標的結合性ポリペプチド
【課題】ハプテンおよび抗原に対する結合活性もしくは特異性を向上または改良した、新規ポリペプチドの構築、応用および製造方法の提供。
【解決手段】ａ）安定なコアポリペプチド領域（ＳＣＲ）と；ｂ）少なくとも一つの標的結合領域（ＴＢＲ）とを具備する標的結合ポリペプチドであって、前記標的結合領域は、前記ＳＣＲに共有結合体に結合しており、また標的に対する特異性、親和性または結合活性を改変するために、任意に成熟プロセスを受けているポリペプチド。該ポリペプチドは、自己会合して安定な二量体、凝集体またはアレイを形成し得る。ポリペプチドは、製薬産業およびヘルスケア産業における診断、治療、予診または予防の分野での有用性を有し、並びに化学物質の検出および分析におけるより一般的な用途での有用性を有している。
【解決手段】ａ）安定なコアポリペプチド領域（ＳＣＲ）と；ｂ）少なくとも一つの標的結合領域（ＴＢＲ）とを具備する標的結合ポリペプチドであって、前記標的結合領域は、前記ＳＣＲに共有結合体に結合しており、また標的に対する特異性、親和性または結合活性を改変するために、任意に成熟プロセスを受けているポリペプチド。該ポリペプチドは、自己会合して安定な二量体、凝集体またはアレイを形成し得る。ポリペプチドは、製薬産業およびヘルスケア産業における診断、治療、予診または予防の分野での有用性を有し、並びに化学物質の検出および分析におけるより一般的な用途での有用性を有している。
【発明の詳細な説明】
【発明の開示】
【０００１】
[発明の技術分野]
本発明は、ハプテンおよび抗原に対する結合活性もしくは特異性を向上または改良した、新規ポリペプチドの構築、応用および製造に関する。
【０００２】
本発明はまた、表面提示抗原成分ライブラリーまたはハプテン結合成分ライブラリーの発現から誘導される抗体様の組換分子の構築、改良および選別、並びにこれらの分子の使用に関する。
【０００３】
本発明のポリペプチドは、製薬産業およびヘルスケア産業における診断、治療、予診または予防の分野での有用性を有し、並びに化学物質の検出および分析におけるより一般的な用途での有用性を有している。
【０００４】
[発明の背景]
抗体は、標的抗原またはハプテンに対する結合親和性をもったタンパク分子である。結合性相互作用の特異性によって、抗体は診断薬および治療用試薬として使用される。モノクローナル抗体はハイブリドーマ細胞のような純粋細胞系から誘導される。しかし、ハイブリドーマ技術は費用が高く、維持に時間を要し、また範囲が限定されている。全範囲の抗原に対して、モノクローナル抗体（適切な親和性をもった極めて少ない抗体）を生産することは不可能である。抗体遺伝子またはそのフラグメントはクローン化することができ、また大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）内で生物学的に機能する形態で発現させることができる。
【０００５】
抗体および抗体フラグメントはまた、バクテリア細胞または哺乳類細胞の何れかを用いた組換ＤＮＡ技術によって製造することができる。抗体のＦａｂ領域には、二つの重鎖および軽鎖の組合せによって、分子の先端に６つの可変表面ループが与えられる。これらの外部ドメイン（Ｆｖ）に存在するループは相補性決定領域（ＣＤＲｓ）と呼称され、その標的抗原に対する抗体結合特異性を与える。この結合作用は抗体分子の可変ドメインに局在しており、該ドメインは重鎖および軽鎖の両方のアミノ末端に位置している。これは図１に示されている。幾つかの抗体における可変領域は、本来の抗体分子からタンパク加水分解によって切断された後でさえも、非共有結合的に会合した状態（ＶHＶLダイマー、Ｆｖ領域と称する）で残り、その抗原認識能および結合能の大半を保持している。定常領域が実質的に存在しない二本鎖Ｆｖを製造する方法は、米国特許第4,642,334号に開示されている。
【０００６】
組換Ｆｖ断片は解離し易い。従って、幾人かの研究者等は２つのドメインを共有結合させて、ｓｃＦｖと称する構築物を形成することを選択した。該ｓｃＦｖにおいては、結合ドメインを有する２つのペプチド（通常は抗体の重鎖可変領域および軽鎖可変領域）が、抗原結合ドメインの相対的位置関係が元の抗体で見られる位置関係と一致するように、一方のドメインのＣ末端を他方のＮ末端に結びつけるリンカーペプチドによって結合されている（図１参照）。
【０００７】
米国特許第4,946,778および同第5,132,405号には、共有結合的に結合されたＦｖ断片の製造方法が開示されている。更に、二官能性試薬（bifunctional agents）および多官能性試薬（multifunctional agents）の製造によって、異種混合（heterogeneity）が達成される（ヒューストン等の米国特許第5,091,513号およびランダー等による米国特許第4,816,397号）。
【０００８】
ｓｃＦｖライブラリーの構築は、例えば欧州特許出願第239400号および米国特許第4,946,778号に開示されている。しかし、ｓｃＦｖをのコードする単一のＤＮＡ分子のクローニングに内在する問題のために、単鎖Ｆｖライブラリーは大きさに制限をうける。ＶHまたはＦabライブラリーのような非ｓｃＦｖライブラリーも公知であり（Ladner及びGutermanWO90/02809）あり、これは表面発現用のファージ系と共に使用される（Ladner et al.， W088/06630及びBonnert et al,，WO92/01047）。
【０００９】
抗体治療に使用する場合、モノクローナル抗体（通常はマウス由来）はヒトに投与すると抗原性反応を引き起こすので、先ず「ヒト化」されない限りは使用が制限される。抗体の可変ドメインは、抗原結合部位を形成する６つの超可変領域（ＣＤＲｓ）を有するβシート構造のフレームワークからなっている。ヒト化は、結合親和性を与えるマウスの配列、特にＣＤＲループ配列を、ヒト可変ドメイン構造内に置換することからなっている。従って、該マウスのＣＤＲループ領域は所望の抗原に対する結合親和性を与える。ＣＤＲｓの移植による組換抗体のヒト化は、Winter et al（EP-239400）に開示されている。
【００１０】
発現／組合せシステムを用いて多様な組換ヒト抗体を発現させることが、Marks el al，J．Mol．Biol．1991 222，581-597に記載されている。繊維状ファージの表面にペプチドおよびタンパクを発現させる方法における最近の新事実（McCafferty et al，Nature 1991 348 552； Clackson et al，J．Mol．Biol.， 1991 352 624-28）は、診断および治療法としてこれら試薬を選択し、改良し及び開発する能力を提供している。マウスおよびヒトの両方に起源をもつクローン化された重鎖および軽鎖遺伝子の発現、提示および対合を行なうための改良されたバクテリオファージゲノムを使用することが、Hoogenboom et al．Nucl．Acids．Res., 19 4133-4137；Marks et al．1991 op．cit．及びBonnert et al，WPI Acc．No．92-056862/07に記載されている。
【００１１】
受容体分子（その発現は、該受容体をコードする遺伝子ライブラリーが発現生物体中で発現した結果である）もまた、同じ方法で表現され得る（Lerner and Scorge，WO90/14430）。細胞表面タンパクと融合した単鎖抗体ドメインの細胞表面での発現については、Ladner et al WO/06630に開示されている。
【００１２】
親和性の成熟は、抗体の結合特異性、親和性または結合活性が改変される過程である。様々な実験技術が工夫されており、抗体フラグメントの全体またはＣＤＲｓ等の選択された領域の何れかに、種々の突然変異ストラテジーを適用することによって、多様なアミノ酸配列が創造される。酵素の特異的活性を変化させる突然変異についても報告されている。当業者は、ランダム突然変異または部位指向性突然変異を達成するため、並びに所望の修飾を施された分子を選択するための、種々の方法を知るであろう。所謂「チェインシャッフリング（chain shuffling）」技術、即ち、固定された相補的鎖（例えば軽鎖）について一つの鎖タイプ（例えば重鎖）のライブラリーの再組合せを行なうことによって、多様性を高め且つ特異的な抗体を選択する機構については、Kang et al Proc．Natl．Acad．Sci．USA，1991 88 4363-466；Hoogenboom et al，Nucl．Acid Res., 1991 19 4133-4137; Marks etal，Bio/Technology，1992 10 779-783に記載されている。
【００１３】
抗体のＶドメイン、フレームワークまたは定常領域の何れかの部分のマウス配列に対して、ヒトが反応する問題を克服するために、末梢血リンパ球を含む種々のヒト組織から、組換ヒト抗体遺伝子ライブラリーを構築することができる（WinterおよびMilstein Nature，1991 349 293）。ヒト成人は既に抗原性刺激を受けているので、広範囲の抗原を認識する予め免疫感作された成人Ｂ細胞集団の能力は、生来のＢ細胞集団と比較して減少し、また抗体のｍＲＮＡ分子の制限された集団に反映される。
【００１４】
従って、できる限り広い抗原結合能を得るために選択される組織の一つは胎児末梢血でありる。この退治末梢血は生れた状態のままであり、ＩｇＭ抗体分子の比率が大人の血液りも高い（約７０％；なおＩｇＧは３０％）。従って、種々様々な抗原を結合で
きるように広範な成熟（進化）を予定した抗体ライブラリーを構築するための、
理想的な遺伝子材料の供給源を提供する。
【００１５】
[発明の概要]
従って、本発明の範囲内には下記の事項が含まれる。
【００１６】
１）標的に対して結合する新規な組換えポリペプチドの同定および構築。
【００１７】
２）このようなポリペプチド剤を、例えばそのＤＮＡコード領域の突然変異を
含む機構によって改変し、その性能を変えること。
【００１８】
３）更に、サブコンポーネントの再組合わせにより、遺伝子レベルまたはタン
パクレベルの何れかにおいて、これらのポリペプチド剤を変化させること。
【００１９】
第一の側面に従えば、本発明は、標的結合性の組換えポリペプチドであって、
ａ）安定なコアポリペプチド領域（ＳＣＲ）と、
ｂ）少なくとも一つの標的結合領域（ＴＢＲ）
とを具備し、
前記標的結合領域は、標的に対する特異性、親和性または結合活性を改変する
ために、任意に成熟プロセスを経ているポリペプチドを提供する。
【００２０】
我々は、結合の特異性、親和性または結合活性が改変された本発明によるポリ
ペプチドを、成熟工程の実施を必要とすることなく、設計および構築することができた。こえは、例えば免疫グロブリン（Ｉｇ）およびＣＤ８を用いて行なわれた。
【００２１】
我々は、ＴＢＲがＳＣＲに共有結合している一価の標的結合性ポリペプチドの構築を開示する。該ＳＣＲは、好ましくは、Ｉｇスーパーファミリーの共有結合した二つのＩｇ様ドメイン（例えば抗体可変部ドメインまたはＣＤ８ドメイン）
の結合によって形成される。
【００２２】
我々はまた、分離しまたは重複したＴＢＲｓをＳＣＲ上に形成することによって、多官能の標的結合性ポリペプチドが如何にして製造され得るかを示す。我々はまた、ＩｇスーパーファミリーのメンバーのＩｇ様ドメインをＳＣＲｓとして構築することができ、また非共有結合的に結合して二官能性および多官能性性の標的結合性ポリペプチドを製造できることを示した。我々は、Ｉｇ様ドメインに共有結合することができ、それにより自己会合して好ましくは二官能性または多官能性の特異性を有する安定なダイマー、集合体またはアレイを形成するアミノ酸配列を、如何にしてデザインするかを開示する 標的結合性領域は標的分子に結合することができ、該標的分子は何れのタイプの化学物質でもよい。例えば、該標的は殺虫剤または薬物等の小分子、ステロイド等のホルモン、アミノ酸、ペプチドまたはポリペプチド；細菌性、ウイルス性、または細胞表面抗原等の抗原；抗体またはＩｇスーパーファミリーの他のメンバー；腫瘍マーカー、増殖因子等であり得る。当業者は、容易に種々様々な目的の標的を選択することができるであろう。
【００２３】
本発明のポリペプチドが、イン・ビトロでの診断目的に使用される場合、コアポリペプチド領域は、適切なタンパクなら何でも良い。しかし、本発明のポリペプチドをイン・ビボ使用することを意図する場合には、該コアポリペプチド領域は非抗原性であることが好ましい。従って、血清中に存在し或いは細胞表面に出現する、一般に耐性のあるタイプの通常のヒトタンパクなら何れも適するであろう。通常の細胞表面タンパクの一定のドメインは可溶型で産生され、また本発明の方法によって、その親和性を向上または改変することができる。Ｔ細胞表面タンパクを本来の標的とするヒトタンパクの場合、その可溶性フラグメントは、特に移植に有用な有望な免疫調節治療試剤になる。これらフラグメントの多くは、イムノグロブリンのスーパーファミリーのタンパクとの相同性を有するであろう。
【００２４】
本発明の特に好ましい態様においては、標的は、グリコホリン（glycophorin）または他の赤血球細胞表面タンパク、インフルエンザウイルス・ノイラミニダーゼ；Ｂ型肝炎抗原、ＨＩＶのｇｐ４０タンパク等のウイルス抗原；腫瘍マーカー、ＣＤ２８およびＣＤ４等の細胞表面タンパク：腫瘍増殖因子α（ＴＧＦ−α）、白血病阻害因子（ＬＩＦ）からなる群より選択される。診断および治療の何れの応用においても、標的結合領域が二以上の特異性をもっていれば特に有用である。標的結合ポリペプチドが、二以上の標的との親和性をもっていることが特に好ましい。この親和性は、表面を分離し又は重複させて、二官能性または多官能性試薬を形成することによって提供される。二作用性または多作用性の試薬もまた、任意にリンカ−ポリペプチドを使用して、個々の標的結合性ポリペプチドを共有結合または非共有結合させることによって作成されと思われる。
【００２５】
第二の側面において、本発明は、上記の標的結合性ポリペプチドをコードするＤＮＡ構築物を提供する。
【００２６】
第三の側面において、本発明は、本発明の標的結合性ポリペプチドをコードするＤＮＡ構築物を製造する方法であって、標的結合性ポリペプチドをコードするＤＮＡを、突然変異および選別からなる１以上のサイクルに供して、親和性、特異性または結合活性の特徴が改変された標的結合性ポリペプチドをコードするＤＮＡ分子のサブ集団を得ることを具備した方法を提供する。
【００２７】
好ましくは、標的結合性ポリペプチドをコードするＤＮＡは、複製能力のある要素または表現ベクター（display vector）、即ち、適切なホスト中で自己複製するベクターの中に存在することが好ましい。該表現ベクターは、好ましくはバクテリオファージ、Ｆｄ等の繊維状バクテリオファージ、ウイルス、細菌、酵母、粘菌、または哺乳類動物細胞からなる群から選択される。
【００２８】
突然変異誘発は、ランダムまたは部位指向的の何れであってもよく、当業者はこの工程を行なうために適した多くの方法を知ってであろう。標的結合性ポリペプチドの一以上の標的結合領域が、突然変異に供される。
【００２９】
本発明に用いられる好ましい突然変異系では、ｍｕｔＤおよびｍｕｔＴ１と命名されたされた大腸菌の特殊な突然変異株を利用する（R．Fowler el al，J．Bacteriol.，1986 167130）。これら特別の突然変異株はファージでトランスフェクトでき、本発明の目的に特に有用である。
【００３０】
好ましい態様において、上記の標的結合性ポリペプチドを製造する方法は、 ａ）一以上の所望の標的結合性ポリペプチドのフレームワーク構造をコードするＤＮＡを、ポリメラーゼチェイン反応によって単離する工程と、 ｂ）標的結合性ポリペプチドの一以上の標的結合領域に突然変異を誘発するために、該ＤＮＡを任意に突然変異誘発に供する工程と、 ｃ）該ＤＮＡを、一以上の表現ベクターに挿入する工程と、 ｄ）所望の特異性、結合活性または親和性をもった標的結合性ポリペプチドを表現する表現ベクターのサブ集団を選別する工程と、 ｅ）該選別されたサブ集団を、親和性、特異性または結合活性の特徴が改変された標的結合性ポリペプチドを表現する表現ベクターのサブ集団を得るために、突然変異誘発および選別からなる１以上のサイクルに供する工程と、 ｆ）改変された標的結合性ポリペプチドをコードするＤＮＡを、高レベル発現ベクターに挿入する工程とを具備する。
【００３１】
表現ベクターのサブ集団の選択は、標的結合、蛍光活性化細胞選別、又はビオチン・アビジン若しくはビオチン・ストレプトアビジンシ系の利用等のような、種々の従来法よって達成される。特に好ましい方法は、免疫チューブ等の不溶性支持体上で行なう親和性選択である。これは特に簡便であることが分かった。
【００３２】
従って、本発明はまた、上記記載の高度の発現ベクターを適当な発現ホスト中に移入し、標的結合ポリペプチドを発現させ、こうして産生されたタンパクを単離することによって、標的結合性ポリペプチドを製造する方法をも提供することが理解されるであろう。
【００３３】
また、標的結合性領域および安定なコアポリペプチドは、同一分子の異なる領域であってもよく、または異なる分子から誘導されてもよいことが明瞭に理解されるであろう。
【００３４】
本発明によって観念される標的結合性ポリペプチド構築物のタイプには、改変された抗体または抗体フラグメント、連続的な際組合せを可能にする会合リンクを含んだｓｃＦｖフラグメント、改変ＣＤ８分子（例えば、単鎖ＣＤ８）、および抗体分子またはそのフラグメントとＣＤ８または免疫グロブリン・スーパーファミリーに関連する他の分子（ＭＨＣクラスＩおよびＩＩ分子のここのドメイン等）との組合せが含まれる。例えば、ＭＨＣクラスＩのα３ドメインはＣＤ８と結合し、従ってα３の可溶性バージョンは有力な免疫調節剤になる。ＣＤ８を利用する好ましい構築物には下記のものが含まれる。
【００３５】
ａ）αおよびβサブユニットのＶ様ドメインのみが連結されている単鎖分子。
【００３６】
ｂ）シグナルペプチドの電荷バランスを変更して、生物学的活性に悪影響を与えずにバクテリアでの発現を可能にするために、Ｎ末端アミノ酸をリジンからセリンに変えた分子。
【００３７】
標的結合性ポリペプチドは、共有結合したポリペプチド尾部を含むことができ、該尾部はＴＢＲｓであってもよく、或いは他のＴＢＲｓと非共有結合的に会合していてもよい。
【００３８】
以下の記載は、特にＩｇＧタイプの抗体およびそのフラグメントに関する幾つかの例に言及しているが、本発明は他のタイプ（ＩｇＭおよびＩｇＡ等）の抗体にも応用可能であることは明確に理解されるであろう。
【００３９】
標的結合性ポリペプチドをコードするＤＮＡ配列は、該ポリペプチドをバクテリアファージまたは細胞表面に表現できる何れのベクターにもクローン化できる。好ましいべクターはｐＨＦＡであり、その構築物は国際特許出願第ＰＣＴ／ＡＵ９３／００２２８に記載されていおり、その構造は図４に示されている。タンパクの発現に好ましい細菌ホストは、大腸菌（E．coli)およびバチルス・サブチルス（Bacillus subtilis）である。
【００４０】
以下の限定的でない実施例および図面を参照して、本発明を詳細に説明する。
【００４１】
本発明の好ましい態様には、次のものが含まれる。
【００４２】
１．標的結合性ポリペプチドの構造は、抗原に対する接触領域（従って特異性）を提供する表面ポリペプチドの６個のループによって一つのＴＢＲが形成されるような、ｓｃＦｖ分子に基づき得る。特に好ましい態様においては、抗原に接触して十分な接触面積および親和性を与えるために、ＴＢＲは４個のＣＤＲループによって形成され得る（図１４）。ＮＣ１０を用いた我々の結果は、これらポリペプチド配列をランダムに突然変異して標的親和性を修飾することが容易であることを示している。
【００４３】
２．二官能性または多官能性の抗体試薬は、個々の標的結合性ポリペプチドを共有結合的に連結することによって製造することができる。この共有結合的結合は、単鎖Ｆｖ分子の形のポリペプチド鎖によって提供され得る。二量体化または凝集し易い傾向をもった個々のタンパク、領域を結合することによって、特異性を組合せることができる。従って、例えば、追加のポリペプチド鎖によって、二つの単鎖Ｆｖフラグメントをその正常な向きで連結することは必要とされない。
【００４４】
これは、異なった特異性の重鎖と軽鎖、重鎖と重鎖、または軽鎖と軽鎖を連結し、次いで機能的な二量体または凝集体を形成することによって達成することができる。勿論、この方法はまた、必要な特異性をもったＶドメインを、ＣＤ８、Ｔ細胞受容体フラグメントまたはＭＨＣフラグメントから誘導された免疫グロブリン様ドメインと連結するためにも用いることができる。
【００４５】
好ましい態様において、抗体の重鎖可変領域および軽鎖可変領域のような二つのＩｇ様ドメインの共有結合的な連結は、リンカーポリペプチドを用いて、または用いること無く行なうことができる。単量体ｓｃＦｖフラグメントの場合、ポリペプチドリンカーは、ｓｃＦｖ結合部位の原形を損なうこと無く、一方の可変（Ｖ）ドメインのカルボキシ末端と他方のＶドメインのアミノ末端との間で、ＶHドメインおよびＶLドメインを共有結合的に連結する。ｓｃＦｖは、ＶH・リンカー・ＶL融合タンパクの、若しくはＶL・リンカー・ＶH融合タンパクの何れかのドメイン順序で組み立てられ得る。このリンカーは、疎水性のＶドメイン表面との会合を防止するために、好ましくは親水性でなければならない。リンカーは、経験的な選別によって確立された好ましい大きさをもった２５アミノ酸残基よりも小さい長さであり得る。好ましいリンカー配列は５量体ユニットのＧｌｙ４Ｓｅｒからなり、ここでセリン残基はペプチド骨格の親水性を高める一方、グリシン残基は、Ｖドメンの回りに或る範囲のコンホメーションを取るために十分な可撓性をリンカーに与える。特に好ましい態様において、ポリマーＦｖフラグメントの共有結合性の会合体は、連結配列において一つのＩｇドメインの切片を除去することによって、追加のリンカーポリペプチドなしで製造することができる。これらのリンカー無しの構築物は、ここでは緊密に結合されたドメイン（tightly coupled domains ；ＴＣＤｓ）と称する。除去すべきアミノ酸の数は経験的に、或いはタンパク設計理論を用いて決定することができる。図１６は、二つのＦｖ分子が背面−背面で会合したＴＣＤｓを描写しており、ここでは二つのＴＢＲｓが分子の反対端にあり、二つの標的分子に交差結合することができる二官能性試薬を形成している。この例においては、密接な会合を得るために、好ましくは１３アミノ酸までが除去される。得られた分子は、近接してはいるがＩｇ様ドメイン間の相互作用が立体的に阻害されないような形で、少なくとも二量体にまでオリゴマー化する傾向を有している。遊離のアミノ末端およびカルボキシ末端にポリペプチド尾部を付加することによって、分子上のＴＢＲｓの数を増加できると思われる。また、Ｉｇ様ドメインの結合部で除去された欠失ポリペプチド配列が、Ｉｇ様ドメインにおける他の位置に結合したポリペプチド配列を与えることによって、全体的または部分的に置換され得ることは明らかである。我々は、これら分子が二次元アレイを形成し、それによって二官能性表面を提供することができるであろうと予期してる。これらのアレイは、生物学的なコーティング手段としての特異的な用途を有するであろうと思われる。
【００４６】
ヘテロ二量体的なα鎖およびβ鎖を含む、成熟したヒト若しくはマウスＣＤ８の完全な三次元構造は未だ知られていない。ヘテロ二量体ヒトＣＤ８αの結晶構造からの予測は、α鎖がトポロジーにおいて抗体ＶL鎖と類似していることを示唆している（Leahy et al., Cell，1992，68，1145-1162）。我々は、バクテリア選別バクターを用いた発現のために、マウスＣＤ８α／βヘテロ二量体の単鎖変種を構築したが、ヒトＣＤ８を用いても同様の結果が期待され得る。本来のヒト若しくはマウスのＣＤ８分子は、ＭＨＣクラスＩの分子にのみ親和性を有すると思われる。我々は、実施例に記載したようなランダムライブラリーのアプローチによって、ｓｃＣＤ８分子を、標的結合性ポリペプチドを製造するための安定なフレームワークとして用いることが可能になるであろうことを予測した。この方法によって、ｓｃＣＤ８分子を疑似抗体として使用することができる。更に、このｓｃＣＤ８分子は、接触表面に６個未満のＣＤＲループのためのフレームワークを提供するために、大きさ及びＣＤＲと等価なループ構造を更に修飾することができる。特に好ましい態様において、我々は、接触領域に４個または５個のＣＤＲループを提供できる安定なタンパクフレームワークを企画している。我々はまた、他のＩｇドメインに適用するためのストラテジーを企画している。例えば、ＭＨＣクラスＩおよびIIの免疫グロブリン様ドメインを可溶性の形で発現させることができ、これを修飾すれば免疫調節剤として使用することができる。
【００４７】
４．標的結合性ポリペプチドに対する上記のような修飾は、図３に示したようなライブラリー選別および修飾ストラテジーを用いることによる、コーディング領域の突然変異に基づくことができる。この突然変異は、低親和性で且つ特異性の広い単鎖ＴＢＰまたはＴＢＰを成熟させ、それが認識する標的分子の範囲を高める。より重要なことは、ライブラリーの各メンバーについての結合親和性の範囲を作成し、その個々のＤＮＡコーディング領域が公知の方法論によって容易に選別され、単離され得ることである。このようなライブラリーは、抗体様フラグメントに対して親和性を示し、或いはリガンド、他のタンパク、酵素若しくは受容体に対して親和性を示す何れか別のペプチドを含むであろうことが想定される。また、それ自身は抗原性ではないが、組換えＤＮＡ技術によってコーディング領域を移植することにより、特定のリガンドに対する親和性をもったＣＤＲループまたはペプチドを付加することによって修飾され得る安定なコアポリペプチドをも含み得る。また、フレームワーク領域に対する変化によって、タンパクのコンホメーションの変化がもたらされ、親分子とは異なった結合特性をもった変化した結合表面が提示されることも見られる。
【００４８】
最も平凡な例には、所定の標的結合特性をもった組換え抗体フラグメント（単鎖Ｆｖフラグメントを含む）を製造する発現ライブラリーの構築が含まれる。図３に示した夫々の選別工程に引き続き、結合ドメイン（好ましい例ではＶHドメインおよびＶLドメインを含む）の継続的な再組合せを可能にする表現ベクターは、例えばｐＨＦＡのために適切に使用することができる。
【００４９】
５．本発明は、広範囲の受容体、受容体様分子、並びに結合活性、構造的一体性および生物学的活性の何れにとっても潜在的に重要な領域における突然変異を伴なって構築された分子を構築し、選別するために使用され得る。発現した後の初期のファージ表面での表現、および大腸菌からのファージ救出は、このアプローチの有効性をモニターするために用いられるが、真核細胞系のような他のシステムも発現能力を有している。酵母（サッカロマイセス・セレヴィシアエ）は、α交配因子プロモータの制御下において、ＮＣ４１のＶH、即ちインフルエンザウイルのスノイラミニダーゼに対するモノクローナル抗体を発現することが示されており、また粘菌のディクチオステリウム・ディスコイデウム（dictyostelium discoideum）はＮＣ１０のＶHおよびｓｃＦｖの両方を含む組換えタンパクを発現することができる。
【００５０】
６．特定の抗原（ＬＩＦ，ＴＧＦ−α、グリコホリン、細胞表面マーカーまたは他の細胞特異的表面タンパクが含まれ得る）に結合することができる標的結合性ポリペプチドの特異的な選別は、表現ベクター上での表現、例えば遺伝子III生成物に融合したこれらペプチドのファージ表面での表現の結果として可能になる。適切なファージを選択することによって、これらは次に、図５に示したように突然変異のラウンドに供される。
【００５１】
以下の実施例においては、分子の全体に亘ってランダムニ突然変異を誘発するために、大腸菌のｍｕｔＤおよびｍｕｔＴ１変異株が用いられる。これは、文献に見られる何れかの標準的な技術を用いることにより、これらの大腸菌株をプラスミドＤＮＡで形質転換することによって行なわれる。好ましい方法は電気穿孔法である。或いは、標準的なトランスフェクション法によって、組換えファージを変異株にトランスフェクトしてもよい。これらのプラスミド／ファージを含む大腸菌の増殖ランドを行なった後、ファージは、ヘルパーファージを用いた標準的な技術によって救出され得る。次いで、結合親和性に対する種々の突然変異の影響を測定するための、抗原結合試験に用いることができる。
【００５２】
これらの突然変異は、ＤＮＡにおける塩基置換を起こすことは確認されていないけれども、分子における結合領域の数、大きさおよび位置が変わるような、分子の構造に対するペプチドの付加も含まれ得る。これらの付加を伴なう単一のドメイン結合ユニットは、特異的でないとすれば、親和性が実質的に変化した結合特性を示すであろう。特定の部位における突然変異と結合親和性との間の相関は、治療的および診断的に有力な標的結合性ポリペプチドのための、新しいＣＤＲループおよびフレームワーク領域をデザインするために用いることができる。
【００５３】
本発明の範囲にはまた、「抗体遺伝子」の制御された発現に向かうプロセスの第一ステップの原因でとなる抗原または何らかのリガンドの直接の制御下での、組換え細胞からの組換えタンパクの発現も包含される。
【００５４】
７．二官能性または多官能性試薬は、上記のライブラリー技術を用いて選別することができる。標的結合性ポリペプチドは、ポリペプチド尾部を介しての結合によるアフィニティー選別のために表現され得る。二以上の異なった標的抗原もしくはハプテンに対する親和性に基づく選別は、同じ分子の異なった位置に二つの結合表面を有する単一の分子を選別するであろう。これらの結合表面は重なり得る。二官能性または多官能性の試薬を選別するためのライブラリーを構築するために、タンパク分子の二以上の表面に適用される部位特異的突然変異およびランダム突然変異のストラテジーが用いられ得る。単鎖Ｆｖまたは単鎖ＣＤ８の場合、突然変異のために好ましい領域は、ＣＤＲループと、ｓｃＦｖ分子の他端にある反対のカウンターパートであろう。Ｆａｂ分子の場合には、好ましい突然変異はＣＤＲループと、定常ドメインの他端にある反対のカウンターパートループにおけるものであろう。
【００５５】
外に特記しない限り、ここで言及される全ての標準法は、Sambrook et al., 1990の「分子クローニング-Ａ実験室マニュアル」に記載されている。
【００５６】
実施例１ ［異なる長さのポリペプチドリンカーを用いた 単鎖Ｆｖフラグメントとしての標的結合性ポ リペプチドの構築および発現］
ＮＣ１０（インフルエンザウイルスＮ９株上のノイラミニダーゼ（ＮＡ）分子を認識するモノクローナル抗体）の親ｓｃＦｖフラグメントをデザインし、構築し、大腸菌中で発現させた（配列認識番号５）。アミノ末端の分泌シグナルＰｅｌＢによって、合成タンパクは大腸菌のペリプラズムに導かれ、そこで不溶性膜フラクションと会合された。オクタペプチド（ＦＬＡＧ；ＩＢＩ ＵＳＡ）の尾部を、該ｓｃＦｖのカルボキシル末端に融合させ、引き続く精製工程を通して該ｓｃＦｖをモニターするために用いた。この試剤は二官能性であり、ノイラミニダーゼおよび抗ＦＬＡＧ抗体の両者に対して特異性を有する。
【００５７】
このｓｃＦｖ・ＮＣ１０タンパクは、大腸菌膜フラクションを塩酸グアニジニウムで溶解し、続いてカラムクロマトグラフィーにかけることによって精製された。精製されたｓｃＦｖ・ＮＣ１０のサイズ排除ＨＰＬＣによって、ｓｃＦｖフラグメントは単量体（２７ｋＤａ）および二量体（５４ｋＤａ）の大きさに対応する二つのピークを生じることが示された。更に、単量体型はＮ９ＮＡに結合して３２０ｋＤａの複合体を形成するのに対し、二量体型はＮ９ＮＡに結合して６４０ｋＤａの複合体を形成した。３２０ｋＤａの複合体は、単一のＮＡ分子に結合している４つのｓｃＦｖ分子から構成されるのに対し、６４０ｋＤａ複合体は、二つのＮＡ分子に結合している４つのｓｃＦｖ分子から構成される。電子顕微鏡によって、２つのノイラミニダーゼ四量体が、四つの二官能性ｓｃＦｖ二量体によって緊密に結合している事が確認された（図１５）。ＮＣ１０・ＭａｂのｓｃＦｖ構築物との間で複合を形成しているインフルエンザ・ノイラミニダーゼのアジサシＮ９（鳥類）株について、高解像度の電子顕微鏡観察を行なった。ここで、該分子複合体はホスホタングステン酸カリウム（potassium phopho-tungstate）（ｐＨ７．０）、または酢酸ウラニル（ｐＨ４．０）によって染色（コントラスト化）した。
【００５８】
同じＮ９ＮＡの、モノクローナルＦａｂ（３２／３、ＮＣ３５およびＮＣ４１）との分子複合体および全モノクローナルＩｇＧｓ（３２／３、ＮＣ４１およびＮＣ１０）との分子複合体を画像化した、我々が以前に行なった広範な実験に基づいて、我々は、Ｎ９Ｎａ−ｓｃＦｖ複合体の画像を、４つの架橋ｓｃＦｖ二量体によって面と面で結合したノイラミニダーゼの頭部対の閉じた構造であり、この結合は緊密に充填された分子複合体が４重の点対称を維持するように行なわれていると解析することができた（図１５）。Ｎ９Ｎａ−ｓｃＦｖ分子複合体のこの画像解析は、溶液中で観察された複合体の分子量、Ｍr 610,000とまさに一致している。
【００５９】
ｓｃＦｖがノイラミニダーゼと複合体を形成している結晶のＸ線回折（図１４）では、二重の回転軸によって関係づけられる二つのｓｃＦｖ分子の間に緊密な会合ある事が実証された。二つの可能な二量体構造が考えられる。最初の例においては、ペプチド尾部を持つ単一のポリペプチド鎖によってコードされたＶHおよびＶLドメインが二官能性のｓｃＦｖを形成し、これが別のｓｃＦｖ分子と非共有結合的に会合する（図１７）。二番目の例では、各Ｆｖにおいて抗原結合表面（ＴＢＲ）を形成するＶHおよびＶLドメインが、非共有結合的に会合しており、該二つのＦｖはリンカーポリペプチドによって共有結合している（図１７）。
【００６０】
分子モデル作成研究（図１４）によって、非共有結合的に会合した二量体のＶHおよびＶLドメイン間の距離は少なくとも３５オングストロームであるのに対して、共有結合した二量体のＶHおよびＶLドメイン間の距離は２５オングストローム未満であろう事が示される。我々は、隣接するペプチド結合間の距離を３．８オングストロームとし、またリンカーが理論的に広がり得る距離を、残基が１５、１０、５および０のリンカーｐＰＯＷ／ｓｃＦｖ・ＮＣ１０構築物について夫々５４、３６、１８、および０オングストロームと仮定して、ｓｃＦｖタンパクが異なる長さのリンカーによって抗原と結合した場合に形成されるｓｃＦｖ−ＮＡ複合体のタイプを調査した。
【００６１】
リンカーの長さを短縮した一連のｓｃＦｖ・ＮＣ１０タンパクを作成した（図５）。最初のｐＰＯＷ−ｓｃＦｖ・ＮＣ１０構築物は、３つの５量体ユニットＧｌｙ４Ｓｅｒからなるポリペプチドリンカーを有している（このｐＰＯＷ−ｓｃＦｖＮＣ１０構築物は１５残基のリンカー、ＶH１５ＶLと称される）。これらの５量体ユニットの各々を順番に除去することによってリンカー欠損突然変異体を構築し、２、１および０ユニットを有する構築物（ＶH１０ＶL）ＶH５ＶL、ＶHＶLの残基リンカーｐＰＯＷ−ｓｃＦｖ・ＮＣ１０構築物と称す）が形成された。更に、ＶHドメインのカルボキシル末端が直接ＶLドメイン（ＶH−１３ＶL）に結合されるように、ＶLドメインの第一β鎖（最初の１３アミノ酸）を欠損させることによってｓｃＦｖ−ＮＣ１０構築物が作成された。
【００６２】
［リンカー長を短縮したｐＰＯＷ−ｓｃＦｖ−ＮＣ１０構築の詳細］
ｐＰＯＷ−ｓｃＦｖ−ＮＣ１０構築物は、ＢｓｔＥＩＩ（New England Biolabs社）およびＳａｃＩ（Pharmacia社）を用いて、製造業者の仕様書に従って連続的に消化され、ポリペプチドリンカーが除去された。制限酵素消化されたリンカーの無いｐＰＯＷ−ｓｃＦｖ・ＮＣ１０ＤＮＡを、0.8％アガロースゲルから電気泳動溶出し、0.3Ｍ酢酸ナトリウムおよび2.5倍体積量のエタノールを用いた沈殿によって濃縮した。合成オリゴヌクレオチドは、0.5単位のＴ４ポリヌクレオチドキナーゼ（Pharmacia社）、１ｍＭＡＴＰ、およびOne-Phor-Allバッファープラス（Pharmacia社）中において３７℃で３０分間インキュベートすることにより、５´末端がリン酸化された。一対の相補的なリン酸化オリゴヌクレオチド・プライマー（図６）を予め等モル比で混合して、長さが変化した単鎖リンカーをコードするＤＮＡ二重体を形成した。これらの二重体を、アマーシャム社のライゲーションキット（Amersham ligation kit）を用いて、ＢｓｔＥＩＩ−ＳａｃＩで制限分解されたｐＰＯＷ−ｓｃＦｖ・ＮＣ１０プラスミド中に連結した。ＶH−１３ＶL構築物を作成するには、若干異なったアプローチが必要とされた。欠損ＶLドメインに亘って広がるオリゴヌクレオチドプライマー（図６）を構築し、これをＦＬＡＧ特異的なオリゴヌクレオチドプライマー（図６）と組合せて合わせて使用し、ＰＣＲによってｓｃＦｖ・ＮＣ１０のＶH−１３ＶLフラグメントを増幅した。この増幅物をＢｓｔＥＩＩおよびＥｃｏＲＩで消化し、同様に消化されたｐＰＯＷ−ｓｃＦｖ・ＮＣ１０プラスミド中に、アマーシャム社製のライゲーションキット（Amersham ligation kit）を使用して連結した。この連結混合物を、等体積量のフェノール／クロロフォルムで抽出精製し、0.3Ｍ酢酸ナトリウムおよび2.5倍体積量のエタノール中で沈殿させた。この連結ＤＮＡを20mlのＨ2Ｏ中に再懸濁し、そのサンプル５ｍｌを大腸菌ＤＨ５ａ（ｓｕｐＥ４４，ｈｓｄＲ１７、ｒｅｃＡ１，ｅｎｄＡ１，ｇｒｙＡ９６，ｔｈｉ−１，ｒｅｌＡ１）およびＬＥ３９２（ｓｕｐＥ４４、ｓｕｐＦ５８，ｈｓｄＲ１４、ｌａｃＹ１，ｇａｌＫ２，ｇａｌＴ２２、ｍｅｔＢ１，ｔｒｐＲ５５）中に形質転換した。細胞を１ｍｌのＬＢ培地中で１時間振盪し、100mg/mlのアンンピシリンを含む２ｘＹＴ培地にプレートした。ｐＰＯＷベクターのＰｅｌＢリーダー配列およびＦＬＡＧ配列に向けられたオリゴヌクレオチドを用いたＰＣＲスクリーニングによって、組換クローンを同定した。短縮されたリンカー領域のＤＮＡ配列は、二本鎖ＤＮＡをシーケナーゼ（Seauenase）２．０（United States Biochemical社）を用いた配列決定によって確認された。
【００６３】
［短縮リンカーを有するｓｃＦｖ・ＮＣ１０タンパクのタンパク発現］
形質転換されたＬＥ３９２を、30℃のＳＢ培地で一晩増殖させ、１：１０に希釈して、新しいＳＢ培地に接種した。培養物を30℃で振盪しながら、600nmでの吸光度（Ａ600）が約４になるまで増殖させた。誘導期間（Ａ600が７になるまで４時間続く）の残りの時間については、温度を42℃まで上昇させた。細胞を遠心分離機（Beckman ＪＡ１０、6,000rpm 15分）から回収し、上澄液分画を除去した。細胞ペレットを、元の体積の10％で、20％シュークロース、10mM Tris・HCl，pH7.5中に再懸濁し、氷上に５分放置した。ＥＤＴＡを５ｍＭの最終容積にまで添加し、該混合物を更に１０分間だけ氷上でインキュベートし、前記のようにして遠心分離し、細胞をペレット化した。上澄液を捨て、細胞ペレットを水中に再懸濁し、該混合物を再度遠心分離し、ペリプラズミックタンパクを含んでいる上澄液を除去した。こうして得られた細胞ペレットを水中に再懸濁し、超音波（大規模調製では30のバーストを６回、小規模調製では30秒のバースチを１回）により溶解させ、氷上に５分放置した。遠心分離の後、水相は溶解細胞室分画として回収され、またペレットは不溶性膜結合分画を含んでいた。ｓｃＦｖ・ＮＣ１０の発現を確認するために、個々のクローンからの全細胞溶解物を還元状態下でのＳＤＳ−ＰＡＧＥ、並びに抗ＦＬＡＧモノクローナル抗体Ｍ２（図７）を用いたウエスタンブロッテイングによって分析した。２８、２９、３１及び３２ｋＤａで移動する単一の陽性バンドが観察された（図７、レーン１３−１６）。これらの分子量は、ｐＰＯＷ−ｓｃＦｖ・ＮＣ１０構築物を残基数０、５、１０および１５のリンカーと夫々組合せて合成されたｓｃＦｖ・ＮＣ１０−ＦＬＡＧ融合タンパクの予想分子量と相関していた。残基数０、５および１０のリンカーを有するｓｃＦｖ・ＮＣ１０タンパクは、１５残基のリンカーを有するタンパクと同じ特徴を示した。ｓｃＦｖ・ＮＣ１０−ＦＬＡＧ融合タンパクは大腸菌の不溶解膜に結合しており、その約半分は、塩酸グアニジニウムで処理にすることによって可溶化することができた。
【００６４】
この可溶性生成物は、ゲル濾過、並びにMono−Ｑ上または尾部に対して特異的な抗体を含む親和性マトリックス上でのクロマトグラフィーによって精製された。該精製物については、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥ−ＨＰＬＣ）、超遠心分離分析、親抗原（インフルエンザ・ノイラミダーゼ）に対する結合活性、抗原と本剤との間に形成された複合体の電子顕微鏡観察によって特徴付けが行なわれた。架橋実験によって、該生産物の大きさ確認された。
【００６５】
その特性を図８に要約して示した。
【００６６】
実施例２ ［マウス及びヒトｓｃＣＤ８の構築］
（Ｇｌｙ4Ｓｅｒ）3リンカーをコードする追加のヌクレオチドを有するＶ様ドメイン（配列認識番号１）に対して相同性のプライマー（入手可能なデータベース配列を用いた）及び用い、ベントポリメラーゼ（Vent polymerase）でのＰＣＲによって、マウスＣＤ８のＶ様ドメインのみを含むα鎖およびβ鎖を別々に増幅した。二つの別々のドメインをアニールした後、ｄＮＴＰｓおよびポリメラーゼを用いて該生成物を伸長させた。
【００６７】
ｓｃＣＤ８遺伝子は、３´末端にＭｓｃＩ部位および５´末端にＳａ１Ｉ部位を含む新しいプライマーを用いて増幅された。この単鎖生成物はＭｓｃＩおよびＳａ１Ｉで消化され、次いでＭｓｃＩおよびＳａ１Ｉで消化したｐＰＯＷベクター中にクローン化された。大腸菌ホスト細胞株であるｐｏｐ2136中において、高レベルのタンパク合成が得られた。正しく開裂した生成物の合成を増大させるために、Ｎ末端の修飾がデザインされた。これは、マウスＣＤ８α鎖のＮ末端残基をリジンからセリンに変えることによって達成された（ヒトＣＤ８のＮ末端残基はセリンである）。大腸菌ホスト細胞株ｐｏｐ2136（全細胞溶解物を示している）を用いたｐＰＯＷ中のｓｃＣＤ８の合成は、図１０に見ることができる。合成されたｓｃＣＤ８生成物は、コンホメーション的に正しい形のタンパクのみを認識する抗ＣＤ８抗体によって検出された。
【００６８】
［ヒト・ｓｃＣＤ８］
成熟α鎖タンパクのＶ様ドメインをコードするＤＮＡが、Ｔａｑポリメラーゼと、（Ｇｌｙ4Ｓｅｒ）3リンカーをコードする追加のヌクレオチドを有し且つ制限酵素部位ＭｓｃＩおよびＢａｍＨＩを含むＶ様ドメイン（配列認識番号２）に対して相同性のプライマー（入手可能なデータベース配列を用いた）とを用いたＰＣＲによって増幅された。ＣＤ８β鎖のＶ様ドメインは、血液から単離されたＤＮＡから、ＢａｍＨＩおよびＥｃｏＲＩ制限酵素部位を含むプライマーを用いたＰＣＲによって直接増幅された。二つの個々の生成物は適切な酵素で消化され、次いでＭｓｃＩおよびＥｃｏＲＩで消化したｐＰＯＷベクター中に連結された。
【００６９】
各単鎖ＣＤ８構築物のＤＮＡ配列は、二本鎖ＤＮＡの配列決定によって確認された。このヌクレオチド配列は、配列認識番号１及び２に示されている。この例において、該ベクターは、診断用途および結合用途（アフィニティー精製を含む）のためのＣ末端ペプチド尾部を有するｓｃＣＤ８の合成を指令する。ｓｃＣＤ８生成物の生物学的活性をモニターする好ましい技術には下記のものが含まれる。
【００７０】
（ａ）例えばバイオセンサ技術を用いたタンパクの結合親和性の直接の測定、或いは、全細胞またはβ２ミクログロブリン若しくはＭＨＣクラスＩ分子のα３ドメインのような細胞表面分子もしくはそのフラグメントに対する結合を用いた超遠心分離。
【００７１】
（ｂ）Ｃ末端ペプチド尾部を診断マーカーに用いた、ＲＭＡ−Ｓ細胞内で発現されたＭＨＣクラスＩ分子（ペプチド付加された）に対する結合試験。
【００７２】
（ｃ）例えば、Ｔ細胞の活性化の際のＩＬ２産生に対するペプチド依存性効果の変化をモニターするような機能阻害試験。
【００７３】
実施例３ ［リンカーを含まない抗グリコホリン１Ｃ３の構築］
親ＩＣ３抗体およびｓｃＦｖ誘導体は、国際出願番号第PCT/AU93/00228号に開示されている。
【００７４】
オリゴヌクレオチドＮ2034(5′-ACGTAGGTCACCGTCGCCTCCGACATCGTCATGTCACAGTCTCCATCCTCC-3′)は、何等の介在リンカーも含まずに１Ｃ３ＶL５´配列の最初の30塩基に結合した、１Ｃ３ＶHの３´末端の最後の15塩基に対して相補性を有するように合成された。
【００７５】
オリゴヌクレオチドＮ2035(5′-TTTATAATCTGCGGCCGCCCGATTAATTTC-3′)は、３´末端近傍のＮｏｔＩ部位の周囲にある、反対鎖上の１Ｃ３ＶL配列に対して相補性を有するように合成された。
【００７６】
この二つのオリゴヌクレオチドは、ＢｓｔＥIIおよびＮＯｔＩ制限エンドヌクレアーゼ部位に隣接する５´−ＶLに並列された３´−ＶH配列の１Ｃ３生成物を製造するために、１Ｃ３鋳型ＤＮＡと共にポリメラーゼ連鎖反応に用いられた。
【００７７】
制限エンドヌクレアーゼ部位ＢｓｔＥIIおよびＮｏｔＩを有するＰＣＲ生成物をインキュベートした後、得られたフラグメントは、予めＢｓｔＥIIおよびＮｏｔＩで消化して介在配列を除去した、１Ｃ３・ｓｃＦｖ配列を含むベクターｐＨＦＡと連結された。この連結生成物は、大腸菌株ＴＧ１を形質転換するために用いられた。挿入物を含む形質転換体コロニーは、配列認識番号４に示したＤＮＡ配列を含むことが確認された。
【００７８】
この遺伝子構築物は、非抑制大腸菌株に導入され且つＩＰＴＧで誘導されたときに、このベクターまたは関連ベクター類中で発現され、また１Ｃ３コーディング領域を熱誘導性発現ベクターｐＰＯＷに導入することによって発現された。
【００７９】
実施例４ ［大腸菌の変異株を用いた突然変異］
組換え抗ノイラミニダーゼ抗体ＮＣ１０・ｓｃＦｖの発現をコードするＮＣ１０・ｓｃＦｖプラスミドを、電気穿孔法により大腸菌ｍｕｔＤに導入した。突然変異体は、サンプルを図１１に示す突然変異サイクルに供することによって製造された。これらは、ＹＴ＋ＡＭＰ＋ＴＥＴ中において、指数相で50世代だけ増殖され（プラスミドＤＮＡの突然変異を誘発するため）、次いでヘルパーファージを用いて救出された。救出されたファージは、予め10μｇ／mlの抗原をコーティングした免疫チューブに掛けられ、ＰＢＳ等で洗浄して非結合ファージを除去し、特異的に結合したファージを100mMトリエチルアミンで溶出し、0.5容積の1M Tris−ヒロロキシメチルメチルアミン−ＨＣｌ pH7.5中に回収し、次いで標準法によってｍｕｔＤ細胞中にトランスフェクトした（特に断らない限り、ここで言及する全ての標準法はSambrook etal.，1990の「分子クローニング-Ａ実験室マニュアル」に記載されている）。また、細胞を対数相増殖に維持しながら、再度50世代の増殖を行なった。適切な回数の突然変異選別ラウンド（この実施例では３回）を実施した後のファージ力価は、１０7〜１０8ファージ／mlである。最終パンニング工程の後、溶出されたファージは大腸菌ＴＧ１細胞中にトランスフェクトされ、ＹＴ＋ＡＭＰ＋グルコースのプレートに撒かれ、単離された各コロニーはファージ救出に先立って増殖され、「ｆｌｕ」ウイルスまたはグリコホリン上でのＥＬＩＳＡによって分析された。ＥＬＩＳＡ活性のレベルで非野生型を発現したコロニーは、次いで増幅され、ＤＮＡ配列が決定され、また可溶性の発現のために、該ファージはアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクションから入手可能な大腸菌HB2151中にトランスフェクトされた。このファージは標準法によってHB2151にトランスフェクトされ、夫々のファージサンプルの選別された個々のコロニーは、ＹＴ＋ＡＭＰ（100μｇ／ml）中で増殖され、次いで１mMのＩＰＴＧ（イソプロピルチオガラクトシド）を用いて37℃で４〜16時間誘導され、引き続き４℃で16時間任意にインキュベートされた。この培養上清および周辺細胞質抽出物、細胞膜および細胞質を回収し、上記のようにして組換え遺伝子の発現について分析した（Power el al., Gene
1992, 113 95-99）。
【００８０】
実施例５
国際出願番号第PCT/AU93/00228に号記載されているようにして調製したファジミドｐＨＦＡ中の組換え１Ｃ３・ｓｃＦｖ（グリコホリン結合性抗体コーディング領域）を、実施例４に記載したようにしてｍｕｔＤ大腸菌内でのランダム突然変異に供し、また選別プロトコールを同様に適用した。但し、この選別には固相マトリックス（ＥＬＩＳＡプレート、免疫チューブまてはラテックスビーズ）をグリコホリンＡのＰＢＳ溶液（10μｇ／ml）でコーティングすることが含まれている。個々のクローンを選別するためのＥＬＩＳＡスクリーニングの結果は、図１２に示されている。抗ＦＬＡＧ抗体での検出を用いた競合ＥＬＩＳＡ試験が、突然変異後の選別されたコロニーに対して行なわれた。表１は、発現されたタンパクの、抗原（アシアログリコホリン）に対する相対的な親和性が増大したことを示している。
【表１】
【００８１】
実施例６
ファジミドベクターｐＨＥＮ中のｓｃＦｖライブラリー（メディカルリサーチ・カウンセル社、Ｕ．Ｋ．）を大腸菌のｍｕｔＴ株にトランスフェクトし、また突然変異ならびに修飾された結合能力でのｓｃＦｖの検出および選別のために、実施例４または５のように処理された。グリコホリンバインダについて選別する。入手可能なグリコホリン結合性抗体の範囲を増やすために、突然変異およびファージ表現ライブラリーのアフィニティー選別の出発点として、本来のｓｃＦｖライブラリーが用いられた。本来のｓｃＦｖファージ表現ライブラリーから選別された二つの独特な抗グリコホリンｓｃＦｖは、その後に突然変異されることが示されたそのＶｋ４鎖の領域について示される推定アミノ酸配列を有しており、これは表２に示される。
【表２】
【００８２】
これら夫々の分子のアフィニティー成熟は、図１１に示したように、突然変異（ｍｕｔＤ５）アフィニティー選別サイクルを用いることによって達成された。突然変異分子のサブセットにもたらされる変化を表３に示す。
【表３】
【００８３】
実施例７ Ｄ．ディスコイデウム中での抗体フラグメントコーディング領域の発現は、親ベクターｐ569（ドイツ国ミュンヘンのマックスプランク研究所のW.Nellen氏からの贈与）および以下に記載するＶHコーディング領域から構築された、ベクターＡＶ１によるものである。ベクターｐ569は図１３に示されている。これは、α−Ｌフコシダーゼプロモータ及び細胞表面に発現された「リガンド結合性ペプチド」の分泌のためのシグナル配列を用いた大腸菌Ｄ．ディスコイデウム・シャトルベクターの一つのファミリーである。表４は、抗ＦＬＡＧ抗体（Ｍ２）によって検出された、インフルエンザＮＣ４１ＶHＦＬＡＧの発現のイムノドットブロットの結果を示している。
【００８４】
モノクローナル抗体ＮＣ４１のＶHコーディング配列が、下記のオリゴヌクレオチド配列を用いたポリメラーゼ連鎖反応によって増幅された。
【００８５】
Ｎ８４９ 5′CCTTGCCTGCAGGTCGACCTATGGACAGGTGCAGCTGCAGCAG 3′ Ｎ８６３
【化１】
【００８６】
Ｎ８４９は、α−Ｌ−フコシダーゼシグナル配列、開裂部位ならびに発現ベクターｐ５６９へのクローニングに適したＳａｌＩ制限部位と共に、ＮＣ４１ＶHコーディング領域のＮ末端に対して相補的な配列を含んでいる。
【００８７】
Ｎ８６３は、トランスメンブラン疎水性配列、クローニングのためのＮｃｏＩ制限部位および翻訳停止コドンと共に、ＮＣ４１ＶHのＦＬＡＧコーディング配列に対して相補的な配列を含んでいる。
【００８８】
ベクターｐＡＶ５６９（ドイツ国マルチンスライドのマックスプランク研究所のW．Nellen氏からの贈与）のＤＮＡを制限酵索ＮｃｏＩおよびＳａｌＩで消化し、切断されたベクターを、アガロース電気泳動およびフェノール抽出の標準技術によって精製した。
【００８９】
ＰＣＲで増幅され、制限酵素で消化されたＮＣ４１ＶH・ＦＬＡＧをベクター中に連結し、この混合物を大腸菌に形質転換した。組換え体コロニーをアンピシリン含有ＹＴプレート上で選別し、組換えプラスミドを回収し、標準技術を用いて精製および同定した。この組換えプラスミドは、ｐＡＶ１と称する。
【００９０】
組換えプラスミドｐＡＶ１を、Friendlender and MellaによってＧＢ-2159821に開示された摂食法（feeding method）を用いることによって、Ｄ．ディスコイデムの休止細胞中に形質転換した。
【００９１】
組換え体Ｄ．ディスコイデムを、ＤＭＢ培地上において、10μｇ／mlの抗生物質Ｇ４１８を用いて選別した。組換え体Ｄ．ディスコイデム・アモエバエ（D．Discoideum amoebae）を、10μｇ／mlのＧ４１８を含むＤＭＢ培地の２ml培養で増殖させた。22℃で48時間の増殖の後、培養上清の100μｌアリコートについてドットブロット分析を行ない、抗ＦＬＡＧ抗体を用いて、培養中のＮＣ１０ＶH・ＦＬＡＧ抗体フラグメントの存在を検出した。その結果を表４に示す。
【表４】
【００９２】
実施例８ Ｄ．ディスコイデウム内の発現のための、１Ｃ３Ｆａｂを含む組換えベクターの構築。親ベクター（ｐ５６９）の構造は図１３に示されており、該ベクターは、制限消化によるＢａｍＨＩ／ＢｇｌIIフラグメントの除去および再連結によって修飾され、下記のプライマーおよび鋳型としての１Ｃ３Ｆａｂを用いたＰＣＲで構築された抗体コーディング領域をクローニングするための、独特のＸｂａＩおよびＳｓｐＩ部位が残された。
【化２】
【００９３】
このＦａｂは、グリコホリン並びに抗ＦＬＡＧおよび抗ＥＥＦ抗体についての結合活性（ＴＢＲｓ）を組合せているから、多官能性ポリペプチドである。ＰＣＲ生成物の制限消化に続いて、大腸菌における構築のために、標準的な精製、連結および形質転換プロトコールが行なわれた。Ｄ．ディスコイデウムの形質転換は、摂食形質転換された大腸菌によって（ＧＢ-2159821A参照）、或いはリン酸カルシウム結晶法（Nellen et al.，Mol．Cell．Biol.，1984，4，2890-2898）もしくは電気穿孔法（Howard et al.，1988，16，2613-2623）のような文献に発表された当業者に公知の標準法により、Ｇ418（ゲネチシン（geneticin））上での選別を伴なって行なわれる。
【００９４】
本発明の一般的な範囲が、上記で詳細に述べた特定の実施例に限定されないことは明瞭に理解されるであろう。
【００９５】
配列確認番号１
ファイル： B：＼P0WLY23V.配列
説明： FLAG尾部を有するMscl-Sal1に連結されたJLApelB Ly-2+Ly-3 Vド メイン
塩基番号： １〜８４９
全塩基数： ８４９
【化３】
【００９６】
配列確認番号２
ファイル： B：＼CD8ACD8B.配列
説明： pPOW（pelB CD8aおよびCD8b V dom）中のヒト単鎖CD8
塩基番号： １〜８２２
全塩基数： ８２２
【化４】
【００９７】
配列確認番号３
ファイル： B：＼MHCA3.配列
説明： pPOW pelB Msc-EcoRI（FLAGなし）中のMHCI a3 H-2Kドメイン
塩基番号： １〜３７１
全塩基数： ３７１
【化５】
【００９８】
配列確認番号４
pHFA中に構築されたリンカー無しの1C3
pHFA中のHind III部位から遺伝子３配列の開始まで
【化６】
【００９９】
配列確認番号５
【化７】
【０１００】
配列確認番号６
ファイル： A：＼1C3FAB.配列
説明： 1C3 Fab中の抗グリコホリン
塩基番号： １〜１４４３
全塩基数： １４４３
【化８】
【図面の簡単な説明】
【０１０１】
【図１】図１は、抗体およびそのフラグメントの構造を例示している。
【０１０２】
（ａ）これは、二つの同じ重鎖および二つの同じ軽鎖からなり、重鎖および軽鎖の夫々が可変ドメイン（Ｖ）と定常ドメイン（Ｃ）とに分かれている、典型的なＩｇＧ抗体のポリペプチド鎖構造を示している。全体のＩｇＧ分子は、Ｆｖ領域の末端に二つの同一の抗原結合表面を有しており、これら抗原結合表面はＶH鎖およびＶL鎖の対合によって形成される。このＶHおよびＶLの組合せによって、相補性決定領域（ＣＤＲｓ）と称する６個のループが分子の先端に提供され、これらループは抗原結合表面を提供することによって、その標的抗原に対する抗体の結合特異性を与える。
【０１０３】
（ｂ）Ｆａｂ抗体フラグメントは、一つの軽鎖および一つの重鎖の一部を含んでいる。
【０１０４】
（ｃ）ＦａｂフラグメントおよびＦｖフラグメントの両者は、何れも親抗体と同じ抗原結合表面を有していると思われる。
【図２】図２は、繊維状Ｆｄバクテリオファージの表面に、該ファージ先端の副次的コートタンパク（遺伝子IIIタンパク）に対する共有結合的な融合によって、或いは主要な遺伝子VIIIコートタンパクとの融合として表現された、Ｆａｂ分子およびｓｃＦｖ分子のような抗体フラグメントを示している。Ｆａｂ分子の表現については、一方の鎖（重鎖又は軽鎖）のみがファージのコートタンパクにアンカーされ、他方の鎖は可溶形でホスト細胞の周辺細胞質中に可溶性の形で与えられる。遺伝子IIIタンパク上での融合によってホスト細胞への感染性が低下しているが、このＦｄバクテリオファージは未だ生存可能である。
【図３】図３は、重鎖領域および軽鎖可変領域のプール（ライブラリー）が、一方の鎖をファージの遺伝子IIIタンパクまたは遺伝子VIIIタンパクに融合させて、Ｆｄファージ表現ベクター中に構築される方法を示している。この表現ベクターはホスト細胞中にトランスフェクトされて、二重組合せライブラリーを生成する。夫々のホスト細胞は、抗体フラグメントがファージ表面に表現される生存可能なＦｄファージを製造し、また抗体をコードする遺伝子はウイルスゲノムと共にパッケージされる。ファージのアフィニティー精製は標的抗原に対する親和性に基づいており、抗体をコードする遺伝子の生存ファージからの同時回収を可能にする。ファジミド表現ベクターは形質転換収率を改善することができるが、生存可能な子孫を組み立てるためのヘルパーファージを必要とする。別のストラテジーには階層的ライブラリーの構築が含まれるが、ここでは一定に維持された一方の鎖が第二の鎖のライブラリーと共に表現され、親和性の最も高い対合鎖が選別される。別の表現ベクター上の遺伝子プールを用いてより複雑なライブラリーを構築することができ、次いで該ライブラリーはホスト細胞に交差トランスフェクトされる。遺伝子の回収は、この二つのベクターの相対的なパッキング効率に依存するであろう。
【図４】図４は、ファジミドベクターＨＦＡの構造を示している。該ベクターは、大腸菌（E.coli）の抑制株において、Ｆｄファージ表面の遺伝子IIIタンパクと融合されたクローン化抗体を発現する能力を有する一方、非抑制株においては、該クローン化抗体遺伝子は可溶性生成物として発現される。ｌａｃＺプロモータは、ＩＰＴＧでの発現の誘導を可能とし、またＦＬＡＧ（抗体との融合体として発現される）は合成の検出およびアフィニティー精製のために用いられる。
【図５】図５は、一連のｓｃＦＶ・ＮＣ１０欠損リンカー構築物と、ポリペプチドリンカーによって連結される理論的な最小距離（オングストローム）とを示している。
【図６】図６は、適切に制限分解されたｐＰＯＷ−ｓｃＦＶ・ＮＣ１０の中に挿入された、長さが異なるポリペプチドリンカーをコードする合成オリゴヌクレオチド二重鎖のＤＮＡ配列を示している。
【図７】図７は、ＶH・１５・ＶL、ＶH・１０・ＶL・ＶH・５・ＶLおよびＶH・ＶLから合成されたｓｃＦＶ・ＮＣ１０タンパクの分析を示している。図の写真は、クーマシーゲル（上部パネル）上での非誘導型（レーン１〜４）および誘導型（レーン５〜８）の分析結果と、抗ＦＬＡＧ、Ｍ２抗体（ＩＢＩ社、New Heven、ＣＴ）でプローブされ、続いて第二抗体としてのヤギ抗マウス抗体・西洋ワサビパーオキシダーセ複合体（シグマ社）で処理され、更に増強化学発光（アマーシャム社）によって検出された該クーマシーゲルのウエスタンブロットの分析結果（レーン９〜１６下部パネル）である。
【図８】図８は、観察されたｓｃＦＶ・ＮＣ１０の会合度と、その標的抗原に対する活性の要約である。
【図９ａ】図９は、抗体Ｆｖフラグメントと、ＣＤ８α鎖ヘテロ二量体との間の構造の同一性を示している。
【０１０５】
（ａ）これは、１〜６の番号を付したＣＤＲループおよび構造的に保存されたフレームワーク領域（リボン）を示す、ＶHまたはＶL分子のリボン図である。
【図９ｂ】図９は、抗体Ｆｖフラグメントと、ＣＤ８α鎖ヘテロ二量体との間の構造の同一性を示している。
【０１０６】
（ｂ）これは、二つのＣＤ８α鎖のリボン図である。抗体ＣＤＲループに対応する領域は分子の頂部に示され、番号が付されている。
【０１０７】
このホモ二量体は、紙面に垂直位置する分子対軸をもって配向されている。分子の頂面からのＣＶＲ様ループが示されており、ＣＤＲ１様ループ、ＣＤＲ２様ループおよびＣＤＲ３様ループには、一方のサブユニットについては夫々１，２および３の番号を付し、他方のサブユニットについては夫々１´，２´および３´の番号を付してある。Ｃ末端は分子の底部から延出している。二量体界面を形成するループは、ＣＤＲ３様ループ（頂部）およびＣ−Ｃ´ループ（底部）である。
【図１０】図１０は、ｐＰＯＷを用いて大腸菌ホスト細胞ｐｏｐ2136中で合成されたｓｃＣＤ８の、全細胞様怪物を示すクーマシーで染色したＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルを示している。矢印は、融合および成熟（開裂したシグナル配列）ｓｃＣＤ８の位置を示している。この図において、 レーン１：ｐＰＯＷ−ｓｃＣＤ８を含む非誘導細胞 レーン２：ｐＰＯＷ−ｓｃＣＤ８の４時間の後インキュベーション レーン３：ｐＰＯＷ−Ｌｙｓ→Ｓｅｒ・ｓｃＣＤ８を含む非誘導細胞 レーン４：ｐＰＯＷ−Ｌｙｓ→Ｓｅｒ・ｓｃＣＤ８の４ 時間の後インキュベーション レーン５：前染色された分子量マーカーである。
【図１１】図１１は、個々の抗体遺伝子がアフィニティー成熟され得るスキームを示している。個々の遺伝子はファージ表現ライブラリーから選別され、次いで数ラウンドのイン・ビボ突然変異またはイン・ビトロ突然変異を受ける。アフィニティー成熟した抗体フラグメントは、次いで、更なる突然変異ラウンドまたは高レベル遺伝子発現に先立って、抗原に結合する能力について選別される。全体の抗体ライブラリーは、パンニングまたはアフィニティー選別による個々のファージの選別に先立って、突然変異ラウンドを繰り返すことにより、その複合度を増大させることができる。
【図１２】図１２は、アフィニティー突然変異のための突然変異を受けたコロニーの、ＥＬＩＳＡスクリーニングの結果を示している。
【図１３】図１３は、ｐ５６９ベクター（W．Nellen氏からの供与）、即ち、Ｄ．ディスコイデウム（D．discoideum）内での発現のためのシャトルベクターの一例を示している。このベクターは、アルファＬフコシダーゼプロモータ配列、シグナル配列、マルチクローニング部位、翻訳ターミネータおよびＧ418による選別のためのトランスポゾンＴｎ903を有している。
【図１４】図１４は、Ｘ線回折分析によって３オングストロームの解像度で解析された、二つのインフルエンザノイラミニダーゼ・サブユニットと複合されたＮＣ１０・ｓｃＦｖフラグメントのポリペプチド骨格として描かれた三次元構造を示している。この図では、重鎖可変領域および軽鎖可変領域を連結しているリンカーポリペプチドは描かれていない。この結晶構造においては、二つのＦｖフラグメントが背面−背面で会合して、二つの異なるノイラミニダーゼサブユニットを二量体化している。このｓｃＦｖフラグメントの状況において、該二量体Ｆｖ分子は二官能性試薬とみなされる。
【図１５】図１５は、溶液中において電子顕微鏡によって解析された、四つのＮＣ１０・ｓｃＦｖ二量体によって一緒に結合された二つのノイラミニダーゼ四量体のモデルを示している。
【図１６】図１６は、背面−背面で二量体化され、立体障害なしに密接に会合された二官能性Ｆｖ分子のモデルを示している。このモデルにおいて、重鎖のＣ末端は、残りのポリペプチド骨格の最小限の再構成を伴なって、軽鎖可変領域の -13残基に直接に連結され得る。
【図１７】図１７は、非共有結合的および共有結合的に夫々連結されたｓｃＦｖ二量体を模式的に示している。
【０１０８】
配列認識番号１は、バクテリアでの発現のためにデザインされたマウスＬｙ−２+ Ｌｙ−３Ｖドメインの一例を示している。
【０１０９】
配列認識番号２は、ｐＰＯＷのようなバクテリア分泌型べクター中での発現のためにデザインされた、ヒト単鎖ＣＤ８構築物の一例を示している。
【０１１０】
配列認識番号３は、発現のためにデザインされたマウスＭＨＣａ３ドメインの一例を示している。
【０１１１】
配列認識番号４は、ｐＨＦＡにおけるリンカーを含まない１Ｃ３・ｓｃＦｖのＤＮＡ配列を示している。
【０１１２】
配列認識番号５は、ｐｅｌＢ分泌シグナルおよびＦＬＡＧ・Ｃ末端ペプチドを伴なった、抗インフルエンザＮＣ１０・ｓｃＦｖのＤＮＡ配列を示している。
【０１１３】
配列認識番号６は、ＰＣＲ増幅後のｐ569への連結のために準備されたｐＨＦＡにおける抗グリコホリン１Ｃ３Ｆａｂの最初の1443塩基のＤＮＡ配列を示している。
【発明の開示】
【０００１】
[発明の技術分野]
本発明は、ハプテンおよび抗原に対する結合活性もしくは特異性を向上または改良した、新規ポリペプチドの構築、応用および製造に関する。
【０００２】
本発明はまた、表面提示抗原成分ライブラリーまたはハプテン結合成分ライブラリーの発現から誘導される抗体様の組換分子の構築、改良および選別、並びにこれらの分子の使用に関する。
【０００３】
本発明のポリペプチドは、製薬産業およびヘルスケア産業における診断、治療、予診または予防の分野での有用性を有し、並びに化学物質の検出および分析におけるより一般的な用途での有用性を有している。
【０００４】
[発明の背景]
抗体は、標的抗原またはハプテンに対する結合親和性をもったタンパク分子である。結合性相互作用の特異性によって、抗体は診断薬および治療用試薬として使用される。モノクローナル抗体はハイブリドーマ細胞のような純粋細胞系から誘導される。しかし、ハイブリドーマ技術は費用が高く、維持に時間を要し、また範囲が限定されている。全範囲の抗原に対して、モノクローナル抗体（適切な親和性をもった極めて少ない抗体）を生産することは不可能である。抗体遺伝子またはそのフラグメントはクローン化することができ、また大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）内で生物学的に機能する形態で発現させることができる。
【０００５】
抗体および抗体フラグメントはまた、バクテリア細胞または哺乳類細胞の何れかを用いた組換ＤＮＡ技術によって製造することができる。抗体のＦａｂ領域には、二つの重鎖および軽鎖の組合せによって、分子の先端に６つの可変表面ループが与えられる。これらの外部ドメイン（Ｆｖ）に存在するループは相補性決定領域（ＣＤＲｓ）と呼称され、その標的抗原に対する抗体結合特異性を与える。この結合作用は抗体分子の可変ドメインに局在しており、該ドメインは重鎖および軽鎖の両方のアミノ末端に位置している。これは図１に示されている。幾つかの抗体における可変領域は、本来の抗体分子からタンパク加水分解によって切断された後でさえも、非共有結合的に会合した状態（ＶHＶLダイマー、Ｆｖ領域と称する）で残り、その抗原認識能および結合能の大半を保持している。定常領域が実質的に存在しない二本鎖Ｆｖを製造する方法は、米国特許第4,642,334号に開示されている。
【０００６】
組換Ｆｖ断片は解離し易い。従って、幾人かの研究者等は２つのドメインを共有結合させて、ｓｃＦｖと称する構築物を形成することを選択した。該ｓｃＦｖにおいては、結合ドメインを有する２つのペプチド（通常は抗体の重鎖可変領域および軽鎖可変領域）が、抗原結合ドメインの相対的位置関係が元の抗体で見られる位置関係と一致するように、一方のドメインのＣ末端を他方のＮ末端に結びつけるリンカーペプチドによって結合されている（図１参照）。
【０００７】
米国特許第4,946,778および同第5,132,405号には、共有結合的に結合されたＦｖ断片の製造方法が開示されている。更に、二官能性試薬（bifunctional agents）および多官能性試薬（multifunctional agents）の製造によって、異種混合（heterogeneity）が達成される（ヒューストン等の米国特許第5,091,513号およびランダー等による米国特許第4,816,397号）。
【０００８】
ｓｃＦｖライブラリーの構築は、例えば欧州特許出願第239400号および米国特許第4,946,778号に開示されている。しかし、ｓｃＦｖをのコードする単一のＤＮＡ分子のクローニングに内在する問題のために、単鎖Ｆｖライブラリーは大きさに制限をうける。ＶHまたはＦabライブラリーのような非ｓｃＦｖライブラリーも公知であり（Ladner及びGutermanWO90/02809）あり、これは表面発現用のファージ系と共に使用される（Ladner et al.， W088/06630及びBonnert et al,，WO92/01047）。
【０００９】
抗体治療に使用する場合、モノクローナル抗体（通常はマウス由来）はヒトに投与すると抗原性反応を引き起こすので、先ず「ヒト化」されない限りは使用が制限される。抗体の可変ドメインは、抗原結合部位を形成する６つの超可変領域（ＣＤＲｓ）を有するβシート構造のフレームワークからなっている。ヒト化は、結合親和性を与えるマウスの配列、特にＣＤＲループ配列を、ヒト可変ドメイン構造内に置換することからなっている。従って、該マウスのＣＤＲループ領域は所望の抗原に対する結合親和性を与える。ＣＤＲｓの移植による組換抗体のヒト化は、Winter et al（EP-239400）に開示されている。
【００１０】
発現／組合せシステムを用いて多様な組換ヒト抗体を発現させることが、Marks el al，J．Mol．Biol．1991 222，581-597に記載されている。繊維状ファージの表面にペプチドおよびタンパクを発現させる方法における最近の新事実（McCafferty et al，Nature 1991 348 552； Clackson et al，J．Mol．Biol.， 1991 352 624-28）は、診断および治療法としてこれら試薬を選択し、改良し及び開発する能力を提供している。マウスおよびヒトの両方に起源をもつクローン化された重鎖および軽鎖遺伝子の発現、提示および対合を行なうための改良されたバクテリオファージゲノムを使用することが、Hoogenboom et al．Nucl．Acids．Res., 19 4133-4137；Marks et al．1991 op．cit．及びBonnert et al，WPI Acc．No．92-056862/07に記載されている。
【００１１】
受容体分子（その発現は、該受容体をコードする遺伝子ライブラリーが発現生物体中で発現した結果である）もまた、同じ方法で表現され得る（Lerner and Scorge，WO90/14430）。細胞表面タンパクと融合した単鎖抗体ドメインの細胞表面での発現については、Ladner et al WO/06630に開示されている。
【００１２】
親和性の成熟は、抗体の結合特異性、親和性または結合活性が改変される過程である。様々な実験技術が工夫されており、抗体フラグメントの全体またはＣＤＲｓ等の選択された領域の何れかに、種々の突然変異ストラテジーを適用することによって、多様なアミノ酸配列が創造される。酵素の特異的活性を変化させる突然変異についても報告されている。当業者は、ランダム突然変異または部位指向性突然変異を達成するため、並びに所望の修飾を施された分子を選択するための、種々の方法を知るであろう。所謂「チェインシャッフリング（chain shuffling）」技術、即ち、固定された相補的鎖（例えば軽鎖）について一つの鎖タイプ（例えば重鎖）のライブラリーの再組合せを行なうことによって、多様性を高め且つ特異的な抗体を選択する機構については、Kang et al Proc．Natl．Acad．Sci．USA，1991 88 4363-466；Hoogenboom et al，Nucl．Acid Res., 1991 19 4133-4137; Marks etal，Bio/Technology，1992 10 779-783に記載されている。
【００１３】
抗体のＶドメイン、フレームワークまたは定常領域の何れかの部分のマウス配列に対して、ヒトが反応する問題を克服するために、末梢血リンパ球を含む種々のヒト組織から、組換ヒト抗体遺伝子ライブラリーを構築することができる（WinterおよびMilstein Nature，1991 349 293）。ヒト成人は既に抗原性刺激を受けているので、広範囲の抗原を認識する予め免疫感作された成人Ｂ細胞集団の能力は、生来のＢ細胞集団と比較して減少し、また抗体のｍＲＮＡ分子の制限された集団に反映される。
【００１４】
従って、できる限り広い抗原結合能を得るために選択される組織の一つは胎児末梢血でありる。この退治末梢血は生れた状態のままであり、ＩｇＭ抗体分子の比率が大人の血液りも高い（約７０％；なおＩｇＧは３０％）。従って、種々様々な抗原を結合で
きるように広範な成熟（進化）を予定した抗体ライブラリーを構築するための、
理想的な遺伝子材料の供給源を提供する。
【００１５】
[発明の概要]
従って、本発明の範囲内には下記の事項が含まれる。
【００１６】
１）標的に対して結合する新規な組換えポリペプチドの同定および構築。
【００１７】
２）このようなポリペプチド剤を、例えばそのＤＮＡコード領域の突然変異を
含む機構によって改変し、その性能を変えること。
【００１８】
３）更に、サブコンポーネントの再組合わせにより、遺伝子レベルまたはタン
パクレベルの何れかにおいて、これらのポリペプチド剤を変化させること。
【００１９】
第一の側面に従えば、本発明は、標的結合性の組換えポリペプチドであって、
ａ）安定なコアポリペプチド領域（ＳＣＲ）と、
ｂ）少なくとも一つの標的結合領域（ＴＢＲ）
とを具備し、
前記標的結合領域は、標的に対する特異性、親和性または結合活性を改変する
ために、任意に成熟プロセスを経ているポリペプチドを提供する。
【００２０】
我々は、結合の特異性、親和性または結合活性が改変された本発明によるポリ
ペプチドを、成熟工程の実施を必要とすることなく、設計および構築することができた。こえは、例えば免疫グロブリン（Ｉｇ）およびＣＤ８を用いて行なわれた。
【００２１】
我々は、ＴＢＲがＳＣＲに共有結合している一価の標的結合性ポリペプチドの構築を開示する。該ＳＣＲは、好ましくは、Ｉｇスーパーファミリーの共有結合した二つのＩｇ様ドメイン（例えば抗体可変部ドメインまたはＣＤ８ドメイン）
の結合によって形成される。
【００２２】
我々はまた、分離しまたは重複したＴＢＲｓをＳＣＲ上に形成することによって、多官能の標的結合性ポリペプチドが如何にして製造され得るかを示す。我々はまた、ＩｇスーパーファミリーのメンバーのＩｇ様ドメインをＳＣＲｓとして構築することができ、また非共有結合的に結合して二官能性および多官能性性の標的結合性ポリペプチドを製造できることを示した。我々は、Ｉｇ様ドメインに共有結合することができ、それにより自己会合して好ましくは二官能性または多官能性の特異性を有する安定なダイマー、集合体またはアレイを形成するアミノ酸配列を、如何にしてデザインするかを開示する 標的結合性領域は標的分子に結合することができ、該標的分子は何れのタイプの化学物質でもよい。例えば、該標的は殺虫剤または薬物等の小分子、ステロイド等のホルモン、アミノ酸、ペプチドまたはポリペプチド；細菌性、ウイルス性、または細胞表面抗原等の抗原；抗体またはＩｇスーパーファミリーの他のメンバー；腫瘍マーカー、増殖因子等であり得る。当業者は、容易に種々様々な目的の標的を選択することができるであろう。
【００２３】
本発明のポリペプチドが、イン・ビトロでの診断目的に使用される場合、コアポリペプチド領域は、適切なタンパクなら何でも良い。しかし、本発明のポリペプチドをイン・ビボ使用することを意図する場合には、該コアポリペプチド領域は非抗原性であることが好ましい。従って、血清中に存在し或いは細胞表面に出現する、一般に耐性のあるタイプの通常のヒトタンパクなら何れも適するであろう。通常の細胞表面タンパクの一定のドメインは可溶型で産生され、また本発明の方法によって、その親和性を向上または改変することができる。Ｔ細胞表面タンパクを本来の標的とするヒトタンパクの場合、その可溶性フラグメントは、特に移植に有用な有望な免疫調節治療試剤になる。これらフラグメントの多くは、イムノグロブリンのスーパーファミリーのタンパクとの相同性を有するであろう。
【００２４】
本発明の特に好ましい態様においては、標的は、グリコホリン（glycophorin）または他の赤血球細胞表面タンパク、インフルエンザウイルス・ノイラミニダーゼ；Ｂ型肝炎抗原、ＨＩＶのｇｐ４０タンパク等のウイルス抗原；腫瘍マーカー、ＣＤ２８およびＣＤ４等の細胞表面タンパク：腫瘍増殖因子α（ＴＧＦ−α）、白血病阻害因子（ＬＩＦ）からなる群より選択される。診断および治療の何れの応用においても、標的結合領域が二以上の特異性をもっていれば特に有用である。標的結合ポリペプチドが、二以上の標的との親和性をもっていることが特に好ましい。この親和性は、表面を分離し又は重複させて、二官能性または多官能性試薬を形成することによって提供される。二作用性または多作用性の試薬もまた、任意にリンカ−ポリペプチドを使用して、個々の標的結合性ポリペプチドを共有結合または非共有結合させることによって作成されと思われる。
【００２５】
第二の側面において、本発明は、上記の標的結合性ポリペプチドをコードするＤＮＡ構築物を提供する。
【００２６】
第三の側面において、本発明は、本発明の標的結合性ポリペプチドをコードするＤＮＡ構築物を製造する方法であって、標的結合性ポリペプチドをコードするＤＮＡを、突然変異および選別からなる１以上のサイクルに供して、親和性、特異性または結合活性の特徴が改変された標的結合性ポリペプチドをコードするＤＮＡ分子のサブ集団を得ることを具備した方法を提供する。
【００２７】
好ましくは、標的結合性ポリペプチドをコードするＤＮＡは、複製能力のある要素または表現ベクター（display vector）、即ち、適切なホスト中で自己複製するベクターの中に存在することが好ましい。該表現ベクターは、好ましくはバクテリオファージ、Ｆｄ等の繊維状バクテリオファージ、ウイルス、細菌、酵母、粘菌、または哺乳類動物細胞からなる群から選択される。
【００２８】
突然変異誘発は、ランダムまたは部位指向的の何れであってもよく、当業者はこの工程を行なうために適した多くの方法を知ってであろう。標的結合性ポリペプチドの一以上の標的結合領域が、突然変異に供される。
【００２９】
本発明に用いられる好ましい突然変異系では、ｍｕｔＤおよびｍｕｔＴ１と命名されたされた大腸菌の特殊な突然変異株を利用する（R．Fowler el al，J．Bacteriol.，1986 167130）。これら特別の突然変異株はファージでトランスフェクトでき、本発明の目的に特に有用である。
【００３０】
好ましい態様において、上記の標的結合性ポリペプチドを製造する方法は、 ａ）一以上の所望の標的結合性ポリペプチドのフレームワーク構造をコードするＤＮＡを、ポリメラーゼチェイン反応によって単離する工程と、 ｂ）標的結合性ポリペプチドの一以上の標的結合領域に突然変異を誘発するために、該ＤＮＡを任意に突然変異誘発に供する工程と、 ｃ）該ＤＮＡを、一以上の表現ベクターに挿入する工程と、 ｄ）所望の特異性、結合活性または親和性をもった標的結合性ポリペプチドを表現する表現ベクターのサブ集団を選別する工程と、 ｅ）該選別されたサブ集団を、親和性、特異性または結合活性の特徴が改変された標的結合性ポリペプチドを表現する表現ベクターのサブ集団を得るために、突然変異誘発および選別からなる１以上のサイクルに供する工程と、 ｆ）改変された標的結合性ポリペプチドをコードするＤＮＡを、高レベル発現ベクターに挿入する工程とを具備する。
【００３１】
表現ベクターのサブ集団の選択は、標的結合、蛍光活性化細胞選別、又はビオチン・アビジン若しくはビオチン・ストレプトアビジンシ系の利用等のような、種々の従来法よって達成される。特に好ましい方法は、免疫チューブ等の不溶性支持体上で行なう親和性選択である。これは特に簡便であることが分かった。
【００３２】
従って、本発明はまた、上記記載の高度の発現ベクターを適当な発現ホスト中に移入し、標的結合ポリペプチドを発現させ、こうして産生されたタンパクを単離することによって、標的結合性ポリペプチドを製造する方法をも提供することが理解されるであろう。
【００３３】
また、標的結合性領域および安定なコアポリペプチドは、同一分子の異なる領域であってもよく、または異なる分子から誘導されてもよいことが明瞭に理解されるであろう。
【００３４】
本発明によって観念される標的結合性ポリペプチド構築物のタイプには、改変された抗体または抗体フラグメント、連続的な際組合せを可能にする会合リンクを含んだｓｃＦｖフラグメント、改変ＣＤ８分子（例えば、単鎖ＣＤ８）、および抗体分子またはそのフラグメントとＣＤ８または免疫グロブリン・スーパーファミリーに関連する他の分子（ＭＨＣクラスＩおよびＩＩ分子のここのドメイン等）との組合せが含まれる。例えば、ＭＨＣクラスＩのα３ドメインはＣＤ８と結合し、従ってα３の可溶性バージョンは有力な免疫調節剤になる。ＣＤ８を利用する好ましい構築物には下記のものが含まれる。
【００３５】
ａ）αおよびβサブユニットのＶ様ドメインのみが連結されている単鎖分子。
【００３６】
ｂ）シグナルペプチドの電荷バランスを変更して、生物学的活性に悪影響を与えずにバクテリアでの発現を可能にするために、Ｎ末端アミノ酸をリジンからセリンに変えた分子。
【００３７】
標的結合性ポリペプチドは、共有結合したポリペプチド尾部を含むことができ、該尾部はＴＢＲｓであってもよく、或いは他のＴＢＲｓと非共有結合的に会合していてもよい。
【００３８】
以下の記載は、特にＩｇＧタイプの抗体およびそのフラグメントに関する幾つかの例に言及しているが、本発明は他のタイプ（ＩｇＭおよびＩｇＡ等）の抗体にも応用可能であることは明確に理解されるであろう。
【００３９】
標的結合性ポリペプチドをコードするＤＮＡ配列は、該ポリペプチドをバクテリアファージまたは細胞表面に表現できる何れのベクターにもクローン化できる。好ましいべクターはｐＨＦＡであり、その構築物は国際特許出願第ＰＣＴ／ＡＵ９３／００２２８に記載されていおり、その構造は図４に示されている。タンパクの発現に好ましい細菌ホストは、大腸菌（E．coli)およびバチルス・サブチルス（Bacillus subtilis）である。
【００４０】
以下の限定的でない実施例および図面を参照して、本発明を詳細に説明する。
【００４１】
本発明の好ましい態様には、次のものが含まれる。
【００４２】
１．標的結合性ポリペプチドの構造は、抗原に対する接触領域（従って特異性）を提供する表面ポリペプチドの６個のループによって一つのＴＢＲが形成されるような、ｓｃＦｖ分子に基づき得る。特に好ましい態様においては、抗原に接触して十分な接触面積および親和性を与えるために、ＴＢＲは４個のＣＤＲループによって形成され得る（図１４）。ＮＣ１０を用いた我々の結果は、これらポリペプチド配列をランダムに突然変異して標的親和性を修飾することが容易であることを示している。
【００４３】
２．二官能性または多官能性の抗体試薬は、個々の標的結合性ポリペプチドを共有結合的に連結することによって製造することができる。この共有結合的結合は、単鎖Ｆｖ分子の形のポリペプチド鎖によって提供され得る。二量体化または凝集し易い傾向をもった個々のタンパク、領域を結合することによって、特異性を組合せることができる。従って、例えば、追加のポリペプチド鎖によって、二つの単鎖Ｆｖフラグメントをその正常な向きで連結することは必要とされない。
【００４４】
これは、異なった特異性の重鎖と軽鎖、重鎖と重鎖、または軽鎖と軽鎖を連結し、次いで機能的な二量体または凝集体を形成することによって達成することができる。勿論、この方法はまた、必要な特異性をもったＶドメインを、ＣＤ８、Ｔ細胞受容体フラグメントまたはＭＨＣフラグメントから誘導された免疫グロブリン様ドメインと連結するためにも用いることができる。
【００４５】
好ましい態様において、抗体の重鎖可変領域および軽鎖可変領域のような二つのＩｇ様ドメインの共有結合的な連結は、リンカーポリペプチドを用いて、または用いること無く行なうことができる。単量体ｓｃＦｖフラグメントの場合、ポリペプチドリンカーは、ｓｃＦｖ結合部位の原形を損なうこと無く、一方の可変（Ｖ）ドメインのカルボキシ末端と他方のＶドメインのアミノ末端との間で、ＶHドメインおよびＶLドメインを共有結合的に連結する。ｓｃＦｖは、ＶH・リンカー・ＶL融合タンパクの、若しくはＶL・リンカー・ＶH融合タンパクの何れかのドメイン順序で組み立てられ得る。このリンカーは、疎水性のＶドメイン表面との会合を防止するために、好ましくは親水性でなければならない。リンカーは、経験的な選別によって確立された好ましい大きさをもった２５アミノ酸残基よりも小さい長さであり得る。好ましいリンカー配列は５量体ユニットのＧｌｙ４Ｓｅｒからなり、ここでセリン残基はペプチド骨格の親水性を高める一方、グリシン残基は、Ｖドメンの回りに或る範囲のコンホメーションを取るために十分な可撓性をリンカーに与える。特に好ましい態様において、ポリマーＦｖフラグメントの共有結合性の会合体は、連結配列において一つのＩｇドメインの切片を除去することによって、追加のリンカーポリペプチドなしで製造することができる。これらのリンカー無しの構築物は、ここでは緊密に結合されたドメイン（tightly coupled domains ；ＴＣＤｓ）と称する。除去すべきアミノ酸の数は経験的に、或いはタンパク設計理論を用いて決定することができる。図１６は、二つのＦｖ分子が背面−背面で会合したＴＣＤｓを描写しており、ここでは二つのＴＢＲｓが分子の反対端にあり、二つの標的分子に交差結合することができる二官能性試薬を形成している。この例においては、密接な会合を得るために、好ましくは１３アミノ酸までが除去される。得られた分子は、近接してはいるがＩｇ様ドメイン間の相互作用が立体的に阻害されないような形で、少なくとも二量体にまでオリゴマー化する傾向を有している。遊離のアミノ末端およびカルボキシ末端にポリペプチド尾部を付加することによって、分子上のＴＢＲｓの数を増加できると思われる。また、Ｉｇ様ドメインの結合部で除去された欠失ポリペプチド配列が、Ｉｇ様ドメインにおける他の位置に結合したポリペプチド配列を与えることによって、全体的または部分的に置換され得ることは明らかである。我々は、これら分子が二次元アレイを形成し、それによって二官能性表面を提供することができるであろうと予期してる。これらのアレイは、生物学的なコーティング手段としての特異的な用途を有するであろうと思われる。
【００４６】
ヘテロ二量体的なα鎖およびβ鎖を含む、成熟したヒト若しくはマウスＣＤ８の完全な三次元構造は未だ知られていない。ヘテロ二量体ヒトＣＤ８αの結晶構造からの予測は、α鎖がトポロジーにおいて抗体ＶL鎖と類似していることを示唆している（Leahy et al., Cell，1992，68，1145-1162）。我々は、バクテリア選別バクターを用いた発現のために、マウスＣＤ８α／βヘテロ二量体の単鎖変種を構築したが、ヒトＣＤ８を用いても同様の結果が期待され得る。本来のヒト若しくはマウスのＣＤ８分子は、ＭＨＣクラスＩの分子にのみ親和性を有すると思われる。我々は、実施例に記載したようなランダムライブラリーのアプローチによって、ｓｃＣＤ８分子を、標的結合性ポリペプチドを製造するための安定なフレームワークとして用いることが可能になるであろうことを予測した。この方法によって、ｓｃＣＤ８分子を疑似抗体として使用することができる。更に、このｓｃＣＤ８分子は、接触表面に６個未満のＣＤＲループのためのフレームワークを提供するために、大きさ及びＣＤＲと等価なループ構造を更に修飾することができる。特に好ましい態様において、我々は、接触領域に４個または５個のＣＤＲループを提供できる安定なタンパクフレームワークを企画している。我々はまた、他のＩｇドメインに適用するためのストラテジーを企画している。例えば、ＭＨＣクラスＩおよびIIの免疫グロブリン様ドメインを可溶性の形で発現させることができ、これを修飾すれば免疫調節剤として使用することができる。
【００４７】
４．標的結合性ポリペプチドに対する上記のような修飾は、図３に示したようなライブラリー選別および修飾ストラテジーを用いることによる、コーディング領域の突然変異に基づくことができる。この突然変異は、低親和性で且つ特異性の広い単鎖ＴＢＰまたはＴＢＰを成熟させ、それが認識する標的分子の範囲を高める。より重要なことは、ライブラリーの各メンバーについての結合親和性の範囲を作成し、その個々のＤＮＡコーディング領域が公知の方法論によって容易に選別され、単離され得ることである。このようなライブラリーは、抗体様フラグメントに対して親和性を示し、或いはリガンド、他のタンパク、酵素若しくは受容体に対して親和性を示す何れか別のペプチドを含むであろうことが想定される。また、それ自身は抗原性ではないが、組換えＤＮＡ技術によってコーディング領域を移植することにより、特定のリガンドに対する親和性をもったＣＤＲループまたはペプチドを付加することによって修飾され得る安定なコアポリペプチドをも含み得る。また、フレームワーク領域に対する変化によって、タンパクのコンホメーションの変化がもたらされ、親分子とは異なった結合特性をもった変化した結合表面が提示されることも見られる。
【００４８】
最も平凡な例には、所定の標的結合特性をもった組換え抗体フラグメント（単鎖Ｆｖフラグメントを含む）を製造する発現ライブラリーの構築が含まれる。図３に示した夫々の選別工程に引き続き、結合ドメイン（好ましい例ではＶHドメインおよびＶLドメインを含む）の継続的な再組合せを可能にする表現ベクターは、例えばｐＨＦＡのために適切に使用することができる。
【００４９】
５．本発明は、広範囲の受容体、受容体様分子、並びに結合活性、構造的一体性および生物学的活性の何れにとっても潜在的に重要な領域における突然変異を伴なって構築された分子を構築し、選別するために使用され得る。発現した後の初期のファージ表面での表現、および大腸菌からのファージ救出は、このアプローチの有効性をモニターするために用いられるが、真核細胞系のような他のシステムも発現能力を有している。酵母（サッカロマイセス・セレヴィシアエ）は、α交配因子プロモータの制御下において、ＮＣ４１のＶH、即ちインフルエンザウイルのスノイラミニダーゼに対するモノクローナル抗体を発現することが示されており、また粘菌のディクチオステリウム・ディスコイデウム（dictyostelium discoideum）はＮＣ１０のＶHおよびｓｃＦｖの両方を含む組換えタンパクを発現することができる。
【００５０】
６．特定の抗原（ＬＩＦ，ＴＧＦ−α、グリコホリン、細胞表面マーカーまたは他の細胞特異的表面タンパクが含まれ得る）に結合することができる標的結合性ポリペプチドの特異的な選別は、表現ベクター上での表現、例えば遺伝子III生成物に融合したこれらペプチドのファージ表面での表現の結果として可能になる。適切なファージを選択することによって、これらは次に、図５に示したように突然変異のラウンドに供される。
【００５１】
以下の実施例においては、分子の全体に亘ってランダムニ突然変異を誘発するために、大腸菌のｍｕｔＤおよびｍｕｔＴ１変異株が用いられる。これは、文献に見られる何れかの標準的な技術を用いることにより、これらの大腸菌株をプラスミドＤＮＡで形質転換することによって行なわれる。好ましい方法は電気穿孔法である。或いは、標準的なトランスフェクション法によって、組換えファージを変異株にトランスフェクトしてもよい。これらのプラスミド／ファージを含む大腸菌の増殖ランドを行なった後、ファージは、ヘルパーファージを用いた標準的な技術によって救出され得る。次いで、結合親和性に対する種々の突然変異の影響を測定するための、抗原結合試験に用いることができる。
【００５２】
これらの突然変異は、ＤＮＡにおける塩基置換を起こすことは確認されていないけれども、分子における結合領域の数、大きさおよび位置が変わるような、分子の構造に対するペプチドの付加も含まれ得る。これらの付加を伴なう単一のドメイン結合ユニットは、特異的でないとすれば、親和性が実質的に変化した結合特性を示すであろう。特定の部位における突然変異と結合親和性との間の相関は、治療的および診断的に有力な標的結合性ポリペプチドのための、新しいＣＤＲループおよびフレームワーク領域をデザインするために用いることができる。
【００５３】
本発明の範囲にはまた、「抗体遺伝子」の制御された発現に向かうプロセスの第一ステップの原因でとなる抗原または何らかのリガンドの直接の制御下での、組換え細胞からの組換えタンパクの発現も包含される。
【００５４】
７．二官能性または多官能性試薬は、上記のライブラリー技術を用いて選別することができる。標的結合性ポリペプチドは、ポリペプチド尾部を介しての結合によるアフィニティー選別のために表現され得る。二以上の異なった標的抗原もしくはハプテンに対する親和性に基づく選別は、同じ分子の異なった位置に二つの結合表面を有する単一の分子を選別するであろう。これらの結合表面は重なり得る。二官能性または多官能性の試薬を選別するためのライブラリーを構築するために、タンパク分子の二以上の表面に適用される部位特異的突然変異およびランダム突然変異のストラテジーが用いられ得る。単鎖Ｆｖまたは単鎖ＣＤ８の場合、突然変異のために好ましい領域は、ＣＤＲループと、ｓｃＦｖ分子の他端にある反対のカウンターパートであろう。Ｆａｂ分子の場合には、好ましい突然変異はＣＤＲループと、定常ドメインの他端にある反対のカウンターパートループにおけるものであろう。
【００５５】
外に特記しない限り、ここで言及される全ての標準法は、Sambrook et al., 1990の「分子クローニング-Ａ実験室マニュアル」に記載されている。
【００５６】
実施例１ ［異なる長さのポリペプチドリンカーを用いた 単鎖Ｆｖフラグメントとしての標的結合性ポ リペプチドの構築および発現］
ＮＣ１０（インフルエンザウイルスＮ９株上のノイラミニダーゼ（ＮＡ）分子を認識するモノクローナル抗体）の親ｓｃＦｖフラグメントをデザインし、構築し、大腸菌中で発現させた（配列認識番号５）。アミノ末端の分泌シグナルＰｅｌＢによって、合成タンパクは大腸菌のペリプラズムに導かれ、そこで不溶性膜フラクションと会合された。オクタペプチド（ＦＬＡＧ；ＩＢＩ ＵＳＡ）の尾部を、該ｓｃＦｖのカルボキシル末端に融合させ、引き続く精製工程を通して該ｓｃＦｖをモニターするために用いた。この試剤は二官能性であり、ノイラミニダーゼおよび抗ＦＬＡＧ抗体の両者に対して特異性を有する。
【００５７】
このｓｃＦｖ・ＮＣ１０タンパクは、大腸菌膜フラクションを塩酸グアニジニウムで溶解し、続いてカラムクロマトグラフィーにかけることによって精製された。精製されたｓｃＦｖ・ＮＣ１０のサイズ排除ＨＰＬＣによって、ｓｃＦｖフラグメントは単量体（２７ｋＤａ）および二量体（５４ｋＤａ）の大きさに対応する二つのピークを生じることが示された。更に、単量体型はＮ９ＮＡに結合して３２０ｋＤａの複合体を形成するのに対し、二量体型はＮ９ＮＡに結合して６４０ｋＤａの複合体を形成した。３２０ｋＤａの複合体は、単一のＮＡ分子に結合している４つのｓｃＦｖ分子から構成されるのに対し、６４０ｋＤａ複合体は、二つのＮＡ分子に結合している４つのｓｃＦｖ分子から構成される。電子顕微鏡によって、２つのノイラミニダーゼ四量体が、四つの二官能性ｓｃＦｖ二量体によって緊密に結合している事が確認された（図１５）。ＮＣ１０・ＭａｂのｓｃＦｖ構築物との間で複合を形成しているインフルエンザ・ノイラミニダーゼのアジサシＮ９（鳥類）株について、高解像度の電子顕微鏡観察を行なった。ここで、該分子複合体はホスホタングステン酸カリウム（potassium phopho-tungstate）（ｐＨ７．０）、または酢酸ウラニル（ｐＨ４．０）によって染色（コントラスト化）した。
【００５８】
同じＮ９ＮＡの、モノクローナルＦａｂ（３２／３、ＮＣ３５およびＮＣ４１）との分子複合体および全モノクローナルＩｇＧｓ（３２／３、ＮＣ４１およびＮＣ１０）との分子複合体を画像化した、我々が以前に行なった広範な実験に基づいて、我々は、Ｎ９Ｎａ−ｓｃＦｖ複合体の画像を、４つの架橋ｓｃＦｖ二量体によって面と面で結合したノイラミニダーゼの頭部対の閉じた構造であり、この結合は緊密に充填された分子複合体が４重の点対称を維持するように行なわれていると解析することができた（図１５）。Ｎ９Ｎａ−ｓｃＦｖ分子複合体のこの画像解析は、溶液中で観察された複合体の分子量、Ｍr 610,000とまさに一致している。
【００５９】
ｓｃＦｖがノイラミニダーゼと複合体を形成している結晶のＸ線回折（図１４）では、二重の回転軸によって関係づけられる二つのｓｃＦｖ分子の間に緊密な会合ある事が実証された。二つの可能な二量体構造が考えられる。最初の例においては、ペプチド尾部を持つ単一のポリペプチド鎖によってコードされたＶHおよびＶLドメインが二官能性のｓｃＦｖを形成し、これが別のｓｃＦｖ分子と非共有結合的に会合する（図１７）。二番目の例では、各Ｆｖにおいて抗原結合表面（ＴＢＲ）を形成するＶHおよびＶLドメインが、非共有結合的に会合しており、該二つのＦｖはリンカーポリペプチドによって共有結合している（図１７）。
【００６０】
分子モデル作成研究（図１４）によって、非共有結合的に会合した二量体のＶHおよびＶLドメイン間の距離は少なくとも３５オングストロームであるのに対して、共有結合した二量体のＶHおよびＶLドメイン間の距離は２５オングストローム未満であろう事が示される。我々は、隣接するペプチド結合間の距離を３．８オングストロームとし、またリンカーが理論的に広がり得る距離を、残基が１５、１０、５および０のリンカーｐＰＯＷ／ｓｃＦｖ・ＮＣ１０構築物について夫々５４、３６、１８、および０オングストロームと仮定して、ｓｃＦｖタンパクが異なる長さのリンカーによって抗原と結合した場合に形成されるｓｃＦｖ−ＮＡ複合体のタイプを調査した。
【００６１】
リンカーの長さを短縮した一連のｓｃＦｖ・ＮＣ１０タンパクを作成した（図５）。最初のｐＰＯＷ−ｓｃＦｖ・ＮＣ１０構築物は、３つの５量体ユニットＧｌｙ４Ｓｅｒからなるポリペプチドリンカーを有している（このｐＰＯＷ−ｓｃＦｖＮＣ１０構築物は１５残基のリンカー、ＶH１５ＶLと称される）。これらの５量体ユニットの各々を順番に除去することによってリンカー欠損突然変異体を構築し、２、１および０ユニットを有する構築物（ＶH１０ＶL）ＶH５ＶL、ＶHＶLの残基リンカーｐＰＯＷ−ｓｃＦｖ・ＮＣ１０構築物と称す）が形成された。更に、ＶHドメインのカルボキシル末端が直接ＶLドメイン（ＶH−１３ＶL）に結合されるように、ＶLドメインの第一β鎖（最初の１３アミノ酸）を欠損させることによってｓｃＦｖ−ＮＣ１０構築物が作成された。
【００６２】
［リンカー長を短縮したｐＰＯＷ−ｓｃＦｖ−ＮＣ１０構築の詳細］
ｐＰＯＷ−ｓｃＦｖ−ＮＣ１０構築物は、ＢｓｔＥＩＩ（New England Biolabs社）およびＳａｃＩ（Pharmacia社）を用いて、製造業者の仕様書に従って連続的に消化され、ポリペプチドリンカーが除去された。制限酵素消化されたリンカーの無いｐＰＯＷ−ｓｃＦｖ・ＮＣ１０ＤＮＡを、0.8％アガロースゲルから電気泳動溶出し、0.3Ｍ酢酸ナトリウムおよび2.5倍体積量のエタノールを用いた沈殿によって濃縮した。合成オリゴヌクレオチドは、0.5単位のＴ４ポリヌクレオチドキナーゼ（Pharmacia社）、１ｍＭＡＴＰ、およびOne-Phor-Allバッファープラス（Pharmacia社）中において３７℃で３０分間インキュベートすることにより、５´末端がリン酸化された。一対の相補的なリン酸化オリゴヌクレオチド・プライマー（図６）を予め等モル比で混合して、長さが変化した単鎖リンカーをコードするＤＮＡ二重体を形成した。これらの二重体を、アマーシャム社のライゲーションキット（Amersham ligation kit）を用いて、ＢｓｔＥＩＩ−ＳａｃＩで制限分解されたｐＰＯＷ−ｓｃＦｖ・ＮＣ１０プラスミド中に連結した。ＶH−１３ＶL構築物を作成するには、若干異なったアプローチが必要とされた。欠損ＶLドメインに亘って広がるオリゴヌクレオチドプライマー（図６）を構築し、これをＦＬＡＧ特異的なオリゴヌクレオチドプライマー（図６）と組合せて合わせて使用し、ＰＣＲによってｓｃＦｖ・ＮＣ１０のＶH−１３ＶLフラグメントを増幅した。この増幅物をＢｓｔＥＩＩおよびＥｃｏＲＩで消化し、同様に消化されたｐＰＯＷ−ｓｃＦｖ・ＮＣ１０プラスミド中に、アマーシャム社製のライゲーションキット（Amersham ligation kit）を使用して連結した。この連結混合物を、等体積量のフェノール／クロロフォルムで抽出精製し、0.3Ｍ酢酸ナトリウムおよび2.5倍体積量のエタノール中で沈殿させた。この連結ＤＮＡを20mlのＨ2Ｏ中に再懸濁し、そのサンプル５ｍｌを大腸菌ＤＨ５ａ（ｓｕｐＥ４４，ｈｓｄＲ１７、ｒｅｃＡ１，ｅｎｄＡ１，ｇｒｙＡ９６，ｔｈｉ−１，ｒｅｌＡ１）およびＬＥ３９２（ｓｕｐＥ４４、ｓｕｐＦ５８，ｈｓｄＲ１４、ｌａｃＹ１，ｇａｌＫ２，ｇａｌＴ２２、ｍｅｔＢ１，ｔｒｐＲ５５）中に形質転換した。細胞を１ｍｌのＬＢ培地中で１時間振盪し、100mg/mlのアンンピシリンを含む２ｘＹＴ培地にプレートした。ｐＰＯＷベクターのＰｅｌＢリーダー配列およびＦＬＡＧ配列に向けられたオリゴヌクレオチドを用いたＰＣＲスクリーニングによって、組換クローンを同定した。短縮されたリンカー領域のＤＮＡ配列は、二本鎖ＤＮＡをシーケナーゼ（Seauenase）２．０（United States Biochemical社）を用いた配列決定によって確認された。
【００６３】
［短縮リンカーを有するｓｃＦｖ・ＮＣ１０タンパクのタンパク発現］
形質転換されたＬＥ３９２を、30℃のＳＢ培地で一晩増殖させ、１：１０に希釈して、新しいＳＢ培地に接種した。培養物を30℃で振盪しながら、600nmでの吸光度（Ａ600）が約４になるまで増殖させた。誘導期間（Ａ600が７になるまで４時間続く）の残りの時間については、温度を42℃まで上昇させた。細胞を遠心分離機（Beckman ＪＡ１０、6,000rpm 15分）から回収し、上澄液分画を除去した。細胞ペレットを、元の体積の10％で、20％シュークロース、10mM Tris・HCl，pH7.5中に再懸濁し、氷上に５分放置した。ＥＤＴＡを５ｍＭの最終容積にまで添加し、該混合物を更に１０分間だけ氷上でインキュベートし、前記のようにして遠心分離し、細胞をペレット化した。上澄液を捨て、細胞ペレットを水中に再懸濁し、該混合物を再度遠心分離し、ペリプラズミックタンパクを含んでいる上澄液を除去した。こうして得られた細胞ペレットを水中に再懸濁し、超音波（大規模調製では30のバーストを６回、小規模調製では30秒のバースチを１回）により溶解させ、氷上に５分放置した。遠心分離の後、水相は溶解細胞室分画として回収され、またペレットは不溶性膜結合分画を含んでいた。ｓｃＦｖ・ＮＣ１０の発現を確認するために、個々のクローンからの全細胞溶解物を還元状態下でのＳＤＳ−ＰＡＧＥ、並びに抗ＦＬＡＧモノクローナル抗体Ｍ２（図７）を用いたウエスタンブロッテイングによって分析した。２８、２９、３１及び３２ｋＤａで移動する単一の陽性バンドが観察された（図７、レーン１３−１６）。これらの分子量は、ｐＰＯＷ−ｓｃＦｖ・ＮＣ１０構築物を残基数０、５、１０および１５のリンカーと夫々組合せて合成されたｓｃＦｖ・ＮＣ１０−ＦＬＡＧ融合タンパクの予想分子量と相関していた。残基数０、５および１０のリンカーを有するｓｃＦｖ・ＮＣ１０タンパクは、１５残基のリンカーを有するタンパクと同じ特徴を示した。ｓｃＦｖ・ＮＣ１０−ＦＬＡＧ融合タンパクは大腸菌の不溶解膜に結合しており、その約半分は、塩酸グアニジニウムで処理にすることによって可溶化することができた。
【００６４】
この可溶性生成物は、ゲル濾過、並びにMono−Ｑ上または尾部に対して特異的な抗体を含む親和性マトリックス上でのクロマトグラフィーによって精製された。該精製物については、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥ−ＨＰＬＣ）、超遠心分離分析、親抗原（インフルエンザ・ノイラミダーゼ）に対する結合活性、抗原と本剤との間に形成された複合体の電子顕微鏡観察によって特徴付けが行なわれた。架橋実験によって、該生産物の大きさ確認された。
【００６５】
その特性を図８に要約して示した。
【００６６】
実施例２ ［マウス及びヒトｓｃＣＤ８の構築］
（Ｇｌｙ4Ｓｅｒ）3リンカーをコードする追加のヌクレオチドを有するＶ様ドメイン（配列認識番号１）に対して相同性のプライマー（入手可能なデータベース配列を用いた）及び用い、ベントポリメラーゼ（Vent polymerase）でのＰＣＲによって、マウスＣＤ８のＶ様ドメインのみを含むα鎖およびβ鎖を別々に増幅した。二つの別々のドメインをアニールした後、ｄＮＴＰｓおよびポリメラーゼを用いて該生成物を伸長させた。
【００６７】
ｓｃＣＤ８遺伝子は、３´末端にＭｓｃＩ部位および５´末端にＳａ１Ｉ部位を含む新しいプライマーを用いて増幅された。この単鎖生成物はＭｓｃＩおよびＳａ１Ｉで消化され、次いでＭｓｃＩおよびＳａ１Ｉで消化したｐＰＯＷベクター中にクローン化された。大腸菌ホスト細胞株であるｐｏｐ2136中において、高レベルのタンパク合成が得られた。正しく開裂した生成物の合成を増大させるために、Ｎ末端の修飾がデザインされた。これは、マウスＣＤ８α鎖のＮ末端残基をリジンからセリンに変えることによって達成された（ヒトＣＤ８のＮ末端残基はセリンである）。大腸菌ホスト細胞株ｐｏｐ2136（全細胞溶解物を示している）を用いたｐＰＯＷ中のｓｃＣＤ８の合成は、図１０に見ることができる。合成されたｓｃＣＤ８生成物は、コンホメーション的に正しい形のタンパクのみを認識する抗ＣＤ８抗体によって検出された。
【００６８】
［ヒト・ｓｃＣＤ８］
成熟α鎖タンパクのＶ様ドメインをコードするＤＮＡが、Ｔａｑポリメラーゼと、（Ｇｌｙ4Ｓｅｒ）3リンカーをコードする追加のヌクレオチドを有し且つ制限酵素部位ＭｓｃＩおよびＢａｍＨＩを含むＶ様ドメイン（配列認識番号２）に対して相同性のプライマー（入手可能なデータベース配列を用いた）とを用いたＰＣＲによって増幅された。ＣＤ８β鎖のＶ様ドメインは、血液から単離されたＤＮＡから、ＢａｍＨＩおよびＥｃｏＲＩ制限酵素部位を含むプライマーを用いたＰＣＲによって直接増幅された。二つの個々の生成物は適切な酵素で消化され、次いでＭｓｃＩおよびＥｃｏＲＩで消化したｐＰＯＷベクター中に連結された。
【００６９】
各単鎖ＣＤ８構築物のＤＮＡ配列は、二本鎖ＤＮＡの配列決定によって確認された。このヌクレオチド配列は、配列認識番号１及び２に示されている。この例において、該ベクターは、診断用途および結合用途（アフィニティー精製を含む）のためのＣ末端ペプチド尾部を有するｓｃＣＤ８の合成を指令する。ｓｃＣＤ８生成物の生物学的活性をモニターする好ましい技術には下記のものが含まれる。
【００７０】
（ａ）例えばバイオセンサ技術を用いたタンパクの結合親和性の直接の測定、或いは、全細胞またはβ２ミクログロブリン若しくはＭＨＣクラスＩ分子のα３ドメインのような細胞表面分子もしくはそのフラグメントに対する結合を用いた超遠心分離。
【００７１】
（ｂ）Ｃ末端ペプチド尾部を診断マーカーに用いた、ＲＭＡ−Ｓ細胞内で発現されたＭＨＣクラスＩ分子（ペプチド付加された）に対する結合試験。
【００７２】
（ｃ）例えば、Ｔ細胞の活性化の際のＩＬ２産生に対するペプチド依存性効果の変化をモニターするような機能阻害試験。
【００７３】
実施例３ ［リンカーを含まない抗グリコホリン１Ｃ３の構築］
親ＩＣ３抗体およびｓｃＦｖ誘導体は、国際出願番号第PCT/AU93/00228号に開示されている。
【００７４】
オリゴヌクレオチドＮ2034(5′-ACGTAGGTCACCGTCGCCTCCGACATCGTCATGTCACAGTCTCCATCCTCC-3′)は、何等の介在リンカーも含まずに１Ｃ３ＶL５´配列の最初の30塩基に結合した、１Ｃ３ＶHの３´末端の最後の15塩基に対して相補性を有するように合成された。
【００７５】
オリゴヌクレオチドＮ2035(5′-TTTATAATCTGCGGCCGCCCGATTAATTTC-3′)は、３´末端近傍のＮｏｔＩ部位の周囲にある、反対鎖上の１Ｃ３ＶL配列に対して相補性を有するように合成された。
【００７６】
この二つのオリゴヌクレオチドは、ＢｓｔＥIIおよびＮＯｔＩ制限エンドヌクレアーゼ部位に隣接する５´−ＶLに並列された３´−ＶH配列の１Ｃ３生成物を製造するために、１Ｃ３鋳型ＤＮＡと共にポリメラーゼ連鎖反応に用いられた。
【００７７】
制限エンドヌクレアーゼ部位ＢｓｔＥIIおよびＮｏｔＩを有するＰＣＲ生成物をインキュベートした後、得られたフラグメントは、予めＢｓｔＥIIおよびＮｏｔＩで消化して介在配列を除去した、１Ｃ３・ｓｃＦｖ配列を含むベクターｐＨＦＡと連結された。この連結生成物は、大腸菌株ＴＧ１を形質転換するために用いられた。挿入物を含む形質転換体コロニーは、配列認識番号４に示したＤＮＡ配列を含むことが確認された。
【００７８】
この遺伝子構築物は、非抑制大腸菌株に導入され且つＩＰＴＧで誘導されたときに、このベクターまたは関連ベクター類中で発現され、また１Ｃ３コーディング領域を熱誘導性発現ベクターｐＰＯＷに導入することによって発現された。
【００７９】
実施例４ ［大腸菌の変異株を用いた突然変異］
組換え抗ノイラミニダーゼ抗体ＮＣ１０・ｓｃＦｖの発現をコードするＮＣ１０・ｓｃＦｖプラスミドを、電気穿孔法により大腸菌ｍｕｔＤに導入した。突然変異体は、サンプルを図１１に示す突然変異サイクルに供することによって製造された。これらは、ＹＴ＋ＡＭＰ＋ＴＥＴ中において、指数相で50世代だけ増殖され（プラスミドＤＮＡの突然変異を誘発するため）、次いでヘルパーファージを用いて救出された。救出されたファージは、予め10μｇ／mlの抗原をコーティングした免疫チューブに掛けられ、ＰＢＳ等で洗浄して非結合ファージを除去し、特異的に結合したファージを100mMトリエチルアミンで溶出し、0.5容積の1M Tris−ヒロロキシメチルメチルアミン−ＨＣｌ pH7.5中に回収し、次いで標準法によってｍｕｔＤ細胞中にトランスフェクトした（特に断らない限り、ここで言及する全ての標準法はSambrook etal.，1990の「分子クローニング-Ａ実験室マニュアル」に記載されている）。また、細胞を対数相増殖に維持しながら、再度50世代の増殖を行なった。適切な回数の突然変異選別ラウンド（この実施例では３回）を実施した後のファージ力価は、１０7〜１０8ファージ／mlである。最終パンニング工程の後、溶出されたファージは大腸菌ＴＧ１細胞中にトランスフェクトされ、ＹＴ＋ＡＭＰ＋グルコースのプレートに撒かれ、単離された各コロニーはファージ救出に先立って増殖され、「ｆｌｕ」ウイルスまたはグリコホリン上でのＥＬＩＳＡによって分析された。ＥＬＩＳＡ活性のレベルで非野生型を発現したコロニーは、次いで増幅され、ＤＮＡ配列が決定され、また可溶性の発現のために、該ファージはアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクションから入手可能な大腸菌HB2151中にトランスフェクトされた。このファージは標準法によってHB2151にトランスフェクトされ、夫々のファージサンプルの選別された個々のコロニーは、ＹＴ＋ＡＭＰ（100μｇ／ml）中で増殖され、次いで１mMのＩＰＴＧ（イソプロピルチオガラクトシド）を用いて37℃で４〜16時間誘導され、引き続き４℃で16時間任意にインキュベートされた。この培養上清および周辺細胞質抽出物、細胞膜および細胞質を回収し、上記のようにして組換え遺伝子の発現について分析した（Power el al., Gene
1992, 113 95-99）。
【００８０】
実施例５
国際出願番号第PCT/AU93/00228に号記載されているようにして調製したファジミドｐＨＦＡ中の組換え１Ｃ３・ｓｃＦｖ（グリコホリン結合性抗体コーディング領域）を、実施例４に記載したようにしてｍｕｔＤ大腸菌内でのランダム突然変異に供し、また選別プロトコールを同様に適用した。但し、この選別には固相マトリックス（ＥＬＩＳＡプレート、免疫チューブまてはラテックスビーズ）をグリコホリンＡのＰＢＳ溶液（10μｇ／ml）でコーティングすることが含まれている。個々のクローンを選別するためのＥＬＩＳＡスクリーニングの結果は、図１２に示されている。抗ＦＬＡＧ抗体での検出を用いた競合ＥＬＩＳＡ試験が、突然変異後の選別されたコロニーに対して行なわれた。表１は、発現されたタンパクの、抗原（アシアログリコホリン）に対する相対的な親和性が増大したことを示している。
【表１】
【００８１】
実施例６
ファジミドベクターｐＨＥＮ中のｓｃＦｖライブラリー（メディカルリサーチ・カウンセル社、Ｕ．Ｋ．）を大腸菌のｍｕｔＴ株にトランスフェクトし、また突然変異ならびに修飾された結合能力でのｓｃＦｖの検出および選別のために、実施例４または５のように処理された。グリコホリンバインダについて選別する。入手可能なグリコホリン結合性抗体の範囲を増やすために、突然変異およびファージ表現ライブラリーのアフィニティー選別の出発点として、本来のｓｃＦｖライブラリーが用いられた。本来のｓｃＦｖファージ表現ライブラリーから選別された二つの独特な抗グリコホリンｓｃＦｖは、その後に突然変異されることが示されたそのＶｋ４鎖の領域について示される推定アミノ酸配列を有しており、これは表２に示される。
【表２】
【００８２】
これら夫々の分子のアフィニティー成熟は、図１１に示したように、突然変異（ｍｕｔＤ５）アフィニティー選別サイクルを用いることによって達成された。突然変異分子のサブセットにもたらされる変化を表３に示す。
【表３】
【００８３】
実施例７ Ｄ．ディスコイデウム中での抗体フラグメントコーディング領域の発現は、親ベクターｐ569（ドイツ国ミュンヘンのマックスプランク研究所のW.Nellen氏からの贈与）および以下に記載するＶHコーディング領域から構築された、ベクターＡＶ１によるものである。ベクターｐ569は図１３に示されている。これは、α−Ｌフコシダーゼプロモータ及び細胞表面に発現された「リガンド結合性ペプチド」の分泌のためのシグナル配列を用いた大腸菌Ｄ．ディスコイデウム・シャトルベクターの一つのファミリーである。表４は、抗ＦＬＡＧ抗体（Ｍ２）によって検出された、インフルエンザＮＣ４１ＶHＦＬＡＧの発現のイムノドットブロットの結果を示している。
【００８４】
モノクローナル抗体ＮＣ４１のＶHコーディング配列が、下記のオリゴヌクレオチド配列を用いたポリメラーゼ連鎖反応によって増幅された。
【００８５】
Ｎ８４９ 5′CCTTGCCTGCAGGTCGACCTATGGACAGGTGCAGCTGCAGCAG 3′ Ｎ８６３
【化１】
【００８６】
Ｎ８４９は、α−Ｌ−フコシダーゼシグナル配列、開裂部位ならびに発現ベクターｐ５６９へのクローニングに適したＳａｌＩ制限部位と共に、ＮＣ４１ＶHコーディング領域のＮ末端に対して相補的な配列を含んでいる。
【００８７】
Ｎ８６３は、トランスメンブラン疎水性配列、クローニングのためのＮｃｏＩ制限部位および翻訳停止コドンと共に、ＮＣ４１ＶHのＦＬＡＧコーディング配列に対して相補的な配列を含んでいる。
【００８８】
ベクターｐＡＶ５６９（ドイツ国マルチンスライドのマックスプランク研究所のW．Nellen氏からの贈与）のＤＮＡを制限酵索ＮｃｏＩおよびＳａｌＩで消化し、切断されたベクターを、アガロース電気泳動およびフェノール抽出の標準技術によって精製した。
【００８９】
ＰＣＲで増幅され、制限酵素で消化されたＮＣ４１ＶH・ＦＬＡＧをベクター中に連結し、この混合物を大腸菌に形質転換した。組換え体コロニーをアンピシリン含有ＹＴプレート上で選別し、組換えプラスミドを回収し、標準技術を用いて精製および同定した。この組換えプラスミドは、ｐＡＶ１と称する。
【００９０】
組換えプラスミドｐＡＶ１を、Friendlender and MellaによってＧＢ-2159821に開示された摂食法（feeding method）を用いることによって、Ｄ．ディスコイデムの休止細胞中に形質転換した。
【００９１】
組換え体Ｄ．ディスコイデムを、ＤＭＢ培地上において、10μｇ／mlの抗生物質Ｇ４１８を用いて選別した。組換え体Ｄ．ディスコイデム・アモエバエ（D．Discoideum amoebae）を、10μｇ／mlのＧ４１８を含むＤＭＢ培地の２ml培養で増殖させた。22℃で48時間の増殖の後、培養上清の100μｌアリコートについてドットブロット分析を行ない、抗ＦＬＡＧ抗体を用いて、培養中のＮＣ１０ＶH・ＦＬＡＧ抗体フラグメントの存在を検出した。その結果を表４に示す。
【表４】
【００９２】
実施例８ Ｄ．ディスコイデウム内の発現のための、１Ｃ３Ｆａｂを含む組換えベクターの構築。親ベクター（ｐ５６９）の構造は図１３に示されており、該ベクターは、制限消化によるＢａｍＨＩ／ＢｇｌIIフラグメントの除去および再連結によって修飾され、下記のプライマーおよび鋳型としての１Ｃ３Ｆａｂを用いたＰＣＲで構築された抗体コーディング領域をクローニングするための、独特のＸｂａＩおよびＳｓｐＩ部位が残された。
【化２】
【００９３】
このＦａｂは、グリコホリン並びに抗ＦＬＡＧおよび抗ＥＥＦ抗体についての結合活性（ＴＢＲｓ）を組合せているから、多官能性ポリペプチドである。ＰＣＲ生成物の制限消化に続いて、大腸菌における構築のために、標準的な精製、連結および形質転換プロトコールが行なわれた。Ｄ．ディスコイデウムの形質転換は、摂食形質転換された大腸菌によって（ＧＢ-2159821A参照）、或いはリン酸カルシウム結晶法（Nellen et al.，Mol．Cell．Biol.，1984，4，2890-2898）もしくは電気穿孔法（Howard et al.，1988，16，2613-2623）のような文献に発表された当業者に公知の標準法により、Ｇ418（ゲネチシン（geneticin））上での選別を伴なって行なわれる。
【００９４】
本発明の一般的な範囲が、上記で詳細に述べた特定の実施例に限定されないことは明瞭に理解されるであろう。
【００９５】
配列確認番号１
ファイル： B：＼P0WLY23V.配列
説明： FLAG尾部を有するMscl-Sal1に連結されたJLApelB Ly-2+Ly-3 Vド メイン
塩基番号： １〜８４９
全塩基数： ８４９
【化３】
【００９６】
配列確認番号２
ファイル： B：＼CD8ACD8B.配列
説明： pPOW（pelB CD8aおよびCD8b V dom）中のヒト単鎖CD8
塩基番号： １〜８２２
全塩基数： ８２２
【化４】
【００９７】
配列確認番号３
ファイル： B：＼MHCA3.配列
説明： pPOW pelB Msc-EcoRI（FLAGなし）中のMHCI a3 H-2Kドメイン
塩基番号： １〜３７１
全塩基数： ３７１
【化５】
【００９８】
配列確認番号４
pHFA中に構築されたリンカー無しの1C3
pHFA中のHind III部位から遺伝子３配列の開始まで
【化６】
【００９９】
配列確認番号５
【化７】
【０１００】
配列確認番号６
ファイル： A：＼1C3FAB.配列
説明： 1C3 Fab中の抗グリコホリン
塩基番号： １〜１４４３
全塩基数： １４４３
【化８】
【図面の簡単な説明】
【０１０１】
【図１】図１は、抗体およびそのフラグメントの構造を例示している。
【０１０２】
（ａ）これは、二つの同じ重鎖および二つの同じ軽鎖からなり、重鎖および軽鎖の夫々が可変ドメイン（Ｖ）と定常ドメイン（Ｃ）とに分かれている、典型的なＩｇＧ抗体のポリペプチド鎖構造を示している。全体のＩｇＧ分子は、Ｆｖ領域の末端に二つの同一の抗原結合表面を有しており、これら抗原結合表面はＶH鎖およびＶL鎖の対合によって形成される。このＶHおよびＶLの組合せによって、相補性決定領域（ＣＤＲｓ）と称する６個のループが分子の先端に提供され、これらループは抗原結合表面を提供することによって、その標的抗原に対する抗体の結合特異性を与える。
【０１０３】
（ｂ）Ｆａｂ抗体フラグメントは、一つの軽鎖および一つの重鎖の一部を含んでいる。
【０１０４】
（ｃ）ＦａｂフラグメントおよびＦｖフラグメントの両者は、何れも親抗体と同じ抗原結合表面を有していると思われる。
【図２】図２は、繊維状Ｆｄバクテリオファージの表面に、該ファージ先端の副次的コートタンパク（遺伝子IIIタンパク）に対する共有結合的な融合によって、或いは主要な遺伝子VIIIコートタンパクとの融合として表現された、Ｆａｂ分子およびｓｃＦｖ分子のような抗体フラグメントを示している。Ｆａｂ分子の表現については、一方の鎖（重鎖又は軽鎖）のみがファージのコートタンパクにアンカーされ、他方の鎖は可溶形でホスト細胞の周辺細胞質中に可溶性の形で与えられる。遺伝子IIIタンパク上での融合によってホスト細胞への感染性が低下しているが、このＦｄバクテリオファージは未だ生存可能である。
【図３】図３は、重鎖領域および軽鎖可変領域のプール（ライブラリー）が、一方の鎖をファージの遺伝子IIIタンパクまたは遺伝子VIIIタンパクに融合させて、Ｆｄファージ表現ベクター中に構築される方法を示している。この表現ベクターはホスト細胞中にトランスフェクトされて、二重組合せライブラリーを生成する。夫々のホスト細胞は、抗体フラグメントがファージ表面に表現される生存可能なＦｄファージを製造し、また抗体をコードする遺伝子はウイルスゲノムと共にパッケージされる。ファージのアフィニティー精製は標的抗原に対する親和性に基づいており、抗体をコードする遺伝子の生存ファージからの同時回収を可能にする。ファジミド表現ベクターは形質転換収率を改善することができるが、生存可能な子孫を組み立てるためのヘルパーファージを必要とする。別のストラテジーには階層的ライブラリーの構築が含まれるが、ここでは一定に維持された一方の鎖が第二の鎖のライブラリーと共に表現され、親和性の最も高い対合鎖が選別される。別の表現ベクター上の遺伝子プールを用いてより複雑なライブラリーを構築することができ、次いで該ライブラリーはホスト細胞に交差トランスフェクトされる。遺伝子の回収は、この二つのベクターの相対的なパッキング効率に依存するであろう。
【図４】図４は、ファジミドベクターＨＦＡの構造を示している。該ベクターは、大腸菌（E.coli）の抑制株において、Ｆｄファージ表面の遺伝子IIIタンパクと融合されたクローン化抗体を発現する能力を有する一方、非抑制株においては、該クローン化抗体遺伝子は可溶性生成物として発現される。ｌａｃＺプロモータは、ＩＰＴＧでの発現の誘導を可能とし、またＦＬＡＧ（抗体との融合体として発現される）は合成の検出およびアフィニティー精製のために用いられる。
【図５】図５は、一連のｓｃＦＶ・ＮＣ１０欠損リンカー構築物と、ポリペプチドリンカーによって連結される理論的な最小距離（オングストローム）とを示している。
【図６】図６は、適切に制限分解されたｐＰＯＷ−ｓｃＦＶ・ＮＣ１０の中に挿入された、長さが異なるポリペプチドリンカーをコードする合成オリゴヌクレオチド二重鎖のＤＮＡ配列を示している。
【図７】図７は、ＶH・１５・ＶL、ＶH・１０・ＶL・ＶH・５・ＶLおよびＶH・ＶLから合成されたｓｃＦＶ・ＮＣ１０タンパクの分析を示している。図の写真は、クーマシーゲル（上部パネル）上での非誘導型（レーン１〜４）および誘導型（レーン５〜８）の分析結果と、抗ＦＬＡＧ、Ｍ２抗体（ＩＢＩ社、New Heven、ＣＴ）でプローブされ、続いて第二抗体としてのヤギ抗マウス抗体・西洋ワサビパーオキシダーセ複合体（シグマ社）で処理され、更に増強化学発光（アマーシャム社）によって検出された該クーマシーゲルのウエスタンブロットの分析結果（レーン９〜１６下部パネル）である。
【図８】図８は、観察されたｓｃＦＶ・ＮＣ１０の会合度と、その標的抗原に対する活性の要約である。
【図９ａ】図９は、抗体Ｆｖフラグメントと、ＣＤ８α鎖ヘテロ二量体との間の構造の同一性を示している。
【０１０５】
（ａ）これは、１〜６の番号を付したＣＤＲループおよび構造的に保存されたフレームワーク領域（リボン）を示す、ＶHまたはＶL分子のリボン図である。
【図９ｂ】図９は、抗体Ｆｖフラグメントと、ＣＤ８α鎖ヘテロ二量体との間の構造の同一性を示している。
【０１０６】
（ｂ）これは、二つのＣＤ８α鎖のリボン図である。抗体ＣＤＲループに対応する領域は分子の頂部に示され、番号が付されている。
【０１０７】
このホモ二量体は、紙面に垂直位置する分子対軸をもって配向されている。分子の頂面からのＣＶＲ様ループが示されており、ＣＤＲ１様ループ、ＣＤＲ２様ループおよびＣＤＲ３様ループには、一方のサブユニットについては夫々１，２および３の番号を付し、他方のサブユニットについては夫々１´，２´および３´の番号を付してある。Ｃ末端は分子の底部から延出している。二量体界面を形成するループは、ＣＤＲ３様ループ（頂部）およびＣ−Ｃ´ループ（底部）である。
【図１０】図１０は、ｐＰＯＷを用いて大腸菌ホスト細胞ｐｏｐ2136中で合成されたｓｃＣＤ８の、全細胞様怪物を示すクーマシーで染色したＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルを示している。矢印は、融合および成熟（開裂したシグナル配列）ｓｃＣＤ８の位置を示している。この図において、 レーン１：ｐＰＯＷ−ｓｃＣＤ８を含む非誘導細胞 レーン２：ｐＰＯＷ−ｓｃＣＤ８の４時間の後インキュベーション レーン３：ｐＰＯＷ−Ｌｙｓ→Ｓｅｒ・ｓｃＣＤ８を含む非誘導細胞 レーン４：ｐＰＯＷ−Ｌｙｓ→Ｓｅｒ・ｓｃＣＤ８の４ 時間の後インキュベーション レーン５：前染色された分子量マーカーである。
【図１１】図１１は、個々の抗体遺伝子がアフィニティー成熟され得るスキームを示している。個々の遺伝子はファージ表現ライブラリーから選別され、次いで数ラウンドのイン・ビボ突然変異またはイン・ビトロ突然変異を受ける。アフィニティー成熟した抗体フラグメントは、次いで、更なる突然変異ラウンドまたは高レベル遺伝子発現に先立って、抗原に結合する能力について選別される。全体の抗体ライブラリーは、パンニングまたはアフィニティー選別による個々のファージの選別に先立って、突然変異ラウンドを繰り返すことにより、その複合度を増大させることができる。
【図１２】図１２は、アフィニティー突然変異のための突然変異を受けたコロニーの、ＥＬＩＳＡスクリーニングの結果を示している。
【図１３】図１３は、ｐ５６９ベクター（W．Nellen氏からの供与）、即ち、Ｄ．ディスコイデウム（D．discoideum）内での発現のためのシャトルベクターの一例を示している。このベクターは、アルファＬフコシダーゼプロモータ配列、シグナル配列、マルチクローニング部位、翻訳ターミネータおよびＧ418による選別のためのトランスポゾンＴｎ903を有している。
【図１４】図１４は、Ｘ線回折分析によって３オングストロームの解像度で解析された、二つのインフルエンザノイラミニダーゼ・サブユニットと複合されたＮＣ１０・ｓｃＦｖフラグメントのポリペプチド骨格として描かれた三次元構造を示している。この図では、重鎖可変領域および軽鎖可変領域を連結しているリンカーポリペプチドは描かれていない。この結晶構造においては、二つのＦｖフラグメントが背面−背面で会合して、二つの異なるノイラミニダーゼサブユニットを二量体化している。このｓｃＦｖフラグメントの状況において、該二量体Ｆｖ分子は二官能性試薬とみなされる。
【図１５】図１５は、溶液中において電子顕微鏡によって解析された、四つのＮＣ１０・ｓｃＦｖ二量体によって一緒に結合された二つのノイラミニダーゼ四量体のモデルを示している。
【図１６】図１６は、背面−背面で二量体化され、立体障害なしに密接に会合された二官能性Ｆｖ分子のモデルを示している。このモデルにおいて、重鎖のＣ末端は、残りのポリペプチド骨格の最小限の再構成を伴なって、軽鎖可変領域の -13残基に直接に連結され得る。
【図１７】図１７は、非共有結合的および共有結合的に夫々連結されたｓｃＦｖ二量体を模式的に示している。
【０１０８】
配列認識番号１は、バクテリアでの発現のためにデザインされたマウスＬｙ−２+ Ｌｙ−３Ｖドメインの一例を示している。
【０１０９】
配列認識番号２は、ｐＰＯＷのようなバクテリア分泌型べクター中での発現のためにデザインされた、ヒト単鎖ＣＤ８構築物の一例を示している。
【０１１０】
配列認識番号３は、発現のためにデザインされたマウスＭＨＣａ３ドメインの一例を示している。
【０１１１】
配列認識番号４は、ｐＨＦＡにおけるリンカーを含まない１Ｃ３・ｓｃＦｖのＤＮＡ配列を示している。
【０１１２】
配列認識番号５は、ｐｅｌＢ分泌シグナルおよびＦＬＡＧ・Ｃ末端ペプチドを伴なった、抗インフルエンザＮＣ１０・ｓｃＦｖのＤＮＡ配列を示している。
【０１１３】
配列認識番号６は、ＰＣＲ増幅後のｐ569への連結のために準備されたｐＨＦＡにおける抗グリコホリン１Ｃ３Ｆａｂの最初の1443塩基のＤＮＡ配列を示している。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
標的結合性の組換えポリペプチドであって、
ａ）安定なコアポリペプチド領域（ＳＣＲ）と、
ｂ）少なくとも一つの標的結合領域（ＴＢＲ）
とを具備し、 前記標的結合領域は、前記ＳＣＲに共有結合体に結合しており、また標的に対する特異性、親和性または結合活性を改変するために、任意に成熟プロセスを受けているポリペプチド。
【請求項２】
請求項１に記載のポリペプチドであって、自己会合して安定な二量体、凝集体またはアレイを形成することができるポリペプチド。
【請求項３】
請求項１または２に記載のポリペプチドであって、前記ＳＣＲおよびＴＢＲがリンカー成分によって結合されているポリペプチド。
【請求項４】
請求項１〜３の何れか１項に記載のポリペプチドであって、二官能性または多官能性であるポリペプチド。
【請求項５】
請求項１〜４の何れか１項に記載のポリペプチドであって、前記ＳＣＲがヒト起源であり、また血清中に存在するか若しくは細胞表面に表現されるタイプのタンパクであるポリペプチド。
【請求項６】
請求項１〜５の何れか１項に記載のポリペプチドであって、前記ＴＢＲが、グリコホリンもしくは他の赤血球細胞表面タンパク、インフルエンザウイルス・ノイラミニダーゼ、ウイルス抗原、抗体もしくは他のＩｇＧファミリーのメンバー、腫瘍増殖因子α（ＴＧＦ−α）、腫瘍マーカー、細胞表面タンパクおよび白血病阻害因子（ＬＩＦ）からなる群から選択される標的に結合することができるポリペプチド。
【請求項７】
請求項１〜６の何れか１項に記載の標的結合性ポリペプチドであって、、修飾抗体もしくは抗体フラグメント、ｓｃＦｖフラグメント、修飾ＣＤ８分子、および抗体分子もしくはそのフラグメントとＣＤ８との組合せを含む、免疫グロブリンスーパーファミリーに対して相同性を有するポリペプチド。
【請求項８】
請求項１〜７の何れか１項に記載の標的結合性ポリペプチドをコードするＤＮＡ構築物。
【請求項９】
請求項１〜７の何れか１項に記載の標的結合性ポリペプチドをコードするＤＮＡ構築物を製造する方法であって、標的結合性ポリペプチドコードするＤＮＡを、突然変異および選別の一以上のサイクルに供して、改変された親和性、特異性または結合活性の特性をもった標的結合性ポリペプチドをコードするＤＮＡのサブポピュレーションを得ることを具備した方法。
【請求項１０】
請求項９に記載の方法であって、標的結合性ポリペプチドをコードする前記ＤＮＡが、複製の能力のある要素または表現ベクター内に存在する方法。
【請求項１１】
請求項１０に記載の方法であって、前記表現ベクターが、バクテリオファージ、繊維状バクテリオファージ、ウイルス、バクテリア、酵母、粘菌、または哺乳類細胞からなる群から選択される方法。
【請求項１２】
請求項１０に記載の方法であて、前記表現ベクターがｐＨＦＡである方法。
【請求項１３】
請求項１２に記載の方法であって、突然変異が大腸菌の突然変異株を用いて行なわれる方法。
【請求項１４】
請求項１〜７の何れか１項に記載の標的結合性ポリペプチドを製造する方法であって、 ａ）一以上の所望の標的結合性ポリペプチドのフレームワーク構造をコードするＤＮＡを、ポリメラーゼチェイン反応によって単離する工程と、 ｂ）該ＤＮＡを一以上の表現ベクターに挿入する工程と、 ｃ）所望の特異性、結合活性または親和性の標的結合性ポリペプチドを表現する表現ベクターのサブポピュレーションを選別することと、 ｄ）改変された親和性、特異性または結合活性の特性を有する標的結合性ポリペプチドを表現する表現ベクターのサブポピュレーションを得るために、前記該選別されたサブポピュレーションを、突然変異誘発および選別の一以上のサイクルに供する工程と、 ｅ）改変された標的結合性ポリペプチドをコードするＤＮＡを、高レベル発現ベクターに挿入する工程と、 ｆ）上記の高レベル発現ベクターを適切な発現ホスト中に導入する工程と、 ｇ）前記標的結合性タンパクを発現させる工程と、 ｈ）こうして産生されたタンパクを単離する工程とを具備した方法。
【請求項１５】
請求項１〜７の何れか１項に記載の標的結合性ポリペプチドと、薬学的に許容され得る担体とを含有する薬剤組成物。
【請求項１６】
請求項１〜７の何れか１項に記載の標的結合性ポリペプチドと、稀釈剤とを含有する診断試薬。
【請求項１７】
請求項１〜７の何れか１項に記載の標的結合性ポリペプチドの診断における使用。
【請求項１８】
請求項１〜７の何れか１項に記載の標的結合性ポリペプチドの医薬としての使用。
【請求項１】
標的結合性の組換えポリペプチドであって、
ａ）安定なコアポリペプチド領域（ＳＣＲ）と、
ｂ）少なくとも一つの標的結合領域（ＴＢＲ）
とを具備し、 前記標的結合領域は、前記ＳＣＲに共有結合体に結合しており、また標的に対する特異性、親和性または結合活性を改変するために、任意に成熟プロセスを受けているポリペプチド。
【請求項２】
請求項１に記載のポリペプチドであって、自己会合して安定な二量体、凝集体またはアレイを形成することができるポリペプチド。
【請求項３】
請求項１または２に記載のポリペプチドであって、前記ＳＣＲおよびＴＢＲがリンカー成分によって結合されているポリペプチド。
【請求項４】
請求項１〜３の何れか１項に記載のポリペプチドであって、二官能性または多官能性であるポリペプチド。
【請求項５】
請求項１〜４の何れか１項に記載のポリペプチドであって、前記ＳＣＲがヒト起源であり、また血清中に存在するか若しくは細胞表面に表現されるタイプのタンパクであるポリペプチド。
【請求項６】
請求項１〜５の何れか１項に記載のポリペプチドであって、前記ＴＢＲが、グリコホリンもしくは他の赤血球細胞表面タンパク、インフルエンザウイルス・ノイラミニダーゼ、ウイルス抗原、抗体もしくは他のＩｇＧファミリーのメンバー、腫瘍増殖因子α（ＴＧＦ−α）、腫瘍マーカー、細胞表面タンパクおよび白血病阻害因子（ＬＩＦ）からなる群から選択される標的に結合することができるポリペプチド。
【請求項７】
請求項１〜６の何れか１項に記載の標的結合性ポリペプチドであって、、修飾抗体もしくは抗体フラグメント、ｓｃＦｖフラグメント、修飾ＣＤ８分子、および抗体分子もしくはそのフラグメントとＣＤ８との組合せを含む、免疫グロブリンスーパーファミリーに対して相同性を有するポリペプチド。
【請求項８】
請求項１〜７の何れか１項に記載の標的結合性ポリペプチドをコードするＤＮＡ構築物。
【請求項９】
請求項１〜７の何れか１項に記載の標的結合性ポリペプチドをコードするＤＮＡ構築物を製造する方法であって、標的結合性ポリペプチドコードするＤＮＡを、突然変異および選別の一以上のサイクルに供して、改変された親和性、特異性または結合活性の特性をもった標的結合性ポリペプチドをコードするＤＮＡのサブポピュレーションを得ることを具備した方法。
【請求項１０】
請求項９に記載の方法であって、標的結合性ポリペプチドをコードする前記ＤＮＡが、複製の能力のある要素または表現ベクター内に存在する方法。
【請求項１１】
請求項１０に記載の方法であって、前記表現ベクターが、バクテリオファージ、繊維状バクテリオファージ、ウイルス、バクテリア、酵母、粘菌、または哺乳類細胞からなる群から選択される方法。
【請求項１２】
請求項１０に記載の方法であて、前記表現ベクターがｐＨＦＡである方法。
【請求項１３】
請求項１２に記載の方法であって、突然変異が大腸菌の突然変異株を用いて行なわれる方法。
【請求項１４】
請求項１〜７の何れか１項に記載の標的結合性ポリペプチドを製造する方法であって、 ａ）一以上の所望の標的結合性ポリペプチドのフレームワーク構造をコードするＤＮＡを、ポリメラーゼチェイン反応によって単離する工程と、 ｂ）該ＤＮＡを一以上の表現ベクターに挿入する工程と、 ｃ）所望の特異性、結合活性または親和性の標的結合性ポリペプチドを表現する表現ベクターのサブポピュレーションを選別することと、 ｄ）改変された親和性、特異性または結合活性の特性を有する標的結合性ポリペプチドを表現する表現ベクターのサブポピュレーションを得るために、前記該選別されたサブポピュレーションを、突然変異誘発および選別の一以上のサイクルに供する工程と、 ｅ）改変された標的結合性ポリペプチドをコードするＤＮＡを、高レベル発現ベクターに挿入する工程と、 ｆ）上記の高レベル発現ベクターを適切な発現ホスト中に導入する工程と、 ｇ）前記標的結合性タンパクを発現させる工程と、 ｈ）こうして産生されたタンパクを単離する工程とを具備した方法。
【請求項１５】
請求項１〜７の何れか１項に記載の標的結合性ポリペプチドと、薬学的に許容され得る担体とを含有する薬剤組成物。
【請求項１６】
請求項１〜７の何れか１項に記載の標的結合性ポリペプチドと、稀釈剤とを含有する診断試薬。
【請求項１７】
請求項１〜７の何れか１項に記載の標的結合性ポリペプチドの診断における使用。
【請求項１８】
請求項１〜７の何れか１項に記載の標的結合性ポリペプチドの医薬としての使用。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９ａ】
【図９ｂ】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図１６】
【図１７】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９ａ】
【図９ｂ】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図１６】
【図１７】
【公開番号】特開２００９−１４８２５２（Ｐ２００９−１４８２５２Ａ）
【公開日】平成２１年７月９日（２００９．７．９）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００８−３０２５２７（Ｐ２００８−３０２５２７）
【出願日】平成２０年１１月２７日（２００８．１１．２７）
【分割の表示】特願平６−５０８５１５の分割
【原出願日】平成５年９月２４日（１９９３．９．２４）
【出願人】（５０６３５３３０１）アビペップ・ピーティーワイ・リミテッド (1)
【氏名又は名称原語表記】Ａｖｉｐｅｐ Ｐｔｙ Ｌｉｍｉｔｅｄ
【住所又は居所原語表記】Ｌｅｖｅｌ １， １５９ Ｄｏｒｃａｓ Ｓｔｒｅｅｔ， Ｓｏｕｔｈ Ｍｅｌｂｏｕｒｎｅ ＶＩＣ ３２０５， Ａｕｓｔｒａｌｉａ
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２１年７月９日（２００９．７．９）
【国際特許分類】
【出願日】平成２０年１１月２７日（２００８．１１．２７）
【分割の表示】特願平６−５０８５１５の分割
【原出願日】平成５年９月２４日（１９９３．９．２４）
【出願人】（５０６３５３３０１）アビペップ・ピーティーワイ・リミテッド (1)
【氏名又は名称原語表記】Ａｖｉｐｅｐ Ｐｔｙ Ｌｉｍｉｔｅｄ
【住所又は居所原語表記】Ｌｅｖｅｌ １， １５９ Ｄｏｒｃａｓ Ｓｔｒｅｅｔ， Ｓｏｕｔｈ Ｍｅｌｂｏｕｒｎｅ ＶＩＣ ３２０５， Ａｕｓｔｒａｌｉａ
【Ｆターム（参考）】
[ Back to top ]