核酸増幅装置
【課題】遺伝子の量を高精度に解析できる核酸増幅装置を提供すること。
【解決手段】核酸増幅反応を行なう核酸増幅装置であって、前記核酸増幅反応を行なうウェルＡ１を複数備え、前記ウェルＡ１ごとに設けられた加熱部１２と、前記複数のウェルＡ１全てに特定波長の励起光を照射可能な光学手段と、前記ウェルＡ１ごとに設けられた蛍光検出部１６と、を少なくとも備えた核酸増幅装置１とすることで、該核酸増幅装置１の各ウェルＡ１を独立して制御することができる。
【解決手段】核酸増幅反応を行なう核酸増幅装置であって、前記核酸増幅反応を行なうウェルＡ１を複数備え、前記ウェルＡ１ごとに設けられた加熱部１２と、前記複数のウェルＡ１全てに特定波長の励起光を照射可能な光学手段と、前記ウェルＡ１ごとに設けられた蛍光検出部１６と、を少なくとも備えた核酸増幅装置１とすることで、該核酸増幅装置１の各ウェルＡ１を独立して制御することができる。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、核酸増幅装置に関する。より詳細には、遺伝子発現解析、感染症検査、またＳＮＰ解析等の遺伝子解析に供せられる核酸増幅装置等に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、ＤＮＡチップ若しくはＤＮＡマイクロアレイをはじめとするハイブリダイゼーション検出技術の実用化が進んでいる。ＤＮＡチップは、多種・多数のＤＮＡプローブを基板表面に集積して固定したものである。このＤＮＡチップを用いて、ＤＮＡチップ基板表面のハイブリダイゼーションを検出することにより、細胞・組織等における遺伝子発現等を網羅的に解析することができる。
【０００３】
そして、このマイクロアレイにより得られたデータを、ＰＣＲ法（Polymerase Chain Reaction；ポリメラーゼ連鎖反応）等の核酸増幅反応を行なって検証することが微量核酸の定量分析の標準的手法となっている。微量核酸の定量分析に用いられる核酸増幅技術はＰＣＲ法以外の手法も用いられているが、ここでは一例としてリアルタイムＰＣＲ法について説明する。
【０００４】
リアルタイムＰＣＲ法は、「熱変性→プライマーとのアニーリング→ポリメラーゼ伸長反応」という増幅サイクルを連続的に行なうことで、ＤＮＡ等を数十万倍にも増幅させることができる。このようにして得られるＰＣＲ増幅産物をリアルタイムでモニタリングして前記微量核酸の定量分析を行なう方法である。このリアルタイムＰＣＲ法では、サーマルサイクラーと分光蛍光光度計を一体化した専用の装置等を用いて前記ＰＣＲ増幅産物をリアルタイムでモニタリングする。
【０００５】
このリアルタイムＰＣＲの検出方法について以下説明する。
まず、ＳＹＢＲ（登録商標）Ｇｒｅｅｎ Ｉを用いるインターカレーター法等が挙げられる。インターカレーター法では、二本鎖ＤＮＡに結合することで蛍光を発する性質を有するインターカレーターを用いる。このインターカレーターをＰＣＲ反応の過程で生成する二本鎖ＤＮＡに結合させ、これに対して励起光を照射することで蛍光が発せられる。この蛍光強度を検出することで、ＰＣＲ増幅産物の生成量をモニターする。このインターカレーター法では、ターゲットに特異的な蛍光標識プローブを設計・合成する必要がなく、種々のターゲットの測定に簡便に利用できる。
【０００６】
また、構造が類似する配列を区別して検出したい場合や、ＳＮＰｓのタイピングのようにマルチプレックス検出が必要な場合等には、プローブ法を用いる。プローブ法としては、例えば、その５´末端を蛍光物質で、３´末端をクエンチャー物質で修飾したオリゴヌクレオチドをプローブＩＩとして用いるＴａｑＭａｎ（登録商標）プローブ法が挙げられる。
【０００７】
ＴａｑＭａｎプローブは、アニーリングステップでは鋳型ＤＮＡに特異的にハイブリダイズするが、プローブ上に前記クエンチャー物質が存在するため、励起光を照射しても消光されるため蛍光を発しない。しかし、伸長反応ステップでは、ＴａｑＤＮＡポリメラーゼの持つ５´→３´エキソヌクレアーゼ活性によって鋳型ＤＮＡにハイブリダイズしたＴａｑＭａｎプローブが分解される。これによって、前記蛍光物質がプローブから遊離し、クエンチャーによる抑制が解除されて蛍光が発せられる。この蛍光強度を検出することで、ＰＣＲ増幅産物の生産量をモニターできる。
【０００８】
上記方法等によって遺伝子発現量をリアルタイムＰＣＲで定量する手順をより詳細に説明する。まず、段階希釈した濃度既知の標準サンプルを鋳型としてＰＣＲを行い、一定の増幅産物量に達するサイクル数（threshold cycle；Ｃｔ値）を求める。このＣｔ値を横軸として、初発のＤＮＡ量を縦軸にプロットし、検量線を作成する。これを踏まえて、未知濃度のサンプルについて同様の条件でＰＣＲ反応を行ってＣｔ値を求める。このＣｔ値と前記検量線とからサンプル中の目的のＤＮＡ量を測定する。
【０００９】
これらに関する技術として、特許文献１や特許文献２では増幅反応時の温度制御等に関する技術が開示されている。
【特許文献１】特表２００３−５２５６１７号公報。
【特許文献２】特開２００１−１３６９５４号公報。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
核酸増幅装置では、目的核酸量を高精度で解析することが望まれている。そのためには、サンプル（遺伝子）の増幅率を一定にする必要がある。そこで、本発明は、遺伝子の増幅率を高精度で制御できる核酸増幅装置を提供することを主目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
まず、本発明は、核酸増幅反応を行なう核酸増幅装置であって、前記核酸増幅反応を行なうウェルを複数備え、前記ウェルごとに設けられた加熱部と、前記複数のウェル全てに特定波長の励起光を照射可能な光学手段と、前記ウェルごとに設けられた蛍光検出部と、を少なくとも備えた核酸増幅装置を提供する。各ウェルごとに加熱部と蛍光検出部を備えることで、ウェル内での反応を各ウェルごとに個別に制御できる。
【００１２】
続いて、本発明は、前記核酸増幅反応はＰＣＲ法を少なくとも用いる核酸増幅装置を提供する。ＰＣＲ法では所定の温度サイクルによって核酸増幅させるが、本発明に係る核酸増幅装置は各ウェルで行なう温度サイクルを個別かつ高精度に制御できるため、より高精度の解析が可能となる。
【００１３】
また、本発明は、前記核酸増幅反応を等温で行う核酸増幅装置を提供する。いわゆる等温核酸増幅装置として用いる場合、各ウェルの温度制御を行なうことで、各ウェルの核酸増幅反応の増幅率を揃えることができる。その結果、等温増幅法であってもより高精度の解析が可能となる。
【００１４】
そして、本発明は、前記ウェルの加熱温度と加熱時間とは、前記ウェルに対応する前記加熱部により個別に制御する核酸増幅装置を提供する。前記加熱部により、前記ウェルごとに加熱温度と加熱時間を個別に制御することで、前記ウェル内の増幅反応等をより高精度で制御できる。
【００１５】
更に、本発明は、前記加熱部は、薄膜トランジスタにより形成され、スイッチング制御する核酸増幅装置を提供する。薄膜トランジスタのスイッチングを利用して、各ウェルの温度制御を個別に行うことができる。
【００１６】
また、本発明は、前記加熱部は、発熱抵抗体で形成され、薄膜トランジスタによりスイッチング制御する核酸増幅装置を提供する。薄膜トランジスタが有するスイッチングを利用して、発熱抵抗体に流れる電流値を制御すること等により、各ウェル内の温度制御を個別に行うことができる。
【００１７】
そして、本発明は、定温制御するペルチェ素子を備える核酸増幅装置を提供する。ペルチェ素子を用いることで、前記ウェル内の温度制御を容易に行うことができる。
【００１８】
また、本発明は、前記光学手段は、特定波長の励起光を発する光源と、前記励起光を前記複数のウェル全てに導入する導光板と、を少なくとも備える核酸増幅装置を提供する。これにより、光源から各ウェル全てに励起光を導入することができる。
【００１９】
続いて、本発明は、前記ウェルと前記蛍光検出部との間に、特定の波長の光を透過するフィルター膜を備えた核酸増幅装置を提供する。前記フィルター膜を設けることで、検出した蛍光を効率よく取り出すことができる。
【００２０】
また、本発明は、前記ウェルと前記導光板との間に、特定の波長の光を透過するフィルター膜を備えた核酸増幅装置を提供する。前記フィルター膜を設けることで各ウェルに照射すべき励起光を効率よく取り出すことができる。
【００２１】
更に、本発明は、前記光源が発光ダイオードである核酸増幅装置を提供する。光源として発光ダイオードを用いることで、不要な紫外線や赤外線等を含まない光を簡便に得ることができる。
【発明の効果】
【００２２】
本発明に係る核酸増幅装置によれば、遺伝子発現量を網羅的に高い精度で解析することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２３】
以下、本発明に係る方法の実施形態例について、添付図面を参照にしながら説明する。なお、図面に示された実施形態等は、本発明の好適な実施形態を例示したものであり、これにより本発明が狭く解釈されることはない。
【００２４】
図１は、本発明に係る核酸増幅装置の第１実施形態を側面視した概念図である。なお、以下に使用する図面では、説明の便宜上、装置の構成等については簡素化して示している。
【００２５】
図１中の符号１は、本発明に係る核酸増幅装置を示している。この核酸増幅装置１のサイズや層構造は、目的に応じて適宜選定可能であり、核酸増幅装置１の形態構成についても本発明の目的に沿う範囲で設計又は変更可能である。
【００２６】
核酸増幅装置１の形態構成について具体的に説明する。核酸増幅装置１は、反応基板１１と、前記反応基板１１を加熱する加熱部１２と、ペルチェ素子１３と、光源１４と、前記反応基板１１に励起光を導く導光板１５と、蛍光を検出する蛍光検出部１６と、特定の波長光のみを透過するフィルター膜１７と、測定基板１８と、を備えている。
【００２７】
反応基板１１は、複数のウェル（反応領域）Ａ１を備えており、このウェルＡ１内で所定の反応を行なう。本発明では、ウェルＡ１の形状等については特に限定されず、適宜好適な形状や容量とすることができる。
【００２８】
ウェルＡ１の容量については特に限定されないが、好適には、マイクロ空間とすることが望ましく、具体的には１μＬ以下の容量とすることが望ましい。このようなマイクロ空間とすることで、ウェルＡ１に必要な反応溶液の液量が少量ですむため、温度制御等を高精度で行なうことができ、かつ反応時間も短縮することができる。
【００２９】
例えば、前記ウェルＡ１を３００μｍ×３００μｍ×３００μｍ（ウェル容量：２７ｎＬ）とする場合、約４万個のウェルＡ１を反応基板１１に設置するとしても、約６ｃｍ四方の面積のデバイスでよい。このようにデバイスとしての小型化が可能であるため、ヒトの遺伝子数に匹敵する数のウェルＡ１をマトリクス状に反応基板１１に配置させることもでき、網羅的解析をより容易にかつ簡便に行なうことができる。
【００３０】
反応基板１１の材料等は、励起光Ｌ１を透過できる材料であれば特に限定されず、測定目的や加工容易性等を考慮して適宜選択できる。例えば、低蛍光発光プラスチックやガラス等を反応基板１１の材料として用いることができる。
【００３１】
また、反応基板１１は、加熱部１２や蛍光検出部１６やフィルター膜１７等と脱着可能としてもよい。あるいは、図示はしないが、反応基板１１と加熱部１２とを一体構造とし、これを脱着可能としてもよい。
【００３２】
加熱部１２は、反応基板１１内の各ウェルＡ１を加熱する。これによりウェルＡ１の温度制御を行なう。そして、前記ウェルＡ１の加熱温度と加熱時間とは、前記ウェルＡ１に対応する加熱部１２により個別に制御できることが望ましい。前記加熱部１２により、前記ウェルＡ１ごとに加熱温度と加熱時間を個別に制御することで、前記ウェルＡ１内の増幅反応等をより高精度で制御できる。
【００３３】
従来のリアルタイムＰＣＲ法に用いられるサーマルサイクラー等による温度制御はグラディエント機構が付加されている場合もあるが、各サンプルの温度制御が個別にできないという問題等がある。これに対して、本発明では、各ウェルＡ１にそれぞれ加熱部１２を設けることで、各ウェルを独立して温度制御することができる。更に、加熱部１２を各ウェルＡ１に対応して設けることで、増幅反応時の加熱時間について個別に制御できる。
【００３４】
加熱部１２の構造等については特に限定されないが、好適には、薄膜トランジスタ（ＴＦＴ：Thin Film Transistor）により形成され、スイッチング制御されるヒーターであることが望ましい。薄膜トランジスタが有するスイッチング機能を利用して、各ウェルＡ１の温度制御を個別に行うことができる。温度制御は、薄膜トランジスタに印加する電圧をコントロールしてソース−ドレイン間の電流値を可変としてもよいし、ソース−ドレイン間の電流を定電流電源としてコントロールしてもよい。特に、熱源としての薄膜トランジスタを用い、かつスイッチング素子としての薄膜トランジスタを用い、これらの薄膜トランジスタを同一回路内に形成することが望ましい。これにより熱源とスイッチング制御とを同一回路内で一括制御できる。
【００３５】
あるいは、加熱部１２は、発熱抵抗体で形成され、薄膜トランジスタによりスイッチング制御されるヒーターとしてもよい。即ち、薄膜トランジスタは、スイッチングとしてのみ利用してもよい。前記発熱抵抗体として、白金（Ｐｔ）、モリブデン（Ｍｏ）、タンタル（Ｔａ）、タングステン（Ｗ）、炭化珪素、モリブデンシリサイド、ニッケル−クロム合金、鉄−クロム−アルミニウム合金等を用いることができる。この場合は、発熱抵抗体に流れる電流値を制御することで、温度制御が可能となる。
【００３６】
本発明において用いられる薄膜トランジスタの種類については、特に限定されず、例えば、ポリ珪素や、α−珪素等のタイプを適宜使用できる。
【００３７】
本発明では、ウェルＡ１の温度制御を行なうためにペルチェ素子１３を備えることが望ましい。ペルチェ素子でウェル全体の温度制御を行ない、各加熱部１２において各ウェルＡ１の温度をより精密に制御することができる。これにより、各ウェルＡ１の微小な温度のばらつきやズレ等を正確に制御できる。ペルチェ素子１３を用いることで、定温制御を容易に行うことができる。その結果、高精度の温度制御を行なうことができる。
【００３８】
また、ＰＣＲサイクルを行う場合には、「熱変性→アニーリング（プライマーのハイブリダイゼーション）→伸長反応」のステップに応じて温度制御を行なう必要がある。例えば、予め、ウェルＡ１内の温度をＰＣＲサイクルの最低温度（例えば、５５℃）に維持しておくことができる。そして、ペルチェ素子１３によってウェル全体の温度サイクルを制御し、更に各加熱部１２によって各ウェルＡ１の温度のばらつきやズレを個別に補正・制御することができる。このようにウェル全体の温度制御と、各ウェル個別の温度制御をそれぞれ行なうことで、より正確な温度制御を行なうことができる。
【００３９】
本発明では、前記複数のウェルＡ１全てに特定波長の励起光を照射可能な光学手段として、光源１４や、励起光を各ウェルＡ１に導入するための導光板１５を用いることができる。
【００４０】
光源１４は、特定波長の光を発光するものであればよく、その種類は特に限定されないが、好適には、白色もしくは単色の発光ダイオード（ＬＥＤ）を用いることが望ましい。発光ダイオードを用いることで、不要な紫外線や赤外線を含まない光を簡便に得ることができる。
【００４１】
本発明では、光源１４の設置場所や光源数については特に限定されない。図示はしないが、各ウェルＡ１に対応するように光源１４を複数設け、各光源１４が対応するそれぞれのウェルＡ１に向かって励起光を直接照射する構造としてもよい。この場合、例えば、各ウェルＡ１を光源１４で直接照射できるため、励起光量をより多くとることや励起光量を個別に制御してすべてのウエルに均一な励起照射を行うことができる。
【００４２】
導光板１５は、光源１４から発せられる励起光Ｌ１を反応基板１１内の各ウェルＡ１に導くためのものである。前記導光板１５内部のスペーサー１５１に光源１４から発せられる励起光Ｌ１が導入される。そして、前記導光板１５上部には反射膜１５２が設けられており、例えば、ダイクロックミラー等を用いることで反応基板１１へ励起光Ｌ２を導入することができる。これにより、各ウェルＡ１内の反応液中の蛍光物質を均一な光量で励起させることができる。
【００４３】
また、本発明では、導光板１５の底部に、前記励起光Ｌ１，Ｌ２の波長光のみを透過するフィルター膜１５３を設けることが望ましい。これにより、光源１４から発せられる光から励起光Ｌ２を効率よく取り出し、ウェルＡ１へ導くことができる。このフィルター膜１５３としては、例えば偏光フィルター等を用いることもできる。
【００４４】
蛍光検出部１６は、ウェルＡ１に照射された励起光Ｌ２に応答して、インターカレートしたプローブ中の蛍光色素が励起することで発せられる蛍光を検出・測定する。本発明では、前記蛍光検出部１６の構成等については限定されず、例えば、フォトダイオードを用いることができる。
【００４５】
蛍光検出部１６は、加熱部１２と同じガラス基板１５上に形成されているが、異なる基板に形成されても良いし、加熱部１２と蛍光検出部１６とが積層された状態であってもよい。
【００４６】
本発明では、各ウェルＡ１とこれに対応する各蛍光検出部１６との間に、前記蛍光Ｌ３の波長光のみを透過するフィルター膜１７を設けることが望ましい。所定の波長光のみを透過するフィルター膜１７を、ウェルＡ１と蛍光検出部１６との間に設けることで、検出した蛍光Ｌ３を効率よく取り出すことができるため、より高精度の分析を行なうことができる。このフィルター膜１７としては、例えば偏光フィルター等を用いることができる。
【００４７】
このように、本発明に係る核酸増幅装置１は蛍光検出部１６を有するため、リアルタイムで蛍光検出できる。そして、蛍光検出部１６を各ウェルＡ１に対応して個別に設けることで、ウェルＡ１ごとに個別かつ高精度の検出が可能となる。
【００４８】
そして、リアルタイムでの蛍光検出が可能であるため、蛍光検出部１６の検出結果を、加熱部１２の温度制御機構にフィードバックすることができる。例えば、蛍光検出部１６で検出したウェルＡ１での反応結果（遺伝子増幅量）に基づいて、加熱部１２の加熱量を制御するように設計できる。このように、蛍光検出部１６の検出結果を、加熱部１２にフィードバックすることで、各ウェルＡ１の遺伝子増幅反応をより高精度に制御できる。
【００４９】
また、加熱部１２や蛍光検出部１６を、測定基板１８上に設けることができる。また、本発明では、前記測定基板１８を設ける位置は、前記加熱部１２や前記蛍光検出部１６の下方に限定されず、適宜好適な場所に設けることができる。本発明で用いられる前記測定基板１８の材料等については、特に限定されず、例えばガラス製基板や種々の樹脂製基板等を用いることができる。
【００５０】
本発明に係る核酸増幅装置１では、通常用いられているＰＣＲ法を行なうことができる。具体的には、（１）増幅させたい目標ＤＮＡ、（２）目標ＤＮＡと特異的に結合する少なくとも２種のオリゴヌクレオチドプライマ−、（３）緩衝液、（４）酵素、（５）ｄＡＴＰ，ｄＣＴＰ，ｄＧＴＰ，ｄＴＴＰのようなデオキシリボヌクレオチド三リン酸、等を用い、「熱変性→アニーリング（プライマーのハイブリダイゼーション）→伸長反応」のサイクルを繰り返すことで、前記目標ＤＮＡを所望する量まで増幅させること等ができる。
【００５１】
以下、本発明に係る核酸増幅装置１を用いた測定手順の一例について説明する。
【００５２】
各ウェルＡ１には、予め設計された異なる塩基配列を有するプライマーを投入する。投入方法については、特に限定されず、例えば、インクジェット等を用いる方法によることができる。このように各ウェルＡ１に各プライマーを含む溶液を滴下して乾燥させる。
【００５３】
続いて、検体から抽出したTotal ＲＮＡを逆転写（reverse transcription）法によりｃＤＮＡに転写して、各ウェルＡ１に投入する。これと併せて、増幅に必要となる各塩基の原材料となるデオキシヌクレオチド三リン酸（ｄＮＴＰ）、インターカレータ（「ＳＹＢＲ（登録商標）Ｇｒｅｅｎ Ｉ」）、ＤＮＡ伸長増幅反応に必要な酵素ＤＮＡポリメラーゼ等を投入する。
【００５４】
本発明に係る核酸増幅装置１は、ＲＴ−ＰＣＲ反応（Reverse Transcriptase Polymerase Chain Reaction；逆転写ポリメラーゼ連鎖反応）を行うリアルタイムＰＣＲ装置としても用いることができる。通常のＰＣＲ法ではＤＮＡポリメラーゼを用いるため、解析対象がＲＮＡである場合は増幅できない。これに対して、ＲＴ−ＰＣＲ法は、ＲＮＡを逆転写酵素によってＤＮＡに逆転写した後、ＰＣＲを行う方法であるが、本発明に係る核酸増幅装置１によればＲＴ−ＰＣＲ反応であっても行なうことができる。
【００５５】
また、ＰＣＲ法において目的としないＤＮＡ断片が増幅されることを防ぐために入れ子プライマー（nested primer）を用いてもよい（nested−PCR法)。そして、本発明に係る核酸増幅装置１においてＰＣＲ法を行う場合には、ＲＴ−ＰＣＲ法やnested−ＰＣＲ法を併用してもよいことは勿論である。
【００５６】
熱変性ステップでは、ウェルＡ１内が９５℃となるように加熱部１２等により設定し、二本鎖のＤＮＡを変性させ一本鎖ＤＮＡにする。続くアニーリングステップでは、ウェルＡ１内が５５℃となるように設定することで、プライマーが前記一本鎖ＤＮＡと相補的な塩基配列と結合させる。次のＤＮＡ伸長ステップでは、ウェルＡ１内が７２℃となるように設定することで、プライマーをＤＮＡ合成の開始点として、ポリメラーゼ反応を進行させてｃＤＮＡを伸長させる。
【００５７】
このような「９５℃（熱変性）→５５℃（プライマーのハイブリダイゼーション）→７２℃（ＤＮＡ伸長）」の温度サイクル毎に、各ウェルＡ１内のｃＤＮＡは２倍量に増幅されていく。そして、各ウェルＡ１にそれぞれ設置された加熱部１２によって、各ウェルＡ１内の温度を設計したプライマー反応の最適値に制御できる。また、プライマーのハイブリダイゼーション時間やポリメラーゼ反応時間も制御できるため、不要な反応副産物の生成も制御できる。その結果、各ウェルＡ１内の遺伝子（ｃＤＮＡ）の増幅率を一定に揃えることができるため、精度のよいＰＣＲ反応を行なうことができる。
【００５８】
ＤＮＡの複製反応時に生成されたｄｓ−ＤＮＡには、ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ Ｉがインターカレートする。このＳＹＢＲ ＧＲＥＥＮ Ｉは、ｄｓ−ＤＮＡにインターカレートし、その後に励起光Ｌ２を照射することで励起して蛍光を発光する物質である（励起光波長：４９７ｎｍ、発光波長：５２０ｎｍ）。
【００５９】
これにより、ＤＮＡポリメラーゼによるＤＮＡ複製時に、光源１４からの光Ｌ１が導光板１５を経由して励起光Ｌ２として、インターカレートしたＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ Ｉを励起させて蛍光Ｌ３を発光させる。この蛍光Ｌ３の発光量を前記温度サイクル毎に蛍光検出部１１で測定し、定量化する。そして、温度サイクル数とこれに対応する発光量との相関関係に基づいて、遺伝子発現量として初期ｃＤＮＡ量を求めることができる。
【００６０】
図２は、本発明に係る核酸増幅装置の第２実施形態を側面視した概念図である。以下、第１実施形態との相違点を中心に説明し、共通する部分についてはその説明を割愛する。
【００６１】
図２において符号２で示された核酸増幅装置は、反応基板２１と、前記反応基板２１を加熱する加熱部２２と、ペルチェ素子２３と、光源２４と、前記反応基板２１に励起光を導く導光板２５と、蛍光を検出する蛍光検出部２６と、測定基板２７と、を備えている。
【００６２】
この核酸増幅装置２は、ウェルＡ２ごとに加熱部２２や蛍光検出部２６を備えている点では、第１の実施形態と共通する。しかし、励起光Ｌ２を反応基板２１の下方から照射して、ウェルＡ２内で反射させて蛍光Ｌ３を検出する点等で相違する。ここで、ウェルＡ２の形状は、前記蛍光Ｌ３を反射させるために曲面部分を有している。
【００６３】
核酸増幅装置２では、光源２４から発せられる励起光Ｌ１が、導光板２５によってウェルＡ２に照射される。導光板２５では、スペーサー２５１を励起光Ｌ１が通過し、反射膜２５２とフィルター膜２５３により反応基板２１に励起光Ｌ２が導入される。そして、該励起光Ｌ２は、ウェルＡ２内の反応液中のプローブの蛍光物質に照射されることで蛍光Ｌ３を発する。この蛍光Ｌ３はウェルＡ２内の壁面で反射して、ウェルＡ２下方に設けられた蛍光検出部２６で検出・測定される。
【００６４】
また、温度制御は、ウェルＡ２下方に設けられた加熱部２２により行われ、ペルチェ素子２３等によって制御することができる。
【００６５】
一般的なリアルタイムＰＣＲ装置では、「熱変性→アニーリング→伸長反応」からなるサイクルを３０サイクル程度行なうために２５〜３０分の反応時間を要する。その際、約２℃／秒の温度制御を行っている。これに対して、本発明の装置では、２０℃以上／秒の温度制御が可能であるため、１サイクルあたり４０秒程度の時間短縮が可能となり、３０サイクル全体ではおよそ２５分以下の反応時間が達成できる。
【００６６】
本発明に係る核酸増幅装置では、ウェルごとに加熱部と蛍光検出部とを設置することで、各ウェルを独立して加熱温度・加熱時間を制御でき、かつ個別に検出することができる。これにより、遺伝子の発現量等について、短時間でありながら高精度で解析することができる。
【００６７】
更に、蛍光検出部として、励起光学系も一体化した装置とすることで、検出システムとしても小型化が可能である。また、前記ウェルをマイクロ空間とし、反応領域を小さくすること等によって、小さなデバイスでありながら網羅的な解析を効率よく行なうこともできる。これにより、本発明に係る核酸増幅装置では網羅的な解析が可能となる。
【００６８】
本発明に係る核酸増幅装置は、核酸増幅反応を等温で実施する等温核酸増幅装置としても用いることができる。この「等温」とは、使用する酵素やプライマー等が実質的に機能し得るほぼ一定の温度条件とすることをいう。そして、「ほぼ一定の温度条件」とは、設定された温度を厳密に保持することのみならず、使用する酵素及びプライマーの実質的な機能を損なわない程度の温度変化であれば許容される温度範囲内に保持することも包含する。
【００６９】
本発明において、先に説明したＰＣＲ法以外にも、以下に挙げる等温増幅法を用いることができる。
ｄｓＤＮＡからＲＮＡを増幅産物として得るＩＶＴ法（In Vitro Transcription）；
逆転写酵素のＲＮａｓｅＨ活性を用いてＲＮＡをトリミングし、ＲＮＡを増幅産物として得るＴＲＣ法（Transcription Reverse transcription Concerted amplification）；
逆転写酵素等を用いてＲＮＡプロモーターが組み込まれたｄｓＤＮＡとし、次にＲＮＡポリメラーゼを用いてｄｓＮＤＡからＲＮＡを増幅産物として得るＮＡＳＢＡ法（Nucleic Acid Sequence-Based Amplification）；
ＲＮＡとＤＮＡのキメラ構造からなるプライマーを利用し、ＲＮＡからｓｓＤＮＡを増幅産物として得るＳＰＩＡ法；
ＤＮＡのループ形成を利用し、一定温度でＤＮＡやＲＮＡからｄｓＤＮＡを増幅産物として得るＬＡＭＰ法（Loop-Mediated Isothermal Amplification）；
複数の酵素を組み合わせて用い、一塩基の違い（ＳＮＰ）を正確に識別しながらｄｓＤＮＡからｄｓＤＮＡを増幅産物として得るＳＭＡＰ法（SMart Amplification Process）；
ＤＮＡとＲＮＡが結合した合成キメラ・プライマーを用いて、ｄｓＤＮＡからｄｓＤＮＡを増幅産物として得るＩＣＡＮ法（Isothermal and Chimeric primer-initiated Amplification of Nucleic acids）等が挙げられる。
【００７０】
なお、本発明において行い得る等温増幅法は、上記の等温増幅法に限定されず、上記の各手法についても上記内容に限定して解釈されるものでないことは勿論である。即ち、本発明において行い得る等温増幅法とは、何らかの温度サイクルを行わずに核酸を増幅させるあらゆる方法を包含するものである。
【００７１】
等温増幅法は、前述のＰＣＲ法のような温度サイクル（例えば、９５℃→５５℃→７２℃）を必要としないため、サーマルサイクラーのような装置が不要であるといった利点を有している。しかし、増幅される核酸の構造や差長等に依存した増幅率の違いが生じるため、定量的な解析を行なうことが困難であった。
【００７２】
これに関して、本発明に係る核酸増幅装置によれば、各ウェルの反応温度を個別に制御することで各ウェルにおける核酸の増幅率の違いを補正できる。これにより、各ウェルにおける核酸増幅反応の反応効率を一定に揃えることができる。その結果、複数のウェルで複数の核酸増幅反応を行う場合であっても、一の検量線により各ウェルでの核酸の増幅量を定量的に知ることができる。従って、本発明に係る核酸増幅装置では発現量の定量的な解析ができる。
【００７３】
更に、所定の核酸増幅反応を行なうにあたり、その適切な反応温度条件が未知である場合であっても、増幅反応の初期の結果から適切な反応温度をフィードバックすることで、核酸増幅反応の反応効率を一定に揃えることができる。まず、増幅反応開始から一定時間内において、その増幅量とその際の温度の相関関係を検出する。そして、その結果を加熱部の温度制御機構にフィードバックすることで、増幅反応を行なうための適切な反応温度条件を決定することができる。
【００７４】
定量反応を行なう場合には、等温増幅法はその適用がＰＣＲ法と比較して困難である。その主な理由としては、増幅される核酸の構造や差長等による増幅率の違いが大きいことである。核酸増幅反応を用いた定量解析では、増幅率が一致した対照と比較する必要があるため、このような増幅率の違いは定量解析を困難にしている。特に、同時に多種類の遺伝子を定量する場合には、目標とする遺伝子ごとに検量線を作成することは困難であり、増幅率が一致したもの同士で比較する必要がある。
【００７５】
これに対して、本発明に係る核酸増幅装置では、等温増幅法により核酸増幅させる場合であっても、増幅する個々の遺伝子やプライマー等に応じた最適温度で増幅反応を行うことができる。従って、各ウェルにおける核酸の増幅率を一定となるように制御できる。その結果、等温増幅法であっても精度の高い定量分析を行なうことが可能となる。
【００７６】
そして、等温で反応を行なうため、温度サイクルを制御するサーマルサイクラー等の構成が不要である。そのため、デバイスとしての小型化にもより貢献できる。そして、同一デバイス上で多種類の遺伝子の量を網羅的に解析することが可能となる。従って、本発明に係る核酸増幅装置は、マイクロ流路を備えたチップや基板等の形態として、ここで等温増幅法を行うことができるハイスループット型の遺伝子解析装置とすることもできる。
【図面の簡単な説明】
【００７７】
【図１】本発明に係る核酸増幅装置の第１実施形態を側面視した概念図である。
【図２】本発明に係る核酸増幅装置の第２実施形態を側面視した概念図である。
【符号の説明】
【００７８】
１，２ 核酸増幅装置
１１，２１ 反応基板
１２，２２ 加熱部
１３，２３ ペルチェ素子
１４，２４ 光源
１５，２５ 導光板
１６，２６ 蛍光検出部
１７ フィルター膜
１８，２７ 測定基板
【技術分野】
【０００１】
本発明は、核酸増幅装置に関する。より詳細には、遺伝子発現解析、感染症検査、またＳＮＰ解析等の遺伝子解析に供せられる核酸増幅装置等に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、ＤＮＡチップ若しくはＤＮＡマイクロアレイをはじめとするハイブリダイゼーション検出技術の実用化が進んでいる。ＤＮＡチップは、多種・多数のＤＮＡプローブを基板表面に集積して固定したものである。このＤＮＡチップを用いて、ＤＮＡチップ基板表面のハイブリダイゼーションを検出することにより、細胞・組織等における遺伝子発現等を網羅的に解析することができる。
【０００３】
そして、このマイクロアレイにより得られたデータを、ＰＣＲ法（Polymerase Chain Reaction；ポリメラーゼ連鎖反応）等の核酸増幅反応を行なって検証することが微量核酸の定量分析の標準的手法となっている。微量核酸の定量分析に用いられる核酸増幅技術はＰＣＲ法以外の手法も用いられているが、ここでは一例としてリアルタイムＰＣＲ法について説明する。
【０００４】
リアルタイムＰＣＲ法は、「熱変性→プライマーとのアニーリング→ポリメラーゼ伸長反応」という増幅サイクルを連続的に行なうことで、ＤＮＡ等を数十万倍にも増幅させることができる。このようにして得られるＰＣＲ増幅産物をリアルタイムでモニタリングして前記微量核酸の定量分析を行なう方法である。このリアルタイムＰＣＲ法では、サーマルサイクラーと分光蛍光光度計を一体化した専用の装置等を用いて前記ＰＣＲ増幅産物をリアルタイムでモニタリングする。
【０００５】
このリアルタイムＰＣＲの検出方法について以下説明する。
まず、ＳＹＢＲ（登録商標）Ｇｒｅｅｎ Ｉを用いるインターカレーター法等が挙げられる。インターカレーター法では、二本鎖ＤＮＡに結合することで蛍光を発する性質を有するインターカレーターを用いる。このインターカレーターをＰＣＲ反応の過程で生成する二本鎖ＤＮＡに結合させ、これに対して励起光を照射することで蛍光が発せられる。この蛍光強度を検出することで、ＰＣＲ増幅産物の生成量をモニターする。このインターカレーター法では、ターゲットに特異的な蛍光標識プローブを設計・合成する必要がなく、種々のターゲットの測定に簡便に利用できる。
【０００６】
また、構造が類似する配列を区別して検出したい場合や、ＳＮＰｓのタイピングのようにマルチプレックス検出が必要な場合等には、プローブ法を用いる。プローブ法としては、例えば、その５´末端を蛍光物質で、３´末端をクエンチャー物質で修飾したオリゴヌクレオチドをプローブＩＩとして用いるＴａｑＭａｎ（登録商標）プローブ法が挙げられる。
【０００７】
ＴａｑＭａｎプローブは、アニーリングステップでは鋳型ＤＮＡに特異的にハイブリダイズするが、プローブ上に前記クエンチャー物質が存在するため、励起光を照射しても消光されるため蛍光を発しない。しかし、伸長反応ステップでは、ＴａｑＤＮＡポリメラーゼの持つ５´→３´エキソヌクレアーゼ活性によって鋳型ＤＮＡにハイブリダイズしたＴａｑＭａｎプローブが分解される。これによって、前記蛍光物質がプローブから遊離し、クエンチャーによる抑制が解除されて蛍光が発せられる。この蛍光強度を検出することで、ＰＣＲ増幅産物の生産量をモニターできる。
【０００８】
上記方法等によって遺伝子発現量をリアルタイムＰＣＲで定量する手順をより詳細に説明する。まず、段階希釈した濃度既知の標準サンプルを鋳型としてＰＣＲを行い、一定の増幅産物量に達するサイクル数（threshold cycle；Ｃｔ値）を求める。このＣｔ値を横軸として、初発のＤＮＡ量を縦軸にプロットし、検量線を作成する。これを踏まえて、未知濃度のサンプルについて同様の条件でＰＣＲ反応を行ってＣｔ値を求める。このＣｔ値と前記検量線とからサンプル中の目的のＤＮＡ量を測定する。
【０００９】
これらに関する技術として、特許文献１や特許文献２では増幅反応時の温度制御等に関する技術が開示されている。
【特許文献１】特表２００３−５２５６１７号公報。
【特許文献２】特開２００１−１３６９５４号公報。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
核酸増幅装置では、目的核酸量を高精度で解析することが望まれている。そのためには、サンプル（遺伝子）の増幅率を一定にする必要がある。そこで、本発明は、遺伝子の増幅率を高精度で制御できる核酸増幅装置を提供することを主目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
まず、本発明は、核酸増幅反応を行なう核酸増幅装置であって、前記核酸増幅反応を行なうウェルを複数備え、前記ウェルごとに設けられた加熱部と、前記複数のウェル全てに特定波長の励起光を照射可能な光学手段と、前記ウェルごとに設けられた蛍光検出部と、を少なくとも備えた核酸増幅装置を提供する。各ウェルごとに加熱部と蛍光検出部を備えることで、ウェル内での反応を各ウェルごとに個別に制御できる。
【００１２】
続いて、本発明は、前記核酸増幅反応はＰＣＲ法を少なくとも用いる核酸増幅装置を提供する。ＰＣＲ法では所定の温度サイクルによって核酸増幅させるが、本発明に係る核酸増幅装置は各ウェルで行なう温度サイクルを個別かつ高精度に制御できるため、より高精度の解析が可能となる。
【００１３】
また、本発明は、前記核酸増幅反応を等温で行う核酸増幅装置を提供する。いわゆる等温核酸増幅装置として用いる場合、各ウェルの温度制御を行なうことで、各ウェルの核酸増幅反応の増幅率を揃えることができる。その結果、等温増幅法であってもより高精度の解析が可能となる。
【００１４】
そして、本発明は、前記ウェルの加熱温度と加熱時間とは、前記ウェルに対応する前記加熱部により個別に制御する核酸増幅装置を提供する。前記加熱部により、前記ウェルごとに加熱温度と加熱時間を個別に制御することで、前記ウェル内の増幅反応等をより高精度で制御できる。
【００１５】
更に、本発明は、前記加熱部は、薄膜トランジスタにより形成され、スイッチング制御する核酸増幅装置を提供する。薄膜トランジスタのスイッチングを利用して、各ウェルの温度制御を個別に行うことができる。
【００１６】
また、本発明は、前記加熱部は、発熱抵抗体で形成され、薄膜トランジスタによりスイッチング制御する核酸増幅装置を提供する。薄膜トランジスタが有するスイッチングを利用して、発熱抵抗体に流れる電流値を制御すること等により、各ウェル内の温度制御を個別に行うことができる。
【００１７】
そして、本発明は、定温制御するペルチェ素子を備える核酸増幅装置を提供する。ペルチェ素子を用いることで、前記ウェル内の温度制御を容易に行うことができる。
【００１８】
また、本発明は、前記光学手段は、特定波長の励起光を発する光源と、前記励起光を前記複数のウェル全てに導入する導光板と、を少なくとも備える核酸増幅装置を提供する。これにより、光源から各ウェル全てに励起光を導入することができる。
【００１９】
続いて、本発明は、前記ウェルと前記蛍光検出部との間に、特定の波長の光を透過するフィルター膜を備えた核酸増幅装置を提供する。前記フィルター膜を設けることで、検出した蛍光を効率よく取り出すことができる。
【００２０】
また、本発明は、前記ウェルと前記導光板との間に、特定の波長の光を透過するフィルター膜を備えた核酸増幅装置を提供する。前記フィルター膜を設けることで各ウェルに照射すべき励起光を効率よく取り出すことができる。
【００２１】
更に、本発明は、前記光源が発光ダイオードである核酸増幅装置を提供する。光源として発光ダイオードを用いることで、不要な紫外線や赤外線等を含まない光を簡便に得ることができる。
【発明の効果】
【００２２】
本発明に係る核酸増幅装置によれば、遺伝子発現量を網羅的に高い精度で解析することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２３】
以下、本発明に係る方法の実施形態例について、添付図面を参照にしながら説明する。なお、図面に示された実施形態等は、本発明の好適な実施形態を例示したものであり、これにより本発明が狭く解釈されることはない。
【００２４】
図１は、本発明に係る核酸増幅装置の第１実施形態を側面視した概念図である。なお、以下に使用する図面では、説明の便宜上、装置の構成等については簡素化して示している。
【００２５】
図１中の符号１は、本発明に係る核酸増幅装置を示している。この核酸増幅装置１のサイズや層構造は、目的に応じて適宜選定可能であり、核酸増幅装置１の形態構成についても本発明の目的に沿う範囲で設計又は変更可能である。
【００２６】
核酸増幅装置１の形態構成について具体的に説明する。核酸増幅装置１は、反応基板１１と、前記反応基板１１を加熱する加熱部１２と、ペルチェ素子１３と、光源１４と、前記反応基板１１に励起光を導く導光板１５と、蛍光を検出する蛍光検出部１６と、特定の波長光のみを透過するフィルター膜１７と、測定基板１８と、を備えている。
【００２７】
反応基板１１は、複数のウェル（反応領域）Ａ１を備えており、このウェルＡ１内で所定の反応を行なう。本発明では、ウェルＡ１の形状等については特に限定されず、適宜好適な形状や容量とすることができる。
【００２８】
ウェルＡ１の容量については特に限定されないが、好適には、マイクロ空間とすることが望ましく、具体的には１μＬ以下の容量とすることが望ましい。このようなマイクロ空間とすることで、ウェルＡ１に必要な反応溶液の液量が少量ですむため、温度制御等を高精度で行なうことができ、かつ反応時間も短縮することができる。
【００２９】
例えば、前記ウェルＡ１を３００μｍ×３００μｍ×３００μｍ（ウェル容量：２７ｎＬ）とする場合、約４万個のウェルＡ１を反応基板１１に設置するとしても、約６ｃｍ四方の面積のデバイスでよい。このようにデバイスとしての小型化が可能であるため、ヒトの遺伝子数に匹敵する数のウェルＡ１をマトリクス状に反応基板１１に配置させることもでき、網羅的解析をより容易にかつ簡便に行なうことができる。
【００３０】
反応基板１１の材料等は、励起光Ｌ１を透過できる材料であれば特に限定されず、測定目的や加工容易性等を考慮して適宜選択できる。例えば、低蛍光発光プラスチックやガラス等を反応基板１１の材料として用いることができる。
【００３１】
また、反応基板１１は、加熱部１２や蛍光検出部１６やフィルター膜１７等と脱着可能としてもよい。あるいは、図示はしないが、反応基板１１と加熱部１２とを一体構造とし、これを脱着可能としてもよい。
【００３２】
加熱部１２は、反応基板１１内の各ウェルＡ１を加熱する。これによりウェルＡ１の温度制御を行なう。そして、前記ウェルＡ１の加熱温度と加熱時間とは、前記ウェルＡ１に対応する加熱部１２により個別に制御できることが望ましい。前記加熱部１２により、前記ウェルＡ１ごとに加熱温度と加熱時間を個別に制御することで、前記ウェルＡ１内の増幅反応等をより高精度で制御できる。
【００３３】
従来のリアルタイムＰＣＲ法に用いられるサーマルサイクラー等による温度制御はグラディエント機構が付加されている場合もあるが、各サンプルの温度制御が個別にできないという問題等がある。これに対して、本発明では、各ウェルＡ１にそれぞれ加熱部１２を設けることで、各ウェルを独立して温度制御することができる。更に、加熱部１２を各ウェルＡ１に対応して設けることで、増幅反応時の加熱時間について個別に制御できる。
【００３４】
加熱部１２の構造等については特に限定されないが、好適には、薄膜トランジスタ（ＴＦＴ：Thin Film Transistor）により形成され、スイッチング制御されるヒーターであることが望ましい。薄膜トランジスタが有するスイッチング機能を利用して、各ウェルＡ１の温度制御を個別に行うことができる。温度制御は、薄膜トランジスタに印加する電圧をコントロールしてソース−ドレイン間の電流値を可変としてもよいし、ソース−ドレイン間の電流を定電流電源としてコントロールしてもよい。特に、熱源としての薄膜トランジスタを用い、かつスイッチング素子としての薄膜トランジスタを用い、これらの薄膜トランジスタを同一回路内に形成することが望ましい。これにより熱源とスイッチング制御とを同一回路内で一括制御できる。
【００３５】
あるいは、加熱部１２は、発熱抵抗体で形成され、薄膜トランジスタによりスイッチング制御されるヒーターとしてもよい。即ち、薄膜トランジスタは、スイッチングとしてのみ利用してもよい。前記発熱抵抗体として、白金（Ｐｔ）、モリブデン（Ｍｏ）、タンタル（Ｔａ）、タングステン（Ｗ）、炭化珪素、モリブデンシリサイド、ニッケル−クロム合金、鉄−クロム−アルミニウム合金等を用いることができる。この場合は、発熱抵抗体に流れる電流値を制御することで、温度制御が可能となる。
【００３６】
本発明において用いられる薄膜トランジスタの種類については、特に限定されず、例えば、ポリ珪素や、α−珪素等のタイプを適宜使用できる。
【００３７】
本発明では、ウェルＡ１の温度制御を行なうためにペルチェ素子１３を備えることが望ましい。ペルチェ素子でウェル全体の温度制御を行ない、各加熱部１２において各ウェルＡ１の温度をより精密に制御することができる。これにより、各ウェルＡ１の微小な温度のばらつきやズレ等を正確に制御できる。ペルチェ素子１３を用いることで、定温制御を容易に行うことができる。その結果、高精度の温度制御を行なうことができる。
【００３８】
また、ＰＣＲサイクルを行う場合には、「熱変性→アニーリング（プライマーのハイブリダイゼーション）→伸長反応」のステップに応じて温度制御を行なう必要がある。例えば、予め、ウェルＡ１内の温度をＰＣＲサイクルの最低温度（例えば、５５℃）に維持しておくことができる。そして、ペルチェ素子１３によってウェル全体の温度サイクルを制御し、更に各加熱部１２によって各ウェルＡ１の温度のばらつきやズレを個別に補正・制御することができる。このようにウェル全体の温度制御と、各ウェル個別の温度制御をそれぞれ行なうことで、より正確な温度制御を行なうことができる。
【００３９】
本発明では、前記複数のウェルＡ１全てに特定波長の励起光を照射可能な光学手段として、光源１４や、励起光を各ウェルＡ１に導入するための導光板１５を用いることができる。
【００４０】
光源１４は、特定波長の光を発光するものであればよく、その種類は特に限定されないが、好適には、白色もしくは単色の発光ダイオード（ＬＥＤ）を用いることが望ましい。発光ダイオードを用いることで、不要な紫外線や赤外線を含まない光を簡便に得ることができる。
【００４１】
本発明では、光源１４の設置場所や光源数については特に限定されない。図示はしないが、各ウェルＡ１に対応するように光源１４を複数設け、各光源１４が対応するそれぞれのウェルＡ１に向かって励起光を直接照射する構造としてもよい。この場合、例えば、各ウェルＡ１を光源１４で直接照射できるため、励起光量をより多くとることや励起光量を個別に制御してすべてのウエルに均一な励起照射を行うことができる。
【００４２】
導光板１５は、光源１４から発せられる励起光Ｌ１を反応基板１１内の各ウェルＡ１に導くためのものである。前記導光板１５内部のスペーサー１５１に光源１４から発せられる励起光Ｌ１が導入される。そして、前記導光板１５上部には反射膜１５２が設けられており、例えば、ダイクロックミラー等を用いることで反応基板１１へ励起光Ｌ２を導入することができる。これにより、各ウェルＡ１内の反応液中の蛍光物質を均一な光量で励起させることができる。
【００４３】
また、本発明では、導光板１５の底部に、前記励起光Ｌ１，Ｌ２の波長光のみを透過するフィルター膜１５３を設けることが望ましい。これにより、光源１４から発せられる光から励起光Ｌ２を効率よく取り出し、ウェルＡ１へ導くことができる。このフィルター膜１５３としては、例えば偏光フィルター等を用いることもできる。
【００４４】
蛍光検出部１６は、ウェルＡ１に照射された励起光Ｌ２に応答して、インターカレートしたプローブ中の蛍光色素が励起することで発せられる蛍光を検出・測定する。本発明では、前記蛍光検出部１６の構成等については限定されず、例えば、フォトダイオードを用いることができる。
【００４５】
蛍光検出部１６は、加熱部１２と同じガラス基板１５上に形成されているが、異なる基板に形成されても良いし、加熱部１２と蛍光検出部１６とが積層された状態であってもよい。
【００４６】
本発明では、各ウェルＡ１とこれに対応する各蛍光検出部１６との間に、前記蛍光Ｌ３の波長光のみを透過するフィルター膜１７を設けることが望ましい。所定の波長光のみを透過するフィルター膜１７を、ウェルＡ１と蛍光検出部１６との間に設けることで、検出した蛍光Ｌ３を効率よく取り出すことができるため、より高精度の分析を行なうことができる。このフィルター膜１７としては、例えば偏光フィルター等を用いることができる。
【００４７】
このように、本発明に係る核酸増幅装置１は蛍光検出部１６を有するため、リアルタイムで蛍光検出できる。そして、蛍光検出部１６を各ウェルＡ１に対応して個別に設けることで、ウェルＡ１ごとに個別かつ高精度の検出が可能となる。
【００４８】
そして、リアルタイムでの蛍光検出が可能であるため、蛍光検出部１６の検出結果を、加熱部１２の温度制御機構にフィードバックすることができる。例えば、蛍光検出部１６で検出したウェルＡ１での反応結果（遺伝子増幅量）に基づいて、加熱部１２の加熱量を制御するように設計できる。このように、蛍光検出部１６の検出結果を、加熱部１２にフィードバックすることで、各ウェルＡ１の遺伝子増幅反応をより高精度に制御できる。
【００４９】
また、加熱部１２や蛍光検出部１６を、測定基板１８上に設けることができる。また、本発明では、前記測定基板１８を設ける位置は、前記加熱部１２や前記蛍光検出部１６の下方に限定されず、適宜好適な場所に設けることができる。本発明で用いられる前記測定基板１８の材料等については、特に限定されず、例えばガラス製基板や種々の樹脂製基板等を用いることができる。
【００５０】
本発明に係る核酸増幅装置１では、通常用いられているＰＣＲ法を行なうことができる。具体的には、（１）増幅させたい目標ＤＮＡ、（２）目標ＤＮＡと特異的に結合する少なくとも２種のオリゴヌクレオチドプライマ−、（３）緩衝液、（４）酵素、（５）ｄＡＴＰ，ｄＣＴＰ，ｄＧＴＰ，ｄＴＴＰのようなデオキシリボヌクレオチド三リン酸、等を用い、「熱変性→アニーリング（プライマーのハイブリダイゼーション）→伸長反応」のサイクルを繰り返すことで、前記目標ＤＮＡを所望する量まで増幅させること等ができる。
【００５１】
以下、本発明に係る核酸増幅装置１を用いた測定手順の一例について説明する。
【００５２】
各ウェルＡ１には、予め設計された異なる塩基配列を有するプライマーを投入する。投入方法については、特に限定されず、例えば、インクジェット等を用いる方法によることができる。このように各ウェルＡ１に各プライマーを含む溶液を滴下して乾燥させる。
【００５３】
続いて、検体から抽出したTotal ＲＮＡを逆転写（reverse transcription）法によりｃＤＮＡに転写して、各ウェルＡ１に投入する。これと併せて、増幅に必要となる各塩基の原材料となるデオキシヌクレオチド三リン酸（ｄＮＴＰ）、インターカレータ（「ＳＹＢＲ（登録商標）Ｇｒｅｅｎ Ｉ」）、ＤＮＡ伸長増幅反応に必要な酵素ＤＮＡポリメラーゼ等を投入する。
【００５４】
本発明に係る核酸増幅装置１は、ＲＴ−ＰＣＲ反応（Reverse Transcriptase Polymerase Chain Reaction；逆転写ポリメラーゼ連鎖反応）を行うリアルタイムＰＣＲ装置としても用いることができる。通常のＰＣＲ法ではＤＮＡポリメラーゼを用いるため、解析対象がＲＮＡである場合は増幅できない。これに対して、ＲＴ−ＰＣＲ法は、ＲＮＡを逆転写酵素によってＤＮＡに逆転写した後、ＰＣＲを行う方法であるが、本発明に係る核酸増幅装置１によればＲＴ−ＰＣＲ反応であっても行なうことができる。
【００５５】
また、ＰＣＲ法において目的としないＤＮＡ断片が増幅されることを防ぐために入れ子プライマー（nested primer）を用いてもよい（nested−PCR法)。そして、本発明に係る核酸増幅装置１においてＰＣＲ法を行う場合には、ＲＴ−ＰＣＲ法やnested−ＰＣＲ法を併用してもよいことは勿論である。
【００５６】
熱変性ステップでは、ウェルＡ１内が９５℃となるように加熱部１２等により設定し、二本鎖のＤＮＡを変性させ一本鎖ＤＮＡにする。続くアニーリングステップでは、ウェルＡ１内が５５℃となるように設定することで、プライマーが前記一本鎖ＤＮＡと相補的な塩基配列と結合させる。次のＤＮＡ伸長ステップでは、ウェルＡ１内が７２℃となるように設定することで、プライマーをＤＮＡ合成の開始点として、ポリメラーゼ反応を進行させてｃＤＮＡを伸長させる。
【００５７】
このような「９５℃（熱変性）→５５℃（プライマーのハイブリダイゼーション）→７２℃（ＤＮＡ伸長）」の温度サイクル毎に、各ウェルＡ１内のｃＤＮＡは２倍量に増幅されていく。そして、各ウェルＡ１にそれぞれ設置された加熱部１２によって、各ウェルＡ１内の温度を設計したプライマー反応の最適値に制御できる。また、プライマーのハイブリダイゼーション時間やポリメラーゼ反応時間も制御できるため、不要な反応副産物の生成も制御できる。その結果、各ウェルＡ１内の遺伝子（ｃＤＮＡ）の増幅率を一定に揃えることができるため、精度のよいＰＣＲ反応を行なうことができる。
【００５８】
ＤＮＡの複製反応時に生成されたｄｓ−ＤＮＡには、ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ Ｉがインターカレートする。このＳＹＢＲ ＧＲＥＥＮ Ｉは、ｄｓ−ＤＮＡにインターカレートし、その後に励起光Ｌ２を照射することで励起して蛍光を発光する物質である（励起光波長：４９７ｎｍ、発光波長：５２０ｎｍ）。
【００５９】
これにより、ＤＮＡポリメラーゼによるＤＮＡ複製時に、光源１４からの光Ｌ１が導光板１５を経由して励起光Ｌ２として、インターカレートしたＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ Ｉを励起させて蛍光Ｌ３を発光させる。この蛍光Ｌ３の発光量を前記温度サイクル毎に蛍光検出部１１で測定し、定量化する。そして、温度サイクル数とこれに対応する発光量との相関関係に基づいて、遺伝子発現量として初期ｃＤＮＡ量を求めることができる。
【００６０】
図２は、本発明に係る核酸増幅装置の第２実施形態を側面視した概念図である。以下、第１実施形態との相違点を中心に説明し、共通する部分についてはその説明を割愛する。
【００６１】
図２において符号２で示された核酸増幅装置は、反応基板２１と、前記反応基板２１を加熱する加熱部２２と、ペルチェ素子２３と、光源２４と、前記反応基板２１に励起光を導く導光板２５と、蛍光を検出する蛍光検出部２６と、測定基板２７と、を備えている。
【００６２】
この核酸増幅装置２は、ウェルＡ２ごとに加熱部２２や蛍光検出部２６を備えている点では、第１の実施形態と共通する。しかし、励起光Ｌ２を反応基板２１の下方から照射して、ウェルＡ２内で反射させて蛍光Ｌ３を検出する点等で相違する。ここで、ウェルＡ２の形状は、前記蛍光Ｌ３を反射させるために曲面部分を有している。
【００６３】
核酸増幅装置２では、光源２４から発せられる励起光Ｌ１が、導光板２５によってウェルＡ２に照射される。導光板２５では、スペーサー２５１を励起光Ｌ１が通過し、反射膜２５２とフィルター膜２５３により反応基板２１に励起光Ｌ２が導入される。そして、該励起光Ｌ２は、ウェルＡ２内の反応液中のプローブの蛍光物質に照射されることで蛍光Ｌ３を発する。この蛍光Ｌ３はウェルＡ２内の壁面で反射して、ウェルＡ２下方に設けられた蛍光検出部２６で検出・測定される。
【００６４】
また、温度制御は、ウェルＡ２下方に設けられた加熱部２２により行われ、ペルチェ素子２３等によって制御することができる。
【００６５】
一般的なリアルタイムＰＣＲ装置では、「熱変性→アニーリング→伸長反応」からなるサイクルを３０サイクル程度行なうために２５〜３０分の反応時間を要する。その際、約２℃／秒の温度制御を行っている。これに対して、本発明の装置では、２０℃以上／秒の温度制御が可能であるため、１サイクルあたり４０秒程度の時間短縮が可能となり、３０サイクル全体ではおよそ２５分以下の反応時間が達成できる。
【００６６】
本発明に係る核酸増幅装置では、ウェルごとに加熱部と蛍光検出部とを設置することで、各ウェルを独立して加熱温度・加熱時間を制御でき、かつ個別に検出することができる。これにより、遺伝子の発現量等について、短時間でありながら高精度で解析することができる。
【００６７】
更に、蛍光検出部として、励起光学系も一体化した装置とすることで、検出システムとしても小型化が可能である。また、前記ウェルをマイクロ空間とし、反応領域を小さくすること等によって、小さなデバイスでありながら網羅的な解析を効率よく行なうこともできる。これにより、本発明に係る核酸増幅装置では網羅的な解析が可能となる。
【００６８】
本発明に係る核酸増幅装置は、核酸増幅反応を等温で実施する等温核酸増幅装置としても用いることができる。この「等温」とは、使用する酵素やプライマー等が実質的に機能し得るほぼ一定の温度条件とすることをいう。そして、「ほぼ一定の温度条件」とは、設定された温度を厳密に保持することのみならず、使用する酵素及びプライマーの実質的な機能を損なわない程度の温度変化であれば許容される温度範囲内に保持することも包含する。
【００６９】
本発明において、先に説明したＰＣＲ法以外にも、以下に挙げる等温増幅法を用いることができる。
ｄｓＤＮＡからＲＮＡを増幅産物として得るＩＶＴ法（In Vitro Transcription）；
逆転写酵素のＲＮａｓｅＨ活性を用いてＲＮＡをトリミングし、ＲＮＡを増幅産物として得るＴＲＣ法（Transcription Reverse transcription Concerted amplification）；
逆転写酵素等を用いてＲＮＡプロモーターが組み込まれたｄｓＤＮＡとし、次にＲＮＡポリメラーゼを用いてｄｓＮＤＡからＲＮＡを増幅産物として得るＮＡＳＢＡ法（Nucleic Acid Sequence-Based Amplification）；
ＲＮＡとＤＮＡのキメラ構造からなるプライマーを利用し、ＲＮＡからｓｓＤＮＡを増幅産物として得るＳＰＩＡ法；
ＤＮＡのループ形成を利用し、一定温度でＤＮＡやＲＮＡからｄｓＤＮＡを増幅産物として得るＬＡＭＰ法（Loop-Mediated Isothermal Amplification）；
複数の酵素を組み合わせて用い、一塩基の違い（ＳＮＰ）を正確に識別しながらｄｓＤＮＡからｄｓＤＮＡを増幅産物として得るＳＭＡＰ法（SMart Amplification Process）；
ＤＮＡとＲＮＡが結合した合成キメラ・プライマーを用いて、ｄｓＤＮＡからｄｓＤＮＡを増幅産物として得るＩＣＡＮ法（Isothermal and Chimeric primer-initiated Amplification of Nucleic acids）等が挙げられる。
【００７０】
なお、本発明において行い得る等温増幅法は、上記の等温増幅法に限定されず、上記の各手法についても上記内容に限定して解釈されるものでないことは勿論である。即ち、本発明において行い得る等温増幅法とは、何らかの温度サイクルを行わずに核酸を増幅させるあらゆる方法を包含するものである。
【００７１】
等温増幅法は、前述のＰＣＲ法のような温度サイクル（例えば、９５℃→５５℃→７２℃）を必要としないため、サーマルサイクラーのような装置が不要であるといった利点を有している。しかし、増幅される核酸の構造や差長等に依存した増幅率の違いが生じるため、定量的な解析を行なうことが困難であった。
【００７２】
これに関して、本発明に係る核酸増幅装置によれば、各ウェルの反応温度を個別に制御することで各ウェルにおける核酸の増幅率の違いを補正できる。これにより、各ウェルにおける核酸増幅反応の反応効率を一定に揃えることができる。その結果、複数のウェルで複数の核酸増幅反応を行う場合であっても、一の検量線により各ウェルでの核酸の増幅量を定量的に知ることができる。従って、本発明に係る核酸増幅装置では発現量の定量的な解析ができる。
【００７３】
更に、所定の核酸増幅反応を行なうにあたり、その適切な反応温度条件が未知である場合であっても、増幅反応の初期の結果から適切な反応温度をフィードバックすることで、核酸増幅反応の反応効率を一定に揃えることができる。まず、増幅反応開始から一定時間内において、その増幅量とその際の温度の相関関係を検出する。そして、その結果を加熱部の温度制御機構にフィードバックすることで、増幅反応を行なうための適切な反応温度条件を決定することができる。
【００７４】
定量反応を行なう場合には、等温増幅法はその適用がＰＣＲ法と比較して困難である。その主な理由としては、増幅される核酸の構造や差長等による増幅率の違いが大きいことである。核酸増幅反応を用いた定量解析では、増幅率が一致した対照と比較する必要があるため、このような増幅率の違いは定量解析を困難にしている。特に、同時に多種類の遺伝子を定量する場合には、目標とする遺伝子ごとに検量線を作成することは困難であり、増幅率が一致したもの同士で比較する必要がある。
【００７５】
これに対して、本発明に係る核酸増幅装置では、等温増幅法により核酸増幅させる場合であっても、増幅する個々の遺伝子やプライマー等に応じた最適温度で増幅反応を行うことができる。従って、各ウェルにおける核酸の増幅率を一定となるように制御できる。その結果、等温増幅法であっても精度の高い定量分析を行なうことが可能となる。
【００７６】
そして、等温で反応を行なうため、温度サイクルを制御するサーマルサイクラー等の構成が不要である。そのため、デバイスとしての小型化にもより貢献できる。そして、同一デバイス上で多種類の遺伝子の量を網羅的に解析することが可能となる。従って、本発明に係る核酸増幅装置は、マイクロ流路を備えたチップや基板等の形態として、ここで等温増幅法を行うことができるハイスループット型の遺伝子解析装置とすることもできる。
【図面の簡単な説明】
【００７７】
【図１】本発明に係る核酸増幅装置の第１実施形態を側面視した概念図である。
【図２】本発明に係る核酸増幅装置の第２実施形態を側面視した概念図である。
【符号の説明】
【００７８】
１，２ 核酸増幅装置
１１，２１ 反応基板
１２，２２ 加熱部
１３，２３ ペルチェ素子
１４，２４ 光源
１５，２５ 導光板
１６，２６ 蛍光検出部
１７ フィルター膜
１８，２７ 測定基板
【特許請求の範囲】
【請求項１】
核酸増幅反応を行なう核酸増幅装置であって、
前記核酸増幅反応を行なうウェルを複数備え、
前記ウェルごとに設けられた加熱部と、
前記複数のウェル全てに特定波長の励起光を照射可能な光学手段と、
前記ウェルごとに設けられた蛍光検出部と、
を少なくとも備えた核酸増幅装置。
【請求項２】
前記核酸増幅反応は、少なくともＰＣＲ（polymerase chain reaction）法により行なわれることを特徴とする請求項１記載の核酸増幅装置。
【請求項３】
前記核酸増幅反応は、等温で行われることを特徴とする請求項１記載の核酸増幅装置。
【請求項４】
前記ウェルの加熱温度と加熱時間は、前記ウェルに対応する前記加熱部により個別に制御されることを特徴とする請求項１記載の核酸増幅装置。
【請求項５】
前記加熱部は、薄膜トランジスタにより形成され、スイッチング制御されることを特徴とする請求項１記載の核酸増幅装置。
【請求項６】
前記加熱部は、発熱抵抗体により形成され、薄膜トランジスタによりスイッチング制御されることを特徴とする請求項１記載の核酸増幅装置。
【請求項７】
定温制御するペルチェ素子を備えることを特徴とする請求項１記載の核酸増幅装置。
【請求項８】
前記光学手段は、特定波長の励起光を発する光源と、前記励起光を各ウェルに導入する導光板と、を少なくとも備えることを特徴とする請求項１記載の核酸増幅装置。
【請求項９】
前記ウェルと前記蛍光検出部との間に、特定の波長の光を透過するフィルター膜を備えることを特徴とする請求項１記載の核酸増幅装置。
【請求項１０】
前記ウェルと前記導光板との間に、特定の波長の光を透過するフィルター膜を備えることを特徴とする請求項８記載の核酸増幅装置。
【請求項１１】
前記光源が、発光ダイオードであることを特徴とする請求項８記載の核酸増幅装置。
【請求項１】
核酸増幅反応を行なう核酸増幅装置であって、
前記核酸増幅反応を行なうウェルを複数備え、
前記ウェルごとに設けられた加熱部と、
前記複数のウェル全てに特定波長の励起光を照射可能な光学手段と、
前記ウェルごとに設けられた蛍光検出部と、
を少なくとも備えた核酸増幅装置。
【請求項２】
前記核酸増幅反応は、少なくともＰＣＲ（polymerase chain reaction）法により行なわれることを特徴とする請求項１記載の核酸増幅装置。
【請求項３】
前記核酸増幅反応は、等温で行われることを特徴とする請求項１記載の核酸増幅装置。
【請求項４】
前記ウェルの加熱温度と加熱時間は、前記ウェルに対応する前記加熱部により個別に制御されることを特徴とする請求項１記載の核酸増幅装置。
【請求項５】
前記加熱部は、薄膜トランジスタにより形成され、スイッチング制御されることを特徴とする請求項１記載の核酸増幅装置。
【請求項６】
前記加熱部は、発熱抵抗体により形成され、薄膜トランジスタによりスイッチング制御されることを特徴とする請求項１記載の核酸増幅装置。
【請求項７】
定温制御するペルチェ素子を備えることを特徴とする請求項１記載の核酸増幅装置。
【請求項８】
前記光学手段は、特定波長の励起光を発する光源と、前記励起光を各ウェルに導入する導光板と、を少なくとも備えることを特徴とする請求項１記載の核酸増幅装置。
【請求項９】
前記ウェルと前記蛍光検出部との間に、特定の波長の光を透過するフィルター膜を備えることを特徴とする請求項１記載の核酸増幅装置。
【請求項１０】
前記ウェルと前記導光板との間に、特定の波長の光を透過するフィルター膜を備えることを特徴とする請求項８記載の核酸増幅装置。
【請求項１１】
前記光源が、発光ダイオードであることを特徴とする請求項８記載の核酸増幅装置。
【図１】
【図２】
【図２】
【公開番号】特開２００８−２３７２０７（Ｐ２００８−２３７２０７Ａ）
【公開日】平成２０年１０月９日（２００８．１０．９）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００７−２２３４９４（Ｐ２００７−２２３４９４）
【出願日】平成１９年８月３０日（２００７．８．３０）
【出願人】（０００００２１８５）ソニー株式会社 (34,172)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２０年１０月９日（２００８．１０．９）
【国際特許分類】
【出願日】平成１９年８月３０日（２００７．８．３０）
【出願人】（０００００２１８５）ソニー株式会社 (34,172)
【Ｆターム（参考）】
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