差によるデータ変動が再度生じてしまうという問題が発生する。これら問題を解決する方法として、マイクロアレイ上に、補正用内部標準用にスポットを新たに搭載し、アレイ間の差を補正する方法もあるが、個別のスポット間の差異については、補正することができない(例えば特許文献１)。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】特開2004-028695号公報
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】稲澤譲治, 水口真希, 臨床検査, 49, 497-502 (2005).
【非特許文献２】D. Pinkel et. al., Nat. Genet., 20, 207-211 (1998)
【非特許文献３】井本逸勢, 稲澤譲治, 細胞工学, 23, 355-361 (2004).
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明が解決しようとする課題は、核酸マイクロアレイを用いた測定方法を実施する際に、二種類以上標識を用いて検体と標準に標識をする方法における標識間の差がデータに反映してしまう問題および一種類の標識を用いて検体と標準に標識する場合、個々のスポット差がデータに反映してしまう問題を同時に改善する方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
核酸マイクロアレイ測定において、一つの標識を用いて実施する場合のデータ精度向上のひとつの手段として、GeneChipのようにオリゴヌクレオチドプローブをアレイ上で合成し、アレイ間の差をできるだけ低く抑え、また、プローブのいわゆるTm値を同等になるように配列設計して、ハイブリダイゼーションのアレイ関の差を低く抑え、加えて補正スポットを設けることで標識工程上の差も抑制する戦略がとられているが、補正の方法は煩雑であり、特に1スポットに対し複数種の配列を持つ核酸マイクロアレイにおいては、このような戦略で比較することは非常に難しい (例えば特許文献１) 。
【０００８】
そこで、本発明では、アレイ内の全スポットおよび、異なるアレイ間の同様のスポットで実質的に同一の結合能を持つ核酸、すなわち、全てのスポットにおいて、少なくともプローブ核酸の一部にハイブリダイズしうる配列を有する検証核酸を、検体および標準と共存させ、それぞれハイブリダイゼーションを実施し、検証核酸の結合量を検出することで、アレイ基板上に結合しているプローブ核酸のスポット差を検知できることを見出した。さらに、結合量を指標に、スポット差を補正することが可能となり、本発明を完成するに至った。
【０００９】
例えば、一枚目のアレイに対して、標準をＣｙ３で標識したものと、Ｃｙ５で標識した検証核酸を共存させ、ハイブリダイゼーションさせる。一方二枚目のアレイに対して、検体をＣｙ３で標識したものとＣｙ５で標識した検証核酸との混合物をアレイ上のプローブ核酸とハイブリダイゼーションさせる。標準と検体を比較し、差を見る場合に、検証核酸を用いて補正を実施することで、スポット差を消失させる事が可能である。
ここで、Ｃｙ５で標識した検証核酸は同等の配列を持つ核酸であることが望ましく、調製が同じものであることが望ましい。また、スポット差を補正する方法としては、どのような計算方法を用いても論理的に補正できるのであれば、どのような計算方法でもかまわない。望ましくは、標準・検体の蛍光値を検証核酸の標識から得られる蛍光値を用いて比を取り、標準・検体を比較する。
標識検証核酸と標準・検体を同一の溶液に添加し、その溶液量をエタノール沈殿法などによって濃縮することが好ましく、実施できない場合にもできるだけ、核酸濃度を濃縮することが望ましい。
すなわち、本発明は、以下の構成よりなるものである。.
【００１０】
１．
核酸マイクロアレイを用いた解析方法であって、
該核酸マイクロアレイが第１のプローブ核酸が固定化されているスポット（Ｘ１）を有し、
検体の標識試料核酸（Ａ１）を、スポット（Ｘ１）に固定化された該プローブ核酸とハイブリダイゼーションさせる工程、
全てのスポットにおいて、少なくともプローブ核酸の一部にハイブリダイズしうる配列を有し、前記標識試料核酸とは異なる標識で標識されている標識検証核酸（Ｂ）を、スポット（Ｘ１）に付与し、少なくとも前記第１のプローブ核酸とハイブリダイズさせる工程、
スポット（Ｘ１）にハイブリダイズした該標識試料核酸の標識量値（Ｆ１）を測定する工程、及び、
スポット（Ｘ１）上にハイブリダイズした該標識検証核酸（Ｂ）の標識量値（Ｆｃ１）を測定する工程を含むことを特徴とする、解析方法。
２．
該標識試料核酸をハイブリダイゼーションさせる工程と、前記標識検証核酸（Ｂ）をハイブリダイゼーションさせる工程とが同時に行われ、かつ、
該ハイブリダイズした該標識試料核酸の量を測定する工程と、前記ハイブリダイズした検証核酸の量を測定する工程とが同時に行われることを特徴とする、１に記載の解析方法。
３．
前記（Ｆｃ１）に基づき、スポット（Ｘ１）における固定されたプローブ核酸の量を検知し、該検量値により前記（Ｆ１）を補正することを特徴とする、１または２に記載の解析方法。
４．
スポット（Ｘ１）と同じ核酸マイクロアレイ上または異なるアレイ上に存在する、スポット（Ｘ１）に固定化された前記第１のプローブと実質的に同一の配列を有する第ｎのプローブ核酸が固定化されたスポット（Ｘｎ）において、
前記標識試料核酸と同一または異なる標識試料核酸（Ａｎ）を、スポット（Ｘｎ）に固定化された該第ｎのプローブ核酸とハイブリダイゼーションさせる工程、
前記標識検証核酸（Ｂ）を、スポット（Ｘｎ）に付与し、ハイブリダイズさせる工程、
スポット（Ｘｎ）にハイブリダイズした該標識試料核酸の標識量値（Ｆｎ）を測定する工程、及び、
スポット（Ｘｎ）上にハイブリダイズした該標識検証核酸（Ｂ）の標識量値（Ｆｃｎ）を測定する工程、
を含むことを特徴とする、１〜３のいずれかに記載の解析方法。
５．
標識量値（Ｆｃ１）と（Ｆｃｎ）とを対比することでスポット（Ｘ１）とスポット（Ｘｎ）とにおける標識量値の係数を算出する工程を含むことを特徴とする、４に記載の解析方法。
６．
標識試料核酸（Ａ１）と標識試料核酸（Ａｎ）とが異なる試料から得られた核酸を標識したものであることを特徴とする４または５に記載の解析方法。
７．
前記標識検証核酸（Ｂ）をハイブリダイゼーションさせる工程において、更に、標識化合物を結合する前の標識検証核酸（Ｂ）と同一種の未標識核酸が添加されていることを特徴とする１〜６のいずれかの解析方法。
８．
スポット（Ｘｎ）における標識試料核酸（Ａｎ）がハイブリダイズした量に相当する補正標識量値を、下記式（１）を用いて算出することを特徴とする、４〜７のいずれかの解析方法。
式（１） 標識試料核酸（Ａｎ）の補正標識量値＝前記（Ｆｃ１）÷前記（Ｆｃｎ）×第ｎの標識試料核酸（Ａｎ）の標識量値 （ｎは２以上の整数）
９．
標識試料核酸（Ａ１）と標識検証核酸（Ｂ）における標識の少なくとも一方が蛍光によるものであることを特徴とする、１〜８のいずれかの解析方法。
１０．
核酸マイクロアレイとして、ＢＡＣ−ＤＮＡマイクロアレイを使用することを特徴とする、１〜９のいずれかの解析方法。
１１．
複数の同種のスポット（Ｘｎ）が異なる核酸マイクロアレイに存在し、それぞれの核酸マイクロアレイ間のプローブ核酸の配置、プローブ核酸のスポット量が、それぞれの核酸マイクロアレイで異なっていることを特徴とする、１〜１０のいずれかの解析方法。
１２．
標識検証核酸（Ｂ）として、検体の核酸とは異なり、第１及び第ｎのプローブ核酸上の配列を持つ核酸を用いる１〜１１のいずれかの解析方法。
１３．
標識検証核酸（Ｂ）として、反復配列を含む核酸を使用することを特徴とする、１〜１２のいずれかの解析方法。
１４．
標識検証核酸（Ｂ）として、Ｃｏｔ−１ ＤＮＡを使用することを特徴とする、１〜１３のいずれかの解析方法。
１５．
標識検証核酸（Ｂ）として、ベクター由来の核酸を使用することを特徴とする、１〜１２のいずれかの解析方法。
１６．
標識量値（Ｆ１）および（Ｆｃ１）のうち、標識量値（Ｆｃ１）がデジタルデータにより供給されることを特徴とする、１〜１５のいずれかの解析方法。
１７．
５〜１６のいずれかに記載の解析方法における、標識試料核酸（Ａｎ）（ｎは２以上の整数）の標識量値（Ｆｎ）を、標識検証核酸（Ｂ）の標識量値（Ｆｃ１）及び標識量値（Ｆｃｎ）を用いて補正するデータ処理をコンピュータに実行するためのプログラム。
１８．
１７に記載のプログラムを記録したコンピュータ読み取り可能な記録媒体。
１９．
１〜１８の解析方法を用いて、検体間の遺伝子発現量もしくは検体間の遺伝子コピー数を計算する方法。
２０．
プローブ核酸が固定化されているスポットを複数有する核酸マイクロアレイ、及び、該核酸マイクロアレイ上の全てのスポットにおいて少なくとも各プローブ核酸の一部にハイブリダイズしうる配列を有する検証核酸、を含む請求項１〜１９のいずれかの解析方法用のキット。
【発明の効果】
【００１１】
標識を標準と検体とを同じにすることで、標識が異なることによる差を無くすことは可能であるが、更に標識検証核酸（Ｂ）を用いた補正法を用いることによって、核酸マイクロアレイ間でのスポット差を無くすことができ、高精度な核酸マイクロアレイ測定が可能となった。さらに、本発明の補正法を用いることで、実質的に同一のプローブを用いていれば、スポットが異なっていても正しく補正することが出来る。例えば、プローブ核酸のスポット量やそのスポットの配置や個数が異なっていても、更には、ハイブリダイゼーション後のわずかなハイブリ条件における違いについても補正することが可能となる。
補正を実施する際に用いている標識検証核酸（Ｂ）については、標識工程においてある望ましい濃度がより多くすることでより良い結果が得られることも見出した。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】本発明の原理の模式図。模式図では、簡素化のために、検体由来の標識試料核酸の種類が二種類のみの場合について示した。また、スポット数は、核酸マイクロアレイあたり１６個と単純化して示した。Ａ１〜Ａ４およびａ１〜ａ４は実質的に同一のプローブ核酸を示す。以下、Ｂ１〜Ｂ４およびｂ１〜ｂ４の組、Ｃ１〜Ｃ４およびｃ１〜ｃ４の組、Ｄ１〜Ｄ４およびｄ１〜ｄ４の組は、それぞれ同一のプローブ核酸を示す。
【図２】検体として、Ｆｅｍａｌｅ ＤＮＡ、標準としてＭａｌｅ ＤＮＡとを用い、標識検証核酸を用いない場合の核酸マイクロアレイを実施し、比較を行った結果。
【図３】検体として、Ｆｅｍａｌｅ ＤＮＡ、標準としてＭａｌｅ ＤＮＡとを用い、標識検証核酸を用いて、その標識量値を補正した場合の核酸マイクロアレイを実施し、比較を行った結果。
【図４】検体として、Ｆｅｍａｌｅ ＤＮＡ、標準としてＭａｌｅ ＤＮＡとを用い、標識検証核酸を使用し補正を行った場合と、標識検証核酸を使用せずに補正を行わなかった場合との、ＬｏｇＲａｔｉｏ差。
【図５】検体として、Ｆｅｍａｌｅ ＤＮＡ、標準としてＭａｌｅ ＤＮＡとを用い、標識検証核酸を使用し補正を行った場合と、標識検証核酸を使用せずに補正を行わなかった場合との、分散。
【図６】試料として、未精製標識試料核酸Ｃｙ５−Ｆｅｍａｌｅと未精製標識試料核酸Ｃｙ５−Ｍａｌｅとを用い、標識検証核酸として、Ｃｙ３−Ｆｅｍａｌｅを用いて補正した場合の結果。
【図７】蛍光値に偏りが生じてしまった場合の例。（ａ）Ｃｙ３−ＦｅｍａｌｅとＣｙ５−Ｃｏｔ−１ 核酸マイクロアレイ実験後のイメージ図（ｂ）Ｃｙ３−ＭａｌｅとＣｙ５−Ｃｏｔ−１ 核酸マイクロアレイ実験後のイメージ図。
【図８】図７の検体Ｆｅｍａｌｅ、標準Ｍａｌｅとの蛍光値を利用して算出したＬｏｇＲａｔｉｏを染色体順にプロットしたもの。
【図９】図８の結果に対して、補正を行ったもの。
【図１０】検体としてＦｅｍａｌｅ、標準としてＭａｌｅとをそれぞれ試料として場合の結果。
【図１１】図１０よりもより多くのＣｏｔ−１ ＤＮＡ（８倍量）を原料として用い、それを標識することによって得た結果。
【図１２】アレイ１同士で補正を行った結果。
【図１３】アレイ２同士で補正を行った結果。
【図１４】アレイフォーマットが異なっており、補正を行わなかった場合の結果。
【図１５】アレイフォーマットが異なっており、補正を行った場合の結果。
【図１６】標識量値をデジタルデータとして供給した場合の結果。
【図１７】検証核酸としてベクター由来の核酸を用いた場合の結果。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
本発明は、核酸マイクロアレイを用いて核酸を解析する方法であって、
該核酸マイクロアレイが配列（ａ）と相補的なプローブ配列（ａ’）を含む第１のプローブ核酸が固定化されているスポット（Ｘ１）を有し、
検体の標識試料核酸（Ａ１）を、スポット（Ｘ１）に少なくとも固定化された該第１のプローブ核酸とハイブリダイゼーションさせる工程、
全てのスポットにおいて、少なくとも該第１のプローブ核酸の一部にハイブリダイズしうる配列を有し、前記標識試料核酸とは異なる標識で標識されている標識検証核酸（Ｂ）を、スポット（Ｘ１）に付与し、ハイブリダイズさせる工程、
スポット（Ｘ１）にハイブリダイズした該標識試料核酸の標識量値（Ｆ１）を測定する工程、及び、
スポット（Ｘ１）上にハイブリダイズした該標識検証核酸（Ｂ）の標識量値（Ｆｃ１）を測定する工程を含むことを特徴とする、解析方法に関する。
【００１４】
上記解析方法は、好ましくは検体（Ａ）においての配列（ａ）を持つ核酸を核酸マイクロアレイを用いて調べる核酸解析方法であって、
該核酸マイクロアレイが（ａ）と相補的な配列（ａ’）を少なくとも一種類以上含む該第１のプローブ核酸が固定化されているスポット（Ｘ１）を有し、
（Ａ）を標識した試料核酸（Ａ１）と全てのスポットにおいて、少なくとも該第１のプローブ核酸の一部にハイブリダイズしうる配列を有する検証核酸（Ｂ）を（Ａ）とは別の標識で標識した核酸（Ｂ１）を共存させ、スポット（Ｘ１）に固定化された該第１のプローブ核酸とハイブリダイゼーションさせる工程、
更に、標準（Ｃ）を（Ａ）と同様の標識で標識した核酸（Ｃ1）と（Ｂ1）を共存させ、（Ｘ１）と同等の配列を持つスポット(Ｘ1‘)に固定化された該プローブ核酸とハイブリダイゼーションさせる工程、
スポット（Ｘ１）にハイブリダイズした該標識試料核酸の標識量値（Ｆa１）を測定する工程、及び、
スポット（Ｘ１）上にハイブリダイズした該標識検証核酸（Ｂ）の標識量値（Ｆb１）を測定する工程、
スポット（Ｘ１’）にハイブリダイズした該配列（ｃ）を含む核酸の標識量値（Ｆc１）を測定する工程、及び、
スポット（Ｘ１’）上にハイブリダイズした該標識検証核酸（Ｂ）の標識量値（Ｆｂ1’）を測定する工程、
を含むことを特徴とする、核酸解析方法である。
【００１５】
任意のスポット（Ｘ１）における標識量値（Ｆａ１）のみで検出目的とする配列（ａ）の量と（Ｘ１‘）における標識量値（Ｆｃ１）とを比較し、測定を行うのに対して、標識検証核酸（Ｂ）の標識量値（Ｆｂ１、Ｆｂ１’）を補正するために用いれば、当該スポットにおける誤差、例えばプローブ核酸がスポットに固定されている量に起因する誤差を検知することが可能となる。
この標識検証核酸（Ｂ）の標識量値を用いれば、例えば（Ｆｃ１）の設計値との対比から当該スポットの異常を判定することができるし、複数のスポットにおいて標識検証核酸（Ｂ）の標識量値を検証することで、スポット間における誤差を検知することもでき、また、誤差を補正することも可能となる。
【００１６】
本発明は、好ましくは複数配列のプローブ核酸を１箇所スポットした核酸マイクロアレイを用いることができる。
本発明においては、更に好ましくは核酸を含むハイブリダイゼーション溶液として、検体の試料核酸（Ａ）と、全てのスポットにおいて、少なくともプローブ核酸の一部にハイブリダイズしうる配列を有する標識検証核酸（Ｂ）と、を含有する溶液を1つのアレイに用い、次に標準の核酸（Ｃ）と標識検証核酸（Ｂ）を別のアレイに用い、アレイ実験を実施し、検出した標識検証核酸（Ｂ）の標識量値を用いて、（Ａ）の標識量値および（Ｃ）の標識量値を補正し、（Ａ）の標識量値と（Ｃ）の標識量値とを比較することで、（Ａ）の量を確定することができる。ここで、別のアレイは、同種のアレイ、即ち同種のプローブがスポットされているアレイを指す。
【００１７】
ここで、比較や補正を行う対象となるスポットは、特に限定されないが、同種のスポット（同じプローブをスポットしたスポット、即ち、固定化されているプローブ核酸の目的とする配列（ａ’）が同じスポット同士）であることが好ましい。
【００１８】
本発明によって、例えばプローブ核酸の量の違いに起因する標識量値の変化やハイブリダイゼーションにおける差を補正することもできる。なお、本発明で標識量値の用語を用いる際には、標識した核酸とプローブ核酸とのハイブリダイゼーションによって生じた複合体、例えば、二重鎖核酸などの標識化合物から得られた標識量を含むものとする。
【００１９】
マイクロアレイ上のスポットに核酸を標識化した標識試料核酸（Ａ）や標識化した標識検証核酸（Ｂ）を含むハイブリダイゼーション溶液を塗布することで、標識試料核酸（Ａ）や標識検証核酸（Ｂ）をハイブリダイゼーションさせ、標識試料核酸（Ａ）や標識検証核酸（Ｂ）の標識量を検出する工程は、より詳しくは以下の工程（ａ）〜（ｅ）を含むことが好ましい。
（ａ）試料核酸を標識化合物で標識することにより、標識試料核酸（Ａ）を得る工程。
（ｂ）全てのスポットにおいて、少なくともプローブ核酸の一部にハイブリダイズしうる配列を含む検証核酸を工程（ａ）とは異なる標識化合物で標識することにより、標識検証核酸（Ｂ）を得る工程。
（ｃ）工程（ａ）で得られた標識試料核酸（Ａ）、工程（ｂ）で得られた標識検証核酸（Ｂ）、を含むハイブリダイゼーション溶液を調製する工程。
（ｄ）工程（ｃ）で得られたハイブリダイゼーション溶液を、核酸マイクロアレイ上に塗布し、ハイブリダイゼーション溶液中の標識試料核酸（Ａ）および標識検証核酸（Ｂ）とプローブ核酸とをハイブリダイゼーションさせる工程。
（ｅ）工程（ｄ）で得られた核酸マイクロアレイから標識試料核酸（Ａ）と標識検証核酸（Ｂ）のプローブ核酸へのハイブリダイゼーション量をそれぞれ読み取り、標識量値を得る工程。
ここで、工程（ｄ）と工程（ｅ）の間で、ハイブリダイズしたアレイを洗浄液で洗浄する工程をさらに含むことが好ましい。
また、工程（ｃ）において、標識試料核酸（Ａ）、標識検証核酸（Ｂ）を添加する際、同時でも別々に添加してもよい。
また、更に下記工程を含むこともできる。
（ａ”）標識した標準の核酸（Ｃ）を得る工程、
（ｃ”）標識した標準の核酸（Ｃ）と上記（ｂ）工程で得られた標識検証核酸（Ｂ）とを含むハイブリダイゼーション溶液を調製する工程、
（ｄ”）前記（ｄ）工程とは異なる同種のアレイに対してハイブリダイズさせる工程、
（ｅ”）前記（ｄ”）でハイブリダイズした標準の核酸（Ｃ）と標識検証核酸（Ｂ）それぞれの標識量値を得て、検出した標識検証核酸（Ｂ）の標識量値を用いて、（（Ａ）の標識量値および）（Ｃ）の標識量値を補正し、（Ａ）の標識量値と（Ｃ）の標識量値とを比較することで、（Ａ）の量を確定する工程。
【００２０】
ハイブリダイズは、市販のハイブリダイゼーションを行う機器や、温度制御だけのみを行うことができる機器を用いて行うことができる。ハイブリダイゼーションにおける温度は、30℃〜50℃の範囲で行うことが好ましく、35℃〜45℃の範囲で行うことがさらに好ましい。
また、ハイブリダイゼーションの時間は、16〜100時間とすることが好ましく、
24〜80時間以上とすることがより好ましく、40〜72時間とすることがさらに好ましい。
ハイブリダイズ後、適宜洗浄等を行う。洗浄の条件は、回数を増やすほど、洗浄効果が高く、また、洗浄液には、2×SSCや2×SSC/50%ホルムアミド、2×SSC/0.1%SDS、1×SSCなど、イオン強度を調整したものや、解離剤、界面活性剤など、一般的にサザンブロッドやコロニブロッド、ノーザンブロッドなど、ハイブリダイゼーション実験を実施する際に用いられる洗浄液を用いることが可能である。温度としては、15℃〜70℃が好ましく、25℃〜50℃の範囲に設定することがより好ましく、ハイブリ条件と同等の溶液量とする必要がある。
【００２１】
好ましくは、以下の工程（１）または（１’）と、および（２）を含む核酸マイクロアレイ間もしくはハイブリダイゼーション領域間で同一プローブ核酸をスポットしたスポット間の標識量値を補正する方法である。
【００２２】
（１）以下の工程（ａ１）〜（ｆ１）を行うことで、標識試料核酸（Ａ）及び標識検証核酸（Ｂ）がスポット上のプローブ核酸に対してハイブリダイゼーションした核酸マイクロアレイを得る工程。
（ａ１）試料核酸を標識化合物で標識することにより、標識試料核酸（Ａ）を得る工程。
（ｂ１）全てのスポットにおいて、少なくともプローブ核酸の一部にハイブリダイズしうる配列を含む検証核酸を工程（ａ）とは異なる標識化合物で標識することにより、標識検証核酸（Ｂ）を得る工程（検証核酸は、試料核酸と相補的であってもかまわない。）。
（ｃ１）工程（ａ１）で得られた標識試料核酸（Ａ）及び工程（ｂ）で得られた標識検証核酸（Ｂ）を含むハイブリダイゼーション溶液を調製する工程。
（ｄ１）工程（ｃ１）で得られた溶液を核酸マイクロアレイ上に塗布し、ハイブリダイゼーションを行う工程。
（ｅ１）工程（ｄ１）によって得られた核酸マイクロアレイを洗浄液によって洗浄する工程。
（ｆ１）工程（ｅ１）によって得られた核酸マイクロアレイから標識試料核酸（Ａ）と標識検証核酸（Ｂ）のプローブ核酸へのハイブリダイゼーション量をそれぞれ読み取り、標識量値を得る工程。
【００２３】
（１’）以下の工程（ａ１’）〜（ｇ１’）を行うことで、標識試料核酸（Ａ）及び標識検証核酸（Ｂ）が核酸マイクロアレイ上のプローブ核酸に対してハイブリダイゼーションした核酸マイクロアレイを得る工程。
（ａ１’）核酸を標識化合物で標識することにより、標識試料核酸（Ａ）を得る工程。
（ｂ１’） 全てのスポットにおいて、少なくともプローブ核酸の一部にハイブリダイズしうる配列を含む検証核酸を工程（ａ）とは異なる標識化合物で標識することにより、標識検証核酸（Ｂ）を得る工程（検証核酸は、核酸と相補的であってもかまわない）。
（ｃ１’）工程（ｂ１’）で得られた標識検証核酸（Ｂ）を含むハイブリダイゼーション溶液を調製する工程。
（ｄ１’）工程（ａ１’）で得られた標識試料核酸（Ａ）、工程（ｃ１’）で得られた標識検証核酸（Ｂ）を含むハイブリダイゼーション溶液とを混合し、標識試料核酸（Ａ）及び標識検証核酸（Ｂ）を含むハイブリダイゼーション溶液を調製する工程。
（ｅ１’）工程（ｄ１’）で得られた溶液を核酸マイクロアレイ上に塗布し、ハイブリダイゼーションを行う工程。
（ｆ１’）工程（ｅ１’）によって得られた核酸マイクロアレイを洗浄液によって洗浄する工程。
（ｇ１’）工程（ｆ１’）によって得られた核酸マイクロアレイから標識試料核酸（Ａ）と標識検証核酸（Ｂ）のプローブ核酸へのハイブリダイゼーション量をそれぞれ読み取り、標識量値を得る工程。
【００２４】
（２）少なくとも二種の検体から得た核酸に対して、それぞれ工程（１）もしくは（１’）を行い、使用した検体の種類に相当する個数の核酸マイクロアレイもしくは使用した検体の種類に相当する個数のハイブリダイゼーション領域を得、使用した検体由来の標識試料核酸（Ａ）の標識量値の中から少なくとも一種に対して標識検証核酸（Ｂ）の標識量値を用いることによって補正し、検体間の遺伝子発現量もしくは検体の遺伝子コピー数を計算する方法。
ここで、検体の少なくとも１つが既知量である上記標準（Ｃ）であることが好ましい。これにより、他の検体がより正確に測定できる。
【００２５】
本発明の標識量値の補正方法は、より具体的には、第一のスポットに対して標識試料核酸（Ａ１）と標識検証核酸（Ｂ）とを同時にハイブリダイゼーションさせることでそれぞれの標識量値を得、前記スポットとは同一のプローブ核酸をスポットしているが、前記スポットとは異なる第ｎのスポットに対して、前記標識試料核酸（Ａ１）とは異なり、かつ前記標識試料核酸（Ａ１）と標識量値を比較することを目的として調製した標識試料核酸（Ａｎ；ｎは２以上の整数値）と前記標識検証核酸（Ｂ）とを同時にハイブリダイゼーションさせることで標識量値を得、第一のスポットおよび第ｎのスポットに対してハイブリダイゼーションさせることで得たそれぞれの標識検証核酸（Ｂ）の標識量値の比を当該スポット間における係数とし、当該スポットにおいて測定された標識試料核酸（Ａ’）の標識量値に当該係数を乗することにより、第ｎのスポットに対してハイブリダイゼーションさせた標識試料核酸（Ａｎ）の補正された標識量値を得る。
【００２６】
標識試料核酸（Ａ）の標識量値、標識検証核酸（Ｂ）の標識量値の少なくともいずれか一方を同一のプローブ核酸をスポットした複数のスポット間おける平均値もしくは平均値に対する偏差を計算することができる。
具体的には、第一のスポット（Ｘ１）と同じ核酸マイクロアレイ上または異なるアレイ上に存在する、同一の配列（ａ’）を有するプローブ核酸が固定化されたｎ個のスポット（Ｘｎ）において、請求項１〜６のいずれかに記載の方法でｎ個のスポット各々のハイブリダイズした該標識検証核酸（Ｂ）の標識量値を得る工程、
ｎ個の該標識検証核酸（Ｂ）の標識量値から平均値もしくは平均値に対する偏差を行った数値を算出する工程、を含むことが好ましい。
【００２７】
より詳しくは、第１の検体由来の標識試料核酸（Ａ１）と標識検証核酸（Ｂ）とをハイブリダイゼーションした第１のスポットから得られた標識検証核酸（Ｂ）の標識量値をＦｃ１、第ｎ番目の検体由来の標識試料核酸（Ａｎ）と標識検証核酸（Ｂ）の標識量値をＦｃｎとすると、第ｎの標識試料核酸（Ａｎ）に対する補正後の補正標識量値を以下の数式（１）を用いて計算し、補正することが好ましい。
式（１） 第ｎの標識試料核酸（Ａｎ）の補正標識量値＝Ｆｃ１÷Ｆｃｎ×第ｎの標識試料核酸（Ａｎ）の標識量値（ｎは２以上の整数）
【００２８】
本発明の原理を図１を用いて説明する。なお、この図は、本発明の原理を説明するためのもので、非常に簡素化しているので、本発明の要点のみを例として図示したものであり、本発明における上記の範囲のすべてを含むものではなく、この図によって本発明を限定するものではない。
図１では、簡略化のため、二種の検体間でのコピー数解析に核酸マイクロアレイを用いた場合で、一枚のアレイに４種のプローブ試料核酸（Ａ〜Ｄまたはａ〜ｄ）と同一のプローブ核酸１〜４の１６スポットをスポットした二枚の核酸マイクロアレイを想定として模式図を作成した。
【００２９】
検体として細胞１由来の標識試料核酸（Ａ）と標識検証核酸（Ｂ）とハイブリダイゼーション溶液との混合物を核酸マイクロアレイ１上に塗布し、ハイブリダイゼーションさせる。また、標準由来の標識試料核酸（Ａ）と標識検証核酸（Ｂ）とハイブリダイゼーション溶液との混合物を核酸マイクロアレイ２上に塗布し、ハイブリダイゼーションさせる。ハイブリダイゼーション後、洗浄、乾燥工程を経て、核酸マイクロアレイ１、核酸マイクロアレイ２ともに標識量値を読み取る。
【００３０】
核酸マイクロアレイ１上のスポットＡ１に対する標識試料核酸（Ａ）由来の標識量値をＦ１、同スポットＡ１に対する標識検証核酸（Ｂ）由来の標識量値をＦｂ１とする。また、核酸マイクロアレイ２上のスポットａ１に対する標識試料核酸（Ａ）由来の標識量値をＦ２、同スポットａ１に対する標識検証核酸（Ｂ）由来の標識量値をＦｂ２とする。核酸マイクロアレイ２上の標識試料核酸（Ａ）由来の標識量値に対して、補正を行った補正後の標識量値Ｆ２’は、例えば以下の計算式によって計算できる。なお、標識量値は、バックグラウンド標識量値を差し引いても良いし、差し引かなくともよい。
Ｆ２’＝Ｆｂ１／Ｆｂ２×Ｆ２
【００３１】
これをすべてのスポットに対して行うことによって結果を得る。すなわち、核酸マイクロアレイ１上のＡ２スポットと核酸マイクロアレイ２上のａ２スポットの組、核酸マイクロアレイ１上のＢ１スポットと核酸マイクロアレイ２上のｂ２スポット組など、実質的に同一のプローブ核酸を結合させたスポット間の組で、補正を行うことによって、核酸マイクロアレイ２に対するすべてのスポットの補正を行う。次に、核酸マイクロアレイ１と核酸マイクロアレイ２との間で、Ｒａｔｉｏ値を以下の計算式によって計算する。
Ｒａｔｉｏ＝Ｆ２’／Ｆ１
これをすべてのスポットの組に対して計算すると、コピー数を求めることが可能となる。
【００３２】
尚、補正するにあたっては、同種の複数のスポットにおいて測定された標識検証核酸（Ｂ）の標識量値の平均に対する、任意のスポットの標識検証核酸（Ｂ）の標識量値の比を当該スポットにおける係数とし、当該スポットにおいて測定された標識試料核酸（Ａ）の標識量値から当該係数を除することにより、標識試料核酸（Ａ）の補正された標識量値を得ることも好ましい。
【００３３】
本発明では、補正するスポットは実質的に同一のプローブ核酸を結合させたスポット間ならばどの様なスポット同士で補正してもかまわない。例えば、核酸マイクロアレイ間で、位置的に対称なスポット同士での補正、すなわち、図１のＡ１とａ１スポット間やＢ１とｂ１スポット間などをあげることができるし、また、実質的に同一のプローブ核酸を固定化させていれば、位置的に非対称なスポット間の補正も行うこともできる。
さらに、本発明では、プローブ核酸がおおよそ同一であれば、異なった核酸マイクロアレイ同士の補正を行うことができる。異なった核酸マイクロアレイとは、異なった目的で製造された核酸マイクロアレイ、異なったスポットの配置、形状、濃度でスポットされた核酸マイクロアレイのことを言う。
即ち、本発明の方法により補正することで、複数の核酸マイクロアレイ間のプローブ核酸の配置、プローブ核酸のスポット量が、それぞれの核酸マイクロアレイで異なっているような場合でも、評価を行うことが出来る。
【００３４】
標識量値は、数学的処理を行った値でもかまわない。例えば、実質的に同一のプローブ核酸をスポットしたスポット同士から得られた標識量値を平均化する工程を行ってから、補正を行っても良い。また、標識量値として、蛍光値をもちいることが好ましい。
【００３５】
標識量値は、実質的に同一のプローブ核酸をスポットしたスポット同士で計算した平均値を用いることもできる。すなわち、補正前の標識量値に対して平均化処理を行うことも出来る。平均値を用いることによって、データは真値に近づく。また、補正後の標識量値に対して、実質的に同一のプローブ核酸をスポットしたスポット同士から得られた標識量値で平均値を計算することもできる。補正後の標識量値を加工した数値に対して平均化を行うこともできる。この様にすることで、例えば、核酸マイクロアレイに対して補正した標識量値から計算されたＲａｔｉｏ値で、実質的に同一のプローブ核酸をスポットしたスポット同士で平均値を計算すると、データが真値により近づくため、より正確にコピー数を算出することが出来、いわゆる擬陽性の発生を抑制することができ、疾病の診や予防の精度を大幅に向上させることが出来る。
また、実質的に同一種のプローブ核酸群の内、最大値と最小値を除いた平均値を使用することも出来るし、プローブ核酸群の平均標識量からある敷居値を除いたスポットの標識量を使用することも出来る。
【００３６】
標識量値の補正は、種々のコントロールスポットと共に用いることも出来る。例えば、細胞間で比較的発現量が一定しているハウスキーピング遺伝子を核酸マイクロアレイ上にスポットしておき、そのハイブリダイゼーション量を元に、試料間の全体を補正した後、各スポットの補正を本発明の検証核酸を用いる補正方法である。また、増幅・標識化時に内部標準核酸を添加しておき、その内部標準核酸で増幅もしくは標識化を補正した後、本発明の検証核酸による各スポットの補正を行っても良い。
【００３７】
本発明では、三枚以上の複数枚の核酸マイクロアレイ間での補正も可能である。例えば、標準、検体を複数種準備した場合をあげることが出来る。より具体的には、標準における標識試料核酸の標識量値および標識検証核酸の標識量値のデータ、複数の検体それぞれにおける標識試料核酸の標識量値および検証核酸の標識量値のデータを取得し、それぞれの検体の標識量値と標準の標識量値を本発明の方法を用いて補正した後、標準とそれぞれの検体の標識量値の比較を行い、量を計算することができる。この様な方法を行うことによって、標準を用いた核酸マイクロアレイの結果を一種類準備さえしておけば、検体を標的とした核酸マイクロアレイを何種類でも行うことが出来、標準を標識化する工程を検体の種類と同数準備する必要はなく、それだけ工程数が省けると共に、実験時間や診断時間を短縮化することが出来る。また、試薬の必要量を大幅に減らすことが出来、これに伴ってコストを大幅に減らすことが出来る。更に、標準を複数種用いることで、より結果を明確化することができる。
【００３８】
＜核酸マイクロアレイ＞
本発明で言うところの、核酸マイクロアレイとは、固体材料表面（ここで言う、表面とは、3次元的表面も言い、繊維等の表面も含む、すなわち、大きな形状としては、内包されているように見えていたとしても、実質的に表面であれば、ここでは表面と呼ぶ。）にプローブ核酸を結合、固定化させ、並べたものを言う。固体材料としては、一般的に使用されるスライドガラスなどのガラス素材のほか、プラスチック材料、炭素繊維、ゲルやゾル、メンブレン、金属など、プローブ核酸が結合可能な材料であれば良く、特に限定はしない。固体材料の形状も、平面状、突起状物の頂上、粒子状、細管の内部など、特に限定しない。本発明での核酸マイクロアレイは、スポッターなどによって製造されたＤＮＡマイクロアレイや半導体技術によって製造されたＤＮＡチップも含むものとする。
本発明においては、核酸マイクロアレイとして、BAC−DNAアレイ、オリゴヌクレオチドマイクロアレイ、ｃ−DNAマイクロアレイ等を使用することができる。
更に、マイクロアレイのスポットの配置は様々あり、アレイを複数エリアもち、複数の検体を1枚の基盤上で測定できる多検体アレイや、複数のアレイを組み合わせ、多くのスポットを1枚の基盤に再現したタイリングアレイなどがある。
マイクロアレイの形状には、様々有り、3次元構造をなすことにより、反応効率を上げたものや、粒子状に核酸を結合させたもの、テープ上に核酸を結合させたものなどや、CDのような円盤状に核酸を結合させたものなどが上げることもできる。
BAC-DNAアレイについては、BACにマンマリアン等のインサートを導入した状態のDNAを基に作成したものであればなんでも良く、そのものを貼り付けたものでもあり、また、PCR等の増幅技術を用いて増幅しているものも含んでおり、特に限定していない。
【００３９】
＜プローブ核酸＞
プローブ核酸は、予めどの配列が含まれているのか分かっている配列を含む核酸であって、マイクロアレイの場合は一般的にスポット状に複数固定されているものである。
【００４０】
プローブ核酸は、化学合成した核酸、ｃＤＮＡ、ＢＡＣ（Bacterial Artificial Chromosomes）、ＹＡＣ（Yeast Artificial Chromosomes）、ＰＡＣ(P1-derived Artificial Chromosomes)などや、これらのものを遺伝子工学的な手法を用いたりして増幅したものを使用することが出来る。さらに、ＤＮＡやＲＮＡなどの天然型の核酸を化学修飾した核酸をプローブ核酸として使用しても良い。例えば、ＰＮＡ（Peptide Nucleic Acid）、ＢＮＡ（Bridged Nucleic Acid）、メチルホスホネート型ＤＮＡ、ホスホロチオエート型ＤＮＡ、ホスホロアミデート型ＤＮＡ、ボラノホスフェート型ＤＮＡなどを用いることが出来る。また、キメラ型核酸を用いることも出来る。例えば、核酸内にＤＮＡ部分とＲＮＡ部分とが混合したものや天然型核酸と修飾型核酸とが混合したものを使用することが出来る。
プローブ核酸を固体基板上に搭載させる方法は、ＧｅｎｅＣｈｉｐを代表とする光脱離基を結合させたアミダイトモノマーを用い、マスクを使用して、一ヌクレオチドずつ化学合成する方法やインクジェット方式でアミダイトモノマーを固体基板上にスポットし、望んだ配列を化学合成する方法、電極上で溶液のｐＨを変化させそのｐＨ変化を利用して保護基を脱離することにより基板上で核酸を合成する方法、あらかじめ化学合成した核酸を精製し基板上にスポットする方法、スポッターを用いてｃＤＮＡをスポットする方法などを用いることが出来る。スポット方式も、インクジェット方式、ピンアレイ方式などを用いることが出来る。
【００４１】
プローブ核酸の大きさは、10ｂ〜10ｋｂであることが好ましく、更には50ｂ〜5ｋｂであることがより好ましく、100ｂ〜2ｋｂであることがさらに好ましい。
【００４２】
・スポット
核酸マイクロアレイは一般に、実質的に同じ配列を有するプローブ核酸を多量に高い密度で固定化した領域（スポット）を複数有するが、本発明で使用することの出来る、実質的に同一種、同一量のプローブ核酸のスポット数は、１つ以上あれば良く、スポット数によらない。解析の目的に応じて任意に選択することが可能である。
プローブ核酸の固定量は、１スポットあたり、0.8〜5μｇとすることが好ましく、1.0〜2.0μｇのとすることがより好ましい。
スポット形状に制約はないが、円形を好ましく用いることができる。
スポット径に制約はないが、１０μm〜１０００μmが好ましい。
【００４３】
＜検体＞
本発明での検体とは、核酸マイクロアレイを用いて解析したいと考える核酸（試料核酸）又は、核酸を含む細胞等であり、核酸マイクロアレイを用いて解析をしようとするものであれば全てを指し、特に限定するものはない。
例えば、核酸マイクロアレイを用いて、核酸の発現量や存在量、ゲノムの中のコピー数などを測定しようとしている核酸を含有している分析対象あるいは診断などの評価を行おうとしている細胞等のことであるが、同時に組織や、器官、一固体なども含まれ、細胞そのものに限定しているわけではない。
他に、検体として考えられるものとして、合成核酸等の存在量が予め分かっている、又は分かっていないものを使用し、アレイや測定機器の能力等を試験する際にもちいる物も検体として考えることができるし、後述する検証核酸も、測定対象とするのであれば検体と考えることも可能である。
検体は、ある疾患を持っていると考えられうる患者や、動物から取得できる核酸又は、核酸を取得できる細胞等が挙げられ、細胞を包括するものであれば全てを指す。狭義には核酸を指す。例えば、疾患としては、癌、遺伝病、感染症等、核酸になんらかの情報を持ちうると考えられる疾患が全て該当し、他に特に限定するものはない。
更に、癌検体はＬＣＭ（Laser Capture Microdissection）処理を行ったものを用いることもできる。
標準は、上記で検体と比較するために予めある程度の情報を持っている核酸や、核酸を取得することができる細胞や細部を包括するものであれば全てを指す。一般的な存在量と異なっていたとしても、検体を比較し、情報を得られることができれば、標準としてみなすことが可能である。例えば、CNVやなんらかのモザイクを持つ患者において、癌が発症したとして、癌細胞から得られた核酸と癌細胞以外の正常細胞から得られた細胞を比較したとした場合、CNVやなんらかのモザイクについては、相殺されるので標準として用いることになんら障害が無いと考えられる。
また、由来が全く異なる細胞等から取得した核酸についても、比較対象として用いることができれば、標準とみなすことが可能である。
本発明においては、試料核酸として検体から抽出した試料核酸や標準の核酸の何れも用いることができるが、前述のように、検体から抽出した試料核酸と、標準の核酸の双方を別々のアレイに対してハイブリダイズさせることが好ましい。
本発明では、試料核酸としてがん細胞由来の核酸または正常細胞（がん化していない細胞）由来の核酸を用いることが好ましい。
【００４４】
・核酸の精製
本発明では、検体や標準から核酸を調製する際には、精製を行うことが望ましい。標識の際に、様々な副反応が生じると共に、タンパクや脂質、糖など細胞溶解物が標識反応に影響を及ぼし、バックグラウンドノイズに大きな影響を与え、精製を行わなければ、核酸マイクロアレイの測定性能を著しく低下する。
【００４５】
精製工程としては、シリカやセルロース誘導体などの核酸吸着性膜を担持したカートリッジを用いた方法、エタノール沈殿やイソプロパノール沈殿、フェノール−クロロホルム抽出などを用いることが出来る。イオン交換樹脂やオクタデシル基などの疎水性置換基を結合したシリカ担体やサイズ排除効果を示す樹脂を使用した固相抽出カートリッジ、クロマトグラフィーなどによる方法を用いることが出来るこの中で、トリ酢酸セルロースをケン化して調製した核酸吸着性多孔質膜をカートリッジに保持させたＱｕｉｃｋＧｅｎｅシリーズ（富士フイルム株式会社）による精製が好ましい。ＱｕｉｃｋＧｅｎｅシリーズを使用することで、低価格な機械を用いて、半自動的に核酸を調製することが出来るからである。
更に、シリカ系核酸吸着性多孔質膜と比較して非常に薄く、少量での核酸抽出に適しており、他の方法と比較して非常に高濃度の核酸を得ることが出来る。また、少量液量での精製が可能なエタノール沈殿法やイソプロパノール沈殿法と比較して、より高純度の核酸を得ることが出来、少量かつ高濃度の標識核酸を得るのに適した方法である また、フェノール−クロロホルム抽出法やその他の種々の沈殿法を用いた場合、以降の工程に悪影響を及ぼしてしまうことから、検体から核酸を調製する場合、純度向上のため、複数回の精製工程を行うことも出来る。
検体からシリカを主成分とする核酸吸着性膜をカートリッジに固定化させたカラム法によって精製した場合、一般的にその回収液量が多く、得られる核酸の濃度が非常に薄くなってしまう。この問題を解決するためには、エタノール沈澱などで、溶液を全て除去してしまうか、限外濾過カラム等を用いて濃縮することなどが可能である。
【００４６】
本発明では、検体から抽出した核酸の鎖長を断片化する処理を行わないほうが工程が簡単で、処理時間が短いという点で、より好ましいが、酵素処理、超音波処理、機械的破砕処理、化学的処理等を行うことで、検体から抽出した核酸の鎖長を断片化、すなわち、短くすることも出来る。さらに、これらの処理を行った後、精製工程を行うことも、精製工程を省くこともできる。
また、精製工程を行った場合には、本発明では、制限酵素などの核酸分解酵素により、核酸を断片化し、得られた核酸を精製することによって、その精製度が増すと共に、精製時に濃縮工程を組み込むこと、例えば、核酸の溶液量よりもより少量の回収液量で抽出することで、より高純度かつ高濃度の核酸を得ることが出来、標識核酸を得るための効率が良くなることから好適に用いることが出来る。
酵素処理に使用する酵素としては、制限酵素または核酸分解酵素を用いることが好ましい。制限酵素の種類は、複数用いることも可能である。
【００４７】
本発明で言うところの機械的破砕処理とは、一定の方向に対して（但し８の字型の様な運動も含む）、容器に対して往復運動を行うことを言う。この処理を行う際に、ガラス、ステンレスやジルコニアなどのボールを添加するとより処理が進行し、より核酸が切断されるので好適に用いることが出来る。また、超音波処理による切断も出来る。
【００４８】
・サブトラクション法
本発明の方法は、サブトラクション法によって、核酸マイクロアレイ測定の精度を上げることも出来る。サブトラクション法とは、対象遺伝子のコピー数や発現に差がある場合、遺伝子の中に存在する違いを、引き算の要領で差し引きし、効率的に遺伝子を単離する方法である。例えば、ＰＣＲ−Ｓｅｌｅｃｔ法、ＲＤＡ（representational difference analysis）法、ＤｓＤＤ（Duplex-specific Direct Digestion）法等を用いることが出来る。
特に、がん細胞の場合、がん組織の中には、がん細胞と共に多量の正常細胞が含まれており、その結果、がん細胞の場合、核酸マイクロアレイの性能が著しく低下するが、サブトラクション法によって、その性能低下をある程度防ぐことが出来る。
【００４９】
＜標識＞
標識とは、検出可能な物質を核酸に対して結合させる行為であり、検出可能であれば、いかなるものも本発明に組み込むことが出来る。例えば、蛍光物質、無機化合物、酵素、放射性同位元素、色素などを含むことが出来、標識が蛍光によるものであることが好ましい。一つの検体に対し、複数標識することも可能である。
【００５０】
・蛍光物質
蛍光物質としては、特に使用は限定しないが、フルオレセインイソチオシアネート(FITC)、Cy-dye、ALEXA、緑色蛍光タンパク質(GFP, Green Fluorescent Protein)、青色蛍光タンパク(BFP,)、黄色蛍光タンパク(YFP)、赤色蛍光タンパク(RFP)、Acridine、DAPI、Ethidium bromide、SYBR Green、Texas Red、希土類蛍光ラベル剤、TAMRA、ROXなど入手可能または作製可能な物質であれば全て使用でき、好ましくはcy-3、cy-5によって蛍光標識することができる。
無機化合物としては、特に使用する素材は限定しないが、例えば、半導体無機材料で出来た量子ドットを挙げることが出来る。その例としては、シリカ、ＣｄＴｅ、ＺｎＳｅ、ＣｄＳｅのナノ微粒子を挙げることが出来る。この微粒子は、その粒径を変えることで、発する蛍光波長を変化させることが出来、直径２ｎｍでは青色、直径３ｎｍでは緑色、４ｎｍでは黄色、５ｎｍでは赤色となる。この様に、蛍光を検出しても良いし、その粒子の存在を直接検出しても良い。例えば、粒子の存在を直接検出する手段として、ＡＦＭ（原子間力顕微鏡）や電子顕微鏡を用いることが出来る。
さらに、ジゴキシゲニン（Digoxigein：DIG）、ビオチンなども利用することも出来る。ビオチンを利用した例としては、プローブに結合させたビオチンに、アビジンを結合させ、ここにビオチンを結合させたアルカリ性ホスファターゼを結合させ、アルカリ性ホスファターゼの基質であるニトロブルーテトラゾリウムと５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリルリン酸を加えると紫色の発色が見られ検出に使用することが出来る。
また、非酵素的に標識することも出来る。例えば、ULS arrayCGH LabelingKit（Kreatech Biotechnology BV社）なども用いることが出来る。
【００５１】
・直接標識法と間接標識法
標識法は、直接標識法、間接標識法いずれの標識法を本発明では用いても良い。直接標識法とは、例えば、Ｃｙ−ｄｙｅを用いる場合、核酸を一本鎖とし、ここに短鎖核酸をハイブリダイゼーションさせ、Ｃｙ−ｄｙｅを結合させたヌクレオチド誘導体をヌクレオチドとともに混合しておき、一段階で標識核酸を合成する方法である。酵素が非天然型のヌクレオチド誘導体を取り込む際の取り込み効率が天然型のヌクレオチドよりも低いという問題点があるものの、工程が簡便であり、本発明でも好適に用いることが出来る。間接標識法とは、例えば、Ｃｙ−ｄｙｅを用いる場合、核酸を一本鎖とし、ここに短鎖核酸をハイブリダイゼーションさせ、Ｃｙ−ｄｙｅが結合できる置換基を持ったヌクレオチド誘導体、例えば、アミノアリル基を持ったヌクレオチド誘導体と天然型のヌクレオチドとともに混合しておき、最初に、この置換基を持った核酸を合成し、次に、アミノアリル基を介してＣｙ−ｄｙｅを結合させ、標識核酸を得る方法である。この方法は、工程が複雑な反面、アミノアリル基を結合させたヌクレオチド誘導体の立体構造が直説標的法で使用するＣｙ−ｄｙｅを結合させたヌクレオチド誘導体よりも、天然型のヌクレオチドと構造的に近く、標識化合物の取り込み効率が高く、本発明でも好適に用いることが出来る。
【００５２】
本発明では、標識化合物を核酸に導入する方法として、ランダムプライマー法（プライマーエクステンション法）、ニックトランスレーション法、ＰＣＲ（Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ Ｃｈａｉｎ Ｒｅａｃｔｉｏｎ）法、末端標識法などを用いることが出来る。特に、本発明ではランダムプライマー法を好適に用いることが出来る。
ランダムプライマー法は、核酸に対して、数ｂｐ（塩基対）から十数ｂｐのランダムなプライマー核酸をハイブリダイゼーションさせ、ポリメラーゼを用いて、増幅と標識とを同時に行い、標識核酸を合成する方法である。ニックトランスレーション法は、例えば、ＤｎａｓｅＩでニックを入れた二本鎖核酸に、ＤＮＡポリメラーゼを作用させ、ＤＮＡを分解すると同時に、ＤＮＡポリメラーゼ活性により、標識核酸を合成する方法である。ＰＣＲ法は、二種類のプライマーを準備し、そのプライマーを用いてＰＣＲ反応を行うことで、増幅と標識とを同時に行い、標識核酸を得る方法である。末端標識法は、５’末端を標識する方法では、アルカリホスファターゼで脱リン酸化した核酸の５’末端に、Ｔ４ ポリヌクレオチドキナーゼによるリン酸化反応で標識化合物を取り込ませる方法である。３’末端を標識する方法は、ターミナルトランスフェラーゼにより、標識化合物を核酸の３’末端に付加する方法である。
【００５３】
・ダイスワップ法
本発明では、ダイスワップ法を用いることもできる。本発明で言うところのダイスワップ法とは、例えば、一枚目の核酸マイクロアレイに対しては、標準細胞由来の核酸をＣｙ３で検証核酸をＣｙ５で標識した試料をハイブリダイゼーションさせ、二枚目の核酸マイクロアレイに対しては、検体細胞由来の核酸をＣｙ３で検証核酸をＣｙ５で標識した試料でハイブリダイゼーションさせる。一枚目と二枚目の核酸マイクロアレイから得られた蛍光値から比を算出する。次に、三枚目の核酸マイクロアレイに対しては、標準細胞由来の核酸をＣｙ５で検証核酸をＣｙ３で標識した試料をハイブリダイゼーションさせ、四枚目の核酸マイクロアレイに対しては、検体細胞由来の核酸をＣｙ５で検証核酸をＣｙ３で標識した試料でハイブリダイゼーションさせる。三枚目と四枚目の核酸マイクロアレイから得られた蛍光値から比を算出する。この様な方法で、標識化合物による酵素の取り込み効率の異なりを補正する方法である。
【００５４】
・酵素活性の失活
本発明では、標識試料核酸および標識検証核酸として、それらを含む未精製の溶液を使用することも可能である。その様な未精製溶液を用いる場合、それらの溶液中には、酵素などがそのまま残存しており、調製後、溶液中に残存する酵素の活性を失活させておくことが好ましい。これは、例えば、検体由来の標識試料核酸をＣｙ３、標識検証核酸をＣｙ５で標識した場合、両者を含む未精製溶液を混合する工程があり、この混合時に、溶液中に残存する酵素が存在していると、残存した酵素によって標識試料核酸がＣｙ５、標識検証核酸がＣｙ３でさらに標識される可能性があり、データの再現性に影響を与えてしまう可能性があるからである。
本発明では、酵素の失活方法として、酵素の失活が可能な方法であればどの様な方法でもかまわないが、キレート剤を添加する方法、６０℃以上の加熱処理を行うことのいずれか一方もしくは両方を行うことが好ましい。加熱温度は、６０℃以上が好ましく、６３℃以上がさらに好ましい。加熱時間は、１分以上あれば良く、最も好ましくは、６５℃以上で５分間以上の加熱処理を行うことが好ましい。
また、klenow fragmentを用いた標識方法であれば、ボルテックスミキサー等を用いて酵素の活性を失わせることも可能である。
【００５５】
・標識核酸
標識核酸とは、標識化合物が結合した核酸のことを言い、精製していても精製していなくともよい。
【００５６】
・標識核酸を含む精製した溶液
標識核酸を含む精製した溶液とは、標識核酸を含む溶液に対して精製工程を行うことによって得た核酸溶液のことを言う。ここで、精製工程とは、標識処理を行った後の未反応の標識化合物や酵素などを取り除く工程のことであるが、ハイブリダイゼーションに寄与しない核酸や、その後のハイブリダイゼーションに対し影響を与えてしまう生体物質・化学物質を取り除くことも含んでおり、工程の前後で何らかの物質が除かれるのであれば、精製工程とする。
【００５７】
・標識核酸を含む未精製の溶液
標識核酸を含む未精製の溶液とは、検体から抽出した核酸の溶液に対して標識工程を行った後に、精製工程を全く行わずに得た核酸溶液のことである。ここで、精製工程とは、標識処理を行った後の未反応の標識化合物や酵素などを取り除く工程のことであり、核酸の溶液を調製するための精製工程は含めない。精製を行わないので、標識工程によって添加した種々の未反応化合物、例えば、プライマー、酵素、ヌクレオチド、バッファー中に含まれるイオンなどが共存した標識核酸の溶液である。さらに、標識核酸を含む未精製の溶液に対して、共存する酵素を失活させる目的で、加熱やキレート剤添加などの処理を行った後の核酸溶液も本発明では標識核酸を含む未精製の溶液という。
【００５８】
＜検証核酸＞
検証核酸は、対象としている全てのスポットにおいて、少なくともプローブ核酸の一部にハイブリダイズしうる配列を有し、対象としているスポットにおけるハイブリダイズ能力の異常、具体的には該スポットに固定化されているプローブ核酸の量に起因する異常を検知し、更にはプローブ核酸量の異常スポット間のスポット量を補正するために使用する核酸のことである。そのため、検証核酸は、核酸マイクロアレイ上の全スポットに固定化されているプローブ核酸とハイブリダイゼーション可能であればよく、どの様な配列、鎖長でも良い。ここで、全てのスポットとは、同一溶液の検体または標準が反応する可能性がある全スポットを表し、通常は単一の核酸マイクロアレイ上のスポット全てのことであるが、これに限定されない。
また、ハイブリダイゼーションが可能であれば、どの様な核酸でも良く、ＤＮＡやＲＮＡの様な天然型の核酸や、ＤＮＡやＲＮＡなどの天然型の核酸を化学修飾した核酸を使用しても良い。例えば、ＰＮＡ（Peptide Nucleic Acid）、ＢＮＡ（Bridged Nucleic Acid）、メチルホスホネート型ＤＮＡ、ホスホロチオエート型ＤＮＡ、ホスホロアミデート型ＤＮＡ、ボラノホスフェート型ＤＮＡなどを用いることが出来る。また、キメラ型核酸を用いることも出来る。例えば、核酸内にＤＮＡ部分とＲＮＡ部分とが混合したものや天然型核酸と修飾型核酸とが混合したものを使用することが出来る。
標識検証核酸（Ｂ）としては、たとえば、反復配列やベクター、大腸菌のゲノムなど、アレイを作製する上で、全てのスポットに存在すると考えられる核酸配列であれば使用出来、検体の核酸とは異なり、第１及び第ｎのプローブ核酸上の配列を持つ核酸を用いることが好ましい。
ベクターとしては、プラスミド、ＢＡＣ、ＹＡＣ、ＰＡＣ、コスミド、ウィルスなど種種のベクターが上げられ、アレイを作製するときに用いたベクターやこのベクターと同じ配列をもつ核酸であれば何を用いても構わない。
検証核酸として好ましい配列としては、反復配列が挙げられる。反復配列とは、リピート配列ともいい、ある塩基数ごとに制限酵素認識部位のように繰り返し出現する配列であり、短い塩基配列のパターンが何度も繰り返す配列、例えば、ｐｏｌｙ ｄ（ＡＴ）やｐｏｌｙ ｄ（ＧＣ）などや、一単位が数千塩基対に及ぶ長い配列が何度も繰り返す配列などをあげることが出来、ヒト等の高等生物中にはゲノム中に高頻度で出現することが知られている。本発明においては、例えばインビトロジェン社で販売されているＣｏｔ−１ ＤＮＡを好適に用いることが出来る。
例えば、マンマリアンＢＡＣ-ＤＮＡを用いた核酸マイクロアレイの場合には、Ｃｏｔ−１ ＤＮＡを用いることが好ましい。Ｃｏｔ−１ ＤＮＡは、通常、核酸マイクロアレイ測定時にマンマリアン（哺乳類）から得られた検体の反復配列をブロックするために使用される核酸であり、マンマリアンＢＡＣプローブを用いた核酸マイクロアレイの場合、通常そのプローブには反復配列が実質的に多くのＢＡＣプローブに含まれている。
【００５９】
例えば、プローブに繰り返し配列を有するＢＡＣ−ＤＮＡを用いた核酸マイクロアレイの場合、Ｃｏｔ−１ ＤＮＡを添加し、標的核酸およびプローブ核酸上に存在するその反復配列にあらかじめ非特異的にハイブリダイゼーションし、ブロックすることで、ターゲット核酸側に存在する反復配列がプローブ核酸側に存在するプローブ核酸と非特異的にハイブリダイゼーションする事を防止し、特異的なハイブリダイゼーションに由来する蛍光値を選択的に検出できるようにしている。本発明では、そのＣｏｔ−１ ＤＮＡの少なくとも一部を標識化して（好ましくは前記標識検証核酸と同一種の（同一の配列をもつ）未標識の核酸、例えば未標識Ｃｏｔ−１ ＤＮＡとともに）用いることによって、特異的なハイブリダイゼーションの検出感度を高め、かつスポット差を低減させることが可能であることを見出した。
【００６０】
また、プローブ核酸中に共通に存在する核酸配列部分に実質的に相補的な核酸配列を有する、合成オリゴヌクレオチドを検証核酸として用いることもできる。
【００６１】
本発明では、核酸に対して、検証核酸の使用量をモル比で１以上用いることが好ましい。モル比を１以上用いることによって、核酸マイクロアレイの性能が向上するからである。
【００６２】
検証核酸の大きさは、２０ｂｐ以上であることが好ましく、２０ｂｐ〜１Ｍｂｐであることがより好ましく、１００ｂｐ〜５００ｋｂであることがさらに好ましい。
検証核酸の使用量は、検体または標準の核酸に対して、０．５〜２倍モルの範囲とすることが好ましい。
【００６３】
・標識検証核酸（Ｂ）
標識検証核酸（Ｂ）とは、検証核酸に対して標識化合物を結合させた検証核酸のことを言い、精製していても精製しなくても本発明では標識検証核酸と言う。
標識検証核酸（Ｂ）として、検体由来の核酸、正常細胞由来の核酸、反復配列を含む核酸、を使用することもでき、Ｃｏｔ−１ ＤＮＡを使用することがより好ましい。
標識検証核酸（Ｂ）を、試料核酸（Ａ）の１モル倍以上用いることが好ましく、３モル倍以上用いることが更に好ましく、８モル倍以上用いることが最も好ましい。
【００６４】
・標識検証核酸を含む精製した溶液
標識検証核酸を含む精製した溶液とは、標識検証核酸（Ｂ）を含む溶液に対して、精製処理を行うことによって得た、標識検証核酸を含む溶液のことである。ここで、精製工程とは、標識処理を行った後の未反応の標識化合物や酵素などを取り除く工程のことである。
【００６５】
・標識検証核酸を含む未精製の溶液
標識検証核酸を含む未精製の溶液とは、標識検証核酸（Ｂ）を含む溶液に対して、精製処理を行わずに得た標識検証核酸を含む溶液のことである。精製を行わないので、標識工程によって添加した種々の未反応化合物、例えば、プライマー、酵素、ヌクレオチド、バッファー中に含まれるイオンなどが共存した標識検証核酸を含む溶液である。さらに、残存する酵素を失活させる目的で、未精製標識検証核酸を含む溶液に対して、加熱やキレート剤添加などの処理を行った後の核酸も本発明では標識検証核酸を含む未精製の溶液という。
【００６６】
＜ブロッキング剤＞
本発明で言うところのブロッキング剤とは、ハイブリダイゼーション時に非特異ハイブリダイゼーションの検出を低減するためのものであり、ハイブリダイゼーション溶液を調製する際に、標識試料核酸（Ａ）、標識検証核酸（Ｂ）などとともに添加することができる。例えば、核酸マイクロアレイのバックグラウンドノイズを低減させる作用を主として有するｔＲＮＡ（トランスファーＲＮＡ）、変性サケ精子ＤＮＡやｐｏｌｙＡ、ｐｏｌｙ ｄＡ、スキムミルクなどのことであり、一般に販売されているブロッキング剤も用いることができる。
【００６７】
＜ハイブリダイゼーション溶液の組成＞
本発明はハイブリダイゼーション溶液の組成として次のものを使用出来る。例えば、ＢＡＣ−ＤＮＡを用いた核酸マイクロアレイの場合、核酸濃度を高める作用や、粘性を上げることで仕切られていても面積をある程度保持できる機能を持った硫酸デキストラン、核酸の融解温度を下げる作用を持ったホルムアミド、イオン強度を上げることができ、ｐＨを一定に保つための機能を持つ溶液を例として挙げることが出来る。
本発明では、下記の試薬を含む溶液を用いることが好ましい。
排除体積効果を持つ物質として、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ、特開２０００−３２５０９９号公報）やデキストラン硫酸等を使用することが出来る。
融点を低下させる化合物として、ホルムアミド、グリセロール、ホルムアルデヒド、ＤＭＳＯ、ＤＭＦ、ＧｕＳＣＮ、ヨウ素などを使用することが出来る。
イオン強度を調整する溶液としては、SSCのほか、SSPEが一般的に上げられる。他に、MES hybridization bufferなどが用いられる。
【００６８】
＜ハイブリダイゼーション溶液＞
本発明で言うところのハイブリダイゼーション溶液とは、上記試薬やブロッキング剤その他の試薬、標識試料核酸・検証核酸を混入した溶液のことであり、標識試料核酸（Ａ）や標識検証核酸（Ｂ）が核酸マイクロアレイ上のプローブ核酸とのハイブリダイゼーションを好適にする性質を持った溶液のことであり、プローブ核酸と標識試料核酸や標識検証核酸との配列の一致度が高いハイブリダイゼーションを促進し、その一方で、配列の一致度が低いハイブリダイゼーションを抑制する働きを持った溶液のことである。
【００６９】
この他に本発明では、特開２００５−０８７１０９に記載されているように、ハイブリダイゼーション溶液の組成の一つとして、リン脂質、デンハルト溶液（フィコール、ポリビニルピロリドン、ウシ血清アルブミンを主成分とする溶液）、４級アンモニウム塩であるベタイン(Biochemistry 32, 137-144(1993))、ＴＭＡＣ（tetramethyl ammonium chloride）(Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82, 1585-1588 (1985)) 、市販されているハイブリダイゼーション溶液、例えば、ExpressHyb (Clontech)、PerfectHyb (東洋紡績株式会社)、ULTRAhyb(Ambion)などを用いることも出来る。
【００７０】
ハイブリダイゼーション溶液には、界面活性剤を添加することもできる。界面活性剤としては、カチオン性界面活性剤、アニオン性界面活性剤、また、ノニオン性界面活性剤を用いることも出来る。アニオン性界面活性剤として、ドデシル硫酸ナトリウムを用いるのが好ましい。ドデシル硫酸ナトリウムは、バックグラウンドを効率よく抑えることが出来る。他に、Ｎ−ラウリルサルコシド、ラウリル硫酸リチウムなどが用いられている。ノニオン性界面活性剤としては、Ｔｗｅｅｎ（登録商標）やＴｒｉｔｏｎＸ（登録商標）などが知られている。本発明では、これらの界面活性剤を使用することが出来る。
【００７１】
・標識試料核酸（Ａ）、標識検証核酸（Ｂ）を含むハイブリダイゼーション溶液
本発明で言うところの標識試料核酸、標識検証核酸を含むハイブリダイゼーション溶液とは、少なくとも一種の標識試料核酸および少なくとも一種の標識検証核酸が混入したハイブリダイゼーション溶液のことである。
【００７２】
・標識試料核酸（Ａ）、標識検証核酸（Ｂ）、ブロッキング剤を含むハイブリダイゼーション溶液
本発明で言うところの標識試料核酸、標識検証核酸、ブロッキング剤を含むハイブリダイゼーション溶液とは、少なくとも一種の標識試料核酸および少なくとも一種の標識検証核酸および少なくとも一種のブロッキング剤が混入したハイブリダイゼーション溶液のことである。
【００７３】
・種々核酸を含むハイブリダイゼーション溶液の調製
標識試料核酸を含まず、それ以外の核酸を含んだハイブリダイゼーション溶液の調製は、使用者が行っても良いが、アレイなどの提供元が作製し提供してもよい。このハイブリダイゼーション溶液に、標識検証核酸（Ｂ）が入っている場合には、標識検証核酸の濃度や種類、ロット番号などを統一しておくほうが好ましく、使用者は、精度の高い核酸マイクロアレイ実験が容易に行うことが可能となる。
即ち、上述した工程（ａ）で調製した標識試料核酸（Ａ）、工程（ｂ）で調製した標識検証核酸（Ｂ）の少なくともいずれか一つを濃縮もしくは精製することも好ましいし、工程（ｃ）で調製したハイブリダイゼーション溶液を濃縮もしくは精製することも好ましい。
【００７４】
・濃縮
標識試料核酸を含まず、それ以外の核酸を含んだハイブリダイゼーション溶液は、濃縮を行っておくことによって精度が高い核酸マイクロアレイ測定を実施することが可能となる。すなわち、ハイブリダイゼーションを実施する核酸同士がであう確率が高くなり、より精度の高い実験を実施することが可能であると考えられる。
【００７５】
・精製
本発明で言うところの精製とは、抽出、分離、分取と同異義語の意味で使用している。
また、そのための手段として、シリカやセルロース誘導体などの核酸吸着性膜を担持したカートリッジを用いた方法、エタノール沈殿やイソプロパノール沈殿、フェノール−クロロホルム抽出、イオン交換樹脂やオクタデシル基などの疎水性置換基を結合したシリカ担体やサイズ排除効果を示す樹脂を使用した固相抽出カートリッジ、クロマトグラフィーなどによる方法を含むことが出来る。
【００７６】
＜ハイブリダイゼーションを読み取る方法＞
核酸マイクロアレイ上のハイブリダイゼーションを読み取る方法としては標識を測定できる方法であればどんなものでも良く、限定するものではない。
例えば、ラジオアイソトープであればX線フイルムやBASS(富士フイルム株式会社)を用いることができる。
本発明で最も好適に用いられる方法は、蛍光スキャナーを用いる方法である。標識核酸の標識化合物として蛍光物質を用いた場合に好適に用いられる。蛍光スキャナーとしては、例えば、ＦＬＡシリーズ（富士フイルム株式会社）やＧｅｎｅＰｉｘシリーズ（Ａｘｏｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）、LS Reloaded（テカン）、などがあげられ、マイクロアレイを読み込むことができる機器であれば特に限定はしない。
また、標識をしていなくとも核酸を測定でき、補正等の計算を実施することができるのであれば、標識することが必須の要件とはいえない。例えば、SPRシステムで測定することが考えられる。
【００７７】
＜自動化＞
本発明の方法は、すべての工程を手作業で行うこともできるし、部分的に自動化された機械で行うこともできるし、全工程を自動化された機械で行うこともできる。自動化を行うことにより、作業者は煩雑な作業から解放され、人件費を低減し、熟練度の違いによる結果の差異を減少させ、ヒューマンエラーを防ぐことが可能となる。
【００７８】
＜データの提供＞
本発明では、別途標準を予め測定しておき、それを提供することで検体を評価するという手法もとることが可能である。この結果、常時標準を準備しなくとも、検体のみのハイブリダイゼーションを実施することが可能となり、効率よく実験を実施することができるようになる。また検体のデータを標準と考え使用することも可能である。
【００７９】
＜プログラム＞
核酸マイクロアレイ測定を実施し得られたデータを処理する際、効率よく実施ため、プログラムを用いたデータ処理を実施することが可能である。
該プログラムは、通常コンピュータ読み取り可能な記録媒体に記録した形態で提供される。該記録媒体は、コンピュータが読み取り可能なものであれば特に限定されない。本発明の記録媒体は、可搬型または固定型の両方の媒体が含まれ、例えば、コンパクトディスク（ＣＤ）、フレキシブルディスク（ＦＤ）、デジタルビデオディスク（ＤＶＤ）、ハードディスク、半導体メモリ等を挙げることができる。
本発明のプログラムは、上記記録媒体に記録されて流通させることも、コンピュータの記録装置に記録しておき、ネットワークを通じて他のコンピュータに転送する形態で流通させることもできる。
【００８０】
本発明の解析方法用キットは、プローブ核酸が固定化されているスポットを複数有する核酸マイクロアレイ、及び、該核酸マイクロアレイ上の全てのスポットにおいて少なくとも各プローブ核酸の一部にハイブリダイズしうる配列を有する検証核酸、を含む。該検証核酸は、予め標識されていても、ユーザーが使用時に標識を行ってもよい。また、該検証核酸は、イオン強度を調整する成分、界面活性剤等を含むハイブリダイゼーション溶液として提供されることも好ましい。
【実施例】
【００８１】
以下、実施例により本発明を更に詳細に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
尚、特に記載が無い場合、％は質量％を表す。
【００８２】
［比較例１］ 未精製標識核酸を試料とし、検証核酸を用いない場合の核酸マイクロアレイ実験および解析
【００８３】
＜未精製標識核酸の調製＞
１．７ｍＬマイクロチューブ（プラチナチューブ、ビーエム機器株式会社）にＦｅｍａｌｅ ＤＮＡ（Ｐｒｏｍｅｇａ,G1521）を３μＬ（０．７５μｇ）、水（Ｄｉｓｔｉｌｌｅｄ Ｗａｔｅｒ ＤＮＡｓｅ，ＲＮＡｓｅ Ｆｒｅｅ、ＧＩＢＣＯ）を８μＬ、ＢｉｏＰｒｉｍｅ（Ｒ） Ａｒｒａｙ ＣＧＨ Ｇｅｎｏｍｉｃ Ｌａｂｅｌｉｎｇ Ｓｙｓｔｅｍの２．５×Ｒａｎｄｏｍ Ｐｒｉｍｅｒｓ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ（ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を２０μＬ入れ、ＢＬＯＣＫ ＩＮＣＵＢＡＴＯＲ ＢＩ−５３５Ａ（株式会社アステック）上にて、９５℃で５分間熱処理を行った。５分後、マイクロチューブを取り出し、氷上にて１０分間急冷処理を行った。ＢｉｏＰｒｉｍｅ（Ｒ） Ａｒｒａｙ ＣＧＨ Ｇｅｎｏｍｉｃ Ｌａｂｅｌｉｎｇ Ｓｙｓｔｅｍの１０×ｄＣＴＰ Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｍｉｘ（ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を５μＬ、Ｃｙ３−ｄＣＴＰ Ｂｕｌｋ Ｐａｃｋ ２５０ｎｍｏｌ（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス株式会社）を３μＬ、ＢｉｏＰｒｉｍｅ（Ｒ） Ａｒｒａｙ ＣＧＨ Ｇｅｎｏｍｉｃ Ｌａｂｅｌｉｎｇ ＳｙｓｔｅｍのＥｘｏ−Ｋｌｅｎｏｗ Ｆｒａｇｍｅｎｔ（ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を１μＬ添加し、３７℃で２時間ＢＬＯＣＫ ＩＮＣＵＢＡＴＯＲ ＢＩ−５３５Ａにて、標識化反応と共に増幅反応を行った。２時間後、マイクロチューブをインキュベータから取り出し、６５℃に設定したＢＬＯＣＫ ＩＮＣＵＢＡＴＯＲ ＢＩ−５３５Ａにて、加熱処理を行い、反応溶液中に含まれているＥｘｏ−Ｋｌｅｎｏｗ Ｆｒａｇｍｅｎｔを失活させた。
【００８４】
上記操作をＭａｌｅ ＤＮＡ(G1471)に対しても行い、以上の操作にて、二種の未精製標識核酸を得た。なお、Ｍａｌｅ ＤＮＡに対しても、標識化合物として、Ｃｙ３−ｄＣＴＰ（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス株式会社）を用いた。
【００８５】
＜Ｃｏｔ−１ ＤＮＡを含む溶液（溶液A）の調製＞
Ｃｏｔ−１ ＤＮＡ ６５μＬ（６５μｇ、ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を１．７ｍＬマイクロチューブに入れ、３Ｍ酢酸ナトリウム（ｐＨ５．２）を６．５μＬ、−２０℃のエタノールを１６７μＬ添加し、混合後、１０分間−８０℃で放置した。その後、ＴＯＭＹ製遠心機ＭＸ−３００を用いて、１５０００ｒｐｍで３０分間、４℃で遠心を行った。遠心後、沈殿物が遠心チューブの底にたまるので、その沈殿物を吸い込まないように注意しながら、上清を除去した。次に、遠心チューブのフタを開けたまま１０分間放置し、残存するエタノールを除去した。１０分後、２０％ＳＤＳを１８μＬ添加し、３０分間静置した。３０分後、デキストラン硫酸（ＳＩＧＭＡ）を１ｇ、ホルムアミドを５ｍＬ、２０ｘＳＳＣを１ｍＬ混合し、溶解後、水を添加することで液量を７ｍＬとしたもの）を２０μＬ添加し、攪拌することで十分に混合させ、溶液Aを調製した。
なおこの工程は、ユーザーが行うのではなく、キット製造者があらかじめ調製しておくことが好ましい。
【００８６】
＜ハイブリダイゼーション溶液の調製＞
＜未精製標識核酸の調製＞で調製したＦｅｍａｌｅの未精製標識核酸を２０μＬ、実施例１と条件を一致させるために添加した水を２０μＬ、溶液Aを３８μＬ、１．７ｍＬマイクロチューブの中に入れ、十分に攪拌（Ｖｏｒｔｅｘ）処理を行った。また、同様に、＜未精製標識核酸の調製＞で調製したＭａｌｅの未精製標識核酸を２０μＬ、実施例１と条件を一致させるために添加した水を２０μＬ、溶液Aを３８μＬ、１．７ｍＬマイクロチューブの中に入れ、十分に攪拌（Ｖｏｒｔｅｘ）処理を行った。
【００８７】
＜核酸マイクロアレイについて＞
市販のBACクローンを大量培養後、イオン交換カラム（QIAGEN社、Plasmid Midi Kit 100 Cat.No.12145）を用いて抽出・精製しBAC DNAを得た。
その後、BAC DNAを４塩基認識酵素、ＲｓａＩ、ＤｐｎＩ、ＨａｅＩＩＩで消化した後、アダプターを加えてライゲーションをおこなった。
次に、アダプターの一方のオリゴヌクレオチドと同一配列を有するプライマーを用いて、ＰＣＲ法により増幅することにより、長さ１０００〜３０００ｂｐ程度のプローブDNAが得られた。
得られたプローブDNAをＧＥＮＥＳＨＯＴ（日本ガイシ株式会社、名古屋）を使用し、ガラス基板へスポットした。
これにより、ＢＡＣクローンから調製したプローブＤＮＡ８００種をそれぞれ２つずつガラス基板上にスポットした、合計１６００個のスポットを有する核酸マイクロアレイが得られ、以下の実験に用いた。
【００８８】
＜核酸マイクロアレイの前処理＞
ブロッキング溶液（松浪硝子工業株式会社）を約２００ｍＬ、ガラス容器に入れ、そこへ上記核酸マイクロアレイを入れ、２０分間ＳＬＩＤＥ ＷＡＳＨＥＲ，ＳＷ−４（十慈フィールド株式会社）を用いて、スライドガラスを上下に移動させながら、ブロッキング反応を行った。２０分後、核酸マイクロアレイをブロッキング溶液から取り出し、水２００ｍＬを入れた容器の中に入れた。３分間、ＳＬＩＤＥ ＷＡＳＨＥＲを用いて洗浄し、３分後、再び新しい水を２００ｍＬ入れた容器の中に入れ、ＳＬＩＤＥ ＷＡＳＨＥＲを用いて洗浄した。
３分後、エタノールを２００ｍＬ入れた容器の中に移し、再びＳＬＩＤＥ ＷＡＳＨＥＲを用いて洗浄した。３分後、核酸マイクロアレイを取り出し、卓上遠心機スピンドライヤーｍｉｎｉ２３５０（トミー工業株式会社）を用いて遠心を行い、核酸マイクロアレイを乾燥させた。
ブロッキング後、沸騰水に核酸マイクロアレイを２分間浸し、ついで、−２０℃の７０％エタノールに２分間、−２０℃の８５％エタノールに２分間、−２０℃の１００％エタノールに２分間浸し、その後、スピンドライヤーで１分間の遠心を行うことで核酸マイクロアレイを乾燥させた。
【００８９】
＜ハイブリダイゼーション＞
ハイブリダイゼーションは、「アレイCGH診断活用ガイドブック 知っておきたい染色体微細構造異常症」（医薬ジャーナル社）に記載されているプロトコール通りに実施した。具体的には、＜ハイブリダイゼーション溶液の調製＞で調製した二種の試料溶液を、それぞれ７５℃で１６分間熱処理を行った。その後、４２℃で３０分以上熱処理を行った。それぞれの溶液を、一枚ずつ核酸マイクロアレイ上に滴下し、その上にギャップカバーグラス（２４×５０ｍｍ）（松浪硝子工業株式会社）を気泡が入らないように載せた。
この２枚の核酸マイクロアレイをタイトボックスＮｏ．１（蝶プラ工業株式会社）に入れ、そのタイトボックスを３７℃で１６時間、恒温槽（ＨＹＢＲＩＤＩＺＡＴＩＯＮ ＩＮＣＵＢＡＴＯＲ，ＨＢ−８０、タイテック株式会社）中に入れて、ハイブリダイゼーションを行った。なお、核酸マイクロアレイの乾燥を防ぐために、タイトボックスの中にペーパータオル（キムタオル）を入れ、その上に４ｍＬの５０％ホルムアミド／２×ＳＳＣ溶液を添加した。
【００９０】
＜核酸マイクロアレイの洗浄＞
ハイブリダイゼーションを行った後、それぞれの核酸マイクロアレイを２×ＳＳＣの溶液４５ｍＬを入れたスミロンチューブに入れ、カバーグラスが自然に核酸マイクロアレイから剥がれ落ちるまで浸した。次に、カバーグラスが外れたそれぞれの核酸マイクロアレイを、あらかじめ５０℃に加熱した４５ｍＬの５０％ホルムアミド／２×ＳＳＣ（ｐＨ７．０）溶液を入れた５０ｍＬのスミロンチューブ（住友ベークライト株式会社）の中に入れた。これを、ＨＹＢＲＩＤＩＺＡＴＩＯＮ ＩＮＣＵＢＡＴＯＲの中に入れ、５０℃で１分間に３０回転のスピードでステージを揺らし、１５分間洗浄を行った。次に、あらかじめ５０℃に加熱しておいた２×ＳＳＣ／０．１％ＳＤＳ（ｐＨ７．０）溶液を中に入れたスミロンチューブの中に、それぞれの核酸マイクロアレイに入れた。それを、恒温槽の中に入れ、５０℃で１分間に３０回転のスピードでステージを揺らし、３０分間洗浄を行った。次に、４５ｍＬの２×ＳＳＣ溶液を中に入れた５０ｍＬのスミロンチューブの中に、それぞれの核酸マイクロアレイを入れ、室温で１分間に３０回転のスピードでステージを揺らすことで５分間洗浄を行った。洗浄後、スピンドライヤー−Ｍｉｎｉ ＭＯＤＥＬ２３５０で１分間の遠心を行うことで核酸マイクロアレイを乾燥させた。
【００９１】
＜データ取り込み＞
洗浄した二枚のマイクロアレイは、ＧｅｎｅＰｉｘ ４０００Ｂ（Ａｘｏｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）を用いて、スキャニングを行った。
【００９２】
＜データ処理＞
未精製標識核酸Ｃｙ３−Ｆｅｍａｌｅ由来の蛍光値をＦＦ、そのバックグラウンドノイズをＢＦ、未精製標識核酸Ｃｙ３−Ｍａｌｅ由来の蛍光値をＦＭ、そのバックグラウンドノイズをＢＭとすると、そのＬｏｇＲａｔｉｏ値は、
ＬｏｇＲａｔｉｏ＝Ｌｏｇ２｛（ＦＦ−ＢＦ）÷（ＦＭ−ＢＭ）｝を用いて計算した。なお、すべてのスポットについてＬｏｇＲａｔｉｏ値を計算した。
なお、本比較例では、バックグラウンドノイズの値を差し引いたが、差し引かなくてもよい場合もある。
また、ＬｏｇＲａｔｉｏ差として、Ｘ染色体に相当する部分のＬｏｇＲａｔｉｏ値から、常染色体に相当する部分のＬｏｇＲａｔｉｏ値を差し引いたものも計算した。
ＬｏｇＲａｔｉｏ差は、Ｆｅｍａｌｅは２本のＸ染色体、Ｍａｌｅは１本のＸ染色体を持つので、その値は理論上、１．０となる。
【００９３】
＜結果＞
図2に、ＬｏｇＲａｔｉｏのグラフを示した。
【００９４】
［実施例１］ 未精製標識核酸を試料とし、検証核酸として未精製標識Ｃｏｔ−１ ＤＮＡを用いた場合の核酸マイクロアレイ実験および解析
【００９５】
＜未精製標識核酸の調製＞
比較例１の＜未精製標識核酸の調製＞と同様の方法で、Ｆｅｍａｌｅ由来の核酸、Ｍａｌｅ由来の核酸から、それぞれ未精製標識試料核酸を調製した。
【００９６】
＜未精製標識検証核酸の調製＞
１．７ｍＬマイクロチューブ（プラチナチューブ、ビーエム機器株式会社）にＣｏｔ−１ ＤＮＡを０．７５μｇ、水を８μＬ、２．５×Ｒａｎｄｏｍ Ｐｒｉｍｅｒｓ Ｓｏｌｕｔｉｏｎを２０μＬ入れ、ＢＬＯＣＫ ＩＮＣＵＢＡＴＯＲ ＢＩ−５３５Ａ上にて、９５℃で５分間熱処理を行った。５分後、マイクロチューブを取り出し、氷上にて１０分間急冷処理を行った。１０×ｄＣＴＰ Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｍｉｘを５μＬ、Ｃｙ５−ｄＣＴＰ Ｂｕｌｋ Ｐａｃｋ ２５０ｎｍｏｌ（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス株式会社）を３μＬ、Ｅｘｏ−Ｋｌｅｎｏｗ Ｆｒａｇｍｅｎｔを１μＬ添加し、３７℃で２時間ＢＬＯＣＫ ＩＮＣＵＢＡＴＯＲ ＢＩ−５３５Ａにて、標識化反応と共に増幅反応を行った。２時間後、マイクロチューブをインキュベータから取り出し、６５℃に設定したＢＬＯＣＫ ＩＮＣＵＢＡＴＯＲ ＢＩ−５３５Ａにて、加熱処理を行い、反応溶液中に含まれているＥｘｏ−Ｋｌｅｎｏｗ Ｆｒａｇｍｅｎｔを失活させた。
【００９７】
＜溶液Aの調製＞
比較例１と同様の方法で、溶液Aの調製を行った。
【００９８】
＜ハイブリダイゼーション溶液の調製＞
＜未精製標識核酸の調製＞で調製した未精製標識試料核酸Ｃｙ３−Ｆｅｍａｌｅを２０μＬ、＜未精製標識検証核酸の調製＞で調製した未精製標識検証核酸Ｃｙ５−Ｃｏｔ−１ ＤＮＡを２０μＬ、溶液Aを３８μＬ、１．７ｍＬマイクロチューブの中に入れ、十分に攪拌（Ｖｏｒｔｅｘ）処理を行った。また、同様に、＜未精製標識核酸の調製＞で調製した未精製標識試料核酸Ｃｙ３−Ｍａｌｅを２０μＬ、＜未精製標識検証核酸の調製＞で調製した未精製標識検証核酸Ｃｙ５−Ｃｏｔ−１ ＤＮＡを２０μＬ、溶液Aを３８μＬ、１．７ｍＬマイクロチューブの中に入れ、十分に攪拌（Ｖｏｒｔｅｘ）処理を行った。
【００９９】
＜核酸マイクロアレイの前処理＞
比較例１の＜核酸マイクロアレイの前処理＞と同様の方法で行った。
【０１００】
＜ハイブリダイゼーション＞
比較例１の＜ハイブリダイゼーション＞と同様の方法でハイブリダイゼーションを行った。なお、試料としては、未精製標識試料核酸Ｃｙ３−Ｆｅｍａｌｅと未精製標識検証核酸Ｃｙ５−Ｃｏｔ１ ＤＮＡとの混合物、未精製標識試料核酸Ｃｙ３−Ｍａｌｅと未精製標識検証核酸Ｃｙ５−Ｃｏｔ１ ＤＮＡとの混合物の、それぞれ二種を用いた。
【０１０１】
＜核酸マイクロアレイの洗浄＞
比較例１の＜核酸マイクロアレイの洗浄＞と同様の方法で核酸マイクロアレイの洗浄を行った。
【０１０２】
＜データ取り込み＞
洗浄した二枚のマイクロアレイは、ＧｅｎｅＰｉｘ ４０００Ｂ（Ａｘｏｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）を用いて、スキャニングを行った。
【０１０３】
＜データ処理＞
未精製標識試料核酸Ｃｙ３−Ｆｅｍａｌｅ由来の蛍光値をＦＦ、そのバックグラウンドノイズをＢＦ、未精製標識試料核酸Ｃｙ３−Ｆｅｍａｌｅと同時にハイブリダイゼーションさせた未精製標識検証核酸Ｃｙ５−Ｃｏｔ１ ＤＮＡの蛍光値をＦｃ１、そのバックグラウンドノイズをＢｃ１、未精製標識試料核酸Ｃｙ３−Ｍａｌｅ由来の蛍光値をＦＭ、そのバックグラウンドノイズをＢＭ、未精製標識試料核酸Ｃｙ３−Ｍａｌｅと同時にハイブリダイゼーションさせた未精製標識検証核酸Ｃｙ５−Ｃｏｔ１ ＤＮＡの蛍光値をＦｃ２、そのバックグラウンドノイズをＢｃ２とすると、補正後のＭａｌｅ由来の未精製標識試料核酸の蛍光値ＦＭ’は、
ＦＭ’＝（Ｆｃ１−Ｂｃ１）÷（Ｆｃ２−Ｂｃ２）×（ＦＭ−ＢＭ）で計算した。計算は、すべてのスポットに対して行った。なお、補正後のＦｅｍａｌｅ由来の未精製標識試料核酸の蛍光値ＦＦ’を以下の式によって計算しても良い。
ＦＦ’＝（Ｆｃ２−Ｂｃ２）÷（Ｆｃ１−Ｂｃ１）×（ＦＦ−ＢＦ）
【０１０４】
なお、本実施例では、バックグラウンドノイズの値を差し引いたが、差し引かなくてもよい場合もある。
【０１０５】
また、そのＬｏｇＲａｔｉｏ値は、
ＬｏｇＲａｔｉｏ＝Ｌｏｇ2｛（ＦＦ−ＢＦ）／ＦＭ’｝で計算した。計算は、すべてのスポットに対して行った。
なお、ＦＦ’を計算した場合には、
ＬｏｇＲａｔｉｏ＝Ｌｏｇ2｛ＦＦ’／（ＦＭ−ＢＭ）｝を用いて、ＬｏｇＲａｔｉｏ値を計算することができる。
ＬｏｇＲａｔｉｏ差は、比較例１と同様に計算することで得た。
【０１０６】
＜結果＞
図3にＬｏｇＲａｔｉｏのプロットを示した。
比較例１の図2と実施例１の図3とを比較すると、未精製標識検証核酸Ｃｙ５−Ｃｏｔ−１ ＤＮＡによる補正を行ったものは、常染色体のプロットが全体的に0点付近であった。
図4に、ＬｏｇＲａｔｉｏの差をプロットした図を示した。なお、ＬｏｇＲａｔｉｏの差は、比較例１と同様の方法によって求めた。即ち、ＬｏｇＲａｔｉｏ差は、Ｘ染色体部分のＬｏｇＲａｔｉｏの平均値と常染色体部分のＬｏｇＲａｔｉｏの平均値との差から計算した。この差が大きいほど、核酸マイクロアレイ測定としては優れている。補正を行わない場合は、０．３８、補正を行った場合には、０．５５となり、補正を行うことによって、ＬｏｇＲａｔｉｏ差が約０．１７増加した。そもそも、maleとfemaleを比較した際に、X染色体の本数は異なっており、常染色体と差がでるはずである。より差異が明確であれば、コピー数変化をより感度良く捉えることができ、より正しい判断をすることができる。つまり、ＬｏｇＲａｔｉｏの差が大きいということは検証核酸を使用することの有効性を示しているものである。
図5に、Ｆｅｍａｌｅ由来、Ｍａｌｅ由来の常染色体部分に相当する部分の常染色体部分のみについて計算した分散の平均値を示した。補正ありの場合の分散は０．１８９となり、補正なしの分散の０．３１３と比較して数値が非常に小さく、真値に近づいており、検証核酸を使用することの有効性を示している。
【０１０７】
［実施例２］ 未精製標識核酸を試料とし、検証核酸として未精製標識検証核酸を用いた場合の核酸マイクロアレイ実験および解析
【０１０８】
＜未精製標識核酸の調製＞
比較例１と同様の方法で、Ｆｅｍａｌｅ由来の核酸、Ｍａｌｅ由来の核酸から、それぞれ未精製標識試料核酸を調製した。なお、Ｆｅｍａｌｅ、ＭａｌｅともにＣｙ５で標識した。
【０１０９】
＜未精製標識検証核酸の調製＞
本実施例では、Ｆｅｍａｌｅ由来の未精製標識核酸を未精製標識検証核酸として用いた。なお、標識化合物として、Ｃｙ３を使用した。
【０１１０】
＜溶液Aの調製＞
比較例１と同様の方法で、溶液Aの調製を行った。
【０１１１】
＜ハイブリダイゼーション溶液の調製＞
＜未精製標識核酸の調製＞で調製した未精製標識試料核酸Ｃｙ５−Ｆｅｍａｌｅを２０μＬ、＜未精製標識検証核酸の調製＞で調製した未精製標識検証核酸Ｃｙ３−Ｆｅｍａｌｅ ＤＮＡを２０μＬ、溶液Aを３８μＬ、１．７ｍＬマイクロチューブの中に入れ、十分に攪拌（Ｖｏｒｔｅｘ）処理を行った。また、同様に、＜未精製標識核酸の調製＞で調製した未精製標識試料核酸Ｃｙ５−Ｍａｌｅを２０μＬ、＜未精製標識検証核酸の調製＞で調製した未精製標識検証核酸Ｃｙ３−Ｆｅｍａｌｅ ＤＮＡを２０μＬ、溶液Aを３８μＬ、１．７ｍＬマイクロチューブの中に入れ、十分に攪拌（Ｖｏｒｔｅｘ）処理を行った。
【０１１２】
＜核酸マイクロアレイの前処理＞
比較例１の＜核酸マイクロアレイの前処理＞と同様の方法で行った。
【０１１３】
＜ハイブリダイゼーション＞
比較例１の＜ハイブリダイゼーション＞と同様の方法でハイブリダイゼーションを行った。なお、試料としては、未精製標識試料核酸Ｃｙ５−Ｆｅｍａｌｅと未精製標識検証核酸Ｃｙ３−Ｆｅｍａｌｅとの混合物、未精製標識試料核酸Ｃｙ５−Ｍａｌｅと未精製標識検証核酸Ｃｙ３−Ｆｅｍａｌｅとの混合物の、それぞれ二種を用いた。
【０１１４】
＜核酸マイクロアレイの洗浄＞
比較例１の＜核酸マイクロアレイの洗浄＞と同様の方法で行った。
【０１１５】
＜データ取り込み＞
洗浄した二枚のマイクロアレイは、ＧｅｎｅＰｉｘ ４０００Ｂ（Ａｘｏｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）を用いて、スキャニングを行った。
【０１１６】
＜データ処理＞
未精製標識試料核酸Ｃｙ５−Ｆｅｍａｌｅ由来の蛍光値をＦＦ、そのバックグラウンドノイズをＢＦ、未精製標識試料核酸Ｃｙ５−Ｆｅｍａｌｅと同時にハイブリダイゼーションさせた未精製標識検証核酸Ｃｙ３−Ｆｅｍａｌｅ ＤＮＡの蛍光値をＦｃ１、そのバックグラウンドノイズをＢｃ１、未精製標識試料核酸Ｃｙ５−Ｍａｌｅ由来の蛍光値をＦＭ、そのバックグラウンドノイズをＢＭ、未精製標識試料核酸Ｃｙ５−Ｍａｌｅと同時にハイブリダイゼーションさせた未精製標識検証核酸Ｃｙ３−Ｆｅｍａｌｅ ＤＮＡの蛍光値をＦｃ２、そのバックグラウンドノイズをＢｃ２とすると、補正後のＭａｌｅ由来の未精製標識試料核酸の蛍光値ＦＭ’は、
ＦＭ’＝（Ｆｃ１−Ｂｃ１）÷（Ｆｃ２−Ｂｃ２）×（ＦＭ−ＢＭ）で計算した。計算は、すべてのスポットに対して行った。
【０１１７】
なお、本実施例では、バックグラウンドノイズの値を差し引いたが、差し引かなくてもよい場合もある。
【０１１８】
また、そのＬｏｇＲａｔｉｏ値は、
ＬｏｇＲａｔｉｏ＝Ｌｏｇ2｛（ＦＦ−ＢＦ）／ＦＭ’｝で計算した。計算は、すべてのスポットに対して行った。
ＬｏｇＲａｔｉｏ差は、比較例１と同様に計算することで得た。
【０１１９】
＜結果＞
図6にＬｏｇＲａｔｉｏのプロットを示した。
図３の検証核酸を使用しないものと比べて、常染色体、Ｘ染色体の区別がはっきりしており、また、ＬｏｇＲａｔｉｏ値も一定の範囲内に収束しており、本実施例でも検証核酸を使用することの有効性を示している。
【０１２０】
［実施例３］ ＬｏｇＲａｔｉｏが大きくばらついた場合の補正例
【０１２１】
＜未精製標識核酸の調製＞
比較例１と同様の方法で、Ｆｅｍａｌｅ由来の核酸、Ｍａｌｅ由来の核酸から、それぞれ未精製標識試料核酸を調製した。
【０１２２】
＜未精製標識検証核酸の調製＞
Ｃｏｔ−１ ＤＮＡを検証核酸として、実施例１と同様の方法で、未精製標識検証核酸Ｃｙ５−Ｃｏｔ−１ ＤＮＡを調製した。
【０１２３】
＜溶液Aの調製＞
比較例１と同様の方法で、溶液Aの調製を行った。
【０１２４】
＜ハイブリダイゼーション溶液の調製＞
実施例１と同様の方法で未精製標識試料核酸および未精製標識検証核酸を含むハイブリダイゼーション溶液を調製した。すなわち、未精製標識試料核酸Ｃｙ３−Ｆｅｍａｌｅと未精製標識検証核酸Ｃｙ５−Ｃｏｔ−１ ＤＮＡを含むハイブリダイゼーション溶液、および未精製標識試料核酸Ｃｙ３−Ｍａｌｅと未精製標識検証核酸Ｃｙ５−Ｃｏｔ−１
ＤＮＡを含むハイブリダイゼーション溶液を調製した。
【０１２５】
＜核酸マイクロアレイの前処理＞
比較例１の＜核酸マイクロアレイの前処理＞と同様の方法で行った。
なお、核酸マイクロアレイは、ＢＡＣクローンから調製した遺伝子を日本ガイシ株式会社にてスポットした、８００遺伝子を２スポットずつスポットした、１６００スポットのマイクロアレイを使用した。
【０１２６】
＜ハイブリダイゼーション＞
比較例１の＜ハイブリダイゼーション＞と同様の方法でハイブリダイゼーションを行った。なお、試料としては、未精製標識試料核酸Ｃｙ３−Ｆｅｍａｌｅと未精製標識検証核酸Ｃｙ５−Ｃｏｔ−１ ＤＮＡとの混合物、未精製標識試料核酸Ｃｙ３−Ｍａｌｅと未精製標識検証核酸Ｃｙ５−Ｃｏｔ−１ ＤＮＡとの混合物の、それぞれ二種を用いた。
【０１２７】
＜核酸マイクロアレイの洗浄＞
比較例１の＜核酸マイクロアレイの洗浄＞と同様の方法で行った。
【０１２８】
＜データ取り込み＞
洗浄した二枚の核酸マイクロアレイは、ＧｅｎｅＰｉｘ ４０００Ｂ（Ａｘｏｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）を用いて、スキャニングを行った。
【０１２９】
＜データ処理＞
実施例１の＜データ処理＞と同様に行った。
【０１３０】
＜結果＞
本実施例でのスキャン画像を図８に示した。右図の右端の中で縦の列のイメージ画像の濃度が薄くなった。
図8に検証核酸を用いて補正しなかった場合のＬｏｇＲａｔｉｏのプロットを示した。
図9に検証核酸を使用して、蛍光値の補正を行った場合のＬｏｇＲａｔｉｏのプロットを示した。
図8と図9とを比較すると、図8の場合には、図7の右側のイメージ図の右端の縦の列に由来する読み取り標識量の薄さが原因と考えられ、この領域のスポットのLogRatio値が真値から大幅に異なる値を示している。しかし、このデータに対して、検証核酸による補正値を計算式に含めた図9の結果を見ると、見事にそのデータ変動を低減させることに成功している。
この様に、本発明の方法は、データが大きくばらついた際には、特にその威力を発揮する。
【０１３１】
［実施例４］ 標識検証核酸がハイブリダイゼーション溶液に含まれる場合の結果
【０１３２】
＜未精製標識核酸の調製＞
比較例１と同様の方法で、Ｆｅｍａｌｅ由来の核酸、Ｍａｌｅ由来の核酸から、それぞれ未精製標識試料核酸を調製した。なお、標識化合物として、両方とも、Ｃｙ３を使用した。
【０１３３】
＜未精製標識検証核酸の調製＞
Ｃｙ５を標識化合物とし、Ｃｏｔ−１ ＤＮＡを検証核酸として、実施例１と同様の方法で、未精製標識検証核酸Ｃｙ５−Ｃｏｔ−１ ＤＮＡを調製した。
【０１３４】
＜標識検証核酸を含む溶液(溶液B)の調製＞
＜未精製標識検証核酸の調製＞で調製したＣｙ５−Ｃｏｔ−１ ＤＮＡを２０μＬ、Ｃｏｔ−１ ＤＮＡ ６５μＬ（６５μｇ）を１．７ｍＬマイクロチューブに入れ、３Ｍ酢酸ナトリウム（ｐＨ５．２）を８．５μＬ、−２０℃のエタノールを２１８μＬ添加し、混合後、１０分間−８０℃で放置した。その後、ＴＯＭＹ製遠心機ＭＸ−３００を用いて、１５０００ｒｐｍで３０分間、４℃で遠心を行った。遠心後、沈殿物が遠心チューブの底にたまるので、その沈殿物を吸い込まないように注意しながら、上清を除去した。次に、遠心チューブのフタを開けたまま１０分間放置し、残存するエタノールを除去した。１０分後、２０％ＳＤＳを１８μＬ添加し、３０分間静置した。３０分後、デキストラン硫酸（ＳＩＧＭＡ）を１ｇ、ホルムアミドを５ｍＬ、２０ｘＳＳＣを１ｍＬ混合し、溶解後、水を添加することで液量を７ｍＬとしたものを２０μＬ添加し、攪拌することで沈殿物を溶解すると共に、溶液を十分に混合させ、溶液Bを調製した
この工程は、ユーザーが行うのではなく、キット製造者があらかじめ調製しておくことが好ましい。
【０１３５】
＜ハイブリダイゼーション溶液の調製＞
＜未精製標識核酸の調製＞で調製した未精製標識試料核酸Ｃｙ３−Ｆｅｍａｌｅを２０μＬ、溶液Bを５８μＬ、１．７ｍＬマイクロチューブの中に入れ、十分に攪拌（Ｖｏｒｔｅｘ）処理を行った。また、同様に、＜未精製標識核酸の調製＞で調製した未精製標識試料核酸Ｃｙ３−Ｍａｌｅを２０μＬ、溶液Bを５８μＬ、１．７ｍＬマイクロチューブの中に入れ、十分に攪拌（Ｖｏｒｔｅｘ）処理を行った。
【０１３６】
＜核酸マイクロアレイの前処理＞
比較例１の＜核酸マイクロアレイの前処理＞と同様の方法で行った。
【０１３７】
＜ハイブリダイゼーション＞
比較例１の＜ハイブリダイゼーション＞と同様の方法でハイブリダイゼーションを行った。なお、試料としては、未精製標識試料核酸Ｃｙ３−Ｆｅｍａｌｅと未精製標識検証核酸Ｃｙ５−Ｃｏｔ１ ＤＮＡとの混合物、未精製標識試料核酸Ｃｙ３−Ｍａｌｅと未精製標識検証核酸Ｃｙ５−Ｃｏｔ１ ＤＮＡとの混合物の、それぞれ二種を用いた。
【０１３８】
＜核酸マイクロアレイの洗浄＞
比較例１の＜核酸マイクロアレイの洗浄＞と同様の方法で行った。
【０１３９】
＜データ取り込み＞
洗浄した二枚の核酸マイクロアレイは、ＧｅｎｅＰｉｘ ４０００Ｂ（Ａｘｏｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）を用いて、スキャニングを行った。
【０１４０】
＜データ処理＞
実施例１の＜データ処理＞と同様に行った。
【０１４１】
＜結果＞
図１０に本実施例のＬｏｇＲａｔｉｏのプロットを示した。ＬｏｇＲａｔｉｏ差は、０．６４４となり、図５の補正ありの結果（実施例１）、０．５４７と比較して数値が約０．１良くなり、核酸マイクロアレイとしてより性能が良いものとなった。これは、実施例１の場合には、未精製標識検証核酸をそのままハイブリダイゼーション溶液に添加、攪拌したのみであるが、本実施例の場合には、未精製標識検証核酸とハイブリダイゼーション溶液とを混合後、エタノール沈殿、すなわち精製を行っており、精製を行ったことによる効果と、このエタノール沈殿を行うことにより、ハイブリダイゼーション溶液の液量が、実施例１の場合と比較して２０μＬ少ない、すなわち、ハイブリダイゼーション溶液中の核酸濃度増加による効果が原因と考えている。また、分散も、０．１３４となり、図６の補正ありの結果０．１８９と比較して小さくなり、より核酸マイクロアレイとしての性能が良くなった。これも同様の原因が理由と考えている。
【０１４２】
［実施例５］ 標識検証核酸の使用量依存性
【０１４３】
＜未精製標識核酸の調製＞
比較例１と同様の方法で、Ｆｅｍａｌｅ由来の核酸、Ｍａｌｅ由来の核酸から、それぞれ未精製標識試料核酸を調製した。なお、標識化合物として、両方ともＣｙ３を使用した。
【０１４４】
＜未精製標識検証核酸の調製＞
Ｃｙ５を標識化合物とし、Ｃｏｔ−１ ＤＮＡを検証核酸として、実施例１と同様の方法で、未精製標識検証核酸Ｃｙ５−Ｃｏｔ−１ ＤＮＡを調製した。なお、Ｃｏｔ−１ ＤＮＡとして、３μｇのＣｏｔ−１ ＤＮＡを使用した。
【０１４５】
＜標識検証核酸を含む溶液の調製＞
実施例３の＜標識検証核酸を含む溶液の調製＞と同様の方法で行った。
【０１４６】
＜ハイブリダイゼーション溶液の調製＞
実施例３の＜ハイブリダイゼーション溶液の調製＞と同様の方法で行った。
【０１４７】
＜核酸マイクロアレイの前処理＞
比較例１の＜核酸マイクロアレイの前処理＞と同様の方法で行った。
【０１４８】
＜ハイブリダイゼーション＞
実施例３の＜ハイブリダイゼーション＞と同様の方法で行った。
【０１４９】
＜核酸マイクロアレイの洗浄＞
比較例１の＜核酸マイクロアレイの洗浄＞と同様の方法で行った。
【０１５０】
＜データ取り込み＞
洗浄した二枚の核酸マイクロアレイは、ＧｅｎｅＰｉｘ ４０００Ｂ（Ａｘｏｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）を用いて、スキャニングを行った。
【０１５１】
＜データ処理＞
実施例１の＜データ処理＞と同様に行った。
【０１５２】
＜結果＞
図１１に検証核酸を使用して、蛍光値の補正を行った場合のＬｏｇＲａｔｉｏのプロットを示した。図１0と比較して、常染色体がより0に収束している。ＬｏｇＲａｔｉｏ差は、０．６４１となり、０．７５μｇのＣｏｔ−１ ＤＮＡを出発とした未精製標識検証核酸を用いた場合の結果（実施例４）の０．６４４と比較してほぼ同等となった。
【０１５３】
［実施例６］ 異なるアレイフォーマット間の補正
本発明では、アレイ間で製造日、製造方法、製造ロット、プロットパターン、固定化プローブ核酸量などが異なっていても、同種のプローブ核酸を用いていれば、その補正を行うことが出来る。その一例として、アレイ上のプロットパターン、すなわち、アレイフォーマットが異なる場合の実施例を以下に示した。
＜アレイ１＞ アレイ１は、１６個の遺伝子を４つずつスポットした合計６４スポットのアレイである。比較例１などで用いたアレイと同じアレイである。
＜アレイ２＞ アレイ２は、５５０個の遺伝子を３つずつスポットし、二つのハイブリダイゼーション領域を持つ多検体アレイである。なお、アレイ２のハイブリダイゼーションは、ハイブリダイザーを用いてハイブリダイゼーションを行った。
【０１５４】
本実施例では、この２種類のアレイで共通する１０個のプローブ核酸間での検証核酸を用いた比較を行った。１０個のプローブは、20p11.22、20p12.3、20q11.21、21q22.3、22q12.2、Xp11.23、Xq12、Xq13.3、Xq24、Xq26.2である。
試料としてＦｅｍａｌｅ ＤＮＡとＭａｌｅ ＤＮＡとを用い、検証核酸として、Ｃｏｔ−１ ＤＮＡを用い、他の実施例と同様の方法で、試料の標識化、ハイブリダイゼーション、データの取り込みを行った。なお、アレイ２は、多検体アレイであるが、一つのハイブリダイゼーション領域からのデータのみを使用した。また、アレイ１は４つの同一プローブをスポットしているが、比較にはその中の３つを用いた。データは、３点の平均を用い、ＬｏｇＲａｔｉｏを図示することで評価を行った。
【０１５５】
図１２にアレイ１同士、すなわち一枚目のアレイにＣｙ３−Ｆｅｍａｌｅ ＤＮＡとＣｙ５−Ｃｏｔ−１ ＤＮＡを、二枚目のアレイにＣｙ３−Ｍａｌｅ ＤＮＡとＣｙ５−Ｃｏｔ−１ ＤＮＡとをハイブリダイゼーションさせ、本発明の方法によって補正した場合の結果である。図の様に、十分に常染色体部分とＸ染色体部分とが分かれている。
図１３にアレイ２同士、すなわち一枚目のアレイにＣｙ３−Ｆｅｍａｌｅ ＤＮＡとＣｙ５−Ｃｏｔ−１ ＤＮＡを、二枚目のアレイにＣｙ３−Ｍａｌｅ ＤＮＡとＣｙ５−Ｃｏｔ−１ ＤＮＡとをハイブリダイゼーションさせ、本発明の方法によって補正した場合の結果である。図の様に、ここでも、十分に常染色体部分とＸ染色体部分とが分かれている。
図１４にアレイ１とアレイ２とを用い、それらの間同士、すなわち一枚目のアレイにＣｙ３−Ｍａｌｅ ＤＮＡとＣｙ５−Ｃｏｔ−１ ＤＮＡを、二枚目のアレイにＣｙ３−Ｆｅｍａｌｅ ＤＮＡとＣｙ５−Ｃｏｔ−１ ＤＮＡとをハイブリダイゼーションさせ、補正を行わなかった場合の結果である。図の様に、常染色体部分とＸ染色体部分とが全く分かれていない。
図１５にアレイ１とアレイ２とを用い、それらの間同士、すなわち一枚目のアレイにＣｙ３−Ｍａｌｅ ＤＮＡとＣｙ５−Ｃｏｔ−１ ＤＮＡを、二枚目のアレイにＣｙ３−Ｆｅｍａｌｅ ＤＮＡとＣｙ５−Ｃｏｔ−１ ＤＮＡとをハイブリダイゼーションさせ、本発明の方法によって補正した場合の結果である。図の様に、十分に常染色体部分とＸ染色体部分とが分かれている。図１4比較すると、本発明による検証核酸を使用することは、非常に有効な方法であり、たとえ、アレイフォーマットが異なっていたとしても十分に補正を行うことが出来ることを示しているものである。更に、アレイ１は、カバーガラスによる手動での静置ハイブリダイゼーション、アレイ２は、ハイブリダイザーによる攪拌型ハイブリダイゼーションと異なるハイブリダイゼーション条件で行っており、これらの結果は、ハイブリダイゼーション条件が異なっていても、本発明の方法を用いることによって、十分に補正を行うことが出来ることを示しているものである。
【０１５６】
［実施例７］ デジタルデータを提供する形式での核酸マイクロアレイ
［実施例１］と同様の方法で、＜未精製標識核酸の調製＞、＜未精製標識検証核酸の調製＞、＜Ｃｏｔ−１ ＤＮＡを含む溶液の調製＞、＜ハイブリダイゼーション溶液の調製＞、＜核酸マイクロアレイの前処理＞、＜ハイブリダイゼーション＞、＜核酸マイクロアレイの洗浄＞を行った。なお、試料は、デジタルデータ供給用のデータとして、正常細胞由来の核酸を想定したＣｙ３−Ｆｅｍａｌｅ ＤＮＡと標識検証核酸Ｃｙ５−Ｃｏｔ−１ ＤＮＡとを使用し、核酸マイクロアレイ上でこれらの核酸をハイブリダイゼーションし、そこから得られたデータをデジタルデータ供給用のデータとした。このデジタルデータを計算した日と別の日に、異常細胞由来の核酸を想定したＣｙ３−Ｍａｌｅ ＤＮＡと標識検証核酸Ｃｙ５−Ｃｏｔ−１ ＤＮＡ（前記の標識検証核酸Ｃｙ５−Ｃｏｔ−１ ＤＮＡと全く同じものを使用）とを核酸マイクロアレイ（前記の核酸マイクロアレイと同じプローブ、同じプローブ配置をもつもの）上でハイブリダイゼーションし、このデータと前記のデータを用いて、標識検証核酸同士によるＣｙ３−Ｍａｌｅ ＤＮＡの標識量値の補正を［実施例１］の＜データ処理＞に従って補正した。
＜結果＞
結果は図１６に示した。常染色体部分のデータが0点に収束し、Ｘ染色体部分との分離も十分に見られた。
【０１５７】
［実施例８］ 検証核酸としてベクター由来の核酸を用いた場合の核酸マイクロアレイ実験および解析
【０１５８】
＜未精製標識核酸の調製＞
比較例１と同様の方法で、Ｆｅｍａｌｅ由来の核酸、Ｍａｌｅ由来の核酸から、それぞれ未精製標識試料核酸を調製した。なお、Ｆｅｍａｌｅ、ＭａｌｅともにＣｙ３で標識した。
【０１５９】
＜未精製標識検証核酸の調製＞
本実施例では、ベクター由来の核酸を検証核酸として用いた。
＜検証核酸の調整＞
ＲＰＣＩ−１１ ｖｅｃｔｏｒより１クローンを選択し、ＬＢ培地に１００ｍｇ／ｍＬになるようにクロラムフェニコールを添加し、ＢＥ−４３ＦＬ（タイテック社製培養器）を用いて、３７℃で１晩培養した。これをＱＩＡｇｅｎ社のＱＩＡａｍｐ ｍｉｎｉｐｒｅｐ ｋｉｔを用いてＢＡＣを抽出した。抽出したＢＡＣをニッポンジーン社の制限酵素ＮｏｔIを用いて消化し、アガロース電気泳動に供した。７ｋｂ附近の断片を切り出し、ＭＮ社のＮｕｃｌｅｏｓｐｉｎカラムを用いてアガロース中から精製した。これをインビトロジェン社 Ｔ４ ＤＮＡ ｌｉｇａｓｅを用いて、４℃で１晩ｌｉｇａｒｉｏｎを実施し、ｐＢＡＣ１０８Ｌを取得した。
ｐＢＡＣ１０８Ｌをインビトロジェン社 ＤＨ−１０Ｂケミカルコンピテントセルに加え、氷上で３０分静置後、４２℃で３０秒加温し、再度氷上に２分静置した。これにＳＯＣ培地６００μＬ添加し、１００ｍｇ／ｍＬクロラムフェニコール入り、ＬＢ寒天培地にスプレッターを用いて塗布した。３７℃で２晩静置後、生育してきたコロニーをピックアップし、１００ｍｇ／ｍＬクロラムフェニコール入りＬＢ培地に植菌した。これを３７℃で１晩培養後、ＱＩＡｇｅｎ社のＱＩＡｐｒｅｐ ｓｐｉｎ ｍｉｎｉｐｒｅｐ ｋｉｔをいてＢＡＣ ＤＮＡを抽出し、ＢＡＣ ｖｅｃｔｏｒを取得した。これをＣｙ５を使用して標識し、ベクター由来の標識検証核酸を取得した。
【０１６０】
＜溶液Ａの調製＞
比較例１と同様の方法で、溶液Ａの調製を行った。
【０１６１】
＜ハイブリダイゼーション溶液の調製＞
実施例１と同様の方法で調製した未精製標識試料核酸Ｃｙ３−Ｆｅｍａｌｅを２０μＬ、実施例１と同様の方法で調製した未精製標識検証核酸Ｃｙ３−Ｆｅｍａｌｅ ＤＮＡを２０μＬ、溶液Aを３８μＬ、１．７ｍＬマイクロチューブの中に入れ、十分に攪拌（Ｖｏｒｔｅｘ）処理を行った。また、同様に、＜未精製標識核酸の調製＞で調製した未精製標識試料核酸Ｃｙ３−Ｍａｌｅを２０μＬ、＜検証核酸の調整＞で調製したベクター由来の標識検証核酸を２０μＬ、溶液Aを３８μＬ、１．７ｍＬマイクロチューブの中に入れ、十分に攪拌（Ｖｏｒｔｅｘ）処理を行った。
【０１６２】
＜核酸マイクロアレイの前処理＞
比較例１の＜核酸マイクロアレイの前処理＞と同様の方法で行った。
【０１６３】
＜ハイブリダイゼーション＞
比較例１の＜ハイブリダイゼーション＞と同様の方法でハイブリダイゼーションを行った。但し、ハイブリダイゼーション装置としてアロカ社製 HS-300を用いた。また、試料としては、未精製標識試料核酸Ｃｙ３−Ｆｅｍａｌｅと上記ベクター由来の標識検証核酸との混合物、未精製標識試料核酸Ｃｙ３−Ｍａｌｅとベクター由来の標識検証核酸との混合物の、それぞれ二種を用いた。
【０１６４】
＜核酸マイクロアレイの洗浄＞
比較例１の＜核酸マイクロアレイの洗浄＞と同様の方法で行った。
【０１６５】
＜データ取り込み＞
洗浄した二枚のマイクロアレイは、ＧｅｎｅＰｉｘ ４０００Ｂ（Ａｘｏｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）を用いて、スキャニングを行った。
【０１６６】
＜データ処理＞
未精製標識試料核酸Ｃｙ３−Ｆｅｍａｌｅ由来の蛍光値をＦＦ、未精製標識試料核酸Ｃｙ３−Ｆｅｍａｌｅと同時にハイブリダイゼーションさせたベクター由来の標識検証核酸の蛍光値をＦｃ１、未精製標識試料核酸Ｃｙ３−Ｍａｌｅ由来の蛍光値をＦＭ、未精製標識試料核酸Ｃｙ３−Ｍａｌｅと同時にハイブリダイゼーションさせたベクター由来の標識検証核酸の蛍光値をＦｃ２とし、ｌｏｇ２（ＦＭ／Ｆｃ２／ＦＦ×Ｆｃ１）で計算し、プローブの染色体ごとに並べた。また、同じプローブの値については平均化しグラフ化した。
結果を図１７に示す。ｌｏｇ２（ＦＭ／Ｆｃ２／ＦＦ×Ｆｃ１）の数値が常染色体はほぼ±０．２５内に収まり、Ｘ染色体についてはほぼ０．６以上の差となり、高い感度で検出が出来た。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
核酸マイクロアレイを用いた解析方法であって、
該核酸マイクロアレイが第１のプローブ核酸が固定化されているスポット（Ｘ１）を有し、
検体の標識試料核酸（Ａ１）を、スポット（Ｘ１）に固定化された該第１のプローブ核酸とハイブリダイゼーションさせる工程、
全てのスポットにおいて、少なくともプローブ核酸の一部にハイブリダイズしうる配列を有し、前記標識試料核酸とは異なる標識で標識されている標識検証核酸（Ｂ）を、スポット（Ｘ１）に付与し、少なくとも前記第１のプローブ核酸とハイブリダイズさせる工程、
スポット（Ｘ１）にハイブリダイズした該標識試料核酸の標識量値（Ｆ１）を測定する工程、及び、
スポット（Ｘ１）上にハイブリダイズした該標識検証核酸（Ｂ）の標識量値（Ｆｃ１）を測定する工程を含むことを特徴とする、解析方法。
【請求項２】
該標識試料核酸をハイブリダイゼーションさせる工程と、前記標識検証核酸（Ｂ）をハイブリダイゼーションさせる工程とが同時に行われ、かつ、
該ハイブリダイズした該標識試料核酸の量を測定する工程と、前記ハイブリダイズした検証核酸の量を測定する工程とが同時に行われることを特徴とする、請求項１に記載の解析方法。
【請求項３】
前記（Ｆｃ１）に基づき、スポット（Ｘ１）における固定された第１のプローブ核酸の量を検知し、該検知量により前記（Ｆ１）を補正することを特徴とする、請求項１または２に記載の解析方法。
【請求項４】
スポット（Ｘ１）と同じ核酸マイクロアレイ上または異なるアレイ上に存在する、スポット（Ｘ１）に固定化された前記第１のプローブと実質的に同一の配列を有する第ｎのプローブ核酸が固定化されたスポット（Ｘｎ）において、
前記標識試料核酸と同一または異なる標識試料核酸（Ａｎ）を、スポット（Ｘｎ）に固定化された該第ｎのプローブ核酸とハイブリダイゼーションさせる工程、
前記標識検証核酸（Ｂ）を、スポット（Ｘｎ）に付与し、ハイブリダイズさせる工程、
スポット（Ｘｎ）にハイブリダイズした該標識試料核酸の標識量値（Ｆｎ）を測定する工程、及び、
スポット（Ｘｎ）上にハイブリダイズした該標識検証核酸（Ｂ）の標識量値（Ｆｃｎ）を測定する工程、
を含むことを特徴とする、請求項１〜３のいずれかに記載の解析方法。
【請求項５】
標識量値（Ｆｃ１）と（Ｆｃｎ）とを対比することでスポット（Ｘ１）とスポット（Ｘｎ）とにおける標識量値の係数を算出する工程を含むことを特徴とする、請求項４に記載の解析方法。
【請求項６】
標識試料核酸（Ａ１）と標識試料核酸（Ａｎ）とが異なる試料から得られた核酸を標識したものであることを特徴とする請求項４または５に記載の解析方法。
【請求項７】
前記標識検証核酸（Ｂ）をハイブリダイゼーションさせる工程において、更に、標識化合物を結合する前の標識検証核酸（Ｂ）と同一種の未標識核酸が添加されていることを特徴とする請求項１〜６のいずれかの解析方法。
【請求項８】
スポット（Ｘｎ）における標識試料核酸（Ａｎ）がハイブリダイズした量に相当する補正標識量値を、下記式（１）を用いて算出することを特徴とする、請求項４〜７のいずれかの解析方法。
式（１） 標識試料核酸（Ａｎ）の補正標識量値＝前記（Ｆｃ１）÷前記（Ｆｃｎ）×第ｎの標識試料核酸（Ａｎ）の標識量値 （ｎは２以上の整数）
【請求項９】
標識試料核酸（Ａ１）と標識検証核酸（Ｂ）における標識の少なくとも一方が蛍光によるものであることを特徴とする、請求項１〜８のいずれかの解析方法。
【請求項１０】
核酸マイクロアレイとして、ＢＡＣ−ＤＮＡマイクロアレイを使用することを特徴とする、請求項１〜９のいずれかの解析方法。
【請求項１１】
複数の同種のスポット（Ｘｎ）が異なる核酸マイクロアレイに存在し、それぞれの核酸マイクロアレイ間のプローブ核酸の配置、プローブ核酸のスポット量が、それぞれの核酸マイクロアレイで異なっていることを特徴とする、請求項１〜１０のいずれかの解析方法。
【請求項１２】
標識検証核酸（Ｂ）として、検体の核酸とは異なり、第１及び第ｎのプローブ核酸上の配列を持つ核酸を用いる請求項１〜１１のいずれかの解析方法。
【請求項１３】
標識検証核酸（Ｂ）として、反復配列を含む核酸を使用することを特徴とする、請求項１〜１２のいずれかの解析方法。
【請求項１４】
標識検証核酸（Ｂ）として、Ｃｏｔ−１ ＤＮＡを使用することを特徴とする、請求項１〜１３のいずれかの解析方法。
【請求項１５】
標識検証核酸（Ｂ）として、ベクター由来の核酸を使用することを特徴とする、請求項１〜１２のいずれかの解析方法。
【請求項１６】
標識量値（Ｆ１）および（Ｆｃ１）のうち、標識量値（Ｆｃ１）がデジタルデータにより供給されることを特徴とする、請求項１〜１５のいずれかの解析方法。
【請求項１７】
請求項５〜１６のいずれかに記載の解析方法における、標識試料核酸（Ａｎ）（ｎは２以上の整数）の標識量値（Ｆｎ）を、標識検証核酸（Ｂ）の標識量値（Ｆｃ１）及び標識量値（Ｆｃｎ）を用いて補正するデータ処理をコンピュータに実行するためのプログラム。
【請求項１８】
請求項１７に記載のプログラムを記録したコンピュータ読み取り可能な記録媒体。
【請求項１９】
請求項１〜１６の解析方法を用いて、検体間の遺伝子発現量もしくは検体間の遺伝子コピー数を計算する方法。
【請求項２０】
プローブ核酸が固定化されているスポットを複数有する核酸マイクロアレイ、及び、該核酸マイクロアレイ上の全てのスポットにおいて少なくとも各プローブ核酸の一部にハイブリダイズしうる配列を有する検証核酸、を含む請求項１〜１６のいずれかの解析方法用のキット。
【請求項１】
核酸マイクロアレイを用いた解析方法であって、
該核酸マイクロアレイが第１のプローブ核酸が固定化されているスポット（Ｘ１）を有し、
検体の標識試料核酸（Ａ１）を、スポット（Ｘ１）に固定化された該第１のプローブ核酸とハイブリダイゼーションさせる工程、
全てのスポットにおいて、少なくともプローブ核酸の一部にハイブリダイズしうる配列を有し、前記標識試料核酸とは異なる標識で標識されている標識検証核酸（Ｂ）を、スポット（Ｘ１）に付与し、少なくとも前記第１のプローブ核酸とハイブリダイズさせる工程、
スポット（Ｘ１）にハイブリダイズした該標識試料核酸の標識量値（Ｆ１）を測定する工程、及び、
スポット（Ｘ１）上にハイブリダイズした該標識検証核酸（Ｂ）の標識量値（Ｆｃ１）を測定する工程を含むことを特徴とする、解析方法。
【請求項２】
該標識試料核酸をハイブリダイゼーションさせる工程と、前記標識検証核酸（Ｂ）をハイブリダイゼーションさせる工程とが同時に行われ、かつ、
該ハイブリダイズした該標識試料核酸の量を測定する工程と、前記ハイブリダイズした検証核酸の量を測定する工程とが同時に行われることを特徴とする、請求項１に記載の解析方法。
【請求項３】
前記（Ｆｃ１）に基づき、スポット（Ｘ１）における固定された第１のプローブ核酸の量を検知し、該検知量により前記（Ｆ１）を補正することを特徴とする、請求項１または２に記載の解析方法。
【請求項４】
スポット（Ｘ１）と同じ核酸マイクロアレイ上または異なるアレイ上に存在する、スポット（Ｘ１）に固定化された前記第１のプローブと実質的に同一の配列を有する第ｎのプローブ核酸が固定化されたスポット（Ｘｎ）において、
前記標識試料核酸と同一または異なる標識試料核酸（Ａｎ）を、スポット（Ｘｎ）に固定化された該第ｎのプローブ核酸とハイブリダイゼーションさせる工程、
前記標識検証核酸（Ｂ）を、スポット（Ｘｎ）に付与し、ハイブリダイズさせる工程、
スポット（Ｘｎ）にハイブリダイズした該標識試料核酸の標識量値（Ｆｎ）を測定する工程、及び、
スポット（Ｘｎ）上にハイブリダイズした該標識検証核酸（Ｂ）の標識量値（Ｆｃｎ）を測定する工程、
を含むことを特徴とする、請求項１〜３のいずれかに記載の解析方法。
【請求項５】
標識量値（Ｆｃ１）と（Ｆｃｎ）とを対比することでスポット（Ｘ１）とスポット（Ｘｎ）とにおける標識量値の係数を算出する工程を含むことを特徴とする、請求項４に記載の解析方法。
【請求項６】
標識試料核酸（Ａ１）と標識試料核酸（Ａｎ）とが異なる試料から得られた核酸を標識したものであることを特徴とする請求項４または５に記載の解析方法。
【請求項７】
前記標識検証核酸（Ｂ）をハイブリダイゼーションさせる工程において、更に、標識化合物を結合する前の標識検証核酸（Ｂ）と同一種の未標識核酸が添加されていることを特徴とする請求項１〜６のいずれかの解析方法。
【請求項８】
スポット（Ｘｎ）における標識試料核酸（Ａｎ）がハイブリダイズした量に相当する補正標識量値を、下記式（１）を用いて算出することを特徴とする、請求項４〜７のいずれかの解析方法。
式（１） 標識試料核酸（Ａｎ）の補正標識量値＝前記（Ｆｃ１）÷前記（Ｆｃｎ）×第ｎの標識試料核酸（Ａｎ）の標識量値 （ｎは２以上の整数）
【請求項９】
標識試料核酸（Ａ１）と標識検証核酸（Ｂ）における標識の少なくとも一方が蛍光によるものであることを特徴とする、請求項１〜８のいずれかの解析方法。
【請求項１０】
核酸マイクロアレイとして、ＢＡＣ−ＤＮＡマイクロアレイを使用することを特徴とする、請求項１〜９のいずれかの解析方法。
【請求項１１】
複数の同種のスポット（Ｘｎ）が異なる核酸マイクロアレイに存在し、それぞれの核酸マイクロアレイ間のプローブ核酸の配置、プローブ核酸のスポット量が、それぞれの核酸マイクロアレイで異なっていることを特徴とする、請求項１〜１０のいずれかの解析方法。
【請求項１２】
標識検証核酸（Ｂ）として、検体の核酸とは異なり、第１及び第ｎのプローブ核酸上の配列を持つ核酸を用いる請求項１〜１１のいずれかの解析方法。
【請求項１３】
標識検証核酸（Ｂ）として、反復配列を含む核酸を使用することを特徴とする、請求項１〜１２のいずれかの解析方法。
【請求項１４】
標識検証核酸（Ｂ）として、Ｃｏｔ−１ ＤＮＡを使用することを特徴とする、請求項１〜１３のいずれかの解析方法。
【請求項１５】
標識検証核酸（Ｂ）として、ベクター由来の核酸を使用することを特徴とする、請求項１〜１２のいずれかの解析方法。
【請求項１６】
標識量値（Ｆ１）および（Ｆｃ１）のうち、標識量値（Ｆｃ１）がデジタルデータにより供給されることを特徴とする、請求項１〜１５のいずれかの解析方法。
【請求項１７】
請求項５〜１６のいずれかに記載の解析方法における、標識試料核酸（Ａｎ）（ｎは２以上の整数）の標識量値（Ｆｎ）を、標識検証核酸（Ｂ）の標識量値（Ｆｃ１）及び標識量値（Ｆｃｎ）を用いて補正するデータ処理をコンピュータに実行するためのプログラム。
【請求項１８】
請求項１７に記載のプログラムを記録したコンピュータ読み取り可能な記録媒体。
【請求項１９】
請求項１〜１６の解析方法を用いて、検体間の遺伝子発現量もしくは検体間の遺伝子コピー数を計算する方法。
【請求項２０】
プローブ核酸が固定化されているスポットを複数有する核酸マイクロアレイ、及び、該核酸マイクロアレイ上の全てのスポットにおいて少なくとも各プローブ核酸の一部にハイブリダイズしうる配列を有する検証核酸、を含む請求項１〜１６のいずれかの解析方法用のキット。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図１６】
【図１７】
【図７】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図１６】
【図１７】
【図７】
【公開番号】特開２０１０−４８７３（Ｐ２０１０−４８７３Ａ）
【公開日】平成２２年１月１４日（２０１０．１．１４）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００９−１２６７８０（Ｐ２００９−１２６７８０）
【出願日】平成２１年５月２６日（２００９．５．２６）
【国等の委託研究の成果に係る記載事項】（出願人による申告）平成１９年度 独立行政法人新エネルギー・産業技術総合開発機構、「個別化医療の実現のための技術融合バイオ診断技術開発／染色体解析技術開発／臨床診断用全自動染色体異常解析システムの開発」委託研究、産業技術力強化法第１９条の適用を受ける特許出願
【出願人】（３０６０３７３１１）富士フイルム株式会社 (25,513)
【出願人】（５０４１７９２５５）国立大学法人 東京医科歯科大学 (228)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２２年１月１４日（２０１０．１．１４）
【国際特許分類】
【出願日】平成２１年５月２６日（２００９．５．２６）
【国等の委託研究の成果に係る記載事項】（出願人による申告）平成１９年度 独立行政法人新エネルギー・産業技術総合開発機構、「個別化医療の実現のための技術融合バイオ診断技術開発／染色体解析技術開発／臨床診断用全自動染色体異常解析システムの開発」委託研究、産業技術力強化法第１９条の適用を受ける特許出願
【出願人】（３０６０３７３１１）富士フイルム株式会社 (25,513)
【出願人】（５０４１７９２５５）国立大学法人 東京医科歯科大学 (228)
【Ｆターム（参考）】
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