本発明は、コード化反応およびデコード反応を使用して少なくとも１つのサンプルにおける標的ポリヌクレオチド配列の存在または非存在を検出（または定量）するための方法、試薬およびキットに関する。特定の標的ポリヌクレオチドがサンプルに存在するとき、アドレス可能なプライマー部分を含む反応生成物がコード化反応において形成される。少なくとも１つの標識および少なくとも１つのアドレスプライマーがデコード増幅反応において用いられ、それにより、配列が存在するか、または非存在であるかに依存して、検出可能なシグナル値を提供する。いくつかの実施形態において、ユニバーサルな塩基と、プローブの縮小されたライブラリーとを、標的ポリヌクレオチドの非常に多重化された分析のために用いることができる。

【特許請求の範囲】
【請求項１】
標的ポリヌクレオチド配列の量を２つのサンプルの間で比較するための方法であって、該方法は、
第１の反応容器１および第１の反応容器２を提供する工程であって、
ここで該第１の反応容器１は、第１のサンプルと順方向プライマーと逆方向プライマーとを含み、ここで該順方向プライマーは、標的特異的部分および順方向のアドレス可能なプライマー部分を含み、該逆方向プライマーは、標的特異的部分および逆方向のアドレス可能なプライマー部分を含み、ここで該順方向プライマーまたは該逆方向プライマーは、第１の同定部分をさらに含み、
ここで該第１の反応容器２は、第２のサンプルと順方向プライマーと逆方向プライマーとを含み、ここで該順方向プライマーは、標的特異的部分および順方向のアドレス可能なプライマー部分を含み、該逆方向プライマーは、標的特異的部分および逆方向のアドレス可能なプライマー部分を含み、ここで該順方向プライマーまたは該逆方向プライマーは、第２の同定部分をさらに含む、工程；
第１のコード化ＰＣＲを該第１の反応容器１において行い、それにより、第１のコード化ＰＣＲ生成物を含む第１のコード化ＰＣＲ生成物混合物を形成させる工程であって、ここで該第１のコード化ＰＣＲ生成物は、該順方向のアドレス可能なプライマー部分と、該第１の同定部分と、該標的特異的部分と、該逆方向のアドレス可能なプライマー部分とを含み、ここで標的ポリヌクレオチド配列の正体が、該順方向のアドレス可能なプライマー部分および該逆方向のアドレス可能なプライマー部分によりコード化され、そして該第１のコード化ＰＣＲにおけるサンプルの正体が、該第１の同定部分によってコード化される、工程；
第２のコード化ＰＣＲを該第１の反応容器２において行い、それにより、第２のコード化ＰＣＲ生成物を含む第２のコード化ＰＣＲ生成物混合物を形成させる工程であって、ここで該第２のコード化ＰＣＲ生成物は、該順方向のアドレス可能なプライマー部分と、該第２の同定部分と、該標的特異的部分と、該逆方向のアドレス可能なプライマー部分とを含み、ここで該標的ポリヌクレオチド配列の正体は、該順方向のアドレス可能なプライマー部分および該逆方向のアドレス可能なプライマー部分によりコード化され、そして該第２のコード化ＰＣＲにおけるサンプルの正体は、該第２の同定部分によってコード化される、工程；
該第１の反応容器１からの該第１のコード化ＰＣＲ生成物混合物を該第１の反応容器２からの該第２のコード化ＰＣＲ生成物混合物と合わせ、合わせたコード化ＰＣＲ生成物混合物を形成する工程；
第２の反応容器を提供する工程であって、ここで該第２の反応容器は、順方向アドレスプライマー、逆方向アドレスプライマー、第１の標識化プローブおよび第２の標識化プローブを含み、ここで該第１の標識化プローブ１は、該第１の反応容器１からのコード化ＰＣＲ生成物の第１の同定部分に対して相補的であるか、または該第１の反応容器１からのコード化ＰＣＲ生成物の第１の同定部分の相補体に対して相補的であり、そして該第２の標識化プローブ１は、該第１の反応容器２からのコード化ＰＣＲ生成物の第２の同定部分に対して相補的であるか、または該第１の反応容器２からのコード化ＰＣＲ生成物の第２の同定部分の相補体に対して相補的である、工程；
該合わされたコード化ＰＣＲ生成物混合物のアリコートを該第２の反応容器に加え、それにより、デコード増幅反応物を該第２の反応容器において形成する工程；
デコード増幅反応を該第２の反応容器において行う工程であって、ここで該順方向アドレスプライマーは、該第１のコード化ＰＣＲおよび該第２のコード化ＰＣＲの間に該コード化ＰＣＲ生成物に導入された順方向のアドレス可能なプライマー部分の相補体にハイブリダイズし、ここで該逆方向アドレスプライマーは、該第１のコード化ＰＣＲおよび該第２のコード化ＰＣＲの間に該コード化ＰＣＲ生成物に導入された逆方向のアドレス可能なプライマー部分にハイブリダイズし、ここで該コード化ＰＣＲ生成物が該第１のコード化ＰＣＲに由来する場合、該コード化ＰＣＲ生成物の増幅は、該第１の標識化プローブからのシグナルを生じさせ、該コード化ＰＣＲ生成物が該第２のコード化ＰＣＲに由来する場合、該コード化ＰＣＲ生成物の増幅は、該第２の標識化プローブからのシグナルを生じさせる、工程；
２つのサンプルにおける標的ポリヌクレオチドを、該デコード反応における該第１の標識化プローブおよび該第２の標識化プローブからのシグナルの存在および量に基づいて検出および定量する工程；ならびに
該標的ポリヌクレオチド配列の量を２つのサンプルの間で比較する工程
を包含する、方法。
【請求項２】
複数の標的ポリヌクレオチド配列が２つのサンプルの間で比較される、請求項１に記載の方法であって、該方法は、
該複数の標的ポリヌクレオチド配列について特異的である、第１のコード化ＰＣＲにおける複数の異なる順方向プライマーおよび逆方向プライマー；
該複数の標的ポリヌクレオチド配列について特異的である、第２のコード化ＰＣＲにおける複数の異なる順方向プライマーおよび逆方向プライマー；
ここで該第１のコード化ＰＣＲにおける複数の異なる順方向プライマーおよび逆方向プライマーは、異なった順方向のアドレス可能なプライマー部分と、異なった逆方向のアドレス可能なプライマー部分と、同じ第１の同定部分とを含み；
ここで該第２のコード化ＰＣＲにおける複数の異なる順方向プライマーおよび逆方向プライマーは、異なった順方向のアドレス可能なプライマー部分と、異なった逆方向のアドレス可能なプライマー部分と、同じ第２の同定部分とを含み；
ここで該異なった順方向のアドレス可能なプライマー部分および異なった逆方向のアドレス可能なプライマー部分は、該２つのサンプルの間で所定の標的ポリヌクレオチドについて同じである、プライマーを含み、
複数のデコード増幅反応を複数の第２の反応容器において行う工程；
それぞれのデコード反応における第１の標識化プローブおよび第２の標識化プローブからのシグナルの存在および量に基づいて該２つのサンプルにおける複数の標的ポリヌクレオチドを検出および定量する工程；ならびに
複数の標的ポリヌクレオチド配列の量を２つのサンプルの間で比較する工程
をさらに包含する、方法。
【請求項３】
前記第１の標識化プローブ、前記第２の標識化プローブ、または両方が、ＰＮＡを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記第１の標識化プローブ、前記第２の標識化プローブ、または両方が、５’ヌクレアーゼ切断可能なプローブを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記標的ポリヌクレオチド配列が、メッセンジャーＲＮＡである、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
標的ポリヌクレオチド配列の量を２つのサンプルの間で比較するための方法であって、該方法は、
第１のコード化反応を標的ポリヌクレオチド配列に対して行って、第１のコード化反応生成物を形成させる工程であって、ここで該標的ポリヌクレオチド配列の正体は、アドレス可能なプライマー部分によりコード化され、そして該サンプルの正体は、第１の同定部分によりコード化される、工程；
第２のコード化反応を標的ポリヌクレオチドに対して行って、第２のコード化反応生成物を形成させる工程であって、ここで該標的ポリヌクレオチド配列の正体は、アドレス可能なプライマー部分によりコード化され、そして該サンプルの正体は、第２の同定部分によりコード化される、工程；
該第１のコード化反応生成物を該第２のコード化反応生成物と合わせる工程；
デコード増幅反応を行う工程であって、ここで該デコード増幅反応は、第１の標識化プローブおよび第２の標識化プローブを含むＰＣＲを含み、ここで第１の標識化プローブは、該第１の同定部分に対して相補的であるか、または該第１の同定部分の相補体に対して相補的であり、そして第２の標識化プローブは、該第２の同定部分に対して相補的であるか、または該第２の同定部分の相補体に対して相補的である、工程；ならびに
該標的ポリヌクレオチド配列の量を該２つのサンプルの間で比較する工程
を包含する、方法。
【請求項７】
前記第１のコード化反応がＰＣＲであり、そして前記第２のコード化反応がＰＣＲである、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
複数の標的ポリヌクレオチド配列が２つのサンプルの間で比較される、請求項７に記載の方法であって、該方法は、
該複数の標的ポリヌクレオチド配列について特異的である、第１のコード化ＰＣＲにおける複数の異なる順方向プライマーおよび逆方向プライマー；
該複数の標的ポリヌクレオチド配列について特異的である、第２のコード化ＰＣＲにおける複数の異なる順方向プライマーおよび逆方向プライマー；
ここで該第１のコード化ＰＣＲにおける複数の異なる順方向プライマーおよび逆方向プライマーは、異なった順方向のアドレス可能なプライマー部分と、異なった逆方向のアドレス可能なプライマー部分と、同じ第１の同定部分とを含み；
ここで該第２のコード化ＰＣＲにおける複数の異なる順方向プライマーおよび逆方向プライマーは、異なった順方向のアドレス可能なプライマー部分と、異なった逆方向のアドレス可能なプライマー部分と、同じ第２の同定部分とを含み；
ここで該異なった順方向のアドレス可能なプライマー部分および異なった逆方向のアドレス可能なプライマー部分は、該２つのサンプルの間で所定の標的ポリヌクレオチドについて同じである、プライマーを含み、
複数のデコード増幅反応を複数の第２の反応容器において行う工程；
それぞれのデコード反応における第１の標識化プローブおよび第２の標識化プローブからのシグナルの存在および量に基づいて該２つのサンプルにおける複数の標的ポリヌクレオチドを検出および定量する工程；ならびに
複数の標的ポリヌクレオチド配列の量を２つのサンプルの間で比較する工程
をさらに包含する、方法。
【請求項９】
前記第１のコード化反応がライゲーション反応であり、そして前記第２のコード化反応がライゲーション反応である、請求項６に記載の方法。
【請求項１０】
前記第１の標識化プローブ、前記第２の標識化プローブ、または両方がＰＮＡを含む、請求項６に記載の方法。
【請求項１１】
前記第１の標識化プローブ、前記第２の標識化プローブ、または両方が５’ヌクレアーゼ切断可能である、請求項６に記載の方法。
【請求項１２】
前記標的ポリヌクレオチド配列がメッセンジャーＲＮＡである、請求項６に記載の方法。
【請求項１３】
標的ポリヌクレオチド配列の量を２つのサンプルの間で比較するためのキットであって、該キットは、
順方向プライマーであって、該順方向プライマーは、標的特異的部分および順方向のアドレス可能なプライマー部分を含む、順方向プライマー；
逆方向プライマーであって、該逆方向プライマーは、標的特異的部分および逆方向のアドレス可能なプライマー部分を含む、逆方向プライマー；
ここで該順方向プライマー、該逆方向プライマー、または両方は同定部分をさらに含む；
順方向アドレスプライマーと、逆方向アドレスプライマーと、標識化プローブとを含む反応容器であって、該標識化プローブは、該同定部分に対して相補的であるか、または該同定部分の相補体に対して相補的である、反応容器；ならびに
ポリメラーゼ、ｄＮＴＰおよび緩衝液を含むＰＣＲマスターミックス
を含む、キット。
【請求項１４】
前記第１の標識化プローブ、前記第２の標識化プローブ、または両方がＰＮＡを含む、請求項１３に記載のキット。
【請求項１５】
前記第１の標識化プローブ、前記第２の標識化プローブ、または両方が５’ヌクレアーゼ切断可能である、請求項１３に記載のキット。

【図１】

【図２】

【図３Ａ】

【図３Ｂ】

【図４Ａ】

【図４Ｂ】

【図５】

【図６Ａ】

【図６Ｂ】

【図６Ｃ】

【図６Ｄ】

【図７】

【図８】

【図９】

【図１０】

【図１１Ａ】

【図１１Ｂ】

【図１２Ａ】

【図１２Ｂ】

【図１３Ａ】

【図１３Ｂ】

【図１４Ａ】

【図１４Ｂ】

【図１５】

【図１６】

【図１７】

【図１８Ａ】

【図１８Ｂ】

【図１８Ｃ】

【図１８Ｄ】

【図１８Ｅ】

【図１８Ｆ】

【図１８Ｇ】

【図１８Ｈ】

【図１８Ｉ】

【図１８Ｊ】

【図１８Ｋ】

【公表番号】特表２００７−５３００４８（Ｐ２００７−５３００４８Ａ）
【公表日】平成１９年１１月１日（２００７．１１．１）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００７−５０５１８７（Ｐ２００７−５０５１８７）
【出願日】平成１７年３月２４日（２００５．３．２４）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００５／００９８８２
【国際公開番号】ＷＯ２００５／０９４５３２
【国際公開日】平成１７年１０月１３日（２００５．１０．１３）
【出願人】（５０００６９０５７）アプレラ　コーポレイション (120)
【住所又は居所原語表記】８５０　Ｌｉｎｃｏｌｎ　Ｃｅｎｔｒｅ　Ｄｒｉｖｅ　Ｆｏｓｔｅｒ　Ｃｉｔｙ　ＣＡＬＩＦＯＲＮＩＡ　９４４０４　Ｕ．Ｓ．Ａ．
【Ｆターム（参考）】