植物α−ファルネセン合成酵素およびそれをコードするポリヌクレオチド
本発明は、単離α−ファルネセン合成酵素およびその酵素をコードするポリヌクレオチド配列を提供する。本発明はまた、そのポリヌクレオチド配列を組み込んでいる核酸構築物、ベクターおよび宿主細胞をも提供する。これはさらに、この酵素を用いたα−ファルネセン産生、植物内でのα−ファルネセン合成の調節、およびα−ファルネセン合成酵素活性が変化した植物の選択にも関する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、酵素であるα−ファルネセン合成酵素、およびその酵素をコードするポリヌクレオチド配列に関する。本発明はまた、そのポリヌクレオチド配列を組み込んでいる核酸構築物、ベクターおよび宿主細胞にも関する。本発明はさらに、α−ファルネセンの産生、および昆虫誘引剤、性フェロモンおよび他の生成物などの生成物におけるその使用にも関する。またα−ファルネセンを使用して、香味および芳香として有用な独特の香りを有する他の生成物を作製することができる。
【０００２】
(背景技術)
α−ファルネセン(図１)は、構成的に存在する、または広範囲の種で誘導される非環式セスキテルペン炭化水素(Ｃ15Ｈ24；３,７,11−トリメチル−１,３,６,10−ドデカテトラエン)である。
【０００３】
セスキテルペンの生合成経路は、一般のテルペノイドの経路から分かれており、アリルジリン酸エステルであるファルネシルジリン酸(ＦＤＰ、ＦＰＰとも短縮される)から開始される(Bohlmann, et al., Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.95, 4126-4133 (1998)、 Cane and Bowser, Bioorg.Med.Chem.Lett.9, 1127-1132 (1999)、 Davis and Croteau, Top.Curr.Chem. 209, 53-95(2000))。α−ファルネセンは、カルボカチオン中間体(図２)を介して進行する反応中でＦＤＰから合成され、セスキテルペン合成酵素であるα−ファルネセン合成酵素によって触媒される(Rupasinghe, et al., J.Am.Soc.Hortic.Sci.123, 882-886(1998))。葉緑体内で行われるモノテルペンおよびジテルペンの生合成経路とは異なり、セスキテルペン生合成経路である酢酸／メバロン酸経路は、細胞質に局在する(Croteau, et al., In Biochemistry and Molecular Biology of Plants, eds Buchanan, Gruissem and Jones, American Society of Plant Physiologists, 1250-1318 (2000)、 Lange, et al., Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.97, 13172-13177 (2000))。
【０００４】
しかし、モノテルペンであれ、セスキテルペンであれ、ジテルペンであれ、既知の植物テルペン合成酵素はすべて密接に関係するように思われる。その類似点には、イントロン配列の位置（Trapp and Croteau, Genetics 158, 811-832(2001)）、およびアスパラギン酸に富むＤＤＸＸ(Ｄ,Ｅ)モチーフ(Lesburg, et al., Curr.Opin.Struct.Biol.8, 695-703(1998))などの保存された配列の存在がある。このモチーフは、金属イオン、通常、触媒反応に必要なＭｇ2+の結合に関与する(Lesburg, et al., Curr.Opin.Struct.Biol.8, 695-703(1998))。
【０００５】
α−ファルネセン合成酵素は、リンゴ果実(Malus domesticaデリシャス(Delicious))の皮から部分的に精製されている。しかし、部分的に精製された酵素の回収率が低く、それが不安定であることから、さらなる精製が制限されていた(Rupasinghe, et al., J.Am.Soc.Hortic.125, 111-119(2000))。
【０００６】
α−ファルネセンは昆虫誘引剤である。これはマウスおよび昆虫の性フェロモンである。酸素化された(空気にさらされることで生じる化学物質を含む)α−ファルネセン産物(例えば、ファルネソール、ファルネサール)は独特の香りを有する(香味／芳香としての使用）。α−ファルネセンおよびその誘導体は他に、強力な癌予防剤として、またプラスチックフィルムの合成に使用される。
【０００７】
またα−ファルネセンおよびその酸化産物の両方のレベルと、冷蔵後のリンゴの皮に黒い着色として現れる、収穫後の生理的な異常である表面のやけの発生との間の関係もある(Watkins, et al., Acta.Hort.343, 155-160(1993)、Ju and Bramlage, J.Am.Soc.Hortic.Sci.125, 498-504(2000)、Whitaker and Saftner, J.Agric.Food Chem.48, 2040-2043(2000)、Rowan, et al., J.Agric.Food Chem.49, 2780-2787(2001))。今日まで、α−ファルネセンとやけの因果関係はまだ明らかでない(Ju and Curry, J.Am.Soc.Hortic.Sci.125, 626-629(2000)、Rupasinghe, et al., J.Am.Soc.Hortic.Sci.125, 111-119(2000))。エチレン産生とα−ファルネセン生合成も密接に関係すると思われる(Watkins, et al., Acta Hort. 343, 155-160(1993)、Fan, et al., J.Agric.Food Chem. 47, 3063-3068(1999))。最近、エチレンが、メバロン酸経路上で働くこと、特にヒドロキシメチルグルタリルＣｏＡのメバロン酸への転換を誘導することにより、果実が成熟する間のα−ファルネセン生合成を制御することができることが示されている(Ju and Curry, J.Am.Soc.Hortic.Sci.125, 105-110(2000)、Ju and Curry, Postharvest Biol.Technol. 19, 9-16(2000)、Ju and Curry, J.Am.Soc.Hortic.Sci. 126, 491-495(2001))。
【０００８】
本発明の目的は、α−ファルネセンをin vitroで合成する方法、ならびに／あるいは植物内でのα−ファルネセン合成酵素活性レベルが変わるようにかつ／または有用な選択が公衆に提供されるように植物を遺伝子改変する方法を提供することである。
【０００９】
(発明の概要)
本発明の第１の態様では、α−ファルネセン合成酵素をコードする単離ポリヌクレオチドを提供する。好ましい実施形態では、このポリヌクレオチドは、ＤＤＸＸＤおよび(Ｌ，Ｖ)(Ｖ,Ｌ,Ａ)(Ｎ,Ｄ)(Ｌ,Ｉ,Ｖ)Ｘ(Ｓ,Ｔ)ＸＸＸＥの反復のうち少なくとも１つを含むポリペプチドをコードする。ここでＸは任意のアミノ酸である。
【００１０】
さらなる態様では、本発明は、配列番号：１の単離ポリヌクレオチド(図３に示す）、あるいはα−ファルネセン合成酵素活性を有するポリペプチドをコードするその断片または変異体をも提供する。
【００１１】
さらなる態様では、本発明は、配列番号：２のポリペプチド(図４に示す)をコードする、またはα−ファルネセン合成酵素活性を有するその配列の変異体または断片をコードする単離ポリヌクレオチドを提供する。
【００１２】
さらなる態様では、本発明は単離α−ファルネセン合成酵素ポリペプチドを提供する。
【００１３】
またさらなる態様では、本発明は、配列番号：２の配列を有する単離α−ファルネセン合成酵素、あるいはα−ファルネセン合成酵素活性を有するその断片または変異体を提供する。
【００１４】
本発明のポリペプチドは、α−ファルネセンのin vitroでの調製に有用である。
【００１５】
さらなる態様では、本発明は、本発明のポリヌクレオチドを含む遺伝子構築物を提供する。
【００１６】
またさらなる態様では、本発明は、５'から３'の方向で本発明のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドのオープンリーディングフレームを含む遺伝子構築物を提供する。
【００１７】
好ましくは、この遺伝子構築物はプロモーター配列をも含む。
【００１８】
好ましくは、この遺伝子構築物はさらに終結配列を含む。
【００１９】
他の態様では、本発明は、５'から３'の方向で、本発明のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドとハイブリダイズするポリヌクレオチドを含む遺伝子構築物を提供する。
【００２０】
好ましくは、この遺伝子構築物はプロモーター配列をも含む。
【００２１】
好ましくは、この遺伝子構築物はさらに終結配列を含む。
【００２２】
さらなる態様では、本発明は、本発明の遺伝子構築物を含むベクターを提供する。
【００２３】
さらなる態様では、本発明は、本発明の遺伝子構築物を含む宿主細胞を提供する。
【００２４】
またさらなる態様では、本発明は、本発明の遺伝子構築物を含むトランスジェニック植物細胞を提供する。
【００２５】
さらに本発明は、このような細胞を含むトランスジェニック植物を提供する。
【００２６】
他の態様では、本発明は、α−ファルネセンを調製する方法を提供する。この方法は、
（ａ）高いα−ファルネセン合成酵素活性をもたらすように本発明のポリヌクレオチドで遺伝子改変された細胞を培養するステップと、
（ｂ）必要な場合にこの細胞にファルネシルジリン酸を提供するステップと、
（ｃ）産生したα−ファルネセンを分離するステップとを含む。
【００２７】
本発明のこの方法は、この産物を調製する簡便な方法に生発酵を使用することを可能にする。
【００２８】
さらなる態様では、本発明は、α−ファルネセンを調製する方法を提供する。この方法は、
（ａ）本発明のポリペプチドを得るステップと、
（ｂ）このポリペプチドの存在下でファルネシルジリン酸をインキュベートするステップと、
（ｃ）産生したα−ファルネセンを分離するステップとを含む。
【００２９】
さらなる態様では、本発明は、植物のα−ファルネセン産生を調節する方法を含む。この方法は、α−ファルネセン合成酵素をコードする遺伝子の発現を変化させる遺伝子改変によって達成される、α−ファルネセン合成酵素の発現を増加させるまたは低下させるステップを含む。この改変細胞およびこのような細胞を含む植物も、本発明の一部となる。
【００３０】
本発明のさらなる態様では、配列番号：１に由来する少なくとも１５個の連続したヌクレオチドを含むポリヌクレオチドが提供される。
【００３１】
さらなる態様では、本発明は、α−ファルネセンの含有量が変化した植物を選択する方法を含む。この方法は、
（ａ）α−ファルネセン合成酵素の発現を評価するため、少なくとも１つの植物に由来するポリヌクレオチドを、請求項１に記載のポリヌクレオチドのうち少なくとも１５個の連続したヌクレオチドを含む、少なくとも１つのポリヌクレオチドと接触させるステップと、
（ｂ）発現量の変化を示す植物を選択するステップを含む。
【００３２】
(図面の簡単な説明)
本発明は、以下に添付した図面を参照すると、よりよく理解されるであろう。
【００３３】
図１は、α−ファルネセンの異性体の構造を示す。
【００３４】
図２は、リンゴにおけるα−ファルネセン合成経路を示す。
【００３５】
図３は、α−ファルネセン合成酵素をコードするｃＤＮＡ配列を示す。この配列は、満開から１５０日後(ＤＡＦＢ)のロイヤルガラ(Royal Gala)のリンゴ皮から構築されたｃＤＮＡライブラリーから得られた。
【００３６】
図４は、リンゴ皮由来のα−ファルネセン合成酵素の予測されたアミノ酸配列を示す。触媒反応に必要な金属イオンの結合に関与するＤＤＸＸＤモチーフを太字で示す。高度に保存されたコンセンサス配列(Ｌ,Ｖ)(Ｖ,Ｌ,Ａ)(Ｎ,Ｄ)Ｄ(Ｌ,Ｉ,Ｖ)Ｘ(Ｓ,Ｔ)ＸＸＸＥも金属イオン結合に関与するが、これを下線で示す。
【００３７】
図５は、リンゴロイヤルガラ上のヘッドスペースのＧＣ−ＭＳスペクトルを示す。この図では、保持時間４２．５７分における(Ｅ,Ｅ)α−ファルネセンのピークが示されている。
【００３８】
図６は、α−ファルネセン合成酵素ｃＤＮＡを含む、(結合バッファー中の)ニッケルで精製された無細胞抽出物上のヘッドスペースのＧＣ−ＭＳスペクトルを示す。この図では、(Ｅ,Ｅ)α−ファルネセン(保持時間４３．０９分)および(Ｚ,Ｅ)α−ファルネセン(保持時間４２．２９分)が示されている。
【００３９】
図７は、混合異性体の前駆体ＦＤＰの供給に反応して、精製組換えα−ファルネセン合成酵素によってin vitroで産生されるα−ファルネセンの各種異性体形を示す。
【００４０】
図８は、Ｓｅｐｈａｃｒｙｌ Ｓ−３００ ＨＲゲルろ過クロマトグラフィー上でのα−ファルネセン合成酵素のタンパク溶出プロフィル、およびそのおよその分子量を示す。
【００４１】
図９は、Ｓ−Ｓｅｐｈａｃｒｙｌ ３００ ＨＲゲルろ過の適用後における精製タンパク分画のα−ファルネセン合成酵素活性を示す。
【００４２】
図１０は、α−ファルネセン合成酵素活性の最適ｐＨを示す。データは、１実験につき３回の反復実験に基づく平均値＋平均値のＳＥである。アッセイ条件は、ｐＨ７．５での飽和Ｍｇ++／Ｍｎ++(７ｍＭ/１５０μＭ)を含む。
【００４３】
図１１は、飽和金属イオンの存在下で、ＦＤＰ濃度を増加させた場合のα−ファルネセン合成酵素活性に対する効果を示す。アッセイ条件は、飽和ＦＤＰ(２５μＭ)および飽和Ｍｇ++／Ｍｎ++(７ｍＭ/１５０μＭ)を含む。
【００４４】
図１２は、飽和ＦＤＰ(２５μＭ)を含む条件でのα−ファルネセン合成酵素活性に対するＭｇ2+の効果を示す。
【００４５】
図１３は、飽和ＦＤＰ(２５μＭ)を含む条件でのα−ファルネセン合成酵素活性に対するＭｎ2+の効果を示す。データは１実験につき３回の反復実験の平均値およびＳＥである。
【００４６】
図１４は、飽和ＦＤＰ(２５μＭ)および金属補助因子Ｍｇ++／Ｍｎ++(７ｍＭ/１５０μＭ)を含む条件で測定された、様々な温度でのα−ファルネセン合成酵素活性を示す。
【００４７】
図１５は、ＦＤＰを浸透させた場合および浸透させない場合のＮ.benthamiana葉におけるＥ,Ｅα−ファルネセン産生を示す一実験の例を示す。
【００４８】
図１６は、α−ファルネセン合成酵素ｃＤＮＡ配列の５'末端から設計したプライマーを用いた、トランスジェニックArabidopsis thaliana植物から抽出されたゲノムＤＮＡのＰＣＲ増幅を示す。予想される増幅産物のサイズは５１３ｂｐである。ＭＷと示したレーンは標準的な分子量マーカー(Invitrogen)を表す。１、２、３および４と示したレーンは、α−ファルネセン合成酵素ｃＤＮＡ挿入物を含む、独立したトランスジェニックArabidopsis thaliana系統のレーンである。リンゴと示したレーンは、「ロイヤルガラ」リンゴ皮から抽出された全ＲＮＡのＲＴ−ＰＣＲから得られた増幅産物を示す。
【００４９】
図１７は、プライマー５７４００＿Ａ３(５'AGAGTTCACTTGCAAGCTGA３'(配列番号：３))および５７４００ＮＲ１(５'GGATGCTTCCCT３'(配列番号：４))を用いてＥＳＴ５７４００から増幅した８１０塩基対の32Ｐ標識ＰＣＲ断片をプローブとして用いた、トランスジェニックシロイヌナズナ植物から抽出されたゲノムＤＮＡのＢａｍＨ１消化物のサザン分析を示す。α−ファルネセン合成酵素ｃＤＮＡを含むそのＢａｍＨ１制限断片のサイズは２０５０塩基対である。ＭＷと示したレーンは分子量マーカー(Invitrogen)である。ｐＨＥＸは、α−ファルネセン合成酵素ｃＤＮＡ挿入物を含まず形質転換ベクターのみを含むトランスジェニックシロイヌナズナ植物から抽出されたゲノムＤＮＡを指す。１、２、３および４と示したレーンは、α−ファルネセン合成酵素ｃＤＮＡ挿入物を含む、独立したトランスジェニックシロイヌナズナ系統のレーンである。ｋｂ＝キロ塩基。
【００５０】
図１８は、α−ファルネセン合成酵素ｃＤＮＡ配列の５'末端(a)、内部配列(b)、および３'末端の近く(c)から設計したプライマーを用いた、トランスジェニックArabidopsis thaliana系統３の植物の実生、葉および花から抽出された全ＲＮＡのＰＣＲ増幅を示す。予想される増幅産物のサイズは、(a)で５１３ｂｐ、(b)で３４９ｂｐおよび(c)で１８０ｂｐである。ＭＷと示したレーンは分子量マーカー(Invitrogen)である。１と示したレーンは全ＲＮＡのＰＣＲ増幅から得られた産物を含み、２と示したレーンは全ＲＮＡのＲＴ−ＰＣＲ増幅から得られた産物を含む。ｂｐ＝塩基対。
【００５１】
図１９は、α−ファルネセン合成酵素遺伝子を発現している系統３の植物由来の、および空のベクターを発現している対照植物由来の、Ａ.thalianaの花中に存在するヘッドスペースの揮発性物質を示す。
【００５２】
図２０は、プライマー５７４００ＮＦ１(５'GCACATTAGAGAACCACCAT３'(配列番号：５))および５７４００ＮＲ１(５'GGATGCTTCCCT３'(配列番号：４))を用いてＥＳＴ５７４００から増幅した３５０塩基対のＤＩＧ標識ＰＣＲ断片をプローブとして用いた、Malus domesticaの様々な組織から抽出した全ＲＮＡのノーザン分析を示す。ＤＡＦＢ＝満開後の日数。
【００５３】
Ａ．各組織から抽出した全ＲＮＡ中に存在したα−ファルネセン合成酵素ｍＲＮＡレベルのヒストグラム
Ｂ．１５０ＤＡＦＢの「ロイヤルガラ」の果皮または「アオテア(Aotea)」の成長中の葉中より低いレベルでα−ファルネセン合成酵素を発現している組織から抽出した全ＲＮＡ中に存在したα−ファルネセン合成酵素ｍＲＮＡレベルのヒストグラム
Ｃ．ｉ α−ファルネセン合成酵素ｍＲＮＡのノーザン分析
ii 18ＳリボソームＲＮＡのハイブリダイゼーション。
【００５４】
図２１は、既知の機能を有するテルペン合成酵素の系統発生分析を示し、α−ファルネセン合成酵素が独特のクレードを形成することを示す。
【００５５】
（詳細な説明）
本発明の一実施形態では、α−ファルネセン合成酵素活性を示すように遺伝子改変した細胞を、α−ファルネセン産生に使用する。細胞は潜在的に、培養で増殖させることができるどんな細胞型でもよいが、現在ではα−ファルネセン(ならびにその酸化産物または誘導体)産生に細菌または酵母細胞を使用することが好ましい。本実施形態の生発酵プロセスにおける使用に好ましい細胞は、ＧＲＡＳ認定細胞であり、例えば、適当なＥ.ｃｏｌｉ株、Lactobacillus属、およびビール酵母など他の非病原性のＧＲＡＳ認定細菌または酵母である。
【００５６】
生発酵によって産生されるα−ファルネセン(またはα−ファルネセンの誘導体)は、フェロモンとして昆虫またはげっ歯類の駆除に使用することもでき、食物、薬剤、練り歯磨きまたは香水に対する香りまたは芳香の添加物として使用することもでき、抗癌性、抗カンジダ性、粘膜安定化性、抗炎症性、抗潰瘍性を有する薬剤の製造に使用することもでき、包装、成型物品、特に分解性プラスチック、一般の農芸化学製品の生産、業務用洗浄のための溶媒(例えば殺藻剤)の生産、ならびに溶媒または油を脱蝋するための膜に使用するフィルムおよびポリマーの製造に使用することもできる。
【００５７】
生発酵によるα−ファルネセン産生の代替方法では、α−ファルネセン合成酵素を抽出し、任意選択で固定化し、α−ファルネセン産生に使用することができる。例えば、上記の培養細胞をα−ファルネセン合成酵素の供給源として使用することができる。この酵素は、例えば、ビーズ、例えばアルギン酸ビーズ上に固定化することができる。
【００５８】
本発明の他の態様では、本発明のポリヌクレオチドを使用して、その植物の少なくとも一部でα−ファルネセン合成酵素を過剰発現するトランスジェニック植物を調製することができる。このように、本発明を用いて、花に芳香を付与し、(指標植物、宿主植物、または代替宿主として)昆虫を追い払いまたは引き寄せ、あるいは改変した香りを果実または野菜に付与し、あるいは果実のやけを予防し、あるいは薬剤産物を抽出し、あるいは動物または昆虫に効果がある抽出物を抽出する。
【００５９】
特定の一態様では、本発明のポリヌクレオチドを、バラ目(order Rosaceae)の植物に、特にMalus属に使用して、果実の風味を増加させる。
【００６０】
他の態様では、本発明のポリヌクレオチドを使用して、リンゴ果実中のα−ファルネセン合成酵素活性を低下させる。これはいくつかの方法で達成することができ、例えば、α−ファルネセン合成酵素ポリヌクレオチドがアンチセンスの位置から転写され、それによってα−ファルネセン合成酵素の翻訳が低下するように、リンゴを遺伝子改変することによって達成することができる。この場合このような果実は、冷蔵後におけるリンゴ皮表面のやけの低下を示す可能性もあり、コドリンガなどの昆虫を引き寄せることが少なくなる可能性もある。
【００６１】
他の態様では、本発明は、リンゴ育種に有用な方法を提供する。本発明のポリヌクレオチド配列の断片をプローブまたはプライマーとして使用して、候補となるリンゴの品種の遺伝子の性質をα−ファルネセン合成酵素活性に関して調べることができる。リンゴ果実中にα−ファルネセン合成酵素活性をコードする高レベルのポリヌクレオチドが存在することを利用して、香りが付加されたリンゴを同定することができ、低レベルのポリヌクレオチドが存在することを使用して、貯蔵に好都合な特性または昆虫抵抗性を有するリンゴを同定することができる。
【００６２】
リンゴの１つのポリペプチドであるα−ファルネセン合成酵素のアミノ酸配列、およびそれをコードするポリヌクレオチド配列のアミノ酸配列を図４および図３にそれぞれ示す(配列番号：２および配列番号：１)。しかし、本発明が、図３および４に示す特定のヌクレオチド／アミノ酸配列を有するポリヌクレオチド／ポリペプチドだけに限定されないことは理解されるであろう。そうではなく、本発明は、α−ファルネセン合成酵素活性をコードするまたは有する図３および４のポリヌクレオチド／ポリペプチドの変異体にも及ぶ。
【００６３】
本明細書において「ポリヌクレオチド(群)」という用語は、デオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチド塩基の一本鎖または二本鎖ポリマーを意味し、センス鎖とアンチセンス鎖両方のｈｎＲＮＡおよびｍＲＮＡ分子を含めた、ＤＮＡおよびその対応するＲＮＡ分子を含み、またｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡおよび組換えＤＮＡ、ならびに全体的にまたは部分的に合成されたポリヌクレオチドを含む。ｈｎＲＮＡ分子はイントロンを含み、ＤＮＡ分子に通常１対１で対応する。ｍＲＮＡ分子はイントロンが切り出されたｈｎＲＮＡおよびＤＮＡ分子に対応する。ポリヌクレオチドは遺伝子全体からなるものでもよく、その任意の一部からなるものでもよい。使用可能なアンチセンスポリヌクレオチドは、その対応するポリヌクレオチドの一断片を含むものでもよく、したがって「ポリヌクレオチド」の定義は、すべてのそのような使用可能なアンチセンス断片を含む。
【００６４】
本明細書において「ポリペプチド(群)」という用語は、ペプチド、ポリペプチドおよびタンパクを含む。
【００６５】
「α−ファルネセン合成酵素活性を有する変異体」という語句は、十分同等の機能性を保持しながらポリペプチド／ポリヌクレオチドのアミノ酸／ヌクレオチド配列が変異することが可能であることを認識した上で使用する。この同等物は、例えば、ポリペプチドの断片、ポリペプチドと他のポリペプチドまたは担体との融合物、あるいは断片と追加のアミノ酸との融合物であってもよい。
【００６６】
「単離」ポリペプチドとは、同定され、分離または回収されてその自然環境の成分が大部分なくなった(したがって、ポリペプチドが、その自然環境由来のポリペプチドを少なくとも５０％含み、好ましくは少なくとも８０％を含み、さらに好ましくは少なくとも９０％を含むようになった)ポリペプチドである。「単離」ポリペプチドの用語は、組換え細胞内にあるin situのポリペプチドを含む。しかし、一般に単離ポリペプチドは、少なくとも１つの精製ステップによって調製される。
【００６７】
「単離」ポリヌクレオチドとは、通常それが結合している少なくとも１つの不純なポリヌクレオチドから同定され分離されたヌクレオチド分子である。
【００６８】
変異体ポリヌクレオチド配列は、サイズ、組成、イントロンの位置および数、ならびに翻訳されない末端領域のサイズおよび組成が異なる同等の配列も含む。変異体ポリヌクレオチドは、機能的に同等のポリペプチドをコードするものも含む。
【００６９】
このポリペプチドの活性を担う構造を保存しながら、様々なアミノ酸の置換が可能であることが理解されるであろう。この保存的な置換は、特許文献に、例えば米国特許第5264558号または第5487983号に記載されている。したがって、例えば非極性脂肪族中性アミノ酸であるグリシン、アラニン、プロリン、バリンおよびイソロイシンの間の交換が可能であるはずであることが予想される。同様に、極性脂肪族中性アミノ酸であるセリン、トレオニン、メチオニン、アスパラギンおよびグルタミンの間の置換を行うこともできるはずである。帯電した酸性アミノ酸であるアスパラギン酸とグルタミン酸の間の置換もおそらく行うことができるはずであり、帯電した塩基性アミノ酸であるリシンとアルギニンの間の置換も同様である。フェニルアラニン、ヒスチジン、トリプトファンおよびチロシンを含めた芳香族アミノ酸間の置換も可能である。このような置換および交換は、当業者なら周知である。
【００７０】
それと同様に、単に核酸コードに縮重があるために、特定の産物をコードするヌクレオチド配列がかなり変わることがあり得る。
【００７１】
公的に利用できるコンピュータアルゴリズムを用いて、ポリヌクレオチドまたはポリペプチド配列をアラインし、特定領域における、他の配列と同一のヌクレオチドの百分率を決定することができる。ポリヌクレオチド配列をアラインしてその類似性を同定するための代表的な２つのアルゴリズムは、ＢＬＡＳＴＮおよびＦＡＳＴＡアルゴリズムである。ポリペプチド配列の類似性は、ＢＬＡＳＴＰアルゴリズムを用いて調べることができる。ＢＬＡＳＴＮおよびＢＬＡＳＴＰソフトウェアは、ＮＣＢＩの匿名ＦＴＰサーバー(ftp：//ncbi.nlm.nih.gov)の/blast/executables/で利用可能である。ＢＬＡＳＴＮアルゴリズム第２.０．４版[１９９８年２月２４日]を、本発明の変異体のドキュメンテーションに記載のデフォルトパラメータに合わせて設定した。ＢＬＡＳＴＮおよびＢＬＡＳＴＰを含めたＢＬＡＳＴファミリーのアルゴリズムの使用法は、URL http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/newblast.HtmlにあるＮＣＢＩのウェブサイト、および刊行物Altschul et al.， Nucleic Acids Res. 25, 3389-34023(1997)に記載されている。コンピュータアルゴリズムＦＡＳＴＡは、インターネット上のftpサイトftp：//ftp.Virginia.edu/pub/fasta/で利用可能である。そのドキュメンテーション中に記載され、そのアルゴリズムで分配されたデフォルトパラメータに合わせて設定した第２．０ｕ４版(1996年２月)を、本発明による変異体の決定に使用することも好ましい。ＦＡＳＴＡアルゴリズムの使用法は、Pearson and Lipman Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85, 2444-2448(1998), Pearson Methods in Enzymology 183, 63-98(1990)に記載されている。
【００７２】
以下の実行パラメータは、ＢＬＡＳＴＮを用いて(以下で論ずる)Ｅ値およびパーセント同一性を求めることに寄与するアラインメントおよび類似性を決定するのに好ましい。Ｕｎｉｘ実行コマンドは、blastall -p blastn -d embldb -e 10 -G 1 -E 1 -r 2 -v 50 -b 50 -I queryseq -o resultsであり、パラメータのデフォルト値は以下の通りである。
−ｐ プログラム名[文字列]
−ｄ データベース[文字列]
−ｅ 期待値(Ｅ)[実数]
−Ｇ ギャップを開始するコスト(０はデフォルト挙動を呼び出す)[整数]
−Ｅ キャップを伸張させるコスト(０はデフォルト挙動を呼び出す)[整数]
−ｒ ヌクレオチドがマッチする場合の報酬(blastnのみ)[整数]
−ｖ １行記載の数(ｖ)[整数]
−ｂ 示すべきアラインメントの数(b)[整数]
−ｉ 照会ファイル[ファイル入力]
−ｏ ＢＬＡＳＴ報告出力ファイル[ファイル出力]任意
ＢＬＡＳＴＰには以下の実行パラメータが好ましい。Blastall -p blastp -d swissprotdb -e 10 -G 1 -E 1 -v 50 -b 50 -I queryseq -o results
−ｐ プログラム名[文字列］
−ｄ データベース[文字列］
−ｅ 期待値(Ｅ)[実数］
−Ｇ ギャップを開始するコスト(０はデフォルト挙動を呼び出す)[整数]
−Ｅ キャップを伸張させるコスト(０はデフォルト挙動を呼び出す)[整数]
−ｖ １行記載の数(ｖ)[整数]
−ｂ 示すべきアラインメントの数(ｂ)[整数]
−ｉ 照会ファイル[ファイル入力]
−ｏ ＢＬＡＳＴ報告出力ファイル[ファイル出力］任意
ＢＬＡＳＴＮ、ＢＬＡＳＴＰ、ＦＡＳＴＡ、またはこれらに類似するアルゴリズムによって生じた、照会配列による１つまたは複数のデータベース配列との「ヒット」により、配列の類似部分がアラインされ同定される。このヒットは、類似性の程度、および配列の重複の長さの順に並べられる。データベース配列とのヒットは一般に、照会配列の配列長の一部分だけの重複しか表さない。
【００７３】
ＢＬＡＳＴＮおよびＦＡＳＴＡアルゴリズムによって、アラインメントの「期待」値またはＥ値も生じる。Ｅ値は、特定のサイズのデータベースを検索するとき、特定の数の連続配列を偶然に認めることが「期待」できるヒット数を示す。期待値は、好ましいＥＭＢＬデータベースなどのデータベースとのヒットが真の類似性を示しているかどうかを決定するための有意性の閾値として使用する。例えば、１つのヒットにＥ値０．１とすると、ＥＭＢＬデータベースのサイズのデータベース中で、ただ偶然に、類似スコアで配列のアラインした部分に０．１のマッチする部分を認めることを期待することができるという意味に解釈される。この基準では、配列のアラインしマッチした部分が同一である確率は９０％である。アラインしマッチした部分のＥ値が０．０１以下の配列では、ＢＬＡＳＴＮまたはＦＡＳＴＡアルゴリズムを用いて、ＥＭＢＬデータベース中でマッチを偶然に認める確率は１％以下である。
【００７４】
一実施形態によれば、「変異体」ポリヌクレオチドは、本発明の各ポリヌクレオチドに関して、好ましくは本発明の各ポリヌクレオチドと同数またはそれより少ない数の核酸を有し、本発明のポリヌクレオチドと比較したときＥ値が０．０１以下となる配列を含む。すなわち、変異体ポリヌクレオチドは、上記で論じたパラメータで設定したＢＬＡＳＴＮまたはＦＡＳＴＡアルゴリズムを用いてＥ値が０．０１以下であると測定され、少なくとも９９％の確率で本発明のポリヌクレオチドと同一である任意の配列である。
【００７５】
変異体ポリヌクレオチド配列は一般に、厳格な条件下で上記のポリヌクレオチド配列とハイブリダイズする。本明細書において、「厳格な条件」とは、６Ｘ ＳＳＣ、０．２％ＳＤＳ溶液中で前洗浄し、６５℃、６Ｘ ＳＳＣ、０．２％ＳＤＳで１晩ハイブリダイズさせた後、各回１Ｘ ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ中、６５℃、３０分間で２回洗浄し、各回０．２Ｘ ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ中、６５℃、３０分間で２回洗浄することを指す。本発明の変異体ポリヌクレオチド配列は、長さが少なくとも５０ヌクレオチドである。
【００７６】
変異体ポリヌクレオチドは、本明細書の配列リストに挙げたヌクレオチド配列との配列同一性が少なくとも２５％または少なくとも６０％、一般に７０％、好ましくは８０％、より好ましくは９０％、さらに好ましくは９５％、非常に好ましくは９８％、最も好ましくは９９％以上である配列も含む。
【００７７】
一般に、本発明のα−ファルネセン合成酵素をコードするポリペプチド配列は、開示されたアミノ酸配列と少なくとも２５％または少なくとも５０％、一般に少なくとも６０％、好ましくは７０％、さらに８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、最も好ましくは９９％以上相同性がある。すなわち、配列類似性は２５％から９９％以上の範囲でもよい。さらに本発明は、これらのアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチド配列を含む。
【００７８】
本発明のポリヌクレオチドおよびポリペプチド配列の断片も本発明に包含されている。ポリヌクレオチド断片は、天然タンパクの生物活性を保持するタンパク断片をコードするものでもよい。あるいは、ハイブリダイゼーションプローブとして使用する断片は一般に、生物活性を示す配列をコードするものではない。ポリヌクレオチド断片は、少なくとも１５、２０、３０、５０、１００、２００、４００、または１０００の連続したヌクレオチドから、本明細書で開示された天然ポリヌクレオチド配列の完全長までの範囲でもよい。
【００７９】
本発明のポリペプチド断片は、少なくとも５、１０、１５、３０、５０、７５、１００、１５０、２００、４００、または５００の連続したアミノ酸、または最大で本発明の完全長ポリペプチド中のアミノ酸の合計数を含む。
【００８０】
変異体はまた、同種または他の種由来の(テルペン合成酵素を含めた)遺伝子に由来する(コード領域、非コード領域またはイントロン領域由来の)１つまたは複数のヌクレオチドまたはドメイン／モチーフの再構成、移動または交換を可能とするものであり、ただしこのような変異体は、機能的に同等な本発明のタンパクまたはポリペプチドあるいはその断片を依然として供給するものとする。
【００８１】
もちろん、図４(配列番号：２)の配列を有する、ここに具体的に記載したα−ファルネセン合成酵素との相同体が他の植物に存在することが明らかに企図される。本明細書において「変異体」の語句を使用するとき、このような相同体も含まれる。
【００８２】
本発明のポリヌクレオチド配列は、融合タンパクをコードするように１つまたは複数の追加ポリペプチドあるいはその断片をコードする１つまたは複数の追加配列をさらに含んでもよい。このような組換え発現系には、それだけに限らないが、哺乳動物、細菌および昆虫の発現系が含まれる。無細胞発現系も企図される。
【００８３】
図３(配列番号：１)のα−ファルネセン合成酵素の相同体である、Malus domestica以外の植物由来のＤＮＡ配列を、(例えば私的なまたは公的な配列データベースのコンピュータ支援による検索によって)同定することができる。あるいは、図４の配列に基づくプローブを合成し、それを使用して、ハイブリダイゼーション法を用いて他の植物に由来するｃＤＮＡまたはゲノムＤＮＡライブラリー中の陽性クローンを同定することもできる。逆転写酵素(ＲＴ)−ＰＣＲを含めた、ＰＣＲに基づく技術も使用することができる。プローブおよび／またはＰＣＲプライマーは、長さが少なくとも約１０、好ましくは少なくとも約１５、最も好ましくは約２０ヌクレオチドである。このようなオリゴヌクレオチドプローブの使用に適したハイブリダイゼーション技術またはＰＣＲ技術は、当技術分野において周知である。陽性ライブラリークローンまたはＰＣＲ産物を、制限酵素消化またはＤＮＡシークエンシングなどによって分析することができる。
【００８４】
本発明のポリヌクレオチドは、当技術分野で周知の技術を用いる合成手段によって生成することができる。自動化されたオリゴヌクレオチド合成の設備は、Perkin Elmer/Applied Biosystems Division(米国カリフォルニア州、Foster City)などの製造業者から市販されており、製造業者の説明書に従って操作することができる。
【００８５】
Malus domestica中での対立遺伝子変異が観察されている。品種アオテアのα−ファルネセン合成酵素ポリペプチドは、配列番号：２のものと部分配列で５アミノ酸異なっている。アオテアにおけるα−ファルネセン合成酵素遺伝子の部分ポリヌクレオチド配列およびその対応するポリペプチドは、それぞれ配列番号：６および配列番号：７の配列である。
【００８６】
【表１】
【００８７】
本発明のポリペプチドおよびポリヌクレオチドが同定された結果、植物内でα−ファルネセン活性を調節することができる。調節は、このポリペプチドの発現および／または活性の低下(すなわちサイレンシング)に関係するものであり得る。
【００８８】
このようなサイレンシングを実施するためのどんな従来技術をも使用することができる。処置は、転写後または転写前に行うことができる。さらに、処置は、その遺伝子自体、またはその遺伝子に関係し、そのコードされたポリペプチドの発現に影響を与える制御エレメントに焦点を合わせたものとすることができる。「制御エレメント」は、本明細書においてできるだけ広い意味で用いられ、対象遺伝子と相互作用する他の遺伝子を含む。
【００８９】
転写前の処置は、その遺伝子自体のまたはその制御エレメントの突然変異に関係するものとすることができる。このような突然変異は、点突然変異、フレームシフト突然変異、挿入突然変異または欠失突然変異である可能性がある。いわゆる「ノックアウト」突然変異では、その遺伝子の発現を完全になくすことができる。あるいは、トランスポゾンタギングを使用することもできる。他の手法は、自然に存在するおよび／または人工の転写因子、例えばα−ファルネセン合成酵素遺伝子の内在プロモーターと相互作用するように設計された人工ジンクフィンガータンパク転写因子(例えばhttp：//www.sangamo.com/tech/tech.htmlを参照)の発現によって転写を改変することである。
【００９０】
転写後の処置の例としては、同時抑制またはアンチセンス戦略、ドミナントネガティブ手法、あるいは標的遺伝子の転写後にＲＮＡを消化する、またはその他の方法でＲＮＡにとって致死性となるリボザイムを使用する技術が含まれる。
【００９１】
同時抑制は、例えば、Napoli et al. Plant Cell 2, 279-290(1990)およびde Carvalho Niebel et al. Plant Cell 7, 347-358(1995)で論じられているものと同様に実施することができる。場合によっては、これは、構成的なプロモーターの使用による、対象遺伝子の過剰発現を使用することができる。これはまた、遺伝子由来のイントロン、５'または３'側の非翻訳領域(ＵＴＲ)など遺伝子の非コード領域を用いた植物の形質転換を使用することもできる。
【００９２】
アンチセンス戦略は、標的遺伝子から転写されたｍＲＮＡの翻訳に干渉することができる発現／転写産物の発現または転写を含む。これは通常、標的ｍＲＮＡとハイブリダイズし二重鎖を形成する発現／転写産物によって行われる。
【００９３】
この発現／転写産物は、比較的小さな分子であるが、依然としてｍＲＮＡの翻訳を妨害することができるものでよい。しかし、同様の結果は、アンチセンスの位置にある遺伝子の転写によって生じるＲＮＡが内在性の標的ｍＲＮＡのすべてまたは一部と相補的であるように、アンチセンスの向きにポリヌクレオチド全体を発現させることによって達成される。
【００９４】
アンチセンス戦略は一般に、Robinson-Benion et al. Methods in Enzymol 254, 363-375(1995)およびKawasaki et al., Artific.Organs 20, 836-845(1996)に記載されている。
【００９５】
遺伝子サイレンシング用に設計された遺伝子構築物は逆位反復を含んでもよい。「逆位反復」とは、反復の後半が相補鎖中にある反復配列であり、例えば以下の通りである。
５'−ＧＡＴＣＴＡ．．．．．．．．．ＴＡＧＡＴＣ−３'
３'−ＣＴＡＧＡＴ．．．．．．．．．ＡＴＣＴＡＧ−５'
形成された転写物は、相補的塩基対形成を経て、反復領域間に少なくとも３〜５ｂｐのスペーサーが存在するという条件でヘアピン構造を形成することができる。
【００９６】
他の手法は、転写物を標的とする、ｍｉＲＮＡ(Llave et al., Science 297, 2053-2056(2002))と同等の小さなアンチセンスＲＮＡを開発することであり、これを標的遺伝子サイレンシングに使用することができる。
【００９７】
ポリペプチド発現を制御するためのリボザイムによる手法は、リボザイム構築物(McIntyre Transgenic Res.5 257-262(1996))内に適当な配列またはサブ配列（例えばＤＮＡまたはＲＮＡ）を挿入する。リボザイムは、２つの領域に相補的なハイブリダイズ領域を含む合成ＲＮＡ分子であり、その２つの領域のそれぞれは、本発明のポリヌクレオチドの１つによってコードされたｍＲＮＡ分子の少なくとも５つの連続したヌクレオチドを含む。リボザイムは、極めて特異的なエンドヌクレアーゼ活性を有し、ｍＲＮＡを自己触媒的に切断する。
【００９８】
ダイサー技術(Stratagene)の使用も企図される。
【００９９】
あるいは、調節は、宿主ゲノム中で、対応するポリヌクレオチドを過剰発現させることによる、または対応するポリヌクレオチドのコピー数を増加させることによるポリペプチドの発現および／または活性の増大に関係するものでもあり得る。
【０１００】
遺伝子サイレンシングの保持で論じたように、過剰発現の手法は、その遺伝子自体、またはその遺伝子に関係し、そのコードされたポリペプチドの発現に影響を与える制御エレメントに焦点を合わせたものとすることができる。「制御エレメント」は、本明細書においてできるだけ広い意味で用いられ、対象遺伝子と相互作用する他の遺伝子を含む。他の手法は、自然に存在する転写因子、および／または人工の転写因子、例えばα−ファルネセン合成酵素遺伝子の内在プロモーターと相互作用するように設計された人工ジンクフィンガータンパク転写因子(例えばhttp：//www.sangamo.com/tech/tech.htmlを参照)の発現によって転写を改変することである。
【０１０１】
「遺伝子構築物」という用語は、それだけに限らないが、ｃＤＮＡ分子など他のポリヌクレオチド分子(挿入ポリヌクレオチド分子）をその中に挿入することができるポリヌクレオチド分子、通常二本鎖ＤＮＡを指す。遺伝子構築物は、挿入ポリヌクレオチド分子を転写し、場合によってはその転写物を翻訳してポリペプチドにすることが可能となるのに必要な成分を含むことができる。挿入ポリヌクレオチド分子は、宿主細胞に由来するものでもよく、それと異なる細胞または生物に由来するものでもよく、かつ／または組換えポリヌクレオチドでもよい。宿主細胞の内部に入った後、遺伝子構築物は、宿主染色体ＤＮＡ中に組み込まれることができる。遺伝子構築物は、ベクターへと系統化することができる。
【０１０２】
上記の戦略を実行するため、本発明はまた、遺伝子構築物、通常ＤＮＡ構築物も提供する。このＤＮＡ構築物は、(センスまたはアンチセンスの位置にある本発明の１つまたは複数のコピーのポリヌクレオチド配列、あるいは適切なリボザイムをコードするポリヌクレオチドなど)所期のＤＮＡ、好ましくは、転写すべきＤＮＡ配列と作動的に結合した(遺伝子の発現を制御する)プロモーター配列および終結配列を含む。プロモーター配列は一般に、転写すべきＤＮＡ配列の５'末端側に位置し、ＤＮＡ配列の転写を開始するのに使用する。プロモーター配列は、一般に遺伝子の５'側の非コード領域に認められるが、イントロン中(Luehrsen Mol.Gen.Genet 225, 81-93(1991))に存在することもあり、コード領域中に存在することもある。
【０１０３】
本発明のＤＮＡ構築物中に有用に使用することができる様々なプロモーター配列は、当技術分野で周知である。プロモーター配列は、また終結配列も、プロモーターおよび終結配列が標的宿主中で機能するという条件のもとで、標的植物宿主に内在するものでもよく、外来のものでもよい。例えば、プロモーターおよび終結配列は、他の植物種、植物ウイルス、細菌プラスミドなどに由来するものでもよい。プロモーターおよび終結配列は、α−ファルネセン合成酵素遺伝子と生体内で関係するものが好ましい。
【０１０４】
プロモーターの選択に影響を与える因子として、構築物の所望の組織に対する特異性、ならびに転写および翻訳のタイミングがある。例えば、３５Ｓカリフラワーモザイクウイルス(ＣａＭＶ ３５Ｓ)プロモーターなどの構成的なプロモーターは、植物のすべての部分の転写に影響を及ぼす。組織特異的プロモーターを使用すると、対象組織中だけで所望のセンスまたはアンチセンスＲＮＡが産生される。誘導性プロモーター配列を使用しているＤＮＡ構築物を用いると、化学物質、光、熱、嫌気性ストレス、栄養状態の変化などの外部刺激により、ＲＮＡポリメラーゼの結合および転写開始の速度を調節することができる。一時的に制御されるプロモーターを使用して、形質転換細胞の発生の間の特定の時間にＲＮＡポリメラーゼの結合および転写開始の速度の調節を実施することができる。好ましくは、問題の遺伝子由来の元のプロモーター、または形質転換すべき生物中の特定組織標的遺伝子由来のプロモーターを使用する。本発明において有用に使用することができるプロモーターの他の例として、マンノピン合成酵素(ｍａｓ)、オクトピン合成酵素(ｏｃｓ)およびChua et al. Science 244, 174-181(1989)に総説が記載されているものがある。
【０１０５】
転写すべきＤＮＡ配列の３'側に位置する終結配列は、プロモーター配列と同じ遺伝子に由来するものでもよく、それと異なる遺伝子に由来するものでもよい。Agrobacterium tumefaciensのノパリン合成酵素遺伝子の３'末端など、当技術分野で知られている多くの終結配列は通常、本発明において使用することができる。しかし、好ましい終結配列は、元の遺伝子由来の、または形質転換すべき標的種由来のものである。
【０１０６】
本発明のＤＮＡ構築物はまた、その構築物を含む形質転換細胞の検出を可能にするのに細胞中で有効な選択マーカーを含むことができる。そのようなマーカーは、当技術分野で周知であり、通常、１つまたは複数の毒素に対する耐性を与える。そのようなマーカーの１つの例は、ＮＰＴＩＩ遺伝子であり、その発現により、通常、中程度の濃度で植物細胞に毒性を示す抗生物質であるカナマイシンまたはヒグロマイシンに対する耐性が生じる。あるいは、ＰＣＲ、サザンブロットなど当技術分野で周知の他の技術を用いて、所望の構築物が形質転換細胞中に存在するかどうかを決定することもできる。
【０１０７】
本発明のＤＮＡ構築物の成分を作動的に結合させる技術は、当技術分野で周知であり、１つまたは複数の制限エンドヌクレアーゼ部位を有する合成リンカーの使用を含む。ＤＮＡ構築物は、少なくとも１つの系、例えばＥ.ｃｏｌｉ中で複製することができるベクターと結合させることができ、それによって、各操作後、得られた構築物の配列を決定し、操作が正しいかどうかを決定することができる。
【０１０８】
本発明のＤＮＡ構築物を使用して、農業用、観賞用、および園芸用植物を含めた様々な植物を形質転換することができる。好ましい実施形態では、ＤＮＡ構築物を使用して植物リンゴ、バナナ、キウイフルーツ、トマト、ワタ、バラ、オリーブ、ジャガイモ、カーネーション、ツクバネアサガオ、マンゴー、パパイヤ、トルコキキョウ(lisianthus）、キク、イネ、茶、ホップ、およびランを形質転換する。
【０１０９】
上記で論じたように、本発明のポリヌクレオチド配列を含むオープンリーディングフレームを含み、そのオープンリーディングフレームがセンス方向に向いているＤＮＡ構築物を用いて植物を形質転換すると、場合によっては、同時抑制によりそのポリペプチドの発現低下が生じ得る。アンチセンスの向きの遺伝子のオープンリーディングフレームまたは非コード(非翻訳）領域を含むＤＮＡ構築物を用いて植物を形質転換すると、形質転換植物におけるポリペプチドの発現低下が生じる。
【０１１０】
細菌(例えば、Ｅ.ｃｏｌｉ、Agrobacterium)、真菌、昆虫、および動物細胞など周知の原核細胞および真核細胞を含めて、他の非植物宿主の形質転換が、実現可能であり、予想されることも理解されるであろう。これにより、本発明の組換えポリペプチドまたはその変異体の産生が可能となるはずである。組換えタンパクの産生に無細胞系(例えば、Roche Rapid Translation System)を使用することも予想される(Zubay Annu Rev Genet 7, 267-287(1973)）。
【０１１１】
周知の技術を用いて、そのような任意の宿主中で産生された本発明のポリペプチドをそれから単離し精製することができる。α−ファルネセンの酵素合成のための無細胞系においてこのポリペプチドを使用することができる。
【０１１２】
標的植物のゲノム中にＤＮＡ構築物を安定に組み込む技術は、当技術分野で周知であり、これには、Agrobacterium tumefaciensが媒介する導入、エレクトロポレーション、プロトプラストとの融合、生殖器官中への注入、未熟胚中への注入、高速遺伝子銃による導入(high velocity projectile introduction)、花の浸漬(floral dipping)などがある。技術の選択は形質転換すべき標的植物によって決まる。
【０１１３】
細胞を形質転換した後、上記で論じたカナマイシン耐性マーカーなどのマーカーを用いて、ＤＮＡ構築物がそのゲノム中に組み込まれた細胞を選択することができる。次いで、当技術分野で周知の技術を用いて、トランスジェニック細胞を適切な培地中で培養して、植物全体を再生させることができる。プロトプラストの場合、適切な浸透条件下で細胞壁を再形成させることが可能である。種子または胚の場合、適切な発芽またはカルス誘導培地を使用する。外植片には適切な再生培地を使用する。
【０１１４】
上記した方法に加えて、裸子植物類、被子植物類、単子葉類および双子葉類を含めた、多種多様な植物種中にＤＮＡ構築物を移入する複数の方法が当技術分野で周知である。
【０１１５】
当技術分野で周知の技術を用いて、得られた形質転換植物を有性生殖でまたは無性生殖で再生して、世代が継続するトランスジェニック植物を得ることができる。
【０１１６】
本明細書において提供したヌクレオチド配列の情報は、例えば、他の生物または組織、特に植物由来の核酸変異体を同定し、α−ファルネセン合成酵素またはその同等物中の変異を有し、その変異によってそれを有する植物が有用となるような植物を予め選択するプログラムにおいても有用である。これによって、α−ファルネセンおよびその誘導体の含有量が調節された植物を生成する育種プログラムが促進される。より具体的には、本明細書において提供したヌクレオチド配列情報を用いて、α−ファルネセン合成酵素のプロービングまたは増幅のためのプローブおよびプライマーを設計することができる。プロービングまたはＰＣＲに使用するオリゴヌクレオチドは、長さ約３０ヌクレオチド以下でもよい。一般に、特異的なプライマーは、長さ１４ヌクレオチドより長い。最適な特異性および費用有効性を得るには、長鎖１６〜２４ヌクレオチドのプライマーが好ましい。当業者なら、ＰＣＲなどのプロセスで使用するプライマーの設計について熟知している。
【０１１７】
必要な場合、本明細書で開示された遺伝子の制限断片全体を用いて、プロービングを行うことができる。もちろん、図４に基づいた配列またはその相補体を使用することができる。このようなプローブおよびプライマーも本発明の一態様をなす。
【０１１８】
本発明によって提供された配列情報を用いて、任意の種から本発明のポリヌクレオチドの変異体を発見する方法には、それだけに限らないが、ｃＤＮＡライブラリーのスクリーニング、ＲＴ−ＰＣＲ、ゲノムライブラリーのスクリーニングならびにコンピュータ支援によるＥＳＴ、ｃＤＮＡおよびゲノムデータベースの検索がある。このような方法は当業者に周知である。
【０１１９】
次に、以下の非限定的な実施例に関して、本発明を説明する。
【０１２０】
(実施例)
以下の実施例は、本発明の実施をさらに説明するものである。
【０１２１】
実施例１ α−ファルネセン合成酵素遺伝子の同定
植物材料およびＧＣ−ＭＳ分析：ニュージーランド、ホークスベイにあるホートリサーチ果樹園(A HortResearch orchard at Hawkes Bay, New Zealand)で成長したロイヤルガラの木から、木で熟した１５０ＤＡＦＢのリンゴ(Malus domestica)を収穫した。１２個の果実を分析用に選択し、すりガラスの平らなフランジ継ぎ手付きの５Ｌの広口丸底サンプリング容器に入れた。この容器をガラス蓋で覆い、すりガラス製継手を、ガス線、およびクロモソーブ１０５(Chromosorb 105)１００ｍｇを含む揮発性物質吸着剤カートリッジを含む挿入口で密封した。フラスコ内のヘッドスペースを２５．０ｍｌ/分のＮ2(ｇ)でパージしながら１５分間トラップした後、ヘッドスペースを２３℃で１時間平衡状態にした。分析の前に、３５℃で、１０ｐｓｉのＮ2(ｇ)流量でクロモソーブカートリッジを１５分間乾燥させた。１５０℃で３分間、クロモソーブトラップからガスクロマトグラフ(ＧＣ)ＨＰ５８９０の注入口中へと、熱により揮発性物質を脱着させた。このＧＣシステムは、３０ｍ×内径０．３２ｍｍであり、フィルムの厚さが０．５μｍであるＤＢ−Ｗａｘキャピラリーカラム(Ｊ＆Ｗ Scientific、米国、Folsom)を備えていた。担体ガスは、流速３０ｃｍ/秒のヘリウムであった。ＧＣオーブンを、６分間３０℃の状態を保ち、次いで３℃/分で１０２℃に上昇させた後、５℃/分で１９０℃に上昇させ、この温度を５分間維持するようにプログラムした。カラムの出口を、質量分析計(ＶＧ７０ＳＥ)、さらにＧＣ水素炎イオン化検出器に分岐させた(ＧＣ−ＦＩＤ／ＭＳ)。７０ｅＶ、スキャン範囲３０〜３２０ａｍｕの電子衝撃イオン化(ＥＩ−ＭＳ)モードで質量分析計を操作した。成分の同定に、標準物質の質量スペクトル、ライブラリースペクトル(ＮＩＳＴおよび本発明者ら所有のもの)およびＧＣ保持指標を助けとして用いた。標準物質に対する試料のピーク面積を測定することによって定量データを得た。
【０１２２】
ｍＲＮＡの単離、およびｃＤＮＡライブラリーの構築：１５０ＤＡＦＢのリンゴの皮を皮むき器でむき、ＧｏｍｅｚおよびＧｏｍｅｚの方法(Langenkamper, et al., Plant Mol.Biol.36, 857-869(1998))に手を加えた方法により、むいた皮から全ＲＮＡを抽出した。オリゴ(ｄＴ)セルロースクロマトグラフィー(Pharmacia)によって全ＲＮＡから精製したｍＲＮＡを用いて、λＺＡＰ−ＣＭＶ(Stratagene)ｃＤＮＡライブラリーを、製造者の説明書に従って構築した。ｃＤＮＡを含むｐＢＫ−ＣＭＶプラスミドをまとめて切り出し、これを用いてＥ.ｃｏｌｉ ＸＬＯＬＲ(Stratagene)を形質転換した。プラスミドをＸＬＯＬＲコロニーから単離し、部分的に配列を決定した。ＮＲＢＤ９０データベース(Altschul, et al., Nucleic Acids Res. 25, 3389-3402(1997))に対して、このデータベース上のすべての配列をＢＬＡＳＴ分析し、鍵となるモチーフに基づいた、既知のテルペン合成酵素との類似性により、推定テルペン合成酵素ｃＤＮＡ配列を同定した。完全長テルペン合成酵素配列(ＥＳＴ５７４００)を同定し、そのポリヌクレオチド配列を決定した。
【０１２３】
ｐＥＴ−３０へのクローニング：機能的発現を行うために、ｐＢＫ−ＣＭＶ５７４００から、開始ＡＴＧのすぐ隣りにあるＥｃｏＲＩ制限エンドヌクレアーゼ部位およびベクターのＸｈｏＩ制限部位を用いて、ＥＳＴ５７４００をコードするｃＤＮＡ断片を切り出した。次いで、同様にＥｃｏＲＩおよびＸｈｏＩで消化した発現ベクターｐＥＴ−３０ａ(Novagen)に、得られた１８９９ｂｐのｃＤＮＡ配列を、フレームを合わせてサブクローン化し、その結果プラスミドｐＥＴ−３０ａ５７４００が生じた。次いでプラスミドｐＥＴ−３０ａ５７４００で、Ｅ.ｃｏｌｉ ＢＬ２１−ＣｏｄｏｎＰｌｕｓ(商標)−ＲＩＬ細胞(Stratagene)を形質転換した。挿入ｃＤＮＡのフレームが合っていることを保証するために、クローンの５'末端の配列を再び決定した。
【０１２４】
細菌培養物由来α−ファルネセン合成酵素の発現および特徴付け：カナマイシン３０μｇ/ｍｌおよびクロラムフェニコール５０μｇ/ｍｌを補充したＬＢ(Lauria-Bertani)培地中で、ｐＥＴ−３０ａ５７４００、および対照としての空のｐＥＴ−３０ベクターを含むＥ.ｃｏｌｉ ＢＬ２１-Ｐｌｕｓ(商標)-ＲＩＬ細胞を３７℃で１晩増殖させた。１晩培養物のアリコート５００μｌを使用して、カナマイシン３０μｇ/ｍｌおよびクロラムフェニコール５０μｇ/ｍｌを補充した新鮮２×ＹＴ培地５０ｍｌに接種した。この培養物を、３７℃で激しく振盪してＡ600＝０．６に増殖させた後、０．３ｍＭのイソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド(ＩＰＴＧ)を用いて誘導し、ファルネシルジリン酸(ＦＤＰ)(１０μＭ)を同時に加えた。実験に応じて、３０℃、１６℃または３７℃のインキュベーターに培養物を直ちに移した。
【０１２５】
細菌培養物のヘッドスペース分析：固相マイクロ抽出(ＳＰＭＥ)を用いて、細菌培養物上の容器内ヘッドスペースを、ＦＤＰを加えた後直ちに収集した。ＳＰＭＥファイバー(６５μｍ ＰＤＭＳ/ＤＶＢ、オーストラリア、Supelco)を４５分間２６０℃にし、使用前にＧＣ−ＦＩＤ(ＨＰ５８９０)を用いて、これに混入があるかどうかバックグラウンドの分析を行った。ヘッドスペースの揮発性物質を、３０℃で４時間連続振盪(１１０ｒｐｍ)して収集した。ＧＣ−ＦＩＤ/ＭＳを用いた分析の前に、隔壁で密封したガラス容器中の周囲温度でファイバーを貯蔵した。２５０℃で５分間、ＧＣ注入口内でファイバーから揮発性物質を脱着させた。このＧＣシステムは、３０ｍ×内径０．２５ｍｍであり、フィルムの厚さが０．５μｍであるＤＢ−Ｗａｘキャピラリーカラム(Ｊ＆Ｗ Scientific、米国、Folsom)を備えていた。担体ガスは、流速30ｃｍ/秒のヘリウムであった。ＧＣオーブンを、６分間３０℃の状態を保ち、次いで３℃/分で１０２℃に上昇させた後、５℃/分で２１０℃に上昇させ、この温度を１１分間維持するようにプログラムした。７０ｅＶ、スキャン範囲３０〜３２０ａｍｕの電子衝撃イオン化(ＥＩ−ＭＳ)モードで質量分析計を操作した。試料のスペクトルをＮＩＳＴ、Ｗｉｌｅｙ由来のもの、および本発明者ら所有の質量スペクトルライブラリーと比較することによって、ピークの同定を実施し、標準物質の保持指標および文献の値(Davies， J.Chrom. 503, 1-24,(1990))によってそれを確認した。ＦＤＰと同時に培養物に加えた内部標準であるヘキサデカンに対する試料のピーク面積を測定することによって、定量データを得た。
【０１２６】
誘導培養物および非誘導培養物の発現の時間経過：ｐＥＴ−３０ａ５７４００を含む細菌培養物６×５０ｍｌを上記のように調製した。Ａ600＝０．６の時点で、３つの培養物に０．３ｍＭのＩＰＴＧで誘導を行ったが、残りの培養物には誘導を行わなかった。次いで培養物を３０℃で、１時間、３時間、または５時間インキュベートし、ヘッドスペースの揮発性物質を上記に記載したように収集した。
【０１２７】
細菌抽出物由来α−ファルネセン合成酵素および部分精製α−ファルネセン合成酵素組換えタンパクの特徴付け：上記のように、培養を開始し、培養物を増殖させ誘導した。誘導後、培養物を２４℃のインキュベーターに直ちに移し、連続振盪してさらに１８〜２０時間増殖させ、細胞を遠心(２０００×ｇで１０分間)によって回収した。結合バッファー(５ｍＭイミダゾール、０．５ｍＭ ＮａＣｌ、１０ｍＭ ＤＴＴ、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ(ｐＨ７．９))２０ｍｌまたは抽出バッファー(２５ｍＭ ＭＯＰＳ(ｐＨ７．０)、１０ｍＭアスコルビン酸ナトリウム、２５ｍＭ ＫＣｌ、１０ｍＭ ＤＴＴ、１０％グリセロール)２０ｍｌ中で、ペレットにした細胞を再懸濁させた。１２７００ｐｓｉでフレンチプレス細胞破砕機(French Pressure Cell Press)(American Instrument Co. Inc、米国メリーランド州シルバースプリング(Silver Spring))に２回かけて細胞を破砕し、次いでこれを８０００×ｇで１５分間遠心した。上清５ｍｌを５０ｍｌ試験管に移し、１０ｍＭ ＭｇＣｌ2および２０μＭ ＭｎＣｌ2に調節した。ＦＤＰ１００μＭ)を加え、反応混合物を３０℃でインキュベートした。培養物全体の場合と同様にヘッドスペースの揮発性物質を収集した。(ＤＴＴを省いた)結合または抽出バッファーで予め平衡化したＰＤ−１０ゲル濾過カラム(Amersham-Pharmacia Biotech)に抽出物の残り(１５ｍｌ)を入れた。次いで溶出分画を貯留し、固定化金属アフィニティークロマトグラフィー(ＩＭＡＣ)を用いて、組換えタンパクの精製を１ステップで実施した。Ｎｉ+に帯電したハイトラップキレーティングＨＰカラム(Hi-trap Chelating HP column)(Amersham-Pharmacia Biotech)に溶出液を入れた。非結合タンパクを除去し、製造者の説明書に従って組換えタンパクを溶出させた。溶出タンパクの試料５ｍｌを、５０ｍｌ試験管に移し、１０ｍＭ ＭｇＣｌ2および２０μＭ ＭｎＣｌ2に調節し、１０μＭのＦＤＰを加えた。細菌培養物の場合と同様にヘッドスペースの揮発性物質を収集した。残っている組換えタンパクのアリコートを２０％グリセロール中で−８０℃で必要となるまで貯蔵した。
【０１２８】
電気泳動およびウェスタン分析：培養物そのもの、フレンチプレスしたＨｉｓ精製および非Ｈｉｓ精製タンパク抽出物を、１０％ポリアクリルアミドゲルを用いてＳＤＳ−ＰＡＧＥで分析した。タンパクバンドを、コロイドクマシー(Colloidal Coomassie)を用いて視覚化し、またはＩｍｍｏｂｉｌｉｎ−Ｐ ＰＶＤＦ膜(Millipore)上に移した。ブロットしたタンパクを、抗Ｈｉｓ6モノクローナル(Roche)第１抗体および抗マウスＩｇＧ−ＡＰ(Stressgen)第２抗体とともにインキュベートし、１−ＳＴＥＰ(商標)ＮＢＴ／ＢＣＩＰ(Pierce)アルカリホスファターゼ検出試薬を用いて検出した。
【０１２９】
タンパク定量：Ｓｐｅｃｔｒｏｍａｘ Ｐｌｕｓ分光光度計を用い、ウシ血清アルブミン(ＢＳＡ)を標準物質として用い、製造者の説明書に従ってＢｉｏｒａｄのキットを用いるブラッドフォード(Bradford)法によって、抽出物および部分精製組換えタンパクのタンパク濃度を決定した。
【０１３０】
(結果)
１５０ＤＡＦＢのリンゴから放出された揮発性物質のヘッドスペース分析：α−ファルネセンが、リンゴ皮組織中で合成され、ヘッドスペース分析において検出されることは十分に認められている。通常、(Ｅ,Ｅ)および(Ｚ,Ｅ)α−ファルネセンというα−ファルネセンの２つの異性体がリンゴ皮中にみられる(Matich et al., Anal.Chem.68, 4114-4118(1996)、Bengtsson, et al., J.Agric.Food Chem. 49, 3736-3741(2001))。この２つの異性体は通常、１００：１の比でそれぞれ同定される(Matich, et al., Anal.Chem.68, 4114-4118(1996))。分析した１５０ＤＡＦＢのリンゴのヘッドスペース中では、α−ファルネセンの「全トランス」型(Ｅ,Ｅ)異性体しか同定されなかった(図５)。この異性体は低レベルで存在し、(Ｅ,Ｅ)α−ファルネセンは１果実につき平均４ｎｇであった。(Ｅ,Ｅ)α−ファルネセン異性体は保持時間４２．５７分であり、これを使用して、この化合物のコバッツ(Kovats)保持指標を計算した。保持指標および質量スペクトルによって、この化合物は(Ｅ,Ｅ)α−ファルネセンとして陽性に同定された。
【０１３１】
α−ファルネセン合成酵素の配列分析：α−ファルネセン合成酵素をコードする、ｐＢＫ−ＣＭＶ中のｃＤＮＡの配列決定から、挿入物のサイズがポリ(Ａ)尾部を除いて１９２６塩基対であることが明らかとなった(図３、配列番号：１)。ｃＤＮＡ配列は、５'末端から６１塩基にある推定開始メチオニンから開始する５７６アミノ酸の予想ＯＲＦを有していた(図４、配列番号：２)。α−ファルネセン合成酵素の分子量は、６６ｋＤと予測されている。α−ファルネセン合成酵素の予想アミノ酸配列は、葉緑体シグナリング(chloroplast-signalling)ペプチド配列を有さず(Emanuelsson， et al., 300, 1005-1016(2000))、このことは、モノテルペンおよびジテルペン合成酵素に特徴的である。他のすべてのテルペン合成酵素で認められているように、α−ファルネセン合成酵素の予想アミノ酸配列は、触媒作用に必要な金属イオンの結合に関与するＤＤＸＸ(Ｄ,Ｅ)モチーフ(ＤＤＶＹＤ)をアミノ酸３２６〜３３０に含む。α−ファルネセン合成酵素は、被子植物セスキテルペンコンセンサス配列ＧＶＹＸＥＰを含まないことが判明したが(Cai et al Phytochem 61, 523-529(2002))、その代わりに極めて類似するＧＶＡＦＥＰモチーフをアミノ酸３０１〜３０６に含んでいる。これがＲＲＸ8Ｗモチーフをアミノ酸３３〜４３に含むことも判明したが、このことは、Ｔｐｓ−ｄおよびＴｐｓ−ｂモノテルペン合成酵素の共通の特徴である(Duderava,N., Martin,D., Kish,C.M., Kolosova,N., Gorenstein,N., Faldt,J., Miller,B., and Bohlmann,J. (2003) Plant Cell. 15, 1227-1241)。
【０１３２】
Bohlmann、Meyer-GauenおよびCroteau(Proc.Natl.Acad.Sci.USA 95, 4126-4133(1998))は、３３種のテルペン合成酵素のアミノ酸配列を比較し、７つの完全に保存されているアミノ酸残基が存在することを示した。α−ファルネセン合成酵素は、この７つの完全に保存されたアミノ酸のうち６つを含む。彼らは、芳香族アミノ酸の６つの位置が完全に保存され、酸性アミノ酸の４つの位置が完全に保存されていることも発見した。α−ファルネセン合成酵素では、芳香族アミノ酸の位置６つのうち４つが、酸性アミノ酸の位置４つのうちすべてが保存されている。
【０１３３】
α−ファルネセン合成酵素(セスキテルペン合成酵素)の予想アミノ酸配列は、Cinnamomum tenuipilum由来の推定モノテルペンのアミノ酸配列に最もよく似ており(Zeng et al, Genbank CAD29734, 2002)、予想アミノ酸３４〜５７４での同一性が３９．８％、類似性が５６．３％である。Melaleuca alternifolia(ティーツリー)由来の推定モノテルペン合成酵素(Shelton et al, Genebank AAP40638,2003)は、類似性が２番目に高く、予想アミノ酸３４〜５７４での同一性が３８．７％、類似性が５４．１％であり、Quercus ilex(トキワガシ(holly oak))由来の推定モノテルペン合成酵素(Fischbach， Genbank CAC41012, 2001)では、予想アミノ酸３４〜５７４での同一性が３７．９％、類似性が５５．８％である。
【０１３４】
α−ファルネセン合成酵素の核酸配列は、少数のセスキテルペン合成酵素のｍＲＮＡの非常に短い部分と相同性を示す。相同性領域の１つは、ヌクレオチド９１８〜９４６に存在する。例えば、Gossypium arboreum(キダチワタ(tree cotton))由来のカジネン合成酵素(Chen, Wang, Chen, Davisson and Heinstein, 1996)は、ヌクレオチド９１８〜９４６の領域中で２５のうち２４の同一塩基を有し、Artemisia annua由来の推定セスキテルペン合成酵素は、この領域中で２６塩基のうち２５が同一である(Van Geldre et al.， Plant Sci. 158, 163-171(2000))。ヌクレオチド３６７〜３８６では、Abies grandis(グランドファー(grand fir))のＥ−ａ−ビサボレン合成酵素は２０のうち２０の同一塩基を有する。
【０１３５】
α−ファルネセン合成酵素合成酵素の予想等電点は５．１であり、これは他のセスキテルペン合成酵素で計算された等電点と類似している。例えば、Artemisia annuaから単離された２つのセスキテルペン合成酵素ｃＡＳＣ３４およびｃＡＳＣ１２５は、等電点がそれぞれ５．２８および５．５０である(Van Geldre et al., Plant Sci. 158, 163-171(2000))。
【０１３６】
α−ファルネセン合成酵素のｃＤＮＡ配列(ＥＳＴ５７４００)は、ロイヤルガラの１５０ＤＡＦＢのリンゴ皮から構築したｃＤＮＡライブラリーから得られた。配列決定した５'末端のポリヌクレオチドがＥＳＴ５７４００と同一である他の切断型ｃＤＮＡも３つ単離された。そのうち、１つはロイヤルガラ１２６ＤＡＦＢの果実の皮層に由来し、１つはロイヤルガラの花芽に由来し、第３の切断型はピンキー(Pinkie）の葉に由来する。アオテアの葉から得られた他の切断型ｃＤＮＡは、配列決定した６７５塩基のうち７塩基対が異なり、その結果５アミノ酸が変化する。
【０１３７】
ウェスタン分析：ウェスタン分析によって、フレンチプレス抽出物中にも部分精製組換えタンパク抽出物中にも、α−ファルネセン合成酵素の予想サイズの範囲(Ｈｉｓタグも含めて６５〜７５ｋＤａ)内の可溶性発現産物が存在することを確認した。精製ｐＥＴ−３０ａ対照と非精製抽出物のどちらにも、それに似たサイズのバンドは検出されなかった。
【０１３８】
α−ファルネセン合成酵素の特徴付け：ｐＥＴ−３０ａ５７４００を含む細菌培養物および抽出物のヘッドスペース内で、(Ｅ,Ｅ)α−ファルネセンおよび少量の(Ｚ,Ｅ)α−ファルネセンが検出された。α−ファルネセン合成酵素ｃＤＮＡ挿入物を欠くｐＥＴ−３０ａで形質転換した大腸菌(Ｅ.ｃｏｌｉ)ＢＬ２１細胞を含む対照では、ごくわずかのα−ファルネセンが得られた、または全く得られなかった。培養物および非精製抽出物中での(Ｅ,Ｅ)α−ファルネセン産生は、前駆体を加えることに依存しないが、α−ファルネセン合成酵素ｃＤＮＡ挿入物が存在することに依存することが示された。対照では、α−ファルネセン(４２．２４分)と似た保持時間にピークが認められたが、質量スペクトルから、これがシトラールであることが示された。細菌培養物にＧＤＰを加えても、α−ファルネセンおよびいずれのモノテルペンも産生されなかった。
【０１３９】
部分精製組換え酵素のヘッドスペース分析から、Ｈｉｓ精製結合バッファー中での抽出に由来するものであれ、セスキテルペン抽出バッファー中での抽出に由来するものであれ、主産物として(Ｅ,Ｅ)α−ファルネセンが少量の(Ｚ,Ｅ)α−ファルネセンとともに存在することが示された(図６)。これにはＦＤＰを加えることが必要であり、前駆体を加えないと、α−ファルネセンは産生されなかった。−８０Ｃで４週間グリセロール中で貯蔵した精製酵素を再び分析したとき、その活性の消失はわずか１５％であった。
【０１４０】
α−ファルネセンｃＤＮＡを含む細菌培養物および非精製抽出物では、誘導を行わない条件下でもわずかな発現が示された。しかし、揮発性物質を５時間にわたってトラップすると、ＩＰＴＧを加えたとき、誘導しなかった試料と比べてどちらの異性体の産生も増大したことが示された。
【０１４１】
したがって、ＥＳＴ５７４００は、α−ファルネセンだけを作成するα−ファルネセン合成酵素をコードしている。
【０１４２】
実施例２ この酵素の特性
異性体特異性：ほとんどの実験および分析において、ＦＤＰ前駆体がＥ,Ｅ型およびＥ,Ｚ型の混合物からなることから、α−ファルネセンのＥ,ＥおよびＺ,Ｅ異性体が遺伝子α−ファルネセン合成酵素によって産生されることが示唆された。異性体特異性を試験するため、標準的なin vitro活性実験において、Ｅ,Ｅ異性体４１．３％、Ｅ,Ｚ異性体２８．７％、Ｚ,Ｅ異性体２４．７％、Ｚ,Ｚ異性体５．４％の比で、ＦＤＰ前駆体を精製タンパク抽出物に与えた。前記のようにＳＰＭＥファイバーで２時間トラッピング後、α−ファルネセンの異性体４つのうち３つが産生した(図７参照)。４０．５４のピークはＺ,Ｚα−ファルネセンである可能性があるが、それは確認されていない。この結果から、この酵素には異性体特異性がなく、ＦＤＰ前駆体の異性体型に応じて、この酵素がα−ファルネセン異性体を産生することが示唆される。
【０１４３】
タンパクの大規模産生の最適化：カナマイシン３０μｇ/ｍｌおよびクロラムフェニコール-1５０μｇ ｍｌを補充したＬＢ(Lauria-Bertani)培地中で、ｐＥＴ−３０ａ５７４００を含むＥ.ｃｏｌｉ ＢＬ２１−Ｐｌｕｓ(商標)−ＲＩＬ細胞を３７℃で１晩増殖させた。１晩培養物のアリコート５ｍＬを使用して、カナマイシン３０μｇ ｍｌ-1およびクロラムフェニコール５０μｇ ｍｌ-1を補充した、１Ｌバッフル付きフラスコ中の新鮮２×ＹＴ培地４×３００ｍＬに接種した。培養物を、３７℃で激しく振盪してＡ600＝０．８に増殖させ、次いで４℃に移動させて１６℃の状態にした後、０．３ｍＭのＩＰＴＧで誘導した。次いで誘導した培養物を、１６℃および２２０ｒｐｍでさらに５０時間インキュベートした。細胞を遠心(２５００×ｇ、１０分)によってペレットにし、−２０℃で１晩貯蔵した。翌日、Ｈｉｓ６結合バッファー１５ｍＬ中に細胞ペレットを再懸濁させ、１５０００〜２００００ｐｓｉの間に設定した圧力でＥｍｕｌｓｉＦｌｅｘ(登録商標)−Ｃ１５高圧ホモジナイザー(Avestin)に３回通して細胞を破砕した。１００００×ｇで１５分間、４℃(Ｓｏｒｖａｌ ＳＳ３４ローター)の遠心を２回行うことにより、細胞の残骸をペレットにした。この上清を０．４５μｍフィルター(Amicon)によって濾過した。フィルター濾過した抽出物を、脱塩し、ニッケルアフィニティーカラムに通した後、３０ｋＤａフィルター(Millipore)に通した。タンパク濃度を吸光率から決定し(ＶｅｃｔｏｒＮＴＩ第８版)、１０％グリセロールおよび１ｍＭ ＤＴＴを含むＨｉｓ６溶出バッファーで、１ｍＬにつきタンパク約１ｍｇにこの精製抽出物を調整した。次いでこの抽出物をアリコート１００μｌに分け、必要となるまで−８０℃で貯蔵した。
【０１４４】
タンパクのオリゴマー形成：６００×１６ｍｍのＳ３００ Ｓｅｐｈａｃｒｙｌカラム(Pharmacia)上に、流速１ｍＬ分-1で精製タンパク約５００μｇを流した。カラムを予め平衡化しておき、１０％グリセロールを含み、５０ｍＭ ＫＣｌまたは０．５Ｍ ＫＣｌを含み、７ｍＭ ＭｇＣｌ2を含むまたは含まない、５０ｍＭのビストリスプロパンバッファーで溶出させた。７ｍＭ ＭｇＣｌ2に調整し、２５μＭの3Ｈ−ＦＤＰを加えた後、タンパクピークに対応する分画を活性について分析した。分子量が既知の標準物質との比較に基づいて、活性がある分画の分子量を計算した。
【０１４５】
結果：α−ファルネセン合成酵素タンパクは、主にモノマーとして働く(図８および９参照)。データから、少量の活性がオリゴマー型に起因している可能性があることが示唆されるが、７０％を超える活性がモノマー酵素に起因している。図８は、Ｓｅｐｈａｃｒｙｌ Ｓ３００ ＨＲゲル濾過クロマトグラフィー上でのα−ファルネセン合成酵素のタンパク溶出プロフィルおよびおよその分子量を示す。４つの異なる精製抽出物を対照の塩およびＭｇのプロフィルと比較した。分画４０での大きなピークは、α−ファルネセン合成酵素ではなく、ＳＤＳゲル上のタンパクがほとんどないことが示され、ＤＮＡが優勢である可能性が高い。酵素活性は６０〜７０の分画に集中している(図９参照)。
【０１４６】
反応速度研究：反応速度研究のために、培養中に誘導され、タンパク最適化で記載したように精製したα−ファルネセン合成酵素の活性タンパクを、５０ｍＭビストリスプロパン(ｐＨ７．５)、１０％(ｖ/ｖ)グリセロール、１ｍＭ ＤＴＴおよび０．１％(ｖ/ｖ)Ｔｗｅｅｎ−２０を含む最小分析バッファーに加えた。放射活性ＦＤＰを実験に応じて様々に加えた。タンパク１〜２μｇを含む分析物１ｍＬにペンタン０．６ｍＬを重層し、これを１．５ｍＬマイクロチューブ中で３０℃および１５０ｒｐｍで２時間インキュベートした。すべての分析は３回反復して行った。インキュベーション後、分析物を氷上に直ちに置き、ペンタン層のアリコート２００μＬを分析用に移した。有機物カウント用シンチレーション剤(Organic Counting Scintillant)(ＯＣＳ)(Amersham)０．７ｍＬを含む１．５ｍＬマイクロチューブにアリコートを加え、これに短くボルテックスをかけた。Ｗａｌｌａｃ １４０９液体シンチレーションカウンターを用いて(3Ｈ効率≒７０％）、シンチレーション分析を行った。
【０１４７】
3Ｈ−ＦＤＰ(１０．０６Ｍｂｑ/ｍＬ)を基質(濃度範囲１μＭ〜１００μＭでＭｇ2+およびＭｎ2+が飽和状態)として用いた反応速度研究を実施して、ＦＤＰのＫｍを決定した。２５μＭ 3Ｈ−ＦＤＰにおけるＭｇ2+およびＭｎ2+の反応速度定数(塩化物の分析範囲はそれぞれ２５μＭ〜２５ｍＭ、１μＭ〜１ｍＭ)を決定した。塩を含む場合および含まない場合の金属補因子の酵素活性に対する効果も試験した。すべての可能な組合せにおいて、５０ｍＭ ＫＣＬおよび５０ｍＬ ＮａＣｌの存在下および不在下でＭｇ2+およびＭｎ2+を加えた。酵素を含めずインキュベートしたもの、酵素を含めるが金属イオン補因子を含めないもの、および１０ｍＭ ＥＤＴＡの存在下で酵素と補因子を含めるものを対照とした。
【０１４８】
この酵素のｐＨ最適条件を決定するために、ｐＨ値４．５〜９．６で、７ｍＭ Ｍｇ、１５０μＭ Ｍｎ、２５μＭ ＦＤＰ、１０％(ｖ/ｖ)グリセロール、１ｍＭ ＤＴＴ、および０．１％(ｖ/ｖ)Ｔｗｅｅｎ−２０を用い、５１ｍＭジエタノールアミン、１００ｍＭ ＭＥＳ、および５１ｍＭ Ｎ−エチルモルホリンを含む、３種のバッファーシステムにおいて分析を実施した。標準的な分析バッファーおよび７ｍＭ Ｍｇ、１５０μＭ Ｍｎおよび２５μＭ ＦＤＰを用いて、１８℃〜５０℃の範囲における酵素活性に最適な温度も決定した。Origin50 graphics packageを用いて、非線形回帰により、ＤＰＭデータから反応速度定数を決定した。示したデータは、３つの決定値の平均を、±１０％以内の標準誤差、および対照から差し引いて計算したバックグラウンドＤＰＭとともに表す。すべての実験を少なくとも２回実施した。
【０１４９】
結果：ｐＨ α−ファルネセン合成酵素は、ｐＨ７〜８．５の広いｐＨ最適条件を示した(図１０）。反復実験から、ｐＨ約７．８で活性がわずかに低下することが示された。最適ｐＨの範囲で産生した産物中で活性の違いは認められなかった(結果は示さず)。このｐＨ範囲は、特徴付けられた他のセスキテルペン合成酵素について文献(Cai et al Phytochemistry 61, 523-529(2002)、Steele et al J.Biol.Chem. 273, 2078-2089(1998))中で報告されたもの(ｐＨ７〜９)と類似する。
【０１５０】
Ｋｍ ＦＤＰのＫｍは２．５〜３．５μＭ(図１１)であり、飽和濃度は１２μＭであった。前駆体抑制はＦＤＰ濃度が最大５０μＭでも認められなかった。補因子Ｍｇ2+のＫｍは６００〜８００μＭ(図１２)であり、高濃度(２５ｍＭ)で活性がわずかに抑制された(２３％)。Ｍｎ2+のＫｍは１０〜２０μＭであり、高濃度(＞８００μＭ)で活性が少なくとも５０％抑制された(図１３)。文献中で報告されたＫｍは、他のセスキテルペン合成酵素に関して、ＦＤＰで０．４〜４．５μＭ、Ｍｇで７０〜１５０μＭ、Ｍｎで７〜３０μＭの範囲である(例えば、Cai et al Phytochemistry 61, 523-529(2002)、Steele et al J.Biol.Chem.273, 2078-2089(1998))。
【０１５１】
他の金属イオンの効果 Ｋ+イオンを加えると、α−ファルネセン合成酵素活性は増強された(表１）。Ｎａ+イオンを加えると、活性のわずかで有意でない増強が生じ、このことから、この増強が金属イオンの型に起因するものであり、一般的な塩の応答に起因するものではないことが示唆される。
【０１５２】
【表２】
【０１５３】
温度 最大のα−ファルネセン合成酵素活性は３７℃で生じ、それより高い温度では活性が急激に低下した(図１４)。活性は５０℃では検出不可能であり、低温(１３℃)では酵素活性は残ったが３分の２低下した。これは他のセスキテルペン合成酵素で報告されているものと類似する。
【０１５４】
(貯蔵)
−８０℃で９ヶ月間貯蔵したタンパクは活性が消失した(９２．５％消失）。この貯蔵タンパクでは、ＦＤＰのＫｍが約１．５μＭに低下したことも示された。しかし、Ｍｇ、ＭｎのＫｍ、およびｐＨ応答は変わらなかった。
【０１５５】
実施例３ 植物中での発現
Nicotiana benthamiana葉中での一過性発現：N.benthamiana葉の形質転換をHawesら(Hawes, C., Boevink, P., and Moore, I., GFP in plants, in Fluorescence microscopy of Proteins：a practical approach., V.Allen, Editor.1999, Oxford University Press：Oxford. P.163-177(2000))に従って行った。ＥＳＴ５７４００を有するｐＨＥＸ２バイナリーベクター(binary vector)、および対照としてｍＲＮＡサイレンシングのウイルス性抑制因子(viral suppressor)を発現するＰ１９ベクター(Voinnet et al. Plant J 33, 949-956(2003))を含むAgrobacterium tumefaciens株ＧＶ３１０１(ＭＰ９０)を、リファンピシン(１０ｍｇ ｍｌ-1)、ゲンタマイシン(２５ｍｇ ｍｌ-1)、およびスペクチノマイシン(１００ｍｇ ｍｌ-1)を含む２ＹＴ培地の５ｍｌ培養中で２８℃で２４時間増殖させた。遠心(３５００×ｇ、１０分間)によって細胞を収集し、最終ＯＤ600０．５〜０．６となるように、浸透用培地(５０ｍＭ ＭＥＳ ｐＨ５．６、０．５％(ｗ/ｖ)グルコース、２ｍＭ Ｎａ3ＰＯ4、(２００ｍＭアセトシリンゴン／ＤＭＳＯストックから新たに作成した)１００ｍＭアセトシリンゴン)中に再懸濁させた。針を取り付けない１ｍｌ注射器を用いて、分離したN.benthamiana葉の裏側の気孔から細菌懸濁液を注入した。後で同定するために、葉の浸透させた部分に消えないマーカーペンで印を付けた。感染させた葉を有する植物を、標準的な温室条件下で７日間育てた。
【０１５６】
形質転換したN.benthamiana葉および対照の葉に、２５μＭ ＦＤＰ、７ｍＭ ＭｇＣｌ2および５０ｍＭ ＫＣｌを含む蒸留水を浸透させた。１時間後、１処理につき３枚の葉を切り出し、これを５０ｍＬのガラス製試験管内に置き、３０℃で１２時間、固相マイクロ抽出(ＳＰＭＥ)を用いて、この葉組織上のヘッドスペースを収集した。前浸透を行わずにこの実験を反復した。それぞれ独立に形質転換した植物の２つの場合において完全な実験を実施した。
【０１５７】
結果：
一過性発現研究から、α−ファルネセン合成酵素遺伝子が存在するときにα−ファルネセンが産生されるが、対照の葉では産生されないことが示される。Ｅ,Ｅα−ファルネセンは前駆体を加えなくても産生された(このことから、N.benthamiana葉中では何らかの内在性前駆体が得られることが示唆される)。しかし、前駆体をも葉中へと浸透させたとき、Ｅ,Ｅα−ファルネセンはさらに産生された。結果を図１５に示す。
【０１５８】
シロイヌナズナ(Arabidopsis)中でのリンゴα−ファルネセン合成酵素の過剰発現：A.tumefaciens株ＧＶ３１０１を、リファンピシン(１０ｍｇ ｍＬ-1)、ゲンタマイシン(２５ｍｇ ｍＬ-1)、およびスペクチノマイシン(１００ｍｇ ｍＬ-1)を含むＬＢ培地１０ｍＬ中に接種し、２００ｒｐｍで振盪して２８℃で２４時間増殖させた。次いで、この最初の培養物を使用して、上記と同様の抗生物質を含むもう１つのＬＢ培地１００〜２００ｍＬ中に接種した。２８℃で振盪して、これを再度２４時間増殖させた。遠心(３５００×ｇ、１０分間、４℃)によって細胞を収集し、最終ＯＤ600０．８となるように、５％ショ糖溶液中に再懸濁させた。シルウェット(Silwet)Ｌ−７７を、濃度０．０５％となるように加えた。このコンピテントAgrobacterium細胞のアリコート４５ｍＬを氷上でゆっくりと解凍した。プラスミドＤＮＡ(ＥＳＴ５７４００を含むｐＨＥＸ２ベクター)５０〜２００ｎｇを各アリコートに加え、ゆっくりと混合し、次いで、この細胞／プラスミド混合物４０ｍＬを、予め冷却したエレクトロポレーション用キュベット(間隔０．２ｃｍ、Bio-Rad)中にピペットで入れた。ＢｉｏＲａｄのジーンパルサー(GenePulser)を用いて、以下の設定でこの細胞にエレクトロポレーションを行った。
電圧：２．５ｋＶ
静電容量：２５ｍＦｄ
抵抗：４００オーム
パルスの時定数は通常７〜９ｍｓであった。
【０１５９】
ＬＢ培地１ｍＬを加えて、細胞を直ちに回復させ、次いでこれを滅菌１５ｍＬ遠心管中にデカントで入れ、室温で振盪して(６０ｒｐｍ)インキュベートした。２時間後、形質転換した細菌１０ｍＬおよび１００ｍＬを、リファンピシン(１０ｍｇ ｍＬ-1)、ゲンタマイシン(２５ｍｇ ｍＬ-1)、およびスペクチノマイシン(１００ｍｇ ｍＬ-1）を含む別々のＬＢプレート上に播き、次いでこれを２８〜３０℃で４８時間増殖させた。
【０１６０】
プラスミドを含むA.tumefaciensを、リファンピシン(１０ｍｇ ｍＬ-1)、ゲンタマイシン(２５ｍｇ ｍＬ-1)、およびスペクチノマイシン(１００ｍｇ ｍＬ-1)を含むＬＢ培地の５ｍＬ培養中で、２８℃で２４時間増殖させた。細胞を遠心によって収集し、最終ＯＤ600０．８となるように、５％ショ糖溶液中に再懸濁させた。シルウェットＬ−７７を、濃度０．０５％となるように加えた。
【０１６１】
多数の未熟な花房が見られる５週齢の健常なArabidopsis thalianaコロンビア系統(cv Columbia)の植物を、ＥＳＴ５７４００を含むまたは空ベクターを含むAgrobacteriumで形質転換した。植物の地上部分全体をAgrobacterium懸濁液中に浸漬し、３〜５秒間ゆっくりと攪拌した。次いで、浸漬した植物を、光を減少させた状態で湿潤チャンバー中に２〜３日間置いた後、通常の温室条件下で開花させ、種をまいた。(浸漬してから５〜６週間後に)植物を完全に乾燥させた後、種子(Ｔ０)を採取した。植物を自家受粉させ、カナマイシン選択プレート上で２世代にわたって個体を増殖させることによって、Ｔ２種子を生じさせた。
【０１６２】
ＤＮＡ抽出：サザン分析を行うために、Dellaporta et al. Plant Mol.Biol.Reporter 1, 19-21(1983)の方法により、Arabidopsis thaliana葉からＤＮＡを抽出した。液体窒素中で組織材料(１ｇ)をすりつぶし、次いで、βメルカプトエタノール２２．５μｌを含むバッファー(１００ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ８．０、５０ｍＭ ＥＤＴＡ ｐＨ８．０、５００ｍＭ ＮａＣｌ)１５ｍｌにこの粉末を加えた。２０％ＳＤＳを１ｍｌ加えた後、ホモジェネートをボルテックスに接触させ、次いで６５℃で２０分間インキュベートした。５Ｍの酢酸カリウム(５ｍｌ)を加えた後、氷上で２０分間インキュベートし、次いで６０００ｒｐｍで３０分間遠心した。上清をミラクロス(miracloth)に通し、冷イソプロパノールを１０ｍｌ加え、４℃で１晩ＤＮＡを沈降させた。５０００ｒｐｍで１５分間遠心することによってＤＮＡをペレットにし、次いで７０％エタノール１ｍｌ中でこれを洗浄し、水０．５ｍｌ中に再懸濁させた。再懸濁させたＤＮＡを、等量の１：１ フェノール：クロロホルムで抽出し、次いで等量のクロロホルムで抽出し、イソプロパノールで再沈降させた。遠心し、７０％エタノールで洗浄した後、ＤＮＡを水５０μｌに再懸濁させた。ＲＮＡｓｅ(Roche)(１０ｍｇ/ｍｌの１μｌ)を加えてＲＮＡを除去した。
【０１６３】
ＰＣＲ反応で使用するＤＮＡの小規模抽出を行うために、Arabidopsis thaliana葉組織１５０ｍｇを液体窒素中ですりつぶした。抽出バッファー(４８０μｌ)を加え、組織をさらにすりつぶし、次いで氷上に置いた。２０％ＳＤＳを３７．５μｌ加えた後、試料を６５℃で１０分間置いた。５Ｍの冷酢酸カリウムを９４μｌ加えた後、試料を転倒混和し、次いで氷中に１０分間置いた後、１３２００ｒｐｍで１０分間遠心した。２５：２４：１ フェノール：クロロホルム：酢酸イソアミル６００μｌとゆっくり混合して上清を抽出し、次いで１０，０００ｒｐｍで５分間遠心した。イソプロパノール３６０μｌを上清に加え、混合し、次いでこれを１３２００ｒｐｍで３分間遠心した。ペレットを７０％エタノールですすぎ、１分間遠心し、９５％エタノールですすぎ、空気乾燥させ、ＲＮＡｓｅ(Roche)を含むＴＥ５０μｌ中に再懸濁させた。
【０１６４】
ＤＮＡのＰＣＲ増幅 Ｅｘｐａｎｄ Ｈｉｇｈ Ｆｉｄｅｌｉｔｙ Ｔａｑ(Roche)を用いて、ＰＣＲ増幅を行った。増幅反応は、製造者の奨励に従って行った。ＰＣＲプライマー(５７４００＿Ａ３ AGAGTTCACTTGCAAGCTGA(配列番号：３)および５７４００＿Ａ４ GAAAAGTTCCAGCATTCCTT(配列番号：８))を設計して、ＥＳＴ５７４００のコード領域の５'末端に由来する５１３塩基対の断片を増幅した。ＰＣＲ増幅は、以下の条件下で行った。９６℃、５分間の変性反応後、９６℃、３０秒間の変性反応、５５℃、４秒間のアニーリング反応、および７２℃、６０秒間の伸長反応のサイクルを３０回。１％ＡｐｐｌｉＣｈｅｍによる電気泳動後、エチジウムブロマイドで染色し、カメラ付き紫外線トランスイルミネーター(ＵＶＰ)(UV tec、Total Lab Systems Ltd)上で視覚化することによって、得られた増幅産物(５μｌ)を分析した。
【０１６５】
結果：リンゴ由来のα−ファルネセン合成酵素をコードするＤＮＡは、４つのトランスジェニックArabidopsisの独立した形質転換体のそれぞれ(図１６）およびリンゴ対照で、ＰＣＲによって検出された。ｐＨＥＸ対照では何も検出されなかった。
【０１６６】
サザン分析
Arabidopsis thaliana葉組織から抽出したゲノムＤＮＡを、総量５００μｌ中でＢａｍＨ１を用いて１晩消化した。消化したＤＮＡを、２倍量のエタノールおよび１０分の１量の３Ｍ酢酸ナトリウムで沈降させ、次いで遠心し、７０％エタノール中で洗浄し、ペレットを水３０μｌ中に再懸濁させた。消化したＤＮＡを、０．７％アガロースで電気泳動し、エチジウムブロマイドを用いて視覚化し、０．２５Ｍ ＨＣｌ中で加水分解し、水で洗浄した後、０．４Ｍ ＮａＯＨ中のＮｙｔｒａｎ−Ｐｌｕｓ(Schleicher ＆ Schuell)膜に１晩トランスファーした。次いでこの膜を０．５Ｍ Ｔｒｉｓ中で中和し、Washing and Pre-Hyb Solution(ＭＲＣ)中で２時間プレハイブリダイズした。α−ファルネセン合成酵素のコード領域の５'末端と相補的である、32Ｐで標識した８１０塩基対のＰＣＲ断片をプローブとして用いて、高効率ハイブリダイゼーションシステム(high Efficiency Hybridzation System)(ＭＲＣ)２０ｍｌ中でハイブリダイゼーションを行った。製造者らの説明書に従い、ｒｅｄｉｐｒｉｍｅ(商標)ＩＩ(Amersham Pharmacia)ランダム標識システムを用いて、プローブ(４０ｎｇ)を32Ｐ ｄＣＴＰを用いて標識した。標識プローブを０．１Ｍ ＮａＯＨ中で30分間変性させた後、ハイブリダイゼーションを１晩行った。製造者らの奨励に従って、Washing and Pre-Hyb Solution(ＭＲＣ)中で膜を洗浄した。ハイブリダイゼーションシグナルは、Ｓｔｏｒｍ ８４０リン酸画像化システム(Molecular Dynamics)上でスキャンすることによって視覚化し、ImageQuantソフトウェアを用いて分析した。
【０１６７】
結果：
プライマー５７４００＿Ａ３(５'AGAGTTCACTTGCAAGCTGA３'配列番号：３）および５７４００ＮＲ１(５'GGATGCTTCCCT３'(配列番号：４))を用いてＥＳＴ５７４００から増幅した８１０塩基対の３２Ｐ標識ＰＣＲ断片をプローブとして用いて、トランスジェニックArabidopsis thaliana植物から抽出したゲノムＤＮＡのＢａｍＨ１消化物のサザン分析を実施した。α−ファルネセン合成酵素ｃＤＮＡを含むＢａｍＨ１制限断片のサイズは、２０５０塩基対である。その結果を図１７に示す。ＭＷと示したレーンは分子量マーカー(Invitrogen）である。ｐＨＥＸは、形質転換ベクターのみを含み、α−ファルネセン合成酵素ｃＤＮＡ挿入物を含まないトランスジェニックArabidopsis thaliana植物から抽出したゲノムＤＮＡを指す。１、２、３および４と示したレーンは、α−ファルネセン合成酵素ｃＤＮＡ挿入物を含む、独立したトランスジェニックArabidopsis thaliana系統である。
【０１６８】
ＲＴ−ＰＣＲ増幅：
系統３のArabidopsis thalianaの実生、葉および花から抽出した全ＲＮＡに対して、製造者らの奨励に従って、ＲＴ−ＰＣＲ(Platinum(登録商標)Quantitative RT-PCR Thermoscript One-Step System、Invitrogen)増幅を行った。ｃＤＮＡ合成を６０℃で３０分間行った後、９６℃で５分間変性し、次いで９６℃、３０秒間の変性反応、５５℃、４０秒間のアニーリング反応、および７２℃、６０秒間の伸長反応を含む増幅サイクルを４０回行った。最終サイクルでは、７２℃の伸長反応をさらに５分間継続させた。ＲＴ−ＰＣＲの前に、ＤＮａｓｅＩ(Life Technologies)で、全ＲＮＡを室温で１０分間処理した。ゲノムＤＮＡが混入しているかどうか調べるために、ＲＴ−ＰＣＲ増幅と同時に、ＤＮａｓｅＩ処理した全ＲＮＡに対してＰＣＲ増幅も行った。ＰＣＲプライマーは以下の通りである。５'末端の増幅には、５７４００＿Ａ３ AGAGTTCACTTGCAAGCTGA(配列番号：３)および５７４００＿Ａ４ GAAAAGTTCCAGCATTCCTT(配列番号：８)、内部配列の増幅には、５７４００ＮＦ１ GCACATTAGAGAACCACCAT(配列番号：９)および５７４００ＮＲ１ GGATGCTTCCCT(配列番号：４)、３'末端の増幅には、５７４００＿Ａ１ CTTCACAAGAATGAAGATCT(配列番号：１０)および５７４００＿Ａ５ TTCCATGCATTGTCTATCAT(配列番号：１１)。ＰＣＲ増幅の場合と同様に得られた増幅産物を分析した。その結果、導入遺伝子に対応するＲＮＡ転写物が存在することが確認された(図１８を参照)。
【０１６９】
Arabidopsisにおける機能証明研究：４つの独立した過剰発現系統および１つの対照系統それぞれから、Ｔ２世代の種子をマイクロ遠心管に入れて、約２００個を測定した。０．０１％Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘを含む１．５％漂白液で種子を滅菌し、これを時折混合しながら１５分間インキュベートした。蒸留水で種子を数回洗浄し、０．１％アガロース中に再懸濁させた後、１００ｍｇ/ｍＬカナマイシンを含む０．５×ＭＳ培地上に播いた。１２時間明るく１２時間暗いサイクルの栽培室内にこのプレートを置いた。育成２〜３週間後、各系統から３０個の植物を鉢内の土に移し、成熟し開花するまで、温室内でその成長を継続させた。
【０１７０】
長角果が見られる前に、３０〜５０個の花を採取し、末端を切断し、直ちに水中に置いた。次いで、２５μＭ ＦＤＰおよび７ｍＭ ＭｇＣｌ2を有する蒸留水５ｍＬを含む、すりガラスの継手の受け口付き５５ｍＬガラス製管に、これを移した。試験管に植物材料をきつく詰め込んだ。ガス線、およびクロモソーブ１０５ １００ｍｇを含む揮発性物質吸着剤カートリッジを含む、すりガラス製の入口の栓で、この管を密封した。フラスコ内のヘッドスペースを、５０ｍｌ/分の乾燥空気でパージしながら、５５時間トラップした。分析の前に、３５Ｃで１５分間、１０ｐｓｉのＮ2(ｇ）流量でクロモソーブカートリッジを乾燥させた。リンゴについて以前に記載したのと同様に、揮発性物質を熱により脱着させ分析した。
【０１７１】
結果：多数のセスキテルペン化合物がArabidopsis thaliana植物の花中に認められた。産物Ｅ,Ｅ α−ファルネセンは、試験した４つの過剰発現植物系統および対照のｐＨＥＸ植物のすべてにおいて認められた。保持時間、および質量スペクトルとライブラリースペクトルとの比較により、これは確認された。ＥＳＴ５７４００で形質転換した４系統では、カリオフィレン：α−ファルネセンのピーク比は３：１であり、ｐＨＥＸ対照では、α−ファルネセンも存在するが、カリオフィレンとα−ファルネセンとのピーク比は１０：１を超えていた(α−ファルネセンのピークは、ｐＨｅｘで４３．３３分、系統３で４３．４１分である、図１９を参照)。このことから、α−ファルネセンは、A.thalianaの花中で、他のセスキテルペンと一緒に少量産生されるが、遺伝子を加えた場合、対照植物より高い割合で、α−ファルネセンが産生されることが示唆される。
【０１７２】
リンゴ(「ロイヤルガラ」)におけるノーザン分析
方法：
ノーザンブロット分析
Ruegerら(1996)に記載のように、アンチセンスＲＮＡプローブを用いてノーザン分析を行った。α−ファルネセン合成酵素のプローブの鋳型は、以下のプライマーを用いてプラスミドＤＮＡにＰＣＲ(Genius thermocycler、Techne、英国ケンブリッジ)を行うことによって調製した。
57400ＮＦ１ ５−GCACATTAGAGAACCACCAT−３(配列番号：９)および
57400ＮＲ１ ５−TAATACGACTCACTATAGGGATGCTTCCCTTAAGTTTT−３(配列番号：１２)
最終反応物の成分は以下の通りである。最終容量５０ｍＬ中で、１×Ｔａｑポリメラーゼバッファー(Invitrogen)、２００ｍＭ ｄＮＴＰｓ、１．５ｍＭ ＭｇＣｌ2、200ｐＭの各プライマー、５０ｎｇのプラスミド鋳型または２５ｎｇのゲノムＤＮＡ、１単位のＰｌａｔｉｎｕｍ(登録商標)Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼ。ＰＣＲ条件は、９４℃で４分間変性後、９４℃で３０秒間、５５℃で３０秒間、および７２℃で３０秒間のサイクルを２５回であった。
【０１７３】
Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼ(Invitrogen)を用いて、１箇所手を加えた以外は製造者らの説明書に従って、α−ファルネセン合成酵素のプローブの転写反応物を調製した。反応物に７０ｍＭ ＤＩＧ−１１−ＵＴＰ(Roche)を補充し、ＵＴＰを１３０ｍＭに低下させた。転写反応物を、３７℃で１時間インキュベートし、次いで、３７℃でさらに１５分間、総量５０μＬ中１単位のＲＱ１ ＲＮａｓｅフリーＤＮａｓｅ(Promega)で処理した。水で１：８０に希釈したアリコート５ｍＬの２６０ｎｍでの吸光度を測定することにより、ＲＮＡプローブの量を計算した。ＤＩＧの効果のために濃度は半分になり、ハイブリダイゼーションバッファー１ｍＬにつきプローブ１００ｎｇの割合でこれを使用した。載せたＲＮＡが等量であることを、ＲＮＡゲルをエチジウムブロマイドで染色することにより、またブロットを１８ＳリボソームＲＮＡのＰＣＲ産物でプロービングした後に視覚化した。
１８Ｓ−ＲＦＴ：CTGGCACCTTATGAGAAATC(配列番号：１３)
１８Ｓ−ＲＴＲ：CCACCCATAGAATCAAGAAA(配列番号：１４)
５５℃でアニーリングするＲＴ−ＰＣＲを行うと、４２℃でＥａｓｙＨｙｂハイブリダイゼーションを行うための、ＧＣ含量が４０％である３４３ｂｐの産物が得られる。
【０１７４】
１８ＳリボソームＲＮＡのハイブリダイゼーションから計算された、ロード量の違いに合わせて、α−ファルネセン合成酵素ｍＲＮＡレベルを調整した。その結果得られたシグナルを、ＩｍａｇｅＱｕａｎｔソフトウェアを用いて分析し、α−ファルネセン合成酵素ｍＲＮＡレベルのヒストグラムをプロットした。
【０１７５】
仮想ノーザン
ＢＬＡＳＴ ＮＲＤＢ９０サーチ(Altschul et al., 1997)内の遺伝子配列を用いることにより、α−ファルネセン合成酵素に関係するホートリサーチＥＳＴデータベース内のＥＳＴを同定した。データベース中に存在するｃＤＮＡライブラリーの解析から、ＥＳＴ配列が見つかっている組織の「仮想ノーザン」を作成した。
【０１７６】
結果：
仮想ノーザンでは、花芽中における１０００種のＥＳＴの間で１種のＥＳＴが同定され、熟した(１５０ＤＡＦＢ)リンゴ皮中における８０５０種のＥＳＴから２種が同定され、１２６ＤＡＦＢ(満開後の日数)リンゴ皮層における４５００種のＥＳＴから１種が長い３'ＵＴＲとともに同定された。したがって、この遺伝子は、果実の発生の間比較的低いレベルで発現している。
【０１７７】
アオテア、ピンキー、および老化中のロイヤルガラ葉という３つの異なる品種由来の成熟した葉中でＥＳＴが同定された。アオテアおよびピンキー由来のＥＳＴ以外のすべてで、ＤＮＡレベルでの配列は、α−ファルネセン合成酵素ｃＤＮＡ配列と同一であった。相同性を示す他の配列は検出されなかった。
【０１７８】
標準的なノーザン分析では、α−ファルネセン合成酵素の発現は、熟した果実(１５０ＤＡＦＢ)の皮において最も高く、成長中の葉(アオテア)がそれに続いた(図２０）。熟した果実の皮より低いレベルであったが、この遺伝子は果実の成長中ずっと発現していた。花の分裂組織、師部および非常に幼弱な小果実中では、α−ファルネセン合成酵素をコードするｍＲＮＡは、少なすぎて検出できなかった、または存在しなかった。
【０１７９】
系統発生分析：
ヨーロッパ分子生物学オープンソフトウェアセット(European Molecular Biology Open Software Suite)(EMBOSS)(Rice et al., 2000)を用いて、コンピュータ分析を行った。NeedlemanおよびWunsch(J.Mol.Biol. 48； 443-453(1970))のアルゴリズムを使用するペアワイズアラインメントプログラムＮｅｅｄｌｅを用いて、配列同一性および類似性を計算した。そのデフォルトパラメータを使用した(任意配列のギャップ伸長ペナルティは０．５、任意配列のギャップ開始ペナルティは１０)。ＣＬＵＳＴＡＬ Ｘを用いて、配列関連性を分析し、プログラムＧｅｎｅＤｏｃ(Nicholas and Nicholas, 1997)を用いて、これをそろえ、それに影を付けた。近隣結合法を用いて、系統発生樹をＣＬＵＳＴＡＬ Ｘ中で作成し、Treedraw( HYPERLINK "http://taxonomy.zooology.gla.ac.us/rod/treeview.html" http://taxonomy.zooology.gla.ac.us/rod/treeview.html; Page 1996)を用いて、根元から取り上げたこの樹を視覚化した。
【０１８０】
完全長α−ファルネセン合成酵素を、既知の機能を有する他のすべてのテルペン合成酵素配列と比較した(図２１）。これは単一メンバーの分岐を形成し、最も近い相同体であるポプラ由来の２つのイソプレン合成酵素からはっきりと分離していた。独特のグループに分類されることは、そのタンパクの配列が他のセスキテルペン合成酵素とモノテルペン合成酵素のどちらにも似ていないということを補強するものである。ＤＤｘｘＤモチーフの周辺にある活性部位の金属結合領域だけをその一連の配列と比較したときも、これと同様の結果が得られた。簡潔に述べると、この遺伝子は、セスキテルペン合成酵素であると予測されないはずである。
【０１８１】
上記の実施例は本発明の実施を説明するものである。多数の変更形態および変形形態を用いて本発明を実施することができることが、当業者によって理解されるであろう。例えば、このヌクレオチド配列の変形形態を使用することができ、その配列を様々な生物中で発現させることができる。
【図面の簡単な説明】
【０１８２】
【図１】α−ファルネセンの異性体の構造を示す。
【図２】リンゴにおけるα−ファルネセン合成経路を示す。
【図３】α−ファルネセン合成酵素をコードするｃＤＮＡ配列を示す。
【図４】リンゴ皮由来のα−ファルネセン合成酵素の予測されたアミノ酸配列を示す。
【図５】リンゴロイヤルガラ上のヘッドスペースのＧＣ−ＭＳスペクトルを示す。
【図６】α−ファルネセン合成酵素ｃＤＮＡを含む、(結合バッファー中の)ニッケルで精製された無細胞抽出物上のヘッドスペースのＧＣ−ＭＳスペクトルを示す。
【図７】混合異性体の前駆体ＦＤＰの供給に反応して、精製組換えα−ファルネセン合成酵素によってin vitroで産生されるα−ファルネセンの各種異性体形を示す。
【図８】Ｓｅｐｈａｃｒｙｌ Ｓ−３００ ＨＲゲルろ過クロマトグラフィー上でのα−ファルネセン合成酵素のタンパク溶出プロフィル、およびそのおよその分子量を示す。
【図９】Ｓ−Ｓｅｐｈａｃｒｙｌ ３００ ＨＲゲルろ過の適用後における精製タンパク分画のα−ファルネセン合成酵素活性を示す。
【図１０】α−ファルネセン合成酵素活性の最適ｐＨを示す。
【図１１】飽和金属イオンの存在下で、ＦＤＰ濃度を増加させた場合のα−ファルネセン合成酵素活性に対する効果を示す。
【図１２】飽和ＦＤＰ(２５μＭ)を含む条件でのα−ファルネセン合成酵素活性に対するＭｇ2+の効果を示す。
【図１３】飽和ＦＤＰ(２５μＭ)を含む条件でのα−ファルネセン合成酵素活性に対するＭｎ2+の効果を示す。
【図１４】飽和ＦＤＰ(２５μＭ)および金属補助因子Ｍｇ++／Ｍｎ++(７ｍＭ/１５０μＭ)を含む条件で測定された、様々な温度でのα−ファルネセン合成酵素活性を示す。
【図１５】ＦＤＰを浸透させた場合および浸透させない場合のＮ.benthamiana葉におけるＥ，Ｅα−ファルネセン産生を示す一実験の例を示す。
【図１６】α−ファルネセン合成酵素ｃＤＮＡ配列の５'末端から設計したプライマーを用いた、トランスジェニックArabidopsis thaliana植物から抽出されたゲノムＤＮＡのＰＣＲ増幅を示す。
【図１７】トランスジェニックシロイヌナズナ植物から抽出されたゲノムＤＮＡのＢａｍＨ１消化物のサザン分析を示す。
【図１８】トランスジェニックArabidopsis thaliana系統３の植物の実生、葉および花から抽出された全ＲＮＡのＰＣＲ増幅を示す。
【図１９】α−ファルネセン合成酵素遺伝子を発現している系統３の植物由来の、および空のベクターを発現している対照植物由来のA.thalianaの花中に存在するヘッドスペースの揮発性物質を示す。
【図２０】Malus domesticaの様々な組織から抽出した全ＲＮＡのノーザン分析を示す。
【図２１】既知の機能を有するテルペン合成酵素の系統発生分析を示す。
【配列表】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、酵素であるα−ファルネセン合成酵素、およびその酵素をコードするポリヌクレオチド配列に関する。本発明はまた、そのポリヌクレオチド配列を組み込んでいる核酸構築物、ベクターおよび宿主細胞にも関する。本発明はさらに、α−ファルネセンの産生、および昆虫誘引剤、性フェロモンおよび他の生成物などの生成物におけるその使用にも関する。またα−ファルネセンを使用して、香味および芳香として有用な独特の香りを有する他の生成物を作製することができる。
【０００２】
(背景技術)
α−ファルネセン(図１)は、構成的に存在する、または広範囲の種で誘導される非環式セスキテルペン炭化水素(Ｃ15Ｈ24；３,７,11−トリメチル−１,３,６,10−ドデカテトラエン)である。
【０００３】
セスキテルペンの生合成経路は、一般のテルペノイドの経路から分かれており、アリルジリン酸エステルであるファルネシルジリン酸(ＦＤＰ、ＦＰＰとも短縮される)から開始される(Bohlmann, et al., Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.95, 4126-4133 (1998)、 Cane and Bowser, Bioorg.Med.Chem.Lett.9, 1127-1132 (1999)、 Davis and Croteau, Top.Curr.Chem. 209, 53-95(2000))。α−ファルネセンは、カルボカチオン中間体(図２)を介して進行する反応中でＦＤＰから合成され、セスキテルペン合成酵素であるα−ファルネセン合成酵素によって触媒される(Rupasinghe, et al., J.Am.Soc.Hortic.Sci.123, 882-886(1998))。葉緑体内で行われるモノテルペンおよびジテルペンの生合成経路とは異なり、セスキテルペン生合成経路である酢酸／メバロン酸経路は、細胞質に局在する(Croteau, et al., In Biochemistry and Molecular Biology of Plants, eds Buchanan, Gruissem and Jones, American Society of Plant Physiologists, 1250-1318 (2000)、 Lange, et al., Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.97, 13172-13177 (2000))。
【０００４】
しかし、モノテルペンであれ、セスキテルペンであれ、ジテルペンであれ、既知の植物テルペン合成酵素はすべて密接に関係するように思われる。その類似点には、イントロン配列の位置（Trapp and Croteau, Genetics 158, 811-832(2001)）、およびアスパラギン酸に富むＤＤＸＸ(Ｄ,Ｅ)モチーフ(Lesburg, et al., Curr.Opin.Struct.Biol.8, 695-703(1998))などの保存された配列の存在がある。このモチーフは、金属イオン、通常、触媒反応に必要なＭｇ2+の結合に関与する(Lesburg, et al., Curr.Opin.Struct.Biol.8, 695-703(1998))。
【０００５】
α−ファルネセン合成酵素は、リンゴ果実(Malus domesticaデリシャス(Delicious))の皮から部分的に精製されている。しかし、部分的に精製された酵素の回収率が低く、それが不安定であることから、さらなる精製が制限されていた(Rupasinghe, et al., J.Am.Soc.Hortic.125, 111-119(2000))。
【０００６】
α−ファルネセンは昆虫誘引剤である。これはマウスおよび昆虫の性フェロモンである。酸素化された(空気にさらされることで生じる化学物質を含む)α−ファルネセン産物(例えば、ファルネソール、ファルネサール)は独特の香りを有する(香味／芳香としての使用）。α−ファルネセンおよびその誘導体は他に、強力な癌予防剤として、またプラスチックフィルムの合成に使用される。
【０００７】
またα−ファルネセンおよびその酸化産物の両方のレベルと、冷蔵後のリンゴの皮に黒い着色として現れる、収穫後の生理的な異常である表面のやけの発生との間の関係もある(Watkins, et al., Acta.Hort.343, 155-160(1993)、Ju and Bramlage, J.Am.Soc.Hortic.Sci.125, 498-504(2000)、Whitaker and Saftner, J.Agric.Food Chem.48, 2040-2043(2000)、Rowan, et al., J.Agric.Food Chem.49, 2780-2787(2001))。今日まで、α−ファルネセンとやけの因果関係はまだ明らかでない(Ju and Curry, J.Am.Soc.Hortic.Sci.125, 626-629(2000)、Rupasinghe, et al., J.Am.Soc.Hortic.Sci.125, 111-119(2000))。エチレン産生とα−ファルネセン生合成も密接に関係すると思われる(Watkins, et al., Acta Hort. 343, 155-160(1993)、Fan, et al., J.Agric.Food Chem. 47, 3063-3068(1999))。最近、エチレンが、メバロン酸経路上で働くこと、特にヒドロキシメチルグルタリルＣｏＡのメバロン酸への転換を誘導することにより、果実が成熟する間のα−ファルネセン生合成を制御することができることが示されている(Ju and Curry, J.Am.Soc.Hortic.Sci.125, 105-110(2000)、Ju and Curry, Postharvest Biol.Technol. 19, 9-16(2000)、Ju and Curry, J.Am.Soc.Hortic.Sci. 126, 491-495(2001))。
【０００８】
本発明の目的は、α−ファルネセンをin vitroで合成する方法、ならびに／あるいは植物内でのα−ファルネセン合成酵素活性レベルが変わるようにかつ／または有用な選択が公衆に提供されるように植物を遺伝子改変する方法を提供することである。
【０００９】
(発明の概要)
本発明の第１の態様では、α−ファルネセン合成酵素をコードする単離ポリヌクレオチドを提供する。好ましい実施形態では、このポリヌクレオチドは、ＤＤＸＸＤおよび(Ｌ，Ｖ)(Ｖ,Ｌ,Ａ)(Ｎ,Ｄ)(Ｌ,Ｉ,Ｖ)Ｘ(Ｓ,Ｔ)ＸＸＸＥの反復のうち少なくとも１つを含むポリペプチドをコードする。ここでＸは任意のアミノ酸である。
【００１０】
さらなる態様では、本発明は、配列番号：１の単離ポリヌクレオチド(図３に示す）、あるいはα−ファルネセン合成酵素活性を有するポリペプチドをコードするその断片または変異体をも提供する。
【００１１】
さらなる態様では、本発明は、配列番号：２のポリペプチド(図４に示す)をコードする、またはα−ファルネセン合成酵素活性を有するその配列の変異体または断片をコードする単離ポリヌクレオチドを提供する。
【００１２】
さらなる態様では、本発明は単離α−ファルネセン合成酵素ポリペプチドを提供する。
【００１３】
またさらなる態様では、本発明は、配列番号：２の配列を有する単離α−ファルネセン合成酵素、あるいはα−ファルネセン合成酵素活性を有するその断片または変異体を提供する。
【００１４】
本発明のポリペプチドは、α−ファルネセンのin vitroでの調製に有用である。
【００１５】
さらなる態様では、本発明は、本発明のポリヌクレオチドを含む遺伝子構築物を提供する。
【００１６】
またさらなる態様では、本発明は、５'から３'の方向で本発明のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドのオープンリーディングフレームを含む遺伝子構築物を提供する。
【００１７】
好ましくは、この遺伝子構築物はプロモーター配列をも含む。
【００１８】
好ましくは、この遺伝子構築物はさらに終結配列を含む。
【００１９】
他の態様では、本発明は、５'から３'の方向で、本発明のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドとハイブリダイズするポリヌクレオチドを含む遺伝子構築物を提供する。
【００２０】
好ましくは、この遺伝子構築物はプロモーター配列をも含む。
【００２１】
好ましくは、この遺伝子構築物はさらに終結配列を含む。
【００２２】
さらなる態様では、本発明は、本発明の遺伝子構築物を含むベクターを提供する。
【００２３】
さらなる態様では、本発明は、本発明の遺伝子構築物を含む宿主細胞を提供する。
【００２４】
またさらなる態様では、本発明は、本発明の遺伝子構築物を含むトランスジェニック植物細胞を提供する。
【００２５】
さらに本発明は、このような細胞を含むトランスジェニック植物を提供する。
【００２６】
他の態様では、本発明は、α−ファルネセンを調製する方法を提供する。この方法は、
（ａ）高いα−ファルネセン合成酵素活性をもたらすように本発明のポリヌクレオチドで遺伝子改変された細胞を培養するステップと、
（ｂ）必要な場合にこの細胞にファルネシルジリン酸を提供するステップと、
（ｃ）産生したα−ファルネセンを分離するステップとを含む。
【００２７】
本発明のこの方法は、この産物を調製する簡便な方法に生発酵を使用することを可能にする。
【００２８】
さらなる態様では、本発明は、α−ファルネセンを調製する方法を提供する。この方法は、
（ａ）本発明のポリペプチドを得るステップと、
（ｂ）このポリペプチドの存在下でファルネシルジリン酸をインキュベートするステップと、
（ｃ）産生したα−ファルネセンを分離するステップとを含む。
【００２９】
さらなる態様では、本発明は、植物のα−ファルネセン産生を調節する方法を含む。この方法は、α−ファルネセン合成酵素をコードする遺伝子の発現を変化させる遺伝子改変によって達成される、α−ファルネセン合成酵素の発現を増加させるまたは低下させるステップを含む。この改変細胞およびこのような細胞を含む植物も、本発明の一部となる。
【００３０】
本発明のさらなる態様では、配列番号：１に由来する少なくとも１５個の連続したヌクレオチドを含むポリヌクレオチドが提供される。
【００３１】
さらなる態様では、本発明は、α−ファルネセンの含有量が変化した植物を選択する方法を含む。この方法は、
（ａ）α−ファルネセン合成酵素の発現を評価するため、少なくとも１つの植物に由来するポリヌクレオチドを、請求項１に記載のポリヌクレオチドのうち少なくとも１５個の連続したヌクレオチドを含む、少なくとも１つのポリヌクレオチドと接触させるステップと、
（ｂ）発現量の変化を示す植物を選択するステップを含む。
【００３２】
(図面の簡単な説明)
本発明は、以下に添付した図面を参照すると、よりよく理解されるであろう。
【００３３】
図１は、α−ファルネセンの異性体の構造を示す。
【００３４】
図２は、リンゴにおけるα−ファルネセン合成経路を示す。
【００３５】
図３は、α−ファルネセン合成酵素をコードするｃＤＮＡ配列を示す。この配列は、満開から１５０日後(ＤＡＦＢ)のロイヤルガラ(Royal Gala)のリンゴ皮から構築されたｃＤＮＡライブラリーから得られた。
【００３６】
図４は、リンゴ皮由来のα−ファルネセン合成酵素の予測されたアミノ酸配列を示す。触媒反応に必要な金属イオンの結合に関与するＤＤＸＸＤモチーフを太字で示す。高度に保存されたコンセンサス配列(Ｌ,Ｖ)(Ｖ,Ｌ,Ａ)(Ｎ,Ｄ)Ｄ(Ｌ,Ｉ,Ｖ)Ｘ(Ｓ,Ｔ)ＸＸＸＥも金属イオン結合に関与するが、これを下線で示す。
【００３７】
図５は、リンゴロイヤルガラ上のヘッドスペースのＧＣ−ＭＳスペクトルを示す。この図では、保持時間４２．５７分における(Ｅ,Ｅ)α−ファルネセンのピークが示されている。
【００３８】
図６は、α−ファルネセン合成酵素ｃＤＮＡを含む、(結合バッファー中の)ニッケルで精製された無細胞抽出物上のヘッドスペースのＧＣ−ＭＳスペクトルを示す。この図では、(Ｅ,Ｅ)α−ファルネセン(保持時間４３．０９分)および(Ｚ,Ｅ)α−ファルネセン(保持時間４２．２９分)が示されている。
【００３９】
図７は、混合異性体の前駆体ＦＤＰの供給に反応して、精製組換えα−ファルネセン合成酵素によってin vitroで産生されるα−ファルネセンの各種異性体形を示す。
【００４０】
図８は、Ｓｅｐｈａｃｒｙｌ Ｓ−３００ ＨＲゲルろ過クロマトグラフィー上でのα−ファルネセン合成酵素のタンパク溶出プロフィル、およびそのおよその分子量を示す。
【００４１】
図９は、Ｓ−Ｓｅｐｈａｃｒｙｌ ３００ ＨＲゲルろ過の適用後における精製タンパク分画のα−ファルネセン合成酵素活性を示す。
【００４２】
図１０は、α−ファルネセン合成酵素活性の最適ｐＨを示す。データは、１実験につき３回の反復実験に基づく平均値＋平均値のＳＥである。アッセイ条件は、ｐＨ７．５での飽和Ｍｇ++／Ｍｎ++(７ｍＭ/１５０μＭ)を含む。
【００４３】
図１１は、飽和金属イオンの存在下で、ＦＤＰ濃度を増加させた場合のα−ファルネセン合成酵素活性に対する効果を示す。アッセイ条件は、飽和ＦＤＰ(２５μＭ)および飽和Ｍｇ++／Ｍｎ++(７ｍＭ/１５０μＭ)を含む。
【００４４】
図１２は、飽和ＦＤＰ(２５μＭ)を含む条件でのα−ファルネセン合成酵素活性に対するＭｇ2+の効果を示す。
【００４５】
図１３は、飽和ＦＤＰ(２５μＭ)を含む条件でのα−ファルネセン合成酵素活性に対するＭｎ2+の効果を示す。データは１実験につき３回の反復実験の平均値およびＳＥである。
【００４６】
図１４は、飽和ＦＤＰ(２５μＭ)および金属補助因子Ｍｇ++／Ｍｎ++(７ｍＭ/１５０μＭ)を含む条件で測定された、様々な温度でのα−ファルネセン合成酵素活性を示す。
【００４７】
図１５は、ＦＤＰを浸透させた場合および浸透させない場合のＮ.benthamiana葉におけるＥ,Ｅα−ファルネセン産生を示す一実験の例を示す。
【００４８】
図１６は、α−ファルネセン合成酵素ｃＤＮＡ配列の５'末端から設計したプライマーを用いた、トランスジェニックArabidopsis thaliana植物から抽出されたゲノムＤＮＡのＰＣＲ増幅を示す。予想される増幅産物のサイズは５１３ｂｐである。ＭＷと示したレーンは標準的な分子量マーカー(Invitrogen)を表す。１、２、３および４と示したレーンは、α−ファルネセン合成酵素ｃＤＮＡ挿入物を含む、独立したトランスジェニックArabidopsis thaliana系統のレーンである。リンゴと示したレーンは、「ロイヤルガラ」リンゴ皮から抽出された全ＲＮＡのＲＴ−ＰＣＲから得られた増幅産物を示す。
【００４９】
図１７は、プライマー５７４００＿Ａ３(５'AGAGTTCACTTGCAAGCTGA３'(配列番号：３))および５７４００ＮＲ１(５'GGATGCTTCCCT３'(配列番号：４))を用いてＥＳＴ５７４００から増幅した８１０塩基対の32Ｐ標識ＰＣＲ断片をプローブとして用いた、トランスジェニックシロイヌナズナ植物から抽出されたゲノムＤＮＡのＢａｍＨ１消化物のサザン分析を示す。α−ファルネセン合成酵素ｃＤＮＡを含むそのＢａｍＨ１制限断片のサイズは２０５０塩基対である。ＭＷと示したレーンは分子量マーカー(Invitrogen)である。ｐＨＥＸは、α−ファルネセン合成酵素ｃＤＮＡ挿入物を含まず形質転換ベクターのみを含むトランスジェニックシロイヌナズナ植物から抽出されたゲノムＤＮＡを指す。１、２、３および４と示したレーンは、α−ファルネセン合成酵素ｃＤＮＡ挿入物を含む、独立したトランスジェニックシロイヌナズナ系統のレーンである。ｋｂ＝キロ塩基。
【００５０】
図１８は、α−ファルネセン合成酵素ｃＤＮＡ配列の５'末端(a)、内部配列(b)、および３'末端の近く(c)から設計したプライマーを用いた、トランスジェニックArabidopsis thaliana系統３の植物の実生、葉および花から抽出された全ＲＮＡのＰＣＲ増幅を示す。予想される増幅産物のサイズは、(a)で５１３ｂｐ、(b)で３４９ｂｐおよび(c)で１８０ｂｐである。ＭＷと示したレーンは分子量マーカー(Invitrogen)である。１と示したレーンは全ＲＮＡのＰＣＲ増幅から得られた産物を含み、２と示したレーンは全ＲＮＡのＲＴ−ＰＣＲ増幅から得られた産物を含む。ｂｐ＝塩基対。
【００５１】
図１９は、α−ファルネセン合成酵素遺伝子を発現している系統３の植物由来の、および空のベクターを発現している対照植物由来の、Ａ.thalianaの花中に存在するヘッドスペースの揮発性物質を示す。
【００５２】
図２０は、プライマー５７４００ＮＦ１(５'GCACATTAGAGAACCACCAT３'(配列番号：５))および５７４００ＮＲ１(５'GGATGCTTCCCT３'(配列番号：４))を用いてＥＳＴ５７４００から増幅した３５０塩基対のＤＩＧ標識ＰＣＲ断片をプローブとして用いた、Malus domesticaの様々な組織から抽出した全ＲＮＡのノーザン分析を示す。ＤＡＦＢ＝満開後の日数。
【００５３】
Ａ．各組織から抽出した全ＲＮＡ中に存在したα−ファルネセン合成酵素ｍＲＮＡレベルのヒストグラム
Ｂ．１５０ＤＡＦＢの「ロイヤルガラ」の果皮または「アオテア(Aotea)」の成長中の葉中より低いレベルでα−ファルネセン合成酵素を発現している組織から抽出した全ＲＮＡ中に存在したα−ファルネセン合成酵素ｍＲＮＡレベルのヒストグラム
Ｃ．ｉ α−ファルネセン合成酵素ｍＲＮＡのノーザン分析
ii 18ＳリボソームＲＮＡのハイブリダイゼーション。
【００５４】
図２１は、既知の機能を有するテルペン合成酵素の系統発生分析を示し、α−ファルネセン合成酵素が独特のクレードを形成することを示す。
【００５５】
（詳細な説明）
本発明の一実施形態では、α−ファルネセン合成酵素活性を示すように遺伝子改変した細胞を、α−ファルネセン産生に使用する。細胞は潜在的に、培養で増殖させることができるどんな細胞型でもよいが、現在ではα−ファルネセン(ならびにその酸化産物または誘導体)産生に細菌または酵母細胞を使用することが好ましい。本実施形態の生発酵プロセスにおける使用に好ましい細胞は、ＧＲＡＳ認定細胞であり、例えば、適当なＥ.ｃｏｌｉ株、Lactobacillus属、およびビール酵母など他の非病原性のＧＲＡＳ認定細菌または酵母である。
【００５６】
生発酵によって産生されるα−ファルネセン(またはα−ファルネセンの誘導体)は、フェロモンとして昆虫またはげっ歯類の駆除に使用することもでき、食物、薬剤、練り歯磨きまたは香水に対する香りまたは芳香の添加物として使用することもでき、抗癌性、抗カンジダ性、粘膜安定化性、抗炎症性、抗潰瘍性を有する薬剤の製造に使用することもでき、包装、成型物品、特に分解性プラスチック、一般の農芸化学製品の生産、業務用洗浄のための溶媒(例えば殺藻剤)の生産、ならびに溶媒または油を脱蝋するための膜に使用するフィルムおよびポリマーの製造に使用することもできる。
【００５７】
生発酵によるα−ファルネセン産生の代替方法では、α−ファルネセン合成酵素を抽出し、任意選択で固定化し、α−ファルネセン産生に使用することができる。例えば、上記の培養細胞をα−ファルネセン合成酵素の供給源として使用することができる。この酵素は、例えば、ビーズ、例えばアルギン酸ビーズ上に固定化することができる。
【００５８】
本発明の他の態様では、本発明のポリヌクレオチドを使用して、その植物の少なくとも一部でα−ファルネセン合成酵素を過剰発現するトランスジェニック植物を調製することができる。このように、本発明を用いて、花に芳香を付与し、(指標植物、宿主植物、または代替宿主として)昆虫を追い払いまたは引き寄せ、あるいは改変した香りを果実または野菜に付与し、あるいは果実のやけを予防し、あるいは薬剤産物を抽出し、あるいは動物または昆虫に効果がある抽出物を抽出する。
【００５９】
特定の一態様では、本発明のポリヌクレオチドを、バラ目(order Rosaceae)の植物に、特にMalus属に使用して、果実の風味を増加させる。
【００６０】
他の態様では、本発明のポリヌクレオチドを使用して、リンゴ果実中のα−ファルネセン合成酵素活性を低下させる。これはいくつかの方法で達成することができ、例えば、α−ファルネセン合成酵素ポリヌクレオチドがアンチセンスの位置から転写され、それによってα−ファルネセン合成酵素の翻訳が低下するように、リンゴを遺伝子改変することによって達成することができる。この場合このような果実は、冷蔵後におけるリンゴ皮表面のやけの低下を示す可能性もあり、コドリンガなどの昆虫を引き寄せることが少なくなる可能性もある。
【００６１】
他の態様では、本発明は、リンゴ育種に有用な方法を提供する。本発明のポリヌクレオチド配列の断片をプローブまたはプライマーとして使用して、候補となるリンゴの品種の遺伝子の性質をα−ファルネセン合成酵素活性に関して調べることができる。リンゴ果実中にα−ファルネセン合成酵素活性をコードする高レベルのポリヌクレオチドが存在することを利用して、香りが付加されたリンゴを同定することができ、低レベルのポリヌクレオチドが存在することを使用して、貯蔵に好都合な特性または昆虫抵抗性を有するリンゴを同定することができる。
【００６２】
リンゴの１つのポリペプチドであるα−ファルネセン合成酵素のアミノ酸配列、およびそれをコードするポリヌクレオチド配列のアミノ酸配列を図４および図３にそれぞれ示す(配列番号：２および配列番号：１)。しかし、本発明が、図３および４に示す特定のヌクレオチド／アミノ酸配列を有するポリヌクレオチド／ポリペプチドだけに限定されないことは理解されるであろう。そうではなく、本発明は、α−ファルネセン合成酵素活性をコードするまたは有する図３および４のポリヌクレオチド／ポリペプチドの変異体にも及ぶ。
【００６３】
本明細書において「ポリヌクレオチド(群)」という用語は、デオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチド塩基の一本鎖または二本鎖ポリマーを意味し、センス鎖とアンチセンス鎖両方のｈｎＲＮＡおよびｍＲＮＡ分子を含めた、ＤＮＡおよびその対応するＲＮＡ分子を含み、またｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡおよび組換えＤＮＡ、ならびに全体的にまたは部分的に合成されたポリヌクレオチドを含む。ｈｎＲＮＡ分子はイントロンを含み、ＤＮＡ分子に通常１対１で対応する。ｍＲＮＡ分子はイントロンが切り出されたｈｎＲＮＡおよびＤＮＡ分子に対応する。ポリヌクレオチドは遺伝子全体からなるものでもよく、その任意の一部からなるものでもよい。使用可能なアンチセンスポリヌクレオチドは、その対応するポリヌクレオチドの一断片を含むものでもよく、したがって「ポリヌクレオチド」の定義は、すべてのそのような使用可能なアンチセンス断片を含む。
【００６４】
本明細書において「ポリペプチド(群)」という用語は、ペプチド、ポリペプチドおよびタンパクを含む。
【００６５】
「α−ファルネセン合成酵素活性を有する変異体」という語句は、十分同等の機能性を保持しながらポリペプチド／ポリヌクレオチドのアミノ酸／ヌクレオチド配列が変異することが可能であることを認識した上で使用する。この同等物は、例えば、ポリペプチドの断片、ポリペプチドと他のポリペプチドまたは担体との融合物、あるいは断片と追加のアミノ酸との融合物であってもよい。
【００６６】
「単離」ポリペプチドとは、同定され、分離または回収されてその自然環境の成分が大部分なくなった(したがって、ポリペプチドが、その自然環境由来のポリペプチドを少なくとも５０％含み、好ましくは少なくとも８０％を含み、さらに好ましくは少なくとも９０％を含むようになった)ポリペプチドである。「単離」ポリペプチドの用語は、組換え細胞内にあるin situのポリペプチドを含む。しかし、一般に単離ポリペプチドは、少なくとも１つの精製ステップによって調製される。
【００６７】
「単離」ポリヌクレオチドとは、通常それが結合している少なくとも１つの不純なポリヌクレオチドから同定され分離されたヌクレオチド分子である。
【００６８】
変異体ポリヌクレオチド配列は、サイズ、組成、イントロンの位置および数、ならびに翻訳されない末端領域のサイズおよび組成が異なる同等の配列も含む。変異体ポリヌクレオチドは、機能的に同等のポリペプチドをコードするものも含む。
【００６９】
このポリペプチドの活性を担う構造を保存しながら、様々なアミノ酸の置換が可能であることが理解されるであろう。この保存的な置換は、特許文献に、例えば米国特許第5264558号または第5487983号に記載されている。したがって、例えば非極性脂肪族中性アミノ酸であるグリシン、アラニン、プロリン、バリンおよびイソロイシンの間の交換が可能であるはずであることが予想される。同様に、極性脂肪族中性アミノ酸であるセリン、トレオニン、メチオニン、アスパラギンおよびグルタミンの間の置換を行うこともできるはずである。帯電した酸性アミノ酸であるアスパラギン酸とグルタミン酸の間の置換もおそらく行うことができるはずであり、帯電した塩基性アミノ酸であるリシンとアルギニンの間の置換も同様である。フェニルアラニン、ヒスチジン、トリプトファンおよびチロシンを含めた芳香族アミノ酸間の置換も可能である。このような置換および交換は、当業者なら周知である。
【００７０】
それと同様に、単に核酸コードに縮重があるために、特定の産物をコードするヌクレオチド配列がかなり変わることがあり得る。
【００７１】
公的に利用できるコンピュータアルゴリズムを用いて、ポリヌクレオチドまたはポリペプチド配列をアラインし、特定領域における、他の配列と同一のヌクレオチドの百分率を決定することができる。ポリヌクレオチド配列をアラインしてその類似性を同定するための代表的な２つのアルゴリズムは、ＢＬＡＳＴＮおよびＦＡＳＴＡアルゴリズムである。ポリペプチド配列の類似性は、ＢＬＡＳＴＰアルゴリズムを用いて調べることができる。ＢＬＡＳＴＮおよびＢＬＡＳＴＰソフトウェアは、ＮＣＢＩの匿名ＦＴＰサーバー(ftp：//ncbi.nlm.nih.gov)の/blast/executables/で利用可能である。ＢＬＡＳＴＮアルゴリズム第２.０．４版[１９９８年２月２４日]を、本発明の変異体のドキュメンテーションに記載のデフォルトパラメータに合わせて設定した。ＢＬＡＳＴＮおよびＢＬＡＳＴＰを含めたＢＬＡＳＴファミリーのアルゴリズムの使用法は、URL http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/newblast.HtmlにあるＮＣＢＩのウェブサイト、および刊行物Altschul et al.， Nucleic Acids Res. 25, 3389-34023(1997)に記載されている。コンピュータアルゴリズムＦＡＳＴＡは、インターネット上のftpサイトftp：//ftp.Virginia.edu/pub/fasta/で利用可能である。そのドキュメンテーション中に記載され、そのアルゴリズムで分配されたデフォルトパラメータに合わせて設定した第２．０ｕ４版(1996年２月)を、本発明による変異体の決定に使用することも好ましい。ＦＡＳＴＡアルゴリズムの使用法は、Pearson and Lipman Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85, 2444-2448(1998), Pearson Methods in Enzymology 183, 63-98(1990)に記載されている。
【００７２】
以下の実行パラメータは、ＢＬＡＳＴＮを用いて(以下で論ずる)Ｅ値およびパーセント同一性を求めることに寄与するアラインメントおよび類似性を決定するのに好ましい。Ｕｎｉｘ実行コマンドは、blastall -p blastn -d embldb -e 10 -G 1 -E 1 -r 2 -v 50 -b 50 -I queryseq -o resultsであり、パラメータのデフォルト値は以下の通りである。
−ｐ プログラム名[文字列]
−ｄ データベース[文字列]
−ｅ 期待値(Ｅ)[実数]
−Ｇ ギャップを開始するコスト(０はデフォルト挙動を呼び出す)[整数]
−Ｅ キャップを伸張させるコスト(０はデフォルト挙動を呼び出す)[整数]
−ｒ ヌクレオチドがマッチする場合の報酬(blastnのみ)[整数]
−ｖ １行記載の数(ｖ)[整数]
−ｂ 示すべきアラインメントの数(b)[整数]
−ｉ 照会ファイル[ファイル入力]
−ｏ ＢＬＡＳＴ報告出力ファイル[ファイル出力]任意
ＢＬＡＳＴＰには以下の実行パラメータが好ましい。Blastall -p blastp -d swissprotdb -e 10 -G 1 -E 1 -v 50 -b 50 -I queryseq -o results
−ｐ プログラム名[文字列］
−ｄ データベース[文字列］
−ｅ 期待値(Ｅ)[実数］
−Ｇ ギャップを開始するコスト(０はデフォルト挙動を呼び出す)[整数]
−Ｅ キャップを伸張させるコスト(０はデフォルト挙動を呼び出す)[整数]
−ｖ １行記載の数(ｖ)[整数]
−ｂ 示すべきアラインメントの数(ｂ)[整数]
−ｉ 照会ファイル[ファイル入力]
−ｏ ＢＬＡＳＴ報告出力ファイル[ファイル出力］任意
ＢＬＡＳＴＮ、ＢＬＡＳＴＰ、ＦＡＳＴＡ、またはこれらに類似するアルゴリズムによって生じた、照会配列による１つまたは複数のデータベース配列との「ヒット」により、配列の類似部分がアラインされ同定される。このヒットは、類似性の程度、および配列の重複の長さの順に並べられる。データベース配列とのヒットは一般に、照会配列の配列長の一部分だけの重複しか表さない。
【００７３】
ＢＬＡＳＴＮおよびＦＡＳＴＡアルゴリズムによって、アラインメントの「期待」値またはＥ値も生じる。Ｅ値は、特定のサイズのデータベースを検索するとき、特定の数の連続配列を偶然に認めることが「期待」できるヒット数を示す。期待値は、好ましいＥＭＢＬデータベースなどのデータベースとのヒットが真の類似性を示しているかどうかを決定するための有意性の閾値として使用する。例えば、１つのヒットにＥ値０．１とすると、ＥＭＢＬデータベースのサイズのデータベース中で、ただ偶然に、類似スコアで配列のアラインした部分に０．１のマッチする部分を認めることを期待することができるという意味に解釈される。この基準では、配列のアラインしマッチした部分が同一である確率は９０％である。アラインしマッチした部分のＥ値が０．０１以下の配列では、ＢＬＡＳＴＮまたはＦＡＳＴＡアルゴリズムを用いて、ＥＭＢＬデータベース中でマッチを偶然に認める確率は１％以下である。
【００７４】
一実施形態によれば、「変異体」ポリヌクレオチドは、本発明の各ポリヌクレオチドに関して、好ましくは本発明の各ポリヌクレオチドと同数またはそれより少ない数の核酸を有し、本発明のポリヌクレオチドと比較したときＥ値が０．０１以下となる配列を含む。すなわち、変異体ポリヌクレオチドは、上記で論じたパラメータで設定したＢＬＡＳＴＮまたはＦＡＳＴＡアルゴリズムを用いてＥ値が０．０１以下であると測定され、少なくとも９９％の確率で本発明のポリヌクレオチドと同一である任意の配列である。
【００７５】
変異体ポリヌクレオチド配列は一般に、厳格な条件下で上記のポリヌクレオチド配列とハイブリダイズする。本明細書において、「厳格な条件」とは、６Ｘ ＳＳＣ、０．２％ＳＤＳ溶液中で前洗浄し、６５℃、６Ｘ ＳＳＣ、０．２％ＳＤＳで１晩ハイブリダイズさせた後、各回１Ｘ ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ中、６５℃、３０分間で２回洗浄し、各回０．２Ｘ ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ中、６５℃、３０分間で２回洗浄することを指す。本発明の変異体ポリヌクレオチド配列は、長さが少なくとも５０ヌクレオチドである。
【００７６】
変異体ポリヌクレオチドは、本明細書の配列リストに挙げたヌクレオチド配列との配列同一性が少なくとも２５％または少なくとも６０％、一般に７０％、好ましくは８０％、より好ましくは９０％、さらに好ましくは９５％、非常に好ましくは９８％、最も好ましくは９９％以上である配列も含む。
【００７７】
一般に、本発明のα−ファルネセン合成酵素をコードするポリペプチド配列は、開示されたアミノ酸配列と少なくとも２５％または少なくとも５０％、一般に少なくとも６０％、好ましくは７０％、さらに８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、最も好ましくは９９％以上相同性がある。すなわち、配列類似性は２５％から９９％以上の範囲でもよい。さらに本発明は、これらのアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチド配列を含む。
【００７８】
本発明のポリヌクレオチドおよびポリペプチド配列の断片も本発明に包含されている。ポリヌクレオチド断片は、天然タンパクの生物活性を保持するタンパク断片をコードするものでもよい。あるいは、ハイブリダイゼーションプローブとして使用する断片は一般に、生物活性を示す配列をコードするものではない。ポリヌクレオチド断片は、少なくとも１５、２０、３０、５０、１００、２００、４００、または１０００の連続したヌクレオチドから、本明細書で開示された天然ポリヌクレオチド配列の完全長までの範囲でもよい。
【００７９】
本発明のポリペプチド断片は、少なくとも５、１０、１５、３０、５０、７５、１００、１５０、２００、４００、または５００の連続したアミノ酸、または最大で本発明の完全長ポリペプチド中のアミノ酸の合計数を含む。
【００８０】
変異体はまた、同種または他の種由来の(テルペン合成酵素を含めた)遺伝子に由来する(コード領域、非コード領域またはイントロン領域由来の)１つまたは複数のヌクレオチドまたはドメイン／モチーフの再構成、移動または交換を可能とするものであり、ただしこのような変異体は、機能的に同等な本発明のタンパクまたはポリペプチドあるいはその断片を依然として供給するものとする。
【００８１】
もちろん、図４(配列番号：２)の配列を有する、ここに具体的に記載したα−ファルネセン合成酵素との相同体が他の植物に存在することが明らかに企図される。本明細書において「変異体」の語句を使用するとき、このような相同体も含まれる。
【００８２】
本発明のポリヌクレオチド配列は、融合タンパクをコードするように１つまたは複数の追加ポリペプチドあるいはその断片をコードする１つまたは複数の追加配列をさらに含んでもよい。このような組換え発現系には、それだけに限らないが、哺乳動物、細菌および昆虫の発現系が含まれる。無細胞発現系も企図される。
【００８３】
図３(配列番号：１)のα−ファルネセン合成酵素の相同体である、Malus domestica以外の植物由来のＤＮＡ配列を、(例えば私的なまたは公的な配列データベースのコンピュータ支援による検索によって)同定することができる。あるいは、図４の配列に基づくプローブを合成し、それを使用して、ハイブリダイゼーション法を用いて他の植物に由来するｃＤＮＡまたはゲノムＤＮＡライブラリー中の陽性クローンを同定することもできる。逆転写酵素(ＲＴ)−ＰＣＲを含めた、ＰＣＲに基づく技術も使用することができる。プローブおよび／またはＰＣＲプライマーは、長さが少なくとも約１０、好ましくは少なくとも約１５、最も好ましくは約２０ヌクレオチドである。このようなオリゴヌクレオチドプローブの使用に適したハイブリダイゼーション技術またはＰＣＲ技術は、当技術分野において周知である。陽性ライブラリークローンまたはＰＣＲ産物を、制限酵素消化またはＤＮＡシークエンシングなどによって分析することができる。
【００８４】
本発明のポリヌクレオチドは、当技術分野で周知の技術を用いる合成手段によって生成することができる。自動化されたオリゴヌクレオチド合成の設備は、Perkin Elmer/Applied Biosystems Division(米国カリフォルニア州、Foster City)などの製造業者から市販されており、製造業者の説明書に従って操作することができる。
【００８５】
Malus domestica中での対立遺伝子変異が観察されている。品種アオテアのα−ファルネセン合成酵素ポリペプチドは、配列番号：２のものと部分配列で５アミノ酸異なっている。アオテアにおけるα−ファルネセン合成酵素遺伝子の部分ポリヌクレオチド配列およびその対応するポリペプチドは、それぞれ配列番号：６および配列番号：７の配列である。
【００８６】
【表１】
【００８７】
本発明のポリペプチドおよびポリヌクレオチドが同定された結果、植物内でα−ファルネセン活性を調節することができる。調節は、このポリペプチドの発現および／または活性の低下(すなわちサイレンシング)に関係するものであり得る。
【００８８】
このようなサイレンシングを実施するためのどんな従来技術をも使用することができる。処置は、転写後または転写前に行うことができる。さらに、処置は、その遺伝子自体、またはその遺伝子に関係し、そのコードされたポリペプチドの発現に影響を与える制御エレメントに焦点を合わせたものとすることができる。「制御エレメント」は、本明細書においてできるだけ広い意味で用いられ、対象遺伝子と相互作用する他の遺伝子を含む。
【００８９】
転写前の処置は、その遺伝子自体のまたはその制御エレメントの突然変異に関係するものとすることができる。このような突然変異は、点突然変異、フレームシフト突然変異、挿入突然変異または欠失突然変異である可能性がある。いわゆる「ノックアウト」突然変異では、その遺伝子の発現を完全になくすことができる。あるいは、トランスポゾンタギングを使用することもできる。他の手法は、自然に存在するおよび／または人工の転写因子、例えばα−ファルネセン合成酵素遺伝子の内在プロモーターと相互作用するように設計された人工ジンクフィンガータンパク転写因子(例えばhttp：//www.sangamo.com/tech/tech.htmlを参照)の発現によって転写を改変することである。
【００９０】
転写後の処置の例としては、同時抑制またはアンチセンス戦略、ドミナントネガティブ手法、あるいは標的遺伝子の転写後にＲＮＡを消化する、またはその他の方法でＲＮＡにとって致死性となるリボザイムを使用する技術が含まれる。
【００９１】
同時抑制は、例えば、Napoli et al. Plant Cell 2, 279-290(1990)およびde Carvalho Niebel et al. Plant Cell 7, 347-358(1995)で論じられているものと同様に実施することができる。場合によっては、これは、構成的なプロモーターの使用による、対象遺伝子の過剰発現を使用することができる。これはまた、遺伝子由来のイントロン、５'または３'側の非翻訳領域(ＵＴＲ)など遺伝子の非コード領域を用いた植物の形質転換を使用することもできる。
【００９２】
アンチセンス戦略は、標的遺伝子から転写されたｍＲＮＡの翻訳に干渉することができる発現／転写産物の発現または転写を含む。これは通常、標的ｍＲＮＡとハイブリダイズし二重鎖を形成する発現／転写産物によって行われる。
【００９３】
この発現／転写産物は、比較的小さな分子であるが、依然としてｍＲＮＡの翻訳を妨害することができるものでよい。しかし、同様の結果は、アンチセンスの位置にある遺伝子の転写によって生じるＲＮＡが内在性の標的ｍＲＮＡのすべてまたは一部と相補的であるように、アンチセンスの向きにポリヌクレオチド全体を発現させることによって達成される。
【００９４】
アンチセンス戦略は一般に、Robinson-Benion et al. Methods in Enzymol 254, 363-375(1995)およびKawasaki et al., Artific.Organs 20, 836-845(1996)に記載されている。
【００９５】
遺伝子サイレンシング用に設計された遺伝子構築物は逆位反復を含んでもよい。「逆位反復」とは、反復の後半が相補鎖中にある反復配列であり、例えば以下の通りである。
５'−ＧＡＴＣＴＡ．．．．．．．．．ＴＡＧＡＴＣ−３'
３'−ＣＴＡＧＡＴ．．．．．．．．．ＡＴＣＴＡＧ−５'
形成された転写物は、相補的塩基対形成を経て、反復領域間に少なくとも３〜５ｂｐのスペーサーが存在するという条件でヘアピン構造を形成することができる。
【００９６】
他の手法は、転写物を標的とする、ｍｉＲＮＡ(Llave et al., Science 297, 2053-2056(2002))と同等の小さなアンチセンスＲＮＡを開発することであり、これを標的遺伝子サイレンシングに使用することができる。
【００９７】
ポリペプチド発現を制御するためのリボザイムによる手法は、リボザイム構築物(McIntyre Transgenic Res.5 257-262(1996))内に適当な配列またはサブ配列（例えばＤＮＡまたはＲＮＡ）を挿入する。リボザイムは、２つの領域に相補的なハイブリダイズ領域を含む合成ＲＮＡ分子であり、その２つの領域のそれぞれは、本発明のポリヌクレオチドの１つによってコードされたｍＲＮＡ分子の少なくとも５つの連続したヌクレオチドを含む。リボザイムは、極めて特異的なエンドヌクレアーゼ活性を有し、ｍＲＮＡを自己触媒的に切断する。
【００９８】
ダイサー技術(Stratagene)の使用も企図される。
【００９９】
あるいは、調節は、宿主ゲノム中で、対応するポリヌクレオチドを過剰発現させることによる、または対応するポリヌクレオチドのコピー数を増加させることによるポリペプチドの発現および／または活性の増大に関係するものでもあり得る。
【０１００】
遺伝子サイレンシングの保持で論じたように、過剰発現の手法は、その遺伝子自体、またはその遺伝子に関係し、そのコードされたポリペプチドの発現に影響を与える制御エレメントに焦点を合わせたものとすることができる。「制御エレメント」は、本明細書においてできるだけ広い意味で用いられ、対象遺伝子と相互作用する他の遺伝子を含む。他の手法は、自然に存在する転写因子、および／または人工の転写因子、例えばα−ファルネセン合成酵素遺伝子の内在プロモーターと相互作用するように設計された人工ジンクフィンガータンパク転写因子(例えばhttp：//www.sangamo.com/tech/tech.htmlを参照)の発現によって転写を改変することである。
【０１０１】
「遺伝子構築物」という用語は、それだけに限らないが、ｃＤＮＡ分子など他のポリヌクレオチド分子(挿入ポリヌクレオチド分子）をその中に挿入することができるポリヌクレオチド分子、通常二本鎖ＤＮＡを指す。遺伝子構築物は、挿入ポリヌクレオチド分子を転写し、場合によってはその転写物を翻訳してポリペプチドにすることが可能となるのに必要な成分を含むことができる。挿入ポリヌクレオチド分子は、宿主細胞に由来するものでもよく、それと異なる細胞または生物に由来するものでもよく、かつ／または組換えポリヌクレオチドでもよい。宿主細胞の内部に入った後、遺伝子構築物は、宿主染色体ＤＮＡ中に組み込まれることができる。遺伝子構築物は、ベクターへと系統化することができる。
【０１０２】
上記の戦略を実行するため、本発明はまた、遺伝子構築物、通常ＤＮＡ構築物も提供する。このＤＮＡ構築物は、(センスまたはアンチセンスの位置にある本発明の１つまたは複数のコピーのポリヌクレオチド配列、あるいは適切なリボザイムをコードするポリヌクレオチドなど)所期のＤＮＡ、好ましくは、転写すべきＤＮＡ配列と作動的に結合した(遺伝子の発現を制御する)プロモーター配列および終結配列を含む。プロモーター配列は一般に、転写すべきＤＮＡ配列の５'末端側に位置し、ＤＮＡ配列の転写を開始するのに使用する。プロモーター配列は、一般に遺伝子の５'側の非コード領域に認められるが、イントロン中(Luehrsen Mol.Gen.Genet 225, 81-93(1991))に存在することもあり、コード領域中に存在することもある。
【０１０３】
本発明のＤＮＡ構築物中に有用に使用することができる様々なプロモーター配列は、当技術分野で周知である。プロモーター配列は、また終結配列も、プロモーターおよび終結配列が標的宿主中で機能するという条件のもとで、標的植物宿主に内在するものでもよく、外来のものでもよい。例えば、プロモーターおよび終結配列は、他の植物種、植物ウイルス、細菌プラスミドなどに由来するものでもよい。プロモーターおよび終結配列は、α−ファルネセン合成酵素遺伝子と生体内で関係するものが好ましい。
【０１０４】
プロモーターの選択に影響を与える因子として、構築物の所望の組織に対する特異性、ならびに転写および翻訳のタイミングがある。例えば、３５Ｓカリフラワーモザイクウイルス(ＣａＭＶ ３５Ｓ)プロモーターなどの構成的なプロモーターは、植物のすべての部分の転写に影響を及ぼす。組織特異的プロモーターを使用すると、対象組織中だけで所望のセンスまたはアンチセンスＲＮＡが産生される。誘導性プロモーター配列を使用しているＤＮＡ構築物を用いると、化学物質、光、熱、嫌気性ストレス、栄養状態の変化などの外部刺激により、ＲＮＡポリメラーゼの結合および転写開始の速度を調節することができる。一時的に制御されるプロモーターを使用して、形質転換細胞の発生の間の特定の時間にＲＮＡポリメラーゼの結合および転写開始の速度の調節を実施することができる。好ましくは、問題の遺伝子由来の元のプロモーター、または形質転換すべき生物中の特定組織標的遺伝子由来のプロモーターを使用する。本発明において有用に使用することができるプロモーターの他の例として、マンノピン合成酵素(ｍａｓ)、オクトピン合成酵素(ｏｃｓ)およびChua et al. Science 244, 174-181(1989)に総説が記載されているものがある。
【０１０５】
転写すべきＤＮＡ配列の３'側に位置する終結配列は、プロモーター配列と同じ遺伝子に由来するものでもよく、それと異なる遺伝子に由来するものでもよい。Agrobacterium tumefaciensのノパリン合成酵素遺伝子の３'末端など、当技術分野で知られている多くの終結配列は通常、本発明において使用することができる。しかし、好ましい終結配列は、元の遺伝子由来の、または形質転換すべき標的種由来のものである。
【０１０６】
本発明のＤＮＡ構築物はまた、その構築物を含む形質転換細胞の検出を可能にするのに細胞中で有効な選択マーカーを含むことができる。そのようなマーカーは、当技術分野で周知であり、通常、１つまたは複数の毒素に対する耐性を与える。そのようなマーカーの１つの例は、ＮＰＴＩＩ遺伝子であり、その発現により、通常、中程度の濃度で植物細胞に毒性を示す抗生物質であるカナマイシンまたはヒグロマイシンに対する耐性が生じる。あるいは、ＰＣＲ、サザンブロットなど当技術分野で周知の他の技術を用いて、所望の構築物が形質転換細胞中に存在するかどうかを決定することもできる。
【０１０７】
本発明のＤＮＡ構築物の成分を作動的に結合させる技術は、当技術分野で周知であり、１つまたは複数の制限エンドヌクレアーゼ部位を有する合成リンカーの使用を含む。ＤＮＡ構築物は、少なくとも１つの系、例えばＥ.ｃｏｌｉ中で複製することができるベクターと結合させることができ、それによって、各操作後、得られた構築物の配列を決定し、操作が正しいかどうかを決定することができる。
【０１０８】
本発明のＤＮＡ構築物を使用して、農業用、観賞用、および園芸用植物を含めた様々な植物を形質転換することができる。好ましい実施形態では、ＤＮＡ構築物を使用して植物リンゴ、バナナ、キウイフルーツ、トマト、ワタ、バラ、オリーブ、ジャガイモ、カーネーション、ツクバネアサガオ、マンゴー、パパイヤ、トルコキキョウ(lisianthus）、キク、イネ、茶、ホップ、およびランを形質転換する。
【０１０９】
上記で論じたように、本発明のポリヌクレオチド配列を含むオープンリーディングフレームを含み、そのオープンリーディングフレームがセンス方向に向いているＤＮＡ構築物を用いて植物を形質転換すると、場合によっては、同時抑制によりそのポリペプチドの発現低下が生じ得る。アンチセンスの向きの遺伝子のオープンリーディングフレームまたは非コード(非翻訳）領域を含むＤＮＡ構築物を用いて植物を形質転換すると、形質転換植物におけるポリペプチドの発現低下が生じる。
【０１１０】
細菌(例えば、Ｅ.ｃｏｌｉ、Agrobacterium)、真菌、昆虫、および動物細胞など周知の原核細胞および真核細胞を含めて、他の非植物宿主の形質転換が、実現可能であり、予想されることも理解されるであろう。これにより、本発明の組換えポリペプチドまたはその変異体の産生が可能となるはずである。組換えタンパクの産生に無細胞系(例えば、Roche Rapid Translation System)を使用することも予想される(Zubay Annu Rev Genet 7, 267-287(1973)）。
【０１１１】
周知の技術を用いて、そのような任意の宿主中で産生された本発明のポリペプチドをそれから単離し精製することができる。α−ファルネセンの酵素合成のための無細胞系においてこのポリペプチドを使用することができる。
【０１１２】
標的植物のゲノム中にＤＮＡ構築物を安定に組み込む技術は、当技術分野で周知であり、これには、Agrobacterium tumefaciensが媒介する導入、エレクトロポレーション、プロトプラストとの融合、生殖器官中への注入、未熟胚中への注入、高速遺伝子銃による導入(high velocity projectile introduction)、花の浸漬(floral dipping)などがある。技術の選択は形質転換すべき標的植物によって決まる。
【０１１３】
細胞を形質転換した後、上記で論じたカナマイシン耐性マーカーなどのマーカーを用いて、ＤＮＡ構築物がそのゲノム中に組み込まれた細胞を選択することができる。次いで、当技術分野で周知の技術を用いて、トランスジェニック細胞を適切な培地中で培養して、植物全体を再生させることができる。プロトプラストの場合、適切な浸透条件下で細胞壁を再形成させることが可能である。種子または胚の場合、適切な発芽またはカルス誘導培地を使用する。外植片には適切な再生培地を使用する。
【０１１４】
上記した方法に加えて、裸子植物類、被子植物類、単子葉類および双子葉類を含めた、多種多様な植物種中にＤＮＡ構築物を移入する複数の方法が当技術分野で周知である。
【０１１５】
当技術分野で周知の技術を用いて、得られた形質転換植物を有性生殖でまたは無性生殖で再生して、世代が継続するトランスジェニック植物を得ることができる。
【０１１６】
本明細書において提供したヌクレオチド配列の情報は、例えば、他の生物または組織、特に植物由来の核酸変異体を同定し、α−ファルネセン合成酵素またはその同等物中の変異を有し、その変異によってそれを有する植物が有用となるような植物を予め選択するプログラムにおいても有用である。これによって、α−ファルネセンおよびその誘導体の含有量が調節された植物を生成する育種プログラムが促進される。より具体的には、本明細書において提供したヌクレオチド配列情報を用いて、α−ファルネセン合成酵素のプロービングまたは増幅のためのプローブおよびプライマーを設計することができる。プロービングまたはＰＣＲに使用するオリゴヌクレオチドは、長さ約３０ヌクレオチド以下でもよい。一般に、特異的なプライマーは、長さ１４ヌクレオチドより長い。最適な特異性および費用有効性を得るには、長鎖１６〜２４ヌクレオチドのプライマーが好ましい。当業者なら、ＰＣＲなどのプロセスで使用するプライマーの設計について熟知している。
【０１１７】
必要な場合、本明細書で開示された遺伝子の制限断片全体を用いて、プロービングを行うことができる。もちろん、図４に基づいた配列またはその相補体を使用することができる。このようなプローブおよびプライマーも本発明の一態様をなす。
【０１１８】
本発明によって提供された配列情報を用いて、任意の種から本発明のポリヌクレオチドの変異体を発見する方法には、それだけに限らないが、ｃＤＮＡライブラリーのスクリーニング、ＲＴ−ＰＣＲ、ゲノムライブラリーのスクリーニングならびにコンピュータ支援によるＥＳＴ、ｃＤＮＡおよびゲノムデータベースの検索がある。このような方法は当業者に周知である。
【０１１９】
次に、以下の非限定的な実施例に関して、本発明を説明する。
【０１２０】
(実施例)
以下の実施例は、本発明の実施をさらに説明するものである。
【０１２１】
実施例１ α−ファルネセン合成酵素遺伝子の同定
植物材料およびＧＣ−ＭＳ分析：ニュージーランド、ホークスベイにあるホートリサーチ果樹園(A HortResearch orchard at Hawkes Bay, New Zealand)で成長したロイヤルガラの木から、木で熟した１５０ＤＡＦＢのリンゴ(Malus domestica)を収穫した。１２個の果実を分析用に選択し、すりガラスの平らなフランジ継ぎ手付きの５Ｌの広口丸底サンプリング容器に入れた。この容器をガラス蓋で覆い、すりガラス製継手を、ガス線、およびクロモソーブ１０５(Chromosorb 105)１００ｍｇを含む揮発性物質吸着剤カートリッジを含む挿入口で密封した。フラスコ内のヘッドスペースを２５．０ｍｌ/分のＮ2(ｇ)でパージしながら１５分間トラップした後、ヘッドスペースを２３℃で１時間平衡状態にした。分析の前に、３５℃で、１０ｐｓｉのＮ2(ｇ)流量でクロモソーブカートリッジを１５分間乾燥させた。１５０℃で３分間、クロモソーブトラップからガスクロマトグラフ(ＧＣ)ＨＰ５８９０の注入口中へと、熱により揮発性物質を脱着させた。このＧＣシステムは、３０ｍ×内径０．３２ｍｍであり、フィルムの厚さが０．５μｍであるＤＢ−Ｗａｘキャピラリーカラム(Ｊ＆Ｗ Scientific、米国、Folsom)を備えていた。担体ガスは、流速３０ｃｍ/秒のヘリウムであった。ＧＣオーブンを、６分間３０℃の状態を保ち、次いで３℃/分で１０２℃に上昇させた後、５℃/分で１９０℃に上昇させ、この温度を５分間維持するようにプログラムした。カラムの出口を、質量分析計(ＶＧ７０ＳＥ)、さらにＧＣ水素炎イオン化検出器に分岐させた(ＧＣ−ＦＩＤ／ＭＳ)。７０ｅＶ、スキャン範囲３０〜３２０ａｍｕの電子衝撃イオン化(ＥＩ−ＭＳ)モードで質量分析計を操作した。成分の同定に、標準物質の質量スペクトル、ライブラリースペクトル(ＮＩＳＴおよび本発明者ら所有のもの)およびＧＣ保持指標を助けとして用いた。標準物質に対する試料のピーク面積を測定することによって定量データを得た。
【０１２２】
ｍＲＮＡの単離、およびｃＤＮＡライブラリーの構築：１５０ＤＡＦＢのリンゴの皮を皮むき器でむき、ＧｏｍｅｚおよびＧｏｍｅｚの方法(Langenkamper, et al., Plant Mol.Biol.36, 857-869(1998))に手を加えた方法により、むいた皮から全ＲＮＡを抽出した。オリゴ(ｄＴ)セルロースクロマトグラフィー(Pharmacia)によって全ＲＮＡから精製したｍＲＮＡを用いて、λＺＡＰ−ＣＭＶ(Stratagene)ｃＤＮＡライブラリーを、製造者の説明書に従って構築した。ｃＤＮＡを含むｐＢＫ−ＣＭＶプラスミドをまとめて切り出し、これを用いてＥ.ｃｏｌｉ ＸＬＯＬＲ(Stratagene)を形質転換した。プラスミドをＸＬＯＬＲコロニーから単離し、部分的に配列を決定した。ＮＲＢＤ９０データベース(Altschul, et al., Nucleic Acids Res. 25, 3389-3402(1997))に対して、このデータベース上のすべての配列をＢＬＡＳＴ分析し、鍵となるモチーフに基づいた、既知のテルペン合成酵素との類似性により、推定テルペン合成酵素ｃＤＮＡ配列を同定した。完全長テルペン合成酵素配列(ＥＳＴ５７４００)を同定し、そのポリヌクレオチド配列を決定した。
【０１２３】
ｐＥＴ−３０へのクローニング：機能的発現を行うために、ｐＢＫ−ＣＭＶ５７４００から、開始ＡＴＧのすぐ隣りにあるＥｃｏＲＩ制限エンドヌクレアーゼ部位およびベクターのＸｈｏＩ制限部位を用いて、ＥＳＴ５７４００をコードするｃＤＮＡ断片を切り出した。次いで、同様にＥｃｏＲＩおよびＸｈｏＩで消化した発現ベクターｐＥＴ−３０ａ(Novagen)に、得られた１８９９ｂｐのｃＤＮＡ配列を、フレームを合わせてサブクローン化し、その結果プラスミドｐＥＴ−３０ａ５７４００が生じた。次いでプラスミドｐＥＴ−３０ａ５７４００で、Ｅ.ｃｏｌｉ ＢＬ２１−ＣｏｄｏｎＰｌｕｓ(商標)−ＲＩＬ細胞(Stratagene)を形質転換した。挿入ｃＤＮＡのフレームが合っていることを保証するために、クローンの５'末端の配列を再び決定した。
【０１２４】
細菌培養物由来α−ファルネセン合成酵素の発現および特徴付け：カナマイシン３０μｇ/ｍｌおよびクロラムフェニコール５０μｇ/ｍｌを補充したＬＢ(Lauria-Bertani)培地中で、ｐＥＴ−３０ａ５７４００、および対照としての空のｐＥＴ−３０ベクターを含むＥ.ｃｏｌｉ ＢＬ２１-Ｐｌｕｓ(商標)-ＲＩＬ細胞を３７℃で１晩増殖させた。１晩培養物のアリコート５００μｌを使用して、カナマイシン３０μｇ/ｍｌおよびクロラムフェニコール５０μｇ/ｍｌを補充した新鮮２×ＹＴ培地５０ｍｌに接種した。この培養物を、３７℃で激しく振盪してＡ600＝０．６に増殖させた後、０．３ｍＭのイソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド(ＩＰＴＧ)を用いて誘導し、ファルネシルジリン酸(ＦＤＰ)(１０μＭ)を同時に加えた。実験に応じて、３０℃、１６℃または３７℃のインキュベーターに培養物を直ちに移した。
【０１２５】
細菌培養物のヘッドスペース分析：固相マイクロ抽出(ＳＰＭＥ)を用いて、細菌培養物上の容器内ヘッドスペースを、ＦＤＰを加えた後直ちに収集した。ＳＰＭＥファイバー(６５μｍ ＰＤＭＳ/ＤＶＢ、オーストラリア、Supelco)を４５分間２６０℃にし、使用前にＧＣ−ＦＩＤ(ＨＰ５８９０)を用いて、これに混入があるかどうかバックグラウンドの分析を行った。ヘッドスペースの揮発性物質を、３０℃で４時間連続振盪(１１０ｒｐｍ)して収集した。ＧＣ−ＦＩＤ/ＭＳを用いた分析の前に、隔壁で密封したガラス容器中の周囲温度でファイバーを貯蔵した。２５０℃で５分間、ＧＣ注入口内でファイバーから揮発性物質を脱着させた。このＧＣシステムは、３０ｍ×内径０．２５ｍｍであり、フィルムの厚さが０．５μｍであるＤＢ−Ｗａｘキャピラリーカラム(Ｊ＆Ｗ Scientific、米国、Folsom)を備えていた。担体ガスは、流速30ｃｍ/秒のヘリウムであった。ＧＣオーブンを、６分間３０℃の状態を保ち、次いで３℃/分で１０２℃に上昇させた後、５℃/分で２１０℃に上昇させ、この温度を１１分間維持するようにプログラムした。７０ｅＶ、スキャン範囲３０〜３２０ａｍｕの電子衝撃イオン化(ＥＩ−ＭＳ)モードで質量分析計を操作した。試料のスペクトルをＮＩＳＴ、Ｗｉｌｅｙ由来のもの、および本発明者ら所有の質量スペクトルライブラリーと比較することによって、ピークの同定を実施し、標準物質の保持指標および文献の値(Davies， J.Chrom. 503, 1-24,(1990))によってそれを確認した。ＦＤＰと同時に培養物に加えた内部標準であるヘキサデカンに対する試料のピーク面積を測定することによって、定量データを得た。
【０１２６】
誘導培養物および非誘導培養物の発現の時間経過：ｐＥＴ−３０ａ５７４００を含む細菌培養物６×５０ｍｌを上記のように調製した。Ａ600＝０．６の時点で、３つの培養物に０．３ｍＭのＩＰＴＧで誘導を行ったが、残りの培養物には誘導を行わなかった。次いで培養物を３０℃で、１時間、３時間、または５時間インキュベートし、ヘッドスペースの揮発性物質を上記に記載したように収集した。
【０１２７】
細菌抽出物由来α−ファルネセン合成酵素および部分精製α−ファルネセン合成酵素組換えタンパクの特徴付け：上記のように、培養を開始し、培養物を増殖させ誘導した。誘導後、培養物を２４℃のインキュベーターに直ちに移し、連続振盪してさらに１８〜２０時間増殖させ、細胞を遠心(２０００×ｇで１０分間)によって回収した。結合バッファー(５ｍＭイミダゾール、０．５ｍＭ ＮａＣｌ、１０ｍＭ ＤＴＴ、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ(ｐＨ７．９))２０ｍｌまたは抽出バッファー(２５ｍＭ ＭＯＰＳ(ｐＨ７．０)、１０ｍＭアスコルビン酸ナトリウム、２５ｍＭ ＫＣｌ、１０ｍＭ ＤＴＴ、１０％グリセロール)２０ｍｌ中で、ペレットにした細胞を再懸濁させた。１２７００ｐｓｉでフレンチプレス細胞破砕機(French Pressure Cell Press)(American Instrument Co. Inc、米国メリーランド州シルバースプリング(Silver Spring))に２回かけて細胞を破砕し、次いでこれを８０００×ｇで１５分間遠心した。上清５ｍｌを５０ｍｌ試験管に移し、１０ｍＭ ＭｇＣｌ2および２０μＭ ＭｎＣｌ2に調節した。ＦＤＰ１００μＭ)を加え、反応混合物を３０℃でインキュベートした。培養物全体の場合と同様にヘッドスペースの揮発性物質を収集した。(ＤＴＴを省いた)結合または抽出バッファーで予め平衡化したＰＤ−１０ゲル濾過カラム(Amersham-Pharmacia Biotech)に抽出物の残り(１５ｍｌ)を入れた。次いで溶出分画を貯留し、固定化金属アフィニティークロマトグラフィー(ＩＭＡＣ)を用いて、組換えタンパクの精製を１ステップで実施した。Ｎｉ+に帯電したハイトラップキレーティングＨＰカラム(Hi-trap Chelating HP column)(Amersham-Pharmacia Biotech)に溶出液を入れた。非結合タンパクを除去し、製造者の説明書に従って組換えタンパクを溶出させた。溶出タンパクの試料５ｍｌを、５０ｍｌ試験管に移し、１０ｍＭ ＭｇＣｌ2および２０μＭ ＭｎＣｌ2に調節し、１０μＭのＦＤＰを加えた。細菌培養物の場合と同様にヘッドスペースの揮発性物質を収集した。残っている組換えタンパクのアリコートを２０％グリセロール中で−８０℃で必要となるまで貯蔵した。
【０１２８】
電気泳動およびウェスタン分析：培養物そのもの、フレンチプレスしたＨｉｓ精製および非Ｈｉｓ精製タンパク抽出物を、１０％ポリアクリルアミドゲルを用いてＳＤＳ−ＰＡＧＥで分析した。タンパクバンドを、コロイドクマシー(Colloidal Coomassie)を用いて視覚化し、またはＩｍｍｏｂｉｌｉｎ−Ｐ ＰＶＤＦ膜(Millipore)上に移した。ブロットしたタンパクを、抗Ｈｉｓ6モノクローナル(Roche)第１抗体および抗マウスＩｇＧ−ＡＰ(Stressgen)第２抗体とともにインキュベートし、１−ＳＴＥＰ(商標)ＮＢＴ／ＢＣＩＰ(Pierce)アルカリホスファターゼ検出試薬を用いて検出した。
【０１２９】
タンパク定量：Ｓｐｅｃｔｒｏｍａｘ Ｐｌｕｓ分光光度計を用い、ウシ血清アルブミン(ＢＳＡ)を標準物質として用い、製造者の説明書に従ってＢｉｏｒａｄのキットを用いるブラッドフォード(Bradford)法によって、抽出物および部分精製組換えタンパクのタンパク濃度を決定した。
【０１３０】
(結果)
１５０ＤＡＦＢのリンゴから放出された揮発性物質のヘッドスペース分析：α−ファルネセンが、リンゴ皮組織中で合成され、ヘッドスペース分析において検出されることは十分に認められている。通常、(Ｅ,Ｅ)および(Ｚ,Ｅ)α−ファルネセンというα−ファルネセンの２つの異性体がリンゴ皮中にみられる(Matich et al., Anal.Chem.68, 4114-4118(1996)、Bengtsson, et al., J.Agric.Food Chem. 49, 3736-3741(2001))。この２つの異性体は通常、１００：１の比でそれぞれ同定される(Matich, et al., Anal.Chem.68, 4114-4118(1996))。分析した１５０ＤＡＦＢのリンゴのヘッドスペース中では、α−ファルネセンの「全トランス」型(Ｅ,Ｅ)異性体しか同定されなかった(図５)。この異性体は低レベルで存在し、(Ｅ,Ｅ)α−ファルネセンは１果実につき平均４ｎｇであった。(Ｅ,Ｅ)α−ファルネセン異性体は保持時間４２．５７分であり、これを使用して、この化合物のコバッツ(Kovats)保持指標を計算した。保持指標および質量スペクトルによって、この化合物は(Ｅ,Ｅ)α−ファルネセンとして陽性に同定された。
【０１３１】
α−ファルネセン合成酵素の配列分析：α−ファルネセン合成酵素をコードする、ｐＢＫ−ＣＭＶ中のｃＤＮＡの配列決定から、挿入物のサイズがポリ(Ａ)尾部を除いて１９２６塩基対であることが明らかとなった(図３、配列番号：１)。ｃＤＮＡ配列は、５'末端から６１塩基にある推定開始メチオニンから開始する５７６アミノ酸の予想ＯＲＦを有していた(図４、配列番号：２)。α−ファルネセン合成酵素の分子量は、６６ｋＤと予測されている。α−ファルネセン合成酵素の予想アミノ酸配列は、葉緑体シグナリング(chloroplast-signalling)ペプチド配列を有さず(Emanuelsson， et al., 300, 1005-1016(2000))、このことは、モノテルペンおよびジテルペン合成酵素に特徴的である。他のすべてのテルペン合成酵素で認められているように、α−ファルネセン合成酵素の予想アミノ酸配列は、触媒作用に必要な金属イオンの結合に関与するＤＤＸＸ(Ｄ,Ｅ)モチーフ(ＤＤＶＹＤ)をアミノ酸３２６〜３３０に含む。α−ファルネセン合成酵素は、被子植物セスキテルペンコンセンサス配列ＧＶＹＸＥＰを含まないことが判明したが(Cai et al Phytochem 61, 523-529(2002))、その代わりに極めて類似するＧＶＡＦＥＰモチーフをアミノ酸３０１〜３０６に含んでいる。これがＲＲＸ8Ｗモチーフをアミノ酸３３〜４３に含むことも判明したが、このことは、Ｔｐｓ−ｄおよびＴｐｓ−ｂモノテルペン合成酵素の共通の特徴である(Duderava,N., Martin,D., Kish,C.M., Kolosova,N., Gorenstein,N., Faldt,J., Miller,B., and Bohlmann,J. (2003) Plant Cell. 15, 1227-1241)。
【０１３２】
Bohlmann、Meyer-GauenおよびCroteau(Proc.Natl.Acad.Sci.USA 95, 4126-4133(1998))は、３３種のテルペン合成酵素のアミノ酸配列を比較し、７つの完全に保存されているアミノ酸残基が存在することを示した。α−ファルネセン合成酵素は、この７つの完全に保存されたアミノ酸のうち６つを含む。彼らは、芳香族アミノ酸の６つの位置が完全に保存され、酸性アミノ酸の４つの位置が完全に保存されていることも発見した。α−ファルネセン合成酵素では、芳香族アミノ酸の位置６つのうち４つが、酸性アミノ酸の位置４つのうちすべてが保存されている。
【０１３３】
α−ファルネセン合成酵素(セスキテルペン合成酵素)の予想アミノ酸配列は、Cinnamomum tenuipilum由来の推定モノテルペンのアミノ酸配列に最もよく似ており(Zeng et al, Genbank CAD29734, 2002)、予想アミノ酸３４〜５７４での同一性が３９．８％、類似性が５６．３％である。Melaleuca alternifolia(ティーツリー)由来の推定モノテルペン合成酵素(Shelton et al, Genebank AAP40638,2003)は、類似性が２番目に高く、予想アミノ酸３４〜５７４での同一性が３８．７％、類似性が５４．１％であり、Quercus ilex(トキワガシ(holly oak))由来の推定モノテルペン合成酵素(Fischbach， Genbank CAC41012, 2001)では、予想アミノ酸３４〜５７４での同一性が３７．９％、類似性が５５．８％である。
【０１３４】
α−ファルネセン合成酵素の核酸配列は、少数のセスキテルペン合成酵素のｍＲＮＡの非常に短い部分と相同性を示す。相同性領域の１つは、ヌクレオチド９１８〜９４６に存在する。例えば、Gossypium arboreum(キダチワタ(tree cotton))由来のカジネン合成酵素(Chen, Wang, Chen, Davisson and Heinstein, 1996)は、ヌクレオチド９１８〜９４６の領域中で２５のうち２４の同一塩基を有し、Artemisia annua由来の推定セスキテルペン合成酵素は、この領域中で２６塩基のうち２５が同一である(Van Geldre et al.， Plant Sci. 158, 163-171(2000))。ヌクレオチド３６７〜３８６では、Abies grandis(グランドファー(grand fir))のＥ−ａ−ビサボレン合成酵素は２０のうち２０の同一塩基を有する。
【０１３５】
α−ファルネセン合成酵素合成酵素の予想等電点は５．１であり、これは他のセスキテルペン合成酵素で計算された等電点と類似している。例えば、Artemisia annuaから単離された２つのセスキテルペン合成酵素ｃＡＳＣ３４およびｃＡＳＣ１２５は、等電点がそれぞれ５．２８および５．５０である(Van Geldre et al., Plant Sci. 158, 163-171(2000))。
【０１３６】
α−ファルネセン合成酵素のｃＤＮＡ配列(ＥＳＴ５７４００)は、ロイヤルガラの１５０ＤＡＦＢのリンゴ皮から構築したｃＤＮＡライブラリーから得られた。配列決定した５'末端のポリヌクレオチドがＥＳＴ５７４００と同一である他の切断型ｃＤＮＡも３つ単離された。そのうち、１つはロイヤルガラ１２６ＤＡＦＢの果実の皮層に由来し、１つはロイヤルガラの花芽に由来し、第３の切断型はピンキー(Pinkie）の葉に由来する。アオテアの葉から得られた他の切断型ｃＤＮＡは、配列決定した６７５塩基のうち７塩基対が異なり、その結果５アミノ酸が変化する。
【０１３７】
ウェスタン分析：ウェスタン分析によって、フレンチプレス抽出物中にも部分精製組換えタンパク抽出物中にも、α−ファルネセン合成酵素の予想サイズの範囲(Ｈｉｓタグも含めて６５〜７５ｋＤａ)内の可溶性発現産物が存在することを確認した。精製ｐＥＴ−３０ａ対照と非精製抽出物のどちらにも、それに似たサイズのバンドは検出されなかった。
【０１３８】
α−ファルネセン合成酵素の特徴付け：ｐＥＴ−３０ａ５７４００を含む細菌培養物および抽出物のヘッドスペース内で、(Ｅ,Ｅ)α−ファルネセンおよび少量の(Ｚ,Ｅ)α−ファルネセンが検出された。α−ファルネセン合成酵素ｃＤＮＡ挿入物を欠くｐＥＴ−３０ａで形質転換した大腸菌(Ｅ.ｃｏｌｉ)ＢＬ２１細胞を含む対照では、ごくわずかのα−ファルネセンが得られた、または全く得られなかった。培養物および非精製抽出物中での(Ｅ,Ｅ)α−ファルネセン産生は、前駆体を加えることに依存しないが、α−ファルネセン合成酵素ｃＤＮＡ挿入物が存在することに依存することが示された。対照では、α−ファルネセン(４２．２４分)と似た保持時間にピークが認められたが、質量スペクトルから、これがシトラールであることが示された。細菌培養物にＧＤＰを加えても、α−ファルネセンおよびいずれのモノテルペンも産生されなかった。
【０１３９】
部分精製組換え酵素のヘッドスペース分析から、Ｈｉｓ精製結合バッファー中での抽出に由来するものであれ、セスキテルペン抽出バッファー中での抽出に由来するものであれ、主産物として(Ｅ,Ｅ)α−ファルネセンが少量の(Ｚ,Ｅ)α−ファルネセンとともに存在することが示された(図６)。これにはＦＤＰを加えることが必要であり、前駆体を加えないと、α−ファルネセンは産生されなかった。−８０Ｃで４週間グリセロール中で貯蔵した精製酵素を再び分析したとき、その活性の消失はわずか１５％であった。
【０１４０】
α−ファルネセンｃＤＮＡを含む細菌培養物および非精製抽出物では、誘導を行わない条件下でもわずかな発現が示された。しかし、揮発性物質を５時間にわたってトラップすると、ＩＰＴＧを加えたとき、誘導しなかった試料と比べてどちらの異性体の産生も増大したことが示された。
【０１４１】
したがって、ＥＳＴ５７４００は、α−ファルネセンだけを作成するα−ファルネセン合成酵素をコードしている。
【０１４２】
実施例２ この酵素の特性
異性体特異性：ほとんどの実験および分析において、ＦＤＰ前駆体がＥ,Ｅ型およびＥ,Ｚ型の混合物からなることから、α−ファルネセンのＥ,ＥおよびＺ,Ｅ異性体が遺伝子α−ファルネセン合成酵素によって産生されることが示唆された。異性体特異性を試験するため、標準的なin vitro活性実験において、Ｅ,Ｅ異性体４１．３％、Ｅ,Ｚ異性体２８．７％、Ｚ,Ｅ異性体２４．７％、Ｚ,Ｚ異性体５．４％の比で、ＦＤＰ前駆体を精製タンパク抽出物に与えた。前記のようにＳＰＭＥファイバーで２時間トラッピング後、α−ファルネセンの異性体４つのうち３つが産生した(図７参照)。４０．５４のピークはＺ,Ｚα−ファルネセンである可能性があるが、それは確認されていない。この結果から、この酵素には異性体特異性がなく、ＦＤＰ前駆体の異性体型に応じて、この酵素がα−ファルネセン異性体を産生することが示唆される。
【０１４３】
タンパクの大規模産生の最適化：カナマイシン３０μｇ/ｍｌおよびクロラムフェニコール-1５０μｇ ｍｌを補充したＬＢ(Lauria-Bertani)培地中で、ｐＥＴ−３０ａ５７４００を含むＥ.ｃｏｌｉ ＢＬ２１−Ｐｌｕｓ(商標)−ＲＩＬ細胞を３７℃で１晩増殖させた。１晩培養物のアリコート５ｍＬを使用して、カナマイシン３０μｇ ｍｌ-1およびクロラムフェニコール５０μｇ ｍｌ-1を補充した、１Ｌバッフル付きフラスコ中の新鮮２×ＹＴ培地４×３００ｍＬに接種した。培養物を、３７℃で激しく振盪してＡ600＝０．８に増殖させ、次いで４℃に移動させて１６℃の状態にした後、０．３ｍＭのＩＰＴＧで誘導した。次いで誘導した培養物を、１６℃および２２０ｒｐｍでさらに５０時間インキュベートした。細胞を遠心(２５００×ｇ、１０分)によってペレットにし、−２０℃で１晩貯蔵した。翌日、Ｈｉｓ６結合バッファー１５ｍＬ中に細胞ペレットを再懸濁させ、１５０００〜２００００ｐｓｉの間に設定した圧力でＥｍｕｌｓｉＦｌｅｘ(登録商標)−Ｃ１５高圧ホモジナイザー(Avestin)に３回通して細胞を破砕した。１００００×ｇで１５分間、４℃(Ｓｏｒｖａｌ ＳＳ３４ローター)の遠心を２回行うことにより、細胞の残骸をペレットにした。この上清を０．４５μｍフィルター(Amicon)によって濾過した。フィルター濾過した抽出物を、脱塩し、ニッケルアフィニティーカラムに通した後、３０ｋＤａフィルター(Millipore)に通した。タンパク濃度を吸光率から決定し(ＶｅｃｔｏｒＮＴＩ第８版)、１０％グリセロールおよび１ｍＭ ＤＴＴを含むＨｉｓ６溶出バッファーで、１ｍＬにつきタンパク約１ｍｇにこの精製抽出物を調整した。次いでこの抽出物をアリコート１００μｌに分け、必要となるまで−８０℃で貯蔵した。
【０１４４】
タンパクのオリゴマー形成：６００×１６ｍｍのＳ３００ Ｓｅｐｈａｃｒｙｌカラム(Pharmacia)上に、流速１ｍＬ分-1で精製タンパク約５００μｇを流した。カラムを予め平衡化しておき、１０％グリセロールを含み、５０ｍＭ ＫＣｌまたは０．５Ｍ ＫＣｌを含み、７ｍＭ ＭｇＣｌ2を含むまたは含まない、５０ｍＭのビストリスプロパンバッファーで溶出させた。７ｍＭ ＭｇＣｌ2に調整し、２５μＭの3Ｈ−ＦＤＰを加えた後、タンパクピークに対応する分画を活性について分析した。分子量が既知の標準物質との比較に基づいて、活性がある分画の分子量を計算した。
【０１４５】
結果：α−ファルネセン合成酵素タンパクは、主にモノマーとして働く(図８および９参照)。データから、少量の活性がオリゴマー型に起因している可能性があることが示唆されるが、７０％を超える活性がモノマー酵素に起因している。図８は、Ｓｅｐｈａｃｒｙｌ Ｓ３００ ＨＲゲル濾過クロマトグラフィー上でのα−ファルネセン合成酵素のタンパク溶出プロフィルおよびおよその分子量を示す。４つの異なる精製抽出物を対照の塩およびＭｇのプロフィルと比較した。分画４０での大きなピークは、α−ファルネセン合成酵素ではなく、ＳＤＳゲル上のタンパクがほとんどないことが示され、ＤＮＡが優勢である可能性が高い。酵素活性は６０〜７０の分画に集中している(図９参照)。
【０１４６】
反応速度研究：反応速度研究のために、培養中に誘導され、タンパク最適化で記載したように精製したα−ファルネセン合成酵素の活性タンパクを、５０ｍＭビストリスプロパン(ｐＨ７．５)、１０％(ｖ/ｖ)グリセロール、１ｍＭ ＤＴＴおよび０．１％(ｖ/ｖ)Ｔｗｅｅｎ−２０を含む最小分析バッファーに加えた。放射活性ＦＤＰを実験に応じて様々に加えた。タンパク１〜２μｇを含む分析物１ｍＬにペンタン０．６ｍＬを重層し、これを１．５ｍＬマイクロチューブ中で３０℃および１５０ｒｐｍで２時間インキュベートした。すべての分析は３回反復して行った。インキュベーション後、分析物を氷上に直ちに置き、ペンタン層のアリコート２００μＬを分析用に移した。有機物カウント用シンチレーション剤(Organic Counting Scintillant)(ＯＣＳ)(Amersham)０．７ｍＬを含む１．５ｍＬマイクロチューブにアリコートを加え、これに短くボルテックスをかけた。Ｗａｌｌａｃ １４０９液体シンチレーションカウンターを用いて(3Ｈ効率≒７０％）、シンチレーション分析を行った。
【０１４７】
3Ｈ−ＦＤＰ(１０．０６Ｍｂｑ/ｍＬ)を基質(濃度範囲１μＭ〜１００μＭでＭｇ2+およびＭｎ2+が飽和状態)として用いた反応速度研究を実施して、ＦＤＰのＫｍを決定した。２５μＭ 3Ｈ−ＦＤＰにおけるＭｇ2+およびＭｎ2+の反応速度定数(塩化物の分析範囲はそれぞれ２５μＭ〜２５ｍＭ、１μＭ〜１ｍＭ)を決定した。塩を含む場合および含まない場合の金属補因子の酵素活性に対する効果も試験した。すべての可能な組合せにおいて、５０ｍＭ ＫＣＬおよび５０ｍＬ ＮａＣｌの存在下および不在下でＭｇ2+およびＭｎ2+を加えた。酵素を含めずインキュベートしたもの、酵素を含めるが金属イオン補因子を含めないもの、および１０ｍＭ ＥＤＴＡの存在下で酵素と補因子を含めるものを対照とした。
【０１４８】
この酵素のｐＨ最適条件を決定するために、ｐＨ値４．５〜９．６で、７ｍＭ Ｍｇ、１５０μＭ Ｍｎ、２５μＭ ＦＤＰ、１０％(ｖ/ｖ)グリセロール、１ｍＭ ＤＴＴ、および０．１％(ｖ/ｖ)Ｔｗｅｅｎ−２０を用い、５１ｍＭジエタノールアミン、１００ｍＭ ＭＥＳ、および５１ｍＭ Ｎ−エチルモルホリンを含む、３種のバッファーシステムにおいて分析を実施した。標準的な分析バッファーおよび７ｍＭ Ｍｇ、１５０μＭ Ｍｎおよび２５μＭ ＦＤＰを用いて、１８℃〜５０℃の範囲における酵素活性に最適な温度も決定した。Origin50 graphics packageを用いて、非線形回帰により、ＤＰＭデータから反応速度定数を決定した。示したデータは、３つの決定値の平均を、±１０％以内の標準誤差、および対照から差し引いて計算したバックグラウンドＤＰＭとともに表す。すべての実験を少なくとも２回実施した。
【０１４９】
結果：ｐＨ α−ファルネセン合成酵素は、ｐＨ７〜８．５の広いｐＨ最適条件を示した(図１０）。反復実験から、ｐＨ約７．８で活性がわずかに低下することが示された。最適ｐＨの範囲で産生した産物中で活性の違いは認められなかった(結果は示さず)。このｐＨ範囲は、特徴付けられた他のセスキテルペン合成酵素について文献(Cai et al Phytochemistry 61, 523-529(2002)、Steele et al J.Biol.Chem. 273, 2078-2089(1998))中で報告されたもの(ｐＨ７〜９)と類似する。
【０１５０】
Ｋｍ ＦＤＰのＫｍは２．５〜３．５μＭ(図１１)であり、飽和濃度は１２μＭであった。前駆体抑制はＦＤＰ濃度が最大５０μＭでも認められなかった。補因子Ｍｇ2+のＫｍは６００〜８００μＭ(図１２)であり、高濃度(２５ｍＭ)で活性がわずかに抑制された(２３％)。Ｍｎ2+のＫｍは１０〜２０μＭであり、高濃度(＞８００μＭ)で活性が少なくとも５０％抑制された(図１３)。文献中で報告されたＫｍは、他のセスキテルペン合成酵素に関して、ＦＤＰで０．４〜４．５μＭ、Ｍｇで７０〜１５０μＭ、Ｍｎで７〜３０μＭの範囲である(例えば、Cai et al Phytochemistry 61, 523-529(2002)、Steele et al J.Biol.Chem.273, 2078-2089(1998))。
【０１５１】
他の金属イオンの効果 Ｋ+イオンを加えると、α−ファルネセン合成酵素活性は増強された(表１）。Ｎａ+イオンを加えると、活性のわずかで有意でない増強が生じ、このことから、この増強が金属イオンの型に起因するものであり、一般的な塩の応答に起因するものではないことが示唆される。
【０１５２】
【表２】
【０１５３】
温度 最大のα−ファルネセン合成酵素活性は３７℃で生じ、それより高い温度では活性が急激に低下した(図１４)。活性は５０℃では検出不可能であり、低温(１３℃)では酵素活性は残ったが３分の２低下した。これは他のセスキテルペン合成酵素で報告されているものと類似する。
【０１５４】
(貯蔵)
−８０℃で９ヶ月間貯蔵したタンパクは活性が消失した(９２．５％消失）。この貯蔵タンパクでは、ＦＤＰのＫｍが約１．５μＭに低下したことも示された。しかし、Ｍｇ、ＭｎのＫｍ、およびｐＨ応答は変わらなかった。
【０１５５】
実施例３ 植物中での発現
Nicotiana benthamiana葉中での一過性発現：N.benthamiana葉の形質転換をHawesら(Hawes, C., Boevink, P., and Moore, I., GFP in plants, in Fluorescence microscopy of Proteins：a practical approach., V.Allen, Editor.1999, Oxford University Press：Oxford. P.163-177(2000))に従って行った。ＥＳＴ５７４００を有するｐＨＥＸ２バイナリーベクター(binary vector)、および対照としてｍＲＮＡサイレンシングのウイルス性抑制因子(viral suppressor)を発現するＰ１９ベクター(Voinnet et al. Plant J 33, 949-956(2003))を含むAgrobacterium tumefaciens株ＧＶ３１０１(ＭＰ９０)を、リファンピシン(１０ｍｇ ｍｌ-1)、ゲンタマイシン(２５ｍｇ ｍｌ-1)、およびスペクチノマイシン(１００ｍｇ ｍｌ-1)を含む２ＹＴ培地の５ｍｌ培養中で２８℃で２４時間増殖させた。遠心(３５００×ｇ、１０分間)によって細胞を収集し、最終ＯＤ600０．５〜０．６となるように、浸透用培地(５０ｍＭ ＭＥＳ ｐＨ５．６、０．５％(ｗ/ｖ)グルコース、２ｍＭ Ｎａ3ＰＯ4、(２００ｍＭアセトシリンゴン／ＤＭＳＯストックから新たに作成した)１００ｍＭアセトシリンゴン)中に再懸濁させた。針を取り付けない１ｍｌ注射器を用いて、分離したN.benthamiana葉の裏側の気孔から細菌懸濁液を注入した。後で同定するために、葉の浸透させた部分に消えないマーカーペンで印を付けた。感染させた葉を有する植物を、標準的な温室条件下で７日間育てた。
【０１５６】
形質転換したN.benthamiana葉および対照の葉に、２５μＭ ＦＤＰ、７ｍＭ ＭｇＣｌ2および５０ｍＭ ＫＣｌを含む蒸留水を浸透させた。１時間後、１処理につき３枚の葉を切り出し、これを５０ｍＬのガラス製試験管内に置き、３０℃で１２時間、固相マイクロ抽出(ＳＰＭＥ)を用いて、この葉組織上のヘッドスペースを収集した。前浸透を行わずにこの実験を反復した。それぞれ独立に形質転換した植物の２つの場合において完全な実験を実施した。
【０１５７】
結果：
一過性発現研究から、α−ファルネセン合成酵素遺伝子が存在するときにα−ファルネセンが産生されるが、対照の葉では産生されないことが示される。Ｅ,Ｅα−ファルネセンは前駆体を加えなくても産生された(このことから、N.benthamiana葉中では何らかの内在性前駆体が得られることが示唆される)。しかし、前駆体をも葉中へと浸透させたとき、Ｅ,Ｅα−ファルネセンはさらに産生された。結果を図１５に示す。
【０１５８】
シロイヌナズナ(Arabidopsis)中でのリンゴα−ファルネセン合成酵素の過剰発現：A.tumefaciens株ＧＶ３１０１を、リファンピシン(１０ｍｇ ｍＬ-1)、ゲンタマイシン(２５ｍｇ ｍＬ-1)、およびスペクチノマイシン(１００ｍｇ ｍＬ-1)を含むＬＢ培地１０ｍＬ中に接種し、２００ｒｐｍで振盪して２８℃で２４時間増殖させた。次いで、この最初の培養物を使用して、上記と同様の抗生物質を含むもう１つのＬＢ培地１００〜２００ｍＬ中に接種した。２８℃で振盪して、これを再度２４時間増殖させた。遠心(３５００×ｇ、１０分間、４℃)によって細胞を収集し、最終ＯＤ600０．８となるように、５％ショ糖溶液中に再懸濁させた。シルウェット(Silwet)Ｌ−７７を、濃度０．０５％となるように加えた。このコンピテントAgrobacterium細胞のアリコート４５ｍＬを氷上でゆっくりと解凍した。プラスミドＤＮＡ(ＥＳＴ５７４００を含むｐＨＥＸ２ベクター)５０〜２００ｎｇを各アリコートに加え、ゆっくりと混合し、次いで、この細胞／プラスミド混合物４０ｍＬを、予め冷却したエレクトロポレーション用キュベット(間隔０．２ｃｍ、Bio-Rad)中にピペットで入れた。ＢｉｏＲａｄのジーンパルサー(GenePulser)を用いて、以下の設定でこの細胞にエレクトロポレーションを行った。
電圧：２．５ｋＶ
静電容量：２５ｍＦｄ
抵抗：４００オーム
パルスの時定数は通常７〜９ｍｓであった。
【０１５９】
ＬＢ培地１ｍＬを加えて、細胞を直ちに回復させ、次いでこれを滅菌１５ｍＬ遠心管中にデカントで入れ、室温で振盪して(６０ｒｐｍ)インキュベートした。２時間後、形質転換した細菌１０ｍＬおよび１００ｍＬを、リファンピシン(１０ｍｇ ｍＬ-1)、ゲンタマイシン(２５ｍｇ ｍＬ-1)、およびスペクチノマイシン(１００ｍｇ ｍＬ-1）を含む別々のＬＢプレート上に播き、次いでこれを２８〜３０℃で４８時間増殖させた。
【０１６０】
プラスミドを含むA.tumefaciensを、リファンピシン(１０ｍｇ ｍＬ-1)、ゲンタマイシン(２５ｍｇ ｍＬ-1)、およびスペクチノマイシン(１００ｍｇ ｍＬ-1)を含むＬＢ培地の５ｍＬ培養中で、２８℃で２４時間増殖させた。細胞を遠心によって収集し、最終ＯＤ600０．８となるように、５％ショ糖溶液中に再懸濁させた。シルウェットＬ−７７を、濃度０．０５％となるように加えた。
【０１６１】
多数の未熟な花房が見られる５週齢の健常なArabidopsis thalianaコロンビア系統(cv Columbia)の植物を、ＥＳＴ５７４００を含むまたは空ベクターを含むAgrobacteriumで形質転換した。植物の地上部分全体をAgrobacterium懸濁液中に浸漬し、３〜５秒間ゆっくりと攪拌した。次いで、浸漬した植物を、光を減少させた状態で湿潤チャンバー中に２〜３日間置いた後、通常の温室条件下で開花させ、種をまいた。(浸漬してから５〜６週間後に)植物を完全に乾燥させた後、種子(Ｔ０)を採取した。植物を自家受粉させ、カナマイシン選択プレート上で２世代にわたって個体を増殖させることによって、Ｔ２種子を生じさせた。
【０１６２】
ＤＮＡ抽出：サザン分析を行うために、Dellaporta et al. Plant Mol.Biol.Reporter 1, 19-21(1983)の方法により、Arabidopsis thaliana葉からＤＮＡを抽出した。液体窒素中で組織材料(１ｇ)をすりつぶし、次いで、βメルカプトエタノール２２．５μｌを含むバッファー(１００ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ８．０、５０ｍＭ ＥＤＴＡ ｐＨ８．０、５００ｍＭ ＮａＣｌ)１５ｍｌにこの粉末を加えた。２０％ＳＤＳを１ｍｌ加えた後、ホモジェネートをボルテックスに接触させ、次いで６５℃で２０分間インキュベートした。５Ｍの酢酸カリウム(５ｍｌ)を加えた後、氷上で２０分間インキュベートし、次いで６０００ｒｐｍで３０分間遠心した。上清をミラクロス(miracloth)に通し、冷イソプロパノールを１０ｍｌ加え、４℃で１晩ＤＮＡを沈降させた。５０００ｒｐｍで１５分間遠心することによってＤＮＡをペレットにし、次いで７０％エタノール１ｍｌ中でこれを洗浄し、水０．５ｍｌ中に再懸濁させた。再懸濁させたＤＮＡを、等量の１：１ フェノール：クロロホルムで抽出し、次いで等量のクロロホルムで抽出し、イソプロパノールで再沈降させた。遠心し、７０％エタノールで洗浄した後、ＤＮＡを水５０μｌに再懸濁させた。ＲＮＡｓｅ(Roche)(１０ｍｇ/ｍｌの１μｌ)を加えてＲＮＡを除去した。
【０１６３】
ＰＣＲ反応で使用するＤＮＡの小規模抽出を行うために、Arabidopsis thaliana葉組織１５０ｍｇを液体窒素中ですりつぶした。抽出バッファー(４８０μｌ)を加え、組織をさらにすりつぶし、次いで氷上に置いた。２０％ＳＤＳを３７．５μｌ加えた後、試料を６５℃で１０分間置いた。５Ｍの冷酢酸カリウムを９４μｌ加えた後、試料を転倒混和し、次いで氷中に１０分間置いた後、１３２００ｒｐｍで１０分間遠心した。２５：２４：１ フェノール：クロロホルム：酢酸イソアミル６００μｌとゆっくり混合して上清を抽出し、次いで１０，０００ｒｐｍで５分間遠心した。イソプロパノール３６０μｌを上清に加え、混合し、次いでこれを１３２００ｒｐｍで３分間遠心した。ペレットを７０％エタノールですすぎ、１分間遠心し、９５％エタノールですすぎ、空気乾燥させ、ＲＮＡｓｅ(Roche)を含むＴＥ５０μｌ中に再懸濁させた。
【０１６４】
ＤＮＡのＰＣＲ増幅 Ｅｘｐａｎｄ Ｈｉｇｈ Ｆｉｄｅｌｉｔｙ Ｔａｑ(Roche)を用いて、ＰＣＲ増幅を行った。増幅反応は、製造者の奨励に従って行った。ＰＣＲプライマー(５７４００＿Ａ３ AGAGTTCACTTGCAAGCTGA(配列番号：３)および５７４００＿Ａ４ GAAAAGTTCCAGCATTCCTT(配列番号：８))を設計して、ＥＳＴ５７４００のコード領域の５'末端に由来する５１３塩基対の断片を増幅した。ＰＣＲ増幅は、以下の条件下で行った。９６℃、５分間の変性反応後、９６℃、３０秒間の変性反応、５５℃、４秒間のアニーリング反応、および７２℃、６０秒間の伸長反応のサイクルを３０回。１％ＡｐｐｌｉＣｈｅｍによる電気泳動後、エチジウムブロマイドで染色し、カメラ付き紫外線トランスイルミネーター(ＵＶＰ)(UV tec、Total Lab Systems Ltd)上で視覚化することによって、得られた増幅産物(５μｌ)を分析した。
【０１６５】
結果：リンゴ由来のα−ファルネセン合成酵素をコードするＤＮＡは、４つのトランスジェニックArabidopsisの独立した形質転換体のそれぞれ(図１６）およびリンゴ対照で、ＰＣＲによって検出された。ｐＨＥＸ対照では何も検出されなかった。
【０１６６】
サザン分析
Arabidopsis thaliana葉組織から抽出したゲノムＤＮＡを、総量５００μｌ中でＢａｍＨ１を用いて１晩消化した。消化したＤＮＡを、２倍量のエタノールおよび１０分の１量の３Ｍ酢酸ナトリウムで沈降させ、次いで遠心し、７０％エタノール中で洗浄し、ペレットを水３０μｌ中に再懸濁させた。消化したＤＮＡを、０．７％アガロースで電気泳動し、エチジウムブロマイドを用いて視覚化し、０．２５Ｍ ＨＣｌ中で加水分解し、水で洗浄した後、０．４Ｍ ＮａＯＨ中のＮｙｔｒａｎ−Ｐｌｕｓ(Schleicher ＆ Schuell)膜に１晩トランスファーした。次いでこの膜を０．５Ｍ Ｔｒｉｓ中で中和し、Washing and Pre-Hyb Solution(ＭＲＣ)中で２時間プレハイブリダイズした。α−ファルネセン合成酵素のコード領域の５'末端と相補的である、32Ｐで標識した８１０塩基対のＰＣＲ断片をプローブとして用いて、高効率ハイブリダイゼーションシステム(high Efficiency Hybridzation System)(ＭＲＣ)２０ｍｌ中でハイブリダイゼーションを行った。製造者らの説明書に従い、ｒｅｄｉｐｒｉｍｅ(商標)ＩＩ(Amersham Pharmacia)ランダム標識システムを用いて、プローブ(４０ｎｇ)を32Ｐ ｄＣＴＰを用いて標識した。標識プローブを０．１Ｍ ＮａＯＨ中で30分間変性させた後、ハイブリダイゼーションを１晩行った。製造者らの奨励に従って、Washing and Pre-Hyb Solution(ＭＲＣ)中で膜を洗浄した。ハイブリダイゼーションシグナルは、Ｓｔｏｒｍ ８４０リン酸画像化システム(Molecular Dynamics)上でスキャンすることによって視覚化し、ImageQuantソフトウェアを用いて分析した。
【０１６７】
結果：
プライマー５７４００＿Ａ３(５'AGAGTTCACTTGCAAGCTGA３'配列番号：３）および５７４００ＮＲ１(５'GGATGCTTCCCT３'(配列番号：４))を用いてＥＳＴ５７４００から増幅した８１０塩基対の３２Ｐ標識ＰＣＲ断片をプローブとして用いて、トランスジェニックArabidopsis thaliana植物から抽出したゲノムＤＮＡのＢａｍＨ１消化物のサザン分析を実施した。α−ファルネセン合成酵素ｃＤＮＡを含むＢａｍＨ１制限断片のサイズは、２０５０塩基対である。その結果を図１７に示す。ＭＷと示したレーンは分子量マーカー(Invitrogen）である。ｐＨＥＸは、形質転換ベクターのみを含み、α−ファルネセン合成酵素ｃＤＮＡ挿入物を含まないトランスジェニックArabidopsis thaliana植物から抽出したゲノムＤＮＡを指す。１、２、３および４と示したレーンは、α−ファルネセン合成酵素ｃＤＮＡ挿入物を含む、独立したトランスジェニックArabidopsis thaliana系統である。
【０１６８】
ＲＴ−ＰＣＲ増幅：
系統３のArabidopsis thalianaの実生、葉および花から抽出した全ＲＮＡに対して、製造者らの奨励に従って、ＲＴ−ＰＣＲ(Platinum(登録商標)Quantitative RT-PCR Thermoscript One-Step System、Invitrogen)増幅を行った。ｃＤＮＡ合成を６０℃で３０分間行った後、９６℃で５分間変性し、次いで９６℃、３０秒間の変性反応、５５℃、４０秒間のアニーリング反応、および７２℃、６０秒間の伸長反応を含む増幅サイクルを４０回行った。最終サイクルでは、７２℃の伸長反応をさらに５分間継続させた。ＲＴ−ＰＣＲの前に、ＤＮａｓｅＩ(Life Technologies)で、全ＲＮＡを室温で１０分間処理した。ゲノムＤＮＡが混入しているかどうか調べるために、ＲＴ−ＰＣＲ増幅と同時に、ＤＮａｓｅＩ処理した全ＲＮＡに対してＰＣＲ増幅も行った。ＰＣＲプライマーは以下の通りである。５'末端の増幅には、５７４００＿Ａ３ AGAGTTCACTTGCAAGCTGA(配列番号：３)および５７４００＿Ａ４ GAAAAGTTCCAGCATTCCTT(配列番号：８)、内部配列の増幅には、５７４００ＮＦ１ GCACATTAGAGAACCACCAT(配列番号：９)および５７４００ＮＲ１ GGATGCTTCCCT(配列番号：４)、３'末端の増幅には、５７４００＿Ａ１ CTTCACAAGAATGAAGATCT(配列番号：１０)および５７４００＿Ａ５ TTCCATGCATTGTCTATCAT(配列番号：１１)。ＰＣＲ増幅の場合と同様に得られた増幅産物を分析した。その結果、導入遺伝子に対応するＲＮＡ転写物が存在することが確認された(図１８を参照)。
【０１６９】
Arabidopsisにおける機能証明研究：４つの独立した過剰発現系統および１つの対照系統それぞれから、Ｔ２世代の種子をマイクロ遠心管に入れて、約２００個を測定した。０．０１％Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘを含む１．５％漂白液で種子を滅菌し、これを時折混合しながら１５分間インキュベートした。蒸留水で種子を数回洗浄し、０．１％アガロース中に再懸濁させた後、１００ｍｇ/ｍＬカナマイシンを含む０．５×ＭＳ培地上に播いた。１２時間明るく１２時間暗いサイクルの栽培室内にこのプレートを置いた。育成２〜３週間後、各系統から３０個の植物を鉢内の土に移し、成熟し開花するまで、温室内でその成長を継続させた。
【０１７０】
長角果が見られる前に、３０〜５０個の花を採取し、末端を切断し、直ちに水中に置いた。次いで、２５μＭ ＦＤＰおよび７ｍＭ ＭｇＣｌ2を有する蒸留水５ｍＬを含む、すりガラスの継手の受け口付き５５ｍＬガラス製管に、これを移した。試験管に植物材料をきつく詰め込んだ。ガス線、およびクロモソーブ１０５ １００ｍｇを含む揮発性物質吸着剤カートリッジを含む、すりガラス製の入口の栓で、この管を密封した。フラスコ内のヘッドスペースを、５０ｍｌ/分の乾燥空気でパージしながら、５５時間トラップした。分析の前に、３５Ｃで１５分間、１０ｐｓｉのＮ2(ｇ）流量でクロモソーブカートリッジを乾燥させた。リンゴについて以前に記載したのと同様に、揮発性物質を熱により脱着させ分析した。
【０１７１】
結果：多数のセスキテルペン化合物がArabidopsis thaliana植物の花中に認められた。産物Ｅ,Ｅ α−ファルネセンは、試験した４つの過剰発現植物系統および対照のｐＨＥＸ植物のすべてにおいて認められた。保持時間、および質量スペクトルとライブラリースペクトルとの比較により、これは確認された。ＥＳＴ５７４００で形質転換した４系統では、カリオフィレン：α−ファルネセンのピーク比は３：１であり、ｐＨＥＸ対照では、α−ファルネセンも存在するが、カリオフィレンとα−ファルネセンとのピーク比は１０：１を超えていた(α−ファルネセンのピークは、ｐＨｅｘで４３．３３分、系統３で４３．４１分である、図１９を参照)。このことから、α−ファルネセンは、A.thalianaの花中で、他のセスキテルペンと一緒に少量産生されるが、遺伝子を加えた場合、対照植物より高い割合で、α−ファルネセンが産生されることが示唆される。
【０１７２】
リンゴ(「ロイヤルガラ」)におけるノーザン分析
方法：
ノーザンブロット分析
Ruegerら(1996)に記載のように、アンチセンスＲＮＡプローブを用いてノーザン分析を行った。α−ファルネセン合成酵素のプローブの鋳型は、以下のプライマーを用いてプラスミドＤＮＡにＰＣＲ(Genius thermocycler、Techne、英国ケンブリッジ)を行うことによって調製した。
57400ＮＦ１ ５−GCACATTAGAGAACCACCAT−３(配列番号：９)および
57400ＮＲ１ ５−TAATACGACTCACTATAGGGATGCTTCCCTTAAGTTTT−３(配列番号：１２)
最終反応物の成分は以下の通りである。最終容量５０ｍＬ中で、１×Ｔａｑポリメラーゼバッファー(Invitrogen)、２００ｍＭ ｄＮＴＰｓ、１．５ｍＭ ＭｇＣｌ2、200ｐＭの各プライマー、５０ｎｇのプラスミド鋳型または２５ｎｇのゲノムＤＮＡ、１単位のＰｌａｔｉｎｕｍ(登録商標)Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼ。ＰＣＲ条件は、９４℃で４分間変性後、９４℃で３０秒間、５５℃で３０秒間、および７２℃で３０秒間のサイクルを２５回であった。
【０１７３】
Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼ(Invitrogen)を用いて、１箇所手を加えた以外は製造者らの説明書に従って、α−ファルネセン合成酵素のプローブの転写反応物を調製した。反応物に７０ｍＭ ＤＩＧ−１１−ＵＴＰ(Roche)を補充し、ＵＴＰを１３０ｍＭに低下させた。転写反応物を、３７℃で１時間インキュベートし、次いで、３７℃でさらに１５分間、総量５０μＬ中１単位のＲＱ１ ＲＮａｓｅフリーＤＮａｓｅ(Promega)で処理した。水で１：８０に希釈したアリコート５ｍＬの２６０ｎｍでの吸光度を測定することにより、ＲＮＡプローブの量を計算した。ＤＩＧの効果のために濃度は半分になり、ハイブリダイゼーションバッファー１ｍＬにつきプローブ１００ｎｇの割合でこれを使用した。載せたＲＮＡが等量であることを、ＲＮＡゲルをエチジウムブロマイドで染色することにより、またブロットを１８ＳリボソームＲＮＡのＰＣＲ産物でプロービングした後に視覚化した。
１８Ｓ−ＲＦＴ：CTGGCACCTTATGAGAAATC(配列番号：１３)
１８Ｓ−ＲＴＲ：CCACCCATAGAATCAAGAAA(配列番号：１４)
５５℃でアニーリングするＲＴ−ＰＣＲを行うと、４２℃でＥａｓｙＨｙｂハイブリダイゼーションを行うための、ＧＣ含量が４０％である３４３ｂｐの産物が得られる。
【０１７４】
１８ＳリボソームＲＮＡのハイブリダイゼーションから計算された、ロード量の違いに合わせて、α−ファルネセン合成酵素ｍＲＮＡレベルを調整した。その結果得られたシグナルを、ＩｍａｇｅＱｕａｎｔソフトウェアを用いて分析し、α−ファルネセン合成酵素ｍＲＮＡレベルのヒストグラムをプロットした。
【０１７５】
仮想ノーザン
ＢＬＡＳＴ ＮＲＤＢ９０サーチ(Altschul et al., 1997)内の遺伝子配列を用いることにより、α−ファルネセン合成酵素に関係するホートリサーチＥＳＴデータベース内のＥＳＴを同定した。データベース中に存在するｃＤＮＡライブラリーの解析から、ＥＳＴ配列が見つかっている組織の「仮想ノーザン」を作成した。
【０１７６】
結果：
仮想ノーザンでは、花芽中における１０００種のＥＳＴの間で１種のＥＳＴが同定され、熟した(１５０ＤＡＦＢ)リンゴ皮中における８０５０種のＥＳＴから２種が同定され、１２６ＤＡＦＢ(満開後の日数)リンゴ皮層における４５００種のＥＳＴから１種が長い３'ＵＴＲとともに同定された。したがって、この遺伝子は、果実の発生の間比較的低いレベルで発現している。
【０１７７】
アオテア、ピンキー、および老化中のロイヤルガラ葉という３つの異なる品種由来の成熟した葉中でＥＳＴが同定された。アオテアおよびピンキー由来のＥＳＴ以外のすべてで、ＤＮＡレベルでの配列は、α−ファルネセン合成酵素ｃＤＮＡ配列と同一であった。相同性を示す他の配列は検出されなかった。
【０１７８】
標準的なノーザン分析では、α−ファルネセン合成酵素の発現は、熟した果実(１５０ＤＡＦＢ)の皮において最も高く、成長中の葉(アオテア)がそれに続いた(図２０）。熟した果実の皮より低いレベルであったが、この遺伝子は果実の成長中ずっと発現していた。花の分裂組織、師部および非常に幼弱な小果実中では、α−ファルネセン合成酵素をコードするｍＲＮＡは、少なすぎて検出できなかった、または存在しなかった。
【０１７９】
系統発生分析：
ヨーロッパ分子生物学オープンソフトウェアセット(European Molecular Biology Open Software Suite)(EMBOSS)(Rice et al., 2000)を用いて、コンピュータ分析を行った。NeedlemanおよびWunsch(J.Mol.Biol. 48； 443-453(1970))のアルゴリズムを使用するペアワイズアラインメントプログラムＮｅｅｄｌｅを用いて、配列同一性および類似性を計算した。そのデフォルトパラメータを使用した(任意配列のギャップ伸長ペナルティは０．５、任意配列のギャップ開始ペナルティは１０)。ＣＬＵＳＴＡＬ Ｘを用いて、配列関連性を分析し、プログラムＧｅｎｅＤｏｃ(Nicholas and Nicholas, 1997)を用いて、これをそろえ、それに影を付けた。近隣結合法を用いて、系統発生樹をＣＬＵＳＴＡＬ Ｘ中で作成し、Treedraw( HYPERLINK "http://taxonomy.zooology.gla.ac.us/rod/treeview.html" http://taxonomy.zooology.gla.ac.us/rod/treeview.html; Page 1996)を用いて、根元から取り上げたこの樹を視覚化した。
【０１８０】
完全長α−ファルネセン合成酵素を、既知の機能を有する他のすべてのテルペン合成酵素配列と比較した(図２１）。これは単一メンバーの分岐を形成し、最も近い相同体であるポプラ由来の２つのイソプレン合成酵素からはっきりと分離していた。独特のグループに分類されることは、そのタンパクの配列が他のセスキテルペン合成酵素とモノテルペン合成酵素のどちらにも似ていないということを補強するものである。ＤＤｘｘＤモチーフの周辺にある活性部位の金属結合領域だけをその一連の配列と比較したときも、これと同様の結果が得られた。簡潔に述べると、この遺伝子は、セスキテルペン合成酵素であると予測されないはずである。
【０１８１】
上記の実施例は本発明の実施を説明するものである。多数の変更形態および変形形態を用いて本発明を実施することができることが、当業者によって理解されるであろう。例えば、このヌクレオチド配列の変形形態を使用することができ、その配列を様々な生物中で発現させることができる。
【図面の簡単な説明】
【０１８２】
【図１】α−ファルネセンの異性体の構造を示す。
【図２】リンゴにおけるα−ファルネセン合成経路を示す。
【図３】α−ファルネセン合成酵素をコードするｃＤＮＡ配列を示す。
【図４】リンゴ皮由来のα−ファルネセン合成酵素の予測されたアミノ酸配列を示す。
【図５】リンゴロイヤルガラ上のヘッドスペースのＧＣ−ＭＳスペクトルを示す。
【図６】α−ファルネセン合成酵素ｃＤＮＡを含む、(結合バッファー中の)ニッケルで精製された無細胞抽出物上のヘッドスペースのＧＣ−ＭＳスペクトルを示す。
【図７】混合異性体の前駆体ＦＤＰの供給に反応して、精製組換えα−ファルネセン合成酵素によってin vitroで産生されるα−ファルネセンの各種異性体形を示す。
【図８】Ｓｅｐｈａｃｒｙｌ Ｓ−３００ ＨＲゲルろ過クロマトグラフィー上でのα−ファルネセン合成酵素のタンパク溶出プロフィル、およびそのおよその分子量を示す。
【図９】Ｓ−Ｓｅｐｈａｃｒｙｌ ３００ ＨＲゲルろ過の適用後における精製タンパク分画のα−ファルネセン合成酵素活性を示す。
【図１０】α−ファルネセン合成酵素活性の最適ｐＨを示す。
【図１１】飽和金属イオンの存在下で、ＦＤＰ濃度を増加させた場合のα−ファルネセン合成酵素活性に対する効果を示す。
【図１２】飽和ＦＤＰ(２５μＭ)を含む条件でのα−ファルネセン合成酵素活性に対するＭｇ2+の効果を示す。
【図１３】飽和ＦＤＰ(２５μＭ)を含む条件でのα−ファルネセン合成酵素活性に対するＭｎ2+の効果を示す。
【図１４】飽和ＦＤＰ(２５μＭ)および金属補助因子Ｍｇ++／Ｍｎ++(７ｍＭ/１５０μＭ)を含む条件で測定された、様々な温度でのα−ファルネセン合成酵素活性を示す。
【図１５】ＦＤＰを浸透させた場合および浸透させない場合のＮ.benthamiana葉におけるＥ，Ｅα−ファルネセン産生を示す一実験の例を示す。
【図１６】α−ファルネセン合成酵素ｃＤＮＡ配列の５'末端から設計したプライマーを用いた、トランスジェニックArabidopsis thaliana植物から抽出されたゲノムＤＮＡのＰＣＲ増幅を示す。
【図１７】トランスジェニックシロイヌナズナ植物から抽出されたゲノムＤＮＡのＢａｍＨ１消化物のサザン分析を示す。
【図１８】トランスジェニックArabidopsis thaliana系統３の植物の実生、葉および花から抽出された全ＲＮＡのＰＣＲ増幅を示す。
【図１９】α−ファルネセン合成酵素遺伝子を発現している系統３の植物由来の、および空のベクターを発現している対照植物由来のA.thalianaの花中に存在するヘッドスペースの揮発性物質を示す。
【図２０】Malus domesticaの様々な組織から抽出した全ＲＮＡのノーザン分析を示す。
【図２１】既知の機能を有するテルペン合成酵素の系統発生分析を示す。
【配列表】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
α−ファルネセン合成酵素をコードする単離ポリヌクレオチド。
【請求項２】
前記ポリヌクレオチドがＤＤＸＸＤおよび(Ｌ,Ｖ)(Ｖ,Ｌ,Ａ)(Ｎ,Ｄ)Ｄ(Ｌ,Ｉ,Ｖ)Ｘ(Ｓ,Ｔ)ＸＸＸＥの反復のうち少なくとも１つを含むポリペプチドをコードし、Ｘは任意のアミノ酸である、請求項１に記載のポリヌクレオチド。
【請求項３】
配列番号：１の配列あるいはその断片または変異体を有し、該断片または変異体がα−ファルネセン合成酵素活性を有するポリペプチドをコードする、請求項１に記載の単離ポリヌクレオチド。
【請求項４】
前記配列が配列番号：１のヌクレオチド配列と少なくとも７０％の同一性を有する、請求項３に記載の単離ポリヌクレオチド。
【請求項５】
前記配列が配列番号：１のヌクレオチド配列と少なくとも９０％の同一性を有する、請求項３に記載の単離ポリヌクレオチド。
【請求項６】
前記配列が配列番号：１のヌクレオチド配列と少なくとも９５％の同一性を有する、請求項３に記載の単離ポリヌクレオチド。
【請求項７】
前記ヌクレオチド配列が配列番号：１の配列である、請求項３に記載の単離ポリヌクレオチド。
【請求項８】
配列番号：２のポリペプチドをコードする、またはα−ファルネセン合成酵素活性を有するその配列の変異体または断片をコードする単離ポリヌクレオチド。
【請求項９】
前記ポリペプチドが配列番号：２のアミノ酸配列と少なくとも７０％の同一性を有する、請求項８に記載の単離ポリヌクレオチド。
【請求項１０】
前記ポリペプチドが配列番号：２のアミノ酸配列と少なくとも９０％の同一性を有する、請求項８に記載の単離ポリヌクレオチド。
【請求項１１】
前記ポリペプチドが配列番号：２のアミノ酸配列と少なくとも９５％の同一性を有する、請求項８に記載の単離ポリヌクレオチド。
【請求項１２】
前記ポリペプチドが配列番号：２の配列を有する、請求項８に記載の単離ポリヌクレオチド。
【請求項１３】
単離α−ファルネセン合成酵素ポリペプチド。
【請求項１４】
配列番号：２の配列、あるいはα−ファルネセン合成酵素活性を有するその断片または変異体を有する単離α−ファルネセン合成酵素。
【請求項１５】
前記アミノ酸配列が配列番号：２の配列と少なくとも７０％の同一性を有する、請求項１４に記載の単離α−ファルネセン合成酵素。
【請求項１６】
前記アミノ酸配列が配列番号：２の配列と少なくとも９０％の同一性を有する、請求項１４に記載の単離α−ファルネセン合成酵素。
【請求項１７】
前記アミノ酸配列が配列番号：２の配列と少なくとも９５％の同一性を有する、請求項１４に記載の単離α−ファルネセン合成酵素。
【請求項１８】
前記アミノ酸配列が配列番号：２の配列由来の完全な配列である、請求項１４に記載の単離α−ファルネセン合成酵素。
【請求項１９】
請求項１から１２のいずれか一項に記載のポリヌクレオチドを含む遺伝子構築物。
【請求項２０】
５’から３’の方向で、請求項１３から１８のいずれか一項に記載のポリペプチドをコードするオープンリーディングフレームのポリヌクレオチドを含む遺伝子構築物。
【請求項２１】
プロモーター配列をさらに含む、請求項２０に記載の遺伝子構築物。
【請求項２２】
終結配列をさらに含む、請求項２１に記載の遺伝子構築物。
【請求項２３】
コードされたポリペプチドの配列が、配列番号：２のアミノ酸配列、またはα−ファルネセン活性を有するその断片を有する、請求項２２に記載の遺伝子構築物。
【請求項２４】
５’から３’の方向で、請求項１３から１８のいずれか一項に記載のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドとハイブリダイズするポリヌクレオチドを含む遺伝子構築物。
【請求項２５】
プロモーター配列をさらに含む、請求項２４に記載の遺伝子構築物。
【請求項２６】
終結配列を含む、請求項２５に記載の遺伝子構築物。
【請求項２７】
コードされたポリペプチドの配列が、配列番号：２のアミノ酸配列、またはα−ファルネセン活性を有するその断片を有する、請求項２６に記載の遺伝子構築物。
【請求項２８】
請求項１９から２７のいずれか一項に記載の遺伝子構築物を含むベクター。
【請求項２９】
請求項１９から２７のいずれか一項に記載の遺伝子構築物を含む宿主細胞。
【請求項３０】
請求項１９から２７のいずれか一項に記載の遺伝子構築物を含むトランスジェニック植物細胞。
【請求項３１】
請求項３０に記載の植物細胞を含むトランスジェニック植物。
【請求項３２】
α−ファルネセンを調製する方法であって、
（ａ）高いα−ファルネセン合成酵素活性をもたらすように請求項１から１２のいずれか一項に記載のポリヌクレオチドで遺伝子改変された細胞を培養するステップと、
（ｂ）必要な場合に前記細胞にファルネシルジリン酸を提供するステップと、
（ｃ）産生したα−ファルネセンを分離するステップと
を含む方法。
【請求項３３】
植物のα−ファルネセン産生を調節する方法であって、α−ファルネセン合成酵素発現を増加させるまたは低下させるステップを含み、前記増加または低下がα−ファルネセン合成酵素をコードする遺伝子の発現を変化させる遺伝子改変によって達成される方法。
【請求項３４】
前記ポリペプチドが配列番号：２の配列を有するポリペプチドを含む、請求項３３に記載の方法。
【請求項３５】
植物内でα−ファルネセン産生を調節する方法であって、
（ａ）請求項１９から２７に記載の遺伝子構築物を前記植物に導入するステップと、
（ｂ）前記植物内で前記ポリヌクレオチドを転写により発現させるステップと
を含む方法。
【請求項３６】
植物内でα−ファルネセン産生を調節する方法であって、
（ａ）請求項１９から２７に記載のＤＮＡ遺伝子構築物を前記植物に導入するステップと、
（ｂ）前記植物内で前記ポリペプチドを発現させるステップと
を含む方法。
【請求項３７】
配列番号：１に由来する少なくとも１５個の連続したヌクレオチドを含むポリヌクレオチド。
【請求項３８】
α−ファルネセンの含有量が変化した植物を選択する方法であって、
（ａ）α−ファルネセン合成酵素の発現を評価するため、少なくとも１つの植物に由来するポリヌクレオチドを、請求項１に記載のポリヌクレオチドのうち少なくとも１５個の連続したヌクレオチドを含む、少なくとも１つのポリヌクレオチドと接触させるステップと、
（ｂ）発現量の変化を示す植物を選択するステップと
を含む方法。
【請求項３９】
前記ポリヌクレオチドが配列番号：１に由来する少なくとも１５個の連続したヌクレオチドを有し、前記植物がリンゴ植物である、請求項３５に記載の方法。
【請求項４０】
α−ファルネセンを調製する方法であって、
（ａ）請求項１３から１８のいずれか一項に記載のポリペプチドを得るステップと、
（ｂ）前記ポリペプチドの存在下でファルネシルジリン酸をインキュベートするステップと、
（ｃ）産生したα−ファルネセンを分離するステップと
を含む方法。
【請求項１】
α−ファルネセン合成酵素をコードする単離ポリヌクレオチド。
【請求項２】
前記ポリヌクレオチドがＤＤＸＸＤおよび(Ｌ,Ｖ)(Ｖ,Ｌ,Ａ)(Ｎ,Ｄ)Ｄ(Ｌ,Ｉ,Ｖ)Ｘ(Ｓ,Ｔ)ＸＸＸＥの反復のうち少なくとも１つを含むポリペプチドをコードし、Ｘは任意のアミノ酸である、請求項１に記載のポリヌクレオチド。
【請求項３】
配列番号：１の配列あるいはその断片または変異体を有し、該断片または変異体がα−ファルネセン合成酵素活性を有するポリペプチドをコードする、請求項１に記載の単離ポリヌクレオチド。
【請求項４】
前記配列が配列番号：１のヌクレオチド配列と少なくとも７０％の同一性を有する、請求項３に記載の単離ポリヌクレオチド。
【請求項５】
前記配列が配列番号：１のヌクレオチド配列と少なくとも９０％の同一性を有する、請求項３に記載の単離ポリヌクレオチド。
【請求項６】
前記配列が配列番号：１のヌクレオチド配列と少なくとも９５％の同一性を有する、請求項３に記載の単離ポリヌクレオチド。
【請求項７】
前記ヌクレオチド配列が配列番号：１の配列である、請求項３に記載の単離ポリヌクレオチド。
【請求項８】
配列番号：２のポリペプチドをコードする、またはα−ファルネセン合成酵素活性を有するその配列の変異体または断片をコードする単離ポリヌクレオチド。
【請求項９】
前記ポリペプチドが配列番号：２のアミノ酸配列と少なくとも７０％の同一性を有する、請求項８に記載の単離ポリヌクレオチド。
【請求項１０】
前記ポリペプチドが配列番号：２のアミノ酸配列と少なくとも９０％の同一性を有する、請求項８に記載の単離ポリヌクレオチド。
【請求項１１】
前記ポリペプチドが配列番号：２のアミノ酸配列と少なくとも９５％の同一性を有する、請求項８に記載の単離ポリヌクレオチド。
【請求項１２】
前記ポリペプチドが配列番号：２の配列を有する、請求項８に記載の単離ポリヌクレオチド。
【請求項１３】
単離α−ファルネセン合成酵素ポリペプチド。
【請求項１４】
配列番号：２の配列、あるいはα−ファルネセン合成酵素活性を有するその断片または変異体を有する単離α−ファルネセン合成酵素。
【請求項１５】
前記アミノ酸配列が配列番号：２の配列と少なくとも７０％の同一性を有する、請求項１４に記載の単離α−ファルネセン合成酵素。
【請求項１６】
前記アミノ酸配列が配列番号：２の配列と少なくとも９０％の同一性を有する、請求項１４に記載の単離α−ファルネセン合成酵素。
【請求項１７】
前記アミノ酸配列が配列番号：２の配列と少なくとも９５％の同一性を有する、請求項１４に記載の単離α−ファルネセン合成酵素。
【請求項１８】
前記アミノ酸配列が配列番号：２の配列由来の完全な配列である、請求項１４に記載の単離α−ファルネセン合成酵素。
【請求項１９】
請求項１から１２のいずれか一項に記載のポリヌクレオチドを含む遺伝子構築物。
【請求項２０】
５’から３’の方向で、請求項１３から１８のいずれか一項に記載のポリペプチドをコードするオープンリーディングフレームのポリヌクレオチドを含む遺伝子構築物。
【請求項２１】
プロモーター配列をさらに含む、請求項２０に記載の遺伝子構築物。
【請求項２２】
終結配列をさらに含む、請求項２１に記載の遺伝子構築物。
【請求項２３】
コードされたポリペプチドの配列が、配列番号：２のアミノ酸配列、またはα−ファルネセン活性を有するその断片を有する、請求項２２に記載の遺伝子構築物。
【請求項２４】
５’から３’の方向で、請求項１３から１８のいずれか一項に記載のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドとハイブリダイズするポリヌクレオチドを含む遺伝子構築物。
【請求項２５】
プロモーター配列をさらに含む、請求項２４に記載の遺伝子構築物。
【請求項２６】
終結配列を含む、請求項２５に記載の遺伝子構築物。
【請求項２７】
コードされたポリペプチドの配列が、配列番号：２のアミノ酸配列、またはα−ファルネセン活性を有するその断片を有する、請求項２６に記載の遺伝子構築物。
【請求項２８】
請求項１９から２７のいずれか一項に記載の遺伝子構築物を含むベクター。
【請求項２９】
請求項１９から２７のいずれか一項に記載の遺伝子構築物を含む宿主細胞。
【請求項３０】
請求項１９から２７のいずれか一項に記載の遺伝子構築物を含むトランスジェニック植物細胞。
【請求項３１】
請求項３０に記載の植物細胞を含むトランスジェニック植物。
【請求項３２】
α−ファルネセンを調製する方法であって、
（ａ）高いα−ファルネセン合成酵素活性をもたらすように請求項１から１２のいずれか一項に記載のポリヌクレオチドで遺伝子改変された細胞を培養するステップと、
（ｂ）必要な場合に前記細胞にファルネシルジリン酸を提供するステップと、
（ｃ）産生したα−ファルネセンを分離するステップと
を含む方法。
【請求項３３】
植物のα−ファルネセン産生を調節する方法であって、α−ファルネセン合成酵素発現を増加させるまたは低下させるステップを含み、前記増加または低下がα−ファルネセン合成酵素をコードする遺伝子の発現を変化させる遺伝子改変によって達成される方法。
【請求項３４】
前記ポリペプチドが配列番号：２の配列を有するポリペプチドを含む、請求項３３に記載の方法。
【請求項３５】
植物内でα−ファルネセン産生を調節する方法であって、
（ａ）請求項１９から２７に記載の遺伝子構築物を前記植物に導入するステップと、
（ｂ）前記植物内で前記ポリヌクレオチドを転写により発現させるステップと
を含む方法。
【請求項３６】
植物内でα−ファルネセン産生を調節する方法であって、
（ａ）請求項１９から２７に記載のＤＮＡ遺伝子構築物を前記植物に導入するステップと、
（ｂ）前記植物内で前記ポリペプチドを発現させるステップと
を含む方法。
【請求項３７】
配列番号：１に由来する少なくとも１５個の連続したヌクレオチドを含むポリヌクレオチド。
【請求項３８】
α−ファルネセンの含有量が変化した植物を選択する方法であって、
（ａ）α−ファルネセン合成酵素の発現を評価するため、少なくとも１つの植物に由来するポリヌクレオチドを、請求項１に記載のポリヌクレオチドのうち少なくとも１５個の連続したヌクレオチドを含む、少なくとも１つのポリヌクレオチドと接触させるステップと、
（ｂ）発現量の変化を示す植物を選択するステップと
を含む方法。
【請求項３９】
前記ポリヌクレオチドが配列番号：１に由来する少なくとも１５個の連続したヌクレオチドを有し、前記植物がリンゴ植物である、請求項３５に記載の方法。
【請求項４０】
α−ファルネセンを調製する方法であって、
（ａ）請求項１３から１８のいずれか一項に記載のポリペプチドを得るステップと、
（ｂ）前記ポリペプチドの存在下でファルネシルジリン酸をインキュベートするステップと、
（ｃ）産生したα−ファルネセンを分離するステップと
を含む方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図１６】
【図１７】
【図１８】
【図１９】
【図２０】
【図２１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図１６】
【図１７】
【図１８】
【図１９】
【図２０】
【図２１】
【公表番号】特表２００６−５０２７３３（Ｐ２００６−５０２７３３Ａ）
【公表日】平成１８年１月２６日（２００６．１．２６）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００４−５４５０９４（Ｐ２００４−５４５０９４）
【出願日】平成１５年１０月１５日（２００３．１０．１５）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＮＺ２００３／０００２２９
【国際公開番号】ＷＯ２００４／０３５７９１
【国際公開日】平成１６年４月２９日（２００４．４．２９）
【公序良俗違反の表示】
（特許庁注：以下のものは登録商標）
ＵＮＩＸ
【出願人】（５０３２４８４１１）ザ ホーティカルチャー アンド フード リサーチ インスティテュート オブ ニュージーランド リミテッド (1)
【氏名又は名称原語表記】ＴＨＥ ＨＯＲＴＩＣＵＬＴＵＲＥ ＡＮＤ ＦＯＯＤ ＲＥＳＥＡＲＣＨ ＩＮＳＴＩＴＵＴＥ ＯＦ ＮＥＷ ＺＥＡＬＡＮＤ ＬＩＭＩＴＥＤ
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成１８年１月２６日（２００６．１．２６）
【国際特許分類】
【出願日】平成１５年１０月１５日（２００３．１０．１５）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＮＺ２００３／０００２２９
【国際公開番号】ＷＯ２００４／０３５７９１
【国際公開日】平成１６年４月２９日（２００４．４．２９）
【公序良俗違反の表示】
（特許庁注：以下のものは登録商標）
ＵＮＩＸ
【出願人】（５０３２４８４１１）ザ ホーティカルチャー アンド フード リサーチ インスティテュート オブ ニュージーランド リミテッド (1)
【氏名又は名称原語表記】ＴＨＥ ＨＯＲＴＩＣＵＬＴＵＲＥ ＡＮＤ ＦＯＯＤ ＲＥＳＥＡＲＣＨ ＩＮＳＴＩＴＵＴＥ ＯＦ ＮＥＷ ＺＥＡＬＡＮＤ ＬＩＭＩＴＥＤ
【Ｆターム（参考）】
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