本発明は、ウイルスにより不死化させた肝細胞の細胞系、及び他の真核細胞による治療用血漿タンパク質を含めたタンパク質の生成、並びにスクリーニング及び治療用のこのようなタンパク質の使用、並びにタンパク質の遺伝情報を保有する核酸、ベクター、及び形質転換又はトランスフェクトされた細胞に関する。

【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願
本出願は、参照によってその全体が本明細書に組み込まれる、２００３年１０月１０日に出願された米国仮出願第６０／５１０，５０９号の特典を主張するものである。
【０００２】
政府の助成金
本発明は、米国特許商標庁の先端技術プログラムによって授与された助成金番号７０−ＮＡＮＢ７Ｈ３０７０で米国政府の支援によって、及びＮＩＨ中小企業経営革新支援機関の助成金からの支援（助成金番号：Ｒ１４３ＧＭ６６４８０−０１）によって部分的になされた。米国政府は、本発明において一定の権利を有する。
【０００３】
本発明は、肝細胞によって活性形で発現され得る、タンパク質、特に治療用血漿タンパク質（ＴＰＰ）を含めた治療用タンパク質を生成するための細胞系、特にウイルスにより不死化させた正常なヒト細胞系の使用、並びに肝臓及び他の臓器に影響を与える疾患及び状態を治療するための、肝細胞によって生成されるタンパク質、治療用タンパク質、及び特に血漿タンパク質の使用に関する。
【背景技術】
【０００４】
新規な治療用タンパク質の安全且つ有効な生産は、ヒトゲノムプロジェクトが近年完了したこと、及びプロテオミクスの分野における急速な技術の進展によって刺激される、生物薬剤産業の拡大する市場を表す。Ｐａｕｌａｕｓ、Ａ．、「ゲノミクス及びプロテオミクス時代の薬剤開発の再設計（Ｔｈｅ ｒｅｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ｏｆ ｄｒｕｇ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｉｎ ｔｈｅ ｇｅｎｏｍｉｃｓ ａｎｄ ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ ｅｒａ）」Ａｍ Ｃｌｉｎｉｃａｌ ｌａｂ、２００１．５：ｐ．５５〜５７。
【０００５】
これらの治療用タンパク質の多くは、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞及び他の非ヒト細胞型において組換え技術によって大量生産されるが、治療上有効なタンパク質の本来の形を使用することによって、複合異種タンパク質の商業化がうまく行われる場合が存在する。このようなタンパク質が多数の遺伝子の産物であり、生成するタンパク質が翻訳後十分にプロセシングされるとき、これは特に当てはまる。ヒト生産者細胞中で発現及びプロセシングされる本来の形のタンパク質又は組換え形のタンパク質を単離することによって、これを行うことができることになる。
【０００６】
さらに、細胞系システムによる治療用血漿タンパク質（ＴＰＰ）の生成によって、その最も顕著なものはウイルス汚染である、血液由来製剤の危険が回避されると思われる。正しく処理すると、血液由来製剤はウイルス感染の伝播はほとんどないが、感知される危険は製造者、ユーザー、及び患者に存在する。実際、新たな系統のヒト免疫不全ウイルス及び狂牛病など伝達性海綿状脳症の原因である物質の近年の発見は、血液由来製剤に関する果てしない関心を示す。Ｃｏｌｌｉｎｇｅ、Ｊら、「プリオン系統変異及び新たな変異体ＣＪＤの病因の分子学的分析。ネイチャー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆｐｒｉｏｎ ｓｔｒａｉｎ ｖａｒｉａｔｉｏｎ ａｎｄ ｔｈｅ ａｅｔｉｏｌｏｇｙ ｏｆ’ｎｅｗ ｖａｒｉａｎｔ’ＣＪＤ．Ｎａｔｕｒｅ）」、１９９６．３８３（６６０２）：ｐ．６８５〜９０。
【０００７】
治療用薬剤としての組換えタンパク質の制約。
現在、臨床及び治療用途に関して承認されている多くのタンパク質は、モノクローナル抗体以外、組換えタンパク質技術によって大量生産されている。これらの製品は安全且つ有効であることが証明されてきているが、それらの全てがその本来の相当物と同一に働くわけではない。例えば、組換え型因子血液凝固因子（ｒＦ）ＶＩＩＩ及びＩＸは、輸液後にそれらの血漿由来の相当物より迅速にクリアランスされる。Ｓｈａｐｉｒｏ、Ａ．、Ｅ．Ｂｅｒｎｔｏｒｐ、及びＭ．Ｍｏｒｆｉｎｉ、「増大分回収評価、並びに組換え型第ＩＸ因子で治療した以前は未処理であった患者における体重及び年齢の影響。（Ｉｎｃｒｅｍｅｎｔａｌ ｒｅｃｏｖｅｒｙ ａｓｓｅｓｓｍｅｎｔ ａｎｄ ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ｗｅｉｇｈｔ ａｎｄ ａｇｅ ｉｎ ｐｒｅｖｉｏｕｓｌｙ ｕｎｔｒｅａｔｅｄ ｐａｔｉｅｎｔｓ ｔｒｅａｔｅｄ ｗｉｔｈ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｆａｃｔｏｒ ＩＸ．）」、Ｂｌｏｏｄ、２０００．９６（補遺１）：ｐ．２６５ａ。
【０００８】
近年の発見は、これが不完全又は不適切な翻訳後修飾の結果であることを示唆する。米国で使用されている第ＶＩＩＩ因子のβ−ドメイン欠失型の迅速なクリアランスは、リン脂質結合の違いによるものである。対照的に、チロシン１５５における硫酸化及び第ＩＸ因子のセリン１５８のリン酸化の違いは、血液凝固因子のより迅速なクリアランスをもたらす。Ｗｈｉｔｅ、Ｃ．Ｇ．Ｉ．、Ａ．Ｂｅｅｂｅ、及びＢ．Ｎｉｅｌｓｅｎ、「組換え型第ＩＸ因子。血栓止血因子（Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｆａｃｔｏｒ ＩＸ．Ｔｈｒｏｍｂ Ｈａｅｍｏｓｔ）」、１９９７．７８：ｐ．２６１〜２６５。
【０００９】
臨床上、これらの凝固因子のより迅速なクリアランスは、患者群に応じておそらくさらに頻繁で高用量の投薬を意味する。これらの欠点を回避するための１つの戦略は、血漿由来のタンパク質を使用することであるが、この手法と関係がある前述のような感知される危険も存在する。
【００１０】
治療用タンパク質に関する重要な未対処の必要性
血友病Ａ（第ＶＩＩＩ因子欠乏症）及び血友病Ｂ（第ＩＸ因子欠乏症）は、Ｘ連鎖劣性形質として遺伝する出血障害である。したがって、両方共にほぼ全ての男性に影響を与える。血友病Ａと血友病Ｂは、さまざまな程度の臨床的発現がある異種状態である。血友病Ａはより一層一般的であり、米国では５０００〜１０，０００人の男性中１人に発生する。Ｓｏｕｃｉｅ、Ｊ．Ｍ．、Ｂ．Ｅｖａｔｔ、及びＤ．Ｊａｃｋｓｏｎ、「米国における血友病の発生。米国血液学専門誌（Ｈｅｍｏｐｈｉｌｉａ Ｏｃｃｕｒｒｅｎｃｅ ｉｎ ｔｈｅ Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ．Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｈｅｍａｔｏｌｏｇｙ）」、１９９８．５９：ｐ．２８８〜２９４。
【００１１】
対照的に、血友病Ｂの発生率は１０，０００人の男性中０．２５人である。現在、血漿由来で組換え型の第ＶＩＩＩ因子及び第ＩＸ因子濃縮物が、血友病の生涯にわたる治療用に使用されている。世界中の血友病群の４分の３は、このＴＰＰが不足しているために治療をほとんど或いは全く受けていないと推測される。したがって、伝統的な組換え法及び／又は血液由来ＴＰＰの限られた利用性の欠点を克服するための、完全に機能的であり、自然に処理される血液凝固因子に関する明らかな必要性が存在する。
【００１２】
α−１−抗トリプシン（ＡＡＴ）は、その主な生理的標的が好中球エラスターゼであるヒト血液タンパク質である。重度のＡＡＴ欠乏症（遺伝性肺気腫）は、欧州及び米国において約１５０，０００〜２００，０００の個人に影響を与えていると考えられる。Ｄｏｎｏｈｕｅ、Ｔ．Ｍ．ら、「肝臓学における、肝臓による血漿タンパク質の合成及び分泌（Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ａｎｄ ｓｅｃｒｅｔｉｏｎ ｏｆ ｐｌａｓｍａ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｂｙ ｔｈｅ ｌｉｖｅｒ、ｉｎ Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ）」：「肝臓疾患の教本（Ａ Ｔｅｘｔｂｏｏｋ ｏｆ Ｌｉｖｅｒ Ｄｉｓｅａｓｅ）」、Ｄ．Ｚａｋｉｍ及びＴ．Ｄ．Ｂｏｙｅｒ、Ｅｄｉｔｏｒｓ．１９９０、Ｗ．Ｂ．Ｓｏｕｎｄｅｒｓ Ｃｏｍｐａｎｙ：フィラデルフィア．ｐ．１２４〜１３７。ＡＡＴ先天性欠乏症、のう胞性線維症、及び慢性閉塞性肺疾患を含めた多くの呼吸器疾患は、肺中のＡＡＴとエラスターゼの不均衡によって特徴付けられる。エラスターゼは、他のタンパク質中の細胞外マトリクスタンパク質分子エラスチンを加水分解するセリンプロテアーゼである。多量のエラスターゼは、肺上皮の損傷に貢献すると考えられる。
【００１３】
したがって追加のＡＡＴを投与することによって、これらの疾患において肺中のエラスターゼの有害な影響を緩和すると、予想される。
【００１４】
２０００人の子供中約１人が、西半球ではＣＦ遺伝的欠陥を有して生まれている。現在、非常に限られて供給されている、米国で認可されている唯一の血漿由来ＡＡＴが存在する。診断を受ける患者の多くは、したがってＡＡＴ治療を受けていない。一般的な炎症状態を治療するためのＡＡＴの臨床的有効性の多大な証拠にもかかわらず、製品の限られた有用性のために、その使用は制限されてきている。したがって、組換え型又は血液由来ＴＰＰの欠点を克服するための、完全に機能的であり、自然に処理されるＡＡＴに関する明らかな必要性が存在する。
【００１５】
敗血症は、感染に対する過剰な全身性応答によって特徴付けられる疾患であり、臓器不全を早急にもたらし、最終的には死をもたらす可能性がある。敗血症は誰でも襲う可能性があり、肺炎、外傷、外科手術及び火傷などの事象によって、或いは癌又はＡＩＤＳなどの状態によって誘導される可能性がある。ひとたび誘導されると、凝固、欠陥的フィブリン溶解現象（血塊分解）、及び炎症の制御不能なカスケードは、敗血症の進行を助長する。米国では、敗血症は心臓性以外での集中治療部での主な死因であり、全体では１１番目の主な死因である。
【００１６】
毎年、７００，０００を超える敗血症の新たな症例が診断されており、毎日１４００人の人々が重度の敗血のため世界中で亡くなっている。現在、敗血症に関する治療は、根本的な感染を管理するための試み、及び感染が臓器不全をもたらす場合は支持療法に限られている。集中医療にもかかわらず、患者の５０％までが依然この病気で死んでいる。Ｒａｎｇｅｌ−Ｆｒａｕｓｔｏ、Ｍ．Ｓ．ら、「全身性炎症反応症候群（ＳＩＲＳ）の自然な病歴：前向き研究。（Ｔｈｅ ｎａｔｕｒａｌ ｈｉｓｔｏｒｙ ｏｆ ｔｈｅ ｓｙｓｔｅｍｉｃ ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ ｒｅｓｐｏｎｓｅ ｓｙｎｄｒｏｍｅ（ＳＩＲＳ）：ａ ｐｒｏｓｐｅｃｔｉｖｅ ｓｔｕｄｙ．）」ＪＡＭＡ、１９９５．２７３：ｐ．１１７〜１２３。
【００１７】
敗血症を有する患者を治療するために必要な集中的な長期のケアを考慮すると、経済的負担は大きい。数十年間、重度の敗血病を有する患者を治療する内科医は、この疾患と関係がある高い死亡率を低下させることができると思われる、彼らの利用可能な治療用在庫（主に抗生物質）への有効な追加を探してきている。ヒト敗血病において試みられた治療介入の多くは、循環するエンドトキシンが重要な臨床症状発現及び敗血症の罹患率を担うという、前提に基づくものとなっている。実際、何人かの研究者は、ひとたび重度の敗血症の臨床徴候が現れると、不可逆的な臓器の損傷が既に起こっているので、いずれの補助療法も失敗することになると結論付けている。近年、抗凝血活性を有する天然の血漿タンパク質を主成分とする有望な新しいクラスの治療剤が、臨床範囲に出現してきている。重度の敗血症では、凝血システムが活性化される；血管及び組織中の血管内トロンビンの存在、並びに播種性血管内凝固の発生によって明らかな事象。敗血症の活性タンパク質Ｃ（ＡＰＣ）及び抗トロンビンＩＩＩ（ＡＴ−ＩＩＩ）の大規模な多施設第ＩＩＩ相治験は、２００１年初期に実施された。２００１年後期には、Ｅｌｉ Ｌｉｌｌｙが、遺伝子工学処理した型のヒト活性タンパク質Ｃ分子であるＸｉｇｒｉｓを市場に出し始めた；しかしながらこの薬剤は、死の絶対的な危険を６パーセント低下させるだけである。この重度の敗血症のさらに有効な治療に関する明らかな必要性が存在する。
【００１８】
インターα阻害剤タンパク質（ＩαＩｐ）、血漿中で比較的高い濃度で見られる天然セリンプロテアーゼ阻害剤は、炎症、傷の治癒及び癌転移において役割を果たすことが示されてきており、これはＢｏｓｔら、Ｂｏｓｔ、Ｆ、Ｍ．Ｄｉａｒｒａ−Ｍｅｈｒｐｏｕｒ、及びＪ．Ｐ．Ｍａｒｔｉｎ、「インターαトリプシン阻害剤プロテオグリカンファミリー−細胞外マトリクスと結合しそれを安定化させるタンパク質群。（Ｉｎｔｅｒ ａｌｐｈａ−ｔｒｙｐｓｉｎ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ ｐｒｏｔｅｏｇｌｙｃａｎ ｆａｍｉｌｙ−ａ ｇｒｏｕｐ ｏｆ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｂｉｎｄｉｎｇ ａｎｄ ｓｔａｂｉｌｉｚｉｎｇ ｔｈｅ ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ｍａｔｒｉｘ．）」Ｅｕｒ Ｊ Ｂｉｏｃｈｅｍ、１９９８．２５２：ｐ．３３９〜３４６によって総説されている。ＩαＩｐの主な形は、インターα阻害剤（ＩαＩ、ビクニンと呼ばれる１つの軽鎖ペプチド及び２つの重鎖を含む）、及び１つの軽鎖及び１つの重鎖）を含むプレ−α−阻害剤ＰαＩである。ＩαＩでは、２つの重鎖はＨ１及びＨ２と表される。これらは、Ｈ１Ｐ及びＨ２Ｐと表される前駆体から切断される。これらの前駆体は、ＩＴＨ１及びＩＴＨ２と表される遺伝子によってコードされている。ビクニンサブユニットは、二重頭部のＫｕｎｉｔｚ型プロテアーゼ阻害剤である。ビクニンサブユニットは、ＡＭＢＰとして知られＡＭＢＰと表される遺伝子によってコードされているα１ｍ／ビクニン前駆体からの切断によって生成される。ＡＭＢＰ融合タンパク質前駆体の性質及び切断プロセスは、以下でさらに論じる。ＰαＩでは、軽鎖はビクニンであり、重鎖はＨ３であり、Ｈ３Ｐと表される前駆体から切断され、ＩＴＩＨ３と表される遺伝子によってコードされている。ＩαＩとＰαＩの両方が示されるＩαＩｐタンパク質複合体であり、この語は本明細書で使用してＩαＩとＰαＩのいずれか、或いはＩαＩとＰαＩの両方を概略的に指す。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１９】
近年、ヒトＩαＩｐの軽鎖を認識するモノクローナル抗体（モノクローナル抗体６９．３１）が、Ｐｒｏｔｈｅｒａ Ｂｉｏｌｏｇｉｃｓ（Ｐｒｏｖｉｄｅｎｃｅ、Ｒｈｏｄｅ Ｉｓｌａｎｄ）の科学者によって開発された。競合ＥＬＩＳＡにおいてモノクローナル抗体６９．３１を使用して、これらの研究者は、血漿ＩαＩｐレベルは健康な対照と比較して重度の敗血症患者において有意に低下したことを実証した。この低下は死亡率と相関関係にあり、ＩαＩｐが敗血症患者において予想可能な値を有する可能性があることが示唆された。Ｌｉｍ、Ｙ．Ｐら、「インタートリプシン阻害剤：敗血症患者における低い血漿レベル、及び実験敗血症モデルにおけるその有益な影響。（Ｉｎｔｅｒ−ｔｒｙｐｓｉｎ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ：ｄｅｃｒｅａｓｅｄ ｐｌａｓｍａ ｌｅｖｅｌｓ ｉｎ ｓｅｐｔｉｃ ｐａｔｉｅｎｔｓ ａｎｄ ｉｔｓ ｂｅｎｅｆｉｃｉａｌ ｅｆｆｅｃｔｓ ｉｎ ａｎ ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ ｓｅｐｓｉｓ ｍｏｄｅｌ．）」Ｓｈｏｃｋ、２０００．１３（補遺）：ｐ．１６１。盲腸結さつ及び穿刺した多発性微生物性敗血症ラットモデルを使用するｉｎ−ｖｉｖｏ動物試験は、ＩαＩｐを投与することによって生理食塩水対照と比較して生存率の劇的な改善が生じたことを示した。Ｙａｎｇ Ｓ、ら、「ヒトインターα阻害剤を投与することによって血行動態の安定性が保たれ、敗血症の生存率が改善される。（Ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｈｕｍａｎ ｉｎｔｅｒ−ａｌｐｈａ−ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ ｍａｉｎｔａｉｎｓ ｈｅｍａｄｙｎａｍｉｃ ｓｔａｂｉｌｉｔｙ ａｎｄ ｉｍｐｒｏｖｅｓ ｓｕｒｖｉｖａｌ ｄｕｒｉｎｇ ｓｅｐｓｉｓ．）」Ｃｒｉｔ Ｃａｒｅ Ｍｅｄ．２００２ Ｍａｒ；３０（３）：６１７〜２２。一緒に考えると、これらの結果は、重度の敗血症の管理におけるＩαＩｐの治療可能性を強く支持する。ヒト血清又は血漿からＩαＩｐを精製することができるが、有効であることが分かった場合でも、敗血症を治療するためのこのタンパク質の世界的な不足が依然として存在するであろう。十分機能的であり、自然に処理される形のこのＩαＩｐ（例えば、天然に存在するか或いは組換えによって生成する）を生成又は発現させるための手段は現在存在しない。さらに、このタンパク質の複雑さによって、それを活性のあるプロセシングされた形で発現させること、及びそれを活性状態で単離することの困難が増す。
【００２０】
不死化細胞系を記載する幾つかの特許及び公開が存在する：米国特許第６，１０７，０４３号（Ｊａｕｒｅｇｕｉ）；米国特許第５，６６５，５８９号（Ｈａｒｒｉｓ）；米国特許出願第２００２／００４５２６２Ａ１号（Ｐｒａｃｈｕｍｓｒｉ）；及び国際公開第ＷＯ９９／５５８５３号（Ｎａｍｂａ）。しかしながら今日まで、特に従来技術の細胞系は、機能的な治療用血漿タンパク質の生成において重要なグリコシル化などのタンパク質の翻訳後修飾を安全に、効果的に、且つコスト効率よく実施するため；多数の治療用血漿タンパク質、特に第ＶＩＩＩ因子タンパク質又は第ＩＸ因子、及びＩαＩｐを同時に生成するため；並びに無血清培地における活性レベルのシトクロムＰ４５０酵素の連続的発現を維持するための手段を提供していない。
【課題を解決するための手段】
【００２１】
本発明の一態様は、不死化ヒト肝細胞を使用してタンパク質を生成する方法であって、
（１）タンパク質をコードし発現することができるＤＮＡを含む不死化ヒト肝細胞を用意するステップ、
（２）タンパク質をコードする１つ又は複数の遺伝子が、タンパク質が不死化肝細胞中で生成されプロセシングされるように発現されるような条件下で、不死化肝細胞を培養するステップ、及び
（３）不死化肝細胞からプロセシングされたタンパク質を単離するステップを含み、必要な場合プロセシングされグリコシル化されるようにタンパク質を発現させ、したがってそのｉｎ ｖｉｖｏ機能がその単離後実質的に保たれる方法である。
【００２２】
タンパク質はヒト肝細胞によって自然に生成されるタンパク質であってよく、或いはヒト肝細胞によって自然に生成されないタンパク質であってよい。タンパク質は治療用タンパク質であることが好ましい。治療用タンパク質は血漿由来の治療用タンパク質であることがより好ましい。
【００２３】
タンパク質は、ヒト肝細胞によって通常生成されるタンパク質のムテインであってもよい。
【００２４】
タンパク質は、第ＶＩＩＩ因子、第ＩＸ因子、ヒト成長ホルモン（ｈＧＨ）、α−１−抗トリプシン、トランスフェリン、及び増殖因子からなる群から選択される血漿タンパク質などの治療用タンパク質、又はこれらのタンパク質の１つのムテインなどであってよい。
【００２５】
或いはタンパク質は、アルブミン、トランスコバラミンＩＩ、Ｃ−反応性タンパク質、フィブロネクチン、セルロプラスミン、及び構造活性、酵素活性、又は輸送活性を有する他のタンパク質からなる群から選択されるタンパク質、或いはこれらのタンパク質の１つのムテインであってよい。
【００２６】
タンパク質は、肝細胞中に本来存在する遺伝子によって発現されるタンパク質であってよく、この場合タンパク質をコードする本来存在する遺伝子の発現が高レベルのプロモーターを肝細胞中に導入することによって増強される。
【００２７】
或いは、（１）発現させるタンパク質、発現させるタンパク質のサブユニット、又は発現させるタンパク質の前駆体をコードする遺伝子、及び（２）遺伝子の転写に影響を与える少なくとも１つの制御要素であって、遺伝子と動作可能に連結した制御要素を含む１つ又は複数の組換えベクターを使用することによって、発現させるタンパク質、発現させるタンパク質のサブユニット、又は発現させるタンパク質の前駆体をコードする遺伝子の多数のコピーを導入することによって発現を増強させる。
【００２８】
一代替では、発現するタンパク質は細胞から周囲の培養培地に分泌される。
【００２９】
タンパク質はグリコシル化されているか、或いは翻訳後にプロセシングされてよい。
【００３０】
タンパク質は切断可能なタグと融合した形で発現されてよい。
【００３１】
タンパク質は少なくとも２つの異なるサブユニットを含む。この場合、不死化肝細胞を少なくとも２つのベクターを用いて形質転換又はトランスフェクトすることができ、それぞれのベクターは（１）タンパク質の少なくとも１つのサブユニットをコードする少なくとも１つの遺伝子を含むＤＮＡ；及びタンパク質のサブユニットをコードする少なくとも１つの遺伝子をコードするＤＮＡと動作可能に連結した少なくとも１つの制御要素を含む。
【００３２】
本発明の他の態様は、疾患又は状態を治療する方法であって、
（ａ）前に記載した方法に従って生成される活性タンパク質を用意するステップ、及び
（ｂ）疾患又は状態に罹患している患者にその疾患又は状態を治療するために治療上有効量、活性タンパク質を投与するステップを含む方法である。
【００３３】
本発明の方法によって生成されるタンパク質は、疾患又は状態に罹患している患者への送達用に医薬組成物中に配合することが好ましい。
【００３４】
本発明の他の態様は、ヒト肝細胞以外の真核細胞を使用してＩαＩｐタンパク質複合体を生成する方法であって、
（１）ＩαＩｐタンパク質複合体を形成するタンパク質をコードし発現することができるＤＮＡを含むヒト肝細胞以外の真核細胞を用意するステップであって、（ａ）ＩαＩｐタンパク質複合体の一部であるタンパク質前駆体の少なくとも１つの遺伝子を含むＤＮＡ及び（ｂ）少なくとも１つの前駆体遺伝子をコードするＤＮＡと動作可能に連結して前駆体遺伝子の発現を増強させる、少なくとも１つの制御要素を含む少なくとも１つのベクターを用いて、真核細胞が形質転換又はトランスフェクトされているステップ、
（２）ＩαＩｐ複合体を形成するタンパク質をコードする遺伝子が、ＩαＩｐ複合体が生成されるように発現されるような条件下で、形質転換又はトランスフェクトされた真核細胞を培養するステップ、及び
（３）形質転換又はトランスフェクトされた真核細胞から発現されたＩαＩｐタンパク質複合体を単離するステップを含む方法である。
【００３５】
本発明の他の態様は、タンパク質をコードし発現することができるＤＮＡを含む不死化ヒト肝細胞であって、（１）タンパク質をコードする少なくとも１つの遺伝子を含むＤＮＡ及び（２）タンパク質をコードするＤＮＡと動作可能に連結してタンパク質の発現を増強させる少なくとも１つの制御要素を含む、少なくとも１つのベクターを用いて形質転換又はトランスフェクトされている不死化ヒト肝細胞である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３６】
略語及び用語
本発明に従い本明細書で使用する、以下の用語及び略語は、他に明確に述べない限り以下の意味で定義する。これらの説明は例示のみを目的とする。これらの説明は、本明細書を通じて記載し言及する用語を制限することは目的としない。そうではなくて、これらの説明は、本明細書で記載し特許請求する用語の任意の追加的態様及び／又は実施例を含むことを意味する。
【００３７】
以下の略語を本明細書では使用する：
ＭＣＴ＝多細胞技術
ＭＦＥ＝多機能性増強培地
ＴＰＰ＝治療用血漿タンパク質
ＩαＩｐ＝インターα阻害剤タンパク質
ＳＶ４０＝シミアンウイルス４０Ｔ抗原及びｔ抗原
ＡＡＴ＝α−１−抗トリプシン
【００３８】
用語「細胞系」は、ｉｎ ｖｉｔｒｏでの数回の継代後に共通の起源で共に増殖する、細胞の個体群又は混合物を指す。同じ培地及び培養条件中で共に増殖させることによって、細胞系の細胞は概して類似した増殖率、温度、気体相、栄養及び表面要件という特性を共有する。幾つかの物質、例えばアルブミンを発現する細胞系中の細胞の存在は、全てではない場合でも十分な比率の細胞系中の細胞が、測定可能な量のその物質を生成するという条件で確認することができる。富化細胞系は、幾つかの形質、例えばアルブミンを発現する形質を有する細胞が、１回又は複数回の二次培養ステップ後に本来の細胞系より高い比率で存在する細胞系である。
【００３９】
用語「クローン細胞」は、単細胞に由来する細胞である。実際問題として、哺乳動物細胞の純粋なクローン細胞培養物を得ることは困難である。細胞富化の連続的な繰り返しによって、高度の細胞純度を得ることができる。本明細書で使用するように、少なくとも８０％の細胞が明確な一組の形質を有する細胞培養物を、クローン細胞培養物と呼ぶ。少なくとも９０％の細胞が明確な一組の形質を有する細胞培養物を、クローン細胞培養物と呼ぶことが好ましい。少なくとも９８％の細胞が明確な一組の形質を有する細胞培養物を、クローン細胞培養物と呼ぶことがより好ましい。本発明で特許請求するＦａ２Ｎ−４及びＥａ１Ｃ−３５細胞系は、クローン細胞系である。
【００４０】
用語「不死化」は、無限の寿命の獲得として定義する。ＳＶ４０のテロメラーゼ、癌遺伝子、又はラージＴ抗原を用いたトランスフェクションによって、或いはＳＶ４０を用いた感染によって、有限の細胞系において不死化を誘導することができる。不死化は必ずしも悪性形質転換ではないが、それが悪性形質転換の一部である可能性はある。
【００４１】
用語「不死化細胞系」は、ｉｎ ｖｉｔｒｏで、適切な増殖培地で培養すると、老化せずに連続的に増殖する細胞系を指す。
【００４２】
用語「ウイルスにより不死化した肝細胞」は、野生型又は突然変異ウイルスのウイルスゲノムの全体又は一部分でトランスフェクト或いは感染させた肝細胞を指す。ウイルスはＤＮＡウイルスであることが好ましい。ウイルスは、ｐ５３及びＲｂ腫瘍抑制タンパク質と結合し、それらの腫瘍抑制経路の不活性化をもたらすＳＶ４０であることがより好ましい。
【００４３】
用語「実質的に純粋なＤＮＡ」は、本来存在する状態でその側面に位置する配列から精製したＤＮＡ、即ち断片と通常隣接する配列、例えばそれが本来存在するゲノム中の断片であり、例えば細胞中にそれを本来伴うタンパク質から精製したＤＮＡを本来伴う他の要素から実質的に精製した断片と隣接する配列から除去したＤＮＡ断片を指す。
【００４４】
用語「肝細胞」は、（例えば肝臓毒性プロセス、疾患、又は外科手術中の）肝臓質量の損失に応じて多量に再生することができ、肝臓の細胞群の約８０％を構成する肝臓の細胞を指す。肝細胞は、２０〜３０μｍの間で測定される大きな多角形細胞である。肝細胞は、細胞当たり２００〜３００もの多くのペルオキシソームを有しており、これは一般的な細胞質の代謝活動の多くにおいて生成される過酸化水素の分解と関係がある。さらにペルオキシソームは、プリン、アルコール及び脂質の糖新生、代謝において特異的な酸化機能を有する。肝細胞中の滑面小胞体（ｓＥＲ）は、毒素及び薬剤の分解及び結合と関係がある酵素を含む。薬剤、毒素又は代謝刺激物質により肝細胞が攻撃される条件下では、ｓＥＲが細胞中の主なオルガネラとなる可能性がある。肝細胞は、恒常性にとって重要な多数の微調整された機能を果たす。哺乳動物身体中のさまざまな細胞型の中では、肝細胞のみが、炭水化物、脂質、アミノ酸、タンパク質、核酸及び補酵素の合成及び分解に関する経路を同時に組み合わせて、独特の生物学的作業を実施する。
【００４５】
用語「単離肝細胞」は、その本来の環境でそれが付着している他の細胞から物理的に分離した肝細胞を指す。
【００４６】
用語「初代肝細胞」は、完全な肝臓組織から新たに単離した肝細胞を指す。
【００４７】
用語「正常な初代ヒト肝細胞」は、非疾患状態のヒト肝臓に由来し適切な培地中で培養すると有限期間ｉｎ ｖｉｔｒｏで保たれる肝細胞を指す。
【００４８】
用語「低温保存したヒト肝細胞」は、適切な培地中で培養する前に低温保存した、正常な初代ヒト肝細胞を指す。
【００４９】
用語「代謝活動」は、異化作用（分解）及び同化作用（増大）を含めた、細胞中で進行する化学反応全体を指す。肝細胞における代謝活動には、おそらく毒性である化合物を処理する、例えば薬剤又は内因性代謝産物を毒性の低い化合物又は非毒性化合物にする能力があるが、これだけには限られない。
【００５０】
用語「シトクロムＰ４５０酵素」又は「ＣＹＰ」は、肝臓中で主に見られるヘム系酸化酵素のファミリーを指す。これらの酵素は毒素に対する防御の第一線を形成し、それらは疎水性薬剤、発癌物質、及び他のおそらく毒性である化合物、並びに血液中を循環する代謝産物の代謝と関係がある。これらは小胞体の表面に結合することが分かっており、そこでそれらは炭素が豊富な毒素上の化学的ハンドルに結合する。次いで他の酵素が大きな可溶性の基をこれらのハンドルと結合させ、その分子全体をさらに水溶性にする。これによって、泌尿系及び消化系による毒素の除去が可能となる。ＣＹＰファミリーは幾つかのサブファミリーに分けられ、それらはＣＹＰ１Ａ、ＣＹＰ２Ａ、ＣＹＰ２Ｃ、ＣＹＰ２Ｄ、ＣＹＰ２Ｅ、及びＣＹＰ３Ａを含むが、これらだけには限られない。これらのサブファミリー中には、「イソ酵素」又は「イソ型」と呼ばれることが多い、多数のヒトＣＹＰ酵素が存在する。ヒトＣＹＰ３Ａ、ＣＹＰ２Ｄ６、ＣＹＰ２Ｃ、及びＣＹＰ１Ａイソ型は、薬剤代謝において重要であることが知られている。例えば、Ｍｕｒｒａｙ、Ｍ．、２３ Ｃｌｉｎ．「薬物動態（Ｐｈａｒｍａｃｏｋｉｎｅｔｉｃｓ）」１３２〜４６（１９９２）を参照のこと。これまでＣＹＰ３Ａ４は、これらの組織中の合計ＣＹＰ４５０タンパク質のそれぞれ３０％及び７０％を構成する、ヒト肝臓及び小腸中の主なイソ型である。主にｉｎ ｖｉｔｒｏ試験に基づいて、ヒト中で使用される全薬剤の４０％〜５０％の代謝が、ＣＹＰ３Ａ４触媒の酸化と関係があると推測されてきている。Ｔｈｕｍｍｅｌ、Ｋ．Ｅ．＆Ｗｉｌｋｉｎｓｏｎ、Ｇ．Ｒ．、「ヒトＣＹＰ３Ａに関するｉｎ ｖｉｔｒｏ及びｉｎ ｖｉｖｏの薬剤相互作用（Ｉｎ Ｖｉｔｒｏ ａｎｄ Ｉｎ Ｖｉｖｏ Ｄｒｕｇ Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ Ｉｎｖｏｌｖｉｎｇ Ｈｕｍａｎ ＣＹＰ３Ａ）」、３８ Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｔｏｘｉｃｏｌ．、３８９〜４３０（１９９８）を参照のこと。
【００５１】
用語「肝機能」は、（１）糖新生；（２）グリコーゲン合成、貯蔵、及び分解（３）アルブミン、ヘモペキシン、セルロプラスミン、血液凝固因子（第Ｖ、ＶＩＩ、ＶＩＩＩ、ＩＸ、Ｘ因子、プロトロンビン、及びフィブリノゲンを含むが、これらだけには限られない）、α−１−抗トリプシン、トランスフェリン、及び抗トロンビンＩＩＩだけには限られないが、これらを含めた血清タンパク質の合成；（４）胆汁酸の結合；（５）ヘムの胆汁色素への転換；（６）リポタンパク質の合成；（７）ビタミンの貯蔵及び代謝；（８）コレステロールの合成；（９）尿素合成及びグルタミン合成を含めたアンモニア代謝；（１０）芳香族アミノ酸の代謝転換及び再利用を含めたアミノ酸代謝；並びに（１１）解毒及び薬剤代謝だけには限られないが、これらを含めた肝臓に特異的な生物学的機能を指す。
【００５２】
肝細胞由来のタンパク質は、治療用途のための本来の血漿タンパク質を生成するための、安全でより再現性のある手法をもたらす。これらの血漿タンパク質は第ＶＩＩＩ因子、第ＩＸ因子、ヒト成長ホルモン（ｈＧＨ）、及びα−１−抗トリプシンを含むが、増殖因子などの他の血漿タンパク質を含むこともできる。この発見は、不死化ヒト肝細胞の細胞系がインターα阻害剤タンパク質、４つの異なる遺伝子から生成される４つの異なるポリペプチドによって作製される血漿タンパク質の複合体ファミリーを生成し続けることを、その所有権で実証するＭＣＴのデータに基づくものである。Ｓａｌｉｅｒ、Ｊ．−Ｐ．ら、「インターａ阻害剤ファミリー：構造から制御まで。（Ｔｈｅ ｉｎｔｅｒ−ａ−ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ ｆａｍｉｌｙ：ｆｒｏｍ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ｔｏ ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ．）」Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｊ、１９９６．３５１：ｐ．１〜９。
【００５３】
タンパク質を生成するための不死化細胞の使用法
本発明の一態様は、タンパク質、好ましくは治療用タンパク質、及びより好ましくは治療用血漿タンパク質を生成するための不死化ヒト肝細胞の使用法である。
【００５４】
一般にこのような方法は、
（１）タンパク質をコードし発現することができるＤＮＡを含む不死化ヒト肝細胞を用意するステップ、
（２）タンパク質をコードする１つ又は複数の遺伝子が、タンパク質が不死化肝細胞中で生成されプロセシングされるように発現されるような条件下で、不死化肝細胞を培養するステップ、及び
（３）不死化肝細胞からプロセシングされたタンパク質を単離するステップを含み、
必要な場合プロセシングされグリコシル化されるようにタンパク質を発現させ、したがってそのｉｎ ｖｉｖｏ機能がその単離後実質的に保たれる方法である。
【００５５】
生成されるタンパク質は、治療用血漿タンパク質などの血漿タンパク質であってよい。治療用血漿タンパク質の例には、第ＶＩＩＩ因子、第ＩＸ因子、ヒト成長ホルモン（ｈＧＨ）、α−１−抗トリプシン、又は増殖因子などのタンパク質があるが、これらだけには限られない。或いは生成されるタンパク質は、ＩαＩ又はＰαＩのいずれか、或いはこれらのタンパク質複合体の両方などの、ＩαＩｐタンパク質複合体であってよい。さらに他の代替では、タンパク質は、アルブミン、トランスコバラミンＩＩ、Ｃ−反応性タンパク質、フィブロネクチン、又はセルロプラスミン、及び構造活性、酵素活性、又は輸送活性を有する他のタンパク質などの、診断用途又は他の用途に有用なタンパク質であってよい。さらに他の代替では、生成されるタンパク質は、増殖因子、第ＶＩＩＩ因子又は第ＩＸ因子などの血液凝固因子、ヒト成長ホルモン、α−１−抗トリプシンなどの抗トリプシン、又は他のタンパク質などのタンパク質のムテインであってよく、その一次構造は、指定部位突然変異誘発などの遺伝子工学の標準的技法によって改変される。同様にタンパク質は、アルブミン、トランスコバラミンＩＩ、Ｃ−反応性タンパク質、フィブロネクチン、又はセルロプラスミン、及び構造活性、酵素活性、又は輸送活性を有する他のタンパク質などの、診断用途又は他の用途に有用なタンパク質のムテインであってよい。
【００５６】
生成されるタンパク質は、構造的に或いはホルモンシグナルなどの１つ又は複数の外部刺激に応じて、肝細胞によって自然に生成されるタンパク質であってよい。或いは生成されるタンパク質は、肝細胞によって自然に生成されないタンパク質であってよい。後者の場合タンパク質は、正常な肝細胞によって自然に生成されるタンパク質のムテインであってよい。
【００５７】
多くの生物学的活性があるタンパク質は、少なくとも２つの異なるサブユニットを含む。このようなタンパク質を発現させるとき、不死化肝細胞を少なくとも２つのベクターを用いて形質転換又はトランスフェクトすることができ、それぞれのベクターは（１）タンパク質の少なくとも１つのサブユニットをコードする少なくとも１つの遺伝子を含むＤＮＡ；及びタンパク質のサブユニットをコードする少なくとも１つの遺伝子をコードするＤＮＡと動作可能に連結した少なくとも１つの制御要素を含む。
【００５８】
不死化肝細胞は、この参照によって本明細書に組み込まれる２００３年１０月１０日に出願されたＬｉｕらによる仮特許出願第１０／５１０，５０９号中に開示された不死化肝細胞であってよい。チャイニーズハムスター卵巣細胞などの哺乳動物細胞において遺伝的組換えによって生成される異種タンパク質とは対照的に、本発明の方法で使用するのと同様の不死化肝細胞由来のタンパク質はより正常に働く、何故なら、完全な機能に必要とされる二次的な翻訳後修飾が、直接肝細胞によって行われるからである。タンパク質、好ましくは治療用タンパク質、及びより好ましくは治療用血漿タンパク質を生成するために不死化肝細胞を使用することの有意な利点は、生産者細胞系がヒト起源であり、したがってより自然なタンパク質を生成することである。したがって、幾つかの治療用血漿タンパク質（ＴＰＰ）はヒト肝細胞によって合成されるので、本発明の細胞系のヒト肝細胞系の発現系を使用して、その「本来の」形のＴＰＰを生成する。１つには、非ヒトタンパク質がヒト対象に与えられる場合、これによって考えられる免疫応答が排除され、非自己として認識されるタンパク質が投与される場合、体液性又は細胞性抗体応答が発生すると思われる。
【００５９】
多数の専有の不死化ヒト肝細胞の細胞系が、この参照によって本明細書に組み込まれる２００３年１０月１０日に出願されたＬｉｕらによる仮特許出願第６０／５１０，５０９号中に記載されている。大部分のこれらの細胞系は、不死化遺伝子としてシミアンウイルス４０（ＳＶ４０）Ｔ抗原を使用して作製された。Ｔ抗原を用いたヒト細胞のトランスフェクションは細胞寿命の延長、細胞がウイルス感染に対して半許容的であるために非腫瘍性の不死化をしばしばもたらすため、この戦略が選択された。Ｔ抗原は９０，０００ダルトンの核タンパク質である。Ｃａｓｃｉｏ、Ｓ．、「ヒト肝細胞を不死化させるための新規な戦略。（Ｎｏｖｅｌ ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ ｆｏｒ ｉｍｍｏｒｔａｌｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｈｕｍａｎ ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅｓ．）」Ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ Ｏｒｇｓ、２００１．２５：ｐ．５２９〜５３８。
【００６０】
Ｔ抗原作用の多数の機構は依然として調査中であるが、多くの研究は、このウイルスタンパク質が、宿主細胞の２つの重要な腫瘍抑制遺伝子であるＲｂ及びｐ５３と結合し、それを不活性化させることを実証している。Ｌｕｄｌｏｗ、Ｊ、「ＳＶ４０巨大−腫瘍抗原と成長抑制タンパク質ｐＲＢ及びｐ５３の間の相互作用。（Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ ｂｅｔｗｅｅｎ ＳＶ４０ ｌａｒｇｅ−ｔｕｍｏｒ ａｎｔｉｇｅｎ ａｎｄ ｔｈｅ ｇｒｏｗｔｈ ｓｕｐｐｒｅｓｓｏｒ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｐＲＢ ａｎｄ ｐ５３．）」ＦＡＳＥＢ Ｊ、１９９３．７：ｐ．８６６〜８７１。
【００６１】
Ｒｂ及びｐ５３の不活性化は細胞の寿命を延長させるが、細胞に老化を回避させ無限に増殖させるために、不死化は二次的な遺伝事象を必要とする。この事象の性質はあまり理解されていないが、細胞が危険状態を経るときに生じる。大部分のＳＶ４０Ｔ抗原不死化細胞系は、初代細胞型と関係があるさまざまなレベルの分化特性を有しており、ｉｎ ｖｉｔｒｏでの多数回の継代前に発癌性は示さない。Ｋｕｒｏｋｉ、Ｔ．及びＮ．Ｈｕｈ、「何故ヒト細胞はｉｎ ｖｉｔｒｏでの悪性細胞形質転換に耐性があるのだろうか？（Ｗｈｙ ａｒｅ ｈｕｍａｎ ｃｅｌｌｓ ｒｅｓｉｓｔａｎｔ ｔｏ ｍａｌｉｇｎａｎｔ ｃｅｌｌ ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｉｎ ｖｉｔｒｏ？）」Ｊｐｎ Ｊ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ、１９９３．８４：ｐ．１０９１〜１１００。
【００６２】
ＳＶ４０ウイルスのＴ抗原遺伝子を用いて細胞をトランスフェクトすることによって、正常なヒト肝臓初代細胞を作製して連続的に増殖させることができる。トランスフェクション又は感染は、ＳＶ４０ウイルスのＴ抗原遺伝子を含むウイルス又はプラスミドを使用することによって実施することができる。トランスフェクション又は感染のいずれかが、細胞系の形質転換をもたらす可能性がある。パピローマウイルス又はエプスタインバーウイルスなどの、他の形質転換ベクターも有用である可能性がある。連続的なヒト細胞系を作製するための技法は、以下の参照文献中に記載されている：Ｇｒａｈｍ．Ｆ．Ｌ．、Ｓｍｉｌｅｙ Ｊ．、Ｒｕｓｓｅｌｌ、Ｗ．Ｃ．及びＮａｉｒｎ、Ｒ．「ヒトアデノウイルス５型由来のＤＮＡによって形質転換したヒト細胞系の特性。（Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｓ ｏｆ ａ ｈｕｍａｎ ｃｅｌｌ ｌｉｎｅ ｔｒａｎｓｆｏｒｍｅｄ ｂｙ ＤＮＡ ｆｒｏｍ ｈｕｍａｎ ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ ｔｙｐｅ ５．）」Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．、３６：５９〜７２（１９７７）；Ｚｕｒ Ｈａｕｓｅｎ、Ｈ．「発癌性ヘルペスウイルス（Ｏｎｃｏｇｅｎｉｃ ｈｅｒｐｅｓ ｖｉｒｕｓｅｓ）」Ｉｎ：Ｊ．Ｔｏｏｚｅ（編）、「ＤＮＡ腫瘍ウイルス（ＤＮＡ ｔｕｍｏｒ ｖｉｒｕｓｅｓ）」、Ｒｅｖ．第２版、ｐｐ７４７〜７９８．Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ、ニューヨーク、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ（１９８１）；Ｐｏｐｏｖｉｃ、Ｍ．、Ｌａｎｇｅ−Ｗａｎｔｅｉｎ、Ｇ．、Ｓａｒｉｎ、Ｐ．Ｓ．、Ｍａｎｎ、Ｄ．及びＧａｌｌｏ、Ｒ．Ｃ．「ヒトＴ細胞白血病／リンパ腫ウイルス（ＨＴＬＶ）によるヒト臍帯血Ｔ細胞の形質転換（Ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｏｆ ａ ｈｕｍａｎ ｕｍｂｉｌｉｃａｌ ｃｏｒｄ ｂｌｏｏｄ Ｔ−ｃｅｌｌｓ ｂｙ ｈｕｍａｎ Ｔ−ｃｅｌｌ ｌｅｕｋｅｍｉａ／ｌｙｍｐｈｏｍａ ｖｉｒｕｓ（ＨＴＬＶ）」、Ｐｒｏｔ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８０：５４０２〜５４０６（１９８３）；ＤｉＰａｏｌｏ、Ｊ．Ａ．Ｐｉｒｉｓｉ、Ｉ．、Ｐｏｐｅｓｅｕ、Ｎ．Ｃ．、Ｙａｓｕｍｏｔｏ、Ｓ．、Ｐｏｎｉｇｅｒ、Ｊ．「ヒトパピローマウイルス１６型ＤＮＡ、癌細胞によってヒト及びマウス細胞において誘導される進行的変化（Ｐｒｏｇｒｅｓｓｉｖｅ ｃｈａｎｇｅｓ ｉｎｄｕｃｅｄ ｉｎ ｈｕｍａｎ ａｎｄ ｍｏｕｓｅ ｃｅｌｌｓ ｂｙ ｈｕｍａｎ Ｐａｐｉｌｌｏｍａｖｉｒｕｓ Ｔｙｐｅ−１６ ＤＮＡ、Ｃａｎｃｅｒ Ｃｅｌｌｓ）」５：２５３〜２５７（１９８７）。
【００６３】
本発明の方法において有用な不死化ヒト肝細胞は、低温保存した初代ヒト肝細胞に由来することが好ましい。本発明の方法において有用な不死化ヒト肝細胞は、実質的に純粋なＳＶ４０のＤＮＡを導入することによって不死化させることが好ましい。実質的に純粋なＳＶ４０のＤＮＡは、野生型ＳＶ４０のラージＴ抗原及びスモールｔ抗原（タグ）を含むことが好ましい。典型的には肝細胞は、そこから腫瘍抑制遺伝子をコードする実質的に純粋なＤＮＡを単離することができるＤＮＡを含む。ＤＮＡによってコードされる腫瘍抑制遺伝子は、ヒトＲｂであることが好ましい。好ましくは肝細胞は、そこからヒトｐ５３をコードする実質的に純粋なＤＮＡを単離することができるＤＮＡも含む。
【００６４】
典型的には、ウイルスにより不死化させたヒト肝細胞は、無血清培地中で保たれ増殖する能力を有する。無血清培地は、ＭＣＴ無血清培地であることが好ましい。
【００６５】
適切な肝細胞の細胞系には、ウイルスにより不死化させたヒト初代肝細胞の細胞系Ｆａ２Ｎ−４、及びウイルスにより不死化させたヒト肝細胞の細胞系Ｅａ１Ｃ−３５がある。他のヒト肝細胞の細胞系も使用することができる。
【００６６】
不死化ヒト肝細胞の細胞系の作製
初代細胞の単離
ドナーであるヒト肝臓の消化は、３７℃において酸素飽和状態のカルシウムを含まないバッファーの前灌流によってｉｎ ｖｉｔｒｏで行った。前灌流は肝臓が平衡状態になるまで続け、次に肝臓が完全に消化されるまで（約４５分）酸素飽和状態のコラゲナーゼバッファーによって灌流を続けた。
【００６７】
細胞を採取するために、肝臓を１ｃｍ^２片に切り刻み、生成した懸濁液は＃１０ワイヤースクリーンを介して濾過し、次いで２５３ｕｍのナイロンメッシュを介して再度濾過した。懸濁液は２０×ｇで５分間４℃において遠心分離にかけて、完全な実質細胞を沈殿させた。ペレットは４℃において再懸濁させ、洗浄バッファーで洗浄して（３回）、全コラゲナーゼを除去した。細胞ペレットは１５０ｍｌの組織培養培地中に再懸濁させて、３〜４×１０^７細胞／ｍｌの密度を有する４００〜５００ｍｌの最終体積にした。トリパンブルー及び乳酸デヒドロゲナーゼによる生存能力の評価を、この懸濁液の等分試料に行った。
【００６８】
初代ヒト肝細胞の低温保存
前に記載したようにドナー肝臓から単離した、新たに単離したヒト肝細胞を、５分間５０×ｇでの遠心分離によって３回洗浄バッファーで洗浄した。細胞ペレットは冷蔵凍結培地（無血清ＭＦＥ培地：ＦＢＳ：ＤＭＳＯ（８：１：１））に、５×１０^６／ｍＬの最終細胞密度で再懸濁させた。細胞懸濁液の等分試料は、Ｎｕｎｃクリオバイアルに移した（１．０ｍＬ／１．５ｍｌクリオバイアル、４．５ｍＬ／５ｍｌクリオバイアル）。クリオバイアル中の細胞は１５〜３０分間４℃において平衡状態にし、次いでバイアルは少なくとも３時間−８０℃のスタイロフォーム（商標）容器中に置いた。次いでバイアルはＬＮ_２中に沈めた。
【００６９】
細胞系の作製
低温保存したヒト肝細胞を摂氏４２度の水浴中で急速に解凍し、洗浄し、ＭＦＥ培養培地に平板培養した。２日後、リポフェクション介在トランスフェクションによって不死化遺伝子を導入した。Ｅａ１Ｃ−３５細胞系は、ＳＶ４０ゲノムの２．５ｋｂの初期領域を含む不死化ベクターを用いたトランスフェクションから誘導したものであり、ＳＶ４０ゲノムはラージＴ抗原とスモールｔ抗原の両方を含み、その発現はＳＶ４０初期プロモーターによって誘導される。この初期領域はＳｔｒａｔａｇｅｎｅ ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＳＫベクター骨格中に挿入し、ｐＢｌｕｅＴａｇと名付けた。ｎｅｏプラスミドのコトランスフェクションによって選択可能なマーカーとして、ネオマイシン耐性をトランスフェクト細胞に与えた。Ｇ４１８含有培地中で増殖するそれらの能力に基づいて、クローンを最初に選択した。Ｅａ１Ｃ−３５細胞系を確立し、ＣＳＭ培地中に保った。
【００７０】
１つの不死化ベクターを用いたリポフェクション介在トランスフェクションによって、Ｆａ２Ｎ−４細胞系を不死化させた。ｐＢｌｕｅＴａｇベクター中に含まれるＳＶ４０ゲノムの初期領域は、ＩｎｖｉｖｏＧｅｎ ｐＧＴ６０ｍｃｓプラスミドに基づく骨格中に挿入し、ｐＴａｇ−１と名付けた。Ｔ−抗原コード領域は、ハイブリッドｈＥＦ１−ＨＴＬＶプロモーターの影響下に存在する。このベクターは、薬剤選択可能なマーカーとしてヒグロマイシン耐性遺伝子もコードしている。ヒグロマイシン含有培地中で増殖するそれらの能力に基づいて、クローンを選択した。Ｆａ２Ｎ−４細胞系を確立し、ＭＦＥ中に保った。
【００７１】
Ｆａ２Ｎ−４細胞系は、ブダペスト条約の合意の下で２００３年１０月６日にＡｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ、１２３０１ Ｐａｒｋｌａｗｎ Ｄｒ．、Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ、Ｍｄに寄託された。Ｅａ１Ｃ−３５細胞系は、ブダペスト条約の合意の下で２００３年１０月６日にＡｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（１２３０１ Ｐａｒｋｌａｗｎ Ｄｒ．，Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，Ｍｄ）に寄託された。
【００７２】
前に記載した細胞系などの適切な不死化肝細胞の細胞系は、前に記載したのと同様にタンパク質を生成するために使用することができる。タンパク質は第ＶＩＩＩ因子、第ＩＸ因子、α−１−抗トリプシン、ヒト成長ホルモン、増殖因子、又は他のタンパク質などの治療用血漿タンパク質であってよい。タンパク質は増殖因子、血液凝固因子、α−１−抗トリプシンなどの抗トリプシン、及び他のタンパク質などのタンパク質のムテインであってもよく、その一次構造は、指定部位突然変異誘発などの遺伝子工学の標準的技法によって改変される。タンパク質は、アルブミン、トランスコバラミンＩＩ、Ｃ−反応性タンパク質、フィブロネクチン、又はセルロプラスミン、及び構造活性、酵素活性、又は輸送活性を有する他のタンパク質を含めた治療又は診断対象の他のタンパク質をさらに含むこともできる。
【００７３】
第ＶＩＩＩ因子、第ＩＸ因子、ヒト成長ホルモン（ｈＧＨ）、又はα−１−抗トリプシンだけには限られないが、これらなどの天然に存在する血漿タンパク質を生成するために肝細胞の細胞系を使用するとき、幾つかの戦略を使用して血漿タンパク質の発現を最大にすることができる。
【００７４】
１つの戦略では、タンパク質をコードする天然に存在する遺伝子の発現は、高レベルのプロモーターを導入することによって増強させる。このようなプロモーターは当分野では知られており、例えばこの参照によって本明細書に組み込まれる、Ｓ．Ｂ．Ｐｒｉｍｒｏｓｅら、「遺伝子操作の原則（Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ｏｆ Ｇｅｎｅ Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｏｎ）」（第６版、２００１、Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ、オクスフォード、イングランド）、ｐ．１９９中に記載されている。このようなプロモーターは、エンハンサーなどの他の調節要素を伴う可能性もある。このようなプロモーター、又はプロモーターとエンハンサーの組合せには、ＳＶ４０初期プロモーターとエンハンサー、ラウス肉腫ウイルス長末端反復プロモーターとエンハンサー、及びヒトサイトメガロウイルス即時型プロモーターがある。
【００７５】
しかしながら、（１）発現させるタンパク質、発現させるタンパク質のサブユニット、又は発現させるタンパク質の前駆体をコードする遺伝子、及び（２）遺伝子の転写に影響を与える少なくとも１つの制御要素であって、遺伝子と動作可能に連結した制御要素を含む１つ又は複数の組換えベクターを使用することによって、発現させるタンパク質、発現させるタンパク質のサブユニット、又は発現させるタンパク質の前駆体をコードする遺伝子の多数のコピーを導入することによって発現を増強させることが一般に好ましい。制御要素は典型的にはプロモーター、プロモーターとエンハンサーの組合せである。適切なベクターの特性は：（１）複製開始点；（２）所望の遺伝子をコードするＤＮＡの挿入を可能にする制限エンドヌクレアーゼ切断部位；及び（３）選択マーカー、典型的には抗生物質耐性を与える選択マーカーも含む。１つの特に好ましい実施形態では、制御要素は少なくとも１つのプロモーター及び少なくとも１つのエンハンサーを含む。
【００７６】
適切な組換えベクターには、ＳＶ４０由来ベクター、ネズミポリオーマ由来ベクター、ＢＫウイルス由来ベクター、エプスタインバーウイルス由来ベクター、アデノウイルス由来ベクター、アデノ関連ウイルス由来ベクター、バキュロウイルス由来ベクター、ヘルペスウイルス由来ベクター、レンチウイルス由来ベクター、レトロウイルス由来ベクター、アルファウイルス由来ベクター、ワクシニアウイルス由来ベクター、及び他のベクターがあるが、これらだけには限られない。このようなベクターは典型的には、強力で構成的なプロモーター、発現されるＤＮＡ中に少なくとも１つのイントロン、及び転写される配列の３’末端にポリアデニル化シグナルを含む。グリコシル化などの適切な翻訳後修飾を確実にするためにシグナルペプチドを加えることが、望ましい可能性がある。これらのベクター及びベクターの特性は、Ｓ．Ｂ．Ｐｒｉｍｒｏｓｅら、「遺伝子操作の原則（Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ｏｆ Ｇｅｎｅ Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｏｎ）」（第６版、２００１、Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ、オクスフォード、イングランド）、ｐｐ．１７４〜２０１中、及びＴ．Ａ．Ｂｒｏｗｎ、「遺伝子クローニング及びＤＮＡ分析：導入章（Ｇｅｎｅ Ｃｌｏｎｉｎｇ ａｎｄ ＤＮＡ Ａｎａｌｙｓｉｓ：Ａｎ Ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ）」（第４版、２００１、Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ、オクスフォード、イングランド）中に記載されており、両方共にこの参照によって本明細書に組み込まれる。
【００７７】
発現されるタンパク質をコードするＤＮＡを単離するための方法、及びそのようなＤＮＡをこれらのベクター中に挿入するための方法も、当分野ではよく知られている。これらの方法は、例えばこの参照によって本明細書に組み込まれる、Ｓ．Ｂ．Ｐｒｉｍｒｏｓｅ、「遺伝子操作の原則（Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ｏｆ Ｇｅｎｅ Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｏｎ）」（第６版、Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ、オクスフォード、２００１）中に記載されている。一般に、クローニングに適したＤＮＡは、特異的ｍＲＮＡの逆転写から得ることができ、これにポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）の施用を続けてＤＮＡを増幅させることができ；このようなＤＮＡはｃＤＮＡとして一般に知られている。特異的な制限エンドヌクレアーゼを用いたベクターの切断、及び切断部位へのＤＮＡの挿入を一般に含む技法によって、ＤＮＡをベクター中に挿入することができる。
【００７８】
ウイルスにより不死化させたヒト肝細胞を形質転換又はトランスフェクトするための方法は当分野でよく知られており、ここではさらに詳細に記載する必要はない。一般にこのような方法には、リポフェクション、リン酸カルシウム仲介トランスフェクション、ＤＥＡＥ−デキストランによって仲介されるトランスフェクション、エレクトロポレーションによるトランスフェクション、バイオリスティック法によるトランスフェクション、及びポリブレンを使用するトランスフェクションがあるが、これらだけには限られない。これらのトランスフェクション法は、この参照によって本明細書に組み込まれる、Ｊ．Ｓａｍｂｒｏｏｋ＆Ｄ．Ｗ．Ｒｕｓｓｅｌｌ、「分子クローニング：研究室マニュアル（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ）」（第３版、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ、ニューヨーク、２００１）、ｖｏｌ．３、ｃｈ．１６中に記載されている。
【００７９】
多くの場合、１つ又は複数のレポーター遺伝子をベクター中に組み込んで、トランスフェクションの効率を評価することが望ましい。選択する遺伝子は、強力な偏在するプロモーターとエンハンサーの組合せの制御下にある。これらはヒトサイトメガロウイルスの即時型遺伝子、ラウス肉腫ウイルス長末端反復、又はヒトβ−アクチン遺伝子由来のものを含む。適切なレポーター遺伝子の一例は、大腸菌トランスポゾン中に見られるクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）遺伝子である。レポーター遺伝子の発現の検出は、蛍光の検出又は放射性生成物の検出などの、さまざまな技法によって行うことができる。レポーター遺伝子及びそれらのアッセイは、この参照によって本明細書に組み込まれる、Ｍ．Ａ．Ａｉｔｋｅｎら、「高等真核生物の組織培養細胞中の遺伝子の移動及び発現（Ｇｅｎｅ Ｔｒａｎｓｆｅｒ ａｎｄ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｉｎ Ｔｉｓｓｕｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｅｌｌｓ ｏｆ Ｈｉｇｈｅｒ Ｅｕｋａｒｙｏｔｅｓ）」、「分子生物学法教本（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｍｅｔｈｏｄｓ Ｈａｎｄｂｏｏｋ）」（Ｒ．Ｒａｐｌｅｙ＆Ｊ．Ｍ．Ｗａｌｋｅｒ編、Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ、Ｔｏｔｏｗａ、Ｎｅｗ Ｊｅｒｓｅｙ、１９９８）、ｐｐ．２３５〜２５０中にさらに記載されている。
【００８０】
タンパク質をひとたび発現させた後、次いで発現したタンパク質を単離することが必要である。これは典型的には、タンパク質を精製するための標準的な方法によって行う。これらの方法には、プロテアーゼ活性などの任意の容易に確認可能な性質を使用してタンパク質を検出する、硫酸アンモニウムなどの塩との沈殿、イオン交換クロマトグラフィー、ゲル濾過クロマトグラフィー、逆相高圧液体クロマトグラフィー、等電点電気泳動法、クロマトフォーカシング、及び／又は免疫親和性クロマトグラフィーがあるが、これらだけには限られない。他の精製法も当分野で知られている。タンパク質精製法は、例えばこの参照によって本明細書に組み込まれる、Ｒ．Ｋ．Ｓｃｏｐｅｓ、「タンパク質精製：原則及び実践（Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ）」（第３版、Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ、ニューヨーク、１９９４）中に記載されている。
【００８１】
幾つかの場合、発現するタンパク質が細胞から周囲の培養培地に分泌される可能性がある。このプロセスの効率は、タンパク質が経るグリコシル化などの転写後修飾の型に依存する。この型は粗面小胞体及びゴルジ装置内でのタンパク質のプロセシング、並びにその後の分泌に影響を与える。このことは、この参照によって本明細書に組み込まれる、Ａ．Ｊ．Ｄｏｒｎｅｒ＆Ｒ．Ｊ．Ｋａｕｆｍａｎ、「哺乳動物細胞中で発現されるタンパク質の合成、プロセシング、及び分泌の分析（Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ、Ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ、ａｎｄ Ｓｅｃｒｅｔｉｏｎ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ Ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ ｉｎ Ｍａｍｍａｌｉａｎ Ｃｅｌｌｓ）」、「遺伝子発現の技術（Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）」（Ｄ．Ｖ．Ｇｏｅｄｄｅｌ、ｅｄ．、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、サンディエゴ、１９９１）、ｐｐ．５７７〜５９８中に記載されている。発現されるタンパク質がタグと呼ばれる他のタンパク質と融合して、それを使用してタンパク質精製を容易にすることができるように、クローニングベクターを選択することもできる。タグの例にはグルタチオンＳ−トランスフェラーゼ、Ｍａ１Ｅマルトース結合タンパク質、及びポリヒスチジン配列がある。生成する融合タンパク質は次いで特異的なタンパク質分解によって切断して、タグを除去し精製血漿タンパク質を生成することができる。この技法は、血漿タンパク質を含めた治療用タンパク質と非治療用タンパク質の両方に施すことができる。
【００８２】
タンパク質を生成するための本発明の適用例の一例では、このようなウイルスにより不死化させた初代ヒト肝細胞は、ＩαＩ及びＰαＩなどのＩαＩｐタンパク質のさまざまな前駆体の遺伝子を含む、ベクターを用いて形質転換又はトランスフェクトすることができる。これを行ってＩαＩｐタンパク質の発現を増大させる。この例の１つの型では、２つのベクター：（１）遺伝子ＩＴＨ３及びＡＭＢＰを含む第一のベクター；及び（２）遺伝子ＩＴＨ２及びＩＴＨ１を含む第二のベクターを使用する。
【００８３】
治療用血漿タンパク質の生成の一例では、ＩＴＨ１及びＩＴＨ２遺伝子をコードするＤＮＡを含むベクターは、ＩｎｖｉｖｏＧｅｎによって販売されている市販のベクターの変形である。ＩｎｖｉｖｏＧｅｎによって販売されているこのベクターはｐＶＩＴＲＯ２と表され、ヒグロマイシン耐性遺伝子を含む。変形ベクターはｐＶＩＴＲＯ２−Ｂｌａｓｔｉと表される。ヒグロマイシン耐性遺伝子とブラスチシジン耐性遺伝子を交換することによって、ベクターを改変する。ベクターは２つのヒトフェリチン複合プロモーターを使用する。ＦｅｒＨ及びＦｅｒＬの５’−ＵＴＲは、マウス及びチンパンジーのＥＦ１ａ遺伝子の５’−ＵＴＲによって置換される。両方のプロモーターの活性は、ＳＶ４０及びＣＭＶエンハンサーを加えてＣＭＶプロモーターの活性と同等の活性を生み出すことによって増大する。組み込んだ２つのｃＤＮＡに関する同等なレベルの発現をそれぞれのベクターから誘導するために、このプロモーター骨格を選択した。これらのｃＤＮＡによってコードされるポリペプチドを使用するとＩαＩｐタンパク質は１：１：１：１の比率で構成されるので、これは非常に望ましい。プラスミドｐＶＩＴＲＯ２−Ｂｌａｓｔｉでは、ＩＴＨ１はＭＣＳ１にクローニングされ、ＩＴＨ２はＭＣＳ２にクローニングされる。これらのｃＤＮＡは、可能な下流のサブクローニングを容易にするためにそれらの両端に加えられた、特有の制限部位を有する。ＩＴＨ１をコードするｃＤＮＡに関する線状構造は、５’−ＢａｍＨＩ−ＡｇｅＩ−ＥｃｏＲＶ−ｃＤＮＡ−ＭＩｕＩ−ＡｖｒＩＩ−ＢａｍＨＩ−３’である。ＩＴＨ２をコードするｃＤＮＡに関する線状構造は、５’−ＦｓｐＩ−ＳｇｒＡ１−ｃＤＮＡ−ＸｈｏＩ−ＦｓｐＩ−３’である。
【００８４】
同様に、治療用血漿タンパク質の生成の一例では、ＡＭＢＰ及びＩＴＨ３遺伝子をコードするＤＮＡを含むベクターは、市販のｐＶＩＴＲＯ２ベクターの他の変形である。この変形はｐＶＩＴＲＯ２−Ｎｅｏと表され、ヒグロマイシン耐性遺伝子の代わりにネオマイシン耐性遺伝子を含む。このベクターはｐＶＩＴＲＯ２−Ｂｌａｓｔｉと同じプロモーター骨格及び５’−ＵＴＲを使用する。このベクターはＭＣＳ１中にＡＭＢＰをコードするＤＮＡ、及びＭＣＳ２中にＩＴＨ３をコードするＤＮＡを含む。ＡＭＢＰをコードするｃＤＮＡに関する線状構造は、５’−ＢａｍＨＩ−ＡｇｅＩ−ＥｃｏＲＶ−ｃＤＮＡ−ＭＩｕＩ−ＡｖｒＩＩ−ＢａｍＨＩ−３’である。ＩＴＨ３をコードするｃＤＮＡに関する線状構造は、５’−ＸｈｏＩ−ＮｈｅＩ−ｃＤＮＡ−Ｂｇ１ＩＩ−ＸｈｏＩ−３’である。他のベクターを使用することができるが、タンパク質複合体中に存在するタンパク質サブユニット間の１：１の比率のため、ベクターはほぼ等しい比率でコードされているタンパク質のそれぞれを発現することが一般に好ましい。
【００８５】
したがって、血漿タンパク質の生成における本発明の適用の他の例は、適切な宿主細胞と適合性がある少なくとも１つの制御配列と動作可能に連結した、遺伝子ＩＴＨ３及びＡＭＢＰをコードするＤＮＡを含むベクターである。制御配列はプロモーター、エンハンサー、又は他の制御配列であってよい。
【００８６】
本発明の血漿タンパク質の生成における本発明の適用のさらに他の例は、適切な宿主細胞と適合性がある少なくとも１つの制御配列と動作可能に連結した、遺伝子ＩＴＨ２及びＩＴＨ１をコードするＤＮＡを含むベクターである。制御配列はプロモーター、エンハンサー、又は他の制御配列であってよい。
【００８７】
治療用血漿タンパク質の生成における本発明の適用のさらに他の例は、適切な宿主細胞と適合性がある少なくとも１つの制御配列と動作可能に連結した、遺伝子ＩＴＨ３及びＡＭＢＰをコードする核酸を含む単離及び精製された核酸配列である。制御配列はプロモーター、エンハンサー、又は他の制御配列であってよい。核酸配列は典型的にはＤＮＡであるが、ＲＮＡ又はＲＮＡ−ＤＮＡハイブリッドであってよい。
【００８８】
同様に、治療用血漿タンパク質の生成における本発明の適用のさらに他の例は、適切な宿主細胞と適合性がある少なくとも１つの制御配列と動作可能に連結した、遺伝子ＩＴＨ２及びＩＴＨ１をコードする核酸を含む単離及び精製された核酸配列である。制御配列はプロモーター、エンハンサー、又は他の制御配列であってよい。核酸配列は典型的にはＤＮＡであるが、ＲＮＡ又はＲＮＡ−ＤＮＡハイブリッドであってよい。
【００８９】
したがって、これらのベクターが存在する結果として、本発明の他の態様は、ウイルスにより不死化させたヒト肝細胞であって、（１）血漿タンパク質をコードする少なくとも１つの遺伝子を含むＤＮＡ及び（２）血漿タンパク質をコードするＤＮＡと動作可能に連結して血漿タンパク質の発現を増強させる少なくとも１つの制御要素を含む、少なくとも１つのベクターを用いて形質転換又はトランスフェクトされている不死化ヒト肝細胞である。したがって、このウイルスにより不死化させたヒト肝細胞は、血漿タンパク質をコードし発現することができるＤＮＡをコードしている。この一例は、ウイルスにより不死化させたヒト肝細胞であって、（１）ＩαＩｐタンパク質複合体の一部であるタンパク質前駆体の少なくとも１つの遺伝子を含むＤＮＡ及び（２）少なくとも１つの前駆体遺伝子をコードするＤＮＡと動作可能に連結して前駆体遺伝子の発現を増強させる少なくとも１つの制御要素を含む、少なくとも１つのベクターを用いて形質転換又はトランスフェクトされている不死化ヒト肝細胞である。
【００９０】
本発明のさらに他の態様は、活性ＩαＩｐ、ＩαＩ又はＰαＩのいずれかを生成する、形質転換又はトランスフェクトされたヒト肝細胞以外の真核細胞である。一般にこれらの細胞は、（１）ＩαＩｐタンパク質複合体の一部であるタンパク質前駆体の少なくとも１つの遺伝子を含むＤＮＡ及び（２）少なくとも１つの前駆体遺伝子をコードするＤＮＡと動作可能に連結して前駆体遺伝子の発現を増強させる少なくとも１つの制御要素を含む、少なくとも１つのベクターを用いて形質転換又はトランスフェクトされている。これらの細胞は、好ましくは前に記載したベクターを用いて形質転換又はトランスフェクトすることができるＣＨＯ細胞、ＣＯＳ細胞、酵母菌細胞、又は他の真核細胞であってよい。これらの細胞はＩαＩ又はＰαＩのいずれか、或いは両方を生成し；これらは他のタンパク質も生成することができる。したがってこれらの細胞は、（１）遺伝子ＩＴＨ３及びＡＭＢＰをコードするＤＮＡ；（２）遺伝子ＩＴＨ２及びＩＴＨ１をコードするＤＮＡ；又は（３）遺伝子ＩＴＨ３及びＡＭＢＰをコードするＤＮＡと、遺伝子ＩＴＨ２及びＩＴＨ１をコードするＤＮＡの両方のいずれかを用いて形質転換又はトランスフェクトする。
【００９１】
本発明の治療用血漿タンパク質の生成のさらに他の例は、これらの形質転換又はトランスフェクトされたヒト肝細胞以外の真核細胞を使用してＩαＩｐを生成する方法である。
【００９２】
一般にこのような方法は、
（１）ＩαＩｐタンパク質複合体を形成するタンパク質をコードし発現することができるＤＮＡを含む、形質転換又はトランスフェクトされたヒト肝細胞以外の真核細胞を用意するステップ、
（２）ＩαＩｐタンパク質複合体を形成するタンパク質をコードする遺伝子が、ＩαＩｐ複合体が生成されるように発現されるような条件下で、不死化真核細胞を培養するステップ、及び
（３）発現されたＩαＩｐタンパク質複合体を不死化真核細胞から単離するステップを含む。
【００９３】
生成されるタンパク質はＩαＩ又はＰαＩのいずれか、或いはこれらのタンパク質複合体の両方であってよい。
【００９４】
このようなタンパク質複合体を、それらを発現する細胞、ウイルスにより不死化させたヒト肝細胞又はヒト肝細胞以外の細胞から単離することは、前に記載したのと同様のタンパク質を精製するための標準的な方法によって行われる。
【００９５】
したがって本発明の他の態様は、疾患又は状態を治療するための不死化肝細胞によって生成されるタンパク質の使用である。疾患又は状態は、敗血症、肝臓癌、肝炎、又は肝不全などの肝臓に影響を与える疾患又は状態であってよく、或いは肝臓以外の部位の癌、関節炎症、又は関節炎などの肝臓以外の臓器に影響を与える疾患又は状態であってよい。このようなタンパク質の一例はＩαＩｐタンパク質複合体であるが、本発明の方法は一般にタンパク質に適用可能である。
【００９６】
本発明の治療用血漿タンパク質の使用の一例は、ＩαＩｐタンパク質複合体の使用である。
【００９７】
一般にこのような方法は、
（１）活性ＩαＩｐタンパク質複合体を用意するステップ、及び
（２）疾患又は状態に罹患している患者にその疾患又は状態を治療する治療活性量の活性ＩαＩｐタンパク質複合体を投与するステップを含む。
【００９８】
前に述べたように、敗血症、癌、肝炎、又は肝不全などの疾患又は状態は、肝臓に影響を与える可能性がある。或いは肝臓以外の部位の癌、関節炎症、又は関節炎などの疾患又は状態は、肝臓以外の臓器に影響を与える可能性がある。正確な配合、投与経路及び用量は、患者の状態を鑑みて個々の医師によって選択することができる。（例えば、Ａ．Ｓ．Ｎｉｅｓ＆Ｓ．Ｐ．Ｓｐｉｅｌｂｅｒｇ、「治療の原則（Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ｏｆ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ）」、Ｊ．Ｇ．Ｈａｒｄｍａｎ＆Ｌ．Ｅ．Ｌｉｍｂｉｒｄ、ｅｄｓ．、「Ｇｏｏｄｍａｎ及びＧｉｌｍａｎの治療の薬理学的基礎（Ｇｏｏｄｍａｎ＆Ｇｉｌｍａｎ’ｓ Ｔｈｅ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ Ｂａｓｉｓ ｏｆ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ）」（第９版、ＭｃＧｒａｗ−Ｈｉｌｌ、ニューヨーク、１９９６）、ｃｈ．３．、ｐｐ．４３〜６２中を参照）担当医はどのようにして何時に毒性又は臓器不全により投与を停止、中断、又は調節するかを理解していると思われることを記さなければならない。逆に担当医は、臨床応答が（毒性を排除するのに）十分ではない場合、治療を高レベルに調節することも理解していると思われる。肝臓疾患又は状態の管理におけるＩαＩｐタンパク質複合体の投与用量の重要性は、疾患又は状態の重度及び投与経路と共に変わる。さらに、用量及びおそらく投与頻度も、個々の患者の年齢、体重、及び応答性、並びに肝機能及び腎機能など薬理学的パラメータに影響を与える他の条件に従って変わると思われる。しかしながら一般に、治療用タンパク質組成物に関しては、消化管のタンパク質分解活動を回避するために、経口以外の経路が典型的には好ましい。これらの経路は静脈内、筋肉内、腹膜内、リンパ管内、皮下、又は他の経路であってよい。
【００９９】
前に記載したように、活性ＩαＩｐタンパク質複合体は不死化肝細胞中で生成することができ、或いは他の真核細胞中で生成することができる。
【０１００】
本発明のさらに他の態様は、疾患を治療するのに治療上有効である量の、真核細胞、ウイルスにより不死化させたヒト細胞又は他の真核細胞によって生成される活性タンパク質、並びに薬剤として許容される担体を含む、疾患又は状態を治療するための医薬組成物である。活性タンパク質を含む本発明の医薬組成物は、固体、半固体及び液体剤形、例えば錠剤、ピル、粉末、液体溶液又は懸濁液、座薬、ポリマーマイクロカプセル又は微小胞、リポソーム、及び注射用又は不溶解性溶液などだけには限られないが、これらを含めたさまざまな剤形であってよい。好ましい形は、投与形式及び個々の治療用途に依存する。
【０１０１】
組成物用の従来の薬剤として許容される担体は、ヒト血清アルブミンを含めた血清タンパク質、リン酸塩、水又は塩又は電解質などのバッファー物質などの、当分野で知られている担体を含むことができる。
【０１０２】
本発明のさらに他の態様は、本発明の方法に従い生成したタンパク質と特異的に結合する抗体である。タンパク質を使用して、精製タンパク質又はそのタンパク質から単離したペプチドと結合するポリクローナル抗体を含めた、抗体を調製することができる。これらの抗体を使用して、多量にタンパク質を精製することができる。例えば、抗体を固形担体に固定し、固形担体に固定した抗体とタンパク質を含むサンプルを反応させてタンパク質と抗体を結合させることによって、タンパク質を精製することができる。或いは抗体を検出可能な標識で標識し、検出可能な標識で標識した抗体とタンパク質を含むサンプルを反応させてタンパク質と抗体を結合させ、それによって抗原−抗体複合体を形成し、サンプル中に存在する他のタンパク質から抗原−抗体複合体を分離することができる。いずれかの場合、高塩、ｐＨの変更、又は低濃度のカオトロピック剤などの標準的技法によって、抗体からタンパク質を次いで解離させることができる。
【０１０３】
精製したタンパク質複合体は、治療又はスクリーニング用途に次いで使用することができる。
【０１０４】
小胞膜輸送タンパク質と反応性があるモノクローナル抗体は、Ｋｏｈｌｅｒ及びＭｉｌｓｔｅｉｎ（Ｋｏｈｌｅｒ及びＭｉｌｓｔｅｉｎ、「ネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ）」、２５６：４９５〜９７（１９７５）を参照）によって導入された手順及びその変形などの、知られている手順を使用して調製したハイブリドーマによって生成して、細胞の相互作用を調節することができる。
【０１０５】
これらの技法は、特定の抗体を生成するために初回抗原刺激した動物の使用を含む。免疫原（例えば、ＩαＩｐタンパク質複合体）を注射することによって動物を初回抗原刺激して、望ましい免疫応答、即ち初回抗原刺激した動物からの抗体の生成を誘導することができる。初回抗原刺激した（免疫処置した）動物のリンパ節、脾臓又は末梢血由来のリンパ球を使用して、特定の抗体を探すことができる。望ましい免疫グロブリンをコードするリンパ球の染色体は、一般にポリエチレングリコール（ＰＥＧ）などの融合剤の存在下で、リンパ球とミエローマ細胞を融合させることによって不死化させる。数種のミエローマ細胞系、例えばＰ３−ＮＳ１／１−Ａｇ４−１、Ｐ３−ｘ６３−Ａｇ８．６５３、Ｓｐ２／０−Ａｇ１４、又はＨＬ１−６５３ミエローマ系のいずれかを、標準的技法に従い融合パートナーとして使用することができる。これらのミエローマ系はＡＴＣＣ（Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ、Ｍｄ）から入手可能である。他のミエローマ系を使用することができる。
【０１０６】
望ましいハイブリドーマを含む生成した細胞は、ＨＡＴ培地などの選択培地中で次いで増殖させ、その中で非融合状態の親ミエローマ又はリンパ球細胞は最終的に死滅する。ハイブリドーマ細胞のみが生存し、限界希釈条件下で増殖させて単離クローンを得ることができる。ハイブリドーマの上清は、例えば免疫処置用に使用されているタンパク質を使用するイムノアッセイ技法によって、望ましい特異性の存在に関してスクリーニングする。陽性クローンは限界希釈条件下で次いでサブクローニングすることができ、生成されるモノクローナル抗体を単離することができる。
【０１０７】
当該のタンパク質に特異的である、ポリクローナル抗体及びモノクローナル抗体を得ることができる。
【０１０８】
モノクローナル抗体を単離及び精製するための、さまざまな従来の方法を使用して、他のタンパク質及び汚染物質を含まない抗体を得ることができる。モノクローナル抗体を精製するために一般的に使用されている方法には、硫酸アンモニウム沈殿法、イオン交換クロマトグラフィー、及び親和性クロマトグラフィーがある（Ｚｏｌａら、「モノクローナルハイブリドーマ抗体：技法及び適用例（Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ）」、Ｈｕｒｅｌｌ（編）ｐｐ．５１〜５２（ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ、１９８２）中を参照）。これらの方法に従い生成されるハイブリドーマは、当分野で知られている技法を使用して、ｉｎ ｖｉｔｒｏ又はｉｎ ｖｉｖｏ（腹水中）で増殖させることができる（Ｆｉｎｋら、Ｐｒｏｇ．Ｃｌｉｎ．Ｐａｔｈｏｌ．、９：１２１〜３３（１９８４）、図６−１、１２３ページを概ね参照のこと）。
【０１０９】
一般に個々の細胞系はｉｎ ｖｉｔｒｏ、例えば研究室の培養容器中で増殖させることができ、高濃度の一種の特異的モノクローナル抗体を含む培養培地はデカンテーション、濾過、又は遠心分離によって採取することができる。
【０１１０】
さらに、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）_２及びＦ_Ｖ断片などの、タンパク質と反応性がある活性結合領域を含むこれらの抗体の断片を生成することができる。当分野で十分に確立されている技法を使用して、このような断片を生成することができる（例えば、Ｒｏｕｓｓｅａｕｘら、「酵素学的方法（Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ）」、１２１：６６３〜６９、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ（１９８６）中を参照）。
【０１１１】
本発明のさらに他の態様は、疾患を検出するためにタンパク質を検出するためのスクリーニング法である。疾患が発症すると、活性タンパク質の発現の低下がある。一般に、本発明のスクリーニング法の一実施形態は、
（１）患者由来の血漿サンプルを用意すること、
（２）血漿サンプル中の活性タンパク質の濃度を測定すること、及び
（３）血漿サンプル中の活性タンパク質の濃度と患者の疾患の存在又は不在を関連付けて、患者の疾患の存在又は不在を決定することを含む。
【０１１２】
典型的には、血漿サンプル中の活性タンパク質の濃度は、前に記載した抗体を使用するイムノアッセイによって測定する。ＥＬＩＳＡ、ラジオイムノアッセイなどの幾つかのイムノアッセイ形式、及び当分野でよく知られている他の形式を使用することができる。競合又は非競合イムノアッセイのいずれかを使用することができる。典型的には抗体を標識するが、競合イムノアッセイ用などに抗原を標識することもできる。放射活性標識、蛍光標識、化学発光標識、生物発光標識、及び酵素標識を含めた、さまざまな型の標識を使用することができる。イムノアッセイは、この参照によって本明細書に組み込まれる、Ｅ．Ｈａｒｌｏｗ＆Ｄ．Ｌａｎｅ、「抗体：研究室マニュアル（Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ）」（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ、ニューヨーク、１９８８）、第１４章、ｐｐ．５５３〜６１２中に記載されている。
【０１１３】
他のスクリーニング法では、タンパク質をコードするｍＲＮＡの量を検出する、何故ならこれが発現と直接関係があるからである。この他の一実施形態では、スクリーニング法は、
（１）患者由来の細胞のサンプルを採取すること、
（２）そのサンプルからｍＲＮＡを単離すること、
（３）タンパク質をコードするサンプル中のｍＲＮＡの量又は濃度を測定すること、及び
（４）タンパク質をコードするサンプル中のｍＲＮＡの量又は濃度と患者の疾患の存在又は不在を関連付けて、患者の疾患の存在又は不在を決定することを含む。
【０１１４】
細胞及び組織からｍＲＮＡを単離するための方法は当分野でよく知られており、ここでさらに詳細に記載する必要はない。このような方法は、この参照によって本明細書に組み込まれる、Ｊ．Ｓａｍｂｒｏｏｋ＆Ｄ．Ｗ．Ｒｕｓｓｅｌｌ、「分子クローニング：研究室マニュアル（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ）」（第３版、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ、ニューヨーク、２００１）、第１巻、第７章中に詳細に記載されている。ＩαＩｐタンパク質複合体をコードするサンプル中のｍＲＮＡの、量又は濃度を測定するステップを行うための１つの方法は、オリゴ−ｄＴプライマー、及び逆転写酵素を使用するポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を行って、サンプル中のポリアデニル化ｍＲＮＡのＤＮＡコピーを作製することである。このＤＮＡコピーは、次いでＩαＩｐタンパク質複合体遺伝子に特異的なプライマーを使用する第二のＰＣＲ反応において増幅させる。この手法は、この参照によって本明細書に組み込まれる、Ｃ．Ｒ．Ｃａｎｔｏｒ＆Ｃ．Ｌ．Ｓｍｉｔｈ、「ゲノミクス：ヒトゲノムプロジェクトの背景にある科学及び技術（Ｇｅｎｏｍｉｃｓ：Ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｂｅｈｉｎｄ ｔｈｅ Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｏｍｅ Ｐｒｏｊｅｃｔ）」（Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ、１９９９）、ｐｐ．１１９〜１２０中に記載されている。ＩαＩｐタンパク質複合体をコードするサンプル中のｍＲＮＡの、量又は濃度を測定するステップを行うための他の方法は、ノーザンブロッティングを使用して、ハイブリダイゼーションによって特異的なｍＲＮＡを検出することである。これは適切なＤＮＡ標識プローブが利用可能であることを必要とし；典型的には、標識プローブを放射標識する。この方法は当分野でよく知られており、この参照によって本明細書に組み込まれる、例えばＰ．Ａ．Ｓａｂｅｌｌｉ、「ノーザンブロッティング（Ｎｏｒｔｈｅｒｎ Ｂｌｏｔｔｉｎｇ）」中、「分子生物学的方法の教本（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｍｅｔｈｏｄｓ Ｈａｎｄｂｏｏｋ）」（Ｒ．Ｒａｐｌｅｙ＆Ｊ．Ｍ．Ｗａｌｋｅｒ、ｅｄｓ．、Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ、ニュージャージー州トトワ、１９９８）、第９章、ｐｐ．８９〜９４中に記載されている。
【０１１５】
治療用タンパク質の翻訳後修飾は、ｉｎ ｖｉｖｏの生物活性、クリアランス率、免疫原性及び／又は安定性に影響を与える可能性がある。本発明の我々の肝細胞系発現系によって分泌されるタンパク質は、組換え相当物より自然に働く。例えば本発明者は、その不死化ヒト肝細胞の細胞系は生物学的活性があるＩαＩｐを生成し、したがって、組換え技術によって生成することができないこのタンパク質の有力な市販用供給源であることを実証している。したがって、本発明者がその「本来の」形のＩαＩｐを生成することによって、敗血症などの生命を脅かす疾患を治療するための、より有効で、安全で、且つコスト効率の良い解決策がもたらされる。
【０１１６】
タンパク質を生成するのに適した細胞系を使用することによって、ウイルス汚染の再発的危険無しで血漿由来のタンパク質と類似した多数の生成物を生成する、一連のタンパク質精製スキームを使用することも可能になる。これらの肝細胞由来の血漿タンパク質は、従来技術の欠点を克服する、本来の血漿タンパク質を商業的に生産するための安全で、有効で、且つコスト効率の良い戦略をもたらす。
【０１１７】
有用性
血漿タンパク質複合体を生成する、ウイルスにより不死化肝臓細胞系の使用の例
以下は、血漿タンパク質、より詳細にはＩαＩｐタンパク質複合体を生成するウイルスにより不死化させた肝臓細胞系の使用である。これらの使用は、ＩαＩｐタンパク質複合体のその生成、及び他のタンパク質のその考えられる生成と関係がある。
【０１１８】
（１）考えられる化学療法剤の同定：これらの細胞は、試験する化学物質を含むｉｎ ｖｉｔｒｏの培地中で細胞を増殖させ、次いで適切な露出期間の後に、どの程度の細胞毒性が存在したかどうかを、例えばいずれも当分野でよく知られている標準的技法である、トリパンブルー排除アッセイ又は関連アッセイ（Ｐａｔｅｒｓｏｎ、「酵素学的方法（Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ）」、５８：１４１（１９７９））によって、或いはコロニー形成効率アッセイ（ＭａｃＤｏｎａｌｄら、Ｅｘｐ．Ｃｅｌｌ．Ｒｅｓ．、５０：４１７（１９６８））などの増殖アッセイによって測定することによって、癌及び関連疾患を治療するのに適した化学物質をスクリーニングするのに有用である。
【０１１９】
（２）遺伝子発現を誘導又は阻害する生物学的物質による遺伝子発現の制御の調査。化学物質及び生物学的物質は、それらをこれらの肝細胞の増殖培地に加え、次いで適切な期間の後に、ＤＮＡ合成の中止、（ＲＴ−ＰＣＲ分析によって測定される）遺伝子発現の誘導又は阻害、及び（免疫化学的技法によって測定される）肝臓特異的タンパク質の生成を含めた変化の複合が生じるかどうかを判定することによって、遺伝子発現又は代謝経路を誘導又は阻害する、それらの能力に関してスクリーニングする。遺伝子発現及び代謝経路の誘導又は阻害に対する化学物質及び生物学的物質の影響を確認することは、癌などの疾患を治療するための新たな薬剤標的を同定するための１つの方法である。
【０１２０】
（３）発癌性物質及び他の生体異物の代謝の試験：発癌性物質及び他の生体異物はこれらの細胞の増殖培地に加えることができ、これらの化合物の代謝産物の出現は、薄層クロマトグラフィー又は高性能液体クロマトグラフィーなどの技法によって調べることができ、化合物及び／又はそれらの代謝産物とＤＮＡの相互作用を決定する。
【０１２１】
（４）ＤＮＡの突然変異誘発の試験：突然変異誘発物質であることが知られているか或いはその疑いがある物質は、細胞の増殖培地に加えることができ、次いで突然変異を、例えば薬剤耐性突然変異細胞コロニーの出現を検出することによってアッセイすることができる（Ｔｈｏｍｐｓｏｎ、「酵素学的方法（Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ）」、５８：３０８、１９７９）。
【０１２２】
（５）無胸腺ヌードマウスにおける足場非依存性増殖又は腫瘍形成などの標準的アッセイを使用する、化学的、物理的及びウイルス因子、並びに腫瘍由来の癌遺伝子及び高分子量ゲノムＤＮＡを含めた転移遺伝子による悪性形質転換の試験。例えば、クローニングしたウイルス癌遺伝子Ｎ−ｒａｓ（多くの肝細胞癌中に存在する癌遺伝子）は、リン酸ストロンチウム法によるトランスフェクションを使用して肝細胞中に導入することができる。マウス中で腫瘍を形成し、且つ足場非依存式に増殖する新たにトランスフェクトされた細胞の二次的な能力を評価することができる。
【０１２３】
（６）（前のパラグラフ（１）に記載した技法によって）考えられる化学療法剤、特に特定の癌遺伝子又は癌遺伝子の組合せの活性化によって形質転換した細胞に特異的である可能性がある化学療法剤をスクリーニングするための、前のパラグラフ（５）中と同様の癌遺伝子の移動によって改変した細胞の使用。
【０１２４】
（７）前のパラグラフ（１）〜（６）に記載したものだけには限られないが、これらを含めた細胞増殖及び外因性因子の作用と関連付けた、細胞内ｐＨ及びカルシウムレベルの変化を含めた細胞生化学の試験。細胞内ｐＨ及びカルシウムレベルを試験するために、適切な培養容器中の細胞を蛍光指示薬色素に曝し、次いで蛍光発光を蛍光分光光度計を用いて検出する（Ｇｒｙｎｋｉｅｗｉｃｚら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２６０：３４４０〜３４５０（１９８５））。
【０１２５】
（８）増殖因子に対する細胞応答、及び増殖因子の生成の試験：ヒト肝臓の肝細胞の増殖及び分化にとって重要な増殖因子の同定及び精製。これらの細胞はこのような適用例に非常に有用である、何故ならそれらは、無血清培地中で増殖するからである。したがって、増殖因子に対する応答は正確に定義された増殖培地において試験することができ、細胞によって生成される任意の因子を、血清が存在する複雑な状況無しで同定及び精製することができる。
【０１２６】
（９）当該のタンパク質を生成するための組換えＤＮＡ発現ベクターの使用。これはＩαＩｐタンパク質複合体に関して前に記載し；同様の技法を他のタンパク質に使用することができる。例えば、治療的価値があるタンパク質をコードする遺伝子は、制御用ＤＮＡセグメント（即ち、エンハンサー配列を含むか或いは含まないプロモーターを含む）を用いて組換え、細胞中に移すことができ（例えばリン酸ストロンチウム法によるトランスフェクションによって）、次いで生成されたタンパク質を、当分野でよく知られている通常の手順によって、培養物上清又は細胞抽出物から採取することができる。
【０１２７】
（１０）ｉｎ ｖｉｔｒｏで増殖する細胞がギャップ接合部を介して伝達する能力を有するかどうかを判定するための、例えばｄｙｅ ｓｃｒａｐｅ ｌｏａｄｉｎｇアッセイによる細胞内伝達の試験。増殖培地中で蛍光色素の存在下において、例えばメスを用いて培養物をかき取ることができる。創傷の端部の細胞を機械的に破壊し、したがって色素を採取し；細胞内伝達が起こったかどうかは、創傷から離れた細胞も色素を含むかどうかを測定することによって確認することができる。
【０１２８】
（１１）細胞表面抗原の特徴付け：当該の細胞表面抗原に対する抗体と共に細胞をインキュベートし、次いで蛍光色素と結合した二次抗体と反応させる。次いで蛍光活性化細胞選別器を使用して細胞を評価して、それらが蛍光性であるかどうか、したがって細胞表面抗原を有するかどうかを判定する。
【０１２９】
（１２）腫瘍抑制活性を同定するための細胞−細胞ハイブリッドの試験（Ｓｔｒａｎｂｒｉｄｇｅら、「サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ）」、２１５：２５２〜２５９（１９８２））。これらの細胞系が腫瘍抑制遺伝子を含むかどうかを判定するために、それらを悪性腫瘍細胞と融合させる。腫瘍抑制遺伝子の存在は、例えば無胸腺ヌードマウス中、ハイブリッド細胞中で腫瘍を形成する能力の消失によって検出されるように、悪性明腫瘍の消失によって示される。
【０１３０】
（１３）標準的な分子生物学的技法（Ｄａｖｉｓら、「分子生物学における方法（Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ）」、ニューヨーク：Ｅｌｓｅｖｉｅｒ（１９８６））、及びｃＤＮＡサブトラクションクローニングなどの技法、並びに類似の方法を使用する、前のパラグラフ（５）に記載した自然に存在する癌中の形質転換遺伝子、前のパラグラフ（８）に記載したのと同様の増殖因子の遺伝子、前のパラグラフ（１２）に記載したのと同様の腫瘍抑制遺伝子を含めた、新規な遺伝子の同定。
【０１３１】
（１４）複製肝炎ウイルスの増殖（例えばＨＢＶ、非Ａ非Ｂ、ＨＡＶ及び他の肝臓向性ウイルス、例えばＣＭＶなど）。ヒト肝臓癌細胞系用に確立されたトランスフェクションの方法（Ｓｅｌｌｓ、Ｍ．Ａ．ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．、８４：４４４〜４４８）を使用する、複製肝炎ウイルスを含むヒト肝臓の肝細胞のクローン細胞系の確立。ＨＢＶ、ＨＢＶの能力を含むヒト肝臓の肝細胞系を単独で、及びアフラトキシンＢなどの化学的な肝臓の発癌性物質と共に使用することによって、足場非依存性増殖アッセイ及び無胸腺ヌードマウスにおける増殖を使用して悪性形質転換を評価することができる。パラグラフ（１３）中の技法と同様の細胞−細胞ハイブリッド技法を使用して、ＨＢＶトランスフェクション前後の悪性細胞との融合によって、腫瘍抑制遺伝子の考えられる不活性化を評価することができる。
【０１３２】
スクリーニングキットは、細胞系及び他の従来要素、並びに試験を行うためのラベル使用説明書を含む他のスクリーニングキットと同様に容易に組み立てられる。
【０１３３】
（１５）肝臓移植、並びに埋め込み型及び体外用の肝機能支援デバイス用に細胞を増殖させる方法として、不死化細胞を使用することができる。さらに、これらの細胞は、臓器移植用、遺伝性代謝障害、特に肝機能低下と関係がある疾患（即ち、幾つかの疾患は特定の遺伝子の欠失又は異常によるものである）の治療用に、細胞にトランスフェクトした／移した他の遺伝子を有することができる。したがってこの遺伝子は、ＩαＩｐタンパク質複合体を生成するのに有用な細胞にトランスフェクトすることができ、細胞は次いで臓器移植用に増殖させることができると思われる。
【０１３４】
（１６）薬剤、発癌性物質、生体異物の細胞毒性の試験：薬剤、発癌性物質、生体異物は細胞の増殖培地に加えることができ、露出時間の関数としての細胞の生存能力は、遺伝子発現概略、色素除外、酵素漏出、コロニー形成効率などのアッセイを使用して確認することができる。
【０１３５】
（１７）遺伝子発現の試験：薬剤、化学物質、新たな化学的物質などは、細胞の培養培地に加えることができ、露出の関数としての遺伝子発現の変化は、生物学的終点でのＲＮＡ及びタンパク質の発現を使用して調べることができる。変化は特定の遺伝子の誘導又は阻害のいずれかを反映する可能性がある。例えば、細胞を薬剤、化学物質、新たな化学的物質などと共に培養して、ＣＹＰ３Ａ４又はＣＹＰ１Ａ２と表されるシトクロムＰ４５０だけには限られないがこれらを含めた薬剤代謝酵素、多剤耐性遺伝子、胆管輸送体、グルクロニルトランスフェラーゼ、グルタチオントランスフェラーゼ、サルファターゼなどの発現を調節する物質を同定することができる。
【０１３６】
（１８）肝臓寄生虫の試験：培養細胞は、肝細胞を侵襲する寄生虫のライフサイクルを試験するのに、有効であることが明らかになると思われる。
【０１３７】
（１９）肝細胞由来のタンパク質の生成。このことは、これらの細胞による血漿タンパク質、特に治療用血漿タンパク質の発現及び生成に関して前に広く記載している。適切な培地中に維持された細胞は、血液凝固因子（例えば、第ＶＩＩＩ因子及び第ＩＸ因子）、α−１−抗トリプシン、ヒト成長ホルモン、増殖因子などのタンパク質を自然に発現すると思われ、これらを精製し使用することができる。これらのタンパク質は、分化したヒト肝細胞によって発現され得る任意のタンパク質であってよい。この範疇のタンパク質は、これらの細胞によって本来コードされており、これらの細胞によって構成上、或いは１つ又は複数のホルモンシグナルなどの外部刺激に応答して発現されるタンパク質を含む。この範疇のタンパク質は、これらのタンパク質の遺伝子がこれらの細胞中に導入されるとき、タンパク質がプロセシングされグリコシル化されて、そのｉｎ ｖｉｖｏ機能が実質的に保たれるように、これらの細胞によって発現され得るタンパク質も含む。これは、増殖因子、血液凝固因子、α−１−抗トリプシンなどの抗トリプシン、及びその一次構造が部位特異的突然変異誘発などの遺伝子工学の標準的技法によって改変されるその他のタンパク質などのタンパク質のムテインを含むことができる。この範疇のタンパク質は、アルブミン、トランスコバラミンＩＩ、Ｃ−反応性タンパク質、フィブロネクチン、又はセルロプラスミン、及び構造活性、酵素活性、又は輸送活性を有する他のタンパク質を含めた治療又は診断対象の他のタンパク質も含むことができる。
【０１３８】
本発明の方法によって生成されるタンパク質を使用して、非常にさまざまな状態、肝臓に影響を与える状態と肝臓以外の臓器に影響を与える状態の両方を治療することができる。後者は肝臓以外の部位の癌、関節炎症、及び関節炎を含むことができる。これらのタンパク質はＩαＩｐ複合体、及び前に記載したこれらの方法によって生成される他のタンパク質を含むことができる。
【０１３９】
細胞系のこれらの性質は、有用性のある他のスクリーニングアッセイを行う能力を与える。
【０１４０】
例えば本発明は、化学療法活性に関して化合物をスクリーニングする方法であって、
（１）Ｆａ２Ｎ−４及びＥａ１Ｃ−３５からなる群から選択される肝細胞の細胞系を用意するステップ、
（２）スクリーニングする化合物に細胞系を曝すステップ、及び
（３）細胞系においてスクリーニングする化合物によって誘導される細胞毒性の程度を測定して、その化合物が化学療法活性を有するかどうか判定するステップを含む方法を含む。
【０１４１】
本発明は、突然変異誘発活性に関して化合物をスクリーニングする方法であって、
（１）Ｆａ２Ｎ−４及びＥａ１Ｃ−３５からなる群から選択される肝細胞の細胞系を用意するステップ、
（２）スクリーニングする化合物に細胞系を曝すステップ、及び
（３）細胞系においてスクリーニングする化合物によって誘導される突然変異誘発の程度を測定して、その化合物が突然変異誘発活性を有するかどうか判定するステップを含む方法も含む。
【０１４２】
さらに本発明は、遺伝子発現を誘導又は抑制する活性に関して化合物をスクリーニングする方法であって、
（１）Ｆａ２Ｎ−４及びＥａ１Ｃ−３５からなる群から選択される肝細胞の細胞系を用意するステップ、
（２）スクリーニングする化合物に細胞系を曝すステップ、及び
（３）細胞系においてスクリーニングする化合物による抑制又は誘導効果を測定して、その化合物が遺伝子発現を誘導又は抑制する活性を有するかどうか判定するステップを含む方法も含む。
【０１４３】
同様に本発明は、細胞毒性に関して化合物をスクリーニングする方法であって、
（１）Ｆａ２Ｎ−４及びＥａ１Ｃ−３５からなる群から選択される肝細胞の細胞系を用意するステップ、
（２）スクリーニングする化合物に細胞系を曝すステップ、及び
（３）濃度及び露出時間の片方或いは両方の関数として細胞系の生存能力を測定することによって、細胞系においてスクリーニングする化合物によって誘導される細胞毒性の程度を測定して、その化合物が細胞毒性活性を有するかどうか判定するステップを含む方法も含む。
【０１４４】
本発明の最も重要なスクリーニング法の１つは、薬剤−薬剤相互作用に関するスクリーニング法である。これらはシトクロムＰ４５０（ＣＹＰ）酵素又はＭＤＲ１などの多種薬剤輸送体（ＭＤＲ）タンパク質のいずれかによって仲介することができる。これらの薬剤−薬剤相互作用は、１薬剤の投与が第二の薬剤の代謝に干渉する場合、非常に臨床上重要である。これらは処方薬又は市販薬によって生じる可能性がある。
【０１４５】
本発明の薬剤−薬剤相互作用の存在に関してスクリーニングするための１つの方法は、
（１）Ｆａ２Ｎ−４及びＥａ１Ｃ−３５からなる群から選択される肝細胞の細胞系を用意するステップ、
（２）第一の薬剤に細胞系を曝すステップ、
（３）第一の薬剤によって誘導されるシトクロムＰ４５０酵素の生成を測定することによって、第二の薬剤を代謝することができるシトクロムＰ４５０酵素の生成を第一の薬剤が誘導するかどうか判定して、第一の薬剤と第二の薬剤の間の相互作用の存在に関してスクリーニングするステップを含む。
【０１４６】
薬剤−薬剤相互作用の存在に関してスクリーニングするための他の方法は、
（１）Ｆａ２Ｎ−４及びＥａ１Ｃ−３５からなる群から選択される肝細胞の細胞系を用意するステップ、
（２）第一の薬剤に細胞系を曝すステップ、
（３）第一の薬剤によって誘導されるＭＤＲタンパク質の生成を測定することによって、ＭＤＲタンパク質の生成を第一の薬剤が誘導するかどうか判定して、第一の薬剤と第二の薬剤の間の相互作用の存在に関してスクリーニングするステップを含む。
【０１４７】
本明細書に記載する実施例及び実施形態は単なる例示目的であり、それらを鑑みたさまざまな変更形態又は変形は当業者の念頭に浮かび、それらの変更形態又は変形は本出願の精神及び範囲内、並びに添付の特許請求の範囲に含まれることは理解されよう。
【実施例】
【０１４８】
以下の実施例は、決して本発明の範囲を制限することは目的とせずに、本発明の具体的な実施形態を記載する目的で示す。
【０１４９】
（実施例１）
不死化ヒト肝細胞の特徴付け
１００を超えるヒト肝細胞のクローン細胞系を、ＳＶ４０初期プロモーターの制御下でシミアンウイルス４０のラージＴ抗原とスモールｔ抗原遺伝子を用いて、ヒト肝細胞をトランスフェクトすることによって確立した。Ｅａ１Ｃ−３５及びＦａ２Ｎ−４と表した２つの細胞系を記載する。
【０１５０】
２つの細胞系は、ＳＶ４０のラージＴ抗原とスモールｔ抗原を含むベクターを用いた、低温保存した初代ヒト肝細胞のリポフェクション介在トランスフェクションによって作製した。Ｅａ１Ｃ−３５細胞系は、不死化ベクターｐＢｌｕｅＴａｇ、野生型ＳＶ４０の初期領域を含む組換えプラスミドを用いた、低温保存したヒト肝細胞のトランスフェクションから誘導した。ｐＢｌｕｅＴａｇベクターを以下のように構築した：ｐＢＲ／ＳＶ（ＡＴＣＣ）を制限酵素ＫｐｎＩ及びＢａｍＨＩを用いて消化して、スモールｔ抗原及びラージＴ抗原由来のＳＶ４０初期プロモーター及びコード領域を含む２９９５ｂｐの断片を切り離した（２３９〜２４６８ｂｐ、Ｆｉｅｒｓ、Ｗら、「サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ）」、２７３：１１３〜１２０に従い番号処理）。このＫｐｎＩ／ＢａｍＨＩ断片をｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＳＫベクター（Ｓｔｒａｔｅｇｅｎｅ）中に挿入してｐＢｌｕｅＴａｇ；ＳＶ４０プロモーターを使用してＴ抗原の発現を誘導するＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ系ベクターを生成した。ｎｅｏプラスミドのコトランスフェクションによって選択可能なマーカーとして、ネオマイシン耐性をトランスフェクト細胞に与えた。Ｇ４１８含有培地中で増殖するそれらの能力に基づいて、クローンを最初に選択した。Ｅａ１Ｃ−３５細胞系を確立し、ＭＣＴの占有血清含有培地、ＣＳＭ中に保った。
【０１５１】
１つの不死化ベクターを用いたリポフェクション介在トランスフェクションによって、Ｆａ２Ｎ−４細胞系を不死化させた。ｐＢｌｕｅＴａｇベクター中に含まれるＳＶ４０ゲノムの初期領域は、ＩｎｖｉｖｏＧｅｎ ｐＧＴ６０ｍｃｓプラスミドに基づく骨格中に挿入し、ｐＴａｇ−１と名付けた。Ｔ−抗原コード領域は、ハイブリッドｈＥＦ１−ＨＴＬＶプロモーターの影響下に存在する。このベクターは、薬剤選択可能なマーカーとしてヒグロマイシン耐性遺伝子もコードしている。ヒグロマイシン含有培地中で増殖するそれらの能力に基づいて、クローンを選択した。Ｆａ２Ｎ−４細胞系を確立し、ＭＦＥ中に保った。
【０１５２】
（実施例２）
肝臓特異的転写因子の発現
肝臓特異的転写因子の保持は肝機能の発現に関する前提条件なので、クローン細胞系を、ヒトＨＮＦ１、ＨＮＦ３、ＨＮＦ４α、ＨＮＦ４γ及びＣ／ＥＢＰ及びアルブミン用のプライマーを使用するＲＴ−ＰＣＲによって最初にスクリーニングした。簡潔には、Ｂｒｅｎｎｅｒら（５５）のマイクロ単離法を使用して、それぞれのクローン細胞系の１０^６個の細胞から全ＲＮＡを調製した。前の参照に関する情報はどこに存在するのだろうか？５０μｇの大腸菌ｒＲＮＡ（Ｓｉｇｍａ）を担体として使用して、少数の細胞からのＲＮＡの単離を容易にした。Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ Ｃｅｔｕｓ、遺伝子増幅ＲＮＡ ＰＣＲキットを使用して、ＲＴ−ＰＣＲ反応を行った。供給者の使用説明書に従いランダムヘキサマー及びＭ−ＭＬＶ逆転写酵素を使用して、１μｇの全ＲＮＡを逆転写した。ＰＣＲ反応はオリゴヌクレオチドプライマーを使用して行い、それによってそれぞれの転写因子に特有のヌクレオチド断片を明らかにした。これらのプライマーは、Ｃｒｕａｃｈｅｍ（Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）によって商業的に合成及び精製された。１分間５８℃のアニーリング温度を使用して、３０サイクルＰＣＲ反応を行った。臭化エチジウムを用いた染色後１％アガロースゲル中において、ＰＣＲ産物を眼に見える状態にした。陽性対照サンプルは、新たに単離したヒト肝細胞の全ＲＮＡのＲＴ−ＰＣＲ分析物を含んでいた（示さず）。表１に以下に示したように、両方の細胞系が全部で５個の肝細胞関連転写因子を発現した。肝臓特異的な遺伝子発現の指標として、アルブミン生成を測定した。表１に以下に示したように、ヒトアルブミンを認識する抗体を使用してＥＬＩＳＡアッセイによって検出すると、両方の細胞系が無血清調整培地にアルブミンを分泌する。
【表１】

【０１５３】
（実施例３）
ＳＶ４０介在の増殖活性
初代ヒト肝細胞は、培養時に限られた増殖活性を有する。この特性を克服するために、ＳＶ４０のラージＴ抗原とスモールｔ抗原をゲノムに導入した。生成したクローン細胞系、Ｆａ２Ｎ−４及びＥａ１Ｃ−３５は、その後１８ヶ月までの間、培養中維持した。両方の不死化細胞系が、ＭＦＥ培地中に維持すると増殖及び機能し、これらは低温保存し積み重ねることができる。ラージＴ抗原及びアルブミンに対する多価抗体を使用する間接的免疫蛍光染色は、細胞系は核局在不死化遺伝子を発現し続け（図１ａ）、且つ分化機能が特徴的な肝細胞特異的遺伝子を発現し続けることを実証した（図１ｂ）。Ｅａ１Ｃ−３５細胞系の形態は以下に示す（図１ｃ）。
【０１５４】
（実施例４）
薬剤代謝データ
両方の細胞系が、モデル基質の代謝に基づいて単層培養物中の、第Ｉ相（シトクロムＰ４５０）及び第ＩＩ相共役反応を触媒し続ける。最も重要な第Ｉ相酵素の１つはＣＹＰ３Ａ４であり、これは全薬剤の約５０％の代謝を担う。ＣＹＰ３Ａ４の発現は、このＰ４５０の全体的発現を誘導又は阻害する可能性がある多剤摂取を含めた、多くの要因によって調節される可能性がある。したがって、薬剤の有効な治療用量は、ＣＹＰ３Ａ４の発現によって部分的には決定される。
【０１５５】
遺伝子の転写応答性を調べることによって、及びモデル基質（即ちテストステロン）に対する酵素活性を測定することによって、ＣＹＰ３Ａ４調節物質を同定することができる。例えば、原型の薬理学的ＣＹＰ３Ａ４誘導物質（即ちリファンピン）に対する転写応答性を、特異的プライマーを使用する逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）によってアッセイして、ＣＹＰ３Ａ４のｍＲＮＡを検出することができる。リファンピンに誘導されるＣＹＰ３Ａ４酵素活性も、細胞をテストステロンと共にインキュベートするときは、６β−ＯＨ−テストステロン代謝産物の生成によって測定することができる。表２に以下に示したように、Ｆａ２Ｎ−４細胞系は、Ｅａ１Ｃ−３５細胞系よりもＣＹＰ誘導物質に対して感受性が強い。
【０１５６】
細胞系が第ＩＩ相共役酵素を発現し続けることを実証するために、細胞を２４時間アセトアミノフェンに曝し、調整培養培地を回収し、アセトアミノフェングルクロン酸又はアセトアミノフェン硫酸の共役体の生成に関して分析した。アセトアミノフェングルクロン酸とアセトアミノフェン硫酸の共役体の生成は、ＨＰＬＣ分析によって測定した。これらの結果は表２中に示す。継代数の影響を決定するために、アセトアミノフェングルクロン酸及びアセトアミノフェン硫酸の生成を、１１、１４、２７、３２、４０、及び４１継代後のＦａ２Ｎ−４細胞に関して測定した。第４１継代に関して、アンモニアのクリアランスも、窒素代謝の指標として測定した。これらの結果は表３中に示す。これらの結果は、両方の経路が完全無欠であることを示す。
【表２】


【表３】

【０１５７】
（実施例５）
ＣＹＰ誘導物質を同定し順位付けするための不死化肝細胞の使用
２つの系の証拠は、不死化ヒト肝細胞を使用して、「誘導能力」に基づいてＣＹＰ３Ａ４誘導物質を同定し順位付けすることができることを示す。第一に、表４に以下に示したように、Ｆａ２Ｎ−４細胞をリファンピン（１０μＭ）に曝すことによって、デキサメタソン（５０μＭ）又はフェノバルビタール（１ｍＭ）などの弱性ＣＹＰ３Ａ４誘導物質で細胞を処理するより、多量の６β−ＯＨ−テストステロン代謝産物の生成がもたらされる。第二にイムノブロット分析は、それぞれの細胞系をリファンピン又はフェノバルビタールに４８〜７２時間曝すことによって、媒体処理した対照と比較してＣＹＰ３Ａ４タンパク質の発現が増大したが；しかしながらリファンピンへの露出が、ＣＹＰ３Ａ４タンパク質のより増大した発現をもたらしたことを実証した。このデータは図２中に示す。
【表４】

【０１５８】
（実施例６）
Ｆａ２Ｎ−４及びＥａ１Ｃ−３５細胞系による血漿タンパク質の発現
タンパク質バイオファクトリーと同様の不死化ヒト肝細胞の使用は、大量培養中に維持すると、細胞系が増殖し血漿タンパク質を分泌し続けることを必要とする。この問題に取り組むために、これらの細胞系による血漿タンパク質の発現を分析した。これらの細胞系の高分化性は、成体肝細胞の機能特異的血漿タンパク質のその連続的な分泌によってさらに支持される（図３）。培養培地は、６０ｍｍプレート又は回転容器に接種したＦａ２Ｎ−４及びＥａ１Ｃ−３５細胞から採取し、ウエスタンブロット分析によって分析した。培地は限外濾過によって５０倍に濃縮し、４０μｇの合計タンパク質をアルブミン以外レーン毎に充填した（１０μｇの合計タンパク質／レーン）。アルブミン、α−１−抗トリプシン、第ＶＩＩＩ因子及び第ＩＸ因子に対するモノクローナル抗体又は親和性精製ポリクローナル抗体と共にブロットをインキュベートし、ホースラディッシュペルオキシダーゼと結合した二次抗体を使用して眼に見える状態にし、次にＤＡＢ基質と共にインキュベートした。図３に以下に示したように、両方の細胞系がアルブミン、α−１−抗トリプシン、及び第ＩＸ因子を発現し続ける。第ＶＩＩＩ因子の発現はさまざまであり、細胞系及び培養条件に大きく依存した。第ＩＸ因子のプロセシングにおいて不均一性が存在し、ヒト血漿由来のタンパク質においても観察された。
【０１５９】
確認事項として、Ｆａ２Ｎ−４細胞はＴ−１５０フラスコ中、無血清培地中で集合状態まで増殖させ、アルブミン生成はＥＬＩＳＡアッセイによって測定した。これらの結果は表４中に示す。これらの結果は、アルブミンの生成が少なくとも４１代の細胞の継代中続くことを示す。
【表５】

【０１６０】
インターα阻害剤タンパク質（ＩαＩｐ）、血漿中で比較的高い濃度で見られる天然セリンプロテアーゼ阻害剤は、炎症、傷の治癒及び癌転移において役割を果たすことが示されてきており、これはＢｏｓｔら、［１９］によって総説されている。ＩαＩｐは、肝細胞によって作製され分泌される血漿タンパク質のファミリーである。ＩαＩｐの主な形は、インターα阻害剤（ＩαＩ、ビクニンと呼ばれる１つの軽鎖ペプチド及び２つの重鎖を含む）、及びプレ−ａ−阻害剤（ＰαＩ、１つの軽鎖及び１つの重鎖を含む）である。近年、ヒトＩαＩｐの軽鎖を認識するモノクローナル抗体（モノクローナル抗体６９．３１）が、Ｐｒｏｔｈｅｒａ Ｂｉｏｌｏｇｉｃｓの科学者によって開発された。競合ＥＬＩＳＡにおいてモノクローナル抗体６９．３１を使用して、これらの研究者は、血漿ＩαＩｐレベルは健康な対照と比較して重度の敗血症患者において有意に低下したことを実証した（Ｌｉｍ ＹＰ、Ｂｅｎｄｅｌｊａ Ｋ、Ｏｐａｌ ＳＭ、Ｓｉｒｙａｐｏｒｎ Ｅ、Ｈｉｘｓｏｎ ＤＣ、Ｐａｌａｒｄｙ ＪＥ．「重度の敗血症患者の死亡率と血漿中のインターα阻害剤のレベルの間の相関関係。（Ｃｏｒｒｅｌａｔｉｏｎ Ｂｅｔｗｅｅｎ Ｍｏｒｔａｌｉｔｙ ａｎｄ ｔｈｅ Ｌｅｖｅｌｓ ｏｆ Ｉｎｔｅｒ−ａｌｐｈａ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ ｉｎ Ｐｌａｓｍａ ｏｆ Ｓｅｖｅｒｅｌｙ Ｓｅｐｔｉｃ Ｐａｔｉｅｎｔｓ．）」「感染疾患ジャーナル（Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ Ｄｉｓｅａｓｅ）」、１８８：９１９〜９２６、２００３）。
【０１６１】
モノクローナル抗体６９．３１を使用するウエスタンブロット分析によって、Ｆａ２Ｎ−４細胞系とＥａ１Ｃ−３５細胞系の両方が、免疫反応性ＩαＩｐを合成し続けることが明らかになった（データ示さず）。その後、調整培地に分泌されたＩαＩｐの量を、ＥＬＩＳＡアッセイを使用して定量化した（以下の実施例を参照）。
【０１６２】
（実施例７）
定量ＥＬＩＳＡ及びトリプシン阻害アッセイ
調整培地の全体的なトリプシン阻害活性は、主要なセリンプロテアーゼ阻害剤、α−１−抗トリプシン及びＩαＩｐ由来の活性を含む。１）トリプシンなどのプロテアーゼの阻害を測定するｉｎ ｖｉｔｒｏアッセイ、及び２）モノクローナル抗体６９．３１、ヒトＩαＩｐ）を特異的に認識するＰｒｏｔｈｅｒａ Ｂｉｏｌｏｇｉｃｓ（ｐｒｏｖｉｄｅｎｃｅ、Ｒｈｏｄｅ Ｉｓｌａｎｄ）からのモノクローナル抗体を使用する競合ＥＬＩＳＡをそれぞれ使用して、ＩαＩｐを機能的且つ定量的に測定することができる。トリプシン阻害アッセイを使用して、発色性トリプシン基質Ｌ−ＢＡＰＡ（Ｎ（α）−ベンゾイル−Ｌ−アルギニン−４−ニトロアニリド塩酸塩、Ｆｌｕｋａ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ）を使用することによって、セリンプロテアーゼ阻害剤の生物学的活性を調べる。このアッセイは、Ｌ−ＢＡＰＡの加水分解を阻害するセリンプロテアーゼ阻害剤の能力に基づく。４１０ｎｍにおけるΔ吸光度／分の比の低下によって、阻害を調べることができる。タンパク質１ｕｇ当たりの生物学的活性に基づき、比活性を計算した。肝細胞の細胞系Ｆａ２Ｎ４及びＥａ１Ｃ３５の調整培地を回収し、３０ｋＤ断片を有するＡｍｉｃｏｎ Ｕｌｔｒａ限外濾過装置（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を使用することによって５０倍に濃縮した。調整培地の全体的なトリプシン阻害活性は、主要なセリンプロテアーゼ阻害剤、α−１−抗トリプシン及びＩαＩｐ由来の活性を含み、これらはウエスタンブロット（前を参照）及びＥＬＩＳＡアッセイ（以下参照）によって検出されたように肝細胞の調整培地中に存在した。培地中のＩαＩｐの量も競合ＥＬＩＳＡにおいて測定した。ＥＬＩＳＡは以下のように行った：９６ウェルＩｍｍｕｎｏｌｏｎ−４プレート（Ｄｙｎｅｘ、ＵＳＡ）は、精製ＩαＩｐ（３００ｎｇ）を５０ｍＭの炭酸塩バッファーｐＨ９．６に溶かしたものでコーティングし、４℃で一晩インキュベートした。精製したヒト血漿由来のＩαＩｐを１％ラット血清を含むＰＢＳに希釈した一連の希釈液を使用して、標準曲線を確立した。培養培地中のＩαＩｐレベルの定量分析用に、５０μＬの培地又は連続的に希釈したＩαＩｐを、９６ウェルプレートの個々のウェルに加えた。５０μＬのモノクローナル抗体６９．３１をそれぞれのウェルに加えた後、プレートは３７℃で１時間インキュベートし、次に自動プレート洗浄装置（Ｌａｂｓｙｓｔｅｍ）を使用して洗浄した。ＨＲＰ結合ヤギ抗マウスＩｇＧ（ヒト吸収性）（Ｂｉｏｓｏｕｒｃｅ、Ｃａｍａｒｉｌｌｏ、ＣＡ、ＵＳＡ）を３７℃で１時間加えることによって、結合したモノクローナル抗体６９．３１を検出した。洗浄後、１００μＬの１−Ｓｔｅｐ ＡＢＴＳ（Ｐｉｅｒｃｅ、Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、ＩＬ、ＵＳＡ）をウェルに加え、４０５ｎｍにおける吸光度をＥＬＩＳＡプレートリーダー（ＢｉｏＴｅｋ）で測定した。それぞれのサンプルは三連で試験した。非調整培養培地は、基本対照として使用した。これらの結果は表５中に示す：
【表６】

【０１６３】
（実施例８）
Ｆａ２Ｎ−４及びＥａ１Ｃ−３５細胞系における酵素誘導
シトクロムＰ４５０（ＣＹＰ）及び関連薬剤代謝酵素（輸送体含む）の誘導は、臨床上有意な薬剤相互作用の十分に認められている原因、及び薬物動態学的耐性又は自己誘導（それによって薬剤がその独自の肝臓代謝を誘導するプロセス）の原因である（１，２）。近年の証拠は、幾つかの型の薬剤誘導型肝臓毒性の重要な決定因子としての酵素誘導を示す（３）。ｉｎ ｖｉｔｒｏでの酵素誘導を評価するための指針は、Ｔｕｃｋｅｒら（４）及びＢｊｏｒｓｓｏｎら（５）によって略述されている。この２つの「一致した報告」は、新たな化学物質（ＮＣＥ）及び薬剤候補の酵素誘導能力を評価するための選択−価値基準−の方法としての、ヒト肝細胞の初代培養を認めている。ヒト由来の試験系に基づくこのｉｎ ｖｉｔｒｏ手法は、実験動物における試験に基づくｉｎ ｖｉｖｏ手法より優れている、何故なら薬剤は、種特異的な形式で酵素誘導を引き起こすことが知られているからである（１）。実際、この実施例中に後で記載する試験で使用した２つの原型誘導物質、即ちオメプラゾール及びリファンピンはヒトＣＹＰ１Ａ２及びＣＹＰ３Ａ４の有効な誘導物質であるが、それらはラット又はマウスにおいて対応する酵素は誘導しない。ヒト肝細胞の初代培養物及びＦａ２Ｎ−４細胞において酵素誘導の試験を行うための基本手順は、図４のフローチャートに示す。
【０１６４】
コラーゲンとそれらが接着した後、一致した報告（４，５）の推奨に従い、肝細胞を２日間培養する。このいわゆる適応期中に、肝細胞はその正常な肝細胞形態及び機能を取り戻す。この再分化の前に、肝細胞は酵素誘導型の薬剤の影響を受けない。肝細胞は、３日間連続で１日１回、試験品並びに陰性及び陽性対照（即ち、溶媒対照及びヒトＣＹＰ酵素の原型誘導物質）で処理する。酵素誘導は、肝細胞自体、或いは好ましくは肝細胞から調製したミクロソームにおける、ｍＲＮＡ分析、ウエスタンイムノブロッティング及び／又は酵素活性の測定を含めたさまざまな技法によって最後の処理後２４時間で評価する。後者の手法は、肝細胞から単離したミクロソーム（ｉｎ ｖｉｔｒｏ）とヒト肝臓から直接単離したミクロソーム（ｅｘ ｖｉｖｏ）の間の、ｉｎ ｖｉｔｒｏ−ｅｘ ｖｉｖｏの比較を可能にする。酵素活性の測定は、２つの一致した報告（４，５）では終点において奨励されている。
【０１６５】
Ｆａ２Ｎ−４細胞における酵素誘導を評価するための手順は、図４中に示すヒト肝細胞に関して記載した手順と著しく似ている。Ｆａ２Ｎ−４細胞は、ＭＣＴによって開発された専有培地中のコラーゲン基質上で増殖させる。ＭＦＥ支持培地Ｆと呼ばれる（以前は多機能性増強（ＭＦＥ）培地として知られていた）この培地は、ＸｅｎｏＴｅｃｈから入手可能である。細胞はトリプシン処理によって脱着させ、遠心分離によって単離し、所望の形式（例えば６−、１２−、２４−又は９６−ウェルプレート）でコラーゲンと再度接着させる。２日間の適応期の後、３日間連続で１日１回、試験品並びに適当な陰性及び陽性対照（即ち、溶媒対照及びヒトＣＹＰ酵素の原型誘導物質）で細胞を処理する。酵素誘導は、最後の処理後２４時間で評価する。
【０１６６】
図５に示すように、形態学的に、Ｆａ２Ｎ−４細胞はヒト肝細胞と非常に似ている。このことは、正常な肝細胞の形状は正常な肝細胞の機能と非常に関係があるので重要であり；この両方が、高分化性の肝細胞の発現を表す（７〜９）。
【０１６７】
一致した報告（４，５）は、ｍＲＮＡ又は免疫反応性タンパク質のレベルの測定ではなく、酵素活性の測定を使用する酵素誘導の評価を推奨したが、これらの後者の終点は、誘導の機構に関する貴重な情報を与えることが多い。例えば一致した報告（４，５）は、ＣＹＰ３Ａ４の阻害剤と誘導物質の両方であるリトナビルに関して近年報告されたのと同様に（１３）、ＣＹＰ活性を非常に強く阻害し、したがってそれらの阻害効果がそれらの誘導効果を封じる化合物による誘導を明らかにすることもできる。この問題は、Ｆａ２Ｎ−４細胞における酵素誘導の化学的特異性に関する項で後に論じる。
【０１６８】
ヒト肝細胞において酵素誘導の試験を行うとき、ＸｅｎｏＴｅｃｈはミクロソーム中の酵素活性を測定する。培養した肝細胞から調製したミクロソーム中で測定したＣＹＰ活性（ｉｎ ｖｉｔｒｏ活性）は、ヒト肝臓から直接調製したミクロソーム中で測定したＣＹＰ活性（ｅｘ ｖｉｖｏ活性）と比較することができる。このような比較によって、ヒト肝細胞を培養するためのＸｅｎｏＴｅｃｈの技法は、ｉｎ ｖｉｖｏで肝細胞中に存在する活性に匹敵するＣＹＰ酵素活性を維持するという、説得力のある証拠が得られる。
【０１６９】
このような分析用にミクロソームを調製するために、ＸｅｎｏＴｅｃｈは、大きな（６０ｍｍ）皿中でヒト肝細胞を培養し、このことは一般にこのような試験を、薬剤開発プロセスにおいて非常に十分な進展性がある薬剤候補の分析に限定する。Ｆａ２Ｎ−４細胞は、多数の新たな化学物質（ＮＣＥ）の酵素誘導性を分析する能力を与え、前臨床薬剤の開発又は発見における酵素誘導能力の評価を可能にする。この目的を念頭において、ＸｅｎｏＴｅｃｈは、６−、１２−、２４−及び９６−ウェルプレートを含めたさまざまな高スループット形式で、Ｆａ２Ｎ−４細胞における酵素誘導を測定することに焦点を当てている。細胞をこのような条件下で培養するとき、ミクロソームを調製することは実際的ではなく、したがって酵素活性の測定に基づく誘導の評価は、マーカー基質をＦａ２Ｎ−４細胞に加えることを含まなければならない。
【０１７０】
ＸｅｎｏＴｅｃｈは、フェナセチン（ＣＹＰ１Ａ２測定用）、ブプロピオン（ＣＹＰ２Ｂ６測定用）、ジクロフェナク（ＣＹＰ２Ｃ９測定用）又はミダゾラム（ＣＹＰ３Ａ４測定用）と共に細胞をインキュベートすることによって、Ｆａ２Ｎ−４細胞における酵素誘導を評価している。それぞれの場合、基質の最終濃度は１００μＭである。代謝産物の形成は、ＬＣ／ＭＳ／ＭＳによってさまざまな時間地点（８時間まで）において、細胞培養培地の等分試料をアッセイすることによって測定する。さまざまな条件下において異なるＣＹＰ活性の比較を容易にするために、これらの結果は、８時間の時間地点で測定した対照の活性に対して表す。
【０１７１】
Ｆａ２Ｎ−４細胞は、酵素誘導物質に適切に応答する。ヒト肝細胞の場合と同様に、ＣＹＰ１Ａ２はＡｈ受容体を活性化させる物質によって十分に誘導可能であるが、一方ＰＸＲ及び／又はＣＡＲを活性化させる物質はＣＹＰ３Ａ４の誘導を引き起こし、より低い程度でＣＹＰ２Ｂ６及びＣＹＰ２Ｃ９の誘導を引き起こす。図６中に示すように、Ｆａ２Ｎ−４細胞を１００μＭのオメプラゾールで処理することによってＣＹＰ１Ａ２活性の顕著な誘導が引き起こされるが、一方２０μＭのリファンピンを用いた処理はＣＹＰ３Ａ４を誘導し、より低い程度でＣＹＰ２Ｂ６及びＣＹＰ２Ｃ９の活性を誘導する。図６中に示した実験用に、Ｆａ２Ｎ−４細胞は６−ウェルプレート中で培養した。
【０１７２】
Ｆａ２Ｎ−４細胞における酵素誘導は１つの実験から次の実験に、及び異なる大きさのマルチ−ウェルプレート中で再現可能である。図７は３つの異なるプレート形式中の、リファンピンによるＣＹＰ２Ｂ６の誘導（ブプロピオンヒドロキシラーゼ）活性の再現性の比較結果を示す。さらに、多数回の細胞継代中のＣＹＰ１Ａ２及びＣＹＰ３Ａ４誘導の再現性を評価し、これらの結果は図８中に示す。第３２〜４７継代中の誘導の程度の再現性は両方のＣＹＰ酵素に関しては良く、ヒト肝細胞の個々の調製物を用いて典型的に見られる誘導の再現性より優れている。異なる個体由来のヒト肝細胞の調製によって、同一条件下での誘導の程度の非常に大きな変化を実証することができる。したがって、多数回の継代したＦａ２Ｎ−４細胞の誘導の再現性は、同じ、又は異なる、新たなヒト肝細胞調製物を用いた再現性より著しく優れている。
【０１７３】
広くは知られていないが、ヒト肝細胞における酵素誘導は細胞培養系の形式によって影響を受け、したがって誘導の程度は、ウェルの大きさが小さくなると低下し再現性が低くなる傾向がある。この特徴（及びヒト肝臓の限られた不規則な供給）が、９６−ウェル形式での高スループットスクリーニング用のヒト肝細胞の使用を複雑にする。この複雑性はＦａ２Ｎ−４細胞に関しては存在しない。
【０１７４】
Ｆａ２Ｎ−４細胞における酵素誘導を、６−、１２−及び２４−ウェルプレートにおいて評価した。図９に示すように、リファンピンによるＣＹＰ２Ｂ６の誘導は６−、１２−及び２４−ウェルプレートにおいて同一である（９６−ウェルプレートにおける試験は進行中である）。同一の結果をＣＹＰ２Ｃ９に関して得た（結果は示さず）。図１０は、オメプラゾールによるＣＹＰ１Ａ２の誘導及びリファンピンによるＣＹＰ３Ａ４の誘導に対する、細胞培養形式の影響を示す。細胞培養形式は、誘導の程度が１２−、２４−又は９６−ウェル形式より６−ウェル中で大きかった点で、ＣＹＰ１Ａ２の誘導に影響を与えるようである。しかしながら、いずれの場合もオメプラゾールは、対照の少なくとも９倍ＣＹＰＩＡ２活性を誘導した（注：９６−ウェルプレートにおけるＣＹＰ１Ａ２の誘導はおそらく９．３倍より大きかった、何故ならこの場合、フェナセチンＯ−の脱アルキル化を１時間後に観察し、図６に示すように、これはＣＹＰ１Ａ２活性を測定するのに最適ではないからである）。ＣＹＰ３Ａ４の場合、リファンピンによる誘導は６−、１２−、２４−及び９６−ウェル形式で同等である（図１０）。
【０１７５】
全体的に、図９及び１０中の結果は、Ｆａ２Ｎ−４細胞における酵素誘導は９６−ウェルプレートを含めたさまざまな細胞培養形式で評価することができることを示し、酵素誘導物質の高スループットスクリーニングの良い前兆となる。
【０１７６】
Ｆａ２Ｎ−４におけるＣＹＰ酵素活性の誘導は、適切で予想される時間行程に従う。ＣＹＰ酵素の最大の誘導を得るために、一致した報告（４，５）において推奨されたのと同様に、ヒト肝細胞は試験品及び原型誘導物質（陽性対照）を用いて３〜５日間連続で処理する。Ｆａ２Ｎ−４細胞におけるＣＹＰ１Ａ２及びＣＹＰ３Ａ４誘導の時間行程を図１１に示す。これらの結果は、ヒト肝細胞の初代培養物において観察した結果と同様である（１２）。
【０１７７】
Ｆａ２Ｎ−４細胞における酵素誘導は、適切な範囲の誘導物質濃度で起こる。Ｆａ２Ｎ−４におけるオメプラゾールによるＣＹＰ１Ａ２の誘導、及びリファンピンによるＣＹＰ３Ａ４の誘導に関する濃度応答曲線を示すグラフを、図１２に示す。同様の結果が、ヒト肝細胞において観察される（１２，１３）。ヒト肝細胞に関する試験用に、１００μＭのオメプラゾール及び２０μＭのリファンピンを通常通り使用して、それぞれＣＹＰ１Ａ２及びＣＹ３Ａ４の最大誘導を得ることができる。これらの同じ濃度は、Ｆａ２Ｎ−４細胞における誘導試験に勧められる。リファンピンの場合、２０μＭを超える濃度は、Ｆａ２Ｎ−４細胞において最大未満の誘導を引き起こした。同様の現象が幾つかのヒト肝細胞の調製物（１３）において観察されたが、他の調製物（１２）では観察されなかった。
【０１７８】
Ｆａ２Ｎ−４細胞は、ヒト肝細胞においてＣＹＰ酵素を誘導する化合物、及びＣＹＰ酵素を誘導しない化合物に適切に応答する。例えば、図１３中に示すような、ヒト肝細胞（１３）においてＰＸＲを活性化させＣＹＰ３Ａ４を誘導することを以前に示した化合物は、Ｆａ２Ｎ−４細胞においてＣＹＰ３Ａ４活性を誘導するが、一方Ａｈ受容体アゴニストは誘導しない。１つの例外はクロトリマゾールであり、これはＣＹＰ３Ａ４の酵素生合成の誘導物質及び酵素活性の阻害剤である。この場合、ＣＹＰ３Ａ４の誘導は、クロトリマゾールの阻害効果によって封じられた（これは臨床観察結果と一致する）。Ｆａ２Ｎ−４細胞においてクロトリマゾールを用いて得た結果は、ＣＹＰ３Ａ４の阻害剤及び誘導物質でもあるリトナビアーで処理した、ヒト肝細胞において観察される結果を暗示する（１３）。化合物が阻害剤及び誘導物質の両方として働くとき、酵素活性及びｍＲＮＡ又は免疫反応性タンパク質レベルを測定することによって、酵素誘導を評価することが役立つ。この教訓は、ヒト肝細胞及びＦａ２Ｎ−４細胞に当てはまる。
【０１７９】
Ｐｆｉｚｅｒ（Ｍｉｌｌｓら、［１４］）及びＨｏｆｆｍａｎｎ−Ｌａ Ｒｏｃｈｅ（Ｍｏｒｒｉｓら、［１５］）の研究者達は、Ｉｎｖａｄｅｒ（登録商標）切断アッセイ（１４）又はＴａｑＭａｎ ＲＴ−ＰＣＲ（１５）によって測定した、ｍＲＮＡレベルの測定値に主に基づいてＦａ２Ｎ−４細胞における酵素誘導を調べた。両方の試験において、ＣＹＰ１Ａ２、ＣＹＰ２Ｃ９、ＣＹＰ３Ａ４及びＰ−糖タンパク質（ＭＤＲ−１）をコードするｍＲＮＡの誘導は、６−及び２４−ウェルプレート（１４）中、或いは６−及び９６−ウェルプレート（１５）中で、さまざまな誘導物質（Ｍｉｌｌｓらの場合リファンピン、フェノバルビタール、デキサメタソン、クロトリマゾール、β−ナフトフラボン及びクリシン、並びにＭｏｒｒｉｓらの場合リファンピン、フェノバルビタール及びオメプラゾール）で処理したＦａ２Ｎ−４細胞において測定した。Ｍｉｌｌｓら（１４）は、β−ナフトフラボン（１０μＭ）はＣＹＰ１Ａ２のｍＲＮＡを６倍まで誘導し；リファンピン（２０μＭ）はＣＹＰ３Ａ４及びＣＹＰ２Ｃ９のｍＲＮＡをそれぞれ１５倍及び３倍まで誘導し、且つフェノバルビタール（１ｍＭ）は３Ａ４及びＣＹＰ２Ｃ９のｍＲＮＡをそれぞれ１２倍及び２．５倍まで誘導することを報告した。６−ウェルプレートと比較してわずかに低い誘導を、２４−ウェルプレートにおいて観察した。例えばリファンピンは、２４−ウェルプレート中での９倍に対して、６−ウェルプレート中でＣＹＰ３Ａ４のｍＲＮＡを１５倍誘導した。一般に、この報告中に記載された結果はＭｉｌｌｓら（１４）によって報告された結果と似ているが、この２つの試験を比較することによって、ＣＹＰ３Ａ４の場合、ｍＲＮＡレベルでの誘導は酵素活性レベルでの誘導より大きく、一方でＣＹＰ１Ａ２の場合は逆が真実であるらしいことが示唆される。しかしながら、特に異なる終点を測定するとき、異なる研究室で行われる試験の結果を比較することは簡単ではない。Ｍｏｒｒｉｓら（１５）による試験では、ＣＹＰ２Ｃ９及びＣＹＰ３Ａ４の誘導は、９６−ウェル形式で活性レベルとｍＲＮＡレベルの両方において測定した。ＣＹＰ３Ａ４の場合、ｍＲＮＡレベルは活性より増大し（例えば１０μＭのリファンピンは、ＣＹＰ活性の７．７倍の増大に対してｍＲＮＡレベルを１１倍増大させた）、一方ＣＹＰ２Ｃ９の場合は逆のことを観察した（ＣＹＰ２Ｃ９活性の２．６倍の増大に対してｍＲＮＡは１．４倍増大した）。Ｍｏｒｒｉｓら（１５）は、ＣＹＰ３Ａの誘導は、ＣＹＰ３Ａ５（主に腎臓形）又はＣＹＰ３Ａ７（主に胎児形）ではなくＣＹＰ３Ａ４の誘導によるものであったことも実証し、これはＦａ２Ｎ−４細胞が高分化成体肝細胞と同様に働くという主張を支持する。Ｍｉｌｌｓら（１４）と同様に、Ｍｏｒｒｉｓら（１５）は、リファンピン（又は高濃度のフェノバルビタール）を用いてＦａ２Ｎ−４細胞を処理することによって、輸送体Ｐ−糖タンパク質（ＭＤＲ−１）及びＭＲＰ２をコードするｍＲＮＡの２倍までの増大が引き起こされたことを実証した。全体として、ＸｅｎｏＴｅｃｈで行われた試験と、ＰｆｉｚｅｒでＭｉｌｌｓら（１４）及びＨｏｆｆｍａｎｎ−Ｌａ ＲｏｃｈｅでＭｏｒｒｉｓら（１５）によって行われた試験の間には十分な一致がある。
【０１８０】
表６は、Ｆａ２Ｎ−４細胞及びヒト肝細胞の初代培養物における、ＣＹＰ１Ａ２、ＣＹＰ２Ｂ６、ＣＹＰ２Ｃ９及びＣＹＰ３Ａ４の誘導の程度を要約するものである。後者のデータは、ＸｅｎｏＴｅｃｈの最近の刊行物（Ｍａｄａｎら、２００３）からのものである。ＣＹＰ１Ａ２の場合、Ｆａ２Ｎ−４細胞における誘導の程度は、ヒト肝細胞における平均誘導倍数より大きかった。ＣＹＰ２Ｂ６、ＣＹＰ２Ｃ９及びＣＹＰ３Ａ４の場合、Ｆａ２Ｎ−４細胞における誘導の程度は、ヒト肝細胞における中央誘導倍数に匹敵したが、平均誘導倍数未満であった。ヒト肝細胞において中央誘導倍数は平均誘導倍数と相当異なる、何故なら後者は、非常に高い誘導倍数値を有する偶発的サンプルによって著しく影響を受けるからである。このことは、ゼロ（１．５倍未満）〜１４５倍の範囲であるＣＹＰ３Ａ４誘導に関して図１４に示す。
【表７】

【０１８１】
図１５は、Ｆａ２Ｎ−４細胞中のＣＹＰ１Ａ２及びＣＹＰ３Ａ４活性に対する酵素誘導物質の影響も示す。左図は、フェナセチンのＯ−脱アルキル化を触媒するＣＹＰ１Ａ２に関する誘導倍数を示す。試験した化合物は、オミプラゾール、３−メチルコラントレン、ラノプラゾール、１，２−ベンズアントラセン、β−ナフトフラボン、レスベラトール、プロベネシド、ベンゾ［ａ］ピレン、オルティプラツ、フェニトイン、及びベンゾ［ｅ］ピレンであった。右図は、ミダゾラム１’−ヒドロキシル化を触媒するＣＹＰ３Ａ４に関する誘導倍数を示す。試験した化合物は、リファンピン、デキサメタソン、ハイパーフォリン、フェノバルビタール、サルフィンピラゾン、シグリタゾン、フェニトイン、エファビレンツ、トロレアンドマイシン、シムバスチン、ビタミンＤ３、プロベネシド、トログリタゾン、カルベマゼピン、タモキシフェン、オメプラゾール、フェキソフェナジン、３−メチルコラントレン、及びクロトリマゾールであった。
【０１８２】
ヒト肝細胞中のＣＹＰ３Ａ４の平均誘導倍数は１０倍であるが、より有意な比較基準である中央誘導倍数は約４倍である。
【０１８３】
培養中のＦａ２Ｎ−４細胞は、ヒト肝細胞の初代培養物と形態的及び機能的に類似している。酵素誘導物質に対するこの細胞系の応答は、ヒト肝細胞において観察される応答と非常に似ており、これは薬剤候補の酵素誘導能力を評価するための、選択−価値基準−のｉｎ ｖｉｔｒｏ系であると考えられる。Ｆａ２Ｎ−４細胞はヒト肝細胞に優る幾つかの利点を与え；その内の幾つかによってＦａ２Ｎ−４細胞は、新たな化学物質の高スループットスクリーニング用の有望なｉｎ ｖｉｔｒｏ試験系となる。その供給が制限的で不安定であるヒト肝臓とは対照的に、Ｆａ２Ｎ−４細胞は非制限的供給で利用可能である。Ｆａ２Ｎ−４細胞におけるＣＹＰ酵素活性の誘導は、ヒト肝細胞における誘導より再現性がある。さらに、Ｆａ２Ｎ−４細胞におけるＣＹＰ誘導は、９６−ウェルプレートを含めたさまざまな細胞培養形式で測定することができるが、これはヒト肝細胞に関しては常に可能であるわけではない。ヒト肝細胞の初代培養物は、薬剤候補の酵素誘導能力を評価するためのｉｎ ｖｉｔｒｏ試験系に適しているとして、統制機関によって現在認められている。ただし試験は、一致した報告（４，５）中に概略された推奨に従い行うものとする。Ｆａ２Ｎ−４細胞系は、独特の性質を有する新たな細胞系である。このように、それは統制機関によって認められていないが、Ｆａ２Ｎ−４細胞とヒト肝細胞の初代培養物の間の類似性は、このような承認は将来考えられることを示唆する。
【０１８４】
この報告は、Ｆａ２Ｎ−４細胞系における酵素誘導に焦点を当てている。Ｍｉｌｌｓら（１４）によるＰｆｉｚｅｒでの試験は、Ｅａ１Ｃ−３５細胞系を酵素誘導試験用に使用することもできるが、Ｅａ１Ｃ−３５は高い基本ＣＹＰ酵素活性を有しており、誘導の程度を下げる可能性があることを示唆する。Ｈｏｆｆｍａｎｎ−Ｌａ ＲｏｃｈｅでのＭｏｒｒｉｓらによる近年の試験によって、この観察結果が支持される（１５）。両方の細胞系を使用して、細胞毒性を引き起こすそれらの能力に関して化合物を調べることができる。実際、細胞毒性の１つ又は２つの試験（例えば、膜の完全性を評価するための酵素漏出、及びミトコンドリアの呼吸を評価するためのアラマーブルーによる還元）を含み、したがって酵素誘導の真の欠如を、細胞毒性のために起こる酵素誘導の失敗と区別することができることが望ましい。
【０１８５】
薬剤誘導型の肝臓毒性は重大な臨床上の問題であり、稀ではあるが重度の（さらには致死的な）肝臓毒性の症例を引き起こすそれらの能力のために、幾つかの薬剤は市場から撤退している。ＸｅｎｏＴｅｃｈの科学者達は、細胞内タンパク質（αＧＳＴ又はＬＤＨ）の放出及びミトコンドリアの呼吸の乱れによって決定される、最終段階の損なわれた膜の完全性を使用する、異なる濃度の知られている毒物及び非毒物に対するＦａ２Ｎ−４細胞の応答の予備分析を終えている。
【０１８６】
毒性試験における不死化肝細胞の使用に関する結果は、図１６に示す。毒性濃度（１００μＭまで）の幾つかの物質、即ち３−メチルコランスレン、メトトレキセート、メナジオン、ロテノン、及びトログリタゾンで細胞を処理することによって、膜の完全性の消失が起こり、細胞内酵素、即ちα−グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ（α−ＧＳＴ）の培地への放出がもたらされ、これはＢｉｏｔｒｉｎ Ｈｉｇｈ Ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ Ａｌｐｈａ ＧＳＴ ＥＩＡ（Ｂｉｏｔｒｉｎ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ、ダブリン、アイルランド）によって測定した。対照的に、非毒性濃度のオメプラゾール、アセトアミノフェン、プロベネシド、フェバメート、又はリファンピンで処理したＦａ２Ｎ−４細胞からは、α−ＧＳＴはほとんど或いは全く放出されなかった。これらの物質の幾つか、アセトアミノフェンなどは、臨床上有意な肝臓毒性を引き起こす可能性があるが、高用量（したがって、図１６に示すこの試験で使用した濃度よりはるかに高い濃度）においてのみであることを記さなければならない。毒性データは表７にも要約する。
【表８】

【０１８７】
Ｆａ２Ｎ−４細胞は、臨床上有意な肝臓毒性を引き起こす高い可能性を有する化合物を同定するための、他の系に対する優れた代替を提供し得る。
【０１８８】
この記載に関して、ＸｅｎｏＴｅｃｈはＦａ２Ｎ−４細胞中でＣＹＰ１Ａ２、２Ｂ６、２Ｃ９及び３Ａ４活性を検出しており、さらに高い活性がＥａ１Ｃ−３５細胞中に存在する。これらの細胞系は、アセトアミノフェンとグルクロン酸を結合させることがＭＣＴによって示されてきている。これらの発見は、片方又は両方の細胞系が、薬剤候補の代謝安定性を評価する際に有用である可能性があることを示唆する。しかしながら、両方の系の基本代謝率は非常に低いので、代謝安定性の試験において現在推奨されているそれらの使用を我々は実現することができない。代謝安定性試験を適切に支持することができる不死化肝細胞の有用性をもたらす可能性がある、Ｆａ２Ｎ−４又はＥａ１Ｃ−３５細胞による異なる手法を、我々は検索中である。
実施例８に関する参照文献
１．Ａ．Ｐａｒｋｉｎｓｏｎ．「生体異物の生物学的形質転換。（Ｂｉｏｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｏｆ Ｘｅｎｏｂｉｏｔｉｃｓ．）」、第６章：「カサレット及びドールの毒物学（Ｃａｓａｒｅｔｔ ａｎｄ Ｄｏｕｌｌ’ｓ Ｔｏｘｉｃｏｌｏｇｙ）」中。「毒物の基本科学（Ｔｈｅ Ｂａｓｉｃ Ｓｃｉｅｎｃｅ ｏｆ Ｐｏｉｓｏｎｓ）」。第６版（Ｅｄ：Ｃ．Ｄ．Ｋｌａａｓｓｅｎ）。ＭｃＧｒａｗ Ｈｉｌｌ。ニューヨーク、ｐｐ．１３３〜２２４、２００１。
２．Ｒ．Ｌｅｖｙ、Ｋ．Ｔｈｕｍｍｅｌ、Ｗ．Ｔｒａｇｅｒ、Ｐ．Ｈａｎｓｔｅｎ及びＭ．Ｅｉｃｈｅｌｂａｕｍ．「代謝薬剤相互作用。（Ｍｅｔａｂｏｌｉｃ Ｄｒｕｇ Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ．）」、Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ、Ｗｉｌｌｉａｍ＆Ｗｉｌｋｉｎｓ、ペンシルベニア州フィラデルフィア、２０００。
３．Ｊ．Ｚｈａｎｇ、Ｗ．Ｈｕａｎｇ、Ｓ．Ｃｈｕａ、Ｐ．Ｗｅｉ及びＤ．Ｄ．Ｍｏｏｒｅ．「生体異物受容体ＣＡＲによるアセトアミノフェン誘導型肝臓毒性の調節。（Ｍｏｄｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ａｃｅｔａｍｉｎｏｐｈｅｎ−ｉｎｄｕｃｅｄ ｈｅｐａｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ ｂｙ ｔｈｅ ｘｅｎｏｂｉｏｔｉｃ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ＣＡＲ．）」、サイエンス２９８、４２２〜４２４、２００２
４．Ｇ．Ｔ Ｔｕｃｋｅｒ、Ｊ．Ｂ．Ｈｏｕｓｔｏｎ及びＳ−Ｍ．Ｈｕａｎｇ．「薬剤開発の最適化：同意に向けた薬剤代謝／輸送体相互作用の可能性を評価するための戦略（Ｏｐｔｉｍｉｚｉｎｇ ｄｒｕｇ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ：Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ ｔｏ ａｓｓｅｓｓ ｄｒｕｇ ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ／ｔｒａｎｓｐｏｒｔｅｒ ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ ｐｏｔｅｎｔｉａｌ−ｔｏｗａｒｄ ａ ｃｏｎｓｅｎｓｕｓ）」、Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃ．Ｒｅｓ．１８：１０７１〜１０８０、２００１
５．Ｔ．Ｄ．Ｂｊｏｒｎｍｓｓｏｎ、Ｊ．Ｔ．Ｃａｌｌａｇｈａｎ、Ｈ．Ｊ．Ｅｉｎｏｌｆ、Ｖ．Ｆｉｓｃｈｅｒ、Ｌ．Ｇａｎ、Ｓ．Ｇｒｉｍｍ、Ｊ．Ｋａｏ、Ｓ．Ｐ．Ｋｉｎｇ、Ｇ．Ｍｉｗａ、Ｌ．Ｎｉ、Ｇ．Ｋｕｍａｒ、Ｊ．ＭｃＬｅｏｄ、Ｓ．Ｒ．Ｏｂａｃｈ、Ｓ．Ｒｏｂｅｒｔｓ、Ａ．Ｒｏｅ、Ａ．Ｓｈａｈ、Ｆ．Ｓｎｉｋｅｒｉｓ、Ｊ．Ｔ．Ｓｕｌｌｉｖａｎ、Ｄ．Ｔｗｅｅｄｉｅ、Ｊ．Ｍ．Ｖｅｇａ、Ｊ．Ｗａｌｓｈ、Ｓ．Ａ．Ｗｒｉｇｈｔｏｎ．「ｉｎ ｖｉｔｒｏ及びｉｎ ｖｉｖｏでの薬剤−薬剤相互作用試験の実施：ＰｈＲＭＡの展望（Ｔｈｅ ｃｏｎｄｕｃｔ ｏｆ ｉｎ ｖｉｔｒｏ ａｎｄ ｉｎ ｖｉｖｏ ｄｒｕｇ−ｄｒｕｇ ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ ｓｔｕｄｉｅｓ：Ａ ＰｈＲＭＡ ｐｅｒｓｐｅｃｔｉｖｅ．）」、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．４３：４４３〜４６９、２００３
６．Ａ．Ｍａｄａｎ、Ｒ．Ａ．Ｇｒａｈａｍ、Ｋ．Ｍ．Ｃａｒｒｏｌｌ、Ｄ．Ｒ．Ｍｕｄｒａ、Ｌ．Ａ．Ｂｕｒｔｏｎ、Ｌ．Ａ．Ｋｒｕｅｇｅｒ、Ａ．Ｄ．Ｄｏｗｎｅｙ、Ｍ．Ｃｚｅｒｗｉｎｓｋｉ、Ｊ．Ｆｏｒｓｔｅｒ、Ｍ．Ｄ．Ｒｉｂａｄｅｎｅｉｒａ、Ｌ−Ｓ．Ｇａｎ、Ｅ．Ｌ．ＬｅＣｌｕｙｓｅ、Ｋ．Ｚｅｃｈ、Ｐ．Ｒｏｂｅｒｔｓｏｎ、Ｐ．Ｋｏｃｈ、Ｌ．Ａｎｔｏｎｉａｎ、Ｇ．Ｗａｇｎｅｒ、Ｌ．Ｙｕ及びＡ．Ｐａｒｋｉｎｓｏｎ．「培養ヒト肝細胞における、原型ミクロソーム酵素誘導物質のシトクロムＰ４５０の発現に対する影響（Ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ｐｒｏｔｏｔｙｐｉｃａｌ ｍｉｃｒｏｓｏｍａｌ ｅｎｚｙｍｅ ｉｎｄｕｃｅｒｓ ｏｎ ｃｙｔｏｃｈｒｏｍｅ Ｐ４５０ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｉｎ ｃｕｌｔｕｒｅｄ ｈｕｍａｎ ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅｓ．）」Ｄｒｕｇ Ｍｅｔａｂ．Ｄｉｓｐｏｓ．３１：４２１〜４３１、２００３．
７．Ｅ．ＬｅＣｌｕｙｓｅ、Ｐ．Ｂｕｌｌｏｃｋ、Ａ．Ｐａｒｋｉｎｓｏｎ ａｎｄ Ｊ．Ｈｏｃｈｍａｎ．「培養したラット肝細胞（Ｃｕｌｔｕｒｅｄ ｒａｔ ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅｓ）」：「薬剤吸収及び代謝を評価するためのモデル。（Ｍｏｄｅｌｓ ｆｏｒ ａｓｓｅｓｓｉｎｇ Ｄｒｕｇ Ａｂｓｏｒｐｔｉｏｎ ａｎｄ Ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ．）」中（編：ＲＴ Ｂｏｒｃｈａｒｄ、ＰＬ Ｓｍｉｔｈ及びＧ Ｗｉｌｓｏｎ）。第９章、ｐｐ．１２１〜１６０．Ｐｌｅｎｕｍ Ｐｒｅｓｓ、ニューヨーク、１９９６。
８．Ｅ．ＬｅＣｌｕｙｓｅ、Ｐ．Ｂｕｌｌｏｃｋ及びＡ．Ｐａｒｋｉｎｓｏｎ．「ラット肝細胞の長期培養における、正常肝臓構造及び機能の回復及び維持用の戦略（Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ ｆｏｒ ｒｅｓｔｏｒａｔｉｏｎ ａｎｄ ｍａｉｎｔｅｎａｎｃｅ ｏｆ ｎｏｒｍａｌ ｈｅｐａｔｉｃ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ａｎｄ ｆｕｎｃｔｉｏｎ ｉｎ ｌｏｎｇ−ｔｅｒｍ ｃｕｌｔｕｒｅｓ ｏｆ ｒａｔ ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅｓ．）」、Ａｄｖ．Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｒｅｖ．２２、１３３〜１８６、１９９６．
９．Ｄ．Ｍｕｄｒａ及びＡ．Ｐａｒｋｉｎｓｏｎ．「薬剤代謝試験用の肝細胞の調製。（Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅｓ ｆｏｒ ｄｒｕｇ ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ ｓｔｕｄｉｅｓ．）」：「毒物学の最新プロトコル。（Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｔｏｘｉｃｏｌｏｇｙ．）」中、Ｕｎｉｔ５．８．（編：Ｍ Ｍａｉｎｅｓ、Ｃ Ｂｒａｄ−ｆｉｅｌｄ、Ｌ Ｃｏｓｔａ、Ｅ Ｈｏｄｇｓｏｎ、Ｄ Ｒｅｅｄ及びＩＧ Ｓｉｐｅｓ）．Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ、Ｉｎｃ．２００１
１０．Ａ．Ｍａｄａｎ、Ｒ．ＤｅＨａａｎ、Ｄ．Ｍｕｄｒａ、Ｋ．Ｃａｒｒｏｌｌ、Ｅ．ＬｅＣｌｕｙｓｅ及びＡ．Ｐａｒｋｉｎｓｏｎ．「培養したラット肝細胞における、シトクロムＰ４５０酵素誘導に対する低温保存の影響。（Ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ ｃｒｙｏｐｒｅｓｅｒｖａｔｉｏｎ ｏｎ ｃｙｔｏｃｈｒｏｍｅ Ｐ４５０ ｅｎｚｙｍｅ ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ ｉｎ ｃｕｌｔｕｒｅｄ ｒａｔ ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅｓ．）」、Ｄｒｕｇ Ｍｅｔａｂ．Ｄｉｓｐｏｓ．２７：３２７〜３３５、１９９９
１１．Ｅ．ＬｅＣｌｕｙｓｅ、Ｐ．Ｂｕｌｌｏｃｋ、Ａ．Ｍａｄａｎ、Ｋ．Ｃａｒｒｏｌｌ及びＡ．Ｐａｒｋｉｎｓｏｎ．「ラット肝細胞の初代培養物における、シトクロムＰ４５０２Ｂの誘導に対する細胞外マトリクス上層及び培地配合の影響。（Ｉｎｆｌｕｅｎｃｅ ｏｆ ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ｍａｔｒｉｘ ｏｖｅｒｌａｙ ａｎｄ ｍｅｄｉｕｍ ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎ ｏｎ ｔｈｅ ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ｃｙｔｏｃｈｒｏｍｅ Ｐ４５０ ２Ｂ ｉｎ ｐｒｉｍａｒｙ ｃｕｌｔｕｒｅｓ ｏｆ ｒａｔ ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅｓ．）」、Ｄｒｕｇ Ｍｅｔａｂ．Ｄｉｓｐｏｓ．２７：９０９〜９１５、１９９９
１２．Ｅ．ＬｅＣｌｕｙｓｅ、Ａ．Ｍａｄａｎ、Ｇ．Ｈａｍｉｌｔｏｎ、Ｋ．Ｃａｒｒｏｌｌ、Ｒ．ＤｅＨａａｎ及びＡ．Ｐａｒｋｉｎｓｏｎ．「ヒト肝細胞の初代培養物における、シトクロムＰ４５０酵素の発現及び制御。（Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ａｎｄ ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｃｙｔｏｃｈｒｏｍｅ Ｐ４５０ ｅｎｚｙｍｅｓ ｉｎ ｐｒｉｍａｒｙ ｃｕｌｔｕｒｅｓ ｏｆ ｈｕｍａｎ ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅｓ．）」、Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｍｏｌ．Ｔｏｘｉｃｏｌ．１４：１７７〜１８８、２０００
１３．Ｇ．Ｌｕｏ、Ｍ．Ｃｕｎｎｉｎｇｈａｍ、Ｓ．Ｋｉｍ、Ｔ．Ｂｕｒｎ、Ｊ．Ｌｉｎ、Ｍ．Ｓｉｎｚ、Ｇ．Ｈａｍｉｌｔｏｎ、Ｃ．Ｒｉｚｚｏ、Ｓ．Ｊｏｌｌｅｙ、Ｄ．Ｇｉｌｂｅｒｔ、Ａ．Ｄｏｗｎｅｙ、Ｄ．Ｍｕｄｒａ、Ｒ．Ｇｒａｈａｍ、Ｋ．Ｃａｒｒｏｌｌ、Ｊ．Ｘｉｅ、Ａ．Ｍａｄａｎ、Ａ．Ｐａｒｋｉｎｓｏｎ、Ｄ．Ｃｈｒｉｓｔ、Ｂ．Ｓｅｌｌｉｎｇ、Ｅ．ＬｅＣｌｕｙｓｅ及びＬ−Ｓ．Ｇａｎ．「薬剤によるＣＹＰ３Ａ４誘導：プレグナンＸ受容体のレポーター遺伝子アッセイとヒト肝細胞中のＣＹＰ３Ａ４発現の間の相関関係。（ＣＹＰ３Ａ４ ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ ｂｙ ｄｒｕｇｓ：Ｃｏｒｒｅｌａｔｉｏｎ ｂｅｔｗｅｅｎ ａ ｐｒｅｇｎａｎｅ Ｘ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｒｅｐｏｒｔｅｒ ｇｅｎｅ ａｓｓａｙ ａｎｄ ＣＹＰ３Ａ４ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｉｎ ｈｕｍａｎ ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅｓ．）」、Ｄｒｕｇ Ｍｅｔａｂ．Ｄｉｓｐｏｓ．３０：７９５〜８０４、２００２
１４．Ｊ．Ｂ．Ｍｉｌｌｓ、Ｒ．Ｆａｒｉｓ、Ｊ．Ｌｉｕ、Ｓ．Ｃａｓｃｉｏ及びＳ．Ｍ．ｄｅ Ｍｏｒａｉｓ ＳＭ．「ヒト肝細胞クローン系及びＲＮＡ検出を使用する、酵素及び輸送体の誘導に関するＨＴＳアッセイ。（Ａｎ ＨＴＳ ａｓｓａｙ ｆｏｒ ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ｅｎｚｙｍｅｓ ａｎｄ ｔｒａｎｓｐｏｒｔｅｒｓ ｕｓｉｎｇ ａ ｈｕｍａｎ ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅ ｃｌｏｎａｌ ｌｉｎｅ ａｎｄ ＲＮＡ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ．）」、Ｄｒｕｇ．Ｍｅｔａｂ．Ｒｅｖ．３４：１２４、２００２．アブストラクト２４８．（２００２年１０月に年次ＩＳＳＸ会合、フロリダ州オーランドにおいて発表された）。
１５．Ａ．Ｌ．Ｍｏｒｒｉｓ、Ｅ．Ａｗｗａｌ及びＫ．Ｂ．Ｆｒａｎｋ．「Ｆａ２Ｎ−４不死化ヒト肝細胞系を使用する、シトクロムＰ４５０及び薬剤輸送体のｉｎ ｖｉｔｒｏでの誘導。（Ｉｎ ｖｉｔｒｏ ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ｃｙｔｏｃｈｒｏｍｅ Ｐ４５０ｓ ａｎｄ ｄｒｕｇ ｔｒａｎｓｐｏｒｔｅｒｓ ｕｓｉｎｇ ｔｈｅ Ｆａ２Ｎ−４ ｉｍｍｏｒｔａｌｉｚｅｄ ｈｕｍａｎ ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅ ｌｉｎｅ．）」、Ｄｒｕｇ．Ｍｅｔａｂ．Ｒｅｖ．３５：１２５、２００３．アブストラクト２４９．（２００３年１０月に年次ＩＳＳＸ会合、ロードアイランド州プロビデンスにおいて発表された）。
【０１８９】
（実施例９）
細胞系Ｆａ２Ｎ−４を使用する薬剤代謝酵素及びＭＤＲ１の誘導
シトクロムＰ４５０（ＣＹＰ）を含めた薬剤代謝酵素、及び輸送体は、薬剤のクリアランスと関係がある。ＣＹＰは、酸化及びヒドロキシル化を含めた、さまざまな薬剤代謝反応を行う。薬剤代謝酵素及び輸送体と関係がある薬剤−薬剤相互作用は、有害反応及び有効性の消失の報告（Ｂａｃｉｅｗｉｃｚら、１９８７；Ｓｐｉｎａら、１９９６）によって関心が高まっている。薬剤開発中に、ｉｎ ｖｉｔｒｏアッセイを使用して誘導物質を回避し、肝臓によって増大した薬剤のクリアランスによる薬剤−薬剤相互作用能力を特徴付けることができる。ＣＹＰは主に肝臓中の薬剤の代謝と関係がある。ＣＹＰ３Ａ遺伝子発現の誘導はリファンピン、フェノバルビタール、クロトリマゾール、及びデキサメタソンを含めたさまざまな市販の薬剤によって引き起こされ（Ｍｅｕｎｉｅｒら、２０００；Ｓａｈｉら、２０００、Ｌｕｏら、２００２；Ｍａｄａｎら、２００３）、幾つかの一般的な薬剤−薬剤相互作用の根底を表す。ＣＹＰ１Ａ２は３−メチルコランスレン、β−ナフトフラボン、及びテトラクロロジベンゾジオキシンによって誘導可能である（Ｌｉら、１９９８；Ｂｒｅｉｎｈｏｌｔら、１９９９；Ｍｅｕｎｉｅｒら、２０００；Ｍａｄａｎら、２００３）。ＣＹＰ２Ｃ９はリファンピン及びフェノバルビタールによって誘導することができるが、しかしながら、その誘導の程度はＣＹＰ３Ａ４に関する誘導の程度より低い（Ｌｉら、１９９７；Ｍａｄａｎら、２００３）。ＵＧＴ１Ａファミリーの誘導物質には、リファンピン、クリシン、及びβ−ナフトフラボンがある（Ｌｉら、１９９７、Ａｂｉｄら、１９９７；Ｂｒｅｉｎｈｏｌｔら、１９９９）。ＭＤＲ１遺伝子産物Ｐ−糖タンパク質（Ｐ−ｇｐ）は、重要な薬剤の流出輸送体である。Ｐ−ｇｐの誘導物質にはリファンピン、フェノバルビタール、クロトリマゾール、及びデキサメタソンがある（Ｓｃｈｕｅｔｚら、１９９６；Ｇｅｉｃｋら、２００１；Ｓａｈｉら、２００３）。
【０１９０】
プレグナンＸ受容体（ＰＸＲ）は、薬剤及び他の生体異物によるＣＹＰ３Ａ遺伝子制御の主な決定要素である（Ｌｅｈｍａｎｎら、１９９８；Ｂｅｒｔｉｌｓｓｏｎら、１９９８、Ｐａｓｃｕｓｓｉら、２００３）。さらに、ＰＸＲはＣＹＰ２Ｂ６、２Ｃ８／９、及び３Ａ７、並びに薬剤輸送体ＭＤＲ１、ＯＡＴＰ−Ｃ、ＢＳＥＰ及びＭＲＰ２の誘導を仲介する（Ｐａｓｃｕｓｓｉら、２００３、Ｔｉｒｏｎａら、２００３）。ＡＤＭＥＴ終点の誘導と関係がある他の核内ホルモン受容体には、糖質コルチコイド受容体（ＧＲ）（ＣＹＰ２Ｂ６、ＣＹＰ２Ｃ８／９、ＣＹＰ３Ａ４／５）、構成的アンドロスタン受容体（ＣＡＲ）（ＵＧＴ１Ａ、ＣＹＰ２Ｂ６、ＣＹＰ３Ａ４、及びＣＹＰ２Ｃ９）、及びペルオキシソーム増殖因子活性化受容体（ＰＰＡＲ）（ＣＹＰ４Ａ）がある（Ｆｅｒｇｕｓｏｎら、２００２；Ｐａｓｃｕｓｓｉら、２００３）。サイトゾル受容体、アリール炭化水素（Ａｈ）受容体は、ＣＹＰ１Ａサブファミリーの誘導と関係がある（Ｗｈｉｔｌｏｃｋら、１９９６）。
【０１９１】
ヒト肝細胞におけるＣＹＰ誘導を評価する能力は非常に望ましい、何故なら幾つかの薬剤は、ラット中ではなくヒト中でＣＹＰ酵素を誘導し、その逆は言えないことが知られているからである（Ｂｅｒｔｉｌｓｓｏｎら、１９９８；Ｍｏｏｒｅ及びＫｌｉｅｗｅｒ、２０００）。例えば、プレグネノロン１６−α−カルボニトリルはヒト中ではなくラット中でＣＹＰ３Ａを誘導し、一方リファンピンは、ラット中ではなくヒト中での知られているＣＹＰ３Ａの誘導物質である。ヒト肝細胞の初代培養物は、ＣＹＰイソ型の種特異的な誘導を示すという独特の利点を有するが、新たな細胞の入手可能性及びドナー毎の変動性に依存する。ＨｅｐＧ２、ＬＳ１８０、及びＬＳ１７４Ｔなどの細胞系は、ＣＹＰ及び薬剤輸送体の限られた亜群の誘導を試験する際に有用であるが（Ｓｃｈｕｅｔｚら、１９９６；Ｌｉら、１９９８；Ｇｅｉｃｋら、２００１）、他の誘導性標的に関する適切な応答性を欠く（Ｓｉｌｖａ及びＮｉｃｏｌｌ−Ｇｒｉｆｆｉｔｈ、２００２）。
【０１９２】
薬剤代謝酵素及び薬剤輸送体の誘導は、ｍＲＮＡレベルで検出することができる（Ｓｃｈｕｅｔｚら、１９９６；Ａｂｉｄら、１９９７；Ｌｉら、１９９８；Ｆｅｒｇｕｓｏｎら、２００２）。Ｉｎｖａｄｅｒ（登録商標）アッセイ（Ｋｗｉａｔｋｏｗｓｋｉら、１９９９；Ｅｉｓら、２００１）は、培養細胞から抽出した全ＲＮＡからの転写物の発現を定量化する。それは等温でのＲＮＡの検出であり、ＰＣＲ増幅ステップを必要としない。上流の侵襲性デオキソリゴヌクレオチド及び下流のデオキシヌクレオチドプローブからなるオリゴヌクレオチド間の重複部分を、いずれもＲＮＡ標的とアニーリングし、次に下流プローブの５’ヌクレアーゼによって切断する。第二の切断反応は、シグナルをさらに増幅させる蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）オリゴヌクレオチドを利用する。このアッセイは、ＣＹＰ亜科中などで密接に関連するＲＮＡ転写物を区別することができる（Ｅｉｓら、２００１）。最新の試験用に、我々は不死化ヒト肝細胞の細胞系Ｆａ２Ｎ−４を使用している。我々はこれらの細胞を、転写物レベルと酵素活性レベルの両方で、それらの薬剤代謝酵素を試験することによって特徴付けている。主要な薬剤代謝酵素の数種の原型誘導物質で細胞を処理し、ｍＲＮＡ及び酵素活性の変化を調べることによって、我々はＦａ２Ｎ−４細胞の誘導能力も試験してきている。この実施例は、薬剤代謝酵素又は輸送体をコードする遺伝子の転写の増大による臨床的薬剤−薬剤相互作用を予想するための考えられる方法として、ｍＲＮＡ検出Ｉｎｖａｄｅｒアッセイと組み合わせた、不死化ヒト肝細胞Ｆａ２Ｎ−４の利用を記載する。
【０１９３】
方法
化学物質
フェノバルビタール（５−エチル−５−フェニル−２，４，６−トリオキソヘキサヒドロピリミジン）、デキサメタソン（９−α−フルオロ−１６−α−メチルプレドニソロン）、β−ナフトフラボン（５，６−ベンゾフラボン）、リファンピン（３−［４−メチルピペラジニルイミノメチル］リファマイシンＳＶ）、クロトリマゾール（１−［ｏ−クロロ−α，α−ジフェニルベンジル］−イミダゾール）、及び１−シクロヘキシル−３−（モルフォリノエチル）カルボジイミドメト−ｐ−トルエンスルホン酸塩、テストステロン、６−ヒドロキシテストステロン、７−エトキシレゾルフィン、レゾルフィン、ヒドロコルチゾン、及びジクロフェナクはＳｉｇｍａ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）から購入した。４’−ヒドロキシジクロフェナクはＧｅｎｔｅｓｔ（Ｂｅｄｆｏｒｄ、ＭＡ）から購入した。［^１３Ｃ_６］−４’−ＯＨ−ジクロフェナクは、Ｐｆｉｚｅｒにおいて内部で製造された。
【０１９４】
Ｆａ２Ｎ−４細胞の誘導
この細胞系は、１２才のメスのドナーから単離し、前に記載したシミアンウイルス４０のラージＴ抗原を用いたトランスフェクションによって不死化させた、ヒト肝細胞由来のものであった。Ｆａ２Ｎ−４細胞（図１７）はＭｕｌｔｉＣｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（Ｗａｒｗｉｃｋ、ＲＩ）から得て、以下のように培養した。ＲＮＡ分析用に、マルチウェルプレートは、２．７５ｍＭの１−シクロヘキシル−３−（モルフォリノエチル）カルボジイミドメト−ｐ−トルエンスルホン酸塩及び４％（ｖ／ｖ）Ｖｉｔｒｏｇｅｎ １００精製コラーゲン（Ｃｏｈｅｓｉｏｎ、Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ、ＣＡ）を滅菌生理食塩水（０．９％のＮａＣｌ）に溶かしたものから構成される硬質コラーゲン複合体で事前にコーティングした。過剰なコラーゲンは、細胞を平板培養する前に除去した。酵素活性の分析用に、ＢｉｏｃｏａｔのＩ型コラーゲンプレート（Ｂｅｃｔｏｎ−Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ、Ｂｅｄｆｏｒｄ、ＭＡ）を使用した。１００単位／ｍＬのペニシリン、１００μｇ／ｍＬストレプトマイシン及び１０％ウシ胎児血清（ＧＩＢＣＯ ＢＲＬ、Ｇｒａｎｄ Ｉｓｌａｎｄ、ＮＹ）を補ったＭＦＥ培地（ＭｕｌｔｉＣｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｗａｒｗｉｃｋ、ＲＩ）中に、Ｆａ２Ｎ−４細胞を集合状態で平板培養した。細胞接着（約３時間）後に、１００単位／ｍＬのペニシリン及び１００μｇ／ｍＬストレプトマイシンを補った無血清ＭＦＥ培地と、培地を交換した。３７℃、二酸化炭素５％、及び相対湿度９５％に設定したインキュベーター中に、細胞を保った。２４時間毎に、１００単位／ｍＬのペニシリン及び１００μｇ／ｍＬストレプトマイシンを補った新たな無血清ＭＦＥ培地と、培地を交換した。平板培養後４８時間で、薬剤を用いた細胞の処理を開始した。ＲＮＡの定量化用に、細胞を薬剤に４８時間曝した。酵素活性の試験用に、細胞を薬剤に７２時間曝した。Ｆａ２Ｎ４細胞は図１７に示す。ＭＦＥ培地（ＭｕｌｔｉＣｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｗａｒｗｉｃｋ、ＲＩ）中、９６ウェルのＢｉｏｃｏａｔのＩ型コラーゲンプレート（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ、Ｂｅｄｆｏｒｄ、ＭＡ）中に平板培養した、集合状態のＦａ２Ｎ−４細胞の位相差顕微鏡画像を、倍率２００倍で図１７に示す。
【０１９５】
ＲＮＡ分析
製造者（Ｑｉａｇｅｎ、Ｖａｌｅｎｃｉａ、ＣＡ）によって提供された使用説明書に従いミニＲＮｅａｓｙキットを使用して、細胞から全ＲＮＡを抽出した。ＲＮＡ（１００ｎｇ）は、製造者（Ｔｈｉｒｄ Ｗａｖｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）によって提供された使用説明書に従い、Ｉｎｖａｄｅｒ（登録商標）ＲＮＡアッセイ試薬キットを使用して分析した。媒体処理と比較したサンプル中の高レベルのＲＮＡに関する統計分析は、ｐ＜０．０５が有意な差を示す、２−サンプルの不対のスチューデントのｔ検定を使用して行った。多数の処理（＞２サンプル）と比較した高レベルのＲＮＡに関する統計分析は、多数の誘導物質を順位序列付ける目的で、ｐ＜０．０５が有意な差を示すＡＮＯＶＡ分析を使用して行った。
【０１９６】
酵素活性
ＣＹＰ３Ａ４。活性は、以下の変更を加えＷｏｏｄら（１９８３）及びＳｏｎｄｅｒｆａｎら（１９８７；１９８８）によって記載されたのとほぼ同様に質量分析法によって、テストステロンからの６β−ヒドロキシテストステロン形成の程度を測定することによって決定した。試験薬剤は添加培地を除去することによって細胞から洗浄し、新たな培地と交換し、細胞は１時間インキュベートした。洗浄培地を除去した後、２００μＭのテストステロンを含む２５０μＬのＭＦＥ培地を組織培養ウェルに加えることによって、反応を開始させた。３０分で、等分試料をＨＰＬＣ又はＬＣ／ＭＳ／ＭＳによって分析用に除去した。ＬＣ／ＭＳ／ＭＳ分析用に、等分試料は２５０ｎｇ／ｍｌのヒドロコルチゾンで汚染した１体積のアセトニトリルと混合させた。質量分析法は、Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ ２００ ＨＰＬＣ系及びＭｉｃｒｏｍａｓｓ Ｑｕａｔｔｒｏ ＩＩ検出器を用いて行った。サンプルを注入し、７０：３０メタノール：トリフルオロ酢酸０．０２％（ｖ／ｖ）、０．２０ｍｌ／分（ｉｓｏｃｒａｔｉｃ）の移動相、及びＫｅｙｓｔｏｎｅ Ａｑｕａｓｉｌ Ｃ１８、１００・２．１ｍｍ、５μｍ粒径カラム中で、エレクトロスプレー正イオンモードを使用してイオン化した。幾つかの試験は、以下のようにテストステロン代謝に関するＨＰＬＣ−ＵＶアッセイを使用した：２００μｌの培地を５μｌの内標準（ＩＳ）溶液（２０μｇ／ｍｌプレドニソロン、アセトニトリル中）と混合させ、約５０μｌまで蒸発させた。次いでサンプル（２０μｌ）を、Ａｇｉｌｅｎｔ Ｚｏｒｂａｘ Ｅｃｌｉｐｓｅ ＸＤＢ−Ｃ８カラム（４．６×１５０ｍｍ）及び２５４ｎｍにおいてＵＶ検出器を使用して、Ａｇｉｌｅｎｔ １１００ ＨＰＬＣ系に注入した。移動相Ａは１０ｍＭリン酸アンモニウム、水中からなり、移動相Ｂは１００％アセトニトリルからなっていた。最初の状態は３５％Ｂで３分間、６５％Ｂに２分間増大し、次いで１０分間、３５％Ｂに戻し、合計作業時間は１５分であった。保持時間はそれぞれ６−β−ヒドロキシ−テストステロン、プレドニソロン、及びテストステロンに関して２．８分、３．０分、及び７．０分であった。６−β−ヒドロキシテストステロンに関する標準曲線は、２５ｎｇ／ｍｌから少なくとも１０００ｎｇ／ｍｌまで直線的であった。６−β−ヒドロキシ−テストステロンに関するピーク領域はＩＳに標準化し、ＤＭＳＯ処理細胞からの倍数の変化として報告した。
【０１９７】
ＣＹＰ２Ｃ９。活性は、以下のように変更したＬｅｅｍａｎｎら（１９９３）の方法を使用することによって、４’−ヒドロキシジクロフェナク形成の程度を測定することによって決定した。試験薬剤は添加培地を除去することによって細胞から洗浄し、新たな培地と交換し、細胞は１５分間インキュベートした。洗浄培地を除去した後、７．５μＭのジクロフェナクを含む２５０μｌのＭＦＥ培地をそれぞれのウェルに加えることによって、反応を開始させた。ＬＣ／ＭＳ／ＭＳ分析用に６０分で等分試料を除去した。質量分析法は、Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ ２００ ＨＰＬＣ系及びＭｉｃｒｏｍａｓｓ Ｑｕａｔｔｒｏ ＩＩ検出器を用いて行った。サンプルを注入し、５０：５０アセトニトリル：０．１％ギ酸、水中（ｖ／ｖ）、０．２７ｍｌ／分（ｉｓｏｃｒａｔｉｃ）の移動相、及びＰｈｅｎｏｍｅｎｅｘ、Ｓｙｎｅｒｇｉ Ｍａｘ ＲＰ、５０・２．０ｍｍ、４μｍ粒径カラム中で、エレクトロスプレー正イオンモードを使用してイオン化した。
【０１９８】
ＣＹＰ１Ａ２。活性は、わずかな変更を加えたＢｕｒｋｅら（１９８５）の蛍光測定法（Ｒｏｄｒｉｇｕｅｓ及びＰｒｏｕｇｈ、１９９１）を使用することによって、７−エトキシレゾルフィンのＯ−脱アルキル化の程度を測定することによって決定した。試験薬剤は添加培地を除去することによって細胞から洗浄し、新たな培地と交換し、細胞は１５分間インキュベートした。洗浄培地を除去した後、７−エトキシレゾルフィン（２０μＭ）を含む２５０μＬのＭＦＥ培地をそれぞれのウェルに加えることによって、反応を開始させた。蛍光測定法による分析用に１５分で等分試料を除去した。測定値と標準曲線を比較することによって、代謝産物を定量化した。それぞれの細胞処理用のタンパク質の濃度は、標準としてウシ血清アルブミンを使用して、製造者によって提供された使用説明書に従いＢｉｏｒａｄ ＤＣ試薬（Ｈｅｒｃｕｌｅｓ、ＣＡ）を用いて測定した。値を使用して、代謝産物のピコモル／タンパク質１ｍｇ／インキュベーション１分間として酵素活性を計算した。
【０１９９】
結果
薬剤代謝酵素及び薬剤輸送体の知られている誘導物質に対するＦａ２Ｎ−４細胞の誘導応答
図１８中に例示するように、知られている誘導物質であるリファンピン（ＣＹＰ２Ｃ９、ＣＹＰ３Ａ４、ＵＧＴ１Ａ、及びＭＤＲ１を誘導する）、フェノバルビタール（ＣＹＰ２Ｃ９、ＣＹＰ３Ａ４、及びＭＤＲ１を誘導する）、デキサメタソン（ＣＹＰ３Ａ４及びＭＤＲ１を誘導する）、並びにβ−ナフトフラボン（ＣＹＰ１Ａ２及びＵＧＴ１Ａを誘導する）を使用して、ＣＹＰ１Ａ２、ＣＹＰ２Ｃ９、ＣＹＰ３Ａ４、ＵＧＴ１Ａ、及びＭＤＲ１を含めた幾つかの終点を調べるのにＦａ２Ｎ−４細胞は有用である。図１８中には、Ｆａ２Ｎ−４細胞におけるＣＹＰ１Ａ２、ＣＹＰ２Ｃ９、ＣＹＰ３Ａ４、ＵＧＴ１Ａ、及びＭＤＲ１転写物の誘導を示す。Ｆａ２Ｎ−４細胞は２４−ウェルプレートに平板培養し、０．１％のＤＭＳＯ媒体（白棒）、１０μＭのリファンピン（赤棒）、１０００μＭのフェノバルビタール（青棒）、５０μＭのデキサメタソン（緑棒）、及び１０μＭのβ−ナフトフラボン（黒棒）に４８時間曝した。転写物のレベルは、処理した細胞から単離した全ＲＮＡから定量化した。プロットは、４連サンプルのデータからの平均±ＳＤを表す。星印は、媒体対照処理に対する転写物の統計上有意な増大を示す（スチューデントのｔ検定、ｐ＜０．０５）。ＣＹＰ３Ａ４誘導物質は、ＡＮＯＶＡ分析を使用すると（ｐ＜０．０５）互いに有意に異なっていた。転写物の増大は、全ての陽性対照に関して観察することができる。媒体対照と比較すると、１０μＭのβ−ナフトフラボンで処理した後にＣＹＰ１Ａ２転写物は１５倍増大したが、他の誘導物質では有意に増大することはなかった。ＣＹＰ２Ｃ９転写物は１０μＭのリファンピンでは３．８倍増大し、１ｍＭのフェノバルビタールでは２．６倍増大し、５０μＭのデキサメタソン、１０μＭのβ−ナフトフラボンを用いた処理によっては誘導されなかった。ＣＹＰ３Ａ４転写物は１０μＭのリファンピンでは１７倍増大し、１ｍＭのフェノバルビタールでは９．２倍増大し、５０μＭのデキサメタソンでは１．３倍増大した。ＵＧＴ１Ａ転写物は１０μＭのβ−ナフトフラボンでは２．１倍増大し、１ｍＭのフェノバルビタール、５０μＭのデキサメタソンを用いた処理によっては誘導されなかった。ＵＧＴ１Ａのリファンピン誘導は、統計上有意ではなかった（ｐ＝０．０８）。ＭＤＲ１転写物は１０μＭのリファンピンでは３．１倍増大し、１ｍＭのフェノバルビタールでは２．３倍増大し、５０μＭのデキサメタソンでは１．３倍増大し、１０μＭのβ−ナフトフラボンによるＭＤＲ１誘導はなかった。表８は、初代肝細胞の公開データと比較してｍＲＮＡの誘導倍数の増大として表した、３つのＣＹＰに関するＦａ２Ｎ−４細胞における誘導データを要約する。
【表９】

【０２００】
Ｆａ２Ｎ−４細胞におけるＣＹＰ酵素活性
それぞれ１０μＭのリファンピン及び５０μＭのデキサメタソンによる６−β−ヒドロキシテストステロンの形成の増大によって評価すると、媒体処理対照と比較して（図１９Ａ）、ＣＹＰ３Ａ４活性は８．９倍及び２．１倍増大した。図１９には、シトクロム−４５０酵素活性による誘導の測定を示す。０．１％のＤＭＳＯ媒体（ＶＥＨ）又は誘導物質に７２時間曝した後の、Ｆａ２Ｎ−４細胞におけるＣＹＰ３Ａ４、ＣＹＰ２Ｃ９、及びＣＹＰ１Ａ２酵素活性の誘導を示す。１２−ウェルプレート形式を使用して試験を行った。データは、形成された代謝産物／合計Ｆａ２Ｎ−４タンパク質のミリグラム／親化合物とのインキュベーション１分当たりの酵素活性を表す。データは、白棒及び黒棒によって示す二連のアッセイからのものである。（Ａ）媒体、１０μＭのリファンピン（ＲＩＦ）、及び５０μＭのデキサメタソン（ＤＥＸ）を用いて誘導した、細胞中のテストステロン代謝産物６−β−ヒドロキシテストステロンの形成によるＣＹＰ３Ａ４活性の測定。（Ｂ）媒体、１０μＭのリファンピン（ＲＩＦ）、及び１０００μＭのフェノバルビタール（ＰＢ）を用いて誘導した、細胞中のジクロフェナク代謝産物４’−ヒドロキシジクロフェナクの形成によるＣＹＰ２Ｃ９活性の測定。（Ｃ）媒体又は５０μＭのβ−ナフトフラボン（ＢＮＦ）を用いて誘導した、細胞中の７−エトキシレゾルフィンのＯ−脱アルキル化によるＣＹＰ１Ａ２活性の測定。ＣＹＰ２Ｃ９活性の評価に関する４’−ヒドロキシジクロフェナクの形成は、１０μＭのリファンピン及び１ｍＭのフェノバルビタールを用いた処理に関して約２倍増大した（図１９Ｂ）。ＣＹＰ１Ａ２に関するＥＲＯＤアッセイ中の倍数の変化は、１０μＭのβ−ナフトフラボンを用いると２７倍であった（図１９Ｃ）。
【０２０１】
１つの濃度の薬剤の誘導効果を調べること以外に、Ｆａ２Ｎ−４細胞を使用して、用量−応答関係を見ることもできる。例えば、１００ｎＭ〜５０μＭの範囲の複数の濃度のリファンピンを投与したＦａ２Ｎ−４細胞の応答に基づいて、ＥＣ５０値を計算した。図２０は、高いＣＹＰ３Ａ４転写物値（図２０Ａ）、及び高いＣＹＰ３Ａ４酵素活性（図２０Ｂ）を使用する、Ｆａ２Ｎ−４細胞に関するＥＣ５０プロットを含む。図２０中には、Ｆａ２Ｎ−４細胞におけるリファンピンによるＣＹＰ３Ａ４誘導の用量応答依存性を示す。ＣＹＰ３Ａ４の誘導の測定は、１００ｎＭ〜５０μＭのリファンピンで処理したＦａ２Ｎ−４細胞において行った。３−パラメータＳ字曲線を使用するＳｉｇｍａＰｌｏｔ（バージョン８）を使用して、データを適合させた。（Ａ）全ＲＮＡを分析してＣＹＰ３Ａ４転写物のレベルを測定し、次いで媒体対照と比較して誘導倍数を測定した。データは、３連サンプルのデータからの平均±ＳＤを表す。（Ｂ）ＣＹＰ３Ａ４活性をテストステロン代謝産物６−β−ヒドロキシテストステロンの形成によって測定して、次いで媒体対照と比較して誘導倍数を測定した。データは、３連サンプルのデータからの平均±ＳＤを表す。計算したＥＣ５０は、それぞれ転写物及び酵素活性に関して０．４３μＭ（ｒ^２＝９２）及び０．７７μＭ（ｒ^２＝９４）であった。さらに、計算した最大誘導（Ｉｍａｘ）値は、転写物の終点に関しては１３倍、酵素活性の終点に関しては９．７倍であった。
【０２０２】
多数回の継代中のＦａ２Ｎ−４の誘導応答
多数回継代したＦａ２Ｎ−４細胞を、ＣＹＰ３Ａ４誘導に関して試験した。図２１は、弱い応答性を有するＣＹＰ３Ａ４誘導物質（５０μＭのデキサメタソン）、及び強い応答性を示すＣＹＰ３Ａ４誘導物質（１０μＭのリファンピン）に対する、多数回継代したＦａ２Ｎ−４細胞の応答性を示す。図２１では、さまざまな継代のＦａ２Ｎ−４細胞は２４−ウェルプレートに平板培養し、０．１％のＤＭＳＯ媒体（白棒）、５０μＭのデキサメタソン（縞模様棒）、及び１０μＭのリファンピン（黒棒）に曝した。（Ａ）ＣＹＰ３Ａ４転写物のレベルは、単離した全ＲＮＡから定量化した。プロットは、４連サンプルのデータからの平均±ＳＤを表す。（Ｂ）ＣＹＰ３Ａ４活性は、テストステロン代謝産物６−β−ヒドロキシテストステロンの形成によって測定した。プロットは、２連サンプルの平均を表す。全ての化合物が、媒体対照処理に対する転写物の統計上有意な増大を示した（スチューデントのｔ検定、ｐ＜０．０５）。デキサメタソンを用いた処理によって、第２１代及び第３６代でそれぞれ１．６倍及び１．５倍、ＣＹＰ３Ａ４転写物が増大した。１０μＭのリファンピンを用いた処理によって、第２１代及び第３６代でそれぞれ１７倍及び１６倍、ＣＹＰ３Ａ４転写物が増大した（図２１Ａ）。ＣＹＰ３Ａ４酵素活性は、第２８代及び第３６代でそれぞれ、デキサメタソンに関して２．１倍及び２．０倍、１０μＭのリファンピンに関して８．９倍及び４．９倍増大した（図２１Ｂ）。
【０２０３】
Ｆａ２Ｎ−４細胞を用いるＨＴＳ及びＩｎｖａｄｅｒ（登録商標）アッセイの能力
図２２は、さまざまなマルチウェルプレート形式を比較する。図２２中には、１０μＭのリファンピン（黒棒）に４８時間曝した後のＦａ２Ｎ−４細胞におけるＣＹＰ３Ａ４転写物の誘導を、媒体（白棒）と比較して示す。データは、示したそれぞれのマルチウェルプレート形式で行った試験からのものである。プロットは、４連サンプルのデータからの平均±ＳＤを表す。全ての化合物が、媒体対照処理に対する転写物の統計上有意な増大を示した（スチューデントのｔ検定、ｐ＜０．０５）。プレート形式とは無関係に、Ｆａ２Ｎ−４細胞はリファンピンに対して相当なＣＹＰ３Ａ４誘導応答を示す。ＣＹＰ３Ａ４転写物の誘導倍数の変化は、２４−ウェルプレートを使用すると１７．１倍であり、２４−ウェルプレートを使用すると６．６倍であり、９６−ウェルプレートを使用すると５．７倍であった。
【０２０４】
考察
Ｆａ２Ｎ−４細胞は、知られている誘導物質に応答して、ＣＹＰ１Ａ２、ＣＹＰ２Ｃ９、ＣＹＰ３Ａ４、ＵＧＴ１Ａ、及びＭＤＲ１のｍＲＮＡを誘導する能力を有している。終点としてＣＹＰ３Ａ４転写物を使用することによって、我々は有効性に従い誘導物質を順位付けるアッセイの能力を実証しており、初代ヒト肝細胞において以前に観察されたのと同様の（Ｌｉら、１９９７；Ｓａｈｉら、２０００）、リファンピンに関する用量応答性を実証している。誘導物質と非誘導物質を区別することに加えて、このアッセイはＣＹＰ３Ａ４及びＣＹＰ１Ａ２などの幾つかの終点に関して広い動的範囲を有し、誘導能力に関する順位序列付けを可能にする。ＣＹＰ３Ａ４誘導物質に関する同一の低い能力（リファンピン＞フェノバルビタール＞デキサメタソン）が、ｍＲＮＡ及び酵素活性の終点を使用する、初代ヒト肝細胞における試験に関する文献中に以前に報告されている（Ｌｕｏら、２００２）。Ｆａ２Ｎ−４細胞におけるｍＲＮＡ誘導を使用する我々の結果は、Ｍａｄａｎら（２００３）による発表と十分一致し、彼らは処理済み細胞由来のミクロソーム調製物中の酵素活性を測定することによって、培養した初代ヒト肝細胞におけるＣＹＰ１Ａ２、ＣＹＰ２Ｃ９、及びＣＹＰ３Ａ４に関する原型誘導物質の影響を報告した。不死化細胞系Ｆａ２Ｎ−４及びｍＲＮＡ測定を使用する我々の誘導結果は、初代ヒト肝細胞を使用するＭａｄａｎら（２００３）による発表と十分一致する。Ｍａｄａｎらは幾つかの異なるドナー由来の肝臓を使用し、我々の試験中と同じ原型誘導物質で処理した後の、幾つかのＣＹＰに対する酵素活性を測定した。媒体対照に対する誘導倍数として表したリファンピン及びフェノバルビタールの、ＣＹＰ３Ａ４誘導能力に関する順位序列付けは、両方の試験で同じであった。ＣＹＰ３Ａ４より低い程度であったがＣＹＰ２Ｃ９も誘導され、ＣＹＰ１Ａ２は両方の系で最も高い応答性を有していた。初代ヒト肝細胞を使用する他の試験（Ｓａｈｉら、２０００）は、活性アッセイを使用して、ＣＹＰ３Ａ４誘導におけるリファンピンに関するＥＣ５０を報告した。これらの結果も、Ｆａ２Ｎ−４細胞及びｍＲＮＡ測定を使用する、我々の独自のＥＣ５０結果と十分一致する。
【０２０５】
この不死化肝細胞クローンは、幾つかのクローンのスクリーニングで同定し、この場合ＣＹＰ３Ａ４のリファンピン誘導に対する最良の応答性が選択基準であった。したがって、このアッセイの最も適切な使用はＣＹＰ３Ａ４誘導に関する使用である。このクローンの他の特徴付けによって、それがＣＹＰ１Ａ２誘導物質に対する高い応答性を有していたことが示され、スクリーニング形式中のこの終点を検出することもできた。ＣＹＰ２Ｃ９及びＭＤＲ１に対する応答性の動的範囲は狭かったが、それらは新しい肝細胞で見られる誘導応答性と同じ比率であった（Ｌｉら、１９９７；Ｍａｄａｎら、２００３；Ｓａｈｉら、２００３）。
【０２０６】
平均ＵＧＴ１Ａ転写物は、媒体処理した細胞中よりリファンピン処理したＦａ２Ｎ−４細胞中に多量に存在したが、誘導のレベルは統計上有意ではなかった。初代ヒト肝細胞における以前の誘導試験は、終点として１−ナフトールグルクロン酸化を使用して、リファンピンの影響の個体間の変化を引用している。Ａｂｉｄら（１９９７）は、この変化性は２つのＵＧＴ１Ａイソ形の分化誘導に原因がある可能性があることを報告した。ここで使用するＩｎｖａｄｅｒ（登録商標）ＵＧＴ１Ａオリゴヌクレオチドは、全てのイソ型でＲＮＡ中の共通の領域に広がり、ｍＲＮＡの測定値は全ＵＧＴ１Ａイソ型の合計である。したがって、リファンピンに対する誘導影響は、非誘導型ＵＧＴ１Ａイソ型によって最小にすることができたと思われる。個々のＵＧＴ１Ａイソ型用に設計したプローブによって、それらのｍＲＮＡの有意な増大を検出することができる可能性がある。
【０２０７】
Ｆａ２Ｎ−４細胞における誘導はｍＲＮＡに限られず、酵素活性レベルで評価することもできる。Ｉｎｖａｄｅｒ（登録商標）で定量化したｍＲＮＡを使用する誘導の程度は、幾つかの原型誘導物質に関する同様の順位序列付けによって示された、酵素活性データと非常に関連があった。ＣＹＰ酵素活性を誘導する能力は、Ｆａ２Ｎ−４細胞中での広範囲のアレイのＣＹＰの発現に関する他の証拠を提供する。さらにそれは、ＣＹＰ阻害又は代謝産物生成などの他の適用例に関する、これらの細胞の可能性を示す。
【０２０８】
Ｉｎｖａｄｅｒ（登録商標）アッセイは、ｍＲＮＡレベルの増大に基づき誘導を適切に定量化することができる。ｍＲＮＡ終点の利点には、高スループット及び標的特異性がある。酵素活性に関しては、それぞれの酵素活性終点用に、マルチウェルプレート中の別個のウェルを使用しなければならないが、一方で１つのウェルを使用して多数のｍＲＮＡ標的を評価することができる。それぞれのサンプル（２４−ウェルプレート）からＲＮＡを回収することは、５０までの別個のｍＲＮＡ終点を得るのに非常に十分である。Ｉｎｖａｄｅｒアッセイは非常に関連があるＣＹＰを区別することができ、一方で酵素活性アッセイは常に特異的であるわけではない。例えば、７−エトキシレゾルフィンのＯ−脱アルキル化はＣＹＰ１Ａ１とＣＹＰ１Ａ２の組合せを特徴付け、６−β−ヒドロキシテストステロンをＣＹＰ３Ａ４及びＣＹＰ３Ａ５によって形成することもできる（Ｗｉｌｌｉａｍｓら、２００２）。
【０２０９】
新しいヒト肝細胞とは対照的に、Ｆａ２Ｎ−４細胞は容易に入手可能である。新しいヒト肝細胞の入手しやすさは、適切な肝臓組織ドナーの入手可能性に依存するので、３つの異なる肝臓から単離した肝細胞を使用する実験を行って、ある１つの化合物が誘導物質であることを確認するためには、長時間を要する可能性がある。さらに、新しい肝細胞の平板培養効率は予測不能であるので、適切なドナーを有することが一般的であるが、良くない平板培養効率又は標準未満の細胞の健康状態のために、これらの細胞は使用することができないことが分かっている。Ｆａ２Ｎ−４細胞は継代することができ、主な薬剤代謝酵素の活性を保持しながら、数代にわたり使用することができる。新しいヒト肝細胞に関しては、細胞は一回のみ使用することができ、試験間のデータを比較することは難しくなる。平板培養可能な低温保存した初代ヒト肝細胞は、１個のドナーから異なる回数の多数の実験を理論上可能にすること、或いはおそらく多数のドナーを一度に使用することによる改良品である。しかしながら、平板培養可能な低温保存した初代ヒト肝細胞は制限的に供給される。新しい初代ヒト肝細胞と平板培養可能な低温保存した初代ヒト肝細胞の両方が、遺伝、環境、及び同時薬物処理の影響に基づいてドナー毎の多様性を有する。ドナーの薬剤代謝酵素の概略において見られる広範囲の差異が存在し、化学物質の誘導能力に関する結論に達する前に３ドナーからデータを得るという最新の奨励につながる。さらに、何人かの著者は、ドナー間のデータを比較するための能力指標の必要性を挙げている（Ｓｉｌｖａ及びＮｉｃｏｌｌ−Ｇｒｉｆｆｉｔｈ、２００２）。試験化合物の誘導応答（即ち誘導倍数）と原型誘導物質の誘導応答の比を報告することによって、能力指標はドナー間のデータを標準化する。
【０２１０】
したがって、数種の原型誘導物質を使用する我々の予備データは、Ｆａ２Ｎ−４細胞は誘導試験において新しいヒト肝細胞の適切な代替であり、高スループット試験に適した他の属性を与える可能性があることを実証する。Ｆａ２Ｎ−４細胞は以前に発表された不死化細胞系より優れている、何故ならＦａ２Ｎ−４細胞は、さまざまな数の遺伝子の誘導を示すからである。初代ヒト肝細胞において増大した酵素活性を観察したことと一致する発見と共に、これらの細胞を使用して薬剤の誘導能力を決定することができる。高スループットの細胞培養及びｍＲＮＡ終点による分析によって、さらに多くの化合物を試験することができ、化合物当たりのコストを低下させる；薬剤発見アッセイの２つの好ましい特性。この誘導アッセイは、薬剤−薬剤相互作用能力を有する化合物を排除し、開発中の化合物に関するＤＤＩの可能性及び程度を理解するための、製薬会社にとって有用なツールとなる可能性を有する。
実施例９に関する参照文献
１．Ａｂｉｄ Ａ、Ｓａｂｏｌｏｖｉｃ Ｎ及びＭａｇｄａｌｏｕ Ｊ（１９９７）「ヒト培養肝細胞系及び肝臓癌細胞系における、ＵＤＰグルコロニルトランスフェラーゼ１−ナフトールの発現及び誘導能力。（Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ａｎｄ ｉｎｄｕｃｉｂｉｌｉｔｙ ｏｆ ＵＤＰｇｌｕｃｕｒｏｎｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅｓ １−ｎａｐｈｔｈｏｌ ｉｎ ｈｕｍａｎ ｃｕｌｔｕｒｅｄ ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅｓ ａｎｄ ｈｅｐａｔｏｃａｒｃｉｉｎｏｍａ ｃｅｌｌ ｌｉｎｅｓ．）」Ｌｉｆｅ Ｓｃｉ６０（２２）、１９４３〜１９５１。
２．Ｂａｃｉｅｗｉｃｚ ＡＭ、Ｓｅｌｆ ＴＨ及びＢｅｋｅｍｅｙｅｒ ＷＢ（１９８７）、「リファンピン薬剤の相互作用に関する最新情報。（Ｕｐｄａｔｅ ｏｎ ｒｉｆａｍｐｉｎ ｄｒｕｇ ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ．）」、Ａｒｃｈ Ｉｎｔｅｒｎ Ｍｅｄ １４７（３）、５６５〜５６８。
３．Ｂｅｒｔｉｌｓｓｏｎ Ｇ、Ｈｅｉｄｒｉｃｈ Ｊ、Ｓｖｅｎｓｓｏｎ Ｋ、Ａｓｍａｎ Ｍ、Ｊｅｎｄｅｂｅｒｇ Ｌ、Ｓｙｄｏｗ−Ｂａｃｋｍａｎ Ｍ、Ｏｈｌｓｓｏｎ Ｒ、Ｐｏｓｔｌｉｎｄ Ｈ、Ｂｌｏｍｑｕｉｓｔ Ｐ及びＢｅｒｋｅｎｓｔａｍ Ａ（１９９８）「ヒト核内受容体を同定することによって、ＣＹＰ３Ａ誘導に関する新たなシグナル経路が画定する。（Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ａ ｈｕｍａｎ ｎｕｃｌｅａｒ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｄｅｆｉｎｅｓ ａ ｎｅｗ ｓｉｇｎａｌｉｎｇ ｐａｔｈｗａｙ ｆｏｒ ＣＹＰ３Ａ ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ．）」Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ９５、１２２０８〜１２２１３。
４．Ｂｒｅｉｎｈｏｌｔ Ｖ、Ｌａｕｒｉｄｓｅｎ ＳＴ及びＤｒａｇｓｔｅｄ ＬＯ（１９９９）「メスラットにおける、薬剤代謝及び抗酸化酵素に対する食用フラボノイドの特異的影響。（Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ｄｉｅｔａｒｙ ｆｌａｖｏｎｏｉｄｓ ｏｎ ｄｒｕｇ ｍｅｔａｂｏｌｉｚｉｎｇ ａｎｄ ａｎｔｉｏｘｉｄａｎｔ ｅｎｚｙｍｅｓ ｉｎ ｆｅｍａｌｅ ｒａｔ．）」Ｘｅｎｏｂｉｏｔｉｃａ ２９（１２）、１２２７〜１２４０。
５．Ｂｕｒｋｅ ＭＤ、Ｔｈｏｍｐｓｏｎ Ｓ、Ｅｌｃｏｍｂｅ ＣＲ、Ｈａｌｐｅｒｔ Ｊ、Ｈａａｐａｒａｎｔ Ｔ及びＭａｙｅｒ ＲＴ（１９８５）「エトキシ−、ペントキシ−、及びベンジルオキシフェノキサゾン並びに相同体：異なる誘導型シトクロムＰ−４５０を区別するための一連の物質。（Ｅｔｈｏｘｙ−、ｐｅｎｔｏｘｙ− ａｎｄ ｂｅｎｚｙｌｏｘｙｐｈｅｎｏｘａｚｏｎｅｓ ａｎｄ ｈｏｍｏｌｏｇｕｅｓ：ａ ｓｅｒｉｅｓ ｏｆ ｓｕｂｓｔｒａｔｅｓ ｔｏ ｄｉｓｔｉｎｇｕｉｓｈ ｂｅｔｗｅｅｎ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｉｎｄｕｃｅｄ ｃｙｔｏｃｈｒｏｍｅｓ Ｐ−４５０．）」Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ ３４（１８）、３３３７〜３３４５。
６．Ｅｉｓ ＰＳ、Ｏｌｓｏｎ ＭＣ、Ｔａｋｏｖａ Ｔ、Ｃｕｒｔｉｓ ＭＬ、Ｏｌｓｏｎ ＳＭ、Ｖｅｎｅｒ ＴＩ、Ｉｐ ＨＳ、Ｖｅｄｖｉｋ ＫＬ、Ｂａｒｔｈｏｌｏｍａｙ ＣＴ、Ａｌｌａｗｉ ＨＴ、Ｍａ Ｗ、Ｈａｌｌ ＪＧ、Ｍｏｒｉｎ ＭＤ、Ｒｕｓｈｍｏｒｅ ＴＨ、Ｌｙａｍｉｃｈｅｖ ＶＩ及びＫｗｉａｔｋｏｗｓｋｉ ＲＷ（２００１）「特異的ＲＮＡを直接定量化するための侵襲性切断アッセイ。（Ａｎ ｉｎｖａｓｉｖｅ ｃｌｅａｖａｇｅ ａｓｓａｙ ｆｏｒ ｄｉｒｅｃｔ ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｏｎ ｏｆ ｓｐｅｃｉｆｉｃ ＲＮＡｓ．）」Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ １９（７）、６７３〜６７６。
７．Ｆｅｒｇｕｓｏｎ ＳＳ、Ｌｅｃｌｕｙｓｅ ＥＬ、Ｎａｇｉｓｈｉ Ｍ及びＧｏｌｄｓｔｅｉｎ ＪＡ（２００２）「構成的アンドロスタン受容体によるヒトＣＹＰ２Ｃ９の制御：新たな末端結合部位の発見。（Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｈｕｍａｎ ＣＹＰ２Ｃ９ ｂｙ ｔｈｅ ｃｏｎｓｔｉｔｕｔｉｖｅ ａｎｄｒｏｓｔａｎｅ ｒｅｃｅｐｔｏｒ：ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ ｏｆ ａ ｎｅｗ ｄｉｓｔａｌ ｂｉｎｄｉｎｇ ｓｉｔｅ．）」Ｍｏｌ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ ６２（３）、７３７〜７４６。
８．Ｇｅｉｃｋ Ａ、Ｅｉｃｈｅｌｂａｕｍ Ｍ及びＢｕｒｋ Ｏ（２００１）「核内受容体応答要素は、リファンピンによる腸管ＭＤＲ１の誘導を仲介する。（Ｎｕｃｌｅａｒ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｒｅｓｐｏｎｓｅ ｅｌｅｍｅｎｔｓ ｍｅｄｉａｔｅ ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ ＭＤＲ１ ｂｙ ｒｉｆａｍｐｉｎ．）」Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２７６（１８）、１４５８１〜１４５８７。
９．Ｋｗｉａｔｋｏｗｓｋｉ ＲＷ、Ｌｙａｍｉｃｈｅｖ Ｖ、ｄｅ Ａｒｒｕｄａ Ｍ及びＮｅｒｉ Ｂ（１９９９）「Ｉｎｖａｄｅｒアッセイの臨床的、遺伝学的、及び薬理遺伝学的用途。（Ｃｌｉｎｉｃａｌ、ｇｅｎｅｔｉｃ、ａｎｄ ｐｈａｒｍａｃｏｇｅｎｅｔｉｃ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｉｎｖａｄｅｒ ａｓｓａｙ．）」Ｍｏｌ Ｄｉａｇｎｏｓｉｓ４（４）、３５３〜６４。
１０．Ｌｅｅｍａｎｎ Ｔ、Ｔｒａｎｓｏｎ Ｃ及びＤａｙｅｒ Ｐ（１９９３）「シトクロムＰ４５０ＴＢ（ＣＹＰ２Ｃ）：ヒト肝臓中のジクロフェナク４’−ヒドロキシル化を触媒する主要なモノオキシゲナーゼ。（Ｃｙｔｏｃｈｒｏｍｅ Ｐ４５０ＴＢ（ＣＹＰ２Ｃ）：ａ ｍａｊｏｒ ｍｏｎｏｏｘｙｇｅｎａｓｅ ｃａｔａｌｙｚｉｎｇ ｄｉｃｌｏｆｅｎａｃ ４’−ｈｙｄｒｏｘｙｌａｔｉｏｎ ｉｎ ｈｕｍａｎ ｌｉｖｅｒ．）」Ｌｉｆｅ Ｓｃｉ ５２（１）、２９〜３４。
１１．Ｌｅｈｍａｎｎ ＪＭ、ＭｃＫｅｅ ＤＤ、Ｗａｔｓｏｎ ＭＡ、Ｗｉｌｌｓｏｎ ＴＭ、Ｍｏｏｒｅ ＪＴ及びＫｌｉｅｗｅｒ ＳＡ（１９９８）「ヒトオーファン核内受容体ＰＸＲは、ＣＹＰ３Ａ４遺伝子発現を制御し薬剤相互作用を引き起こす化合物によって活性化される。（Ｔｈｅ ｈｕｍａｎ ｏｒｐｈａｎ ｎｕｃｌｅａｒ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ＰＸＲ ｉｓ ａｃｔｉｖａｔｅｄ ｂｙ ｃｏｍｐｏｕｎｄｓ ｔｈａｔ ｒｅｇｕｌａｔｅ ＣＹＰ３Ａ４ ｇｅｎｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ａｎｄ ｃａｕｓｅ ｄｒｕｇ ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ．）」Ｊ Ｃｌｉｎ Ｉｎｖｅｓｔｉｇ １０２、１０１６〜１０２３。
１２．Ｌｉ ＡＰ、Ｒｅｉｔｈ ＭＫ、Ｒａｓｍｕｓｓｅｎ Ａ、Ｇｏｒｓｋｉ ＪＣ、Ｈａｌｌ ＳＤ、Ｘｕ Ｌ、Ｋａｍｉｎｓｋｉ ＤＬ及びＣｈｅｎｇ ＬＫ（１９９７）「生体異物のシトクロムＰ４５０誘導能力の構造−活性の関係を評価するためのツールとしての初代ヒト肝細胞：リファンピン、リファペリチン及びリファブチンの評価。（Ｐｒｉｍａｒｙ ｈｕｍａｎ ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅｓ ａｓ ａ ｔｏｏｌ ｆｏｒ ｔｈｅ ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ ｏｆ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ−ａｃｔｉｖｉｔｙ ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐ ｉｎ ｃｙｔｏｃｈｒｏｍｅ Ｐ４５０ ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ ｐｏｔｅｎｔｉａｌ ｏｆ ｘｅｎｏｂｉｏｔｉｃｓ：ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ ｏｆ ｒｉｆａｍｐｉｎ、ｒｉｆａｐｅｎｔｉｎｅ ａｎｄ ｒｉｆａｂｕｔｉｎ．）」Ｃｈｅｍ Ｂｉｏｌ Ｉｎｔｅｒａｃｔ １０７、１７〜３０。
１３．Ｌｉ Ｗ、Ｈａｒｐｅｒ ＰＡ、Ｔａｎｇ ＢＫ及びＯｋｅｙ ＡＢ（１９９８）「ヒト細胞中のアリール炭化水素受容体によるシトクロムＰ４５０酵素の制御。（Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｃｙｔｏｃｈｒｏｍｅ Ｐ４５０ ｅｎｚｙｍｅｓ ｂｙ ａｒｙｌ ｈｙｄｒｏｃａｒｂｏｎ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｉｎ ｈｕｍａｎ ｃｅｌｌｓ．）」Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｐｈａｍａｃｏｌ５６（５）、５９９〜６１２。
１４．Ｌｕｏ Ｇ、Ｃｕｎｎｉｎｇｈａｍ Ｍ、Ｋｉｍ Ｓ、Ｂｕｒｎ Ｔ、Ｌｉｎ Ｊ、Ｓｉｎｚ Ｍ．、Ｈａｍｉｌｔｏｎ Ｇ、Ｒｉｚｚｏ Ｃ、Ｊｏｌｌｅｙ Ｓ、Ｇｉｌｂｅｒｔ Ｄ、Ｄｏｗｎｅｙ Ａ、Ｍｕｄｒａ Ｄ、Ｇｒａｈａｍ Ｒ、Ｃａｒｒｏｌ Ｋ、Ｘｉｅ Ｊ、Ｍａｄａｎ Ａ、Ｐａｒｋｉｎｓｏｎ Ａ、Ｃｈｒｉｓｔ Ｄ、Ｓｅｌｌｉｎｇ Ｂ、ＬｅＣｌｕｙｓｅ Ｅ及びＧａｎ ＬＳ（２００２）「薬剤によるＣＹＰ３Ａ４誘導：プレグナンＸ受容体の受容体遺伝子アッセイとヒト肝細胞におけるＣＹＰ３Ａ４発現の間の相関関係。（ＣＹＰ３Ａ４ ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ ｂｙ ｄｒｕｇｓ：ｃｏｒｒｅｌａｔｉｏｎ ｂｅｔｗｅｅｎ ａ ｐｒｅｇｎａｎｅ Ｘ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｒｅｐｏｒｔｅｒ ｇｅｎｅ ａｓｓａｙ ａｎｄ ＣＹＰ３Ａ４ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｉｎ ｈｕｍａｎ ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅｓ．）」Ｄｒｕｇ Ｍｅｔａｂ Ｄｉｓｐｏｓ３０（７）、７９５〜８０４。
１５．Ｍａｄａｎ Ａ、Ｇｒａｈｍ ＲＡ、Ｃａｒｒｏｌｌ ＫＭ、Ｍｕｄｒａ ＤＲ、Ｂｕｒｔｏｎ ＬＡ、Ｋｒｕｅｇｅｒ ＬＡ、Ｄｏｗｎｅｙ ＡＤ、Ｃｚｅｒｗｉｎｓｋｉ Ｍ、Ｆｏｒｓｔｅｒ Ｊ、Ｒｉｂａｄｅｎｅｉｒａ ＭＤ、Ｇａｎ Ｌ、ＬｅＣＩｕｙｓｅ ＥＬ、Ｚｅｃｈ Ｋ、Ｒｏｂｅｒｔｓｏｎ Ｐ、Ｋｏｃｈ Ｐ、Ａｎｔｏｎｉａｎ Ｌ、Ｗａｇｎｅｒ Ｇ、Ｙｕ Ｌ、及びＰａｒｋｉｎｓｏｎ Ａ（２００３）「培養ヒト肝細胞における、原型ミクロソーム酵素誘導物質のシトクロムＰ４５０発現に対する影響。（Ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ｐｒｏｔｏｔｙｐｉｃａｌ ｍｉｒｏｓｏｍａｌ ｅｎｚｙｍｅ ｉｎｄｕｃｅｒｓ ｏｎ ｃｙｔｏｃｈｒｏｍｅ Ｐ４５０ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｉｎ ｃｕｌｔｕｒｅｄ ｈｕｍａｎ ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅｓ．）」Ｄｒｕｇ Ｍｅｔａｂ Ｄｉｓｐｏｓ ３１（４）、４２１〜４３１。
１６．Ｍｅｕｎｉｅｒ Ｖ、Ｂｏｕｒｒｉｅ Ｍ、Ｊｕｌｉａｎ Ｂ、Ｍａｒｔｉ Ｅ、Ｇｕｉｌｌｏｕ Ｆ、Ｂｅｒｇｅｒ Ｙ及びＦａｂｒｅ Ｇ（２０００）「ヒト肝細胞の初代培養物における、ＣＹＰ１Ａ１／１Ａ２、ＣＹＰ２Ａ６及びＣＹＰ３Ａ４の発現及び誘導：１０年のフォローアップ。（Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ａｎｄ ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ＣＹＰ１Ａ１／１Ａ２、ＣＹＰ２Ａ６ ａｎｄ ＣＹＰ３Ａ４ ｉｎ ｐｒｉｍａｒｙ ｃｕｌｔｕｒｅｓ ｏｆ ｈｕｍａｎ ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅｓ：ａ １０−ｙｅａｒ ｆｏｌｌｏｗ−ｕｐ．）」Ｘｅｎｏｂｉｏｔｉｃａ ３０（６）、５８９〜６０７。
１７．Ｍｏｏｒｅ ＪＴ及びＫｌｉｅｗｅｒ ＳＡ（２０００）「薬剤相互作用を予想するための核内受容体ＰＸＲの使用。（Ｕｓｅ ｏｆ ｎｕｃｌｅａｒ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ＰＸＲ ｔｏ ｐｒｅｄｉｃｔ ｄｒｕｇ ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ．）」Ｔｏｘｉｃｏｌｏｇｙ １５３、１〜１０。
１８．Ｐａｓｃｕｓｓｉ ＪＭ、Ｇｅｒｂａｌ−Ｃｈａｌｏｉｎ Ｓ、Ｄｒｏｃｏｕｒｔ Ｌ、Ｍａｕｒｅｌ Ｐ及びＶｉｌａｒｅｍ ＭＪ（２００３）「ＣＹＰ２Ｂ６、ＣＹＰ２Ｃ９及びＣＹＰ３Ａ４遺伝子の発現：核内受容体とステロイド受容体のネットワークの繋がり。（Ｔｈｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ＣＹＰ２Ｂ６、ＣＹＰ２Ｃ９ ａｎｄ ＣＹＰ３Ａ４ ｇｅｎｅｓ：ａ ｔａｎｇｌｅ ｏｆ ｎｅｔｗｏｒｋｓ ｏｆ ｎｕｃｌｅａｒ ａｎｄ ｓｔｅｒｏｉｄ ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ．）」Ｂｉｏｃｈｉｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ａｃｔａ １６１９、２４３〜２５３。
１９．Ｒｏｄｒｉｇｕｅｓ ＡＤ及びＰｒｏｕｇｈ ＲＡ（１９９１）「シトクロムＰ４５０ＩＡ１及びＰ４５０ＩＡ２の誘導、並びに触媒活性の測定。（Ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ｃｙｔｏｃｈｒｏｍｅｓ Ｐ４５０ＩＡ１ ａｎｄ Ｐ４５０ＩＡ２ ａｎｄ ｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔ ｏｆ ｃａｔａｌｙｔｉｃ ａｃｔｉｖｉｔｉｅｓ．）」Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ ２０６、４２３〜４３１。
２０．Ｓａｈｉ Ｊ、Ｈａｍｉｌｔｏｎ、Ｇ、Ｓｉｎｚ Ｍ、Ｂａｒｒｏｓ Ｓ、Ｈｕａｎｇ ＳＭ、Ｌｅｓｋｏ ＬＪ、ＬｅＣｌｕｙｓｅ ＥＬ（２０００）「ヒト肝細胞及びラット肝細胞の初代培養物における、シトクロムＰ４５０酵素に対するトログリタゾンの影響（Ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ ｔｒｏｇｌｉｔａｚｏｎｅ ｏｎ ｃｙｔｏｃｈｒｏｍｅ Ｐ４５０ ｅｎｚｙｍｅｓ ｉｎ ｐｒｉｍａｒｙ ｃｕｌｔｕｒｅｓ ｏｆ ｈｕｍａｎ、ａｎｄ ｒａｔ ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅｓ．）」Ｘｅｎｏｂｉｏｔｉｃａ ３０（３）、２７３〜２８４。
２１．Ｓａｈｉ、Ｊ、Ｍｉｌａｄ ＭＡ、Ｚｈｅｎｇ Ｘ、Ｒｏｓｅ ＫＡ、Ｗａｎｇ Ｈ、Ｓｔｉｌｇｅｎｂａｕｅｒ Ｌ、Ｇｉｌｂｅｒｔ Ｄ、Ｊｏｌｌｅｙ Ｓ、Ｓｔｅｒｎ ＲＨ、及びＬｅＣｌｕｙｓｅ ＥＬ（２００３）「アバシマイブは、プレグナンＸ受容体の活性化によって、ＣＹＰ３Ａ４及び多剤耐性タンパク質１遺伝子の発現を誘導する。（Ａｖａｓｉｍｉｂｅ ｉｎｄｕｃｅｓ ＣＹＰ３Ａ４ ａｎｄ ｍｕｌｔｉｐｌｅ ｄｒｕｇ ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ ｐｒｏｔｅｉｎ １ ｇｅｎｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｔｈｒｏｕｇｈ ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｐｒｅｇｎａｎｅ Ｘ ｒｅｃｅｐｔｏｒ．）」Ｊ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ Ｅｘｐ Ｔｈｅｒ ３０６、１０２７〜１０３４。
２２．Ｓｃｈｕｅｔｚ ＥＧ、Ｂｅｃｋ ＷＴ及びＳｃｈｕｅｔｚ ＪＤ（１９９６）「Ｐ−糖タンパク質及びシトクロムＰ４５０３Ａの制御物質及び基質は、ヒト結腸癌細胞においてこれらのタンパク質を同等に上方制御する。（Ｍｏｄｕｌａｔｏｒｓ ａｎｄ ｓｕｂｓｔｒａｔｅｓ ｏｆ Ｐ−ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ ａｎｄ ｃｙｔｏｃｈｒｏｍｅ Ｐ４５０３Ａ ｃｏｏｒｄｉｎａｔｅｌｙ ｕｐ−ｒｅｇｕｌａｔｅ ｔｈｅｓｅ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｉｎ ｈｕｍａｎ ｃｏｌｏｎ ｃａｒｃｉｎｏｍａ ｃｅｌｌｓ．）」Ｍｏｌ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ（４９）、３１１〜３１８。
２３．Ｓｉｌｖａ ＪＭ及びＮｉｃｏｌｌ−Ｇｒｉｆｆｉｔｈ ＤＡ（２００２）「シトクロムＰ４５０酵素の誘導を試験するためのｉｎ ｖｉｔｒｏモデル。薬剤−薬剤相互作用（Ｉｎ ｖｉｔｒｏ ｍｏｄｅｌｓ ｆｏｒ ｓｔｕｄｙｉｎｇ ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ｃｙｔｏｃｈｒｏｍｅ Ｐ４５０ ｅｎｚｙｍｅｓ．Ｄｒｕｇ−Ｄｒｕｇ Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ）」ｅｄ．Ｒｏｄｒｉｇｕｅｓ ＡＤ（Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ、ニューヨーク、ＮＹ）、１８９〜２１６。
２４．Ｓｏｎｄｅｒｆａｎ ＡＪ、Ａｒｌｏｔｔｏ ＭＰ、Ｄｕｔｔｏｎ ＤＲ、ＭｃＭｉｌｌｅｎ ＳＫ及びＰａｒｋｉｎｓｏｎ Ａ（１９８７）。「ラット肝臓のミクロソームシトクロムＰ−４５０による、テストステロンヒドロキシル化の制御。（Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｅｓｔｏｓｔｅｒｏｎｅ ｈｙｄｒｏｘｙｌａｔｉｏｎ ｂｙ ｒａｔ ｌｉｖｅｒ ｍｉｃｒｏｓｏｍａｌ ｃｙｔｏｃｈｒｏｍｅ Ｐ−４５０．）」Ａｒｃｈ Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ ２５５、２７〜４１。
２５．Ｓｏｎｄｅｒｆａｎ ＡＪ及びＰａｒｋｉｎｓｏｎ Ａ（１９８８）「ラット肝臓のミクロソームシトクロムＰ−４５０による、ステロイド５α−リダクターゼの阻害、及びテストステロンヒドロキシル化に対するその影響。（Ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ ｏｆ ｓｔｅｒｏｉｄ ５ ａｌｐｈａ−ｒｅｄｕｃｔａｓｅ ａｎｄ ｉｔｓ ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｎ ｔｅｓｔｏｓｔｅｒｏｎｅ ｈｙｄｒｏｘｙｌａｔｉｏｎ ｂｙ ｒａｔ ｌｉｖｅｒ ｍｉｃｒｏｓｏｍａｌ ｃｙｔｏｃｈｒｏｍｅ Ｐ−４５０．）」Ａｒｃｈ Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ２６５、２０８〜２１８。
２６．Ｓｐｉｎａ Ｅ、Ｐｉｓａｎｉ Ｆ及びＰｅｒｕｃｃａ Ｅ（１９９６）「臨床上有意なカルバマゼピンとの薬物動態学的薬剤相互作用：最新の臨床薬物動態学（Ｃｌｉｎｉｃａｌｌｙ ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔ ｐｈａｒｍａｃｏｋｉｎｅｔｉｃ ｄｒｕｇ ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ ｗｉｔｈ ｃａｒｂａｍａｚｅｐｉｎｅ：Ａｎ ｕｐｄａｔｅ．Ｃｌｉｎ Ｐｈａｒｍａｃｏｋｉｎｅｔ）」３１（３）、１９８〜２１４。
２７．Ｔｉｒｏｎａ ＲＧ、Ｌｅａｋｅ ＢＦ、Ｗｏｌｋｏｆｆ ＡＷ、及びＫｉｍ ＲＢ（２００３）「ヒト有機アニオン輸送ポリペプチド−Ｃ（ＳＬＣ２１Ａ６）は、リファンピン仲介型プレグナンＸ受容体活性化の主な決定要素である。（Ｈｕｍａｎ ｏｒｇａｎｉｃ ａｎｉｏｎ ｔｒａｎｓｐｏｒｔｉｎｇ ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ−Ｃ（ＳＬＣ２１Ａ６）ｉｓ ａ ｍａｊｏｒ ｄｅｔｅｒｍｉｎａｎｔ ｏｆ ｒｉｆａｍｐｉｎ−ｍｅｄｉａｔｅｄ ｐｒｅｇｎａｎｅ Ｘ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ．）」Ｊ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ Ｅｘｐ Ｔｈｅｒ ３０４、２２３〜２２８。
２８．Ｗｈｉｔｌｏｃｋ ＪＰ、Ｏｋｉｎｏ ＳＴ、Ｄｏｎｇ Ｌ、Ｋｏ ＨＰ、Ｃｌａｒｋｅ−Ｋａｔｚｅｎｂｅｒｇ Ｒ、Ｍａ Ｑ及びＬｉ Ｈ（１９９６）「シトクロムＰ４５０１Ａ１の誘導：哺乳動物遺伝子の転写を分析するためのモデル。（Ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ｃｙｔｏｃｈｒｏｍｅ Ｐ４５０１Ａ１： ａ ｍｏｄｅｌ ｆｏｒ ａｎａｌｙｚｉｎｇ ｍａｍｍａｌｉａｎ ｇｅｎｅ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ．）」ＦＡＳＥＢ１０（８）、８０９〜８１８。
２９．Ｗｉｌｌｉａｍｓ ＡＪ、Ｒｉｎｇ ＢＪ、Ｃａｎｔｒｅｌｌ ＶＥ、Ｊｏｎｅｓ ＤＲ、Ｅｃｋｓｔｅｉｎ Ｊ、Ｒｕｔｅｒｂｏｒｉｅｓ Ｋ、Ｈａｍｍａｎ ＭＡ、Ｈａｌｌ ＳＤ及びＷｒｉｇｈｔｏｎ ＳＡ（２００２）「ＣＹＰ３Ａ４、ＣＹＰ３Ａ５、及びＣＹＰ３Ａ７の相対的代謝能力。（Ｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅ ｍｅｔａｂｏｌｉｃ ｃａｐａｂｉｌｉｔｉｅｓ ｏｆ ＣＹＰ３Ａ４、ＣＹＰ３Ａ５、ａｎｄ ＣＹＰ３Ａ７．）」Ｄｒｕｇ Ｍｅｔａｂ Ｄｉｓｐｏｓ３０（８）、８８３〜８９１。
３０．Ｗｏｏｄ ＡＷ、Ｒｙａｎ ＤＥ、Ｔｈｏｍａｓ ＰＥ及びＬｅｖｉｎ Ｗ（１９８３）Ｒｅｇｉｏ−及び５つの十分に精製及び還元されたラット肝臓のシトクロムＰ−４５０イソ酵素による、２つのＣ１９ステロイドの立体選択的代謝。（ｓｔｅｒｅｏｓｅｌｅｃｔｉｖｅ ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ ｏｆ ｔｗｏ Ｃ１９ ｓｔｅｒｏｉｄｓ ｂｙ ｆｉｖｅ ｈｉｇｈｌｙ ｐｕｒｉｆｉｅｄ ａｎｄ ｒｅｃｏｎｓｔｉｔｕｔｅｄ ｒａｔ ｈｅｐａｔｉｃ ｃｙｔｏｃｈｒｏｍｅ Ｐ−４５０ ｉｓｏｚｙｍｅｓ．）」Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２５８、８８３９〜８８４７。
【０２１１】
（実施例１０）
不死化肝細胞の細胞系をシトクロムＰ４５０の誘導物質に曝した後の、ｍＲＮＡ転写物の発現に関する逆転写ポリメラーゼ連鎖反応の分析
Ｅａ１Ｃ−３５及びＦａ２Ｎ−４と表す、２つの不死化ヒト肝細胞の細胞系にＲＴ−ＰＣＲ分析を行った。細胞はＩ型コラーゲンをコーティングした皿上で平板培養し、ＭｕｌｔｉＣｅｌｌの専有培地中に保った。培養細胞はリファンピン（１０μＭ）で３日間、或いは等体積のＤＭＳＯ（例えば対照）で処理した。
【０２１２】
肝細胞特異的転写因子（例えば、ＨＮＦ−１α、ＨＮＦ−３、ＨＮＦ−４α、ＨＮＦ４γ、ｃＥＢＰ）、肝臓特異的遺伝子（例えば、アルブミン及びアシアロ糖タンパク質受容体）、薬剤代謝遺伝子を制御する転写因子（例えば、ＳＸＲ、ＲＸＲα、ＲＸＲβ、ＣＡＲ）、並びに第Ｉ相及び第ＩＩ相薬剤代謝酵素（例えば、それぞれＣＹＰ１Ａ２、ＣＹＰ２Ａ６、ＣＹＰ２Ｃ９、ＣＹＰ３Ａ４、ＣＹＰ２Ｄ６、ＣＹＰ２Ｅ１、及びＵＧＴ１Ａ１、ＵＧＴ２Ｂ４）の発現をスクリーニングするために、これを行った。
【０２１３】
ＣＹＰ３Ａ４発現の知られている薬理学的誘導物質、リファンピンへの露出有り及び無しで分析を行った。ＲＴ−ＰＣＲ分析によって、さまざまなレベルではあったが、調べた全ての転写物が両方の細胞系によって発現されたことが明らかになった。リファンピン誘導は、ＣＹＰ３Ａ４転写物の発現を増大させた。
【０２１４】
以下のプライマーをＲＴ−ＰＣＲ分析用に使用した：アルブミン、アシアロ糖タンパク質ＩＩ受容体、ＨＮＦ−１α、ＨＮＦ−３、ＨＮＦ−４α、ＨＮＦ４γ、ｃ／ＥＢＰ、ＵＧＴ１Ａ１、ＵＧＴ２Ｂ４、ＳＸＲ、ＲＸＲα、ＲＸＲβ、ＣＡＲ、ＣＹＰ１Ａ２、ＣＹＰ２Ａ６、ＣＹＰ２Ｃ９、ＣＹＰ３Ａ４、ＣＹＰ２Ｄ６、ＣＹＰ２Ｅ１、シトクロムｃ、及びＮＡＤＰＨ。ゲル１〜４に関する図（図２３〜２６）の凡例は、表９に示す。ゲル５〜８に関する図（図２７〜３０）の凡例は、表１０に示す。
【表１０】


【表１１】

【０２１５】
（実施例１１）
Ｆａ２Ｎ４及びＥａ１Ｃ３５細胞系による血漿タンパク質の発現に関する条件
二次元ゲル電気泳動分析を使用して、Ｆａ２Ｎ４及びＥａ１Ｃ３５細胞系の分泌したタンパク質を分離した。ＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎのＺＯＯＭ ＩＰＧＲｕｎｎｅｒシステムを使用して、タンパク質の最初のＩＥＦ分離は固定ｐＨ勾配ストリップ（３〜１０のｐＨ範囲）を使用して行い、次に４〜１２％のトリス−グリシンＳＤＳ−ＰＡＧＥを使用して二次元分離を行った。両方の細胞系において、タンパク質の多数のスポットを、治療用タンパク質の考えられる候補として同定することができた（図３１Ａ．Ｆａ２Ｎ４；３１Ｂ、Ｅａ１Ｃ３５）。２次元ゲルの分離の後、Ｅａ１Ｃ３５細胞系の分泌したタンパク質はニトロセルロース上に移し、抗第ＩＸ因子抗体を使用するウエスタンブロット分析を行った。７０ｋＤの分子量及びｐＩ６．５〜７．０を有する反応性タンパク質を検出した（図３１Ｃ）。
【０２１６】
アルブミン発現に関するＦａ２Ｎ−４細胞の免疫染色も行った。細胞はＩ型コラーゲン上に平板培養し、無血清培地中で７２時間培養した。二次抗体と結合したフルオレセインを用いた間接的な免疫蛍光性によって、アルブミンを目に見える状態にした。図１ｂ中に示したように、ほぼ全ての細胞がアルブミンを発現する（例えば緑色）。
【０２１７】
さまざまな継代由来のＥａ１Ｃ−３５及びＦａ２Ｎ−４細胞が、トランスフェリンを作製し分泌したかどうかを判定するために、細胞は無血清培地中において移動無しで７日間培養した。調整培養培地を７日後に回収し、市販のトランスフェリンに対する抗体を使用してイムノブロット分析を行った。ヒト血漿を陽性対照として使用した。イムノブロットによって、全継代由来の細胞がこの血漿タンパク質を発現し続けることが明らかになった。これらの結果は図３２中に示す。図３２のレーンは表１１中に示す。
【表１２】

【０２１８】
生産者細胞として培養した不死化ヒト肝細胞を使用する、治療用血漿タンパク質の経済的な生産は、大量培養において増殖させると、細胞がこれらの血漿タンパク質を作製及び分泌し続ける場合のみ行うことができる。この問題を最初に評価するために、Ｆａ２Ｎ−４細胞をＴ２５、Ｔ７５及びＴ１５０培養フラスコ中で集合状態まで増殖させ、選択した血漿タンパク質を、アルブミン、ＡＡＴ又はＩαＩｐを認識する捕捉抗体と組み合わせたＥＬＩＳＡアッセイを使用して定量化した。等しい数の細胞、それぞれ１平方ｃｍ当たり５００万、１５００万及び３０００万個の細胞を最初に平板培養した。調整培地は３日間回収し、集め、限外濾過によって１０倍に濃縮し、アッセイした。表１２〜１４に示すように、それぞれの血漿タンパク質の全体的な発現は、細胞数にほぼ正比例した。値は３連サンプルの平均±ＳＤを表す。３日間にわたり、Ｔ１５０フラスコ中で培養した細胞は約２００ｕｇのアルブミン、５００ｎｇのＩαＩｐ及び１５０ｎｇのＡＡＴを生成した。
【表１３】


【表１４】


【表１５】

【０２１９】
治療用タンパク質の工業生産用のバイオファクトリーとして、不死化ヒト肝細胞を使用することを我々は計画している。したがって、血漿タンパク質分泌が長期の培養中に著しく低下してはならないことは必要不可欠である。我々はこの問題を評価するための試験を近年開始した、Ｆａ２Ｎ−４細胞は前に記載したのと同様にＴ２５、Ｔ７５及びＴ１５０培養フラスコ中で増殖させ、アルブミン生成は全体的なタンパク質分泌の指標として測定した。第３日に調整培地を回収し、第６日に細胞に再度栄養を与え再度サンプル処理した。アルブミン分泌はＥＬＩＳＡアッセイによって分析した。これらの結果は、平板培養形式とは無関係に６日間の回収期間中、アルブミン分泌が増大し続けることを示す（表１５参照）。非常に注目すべきことに、Ｔ７５及びＴ１５０フラスコ中で細胞を培養すると、アルブミンの劇的な増大がある。全体的な細胞タンパク質は培養中経時的に著しく増大するわけではないので（データ示さず）、おそらくこれらの結果は、フラスコ当たりの細胞数の劇的な増大の結果としてではなく、培養条件への適応の結果として増大した生成によるものであるであると考えられる。
【表１６】

【０２２０】
幾つかの血漿タンパク質の生成はｉｎ ｖｉｖｏではＴＮＦαなどの急性段階タンパク質によって調節され得るので、我々はこのサイトカインが、不死化ヒト肝細胞による血漿タンパク質の分泌を増大させる可能性があると推論した。本発明中の試験において我々は、ＡＡＴの分泌に対するＴＮＦαの影響を調べた。Ｆａ２Ｎ−４細胞は、３日間ＴＮＦα（０、１、５、又は１０ｎｇ／ｍｌ）を含む無血清の占有ＭＦＥ培地中に保った。これらの結果は表１６中に示す。値は二連サンプルの平均である。表１６中に示すように、無血清培養培地中に５ｎｇ／ｍｌのＴＮＦαを含ませることによって、ＡＡＴの分泌は最も顕著に増大した。したがって、このサイトカインを使用してＡＡＴ生成を増大させることが可能であると思われる。
【表１７】

【０２２１】
アルブミン発現は、デキサメタソン誘導プロモーターによって部分的に制御される。不死化ヒト肝細胞によるアルブミンの生成及び分泌に対するデキサメタソンの影響を調べるために、Ｆａ２Ｎ−４細胞（３２回継代）を、培養培地中において４８時間デキサメタソン有り又は無しで、Ｉ型コラーゲン皿上で培養し、アルブミン発現はＥＬＩＳＡアッセイによって測定した。値は二連サンプルの平均である。以下の表（表１７）中に要約したように、アルブミンの分泌はデキサメタソンの不在下で著しく低下した。
【表１８】

【０２２２】
（実施例１２）
治療用血漿タンパク質を生成及び発現する能力
免疫反応性のある治療用血漿タンパク質を正確に生成する我々のＦａ２Ｎ−４細胞系の能力を、免疫反応性のあるヒト成長ホルモン（ｈＧＨ）の生成と共に例示した。一過性トランスフェクションの前の日に、１０％のＮＢＣＳ−ＭＦＥ培地を使用して６ウェルＮｕｎｃプレート中に、ウェル当たり０．５〜０．８×１０^６個の細胞の密度でＦａ２Ｎ−４細胞を平板培養した。トランスフェクションの日に、細胞を１回洗浄して血清を除去し、ｈＧＨの完全ｃＤＮＡを含むＣＭＶ系プラスミドは、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ Ｐｌｕｓ又はＱｉａｇｅｎ Ｅｆｆｅｃｔｅｎｅトランスフェクション試薬キットを使用してＦａ２Ｎ−４細胞に一過的にトランスフェクトした。製造者のプロトコルに従い、トランスフェクションを行った。
【０２２３】
調整培地を２４及び／又は４８時間後にそれぞれのウェルから回収し、ＥＬＩＳＡ系免疫検出アッセイ用にその後使用した。ＥＬＩＳＡアッセイは、サンドウィッチＥＬＩＳＡ原理を利用して分泌されたｈＧＨを定量測定するための、比色定量酵素イムノアッセイである。マイクロタイタープレートに予め結合したｈＧＨに対する抗体は、調整培地中に含まれていた分泌されたｈＧＨと結合する。その後、ジゴキシゲニン標識ｈＧＨ抗体が、調整培地中に含まれていたｈＧＨペプチドの第二のエピトープと結合し、マイクロタイタープレート上に保持される。ペルオキシダーゼと結合するジゴキシゲニンに対する抗体、次にペルオキシダーゼ基質ＡＢＴＳを次いで加える。基質のペルオキシダーゼ触媒型切断によって、マイクロタイタープレートリーダーを使用して容易に検出することができる着色反応生成物が生じる。
【０２２４】
我々の結果によって、トランスフェクションキットを使用し、トランスフェクション後２４又は４８時間で調整培地を採取することによって、Ｆａ２Ｎ−４細胞は非常に多量の二重に免疫検出されるｈＧＨを生成するが、一方ＬａｃＺを用いるトランスフェクション、又はプラスミド陰性対照を用いないトランスフェクションは、検出可能なレベルのｈＧＨは生成しなかったことが確認される。ＥＬＩＳＡプレート１及び２の写真は、それぞれ図３３及び３４中に示す。図３３及び３４に関する重要事項は表１８中に示す。
【表１９】

【０２２５】
（実施例１３）
ＥＡ１Ｃ−３５及びＦａ２Ｎ−４細胞系の免疫学的表現型の特徴付け
Ｅａ１Ｃ−３５（継代２６回）とＦａ２Ｎ−４（継代３０回）細胞系の両方を、異なる肝細胞又は胆管マーカー及びＳＶ４０不死化遺伝子に対する一群の抗体を使用する、間接的な免疫蛍光分析によって表現型を決定した。この分析からの結果は、以下の表１９中に要約する。
【表２０】

【０２２６】
コネクシン３２の発現は密度依存性であった。低い平板培養密度では、この２つのタンパク質の発現は検出不能であった。しかしながら、細胞を集合状態の単層まで増殖させると、Ｅａ１Ｃ−３５及びｆａ２Ｎ−４細胞の亜群は、成体肝臓組織中で肝細胞によってのみ発現される、このギャップ接合タンパク質を発現する。
【０２２７】
全ての細胞がＳＶ４０Ｔ−抗原、それらの核中で不死化遺伝子を発現した。不死化肝細胞の高分化性は、成体肝細胞特異的系統マーカー、アルブミン及びコネクシン３２の強力な発現、並びに胎児肝細胞マーカー、αフェトプロテインの欠如によって示される。これらの細胞は、ＣＤ４９ｆ、胆管マーカーは発現しない。これらの細胞はＣＤ８１、Ｃ型肝炎ウイルス糖タンパク質仲介ウイルス感染に関する推定受容体を発現する。ＣＤ８１に関して免疫染色したＦａ２Ｎ−４細胞の顕微鏡写真を図３５中に示す。ＣＤ８１の発現は原形質膜に局在することに留意されたい。
【０２２８】
合わせて考えると、全ての前述の例が、２つの不死化ヒト肝細胞の細胞系はｉｎ ｖｉｖｏの肝細胞に特徴的な多くの機能的属性を維持しており、治療用血漿タンパク質を含めた血漿タンパク質を生成するための非常に重要なｉｎ ｖｉｔｒｏ系であることを強く示す。
【０２２９】
本明細書に例示的に記載した本発明は、本明細書で詳細に開示しなかった、任意の１つ又は複数の要素、１つ又は複数の制約の不在下で適切に実施することができる。したがって例えば、用語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」、「含む（ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ）」などは、広く非制限的に読み取られるであろう。さらに、本明細書で使用する用語及び表現は、制限ではなく記載する用語として使用されてきており、さらに示し記載する特徴の任意の均等物又はそれらの任意の一部分の排除で、このような用語及び表現を使用する意図はなく、さまざまな変更形態が特許請求する本発明の範囲内で考えられることは理解される。したがって、本発明を好ましい実施形態及び任意選択の特徴によって詳細に開示してきたが、本明細書で開示する本発明の変更形態及び変形は当業者によって再分類することができ、このような変更形態及び変形は、本明細書で開示する本発明の範囲内にあると考えられることは理解されるはずである。本発明は、本明細書に広く一般的に記載してきた。一般的開示の範囲の範疇の狭い範囲の種及び亜族群のそれぞれも、これらの本発明の一部分を形成する。これは、取り出した題材がその中に明確に存在するかどうかに関係なく、その属由来の任意の主題を除去する条件付き又は否定的制約を有する、それぞれの本発明の一般的記載を含む。
【０２３０】
さらに、本発明の幾つかの特徴又は態様はマーカッシュ群の形式で記載するが、本発明はマーカッシュ群の任意の個々の要素又は要素の亜群の形式によってもしたがって記載されることを、当業者は理解しているであろう。前述の記載事項は制限的ではなく例示的であることを目的とすることも理解されよう。多くの実施形態が、前述の記載事項を再考することによって当業者に明らかであろう。したがって本発明の範囲は、前述の記載事項を参照して決定されるべきではなく、その代わりに添付の特許請求の範囲、及びその特許請求の範囲が権利を有する全範囲の均等物を参照して決定されるべきである。全ての物品、及び特許公開を含めた参照文献の開示は、参照によって本明細書に組み込まれる。
【図面の簡単な説明】
【０２３１】
【図１ａ】不死化細胞のゲノムＤＮＡ中へのＳＶ４０ＤＮＡの組み込みを確認する、ラージＴ抗原のＥａ１Ｃ−３５不死化肝細胞の細胞系の免疫染色を示す図である。
【図１ｂ】増殖細胞がアルブミンを発現し続けることを実証する、培養したＦａ２Ｎ−４細胞の免疫染色を示す図である。
【図１ｃ】正常な初代肝細胞の独特の特徴である非常に明確な核小体及び顆粒状細胞質を示す、不死化細胞の形態を示す図である。
【図２】リファンピン（ＲＩＦ）、β−ナフトフラボン（ＢＮＦ）及びフェノバルビタール（ＰＢ）を用いたＦａ２Ｎ−４及びＥＡ１Ｃ−３５の処理のＣＹＰ３Ａ４誘導の結果を示す、イムノブロットを示す図である。Ｃは未処理対照である。上側バンドは非特異的であり、ＢＮＦ、ＣＹＰ１Ａ誘導物質はＣＹＰ３Ａ４タンパク質発現を誘導しないことを記さなければならない。
【図３】以下のレーン：１）ヒト血漿；２）空；３）培養培地（対照）；４）初代ヒト肝細胞（７２時間培養）；５）ＥＡ１Ｃ−３５単層、７２時間培養；６）ＥＡ１Ｃ−３５、回転容器、７日培養；７）ＥＡ１Ｃ−３５回転容器／１４日培養；８）Ｆａ２Ｎ−４単層／７２時間培養；９）Ｆａ２Ｎ−４回転容器／７日培養；１０）Ｆａ２Ｎ−４、回転容器／１４日培養を示す図である。
【図４】ヒト肝細胞の初代培養物及びＦａ２Ｎ−４細胞における酵素誘導の試験を行うための、基本的手順を示すフローチャートである。
【図５】光学顕微鏡レベルでのヒト肝細胞（左図）及びＦａ２Ｎ−４細胞（右図）の形態を示す、顕微鏡写真の図である。
【図６】Ｆａ２Ｎ−４細胞におけるオメプラゾール及びリファンピンによる、ＣＹＰ酵素の誘導を示す一組のグラフである（ＣＹＰ１Ａ２、ＣＹＰ３Ａ４、ＣＹＰ２Ｂ６、及びＣＹＰ２Ｃ９；ＤＭＳＯ対照）。
【図７】６−、１２−及び２４−ウェルプレート中のリファンピン処理したＦａ２Ｎ−４細胞における、ＣＹＰ２Ｂ６誘導の再現性を示すグラフである。
【図８】多数回の細胞継代中のＣＹＰ１Ａ２及びＣＹＰ３Ａ４誘導の再現性を示すグラフである。
【図９】リファンピンによるＣＹＰ２Ｂ６の誘導が６−、１２−及び２４−ウェルプレート中において同一であることを示す、簡単なグラフである。
【図１０】オメプラゾールによるＣＹＰ１Ａ２の誘導、及びリファンピンによるＣＹＰ３Ａ４の誘導に対する細胞培養形式の影響を示すグラフである。
【図１１】Ｆａ２Ｎ−４細胞におけるＣＹＰ１Ａ２及びＣＹＰ３Ａ４誘導の時間行程を示すグラフである。
【図１２】Ｆａ２Ｎ−４におけるオメプラゾールによるＣＹＰ１Ａ２の誘導、及びリファンピンによるＣＹＰ３Ａ４の誘導に関する濃度応答曲線を示すグラフである。
【図１３】ヒト肝細胞においてＰＸＲを活性化させＣＹＰ３Ａ４を誘導することが以前に示された化合物は、Ｆａ２Ｎ−４細胞においてＣＹＰ３Ａ４活性を誘導するが、一方Ａｈ受容体アゴニストは誘導しないことを示すグラフである。
【図１４】ヒト肝細胞の初代培養物におけるＣＹＰ３Ａ４誘導の範囲を示すグラフである。
【図１５】Ｆａ２Ｎ−４細胞におけるＣＹＰ１Ａ２及びＣＹＰ３Ａ４活性に対する酵素誘導物質の影響を示すグラフである（左図、ＣＹＰ１Ａ２；右図、ＣＹＰ３Ａ４）。
【図１６】毒性試験における不死化肝細胞の使用の結果を示すグラフである。
【図１７】２００倍の倍率での、ＭＰＥ培地中９６ウェルＢｉｏｃｏａｔＩ型コラーゲンプレート中に平板培養した集合状態のＦａ２Ｎ−４細胞の、位相差顕微鏡画像の図である。
【図１８】Ｆａ２Ｎ−４細胞におけるＣＹＰ１Ａ２、ＣＹＰ２Ｃ９、ＣＹＰ３Ａ４、ＵＧＴ１Ａ、及びＭＤＲ１転写物の誘導を示すグラフである。
【図１９】Ｆａ２Ｎ−４細胞におけるシトクロム−４５０酵素活性による誘導の測定を示すグラフである（（Ａ）：ＣＹＰ３Ａ４活性の測定；（Ｂ）：ＣＹＰ２Ｃ９活性の測定；（Ｃ）：ＣＹＰ１Ａ２活性の測定）。
【図２０】高いＣＹＰ３Ａ４転写物値（図（Ａ））及び高いＣＹＰ３Ａ４酵素活性（図（Ｂ））を使用する、Ｆａ２Ｎ−４細胞に関するＥＣ５０プロットを示すグラフである。
【図２１】弱い応答性を有するＣＹＰ３Ａ４誘導物質（５０μＭのデキサメタソン）、及び強い応答性を示すＣＹＰ３Ａ４誘導物質（１０μＭのリファンピン）に対する多数回継代したＦａ２Ｎ−４細胞の応答性を示すグラフである。
【図２２】１０μＭのリファンピン（黒棒）に４８時間曝した後のＦａ２Ｎ−４細胞におけるＣＹＰ３Ａ４転写物の誘導が、媒体（白棒）と比較して示されることを示すグラフである。
【図２３】そのレーンを実施例１０の表９中に示す、ゲル（ゲル１）のオートラジオグラフである。
【図２４】そのレーンを実施例１０の表９中に示す、ゲル（ゲル２）のオートラジオグラフである。
【図２５】そのレーンを実施例１０の表９中に示す、ゲル（ゲル３）のオートラジオグラフである。
【図２６】そのレーンを実施例１０の表９中に示す、ゲル（ゲル４）のオートラジオグラフである。
【図２７】そのレーンを実施例１０の表１０中に示す、ゲル（ゲル５）のオートラジオグラフである。
【図２８】そのレーンを実施例１０の表１０中に示す、ゲル（ゲル６）のオートラジオグラフである。
【図２９】そのレーンを実施例１０の表１０中に示す、ゲル（ゲル７）のオートラジオグラフである。
【図３０】そのレーンを実施例１０の表１０中に示す、ゲル（ゲル８）のオートラジオグラフである。
【図３１】Ｆａ２Ｎ−４及びＥａ１Ｃ−３５細胞系の分泌したタンパク質の、二次元電気泳動分析後のゲルの写真図である（（Ａ）：Ｆａ２Ｎ−４；（Ｂ）：Ｅａ１Ｃ−３５；（Ｃ）：Ｅａ１Ｃ−３５用の抗第ＩＸ因子抗体を使用して分泌された第ＩＸ因子を検出するウエスタンブロット）。
【図３２】そのレーンを実施例１１の表１１中に示す、ゲル（ゲル８）のオートラジオグラフである。
【図３３】サンドウィッチＥＬＩＳＡ原理を使用して分泌されたｈＧＨを定量測定するための比色定量酵素イムノアッセイを含む、ＥＬＩＳＡ（プレート１）の写真を示す図である；このプレートに関する重要事項は表１８に示す。
【図３４】サンドウィッチＥＬＩＳＡ原理を使用して分泌されたｈＧＨを定量測定するための比色定量酵素イムノアッセイを含む、ＥＬＩＳＡ（プレート２）の写真を示す図である；このプレートに関する重要事項は表１８に示す。
【図３５】ＣＤ８１発現に関して染色された免疫染色Ｆａ２Ｎ−４細胞の写真の図である。二次抗体と結合したフルオレセインを用いた間接的な免疫蛍光性によって、ＣＤ８１を目に見える状態にした。

【特許請求の範囲】
【請求項１】
不死化ヒト肝細胞を使用してタンパク質を生成する方法であって、
（ａ）タンパク質をコードし発現することができるＤＮＡを含む不死化ヒト肝細胞を用意するステップ、
（ｂ）前記タンパク質をコードする１つ又は複数の遺伝子が、前記タンパク質が前記不死化肝細胞中で生成されプロセシングされるように発現されるような条件下で、前記不死化肝細胞を培養するステップ、及び
（ｃ）前記不死化肝細胞から前記プロセシングされたタンパク質を単離するステップ
を含み、必要な場合プロセシングされグリコシル化されるように前記タンパク質を発現させ、そのｉｎ ｖｉｖｏ機能がその単離後実質的に保たれる方法。
【請求項２】
前記タンパク質がヒト肝細胞によって自然に生成される血漿タンパク質である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記タンパク質がヒト肝細胞によって自然に生成されないタンパク質である、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記タンパク質がヒト肝細胞によって通常生成されるタンパク質のムテインである、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記タンパク質が治療用タンパク質である、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記治療用タンパク質が治療用血漿タンパク質である、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記タンパク質が第ＶＩＩＩ因子、第ＩＸ因子、ヒト成長ホルモン（ｈＧＨ）、α−１−抗トリプシン、及び増殖因子からなる群から選択される、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記タンパク質が第ＶＩＩＩ因子のムテイン、第ＩＸ因子のムテイン、ヒト成長ホルモンのムテイン、α−１−抗トリプシンのムテイン、及び増殖因子のムテインからなる群から選択される、請求項６に記載の方法。
【請求項９】
前記タンパク質がＩαＩｐタンパク質複合体である、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
前記タンパク質がアルブミン、トランスコバラミンＩＩ、Ｃ−反応性タンパク質、フィブロネクチン、セルロプラスミン、及び構造活性、酵素活性、又は輸送活性を有する他のタンパク質からなる群から選択されるタンパク質である、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
前記タンパク質がアルブミン、トランスコバラミンＩＩ、Ｃ−反応性タンパク質、フィブロネクチン、セルロプラスミン、及び構造活性、酵素活性、又は輸送活性を有する他のタンパク質からなる群から選択されるタンパク質のムテインである、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
肝細胞中に本来存在する遺伝子によってタンパク質を発現させ、前記タンパク質をコードする本来存在する遺伝子の発現が高レベルのプロモーターを前記肝細胞中に導入することによって増強される、請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
（１）発現させるタンパク質、発現させるタンパク質のサブユニット、又は発現させるタンパク質の前駆体をコードする遺伝子、及び（２）前記遺伝子の転写に影響を与える少なくとも１つの制御要素であって、前記遺伝子と動作可能に連結した制御要素を含む１つ又は複数の組換えベクターを使用することによって、前記発現させるタンパク質、前記発現させるタンパク質のサブユニット、又は前記発現させるタンパク質の前駆体をコードする遺伝子の多数のコピーを導入することによって発現を増強させる、請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
前記組換えベクターがＳＶ４０由来ベクター、ネズミポリオーマ由来ベクター、ＢＫウイルス由来ベクター、エプスタインバーウイルス由来ベクター、アデノウイルス由来ベクター、アデノ関連ウイルス由来ベクター、バキュロウイルス由来ベクター、ヘルペスウイルス由来ベクター、レンチウイルス由来ベクター、レトロウイルス由来ベクター、アルファウイルス由来ベクター、及びワクシニアウイルス由来ベクターからなる群から選択される、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記ベクターが１つ又は複数のレポーター遺伝子を取り込む、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記発現したタンパク質が細胞から周囲の培養培地に分泌される、請求項１に記載の方法。
【請求項１７】
前記タンパク質がグリコシル化される、請求項１に記載の方法。
【請求項１８】
前記タンパク質が翻訳後にプロセシングされる、請求項１に記載の方法。
【請求項１９】
前記タンパク質が切断可能なタグと融合した形で発現される、請求項１に記載の方法。
【請求項２０】
前記切断可能なタグがグルタチオンＳ−トランスフェラーゼ、ＭａｌＥマルトース結合タンパク質、及びポリヒスチジン配列からなる群から選択される、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
前記タンパク質が少なくとも２つの異なるサブユニットを含み、前記不死化肝細胞を少なくとも２つのベクターを用いて形質転換又はトランスフェクトし、それぞれのベクターが（１）前記タンパク質の少なくとも１つのサブユニットをコードする少なくとも１つの遺伝子を含むＤＮＡ；及び前記タンパク質のサブユニットをコードする少なくとも１つの遺伝子をコードする前記ＤＮＡと動作可能に連結した少なくとも１つの制御要素を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項２２】
前記不死化ヒト肝細胞をウイルスにより不死化させる、請求項１に記載の方法。
【請求項２３】
実質的に純粋なシミアンウイルス（ＳＶ４０）のＤＮＡを用いた形質転換又はトランスフェクションによって前記肝細胞を不死化させる、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
前記実質的に純粋なＳＶ４０のＤＮＡがラージＴ抗原及びスモールｔ抗原（タグ）をコードする、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
前記不死化ヒト肝細胞が低温保存した初代ヒト肝細胞に由来する、請求項１に記載の方法。
【請求項２６】
前記肝細胞が、腫瘍抑制遺伝子をコードする実質的に純粋なＤＮＡを前記肝細胞から単離し精製することができるようにＤＮＡをコードする腫瘍抑制遺伝子を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項２７】
前記肝細胞が、Ｒｂをコードする実質的に純粋なＤＮＡを前記肝細胞から単離し精製することができるようにＲｂをコードするＤＮＡを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項２８】
前記肝細胞が、ｐ５３をコードする実質的に純粋なＤＮＡを前記肝細胞から単離し精製することができるようにｐ５３をコードするＤＮＡを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項２９】
前記肝細胞が非腫瘍形成性であり、無血清培地中に保たれる能力を有し、血漿タンパク質を生成する、請求項１に記載の方法。
【請求項３０】
前記肝細胞がＦａ２Ｎ−４細胞系の肝細胞である、請求項１に記載の方法。
【請求項３１】
前記肝細胞がＥａ１Ｃ−３５細胞系の肝細胞である、請求項１に記載の方法。
【請求項３２】
ヒト肝細胞以外の真核細胞を使用してＩαＩｐタンパク質複合体を生成する方法であって、
（ａ）ＩαＩｐタンパク質複合体を形成するタンパク質をコードし発現することができるＤＮＡを含むヒト肝細胞以外の真核細胞を用意するステップであって、（１）ＩαＩｐタンパク質複合体の一部であるタンパク質前駆体の少なくとも１つの遺伝子を含むＤＮＡ及び（２）少なくとも１つの前駆体遺伝子をコードする前記ＤＮＡと動作可能に連結して前記前駆体遺伝子の発現を増強させる、少なくとも１つの制御要素を含む少なくとも１つのベクターを用いて、前記真核細胞が形質転換又はトランスフェクトされているステップ、
（ｂ）ＩαＩｐ複合体を形成するタンパク質をコードする遺伝子が、ＩαＩｐ複合体が生成されるように発現されるような条件下で、前記形質転換又はトランスフェクトされた真核細胞を培養するステップ、及び
（ｃ）前記形質転換又はトランスフェクトされた真核細胞から前記発現されたＩαＩｐタンパク質複合体を単離するステップ
を含む方法。
【請求項３３】
前記真核細胞がＣＨＯ細胞、ＣＯＳ細胞、及び酵母菌細胞からなる群から選択される、請求項３２に記載の方法。
【請求項３４】
２つのベクター：（１）遺伝子Ｈ３及びＡＭＢＰを含む第一のベクター；及び（２）遺伝子Ｈ２及びＨ１を含む第二のベクターを用いて、前記肝細胞を形質転換又はトランスフェクトする、請求項３２に記載の方法。
【請求項３５】
タンパク質をコードし発現することができるＤＮＡを含む不死化ヒト肝細胞であって、（１）タンパク質をコードする少なくとも１つの遺伝子を含むＤＮＡ及び（２）前記タンパク質をコードするＤＮＡと動作可能に連結して前記タンパク質の発現を増強させる少なくとも１つの制御要素を含む少なくとも１つのベクターを用いて、形質転換又はトランスフェクトされている不死化ヒト肝細胞。
【請求項３６】
前記タンパク質がヒト肝細胞によって自然に生成されるタンパク質である、請求項３５に記載の細胞。
【請求項３７】
前記タンパク質がヒト肝細胞によって自然に生成されないタンパク質である、請求項３５に記載の細胞。
【請求項３８】
前記タンパク質がヒト肝細胞によって通常生成されるタンパク質のムテインである、請求項３７に記載の細胞。
【請求項３９】
前記タンパク質が治療用タンパク質である、請求項３５に記載の細胞。
【請求項４０】
前記治療用タンパク質が治療用血漿タンパク質である、請求項３９に記載の細胞。
【請求項４１】
前記タンパク質が第ＶＩＩＩ因子、第ＩＸ因子、ヒト成長ホルモン（ｈＧＨ）、α−１−抗トリプシン、及び増殖因子からなる群から選択される治療用血漿タンパク質である、請求項４０に記載の細胞。
【請求項４２】
前記タンパク質が第ＶＩＩＩ因子のムテイン、第ＩＸ因子のムテイン、ヒト成長ホルモンのムテイン、α−１−抗トリプシンのムテイン、及び増殖因子のムテインからなる群から選択される血漿タンパク質である、請求項４０に記載の細胞。
【請求項４３】
前記血漿タンパク質がＩαＩｐタンパク質複合体である、請求項３５に記載の細胞。
【請求項４４】
前記タンパク質がアルブミン、トランスコバラミンＩＩ、Ｃ−反応性タンパク質、フィブロネクチン、セルロプラスミン、及び構造活性、酵素活性、又は輸送活性を有する他のタンパク質からなる群から選択されるタンパク質である、請求項３５に記載の細胞。
【請求項４５】
前記タンパク質がアルブミン、トランスコバラミンＩＩ、Ｃ−反応性タンパク質、フィブロネクチン、セルロプラスミン、及び構造活性、酵素活性、又は輸送活性を有する他のタンパク質からなる群から選択されるタンパク質のムテインである、請求項４５に記載の細胞。
【請求項４６】
疾患又は状態を治療する方法であって、
（ａ）請求項１に記載の方法に従って生成される活性タンパク質を用意するステップ、及び
（ｂ）前記疾患又は状態に罹患している患者に前記疾患又は状態を治療する治療活性量の前記活性タンパク質を投与するステップ
を含む方法。
【請求項４７】
前記疾患又は状態が肝臓に影響を与える疾患又は状態である、請求項４６に記載の方法。
【請求項４８】
前記肝臓に影響を与える疾患又は状態が敗血症、癌、肝炎、及び肝不全からなる群から選択される、請求項４７に記載の方法。
【請求項４９】
前記疾患又は状態が肝臓以外の臓器に影響を与える疾患又は状態である、請求項４６に記載の方法。
【請求項５０】
前記疾患又は状態が癌、関節炎症、及び関節炎からなる群から選択される、請求項４９に記載の方法。
【請求項５１】
疾患又は状態を治療するための医薬組成物であって、
（ａ）疾患又は状態を治療するのに治療上有効な量の真核細胞によって生成されたＩαＩｐタンパク質複合体、及び
（ｂ）薬剤として許容される担体
を含む医薬組成物。
【請求項５２】
前記疾患又は状態が肝臓に影響を与える疾患又は状態である、請求項５１に記載の医薬組成物。
【請求項５３】
前記肝臓に影響を与える疾患又は状態が敗血症、癌、肝炎、及び肝不全からなる群から選択される、請求項５２に記載の医薬組成物。
【請求項５４】
前記疾患又は状態が肝臓以外の臓器に影響を与える疾患又は状態である、請求項５１に記載の医薬組成物。
【請求項５５】
前記疾患又は状態が癌、関節炎症、及び関節炎からなる群から選択される、請求項５４に記載の医薬組成物。
【請求項５６】
疾患又は状態を治療する方法であって、
（ａ）請求項１に記載の方法によって生成される活性のある血漿タンパク質を用意するステップ、及び
（ｂ）前記疾患又は状態に罹患している患者に前記疾患又は状態を治療するための治療上有効な量の前記活性のある血漿タンパク質を投与するステップ
を含む方法。
【請求項５７】
前記疾患又は状態が肝臓に影響を与える疾患又は状態である、請求項５６に記載の方法。
【請求項５８】
前記肝臓に影響を与える疾患又は状態が敗血症、癌、肝炎、及び肝不全からなる群から選択される、請求項５７に記載の方法。
【請求項５９】
前記疾患又は状態が肝臓以外の臓器に影響を与える疾患又は状態である、請求項５６に記載の方法。
【請求項６０】
前記疾患又は状態が癌、関節炎症、及び関節炎からなる群から選択される、請求項５９に記載の方法。
【請求項６１】
前記活性のある血漿タンパク質が第ＶＩＩＩ因子、第ＩＸ因子、ヒト成長ホルモン（ｈＧＨ）、α−１−抗トリプシン、及び増殖因子からなる群から選択される、請求項５６に記載の方法。

【図１ａ】

【図１ｂ】

【図１ｃ】

【図２】

【図３】

【図４】

【図５】

【図６】

【図７】

【図８】

【図９】

【図１０】

【図１１】

【図１２】

【図１３】

【図１４】

【図１５】

【図１６】

【図１７】

【図１８】

【図１９】

【図２０】

【図２１】

【図２２】

【図２３】

【図２４】

【図２５】

【図２６】

【図２７】

【図２８】

【図２９】

【図３０】

【図３１】

【図３２】

【図３３】

【図３４】

【図３５】

【公表番号】特表２００７−５０８０１９（Ｐ２００７−５０８０１９Ａ）
【公表日】平成１９年４月５日（２００７．４．５）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００６−５３４３８８（Ｐ２００６−５３４３８８）
【出願日】平成１６年１０月７日（２００４．１０．７）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００４／０３３２６０
【国際公開番号】ＷＯ２００５／０３４８７６
【国際公開日】平成１７年４月２１日（２００５．４．２１）
【出願人】（５０６１１８７７７）マルチセル　テクノロジーズ、インコーポレイテッド (2)
【Ｆターム（参考）】