浮腫を治療または軽減するための新規な化合物およびその使用方法
単離され、実質的に精製されたオリゴヌクレオチド化合物は、腫脹および浮腫の低下に有効であることが示された。様々な病因の浮腫を予防、軽減、または治療するための新規な方法および物質に提供される。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明およびその実施形態は、医学の分野、特に、いくつかの医学的状態において直面する、任意の器官または組織中の間質液のバランスにおける障害または機能不全である浮腫の治療または軽減で使用するための新規な化合物および方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
浮腫は、組織空間または体腔における細胞の間中の隙体液の異常な蓄積（貯留）として定義することができる。これは、血管系から組織への体液の過剰な移動、または組織から血管系へ戻る体液の不適正な移動によって引き起こされ得る。これらの２つの区画間での体液の正常な交換は、組織液の「スターリングの式」によって調節され、間質液の生成は、半透性の毛細血管壁を介して反対方向に作用する浸透圧および静水圧のバランスに依存する。浮腫は、これらの力におけるアンバランスの結果であり、これは、間質空間における体液の異常な蓄積を引き起こす傾向がある。
【０００３】
浮腫の臨床症状は、身体の軽症から重症の腫脹および体重の増加を含む。腫脹は、細胞外液における広汎の（もしくは全身性の）増加によってまたは限局性の部位に限られる浮腫の集中により引き起こされ得る。広汎の浮腫についての医学的状態である全身浮腫は、皮下組織の腫脹によって特徴づけられるが、限局性の浮腫は通常、とりわけ水胸症（胸膜の間の空間における漿液過多）、心膜水腫（心膜における体液過多）、腹水症、または腹水（腹膜腔における体液過多）など、罹患部位に基づいて称される。
【０００４】
浮腫において蓄積する血管外液の組成は、その病因によって変動する。非炎症性のメカニズムによって引き起こされる浮腫の場合において、体液（漏出液）は、比較的低いタンパク質濃度を含み、比重が小さく、罹患部位の内皮が正常であることを示す。そのような場合において、漏出液は、本質的に、血漿の限外濾過液である。この種類の非炎症性の浮腫は、毛細血管壁を介した、血行動態による力の変化によって主に引き起こされ、血行動態による浮腫としても知られている。他方では、炎症応答によって引き起こされる浮腫の場合において、血管外液（滲出液）は、高濃度のタンパク質、細胞、および細胞破片を含み、比重が大きい。これは、罹患エリアにおける微小血管の正常な透過性における著しい変化を示す。
【０００５】
浮腫は、様々な疾患の発病の重要な機能的徴候として通常、生じるが、外傷および傷害の結果としても生じ得る。心不全、肝硬変、およびネフローゼ症候群などの腎疾患は、浮腫を引き起こす最も一般的な全身性疾患の一部である。疾患発病の間の浮腫の発症に関与する主なメカニズムは、血管内の静水圧の増加、リンパ流の機能障害、不適切な腎臓のナトリウムおよび水の貯留（滞留）、血漿浸透圧の低下、ならびに血管透過性の増加を含む。
【０００６】
静脈における静水圧の増加は、組織からの体液の再吸収の不良をもたらし、このアンバランスは、浮腫をもたらす。静水圧の増加は、静脈圧の広汎の増加として生じる可能性もあり、または特定の部位にしか影響しない可能性もある。静水圧の局所的な増加は、静脈流出障害に起因する可能性があり、これは、普通、より低い末端で起こり、閉塞性血栓症および静脈瘤の発症に対する二次性のものである。結果として生じる浮腫は、肢および下肢において限局性であり、末梢浮腫として一般的に知られている。静脈圧の広汎の増加は、全身性の浮腫をもたらし、これは、うっ血性心不全の場合において一般的に観察される。具体的には、心臓の左側の不全は、肺（肺胞）における体液の集中をもたらし、肺水腫および呼吸困難をもたらす。他方では、心臓の右側の不全の間に、体液は、下肢において蓄積し、末梢浮腫を引き起こす。状態が進行するまたは悪化するとともに、上肢もまた膨張し、最終的に、腹膜腔において体液が集中し、これは、腹水として知られている浮腫の状態をもたらす。全身において広汎である浮腫の原因は、複数の器官において浮腫を引き起こし得ることが観察されている。
【０００７】
リンパ流の障害またはリンパ液の閉塞は、間質液の不適正な排液をもたらし、これは、結果的に、限局性のリンパ水腫を引き起こす。リンパ水腫は、リンパ液過多が組織に集中する、一般的な衰弱性の浮腫状態である。それは、とりわけ炎症性のもしくは新生物性の閉塞、癌もしくは拡大したリンパ節からの圧力、放射線療法によるリンパ管の破壊、または象皮病もしくはフィラリア症などの感染によるリンパ管の浸潤によって引き起こされ得る。
【０００８】
腎臓によるナトリウムおよび水の過剰な貯留は、血管内の体液の容量の増加を引き起こし、これは、最終的に、静水圧を増加させ、浮腫を引き起こす。とりわけ急性腎不全または連鎖球菌性糸球体腎炎などの状態は、正常な腎機能に直接、影響を与え、身体における異常な塩類貯留を引き起こす。これとは別に、うっ血性心不全、低アルブミン血症などのいくつかの障害の発病は、レニン−アンギオテンシン−アルドステロン（ＲＡＡＳ）ホルモン系を活性化し、これは、ナトリウムおよび水の貯留を促進する。したがって、あるメカニズムによって開始される浮腫は、塩類および体液の貯留の二次性のメカニズムによって複雑になる。身体における余分な体液負荷および体液の貯留の悪循環は、膜を介した圧力勾配をさらにアンバランスにし、浮腫の悪化をもたらす。
【０００９】
血管内部の血漿浸透圧の減少は、間質空間への体液の移動を促進し、浮腫をもたらす。血漿浸透圧のそのような減少は、血液容量を維持するために主として寄与する、毛細血管膜に対して不透過性である血漿タンパク質、特にアルブミンの過剰な損失または合成の低下のいずれかの結果となり得る。アルブミンの過剰な損失の最も重要な原因は、ネフローゼ症候群として知られている腎臓障害であり、これは、漏出性の糸球体基底膜によって特徴づけられ、これは、広汎の浮腫を最終的にもたらす。血清タンパク質、特にアルブミンの合成の低下（または低アルブミン血症）は、肝硬変などの肝臓のびまん性疾患において生じるまたは栄養失調と関連する。これらのすべての例において、血管内から間質区画への体液の移動は、血漿の容量の収縮をもたらし、これは、とりわけ腹水および末梢浮腫などの広汎の浮腫様の症状をもたらす。
【００１０】
血漿タンパク質の過剰な損失の他の重要な原因は、血漿タンパク質に対する血管の透過性の増加である。この透過性の増加は、血行路から間質への、タンパク質および白血球などの細胞の移動を引き起こす。血漿からの、タンパク質が豊富な体液の損失は、血管内の浸透圧を低下させ、間質空間の浸透圧を増加させて、これは、血管から間質への体液の流出を最終的にもたらし、浮腫を引き起こす。血管透過性の増加は、特に急性炎症の場合における、刺激に対する身体の炎症応答の主な特徴の１つである。実際に、浮腫は、急性炎症の主な徴候の１つである。炎症の間に、血漿に由来し、炎症性の刺激によって誘発される化学的因子は、罹患部位におけるいくつかの血管応答および細胞応答を媒介する。微小血管系におけるこれらの構造変化は、血管膜の透過性の増加をもたらし、血行路から間質への、血漿タンパク質および細胞、たとえば白血球の移動を引き起こし、これは、部位特異的な浮腫を最終的にもたらす。炎症性浮腫は、大部分は、ヒスタミン、ブラジキニン、および他の放出される物質の直接作用に起因し得る。炎症における血管透過性の増加の主なメカニズムは、とりわけ内皮細胞収縮、接合部の退縮、直接の傷害、白血球依存性の漏出、再生内皮を含む。間質への体液濾過の増加は、炎症媒介物質の小動脈血管拡張作用によってさらに増強され、これは、血流、灌流表面積、毛細血管静水圧を増加させ、同様に、他のメカニズムによって浮腫を促進する。
【００１１】
要約すれば、浮腫は、様々な疾患の発病の重要な機能的徴候の１つとして知られている。とりわけ心不全、肝硬変、ネフローゼ症候群は、浮腫を最終的にもたらす最も一般的な全身性疾患の一部である。浮腫の動態およびこれらの疾患と関連する他の関係する臨床症状の理解は、それらの全病状を解明するのに重要であり、これらの疾患への、新規かつ高度に特異的な診断、治療および予防的な戦略を開発する際に助けとなり得る。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【００１２】
【非特許文献１】Guochang Hu、 Stephen M.Vogel、 David E.Schwartz、 Asrar B.Malik、 Richard D.Minshall.(2008) 「Intercellular Adhesion Molecule-1-Dependent Neutrophil Adhesion to Endothelial Cells Induces Caveolae-Mediated Pulmonary Vascular Hyperpermeability」 Circ Res.102:e120-e131.
【非特許文献２】A.Gennaro(編)、 Remington's Pharmaceutical Sciences、 第１８版、 Mack Publishing Co.、 Easton、 PA、 1990
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１３】
一目的は、浮腫を予防、軽減、または治療するための新規な化合物および方法を利用可能にすることである。他の目的およびそれらの関連する利点は、説明および実施例の検討後に明らかになるであろう。
【課題を解決するための手段】
【００１４】
本発明者らは、参照によって本明細書に組み込まれる添付の特許請求の範囲において記載されるように、浮腫を予防、治療、または軽減するための新規な化合物および方法を利用可能にする。本発明者らは、驚いたことに、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、および配列番号１０を含む群から選択される配列を含むオリゴヌクレオチド化合物が、浮腫の治療または軽減に有効であることを発見した。
【００１５】
本発明の一実施形態によれば、配列番号１〜１０の配列の少なくとも１つを含むオリゴヌクレオチド化合物は、約１２〜約３０塩基の全長を有する。
【００１６】
本発明者らは、個々のオリゴヌクレオチド配列を同定し、試験し、浮腫の治療または軽減におけるそれらの有用性を示した。
【００１７】
これらの発見に基づいて、本発明者らは、添付の特許請求の範囲において開示される特定の化合物を提供する。これらの化合物は、インビトロおよびインビボの両方で試験され、実験結果は、化合物が、血管透過性を低下させることによって浮腫を低下させるという理論を暫定的に支持する。
【００１８】
この説明、実施例、および特許請求の範囲において、より詳細に下記で実施形態を説明し、添付の図面と共に検討する。
【図面の簡単な説明】
【００１９】
【図１】テトラデカノイルホルボール１３−アセテート（ＴＰＡ）誘発性の耳浮腫モデルにおける、試験薬剤およびコントロール薬剤の抗炎症効果を示すグラフである。ＩＤＸ０９２０（５０μｇ）、ＩＤＸ０１５０（１００μｇ）、ＩＤＸ０９５５（１００μｇ）、および試験薬剤ＩＤＸ０００１（１００μｇ）をＴＰＡの投与の２０分前に、１回の単一ｓ．ｃ．注射として与えた。耳の最初の厚さを１００％として設定した。ＰＢＳと比較した曲線下面積（ＡＵＣ）の低下は、ＩＤＸ０９２０ −２２．１％（Ｐ＜０．０１１）、ＩＤＸ０１５０ −３８．９％（Ｐ＜０．０１１）、ＩＤＸ０９５５ −４．８％、およびＩＤＸ０００１ −１５．７％（Ｐ＞０．０５）である。ダネットの多重比較検定を用いる一元配置ＡＮＯＶＡ。
【００２０】
【図２】ネガティブコントロール（ＴＰＡを有するＰＢＳ媒体）と比較した、ＴＰＡモデルを用いる１０回の実験から組み合わせた、１００μｇ ＩＤＸ０１５０の投与の後の膨張の平均炎症ピーク値を示す、ＴＰＡ誘発性の耳浮腫モデルからの結果を示す図である。スチューデント検定、***Ｐ＜０．００１、±ＳＤ。
【００２１】
【図３ａ】ＴＰＡ誘発性の耳浮腫モデルからの組み合わせのヒストグラムを示す図である。媒体（ＰＢＳ）治療と比較した、ＩＤＸ０１５０治療による浮腫ピーク値の低下。黒色の棒、鼻腔内（ｉ．ｎ．）投与、白色の棒、腹腔内（ｉ．ｐ．）投与、および斜線をひいた棒、皮下（ｓ．ｃ．）投与。ＴＰＡ投与の４日前（Ｉ、Ｅ、およびＦ）、ＴＰＡ投与の２日前（Ｄ）、ＴＰＡ投与の２０分前（Ｈ、Ａ、Ｂ、およびＣ）、ＴＰＡ投与の２時間後（ＪおよびＧ）にＩＤＸ０１５０を用いて治療。５０μｇ ＩＤＸ０１５０／マウスを使用した試験Ｆを除いて、すべての場合において、１００μｇ ＩＤＸ０１５０／マウスを治療に使用した。Ｅ、ＦまたはＢ、Ｃは、２回の実験の平均である。
【００２２】
【図３ｂ】ＴＰＡ誘発性の耳浮腫モデルからの組み合わせのヒストグラムを示す図である。媒体（ＰＢＳ）治療と比較した、ＩＤＸ０１５０治療による浮腫曲線下面積（ＡＵＣ）の低下。黒色の棒、鼻腔内（ｉ．ｎ．）投与、白色の棒、腹腔内（ｉ．ｐ．）投与、および斜線をひいた棒、皮下（ｓ．ｃ．）投与。ＴＰＡ投与の４日前（Ｉ、Ｅ、およびＦ）、ＴＰＡ投与の２日前（Ｄ）、ＴＰＡ投与の２０分前（Ｈ、Ａ、Ｂ、およびＣ）、ＴＰＡ投与の２時間後（ＪおよびＧ）にＩＤＸ０１５０を用いて治療。５０μｇ ＩＤＸ０１５０／マウスを使用した試験Ｆを除いて、すべての場合において、１００μｇ ＩＤＸ０１５０／マウスを治療に使用した。Ｅ、ＦまたはＢ、Ｃは、２回の実験の平均である。
【００２３】
【図４】アラキドン酸（ＡＡ）誘発性の耳浮腫モデルにおける、フェニドンおよびＩＤＸ０１５０の効果を示すヒストグラムである。ＡＡ誘発の３０分前に与えたフェニドンは、ＡＵＣ −３９．１％、Ｐ＜０．０５の低下を示し、これは、前に得られたＩＤＸ０１５０を用いる治療に類似した（図２を参照されたい）。ＡＡの２０分前に与えたＩＤＸ０１５０と組み合わせた、ＡＡの３０分前に与えたフェニドンは、さらなる低下をもたらした（−７６．８％、Ｐ＜０．００１）。
【００２４】
【図５ａ】ＴＰＡ誘発性の耳浮腫モデルにおける試験薬剤および媒体（ＰＢＳ）の抗炎症効果を示すグラフである。１０μｇのＩＤＸ９０２４、ＩＤＸ９０２５、ＩＤＸ９０３８、ＩＤＸ９０５１、およびＩＤＸ９０５３を、ＴＰＡの投与の２０分前に、１回の単一ｓ．ｃ．注射として与えた。耳の最初の厚さを１００％として設定した。ＡＵＣ低下は、ＰＢＳコントロールと比較して、ＩＤＸ９０２４ −４７．３％、ＩＤＸ９０２５ −５７．８％、ＩＤＸ９０３８ −４７．４％、ＩＤＸ９０５１ −５４．０％、およびＩＤＸ９０５３ −３９．０％。
【００２５】
【図５ｂ】ＴＰＡ誘発性の耳浮腫モデルにおける試験薬剤および媒体（ＰＢＳ）の抗炎症効果を示すグラフである。１０μｇのＩＤＸ９０６４、ＩＤＸ９０７６、ＩＤＸ９０７８、ＩＤＸ９０８０、およびＩＤＸ９０８９を、ＴＰＡの投与の２０分前に、１回の単一ｓ．ｃ．注射として与えた。耳の最初の厚さを１００％として設定した。ＡＵＣ低下は、ＰＢＳコントロールと比較して、ＩＤＸ９０６４ −５９．７％、ＩＤＸ９０７６ −５．１％、ＩＤＸ９０７８ −４１．３％、ＩＤＸ９０８７ −４０．２％。
【００２６】
【図５ｃ】ＡＡ誘発性の耳浮腫モデルにおける試験薬剤および媒体（ＰＢＳ）の抗炎症効果を示すグラフである。１０μｇのＩＤＸ９０２４、ＩＤＸ９０２５、およびＩＤＸ９０５１を、ＡＡの投与の２０分前に、１回の単一ｓ．ｃ．注射として与えた。耳の最初の厚さを１００％として設定した。ＡＵＣ低下は、ＰＢＳコントロールと比較して、ＩＤＸ９０２４ −５８．５％、ＩＤＸ９０２５ −８１．９％、およびＩＤＸ９０５１ −６７．５％。
【００２７】
【図５ｄ】ＡＡ誘発性の耳浮腫モデルにおける試験薬剤および媒体（ＰＢＳ）の抗炎症効果を示すグラフである。１０μｇのＩＤＸ９０７６、ＩＤＸ９０７８、およびＩＤＸ０１５０を、ＡＡの投与の２０分前に、１回の単一ｓ．ｃ．注射として与えた。耳の最初の厚さを１００％として設定した。ＡＵＣ低下は、ＰＢＳコントロールと比較して、ＩＤＸ９０７６ −４５．７％、ＩＤＸ９０７８ −７９．４％、およびＩＤＸ０１５０ −８９．４％。
【００２８】
【図６】オボアルブミン（ＯＶＡ）誘発性のアレルギー性気道炎症のマウスモデルについての予防および治療プロトコルを示す図である。
【００２９】
【図７】最後のＯＶＡエアロゾルの４８時間後の、ＯＶＡ免疫Ｂａｌｂ／ｃマウスからの気管支肺胞洗浄（ＢＡＬ）体液中の異なる細胞型の総数を示す組み合わせを示すヒストグラムである。マウスは、予防プロトコルにおいて、１６および２１日目に鼻腔内滴下によって投与されるＩＤＸ０１５０（５０μｇ／動物）を用いて治療した（ＩＤＸ０１５０、Ｍ＆Ｍを参照されたい）。治療プロトコルにおいて、ＩＤＸ０１５０を、３０および３３日目（ＩＤＸ０１５０Ａ、Ｍ＆Ｍを参照されたい）または３０および３４日目（ＩＤＸ０１５０Ｂ）に与えた。３０および３３日目の治療プロトコル（Ａ＆Ｂ）における滴下を、エアロゾル誘発の４時間後に行った。３４日目のプロトコルＢにおける第２の滴下を、最後のエアロゾル誘発の２４時間後に行った。健常コントロールは、ＰＢＳを用いて治療し、ＯＶＡエアロゾルに曝露した。データは平均±ＳＤとして示す。*Ｐ＜０．０５、***Ｐ＜０．００１、分散（ＡＮＯＶＡ）の一元配置分析、ダネットの事後補正を使用。ＰＢＳグループは、ＰＢＳを用いて偽治療し、ＯＶＡエアロゾルに曝露した。
【００３０】
【図８】ＯＶＡ誘発性のアレルギー喘息モデルにおける予防プロトコルの結果を示す、組み合わせのヒストグラムである。最後のＯＶＡエアロゾルの４８時間後の、ＯＶＡ免疫Ｂａｌｂ／ｃマウス（最初０日目、最後１２日目）からの気管支肺胞洗浄（ＢＡＬ）体液における細胞の総数。マウスは、第１の免疫の後に、１６および２１日目に鼻腔内滴下によって投与したＩＤＸ９０２５、ＩＤＸ９０３８、またはＩＤＸ９０５３（５０μｇ／動物）を用いて治療した。ＰＢＳグループは、免疫し、ＰＢＳを用いて偽治療し、ＯＶＡエアロゾルに曝露した。データは平均±ＳＤとして示す。*Ｐ＜０．０５、***Ｐ＜０．００１、分散（ＡＮＯＶＡ）の一元配置分析、ダネットの事後補正を使用。
【００３１】
【図９ａ】チオグリコレート誘発性の胸膜炎の誘発の２０分前に与えた５０μｇ ＩＤＸ０１５０／マウスを用いる腹腔内治療の結果を示すヒストグラムである。胸膜滲出液における多形核細胞（ＰＭＮ）の数は、炎症を起こしたマウス（ＰＢＳ）と比較して、ＩＤＸ０１５０治療の後に４０．９％の低下を示した。データは平均±ＳＤとして示す。
【００３２】
【図９ｂ】チオグリコレート誘発性の胸膜炎の誘発の２０分前に与えた５０μｇ ＩＤＸ０１５０／マウスを用いる腹腔内治療の結果を示すヒストグラムである。ＩＤＸ０１５０は、チオグリコレート治療と比較して、６９．２％の、胸膜浮腫のクリアランス容量の低下を示した。データは平均±ＳＤとして示す。
【発明を実施するための形態】
【００３３】
実施形態について説明する前に、実施形態の範囲は、添付の特許請求の範囲およびその均等物によってのみ限定されるので、本明細書において用いられる術語は、特定の実施形態のみを説明する目的で使用され、限定することを意図しないことを理解されたい。
【００３４】
本明細書および添付の特許請求の範囲において使用される場合、単数形「ａ」、「ａｎ」、および「ｔｈｅ」は、文脈が明確に規定しない限り、複数の指示物を含むことに注意されなければならない。
【００３５】
用語「軽減」、「治療」、「予防」、「療法」、「治療的な使用」、「予防的な使用」、「医薬」、および「医学的な使用」は、明細書および請求項において使用される場合、ヒトおよび動物の両方または獣医の適用を包含する。重要なことに、用語「治療」は、本明細書ではその最も広い意味においてここで使用され、疾患の反転または治癒に限定されないが、症状の軽減または疾患の進行の遅延も含む。
【００３６】
さらに、用語「治療方法」を使用する場合、方法のステップおよび付属的な方法もまた包含される、つまり、開示される方法自体が網羅的な方法を構成しない場合もまた包含される。本発明の方法は、一連の操作および手段におけるステップを構成し、疾患の軽減、予防、または治療を導くことができることが企図される。
【００３７】
用語「約」は、数値との関連で使用される場合、当業者によく知られており、許容可能である精度の間隔を表す。上述の間隔は、＋／−１０％または好ましくは＋／−５％とすることができる。
【００３８】
本明細書において使用される場合の句「治療有効量」は、ピーク値または他の妥当な測定値の低下として測定される、ある有益な程度まで、好ましくは少なくとも約１０％、より好ましくは少なくとも２０％、およびより好ましくは少なくとも３０％またはそれ以上、浮腫を阻害するまたは低下させるのに十分な量に関する。
【００３９】
本明細書において使用される場合、用語「生理学的に許容可能な」は、細胞、細胞培養物、組織、または器官などの生物系と適合する材料を指す。好ましくは、生物系は、脊椎動物などの生きている生物である。
【００４０】
本明細書において使用される場合、用語「担体」は、任意の賦形剤、希釈剤、増量剤、塩類、緩衝剤、安定剤、溶解剤、脂質、または医薬製剤における使用のための、当技術分野においてよく知られている他の材料を包含する。担体、賦形剤、または希釈剤の特徴は、特定の適用のための投与経路に依存することが理解されるであろう。粘膜投与に特に適した担体の例は、生理食塩水、リポソーム、界面活性剤、粘膜付着性化合物、酵素阻害剤、胆汁酸塩、吸収促進剤、およびシクロデキストリンを含むが、これらに限定されない。これらの材料を含有する薬学的に許容可能な製剤の調製は、たとえばＲｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、第１８版、Ａ．Ｇｅｎｎａｒｏ編、Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．、Ｅａｓｔｏｎ、ＰＡ、１９９０において記載される。
【００４１】
本明細書の目的で、用語「免疫調節性」は、哺乳動物などの脊椎動物に投与される場合に、生物において、免疫系を刺激するまたは免疫系を抑制するまたはその両方の免疫応答を誘発するための、化合物、たとえば、本明細書および請求項において定義されるオリゴヌクレオチドの特性を指す。本明細書において使用される場合、用語「哺乳動物」は、限定を伴うことなく、ラット、マウス、ネコ、イヌ、ウマ、ウシ、雌ウシ、ブタ、ウサギ、非ヒト霊長動物、およびヒトを含む。
【００４２】
本明細書の目的で、用語「オリゴヌクレオチド」は、複数の連結された個々のヌクレオシド単位から形成されるポリヌクレオシドを指す。そのようなオリゴヌクレオチドは、ゲノムまたはｃＤＮＡを含む既存の核酸源から得ることができるが、合成法によって好ましくは産生される。ヌクレオシド残基は、多数の知られているヌクレオシド間連結のいずれかによって互いに結合させることができる。そのようなヌクレオシド間連結は、限定を伴うことなく、天然のヌクレオシド間ホスホジエステル結合またはこれらに限定されないが、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、アルキルホスホネート、アルキルホスホノチオエート、ホスホトリエステル、ホスホロアミデート、シロキサン、カーボネート、カルボアルコキシ、アセトアミデート、カルバメート、モルホリノ、ボラノ、チオエーテル、架橋ホスホロアミデート、架橋メチレンホスホネート、架橋ホスホロチオエート、およびスルホンヌクレオシド間連結などの実際に修飾されたヌクレオシド間のものを含む。用語「オリゴヌクレオチド」はまた、１つまたは複数の立体特異的ヌクレオシド間連結（たとえば（Ｒｐ）−または（Ｓｐ）−ホスホロチオエート、アルキルホスホネート、またはホスホトリエステル連結）を有するポリヌクレオシドを包含する。本明細書において使用される場合、連結がリン酸基を含むかどうかにかかわらず、用語「オリゴヌクレオチド」および「ジヌクレオチド」は、任意のそのようなヌクレオシド間連結を有するポリヌクレオシドおよびジヌクレオシドを含むことが明らかに意図される。ある好ましい実施形態において、これらのヌクレオシド間連結は、ホスホジエステル、ホスホロチオエート、もしくはホスホロジチオエート連結またはその組み合わせであってもよい。
【００４３】
用語「オリゴヌクレオチド」はまた、限定を伴うことなく、タンパク質群、親油基、挿入剤、ジアミン、葉酸、コレステロール、およびアダマンタンを含む追加の置換基を有するポリヌクレオシドをも包含する。用語「オリゴヌクレオチド」はまた、限定を伴うことなく、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、リン酸基を有するペプチド核酸（ＰＨＯＮＡ）、ロックド核酸（ＬＮＡ）、モルホリノ骨格オリゴヌクレオチド、およびアルキルリンカーまたはアミノリンカーの付いた骨格セクションを有するオリゴヌクレオチドを含む、任意の他の核酸塩基含有ポリマーをも包含する。
【００４４】
用語「粘膜投与」は、動物体における粘膜のタイプのいずれか、たとえば、これらに限定されないが、鼻、頬側、食道、胃、腸、嗅、口腔、気管支、および泌尿生殖器粘膜への投与を含む。
【００４５】
様々の実施形態は、配列番号１〜１０の中から選ばれる配列を含む、単離され、実質的に精製されたオリゴヌクレオチド化合物を利用可能にする。特定の配列が、下記の表１および２において提供される。表１の配列、配列番号１〜７が、以下の配列またはモチーフ：５’−ＴＣＧＴＣ−３’を共有することに注意されたい。
【００４６】
これらの配列を含む本発明の様々な実施形態による化合物は、約１２〜約３０塩基の全長を好ましくは有することが意図される。
【００４７】
【表１】
【００４８】
【表２】
【００４９】
本発明者らはまた、ポジティブおよびネガティブコントロールとして異なるオリゴヌクレオチド配列をも使用した。これらを表３に挙げる。
【００５０】
【表３】
【００５１】
本発明の実施形態によれば、一般式１によるオリゴヌクレオチド、配列番号１〜７の中から選ばれるオリゴヌクレオチド、または配列番号８〜１０の中から選ばれるオリゴヌクレオチドを、化学的に修飾することができる。この化学修飾は、たとえば、少なくとも１つのヌクレオチドのリン酸骨格修飾である。好ましくは、リン酸骨格修飾は、ホスホロチオエートまたはホスホロジチオエート修飾である。
【００５２】
他の実施形態は、配列番号１〜７の中から選ばれるオリゴヌクレオチドまたは配列番号８〜１０の中から選ばれるオリゴヌクレオチドを含む医薬組成物を利用可能にする。そのような医薬組成物は、さらに好ましくは、薬理学的に適合し、生理学的に許容可能な賦形剤または担体を含む。
【００５３】
本発明の一実施形態によれば、上記に定義されるオリゴヌクレオチドを含む医薬組成物は、生理食塩水、リポソーム、界面活性剤、粘膜付着性化合物、酵素阻害剤、胆汁酸塩、吸収促進剤、シクロデキストリンなどから選ばれる、薬理学的に適合し、生理学的に許容可能な賦形剤または担体をさらに含む。当業者は、発明的努力を伴うことなく、必要な賦形剤または担体を容易に選ぶであろう。
【００５４】
現在好ましい実施形態は、配列番号１〜７の中から選ばれるオリゴヌクレオチドまたは配列番号８〜１０の中から選ばれるオリゴヌクレオチドを含む、粘膜投与のための医薬製剤に関する。本発明の実施形態はまた、浮腫を予防、治療、および／または軽減するための医薬組成物の製造のための、配列番号１〜７の中から選ばれるオリゴヌクレオチドまたは配列番号８〜１０の中から選ばれるオリゴヌクレオチドの使用にも関する。
【００５５】
本発明の一実施形態によるこの使用は、浮腫を伴う状態または障害の予防、治療、および／または軽減に好ましくは着目し、浮腫は、たとえば心不全、肝硬変、ネフローゼ症候群などの腎疾患、栄養失調、癌、喘息、アレルギー性鼻炎、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）、虚血、外傷、および敗血症性ショックの中から選ばれる状態につながる、任意の器官または組織中の間質液のバランスにおける障害または機能不全として定義される。
【００５６】
本発明の実施形態によるそのような使用において、上述のオリゴヌクレオチドは、生理学的に許容可能な治療有効量、つまり、血管透過性の調節、白血球遊走の阻害または低下、好中球遊走または活性化の阻害または低下、好酸球遊走の阻害または低下、およびリンパ球遊走の阻害または低下の１つを達成するのに有効な量で投与される。
【００５７】
本発明の一実施形態によれば、オリゴヌクレオチドは、配列番号１〜７からなる群から選ばれ、または配列番号８〜１０の中から選ばれるオリゴヌクレオチドであり好中球遊走もしくは活性化の阻害もしくは低下によって喘息を治療するために使用される。
【００５８】
本発明の実施形態はまた、浮腫を予防、治療、および／または軽減するための方法をも利用可能にし、配列番号１〜７の中から選ばれるオリゴヌクレオチドまたは配列番号８〜１０の中から選ばれるオリゴヌクレオチドは、血管透過性の修飾、好中球遊走および／または活性化の阻害、好酸球遊走の阻害または低下、白血球遊走の阻害または低下、ならびにリンパ球遊走の阻害または低下の１つまたはいくつかを達成するのに有効な用量で投与される。
【００５９】
大まかに言えば、本発明の実施形態は、浮腫を予防、治療、および／または軽減するための方法をも利用可能にし、配列番号１〜７の中から選ばれるオリゴヌクレオチドまたは配列番号８〜１０の中から選ばれるオリゴヌクレオチドを含む医薬組成物を患者に投与する。投与の適した経路は、粘膜投与、経皮投与、皮下投与、および腹腔内投与から選ばれる。
【００６０】
一実施形態によれば、粘膜投与は、胃、経鼻投与、吸入、眼内投与、直腸投与、泌尿生殖器、および膣投与から選ばれる。
【００６１】
本発明者らによって行われた動物実験において記録された著しい抗膨張効果および抗浮腫効果に基づいて、浮腫を予防、治療、および／または軽減するための方法は、心不全、肝硬変、ネフローゼ症候群などの腎疾患、栄養失調、癌、喘息、アレルギー性鼻炎、ＣＯＰＤ、急性肺傷害、１つまたは複数の肺における滲出液の蓄積を伴う状態、虚血、外傷、および敗血症性ショックの中から選ばれる疾患または状態などの、浮腫が構成要素である任意の疾患または状態まで広げることができる。
【００６２】
肺における滲出液の蓄積を伴う状態の中で、以下の状態に言及することができる：異なる病因の複数の浸出液、下気道感染、肺炎、肺の急性細菌感染、結核、職業性肺疾患、主に塵肺（無機塵および粒子状物質の吸入によって引き起こされる慢性繊維性肺疾患、たとえば石綿肺、珪肺）ならびに過敏性肺炎（有機塵の吸入に起因する炎症などのアレルギー性肺疾患、たとえば農夫肺）、放射能に対する曝露に起因する肺損傷など。
【００６３】
本発明の実施形態による方法において、オリゴヌクレオチドは、体重１ｋｇ当たり約５〜約５００μｇの量で、好ましくは、体重１ｋｇ当たり約１０〜１００μｇの量で投与される。
【００６４】
他の実施形態は、オリゴヌクレオチドが、たとえば侵襲性の外科手技、放射線療法、ホルモン治療、移植手術、および移植術の前に、予防的に投与される方法を利用可能にする。動物実験は、化合物が、浮腫の誘発の前に投与された場合にも、顕著な効果を有することを示す。
【００６５】
本発明者はまた、オリゴヌクレオチドが、刺激源またはアレルゲンへの曝露が予期される前に、予防的に投与される方法を利用可能にする。本発明の実施形態による化合物は、したがって、単独でまたは他の慣習的に使用される医薬品と組み合わせて、季節性アレルギーを軽減または予防するために使用することができる。
【００６６】
他の実施形態は、オリゴヌクレオチドが抗炎症薬、たとえばステロイド薬と組み合わせて投与される方法である。
【００６７】
他の実施形態は、オリゴヌクレオチドが利尿薬と組み合わせて投与される方法である。
【００６８】
興味深いことに、目下試験されている化合物を用いて達成される抗膨張効果または抗浮腫効果はまた、表１ならびに２において提供される配列を含む他の免疫調節性化合物ならびに分岐オリゴヌクレオチド、ダンベル状オリゴヌクレオチド構築物、グリシン連結オリゴヌクレオチド構築物、およびその他同種のものなどのその構造変化体を投与する場合にも見ることができたことが企図される。
【００６９】
しかしながら、あらゆる特定の理論によって拘束されることを望むものではないが、本発明者らは、ここで提供されるＤＮＡベースのオリゴヌクレオチドが、膨張または浮腫に対するより高い特異性および効能の改善を示し、それらの特異的配列により、ヒトの臨床使用に、より適していると考える。
【実施例】
【００７０】
１．マウスホルボールアセテート（テトラデカノイルホルボール１３−アセテート、ＴＰＡ）またはアラキドン酸（ＡＡ）誘発性の耳浮腫に対する、異なる投与計画によって与えられる実験用オリゴヌクレオチド化合物の効果
【００７１】
材料および方法
化学薬品
ＴＬＣ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ Ｓｗｅｄｅｎ ＡＢ、Ｓｔｏｃｋｈｏｌｍ、Ｓｗｅｄｅｎ）のテトラデカノイルホルボール１３−アセテート（ＴＰＡ）、ＣＡＳ １６５６１−２９−８、純度約９９％を凍結乾燥粉末として保存した。ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、ＣＡＳ ６７−６８−５、無菌濾過、Ｈｙｂｒｉ−Ｍａｘ（登録商標）（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ Ｓｗｅｄｅｎ ＡＢ、Ｓｔｏｃｋｈｏｌｍ、Ｓｗｅｄｅｎ）。アセトン、分析グレード、ＣＡＳ ６７−６４−１、Ｌａｂｏｒａ ＡＢ、Ｓｏｌｌｅｎｔｕｎａ、Ｓｗｅｄｅｎ。
【００７２】
ＴＰＡの原液は、１ｍｇ／ｍＬでＤＭＳＯ中にＴＰＡを溶解することによって調製し、−８０℃で凍結保存した。試験Ｂ〜Ｅについては、使用溶液は、２００μＬのＴＰＡ原液を８００μＬアセトンに加えて調製した。使用溶液は、それを調製したのと同じ日に使用した。
【００７３】
ＴＬＣ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ Ｓｗｅｄｅｎ ＡＢ、Ｓｔｏｃｋｈｏｌｍ、Ｓｗｅｄｅｎ）のアラキドン酸（ＡＡ）、ＣＡＳ ５０６−３２−１、Ｂａｔｃｈ １０６Ｋ１４３２、油状、純度約９９％。アセトン、分析グレード、ＣＡＳ ６７−６４−１、Ｌａｂｏｒａ ＡＢ、Ｓｏｌｌｅｎｔｕｎａ、Ｓｗｅｄｅｎ。
【００７４】
ＡＡの原液は、４ｍｇ／１０μＬでアセトン中にＡＡを希釈することによって調製し、−８０℃で凍結保存した。アセトン中の最終使用溶液１ｍｇ／１０μＬを調製した。使用溶液は調製の後の１時間以内に使用した。
【００７５】
試験化合物
合計で、１５種の化合物を、ＴＰＡおよび／またはＡＡ実験において試験した。表１〜３を参照されたい。オリゴヌクレオチドは、ｂｉｏｍｅｒｓ．ｎｅｔ ＧｍｂＨ、Ｕｌｍ、Ｇｅｒｍａｎｙによって合成され、−２０℃で凍結保存された。
【００７６】
製剤
化合物は、室温で、ＰＢＳ（Ｆｌｕｋａ、Ｓｉｇｍａ）を用いて使用濃度まで希釈した。濃度は、ＵＶ分光光度法（ＳｍａｒｔＳｐｅｃ（登録商標）３０００、ＢＩＯ−ＲＡＩＤ、Ｈｅｒｃｕｌｅｓ、ＵＳＡ）を用いて９５％の精度まで調整した。
【００７７】
動物実験および投薬量
動物
メスおよびオスのＳＰＦ ＮＭＲＩ／ＫＳマウス（ＩｎＤｅｘ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ ＡＢ所有の種畜のＳＰＦ ＮＭＲＩマウス、ＭＴＣ、Ｋａｒｏｌｉｎｓｋａ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｔ、Ｓｔｏｃｋｈｏｌｍ、Ｓｗｅｄｅｎ）またはメスのＢＡＬＢ／ｃＪマウス（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｂａｒ Ｈａｒｂｏｒ、Ｍａｉｎｅ、ＵＳＡ）。動物は、グループ化し、実験に入る前に少なくとも１週間、順応させた。
【００７８】
飼育ケース
動物を、２１℃±３℃および５５％±１５％の相対湿度の部屋で飼育した。換気システムを、１時間当たり１０回、空気交換するように設計した。部屋を、１２時間明および１２時間暗のサイクルとなるように照明した。照明を０６：００〜１８：００の時間つけた。
【００７９】
マウスを、それぞれのケージに８匹、透明なポリカーボネート（ＭａｃｒｏｌｏｎｅタイプＩＩＩ）ケージ（床面積：８１０ｃｍ2）において飼育した。
【００８０】
敷床
ケージ中の敷床は、Ｂｅｅｋａｙ敷床（Ｂ＆Ｋ、Ｓｏｌｌｅｎｔｕｎａ、Ｓｗｅｄｅｎ）とした。
【００８１】
環境強化
環境強化のために、動物に、Ｓｉｚｚｅｌｅ ＮｅｓｔまたはＨａｐｐｙ−Ｍａｔ（Ｓｃａｎｂｕｒ Ａ．Ｓ、Ｌｅｌｌｉｎｇｅｒ、Ｄｅｎｍａｒｋ）を供給した。
【００８２】
食餌
十分なペレットげっ歯動物用食餌、Ｒ３６（Ｌａｋｔａｍｉｎ ＡＢ、Ｓｔｏｃｋｈｏｌｍ、Ｓｗｅｄｅｎ）を適宜、供給した。
【００８３】
飲料水
動物が国内品質の飲料水を有する動物飲用ボトルに自由にアクセスできるようにした。
【００８４】
動物識別、グループ化、および治療
それぞれのケージを、試験番号、グループ番号、倫理的な承認番号、性別、および動物耳番号を用いてマークしたケージカードによって識別した。動物は、パーマネントインクフェルトペンを使用して、動物の番号に対応する横線を用いて尾に個々にマークした。異なる治療に使用したプロトコルの例を表４に概説する。化合物を、必要な変更を伴う同じプロトコルに従って試験した。
【００８５】
【表４】
【００８６】
試験手順
用量投与
腹の右下腹部中に１００μＬを施すことによって腹腔内（ｉ．ｐ．）注射を行った。首領域中に１００μＬを用いて皮下注射を行った。鼻孔の中に液滴、全容量４０μＬをマウスに吸入させることによって鼻腔内投与を行った。投与をすべて、非麻酔マウスに行った。
【００８７】
浮腫の誘発
非麻酔マウスの両方の外耳を、柔らかい歯ブラシを使用して、低刺激石けん（Ｐａｌｍｏｌｉｖｅ、Ｓｗｅｄｅｎ）を用いて洗浄し、ティッシュを用いて耳を乾燥させ、アセトンを浸したティッシュを用いてきれいにした。アセトンを蒸発させた後に、ＴＰＡまたはＡＡを、耳全体を覆うように注意して、耳のそれぞれの側に１０μＬ、両側に適用した。溶媒を蒸発させるために、マウスを２０秒間保持した。
【００８８】
薬理学的治療
腹腔内注射を、動物を背位に保持して、腹の右下腹部に施した。皮下（ｓ．ｃ．）注射を、動物の首に施した。鼻腔内投与を、わずかに後にもたれかかる姿勢に保持したマウスに施した。調整可能なマイクロピペット４０μＬの試験物質を鼻孔上に液滴で施し、マウスに自由意志で吸引させた。
【００８９】
臨床徴候
殺すまでそれぞれのマウスを毎日観察した。病気のすべての徴候、健康、およびあらゆる行動の変化を記録した。
【００９０】
臨床パラメーター
非麻酔マウスの耳を、ＴＰＡを投与した後の９６時間までまたはＡＡモデルについては２４時間までの異なる時点で測定した。第１の測定を、浮腫を誘発する前に行った。耳当たりすべての時点で三通り、スプリング式ダイヤルマイクロメーター（Ｌｉｍｉｔ、Ｔｈｉｃｋｎｅｓｓ Ｇａｕｇｅ、精度０．０１ｍｍ、接触域φ６ｍｍ、Ｌｕｎａ ＡＢ、Ａｌｌｉｎｇｓａｅｓ、Ｓｗｅｄｅｎ）を用いて厚さを記録した。
【００９１】
マウスの両方の耳についての平均の厚さを計算し、開始時点の耳の平均の厚さと比較した。実験の開始時に得た値を１００％として設定した。治療グループについてのピーク値および曲線下面積（ＡＵＣ）値を計算し、ＰＢＳを用いて治療した、炎症を起こしたコントロールグループ（１００％として設定）と比較し、パーセンテージ変化（△％ＡＵＣ）として表した。
【００９２】
統計
スチューデントのｔ検定を使用して統計的有意性を計算した（Ｅｘｃｅｌ Ｓｔａｔｉｓｔｉｃａｌ Ｆｕｎｃｔｉｏｎｓ、Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ（登録商標） Ｅｘｃｅｌ ２００２、Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ Ｃｏｒｐ．、Ｒｅｄｍｏｎｄ、ＵＳＡ）。
【００９３】
基準線を１００に設定した曲線下面積（ＡＵＣ）は、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ ｖｅｒｓｉｏｎ ４．０３ ｆｏｒ Ｗｉｎｄｏｗｓ（登録商標）を使用して計算した（ＧｒａｐｈＰａｄ Ｓｏｆｔｗａｒｅ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ ＵＳＡ、ｗｗｗ．ｇｒａｐｈｐａｄ．ｃｏｍ）。
【００９４】
結果
実験プロトコルを、表４に示す例によって示す。ＡＵＣ低下およびＰ−値をポジティブコントロール（ＴＰＡまたはＡＡ＋ＰＢＳ）に対して計算した。
【００９５】
試験Ａ
この試験は、浮腫の誘発を０日目に開始して、本発明の化合物をｉ．ｐ．で施した場合、浮腫の低下を示した。本実験において、コントロール物質ＩＤＸ０１５０は、炎症のほぼ十分な寛解を示し、ＡＵＣを−３８．９％低下させた。
【００９６】
試験Ｂ
試験Ｂは、浮腫の誘発の４日前にｓ．ｃ．を施した場合の化合物の予防効果を調査した。ＩＤＸ０９２０、ＩＤＸ０９５５、およびＩＤＸ０００１は、それぞれ−１９．３％、−２２．７％、および−１６．３％のＡＵＣの低下を示したが、統計的に有意ではなかった（ＮＳ）。ＩＤＸ０１５０は、ＡＵＣの低下を示さなかった。測定値の間の大きな差異による不十分な結果のために、この試験を繰り返した（試験Ｃ）。
【００９７】
試験Ｃ
試験Ｂの繰り返しの試験において、浮腫の誘発の４日前にｓ．ｃ．を施したＯＤＮは、それぞれ、−３％、−２２％、−２４．３％、および−１７．９％のＡＵＣの低下を示し、ＩＤＸ０１５０（Ｐ＜０．０１）、ＩＤＸ０９５５（Ｐ＜０．０１）、およびＩＤＸ０００１（Ｐ＜０．０５）について統計的に有意であった。
【００９８】
試験Ｄ
より短い予防レジメンにおいて、浮腫の誘発の２日前にｓ．ｃ．を施すと、試験Ｃとほぼ類似した結果が得られた。ＩＤＸ０９２０、ＩＤＸ０１５０、ＩＤＸ０９５５（Ｐ＜０．０１）について統計的に有意であったが、ＩＤＸ０００１について有意ではなかった。ＡＵＣの低下は、それぞれ、−１９．１％、−１６．５％、−１７．８％、および−１２．４％であった。
【００９９】
試験Ｅ
この試験において、浮腫を誘発したのと同じ日に化合物を施した。誘発は、それぞれのマウスについて約２０分間の待ち時間を考慮に入れるためにずらした。この試験において、ＡＵＣの比較的一様な低下、ＩＤＸ０９２０ −１９．４％、ＩＤＸ０１５０ −２７．３％、ＩＤＸ０９５５ −１７．７％、およびＩＤＸ０００１ −１６．７％があった。すべての化合物は、統計的に有意な低下をもたらした（Ｐ＜０．０１）。
【０１００】
試験Ｆ
この試験において、それぞれの動物に対して等用量（５０μｇ）で、膨張を誘発したのと同じ日に化合物を施した。これもまた、ＡＵＣの低下、ＩＤＸ０９２０ −１７％、ＩＤＸ０１５０ −３１．１％、ＩＤＸ０９５５ −１８．３％、およびＩＤＸ０００１ −１３．２％をもたらした。下方への傾斜の遅れを示したＩＤＸ０９２０を除いて、すべての他の化合物は、膨張の有意な低下を示し、ＩＤＸ０１５０およびＩＤＸ０９５５はＰ＜０．０１およびＩＤＸ０００１はＰ＜０．０５であった。
【０１０１】
試験Ｇ
治療レジメンを調査するために、化合物を浮腫の誘発の２時間後に与えた。これは、ＡＵＣの有意な低下、ＩＤＸ０９２０ −４３．８％（Ｐ＜０．０１）、ＩＤＸ０１５０ −４２．３％（Ｐ＜０．０１）、およびＩＤＸ０９５５ −４０．７％（Ｐ＜０．０５）をもたらした。ＩＤＸ０００１は、統計的に有意ではない−１７．９％の低下を示した。
【０１０２】
試験Ｈ
代替投与経路を検討するために、鼻腔内投与を調査した。ｓ．ｃ．投与に対する比較において、類似した時点および用量を選んだ。試験Ｈにおいて、鼻腔内投与を、膨張を誘発する４日前に予防プロトコルにおいて施した。これは、ｓ．ｃ．投与を用いて得たものよりも膨張の有効な低下をもたらした。ＡＵＣの低下は、ＩＤＸ０９２０ −３３．８％。（Ｐ＜０．０１）、ＩＤＸ０１５０ −２５．７％（Ｐ＜０．０１）、ＩＤＸ０９５５ −１７．４％（Ｐ＜０．０５）、およびＩＤＸ０００１ −２５．７％（Ｐ＜０．０５）であった。
【０１０３】
試験Ｉ
鼻腔内投与を、浮腫を誘発したのと同じ日に、０日目に施した場合、膨張の有効な低下が見られた。ＡＵＣの低下は、ＩＤＸ０９２０ −２７．３％。（Ｐ＜０．０１）、ＩＤＸ０１５０ −２８．４％（Ｐ＜０．０１）、ＩＤＸ０９５５ −２８．８％（Ｐ＜０．０５）、およびＩＤＸ０００１ −６．４％（ＮＳ）であった。
【０１０４】
試験Ｊ
試験Ｇにおいて使用したような治療プロトコルにおいて、鼻腔内投与もまた膨張の好適な低下をもたらした。ＡＵＣは、ＩＤＸ０９２０で−２８．７％（Ｐ＜０．０５）、ＩＤＸ０１５０で−２８．８％（Ｐ＜０．０１）、ＩＤＸ０９５５で−１７．２％（Ｐ＜０．０５）、およびＩＤＸ０００１で−２５．２％（Ｐ＜０．０５）低下することが示された。
【０１０５】
試験Ｋ
用量応答を試験Ｋ〜Ｏにおいて調査した。試験Ｋにおいて、０．１、１、１０、および１００μｇのＩＤＸ０１５０を与えた。結果は、用量依存的に膨張の低下を示した。ＡＵＣの低下は、０．１μｇで−１３．９％（Ｐ＜０．０５）、１μｇで−１６．３％（Ｐ＜０．０５）、１０μｇで−２７．９％（Ｐ＜０．０５）、および１００μｇで−４５％（Ｐ＜０．０１）であった。
【０１０６】
試験１０３Ｌ
ＧＣを用いて置換したＣｐＧモチーフを有するネガティブコントロールＩＤＸ０５２６を、試験Ｋに類似した用量応答プロトコルにおいて調査した。ＩＤＸ０５２６を使用すると、抗膨張活性がなかったことが分かった。ＡＵＣにおける差異は、０．１μｇで＋１．２４％、１μｇで−１．２４％、１０μｇで−０．２６％、および１００μｇで＋６．１８％であり、統計的に有意な変化は全くなかった。
【０１０７】
試験Ｍ
オリゴヌクレオチドの骨格におけるホスホロチオエート修飾の程度の有意性を調査するために、完全にホスホロチオエート化したオリゴヌクレオチド、ＩＤＸ０５００を使用した。この化合物は、すべての試験した用量において統計的に有意な抗膨張特性を示し、ＡＵＣの低下は、０．１μｇ −４６．９％、１μｇ −４１．３％、１０μｇ −４０．９％、および１００μｇ −５９．１％（すべてＰ＜０．０１）であった。
【０１０８】
試験Ｎ
ＩＤＸ０５００の治療濃度域をさらに検討するために、試験Ｎを試みた。用量は、０．００５μｇ、０．０１μｇ、０．１μｇ、および１μｇとした。化合物は、試験Ｍと一致して、用量０．１および１μｇにおいて統計的に有意な効果を示した。ＡＵＣの低下は、０．００５μｇについて−１５％（ＮＳ）、０．０１μｇについて−１５．３％（ＮＳ）、０．１μｇについて−１８．２％（Ｐ＜０．０１）、および１μｇについて−５４．１％（Ｐ＜０．０１）であった。
【０１０９】
試験Ｏ
本実験において、ＩＤＸ０５００およびＩＤＸ０１５０を、０日目にｓ．ｃ．を施した、１０および１００μｇの等用量で比較した。類似した結果が用量および２つの化合物の間で得られ、ＡＵＣの統計的に有意な低下を示し、ＩＤＸ０５００については、１０μｇで−２５．５％、１００μｇで−３９．９％、ＩＤＸ０１５０については、１０μｇで−２５．５％、１００μｇで−３９．９％であった（すべての用量でＰ＜０．０１）。
【０１１０】
コントロール化合物およびＩＤＸ０００１を用いて行った実験に加えて、すべての他の試験化合物を、ＴＰＡおよび／またはＡＡの耳浮腫モデルにおいて類似した様式において調査し、浮腫の誘発の２０分前に皮下に試験化合物を施した（１０μｇ）。結果を、表５において、ピーク値の低下および曲線下面積（ＡＵＣ）の低下として表した。
【０１１１】
【表５】
【０１１２】
ピーク値
ピーク値およびＡＵＣ値もまた、異なる治療計画の抗膨張有効性を階層化するために比較した。
【０１１３】
考察
本実験により、腹腔内、皮下、および鼻腔内経路を使用して、広範な予防的なおよび治療上の治療レジメンを検討した。さらに、用量応答を、化合物ＩＤＸ０１５０およびＩＤＸ０５００（それぞれ配列番号１１および１２）を使用して調査した。
【０１１４】
浮腫のグレードは、マウスにおける外耳の局所的なＴＰＡ治療の後の浮腫形成または膨張を測定することによってたどることができる。この膨張は、２４時間後に通常ピークに達し、その後、１週間の間に徐々におさまる。
【０１１５】
ＡＵＣ値およびピーク値はすべて、ポジティブコントロールよりも低いことが分かった。ほとんどの例において、膨張のこの低下は統計的に有意であった（Ｐ＜０．０５）。しかしながら、いくつかの実験において、統計的に有意な低下に達しなかった。これは、そのような実験全体における低いグレードの浮腫誘発に関連して観察された。これを回避するために、ＴＰＡ用量を最適化するように、また免疫学的に成熟したマウスを使用することによって特別に注意した。
【０１１６】
耳浮腫は、すべての浮腫測定からＴＰＡ誘発性の浮腫のピーク値を得ることによっておよび曲線下面積（ＡＵＣ）を計算することによって検討することができる。ＡＵＣは、したがって、浮腫の誘発および寛解の両方を表す。
【０１１７】
１０回のＩＤＸ０１５０実験からの平均ピーク値を計算すると（図２）、ピーク値における非常に高度な統計的に有意な低下が見られた（Ｐ＜０．００１）。
【０１１８】
したがって、ＩＤＸ０１５０を、この試験において、他の化合物との比較のための基準として使用した。
【０１１９】
ＩＤＸ０１５０（０．１〜１００μｇ）およびＩＤＸ０５００（０．００５〜１００μｇ）の抗膨張効果は、広い用量応答範囲を示した。ピーク値低下として計算される、異なる時点で与えたＩＤＸ０１５０の抗膨張効果は、２時間＞−２日＞０日＞−４日の順に減少した。
【０１２０】
ＡＵＣ低下は２時間＞０日＞−２日＞−４日の順に減少した。これらの結果は、これらの化合物が、予防投与および膨張を開始させた後の治療の両方に使用することができることを示す。鼻腔内投与を用いる非常に好適な結果は、粘膜投与が、身体における免疫系にオリゴヌクレオチド化合物を提供するのに効率的であることを示す。
【０１２１】
結論
試験Ａ〜Ｏは、まとめると、マウスにおけるＴＰＡ誘発性の耳浮腫モデルにおける本発明の化合物の抗膨張効果を支持する。これらの化合物は、腹腔内、皮下、および鼻腔内投与経路によって与えた場合、有効な免疫調節剤となり、浮腫を低下させるためのそれらの効能はまた、図１〜３におけるＩＤＸ０１５０によって例示されるように、異なる予防および治療計画においても証明された。化合物の抗膨張効果は、一般的な炎症経路に限定されないが、たとえばプロスタグランジン系を活性化するＡＡによって誘発される炎症をダウンレギュレートすることもできる。試験化合物配列番号１〜１０はすべて、ＴＰＡおよび／またはＡＡモデルにおいて示されるように浮腫を低下させることができた。
【０１２２】
２．オボアルブミン（ＯＶＡ）誘発性の気道炎症のマウスモデルにおける免疫調節オリゴヌクレオチド試験物質の経鼻投与：予防および異なる治療プロトコルの比較
【０１２３】
材料および方法
動物
Ｂ＆Ｋ（Ｓｏｌｌｅｎｔｕｎａ、Ｓｔｏｃｋｈｏｌｍ、Ｓｗｅｄｅｎ）から得たメスのＢａｌｂ／ｃマウス（８週齢）を実験において使用した。マウスに、十分なペレットげっ歯動物用食餌、Ｒ３６（Ｌａｋｔａｍｉｎ ＡＢ、Ｓｔｏｃｋｈｏｌｍ、Ｓｗｅｄｅｎ）および国内の飲用に適した品質の水を適宜与えた。動物は、２１℃±３℃および５５％±１５％の相対湿度の動物室で飼育した。換気システムは、１時間当たり１０回、空気交換するように設計した。部屋は、１２時間明および１２時間暗のサイクルとなるように照明した。照明は０７：００〜１９：００の時間、つける。マウスは、それぞれのケージに５匹、透明なポリカーボネート（ＭａｃｒｏｌｏｎｅタイプＩＩＩ）ケージ（床面積：８２０ｃｍ2）において飼育した。ケージ中の敷床は４ＨＶポプラ敷床（Ｔａｐｖｅｉ、Ｆｉｎｌａｎｄ）とした。それぞれのケージを、試験番号、グループ番号、性別、および動物番号を用いてマークしたケージカードによって識別した。
【０１２４】
感作およびエアロゾル誘発
マウスは、０および１２日目に、２００μＬ ＯＶＡ／水酸化アルミニウムゲル（１：３）を用いて腹腔内感作した（図６を参照されたい）。ＯＶＡ（ニワトリ卵アルブミングレードＶ、Ｓｉｇｍａ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）を生理食塩水中に溶解し、３時間４℃での回転流動によって５０μｇ／ｍＬの濃度まで水酸化アルミニウムゲルと混合した。２３、２６、３０、および３３日目に（図６を参照されたい）、Ｂａｔｅｌｌｅ曝露チャンバーを使用して、３０分間、エアロゾル化ＯＶＡの吸入によってマウスの肺中で誘発した。エアロゾルを、ＰＢＳ中に溶解した１０ｍｇ／ｍＬ ＯＶＡ（Ｓｉｇｍａ、Ｓｔ Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ、ＵＳＡ）の噴霧器濃度を使用して、気流７．４Ｌ／分で圧縮空気噴霧器（Ｃｏｌｌｉｓｏｎ ６−ｊｅｔ）によって生成した。非感作動物を有するコントロールグループは、２３、２６、３０、および３３日目のエアロゾル化ＯＶＡ以外に治療を受けなかった。エアロゾル誘発を受けなかった感作マウスのコントロールグループもまた用意した。
【０１２５】
オリゴヌクレオチド
このＯＶＡモデルにおいて（図６）、合計４つのオリゴヌクレオチドを試験した、ＩＤＸ９０２５、ＩＤＸ９０３８、ＩＤＸ９０５３（表１、配列番号２〜４））、およびＩＤＸ０１５０（表３、配列番号１１）。オリゴヌクレオチドは、ｂｉｏｍｅｒｓ．ｎｅｔ ＧｍｂＨ、Ｕｌｍ、Ｇｅｒｍａｎｙによって合成され、−２０℃で凍結保存された。オリゴヌクレオチドは、使用濃度（１，２４７μｇ／μＬ）にＰＢＳを用いて希釈し、滴下の１日目まで−２０℃に保ち、その後、それらを４℃にした。
【０１２６】
ＯＶＡ誘発性の気道炎症の治療
第１の実験において、予防および治療プロトコルの両方を試験した（図６を参照されたい）。薬剤治療は、１６および２１日目（予防プロトコル）、３０および３３日目（治療プロトコルＡ）、または３０および３４日目（治療プロトコルＢ）のＩＤＸ０１５０（ＩｎＤｅｘ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ ＡＢ、Ｓｔｏｃｋｈｏｌｍ、Ｓｗｅｄｅｎによって提供される１，２４７μｇ／μＬ）の鼻腔内滴下からなった。３０および３３日目の治療プロトコル（Ａ＆Ｂ）における滴下は、エアロゾル誘発の４時間後に施した。３４日目のプロトコルＢにおける第２の滴下は、最後のエアロゾル誘発の２４時間後に施した。薬剤は、４０μＬ ＰＢＳ中で投与し、約５０μｇ／マウス（４９．８８μｇ／マウス）の用量を施した。２つの感作偽治療グループに、予防プロトコル（１６および２１日目）または治療プロトコルＡ（３０および３３日目）による治療グループと同じ全容量のＰＢＳを滴下した。
【０１２７】
【表６】
【０１２８】
第２の実験において、予防プロトコル（図６）を使用する第１の実験におけるＩＤＸ０１５０の投与が、気道炎症の有意な低下を示したので（図７）、他の３つの物質を、同じプロトコルを用いて試験した。薬剤治療は、１６および２１日目（図６、予防プロトコルを参照されたい）のＩＤＸ９０２５、ＩＤＸ９０３８、およびＩＤＸ９０５３（表１）（１，２４７μｇ／μＬ、ＩｎＤｅｘ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ ＡＢによって提供される）の鼻腔内滴下からなった。物質はすべて、４０μＬ ＰＢＳ中で投与し、約５０μｇ／マウス（４９．８８μｇ／マウス）の用量を施した。２つの感作偽治療グループに、予防プロトコル（１６および２１日目）に従って、治療グループと同じ全容量のＰＢＳを滴下した。
【０１２９】
気道炎症パラメーターの分析
最後のＯＶＡエアロゾル誘発の４２時間後に頚椎脱臼によってマウスを殺した。気管に、ポリエチレン管（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ、Ｓｐａｒｋｓ、ＭＤ、ＵＳＡ）を挿入し、気管支肺胞洗浄（ＢＡＬ）を、４×１ｍＬ分割量の氷冷ハンクス平衡塩類溶液（ＨＢＳＳ）（Ｓｉｇｍａ、Ｓｔ Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ、ＵＳＡ）を使用して行った。ＢＡＬ体液を遠心分離し（４００ｇ、１０分、４℃）、ＢＡＬ体液細胞を０．４ｍＬ ＰＢＳ中に再懸濁した。白血球の総数を、Ｂｕｅｒｋｅｒチャンバー中で、トリパンブルー排除法を使用して数えた。ＢＡＬ体液細胞の二連のＣｙｔｏｓｐｉｎ（Ｃｙｔｏｓｐｉｎ３、Ｓｈａｎｄｏｎ、Ｒｕｎｃｏｒｎ、ＵＫ）調製物を、標準的な形態学的基準を使用して、白血球百分率について、Ｍａｙ Ｇｒｕｅｎｅｗａｌｄ Ｇｉｅｍｓａを用いて染色した。
【０１３０】
統計分析
統計比較は、感作ＰＢＳ治療コントロールマウスと比較するために、ダネットの事後補正を使用する分散（ＡＮＯＶＡ）の一元配置分析を使用して行った（ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ ３）。データは平均±標準偏差として示す。Ｐ＜０．０５は、有意であると考えた。
【０１３１】
結果
オボアルブミン誘発性のアレルギー喘息モデルは、喘息の間に見られる肺炎症を再現するために広く使用されるモデルである。ここで得られた結果は、気道の粘膜の膨張に相互に関連し、結果は、したがって、浮腫の低下の妥当な測定値である。このモデルの分析は、多形核細胞（ＰＭＮ）などの浸潤炎症細胞のタイプおよび量が同定され、数えられるＢＡＬ分析などの喘息の一般的な指標に依存する。
【０１３２】
結果的に、それぞれのマウスに由来するＢＡＬ体液細胞を記載されるように数え、値を、異なる治療グループの平均値を提供する組み合わせのヒストグラムとしてプロットした（図７）。
【０１３３】
大まかに言えば、実験の両方における動物（ＰＢＳグループ）の肺への４つの分析した細胞型の多量の流入によって示されるように、誘発性の気道炎症のレベルは高度であった。コントロールグループ（「エアロゾルなし」また「誘発なし」）は、誘発性の炎症の徴候を示さず、動物が、エアロゾルオボアルブミンタンパク質に対して天然のアレルギー応答を示さなかったことおよび使用したオボアルブミンタンパク質にたとえばＬＰＳが混入していなかったことを確認した。
【０１３４】
「エアロゾルなし」コントロールグループにおける炎症のあらゆる徴候の完全な欠如により、ＯＶＡ免疫自体の実験手順が肺炎症を誘発しなかったことを確認した。
【０１３５】
予防プロトコルにおける鼻治療に続いて、炎症の誘発の７および２日前に、２度施した場合、試験物質ＩＤＸ０１５０は、ＢＡＬ体液への白血球および好酸球の遊走を有意に低下させることができた（それぞれＰ＜０．０５およびＰ＜０．００１）（図７）。
【０１３６】
このプロトコルの治療アームにおいて、ＩＤＸ０１５０を炎症の誘発の７および１１日後に、つまり実験期間の極めて後半に施した場合、統計的に証明された効果はなかった。
【０１３７】
第２の実験における鼻治療に続いて（図８）、試験物質ＩＤＸ９０３８は、ＢＡＬＦ体液への白血球（Ｐ＜０．０５）および好酸球（Ｐ＜０．００１）の遊走を有意に低下させることができた。ＩＤＸ９０２５およびＩＤＸ９０５３は、本実験において、ＢＡＬＦ体液への細胞遊走の有意な低下を示さなかった。
【０１３８】
結論
本インビボ試験は、以下の結論を出す：ＢＡＬ体液に浸潤する白血球、好酸球、およびリンパ球の数の統計的に有意な低下は、本発明の化合物を用いて治療した場合、動物において観察された。本モデルにおいて、炎症を測定することは、より適切であったが、結果は、浮腫に対して等しく適用可能である。さらに、試験は、有効な経路としての経鼻投与の適合性を確認した。
【０１３９】
３．Ｃ５７／ＢＩ６マウスにおけるチオグリコレート誘発性の胸膜炎
【０１４０】
材料および方法
動物モデルは、細胞遊走および血管透過性に対する本発明の実施形態によるオリゴヌクレオチドの効果を検討するために設定した。
【０１４１】
マウスに、ケタミン（Ｋｅｔａｌａｒ（登録商標） Ｐａｒｋｅ−Ｄａｖｉｓ；２５ｍｇ／ｍｌ）およびキシラジン（Ｎａｒｃｏｘｙｌ ｖｅｔ．（登録商標） Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｉａ ＡＧ；５ｍｇ／ｍｌ）の０．１５〜０．２０ｍｌの混合物の腹腔内注射によって麻酔をかけた。
【０１４２】
左の頚静脈に、静脈内投与（ｉ．ｖ．）のためのポリエチレン管（ＰＥ１０）を挿入した。皮膚切開を胸の右側に行った。下層にある筋肉の解剖に続いて、胸膜炎（胸膜の炎症）を、１００μｌのチオグリコレート（Ｓｉｇｍａ）の単一胸膜内注射によって誘発した。無菌ＰＢＳを、ネガティブコントロールとして使用した。
【０１４３】
ＰＢＳ中のＦＩＴＣ抱合デキストラン（１００μｌ、３０ｍｇ／ｍｌ）をｉ．ｖ．注射した。４時間後、動物を、過量の麻酔を用いて安楽死させ、胸を慎重に開き、滲出液を吸引によって取り出し、容量を書き留めた。胸部を、その後、ＰＢＳ中の氷冷３ｍＭ ＥＤＴＡの１ｍｌですすいだ。赤血球が混入した滲出液を廃棄した。
【０１４４】
滲出液およびすすいだ材料を、５分間、１５００ｇで遠心分離し、上清を、蛍光光度計（Ｆｌｕｏｒｏｓｋａｎ Ａｃｓｅｎｔ、ＬａｂＳｙｓｔｅｍｓ）における蛍光強度の測定のために使用し、ＦＩＴＣデキストランのクリアランス容量を計算した。ペレットを、非特異的抗体結合を遮断するために１５分間、０．１％ＢＳＡを有するＰＢＳ中に再懸濁した。１０μｌの細胞懸濁液を、Ｂｕｅｒｋｅｒチャンバーにおいて、白血球（ＷＢＣ）百分率のために使用した。
【０１４５】
滲出液からの細胞を、好中球およびマクロファージ特異的抗体を用いて染色し、フローサイトメトリー（ＦＡＣＳｏｒｔおよびＣｅｌｌＱｕｅｓｔのソフトウェア、ＢＤ）によって分析した。分析は、前方散乱光および側方散乱光のそれらの典型的な出現に基づく総白血球数を含んだ。ＰＭＮおよびマクロファージは、それぞれＬｙ６ＧおよびＦ４／８０のそれらの発現によってさらに同定した。
【０１４６】
本発明の実施形態によるオリゴヌクレオチドの効果を試験するために、試験される化合物を、１００μｌの用量、つまり５０μｇ／マウスで、胸膜炎の誘発の約２０分前に、腹腔内に投与した。この試験において、試験した化合物をＩＤＸＯ１５０（配列番号１１、表３）とした。
【０１４７】
結果
チオグリコレート誘発性の胸膜炎モデルは、技術的に複雑になり、時に個々の異なる値を示し得るが、開発中の新薬の実践的なスクリーニングに最適なモデルの１つである。しかしながら、このモデルは、同時に試験することができる動物の数が制限される。
【０１４８】
結果は、胸膜腔へのＰＭＮの高度な移行によって、炎症誘発剤、チオグリコレートに対して動物が応答したことを示した。この細胞反応は、高度なクリアランス容量として見られる胸膜浮腫の蓄積において反映された。ＩＤＸ０１５０治療は、チオグリコレート炎症誘発の後にＰＭＮの動員を低下させた（４２％低下）（図９ａ）。ＩＤＸ０１５０を用いる治療はまた、ＰＢＳコントロールに類似した、低レベルの血管透過性（６８．２％低下）をも示した（図９ｂ）。結果は平均±ＳＤを表す。
【０１４９】
Ｈｕら（２００８）は、浮腫形成に対する経内皮小胞経路の寄与を調査した。グループは、肺血管透過性が、血管壁に付着したＰＭＮの活性化によってを誘発することができることを示し、より重症の浮腫は、より多いＰＭＮ数を伴って観察された。本発明の実施形態による化合物は、ＰＭＮの低下（図７、８、および９ａ）および結果的に浮腫の低下（図９ｂ）を明確に示す。抗ＰＭＮ抗体を使用する実験は、抗ＰＭＮ−ａｂが、本発明の化合物と類似したレベルまでＰＭＮおよび浮腫を等しく低下させることができたことを示した（データ示さず）。
【０１５０】
結論
胸膜炎動物モデルにおけるこれらの結果は、化合物が、さらなる試験および薬剤開発に適した好ましい治療プロファイルを有するという事実を指す。
【０１５１】
特定の実施形態が本明細書において詳細に開示されるが、これは、例証のみの目的で、一例として開示されたものであり、続く、添付の特許請求の範囲に関して限定することを意図しない。特に、特許請求の範囲によって定義される本発明の趣旨および範囲から逸脱することなく、様々な置換、変更、および改変を、本発明に対してなし得ることが本発明者によって企図される。
【技術分野】
【０００１】
本発明およびその実施形態は、医学の分野、特に、いくつかの医学的状態において直面する、任意の器官または組織中の間質液のバランスにおける障害または機能不全である浮腫の治療または軽減で使用するための新規な化合物および方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
浮腫は、組織空間または体腔における細胞の間中の隙体液の異常な蓄積（貯留）として定義することができる。これは、血管系から組織への体液の過剰な移動、または組織から血管系へ戻る体液の不適正な移動によって引き起こされ得る。これらの２つの区画間での体液の正常な交換は、組織液の「スターリングの式」によって調節され、間質液の生成は、半透性の毛細血管壁を介して反対方向に作用する浸透圧および静水圧のバランスに依存する。浮腫は、これらの力におけるアンバランスの結果であり、これは、間質空間における体液の異常な蓄積を引き起こす傾向がある。
【０００３】
浮腫の臨床症状は、身体の軽症から重症の腫脹および体重の増加を含む。腫脹は、細胞外液における広汎の（もしくは全身性の）増加によってまたは限局性の部位に限られる浮腫の集中により引き起こされ得る。広汎の浮腫についての医学的状態である全身浮腫は、皮下組織の腫脹によって特徴づけられるが、限局性の浮腫は通常、とりわけ水胸症（胸膜の間の空間における漿液過多）、心膜水腫（心膜における体液過多）、腹水症、または腹水（腹膜腔における体液過多）など、罹患部位に基づいて称される。
【０００４】
浮腫において蓄積する血管外液の組成は、その病因によって変動する。非炎症性のメカニズムによって引き起こされる浮腫の場合において、体液（漏出液）は、比較的低いタンパク質濃度を含み、比重が小さく、罹患部位の内皮が正常であることを示す。そのような場合において、漏出液は、本質的に、血漿の限外濾過液である。この種類の非炎症性の浮腫は、毛細血管壁を介した、血行動態による力の変化によって主に引き起こされ、血行動態による浮腫としても知られている。他方では、炎症応答によって引き起こされる浮腫の場合において、血管外液（滲出液）は、高濃度のタンパク質、細胞、および細胞破片を含み、比重が大きい。これは、罹患エリアにおける微小血管の正常な透過性における著しい変化を示す。
【０００５】
浮腫は、様々な疾患の発病の重要な機能的徴候として通常、生じるが、外傷および傷害の結果としても生じ得る。心不全、肝硬変、およびネフローゼ症候群などの腎疾患は、浮腫を引き起こす最も一般的な全身性疾患の一部である。疾患発病の間の浮腫の発症に関与する主なメカニズムは、血管内の静水圧の増加、リンパ流の機能障害、不適切な腎臓のナトリウムおよび水の貯留（滞留）、血漿浸透圧の低下、ならびに血管透過性の増加を含む。
【０００６】
静脈における静水圧の増加は、組織からの体液の再吸収の不良をもたらし、このアンバランスは、浮腫をもたらす。静水圧の増加は、静脈圧の広汎の増加として生じる可能性もあり、または特定の部位にしか影響しない可能性もある。静水圧の局所的な増加は、静脈流出障害に起因する可能性があり、これは、普通、より低い末端で起こり、閉塞性血栓症および静脈瘤の発症に対する二次性のものである。結果として生じる浮腫は、肢および下肢において限局性であり、末梢浮腫として一般的に知られている。静脈圧の広汎の増加は、全身性の浮腫をもたらし、これは、うっ血性心不全の場合において一般的に観察される。具体的には、心臓の左側の不全は、肺（肺胞）における体液の集中をもたらし、肺水腫および呼吸困難をもたらす。他方では、心臓の右側の不全の間に、体液は、下肢において蓄積し、末梢浮腫を引き起こす。状態が進行するまたは悪化するとともに、上肢もまた膨張し、最終的に、腹膜腔において体液が集中し、これは、腹水として知られている浮腫の状態をもたらす。全身において広汎である浮腫の原因は、複数の器官において浮腫を引き起こし得ることが観察されている。
【０００７】
リンパ流の障害またはリンパ液の閉塞は、間質液の不適正な排液をもたらし、これは、結果的に、限局性のリンパ水腫を引き起こす。リンパ水腫は、リンパ液過多が組織に集中する、一般的な衰弱性の浮腫状態である。それは、とりわけ炎症性のもしくは新生物性の閉塞、癌もしくは拡大したリンパ節からの圧力、放射線療法によるリンパ管の破壊、または象皮病もしくはフィラリア症などの感染によるリンパ管の浸潤によって引き起こされ得る。
【０００８】
腎臓によるナトリウムおよび水の過剰な貯留は、血管内の体液の容量の増加を引き起こし、これは、最終的に、静水圧を増加させ、浮腫を引き起こす。とりわけ急性腎不全または連鎖球菌性糸球体腎炎などの状態は、正常な腎機能に直接、影響を与え、身体における異常な塩類貯留を引き起こす。これとは別に、うっ血性心不全、低アルブミン血症などのいくつかの障害の発病は、レニン−アンギオテンシン−アルドステロン（ＲＡＡＳ）ホルモン系を活性化し、これは、ナトリウムおよび水の貯留を促進する。したがって、あるメカニズムによって開始される浮腫は、塩類および体液の貯留の二次性のメカニズムによって複雑になる。身体における余分な体液負荷および体液の貯留の悪循環は、膜を介した圧力勾配をさらにアンバランスにし、浮腫の悪化をもたらす。
【０００９】
血管内部の血漿浸透圧の減少は、間質空間への体液の移動を促進し、浮腫をもたらす。血漿浸透圧のそのような減少は、血液容量を維持するために主として寄与する、毛細血管膜に対して不透過性である血漿タンパク質、特にアルブミンの過剰な損失または合成の低下のいずれかの結果となり得る。アルブミンの過剰な損失の最も重要な原因は、ネフローゼ症候群として知られている腎臓障害であり、これは、漏出性の糸球体基底膜によって特徴づけられ、これは、広汎の浮腫を最終的にもたらす。血清タンパク質、特にアルブミンの合成の低下（または低アルブミン血症）は、肝硬変などの肝臓のびまん性疾患において生じるまたは栄養失調と関連する。これらのすべての例において、血管内から間質区画への体液の移動は、血漿の容量の収縮をもたらし、これは、とりわけ腹水および末梢浮腫などの広汎の浮腫様の症状をもたらす。
【００１０】
血漿タンパク質の過剰な損失の他の重要な原因は、血漿タンパク質に対する血管の透過性の増加である。この透過性の増加は、血行路から間質への、タンパク質および白血球などの細胞の移動を引き起こす。血漿からの、タンパク質が豊富な体液の損失は、血管内の浸透圧を低下させ、間質空間の浸透圧を増加させて、これは、血管から間質への体液の流出を最終的にもたらし、浮腫を引き起こす。血管透過性の増加は、特に急性炎症の場合における、刺激に対する身体の炎症応答の主な特徴の１つである。実際に、浮腫は、急性炎症の主な徴候の１つである。炎症の間に、血漿に由来し、炎症性の刺激によって誘発される化学的因子は、罹患部位におけるいくつかの血管応答および細胞応答を媒介する。微小血管系におけるこれらの構造変化は、血管膜の透過性の増加をもたらし、血行路から間質への、血漿タンパク質および細胞、たとえば白血球の移動を引き起こし、これは、部位特異的な浮腫を最終的にもたらす。炎症性浮腫は、大部分は、ヒスタミン、ブラジキニン、および他の放出される物質の直接作用に起因し得る。炎症における血管透過性の増加の主なメカニズムは、とりわけ内皮細胞収縮、接合部の退縮、直接の傷害、白血球依存性の漏出、再生内皮を含む。間質への体液濾過の増加は、炎症媒介物質の小動脈血管拡張作用によってさらに増強され、これは、血流、灌流表面積、毛細血管静水圧を増加させ、同様に、他のメカニズムによって浮腫を促進する。
【００１１】
要約すれば、浮腫は、様々な疾患の発病の重要な機能的徴候の１つとして知られている。とりわけ心不全、肝硬変、ネフローゼ症候群は、浮腫を最終的にもたらす最も一般的な全身性疾患の一部である。浮腫の動態およびこれらの疾患と関連する他の関係する臨床症状の理解は、それらの全病状を解明するのに重要であり、これらの疾患への、新規かつ高度に特異的な診断、治療および予防的な戦略を開発する際に助けとなり得る。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【００１２】
【非特許文献１】Guochang Hu、 Stephen M.Vogel、 David E.Schwartz、 Asrar B.Malik、 Richard D.Minshall.(2008) 「Intercellular Adhesion Molecule-1-Dependent Neutrophil Adhesion to Endothelial Cells Induces Caveolae-Mediated Pulmonary Vascular Hyperpermeability」 Circ Res.102:e120-e131.
【非特許文献２】A.Gennaro(編)、 Remington's Pharmaceutical Sciences、 第１８版、 Mack Publishing Co.、 Easton、 PA、 1990
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１３】
一目的は、浮腫を予防、軽減、または治療するための新規な化合物および方法を利用可能にすることである。他の目的およびそれらの関連する利点は、説明および実施例の検討後に明らかになるであろう。
【課題を解決するための手段】
【００１４】
本発明者らは、参照によって本明細書に組み込まれる添付の特許請求の範囲において記載されるように、浮腫を予防、治療、または軽減するための新規な化合物および方法を利用可能にする。本発明者らは、驚いたことに、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、および配列番号１０を含む群から選択される配列を含むオリゴヌクレオチド化合物が、浮腫の治療または軽減に有効であることを発見した。
【００１５】
本発明の一実施形態によれば、配列番号１〜１０の配列の少なくとも１つを含むオリゴヌクレオチド化合物は、約１２〜約３０塩基の全長を有する。
【００１６】
本発明者らは、個々のオリゴヌクレオチド配列を同定し、試験し、浮腫の治療または軽減におけるそれらの有用性を示した。
【００１７】
これらの発見に基づいて、本発明者らは、添付の特許請求の範囲において開示される特定の化合物を提供する。これらの化合物は、インビトロおよびインビボの両方で試験され、実験結果は、化合物が、血管透過性を低下させることによって浮腫を低下させるという理論を暫定的に支持する。
【００１８】
この説明、実施例、および特許請求の範囲において、より詳細に下記で実施形態を説明し、添付の図面と共に検討する。
【図面の簡単な説明】
【００１９】
【図１】テトラデカノイルホルボール１３−アセテート（ＴＰＡ）誘発性の耳浮腫モデルにおける、試験薬剤およびコントロール薬剤の抗炎症効果を示すグラフである。ＩＤＸ０９２０（５０μｇ）、ＩＤＸ０１５０（１００μｇ）、ＩＤＸ０９５５（１００μｇ）、および試験薬剤ＩＤＸ０００１（１００μｇ）をＴＰＡの投与の２０分前に、１回の単一ｓ．ｃ．注射として与えた。耳の最初の厚さを１００％として設定した。ＰＢＳと比較した曲線下面積（ＡＵＣ）の低下は、ＩＤＸ０９２０ −２２．１％（Ｐ＜０．０１１）、ＩＤＸ０１５０ −３８．９％（Ｐ＜０．０１１）、ＩＤＸ０９５５ −４．８％、およびＩＤＸ０００１ −１５．７％（Ｐ＞０．０５）である。ダネットの多重比較検定を用いる一元配置ＡＮＯＶＡ。
【００２０】
【図２】ネガティブコントロール（ＴＰＡを有するＰＢＳ媒体）と比較した、ＴＰＡモデルを用いる１０回の実験から組み合わせた、１００μｇ ＩＤＸ０１５０の投与の後の膨張の平均炎症ピーク値を示す、ＴＰＡ誘発性の耳浮腫モデルからの結果を示す図である。スチューデント検定、***Ｐ＜０．００１、±ＳＤ。
【００２１】
【図３ａ】ＴＰＡ誘発性の耳浮腫モデルからの組み合わせのヒストグラムを示す図である。媒体（ＰＢＳ）治療と比較した、ＩＤＸ０１５０治療による浮腫ピーク値の低下。黒色の棒、鼻腔内（ｉ．ｎ．）投与、白色の棒、腹腔内（ｉ．ｐ．）投与、および斜線をひいた棒、皮下（ｓ．ｃ．）投与。ＴＰＡ投与の４日前（Ｉ、Ｅ、およびＦ）、ＴＰＡ投与の２日前（Ｄ）、ＴＰＡ投与の２０分前（Ｈ、Ａ、Ｂ、およびＣ）、ＴＰＡ投与の２時間後（ＪおよびＧ）にＩＤＸ０１５０を用いて治療。５０μｇ ＩＤＸ０１５０／マウスを使用した試験Ｆを除いて、すべての場合において、１００μｇ ＩＤＸ０１５０／マウスを治療に使用した。Ｅ、ＦまたはＢ、Ｃは、２回の実験の平均である。
【００２２】
【図３ｂ】ＴＰＡ誘発性の耳浮腫モデルからの組み合わせのヒストグラムを示す図である。媒体（ＰＢＳ）治療と比較した、ＩＤＸ０１５０治療による浮腫曲線下面積（ＡＵＣ）の低下。黒色の棒、鼻腔内（ｉ．ｎ．）投与、白色の棒、腹腔内（ｉ．ｐ．）投与、および斜線をひいた棒、皮下（ｓ．ｃ．）投与。ＴＰＡ投与の４日前（Ｉ、Ｅ、およびＦ）、ＴＰＡ投与の２日前（Ｄ）、ＴＰＡ投与の２０分前（Ｈ、Ａ、Ｂ、およびＣ）、ＴＰＡ投与の２時間後（ＪおよびＧ）にＩＤＸ０１５０を用いて治療。５０μｇ ＩＤＸ０１５０／マウスを使用した試験Ｆを除いて、すべての場合において、１００μｇ ＩＤＸ０１５０／マウスを治療に使用した。Ｅ、ＦまたはＢ、Ｃは、２回の実験の平均である。
【００２３】
【図４】アラキドン酸（ＡＡ）誘発性の耳浮腫モデルにおける、フェニドンおよびＩＤＸ０１５０の効果を示すヒストグラムである。ＡＡ誘発の３０分前に与えたフェニドンは、ＡＵＣ −３９．１％、Ｐ＜０．０５の低下を示し、これは、前に得られたＩＤＸ０１５０を用いる治療に類似した（図２を参照されたい）。ＡＡの２０分前に与えたＩＤＸ０１５０と組み合わせた、ＡＡの３０分前に与えたフェニドンは、さらなる低下をもたらした（−７６．８％、Ｐ＜０．００１）。
【００２４】
【図５ａ】ＴＰＡ誘発性の耳浮腫モデルにおける試験薬剤および媒体（ＰＢＳ）の抗炎症効果を示すグラフである。１０μｇのＩＤＸ９０２４、ＩＤＸ９０２５、ＩＤＸ９０３８、ＩＤＸ９０５１、およびＩＤＸ９０５３を、ＴＰＡの投与の２０分前に、１回の単一ｓ．ｃ．注射として与えた。耳の最初の厚さを１００％として設定した。ＡＵＣ低下は、ＰＢＳコントロールと比較して、ＩＤＸ９０２４ −４７．３％、ＩＤＸ９０２５ −５７．８％、ＩＤＸ９０３８ −４７．４％、ＩＤＸ９０５１ −５４．０％、およびＩＤＸ９０５３ −３９．０％。
【００２５】
【図５ｂ】ＴＰＡ誘発性の耳浮腫モデルにおける試験薬剤および媒体（ＰＢＳ）の抗炎症効果を示すグラフである。１０μｇのＩＤＸ９０６４、ＩＤＸ９０７６、ＩＤＸ９０７８、ＩＤＸ９０８０、およびＩＤＸ９０８９を、ＴＰＡの投与の２０分前に、１回の単一ｓ．ｃ．注射として与えた。耳の最初の厚さを１００％として設定した。ＡＵＣ低下は、ＰＢＳコントロールと比較して、ＩＤＸ９０６４ −５９．７％、ＩＤＸ９０７６ −５．１％、ＩＤＸ９０７８ −４１．３％、ＩＤＸ９０８７ −４０．２％。
【００２６】
【図５ｃ】ＡＡ誘発性の耳浮腫モデルにおける試験薬剤および媒体（ＰＢＳ）の抗炎症効果を示すグラフである。１０μｇのＩＤＸ９０２４、ＩＤＸ９０２５、およびＩＤＸ９０５１を、ＡＡの投与の２０分前に、１回の単一ｓ．ｃ．注射として与えた。耳の最初の厚さを１００％として設定した。ＡＵＣ低下は、ＰＢＳコントロールと比較して、ＩＤＸ９０２４ −５８．５％、ＩＤＸ９０２５ −８１．９％、およびＩＤＸ９０５１ −６７．５％。
【００２７】
【図５ｄ】ＡＡ誘発性の耳浮腫モデルにおける試験薬剤および媒体（ＰＢＳ）の抗炎症効果を示すグラフである。１０μｇのＩＤＸ９０７６、ＩＤＸ９０７８、およびＩＤＸ０１５０を、ＡＡの投与の２０分前に、１回の単一ｓ．ｃ．注射として与えた。耳の最初の厚さを１００％として設定した。ＡＵＣ低下は、ＰＢＳコントロールと比較して、ＩＤＸ９０７６ −４５．７％、ＩＤＸ９０７８ −７９．４％、およびＩＤＸ０１５０ −８９．４％。
【００２８】
【図６】オボアルブミン（ＯＶＡ）誘発性のアレルギー性気道炎症のマウスモデルについての予防および治療プロトコルを示す図である。
【００２９】
【図７】最後のＯＶＡエアロゾルの４８時間後の、ＯＶＡ免疫Ｂａｌｂ／ｃマウスからの気管支肺胞洗浄（ＢＡＬ）体液中の異なる細胞型の総数を示す組み合わせを示すヒストグラムである。マウスは、予防プロトコルにおいて、１６および２１日目に鼻腔内滴下によって投与されるＩＤＸ０１５０（５０μｇ／動物）を用いて治療した（ＩＤＸ０１５０、Ｍ＆Ｍを参照されたい）。治療プロトコルにおいて、ＩＤＸ０１５０を、３０および３３日目（ＩＤＸ０１５０Ａ、Ｍ＆Ｍを参照されたい）または３０および３４日目（ＩＤＸ０１５０Ｂ）に与えた。３０および３３日目の治療プロトコル（Ａ＆Ｂ）における滴下を、エアロゾル誘発の４時間後に行った。３４日目のプロトコルＢにおける第２の滴下を、最後のエアロゾル誘発の２４時間後に行った。健常コントロールは、ＰＢＳを用いて治療し、ＯＶＡエアロゾルに曝露した。データは平均±ＳＤとして示す。*Ｐ＜０．０５、***Ｐ＜０．００１、分散（ＡＮＯＶＡ）の一元配置分析、ダネットの事後補正を使用。ＰＢＳグループは、ＰＢＳを用いて偽治療し、ＯＶＡエアロゾルに曝露した。
【００３０】
【図８】ＯＶＡ誘発性のアレルギー喘息モデルにおける予防プロトコルの結果を示す、組み合わせのヒストグラムである。最後のＯＶＡエアロゾルの４８時間後の、ＯＶＡ免疫Ｂａｌｂ／ｃマウス（最初０日目、最後１２日目）からの気管支肺胞洗浄（ＢＡＬ）体液における細胞の総数。マウスは、第１の免疫の後に、１６および２１日目に鼻腔内滴下によって投与したＩＤＸ９０２５、ＩＤＸ９０３８、またはＩＤＸ９０５３（５０μｇ／動物）を用いて治療した。ＰＢＳグループは、免疫し、ＰＢＳを用いて偽治療し、ＯＶＡエアロゾルに曝露した。データは平均±ＳＤとして示す。*Ｐ＜０．０５、***Ｐ＜０．００１、分散（ＡＮＯＶＡ）の一元配置分析、ダネットの事後補正を使用。
【００３１】
【図９ａ】チオグリコレート誘発性の胸膜炎の誘発の２０分前に与えた５０μｇ ＩＤＸ０１５０／マウスを用いる腹腔内治療の結果を示すヒストグラムである。胸膜滲出液における多形核細胞（ＰＭＮ）の数は、炎症を起こしたマウス（ＰＢＳ）と比較して、ＩＤＸ０１５０治療の後に４０．９％の低下を示した。データは平均±ＳＤとして示す。
【００３２】
【図９ｂ】チオグリコレート誘発性の胸膜炎の誘発の２０分前に与えた５０μｇ ＩＤＸ０１５０／マウスを用いる腹腔内治療の結果を示すヒストグラムである。ＩＤＸ０１５０は、チオグリコレート治療と比較して、６９．２％の、胸膜浮腫のクリアランス容量の低下を示した。データは平均±ＳＤとして示す。
【発明を実施するための形態】
【００３３】
実施形態について説明する前に、実施形態の範囲は、添付の特許請求の範囲およびその均等物によってのみ限定されるので、本明細書において用いられる術語は、特定の実施形態のみを説明する目的で使用され、限定することを意図しないことを理解されたい。
【００３４】
本明細書および添付の特許請求の範囲において使用される場合、単数形「ａ」、「ａｎ」、および「ｔｈｅ」は、文脈が明確に規定しない限り、複数の指示物を含むことに注意されなければならない。
【００３５】
用語「軽減」、「治療」、「予防」、「療法」、「治療的な使用」、「予防的な使用」、「医薬」、および「医学的な使用」は、明細書および請求項において使用される場合、ヒトおよび動物の両方または獣医の適用を包含する。重要なことに、用語「治療」は、本明細書ではその最も広い意味においてここで使用され、疾患の反転または治癒に限定されないが、症状の軽減または疾患の進行の遅延も含む。
【００３６】
さらに、用語「治療方法」を使用する場合、方法のステップおよび付属的な方法もまた包含される、つまり、開示される方法自体が網羅的な方法を構成しない場合もまた包含される。本発明の方法は、一連の操作および手段におけるステップを構成し、疾患の軽減、予防、または治療を導くことができることが企図される。
【００３７】
用語「約」は、数値との関連で使用される場合、当業者によく知られており、許容可能である精度の間隔を表す。上述の間隔は、＋／−１０％または好ましくは＋／−５％とすることができる。
【００３８】
本明細書において使用される場合の句「治療有効量」は、ピーク値または他の妥当な測定値の低下として測定される、ある有益な程度まで、好ましくは少なくとも約１０％、より好ましくは少なくとも２０％、およびより好ましくは少なくとも３０％またはそれ以上、浮腫を阻害するまたは低下させるのに十分な量に関する。
【００３９】
本明細書において使用される場合、用語「生理学的に許容可能な」は、細胞、細胞培養物、組織、または器官などの生物系と適合する材料を指す。好ましくは、生物系は、脊椎動物などの生きている生物である。
【００４０】
本明細書において使用される場合、用語「担体」は、任意の賦形剤、希釈剤、増量剤、塩類、緩衝剤、安定剤、溶解剤、脂質、または医薬製剤における使用のための、当技術分野においてよく知られている他の材料を包含する。担体、賦形剤、または希釈剤の特徴は、特定の適用のための投与経路に依存することが理解されるであろう。粘膜投与に特に適した担体の例は、生理食塩水、リポソーム、界面活性剤、粘膜付着性化合物、酵素阻害剤、胆汁酸塩、吸収促進剤、およびシクロデキストリンを含むが、これらに限定されない。これらの材料を含有する薬学的に許容可能な製剤の調製は、たとえばＲｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、第１８版、Ａ．Ｇｅｎｎａｒｏ編、Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．、Ｅａｓｔｏｎ、ＰＡ、１９９０において記載される。
【００４１】
本明細書の目的で、用語「免疫調節性」は、哺乳動物などの脊椎動物に投与される場合に、生物において、免疫系を刺激するまたは免疫系を抑制するまたはその両方の免疫応答を誘発するための、化合物、たとえば、本明細書および請求項において定義されるオリゴヌクレオチドの特性を指す。本明細書において使用される場合、用語「哺乳動物」は、限定を伴うことなく、ラット、マウス、ネコ、イヌ、ウマ、ウシ、雌ウシ、ブタ、ウサギ、非ヒト霊長動物、およびヒトを含む。
【００４２】
本明細書の目的で、用語「オリゴヌクレオチド」は、複数の連結された個々のヌクレオシド単位から形成されるポリヌクレオシドを指す。そのようなオリゴヌクレオチドは、ゲノムまたはｃＤＮＡを含む既存の核酸源から得ることができるが、合成法によって好ましくは産生される。ヌクレオシド残基は、多数の知られているヌクレオシド間連結のいずれかによって互いに結合させることができる。そのようなヌクレオシド間連結は、限定を伴うことなく、天然のヌクレオシド間ホスホジエステル結合またはこれらに限定されないが、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、アルキルホスホネート、アルキルホスホノチオエート、ホスホトリエステル、ホスホロアミデート、シロキサン、カーボネート、カルボアルコキシ、アセトアミデート、カルバメート、モルホリノ、ボラノ、チオエーテル、架橋ホスホロアミデート、架橋メチレンホスホネート、架橋ホスホロチオエート、およびスルホンヌクレオシド間連結などの実際に修飾されたヌクレオシド間のものを含む。用語「オリゴヌクレオチド」はまた、１つまたは複数の立体特異的ヌクレオシド間連結（たとえば（Ｒｐ）−または（Ｓｐ）−ホスホロチオエート、アルキルホスホネート、またはホスホトリエステル連結）を有するポリヌクレオシドを包含する。本明細書において使用される場合、連結がリン酸基を含むかどうかにかかわらず、用語「オリゴヌクレオチド」および「ジヌクレオチド」は、任意のそのようなヌクレオシド間連結を有するポリヌクレオシドおよびジヌクレオシドを含むことが明らかに意図される。ある好ましい実施形態において、これらのヌクレオシド間連結は、ホスホジエステル、ホスホロチオエート、もしくはホスホロジチオエート連結またはその組み合わせであってもよい。
【００４３】
用語「オリゴヌクレオチド」はまた、限定を伴うことなく、タンパク質群、親油基、挿入剤、ジアミン、葉酸、コレステロール、およびアダマンタンを含む追加の置換基を有するポリヌクレオシドをも包含する。用語「オリゴヌクレオチド」はまた、限定を伴うことなく、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、リン酸基を有するペプチド核酸（ＰＨＯＮＡ）、ロックド核酸（ＬＮＡ）、モルホリノ骨格オリゴヌクレオチド、およびアルキルリンカーまたはアミノリンカーの付いた骨格セクションを有するオリゴヌクレオチドを含む、任意の他の核酸塩基含有ポリマーをも包含する。
【００４４】
用語「粘膜投与」は、動物体における粘膜のタイプのいずれか、たとえば、これらに限定されないが、鼻、頬側、食道、胃、腸、嗅、口腔、気管支、および泌尿生殖器粘膜への投与を含む。
【００４５】
様々の実施形態は、配列番号１〜１０の中から選ばれる配列を含む、単離され、実質的に精製されたオリゴヌクレオチド化合物を利用可能にする。特定の配列が、下記の表１および２において提供される。表１の配列、配列番号１〜７が、以下の配列またはモチーフ：５’−ＴＣＧＴＣ−３’を共有することに注意されたい。
【００４６】
これらの配列を含む本発明の様々な実施形態による化合物は、約１２〜約３０塩基の全長を好ましくは有することが意図される。
【００４７】
【表１】
【００４８】
【表２】
【００４９】
本発明者らはまた、ポジティブおよびネガティブコントロールとして異なるオリゴヌクレオチド配列をも使用した。これらを表３に挙げる。
【００５０】
【表３】
【００５１】
本発明の実施形態によれば、一般式１によるオリゴヌクレオチド、配列番号１〜７の中から選ばれるオリゴヌクレオチド、または配列番号８〜１０の中から選ばれるオリゴヌクレオチドを、化学的に修飾することができる。この化学修飾は、たとえば、少なくとも１つのヌクレオチドのリン酸骨格修飾である。好ましくは、リン酸骨格修飾は、ホスホロチオエートまたはホスホロジチオエート修飾である。
【００５２】
他の実施形態は、配列番号１〜７の中から選ばれるオリゴヌクレオチドまたは配列番号８〜１０の中から選ばれるオリゴヌクレオチドを含む医薬組成物を利用可能にする。そのような医薬組成物は、さらに好ましくは、薬理学的に適合し、生理学的に許容可能な賦形剤または担体を含む。
【００５３】
本発明の一実施形態によれば、上記に定義されるオリゴヌクレオチドを含む医薬組成物は、生理食塩水、リポソーム、界面活性剤、粘膜付着性化合物、酵素阻害剤、胆汁酸塩、吸収促進剤、シクロデキストリンなどから選ばれる、薬理学的に適合し、生理学的に許容可能な賦形剤または担体をさらに含む。当業者は、発明的努力を伴うことなく、必要な賦形剤または担体を容易に選ぶであろう。
【００５４】
現在好ましい実施形態は、配列番号１〜７の中から選ばれるオリゴヌクレオチドまたは配列番号８〜１０の中から選ばれるオリゴヌクレオチドを含む、粘膜投与のための医薬製剤に関する。本発明の実施形態はまた、浮腫を予防、治療、および／または軽減するための医薬組成物の製造のための、配列番号１〜７の中から選ばれるオリゴヌクレオチドまたは配列番号８〜１０の中から選ばれるオリゴヌクレオチドの使用にも関する。
【００５５】
本発明の一実施形態によるこの使用は、浮腫を伴う状態または障害の予防、治療、および／または軽減に好ましくは着目し、浮腫は、たとえば心不全、肝硬変、ネフローゼ症候群などの腎疾患、栄養失調、癌、喘息、アレルギー性鼻炎、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）、虚血、外傷、および敗血症性ショックの中から選ばれる状態につながる、任意の器官または組織中の間質液のバランスにおける障害または機能不全として定義される。
【００５６】
本発明の実施形態によるそのような使用において、上述のオリゴヌクレオチドは、生理学的に許容可能な治療有効量、つまり、血管透過性の調節、白血球遊走の阻害または低下、好中球遊走または活性化の阻害または低下、好酸球遊走の阻害または低下、およびリンパ球遊走の阻害または低下の１つを達成するのに有効な量で投与される。
【００５７】
本発明の一実施形態によれば、オリゴヌクレオチドは、配列番号１〜７からなる群から選ばれ、または配列番号８〜１０の中から選ばれるオリゴヌクレオチドであり好中球遊走もしくは活性化の阻害もしくは低下によって喘息を治療するために使用される。
【００５８】
本発明の実施形態はまた、浮腫を予防、治療、および／または軽減するための方法をも利用可能にし、配列番号１〜７の中から選ばれるオリゴヌクレオチドまたは配列番号８〜１０の中から選ばれるオリゴヌクレオチドは、血管透過性の修飾、好中球遊走および／または活性化の阻害、好酸球遊走の阻害または低下、白血球遊走の阻害または低下、ならびにリンパ球遊走の阻害または低下の１つまたはいくつかを達成するのに有効な用量で投与される。
【００５９】
大まかに言えば、本発明の実施形態は、浮腫を予防、治療、および／または軽減するための方法をも利用可能にし、配列番号１〜７の中から選ばれるオリゴヌクレオチドまたは配列番号８〜１０の中から選ばれるオリゴヌクレオチドを含む医薬組成物を患者に投与する。投与の適した経路は、粘膜投与、経皮投与、皮下投与、および腹腔内投与から選ばれる。
【００６０】
一実施形態によれば、粘膜投与は、胃、経鼻投与、吸入、眼内投与、直腸投与、泌尿生殖器、および膣投与から選ばれる。
【００６１】
本発明者らによって行われた動物実験において記録された著しい抗膨張効果および抗浮腫効果に基づいて、浮腫を予防、治療、および／または軽減するための方法は、心不全、肝硬変、ネフローゼ症候群などの腎疾患、栄養失調、癌、喘息、アレルギー性鼻炎、ＣＯＰＤ、急性肺傷害、１つまたは複数の肺における滲出液の蓄積を伴う状態、虚血、外傷、および敗血症性ショックの中から選ばれる疾患または状態などの、浮腫が構成要素である任意の疾患または状態まで広げることができる。
【００６２】
肺における滲出液の蓄積を伴う状態の中で、以下の状態に言及することができる：異なる病因の複数の浸出液、下気道感染、肺炎、肺の急性細菌感染、結核、職業性肺疾患、主に塵肺（無機塵および粒子状物質の吸入によって引き起こされる慢性繊維性肺疾患、たとえば石綿肺、珪肺）ならびに過敏性肺炎（有機塵の吸入に起因する炎症などのアレルギー性肺疾患、たとえば農夫肺）、放射能に対する曝露に起因する肺損傷など。
【００６３】
本発明の実施形態による方法において、オリゴヌクレオチドは、体重１ｋｇ当たり約５〜約５００μｇの量で、好ましくは、体重１ｋｇ当たり約１０〜１００μｇの量で投与される。
【００６４】
他の実施形態は、オリゴヌクレオチドが、たとえば侵襲性の外科手技、放射線療法、ホルモン治療、移植手術、および移植術の前に、予防的に投与される方法を利用可能にする。動物実験は、化合物が、浮腫の誘発の前に投与された場合にも、顕著な効果を有することを示す。
【００６５】
本発明者はまた、オリゴヌクレオチドが、刺激源またはアレルゲンへの曝露が予期される前に、予防的に投与される方法を利用可能にする。本発明の実施形態による化合物は、したがって、単独でまたは他の慣習的に使用される医薬品と組み合わせて、季節性アレルギーを軽減または予防するために使用することができる。
【００６６】
他の実施形態は、オリゴヌクレオチドが抗炎症薬、たとえばステロイド薬と組み合わせて投与される方法である。
【００６７】
他の実施形態は、オリゴヌクレオチドが利尿薬と組み合わせて投与される方法である。
【００６８】
興味深いことに、目下試験されている化合物を用いて達成される抗膨張効果または抗浮腫効果はまた、表１ならびに２において提供される配列を含む他の免疫調節性化合物ならびに分岐オリゴヌクレオチド、ダンベル状オリゴヌクレオチド構築物、グリシン連結オリゴヌクレオチド構築物、およびその他同種のものなどのその構造変化体を投与する場合にも見ることができたことが企図される。
【００６９】
しかしながら、あらゆる特定の理論によって拘束されることを望むものではないが、本発明者らは、ここで提供されるＤＮＡベースのオリゴヌクレオチドが、膨張または浮腫に対するより高い特異性および効能の改善を示し、それらの特異的配列により、ヒトの臨床使用に、より適していると考える。
【実施例】
【００７０】
１．マウスホルボールアセテート（テトラデカノイルホルボール１３−アセテート、ＴＰＡ）またはアラキドン酸（ＡＡ）誘発性の耳浮腫に対する、異なる投与計画によって与えられる実験用オリゴヌクレオチド化合物の効果
【００７１】
材料および方法
化学薬品
ＴＬＣ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ Ｓｗｅｄｅｎ ＡＢ、Ｓｔｏｃｋｈｏｌｍ、Ｓｗｅｄｅｎ）のテトラデカノイルホルボール１３−アセテート（ＴＰＡ）、ＣＡＳ １６５６１−２９−８、純度約９９％を凍結乾燥粉末として保存した。ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、ＣＡＳ ６７−６８−５、無菌濾過、Ｈｙｂｒｉ−Ｍａｘ（登録商標）（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ Ｓｗｅｄｅｎ ＡＢ、Ｓｔｏｃｋｈｏｌｍ、Ｓｗｅｄｅｎ）。アセトン、分析グレード、ＣＡＳ ６７−６４−１、Ｌａｂｏｒａ ＡＢ、Ｓｏｌｌｅｎｔｕｎａ、Ｓｗｅｄｅｎ。
【００７２】
ＴＰＡの原液は、１ｍｇ／ｍＬでＤＭＳＯ中にＴＰＡを溶解することによって調製し、−８０℃で凍結保存した。試験Ｂ〜Ｅについては、使用溶液は、２００μＬのＴＰＡ原液を８００μＬアセトンに加えて調製した。使用溶液は、それを調製したのと同じ日に使用した。
【００７３】
ＴＬＣ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ Ｓｗｅｄｅｎ ＡＢ、Ｓｔｏｃｋｈｏｌｍ、Ｓｗｅｄｅｎ）のアラキドン酸（ＡＡ）、ＣＡＳ ５０６−３２−１、Ｂａｔｃｈ １０６Ｋ１４３２、油状、純度約９９％。アセトン、分析グレード、ＣＡＳ ６７−６４−１、Ｌａｂｏｒａ ＡＢ、Ｓｏｌｌｅｎｔｕｎａ、Ｓｗｅｄｅｎ。
【００７４】
ＡＡの原液は、４ｍｇ／１０μＬでアセトン中にＡＡを希釈することによって調製し、−８０℃で凍結保存した。アセトン中の最終使用溶液１ｍｇ／１０μＬを調製した。使用溶液は調製の後の１時間以内に使用した。
【００７５】
試験化合物
合計で、１５種の化合物を、ＴＰＡおよび／またはＡＡ実験において試験した。表１〜３を参照されたい。オリゴヌクレオチドは、ｂｉｏｍｅｒｓ．ｎｅｔ ＧｍｂＨ、Ｕｌｍ、Ｇｅｒｍａｎｙによって合成され、−２０℃で凍結保存された。
【００７６】
製剤
化合物は、室温で、ＰＢＳ（Ｆｌｕｋａ、Ｓｉｇｍａ）を用いて使用濃度まで希釈した。濃度は、ＵＶ分光光度法（ＳｍａｒｔＳｐｅｃ（登録商標）３０００、ＢＩＯ−ＲＡＩＤ、Ｈｅｒｃｕｌｅｓ、ＵＳＡ）を用いて９５％の精度まで調整した。
【００７７】
動物実験および投薬量
動物
メスおよびオスのＳＰＦ ＮＭＲＩ／ＫＳマウス（ＩｎＤｅｘ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ ＡＢ所有の種畜のＳＰＦ ＮＭＲＩマウス、ＭＴＣ、Ｋａｒｏｌｉｎｓｋａ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｔ、Ｓｔｏｃｋｈｏｌｍ、Ｓｗｅｄｅｎ）またはメスのＢＡＬＢ／ｃＪマウス（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｂａｒ Ｈａｒｂｏｒ、Ｍａｉｎｅ、ＵＳＡ）。動物は、グループ化し、実験に入る前に少なくとも１週間、順応させた。
【００７８】
飼育ケース
動物を、２１℃±３℃および５５％±１５％の相対湿度の部屋で飼育した。換気システムを、１時間当たり１０回、空気交換するように設計した。部屋を、１２時間明および１２時間暗のサイクルとなるように照明した。照明を０６：００〜１８：００の時間つけた。
【００７９】
マウスを、それぞれのケージに８匹、透明なポリカーボネート（ＭａｃｒｏｌｏｎｅタイプＩＩＩ）ケージ（床面積：８１０ｃｍ2）において飼育した。
【００８０】
敷床
ケージ中の敷床は、Ｂｅｅｋａｙ敷床（Ｂ＆Ｋ、Ｓｏｌｌｅｎｔｕｎａ、Ｓｗｅｄｅｎ）とした。
【００８１】
環境強化
環境強化のために、動物に、Ｓｉｚｚｅｌｅ ＮｅｓｔまたはＨａｐｐｙ−Ｍａｔ（Ｓｃａｎｂｕｒ Ａ．Ｓ、Ｌｅｌｌｉｎｇｅｒ、Ｄｅｎｍａｒｋ）を供給した。
【００８２】
食餌
十分なペレットげっ歯動物用食餌、Ｒ３６（Ｌａｋｔａｍｉｎ ＡＢ、Ｓｔｏｃｋｈｏｌｍ、Ｓｗｅｄｅｎ）を適宜、供給した。
【００８３】
飲料水
動物が国内品質の飲料水を有する動物飲用ボトルに自由にアクセスできるようにした。
【００８４】
動物識別、グループ化、および治療
それぞれのケージを、試験番号、グループ番号、倫理的な承認番号、性別、および動物耳番号を用いてマークしたケージカードによって識別した。動物は、パーマネントインクフェルトペンを使用して、動物の番号に対応する横線を用いて尾に個々にマークした。異なる治療に使用したプロトコルの例を表４に概説する。化合物を、必要な変更を伴う同じプロトコルに従って試験した。
【００８５】
【表４】
【００８６】
試験手順
用量投与
腹の右下腹部中に１００μＬを施すことによって腹腔内（ｉ．ｐ．）注射を行った。首領域中に１００μＬを用いて皮下注射を行った。鼻孔の中に液滴、全容量４０μＬをマウスに吸入させることによって鼻腔内投与を行った。投与をすべて、非麻酔マウスに行った。
【００８７】
浮腫の誘発
非麻酔マウスの両方の外耳を、柔らかい歯ブラシを使用して、低刺激石けん（Ｐａｌｍｏｌｉｖｅ、Ｓｗｅｄｅｎ）を用いて洗浄し、ティッシュを用いて耳を乾燥させ、アセトンを浸したティッシュを用いてきれいにした。アセトンを蒸発させた後に、ＴＰＡまたはＡＡを、耳全体を覆うように注意して、耳のそれぞれの側に１０μＬ、両側に適用した。溶媒を蒸発させるために、マウスを２０秒間保持した。
【００８８】
薬理学的治療
腹腔内注射を、動物を背位に保持して、腹の右下腹部に施した。皮下（ｓ．ｃ．）注射を、動物の首に施した。鼻腔内投与を、わずかに後にもたれかかる姿勢に保持したマウスに施した。調整可能なマイクロピペット４０μＬの試験物質を鼻孔上に液滴で施し、マウスに自由意志で吸引させた。
【００８９】
臨床徴候
殺すまでそれぞれのマウスを毎日観察した。病気のすべての徴候、健康、およびあらゆる行動の変化を記録した。
【００９０】
臨床パラメーター
非麻酔マウスの耳を、ＴＰＡを投与した後の９６時間までまたはＡＡモデルについては２４時間までの異なる時点で測定した。第１の測定を、浮腫を誘発する前に行った。耳当たりすべての時点で三通り、スプリング式ダイヤルマイクロメーター（Ｌｉｍｉｔ、Ｔｈｉｃｋｎｅｓｓ Ｇａｕｇｅ、精度０．０１ｍｍ、接触域φ６ｍｍ、Ｌｕｎａ ＡＢ、Ａｌｌｉｎｇｓａｅｓ、Ｓｗｅｄｅｎ）を用いて厚さを記録した。
【００９１】
マウスの両方の耳についての平均の厚さを計算し、開始時点の耳の平均の厚さと比較した。実験の開始時に得た値を１００％として設定した。治療グループについてのピーク値および曲線下面積（ＡＵＣ）値を計算し、ＰＢＳを用いて治療した、炎症を起こしたコントロールグループ（１００％として設定）と比較し、パーセンテージ変化（△％ＡＵＣ）として表した。
【００９２】
統計
スチューデントのｔ検定を使用して統計的有意性を計算した（Ｅｘｃｅｌ Ｓｔａｔｉｓｔｉｃａｌ Ｆｕｎｃｔｉｏｎｓ、Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ（登録商標） Ｅｘｃｅｌ ２００２、Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ Ｃｏｒｐ．、Ｒｅｄｍｏｎｄ、ＵＳＡ）。
【００９３】
基準線を１００に設定した曲線下面積（ＡＵＣ）は、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ ｖｅｒｓｉｏｎ ４．０３ ｆｏｒ Ｗｉｎｄｏｗｓ（登録商標）を使用して計算した（ＧｒａｐｈＰａｄ Ｓｏｆｔｗａｒｅ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ ＵＳＡ、ｗｗｗ．ｇｒａｐｈｐａｄ．ｃｏｍ）。
【００９４】
結果
実験プロトコルを、表４に示す例によって示す。ＡＵＣ低下およびＰ−値をポジティブコントロール（ＴＰＡまたはＡＡ＋ＰＢＳ）に対して計算した。
【００９５】
試験Ａ
この試験は、浮腫の誘発を０日目に開始して、本発明の化合物をｉ．ｐ．で施した場合、浮腫の低下を示した。本実験において、コントロール物質ＩＤＸ０１５０は、炎症のほぼ十分な寛解を示し、ＡＵＣを−３８．９％低下させた。
【００９６】
試験Ｂ
試験Ｂは、浮腫の誘発の４日前にｓ．ｃ．を施した場合の化合物の予防効果を調査した。ＩＤＸ０９２０、ＩＤＸ０９５５、およびＩＤＸ０００１は、それぞれ−１９．３％、−２２．７％、および−１６．３％のＡＵＣの低下を示したが、統計的に有意ではなかった（ＮＳ）。ＩＤＸ０１５０は、ＡＵＣの低下を示さなかった。測定値の間の大きな差異による不十分な結果のために、この試験を繰り返した（試験Ｃ）。
【００９７】
試験Ｃ
試験Ｂの繰り返しの試験において、浮腫の誘発の４日前にｓ．ｃ．を施したＯＤＮは、それぞれ、−３％、−２２％、−２４．３％、および−１７．９％のＡＵＣの低下を示し、ＩＤＸ０１５０（Ｐ＜０．０１）、ＩＤＸ０９５５（Ｐ＜０．０１）、およびＩＤＸ０００１（Ｐ＜０．０５）について統計的に有意であった。
【００９８】
試験Ｄ
より短い予防レジメンにおいて、浮腫の誘発の２日前にｓ．ｃ．を施すと、試験Ｃとほぼ類似した結果が得られた。ＩＤＸ０９２０、ＩＤＸ０１５０、ＩＤＸ０９５５（Ｐ＜０．０１）について統計的に有意であったが、ＩＤＸ０００１について有意ではなかった。ＡＵＣの低下は、それぞれ、−１９．１％、−１６．５％、−１７．８％、および−１２．４％であった。
【００９９】
試験Ｅ
この試験において、浮腫を誘発したのと同じ日に化合物を施した。誘発は、それぞれのマウスについて約２０分間の待ち時間を考慮に入れるためにずらした。この試験において、ＡＵＣの比較的一様な低下、ＩＤＸ０９２０ −１９．４％、ＩＤＸ０１５０ −２７．３％、ＩＤＸ０９５５ −１７．７％、およびＩＤＸ０００１ −１６．７％があった。すべての化合物は、統計的に有意な低下をもたらした（Ｐ＜０．０１）。
【０１００】
試験Ｆ
この試験において、それぞれの動物に対して等用量（５０μｇ）で、膨張を誘発したのと同じ日に化合物を施した。これもまた、ＡＵＣの低下、ＩＤＸ０９２０ −１７％、ＩＤＸ０１５０ −３１．１％、ＩＤＸ０９５５ −１８．３％、およびＩＤＸ０００１ −１３．２％をもたらした。下方への傾斜の遅れを示したＩＤＸ０９２０を除いて、すべての他の化合物は、膨張の有意な低下を示し、ＩＤＸ０１５０およびＩＤＸ０９５５はＰ＜０．０１およびＩＤＸ０００１はＰ＜０．０５であった。
【０１０１】
試験Ｇ
治療レジメンを調査するために、化合物を浮腫の誘発の２時間後に与えた。これは、ＡＵＣの有意な低下、ＩＤＸ０９２０ −４３．８％（Ｐ＜０．０１）、ＩＤＸ０１５０ −４２．３％（Ｐ＜０．０１）、およびＩＤＸ０９５５ −４０．７％（Ｐ＜０．０５）をもたらした。ＩＤＸ０００１は、統計的に有意ではない−１７．９％の低下を示した。
【０１０２】
試験Ｈ
代替投与経路を検討するために、鼻腔内投与を調査した。ｓ．ｃ．投与に対する比較において、類似した時点および用量を選んだ。試験Ｈにおいて、鼻腔内投与を、膨張を誘発する４日前に予防プロトコルにおいて施した。これは、ｓ．ｃ．投与を用いて得たものよりも膨張の有効な低下をもたらした。ＡＵＣの低下は、ＩＤＸ０９２０ −３３．８％。（Ｐ＜０．０１）、ＩＤＸ０１５０ −２５．７％（Ｐ＜０．０１）、ＩＤＸ０９５５ −１７．４％（Ｐ＜０．０５）、およびＩＤＸ０００１ −２５．７％（Ｐ＜０．０５）であった。
【０１０３】
試験Ｉ
鼻腔内投与を、浮腫を誘発したのと同じ日に、０日目に施した場合、膨張の有効な低下が見られた。ＡＵＣの低下は、ＩＤＸ０９２０ −２７．３％。（Ｐ＜０．０１）、ＩＤＸ０１５０ −２８．４％（Ｐ＜０．０１）、ＩＤＸ０９５５ −２８．８％（Ｐ＜０．０５）、およびＩＤＸ０００１ −６．４％（ＮＳ）であった。
【０１０４】
試験Ｊ
試験Ｇにおいて使用したような治療プロトコルにおいて、鼻腔内投与もまた膨張の好適な低下をもたらした。ＡＵＣは、ＩＤＸ０９２０で−２８．７％（Ｐ＜０．０５）、ＩＤＸ０１５０で−２８．８％（Ｐ＜０．０１）、ＩＤＸ０９５５で−１７．２％（Ｐ＜０．０５）、およびＩＤＸ０００１で−２５．２％（Ｐ＜０．０５）低下することが示された。
【０１０５】
試験Ｋ
用量応答を試験Ｋ〜Ｏにおいて調査した。試験Ｋにおいて、０．１、１、１０、および１００μｇのＩＤＸ０１５０を与えた。結果は、用量依存的に膨張の低下を示した。ＡＵＣの低下は、０．１μｇで−１３．９％（Ｐ＜０．０５）、１μｇで−１６．３％（Ｐ＜０．０５）、１０μｇで−２７．９％（Ｐ＜０．０５）、および１００μｇで−４５％（Ｐ＜０．０１）であった。
【０１０６】
試験１０３Ｌ
ＧＣを用いて置換したＣｐＧモチーフを有するネガティブコントロールＩＤＸ０５２６を、試験Ｋに類似した用量応答プロトコルにおいて調査した。ＩＤＸ０５２６を使用すると、抗膨張活性がなかったことが分かった。ＡＵＣにおける差異は、０．１μｇで＋１．２４％、１μｇで−１．２４％、１０μｇで−０．２６％、および１００μｇで＋６．１８％であり、統計的に有意な変化は全くなかった。
【０１０７】
試験Ｍ
オリゴヌクレオチドの骨格におけるホスホロチオエート修飾の程度の有意性を調査するために、完全にホスホロチオエート化したオリゴヌクレオチド、ＩＤＸ０５００を使用した。この化合物は、すべての試験した用量において統計的に有意な抗膨張特性を示し、ＡＵＣの低下は、０．１μｇ −４６．９％、１μｇ −４１．３％、１０μｇ −４０．９％、および１００μｇ −５９．１％（すべてＰ＜０．０１）であった。
【０１０８】
試験Ｎ
ＩＤＸ０５００の治療濃度域をさらに検討するために、試験Ｎを試みた。用量は、０．００５μｇ、０．０１μｇ、０．１μｇ、および１μｇとした。化合物は、試験Ｍと一致して、用量０．１および１μｇにおいて統計的に有意な効果を示した。ＡＵＣの低下は、０．００５μｇについて−１５％（ＮＳ）、０．０１μｇについて−１５．３％（ＮＳ）、０．１μｇについて−１８．２％（Ｐ＜０．０１）、および１μｇについて−５４．１％（Ｐ＜０．０１）であった。
【０１０９】
試験Ｏ
本実験において、ＩＤＸ０５００およびＩＤＸ０１５０を、０日目にｓ．ｃ．を施した、１０および１００μｇの等用量で比較した。類似した結果が用量および２つの化合物の間で得られ、ＡＵＣの統計的に有意な低下を示し、ＩＤＸ０５００については、１０μｇで−２５．５％、１００μｇで−３９．９％、ＩＤＸ０１５０については、１０μｇで−２５．５％、１００μｇで−３９．９％であった（すべての用量でＰ＜０．０１）。
【０１１０】
コントロール化合物およびＩＤＸ０００１を用いて行った実験に加えて、すべての他の試験化合物を、ＴＰＡおよび／またはＡＡの耳浮腫モデルにおいて類似した様式において調査し、浮腫の誘発の２０分前に皮下に試験化合物を施した（１０μｇ）。結果を、表５において、ピーク値の低下および曲線下面積（ＡＵＣ）の低下として表した。
【０１１１】
【表５】
【０１１２】
ピーク値
ピーク値およびＡＵＣ値もまた、異なる治療計画の抗膨張有効性を階層化するために比較した。
【０１１３】
考察
本実験により、腹腔内、皮下、および鼻腔内経路を使用して、広範な予防的なおよび治療上の治療レジメンを検討した。さらに、用量応答を、化合物ＩＤＸ０１５０およびＩＤＸ０５００（それぞれ配列番号１１および１２）を使用して調査した。
【０１１４】
浮腫のグレードは、マウスにおける外耳の局所的なＴＰＡ治療の後の浮腫形成または膨張を測定することによってたどることができる。この膨張は、２４時間後に通常ピークに達し、その後、１週間の間に徐々におさまる。
【０１１５】
ＡＵＣ値およびピーク値はすべて、ポジティブコントロールよりも低いことが分かった。ほとんどの例において、膨張のこの低下は統計的に有意であった（Ｐ＜０．０５）。しかしながら、いくつかの実験において、統計的に有意な低下に達しなかった。これは、そのような実験全体における低いグレードの浮腫誘発に関連して観察された。これを回避するために、ＴＰＡ用量を最適化するように、また免疫学的に成熟したマウスを使用することによって特別に注意した。
【０１１６】
耳浮腫は、すべての浮腫測定からＴＰＡ誘発性の浮腫のピーク値を得ることによっておよび曲線下面積（ＡＵＣ）を計算することによって検討することができる。ＡＵＣは、したがって、浮腫の誘発および寛解の両方を表す。
【０１１７】
１０回のＩＤＸ０１５０実験からの平均ピーク値を計算すると（図２）、ピーク値における非常に高度な統計的に有意な低下が見られた（Ｐ＜０．００１）。
【０１１８】
したがって、ＩＤＸ０１５０を、この試験において、他の化合物との比較のための基準として使用した。
【０１１９】
ＩＤＸ０１５０（０．１〜１００μｇ）およびＩＤＸ０５００（０．００５〜１００μｇ）の抗膨張効果は、広い用量応答範囲を示した。ピーク値低下として計算される、異なる時点で与えたＩＤＸ０１５０の抗膨張効果は、２時間＞−２日＞０日＞−４日の順に減少した。
【０１２０】
ＡＵＣ低下は２時間＞０日＞−２日＞−４日の順に減少した。これらの結果は、これらの化合物が、予防投与および膨張を開始させた後の治療の両方に使用することができることを示す。鼻腔内投与を用いる非常に好適な結果は、粘膜投与が、身体における免疫系にオリゴヌクレオチド化合物を提供するのに効率的であることを示す。
【０１２１】
結論
試験Ａ〜Ｏは、まとめると、マウスにおけるＴＰＡ誘発性の耳浮腫モデルにおける本発明の化合物の抗膨張効果を支持する。これらの化合物は、腹腔内、皮下、および鼻腔内投与経路によって与えた場合、有効な免疫調節剤となり、浮腫を低下させるためのそれらの効能はまた、図１〜３におけるＩＤＸ０１５０によって例示されるように、異なる予防および治療計画においても証明された。化合物の抗膨張効果は、一般的な炎症経路に限定されないが、たとえばプロスタグランジン系を活性化するＡＡによって誘発される炎症をダウンレギュレートすることもできる。試験化合物配列番号１〜１０はすべて、ＴＰＡおよび／またはＡＡモデルにおいて示されるように浮腫を低下させることができた。
【０１２２】
２．オボアルブミン（ＯＶＡ）誘発性の気道炎症のマウスモデルにおける免疫調節オリゴヌクレオチド試験物質の経鼻投与：予防および異なる治療プロトコルの比較
【０１２３】
材料および方法
動物
Ｂ＆Ｋ（Ｓｏｌｌｅｎｔｕｎａ、Ｓｔｏｃｋｈｏｌｍ、Ｓｗｅｄｅｎ）から得たメスのＢａｌｂ／ｃマウス（８週齢）を実験において使用した。マウスに、十分なペレットげっ歯動物用食餌、Ｒ３６（Ｌａｋｔａｍｉｎ ＡＢ、Ｓｔｏｃｋｈｏｌｍ、Ｓｗｅｄｅｎ）および国内の飲用に適した品質の水を適宜与えた。動物は、２１℃±３℃および５５％±１５％の相対湿度の動物室で飼育した。換気システムは、１時間当たり１０回、空気交換するように設計した。部屋は、１２時間明および１２時間暗のサイクルとなるように照明した。照明は０７：００〜１９：００の時間、つける。マウスは、それぞれのケージに５匹、透明なポリカーボネート（ＭａｃｒｏｌｏｎｅタイプＩＩＩ）ケージ（床面積：８２０ｃｍ2）において飼育した。ケージ中の敷床は４ＨＶポプラ敷床（Ｔａｐｖｅｉ、Ｆｉｎｌａｎｄ）とした。それぞれのケージを、試験番号、グループ番号、性別、および動物番号を用いてマークしたケージカードによって識別した。
【０１２４】
感作およびエアロゾル誘発
マウスは、０および１２日目に、２００μＬ ＯＶＡ／水酸化アルミニウムゲル（１：３）を用いて腹腔内感作した（図６を参照されたい）。ＯＶＡ（ニワトリ卵アルブミングレードＶ、Ｓｉｇｍａ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）を生理食塩水中に溶解し、３時間４℃での回転流動によって５０μｇ／ｍＬの濃度まで水酸化アルミニウムゲルと混合した。２３、２６、３０、および３３日目に（図６を参照されたい）、Ｂａｔｅｌｌｅ曝露チャンバーを使用して、３０分間、エアロゾル化ＯＶＡの吸入によってマウスの肺中で誘発した。エアロゾルを、ＰＢＳ中に溶解した１０ｍｇ／ｍＬ ＯＶＡ（Ｓｉｇｍａ、Ｓｔ Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ、ＵＳＡ）の噴霧器濃度を使用して、気流７．４Ｌ／分で圧縮空気噴霧器（Ｃｏｌｌｉｓｏｎ ６−ｊｅｔ）によって生成した。非感作動物を有するコントロールグループは、２３、２６、３０、および３３日目のエアロゾル化ＯＶＡ以外に治療を受けなかった。エアロゾル誘発を受けなかった感作マウスのコントロールグループもまた用意した。
【０１２５】
オリゴヌクレオチド
このＯＶＡモデルにおいて（図６）、合計４つのオリゴヌクレオチドを試験した、ＩＤＸ９０２５、ＩＤＸ９０３８、ＩＤＸ９０５３（表１、配列番号２〜４））、およびＩＤＸ０１５０（表３、配列番号１１）。オリゴヌクレオチドは、ｂｉｏｍｅｒｓ．ｎｅｔ ＧｍｂＨ、Ｕｌｍ、Ｇｅｒｍａｎｙによって合成され、−２０℃で凍結保存された。オリゴヌクレオチドは、使用濃度（１，２４７μｇ／μＬ）にＰＢＳを用いて希釈し、滴下の１日目まで−２０℃に保ち、その後、それらを４℃にした。
【０１２６】
ＯＶＡ誘発性の気道炎症の治療
第１の実験において、予防および治療プロトコルの両方を試験した（図６を参照されたい）。薬剤治療は、１６および２１日目（予防プロトコル）、３０および３３日目（治療プロトコルＡ）、または３０および３４日目（治療プロトコルＢ）のＩＤＸ０１５０（ＩｎＤｅｘ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ ＡＢ、Ｓｔｏｃｋｈｏｌｍ、Ｓｗｅｄｅｎによって提供される１，２４７μｇ／μＬ）の鼻腔内滴下からなった。３０および３３日目の治療プロトコル（Ａ＆Ｂ）における滴下は、エアロゾル誘発の４時間後に施した。３４日目のプロトコルＢにおける第２の滴下は、最後のエアロゾル誘発の２４時間後に施した。薬剤は、４０μＬ ＰＢＳ中で投与し、約５０μｇ／マウス（４９．８８μｇ／マウス）の用量を施した。２つの感作偽治療グループに、予防プロトコル（１６および２１日目）または治療プロトコルＡ（３０および３３日目）による治療グループと同じ全容量のＰＢＳを滴下した。
【０１２７】
【表６】
【０１２８】
第２の実験において、予防プロトコル（図６）を使用する第１の実験におけるＩＤＸ０１５０の投与が、気道炎症の有意な低下を示したので（図７）、他の３つの物質を、同じプロトコルを用いて試験した。薬剤治療は、１６および２１日目（図６、予防プロトコルを参照されたい）のＩＤＸ９０２５、ＩＤＸ９０３８、およびＩＤＸ９０５３（表１）（１，２４７μｇ／μＬ、ＩｎＤｅｘ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ ＡＢによって提供される）の鼻腔内滴下からなった。物質はすべて、４０μＬ ＰＢＳ中で投与し、約５０μｇ／マウス（４９．８８μｇ／マウス）の用量を施した。２つの感作偽治療グループに、予防プロトコル（１６および２１日目）に従って、治療グループと同じ全容量のＰＢＳを滴下した。
【０１２９】
気道炎症パラメーターの分析
最後のＯＶＡエアロゾル誘発の４２時間後に頚椎脱臼によってマウスを殺した。気管に、ポリエチレン管（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ、Ｓｐａｒｋｓ、ＭＤ、ＵＳＡ）を挿入し、気管支肺胞洗浄（ＢＡＬ）を、４×１ｍＬ分割量の氷冷ハンクス平衡塩類溶液（ＨＢＳＳ）（Ｓｉｇｍａ、Ｓｔ Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ、ＵＳＡ）を使用して行った。ＢＡＬ体液を遠心分離し（４００ｇ、１０分、４℃）、ＢＡＬ体液細胞を０．４ｍＬ ＰＢＳ中に再懸濁した。白血球の総数を、Ｂｕｅｒｋｅｒチャンバー中で、トリパンブルー排除法を使用して数えた。ＢＡＬ体液細胞の二連のＣｙｔｏｓｐｉｎ（Ｃｙｔｏｓｐｉｎ３、Ｓｈａｎｄｏｎ、Ｒｕｎｃｏｒｎ、ＵＫ）調製物を、標準的な形態学的基準を使用して、白血球百分率について、Ｍａｙ Ｇｒｕｅｎｅｗａｌｄ Ｇｉｅｍｓａを用いて染色した。
【０１３０】
統計分析
統計比較は、感作ＰＢＳ治療コントロールマウスと比較するために、ダネットの事後補正を使用する分散（ＡＮＯＶＡ）の一元配置分析を使用して行った（ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ ３）。データは平均±標準偏差として示す。Ｐ＜０．０５は、有意であると考えた。
【０１３１】
結果
オボアルブミン誘発性のアレルギー喘息モデルは、喘息の間に見られる肺炎症を再現するために広く使用されるモデルである。ここで得られた結果は、気道の粘膜の膨張に相互に関連し、結果は、したがって、浮腫の低下の妥当な測定値である。このモデルの分析は、多形核細胞（ＰＭＮ）などの浸潤炎症細胞のタイプおよび量が同定され、数えられるＢＡＬ分析などの喘息の一般的な指標に依存する。
【０１３２】
結果的に、それぞれのマウスに由来するＢＡＬ体液細胞を記載されるように数え、値を、異なる治療グループの平均値を提供する組み合わせのヒストグラムとしてプロットした（図７）。
【０１３３】
大まかに言えば、実験の両方における動物（ＰＢＳグループ）の肺への４つの分析した細胞型の多量の流入によって示されるように、誘発性の気道炎症のレベルは高度であった。コントロールグループ（「エアロゾルなし」また「誘発なし」）は、誘発性の炎症の徴候を示さず、動物が、エアロゾルオボアルブミンタンパク質に対して天然のアレルギー応答を示さなかったことおよび使用したオボアルブミンタンパク質にたとえばＬＰＳが混入していなかったことを確認した。
【０１３４】
「エアロゾルなし」コントロールグループにおける炎症のあらゆる徴候の完全な欠如により、ＯＶＡ免疫自体の実験手順が肺炎症を誘発しなかったことを確認した。
【０１３５】
予防プロトコルにおける鼻治療に続いて、炎症の誘発の７および２日前に、２度施した場合、試験物質ＩＤＸ０１５０は、ＢＡＬ体液への白血球および好酸球の遊走を有意に低下させることができた（それぞれＰ＜０．０５およびＰ＜０．００１）（図７）。
【０１３６】
このプロトコルの治療アームにおいて、ＩＤＸ０１５０を炎症の誘発の７および１１日後に、つまり実験期間の極めて後半に施した場合、統計的に証明された効果はなかった。
【０１３７】
第２の実験における鼻治療に続いて（図８）、試験物質ＩＤＸ９０３８は、ＢＡＬＦ体液への白血球（Ｐ＜０．０５）および好酸球（Ｐ＜０．００１）の遊走を有意に低下させることができた。ＩＤＸ９０２５およびＩＤＸ９０５３は、本実験において、ＢＡＬＦ体液への細胞遊走の有意な低下を示さなかった。
【０１３８】
結論
本インビボ試験は、以下の結論を出す：ＢＡＬ体液に浸潤する白血球、好酸球、およびリンパ球の数の統計的に有意な低下は、本発明の化合物を用いて治療した場合、動物において観察された。本モデルにおいて、炎症を測定することは、より適切であったが、結果は、浮腫に対して等しく適用可能である。さらに、試験は、有効な経路としての経鼻投与の適合性を確認した。
【０１３９】
３．Ｃ５７／ＢＩ６マウスにおけるチオグリコレート誘発性の胸膜炎
【０１４０】
材料および方法
動物モデルは、細胞遊走および血管透過性に対する本発明の実施形態によるオリゴヌクレオチドの効果を検討するために設定した。
【０１４１】
マウスに、ケタミン（Ｋｅｔａｌａｒ（登録商標） Ｐａｒｋｅ−Ｄａｖｉｓ；２５ｍｇ／ｍｌ）およびキシラジン（Ｎａｒｃｏｘｙｌ ｖｅｔ．（登録商標） Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｉａ ＡＧ；５ｍｇ／ｍｌ）の０．１５〜０．２０ｍｌの混合物の腹腔内注射によって麻酔をかけた。
【０１４２】
左の頚静脈に、静脈内投与（ｉ．ｖ．）のためのポリエチレン管（ＰＥ１０）を挿入した。皮膚切開を胸の右側に行った。下層にある筋肉の解剖に続いて、胸膜炎（胸膜の炎症）を、１００μｌのチオグリコレート（Ｓｉｇｍａ）の単一胸膜内注射によって誘発した。無菌ＰＢＳを、ネガティブコントロールとして使用した。
【０１４３】
ＰＢＳ中のＦＩＴＣ抱合デキストラン（１００μｌ、３０ｍｇ／ｍｌ）をｉ．ｖ．注射した。４時間後、動物を、過量の麻酔を用いて安楽死させ、胸を慎重に開き、滲出液を吸引によって取り出し、容量を書き留めた。胸部を、その後、ＰＢＳ中の氷冷３ｍＭ ＥＤＴＡの１ｍｌですすいだ。赤血球が混入した滲出液を廃棄した。
【０１４４】
滲出液およびすすいだ材料を、５分間、１５００ｇで遠心分離し、上清を、蛍光光度計（Ｆｌｕｏｒｏｓｋａｎ Ａｃｓｅｎｔ、ＬａｂＳｙｓｔｅｍｓ）における蛍光強度の測定のために使用し、ＦＩＴＣデキストランのクリアランス容量を計算した。ペレットを、非特異的抗体結合を遮断するために１５分間、０．１％ＢＳＡを有するＰＢＳ中に再懸濁した。１０μｌの細胞懸濁液を、Ｂｕｅｒｋｅｒチャンバーにおいて、白血球（ＷＢＣ）百分率のために使用した。
【０１４５】
滲出液からの細胞を、好中球およびマクロファージ特異的抗体を用いて染色し、フローサイトメトリー（ＦＡＣＳｏｒｔおよびＣｅｌｌＱｕｅｓｔのソフトウェア、ＢＤ）によって分析した。分析は、前方散乱光および側方散乱光のそれらの典型的な出現に基づく総白血球数を含んだ。ＰＭＮおよびマクロファージは、それぞれＬｙ６ＧおよびＦ４／８０のそれらの発現によってさらに同定した。
【０１４６】
本発明の実施形態によるオリゴヌクレオチドの効果を試験するために、試験される化合物を、１００μｌの用量、つまり５０μｇ／マウスで、胸膜炎の誘発の約２０分前に、腹腔内に投与した。この試験において、試験した化合物をＩＤＸＯ１５０（配列番号１１、表３）とした。
【０１４７】
結果
チオグリコレート誘発性の胸膜炎モデルは、技術的に複雑になり、時に個々の異なる値を示し得るが、開発中の新薬の実践的なスクリーニングに最適なモデルの１つである。しかしながら、このモデルは、同時に試験することができる動物の数が制限される。
【０１４８】
結果は、胸膜腔へのＰＭＮの高度な移行によって、炎症誘発剤、チオグリコレートに対して動物が応答したことを示した。この細胞反応は、高度なクリアランス容量として見られる胸膜浮腫の蓄積において反映された。ＩＤＸ０１５０治療は、チオグリコレート炎症誘発の後にＰＭＮの動員を低下させた（４２％低下）（図９ａ）。ＩＤＸ０１５０を用いる治療はまた、ＰＢＳコントロールに類似した、低レベルの血管透過性（６８．２％低下）をも示した（図９ｂ）。結果は平均±ＳＤを表す。
【０１４９】
Ｈｕら（２００８）は、浮腫形成に対する経内皮小胞経路の寄与を調査した。グループは、肺血管透過性が、血管壁に付着したＰＭＮの活性化によってを誘発することができることを示し、より重症の浮腫は、より多いＰＭＮ数を伴って観察された。本発明の実施形態による化合物は、ＰＭＮの低下（図７、８、および９ａ）および結果的に浮腫の低下（図９ｂ）を明確に示す。抗ＰＭＮ抗体を使用する実験は、抗ＰＭＮ−ａｂが、本発明の化合物と類似したレベルまでＰＭＮおよび浮腫を等しく低下させることができたことを示した（データ示さず）。
【０１５０】
結論
胸膜炎動物モデルにおけるこれらの結果は、化合物が、さらなる試験および薬剤開発に適した好ましい治療プロファイルを有するという事実を指す。
【０１５１】
特定の実施形態が本明細書において詳細に開示されるが、これは、例証のみの目的で、一例として開示されたものであり、続く、添付の特許請求の範囲に関して限定することを意図しない。特に、特許請求の範囲によって定義される本発明の趣旨および範囲から逸脱することなく、様々な置換、変更、および改変を、本発明に対してなし得ることが本発明者によって企図される。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、および配列番号１０の中から選ばれる配列を含む、単離され、実質的に精製されたオリゴヌクレオチド化合物。
【請求項２】
配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、および配列番号７の中から選ばれる配列を含む、請求項１に記載のオリゴヌクレオチド化合物。
【請求項３】
配列番号８、配列番号９、および配列番号１０の中から選ばれる配列を含む、請求項１に記載のオリゴヌクレオチド化合物。
【請求項４】
化合物の全長が、約１２〜約３０塩基である、請求項１に記載のオリゴヌクレオチド化合物。
【請求項５】
化学的に修飾される、請求項１に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項６】
少なくとも１つのヌクレオチドがリン酸骨格修飾を有する、請求項１に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項７】
リン酸骨格修飾が、ホスホロチオエートまたはホスホロジチオエートの修飾である、請求項６に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項８】
請求項１から７のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチドを含む医薬組成物。
【請求項９】
薬理学的に適合し、生理学的に許容可能な賦形剤または担体をさらに含む、請求項８に記載のオリゴヌクレオチドを含む医薬組成物。
【請求項１０】
生理食塩水、リポソーム、界面活性剤、粘膜付着性化合物、酵素阻害剤、胆汁酸塩、吸収促進剤、およびシクロデキストリンから選ばれる、薬理学的に適合し、生理学的に許容可能な賦形剤または担体をさらに含む、請求項８に記載のオリゴヌクレオチドを含む医薬組成物。
【請求項１１】
請求項１から７のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチドを含む、粘膜投与のための医薬製剤。
【請求項１２】
浮腫を予防、治療、および／または軽減するための医薬組成物の製造のための、請求項１から７のいずれか一項に記載の単離され、実質的に精製されたオリゴヌクレオチドの使用。
【請求項１３】
浮腫が、心不全、肝硬変、ネフローゼ症候群などの腎疾患、栄養失調、癌、喘息、アレルギー性鼻炎、ＣＯＰＤ、虚血、外傷、および敗血症性ショックの中から選ばれる状態につながる、任意の器官または組織中の間質液のバランスにおける障害または機能不全として定義される、請求項１２に記載の使用。
【請求項１４】
前記オリゴヌクレオチドが、血管透過性の調節、白血球遊走の阻害または低下、好中球遊走または活性化の阻害または低下、好酸球遊走の阻害または低下、およびリンパ球遊走の阻害または低下の１つを達成するのに有効な量で投与される、請求項１２に記載の使用。
【請求項１５】
浮腫を予防、治療、および／または軽減するための医薬組成物の製造のための、単離され、実質的に精製されたオリゴヌクレオチドの使用であって、オリゴヌクレオチドが、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、および配列番号１０からなる群から選ばれ、好中球遊走または活性化の阻害または低下によって喘息を治療または軽減するのに有効な投与量および形態で投与される使用。
【請求項１６】
請求項１に記載のオリゴヌクレオチドが、血管透過性の修飾、好中球遊走／活性化の阻害、好酸球遊走の阻害または低下、白血球遊走の阻害または低下、およびリンパ球遊走の阻害または低下の１つまたはいくつかを達成するのに有効な用量で投与される、浮腫を予防、治療、および／または軽減するための方法。
【請求項１７】
請求項８から１１のいずれか一項に記載の医薬組成物が患者に投与される、浮腫を予防、治療、および／または軽減するための方法。
【請求項１８】
投与経路が、頬側、食道、胃、粘膜、経皮、皮下、および腹腔内投与から選ばれる、請求項１６または１７に記載の方法。
【請求項１９】
粘膜投与が、経鼻投与、吸入、眼内投与、直腸投与、経口、泌尿生殖器、および膣投与から選ばれる、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
疾患が、心不全、肝硬変、ネフローゼ症候群などの腎疾患、栄養失調、癌、喘息、アレルギー性鼻炎、急性肺傷害、滲出液の蓄積を伴う肺疾患、ＣＯＰＤ、虚血、外傷、および敗血症性ショックの中から選ばれる、請求項１６に記載の方法。
【請求項２１】
オリゴヌクレオチドが、体重１ｋｇ当たり約５〜約５００μｇの量で投与される、請求項１６に記載の方法。
【請求項２２】
オリゴヌクレオチドが、体重１ｋｇ当たり約１０〜約１００μｇの量で投与される、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
オリゴヌクレオチドが、たとえば侵襲性の外科手技、放射線療法、ホルモン治療、移植手術、および移植術の前に、予防的に投与される、請求項１６に記載の方法。
【請求項２４】
オリゴヌクレオチドが、アレルゲンへの曝露が予期される前に、予防的に投与される、請求項１６に記載の方法。
【請求項２５】
オリゴヌクレオチドが、抗炎症薬と組み合わせて投与される、請求項１６に記載の方法。
【請求項１】
配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、および配列番号１０の中から選ばれる配列を含む、単離され、実質的に精製されたオリゴヌクレオチド化合物。
【請求項２】
配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、および配列番号７の中から選ばれる配列を含む、請求項１に記載のオリゴヌクレオチド化合物。
【請求項３】
配列番号８、配列番号９、および配列番号１０の中から選ばれる配列を含む、請求項１に記載のオリゴヌクレオチド化合物。
【請求項４】
化合物の全長が、約１２〜約３０塩基である、請求項１に記載のオリゴヌクレオチド化合物。
【請求項５】
化学的に修飾される、請求項１に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項６】
少なくとも１つのヌクレオチドがリン酸骨格修飾を有する、請求項１に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項７】
リン酸骨格修飾が、ホスホロチオエートまたはホスホロジチオエートの修飾である、請求項６に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項８】
請求項１から７のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチドを含む医薬組成物。
【請求項９】
薬理学的に適合し、生理学的に許容可能な賦形剤または担体をさらに含む、請求項８に記載のオリゴヌクレオチドを含む医薬組成物。
【請求項１０】
生理食塩水、リポソーム、界面活性剤、粘膜付着性化合物、酵素阻害剤、胆汁酸塩、吸収促進剤、およびシクロデキストリンから選ばれる、薬理学的に適合し、生理学的に許容可能な賦形剤または担体をさらに含む、請求項８に記載のオリゴヌクレオチドを含む医薬組成物。
【請求項１１】
請求項１から７のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチドを含む、粘膜投与のための医薬製剤。
【請求項１２】
浮腫を予防、治療、および／または軽減するための医薬組成物の製造のための、請求項１から７のいずれか一項に記載の単離され、実質的に精製されたオリゴヌクレオチドの使用。
【請求項１３】
浮腫が、心不全、肝硬変、ネフローゼ症候群などの腎疾患、栄養失調、癌、喘息、アレルギー性鼻炎、ＣＯＰＤ、虚血、外傷、および敗血症性ショックの中から選ばれる状態につながる、任意の器官または組織中の間質液のバランスにおける障害または機能不全として定義される、請求項１２に記載の使用。
【請求項１４】
前記オリゴヌクレオチドが、血管透過性の調節、白血球遊走の阻害または低下、好中球遊走または活性化の阻害または低下、好酸球遊走の阻害または低下、およびリンパ球遊走の阻害または低下の１つを達成するのに有効な量で投与される、請求項１２に記載の使用。
【請求項１５】
浮腫を予防、治療、および／または軽減するための医薬組成物の製造のための、単離され、実質的に精製されたオリゴヌクレオチドの使用であって、オリゴヌクレオチドが、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、および配列番号１０からなる群から選ばれ、好中球遊走または活性化の阻害または低下によって喘息を治療または軽減するのに有効な投与量および形態で投与される使用。
【請求項１６】
請求項１に記載のオリゴヌクレオチドが、血管透過性の修飾、好中球遊走／活性化の阻害、好酸球遊走の阻害または低下、白血球遊走の阻害または低下、およびリンパ球遊走の阻害または低下の１つまたはいくつかを達成するのに有効な用量で投与される、浮腫を予防、治療、および／または軽減するための方法。
【請求項１７】
請求項８から１１のいずれか一項に記載の医薬組成物が患者に投与される、浮腫を予防、治療、および／または軽減するための方法。
【請求項１８】
投与経路が、頬側、食道、胃、粘膜、経皮、皮下、および腹腔内投与から選ばれる、請求項１６または１７に記載の方法。
【請求項１９】
粘膜投与が、経鼻投与、吸入、眼内投与、直腸投与、経口、泌尿生殖器、および膣投与から選ばれる、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
疾患が、心不全、肝硬変、ネフローゼ症候群などの腎疾患、栄養失調、癌、喘息、アレルギー性鼻炎、急性肺傷害、滲出液の蓄積を伴う肺疾患、ＣＯＰＤ、虚血、外傷、および敗血症性ショックの中から選ばれる、請求項１６に記載の方法。
【請求項２１】
オリゴヌクレオチドが、体重１ｋｇ当たり約５〜約５００μｇの量で投与される、請求項１６に記載の方法。
【請求項２２】
オリゴヌクレオチドが、体重１ｋｇ当たり約１０〜約１００μｇの量で投与される、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
オリゴヌクレオチドが、たとえば侵襲性の外科手技、放射線療法、ホルモン治療、移植手術、および移植術の前に、予防的に投与される、請求項１６に記載の方法。
【請求項２４】
オリゴヌクレオチドが、アレルゲンへの曝露が予期される前に、予防的に投与される、請求項１６に記載の方法。
【請求項２５】
オリゴヌクレオチドが、抗炎症薬と組み合わせて投与される、請求項１６に記載の方法。
【図１】
【図２】
【図３ａ】
【図３ｂ】
【図４】
【図５ａ】
【図５ｂ】
【図５ｃ】
【図５ｄ】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９ａ】
【図９ｂ】
【図２】
【図３ａ】
【図３ｂ】
【図４】
【図５ａ】
【図５ｂ】
【図５ｃ】
【図５ｄ】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９ａ】
【図９ｂ】
【公表番号】特表２０１０−５３９９７４（Ｐ２０１０−５３９９７４Ａ）
【公表日】平成２２年１２月２４日（２０１０．１２．２４）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１０−５２７９０４（Ｐ２０１０−５２７９０４）
【出願日】平成２０年１０月２日（２００８．１０．２）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＳＥ２００８／０００５４２
【国際公開番号】ＷＯ２００９／０４５１４５
【国際公開日】平成２１年４月９日（２００９．４．９）
【出願人】（５０８００３０１１）インデックス・ファーマシューティカルズ・アクチエボラーグ (12)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２２年１２月２４日（２０１０．１２．２４）
【国際特許分類】
【出願日】平成２０年１０月２日（２００８．１０．２）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＳＥ２００８／０００５４２
【国際公開番号】ＷＯ２００９／０４５１４５
【国際公開日】平成２１年４月９日（２００９．４．９）
【出願人】（５０８００３０１１）インデックス・ファーマシューティカルズ・アクチエボラーグ (12)
【Ｆターム（参考）】
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