核酸担持ウイルス様粒子を用いた遺伝子発現の下方制御
本発明は、真核細胞へのＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）誘導分子の導入のためのウイルス様粒子の組成物、及びＲＮＡｉ誘導分子による複数の真核細胞の細胞型特異的な形質導入の方法に関する。本発明はさらに、少なくとも１つの内因性遺伝子の発現比率の増加、並びに／又は少なくとも１つの内因性遺伝子及び／若しくは外来核酸、特にウイルス核酸の望ましくない発現に関連した疾患若しくは疾患状態の診断、予防及び／若しくは治療の方法に関する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、真核細胞へのＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）誘導分子の導入のためのウイルス様粒子の組成物、及びＲＮＡｉ誘導分子による複数の真核細胞の細胞型特異的な形質導入の方法に関する。本発明はさらに、少なくとも１つの内因性遺伝子の発現比率の増加に、並びに／或いは少なくとも１つの内因性遺伝子及び／又は外来核酸、特にウイルス核酸の望ましくない発現に関連した疾患若しくは疾患状態の診断、予防及び／又は治療の方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
現在知られている遺伝子治療方法は、所望の遺伝子産物、主に治療上有効なタンパク質をコードするＤＮＡ構築物による細胞のトランスフェクションに基づいている。これによって使用される方法は、通常ｉｎ ｖｉｔｒｏでの方法に適している。細胞の自然環境からの事前に単離せずに特異的な細胞型のターゲット・トランスフェクション、即ち選択的トランスフェクションを行うことは、例えば電気穿孔又はリポソームトランスフェクションのような最先端の方法の多くでは実現され得ない。
【０００３】
ｉｎ ｖｉｖｏでの組織特異的なＤＮＡトランスファーに関する方法はこれまでのところ、ウイルストランスファー系に依存している。それにも関わらず、細胞配列（ｃｅｌｌｕｌａｒ ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ）での組換えの潜在的な危険性に起因して、これらは、ほぼ予測することができない安全上のリスクを負う。治療用遺伝子の輸送にとって現在好ましい系であるアデノウイルス及びアデノ随伴ウイルスの繰り返しのｉｎ ｖｉｖｏでの適用は、大部分の患者におけるそれらの高い免疫原性のため不可能である。さらに、アデノウイルスの複雑な構造及びアデノウイルスゲノムの構造に起因して、標的部位で治療用ＤＮＡを十分な程度に且つ適切な形態で供給することは、相当な尽力によってのみ可能である。
【０００４】
特に、望ましくない組換え、及び永続的にゲノムを改変させることに伴う危険性を考慮すると、遺伝子治療方法は、例えば急性感染のような一過的に生じる疾患状態の治療に関して検討することができなかった。例えばリポソーム及びＤＮＡ縮合分子のような非ウイルス系は、実際にこれらの欠点を回避したが、今度はレトロウイルス系と同様に、かなり低いトランスファー効率及び標的細胞特異性を示した。
【０００５】
したがって、これらの問題を回避するために、臨床上適用可能な遺伝子治療用組成物及び方法を提供する必要がある。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明の目的は、標的細胞の細胞ゲノムの完全性を維持すると同時に、ｉｎ ｖｉｖｏ及びｉｎ ｖｉｔｒｏの両方における真核細胞への遺伝子治療上有効な分子の高い効率での細胞型特異的な導入を可能にする組成物を提供することであった。本発明のさらなる目的は、病原性感染症の治療に関する、又は改変された遺伝子発現に関連する疾患症状の治療及び／若しくは診断に関する非常に効率的な方法を提供することであった。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明によれば、これらの目的は、少なくとも１つのウイルスキャプシドタンパク質の幾つかの分子で構成されるウイルス様粒子（「ウイルス様粒子」；ＶＬＰ）を含む組成物であって、少なくとも１つのＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）誘導分子が上記ＶＬＰ中に含まれることを特徴とする組成物により解決された。標的細胞へのトランスファー後に、ＲＮＡｉ誘導分子は、所定の遺伝子の発現の有効な下方制御を引き起こす。
【０００８】
ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）は、１つ又は複数の遺伝子の発現を下方制御するための進化的に保存されたメカニズム（「遺伝子サイレンシング」）である。複数の真核生物は、ウイルスに対するＲＮＡｉ及びトランスポゾンエレメントの発現を用いて自身を防御することが可能である。ＲＮＡｉを用いた遺伝子発現の下方制御の原理は、一方では、例えば２１ヌクレオチド〜２８ヌクレオチドを含む短ＲＮＡ分子、いわゆる低分子干渉ＲＮＡ分子（「低分子干渉ＲＮＡ」、ｓｉＲＮＡ）と転写産物との相互作用に基づく、標的遺伝子の転写により産生されるＲＮＡ（特にｍＲＮＡ）の配列特異的な分解に基づく。ＲＮＡ分解酵素ＩＩＩ ダイサーにより触媒されて、ｍＲＮＡ分子の標的分解はまず、前駆分子からの二重鎖ｓｉＲＮＡ分子の形成、及びこれらの分子の続くプロセシングに始まり、続いて二重鎖ｓｉＲＮＡの一方の鎖とｍＲＮＡ分子とのハイブリダイゼーションが行われ、二重鎖ｓｉＲＮＡ−ｍＲＮＡハイブリッド分子を形成する。次に、ｓｉＲＮＡとハイブリダイズした領域内部のｍＲＮＡの切断が起きる。それぞれこの切断又は加水分解はまず、ヌクレオチド鎖の内部切断的に行われる（例えば、ＲＩＳＣ複合体のエンドヌクレアーゼアルゴノート２により触媒される）。最終的に、このようにして生成される切断産物は、ＲＩＳＣ複合体のエキソヌクレアーゼにより加水分解される。ｍＲＮＡ転写産物の標的分解の原因として、標的遺伝子の発現が少なくとも部分的に抑制される。
【０００９】
他方で、遺伝子の発現はまた、翻訳レベルで下方制御することができる。これを担うエフェクター分子はマイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）と称され、これは、前駆ＲＮＡのヘアピン構造（「ヘアピン」）から始まって、エンドヌクレアーゼのドローシャ、パシャ(Pasha)及びダイサーを含む幾つかのプロセシング工程を経て形成される。標的ｍＲＮＡとのｍｉＲＮＡの部分的相補性のため、ｍｉＲＮＡは、その翻訳を阻害する。
【００１０】
細胞培養に関する研究により、それぞれ外因的に供給されるｓｉＲＮＡ又はｍｉＲＮＡはまた、ヒト細胞を含む真核細胞（例えば、哺乳類細胞）においてＲＮＡ干渉を誘導することができることが示されている。低いトランスファー効率のため、真核細胞へＲＮＡｉ誘導分子を導入する従来の方法は、病原性ウイルスによる感染症の治療に関する、若しくは改変された遺伝子発現に関連する疾患の治療に関する治療上のアプローチとしてのこのメカニズムの使用を可能にしないか、又は非常に限られた程度でしか可能にしない。
【００１１】
ＲＮＡｉ誘導分子は、標的ＲＮＡのプロセシング、即ち標的ＲＮＡの分解を引き起こすために、少なくとも１つのポリヌクレオチド鎖が、標的ＲＮＡ（好ましくは標的ｍＲＮＡ）に対して十分に相補的である配列を有するＲＮＡ分子を意味するものとする。ＲＮＡｉ誘導性であるためには、ＲＮＡｉ誘導分子と標的ＲＮＡの領域との間の相補性が、ハイブリダイゼーション及び続くプロセシングを達成するために十分であることが要される。例えば、相補性は、少なくとも８０％、好ましくは少なくとも９０％、最も好ましくは少なくとも９９％であり、ここで５’末端及び／又は３’末端にて、並びにＲＮＡｉエフェクター分子のオーバーハングにて、標的ＲＮＡに対して相補的ではないヌクレオチドもまた存在し得る。
【００１２】
ＲＮＡｉを誘導するために、幾つかの経路をたどることができる。それによって、エフェクター分子、即ちｓｉＲＮＡ分子及び／又はｍｉＲＮＡ分子の直接的なトランスファーは、１つの可能性を表す。ｓｉＲＮＡ分子は好ましくは、１９ヌクレオチド〜３０ヌクレオチド、好ましくは２０ヌクレオチド〜２８ヌクレオチドの長さを有する、特に好ましくは単鎖それぞれが２１ヌクレオチド〜２３ヌクレオチドの長さを有する二重鎖ＲＮＡ分子を意味するものとする。ｓｉＲＮＡ分子はまた、１９ヌクレオチド〜３０ヌクレオチド、好ましくは２０ヌクレオチド〜２８ヌクレオチドの長さを有する、特に好ましくは２１ヌクレオチド〜２３ヌクレオチドの長さを有する単鎖ＲＮＡ分子を意味し、ここで単鎖ＲＮＡ分子は、標的ＲＮＡ、特に標的ｍＲＮＡの配列に対して、少なくとも８０％、好ましくは少なくとも９０％、特に９９％を上回って相補的であり、また標的ＲＮＡへのｓｉＲＮＡの結合は、配列特異的な分解を達成する。好ましくは、ｓｉＲＮＡ分子は、１ヌクレオチド〜３ヌクレオチドの３’側のオーバーハングを有する。
【００１３】
ｍｉＲＮＡは、１９ヌクレオチド〜３０ヌクレオチド、好ましくは２０ヌクレオチド〜２８ヌクレオチドの長さを有する、特に好ましくは２１ヌクレオチド〜２３ヌクレオチドの長さを有する単鎖ＲＮＡｉ誘導分子を意味するものとし、これは、標的ｍＲＮＡとのハイブリダイゼーション後に、それらの分解を達成することができるとともに、翻訳の阻害を達成することができる。
【００１４】
或いは、標的細胞のｓｉＲＮＡ／ｍｉＲＮＡ生合成装置に関する基質として機能する実際の有効なエフェクター分子の前駆分子、即ちｓｉＲＮＡ及び／又はｍｉＲＮＡの前駆分子を供給することも可能である。これらとしては、例えば、それぞれエンドヌクレアーゼ（例えば、ダイサー、ドローシャ及び／又はパシャ）によりｓｉＲＮＡ分子又はｍｉＲＮＡ分子へプロセシングされるＲＮＡ前駆分子（例えば、二重鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ））又は短ヘアピンＲＮＡ分子（ｓｈＲＮＡ）が挙げられる。これに関して、例えば、２７ヌクレオチドを上回る、好ましくは３０ヌクレオチド〜約１００ヌクレオチド又はそれ以上の長さを有するｄｓＲＮＡ分子又は短ヘアピンＲＮＡ分子（ｓｈＲＮＡ）、最も好ましくは３０ヌクレオチド〜５０ヌクレオチドの長さを有するｄｓＲＮＡ分子が使用され得る。
【００１５】
この他に、ＤＮＡベースのＲＮＡｉアプローチを用いてＲＮＡｉ誘導分子を標的細胞へ導入することも可能である。これに関して、ｄｓＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ及び／又はｍｉＲＮＡをコードするＤＮＡ構築物が創出され、ここでコードエレメントは、標的細胞中でｄｓＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ及び／又はｍｉＲＮＡの発現を可能にする調節エレメントの制御下にある。かかる制御エレメントの例は、ポリメラーゼＩＩプロモーター又はポリメラーゼＩＩＩプロモーター（例えば、Ｕ６又はＨ１）である。
【００１６】
驚くべきことに、本発明による組成物を使用して、最も多様な種類のＲＮＡｉ誘導分子を、細胞型特異的な態様で非常に高い効率で標的細胞へ導入することができることが今回見出された。それによって、本発明による組成物を用いて導入されるＲＮＡｉ誘導分子は、病原性生物の核酸の発現により、又は内因性遺伝子の発現の増加若しくは望ましくない発現により引き起こされる疾患若しくは疾患状態の治療、診断及び／又は予防におけるＲＮＡ干渉のメカニズムの使用を今回可能にする程度にまで標的遺伝子の発現の下方制御を達成する。そのため、本発明による組成物を使用して、規定の二次構造を有するＲＮＡ分子を細胞へ導入することができ、ここで導入されるＲＮＡ分子は、それらのコンホメーションのため標的細胞のＲＮＡｉ生合成装置に関する基質として機能し、その結果標的遺伝子の発現の効率的な下方制御が可能となるということは、完全に驚くべき発見であった。したがって、本発明による組成物を用いて、ｄｓＲＮＡ及びｓｈＲＮＡのようなｓｉ／ｍｉＲＮＡ前駆分子は、それらが細胞中でｓｉ／ｍｉＲＮＡ生成酵素複合体により基質として認識されて、標的遺伝子の発現の配列特異的な下方制御のエフェクター分子へ効率的にプロセシングされるように標的細胞へ導入させることができる。さらに、ＤＮＡウイルスに由来するＶＬＰでさえも、それぞれ標的細胞へのｓｉＲＮＡ若しくはｍｉＲＮＡ、又はそれらの前駆分子（例えば、ｄｓＲＮＡ若しくはｓｈＲＮＡ）のトランスファーに使用することができることは驚くべきことであった。
【００１７】
さらに、ＲＮＡｉ誘導分子はまた、蛍光基及び／若しくは３’−ｄＴｄＴオーバーハングのような５’並びに／又は３’修飾を含み、真核細胞における所定の遺伝子の発現の下方制御に影響を及ぼす修飾ＲＮＡ分子を包含するものとする。
【００１８】
本発明によれば、ＲＮＡｉ誘導分子はさらに、ヌクレオチド配列中に１つ又は幾つかのリボヌクレオチドを有する類似体を含み、真核細胞における所定の遺伝子の発現の下方制御に影響を及ぼすＲＮＡ分子を意味するものとする。これらのリボヌクレオチド類似体は、例えばＲＮＡ分子の構造安定性又はリボヌクレアーゼに対する安定性を増大させることができる。リボヌクレオチド類似体は当業者に既知であり、元のＲＮＡ分子と比較して、塩基修飾、糖修飾（例えば、リボースの２’−ＯＨ基の修飾）及び／又はリン酸骨格修飾により修飾される。
【００１９】
したがって、ＶＬＰ内に、単一型のＲＮＡｉ誘導分子、即ちｓｉＲＮＡ、ｄｓＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ若しくはｍｉＲＮＡ又はそれらの前駆分子、又はコードＤＮＡがパッケージングされ得る。それにもかかわらず、異なるタイプのＲＮＡｉ誘導分子もまた、ＶＬＰ中に含まれ得る。本発明による組成物のＲＮＡｉ誘導分子は、１つ又は幾つかの標的遺伝子に対して、且つ／又は単一標的遺伝子の同じ配列若しくは異なる配列に対して作用し得る。
【００２０】
本明細書において、「遺伝子に対して作用する」という用語は、ＲＮＡｉ誘導分子が標的遺伝子のＲＮＡ分子、好ましくはｍＲＮＡ分子の配列特異的な分解に関する配列情報を含むものとして使用されるものとする。
【００２１】
本発明によれば、ＲＮＡｉ誘導分子は、１つ又は幾つかの遺伝子に対して作用することができ、その遺伝子の発現は下方制御されることになる。好ましくは、本発明による組成物のＲＮＡｉ誘導分子は、発現が活性化している遺伝子に対して作用し、その発現は病的状態と相関する。
【００２２】
特に好ましくは、本発明による組成物は、病原体、例えば病原性ウイルスの少なくとも１つの遺伝子に対して作用するＲＮＡｉ誘導分子を含有する。さらに、本発明による組成物は、少なくとも１つの内因性遺伝子に対して作用するＲＮＡｉ誘導分子を含有することができ、ここで内因性遺伝子の発現及び／又は内因性遺伝子の発現の増加は、病的状態と相関する。かかる細胞内因性遺伝子に関する例は、例えば腫瘍関連遺伝子、自己免疫関連遺伝子、代謝疾患関連遺伝子、特に神経変性疾患及び一般的な神経疾患に関連する遺伝子である。さらなる例は、感染性疾患に関連する内因性遺伝子（宿主因子）並びに栄養失調症及び早老疾患に関連する遺伝子（対立遺伝子特異的、例えばエメリン、ラミンＡ／Ｃ、ＦＡＣＥ−１等）である。
【００２３】
本発明による組成物のＶＬＰは、１つのタイプのキャプシドタンパク質で、又は幾つかの異なるキャプシドタンパク質で構成され得る。好ましくは、本発明による組成物は、１つのタイプのキャプシドタンパク質で構成されるＶＬＰを含有する。特に好ましくは、そのキャプシドタンパク質が、ｉｎ ｖｉｖｏ及びｉｎ ｖｉｔｒｏの両方において適切な条件下でＶＬＰへと併せて構築するための固有の特性を有するＶＬＰが使用され、即ち、さらなる補助因子は、単量体タンパク質からのＶＬＰの形成に要されない。
【００２４】
ＶＬＰ：ＲＮＡｉ誘導分子の質量の比は通常、１：１００〜１００：１、好ましくは１：５０〜５０：１、特に好ましくは１：２０〜２０：１、最も好ましくは１：１〜２０：１の範囲で見出される。
【００２５】
好ましくは、例えば標準の(authentic)ウイルス核酸のような標準のウイルスの他の構成成分を含まないＶＬＰが使用される。ヒトＪＣウイルス（ＪＣＶ）のキャプシドタンパク質ＶＰ１で構成されるＶＬＰの使用が特に好ましい。ＪＣＶはポリオーマウイルスの属に属し、そのウイルスゲノムは、二重鎖ＤＮＡの形態でキャプシド内部に存在する。
【００２６】
特定の実施形態では、ＶＬＰは、組換え的に生産されたキャプシドタンパク質で構成される。本発明による「キャプシドタンパク質」という用語は、例えば野生型ＶＰ１のような各々のウイルスの野生型株のキャプシドタンパク質に加えて、キャプシドタンパク質の修飾形態、即ち例えば置換、挿入及び／又は欠失のような突然変異により野生型キャプシドタンパク質と異なるタンパク質も含む。組換えＶＰ１を生産するためには、好ましくは配列番号１に示されるような配列、遺伝子コードの縮重との関連からこの配列に相当する配列又はストリンジェントな条件下で上記配列とハイブリダイズする配列を有する核酸が使用され、それによって核酸配列又はこの配列を含有する組換えベクターは、適切な宿主細胞へ導入されて、宿主細胞は、核酸配列の発現が行われる条件下で培養されて、タンパク質は、細胞又は細胞上清から単離される。ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件は好ましくは、Sambrook et al. (1989) Molecular Cloning. A Laboratory Manual,Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Pressに従って規定され、６８℃にて０．１×ＳＳＣ、０．５％ ＳＤＳ中で３０分の洗浄工程を含む。
【００２７】
配列番号１による核酸によりコードされるアミノ酸配列は、配列番号２に示される。本発明では、好ましくは、配列番号２又は上記配列に対して少なくとも７０％、好ましくは少なくとも８０％、特に好ましくは少なくとも９０％、最も好ましくは少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列を含有するＶＰ１ポリペプチドが使用され、ここで同一性は配列番号２の全領域にわたって確定される。
【００２８】
さらに好ましい実施形態では、アミノ酸配列がＮ末端領域で、例えば２５のＮ末端アミノ酸領域で修飾されたＶＰ１タンパク質が使用される。その際、好ましくは、異種核局在化シグナルが、ＶＰ１のアミノ酸配列へ導入される。好ましい核局在化シグナルは、アミノ酸配列ＣＰＧＡＡＰＸ１Ｘ２Ｐ（式中、Ｘ１及びＸ２は任意のアミノ酸を意味し、好ましくはいずれの場合でもＫを意味する）を含有し、例えば、ＳＶ４０又はＢＫＶの核局在化シグナルに基づく。特に好ましい核局在化シグナルのアミノ酸配列を図４Ａに示す。
【００２９】
好適な修飾ＶＰ１タンパク質（ＶＰ１−Ｍｕｔ２）をコードする核酸配列は、配列番号３に示される。相当するアミノ酸配列は、配列番号４に示される。したがって、本発明の目的の１つは、好ましくは上述したような異種核局在化シグナルを含有する修飾ＪＣＶ−ＶＰ１タンパク質、それをコードする核酸及び少なくとも１つの適宜修飾されたＶＰ１タンパク質を含有するＶＬＰであり、ここで上記ＶＬＰは、活性剤、特に核酸だけでなく、他の分子も任意で含有することができる。
【００３０】
使用される宿主／ベクター系に応じて、組換えキャプシドタンパク質の単離は、直接的に宿主細胞から、及び／又は細胞培養上清から行われる。組換え方法の利点は、主としてＶＬＰが簡素な態様で高純度且つ大量に得られ得るという事実に存する。実際に、ＶＰ１の組換え合成では、昆虫細胞とともに、例えば昆虫細胞株Ｓｆ１５８とともにバキュロウイルスを使用することにより、発現系としてのその価値が証明されている。
【００３１】
腎臓由来及びニューロン由来の細胞に関する細胞特異的なＤＮＡ輸送並びに形質導入系としてのＶＰ１−ＶＬＰの適合性は、すでに独国特許第１０１ ３１ １４５．１号明細書に示されていた。この文献はさらに、ＶＰ１−ＶＬＰの細胞向性を系統的に修飾するためのＶＰ１−ＶＬＰの修飾に関する方法について記載しており、その結果、規定の標的細胞及び組織は選択的に形質導入され得る。
【００３２】
驚くべきことに、同様にＲＮＡｉ誘導分子、特にｄｓＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ又はそれらの前駆分子は、これらの分子の構造を変化させることなくＪＣウイルスのＶＬＰ内部でパッケージングされ得ることが今回見出された。標的細胞中でＲＮＡｉを誘導するＲＮＡｉ誘導分子は、分解及び構造的変化の両方に対してＶＬＰの内部で十分に防御されることが見出された。標的細胞という用語は、真核細胞、好ましくは多細胞生物の細胞、特に哺乳類細胞（ヒト由来の細胞を含む）を意味するものとする。
【００３３】
そのキャプシドタンパク質が本発明による組成物の構成成分であるウイルスの天然宿主スペクトルに相当する細胞へＲＮＡｉ誘導分子を導入するために、好ましくはそのキャプシドタンパク質が野生型キャプシドタンパク質に相当するＶＬＰが使用される。例えば、ＪＣＶの宿主スペクトルは、例えばオリゴデンドロサイト、アストロサイト及びグリア細胞のような神経組織の細胞並びに神経関連組織の細胞を含む。ＲＮＡｉ誘導分子がこれらの細胞に導入される場合、本発明による組成物は、好ましくはＪＣウイルスの野生型ＶＰ１キャプシドタンパク質で構成されるＶＬＰを含有する。
【００３４】
そのキャプシドタンパク質が本発明による組成物の構成成分であるウイルスの天然宿主スペクトルに相当しない細胞にＲＮＡｉ誘導分子を供給するためには、好ましくはそのキャプシドタンパク質が野生型キャプシドタンパク質と比較した場合に修飾されるＶＬＰが使用される。本発明による組成物における修飾ＶＬＰの使用は好ましくは、それぞれ特定の型の細胞に、又は特定の組織に限定される疾患の治療を可能にする。特に好ましくは、本発明による組成物は、ＪＣウイルスのＶＬＰで構成され、ここでＶＰ１−ＶＬＰの少なくとも１つのキャプシドタンパク質は、野生型ＶＰ１と比較した場合に修飾される。
【００３５】
一方で、修飾は、野生型キャプシドタンパク質のアミノ酸配列における修飾を含む。特に、挿入、欠失、置換及び／又は他のアミノ酸配列との融合がこの群に属するが、但し、自己集合に関する、即ちＶＬＰを形成することに関するキャプシドタンパク質の固有の特性は失われない。したがって、本発明による組成物のＶＬＰは、融合タンパク質の形態でキャプシド構造中に１つ又は幾つかのさらなる異種タンパク質又はタンパク質の一部を包含し得る。このことは、異種タンパク質又はタンパク質の異種部分がキャプシド構造中で固着されることを意味し、ここで好ましくはこのタンパク質の少なくとも一部は、外側から接近可能である。かかる融合タンパク質で構成されるＶＬＰは、融合部分のため、対象とされる標的細胞の特異的な表面受容体と相互作用することができる。このようにして、対象とされる標的細胞との相互作用の特異性を保証することができ、使用に応じて多数の細胞型へ調節することができる。同様に、キャプシドタンパク質の標的修飾により、ＶＬＰの向性を種々の細胞又は組織へ限定することが可能である。
【００３６】
規定のタイプの細胞に向かってＶＬＰの向性を誘導するためのさらなる可能性は、本発明による組成物のＶＬＰの化学修飾にある。ＶＬＰの化学修飾は、それぞれ特定の細胞又は組織に関するＲＮＡｉ誘導分子用のトランスファー系としての本発明による組成物の融通性の高い使用を可能にする。ＶＬＰの標的細胞特異性の標的修飾に関して、ＶＬＰ及び細胞型特異的なリガンドの結合体は有利であることが証明されている。好ましい実施形態では、少なくとも１つのリガンドは、ＶＬＰに結合されている。そのため、リガンドは基本的に任意の物質であり得る。
【００３７】
例えばリガンドは、標的細胞特異的なサブユニット、例えば細胞表面受容体に関する結合パートナーであり得る。結合パートナーに適した例は、天然リガンド又はそれらの合成類似体であり、ここでタンパク質（例えば、トランスフェリン）、抗体又は糖（例えば、マンノース）のような高分子量リガンドだけでなく、低分子量合成リガンド（例えば、トリペプチドモチーフＲ−Ｇ−Ｄ（Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ））もまた使用することができる。或いは、又はさらには、標識サブユニット、例えば適切な検出方法を用いて検出され得るサブユニット（例えば、蛍光標識サブユニット又はビオチンのような）もまたリガンドとして使用することができる。さらに、リガンドはまた、エフェクターサブユニット、例えば細胞障害性サブユニットであり得る。当然のことながら、幾つかのリガンドの組合せ、特に上述のリガンドの組合せもまた使用することができる。
【００３８】
リガンドとＶＬＰのキャプシドタンパク質との間の相互作用は、好ましくは化学アンカーサブユニットにより媒介される。そのため、特に細胞特異的なリガンドのためのアンカー分子としてのカチオンポリマーによるキャプシドタンパク質の担持は適切であると証明されている。
【００３９】
カチオンポリマーに関する具体例は、例えばポリリシンのような本質的に塩基性のアミノ酸ベースのポリマー、特にポリ−Ｌ−リシン等である。適切なカチオンポリマーに関するさらなる具体例は、ポリアルキレンアミン、ポリアルキレンイミン、好ましくはポリ−Ｃ２〜Ｃ４−アルキレンイミン、特にポリエチレンイミン（ＰＥＩ）、ｐＡＭＡＭ（ポリアミドアミン）デンドリマー及び分画デンドリマー、並びにカチオン修飾されたポリエチレングリコールである。ポリエチレンイミンは、それが無毒性であり、且つ高密度の正電荷を有するため、本発明の意味合いで特に好ましいカチオンポリマーである。さらに、ＰＥＩは、細胞への取込み後にｐＨ依存性の構造的変化を達成することが可能であり、エンドソーム細胞区画及びリソソーム細胞区画の不安定化、したがって細胞質へのＲＮＡｉ誘導分子の放出の支持につながる。このプロセスは、酸性化後にリソソーム中でプロトン化され、続いて小胞膜の浸透圧破裂につながるイミノ基の顕著な緩衝能により支持される。
【００４０】
結合体におけるＶＬＰ対カチオンポリマーの重量比は、広範囲内で様々であり得る。したがって、５：１〜１：１０の重量比が適切であると証明されており、ここで、最適な結合を可能にするためには２：１及び１：５の重量比が特に好ましい。
【００４１】
ＶＰ１−ＶＬＰ及びカチオンポリマーの結合体を生産する方法は、独国特許第１０１ ３１ １４５．１号明細書から既知である。
【００４２】
さらなる好ましい実施形態では、異種結合パートナー又はリガンド、それぞれ例えばポリペプチド又は標識サブユニットは、直接的に且つ制御可能な化学量論でＶＬＰへ連結させることができる。ヘテロ二官能性タンパク質間リンカーの例は図５に示される。本発明では、リンカー（本発明では、ＰＥＯ−マレイミドリンカー）をＶＰ１に結合するために、好ましくはＫ６０及び／又はＫ１６４の外側にあるリシン残基のアミノ基が使用される。リガンドは、システイン残基、例えばシステイン残基のカルボキシ末端を通じて、リンカーの第２の活性部位へ結合することができ、細胞のリガンド特異的なタイプへＶＬＰ担持を特異的に送達することができる安定なＶＰ１−リガンド結合体を付与することができる。
【００４３】
したがって、本発明の別の目的は、少なくとも１つの異種結合パートナー、例えばポリペプチドがアミノ酸残基Ｋ６０及び／又はＫ１６４を通じて結合されているＪＣＶ−ＶＰ１キャプシドタンパク質である。
【００４４】
さらに、本発明の目的は、
（ｉ）少なくとも１つのウイルスキャプシドタンパク質の幾つかの分子で構成されるウイルス様粒子（ＶＬＰ）及び少なくとも１つの細胞型特異的なリガンドの結合体（ここで、ＶＬＰ及びリガンドは、例えばカチオンポリマーのようなアンカー基により、又はヘテロ二官能性リンカーを通じて互いに結合される）、及び
（ｉｉ）ＶＬＰ及びリガンドの結合体へ組み込まれるＲＮＡｉ誘導分子を含む組成物である。
【００４５】
好ましくは、ヒトポリオーマウイルスＪＣのキャプシドタンパク質ＶＰ１に由来するＶＬＰが使用される。好ましくは、ＲＮＡｉ誘導分子として、上述したものが使用される。
【００４６】
請求項１に記載の組成物を生産するためには、ＲＮＡｉ誘導分子、及び任意でさらなる活性物質並びにキャリア、助剤及び／又は添加剤が、それぞれ、構築前に及び／又は構築中に所望の量又は濃度でキャプシドタンパク質に添加される。そうする際に、粒子内にＲＮＡｉ誘導分子を含有するＶＬＰを生成することができる。好ましくは、ＶＬＰのＲＮＡｉ誘導分子の担持は、ＶＬＰへのキャプシドタンパク質の会合中に行われる。ＲＮＡｉ誘導分子のパッケージングは、ｉｎ ｖｉｔｒｏ及びｉｎ ｖｉｖｏの両方で起きることができ、ここでＶＬＰ中でのＲＮＡｉ誘導分子の組込みは好ましくは、ｉｎ ｖｉｔｒｏ条件下で行われる。キャプシドコーティングの内部へのＲＮＡｉ誘導分子の組込みは、例えばキャプシドコーティングの解離（脱構築(de-assembly））及びＲＮＡｉ誘導分子の存在下での続く再構築により、又はＲＮＡｉ誘導分子の存在下でのＶＬＰの浸透圧ショックにより行われ得る。さらに、標的細胞の表面上で受容体と結合することが可能である標的細胞特異的なサブユニットは、上述したようにＲＮＡｉ誘導分子を担持するＶＬＰへ結合させることができる。ＶＬＰの担持に関する条件はそれぞれ、ＲＮＡｉ誘導分子の分解又は構造的変化がそれぞれ回避されるように選択されるべきである。
【００４７】
パッケージング中、キャプシド−タンパク質−モノマー対ＲＮＡｉ誘導分子の比は、ＶＬＰ当たりのキャプシドタンパク質の数及びパッケージングされるべき分子の大きさに応じて、広範囲にわたって様々であり得る。キャプシドタンパク質対ＲＮＡｉ誘導分子の質量比は通常、１：１００〜１００：１、好ましくは１：５０〜５０：１、特に好ましくは１：２０〜２０：１、最も好ましくは約１：１〜２０：１の範囲で見出される。
【００４８】
キャプシドタンパク質は、大量に且つ高純度でＲＮＡｉ誘導分子から組換え的に且つ個々に生産され、また核酸のパッケージングが、レトロウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター又はアデノウイルスベクターと対比して、パッケージング細胞株では行われないという背景に反して、組換え現象に起因するウイルス核酸の混入及び感染性ウイルスの生成の潜在的な危険性が回避され得る。さらに、ＲＮＡｉ誘導分子のパッケージング及び細胞特異的なリガンドでのＶＬＰの担持は、規定のｉｎ ｖｉｔｒｏでの条件下で行われるため、ＶＬＰ−ＲＮＡｉトランスファー系、本発明では特にＶＰ１−ＶＬＰトランスファー系は、ウイルス系及び非ウイルス系の利点を組み合わせている生物学的に安全なプラットフォーム技術を表すが、それらの欠点を示すことはない。したがって、本発明による組成物のＶＬＰは特に、それらが元のウイルスの核酸を含まないという事実を特徴とする。かかるＶＬＰ、特に組換えＶＰ１分子のＶＬＰは、国際公開第９７／１９１７４号パンフレットに記載されている。
【００４９】
本発明による組成物は、ｉｎ ｖｉｖｏ及びｉｎ ｖｉｔｒｏの両方で任意のタイプの細胞へＲＮＡｉ誘導分子を特異的に導入するために使用することができる。それによって、多細胞生物内での機能的ＲＮＡｉ誘導分子のターゲット・トランスファーは、ＲＮＡｉを用いた所定の遺伝子の発現の局所的に限定された下方制御を導く。したがって、本発明による組成物を使用する場合、例えば内因性遺伝子の発現の増加は、標的細胞のゲノムの修飾の既存の危険性を伴わずに一過的に下方制御され得る。それにもかかわらず、ＲＮＡｉを用いて、ＲＮＡ、特にｍＲＮＡの標的（即ち、配列特異的な）分解に関する遺伝情報を標的細胞へ永続的に組み込むことも可能である。さらに、本発明による組成物は、細胞型特異的な態様で、例えばＤＮＡセグメントの転位又はウイルス感染の結果としての望ましくない遺伝子の発現を下方制御するために使用することができる。特に、本発明による組成物は、病的状態と相関する少なくとも１つの遺伝子の発現を下方制御するために使用することができる。
【００５０】
本発明による組成物は、慢性疾患又はそれらの症状それぞれを治療するために使用することができる。この場合、ＲＮＡｉ誘導分子は、例えば、標的細胞においてｓｉＲＮＡ又はそれらの前駆分子の永続的な供給を達成するＤＮＡ構築物の形態で使用することができる。さらに、本発明による組成物を使用して、例えば獣医学及び人間医学の両方において急性感染症の治療のための細胞型特異的な遺伝子治療を一過的に確立することが今や可能となる。本発明による組成物の投与されるべき量は、とりわけ疾患の種類、症状の重篤性及び罹患されている細胞の範囲に依存する。
【００５１】
本発明による組成物は、ＶＬＰの適用に関する既知の方法に従って局所的に又は全身的に投与され得る。
【００５２】
したがって、本発明の別の目的は、標的細胞へＲＮＡｉ誘導分子を導入する方法であって、
（ｉ）上記ＲＮＡｉ誘導分子の存在下でのウイルスキャプシドタンパク質のＶＬＰへの構築工程、及び
（ｉｉ）上記標的細胞への上記ＲＮＡｉ誘導分子の取込みが起こり得る条件下で、上記ＲＮＡｉ誘導分子を担持した上記ＶＬＰを上記標的細胞と接触させる工程を含む方法である。
【００５３】
標的細胞特異性を修飾するために、さらに標的細胞の表面上の受容体と結合することができる１つ又は複数の標的細胞特異的なサブユニットを、工程（ｉ）で得られるＶＬＰへ結合させることができる。本発明による方法はとりわけ、標的細胞における所定の少なくとも１つの遺伝子の下方制御に使用され得る。
【００５４】
任意の真核細胞を標的細胞として使用することができる。好ましくは、真核細胞は、哺乳類細胞であり、特にヒト由来である。請求項１に記載の組成物を使用して、その自然環境中に存在する細胞、及びその自然な環境から単離された細胞の両方へ、ＲＮＡｉ誘導分子を導入することが可能である。
【００５５】
ＲＮＡｉ誘導分子を導入する目的の標的細胞が、本発明による方法で使用されるＶＬＰが由来するウイルスの天然宿主スペクトルに相当しない場合、ＶＬＰの細胞型特異性は、上述したようなキャプシドタンパク質とリガンドとの複合体形成を通じて、ＲＮＡｉ誘導分子及び任意でさらなる活性剤による担持前、担持中又は担持後に修飾され得る（「再ターゲッティング」）。そのため、有利には、標的細胞の細胞表面上に露出される受容体と特異的に結合することができるリガンドが選択される。或いは、そのアミノ酸組成物中に、標的細胞の外側表面上の特異的な受容体に結合するその能力に起因して、異種タンパク質（これは、ＲＮＡｉ誘導分子のターゲット・トランスファーを媒介する）及び任意でさらなる活性剤を含むキャプシドタンパク質で構成されるＶＬＰが、このために使用され得る。
【００５６】
本発明のさらなる目的は、外来核酸、例えば病原性生物、特に病原性ウイルスの核酸の発現により、又は内因性遺伝子の発現の増加若しくは望ましくない発現により引き起こされる疾患若しくは疾患状態の診断、予防及び／又は治療のための上述したようなＲＮＡｉ誘導分子を含む上述したようなＶＬＰを含む薬学的組成物である。
【００５７】
本発明はさらに、上述したようなＶＬＰを含む任意の種類の細胞又は組織へそれぞれＲＮＡｉ誘導分子を導入するための試験キットに関する。
【００５８】
本発明のさらに別の目的は、任意でポリペプチド免疫原又はペプチド免疫原、アプタマー又はｓｉＤＮＡ分子と組み合わせて、他の種類の核酸、例えば免疫刺激性核酸を含有する上述したようなＶＬＰ組成物である。さらに適切な薬物は、極性細胞分裂阻害剤又は毒素である。
【００５９】
上述のＲＮＡｉ誘導分子の他に、特に感染性レトロウイルス疾患（例えば、ＨＩＶ−１）との関連から、さらなる治療的ＶＬＰ担持及び予防的ＶＬＰ担持として他の核酸も同様に言及されなくてはならない。予防的用途に関しては、免疫刺激性配列（ＩＳＳ）が、それぞれのレトロウイルスからの免疫原（例えば、ＨＩＶ−１からのｅｎｖ構成成分）と最適に組み合わせて、本発明では挙げられるであろう。さらに、治療に関しては、幾つかの非ＲＮＡｉ誘導核酸配列を通じて、ウイルス阻害が達成されるであろう。これらの分子は、阻害性ＤＮＡアプタマー及び阻害性ＲＮＡアプタマーから、並びに酵素リボヌクレアーゼＨの早発活性化によりレトロウイルスのゲノムを、宿主ゲノムへのその組み込み前に破壊することができるいわゆるｓｉＤＮＡから選択することができる。（Matskevich et al., Aids Res & Human Retroviruses 22 (2006),1220-1230、Matzen et al. Nature Biotechnology 6 (2007)）。かかる核酸をＶＬＰへ含ませることに関しては、ＲＮＡｉ分子に関連した記述を参照されたい。
【図面の簡単な説明】
【００６０】
【図１】グリオーマＳＷ１０３細胞へのｓｉＲＮＡ分子及びＤＮＡの効率的且つ機能的導入。Ａ）細胞をｓｉＬａｍＡ１又はｓｉＧＬ２ ｓｉＲＮＡ担持ＶＬＰで処理して、ＶＬＰ処理の４４時間後に、間接的免疫蛍光（ＩＩＦ）を用いて検査した。左側はｓｉＬａｍＡ１−ＶＬＰで処理した細胞の群を示す。ここで、細胞は、標的タンパク質のほぼ完全な下方制御を示す（上部）。非関連対照ｓｉＧＬ２−ＶＬＰで処理した対照細胞は正常なラミンＡ／Ｃ含有量を示した。ここで、ラミンＡ／Ｃは、細胞の核中に存在する。ＤＮＡは、ヘキスト３３３４２で染色した。Ｂ）直接的免疫蛍光顕微鏡法による観察結果は、ウェスタンブロット分析で確認された。未処理の細胞又はｓｉＬａｍＡ１−ＶＬＰ若しくはｓｉＧＬ２−ＶＬＰで処理した細胞の細胞抽出物を処理の４４時間後に収集して、抗ラミンＡ／Ｃ抗体で染色した。ラミンＡ／Ｃ含有量は、両方の対照レーンでは同一であった。ここで、ｓｉＲＮＡ−ＶＬＰ処理した集団におけるラミンＡ／Ｃの比率は顕著に低減した。均一なタンパク質量を確認するために、並行してビメンチンに関してブロットを分析した。Ｃ）ｓｉＲＮＡ分子に加えて、ｅＧＦＰをコードする直鎖化発現構築物をＶＬＰへパッケージングして、グリオーマ細胞へ形質導入した。この処理の２４時間後に、ほぼ全ての細胞が陽性ＧＦＰ発現を示した。
【図２Ａ】修飾されたＶＬＰを用いたｓｉＲＮＡの首尾よい導入の定性的及び定量的考証。Ａ）この図は、３つの個別に実施された実験の定量的ウェスタンブロット分析のデータを示す。ここで、ｓｉＲＮＡは、ＰＥＩ−Ｔｆ−ＶＬＰを使用してＨｅＬａ ＳＳ６細胞及びＭＣＦ７細胞へ導入された。ＰＥＩ−Ｔｆ及びｓｉＲＮＡでの細胞の処理では、ｓｉＲＮＡ単独、空ＰＥＩ−Ｔｆ−ＶＬＰ及び非関連ｓｉＲＮＡ担持ＰＥＩ−Ｔｆ−ＶＬＰをそれぞれ陰性対照とした。ＰＥＩ−Ｔｆ及びｓｉＬａｍＡでの処理のみが標的タンパク質の含有量の弱い（１５％〜２０％）低減を示し、５０ｎＭの量でのｓｉＲＮＡのＶＬＰパッケージングはより効率がよかった。５μＭ ｓｉＲＮＡでＶＬＰに担持させた後のＰＥＩ−Ｔｆとの複合体形成は、ラミンＡ／Ｃのほぼ完全な下方制御を導いた。ラミンＡ／Ｃに対して作用する他のｓｉＲＮＡ分子（それらのうちの１つは、センス鎖の５’末端にフルオレセインを伴って又は伴わずに結合された）は、ＨｅＬａ細胞での下方制御に関して同等の有効性を示した。ヒトエメリンに対して作用するｓｉＲＮＡ分子の第２の組は、ＭＣＦ７細胞で検討された。定量的ウェスタンブロット分析により示されるように、３つ全ての場合で、ｓｉＲＮＡは、細胞へ首尾よく導入された。下部は、ＥＣＬ-現像後の代表的なブロットを示す。全ての場合において、ビメンチンは添加量の比較対照として使用された。
【図２Ｂ】修飾されたＶＬＰを用いたｓｉＲＮＡの首尾よい導入の定性的及び定量的考証。Ｂ）ｓｉＬａｍＡ−Ｆ−ＰＥＩ−Ｔｆ−ＶＬＰで処理したＨｅＬａ細胞の蛍光顕微鏡画像は、ｓｉＲＮＡ分子の取込み（緑）及びラミンＡ／Ｃの用量依存的下方制御（赤）を示す。より高い担持濃度（下部）と比較して、ｓｉＲＮＡが５０ｎＭの濃度でＶＬＰへ組み込まれる場合、標的遺伝子の下方制御に対する影響が弱くなる（中央部）。対照細胞では、対照細胞が非関連ｓｉＲＮＡ分子を含有するＶＬＰで処理された場合、ラミンＡ／Ｃ含有量の低減を観察することはできない（上部）。
【図３】ヒトＴ細胞における一過的ＲＮＡ干渉。ヒトＳｕｐＴ１細胞をデスフェリオキサミンで刺激した２４時間後に、ｓｉＲＮＡ担持ＰＥＩ−Ｔｆ−ＶＬＰで処理した。Ａ）ＶＬＰによる処理の２４時間後の単一ｓｕｐＴ１細胞の共焦点蛍光顕微鏡法により、細胞質における蛍光ｓｉＲＮＡ分子（ｓｉＬａｍＡ−Ｆ）の均質な分散が示される。Ｚ軸に沿った切片は、ｓｉＲＮＡの存在が主として細胞質に限定され、蛍光シグナルが細胞の周辺で又は細胞の核中でほぼ観察され得ないことを示す。Ｂ）細胞への導入後、抗エメリン−ｓｉＲＮＡ−ｓｉＥｍｅ１は、このｓｉＲＮＡが細胞のＲＮＡ干渉機構に利用可能であることを明らかに示した。抗エメリン抗体を使用した間接的免疫蛍光顕微鏡法は、ｓｉＥｍｅ−ＰＥＩ−Ｔｆ−ＶＬＰ処理した集団においてエメリンの強力な下方制御を示すのに対して、ｓｉＧＬ２−ＰＥＩ−Ｔｆ−ＶＬＰで処理した対照集団におけるエメリン含有量は変化しないままであった。Ｃ）免疫蛍光顕微鏡法の結果は、ウェスタンブロット分析を使用して確認した。ｓｉＥｍｅ1−ＰＥＩ−Ｔｆ−ＶＬＰ処理した集団のみが、エメリンの下方制御を示したのに対して、ｓｉＧＬ２−ＰＥＩ−Ｔｆ−ＶＬＰ又は空ＰＥＩ−Ｔｆ−ＶＬＰで処理した対照細胞、並びにｓｉＥｍｅ1及びＰＥＩ−Ｔｆでのみ処理した細胞は、エメリン含有量の低減を示さなかった。等量のタンパク質の添加は、ポンソーレッドによる膜の染色により確認された（色素は背景に示されている）。
【図４】ＶＰ１タンパク質の配列修飾。Ａ）ポリオーマＪＣウイルス野生型ＶＰ１及びキメラＶＰ１タンパク質（ＶＰ−Ｍｕｔ２）（これは、アミノ酸挿入に起因して２部核局在化シグナルを含有する）のアミノ末端配列の比較。ウイルスＳＶ４０及びＢＫＶに由来する配列（これは、修飾のための基礎を成した）は比較用に示される。Ｂ）電子顕微鏡画像化では、キメラＶＰ１タンパク質Ｍｕｔ２が、野生型ＶＰ１タンパク質と同じ脱構築特性及び再構築特性を示した。Ｃ）キメラＶＰ１タンパク質Ｍｕｔ２は、野生型タンパク質よりもＳＶＧグリア細胞においてより高い形質導入効率を示した。ルシフェラーゼ発現構築物の形質導入に続いて、相対ルシフェラーゼ活性が確定された。
【図５】ＶＰ１のリシン残基へのリガンドの連結により、再ターゲッティングが可能となる。アミノ基をスルフィドリル基へ連結することが可能であるヘテロ二官能性リンカー分子に関する一例を上方に示す。このリンカー分子（又はそれに類するリンカー分子）を使用して、第１のタンパク質（例えば、ＶＰ１）上のリシン残基及び第２のタンパク質（例えば、リガンド）上のシステイン残基を相互接続することができる。図の中央部分において、計算されるＪＣＶ−ＶＰ１タンパク質の構造、及び概略的に、接近可能なリシン残基へ連結される場合のリンカー分子が示される。最下部では、ＪＣＶ−ＶＰ１タンパク質が上面図で示される（即ち、キャプシドの外側から）。リガンドの連結に適しているリシン残基Ｋ６０及びＫ１６４の両方が示されている。これらのリシン残基は、上記で示されるようにヘテロ二官能性リンカー分子を結合するのに使用され得る。
【発明を実施するための形態】
【００６１】
ここで、本発明は、下記実施例並びに添付の図面及び配列表によりさらに説明される。
【実施例】
【００６２】
実施例１
材料及び方法
ｓｉＲＮＡ分子の構築及び合成
化学的に合成されたＲＮＡオリゴヌクレオチドは、Dharmacon（コロラド州、ラフィーエット）から入手した。ｓｉＲＮＡ分子は全て、３’−ｄＴｄＴオーバーハングを含有した。蛍光標識は、その官能性に影響を及ぼさないように、ｓｉＲＮＡ分子のセンス鎖の５’末端に連結させた。ＰＣＲ用のヌクレオチド（ｄＮＴＰ）は、Boehringer（ドイツ、マンハイム）から入手し、ｉｎ ｖｉｔｒｏでの転写を用いてｓｈＲＮＡを生産するためのＰＣＲプライマー及びＤＮＡフラグメントは、NAPS（ドイツ、ゲッティンゲン）により供給された。化学的に合成された、２７ヌクレオチドの長さを有する二重鎖ＲＮＡ（２７ｍｅｒｄｓＲＮＡ）は、IBA（ドイツ、ゲッティンゲン）により供給された。
【００６３】
【表１】
【００６４】
抗体及び間接的免疫蛍光顕微鏡法
形質導入された細胞を、処理の４４時間後にＶＬＰとともに−２０℃冷メタノールで処理した。一次抗体として、マウス抗ラミン Ａ／Ｃ抗体（クローン６３６．２３）、マウス抗エメリン抗体(Novagen)及びマウス抗α−チューブリン抗体（Ｄ１Ｈ、Sigma、ドイツ）を使用した。二次抗体として、ローダミン又はフルオレセイン結合ヤギ抗マウスＩｇＧを使用した。固定化後、ＰＢＳで洗浄した細胞を、３７℃にて湿気チャンバ中で一次抗体とともに１時間インキュベートした。次に、細胞をＰＢＳで３回洗浄して、蛍光二次抗体を３７℃で１時間添加した。ＰＢＳで３回洗浄することにより、未結合抗体を除去した後、２μＭ ヘキスト３３３４２色素（Hoechst、ドイツ）でＤＮＡを可視化させた。これに関して、細胞を、スライドガラス上でモヴィオール（Hoechst、ドイツ）により固定化させた。
【００６５】
定量的ウェスタンブロット分析
ＳＤＳゲル電気泳動は、標準的なプロトコルに従って実施した。タンパク質は、標準的なＳＤＳゲル電気泳動を用いて分離させて、半乾燥転写方法を使用してニトロセルロース膜上へ転写した。膜をＴＢＳＴ（２０ｍＭ トリスＨＣｌ、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、０．２％ツイーン２０、ｐＨ７．４）でブロックした。ここで、ＴＢＳＴは、脱脂粉乳粉末を５％含有していた。ラミンＡ／Ｃ、エメリン又はビメンチンに対する抗体もまた、ＴＢＳＴ中で希釈した。ここで、ＴＢＳＴは、脱脂粉乳粉末を２．５％含有していた。そのようにして希釈した抗体を、室温で１時間膜とともにインキュベートした。ウェスタンブロットにおいて同一量のタンパク質の分析を可能にするために、ビメンチンタンパク質含有量を確定した。膜をＴＢＳＴで２度、０．５％トリトンＸ−１００を加えたＴＢＳＴで１度洗浄した。アフィニティ精製したホースラディッシュ結合ブタ抗マウス免疫グロブリンは、Dako（デンマーク、コペンハーゲン）から入手した。それらを、脱脂粉乳を２．５％含有するブロッキング緩衝液中に１：１００００で希釈して、室温で２時間、膜とともにインキュベートした。ＥＣＬキット(Amersham Biosciences)を使用してバンドを検出して、ルミイメージャー（Boehringer/Roche、ドイツ）で定量化した。
【００６６】
細胞
【００６７】
【表２】
【００６８】
接着細胞（即ち、ＨｅＬａ ＳＳ６、ＭＣＦ−７、２９３Ｔ、ＣＯＳ−７、軟骨細胞及びグリオーマＳＷ１０３）をＤＭＥＭ中で培養した。ＤＭＥＭには、１０％ウシ胎児血清（ＦＣＳ）及び抗生物質（ペニシリン及びストレプトマイシン、ｐｅｎ／ｓｔｒｅｐ）を補充した。浮遊状態の細胞（即ち、ＨｅＬａ Ｓ３及びＳｕｐＴ１）をＲＰＭＩ−１６４０高グルコース培地中で培養した。ＲＰＭＩ−１６４０高グルコース培地には、１０％ＦＣＳ及びｐｅｎ／ｓｔｒｅｐが補充した。
【００６９】
ＶＬＰの生産及び担持
ポリオーマＪＣウイルスのＶＰ１タンパク質を、バキュロウイルス系を使用して昆虫細胞（ＳＦ）で発現させた。分泌されたタンパク質を、勾配遠心分離又はイオン交換ＦＰＬＣを使用して培地上清から単離した。
【００７０】
精製ＶＰ１は、５量体及びより高次のキャプシドで存在し、したがって核酸を担持する前に、これらをまず、脱構築緩衝液（１０ｍＭトリス、ｐＨ７．５、１０ｍＭ ＥＧＴＡ、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、５ｍＭ ＤＴＴ）を使用して脱構築しなければならなかった。再構築によるＶＬＰの担持は、微小透析設定で３．５ｋＤａの排除サイズを用いて４℃にて一晩、再構築緩衝液（１０ｍＭトリス、ｐＨ７．５、１ｍＭ ＣａＣｌ２、１５０ｍＭ ＮａＣｌ）に対するＶＰ１／核酸混合物の透析により行った。ＤＮＡ対ＶＬＰの標準的な比は１：１０であった（例えば、ＶＬＰ ５μｇに５００ｎｇを添加した）。続く再ターゲッティングのために、再会合したＶＬＰを１：５（ＰＥＩ：ＶＬＰ、例えばＰＥＩ １μｇをＶＬＰ ５μｇに添加した）の比でＰＥＩ−Ｔｆと混合した。
【００７１】
トランスフェクション／形質導入
ｓｉＲＮＡ担持ＶＬＰによる処理の２４時間前に、細胞をそれぞれ、２４ウェルプレートに５００００細胞／ｍｌ〜１０００００細胞／ｍｌで播いた。浮遊状態で培養された細胞（即ち、ＳｕｐＴ１細胞株及びＨｅＬａ Ｓ３細胞株）の場合、トランスフェリン代謝を刺激するために、また細胞表面上のトランスフェリン受容体の密度を増大させるために、培養培地に、０．５ｎｇ／ｍｌのデスフェリオキサミンを補充した。ＶＬＰによる直前に、作用物質の細胞毒性副作用を回避するために、刺激培地を正常な培養培地と取り替えた。
【００７２】
結果
ヒトグリオーマ細胞へのＤＮＡ及びｓｉＲＮＡの導入
ｓｉＲＮＡ担持ＶＬＰを、ヒトグリオーマＳＷ１０３細胞の培養培地へ添加した。処理の１時間後、ヒトラミンＡ／Ｃ（ｓｉＬａｍＡ−Ｆ）に対して作用する蛍光標識されたｓｉＲＮＡを、グリオーマ細胞の細胞質で観察することができた（図１を参照）。裸のｓｉＲＮＡ及び空ＶＬＰによる対照細胞の処理により、ＶＬＰにパッケージングされたｓｉＲＮＡのみの特異的な取込みが確認された。ＶＬＰ形質導入の２４時間後に、ＲＮＡ干渉効果を考慮して、間接的免疫蛍光顕微鏡法及びウェスタンブロット分析を用いて細胞を検査した。標的タンパク質ラミンＡ／Ｃの量は、ｓｉＬａｍＡ−Ｆ−ＶＬＰで処理した細胞中で有効に下方制御されたのに対して、このことは対照細胞では観察することができなかった（図１）。
【００７３】
ＶＬＰとＰＥＩ−Ｔｆとの複合体形成によるＶＬＰの再ターゲッティングを含むグリオーマＳＷ１０３細胞へのｓｉＲＮＡ分子の導入はまた、ＶＬＰへの核酸のパッケージングに関する品質管理として続く実験でも使用した。
【００７４】
ＰＥＩ−Ｔｆと複合体形成されているｓｉＲＮＡ担持ＶＬＰにより媒介される接着細胞におけるＲＮＡ干渉
ｓｉＲＮＡ担持ＶＬＰを、種々のヒト細胞株の培養培地へ添加した。ＨｅＬａ ＳＳ６細胞に関して幾つかの実験を実施した。ＶＬＰによる処理の２４時間前に、細胞を静置培養した。検査は、この処理の２４時間後又は４８時間後に行った。
【００７５】
ＨｅＬａ細胞
１．ｓｉＲＮＡ分子のＰＥＩ−Ｔｆ−ＶＬＰ媒介性導入による用量依存的及び機能的ＲＮＡ干渉
ＨｅＬａ細胞を約７５０００細胞／ウェルの密度で２４ウェルプレートで培養し、２４時間後にＶＬＰ １μｇ又は５μｇで処理した。機能的且つ有効なＲＮＡ干渉に要されるｓｉＲＮＡ分子の量を確定するために、再構築緩衝液中でＶＬＰに５０ｎＭ又は３μＭのｓｉＲＮＡを添加した。空ＶＬＰ、非関連ｓｉＲＮＡ分子を担持したＶＬＰ及び単にＰＥＩ−Ｔｆと複合体形成したｓｉＲＮＡ分子は、対照として用いた。トランスフェリン受容体を用いた細胞への取込みを可能にするために、ＰＥＩ−Ｔｆを１：５（ＰＥＩ−Ｔｆ １μｇ：ｓｉＲＮＡ−ＶＬＰ ５μｇ）の比で再構築された担持ＶＬＰへ添加した。２４ウェルプレートの各ウェルの約１０００００細胞において効率的なＲＮＡ干渉を行うためには、これらを３μＭ ｓｉＲＮＡで担持されたＶＬＰ ５μｇで処理する必要がある（図２）。５０ｎＭ ｓｉＲＮＡ担持ＶＬＰによるｓｉＲＮＡの形質導入は、単に標的タンパク質ラミンＡ（／Ｃ）の若干の減少を招いたに過ぎなかった。ｓｉＲＮＡの取込みは、蛍光標識されたｓｉＲＮＡ ｓｉＬａｍＡ−Ｆの形質導入を用いて確認され、下方制御の影響は、定量的ウェスタンブロット分析及び間接的免疫蛍光顕微鏡法を用いてタンパク質レベルに関して検査された。空ＰＥＩ−Ｔｆ−ＶＬＰによるか又は非関連ｓｉＲＮＡを含有するＶＬＰによる細胞の形質導入は、ラミンＡ（／Ｃ）タンパク質含有量の減少に至らなかった。ＶＬＰを伴わないＰＥＩ−Ｔｆと複合体形成されたｓｉＲＮＡは、ラミンＡ（／Ｃ）発現の弱い阻害を引き起こし（ここでは、それにも関わらず、下方制御は１５％〜２０％に限られた）のに対して、ｓｉＬａｍＡ−ＰＥＩ−Ｔｆ−ＶＬＰは、適切な濃度で使用される場合に標的タンパク質のほぼ完全な下方制御（「ノックダウン」）を引き起こした（ＨｅＬａＡの図）。ラミンＡ／Ｃに対して作用する３つの異なるｓｉＲＮＡ分子（そのうちの１つは、蛍光標識された）は、細胞への及び細胞質へのＶＬＰの取込みを可視化するためにＨｅＬａ細胞に関して検査された。ｓｉＲＮＡ分子は全て、それらがＰＥＩ−Ｔｆ−ＶＬＰの形態で細胞へ投与された場合に、標的タンパク質発現の有効な下方制御を導いた。
【００７６】
２．非古典的な２７ｍｅｒ ｄｓＲＮＡ分子は、下方制御に首尾よく使用された
さらに、非古典的なｓｉＲＮＡ、即ちｓｉＬ２７ＡＣ（これは、３’オーバーハングを有さない２７ヌクレオチドの長さを有する５’リン酸化ｄｓＲＮＡで構成される）をＨｅＬａ細胞へ形質導入して、これがラミンＡ／Ｃタンパク質の発現の効率的な下方制御を引き起こした。したがって、本発明による組成物はまた、ＶＬＰを細胞のＲＮＡ干渉機構に利用可能とするために、ＶＬＰの２７ｍｅｒｄｓＲＮＡ担持により標的細胞の細胞質へエンドヌクレアーゼダイサー用の基質を導入することも可能にする。
【００７７】
３．ＰＥＩ−Ｔｆ−ＶＬＰは、乳癌細胞への活性ｓｉＲＮＡ分子の導入に使用された
ヒトエメリン遺伝子に対して作用する３つの異なるｓｉＲＮＡ分子の第２の組を、上述したようにヒト乳癌ＭＣＦ−７細胞へ形質導入した。定量的ウェスタンブロット分析により、これらの実験で使用された３つのｓｉＲＮＡ種は全て、標的遺伝子の下方制御を首尾よく引き起こすことが示された（図２Ａ）。これらの結果は、種々のタイプの細胞において代替標的遺伝子に対して作用するｓｉＲＮＡ分子の効率的なトランスファーの観点からＶＬＰが広範に適用可能であることを強調するものである。
【００７８】
さらなる細胞株及び情報は表３から得ることができ、表３は、種々の細胞株においてＶＬＰを使用した核酸トランスファー実験に関する概要を示す。
【００７９】
ＰＥＩ−Ｔｆと複合体形成されたｓｉＲＮＡ担持ＶＬＰにより媒介される非接着細胞におけるＲＮＡ干渉
ヒトＳｕｐＴ１ Ｔ細胞を浮遊状態で培養し、ＶＬＰによる処理の２４時間前に静置培養した。細胞エネルギー代謝を誘導するために、また細胞の表面上のトランスフェリン受容体の密度を増大させるために、１５ｎＭのデスフェリオキサミンを培養培地に添加した。ＶＬＰによる処理の直前に、培地を標準的な培養培地で取り替えて、ＶＬＰは上記で挙げられるような量で添加した。ＳｕｐＴ１細胞は、内因性ヒトエメリンに対して作用するｓｉＲＮＡ分子を含有するＶＬＰ、非関連ｓｉＲＮＡ（ＧＬ２）を含有するＶＬＰ又はｓｉＲＮＡを含有しないＶＬＰで形質導入した（図３）。同じＶＬＰをＰＥＩ−トランスフェリンを伴わせるかまたは伴わせずに対照として使用した。さらなる対照として、細胞をＰＥＩ−Ｔｆと複合体形成されたｓｉＲＮＡ分子で処理したが、このＲＮＡは、ＶＬＰへ組み込まれなかった。細胞の細胞質へのｓｉＲＮＡ分子の取込みを示すために、蛍光標識されたｓｉＲＮＡを使用した。共焦点顕微鏡法を使用して、ＳｕｐＴ１細胞の細胞質における蛍光ｓｉＲＮＡの均質な分散が示された。かかる細胞のＸ軸に沿った切片を図３Ａに示す。ＶＬＰ導入されたｓｉＲＮＡを用いた標的遺伝子発現の有効な下方制御は、間接的免疫蛍光顕微鏡法（図３Ｂ）及びウェスタンブロット分析（図３Ｃ）を使用して確認された。結果として、処理した細胞のほぼ１００％でエメリン遺伝子発現の非常に効率的な下方制御が示された一方で、非関連ｓｉＲＮＡによる処理では、エメリンの含有量に影響を与えなかった。ウェスタンブロットデータにより、細胞をｓｉＥｍｅ担持ＰＥＩ−Ｔｆと複合体形成されたＶＬＰで処理した場合にのみ、エメリンの十分な下方制御が達成され得る一方で、ＰＥＩ−Ｔｆ複合体形成単独ではタンパク質の測定可能な下方制御に至らないことが示された。
【００８０】
同様に、ＶＬＰ媒介性ｓｉＲＮＡの取込みは、ＨｅＬａ Ｓ３細胞が使用された場合に成功した。これらの細胞は、浮遊状態での成長に適応している（データは示さず）。
【００８１】
【表３】
【００８２】
実施例２
野生型配列と比較して、アミノ末端領域に修飾を有する修飾タンパク質ＶＰ１−Ｍｕｔ２を生産した。この修飾のため、ウイルスＳＶ４０又はＢＫＶの配列に基づく異種核局在化シグナルのアミノ酸配列が導入された。異種核局在化シグナルの配列を図４Ａに示す。
【００８３】
キメラタンパク質ＶＰ１−Ｍｕｔ２を、無傷のＶＬＰを形成する能力に関して試験した。これは、電子顕微鏡画像化により確認された。さらに、種々のタイプの細胞が、ＤＮＡ担持ＶＰ１−Ｍｕｔ２ ＶＬＰで形質導入され、そうする際にキメラ形態は、少なくとも同等の（ＣＯＳ−７腎臓細胞）形質導入効率又は最大５倍増加された（ＳＶＧグリア細胞）形質導入効率を示した。結果を図４Ｂ及び図４Ｃに示す。
【００８４】
実施例３
ヘテロ二官能性リンカーを使用して、リガンドをＶＰ１タンパク質へ直接結合させることができる。かかる連結方法に関する好ましい実施形態を図５に表す。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、真核細胞へのＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）誘導分子の導入のためのウイルス様粒子の組成物、及びＲＮＡｉ誘導分子による複数の真核細胞の細胞型特異的な形質導入の方法に関する。本発明はさらに、少なくとも１つの内因性遺伝子の発現比率の増加に、並びに／或いは少なくとも１つの内因性遺伝子及び／又は外来核酸、特にウイルス核酸の望ましくない発現に関連した疾患若しくは疾患状態の診断、予防及び／又は治療の方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
現在知られている遺伝子治療方法は、所望の遺伝子産物、主に治療上有効なタンパク質をコードするＤＮＡ構築物による細胞のトランスフェクションに基づいている。これによって使用される方法は、通常ｉｎ ｖｉｔｒｏでの方法に適している。細胞の自然環境からの事前に単離せずに特異的な細胞型のターゲット・トランスフェクション、即ち選択的トランスフェクションを行うことは、例えば電気穿孔又はリポソームトランスフェクションのような最先端の方法の多くでは実現され得ない。
【０００３】
ｉｎ ｖｉｖｏでの組織特異的なＤＮＡトランスファーに関する方法はこれまでのところ、ウイルストランスファー系に依存している。それにも関わらず、細胞配列（ｃｅｌｌｕｌａｒ ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ）での組換えの潜在的な危険性に起因して、これらは、ほぼ予測することができない安全上のリスクを負う。治療用遺伝子の輸送にとって現在好ましい系であるアデノウイルス及びアデノ随伴ウイルスの繰り返しのｉｎ ｖｉｖｏでの適用は、大部分の患者におけるそれらの高い免疫原性のため不可能である。さらに、アデノウイルスの複雑な構造及びアデノウイルスゲノムの構造に起因して、標的部位で治療用ＤＮＡを十分な程度に且つ適切な形態で供給することは、相当な尽力によってのみ可能である。
【０００４】
特に、望ましくない組換え、及び永続的にゲノムを改変させることに伴う危険性を考慮すると、遺伝子治療方法は、例えば急性感染のような一過的に生じる疾患状態の治療に関して検討することができなかった。例えばリポソーム及びＤＮＡ縮合分子のような非ウイルス系は、実際にこれらの欠点を回避したが、今度はレトロウイルス系と同様に、かなり低いトランスファー効率及び標的細胞特異性を示した。
【０００５】
したがって、これらの問題を回避するために、臨床上適用可能な遺伝子治療用組成物及び方法を提供する必要がある。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明の目的は、標的細胞の細胞ゲノムの完全性を維持すると同時に、ｉｎ ｖｉｖｏ及びｉｎ ｖｉｔｒｏの両方における真核細胞への遺伝子治療上有効な分子の高い効率での細胞型特異的な導入を可能にする組成物を提供することであった。本発明のさらなる目的は、病原性感染症の治療に関する、又は改変された遺伝子発現に関連する疾患症状の治療及び／若しくは診断に関する非常に効率的な方法を提供することであった。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明によれば、これらの目的は、少なくとも１つのウイルスキャプシドタンパク質の幾つかの分子で構成されるウイルス様粒子（「ウイルス様粒子」；ＶＬＰ）を含む組成物であって、少なくとも１つのＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）誘導分子が上記ＶＬＰ中に含まれることを特徴とする組成物により解決された。標的細胞へのトランスファー後に、ＲＮＡｉ誘導分子は、所定の遺伝子の発現の有効な下方制御を引き起こす。
【０００８】
ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）は、１つ又は複数の遺伝子の発現を下方制御するための進化的に保存されたメカニズム（「遺伝子サイレンシング」）である。複数の真核生物は、ウイルスに対するＲＮＡｉ及びトランスポゾンエレメントの発現を用いて自身を防御することが可能である。ＲＮＡｉを用いた遺伝子発現の下方制御の原理は、一方では、例えば２１ヌクレオチド〜２８ヌクレオチドを含む短ＲＮＡ分子、いわゆる低分子干渉ＲＮＡ分子（「低分子干渉ＲＮＡ」、ｓｉＲＮＡ）と転写産物との相互作用に基づく、標的遺伝子の転写により産生されるＲＮＡ（特にｍＲＮＡ）の配列特異的な分解に基づく。ＲＮＡ分解酵素ＩＩＩ ダイサーにより触媒されて、ｍＲＮＡ分子の標的分解はまず、前駆分子からの二重鎖ｓｉＲＮＡ分子の形成、及びこれらの分子の続くプロセシングに始まり、続いて二重鎖ｓｉＲＮＡの一方の鎖とｍＲＮＡ分子とのハイブリダイゼーションが行われ、二重鎖ｓｉＲＮＡ−ｍＲＮＡハイブリッド分子を形成する。次に、ｓｉＲＮＡとハイブリダイズした領域内部のｍＲＮＡの切断が起きる。それぞれこの切断又は加水分解はまず、ヌクレオチド鎖の内部切断的に行われる（例えば、ＲＩＳＣ複合体のエンドヌクレアーゼアルゴノート２により触媒される）。最終的に、このようにして生成される切断産物は、ＲＩＳＣ複合体のエキソヌクレアーゼにより加水分解される。ｍＲＮＡ転写産物の標的分解の原因として、標的遺伝子の発現が少なくとも部分的に抑制される。
【０００９】
他方で、遺伝子の発現はまた、翻訳レベルで下方制御することができる。これを担うエフェクター分子はマイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）と称され、これは、前駆ＲＮＡのヘアピン構造（「ヘアピン」）から始まって、エンドヌクレアーゼのドローシャ、パシャ(Pasha)及びダイサーを含む幾つかのプロセシング工程を経て形成される。標的ｍＲＮＡとのｍｉＲＮＡの部分的相補性のため、ｍｉＲＮＡは、その翻訳を阻害する。
【００１０】
細胞培養に関する研究により、それぞれ外因的に供給されるｓｉＲＮＡ又はｍｉＲＮＡはまた、ヒト細胞を含む真核細胞（例えば、哺乳類細胞）においてＲＮＡ干渉を誘導することができることが示されている。低いトランスファー効率のため、真核細胞へＲＮＡｉ誘導分子を導入する従来の方法は、病原性ウイルスによる感染症の治療に関する、若しくは改変された遺伝子発現に関連する疾患の治療に関する治療上のアプローチとしてのこのメカニズムの使用を可能にしないか、又は非常に限られた程度でしか可能にしない。
【００１１】
ＲＮＡｉ誘導分子は、標的ＲＮＡのプロセシング、即ち標的ＲＮＡの分解を引き起こすために、少なくとも１つのポリヌクレオチド鎖が、標的ＲＮＡ（好ましくは標的ｍＲＮＡ）に対して十分に相補的である配列を有するＲＮＡ分子を意味するものとする。ＲＮＡｉ誘導性であるためには、ＲＮＡｉ誘導分子と標的ＲＮＡの領域との間の相補性が、ハイブリダイゼーション及び続くプロセシングを達成するために十分であることが要される。例えば、相補性は、少なくとも８０％、好ましくは少なくとも９０％、最も好ましくは少なくとも９９％であり、ここで５’末端及び／又は３’末端にて、並びにＲＮＡｉエフェクター分子のオーバーハングにて、標的ＲＮＡに対して相補的ではないヌクレオチドもまた存在し得る。
【００１２】
ＲＮＡｉを誘導するために、幾つかの経路をたどることができる。それによって、エフェクター分子、即ちｓｉＲＮＡ分子及び／又はｍｉＲＮＡ分子の直接的なトランスファーは、１つの可能性を表す。ｓｉＲＮＡ分子は好ましくは、１９ヌクレオチド〜３０ヌクレオチド、好ましくは２０ヌクレオチド〜２８ヌクレオチドの長さを有する、特に好ましくは単鎖それぞれが２１ヌクレオチド〜２３ヌクレオチドの長さを有する二重鎖ＲＮＡ分子を意味するものとする。ｓｉＲＮＡ分子はまた、１９ヌクレオチド〜３０ヌクレオチド、好ましくは２０ヌクレオチド〜２８ヌクレオチドの長さを有する、特に好ましくは２１ヌクレオチド〜２３ヌクレオチドの長さを有する単鎖ＲＮＡ分子を意味し、ここで単鎖ＲＮＡ分子は、標的ＲＮＡ、特に標的ｍＲＮＡの配列に対して、少なくとも８０％、好ましくは少なくとも９０％、特に９９％を上回って相補的であり、また標的ＲＮＡへのｓｉＲＮＡの結合は、配列特異的な分解を達成する。好ましくは、ｓｉＲＮＡ分子は、１ヌクレオチド〜３ヌクレオチドの３’側のオーバーハングを有する。
【００１３】
ｍｉＲＮＡは、１９ヌクレオチド〜３０ヌクレオチド、好ましくは２０ヌクレオチド〜２８ヌクレオチドの長さを有する、特に好ましくは２１ヌクレオチド〜２３ヌクレオチドの長さを有する単鎖ＲＮＡｉ誘導分子を意味するものとし、これは、標的ｍＲＮＡとのハイブリダイゼーション後に、それらの分解を達成することができるとともに、翻訳の阻害を達成することができる。
【００１４】
或いは、標的細胞のｓｉＲＮＡ／ｍｉＲＮＡ生合成装置に関する基質として機能する実際の有効なエフェクター分子の前駆分子、即ちｓｉＲＮＡ及び／又はｍｉＲＮＡの前駆分子を供給することも可能である。これらとしては、例えば、それぞれエンドヌクレアーゼ（例えば、ダイサー、ドローシャ及び／又はパシャ）によりｓｉＲＮＡ分子又はｍｉＲＮＡ分子へプロセシングされるＲＮＡ前駆分子（例えば、二重鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ））又は短ヘアピンＲＮＡ分子（ｓｈＲＮＡ）が挙げられる。これに関して、例えば、２７ヌクレオチドを上回る、好ましくは３０ヌクレオチド〜約１００ヌクレオチド又はそれ以上の長さを有するｄｓＲＮＡ分子又は短ヘアピンＲＮＡ分子（ｓｈＲＮＡ）、最も好ましくは３０ヌクレオチド〜５０ヌクレオチドの長さを有するｄｓＲＮＡ分子が使用され得る。
【００１５】
この他に、ＤＮＡベースのＲＮＡｉアプローチを用いてＲＮＡｉ誘導分子を標的細胞へ導入することも可能である。これに関して、ｄｓＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ及び／又はｍｉＲＮＡをコードするＤＮＡ構築物が創出され、ここでコードエレメントは、標的細胞中でｄｓＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ及び／又はｍｉＲＮＡの発現を可能にする調節エレメントの制御下にある。かかる制御エレメントの例は、ポリメラーゼＩＩプロモーター又はポリメラーゼＩＩＩプロモーター（例えば、Ｕ６又はＨ１）である。
【００１６】
驚くべきことに、本発明による組成物を使用して、最も多様な種類のＲＮＡｉ誘導分子を、細胞型特異的な態様で非常に高い効率で標的細胞へ導入することができることが今回見出された。それによって、本発明による組成物を用いて導入されるＲＮＡｉ誘導分子は、病原性生物の核酸の発現により、又は内因性遺伝子の発現の増加若しくは望ましくない発現により引き起こされる疾患若しくは疾患状態の治療、診断及び／又は予防におけるＲＮＡ干渉のメカニズムの使用を今回可能にする程度にまで標的遺伝子の発現の下方制御を達成する。そのため、本発明による組成物を使用して、規定の二次構造を有するＲＮＡ分子を細胞へ導入することができ、ここで導入されるＲＮＡ分子は、それらのコンホメーションのため標的細胞のＲＮＡｉ生合成装置に関する基質として機能し、その結果標的遺伝子の発現の効率的な下方制御が可能となるということは、完全に驚くべき発見であった。したがって、本発明による組成物を用いて、ｄｓＲＮＡ及びｓｈＲＮＡのようなｓｉ／ｍｉＲＮＡ前駆分子は、それらが細胞中でｓｉ／ｍｉＲＮＡ生成酵素複合体により基質として認識されて、標的遺伝子の発現の配列特異的な下方制御のエフェクター分子へ効率的にプロセシングされるように標的細胞へ導入させることができる。さらに、ＤＮＡウイルスに由来するＶＬＰでさえも、それぞれ標的細胞へのｓｉＲＮＡ若しくはｍｉＲＮＡ、又はそれらの前駆分子（例えば、ｄｓＲＮＡ若しくはｓｈＲＮＡ）のトランスファーに使用することができることは驚くべきことであった。
【００１７】
さらに、ＲＮＡｉ誘導分子はまた、蛍光基及び／若しくは３’−ｄＴｄＴオーバーハングのような５’並びに／又は３’修飾を含み、真核細胞における所定の遺伝子の発現の下方制御に影響を及ぼす修飾ＲＮＡ分子を包含するものとする。
【００１８】
本発明によれば、ＲＮＡｉ誘導分子はさらに、ヌクレオチド配列中に１つ又は幾つかのリボヌクレオチドを有する類似体を含み、真核細胞における所定の遺伝子の発現の下方制御に影響を及ぼすＲＮＡ分子を意味するものとする。これらのリボヌクレオチド類似体は、例えばＲＮＡ分子の構造安定性又はリボヌクレアーゼに対する安定性を増大させることができる。リボヌクレオチド類似体は当業者に既知であり、元のＲＮＡ分子と比較して、塩基修飾、糖修飾（例えば、リボースの２’−ＯＨ基の修飾）及び／又はリン酸骨格修飾により修飾される。
【００１９】
したがって、ＶＬＰ内に、単一型のＲＮＡｉ誘導分子、即ちｓｉＲＮＡ、ｄｓＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ若しくはｍｉＲＮＡ又はそれらの前駆分子、又はコードＤＮＡがパッケージングされ得る。それにもかかわらず、異なるタイプのＲＮＡｉ誘導分子もまた、ＶＬＰ中に含まれ得る。本発明による組成物のＲＮＡｉ誘導分子は、１つ又は幾つかの標的遺伝子に対して、且つ／又は単一標的遺伝子の同じ配列若しくは異なる配列に対して作用し得る。
【００２０】
本明細書において、「遺伝子に対して作用する」という用語は、ＲＮＡｉ誘導分子が標的遺伝子のＲＮＡ分子、好ましくはｍＲＮＡ分子の配列特異的な分解に関する配列情報を含むものとして使用されるものとする。
【００２１】
本発明によれば、ＲＮＡｉ誘導分子は、１つ又は幾つかの遺伝子に対して作用することができ、その遺伝子の発現は下方制御されることになる。好ましくは、本発明による組成物のＲＮＡｉ誘導分子は、発現が活性化している遺伝子に対して作用し、その発現は病的状態と相関する。
【００２２】
特に好ましくは、本発明による組成物は、病原体、例えば病原性ウイルスの少なくとも１つの遺伝子に対して作用するＲＮＡｉ誘導分子を含有する。さらに、本発明による組成物は、少なくとも１つの内因性遺伝子に対して作用するＲＮＡｉ誘導分子を含有することができ、ここで内因性遺伝子の発現及び／又は内因性遺伝子の発現の増加は、病的状態と相関する。かかる細胞内因性遺伝子に関する例は、例えば腫瘍関連遺伝子、自己免疫関連遺伝子、代謝疾患関連遺伝子、特に神経変性疾患及び一般的な神経疾患に関連する遺伝子である。さらなる例は、感染性疾患に関連する内因性遺伝子（宿主因子）並びに栄養失調症及び早老疾患に関連する遺伝子（対立遺伝子特異的、例えばエメリン、ラミンＡ／Ｃ、ＦＡＣＥ−１等）である。
【００２３】
本発明による組成物のＶＬＰは、１つのタイプのキャプシドタンパク質で、又は幾つかの異なるキャプシドタンパク質で構成され得る。好ましくは、本発明による組成物は、１つのタイプのキャプシドタンパク質で構成されるＶＬＰを含有する。特に好ましくは、そのキャプシドタンパク質が、ｉｎ ｖｉｖｏ及びｉｎ ｖｉｔｒｏの両方において適切な条件下でＶＬＰへと併せて構築するための固有の特性を有するＶＬＰが使用され、即ち、さらなる補助因子は、単量体タンパク質からのＶＬＰの形成に要されない。
【００２４】
ＶＬＰ：ＲＮＡｉ誘導分子の質量の比は通常、１：１００〜１００：１、好ましくは１：５０〜５０：１、特に好ましくは１：２０〜２０：１、最も好ましくは１：１〜２０：１の範囲で見出される。
【００２５】
好ましくは、例えば標準の(authentic)ウイルス核酸のような標準のウイルスの他の構成成分を含まないＶＬＰが使用される。ヒトＪＣウイルス（ＪＣＶ）のキャプシドタンパク質ＶＰ１で構成されるＶＬＰの使用が特に好ましい。ＪＣＶはポリオーマウイルスの属に属し、そのウイルスゲノムは、二重鎖ＤＮＡの形態でキャプシド内部に存在する。
【００２６】
特定の実施形態では、ＶＬＰは、組換え的に生産されたキャプシドタンパク質で構成される。本発明による「キャプシドタンパク質」という用語は、例えば野生型ＶＰ１のような各々のウイルスの野生型株のキャプシドタンパク質に加えて、キャプシドタンパク質の修飾形態、即ち例えば置換、挿入及び／又は欠失のような突然変異により野生型キャプシドタンパク質と異なるタンパク質も含む。組換えＶＰ１を生産するためには、好ましくは配列番号１に示されるような配列、遺伝子コードの縮重との関連からこの配列に相当する配列又はストリンジェントな条件下で上記配列とハイブリダイズする配列を有する核酸が使用され、それによって核酸配列又はこの配列を含有する組換えベクターは、適切な宿主細胞へ導入されて、宿主細胞は、核酸配列の発現が行われる条件下で培養されて、タンパク質は、細胞又は細胞上清から単離される。ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件は好ましくは、Sambrook et al. (1989) Molecular Cloning. A Laboratory Manual,Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Pressに従って規定され、６８℃にて０．１×ＳＳＣ、０．５％ ＳＤＳ中で３０分の洗浄工程を含む。
【００２７】
配列番号１による核酸によりコードされるアミノ酸配列は、配列番号２に示される。本発明では、好ましくは、配列番号２又は上記配列に対して少なくとも７０％、好ましくは少なくとも８０％、特に好ましくは少なくとも９０％、最も好ましくは少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列を含有するＶＰ１ポリペプチドが使用され、ここで同一性は配列番号２の全領域にわたって確定される。
【００２８】
さらに好ましい実施形態では、アミノ酸配列がＮ末端領域で、例えば２５のＮ末端アミノ酸領域で修飾されたＶＰ１タンパク質が使用される。その際、好ましくは、異種核局在化シグナルが、ＶＰ１のアミノ酸配列へ導入される。好ましい核局在化シグナルは、アミノ酸配列ＣＰＧＡＡＰＸ１Ｘ２Ｐ（式中、Ｘ１及びＸ２は任意のアミノ酸を意味し、好ましくはいずれの場合でもＫを意味する）を含有し、例えば、ＳＶ４０又はＢＫＶの核局在化シグナルに基づく。特に好ましい核局在化シグナルのアミノ酸配列を図４Ａに示す。
【００２９】
好適な修飾ＶＰ１タンパク質（ＶＰ１−Ｍｕｔ２）をコードする核酸配列は、配列番号３に示される。相当するアミノ酸配列は、配列番号４に示される。したがって、本発明の目的の１つは、好ましくは上述したような異種核局在化シグナルを含有する修飾ＪＣＶ−ＶＰ１タンパク質、それをコードする核酸及び少なくとも１つの適宜修飾されたＶＰ１タンパク質を含有するＶＬＰであり、ここで上記ＶＬＰは、活性剤、特に核酸だけでなく、他の分子も任意で含有することができる。
【００３０】
使用される宿主／ベクター系に応じて、組換えキャプシドタンパク質の単離は、直接的に宿主細胞から、及び／又は細胞培養上清から行われる。組換え方法の利点は、主としてＶＬＰが簡素な態様で高純度且つ大量に得られ得るという事実に存する。実際に、ＶＰ１の組換え合成では、昆虫細胞とともに、例えば昆虫細胞株Ｓｆ１５８とともにバキュロウイルスを使用することにより、発現系としてのその価値が証明されている。
【００３１】
腎臓由来及びニューロン由来の細胞に関する細胞特異的なＤＮＡ輸送並びに形質導入系としてのＶＰ１−ＶＬＰの適合性は、すでに独国特許第１０１ ３１ １４５．１号明細書に示されていた。この文献はさらに、ＶＰ１−ＶＬＰの細胞向性を系統的に修飾するためのＶＰ１−ＶＬＰの修飾に関する方法について記載しており、その結果、規定の標的細胞及び組織は選択的に形質導入され得る。
【００３２】
驚くべきことに、同様にＲＮＡｉ誘導分子、特にｄｓＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ又はそれらの前駆分子は、これらの分子の構造を変化させることなくＪＣウイルスのＶＬＰ内部でパッケージングされ得ることが今回見出された。標的細胞中でＲＮＡｉを誘導するＲＮＡｉ誘導分子は、分解及び構造的変化の両方に対してＶＬＰの内部で十分に防御されることが見出された。標的細胞という用語は、真核細胞、好ましくは多細胞生物の細胞、特に哺乳類細胞（ヒト由来の細胞を含む）を意味するものとする。
【００３３】
そのキャプシドタンパク質が本発明による組成物の構成成分であるウイルスの天然宿主スペクトルに相当する細胞へＲＮＡｉ誘導分子を導入するために、好ましくはそのキャプシドタンパク質が野生型キャプシドタンパク質に相当するＶＬＰが使用される。例えば、ＪＣＶの宿主スペクトルは、例えばオリゴデンドロサイト、アストロサイト及びグリア細胞のような神経組織の細胞並びに神経関連組織の細胞を含む。ＲＮＡｉ誘導分子がこれらの細胞に導入される場合、本発明による組成物は、好ましくはＪＣウイルスの野生型ＶＰ１キャプシドタンパク質で構成されるＶＬＰを含有する。
【００３４】
そのキャプシドタンパク質が本発明による組成物の構成成分であるウイルスの天然宿主スペクトルに相当しない細胞にＲＮＡｉ誘導分子を供給するためには、好ましくはそのキャプシドタンパク質が野生型キャプシドタンパク質と比較した場合に修飾されるＶＬＰが使用される。本発明による組成物における修飾ＶＬＰの使用は好ましくは、それぞれ特定の型の細胞に、又は特定の組織に限定される疾患の治療を可能にする。特に好ましくは、本発明による組成物は、ＪＣウイルスのＶＬＰで構成され、ここでＶＰ１−ＶＬＰの少なくとも１つのキャプシドタンパク質は、野生型ＶＰ１と比較した場合に修飾される。
【００３５】
一方で、修飾は、野生型キャプシドタンパク質のアミノ酸配列における修飾を含む。特に、挿入、欠失、置換及び／又は他のアミノ酸配列との融合がこの群に属するが、但し、自己集合に関する、即ちＶＬＰを形成することに関するキャプシドタンパク質の固有の特性は失われない。したがって、本発明による組成物のＶＬＰは、融合タンパク質の形態でキャプシド構造中に１つ又は幾つかのさらなる異種タンパク質又はタンパク質の一部を包含し得る。このことは、異種タンパク質又はタンパク質の異種部分がキャプシド構造中で固着されることを意味し、ここで好ましくはこのタンパク質の少なくとも一部は、外側から接近可能である。かかる融合タンパク質で構成されるＶＬＰは、融合部分のため、対象とされる標的細胞の特異的な表面受容体と相互作用することができる。このようにして、対象とされる標的細胞との相互作用の特異性を保証することができ、使用に応じて多数の細胞型へ調節することができる。同様に、キャプシドタンパク質の標的修飾により、ＶＬＰの向性を種々の細胞又は組織へ限定することが可能である。
【００３６】
規定のタイプの細胞に向かってＶＬＰの向性を誘導するためのさらなる可能性は、本発明による組成物のＶＬＰの化学修飾にある。ＶＬＰの化学修飾は、それぞれ特定の細胞又は組織に関するＲＮＡｉ誘導分子用のトランスファー系としての本発明による組成物の融通性の高い使用を可能にする。ＶＬＰの標的細胞特異性の標的修飾に関して、ＶＬＰ及び細胞型特異的なリガンドの結合体は有利であることが証明されている。好ましい実施形態では、少なくとも１つのリガンドは、ＶＬＰに結合されている。そのため、リガンドは基本的に任意の物質であり得る。
【００３７】
例えばリガンドは、標的細胞特異的なサブユニット、例えば細胞表面受容体に関する結合パートナーであり得る。結合パートナーに適した例は、天然リガンド又はそれらの合成類似体であり、ここでタンパク質（例えば、トランスフェリン）、抗体又は糖（例えば、マンノース）のような高分子量リガンドだけでなく、低分子量合成リガンド（例えば、トリペプチドモチーフＲ−Ｇ−Ｄ（Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ））もまた使用することができる。或いは、又はさらには、標識サブユニット、例えば適切な検出方法を用いて検出され得るサブユニット（例えば、蛍光標識サブユニット又はビオチンのような）もまたリガンドとして使用することができる。さらに、リガンドはまた、エフェクターサブユニット、例えば細胞障害性サブユニットであり得る。当然のことながら、幾つかのリガンドの組合せ、特に上述のリガンドの組合せもまた使用することができる。
【００３８】
リガンドとＶＬＰのキャプシドタンパク質との間の相互作用は、好ましくは化学アンカーサブユニットにより媒介される。そのため、特に細胞特異的なリガンドのためのアンカー分子としてのカチオンポリマーによるキャプシドタンパク質の担持は適切であると証明されている。
【００３９】
カチオンポリマーに関する具体例は、例えばポリリシンのような本質的に塩基性のアミノ酸ベースのポリマー、特にポリ−Ｌ−リシン等である。適切なカチオンポリマーに関するさらなる具体例は、ポリアルキレンアミン、ポリアルキレンイミン、好ましくはポリ−Ｃ２〜Ｃ４−アルキレンイミン、特にポリエチレンイミン（ＰＥＩ）、ｐＡＭＡＭ（ポリアミドアミン）デンドリマー及び分画デンドリマー、並びにカチオン修飾されたポリエチレングリコールである。ポリエチレンイミンは、それが無毒性であり、且つ高密度の正電荷を有するため、本発明の意味合いで特に好ましいカチオンポリマーである。さらに、ＰＥＩは、細胞への取込み後にｐＨ依存性の構造的変化を達成することが可能であり、エンドソーム細胞区画及びリソソーム細胞区画の不安定化、したがって細胞質へのＲＮＡｉ誘導分子の放出の支持につながる。このプロセスは、酸性化後にリソソーム中でプロトン化され、続いて小胞膜の浸透圧破裂につながるイミノ基の顕著な緩衝能により支持される。
【００４０】
結合体におけるＶＬＰ対カチオンポリマーの重量比は、広範囲内で様々であり得る。したがって、５：１〜１：１０の重量比が適切であると証明されており、ここで、最適な結合を可能にするためには２：１及び１：５の重量比が特に好ましい。
【００４１】
ＶＰ１−ＶＬＰ及びカチオンポリマーの結合体を生産する方法は、独国特許第１０１ ３１ １４５．１号明細書から既知である。
【００４２】
さらなる好ましい実施形態では、異種結合パートナー又はリガンド、それぞれ例えばポリペプチド又は標識サブユニットは、直接的に且つ制御可能な化学量論でＶＬＰへ連結させることができる。ヘテロ二官能性タンパク質間リンカーの例は図５に示される。本発明では、リンカー（本発明では、ＰＥＯ−マレイミドリンカー）をＶＰ１に結合するために、好ましくはＫ６０及び／又はＫ１６４の外側にあるリシン残基のアミノ基が使用される。リガンドは、システイン残基、例えばシステイン残基のカルボキシ末端を通じて、リンカーの第２の活性部位へ結合することができ、細胞のリガンド特異的なタイプへＶＬＰ担持を特異的に送達することができる安定なＶＰ１−リガンド結合体を付与することができる。
【００４３】
したがって、本発明の別の目的は、少なくとも１つの異種結合パートナー、例えばポリペプチドがアミノ酸残基Ｋ６０及び／又はＫ１６４を通じて結合されているＪＣＶ−ＶＰ１キャプシドタンパク質である。
【００４４】
さらに、本発明の目的は、
（ｉ）少なくとも１つのウイルスキャプシドタンパク質の幾つかの分子で構成されるウイルス様粒子（ＶＬＰ）及び少なくとも１つの細胞型特異的なリガンドの結合体（ここで、ＶＬＰ及びリガンドは、例えばカチオンポリマーのようなアンカー基により、又はヘテロ二官能性リンカーを通じて互いに結合される）、及び
（ｉｉ）ＶＬＰ及びリガンドの結合体へ組み込まれるＲＮＡｉ誘導分子を含む組成物である。
【００４５】
好ましくは、ヒトポリオーマウイルスＪＣのキャプシドタンパク質ＶＰ１に由来するＶＬＰが使用される。好ましくは、ＲＮＡｉ誘導分子として、上述したものが使用される。
【００４６】
請求項１に記載の組成物を生産するためには、ＲＮＡｉ誘導分子、及び任意でさらなる活性物質並びにキャリア、助剤及び／又は添加剤が、それぞれ、構築前に及び／又は構築中に所望の量又は濃度でキャプシドタンパク質に添加される。そうする際に、粒子内にＲＮＡｉ誘導分子を含有するＶＬＰを生成することができる。好ましくは、ＶＬＰのＲＮＡｉ誘導分子の担持は、ＶＬＰへのキャプシドタンパク質の会合中に行われる。ＲＮＡｉ誘導分子のパッケージングは、ｉｎ ｖｉｔｒｏ及びｉｎ ｖｉｖｏの両方で起きることができ、ここでＶＬＰ中でのＲＮＡｉ誘導分子の組込みは好ましくは、ｉｎ ｖｉｔｒｏ条件下で行われる。キャプシドコーティングの内部へのＲＮＡｉ誘導分子の組込みは、例えばキャプシドコーティングの解離（脱構築(de-assembly））及びＲＮＡｉ誘導分子の存在下での続く再構築により、又はＲＮＡｉ誘導分子の存在下でのＶＬＰの浸透圧ショックにより行われ得る。さらに、標的細胞の表面上で受容体と結合することが可能である標的細胞特異的なサブユニットは、上述したようにＲＮＡｉ誘導分子を担持するＶＬＰへ結合させることができる。ＶＬＰの担持に関する条件はそれぞれ、ＲＮＡｉ誘導分子の分解又は構造的変化がそれぞれ回避されるように選択されるべきである。
【００４７】
パッケージング中、キャプシド−タンパク質−モノマー対ＲＮＡｉ誘導分子の比は、ＶＬＰ当たりのキャプシドタンパク質の数及びパッケージングされるべき分子の大きさに応じて、広範囲にわたって様々であり得る。キャプシドタンパク質対ＲＮＡｉ誘導分子の質量比は通常、１：１００〜１００：１、好ましくは１：５０〜５０：１、特に好ましくは１：２０〜２０：１、最も好ましくは約１：１〜２０：１の範囲で見出される。
【００４８】
キャプシドタンパク質は、大量に且つ高純度でＲＮＡｉ誘導分子から組換え的に且つ個々に生産され、また核酸のパッケージングが、レトロウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター又はアデノウイルスベクターと対比して、パッケージング細胞株では行われないという背景に反して、組換え現象に起因するウイルス核酸の混入及び感染性ウイルスの生成の潜在的な危険性が回避され得る。さらに、ＲＮＡｉ誘導分子のパッケージング及び細胞特異的なリガンドでのＶＬＰの担持は、規定のｉｎ ｖｉｔｒｏでの条件下で行われるため、ＶＬＰ−ＲＮＡｉトランスファー系、本発明では特にＶＰ１−ＶＬＰトランスファー系は、ウイルス系及び非ウイルス系の利点を組み合わせている生物学的に安全なプラットフォーム技術を表すが、それらの欠点を示すことはない。したがって、本発明による組成物のＶＬＰは特に、それらが元のウイルスの核酸を含まないという事実を特徴とする。かかるＶＬＰ、特に組換えＶＰ１分子のＶＬＰは、国際公開第９７／１９１７４号パンフレットに記載されている。
【００４９】
本発明による組成物は、ｉｎ ｖｉｖｏ及びｉｎ ｖｉｔｒｏの両方で任意のタイプの細胞へＲＮＡｉ誘導分子を特異的に導入するために使用することができる。それによって、多細胞生物内での機能的ＲＮＡｉ誘導分子のターゲット・トランスファーは、ＲＮＡｉを用いた所定の遺伝子の発現の局所的に限定された下方制御を導く。したがって、本発明による組成物を使用する場合、例えば内因性遺伝子の発現の増加は、標的細胞のゲノムの修飾の既存の危険性を伴わずに一過的に下方制御され得る。それにもかかわらず、ＲＮＡｉを用いて、ＲＮＡ、特にｍＲＮＡの標的（即ち、配列特異的な）分解に関する遺伝情報を標的細胞へ永続的に組み込むことも可能である。さらに、本発明による組成物は、細胞型特異的な態様で、例えばＤＮＡセグメントの転位又はウイルス感染の結果としての望ましくない遺伝子の発現を下方制御するために使用することができる。特に、本発明による組成物は、病的状態と相関する少なくとも１つの遺伝子の発現を下方制御するために使用することができる。
【００５０】
本発明による組成物は、慢性疾患又はそれらの症状それぞれを治療するために使用することができる。この場合、ＲＮＡｉ誘導分子は、例えば、標的細胞においてｓｉＲＮＡ又はそれらの前駆分子の永続的な供給を達成するＤＮＡ構築物の形態で使用することができる。さらに、本発明による組成物を使用して、例えば獣医学及び人間医学の両方において急性感染症の治療のための細胞型特異的な遺伝子治療を一過的に確立することが今や可能となる。本発明による組成物の投与されるべき量は、とりわけ疾患の種類、症状の重篤性及び罹患されている細胞の範囲に依存する。
【００５１】
本発明による組成物は、ＶＬＰの適用に関する既知の方法に従って局所的に又は全身的に投与され得る。
【００５２】
したがって、本発明の別の目的は、標的細胞へＲＮＡｉ誘導分子を導入する方法であって、
（ｉ）上記ＲＮＡｉ誘導分子の存在下でのウイルスキャプシドタンパク質のＶＬＰへの構築工程、及び
（ｉｉ）上記標的細胞への上記ＲＮＡｉ誘導分子の取込みが起こり得る条件下で、上記ＲＮＡｉ誘導分子を担持した上記ＶＬＰを上記標的細胞と接触させる工程を含む方法である。
【００５３】
標的細胞特異性を修飾するために、さらに標的細胞の表面上の受容体と結合することができる１つ又は複数の標的細胞特異的なサブユニットを、工程（ｉ）で得られるＶＬＰへ結合させることができる。本発明による方法はとりわけ、標的細胞における所定の少なくとも１つの遺伝子の下方制御に使用され得る。
【００５４】
任意の真核細胞を標的細胞として使用することができる。好ましくは、真核細胞は、哺乳類細胞であり、特にヒト由来である。請求項１に記載の組成物を使用して、その自然環境中に存在する細胞、及びその自然な環境から単離された細胞の両方へ、ＲＮＡｉ誘導分子を導入することが可能である。
【００５５】
ＲＮＡｉ誘導分子を導入する目的の標的細胞が、本発明による方法で使用されるＶＬＰが由来するウイルスの天然宿主スペクトルに相当しない場合、ＶＬＰの細胞型特異性は、上述したようなキャプシドタンパク質とリガンドとの複合体形成を通じて、ＲＮＡｉ誘導分子及び任意でさらなる活性剤による担持前、担持中又は担持後に修飾され得る（「再ターゲッティング」）。そのため、有利には、標的細胞の細胞表面上に露出される受容体と特異的に結合することができるリガンドが選択される。或いは、そのアミノ酸組成物中に、標的細胞の外側表面上の特異的な受容体に結合するその能力に起因して、異種タンパク質（これは、ＲＮＡｉ誘導分子のターゲット・トランスファーを媒介する）及び任意でさらなる活性剤を含むキャプシドタンパク質で構成されるＶＬＰが、このために使用され得る。
【００５６】
本発明のさらなる目的は、外来核酸、例えば病原性生物、特に病原性ウイルスの核酸の発現により、又は内因性遺伝子の発現の増加若しくは望ましくない発現により引き起こされる疾患若しくは疾患状態の診断、予防及び／又は治療のための上述したようなＲＮＡｉ誘導分子を含む上述したようなＶＬＰを含む薬学的組成物である。
【００５７】
本発明はさらに、上述したようなＶＬＰを含む任意の種類の細胞又は組織へそれぞれＲＮＡｉ誘導分子を導入するための試験キットに関する。
【００５８】
本発明のさらに別の目的は、任意でポリペプチド免疫原又はペプチド免疫原、アプタマー又はｓｉＤＮＡ分子と組み合わせて、他の種類の核酸、例えば免疫刺激性核酸を含有する上述したようなＶＬＰ組成物である。さらに適切な薬物は、極性細胞分裂阻害剤又は毒素である。
【００５９】
上述のＲＮＡｉ誘導分子の他に、特に感染性レトロウイルス疾患（例えば、ＨＩＶ−１）との関連から、さらなる治療的ＶＬＰ担持及び予防的ＶＬＰ担持として他の核酸も同様に言及されなくてはならない。予防的用途に関しては、免疫刺激性配列（ＩＳＳ）が、それぞれのレトロウイルスからの免疫原（例えば、ＨＩＶ−１からのｅｎｖ構成成分）と最適に組み合わせて、本発明では挙げられるであろう。さらに、治療に関しては、幾つかの非ＲＮＡｉ誘導核酸配列を通じて、ウイルス阻害が達成されるであろう。これらの分子は、阻害性ＤＮＡアプタマー及び阻害性ＲＮＡアプタマーから、並びに酵素リボヌクレアーゼＨの早発活性化によりレトロウイルスのゲノムを、宿主ゲノムへのその組み込み前に破壊することができるいわゆるｓｉＤＮＡから選択することができる。（Matskevich et al., Aids Res & Human Retroviruses 22 (2006),1220-1230、Matzen et al. Nature Biotechnology 6 (2007)）。かかる核酸をＶＬＰへ含ませることに関しては、ＲＮＡｉ分子に関連した記述を参照されたい。
【図面の簡単な説明】
【００６０】
【図１】グリオーマＳＷ１０３細胞へのｓｉＲＮＡ分子及びＤＮＡの効率的且つ機能的導入。Ａ）細胞をｓｉＬａｍＡ１又はｓｉＧＬ２ ｓｉＲＮＡ担持ＶＬＰで処理して、ＶＬＰ処理の４４時間後に、間接的免疫蛍光（ＩＩＦ）を用いて検査した。左側はｓｉＬａｍＡ１−ＶＬＰで処理した細胞の群を示す。ここで、細胞は、標的タンパク質のほぼ完全な下方制御を示す（上部）。非関連対照ｓｉＧＬ２−ＶＬＰで処理した対照細胞は正常なラミンＡ／Ｃ含有量を示した。ここで、ラミンＡ／Ｃは、細胞の核中に存在する。ＤＮＡは、ヘキスト３３３４２で染色した。Ｂ）直接的免疫蛍光顕微鏡法による観察結果は、ウェスタンブロット分析で確認された。未処理の細胞又はｓｉＬａｍＡ１−ＶＬＰ若しくはｓｉＧＬ２−ＶＬＰで処理した細胞の細胞抽出物を処理の４４時間後に収集して、抗ラミンＡ／Ｃ抗体で染色した。ラミンＡ／Ｃ含有量は、両方の対照レーンでは同一であった。ここで、ｓｉＲＮＡ−ＶＬＰ処理した集団におけるラミンＡ／Ｃの比率は顕著に低減した。均一なタンパク質量を確認するために、並行してビメンチンに関してブロットを分析した。Ｃ）ｓｉＲＮＡ分子に加えて、ｅＧＦＰをコードする直鎖化発現構築物をＶＬＰへパッケージングして、グリオーマ細胞へ形質導入した。この処理の２４時間後に、ほぼ全ての細胞が陽性ＧＦＰ発現を示した。
【図２Ａ】修飾されたＶＬＰを用いたｓｉＲＮＡの首尾よい導入の定性的及び定量的考証。Ａ）この図は、３つの個別に実施された実験の定量的ウェスタンブロット分析のデータを示す。ここで、ｓｉＲＮＡは、ＰＥＩ−Ｔｆ−ＶＬＰを使用してＨｅＬａ ＳＳ６細胞及びＭＣＦ７細胞へ導入された。ＰＥＩ−Ｔｆ及びｓｉＲＮＡでの細胞の処理では、ｓｉＲＮＡ単独、空ＰＥＩ−Ｔｆ−ＶＬＰ及び非関連ｓｉＲＮＡ担持ＰＥＩ−Ｔｆ−ＶＬＰをそれぞれ陰性対照とした。ＰＥＩ−Ｔｆ及びｓｉＬａｍＡでの処理のみが標的タンパク質の含有量の弱い（１５％〜２０％）低減を示し、５０ｎＭの量でのｓｉＲＮＡのＶＬＰパッケージングはより効率がよかった。５μＭ ｓｉＲＮＡでＶＬＰに担持させた後のＰＥＩ−Ｔｆとの複合体形成は、ラミンＡ／Ｃのほぼ完全な下方制御を導いた。ラミンＡ／Ｃに対して作用する他のｓｉＲＮＡ分子（それらのうちの１つは、センス鎖の５’末端にフルオレセインを伴って又は伴わずに結合された）は、ＨｅＬａ細胞での下方制御に関して同等の有効性を示した。ヒトエメリンに対して作用するｓｉＲＮＡ分子の第２の組は、ＭＣＦ７細胞で検討された。定量的ウェスタンブロット分析により示されるように、３つ全ての場合で、ｓｉＲＮＡは、細胞へ首尾よく導入された。下部は、ＥＣＬ-現像後の代表的なブロットを示す。全ての場合において、ビメンチンは添加量の比較対照として使用された。
【図２Ｂ】修飾されたＶＬＰを用いたｓｉＲＮＡの首尾よい導入の定性的及び定量的考証。Ｂ）ｓｉＬａｍＡ−Ｆ−ＰＥＩ−Ｔｆ−ＶＬＰで処理したＨｅＬａ細胞の蛍光顕微鏡画像は、ｓｉＲＮＡ分子の取込み（緑）及びラミンＡ／Ｃの用量依存的下方制御（赤）を示す。より高い担持濃度（下部）と比較して、ｓｉＲＮＡが５０ｎＭの濃度でＶＬＰへ組み込まれる場合、標的遺伝子の下方制御に対する影響が弱くなる（中央部）。対照細胞では、対照細胞が非関連ｓｉＲＮＡ分子を含有するＶＬＰで処理された場合、ラミンＡ／Ｃ含有量の低減を観察することはできない（上部）。
【図３】ヒトＴ細胞における一過的ＲＮＡ干渉。ヒトＳｕｐＴ１細胞をデスフェリオキサミンで刺激した２４時間後に、ｓｉＲＮＡ担持ＰＥＩ−Ｔｆ−ＶＬＰで処理した。Ａ）ＶＬＰによる処理の２４時間後の単一ｓｕｐＴ１細胞の共焦点蛍光顕微鏡法により、細胞質における蛍光ｓｉＲＮＡ分子（ｓｉＬａｍＡ−Ｆ）の均質な分散が示される。Ｚ軸に沿った切片は、ｓｉＲＮＡの存在が主として細胞質に限定され、蛍光シグナルが細胞の周辺で又は細胞の核中でほぼ観察され得ないことを示す。Ｂ）細胞への導入後、抗エメリン−ｓｉＲＮＡ−ｓｉＥｍｅ１は、このｓｉＲＮＡが細胞のＲＮＡ干渉機構に利用可能であることを明らかに示した。抗エメリン抗体を使用した間接的免疫蛍光顕微鏡法は、ｓｉＥｍｅ−ＰＥＩ−Ｔｆ−ＶＬＰ処理した集団においてエメリンの強力な下方制御を示すのに対して、ｓｉＧＬ２−ＰＥＩ−Ｔｆ−ＶＬＰで処理した対照集団におけるエメリン含有量は変化しないままであった。Ｃ）免疫蛍光顕微鏡法の結果は、ウェスタンブロット分析を使用して確認した。ｓｉＥｍｅ1−ＰＥＩ−Ｔｆ−ＶＬＰ処理した集団のみが、エメリンの下方制御を示したのに対して、ｓｉＧＬ２−ＰＥＩ−Ｔｆ−ＶＬＰ又は空ＰＥＩ−Ｔｆ−ＶＬＰで処理した対照細胞、並びにｓｉＥｍｅ1及びＰＥＩ−Ｔｆでのみ処理した細胞は、エメリン含有量の低減を示さなかった。等量のタンパク質の添加は、ポンソーレッドによる膜の染色により確認された（色素は背景に示されている）。
【図４】ＶＰ１タンパク質の配列修飾。Ａ）ポリオーマＪＣウイルス野生型ＶＰ１及びキメラＶＰ１タンパク質（ＶＰ−Ｍｕｔ２）（これは、アミノ酸挿入に起因して２部核局在化シグナルを含有する）のアミノ末端配列の比較。ウイルスＳＶ４０及びＢＫＶに由来する配列（これは、修飾のための基礎を成した）は比較用に示される。Ｂ）電子顕微鏡画像化では、キメラＶＰ１タンパク質Ｍｕｔ２が、野生型ＶＰ１タンパク質と同じ脱構築特性及び再構築特性を示した。Ｃ）キメラＶＰ１タンパク質Ｍｕｔ２は、野生型タンパク質よりもＳＶＧグリア細胞においてより高い形質導入効率を示した。ルシフェラーゼ発現構築物の形質導入に続いて、相対ルシフェラーゼ活性が確定された。
【図５】ＶＰ１のリシン残基へのリガンドの連結により、再ターゲッティングが可能となる。アミノ基をスルフィドリル基へ連結することが可能であるヘテロ二官能性リンカー分子に関する一例を上方に示す。このリンカー分子（又はそれに類するリンカー分子）を使用して、第１のタンパク質（例えば、ＶＰ１）上のリシン残基及び第２のタンパク質（例えば、リガンド）上のシステイン残基を相互接続することができる。図の中央部分において、計算されるＪＣＶ−ＶＰ１タンパク質の構造、及び概略的に、接近可能なリシン残基へ連結される場合のリンカー分子が示される。最下部では、ＪＣＶ−ＶＰ１タンパク質が上面図で示される（即ち、キャプシドの外側から）。リガンドの連結に適しているリシン残基Ｋ６０及びＫ１６４の両方が示されている。これらのリシン残基は、上記で示されるようにヘテロ二官能性リンカー分子を結合するのに使用され得る。
【発明を実施するための形態】
【００６１】
ここで、本発明は、下記実施例並びに添付の図面及び配列表によりさらに説明される。
【実施例】
【００６２】
実施例１
材料及び方法
ｓｉＲＮＡ分子の構築及び合成
化学的に合成されたＲＮＡオリゴヌクレオチドは、Dharmacon（コロラド州、ラフィーエット）から入手した。ｓｉＲＮＡ分子は全て、３’−ｄＴｄＴオーバーハングを含有した。蛍光標識は、その官能性に影響を及ぼさないように、ｓｉＲＮＡ分子のセンス鎖の５’末端に連結させた。ＰＣＲ用のヌクレオチド（ｄＮＴＰ）は、Boehringer（ドイツ、マンハイム）から入手し、ｉｎ ｖｉｔｒｏでの転写を用いてｓｈＲＮＡを生産するためのＰＣＲプライマー及びＤＮＡフラグメントは、NAPS（ドイツ、ゲッティンゲン）により供給された。化学的に合成された、２７ヌクレオチドの長さを有する二重鎖ＲＮＡ（２７ｍｅｒｄｓＲＮＡ）は、IBA（ドイツ、ゲッティンゲン）により供給された。
【００６３】
【表１】
【００６４】
抗体及び間接的免疫蛍光顕微鏡法
形質導入された細胞を、処理の４４時間後にＶＬＰとともに−２０℃冷メタノールで処理した。一次抗体として、マウス抗ラミン Ａ／Ｃ抗体（クローン６３６．２３）、マウス抗エメリン抗体(Novagen)及びマウス抗α−チューブリン抗体（Ｄ１Ｈ、Sigma、ドイツ）を使用した。二次抗体として、ローダミン又はフルオレセイン結合ヤギ抗マウスＩｇＧを使用した。固定化後、ＰＢＳで洗浄した細胞を、３７℃にて湿気チャンバ中で一次抗体とともに１時間インキュベートした。次に、細胞をＰＢＳで３回洗浄して、蛍光二次抗体を３７℃で１時間添加した。ＰＢＳで３回洗浄することにより、未結合抗体を除去した後、２μＭ ヘキスト３３３４２色素（Hoechst、ドイツ）でＤＮＡを可視化させた。これに関して、細胞を、スライドガラス上でモヴィオール（Hoechst、ドイツ）により固定化させた。
【００６５】
定量的ウェスタンブロット分析
ＳＤＳゲル電気泳動は、標準的なプロトコルに従って実施した。タンパク質は、標準的なＳＤＳゲル電気泳動を用いて分離させて、半乾燥転写方法を使用してニトロセルロース膜上へ転写した。膜をＴＢＳＴ（２０ｍＭ トリスＨＣｌ、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、０．２％ツイーン２０、ｐＨ７．４）でブロックした。ここで、ＴＢＳＴは、脱脂粉乳粉末を５％含有していた。ラミンＡ／Ｃ、エメリン又はビメンチンに対する抗体もまた、ＴＢＳＴ中で希釈した。ここで、ＴＢＳＴは、脱脂粉乳粉末を２．５％含有していた。そのようにして希釈した抗体を、室温で１時間膜とともにインキュベートした。ウェスタンブロットにおいて同一量のタンパク質の分析を可能にするために、ビメンチンタンパク質含有量を確定した。膜をＴＢＳＴで２度、０．５％トリトンＸ−１００を加えたＴＢＳＴで１度洗浄した。アフィニティ精製したホースラディッシュ結合ブタ抗マウス免疫グロブリンは、Dako（デンマーク、コペンハーゲン）から入手した。それらを、脱脂粉乳を２．５％含有するブロッキング緩衝液中に１：１００００で希釈して、室温で２時間、膜とともにインキュベートした。ＥＣＬキット(Amersham Biosciences)を使用してバンドを検出して、ルミイメージャー（Boehringer/Roche、ドイツ）で定量化した。
【００６６】
細胞
【００６７】
【表２】
【００６８】
接着細胞（即ち、ＨｅＬａ ＳＳ６、ＭＣＦ−７、２９３Ｔ、ＣＯＳ−７、軟骨細胞及びグリオーマＳＷ１０３）をＤＭＥＭ中で培養した。ＤＭＥＭには、１０％ウシ胎児血清（ＦＣＳ）及び抗生物質（ペニシリン及びストレプトマイシン、ｐｅｎ／ｓｔｒｅｐ）を補充した。浮遊状態の細胞（即ち、ＨｅＬａ Ｓ３及びＳｕｐＴ１）をＲＰＭＩ−１６４０高グルコース培地中で培養した。ＲＰＭＩ−１６４０高グルコース培地には、１０％ＦＣＳ及びｐｅｎ／ｓｔｒｅｐが補充した。
【００６９】
ＶＬＰの生産及び担持
ポリオーマＪＣウイルスのＶＰ１タンパク質を、バキュロウイルス系を使用して昆虫細胞（ＳＦ）で発現させた。分泌されたタンパク質を、勾配遠心分離又はイオン交換ＦＰＬＣを使用して培地上清から単離した。
【００７０】
精製ＶＰ１は、５量体及びより高次のキャプシドで存在し、したがって核酸を担持する前に、これらをまず、脱構築緩衝液（１０ｍＭトリス、ｐＨ７．５、１０ｍＭ ＥＧＴＡ、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、５ｍＭ ＤＴＴ）を使用して脱構築しなければならなかった。再構築によるＶＬＰの担持は、微小透析設定で３．５ｋＤａの排除サイズを用いて４℃にて一晩、再構築緩衝液（１０ｍＭトリス、ｐＨ７．５、１ｍＭ ＣａＣｌ２、１５０ｍＭ ＮａＣｌ）に対するＶＰ１／核酸混合物の透析により行った。ＤＮＡ対ＶＬＰの標準的な比は１：１０であった（例えば、ＶＬＰ ５μｇに５００ｎｇを添加した）。続く再ターゲッティングのために、再会合したＶＬＰを１：５（ＰＥＩ：ＶＬＰ、例えばＰＥＩ １μｇをＶＬＰ ５μｇに添加した）の比でＰＥＩ−Ｔｆと混合した。
【００７１】
トランスフェクション／形質導入
ｓｉＲＮＡ担持ＶＬＰによる処理の２４時間前に、細胞をそれぞれ、２４ウェルプレートに５００００細胞／ｍｌ〜１０００００細胞／ｍｌで播いた。浮遊状態で培養された細胞（即ち、ＳｕｐＴ１細胞株及びＨｅＬａ Ｓ３細胞株）の場合、トランスフェリン代謝を刺激するために、また細胞表面上のトランスフェリン受容体の密度を増大させるために、培養培地に、０．５ｎｇ／ｍｌのデスフェリオキサミンを補充した。ＶＬＰによる直前に、作用物質の細胞毒性副作用を回避するために、刺激培地を正常な培養培地と取り替えた。
【００７２】
結果
ヒトグリオーマ細胞へのＤＮＡ及びｓｉＲＮＡの導入
ｓｉＲＮＡ担持ＶＬＰを、ヒトグリオーマＳＷ１０３細胞の培養培地へ添加した。処理の１時間後、ヒトラミンＡ／Ｃ（ｓｉＬａｍＡ−Ｆ）に対して作用する蛍光標識されたｓｉＲＮＡを、グリオーマ細胞の細胞質で観察することができた（図１を参照）。裸のｓｉＲＮＡ及び空ＶＬＰによる対照細胞の処理により、ＶＬＰにパッケージングされたｓｉＲＮＡのみの特異的な取込みが確認された。ＶＬＰ形質導入の２４時間後に、ＲＮＡ干渉効果を考慮して、間接的免疫蛍光顕微鏡法及びウェスタンブロット分析を用いて細胞を検査した。標的タンパク質ラミンＡ／Ｃの量は、ｓｉＬａｍＡ−Ｆ−ＶＬＰで処理した細胞中で有効に下方制御されたのに対して、このことは対照細胞では観察することができなかった（図１）。
【００７３】
ＶＬＰとＰＥＩ−Ｔｆとの複合体形成によるＶＬＰの再ターゲッティングを含むグリオーマＳＷ１０３細胞へのｓｉＲＮＡ分子の導入はまた、ＶＬＰへの核酸のパッケージングに関する品質管理として続く実験でも使用した。
【００７４】
ＰＥＩ−Ｔｆと複合体形成されているｓｉＲＮＡ担持ＶＬＰにより媒介される接着細胞におけるＲＮＡ干渉
ｓｉＲＮＡ担持ＶＬＰを、種々のヒト細胞株の培養培地へ添加した。ＨｅＬａ ＳＳ６細胞に関して幾つかの実験を実施した。ＶＬＰによる処理の２４時間前に、細胞を静置培養した。検査は、この処理の２４時間後又は４８時間後に行った。
【００７５】
ＨｅＬａ細胞
１．ｓｉＲＮＡ分子のＰＥＩ−Ｔｆ−ＶＬＰ媒介性導入による用量依存的及び機能的ＲＮＡ干渉
ＨｅＬａ細胞を約７５０００細胞／ウェルの密度で２４ウェルプレートで培養し、２４時間後にＶＬＰ １μｇ又は５μｇで処理した。機能的且つ有効なＲＮＡ干渉に要されるｓｉＲＮＡ分子の量を確定するために、再構築緩衝液中でＶＬＰに５０ｎＭ又は３μＭのｓｉＲＮＡを添加した。空ＶＬＰ、非関連ｓｉＲＮＡ分子を担持したＶＬＰ及び単にＰＥＩ−Ｔｆと複合体形成したｓｉＲＮＡ分子は、対照として用いた。トランスフェリン受容体を用いた細胞への取込みを可能にするために、ＰＥＩ−Ｔｆを１：５（ＰＥＩ−Ｔｆ １μｇ：ｓｉＲＮＡ−ＶＬＰ ５μｇ）の比で再構築された担持ＶＬＰへ添加した。２４ウェルプレートの各ウェルの約１０００００細胞において効率的なＲＮＡ干渉を行うためには、これらを３μＭ ｓｉＲＮＡで担持されたＶＬＰ ５μｇで処理する必要がある（図２）。５０ｎＭ ｓｉＲＮＡ担持ＶＬＰによるｓｉＲＮＡの形質導入は、単に標的タンパク質ラミンＡ（／Ｃ）の若干の減少を招いたに過ぎなかった。ｓｉＲＮＡの取込みは、蛍光標識されたｓｉＲＮＡ ｓｉＬａｍＡ−Ｆの形質導入を用いて確認され、下方制御の影響は、定量的ウェスタンブロット分析及び間接的免疫蛍光顕微鏡法を用いてタンパク質レベルに関して検査された。空ＰＥＩ−Ｔｆ−ＶＬＰによるか又は非関連ｓｉＲＮＡを含有するＶＬＰによる細胞の形質導入は、ラミンＡ（／Ｃ）タンパク質含有量の減少に至らなかった。ＶＬＰを伴わないＰＥＩ−Ｔｆと複合体形成されたｓｉＲＮＡは、ラミンＡ（／Ｃ）発現の弱い阻害を引き起こし（ここでは、それにも関わらず、下方制御は１５％〜２０％に限られた）のに対して、ｓｉＬａｍＡ−ＰＥＩ−Ｔｆ−ＶＬＰは、適切な濃度で使用される場合に標的タンパク質のほぼ完全な下方制御（「ノックダウン」）を引き起こした（ＨｅＬａＡの図）。ラミンＡ／Ｃに対して作用する３つの異なるｓｉＲＮＡ分子（そのうちの１つは、蛍光標識された）は、細胞への及び細胞質へのＶＬＰの取込みを可視化するためにＨｅＬａ細胞に関して検査された。ｓｉＲＮＡ分子は全て、それらがＰＥＩ−Ｔｆ−ＶＬＰの形態で細胞へ投与された場合に、標的タンパク質発現の有効な下方制御を導いた。
【００７６】
２．非古典的な２７ｍｅｒ ｄｓＲＮＡ分子は、下方制御に首尾よく使用された
さらに、非古典的なｓｉＲＮＡ、即ちｓｉＬ２７ＡＣ（これは、３’オーバーハングを有さない２７ヌクレオチドの長さを有する５’リン酸化ｄｓＲＮＡで構成される）をＨｅＬａ細胞へ形質導入して、これがラミンＡ／Ｃタンパク質の発現の効率的な下方制御を引き起こした。したがって、本発明による組成物はまた、ＶＬＰを細胞のＲＮＡ干渉機構に利用可能とするために、ＶＬＰの２７ｍｅｒｄｓＲＮＡ担持により標的細胞の細胞質へエンドヌクレアーゼダイサー用の基質を導入することも可能にする。
【００７７】
３．ＰＥＩ−Ｔｆ−ＶＬＰは、乳癌細胞への活性ｓｉＲＮＡ分子の導入に使用された
ヒトエメリン遺伝子に対して作用する３つの異なるｓｉＲＮＡ分子の第２の組を、上述したようにヒト乳癌ＭＣＦ−７細胞へ形質導入した。定量的ウェスタンブロット分析により、これらの実験で使用された３つのｓｉＲＮＡ種は全て、標的遺伝子の下方制御を首尾よく引き起こすことが示された（図２Ａ）。これらの結果は、種々のタイプの細胞において代替標的遺伝子に対して作用するｓｉＲＮＡ分子の効率的なトランスファーの観点からＶＬＰが広範に適用可能であることを強調するものである。
【００７８】
さらなる細胞株及び情報は表３から得ることができ、表３は、種々の細胞株においてＶＬＰを使用した核酸トランスファー実験に関する概要を示す。
【００７９】
ＰＥＩ−Ｔｆと複合体形成されたｓｉＲＮＡ担持ＶＬＰにより媒介される非接着細胞におけるＲＮＡ干渉
ヒトＳｕｐＴ１ Ｔ細胞を浮遊状態で培養し、ＶＬＰによる処理の２４時間前に静置培養した。細胞エネルギー代謝を誘導するために、また細胞の表面上のトランスフェリン受容体の密度を増大させるために、１５ｎＭのデスフェリオキサミンを培養培地に添加した。ＶＬＰによる処理の直前に、培地を標準的な培養培地で取り替えて、ＶＬＰは上記で挙げられるような量で添加した。ＳｕｐＴ１細胞は、内因性ヒトエメリンに対して作用するｓｉＲＮＡ分子を含有するＶＬＰ、非関連ｓｉＲＮＡ（ＧＬ２）を含有するＶＬＰ又はｓｉＲＮＡを含有しないＶＬＰで形質導入した（図３）。同じＶＬＰをＰＥＩ−トランスフェリンを伴わせるかまたは伴わせずに対照として使用した。さらなる対照として、細胞をＰＥＩ−Ｔｆと複合体形成されたｓｉＲＮＡ分子で処理したが、このＲＮＡは、ＶＬＰへ組み込まれなかった。細胞の細胞質へのｓｉＲＮＡ分子の取込みを示すために、蛍光標識されたｓｉＲＮＡを使用した。共焦点顕微鏡法を使用して、ＳｕｐＴ１細胞の細胞質における蛍光ｓｉＲＮＡの均質な分散が示された。かかる細胞のＸ軸に沿った切片を図３Ａに示す。ＶＬＰ導入されたｓｉＲＮＡを用いた標的遺伝子発現の有効な下方制御は、間接的免疫蛍光顕微鏡法（図３Ｂ）及びウェスタンブロット分析（図３Ｃ）を使用して確認された。結果として、処理した細胞のほぼ１００％でエメリン遺伝子発現の非常に効率的な下方制御が示された一方で、非関連ｓｉＲＮＡによる処理では、エメリンの含有量に影響を与えなかった。ウェスタンブロットデータにより、細胞をｓｉＥｍｅ担持ＰＥＩ−Ｔｆと複合体形成されたＶＬＰで処理した場合にのみ、エメリンの十分な下方制御が達成され得る一方で、ＰＥＩ−Ｔｆ複合体形成単独ではタンパク質の測定可能な下方制御に至らないことが示された。
【００８０】
同様に、ＶＬＰ媒介性ｓｉＲＮＡの取込みは、ＨｅＬａ Ｓ３細胞が使用された場合に成功した。これらの細胞は、浮遊状態での成長に適応している（データは示さず）。
【００８１】
【表３】
【００８２】
実施例２
野生型配列と比較して、アミノ末端領域に修飾を有する修飾タンパク質ＶＰ１−Ｍｕｔ２を生産した。この修飾のため、ウイルスＳＶ４０又はＢＫＶの配列に基づく異種核局在化シグナルのアミノ酸配列が導入された。異種核局在化シグナルの配列を図４Ａに示す。
【００８３】
キメラタンパク質ＶＰ１−Ｍｕｔ２を、無傷のＶＬＰを形成する能力に関して試験した。これは、電子顕微鏡画像化により確認された。さらに、種々のタイプの細胞が、ＤＮＡ担持ＶＰ１−Ｍｕｔ２ ＶＬＰで形質導入され、そうする際にキメラ形態は、少なくとも同等の（ＣＯＳ−７腎臓細胞）形質導入効率又は最大５倍増加された（ＳＶＧグリア細胞）形質導入効率を示した。結果を図４Ｂ及び図４Ｃに示す。
【００８４】
実施例３
ヘテロ二官能性リンカーを使用して、リガンドをＶＰ１タンパク質へ直接結合させることができる。かかる連結方法に関する好ましい実施形態を図５に表す。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
少なくとも１つのウイルスキャプシドタンパク質の幾つかの分子で構成されるウイルス様粒子（ＶＬＰ）を含む組成物であって、少なくとも１つのＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）誘導分子が、該ＶＬＰの内部に含まれることを特徴とする組成物。
【請求項２】
前記ＲＮＡｉ誘導分子が、ＲＮＡ及び／又はＲＮＡ類似体である、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
前記ＲＮＡが、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｄｓＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ又はそれらの前駆体である、請求項２に記載の組成物。
【請求項４】
前記ＲＮＡｉ誘導分子が、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｄｓＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ若しくはそれらの前駆体をコードするＤＮＡ及び／又はＤＮＡ類似体である、請求項１に記載の組成物。
【請求項５】
該ＤＮＡが、標的細胞中での発現を可能にする調節エレメントをさらに含むことを特徴とする、請求項４に記載の組成物。
【請求項６】
ＶＬＰ対ＲＮＡｉ誘導分子の質量比が、１００：１〜１：１００の範囲に存在することを特徴とする、請求項１〜５のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項７】
ＶＬＰ対ＲＮＡｉ誘導分子の質量の比が、１：１〜２０：１の範囲に存在することを特徴とする、請求項１〜６のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項８】
前記ＶＬＰが、ヒトポリオーマＪＣウイルスのキャプシドタンパク質ＶＰ１で構成される、請求項１に記載の組成物。
【請求項９】
前記ＶＬＰが、標準のウイルスの他の構成成分を含まない、請求項１に記載の組成物。
【請求項１０】
該ＶＬＰの少なくとも１つのキャプシドタンパク質が修飾される、請求項１〜９のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１１】
該ＶＬＰの少なくとも１つのキャプシドタンパク質が、化学的に修飾される、請求項１０に記載の組成物。
【請求項１２】
該ＶＬＰの少なくとも１つのキャプシドタンパク質が、少なくとも１つの標的細胞特異的なサブユニットと結合される、請求項１１に記載の組成物。
【請求項１３】
前記標的細胞特異的なサブユニットが、該標的細胞の細胞表面上に提示される受容体に結合することが可能であるリガンドであることを特徴とする、請求項１２に記載の組成物。
【請求項１４】
前記リガンドがトランスフェリンであり、前記受容体がトランスフェリン受容体であることを特徴とする、請求項１３に記載の組成物。
【請求項１５】
前記標的細胞特異的なサブユニットが、化学リンカー基を用いて該ＶＬＰの少なくとも１つのキャプシドタンパク質に結合されることを特徴とする、請求項１２〜１４のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１６】
前記リンカー基が、カチオンポリマーであることを特徴とする、請求項１５に記載の組成物。
【請求項１７】
前記カチオンポリマーが、ポリエチレンイミンであることを特徴とする、請求項１６に記載の組成物。
【請求項１８】
前記キャプシドタンパク質が、融合タンパク質である、請求項１０に記載の組成物。
【請求項１９】
前記融合部分が、前記ＶＬＰの形成を妨害しないことを特徴とする、請求項１８に記載の組成物。
【請求項２０】
前記融合部分が、標的細胞の細胞表面上に提示される受容体に結合することが可能であることを特徴とする、請求項１８又は１９に記載の組成物。
【請求項２１】
修飾されたキャプシドタンパク質から成る該ＶＬＰが、非修飾ＶＬＰの宿主スペクトルと同一でない宿主スペクトルを有することを特徴とする、請求項１〜２０のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項２２】
該ＶＬＰの前記キャプシドタンパク質が、組換え的に生産されることを特徴とする、請求項１〜２１のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項２３】
ＲＮＡｉ誘導分子を標的細胞へ導入するための請求項１〜２２のいずれか１項に記載の組成物の使用。
【請求項２４】
該標的細胞が、真核細胞であることを特徴とする、請求項２３に記載の使用。
【請求項２５】
該真核細胞が、哺乳類細胞であることを特徴とする、請求項２４に記載の使用。
【請求項２６】
該哺乳類細胞が、ヒト由来であることを特徴とする、請求項２５に記載の使用。
【請求項２７】
該標的細胞中の少なくとも１つの遺伝子の発現が、病的状態と相関する、請求項２３〜２６のいずれか１項に記載の使用。
【請求項２８】
少なくとも１つの遺伝子が、病原性ウイルスから生じるか又は病原性ウイルスに由来する標的細胞中で発現される、請求項２７に記載の使用。
【請求項２９】
少なくとも１つの内因性遺伝子の発現が、該標的細胞で増加される、請求項２３〜２６のいずれか１項に記載の使用。
【請求項３０】
該内因性遺伝子の該発現の増加が、病的状態と相関する、請求項２９に記載の使用。
【請求項３１】
薬剤としての使用ための請求項１〜２２のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項３２】
病原性生物から生じるか又は病原性生物に由来する核酸の発現により、或いは内因性遺伝子の発現の増加又は望ましくない発現により引き起こされる疾患若しくは疾患状態の診断、予防及び／又は治療のための薬剤を製造するための請求項１〜２２のいずれか１項に記載の組成物の使用。
【請求項３３】
該ＲＮＡｉ誘導分子の存在下での該ウイルスキャプシドタンパク質のＶＬＰへの構築を含む、請求項１〜２２のいずれか１項に記載の組成物を製造する方法。
【請求項３４】
標的細胞の細胞表面上の受容体に結合することが可能である該ＶＬＰへの標的細胞特異的な基の連結をさらに含む、請求項３３に記載の組成物を製造する方法。
【請求項３５】
ＲＮＡｉ誘導分子を標的細胞へ導入する方法であって、
（ｉ）該ＲＮＡｉ誘導分子の存在下でのウイルスキャプシドタンパク質のＶＬＰへの構築の工程、及び
（ｉｉ）該ＲＮＡｉ誘導分子を担持する該ＶＬＰを、該標的細胞への該ＲＮＡｉ誘導分子の取込みを可能にする条件下で該標的細胞と接触させる工程を含む方法。
【請求項３６】
標的細胞の細胞表面上の受容体に結合することが可能である該ＶＬＰへの標的細胞特異的な基の連結をさらに含む、請求項３５に記載の方法。
【請求項３７】
標的細胞中で少なくとも１つの遺伝子を下方制御する方法であって、
（ｉ）請求項１〜２２のいずれか１項に記載の組成物を供給する工程、及び
（ｉｉ）工程（ｉ）からの該組成物を、該標的細胞への該ＲＮＡｉ誘導分子の取込みを可能にする条件下で該標的細胞と接触させる工程
を含む方法。
【請求項３８】
請求項１〜２２のいずれか１項に記載の組成物を含む、ＲＮＡｉ誘導分子を標的細胞へ導入するための試験キット。
【請求項３９】
任意で一般的な緩衝液、助剤、添加剤及び／又は希釈剤とともに、請求項１〜３８のいずれか１項において規定されるようなＶＬＰ及びＲＮＡｉ誘導分子を含む薬学的組成物。
【請求項４０】
病原性生物から生じるか又は病原性生物に由来する核酸の発現により、或いは内因性遺伝子の発現の増加又は望ましくない発現により引き起こされる疾患若しくは疾患状態の治療及び／又は診断のための請求項３９に記載の薬学的組成物の使用。
【請求項４１】
異種核局在化シグナル、異種核局在化シグナルをコードする核酸を含有する修飾ＪＣＶ−ＶＰ１キャプシドタンパク質、又はそれ相応に修飾された少なくとも１つのキャプシドタンパク質を含有するＶＬＰ組成物。
【請求項４２】
少なくとも１つの免疫刺激性核酸が、任意でポリペプチド若しくはペプチド免疫原、アプタマー又はｓｉＤＮＡ分子と組み合わせてＶＬＰの内部に含まれることを特徴とするＶＬＰ組成物。
【請求項４３】
少なくとも１つの異種結合パートナー、例えばポリペプチドへ、アミノ酸残基Ｋ６０及び／又はＫ１６４を介して結合されるＪＣＶ−ＶＰ１キャプシドタンパク質。
【請求項１】
少なくとも１つのウイルスキャプシドタンパク質の幾つかの分子で構成されるウイルス様粒子（ＶＬＰ）を含む組成物であって、少なくとも１つのＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）誘導分子が、該ＶＬＰの内部に含まれることを特徴とする組成物。
【請求項２】
前記ＲＮＡｉ誘導分子が、ＲＮＡ及び／又はＲＮＡ類似体である、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
前記ＲＮＡが、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｄｓＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ又はそれらの前駆体である、請求項２に記載の組成物。
【請求項４】
前記ＲＮＡｉ誘導分子が、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｄｓＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ若しくはそれらの前駆体をコードするＤＮＡ及び／又はＤＮＡ類似体である、請求項１に記載の組成物。
【請求項５】
該ＤＮＡが、標的細胞中での発現を可能にする調節エレメントをさらに含むことを特徴とする、請求項４に記載の組成物。
【請求項６】
ＶＬＰ対ＲＮＡｉ誘導分子の質量比が、１００：１〜１：１００の範囲に存在することを特徴とする、請求項１〜５のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項７】
ＶＬＰ対ＲＮＡｉ誘導分子の質量の比が、１：１〜２０：１の範囲に存在することを特徴とする、請求項１〜６のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項８】
前記ＶＬＰが、ヒトポリオーマＪＣウイルスのキャプシドタンパク質ＶＰ１で構成される、請求項１に記載の組成物。
【請求項９】
前記ＶＬＰが、標準のウイルスの他の構成成分を含まない、請求項１に記載の組成物。
【請求項１０】
該ＶＬＰの少なくとも１つのキャプシドタンパク質が修飾される、請求項１〜９のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１１】
該ＶＬＰの少なくとも１つのキャプシドタンパク質が、化学的に修飾される、請求項１０に記載の組成物。
【請求項１２】
該ＶＬＰの少なくとも１つのキャプシドタンパク質が、少なくとも１つの標的細胞特異的なサブユニットと結合される、請求項１１に記載の組成物。
【請求項１３】
前記標的細胞特異的なサブユニットが、該標的細胞の細胞表面上に提示される受容体に結合することが可能であるリガンドであることを特徴とする、請求項１２に記載の組成物。
【請求項１４】
前記リガンドがトランスフェリンであり、前記受容体がトランスフェリン受容体であることを特徴とする、請求項１３に記載の組成物。
【請求項１５】
前記標的細胞特異的なサブユニットが、化学リンカー基を用いて該ＶＬＰの少なくとも１つのキャプシドタンパク質に結合されることを特徴とする、請求項１２〜１４のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１６】
前記リンカー基が、カチオンポリマーであることを特徴とする、請求項１５に記載の組成物。
【請求項１７】
前記カチオンポリマーが、ポリエチレンイミンであることを特徴とする、請求項１６に記載の組成物。
【請求項１８】
前記キャプシドタンパク質が、融合タンパク質である、請求項１０に記載の組成物。
【請求項１９】
前記融合部分が、前記ＶＬＰの形成を妨害しないことを特徴とする、請求項１８に記載の組成物。
【請求項２０】
前記融合部分が、標的細胞の細胞表面上に提示される受容体に結合することが可能であることを特徴とする、請求項１８又は１９に記載の組成物。
【請求項２１】
修飾されたキャプシドタンパク質から成る該ＶＬＰが、非修飾ＶＬＰの宿主スペクトルと同一でない宿主スペクトルを有することを特徴とする、請求項１〜２０のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項２２】
該ＶＬＰの前記キャプシドタンパク質が、組換え的に生産されることを特徴とする、請求項１〜２１のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項２３】
ＲＮＡｉ誘導分子を標的細胞へ導入するための請求項１〜２２のいずれか１項に記載の組成物の使用。
【請求項２４】
該標的細胞が、真核細胞であることを特徴とする、請求項２３に記載の使用。
【請求項２５】
該真核細胞が、哺乳類細胞であることを特徴とする、請求項２４に記載の使用。
【請求項２６】
該哺乳類細胞が、ヒト由来であることを特徴とする、請求項２５に記載の使用。
【請求項２７】
該標的細胞中の少なくとも１つの遺伝子の発現が、病的状態と相関する、請求項２３〜２６のいずれか１項に記載の使用。
【請求項２８】
少なくとも１つの遺伝子が、病原性ウイルスから生じるか又は病原性ウイルスに由来する標的細胞中で発現される、請求項２７に記載の使用。
【請求項２９】
少なくとも１つの内因性遺伝子の発現が、該標的細胞で増加される、請求項２３〜２６のいずれか１項に記載の使用。
【請求項３０】
該内因性遺伝子の該発現の増加が、病的状態と相関する、請求項２９に記載の使用。
【請求項３１】
薬剤としての使用ための請求項１〜２２のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項３２】
病原性生物から生じるか又は病原性生物に由来する核酸の発現により、或いは内因性遺伝子の発現の増加又は望ましくない発現により引き起こされる疾患若しくは疾患状態の診断、予防及び／又は治療のための薬剤を製造するための請求項１〜２２のいずれか１項に記載の組成物の使用。
【請求項３３】
該ＲＮＡｉ誘導分子の存在下での該ウイルスキャプシドタンパク質のＶＬＰへの構築を含む、請求項１〜２２のいずれか１項に記載の組成物を製造する方法。
【請求項３４】
標的細胞の細胞表面上の受容体に結合することが可能である該ＶＬＰへの標的細胞特異的な基の連結をさらに含む、請求項３３に記載の組成物を製造する方法。
【請求項３５】
ＲＮＡｉ誘導分子を標的細胞へ導入する方法であって、
（ｉ）該ＲＮＡｉ誘導分子の存在下でのウイルスキャプシドタンパク質のＶＬＰへの構築の工程、及び
（ｉｉ）該ＲＮＡｉ誘導分子を担持する該ＶＬＰを、該標的細胞への該ＲＮＡｉ誘導分子の取込みを可能にする条件下で該標的細胞と接触させる工程を含む方法。
【請求項３６】
標的細胞の細胞表面上の受容体に結合することが可能である該ＶＬＰへの標的細胞特異的な基の連結をさらに含む、請求項３５に記載の方法。
【請求項３７】
標的細胞中で少なくとも１つの遺伝子を下方制御する方法であって、
（ｉ）請求項１〜２２のいずれか１項に記載の組成物を供給する工程、及び
（ｉｉ）工程（ｉ）からの該組成物を、該標的細胞への該ＲＮＡｉ誘導分子の取込みを可能にする条件下で該標的細胞と接触させる工程
を含む方法。
【請求項３８】
請求項１〜２２のいずれか１項に記載の組成物を含む、ＲＮＡｉ誘導分子を標的細胞へ導入するための試験キット。
【請求項３９】
任意で一般的な緩衝液、助剤、添加剤及び／又は希釈剤とともに、請求項１〜３８のいずれか１項において規定されるようなＶＬＰ及びＲＮＡｉ誘導分子を含む薬学的組成物。
【請求項４０】
病原性生物から生じるか又は病原性生物に由来する核酸の発現により、或いは内因性遺伝子の発現の増加又は望ましくない発現により引き起こされる疾患若しくは疾患状態の治療及び／又は診断のための請求項３９に記載の薬学的組成物の使用。
【請求項４１】
異種核局在化シグナル、異種核局在化シグナルをコードする核酸を含有する修飾ＪＣＶ−ＶＰ１キャプシドタンパク質、又はそれ相応に修飾された少なくとも１つのキャプシドタンパク質を含有するＶＬＰ組成物。
【請求項４２】
少なくとも１つの免疫刺激性核酸が、任意でポリペプチド若しくはペプチド免疫原、アプタマー又はｓｉＤＮＡ分子と組み合わせてＶＬＰの内部に含まれることを特徴とするＶＬＰ組成物。
【請求項４３】
少なくとも１つの異種結合パートナー、例えばポリペプチドへ、アミノ酸残基Ｋ６０及び／又はＫ１６４を介して結合されるＪＣＶ−ＶＰ１キャプシドタンパク質。
【図１】
【図２Ａ】
【図２Ｂ】
【図３】
【図４】
【図５】
【図２Ａ】
【図２Ｂ】
【図３】
【図４】
【図５】
【公表番号】特表２０１０−５３８６２５（Ｐ２０１０−５３８６２５Ａ）
【公表日】平成２２年１２月１６日（２０１０．１２．１６）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１０−５２４４０９（Ｐ２０１０−５２４４０９）
【出願日】平成２０年９月１２日（２００８．９．１２）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＥＰ２００８／００７５８０
【国際公開番号】ＷＯ２００９／０３６９３３
【国際公開日】平成２１年３月２６日（２００９．３．２６）
【出願人】（５１００７１４８２）
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２２年１２月１６日（２０１０．１２．１６）
【国際特許分類】
【出願日】平成２０年９月１２日（２００８．９．１２）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＥＰ２００８／００７５８０
【国際公開番号】ＷＯ２００９／０３６９３３
【国際公開日】平成２１年３月２６日（２００９．３．２６）
【出願人】（５１００７１４８２）
【Ｆターム（参考）】
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