標的検出装置及びその製造方法
【課題】標的核酸を高精度且つ短時間で検出可能な標的検出装置及びその製造方法の提供。
【解決手段】標的検出装置は、基材と、該基材上に一端が結合され、前記基材から離間したときに標識として機能する標識を一部に有し、かつ、標的核酸と共に２本鎖を形成可能な複数のプローブとを有してなり、前記プローブが前記標的核酸と共に２本鎖を形成したときに、一の２本鎖と該一の２本鎖に隣接する他の２本鎖との間で前記標識を前記基材から離間させる立体障害が生ずる位置に、前記複数のプローブが配置された。
【解決手段】標的検出装置は、基材と、該基材上に一端が結合され、前記基材から離間したときに標識として機能する標識を一部に有し、かつ、標的核酸と共に２本鎖を形成可能な複数のプローブとを有してなり、前記プローブが前記標的核酸と共に２本鎖を形成したときに、一の２本鎖と該一の２本鎖に隣接する他の２本鎖との間で前記標識を前記基材から離間させる立体障害が生ずる位置に、前記複数のプローブが配置された。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、標的検出装置及びその製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、「ナノバイオ」乃至「バイオナノ」をキーワードとして、試験管、フラスコなどを用いた従来のバイオ実験を固体基板上で実施可能な、バイオチップ、バイオ検出デバイスの研究開発が精力的に行われている。標的分子として特定の核酸を評価乃至検出可能なチップは、ＤＮＡチップ（ＲＮＡチップ）と呼ばれ、遺伝子解析に広く利用されている（例えば、特許文献１参照）。また、特定のタンパク質を検出可能なチップは、プロテインチップと呼ばれ、現在開発途上である。
【０００３】
これらのＤＮＡチップ、ＲＮＡチップなどを用いた遺伝子解析は、ライフサイエンス、食品、農業、創薬、医療など様々な分野に応用されている。ＤＮＡチップ（ＲＮＡチップ）の基本原理は、標的（検査対象）ＤＮＡ（ＲＮＡ）を蛍光色素等でラベル化（可視化）し、基板に固定された相補配列のＤＮＡ（ＲＮＡ）との２本鎖形成（ハイブリダイゼーション）を通して、標的ＤＮＡ（ＲＮＡ）の有無、配列の同定を蛍光色素等のラベルから発光される光の信号により解析している。このような手法では、標的ＤＮＡ（ＲＮＡ）のラベル化は必須である。よって、標的ＤＮＡ（ＲＮＡ）を確実にラベル化する手法と、基板に固定された相補配列のＤＮＡ（ＲＮＡ）と２本鎖を形成していないラベル化ＤＮＡ（ＲＮＡ）からの信号（非特異的吸着による信号）を低減して、ＳＮ比を改善する方法が必要である。このため、標的ＤＮＡ（ＲＮＡ）を含んだサンプルのラベル化工程と、非特異吸着したＤＮＡ（ＲＮＡ）を除去する洗浄工程が別途必要となり、その工程に時間がかかり、また、十分な洗浄処理ができなかった場合に、ＳＮ比が低下するという問題がある。
【０００４】
また、電荷を有する分子を基板に付着させるに際し、前記分子を含んだ溶液に電解質を共存させ、前記基板への分子付着密度をコントロールすること（例えば、特許文献２参照）が検討されており、さらに、導電性基材上に、分子による分子膜を形成し、導電性基材上に電位を印加し、該分子膜における分子の一部を前記導電性基材から脱離させ、前記分子膜における分子密度を調節することにより、基板上に形成された分子間の立体障害を小さくすること（例えば、特許文献３参照）が検討されているが、基板上に形成された分子間の立体障害を利用して、標的核酸の評価乃至検出を行うことは未だ検討されていなかった。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】国際公開第０６／０７５７３５号パンフレット
【特許文献２】特許４２３０４３１号公報
【特許文献３】特開２００７−２０２４５１号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明は、標的核酸を高精度且つ短時間で検出可能な標的検出装置及びその製造方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
前記課題を解決するための手段としては以下の通りである。即ち、
開示の標的検出装置は、基材と、該基材上に一端が結合され、前記基材から離間したときに標識として機能する標識を一部に有し、かつ、標的核酸と共に２本鎖を形成可能な複数のプローブとを有してなり、前記プローブが前記標的核酸と共に２本鎖を形成したときに、一の２本鎖と該一の２本鎖に隣接する他の２本鎖との間で前記標識を前記基材から離間させる立体障害が生ずる位置に、前記複数のプローブが配置された。
また、開示の標的検出装置の製造方法は、プローブが標的核酸と共に２本鎖を形成したときに、一の２本鎖と該一の２本鎖に隣接する他の２本鎖との間で標識を基材から離間させる立体障害が生ずる数のプローブを基板上に配置させるプローブ配置工程を含む。
【発明の効果】
【０００８】
開示の標的検出装置によれば、従来における前記諸問題を解決し、前記目的を達成することができ、標的核酸を高精度且つ短時間で検出することができる。
【図面の簡単な説明】
【０００９】
【図１Ａ】図１Ａは、標的検出装置を説明するための図である（その１）。
【図１Ｂ】図１Ｂは、標的検出装置を説明するための図である（その２）。
【図１Ｃ】図１Ｃは、標的検出装置を説明するための図である（その３）。
【図１Ｄ】図１Ｄは、標的検出装置を説明するための図である（その４）。
【図２Ａ】図２Ａは、６方最密（細密）充填で配置されたプローブの長さと、２本鎖が立体障害を発生する面密度との関係を説明するための図である（その１）。
【図２Ｂ】図２Ｂは、６方最密充填で配置されたプローブの長さと、２本鎖が立体障害を発生する面密度との関係を説明するための図である（その２）。
【図２Ｃ】図２Ｃは、６方最密充填で配置されたプローブの長さと、２本鎖が立体障害を発生する面密度との関係を説明するための図である（その３）。
【図３Ａ】図３Ａは、標的検出装置としてのＤＮＡチップを示す図である（その１）。
【図３Ｂ】図３Ｂは、標的検出装置としてのＤＮＡチップを示す図である（その２）。
【図３Ｃ】図３Ｃは、基板からの距離と蛍光強度との関係を示すグラフである。
【図４】図４は、１本鎖オリゴヌクレオチドの付着密度と電解質のイオン濃度の関係と電解質のイオン濃度の関係を示すグラフである。
【図５Ａ】図５Ａは、実施例１を説明するための図である(その１)。
【図５Ｂ】図５Ｂは、実施例１を説明するための図である(その２)。
【図５Ｃ】図５Ｃは、実施例１を説明するための図である(その３)。
【図５Ｄ】図５Ｄは、実施例１を説明するための図である(その４)。
【図６Ａ】図６Ａは、実施例２を説明するための図である(その１)。
【図６Ｂ】図６Ｂは、実施例２を説明するための図である(その２)。
【図６Ｃ】図６Ｃは、実施例２を説明するための図である(その３)。
【図６Ｄ】図６Ｄは、実施例２説明するための図である(その４)。
【図７Ａ】図７Ａは、比較例１を説明するための図である(その１)。
【図７Ｂ】図７Ｂは、比較例１を説明するための図である(その２)。
【図７Ｃ】図７Ｃは、比較例１を説明するための図である(その３)。
【図８Ａ】図８Ａは、比較例２を説明するための図である(その１)。
【図８Ｂ】図８Ｂは、比較例２を説明するための図である(その２)。
【図８Ｃ】図８Ｃは、比較例２を説明するための図である(その３)。
【発明を実施するための形態】
【００１０】
（標的検出装置）
本発明の標的検出装置は、基材と、プローブとを少なくとも有し、更に必要に応じて、その他の部材を有する。
【００１１】
＜基材＞
前記基材としては、特に制限はなく、適宜目的に応じて選択することができるが、導電性基材が好ましく、その構造としては、例えば、単層構造であってもよいし、積層構造であってもよく、また、全体が導電性材料で形成された構造であってもよいし、絶縁性基材上に導電性材料による電極層が設けられた構造などであってもよい。
【００１２】
前記基材としては、その形状、大きさ、表面性状、数等については、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。前記形状としては、例えば、平板状、円状、楕円状などが挙げられる。前記大きさとしては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。前記表面性状としては、例えば、光沢面、粗面などが挙げられる。これらは、１種単独で使用してもよいし、２種以上を併用してもよい。
前記絶縁性基材の材質としては、例えば、石英ガラス、シリコン、酸化ケイ素、窒化ケイ素、サファイヤ、等が好適に挙げられる。これらは、１種単独で使用してもよいし、２種以上を併用してもよい。
前記導電性材料又は前記電極層の材質としては、導電性を有する限り、特に制限はなく、例えば、金属、合金、導電性樹脂、炭素化合物、などが挙げられる。前記金属としては、例えば、金、白金、銀、銅、亜鉛、などが挙げられる。前記合金としては、例えば、前記金属として例示したものの２種以上の合金などが挙げられる。前記導電性樹脂としては、例えば、ポリアセチレン、ポリチオフェン、ポリピロール、ポリフェニレン、ポリフェニレンビニレン、ポリアニリン、などが挙げられる。前記炭素化合物としては、例えば、導電性カーボン、導電性ダイヤモンド、などが挙げられる。これらは、１種単独で使用してもよいし、２種以上を併用してもよい。
【００１３】
前記電極層を前記絶縁性基材上に設ける場合、該電極層と該絶縁性基材との密着性を向上させる目的で、これらの間に密着層を設けてもよい。
前記密着層の材質、形状、構造、厚み、大きさ等については、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、前記材質としては、例えば、クロム、チタンなどが挙げられ、前記構造としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、単層構造であってもよいし、積層構造であってもよい。
【００１４】
前記電極層としては、その表面に絶縁膜を被覆して該電極層の一部のみが露出するようにして、該電極層の大きさ、形状等を適宜所望の程度に調節してもよい。前記電極層の数としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、１つであってもよいし、２以上であってもよい。
前記絶縁膜としては、その材質、形状、構造、厚み、大きさ等については特に制限はなく、目的に応じて公知のものの中から適宜選択することができるが、前記材質としては、例えば、アモルファスガラス、ノンドープ・ドープＳｉＯ２、ＳｉＮｘなどの酸化物、窒化物、また、ポリイミドやフォトレジストのような高分子化合物が好適に挙げられる。前記フォトレジスト材料としては、例えば、ｇ線レジスト、ｉ線レジスト、ＫｒＦレジスト、ＡｒＦレジスト、Ｆ２レジスト、電子線レジストなどが挙げられる。
【００１５】
なお、本発明においては、前記導電性基材乃至前記電極層（作用電極）に電位を印加するために、これらとは異なる対向電極、参照電極などを有するのが好ましい。これらの数は、１つであってもよいし、２以上であってもよい。前記対向電極は、前記導電性基材乃至前記電極（作用電極）と対向して配置され、これらに電位を印加するための電極である。前記参照電極は、前記導電性基材乃至前記電極層（作用電極）との間の電位を調整するための電極である。前記参照電極を用いた電位の調整は、三電極法として知られている。
前記導電性基材乃至前記電極層（作用電極）が２以上設けられている場合、これらの前記導電性基材乃至前記電極層（作用電極）に対し、異なるタイミングで任意に電位を印加乃至変化させることにより、異なるタイミングで各作用電極層に固定（結合）させた前記プローブを脱離させることができる。
【００１６】
＜プローブ＞
前記プローブとしては、前記基材に一端が結合され、標識を一部に有し、標的核酸と共に２本鎖を形成可能である限り、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。なお、前記プローブは、通常、水溶液中で負に帯電している。
前記基材との結合としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、例えば、電気的結合、化学結合、吸着などが挙げられる。
前記化学結合としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、例えば、硫黄原子（Ｓ）を含む結合、具体的には、チオール基（−Ｓ−Ｈ）、ジスルフィド基（−Ｓ−Ｓ−）などを含んだプローブと導電性基材との結合が挙げられる。該導電性基材と前記チオール基（−Ｓ−Ｈ）又は前記ジスルフィド基（−Ｓ−Ｓ−）を含むプローブとの結合である場合には、後述するように、該導電性基材に一定の電位を印加すると、前記導電性基材と結合する硫黄原子（Ｓ）との結合が切断され、前記プローブのうちのいくつかが前記導電性基材から脱離する。その結果、いくつかの前記プローブの脱離によってプローブ密度が低減され、所望の程度に調整される。
【００１７】
前記プローブの形状としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、線状、粒状、板状、これらの２以上の組合せ、など挙げられるが、これらの中でも、線状などが好ましい。
【００１８】
前記プローブの具体例としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、プローブの一部に前記チオール基（−Ｓ−Ｈ）又は前記ジスルフィド基（−Ｓ−Ｓ−）を有するポリヌクレオチドが好ましく、末端に前記チオール基（−Ｓ−Ｈ）又は前記ジスルフィド基（−Ｓ−Ｓ−）を有する、ＤＮＡ、ＲＮＡ、これらとタンパク質との複合体などが特に好ましい。なお、前記ＤＮＡ及びＲＮＡは、一本鎖である。
【００１９】
前記プローブの大きさ乃至長さとしては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、該プローブが前記ポリヌクレオチドである場合、少なくとも６塩基以上が好ましく、６塩基〜１，０００塩基がより好ましく、１０塩基〜１５０塩基が特に好ましい。
【００２０】
前記プローブの合成方法としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、化学合成法、発酵生産法などのいずれでもよく、また、該プローブは、合成したものを使用してもよいし、市販品を使用してもよい。
【００２１】
−標識−
前記標識としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、蛍光色素、酸化還元マーカーなどが好適に挙げられる。
なお、前記標識が蛍光色素である場合、蛍光強度により、標識と基材との距離を検出でき、前記標識が酸化還元マーカーである場合、酸化還元電流により、標識と基材との距離を検出できる。
【００２２】
−−蛍光色素−−
前記蛍光色素は、基材と相互作用している間（例えば、該金属の近傍に位置している間）は、吸収可能な波長の光が照射されても発光せず、該金属と相互作用しなくなった時（例えば、該金属とは離接している時）には、吸収可能な波長の光が照射されるとその光エネルギーにより発光可能であるものが特に好適に使用可能である。前記蛍光色素としては、特に制限はなく、目的に応じて公知のものの中から適宜選択することができるが、例えば、下記構造式１で表される化合物などが好適に挙げられる。
【００２３】
【化１】
【００２４】
−−酸化還元マーカー−−
前記酸化還元マーカーとしては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、下記構造式２で表される化合物、下記構造式３で表される化合物、などが挙げられる。
【化２】
【化３】
【００２５】
−標的核酸−
前記標的核酸としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、ＤＮＡ、ＲＮＡなどのポリヌクレオチドが挙げられ、ポリヌクレオチドの具体例としては、癌関連遺伝子、遺伝病に関連する遺伝子、ウイルス遺伝子、細菌遺伝子、病気のリスクファクターと呼ばれる多型性を示す遺伝子、などが挙げられる。
前記標的核酸の形状としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、線状、ループ状、立体構造状、などが挙げられるが、これらの中でも、線状が好ましい。
前記標的核酸の長さとしては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、３塩基〜２，０００塩基が好ましく、６塩基〜１，０００塩基がより好ましく、１０塩基〜２００塩基が特に好ましい。
前記長さが３塩基未満であると、２本鎖を形成する力が弱く、ハイブリダイゼーションが進まないことがあり、２，０００塩基を超えると、標的核酸自身がハイブリダイゼーションを起こし、プローブとの２本鎖形成を阻害することがある。一方、特に好ましい範囲であると、２本鎖形成がスムーズに進む点で有利である。
前記標的核酸の添加量としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、前記プローブの全てが２本鎖を形成するのに十分な量であることが好ましい。
十分な量の標的核酸を得るために、該標的核酸をポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）等で増幅させてもよい。
【００２６】
−２本鎖−
前記２本鎖は、プローブと標的核酸が結合して二重螺旋を形成したものである。
前記プローブの塩基と、前記標的核酸の塩基とが一旦結合すると、該結合点から塩基同士の結合が基材側及び標識側に進むと考えられる。
前記２本鎖形成において、プローブの長さが、標的核酸の長さより長い場合、２本鎖は、二重螺旋構造と、標的核酸と二重螺旋を形成していないプローブ部分とを有する。一方、前記２本鎖形成において、標的核酸の長さが、プローブの長さより長い場合、２本鎖は、二重螺旋構造と、プローブと二重螺旋を形成していない標的核酸部分とを有する。
このように標的核酸とのハイブリダイゼーションにより生じた２本鎖の形状としては、特に制限はなく、標的核酸がプローブに比べて長い場合、プローブが標的核酸に比べて長い場合、標的核酸とプローブが同じ長さの場合などが挙げられるが、これらの中でも、標的核酸とプローブが同程度の長さが好ましい。
前記２本鎖形成部分の直径は、塩を適宜含んだ水溶液中では、２ｎｍであることが広く知られている。
前記２本鎖の直径とは、二重螺旋を円柱とした場合の直径を示す。
前記２本鎖の長さとしては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、少なくとも６塩基以上が好ましく、６塩基〜１，０００塩基がより好ましく、１０塩基〜１５０塩基が特に好ましい。
前記長さが６塩基未満であると、２本鎖を形成する力が弱く、ハイブリダイゼーションが進まないことがあり、１，０００塩基を超えると、標的核酸自身がハイブリダイゼーションを起こしプローブとの２本鎖形成を阻害することがある。一方、特に好ましい範囲であると、２本鎖形成がスムーズに進む点で有利である。
前記２本鎖の長さは、二重螺旋部分の長さである。
【００２７】
＜基材におけるプローブの配置＞
前記基材におけるプローブの配置としては、前記標的核酸と共に２本鎖を形成可能であり、前記プローブが前記標的核酸と共に２本鎖を形成したときに、一の２本鎖と該一の２本鎖に隣接する他の２本鎖との間で前記標識を前記基材から離間させる立体障害が生ずる位置に、前記複数のプローブが配置される限り、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択できる。ただし、六方最密で基板上に配置される分子の理論上の上限は、７．６×１０−１０ｍｏｌ／ｃｍ２（４．６×１０１４ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ／ｃｍ２）であるため、配置されるプローブの面密度は、この面密度以下が好ましい（Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｔｈｅ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｓｏｃｉｅｔｙ Ｖｏｌ．１１３，ｐ．２８０５−２８１０，１９９１ Ｃｉｎｄｒａ Ａ． Ｗｉｄｒｉｇ， Ｃａｒｌａ Ａ． Ａｌｖｅｓ， Ｍａｒｃ Ｄ． Ｐｏｒｔｅｒ参照）。
「前記標的核酸と共に２本鎖を形成可能である」ためには、複数のプローブのうちの、一のプローブの基材に対する結合点と、該一のプローブに隣接する他のプローブの基材に対する結合点との間隔が、２本鎖の直径以上である必要がある。
また、「前記プローブが前記標的核酸と共に２本鎖を形成したときに、一の２本鎖と該一の２本鎖に隣接する他の２本鎖との間で前記標識を前記基材から離間させる立体障害が生ずる」ためには、複数のプローブのうちの、一のプローブの基材に対する結合点と、該一のプローブに隣接する他のプローブの基材に対する結合点との間隔が、前記一のプローブの長さと前記一のプローブに隣接する他のプローブの長さとの合計未満である必要がある。
【００２８】
また、後述する図２Ａで示すように、プローブの長さより短い任意の長さを半径ｒとする円Ａが六方最密で配置されたとしたとき、前記各円Ａの中心Ｃに、各プローブの基材に対する結合点が位置することが好ましい。
また、プローブの長さより短い任意の長さを半径とする円が六方最密で配置されたとしたとき、前記円の中心に、複数のプローブの基材に対する結合点が位置する場合、Ｘがプローブ（一本鎖）の平均長さを示すとすると、複数のプローブの基材に対する結合点の面密度が、下記式（１）を満たすと、前記プローブが前記標的核酸と共に２本鎖を形成したときに、一の２本鎖と該一の２本鎖に隣接する他の２本鎖との間で前記標識を前記基材から離間させる立体障害が生ずる。
面密度＞√３／（６Ｘ２） ・・・式（１）
【００２９】
前記複数のプローブの基材に対する結合点の面密度のコントロールは、電解液中の塩濃度及び浸漬時間を調節する方法（例えば、特許文献２参照）や、ｓｓＤＮＡを導電性基板上に固定した後で、電気的に一部のｓｓＤＮＡを脱離させる方法（例えば、特許文献３参照）等を用いて行う。
【００３０】
図１Ａ〜Ｃは、標的検出装置を説明するための図であり、図１Ａ〜Ｃでは、信号観測用に蛍光色素を用いたＤＮＡチップが例示されている。
【００３１】
図１Ａに示すように、ＤＮＡ１０の先端にラベルした蛍光色素１１は、導電性基板１２に近づくと発光のエネルギーが導電性基板１２に移動し（共鳴エネルギー移動）、発光が弱まったり、消光したりする現象が知られている。このことから、数百ナノメートルの距離のオーダーでは、発光強度は距離の３乗に比例することが、Ｒａｎｔ， Ｕ．， Ａｒｉｎａｇａ， Ｋ．， Ｆｕｊｉｔａ， Ｓ．， Ｙｏｋｏｙａｍａ， Ｎ．， Ａｂｓｔｒｅｉｔｅｒ， Ｇ．， Ｔｏｒｎｏｗ， Ｍ．， “Ｄｙｎａｍｉｃ ｅｌｅｃｔｒｉｃａｌ ｓｗｉｔｃｈｉｎｇ ｏｆ ＤＮＡ ｌａｙｅｒｓ ｏｎ ａ ｍｅｔａｌ ｓｕｒｆａｃｅ”， ２００４． Ｎａｎｏ Ｌｅｔｔ． ４， ２４４１−２４４５．に報告されている。
【００３２】
図１Ａでは、蛍光強度によりＤＮＡ１０の形態を検出する方法が模式的に表されている。ＤＮＡ１０が立ち上がった状態では、蛍光色素１１と導電性基板１２表面の距離が大きく、発光強度が高い。一方、ＤＮＡ１０が倒れたり、収縮した状態では、蛍光色素１１と導電性基板１２表面との距離が縮まり、発光が抑えられる。
【００３３】
図１Ｂでは、比較的密に検出用の１本鎖プローブＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ）１５を形成した状態を示す。１本鎖プローブＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ）１５は、柔軟で、屈曲、収縮が可能なため、平均として、基板１７上で収縮したような構造を取り、先端にラベルした蛍光色素１６と基板１７の表面との距離は小さい。このような状態では蛍光強度も小さい。
基板１７上に、標的ＤＮＡ１８を含む水溶液を加えると、直ちにハイブリダイゼーションが始まり、最終的に、図１Ｃのような２本鎖（ｄｓＤＮＡ）２０を形成する。２本鎖（ｄｓＤＮＡ）２０は、このスケール（１００ナノメートル程度）では、硬く、ロッド状の形状を取ることが知られているため、基板１７上では、隣接する２本鎖（ｄｓＤＮＡ）２０による立体障害によって、大きく傾いたり、倒れこんだりすることができず、比較的立ち上がった状態を維持する。２本鎖（ｄｓＤＮＡ）２０と基板１７上との固定点が、１本鎖プローブＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ）１５の端部の１点のみであるため、根元（基板への固定点側）から倒れこむとも考えられるが、通常のＤＮＡチップ等の測定温度である室温付近、あるいは２本鎖を形成する温度（４℃〜９０℃）範囲では、熱エネルギーにより、２本鎖の先端（蛍光色素１６）が図１Ｄにおける半球状領域Ａ内を高速移動して、隣接する２本鎖（ｄｓＤＮＡ）２０による立体障害により、２本鎖の先端（蛍光色素１６）の高さ位置がＢより低くなることはない。このような状態では、蛍光色素１６と基板１７の表面との距離が大きく、蛍光強度も大きい。以上より、立体障害が発生するような面密度に調整した１本鎖プローブＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ）１５を用いることにより、蛍光強度の変化を観察することによって、標的ＤＮＡ１８とのハイブリダイゼーションを検出するＤＮＡチップを作製することができる。また、１本鎖プローブＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ）１５のみをラベル化しているため、標的ＤＮＡは非標識（ノンラベル）で、検出可能である。これにより、ラベル化標的ＤＮＡの非特異吸着を防ぐための洗浄をなくすことができ、また、ラベル化標的ＤＮＡの非特異吸着によるＳＮ比低減を防止することができる。
【００３４】
本発明では、導電性基板に固定されている一端の反対側の他端を蛍光色素でラベル化したプローブＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ）（標的ＤＮＡの相補鎖ＤＮＡ）を用い、２本鎖を形成する場合に立体障害が生ずる面密度（隣接するプローブＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ）の基板に対する結合点間の間隔が、２本鎖の直径以上であり、隣接するプローブＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ）の長さの合計未満に調整されたもの）で金属基板に固定する。標的ＤＮＡを含む溶液は、標的ＤＮＡがラベルフリーの状態で、基板上に注がれ、プローブＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ）と２本鎖を形成させる。なお、プローブＤＮＡ、標的ＤＮＡは、それぞれ、プローブＲＮＡ、標的ＲＮＡであってもよい。
【００３５】
即ち、金属基板に固定されたプローブＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ）は、１本鎖で、構造に柔軟性があり（Ｔｉｎｌａｎｄ， Ｂ．， Ｐｌｕｅｎ， Ａ．， Ｓｔｕｒｍ， Ｊ．， Ｗｅｉｌｌ， Ｇ．， “Ｐｅｒｓｉｓｔｅｎｃｅ Ｌｅｎｇｔｈ ｏｆ Ｓｉｎｇｌｅ−Ｓｔｒａｎｄｅｄ ＤＮＡ”， １９９７． Ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ ３０， ５７６３−５７６５．参照）、立体障害が起きにくく、熱揺らぎにより、ある特定の平均的な構造を取っている。この状態で、プローブＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ）にラベルされた蛍光色素は、励起光によって蛍光を発するが、金属基板にも励起エネルギーの一部が移動するために、その蛍光強度はラベルと基板との距離に依存する。次に、標的ＤＮＡを挿入し、プローブＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ）とハイブリダイズし、２本鎖を形成させる。２本鎖ＤＮＡは、１本鎖ＤＮＡに比べ、硬く、棒のような構造を取ることが知られている（Ｍａｒｋｏ， Ｊ．Ｆ．， Ｓｉｇｇｉａ， Ｅ．Ｄ．， “Ｓｔｒｅｔｃｈｉｎｇ ＤＮＡ”， １９９５． Ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ ２８， ８７５９−８７７０．参照）。よって、２本鎖ＤＮＡは、図１Ｄにおける半球状領域Ａ内を高速移動して、隣接する２本鎖ＤＮＡによる立体障害を避けるために、立ち上がった構造を取る。その結果、２本鎖ＤＮＡの先端（他端）の蛍光色素と基板との距離はより広がり、ハイブリダイゼーション前より、蛍光強度は増大する。この蛍光強度の変化から、検査溶液中の標的ＤＮＡの有無、配列情報を得ることが可能となる。また、検査溶液中の標的ＤＮＡをラベル化する必要が無く、また、信号はハイブリダイゼーションに由来するもののみであることから、標的ＤＮＡの非特異吸着によるＳＮ比の低下は、起こらない。
【００３６】
以下に、本発明の動作原理について、図２Ａ〜図２Ｃ、図３Ａ〜図３Ｃを用いて、さらに詳細に説明する。
まず、導電性基板上に標的ＤＮＡと相補関係の１本鎖プローブＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ）を所定の密度で固定化する。１本鎖プローブＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ）の固定は、１本鎖プローブＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ）を含有する電解液中に導電性基板を浸漬することによって行い、密度のコントロールは、電解液中の塩濃度及び浸漬時間を調節する方法（例えば、特許文献２参照）や、ｓｓＤＮＡを導電性基板上に固定した後で、電気的に一部のｓｓＤＮＡを脱離させる方法（例えば、特許文献３参照）等を用いて行う。前記プローブは、水溶液中で負に帯電しているので、図２Ａに示すように、プローブの長さより短い任意の長さを半径ｒとする円Ａが六方最密（ヘキサゴナル）で配置され、前記各円Ａの中心Ｃに、各プローブの基材に対する結合点が位置するものと考えられる。このため、基板３０に固定するプローブ（ｓｓＤＮＡ）３１の長さＸが決まれば（図２Ｂ）、２本鎖を形成したときに前記標識を前記基材から離間させる立体障害が発生する、プローブの基材に対する結合点の面密度を求めることができる（図２Ｃ）。図２Ｃの斜線部分の領域の面密度となるようにコントロールすれば、前記立体障害が発生する。
なお、プローブの長さＸを半径ｒとする円Ａが六方最密（ヘキサゴナル）で配置され、前記各円Ａの中心Ｃに、各プローブの基材に対する結合点が位置すると仮定すると（図２Ａ参照）、プローブの基材に対する結合点の面密度が下記式（２）を満たす。前記プローブの基材に対する結合点の面密度が、下記式（２）の面密度より大きくなると（プローブの長さより短い任意の長さを半径ｒとする円Ａが六方最密（ヘキサゴナル）で配置され、前記各円Ａの中心Ｃに、各プローブの基材に対する結合点が位置する）と、２本鎖を形成したときに立体障害が発生する。
面密度＝１／（２Ｘ・２√３Ｘ／２）＝√３／（６Ｘ２） ・・・式（２）
【００３７】
図３Ａに示すように、ｓｓＤＮＡ１の他端（基板３に固定されている一端の反対側）には、蛍光色素等の標識（ラベル）２を付与し、ｓｓＤＮＡ１の平均的な状態を可視化できるようにする。ｓｓＤＮＡ１は、柔軟な（屈曲、収縮が可能な）性質を有するため、一のｓｓＤＮＡと該一のｓｓＤＮＡに隣接した他のｓｓＤＮＡとの距離が、一のｓｓＤＮＡの長さと該一のｓｓＤＮＡに隣接した他のｓｓＤＮＡの長さの合計未満であっても、立体障害を起こしにくく、溶液中では熱運動によって、伸張したり収縮したりする運動を繰り返しており、平均的な標識（他端）の位置はｓｓＤＮＡ１の長さの半分であるＤｓに相当する。それに対し、標的ＤＮＡと２本鎖を形成した２本鎖ＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ）４は、比較的硬い棒状の形態であると考えられるため、図３Ｂに示すように、隣接する２本鎖ＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ）４との間で立体障害が発生し、標識２（他端）が基板３に近づくことができない。このときの基板３から標識２（他端）までの平均的な距離は、２本鎖ＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ）４の長さよりも短いＤｗである。
図３Ｃは、蛍光色素（標識２）のエネルギーの基板３への共鳴エネルギー移動を考慮して、蛍光強度と基板３からの距離の関係をプロットしたものである。図３Ｃより明らかなように、標的ＤＮＡと２本鎖を形成する前のｓｓＤＮＡ１の標識２（他端）部分と基板３との距離は平均としてＤｓ、２本鎖を形成した後のｄｓＤＮＡ４の標識２（他端）と基板３との距離の平均はＤｗであることから、蛍光強度を観察することによって、標的ＤＮＡの検出を距離Ｄｓでの蛍光強度ＦＩｓと距離Ｄｗでの蛍光強度ＦＩｗの差として、観察することが可能である。また、蛍光強度は距離の３乗に比例することから、検出はノンリニアで、感度が高いものといえる。
【００３８】
（標的検出装置の製造方法）
本発明の標的検出装置の製造方法は、プローブ配置工程を少なくとも含み、更に必要に応じて、その他の工程を含んでもよい。
【００３９】
＜プローブ配置工程＞
前記プローブ配置工程は、プローブが標的核酸と共に２本鎖を形成したときに、一の２本鎖と該一の２本鎖に隣接する他の２本鎖との間で標識を基材から離間させる立体障害が生ずる数のプローブを基板上に配置させる工程である。
【００４０】
前記立体障害を生じる数は、例えば、一の２本鎖と該一の２本鎖に隣接する他の２本鎖との間で標識を基材から離間させる立体障害が生じる面密度と、プローブを配置する領域の面積との積により算出することができる。
【００４１】
前記プローブには、カウンターカチオンが配位したことが好ましい。
前記プローブに、カウンターカチオンが配位することにより、前記プローブにおけるアニオンがカウンターカチオンによって中和して、プローブ間の静電反発を抑制する。従って、カウンターカチオンの濃度を変えて、プローブ間の静電反発力を制御することで、プローブの密度をコントロールすることができる。
【００４２】
前記カウンターカチオンとしては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、Ｎａ＋、Ｋ＋などが挙げられる。
【００４３】
例えば、ＮａＣｌを用い、ＮａＣｌのイオン濃度（塩濃度）を変化させて、負電荷を有するオリゴヌクレオチドのスクリーニング効果を制御した。オリゴヌクレオチドの構造は既知であるが、水溶液中の実効サイズは不明なため、塩濃度３ｍＭ，５００ｍＭ，１，０００ｍＭの条件で、あらかじめ、一本鎖オリゴヌクレオチドのチオール基を金電極と反応させ、金電極表面に付着したオリゴヌクレオチドの付着密度を測定した。
【００４４】
図４は、１本鎖オリゴヌクレオチドの付着密度と電解質のイオン濃度の関係を示すグラフである。図４の○印は実験で求めた２４残基１本鎖ＤＮＡの付着密度である。
【００４５】
次に、所望の付着密度として、３×１０１２ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ／ｃｍ２にコントロールされた電極表面をこの計算曲線から得る場合には、一旦求められたこの計算曲線から、塩濃度を５０ｍＭに制御すればよいことが分かる。図４中●印は塩濃度を５０ｍＭに制御してオリゴヌクレオチドを付着させた実験値である。計算から容易に所望の付着密度の塩濃度の条件を得ることができる。
【００４６】
また、■印は、同様のチオール基を持つ１２残基１本鎖オリゴヌクレオチドを用いた場合の付着実験結果である。
【実施例】
【００４７】
以下、実施例を挙げて本発明をより具体的に説明するが、本発明は、これらの実施例に何ら制限されるものではない。
【００４８】
（実施例１）
＜標的検出装置の作製＞
厚み１００ｎｍのＡｕ薄膜が形成された絶縁性ガラス基板（信越シリコン製）上に、標的ＤＮＡと相補関係の４８塩基長の１本鎖プローブＤＮＡ（ｓｓ４８ＤＮＡ、長さＬ４８：１６ｎｍ）（つくばオリゴサービス製）の一端を４．５×１０１１（ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ／ｃｍ２）の密度で固定化した。
なお、ｓｓ４８ＤＮＡの固定は、ｓｓ４８ＤＮＡを含有する電解液中（ｐＨ７．４に調整された、ＮａＣｌ（塩）を含有する１０ｍＭのトリスバッファー）に前記導電性基板を浸漬することによって行い、密度のコントロールは、電解液中の塩濃度を５０ｍＭに調節し、浸漬時間を１５分間に調節することによって行った。２本鎖を形成したときに立体障害が発生するよう、ｓｓ４８ＤＮＡの導電性基板に対する結合点の間隔が１６ｎｍになるように密度を４．５×１０１１（ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ／ｃｍ２）に調整した。なお、図２Ｃより、密度を１．１×１０１１（ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ／ｃｍ２）超に調整すれば立体障害が発生することが分かる。
また、ｓｓ４８ＤＮＡの他端（導電性基板に固定されている一端の反対側）には、５６５ｎｍに発光波長を持つシアニン蛍光色素（商品名：Ｃｙ３（商標））の標識（ラベル）を付与し、ｓｓ４８ＤＮＡの平均的な状態を可視化できるようにした。
【００４９】
＜標的検出＞
ｓｓ４８ＤＮＡと標的ＤＮＡが２本鎖を形成するように、作製した標的検出装置に、濃度１００ｐＭの標的ＤＮＡ（つくばオリゴサービス製、長さ１６ｎｍ）を含有するバッファー溶液（ｐＨ７．４、ＮａＣｌ＝５０ｍＭ、トリスバッファー＝１０ｍＭ）を加えた。なお、前記２本鎖の直径は、２ｎｍと見積もれる。
２本鎖を形成したのち、蛍光検出装置（商品名：Ｔｙｐｈｏｏｎ）を用いて、蛍光強度を測定した。
【００５０】
図５Ａに示すように、ｓｓ４８ＤＮＡ５は、柔軟な（屈曲、収縮が可能な）性質を有するため、一のｓｓ４８ＤＮＡの基板７に対する結合点と該一のｓｓ４８ＤＮＡに隣接した他のｓｓ４８ＤＮＡの基板７に対する結合点との距離（１６ｎｍ）が、一のｓｓ４８ＤＮＡの長さと該一のｓｓ４８ＤＮＡに隣接した他のｓｓ４８ＤＮＡの長さの合計長さ（３２ｎｍ）未満であっても、立体障害を起こしにくい。また、ｓｓ４８ＤＮＡ５は、溶液中では熱運動によって、伸張したり収縮したりする運動を繰り返しており、平均的な他端（標識６）の位置（基板との距離）は、ｓｓ４８ＤＮＡ５の長さＬ４８の１６ｎｍの半分である８ｎｍに相当する。それに対し、ｓｓ４８ＤＮＡ５と標的ＤＮＡとで形成された２本鎖ＤＮＡ（ｄｓ４８ＤＮＡ）８は、比較的硬い棒状であり、図５Ｂに示すように、隣接する２本鎖ＤＮＡ（ｄｓ４８ＤＮＡ）８との間で立体障害が発生し、標識６が基板７に近づくことができない。このときの基板７から２本鎖ＤＮＡ（ｄｓ４８ＤＮＡ）８の他端（標識６）までの平均的な距離は、図５Ｃに示すように、（Ｌ４８＋√３／２Ｌ４８）／２＝（２＋√３）Ｌ４８／４（＝１５ｎｍ）である。
【００５１】
図５Ｄは、観察される蛍光強度を推定される基板からの距離でプロットしたものである。理論値（点線）と良く一致しており、１本鎖、２本鎖の違いを蛍光強度の差で、顕著に検出することが可能なことが示されている。また、ここでは、ハイブリダイゼーション前後の蛍光強度の差を観察し、標的ＤＮＡを検出しているが、ハイブリダイゼーションをリアルタイムで観察することによって、２本鎖形成途中の状態を観察することもできる。
【００５２】
（実施例２）
＜標的検出装置の作製＞
厚み１００ｎｍのＡｕ薄膜が形成された絶縁性ガラス基板（信越シリコン製）上に、標的ＤＮＡと相補関係の４８塩基長の１本鎖プローブＤＮＡ（ｓｓ４８ＤＮＡ、長さＬ４８：１６ｎｍ）（つくばオリゴサービス製）の一端を１．５×１０１１（ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ／ｃｍ２）の密度で固定化した。
なお、ｓｓ４８ＤＮＡの固定は、ｓｓ４８ＤＮＡを含有する電解液中（ｐＨ７．４に調整された、ＮａＣｌ（塩）を含有する１０ｍＭのトリスバッファー）に前記導電性基板を浸漬することによって行い、密度のコントロールは、電解液中の塩濃度を５０ｍＭに調節し、浸漬時間を５分間に調節することによって行った。２本鎖を形成したときに立体障害が発生するよう、ｓｓ４８ＤＮＡの導電性基板に対する結合点の間隔が１６√３＝２７．７ｎｍになるように密度を１．５×１０１１（ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ／ｃｍ２）に調整した。
また、ｓｓ４８ＤＮＡの他端（導電性基板に固定されている一端の反対側）には、５６５ｎｍに発光波長を持つシアニン蛍光色素（商品名：Ｃｙ３（商標））の標識（ラベル）を付与し、ｓｓ４８ＤＮＡの平均的な状態を可視化できるようにした。
【００５３】
＜標的検出＞
ｓｓ４８ＤＮＡと標的ＤＮＡが２本鎖を形成するように、作製した標的検出装置に、濃度１００ｐＭの標的ＤＮＡ（つくばオリゴサービス製、長さ１６ｎｍ）を含有するバッファー溶液（ｐＨ７．４、ＮａＣｌ＝５０ｍＭ、トリスバッファー＝１０ｍＭ）を加えた。なお、前記２本鎖の直径は、２ｎｍと見積もれる。
２本鎖を形成したのち、蛍光検出装置（商品名：Ｔｙｐｈｏｏｎ）を用いて、蛍光強度を測定した。
【００５４】
図６Ａに示すように、ｓｓ４８ＤＮＡ５は、柔軟な（屈曲、収縮が可能な）性質を有するため、一のｓｓ４８ＤＮＡの基板７に対する結合点と該一のｓｓ４８ＤＮＡに隣接した他のｓｓ４８ＤＮＡの基板７に対する結合点との距離（２７．７ｎｍ）が、一のｓｓ４８ＤＮＡの長さと該一のｓｓ４８ＤＮＡに隣接した他のｓｓ４８ＤＮＡの長さの合計長さ（３２ｎｍ）未満であっても、立体障害を起こしにくい。また、ｓｓ４８ＤＮＡ５は、溶液中では熱運動によって、伸張したり収縮したりする運動を繰り返しており、平均的な他端（標識６）の位置（基板７との距離）は、ｓｓ４８ＤＮＡ５の長さＬ４８の１６ｎｍの半分である８ｎｍに相当する。それに対し、ｓｓ４８ＤＮＡ５と標的ＤＮＡとで形成された２本鎖ＤＮＡ（ｄｓ４８ＤＮＡ）８は、比較的硬い棒状であり、図６Ｂに示すように、隣接する２本鎖ＤＮＡ（ｄｓ４８ＤＮＡ）８との間で立体障害が発生し、標識６が基板７に近づくことができない。このときの基板７から２本鎖ＤＮＡ（ｄｓ４８ＤＮＡ）の他端（標識６）までの平均的な距離は、図６Ｃに示すように、（Ｌ４８＋１／２Ｌ４８）／２＝（３／４）Ｌ４８（＝１２ｎｍ）である。
【００５５】
図６Ｄは、観察される蛍光強度を推定される基板からの距離でプロットしたものである。理論値（点線）と良く一致しており、１本鎖、２本鎖の違いを蛍光強度の差で、顕著に検出することが可能なことが示されている。また、ここでは、ハイブリダイゼーション前後の蛍光強度の差を観察し、標的ＤＮＡを検出しているが、ハイブリダイゼーションをリアルタイムで観察することによって、２本鎖形成途中の状態も観察することもできる。
【００５６】
（比較例１）
＜標的検出装置の作製＞
厚み１００ｎｍのＡｕ薄膜が形成された絶縁性ガラス基板（信越シリコン製）上に、標的ＤＮＡと相補関係の４８塩基長の１本鎖プローブＤＮＡ（ｓｓ４８ＤＮＡ、長さＬ４８：１６ｎｍ）（つくばオリゴサービス製）の一端を９．４×１０１０（ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ／ｃｍ２）の密度で固定化した。
なお、ｓｓ４８ＤＮＡの固定は、ｓｓ４８ＤＮＡを含有する電解液中（ｐＨ７．４に調整された、ＮａＣｌ（塩）を含有する１０ｍＭのトリスバッファー）に前記導電性基板を浸漬することによって行い、密度のコントロールは、電解液中の塩濃度を１０ｍＭに調節し、浸漬時間を１５分間に調節することによって行った。２本鎖を形成したときに立体障害が発生しないよう、ｓｓ４８ＤＮＡの導電性基板に対する結合点の間隔が３５ｎｍになるように密度を９．４×１０１０（ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ／ｃｍ２）に調整した。
また、ｓｓ４８ＤＮＡの他端（導電性基板に固定されている一端の反対側）には、５６５ｎｍに発光波長を持つシアニン蛍光色素（商品名：Ｃｙ３（商標））の標識（ラベル）を付与し、ｓｓ４８ＤＮＡの平均的な状態を可視化できるようにした。
【００５７】
＜標的検出＞
ｓｓ４８ＤＮＡと標的ＤＮＡが２本鎖を形成するように、作製した標的検出装置に、濃度１００ｐＭの標的ＤＮＡ（つくばオリゴサービス製、長さ１６ｎｍ）を含有するバッファー溶液（ｐＨ７．４、ＮａＣｌ＝５０ｍＭ、トリスバッファー＝１０ｍＭ）を加えた。なお、前記２本鎖の直径は、２ｎｍと見積もれる。
２本鎖を形成したのち、蛍光検出装置（商品名：Ｔｙｐｈｏｏｎ）を用いて、蛍光強度を測定した。
【００５８】
図７Ａに示すように、ｓｓ４８ＤＮＡ５は、柔軟な（屈曲、収縮が可能な）性質を有し、さらに、一のｓｓ４８ＤＮＡの基板７に対する結合点と該一のｓｓ４８ＤＮＡに隣接した他のｓｓ４８ＤＮＡの基板７に対する結合点との距離（３５ｎｍ）が、一のｓｓ４８ＤＮＡの長さと該一のｓｓ４８ＤＮＡに隣接した他のｓｓ４８ＤＮＡの長さの合計長さ（３２ｎｍ）以上であるため、立体障害を起こさない。また、ｓｓ４８ＤＮＡ５は、溶液中では熱運動によって、伸張したり収縮したりする運動を繰り返しており、平均的な他端（標識６）の位置（基板７との距離）は、ｓｓ４８ＤＮＡ５の長さＬ４８の１６ｎｍの半分である８ｎｍに相当する。一方、標的ＤＮＡと２本鎖を形成した２本鎖ＤＮＡ（ｄｓ４８ＤＮＡ）８は、比較的硬い棒状であるものの、一のｓｓ４８ＤＮＡの基板７に対する結合点と該一のｓｓ４８ＤＮＡに隣接した他のｓｓ４８ＤＮＡの基板７に対する結合点との距離（３５ｎｍ）が、一のｓｓ４８ＤＮＡの長さと該一のｓｓ４８ＤＮＡに隣接した他のｓｓ４８ＤＮＡの長さの合計長さ（３２ｎｍ）以上であり、図７Ｂに示すように、隣接する２本鎖ＤＮＡ（ｄｓ４８ＤＮＡ）８との間で立体障害が発生しないため、このときの基板７からＤＮＡの先端までの平均的な距離もｓｓ４８ＤＮＡ５と同じ８ｎｍである。
結果として、図７Ｃのように、１本鎖、２本鎖の違いを蛍光強度の差で、検出することはできなかった。
【００５９】
（比較例２）
＜標的検出装置の作製＞
厚み１００ｎｍのＡｕ薄膜が形成された絶縁性ガラス基板（信越シリコン製）上に、標的ＤＮＡと相補関係の４８塩基長の１本鎖プローブＤＮＡ（ｓｓ４８ＤＮＡ、長さＬ４８：１６ｎｍ）（つくばオリゴサービス製）の一端を７．２×１０１２（ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ／ｃｍ２）の密度で固定化した。
なお、ｓｓ４８ＤＮＡの固定は、ｓｓ４８ＤＮＡを含有する電解液中（ｐＨ７．４に調整された、ＮａＣｌ（塩）を含有する１０ｍＭのトリスバッファー）に前記導電性基板を浸漬することによって行い、密度のコントロールは、電解液中の塩濃度を５００ｍＭに調節し、浸漬時間を３０分間に調節することによって行った。１本鎖を基板に形成したときに、すでに十分な立体障害が発生するよう、ｓｓ４８ＤＮＡの導電性基板に対する結合点の間隔が４ｎｍになるように密度を７．２×１０１２（ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ／ｃｍ２）に調整した。
また、ｓｓ４８ＤＮＡの他端（導電性基板に固定されている一端の反対側）には、５６５ｎｍに発光波長を持つシアニン蛍光色素（商品名：Ｃｙ３（商標））の標識（ラベル）を付与し、ｓｓ４８ＤＮＡの平均的な状態を可視化できるようにした。
【００６０】
＜標的検出＞
ｓｓ４８ＤＮＡと標的ＤＮＡが２本鎖を形成するように、作製した標的検出装置に、濃度１００ｐＭの標的ＤＮＡ（つくばオリゴサービス製、長さ１６ｎｍ）を含有するバッファー溶液（ｐＨ７．４、ＮａＣｌ＝５０ ｍＭ、トリスバッファー＝１０ｍＭ）を加えた。なお、前記２本鎖の直径は、２ｎｍと見積もれる。
２本鎖を形成したのち、蛍光検出装置（商品名：Ｔｙｐｈｏｏｎ）を用いて、蛍光強度を測定した。
図８Ａに示すように、ｓｓ４８ＤＮＡ５は、柔軟な（屈曲、収縮が可能な）性質を有するが、隣接したＤＮＡとの距離が非常に短い場合は、立体障害を起こし、伸張した状態を維持し、平均的な他端（標識６）の位置（基板７との距離）は、ｓｓ４８ＤＮＡ５の長さＬ４８（＝１６ｎｍ）に相当する。また、標的ＤＮＡと２本鎖を形成した２本鎖ＤＮＡ（ｄｓ４８ＤＮＡ）８は、同様に、立体障害で立ち上がった状態となり、このときの基板から２本鎖ＤＮＡ（ｄｓ４８ＤＮＡ）８の他端までの平均的な距離は、図８Ｂに示すようにｓｓ４８ＤＮＡ５と同じＬ４８（＝１６ｎｍ）である。
結果として、図８Ｃのように、１本鎖、２本鎖の違いを蛍光強度の差で、検出することはできなかった。
【００６１】
以上の実施例１〜２、比較例１〜２より、基板７と２本鎖ＤＮＡ８とのなす角が３０°から６０°の範囲に面密度を調整したものが好ましいことが分かる。
【符号の説明】
【００６２】
１ １本鎖ＤＮＡ（プローブｓｓＤＮＡ）
２ 標識（ラベル）
３ 基板
４ ２本鎖ＤＮＡ
５ ｓｓ４８ＤＮＡ
６ 標識（ラベル）
７ 基板
８ ２本鎖ＤＮＡ（ｄｓ４８ＤＮＡ）
１０ ＤＮＡ
１１ 蛍光色素
１２ 導電性基板
１５ １本鎖プローブＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ）
１６ 蛍光色素
１７ 基板
１８ 標的ＤＮＡ
２０ ２本鎖（ｄｓＤＮＡ）
３０ 基板
３１ プローブ（ｓｓＤＮＡ）
【技術分野】
【０００１】
本発明は、標的検出装置及びその製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、「ナノバイオ」乃至「バイオナノ」をキーワードとして、試験管、フラスコなどを用いた従来のバイオ実験を固体基板上で実施可能な、バイオチップ、バイオ検出デバイスの研究開発が精力的に行われている。標的分子として特定の核酸を評価乃至検出可能なチップは、ＤＮＡチップ（ＲＮＡチップ）と呼ばれ、遺伝子解析に広く利用されている（例えば、特許文献１参照）。また、特定のタンパク質を検出可能なチップは、プロテインチップと呼ばれ、現在開発途上である。
【０００３】
これらのＤＮＡチップ、ＲＮＡチップなどを用いた遺伝子解析は、ライフサイエンス、食品、農業、創薬、医療など様々な分野に応用されている。ＤＮＡチップ（ＲＮＡチップ）の基本原理は、標的（検査対象）ＤＮＡ（ＲＮＡ）を蛍光色素等でラベル化（可視化）し、基板に固定された相補配列のＤＮＡ（ＲＮＡ）との２本鎖形成（ハイブリダイゼーション）を通して、標的ＤＮＡ（ＲＮＡ）の有無、配列の同定を蛍光色素等のラベルから発光される光の信号により解析している。このような手法では、標的ＤＮＡ（ＲＮＡ）のラベル化は必須である。よって、標的ＤＮＡ（ＲＮＡ）を確実にラベル化する手法と、基板に固定された相補配列のＤＮＡ（ＲＮＡ）と２本鎖を形成していないラベル化ＤＮＡ（ＲＮＡ）からの信号（非特異的吸着による信号）を低減して、ＳＮ比を改善する方法が必要である。このため、標的ＤＮＡ（ＲＮＡ）を含んだサンプルのラベル化工程と、非特異吸着したＤＮＡ（ＲＮＡ）を除去する洗浄工程が別途必要となり、その工程に時間がかかり、また、十分な洗浄処理ができなかった場合に、ＳＮ比が低下するという問題がある。
【０００４】
また、電荷を有する分子を基板に付着させるに際し、前記分子を含んだ溶液に電解質を共存させ、前記基板への分子付着密度をコントロールすること（例えば、特許文献２参照）が検討されており、さらに、導電性基材上に、分子による分子膜を形成し、導電性基材上に電位を印加し、該分子膜における分子の一部を前記導電性基材から脱離させ、前記分子膜における分子密度を調節することにより、基板上に形成された分子間の立体障害を小さくすること（例えば、特許文献３参照）が検討されているが、基板上に形成された分子間の立体障害を利用して、標的核酸の評価乃至検出を行うことは未だ検討されていなかった。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】国際公開第０６／０７５７３５号パンフレット
【特許文献２】特許４２３０４３１号公報
【特許文献３】特開２００７−２０２４５１号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明は、標的核酸を高精度且つ短時間で検出可能な標的検出装置及びその製造方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
前記課題を解決するための手段としては以下の通りである。即ち、
開示の標的検出装置は、基材と、該基材上に一端が結合され、前記基材から離間したときに標識として機能する標識を一部に有し、かつ、標的核酸と共に２本鎖を形成可能な複数のプローブとを有してなり、前記プローブが前記標的核酸と共に２本鎖を形成したときに、一の２本鎖と該一の２本鎖に隣接する他の２本鎖との間で前記標識を前記基材から離間させる立体障害が生ずる位置に、前記複数のプローブが配置された。
また、開示の標的検出装置の製造方法は、プローブが標的核酸と共に２本鎖を形成したときに、一の２本鎖と該一の２本鎖に隣接する他の２本鎖との間で標識を基材から離間させる立体障害が生ずる数のプローブを基板上に配置させるプローブ配置工程を含む。
【発明の効果】
【０００８】
開示の標的検出装置によれば、従来における前記諸問題を解決し、前記目的を達成することができ、標的核酸を高精度且つ短時間で検出することができる。
【図面の簡単な説明】
【０００９】
【図１Ａ】図１Ａは、標的検出装置を説明するための図である（その１）。
【図１Ｂ】図１Ｂは、標的検出装置を説明するための図である（その２）。
【図１Ｃ】図１Ｃは、標的検出装置を説明するための図である（その３）。
【図１Ｄ】図１Ｄは、標的検出装置を説明するための図である（その４）。
【図２Ａ】図２Ａは、６方最密（細密）充填で配置されたプローブの長さと、２本鎖が立体障害を発生する面密度との関係を説明するための図である（その１）。
【図２Ｂ】図２Ｂは、６方最密充填で配置されたプローブの長さと、２本鎖が立体障害を発生する面密度との関係を説明するための図である（その２）。
【図２Ｃ】図２Ｃは、６方最密充填で配置されたプローブの長さと、２本鎖が立体障害を発生する面密度との関係を説明するための図である（その３）。
【図３Ａ】図３Ａは、標的検出装置としてのＤＮＡチップを示す図である（その１）。
【図３Ｂ】図３Ｂは、標的検出装置としてのＤＮＡチップを示す図である（その２）。
【図３Ｃ】図３Ｃは、基板からの距離と蛍光強度との関係を示すグラフである。
【図４】図４は、１本鎖オリゴヌクレオチドの付着密度と電解質のイオン濃度の関係と電解質のイオン濃度の関係を示すグラフである。
【図５Ａ】図５Ａは、実施例１を説明するための図である(その１)。
【図５Ｂ】図５Ｂは、実施例１を説明するための図である(その２)。
【図５Ｃ】図５Ｃは、実施例１を説明するための図である(その３)。
【図５Ｄ】図５Ｄは、実施例１を説明するための図である(その４)。
【図６Ａ】図６Ａは、実施例２を説明するための図である(その１)。
【図６Ｂ】図６Ｂは、実施例２を説明するための図である(その２)。
【図６Ｃ】図６Ｃは、実施例２を説明するための図である(その３)。
【図６Ｄ】図６Ｄは、実施例２説明するための図である(その４)。
【図７Ａ】図７Ａは、比較例１を説明するための図である(その１)。
【図７Ｂ】図７Ｂは、比較例１を説明するための図である(その２)。
【図７Ｃ】図７Ｃは、比較例１を説明するための図である(その３)。
【図８Ａ】図８Ａは、比較例２を説明するための図である(その１)。
【図８Ｂ】図８Ｂは、比較例２を説明するための図である(その２)。
【図８Ｃ】図８Ｃは、比較例２を説明するための図である(その３)。
【発明を実施するための形態】
【００１０】
（標的検出装置）
本発明の標的検出装置は、基材と、プローブとを少なくとも有し、更に必要に応じて、その他の部材を有する。
【００１１】
＜基材＞
前記基材としては、特に制限はなく、適宜目的に応じて選択することができるが、導電性基材が好ましく、その構造としては、例えば、単層構造であってもよいし、積層構造であってもよく、また、全体が導電性材料で形成された構造であってもよいし、絶縁性基材上に導電性材料による電極層が設けられた構造などであってもよい。
【００１２】
前記基材としては、その形状、大きさ、表面性状、数等については、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。前記形状としては、例えば、平板状、円状、楕円状などが挙げられる。前記大きさとしては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。前記表面性状としては、例えば、光沢面、粗面などが挙げられる。これらは、１種単独で使用してもよいし、２種以上を併用してもよい。
前記絶縁性基材の材質としては、例えば、石英ガラス、シリコン、酸化ケイ素、窒化ケイ素、サファイヤ、等が好適に挙げられる。これらは、１種単独で使用してもよいし、２種以上を併用してもよい。
前記導電性材料又は前記電極層の材質としては、導電性を有する限り、特に制限はなく、例えば、金属、合金、導電性樹脂、炭素化合物、などが挙げられる。前記金属としては、例えば、金、白金、銀、銅、亜鉛、などが挙げられる。前記合金としては、例えば、前記金属として例示したものの２種以上の合金などが挙げられる。前記導電性樹脂としては、例えば、ポリアセチレン、ポリチオフェン、ポリピロール、ポリフェニレン、ポリフェニレンビニレン、ポリアニリン、などが挙げられる。前記炭素化合物としては、例えば、導電性カーボン、導電性ダイヤモンド、などが挙げられる。これらは、１種単独で使用してもよいし、２種以上を併用してもよい。
【００１３】
前記電極層を前記絶縁性基材上に設ける場合、該電極層と該絶縁性基材との密着性を向上させる目的で、これらの間に密着層を設けてもよい。
前記密着層の材質、形状、構造、厚み、大きさ等については、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、前記材質としては、例えば、クロム、チタンなどが挙げられ、前記構造としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、単層構造であってもよいし、積層構造であってもよい。
【００１４】
前記電極層としては、その表面に絶縁膜を被覆して該電極層の一部のみが露出するようにして、該電極層の大きさ、形状等を適宜所望の程度に調節してもよい。前記電極層の数としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、１つであってもよいし、２以上であってもよい。
前記絶縁膜としては、その材質、形状、構造、厚み、大きさ等については特に制限はなく、目的に応じて公知のものの中から適宜選択することができるが、前記材質としては、例えば、アモルファスガラス、ノンドープ・ドープＳｉＯ２、ＳｉＮｘなどの酸化物、窒化物、また、ポリイミドやフォトレジストのような高分子化合物が好適に挙げられる。前記フォトレジスト材料としては、例えば、ｇ線レジスト、ｉ線レジスト、ＫｒＦレジスト、ＡｒＦレジスト、Ｆ２レジスト、電子線レジストなどが挙げられる。
【００１５】
なお、本発明においては、前記導電性基材乃至前記電極層（作用電極）に電位を印加するために、これらとは異なる対向電極、参照電極などを有するのが好ましい。これらの数は、１つであってもよいし、２以上であってもよい。前記対向電極は、前記導電性基材乃至前記電極（作用電極）と対向して配置され、これらに電位を印加するための電極である。前記参照電極は、前記導電性基材乃至前記電極層（作用電極）との間の電位を調整するための電極である。前記参照電極を用いた電位の調整は、三電極法として知られている。
前記導電性基材乃至前記電極層（作用電極）が２以上設けられている場合、これらの前記導電性基材乃至前記電極層（作用電極）に対し、異なるタイミングで任意に電位を印加乃至変化させることにより、異なるタイミングで各作用電極層に固定（結合）させた前記プローブを脱離させることができる。
【００１６】
＜プローブ＞
前記プローブとしては、前記基材に一端が結合され、標識を一部に有し、標的核酸と共に２本鎖を形成可能である限り、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。なお、前記プローブは、通常、水溶液中で負に帯電している。
前記基材との結合としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、例えば、電気的結合、化学結合、吸着などが挙げられる。
前記化学結合としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、例えば、硫黄原子（Ｓ）を含む結合、具体的には、チオール基（−Ｓ−Ｈ）、ジスルフィド基（−Ｓ−Ｓ−）などを含んだプローブと導電性基材との結合が挙げられる。該導電性基材と前記チオール基（−Ｓ−Ｈ）又は前記ジスルフィド基（−Ｓ−Ｓ−）を含むプローブとの結合である場合には、後述するように、該導電性基材に一定の電位を印加すると、前記導電性基材と結合する硫黄原子（Ｓ）との結合が切断され、前記プローブのうちのいくつかが前記導電性基材から脱離する。その結果、いくつかの前記プローブの脱離によってプローブ密度が低減され、所望の程度に調整される。
【００１７】
前記プローブの形状としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、線状、粒状、板状、これらの２以上の組合せ、など挙げられるが、これらの中でも、線状などが好ましい。
【００１８】
前記プローブの具体例としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、プローブの一部に前記チオール基（−Ｓ−Ｈ）又は前記ジスルフィド基（−Ｓ−Ｓ−）を有するポリヌクレオチドが好ましく、末端に前記チオール基（−Ｓ−Ｈ）又は前記ジスルフィド基（−Ｓ−Ｓ−）を有する、ＤＮＡ、ＲＮＡ、これらとタンパク質との複合体などが特に好ましい。なお、前記ＤＮＡ及びＲＮＡは、一本鎖である。
【００１９】
前記プローブの大きさ乃至長さとしては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、該プローブが前記ポリヌクレオチドである場合、少なくとも６塩基以上が好ましく、６塩基〜１，０００塩基がより好ましく、１０塩基〜１５０塩基が特に好ましい。
【００２０】
前記プローブの合成方法としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、化学合成法、発酵生産法などのいずれでもよく、また、該プローブは、合成したものを使用してもよいし、市販品を使用してもよい。
【００２１】
−標識−
前記標識としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、蛍光色素、酸化還元マーカーなどが好適に挙げられる。
なお、前記標識が蛍光色素である場合、蛍光強度により、標識と基材との距離を検出でき、前記標識が酸化還元マーカーである場合、酸化還元電流により、標識と基材との距離を検出できる。
【００２２】
−−蛍光色素−−
前記蛍光色素は、基材と相互作用している間（例えば、該金属の近傍に位置している間）は、吸収可能な波長の光が照射されても発光せず、該金属と相互作用しなくなった時（例えば、該金属とは離接している時）には、吸収可能な波長の光が照射されるとその光エネルギーにより発光可能であるものが特に好適に使用可能である。前記蛍光色素としては、特に制限はなく、目的に応じて公知のものの中から適宜選択することができるが、例えば、下記構造式１で表される化合物などが好適に挙げられる。
【００２３】
【化１】
【００２４】
−−酸化還元マーカー−−
前記酸化還元マーカーとしては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、下記構造式２で表される化合物、下記構造式３で表される化合物、などが挙げられる。
【化２】
【化３】
【００２５】
−標的核酸−
前記標的核酸としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、ＤＮＡ、ＲＮＡなどのポリヌクレオチドが挙げられ、ポリヌクレオチドの具体例としては、癌関連遺伝子、遺伝病に関連する遺伝子、ウイルス遺伝子、細菌遺伝子、病気のリスクファクターと呼ばれる多型性を示す遺伝子、などが挙げられる。
前記標的核酸の形状としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、線状、ループ状、立体構造状、などが挙げられるが、これらの中でも、線状が好ましい。
前記標的核酸の長さとしては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、３塩基〜２，０００塩基が好ましく、６塩基〜１，０００塩基がより好ましく、１０塩基〜２００塩基が特に好ましい。
前記長さが３塩基未満であると、２本鎖を形成する力が弱く、ハイブリダイゼーションが進まないことがあり、２，０００塩基を超えると、標的核酸自身がハイブリダイゼーションを起こし、プローブとの２本鎖形成を阻害することがある。一方、特に好ましい範囲であると、２本鎖形成がスムーズに進む点で有利である。
前記標的核酸の添加量としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、前記プローブの全てが２本鎖を形成するのに十分な量であることが好ましい。
十分な量の標的核酸を得るために、該標的核酸をポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）等で増幅させてもよい。
【００２６】
−２本鎖−
前記２本鎖は、プローブと標的核酸が結合して二重螺旋を形成したものである。
前記プローブの塩基と、前記標的核酸の塩基とが一旦結合すると、該結合点から塩基同士の結合が基材側及び標識側に進むと考えられる。
前記２本鎖形成において、プローブの長さが、標的核酸の長さより長い場合、２本鎖は、二重螺旋構造と、標的核酸と二重螺旋を形成していないプローブ部分とを有する。一方、前記２本鎖形成において、標的核酸の長さが、プローブの長さより長い場合、２本鎖は、二重螺旋構造と、プローブと二重螺旋を形成していない標的核酸部分とを有する。
このように標的核酸とのハイブリダイゼーションにより生じた２本鎖の形状としては、特に制限はなく、標的核酸がプローブに比べて長い場合、プローブが標的核酸に比べて長い場合、標的核酸とプローブが同じ長さの場合などが挙げられるが、これらの中でも、標的核酸とプローブが同程度の長さが好ましい。
前記２本鎖形成部分の直径は、塩を適宜含んだ水溶液中では、２ｎｍであることが広く知られている。
前記２本鎖の直径とは、二重螺旋を円柱とした場合の直径を示す。
前記２本鎖の長さとしては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、少なくとも６塩基以上が好ましく、６塩基〜１，０００塩基がより好ましく、１０塩基〜１５０塩基が特に好ましい。
前記長さが６塩基未満であると、２本鎖を形成する力が弱く、ハイブリダイゼーションが進まないことがあり、１，０００塩基を超えると、標的核酸自身がハイブリダイゼーションを起こしプローブとの２本鎖形成を阻害することがある。一方、特に好ましい範囲であると、２本鎖形成がスムーズに進む点で有利である。
前記２本鎖の長さは、二重螺旋部分の長さである。
【００２７】
＜基材におけるプローブの配置＞
前記基材におけるプローブの配置としては、前記標的核酸と共に２本鎖を形成可能であり、前記プローブが前記標的核酸と共に２本鎖を形成したときに、一の２本鎖と該一の２本鎖に隣接する他の２本鎖との間で前記標識を前記基材から離間させる立体障害が生ずる位置に、前記複数のプローブが配置される限り、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択できる。ただし、六方最密で基板上に配置される分子の理論上の上限は、７．６×１０−１０ｍｏｌ／ｃｍ２（４．６×１０１４ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ／ｃｍ２）であるため、配置されるプローブの面密度は、この面密度以下が好ましい（Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｔｈｅ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｓｏｃｉｅｔｙ Ｖｏｌ．１１３，ｐ．２８０５−２８１０，１９９１ Ｃｉｎｄｒａ Ａ． Ｗｉｄｒｉｇ， Ｃａｒｌａ Ａ． Ａｌｖｅｓ， Ｍａｒｃ Ｄ． Ｐｏｒｔｅｒ参照）。
「前記標的核酸と共に２本鎖を形成可能である」ためには、複数のプローブのうちの、一のプローブの基材に対する結合点と、該一のプローブに隣接する他のプローブの基材に対する結合点との間隔が、２本鎖の直径以上である必要がある。
また、「前記プローブが前記標的核酸と共に２本鎖を形成したときに、一の２本鎖と該一の２本鎖に隣接する他の２本鎖との間で前記標識を前記基材から離間させる立体障害が生ずる」ためには、複数のプローブのうちの、一のプローブの基材に対する結合点と、該一のプローブに隣接する他のプローブの基材に対する結合点との間隔が、前記一のプローブの長さと前記一のプローブに隣接する他のプローブの長さとの合計未満である必要がある。
【００２８】
また、後述する図２Ａで示すように、プローブの長さより短い任意の長さを半径ｒとする円Ａが六方最密で配置されたとしたとき、前記各円Ａの中心Ｃに、各プローブの基材に対する結合点が位置することが好ましい。
また、プローブの長さより短い任意の長さを半径とする円が六方最密で配置されたとしたとき、前記円の中心に、複数のプローブの基材に対する結合点が位置する場合、Ｘがプローブ（一本鎖）の平均長さを示すとすると、複数のプローブの基材に対する結合点の面密度が、下記式（１）を満たすと、前記プローブが前記標的核酸と共に２本鎖を形成したときに、一の２本鎖と該一の２本鎖に隣接する他の２本鎖との間で前記標識を前記基材から離間させる立体障害が生ずる。
面密度＞√３／（６Ｘ２） ・・・式（１）
【００２９】
前記複数のプローブの基材に対する結合点の面密度のコントロールは、電解液中の塩濃度及び浸漬時間を調節する方法（例えば、特許文献２参照）や、ｓｓＤＮＡを導電性基板上に固定した後で、電気的に一部のｓｓＤＮＡを脱離させる方法（例えば、特許文献３参照）等を用いて行う。
【００３０】
図１Ａ〜Ｃは、標的検出装置を説明するための図であり、図１Ａ〜Ｃでは、信号観測用に蛍光色素を用いたＤＮＡチップが例示されている。
【００３１】
図１Ａに示すように、ＤＮＡ１０の先端にラベルした蛍光色素１１は、導電性基板１２に近づくと発光のエネルギーが導電性基板１２に移動し（共鳴エネルギー移動）、発光が弱まったり、消光したりする現象が知られている。このことから、数百ナノメートルの距離のオーダーでは、発光強度は距離の３乗に比例することが、Ｒａｎｔ， Ｕ．， Ａｒｉｎａｇａ， Ｋ．， Ｆｕｊｉｔａ， Ｓ．， Ｙｏｋｏｙａｍａ， Ｎ．， Ａｂｓｔｒｅｉｔｅｒ， Ｇ．， Ｔｏｒｎｏｗ， Ｍ．， “Ｄｙｎａｍｉｃ ｅｌｅｃｔｒｉｃａｌ ｓｗｉｔｃｈｉｎｇ ｏｆ ＤＮＡ ｌａｙｅｒｓ ｏｎ ａ ｍｅｔａｌ ｓｕｒｆａｃｅ”， ２００４． Ｎａｎｏ Ｌｅｔｔ． ４， ２４４１−２４４５．に報告されている。
【００３２】
図１Ａでは、蛍光強度によりＤＮＡ１０の形態を検出する方法が模式的に表されている。ＤＮＡ１０が立ち上がった状態では、蛍光色素１１と導電性基板１２表面の距離が大きく、発光強度が高い。一方、ＤＮＡ１０が倒れたり、収縮した状態では、蛍光色素１１と導電性基板１２表面との距離が縮まり、発光が抑えられる。
【００３３】
図１Ｂでは、比較的密に検出用の１本鎖プローブＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ）１５を形成した状態を示す。１本鎖プローブＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ）１５は、柔軟で、屈曲、収縮が可能なため、平均として、基板１７上で収縮したような構造を取り、先端にラベルした蛍光色素１６と基板１７の表面との距離は小さい。このような状態では蛍光強度も小さい。
基板１７上に、標的ＤＮＡ１８を含む水溶液を加えると、直ちにハイブリダイゼーションが始まり、最終的に、図１Ｃのような２本鎖（ｄｓＤＮＡ）２０を形成する。２本鎖（ｄｓＤＮＡ）２０は、このスケール（１００ナノメートル程度）では、硬く、ロッド状の形状を取ることが知られているため、基板１７上では、隣接する２本鎖（ｄｓＤＮＡ）２０による立体障害によって、大きく傾いたり、倒れこんだりすることができず、比較的立ち上がった状態を維持する。２本鎖（ｄｓＤＮＡ）２０と基板１７上との固定点が、１本鎖プローブＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ）１５の端部の１点のみであるため、根元（基板への固定点側）から倒れこむとも考えられるが、通常のＤＮＡチップ等の測定温度である室温付近、あるいは２本鎖を形成する温度（４℃〜９０℃）範囲では、熱エネルギーにより、２本鎖の先端（蛍光色素１６）が図１Ｄにおける半球状領域Ａ内を高速移動して、隣接する２本鎖（ｄｓＤＮＡ）２０による立体障害により、２本鎖の先端（蛍光色素１６）の高さ位置がＢより低くなることはない。このような状態では、蛍光色素１６と基板１７の表面との距離が大きく、蛍光強度も大きい。以上より、立体障害が発生するような面密度に調整した１本鎖プローブＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ）１５を用いることにより、蛍光強度の変化を観察することによって、標的ＤＮＡ１８とのハイブリダイゼーションを検出するＤＮＡチップを作製することができる。また、１本鎖プローブＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ）１５のみをラベル化しているため、標的ＤＮＡは非標識（ノンラベル）で、検出可能である。これにより、ラベル化標的ＤＮＡの非特異吸着を防ぐための洗浄をなくすことができ、また、ラベル化標的ＤＮＡの非特異吸着によるＳＮ比低減を防止することができる。
【００３４】
本発明では、導電性基板に固定されている一端の反対側の他端を蛍光色素でラベル化したプローブＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ）（標的ＤＮＡの相補鎖ＤＮＡ）を用い、２本鎖を形成する場合に立体障害が生ずる面密度（隣接するプローブＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ）の基板に対する結合点間の間隔が、２本鎖の直径以上であり、隣接するプローブＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ）の長さの合計未満に調整されたもの）で金属基板に固定する。標的ＤＮＡを含む溶液は、標的ＤＮＡがラベルフリーの状態で、基板上に注がれ、プローブＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ）と２本鎖を形成させる。なお、プローブＤＮＡ、標的ＤＮＡは、それぞれ、プローブＲＮＡ、標的ＲＮＡであってもよい。
【００３５】
即ち、金属基板に固定されたプローブＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ）は、１本鎖で、構造に柔軟性があり（Ｔｉｎｌａｎｄ， Ｂ．， Ｐｌｕｅｎ， Ａ．， Ｓｔｕｒｍ， Ｊ．， Ｗｅｉｌｌ， Ｇ．， “Ｐｅｒｓｉｓｔｅｎｃｅ Ｌｅｎｇｔｈ ｏｆ Ｓｉｎｇｌｅ−Ｓｔｒａｎｄｅｄ ＤＮＡ”， １９９７． Ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ ３０， ５７６３−５７６５．参照）、立体障害が起きにくく、熱揺らぎにより、ある特定の平均的な構造を取っている。この状態で、プローブＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ）にラベルされた蛍光色素は、励起光によって蛍光を発するが、金属基板にも励起エネルギーの一部が移動するために、その蛍光強度はラベルと基板との距離に依存する。次に、標的ＤＮＡを挿入し、プローブＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ）とハイブリダイズし、２本鎖を形成させる。２本鎖ＤＮＡは、１本鎖ＤＮＡに比べ、硬く、棒のような構造を取ることが知られている（Ｍａｒｋｏ， Ｊ．Ｆ．， Ｓｉｇｇｉａ， Ｅ．Ｄ．， “Ｓｔｒｅｔｃｈｉｎｇ ＤＮＡ”， １９９５． Ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ ２８， ８７５９−８７７０．参照）。よって、２本鎖ＤＮＡは、図１Ｄにおける半球状領域Ａ内を高速移動して、隣接する２本鎖ＤＮＡによる立体障害を避けるために、立ち上がった構造を取る。その結果、２本鎖ＤＮＡの先端（他端）の蛍光色素と基板との距離はより広がり、ハイブリダイゼーション前より、蛍光強度は増大する。この蛍光強度の変化から、検査溶液中の標的ＤＮＡの有無、配列情報を得ることが可能となる。また、検査溶液中の標的ＤＮＡをラベル化する必要が無く、また、信号はハイブリダイゼーションに由来するもののみであることから、標的ＤＮＡの非特異吸着によるＳＮ比の低下は、起こらない。
【００３６】
以下に、本発明の動作原理について、図２Ａ〜図２Ｃ、図３Ａ〜図３Ｃを用いて、さらに詳細に説明する。
まず、導電性基板上に標的ＤＮＡと相補関係の１本鎖プローブＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ）を所定の密度で固定化する。１本鎖プローブＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ）の固定は、１本鎖プローブＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ）を含有する電解液中に導電性基板を浸漬することによって行い、密度のコントロールは、電解液中の塩濃度及び浸漬時間を調節する方法（例えば、特許文献２参照）や、ｓｓＤＮＡを導電性基板上に固定した後で、電気的に一部のｓｓＤＮＡを脱離させる方法（例えば、特許文献３参照）等を用いて行う。前記プローブは、水溶液中で負に帯電しているので、図２Ａに示すように、プローブの長さより短い任意の長さを半径ｒとする円Ａが六方最密（ヘキサゴナル）で配置され、前記各円Ａの中心Ｃに、各プローブの基材に対する結合点が位置するものと考えられる。このため、基板３０に固定するプローブ（ｓｓＤＮＡ）３１の長さＸが決まれば（図２Ｂ）、２本鎖を形成したときに前記標識を前記基材から離間させる立体障害が発生する、プローブの基材に対する結合点の面密度を求めることができる（図２Ｃ）。図２Ｃの斜線部分の領域の面密度となるようにコントロールすれば、前記立体障害が発生する。
なお、プローブの長さＸを半径ｒとする円Ａが六方最密（ヘキサゴナル）で配置され、前記各円Ａの中心Ｃに、各プローブの基材に対する結合点が位置すると仮定すると（図２Ａ参照）、プローブの基材に対する結合点の面密度が下記式（２）を満たす。前記プローブの基材に対する結合点の面密度が、下記式（２）の面密度より大きくなると（プローブの長さより短い任意の長さを半径ｒとする円Ａが六方最密（ヘキサゴナル）で配置され、前記各円Ａの中心Ｃに、各プローブの基材に対する結合点が位置する）と、２本鎖を形成したときに立体障害が発生する。
面密度＝１／（２Ｘ・２√３Ｘ／２）＝√３／（６Ｘ２） ・・・式（２）
【００３７】
図３Ａに示すように、ｓｓＤＮＡ１の他端（基板３に固定されている一端の反対側）には、蛍光色素等の標識（ラベル）２を付与し、ｓｓＤＮＡ１の平均的な状態を可視化できるようにする。ｓｓＤＮＡ１は、柔軟な（屈曲、収縮が可能な）性質を有するため、一のｓｓＤＮＡと該一のｓｓＤＮＡに隣接した他のｓｓＤＮＡとの距離が、一のｓｓＤＮＡの長さと該一のｓｓＤＮＡに隣接した他のｓｓＤＮＡの長さの合計未満であっても、立体障害を起こしにくく、溶液中では熱運動によって、伸張したり収縮したりする運動を繰り返しており、平均的な標識（他端）の位置はｓｓＤＮＡ１の長さの半分であるＤｓに相当する。それに対し、標的ＤＮＡと２本鎖を形成した２本鎖ＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ）４は、比較的硬い棒状の形態であると考えられるため、図３Ｂに示すように、隣接する２本鎖ＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ）４との間で立体障害が発生し、標識２（他端）が基板３に近づくことができない。このときの基板３から標識２（他端）までの平均的な距離は、２本鎖ＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ）４の長さよりも短いＤｗである。
図３Ｃは、蛍光色素（標識２）のエネルギーの基板３への共鳴エネルギー移動を考慮して、蛍光強度と基板３からの距離の関係をプロットしたものである。図３Ｃより明らかなように、標的ＤＮＡと２本鎖を形成する前のｓｓＤＮＡ１の標識２（他端）部分と基板３との距離は平均としてＤｓ、２本鎖を形成した後のｄｓＤＮＡ４の標識２（他端）と基板３との距離の平均はＤｗであることから、蛍光強度を観察することによって、標的ＤＮＡの検出を距離Ｄｓでの蛍光強度ＦＩｓと距離Ｄｗでの蛍光強度ＦＩｗの差として、観察することが可能である。また、蛍光強度は距離の３乗に比例することから、検出はノンリニアで、感度が高いものといえる。
【００３８】
（標的検出装置の製造方法）
本発明の標的検出装置の製造方法は、プローブ配置工程を少なくとも含み、更に必要に応じて、その他の工程を含んでもよい。
【００３９】
＜プローブ配置工程＞
前記プローブ配置工程は、プローブが標的核酸と共に２本鎖を形成したときに、一の２本鎖と該一の２本鎖に隣接する他の２本鎖との間で標識を基材から離間させる立体障害が生ずる数のプローブを基板上に配置させる工程である。
【００４０】
前記立体障害を生じる数は、例えば、一の２本鎖と該一の２本鎖に隣接する他の２本鎖との間で標識を基材から離間させる立体障害が生じる面密度と、プローブを配置する領域の面積との積により算出することができる。
【００４１】
前記プローブには、カウンターカチオンが配位したことが好ましい。
前記プローブに、カウンターカチオンが配位することにより、前記プローブにおけるアニオンがカウンターカチオンによって中和して、プローブ間の静電反発を抑制する。従って、カウンターカチオンの濃度を変えて、プローブ間の静電反発力を制御することで、プローブの密度をコントロールすることができる。
【００４２】
前記カウンターカチオンとしては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、Ｎａ＋、Ｋ＋などが挙げられる。
【００４３】
例えば、ＮａＣｌを用い、ＮａＣｌのイオン濃度（塩濃度）を変化させて、負電荷を有するオリゴヌクレオチドのスクリーニング効果を制御した。オリゴヌクレオチドの構造は既知であるが、水溶液中の実効サイズは不明なため、塩濃度３ｍＭ，５００ｍＭ，１，０００ｍＭの条件で、あらかじめ、一本鎖オリゴヌクレオチドのチオール基を金電極と反応させ、金電極表面に付着したオリゴヌクレオチドの付着密度を測定した。
【００４４】
図４は、１本鎖オリゴヌクレオチドの付着密度と電解質のイオン濃度の関係を示すグラフである。図４の○印は実験で求めた２４残基１本鎖ＤＮＡの付着密度である。
【００４５】
次に、所望の付着密度として、３×１０１２ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ／ｃｍ２にコントロールされた電極表面をこの計算曲線から得る場合には、一旦求められたこの計算曲線から、塩濃度を５０ｍＭに制御すればよいことが分かる。図４中●印は塩濃度を５０ｍＭに制御してオリゴヌクレオチドを付着させた実験値である。計算から容易に所望の付着密度の塩濃度の条件を得ることができる。
【００４６】
また、■印は、同様のチオール基を持つ１２残基１本鎖オリゴヌクレオチドを用いた場合の付着実験結果である。
【実施例】
【００４７】
以下、実施例を挙げて本発明をより具体的に説明するが、本発明は、これらの実施例に何ら制限されるものではない。
【００４８】
（実施例１）
＜標的検出装置の作製＞
厚み１００ｎｍのＡｕ薄膜が形成された絶縁性ガラス基板（信越シリコン製）上に、標的ＤＮＡと相補関係の４８塩基長の１本鎖プローブＤＮＡ（ｓｓ４８ＤＮＡ、長さＬ４８：１６ｎｍ）（つくばオリゴサービス製）の一端を４．５×１０１１（ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ／ｃｍ２）の密度で固定化した。
なお、ｓｓ４８ＤＮＡの固定は、ｓｓ４８ＤＮＡを含有する電解液中（ｐＨ７．４に調整された、ＮａＣｌ（塩）を含有する１０ｍＭのトリスバッファー）に前記導電性基板を浸漬することによって行い、密度のコントロールは、電解液中の塩濃度を５０ｍＭに調節し、浸漬時間を１５分間に調節することによって行った。２本鎖を形成したときに立体障害が発生するよう、ｓｓ４８ＤＮＡの導電性基板に対する結合点の間隔が１６ｎｍになるように密度を４．５×１０１１（ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ／ｃｍ２）に調整した。なお、図２Ｃより、密度を１．１×１０１１（ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ／ｃｍ２）超に調整すれば立体障害が発生することが分かる。
また、ｓｓ４８ＤＮＡの他端（導電性基板に固定されている一端の反対側）には、５６５ｎｍに発光波長を持つシアニン蛍光色素（商品名：Ｃｙ３（商標））の標識（ラベル）を付与し、ｓｓ４８ＤＮＡの平均的な状態を可視化できるようにした。
【００４９】
＜標的検出＞
ｓｓ４８ＤＮＡと標的ＤＮＡが２本鎖を形成するように、作製した標的検出装置に、濃度１００ｐＭの標的ＤＮＡ（つくばオリゴサービス製、長さ１６ｎｍ）を含有するバッファー溶液（ｐＨ７．４、ＮａＣｌ＝５０ｍＭ、トリスバッファー＝１０ｍＭ）を加えた。なお、前記２本鎖の直径は、２ｎｍと見積もれる。
２本鎖を形成したのち、蛍光検出装置（商品名：Ｔｙｐｈｏｏｎ）を用いて、蛍光強度を測定した。
【００５０】
図５Ａに示すように、ｓｓ４８ＤＮＡ５は、柔軟な（屈曲、収縮が可能な）性質を有するため、一のｓｓ４８ＤＮＡの基板７に対する結合点と該一のｓｓ４８ＤＮＡに隣接した他のｓｓ４８ＤＮＡの基板７に対する結合点との距離（１６ｎｍ）が、一のｓｓ４８ＤＮＡの長さと該一のｓｓ４８ＤＮＡに隣接した他のｓｓ４８ＤＮＡの長さの合計長さ（３２ｎｍ）未満であっても、立体障害を起こしにくい。また、ｓｓ４８ＤＮＡ５は、溶液中では熱運動によって、伸張したり収縮したりする運動を繰り返しており、平均的な他端（標識６）の位置（基板との距離）は、ｓｓ４８ＤＮＡ５の長さＬ４８の１６ｎｍの半分である８ｎｍに相当する。それに対し、ｓｓ４８ＤＮＡ５と標的ＤＮＡとで形成された２本鎖ＤＮＡ（ｄｓ４８ＤＮＡ）８は、比較的硬い棒状であり、図５Ｂに示すように、隣接する２本鎖ＤＮＡ（ｄｓ４８ＤＮＡ）８との間で立体障害が発生し、標識６が基板７に近づくことができない。このときの基板７から２本鎖ＤＮＡ（ｄｓ４８ＤＮＡ）８の他端（標識６）までの平均的な距離は、図５Ｃに示すように、（Ｌ４８＋√３／２Ｌ４８）／２＝（２＋√３）Ｌ４８／４（＝１５ｎｍ）である。
【００５１】
図５Ｄは、観察される蛍光強度を推定される基板からの距離でプロットしたものである。理論値（点線）と良く一致しており、１本鎖、２本鎖の違いを蛍光強度の差で、顕著に検出することが可能なことが示されている。また、ここでは、ハイブリダイゼーション前後の蛍光強度の差を観察し、標的ＤＮＡを検出しているが、ハイブリダイゼーションをリアルタイムで観察することによって、２本鎖形成途中の状態を観察することもできる。
【００５２】
（実施例２）
＜標的検出装置の作製＞
厚み１００ｎｍのＡｕ薄膜が形成された絶縁性ガラス基板（信越シリコン製）上に、標的ＤＮＡと相補関係の４８塩基長の１本鎖プローブＤＮＡ（ｓｓ４８ＤＮＡ、長さＬ４８：１６ｎｍ）（つくばオリゴサービス製）の一端を１．５×１０１１（ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ／ｃｍ２）の密度で固定化した。
なお、ｓｓ４８ＤＮＡの固定は、ｓｓ４８ＤＮＡを含有する電解液中（ｐＨ７．４に調整された、ＮａＣｌ（塩）を含有する１０ｍＭのトリスバッファー）に前記導電性基板を浸漬することによって行い、密度のコントロールは、電解液中の塩濃度を５０ｍＭに調節し、浸漬時間を５分間に調節することによって行った。２本鎖を形成したときに立体障害が発生するよう、ｓｓ４８ＤＮＡの導電性基板に対する結合点の間隔が１６√３＝２７．７ｎｍになるように密度を１．５×１０１１（ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ／ｃｍ２）に調整した。
また、ｓｓ４８ＤＮＡの他端（導電性基板に固定されている一端の反対側）には、５６５ｎｍに発光波長を持つシアニン蛍光色素（商品名：Ｃｙ３（商標））の標識（ラベル）を付与し、ｓｓ４８ＤＮＡの平均的な状態を可視化できるようにした。
【００５３】
＜標的検出＞
ｓｓ４８ＤＮＡと標的ＤＮＡが２本鎖を形成するように、作製した標的検出装置に、濃度１００ｐＭの標的ＤＮＡ（つくばオリゴサービス製、長さ１６ｎｍ）を含有するバッファー溶液（ｐＨ７．４、ＮａＣｌ＝５０ｍＭ、トリスバッファー＝１０ｍＭ）を加えた。なお、前記２本鎖の直径は、２ｎｍと見積もれる。
２本鎖を形成したのち、蛍光検出装置（商品名：Ｔｙｐｈｏｏｎ）を用いて、蛍光強度を測定した。
【００５４】
図６Ａに示すように、ｓｓ４８ＤＮＡ５は、柔軟な（屈曲、収縮が可能な）性質を有するため、一のｓｓ４８ＤＮＡの基板７に対する結合点と該一のｓｓ４８ＤＮＡに隣接した他のｓｓ４８ＤＮＡの基板７に対する結合点との距離（２７．７ｎｍ）が、一のｓｓ４８ＤＮＡの長さと該一のｓｓ４８ＤＮＡに隣接した他のｓｓ４８ＤＮＡの長さの合計長さ（３２ｎｍ）未満であっても、立体障害を起こしにくい。また、ｓｓ４８ＤＮＡ５は、溶液中では熱運動によって、伸張したり収縮したりする運動を繰り返しており、平均的な他端（標識６）の位置（基板７との距離）は、ｓｓ４８ＤＮＡ５の長さＬ４８の１６ｎｍの半分である８ｎｍに相当する。それに対し、ｓｓ４８ＤＮＡ５と標的ＤＮＡとで形成された２本鎖ＤＮＡ（ｄｓ４８ＤＮＡ）８は、比較的硬い棒状であり、図６Ｂに示すように、隣接する２本鎖ＤＮＡ（ｄｓ４８ＤＮＡ）８との間で立体障害が発生し、標識６が基板７に近づくことができない。このときの基板７から２本鎖ＤＮＡ（ｄｓ４８ＤＮＡ）の他端（標識６）までの平均的な距離は、図６Ｃに示すように、（Ｌ４８＋１／２Ｌ４８）／２＝（３／４）Ｌ４８（＝１２ｎｍ）である。
【００５５】
図６Ｄは、観察される蛍光強度を推定される基板からの距離でプロットしたものである。理論値（点線）と良く一致しており、１本鎖、２本鎖の違いを蛍光強度の差で、顕著に検出することが可能なことが示されている。また、ここでは、ハイブリダイゼーション前後の蛍光強度の差を観察し、標的ＤＮＡを検出しているが、ハイブリダイゼーションをリアルタイムで観察することによって、２本鎖形成途中の状態も観察することもできる。
【００５６】
（比較例１）
＜標的検出装置の作製＞
厚み１００ｎｍのＡｕ薄膜が形成された絶縁性ガラス基板（信越シリコン製）上に、標的ＤＮＡと相補関係の４８塩基長の１本鎖プローブＤＮＡ（ｓｓ４８ＤＮＡ、長さＬ４８：１６ｎｍ）（つくばオリゴサービス製）の一端を９．４×１０１０（ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ／ｃｍ２）の密度で固定化した。
なお、ｓｓ４８ＤＮＡの固定は、ｓｓ４８ＤＮＡを含有する電解液中（ｐＨ７．４に調整された、ＮａＣｌ（塩）を含有する１０ｍＭのトリスバッファー）に前記導電性基板を浸漬することによって行い、密度のコントロールは、電解液中の塩濃度を１０ｍＭに調節し、浸漬時間を１５分間に調節することによって行った。２本鎖を形成したときに立体障害が発生しないよう、ｓｓ４８ＤＮＡの導電性基板に対する結合点の間隔が３５ｎｍになるように密度を９．４×１０１０（ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ／ｃｍ２）に調整した。
また、ｓｓ４８ＤＮＡの他端（導電性基板に固定されている一端の反対側）には、５６５ｎｍに発光波長を持つシアニン蛍光色素（商品名：Ｃｙ３（商標））の標識（ラベル）を付与し、ｓｓ４８ＤＮＡの平均的な状態を可視化できるようにした。
【００５７】
＜標的検出＞
ｓｓ４８ＤＮＡと標的ＤＮＡが２本鎖を形成するように、作製した標的検出装置に、濃度１００ｐＭの標的ＤＮＡ（つくばオリゴサービス製、長さ１６ｎｍ）を含有するバッファー溶液（ｐＨ７．４、ＮａＣｌ＝５０ｍＭ、トリスバッファー＝１０ｍＭ）を加えた。なお、前記２本鎖の直径は、２ｎｍと見積もれる。
２本鎖を形成したのち、蛍光検出装置（商品名：Ｔｙｐｈｏｏｎ）を用いて、蛍光強度を測定した。
【００５８】
図７Ａに示すように、ｓｓ４８ＤＮＡ５は、柔軟な（屈曲、収縮が可能な）性質を有し、さらに、一のｓｓ４８ＤＮＡの基板７に対する結合点と該一のｓｓ４８ＤＮＡに隣接した他のｓｓ４８ＤＮＡの基板７に対する結合点との距離（３５ｎｍ）が、一のｓｓ４８ＤＮＡの長さと該一のｓｓ４８ＤＮＡに隣接した他のｓｓ４８ＤＮＡの長さの合計長さ（３２ｎｍ）以上であるため、立体障害を起こさない。また、ｓｓ４８ＤＮＡ５は、溶液中では熱運動によって、伸張したり収縮したりする運動を繰り返しており、平均的な他端（標識６）の位置（基板７との距離）は、ｓｓ４８ＤＮＡ５の長さＬ４８の１６ｎｍの半分である８ｎｍに相当する。一方、標的ＤＮＡと２本鎖を形成した２本鎖ＤＮＡ（ｄｓ４８ＤＮＡ）８は、比較的硬い棒状であるものの、一のｓｓ４８ＤＮＡの基板７に対する結合点と該一のｓｓ４８ＤＮＡに隣接した他のｓｓ４８ＤＮＡの基板７に対する結合点との距離（３５ｎｍ）が、一のｓｓ４８ＤＮＡの長さと該一のｓｓ４８ＤＮＡに隣接した他のｓｓ４８ＤＮＡの長さの合計長さ（３２ｎｍ）以上であり、図７Ｂに示すように、隣接する２本鎖ＤＮＡ（ｄｓ４８ＤＮＡ）８との間で立体障害が発生しないため、このときの基板７からＤＮＡの先端までの平均的な距離もｓｓ４８ＤＮＡ５と同じ８ｎｍである。
結果として、図７Ｃのように、１本鎖、２本鎖の違いを蛍光強度の差で、検出することはできなかった。
【００５９】
（比較例２）
＜標的検出装置の作製＞
厚み１００ｎｍのＡｕ薄膜が形成された絶縁性ガラス基板（信越シリコン製）上に、標的ＤＮＡと相補関係の４８塩基長の１本鎖プローブＤＮＡ（ｓｓ４８ＤＮＡ、長さＬ４８：１６ｎｍ）（つくばオリゴサービス製）の一端を７．２×１０１２（ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ／ｃｍ２）の密度で固定化した。
なお、ｓｓ４８ＤＮＡの固定は、ｓｓ４８ＤＮＡを含有する電解液中（ｐＨ７．４に調整された、ＮａＣｌ（塩）を含有する１０ｍＭのトリスバッファー）に前記導電性基板を浸漬することによって行い、密度のコントロールは、電解液中の塩濃度を５００ｍＭに調節し、浸漬時間を３０分間に調節することによって行った。１本鎖を基板に形成したときに、すでに十分な立体障害が発生するよう、ｓｓ４８ＤＮＡの導電性基板に対する結合点の間隔が４ｎｍになるように密度を７．２×１０１２（ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ／ｃｍ２）に調整した。
また、ｓｓ４８ＤＮＡの他端（導電性基板に固定されている一端の反対側）には、５６５ｎｍに発光波長を持つシアニン蛍光色素（商品名：Ｃｙ３（商標））の標識（ラベル）を付与し、ｓｓ４８ＤＮＡの平均的な状態を可視化できるようにした。
【００６０】
＜標的検出＞
ｓｓ４８ＤＮＡと標的ＤＮＡが２本鎖を形成するように、作製した標的検出装置に、濃度１００ｐＭの標的ＤＮＡ（つくばオリゴサービス製、長さ１６ｎｍ）を含有するバッファー溶液（ｐＨ７．４、ＮａＣｌ＝５０ ｍＭ、トリスバッファー＝１０ｍＭ）を加えた。なお、前記２本鎖の直径は、２ｎｍと見積もれる。
２本鎖を形成したのち、蛍光検出装置（商品名：Ｔｙｐｈｏｏｎ）を用いて、蛍光強度を測定した。
図８Ａに示すように、ｓｓ４８ＤＮＡ５は、柔軟な（屈曲、収縮が可能な）性質を有するが、隣接したＤＮＡとの距離が非常に短い場合は、立体障害を起こし、伸張した状態を維持し、平均的な他端（標識６）の位置（基板７との距離）は、ｓｓ４８ＤＮＡ５の長さＬ４８（＝１６ｎｍ）に相当する。また、標的ＤＮＡと２本鎖を形成した２本鎖ＤＮＡ（ｄｓ４８ＤＮＡ）８は、同様に、立体障害で立ち上がった状態となり、このときの基板から２本鎖ＤＮＡ（ｄｓ４８ＤＮＡ）８の他端までの平均的な距離は、図８Ｂに示すようにｓｓ４８ＤＮＡ５と同じＬ４８（＝１６ｎｍ）である。
結果として、図８Ｃのように、１本鎖、２本鎖の違いを蛍光強度の差で、検出することはできなかった。
【００６１】
以上の実施例１〜２、比較例１〜２より、基板７と２本鎖ＤＮＡ８とのなす角が３０°から６０°の範囲に面密度を調整したものが好ましいことが分かる。
【符号の説明】
【００６２】
１ １本鎖ＤＮＡ（プローブｓｓＤＮＡ）
２ 標識（ラベル）
３ 基板
４ ２本鎖ＤＮＡ
５ ｓｓ４８ＤＮＡ
６ 標識（ラベル）
７ 基板
８ ２本鎖ＤＮＡ（ｄｓ４８ＤＮＡ）
１０ ＤＮＡ
１１ 蛍光色素
１２ 導電性基板
１５ １本鎖プローブＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ）
１６ 蛍光色素
１７ 基板
１８ 標的ＤＮＡ
２０ ２本鎖（ｄｓＤＮＡ）
３０ 基板
３１ プローブ（ｓｓＤＮＡ）
【特許請求の範囲】
【請求項１】
基材と、該基材上に一端が結合され、前記基材から離間したときに標識として機能する標識を一部に有し、かつ、標的核酸と共に２本鎖を形成可能な複数のプローブとを有してなり、
前記プローブが前記標的核酸と共に２本鎖を形成したときに、一の２本鎖と該一の２本鎖に隣接する他の２本鎖との間で前記標識を前記基材から離間させる立体障害が生ずる位置に、前記複数のプローブが配置されたことを特徴とする標的検出装置。
【請求項２】
複数のプローブのうちの、一のプローブの基材に対する結合点と、該一のプローブに隣接する他のプローブの基材に対する結合点との間隔が、２本鎖の直径以上であって、前記一のプローブの長さと前記一のプローブに隣接する他のプローブの長さとの合計未満である請求項１に記載の標的検出装置。
【請求項３】
プローブの長さより短い任意の長さを半径とする円が六方最密で基材上に配置されたとしたとき、前記各円の中心に、各プローブの前記基材に対する結合点が位置する請求項１から２のいずれかに記載の標的検出装置。
【請求項４】
複数のプローブの基材に対する結合点の面密度が、下記式（１）を満たす請求項１から３のいずれかに記載の標的検出装置。
面密度＞√３／（６Ｘ２） ・・・式（１）
但し、前記式（１）中、Ｘは、プローブの平均長さを示す。
【請求項５】
標識が蛍光色素であり、基材が導電性基板である請求項１から４のいずれかに記載の標的検出装置。
【請求項６】
標識が酸化還元マーカーであり、基材が導電性基板である請求項１から４のいずれかに記載の標的検出装置。
【請求項７】
プローブが、硫黄原子を分子の一部に有してなり、該硫黄原子を介して基材に結合可能である請求項１から６のいずれかに記載の標的検出装置。
【請求項８】
請求項１から７のいずれかに記載の標的検出装置の製造方法であって、プローブが標的核酸と共に２本鎖を形成したときに、一の２本鎖と該一の２本鎖に隣接する他の２本鎖との間で標識を基材から離間させる立体障害が生ずる数のプローブを基板上に配置させるプローブ配置工程を含むことを特徴とする標的検出装置の製造方法。
【請求項９】
プローブにカウンターカチオンが配位した請求項８に記載の標的検出装置の製造方法。
【請求項１０】
カウンターカチオンがＮａ＋及びＫ＋の少なくともいずれかである請求項９に記載の標的検出装置の製造方法。
【請求項１】
基材と、該基材上に一端が結合され、前記基材から離間したときに標識として機能する標識を一部に有し、かつ、標的核酸と共に２本鎖を形成可能な複数のプローブとを有してなり、
前記プローブが前記標的核酸と共に２本鎖を形成したときに、一の２本鎖と該一の２本鎖に隣接する他の２本鎖との間で前記標識を前記基材から離間させる立体障害が生ずる位置に、前記複数のプローブが配置されたことを特徴とする標的検出装置。
【請求項２】
複数のプローブのうちの、一のプローブの基材に対する結合点と、該一のプローブに隣接する他のプローブの基材に対する結合点との間隔が、２本鎖の直径以上であって、前記一のプローブの長さと前記一のプローブに隣接する他のプローブの長さとの合計未満である請求項１に記載の標的検出装置。
【請求項３】
プローブの長さより短い任意の長さを半径とする円が六方最密で基材上に配置されたとしたとき、前記各円の中心に、各プローブの前記基材に対する結合点が位置する請求項１から２のいずれかに記載の標的検出装置。
【請求項４】
複数のプローブの基材に対する結合点の面密度が、下記式（１）を満たす請求項１から３のいずれかに記載の標的検出装置。
面密度＞√３／（６Ｘ２） ・・・式（１）
但し、前記式（１）中、Ｘは、プローブの平均長さを示す。
【請求項５】
標識が蛍光色素であり、基材が導電性基板である請求項１から４のいずれかに記載の標的検出装置。
【請求項６】
標識が酸化還元マーカーであり、基材が導電性基板である請求項１から４のいずれかに記載の標的検出装置。
【請求項７】
プローブが、硫黄原子を分子の一部に有してなり、該硫黄原子を介して基材に結合可能である請求項１から６のいずれかに記載の標的検出装置。
【請求項８】
請求項１から７のいずれかに記載の標的検出装置の製造方法であって、プローブが標的核酸と共に２本鎖を形成したときに、一の２本鎖と該一の２本鎖に隣接する他の２本鎖との間で標識を基材から離間させる立体障害が生ずる数のプローブを基板上に配置させるプローブ配置工程を含むことを特徴とする標的検出装置の製造方法。
【請求項９】
プローブにカウンターカチオンが配位した請求項８に記載の標的検出装置の製造方法。
【請求項１０】
カウンターカチオンがＮａ＋及びＫ＋の少なくともいずれかである請求項９に記載の標的検出装置の製造方法。
【図１Ａ】
【図１Ｂ】
【図１Ｃ】
【図１Ｄ】
【図２Ａ】
【図２Ｂ】
【図２Ｃ】
【図３Ａ】
【図３Ｂ】
【図３Ｃ】
【図４】
【図５Ａ】
【図５Ｂ】
【図５Ｃ】
【図５Ｄ】
【図６Ａ】
【図６Ｂ】
【図６Ｃ】
【図６Ｄ】
【図７Ａ】
【図７Ｂ】
【図７Ｃ】
【図８Ａ】
【図８Ｂ】
【図８Ｃ】
【図１Ｂ】
【図１Ｃ】
【図１Ｄ】
【図２Ａ】
【図２Ｂ】
【図２Ｃ】
【図３Ａ】
【図３Ｂ】
【図３Ｃ】
【図４】
【図５Ａ】
【図５Ｂ】
【図５Ｃ】
【図５Ｄ】
【図６Ａ】
【図６Ｂ】
【図６Ｃ】
【図６Ｄ】
【図７Ａ】
【図７Ｂ】
【図７Ｃ】
【図８Ａ】
【図８Ｂ】
【図８Ｃ】
【公開番号】特開２０１１−６７１７４（Ｐ２０１１−６７１７４Ａ）
【公開日】平成２３年４月７日（２０１１．４．７）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００９−２２２８７８（Ｐ２００９−２２２８７８）
【出願日】平成２１年９月２８日（２００９．９．２８）
【出願人】（０００００５２２３）富士通株式会社 (25,993)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２３年４月７日（２０１１．４．７）
【国際特許分類】
【出願日】平成２１年９月２８日（２００９．９．２８）
【出願人】（０００００５２２３）富士通株式会社 (25,993)
【Ｆターム（参考）】
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