機能性養殖飼料及びその製造方法
【課題】 養殖現場ではエドワジエラ感染症等に代表される魚病の蔓延が問題となっていた。しかし、養殖魚用のワクチンは高価であり、またワクチンの接種に手間がかかるという問題があった。したがって、ワクチン接種よりも安価で簡易な方法で魚病の発生を抑制する必要があった。
【解決手段】 本発明は、植物性原料と動物性原料とを含む発酵原料を、複数の生物種の好熱性微生物を含む微生物群を用いて発酵することにより得られ、魚病の発生を抑制する機能を有する機能性養殖飼料を提供する。
【解決手段】 本発明は、植物性原料と動物性原料とを含む発酵原料を、複数の生物種の好熱性微生物を含む微生物群を用いて発酵することにより得られ、魚病の発生を抑制する機能を有する機能性養殖飼料を提供する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、植物性原料と動物性原料とを含む発酵原料を、複数の生物種の好熱性微生物を含む微生物群を用いて発酵することにより得られ、魚病の発生を抑制する機能を有する機能性養殖飼料、及びその製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、養殖飼料の原料となる魚粉の価格が高騰しており、養殖業者の経営を圧迫している。そこで、魚粉を代替することが可能な飼料原料が求められている。特に、未利用の有機物を発酵して得られる発酵飼料について、さまざまな開発が行われている（特許文献１〜４参照）。
【０００３】
また、エドワジエラ感染症等の魚病が養殖魚の間で蔓延しており、養殖業者に大きな被害をもたらしている。そこで、魚病の発生を抑制するためのワクチンの研究開発が行われている（特許文献５〜７参照）。
【０００４】
一方、発明者等は、Bacillus brevisやBacillus
stearothermophilus、Thermopholic actinomycetesや、それらの近縁の種等の複数の生物種の好熱性微生物を含む微生物群を用いた発酵飼料の開発を行ってきた（特許文献８及び９参照）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特開２０１０−０５７５０５号公報
【特許文献２】特開２０１０−０４６０２３号公報
【特許文献３】特開２００９−２７８８９５号公報
【特許文献４】特開２００６−０５０９１５号公報
【特許文献５】特開２００８−２２０２６２号公報
【特許文献６】特開２００７−２３８５０５号公報
【特許文献７】特開２００６−３１２５９５号公報
【特許文献８】特許第３３１４３０２号公報
【特許文献９】特許第３１４６３０５号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
養殖魚用のワクチンは高価であり、またワクチンの接種に手間がかかるという問題があった。したがって、ワクチン接種よりも安価で簡易な方法で魚病の発生を抑制する必要があった。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明は、上記の課題を解決する機能性養殖飼料を提供することにある。すなわち、本発明は、植物性原料と動物性原料とを含む発酵原料を、複数の生物種の好熱性微生物を含む微生物群を用いて発酵することにより得られ、魚病の発症を抑制する機能を有する、機能性養殖飼料である。
【０００８】
また、本発明の機能性養殖飼料は、発酵原料が約７０重量％〜約８０重量％の植物性原料と約３０重量％〜約２０重量％の動物性原料とから構成されるものであってよい。
【０００９】
また、本発明の別の機能性養殖飼料は、受託番号：ATCC PTA-1773である微生物、及び／又は受託番号：NITE BP-863の微生物を含む微生物群を用いて発酵することにより得られるものである。また、本発明の機能性養殖飼料が含む微生物群は、該機能性養殖飼料１ｇ当たり約１０８個〜約１０９個であり得る。
【００１０】
さらに、本発明の機能性養殖飼料が抑制する魚病は、エドワジエラ感染症であり得る。
【００１１】
また、本発明の機能性養殖飼料に用いられる植物性原料は、米糠、麦糠、すふま、大豆粕、おから、酒粕、焼酎粕、茶粕、コーヒー粕、果実搾り粕、及び野菜搾り粕からなる群より選択される1又は複数であり得る。また、本発明の機能性養殖飼料に用いられる動物性原料は、甲殻類、魚類、甲殻類加工残渣、及び魚類加工残渣からなる群より選択される1又は複数であり得る。
【００１２】
また、本発明の別の機能性養殖飼料は、上述の機能性養殖飼料を約０．１重量％〜約５重量％含有する機能性養殖飼料である。さらに別の機能性養殖飼料は、上述の機能性養殖飼料を約１重量％〜約５重量％含有する機能性養殖飼料である。
【００１３】
さらに、本発明は、植物性原料と動物性原料とを撹拌して発酵原料を得る撹拌工程、及び、撹拌工程で得られた発酵原料を、受託番号ATCC PTA-1773である微生物、及び／又は受託番号：NITE BP-863の微生物を用いて発酵する発酵工程を含む、機能性養殖飼料を製造する方法である。
【発明の効果】
【００１４】
本発明の機能性養殖飼料は、エドワジエラ感染症等の魚病の発生の抑制効果を有する。したがって、飼料の供与という簡便な方法で魚病の発生を抑制することができる。さらに、本発明の機能性養殖飼料は、安価な原料を用い、短時間での高温発酵により製造されるため、低価格で提供することが可能であり、養殖業者の利益に大いに貢献することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１】本発明の機能性養殖飼料によるエドワジエラ感染症の抑制効果を示す実験の結果のグラフである。
【図２】本発明の機能性養殖飼料によるマダイの白血球貪食への作用を示す実験の結果のグラフである。
【図３】本発明の機能性養殖飼料によるマダイの白血球貪食への作用を示す実験の結果のグラフである。
【図４】本発明の機能性養殖飼料によるマダイの成長への作用を示す実験の結果のグラフである。
【図５】本発明の機能性養殖飼料によるマダイの成長への作用を示す実験の結果のグラフである。
【図６】本発明の機能性養殖飼料によるマダイの脾臓への作用を示す実験の結果のグラフである。
【図７】本発明の機能性養殖飼料によるマダイの白血球貪食への作用を示す実験の結果のグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
次に、本発明を実施するための形態について説明するが、本発明はこれらの実施形態に限定されるものではない。
【００１７】
本発明は、植物性原料と動物性原料とを含む発酵原料を、複数の生物種の好熱性微生物を含む微生物群を用いて発酵することにより得られ、魚病の発生を抑制する機能を有する機能性養殖飼料を提供する。
【００１８】
本発明の機能性養殖飼料に含まれる微生物群は、該機能性養殖飼料を摂食した養殖魚の腸内免疫系に作用し、自然免疫を活性化させることで、魚病の発生が抑制されると考えられる。
【００１９】
本発明で用いられる微生物群は、複数の生物種の好熱性微生物を含む。具体的な生物種として、Bacillus brevis、Bacillus
stearothermophilus、Bacillus thermoamylovorans、Thermopholic actinomycetesや、それらの近縁の種等が挙げられる。なかでも、本発明で用いられる微生物群は、受託番号：ATCC PTA-1773である微生物及び／又は受託番号：NITE BP-863である微生物を含むことが好ましい。
【００２０】
受託番号：ATCC PTA-1773の微生物は、複数種の微生物からなる混合菌である。具体的には、Bacillus brevisの近縁の種である好熱性細菌C-1、Bacillus brevisの近縁の種である好熱性細菌C-3、及びBacillus stearothermophilusの近縁の種である好熱性細菌CH-4、好熱性放線菌MH-1、Bacillus coagulansの近縁の種である好熱性又は耐熱性乳酸菌LM-1、及びBacillus coagulansの近縁の種である好熱性又は耐熱性乳酸菌LM-2が含まれる。また、受託番号：NITE BP-863の微生物は、Bacillus thermoamylovorans近縁の種であるN-11を含む。
【００２１】
ここで、受託番号：ATCC PTA-1773、及び受託番号：NITE BP-863に含まれる各微生物の分離株の同定試験の結果を表１〜表４に示す。
【００２２】
【表１】
【００２３】
【表２】
【００２４】
【表３】
【００２５】
【表４】
【００２６】
本発明の機能性養殖飼料は、約１０８個／ｇ〜約１０９個／ｇの微生物群を含むことが好ましい。また、本発明の機能性養殖飼料は、約１０８個／ｇ〜約１０９個／ｇの受託番号：ATCC PTA-1773の微生物、及び約１０６個／ｇ〜約１０７個／ｇの受託番号：NITE BP-863の微生物を含むことがさらに好ましい。
【００２７】
本発明で用いられる微生物群は、７０重量％〜９９重量％の受託番号：ATCC PTA-1773の微生物、及び３０重量％〜１重量％の受託番号：NITE
BP-863の微生物から構成されることが好ましい。また、７０重量％〜９０重量％の受託番号：ATCC PTA-1773の微生物、及び３０重量％〜１０重量％の受託番号：NITE BP-863の微生物から構成される微生物群を用いて発酵原料を発酵し、得られた機能性養殖飼料に含まれる微生物群が７０重量％〜９９重量％の受託番号：ATCC PTA-1773の微生物、及び３０重量％〜１重量％の受託番号：NITE
BP-863の微生物から構成されることが好ましく、９０重量％〜９９重量％の受託番号：ATCC PTA-1773の微生物、及び１０重量％〜１重量％の受託番号：NITE BP-863の微生物から構成されることがさらに好ましい。
【００２８】
本発明で用いられる植物性原料とは、野菜や穀物等の植物に由来する原料をいい、食品残渣等の安価な原料を用いることができる。具体的には、米糠、麦糠、すふま、大豆粕、おから、酒粕、焼酎粕、茶粕、コーヒー粕、果実搾り粕、及び野菜搾り粕等が挙げられる。なかでも、コーヒー粕等の多孔質な原料は発酵反応が促進され、またコーヒー粕はハンマーミル等の簡易な粉砕装置での微粉砕が可能である等の利点を有する。
【００２９】
本発明で用いられる動物性原料とは、魚類や甲殻類等の動物に由来する原料をいい、海産物であることが好ましい。具体的には、甲殻類、魚類やそれらの加工残渣等が挙げられる。
【００３０】
甲殻類としては、エビやカニ、ヤドカリ等と称される生物を用いることができる。また、魚類としては、底引き網で引き上げられる底魚や、漁で得られたが市場では販売されない未利用魚等を用いることができる。さらに、食品用に加工された際に発生する甲殻類や魚類の残渣を用いることもできる。
【００３１】
本発明で用いられる発酵原料は、約５０重量％〜約９０重量％の植物性原料と約５０重量％〜約１０重量％の動物性原料とから構成されることが好ましく、約７０重量％〜約８０重量％の植物性原料と約３０重量％〜約２０重量％の動物性原料とから構成されることがさらに好ましい。
【００３２】
本発明の機能性養殖飼料は、ウイルスや細菌が原因となる養殖魚の感染症の発生を抑制することができる。なかでも、マダイやヒラメの養殖で大きな問題となっているエドワジエラ感染症に対し、多大な抑制効果・治療効果を有することが示された。
【００３３】
エドワジエラ感染症とは、グラム陰性細菌であるEdwadsiella tardaを原因とする感染症であり、頭部や筋肉内の腫瘍、腹水、腎臓や脾臓の小白点等の症状がみられる。マダイをエドワジエラに強制感染させた実験では、本発明の機能性養殖飼料を約１重量％〜約５重量％含有する飼料を供与した群で、エドワジエラ感染症の発症を顕著に抑制することが認められた。また、本発明の機能性養殖飼料を約１重量％〜約５重量％含有する飼料を供与したマダイは、細胞性免疫が活性化されていることが確認された。
【００３４】
本発明の別の機能性養殖飼料は、上述の機能性養殖飼料を含有する。好ましくは約０．０１重量％〜約１０重量％含有し、より好ましくは約０．１重量％〜約５重量％含有し、さらに好ましくは約１重量％〜約５重量％含有する。含有の方法は限定されないが、他の飼料原料と混合して成型してもよいし、添着剤を用いて飼料表面に上述の機能性飼料を添着させてもよい。
【００３５】
さらに、本発明は、上述の機能性養殖飼料を製造する方法を提供する。該機能性養殖飼料を製造する方法は、（ａ）植物性原料と動物性原料とを撹拌して発酵原料を得る撹拌工程、及び（ｂ）撹拌工程で得られた発酵原料を、受託番号がATCC PTA-1773である微生物群を用いて発酵する発酵工程、を含む。
【００３６】
本発明の（ａ）撹拌工程は、上述の植物性原料と上述の動物性原料を撹拌して混合し、各原料が略均一に分散した発酵原料を得る工程である。発酵原料の分散が十分になされていない場合は、その後の発酵工程での発酵が不完全になる可能性がある。また撹拌の前に植物性原料又は動物性原料を粉砕することが好ましい。原料を粉砕することで撹拌が容易になるためである。
【００３７】
本発明の（ｂ）発酵工程は、（ａ）撹拌工程で得られた発酵原料を発酵する工程である。発酵には、受託番号：ATCC PTA-1773の微生物群が用いられる。発酵の温度は、約２０℃〜約９０℃が好ましく、約３０℃〜約５０℃がさらに好ましい。また、発酵の時間は約５時間〜約２４時間が好ましく、約１０時間〜約１４時間がさらに好ましい。
【００３８】
また、（ｂ）発酵工程は、複数の発酵槽で行うことが好ましい。複数の発酵槽を用いた場合には、各発酵槽で発酵温度を変えることが好ましい。各発酵槽内では、それぞれの温度に嗜好性を持った微生物による発酵が行われるため、複合的な発酵反応により生産された機能性養殖飼料を得ることができるためである。
【実施例】
【００３９】
さらに、実施例に基づいて本発明をさらに詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
【００４０】
１．機能性養殖飼料の生産
実施例１及び実施例２の機能性養殖飼料を以下に示す方法で作製した。
【００４１】
（実施例１）
植物性原料として、原料全体に対し、約５０重量％の大麦糠、約２０重量％の麦焼酎粕、約１０重量％の米糠を含むものを用いた。さらに動物性原料として、原料全体に対し、約２０重量％の、底引き網漁で得られたエビ・カニ等の甲殻類や底魚等を含む海産物を発酵して得られた海産物発酵物を用いた。該海産物発酵物は約１０８個／ｇ〜約１０９個／ｇの微生物群を含み、該微生物群は約７０重量％〜約９０重量％の受託番号：PTA-1773の微生物及び約３０重量％〜約１０重量％の受託番号：NITE BP-863の微生物から構成された。
【００４２】
上記の植物性原料及び動物性原料を混合して十分に撹拌し発酵原料を得た。さらに該発酵原料を、４０℃で１４時間の１段階で発酵し、乾燥し、本発明の機能性養殖飼料を得た。該機能性養殖飼料は約１０８個／ｇ〜約１０９個／ｇの微生物群を含み、該微生物群は約９０重量％〜約９９重量％の受託番号：PTA-1773の微生物及び約１０重量％〜約１重量％の受託番号：NITE BP-863の微生物から構成された。
【００４３】
（実施例２）
植物性原料として、原料全体に対し、約２０重量％の液状焼酎粕、約５０重量％の焼酎粕乾燥物を含むものを用いた。さらに動物性原料として、原料全体に対し、約３０重量％の、底引き網漁で得られたエビ・カニ等の甲殻類や底魚等を含む海産物を用いた。該液状焼酎粕は約１０８個／ｇ〜約１０９個／ｇの微生物群を含み、該微生物群は約７０重量％〜約９０重量％の受託番号：PTA-1773の微生物及び約３０重量％〜約１０重量％の受託番号：NITE-863の微生物から構成された
【００４４】
上記の植物性原料及び動物性原料を混合して十分に撹拌し発酵原料を得た。さらに該発酵原料の発酵を２段階行った。１段階目の発酵の条件は、５０℃〜６０℃で４〜５時間、２段階目の発酵の条件は、３０℃〜４０℃、６〜８時間とした。２段階目の発酵後に、発酵された発酵原料を乾燥し、本発明の機能性養殖飼料を得た。該機能性養殖飼料は約１０８個／ｇ〜約１０９個／ｇの微生物群を含み、該微生物群は約７０重量％〜約９０重量％の受託番号：PTA-1773の微生物及び約３０重量％〜約１０重量％の受託番号：NITE BP-863の微生物から構成された。
【００４５】
２．魚病発症の抑制能の評価
実施例１で作製した機能性養殖飼料の魚病の発生に対する抑制効果を検証した。実験魚にはマダイを用いた。実施例１の機能性養殖飼料を１重量％添着した群（１重量％）、５重量％添着した群（５重量％）、及び対照群（Cont.）、さらにE.tardaを感染させなかった群（Blank）の合計４群を設け、各群１５匹の体重約２０ｇのマダイの稚魚を実験水槽内で飼育した。実施例１の機能性養殖飼料は、ハンマーミルで微粉砕し、添着剤（アピファック社製）を用いて市販EP飼料に添着してマダイに供与した。１日１回飽食になるまで各飼料を供与した。飼育開始３１日目に、E.tardaを感染させなかった群（Blank）以外の群のマダイに対し、１．５７×１０７個体のE.tardaを含む溶液を投与してE.tardaをマダイに強制感染させ、各群の死亡数を比較した。
【００４６】
結果を図１に示す。対照群では、感染後１０日で多くのマダイが死亡した。一方、実施例１の機能性養殖飼料を１重量％添着した群、及び５重量％添着した群では、対照群に比べてマダイの死亡数が大幅に抑えられた。したがって、本発明の機能性養殖飼料は魚病の発生の抑制効果を有することが示された。
【００４７】
３．白血球貪食能の測定
さらに、実施例１の機能性養殖飼料を供与したマダイの白血球貪食能を測定した。実施例１の機能性養殖飼料は、ハンマーミルで微粉砕し、添着剤（アピファック社製）を用いて市販EP飼料に添着してマダイに供与した。実施例１の機能性養殖飼料を１重量％添着した群（１重量％）、５重量％添着した群（５重量％）、及び対照群（Cont.）を設け、飼育開始時魚体重約１００ｇの３００尾のマダイに対し、２日に１回１ｋｇの飼料を供与した。
【００４８】
飼育開始後１７０日目のマダイから血液を採取し、５０％モノ・ポリ分離溶液（大日本住友製薬社製）を用いて全血から白血球を分離した。分離した白血球に粒径３μｍのラテックスビーズを貪食させ、フローサイトメトリを用いて貪食細胞数を測定した。各群のマダイにおける、貪食細胞数が全細胞数に占める割合を図２に示す。実施例１で作製された機能性養殖飼料を供与したマダイは、対照群のマダイに対して白血球の貪食能が高いことから、自然免疫が活性化されていることが示された。したがって、本発明の機能性養殖飼料は、供与したマダイの自然免疫系を活性化させることが明らかとなった。
【００４９】
４．白血球貪食能の測定
さらに、実施例１の機能性養殖飼料を供与したマダイの白血球貪食能を測定した。実施例１の機能性養殖飼料は、ハンマーミルで微粉砕し、モイストペレットを作製した。モイストペレットの組成は、魚粉が５０重量％、大豆が２４重量％、小麦が２３．９重量％、ビタミンが１重量％、CMCが１．１重量％、水が５０重量％、魚油５重量％であり、さらに実施例１の機能性養殖飼料を０．００１重量％含有するもの、０．０１重量％含有するもの、０．１重量％含有するもの、１重量％含有するもの、とした。飼育開始時の尾叉長が約１７５ｍｍ、魚体重が約１３０ｇのマダイ各５尾ずつに上述の飼料を毎日飽食まで供与した。
【００５０】
飼育後のマダイから血液を採取し、フローサイトメトリを用いて貪食細胞数を測定した。各群のマダイにおける、貪食細胞数が全細胞数に占める割合を図３に示す。実施例１で作製された機能性養殖飼料を供与したマダイは、対照群のマダイに対して白血球の貪食能が高いことから、自然免疫が活性化されていることが示された。また、０．０１重量％含有する飼料と０．１重量％含有する飼料とでは貪食能に明らかに差異がみられた。
【００５１】
（実施例３）
植物性原料として、原料全体に対し、約４８重量％のコーヒー粕、約２１重量％の焼酎粕、約５重量％の大麦糠、約３重量％の米糠、動物性原料として、原料全体に対し、約２３重量％のマダイ加工残渣を用い、さらに、受託番号：PTA-1773の微生物及び受託番号：NITE-863の微生物を含む微生物群を用いて機能性養殖飼料を得た。
【００５２】
上記の植物性原料及び動物性原料を混合して十分に撹拌し発酵原料を得た。さらに該発酵原料の発酵を２段階行った。１段階目の発酵の条件は、６０℃〜７０℃で１０〜１２時間、２段階目の発酵の条件は、６０℃〜７０℃、２０〜２４時間とした。２段階目の発酵後に、発酵された発酵原料を乾燥し、本発明の機能性養殖飼料を得た。
【００５３】
５．魚病発症の抑制能の評価
続いて、実施例３の機能性養殖飼料による魚病発症の抑制能を海面養殖で評価した。実験魚にはマダイを用いて、試験区には実施例３の機能性養殖飼料を０．１重量％含む飼料を供与した。尾叉長の変化を図４に、魚体重の変化を図５に示す。いずれも実施例３の機能性養殖飼料を供与した試験区のマダイの成長が促進されたことから、本発明の機能性養殖飼料が成長促進剤としても用いることができることが示された。
【００５４】
さらに、試験開始後３月の脾臓重量及び脾臓体指数を図６に、白血球の貪食能を図７に示す。脾臓の重量及び脾臓体指数、貪食能共に実施例３の機能性養殖飼料を供与した試験区が高く、特に貪食能の差は大きくなった。以上の結果から、本発明の機能性養殖飼料は供与した魚類の免疫を高め、魚病発生を抑制する可能性があることが示された。
【受託番号】
【００５５】
ATCC
PTA-1773
【００５６】
NITE
BP-863
【技術分野】
【０００１】
本発明は、植物性原料と動物性原料とを含む発酵原料を、複数の生物種の好熱性微生物を含む微生物群を用いて発酵することにより得られ、魚病の発生を抑制する機能を有する機能性養殖飼料、及びその製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、養殖飼料の原料となる魚粉の価格が高騰しており、養殖業者の経営を圧迫している。そこで、魚粉を代替することが可能な飼料原料が求められている。特に、未利用の有機物を発酵して得られる発酵飼料について、さまざまな開発が行われている（特許文献１〜４参照）。
【０００３】
また、エドワジエラ感染症等の魚病が養殖魚の間で蔓延しており、養殖業者に大きな被害をもたらしている。そこで、魚病の発生を抑制するためのワクチンの研究開発が行われている（特許文献５〜７参照）。
【０００４】
一方、発明者等は、Bacillus brevisやBacillus
stearothermophilus、Thermopholic actinomycetesや、それらの近縁の種等の複数の生物種の好熱性微生物を含む微生物群を用いた発酵飼料の開発を行ってきた（特許文献８及び９参照）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特開２０１０−０５７５０５号公報
【特許文献２】特開２０１０−０４６０２３号公報
【特許文献３】特開２００９−２７８８９５号公報
【特許文献４】特開２００６−０５０９１５号公報
【特許文献５】特開２００８−２２０２６２号公報
【特許文献６】特開２００７−２３８５０５号公報
【特許文献７】特開２００６−３１２５９５号公報
【特許文献８】特許第３３１４３０２号公報
【特許文献９】特許第３１４６３０５号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
養殖魚用のワクチンは高価であり、またワクチンの接種に手間がかかるという問題があった。したがって、ワクチン接種よりも安価で簡易な方法で魚病の発生を抑制する必要があった。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明は、上記の課題を解決する機能性養殖飼料を提供することにある。すなわち、本発明は、植物性原料と動物性原料とを含む発酵原料を、複数の生物種の好熱性微生物を含む微生物群を用いて発酵することにより得られ、魚病の発症を抑制する機能を有する、機能性養殖飼料である。
【０００８】
また、本発明の機能性養殖飼料は、発酵原料が約７０重量％〜約８０重量％の植物性原料と約３０重量％〜約２０重量％の動物性原料とから構成されるものであってよい。
【０００９】
また、本発明の別の機能性養殖飼料は、受託番号：ATCC PTA-1773である微生物、及び／又は受託番号：NITE BP-863の微生物を含む微生物群を用いて発酵することにより得られるものである。また、本発明の機能性養殖飼料が含む微生物群は、該機能性養殖飼料１ｇ当たり約１０８個〜約１０９個であり得る。
【００１０】
さらに、本発明の機能性養殖飼料が抑制する魚病は、エドワジエラ感染症であり得る。
【００１１】
また、本発明の機能性養殖飼料に用いられる植物性原料は、米糠、麦糠、すふま、大豆粕、おから、酒粕、焼酎粕、茶粕、コーヒー粕、果実搾り粕、及び野菜搾り粕からなる群より選択される1又は複数であり得る。また、本発明の機能性養殖飼料に用いられる動物性原料は、甲殻類、魚類、甲殻類加工残渣、及び魚類加工残渣からなる群より選択される1又は複数であり得る。
【００１２】
また、本発明の別の機能性養殖飼料は、上述の機能性養殖飼料を約０．１重量％〜約５重量％含有する機能性養殖飼料である。さらに別の機能性養殖飼料は、上述の機能性養殖飼料を約１重量％〜約５重量％含有する機能性養殖飼料である。
【００１３】
さらに、本発明は、植物性原料と動物性原料とを撹拌して発酵原料を得る撹拌工程、及び、撹拌工程で得られた発酵原料を、受託番号ATCC PTA-1773である微生物、及び／又は受託番号：NITE BP-863の微生物を用いて発酵する発酵工程を含む、機能性養殖飼料を製造する方法である。
【発明の効果】
【００１４】
本発明の機能性養殖飼料は、エドワジエラ感染症等の魚病の発生の抑制効果を有する。したがって、飼料の供与という簡便な方法で魚病の発生を抑制することができる。さらに、本発明の機能性養殖飼料は、安価な原料を用い、短時間での高温発酵により製造されるため、低価格で提供することが可能であり、養殖業者の利益に大いに貢献することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１】本発明の機能性養殖飼料によるエドワジエラ感染症の抑制効果を示す実験の結果のグラフである。
【図２】本発明の機能性養殖飼料によるマダイの白血球貪食への作用を示す実験の結果のグラフである。
【図３】本発明の機能性養殖飼料によるマダイの白血球貪食への作用を示す実験の結果のグラフである。
【図４】本発明の機能性養殖飼料によるマダイの成長への作用を示す実験の結果のグラフである。
【図５】本発明の機能性養殖飼料によるマダイの成長への作用を示す実験の結果のグラフである。
【図６】本発明の機能性養殖飼料によるマダイの脾臓への作用を示す実験の結果のグラフである。
【図７】本発明の機能性養殖飼料によるマダイの白血球貪食への作用を示す実験の結果のグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
次に、本発明を実施するための形態について説明するが、本発明はこれらの実施形態に限定されるものではない。
【００１７】
本発明は、植物性原料と動物性原料とを含む発酵原料を、複数の生物種の好熱性微生物を含む微生物群を用いて発酵することにより得られ、魚病の発生を抑制する機能を有する機能性養殖飼料を提供する。
【００１８】
本発明の機能性養殖飼料に含まれる微生物群は、該機能性養殖飼料を摂食した養殖魚の腸内免疫系に作用し、自然免疫を活性化させることで、魚病の発生が抑制されると考えられる。
【００１９】
本発明で用いられる微生物群は、複数の生物種の好熱性微生物を含む。具体的な生物種として、Bacillus brevis、Bacillus
stearothermophilus、Bacillus thermoamylovorans、Thermopholic actinomycetesや、それらの近縁の種等が挙げられる。なかでも、本発明で用いられる微生物群は、受託番号：ATCC PTA-1773である微生物及び／又は受託番号：NITE BP-863である微生物を含むことが好ましい。
【００２０】
受託番号：ATCC PTA-1773の微生物は、複数種の微生物からなる混合菌である。具体的には、Bacillus brevisの近縁の種である好熱性細菌C-1、Bacillus brevisの近縁の種である好熱性細菌C-3、及びBacillus stearothermophilusの近縁の種である好熱性細菌CH-4、好熱性放線菌MH-1、Bacillus coagulansの近縁の種である好熱性又は耐熱性乳酸菌LM-1、及びBacillus coagulansの近縁の種である好熱性又は耐熱性乳酸菌LM-2が含まれる。また、受託番号：NITE BP-863の微生物は、Bacillus thermoamylovorans近縁の種であるN-11を含む。
【００２１】
ここで、受託番号：ATCC PTA-1773、及び受託番号：NITE BP-863に含まれる各微生物の分離株の同定試験の結果を表１〜表４に示す。
【００２２】
【表１】
【００２３】
【表２】
【００２４】
【表３】
【００２５】
【表４】
【００２６】
本発明の機能性養殖飼料は、約１０８個／ｇ〜約１０９個／ｇの微生物群を含むことが好ましい。また、本発明の機能性養殖飼料は、約１０８個／ｇ〜約１０９個／ｇの受託番号：ATCC PTA-1773の微生物、及び約１０６個／ｇ〜約１０７個／ｇの受託番号：NITE BP-863の微生物を含むことがさらに好ましい。
【００２７】
本発明で用いられる微生物群は、７０重量％〜９９重量％の受託番号：ATCC PTA-1773の微生物、及び３０重量％〜１重量％の受託番号：NITE
BP-863の微生物から構成されることが好ましい。また、７０重量％〜９０重量％の受託番号：ATCC PTA-1773の微生物、及び３０重量％〜１０重量％の受託番号：NITE BP-863の微生物から構成される微生物群を用いて発酵原料を発酵し、得られた機能性養殖飼料に含まれる微生物群が７０重量％〜９９重量％の受託番号：ATCC PTA-1773の微生物、及び３０重量％〜１重量％の受託番号：NITE
BP-863の微生物から構成されることが好ましく、９０重量％〜９９重量％の受託番号：ATCC PTA-1773の微生物、及び１０重量％〜１重量％の受託番号：NITE BP-863の微生物から構成されることがさらに好ましい。
【００２８】
本発明で用いられる植物性原料とは、野菜や穀物等の植物に由来する原料をいい、食品残渣等の安価な原料を用いることができる。具体的には、米糠、麦糠、すふま、大豆粕、おから、酒粕、焼酎粕、茶粕、コーヒー粕、果実搾り粕、及び野菜搾り粕等が挙げられる。なかでも、コーヒー粕等の多孔質な原料は発酵反応が促進され、またコーヒー粕はハンマーミル等の簡易な粉砕装置での微粉砕が可能である等の利点を有する。
【００２９】
本発明で用いられる動物性原料とは、魚類や甲殻類等の動物に由来する原料をいい、海産物であることが好ましい。具体的には、甲殻類、魚類やそれらの加工残渣等が挙げられる。
【００３０】
甲殻類としては、エビやカニ、ヤドカリ等と称される生物を用いることができる。また、魚類としては、底引き網で引き上げられる底魚や、漁で得られたが市場では販売されない未利用魚等を用いることができる。さらに、食品用に加工された際に発生する甲殻類や魚類の残渣を用いることもできる。
【００３１】
本発明で用いられる発酵原料は、約５０重量％〜約９０重量％の植物性原料と約５０重量％〜約１０重量％の動物性原料とから構成されることが好ましく、約７０重量％〜約８０重量％の植物性原料と約３０重量％〜約２０重量％の動物性原料とから構成されることがさらに好ましい。
【００３２】
本発明の機能性養殖飼料は、ウイルスや細菌が原因となる養殖魚の感染症の発生を抑制することができる。なかでも、マダイやヒラメの養殖で大きな問題となっているエドワジエラ感染症に対し、多大な抑制効果・治療効果を有することが示された。
【００３３】
エドワジエラ感染症とは、グラム陰性細菌であるEdwadsiella tardaを原因とする感染症であり、頭部や筋肉内の腫瘍、腹水、腎臓や脾臓の小白点等の症状がみられる。マダイをエドワジエラに強制感染させた実験では、本発明の機能性養殖飼料を約１重量％〜約５重量％含有する飼料を供与した群で、エドワジエラ感染症の発症を顕著に抑制することが認められた。また、本発明の機能性養殖飼料を約１重量％〜約５重量％含有する飼料を供与したマダイは、細胞性免疫が活性化されていることが確認された。
【００３４】
本発明の別の機能性養殖飼料は、上述の機能性養殖飼料を含有する。好ましくは約０．０１重量％〜約１０重量％含有し、より好ましくは約０．１重量％〜約５重量％含有し、さらに好ましくは約１重量％〜約５重量％含有する。含有の方法は限定されないが、他の飼料原料と混合して成型してもよいし、添着剤を用いて飼料表面に上述の機能性飼料を添着させてもよい。
【００３５】
さらに、本発明は、上述の機能性養殖飼料を製造する方法を提供する。該機能性養殖飼料を製造する方法は、（ａ）植物性原料と動物性原料とを撹拌して発酵原料を得る撹拌工程、及び（ｂ）撹拌工程で得られた発酵原料を、受託番号がATCC PTA-1773である微生物群を用いて発酵する発酵工程、を含む。
【００３６】
本発明の（ａ）撹拌工程は、上述の植物性原料と上述の動物性原料を撹拌して混合し、各原料が略均一に分散した発酵原料を得る工程である。発酵原料の分散が十分になされていない場合は、その後の発酵工程での発酵が不完全になる可能性がある。また撹拌の前に植物性原料又は動物性原料を粉砕することが好ましい。原料を粉砕することで撹拌が容易になるためである。
【００３７】
本発明の（ｂ）発酵工程は、（ａ）撹拌工程で得られた発酵原料を発酵する工程である。発酵には、受託番号：ATCC PTA-1773の微生物群が用いられる。発酵の温度は、約２０℃〜約９０℃が好ましく、約３０℃〜約５０℃がさらに好ましい。また、発酵の時間は約５時間〜約２４時間が好ましく、約１０時間〜約１４時間がさらに好ましい。
【００３８】
また、（ｂ）発酵工程は、複数の発酵槽で行うことが好ましい。複数の発酵槽を用いた場合には、各発酵槽で発酵温度を変えることが好ましい。各発酵槽内では、それぞれの温度に嗜好性を持った微生物による発酵が行われるため、複合的な発酵反応により生産された機能性養殖飼料を得ることができるためである。
【実施例】
【００３９】
さらに、実施例に基づいて本発明をさらに詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
【００４０】
１．機能性養殖飼料の生産
実施例１及び実施例２の機能性養殖飼料を以下に示す方法で作製した。
【００４１】
（実施例１）
植物性原料として、原料全体に対し、約５０重量％の大麦糠、約２０重量％の麦焼酎粕、約１０重量％の米糠を含むものを用いた。さらに動物性原料として、原料全体に対し、約２０重量％の、底引き網漁で得られたエビ・カニ等の甲殻類や底魚等を含む海産物を発酵して得られた海産物発酵物を用いた。該海産物発酵物は約１０８個／ｇ〜約１０９個／ｇの微生物群を含み、該微生物群は約７０重量％〜約９０重量％の受託番号：PTA-1773の微生物及び約３０重量％〜約１０重量％の受託番号：NITE BP-863の微生物から構成された。
【００４２】
上記の植物性原料及び動物性原料を混合して十分に撹拌し発酵原料を得た。さらに該発酵原料を、４０℃で１４時間の１段階で発酵し、乾燥し、本発明の機能性養殖飼料を得た。該機能性養殖飼料は約１０８個／ｇ〜約１０９個／ｇの微生物群を含み、該微生物群は約９０重量％〜約９９重量％の受託番号：PTA-1773の微生物及び約１０重量％〜約１重量％の受託番号：NITE BP-863の微生物から構成された。
【００４３】
（実施例２）
植物性原料として、原料全体に対し、約２０重量％の液状焼酎粕、約５０重量％の焼酎粕乾燥物を含むものを用いた。さらに動物性原料として、原料全体に対し、約３０重量％の、底引き網漁で得られたエビ・カニ等の甲殻類や底魚等を含む海産物を用いた。該液状焼酎粕は約１０８個／ｇ〜約１０９個／ｇの微生物群を含み、該微生物群は約７０重量％〜約９０重量％の受託番号：PTA-1773の微生物及び約３０重量％〜約１０重量％の受託番号：NITE-863の微生物から構成された
【００４４】
上記の植物性原料及び動物性原料を混合して十分に撹拌し発酵原料を得た。さらに該発酵原料の発酵を２段階行った。１段階目の発酵の条件は、５０℃〜６０℃で４〜５時間、２段階目の発酵の条件は、３０℃〜４０℃、６〜８時間とした。２段階目の発酵後に、発酵された発酵原料を乾燥し、本発明の機能性養殖飼料を得た。該機能性養殖飼料は約１０８個／ｇ〜約１０９個／ｇの微生物群を含み、該微生物群は約７０重量％〜約９０重量％の受託番号：PTA-1773の微生物及び約３０重量％〜約１０重量％の受託番号：NITE BP-863の微生物から構成された。
【００４５】
２．魚病発症の抑制能の評価
実施例１で作製した機能性養殖飼料の魚病の発生に対する抑制効果を検証した。実験魚にはマダイを用いた。実施例１の機能性養殖飼料を１重量％添着した群（１重量％）、５重量％添着した群（５重量％）、及び対照群（Cont.）、さらにE.tardaを感染させなかった群（Blank）の合計４群を設け、各群１５匹の体重約２０ｇのマダイの稚魚を実験水槽内で飼育した。実施例１の機能性養殖飼料は、ハンマーミルで微粉砕し、添着剤（アピファック社製）を用いて市販EP飼料に添着してマダイに供与した。１日１回飽食になるまで各飼料を供与した。飼育開始３１日目に、E.tardaを感染させなかった群（Blank）以外の群のマダイに対し、１．５７×１０７個体のE.tardaを含む溶液を投与してE.tardaをマダイに強制感染させ、各群の死亡数を比較した。
【００４６】
結果を図１に示す。対照群では、感染後１０日で多くのマダイが死亡した。一方、実施例１の機能性養殖飼料を１重量％添着した群、及び５重量％添着した群では、対照群に比べてマダイの死亡数が大幅に抑えられた。したがって、本発明の機能性養殖飼料は魚病の発生の抑制効果を有することが示された。
【００４７】
３．白血球貪食能の測定
さらに、実施例１の機能性養殖飼料を供与したマダイの白血球貪食能を測定した。実施例１の機能性養殖飼料は、ハンマーミルで微粉砕し、添着剤（アピファック社製）を用いて市販EP飼料に添着してマダイに供与した。実施例１の機能性養殖飼料を１重量％添着した群（１重量％）、５重量％添着した群（５重量％）、及び対照群（Cont.）を設け、飼育開始時魚体重約１００ｇの３００尾のマダイに対し、２日に１回１ｋｇの飼料を供与した。
【００４８】
飼育開始後１７０日目のマダイから血液を採取し、５０％モノ・ポリ分離溶液（大日本住友製薬社製）を用いて全血から白血球を分離した。分離した白血球に粒径３μｍのラテックスビーズを貪食させ、フローサイトメトリを用いて貪食細胞数を測定した。各群のマダイにおける、貪食細胞数が全細胞数に占める割合を図２に示す。実施例１で作製された機能性養殖飼料を供与したマダイは、対照群のマダイに対して白血球の貪食能が高いことから、自然免疫が活性化されていることが示された。したがって、本発明の機能性養殖飼料は、供与したマダイの自然免疫系を活性化させることが明らかとなった。
【００４９】
４．白血球貪食能の測定
さらに、実施例１の機能性養殖飼料を供与したマダイの白血球貪食能を測定した。実施例１の機能性養殖飼料は、ハンマーミルで微粉砕し、モイストペレットを作製した。モイストペレットの組成は、魚粉が５０重量％、大豆が２４重量％、小麦が２３．９重量％、ビタミンが１重量％、CMCが１．１重量％、水が５０重量％、魚油５重量％であり、さらに実施例１の機能性養殖飼料を０．００１重量％含有するもの、０．０１重量％含有するもの、０．１重量％含有するもの、１重量％含有するもの、とした。飼育開始時の尾叉長が約１７５ｍｍ、魚体重が約１３０ｇのマダイ各５尾ずつに上述の飼料を毎日飽食まで供与した。
【００５０】
飼育後のマダイから血液を採取し、フローサイトメトリを用いて貪食細胞数を測定した。各群のマダイにおける、貪食細胞数が全細胞数に占める割合を図３に示す。実施例１で作製された機能性養殖飼料を供与したマダイは、対照群のマダイに対して白血球の貪食能が高いことから、自然免疫が活性化されていることが示された。また、０．０１重量％含有する飼料と０．１重量％含有する飼料とでは貪食能に明らかに差異がみられた。
【００５１】
（実施例３）
植物性原料として、原料全体に対し、約４８重量％のコーヒー粕、約２１重量％の焼酎粕、約５重量％の大麦糠、約３重量％の米糠、動物性原料として、原料全体に対し、約２３重量％のマダイ加工残渣を用い、さらに、受託番号：PTA-1773の微生物及び受託番号：NITE-863の微生物を含む微生物群を用いて機能性養殖飼料を得た。
【００５２】
上記の植物性原料及び動物性原料を混合して十分に撹拌し発酵原料を得た。さらに該発酵原料の発酵を２段階行った。１段階目の発酵の条件は、６０℃〜７０℃で１０〜１２時間、２段階目の発酵の条件は、６０℃〜７０℃、２０〜２４時間とした。２段階目の発酵後に、発酵された発酵原料を乾燥し、本発明の機能性養殖飼料を得た。
【００５３】
５．魚病発症の抑制能の評価
続いて、実施例３の機能性養殖飼料による魚病発症の抑制能を海面養殖で評価した。実験魚にはマダイを用いて、試験区には実施例３の機能性養殖飼料を０．１重量％含む飼料を供与した。尾叉長の変化を図４に、魚体重の変化を図５に示す。いずれも実施例３の機能性養殖飼料を供与した試験区のマダイの成長が促進されたことから、本発明の機能性養殖飼料が成長促進剤としても用いることができることが示された。
【００５４】
さらに、試験開始後３月の脾臓重量及び脾臓体指数を図６に、白血球の貪食能を図７に示す。脾臓の重量及び脾臓体指数、貪食能共に実施例３の機能性養殖飼料を供与した試験区が高く、特に貪食能の差は大きくなった。以上の結果から、本発明の機能性養殖飼料は供与した魚類の免疫を高め、魚病発生を抑制する可能性があることが示された。
【受託番号】
【００５５】
ATCC
PTA-1773
【００５６】
NITE
BP-863
【特許請求の範囲】
【請求項１】
植物性原料と動物性原料とを含む発酵原料を、
複数の生物種の好熱性微生物を含む微生物群を用いて発酵することにより得られ、
魚病の発症を抑制する機能を有する、機能性養殖飼料
【請求項２】
前記発酵原料が、約７０重量％〜約８０重量％の前記植物性原料と約３０重量％〜約２０重量％の前記動物性原料とから構成される、
請求項１に記載の機能性養殖飼料
【請求項３】
前記微生物群が、受託番号：ATCC
PTA-1773の微生物、及び／又は受託番号：NITE BP-863の微生物を含む、
請求項１又は２に記載の機能性養殖飼料
【請求項４】
前記機能性養殖飼料が、該機能性養殖飼料１ｇ当たり約１０８個〜約１０９個の前記微生物群を含む、
請求項１〜３いずれか一項に記載の機能性養殖飼料
【請求項５】
前記魚病がエドワジエラ感染症である、
請求項１〜４いずれか一項に記載の機能性養殖飼料
【請求項６】
前記植物性原料が、米糠、麦糠、すふま、大豆粕、おから、酒粕、焼酎粕、茶粕、コーヒー粕、果実搾り粕、及び野菜搾り粕からなる群より選択される1又は複数を含む、
請求項１〜５いずれか一項に記載の機能性養殖飼料
【請求項７】
前記動物性原料が、甲殻類、魚類、甲殻類加工残渣、及び魚類加工残渣からなる群より選択される1又は複数を含む、
請求項１〜６いずれか一項に記載の機能性養殖飼料
【請求項８】
請求項１〜７いずれか一項に記載の機能性養殖飼料を約０．１重量％〜約５重量％含有する、
機能性養殖飼料
【請求項９】
請求項１〜７いずれか一項に記載の機能性養殖飼料を約１重量％〜約５重量％含有する、
機能性養殖飼料
【請求項１０】
植物性原料と動物性原料とを撹拌して発酵原料を得る撹拌工程、
及び、前記発酵原料を、受託番号：ATCC
PTA-1773の微生物、及び／又は受託番号：NITE BP-863の微生物を含む微生物群を用いて発酵する発酵工程、
を含む、機能性養殖飼料を製造する方法
【請求項１】
植物性原料と動物性原料とを含む発酵原料を、
複数の生物種の好熱性微生物を含む微生物群を用いて発酵することにより得られ、
魚病の発症を抑制する機能を有する、機能性養殖飼料
【請求項２】
前記発酵原料が、約７０重量％〜約８０重量％の前記植物性原料と約３０重量％〜約２０重量％の前記動物性原料とから構成される、
請求項１に記載の機能性養殖飼料
【請求項３】
前記微生物群が、受託番号：ATCC
PTA-1773の微生物、及び／又は受託番号：NITE BP-863の微生物を含む、
請求項１又は２に記載の機能性養殖飼料
【請求項４】
前記機能性養殖飼料が、該機能性養殖飼料１ｇ当たり約１０８個〜約１０９個の前記微生物群を含む、
請求項１〜３いずれか一項に記載の機能性養殖飼料
【請求項５】
前記魚病がエドワジエラ感染症である、
請求項１〜４いずれか一項に記載の機能性養殖飼料
【請求項６】
前記植物性原料が、米糠、麦糠、すふま、大豆粕、おから、酒粕、焼酎粕、茶粕、コーヒー粕、果実搾り粕、及び野菜搾り粕からなる群より選択される1又は複数を含む、
請求項１〜５いずれか一項に記載の機能性養殖飼料
【請求項７】
前記動物性原料が、甲殻類、魚類、甲殻類加工残渣、及び魚類加工残渣からなる群より選択される1又は複数を含む、
請求項１〜６いずれか一項に記載の機能性養殖飼料
【請求項８】
請求項１〜７いずれか一項に記載の機能性養殖飼料を約０．１重量％〜約５重量％含有する、
機能性養殖飼料
【請求項９】
請求項１〜７いずれか一項に記載の機能性養殖飼料を約１重量％〜約５重量％含有する、
機能性養殖飼料
【請求項１０】
植物性原料と動物性原料とを撹拌して発酵原料を得る撹拌工程、
及び、前記発酵原料を、受託番号：ATCC
PTA-1773の微生物、及び／又は受託番号：NITE BP-863の微生物を含む微生物群を用いて発酵する発酵工程、
を含む、機能性養殖飼料を製造する方法
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【公開番号】特開２０１２−１２０５２６（Ｐ２０１２−１２０５２６Ａ）
【公開日】平成２４年６月２８日（２０１２．６．２８）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１１−２１５７９５（Ｐ２０１１−２１５７９５）
【出願日】平成２３年９月３０日（２０１１．９．３０）
【新規性喪失の例外の表示】特許法第３０条第１項適用申請有り 発行者名：関東経済産業局 産業部 製造産業課 刊行物名：戦略的基盤技術高度化支援事業 研究開発成果事例集 平成２１年度補正予算採択事業 発行年月日：平成２２年７月
【国等の委託研究の成果に係る記載事項】（出願人による申告）平成２１年度、経済産業省、戦略的基盤技術高度化支援事業、産業技術強化法第１９条の適用を受ける特許出願
【出願人】（５０４１４７２５４）国立大学法人愛媛大学 (214)
【出願人】（５９８０９２９９３）京葉プラントエンジニアリング株式会社 (8)
【出願人】（５９７１４９９５１）株式会社三六九 (6)
【出願人】（５０１１７６３０３）日環科学株式会社 (10)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２４年６月２８日（２０１２．６．２８）
【国際特許分類】
【出願日】平成２３年９月３０日（２０１１．９．３０）
【新規性喪失の例外の表示】特許法第３０条第１項適用申請有り 発行者名：関東経済産業局 産業部 製造産業課 刊行物名：戦略的基盤技術高度化支援事業 研究開発成果事例集 平成２１年度補正予算採択事業 発行年月日：平成２２年７月
【国等の委託研究の成果に係る記載事項】（出願人による申告）平成２１年度、経済産業省、戦略的基盤技術高度化支援事業、産業技術強化法第１９条の適用を受ける特許出願
【出願人】（５０４１４７２５４）国立大学法人愛媛大学 (214)
【出願人】（５９８０９２９９３）京葉プラントエンジニアリング株式会社 (8)
【出願人】（５９７１４９９５１）株式会社三六九 (6)
【出願人】（５０１１７６３０３）日環科学株式会社 (10)
【Ｆターム（参考）】
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