核酸配列検出
本出願は、核酸プローブ２４が付着した電極２２を備える支持体１０４を用いる標的核酸配列を検出するためのシステムおよび方法を開示している。核酸標的２６および非共有結合光電気化学的標識３０がこのプローブ２４と接触される。この非共有結合光電気化学的標識３０は、好ましくは、二本鎖核酸に結合する。この混合物を照射することは、電極２２で光電流を生成する。核酸プローブ要素のアレイを備える支持体１０４もまた開示される。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（技術分野）
本出願は一般に分子の検出に関し、そしてより詳細には標的核酸配列の検出に関する。
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【０００２】
（発明の要旨）
本明細書に開示されるのは、標的核酸配列を検出するための方法、ならびにそのための装置およびキットである。この方法は、一本鎖核酸の対し二本鎖核酸を優先的に標識する非共有結合光電気化学的化合物を用いる。この光電気化学的インターカレーターは、必ずしも、標的核酸配列に共有結合により付着されるか、またはその他で結合される必要はない。
【０００３】
１つの局面では、標的核酸配列を検出するための装置が提供される。このシステムの１つの実施形態は：電極およびそれに付着した核酸プローブを備えた支持体であって、該核酸プローブが該標的核酸配列に相補的な配列を含む支持体；該核酸プローブと接触するための非共有結合光電気化学的標識；核酸プローブを照射するための光源；および該電極で電流を測定するためのデータ収集コントローラーを備える。このシステムのいくつかの実施形態では、必要に応じて、流体取り扱いシステム、温度制御システム、および／または光学的スキャナーをさらに備える。
【０００４】
本発明の別の局面は、標的核酸配列を検出するための方法を提供する。この方法の実施形態は、少なくとも：核酸プローブを、標的核酸および非共有結合光電気化学的標識と接触し、反応混合物を形成する工程；該混合物を照射する工程；および該電極で光電流を観察する工程を包含し、ここで、該光電流が該標的核酸の存在および／またはその量を示す。この核酸プローブは電極に付着され、この核酸プローブは標的核酸配列に相補的な配列を含み、そして支持体がこの核酸プローブおよび電極を備える。
【０００５】
いくつかの実施形態では、この方法は、上記核酸プローブを犠牲的還元剤または犠牲的酸化剤と接触する工程をさらに包含する。いくつかの実施形態では、この犠牲的還元剤は、三級アミン、トリプロピルアミン、エチレンジアミン四酢酸、およびそれらの塩の少なくとも１つを含む。
【０００６】
いくつかの実施形態では、この方法は、上記核酸プローブを、核酸ハイブリダイゼーションを誘導する条件下に維持する工程をさらに包含する。いくつかの実施形態では、この方法は、上記核酸プローブを洗浄し、過剰の核酸標的を除去する工程をさらに包含する。いくつかの実施形態では、この方法は、上記核酸プローブを洗浄し、過剰の非共有結合光電気化学的標識を除去する工程をさらに包含する。
【０００７】
別の局面では、標的核酸配列を検出するためのキットが提供される。キットの実施形態は：支持体であって、電極およびそれに付着した核酸プローブを備え、そしてこの核酸プローブが、上記標的核酸配列に相補的な配列を含む、支持体；および非共有結合光電気化学的標識を備える。
【０００８】
いくつかの実施形態では、上記核酸プローブはＤＮＡを含む。いくつかの実施形態では、上記核酸プローブはＲＮＡを含む。いくつかの実施形態では、上記標的核酸はＤＮＡを含む。いくつかの実施形態では、上記標的核酸はＲＮＡを含む。
【０００９】
いくつかの実施形態では、上記支持体は、核酸プローブ要素のアレイを備える。いくつかの実施形態では、上記アレイは、約１０より多い核酸プローブ要素を備える。
【００１０】
いくつかの実施形態では、上記電極は、金、白金、シリコン、ガラス状炭素、グラファイト、インジウム−錫酸化物、およびダイヤモンドの少なくとも１つを含む。
【００１１】
いくつかの実施形態では、上記非共有結合光電気化学的標識は：ルテニウム、オスミウム、コバルト、ロジウム、ニッケル、および白金の少なくとも１つを含む金属；およびポリピリジルリガンドである、ｂｉｐｙ、ｐｈｅｎ、ＤＩＰ、ｄｐｐｚ、ｐｈｉ、ｔｅｒｐｙ、およびそられの誘導体を含む。いくつかの実施形態では、上記非共有結合光電気化学的標識が：［Ｒｕ（ｂｉｐｙ）３］＋、［Ｒｕ（ｂｉｐｙ）２ｄｐｐｚ］２＋、［Ｒｕ（ｂｉｐｙ）（ｐｈｅｎ）３］２＋、およびそれらの組み合わせからなる群から選択されるカチオンを含む。
【００１２】
いくつかの実施形態では、上記光源はレーザーである。いくつかの実施形態では、上記光源は可視光源である。
【００１３】
いくつかの実施形態は、上記核酸プローブと接触するための犠牲的還元剤または犠牲的酸化剤をさらに含む。いくつかの実施形態では、上記犠牲的還元剤は、三級アミン、トリプロピルアミン、エチレンジアミン四酢酸、およびそれらの塩からなる群から選択される。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１４】
（好適な実施形態の詳細な説明）
本明細書で用いられるとき、「ｂｉｐｙ」は、２，２’−ビピリジンであり、「ｐｈｅｎ」は、１，１０−フェナントロリンであり、「ＤＩＰ」は、４，７−ジフェニル−１，１０−フェナントロリンであり、「ｄｐｐｚ」は、ジピリド［３，２−ａ：２’，３’−ｃ］フェナジンであり、そして、「ｔｅｒｐｙ」は、２，２’：６，２’’−ターピリジンである。これらのリガンドは、複数のピリジン単位であり、そして本明細書で「ポリピリジルリガンド」と称されるリガンドのファミリーのメンバーである。用語「ｐｈｉ」は、９，１０−フェナントレンキノンジイミンを表す。「核酸」は、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ＰＮＡ、ロックされた核酸（ＬＮＡ）、およびそれらの組み合わせを含み、それらのいずれも一本および／または二本鎖である。二本鎖核酸は、ホモ二重鎖、例えばＤＮＡ−ＤＮＡ、およびヘテロ二重鎖、例えば、ＤＮＡ−ＲＮＡを包含する。「ｓｓ」接頭辞は、「一本鎖」を意味する。同様に、「ｄｓ」は、「二本鎖」または二重鎖を意味する。本開示におけるＤＮＡへの参照はまた、他であることが提供されなければ、他の核酸、例えば、ＲＮＡ、ＰＮＡ、ＬＮＡ、およびそれらの組み合わせに関する。用語「光電気化学」はまた、当業者によって「電気化学的発光」または「ＥＣＬ」としばしば称されている。
【００１５】
図１は、開示された方法を実施するために適切な装置１００の実施形態を示す。この装置１００は、電気化学的セル１０２、作動電極１０４、対電極１０６、データ捕獲コントローラー１０８、光源１１０、選択が自由の流体取り扱いシステム１１２、および選択が自由の温度制御システム１１４を備える。作動電極１０４はまた、本明細書では「支持体」とも呼ばれる。
【００１６】
電気化学的セル１０２は、支持体１０４、対電極１０６、および必要に応じて参照電極（図示せず）を備える。選択が自由の参照電極は、当該技術分野で公知の任意のタイプである。いくつかの実施形態は、中実の参照電極を用いる。いくつかの実施形態では、支持体１０４は、電気化学的セル１０２の１つ以上の壁を備える。この電気化学的セル１０２は、必要に応じて、例えば、サンプルを注入するため、細胞を洗浄するため、試薬を添加するためなどに用いられる、当該技術分野で公知の任意のタイプの流体取り扱いシステム１１２を備える。いくつかの実施形態では、この電気化学的セル１０２は、フローセルである。いくつかの実施形態では、この電気化学的セル１０２は、上記支持体１０４および／または電気化学的セル１０２を加熱および／または冷却するために用いられる、当該技術分野で公知の任意のタイプの温度制御システム１１４を装備する。いくつかの実施形態は、その使用が以下により詳細に考察される当該技術分野で公知の任意のタイプの光学的スキャナー１１６をさらに備え得る。
【００１７】
上記支持体１０４は、１つ以上のタイプの核酸プローブが付着される電極を備える。この支持体１０４は、以下により詳細に説明される。対電極１０６および選択が自由である参照電極は、開示される装置および方法に適合する当該技術分野で公知の任意のタイプである。
【００１８】
上記光源１１０は、上記支持体１０４を電磁照射で照射するように構成される。この光源１１０は、以下により詳細に記載される開示された光電気化学的反応を開始するに十分なエネルギーおよび強度の任意の供給源である。適切な光源の例は、白熱ランプ、ハロゲンランプ、発光ダイオード（ＬＥＤ）、蛍光ランプ、アーク灯、日光、およびレーザーを含む。いくつかの実施形態では、上記電磁照射は、赤外線照射、可視光、および／または紫外線照射である。いくつかの実施形態では、上記光源１１０は、電磁照射を、支持体１０４またはその部分に衝突するように向けるよう構成された光学的システムを含む。いくつかの実施形態では、この光源１１０は、支持体１０４の表面を走査するように構成される。いくつかの実施形態では、この光源１１０は、この支持体１０４を移動することにより支持体１０４の表面を走査する。
【００１９】
上記データ捕獲コントローラー１０８は、上記電気化学的セル１０２を制御するために用いられる。いくつかの実施形態では、このデータ捕獲コントローラー１０８は、以下に説明されるように、装置１００のその他のコンポーネントの操作を制御する。電気化学的セル１０２に対し、データ捕獲コントローラーは、少なくとも、ポテンシオスタットの機能を備え、すなわち、上記セル１０２内の電圧および／または電流を制御および測定し得る。ナノアンペアおよびピコアンペアの大きさの電流が、当該技術分野で公知のデバイスを用いて慣用的に測定される。単一電子と同じぐらい小さな電流もまた測定可能であり、例えば、量子ドット、走査プローブデバイス、および単一電子トンネル（ＳＥＴ）デバイスを用いる。データ捕獲コントローラー１０８が光源１１０を調節する実施形態では、データ捕獲コントローラー１０８は、少なくとも、支持体１０４の照射を制御する。いくつかの実施形態では、データ捕獲コントローラー１０８はまた、支持体１０４の照射を制御する。いくつかの実施形態では、データ捕獲コントローラー１０８はまた、支持体１０４のどの部分が照射されるのかを制御する。例えば、いくつかの実施形態では、データ捕獲コントローラー１０８は、上記光源１１０が支持体１０４を所定のパターンで走査するようにする。この実施形態は、例えば、支持体が以下により詳細に論議されるようなアレイを備える実施形態で有用である。いくつかの実施形態では、データ捕獲コントローラー１０８は、必要に応じて、支持体１０４からの光学的情報を読み取るように構成された光学的スキャナーまたは検出器１１６からのデータを受容する。例えば、いくつかの実施形態では、支持体１０４は、光学的にコードされた識別印、例えば、バーコードまたは以下で考察されるその他の印を含む。以下に考察されるその他の実施形態では、上記光学的スキャナー１１６は、支持体１０４からの蛍光を検出するように構成される。その他の実施形態では、データ捕獲コントローラー１０８は、その他の方法、例えば、高周波（ＲＦ）タグを用いるか、または集積デバイス、例えば、マイクロプロセッサを用いてコードされる識別印を読み取るように構成される。いくつかの実施形態では、この印がデータ捕獲コントローラーのためのプログラムを識別する。データ捕獲コントローラー１０８は、例えば、ディスプレイ、キーボード、プリンター、ディスクドライブ、データポート、Ｉ／Ｏポートなど、当該技術分野で公知のデータ獲得および／またはデータ入力のための１つ以上のインターフェースを備える。
【００２０】
いくつかの実施形態では、データ捕獲コントローラー１０８はまた、流体取り扱いシステム１１２、温度制御システム１１４、および／または光学的スキャナー１１６を含む光学的コンポーネントからのデータを制御および獲得する。このデータ捕獲コントローラー１０８は単一ユニットとして示されているが、機能の各々、または機能の組み合わせを履行する別個のユニットを備え得る。例えば、いくつかの実施形態では、データ捕獲コントローラー１０８は、モジュールユニットを備え、それによってユーザーが制御およびデータ獲得機能を付加することを許容し、開示された装置の能力を増強する。いくつかの実施形態では、データ捕獲コントローラー１０８は、マイクロプロセッサを基礎にしたデバイスである。いくつかの実施形態では、データ捕獲コントローラー１０８は、ユーザーがプログラム可能である。いくつかの実施形態では、データ捕獲コントローラー１０８は、予めプログラムされている。
【００２１】
支持体１０４の実施形態の詳細図を図２に示す。支持体１０４は、核酸プローブ２４が付着される電極２２を備える。相補的核酸配列（「核酸標的」）２６は、このプローブ２４に結合する。非相補的核酸配列（図示せず）はこのプローブ２４に結合しない。
【００２２】
開示されたシステムは、一本鎖核酸よりも二本鎖核酸を優先的に標識する非共有結合光電気化学的化合物を用いる。いくつかの実施形態は、複数の光電気化学的化合物を用いる。いくつかの実施形態では、この光電気化学的化合物は、二本鎖核酸のための非共有結合標識である。例示の実施形態では、この光電気化学的標識は、二本鎖核酸に結合するが、一本鎖核酸には感知し得るほどに結合しない光電気化学的インターカレーター３０である。任意の理論に拘束されることなく、結合したインターカレーター３０を照射することは、励起された状態にあるインターカレーターを生成すると考えられる。この励起されたインターカレーター３２は、基底状態のインターカレーター３０よりも容易に酸化される。電極２２を励起されたインターカレーター３２は酸化するに十分であるが、基底状態のインターカレーター３０は酸化しない電位に偏移することは、励起されたインターカレーター３２の酸化されたインターカレーター３４への酸化を引き起こす。例示の実施形態では、酸化されたインターカレーター３４は、二本鎖核酸に結合したままである。いくつかの実施形態では、犠牲的還元剤が提供され、これは、酸化されたインターカレーター３４０基底状態インターカレーター３０に戻し、それによって、この犠牲的還元剤が消費されるか、または照射が中断するまで光電流を提供する。
【００２３】
電極２２は、開示されたアッセイと適合する当該分野で公知の任意の電極材料、例えば、金、白金、シリコン、ガラス状炭素、グラフィイト、インジウム−錫酸化物、および導電性または半導電性ダイヤモンドである。ダイヤモンドおよびインジウム−錫酸化物電極は透明であり、例えば、上記支持体１０４が電気化学的セル１０２で壁を形成する実施形態で、コンポーネントの光学的配列において柔軟性を提供する。いくつかの実施形態では、この電極２２は、当該分野で公知の任意の手段、例えば、物理的蒸着、化学的蒸着、スピンコーティング、プリンティングなどによって基体上に堆積された層である。この基体は、任意の適切な基体、例えば、半導体基体、シリコン、ガラス、シリカ、またはサファイアである。この電極２２は、任意の適切な形状、例えば、矩形、円形、六角形、または任意のその他の適切な形状を有する。図１に示される実施形態では、この電極２２は平面状である。当業者は、この電極２２が非平面状、例えば、円筒形、管状、プリズム、ピラミッドなどである得ることを理解する。いくつかの実施形態では、電気化学的セル１０２の全内壁が電極２２である。
【００２４】
核酸プローブ３４は、当該分野で公知の方法を用いて電極２２に付着される。いくつかの実施形態では、この核酸プローブ３４は、付着基を用いて付着される。この付着基は、誘導体化されるべき特定の電極材料の組成に依存し得る。例えば、チオール付着基で終結する核酸の単層で金電極を誘導体化することは、例えば、米国特許第５,４７２,８８１号に記載されるように、当該技術分野で周知である。ダイヤモンド電極は、Ｋｕｏら、「ホウ素ドープされた化学的蒸着ダイヤモンド表面の共有結合単層での電気化学的改変」Ｅｌｅｃｔｒｏｃｈｅｍ．Ｓｏｌｉｄ−Ｓｔａｔｅ Ｌｅｔｔ．１９９９、２：６、２８８〜２９０に記載のように、ジアゾニウム化合物で誘導体化されている。シリコン電極は、Ｙｉ Ｃｕｉら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２００１、２９３、１２８９〜９２に記載のように、置換されたアルコシキシランを用いて誘導体化されている。ガラス状炭素電極は、Ｒ．Ｄｅｉｎｈａｍｍｅｒら、Ｌａｎｇｍｕｉｒ １９９４、１０、１３０６に記載されるようにアミンにより、またはＭｉｋｋｅｌｓｅｎら、Ｅｌｅｃｔｒｏａｎａｌｙｓｉｓ １９９２、４、９２９に記載のようにカルボジイミドにより誘導体化されている。電極はまた、カルボキシレート−アミン官能基およびビオチン−アビジンカップリングにより誘導体化されている。
【００２５】
いくつかの実施形態では、上記支持体１０４は、核酸プローブ要素のアレイまたはミクロアレイを備え、これは、複数の標的核酸配列を掲出することで有用である。このようなアレイおよびミクロアレイはまた、しばしば、「チップ」と称される。各アレイ要素は、核酸プローブ２４を備える。これらプローブは、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ＰＮＡ、および／またはロックされた核酸（ＬＮＡ）任意のタイプのヌクレオチドまたはそのアナログ、またはそれらの任意の組み合わせを含み得る。上記アレイの核酸プローブ要素は、光学的にアドレス可能であるので、アレイは、各アレイ要素が電気的にアドレス可能ある必要でなく構築され得る。この光学的にアドレス可能性の結果は、全体の核酸アレイが単一の電極上に据え付けられ得、それによって構築を単純化することである。いくつかの実施形態では、このアレイは、複数の電極上でパターン化され得る。いくつかの実施形態では、このアレイは、支持体１０４の１つの表面上でパターン化される。いくつかの実施形態では、このアレイは、支持体１０４の複数の表面、例えば、平面状支持体１０４の両側面上でパターン化される。
【００２６】
上記アレイを構築する際に、上記核酸プローブ２４は、上記電極２２に、当該技術分野で公知の任意の手段、例えば、ピペット、インクジェットプリンティング、フォトリソグラフィー、または接触プリンティングにより付与される。アレイをアセンブルする際に、プローブ２４は、電極に、上記のように付着される。本明細書で用いられるとき、アレイ要素または要素は、アレイのアドレス可能なユニットである。要素は、１つ以上のプローブを備え得る。アレイは、少なくとも２つの要素を備える。約１０９までの要素を含むアレイが報告されている。従って、本開示に従って構築されたアレイ中の要素の数は、約１０、１００、１０００、１０，０００、１００，０００、１０６、１０７、１０８、１０９、またはそれ以上であり得る。このアレイ要素の間隔は、均一であるか、または変動し得る。多数の要素を備えるアレイには、より近い要素間間隔は、物理的により小さいアレイの構築を許容する。１００μｍの大きさの要素の中心から中心までの間隔が一般的である。約１０μｍ、１μｍ、およびより小さな間隔が報告されている。本開示は、これら値の任意またはすべての要素間間隔をもつアレイを企図する。例によれば、１０，０００を超える要素のアレイが標準的な顕微鏡スライド上に慣用的に製作される。アレイ要素の１００μｍの中心から中心までの間隔は、標準的な９６ウェルのマイクロタイタープレート中に１００，０００を超える要素のアレイを提供する。
【００２７】
いくつかの実施形態では、これらアレイ要素は、方形の格子、矩形の格子、六角形の格子、または所望の任意のパターンまたはパターンの組み合わせを形成する。いくつかの実施形態では、これらアレイ要素はランダムに据え付けられ、次いで、それらの空間的アドレスを決定するために検索される。これら要素がアドレス可能である限り、アイレ要素の任意の空間的配列が用いられ得る。これら要素のサイズは、特定の適用に依存する。例えば、小量の核酸の検出は、小さなアレイ要素を必要とし得る。マイクロアレイの構築は、同様に小要素を用いる。単一アレイは、異なるサイズの要素を備え得る。接触プリンティングは、ナノリットルの大きさで溶液のサンプルを堆積し得る。当業者は、要素のサイズが要素間間隔によって制限されることを認識する。
【００２８】
アレイの表面は、実質的に平滑であり得るか、または特徴を有し得る。例えば、これらアレイ要素は、窪みで、または高まった特徴で付与され得る。さらに、複数のアレイ要素は、各々が窪んだ、または高められた特徴で配置され得る。１０，０００要素をもつアレイが標準的な９６ウェルプレート上に形成された上記で引用した例では、各ウェルは約１００の要素を含んだ。これらの窪んだか、または高められた領域は、例えば、溶液を保持することによるか、または乾燥を容易にすることにより、これらアレイ要素のための特定の環境を提供するために供し得る。
【００２９】
上記支持体は、印またはマーキングをさらに所有し得、これらアレイ要素のアドレス可能性を提供または支援する。上記に記載の窪んだ、または高められた特徴もまた、この目的のために供し得る。このマーキングまたは印は、バーコードまたは別の機械読み取り可能なマーキングを用いて、装置中に支持体１０４を配向するため、またはそれを識別するために供し得る。この印は、任意の便利な位置に付与され、これは、アレイが付与される支持体１０４の表面上か、または異なる表面上であり得る。この位置は、光学的スキャナー１１６により読み取り可能であるように選択される。いくつかの実施形態では、支持体１０４は、別の機械読み取り可能な識別、例えば、ＲＦタグまたは集積デバイス（例えば、マイクロプロセッサ）を備える。
【００３０】
レーザーは、小アレイ要素を備えるシステムのために有用な光源１１０であるが、任意の十分に焦点を合わされた光源が用いられ得る。レーザーを用いてアレイを走査するための方法は、当該分野で周知である。
【００３１】
いくつかの実施形態では、支持体１０４には、光源が光学的スキャナー１１６と組み合わせて照射している位置を決定するための手段が提供される。例えば、電極それ自身が格子またはその他の参照マークまたは印を有し得る。このような参照マークを生成するための方法は、電極のタイプで変動し、そして当業者に公知であり、例えば、リソグラフィー、電気化学的エッチング、イオン支援エッチング、電気メッキ、物理的蒸着、および化学的蒸着である。あるいは、このような印は、アレイパターンの一部であり得る。例えば、着色、蛍光、または光電気化学的分子がアレイ要素として電極に付着され得る。いくつかの実施形態では、指標は、核酸プローブである。この指標プローブに結合することが知られる指標標的が添加され、そしてこのプローブにハイブリダイズされる。上記光源がアレイを走査するとき、それは、これらの指標要素の各々が照射されるとき光電流を生成する。いくつかの実施形態では、上記指標標的は、着色、蛍光、または光電気化学的分子に結合される。
【００３２】
いくつかの実施形態では、上記支持体１０４は、照射されるとき電気的信号を生成する要素、例えば、当該技術分野で公知の、光起電力、光抵抗、または別の光感受性要素を含む。
【００３３】
光電気化学的インターカレーターが蛍光で実施形態では、このインターカレーターが結合する二本鎖核酸を含むアレイ要素が光学的に決定され得、それによって、蛍光アレイ要素のみを走査することによりシステムスループットを増加する。
【００３４】
図３は、図２に示される支持体に関して核酸配列を検出するための方法３００を提供する。ステップ３１０では、支持体１０４が得られる。ステップ３２０では、この支持体１０４に付着されている核酸プローブ２４は、核酸標的２６と接触される。ステップ３３０では、核酸プローブ２４は、ハイブリダイゼーションに誘導する条件になる。プローブ２４と標的２６相補的配列を有する場合、それらはハイブリダイズし、それによって二本鎖核酸を形成する。そうでなければ、それらは、感知し得るようにハイブリダイズしない。この支持体１０４は、次いで、必要に応じて洗浄され、ステップ３３５でハイブリダイズした標的２６を除去する。ステップ３４０では、核酸プローブ２４は、光電気化学的インターカレーター３０と接触される。このインターカレーター３０は、ハイブリダイゼーションステップで形成された二本鎖核酸に結合する。プローブ２４が一本鎖のまま、すなわち、ハイブリダイズしない場合、ハイブリダイゼーション３０は、感知し得るほどに結合しない。ステップ３４５では、支持体１０４は、必要に応じて洗浄されて非結合インターカレーター３０を除去する。ステップ３５０では、核酸プローブ２４は、必要に応じて犠牲的還元剤と接触される。核酸プローブ２４、核酸標的２６、光電気化学的インターカレーター３０、および選択が自由の犠牲的還元剤は、一緒に反応混合物を形成し、それは、さらなる成分をさらに含み得る。ステップ３６０では、反応混合物は、電磁照射によって、基底状態にある結合したインターカレーター３０を、基底状態のインターカレーターより酸化するのがより容易な励起状態インターカレーター３２に励起するに十分なエネルギーおよび強度で照射される。ステップ３７０では、電極２２が、励起状態にあるインターカレーター３２を、酸化されたインターカレーター３６に酸化するが、基底状態にあるインターカレーターはそうしない電位に偏位される。励起状態のインターカレーター３２の酸化は、光電流を生成する。ステップ３８０では、光電流が測定される。
【００３５】
ステップ３１０では、支持体１０４が得られる。この開示された方法は、本明細書に開示の任意の核酸支持体１０４を用いて実施される。いくつかの実施形態では、この支持体１０４は、核酸プローブのアレイまたはマイクロアレイを備える。
【００３６】
ステップ３２０では、核酸標的２６は、支持体１０４上の電極に結合した核酸プローブ２４と接触される。代表的には、この核酸標的２６は、溶媒、例えば、水、水性緩衝液、有機溶媒、または別の適切な溶媒中に溶解される。いくつかの実施形態では、核酸標的２６は、流体取り扱いシステム１１２を用いて核酸プローブ２４と接触される。いくつかの実施形態では、この流体取り扱いシステム１１２は、データ捕獲コントローラー１０８によって制御される。
【００３７】
ステップ３３０では、標的２６およびプローブはハイブリダイズされる。いくつかの実施形態では、このハイブリダイゼーション状態は、上記で説明されたように、流体取り扱いシステム１１２および／または温度制御システム１１２と協調するデータ捕獲コントローラー１０８を用いて確立および維持される。
【００３８】
核酸ハイブリダイゼーションに誘導する条件は当該技術分野で公知であり、そして核酸標的２６およびプローブ２４の性質、溶媒のイオン強度、および溶媒の個性を含む因子に依存して異なる。例えば、一本鎖ＤＮＡ標的を一本鎖ＤＮＡプローブにハイブリダイズすることは、一本鎖ＲＮＡ標的を一本鎖ＤＮＡプローブにハイブリダイズすることとは異なる条件を必要とする。標的およびプローブのいずれか、または両方はまた、二本鎖であり得、その場合、この二本鎖核酸は、ハイブリダイゼーションステップの前に変性される。プローブおよび標的は、それらの個々の長さの部分に沿ってのみハイブリダイズする必要があり、すなわち、プローブおよび標的のいずれか、または両方は、ハイブリダイゼーションステップの後、一本鎖部分を有し得る。最適ハイブリダイゼーション条件は、代表的には、核酸の融点性質（Ｔｍ）、およびハイブリダイゼーション溶液のイオン強度により決定される。ハイブリダイゼーション速度は、一般に、Ｔｍの下約２０〜３０℃で最適であるが、特定の場合には、温度は、Ｔｍよりわずかに低いか、Ｔｍであるか、またはＴｍの上でさえ、有用であり得る。代表的なプロトコールで提供される洗浄条件は、ストリリンジェンシーを最大にする、すなわち、（完全相補性が要求される場合）完全に相補的でない核酸とのハイブリダイゼーションを防ぐために供される。高ストリンジェンシーが必要ではない場合、洗浄温度は減少され得るか、および／または洗浄緩衝液のイオン強度が上昇され得る。ハイブリダイゼーション反応の「ストリンジェンシー」は、慣用的な最適化により容易に決定可能であり、そして核酸鎖の長さ、洗浄温度、および塩濃度に依存して実験に基づいた計算である。一般に、より長い鎖は、適正なアニーリングにより高い温度を必要とし、その一方、より短い鎖はより低い温度を必要とする。ハイブリダイゼーションは、一般に、相補的鎖がそれらの融点温度未満の環境に存在するとき、変性された核酸がアニールする能力に依存する。プローブと標的との間の所望の相同性の程度が高くなるほど、用いられ得る相対温度は高くなる。結果として、より高い相対温度は、よりストリンジェントな反応条件を作製する傾向になり、その一方、より低い温度はそのような傾向が少なくなる。ハイブリダイゼーション反応のストリンジェンシーのさらなる詳細および説明は、Ａｕｓｂｅｌら、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｗｉｌｅｙ；１９９５を参照のこと。
【００３９】
ステップ３４０では、核酸プローブ２４は、光電気化学的インターカレーター３０と接触される。いくつかの実施形態では、この光電気化学的インターカレーター３０は、必要に応じてデータ捕獲コントローラー１０８を用いて制御される流体取り扱い器（ハンドラー）１１２を用いて核酸プローブ２４と接触される。いくつかの実施形態は、複数の光電気化学的インターカレーター３０を用いる。いくつかの実施形態では、核酸プローブ２４は、標的核酸と同時に（ステップ３２０）および光電気化学的インターカレーター３０と（ステップ３４０）接触される。
【００４０】
光電気化学的インターカレーター３０は、ハイブリダイゼーションステップで形成された二重鎖核酸に結合するが、一本鎖プローブ２４または標的２６には結合しないように選択される。その他の要求は、インターカレーター３０が光電気化学的に活性であることである。これらの規準に合致する任意のインターカレーターが用いられ得る。このインターカレーターは、有機物、無機物、または有機金属であり得る。有機のインターカレーターは、臭化エチジウムおよび関連化合物を含む。少なくとも１つのリガンドが、ｂｉｐｙ、ｐｈｅｎ、ＤＩＰ、ｄｐｐｚ、ｐｈｉ、ｔｅｒｐｙ、またはそれらの誘導体である、ルテニウム、オスミウム、コバルト、ロジウム、ニッケル、および白金の金属錯塩が適切な電気化学的インターカレーターである。このような錯塩の例は、米国特許第５，１１２，９７４号、同第４，６９９，９８７号、同第４，９８０，４７３号、およびＥｒｋｋｉｌａら、「金属インターカレーターのＤＮＡとの認識および反応」Ｃｈｅｍ．Ｒｅｖ．、１９９９、９９、２７７７に開示されている。米国特許第４，９８０，４７３号は、Ｚ−およびＢ−ＤＮＡを鑑別的に結合する［Ｒｕ（ＤＩＰ）３］２＋のそのエナンチオマーを開示している。
【００４１】
特にその中でカチオンが［Ｒｕ（ｂｉｐｙ）３］２＋、［Ｒｕ（ｂｉｐｙ）２ｄｐｐｚ］２＋、または［Ｒｕ（ｐｈｅｎ）３］２＋である、トリス（ポリピリジル）ルテニウム化合物が光電気化学的インターカレーターとして有用である。オスミウムアナログもまた、有用な光電気化学的インターカレーターである。
【００４２】
光電気化学的インターカレーター３０がハイブリダイズしたプローブ−標的に添加されるとき、それは、二本鎖核酸に結合するが、一本鎖核酸には結合しない。従って、インターカレーター３０は、標的核酸２６にハイブリダイズしない任意のプローブ核酸２４に有意に結合しない。従って、インターカレーター３０は、二本鎖核酸のための汎用標識であって、それは共有結合により付着される必要がないという利点を付加する。二本鎖ＤＮＡ−インターカレーター種は、本明細書では「インターカレーター−標識ＤＮＡ」と称される。
【００４３】
ルテニウムのポリピリジルインターカレーターは、代表的には、二本鎖核酸にランダムに結合する。光電気化学的信号を最適化するために必要な光電気化学的インターカレーターの濃度は、プローブ２４と標的２６との間の重複長さ、プローブ２４および標的２６の量、インターカレーター３０の励起状態３２への光励起の効率、励起インターカレーター３２の酸化形態３４への酸化の効率、およびもし存在する場合犠牲的還元剤の濃度を含む因子に依存する。この濃度は、当業者により容易に決定される。このアッセイは較正され得、定量結果を提供する。さらに、特有の構造特徴をもつ二本鎖核酸に選択的に結合するインターカレーターを選択し得る。上記のように、特定のインターカレーターのエナンチオマーが、Ｂ−またはＺ−ＤＮＡのために選択されることが知られている。米国特許第６，０３１，０９８号に記載されるインターカレーターを用いる塩基対ミスマッチのために選択することもまた可能である。
【００４４】
ステップ３５０では、プローブ核酸２４は、必要に応じて犠牲的還元剤と接触される。この犠牲的還元剤は、酸化されたインターカレーター３４を基底状態インターカレーター３０に還元し得、それによって、インターカレーター３０を、それが照射されている限り光電流を生成することを可能にし、これは、光電流の検出および測定を容易にする。適切な犠牲的還元剤は、このアッセイが使用不能である程度まで妨害しない。いくつかの実施形態では、電極２２は、この犠牲的還元剤を直接酸化せず、それによって潜在的に妨害するバックグラウンド電流を減少する。この犠牲的還元剤は、用いられる特定の光電気化学的インターカレーターに依存する。ルテニウムを基礎にしたインターカレーターのための適切な犠牲的還元剤は、一般に、三級アミン、特に、トリプロピルアミン（ＴＰＡ）、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）を含む。別の適切な犠牲的還元剤はβ−ラクタムである。
【００４５】
プローブ核酸２４、核酸標的２６、光電気化学的インターカレーター３０、および選択が自由の犠牲的還元剤は、一緒に反応混合物を形成し、これはさらに、さらなる成分を含み得る。
【００４６】
以下により詳細に記載されるその他の実施形態は、犠牲的還元剤の代わりに犠牲的酸化剤を用いる。他の実施形態は、犠牲的還元剤または犠牲的酸化剤のいずれをも用いない。
【００４７】
ステップ３６０では、この反応混合物は、必要に応じてデータ捕獲コントローラー１０８を用いて調節される光源１１０を用いて照射される。光のエネルギーおよび強度は、ハイブリダイズしたプローブ−標的の二本鎖領域に結合したインターカレーター３０を励起された状態のインターカレーター３２に励起するように選択される。いくつかの実施形態では、この装置は、光源１１０で支持体１０４の表面の走査を可能するように構成される。支持体１０４が核酸プローブのアレイを備える実施形態では、この装置は、各アレイ要素を個々に照射するよう構成される。アレイ要素を作製するプローブ核酸２４の塩基配列は既知であるので、アレイ中のプローブの位置によってプローブに結合する任意の標的２６の配列の部分を同定し得る。
【００４８】
ステップ３７０では、電極２２は、励起されたインターカレーター３２に対して酸化する電位に偏位される。この電極２２の電位は、データ捕獲コントローラー１０８によって制御される。いくつかの実施形態では、この電極２２は、励起されたインターカレーター３２を酸化し得るが、基底状態にあるインターカレーター３０は酸化しない電位に偏位される。いくつかの実施形態では、ステップ３６０および３７０は、時間が重複する。
【００４９】
いくつかの実施形態では、この電極２２は、基底状態インターカレーター３０を酸化し得る電位に偏位される。この実施形態は、光学的アドレス付けが必要ではない、例えば、支持体１０４が１つのタイプのみのプローブ核酸２４を含む場合に有用である。このアッセイは、光電気化学的アッセイよりはむしろ電気化学的アッセイである。
【００５０】
いくつかの実施形態では、以下により詳細に考察されるが、この電極２２は、還元電位に偏位される。
【００５１】
ステップ３８０では、電極２２における電流は、当該技術分野で公知の任意の手段を用いて測定される。例示される実施形態では、データ捕獲コントローラー１０８は、電流を測定するように構成される。犠牲的還元剤を用いる実施形態では、上記光電流は、犠牲的還元剤が消費されるか、または照射が終了するまで継続する。犠牲的還元剤を用いない実施形態では、光電流は、励起されたインターカレーター３２が酸化されるまで光電流が継続する。
【００５２】
いくつかの実施形態では、電極は、さらなるアッセイのために再利用可能である。いくつかの実施形態では、支持体１０４は、単に変性条件にされ、そして変性した一本鎖核酸は、電極から洗浄される。
【００５３】
任意の理論によって拘束されることなく、以下は、光電気化学的インターカレーターとして［Ｒｕ（ｂｉｐｙ）３］２＋を用いるシステムで作動すると考えられる機構を記載する。同様の機構が、その他の光電気化学的インターカレーターに同様に適用されると考えられる。以下の説明では、基底状態インターカレーター３０は、［Ｒｕ（ｂｉｐｙ）３］２＋であり、励起状態インターカレーター３２は、［Ｒｕ（ｂｉｐｙ）３］２＋＊であり、そして酸化されたインターカレーター３２は、［Ｒｕ（ｂｉｐｙ）３］３＋である。［Ｒｕ（ｂｉｐｙ）３］２＋を照射することは、励起種［Ｒｕ（ｂｉｐｙ）３］２＋＊を生成し、これは、［Ｒｕ（ｂｉｐｙ）３］２＋より［Ｒｕ（ｂｉｐｙ）３］３＋により容易に酸化される。励起種の正確な性質は、この方法にとって重要ではなく、そして光電子は、金属中心またはリガンド中心に存在し得る。［Ｒｕ（ｂｉｐｙ）３］２＋は、電極２２に付着したプローブ核酸２４にハイブリダイズした標的２６の二本鎖領域にインターカレートする。このインターカレーターを照射することは、このインターカレーターを励起された状態［Ｒｕ（ｂｉｐｙ）３］２＋＊にする。
【００５４】
いくつかの実施形態では、電極２２は、［Ｒｕ（ｂｉｐｙ）３］２＋＊を［Ｒｕ（ｂｉｐｙ）３］３＋に酸化するが、［Ｒｕ（ｂｉｐｙ）３］２＋はそうしない電位の偏位される。インターカレーター−標識核酸を照射することは、インターカレートされた［Ｒｕ（ｂｉｐｙ）３］２＋＊を生成し、これは、電極２２によって［Ｒｕ（ｂｉｐｙ）３］３＋に酸化され、光電流を生成する。プローブ２４がハイブリダイズしない場合、インターカレーター３０は結合せず、そして光電流は観察されない。
【００５５】
任意の理論に拘束されることなく、光電子量子は、励起された［Ｒｕ（ｂｉｐｙ）３］２＋＊から電極２２に機械的にトンネルを通り抜けると考えられる。トンネル通り抜けの速度は、［Ｒｕ（ｂｉｐｙ）３］２＋＊と電極２２との間の距離に依存するので、光電流は、電極表面の近傍にある［Ｒｕ（ｂｉｐｙ）３］２＋＊分子によってのみ生成される。代表的には、電極２２の表面に付着した標的−プローブ二重鎖に結合したような［Ｒｕ（ｂｉｐｙ）３］２＋＊分子のみが、光電流を生成するに十分なこの電極の近傍にある。その他の研究は、ＤＮＡ二重ヘリックス自体が、電子移動を容易にすることを示す。例えば、Ｍｕｒｐｈｙら、「ＤＮＡインターカーレーションを通る迅速光誘導電子移動」Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、１９９４、９１、５３１５を参照のこと。
【００５６】
その他の実施形態では、［Ｒｕ（ｂｉｐｙ）３］３＋を［Ｒｕ（ｂｉｐｙ）３］２＋に還元するが、［Ｒｕ（ｂｉｐｙ）３］２＋を［Ｒｕ（ｂｉｐｙ）３］１＋に還元しない犠牲的還元剤が添加される。この実施形態では、上記電極２２は、［Ｒｕ（ｂｉｐｙ）３］２＋＊を［Ｒｕ（ｂｉｐｙ）３］３＋に酸化するが、［Ｒｕ（ｂｉｐｙ）３］２＋はそうしない電位に偏位される。インターカレーター−結合核酸を照射することは、インターカレートされた［Ｒｕ（ｂｉｐｙ）３］２＋＊を生成し、これは、電極によって酸化されて［Ｒｕ（ｂｉｐｙ）３］３＋に酸化し、光電流を生成する。犠牲的還元剤は、インターカレートされた［Ｒｕ（ｂｉｐｙ）３］３＋を、［Ｒｕ（ｂｉｐｙ）３］２＋に戻す。［Ｒｕ（ｂｉｐｙ）３］２＋は、この実施形態では再生されるので、光電流は、この犠牲的還元剤が消費されるか、または照射が終了されるまで継続する。ここで再び、プローブがハイブリダイズしないとき、結合するインターカレーター３０はなく、そして光電流は観察されない。
【００５７】
なお別の実施形態では、［Ｒｕ（ｂｉｐｙ）３］２＋＊を［Ｒｕ（ｂｉｐｙ）３］３＋に酸化するが、［Ｒｕ（ｂｉｐｙ）３］２＋はそうしない犠牲的酸化剤がシステムに添加される。電極は、［Ｒｕ（ｂｉｐｙ）３］３＋を［Ｒｕ（ｂｉｐｙ）３］２＋に還元するが、［Ｒｕ（ｂｉｐｙ）３］１＋にしない電位に偏位される。インターカレーター−結合核酸を照射することは、インターカレートされた［Ｒｕ（ｂｉｐｙ）３］２＋＊を生成し、これは、犠牲的酸化剤によって［Ｒｕ（ｂｉｐｙ）３］２＋に酸化されて光電流を生成する。この実施形態では、［Ｒｕ（ｂｉｐｙ）３］２＋が再生されるので、光電流は、この犠牲的酸化剤が消費されるか、または照射が終了するまで継続する。ここで再び、プローブがハイブリダイズしないとき、結合するインターカレーター３０はなく、そして光電流は観察されない。その他にこのアッセイを妨害しない任意の犠牲的酸化剤が用いられ得る。［Ｃｏ（Ｃ２Ｏ４）］３−およびビドラジンが適切な犠牲的酸化剤である。
【００５８】
先行する記載は、光支援酸化を受ける光電気化学的インターカレーターを論議している。当業者は、光支援還元を受ける光電気化学的インターカレーターもまた開示された発明の範囲内で用いられ得ることを明確に理解する。
【実施例】
【００５９】
Ａｕ作動電極、Ｐｔワイヤー対電極、およびＡｇ／ＡｇＣｌ参照電極を備えた３電極電気化学的セルを、電位の偏位を制御するようセットアップされ、そして電流を測定するポテンショスタットに接続した。光源は、ピンホールを通じて５０−μｍのビームサイズに焦光された４０５−ｎｍのダイオードレーザー、および作動電極表面上の１セットの光学的レンズであった。コンピューターを用いてこのレーザーを矩形波（オフ−オン）によって調整し、そしてデータ獲得ボードを通じてデータを獲得した。
【００６０】
金の作動電極は、硫酸および３０％の過酸化水素の７０／３０−Ｖ／Ｖ溶液で清澄化し、次いで、脱イオン水で完全にすすいだ。チオール化プローブオリゴヌクレオチドＸ２０（チオール−ＡＡＣＣＡＧＧＡＴＴＡＴＣＣＧＣＴＣＡＣ）を電極の表面上に配置し、そして電極を脱イオン水で完全にすすいだ。このプローブを金表面上の単層に自己アセンブルした。１×ＳＳＣ緩衝液中の標的オリゴヌクレオチドＴ２０（ＧＴＧＡＧＣＧＧＡＴＡＡＴＣＣＴＧＧＴＴ）をこの電極に添加し、そして３８℃でハイブリダイズさせた。この電極を１×ＳＳＣ緩衝液ですすぎ、任意の過剰の標的を除去した。１×ＳＳＣ緩衝液中の［Ｒｕ（ｂｉｐｙ）３］Ｃｌ２の１ｍＭ溶液を電極に添加し、そして電極を１×ＳＳＣ緩衝液ですすいだ。光電気化学的検出を、５０ｍＭ ＥＤＴＡおよび０．１ｍＭ ＮａＣｌ中で実施した。電極電位は、Ａｇ／ＡｇＣｌ参照電極に対し０〜０．７Ｖであった。
【００６１】
レーザーが１Ｈｚで調整される試験では、３２Ｈｚで、そして電極電位が０．５Ｖであた収集されたデータは、図４で提供されるデータを生成した。一本鎖ＤＮＡのデータでは、電流は、レーザーの調整で認知し得る変化をしなかった。二本鎖ＤＮＡデータでは、電流は、レーザーの調整とカップルしている。図５は、電極における電位に対する光電流の依存性を示す。
【００６２】
上記に示され、かつ記載された実施形態は、例示のみとして提供される。種々の変更および改変が、本明細書の教示の思想および範囲から逸脱することなく、当業者によって、本明細書中に存在する実施形態になされ得る。
【図面の簡単な説明】
【００６３】
【図１】図１は、本明細書に開示される光電気化学的方法を実施するために適切な装置の実施形態の概略である。
【図２】図２は、開示される方法が作動され得る可能な機構を示す。
【図３】図３は、開示される方法のいくつかの実施形態のフローチャートである。
【図４】図４は、［Ｒｕ（ｂｉｐｙ）３］２＋およびＥＤＴＡの存在下、一本鎖および二本鎖ＤＮＡで修飾された電極で測定された光電流である。
【図５】図５は、二本鎖ＤＮＡで修飾された電極の電位と、［Ｒｕ（ｂｉｐｙ）３］２＋およびＥＤＴＡの存在下で観察された光電流との間の関係を示すグラフである。
【技術分野】
【０００１】
（技術分野）
本出願は一般に分子の検出に関し、そしてより詳細には標的核酸配列の検出に関する。
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【０００２】
（発明の要旨）
本明細書に開示されるのは、標的核酸配列を検出するための方法、ならびにそのための装置およびキットである。この方法は、一本鎖核酸の対し二本鎖核酸を優先的に標識する非共有結合光電気化学的化合物を用いる。この光電気化学的インターカレーターは、必ずしも、標的核酸配列に共有結合により付着されるか、またはその他で結合される必要はない。
【０００３】
１つの局面では、標的核酸配列を検出するための装置が提供される。このシステムの１つの実施形態は：電極およびそれに付着した核酸プローブを備えた支持体であって、該核酸プローブが該標的核酸配列に相補的な配列を含む支持体；該核酸プローブと接触するための非共有結合光電気化学的標識；核酸プローブを照射するための光源；および該電極で電流を測定するためのデータ収集コントローラーを備える。このシステムのいくつかの実施形態では、必要に応じて、流体取り扱いシステム、温度制御システム、および／または光学的スキャナーをさらに備える。
【０００４】
本発明の別の局面は、標的核酸配列を検出するための方法を提供する。この方法の実施形態は、少なくとも：核酸プローブを、標的核酸および非共有結合光電気化学的標識と接触し、反応混合物を形成する工程；該混合物を照射する工程；および該電極で光電流を観察する工程を包含し、ここで、該光電流が該標的核酸の存在および／またはその量を示す。この核酸プローブは電極に付着され、この核酸プローブは標的核酸配列に相補的な配列を含み、そして支持体がこの核酸プローブおよび電極を備える。
【０００５】
いくつかの実施形態では、この方法は、上記核酸プローブを犠牲的還元剤または犠牲的酸化剤と接触する工程をさらに包含する。いくつかの実施形態では、この犠牲的還元剤は、三級アミン、トリプロピルアミン、エチレンジアミン四酢酸、およびそれらの塩の少なくとも１つを含む。
【０００６】
いくつかの実施形態では、この方法は、上記核酸プローブを、核酸ハイブリダイゼーションを誘導する条件下に維持する工程をさらに包含する。いくつかの実施形態では、この方法は、上記核酸プローブを洗浄し、過剰の核酸標的を除去する工程をさらに包含する。いくつかの実施形態では、この方法は、上記核酸プローブを洗浄し、過剰の非共有結合光電気化学的標識を除去する工程をさらに包含する。
【０００７】
別の局面では、標的核酸配列を検出するためのキットが提供される。キットの実施形態は：支持体であって、電極およびそれに付着した核酸プローブを備え、そしてこの核酸プローブが、上記標的核酸配列に相補的な配列を含む、支持体；および非共有結合光電気化学的標識を備える。
【０００８】
いくつかの実施形態では、上記核酸プローブはＤＮＡを含む。いくつかの実施形態では、上記核酸プローブはＲＮＡを含む。いくつかの実施形態では、上記標的核酸はＤＮＡを含む。いくつかの実施形態では、上記標的核酸はＲＮＡを含む。
【０００９】
いくつかの実施形態では、上記支持体は、核酸プローブ要素のアレイを備える。いくつかの実施形態では、上記アレイは、約１０より多い核酸プローブ要素を備える。
【００１０】
いくつかの実施形態では、上記電極は、金、白金、シリコン、ガラス状炭素、グラファイト、インジウム−錫酸化物、およびダイヤモンドの少なくとも１つを含む。
【００１１】
いくつかの実施形態では、上記非共有結合光電気化学的標識は：ルテニウム、オスミウム、コバルト、ロジウム、ニッケル、および白金の少なくとも１つを含む金属；およびポリピリジルリガンドである、ｂｉｐｙ、ｐｈｅｎ、ＤＩＰ、ｄｐｐｚ、ｐｈｉ、ｔｅｒｐｙ、およびそられの誘導体を含む。いくつかの実施形態では、上記非共有結合光電気化学的標識が：［Ｒｕ（ｂｉｐｙ）３］＋、［Ｒｕ（ｂｉｐｙ）２ｄｐｐｚ］２＋、［Ｒｕ（ｂｉｐｙ）（ｐｈｅｎ）３］２＋、およびそれらの組み合わせからなる群から選択されるカチオンを含む。
【００１２】
いくつかの実施形態では、上記光源はレーザーである。いくつかの実施形態では、上記光源は可視光源である。
【００１３】
いくつかの実施形態は、上記核酸プローブと接触するための犠牲的還元剤または犠牲的酸化剤をさらに含む。いくつかの実施形態では、上記犠牲的還元剤は、三級アミン、トリプロピルアミン、エチレンジアミン四酢酸、およびそれらの塩からなる群から選択される。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１４】
（好適な実施形態の詳細な説明）
本明細書で用いられるとき、「ｂｉｐｙ」は、２，２’−ビピリジンであり、「ｐｈｅｎ」は、１，１０−フェナントロリンであり、「ＤＩＰ」は、４，７−ジフェニル−１，１０−フェナントロリンであり、「ｄｐｐｚ」は、ジピリド［３，２−ａ：２’，３’−ｃ］フェナジンであり、そして、「ｔｅｒｐｙ」は、２，２’：６，２’’−ターピリジンである。これらのリガンドは、複数のピリジン単位であり、そして本明細書で「ポリピリジルリガンド」と称されるリガンドのファミリーのメンバーである。用語「ｐｈｉ」は、９，１０−フェナントレンキノンジイミンを表す。「核酸」は、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ＰＮＡ、ロックされた核酸（ＬＮＡ）、およびそれらの組み合わせを含み、それらのいずれも一本および／または二本鎖である。二本鎖核酸は、ホモ二重鎖、例えばＤＮＡ−ＤＮＡ、およびヘテロ二重鎖、例えば、ＤＮＡ−ＲＮＡを包含する。「ｓｓ」接頭辞は、「一本鎖」を意味する。同様に、「ｄｓ」は、「二本鎖」または二重鎖を意味する。本開示におけるＤＮＡへの参照はまた、他であることが提供されなければ、他の核酸、例えば、ＲＮＡ、ＰＮＡ、ＬＮＡ、およびそれらの組み合わせに関する。用語「光電気化学」はまた、当業者によって「電気化学的発光」または「ＥＣＬ」としばしば称されている。
【００１５】
図１は、開示された方法を実施するために適切な装置１００の実施形態を示す。この装置１００は、電気化学的セル１０２、作動電極１０４、対電極１０６、データ捕獲コントローラー１０８、光源１１０、選択が自由の流体取り扱いシステム１１２、および選択が自由の温度制御システム１１４を備える。作動電極１０４はまた、本明細書では「支持体」とも呼ばれる。
【００１６】
電気化学的セル１０２は、支持体１０４、対電極１０６、および必要に応じて参照電極（図示せず）を備える。選択が自由の参照電極は、当該技術分野で公知の任意のタイプである。いくつかの実施形態は、中実の参照電極を用いる。いくつかの実施形態では、支持体１０４は、電気化学的セル１０２の１つ以上の壁を備える。この電気化学的セル１０２は、必要に応じて、例えば、サンプルを注入するため、細胞を洗浄するため、試薬を添加するためなどに用いられる、当該技術分野で公知の任意のタイプの流体取り扱いシステム１１２を備える。いくつかの実施形態では、この電気化学的セル１０２は、フローセルである。いくつかの実施形態では、この電気化学的セル１０２は、上記支持体１０４および／または電気化学的セル１０２を加熱および／または冷却するために用いられる、当該技術分野で公知の任意のタイプの温度制御システム１１４を装備する。いくつかの実施形態は、その使用が以下により詳細に考察される当該技術分野で公知の任意のタイプの光学的スキャナー１１６をさらに備え得る。
【００１７】
上記支持体１０４は、１つ以上のタイプの核酸プローブが付着される電極を備える。この支持体１０４は、以下により詳細に説明される。対電極１０６および選択が自由である参照電極は、開示される装置および方法に適合する当該技術分野で公知の任意のタイプである。
【００１８】
上記光源１１０は、上記支持体１０４を電磁照射で照射するように構成される。この光源１１０は、以下により詳細に記載される開示された光電気化学的反応を開始するに十分なエネルギーおよび強度の任意の供給源である。適切な光源の例は、白熱ランプ、ハロゲンランプ、発光ダイオード（ＬＥＤ）、蛍光ランプ、アーク灯、日光、およびレーザーを含む。いくつかの実施形態では、上記電磁照射は、赤外線照射、可視光、および／または紫外線照射である。いくつかの実施形態では、上記光源１１０は、電磁照射を、支持体１０４またはその部分に衝突するように向けるよう構成された光学的システムを含む。いくつかの実施形態では、この光源１１０は、支持体１０４の表面を走査するように構成される。いくつかの実施形態では、この光源１１０は、この支持体１０４を移動することにより支持体１０４の表面を走査する。
【００１９】
上記データ捕獲コントローラー１０８は、上記電気化学的セル１０２を制御するために用いられる。いくつかの実施形態では、このデータ捕獲コントローラー１０８は、以下に説明されるように、装置１００のその他のコンポーネントの操作を制御する。電気化学的セル１０２に対し、データ捕獲コントローラーは、少なくとも、ポテンシオスタットの機能を備え、すなわち、上記セル１０２内の電圧および／または電流を制御および測定し得る。ナノアンペアおよびピコアンペアの大きさの電流が、当該技術分野で公知のデバイスを用いて慣用的に測定される。単一電子と同じぐらい小さな電流もまた測定可能であり、例えば、量子ドット、走査プローブデバイス、および単一電子トンネル（ＳＥＴ）デバイスを用いる。データ捕獲コントローラー１０８が光源１１０を調節する実施形態では、データ捕獲コントローラー１０８は、少なくとも、支持体１０４の照射を制御する。いくつかの実施形態では、データ捕獲コントローラー１０８はまた、支持体１０４の照射を制御する。いくつかの実施形態では、データ捕獲コントローラー１０８はまた、支持体１０４のどの部分が照射されるのかを制御する。例えば、いくつかの実施形態では、データ捕獲コントローラー１０８は、上記光源１１０が支持体１０４を所定のパターンで走査するようにする。この実施形態は、例えば、支持体が以下により詳細に論議されるようなアレイを備える実施形態で有用である。いくつかの実施形態では、データ捕獲コントローラー１０８は、必要に応じて、支持体１０４からの光学的情報を読み取るように構成された光学的スキャナーまたは検出器１１６からのデータを受容する。例えば、いくつかの実施形態では、支持体１０４は、光学的にコードされた識別印、例えば、バーコードまたは以下で考察されるその他の印を含む。以下に考察されるその他の実施形態では、上記光学的スキャナー１１６は、支持体１０４からの蛍光を検出するように構成される。その他の実施形態では、データ捕獲コントローラー１０８は、その他の方法、例えば、高周波（ＲＦ）タグを用いるか、または集積デバイス、例えば、マイクロプロセッサを用いてコードされる識別印を読み取るように構成される。いくつかの実施形態では、この印がデータ捕獲コントローラーのためのプログラムを識別する。データ捕獲コントローラー１０８は、例えば、ディスプレイ、キーボード、プリンター、ディスクドライブ、データポート、Ｉ／Ｏポートなど、当該技術分野で公知のデータ獲得および／またはデータ入力のための１つ以上のインターフェースを備える。
【００２０】
いくつかの実施形態では、データ捕獲コントローラー１０８はまた、流体取り扱いシステム１１２、温度制御システム１１４、および／または光学的スキャナー１１６を含む光学的コンポーネントからのデータを制御および獲得する。このデータ捕獲コントローラー１０８は単一ユニットとして示されているが、機能の各々、または機能の組み合わせを履行する別個のユニットを備え得る。例えば、いくつかの実施形態では、データ捕獲コントローラー１０８は、モジュールユニットを備え、それによってユーザーが制御およびデータ獲得機能を付加することを許容し、開示された装置の能力を増強する。いくつかの実施形態では、データ捕獲コントローラー１０８は、マイクロプロセッサを基礎にしたデバイスである。いくつかの実施形態では、データ捕獲コントローラー１０８は、ユーザーがプログラム可能である。いくつかの実施形態では、データ捕獲コントローラー１０８は、予めプログラムされている。
【００２１】
支持体１０４の実施形態の詳細図を図２に示す。支持体１０４は、核酸プローブ２４が付着される電極２２を備える。相補的核酸配列（「核酸標的」）２６は、このプローブ２４に結合する。非相補的核酸配列（図示せず）はこのプローブ２４に結合しない。
【００２２】
開示されたシステムは、一本鎖核酸よりも二本鎖核酸を優先的に標識する非共有結合光電気化学的化合物を用いる。いくつかの実施形態は、複数の光電気化学的化合物を用いる。いくつかの実施形態では、この光電気化学的化合物は、二本鎖核酸のための非共有結合標識である。例示の実施形態では、この光電気化学的標識は、二本鎖核酸に結合するが、一本鎖核酸には感知し得るほどに結合しない光電気化学的インターカレーター３０である。任意の理論に拘束されることなく、結合したインターカレーター３０を照射することは、励起された状態にあるインターカレーターを生成すると考えられる。この励起されたインターカレーター３２は、基底状態のインターカレーター３０よりも容易に酸化される。電極２２を励起されたインターカレーター３２は酸化するに十分であるが、基底状態のインターカレーター３０は酸化しない電位に偏移することは、励起されたインターカレーター３２の酸化されたインターカレーター３４への酸化を引き起こす。例示の実施形態では、酸化されたインターカレーター３４は、二本鎖核酸に結合したままである。いくつかの実施形態では、犠牲的還元剤が提供され、これは、酸化されたインターカレーター３４０基底状態インターカレーター３０に戻し、それによって、この犠牲的還元剤が消費されるか、または照射が中断するまで光電流を提供する。
【００２３】
電極２２は、開示されたアッセイと適合する当該分野で公知の任意の電極材料、例えば、金、白金、シリコン、ガラス状炭素、グラフィイト、インジウム−錫酸化物、および導電性または半導電性ダイヤモンドである。ダイヤモンドおよびインジウム−錫酸化物電極は透明であり、例えば、上記支持体１０４が電気化学的セル１０２で壁を形成する実施形態で、コンポーネントの光学的配列において柔軟性を提供する。いくつかの実施形態では、この電極２２は、当該分野で公知の任意の手段、例えば、物理的蒸着、化学的蒸着、スピンコーティング、プリンティングなどによって基体上に堆積された層である。この基体は、任意の適切な基体、例えば、半導体基体、シリコン、ガラス、シリカ、またはサファイアである。この電極２２は、任意の適切な形状、例えば、矩形、円形、六角形、または任意のその他の適切な形状を有する。図１に示される実施形態では、この電極２２は平面状である。当業者は、この電極２２が非平面状、例えば、円筒形、管状、プリズム、ピラミッドなどである得ることを理解する。いくつかの実施形態では、電気化学的セル１０２の全内壁が電極２２である。
【００２４】
核酸プローブ３４は、当該分野で公知の方法を用いて電極２２に付着される。いくつかの実施形態では、この核酸プローブ３４は、付着基を用いて付着される。この付着基は、誘導体化されるべき特定の電極材料の組成に依存し得る。例えば、チオール付着基で終結する核酸の単層で金電極を誘導体化することは、例えば、米国特許第５,４７２,８８１号に記載されるように、当該技術分野で周知である。ダイヤモンド電極は、Ｋｕｏら、「ホウ素ドープされた化学的蒸着ダイヤモンド表面の共有結合単層での電気化学的改変」Ｅｌｅｃｔｒｏｃｈｅｍ．Ｓｏｌｉｄ−Ｓｔａｔｅ Ｌｅｔｔ．１９９９、２：６、２８８〜２９０に記載のように、ジアゾニウム化合物で誘導体化されている。シリコン電極は、Ｙｉ Ｃｕｉら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２００１、２９３、１２８９〜９２に記載のように、置換されたアルコシキシランを用いて誘導体化されている。ガラス状炭素電極は、Ｒ．Ｄｅｉｎｈａｍｍｅｒら、Ｌａｎｇｍｕｉｒ １９９４、１０、１３０６に記載されるようにアミンにより、またはＭｉｋｋｅｌｓｅｎら、Ｅｌｅｃｔｒｏａｎａｌｙｓｉｓ １９９２、４、９２９に記載のようにカルボジイミドにより誘導体化されている。電極はまた、カルボキシレート−アミン官能基およびビオチン−アビジンカップリングにより誘導体化されている。
【００２５】
いくつかの実施形態では、上記支持体１０４は、核酸プローブ要素のアレイまたはミクロアレイを備え、これは、複数の標的核酸配列を掲出することで有用である。このようなアレイおよびミクロアレイはまた、しばしば、「チップ」と称される。各アレイ要素は、核酸プローブ２４を備える。これらプローブは、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ＰＮＡ、および／またはロックされた核酸（ＬＮＡ）任意のタイプのヌクレオチドまたはそのアナログ、またはそれらの任意の組み合わせを含み得る。上記アレイの核酸プローブ要素は、光学的にアドレス可能であるので、アレイは、各アレイ要素が電気的にアドレス可能ある必要でなく構築され得る。この光学的にアドレス可能性の結果は、全体の核酸アレイが単一の電極上に据え付けられ得、それによって構築を単純化することである。いくつかの実施形態では、このアレイは、複数の電極上でパターン化され得る。いくつかの実施形態では、このアレイは、支持体１０４の１つの表面上でパターン化される。いくつかの実施形態では、このアレイは、支持体１０４の複数の表面、例えば、平面状支持体１０４の両側面上でパターン化される。
【００２６】
上記アレイを構築する際に、上記核酸プローブ２４は、上記電極２２に、当該技術分野で公知の任意の手段、例えば、ピペット、インクジェットプリンティング、フォトリソグラフィー、または接触プリンティングにより付与される。アレイをアセンブルする際に、プローブ２４は、電極に、上記のように付着される。本明細書で用いられるとき、アレイ要素または要素は、アレイのアドレス可能なユニットである。要素は、１つ以上のプローブを備え得る。アレイは、少なくとも２つの要素を備える。約１０９までの要素を含むアレイが報告されている。従って、本開示に従って構築されたアレイ中の要素の数は、約１０、１００、１０００、１０，０００、１００，０００、１０６、１０７、１０８、１０９、またはそれ以上であり得る。このアレイ要素の間隔は、均一であるか、または変動し得る。多数の要素を備えるアレイには、より近い要素間間隔は、物理的により小さいアレイの構築を許容する。１００μｍの大きさの要素の中心から中心までの間隔が一般的である。約１０μｍ、１μｍ、およびより小さな間隔が報告されている。本開示は、これら値の任意またはすべての要素間間隔をもつアレイを企図する。例によれば、１０，０００を超える要素のアレイが標準的な顕微鏡スライド上に慣用的に製作される。アレイ要素の１００μｍの中心から中心までの間隔は、標準的な９６ウェルのマイクロタイタープレート中に１００，０００を超える要素のアレイを提供する。
【００２７】
いくつかの実施形態では、これらアレイ要素は、方形の格子、矩形の格子、六角形の格子、または所望の任意のパターンまたはパターンの組み合わせを形成する。いくつかの実施形態では、これらアレイ要素はランダムに据え付けられ、次いで、それらの空間的アドレスを決定するために検索される。これら要素がアドレス可能である限り、アイレ要素の任意の空間的配列が用いられ得る。これら要素のサイズは、特定の適用に依存する。例えば、小量の核酸の検出は、小さなアレイ要素を必要とし得る。マイクロアレイの構築は、同様に小要素を用いる。単一アレイは、異なるサイズの要素を備え得る。接触プリンティングは、ナノリットルの大きさで溶液のサンプルを堆積し得る。当業者は、要素のサイズが要素間間隔によって制限されることを認識する。
【００２８】
アレイの表面は、実質的に平滑であり得るか、または特徴を有し得る。例えば、これらアレイ要素は、窪みで、または高まった特徴で付与され得る。さらに、複数のアレイ要素は、各々が窪んだ、または高められた特徴で配置され得る。１０，０００要素をもつアレイが標準的な９６ウェルプレート上に形成された上記で引用した例では、各ウェルは約１００の要素を含んだ。これらの窪んだか、または高められた領域は、例えば、溶液を保持することによるか、または乾燥を容易にすることにより、これらアレイ要素のための特定の環境を提供するために供し得る。
【００２９】
上記支持体は、印またはマーキングをさらに所有し得、これらアレイ要素のアドレス可能性を提供または支援する。上記に記載の窪んだ、または高められた特徴もまた、この目的のために供し得る。このマーキングまたは印は、バーコードまたは別の機械読み取り可能なマーキングを用いて、装置中に支持体１０４を配向するため、またはそれを識別するために供し得る。この印は、任意の便利な位置に付与され、これは、アレイが付与される支持体１０４の表面上か、または異なる表面上であり得る。この位置は、光学的スキャナー１１６により読み取り可能であるように選択される。いくつかの実施形態では、支持体１０４は、別の機械読み取り可能な識別、例えば、ＲＦタグまたは集積デバイス（例えば、マイクロプロセッサ）を備える。
【００３０】
レーザーは、小アレイ要素を備えるシステムのために有用な光源１１０であるが、任意の十分に焦点を合わされた光源が用いられ得る。レーザーを用いてアレイを走査するための方法は、当該分野で周知である。
【００３１】
いくつかの実施形態では、支持体１０４には、光源が光学的スキャナー１１６と組み合わせて照射している位置を決定するための手段が提供される。例えば、電極それ自身が格子またはその他の参照マークまたは印を有し得る。このような参照マークを生成するための方法は、電極のタイプで変動し、そして当業者に公知であり、例えば、リソグラフィー、電気化学的エッチング、イオン支援エッチング、電気メッキ、物理的蒸着、および化学的蒸着である。あるいは、このような印は、アレイパターンの一部であり得る。例えば、着色、蛍光、または光電気化学的分子がアレイ要素として電極に付着され得る。いくつかの実施形態では、指標は、核酸プローブである。この指標プローブに結合することが知られる指標標的が添加され、そしてこのプローブにハイブリダイズされる。上記光源がアレイを走査するとき、それは、これらの指標要素の各々が照射されるとき光電流を生成する。いくつかの実施形態では、上記指標標的は、着色、蛍光、または光電気化学的分子に結合される。
【００３２】
いくつかの実施形態では、上記支持体１０４は、照射されるとき電気的信号を生成する要素、例えば、当該技術分野で公知の、光起電力、光抵抗、または別の光感受性要素を含む。
【００３３】
光電気化学的インターカレーターが蛍光で実施形態では、このインターカレーターが結合する二本鎖核酸を含むアレイ要素が光学的に決定され得、それによって、蛍光アレイ要素のみを走査することによりシステムスループットを増加する。
【００３４】
図３は、図２に示される支持体に関して核酸配列を検出するための方法３００を提供する。ステップ３１０では、支持体１０４が得られる。ステップ３２０では、この支持体１０４に付着されている核酸プローブ２４は、核酸標的２６と接触される。ステップ３３０では、核酸プローブ２４は、ハイブリダイゼーションに誘導する条件になる。プローブ２４と標的２６相補的配列を有する場合、それらはハイブリダイズし、それによって二本鎖核酸を形成する。そうでなければ、それらは、感知し得るようにハイブリダイズしない。この支持体１０４は、次いで、必要に応じて洗浄され、ステップ３３５でハイブリダイズした標的２６を除去する。ステップ３４０では、核酸プローブ２４は、光電気化学的インターカレーター３０と接触される。このインターカレーター３０は、ハイブリダイゼーションステップで形成された二本鎖核酸に結合する。プローブ２４が一本鎖のまま、すなわち、ハイブリダイズしない場合、ハイブリダイゼーション３０は、感知し得るほどに結合しない。ステップ３４５では、支持体１０４は、必要に応じて洗浄されて非結合インターカレーター３０を除去する。ステップ３５０では、核酸プローブ２４は、必要に応じて犠牲的還元剤と接触される。核酸プローブ２４、核酸標的２６、光電気化学的インターカレーター３０、および選択が自由の犠牲的還元剤は、一緒に反応混合物を形成し、それは、さらなる成分をさらに含み得る。ステップ３６０では、反応混合物は、電磁照射によって、基底状態にある結合したインターカレーター３０を、基底状態のインターカレーターより酸化するのがより容易な励起状態インターカレーター３２に励起するに十分なエネルギーおよび強度で照射される。ステップ３７０では、電極２２が、励起状態にあるインターカレーター３２を、酸化されたインターカレーター３６に酸化するが、基底状態にあるインターカレーターはそうしない電位に偏位される。励起状態のインターカレーター３２の酸化は、光電流を生成する。ステップ３８０では、光電流が測定される。
【００３５】
ステップ３１０では、支持体１０４が得られる。この開示された方法は、本明細書に開示の任意の核酸支持体１０４を用いて実施される。いくつかの実施形態では、この支持体１０４は、核酸プローブのアレイまたはマイクロアレイを備える。
【００３６】
ステップ３２０では、核酸標的２６は、支持体１０４上の電極に結合した核酸プローブ２４と接触される。代表的には、この核酸標的２６は、溶媒、例えば、水、水性緩衝液、有機溶媒、または別の適切な溶媒中に溶解される。いくつかの実施形態では、核酸標的２６は、流体取り扱いシステム１１２を用いて核酸プローブ２４と接触される。いくつかの実施形態では、この流体取り扱いシステム１１２は、データ捕獲コントローラー１０８によって制御される。
【００３７】
ステップ３３０では、標的２６およびプローブはハイブリダイズされる。いくつかの実施形態では、このハイブリダイゼーション状態は、上記で説明されたように、流体取り扱いシステム１１２および／または温度制御システム１１２と協調するデータ捕獲コントローラー１０８を用いて確立および維持される。
【００３８】
核酸ハイブリダイゼーションに誘導する条件は当該技術分野で公知であり、そして核酸標的２６およびプローブ２４の性質、溶媒のイオン強度、および溶媒の個性を含む因子に依存して異なる。例えば、一本鎖ＤＮＡ標的を一本鎖ＤＮＡプローブにハイブリダイズすることは、一本鎖ＲＮＡ標的を一本鎖ＤＮＡプローブにハイブリダイズすることとは異なる条件を必要とする。標的およびプローブのいずれか、または両方はまた、二本鎖であり得、その場合、この二本鎖核酸は、ハイブリダイゼーションステップの前に変性される。プローブおよび標的は、それらの個々の長さの部分に沿ってのみハイブリダイズする必要があり、すなわち、プローブおよび標的のいずれか、または両方は、ハイブリダイゼーションステップの後、一本鎖部分を有し得る。最適ハイブリダイゼーション条件は、代表的には、核酸の融点性質（Ｔｍ）、およびハイブリダイゼーション溶液のイオン強度により決定される。ハイブリダイゼーション速度は、一般に、Ｔｍの下約２０〜３０℃で最適であるが、特定の場合には、温度は、Ｔｍよりわずかに低いか、Ｔｍであるか、またはＴｍの上でさえ、有用であり得る。代表的なプロトコールで提供される洗浄条件は、ストリリンジェンシーを最大にする、すなわち、（完全相補性が要求される場合）完全に相補的でない核酸とのハイブリダイゼーションを防ぐために供される。高ストリンジェンシーが必要ではない場合、洗浄温度は減少され得るか、および／または洗浄緩衝液のイオン強度が上昇され得る。ハイブリダイゼーション反応の「ストリンジェンシー」は、慣用的な最適化により容易に決定可能であり、そして核酸鎖の長さ、洗浄温度、および塩濃度に依存して実験に基づいた計算である。一般に、より長い鎖は、適正なアニーリングにより高い温度を必要とし、その一方、より短い鎖はより低い温度を必要とする。ハイブリダイゼーションは、一般に、相補的鎖がそれらの融点温度未満の環境に存在するとき、変性された核酸がアニールする能力に依存する。プローブと標的との間の所望の相同性の程度が高くなるほど、用いられ得る相対温度は高くなる。結果として、より高い相対温度は、よりストリンジェントな反応条件を作製する傾向になり、その一方、より低い温度はそのような傾向が少なくなる。ハイブリダイゼーション反応のストリンジェンシーのさらなる詳細および説明は、Ａｕｓｂｅｌら、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｗｉｌｅｙ；１９９５を参照のこと。
【００３９】
ステップ３４０では、核酸プローブ２４は、光電気化学的インターカレーター３０と接触される。いくつかの実施形態では、この光電気化学的インターカレーター３０は、必要に応じてデータ捕獲コントローラー１０８を用いて制御される流体取り扱い器（ハンドラー）１１２を用いて核酸プローブ２４と接触される。いくつかの実施形態は、複数の光電気化学的インターカレーター３０を用いる。いくつかの実施形態では、核酸プローブ２４は、標的核酸と同時に（ステップ３２０）および光電気化学的インターカレーター３０と（ステップ３４０）接触される。
【００４０】
光電気化学的インターカレーター３０は、ハイブリダイゼーションステップで形成された二重鎖核酸に結合するが、一本鎖プローブ２４または標的２６には結合しないように選択される。その他の要求は、インターカレーター３０が光電気化学的に活性であることである。これらの規準に合致する任意のインターカレーターが用いられ得る。このインターカレーターは、有機物、無機物、または有機金属であり得る。有機のインターカレーターは、臭化エチジウムおよび関連化合物を含む。少なくとも１つのリガンドが、ｂｉｐｙ、ｐｈｅｎ、ＤＩＰ、ｄｐｐｚ、ｐｈｉ、ｔｅｒｐｙ、またはそれらの誘導体である、ルテニウム、オスミウム、コバルト、ロジウム、ニッケル、および白金の金属錯塩が適切な電気化学的インターカレーターである。このような錯塩の例は、米国特許第５，１１２，９７４号、同第４，６９９，９８７号、同第４，９８０，４７３号、およびＥｒｋｋｉｌａら、「金属インターカレーターのＤＮＡとの認識および反応」Ｃｈｅｍ．Ｒｅｖ．、１９９９、９９、２７７７に開示されている。米国特許第４，９８０，４７３号は、Ｚ−およびＢ−ＤＮＡを鑑別的に結合する［Ｒｕ（ＤＩＰ）３］２＋のそのエナンチオマーを開示している。
【００４１】
特にその中でカチオンが［Ｒｕ（ｂｉｐｙ）３］２＋、［Ｒｕ（ｂｉｐｙ）２ｄｐｐｚ］２＋、または［Ｒｕ（ｐｈｅｎ）３］２＋である、トリス（ポリピリジル）ルテニウム化合物が光電気化学的インターカレーターとして有用である。オスミウムアナログもまた、有用な光電気化学的インターカレーターである。
【００４２】
光電気化学的インターカレーター３０がハイブリダイズしたプローブ−標的に添加されるとき、それは、二本鎖核酸に結合するが、一本鎖核酸には結合しない。従って、インターカレーター３０は、標的核酸２６にハイブリダイズしない任意のプローブ核酸２４に有意に結合しない。従って、インターカレーター３０は、二本鎖核酸のための汎用標識であって、それは共有結合により付着される必要がないという利点を付加する。二本鎖ＤＮＡ−インターカレーター種は、本明細書では「インターカレーター−標識ＤＮＡ」と称される。
【００４３】
ルテニウムのポリピリジルインターカレーターは、代表的には、二本鎖核酸にランダムに結合する。光電気化学的信号を最適化するために必要な光電気化学的インターカレーターの濃度は、プローブ２４と標的２６との間の重複長さ、プローブ２４および標的２６の量、インターカレーター３０の励起状態３２への光励起の効率、励起インターカレーター３２の酸化形態３４への酸化の効率、およびもし存在する場合犠牲的還元剤の濃度を含む因子に依存する。この濃度は、当業者により容易に決定される。このアッセイは較正され得、定量結果を提供する。さらに、特有の構造特徴をもつ二本鎖核酸に選択的に結合するインターカレーターを選択し得る。上記のように、特定のインターカレーターのエナンチオマーが、Ｂ−またはＺ−ＤＮＡのために選択されることが知られている。米国特許第６，０３１，０９８号に記載されるインターカレーターを用いる塩基対ミスマッチのために選択することもまた可能である。
【００４４】
ステップ３５０では、プローブ核酸２４は、必要に応じて犠牲的還元剤と接触される。この犠牲的還元剤は、酸化されたインターカレーター３４を基底状態インターカレーター３０に還元し得、それによって、インターカレーター３０を、それが照射されている限り光電流を生成することを可能にし、これは、光電流の検出および測定を容易にする。適切な犠牲的還元剤は、このアッセイが使用不能である程度まで妨害しない。いくつかの実施形態では、電極２２は、この犠牲的還元剤を直接酸化せず、それによって潜在的に妨害するバックグラウンド電流を減少する。この犠牲的還元剤は、用いられる特定の光電気化学的インターカレーターに依存する。ルテニウムを基礎にしたインターカレーターのための適切な犠牲的還元剤は、一般に、三級アミン、特に、トリプロピルアミン（ＴＰＡ）、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）を含む。別の適切な犠牲的還元剤はβ−ラクタムである。
【００４５】
プローブ核酸２４、核酸標的２６、光電気化学的インターカレーター３０、および選択が自由の犠牲的還元剤は、一緒に反応混合物を形成し、これはさらに、さらなる成分を含み得る。
【００４６】
以下により詳細に記載されるその他の実施形態は、犠牲的還元剤の代わりに犠牲的酸化剤を用いる。他の実施形態は、犠牲的還元剤または犠牲的酸化剤のいずれをも用いない。
【００４７】
ステップ３６０では、この反応混合物は、必要に応じてデータ捕獲コントローラー１０８を用いて調節される光源１１０を用いて照射される。光のエネルギーおよび強度は、ハイブリダイズしたプローブ−標的の二本鎖領域に結合したインターカレーター３０を励起された状態のインターカレーター３２に励起するように選択される。いくつかの実施形態では、この装置は、光源１１０で支持体１０４の表面の走査を可能するように構成される。支持体１０４が核酸プローブのアレイを備える実施形態では、この装置は、各アレイ要素を個々に照射するよう構成される。アレイ要素を作製するプローブ核酸２４の塩基配列は既知であるので、アレイ中のプローブの位置によってプローブに結合する任意の標的２６の配列の部分を同定し得る。
【００４８】
ステップ３７０では、電極２２は、励起されたインターカレーター３２に対して酸化する電位に偏位される。この電極２２の電位は、データ捕獲コントローラー１０８によって制御される。いくつかの実施形態では、この電極２２は、励起されたインターカレーター３２を酸化し得るが、基底状態にあるインターカレーター３０は酸化しない電位に偏位される。いくつかの実施形態では、ステップ３６０および３７０は、時間が重複する。
【００４９】
いくつかの実施形態では、この電極２２は、基底状態インターカレーター３０を酸化し得る電位に偏位される。この実施形態は、光学的アドレス付けが必要ではない、例えば、支持体１０４が１つのタイプのみのプローブ核酸２４を含む場合に有用である。このアッセイは、光電気化学的アッセイよりはむしろ電気化学的アッセイである。
【００５０】
いくつかの実施形態では、以下により詳細に考察されるが、この電極２２は、還元電位に偏位される。
【００５１】
ステップ３８０では、電極２２における電流は、当該技術分野で公知の任意の手段を用いて測定される。例示される実施形態では、データ捕獲コントローラー１０８は、電流を測定するように構成される。犠牲的還元剤を用いる実施形態では、上記光電流は、犠牲的還元剤が消費されるか、または照射が終了するまで継続する。犠牲的還元剤を用いない実施形態では、光電流は、励起されたインターカレーター３２が酸化されるまで光電流が継続する。
【００５２】
いくつかの実施形態では、電極は、さらなるアッセイのために再利用可能である。いくつかの実施形態では、支持体１０４は、単に変性条件にされ、そして変性した一本鎖核酸は、電極から洗浄される。
【００５３】
任意の理論によって拘束されることなく、以下は、光電気化学的インターカレーターとして［Ｒｕ（ｂｉｐｙ）３］２＋を用いるシステムで作動すると考えられる機構を記載する。同様の機構が、その他の光電気化学的インターカレーターに同様に適用されると考えられる。以下の説明では、基底状態インターカレーター３０は、［Ｒｕ（ｂｉｐｙ）３］２＋であり、励起状態インターカレーター３２は、［Ｒｕ（ｂｉｐｙ）３］２＋＊であり、そして酸化されたインターカレーター３２は、［Ｒｕ（ｂｉｐｙ）３］３＋である。［Ｒｕ（ｂｉｐｙ）３］２＋を照射することは、励起種［Ｒｕ（ｂｉｐｙ）３］２＋＊を生成し、これは、［Ｒｕ（ｂｉｐｙ）３］２＋より［Ｒｕ（ｂｉｐｙ）３］３＋により容易に酸化される。励起種の正確な性質は、この方法にとって重要ではなく、そして光電子は、金属中心またはリガンド中心に存在し得る。［Ｒｕ（ｂｉｐｙ）３］２＋は、電極２２に付着したプローブ核酸２４にハイブリダイズした標的２６の二本鎖領域にインターカレートする。このインターカレーターを照射することは、このインターカレーターを励起された状態［Ｒｕ（ｂｉｐｙ）３］２＋＊にする。
【００５４】
いくつかの実施形態では、電極２２は、［Ｒｕ（ｂｉｐｙ）３］２＋＊を［Ｒｕ（ｂｉｐｙ）３］３＋に酸化するが、［Ｒｕ（ｂｉｐｙ）３］２＋はそうしない電位の偏位される。インターカレーター−標識核酸を照射することは、インターカレートされた［Ｒｕ（ｂｉｐｙ）３］２＋＊を生成し、これは、電極２２によって［Ｒｕ（ｂｉｐｙ）３］３＋に酸化され、光電流を生成する。プローブ２４がハイブリダイズしない場合、インターカレーター３０は結合せず、そして光電流は観察されない。
【００５５】
任意の理論に拘束されることなく、光電子量子は、励起された［Ｒｕ（ｂｉｐｙ）３］２＋＊から電極２２に機械的にトンネルを通り抜けると考えられる。トンネル通り抜けの速度は、［Ｒｕ（ｂｉｐｙ）３］２＋＊と電極２２との間の距離に依存するので、光電流は、電極表面の近傍にある［Ｒｕ（ｂｉｐｙ）３］２＋＊分子によってのみ生成される。代表的には、電極２２の表面に付着した標的−プローブ二重鎖に結合したような［Ｒｕ（ｂｉｐｙ）３］２＋＊分子のみが、光電流を生成するに十分なこの電極の近傍にある。その他の研究は、ＤＮＡ二重ヘリックス自体が、電子移動を容易にすることを示す。例えば、Ｍｕｒｐｈｙら、「ＤＮＡインターカーレーションを通る迅速光誘導電子移動」Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、１９９４、９１、５３１５を参照のこと。
【００５６】
その他の実施形態では、［Ｒｕ（ｂｉｐｙ）３］３＋を［Ｒｕ（ｂｉｐｙ）３］２＋に還元するが、［Ｒｕ（ｂｉｐｙ）３］２＋を［Ｒｕ（ｂｉｐｙ）３］１＋に還元しない犠牲的還元剤が添加される。この実施形態では、上記電極２２は、［Ｒｕ（ｂｉｐｙ）３］２＋＊を［Ｒｕ（ｂｉｐｙ）３］３＋に酸化するが、［Ｒｕ（ｂｉｐｙ）３］２＋はそうしない電位に偏位される。インターカレーター−結合核酸を照射することは、インターカレートされた［Ｒｕ（ｂｉｐｙ）３］２＋＊を生成し、これは、電極によって酸化されて［Ｒｕ（ｂｉｐｙ）３］３＋に酸化し、光電流を生成する。犠牲的還元剤は、インターカレートされた［Ｒｕ（ｂｉｐｙ）３］３＋を、［Ｒｕ（ｂｉｐｙ）３］２＋に戻す。［Ｒｕ（ｂｉｐｙ）３］２＋は、この実施形態では再生されるので、光電流は、この犠牲的還元剤が消費されるか、または照射が終了されるまで継続する。ここで再び、プローブがハイブリダイズしないとき、結合するインターカレーター３０はなく、そして光電流は観察されない。
【００５７】
なお別の実施形態では、［Ｒｕ（ｂｉｐｙ）３］２＋＊を［Ｒｕ（ｂｉｐｙ）３］３＋に酸化するが、［Ｒｕ（ｂｉｐｙ）３］２＋はそうしない犠牲的酸化剤がシステムに添加される。電極は、［Ｒｕ（ｂｉｐｙ）３］３＋を［Ｒｕ（ｂｉｐｙ）３］２＋に還元するが、［Ｒｕ（ｂｉｐｙ）３］１＋にしない電位に偏位される。インターカレーター−結合核酸を照射することは、インターカレートされた［Ｒｕ（ｂｉｐｙ）３］２＋＊を生成し、これは、犠牲的酸化剤によって［Ｒｕ（ｂｉｐｙ）３］２＋に酸化されて光電流を生成する。この実施形態では、［Ｒｕ（ｂｉｐｙ）３］２＋が再生されるので、光電流は、この犠牲的酸化剤が消費されるか、または照射が終了するまで継続する。ここで再び、プローブがハイブリダイズしないとき、結合するインターカレーター３０はなく、そして光電流は観察されない。その他にこのアッセイを妨害しない任意の犠牲的酸化剤が用いられ得る。［Ｃｏ（Ｃ２Ｏ４）］３−およびビドラジンが適切な犠牲的酸化剤である。
【００５８】
先行する記載は、光支援酸化を受ける光電気化学的インターカレーターを論議している。当業者は、光支援還元を受ける光電気化学的インターカレーターもまた開示された発明の範囲内で用いられ得ることを明確に理解する。
【実施例】
【００５９】
Ａｕ作動電極、Ｐｔワイヤー対電極、およびＡｇ／ＡｇＣｌ参照電極を備えた３電極電気化学的セルを、電位の偏位を制御するようセットアップされ、そして電流を測定するポテンショスタットに接続した。光源は、ピンホールを通じて５０−μｍのビームサイズに焦光された４０５−ｎｍのダイオードレーザー、および作動電極表面上の１セットの光学的レンズであった。コンピューターを用いてこのレーザーを矩形波（オフ−オン）によって調整し、そしてデータ獲得ボードを通じてデータを獲得した。
【００６０】
金の作動電極は、硫酸および３０％の過酸化水素の７０／３０−Ｖ／Ｖ溶液で清澄化し、次いで、脱イオン水で完全にすすいだ。チオール化プローブオリゴヌクレオチドＸ２０（チオール−ＡＡＣＣＡＧＧＡＴＴＡＴＣＣＧＣＴＣＡＣ）を電極の表面上に配置し、そして電極を脱イオン水で完全にすすいだ。このプローブを金表面上の単層に自己アセンブルした。１×ＳＳＣ緩衝液中の標的オリゴヌクレオチドＴ２０（ＧＴＧＡＧＣＧＧＡＴＡＡＴＣＣＴＧＧＴＴ）をこの電極に添加し、そして３８℃でハイブリダイズさせた。この電極を１×ＳＳＣ緩衝液ですすぎ、任意の過剰の標的を除去した。１×ＳＳＣ緩衝液中の［Ｒｕ（ｂｉｐｙ）３］Ｃｌ２の１ｍＭ溶液を電極に添加し、そして電極を１×ＳＳＣ緩衝液ですすいだ。光電気化学的検出を、５０ｍＭ ＥＤＴＡおよび０．１ｍＭ ＮａＣｌ中で実施した。電極電位は、Ａｇ／ＡｇＣｌ参照電極に対し０〜０．７Ｖであった。
【００６１】
レーザーが１Ｈｚで調整される試験では、３２Ｈｚで、そして電極電位が０．５Ｖであた収集されたデータは、図４で提供されるデータを生成した。一本鎖ＤＮＡのデータでは、電流は、レーザーの調整で認知し得る変化をしなかった。二本鎖ＤＮＡデータでは、電流は、レーザーの調整とカップルしている。図５は、電極における電位に対する光電流の依存性を示す。
【００６２】
上記に示され、かつ記載された実施形態は、例示のみとして提供される。種々の変更および改変が、本明細書の教示の思想および範囲から逸脱することなく、当業者によって、本明細書中に存在する実施形態になされ得る。
【図面の簡単な説明】
【００６３】
【図１】図１は、本明細書に開示される光電気化学的方法を実施するために適切な装置の実施形態の概略である。
【図２】図２は、開示される方法が作動され得る可能な機構を示す。
【図３】図３は、開示される方法のいくつかの実施形態のフローチャートである。
【図４】図４は、［Ｒｕ（ｂｉｐｙ）３］２＋およびＥＤＴＡの存在下、一本鎖および二本鎖ＤＮＡで修飾された電極で測定された光電流である。
【図５】図５は、二本鎖ＤＮＡで修飾された電極の電位と、［Ｒｕ（ｂｉｐｙ）３］２＋およびＥＤＴＡの存在下で観察された光電流との間の関係を示すグラフである。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
標的核酸配列を検出するためのシステムであって：
電極およびそれに付着した核酸プローブを備えた支持体であって、該核酸プローブが該標的核酸配列に相補的な配列を含む、支持体；
該核酸プローブと接触するための非共有結合光電気化学的標識；
該核酸プローブを照射するための光源；および
該電極で電流を測定するためのデータ収集コントローラー、を備える、システム。
【請求項２】
前記核酸プローブがＤＮＡを含む、請求項１に記載のシステム。
【請求項３】
前記核酸プローブがＲＮＡを含む、請求項１に記載のシステム。
【請求項４】
前記標的核酸配列がＤＮＡ配列を含む、請求項１に記載のシステム。
【請求項５】
前記標的核酸配列がＲＮＡ配列を含む、請求項１に記載のシステム。
【請求項６】
前記支持体が核酸プローブ要素のアレイを備える、請求項１に記載のシステム。
【請求項７】
前記アレイが約１０より多い核酸プローブ要素を備える、請求項６に記載のシステム。
【請求項８】
前記電極が、金、白金、シリコン、ガラス状炭素、グラファイト、インジウム−錫酸化物、およびダイヤモンドの少なくとも１つを含む、請求項１に記載のシステム。
【請求項９】
前記非共有結合光電気化学的標識が：
ルテニウム、オスミウム、コバルト、ロジウム、ニッケル、および白金の少なくとも１つを含む金属；および
ポリピリジルリガンドである２，２’−ビピリジン、１，１０−フェナントロリン、４，７−ジフェニル−１，１０−フェナントロリン、ジピリド［３，２−ａ：２’，３’−ｃ］フェナジン、９，１０−フェナントレンキノンジイミン、２，２’：６，２’’−ターピリジン、およびその誘導体の少なくとも１つを含むリガンドを含む、請求項１に記載のシステム。
【請求項１０】
前記非共有結合光電気化学的標識が：［Ｒｕ（ｂｉｐｙ）３］２＋、［Ｒｕ（ｂｉｐｙ）２ｄｐｐｚ］２＋、［Ｒｕ（ｐｈｅｎ）３］２＋、およびそれらの組み合わせからなる群から選択されるカチオンを含む、請求項９に記載のシステム。
【請求項１１】
前記光源がレーザーである、請求項１に記載のシステム。
【請求項１２】
前記光源が可視光を照射する、請求項１に記載のシステム。
【請求項１３】
前記核酸プローブと接触するための犠牲的還元剤をさらに含む、請求項１に記載のシステム。
【請求項１４】
前記犠牲的還元剤が、三級アミン、トリプロピルアミン、エチレンジアミン四酢酸、およびそれらの塩の少なくとも１つを含む、請求項１に記載のシステム。
【請求項１５】
前記支持体を走査するための光学的スキャナーをさらに備える、請求項１に記載のシステム。
【請求項１６】
前記支持体のための流体取り扱いシステムをさらに備える、請求項１に記載のシステム。
【請求項１７】
前記支持体のための温度制御システムをさらに備える、請求項１に記載のシステム。
【請求項１８】
前記支持体が機械読み取り可能な識別印をさらに備える、請求項１に記載のシステム。
【請求項１９】
標的核酸配列を検出するための方法であって：
核酸プローブを、標的核酸および非共有結合光電気化学的標識と接触し、反応混合物を形成する工程であって、
ここで、該核酸プローブが電極に取り付けられ、該核酸プローブが該標的核酸配列に相補的な配列を含み、そして支持体が該核酸プローブおよび該電極を備える、工程；
該混合物を照射する工程；および
該電極で光電流を観察する工程であって、該光電流が該標的核酸の存在および／またはその量を示す、工程、を包含する、方法。
【請求項２０】
前記核酸プローブがＤＮＡを含む、請求項１８に記載の方法。
【請求項２１】
前記核酸プローブがＲＮＡを含む、請求項１８に記載の方法。
【請求項２２】
前記標的核酸がＤＮＡを含む、請求項１８に記載の方法。
【請求項２３】
前記標的核酸がＲＮＡを含む、請求項１８に記載の方法。
【請求項２４】
前記支持体が核酸プローブ要素のアレイを備える、請求項１８に記載の方法。
【請求項２５】
前記アレイが約１０より多い核酸プローブ要素を備える、請求項１８に記載の方法。
【請求項２６】
前記電極が、金、白金、シリコン、ガラス状炭素、グラファイト、インジウム−錫酸化物、およびダイヤモンドの少なくとも１つを含む、請求項１８に記載の方法。
【請求項２７】
前記非共有結合光電気化学的標識が：
ルテニウム、オスミウム、コバルト、ロジウム、ニッケル、および白金の少なくとも１つを含む金属；および
ポリピリジルリガンドである２，２’−ビピリジン、１，１０−フェナントロリン、４，７−ジフェニル−１，１０−フェナントロリン、ジピリド［３，２−ａ：２’，３’−ｃ］フェナジン、９，１０−フェナントレンキノンジイミン、２，２’：６，２’’−ターピリジン、およびその誘導体の少なくとも１つを含むリガンドを含む、請求項１８に記載の方法。
【請求項２８】
前記非共有結合光電気化学的標識が：［Ｒｕ（ｂｉｐｙ）３］２＋、［Ｒｕ（ｂｉｐｙ）２ｄｐｐｚ］２＋、［Ｒｕ（ｐｈｅｎ）３］２＋、およびそれらの組み合わせからなる群から選択されるカチオンを含む、請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
前記核酸プローブがレーザーを用いて照射される、請求項１８に記載の方法。
【請求項３０】
前記核酸プローブが可視光で照射される、請求項１８に記載の方法。
【請求項３１】
前記核酸プローブを犠牲的還元剤または犠牲的酸化剤と接触する工程をさらに包含する、請求項１８に記載の方法。
【請求項３２】
前記犠牲的還元剤が、三級アミン、トリプロピルアミン、エチレンジアミン四酢酸、およびそれらの塩の少なくとも１つを含む、請求項３０に記載の方法。
【請求項３３】
前記核酸プローブを、核酸ハイブリダイゼーションを誘導する条件下に維持する工程をさらに包含する、請求項３０に記載の方法。
【請求項３４】
前記核酸プローブを洗浄し、過剰の核酸標的を除去する工程をさらに包含する、請求項３０に記載の方法。
【請求項３５】
前記核酸プローブを洗浄し、過剰の非共有結合光電気化学的標識を除去する工程をさらに包含する、請求項３０に記載の方法。
【請求項３６】
標的核酸配列を検出するためのキットであって：
電極およびそれに付着した核酸プローブを備えた支持体であって、該核酸プローブが該標的核酸配列に相補的な配列を含む、支持体；および
非共有結合光電気化学的標識を備える、キット。
【請求項３７】
前記核酸プローブがＤＮＡを含む、請求項３６に記載のキット。
【請求項３８】
前記核酸プローブがＲＮＡを含む、請求項３６に記載のキット。
【請求項３９】
前記支持体が核酸プローブ要素のアレイを備える、請求項３６に記載のキット。
【請求項４０】
前記電極が、金、白金、シリコン、ガラス状炭素、グラファイト、インジウム−錫酸化物、およびダイヤモンドの少なくとも１つを含む、請求項３６に記載のキット。
【請求項４１】
前記非共有結合光電気化学的標識が：
ルテニウム、オスミウム、コバルト、ロジウム、ニッケル、および白金の少なくとも１つを含む金属；および
ポリピリジルリガンドである２，２’−ビピリジン、１，１０−フェナントロリン、４，７−ジフェニル−１，１０−フェナントロリン、ジピリド［３，２−ａ：２’，３’−ｃ］フェナジン、９，１０−フェナントレンキノンジイミン、２，２’：６，２’’−ターピリジン、およびその誘導体の少なくとも１つを含む、リガンド、を含む、請求項３６に記載のキット。
【請求項４２】
前記非共有結合光電気化学的標識が：［Ｒｕ（ｂｉｐｙ）３］２＋、［Ｒｕ（ｂｉｐｙ）２ｄｐｐｚ］２＋、［Ｒｕ（ｐｈｅｎ）３］２＋、およびそれらの組み合わせからなる群から選択されるカチオンを含む、請求項４１に記載のキット。
【請求項４３】
犠牲的還元剤または犠牲的酸化剤をさらに含む、請求項３６に記載のキット。
【請求項４４】
前記犠牲的還元剤が、三級アミン、トリプロピルアミン、エチレンジアミン四酢酸、およびそれらの塩の少なくとも１つを含む、請求項４３に記載のキット。
【請求項４５】
前記支持体が機械読み取り可能な識別印をさらに備える、請求項３６に記載のキット。
【請求項１】
標的核酸配列を検出するためのシステムであって：
電極およびそれに付着した核酸プローブを備えた支持体であって、該核酸プローブが該標的核酸配列に相補的な配列を含む、支持体；
該核酸プローブと接触するための非共有結合光電気化学的標識；
該核酸プローブを照射するための光源；および
該電極で電流を測定するためのデータ収集コントローラー、を備える、システム。
【請求項２】
前記核酸プローブがＤＮＡを含む、請求項１に記載のシステム。
【請求項３】
前記核酸プローブがＲＮＡを含む、請求項１に記載のシステム。
【請求項４】
前記標的核酸配列がＤＮＡ配列を含む、請求項１に記載のシステム。
【請求項５】
前記標的核酸配列がＲＮＡ配列を含む、請求項１に記載のシステム。
【請求項６】
前記支持体が核酸プローブ要素のアレイを備える、請求項１に記載のシステム。
【請求項７】
前記アレイが約１０より多い核酸プローブ要素を備える、請求項６に記載のシステム。
【請求項８】
前記電極が、金、白金、シリコン、ガラス状炭素、グラファイト、インジウム−錫酸化物、およびダイヤモンドの少なくとも１つを含む、請求項１に記載のシステム。
【請求項９】
前記非共有結合光電気化学的標識が：
ルテニウム、オスミウム、コバルト、ロジウム、ニッケル、および白金の少なくとも１つを含む金属；および
ポリピリジルリガンドである２，２’−ビピリジン、１，１０−フェナントロリン、４，７−ジフェニル−１，１０−フェナントロリン、ジピリド［３，２−ａ：２’，３’−ｃ］フェナジン、９，１０−フェナントレンキノンジイミン、２，２’：６，２’’−ターピリジン、およびその誘導体の少なくとも１つを含むリガンドを含む、請求項１に記載のシステム。
【請求項１０】
前記非共有結合光電気化学的標識が：［Ｒｕ（ｂｉｐｙ）３］２＋、［Ｒｕ（ｂｉｐｙ）２ｄｐｐｚ］２＋、［Ｒｕ（ｐｈｅｎ）３］２＋、およびそれらの組み合わせからなる群から選択されるカチオンを含む、請求項９に記載のシステム。
【請求項１１】
前記光源がレーザーである、請求項１に記載のシステム。
【請求項１２】
前記光源が可視光を照射する、請求項１に記載のシステム。
【請求項１３】
前記核酸プローブと接触するための犠牲的還元剤をさらに含む、請求項１に記載のシステム。
【請求項１４】
前記犠牲的還元剤が、三級アミン、トリプロピルアミン、エチレンジアミン四酢酸、およびそれらの塩の少なくとも１つを含む、請求項１に記載のシステム。
【請求項１５】
前記支持体を走査するための光学的スキャナーをさらに備える、請求項１に記載のシステム。
【請求項１６】
前記支持体のための流体取り扱いシステムをさらに備える、請求項１に記載のシステム。
【請求項１７】
前記支持体のための温度制御システムをさらに備える、請求項１に記載のシステム。
【請求項１８】
前記支持体が機械読み取り可能な識別印をさらに備える、請求項１に記載のシステム。
【請求項１９】
標的核酸配列を検出するための方法であって：
核酸プローブを、標的核酸および非共有結合光電気化学的標識と接触し、反応混合物を形成する工程であって、
ここで、該核酸プローブが電極に取り付けられ、該核酸プローブが該標的核酸配列に相補的な配列を含み、そして支持体が該核酸プローブおよび該電極を備える、工程；
該混合物を照射する工程；および
該電極で光電流を観察する工程であって、該光電流が該標的核酸の存在および／またはその量を示す、工程、を包含する、方法。
【請求項２０】
前記核酸プローブがＤＮＡを含む、請求項１８に記載の方法。
【請求項２１】
前記核酸プローブがＲＮＡを含む、請求項１８に記載の方法。
【請求項２２】
前記標的核酸がＤＮＡを含む、請求項１８に記載の方法。
【請求項２３】
前記標的核酸がＲＮＡを含む、請求項１８に記載の方法。
【請求項２４】
前記支持体が核酸プローブ要素のアレイを備える、請求項１８に記載の方法。
【請求項２５】
前記アレイが約１０より多い核酸プローブ要素を備える、請求項１８に記載の方法。
【請求項２６】
前記電極が、金、白金、シリコン、ガラス状炭素、グラファイト、インジウム−錫酸化物、およびダイヤモンドの少なくとも１つを含む、請求項１８に記載の方法。
【請求項２７】
前記非共有結合光電気化学的標識が：
ルテニウム、オスミウム、コバルト、ロジウム、ニッケル、および白金の少なくとも１つを含む金属；および
ポリピリジルリガンドである２，２’−ビピリジン、１，１０−フェナントロリン、４，７−ジフェニル−１，１０−フェナントロリン、ジピリド［３，２−ａ：２’，３’−ｃ］フェナジン、９，１０−フェナントレンキノンジイミン、２，２’：６，２’’−ターピリジン、およびその誘導体の少なくとも１つを含むリガンドを含む、請求項１８に記載の方法。
【請求項２８】
前記非共有結合光電気化学的標識が：［Ｒｕ（ｂｉｐｙ）３］２＋、［Ｒｕ（ｂｉｐｙ）２ｄｐｐｚ］２＋、［Ｒｕ（ｐｈｅｎ）３］２＋、およびそれらの組み合わせからなる群から選択されるカチオンを含む、請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
前記核酸プローブがレーザーを用いて照射される、請求項１８に記載の方法。
【請求項３０】
前記核酸プローブが可視光で照射される、請求項１８に記載の方法。
【請求項３１】
前記核酸プローブを犠牲的還元剤または犠牲的酸化剤と接触する工程をさらに包含する、請求項１８に記載の方法。
【請求項３２】
前記犠牲的還元剤が、三級アミン、トリプロピルアミン、エチレンジアミン四酢酸、およびそれらの塩の少なくとも１つを含む、請求項３０に記載の方法。
【請求項３３】
前記核酸プローブを、核酸ハイブリダイゼーションを誘導する条件下に維持する工程をさらに包含する、請求項３０に記載の方法。
【請求項３４】
前記核酸プローブを洗浄し、過剰の核酸標的を除去する工程をさらに包含する、請求項３０に記載の方法。
【請求項３５】
前記核酸プローブを洗浄し、過剰の非共有結合光電気化学的標識を除去する工程をさらに包含する、請求項３０に記載の方法。
【請求項３６】
標的核酸配列を検出するためのキットであって：
電極およびそれに付着した核酸プローブを備えた支持体であって、該核酸プローブが該標的核酸配列に相補的な配列を含む、支持体；および
非共有結合光電気化学的標識を備える、キット。
【請求項３７】
前記核酸プローブがＤＮＡを含む、請求項３６に記載のキット。
【請求項３８】
前記核酸プローブがＲＮＡを含む、請求項３６に記載のキット。
【請求項３９】
前記支持体が核酸プローブ要素のアレイを備える、請求項３６に記載のキット。
【請求項４０】
前記電極が、金、白金、シリコン、ガラス状炭素、グラファイト、インジウム−錫酸化物、およびダイヤモンドの少なくとも１つを含む、請求項３６に記載のキット。
【請求項４１】
前記非共有結合光電気化学的標識が：
ルテニウム、オスミウム、コバルト、ロジウム、ニッケル、および白金の少なくとも１つを含む金属；および
ポリピリジルリガンドである２，２’−ビピリジン、１，１０−フェナントロリン、４，７−ジフェニル−１，１０−フェナントロリン、ジピリド［３，２−ａ：２’，３’−ｃ］フェナジン、９，１０−フェナントレンキノンジイミン、２，２’：６，２’’−ターピリジン、およびその誘導体の少なくとも１つを含む、リガンド、を含む、請求項３６に記載のキット。
【請求項４２】
前記非共有結合光電気化学的標識が：［Ｒｕ（ｂｉｐｙ）３］２＋、［Ｒｕ（ｂｉｐｙ）２ｄｐｐｚ］２＋、［Ｒｕ（ｐｈｅｎ）３］２＋、およびそれらの組み合わせからなる群から選択されるカチオンを含む、請求項４１に記載のキット。
【請求項４３】
犠牲的還元剤または犠牲的酸化剤をさらに含む、請求項３６に記載のキット。
【請求項４４】
前記犠牲的還元剤が、三級アミン、トリプロピルアミン、エチレンジアミン四酢酸、およびそれらの塩の少なくとも１つを含む、請求項４３に記載のキット。
【請求項４５】
前記支持体が機械読み取り可能な識別印をさらに備える、請求項３６に記載のキット。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【公表番号】特表２００６−５０６６４４（Ｐ２００６−５０６６４４Ａ）
【公表日】平成１８年２月２３日（２００６．２．２３）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００４−５５３６０８（Ｐ２００４−５５３６０８）
【出願日】平成１５年１１月１４日（２００３．１１．１４）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００３／０３６１９７
【国際公開番号】ＷＯ２００４／０４６３６９
【国際公開日】平成１６年６月３日（２００４．６．３）
【出願人】（５０００６９０５７）アプレラ コーポレイション (120)
【住所又は居所原語表記】８５０ Ｌｉｎｃｏｌｎ Ｃｅｎｔｒｅ Ｄｒｉｖｅ Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ ＣＡＬＩＦＯＲＮＩＡ ９４４０４ Ｕ．Ｓ．Ａ．
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成１８年２月２３日（２００６．２．２３）
【国際特許分類】
【出願日】平成１５年１１月１４日（２００３．１１．１４）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００３／０３６１９７
【国際公開番号】ＷＯ２００４／０４６３６９
【国際公開日】平成１６年６月３日（２００４．６．３）
【出願人】（５０００６９０５７）アプレラ コーポレイション (120)
【住所又は居所原語表記】８５０ Ｌｉｎｃｏｌｎ Ｃｅｎｔｒｅ Ｄｒｉｖｅ Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ ＣＡＬＩＦＯＲＮＩＡ ９４４０４ Ｕ．Ｓ．Ａ．
【Ｆターム（参考）】
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