本発明は、コンパニオン動物において歯周病を引き起こし、１６Ｓ ｒＲＮＡ ＤＮＡによって同定される新規細菌単離体、該細菌に含有されるポリヌクレオチド配列、こうしたポリヌクレオチド配列にコードされるポリペプチド、およびこうした細菌、ポリヌクレオチドまたはポリペプチドを含むワクチンに関する。やはり提供するのは、歯周病を治療し、そして予防するための方法、および歯周病を検出し、そして治療するためのキット、歯周病を検出し、そして予防するためのキットである。さらに、動物における歯周病に対するワクチンの有効性を評価するための方法を提供する。

【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の分野
本発明は、コンパニオン動物において歯周病を引き起こし、１６Ｓ ｒＲＮＡ ＤＮＡによって同定される新規細菌単離体、該細菌に含有されるポリヌクレオチド配列、こうしたポリヌクレオチド配列にコードされるポリペプチド、および不活化もしくは弱毒化されているこうした細菌単離体、ポリヌクレオチドまたはポリペプチドを含むワクチンに関する。やはり提供するのは、歯周病を治療し、そして予防するための方法、および歯周病を検出し、治療し、そして予防するためのキットである。さらに、動物における歯周病に対するワクチンの有効性を評価するための方法を提供する。
【背景技術】
【０００２】
背景技術
歯周病に関する実験データの大部分は、ヒトまたはヒトから単離された細菌の研究に基づく。非ヒト動物、例えばコンパニオン動物、そして特にイヌおよびネコなどにおける歯周病に関しては、比較的わずかしか知られていない。
【０００３】
歯周病は、歯を支持する組織に関連する感染群を含む。これらの重症度の範囲は、歯肉（歯茎）の軽度でそして可逆的な炎症から、最終的に歯の剥脱を伴う歯周組織（歯肉、歯周靱帯、および歯槽骨）の慢性破壊に渡る。
【０００４】
微生物学的な見地からは、この疾患のいくつかの特徴に興味が持たれる。細菌の病因は複雑であり、多様な生物がヒトにおける疾患の開始および進行の原因となる。これらの生物のうち、すべてでないとしても多くが、健康な個体の歯周にもまた存在しうるし、そして宿主と片利共生的な調和で存在しうる。したがって、疾患症状の発現は、例えば特定の生物の絶対数または相対数の改変、病原潜在能力の変化、または特定の宿主因子の調節の結果として、細菌および宿主の因子の間の生態学的バランスがシフトするのに続いて生じる可能性もある。局所環境は、歯肉縁上の歯表面および歯肉縁下の割れ目（疾患が進行するにつれて、歯周ポケット内に深くなっていく、歯根および歯肉間の溝）の構成要素微生物群に対して、多様なユニークな制限を課す。
【０００５】
歯の石灰化された硬い組織および歯肉の上皮細胞はどちらも、コロニー形成に利用可能である。これらの組織は、宿主唾液分泌および歯肉溝浸出液（血清浸出液）に曝露され、これらはどちらも、細菌と直接相互作用して、そして広く行き渡る環境条件を改変する分子を含有する。さらに、ヒトにおいて、歯および歯肉縁下領域のコロニー形成に成功した細菌は、これらの領域に宿する、多くの（６００を超える）他の細菌種と共存しなければならないことが知られる。したがって、ヒトにおける歯周病の病因の研究は、微小環境の生態学的な複雑さによって、困難になっている。
【０００６】
ヒトにおける歯周病の多様な徴候の分類は、常に変化しており、そして疾患の重症度、進行速度、および罹患している歯の数が変動し、そして乳歯発生後の異なる年齢群が感受性でありうることに言及すれば十分であろう。病原体の性質は、これらの疾患実体間で多様であり、それとともに、ヒト患者間で、そして患者内の異なる疾患部位間でさえ多様である。しかし、一般的に、重症な型の疾患は、いくつかのグラム陰性嫌気性細菌と関連する。この群のうち、ヒトでは、大部分の証拠が、ポルフィロモナス（Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ）（以前のバクテロイデス（Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ））・ジンジバリス（ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ）が病因に役割を果たすことを示す。この生物が存在することが、単独で、または他の細菌との混合感染としてのいずれかで作用して、そしておそらく有益な種が存在せず、そして宿主の特定の免疫学的応答が存在しないことと合わせて、疾患活性に必須であるようである。
【０００７】
口腔のコロニー形成は、細菌がまず、口に進入し、そして次いで、利用可能な表面に局在し、そして付着することを必要とする。細菌コロニー形成を予防するように機能する宿主因子には、唾液および歯肉溝浸出液流を伴う、舌の動きの機械的剪断力が含まれる。口腔コロニー形成に成功する細菌は、したがって、宿主防御機構を克服する、多様な特質を所持する。続いて、口の硬組織および柔組織上に集積する、固着性歯垢バイオフィルムは、多様な微生物種で構成される動的な系である。ヒトでは、Ｐ．ジンジバリスは、通常、口腔の後期または二次コロニー形成細菌の１つであり、必要な環境条件を生成する先行生物を必要とする。
【０００８】
ヒト口腔へのＰ．ジンジバリスの最初の進入は、感染した個体からの伝染によって起こると考えられる。したがって、他のベクターもまた、使用可能であるようである。これらの研究は、個体が、コロニー形成部位または臨床状態にかかわらず、単一の（または少なくとも主な）遺伝子型によってコロニー形成されることを示す。対照的に、多くの異なるクローン起源の株が、異なる個体に存在する。これは、Ｐ．ジンジバリスが、本質的に日和見病原体であり、病原性が特定のクローン種に限定されないという概念を裏付ける。
【０００９】
ヒト口腔は、Ｐ．ジンジバリスが接着可能な多様な表面を提供する。歯の石化した硬組織に加えて、歯肉、頬、および舌のものを含む粘膜表面がある。
上述のように、ヒトにおける歯周病に関しては、非常に多くが知られている一方、コンパニオン動物における同じ疾患に関しては、非常にわずかしか知られていない。Ｆｏｕｒｎｉｅｒ，Ｄ．ら，“Ｐｏｒｐｈｏｒｙｍｏｎａｓ ｇｕｌａｅ ｓｐ．ｎｏｖ．，ａｎ Ａｎａｅｒｏｂｉｃ，Ｇｒａｍ−ｎｅｇａｔｉｖｅ，Ｃｏｃｃｉｂａｃｉｌｌｕｓ ｆｒｏｍ ｔｈｅ Ｇｉｎｇｉｖａｌ Ｓｕｌｃｕｓ ｏｆ Ｖａｒｉｏｕｓ Ａｎｉｍａｌ Ｈｏｓｔｓ”，Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ａ Ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ ａｎｄ Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎａｒｙ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ（２００１），５１，１１７９−１１８９は、ＡＴＣＣ ５７１００と称するＰ．グラエ（Ｐ．ｇｕｌａｅ）新種の株を含む、多様な動物宿主から単離されたいくつかの株を記載する。著者らは、Ｐ．ジンジバリスの動物バイオタイプの株は、Ｐ．ジンジバリスとは異なるポルフィロモナス属種に相当すると仮定している。コンパニオン動物における歯周病を治療するのに有用なワクチンについての言及はない。ＨｉｒａｓａｗａおよびＴａｋａｄａ，“Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ ｇｉｎｇｉｖｉｃａｎｉｓ ｓｐ． ｎｏｖ． ａｎｄ Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ ｃｒｅｖｉｏｒｉｃａｎｉｓ ｓｐ． ｎｏｖ．， Ｉｓｏｌａｔｅｄ ｆｒｏｍ Ｂｅａｇｌｅｓ”，Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｓｙｓｔｅｍｉｃ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ，ｐｐ．６３７−６４０，（１９９４）は、ビーグル犬の歯肉溝浸出液から単離された２つの細菌種を記載する。これらの種は、米国特許第５，７１０，０３９号およびＵＳ ５，５６３，０６３に記載される。著者らは、歯周病を治療するワクチンにおけるこれらの種の使用をどこにも示唆していない。公開番号ＷＯ ９９／２９８７０を有する国際出願ＰＣＴ／ＡＵ９８／０１０２３は、多様なＰ．ジンジバリス・ポリペプチドおよびヌクレオチドを記載する。しかし、コンパニオン動物における歯周病を予防するのに有効なワクチンの証拠はまったく提供されない。ヒト疾患に関しては、非常に多くの情報があるが、ヒトにおいてさえ、この疾患を予防するかまたは治療する目的では、ほとんど達成されていない。
【００１０】
コンパニオン動物における歯周病を治療し、そして予防するための安全でそして有効なワクチンに対する必要性が依然としてある。
Ｇｅｎｃｏら（Ｔｒｅｎｄｓ ｉｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ ６：４４４−４４９，１９９８）は、ポルフィロモナス・ジンジビカニス（Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ ｇｉｎｇｉｖｉｃａｎｉｓ）が仲介する歯周病を調べるためのラット・モデルを記載する。Ｇｒｅｃｃａら（Ｊ．Ｅｎｄｏｄｏｎｔｉｃｓ ２７：６１０，２００１）は、誘導された歯根周囲歯周炎のイヌの歯を歯内治療した後、歯根周囲の修復のＸ線写真評価を記載する。
【００１１】
本発明以前には、定義され、そして定量的な方式で、１以上の歯周病原性細菌に対するワクチンの有効性を評価するために利用可能な動物モデルはまったくなかった。
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【００１２】
発明の概要
本発明は、細菌が、イヌ２０Ｂと称されるポルフィロモナス・ジンジバリスの株でないという条件で、配列番号８６〜９４からなる群より選択されるヌクレオチド配列を含む、１６Ｓ ｒＲＮＡ ＤＮＡ配列を有する、単離色素性嫌気性細菌を提供する。
【００１３】
１つの態様において、細菌は、イヌ２０Ｂと称されるポルフィロモナス・ジンジバリスの株でないという条件で、ポルフィロモナス・グラエ（Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ ｇｕｌａｅ）Ｂ４３、Ｐ．カンスルシ（Ｐ．ｃａｎｓｕｌｃｉ）Ｂ４６、Ｐ．シルクムデンタリア（Ｐ．ｃｉｒｃｕｍｄｅｎｔａｒｉａ）Ｂ５２、Ｐ．グラエＢ６９、Ｐ．シルクムデンタリアＢ９７、Ｐ．カンジンジバリス（Ｐ．ｃａｎｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ）Ｂ９８、Ｐ．サリボサ（Ｐ．ｓａｌｉｖｏｓａ）Ｂ１０４、Ｏ．デンティカニス（Ｏ．ｄｅｎｔｉｃａｎｉｓ）Ｂ１０６、およびＰ．エンドドンタリス（Ｐ．ｅｎｄｏｄｏｎｔａｌｉｓ）Ｂ１１４からなる群より選択される。
【００１４】
別の態様において、本発明は、直接、または他の病原体と組み合わされてのいずれかで、コンパニオン動物において歯周病を引き起こす、単離色素性嫌気性細菌であって、コンパニオン動物における歯周病を治療するかまたは予防するためのワクチンを調製するのに使用可能である、前記細菌を提供し、該ワクチンは、細菌がＡＴＣＣ ５１７００と称されるＰ．グラエ新種の株でないという条件で、不活化または弱毒化されている、少なくとも１つの細菌の免疫学的有効量を含む。好ましくは、細菌は、配列番号８６〜９４に示す配列いずれかに、少なくとも約９５％相同である１６Ｓ ｒＲＮＡ ＤＮＡ配列を有する。より好ましくは、細菌は、配列番号８６〜９４からなる群より選択されるヌクレオチド配列を含む１６Ｓ ｒＲＮＡ ＤＮＡ配列を有する。
【００１５】
別の態様において、本発明は、直接、または他の病原体と組み合わされてのいずれかで、コンパニオン動物において歯周病を引き起こす、単離色素性嫌気性細菌であって、コンパニオン動物における歯周病を治療するかまたは予防するためのワクチンを調製するのに使用可能である、前記細菌を提供し、該ワクチンは、コンパニオン動物における歯周病を予防するかまたは治療するためのワクチンとして免疫学的に有効な単離ポリペプチドを含み、該ポリペプチドは、細菌がＡＴＣＣ ５１７００と称されるＰ．グラエ新種の株でないという条件で、細菌から単離されたポリヌクレオチドにコードされる。好ましくは、細菌は、配列番号８６〜９４に示す配列いずれかに、少なくとも約９５％相同である１６Ｓ ｒＲＮＡ ＤＮＡ配列を有する。より好ましくは、細菌は、配列番号８６〜９４からなる群より選択されるヌクレオチド配列を含む１６Ｓ ｒＲＮＡ ＤＮＡ配列を有する。
【００１６】
さらなる態様において、本発明は、直接、または他の病原体と組み合わされてのいずれかで、コンパニオン動物において歯周病を引き起こす、単離色素性嫌気性細菌であって、コンパニオン動物における歯周病を治療するかまたは予防するためのワクチンを産生するのに使用可能である、前記細菌を提供し、該ワクチンは、コンパニオン動物における歯周病を予防するかまたは治療するためのワクチンとして免疫学的に有効なポリペプチドをコードする単離ポリヌクレオチド分子を含み、該ポリヌクレオチド分子は、細菌がＡＴＣＣ ５１７００と称されるＰ．グラエ新種の株でないという条件で、細菌から単離されている。好ましくは、細菌は、配列番号８６〜９４に示す配列いずれかに、少なくとも約９５％相同である１６Ｓ ｒＲＮＡ ＤＮＡ配列を有する。より好ましくは、細菌は、配列番号８６〜９４からなる群より選択されるヌクレオチド配列を含む１６Ｓ ｒＲＮＡ ＤＮＡ配列を有する。
【００１７】
コンパニオン動物は、好ましくはイヌまたはネコである。
別の側面において、本発明は、細菌がＡＴＣＣ ５１７００と称されるＰ．グラエ新種の株でないという条件で、ポルフィロモナス・グラエＢ４３、Ｐ．カンスルシＢ４６、Ｐ．シルクムデンタリアＢ５２、Ｐ．グラエＢ６９、Ｐ．シルクムデンタリアＢ９７、Ｐ．カンジンジバリスＢ９８、Ｐ．サリボサＢ１０４、Ｏ．デンティカニスＢ１０６、およびＰ．エンドドンタリスＢ１１４を同定する特徴を有する細菌からなる群より選択される細菌から単離されたヌクレオチド配列を含む、単離ポリヌクレオチド分子を提供する。
【００１８】
１つの態様において、単離ポリヌクレオチド分子は、ポルフィロモナス・グラエＢ４３、Ｐ．カンスルシＢ４６、Ｐ．シルクムデンタリアＢ５２、Ｐ．グラエＢ６９、Ｐ．シルクムデンタリアＢ９７、Ｐ．カンジンジバリスＢ９８、Ｐ．サリボサＢ１０４、Ｏ．デンティカニスＢ１０６、およびＰ．エンドドンタリスＢ１１４からなる群より選択される細菌から単離される。
【００１９】
別の態様において、単離ポリヌクレオチドは、ポリペプチドをコードする。
さらに別の態様において、単離ポリヌクレオチドは、リボソームＲＮＡまたはトランスファーＲＮＡをコードする。
【００２０】
さらにさらなる態様において、本発明は、ヌクレオチド配列がＡＴＣＣ ５１７００と称される細菌、Ｐ．グラエ新種由来の１６Ｓ ｒＲＮＡ ＤＮＡではないという条件で、配列番号８６〜９４、および該配列に少なくとも９５％の相同性を有する相同体からなる群より選択される、ヌクレオチド配列のいずれかを含む、単離ポリヌクレオチド分子を提供する。
【００２１】
好ましくは、単離ポリヌクレオチド分子は、コンパニオン動物における歯周病を予防するかまたは治療するためのワクチンとして免疫学的に有効なポリペプチドをコードする、配列番号９５〜１０２および１１１〜１１９（それぞれｆｉｍＡまたはｏｐｒＦ）からなる群より選択されるヌクレオチド配列、またはその相補体のいずれかを含む。
【００２２】
やはり好ましいのは、配列番号９５〜１０２、および１１１〜１１９に示すヌクレオチド配列、該配列に少なくとも９５％の相同性を有する相同体であって、その配列が、コンパニオン動物における歯周病を予防するかまたは治療するためのワクチンとして免疫学的に有効なポリペプチドをコードする、前記相同体、またはその相補体のいずれかを含む、単離ポリヌクレオチド分子である。
【００２３】
さらなる態様において、単離ポリヌクレオチド分子は、配列番号９５〜１０２および１１１〜１１９に示すヌクレオチド配列、または該配列の断片もしくは変異体のいずれかであって、コンパニオン動物における歯周病を予防するかもしくは治療するためのワクチンとして免疫学的に有効なポリペプチドをコードする、前記断片もしくは変異体、あるいはその相補体のいずれかを含む。
【００２４】
さらにさらなる態様において、単離ポリヌクレオチド分子は、高ストリンジェンシーの条件下で、配列番号９５〜１０２および１１１〜１１９に示す配列、またはその相補体のいずれかにハイブリダイズする、ヌクレオチド配列を含む。好ましくは、単離ポリヌクレオチド配列は、配列番号９５〜１０２に示す配列のいずれかから選択されるｆｉｍＡ、ｆｉｍＡに少なくとも約９５％、９８％または９９％の配列同一性を有する、ｆｉｍＡの断片または変異体の配列を含む。やはり好ましいのは、その配列が、配列番号１１１〜１１９に示す配列のいずれかから選択されるｏｐｒＦ、ｏｐｒＦに少なくとも約９５％、９８％または９９％の配列同一性を有する、ｏｐｒＦの断片または変異体の配列を含む、単離ポリヌクレオチド分子である。
【００２５】
好ましくは、本発明記載のポリヌクレオチド分子の断片または変異体は、該分子に少なくとも約９８％相同である。
別の態様において、本発明は、配列番号９５〜１０２に示す配列のいずれかから選択されるｆｉｍＡ、またはその相補体に、高ストリンジェンシーの条件下でハイブリダイズする、ヌクレオチド配列を含む、単離ポリヌクレオチド分子を提供する。
【００２６】
さらに別の態様において、本発明は、配列番号１１１〜１１９に示す配列のいずれかから選択されるｏｐｒＦ、またはその相補体に、高ストリンジェンシーの条件下でハイブリダイズする、ヌクレオチド配列を含む、単離ポリヌクレオチド分子を提供する。
【００２７】
本発明はまた、配列番号９５〜１０２および１０９〜１１９のヌクレオチド配列いずれかにコードされるポリペプチドいずれかの少なくとも約１０の隣接アミノ酸の配列を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列、またはその相補体を有する、ＤＮＡ分子に、非常にストリンジェントな条件下でハイブリダイズする、約３０ヌクレオチドのヌクレオチド配列を含む、単離ポリヌクレオチド分子も提供する。好ましくは、単離ポリヌクレオチド分子は、配列番号９５〜１０２および１１１〜１１９のヌクレオチド配列いずれかにコードされるポリペプチドいずれかの少なくとも約３０の隣接アミノ酸の配列を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列、またはその相補体を有する、ＤＮＡ分子に、高ストリンジェンシーの条件下でハイブリダイズする、少なくとも約９０ヌクレオチドを含む。
【００２８】
別の側面において、本発明は、異種プロモーターに機能可能であるように連結された、本発明記載の単離ポリヌクレオチドを提供する。単離ポリヌクレオチドは、原核細胞または真核細胞において活性である複製起点を、さらに含むことも可能である。
【００２９】
別の側面において、本発明は、プロモーター配列に機能可能であるように連結された、配列番号９５〜１０２および１１１〜１１９のヌクレオチド配列、その断片または変異体のいずれかからなる群より選択されるポリヌクレオチドを含む、組換え発現ベクターを提供する。
【００３０】
さらに別の側面において、本発明は、プロモーター配列に機能可能であるように連結された、配列番号９５〜１０２および１１１〜１１９のヌクレオチド配列、その断片または変異体のいずれかからなる群より選択されるポリヌクレオチドを含む、プラスミドを提供する。
【００３１】
さらなる側面において、本発明は、本発明記載の単離ポリヌクレオチド配列、ベクターまたはプラスミドを含む宿主細胞を提供する。
好ましくは、宿主細胞は大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＢＬ２１であり、そして前記ポリヌクレオチドは、発現ベクターｐＢＡＤ／ＨｉｓＡまたはλ発現プラスミドをさらに含む。
【００３２】
さらなる側面において、本発明は、配列番号１０３〜１１０または１２０〜１２８に示す配列のいずれかから選択される、組換えＦｉｍＡまたはＯｐｒＦ、あるいはその断片または変異体を産生するための方法であって、（１）請求項３６の細胞を、ＦｉｍＡ、ＯｐｒＦ、あるいはその断片または変異体を含むポリペプチドが発現される条件下で増殖させ、そして（２）前記ポリペプチドを回収することを含む、前記方法を提供する。ポリペプチドは、可溶性型または不溶性型で回収可能である。
【００３３】
別の側面において、本発明の単離ポリペプチドは、コンパニオン動物における歯周病を予防するかまたは治療するためのワクチンとして免疫学的に有効であり、そして配列番号１０３〜１１０および１２０〜１２８に示すアミノ酸配列を含む。
【００３４】
１つの態様において、コンパニオン動物における歯周病を予防するかまたは治療するためのワクチンとして免疫学的に有効な単離ポリペプチドは、配列番号１０３〜１１０および１２０〜１２８に示すアミノ酸配列、並びに該配列に少なくとも９５％、９８％、または９９％の配列同一性を有する相同体を含む。
【００３５】
別の態様において、コンパニオン動物における歯周病を予防するかまたは治療するためのワクチンとして免疫学的に有効な単離ポリペプチドは、配列番号１０３〜１１０および１２０〜１２８に示すアミノ酸配列、あるいはその断片または変異体を含む。
【００３６】
さらに別の態様において、コンパニオン動物における歯周病を予防するかまたは治療するためのワクチンとして免疫学的に有効な単離ポリペプチドは、配列番号９５〜１０２および１１１〜１１９に示す配列いずれかに、高ストリンジェンシーの条件下でハイブリダイズするヌクレオチド配列を含むＤＮＡ分子にコードされる、アミノ酸配列を有する。
【００３７】
さらにさらなる態様において、少なくとも約１０の隣接アミノ酸を含む、コンパニオン動物における歯周病を予防するかまたは治療するためのワクチンとして免疫学的に有効な単離ポリペプチドは、配列番号１０３〜１１０および１２０〜１２８のポリペプチド配列いずれかの断片を含み、該ポリペプチドは、コンパニオン動物における歯周病を予防するかまたは治療するためのワクチンとして、単独で、またはキャリアーに連結されてのいずれかで、免疫学的に有効である。好ましくは、単離ポリペプチドは、少なくとも約２５アミノ酸を含む。
【００３８】
好ましくは、コンパニオン動物における歯周病を予防するかまたは治療するための単離ポリペプチドは、ｆｉｍＡの配列（配列番号９５〜１０２）を含むヌクレオチド配列を含む、ＤＮＡ分子にコードされる。
【００３９】
やはり好ましくは、コンパニオン動物における歯周病を予防するかまたは治療するための単離ポリペプチドは、ｏｐｒＦの配列（配列番号１１１〜１１９）を含むヌクレオチド配列を含む、ＤＮＡ分子にコードされる。
【００４０】
好ましい態様において、単離ポリペプチドは、ＦｉｍＡ（配列番号１０３〜１１０）およびＯｐｒＦ（配列番号１２０〜１２８）からなる群より選択される、組換え発現ポリペプチドである。
【００４１】
別の態様において、組換え発現ポリペプチドは、キャリアー・ポリペプチドに融合される。融合ポリペプチドは、好ましくは、本質的にポリ・ヒスチジンまたはポリ・スレオニン配列である。
【００４２】
さらなる側面において、本発明は、コンパニオン動物における歯周病を治療するかまたは予防するためのワクチンであって、本発明記載の少なくとも１つの不活化色素性嫌気性細菌の免疫学的有効量、および薬学的に許容しうるキャリアーを含む、前記ワクチンを提供する。
【００４３】
別の態様において、本発明は、コンパニオン動物における歯周病を治療するかまたは予防するためのワクチンであって、少なくとも１つの不活化色素性嫌気性細菌の免疫学的有効量、少なくとも１つの他の細菌またはウイルス、および薬学的に許容しうるキャリアーを含む、前記ワクチンを提供する。
【００４４】
好ましい態様において、ワクチンは、少なくとも１つの不活化色素性嫌気性細菌の免疫学的有効量、少なくとも１つのイヌ・ジステンパーウイルス（ＣＤＶ）、イヌ・アデノウイルス−２（ＣＡＶ−２）、イヌ・パルボウイルス（ＣＰＶ）、イヌ・パラインフルエンザウイルス（ＣＰＩ）、またはイヌ・コロナウイルス（ＣＣＶ）、および薬学的に許容しうるキャリアーを含む。
【００４５】
別の側面において、本発明は、コンパニオン動物における歯周病を治療するかまたは予防するためのワクチンであって、少なくとも１つの本発明記載のポリヌクレオチド分子の免疫学的有効量、および薬学的に許容しうるキャリアーを含む、前記ワクチンを提供する。
【００４６】
さらに別の側面において、本発明は、コンパニオン動物における歯周病を治療するかまたは予防するためのワクチンであって、本発明記載の少なくとも１つのポリペプチドの免疫学的有効量、および薬学的に許容しうるキャリアーを含む、前記ワクチンを提供する。
【００４７】
好ましくは、コンパニオン動物における歯周病を治療するかまたは予防するためのワクチンは、免疫学的有効量のＦｉｍＡおよび薬学的に許容しうるキャリアーを含む。
やはり好ましいのは、免疫学的有効量のＯｐｒＦおよび薬学的に許容しうるキャリアーを含む、コンパニオン動物における歯周病を治療するかまたは予防するためのワクチンである。
【００４８】
本発明のワクチンで使用するための細菌は、ポルフィロモナス・グラエＢ４３、Ｐ．カンスルシＢ４６、Ｐ．シルクムデンタリアＢ５２、Ｐ．グラエＢ６９、Ｐ．シルクムデンタリアＢ９７、Ｐ．カンジンジバリスＢ９８、Ｐ．サリボサＢ１０４、Ｏ．デンティカニスＢ１０６、およびＰ．エンドドンタリスＢ１１４からなる群より選択可能である。
【００４９】
好ましい態様において、色素性嫌気性細菌は、Ｐ．グラエＢ４３、Ｐ．サリボサＢ１０４、およびＯ．デンティカニスＢ１０６である。
さらに別の態様において、本発明は、コンパニオン動物における歯周病を治療するかまたは予防するためのワクチン組成物であって、本発明記載の少なくとも１つの不活化単離色素性嫌気性細菌の免疫学的有効量、薬学的に許容しうるキャリアー、および場合によってアジュバントを含む、前記ワクチン組成物を提供する。
【００５０】
さらに別の態様において、本発明は、コンパニオン動物における歯周病を治療するかまたは予防するためのワクチン組成物であって、本発明記載の少なくとも１つのポリヌクレオチド分子の免疫学的有効量、薬学的に許容しうるキャリアー、および場合によってアジュバントを含む、前記ワクチン組成物を提供する。
【００５１】
さらにさらなる態様において、本発明は、コンパニオン動物における歯周病を治療するかまたは予防するためのワクチン組成物であって、本発明記載の少なくとも１つのポリペプチドの免疫学的有効量、薬学的に許容しうるキャリアー、および場合によってアジュバントを含む、前記ワクチン組成物を提供する。
【００５２】
別の側面において、本発明は、コンパニオン動物における歯周病を治療するかまたは予防するための方法であって、ワクチン組成物を投与する必要があるコンパニオン動物に、本発明記載のワクチン組成物を投与することを含む、前記方法を提供する。
【００５３】
別の側面において、本発明は、本発明の細菌、ポリペプチドまたはポリヌクレオチドに関して、試料を分析することによって、コンパニオン動物における歯周病を診断するための方法であって、該細菌、ポリペプチドまたはポリヌクレオチドの存在が疾患の指標となる、前記方法を提供する。好ましくは、分析工程には、ＰＣＲ、ハイブリダイゼーション、および抗体検出からなる群より選択される方法を用いて、試料を分析する工程が含まれる。
【００５４】
さらに別の側面において、本発明は、本発明の少なくとも１つの不活化単離色素性嫌気性細菌、ポリペプチド、またはポリヌクレオチドの有効量、および薬学的に許容しうるキャリアーを含む、コンパニオン動物における歯周病を治療し、そして予防するための組成物を、少なくとも１つの容器中に含むキットであって；該キットが、コンパニオン動物における歯周病を治療するかまたは予防するのに有用であることを示す、印刷した使用説明書セットをさらに含む、前記キットを提供する。キットは、前記組成物を分配するための手段をさらに含むことも可能である。
【００５５】
さらに別の側面において、本発明は、少なくとも１つの容器中に、配列番号８６〜９４、９５〜１０２、および１１１〜１１９に示すヌクレオチド配列いずれかの相補体に、非常にストリンジェントな条件下でハイブリダイズする、配列番号８６〜９４、９５〜１０２、および１１１〜１１９のいずれかから選択される、少なくとも約１５の隣接ヌクレオチドのヌクレオチド配列を含む、単離ＤＮＡ分子を含み、そして第二の容器中に、配列番号８６〜９４、９５〜１０２、および１１１〜１１９に示すヌクレオチド配列いずれかに、非常にストリンジェントな条件下でハイブリダイズする、配列番号８６〜９４、９５〜１０２、および１１１〜１１９に示すヌクレオチド配列いずれかの相補体から選択される、少なくとも約１５の隣接ヌクレオチドのヌクレオチド配列を含む、単離ＤＮＡ分子を含む、第二の単離ＤＮＡ分子を含む、キットを提供し、該キットはさらに、該キットが、ポルフィロモナス属種の検出に有用であることを示す、使用説明書セットを含む。こうした方法は、一般的に、ヒトを含むすべての哺乳動物において使用可能である。
【００５６】
さらに別の側面において、本発明は、少なくとも１つの容器中に、配列番号９５〜１０２および１１１〜１１９のヌクレオチド配列いずれかにコードされる、少なくとも３０の隣接アミノ酸を含むアミノ酸配列を有するタンパク質、およびキットがポルフィロモナス属種の検出に有用であることを示す説明書を含む、キットを提供する。該キットはさらに、第二のポリペプチドを含むことも可能であり、ここで第二のポリペプチドは、比色または を触媒する酵素にコンジュゲート化された抗体である。酵素は、好ましくは、アルカリ・ホスファターゼおよび西洋ワサビ（ｈｏｒｓｅｒａｄｉｓｈ）・ペルオキシダーゼからなる群より選択される。キットは、比色アッセイまたは化学発光アッセイのための試薬をさらに含むことも可能である。
【００５７】
さらなる側面において、本発明は、少なくとも１つの容器中に、配列番号８６〜９４、９５〜１０２、および１１１〜１１９のいずれかから選択される、少なくとも約１５の隣接ヌクレオチドのヌクレオチド配列、またはその相補体を含む、単離ＤＮＡ分子を含む、ハイブリダイゼーションキットを提供し、ここでハイブリダイゼーションはポルフィロモナス属種に特異的であり、そして該キットはさらに、該キットがポルフィロモナス属種の検出に有用であることを示す使用説明書セットを含む。好ましくは、ハイブリダイゼーションは、非常にストリンジェントな条件下で行われる。
【００５８】
さらにさらなる側面において、本発明は、動物において、特にイヌにおいて、１以上の歯周病原性細菌に対するワクチンの有効性を評価する方法を提供する。
さらにさらなる側面において、本発明は、１以上の歯周病原性細菌に対するワクチンの有効性を評価する方法であって、動物において測定される臨床徴候が、歯肉溝浸出液、歯垢、感染した骨、または歯肉溝中の１以上の歯周病原性細菌レベルの増加、あるいはＸ線写真測定を介して定量化される歯槽骨（ａｖｅｏｌａｒ ｂｏｎｅ）量の変化を含む、前記方法を提供する。
【００５９】
本発明の細菌、ポリヌクレオチド、ポリペプチド、ワクチン、ワクチン組成物まはたキットはいずれも、ＡＴＣＣ ５７１００と称されるＰ．グラエ新種株を含めて、Ｆｏｕｒｎｉｅｒ，Ｄ．ら，“Ｐｏｒｐｈｏｒｙｍｏｎａｓ ｇｕｌａｅ ｓｐ． ｎｏｖ．，ａｎ Ａｎａｅｒｏｂｉｃ，Ｇｒａｍ−ｎｅｇａｔｉｖｅ，Ｃｏｃｃｉｂａｃｉｌｌｕｓ ｆｒｏｍ ｔｈｅ Ｇｉｎｇｉｖａｌ Ｓｕｌｃｕｓ ｏｆ Ｖａｒｉｏｕｓ Ａｎｉｍａｌ Ｈｏｓｔｓ”，Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ａ Ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ ａｎｄ Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎａｒｙ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ（２００１）， ５１，１１７９−１１８９、ＨｉｒａｓａｗａおよびＴａｋａｄａ，“Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ ｇｉｎｇｉｖｉｃａｎｉｓ ｓｐ． ｎｏｖ． ａｎｄ Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ ｃｒｅｖｉｏｒｉｃａｎｉｓ ｓｐ． ｎｏｖ．，Ｉｓｏｌａｔｅｄ ｆｒｏｍ Ｂｅａｇｌｅｓ”，Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｓｙｓｔｅｍｉｃ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ，ｐｐ．６３７−６４０，（１９９４）、米国特許第５，７１０，０３９号またはＵＳ ５，５６３，０６３、あるいは公開番号ＷＯ ９９／２９８７０を有する国際出願ＰＣＴ／ＡＵ９８／０１０２３に記載される、細菌、ポリヌクレオチドまたはペプチドのいずれをも含まない。
【００６０】
発明の詳細な説明
細菌単離体
本発明は、１６Ｓ ｒＲＮＡ ＤＮＡ配列によって同定される、単離嫌気性細菌であって、コンパニオン動物において、歯周病、並びに多様な他の疾患および臨床徴候を引き起こす、前記細菌を提供する。より具体的には、細菌は、ポルフィロモナス属から選択される。
【００６１】
好ましくは、本発明の単離細菌には、Ｐ．グラエＢ４３、Ｐ．カンスルシＢ４６、Ｐ．シルクムデンタリアＢ５２、Ｐ．グラエＢ６９、Ｐ．シルクムデンタリアＢ９７、Ｐ．カンジンジバリスＢ９８、Ｐ．サリボサＢ１０４、Ｏ．デンティカニスＢ１０６、およびＰ．エンドドンタリスＢ１１４が含まれるが、他の種または株が本発明に含まれる。好ましい態様において、本発明の単離細菌は、配列番号８６〜９４に示す１６Ｓ ｒＲＮＡ ＤＮＡ配列によって同定可能である。
【００６２】
本発明の細菌での感染によって引き起こされる疾患には、限定されるわけではないが、コンパニオン動物歯周病、コンパニオン動物の口の悪臭（口臭）、ウシ腐蹄症、イヌ冠状動脈性心疾患およびイヌ全身感染が含まれる。ポルフィロモナス属内の細菌はまた、多様なヒト疾患にも関連付けられてきており、これらの疾患には、冠状動脈性心疾患、耳下腺炎、口の悪臭、歯肉炎、歯周炎、脳卒中、アテローム性動脈硬化症、高脂血症、細菌性膣疾患、子宮内胎児発育遅延（ＩＵＧＲ）、および低体重乳児の早産の発生率増加が含まれる。
【００６３】
本発明は、ポルフィロモナス属種の単離ポリヌクレオチドおよび単離ポリペプチド分子を提供する。より具体的には、本発明は、ポルフィロモナス属種ｆｉｍＡ遺伝子およびｏｐｒＦ遺伝子またはその縮重変異体のヌクレオチド配列を有する単離ポリヌクレオチド分子、並びにそれぞれ、こうした遺伝子にコードされるＦｉｍＡタンパク質およびＯｐｒＦタンパク質のアミノ酸配列を有する単離ポリペプチド分子を提供する。
【００６４】
本発明はまた、既知の標準的同定アルゴリズムいずれかを用いて決定されるような、配列番号９５〜１０２および１１１〜１１９のいずれかに対して、少なくとも約９０％の相同性、好ましくは少なくとも約９５％、そして最も好ましくは少なくとも９９％の配列同一性を有するポリヌクレオチド配列も提供する。さらに、本発明は、配列番号９５〜１０２および１１１〜１１９に示すポリヌクレオチド配列いずれかの相補体に、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチド配列を提供する。
【００６５】
別の特定の態様において、配列番号８６〜１０２および１１１〜１１９に示すポリヌクレオチド配列、またはその相補体のいずれかに、高ストリンジェンシーの条件下でハイブリダイズ可能な核酸を提供する。例えば、そして限定ではなく、９０ヌクレオチドを超えるハイブリダイゼーション領域に対する、こうした高ストリンジェンシー条件を用いる方法は、以下のとおりである。ＤＮＡを含有するフィルターのプレハイブリダイゼーションを、６ｘＳＳＣ、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、１ｍＭ ＥＤＴＡ、０．０２％ＰＶＰ、０．０２％Ｆｉｃｏｌｌ、０．０２％ＢＳＡ、および５００μｇ／ｍｌ変性サケ精子ＤＮＡで構成される緩衝液中、６５℃で８時間〜一晩行う。１００μｇ／ｍｌ変性サケ精子ＤＮＡおよび５〜２０ｘ１０^６ｃｐｍの^３２Ｐ標識プローブを含有するプレハイブリダイゼーション混合物中、フィルターを６５℃で４８時間ハイブリダイズさせる。２ｘＳＳＣ、０．０１％ＰＶＰ、０．０１％Ｆｉｃｏｌｌ、および０．０１％ＢＳＡを含有する溶液中、フィルターの洗浄を３７℃で１時間行う。これに続いて、０．１ｘＳＳＣ中、５０℃で４５分間洗浄した後、オートラジオグラフィーを行う。
【００６６】
使用可能な、高ストリンジェンシーの他の条件は、核酸の性質（例えば長さ、ＧＣ含量など）およびハイブリダイゼーションの目的（検出、増幅など）次第であり、そして当該技術分野に周知である。例えば、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）において、相補配列へのおよそ１５〜４０塩基のオリゴヌクレオチドのストリンジェントなハイブリダイゼーションは、以下の条件下で行われる：５０ｍＭ ＫＣｌの塩濃度、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌの緩衝液濃度、１．５ｍＭのＭｇ^２＋濃度、７〜７．５のｐＨ、および５５〜６０℃のアニーリング温度。
【００６７】
好ましい特定の態様において、ハイブリダイゼーション後の洗浄条件は以下のとおりである。各膜を、４０ｍＭリン酸ナトリウム、ｐＨ７．２、５％ＳＤＳ、１ｍＭ ＥＤＴＡ、０．５％ウシ血清アルブミン中、４５℃で各３０分間、各２回洗浄し、その後、リン酸ナトリウム、ｐＨ７．２、１％ＳＤＳ、１ｍＭ ＥＤＴＡ中、各３０分間、４回洗浄する。高ストリンジェンシー・ハイブリダイゼーションのため、膜をさらに、４０ｍＭリン酸ナトリウム、ｐＨ７．２、１％ＳＤＳ、１ｍＭ ＥＤＴＡ中、５５℃で各３０分間、４回の洗浄、その後、リン酸ナトリウム、ｐＨ７．２、１％ＳＤＳ、１ｍＭ ＥＤＴＡ中、６５℃で各３０分間、４回の洗浄に供する。
【００６８】
本発明はさらに、療法的に有効な量でコンパニオン動物に投与した際、コンパニオン動物における歯周病を治療するかまたは予防する（すなわち歯周病に対する抵抗性を与える）のに有用な、ワクチンおよびワクチン配合物を提供する。
【００６９】
１つの態様において、本発明は、少なくとも１つの弱毒化（修飾生）または不活化全細胞ポルフィロモナス属種調製物（バクテリン）を含む、ワクチンを提供する。好ましい態様において、本発明は、少なくとも３つのポルフィロモナス属種、例えばＰ．グラエＢ４３、Ｐ．サリボサＢ１０４およびＯ．デンティカニスＢ１０６の組み合わせの不活化全細胞調製物を含有する、ワクチンを提供する。ホルマリン、二元性エチレンイミン（ＢＥＩ）またはベータ−プロピオラクトンなどの多様な剤を用いて、細菌細胞を不活化することも可能である。好ましくは、不活化剤として、ホルマリンを用いる。
【００７０】
別の態様において、ワクチンは、免疫応答を誘導可能なポルフィロモナス属種のサブユニット分画を含む。
好ましい態様において、本発明のワクチンは、１以上のサブユニット・ポリペプチド、またはその断片もしくは変異体、あるいは１以上の単離ポリヌクレオチド配列、またはその断片もしくは変異体を含む。
【００７１】
弱毒化（修飾生）または不活化ワクチン（バクテリン）、あるいは単離サブユニット・ポリペプチド、あるいは単離ポリヌクレオチドは、適合するアジュバント、希釈剤またはキャリアーなどの他の既知のワクチン配合構成要素と組み合わせて存在することも可能である。
【００７２】
定義および略語
用語「ＯＲＦ」は「オープンリーディングフレーム」、すなわち遺伝子のコード領域を示す。
【００７３】
用語、ヌクレオチド配列およびポリペプチド配列の「配列同一性パーセント」は、比較ウインドウに渡って、２つの最適並列配列を比較することによって決定され、ここで最適並列は、最高順位のマッチを提供し、そして試験配列または参照配列に対して、ヌクレオチド付加またはアミノ酸付加を導入することも可能である。同一性パーセントは、全配列に渡って、各位の試験配列および参照配列間で同一であるヌクレオチドの割合を計算することによって決定される。最適配列並列および同一性パーセントを手動で決定することも可能であるし、またより好ましくは、限定されるわけではないが、ＴＢＬＡＳＴＮ、ＢＬＡＳＴＰ、ＦＡＳＴＡ、ＴＦＡＳＴＡ、ＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、およびＣＬＵＳＴＡＬＷ（Ａｌｔｓｃｈｕｌら，１９９０，Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ．，２１５（３）：４０３−１０；ＰｅａｒｓｏｎおよびＬｉｐｍａｎ，１９８８，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８５（８）：２４４４−８；Ｔｈｏｍｐｓｏｎら，１９９４，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，２２（２２）：４６７３−８０；Ｄｅｖｅｒｅｕｘら，１９８４，Ｎｕｃ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，１２：３８７−３９５）；Ｈｉｇｇｉｎｓら，１９９６，Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．，２６６：３８３−４０２）を含む、コンピュータ・アルゴリズムによって決定することも可能である。好ましくは、デフォルト・パラメータに設定したＮＣＢＩ Ｂｌａｓｔサーバー（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ）を用いて、相同配列に関して、多数のデータベースを検索する。
【００７４】
用語「異種」は、本明細書において、異なる細菌種または株から得られることを意味する。
用語「相同性」、「相同」等は、本明細書において、ポリヌクレオチド配列またはポリペプチド配列間で共有される同一性の度合いを意味する。
【００７５】
用語「相同」は、細菌種に関して用いた場合、同じ細菌種または株を意味する。
用語「宿主細胞」は、本明細書において、プラスミド、ウイルス、または他のベクターを宿する細菌または真核細胞を意味する。
【００７６】
用語「単離」は、本明細書において、天然存在環境から取り除かれ、単独で存在するか、あるいは異種宿主細胞、または染色体またはベクター（例えばプラスミド、ファージなど）中にあるかいずれかであることを意味する。
【００７７】
用語「単離嫌気性細菌」、「単離細菌」、「単離細菌株」等は、細菌が、他の微生物を実質的に含まない、例えば培養中にある、天然存在環境から分離されている場合などの組成物を指す。
【００７８】
用語「単離ポリヌクレオチド」は、単離ヌクレオチドが、組成物の少なくとも重量５０％を構成する組成物を示す。より好ましくは、単離ポリヌクレオチドは、組成物の重量の約９５％、そして最も好ましくは、約９９％を構成する。
【００７９】
用語「単離ポリペプチド」は、単離ポリペプチドが、組成物の少なくとも重量５０％を構成する組成物を示す。より好ましくは、単離ポリペプチドは、組成物の重量の約９５％、そして最も好ましくは、約９９％を構成する。
【００８０】
用語「機能的に同等である」は、本明細書において、コンパニオン動物において歯周病を引き起こす細菌によって産生される天然ポリペプチドに対して特異的な抗体に認識されることが可能な組換えポリペプチド、あるいは内因性細菌由来の天然タンパク質のものと実質的に類似の免疫学的応答を誘発するかまたは引き起こすことが可能な組換えポリペプチドを指す。したがって、機能的に同等なポリペプチドに対して作成された抗体はまた、コンパニオン動物において歯周病を引き起こす細菌によって産生される天然ポリペプチドも認識する。
【００８１】
用語「免疫原性」は、タンパク質またはポリペプチドが、コンパニオン動物における歯周病を引き起こす細菌に対して特異的に向けられる免疫応答を誘発する能力を指す。
用語「抗原性」は、タンパク質またはポリペプチドが、該タンパク質またはポリペプチドに対して作成された抗体に免疫特異的に結合される能力を指す。
【００８２】
用語「抗体」は、本明細書において、抗原に結合可能な免疫グロブリン分子を指す。抗体は、ポリクローナル混合物であることもまたはモノクローナルであることも可能である。抗体は、天然供給源由来または組換え供給源由来の損なわれていない（ｉｎｔａｃｔ）免疫グロブリンであることも可能であるし、あるいは損なわれていない免疫グロブリンの免疫反応性部分であることも可能である。抗体は、例えば、Ｆｖ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）_２、並びに一本鎖を含む、多様な型で存在することも可能である。
【００８３】
用語「コンパニオン動物」は、本明細書において、ペットと見なされる捕獲された非ヒト動物いずれかを指す。これらには、限定されるわけではないが、イヌ、ネコ、ウマ、ヒツジ、ウサギ、サル、並びにマウス、ラット、ハムスター、アレチネズミ（ｇｅｒｂｉｌ）、およびフェレットを含むげっ歯類が含まれることも可能である。
【００８４】
用語「防御」、「防御する」等は、本明細書においてワクチンに関して用いる場合、ワクチン中で用いられる抗原（単数または複数）が由来する生物によって引き起こされる疾患の症状を、該ワクチンが予防するかまたは減少させることを意味する。用語「防御」および「防御する」等はまた、ワクチンを用いて、被験者に既に存在する疾患または該疾患の１以上の症状を「治療」可能であることも意味する。
【００８５】
用語「療法的有効量」は、投与された被験者において、免疫応答を誘発するのに十分な細菌、またはサブユニット（例えばポリペプチド、ポリヌクレオチド配列）およびその組み合わせの量を指す。免疫応答は、限定なしに、細胞性免疫および／または体液性免疫の誘導を含むことも可能である。
【００８６】
用語「感染を予防する」は、コンパニオン動物において歯周病を引き起こす細菌の複製を予防するかまたは阻害するか、細菌の伝染を阻害するか、あるいは宿主において細菌が自身を確立するのを予防するか、あるいは感染によって引き起こされる疾患症状を軽減することを意味する。治療は、細菌負荷の減少がある場合、療法性であると見なされる。
【００８７】
用語「薬学的に許容しうるキャリアー」は、活性成分の生物学的活性の有効性に干渉せず、そして投与される被験者に毒性でないキャリアー媒体を指す。
用語「療法剤」は、細菌感染、あるいはそれによって引き起こされる疾患または状態の治療を補助する、分子、化合物または治療いずれか、好ましくは抗細菌分子または化合物を指す。
【００８８】
用語「その断片または変異体」は、本発明記載の部分的ヌクレオチド配列またはアミノ酸配列を指す。好ましくは、本発明で提供されるポリペプチドの断片または変異体は、コンパニオン動物において、体液性免疫応答および／または細胞性免疫応答を誘発することが可能である。類似体が、用語「その断片または変異体」に含まれる。ヌクレオチド残基の欠失、挿入または置換である、１以上の突然変異を所持しうる、突然変異体ポリヌクレオチドが、用語「その断片または変異体」に含まれる。アレル変異体が、用語「その断片または変異体」に含まれる。
【００８９】
ポルフィロモナス属種の単離および性質決定
既知の試料採取、培養および単離技術を用いて、本発明が提供する細菌を得ることも可能である。例えば、歯周病を示すコンパニオン動物集団から、例えばイヌおよびネコから、微生物試料を得ることも可能である。＞３ｍｍの歯周ポケットを持つイヌおよび＞２ｍｍの歯周ポケットを持つネコなど、既知の目安を用いて、歯周病の証拠を観察することも可能である。コンパニオン動物の標本集団に関して、歯科指数（歯肉指数および歯周疾患指数）および歯周ポケットの深さなどの、歯周病を性質決定するための既知のパラメータを決定することも可能である。特定の動物の歯周ポケットから、個々の試料を得て、嫌気性条件下で維持し、そして多様な既知の培地を用いて培養することも可能である。
【００９０】
いくつかの生化学試験、および１６Ｓ ｒＲＮＡ ＤＮＡ配列分析などの既知の技術を用いて、臨床単離体を性質決定して、その属および種を決定することも可能である。個々の単離体をプレートに移して、そして抗生物質ディスク（Ａｎａｅｒｏｂｅ Ｓｙｓｔｅｍｓ）を寒天表面に置いて、各単離体の抗生物質耐性パターンを決定することも可能である。精製コロニーを既知のインドールおよびカタラーゼ試験に供することもまた可能である（Ａｎａｅｒｏｂｅ Ｓｙｓｔｅｍｓ）。個々の単離体に関して、リパーゼおよびレシチナーゼ産生パターンを決定することも可能である。
【００９１】
１６Ｓ ｒＲＮＡ ＤＮＡ配列に基づいて、単離体のタイプを決定することも可能である。例えばプライマーＤ００５６およびＤ００５７（配列番号１および配列番号２；表１）を用いた、１６Ｓ ｒＲＮＡ領域のポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）増幅のテンプレートとして、個々のよく単離されたコロニーを利用することも可能である。利用可能なＰＣＲ調製キット（Ｐｒｏｍｅｇａ社；ウィスコンシン州マディソン）を用いて、生じたＰＣＲ産物を精製し、そして単離体ごとにプールすることも可能である。次いで、精製ＰＣＲ産物を脱塩し、そしてＤＮＡ配列分析に供することも可能である。生じたＤＮＡ配列を用いて、入手可能なＤＮＡデータベースを検索することも可能である。次いで、データベース検索によって同定された最も近いマッチに基づいて、細菌単離体のタイプを決定することも可能である。
【００９２】
表１．ＤＮＡ配列同定リスト。すべてのオリゴヌクレオチド・プライマーは、Ｇｉｂｃｏ−ＢＲＬ（米国）またはＬａｒｋ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｉｎｃ．（米国）のいずれかによって合成された。
【００９３】
【表１−１】

【００９４】
【表１−２】

【００９５】
【表１−３】

【００９６】
【表１−４】

【００９７】
【表１−５】

【００９８】
【表１−６】

【００９９】
【表１−７】

【０１００】
【表１−８】

【０１０１】
【表１−９】

【０１０２】
【表１−１０】

【０１０３】
【表１−１１】

【０１０４】
【表１−１２】

【０１０５】
【表１−１３】

【０１０６】
【表１−１４】

【０１０７】
【表１−１５】

【０１０８】
【表１−１６】

【０１０９】
【表１−１７】

【０１１０】
【表１−１８】

【０１１１】
【表１−１９】

【０１１２】
【表１−２０】

【０１１３】
【表１−２１】

【０１１４】
【表１−２２】

【０１１５】
【表１−２３】

【０１１６】
【表１−２４】

【０１１７】
【表１−２５】

【０１１８】
【表１−２６】

【０１１９】
【表１−２７】

【０１２０】
【表１−２８】

【０１２１】
【表１−２９】

【０１２２】
【表１−３０】

【０１２３】
【表１−３１】

【０１２４】
【表１−３２】

【０１２５】
【表１−３３】

【０１２６】
【表１−３４】

【０１２７】
【表１−３５】

【０１２８】
【表１−３６】

【０１２９】
【表１−３７】

【０１３０】
【表１−３８】

【０１３１】
【表１−３９】

【０１３２】
【表１−４０】

【０１３３】
【表１−４１】

【０１３４】
注：小文字のヌクレオチドは、ターゲットＤＮＡ配列には存在しない。これらは、クローニングを補助するため、プライマーの５’領域に付加されている。ＮＡ、該当なし。
以下のコンパニオン動物歯周単離体が、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（ＡＴＣＣ）， １０８０１ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｂｌｖｄ．， Ｍａｎａｓｓａｓ， ＶＡ， ２０１１０， ＵＳＡに、２００１年８月９日に寄託された：Ｐ．グラエＢ４３（ＰＴＡ−３６１８）、Ｐ．カンスルシＢ４６（ＰＴＡ−３６１９）、Ｐ．シルクムデンタリアＢ５２（ＰＴＡ−３６２０）、Ｐ．グラエＢ６９（ＰＴＡ−３６２１）、Ｐ．シルクムデンタリアＢ９７（ＰＴＡ−３６２２）、Ｐ．カンジンジバリスＢ９８（ＰＴＡ−３６２３）、Ｐ．サリボサＢ１０４（ＰＴＡ−３６２４）、Ｏ．デンティカニスＢ１０６（ＰＴＡ−３６２５）、およびＰ．エンドドンタリスＢ１１４（ＰＴＡ−３６２６）。本発明の好ましい態様において、本発明の単離ポリヌクレオチド分子は、配列番号８６〜１０２および１１１〜１１９からなる群より選択されるヌクレオチド配列を有する。本発明の好ましいポリペプチドは、配列番号１０３〜１１０および１２０〜１２８からなる群より選択されるアミノ酸配列を有する。
【０１３５】
ポルフィロモナス属ヌクレオチド配列のクローニング
本発明のポルフィロモナス属ヌクレオチド配列をクローニングするのに使用可能な、いくつかの既知の方法または技術がある。例えば、制限断片として配列を単離して、そしてクローニングおよび／または発現ベクターにクローニングすることも可能であるし、配列をＰＣＲ増幅し、そしてクローニングおよび／または発現ベクターにクローニングすることも可能であるし、またはこれらの２つの方法の組み合わせによって、配列をクローニングすることも可能である。
【０１３６】
当該技術分野に知られ、そして特に記載しない標準的分子生物学技術は、Ｓａｍｂｒｏｏｋら，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，ニューヨーク（１９８９）；Ａｕｓｕｂｅｌら，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ，メリーランド州ボルチモア（１９８９）；Ｐｅｒｂａｌ，Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，ニューヨーク（１９８８）；Ｗａｔｓｏｎら，Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ＤＮＡ，Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｂｏｏｋｓ，ニューヨーク；Ｂｉｒｒｅｎら（監修） Ｇｅｎｏｍｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ Ｓｅｒｉｅｓ，Ｖｏｌｓ．１−４ Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，ニューヨーク（１９９８）；並びに米国特許第４，６６６，８２８号；第４，６８３，２０２号；第４，８０１，５３１号；第５，１９２，６５９号および第５，２７２，０５７号に示される方法論に記載されるように一般的に理解されうる。ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）は、ＰＣＲ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ：Ａ Ｇｕｉｄｅ Ｔｏ Ｍｅｔｈｏｄｓ Ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，カリフォルニア州サンディエゴ（１９９０）に記載されるように行われる。
【０１３７】
本発明のポリヌクレオチドのクローニングおよび配列決定に有用な方法の例を、実施例に提供する。
ｆｉｍＡおよびｏｐｒＦがコードするポリペプチドおよびタンパク質
本発明は、本発明のヌクレオチド配列によって発現される組換えポリペプチドの、一部切除（ｔｒｕｎｃａｔｅｄ）型および全長（天然タンパク質）型の両方を発現するのに使用可能な、ベクターおよび宿主細胞を含む、原核発現系および真核発現系の使用を含む。
【０１３８】
本発明の好ましい態様において、本発明の単離ポリヌクレオチド分子は、配列番号９５〜１０２および１１１〜１１９の配列またはその縮重変異体の１つから選択され；そしてそれぞれ、配列番号１０３〜１１０および１２０〜１２８のアミノ酸配列から選択される、対応するポリペプチドをコードする、ヌクレオチド配列を有する。
【０１３９】
多様な宿主発現ベクター系を利用して、本発明のポリペプチドを発現させることも可能である。こうした宿主発現系はまた、目的のコード配列をクローニングし、そして続いて精製することも可能なビヒクルにも相当する。本発明はさらに、適切なベクターまたはヌクレオチド配列で形質転換されるかまたはトランスフェクションされた際に、コードされる本発明のポリペプチド遺伝子産物を発現することが可能である、宿主細胞を提供する。こうした宿主細胞には、限定されるわけではないが、コード配列を含有する組換えバクテリオファージＤＮＡ、プラスミドＤＮＡまたはコスミドＤＮＡ発現ベクターで形質転換された細菌（例えば大腸菌、枯草菌（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ））などの微生物；遺伝子産物コード配列を含有する組換え酵母発現ベクターで形質転換された酵母（例えばサッカロミセス属（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）、ピキア属（Ｐｉｃｈｉａ））；コード配列を含有する組換えウイルス発現ベクター（例えばバキュロウイルス）に感染した昆虫細胞系；コード配列を含有する組換えウイルス発現ベクター（例えばカリフラワーモザイクウイルス、ＣａＭＶ；タバコモザイクウイルス、ＴＭＶ）に感染したか、または組換えプラスミド発現ベクター（例えばＴｉプラスミド）で形質転換された植物細胞系；あるいは哺乳動物細胞ゲノム由来のプロモーター（例えばメタロチオネイン・プロモーター）または哺乳動物ウイルス由来のプロモーター（例えばアデノウイルス後期プロモーター；ワクシニアウイルス７．５Ｋプロモーター）を含有する組換え発現構築物を宿する哺乳動物細胞系（例えばＣＯＳ、ＣＨＯ、ＢＨＫ、２９３、３Ｔ３）が含まれる。
【０１４０】
好ましい態様において、発現系は細菌系である。発現される産物に関して意図される使用に応じて、いくつかの発現ベクターを好適に選択することも可能である。例えば、ワクチン組成物を生成するため、または抗体を作成するため、多量のこうしたポリペプチドを産生しようとする場合、例えば、容易に精製される融合タンパク質産物の高レベルの発現を指示するベクターが望ましい可能性もある。好ましくは、ベクターは、誘導性遺伝子発現を指示するプロモーターを含有する。適切なベクターには、限定されるわけではないが、コード配列を、インフレームで、多数（例えば６つ）のヒスチジン残基をコードする配列に融合することが可能な、大腸菌ｐＥＴ発現ベクター（ＳｔｕｄｉｅｒおよびＭｏｆｆａｔｔ，１９８６，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ． １８９：１１３；Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇら，１９８７，Ｇｅｎｅ ５６：１２５−１３５；Ｎｏｖａｇｅｎ、ウィスコンシン州マディソン）；アラビノース誘導性タンパク質の調節下で異種タンパク質を発現することが可能な、ｐＢＡＤベクター（Ｇｕｚｍａｎら，１９９５，Ｊ．Ｂａｃｔ． １７７：４１２１−４１３０）；およびグルタチオンＳ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）との融合タンパク質として異種ポリペプチドを発現するのに用いられる、ｐＧＥＸベクター（Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ、米国）が含まれる。本発明のｆｉｍＡまたはｏｐｒＦ配列をλ発現ベクターにクローニングして、そしてλ⁻細菌株で発現させることも可能である。好ましい様式において、細菌株は、大腸菌ＢＬ２１（Ｇｉｂｃｏ−ＢＲＬ、米国）である。好ましくは、使用可能なベクターには、限定されるわけではないが、ｐＬＥＸ発現ベクター（ＬａＶａｌｌｉｅら，１９９２，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １１：１８７−１９３；Ｍｉｅｓｃｈｅｎｄａｈｌら，１９８６，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ４：８０２−８０８；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）およびｐＲＩＴ２Ｔ発現ベクター（Ｎｉｌｓｓｏｎら，１９８５，ＥＭＢＯ ４：１０７５；ＺａｂｅａｕおよびＳｔａｎｌｅｙ，１９８２， ＥＭＢＯ １：１２１７；Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ）が含まれる。他のベクターおよび細菌株が使用可能であり、そして当業者に知られる。
【０１４１】
抗体産生
抗体は、モノクローナル、ポリクローナル、または組換えのいずれかであることも可能である。好適に、免疫原またはその一部、例えば配列に基づく合成ペプチドに対して抗体を調製することも可能であるし、あるいはクローニング技術によって組換え的に調製することも可能であるし、あるいは天然遺伝子産物および／またはその一部を単離して、そして免疫原として用いることも可能である。ＨａｒｌｏｗおよびＬａｎｅ，Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，ニューヨーク州コールドスプリングハーバー，１９８８、並びにＢｏｒｒｅｂａｅｃｋ，Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ−Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ｇｕｉｄｅ，Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ ａｎｄ Ｃｏ．，１９９２に一般的に記載されるように、当業者に周知の標準的抗体産生技術によって、免疫原を用いて、抗体を産生することも可能である。抗体断片もまた、抗体から調製可能であり、そして当業者に知られる方法による、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）_２、およびＦｖが含まれる。
【０１４２】
抗体産生において、当該技術分野に知られる免疫学における標準法によって、所望の抗体に関するスクリーニングを達成することも可能である。具体的に記載しない技術は、一般的に、Ｓｔｉｔｅｓら（監修），Ｂａｓｉｃ ａｎｄ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（第８版），Ａｐｐｌｅｔｏｎ ＆ Ｌａｎｇｅ，コネチカット州ノーウォーク（１９９４）、並びにＭｉｓｈｅｌｌおよびＳｈｉｉｇｉ（監修），Ｓｅｌｅｃｔｅｄ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ ａｎｄ Ｃｏ．，ニューヨーク（１９８０）におけるように理解される。一般的に、ＥＬＩＳＡおよびウェスタンブロッティングは、イムノアッセイの好ましい種類である。両方のアッセイが当業者に周知である。ポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体両方がアッセイに使用可能である。当該技術分野に周知であるように、抗体を固体支持担体に結合させるか、または検出可能部分にコンジュゲート化するか、または結合させ、そしてかつコンジュゲート化もさせることも可能である（蛍光部分または酵素部分のコンジュゲート化の一般的な考察に関しては、Ｊｏｈｎｓｔｏｎｅ ＆ Ｔｈｏｒｐｅ，ｌｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ｉｎ Ｐｒａｃｔｉｃｅ，Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ｏｘｆｏｒｄ，１９８２を参照されたい）。固体支持担体への抗体の結合もまた、当該技術分野に周知である（一般的な考察に関しては、Ｈａｒｌｏｗ ＆ Ｌａｎｅ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ，ニューヨーク，１９８８およびＢｏｒｒｅｂａｅｃｋ，Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ−Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ｇｕｉｄｅ，Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ ａｎｄ Ｃｏ．，１９９２を参照されたい）。本発明で使用が意図される検出可能部分には、限定されるわけではないが、蛍光、金属、酵素および放射性マーカー、例えばビオチン、金、フェリチン、アルカリ・ホスファターゼ、ｂ−ガラクトシダーゼ、ペルオキシダーゼ、ウレアーゼ、フルオレセイン、ローダミン、トリチウム、^１４Ｃおよびヨウ素化が含まれることも可能である。
【０１４３】
適切な場合、当該技術分野に知られるように、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）などの他のイムノアッセイを用いることも可能である。利用可能なイムノアッセイは、特許および科学文献に、広範囲に渡って記載されている。例えば、米国特許第３，７９１，９３２号；第３，８３９，１５３号；第３，８５０，７５２号；第３，８５０，５７８号；第３，８５３，９８７号；第３，８６７，５１７号；第３，８７９，２６２号；第３，９０１，６５４号；第３，９３５，０７４号；第３，９８４，５３３号；第３，９９６，３４５号；第４，０３４，０７４号；第４，０９８，８７６号；第４，８７９，２１９号；第５，０１１，７７１号；および第５，２８１，５２１号、並びに、Ｓａｍｂｒｏｏｋら，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，ニューヨーク州コールドスプリングハーバー，１９８９を参照されたい。
【０１４４】
検出、診断、および予防キット
本発明はさらに、ポルフィロモナス属種を検出するためのキットを提供する。該キットには、本発明のポルフィロモナス属生物、ポリペプチド、またはポルフィロモナス属ヌクレオチド配列の存在に関して、試料を分析するための試薬が含まれ、ここでヌクレオチド配列の存在は、生物が存在する指標となる。この方法は、症状が存在する前に、疾患を診断可能であり、そしてしたがって、患者にダメージが発生する前に、疾患の開始を予防可能であるため、価値がある。抗体、ＰＣＲ、ハイブリダイゼーション、および当業者に知られる他の検出法を用いて、ポルフィロモナス属種細菌、ポリペプチド、またはヌクレオチド配列の存在を決定することも可能である。
【０１４５】
１つの態様において、キットは、ポルフィロモナス属に対する抗体を検出するための試薬を提供する。特定の態様において、キットは、該キットがポルフィロモナス属種の検出に有用であることを示す印刷された使用説明書またはラベルのセットを含むことも可能である。最低限、キットは、１つの容器中に、配列番号１０３〜１１０および１２０〜１２８のポリペプチドいずれかの少なくとも３０の隣接アミノ酸を含むアミノ酸配列を有するタンパク質を含む。１つの態様において、キットはさらに、二次抗体を含む。好ましい態様において、二次抗体は、検出可能部分、例えば比色反応または化学発光反応を触媒する酵素、例えばアルカリ・ホスファターゼまたは西洋ワサビ・ペルオキシダーゼにコンジュゲート化される。さらなる態様において、キットは、比色アッセイまたは化学発光アッセイを行うための試薬を含む。
【０１４６】
別の態様において、キットは、ポルフィロモナス属核酸を検出するための試薬を提供する。１つの態様において、キットは、ポルフィロモナス属核酸をＰＣＲ検出するための試薬を提供し、そして少なくとも１つの容器中に、配列番号１０３〜１１０または１２０〜１２８のポリペプチドのいずれかの、少なくとも５、１０、１５、２０、２５、または３０の隣接アミノ酸の配列、あるいは完全アミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするＤＮＡ分子に、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする、少なくとも約１５、２０、２５または３０ヌクレオチドの断片を含む、第一の単離ＤＮＡ分子、および配列番号１０３〜１１０または１２０〜１２８のポリペプチドのいずれかの、少なくとも５、１０、１５、２０、２５、または３０の隣接アミノ酸の配列、あるいは完全アミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするＤＮＡ分子に相補的なＤＮＡ分子に、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする、少なくとも１５、２０、２５または３０ヌクレオチドの断片を含む、第二の単離ＤＮＡ分子を含み、ここで、第一および第二のＤＮＡ分子を用いて、配列番号１〜９からなる群より選択されるＤＮＡ分子にコードされる、１６Ｓ ｒＲＮＡをコードする、ポルフィロモナス属種核酸を特異的に増幅することも可能である。
【０１４７】
さらなる態様において、本発明は、少なくとも１つの容器中に、配列番号８６〜９４、９５〜１０２、および１１１〜１１９に示すヌクレオチド配列いずれかの相補体に、非常にストリンジェントな条件下でハイブリダイズする、配列番号８６〜９４、９５〜１０２、および１１１〜１１９のいずれかから選択される、少なくとも約１５の隣接ヌクレオチドのヌクレオチド配列を含む、単離ＤＮＡ分子を含み、そして第二の容器中に、配列番号８６〜９４、９５〜１０２、および１１１〜１１９に示すヌクレオチド配列いずれかに、非常にストリンジェントな条件下でハイブリダイズする、配列番号８６〜９４、９５〜１０２、および１１１〜１１９に示すヌクレオチド配列いずれかの相補体から選択される、少なくとも約１５の隣接ヌクレオチドのヌクレオチド配列を含む、単離ＤＮＡ分子を含む、第二の単離ＤＮＡ分子を含む、キットを提供し、該キットはさらに、該キットが、ポルフィロモナス属種の検出に有用であることを示す、使用説明書セットを含む。
【０１４８】
ワクチン配合物および投与法
ワクチンが、コンパニオン動物において歯周病を療法的に治療するか、または歯周病に対する抵抗性を与えるか、または歯周病を予防するように、有効量で、本発明のワクチンをコンパニオン動物に投与することも可能である。本発明のワクチンは、歯周病を引き起こす細菌の管理に有用である。本発明のワクチンを、特に、獣医学の分野で用いて、コンパニオン動物を治療することも可能であり、そして歯周病を引き起こすことが知られる、本明細書記載の細菌に対する公衆衛生の維持のために用いることも可能である。
【０１４９】
本発明のワクチンは、ヒトおよびコンパニオン動物に有害であるか、あるいはヒトおよびコンパニオン動物において疾患を蔓延させるか、または疾患のベクターとして作用する細菌、例えば本明細書に記載するようなものの管理に価値がある。本発明のワクチンは、コンパニオン動物に存在する細菌を管理するのに特に有用であり、この目的のため、限定されるわけではないが、経口、非経口、鼻内、皮下、または局所を含む、既知の投与法のいずれを用いて、これらを投与することも可能である。
【０１５０】
本発明のさらなる側面にしたがって、適合するアジュバント、希釈剤またはキャリアーと混合した、本発明のワクチンを含む組成物を提供する。好ましい態様において、本発明のワクチン配合物は、すぐ注射できる形で、好ましくは生理学的ｐＨに緩衝されている、本発明の少なくとも１つの細菌および／または少なくとも１つのサブユニット・タンパク質を含有する水性懸濁物または溶液で構成される。別の好ましい態様において、本発明のワクチン配合物は、少なくとも３つのポルフィロモナス属種、例えばＰ．グラエＢ４３、Ｐ．サリボサＢ１０４およびＯ．デンティカニスＢ１０６の不活化全細胞調製物で構成される。
【０１５１】
本発明は、細菌感染を治療するかまたは予防する方法であって、本発明のワクチンまたはワクチン配合物の有効量を用いた治療を含む、前記方法をさらに提供する。治療に対する言及には、細菌感染の予防、並びに、確立された症状の軽減も含まれることが認識されるものとする。
【０１５２】
本発明のワクチンおよびワクチン配合物を用いて、歯周病を引き起こす細菌によって引き起こされる歯周病に特徴的な病理学的変化を予防する応答を誘導することも可能である。ワクチン配合物において、細菌、精製タンパク質、核酸、またはその組み合わせの免疫原性である量が、望ましくは、哺乳動物で使用するのに適した慣用的ワクチンアジュバントおよび生理学的ビヒクルと混合される。
【０１５３】
少なくとも１つの単離および精製不活化または弱毒化細菌、精製ポリペプチド（例えば天然タンパク質、サブユニット・タンパク質、またはポリペプチド）を用いて、そしてこれらの１以上を、適合するアジュバント、希釈剤、またはキャリアーと混合して、コンパニオン動物における歯周病を予防するためのワクチン配合物を産生することも可能である。好ましくは、ポリペプチド配列は、ＦｉｍＡ（配列番号１０３〜１１０）およびＯｐｒＦ（配列番号１２０〜１２８）を含む群から選択されるサブユニット・タンパク質である。
【０１５４】
診断ポリペプチドのため、またはワクチン調製のために使用可能な、ＦｉｍＡおよびＯｐｒＦの断片の例には、限定されるわけではないが、ＡＣＮＫＤＮＥＡＥＰＶＶ、ＹＰＶＬＶＮＦＥＳＮＮＹＴＹＴＧＤＡＶＥＫ、ＴＧＰＧＴＮＮＰＥＮＰＩＴＥＳＡ、ＮＤＮＮＮＫＤＦＶＤＲＬＧＡ、ＤＬＮＧＱＩＮＲＬＲＲＥＶＥＥＬＳＫＲＰＶＳＣＰＥＣＰＤＶ、およびＡＤＰＴＧＤＴＱＹＮＥＲＬＳＥＲＲＡＫＡＶ（配列番号１２９〜１３４）が含まれる。サブユニット・タンパク質は、単独で、あるいは別のポリペプチド配列またはタンパク質に融合されるかいずれかで、組換え的に発現されることも可能である。他のポリペプチド配列またはタンパク質には、限定されるわけではないが、例えばポリＨｉｓタグ、ＭＢＰ、チオレドキシン、またはＧＳＴが含まれる。本発明にやはり提供されるのは、上述のサブユニット・タンパク質のいずれかをコードするポリヌクレオチド配列または遺伝子である。細菌のポリヌクレオチド配列は、ｆｉｍＡおよびｏｐｒＦ、またはその断片もしくは変異体であって、該配列に少なくとも約９０％、９５％、または９９％の相同性を示す、前記断片もしくは変異体、または高ストリンジェンシーの条件下でハイブリダイズする相補的ポリヌクレオチド配列、あるいは両方の組み合わせから選択されることも可能である。好ましくは、本発明のポリヌクレオチド配列を用いて、本発明のｆｉｍＡまたはｏｐｒＦ ＤＮＡ分子を増幅することも可能であるし、あるいは本発明のポリヌクレオチドは、ＦｉｍＡまたはＯｐｒＦに対する抗体を作製するのに使用可能なアミノ酸断片をコードする。
【０１５５】
ＤＮＡに基づく療法のため、宿主細胞に異種核酸を搬送するかまたはトランスファーすることが可能なビヒクルを使用することも可能である。発現ビヒクルには、当該技術分野に知られるように、細胞選択的方式で、核酸のターゲティング、発現および転写を調節する要素が含まれることも可能である。発現ビヒクルには、異種成分の転写を調節するためのプロモーターが含まれることも可能であり、そしてこれは恒常性プロモーターまたは選択的転写を可能にする誘導性プロモーターのいずれかであることも可能である。場合によって、必要な転写レベルを得るのに必要でありうるエンハンサーを含むことも可能である。
【０１５６】
当該技術分野内に知られる多様な方法のいずれか１つによって、細胞または組織にベクターを導入することも可能である。こうした方法は、Ｓａｍｂｒｏｏｋら，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，ニューヨーク（１９８９，１９９２）；Ａｕｓｕｂｅｌら，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ，メリーランド州ボルチモア（１９８９）；Ｃｈａｎｇら，Ｓｏｍａｔｉｃ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ，ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ，ミシガン州アナーバー（１９９５）；Ｖｅｇａら，Ｇｅｎｅ Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ，ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ，ミシガン州アナーバー（１９９５）；Ｒ．Ｌ．Ｒｏｄｒｉｇｕｅｚ，Ｖｅｃｔｏｒｓ：Ａ Ｓｕｒｖｅｙ ｏｆ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｖｅｃｔｏｒｓ ａｎｄ Ｔｈｅｉｒ Ｕｓｅｓ，Ｂｕｔｔｅｒｗｏｒｔｈｓ，マサチューセッツ州ボストン（１９８８）に、一般的に記載されて見出されることも可能であり、そして例えば、組換えウイルスベクターでの安定または一過性トランスフェクション、リポフェクション、エレクトロポレーションおよび感染を含む。
【０１５７】
本発明はさらに、１以上のさらなる免疫原性構成要素と組み合わせて、本発明の不活化または弱毒化細菌、ヌクレオチド配列、あるいはポリペプチド配列の少なくとも１つを有する、併用ワクチンを提供する。こうした併用ワクチンは、ワクチン接種した動物において、各構成要素を別個に投与した効果を単純に加算することによって期待されるよりも、驚くほど高い効果を生じることも可能である。このように、併用ワクチンは、動物における抗体の相乗産生を刺激することも可能である。
【０１５８】
好ましい態様において、本発明の併用ワクチンは、１以上のさらなる細菌またはウイルス免疫原性構成要素と組み合わされた、少なくとも３つのポルフィロモナス属種、例えばＰ．グラエＢ４３、Ｐ．サリボサＢ１０４およびＯ．デンティカニスＢ１０６の不活化全細胞調製物で構成される。本発明の併用ワクチンで使用するのに適したさらなる免疫原性構成要素には、限定されるわけではないが、イヌ・ジステンパーウイルス（ＣＤＶ）、イヌ・アデノウイルス−２（ＣＡＶ−２）、イヌ・パルボウイルス（ＣＰＶ）、イヌ・パラインフルエンザウイルス（ＣＰＩ）、およびイヌ・コロナウイルス（ＣＣＶ）が含まれる。
【０１５９】
本発明の少なくとも１つの不活化または弱毒化細菌、ヌクレオチド配列、あるいはポリペプチド配列と、薬学的に許容しうるキャリアー、および好ましくはアジュバントを組み合わせることによって、本発明のワクチンを調製することも可能である。
【０１６０】
本発明のワクチンの適切な調製物には、液体溶液または懸濁物いずれかの注射可能物質が含まれる。注射前に、液体の薬学的に許容しうるキャリアー中の溶液または懸濁物とするのに適した固体型もまた、調製可能である。ワクチン調製物を乳化することも可能である。活性免疫原性構成要素を、好ましくは、薬学的に許容可能であり、そして活性免疫原性構成要素と適合する、アジュバントと混合する。適切なアジュバントには、限定されるわけではないが：ミネラルゲル、例えば水酸化アルミニウム；表面活性物質、例えばリゾレシチン；グリコシド、例えばＱｕｉｌＡまたはＧＰＩ−０１００などのサポニン誘導体（米国特許第５，９７７，０８１号）；ＤＤＡ、プルロニックポリオールなどの陽イオン性界面活性剤；ポリアニオン；非イオン性ブロック・ポリマー、例えばＰｌｕｒｏｎｉｃ Ｆ−１２７（Ｂ．Ａ．Ｓ．Ｆ．、米国）；ペプチド；ミネラルオイル、例えばＭｏｎｔａｎｉｄｅ ＩＳＡ−５０（Ｓｅｐｐｉｃ、フランス・パリ）、カルボポール、Ａｍｐｈｉｇｅｎ（Ｈｙｄｒｏｎｉｃｓ、米国ネブラスカ州オマハ）、Ａｌｈｙｄｒｏｇｅｌ（Ｓｕｐｅｒｆｏｓ Ｂｉｏｓｅｃｔｏｒ、デンマーク・フレデリクスン）、油エマルジョン、例えばＢａｙｏｌＦ／ＡｒｌａｃｅｌＡおよび水などのミネラルオイルのエマルジョン、または植物油、水およびレシチンなどの乳化剤のエマルジョン；ミョウバン、コレステロール、ｒｍＬＴ、サイトカインおよびその組み合わせなどが含まれる。免疫原性構成要素は、リポソームに取り込まれることも可能であるし、または多糖および／またはワクチン配合に用いられる他のポリマーにコンジュゲート化されることも可能である。本発明の方法で使用するための産物に含まれることも可能なさらなる物質には、限定されるわけではないが、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）の二ナトリウムおよび四ナトリウム塩、メルチオレートなどの１以上の保存剤が含まれる。
【０１６１】
ワクチンを投与する被験者は、好ましくはコンパニオン動物、最も好ましくはイヌまたはネコである。
本発明のワクチンは、ワクチン配合物において、単位投薬型で存在することが好ましい。本発明の目的のため、免疫原性の量は、投与時に、約１ｘ１０^４〜１ｘ１０^１３不活化細菌細胞、０．１μｇ〜１ｍｇの精製タンパク質、または０．１μｇ〜１０ｍｇの核酸を含む。多数の構成要素を含有するワクチン配合物では、同一のまたはより少ない免疫原性量を有用に使用可能である。
【０１６２】
免疫原性量、治療しようとする状態、および動物の生理学的特徴に基づいて、当業者は、適切な療法的有効量を容易に決定することも可能である。したがって、ワクチン調製物は、免疫原性量の活性成分（単数または複数）の無菌調製物の投薬量を提供し、ここで、活性成分は、少なくとも１つの細菌、タンパク質、核酸、またはその組み合わせいずれかである。当業者は、さらなる活性剤の存在下で、これらの単位投薬量を容易に調整可能である。
【０１６３】
望ましい投薬措置は、所望のワクチン組成物の少なくとも１つの用量の投与を伴い、ここで各分画の抗原量は、上述のとおりである。本発明のワクチンの有効用量（免疫量）はまた、モデル試験系由来の用量−反応曲線からも推定可能である。本発明のワクチンの投与様式は、宿主にワクチンを搬送する適切な経路いずれであることも可能である。これらには、限定されるわけではないが、経口、皮内、筋内、腹腔内、皮下、鼻内経路、および乱切（例えば二股に分かれた針を用いて、皮膚の最上層を貫いて引っかく）を介するものが含まれる。しかし、ワクチンは好ましくは皮下投与または筋内注射によって投与される。望ましい場合、皮内、静脈内、鼻内、または扁桃腺内などの、他の投与様式もまた使用可能である。
【０１６４】
上述のワクチン組成物各々に関して、望ましくは、若い動物（８週齢以後）の一次免疫を惹起して、１２週齢および１６週齢で、追加用量を投与する。毎年、再ワクチン接種することが推奨される。
【０１６５】
個々の被験者の臨床状態、投与部位および方法、投与のスケジューリング、被験者の年齢、性別、体重、および医師に知られる他の要因を考慮に入れ、良質の医療のための原則（ｇｏｏｄ ｍｅｄｉｃａｌ ｐｒａｃｔｉｃｅ）にしたがって、本発明のワクチンを投与し、そして投薬する。
【０１６６】
本発明はさらに、コンパニオン動物における歯周病を予防するためのキットを提供する。１つの態様において、キットは、コンパニオン動物において、歯周病を予防する組成物を療法的有効量で含む容器を提供する。同じ容器または異なる容器中に、組成物中で使用可能な薬学的に許容しうるキャリアーもまた提供される。キットはさらに、本発明の組成物に対する応答を生成するのを補助するのに使用可能なアジュバントを含むことも可能である。また、キットは、好ましくは単位投薬型で、組成物を分配するディスペンサーを含むことも可能である。ディスペンサーは、例えば、金属またはプラスチックホイル、例えばブリスター・パックを含むことも可能である。キットには、コンパニオン動物における歯周病を予防するための組成物の投与を説明する、ラベルまたは印刷された使用説明書が付随することも可能である。薬学的に許容しうるキャリアー中に配合された、本発明のワクチン組成物を含む組成物を調製し、適切な容器に入れ、そして示す歯周状態の治療のためにラベルを付けることもまた可能である。
【０１６７】
ワクチン有効性の決定
本発明のワクチンおよびワクチン組成物によって誘導される特定の防御機構は、以下に示すｉｎ ｖｉｖｏ動物試験によって示されるように、ワクチン接種した動物における抗体および／または細胞性免疫応答の誘導である。
【０１６８】
本発明の細菌、ポリヌクレオチド、ポリペプチド、ワクチン、およびワクチン組成物は、コンパニオン動物歯周病、ウシ腐蹄症、冠状動脈性心疾患（イヌ）、または全身感染（イヌ）を治療するかまたは予防するのに有用でありうる。さらに、本発明の組成物はまた、冠状動脈性心（あるいは血管または動脈）疾患、耳下腺炎、口の悪臭、歯肉炎、歯周炎、脳卒中、アテローム性動脈硬化症、高脂血症、低体重乳児の早産の発生率増加、細菌性膣疾患および子宮内胎児発育遅延（ＩＵＧＲ）など、ヒトにおける類似の疾病と対応する、コンパニオン動物における特定の疾病を治療するかまたは予防するのにも有用でありうる。
【０１６９】
本発明のさらなる側面において、動物における１以上の歯周病原性細菌に対するワクチンの有効性を評価する方法を提供する。本発明は、１以上の歯周病原性細菌に対するワクチンが、マウスまたはイヌなどの動物種、特にイヌにおいて評価可能であることを示した。
【０１７０】
本発明にしたがって、限定されるわけではないが、ポルフィロモナス属、バクテリオデス属（Ｂａｃｔｅｒｉｏｄｅｓ）、プレボテラ属（Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ）、タネレラ属（Ｔａｎｎｅｒｅｌｌａ）（タネレラ・フォルシテンシス（Ｔａｎｎｅｒｅｌｌａ ｆｏｒｓｙｔｈｅｎｓｉｓ）、以前のバクテロイデス・フォルシサス（Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ ｆｏｒｓｙｔｈｕｓ））、およびトレポネーマ属（Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ）を含めて、多様な歯周病原性細菌に対するワクチンが、上述の方法を用いて評価可能であり、こうしたワクチンは、これらの細菌によって引き起こされるヒトまたはコンパニオン動物における歯周病を治療するかまたは予防するために設計されている。ワクチンは、これらの細菌種いずれかの、不活性化または弱毒化細菌、ポリペプチド、またはポリヌクレオチドを含有することも可能である。
【０１７１】
ワクチン接種動物および非ワクチン接種動物に、曝露培養物を別個に導入し、そして２つの動物における臨床徴候を比較することによって、ワクチンの有効性を評価することも可能である。曝露培養物は、ワクチンと同じ歯周病原性細菌で構成されることも可能である。しかし、曝露培養物は、ワクチンが他の細菌種に対して有しうる、交差防御いずれかを評価するため、ワクチン中のものとは異なる細菌を含有することも可能である。
【０１７２】
本発明にしたがって、歯根成分が摘出され、その後、修復物が配置されている、動物の歯の根管内に、曝露培養物が導入されることが望ましい。曝露培養物は、典型的には、曝露用量あたり、約１ｘ１０^２〜約１ｘ１０^１２コロニー形成単位（ＣＦＵ）を含有し；好ましくは、曝露用量あたり、１ｘ１０^５〜約１ｘ１０^１１コロニー形成単位（ＣＦＵ）を含有し；さらにより好ましくは、曝露用量あたり、約５ｘ１０^７〜約５ｘ１０^１０コロニー形成単位（ＣＦＵ）を含有する。
【０１７３】
評価可能な疾患の臨床徴候には、歯肉溝浸出液、歯垢、感染した骨、または歯肉溝中の１以上の歯周病原性細菌レベルの増加、あるいは歯槽骨量の変化、特に歯槽骨の歯根尖端周囲領域の変化が含まれる。例えばＸ線写真測定によって、骨変化を定量化することも可能である。
【０１７４】
本発明は、以下の限定されない実施例および付随する図によって、さらに例示される。
【実施例】
【０１７５】
（実施例１）
コンパニオン動物歯肉溝浸出液試料
獣医クリニックで歯周治療のために診察されたイヌおよびネコから、あるいは通常の検査のため、Ｐｆｉｚｅｒ Ｔｅｒｒｅ ＨａｕｔｅまたはＰｆｉｚｅｒ Ｓａｎｄｗｉｃｈ施設のいずれかで診察されたイヌから、微生物試料を採取した。＞３ｍｍの歯周ポケットを持つイヌおよび＞２ｍｍの歯周ポケットを持つネコがこの研究に含まれた。歯科指数（歯肉指数および歯周疾患指数）および歯周ポケットの深さを記録した。目が粗い個々の吸収ペーパーポイント（Ｈｅｎｒｙ Ｓｃｈｅｉｎ；ニューヨーク州メルビル）を歯周ポケットに無菌的に挿入した。除去に際して、ペーパーポイントを、あらかじめ還元した嫌気性無菌（ＰＲＡＳ）嫌気性歯科輸送（ＡＤＴ）培地（Ａｎａｅｒｏｂｅ Ｓｙｓｔｅｍｓ；カリフォルニア州モーガンヒルズ）を含有するバイアルに、直ちに挿入した。
【０１７６】
バイアルをＢａｃｔｒｏｎ ＩＶ嫌気性チャンバー（Ｓｈｅｌｄｏｎ Ｍａｎｕｆａｃｔｕｒｉｎｇ、オレゴン州コーネリウス）に移し、そして９０％Ｎ_２、５％Ｈ_２、５％ＣＯ_２下でプロセシングした。ペーパーポイントを５０μｌのＰＲＡＳ脳心臓注入（ＢＨＩ）培地（Ａｎａｅｒｏｂｅ Ｓｙｓｔｅｍｓ）に無菌的に入れ、そして３０秒間ボルテックスした。ＢＨＩ培地中で１：１００および１：１０００の希釈を調製した。１：１００および１：１０００希釈の１００μｌのアリコットを、ＰＲＡＳブルセラ（Ｂｕｒｃｅｌｌａ）血液寒天（ＢＲＵ）プレート（Ａｎａｅｒｏｂｅ Ｓｙｓｔｅｍｓ）上に広げた。嫌気性チャンバー中、５〜７日間、プレートを３７℃でインキュベーションした。細菌コロニー総数および黒色色素性嫌気性細菌（ＢＰＡＢ）コロニーの数を計数した。個々のＢＰＡＰコロニーを新規ＢＲＵプレートに移し、そして上述のように再インキュベーションした。
【０１７７】
臨床単離体性質決定
各臨床単離体を、いくつかの生化学分析、並びにプライマーＤ００５６およびＤ００５７（配列番号１および配列番号２；表１）を用いた１６Ｓ ｒＲＮＡ ＤＮＡ配列分析に供して、属および種を決定した。個々の単離体をＢＲＵプレート上にストリークした。カナマイシン、バンコマイシン、およびコリスチン・ディスク（Ａｎａｅｒｏｂｅ Ｓｙｓｔｅｍｓ）を寒天表面上に置いて、各単離体のＫＶＣ耐性パターンを決定した。また、精製コロニーをインドールおよびカタラーゼ試験（Ａｎａｅｒｏｂｅ Ｓｙｓｔｅｍｓ）にも供した。リパーゼおよびレシチナーゼ産生パターンを決定するため、個々の単離体を卵黄寒天（ＥＹＡ）プレート（Ａｎａｅｒｏｂｅ Ｓｙｓｔｅｍｓ）に移した。このデータを表２に示す。
【０１７８】
表２．イヌおよびネコＢＰＡＢ単離体性質決定
【０１７９】
【表２−１】

【０１８０】
【表２−２】

【０１８１】
【表２−３】

【０１８２】
【表２−４】

【０１８３】
【表２−５】

【０１８４】
【表２−６】

【０１８５】
【表２−７】

【０１８６】
【表２−８】

【０１８７】
【表２−９】

【０１８８】
【表２−１０】

【０１８９】
【表２−１１】

【０１９０】
【表２−１２】

【０１９１】
【表２−１３】

【０１９２】
【表２−１４】

【０１９３】
略語：Ｄ、イヌ；Ｃ、ネコ；ＮＡ、該当なし；ＮＤ、未測定；Ｍ、雄；Ｆ、雌；Ｙ、あり；Ｎ、なし；Ｐ、陽性；Ｎｅ、陰性

１６Ｓ ｒＲＮＡ ＤＮＡ配列に基づいて、単離体のタイプを決定した。３つ組で、プライマーＤ００５６およびＤ００５７（配列番号１および配列番号２；表１）を用いて、１６Ｓ ｒＲＮＡ領域のポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）増幅のテンプレートとして、個々のよく単離されたコロニーを利用した。１ｘＰＣＲ緩衝液（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ；メリーランド州ロックビル）、１．０ｍＭ ＭｇＣｌ_２、各１．２５μＭプライマー、各３００μＭデオキシ−ＮＴＰ、および２．５Ｕ白金Ｐｆｘ ＤＮＡポリメラーゼ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を含有する５０μｌ反応体積中でＰＣＲを行った。以下のＰＣＲ周期条件を利用した：９４℃２分間の変性工程；９４℃４０秒間の変性、６０℃４０秒間のアニーリング、および７２℃１分間の伸長の３０周期；７２℃２分間の最終伸長工程；並びに４℃への最終冷却工程。すべてのＰＣＲ増幅に、ＧｅｎｅＡｍｐ ９７００サーモサイクラー（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ；カリフォルニア州フォスターシティ）を利用した。
【０１９４】
ＰＣＲ調製キット（Ｐｒｏｍｅｇａ社；ウィスコンシン州マディソン）を用いて、生じたＰＣＲ産物を精製し、そして単離体ごとにプールした。次いで、０．０２５μｍニトロセルロース・フィルター（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社；マサチューセッツ州ベッドフォード）を用いて、２５ｍｌ滅菌水に対して点滴分析することによって、精製ＰＣＲ産物を脱塩した。ＡＢＩ自動化ＤＮＡ配列決定装置（テキサス大学遺伝学コア施設、テキサス州ヒューストン、およびＬａｒｋ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｉｎｃ．、テキサス州ヒューストン）上でのＤｙｅＤｅｏｘｙ終結反応を用いて、精製脱塩ＰＣＲ産物をＤＮＡ配列分析に供した。合成オリゴヌクレオチド・プライマー、Ｄ００５６、Ｄ００５７、ＰＦＺ１７５−ＡＰ１、ＰＦＺ１７５−ＡＰ２、およびＰＦＺ１７５−ＡＰ３（それぞれ配列番号１〜５；表１）を用いて、二本鎖ＤＮＡ配列を得た。生じたＤＮＡ配列を用い、米国バイオテクノロジー情報センターから公的に入手可能なＢＬＡＳＴ−Ｎプログラムを用いて、公的に入手可能なＤＮＡデータベースを検索した。
【０１９５】
データベース検索によって同定された最も近いマッチに基づいて、細菌単離体のタイプを決定した。Ｂ１０６単離体は、正確なマッチを持たず、新規細菌属／種に相当しうることが示唆された（以下を参照されたい）。すべての単離体およびそれぞれの特性の完全なリストを、表２に示す。最も頻繁に単離される株の上位９つは、以下の単離体によって例示される：Ｐ．グラエＢ４３（イヌ試料Ｓａｎｄｗｉｃｈ ４）、Ｐ．カンスルシＢ４６（イヌ試料ＶＨＵＰ １Ｂ）、Ｐ．シルクムデンタリアＢ５２（ネコ試料ＶＨＵＰ ２Ａ）、Ｐ．グラエＢ６９（ネコ試料ＶＨＵＰ ３Ａ）、Ｐ．シルクムデンタリアＢ９７（イヌ試料ＴＨ １ｂＣ）、Ｐ．カンジンジバリスＢ９８（イヌ試料ＴＨ １ａＣ）、Ｐ．サリボサＢ１０４（イヌ試料ＴＨ １ｂＣ）、Ｏ．デンティカニスＢ１０６（イヌ試料ＴＨ １ｂＥ）、およびＰ．エンドドンタリスＢ１１４（イヌ試料ＴＨ ２ｂＡ）。
【０１９６】
単離体分布を表３に示す。
表３．示した細菌種を宿することが同定されたイヌおよびネコの数のまとめ
【０１９７】
【表３−１】

【０１９８】
【表３−２】

【０１９９】
上に列挙する単離体は、イヌまたはネコの最も高い割合に、最も頻繁に同定され、そして存在した種に相当する。
以下のコンパニオン動物歯周単離体が、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（ＡＴＣＣ）， １０８０１ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｂｌｖｄ．， Ｍａｎａｓｓａｓ， ＶＡ， ２０１１０， ＵＳＡに、２００１年８月９日に寄託された：Ｐ．グラエＢ４３（ＰＴＡ−３６１８）、Ｐ．カンスルシＢ４６（ＰＴＡ−３６１９）、Ｐ．シルクムデンタリアＢ５２（ＰＴＡ−３６２０）、Ｐ．グラエＢ６９（ＰＴＡ−３６２１）、Ｐ．シルクムデンタリアＢ９７（ＰＴＡ−３６２２）、Ｐ．カンジンジバリスＢ９８（ＰＴＡ−３６２３）、Ｐ．サリボサＢ１０４（ＰＴＡ−３６２４）、Ｏ．デンティカニスＢ１０６（ＰＴＡ−３６２５）、およびＰ．エンドドンタリスＢ１１４（ＰＴＡ−３６２６）。
【０２００】
新規属／種の同定（オドリバクター・デンティカニス）
この研究の経過中、細菌の１６Ｓ ｒＲＮＡ配列が、入手可能なデータベース中に非常に類似のマッチを持たず、該細菌が新規単離体に相当しうることが示される、多くの臨床単離体を同定した。これらの単離体のうち１つの群は、新規種に相当するようであった。本明細書に提示するデータに基づいて、我々は、この新規の種が、オドリバクター新属と称する新規属に位置づけられると提唱する。オドリバクター・デンティカニスの標準株は、株Ｂ１０６^Ｔ（＝ＡＴＣＣ ＰＴＡ−３６２５^Ｔ；＝ＣＮＣＭ Ｉ−３２２５^Ｔ）である。
【０２０１】
オドリバクター・デンティカニスＢ１０６^Ｔは、年齢不詳で歯周病の雑種の成体雄イヌから単離された。深さ４ｍｍの歯周ポケットおよび歯肉指数１を有する下顎第一臼歯から、ペーパーポイント試料を得た。試料を上述のようにプロセシングした。ＲａｐＩＤ ＡＮＡ ＩＩ臨床試験キット（Ｒｅｍｅｌ；カンザス州レネクサ）およびＶｉｔｅｋ嫌気性生物同定（ＡＮＩ）カード系（ＢｉｏＭｅｒｉｅｕｘ Ｉｎｃ．；ノースカロライナ州ダーハム）を用いて、精製細胞を生化学分析に供した。簡潔には、集密まで増殖させたブルセラ血液寒天プレート上の細菌細胞を、ＭｃＦａｒｌａｎｄ＃３等価に再懸濁した。懸濁物をＲａｐＩＤ ＡＮＡ ＩＩ試験ウェルまたはＶｉｔｅｋ ＡＮＩカードに添加し、そして３７℃で４時間インキュベーションした。インキュベーション期間後、生化学試験の結果を記録した。
【０２０２】
表４は、Ｏ．デンティカニスＢ１０６^Ｔ、並びに６つの関連細菌のＲａｐＩＤ ＡＮＡ ＩＩ試験の結果を示す。ＲａｐＩＤ ＡＮＡ ＩＩキットによって行った１８の試験のうち、Ｏ．デンティカニスＢ１０６^Ｔに関しては、２つ（ＬＧＹおよびＩＮＤ）のみが陽性であった。これに比較して、ポルフィロモナス・ジンジバリスＡＴＣＣ ３３２７７、プレボテラ・インテルメディア（Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａ）ＡＴＣＣ ２５６１１、タネレラ・フォルシテンシスＡＴＣＣ ４３０３７、バクテロイデス・テタイオタオミクロン（Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ ｔｈｅｔａｉｏｔａｏｍｉｃｒｏｎ）ＡＴＣＣ ２９１４８、バクテロイデス・フラジリス（Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ ｆｒａｇｉｌｉｓ）ＡＴＣＣ ２５２８５、およびバクテロイデス・スプランチニクス（Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ ｓｐｌａｎｃｈｎｉｃｕｓ）ＡＴＣＣ ２９５７２は、それぞれ、５、４、１０、１２、９、および８の陽性試験を生じた。
【０２０３】
表４．Ｏ．デンティカニスＢ１０６^Ｔおよび関連株のＲａｐＩＤ ＡＮＡ ＩＩ生化学試験^＊
【０２０４】
【表４】

【０２０５】
^＊各試験の反応性成分：ＵＲＥ、尿素；ＢＬＴＳ、ｐ−ニトロフェニル−β，Ｄ−二糖；αＡＲＡ、ｐ−ニトロフェニル−α，Ｌ−アラビノシド；ＯＮＰＧ、ｏ−ニトロフェニル−β，Ｄ−ガラクトシド；αＧＬＵ、ｐ−ニトロフェニル−α，Ｄ−グルコシド；βＧＬＵ、ｐ−ニトロフェニル−β，Ｄ−グルコシド；αＧＡＬ、ｐ−ニトロフェニル−α，Ｄ−ガラクトシド；αＦＵＣ、ｐ−ニトロフェニル−α，Ｌ−フコシド；ＮＡＧ、ｐ−ニトロフェニル−ｎ−アセチル−α，Ｄ−グルコサミニド；ＰＯ_４、ｐ−ニトロフェニルホスフェート；ＬＧＹ、ロイシル−グリシン−□−ナフチルアミド；ＧＬＹ、グリシン−β−ナフチルアミド；ＰＲＯ、プロリン−β−ナフチルアミド；ＰＡＬ、フェニルアラニン−β−ナフチルアミド；ＡＲＧ、アルギニン−□−ナフチルアミド；ＳＥＲ、セリン−β−ナフチルアミド；ＰＹＲ、ピロリドニル−β−ナフチルアミド、およびＩＮＤ、トリプトファン。
【０２０６】
^†略語：Ｐ、陽性；Ｎ、陰性；Ｖ、多様。

Ｖｉｔｅｋ ＡＮＩカードを用いて、Ｏ．デンティカニスＢ１０６Ｔ、Ｐ．ジンジバリスＡＴＣＣ ５３９７７、およびフゾバクテリウム・ヌクレアツム（Ｆｕｓｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｎｕｃｌｅａｔｕｍ）亜種ヌクレアツムＡＴＣＣ ２３７２６の生化学反応パターンを決定した（表５）。Ｏ．デンティカニスＢ１０６Ｔは、陽性試験２つのみ（ＩＮＤＯＬおよびＴＴＺ）を生じたが、Ｐ．ジンジバリスＡＴＣＣ ５３９７７は、５つの陽性試験（ＩＮＤＯＬ、ＰＯ４、ＮＡＧ、ＢＡＮＡ、およびＴＴＺ）を生じた。ＲａｐＩＤ−ＡＮＡ ＩＩおよびＶｉｔｅｋ ＡＮＩカード間で共通する１２の試験のすべてが類似の結果を生じた。Ｖｉｔｅｋに供給されるデータベースを用いると、Ｏ．デンティカニスＢ１０６Ｔ単離体は、信頼レベル６３％で、誤ってＦ．ヌクレアツムと同定された（データ未提示）。この誤認は、Ｖｉｔｅｋデータベースに獣医学的ＰＡＢ単離体が欠けているためである可能性もある。
【０２０７】
表５．Ｏ．デンティカニスＢ１０６Ｔおよび関連株のＶｉｔｅｋ ＡＮＩ生化学試験^＊
【０２０８】
【表５】

【０２０９】
^＊各試験の反応性成分：ＩＮＤ、トリプトファン；ＰＯ_４、ｐ−ニトロフェニルホスフェート；ＰＨＣ、ｐ−ニトロフェニルホスフェートコリン；ＯＮＰＧ、ｏ−ニトロフェニル−β，Ｄ−ガラクトピラノシド；ＡＧＡＬ、ｐ−ニトロフェニル−α，Ｄ−ガラクトピラノシド；ＢＧＬＵ、ｐ−ニトロフェニル−β，Ｄ−グルコピラノシド；ＡＧＬＵ、ｐ−ニトロフェニル−α，Ｄ−グルコピラノシド；ＢＧＵＲ、ｐ−ニトロフェニル−β，Ｄ−グルクロニド；ＢＬＡＣ、ｐ−ニトロフェニル−β，Ｄ−ラクトシド；ＡＭＡＮ、ｐ−ニトロフェニル−α，Ｄ−マンノピラノシド；ＡＦＵＣ、ｐ−ニトロフェニル−α，Ｌ−フコピラノシド；ＢＦＵＣ、ｐ−ニトロフェニル−β，Ｄ−フコピラノシド；ＢＸＹＬ、ｐ−ニトロフェニル−β，Ｄ−キシロピラノシド；ＡＡＲＡ、ｐ−ニトロフェニル−α，Ｌ−アラビノフラノシド；ＮＡＧ、ｐ−ニトロフェニル−Ｎ−アセチル−グルコサミニド；ＢＡＮＡ、Ｎ−ベンジル−ＤＬ−アルギニン ｐ−ニトロアニリド；ＬＥＵ、Ｌ−ロイシン ｐ−ニトロアニリド；ＰＲＯ、Ｌ−プロリン ｐ−ニトロアニリド；ＡＬＡ、Ｌ−アラニン ｐ−ニトロアニリド；ＬＹＳ、Ｌ−リジン ｐ−ニトロアニリド；ＧＧＴ、ガンマ−グルタミル ｐ−ニトロアニリド；ＴＴＺ、トリフェニルテトラゾリウム；ＡＤＨ、アルギニン；ＵＲＥ、尿素；ＧＬＵ、グルコース；ＴＲＥ、トレハロース；ＡＲＡ、アラビノース；ＲＡＦ、レアフィノース（ｒｅａｆｆｉｎｏｓｅ）；ＸＬＹ、キシロース。
【０２１０】
^†略語：＋、陽性；−、陰性。

プライマーＤ１３４（配列番号１６９）およびＤ５７（配列番号２）を用いて、３つ組で、Ｏ．デンティカニスＢ１０６^Ｔ由来の１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子をＰＣＲ増幅した。ＰＣＲ産物をプールし、精製し、脱塩し、そして直接ＤＮＡ配列分析に供した。Ｏ．デンティカニスＢ１０６^Ｔ １６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子配列を用いた、米国バイオテクノロジー情報センターの非冗長ヌクレオチド・データベースのＢＬＡＳＴ−Ｎ（Ａｌｔｓｃｈｕｌら、１９９０）検索によって、Ｏ．デンティカニスＢ１０６^Ｔ単離体が、バクテロイデス属のメンバーに関連することが示された。Ｏ．デンティカニスＢ１０６^Ｔ １６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子配列は、バクテロイデス綱（Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｔｅｓ）種口腔クローンＦＸ０６９（寄託番号ＡＹ１３４９０６）の１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子配列と最も近く関連し、１，４６５ｂｐに渡って、９６．３％の同一性を示した。バクテロイデス綱種口腔クローンＦＸ０６９は、ＨＩＶ陽性患者における壊死性潰瘍性歯周炎（ＮＵＰ）と関連する細菌種を定義する研究中、ＮＵＰのヒト患者から単離された（Ｐａｓｔｅｒ， Ｂ．Ｊ．ら，“Ｐｈｙｌｏｇｅｎｙ ｏｆ Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ， Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ，ａｎｄ Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ ｓｐｐ． ａｎｄ ｒｅｌａｔｅｄ ｂａｃｔｅｒｉａ”，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．（１９９４），１７６：７２５−７３２）。
【０２１１】
ＣＬＵＳＴＡＬ Ｘバージョン１．８１ソフトウェアを用いて、１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子配列に基づく系統樹分析を行った（Ｔｈｏｍｐｓｏｍ，Ｊ．Ｄ．ら，“ＣＬＵＳＴＡＬ Ｗ：ｉｍｐｒｏｖｉｎｇ ｔｈｅ ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ ｏｆ ｐｒｏｇｒｅｓｓｉｖｅ ｍｕｌｔｉｐｌｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ａｌｉｇｎｍｅｎｔ ｔｈｒｏｕｇｈ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｗｅｉｇｈｔｉｎｇ，ｐｏｓｉｔｉｏｎｓ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｇａｐ ｐｅｎａｌｔｉｅｓ ａｎｄ ｗｅｉｇｈｔ ｍａｔｒｉｘ ｃｈｏｉｃｅ”，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．（１９９４）２２：４６７３−４６８０）。近隣結合法を用いて、系統樹を生成した（Ｓａｉｔｏｕ，Ｎ．＆Ｎｅｉ，Ｍ．，“Ｔｈｅ ｎｅｉｇｈｂｏｒ−ｊｏｉｎｉｎｇ ｍｅｔｈｏｄ：ａ ｎｅｗ ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ ｒｅｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｎｇ ｐｈｙｌｏｇｅｎｅｔｉｃ ｔｒｅｅｓ．”，Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．Ｅｖｏｌ．，（１９８７）４：４０６−４２５）。１０００の複製物を用いて、ブートストラップ分析値を得た。図１は、Ｏ．デンティカニスＢ１０６^Ｔ単離体の系統樹分析の結果を示す。主な属（ポルフィロモナス属、バクテロイデス属、プレボテラ属、タネレラ属等）の配置は、以前公表されたシトファガ−フラボバクター−バクテロイデス（ＣＦＢ）群の系統樹と一致する（Ｐａｓｔｅｒら，１９９４；Ｓａｋａｍｏｔｏ，Ｍ．ら，“Ｒｅｃｌａｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ ｆｏｒｓｙｔｈｕｓ（Ｔａｎｎｅｒ ｅｔ ａｌ． １９８６）ａｓ Ｔａｎｎｅｒｅｌｌａ ｆｏｒｓｙｔｈｅｎｓｉｓ ｃｏｒｒｉｇ．，ｇｅｎ．ｎｏｖ．，ｃｏｍｂ．ｎｏｖ．”，Ｉｎｔ．Ｊ Ｓｙｓｔ．Ｅｖｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．（２００２）５２：８４１−８４９；Ｓｈａｈ，Ｈ．Ｎ．＆ Ｃｏｌｌｉｎｓ，Ｄ．，“Ｐｒｏｐｏｓａｌ ｆｏｒ ｒｅｃｌａｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ ａｓａｃｃｈａｒｏｌｙｔｉｃｕｓ，Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ，ａｎｄ Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ ｅｎｄｏｄｏｎｔａｌｉｓ ｉｎ ａ ｎｅｗ ｇｅｎｕｓ，Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ．”，Ｉｎｔ．Ｊ Ｓｙｓｔ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．（１９９８）３８：１２８−１３１）。
【０２１２】
Ｏ．デンティカニスＢ１０６Ｔは、Ｂ．スプランチニクス（Ｗｅｒｎｅｒ，Ｈ．ら，“Ａ ｎｅｗ ｂｕｔｙｒｉｃ ａｃｉｄ−ｐｒｏｄｕｃｉｎｇ Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ ｓｐｅｃｉｅｓ：Ｂ．ｓｐｌａｎｃｈｎｉｃｕｓ ｎ．ｓｐ．”，Ｚｅｎｔｒａｌｂｌ．Ｂａｋｔｅｒｉｏｌ．（１９７５）２３１：１３３−１４４）、いくつかの口腔単離体、および多くの未培養株を含む、バクテロイデス属の外集団に分類される。Ｏ．デンティカニスＢ１０６^ＴおよびＢ．スプランチニクスの分岐点での７１．０％のブートストラップ信頼値は、これらの２つの生物が関連しているという中程度に高い度合いの確実性を示す。しかし、バクテロイデス属内にＢ．スプランチニクスを置くかどうかに関しては、歴史的に議論されてきている（Ｐａｓｔｅｒら、１９９４；Ｓｈａｈら、１９９８）。Ｐａｓｔｅｒらは、Ｂ．スプランチニクスが新規属に相当しうると示唆した。Ｓｈａｈらは、Ｂ．スプランチニクスが、ポルフィロモナス属のメンバーと多くの化学分類学的特性を共有することを示した。Ｂ．スプランチニクス／Ｂ．デンティカニスＢ１０６^Ｔ群の枝が、バクテロイデス属の枝よりもポルフィロモナス属の枝に近いため、我々のデータは、この仮説と一致する（図１）。
【０２１３】
Ｏ．デンティカニスの２５のさらなるイヌ臨床単離体（表１）から、上述のＤ５６プライマーおよびＤ５７プライマーを用いて、１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子のおよそ５８０ｂｐの領域をＰＣＲ増幅した。ＰＣＲ産物を精製し、そして脱塩した。次いで、ＰＣＲ産物のＤＮＡ配列を決定した。Ｏ．デンティカニス単離体由来の部分的１６Ｓ ｒＲＮＡ配列（配列番号１３８〜１６２）はすべて、同一であるかまたは非常に保存された配列群として共にクラスター形成し、これらの群間の最大多様性は、分析した領域に渡って９７％の同一性であった。図２は、Ｏ．デンティカニス単離体部分的１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子配列の系統樹分析の結果を示し；関連配列各群の代表的な単離体を分析のために選択した。この観察に基づいて、これらの単離体はすべて、同じ種の多様な株であると結論付けることが可能である。
【０２１４】
Ｏ．デンティカニスの臨床単離体をネコからも得た（表１）。Ｄ５６プライマーおよびＤ５７プライマーを用いたＰＣＲによって、上述の１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子の同じおよそ５８０ｂｐ領域を、これらの単離体から増幅した。精製ＰＣＲ産物から得たＤＮＡ配列（配列番号１６３〜１６８）を、イヌ単離体から得た配列と並列させた。並列の結果によって、ネコＯ．デンティカニス単離体が、イヌで見出されたものと同じ種の変動株であることが示される。
【０２１５】
Ｏ．デンティカニスＢ１０６^Ｔのポルフィロモナス属に対する関係をさらに分析するため、縮重ＰＣＲプライマーＤ１２２（配列番号８４）およびＤ１２３（配列番号８５）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を用いて、ｆｉｍＡ遺伝子をＰＣＲ増幅した（３つ組）。ＰＣＲ産物を精製し、脱塩し、プールし、そして直接ＤＮＡ配列分析に供した。ＦｉｍＡアミノ酸配列を用いた、米国バイオテクノロジー情報センターの非冗長ポリペプチド・データベースのＢＬＡＳＴ−Ｐ（Ａｌｔｓｃｈｕｌら、１９９０）検索によって、Ｏ．デンティカニスＢ１０６^Ｔ ＦｉｍＡタンパク質が、ポルフィロモナス属のメンバー由来のＦｉｍＡタンパク質に関連することが示された。図３は、多様なＦｉｍＡタンパク質配列の系統樹的関係を示す。Ｏ．デンティカニスＢ１０６^Ｔタンパク質およびポルフィロモナス属種のいくつかのＩ型フィムブリリン・タンパク質の間には、非常に強い関係が存在する（１００％のブートストラップ値）。
【０２１６】
Ｏ．デンティカニスＢ１０６^Ｔおよびポルフィロモナス・グラエＢ４３を、走査型電子顕微鏡検査に供して、細胞形態を決定した。簡潔には、修飾ＰＹＧ培地中の３６時間液体培養物を１８００ｘｇで遠心分離した。０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．３）中の３％ＥＭ等級グルタルアルデヒド（Ｐｏｌｙｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｉｎｃ．、ペンシルバニア州ワーリントン）と培地を交換し、そして４℃で１時間インキュベーションした。次いで、０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．３）で２回、細胞を洗浄し、そして緩衝１％四酸化オスミウム（Ｐｏｌｙｓｃｉｅｎｃｅ，Ｉｎｃ．、ペンシルバニア州ワーリントン）中に、室温で１時間懸濁した。一連の段階的エタノール中で試料を脱水し、ヘキサメチルジシラザン中に１５分間浸し、その後、１時間風乾することによって、最後の脱水を行った。アルミニウム・スタブ上に試料をマウントし、そしてＰｏｌａｒｏｎ ＳＥＭ自動コーティング装置（Ｐｏｌａｒｏｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ，Ｉｎｃ．、ペンシルバニア州ハットフィールド）中、２００Åの金でコーティングした。ＩＳＩ、ＤＳ−１３０走査型電子顕微鏡（ＩＳＩ，Ｉｎｃ．、日本・東京）を用いて、各試料を調べた。Ｎｏｒａｎ ４４８５デジタルビーム制御インターフェース（Ｎｏｒａｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ，Ｉｎｃ．、米国）を用いて、画像を捕捉した。図４は、Ｐ．グラエＢ４３およびＯ．デンティカニスＢ１０６^Ｔの走査型電子顕微鏡写真を示す。Ｐ．グラエＢ４３の短い棒状の形態（平均長１．２５μｍ）（図４Ａ）は、ポルフィロモナス属のメンバーに典型的である。対照的に、Ｏ．デンティカニスＢ１０６^Ｔは、紡錘状で端が先細りであり、そして平均細胞長は５．９μｍであった（図４Ｂ）。Ｏ．デンティカニスＢ１０６^Ｔの形態は、これらの増殖条件下では、タネレラ・フォルシテンシスのものに類似である（Ｔａｎｎｅｒら、１９８６）。Ｐ．グラエおよびＯ．デンティカニスの間の形態学的相違は、Ｏ．デンティカニスがポルフィロモナス属の外に配置されることをさらに裏付ける。
【０２１７】
ポルフィロモナス属種の培養条件
ポルフィロモナス属種の標準的増殖培地（脳心臓注入液（ＢＨＩ）および肉細切れ炭水化物（ＣＭＣ）培地）は、動物産物を含有し、これはワクチン産生には受け入れられないため、これらの成分を含有しない増殖培地を模索した。ＢＨＩまたはＣＭＣの増殖のものと同等の増殖を支持する能力に関して、ヘミンおよびビタミンＫの添加を伴うおよび伴わない多様な培地組成物を試験した。ＰＹＧ完全培地およびＭＥ完全培地はどちらも、Ｐ．グラエＢ４３（ＰＴＡ−３６１８）の増殖を、ＢＨＩのものと同等のレベルに支持した（図５）。ＰＹＧ完全培地は、発酵中、高密度の培養を生じる能力があるため、この培地をＰ．グラエＢ４３（ＰＴＡ−３６１８）増殖培地として選択した。この培地は、以下の成分を含有する：３％フィトン（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ；メリーランド州コッキースビル）、０．３％酵母エキス（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）、０．３％グルコース（Ｓｉｇｍａ社；ミズーリ州セントルイス）、０．０５％チオグリコール酸ナトリウム（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）、０．５％塩化ナトリウム（Ｓｉｇｍａ社）、５μｇ／ｍｌヘミン（Ｓｉｇｍａ社）（オートクレーブ後に添加）、０．５μｇ／ｍｌメナジオン（Ｓｉｇｍａ社）（オートクレーブ後に添加）、および０．２％重炭酸ナトリウム（Ｓｉｇｍａ社）、ｐＨ７．０。
【０２１８】
Ｐ．グラエＢ４３（ＰＴＡ−３６１８）を、ブルセラ血液寒天プレート（Ａｎａｅｒｏｂｅ Ｓｙｓｔｅｍｓ）上、あるいは完全ＰＹＧ培地またはＢＨＩ中、９０％Ｎ_２、５％ＣＯ_２下、Ｂａｃｔｒｏｎ ＩＶ嫌気性チャンバー（Ｓｈｅｌ Ｌａｂｓ；オレゴン州コーネリウス）中で、３〜５日間（プレート）または２４〜４８時間（液体培養物）、日常的に培養した。全細胞バクテリン調製物のため、５リットルのＰＹＧ完全培地を用いて、ＢｉｏＦｌｏ ３０００バイオリアクター中、Ｐ．グラエＢ４３（ＰＴＡ−３６１８）を培養した。オートクレーブ後、直ちに９５〜９９．５％Ｎ_２および０．５〜５％ＣＯ_２を散布することによって、容器中の培地を嫌気性にした。還元培地に０．０２％のＰ．グラエＢ４３（ＰＴＡ−３６１８）ストックを植え付け、そして１００ｒｐｍの攪拌速度で３７℃で培養し、そしてＮａＯＨを自動的に添加することによって、ｐＨを７．０に維持した。培養中、容器に定期的にＮ_２およびＣＯ_２両方を散布した。３６〜４８時間後、２．０〜３．５のＯＤ_６００で、細菌細胞がまだ対数増殖している間に、細菌細胞を収集した。
【０２１９】
マウスにおける臨床単離体の病原性試験
マウス歯周骨損失モデルにおいて、病原性に関して、９つの単離体（Ｐ．グラエＢ４３、Ｐ．カンスルシＢ４６、Ｐ．シルクムデンタリアＢ５２、Ｐ．グラエＢ６９、Ｐ．シルクムデンタリアＢ９７、Ｐ．カンジンジバリスＢ９８、Ｐ．サリボサＢ１０４、Ｏ．デンティカニスＢ１０６、およびＰ．エンドドンタリスＢ１１４）を試験した。体重が１４〜１５グラムと概算される、３週齢の年齢マッチさせた雄Ｂａｌｂ／ｃ ＣｙＪマウス（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ；メイン州バーハーバー）をこの研究に利用した。動物を陽圧下のバリアケージ装置中で飼育した。実験全体を通じて、種に標準的な食物ペレット、および水を任意に提供した。利用したベッディングは、歯肉組織における固着（ｉｍｐａｃｔｉｏｎ）を最小限にするため、顆粒Ｂｅｄ Ｏ’Ｃｏｂｂｓであった。受け入れ後、すべての動物を５〜７日間、慣れさせた。競合口腔フローラを減少させるため、スルファメトキサゾール（ｓｕｌｆａｍａｔｈｏｘａｚｏｌｅ）およびトリメトプリムの混合物（１０ｍｌ飲用水；それぞれ、およそ２ｍｇおよび０．４ｍｇ／ｍｌ）を１０日間、動物に与え、その後、５日間の流出期間を置いた。各マウスの尾静脈血から、血清試料を採取した。強制経口投与によって、１％カルボキシメチルセルロース中、適切な細菌株およそ１ｘ１０^１０ｃｆｕ／ｍｌの０．５ｍｌ懸濁物で動物を感染させた。さらなる滴を口腔に入れた。この感染をさらに２回反復して全部で３回行った（月曜日、水曜日、および金曜日）。
【０２２０】
実験第１日を、最初の感染後の火曜日と定義した。すべての動物を第２日に屠殺した。感染後の血清を収集し、微生物試料も収集した。各マウスの顎の肉を剥がし（ｄｅｆｌｅｓｈ）、染色し、そして水平方向の骨損失に関して、顕微鏡を用いてスコア付けした。スコア付けを３回反復して、実験者のエラーを減少させた。平均骨損失を、平均骨損失／部位／顎ｍｍとして表した。ＳＰＳＳ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｉｎｃ．（イリノイ州シカゴ）から入手可能なＳｙｓｔａｔ（バージョン９）、ＳｉｇｍａＳｔａｔ（バージョン２）、およびＳｉｇｍａＰｌｏｔ（バージョン２０００）を用いて、生じたデータの統計分析を行った。表６は、上位９つの単離体の数値結果を示す。
【０２２１】
表６．マウス歯周病病原性試験の要約
【０２２２】
【表６】

【０２２３】
これらの各々は、このモデルにおいて、統計的に有意な骨損失を生じた。
図６は、純骨損失をグラフで示す。平均歯槽骨レベル（セメントエナメル接合部−歯槽骨稜）をｍｍで１４の上顎部位から得て、そし各顎に関する平均値を決定した。各実験群に関して、各顎の平均値を合計して、そしてその群の動物総数で割ることによって、群平均を得た。
【０２２４】
図７は、純骨損失の比較を示す。平均歯槽骨レベル（セメントエナメル接合部−歯槽骨稜）をｍｍで１４の上顎部位から得て、そし各顎に関する平均値を決定した。各実験群に関して、各顎の平均値を合計して、そしてその群の動物総数で割ることによって、群平均を得た。各実験群から偽感染平均値を引くことによって、純骨損失を決定した。このデータを、１００％と設定した陽性対照群（Ｐ．ジンジバリス５３９７７）の割合として示す。Ｐ．ジンジバリスＷ５０は、この動物モデルでは、病原性が減少した、線毛が少ない（ｐｏｏｒｌｙ ｆｉｍｂｒｉｎａｔｅｄ）株である。
【０２２５】
これらのデータによって、以下の臨床単離体が、歯周病のマウスモデルにおいて、高レベルの骨損失を生じることが可能であることが示される：Ｐ．グラエＢ４３（ＰＴＡ−３６１８）、Ｐ．グラエＢ６９（ＰＴＡ−３６２１）、Ｐ．カンジンジバリスＢ９８（ＰＴＡ−３６２３）、およびＯ．デンティカニスＢ１０６（ＰＴＡ−３６２５）。以下の臨床単離体は、マウス歯周病モデルにおいて、穏やかな骨損失を生じた：Ｐ．カンスルシＢ４６（ＰＴＡ−３６１９）、Ｐ．サリボサＢ１０４（ＰＴＡ−３６２４）、およびＰ．エンドドンタリスＢ１１４（ＰＴＡ−３６２６）。以下の臨床単離体は、マウス歯周病モデルにおいて、最小限の骨損失を生じた：Ｐ．シルクムデンタリアＢ５２（ＰＴＡ−３６２０）およびＰ．シルクムデンタリアＢ９７（ＰＴＡ−３６２２）。臨床単離体間で多様な量の骨損失が観察されたが、各場合で、観察された骨損失の量が、偽感染マウスで観察されたものより、はるかに高かったことに注目しなければならない。これらのデータに基づいて、上位９つの臨床単離体各々が、単独であるか、または他の細菌と協調するかいずれかで、歯周病を引き起こすことが可能であると結論付け可能である。
【０２２６】
細菌細胞およびゲノムＤＮＡの調製
細菌種をＢＨＩまたは完全ＰＹＧ中、３７℃で４８時間、嫌気性培養した。１〜３ｍｌの培養からの細胞を、遠心分離によってペレットにして、等量の嫌気性ＰＢＳ中で１回洗浄し、再度遠心分離し、そして１／１０体積の嫌気性ＰＢＳに再懸濁した。
【０２２７】
ＢＨＩまたは完全ＰＹＧ中、３７℃で４８時間、嫌気性培養した細菌種の５ｍｌ培養物から、ゲノムＤＮＡを精製した。すべてのゲノムＤＮＡ調製物に関して、ＷｉｚａｒｄゲノムＤＮＡ抽出キット（Ｐｒｏｍｅｇａ社）を利用した。
【０２２８】
臨床単離体からの線毛遺伝子のクローニング
以下のＰＣＲプライマー：Ｄ００６７（順方向；配列番号６）、Ｄ００７８（順方向；配列番号８）、Ｄ００９７（順方向；配列番号９）、Ｄ００６８（逆方向；配列番号７）およびＤ００９８（逆方向；配列番号１０）の組み合わせを用いて、上位１０の臨床単離体から単離したゲノムＤＮＡから、ｆｉｍＡ遺伝子をＰＣＲ増幅した。１ｘＰＣＲ緩衝液（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、１．０ｍＭ ＭｇＣｌ_２、各１．２５μＭのプライマー、各３００Ｍのデオキシ−ＮＴＰ、および２．５Ｕ白金Ｐｆｘ ＤＮＡポリメラーゼ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を含有する５０μｌ反応体積中で、ＰＣＲを行った。以下のＰＣＲ周期条件を利用した：９４℃２分間の変性工程；９４℃４０秒間の変性、６０℃４０秒間のアニーリング、および７２℃１．５分間の伸長の３０周期；７２℃５分間の最終伸長工程；並びに４℃への最終冷却工程。すべてのＰＣＲ増幅に、ＧｅｎｅＡｍｐ ９７００サーモサイクラー（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ；カリフォルニア州フォスターシティ）を利用した。１．２％ Ｅ−ゲル（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ；カリフォルニア州カールスバッド）上で増幅産物を視覚化した。
【０２２９】
１０単位のＫｌｅｎＴａｑポリメラーゼ（Ａｂ Ｐｅｐｔｉｄｅｓ，Ｉｎｃ．；ミズーリ州セントルイス）を７２℃で５分間用いて、ＰＣＲ産物にＡテールを付加した。製造者のプロトコルを用いて、生じた産物を直ちに、ｐＣＲ２．１−ＴＯＰＯベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）にＴ−テール・クローニングして、そして大腸菌Ｔｏｐ１０Ｆ’（Ｎｏｖａｇｅｎ；ウィスコンシン州マディソン）に形質転換した。正しい挿入物ＤＮＡを含む組換えプラスミドを宿する形質転換体を、コロニーＰＣＲ、制限酵素消化、およびＡＢＩ自動化ＤＮＡ配列決定装置（Ｌａｒｋ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．）上のＤｙｅＤｅｏｘｙ終結反応を用いたＤＮＡ配列分析の組み合わせによって同定した。合成オリゴヌクレオチド・プライマー（配列番号６、７、８、１１〜４２）を用いて、二本鎖ＤＮＡ配列を得た。
【０２３０】
Ｐ．グラエＢ４３ＦｉｍＡ遺伝子の発現プラスミドへのクローニング
高レベルのタンパク質発現を得る目的のため、Ｐ．グラエＢ４３（ＰＴＡ−３６１８）ｆｉｍＡ遺伝子を、ｐＢＡＤ／ＨｉｓＡ発現ベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）にクローニングした。ゲノムＤＮＡ抽出キット（Ｐｒｏｍｅｇａ社）を用いて、ＢＨＩ中、３７℃で２日間、嫌気性にインキュベーションしたＰ．グラエＢ４３の５ｍｌ培養物から、ゲノムＤＮＡを精製した。３つ組で、プライマーＤ００９７およびＤ００９８（配列番号９および配列番号１０）を用いて、ｆｉｍＡ遺伝子をＰＣＲ増幅した。１ｘＰＣＲ緩衝液（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、５０ｎｇ Ｐ．グラエＢ４３ゲノムＤＮＡ、１．０ｍＭ ＭｇＣｌ_２、各１．２５μＭプライマー、各３００μＭデオキシ−ＮＴＰ、および２．５Ｕ白金Ｐｆｘ ＤＮＡポリメラーゼ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を含有する５０μｌ反応体積中でＰＣＲを行った。
【０２３１】
以下のＰＣＲ周期条件を利用した：９４℃２分間の変性工程；９４℃４０秒間の変性、５８℃４０秒間のアニーリング、および７２℃１．５分間の伸長の５周期；９４℃４０秒間の変性、６５℃４０秒間のアニーリング、および７２℃１．５分間の伸長の３０周期；７２℃５分間の最終伸長工程；並びに４℃への最終冷却工程。すべてのＰＣＲ増幅に、ＧｅｎｅＡｍｐ ９７００サーモサイクラー（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を利用した。ＰＣＲ調製キット（Ｐｒｏｍｅｇａ社）を用いて、ＰＣＲ産物を精製した。精製したＰＣＲ産物およびｐＢＡＤ／ＨｉｓＡを、３７℃で３時間、ＨｉｎｄＩＩＩおよびＸｈｏＩで二重消化した。消化の途中で、５単位のエビ（ｓｈｒｉｍｐ）・アルカリ・ホスファターゼ（ＳＡＰ）（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ，Ｉｎｃ．；ニュージャージー州ピスカタウェイ）をベクター消化に加えた。ＤＮＡ Ｃｌｅａｎ−Ｕｐキット（Ｐｒｏｍｅｇａ社）を用いて、消化したＤＮＡを精製した。１ｘＴ４ ＤＮＡリガーゼ緩衝液の存在下、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼ酵素（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用い、ＨｉｎｄＩＩＩ／ＸｈｏＩで消化した精製ＰＣＲ産物を、ＨｉｎｄＩＩＩ／ＸｈｏＩで消化してＳＡＰ処理したｐＢＡＤ／ＨｉｓＡに、１６℃で１８時間、連結した。生じた連結混合物の一部を、コンピテント大腸菌Ｔｏｐ１０Ｆ’細胞（Ｎｏｖａｇｅｎ）に形質転換した。組換えプラスミド、ｐＢＡＤ：Ｂ４３ｆｉｍＡ４が、正しい配向でｆｉｍＡ遺伝子を含有することが見出された。生じた組換えＦｉｍＡは、末端に、ベクターがコードする配列（ＭＧＧＳＨＨＨＨＨＨＧＭＡＳＭＴＧＧＱＭＧＲＤＬＹＤＤＤＤＫＤＲＷＧＳＥＬＥＩＣＳＱＹＨＭＧＩ、配列番号１３５）を含有し、アスパラギン−２０で始まるＦｉｍＡの成熟部分が続く。さらなるタンパク質発現分析のため、このプラスミドを、コンピテント大腸菌ＢＬ２１細胞（Ｎｏｖａｇｅｎ）に形質転換した。
【０２３２】
組換えＦｉｍＡタンパク質の発現および精製
大腸菌ＢＬ２１／ｐＢＡＤ：Ｂ４３ｆｉｍＡ４の凍結作業ストックを融解し、１００μｇ／ｍｌアンピシリンを含有するルリア・ブロス（１％トリプトン、０．５％酵母エキス、０．５％ＮａＣｌ）中に１：５０００希釈で植え付け、そして５リットル作業体積のＢｉｏＦｌｏ３０００バイオリアクター（Ｎｅｗ Ｂｒｕｎｓｗｉｃｋ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ；ニュージャージー州エジソン）中、３７℃、１００ｒｐｍ攪拌速度で、Ａ_６２５が２．５〜３．５になるまで増殖させた。次いで、Ｌ−アラビノースを培養に添加して最終濃度０．１％にして、ＦｉｍＡ発現を誘導した。さらに３時間、培養物をインキュベーションした。抗Ｅｘｐｒｅｓｓ血清（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて、組換えＦｉｍＡの発現をＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびウェスタンブロット分析によって検出した（図８）。組換えＦｉｍＡタンパク質は、４５ｋＤａの予測される分子量を有した。
【０２３３】
５リットル発酵から、組換えＦｉｍＡを発現する大腸菌ＢＬ２１形質転換体の湿細胞を、遠心分離によって採取して、そしてリン酸緩衝生理食塩水中に再懸濁した。細胞を機械的に溶解した。遠心分離後、ペレットを廃棄した。上清をＮｉ^２＋アフィニティーカラムに通し、そしてイミダゾール勾配を用いて溶出させた。組換えタンパク質を含有する分画をプールし、透析してイミダゾールを取り除き、そして０．２μｍフィルターを用いてフィルター滅菌した。
【０２３４】
臨床単離体からのｏｐｒＦ遺伝子のクローニング
Ｐ．ジンジバリス株Ｗ５０ ｏｐｒＦ相同体、遺伝子ＰＧ３２（Ｇｅｎｂａｎｋ寄託番号ＡＦ１７５７１４）の配列に基づいて、オリゴヌクレオチド・プライマーＤ００８６（配列番号４３）、Ｄ００８７（配列番号４４）、およびＫＷＫ−Ｐｇ−０３（配列番号４５）を設計し、そして合成した（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）。ＰＣＲのため、プライマーＤ００８６（配列番号４３）を、Ｄ００８７（配列番号４４）またはＫＷＫ−Ｐｇ−０３（配列番号４５）のいずれかと組み合わせて、１ｘＰＣ２緩衝液（Ａｂ Ｐｅｐｔｉｄｅｓ）、各２００μＭ ｄＮＴＰ、７．５Ｕ Ｋｌｅｎ Ｔａｑ１（Ａｂ Ｐｅｐｔｉｄｅｓ）および０．１５ＵクローニングＰｆｕ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ；カリフォルニア州ラホヤ）熱安定性ポリメラーゼ中、５０μｌ最終試料体積で用いた。Ｐ．グラエＢ４３、Ｐ．カンスルシＢ４６、Ｐ．シルクムデンタリアＢ５２、Ｐ．グラエＢ６９、Ｐ．シルクムデンタリアＢ９７、Ｐ．カンジンジバリスＢ９８、Ｐ．サリボサＢ１０４、Ｏ．デンティカニスＢ１０６、およびＰ．エンドドンタリスＢ１１４由来の洗浄細胞懸濁物または精製ゲノムＤＮＡのいずれかを、テンプレートとして用いて、３つ組で、反応を行った。増幅を以下のとおりに行った：変性（９４℃、９分間）；３０〜４０周期の変性（９４℃、３０秒間）、アニーリング（５５〜６０℃、３０秒間）、および重合（７２℃、１．５分間）；その後、７２℃７分間の最終伸長。
【０２３５】
Ｐ．カンジンジバリスＢ９８からｏｐｒＦ相同体をポリメラーゼ連鎖増幅するため、プライマーＫＷＫ−Ｐｓ−０４ｂ（配列番号８１）を、ＫＷＫ−Ｐｓ−０６ｂ（配列番号８３）と組み合わせて用いた。Ｐ．サリボサＢ１０４から相同体を増幅するため、プライマーＫＷＫ−Ｐｓ−０４ｂ（配列番号８１）を、ＫＷＫ−Ｐｓ−０５ｂ（配列番号８２）と組み合わせて用いた。Ｏ．デンティカニスＢ１０６から遺伝子を増幅するため、プライマーＫＷＫ−Ｐｓ−０２（配列番号７９）を、ＫＷＫ−Ｐｓ−０３（配列番号８０）と組み合わせて用いた。株、Ｐ．カンジンジバリスＢ９８、Ｐ．サリボサＢ１０４、およびＯ．デンティカニスＢ１０６由来の精製した染色体ＤＮＡをテンプレートとして用いて、３つ組で反応を行った。増幅を以下のとおりに行った：変性（９４℃、９分間）；３０〜３５周期の変性（９４℃、３０秒間）、アニーリング（６１〜７２℃、３０秒間）、および重合（７２℃、１．５分間）；この後に、７２℃７分間の最終伸長が続いた。
【０２３６】
１．０％アガロースゲル（Ｓｉｇｍａ）上で分離することによって、ＰＣＲ増幅遺伝子産物を視覚化した。ＱＩＡｑｕｉｃｋ^ＴＭ ＰＣＲ精製キット（Ｑｉａｇｅｎ；カリフォルニア州バレンシア）を用いて、ＰＣＲ産物を精製し、そして３つ組試料の各セットをプールした。ＰＣＲ増幅および続くクローニング工程の間に生じる突然変異によって配列アーチファクトが導入されるのを回避するために、次いで、これらの断片を直接配列決定した。次いで、プールした混合物を、ＡＢＩ自動化ＤＮＡ配列決定装置（Ｌａｒｋ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）上、ＤｙｅＤｅｏｘｙ終結反応を用いた直接配列分析に供した。合成オリゴヌクレオチド・プライマー（配列番号４６〜７５）を用いて、増幅産物の両方のＤＮＡ鎖を配列決定した。
【０２３７】
Ｐ．グラエＢ４３、Ｐ．カンスルシＢ４６、Ｐ．シルクムデンタリアＢ５２、Ｐ．グラエＢ６９、Ｐ．シルクムデンタリアＢ９７、Ｐ．カンジンジバリスＢ９８、Ｐ．サリボサＢ１０４、Ｏ．デンティカニスＢ１０６、Ｐ．カンジンジバリスＢ９８、Ｐ．サリボサＢ１０４、Ｏ．デンティカニスＢ１０６、およびＰ．エンドドンタリスＢ１１４由来のＯｐｒＦ相同体をコードするヌクレオチド配列を、配列番号１１１〜１１９に示す。各遺伝子のＰＣＲ増幅に用いた５’プライマーおよび３’プライマーに相当する配列は、それぞれの株各々の遺伝子の実際の配列に相当しない可能性があるため、こうした配列を取り除いた。配列番号１１１〜１１９にコードされるＯＲＦを、それぞれ、配列番号１２０〜１２８に示す。コードされるＯＲＦの各々に関して、５’プライマーにコードされるものが除去された場合であっても、アミノ末端配列は、原核生物シグナル配列の特徴をなお維持した（ｖｏｎ Ｈｅｉｊｎｅ，１９８５，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１８４：９９−１０５；Ｎｉｅｌｓｅｎ，Ｈ．，Ｅｎｇｅｌｂｒｅｃｈｔ，Ｊ．，Ｂｒｕｎａｋ，Ｓ．，およびｖｏｎ Ｈｅｉｊｎｅ，Ｇ．，１９９７ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，１０：１−６）。基本局所並列検索ツール（ＢＬＡＳＴ）プログラムを用いて、存在するヌクレオチドおよびタンパク質データベースに対して、各ＯＲＦを比較した（Ａｌｔｓｃｈｕｌ，Ｓ．Ｆ．，Ｇｉｓｈ，Ｗ．，Ｍｉｌｌｅｒ，Ｗ．，Ｍｙｅｒｓ，Ｅ．Ｗ．，Ｌｉｐｍａｎ，Ｄ．Ｊ．，１９９０，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ． ２１５：４０３−４１０）。各々、最大の相同性を共有するエントリーは、Ｐ．ジンジバリス由来のＰＧ３２であった。
【０２３８】
Ｐ．グラエＢ４３ ｏｐｒＦ遺伝子の発現プラスミドへのクローニング
組換えタンパク質を発現する目的で、ＯｐｒＦをコードする遺伝子を、シグナルペプチドをコードする配列と一緒にクローニングした。オリゴヌクレオチド・プライマーＫＷＫ−Ｐｇ−０６（配列番号７６）およびＫＷＫ−Ｐｇ−０３（配列番号４５）を用いて、Ｐ．グラエＢ４３からＯｐｒＦを増幅した。ポリメラーゼ連鎖増幅のため、テンプレートとしての染色体ＤＮＡ、１ｘＰＣ２緩衝液、各２００μＭ ｄＮＴＰ、各５０ｐＭｏｌプライマー、７．５Ｕ Ｋｌｅｎ Ｔａｑ１および０．１５ＵクローニングＰｆｕ熱安定性ポリメラーゼを含有する、２つ組５０μｌ反応物をセットアップした。増幅を以下のとおりに行った：変性（９４℃、９分間）；３０周期の変性（９４℃、３０秒間）、アニーリング（６０℃、３０秒間）、および重合（７２℃、１．５分間）；その後、７２℃７分間の最終伸長。増幅後、試料を精製し（ＱＩＡｑｕｉｃｋ^ＴＭ ＰＣＲ精製キット）、そしてプールした。精製したＰＣＲ産物を、ｐＢＡＤ−ＴＯＰＯおよびｐＢＡＤ／Ｔｈｉｏ−ＴＯＰＯ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）の両方のＴＡクローニング部位に直接クローニングした。リガンド産物（ligand products）を最大効率大腸菌ＤＨ５α細胞に形質転換した。ｐＢＡＤ−ＴＯＰＯ：ＯｐｒＦから発現される、コードタンパク質の予測されるアミノ末端配列は、ベクターにコードされる配列ＭＧＳＧＳＧＤＤＤＤＫＬＡＬＭ（配列番号１３６）からなり、そのすぐ後に、ＯｐｒＦのグルタミン−１３から始まる配列（配列番号１２０）が続く。適切なプラスミドを含有するクローンを同定し、そしてＱＩＡｐｒｅｐ Ｓｐｉｎ Ｍｉｎｉｐｒｅｐキット（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて、小規模ブロス培養物から、精製したプラスミドを単離した。このプラスミドを大腸菌ＢＬ２１細胞（Ｎｏｖａｇｅｎ）に形質転換し、そして適切なプラスミドを含有するクローンを同定した。
【０２３９】
ｐＢＡＤ／Ｔｈｉｏ−ＴＯＰＯ：ｏｐｒＦから発現されるコード融合タンパク質の予測されるアミノ末端配列は、チオレドキシン・タンパク質および１４アミノ酸残基のリンカーからなり、そのすぐ後に、ＯｐｒＦのグルタミン−１３から始まる配列（配列番号１２０）が続く。適切なプラスミドを含有するクローンを同定し、そしてＱＩＡｐｒｅｐ Ｓｐｉｎ Ｍｉｎｉｐｒｅｐキットを用いて、小規模ブロス培養物から、精製したプラスミドを単離した。このプラスミドを大腸菌ＢＬ２１細胞に形質転換し、そして適切なプラスミドを含有するクローンを同定した。
【０２４０】
シグナルペプチドをコードする配列を欠くｏｐｒＦ遺伝子もまた、２つの異なるλ発現プラスミドにクローニングした。これらのプラスミドはどちらも、温度感受性λリプレッサーｃｌ８５７をコードし、該リプレッサーは、３０℃でλプロモーターからの発現を阻害する。４２℃で、リプレッサーは不活化され、そしてλプロモーターからの発現が可能になり、高レベルの転写および翻訳を生じる。これらのベクターにクローニングするため、オリゴヌクレオチド・プライマーＫＷＫ−Ｐｇｕ−１４（配列番号７７）およびＫＷＫ−Ｐｇｕ−１５（配列番号７８）を用いて、Ｐ．グラエＢ４３からｏｐｒＦを増幅した。ポリメラーゼ連鎖増幅のため、テンプレートとしての洗浄Ｐ．グラエＢ４３細胞、１ｘＰＣ２緩衝液、各２００μＭ ｄＮＴＰ、各５０ｐＭｏｌプライマー、７．５Ｕ Ｋｌｅｎ Ｔａｑ１および０．１５ＵクローニングＰｆｕ熱安定性ポリメラーゼを含有する、２つ組５０μｌ反応物をセットアップした。増幅を以下のとおりに行った：変性（９４℃、９分間）；４５周期の変性（９４℃、３０秒間）、アニーリング（５５℃、３０秒間）、および重合（７２℃、１．５分間）；その後、７２℃７分間の最終伸長。増幅後、試料をプールし、そして制限酵素で消化して、やはり同じ酵素を用いて直線化しておいたプラスミドと適合するオーバーハングを生成した。制限消化後、ＰＣＲ断片およびプラスミドを精製し（ＱＩＡｑｕｉｃｋ^ＴＭ ＰＣＲ精製キット；Ｑｉａｇｅｎ社）、連結し、そして大腸菌ＤＨ５α細胞（Ｎｏｖａｇｅｎ）に形質転換した。予測されるアミノ末端は、ベクターにコードされる配列ＭＧＴＴＴＴＴＴＳＬＨＭ（配列番号１３７）からなり、そのすぐ後に、ＯｐｒＦのグルタミン−１３から始まる配列（配列番号１２０）が続く。第二のプラスミドから発現されるタンパク質は、ベクターにコードされるＭｅｔのみに続く、ＯｐｒＦのグルタミン−１３（配列番号１２０）からなるであろう。適切なプラスミドを含有するクローンを同定し、そしてＱＩＡｐｒｅｐ Ｓｐｉｎ Ｍｉｎｉｐｒｅｐキット（Ｑｉａｇｅｎ社）を用いて、小規模ブロス培養物から、プラスミドを単離した。これらのプラスミドを大腸菌ＢＬ２１細胞に形質転換し、そして適切なプラスミドを含有する別個のクローンを同定した。
【０２４１】
組換えＯｐｒＦタンパク質の発現および精製
組換えＯｐｒＦ（Ｎ末端で配列番号１３７に融合）を発現する大腸菌ＢＬ２１細胞を発現研究に利用した。凍結ストックを融解し、５０μｇ／ｍｌカナマイシン硫酸を含有する２ｘＹＴ培地（１．６％トリプトン、１％酵母エキス、０．５ＮａＣｌ）中に１：５０００希釈で植え付け、そして５リットル作業体積のＢｉｏＦｌｏ３０００バイオリアクター（Ｎｅｗ Ｂｒｕｎｓｗｉｃｋ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ；ニュージャージー州エジソン）中、２９℃、１００ｒｐｍ攪拌速度で、Ａ_６２５が２．５〜３．５になるまで増殖させた。次いで、培養を４２℃にシフトして、ＯｐｒＦ発現を誘導した。さらに３時間、培養物をインキュベーションした。多様な時点でアリコットを取り除き、遠心分離し、そして還元試料緩衝液に再懸濁した。すべての試料を１０％ＮｕＰＡＧＥゲル（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、米国）上で分析した（図９）。
【０２４２】
５リットル発酵から、組換えＯｐｒＦを発現する大腸菌ＢＬ２１形質転換体の湿細胞を、遠心分離によって採取して、そしてリン酸緩衝生理食塩水中に再懸濁した。細胞を機械的に溶解した。遠心分離後、ペレットを廃棄した。上清をイオン交換カラムに通し、そしてＮａＣｌ勾配を用いて溶出させた。組換えタンパク質を含有する分画をプールし、透析してＮａＣｌを取り除き、そして０．２μｍフィルターを用いてフィルター滅菌した。
【０２４３】
全細胞バクテリン調製物
Ｐ．グラエＢ４３の５リットル・バッチを、上述のように発酵装置中で増殖させ、そして１リットル部分に分けた。各１リットル分画中の細胞（４．４ｘ１０^１２総Ｐ．グラエＢ４３細胞）を以下の処理によって不活化した：０．４％ホルマリンに２３℃で２４時間曝露、ｐＨ８．５の１０ｍＭ二元性エチレンイミン（ＢＥＩ）に３７℃で４８時間曝露、２日連続で６０℃で３０分間加熱、および４８時間空気に曝露。ＢＥＩ処理後、５０ｍＭチオ硫酸ナトリウムで処理することによって、ＢＥＩを不活化した。細胞を遠心分離によって収集した。生じた細胞ペレットを２２０ｍｌ ＰＢＳ中に再懸濁し、１ｍｌあたり２ｘ１０^１０細胞の最終濃度を生じた。各不活化細胞７ｍｌを７ｍｌのＭＰＬ＋ＴＤＭアジュバント（Ｓｉｇｍａ社）と混合して、１ｍｌあたり、最終濃度１．０ｘ１０^１０細胞を生じた。
【０２４４】
他の上位８つの臨床単離体（Ｐ．カンスルシＢ４６、Ｐ．シルクムデンタリアＢ５２、Ｐ．グラエＢ６９、Ｐ．シルクムデンタリアＢ９７、Ｐ．カンジンジバリスＢ９８、Ｐ．サリボサＢ１０４、Ｏ．デンティカニスＢ１０６、およびＰ．エンドドンタリスＢ１１４）または他の色素性嫌気性細菌の全細胞バクテリン調製物を、同一の方式で調製することも可能である。
【０２４５】
マウスにおける相同ワクチン有効性
相同ワクチン有効性研究において、３週間間隔をあけて、ＭＰＬ＋ＴＤＭアジュバント中、上述の不活化Ｐ．グラエＢ４３細胞の各０．２ｍｌを２回注射して、マウスを免疫した。先に記載するように、追加免疫２週間後、これらのマウスを、Ｐ．グラエＢ４３に感染させた。感染４２日後、マウスを屠殺し、そして先に記載するようにプロセシングした。表７は、骨損失測定の数値結果を示す。
【０２４６】
表７．マウス相同ワクチン有効性研究結果
【０２４７】
【表７−１】

【０２４８】
【表７−２】

【０２４９】
【表７−３】

【０２５０】
（ａ）陽性対照群としてのＢ群に基づいて計算したパーセント。
（ｂ）陽性対照群としてのＣ群に基づいて計算したパーセント。
（ｃ）ＮＡ＝該当なし。

図１０、１１、および１２は、これらの結果をグラフで示す。図１１は、対照実験に関する骨損失パーセントを示す。ホルマリン不活化Ｐ．ジンジバリス５３９７７、およびフロイントの完全／不完全またはＭＰＬ＋ＴＤＬアジュバントのいずれかを含有するワクチンは、Ｐ．ジンジバリス５３９７７の感染によって誘導される骨損失を、それぞれおよそ３２％および４３％減少させた。図１２は、試験実験に関する骨損失パーセントを示す。ホルマリン、熱、または空気のいずれかで不活化したＰ．グラエＢ４３およびＭＰＬ＋ＴＤＭアジュバントを含有するワクチンは、Ｐ．グラエＢ４３感染によって誘導される骨損失を、それぞれおよそ４５％、３５％、および７５％減少させた。これらのデータに基づいて、ホルマリン、空気、および熱不活化Ｐ．グラエＢ４３ワクチンは、この重感染モデルにおいて誘導される骨損失を減少させる能力が有効であった。このデータを臨床設定に当てはめると、これらの３つのワクチンは、歯周病の予防的防止に有効である可能性があり、そして歯周病の療法治療に有効であることをよく立証することも可能である。
【０２５１】
マウスにおける異種ワクチン有効性研究
異種ワクチン有効性研究において、３週間間隔をあけて、ＭＰＬ＋ＴＤＭアジュバント中、ホルマリン不活化Ｐ．グラエＢ４３、またはホルマリン不活化Ｐ．サリボサＢ１０４およびＯ．デンティカニスＢ１０６細胞いずれかの各０．２ｍｌを２回注射して、マウスを免疫した。先に記載するように、追加免疫２週間後、これらのマウスを、Ｐ．グラエＢ４３、Ｐ．グラエＢ６９、Ｐ．サリボサＢ１０４、またはＯ．デンティカニスＢ１０６いずれかに感染させた。感染４２日後、マウスを屠殺し、そして先に記載するようにプロセシングした。表８は、骨損失測定の数値結果を示す。
【０２５２】
表８．マウス異種ワクチン有効性研究結果
【０２５３】
【表８】

【０２５４】
^ａＰ．グラエＢ４３感染マウスに関する骨損失パーセントを計算する。
^ｂＰ．グラエＢ６９感染マウスに関する骨損失パーセントを計算する。
^ｃＰ．サリボサＢ１０４感染マウスに関する骨損失パーセントを計算する。
【０２５５】
^ｄＯ．デンティカニスＢ１０６感染マウスに関する骨損失パーセントを計算する。
^ｅＮＡ、該当なし。

図１３、１４、１５、１６および１７は、これらの結果をグラフで示す。図９は、これらの実験に関する純骨損失を示す。図１４は、Ｐ．グラエＢ４３感染群に関する骨損失パーセントを示す。ホルマリン不活化Ｐ．グラエＢ４３およびＭＰＬ＋ＴＤＭアジュバントは、Ｐ．グラエＢ４３感染によって誘導される骨損失を、およそ８４％減少させた。図１５は、Ｐ．グラエＢ６９感染群に関する骨損失パーセントを示す。ＭＰＬ＋ＴＤＭアジュバントを含有するホルマリン不活化Ｐ．グラエＢ４３およびホルマリン不活化Ｐ．サリボサＢ１０４／Ｏ．デンティカニスＢ１０６ワクチンは、Ｐ．グラエＢ６９感染によって誘導される骨損失を、それぞれおよそ４０％および４９％減少させた。図１６は、Ｐ．サリボサＢ１０４感染群に関する骨損失パーセントを示す。ホルマリン不活化Ｐ．グラエＢ４３およびＭＰＬ＋ＴＤＭアジュバントは、Ｐ．サリボサＢ１０４によって誘導される骨損失を、およそ６５％減少させた。図１７は、Ｏ．デンティカニスＢ１０６感染群に関する骨損失パーセントを示す。ＭＰＬ＋ＴＤＭアジュバントを含むホルマリン不活化Ｐ．グラエＢ４３は、Ｏ．デンティカニスＢ１０６の曝露に対して、交差防御に失敗した。これらのデータに基づいて、ＭＰＬ＋ＴＤＭをアジュバントとするホルマリン不活化Ｐ．グラエＢ４３ワクチンは、相同体曝露からの防御だけでなく、Ｐ．グラエＢ６９での異種曝露からの防御も提供可能であると結論付け可能であった。さらに、Ｐ．グラエＢ４３ワクチンがＰ．サリボサＢ１０４曝露に対して防御したように、防御は、２つのポルフィロモナス属種間でも観察された。このデータを臨床設定に当てはめると、多価ワクチンは、歯周病の予防的防止に有効である可能性があり、そして歯周病の療法治療に有効であることをよく立証することも可能である。
【０２５６】
組換えＦｉｍＡおよびＯｐｒＦマウス血清学的研究
サブユニット・ワクチン血清学研究において、３週間間隔をあけて、ＱｕｉｌＡ／コレステロール・アジュバント中、組換え発現させて精製したＰ．グラエＢ４３ ＦｉｍＡ、または組換え発現させて精製したＰ．グラエＢ４３ ＯｐｒＦいずれかを各０．２ｍｌ、２回注射して、マウスを免疫した。第一のワクチン接種前、および追加免疫の２週間後、マウスを出血させた。表９は、数値結果を示し、一方、図１８および１９は、結果をグラフで示す。
【０２５７】
表９．マウス・サブユニット・ワクチン血清学研究
【０２５８】
【表９】

【０２５９】
（実施例２）
イヌ曝露モデルにおける歯周病原性
この研究には、成体歯牙状態の１０頭のビーグル犬を用いた。動物を麻酔し、そして高速ハンドピース（Ｈｅｎｒｙ Ｓｃｈｅｉｎ Ｉｎｃ．；ニューヨーク州メルビル）を備えたＳｃｈｅｉｎ Ｕｌｔｉｍａ ２０００歯科装置中、西洋ナシ型歯科バー（ｂｕｒｒ）（Ｍｉｄｗｅｓｔ Ｄｅｎｔａｌ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ Ｃｏｒｐ；イリノイ州デスプレインズ）を用いて、下顎小臼歯および第一臼歯の根管に、アクセスを作製した。獣医用有刺根管針（２１ｍｍ、サイズ＃５；Ｒｏｙｄｅｎｔ Ｄｅｎｔａｌ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ；テネシー州ジョンソンシティ）を、根管の深さに近い深さまで根管内に通すことによって、根管へのアクセスがあることを確認した。有刺根管針を反復して通過させて、結合組織、血管および神経組織を取り除いた。出血は微量であり；根管中に入れた無菌ペーパーポイント（Ｈｅｎｒｙ Ｓｃｈｅｉｎ Ｉｎｃ．）を用いて止血を達成した。この時点で、根管の掘削および排出中、根管のいかなる不都合な汚染物質も取り除かれていることを確実にすることが重要である。したがって、根管を１０％の漂白剤溶液で洗い流した。修復物配置に適した表面を生成するため、４０％硫酸ゲル（Ｓｃｏｔｃｈｂｏｎｄ Ｅｔｃｈｉｎｇ Ｇｅｌ、３Ｍ；ミネソタ州セントポール）を用いて、アクセスポート周囲のエナメルをエッチングした。残った漂白剤溶液または酸ゲルによる、曝露成分の生存度に対するいかなる影響も妨げるため、歯内針（２７ｇａ．、Ｄｅｎｔｓｐｌｙ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ；ペンシルバニア州ヨーク）および多量の無菌生理食塩水を用いて、中から外に根管を洗い流した。無菌ペーパーポイントを用いて、アクセス領域および根管を乾燥させた。
【０２６０】
ブルセラ血液寒天（Ａｎａｅｒｏｂｅ Ｓｙｓｔｅｍｓ；カリフォルニア州モーガンヒル）上でＰ．グラエ株Ｂ６９を増殖させ、そして嫌気性環境（５％Ｈ_２、５％ＣＯ_２、９０％Ｎ_２）中、３７℃でインキュベーションすることによって、曝露成分を調製した。細胞を採取して、そして無菌ＳＳＹＧ培地中に再懸濁した。次いで、およそ７．５ｘ１０^８コロニー形成単位（ＣＦＵ）の曝露用量を、選択した歯の暴露された根管腔に、歯内針を用いて導入した。５頭の動物に曝露成分（Ｔ０１）を与え、一方、他の５頭には、無菌ＳＳＹＧ培地からなる偽曝露（Ｔ０２）を与えた。次いで、ガラス・イオノマーおよび光重合型歯科混合修復剤（Ｒｅｖｏｌｕｔｉｏｎ ３；３Ｍ）の組み合わせを用いてアクセスポートを封印した。
【０２６１】
歯を取り巻く歯周骨密度の変化に基づいて、曝露生物の歯周病原性を決定した。研究第０週、第３週、第６週、第９週および第１２週に、Ｓｃｈｉｃｋ Ｃｏｍｐｕｔｅｄ Ｄｅｎｔａｌ Ｒａｄｉｏｇｒａｐｈｙ（ＣＤＲ（登録商標））センサーおよびソフトウェアを用いて、デジタルＸ線写真撮影のピクセル強度を測定することによって、この評価を行った。各動物において、６〜８本の歯のＸ線写真を撮影した。ベースライン値を得るため、処置直前にＸ線写真を撮影した。曝露に続いて、３週ごとに曝露後１２週間、Ｘ線写真を撮影した。２つの異なる方法を介して、Ｘ線写真を分析した。最初の方法は、歯科Ｘ線写真の分析に関して訓練された獣医が、Ｘ線写真を主観的に評価することからなった。簡潔には、これは、訓練された観察者がＸ線写真を調べ、異常に注目し、そして各イヌの異常の度合いを視覚的アナログスケール上に記録することからなった。第二に、Ｘ線写真ソフトウェア内の面積測定ツールを用いて、曝露後０週、６週、および１２週に撮影したＸ線写真で明らかな罹患骨の面積を測定した。これは、Ｓｃｈｉｃｋ ＣＤＲソフトウェア内の直線測定ツールを用いて、Ｘ線写真上の可視病変のおおよその直径の境界を定めることからなった。生じた距離から、病変のおよその面積を決定した。各イヌに関して、これらの面積を総計して、そして表にした。
【０２６２】
両方の方法を用いてＸ線写真を分析することによって、Ｔ０１群は、Ｔ０２群より多くの歯周骨を失うことが示唆された（図２０）。この研究から、実行可能な曝露モデルが開発されたと結論付けた。しかし、２次元測定（Ｘ線写真）に基づいて、３次元領域（歯周骨）で生じる変化を定量化することは困難であるため、改善された定量法が追求されるであろう。
【０２６３】
（実施例３）
イヌ曝露モデルにおける三価ワクチン有効性評価
モデル開発後、イヌにおいて研究を行って、三価ワクチン調製物の有効性を試験した。三価バクテリンは、用量あたり、各５０μｇのＱｕｉｌＡおよびコレステロールをアジュバントとする、ホルマリン不活性化Ｐ．グラエ（Ｂ４３）、Ｐ．サリボサ（Ｂ１０４）、およびＯ．デンティカニス（Ｂ１０６）を含有した。およそ１ｘ１０^１０ＣＦＵ／ワクチン用量の濃度で、各バクテリン株を集めた。この研究では、成体歯牙状態の８頭の動物３群を用いた。第１群（Ｔ０１）のイヌに１ｍｌの三価ワクチンを筋内（ＩＭ）ワクチン接種した。第２群（Ｔ０２）および第３群（Ｔ０３）には、１ｍｌの無菌生理食塩水を偽ワクチン接種した。すべてのイヌに、投与間を３週間間隔として３回、筋内（ＩＭ）投与した。最終投与の３週間後、動物を上述のように麻酔し、そして根成分の摘出後、下顎小臼歯および第一臼歯の根管に、曝露成分を導入した。Ｔ０１群およびＴ０２群のイヌを、実施例１に記載するように調製した、１ｘ１０^１０ＣＦＵの異種Ｐ．グラエ株（Ｂ６９）に曝露した。処置の影響を測定する目的で、Ｔ０３群のイヌを、無菌培地に曝露した。
【０２６４】
Ｈｅｌｉｏｄｏｎｔ歯科Ｘ線写真装置、Ｓｃｈｉｃｋ（登録商標）ＣＤＲ（コンピュータデジタルＸ線写真）捕捉系、および標準的技術を用いて、曝露後３週、６週、９週、および１２週に、Ｘ線写真を撮影した。この研究のため、デジタルＸ線写真を得たら、計測回転技術を持つ、プラグインＴｕｒｂｏＲｅｇ（登録商標）を用いて、ＩｍａｇｅＪ（ｖ１．２８、ＮＩＨ；メリーランド州ベセスダ）を通じて、各イヌの連続画像をまず、互いに対して登録した。次いで、三次多項式関数の外部グレー・スケールを用いて、登録した画像セットを較正した。次いで、歯および空気を除いて、処置した歯の周囲の骨領域の輪郭を描き、そして各画像に関して、その領域の平均密度を記録した。こうして、歯根周囲の骨の「白さ」を表す数値が客観的に得られ、そして分析に利用可能になった。この数値を「骨反応性スコア」と呼び、そしてこれは平均骨密度の代用物である。
【０２６５】
この研究の結果を図２１に示す。曝露に続いて、曝露後１２週まで、Ｔ０２群の動物に関する平均骨スコアは減少し、またはより白くなり、第１２週で曝露前レベルに戻った。Ｔ０１群およびＴ０３群の平均骨反応性スコアは、最初に減少し、次いで、曝露後１２週まで正常値近くまで回復したようであり、１２週を過ぎると多様になった。Ｔ０３群の処置対照は白くなり、一方、Ｔ０１群のワクチン接種した動物は、曝露前レベルに似た平均値を維持した。したがって、ワクチン投与されたイヌは、歯内曝露に直面したとき、ワクチン未接種のイヌよりも、より迅速に骨密度を回復可能であった。さらに、観察点各々で収集した血清の分析によって、ワクチンを投与された動物が、ワクチン株に対して高い抗体力価を生じ、そして曝露株に対して、増加した抗体交差反応性を有することが示された（データ未提示）。
【０２６６】
骨感染の場合、より黒くなるのがより直感的な方向であるが、それとは対照的に、Ｘ線写真は、曝露後、より白くなった。骨は、二重の様式で炎症および感染に反応して、骨マトリックスを失うとともに、広がる感染を「囲い込む（ｗａｌｌ ｏｆｆ）」ために、周囲の骨が増加する。溶解−硬化病変の混合は、いくつかの骨感染で見られるものに典型的であるが、１）病原体の病原性、２）動物の年齢、３）動物の遺伝学、および４）炎症の扇動に関連する外傷の量に影響される。この研究に用いた動物は若く（１０〜１４ヶ月齢）、そして曝露処置に関連する歯および周囲の骨に対して、重大な外傷があった。これらの要因は、骨が感染および炎症にどのように反応するかに関して知られていることを考慮した際、周囲の骨の密度がなぜ増加したかを説明することも可能である。
【０２６７】
（実施例４）
イヌ曝露モデルにおけるワクチン有効性
このワクチン有効性研究は、実施例３に記載するものと設計が類似であった。各処置群は１０頭の動物を含有した。Ｔ０１群のイヌにワクチン接種して、そして曝露し；Ｔ０２群には、曝露前に偽ワクチン接種し、そしてＴ０３群には偽ワクチン接種して、そして偽曝露した。各ワクチンは、用量あたり各株１ｘ１０^７ ＣＦＵの濃度で、ホルマリン不活化Ｐ．グラエ株Ｂ４３、Ｐ．サリボサ株Ｂ１０４、およびＯ．デンティカニス株Ｂ１０６を含有した。ワクチン接種スケジュールは、実施例３に示すものと同一であった。曝露接種物は、第三のワクチン接種の３週間後に投与する、Ｐ．グラエ株Ｂ６９であった。Ｘ線写真を、やはり３週間間隔で撮影したが、曝露後９週までのみであり、そして実施例２に記載するのと類似の方式で分析した。図２２は、骨反応性分析結果を示す。
【０２６８】
この研究において、動物は曝露処置に反応して、平均骨反応性スコアが増加した。これは、Ｘ線写真が骨密度の減少に対応して、より黒くなることを意味する（図２３）。Ｘ線写真は、Ｔ０１群およびＴ０２群の両方で、重大な病変を示したが、ワクチン接種していない動物の骨は、ワクチン接種した動物の骨よりも、全体に、はるかに密度が低かった。第９週、Ｔ０２群のワクチン接種していないイヌの平均骨反応性スコアは、ワクチン接種したＴ０１群と有意に異なった（ｐ＝０．０５）。この研究のイヌは、実施例２のものより一様に年を取っており、そして実験者の技量は、はるかに改善されていた。これらの要因が、骨感染に関連するものにより典型的な反応、すなわち骨密度減少に貢献したと仮定される。したがって、イヌ歯周炎の歯内モデルは、歯周炎を研究するための、新規でそして有用なツールである。該モデルは、ワクチン評価に関連するワクチン接種／曝露研究に価値があるだけでなく、抗微生物および局所療法研究で使用することも可能である。
【０２６９】
（実施例５）
ワクチンに対する全身反応性および局所反応性の評価
イヌに投与した、他のワクチンと併用した三価ワクチンに対する全身反応および局所組織反応の評価に取り掛かった。研究開始時におよそ６週齢の５頭のイヌ２群の、６週齢、９週齢、および１２週齢時に、ＩＭワクチン接種した。各ワクチン接種前に、血液試料を収集した。各ワクチン接種１週間後、全身反応および局所反応に関して、すべてのイヌを毎日調べた。これらの日にはまた、体温を測定し、そして記録した。Ｔ０１群に、総抗原３ｘ１０^８ＣＦＵの濃度で、三価バクテリン（実施例３および４に記載するように調製）の組み合わせであり、そして用量あたり各５０μｇのＱｕｉｌＡおよびコレステロールをアジュバントとし、そして以下の修飾生ウイルスおよび死ウイルス構成要素を含む、ワクチンを接種した：イヌ・ジステンパーウイルス（ＣＤＶ）、イヌ・アデノウイルス−２（ＣＡＶ−２）、イヌ・パルボウイルス（ＣＰＶ）、イヌ・パラインフルエンザウイルス（ＣＰＩ）、およびイヌ・コロナウイルス（ＣＣＶ）。Ｔ０２群には、３ｘ１０^６ＣＦＵの濃度の三価バクテリンおよび同じ組み合わせのウイルス構成要素を投与した。図２４の結果は、子犬に典型的に投与されるウイルス構成要素の組み合わせに添加した際、三価ワクチンが、試験群において、不都合な全身反応または局所反応を引き起こさなかったことを例証する。
【０２７０】
本出願全体で、米国特許を含めて、多様な特許および科学的刊行物が、著者および年によって引用され、そして特許は番号によって引用される。これらの刊行物および特許の開示は、本発明が関連する当該技術分野の最先端をより完全に説明するため、本出願にその全体が援用される。
【図面の簡単な説明】
【０２７１】
【図１】図１は、バクテロイデス綱の代表に関する近隣結合系統樹である。ＣＬＵＳＴＡＬ Ｘバージョン１．８１およびＮＪ Ｐｌｏｔソフトウェアプログラム（どちらもｆｔｐ：／／ｆｔｐ−ｉｇｂｍｃ．ｕ−ｓｔｒａｓｂｇ．ｆｒ／ｐｕｂ／ＣｌｕｓｔａｌＸ／から入手可能）を用いて、系統樹を生成した。該系統樹は、大腸菌１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子配列（寄託番号Ｊ０１６９５；データ未提示）を根とした。１０００の複製物を用いて、ブートストラップ分析を行った。ブートストラップ値を、図式的に示す（●、＞９５０；■、＞８５０；○、＞７００；□、＞５００；指定なし＜５００）。スケールバーは、ヌクレオチド位あたり０．０１置換を示す。矢印は、Ｏ．デンティカニスＢ１０６^Ｔの位置を示す。寄託番号：Ｐ．ジンジバリスＡＴＣＣ ３３２７７、Ｊ０１６９５；Ｐ．グラエＢ２４３、ＡＦ２８５８７４；Ｐ．カンスルシＶＰＢ ４８７５、Ｘ７６２６０；Ｐ．サリボサＮＣＴＣ １１６３２、Ｌ２６１０３；Ｐ．エンドドンタリスＡＴＣＣ ３５４０６、ＡＹ２５３７２８；Ｔ．フォルシテンシスＡＴＣＣ ４３０３７、ＡＢ０３５４６０；バクテロイデスｃｆ．フォルシサス口腔クローンＢＵ４５、ＡＦ３８５５６５；Ｂ．メルダエ（Ｂ． ｍｅｒｄａｅ）ＡＴＣＣ ４３１８４Ｔ、Ｘ８３９５４；Ｂ．ディスタソニス（Ｂ． ｄｉｓｔａｓｏｎｉｓ）ＡＴＣＣ ８５０３、Ｍ８６６９５；ウマ糞便細菌（Ｅｑｕｉｎｅ ｆｅｃａｌ ｂａｃｔｅｒｉｕｍ）１１８ｄｓ１０、ＡＹ２１２５６９；Ｄ．シャヒイ（Ｄ． ｓｈａｈｉｉ）株ＣＣＵＧ ４３４５７、ＡＪ３１９８６７；未培養バクテロイデス科（Ｂａｃｔｅｒｏｉｄａｃｅａｅ）クローン：Ｒｓ−Ｐ８２、ＡＢ０８８９１９；未培養細菌ｃａｄｈｕｆｅｃ ０５９ｈ７、ＡＦ５３０３０２；Ｂ．スプランチニクスＮＣＴＣ １０８２５、Ｌ１６４９６；Ｏ．デンティカニスＢ１０６^Ｔ、ＡＹ５６００２０；バクテロイデス綱種口腔クローンＦＸ０６９、ＡＹ１３４９０６；未培養細菌ＳＨＡ−３８、ＡＪ２４９１０５；Ａ．プトレディニス（Ａ． ｐｕｔｒｅｄｉｎｉｓ）ＡＴＣＣ ２９８００、Ｌ１６４９７；Ｒ．ミクロフサス（Ｒ． ｍｉｃｒｏｆｕｓｕｓ）ＡＴＣＣ ２９７２８、Ｌ１６４９８；Ｂ．デンティカニウム（Ｂ． ｄｅｎｔｉｃａｎｉｕｍ）Ｂ７８、ＡＹ５４９４３１；Ｂ．フラジリスＡＴＣＣ ２５２８５Ｔ、Ｘ８３９３５；Ｂ．テタイオタオミクロン株１７．４、ＡＹ３１９３９２；Ｂ．アシドファシエンス（Ｂ． ａｃｉｄｏｆａｃｉｅｎｓ）株Ａ３７、ＡＢ０２１１６３；Ｐ．ビビア（Ｐ． ｂｉｖｉａ）ＡＴＣＣ ２９３０３、Ｌ１６４７５；Ｐ．ニグレセンス（Ｐ． ｎｉｇｒｅｓｃｅｎｓ）ＡＴＣＣ ２５２６１、Ｌ１６４７９；Ｐ．インテルメディアＡＴＣＣ ２５６１１、Ｌ１６４６８；Ｐ．デンティコラ（Ｐ． ｄｅｎｔｉｃｏｌａ）ＡＴＣＣ ３５３０８、Ｌ１６４６７；およびＰ．ブカエ（Ｐ． ｂｕｃｃａｅ）ＡＴＣＣ ３３６９０、Ｌ１６４７８。
【図２】図２は、オドリバクター・デンティカニスの臨床単離体に関する近隣結合系統樹である。図１におけるように系統樹を生成した。該系統樹は、ポルフィロモナス・ジンジバリスＡＴＣＣ ５３９７７ １６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子配列（寄託番号Ｌ１６４９４２；データ未提示）を根とした。スケールバーは、ヌクレオチド位あたり０．０１置換を示す。寄託番号：Ｏ．デンティカニスＢ１０６^Ｔ、ＡＹ５６００２０；Ｏ．デンティカニスＢ１１３、ＡＹ５６００２２；Ｏ．デンティカニスＢ１５０、ＡＹ５６００２７；Ｏ．デンティカニスＢ１５５、ＡＹ５６００３０；Ｏ．デンティカニスＢ１７２、ＡＹ５６００３３；Ｏ．デンティカニスＢ１８３、ＡＹ５６００３５；バクテロイデス綱種口腔クローンＦＸ０６９、ＡＹ１３４９０６；未培養細菌ｃａｄｈｕｆｅｃ ０５９ｈ７、ＡＦ５３０３０２；Ｂ．スプランチニクスＮＣＴＣ １０８２５；および未培養バクテロイデス科クローン：Ｒｓ−Ｐ８２、ＡＢ０８８９１９。
【図３】図３は、ポルフィロモナス・ジンジバリスＦｉｍＡタンパク質ファミリー（クラスＩ〜Ｖ）の代表に関する近隣結合系統樹である。ＣＬＵＳＴＡＬ Ｘバージョン１．８１およびＮＪ Ｐｌｏｔソフトウェアプログラムを用いて、系統樹を生成した。該系統樹は、大腸菌ＣＦＴ０７３フィムブリリン・タンパク質（寄託番号ＮＰ ７５７２４１；データ未提示）を根とした。１０００の複製物を用いて、ブートストラップ分析を行った。ブートストラップ値を、図式的に示す（●、＞９５０；■、＞８５０；○、＞７００；□、＞５００；指定なし＜５００）。スケールバーは、アミノ酸位あたり０．０５置換を示す。ＦｉｍＡ寄託番号：Ｏ．デンティカニスＢ１０６^Ｔ、ＡＹ５７３８０１；Ｐ．ジンジバリスＨＧ１６９１、Ｑ９３Ｒ８０；Ｐ．ジンジバリスＢＨ１８／１０、ＪＮ０９１５；Ｐ．ジンジバリスＡＴＣＣ ３３２７７、Ｐ１３７９３；Ｐ．ジンジバリスＯＭＺ３１４、ＢＡＡ０４６２４；Ｐ．ジンジバリスＯＭＺ４０９、Ｑ５１８２２；Ｐ．ジンジバリス６／２６、Ｑ５１８２６；Ｐ．ジンジバリスＡＴＣＣ ４９４１７、Ｑ５１８２５；Ｐ．ジンジバリスＷ８３、ＡＡＱ６７０８７；Ｐ．ジンジバリスＨＧ５６４、Ｑ５１８２７；およびＰ．ジンジバリスＨＮＡ−９９、Ｑ９Ｓ０Ｗ８。
【図４】図４は、（Ａ）Ｐ．グラエＢ４３および（Ｂ）Ｏ．デンティカニスＢ１０６^Ｔの走査型電子顕微鏡写真からなる。スケールバーは、１０００ｎｍの距離に相当する。
【図５】図５は、ポルフィロモナス・グラエＢ４３の増殖を支持する、「動物産物不含」培地を同定する増殖研究の結果を示すグラフである。以下の培地を試験した：ＭＥ−完全、ＭＥ−ヘミン、ＭＥ−ビタミンＫ、ＭＥ−ヘミンおよびビタミンＫ両方、ＰＹＧ−完全、ＰＹＧ−ヘミン、ＰＹＧ−ビタミンＫ、ＰＹＧ−ヘミンおよびビタミンＫ両方、並びにＢＨＩ。
【図６】図６は、示した細菌種での重感染から生じる、マウスにおける平均骨損失を示すグラフである。マウスを偽曝露するかまたは示した細菌に曝露した。純骨損失は、偽曝露群で観察されるものを上回り、そして超える骨損失に相当する。点線は、陽性対照群の純骨損失に相当する。標準誤差を示す。
【図７】図７は、示した細菌種での重感染から生じる、マウスにおける骨損失パーセントを示すグラフである。マウスを偽曝露するかまたは示した細菌に曝露した。骨損失パーセントは、１００％骨損失と設定した陽性対照群の純骨損失に基づく。
【図８】図８ＡおよびＢは、大腸菌ＢＬ２１において、ｐＢＡＤ−ＨｉｓＡから発現された組換えＰ．グラエＢ４３ ＦｉｍＡの抗Ｘｐｒｅｓｓ^ＴＭエピトープ血清（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いた、図８ＡではＳＤＳ ＰＡＧＥ、そして図８Ｂではウェスタンブロット分析を示す写真である。略語：Ｓｔｄ（ｋＤａで）、標準；Ｉｎｄ、（誘導）；Ｓｏｌ、可溶性分画；およびＩｎｓｏｌ、不溶性分画。矢じりは、ｒＦｉｍＡの位置を示す。
【図９】図９は、大腸菌ＢＬ２１細胞において、発現プラスミドから発現された組換えＰ．グラエＢ４３ ｏｐｒＦのＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を示す写真である。Ｔ＝は、培養を３０℃から４２℃にシフトした後の時間を示す。分子量サイズ標準をｋＤａで示す。矢じりはｒＯｐｒＦの位置を示す。
【図１０】図１０は、純骨損失に基づく、相同ワクチン有効性研究の結果を示すグラフである。純骨損失に基づく、相同ワクチン有効性研究。マウスに以下のワクチン抗原およびＲＩＢＩ ＭＰＬ＋ＴＤＭアジュバント（フロイントの完全および不完全アジュバントを利用したＣ群を除く）をワクチン接種した：Ａ、Ｂ、およびＥ、ＰＢＳのみ；ＣおよびＤ、ホルマリン不活性化Ｐ．ジンジバリス５３９７７；Ｆ、ホルマリン不活化Ｐ．グラエＢ４３；Ｇ、ＢＥＩ不活化Ｐ．グラエＢ４３；Ｈ、熱不活化Ｐ．グラエＢ４３；およびＩ、通気不活化Ｐ．グラエＢ４３。マウスを、１％カルボキシメチルセルロース中、偽曝露（Ａ群）、Ｐ．ジンジバリス５３９７７に曝露（ストライプの棒）、またはＰ．グラエＢ４３に曝露（塗りつぶした（ｓｏｌｉｄ）棒）した。標準誤差測定値を示す。
【図１１】図１１は、骨損失パーセントに基づく、Ｐ．ジンジバリス５３９７７相同ワクチン有効性研究を示すグラフである。マウスに以下のワクチン抗原およびＲＩＢＩ ＭＰＬ＋ＴＤＭアジュバント（フロイントの完全および不完全アジュバントを利用したＣ群を除く）をワクチン接種した：ＡおよびＢ、ＰＢＳのみ；ＣおよびＤ、ホルマリン不活性化Ｐ．ジンジバリス５３９７７。１％カルボキシメチルセルロース中の、ＡではＰＢＳに；またＢ〜ＤではＰ．ジンジバリス５３９７７に、マウスを曝露した。
【図１２】図１２は、骨損失パーセントに基づく、Ｐ．グラエＢ４３相同ワクチン有効性研究を示すグラフである。マウスに以下のワクチン抗原およびＲＩＢＩ ＭＰＬ＋ＴＤＭアジュバントをワクチン接種した：Ａ〜Ｂ、ＰＢＳのみ；Ｃ、ホルマリン不活性化Ｐ．グラエＢ４３；Ｄ、ＢＥＩ不活化Ｐ．グラエＢ４３；Ｅ、熱不活化Ｐ．グラエＢ４３；およびＦ、通気不活化Ｐ．グラエＢ４３。１％カルボキシメチルセルロース中の、ＡではＰＢＳに；またＢ〜ＦではＰ．グラエＢ４３に、マウスを曝露した。
【図１３】図１３は、純骨損失に基づく、異種ワクチン有効性研究の結果を示すグラフである。マウスに以下のワクチン抗原およびＲＩＢＩ ＭＰＬ＋ＴＤＭアジュバントをワクチン接種した：Ａ〜Ｅ、ＰＢＳのみ；Ｆ〜Ｉ、ホルマリン不活化Ｐ．グラエＢ４３；Ｊ、ホルマリン不活化Ｐ．サリボサＢ１０４およびホルマリン不活化Ｏ．デンティカニスＢ１０６。１％カルボキシメチルセルロース中の、ＰＢＳ（Ａ）、Ｐ．グラエＢ４３（ＢおよびＦ；塗りつぶした棒）、Ｐ．グラエＢ６９（Ｃ、Ｇ、およびＪ；ストライプの棒）、Ｐ．サリボサＢ１０４（ＤおよびＨ；横線の（ｌｉｎｅｄ）棒）、またはＯ．デンティカニスＢ１０６（ＥおよびＩ；ポルカドットの棒）に、マウスを曝露した。標準誤差測定値を示す。
【図１４】図１４は、骨損失パーセントに基づく、異種ワクチン有効性研究のＰ．グラエＢ４３曝露群に関する結果を示すグラフである。マウスに以下のワクチン抗原およびＲＩＢＩ ＭＰＬ＋ＴＤＭアジュバントをワクチン接種した：Ａ〜Ｂ、ＰＢＳのみ；Ｃ、ホルマリン不活化Ｐ．グラエＢ４３。１％カルボキシメチルセルロース中の、ＡではＰＢＳに；またＢ〜ＣではＰ．グラエＢ４３に、マウスを曝露した。
【図１５】図１５は、骨損失パーセントに基づく、異種ワクチン有効性研究のＰ．グラエＢ６９曝露群に関する結果を示すグラフである。マウスに以下のワクチン抗原およびＲＩＢＩ ＭＰＬ＋ＴＤＭアジュバントをワクチン接種した：Ａ〜Ｂ、ＰＢＳのみ；Ｃ、ホルマリン不活化Ｐ．グラエＢ４３；またはＤ、ホルマリン不活化Ｐ．サリボサＢ１０４およびホルマリン不活化Ｏ．デンティカニスＢ１０６。１％カルボキシメチルセルロース中の、ＡではＰＢＳに；またＢ〜ＤではＰ．グラエＢ６９に、マウスを曝露した。
【図１６】図１６は、骨損失パーセントに基づく、異種ワクチン有効性研究のＰ．サリボサＢ１０４曝露群に関する結果を示すグラフである；マウスに以下のワクチン抗原およびＲＩＢＩ ＭＰＬ＋ＴＤＭアジュバントをワクチン接種した：Ａ〜Ｂ、ＰＢＳのみ；またはＣ、ホルマリン不活化Ｐ．グラエＢ４３。１％カルボキシメチルセルロース中の、ＡではＰＢＳに；またＢ〜ＣではＰ．サリボサＢ１０４に、マウスを曝露した。
【図１７】図１７は、骨損失パーセントに基づく、異種ワクチン有効性研究のＯ．デンティカニスＢ１０６曝露群に関する結果を示すグラフである。Ｏ．デンティカニスＢ１０６感染群に関する骨損失パーセントに基づく、異種ワクチン有効性研究。マウスに以下のワクチン抗原およびＲＩＢＩ ＭＰＬ＋ＴＤＭアジュバントをワクチン接種した：Ａ〜Ｂ、ＰＢＳのみ；またはＣ、ホルマリン不活化Ｐ．グラエＢ４３。１％カルボキシメチルセルロース中の、ＡではＰＢＳに；またＢ〜ＣではＯ．デンティカニスＢ１０６に、マウスを曝露した。
【図１８】図１８は、ＦｉｍＡ特異的ＥＬＩＳＡを利用した、組換えＰ．グラエＢ４３ ＦｉｍＡまたは生理食塩水をワクチン接種したマウスの血清学的結果を示すグラフである。各１６匹のマウスに、生理食塩水（Ａ）またはｒＦｉｍＡ／ＱｕｉｌＡ／コレステロール（Ｂ）のいずれかをワクチン接種した。ＦｉｍＡ特異的ＥＬＩＳＡを介し、ＦｉｍＡ特異的抗体に関して、プールした血清を試験した。試験した最小希釈は１：１００であった。この希釈で陰性結果を生じた試料にはいずれも、５０の力価を与えた。
【図１９】図１９は、ＯｐｒＦ特異的ＥＬＩＳＡを利用した、組換えＰ．グラエＢ４３ ＯｐｒＦまたは生理食塩水をワクチン接種したマウスの血清学的結果を示すグラフである。各１６匹のマウスに、生理食塩水（Ａ）またはｒＯｐｒＦ／ＱｕｉｌＡ／コレステロール（Ｂ）のいずれかをワクチン接種した。ＯｐｒＦ特異的ＥＬＩＳＡを介し、ＯｐｒＦ特異的抗体に関して、プールした血清を試験した。試験した最小希釈は１：１００であった。この希釈で陰性結果を生じた試料にはいずれも、５０の力価を与えた。
【図２０】図２０は、曝露後、第０週、第６週、および第１２週の骨損失を示すグラフである。Ｔ０１群は、イヌ３５５９４２４、３５９２６６９、３６７２８５９、３６７３３７５、および３６９１９２６に代表され；Ｔ０２群は、イヌ３３８９６００、３６２８８８４、３６５３５５２、３６５７３９６、３６９０１６４に代表される。
【図２１】図２１は、曝露後、第０週、第３週、第６週、第９週、および第１２週でのＴ０１群（ワクチン接種されそして曝露された群、またはＶｘ／Ｃｈ群）、Ｔ０２群（偽ワクチン接種され、そして曝露された群、または非Ｖｘ／Ｃｈ群）、およびＴ０３群（偽ワクチン接種され、そして偽曝露された群、または非Ｖｘ／非Ｃｈ群）の骨反応性スコアを示すグラフである。処置効果の統計的有意性もまた示す。
【図２２】図２２は、曝露後、第０週、第３週、第６週、および第９週でのＴ０１群（Ｖｘ／Ｃｈ群）、Ｔ０２群（非Ｖｘ／Ｃｈ群）、およびＴ０３群（非Ｖｘ／非Ｃｈ群）の骨反応性スコアを示すグラフである。Ｔ０１群およびＴ０２群間の統計的有意性を示す。
【図２３】図２３Ａ〜２３Ｄは、曝露後、第０週（２３Ａ）、第３週（２３Ｂ）、第６週（２３Ｃ）、および第９週（２３Ｄ）のＴ０１群（Ｖｘ／Ｃｈ群）の単一のイヌ由来のＸ線写真画像である。図２３Ｅ〜２３Ｈは、曝露後、第０週（２３Ｅ）、第３週（２３Ｆ）、第６週（２３Ｇ）、および第９週（２３Ｈ）のＴ０２群（非Ｖｘ／Ｃｈ群）の単一のイヌ由来のＸ線写真画像である。
【図２４Ａ】図２４Ａ〜２４Ｃは、Ｔ０１群（Ｖｘ／Ｃｈ群）およびＴ０２群（非Ｖｘ／Ｃｈ群）の平均全身反応を示すグラフであり；スコアは、各群それぞれのすべてのイヌの身体活動レベルの等級付け評価に基づく。
【図２４Ｂ】図２４Ａ〜２４Ｃは、Ｔ０１群（Ｖｘ／Ｃｈ群）およびＴ０２群（非Ｖｘ／Ｃｈ群）の平均全身反応を示すグラフであり；スコアは、各群それぞれのすべてのイヌの身体活動レベルの等級付け評価に基づく。
【図２４Ｃ】図２４Ａ〜２４Ｃは、Ｔ０１群（Ｖｘ／Ｃｈ群）およびＴ０２群（非Ｖｘ／Ｃｈ群）の平均全身反応を示すグラフであり；スコアは、各群それぞれのすべてのイヌの身体活動レベルの等級付け評価に基づく。
【図２４Ｄ】図２４Ｄ〜２４Ｆは、Ｔ０１群（Ｖｘ／Ｃｈ群）およびＴ０２群（非Ｖｘ／Ｃｈ群）の平均局所反応を示すグラフであり；スコアは、各群それぞれのすべてのイヌの注射部位に存在する腫脹レベルの等級付け評価に基づく。
【図２４Ｅ】図２４Ｄ〜２４Ｆは、Ｔ０１群（Ｖｘ／Ｃｈ群）およびＴ０２群（非Ｖｘ／Ｃｈ群）の平均局所反応を示すグラフであり；スコアは、各群それぞれのすべてのイヌの注射部位に存在する腫脹レベルの等級付け評価に基づく。
【図２４Ｆ】図２４Ｄ〜２４Ｆは、Ｔ０１群（Ｖｘ／Ｃｈ群）およびＴ０２群（非Ｖｘ／Ｃｈ群）の平均局所反応を示すグラフであり；スコアは、各群それぞれのすべてのイヌの注射部位に存在する腫脹レベルの等級付け評価に基づく。

【特許請求の範囲】
【請求項１】
コンパニオン動物における歯周病を治療するかまたは予防するためのワクチンであって、Ｐ．グラエ（Ｐ．ｇｕｌａｅ）Ｂ４３、Ｐ．サリボサ（Ｐ．ｓａｌｉｖｏｓａ）Ｂ１０４およびＯ．デンティカニス（Ｏ．ｄｅｎｔｉｃａｎｉｓ）Ｂ１０６の不活化全細胞調製物、並びに薬学的に許容しうるキャリアーを含む、前記ワクチン。
【請求項２】
細菌がホルマリンによって不活化された、請求項１のワクチン。
【請求項３】
イヌ・ジステンパーウイルス（ＣＤＶ）、イヌ・アデノウイルス−２（ＣＡＶ−２）、イヌ・パルボウイルス（ＣＰＶ）、イヌ・パラインフルエンザウイルス（ＣＰＩ）、またはイヌ・コロナウイルス（ＣＣＶ）の少なくとも１つをさらに含む、請求項１のワクチン。
【請求項４】
コンパニオン動物における歯周病を治療するかまたは予防するための方法であって、ワクチンを投与する必要があるコンパニオン動物に、請求項１〜３のいずれか１項記載のワクチンを投与することを含む、前記方法。
【請求項５】
薬学的に許容しうるキャリアー、並びにＰ．グラエＢ４３、Ｐ．サリボサＢ１０４およびＯ．デンティカニスＢ１０６の不活化全細胞調製物を含む、コンパニオン動物における歯周病を治療し、そして予防するための組成物を、少なくとも１つの容器中に含む、キットであって；該キットが、コンパニオン動物における歯周病を治療するかまたは予防するのに有用であることを示す、印刷した使用説明書セットをさらに含む、前記キット。
【請求項６】
１以上の歯周病原性（ｐｅｒｉｏｐａｔｈｏｇｅｎｉｃ）細菌に対するワクチンの有効性を評価するための方法であって：
ａ．第一の動物に、１以上の不活化または弱毒化歯周病原性細菌を含むワクチンを投与し；
ｂ．前記動物を、１以上の歯周病原性細菌を含有する、有効量の曝露培養物に曝露し；
ｃ．ワクチン接種していない第二の動物を、同量の前記曝露培養物に曝露し、ここで第二の動物は、第一の動物と同じ種である；
ｄ．前記歯周病原性細菌によって引き起こされる疾患の臨床徴候を測定し；そして
ｅ．ワクチン接種した動物に存在する疾患の臨床徴候を、ワクチン接種していない動物に存在する疾患の臨床徴候と比較して、それによって前記ワクチンの有効性を決定する
ことを含む、前記方法。
【請求項７】
前記ワクチンが、ポルフィロモナス属（Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ）、バクテリオデス属（Ｂａｃｔｅｒｉｏｄｅｓ）、プレボテラ属（Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ）、タネレラ属（Ｔａｎｎｅｒｅｌｌａ）またはトレポネーマ属（Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ）の少なくとも１種の弱毒化細菌または生細菌を含む、請求項６の方法。
【請求項８】
歯根成分が摘出され、その後、修復物が配置されている、歯の根管内に、前記曝露培養物が導入される、請求項６の方法。
【請求項９】
前記の第一および第二の動物がコンパニオン動物である、請求項６の方法。
【請求項１０】
前記曝露培養物が、曝露用量あたり、約１ｘ１０^２〜約１ｘ１０^１２コロニー形成単位（ＣＦＵ）を含む、請求項６の方法。
【請求項１１】
前記曝露培養物が、曝露用量あたり、約１ｘ１０^５〜約１ｘ１０^１１コロニー形成単位（ＣＦＵ）を含む、請求項６の方法。
【請求項１２】
前記曝露培養物が、曝露用量あたり、約５ｘ１０^７〜約５ｘ１０^１０コロニー形成単位（ＣＦＵ）を含む、請求項６の方法。
【請求項１３】
前記臨床徴候が、歯肉溝浸出液、歯垢、感染した骨、または歯肉溝中の１以上の歯周病原性細菌レベルの増加、あるいは歯槽骨（ａｖｅｏｌａｒ ｂｏｎｅ）量の変化を含む、請求項６の方法。
【請求項１４】
前記骨変化が、歯槽骨の歯根尖端周囲領域中である、請求項６の方法。
【請求項１５】
前記骨変化が、Ｘ線写真測定を介して定量化される、請求項６の方法。

【図１】

【図２】

【図３】

【図４ａ】

【図４ｂ】

【図５】

【図６】

【図７】

【図８ａ】

【図８ｂ】

【図９】

【図１０】

【図１１】

【図１２】

【図１３】

【図１４】

【図１５】

【図１６】

【図１７】

【図１８】

【図１９】

【図２０】

【図２１】

【図２２】

【図２３ａ】

【図２３ｂ】

【図２３ｃ】

【図２３ｄ】

【図２３ｅ】

【図２３ｆ】

【図２３ｇ】

【図２３ｈ】

【図２４Ａ】

【図２４Ｂ】

【図２４Ｃ】

【図２４Ｄ】

【図２４Ｅ】

【図２４Ｆ】

【公表番号】特表２００８−５００３７９（Ｐ２００８−５００３７９Ａ）
【公表日】平成２０年１月１０日（２００８．１．１０）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００７−５１７４７１（Ｐ２００７−５１７４７１）
【出願日】平成１７年３月２１日（２００５．３．２１）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＩＢ２００５／０００８２２
【国際公開番号】ＷＯ２００５／１１２９９３
【国際公開日】平成１７年１２月１日（２００５．１２．１）
【出願人】（３９７０６７１５２）ファイザー・プロダクツ・インク (504)
【Ｆターム（参考）】