検体センサに使用されるＨＰＴＳ−モノ及びビス−Ｃｙｓ−ＭＡ重合性蛍光色素
検体検出に使用される新規な蛍光色素が開示される。詳細には、モノ置換ＨＰＴＳ色素及びビス置換ＨＰＴＳ色素並びにそれらを製造する方法が提供される。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
検体検出に使用される新規な蛍光色素が開示される。
【背景技術】
【０００２】
研究者等は、体液中のポリヒドロキシル化合物（例えばグルコース）濃度を測定するのに蛍光技術を使用している。例えば、Russellは、グルコースと結合してグルコース濃度に依存するシグナルを発するボロン酸官能化色素を開示している（米国特許第５，５１２，２４６号明細書）。James他は、同じ原理を使用しているが、単一の複合部分において蛍光色素と、アミン消光官能基と、ボロン酸とを組み合わせており、この単一の複合部分からの蛍光発光がグルコース結合度に応じて変化する（米国特許第５，５０３，７７０号明細書）。蛍光色素と、ボロン酸を付加した単一のビオロゲン部分を含む消光剤とを含むグルコースセンサが、合成及び研究されている（例えば、Gamsey, S.他、2006 Langmuir 22:9067-9074；Thoniyot, P.他、2006 Diabetes Technol Ther 8:279-287；Cordes, D.B.他、2005 Langmuir 21:6540-6547；Cordes, D.B.他、2005 Org Biomol Chem 3:1708-1713；Cappuccio, E.E.他、2004 J Fluoresc 14:521-533；Gamsey, S.他、2007 J Am Chem Soc 129:1278-1286及びCordes, D.B.他、2006 Angew Chem Int Ed Engl 45:3829-3832）。
【０００３】
８−ヒドロキシピレン−１，３，６−トリスルホン酸（ＨＰＴＳ）及びその誘導体を含む蛍光色素は既知であり、検体検出で使用されている。例えば、米国特許第６，６５３，１４１号明細書、同第６，６２７，１７７号明細書、同第５，５１２，２４６号明細書、同第５，１３７，８３３号明細書、同第６，８００，４５１号明細書、同第６，７９４，１９５号明細書、同第６，８０４，５４４号明細書、同第６，００２，９５４号明細書、同第６，３１９，５４０号明細書、同第６，７６６，１８３号明細書、同第５，５０３，７７０号明細書及び同第５，７６３，２３８号明細書、国際出願ＰＣＴ／ＵＳ２００３／０３０１６７号明細書並びに同時係属中の米国特許出願第１０／４５６，８９５号明細書及び同第１１／２９６，８９８号明細書（これらはそれぞれ、その全体が参照により本明細書に援用される）を参照されたい。国際出願ＰＣＴ／ＵＳ２００３／０３０１６７号明細書は、ビス置換ＨＰＴＳ誘導体を記載しているが、それらは本明細書中に開示するビス置換ＨＰＴＳ化合物とは構造が異なり、記載されているその合成方法は、本明細書中に開示する合成方法と異なるものである。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
検体センサを合成するための現行対策の一環として、本発明者等は、新たなモノ置換及びビス置換ＨＴＰＳ蛍光色素を開発した。これらの色素は、検体結合部分と組み合わせて使用することにより、ｉｎ ｖｉｖｏにおける検体レベルのリアルタイム測定を達成し得る。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
モノ置換色素
下記一般構造を有するＨＰＴＳのＮ置換モノスルホンアミド誘導体が本発明において開示される：
【０００６】
【化１】
【０００７】
（式中、Ｒ１及びＲ２は独立して、Ｈ、陰イオン基及び反応基から成る群から選択されるが、但し、Ｒ１及びＲ２は、少なくとも１つの陰イオン基及び少なくとも１つの反応基を総じて含むものとし、Ｍは対イオンである）。
【０００８】
幾つかの実施の形態では、陰イオン基がスルホン酸である。
【０００９】
幾つかの実施の形態では、反応基が、アクリロイル、メタクリロイル、アクリルアミド、メタクリルアミド及びスチリル等から成る群から選択されるエチレン性不飽和重合性基である。
【００１０】
幾つかの実施の形態では、反応基が、カルボン酸、アルデヒド、アルキン、アジド、活性化エステル、スクシンイミド及びニトロベンゾエートから成る群から選択されるカップリング基を含み、該カップリング基が化合物をポリマー又は支持体に結合させることを可能にする。
【００１１】
Ｒ１及びＲ２のうちの一方がＨである実施の形態では、他方の基が陰イオン基と反応基とを両方とも含む。
【００１２】
幾つかの実施の形態では、Ｒ１及びＲ２が環状構造中で互いに結合する。
【００１３】
１．モノ−ＣｙｓＭＡ
下記構造を有するモノ−ＣｙｓＭＡと称するモノ置換蛍光色素が、本発明の好ましい実施の形態により開示される。
【００１４】
【化２】
【００１５】
モノ−ＣｙｓＭＡを製造する方法が、本発明の別の実施の形態により開示される。本方法は下記工程を含む。
【００１６】
【化３】
【００１７】
２．モノ−ＭＡ
下記構造を有するモノ−ＭＡと称する別のモノ置換蛍光色素が、本発明の好ましい実施の形態により開示される。
【００１８】
【化４】
【００１９】
モノ−ＭＡを製造する方法が、本発明の別の実施の形態により開示される。本方法は下記工程を含む。
【００２０】
【化５】
【００２１】
ビス置換色素
下記一般構造を有するＨＰＴＳのＮ置換ビススルホンアミド誘導体が開示される：
【００２２】
【化６】
【００２３】
（式中、Ｒ１及びＲ２は独立して、Ｈ、陰イオン基及び反応基から成る群から選択されるが、但し、Ｒ１及びＲ２は、少なくとも１つの陰イオン基及び少なくとも１つの反応基を総じて含むものとし、Ｍは対イオンである）。
【００２４】
幾つかの実施の形態では、陰イオン基がスルホン酸である。
【００２５】
幾つかの実施の形態では、反応基が、アクリロイル、メタクリロイル、アクリルアミド、メタクリルアミド及びスチリル等から成る群から選択されるエチレン性不飽和重合性基である。
【００２６】
幾つかの実施の形態では、反応基が、カルボン酸、アルデヒド、アルキン、アジド、活性化エステル、スクシンイミド及びニトロベンゾエートから成る群から選択されるカップリング基を含み、該カップリング基が化合物をポリマー又は支持体に結合させることを可能にする。
【００２７】
幾つかの実施の形態では、Ｒ１及びＲ２が環状構造中で互いに結合する。
【００２８】
下記構造を有するビス−ＣｙｓＭＡと称するビス置換蛍光色素が、本発明の好ましい実施の形態により開示される。
【００２９】
【化７】
【００３０】
ビス置換色素を製造する方法が、本発明の別の実施の形態により開示される。本方法は下記工程を含む。
【００３１】
【化８】
【００３２】
グルコースセンサ
本明細書中に記載のモノ置換色素又はビス置換色素と、ボロン酸置換ビオロゲン、又はボロン酸で官能化されたピリジニウム塩及びキノリニウム塩等の、ボロン酸を含む消光剤(quencher)とを含むグルコースセンサが、本発明の別の実施の形態により開示される。
【図面の簡単な説明】
【００３３】
【図１】ｐＨ５における４０％ＤＭＡＡ中のモノ−ＣｙｓＭＡとトリ−ＣｙｓＭＡとの比較を示す図である。
【図２】モノ−ＣｙｓＭＡのｐＨプロファイルを示す図である。
【図３】グルコースに対するモノ−ＣｙｓＭＡ応答を示す図である（４０％ＤＭＡＡ中、モノ−ＣｙｓＭＡ＋３，３’−ｏＢＢＶ）。
【図４】種々のｐＨにおけるモノ−ＭＡの蛍光スペクトルを示す図である。
【図５】種々のｐＨにおけるモノ−ＣｙｓＭＡの蛍光スペクトルを示す図である。
【図６】種々のｐＨにおけるトリ−ＣｙｓＭＡの蛍光スペクトルを示す図である。
【図７】３，３’−ｏＢＢＶを伴ったＨＰＴＳ色素のＳｔｅｒｎ−Ｖｏｌｍｅｒ比較を示す図である。
【図８】種々の色素及び３，３’−ｏＢＢＶによるグルコース応答の比較を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００３４】
色素
本明細書中で使用する場合、「蛍光体」又は「蛍光体色素」若しくは「色素」という用語は、適切な波長の光に曝されると、光を発する、すなわち、蛍光を発する化合物を指す。
【００３５】
本明細書中で使用する場合、「カップリング基」とは、ポリマー、支持体マトリックス等、特に予め形成されたヒドロゲルと共有結合を形成し得る反応性官能基である。かかる反応性官能基としては、カルボン酸、アルデヒド、アルキン及びアジド、並びにスクシンイミド及びニトロベンゾエート等の活性化エステル、又はポリマー、支持体マトリックス等、特に予め形成されたヒドロゲルと共有結合し得る任意の他の単官能性リンカー化学物質が挙げられるが、これらに限定されない。
【００３６】
本明細書中で使用する場合、「陰イオン基」とは、任意の負に帯電した基（例えば、ＳＯ３−、ＨＰＯ３−、ＣＯ２−及び
【００３７】
【化９】
【００３８】
）である。
【００３９】
本明細書中で使用する場合、「対イオン」とは、色素分子中の反対電荷のイオンに結合するイオンである。非限定的な例の対イオンとしては、Ｈ＋、アルカリ金属イオン、Ｌｉ＋、Ｎａ＋、Ｋ＋、Ｒｂ＋、Ｃｓ＋、Ｆｒ＋、オニウムイオン及びＮＲ４＋（式中、Ｒは、アルキル基、アルキルアリール基及び芳香族基から成る群から選択される）が挙げられる。当業者は、対イオンが、センサに組み込まれても色素の機能に影響を及ぼさないことを認識している。センサが生理液中に存在する場合、対イオンは、生理液中の既存のイオンと平衡化する。
【００４０】
本発明の色素は、グルコースセンシング用途において通常生じる条件下で使用する場合、ビオロゲン等の電子受容体分子による消光に対して応答性であり、光退色に対して耐性であり、光酸化、加水分解及び生分解に対して安定である。実施形態によっては、色素がスルホンアミド官能基を介してポリマーと結合する。この高分子色素は、水溶性、水不溶性、有機溶媒可溶性又は有機溶媒不溶性であってもよい。検知を起こすために、検知部分（検体、色素及び消光剤）を物理的に近接させて、相互作用させる、すなわち、分子レベルで且つ検出すべき化学種と平衡化した状態で混合させて、消光を起こさせる。
【００４１】
消光剤
本明細書中で使用する場合、「消光剤」という用語は、その存在時に、蛍光体の発光を低減する化合物を指す。
【００４２】
実施形態によっては、消光剤部分は、グルコース認識を提供する。かかる部分は、芳香族ボロン酸を含む。より具体的には、ボロン酸は、共役窒素含有複素環式芳香族ビスオニウム構造（例えば、ビオロゲン）に共有結合され、ここでボロン酸は、水性媒質、有機媒質又は組合せ媒質中でグルコースと可逆的に反応して、ボロン酸エステルを形成する。反応の程度は、媒質中のグルコース濃度に関連する。
【００４３】
ビスオニウム塩は、共役複素環式芳香族二窒素化合物から調製される。共役複素環式芳香族二窒素は、例えばジピリジル、ジピリジルエチレン、ジピリジルフェニレン、フェナントロリン及びジアザフルオレンである。両方の窒素が置換され得る上記共役複素環式芳香族二窒素化合物の全ての異性体が本発明で有用であることが理解される。
【００４４】
実施形態によっては、３，３’−ｏＢＢＶを消光剤部分として使用してもよい。３，３’−ｏＢＢＶの構造は：
【００４５】
【化１０】
【００４６】
である。
【００４７】
モノ置換色素
下記一般構造を有するＨＰＴＳのＮ置換モノスルホンアミド誘導体が本発明において開示される：
【００４８】
【化１１】
【００４９】
（式中、Ｍは対イオンであり、Ｒ１及びＲ２は個々にＨ−又は有機基であるか、又はＲ１及びＲ２は必要に応じて、反応基及び陰イオン基、好ましくはスルホネートイオンを含むが、但し、Ｒ１及びＲ２のうちの一方がＨである場合には、他方が有機基であり、Ｒ１及びＲ２が共に有機基である場合には、Ｒ１及びＲ２のうちの少なくとも一方が、重合性基又はカップリング基から選択される反応基、好ましくは重合性基を含むものとする）。実施形態によっては、Ｒ１及びＲ２は環状構造中で互いに結合されていてもよい。重合性基は好ましくは、アクリロイル、メタクリロイル、アクリルアミド、メタクリルアミド（methacrylamido）、スチリル等を含むエチレン性不飽和基である。色素を既存のポリマー又は支持体と結合させるのに用いられるカップリング基としては、カルボン酸、アルデヒド、アルキン及びアジド、並びにスクシンイミド及びニトロベンゾエート等の活性化エステルが挙げられるが、これらに限定されない。
【００５０】
重合性基を１つだけ含む色素は、従来技術における重合性ＨＰＴＳ誘導体とは対照的に、架橋剤として作用しないため、ヒドロゲル及び他の検知ポリマーを製造するのに有益である。さらに、１点でのみポリマーマトリックスと結合する色素の基は、固定化状態でより大きな移動度を有するため、消光剤とのより良好な相互作用を可能にすると仮定される。相互作用は、生理ｐＨで完全にイオン化した酸基の存在によってさらに改良される。好ましい色素は、ピレン環上の１つのスルホネート基がＮ置換スルホンアミドに変換するＨＰＴＳのモノ置換誘導体である。Ｎ置換基は、エチレン性不飽和基、及び必要に応じてスルホン酸基又はその塩と共有結合する結合基を含む。エチレン性不飽和基は好ましくは、アクリロイル、メタクリロイル、アクリルアミド（acrylamido）、メタクリルアミド及びスチリルである。モノ置換基を含む色素はまた、かかる色素のｐＫａが生理条件に最適なもの、すなわちｐＨ７．４となることから有益である。
【００５１】
実施形態によっては、Ｎ置換スルホンアミド誘導体が、塩化スルホニル中間体と、第一アミン（Ｒ１−ＮＨ２）との反応によって形成される。他の実施形態において、Ｎ，Ｎ−ビス置換スルホンアミド誘導体は、第二アミン（Ｒ１−ＮＨ−Ｒ２）との反応によって形成される。必要に応じて、これらのＲ基は、環状第二アミンを形成するように連結されてもよい。
【００５２】
下記スキームに、第二アミン及び芳香族アミンを含む種々のタイプのモノ置換色素を包含する構造例を挙げる。
【００５３】
【化１２】
【００５４】
本明細書中で使用される幾つかのＨＰＴＳ色素構造としては：
【００５５】
【化１３】
【００５６】
が挙げられる。
【００５７】
１．モノ−ＣｙｓＭＡ
モノ−ＣｙｓＭＡの構造は：
【００５８】
【化１４】
【００５９】
である。
【００６０】
当然ながら、実施形態によっては、ＨＰＴＳコア上のＣｙｓ−ＭＡ以外の置換基が負に帯電し且つ重合性基を有するものであれば、その置換基は本発明の態様に適合する。システイン酸のＬ立体異性体又はＤ立体異性体のいずれを使用してもよい。同様に、上記に示されるモノ−ＣｙｓＭＡに対する変形形態において、Ｎａ＋に加えて他の対イオン、例えばＮＢｕ４＋を使用してもよい。他の変形形態では、スルホン酸基が、例えば、リン酸、カルボン酸等の官能基で置き換えられてもよい。
【００６１】
モノ−ＣｙｓＭＡの合成をスキーム１に示す。１５０℃２０分間のＨＰＴＳと３０％硫酸との反応により、３−ヒドロキシピレン−５−スルホン酸ナトリウム１が収率１０％で得られた。１をアセチル化した後に、２を塩素化することにより、中間体３が得られた。これは、ＨＰＴＳ−Ｃｌに類似しているが、塩化スルホニルを１つしか有しない。重合性基がシステイン酸部分を介して結合し、３と反応して、化合物４が得られる。重合性基に影響を及ぼすことなく４のクロロスルホン化が達成され、ポリスチレンビーズによる精製後に、モノ−ＣｙｓＭＡが２工程にわたって収率５０％で得られた。この色素の特性決定は１Ｈ ＮＭＲ、ＨＰＬＣ及びＭＳにより行った。
【００６２】
スキーム４に関して、磁気攪拌子を備えた５０ｍＬ容丸底フラスコに、ＨＰＴＳ（９．５ｍｍｏｌ、５ｇ）及び３０％Ｈ２ＳＯ４（３５ｍＬ）を充填した。この混合物を１５０℃で２０分間加熱し、次に周囲温度で１０分間冷却した。溶液を１００ｇの砕氷に注ぎ入れ、水で２００ｍＬに希釈した。この混合物をイソプロピルアセテート（２００ｍＬ×４）で抽出し、真空中で濃縮させた。残渣をシリカゲル（３ｇ）と混合し、細粉末に砕き、Ｂｉｏｔａｇｅ ４０Ｍカートリッジに乾燥装填した。５％ＭｅＯＨ：（５％ＮＥｔ３：ＣＨ２Ｃｌ２）→１５％ＭｅＯＨ：（５％ＮＥｔ３：ＣＨ２Ｃｌ２）を用いた勾配溶出により残渣を精製し、１のトリエチルアミン塩を得た（０．２８１ｇ）。塩を１Ｍ ＨＣｌで処理し、イソプロピルアセテートで抽出し、イソプロピルアセテート層をＭｇＳＯ４により乾燥させ、真空中で濃縮して、褐色／緑色の発泡体として１を得た。１の合成はE. Tietze及びO. Bayer 1939 Ann 540:189-210により以前に報告されている。ＴＬＣ（ＭｅＯＨ：ＣＨ２Ｃｌ２：ＮＥｔ３、２：７：１）Ｒｆ＝０．２３。１Ｈ ＮＭＲ（５００ＭＨｚ，ＣＤ３ＯＤ）δ７．９４（ｔ，Ｊ＝７．６Ｈｚ，１Ｈ）、７．９７（ｄ，Ｊ＝９．４Ｈｚ，１Ｈ）、８．０２（ｄ，Ｊ＝９．２Ｈｚ，１Ｈ）、８．１１（ｔ，Ｊ＝７．７Ｈｚ，２Ｈ）、８．２５（ｓ，１Ｈ）、８．３９（ｄ，Ｊ＝９．１Ｈｚ，１Ｈ）、８．９８（ｄ，Ｊ＝９．３Ｈｚ，１Ｈ）。
【００６３】
【化１５】
【００６４】
スキーム５に関して、磁気攪拌子を備えた５０ｍＬ容丸底フラスコに、１（１．７ｍｍｏｌ、０．５ｇ）、無水酢酸（３０ｍＬ）及び酢酸ナトリウム（３．４ｍｍｏｌ、０．２７９ｇ）を充填した。この混合物を１５０℃で２時間加熱し、次に周囲温度に冷却した。溶液をエーテル：ヘキサン（１：１、５０ｍＬ）で沈殿させ、固体をガラス漏斗上に回収し、エーテルで洗浄した。固体をシリカゲル（３ｇ）と混合し、細粉末に砕き、Ｂｉｏｔａｇｅ ４０Ｍカートリッジに乾燥装填した。５％ＭｅＯＨ：ＣＨ２Ｃｌ２→１５％ＭｅＯＨ：ＣＨ２Ｃｌ２を用いた勾配溶出により生成物を精製して、クリーム色の固体として２を得た（０．４６３６ｇ）。ＴＬＣ（２０％ＭｅＯＨ：ＣＨ２Ｃｌ２）Ｒｆ＝０．４９。
【００６５】
【化１６】
【００６６】
スキーム６に関して、磁気攪拌子を備えた５０ｍＬ容丸底フラスコに、２（１．２８ｍｍｏｌ、０．４６３ｇ）、ＣＨ２Ｃｌ２（２０ｍＬ）及び塩化オキサリル（３．８４ｍｍｏｌ、１．９２ｍＬの２．０ＭのＣＨ２Ｃｌ２溶液）を充填した。ＤＭＦ（０．２ｍＬ）を滴下し、この混合物を２７時間還流させた。溶液を室温に冷却し、５ｇのシリカゲルと混合し、ガラス漏斗を通して濾過した。３を含有する濾液を真空中で約５ｍＬまで濃縮し、新たに調製した４（１．６３ｍｍｏｌ、０．８７２ｇ）をＮＥｔ３（１．６３ｍｍｏｌ、０．２２７ｍＬ）と共に添加した。この混合物を１３．５時間室温で攪拌し、形成される沈殿物を濾過により除去した。濾液を真空中で濃縮し、Ｂｉｏｔａｇｅ ４０Ｍカートリッジに装填し、５％ＭｅＯＨ：（５％ＮＥｔ３：ＣＨＣｌ３）→３０％ＭｅＯＨ：（５％ＮＥｔ３：ＣＨＣｌ３）を用いた勾配溶出により精製した。所望の画分を合わせて、１Ｍ ＨＣｌで処理し、ＥｔＯＡｃで抽出した。ＥｔＯＡｃ層をＭｇＳＯ４により乾燥させ、真空中で濃縮すると、黄色の発泡体が得られた。この発泡体をクロロスルホン酸（５ｍＬ）で処理し、混合物を１時間室温で攪拌した。溶液を氷の上に注ぎ、３Ｍ ＮａＯＨで塩基性とした。橙色の水層をポリスチレン−ジビニルベンゼンビーズ（２５０ｇ）に吸着させ、水で洗浄してあらゆる塩を除去した。ＭｅＯＨを用いて所望の生成物をビーズから抽出した。ＭｅＯＨ／水層を真空中で濃縮し、次にアセトンで沈殿させて、０．１９４７ｇのモノ−ＣｙｓＭＡを得た。１Ｈ ＮＭＲ（５００ＭＨｚ，Ｄ２Ｏ）δ０．８０（ｍ，２Ｈ）、２．１２（ｓ，３Ｈ），３．０９（ｍ，４Ｈ）、３．２４（ｍ，２Ｈ）、４．２６（ｔ，Ｊ＝６．８Ｈｚ，１Ｈ）、５．１５（ｓ，１Ｈ）、５．２１（ｓ，１Ｈ）、８．１９（ｓ，１Ｈ）、８．５４（ｄ，Ｊ＝９．６Ｈｚ，１Ｈ）、８．９１（ｍ，３Ｈ）、９．１４（ｓ，１Ｈ）；ＭＳ（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ）Ｃ２６Ｈ２７Ｎ３Ｏ１４Ｓ４、ＭＨ＋７３４．０５。
【００６７】
【化１７】
【００６８】
米国特許出願第１１／６７１，８８０号明細書において以前に記載されているように、モノ−ＣｙｓＭＡを含有するヒドロゲルを調製し、モノ−ＣｙｓＭＡの蛍光特性（励起（ｅｘ）、発光（ｅｍ）及びｐＫａ）を評価した。励起スペクトル及び発光スペクトルを図１に示し、トリ−ＣｙｓＭＡと比較する。
【００６９】
ゲルによりｐＨ調査を行った。データを図２にまとめる。このデータから、ｐＫａ＝７．２である。このため、モノ置換基は、ＨＰＴＳ（ｐＫａ＝７．３）に比べてｐＫａの変化が最小限である、重合性基及びスルホネートの組み込みを可能にする。
【００７０】
米国特許出願第１１／６７１，８８０号明細書において以前に記載されているように、４０％ＤＭＡＡゲルを調製した（図３）。このため、モノ−ＣｙｓＭＡはｐＨ応答性色素として且つグルコース応答性色素として機能する（トリ−ＣｙｓＭＡも同様に機能する）。
【００７１】
２．モノ−ＭＡ
モノ−ＭＡの構造は：
【００７２】
【化１８】
【００７３】
である。
【００７４】
モノ−ＭＡの合成をスキーム２に示す。３とアミノプロピルメタクリルアミドとの反応によりピレン７が得られる。７のクロロスルホン化により所望の生成物であるモノ−ＭＡが得られる。この色素は、負電荷を２つしか含有しないという点で特有である。そのため、１つの色素分子が１つの消光剤に結合することにより、電荷のバランスがとれた１：１複合体を得ることができる。
【００７５】
スキーム７に関して、下記方法に従ってモノ−ＭＡを生成した。磁気攪拌子を備えた５０ｍＬ容丸底フラスコに、２（０．５９１ｍｍｏｌ、０．２１４ｇ）、ＣＨ２Ｃｌ２（１０ｍＬ）及び塩化オキサリル（１．８ｍｍｏｌ、０．９ｍＬの２．０ＭのＣＨ２Ｃｌ２溶液）を充填した。ＤＭＦ（０．１ｍＬ）を滴下し、この混合物を２７時間還流させた。溶液を室温に冷却し、５ｇのシリカゲルと混合し、ガラス漏斗を通して濾過した。３を含有する濾液を真空中で約５ｍＬまで濃縮し、新たに調製した６（０．６５ｍｍｏｌ、０．１１６ｇ）をＮＥｔ３（０．７ｍｍｏｌ、０．０９７ｍＬ）と共に添加した。この混合物を２０時間室温で攪拌し、形成される沈殿物を濾過により除去した。濾液を真空中で濃縮し、Ｂｉｏｔａｇｅ ４０Ｍカートリッジに装填し、５％ＭｅＯＨ：ＣＨ２Ｃｌ２→１５％ＭｅＯＨ：ＣＨ２Ｃｌ２を用いた勾配溶出により精製して、黄色の固体を得た（４６ｍｇ）。この固体をクロロスルホン酸（１ｍＬ）で処理し、混合物を１時間室温で攪拌した。溶液を氷の上に注ぎ、３Ｍ ＮａＯＨで塩基性とした。橙色の水層をポリスチレン−ジビニルベンゼンビーズ（５０ｇ）に吸収させ、水で洗浄してあらゆる塩を除去した。ＭｅＯＨを用いて所望の生成物をビーズから抽出した。ＭｅＯＨ／水層を真空中で濃縮し、次にアセトンで沈殿させて、８ｍｇのモノ−ＭＡを得た。
【００７６】
【化１９】
【００７７】
モノ−ＭＡ色素を調製し、その量子収率を他のＨＰＴＳ誘導体と比較した。ＨＰＴＳ、モノ−ＭＡ、モノ−ＣｙｓＭＡ及びトリ−ＣｙｓＭＡに関する発光／吸光度（Ｅｍ／Ａｂｓ）比の概要を表１に示す。実数値は任意のものであるが、比較に用いられ得るため、本発明者等はこれを見かけの量子収率とみなしている。図４、図５及び図６は、それぞれ種々のｐＨにおける、ＤＭＡＡ膜中のモノ−ＭＡ、モノ−ＣｙｓＭＡ及びトリ−ＣｙｓＭＡの蛍光励起スペクトル及び蛍光発光スペクトルを示す。
【００７８】
【表１】
【００７９】
色素全てに関するＳｔｅｒｎ−Ｖｏｌｍｅｒ曲線を図７にまとめる。モノ−ＭＡは他の色素に比べ最も効果的に消光する。これは、色素と消光剤との間の電荷間のマッチングの結果であると見られる。すなわち、色素が２つの負電荷を有し、消光剤が２つの負電荷を有するためである。
【００８０】
４０％ＤＭＡＡを用いて３つの重合性色素を固定化し、ｐＨ調査によりそれらのｐＫａを測定した。結果を表２にまとめる。
【００８１】
【表２】
【００８２】
ＨＰＴＳに比べ、モノ置換色素はより低いｐＫａを有する。いかなる特定の理論にも拘束されることを望むものではないが、各色素の有効ｐＫａは、ＨＰＴＳに対する２つの構造修飾、例えば、ピレンコア上のスルホンアミド置換基及びリンカー上の陰イオン性置換基の結果であると見られる。ｐＫａにより色素が生理範囲内のｐＨ変化に対してより応答性となるため、モノ置換の色素が有益である。
【００８３】
３，３’−ｏＢＢＶを伴いｐＨ７．４ＰＢＳ中、グルコース応答用の溶液中で色素を試験した（図８）。また、色素を、これまでに記載した配合を用いた４０％ＤＭＡＡゲル中で固定化し、グルコース応答実験を行った（図３）。
【００８４】
ビス置換色素
下記一般構造を有するＨＰＴＳのＮ置換ビススルホンアミド誘導体が開示される：
【００８５】
【化２０】
【００８６】
（式中、Ｍは対イオンであり、Ｒ１及びＲ２は個々にＨ−又は有機基であるか、又はＲ１及びＲ２は必要に応じて、反応基及び陰イオン基、好ましくはスルホネートイオンを含むが、但し、Ｒ１及びＲ２のうちの一方がＨである場合、他方は有機基であり、Ｒ１及びＲ２が共に有機基である場合、Ｒ１及びＲ２のうちの少なくとも一方が、重合性基又はカップリング基から選択される反応基、好ましくは重合性基を含む）。実施形態によっては、Ｒ１及びＲ２は環状構造中で互いに結合されていてもよい。重合性基は好ましくは、アクリロイル、メタクリロイル、アクリルアミド、メタクリルアミド、スチリル等を含むエチレン性不飽和基である。色素を既存のポリマー又は支持体と結合させるのに用いられるカップリング基としては、カルボン酸、アルデヒド、アルキン及びアジド、並びにスクシンイミド及びニトロベンゾエート等の活性化エステルが挙げられるが、これらに限定されない。
【００８７】
下記スキームに、第二アミン及び芳香族アミンを含む種々のタイプのビス置換色素を包含する構造例を挙げる。
【００８８】
【化２１】
【００８９】
下記構造を有するビス−ＣｙｓＭＡと称するビス置換蛍光色素が、本発明の好ましい実施形態により開示される。
【００９０】
【化２２】
【００９１】
ビス−ｃｙｓＭＡを製造する方法が、本発明の別の実施形態により開示される。本方法は下記工程を含む。
【００９２】
【化２３】
【００９３】
ビス置換色素は架橋剤として作用する。ビス置換色素はまた、三置換色素と比較して、生理範囲内のｐＨ変化に対して色素がより応答性となるより最適なｐＫａを有し得る。さらに、色素と結合する複数の官能基を有することが可能である（例えば、１つのスルホンアミドが重合性基を含有し得る一方で、他のものがスルホン酸等の陰イオン基を含有していてもよい）。
【００９４】
スキーム１は、化合物３を合成するのに使用される工程を示す。１５０℃２０分間のＨＰＴＳと３０％硫酸との反応により、３−ヒドロキシピレン−５−スルホン酸ナトリウム１が収率１０％で得られた。１をアセチル化した後に、２を塩素化することにより、中間体３が得られた。これは、ＨＰＴＳ−Ｃｌに類似しているが、塩化スルホニルを１つしか有しない。
【００９５】
スキーム３に関して、塩基（例えば、ピリジン、Ｋ２ＣＯ３等）の存在下で化合物３をフェノールと反応させて、スルホン酸エステル８を得る。８のクロロスルホン化を行って、ビス塩化スルホニル９を得る。９と４との反応により１０が得られ、塩基による脱保護により、ビス−ＣｙｓＭＡが得られる。
【００９６】
グルコースセンサ
本発明のグルコースセンサは、グルコース結合部分と操作可能にカップリングする蛍光体を含み、この際、グルコースの結合は、蛍光体（fluophores）濃度（例えば、発光強度）における明らかな光学変化を起こす。例えば、ボロン酸を付加したビオロゲン（例えば、３，３’−ｏＢＢＶ）又はボロン酸で官能化されたピリジニウム塩等のグルコース結合部分が、本明細書中に記載のもの等の蛍光色素に操作可能にカップリングする。グルコース結合部分は蛍光色素の発光強度を抑え（quench）、この際、消光度がグルコースの結合を受けて減少し、その結果、グルコース濃度に関連する発光強度が増大する。
【００９７】
実施形態によっては、グルコースセンサシステムは、検知部分（例えば、色素−消光剤）が互いに相互作用（消光)するのに十分に物理的に接近した状態を維持するように、検知部分を固定化する手段を含む。ｉｎ ｖｉｖｏにおける検知が望ましい場合、かかる固定化手段は好ましくは、水性環境中（例えば、血管内）で不溶性であり、グルコースにとって透過性であり、且つ検知部分にとって不透過性である。典型的に、固定化手段は水不溶性有機ポリマーマトリックスを含む。例えば、色素−消光剤は、ＤＭＡＡ（Ｎ，Ｎ’−ジメチルアクリルアミド）ヒドロゲルマトリックスにより有効に固定化され、ｉｎ ｖｉｖｏにおけるグルコース検知が可能となり得る。
【００９８】
典型的なセンサの構成は、１つ又は複数の励起波長で光を発するように構成される光源と、光源から光を化学指標系（例えば、蛍光色素、消光剤及び固定化ポリマー）に伝送するように構成される光ファイバと（ここで、指標系は好ましくは、末端領域の光ファイバに沿って光路内に配置され、（例えば、血管内の）グルコースを幾らか含有する生理液と接触する）、１つ又は複数の発光波長における発光蛍光を測定するように構成される検出器とを備える。
【００９９】
グルコースセンサ化学物質、装置の構成、及びハードウェアとしては、同時係属中の米国特許出願第１０／４５６，８９５号明細書、同第１１／２９６，８９８号明細書、同第１１／６７１，８８０号明細書、同第１１／７８２，５５３号明細書、同第６０／８８８，４７７号明細書、同第６０／８８８，４７５号明細書、同第６０／９１７，３０９号明細書、同第６０／９１７，３０７号明細書、同第６０／９１５，３７２号明細書及び同第６０／９４９，１４５号明細書（これらはそれぞれ、その全体が参照により本明細書に援用される）に開示されている任意の実施形態が挙げられ得る。
【０１００】
センサのためのポリマーマトリックス
ｉｎ ｖｉｖｏ用途に関しては、センサは、好ましくは、１つ又は複数のポリヒドロキシル有機化合物を含有するか、又は該化合物を含有する筋肉のような組織中に埋め込まれている、例えば血管内の生理液の移動している流れにおいて使用される。したがって、検知部分はいずれもセンサアセンブリから抜け出ないことが好ましい。したがって、ｉｎ ｖｉｖｏでの使用に関して、検知構成成分は、有機ポリマー検知アセンブリの一部である。可溶性色素及び消光剤は、検体の通過を可能にするが、検知部分の通過を阻止する半透膜により閉じ込められ得る。このことは、検体分子よりも実質的に大きい可溶性分子（検体の分子量の少なくとも２倍、又は１０００より大きい、好ましくは５０００より大きい分子量）を検知部分として使用すること、及び検知部分が定量的に保持されるように２つの間で特定の分子量カットオフを有する選択的半透膜（例えば、透析又は限外濾過膜）を用いることにより実現することができる。
【０１０１】
好ましくは、検知部分は、グルコースにとって自由に透過性である不溶性ポリマーマトリックスに固定化される。ポリマーマトリックスは、有機ポリマー、無機ポリマー又はそれらのポリマーの組合せで構成され得る。マトリックスは、生体適合性材料で構成されてもよい。或いは、マトリックスは、所定の検体にとって透過性である第２の生体適合性ポリマーでコーティングされる。
【０１０２】
ポリマーマトリックスの一機能は、検体との接触を可能とし、且つ検体をボロン酸に結合させると同時に、蛍光体及び消光剤部分を一緒に保持及び固定化してこれらの部分を動作可能にカップリングすることである。この効果を達成するには、マトリックスは、好ましくは、媒質中では不溶性であり、マトリックスと検体溶液との間で高表面積界面を確立することにより検体と密接に結び付かなくてはならない。例えば、超薄フィルム又は微孔質支持体マトリックスが使用され得る。或いは、マトリックスは、検体溶液中で膨潤性であり、例えばヒドロゲルマトリックスが水系で使用される。場合によっては、検知ポリマーは、光導管の表面のような表面に結合されるか、又は微孔質膜中に含浸される。全ての場合において、マトリックスは、好ましくは、結合部位への検体の輸送を妨害せず、その結果、２相間で平衡が確立され得る。超薄フィルム、微孔質ポリマー、微孔質ゾルゲル及びヒドロゲルを調製するための技法は当該技術分野で確立されている。有用なマトリックスは全て、検体透過性であるとして規定される。
【０１０３】
本発明の実施形態にはヒドロゲルポリマーが好ましい。本明細書中で使用する場合、ヒドロゲルという用語は、実質的に膨潤するが、水に溶解しないポリマーを指す。かかるヒドロゲルは、線形、分岐状若しくは網状ポリマー、又は高分子電解質複合体であってもよいが、但し、可溶性又は浸出性の画分を含有しないものとする。典型的に、ヒドロゲルの網状構造は、水溶性ポリマー上で実施される架橋工程により調製されるため、膨潤するが水性媒体に溶解しない。代替的に、ヒドロゲルポリマーは、親水性モノマーと架橋モノマーとの混合物を共重合して水膨潤性の網状ポリマーを得ることによって調製される。かかるポリマーは、付加重合若しくは重縮合、又は組合せプロセスのいずれかによって形成される。このような場合、検知部分は、網目構造形成モノマーと組み合わせたモノマー誘導体を用いた共重合によってポリマー中に組み込まれる。代替的に、反応部分は、後重合反応を用いて、既に調製されたマトリックスとカップリングする。上記検知部分は、ポリマー鎖、又は鎖と結合するペンダント基中の単位である。
【０１０４】
また、本発明において有用なヒドロゲルは、色素及び消光剤が共に共有結合する単一の網目構造等のモノリシックポリマーであってもよく、又は多成分ヒドロゲルであってもよい。多成分ヒドロゲルとしては、相互貫入網目構造、高分子電解質複合体、及びヒドロゲルマトリックス中の第２のポリマーの分散体を含む水膨潤性複合材が得られるような２つ以上のポリマーの様々な他のブレンド、及び交互ミクロレイヤーアセンブリが挙げられる。
【０１０５】
モノリシックヒドロゲルは典型的に、ＨＥＭＡ、ＰＥＧＭＡ、メタクリル酸、ヒドロキシエチルアクリレート、Ｎ−ビニルピロリドン、アクリルアミド、Ｎ，Ｎ’−ジメチルアクリルアミド等を含むがこれらに限定されない親水性モノマーのフリーラジカル共重合によって形成され、イオン性モノマーとしては、メタクリロイルアミノプロピルトリメチルアンモニウムクロライド、ジアリルジメチルアンモニウムクロライド、ビニルベンジルトリメチルアンモニウムクロライド、スルホプロピルメタクリル酸ナトリウム等が挙げられ、架橋剤としては、エチレンジメタクリレート、ＰＥＧＤＭＡ、Ｎ，Ｎ’−メチレン−ビス−アクリルアミドトリメチロールプロパントリアクリレート等が挙げられる。モノマー同士の比は、当該技術分野において確立された原理を用いて、透過性、膨潤指数及びゲル強度を含む網目構造特性を最適なものにするように選択される。色素の濃度は、発光強度を最適なものにするように選択される。色素に対する消光剤の比は、所望の測定可能なシグナルが生じるのに十分な消光をもたらすように調節される。
【０１０６】
代替的に、モノリシックヒドロゲルは重縮合によって形成され得る。
【０１０７】
本方法の条件下でボロン酸と反応してボロン酸エステルを形成し得るポリマーは、マトリックスポリマーとして好ましくない。セルロースポリマー、多糖類、ポリビニルアルコール及びそのコポリマー等を含むがこれらに限定されないかかるポリマーは、１，２−又は１，３−ジヒドロキシ置換基を有する。
【０１０８】
明瞭性及び理解の目的で本発明を幾らか詳細に記載してきたが、本発明の真の範囲を逸脱することなく、形態及び詳細において様々な変更がなされ得ることは当業者に理解されよう。図、表及び付録並びに上記で参照した特許、出願及び刊行物は全て、参照により本明細書に援用される。
【技術分野】
【０００１】
検体検出に使用される新規な蛍光色素が開示される。
【背景技術】
【０００２】
研究者等は、体液中のポリヒドロキシル化合物（例えばグルコース）濃度を測定するのに蛍光技術を使用している。例えば、Russellは、グルコースと結合してグルコース濃度に依存するシグナルを発するボロン酸官能化色素を開示している（米国特許第５，５１２，２４６号明細書）。James他は、同じ原理を使用しているが、単一の複合部分において蛍光色素と、アミン消光官能基と、ボロン酸とを組み合わせており、この単一の複合部分からの蛍光発光がグルコース結合度に応じて変化する（米国特許第５，５０３，７７０号明細書）。蛍光色素と、ボロン酸を付加した単一のビオロゲン部分を含む消光剤とを含むグルコースセンサが、合成及び研究されている（例えば、Gamsey, S.他、2006 Langmuir 22:9067-9074；Thoniyot, P.他、2006 Diabetes Technol Ther 8:279-287；Cordes, D.B.他、2005 Langmuir 21:6540-6547；Cordes, D.B.他、2005 Org Biomol Chem 3:1708-1713；Cappuccio, E.E.他、2004 J Fluoresc 14:521-533；Gamsey, S.他、2007 J Am Chem Soc 129:1278-1286及びCordes, D.B.他、2006 Angew Chem Int Ed Engl 45:3829-3832）。
【０００３】
８−ヒドロキシピレン−１，３，６−トリスルホン酸（ＨＰＴＳ）及びその誘導体を含む蛍光色素は既知であり、検体検出で使用されている。例えば、米国特許第６，６５３，１４１号明細書、同第６，６２７，１７７号明細書、同第５，５１２，２４６号明細書、同第５，１３７，８３３号明細書、同第６，８００，４５１号明細書、同第６，７９４，１９５号明細書、同第６，８０４，５４４号明細書、同第６，００２，９５４号明細書、同第６，３１９，５４０号明細書、同第６，７６６，１８３号明細書、同第５，５０３，７７０号明細書及び同第５，７６３，２３８号明細書、国際出願ＰＣＴ／ＵＳ２００３／０３０１６７号明細書並びに同時係属中の米国特許出願第１０／４５６，８９５号明細書及び同第１１／２９６，８９８号明細書（これらはそれぞれ、その全体が参照により本明細書に援用される）を参照されたい。国際出願ＰＣＴ／ＵＳ２００３／０３０１６７号明細書は、ビス置換ＨＰＴＳ誘導体を記載しているが、それらは本明細書中に開示するビス置換ＨＰＴＳ化合物とは構造が異なり、記載されているその合成方法は、本明細書中に開示する合成方法と異なるものである。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
検体センサを合成するための現行対策の一環として、本発明者等は、新たなモノ置換及びビス置換ＨＴＰＳ蛍光色素を開発した。これらの色素は、検体結合部分と組み合わせて使用することにより、ｉｎ ｖｉｖｏにおける検体レベルのリアルタイム測定を達成し得る。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
モノ置換色素
下記一般構造を有するＨＰＴＳのＮ置換モノスルホンアミド誘導体が本発明において開示される：
【０００６】
【化１】
【０００７】
（式中、Ｒ１及びＲ２は独立して、Ｈ、陰イオン基及び反応基から成る群から選択されるが、但し、Ｒ１及びＲ２は、少なくとも１つの陰イオン基及び少なくとも１つの反応基を総じて含むものとし、Ｍは対イオンである）。
【０００８】
幾つかの実施の形態では、陰イオン基がスルホン酸である。
【０００９】
幾つかの実施の形態では、反応基が、アクリロイル、メタクリロイル、アクリルアミド、メタクリルアミド及びスチリル等から成る群から選択されるエチレン性不飽和重合性基である。
【００１０】
幾つかの実施の形態では、反応基が、カルボン酸、アルデヒド、アルキン、アジド、活性化エステル、スクシンイミド及びニトロベンゾエートから成る群から選択されるカップリング基を含み、該カップリング基が化合物をポリマー又は支持体に結合させることを可能にする。
【００１１】
Ｒ１及びＲ２のうちの一方がＨである実施の形態では、他方の基が陰イオン基と反応基とを両方とも含む。
【００１２】
幾つかの実施の形態では、Ｒ１及びＲ２が環状構造中で互いに結合する。
【００１３】
１．モノ−ＣｙｓＭＡ
下記構造を有するモノ−ＣｙｓＭＡと称するモノ置換蛍光色素が、本発明の好ましい実施の形態により開示される。
【００１４】
【化２】
【００１５】
モノ−ＣｙｓＭＡを製造する方法が、本発明の別の実施の形態により開示される。本方法は下記工程を含む。
【００１６】
【化３】
【００１７】
２．モノ−ＭＡ
下記構造を有するモノ−ＭＡと称する別のモノ置換蛍光色素が、本発明の好ましい実施の形態により開示される。
【００１８】
【化４】
【００１９】
モノ−ＭＡを製造する方法が、本発明の別の実施の形態により開示される。本方法は下記工程を含む。
【００２０】
【化５】
【００２１】
ビス置換色素
下記一般構造を有するＨＰＴＳのＮ置換ビススルホンアミド誘導体が開示される：
【００２２】
【化６】
【００２３】
（式中、Ｒ１及びＲ２は独立して、Ｈ、陰イオン基及び反応基から成る群から選択されるが、但し、Ｒ１及びＲ２は、少なくとも１つの陰イオン基及び少なくとも１つの反応基を総じて含むものとし、Ｍは対イオンである）。
【００２４】
幾つかの実施の形態では、陰イオン基がスルホン酸である。
【００２５】
幾つかの実施の形態では、反応基が、アクリロイル、メタクリロイル、アクリルアミド、メタクリルアミド及びスチリル等から成る群から選択されるエチレン性不飽和重合性基である。
【００２６】
幾つかの実施の形態では、反応基が、カルボン酸、アルデヒド、アルキン、アジド、活性化エステル、スクシンイミド及びニトロベンゾエートから成る群から選択されるカップリング基を含み、該カップリング基が化合物をポリマー又は支持体に結合させることを可能にする。
【００２７】
幾つかの実施の形態では、Ｒ１及びＲ２が環状構造中で互いに結合する。
【００２８】
下記構造を有するビス−ＣｙｓＭＡと称するビス置換蛍光色素が、本発明の好ましい実施の形態により開示される。
【００２９】
【化７】
【００３０】
ビス置換色素を製造する方法が、本発明の別の実施の形態により開示される。本方法は下記工程を含む。
【００３１】
【化８】
【００３２】
グルコースセンサ
本明細書中に記載のモノ置換色素又はビス置換色素と、ボロン酸置換ビオロゲン、又はボロン酸で官能化されたピリジニウム塩及びキノリニウム塩等の、ボロン酸を含む消光剤(quencher)とを含むグルコースセンサが、本発明の別の実施の形態により開示される。
【図面の簡単な説明】
【００３３】
【図１】ｐＨ５における４０％ＤＭＡＡ中のモノ−ＣｙｓＭＡとトリ−ＣｙｓＭＡとの比較を示す図である。
【図２】モノ−ＣｙｓＭＡのｐＨプロファイルを示す図である。
【図３】グルコースに対するモノ−ＣｙｓＭＡ応答を示す図である（４０％ＤＭＡＡ中、モノ−ＣｙｓＭＡ＋３，３’−ｏＢＢＶ）。
【図４】種々のｐＨにおけるモノ−ＭＡの蛍光スペクトルを示す図である。
【図５】種々のｐＨにおけるモノ−ＣｙｓＭＡの蛍光スペクトルを示す図である。
【図６】種々のｐＨにおけるトリ−ＣｙｓＭＡの蛍光スペクトルを示す図である。
【図７】３，３’−ｏＢＢＶを伴ったＨＰＴＳ色素のＳｔｅｒｎ−Ｖｏｌｍｅｒ比較を示す図である。
【図８】種々の色素及び３，３’−ｏＢＢＶによるグルコース応答の比較を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００３４】
色素
本明細書中で使用する場合、「蛍光体」又は「蛍光体色素」若しくは「色素」という用語は、適切な波長の光に曝されると、光を発する、すなわち、蛍光を発する化合物を指す。
【００３５】
本明細書中で使用する場合、「カップリング基」とは、ポリマー、支持体マトリックス等、特に予め形成されたヒドロゲルと共有結合を形成し得る反応性官能基である。かかる反応性官能基としては、カルボン酸、アルデヒド、アルキン及びアジド、並びにスクシンイミド及びニトロベンゾエート等の活性化エステル、又はポリマー、支持体マトリックス等、特に予め形成されたヒドロゲルと共有結合し得る任意の他の単官能性リンカー化学物質が挙げられるが、これらに限定されない。
【００３６】
本明細書中で使用する場合、「陰イオン基」とは、任意の負に帯電した基（例えば、ＳＯ３−、ＨＰＯ３−、ＣＯ２−及び
【００３７】
【化９】
【００３８】
）である。
【００３９】
本明細書中で使用する場合、「対イオン」とは、色素分子中の反対電荷のイオンに結合するイオンである。非限定的な例の対イオンとしては、Ｈ＋、アルカリ金属イオン、Ｌｉ＋、Ｎａ＋、Ｋ＋、Ｒｂ＋、Ｃｓ＋、Ｆｒ＋、オニウムイオン及びＮＲ４＋（式中、Ｒは、アルキル基、アルキルアリール基及び芳香族基から成る群から選択される）が挙げられる。当業者は、対イオンが、センサに組み込まれても色素の機能に影響を及ぼさないことを認識している。センサが生理液中に存在する場合、対イオンは、生理液中の既存のイオンと平衡化する。
【００４０】
本発明の色素は、グルコースセンシング用途において通常生じる条件下で使用する場合、ビオロゲン等の電子受容体分子による消光に対して応答性であり、光退色に対して耐性であり、光酸化、加水分解及び生分解に対して安定である。実施形態によっては、色素がスルホンアミド官能基を介してポリマーと結合する。この高分子色素は、水溶性、水不溶性、有機溶媒可溶性又は有機溶媒不溶性であってもよい。検知を起こすために、検知部分（検体、色素及び消光剤）を物理的に近接させて、相互作用させる、すなわち、分子レベルで且つ検出すべき化学種と平衡化した状態で混合させて、消光を起こさせる。
【００４１】
消光剤
本明細書中で使用する場合、「消光剤」という用語は、その存在時に、蛍光体の発光を低減する化合物を指す。
【００４２】
実施形態によっては、消光剤部分は、グルコース認識を提供する。かかる部分は、芳香族ボロン酸を含む。より具体的には、ボロン酸は、共役窒素含有複素環式芳香族ビスオニウム構造（例えば、ビオロゲン）に共有結合され、ここでボロン酸は、水性媒質、有機媒質又は組合せ媒質中でグルコースと可逆的に反応して、ボロン酸エステルを形成する。反応の程度は、媒質中のグルコース濃度に関連する。
【００４３】
ビスオニウム塩は、共役複素環式芳香族二窒素化合物から調製される。共役複素環式芳香族二窒素は、例えばジピリジル、ジピリジルエチレン、ジピリジルフェニレン、フェナントロリン及びジアザフルオレンである。両方の窒素が置換され得る上記共役複素環式芳香族二窒素化合物の全ての異性体が本発明で有用であることが理解される。
【００４４】
実施形態によっては、３，３’−ｏＢＢＶを消光剤部分として使用してもよい。３，３’−ｏＢＢＶの構造は：
【００４５】
【化１０】
【００４６】
である。
【００４７】
モノ置換色素
下記一般構造を有するＨＰＴＳのＮ置換モノスルホンアミド誘導体が本発明において開示される：
【００４８】
【化１１】
【００４９】
（式中、Ｍは対イオンであり、Ｒ１及びＲ２は個々にＨ−又は有機基であるか、又はＲ１及びＲ２は必要に応じて、反応基及び陰イオン基、好ましくはスルホネートイオンを含むが、但し、Ｒ１及びＲ２のうちの一方がＨである場合には、他方が有機基であり、Ｒ１及びＲ２が共に有機基である場合には、Ｒ１及びＲ２のうちの少なくとも一方が、重合性基又はカップリング基から選択される反応基、好ましくは重合性基を含むものとする）。実施形態によっては、Ｒ１及びＲ２は環状構造中で互いに結合されていてもよい。重合性基は好ましくは、アクリロイル、メタクリロイル、アクリルアミド、メタクリルアミド（methacrylamido）、スチリル等を含むエチレン性不飽和基である。色素を既存のポリマー又は支持体と結合させるのに用いられるカップリング基としては、カルボン酸、アルデヒド、アルキン及びアジド、並びにスクシンイミド及びニトロベンゾエート等の活性化エステルが挙げられるが、これらに限定されない。
【００５０】
重合性基を１つだけ含む色素は、従来技術における重合性ＨＰＴＳ誘導体とは対照的に、架橋剤として作用しないため、ヒドロゲル及び他の検知ポリマーを製造するのに有益である。さらに、１点でのみポリマーマトリックスと結合する色素の基は、固定化状態でより大きな移動度を有するため、消光剤とのより良好な相互作用を可能にすると仮定される。相互作用は、生理ｐＨで完全にイオン化した酸基の存在によってさらに改良される。好ましい色素は、ピレン環上の１つのスルホネート基がＮ置換スルホンアミドに変換するＨＰＴＳのモノ置換誘導体である。Ｎ置換基は、エチレン性不飽和基、及び必要に応じてスルホン酸基又はその塩と共有結合する結合基を含む。エチレン性不飽和基は好ましくは、アクリロイル、メタクリロイル、アクリルアミド（acrylamido）、メタクリルアミド及びスチリルである。モノ置換基を含む色素はまた、かかる色素のｐＫａが生理条件に最適なもの、すなわちｐＨ７．４となることから有益である。
【００５１】
実施形態によっては、Ｎ置換スルホンアミド誘導体が、塩化スルホニル中間体と、第一アミン（Ｒ１−ＮＨ２）との反応によって形成される。他の実施形態において、Ｎ，Ｎ−ビス置換スルホンアミド誘導体は、第二アミン（Ｒ１−ＮＨ−Ｒ２）との反応によって形成される。必要に応じて、これらのＲ基は、環状第二アミンを形成するように連結されてもよい。
【００５２】
下記スキームに、第二アミン及び芳香族アミンを含む種々のタイプのモノ置換色素を包含する構造例を挙げる。
【００５３】
【化１２】
【００５４】
本明細書中で使用される幾つかのＨＰＴＳ色素構造としては：
【００５５】
【化１３】
【００５６】
が挙げられる。
【００５７】
１．モノ−ＣｙｓＭＡ
モノ−ＣｙｓＭＡの構造は：
【００５８】
【化１４】
【００５９】
である。
【００６０】
当然ながら、実施形態によっては、ＨＰＴＳコア上のＣｙｓ−ＭＡ以外の置換基が負に帯電し且つ重合性基を有するものであれば、その置換基は本発明の態様に適合する。システイン酸のＬ立体異性体又はＤ立体異性体のいずれを使用してもよい。同様に、上記に示されるモノ−ＣｙｓＭＡに対する変形形態において、Ｎａ＋に加えて他の対イオン、例えばＮＢｕ４＋を使用してもよい。他の変形形態では、スルホン酸基が、例えば、リン酸、カルボン酸等の官能基で置き換えられてもよい。
【００６１】
モノ−ＣｙｓＭＡの合成をスキーム１に示す。１５０℃２０分間のＨＰＴＳと３０％硫酸との反応により、３−ヒドロキシピレン−５−スルホン酸ナトリウム１が収率１０％で得られた。１をアセチル化した後に、２を塩素化することにより、中間体３が得られた。これは、ＨＰＴＳ−Ｃｌに類似しているが、塩化スルホニルを１つしか有しない。重合性基がシステイン酸部分を介して結合し、３と反応して、化合物４が得られる。重合性基に影響を及ぼすことなく４のクロロスルホン化が達成され、ポリスチレンビーズによる精製後に、モノ−ＣｙｓＭＡが２工程にわたって収率５０％で得られた。この色素の特性決定は１Ｈ ＮＭＲ、ＨＰＬＣ及びＭＳにより行った。
【００６２】
スキーム４に関して、磁気攪拌子を備えた５０ｍＬ容丸底フラスコに、ＨＰＴＳ（９．５ｍｍｏｌ、５ｇ）及び３０％Ｈ２ＳＯ４（３５ｍＬ）を充填した。この混合物を１５０℃で２０分間加熱し、次に周囲温度で１０分間冷却した。溶液を１００ｇの砕氷に注ぎ入れ、水で２００ｍＬに希釈した。この混合物をイソプロピルアセテート（２００ｍＬ×４）で抽出し、真空中で濃縮させた。残渣をシリカゲル（３ｇ）と混合し、細粉末に砕き、Ｂｉｏｔａｇｅ ４０Ｍカートリッジに乾燥装填した。５％ＭｅＯＨ：（５％ＮＥｔ３：ＣＨ２Ｃｌ２）→１５％ＭｅＯＨ：（５％ＮＥｔ３：ＣＨ２Ｃｌ２）を用いた勾配溶出により残渣を精製し、１のトリエチルアミン塩を得た（０．２８１ｇ）。塩を１Ｍ ＨＣｌで処理し、イソプロピルアセテートで抽出し、イソプロピルアセテート層をＭｇＳＯ４により乾燥させ、真空中で濃縮して、褐色／緑色の発泡体として１を得た。１の合成はE. Tietze及びO. Bayer 1939 Ann 540:189-210により以前に報告されている。ＴＬＣ（ＭｅＯＨ：ＣＨ２Ｃｌ２：ＮＥｔ３、２：７：１）Ｒｆ＝０．２３。１Ｈ ＮＭＲ（５００ＭＨｚ，ＣＤ３ＯＤ）δ７．９４（ｔ，Ｊ＝７．６Ｈｚ，１Ｈ）、７．９７（ｄ，Ｊ＝９．４Ｈｚ，１Ｈ）、８．０２（ｄ，Ｊ＝９．２Ｈｚ，１Ｈ）、８．１１（ｔ，Ｊ＝７．７Ｈｚ，２Ｈ）、８．２５（ｓ，１Ｈ）、８．３９（ｄ，Ｊ＝９．１Ｈｚ，１Ｈ）、８．９８（ｄ，Ｊ＝９．３Ｈｚ，１Ｈ）。
【００６３】
【化１５】
【００６４】
スキーム５に関して、磁気攪拌子を備えた５０ｍＬ容丸底フラスコに、１（１．７ｍｍｏｌ、０．５ｇ）、無水酢酸（３０ｍＬ）及び酢酸ナトリウム（３．４ｍｍｏｌ、０．２７９ｇ）を充填した。この混合物を１５０℃で２時間加熱し、次に周囲温度に冷却した。溶液をエーテル：ヘキサン（１：１、５０ｍＬ）で沈殿させ、固体をガラス漏斗上に回収し、エーテルで洗浄した。固体をシリカゲル（３ｇ）と混合し、細粉末に砕き、Ｂｉｏｔａｇｅ ４０Ｍカートリッジに乾燥装填した。５％ＭｅＯＨ：ＣＨ２Ｃｌ２→１５％ＭｅＯＨ：ＣＨ２Ｃｌ２を用いた勾配溶出により生成物を精製して、クリーム色の固体として２を得た（０．４６３６ｇ）。ＴＬＣ（２０％ＭｅＯＨ：ＣＨ２Ｃｌ２）Ｒｆ＝０．４９。
【００６５】
【化１６】
【００６６】
スキーム６に関して、磁気攪拌子を備えた５０ｍＬ容丸底フラスコに、２（１．２８ｍｍｏｌ、０．４６３ｇ）、ＣＨ２Ｃｌ２（２０ｍＬ）及び塩化オキサリル（３．８４ｍｍｏｌ、１．９２ｍＬの２．０ＭのＣＨ２Ｃｌ２溶液）を充填した。ＤＭＦ（０．２ｍＬ）を滴下し、この混合物を２７時間還流させた。溶液を室温に冷却し、５ｇのシリカゲルと混合し、ガラス漏斗を通して濾過した。３を含有する濾液を真空中で約５ｍＬまで濃縮し、新たに調製した４（１．６３ｍｍｏｌ、０．８７２ｇ）をＮＥｔ３（１．６３ｍｍｏｌ、０．２２７ｍＬ）と共に添加した。この混合物を１３．５時間室温で攪拌し、形成される沈殿物を濾過により除去した。濾液を真空中で濃縮し、Ｂｉｏｔａｇｅ ４０Ｍカートリッジに装填し、５％ＭｅＯＨ：（５％ＮＥｔ３：ＣＨＣｌ３）→３０％ＭｅＯＨ：（５％ＮＥｔ３：ＣＨＣｌ３）を用いた勾配溶出により精製した。所望の画分を合わせて、１Ｍ ＨＣｌで処理し、ＥｔＯＡｃで抽出した。ＥｔＯＡｃ層をＭｇＳＯ４により乾燥させ、真空中で濃縮すると、黄色の発泡体が得られた。この発泡体をクロロスルホン酸（５ｍＬ）で処理し、混合物を１時間室温で攪拌した。溶液を氷の上に注ぎ、３Ｍ ＮａＯＨで塩基性とした。橙色の水層をポリスチレン−ジビニルベンゼンビーズ（２５０ｇ）に吸着させ、水で洗浄してあらゆる塩を除去した。ＭｅＯＨを用いて所望の生成物をビーズから抽出した。ＭｅＯＨ／水層を真空中で濃縮し、次にアセトンで沈殿させて、０．１９４７ｇのモノ−ＣｙｓＭＡを得た。１Ｈ ＮＭＲ（５００ＭＨｚ，Ｄ２Ｏ）δ０．８０（ｍ，２Ｈ）、２．１２（ｓ，３Ｈ），３．０９（ｍ，４Ｈ）、３．２４（ｍ，２Ｈ）、４．２６（ｔ，Ｊ＝６．８Ｈｚ，１Ｈ）、５．１５（ｓ，１Ｈ）、５．２１（ｓ，１Ｈ）、８．１９（ｓ，１Ｈ）、８．５４（ｄ，Ｊ＝９．６Ｈｚ，１Ｈ）、８．９１（ｍ，３Ｈ）、９．１４（ｓ，１Ｈ）；ＭＳ（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ）Ｃ２６Ｈ２７Ｎ３Ｏ１４Ｓ４、ＭＨ＋７３４．０５。
【００６７】
【化１７】
【００６８】
米国特許出願第１１／６７１，８８０号明細書において以前に記載されているように、モノ−ＣｙｓＭＡを含有するヒドロゲルを調製し、モノ−ＣｙｓＭＡの蛍光特性（励起（ｅｘ）、発光（ｅｍ）及びｐＫａ）を評価した。励起スペクトル及び発光スペクトルを図１に示し、トリ−ＣｙｓＭＡと比較する。
【００６９】
ゲルによりｐＨ調査を行った。データを図２にまとめる。このデータから、ｐＫａ＝７．２である。このため、モノ置換基は、ＨＰＴＳ（ｐＫａ＝７．３）に比べてｐＫａの変化が最小限である、重合性基及びスルホネートの組み込みを可能にする。
【００７０】
米国特許出願第１１／６７１，８８０号明細書において以前に記載されているように、４０％ＤＭＡＡゲルを調製した（図３）。このため、モノ−ＣｙｓＭＡはｐＨ応答性色素として且つグルコース応答性色素として機能する（トリ−ＣｙｓＭＡも同様に機能する）。
【００７１】
２．モノ−ＭＡ
モノ−ＭＡの構造は：
【００７２】
【化１８】
【００７３】
である。
【００７４】
モノ−ＭＡの合成をスキーム２に示す。３とアミノプロピルメタクリルアミドとの反応によりピレン７が得られる。７のクロロスルホン化により所望の生成物であるモノ−ＭＡが得られる。この色素は、負電荷を２つしか含有しないという点で特有である。そのため、１つの色素分子が１つの消光剤に結合することにより、電荷のバランスがとれた１：１複合体を得ることができる。
【００７５】
スキーム７に関して、下記方法に従ってモノ−ＭＡを生成した。磁気攪拌子を備えた５０ｍＬ容丸底フラスコに、２（０．５９１ｍｍｏｌ、０．２１４ｇ）、ＣＨ２Ｃｌ２（１０ｍＬ）及び塩化オキサリル（１．８ｍｍｏｌ、０．９ｍＬの２．０ＭのＣＨ２Ｃｌ２溶液）を充填した。ＤＭＦ（０．１ｍＬ）を滴下し、この混合物を２７時間還流させた。溶液を室温に冷却し、５ｇのシリカゲルと混合し、ガラス漏斗を通して濾過した。３を含有する濾液を真空中で約５ｍＬまで濃縮し、新たに調製した６（０．６５ｍｍｏｌ、０．１１６ｇ）をＮＥｔ３（０．７ｍｍｏｌ、０．０９７ｍＬ）と共に添加した。この混合物を２０時間室温で攪拌し、形成される沈殿物を濾過により除去した。濾液を真空中で濃縮し、Ｂｉｏｔａｇｅ ４０Ｍカートリッジに装填し、５％ＭｅＯＨ：ＣＨ２Ｃｌ２→１５％ＭｅＯＨ：ＣＨ２Ｃｌ２を用いた勾配溶出により精製して、黄色の固体を得た（４６ｍｇ）。この固体をクロロスルホン酸（１ｍＬ）で処理し、混合物を１時間室温で攪拌した。溶液を氷の上に注ぎ、３Ｍ ＮａＯＨで塩基性とした。橙色の水層をポリスチレン−ジビニルベンゼンビーズ（５０ｇ）に吸収させ、水で洗浄してあらゆる塩を除去した。ＭｅＯＨを用いて所望の生成物をビーズから抽出した。ＭｅＯＨ／水層を真空中で濃縮し、次にアセトンで沈殿させて、８ｍｇのモノ−ＭＡを得た。
【００７６】
【化１９】
【００７７】
モノ−ＭＡ色素を調製し、その量子収率を他のＨＰＴＳ誘導体と比較した。ＨＰＴＳ、モノ−ＭＡ、モノ−ＣｙｓＭＡ及びトリ−ＣｙｓＭＡに関する発光／吸光度（Ｅｍ／Ａｂｓ）比の概要を表１に示す。実数値は任意のものであるが、比較に用いられ得るため、本発明者等はこれを見かけの量子収率とみなしている。図４、図５及び図６は、それぞれ種々のｐＨにおける、ＤＭＡＡ膜中のモノ−ＭＡ、モノ−ＣｙｓＭＡ及びトリ−ＣｙｓＭＡの蛍光励起スペクトル及び蛍光発光スペクトルを示す。
【００７８】
【表１】
【００７９】
色素全てに関するＳｔｅｒｎ−Ｖｏｌｍｅｒ曲線を図７にまとめる。モノ−ＭＡは他の色素に比べ最も効果的に消光する。これは、色素と消光剤との間の電荷間のマッチングの結果であると見られる。すなわち、色素が２つの負電荷を有し、消光剤が２つの負電荷を有するためである。
【００８０】
４０％ＤＭＡＡを用いて３つの重合性色素を固定化し、ｐＨ調査によりそれらのｐＫａを測定した。結果を表２にまとめる。
【００８１】
【表２】
【００８２】
ＨＰＴＳに比べ、モノ置換色素はより低いｐＫａを有する。いかなる特定の理論にも拘束されることを望むものではないが、各色素の有効ｐＫａは、ＨＰＴＳに対する２つの構造修飾、例えば、ピレンコア上のスルホンアミド置換基及びリンカー上の陰イオン性置換基の結果であると見られる。ｐＫａにより色素が生理範囲内のｐＨ変化に対してより応答性となるため、モノ置換の色素が有益である。
【００８３】
３，３’−ｏＢＢＶを伴いｐＨ７．４ＰＢＳ中、グルコース応答用の溶液中で色素を試験した（図８）。また、色素を、これまでに記載した配合を用いた４０％ＤＭＡＡゲル中で固定化し、グルコース応答実験を行った（図３）。
【００８４】
ビス置換色素
下記一般構造を有するＨＰＴＳのＮ置換ビススルホンアミド誘導体が開示される：
【００８５】
【化２０】
【００８６】
（式中、Ｍは対イオンであり、Ｒ１及びＲ２は個々にＨ−又は有機基であるか、又はＲ１及びＲ２は必要に応じて、反応基及び陰イオン基、好ましくはスルホネートイオンを含むが、但し、Ｒ１及びＲ２のうちの一方がＨである場合、他方は有機基であり、Ｒ１及びＲ２が共に有機基である場合、Ｒ１及びＲ２のうちの少なくとも一方が、重合性基又はカップリング基から選択される反応基、好ましくは重合性基を含む）。実施形態によっては、Ｒ１及びＲ２は環状構造中で互いに結合されていてもよい。重合性基は好ましくは、アクリロイル、メタクリロイル、アクリルアミド、メタクリルアミド、スチリル等を含むエチレン性不飽和基である。色素を既存のポリマー又は支持体と結合させるのに用いられるカップリング基としては、カルボン酸、アルデヒド、アルキン及びアジド、並びにスクシンイミド及びニトロベンゾエート等の活性化エステルが挙げられるが、これらに限定されない。
【００８７】
下記スキームに、第二アミン及び芳香族アミンを含む種々のタイプのビス置換色素を包含する構造例を挙げる。
【００８８】
【化２１】
【００８９】
下記構造を有するビス−ＣｙｓＭＡと称するビス置換蛍光色素が、本発明の好ましい実施形態により開示される。
【００９０】
【化２２】
【００９１】
ビス−ｃｙｓＭＡを製造する方法が、本発明の別の実施形態により開示される。本方法は下記工程を含む。
【００９２】
【化２３】
【００９３】
ビス置換色素は架橋剤として作用する。ビス置換色素はまた、三置換色素と比較して、生理範囲内のｐＨ変化に対して色素がより応答性となるより最適なｐＫａを有し得る。さらに、色素と結合する複数の官能基を有することが可能である（例えば、１つのスルホンアミドが重合性基を含有し得る一方で、他のものがスルホン酸等の陰イオン基を含有していてもよい）。
【００９４】
スキーム１は、化合物３を合成するのに使用される工程を示す。１５０℃２０分間のＨＰＴＳと３０％硫酸との反応により、３−ヒドロキシピレン−５−スルホン酸ナトリウム１が収率１０％で得られた。１をアセチル化した後に、２を塩素化することにより、中間体３が得られた。これは、ＨＰＴＳ−Ｃｌに類似しているが、塩化スルホニルを１つしか有しない。
【００９５】
スキーム３に関して、塩基（例えば、ピリジン、Ｋ２ＣＯ３等）の存在下で化合物３をフェノールと反応させて、スルホン酸エステル８を得る。８のクロロスルホン化を行って、ビス塩化スルホニル９を得る。９と４との反応により１０が得られ、塩基による脱保護により、ビス−ＣｙｓＭＡが得られる。
【００９６】
グルコースセンサ
本発明のグルコースセンサは、グルコース結合部分と操作可能にカップリングする蛍光体を含み、この際、グルコースの結合は、蛍光体（fluophores）濃度（例えば、発光強度）における明らかな光学変化を起こす。例えば、ボロン酸を付加したビオロゲン（例えば、３，３’−ｏＢＢＶ）又はボロン酸で官能化されたピリジニウム塩等のグルコース結合部分が、本明細書中に記載のもの等の蛍光色素に操作可能にカップリングする。グルコース結合部分は蛍光色素の発光強度を抑え（quench）、この際、消光度がグルコースの結合を受けて減少し、その結果、グルコース濃度に関連する発光強度が増大する。
【００９７】
実施形態によっては、グルコースセンサシステムは、検知部分（例えば、色素−消光剤）が互いに相互作用（消光)するのに十分に物理的に接近した状態を維持するように、検知部分を固定化する手段を含む。ｉｎ ｖｉｖｏにおける検知が望ましい場合、かかる固定化手段は好ましくは、水性環境中（例えば、血管内）で不溶性であり、グルコースにとって透過性であり、且つ検知部分にとって不透過性である。典型的に、固定化手段は水不溶性有機ポリマーマトリックスを含む。例えば、色素−消光剤は、ＤＭＡＡ（Ｎ，Ｎ’−ジメチルアクリルアミド）ヒドロゲルマトリックスにより有効に固定化され、ｉｎ ｖｉｖｏにおけるグルコース検知が可能となり得る。
【００９８】
典型的なセンサの構成は、１つ又は複数の励起波長で光を発するように構成される光源と、光源から光を化学指標系（例えば、蛍光色素、消光剤及び固定化ポリマー）に伝送するように構成される光ファイバと（ここで、指標系は好ましくは、末端領域の光ファイバに沿って光路内に配置され、（例えば、血管内の）グルコースを幾らか含有する生理液と接触する）、１つ又は複数の発光波長における発光蛍光を測定するように構成される検出器とを備える。
【００９９】
グルコースセンサ化学物質、装置の構成、及びハードウェアとしては、同時係属中の米国特許出願第１０／４５６，８９５号明細書、同第１１／２９６，８９８号明細書、同第１１／６７１，８８０号明細書、同第１１／７８２，５５３号明細書、同第６０／８８８，４７７号明細書、同第６０／８８８，４７５号明細書、同第６０／９１７，３０９号明細書、同第６０／９１７，３０７号明細書、同第６０／９１５，３７２号明細書及び同第６０／９４９，１４５号明細書（これらはそれぞれ、その全体が参照により本明細書に援用される）に開示されている任意の実施形態が挙げられ得る。
【０１００】
センサのためのポリマーマトリックス
ｉｎ ｖｉｖｏ用途に関しては、センサは、好ましくは、１つ又は複数のポリヒドロキシル有機化合物を含有するか、又は該化合物を含有する筋肉のような組織中に埋め込まれている、例えば血管内の生理液の移動している流れにおいて使用される。したがって、検知部分はいずれもセンサアセンブリから抜け出ないことが好ましい。したがって、ｉｎ ｖｉｖｏでの使用に関して、検知構成成分は、有機ポリマー検知アセンブリの一部である。可溶性色素及び消光剤は、検体の通過を可能にするが、検知部分の通過を阻止する半透膜により閉じ込められ得る。このことは、検体分子よりも実質的に大きい可溶性分子（検体の分子量の少なくとも２倍、又は１０００より大きい、好ましくは５０００より大きい分子量）を検知部分として使用すること、及び検知部分が定量的に保持されるように２つの間で特定の分子量カットオフを有する選択的半透膜（例えば、透析又は限外濾過膜）を用いることにより実現することができる。
【０１０１】
好ましくは、検知部分は、グルコースにとって自由に透過性である不溶性ポリマーマトリックスに固定化される。ポリマーマトリックスは、有機ポリマー、無機ポリマー又はそれらのポリマーの組合せで構成され得る。マトリックスは、生体適合性材料で構成されてもよい。或いは、マトリックスは、所定の検体にとって透過性である第２の生体適合性ポリマーでコーティングされる。
【０１０２】
ポリマーマトリックスの一機能は、検体との接触を可能とし、且つ検体をボロン酸に結合させると同時に、蛍光体及び消光剤部分を一緒に保持及び固定化してこれらの部分を動作可能にカップリングすることである。この効果を達成するには、マトリックスは、好ましくは、媒質中では不溶性であり、マトリックスと検体溶液との間で高表面積界面を確立することにより検体と密接に結び付かなくてはならない。例えば、超薄フィルム又は微孔質支持体マトリックスが使用され得る。或いは、マトリックスは、検体溶液中で膨潤性であり、例えばヒドロゲルマトリックスが水系で使用される。場合によっては、検知ポリマーは、光導管の表面のような表面に結合されるか、又は微孔質膜中に含浸される。全ての場合において、マトリックスは、好ましくは、結合部位への検体の輸送を妨害せず、その結果、２相間で平衡が確立され得る。超薄フィルム、微孔質ポリマー、微孔質ゾルゲル及びヒドロゲルを調製するための技法は当該技術分野で確立されている。有用なマトリックスは全て、検体透過性であるとして規定される。
【０１０３】
本発明の実施形態にはヒドロゲルポリマーが好ましい。本明細書中で使用する場合、ヒドロゲルという用語は、実質的に膨潤するが、水に溶解しないポリマーを指す。かかるヒドロゲルは、線形、分岐状若しくは網状ポリマー、又は高分子電解質複合体であってもよいが、但し、可溶性又は浸出性の画分を含有しないものとする。典型的に、ヒドロゲルの網状構造は、水溶性ポリマー上で実施される架橋工程により調製されるため、膨潤するが水性媒体に溶解しない。代替的に、ヒドロゲルポリマーは、親水性モノマーと架橋モノマーとの混合物を共重合して水膨潤性の網状ポリマーを得ることによって調製される。かかるポリマーは、付加重合若しくは重縮合、又は組合せプロセスのいずれかによって形成される。このような場合、検知部分は、網目構造形成モノマーと組み合わせたモノマー誘導体を用いた共重合によってポリマー中に組み込まれる。代替的に、反応部分は、後重合反応を用いて、既に調製されたマトリックスとカップリングする。上記検知部分は、ポリマー鎖、又は鎖と結合するペンダント基中の単位である。
【０１０４】
また、本発明において有用なヒドロゲルは、色素及び消光剤が共に共有結合する単一の網目構造等のモノリシックポリマーであってもよく、又は多成分ヒドロゲルであってもよい。多成分ヒドロゲルとしては、相互貫入網目構造、高分子電解質複合体、及びヒドロゲルマトリックス中の第２のポリマーの分散体を含む水膨潤性複合材が得られるような２つ以上のポリマーの様々な他のブレンド、及び交互ミクロレイヤーアセンブリが挙げられる。
【０１０５】
モノリシックヒドロゲルは典型的に、ＨＥＭＡ、ＰＥＧＭＡ、メタクリル酸、ヒドロキシエチルアクリレート、Ｎ−ビニルピロリドン、アクリルアミド、Ｎ，Ｎ’−ジメチルアクリルアミド等を含むがこれらに限定されない親水性モノマーのフリーラジカル共重合によって形成され、イオン性モノマーとしては、メタクリロイルアミノプロピルトリメチルアンモニウムクロライド、ジアリルジメチルアンモニウムクロライド、ビニルベンジルトリメチルアンモニウムクロライド、スルホプロピルメタクリル酸ナトリウム等が挙げられ、架橋剤としては、エチレンジメタクリレート、ＰＥＧＤＭＡ、Ｎ，Ｎ’−メチレン−ビス−アクリルアミドトリメチロールプロパントリアクリレート等が挙げられる。モノマー同士の比は、当該技術分野において確立された原理を用いて、透過性、膨潤指数及びゲル強度を含む網目構造特性を最適なものにするように選択される。色素の濃度は、発光強度を最適なものにするように選択される。色素に対する消光剤の比は、所望の測定可能なシグナルが生じるのに十分な消光をもたらすように調節される。
【０１０６】
代替的に、モノリシックヒドロゲルは重縮合によって形成され得る。
【０１０７】
本方法の条件下でボロン酸と反応してボロン酸エステルを形成し得るポリマーは、マトリックスポリマーとして好ましくない。セルロースポリマー、多糖類、ポリビニルアルコール及びそのコポリマー等を含むがこれらに限定されないかかるポリマーは、１，２−又は１，３−ジヒドロキシ置換基を有する。
【０１０８】
明瞭性及び理解の目的で本発明を幾らか詳細に記載してきたが、本発明の真の範囲を逸脱することなく、形態及び詳細において様々な変更がなされ得ることは当業者に理解されよう。図、表及び付録並びに上記で参照した特許、出願及び刊行物は全て、参照により本明細書に援用される。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
化合物：
【化１】
（式中、Ｒ１及びＲ２は独立して、Ｈ、陰イオン基及び反応基から成る群から選択されるが、但し、Ｒ１及びＲ２は、少なくとも１つの陰イオン基及び少なくとも１つの反応基を総じて含むものとし、Ｍは対イオンである）。
【請求項２】
前記陰イオン基がスルホン酸である、請求項１に記載の化合物。
【請求項３】
前記反応基が、アクリロイル、メタクリロイル、アクリルアミド、メタクリルアミド及びスチリルから成る群から選択されるエチレン性不飽和重合性基である、請求項１に記載の化合物。
【請求項４】
前記反応基が、カルボン酸、アルデヒド、アルキン、アジド、活性化エステル、スクシンイミド及びニトロベンゾエートから成る群から選択されるカップリング基を含み、該カップリング基が化合物をポリマー又は支持体に結合させることを可能にする、請求項１に記載の化合物。
【請求項５】
Ｒ１及びＲ２が環状構造中で互いに結合する、請求項１に記載の化合物。
【請求項６】
化合物：
【化２】
（式中、Ｍは対イオンである）。
【請求項７】
化合物：
【化３】
（式中、Ｍは対イオンである）。
【請求項８】
化合物：
【化４】
（式中、Ｍは対イオンである）。
【請求項９】
化合物：
【化５】
（式中、Ｍは対イオンである）。
【請求項１０】
化合物：
【化６】
（式中、Ｍは対イオンである）。
【請求項１１】
下記工程を含む、ＭがＮａである請求項１０に記載の化合物を製造する方法。
【化７】
【請求項１２】
化合物：
【化８】
（式中、Ｍは対イオンである）。
【請求項１３】
下記工程を含む、ＭがＮａである請求項１２に記載の化合物を製造する方法。
【化９】
【請求項１４】
化合物：
【化１０】
（式中、Ｒ１及びＲ２は独立して、Ｈ、陰イオン基及び反応基から成る群から選択されるが、但し、Ｒ１及びＲ２は、少なくとも１つの陰イオン基及び少なくとも１つの反応基を総じて含むものとし、Ｍは対イオンである）。
【請求項１５】
前記陰イオン基がスルホン酸である、請求項１４に記載の化合物。
【請求項１６】
前記反応基が、アクリロイル、メタクリロイル、アクリルアミド、メタクリルアミド及びスチリルから成る群から選択されるエチレン性不飽和重合性基である、請求項１４に記載の化合物。
【請求項１７】
前記反応基が、カルボン酸、アルデヒド、アルキン、アジド、活性化エステル、スクシンイミド及びニトロベンゾエートから成る群から選択されるカップリング基を含み、該カップリング基が化合物をポリマー又は支持体に結合させることを可能にする、請求項１４に記載の化合物。
【請求項１８】
Ｒ１及びＲ２が環状構造中で互いに結合する、請求項１４に記載の化合物。
【請求項１９】
化合物：
【化１１】
（式中、Ｍは対イオンである）。
【請求項２０】
下記工程を含む、ＭがＮａである請求項１９に記載の化合物を製造する方法。
【化１２】
【請求項２１】
化合物：
【化１３】
（式中、Ｍは対イオンである）。
【請求項２２】
化合物：
【化１４】
（式中、Ｍは対イオンである）。
【請求項２３】
化合物：
【化１５】
（式中、Ｍは対イオンである）。
【請求項２４】
化合物：
【化１６】
（式中、Ｍは対イオンである）。
【請求項２５】
システイン酸のＬ立体異性体、Ｄ立体異性体、又はＬ立体異性体及びＤ立体異性体（sterioisomers）を含む、請求項１又は１４に記載の化合物。
【請求項２６】
請求項１又は１４に記載の化合物を含む、ヒドロゲル。
【請求項２７】
請求項１又は１４に記載の化合物を含む、グルコースセンサ。
【請求項２８】
ボロン酸を含む消光剤部分をさらに含む、請求項２７に記載のグルコースセンサ。
【請求項２９】
ボロン酸を含む前記消光剤部分が、３，３’−ｏＢＢＶ：
【化１７】
である、請求項２８に記載のグルコースセンサ。
【請求項３０】
請求項２７に記載のグルコースセンサを含む、ヒドロゲル。
【請求項３１】
ＭがＮａである、請求項１０、１２又は１９に記載の化合物。
【請求項１】
化合物：
【化１】
（式中、Ｒ１及びＲ２は独立して、Ｈ、陰イオン基及び反応基から成る群から選択されるが、但し、Ｒ１及びＲ２は、少なくとも１つの陰イオン基及び少なくとも１つの反応基を総じて含むものとし、Ｍは対イオンである）。
【請求項２】
前記陰イオン基がスルホン酸である、請求項１に記載の化合物。
【請求項３】
前記反応基が、アクリロイル、メタクリロイル、アクリルアミド、メタクリルアミド及びスチリルから成る群から選択されるエチレン性不飽和重合性基である、請求項１に記載の化合物。
【請求項４】
前記反応基が、カルボン酸、アルデヒド、アルキン、アジド、活性化エステル、スクシンイミド及びニトロベンゾエートから成る群から選択されるカップリング基を含み、該カップリング基が化合物をポリマー又は支持体に結合させることを可能にする、請求項１に記載の化合物。
【請求項５】
Ｒ１及びＲ２が環状構造中で互いに結合する、請求項１に記載の化合物。
【請求項６】
化合物：
【化２】
（式中、Ｍは対イオンである）。
【請求項７】
化合物：
【化３】
（式中、Ｍは対イオンである）。
【請求項８】
化合物：
【化４】
（式中、Ｍは対イオンである）。
【請求項９】
化合物：
【化５】
（式中、Ｍは対イオンである）。
【請求項１０】
化合物：
【化６】
（式中、Ｍは対イオンである）。
【請求項１１】
下記工程を含む、ＭがＮａである請求項１０に記載の化合物を製造する方法。
【化７】
【請求項１２】
化合物：
【化８】
（式中、Ｍは対イオンである）。
【請求項１３】
下記工程を含む、ＭがＮａである請求項１２に記載の化合物を製造する方法。
【化９】
【請求項１４】
化合物：
【化１０】
（式中、Ｒ１及びＲ２は独立して、Ｈ、陰イオン基及び反応基から成る群から選択されるが、但し、Ｒ１及びＲ２は、少なくとも１つの陰イオン基及び少なくとも１つの反応基を総じて含むものとし、Ｍは対イオンである）。
【請求項１５】
前記陰イオン基がスルホン酸である、請求項１４に記載の化合物。
【請求項１６】
前記反応基が、アクリロイル、メタクリロイル、アクリルアミド、メタクリルアミド及びスチリルから成る群から選択されるエチレン性不飽和重合性基である、請求項１４に記載の化合物。
【請求項１７】
前記反応基が、カルボン酸、アルデヒド、アルキン、アジド、活性化エステル、スクシンイミド及びニトロベンゾエートから成る群から選択されるカップリング基を含み、該カップリング基が化合物をポリマー又は支持体に結合させることを可能にする、請求項１４に記載の化合物。
【請求項１８】
Ｒ１及びＲ２が環状構造中で互いに結合する、請求項１４に記載の化合物。
【請求項１９】
化合物：
【化１１】
（式中、Ｍは対イオンである）。
【請求項２０】
下記工程を含む、ＭがＮａである請求項１９に記載の化合物を製造する方法。
【化１２】
【請求項２１】
化合物：
【化１３】
（式中、Ｍは対イオンである）。
【請求項２２】
化合物：
【化１４】
（式中、Ｍは対イオンである）。
【請求項２３】
化合物：
【化１５】
（式中、Ｍは対イオンである）。
【請求項２４】
化合物：
【化１６】
（式中、Ｍは対イオンである）。
【請求項２５】
システイン酸のＬ立体異性体、Ｄ立体異性体、又はＬ立体異性体及びＤ立体異性体（sterioisomers）を含む、請求項１又は１４に記載の化合物。
【請求項２６】
請求項１又は１４に記載の化合物を含む、ヒドロゲル。
【請求項２７】
請求項１又は１４に記載の化合物を含む、グルコースセンサ。
【請求項２８】
ボロン酸を含む消光剤部分をさらに含む、請求項２７に記載のグルコースセンサ。
【請求項２９】
ボロン酸を含む前記消光剤部分が、３，３’−ｏＢＢＶ：
【化１７】
である、請求項２８に記載のグルコースセンサ。
【請求項３０】
請求項２７に記載のグルコースセンサを含む、ヒドロゲル。
【請求項３１】
ＭがＮａである、請求項１０、１２又は１９に記載の化合物。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【公表番号】特表２０１０−５３５９０３（Ｐ２０１０−５３５９０３Ａ）
【公表日】平成２２年１１月２５日（２０１０．１１．２５）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１０−５２０２８６（Ｐ２０１０−５２０２８６）
【出願日】平成２０年８月６日（２００８．８．６）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００８／０７２３５９
【国際公開番号】ＷＯ２００９／０２１０５７
【国際公開日】平成２１年２月１２日（２００９．２．１２）
【出願人】（５０７２６２６９３）グルメトリックス，インコーポレイテッド (2)
【氏名又は名称原語表記】ＧｌｕＭｅｔｒｉｃｓ，Ｉｎｃ．
【住所又は居所原語表記】１５３７５ Ｂａｒｒａｎｃａ Ｐａｒｋｗａｙ， Ｓｔｅ Ｉ−１０８，Ｉｒｖｉｎｅ， ＣＡ ９２６１８ Ｕ．Ｓ．Ａ．
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２２年１１月２５日（２０１０．１１．２５）
【国際特許分類】
【出願日】平成２０年８月６日（２００８．８．６）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００８／０７２３５９
【国際公開番号】ＷＯ２００９／０２１０５７
【国際公開日】平成２１年２月１２日（２００９．２．１２）
【出願人】（５０７２６２６９３）グルメトリックス，インコーポレイテッド (2)
【氏名又は名称原語表記】ＧｌｕＭｅｔｒｉｃｓ，Ｉｎｃ．
【住所又は居所原語表記】１５３７５ Ｂａｒｒａｎｃａ Ｐａｒｋｗａｙ， Ｓｔｅ Ｉ−１０８，Ｉｒｖｉｎｅ， ＣＡ ９２６１８ Ｕ．Ｓ．Ａ．
【Ｆターム（参考）】
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