治療におけるレトロトランスポゾン阻害
少なくとも１つのＬＩＮＥ−１反復因子の一部分を認識するＲＮＡ干渉は、癌性病変の治療に有用である。
【発明の詳細な説明】
【発明の背景】
【０００１】
本発明は、治療における逆転写酵素発現の阻害剤の使用に関する。
【０００２】
Ｓｐａｄａｆｏｒａ（Cytogenet Genome Res 105:346-350 (2004)）は、自身の論文で、内因性非テロメア逆転写酵素、ならびに胚形成および形質転換へのその関与について論じている。
【０００３】
より詳細には、逆転写酵素（ＲＴ）は、２種類の反復ゲノム因子、すなわちレトロトランスポゾンおよび内因性レトロウイルスによってコードされる。これらの因子はいずれも、それらの機構の必須成分としてＲＴを必要としている。
【０００４】
長鎖散在反復配列（long interspersed elements）（ＬＩＮＥ）などのレトロ転位可能な因子は、「ジャンクＤＮＡ」であり、もはや必要ではないが、ゲノムから削除されていない残りのＤＮＡとしてほとんど何の役割も果たさないと長い間考えられてきた。１９７１年というかなり以前から（Temin, J Natl Cancer Inst 46:56-60）、この見解は疑問視されていたが、当技術分野では依然としてこのような因子を単に「ジャンクＤＮＡ」として考えている。
【０００５】
Ｓｐａｄａｆｏｒａ（前掲）は、自身の論文で当該技術を再検討し、ＲＴコード遺伝子の発現が、一般には、非病理学的な終末分化細胞では抑制されるが、ごく初期の胚、胚細胞、胚および腫瘍組織（これらは全て高い増殖能を有している）においては活性であることを論証している。ネズミ胚でＲＴを阻止するとそれらの発育は停止し、阻止作用を取り除いても胚形成は再開しなかった。癌細胞では、増殖は著しく低下し、分化は４８時間から７２時間までの間で顕著であった。
【０００６】
Ｋｕｏら（Biochem and Biophys Res Com 253:566-570 (1998)）は、ヒト小細胞肺癌のｃＤＮＡライブラリから１．７ｋｂのＬＩＮＥ−１（Ｌ１）転写産物を同定した。彼らは、この反復因子が正常ヒト組織（繊維芽細胞および肝臓）および形質転換されたヒト組織の両方において普遍的に発現することを見出した。更に、彼らは、この転写産物に由来する、ヒト肝臓癌細胞を用いてインキュベーションされたセンスオリゴヌクレオチドが細胞増殖率を低下させることを示した。正常組織および癌組織の両方におけるこの因子の存在は、この反復因子と、細胞増殖の一般的な機能とを関連付けるようである。細胞増殖の低下は、突然変異による、細胞増殖の制御に関与する遺伝子のサイレンシングまたは機能的改変の結果であると、著者らは説明している。著者らは、形質転換が可逆的な事象であるとは示唆していない。
【０００７】
対照的に、本発明者らは、レトロトランスポゾンのＬＩＮＥ−１ファミリーの阻害が、癌性組織の増殖を阻害または阻止すると共に、それらの分化を刺激するのに効果的であることを本明細書中で立証している。
【発明の概要】
【０００８】
従って、第一の態様では、本発明は、癌性組織の未分化（unspecialised）増殖を阻害するためのＲＮＡ干渉の使用を提供し、該ＲＮＡは少なくとも１種のＬＩＮＥ−１反復因子の一部分を認識するものである。
【０００９】
他の態様では、本発明は、癌性病変の治療におけるＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）の使用を提供し、該ＲＮＡは少なくとも１種のＬＩＮＥ−１反復因子の一部分を認識するものである。
【００１０】
本発明のＲＮＡｉの使用によりＲＴ発現が低下すると、癌性組織の増殖が低下し、多くの場合には５０％を超える低下が見られ、その後の増殖は、少なくとも処理細胞においては、概して分化増殖に起因している。従って、本発明のＲＮＡｉは、一般に、癌性組織の増殖を低下させ、かつ分化を刺激するという両方の役割を果たす。
【００１１】
本発明のＲＮＡｉがＬＩＮＥ−１に特異的であること、かつ、それを使用することにより、全てのＲＴを阻止する包括的な非ヌクレオチドＲＴ阻害剤（ＮＮＲＴＩ）を使用する必要がなくなることが理解される。実際、ＬＩＮＥ−１がＲＴコード因子のサブグループにすぎないことを考えると、ＬＩＮＥ−１を対象とする本発明のＲＮＡｉが癌性組織の増殖を阻止または阻害する役割を果たすということは驚くべきことである。
【００１２】
現在、ＬＩＮＥ−１ファミリーのわずか数種（約６〜８）のメンバーだけがきわめて高い活性を有するものとして認識されており、これらのいずれか１つに対するＲＮＡｉが本発明により想定される。各ＲＮＡが個々のＬＩＮＥ−１レトロトランスポゾンに対して特異的であるＲＮＡｉを使用する組み合わせ療法が想定されるが、コンセンサンス配列に対するＲＮＡを使用することが好ましい。コンセンサス配列は、２種以上のＬＩＮＥ−１ファミリーメンバーに関するものであってもよいが、活性メンバーに関するものであるのが好ましく、それ以上が同定される場合にはそれ以上のメンバーに関するものであってもよい。
【００１３】
好ましくは、ＲＮＡｉは短鎖干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）であるか、または二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）である。
【００１４】
また、ＲＮＡは短鎖ヘアピンＲＮＡであり、好ましくはｓｉＲＮＡ発現ベクターに適合され、好ましくはそれにより投与されることが好ましい。好適なベクターとしては、当技術分野において周知であり、かつ本明細書に記載されているレトロウイルスのプラスミドが挙げられる
【００１５】
一般に、本発明で使用するＲＮＡの伸張部は、１０以上、例えば１５、２０、３０、４０以上のヌクレオチドであるのが好ましく、これらヌクレオチドは転写ＬＩＮＥ−１ ＤＮＡの領域の直接的なセンス等価物である。しかしながら、２１個のヌクレオチドが特に好ましい。転写ＬＩＮＥ−１ ＤＮＡは、コンセンサス領域から選択されるのが好ましい。しかしながら、本発明の干渉ＲＮＡがＬＩＮＥ−１ ＤＮＡからの転写ＲＮＡを結合する役割を果たす場合、ヌクレオチドの伸張部は、転写ＬＩＮＥ−１ ＤＮＡの選択領域に対して完全に忠実である必要はない。
【００１６】
それにもかかわらず、ＲＮＡｉからのＲＮＡヌクレオチドの伸張部は、ＬＩＮＥ−１配列からの転写ＤＮＡの相当する伸張部に対して忠実であることが特に好ましい。ＲＮＡＩは、ＬＩＮＥ−１配列からの転写ＤＮＡの相当する伸張部に対して忠実な２１個のヌクレオチド配列を含むのが好ましく、当該配列からなるのがより好ましい。
【００１７】
本発明のＲＮＡｉはループ構造を形成してもよく、ループは上述のヌクレオチドの伸張部内に位置していてもよく、その場合、伸張部はループによって中断されていてもよい。このループは、その構造の一部分についてはｄｓＲＮＡの形態を取っていてもよく、ＲＮＡの伸張部内に１、２または３のヌクレオチド分のギャップを設けていてもよい。標的ｍＲＮＡは選択配列に沿って結合されるように、前記ループはＲＮＡの伸張部から何も削除しないのが一般的に好ましい。
【００１８】
本発明のＲＮＡｉは、単にＬＩＮＥ−１因子からの対応する転写配列に結合することが可能な短い配列であってもよく、１種または２種の末端配列および／または内部ループ配列を更に含んでもよい。
【００１９】
ＬＩＮＥ−１内で選択された配列は、オープンリーディングフレームであるべきであり、例えば、ＲＴのＯＲＦ１およびＯＲＦ２から選択されてもよいことが理解される。従って、オープンリーディングフレームは逆転写酵素をコードするのが好ましい。これには、逆転写活性を有するあらゆるタンパク質が含まれる。
【００２０】
ＲＮＡｉ療法は、あらゆる便利な方法で行われてもよい。一般に、ＲＮＡｉが標的細胞に到達することを保証することが重要である。
【００２１】
本発明のＲＮＡｉは、任意の好適なベヒクル中に含まれた形で標的部位に直接注入してもよいが、例えば、スカフォードまたはナノ粒子に固定して投与してもよい。
【００２２】
より好ましくは、ＲＮＡｉは、例えばプラスミドとして、またはレトロウイルスを介して投与してもよい。アデノウイルスおよびアデノ随伴ウイルスベクターを用いて、好ましくはプラスミドの形態で、ＲＮＡｉ用コード配列を分配してもよい。他の同様のウイルスおよびレトロウイルス、ならびに他のこのようなベヒクルを使用してもよい。特に、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）などの透過因子を使用すると、プラスミドなどのコード配列を標的部位に送達する効果が血液循環において増大し得ることが確立されている。
【００２３】
別の好適な送達手段は、ｐＳＵＰＥＲ ＲＮＡｉシステムキット（www.oligoengine.com）である。
【発明の具体的説明】
【００２４】
本発明のＲＮＡｉが対象とするＬＩＮＥ−１因子（Ｌ１）は、好ましくは、Ｂｒｏｕｈａらの教示（２００３）（参照することにより本明細書の一部とされる）に従って選択される。
【００２５】
Ｌ１は活性である場合にＲＴを発現することができるようであるので、活性Ｌ１が好ましい。従って、本発明のＲＮＡｉは、好ましくは、少なくとも１つの活性Ｌ１の一部分を認識するか、または標的とする。好ましくは、ＲＴ発現は、ＲＮＡｉによって阻害される。
【００２６】
使用するＲＮＡｉ配列は、標的Ｌ１内に含まれる特定のＯＲＦからの転写によって得られるＲＮＡを認識し、かつ該ＲＮＡと結合できることが理解される。Ｌ１因子は、本明細書に記載される好ましい配列も含むという事実によって特徴付けられる。
【００２７】
従って、Ｌ１配列は、他の箇所で論じるように、本発明の好ましい配列（例えば配列番号２７）、その対応するＤＮＡ配列またはその相同体などによって同定されるが、Ｌ１配列はまた、タンパク質、好ましくはＲＴを発現可能であるのが好ましく、その発現はＲＮＡｉによって阻害される。
【００２８】
ＬＩＮＥ−１ ＲＮＡに対するＲＮＡｉ配列の結合は、５０％ホルムアミドと６×ＳＳＣとを含有する緩衝液中などのストリンジェント条件下でなされるのが好ましい。
【００２９】
Ｌ１因子を特徴付けるために使用する配列は、それ自身がＯＲＦである、ＯＲＦの一部分である、またはＯＲＦの少なくとも一部分を含むのが好ましい。好ましくは、ＲＮＡｉが標的として使用するＬ１配列は前記Ｌ１因子のＯＲＦ内に含まれる。
【００３０】
故に、好ましい特定のＤＮＡ配列について言及すると、これは、同定するのに使用される配列であり、Ｌ１因子のより大きな配列内に含有されるようであることが理解される。従って、Ｌ１因子自身が発現可能なＯＲＦを含有する場合、Ｌ１因子の同定配列はＯＲＦを含有する必要はなく、ＯＲＦから転写されたＲＮＡは、当該特定Ｌ１因子を標的とするＲＮＡｉに結合され得る。
【００３１】
故に、ＲＮＡｉは、この好ましいＤＮＡ配列もしくその対応配列、またはその相同体を含むＬ１因子を標的とするのが好ましい。
【００３２】
好ましいＬ１因子に含まれるＯＲＦの例は、配列番号２０〜２５のプライマー配列に相当する配列である。従って、ＲＮＡｉは、好ましくは、これらの配列番号またはそれらに相当する配列を認識する。
【００３３】
より詳細には、ＯＲＦ１については：
５’−ＡＧＡＡＡＴＧＡＧＣＡＡＡＧＣＣＴＣＣＡ−３’（配列番号２０）；
５’−ＧＣＣＴＧＧＴＧＧＴＧＡＣＡＡＡＡＴＣＴ−３’（配列番号２１）；および
５’−ＴＡＡＧＧＧＣＡＧＣＣＡＧＡＧＡＧＡＡＡ−３’（配列番号２４）。
【００３４】
ＯＲＦ２については：
５’−ＴＣＣＡＧＣＡＧＣＡＣＡＴＣＡＡＡＡＡＧ−３’（配列番号２２）；
５’−ＣＣＡＧＴＴＴＴＴＧＣＣＣＡＴＴＣＡＧＴ−３’（配列番号２３）；および
５’−ＴＧＡＣＡＡＡＣＣＣＡＣＡＧＣＣＡＡＴＡ−３’（配列番号２５）。
【００３５】
従って、これらの配列のＲＮＡ等価物は、ＯＲＦ１については：
５’−ＡＧＡＡＡＵＧＡＧＣＡＡＡＧＣＣＵＣＣＡ−３’（配列番号３９）；
５’−ＧＣＣＵＧＧＵＧＧＵＧＡＣＡＡＡＡＵＣＵ−３’（配列番号４０）；および
５’−ＵＡＡＧＧＧＣＡＧＣＣＡＧＡＧＡＧＡＡＡ−３’（配列番号４１）であり、
【００３６】
ＯＲＦ２については：
５’−ＵＣＣＡＧＣＡＧＣＡＣＡＵＣＡＡＡＡＡＧ−３’（配列番号４２）；
５’−ＣＣＡＧＵＵＵＵＵＧＣＣＣＡＵＵＣＡＧＵ−３’（配列番号４３）；および
５’−ＵＧＡＣＡＡＡＣＣＣＡＣＡＧＣＣＡＡＵＡ−３’（配列番号４４）である。
【００３７】
従って、ＲＮＡｉは、配列番号３９から４４のいずれか１つからの少なくとも１つの断片、好ましくは少なくとも１０個の連続する、より好ましくは１５個、最も好ましくは２０個の連続するヌクレオチドを含むことが特に好ましい。上述のように、様々な機構が散在する前記配列のより短い伸張部、例えばヘアピンループも好ましい。
【００３８】
Ｌ１ＲＰの場合、ＯＲＦ１のＣＤＳは、配列番号２７の９０７位〜１９２３位に存在して、配列番号４５のタンパク質配列をコードし、配列番号２７の１９８７位から５８１４位に存在するＣＤＳはＯＲＦ２をコードし、このタンパク質配列は配列番号４６で表される。ＲＴ活性を有すると考えられるのは、ＯＲＦ２にコードされるタンパク質である。従って、ＲＮＡｉは配列番号２７の９０７位〜１９２３位および／または配列番号２７の１９８７位〜５８１４位に含まれるＤＮＡを対象とし、好ましくは配列番号４５、最も好ましくは配列番号４６に従ったタンパク質の発現を阻害することができるのが好ましい。同様に、ＣＤＳは、配列番号３２の１７７１７位〜１８６９７位、および１１５０３３位〜１１６１６１位に存在するが、これらは擬似遺伝子と記載され、故に好ましくない。
【００３９】
従って、ＲＮＡｉは配列番号４５、最も好ましくは配列番号４６に従ったタンパク質をコードするＲＮＡ配列に相当するＲＮＡの伸張部を含むことが好ましい。この伸張部は、他の箇所に記載されるヘアピン構造または他の機構を包含していてもよい。好ましくは、ＲＮＡｉは、配列番号４５、最も好ましくは配列番号４６に従ったタンパク質をコードするＲＮＡ配列に相当するＲＮＡの２０または２１ｂｐの伸張部からなる。好ましくは、ＲＮＡｉは、配列番号１９の配列またはそのＲＮＡ等価物（配列番号４７）を有し、これはホットＬ１におけるコンセンサス配列を標的とする。
【００４０】
更なる態様において、本発明はこのようなＲＮＡｉを提供する。
【００４１】
Ｂｒｏｕｈａ（２００３）らの文献に記載されるように、活性Ｌ１は、好ましくは多型であり、「若い」、すなわち最近形成されたものであるのが好ましい。その理由は、Ｌ１因子または配列の年齢が、そこで起こり得る多様化（diversion）を決定するからである。Ｂｒｏｕｈａ（２００３）らの文献で論じられるように、配列の多様化がほとんど見られないＬ１は、一般には、集団内では多型であり、培養細胞内では活性であった。逆に、高度に多様化したＬ１配列は、最も頻繁には固定され、不活性である。
【００４２】
活性Ｌ１は、６ｋｂｐ長である場合が多く、５’欠失がないことを示している。従って、ＬＩＮＥ−１因子は、少なくとも６ｋｂｐ長であるのが好ましい。
【００４３】
好ましいのは、平均的なヒトにおける、Ｂｒｏｕｈａ（２００３）らの文献において活性であると予測された８０〜１００個のレトロ転位コンピテントなＬ１である。これらのレトロ転位コンピテントなＬ１のうちの６種は「高度に活性なＬ１（ホットＬ１）」であることが判明した。ホットＬ１は、Ｌ１ＲＰの活性の少なくとも１／３を示すのが好ましい。従って、Ｌ１配列が「ホットＬ１」であり、ヒトにおいて高い生物学的活性を有し、好ましくはＬ１ＲＰ活性の少なくとも１／３を示すことが特に好ましい。
【００４４】
Ｌ１ＲＰはホットＬ１であり、Ｂｒｏｕｈａら（２００３）の文献およびＨｕｍ．Ｍｏｌ．Ｇｅｎｅｔ．８（８），１５５７−１５６０（１９９９）に記載されている（http://hmg.oxfordjournals.org/cgi/reprint/8/8/1557で入手可能：ＮＣＢＩアクセッション番号ＡＦ１４８８５６、配列番号２７）。ＯＲＦを標的とするのが好ましいので、配列番号２７の９０７位〜１９２３位（ＯＲＦ１）および１９８７位〜５８１４位（ＯＲＦ２）のヌクレオチドがＲＮＡｉの特に好ましい標的である。
【００４５】
Ｌ１ＲＰに関する活性は、好適なアッセイによって、例えば当業者によって容易に選択される検出可能な発現マーカーにＬＩＮＥ−１因子を連結することによって測定してもよい。好ましくは、これには、Ｂｒｏｕｈａら（２００３）の文献で使用されている方法やＥＧＦＰアッセイが含まれる。ＥＧＦＰカセットの構築および活性を評価するための当該カセットの使用方法は、Ｂｒｏｕｈａら（２００３）の文献からの参照番号２３、Ｈａｉｇ Ｈ． Ｋａｚａｚｉａｎ Ｊｒ ｅｔ al：Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ， ２０００， Ｖｏｌ． ２８， Ｎｏ． ６， １４１８−１４２３に更に記載されている。ＥＧＦＰを含むＬ１の好適な例は、以下に記載される配列番号２６である。
【００４６】
理論に拘束されることなく、転写は、その５開始ＵＴＲ内に位置する内部プロモータから開始され、ＲＮＡは細胞質に移送されると考えられている。Ｌ１コードタンパク質、すなわちＯＲＦ１ｐおよびＯＲＦ２ｐは、それらをコードしたｍＲＮＡに作用し、この現象はｃｉｓ型優先（cis preference）として知られている。
【００４７】
次いで、生じたリボヌクレオタンパク質粒子は、細胞核に再度入り、ここで、最初に標的開始（target-primed）逆転写によってＬ１の組み込みが生じると考えられている。このプロセスの間、Ｌ１エンドヌクレアーゼは、ゲノムＤＮＡ中の緩いコンセンサス配列５’−ＴＴＴＴＴ／Ａ−３’にて一本鎖ニックを生成して、３’ＯＨを露出し、これはＬ１ ＲＴ（逆転写酵素）によるＬ１ ＲＮＡの逆転写用プライマーとして使用される。
【００４８】
好ましくは、ＬＩＮＥ−１配列は、２１塩基対のコンセンサス配列（配列番号１９）、その対応する（アンチセンス）ＤＮＡ配列またはそのＲＮＡ等価物を含む。故に、本発明のＲＮＡｉがこの２１塩基対配列のＲＮＡ等価物、または配列番号１９に相当するＤＮＡ配列のＲＮＡ等価物、または６×ＳＳＣなどのストリンジェント条件下でそれとハイブリダイズできる配列を含むことも好ましい。
【００４９】
また、ＲＮＡｉが標的とする配列は、配列番号３５〜３８のいずれか、より好ましくは配列番号３７、最も好ましくは配列番号３５であるのが好ましい。対応するＤＮＡ配列またはそのＲＮＡ等価物もこれに含まれる。配列番号３５は実施例２において標的とされる６０ｂｐの配列であり、一方、配列番号３６〜３８は、下記に記載されるような、より長いコンセンサス配列である。
【００５０】
標的とされるＬ１配列はまた、本明細書に記載される配列のいずれかと、ある程度の相同性、好ましくは少なくとも７０％、より好ましくは少なくとも８５％、より好ましくは少なくとも９５％、より好ましくは少なくとも９９％、より好ましくは少なくとも９９．５％、より好ましくは少なくとも９９．９％、より好ましくは少なくとも９９．９５％、最も好ましくは少なくとも９９．９９％の相同性を有することができる。故に、ＲＮＡｉは、これらの好ましい配列またはそれらの対応する配列、またはその相同体を含むＬ１因子を標的とするのが好ましい。
【００５１】
特定の配列について言及すると、当該配列がＤＮＡ配列の場合、これには、その対応するＤＮＡ配列（例えば、６×ＳＳＣなどの高度にストリンジェントな条件下で前記配列とハイブリダイズする配列）、またはそのＲＮＡ等価物、すなわち前記ＤＮＡ配列の転写によって得られるＲＮＡ配列が含まれると理解される。
【００５２】
ＬＩＮＥ−１因子（Ｌ１）は、ＲＴをコードするものであれば、広範なレトロ転位可能な因子群から選択されてもよい。Ｌ１は、Ｌ１因子の「転写群Ａ」（Ｔａ）サブセットまたはプレ−Ｔａサブセットに由来するのが好ましい。しかしながら、Ｔａサブセットが特に好ましく、特にＴａ−１ｄファミリーが好ましい。
【００５３】
しかしながら、Ｌ１がＬＲＥ３、Ｌ１ＲＰ（ＮＣＢＩアクセッション番号ＡＦ１４８８５６）、ならびにアクセッション番号ａｃ００４２００、ａｃ００２９８０、ａｌ３５６４３８、ａｌ５１２４２８、ａｃ０２１０１７およびａｌ１３７８４５（それぞれ配列番号２６〜３３）からなる群から選択されることが特に好ましい。これらの配列およびその関連する特徴データは、ＮＣＢＩウェブサイト（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi）から入手可能である。
【００５４】
配列番号２６に関して、与えられた全配列は、ＬＲＥ３−ＥＧＦＰの合成構築物、すなわちＥＧＦＰ（強化緑色蛍光タンパク質（Enhanced Green Fluorescent Protein））で標識されたＬＲＥ３、ならびに破壊されたＤｌｇｈ２遺伝子（部分配列）である。しかしながら、当業者であれば、１位〜１５５位にＥＧＦＰコード領域を包含する必要はなく、また５１０位〜９１０位にＤｌｇｈ２遺伝子部分を包含する必要もなく、これらは、与えられた他のＬ１に存在するようなＯＲＦ１およびＯＲＦ２と置き換えてもよいことを容易に理解する。この特徴および更なる特徴に関する情報は、ＮＣＢＩウェブサイトから配列番号２６に関するアクセッション番号、すなわちＡＹ９９５１８６のもとで入手可能である。
【００５５】
当業者は、ＥＧＦＰのような検出可能なマーカーを包含するＬ１を設計することができ、開始点または鋳型として配列番号２６を使用してもよい。
【００５６】
Ｌ１因子群に関するコンセンサス配列は、配列番号３６〜３８に提供されている。配列番号３６はＴａ−１ｄコンセンサス配列であり、配列番号３７はホット因子コンセンサス配列であり、配列番号３８は９０個の活性なＬ１に関するより広範なコンセンサス配列である。これらは、Ｂｒｏｕｈａら（２００３）のオンライン文献の「supporting information」から得られたものである（www.pnas.orgから入手可能）。
【００５７】
故に、Ｌ１配列は、配列番号３６、３７および３８のいずれか、またはその対応する配列または相同体から選択されることが好ましい。相同体は、好ましくは、前記配列番号またはその対応する配列と、好ましくは少なくとも７０％、より好ましくは少なくとも８５％、より好ましくは少なくとも９５％、より好ましくは少なくとも９９％、より好ましくは少なくとも９９．５％、より好ましくは少なくとも９９．９５％、最も好ましくは少なくとも９９．９９％の相同性を有する。
【００５８】
ホットＬ１コンセンサス配列（配列番号３７）またはその対応する配列もしくは相同体は、活性が高いので特に好ましい。ホットｌ１コンセンサスに対する相同性または類似性の程度は、レトロ転位活性の良好な予測材料となる。Ｂｒｏｕｈａ（２００３）は、Ｌ１活性とヌクレオチド配列との関係を分析し、コンセンサス配列（８個のホットＬ１（ＬＲＥ３、Ｌ１ＲＰ、ａｃ００４２００、ａｃ００２９８０、ａｌ３５６４３８、ａｌ５１２４２８、ａｃ０２１０１７およびａｌ１３７８４５）を有する配列番号３７）を構築した。この配列は、１０３３位におけるＯＲＦ１のサイレント変異を除いて、Ｔａ−１ｄコンセンサス（配列番号３６）と同じであり、１２個の多型部位を除いて、９０個の無傷なＬ１のコンセンサスと同じである。
【００５９】
Ｂｒｏｕｈａら（２００３）は、Ｌ１を、最初に活性群および不活性群として、次に対で、ホット因子のコンセンサスと比較した。彼らは、Ｌ１を、全体的に、次いで領域ごとに、最後にアミノ酸変異を引き起こす差異ごとに分析した。活性または不活性Ｌ１と独自に関連するヌクレオチド変異は存在しないことが判明した。予期するように、幾つかの例外はあるが、Ｌ１がホットＬ１コンセンサスに近い程、活性である可能性が高かった。上記の結果を踏まえると、彼らのデータは、レトロ転位活性の低下が時間の関数として生じることを示している。Ｌ１が「ホット」コンセンサス配列から遠い程、活性である可能性は低い。
【００６０】
ＬＩＮＥ−１因子が上述の配列、特にホットＬ１に対してきわめて高い配列相同性を有することが特に好ましい。この理由は、Ｂｒｏｕｈａらの文献で論じられるように、幾つかの例外はあるが、Ｌ１配列は、ホットＬ１配列に近い程、活性である可能性が高いからである。上述のように、ＬＩＮＥ−１配列または因子がホットＬ１であり、好ましくはＬ１ＲＰの活性の少なくとも１／３、好ましくは少なくとも２／３、より好ましくは１００％、最も好ましくは１００％よりも高く、好ましくは１５０％以上であるのが好ましい。
【００６１】
特に好ましいホットＬ１の中では、全てが多型であり、そのうち３個（ａｃ００２９８０、ａｃ００４２００およびａｌ３５６４３８）が、最も若いＴａ−１ｄ群に由来する。更に、１つはＴａ−１ｎｄ群（ａｌ５１２４２８）であり、別のものは、より若いＴａ−０サブグループ（ａｌ１３７８４５）のメンバーである。これら５個の標準的なホットＬ１の配列は、それら各々の群またはサブグループのコンセンサス配列に非常に類似しており、これは、それらがヒトの進化の過程で比較的最近になってレトロ転位したことを示している。最後に、１つのホットＬ１（ａｃ０２１０１７）は非標準的である。
【００６２】
２１個のヌクレオチド配列（配列番号１９）は、約９０（８０〜１００）個の活性なＬ１レトロ因子内に存在する対応配列に相補的であり、これらのレトロ因子は本発明の好ましい標的である。故に、ＲＮＡｉは、好ましくは、当該配列もしくはその対応配列、またはその相同体を含むＬ１因子を標的とする。
【００６３】
約３０年前からＬＩＮＥ−１と逆転写酵素（ＲＴ）との関連が知られていたが、ＲＴがＬＩＮＥ−１にコードされる遺伝子の１つであることが明らかにされた後は、ＬＩＮＥ−１レトロ因子は、従来から無用なものとして分類され、しばしば「ジャンクＤＮＡ」と呼ばれている。従って、このジャンクＤＮＡは、生物学的役割を果たさないものとして広くみなされていた。これにもかかわらず、本発明者らは、驚くべきことに、ＲＴ阻害が腫瘍増殖に拮抗することができることを発見した。本発明者らは初めて、ＬＩＮＥ−１配列に特異的な標的ＲＮＡｉが、培養物における細胞増殖および動物モデルにおける腫瘍増殖を阻害することを認識した。
【００６４】
Ｏｎｃｏｇｅｎｅ ２００３，Ｖｏｌ．２２，ｐｐ．２７５０〜２７６１（Ｍａｎｇｉａｃａｓａｌｅら）は、薬理学的ＲＴ阻害剤に焦点を当てており、ＲＮＡｉについては全く言及していない。Ｃｙｔｏｇｅｎｅｔ． Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓ ２００４，Ｖｏｌ．１０５，ｐｐ．３４６〜３６０（本発明者らの一人であるＣ． Ｓｐａｄａｆｏｒａ）は、従来技術の様々な系譜をまとめた総説であるが、やはりＲＮＡｉの手法は開示していない。
【００６５】
ＲＮＡｉは、好ましくは二本鎖である。好ましくは、二本鎖リボオリゴヌクレオチドは、細胞トランスフェクションのために、遊離形態では使用されておらず、好ましくは特異的ｓｉＲＮＡをコードするＤＮＡ構築物によって担持されている。好ましくは、転写ＲＮＡは、細胞「ｄｉｃｅｒ」システムによって更に自然発生的に加工される二本鎖パリンドローム構造を形成することにより、例えばＢｒｕｍｍｅｌｋａｍｐら（２００２）に教示されるようなｓｉＲＮＡ分子を形成する。（ＤＭＩに対する注記：この参照を参考文献一覧の最後に挿入する）
【００６６】
他の態様において、ＲＮＡｉを送達するための標準的な細胞トランスフェクション手順を、レトロウイルスまたはアデノウイルス起源の適切な送達システムに置き換えるのが好ましい。このようなウイルスシステムは、当技術分野において周知である。好ましくは、Ｌ１標的ＲＮＡｉを発現するウイルスベクターまたはキャプシド、好ましくはｓｉＲＮＡは、腫瘍細胞を特異的に標的とすることができ、腫瘍細胞に感染することによってＲＮＡｉを発現させ、例えば転写によってｓｉＲＮＡを提供し、それにより腫瘍の増殖に拮抗し、腫瘍細胞の分化を刺激する。
【００６７】
あらゆる腫瘍細胞を標的とする、または治療することが想定されるが、腫瘍細胞は、好ましくは乳癌腫瘍、肺癌腫瘍、黒色腫および前立腺癌からなる群から選択され得る。実際、黒色腫および前立腺癌が特に好ましい。
【００６８】
従って、適切である場合には、ＲＮＡｉは、例えば注入または移植片からの放出により癌性組織に送達されることが特に好ましい。上述のように、好ましくは特異的ｓｉＲＮＡをコードするＤＮＡ構築物を含むウイルスベクターまたはキャプシドが使用されることが特に好ましい。この例において、ウイルスベクターまたはキャプシドは、標的組織、すなわち癌性組織または腫瘍組織においてＤＮＡ構築物を発現できるのが好ましい。これは、ＤＮＡ構築物に含まれる適切な組織特異的プロモータによる、および／または特定の組織に特異的なウイルスキャプシドまたはベクターによるものであってもよい。
【００６９】
上述のことは、特異的ｓｉＲＮＡをコードするポリヌクレオチド、好ましくはＤＮＡを含むプラスミドにも当てはまる。特に、このプラスミドが、好適な組織特異的プロモータまたはｓｉＲＮＡの組織特異的発現のための他の手段を含むのが好ましい。
【００７０】
プラスミドおよびベクターまたはキャプシドのいずれの例においても、プラスミド、ベクターまたはキャプシドが、やはり好ましくは組織特異的に癌性組織のみを標的とするのが好ましい。
【００７１】
更なる態様において、本発明はまた、癌または腫瘍を有する患者を治療する方法を提供し、該方法は、好ましくは上述のようなＲＮＡ干渉の利用を含む。好ましくは、この方法は、上述のように、癌性組織を有する個人を選択し、少なくとも１つのＬ１因子に対してＲＮＡ干渉手法を使用することを含む。好ましくは、この方法は、癌性組織の増殖の阻害または阻止を引き起こす、好ましくは前記組織の分化を刺激するのに十分な逆転写酵素（ＲＴ）の治療的に有効な阻害を含む。
【００７２】
１個のＬＩＮＥ−１因子だけを標的とすることが想定されているが、複数のＬＩＮＥ−１因子を、同時にまたは連続的に、予定される投薬計画の一部として、標的とすることが好ましい。
【００７３】
更なる態様において、本発明はまた、癌性疾患を治療するための医薬の製造における、少なくとも１つのＬＩＮＥ−１因子の一部分を標的とするか、またはこれを認識することができるｓｉＲＮＡをコードするポリヌクレオチド配列、好ましくはＤＮＡ配列の使用を提供する。好ましくは、この医薬は、当該ポリヌクレオチドを含んでなるウイルスキャプシドまたはベクターを含む。
【００７４】
ここで、本発明は、添付の非制限的な実施例を参照して更に説明される。
【実施例】
【００７５】
実施例１
方法
細胞培養物
ヒトＡ−３７５黒色腫（ＡＴＣＣ−ＣＲＬ−１６１９）、ＴＶＭ−Ａ１２一次黒色腫由来（２０）、ＨＴ２９腺癌（ＡＴＣＣ ＨＴＢ−３８）、Ｈ６９小細胞肺癌（ＳＣＬＣ）（ＡＴＣＣ ＨＴＢ１１９）およびＰＣ３前立腺癌（ＡＴＣＣ ＣＲＬ−１４３５）細胞系を、１０４〜５×１０４細胞／ウェルの密度にて６ウェルプレートに播種し、１０％ウシ胎仔血清を含むＤＭＥＭまたはＲＰＭＩ１６４０内で培養した。ネビラピン（Nevirapine）およびエファビレンツ（Efavirenz）を、上述のような市販のビラミューン（Viramune）（Boehringer-Ingelheim）およびサスティバ（Sustiva）（Bristol-Myers Squibb）から精製した（１８）。薬剤をジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）（Sigma-Aldrich）中でそれぞれ３５０μＭおよび１５μＭとし、播種から５時間後に細胞に添加した。対照には、同じＤＭＳＯ容積（最終濃度０．２％）を添加した。４８時間ごとに新鮮なＲＴ阻害剤含有培地に交換した。細胞を９６時間ごとに回収し、Ｂｕｒｋｅｒチャンバ内でカウントし（２回のカウント／試料）、同じ密度にて再プレーティングした。
【００７６】
細胞周期および細胞死分析
回収直前の３０分間に、ＢｒｄＵ（２０μＭ）を培養物に添加した。次いで、回収した細胞を抗ＢｒｄＵ抗体およびヨウ化プロピディウム（ＰＩ）で処理し、ＦＡＣＳｔａｒ Ｐｌｕｓフローサイトメーター（Beckton-Dickinson）においてＤＮＡ含量とＢｒｄＵ取り込みとの二重パラメータ（biparametric）分析に供した。ＤＡＰＩ（核形態学）、ＰＩ（細胞浸透性）および３，３ジヘキシルオキサカルボシアニン［ＤｉＯＣ６（３）］、ミトコンドリア膜電位用蛍光プローブによる複合染色後、顕微鏡で細胞死を評価した。
【００７７】
間接的免疫蛍光検査および共焦点レーザー走査顕微鏡法
Ａ−３７５およびＴＶＭ−Ａ１２細胞を４％パラホルムアルデヒドで１０分間固定し、ＰＢＳ中の０．２％Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ１００において５分間浸透化した。マウスモノクローナル抗ウシα−チューブリン（Molecular Probes, A-11126）をＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４８８−結合二次抗体（Molecular Probes, cat. A-11001）によって顕在化し、０．１ｍｇ／ｍｌのリボヌクレアーゼＡの存在下、２μｇ／ｍｌのＰＩで核を染色した。アルゴン／クリプトンレーザー（励起波長および発光波長：Ａｌｅｘａ４８８の場合４８８ｎｍおよび５１０ｎｍ、ＰＩの場合５６８ｎｍおよび５９０ｎｍ）を備えた共焦点Ｌｅｉｃａ ＴＣＳ ４Ｄ顕微鏡下で撮像した。共焦点区域は、０．５〜１μｍ間隔で設けた。
【００７８】
走査電子顕微鏡（ＳＥＭ）
Ａ−３７５およびＴＶＭ−Ａ１２細胞を、０．１Ｍ Ｍｉｌｌｏｎｉｇ’ｓリン酸塩緩衝液中の２．５％グルタルアルデヒドで固定した。洗浄後、細胞をＭＰＢ中の１％ＯｓＯ４（１時間、４℃）でポスト固定し、高アセトン濃度で脱水した。液体ＣＯ２を用いて試料を臨界点乾燥させ、金でスパッタコーティングし、Ｓｔｅｒｅｏｓｃａｎ２４０走査電子顕微鏡（Cambridge Instr.（英国、ケンブリッジ（Cambidge, UK）））上で検査した。
【００７９】
半定量的ＲＴ−ＰＣＲ
ＲＮＡ抽出およびＲＮａｓｅを含まないＤＮａｓｅ Ｉによる処理は（１８）に記載される通りに行った。３００ｎｇのＲＮＡ、オリゴ（ｄＴ）およびＴｈｅｒｍｏｓｃｒｉｐｔシステム（Invitrogen）を用いてｃＤＮＡを合成した。最初の工程は９４℃で２分間、続いて９４℃で３０秒、５８℃〜６２℃で３０秒、７２℃で１分間のサイクルにて、Ｐｌａｔｉｎｕｍ Ｔａｑ ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅキット（Invitrogen）および３０ｐｍｏｌのオリゴヌクレオチド（MWG-Biotech、ドイツ、エーベルスベルグ（Ebersberg, Germany））を用いて反応混合物の１／２５を増幅した。
【００８０】
サイクル数を増やした（２５〜４０）一連の増幅において、各オリゴ対を使用した。ＰＣＲ産物を、電気泳動させ、膜に転写し、［３２Ｐ］γ−ＡＴＰ末端標識内部オリゴヌクレオチドで４２℃にて１６時間ハイブリダイズさせた。各遺伝子につき少なくとも３回の独立した実験において、増幅シグナルの強度をデンシトメトリーによって測定した。
【００８１】
半定量的ＰＣＲ分析に使用するオリゴヌクレオチド（正：Ｆ、逆：Ｒ）およびハイブリダイゼーション用の内部プローブ（ＩＮＴ）
Ｃ−ｍｙｃ ＰＣＲ産物のサイズ：６３３ｂｐ；
Ｆ，５’−ｇｔｃａｃａｃｃｃｔｔｃｔｃｃｃｔｔｃｇ−３’（配列番号１）；
Ｒ，５’−ｔｇｔｇｃｔｇａｔｇｔｇｔｇｇａｇａｃｇ−３’（配列番号２）；
ＩＮＴ，５’−ａｇａｇａａｇｃｔｇｇｃｃｔｃｃｔａｃｃ−３’（配列番号３）；
【００８２】
Ｂｃｌ２ ＰＣＲ産物のサイズ：４５９ｂｐ；
Ｆ，５’−ｇｇｔｇｃｃａｃｃｔｇｔｇｇｔｃｃａｃｃｔｇ−３’（配列番号４）；
Ｒ，５’−ｃｔｔｃａｃｔｔｇｔｇｇｃｃｃａｇａｔａｇｇ−３’（配列番号５）；
ＩＮＴ，５’−ｃｔｇａａｇａｇｃｔｃｃｔｃｃａｃｃａｃ−３’（配列番号６）；
【００８３】
Ｅ−カドヘリン ＰＣＲ産物のサイズ：７３２ｂｐ；
Ｆ，５’−ｃｔｃｃｔｃｔｃｃｔｇｇｃｃｔｃａｇａａ−３’（配列番号７）；
Ｒ，５’−ｔａｃｔｇｃｔｇｃｔｔｇｇｃｃｔｃａａａ−３’（配列番号８）；
ＩＮＴ，５’−ｇａａｃｇｃａｔｔｇｃｃａｃａｔａｃａｃ−３’（配列番号９）；
【００８４】
ＰＳＡ ＰＣＲ産物のサイズ：５８４ｂｐ；
Ｆ，５’−ｔｔｇｔｃｔｔｃｃｔｃａｃｃｃｔｇｔｃｃ−３’（配列番号１０）；
Ｒ，５’−ａｇｃａｃａｃａｇｃａｔｇａａｃｔｔｇｇ−３’（配列番号１１）；
ＩＮＴ，５’−ｃｃａｃａｃｃｃｇｃｔｃｔａｃｇａｔａｔ−３’（配列番号１２）；
【００８５】
Ｃｃｎｄ１ ＰＣＲ産物のサイズ：６９０ｂｐ；
Ｆ，５’−ｃｃｃｔｃｇｇｔｇｔｃｃｔａｃｔｔｃａａ−３’（配列番号１３）；
Ｒ，５’−ｔｃｃｔｃｃｔｃｔｔｃｃｔｃｃｔｃｃｔｃ−３’（配列番号１４）；
ＩＮＴ，５’−ｃｇｃａｃｇａｔｔｔｃａｔｔｇａａｃａｃ−３’（配列番号１５）；
【００８６】
Ｇａｐｄｈ ＰＣＲ産物のサイズ：５９０ｂｐ；
Ｆ，５’−ａｇｇｇｇｔｃｔａｃａｔｇｇｃａａｃｔｇ−３’（配列番号１６）；
Ｒ，５’−ａｃｃｃａｇａａｇａｃｔｇｔｇｇａｔｇｇ−３’（配列番号１７）；
ＩＮＴ，５’−ｇｔｃａｇｔｇｇｔｇｇａｃｃｔｇａｃｃｔ−３’（配列番号１８）。
【００８７】
ＬＩＮＥ−１に対するＲＮＡ干渉
Ｂｒｕｈａらの文献（２１）に記載される高度に活性なＬＩＮＥ−１因子のコンセンサス配列を標的とするべく、Ａ２１−ｎｔ二本鎖ｓｉＲＮＡオリゴヌクレオチド（Ｌ１−Ｉ）（５’−ＡＡＧＡＧＣＡＡＣＴＣＣＡＡＧＡＣＡＣＡＴ−３’（配列番号１９））を設計した。具体的に、以下の配列を標的とした：
【００８８】
ｉ）８個のホットＬ１（ＬＲＥ３（配列番号２６）、ＬＩＲＰ（配列番号２７）、ａｃ００４２００（配列番号２８）、ａｃ００２９８０（配列番号２９）、ａｌ３５６４３８（配列番号３０）、ａｌ５１２４２８（配列番号３１）、ａｃ０２１０１７（配列番号３２）、ａｌ１３７８４５９（配列番号３３））；
【００８９】
ｉｉ）Ｔａ−１ｄファミリー；および
【００９０】
ｉｉｉ）９０個の全長Ｌ１因子。対照については、トランスフェクション効率をモニタリングするために３’−フルオレセイン修飾された非特異的ｓｉＲＮＡ（配列番号３４）を細胞にトランスフェクトした。
【００９１】
ＱＩＡＧＥＮ（米国）によってｓｉＲＮＡオリゴヌクレオチドを合成した。ウェルごとに１．５μｇのｓｉＲＮＡを添加した２４ウェルプレートにおいて、ＲＮＡｉＦｅｃｔ Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ Ｒｅａｇｅｎｔ（QIAGEN cat. 301605）を用いてＡ−３７５細胞においてトランスフェクションを行った。トランスフェクションから４８時間後および７２時間後に細胞をカウントし、Ｏｌｙｍｐｕｓ ＣＡＭＥＤＩＡデジタルカメラを備えたＯｌｙｍｐｕｓ ＣＫ３０倒立顕微鏡下で細胞形態を記録した。蛍光顕微鏡によって測定されるように、細胞の約８０％が２４時間後にトランスフェクトされた。
【００９２】
トランスフェクションから４８時間後、ＬＩＮＥ−１ ＯＲＦ−１およびＯＲＦ−２に特異的なプライマー対を用いて、ＲＴ−ＰＣＲによってＬＩＮＥ−１発現を分析した：
【００９３】
ＯＲＦ−１：
Ｆ，５’−ＡＧＡＡＡＴＧＡＧＣＡＡＡＧＣＣＴＣＣＡ−３’（配列番号２０）；
Ｒ，５’−ＧＣＣＴＧＧＴＧＧＴＧＡＣＡＡＡＡＴＣＴ−３’（配列番号２１）
【００９４】
ＯＲＦ−２：
Ｆ，５’−ＴＣＣＡＧＣＡＧＣＡＣＡＴＣＡＡＡＡＡＧ−３’（配列番号２２）；
Ｒ，５’−ＣＣＡＧＴＴＴＴＴＧＣＣＣＡＴＴＣＡＧＴ−３’（配列番号２３）。
【００９５】
ＲＮＡ抽出およびＲＴ−ＰＣＲ条件は、アニーリングＴ℃が５４℃であり、増幅が２３サイクル行われたことを除いて、本明細書に記載される通りであった。サザン分析用の内部オリゴヌクレオチドは、５’−ＴＡＡＧＧＧＣＡＧＣＣＡＧＡＧＡＧＡＡＡ−３’（ＯＲＦ−１（配列番号２４））および５’−ＴＧＡＣＡＡＡＣＣＣＡＣＡＧＣＣＡＡＴＡ−３’（ＯＲＦ−２（配列番号２５））であった。
【００９６】
腫瘍異種移植片および動物の治療
欧州連合ガイドラインに従って保有された５週齢の無胸腺ヌードマウス（イタリア、ハーラン（Harlan, Italy））に、１００μｌのＰＢＳ中のＡ−３７５黒色腫（４ｘ１０６）、Ｈ−６９（１０７）、ＰＣ３（２ｘ１０６）およびＨＴ−２９（１０６）細胞を皮下接種した。生理溶液で１：１に新たに希釈したＤＭＳＯ中の４ｍｇ／ｍｌのストックを用いて、エファビレンツ（２０ｍｇ／ｋｇ）を週に５日、毎日マウスに皮下注射した。対照には５０％ＤＭＳＯを注射した。治療は、腫瘍の移植から１日後または１週間後に開始し、幾つかの実験においては１４日後に中断した。キャリパー測定により腫瘍の増殖を一日おきにモニタリングし、以下の式を用いて体積を計算した：
長さ×幅×高さ×０．５２ （２２）。
【００９７】
結果
ＲＴコードＬＩＮＥ−１ファミリーを標的としたＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）は、黒色腫細胞において増殖を低下させ、分化を促進する
以下に論じるように、医薬ＲＴ阻害剤に反応して観察された増殖率の低下および分化の誘発が、実際に、細胞ＲＴの特異的な阻害に起因するかどうかを究明しようとした。これに対処すべく、ヒト細胞において最も豊富に発現することが知られているＬＩＮＥ−１因子のサブファミリー（２１個、および上述の「方法」の対応する部分に記載される標的配列）を特異的標的とするようにＲＮＡｉ実験を設計した。
【００９８】
ＬＩＮＥ−１ ＯＲＦ１（図４、パネルＡ）に相同な二本鎖ＲＮＡオリゴヌクレオチドをＡ−３７５細胞内にトランスフェクトした。トランスフェクトから４８〜７２時間後、典型的な分化形態（パネルＢ）が誘発された。それに付随して、増殖は、非特異的オリゴヌクレオチドでトランスフェクトされた細胞と比べて、約７０％低下した（パネルＣ）。これらの結果は、医薬ＲＴ阻害により得られたものに匹敵する。半定量的ＲＴ−ＰＣＲ分析により、ＯＲＦ１およびＯＲＦ２双方の発現は、非特異的オリゴヌクレオチドでトランスフェクトされた細胞と比べて、ほぼ８０％低下した（パネルＤ）。更に、ＬＩＮＥ−１因子に対するＲＮＡｉは、ＲＴ阻害剤に反応して見られるように、ＧＡＰＤＨではなく、ｃ−ｍｙｃおよびサイクリン−Ｄ１遺伝子の発現の下方制御を誘発した。
【００９９】
ＲＴ阻害剤は細胞増殖を可逆的に低下させる
また、広く使用されている２つのＲＴ阻害剤、すなわちネビラピンおよびエファヴィレンツに長期間曝露したヒト形質転換細胞系の反応を調査した。Ａ−３７５黒色腫、ＰＣ３前立腺癌およびＴＶＭ−Ａ１２一次黒色腫由来細胞系からの培養物を継代培養し、カウントし、少なくとも２０日間（９６時間周期を５回）連続的に薬剤を再添加しつつ９６時間ごとに再プレーティングした。図１Ａに示すように、これらの阻害剤はいずれも、全ての細胞系において細胞の増殖を効果的に低下させ、長期間の曝露中に安定な阻害効果を呈する。増殖の阻害は可逆的であった。ＲＴ阻害剤を除去すると、全ての細胞系は１回または２回の９６時間周期中、対照と同程度の比率で増殖を再開した。薬剤の再添加により、全ての細胞系において再び増殖が阻害された。故に、ＲＴ阻害に関連する細胞増殖の低下は、細胞分裂を通じての永続的変化として継承したものではない。
【０１００】
増殖低下の根拠を解明するために、いずれのＲＴ阻害剤もＡ−３７５またはＰＣ３細胞系における細胞死を誘発するかどうかを調査した。透過性壊死細胞を顕在化するためにＰＩを使用し、アポトーシス核を視覚化するためにＤＡＰＩを使用し、ミトコンドリア膜電位の損失をモニタリングするためにＤｉＯＣ６（３）を使用した複合染色は、いずれのＲＴ阻害剤によっても著しい細胞死の誘発は見られなかった。低い割合を記録したもの（いずれかの薬剤に曝露してから７２時間後、最大で１５％）は、概してアポトーシスによって説明された（データ示さず）。故に、いずれの薬剤も著しい非特異的毒性を有しておらず、これは、細胞増殖の低下が細胞周期遅延の誘発をかなり反映していることを示唆している。
【０１０１】
これを評価するために、ＲＴ阻害剤に対する曝露を９６時間周期で４回行った後に、ＤＮＡ含量（ＰＩにより顕在化）およびＤＮＡ複製（ＢｒｄＵの取り込みによる）を測定するために二重パラメータＦＡＣＳ分析を用いた。細胞周期のプロファイルは、抗ＲＴ処理培養物においては著しく変化し、これは、Ａ−３７５細胞培養物において特に顕著なＧ０／Ｇ１内容物を有するＢｒｄＵ陰性細胞の割合が増加したことを示している（図１Ｂ）。薬剤を除去すると、もとの細胞周期プロファイルが再び確立し、Ｇ１遅延が排除された。
【０１０２】
ネビラピンは、形質転換細胞系において、形態的分化ならびに分化および増殖遺伝子の発現を誘発する
黒色腫は、治療に対して最も耐性が高いので、ＲＴ阻害剤が細胞増殖の低下に付随する分化を誘発するかどうかを解明するのに適切であった。まず、幾つかの分化誘導因子に反応して、典型的な樹状表現型を取得することができるＡ−３７５黒色腫細胞を試験した（２３）。図２Ａに示すように、細胞の形状によって示された形態的分化（樹状伸長および接着性の増加）は、ＤＭＳＯで処理した対照（ａ）と比べて、ネビラピン（ｄ）またはエファビレンツ（ｇ）への曝露から４〜５日の間に明らかとなった。走査電子顕微鏡（ＳＥＭ）により、ネビラピン（ｅ）およびエファビレンツ（ｈ）を用いて培養したＡ−３７５細胞は、処理していない対照（ｂ）と比べて平坦化しており、基質に密着する伸長した樹状伸長を呈していた。α−チューブリン免疫染色後の共焦点顕微鏡検査により、更に、対照（ｃ）とは異なり、ＲＴ阻害細胞（ｆ−ｉ）における成長した樹状突起の長さ全体にわたって微小管アレイが再編成され、ここでは短い微小管が核形成中心の周りに集中していることが判明した。
【０１０３】
ネビラピン処理後、黒色腫由来の一次ＴＶＭ−Ａ１２細胞においても同様の反応が認められた。未処理細胞は、位相差顕微鏡（ａ）およびＳＥＭ（ｂ）で観察すると、スピンドル状形態を有する。ネビラピンで処理したＴＶＭ−Ａ１２細胞は、その代わりに典型的な分岐樹状突起（ｄ−ｅ）を形成し、未処理細胞（ｃ）と比べて、よく編成された伸長微小管アレイ（ｆ）を呈した。
【０１０４】
形態的分化の誘発は、重要な調節遺伝子が、ＲＴ阻害処理に反応して調節されることを示唆している。これは、ＤＭＳＯのみで、またはネビラピンもしくはエファビレンツで４周期間処理した培養物の半定量的ＲＴ−ＰＣＲ分析において調査した。Ａ−３７５黒色腫細胞において、４種の遺伝子の組、すなわち、細胞間接着に関与し、分化した非腫瘍細胞内で発現するＥ−カドヘリン遺伝子（２４）、および黒色腫細胞増殖および腫瘍増殖に直接関与するｃ−ｍｙｃ、ｂｃｌ−２（２５）およびサイクリン Ｄ１（２６）遺伝子に焦点をあてた。
【０１０５】
図３Ａに示すように、Ｅ−カドヘリン遺伝子は、対照と比べて、ＲＴ阻害Ａ−３７５培養物において著しく上方制御され、対照的に、ｃ−ｍｙｃ、ｂｃｌ−２およびサイクリンＤ１遺伝子は下方制御されることが判明した。サイクリンＤ１発現を下方制御できなかった１つの例外が、エファビレンツに関して記録された。また、ＰＣ３前立腺癌細胞、および分化した前立腺上皮の選択された２つのマーカー遺伝子、すなわち前立腺特異的抗原ＰＳＡ（２７）およびアンドロゲン受容体（ＡＲ）（２８）遺伝子を分析した。これらの遺伝子はいずれも、未処理培養物では発現されないが、いずれの遺伝子もＲＴ阻害剤に反応して誘発された（図３Ｂ）。再び、全ての遺伝子の発現は、阻害剤を除去すると、元のレベルに戻った。故に、ＲＴ阻害剤は、分化の誘発と一致した、形質転換細胞における重要遺伝子の発現を再プログラミングするが、この再プログラミングは可逆的であり、ＲＴ阻害が解除されると行われなくなる。
【０１０６】
ＲＴ阻害剤は、無胸腺ヌードマウスにおけるヒト腫瘍異種移植片の成長を低下させる
増殖および分化を含む形質転換細胞の重要な特徴がＲＴ阻害によって調節されるので、ＲＴ阻害剤が腫瘍増殖に拮抗する能力をｉｎ ｖｉｖｏでテストした。
【０１０７】
これらの実験用に選択した発癌性細胞系としては、Ａ−３７５およびＰＣ系、ならびにＨＴ２９コドンおよびＨ６９小細胞肺癌系が挙げられ、これらはまた、ＲＴ阻害剤（１９、およびデータ示さず）に反応して細胞増殖の低下を示した。無胸腺ヌードマウスの肢部に細胞を皮下接種した。次いで、動物をエファビレンツによる処理に供した。その理由は、この薬剤が、事前アッセイにおいてネビラピンよりも高いｉｎ ｖｉｖｏ効率を示したからである。４〜４０ｍｇ／ｋｇの薬剤をテストする用量反応実験において最適な投薬量（２０ｍｇ／ｋｇ体重）を決定した。
【０１０８】
エファビレンツ処理は、全ての動物群において安全であり、これらの群のいずれにおいても動物の死や明白な毒性の徴候を示さないことが分かった。但し、４０ｍｇ／ｋｇで処理した群は、６０％を超える動物において著しい体重の減少を示した。図５は、未処理マウス（赤）または腫瘍接種から１日後（紫）、または１週間後（黄色）にエファビレンツによる処理を開始したマウスにおける腫瘍増殖の記録曲線を示している。
【０１０９】
全タイプの異種移植片について、処理動物における腫瘍増殖は、未処理動物と比べて著しく低下し、初期の腫瘍サイズの差にもかかわらず、処理開始のタイミングに関係なく、腫瘍の進行は同程度の効率で拮抗された。接種後１日目から処理し、１５日目に処理を中断した動物におけるＰＣ３およびＨＴ２９由来腫瘍の増殖曲線（緑色の曲線）は、腫瘍増殖のＲＴ依存性阻害がｉｎ ｖｉｖｏで可逆的であることを示している。
【０１１０】
エファビレンツで処理したＰＣ３細胞は、腫瘍形成をｉｎ ｖｉｖｏで低下させる
また、形質転換細胞をエファビレンツで事前処理したときに、生成された異種移植片の腫瘍形成能が調節されるかどうかを調査した。ＰＣ３前立腺癌細胞を、２回の９６時間周期（ＰＳＡおよびＡＲ遺伝子を誘導するに十分な時間）の間、２０μＭのエファビレンツを用いて培養し（図３Ｂ）、次いでヌードマウスに接種した。
【０１１１】
平行バッチの動物に未処理細胞を接種した。次いで、エファビレンツで事前処理した、または未処理のＰＣ３細胞異種移植片を連続してエファビレンツでｉｎ ｖｉｖｏで処理するか、または未処理のまま放置した。図６Ａに示すように、未処理ＰＣ３細胞は、全ての動物において侵攻性腫瘍を生じた。対照的に、エファビレンツで事前処理したＰＣ３細胞は、ｉｎ ｖｉｖｏで腫瘍を形成する能力が低下し、異種移植片の成長はより緩慢であった。図６Ｂに要約されるように、エファビレンツで事前処理したＰＣ３細胞は、未処理細胞を使用する１００％と比較して、接種動物の６５％において緩慢に成長する異種移植片を生じた。更に、事前処理した細胞を接種し、更にｉｎ ｖｉｖｏでエファビレンツにより処理した動物の４０％だけが腫瘍を発現し、その場合、増殖曲線は平坦であった。故に、エファビレンツは形質転換細胞の腫瘍形成能を減衰させる。
【０１１２】
考察
この研究は、癌に関与するヒトゲノムの３つの特徴を強調している。第一に、ＬＩＮＥ−１因子は、細胞分化および増殖の制御に関与する機構の活性成分として同定される。第二に、ＬＩＮＥ−１因子のＲＮＡｉ依存型の不活性化、またはそれらがコードする内因性ＲＴ活性の薬理学的阻害は、形質転換細胞におけるこれらの特色の制御を回復させることができる。第三に、ＲＴ阻害剤は、動物モデルにおける腫瘍の増殖をｉｎ ｖｉｖｏで低下させる。
【０１１３】
この研究で使用するＲＴ阻害剤、すなわちネビラピンおよびエファビレンツは、ＲＴ酵素のｐ６６サブユニットにおいて疎水性ポケットを結合することにより、共通の作用機序を有する（２９，３０）。両阻害剤は、ＨＩＶコードＲＴを標的とするべく設計されているが、非感染細胞における内因性ＲＴの酵素活性をｉｎ ｖｉｖｏで阻害する（１９）。ここで、両阻害剤が、概して細胞死とは独立しているが、Ｇ１遅延または停止に関連する形質転換細胞の増殖を低下させることを示している。これに付随して、ＲＴ阻害剤は、形質転換細胞の形態的分化を誘発する。長い治療時間（１２０日）を必要とするテロメラーゼ関連ＲＴ（ＴＥＲＴ）の阻害剤によって引き起こされた表現型の変化とは異なり、分化の誘発は迅速である（３１）。更に、老化細胞に特有のアクチンストレス繊維または焦点接着部位の再編成は認められなかった。老化特異的変異の不在および分化の迅速な誘発は、ここで使用されるＲＴ阻害剤がＴＥＲＴを標的とせず、老化ではなく低増殖性分化表現型を誘発することを示している。
【０１１４】
特に驚くべきことは、ＲＴ阻害効果の特異性が、ヒト細胞において高度に発現される６個のＬＩＮＥ−１レトロポゾンのサブグループを標的とするＲＮＡｉ実験において証明され、レトロ転位能全体の８４％を示すことであった（２１）。特に、ＲＮＡｉがＡ−３７５細胞におけるＬＩＮＥ−１由来ＯＲＦ１およびＯＲＦ２の発現をおよそ８０％低下させることが判明し、これは、生物学的に活性なＬＩＮＥ−１サブグループが効果的に下方制御されたことを示唆している。ＲＮＡｉによって誘発されるＲＴコードＬＩＮＥ−１因子の変化は、薬理学的ＲＴ阻害剤により引き起こされる変化と区別できず、これは、ＬＩＮＥ−１が細胞増殖および分化の制御に関与していることを暗示している。独立した手法で観察された表現型の類似性は、ＬＩＮＥ−１発現またはＲＴ活性の阻害が増殖を遅延させ、分化を促進するのに十分であることを示している。これらの観察によれば、薬剤のいかなる未知の副作用も、非特異的に観察された表現型の一因にはあたらないことを示している。
【０１１５】
増殖の低下および分化形態の誘発と一致して、選択された遺伝子パネルの発現がＲＴ阻害に反応して再プログラミングされることが判明した。これは、ＲＴ活性が、増殖度が高い形質転換した表現型から増殖度が低い分化した表現型への遷移を促進する遺伝子の発現を効果的に調節できることを示しており、これは、ゲノム機能がＲＴ活性の医薬的またはＲＮＡｉ依存性阻害の究極的な標的であることを示唆している。しかしながら、遺伝子発現における変化は、細胞分裂中に継承されるものではなく、ＲＴ阻害を解除すると回復する。試験した特徴の可逆性および阻害剤の存在に対するそれらの依存性は、ＬＩＮＥ−１コードＲＴが遺伝子発現を調節する後成的機構の一部であり、細胞増殖および分化の基礎となる分子機構において役割を果たすという概念と一致している。
【０１１６】
この研究の１つの態様は、４つのヒト異種移植片モデルをｉｎ ｖｉｖｏで接種したヌードマウスにおいて腫瘍増殖を低下させるというＲＴ阻害剤の能力にある。細胞系において観察されるように、動物に対してＲＴ阻害剤が供給されている限り、腫瘍増殖は阻害され、処理が中断されると再開された。このデータは、癌治療におけるＲＴ阻害剤の有望な細胞増殖抑制能力を例証しているが、腫瘍増殖における内因性ＲＴの後成的役割を確認するものである。更に、ＰＣ３前立腺癌細胞のエファビレンツによるｉｎ ｖｉｔｒｏ事前処理は、それらの腫瘍形成をｉｎ ｖｉｖｏで減衰させる。故に、ＲＴ阻害に関連する分化マーカーの活性化と増殖の低下は、形質転換細胞の悪性表現型をｉｎ ｖｉｖｏで減衰させることができる大規模な再プログラミングの一部である。
【０１１７】
増えつつあるデータは、後成的変化が、腫瘍細胞を再プログラムし、かつ、形質転換された表現型を「標準の」非病理学的状態に転換することができることを示している（３２，３３）。後成的再プログラミングは、元来、多様な腫瘍における悪性形質転換の原因となる遺伝子変化を回避することができる（３２）。故に、後成的な調節因子は、腫瘍治療において貴重な価値ある標的と見なされている（３４）。しかしながら、多くの試験化合物は、一般には毒性であり、かつ／または化学的に不安定であることが判明している。ネビラピンおよびエファビレンツは、長年ＡＩＤＳ治療に用いられてきた。これらのＲＴ阻害剤が連続投与に対して一般に良好な耐性を有することを示す疫学的記録に鑑みると、当該阻害剤を使用するという展望は明白な利点を有する。更に、後成的証拠は、カポジ肉腫（３５）および他のＡＩＤＳ関連癌（３６）の発生が、高度に活性な抗レトロウイルス療法（ＨＡＡＲＴ）で治療した患者において低下することを示している。これは、一般的には、治療した患者において免疫反応が向上したことの表れとして見なされるが、それはまた、腫瘍細胞における内因性ＲＴ活性に対するＨＡＡＲＴの直接的な阻害効果を示唆している。
【０１１８】
この段階では、ＲＴ活性が細胞の運命を指示できる機構は依然として不明確である。レトロポゾンは、分裂酵母におけるヘテロクロマチン形成に寄与し得る（３７）。このような機構はより高等な真核生物においては立証されなかったが、研究所内での研究は、ＬＩＮＥ−１コードＲＴが、ＤＮＡメチル化の再分布およびクロマチン再構築に依存する遺伝子発現の調節に関与する。
【０１１９】
合成の際、内因性ＲＴは、高い増殖および分化の欠損と関連する細胞機構の「機能的な」マーカーとして出現し、癌治療の新規な潜在的標的と見なすことができる。データは、特に前立腺癌について奨励しており、ＡＲ発現の欠損がホルモン療法失敗の主な原因である。ＲＴ阻害剤はＡＲおよびＰＳＡ遺伝子の両方を上方制御するので、これらの分化誘発化合物は、前立腺癌細胞におけるアンドロゲン感受性を回復するのに有用であろう。
【０１２０】
実施例２
Ａ）ＬＩＮＥ−１標的ｓｉＲＮＡを発現するＤＮＡ構築物のクローニング
ｓｉＲＮＡ標的配列は、ヒト細胞において高度に活性であることが知られているＬＩＮＥ−１因子に由来していた（Brouha et al., 2003, supplementary material）。標的配列は６０ｂｐ長（１４９２〜１５５２）であって、配列番号３５で表され、二本鎖ＤＮＡとして人工的に合成された。次いで、市販のベクターｐＳｕｐｅｒ．ｒｅｔｒｏ．ｎｅｏ＋ＧＦＰにおいて、ＤＮＡオリゴヌクレオチドをクローニングした（OligoEngine, USA, cat.#VEC-PRT-0006）。
【０１２１】
Ｂ）レトロウイルスベクターの組立て
次に、レトロウイルス産生Ｐｈｉ−ＮＸ細胞（ＡＴＣＣから入手）内で構築物をトランスフェクトし、新たに合成したレトロウイルス粒子内にパッケージし、細胞から培地内へ自然発生的に放出させた。トランスフェクションから４８時間後、レトロウイルス粒子（ｐＳ−Ｌ１ｉと呼ぶ）を遠心分離によって収集し、０．４５マイクロメートルのＭｉｌｌｉｐｏｒｅフィルタを用いて濾過し、細胞感染に使用した。このプロトコルは、製造業者の推奨（OligoEngine）に従って行った。
【０１２２】
Ｃ）ヒト発癌性細胞系の感染
トランスフェクト細胞の上澄みと、細胞培養物とを単純に混合し、２４時間インキュベーションすることによって、Ａ３７５（黒色腫）およびＰＣ３（前立腺癌）ヒト細胞系をｐＳ−Ｌｌｉに感染させた。次いで、ネオマイシンの存在下、７日間トランスフェクト細胞を選択した。全てのネオ耐性細胞がＧＦＰレポーター遺伝子の発現に対して陽性であることが判明した。対照として、同じ細胞系からの平行培養物を、ｓｉＲＮＡコード配列を持たない空のＤＮＡベクター（ｐＳ）を含有するレトロウイルス粒子に感染させた。
【０１２３】
図７に示すように、ｐＳ−Ｌ１に感染した細胞は、劇的な増殖の低下を呈し、これは少なくとも３９日間一定のままであった。非感染細胞は、高い増殖率を維持し、ｐＳ感染細胞は、感染から最初の数日は穏やかな増殖の低下を示したが、次いで、非感染細胞に匹敵する高い増殖率まで急速に戻った。
【０１２４】
これらデータとよく相関して、特異的抗体を用いたウエスタンブロット分析（データ示さず）によって明らかになるように、ＬＩＮＥ−１（ＯＲＦ１およびＯＲＦ２の両方）の発現は、ｐＳ感染細胞以外のｐＳ−Ｌ１において、ＲＮＡレベルおよびタンパク質レベルの両方において強力に下方調整された。
【０１２５】
Ｄ）ｐＳ−Ｌ１感染Ａ３７５細胞は、ヌードマウスにおける接種により、ｉｎ ｖｉｖｏアッセイにおいて測定されるような腫瘍形成の低下を示す
ｐＳ−Ｌｌｉ細胞の腫瘍形成能が影響を受けたかどうかを評価するために、ｐＳベクターまたはＬＩＮＥ−１ノックアウトｐＳ−Ｌ１ｉ構築物に感染させた５×１０６ Ａ３７５細胞を、２群の無胸腺ヌードマウスに皮内接種した（感染から１５日後）。次いで、両マウス群において腫瘍の進行をモニタリングした。図８のパネルＡは、Ａ３７５ ｐＳおよびＡ３７５ ｐＳ−Ｌ１ｉ細胞を接種されたマウスにおける腫瘍増殖の進行を示している。パネルＢにおける例は、対照細胞を接種されたマウスと比べて、ＬＩＮＥ−１感染細胞を接種されたマウスでは腫瘍の増殖が著しく低下したことを示している。
【０１２６】
共に、これらの結果は、ＬＩＮＥ１遺伝子活性が、形質転換細胞の増殖に寄与し、遺伝子癌治療における新規な潜在的標的と見なされ得るという結論を支持するものである。
【０１２７】
故に、遺伝子治療による本発明の開発を改良するために、以下の２つの改良が、記載される方法に導入されている：
【０１２８】
ｉ）二本鎖リボオリゴヌクレオチドは、細胞トランスフェクションのために遊離形態では使用されず、特異的ｓｉＲＮＡをコードするＤＮＡ構築物によって担持される。転写ＲＮＡは、細胞の「ｄｉｃｅｒ」システムによって更に自然発生的に加工される二本鎖パリンドローム構造を形成し、それによりｓｉＲＮＡ分子を形成する（Brummelkamp et al., 2002, reference 38）。
【０１２９】
ｉｉ）標準的な細胞トランスフェクション手順を、レトロウイルスまたはアデノウイルス起源の適切な送達システムに置き換える必要がある。
【０１３０】
換言すると、本方法の改良は、腫瘍に感染させるのに使用されるＬＩＮＥ−１標的ｓｉＲＮＡを発現するウイルスベクターの開発にある。ＬＩＮＥ−１標的ｓｉＲＮＡ発現構築物は、ウイルスベクターによって発癌性細胞に送達され、それにより内因性ＬＩＮＥ−１の発現を阻害する。これまでの経験に基づけば、このようにして得られたＬＩＮＥ−１の構成的な機能的ノックアウトは、腫瘍の進行に対して強く拮抗する。
【０１３１】
参考文献
【表１】
【０１３２】
Ｌ１ＲＰに関する追加情報：
ＮＣＢＩアクセッション番号ＡＦ１４８８５６、http://www.ncbi.nig.gov/entrez/viewer.fcgi?db=nucleotide&val=5070620で入手可能および以下に記載：
【表２】
【０１３３】
重要な配列
【化１】
【図面の簡単な説明】
【０１３４】
【図１】抗ＲＴ薬剤による増殖阻害。（Ａ）ＤＭＳＯ（対照）、ネビラピン（ＮＥＶ）およびエファビレンツ（ＥＦＶ）で処理した培養物における細胞の増殖。細胞をカウントし、９６時間毎に５周期の間、再プレーティングした。次いで、阻害剤を含まない培地内で細胞を培養した（２周期）。次いで、ＲＴ阻害剤を２周期の間再び添加した。細胞の数は対照（１００％とする）の％で表される。値は、３つの実験から蓄積したデータである。（Ｂ）９６時間周期を４回行う間および薬剤除去後の、ＲＴ阻害剤の存在下での細胞周期プロファイル。
【図２】ＲＴ阻害剤は黒色腫細胞における形態的分化を誘発する。 （Ａ）ＤＭＳＯ（ａ，ｂ，ｃ）、ネビラピン（ｄ，ｅ，ｆ）またはエファビレンツ（ｇ，ｈ，ｉ）において培養されたＡ−３７５細胞系。Ｗｒｉｇｈｔ Ｇｉｅｍｓａ染色後に位相差顕微鏡によって（左欄）、ＳＥＭによって（中欄）、およびα−チューブリン染色（緑）および核のＰＩ染色（赤）後に共焦点顕微鏡によって（右欄）、培養物を観察した。 （Ｂ）黒色腫由来ＴＶＭ−Ａ１２一次細胞。位相差顕微鏡（左欄）、ＳＥＭ（中欄）および共焦点顕微鏡（右欄）下で観察したＤＭＳＯ（ａ，ｂ，ｃ）およびネビラピン処理（ｄ，ｅ，ｆ）細胞。バー：２０μｍ。
【図３】ＲＴ阻害剤はＡ−３７５（パネルＡ）およびＰＣ３（パネルＢ）細胞系における遺伝子発現を調節する。 ＤＭＳＯ（ｃｔｒ）、ネビラピン（ｎｅｖ）またはエファビレンツ（ｅｆｖ）で処理した細胞からＲＮＡを抽出し、ネビラピン（ｎｅｖ／ｒ）またはエファビレンツ（ｅｆｖ／ｒ）を除去した後、当該ＲＮＡをＲＴ−ＰＣＲによって増幅し、ブロットし、内部オリゴヌクレオチドでハイブリダイズした。ＧＡＰＤＨを内部標準として使用した。
【図４】ＬＩＮＥ−１に対するＲＮＡｉは、Ａ−３７５細胞において形態的分化を誘発し、増殖を低下させ、かつ遺伝子発現を調節する。 （Ａ）全長ＬＩＮＥ−１因子の構造。ｓｉＲＮＡオリゴヌクレオチドの位置が示されている。矢印は、ＲＴ−ＰＣＲ分析に使用するプライマー対の位置を示している。 （Ｂ）対照（ＣＴＲ）およびＬＩＮＥ−１ ｓｉＲＮＡオリゴヌクレオチド（ＬＩ−ｉ）でトランスフェクトしたＡ−３７５培養物の位相差顕微鏡図。 （Ｃ）ＣＴＲおよびＬＩ−ｉオリゴヌクレオチドでのトランスフェクション後の細胞増殖。 （Ｄ）ＣＴＲおよびＬＩ−ｉオリゴヌクレオチドでトラスフェクトしたＡ−３７５細胞からのＲＮＡの半定量的ＲＴ−ＰＣＲ後の遺伝子発現パターンを例証している。定量的変動（ＣＴＲトランスフェクト培養物内のシグナルに対するＬ１−ｉ内のシグナルの％として表される）は、独立した３つの実験からの平均を表している。増幅産物は、帯域のデンシトメトリーによって推定し、同実験におけるＧＡＰＤＨシグナルに対して標準化した。
【図５】エファビレンツはヌードマウスにおけるヒト腫瘍増殖を低下させる。 示した細胞系により形成される腫瘍の増殖を、未処理動物（赤）および接種後１日目（紫）または１週間目（黄）にエファビレンツで処理した動物においてモニタリングした。ＰＣ３およびＨＴ２９における上から２つの曲線は、処理済動物におけるＰＣ３およびＨ６９由来腫瘍の増殖が接種後１日目から開始し、１４日後に処理が中止されたことを示している。曲線は、５種の動物群における腫瘍サイズの平均値を示す。
【図６】エファビレンツで事前処理したＰＣ３細胞の腫瘍形成の低下。 （Ａ）処理しなかったか、またはｉｎ ｖｉｖｏでエファビレンツで事前処理したマウスに注入した未処理細胞またはエファビレンツ事前処理細胞によって形成された腫瘍の増殖。 （Ｂ）示した処理を３０日間行った後のＰＣ３由来異種移植片の結果（ｎ＝２０種の動物／群）。
【図７Ａ】ｐＳ−Ｌ１感染細胞の増殖は劇的に低下する。 ｐＳ−Ｌ１感染細胞はＡ３７５ｐＳ−ｌ１として示されている。増殖は、少なくとも３９日間一定のままであった。非感染細胞（Ａ３７５、図７Ａ）は、高い増殖率を維持し、ｐＳ感染細胞（Ａ３７５ｐＳ、図７Ｂ）は、感染してから最初の数日は中程度の増殖の低下を示したが、その後、非感染細胞と同程度の高い増殖を迅速に再開した。
【図７Ｂ】ｐＳ−Ｌ１感染細胞の増殖は劇的に低下する。 ｐＳ−Ｌ１感染細胞はＡ３７５ｐＳ−ｌ１として示されている。増殖は、少なくとも３９日間一定のままであった。非感染細胞（Ａ３７５、図７Ａ）は、高い増殖率を維持し、ｐＳ感染細胞（Ａ３７５ｐＳ、図７Ｂ）は、感染してから最初の数日は中程度の増殖の低下を示したが、その後、非感染細胞と同程度の高い増殖を迅速に再開した。
【図８】ＬＩＮＥ１感染細胞を接種されたマウスにおける腫瘍増殖は、対照と比較して著しく低減された。 パネルＡは、Ａ３７５ｐＳおよびＡ３７５ ｐＳ−Ｌ１ｉ細胞を接種されたマウスにおける腫瘍増殖の進行度を示す。パネルＢにおける例は、ＬＩＮＥ１干渉細胞を接種されたマウスにおける腫瘍増殖が、対照細胞を接種されたマウスと比較して著しく低減されたことを示している。
【発明の背景】
【０００１】
本発明は、治療における逆転写酵素発現の阻害剤の使用に関する。
【０００２】
Ｓｐａｄａｆｏｒａ（Cytogenet Genome Res 105:346-350 (2004)）は、自身の論文で、内因性非テロメア逆転写酵素、ならびに胚形成および形質転換へのその関与について論じている。
【０００３】
より詳細には、逆転写酵素（ＲＴ）は、２種類の反復ゲノム因子、すなわちレトロトランスポゾンおよび内因性レトロウイルスによってコードされる。これらの因子はいずれも、それらの機構の必須成分としてＲＴを必要としている。
【０００４】
長鎖散在反復配列（long interspersed elements）（ＬＩＮＥ）などのレトロ転位可能な因子は、「ジャンクＤＮＡ」であり、もはや必要ではないが、ゲノムから削除されていない残りのＤＮＡとしてほとんど何の役割も果たさないと長い間考えられてきた。１９７１年というかなり以前から（Temin, J Natl Cancer Inst 46:56-60）、この見解は疑問視されていたが、当技術分野では依然としてこのような因子を単に「ジャンクＤＮＡ」として考えている。
【０００５】
Ｓｐａｄａｆｏｒａ（前掲）は、自身の論文で当該技術を再検討し、ＲＴコード遺伝子の発現が、一般には、非病理学的な終末分化細胞では抑制されるが、ごく初期の胚、胚細胞、胚および腫瘍組織（これらは全て高い増殖能を有している）においては活性であることを論証している。ネズミ胚でＲＴを阻止するとそれらの発育は停止し、阻止作用を取り除いても胚形成は再開しなかった。癌細胞では、増殖は著しく低下し、分化は４８時間から７２時間までの間で顕著であった。
【０００６】
Ｋｕｏら（Biochem and Biophys Res Com 253:566-570 (1998)）は、ヒト小細胞肺癌のｃＤＮＡライブラリから１．７ｋｂのＬＩＮＥ−１（Ｌ１）転写産物を同定した。彼らは、この反復因子が正常ヒト組織（繊維芽細胞および肝臓）および形質転換されたヒト組織の両方において普遍的に発現することを見出した。更に、彼らは、この転写産物に由来する、ヒト肝臓癌細胞を用いてインキュベーションされたセンスオリゴヌクレオチドが細胞増殖率を低下させることを示した。正常組織および癌組織の両方におけるこの因子の存在は、この反復因子と、細胞増殖の一般的な機能とを関連付けるようである。細胞増殖の低下は、突然変異による、細胞増殖の制御に関与する遺伝子のサイレンシングまたは機能的改変の結果であると、著者らは説明している。著者らは、形質転換が可逆的な事象であるとは示唆していない。
【０００７】
対照的に、本発明者らは、レトロトランスポゾンのＬＩＮＥ−１ファミリーの阻害が、癌性組織の増殖を阻害または阻止すると共に、それらの分化を刺激するのに効果的であることを本明細書中で立証している。
【発明の概要】
【０００８】
従って、第一の態様では、本発明は、癌性組織の未分化（unspecialised）増殖を阻害するためのＲＮＡ干渉の使用を提供し、該ＲＮＡは少なくとも１種のＬＩＮＥ−１反復因子の一部分を認識するものである。
【０００９】
他の態様では、本発明は、癌性病変の治療におけるＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）の使用を提供し、該ＲＮＡは少なくとも１種のＬＩＮＥ−１反復因子の一部分を認識するものである。
【００１０】
本発明のＲＮＡｉの使用によりＲＴ発現が低下すると、癌性組織の増殖が低下し、多くの場合には５０％を超える低下が見られ、その後の増殖は、少なくとも処理細胞においては、概して分化増殖に起因している。従って、本発明のＲＮＡｉは、一般に、癌性組織の増殖を低下させ、かつ分化を刺激するという両方の役割を果たす。
【００１１】
本発明のＲＮＡｉがＬＩＮＥ−１に特異的であること、かつ、それを使用することにより、全てのＲＴを阻止する包括的な非ヌクレオチドＲＴ阻害剤（ＮＮＲＴＩ）を使用する必要がなくなることが理解される。実際、ＬＩＮＥ−１がＲＴコード因子のサブグループにすぎないことを考えると、ＬＩＮＥ−１を対象とする本発明のＲＮＡｉが癌性組織の増殖を阻止または阻害する役割を果たすということは驚くべきことである。
【００１２】
現在、ＬＩＮＥ−１ファミリーのわずか数種（約６〜８）のメンバーだけがきわめて高い活性を有するものとして認識されており、これらのいずれか１つに対するＲＮＡｉが本発明により想定される。各ＲＮＡが個々のＬＩＮＥ−１レトロトランスポゾンに対して特異的であるＲＮＡｉを使用する組み合わせ療法が想定されるが、コンセンサンス配列に対するＲＮＡを使用することが好ましい。コンセンサス配列は、２種以上のＬＩＮＥ−１ファミリーメンバーに関するものであってもよいが、活性メンバーに関するものであるのが好ましく、それ以上が同定される場合にはそれ以上のメンバーに関するものであってもよい。
【００１３】
好ましくは、ＲＮＡｉは短鎖干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）であるか、または二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）である。
【００１４】
また、ＲＮＡは短鎖ヘアピンＲＮＡであり、好ましくはｓｉＲＮＡ発現ベクターに適合され、好ましくはそれにより投与されることが好ましい。好適なベクターとしては、当技術分野において周知であり、かつ本明細書に記載されているレトロウイルスのプラスミドが挙げられる
【００１５】
一般に、本発明で使用するＲＮＡの伸張部は、１０以上、例えば１５、２０、３０、４０以上のヌクレオチドであるのが好ましく、これらヌクレオチドは転写ＬＩＮＥ−１ ＤＮＡの領域の直接的なセンス等価物である。しかしながら、２１個のヌクレオチドが特に好ましい。転写ＬＩＮＥ−１ ＤＮＡは、コンセンサス領域から選択されるのが好ましい。しかしながら、本発明の干渉ＲＮＡがＬＩＮＥ−１ ＤＮＡからの転写ＲＮＡを結合する役割を果たす場合、ヌクレオチドの伸張部は、転写ＬＩＮＥ−１ ＤＮＡの選択領域に対して完全に忠実である必要はない。
【００１６】
それにもかかわらず、ＲＮＡｉからのＲＮＡヌクレオチドの伸張部は、ＬＩＮＥ−１配列からの転写ＤＮＡの相当する伸張部に対して忠実であることが特に好ましい。ＲＮＡＩは、ＬＩＮＥ−１配列からの転写ＤＮＡの相当する伸張部に対して忠実な２１個のヌクレオチド配列を含むのが好ましく、当該配列からなるのがより好ましい。
【００１７】
本発明のＲＮＡｉはループ構造を形成してもよく、ループは上述のヌクレオチドの伸張部内に位置していてもよく、その場合、伸張部はループによって中断されていてもよい。このループは、その構造の一部分についてはｄｓＲＮＡの形態を取っていてもよく、ＲＮＡの伸張部内に１、２または３のヌクレオチド分のギャップを設けていてもよい。標的ｍＲＮＡは選択配列に沿って結合されるように、前記ループはＲＮＡの伸張部から何も削除しないのが一般的に好ましい。
【００１８】
本発明のＲＮＡｉは、単にＬＩＮＥ−１因子からの対応する転写配列に結合することが可能な短い配列であってもよく、１種または２種の末端配列および／または内部ループ配列を更に含んでもよい。
【００１９】
ＬＩＮＥ−１内で選択された配列は、オープンリーディングフレームであるべきであり、例えば、ＲＴのＯＲＦ１およびＯＲＦ２から選択されてもよいことが理解される。従って、オープンリーディングフレームは逆転写酵素をコードするのが好ましい。これには、逆転写活性を有するあらゆるタンパク質が含まれる。
【００２０】
ＲＮＡｉ療法は、あらゆる便利な方法で行われてもよい。一般に、ＲＮＡｉが標的細胞に到達することを保証することが重要である。
【００２１】
本発明のＲＮＡｉは、任意の好適なベヒクル中に含まれた形で標的部位に直接注入してもよいが、例えば、スカフォードまたはナノ粒子に固定して投与してもよい。
【００２２】
より好ましくは、ＲＮＡｉは、例えばプラスミドとして、またはレトロウイルスを介して投与してもよい。アデノウイルスおよびアデノ随伴ウイルスベクターを用いて、好ましくはプラスミドの形態で、ＲＮＡｉ用コード配列を分配してもよい。他の同様のウイルスおよびレトロウイルス、ならびに他のこのようなベヒクルを使用してもよい。特に、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）などの透過因子を使用すると、プラスミドなどのコード配列を標的部位に送達する効果が血液循環において増大し得ることが確立されている。
【００２３】
別の好適な送達手段は、ｐＳＵＰＥＲ ＲＮＡｉシステムキット（www.oligoengine.com）である。
【発明の具体的説明】
【００２４】
本発明のＲＮＡｉが対象とするＬＩＮＥ−１因子（Ｌ１）は、好ましくは、Ｂｒｏｕｈａらの教示（２００３）（参照することにより本明細書の一部とされる）に従って選択される。
【００２５】
Ｌ１は活性である場合にＲＴを発現することができるようであるので、活性Ｌ１が好ましい。従って、本発明のＲＮＡｉは、好ましくは、少なくとも１つの活性Ｌ１の一部分を認識するか、または標的とする。好ましくは、ＲＴ発現は、ＲＮＡｉによって阻害される。
【００２６】
使用するＲＮＡｉ配列は、標的Ｌ１内に含まれる特定のＯＲＦからの転写によって得られるＲＮＡを認識し、かつ該ＲＮＡと結合できることが理解される。Ｌ１因子は、本明細書に記載される好ましい配列も含むという事実によって特徴付けられる。
【００２７】
従って、Ｌ１配列は、他の箇所で論じるように、本発明の好ましい配列（例えば配列番号２７）、その対応するＤＮＡ配列またはその相同体などによって同定されるが、Ｌ１配列はまた、タンパク質、好ましくはＲＴを発現可能であるのが好ましく、その発現はＲＮＡｉによって阻害される。
【００２８】
ＬＩＮＥ−１ ＲＮＡに対するＲＮＡｉ配列の結合は、５０％ホルムアミドと６×ＳＳＣとを含有する緩衝液中などのストリンジェント条件下でなされるのが好ましい。
【００２９】
Ｌ１因子を特徴付けるために使用する配列は、それ自身がＯＲＦである、ＯＲＦの一部分である、またはＯＲＦの少なくとも一部分を含むのが好ましい。好ましくは、ＲＮＡｉが標的として使用するＬ１配列は前記Ｌ１因子のＯＲＦ内に含まれる。
【００３０】
故に、好ましい特定のＤＮＡ配列について言及すると、これは、同定するのに使用される配列であり、Ｌ１因子のより大きな配列内に含有されるようであることが理解される。従って、Ｌ１因子自身が発現可能なＯＲＦを含有する場合、Ｌ１因子の同定配列はＯＲＦを含有する必要はなく、ＯＲＦから転写されたＲＮＡは、当該特定Ｌ１因子を標的とするＲＮＡｉに結合され得る。
【００３１】
故に、ＲＮＡｉは、この好ましいＤＮＡ配列もしくその対応配列、またはその相同体を含むＬ１因子を標的とするのが好ましい。
【００３２】
好ましいＬ１因子に含まれるＯＲＦの例は、配列番号２０〜２５のプライマー配列に相当する配列である。従って、ＲＮＡｉは、好ましくは、これらの配列番号またはそれらに相当する配列を認識する。
【００３３】
より詳細には、ＯＲＦ１については：
５’−ＡＧＡＡＡＴＧＡＧＣＡＡＡＧＣＣＴＣＣＡ−３’（配列番号２０）；
５’−ＧＣＣＴＧＧＴＧＧＴＧＡＣＡＡＡＡＴＣＴ−３’（配列番号２１）；および
５’−ＴＡＡＧＧＧＣＡＧＣＣＡＧＡＧＡＧＡＡＡ−３’（配列番号２４）。
【００３４】
ＯＲＦ２については：
５’−ＴＣＣＡＧＣＡＧＣＡＣＡＴＣＡＡＡＡＡＧ−３’（配列番号２２）；
５’−ＣＣＡＧＴＴＴＴＴＧＣＣＣＡＴＴＣＡＧＴ−３’（配列番号２３）；および
５’−ＴＧＡＣＡＡＡＣＣＣＡＣＡＧＣＣＡＡＴＡ−３’（配列番号２５）。
【００３５】
従って、これらの配列のＲＮＡ等価物は、ＯＲＦ１については：
５’−ＡＧＡＡＡＵＧＡＧＣＡＡＡＧＣＣＵＣＣＡ−３’（配列番号３９）；
５’−ＧＣＣＵＧＧＵＧＧＵＧＡＣＡＡＡＡＵＣＵ−３’（配列番号４０）；および
５’−ＵＡＡＧＧＧＣＡＧＣＣＡＧＡＧＡＧＡＡＡ−３’（配列番号４１）であり、
【００３６】
ＯＲＦ２については：
５’−ＵＣＣＡＧＣＡＧＣＡＣＡＵＣＡＡＡＡＡＧ−３’（配列番号４２）；
５’−ＣＣＡＧＵＵＵＵＵＧＣＣＣＡＵＵＣＡＧＵ−３’（配列番号４３）；および
５’−ＵＧＡＣＡＡＡＣＣＣＡＣＡＧＣＣＡＡＵＡ−３’（配列番号４４）である。
【００３７】
従って、ＲＮＡｉは、配列番号３９から４４のいずれか１つからの少なくとも１つの断片、好ましくは少なくとも１０個の連続する、より好ましくは１５個、最も好ましくは２０個の連続するヌクレオチドを含むことが特に好ましい。上述のように、様々な機構が散在する前記配列のより短い伸張部、例えばヘアピンループも好ましい。
【００３８】
Ｌ１ＲＰの場合、ＯＲＦ１のＣＤＳは、配列番号２７の９０７位〜１９２３位に存在して、配列番号４５のタンパク質配列をコードし、配列番号２７の１９８７位から５８１４位に存在するＣＤＳはＯＲＦ２をコードし、このタンパク質配列は配列番号４６で表される。ＲＴ活性を有すると考えられるのは、ＯＲＦ２にコードされるタンパク質である。従って、ＲＮＡｉは配列番号２７の９０７位〜１９２３位および／または配列番号２７の１９８７位〜５８１４位に含まれるＤＮＡを対象とし、好ましくは配列番号４５、最も好ましくは配列番号４６に従ったタンパク質の発現を阻害することができるのが好ましい。同様に、ＣＤＳは、配列番号３２の１７７１７位〜１８６９７位、および１１５０３３位〜１１６１６１位に存在するが、これらは擬似遺伝子と記載され、故に好ましくない。
【００３９】
従って、ＲＮＡｉは配列番号４５、最も好ましくは配列番号４６に従ったタンパク質をコードするＲＮＡ配列に相当するＲＮＡの伸張部を含むことが好ましい。この伸張部は、他の箇所に記載されるヘアピン構造または他の機構を包含していてもよい。好ましくは、ＲＮＡｉは、配列番号４５、最も好ましくは配列番号４６に従ったタンパク質をコードするＲＮＡ配列に相当するＲＮＡの２０または２１ｂｐの伸張部からなる。好ましくは、ＲＮＡｉは、配列番号１９の配列またはそのＲＮＡ等価物（配列番号４７）を有し、これはホットＬ１におけるコンセンサス配列を標的とする。
【００４０】
更なる態様において、本発明はこのようなＲＮＡｉを提供する。
【００４１】
Ｂｒｏｕｈａ（２００３）らの文献に記載されるように、活性Ｌ１は、好ましくは多型であり、「若い」、すなわち最近形成されたものであるのが好ましい。その理由は、Ｌ１因子または配列の年齢が、そこで起こり得る多様化（diversion）を決定するからである。Ｂｒｏｕｈａ（２００３）らの文献で論じられるように、配列の多様化がほとんど見られないＬ１は、一般には、集団内では多型であり、培養細胞内では活性であった。逆に、高度に多様化したＬ１配列は、最も頻繁には固定され、不活性である。
【００４２】
活性Ｌ１は、６ｋｂｐ長である場合が多く、５’欠失がないことを示している。従って、ＬＩＮＥ−１因子は、少なくとも６ｋｂｐ長であるのが好ましい。
【００４３】
好ましいのは、平均的なヒトにおける、Ｂｒｏｕｈａ（２００３）らの文献において活性であると予測された８０〜１００個のレトロ転位コンピテントなＬ１である。これらのレトロ転位コンピテントなＬ１のうちの６種は「高度に活性なＬ１（ホットＬ１）」であることが判明した。ホットＬ１は、Ｌ１ＲＰの活性の少なくとも１／３を示すのが好ましい。従って、Ｌ１配列が「ホットＬ１」であり、ヒトにおいて高い生物学的活性を有し、好ましくはＬ１ＲＰ活性の少なくとも１／３を示すことが特に好ましい。
【００４４】
Ｌ１ＲＰはホットＬ１であり、Ｂｒｏｕｈａら（２００３）の文献およびＨｕｍ．Ｍｏｌ．Ｇｅｎｅｔ．８（８），１５５７−１５６０（１９９９）に記載されている（http://hmg.oxfordjournals.org/cgi/reprint/8/8/1557で入手可能：ＮＣＢＩアクセッション番号ＡＦ１４８８５６、配列番号２７）。ＯＲＦを標的とするのが好ましいので、配列番号２７の９０７位〜１９２３位（ＯＲＦ１）および１９８７位〜５８１４位（ＯＲＦ２）のヌクレオチドがＲＮＡｉの特に好ましい標的である。
【００４５】
Ｌ１ＲＰに関する活性は、好適なアッセイによって、例えば当業者によって容易に選択される検出可能な発現マーカーにＬＩＮＥ−１因子を連結することによって測定してもよい。好ましくは、これには、Ｂｒｏｕｈａら（２００３）の文献で使用されている方法やＥＧＦＰアッセイが含まれる。ＥＧＦＰカセットの構築および活性を評価するための当該カセットの使用方法は、Ｂｒｏｕｈａら（２００３）の文献からの参照番号２３、Ｈａｉｇ Ｈ． Ｋａｚａｚｉａｎ Ｊｒ ｅｔ al：Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ， ２０００， Ｖｏｌ． ２８， Ｎｏ． ６， １４１８−１４２３に更に記載されている。ＥＧＦＰを含むＬ１の好適な例は、以下に記載される配列番号２６である。
【００４６】
理論に拘束されることなく、転写は、その５開始ＵＴＲ内に位置する内部プロモータから開始され、ＲＮＡは細胞質に移送されると考えられている。Ｌ１コードタンパク質、すなわちＯＲＦ１ｐおよびＯＲＦ２ｐは、それらをコードしたｍＲＮＡに作用し、この現象はｃｉｓ型優先（cis preference）として知られている。
【００４７】
次いで、生じたリボヌクレオタンパク質粒子は、細胞核に再度入り、ここで、最初に標的開始（target-primed）逆転写によってＬ１の組み込みが生じると考えられている。このプロセスの間、Ｌ１エンドヌクレアーゼは、ゲノムＤＮＡ中の緩いコンセンサス配列５’−ＴＴＴＴＴ／Ａ−３’にて一本鎖ニックを生成して、３’ＯＨを露出し、これはＬ１ ＲＴ（逆転写酵素）によるＬ１ ＲＮＡの逆転写用プライマーとして使用される。
【００４８】
好ましくは、ＬＩＮＥ−１配列は、２１塩基対のコンセンサス配列（配列番号１９）、その対応する（アンチセンス）ＤＮＡ配列またはそのＲＮＡ等価物を含む。故に、本発明のＲＮＡｉがこの２１塩基対配列のＲＮＡ等価物、または配列番号１９に相当するＤＮＡ配列のＲＮＡ等価物、または６×ＳＳＣなどのストリンジェント条件下でそれとハイブリダイズできる配列を含むことも好ましい。
【００４９】
また、ＲＮＡｉが標的とする配列は、配列番号３５〜３８のいずれか、より好ましくは配列番号３７、最も好ましくは配列番号３５であるのが好ましい。対応するＤＮＡ配列またはそのＲＮＡ等価物もこれに含まれる。配列番号３５は実施例２において標的とされる６０ｂｐの配列であり、一方、配列番号３６〜３８は、下記に記載されるような、より長いコンセンサス配列である。
【００５０】
標的とされるＬ１配列はまた、本明細書に記載される配列のいずれかと、ある程度の相同性、好ましくは少なくとも７０％、より好ましくは少なくとも８５％、より好ましくは少なくとも９５％、より好ましくは少なくとも９９％、より好ましくは少なくとも９９．５％、より好ましくは少なくとも９９．９％、より好ましくは少なくとも９９．９５％、最も好ましくは少なくとも９９．９９％の相同性を有することができる。故に、ＲＮＡｉは、これらの好ましい配列またはそれらの対応する配列、またはその相同体を含むＬ１因子を標的とするのが好ましい。
【００５１】
特定の配列について言及すると、当該配列がＤＮＡ配列の場合、これには、その対応するＤＮＡ配列（例えば、６×ＳＳＣなどの高度にストリンジェントな条件下で前記配列とハイブリダイズする配列）、またはそのＲＮＡ等価物、すなわち前記ＤＮＡ配列の転写によって得られるＲＮＡ配列が含まれると理解される。
【００５２】
ＬＩＮＥ−１因子（Ｌ１）は、ＲＴをコードするものであれば、広範なレトロ転位可能な因子群から選択されてもよい。Ｌ１は、Ｌ１因子の「転写群Ａ」（Ｔａ）サブセットまたはプレ−Ｔａサブセットに由来するのが好ましい。しかしながら、Ｔａサブセットが特に好ましく、特にＴａ−１ｄファミリーが好ましい。
【００５３】
しかしながら、Ｌ１がＬＲＥ３、Ｌ１ＲＰ（ＮＣＢＩアクセッション番号ＡＦ１４８８５６）、ならびにアクセッション番号ａｃ００４２００、ａｃ００２９８０、ａｌ３５６４３８、ａｌ５１２４２８、ａｃ０２１０１７およびａｌ１３７８４５（それぞれ配列番号２６〜３３）からなる群から選択されることが特に好ましい。これらの配列およびその関連する特徴データは、ＮＣＢＩウェブサイト（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi）から入手可能である。
【００５４】
配列番号２６に関して、与えられた全配列は、ＬＲＥ３−ＥＧＦＰの合成構築物、すなわちＥＧＦＰ（強化緑色蛍光タンパク質（Enhanced Green Fluorescent Protein））で標識されたＬＲＥ３、ならびに破壊されたＤｌｇｈ２遺伝子（部分配列）である。しかしながら、当業者であれば、１位〜１５５位にＥＧＦＰコード領域を包含する必要はなく、また５１０位〜９１０位にＤｌｇｈ２遺伝子部分を包含する必要もなく、これらは、与えられた他のＬ１に存在するようなＯＲＦ１およびＯＲＦ２と置き換えてもよいことを容易に理解する。この特徴および更なる特徴に関する情報は、ＮＣＢＩウェブサイトから配列番号２６に関するアクセッション番号、すなわちＡＹ９９５１８６のもとで入手可能である。
【００５５】
当業者は、ＥＧＦＰのような検出可能なマーカーを包含するＬ１を設計することができ、開始点または鋳型として配列番号２６を使用してもよい。
【００５６】
Ｌ１因子群に関するコンセンサス配列は、配列番号３６〜３８に提供されている。配列番号３６はＴａ−１ｄコンセンサス配列であり、配列番号３７はホット因子コンセンサス配列であり、配列番号３８は９０個の活性なＬ１に関するより広範なコンセンサス配列である。これらは、Ｂｒｏｕｈａら（２００３）のオンライン文献の「supporting information」から得られたものである（www.pnas.orgから入手可能）。
【００５７】
故に、Ｌ１配列は、配列番号３６、３７および３８のいずれか、またはその対応する配列または相同体から選択されることが好ましい。相同体は、好ましくは、前記配列番号またはその対応する配列と、好ましくは少なくとも７０％、より好ましくは少なくとも８５％、より好ましくは少なくとも９５％、より好ましくは少なくとも９９％、より好ましくは少なくとも９９．５％、より好ましくは少なくとも９９．９５％、最も好ましくは少なくとも９９．９９％の相同性を有する。
【００５８】
ホットＬ１コンセンサス配列（配列番号３７）またはその対応する配列もしくは相同体は、活性が高いので特に好ましい。ホットｌ１コンセンサスに対する相同性または類似性の程度は、レトロ転位活性の良好な予測材料となる。Ｂｒｏｕｈａ（２００３）は、Ｌ１活性とヌクレオチド配列との関係を分析し、コンセンサス配列（８個のホットＬ１（ＬＲＥ３、Ｌ１ＲＰ、ａｃ００４２００、ａｃ００２９８０、ａｌ３５６４３８、ａｌ５１２４２８、ａｃ０２１０１７およびａｌ１３７８４５）を有する配列番号３７）を構築した。この配列は、１０３３位におけるＯＲＦ１のサイレント変異を除いて、Ｔａ−１ｄコンセンサス（配列番号３６）と同じであり、１２個の多型部位を除いて、９０個の無傷なＬ１のコンセンサスと同じである。
【００５９】
Ｂｒｏｕｈａら（２００３）は、Ｌ１を、最初に活性群および不活性群として、次に対で、ホット因子のコンセンサスと比較した。彼らは、Ｌ１を、全体的に、次いで領域ごとに、最後にアミノ酸変異を引き起こす差異ごとに分析した。活性または不活性Ｌ１と独自に関連するヌクレオチド変異は存在しないことが判明した。予期するように、幾つかの例外はあるが、Ｌ１がホットＬ１コンセンサスに近い程、活性である可能性が高かった。上記の結果を踏まえると、彼らのデータは、レトロ転位活性の低下が時間の関数として生じることを示している。Ｌ１が「ホット」コンセンサス配列から遠い程、活性である可能性は低い。
【００６０】
ＬＩＮＥ−１因子が上述の配列、特にホットＬ１に対してきわめて高い配列相同性を有することが特に好ましい。この理由は、Ｂｒｏｕｈａらの文献で論じられるように、幾つかの例外はあるが、Ｌ１配列は、ホットＬ１配列に近い程、活性である可能性が高いからである。上述のように、ＬＩＮＥ−１配列または因子がホットＬ１であり、好ましくはＬ１ＲＰの活性の少なくとも１／３、好ましくは少なくとも２／３、より好ましくは１００％、最も好ましくは１００％よりも高く、好ましくは１５０％以上であるのが好ましい。
【００６１】
特に好ましいホットＬ１の中では、全てが多型であり、そのうち３個（ａｃ００２９８０、ａｃ００４２００およびａｌ３５６４３８）が、最も若いＴａ−１ｄ群に由来する。更に、１つはＴａ−１ｎｄ群（ａｌ５１２４２８）であり、別のものは、より若いＴａ−０サブグループ（ａｌ１３７８４５）のメンバーである。これら５個の標準的なホットＬ１の配列は、それら各々の群またはサブグループのコンセンサス配列に非常に類似しており、これは、それらがヒトの進化の過程で比較的最近になってレトロ転位したことを示している。最後に、１つのホットＬ１（ａｃ０２１０１７）は非標準的である。
【００６２】
２１個のヌクレオチド配列（配列番号１９）は、約９０（８０〜１００）個の活性なＬ１レトロ因子内に存在する対応配列に相補的であり、これらのレトロ因子は本発明の好ましい標的である。故に、ＲＮＡｉは、好ましくは、当該配列もしくはその対応配列、またはその相同体を含むＬ１因子を標的とする。
【００６３】
約３０年前からＬＩＮＥ−１と逆転写酵素（ＲＴ）との関連が知られていたが、ＲＴがＬＩＮＥ−１にコードされる遺伝子の１つであることが明らかにされた後は、ＬＩＮＥ−１レトロ因子は、従来から無用なものとして分類され、しばしば「ジャンクＤＮＡ」と呼ばれている。従って、このジャンクＤＮＡは、生物学的役割を果たさないものとして広くみなされていた。これにもかかわらず、本発明者らは、驚くべきことに、ＲＴ阻害が腫瘍増殖に拮抗することができることを発見した。本発明者らは初めて、ＬＩＮＥ−１配列に特異的な標的ＲＮＡｉが、培養物における細胞増殖および動物モデルにおける腫瘍増殖を阻害することを認識した。
【００６４】
Ｏｎｃｏｇｅｎｅ ２００３，Ｖｏｌ．２２，ｐｐ．２７５０〜２７６１（Ｍａｎｇｉａｃａｓａｌｅら）は、薬理学的ＲＴ阻害剤に焦点を当てており、ＲＮＡｉについては全く言及していない。Ｃｙｔｏｇｅｎｅｔ． Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓ ２００４，Ｖｏｌ．１０５，ｐｐ．３４６〜３６０（本発明者らの一人であるＣ． Ｓｐａｄａｆｏｒａ）は、従来技術の様々な系譜をまとめた総説であるが、やはりＲＮＡｉの手法は開示していない。
【００６５】
ＲＮＡｉは、好ましくは二本鎖である。好ましくは、二本鎖リボオリゴヌクレオチドは、細胞トランスフェクションのために、遊離形態では使用されておらず、好ましくは特異的ｓｉＲＮＡをコードするＤＮＡ構築物によって担持されている。好ましくは、転写ＲＮＡは、細胞「ｄｉｃｅｒ」システムによって更に自然発生的に加工される二本鎖パリンドローム構造を形成することにより、例えばＢｒｕｍｍｅｌｋａｍｐら（２００２）に教示されるようなｓｉＲＮＡ分子を形成する。（ＤＭＩに対する注記：この参照を参考文献一覧の最後に挿入する）
【００６６】
他の態様において、ＲＮＡｉを送達するための標準的な細胞トランスフェクション手順を、レトロウイルスまたはアデノウイルス起源の適切な送達システムに置き換えるのが好ましい。このようなウイルスシステムは、当技術分野において周知である。好ましくは、Ｌ１標的ＲＮＡｉを発現するウイルスベクターまたはキャプシド、好ましくはｓｉＲＮＡは、腫瘍細胞を特異的に標的とすることができ、腫瘍細胞に感染することによってＲＮＡｉを発現させ、例えば転写によってｓｉＲＮＡを提供し、それにより腫瘍の増殖に拮抗し、腫瘍細胞の分化を刺激する。
【００６７】
あらゆる腫瘍細胞を標的とする、または治療することが想定されるが、腫瘍細胞は、好ましくは乳癌腫瘍、肺癌腫瘍、黒色腫および前立腺癌からなる群から選択され得る。実際、黒色腫および前立腺癌が特に好ましい。
【００６８】
従って、適切である場合には、ＲＮＡｉは、例えば注入または移植片からの放出により癌性組織に送達されることが特に好ましい。上述のように、好ましくは特異的ｓｉＲＮＡをコードするＤＮＡ構築物を含むウイルスベクターまたはキャプシドが使用されることが特に好ましい。この例において、ウイルスベクターまたはキャプシドは、標的組織、すなわち癌性組織または腫瘍組織においてＤＮＡ構築物を発現できるのが好ましい。これは、ＤＮＡ構築物に含まれる適切な組織特異的プロモータによる、および／または特定の組織に特異的なウイルスキャプシドまたはベクターによるものであってもよい。
【００６９】
上述のことは、特異的ｓｉＲＮＡをコードするポリヌクレオチド、好ましくはＤＮＡを含むプラスミドにも当てはまる。特に、このプラスミドが、好適な組織特異的プロモータまたはｓｉＲＮＡの組織特異的発現のための他の手段を含むのが好ましい。
【００７０】
プラスミドおよびベクターまたはキャプシドのいずれの例においても、プラスミド、ベクターまたはキャプシドが、やはり好ましくは組織特異的に癌性組織のみを標的とするのが好ましい。
【００７１】
更なる態様において、本発明はまた、癌または腫瘍を有する患者を治療する方法を提供し、該方法は、好ましくは上述のようなＲＮＡ干渉の利用を含む。好ましくは、この方法は、上述のように、癌性組織を有する個人を選択し、少なくとも１つのＬ１因子に対してＲＮＡ干渉手法を使用することを含む。好ましくは、この方法は、癌性組織の増殖の阻害または阻止を引き起こす、好ましくは前記組織の分化を刺激するのに十分な逆転写酵素（ＲＴ）の治療的に有効な阻害を含む。
【００７２】
１個のＬＩＮＥ−１因子だけを標的とすることが想定されているが、複数のＬＩＮＥ−１因子を、同時にまたは連続的に、予定される投薬計画の一部として、標的とすることが好ましい。
【００７３】
更なる態様において、本発明はまた、癌性疾患を治療するための医薬の製造における、少なくとも１つのＬＩＮＥ−１因子の一部分を標的とするか、またはこれを認識することができるｓｉＲＮＡをコードするポリヌクレオチド配列、好ましくはＤＮＡ配列の使用を提供する。好ましくは、この医薬は、当該ポリヌクレオチドを含んでなるウイルスキャプシドまたはベクターを含む。
【００７４】
ここで、本発明は、添付の非制限的な実施例を参照して更に説明される。
【実施例】
【００７５】
実施例１
方法
細胞培養物
ヒトＡ−３７５黒色腫（ＡＴＣＣ−ＣＲＬ−１６１９）、ＴＶＭ−Ａ１２一次黒色腫由来（２０）、ＨＴ２９腺癌（ＡＴＣＣ ＨＴＢ−３８）、Ｈ６９小細胞肺癌（ＳＣＬＣ）（ＡＴＣＣ ＨＴＢ１１９）およびＰＣ３前立腺癌（ＡＴＣＣ ＣＲＬ−１４３５）細胞系を、１０４〜５×１０４細胞／ウェルの密度にて６ウェルプレートに播種し、１０％ウシ胎仔血清を含むＤＭＥＭまたはＲＰＭＩ１６４０内で培養した。ネビラピン（Nevirapine）およびエファビレンツ（Efavirenz）を、上述のような市販のビラミューン（Viramune）（Boehringer-Ingelheim）およびサスティバ（Sustiva）（Bristol-Myers Squibb）から精製した（１８）。薬剤をジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）（Sigma-Aldrich）中でそれぞれ３５０μＭおよび１５μＭとし、播種から５時間後に細胞に添加した。対照には、同じＤＭＳＯ容積（最終濃度０．２％）を添加した。４８時間ごとに新鮮なＲＴ阻害剤含有培地に交換した。細胞を９６時間ごとに回収し、Ｂｕｒｋｅｒチャンバ内でカウントし（２回のカウント／試料）、同じ密度にて再プレーティングした。
【００７６】
細胞周期および細胞死分析
回収直前の３０分間に、ＢｒｄＵ（２０μＭ）を培養物に添加した。次いで、回収した細胞を抗ＢｒｄＵ抗体およびヨウ化プロピディウム（ＰＩ）で処理し、ＦＡＣＳｔａｒ Ｐｌｕｓフローサイトメーター（Beckton-Dickinson）においてＤＮＡ含量とＢｒｄＵ取り込みとの二重パラメータ（biparametric）分析に供した。ＤＡＰＩ（核形態学）、ＰＩ（細胞浸透性）および３，３ジヘキシルオキサカルボシアニン［ＤｉＯＣ６（３）］、ミトコンドリア膜電位用蛍光プローブによる複合染色後、顕微鏡で細胞死を評価した。
【００７７】
間接的免疫蛍光検査および共焦点レーザー走査顕微鏡法
Ａ−３７５およびＴＶＭ−Ａ１２細胞を４％パラホルムアルデヒドで１０分間固定し、ＰＢＳ中の０．２％Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ１００において５分間浸透化した。マウスモノクローナル抗ウシα−チューブリン（Molecular Probes, A-11126）をＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４８８−結合二次抗体（Molecular Probes, cat. A-11001）によって顕在化し、０．１ｍｇ／ｍｌのリボヌクレアーゼＡの存在下、２μｇ／ｍｌのＰＩで核を染色した。アルゴン／クリプトンレーザー（励起波長および発光波長：Ａｌｅｘａ４８８の場合４８８ｎｍおよび５１０ｎｍ、ＰＩの場合５６８ｎｍおよび５９０ｎｍ）を備えた共焦点Ｌｅｉｃａ ＴＣＳ ４Ｄ顕微鏡下で撮像した。共焦点区域は、０．５〜１μｍ間隔で設けた。
【００７８】
走査電子顕微鏡（ＳＥＭ）
Ａ−３７５およびＴＶＭ−Ａ１２細胞を、０．１Ｍ Ｍｉｌｌｏｎｉｇ’ｓリン酸塩緩衝液中の２．５％グルタルアルデヒドで固定した。洗浄後、細胞をＭＰＢ中の１％ＯｓＯ４（１時間、４℃）でポスト固定し、高アセトン濃度で脱水した。液体ＣＯ２を用いて試料を臨界点乾燥させ、金でスパッタコーティングし、Ｓｔｅｒｅｏｓｃａｎ２４０走査電子顕微鏡（Cambridge Instr.（英国、ケンブリッジ（Cambidge, UK）））上で検査した。
【００７９】
半定量的ＲＴ−ＰＣＲ
ＲＮＡ抽出およびＲＮａｓｅを含まないＤＮａｓｅ Ｉによる処理は（１８）に記載される通りに行った。３００ｎｇのＲＮＡ、オリゴ（ｄＴ）およびＴｈｅｒｍｏｓｃｒｉｐｔシステム（Invitrogen）を用いてｃＤＮＡを合成した。最初の工程は９４℃で２分間、続いて９４℃で３０秒、５８℃〜６２℃で３０秒、７２℃で１分間のサイクルにて、Ｐｌａｔｉｎｕｍ Ｔａｑ ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅキット（Invitrogen）および３０ｐｍｏｌのオリゴヌクレオチド（MWG-Biotech、ドイツ、エーベルスベルグ（Ebersberg, Germany））を用いて反応混合物の１／２５を増幅した。
【００８０】
サイクル数を増やした（２５〜４０）一連の増幅において、各オリゴ対を使用した。ＰＣＲ産物を、電気泳動させ、膜に転写し、［３２Ｐ］γ−ＡＴＰ末端標識内部オリゴヌクレオチドで４２℃にて１６時間ハイブリダイズさせた。各遺伝子につき少なくとも３回の独立した実験において、増幅シグナルの強度をデンシトメトリーによって測定した。
【００８１】
半定量的ＰＣＲ分析に使用するオリゴヌクレオチド（正：Ｆ、逆：Ｒ）およびハイブリダイゼーション用の内部プローブ（ＩＮＴ）
Ｃ−ｍｙｃ ＰＣＲ産物のサイズ：６３３ｂｐ；
Ｆ，５’−ｇｔｃａｃａｃｃｃｔｔｃｔｃｃｃｔｔｃｇ−３’（配列番号１）；
Ｒ，５’−ｔｇｔｇｃｔｇａｔｇｔｇｔｇｇａｇａｃｇ−３’（配列番号２）；
ＩＮＴ，５’−ａｇａｇａａｇｃｔｇｇｃｃｔｃｃｔａｃｃ−３’（配列番号３）；
【００８２】
Ｂｃｌ２ ＰＣＲ産物のサイズ：４５９ｂｐ；
Ｆ，５’−ｇｇｔｇｃｃａｃｃｔｇｔｇｇｔｃｃａｃｃｔｇ−３’（配列番号４）；
Ｒ，５’−ｃｔｔｃａｃｔｔｇｔｇｇｃｃｃａｇａｔａｇｇ−３’（配列番号５）；
ＩＮＴ，５’−ｃｔｇａａｇａｇｃｔｃｃｔｃｃａｃｃａｃ−３’（配列番号６）；
【００８３】
Ｅ−カドヘリン ＰＣＲ産物のサイズ：７３２ｂｐ；
Ｆ，５’−ｃｔｃｃｔｃｔｃｃｔｇｇｃｃｔｃａｇａａ−３’（配列番号７）；
Ｒ，５’−ｔａｃｔｇｃｔｇｃｔｔｇｇｃｃｔｃａａａ−３’（配列番号８）；
ＩＮＴ，５’−ｇａａｃｇｃａｔｔｇｃｃａｃａｔａｃａｃ−３’（配列番号９）；
【００８４】
ＰＳＡ ＰＣＲ産物のサイズ：５８４ｂｐ；
Ｆ，５’−ｔｔｇｔｃｔｔｃｃｔｃａｃｃｃｔｇｔｃｃ−３’（配列番号１０）；
Ｒ，５’−ａｇｃａｃａｃａｇｃａｔｇａａｃｔｔｇｇ−３’（配列番号１１）；
ＩＮＴ，５’−ｃｃａｃａｃｃｃｇｃｔｃｔａｃｇａｔａｔ−３’（配列番号１２）；
【００８５】
Ｃｃｎｄ１ ＰＣＲ産物のサイズ：６９０ｂｐ；
Ｆ，５’−ｃｃｃｔｃｇｇｔｇｔｃｃｔａｃｔｔｃａａ−３’（配列番号１３）；
Ｒ，５’−ｔｃｃｔｃｃｔｃｔｔｃｃｔｃｃｔｃｃｔｃ−３’（配列番号１４）；
ＩＮＴ，５’−ｃｇｃａｃｇａｔｔｔｃａｔｔｇａａｃａｃ−３’（配列番号１５）；
【００８６】
Ｇａｐｄｈ ＰＣＲ産物のサイズ：５９０ｂｐ；
Ｆ，５’−ａｇｇｇｇｔｃｔａｃａｔｇｇｃａａｃｔｇ−３’（配列番号１６）；
Ｒ，５’−ａｃｃｃａｇａａｇａｃｔｇｔｇｇａｔｇｇ−３’（配列番号１７）；
ＩＮＴ，５’−ｇｔｃａｇｔｇｇｔｇｇａｃｃｔｇａｃｃｔ−３’（配列番号１８）。
【００８７】
ＬＩＮＥ−１に対するＲＮＡ干渉
Ｂｒｕｈａらの文献（２１）に記載される高度に活性なＬＩＮＥ−１因子のコンセンサス配列を標的とするべく、Ａ２１−ｎｔ二本鎖ｓｉＲＮＡオリゴヌクレオチド（Ｌ１−Ｉ）（５’−ＡＡＧＡＧＣＡＡＣＴＣＣＡＡＧＡＣＡＣＡＴ−３’（配列番号１９））を設計した。具体的に、以下の配列を標的とした：
【００８８】
ｉ）８個のホットＬ１（ＬＲＥ３（配列番号２６）、ＬＩＲＰ（配列番号２７）、ａｃ００４２００（配列番号２８）、ａｃ００２９８０（配列番号２９）、ａｌ３５６４３８（配列番号３０）、ａｌ５１２４２８（配列番号３１）、ａｃ０２１０１７（配列番号３２）、ａｌ１３７８４５９（配列番号３３））；
【００８９】
ｉｉ）Ｔａ−１ｄファミリー；および
【００９０】
ｉｉｉ）９０個の全長Ｌ１因子。対照については、トランスフェクション効率をモニタリングするために３’−フルオレセイン修飾された非特異的ｓｉＲＮＡ（配列番号３４）を細胞にトランスフェクトした。
【００９１】
ＱＩＡＧＥＮ（米国）によってｓｉＲＮＡオリゴヌクレオチドを合成した。ウェルごとに１．５μｇのｓｉＲＮＡを添加した２４ウェルプレートにおいて、ＲＮＡｉＦｅｃｔ Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ Ｒｅａｇｅｎｔ（QIAGEN cat. 301605）を用いてＡ−３７５細胞においてトランスフェクションを行った。トランスフェクションから４８時間後および７２時間後に細胞をカウントし、Ｏｌｙｍｐｕｓ ＣＡＭＥＤＩＡデジタルカメラを備えたＯｌｙｍｐｕｓ ＣＫ３０倒立顕微鏡下で細胞形態を記録した。蛍光顕微鏡によって測定されるように、細胞の約８０％が２４時間後にトランスフェクトされた。
【００９２】
トランスフェクションから４８時間後、ＬＩＮＥ−１ ＯＲＦ−１およびＯＲＦ−２に特異的なプライマー対を用いて、ＲＴ−ＰＣＲによってＬＩＮＥ−１発現を分析した：
【００９３】
ＯＲＦ−１：
Ｆ，５’−ＡＧＡＡＡＴＧＡＧＣＡＡＡＧＣＣＴＣＣＡ−３’（配列番号２０）；
Ｒ，５’−ＧＣＣＴＧＧＴＧＧＴＧＡＣＡＡＡＡＴＣＴ−３’（配列番号２１）
【００９４】
ＯＲＦ−２：
Ｆ，５’−ＴＣＣＡＧＣＡＧＣＡＣＡＴＣＡＡＡＡＡＧ−３’（配列番号２２）；
Ｒ，５’−ＣＣＡＧＴＴＴＴＴＧＣＣＣＡＴＴＣＡＧＴ−３’（配列番号２３）。
【００９５】
ＲＮＡ抽出およびＲＴ−ＰＣＲ条件は、アニーリングＴ℃が５４℃であり、増幅が２３サイクル行われたことを除いて、本明細書に記載される通りであった。サザン分析用の内部オリゴヌクレオチドは、５’−ＴＡＡＧＧＧＣＡＧＣＣＡＧＡＧＡＧＡＡＡ−３’（ＯＲＦ−１（配列番号２４））および５’−ＴＧＡＣＡＡＡＣＣＣＡＣＡＧＣＣＡＡＴＡ−３’（ＯＲＦ−２（配列番号２５））であった。
【００９６】
腫瘍異種移植片および動物の治療
欧州連合ガイドラインに従って保有された５週齢の無胸腺ヌードマウス（イタリア、ハーラン（Harlan, Italy））に、１００μｌのＰＢＳ中のＡ−３７５黒色腫（４ｘ１０６）、Ｈ−６９（１０７）、ＰＣ３（２ｘ１０６）およびＨＴ−２９（１０６）細胞を皮下接種した。生理溶液で１：１に新たに希釈したＤＭＳＯ中の４ｍｇ／ｍｌのストックを用いて、エファビレンツ（２０ｍｇ／ｋｇ）を週に５日、毎日マウスに皮下注射した。対照には５０％ＤＭＳＯを注射した。治療は、腫瘍の移植から１日後または１週間後に開始し、幾つかの実験においては１４日後に中断した。キャリパー測定により腫瘍の増殖を一日おきにモニタリングし、以下の式を用いて体積を計算した：
長さ×幅×高さ×０．５２ （２２）。
【００９７】
結果
ＲＴコードＬＩＮＥ−１ファミリーを標的としたＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）は、黒色腫細胞において増殖を低下させ、分化を促進する
以下に論じるように、医薬ＲＴ阻害剤に反応して観察された増殖率の低下および分化の誘発が、実際に、細胞ＲＴの特異的な阻害に起因するかどうかを究明しようとした。これに対処すべく、ヒト細胞において最も豊富に発現することが知られているＬＩＮＥ−１因子のサブファミリー（２１個、および上述の「方法」の対応する部分に記載される標的配列）を特異的標的とするようにＲＮＡｉ実験を設計した。
【００９８】
ＬＩＮＥ−１ ＯＲＦ１（図４、パネルＡ）に相同な二本鎖ＲＮＡオリゴヌクレオチドをＡ−３７５細胞内にトランスフェクトした。トランスフェクトから４８〜７２時間後、典型的な分化形態（パネルＢ）が誘発された。それに付随して、増殖は、非特異的オリゴヌクレオチドでトランスフェクトされた細胞と比べて、約７０％低下した（パネルＣ）。これらの結果は、医薬ＲＴ阻害により得られたものに匹敵する。半定量的ＲＴ−ＰＣＲ分析により、ＯＲＦ１およびＯＲＦ２双方の発現は、非特異的オリゴヌクレオチドでトランスフェクトされた細胞と比べて、ほぼ８０％低下した（パネルＤ）。更に、ＬＩＮＥ−１因子に対するＲＮＡｉは、ＲＴ阻害剤に反応して見られるように、ＧＡＰＤＨではなく、ｃ−ｍｙｃおよびサイクリン−Ｄ１遺伝子の発現の下方制御を誘発した。
【００９９】
ＲＴ阻害剤は細胞増殖を可逆的に低下させる
また、広く使用されている２つのＲＴ阻害剤、すなわちネビラピンおよびエファヴィレンツに長期間曝露したヒト形質転換細胞系の反応を調査した。Ａ−３７５黒色腫、ＰＣ３前立腺癌およびＴＶＭ−Ａ１２一次黒色腫由来細胞系からの培養物を継代培養し、カウントし、少なくとも２０日間（９６時間周期を５回）連続的に薬剤を再添加しつつ９６時間ごとに再プレーティングした。図１Ａに示すように、これらの阻害剤はいずれも、全ての細胞系において細胞の増殖を効果的に低下させ、長期間の曝露中に安定な阻害効果を呈する。増殖の阻害は可逆的であった。ＲＴ阻害剤を除去すると、全ての細胞系は１回または２回の９６時間周期中、対照と同程度の比率で増殖を再開した。薬剤の再添加により、全ての細胞系において再び増殖が阻害された。故に、ＲＴ阻害に関連する細胞増殖の低下は、細胞分裂を通じての永続的変化として継承したものではない。
【０１００】
増殖低下の根拠を解明するために、いずれのＲＴ阻害剤もＡ−３７５またはＰＣ３細胞系における細胞死を誘発するかどうかを調査した。透過性壊死細胞を顕在化するためにＰＩを使用し、アポトーシス核を視覚化するためにＤＡＰＩを使用し、ミトコンドリア膜電位の損失をモニタリングするためにＤｉＯＣ６（３）を使用した複合染色は、いずれのＲＴ阻害剤によっても著しい細胞死の誘発は見られなかった。低い割合を記録したもの（いずれかの薬剤に曝露してから７２時間後、最大で１５％）は、概してアポトーシスによって説明された（データ示さず）。故に、いずれの薬剤も著しい非特異的毒性を有しておらず、これは、細胞増殖の低下が細胞周期遅延の誘発をかなり反映していることを示唆している。
【０１０１】
これを評価するために、ＲＴ阻害剤に対する曝露を９６時間周期で４回行った後に、ＤＮＡ含量（ＰＩにより顕在化）およびＤＮＡ複製（ＢｒｄＵの取り込みによる）を測定するために二重パラメータＦＡＣＳ分析を用いた。細胞周期のプロファイルは、抗ＲＴ処理培養物においては著しく変化し、これは、Ａ−３７５細胞培養物において特に顕著なＧ０／Ｇ１内容物を有するＢｒｄＵ陰性細胞の割合が増加したことを示している（図１Ｂ）。薬剤を除去すると、もとの細胞周期プロファイルが再び確立し、Ｇ１遅延が排除された。
【０１０２】
ネビラピンは、形質転換細胞系において、形態的分化ならびに分化および増殖遺伝子の発現を誘発する
黒色腫は、治療に対して最も耐性が高いので、ＲＴ阻害剤が細胞増殖の低下に付随する分化を誘発するかどうかを解明するのに適切であった。まず、幾つかの分化誘導因子に反応して、典型的な樹状表現型を取得することができるＡ−３７５黒色腫細胞を試験した（２３）。図２Ａに示すように、細胞の形状によって示された形態的分化（樹状伸長および接着性の増加）は、ＤＭＳＯで処理した対照（ａ）と比べて、ネビラピン（ｄ）またはエファビレンツ（ｇ）への曝露から４〜５日の間に明らかとなった。走査電子顕微鏡（ＳＥＭ）により、ネビラピン（ｅ）およびエファビレンツ（ｈ）を用いて培養したＡ−３７５細胞は、処理していない対照（ｂ）と比べて平坦化しており、基質に密着する伸長した樹状伸長を呈していた。α−チューブリン免疫染色後の共焦点顕微鏡検査により、更に、対照（ｃ）とは異なり、ＲＴ阻害細胞（ｆ−ｉ）における成長した樹状突起の長さ全体にわたって微小管アレイが再編成され、ここでは短い微小管が核形成中心の周りに集中していることが判明した。
【０１０３】
ネビラピン処理後、黒色腫由来の一次ＴＶＭ−Ａ１２細胞においても同様の反応が認められた。未処理細胞は、位相差顕微鏡（ａ）およびＳＥＭ（ｂ）で観察すると、スピンドル状形態を有する。ネビラピンで処理したＴＶＭ−Ａ１２細胞は、その代わりに典型的な分岐樹状突起（ｄ−ｅ）を形成し、未処理細胞（ｃ）と比べて、よく編成された伸長微小管アレイ（ｆ）を呈した。
【０１０４】
形態的分化の誘発は、重要な調節遺伝子が、ＲＴ阻害処理に反応して調節されることを示唆している。これは、ＤＭＳＯのみで、またはネビラピンもしくはエファビレンツで４周期間処理した培養物の半定量的ＲＴ−ＰＣＲ分析において調査した。Ａ−３７５黒色腫細胞において、４種の遺伝子の組、すなわち、細胞間接着に関与し、分化した非腫瘍細胞内で発現するＥ−カドヘリン遺伝子（２４）、および黒色腫細胞増殖および腫瘍増殖に直接関与するｃ−ｍｙｃ、ｂｃｌ−２（２５）およびサイクリン Ｄ１（２６）遺伝子に焦点をあてた。
【０１０５】
図３Ａに示すように、Ｅ−カドヘリン遺伝子は、対照と比べて、ＲＴ阻害Ａ−３７５培養物において著しく上方制御され、対照的に、ｃ−ｍｙｃ、ｂｃｌ−２およびサイクリンＤ１遺伝子は下方制御されることが判明した。サイクリンＤ１発現を下方制御できなかった１つの例外が、エファビレンツに関して記録された。また、ＰＣ３前立腺癌細胞、および分化した前立腺上皮の選択された２つのマーカー遺伝子、すなわち前立腺特異的抗原ＰＳＡ（２７）およびアンドロゲン受容体（ＡＲ）（２８）遺伝子を分析した。これらの遺伝子はいずれも、未処理培養物では発現されないが、いずれの遺伝子もＲＴ阻害剤に反応して誘発された（図３Ｂ）。再び、全ての遺伝子の発現は、阻害剤を除去すると、元のレベルに戻った。故に、ＲＴ阻害剤は、分化の誘発と一致した、形質転換細胞における重要遺伝子の発現を再プログラミングするが、この再プログラミングは可逆的であり、ＲＴ阻害が解除されると行われなくなる。
【０１０６】
ＲＴ阻害剤は、無胸腺ヌードマウスにおけるヒト腫瘍異種移植片の成長を低下させる
増殖および分化を含む形質転換細胞の重要な特徴がＲＴ阻害によって調節されるので、ＲＴ阻害剤が腫瘍増殖に拮抗する能力をｉｎ ｖｉｖｏでテストした。
【０１０７】
これらの実験用に選択した発癌性細胞系としては、Ａ−３７５およびＰＣ系、ならびにＨＴ２９コドンおよびＨ６９小細胞肺癌系が挙げられ、これらはまた、ＲＴ阻害剤（１９、およびデータ示さず）に反応して細胞増殖の低下を示した。無胸腺ヌードマウスの肢部に細胞を皮下接種した。次いで、動物をエファビレンツによる処理に供した。その理由は、この薬剤が、事前アッセイにおいてネビラピンよりも高いｉｎ ｖｉｖｏ効率を示したからである。４〜４０ｍｇ／ｋｇの薬剤をテストする用量反応実験において最適な投薬量（２０ｍｇ／ｋｇ体重）を決定した。
【０１０８】
エファビレンツ処理は、全ての動物群において安全であり、これらの群のいずれにおいても動物の死や明白な毒性の徴候を示さないことが分かった。但し、４０ｍｇ／ｋｇで処理した群は、６０％を超える動物において著しい体重の減少を示した。図５は、未処理マウス（赤）または腫瘍接種から１日後（紫）、または１週間後（黄色）にエファビレンツによる処理を開始したマウスにおける腫瘍増殖の記録曲線を示している。
【０１０９】
全タイプの異種移植片について、処理動物における腫瘍増殖は、未処理動物と比べて著しく低下し、初期の腫瘍サイズの差にもかかわらず、処理開始のタイミングに関係なく、腫瘍の進行は同程度の効率で拮抗された。接種後１日目から処理し、１５日目に処理を中断した動物におけるＰＣ３およびＨＴ２９由来腫瘍の増殖曲線（緑色の曲線）は、腫瘍増殖のＲＴ依存性阻害がｉｎ ｖｉｖｏで可逆的であることを示している。
【０１１０】
エファビレンツで処理したＰＣ３細胞は、腫瘍形成をｉｎ ｖｉｖｏで低下させる
また、形質転換細胞をエファビレンツで事前処理したときに、生成された異種移植片の腫瘍形成能が調節されるかどうかを調査した。ＰＣ３前立腺癌細胞を、２回の９６時間周期（ＰＳＡおよびＡＲ遺伝子を誘導するに十分な時間）の間、２０μＭのエファビレンツを用いて培養し（図３Ｂ）、次いでヌードマウスに接種した。
【０１１１】
平行バッチの動物に未処理細胞を接種した。次いで、エファビレンツで事前処理した、または未処理のＰＣ３細胞異種移植片を連続してエファビレンツでｉｎ ｖｉｖｏで処理するか、または未処理のまま放置した。図６Ａに示すように、未処理ＰＣ３細胞は、全ての動物において侵攻性腫瘍を生じた。対照的に、エファビレンツで事前処理したＰＣ３細胞は、ｉｎ ｖｉｖｏで腫瘍を形成する能力が低下し、異種移植片の成長はより緩慢であった。図６Ｂに要約されるように、エファビレンツで事前処理したＰＣ３細胞は、未処理細胞を使用する１００％と比較して、接種動物の６５％において緩慢に成長する異種移植片を生じた。更に、事前処理した細胞を接種し、更にｉｎ ｖｉｖｏでエファビレンツにより処理した動物の４０％だけが腫瘍を発現し、その場合、増殖曲線は平坦であった。故に、エファビレンツは形質転換細胞の腫瘍形成能を減衰させる。
【０１１２】
考察
この研究は、癌に関与するヒトゲノムの３つの特徴を強調している。第一に、ＬＩＮＥ−１因子は、細胞分化および増殖の制御に関与する機構の活性成分として同定される。第二に、ＬＩＮＥ−１因子のＲＮＡｉ依存型の不活性化、またはそれらがコードする内因性ＲＴ活性の薬理学的阻害は、形質転換細胞におけるこれらの特色の制御を回復させることができる。第三に、ＲＴ阻害剤は、動物モデルにおける腫瘍の増殖をｉｎ ｖｉｖｏで低下させる。
【０１１３】
この研究で使用するＲＴ阻害剤、すなわちネビラピンおよびエファビレンツは、ＲＴ酵素のｐ６６サブユニットにおいて疎水性ポケットを結合することにより、共通の作用機序を有する（２９，３０）。両阻害剤は、ＨＩＶコードＲＴを標的とするべく設計されているが、非感染細胞における内因性ＲＴの酵素活性をｉｎ ｖｉｖｏで阻害する（１９）。ここで、両阻害剤が、概して細胞死とは独立しているが、Ｇ１遅延または停止に関連する形質転換細胞の増殖を低下させることを示している。これに付随して、ＲＴ阻害剤は、形質転換細胞の形態的分化を誘発する。長い治療時間（１２０日）を必要とするテロメラーゼ関連ＲＴ（ＴＥＲＴ）の阻害剤によって引き起こされた表現型の変化とは異なり、分化の誘発は迅速である（３１）。更に、老化細胞に特有のアクチンストレス繊維または焦点接着部位の再編成は認められなかった。老化特異的変異の不在および分化の迅速な誘発は、ここで使用されるＲＴ阻害剤がＴＥＲＴを標的とせず、老化ではなく低増殖性分化表現型を誘発することを示している。
【０１１４】
特に驚くべきことは、ＲＴ阻害効果の特異性が、ヒト細胞において高度に発現される６個のＬＩＮＥ−１レトロポゾンのサブグループを標的とするＲＮＡｉ実験において証明され、レトロ転位能全体の８４％を示すことであった（２１）。特に、ＲＮＡｉがＡ−３７５細胞におけるＬＩＮＥ−１由来ＯＲＦ１およびＯＲＦ２の発現をおよそ８０％低下させることが判明し、これは、生物学的に活性なＬＩＮＥ−１サブグループが効果的に下方制御されたことを示唆している。ＲＮＡｉによって誘発されるＲＴコードＬＩＮＥ−１因子の変化は、薬理学的ＲＴ阻害剤により引き起こされる変化と区別できず、これは、ＬＩＮＥ−１が細胞増殖および分化の制御に関与していることを暗示している。独立した手法で観察された表現型の類似性は、ＬＩＮＥ−１発現またはＲＴ活性の阻害が増殖を遅延させ、分化を促進するのに十分であることを示している。これらの観察によれば、薬剤のいかなる未知の副作用も、非特異的に観察された表現型の一因にはあたらないことを示している。
【０１１５】
増殖の低下および分化形態の誘発と一致して、選択された遺伝子パネルの発現がＲＴ阻害に反応して再プログラミングされることが判明した。これは、ＲＴ活性が、増殖度が高い形質転換した表現型から増殖度が低い分化した表現型への遷移を促進する遺伝子の発現を効果的に調節できることを示しており、これは、ゲノム機能がＲＴ活性の医薬的またはＲＮＡｉ依存性阻害の究極的な標的であることを示唆している。しかしながら、遺伝子発現における変化は、細胞分裂中に継承されるものではなく、ＲＴ阻害を解除すると回復する。試験した特徴の可逆性および阻害剤の存在に対するそれらの依存性は、ＬＩＮＥ−１コードＲＴが遺伝子発現を調節する後成的機構の一部であり、細胞増殖および分化の基礎となる分子機構において役割を果たすという概念と一致している。
【０１１６】
この研究の１つの態様は、４つのヒト異種移植片モデルをｉｎ ｖｉｖｏで接種したヌードマウスにおいて腫瘍増殖を低下させるというＲＴ阻害剤の能力にある。細胞系において観察されるように、動物に対してＲＴ阻害剤が供給されている限り、腫瘍増殖は阻害され、処理が中断されると再開された。このデータは、癌治療におけるＲＴ阻害剤の有望な細胞増殖抑制能力を例証しているが、腫瘍増殖における内因性ＲＴの後成的役割を確認するものである。更に、ＰＣ３前立腺癌細胞のエファビレンツによるｉｎ ｖｉｔｒｏ事前処理は、それらの腫瘍形成をｉｎ ｖｉｖｏで減衰させる。故に、ＲＴ阻害に関連する分化マーカーの活性化と増殖の低下は、形質転換細胞の悪性表現型をｉｎ ｖｉｖｏで減衰させることができる大規模な再プログラミングの一部である。
【０１１７】
増えつつあるデータは、後成的変化が、腫瘍細胞を再プログラムし、かつ、形質転換された表現型を「標準の」非病理学的状態に転換することができることを示している（３２，３３）。後成的再プログラミングは、元来、多様な腫瘍における悪性形質転換の原因となる遺伝子変化を回避することができる（３２）。故に、後成的な調節因子は、腫瘍治療において貴重な価値ある標的と見なされている（３４）。しかしながら、多くの試験化合物は、一般には毒性であり、かつ／または化学的に不安定であることが判明している。ネビラピンおよびエファビレンツは、長年ＡＩＤＳ治療に用いられてきた。これらのＲＴ阻害剤が連続投与に対して一般に良好な耐性を有することを示す疫学的記録に鑑みると、当該阻害剤を使用するという展望は明白な利点を有する。更に、後成的証拠は、カポジ肉腫（３５）および他のＡＩＤＳ関連癌（３６）の発生が、高度に活性な抗レトロウイルス療法（ＨＡＡＲＴ）で治療した患者において低下することを示している。これは、一般的には、治療した患者において免疫反応が向上したことの表れとして見なされるが、それはまた、腫瘍細胞における内因性ＲＴ活性に対するＨＡＡＲＴの直接的な阻害効果を示唆している。
【０１１８】
この段階では、ＲＴ活性が細胞の運命を指示できる機構は依然として不明確である。レトロポゾンは、分裂酵母におけるヘテロクロマチン形成に寄与し得る（３７）。このような機構はより高等な真核生物においては立証されなかったが、研究所内での研究は、ＬＩＮＥ−１コードＲＴが、ＤＮＡメチル化の再分布およびクロマチン再構築に依存する遺伝子発現の調節に関与する。
【０１１９】
合成の際、内因性ＲＴは、高い増殖および分化の欠損と関連する細胞機構の「機能的な」マーカーとして出現し、癌治療の新規な潜在的標的と見なすことができる。データは、特に前立腺癌について奨励しており、ＡＲ発現の欠損がホルモン療法失敗の主な原因である。ＲＴ阻害剤はＡＲおよびＰＳＡ遺伝子の両方を上方制御するので、これらの分化誘発化合物は、前立腺癌細胞におけるアンドロゲン感受性を回復するのに有用であろう。
【０１２０】
実施例２
Ａ）ＬＩＮＥ−１標的ｓｉＲＮＡを発現するＤＮＡ構築物のクローニング
ｓｉＲＮＡ標的配列は、ヒト細胞において高度に活性であることが知られているＬＩＮＥ−１因子に由来していた（Brouha et al., 2003, supplementary material）。標的配列は６０ｂｐ長（１４９２〜１５５２）であって、配列番号３５で表され、二本鎖ＤＮＡとして人工的に合成された。次いで、市販のベクターｐＳｕｐｅｒ．ｒｅｔｒｏ．ｎｅｏ＋ＧＦＰにおいて、ＤＮＡオリゴヌクレオチドをクローニングした（OligoEngine, USA, cat.#VEC-PRT-0006）。
【０１２１】
Ｂ）レトロウイルスベクターの組立て
次に、レトロウイルス産生Ｐｈｉ−ＮＸ細胞（ＡＴＣＣから入手）内で構築物をトランスフェクトし、新たに合成したレトロウイルス粒子内にパッケージし、細胞から培地内へ自然発生的に放出させた。トランスフェクションから４８時間後、レトロウイルス粒子（ｐＳ−Ｌ１ｉと呼ぶ）を遠心分離によって収集し、０．４５マイクロメートルのＭｉｌｌｉｐｏｒｅフィルタを用いて濾過し、細胞感染に使用した。このプロトコルは、製造業者の推奨（OligoEngine）に従って行った。
【０１２２】
Ｃ）ヒト発癌性細胞系の感染
トランスフェクト細胞の上澄みと、細胞培養物とを単純に混合し、２４時間インキュベーションすることによって、Ａ３７５（黒色腫）およびＰＣ３（前立腺癌）ヒト細胞系をｐＳ−Ｌｌｉに感染させた。次いで、ネオマイシンの存在下、７日間トランスフェクト細胞を選択した。全てのネオ耐性細胞がＧＦＰレポーター遺伝子の発現に対して陽性であることが判明した。対照として、同じ細胞系からの平行培養物を、ｓｉＲＮＡコード配列を持たない空のＤＮＡベクター（ｐＳ）を含有するレトロウイルス粒子に感染させた。
【０１２３】
図７に示すように、ｐＳ−Ｌ１に感染した細胞は、劇的な増殖の低下を呈し、これは少なくとも３９日間一定のままであった。非感染細胞は、高い増殖率を維持し、ｐＳ感染細胞は、感染から最初の数日は穏やかな増殖の低下を示したが、次いで、非感染細胞に匹敵する高い増殖率まで急速に戻った。
【０１２４】
これらデータとよく相関して、特異的抗体を用いたウエスタンブロット分析（データ示さず）によって明らかになるように、ＬＩＮＥ−１（ＯＲＦ１およびＯＲＦ２の両方）の発現は、ｐＳ感染細胞以外のｐＳ−Ｌ１において、ＲＮＡレベルおよびタンパク質レベルの両方において強力に下方調整された。
【０１２５】
Ｄ）ｐＳ−Ｌ１感染Ａ３７５細胞は、ヌードマウスにおける接種により、ｉｎ ｖｉｖｏアッセイにおいて測定されるような腫瘍形成の低下を示す
ｐＳ−Ｌｌｉ細胞の腫瘍形成能が影響を受けたかどうかを評価するために、ｐＳベクターまたはＬＩＮＥ−１ノックアウトｐＳ−Ｌ１ｉ構築物に感染させた５×１０６ Ａ３７５細胞を、２群の無胸腺ヌードマウスに皮内接種した（感染から１５日後）。次いで、両マウス群において腫瘍の進行をモニタリングした。図８のパネルＡは、Ａ３７５ ｐＳおよびＡ３７５ ｐＳ−Ｌ１ｉ細胞を接種されたマウスにおける腫瘍増殖の進行を示している。パネルＢにおける例は、対照細胞を接種されたマウスと比べて、ＬＩＮＥ−１感染細胞を接種されたマウスでは腫瘍の増殖が著しく低下したことを示している。
【０１２６】
共に、これらの結果は、ＬＩＮＥ１遺伝子活性が、形質転換細胞の増殖に寄与し、遺伝子癌治療における新規な潜在的標的と見なされ得るという結論を支持するものである。
【０１２７】
故に、遺伝子治療による本発明の開発を改良するために、以下の２つの改良が、記載される方法に導入されている：
【０１２８】
ｉ）二本鎖リボオリゴヌクレオチドは、細胞トランスフェクションのために遊離形態では使用されず、特異的ｓｉＲＮＡをコードするＤＮＡ構築物によって担持される。転写ＲＮＡは、細胞の「ｄｉｃｅｒ」システムによって更に自然発生的に加工される二本鎖パリンドローム構造を形成し、それによりｓｉＲＮＡ分子を形成する（Brummelkamp et al., 2002, reference 38）。
【０１２９】
ｉｉ）標準的な細胞トランスフェクション手順を、レトロウイルスまたはアデノウイルス起源の適切な送達システムに置き換える必要がある。
【０１３０】
換言すると、本方法の改良は、腫瘍に感染させるのに使用されるＬＩＮＥ−１標的ｓｉＲＮＡを発現するウイルスベクターの開発にある。ＬＩＮＥ−１標的ｓｉＲＮＡ発現構築物は、ウイルスベクターによって発癌性細胞に送達され、それにより内因性ＬＩＮＥ−１の発現を阻害する。これまでの経験に基づけば、このようにして得られたＬＩＮＥ−１の構成的な機能的ノックアウトは、腫瘍の進行に対して強く拮抗する。
【０１３１】
参考文献
【表１】
【０１３２】
Ｌ１ＲＰに関する追加情報：
ＮＣＢＩアクセッション番号ＡＦ１４８８５６、http://www.ncbi.nig.gov/entrez/viewer.fcgi?db=nucleotide&val=5070620で入手可能および以下に記載：
【表２】
【０１３３】
重要な配列
【化１】
【図面の簡単な説明】
【０１３４】
【図１】抗ＲＴ薬剤による増殖阻害。（Ａ）ＤＭＳＯ（対照）、ネビラピン（ＮＥＶ）およびエファビレンツ（ＥＦＶ）で処理した培養物における細胞の増殖。細胞をカウントし、９６時間毎に５周期の間、再プレーティングした。次いで、阻害剤を含まない培地内で細胞を培養した（２周期）。次いで、ＲＴ阻害剤を２周期の間再び添加した。細胞の数は対照（１００％とする）の％で表される。値は、３つの実験から蓄積したデータである。（Ｂ）９６時間周期を４回行う間および薬剤除去後の、ＲＴ阻害剤の存在下での細胞周期プロファイル。
【図２】ＲＴ阻害剤は黒色腫細胞における形態的分化を誘発する。 （Ａ）ＤＭＳＯ（ａ，ｂ，ｃ）、ネビラピン（ｄ，ｅ，ｆ）またはエファビレンツ（ｇ，ｈ，ｉ）において培養されたＡ−３７５細胞系。Ｗｒｉｇｈｔ Ｇｉｅｍｓａ染色後に位相差顕微鏡によって（左欄）、ＳＥＭによって（中欄）、およびα−チューブリン染色（緑）および核のＰＩ染色（赤）後に共焦点顕微鏡によって（右欄）、培養物を観察した。 （Ｂ）黒色腫由来ＴＶＭ−Ａ１２一次細胞。位相差顕微鏡（左欄）、ＳＥＭ（中欄）および共焦点顕微鏡（右欄）下で観察したＤＭＳＯ（ａ，ｂ，ｃ）およびネビラピン処理（ｄ，ｅ，ｆ）細胞。バー：２０μｍ。
【図３】ＲＴ阻害剤はＡ−３７５（パネルＡ）およびＰＣ３（パネルＢ）細胞系における遺伝子発現を調節する。 ＤＭＳＯ（ｃｔｒ）、ネビラピン（ｎｅｖ）またはエファビレンツ（ｅｆｖ）で処理した細胞からＲＮＡを抽出し、ネビラピン（ｎｅｖ／ｒ）またはエファビレンツ（ｅｆｖ／ｒ）を除去した後、当該ＲＮＡをＲＴ−ＰＣＲによって増幅し、ブロットし、内部オリゴヌクレオチドでハイブリダイズした。ＧＡＰＤＨを内部標準として使用した。
【図４】ＬＩＮＥ−１に対するＲＮＡｉは、Ａ−３７５細胞において形態的分化を誘発し、増殖を低下させ、かつ遺伝子発現を調節する。 （Ａ）全長ＬＩＮＥ−１因子の構造。ｓｉＲＮＡオリゴヌクレオチドの位置が示されている。矢印は、ＲＴ−ＰＣＲ分析に使用するプライマー対の位置を示している。 （Ｂ）対照（ＣＴＲ）およびＬＩＮＥ−１ ｓｉＲＮＡオリゴヌクレオチド（ＬＩ−ｉ）でトランスフェクトしたＡ−３７５培養物の位相差顕微鏡図。 （Ｃ）ＣＴＲおよびＬＩ−ｉオリゴヌクレオチドでのトランスフェクション後の細胞増殖。 （Ｄ）ＣＴＲおよびＬＩ−ｉオリゴヌクレオチドでトラスフェクトしたＡ−３７５細胞からのＲＮＡの半定量的ＲＴ−ＰＣＲ後の遺伝子発現パターンを例証している。定量的変動（ＣＴＲトランスフェクト培養物内のシグナルに対するＬ１−ｉ内のシグナルの％として表される）は、独立した３つの実験からの平均を表している。増幅産物は、帯域のデンシトメトリーによって推定し、同実験におけるＧＡＰＤＨシグナルに対して標準化した。
【図５】エファビレンツはヌードマウスにおけるヒト腫瘍増殖を低下させる。 示した細胞系により形成される腫瘍の増殖を、未処理動物（赤）および接種後１日目（紫）または１週間目（黄）にエファビレンツで処理した動物においてモニタリングした。ＰＣ３およびＨＴ２９における上から２つの曲線は、処理済動物におけるＰＣ３およびＨ６９由来腫瘍の増殖が接種後１日目から開始し、１４日後に処理が中止されたことを示している。曲線は、５種の動物群における腫瘍サイズの平均値を示す。
【図６】エファビレンツで事前処理したＰＣ３細胞の腫瘍形成の低下。 （Ａ）処理しなかったか、またはｉｎ ｖｉｖｏでエファビレンツで事前処理したマウスに注入した未処理細胞またはエファビレンツ事前処理細胞によって形成された腫瘍の増殖。 （Ｂ）示した処理を３０日間行った後のＰＣ３由来異種移植片の結果（ｎ＝２０種の動物／群）。
【図７Ａ】ｐＳ−Ｌ１感染細胞の増殖は劇的に低下する。 ｐＳ−Ｌ１感染細胞はＡ３７５ｐＳ−ｌ１として示されている。増殖は、少なくとも３９日間一定のままであった。非感染細胞（Ａ３７５、図７Ａ）は、高い増殖率を維持し、ｐＳ感染細胞（Ａ３７５ｐＳ、図７Ｂ）は、感染してから最初の数日は中程度の増殖の低下を示したが、その後、非感染細胞と同程度の高い増殖を迅速に再開した。
【図７Ｂ】ｐＳ−Ｌ１感染細胞の増殖は劇的に低下する。 ｐＳ−Ｌ１感染細胞はＡ３７５ｐＳ−ｌ１として示されている。増殖は、少なくとも３９日間一定のままであった。非感染細胞（Ａ３７５、図７Ａ）は、高い増殖率を維持し、ｐＳ感染細胞（Ａ３７５ｐＳ、図７Ｂ）は、感染してから最初の数日は中程度の増殖の低下を示したが、その後、非感染細胞と同程度の高い増殖を迅速に再開した。
【図８】ＬＩＮＥ１感染細胞を接種されたマウスにおける腫瘍増殖は、対照と比較して著しく低減された。 パネルＡは、Ａ３７５ｐＳおよびＡ３７５ ｐＳ−Ｌ１ｉ細胞を接種されたマウスにおける腫瘍増殖の進行度を示す。パネルＢにおける例は、ＬＩＮＥ１干渉細胞を接種されたマウスにおける腫瘍増殖が、対照細胞を接種されたマウスと比較して著しく低減されたことを示している。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
癌性組織の未分化増殖を阻害するためのＲＮＡ干渉の使用であって、該ＲＮＡが少なくとも１つのＬＩＮＥ−１（Ｌ１）反復因子の一部分を認識するものである、使用。
【請求項２】
癌性病変の治療におけるＲＮＡ干渉の使用であって、該ＲＮＡが少なくとも１つのＬＩＮＥ−１（Ｌ１）反復因子の一部分を認識するものである、使用。
【請求項３】
請求項１または２に定義される、ＲＮＡｉ。
【請求項４】
ＬＩＮＥ−１ファミリーメンバーの転写オープンリーティングフレームに対して特異的である、請求項３に記載のＲＮＡｉ。
【請求項５】
前記オープンリーディングフレームが逆転写酵素をコードするものである、請求項４に記載のＲＮＡｉ。
【請求項６】
前記Ｌ１因子が活性Ｌ１因子である、請求項３〜５のいずれか一項に記載のＲＮＡｉ。
【請求項７】
ＬＩＮＥ−１コンセンサス配列に対して特異的である、請求項３〜６のいずれか一項に記載のＲＮＡｉ。
【請求項８】
前記ＲＮＡが短鎖干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）である、請求項３〜７のいずれか一項に記載のＲＮＡｉ。
【請求項９】
前記ＲＮＡが二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）である、請求項３〜７のいずれか一項に記載のＲＮＡｉ。
【請求項１０】
前記ＲＮＡが短鎖ヘアピンＲＮＡであり、ｓｉＲＮＡ発現ベクターによる投与に適合するものである、請求項３〜７のいずれか一項に記載のＲＮＡｉ。
【請求項１１】
前記ＲＮＡｉ配列が、標的Ｌ１内に含まれるＯＲＦからの転写により得られるＲＮＡを認識し、かつ該ＲＮＡに結合することができるものである、請求項３〜１０のいずれか一項に記載のＲＮＡｉ。
【請求項１２】
前記ＲＮＡｉの結合が、５０％ホルムアミドおよび６×ＳＳＣを含有する緩衝液中などのストリンジェント条件下でなされるものである、請求項１１に記載のＲＮＡｉ。
【請求項１３】
前記ＲＮＡｉによって認識される前記Ｌ１配列が、ＯＲＦの少なくとも一部分を含んでなるものである、請求項３〜１１のいずれか一項に記載のＲＮＡｉ。
【請求項１４】
前記Ｌ１ ＯＲＦ配列が、配列番号２０〜２５またはそれらに相当するＤＮＡ配列のいずれかである、請求項１３に記載のＲＮＡｉ。
【請求項１５】
配列番号３９〜４４のいずれか１つからの少なくとも２０個の連続するヌクレオチドを含んでなる、請求項３〜１４のいずれか一項に記載のＲＮＡｉ。
【請求項１６】
配列番号２７の９０７位〜１９２３位および／または配列番号２７の１９８７位〜５８１４位に含まれるＤＮＡを対象とするものである、請求項３〜１５のいずれか一項に記載のＲＮＡｉ。
【請求項１７】
配列番号４５および／または配列番号４６に従ったタンパク質の発現を阻害することができるものである、請求項１６に記載のＲＮＡｉ。
【請求項１８】
配列番号４５および／または配列番号４６に従ったタンパク質をコードするＲＮＡ配列に相当するＲＮＡの伸張部を含んでなる、請求項１７に記載のＲＮＡｉ。
【請求項１９】
配列番号４５および／または配列番号４６に従ったタンパク質をコードするＲＮＡ配列に相当するＲＮＡの２０または２１ｂｐの伸張部からなるものである、請求項１８に記載のＲＮＡｉ。
【請求項２０】
配列番号１９の配列またはそのＲＮＡ等価物（配列番号４７）を有するものである、請求項１８または１９に記載のＲＮＡｉ。
【請求項２１】
前記少なくとも１つのＬ１が、多型および／または６ｋｂｐ長である、請求項３〜２０のいずれか一項に記載のＲＮＡｉ。
【請求項２２】
前記少なくとも１つのＬ１が、ヒトにおいて高度に活性である「ホットＬ１」であり、Ｌ１ＲＰ（配列番号２７）の活性の少なくとも１／３を有するものである、請求項３〜２１のいずれか一項に記載のＲＮＡｉ。
【請求項２３】
前記少なくとも１つのＬ１配列が、配列番号３５〜３８、またはこれらの配列に対して少なくとも７０％の配列相同性を有する相同体、またはその相当するＤＮＡ配列からなる群から選択されるものである、請求項３〜２２のいずれか一項に記載のＲＮＡｉ。
【請求項２４】
前記少なくとも１つのＬＩＮＥ−１因子が、Ｌ１因子の「転写群Ａ」（Ｔａ）サブセット、またはプレ−Ｔａサブセットに由来するものである、請求項３〜２３のいずれか一項に記載のＲＮＡｉ。
【請求項２５】
前記少なくとも１つのＬ１が、ＬＲＥ３、Ｌ１ＲＰ（ＮＣＢＩアクセッション番号ＡＦ１４８８５６）、ならびにアクセッション番号ａｃ００４２００、ａｃ００２９８０、ａｌ３５６４３８、ａｌ５１２４２８、ａｃ０２１０１７およびａｌ１３７８４５（それぞれ配列番号２６〜３３）からなる群から選択されるものである、請求項２４に記載のＲＮＡｉ。
【請求項２６】
前記少なくとも１つのＬ１がＬ１ＲＰ（配列番号２７）である、請求項２５に記載のＲＮＡｉ。
【請求項２７】
前記発現ベクターが、前記ｓｉＲＮＡをコードするＤＮＡ構築物を含んでなるレトロウイルスまたはアデノウイルス起源のものである、請求項１０に記載のＲＮＡｉ。
【請求項２８】
前記発現ベクターが、前記ｓｉＲＮＡをコードするＤＮＡ構築物を含んでなるプラスミドである、請求項１０に記載のＲＮＡｉ。
【請求項２９】
癌または腫瘍を有する患者を治療する方法であって、請求項３〜２８のいずれか一項に記載の、少なくとも１つのＬ１因子に対するＲＮＡ干渉の利用を含んでなる、方法。
【請求項３０】
癌性疾患を治療するための医薬の製造における、少なくとも１つのＬＩＮＥ−１因子の一部分を標的とするか、またはこれを認識することができるｓｉＲＮＡをコードするポリヌクレオチド配列の使用。
【請求項３１】
配列番号１９の配列、またはそのＲＮＡ等価物（配列番号４７）を有する、ＲＮＡｉ。
【請求項１】
癌性組織の未分化増殖を阻害するためのＲＮＡ干渉の使用であって、該ＲＮＡが少なくとも１つのＬＩＮＥ−１（Ｌ１）反復因子の一部分を認識するものである、使用。
【請求項２】
癌性病変の治療におけるＲＮＡ干渉の使用であって、該ＲＮＡが少なくとも１つのＬＩＮＥ−１（Ｌ１）反復因子の一部分を認識するものである、使用。
【請求項３】
請求項１または２に定義される、ＲＮＡｉ。
【請求項４】
ＬＩＮＥ−１ファミリーメンバーの転写オープンリーティングフレームに対して特異的である、請求項３に記載のＲＮＡｉ。
【請求項５】
前記オープンリーディングフレームが逆転写酵素をコードするものである、請求項４に記載のＲＮＡｉ。
【請求項６】
前記Ｌ１因子が活性Ｌ１因子である、請求項３〜５のいずれか一項に記載のＲＮＡｉ。
【請求項７】
ＬＩＮＥ−１コンセンサス配列に対して特異的である、請求項３〜６のいずれか一項に記載のＲＮＡｉ。
【請求項８】
前記ＲＮＡが短鎖干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）である、請求項３〜７のいずれか一項に記載のＲＮＡｉ。
【請求項９】
前記ＲＮＡが二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）である、請求項３〜７のいずれか一項に記載のＲＮＡｉ。
【請求項１０】
前記ＲＮＡが短鎖ヘアピンＲＮＡであり、ｓｉＲＮＡ発現ベクターによる投与に適合するものである、請求項３〜７のいずれか一項に記載のＲＮＡｉ。
【請求項１１】
前記ＲＮＡｉ配列が、標的Ｌ１内に含まれるＯＲＦからの転写により得られるＲＮＡを認識し、かつ該ＲＮＡに結合することができるものである、請求項３〜１０のいずれか一項に記載のＲＮＡｉ。
【請求項１２】
前記ＲＮＡｉの結合が、５０％ホルムアミドおよび６×ＳＳＣを含有する緩衝液中などのストリンジェント条件下でなされるものである、請求項１１に記載のＲＮＡｉ。
【請求項１３】
前記ＲＮＡｉによって認識される前記Ｌ１配列が、ＯＲＦの少なくとも一部分を含んでなるものである、請求項３〜１１のいずれか一項に記載のＲＮＡｉ。
【請求項１４】
前記Ｌ１ ＯＲＦ配列が、配列番号２０〜２５またはそれらに相当するＤＮＡ配列のいずれかである、請求項１３に記載のＲＮＡｉ。
【請求項１５】
配列番号３９〜４４のいずれか１つからの少なくとも２０個の連続するヌクレオチドを含んでなる、請求項３〜１４のいずれか一項に記載のＲＮＡｉ。
【請求項１６】
配列番号２７の９０７位〜１９２３位および／または配列番号２７の１９８７位〜５８１４位に含まれるＤＮＡを対象とするものである、請求項３〜１５のいずれか一項に記載のＲＮＡｉ。
【請求項１７】
配列番号４５および／または配列番号４６に従ったタンパク質の発現を阻害することができるものである、請求項１６に記載のＲＮＡｉ。
【請求項１８】
配列番号４５および／または配列番号４６に従ったタンパク質をコードするＲＮＡ配列に相当するＲＮＡの伸張部を含んでなる、請求項１７に記載のＲＮＡｉ。
【請求項１９】
配列番号４５および／または配列番号４６に従ったタンパク質をコードするＲＮＡ配列に相当するＲＮＡの２０または２１ｂｐの伸張部からなるものである、請求項１８に記載のＲＮＡｉ。
【請求項２０】
配列番号１９の配列またはそのＲＮＡ等価物（配列番号４７）を有するものである、請求項１８または１９に記載のＲＮＡｉ。
【請求項２１】
前記少なくとも１つのＬ１が、多型および／または６ｋｂｐ長である、請求項３〜２０のいずれか一項に記載のＲＮＡｉ。
【請求項２２】
前記少なくとも１つのＬ１が、ヒトにおいて高度に活性である「ホットＬ１」であり、Ｌ１ＲＰ（配列番号２７）の活性の少なくとも１／３を有するものである、請求項３〜２１のいずれか一項に記載のＲＮＡｉ。
【請求項２３】
前記少なくとも１つのＬ１配列が、配列番号３５〜３８、またはこれらの配列に対して少なくとも７０％の配列相同性を有する相同体、またはその相当するＤＮＡ配列からなる群から選択されるものである、請求項３〜２２のいずれか一項に記載のＲＮＡｉ。
【請求項２４】
前記少なくとも１つのＬＩＮＥ−１因子が、Ｌ１因子の「転写群Ａ」（Ｔａ）サブセット、またはプレ−Ｔａサブセットに由来するものである、請求項３〜２３のいずれか一項に記載のＲＮＡｉ。
【請求項２５】
前記少なくとも１つのＬ１が、ＬＲＥ３、Ｌ１ＲＰ（ＮＣＢＩアクセッション番号ＡＦ１４８８５６）、ならびにアクセッション番号ａｃ００４２００、ａｃ００２９８０、ａｌ３５６４３８、ａｌ５１２４２８、ａｃ０２１０１７およびａｌ１３７８４５（それぞれ配列番号２６〜３３）からなる群から選択されるものである、請求項２４に記載のＲＮＡｉ。
【請求項２６】
前記少なくとも１つのＬ１がＬ１ＲＰ（配列番号２７）である、請求項２５に記載のＲＮＡｉ。
【請求項２７】
前記発現ベクターが、前記ｓｉＲＮＡをコードするＤＮＡ構築物を含んでなるレトロウイルスまたはアデノウイルス起源のものである、請求項１０に記載のＲＮＡｉ。
【請求項２８】
前記発現ベクターが、前記ｓｉＲＮＡをコードするＤＮＡ構築物を含んでなるプラスミドである、請求項１０に記載のＲＮＡｉ。
【請求項２９】
癌または腫瘍を有する患者を治療する方法であって、請求項３〜２８のいずれか一項に記載の、少なくとも１つのＬ１因子に対するＲＮＡ干渉の利用を含んでなる、方法。
【請求項３０】
癌性疾患を治療するための医薬の製造における、少なくとも１つのＬＩＮＥ−１因子の一部分を標的とするか、またはこれを認識することができるｓｉＲＮＡをコードするポリヌクレオチド配列の使用。
【請求項３１】
配列番号１９の配列、またはそのＲＮＡ等価物（配列番号４７）を有する、ＲＮＡｉ。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７Ａ】
【図７Ｂ】
【図８】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７Ａ】
【図７Ｂ】
【図８】
【公表番号】特表２００８−５２６７１０（Ｐ２００８−５２６７１０Ａ）
【公表日】平成２０年７月２４日（２００８．７．２４）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００７−５４８７７５（Ｐ２００７−５４８７７５）
【出願日】平成１７年１２月３０日（２００５．１２．３０）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＥＰ２００５／０１４２０６
【国際公開番号】ＷＯ２００６／０６９８１２
【国際公開日】平成１８年７月６日（２００６．７．６）
【出願人】（５０６１１９１３２）
【出願人】（５０７２２３５３５）
【氏名又は名称原語表記】ＥＮＲＩＣＯ ＧＡＲＡＣＩ
【出願人】（５０７２２３５４６）
【氏名又は名称原語表記】ＰＡＯＬＡ ＳＩＮＩＢＡＬＤＩ
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２０年７月２４日（２００８．７．２４）
【国際特許分類】
【出願日】平成１７年１２月３０日（２００５．１２．３０）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＥＰ２００５／０１４２０６
【国際公開番号】ＷＯ２００６／０６９８１２
【国際公開日】平成１８年７月６日（２００６．７．６）
【出願人】（５０６１１９１３２）
【出願人】（５０７２２３５３５）
【氏名又は名称原語表記】ＥＮＲＩＣＯ ＧＡＲＡＣＩ
【出願人】（５０７２２３５４６）
【氏名又は名称原語表記】ＰＡＯＬＡ ＳＩＮＩＢＡＬＤＩ
【Ｆターム（参考）】
[ Back to top ]