溶菌剤
【課題】有用物質の生産菌から有用物質を抽出する工程において溶菌力に優れ、かつ、工程中の有用物質の変質が少ない溶菌剤、およびそれを用いた有用物質の生産方法の提供。
【解決手段】一般式で表される特定な構造の４級アンモニウムアルキル炭酸塩をカルボン酸で塩交換して得られる４級アンモニウムカルボン酸塩型カチオン性界面活性剤を含有する溶菌剤；該溶菌剤を使用して有用物質生産菌から有用物質を生産する方法、および該生産方法によって生産された有用物質。
【解決手段】一般式で表される特定な構造の４級アンモニウムアルキル炭酸塩をカルボン酸で塩交換して得られる４級アンモニウムカルボン酸塩型カチオン性界面活性剤を含有する溶菌剤；該溶菌剤を使用して有用物質生産菌から有用物質を生産する方法、および該生産方法によって生産された有用物質。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、有用物質生産菌からタンパク質などの有用物質を抽出する際に使用される溶菌剤および有用物質の生産方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
微生物は、アミノ酸、タンパク質などの有用物質を生産するための宿主として広く利用されている。特に近年は、遺伝子工学技術を活用して、産業上有用なタンパク質の遺伝子を導入した形質転換された微生物を使用し、有用物質を効率的に製造する技術が知られるようになっている。
有用物質を生産する好ましい微生物の例として、大腸菌やシュードモナス属菌などのグラム陰性菌、バチルス属菌や乳酸菌などのグラム陽性菌、サッカロマイセス属やキャンディダ属などの酵母、アスペルギウス属やペニシリウム属などの糸状菌、ストレプトマイセス属やロドコッカス属などの放線菌を挙げることができる。
タンパク質などの有用物質の精製における第１の段階は、これらの有用物質を生産する細胞を溶解して、細胞成分を遊離させる段階である。
細胞の溶解方法には、物理的方法と化学的方法がある。このうち化学的細胞溶解法としては、界面活性剤を用いて細胞膜または細胞壁の完全性を破壊する方法がある。
提案されている非イオン性界面活性剤としては、糖鎖を有する非イオン性界面活性剤（例えば、特許文献−１）、アルキルアミンエチレンオキサイド付加物（例えば、特許文献−２）およびソルビタン脂肪酸エステルエチレンオキサイド付加物（例えば、特許文献−３）などがある。イオン性界面活性剤としては、第４級アンモニウム塩（例えば特許文献−４）などのカチオン性界面活性剤の他にアニオン性界面活性剤および両性界面活性剤も提案されている（例えば特許文献−５、６）。
【特許文献−１】特開２００４−５０４３３０号公報
【特許文献−２】特開２００２−１１９２８８号公報
【特許文献−３】特開平６−１５３９４７号公報
【特許文献−４】特開２００２−３３５９６９号公報
【特許文献−５】特開２００２−１９９８８５号公報
【特許文献−６】特開平５−６４５８４号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
しかしながら、従来の非イオン性界面活性剤を用いる方法では溶菌力が不十分であるため大量合成には適さず、また、従来のイオン性界面活性剤を用いた方法では抽出されたタンパク質などの有用物質が変性してしまって、３次元コンホメーションを崩してしまうという課題があった。
【課題を解決するための手段】
【０００４】
本発明者らは上記の課題を解決するため鋭意検討した結果、本発明に至った。
すなわち、本発明は一般式（１）で表される４級アンモニウムアルキル炭酸塩をカルボン酸で塩交換して得られる４級アンモニウムカルボン酸塩型カチオン性界面活性剤（Ａ１）；一般式（２）で表される４級アンモニウムハロゲン化物または水酸化物をカルボン酸の強塩基性塩で塩交換して得られる４級アンモニウムカルボン酸塩型カチオン性界面活性剤（Ａ２）を含有する溶菌剤；該溶菌剤を使用して有用物質生産菌から有用物質を生産する方法、および該生産方法によって生産されたタンパク質、アミノ酸、核酸、抗生物質、糖類またはビタミン類である。
【０００５】
【化３】
【０００６】
式中、Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3およびＲ4は、それぞれ炭素数１〜２２の直鎖または分岐の炭化水素基であって、Ｒ1〜Ｒ4のうちの少なくとも１個は炭素数６〜２２の炭化水素基であり、Ｒ1〜Ｒ4はそれぞれ同一でも異なっていてもよく、Ｒ5は炭素数１〜６のアルキル基である。
【０００７】
【化４】
【０００８】
式中、Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3およびＲ4は、それぞれ炭素数１〜２２の直鎖または分岐の炭化水素基であって、Ｒ1〜Ｒ4のうちの少なくとも１個は炭素数６〜２２の炭化水素基であり、Ｒ1〜Ｒ4はそれぞれ同一でも異なっていてもよく、Ｘはハロゲン原子または水酸基である。
【発明の効果】
【０００９】
本発明の溶菌剤は、特に大腸菌等の有用物質生産菌から有用物質を抽出するための溶菌剤として、従来よりも改善された溶菌力を有しており、また、従来よりも有用物質を変性することが少ない。
従って、高品質の有用物質、例えば、変性の程度が少なくて活性の高い酵素などを得ることができる。また、糖類などの生産性も良好である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１０】
本発明における第１の実施態様は、一般式（１）で表される４級アンモニウムアルキル炭酸塩をカルボン酸で塩交換して得られる４級アンモニウムカルボン酸塩型カチオン性界面活性剤（Ａ１）を含有することを特徴とする溶菌剤である。
【００１１】
【化５】
【００１２】
式中、Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3およびＲ4は、それぞれ炭素数１〜２２の直鎖または分岐の炭化水素基であって、Ｒ1〜Ｒ4のうちの少なくとも１個は炭素数６〜２２の炭化水素基であり、Ｒ1〜Ｒ4はそれぞれ同一でも異なっていてもよく、Ｒ5は炭素数１〜６のアルキル基である。
【００１３】
Ｒ1〜Ｒ4で示される炭化水素基には、脂肪族炭化水素基および芳香族炭化水素基が挙げられる。
脂肪族炭化水素基としては、直鎖又は分岐のアルキル基（メチル基、エチル基、プロピル基、ｎ−ブチル基、ペンチル基、ｎ−ヘキシル基、ヘプチル基、ｎ−オクチル基、ノニル基、デシル基、ウンデシル基、ドデシル基、ｉ−、ｓｅｃ−、およびｔ−ブチル基、２−メチルブチル基、２，２−ジメチルプロピル基、３−メチルブチル基、２−エチルヘキシル基など）およびアルケニル基（ビニル基、アリル基、メタリル基、など）が挙げられる。
芳香族炭化水素基としては、フェニル基、アリールアルキル基（ベンジル基、フェニルエチル基、フェニルプロピル基、フェニルブチル基など）およびアルキルアリール基（メチルフェニル基、エチルフェニル基、オクチルフェニル基、ノニルフェニル基、デシルフェニル基、ドデシルフェニル基など）が挙げられる。
【００１４】
Ｒ1〜Ｒ4の炭化水素基の好ましい組み合わせとしては、以下の（ａ）〜（ｄ）が挙げられる。
（ａ）１個のみが炭素数６〜２２の脂肪族炭化水素基で他は炭素数１〜４のアルキル基である組み合わせ；
ドデシルトリメチルアンモニウム、テトラデシルトリメチルアンモニウム、ヘキサデシルトリメチルアンモニウム、オクタデシルトリメチルアンモニウム、ドデシルジメチルエチルアンモニウム、テトラデシルジメチルエチルアンモニウム、ヘキサデシルジメチルエチルアンモニウム、オクタデシルジメチルエチルアンモニウム、ドデシルメチルジエチルアンモニウム、テトラデシルメチルジエチルアンモニウム、ヘキサデシルメチルジエチルアンモニウムおよびオクタデシルメチルジエチルアンモニウムなど。
（ｂ）２個のみが炭素数６〜２２の脂肪族炭化水素基で他は炭素数１〜４のアルキル基である組み合わせ；
オクチルデシルジメチルアンモニウム、ジオクチルジメチルアンモニウム、ジデシルジメチルアンモニウム、デシルドデシルジメチルアンモニウム、ジドデシルジメチルアンモニウム、オクチルデシルメチルエチルアンモニウム、ジオクチルメチルエチルアンモニウム、ジデシルメチルエチルアンモニウム、ジドデシルメチルエチルアンモニウム、ジデシルメチルプロピルアンモニウム、ジドデシルエチルプロピルアンモニウムおよびジステアリルジメチルアンモニウムなど
（ｃ）１個のみが炭素数６〜２２の芳香族炭化水素基で他は炭素数１〜４のアルキル基である組み合わせ；
ベンジルトリメチルアンモニウム、ベンジルトリエチルアンモニウム、ベンジルトリプロピルアンモニウムおよびベンジルエチルジメチルアンモニウムなど。
（ｄ）１個のみが炭素数６〜２２の脂肪族炭化水素基、１個のみが炭素数６〜２２の芳香族炭化水素基で他は炭素数１〜４のアルキル基である組み合わせ；
デシルジメチルベンジルアンモニウム、ドデシルジメチルベンジルアンモニウム、テトラデシルジメチルベンジルアンモニウム、ヘキサデシルジメチルベンジルアンモニウムおよびヤシ油アルキルジメチルベンジルアンモニウムなど。
これらのうち、溶菌力の観点から、好ましいのは（ｂ）、さらに好ましいのはＲ1〜Ｒ4のうちの２個が炭素数８〜１４のアルキル基であるものである。
【００１５】
一般式（１）におけるＲ5ＣＯ3-は炭素数１〜６のアルキル基を有するアルキル炭酸イオンである。アルキル炭酸イオンとしては、メチル炭酸イオン、エチル炭酸イオン、プロピル炭酸イオン、ブチル炭酸イオンなどが挙げられ、好ましくはメチル炭酸イオンおよびエチル炭酸イオン、さらに好ましくはメチル炭酸イオンである。
【００１６】
一般式（１）で示される４級アンモニウムアルキル炭酸塩としては、例えばオクチルデシルジメチルアンモニウム・メチル炭酸塩、ジオクチルジメチルアンモニウム・メチル炭酸塩、ジデシルジメチルアンモニウム・メチル炭酸塩、デシルドデシルジメチルアンモニウム・メチル炭酸塩、ジドデシルジメチルアンモニウム・メチル炭酸塩、オクチルデシルメチルエチルアンモニウム・メチル炭酸塩、ジオクチルメチルエチルアンモニウム・メチル炭酸塩、ジデシルメチルエチルアンモニウム・メチル炭酸塩、ジドデシルメチルエチルアンモニウム・メチル炭酸塩、ジデシルメチルプロピルアンモニウム・メチル炭酸塩、ジドデシルエチルプロピルアンモニウム・メチル炭酸塩およびジステアリルジメチルアンモニウム・メチル炭酸塩が挙げられる。
【００１７】
一般式（１）で示される４級アンモニウムアルキル炭酸塩の製法は、第３級アミン（アルキル基の炭素数９〜４８）と同当量以上（好ましくは１．１〜５．０当量）の炭酸ジアルキルエステル（アルキル基の炭素数１〜６）を溶媒（例えば、メタノール）の存在下（第３級アミンの重量に基づいて１０〜１，０００％）または非存在下、反応温度８０〜２００℃、好ましくは１００〜１５０℃で反応させて得ることができる。
【００１８】
本発明における４級アンモニウムカルボン酸塩型カチオン性界面活性剤（Ａ１）は、一般式（１）で示される４級アンモニウムアルキル炭酸塩をカルボン酸（ａ0）で塩交換して得られる界面活性剤である。
【００１９】
カルボン酸（ａ0）としては、以下の１価カルボン酸（ａ0１）および多価カルボン酸（ａ0２）があげられる。
（ａ0１）１価カルボン酸；
脂肪族飽和モノカルボン酸（酢酸、プロピオン酸、酪酸、イソ酪酸、吉草酸、カプロン酸、エナント酸、カプリル酸、ベラルゴン酸、ラウリル酸、ミリスチン酸、ステアリン酸、ベヘン酸、２−エチルヘキサン酸など）；脂肪族不飽和モノカルボン酸（オレイン酸など）
；並びに、脂肪族オキシモノカルボン酸（グリコール酸、乳酸、酒石酸、グルコン酸など）が挙げられる。
（ａ0２）多価カルボン酸；
脂肪族飽和ジカルボン酸（シュウ酸、マロン酸、コハク酸、グルタル酸、アジピン酸、ピメリン酸、スベリン酸、アゼライン酸、セバシン酸など）；脂肪族不飽和ジカルボン酸（マレイン酸、フマール酸、イタコン酸など）；芳香族ジカルボン酸（フタル酸、イソフタル酸、テレフタル酸など）；トリカルボン酸（トリメリット酸、クエン酸など）；テトラカルボン酸（ピロメリット酸、ブタンテトラカルボン酸、シクロペンタンテトラカルボン酸、エチレンジアミン四酢酸など）；並びに、ペンタカルボン酸（ジエチレントリアミン五酢酸など）が挙げられる。
これらのうち好ましいのは、タンパク質などの変性されにくさの観点から（ａ0２）であり、さらに好ましいのは２もしくは３〜８価の多価カルボン酸、特に好ましいのはトリカルボン酸およびテトラカルボン酸、最も好ましいのはテトラカルボン酸である。
【００２０】
塩交換の方法としては、４級アンモニウムアルキル炭酸塩に当量のカルボン酸を加えて、６０〜１００℃で２〜２０時間撹拌することにより、二酸化炭素とアルコールが副生し、二酸化炭素は系外に放出され、アルコールも、その沸点低い場合は系外に留出され、目的の４級アンモニウムカルボン酸塩型カチオン性界面活性剤（Ａ１）を得ることができる。
例えば、ジデシルジメチルアンモニウムのメチル炭酸塩に当量のシクロペンタンテトラカルボン酸を加え、撹拌機付き恒温槽で８０℃に加温しながら８時間撹拌し続けると、二酸化炭素およびメタノールが系外に放出され、ジデシルジメチルアンモニウムのシクロペンタンテトラカルボン酸塩を得ることができる。
【００２１】
本発明における第２の実施態様は、一般式（２）で表される４級アンモニウムハロゲン化物または４級アンモニウム水酸化物をカルボン酸の強塩基性塩で塩交換して得られる４級アンモニウムカルボン酸塩型カチオン性界面活性剤（Ａ２）を含有することを特徴とする溶菌剤である。
【００２２】
【化６】
【００２３】
式中、Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3およびＲ4は、それぞれ炭素数１〜２２の直鎖または分岐の炭化水素基であって、Ｒ1〜Ｒ4のうちの少なくとも１個は炭素数６〜２２の炭化水素基であり、Ｒ1〜Ｒ4はそれぞれ同一でも異なっていてもよく、Ｘはハロゲン原子または水酸基である。
Ｒ1〜Ｒ4で示される炭化水素基としては、一般式（１）で挙げた基と同様の基が挙げられ、好ましい組み合わせ、および好ましいものも上記と同様である。
Ｘで示されるハロゲン原子としては、フッ素、塩素、臭素、ヨウ素が挙げられ、好ましくは塩素である。
Ｘとしては、塩交換のし易さの観点から、水酸基よりもハロゲン原子が好ましい。
【００２４】
４級アンモニウムハロゲン化物の具体例としては、オクチルデシルジメチルアンモニウム・塩化物、ジオクチルジメチルアンモニウム・塩化物、ジデシルジメチルアンモニウム・塩化物、デシルドデシルジメチルアンモニウム・塩化物、ジドデシルジメチルアンモニウム・塩化物、オクチルデシルメチルエチルアンモニウム・塩化物、ジオクチルメチルエチルアンモニウム・塩化物、ジデシルメチルエチルアンモニウム・塩化物、ジドデシルメチルエチルアンモニウム・塩化物、ジデシルメチルプロピルアンモニウム・塩化物、ジドデシルエチルプロピルアンモニウム・塩化物およびジステアリルジメチルアンモニウム・塩化物が挙げられる。
４級アンモニウム水酸化物の具体例としては、オクチルデシルジメチルアンモニウム・水酸化物、ジオクチルジメチルアンモニウム・水酸化物、ジデシルジメチルアンモニウム・水酸化物、デシルドデシルジメチルアンモニウム・水酸化物、ジドデシルジメチルアンモニウム・水酸化物、オクチルデシルメチルエチルアンモニウム・水酸化物、ジオクチルメチルエチルアンモニウム・水酸化物、ジデシルメチルエチルアンモニウム・水酸化物、ジドデシルメチルエチルアンモニウム・水酸化物、ジデシルメチルプロピルアンモニウム・水酸化物、ジドデシルエチルプロピルアンモニウム・水酸化物およびジステアリルジメチルアンモニウム・水酸化物が挙げられる。
【００２５】
塩交換に使用されるカルボン酸の強塩基性塩を構成するカルボン酸としては、上記に示したと同様のカルボン酸が挙げられ、好ましいものも同様である。
また、使用できるカルボン酸の強塩基性塩としては、カルボン酸を強塩基性化合物（例えば、水酸化ナトリウムおよび水酸化カリウムなどのアルカリ金属水酸化物、並びにテトラメチルアンモニウム水酸化物およびテトラエチルアンモニウム水酸化物などの４級アンモニウム水酸化物など）で中和した塩が挙げられる。
カルボン酸の強塩基性塩の具体例としては、酢酸ナトリウム、シュウ酸ナトリウム、シクロペンタンテトラカルボン酸ナトリウムおよびテトラメチルアンモニウム酢酸塩などが挙げられる。
【００２６】
４級アンモニウムカルボン酸塩型カチオン性界面活性剤（Ａ２）の製造における塩交換の方法としては、４級アンモニウムハロゲン化物または水酸化物に当量のカルボン酸の強塩基性塩を加えて、３０〜６０℃で０．３〜３時間撹拌し、副生する塩（ハロゲンアルカリまたはアルカリ金属水酸化物など）を除去して精製する方法が挙げられる。
精製の方法としては、目的物の溶剤抽出などが挙げられる。溶剤抽出に使用できる溶剤としては、非水溶性の溶剤、例えば炭素数６〜１２の脂肪族炭化水素系溶剤（ｎ−ヘキサン、シクロヘキサン、オクタンなど）、芳香族炭化水素系溶剤（トルエン、ベンゼンなど）およびエーテル系溶剤（ジエチルエーテルなど）が挙げられる。
塩交換の具体例としては、例えばジデシルジメチルアンモニウム・シクロペンタンテトラカルボン酸塩水溶液の例を挙げると、ジデシルジメチルアンモニウム・塩化物の水溶液に、当量のシクロペンタンテトラカルボン酸ナトリウム水溶液を加え、４０℃で１時間加熱攪拌し、３０℃まで放冷し、ジエチルエーテルで抽出し、脱塩（脱塩化ナトリウム）する方法を挙げることができる。
【００２７】
本発明の溶菌剤は、上記の４級アンモニウムカルボン酸塩型カチオン性界面活性剤のうちの（Ａ１）であっても、（Ａ２）であってもよいが、副生物が少なく、比較的高純度のものが得られるという観点から、好ましいのは（Ａ１）である。
【００２８】
本発明の溶菌剤は、上記の４級アンモニウムカルボン酸塩型カチオン性界面活性剤（Ａ１）および／または（Ａ２）のみを含むものでもよいが、本発明の効果を阻害しない範囲において、有機溶剤（Ｂ）、他の界面活性剤（Ｃ）および／または安定化剤（Ｄ）を含有していてもよい。
【００２９】
有機溶剤（Ｂ）としては、炭化水素系溶剤（キシレン、トルエンなど）、脂肪族アルコール系溶剤（メタノール、エタノールなど）、ケトン系溶剤（アセトン、メチルエチルケトンなど）およびカルボン酸エステル系溶剤（酢酸エチル、酢酸プロピル、ギ酸メチルなど）が挙げられる。
有機溶剤（Ｂ）の使用割合は、溶菌剤の重量に基づいて好ましくは１０重量％以下、さらに好ましくは５％以下（以下、特に限定しない限り％は重量％を表す）、特に好ましくは３％以下である。
【００３０】
他の界面活性剤（Ｃ）としては、下記の、非イオン性界面活性剤（Ｃ１）、（Ａ）以外のカチオン性界面活性剤（Ｃ２）、アニオン性界面活性剤（Ｃ３）、および両性界面活性剤（Ｃ４）から選ばれる１種以上が挙げられる。
【００３１】
非イオン性界面活性剤（Ｃ１）；
（Ｃ１１）高級アルコールアルキレンオキサイド（以下、ＡＯと略記）付加物：
炭素数８〜２４の高級アルコール（デシルアルコール、ドデシルアルコール、ヤシ油アルキルアルコール、オクタデシルアルコールおよびオレイルアルコールなど）のエチレンオキサイド（以下、ＥＯと略記）１〜２０モルおよび／またはプロピレンオキサイド（以下、ＰＯと略記）１〜２０モル付加物（ブロック付加物および／またはランダム付加物を含む。以下同様）［例えば、デシルアルコールのＥＯ８モル／ＰＯ７モルブロック付加物］が挙げられる。
（Ｃ１２）炭素数６〜２４のアルキルを有するアルキルフェノールのＡＯ付加物：
オクチルもしくはノニルフェノールのＥＯ１〜２０モルおよび／またはＰＯ１〜２０モル付加物（例えば、ＴＲＩＴＯＮ（登録商標）Ｘ−１００およびＴＲＩＴＯＮ（登録商標）Ｘ−１１４など）が挙げられる。
（Ｃ１３）ポリプロピレングリコールＥＯ付加物およびポリエチレングリコールＰＯ付加物：
プルロニック型界面活性剤などが挙げられる。
（Ｃ１３）脂肪酸ＡＯ付加物：
炭素数８〜２４の脂肪酸（デカン酸、ラウリン酸、ミリスチン酸、パルミチン酸、ステアリン酸、オレイン酸およびヤシ油脂肪酸など）のＥＯ１〜２０モルおよび／またはＰＯ１〜２０モル付加物などが挙げられる。
（Ｃ１４）多価アルコール型非イオン性界面活性剤：
炭素数３〜３６の２〜８価の多価アルコール（グリセリン、トリメチロールプロパン、ペンタエリスリトール、ソルビットおよびソルビタンなど）のＥＯおよび／またはＰＯ付加物；前記多価アルコールの脂肪酸エステルおよびそのＥＯ付加物（例えば、ＴＷＥＥＮ（登録商標）２０およびＴＷＥＥＮ（登録商標）８０など）；アルキルグルコシド（例えば、Ｎ−オクチル−β−Ｄ−マルトシド、ｎ−ドデカノイルスクロース、ｎ−オクチル−β−Ｄ−グルコピラノシドなど）；並びに、砂糖の脂肪酸エステル、脂肪酸アルカノールアミドおよびこれらのＡＯ付加物（ポリオキシエチレン脂肪酸アルカノールアミドなど）；が挙げられ、脂肪酸としては前記のものが挙げられる。
【００３２】
（Ａ）以外のカチオン性界面活性剤（Ｃ２）としては、対イオンとしてハロゲンアニオン、ヒドロキシアニオン、アルキル硫酸アニオンおよび超強酸アニオンから選ばれる１種以上の対イオンを有するカチオン性界面活性剤が挙げられる。
ハロゲンアニオンとしては、フッ化物イオン、塩化物イオン、臭化物イオン、ヨウ化物イオンなど、アルキル硫酸アニオンとしてはメチル硫酸イオン、エチル硫酸イオンなど、超強酸アニオンとしてはテトラフルオロホウ素酸イオン、トリフルオロメタンスルホン酸イオンなどが挙げられる。
なお、（Ｃ２）を構成するカチオン部分は、（Ａ）で挙げたものと同様のカチオン部分が挙げられる。
（Ｃ２）の具体例として、塩化ベンザルコニウムおよび臭化セチルトリメチルアンモニウムなどが挙げられる。
【００３３】
アニオン性界面活性剤（Ｃ３）としては、炭素数８〜２４の炭化水素基を有する、エーテルカルボン酸またはその塩、硫酸エステルもしくはエーテル硫酸エステルおよびそれらの塩、スルホン酸塩、スルホコハク酸塩、リン酸エステルもしくはエーテルリン酸エステルおよびそれらの塩、脂肪酸塩、アシル化アミノ酸塩、並びに天然由来のカルボン酸およびその塩（例えばケノデオキシコール酸、コール酸およびデオキシコール酸など）が挙げられる。
【００３４】
両性界面活性剤（Ｃ４）としては、ベタイン型両性界面活性剤およびアミノ酸型両性界面活性剤が挙げられる。
具体的には、アミドスルホベタイン、コールアミドプロピルジメチルアンモニオプロパンスルホン酸（ＣＨＡＰＳ）、コールアミドプロピルジメチルアンモニオ２−ヒドロキシプロパンスルホン酸（ＣＨＡＰＳＯ）、カルボキシベタイン、ラウロイルサルコシンおよびメチルベタインが挙げられる。
【００３５】
他の界面活性剤（Ｃ）の使用割合は、タンパク質の変性されにくさの観点から、溶菌剤の重量に基づいて好ましくは６０％以下、さらに好ましくは４０％以下、特に好ましくは２０％以下である。
また、（Ａ）の含有量に基づく（Ｃ）の含有量は、タンパク質の変性されにくさの観点から、好ましくは６０％以下、さらに好ましくは４０％以下である。
タンパク質の変性されにくさの観点から、（Ａ）の重量に基づく（Ｃ１）〜（Ｃ４）の含有量は以下の通りである。
（Ｃ１）は、好ましくは５０％以下、さらに好ましくは３０％以下、（Ｃ２）は、好ましくは２０％以下、さらに好ましくは１０％以下、（Ｃ３）は、好ましくは２０％以下、さらに好ましくは１０％以下、（Ｃ４）は、好ましくは２０％以下、さらに好ましくは１０％以下である。
【００３６】
安定化剤（Ｄ）としてはキレート剤、有機酸およびその塩、多価アルコールがあげられる。
キレート剤としては、エチレンジアミン四酢酸およびその塩、ポリリン酸およびその塩、メタリン酸およびその塩があげられる。
有機酸およびその塩としては、乳酸およびその塩、ヒアルロン酸およびその塩等があげられる。
多価アルコールとしては、グリセリン、ソルビトール、マンニトール、マルチトール、ペンタエリスリトール、キシリトール、ポリエチレングリコールおよびプロピレングリコールなどがあげられる。
【００３７】
本発明の溶菌剤における各成分の重量比（Ａ）／（Ｂ）／（Ｃ）／（Ｄ）は、タンパク質の変性のしにくさの観点から、好ましくは３０〜１００／０〜１０／０〜６０／０〜５０、さらに好ましくは５０〜１００／０〜５／０〜４０／０〜３０、特に好ましくは７０〜１００／０〜３／０〜２０／０〜２０である。
【００３８】
本発明の溶菌剤は、通常は液状である。
本発明の溶菌剤は、使用に当たっては、必要により水で稀釈して、水溶液状または水分散液状の溶菌剤水性稀釈液として用いることができる。
溶菌剤水性稀釈液における、水以外の成分の濃度は、対象となる菌体、有用物質の種類および抽出方法の種類によって適宜選択されるが、０．０１〜９９．９％、好ましくは０．１〜５０％である。
【００３９】
本発明の第３の実施態様は、上記の溶菌剤を使用して有用物質生産菌から有用物質を生産する方法である。
本発明の有用物質産生方法で得られる有用物質は、上記の溶菌方法で得られるため、従来よりも純度が高く、また溶菌力に優れているので高い収量を得ることができる。
本発明の有用物質の産生方法としては、例えば、以下のような順序の工程による産生方法が挙げられる。（有用物質が組み換えタンパク質の場合の１例）
（１）タンパク質の培養工程：大腸菌などのタンパク質生産体に組み換えタンパク質を培養させる。
（２）溶菌工程：溶菌剤の使用によってタンパク質生産体内のインクルージョンボディを取り出す。
（３）アンフォールディング工程；インクルージョンボディ懸濁液（例えば１０ｍｇタンパク質／ｍＬ）に０．５モル／Ｌ以上のアンフォールディング剤および２０ミリモル／Ｌ以下の還元剤を加え軽くかきまぜ室温で数時間放置する。
（４）リフォールディング工程：アンフォールディングされたタンパク質懸濁液に、０．２〜６モル／Ｌの濃度になるようにリフォールディング剤を加えて軽くかき混ぜ、室温で１晩放置する。またはリフォールディングバッファーで大希釈することによりリフォールディングを行う。
（５）分離・取り出し工程：懸濁液から目的とする正常なタンパク質をカラムクロマトグラフィーなどによって分離して取り出す。
【００４０】
上記の（１）のタンパク質の培養工程におけるタンパク質生産体としては、以下の細菌細胞、エシェリヒア属菌およびバチルス属菌などが挙げられる。
細菌細胞としては、連鎖球菌属（ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｉ）、ブドウ球菌属（ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｉ）、エシェリヒア属菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）、ストレプトミセス属菌（ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）およびバチルス属菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）細胞、真菌細胞：例えば酵母細胞およびアスペルギルス属（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）細胞、昆虫細胞：例えばドロソフィラＳ２（ＤｒｏｓｏｐｈｉｌａＳ２）、スポドプテラＳf９（ＳｐｏｄｏｐｔｅｒａＳｆ９）細胞、動物細胞：例えば、ＣＨＯ、ＣＯＳ、Ｈｅｌａ、Ｃ１２７、３Ｔ３、ＢＨＫ、２９３およびボウズ（Ｂｏｗｓ）メラノーマ細胞、ならびに植物細胞等が挙げられる。
エシェリヒア属菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）としては、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｋ１２ＤＨ１〔プロシージング・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンス（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．）６０巻、１６０頁（１９６８年）を参照〕、ＪＭ１０３〔ヌクレイック・アシッズ・リサーチ（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ）９巻、３０９頁（１９８１年）を参照〕、ＪＡ２２１〔ジャーナル・オブ・モレキュラー・バイオロジー（Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ）１２０巻、５１７頁（１９７８年）を参照〕、ＨＢ１０１〔ジャーナル・オブ・モレキュラー・バイオロジー（Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ）４１巻、４５９頁（１９６９年）を参照〕、Ｃ６００〔ジェネティックス（Ｇｅｎｅｔｉｃｓ）３９巻、４４０頁（１９５４年）を参照〕、ＭＭ２９４〔ネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ）２１７巻、１１１０頁（１９６８年）を参照〕などが挙げられる。
バチルス属菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）としては、枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓｓｕｂｔｉｌｉｓ）ＭＩ１１４〔ジーン、２４巻、２５５頁（１９８３年）を参照〕、２０７−２１〔ジャーナル・オブ・バイオケミストリー（Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）９５巻、８７頁（１９８４年）を参照〕などが挙げられる。
【００４１】
組み換えタンパク質の生産方法としては、具体的に次の方法がある。
（ｉ）目的タンパク産生細胞からメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）を分離し、該ｍＲＮＡから単鎖のｃＤＮＡを、次に二重鎖ＤＮＡを合成し、該相補ＤＮＡをファージまたはプラスミドに組み込む。
（ｉｉ）得られた組み換えファージまたはプラスミドで宿主を形質転換し、培養後、目的タンパクの一部をコードするＤＮＡプローブとのハイブリダイゼーション、あるいは抗体を用いたイムノアッセイ法により目的とするＤＮＡを含有するファージあるいはプラスミドを単離する。
（ｉｉｉ）その組み換えＤＮＡから目的とするクローン化ＤＮＡを切りだし、該クローン化ＤＮＡまたはその一部を発現ベクター中のプロモーターの下流に連結することによって製造することができる。
その後、適当な方法により、宿主を発現ベクターで形質転換し培養する。培養は通常１５〜４３℃で３〜２４時間行い、必要により通気、攪拌を加えることもできる。
【００４２】
アンフォールディング工程およびリフォールディング工程におけるタンパク質のリフォールディング方法としては、本発明の溶菌剤を用いたあとに、アンフォールディング剤でタンパクの３次元構造を崩し（アンフォールディング）、その後、希釈法、透析法、界面活性剤利用法、人工シャペロン利用法および特願２００５−２３５９８０記載の方法いずれの方法でもリフォールディングすることができる。特に特願２００５−２３５９８０記載の方法は生産性・汎用性の観点から好ましい。
【００４３】
アンフォールディング工程において使用されるアンフォールディング剤としては、塩酸グアニジン、尿素およびこれらの併用などが挙げられる。
なお、タンパク質が、分子内にＳ−Ｓ結合を含むタンパク質である場合には、還元剤として塩酸グアニジンおよび／または尿素以外に、さらに２−メルカプトエタノール、ジチオスレイトール、シスチンまたはチオフェノールなどを加えてもよい。
【００４４】
タンパク質の分離・取り出し工程におけるカラムクロマトグラフィーに使用される充填剤としてはシリカ、デキストラン、アガロース、セルロース、アクリルアミド、ビニルポリマーなどが挙げられ、市販品ではＳｅｐｈａｄｅｘシリーズ、Ｓｅｐｈａｃｒｙｌシリーズ、Ｓｅｐｈａｒｏｓｅシリーズ（以上、Ｐｈａｒｍａｃｉａ社）、Ｂｉｏ−Ｇｅｌシリーズ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ社）等があり入手可能である。
【００４５】
本発明の有用物質の生産方法における有用物質としては、タンパク質、アミノ酸、核酸、抗生物質、糖類またはビタミン類が挙げられる。
【００４６】
タンパク質としては、酵素と組み換えタンパク質が挙げられる。酵素としては、加水分解酵素、異性化酵素、酸化還元酵素、転移酵素、合成酵素および脱離酵素などが挙げられる。
加水分解酵素としては、プロテアーゼ、セリンプロテアーゼ、アミラーゼ、リパーゼ、セルラーゼ、グルコアミラーゼなどが挙げられる。
異性化酵素としては、グルコースイソメラーゼが挙げられる。
酸化還元酵素としては、ペルオキシダーゼなどが挙げられる。
転移酵素としては、アシルトランスフェラーゼ、スルホトランスフェラーゼなどが挙げられる。
合成酵素としては、脂肪酸シンターゼ、リン酸シンターゼ、クエン酸シンターゼなどが挙げられる。
脱離酵素としては、ペクチンリアーゼなどが挙げられる。
【００４７】
組み換えタンパク質としては、タンパク製剤、ワクチン等が挙げられる。
タンパク製剤としては、インターフェロンα、インターフェロンβ、インターロイキン１〜１２、成長ホルモン、エリスロポエチン、インスリン、顆粒状コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）、組織プラスミノーゲン活性化因子（ＴＰＡ）、ナトリウム利尿ペプチド、血液凝固第■因子、ソマトメジン、グルカゴン、成長ホルモン放出因子、血清アルブミン、カ
ルシトニン等が挙げられる。
ワクチンとしては、Ａ型肝炎ワクチン、Ｂ型肝炎ワクチン、Ｃ型肝炎ワクチン等が挙げられる。
【００４８】
アミノ酸としては、例えばグルタミン酸、トリプトファン、アラニン、およびジペプチドなどが挙げられる。
【００４９】
核酸としてはデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）、リボ核酸（ＲＮＡ）が挙げられる。
【００５０】
抗生物質としてはストレプトマイシンおよびバンコマイシンなどが挙げられる。
【００５１】
糖類としては、ヒアルロン酸、アルブミン、セラミド、エリスリトール、トレハロース、リポ多糖およびシクロデキストリンなどが挙げられる。
【００５２】
ビタミン類としては、ビタミンＡ類およびそれらの誘導体並びにその塩、ビタミンＢ６、ビタミンＢ１２等のビタミンＢ類およびそれらの誘導体並びにその塩、ビタミンＣ類およびそれらの誘導体並びにその塩が挙げられる。
これらのうち本発明の溶菌剤は、タンパク質およびアミノ酸、特にタンパク質の生産に適している。
【００５３】
本発明の他の実施態様は、上記の有用物質産生方法で得られたタンパク質、アミノ酸、核酸、抗生物質、糖類またはビタミン類であり、例えば上記のものが挙げられる。
これらのうち好ましいのはタンパク質およびアミノ酸、特にタンパク質である。
【００５４】
［実施例］
【００５５】
以下の実施例により本発明を更に説明するが、本発明はこれに限定されるものではない。
製造例１：
ジデシルジメチルアンモニウムのシクロペンタンテトラカルボン酸塩の製造；
５０ｍｌ三角フラスコに、ジデシルジメチルアンモニウムのメチル炭酸塩１６．０４ｇ（カチオン基として０．０４当量）を入れ、撹拌しながら、シクロペンタンテトラカルボン酸２．４６ｇ（カルボキシル基として０．０４当量）を少量ずつ加えた。撹拌機付き恒温槽で８０℃に加温しながら８時間撹拌し続けると、二酸化炭素およびメタノールが系外に放出され、ジデシルジメチルアンモニウムのシクロペンタンテトラカルボン酸塩１５．４９ｇ（収率９９．９％）を得た。
【００５６】
製造例２：
ジデシルジメチルアンモニウムのピロメリット酸塩の製造；
５０ｍｌ三角フラスコに、ジデシルジメチルアンモニウムの塩化物１４．４８ｇ（カチオン基として０．０４当量）を入れ、撹拌しながら、ピロメリット酸ナトリウム塩３．４２ｇ（カルボキシル基として０．０４当量）を少量ずつ加えた。撹拌機付き恒温槽で４０℃に加温しながら１時間攪拌し続け、３０℃まで放冷し、１００ｇのジエチルエーテルで抽出し脱塩（脱塩化ナトリウム）した。その後、ジエチルエーテルを蒸発することでジデシルジメチルアンモニウムのピロメリット酸塩１５．５４ｇ（収率９９．９％）を得た。
【００５７】
製造例３：
ジデシルジメチルアンモニウムのクエン酸塩の製造；
５０ｍｌ三角フラスコに、ジデシルジメチルアンモニウムの水酸化物塩１０．２９ｇ（カチオン基として０．０３当量）を入れ、撹拌しながら、クエン酸ナトリウム塩２．６０ｇ（カルボキシル基として０．０３当量）を少量ずつ加えた。撹拌機付き恒温槽で４０℃に加温しながら１時間攪拌し続け、３０℃まで放冷し、１００ｇのジエチルエーテルで抽出し脱アルカリ（脱水酸化ナトリウム）した。その後、ジエチルエーテルを蒸発することでジデシルジメチルアンモニウムのクエン酸塩１１．６９ｇ（収率９９．９％）を得た。
【００５８】
比較の溶菌剤として、ラウリルアミンＥＯ２モル付加物のキシレン溶液（キシレンが７０％）、テトラデシルおよびペンタデシルアルコール混合物（重量比６／４）ＥＯ２モル付加物、および塩化ジデシルジメチルアンモニウムを使用した。
【００５９】
以上の溶菌剤について、溶菌力、タンパク質の変性のされにくさ、および糖類の生産性を評価した。
評価方法は以下の通りである。
【００６０】
＜溶菌力＞
２ｍｌのスクリュー管に、菌体溶液０．５ｍｌ、および界面活性剤として５０％濃度になるように稀釈した溶菌剤水性稀釈液を５０μｌマイクロピペットで加え、手振り混合した。２０℃で３日間静置保存したものを試料として、超深度形状測定顕微鏡（KEYENCE社製、VK−８５００）で菌体数を測定した。溶菌力を以下の式で算出した。
なお、ブランクには溶菌剤水性稀釈液の代わりにイオン交換水５０μｌを用いた。
溶菌力（％）＝（１−試料中の菌体数／ブランクの菌体数）×１００
【００６１】
判定基準：
溶菌力≧８０％・・・・・・・５点
６０％≦溶菌力＜８０％・・・４点
４０％≦溶菌力＜６０％・・・３点
２０％≦溶菌力＜４０％・・・２点
溶菌力＜２０％・・・・・・・１点
【００６２】
＜タンパク質（酵素）の変性されにくさ＞
２ｍｌの遠心分離用チューブに、１％セチルメチルセルロース水分散液０．６ｍｌ、界面活性剤として０．２％濃度になるように稀釈した溶菌剤水性稀釈液０．６ｍｌ、さらに、セルラーゼ（ナガセ社製、セルライザーHT）の１００ｐｐｍ水溶液を１０μｌ加え、手振り混合した。３７℃で５分間静置後、遠心分離機（ベックマン社製Ｍｉｃｒｏｆｕｇｅ．１１）で遠心分離（１０，０００ｒｐｍ×３分）し、上層を分離して回収した。２０ｍｌ試験管に、上層０．２５ｍｌ、イオン交換水０．２５ｍｌおよび５％フェノール水溶液０．５ｍｌを入れて、混合した。
さらに濃硫酸を２．５ｍｌ加え、室温で１０分間静置後、混合し、その後２０分間２０℃で静置して試料溶液を得た。試料溶液の４９０ｎｍにおける吸光度（セチルメチルセルロースが酵素で分解された生成物の吸収）を紫外可視分光光度計（島津製作所社製ＵＶ−２５５０）で測定した。ブランクには溶菌剤水希釈液の代わりにイオン交換水０．６ｍｌを用いた。 溶菌の工程においてセルラーゼ（酵素）が変性されずに、活性が保たれて、セチルメチルセルロースが効率よく分解されている場合は、吸光度が大きくなる（ブランクに近い吸光度になる）。
タンパク質の変性されにくさは、以下の式で算出した。
タンパク質の変性されにくさ（％）＝（試料溶液の吸光度／ブランクの吸光度）×１００
【００６３】
判定基準
タンパク質の変性されにくさ≧９０％・・・・・・・５点
７０％≦タンパク質の変性されにくさ＜９０％・・・４点
５０％≦タンパク質の変性されにくさ＜７０％・・・３点
３０％≦タンパク質の変性されにくさ＜５０％・・・２点
タンパク質の変性されにくさ＜３０％・・・・・・・１点
【００６４】
＜糖類（ヒアルロン酸）の生産性＞
グルコース５％、リン酸第１カリウム０．２％、ポリペプトン１．０％、酵母エキス０．５％からなる培地１リットルを加熱殺菌後、ストレプトコッカス・ミュータンスを接種し、
３７℃で撹拌下２日間培養した。培養後の培地に、各溶菌剤を最終濃度０．４重量％となるように加え１時間攪拌し、遠心分離により菌体の破片をを除去した後、その上澄みを２回エタノール沈殿し、この沈殿を４０℃で真空乾燥し精製ヒアルロン酸を得た。
糖類の生産性は、ヒアルロン酸の収量で評価した。
【００６５】
判定基準
ヒアルロン酸の収量≧５（ｇ／Ｌ）・・・・・・・・・５点
３（ｇ／Ｌ）≦ヒアルロン酸の収量≧５（ｇ／Ｌ）・・３点
ヒアルロン酸の収量＜３（ｇ／Ｌ）・・・・・・・・・１点
【００６６】
【表１】
【産業上の利用可能性】
【００６７】
本発明の溶菌剤は、タンパク質などの有用物質を生産菌から抽出する工程において使用できる。有用物質としては、タンパク質、アミノ酸、核酸、抗生物質、糖類またはビタミン類が挙げられる。また、本発明の溶菌剤は、遺伝子を細胞に導入するためのベクターとしての利用ができ、さらには、本発明の溶菌剤と酵素等を併用して細胞破壊剤として利用することもできる。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、有用物質生産菌からタンパク質などの有用物質を抽出する際に使用される溶菌剤および有用物質の生産方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
微生物は、アミノ酸、タンパク質などの有用物質を生産するための宿主として広く利用されている。特に近年は、遺伝子工学技術を活用して、産業上有用なタンパク質の遺伝子を導入した形質転換された微生物を使用し、有用物質を効率的に製造する技術が知られるようになっている。
有用物質を生産する好ましい微生物の例として、大腸菌やシュードモナス属菌などのグラム陰性菌、バチルス属菌や乳酸菌などのグラム陽性菌、サッカロマイセス属やキャンディダ属などの酵母、アスペルギウス属やペニシリウム属などの糸状菌、ストレプトマイセス属やロドコッカス属などの放線菌を挙げることができる。
タンパク質などの有用物質の精製における第１の段階は、これらの有用物質を生産する細胞を溶解して、細胞成分を遊離させる段階である。
細胞の溶解方法には、物理的方法と化学的方法がある。このうち化学的細胞溶解法としては、界面活性剤を用いて細胞膜または細胞壁の完全性を破壊する方法がある。
提案されている非イオン性界面活性剤としては、糖鎖を有する非イオン性界面活性剤（例えば、特許文献−１）、アルキルアミンエチレンオキサイド付加物（例えば、特許文献−２）およびソルビタン脂肪酸エステルエチレンオキサイド付加物（例えば、特許文献−３）などがある。イオン性界面活性剤としては、第４級アンモニウム塩（例えば特許文献−４）などのカチオン性界面活性剤の他にアニオン性界面活性剤および両性界面活性剤も提案されている（例えば特許文献−５、６）。
【特許文献−１】特開２００４−５０４３３０号公報
【特許文献−２】特開２００２−１１９２８８号公報
【特許文献−３】特開平６−１５３９４７号公報
【特許文献−４】特開２００２−３３５９６９号公報
【特許文献−５】特開２００２−１９９８８５号公報
【特許文献−６】特開平５−６４５８４号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
しかしながら、従来の非イオン性界面活性剤を用いる方法では溶菌力が不十分であるため大量合成には適さず、また、従来のイオン性界面活性剤を用いた方法では抽出されたタンパク質などの有用物質が変性してしまって、３次元コンホメーションを崩してしまうという課題があった。
【課題を解決するための手段】
【０００４】
本発明者らは上記の課題を解決するため鋭意検討した結果、本発明に至った。
すなわち、本発明は一般式（１）で表される４級アンモニウムアルキル炭酸塩をカルボン酸で塩交換して得られる４級アンモニウムカルボン酸塩型カチオン性界面活性剤（Ａ１）；一般式（２）で表される４級アンモニウムハロゲン化物または水酸化物をカルボン酸の強塩基性塩で塩交換して得られる４級アンモニウムカルボン酸塩型カチオン性界面活性剤（Ａ２）を含有する溶菌剤；該溶菌剤を使用して有用物質生産菌から有用物質を生産する方法、および該生産方法によって生産されたタンパク質、アミノ酸、核酸、抗生物質、糖類またはビタミン類である。
【０００５】
【化３】
【０００６】
式中、Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3およびＲ4は、それぞれ炭素数１〜２２の直鎖または分岐の炭化水素基であって、Ｒ1〜Ｒ4のうちの少なくとも１個は炭素数６〜２２の炭化水素基であり、Ｒ1〜Ｒ4はそれぞれ同一でも異なっていてもよく、Ｒ5は炭素数１〜６のアルキル基である。
【０００７】
【化４】
【０００８】
式中、Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3およびＲ4は、それぞれ炭素数１〜２２の直鎖または分岐の炭化水素基であって、Ｒ1〜Ｒ4のうちの少なくとも１個は炭素数６〜２２の炭化水素基であり、Ｒ1〜Ｒ4はそれぞれ同一でも異なっていてもよく、Ｘはハロゲン原子または水酸基である。
【発明の効果】
【０００９】
本発明の溶菌剤は、特に大腸菌等の有用物質生産菌から有用物質を抽出するための溶菌剤として、従来よりも改善された溶菌力を有しており、また、従来よりも有用物質を変性することが少ない。
従って、高品質の有用物質、例えば、変性の程度が少なくて活性の高い酵素などを得ることができる。また、糖類などの生産性も良好である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１０】
本発明における第１の実施態様は、一般式（１）で表される４級アンモニウムアルキル炭酸塩をカルボン酸で塩交換して得られる４級アンモニウムカルボン酸塩型カチオン性界面活性剤（Ａ１）を含有することを特徴とする溶菌剤である。
【００１１】
【化５】
【００１２】
式中、Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3およびＲ4は、それぞれ炭素数１〜２２の直鎖または分岐の炭化水素基であって、Ｒ1〜Ｒ4のうちの少なくとも１個は炭素数６〜２２の炭化水素基であり、Ｒ1〜Ｒ4はそれぞれ同一でも異なっていてもよく、Ｒ5は炭素数１〜６のアルキル基である。
【００１３】
Ｒ1〜Ｒ4で示される炭化水素基には、脂肪族炭化水素基および芳香族炭化水素基が挙げられる。
脂肪族炭化水素基としては、直鎖又は分岐のアルキル基（メチル基、エチル基、プロピル基、ｎ−ブチル基、ペンチル基、ｎ−ヘキシル基、ヘプチル基、ｎ−オクチル基、ノニル基、デシル基、ウンデシル基、ドデシル基、ｉ−、ｓｅｃ−、およびｔ−ブチル基、２−メチルブチル基、２，２−ジメチルプロピル基、３−メチルブチル基、２−エチルヘキシル基など）およびアルケニル基（ビニル基、アリル基、メタリル基、など）が挙げられる。
芳香族炭化水素基としては、フェニル基、アリールアルキル基（ベンジル基、フェニルエチル基、フェニルプロピル基、フェニルブチル基など）およびアルキルアリール基（メチルフェニル基、エチルフェニル基、オクチルフェニル基、ノニルフェニル基、デシルフェニル基、ドデシルフェニル基など）が挙げられる。
【００１４】
Ｒ1〜Ｒ4の炭化水素基の好ましい組み合わせとしては、以下の（ａ）〜（ｄ）が挙げられる。
（ａ）１個のみが炭素数６〜２２の脂肪族炭化水素基で他は炭素数１〜４のアルキル基である組み合わせ；
ドデシルトリメチルアンモニウム、テトラデシルトリメチルアンモニウム、ヘキサデシルトリメチルアンモニウム、オクタデシルトリメチルアンモニウム、ドデシルジメチルエチルアンモニウム、テトラデシルジメチルエチルアンモニウム、ヘキサデシルジメチルエチルアンモニウム、オクタデシルジメチルエチルアンモニウム、ドデシルメチルジエチルアンモニウム、テトラデシルメチルジエチルアンモニウム、ヘキサデシルメチルジエチルアンモニウムおよびオクタデシルメチルジエチルアンモニウムなど。
（ｂ）２個のみが炭素数６〜２２の脂肪族炭化水素基で他は炭素数１〜４のアルキル基である組み合わせ；
オクチルデシルジメチルアンモニウム、ジオクチルジメチルアンモニウム、ジデシルジメチルアンモニウム、デシルドデシルジメチルアンモニウム、ジドデシルジメチルアンモニウム、オクチルデシルメチルエチルアンモニウム、ジオクチルメチルエチルアンモニウム、ジデシルメチルエチルアンモニウム、ジドデシルメチルエチルアンモニウム、ジデシルメチルプロピルアンモニウム、ジドデシルエチルプロピルアンモニウムおよびジステアリルジメチルアンモニウムなど
（ｃ）１個のみが炭素数６〜２２の芳香族炭化水素基で他は炭素数１〜４のアルキル基である組み合わせ；
ベンジルトリメチルアンモニウム、ベンジルトリエチルアンモニウム、ベンジルトリプロピルアンモニウムおよびベンジルエチルジメチルアンモニウムなど。
（ｄ）１個のみが炭素数６〜２２の脂肪族炭化水素基、１個のみが炭素数６〜２２の芳香族炭化水素基で他は炭素数１〜４のアルキル基である組み合わせ；
デシルジメチルベンジルアンモニウム、ドデシルジメチルベンジルアンモニウム、テトラデシルジメチルベンジルアンモニウム、ヘキサデシルジメチルベンジルアンモニウムおよびヤシ油アルキルジメチルベンジルアンモニウムなど。
これらのうち、溶菌力の観点から、好ましいのは（ｂ）、さらに好ましいのはＲ1〜Ｒ4のうちの２個が炭素数８〜１４のアルキル基であるものである。
【００１５】
一般式（１）におけるＲ5ＣＯ3-は炭素数１〜６のアルキル基を有するアルキル炭酸イオンである。アルキル炭酸イオンとしては、メチル炭酸イオン、エチル炭酸イオン、プロピル炭酸イオン、ブチル炭酸イオンなどが挙げられ、好ましくはメチル炭酸イオンおよびエチル炭酸イオン、さらに好ましくはメチル炭酸イオンである。
【００１６】
一般式（１）で示される４級アンモニウムアルキル炭酸塩としては、例えばオクチルデシルジメチルアンモニウム・メチル炭酸塩、ジオクチルジメチルアンモニウム・メチル炭酸塩、ジデシルジメチルアンモニウム・メチル炭酸塩、デシルドデシルジメチルアンモニウム・メチル炭酸塩、ジドデシルジメチルアンモニウム・メチル炭酸塩、オクチルデシルメチルエチルアンモニウム・メチル炭酸塩、ジオクチルメチルエチルアンモニウム・メチル炭酸塩、ジデシルメチルエチルアンモニウム・メチル炭酸塩、ジドデシルメチルエチルアンモニウム・メチル炭酸塩、ジデシルメチルプロピルアンモニウム・メチル炭酸塩、ジドデシルエチルプロピルアンモニウム・メチル炭酸塩およびジステアリルジメチルアンモニウム・メチル炭酸塩が挙げられる。
【００１７】
一般式（１）で示される４級アンモニウムアルキル炭酸塩の製法は、第３級アミン（アルキル基の炭素数９〜４８）と同当量以上（好ましくは１．１〜５．０当量）の炭酸ジアルキルエステル（アルキル基の炭素数１〜６）を溶媒（例えば、メタノール）の存在下（第３級アミンの重量に基づいて１０〜１，０００％）または非存在下、反応温度８０〜２００℃、好ましくは１００〜１５０℃で反応させて得ることができる。
【００１８】
本発明における４級アンモニウムカルボン酸塩型カチオン性界面活性剤（Ａ１）は、一般式（１）で示される４級アンモニウムアルキル炭酸塩をカルボン酸（ａ0）で塩交換して得られる界面活性剤である。
【００１９】
カルボン酸（ａ0）としては、以下の１価カルボン酸（ａ0１）および多価カルボン酸（ａ0２）があげられる。
（ａ0１）１価カルボン酸；
脂肪族飽和モノカルボン酸（酢酸、プロピオン酸、酪酸、イソ酪酸、吉草酸、カプロン酸、エナント酸、カプリル酸、ベラルゴン酸、ラウリル酸、ミリスチン酸、ステアリン酸、ベヘン酸、２−エチルヘキサン酸など）；脂肪族不飽和モノカルボン酸（オレイン酸など）
；並びに、脂肪族オキシモノカルボン酸（グリコール酸、乳酸、酒石酸、グルコン酸など）が挙げられる。
（ａ0２）多価カルボン酸；
脂肪族飽和ジカルボン酸（シュウ酸、マロン酸、コハク酸、グルタル酸、アジピン酸、ピメリン酸、スベリン酸、アゼライン酸、セバシン酸など）；脂肪族不飽和ジカルボン酸（マレイン酸、フマール酸、イタコン酸など）；芳香族ジカルボン酸（フタル酸、イソフタル酸、テレフタル酸など）；トリカルボン酸（トリメリット酸、クエン酸など）；テトラカルボン酸（ピロメリット酸、ブタンテトラカルボン酸、シクロペンタンテトラカルボン酸、エチレンジアミン四酢酸など）；並びに、ペンタカルボン酸（ジエチレントリアミン五酢酸など）が挙げられる。
これらのうち好ましいのは、タンパク質などの変性されにくさの観点から（ａ0２）であり、さらに好ましいのは２もしくは３〜８価の多価カルボン酸、特に好ましいのはトリカルボン酸およびテトラカルボン酸、最も好ましいのはテトラカルボン酸である。
【００２０】
塩交換の方法としては、４級アンモニウムアルキル炭酸塩に当量のカルボン酸を加えて、６０〜１００℃で２〜２０時間撹拌することにより、二酸化炭素とアルコールが副生し、二酸化炭素は系外に放出され、アルコールも、その沸点低い場合は系外に留出され、目的の４級アンモニウムカルボン酸塩型カチオン性界面活性剤（Ａ１）を得ることができる。
例えば、ジデシルジメチルアンモニウムのメチル炭酸塩に当量のシクロペンタンテトラカルボン酸を加え、撹拌機付き恒温槽で８０℃に加温しながら８時間撹拌し続けると、二酸化炭素およびメタノールが系外に放出され、ジデシルジメチルアンモニウムのシクロペンタンテトラカルボン酸塩を得ることができる。
【００２１】
本発明における第２の実施態様は、一般式（２）で表される４級アンモニウムハロゲン化物または４級アンモニウム水酸化物をカルボン酸の強塩基性塩で塩交換して得られる４級アンモニウムカルボン酸塩型カチオン性界面活性剤（Ａ２）を含有することを特徴とする溶菌剤である。
【００２２】
【化６】
【００２３】
式中、Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3およびＲ4は、それぞれ炭素数１〜２２の直鎖または分岐の炭化水素基であって、Ｒ1〜Ｒ4のうちの少なくとも１個は炭素数６〜２２の炭化水素基であり、Ｒ1〜Ｒ4はそれぞれ同一でも異なっていてもよく、Ｘはハロゲン原子または水酸基である。
Ｒ1〜Ｒ4で示される炭化水素基としては、一般式（１）で挙げた基と同様の基が挙げられ、好ましい組み合わせ、および好ましいものも上記と同様である。
Ｘで示されるハロゲン原子としては、フッ素、塩素、臭素、ヨウ素が挙げられ、好ましくは塩素である。
Ｘとしては、塩交換のし易さの観点から、水酸基よりもハロゲン原子が好ましい。
【００２４】
４級アンモニウムハロゲン化物の具体例としては、オクチルデシルジメチルアンモニウム・塩化物、ジオクチルジメチルアンモニウム・塩化物、ジデシルジメチルアンモニウム・塩化物、デシルドデシルジメチルアンモニウム・塩化物、ジドデシルジメチルアンモニウム・塩化物、オクチルデシルメチルエチルアンモニウム・塩化物、ジオクチルメチルエチルアンモニウム・塩化物、ジデシルメチルエチルアンモニウム・塩化物、ジドデシルメチルエチルアンモニウム・塩化物、ジデシルメチルプロピルアンモニウム・塩化物、ジドデシルエチルプロピルアンモニウム・塩化物およびジステアリルジメチルアンモニウム・塩化物が挙げられる。
４級アンモニウム水酸化物の具体例としては、オクチルデシルジメチルアンモニウム・水酸化物、ジオクチルジメチルアンモニウム・水酸化物、ジデシルジメチルアンモニウム・水酸化物、デシルドデシルジメチルアンモニウム・水酸化物、ジドデシルジメチルアンモニウム・水酸化物、オクチルデシルメチルエチルアンモニウム・水酸化物、ジオクチルメチルエチルアンモニウム・水酸化物、ジデシルメチルエチルアンモニウム・水酸化物、ジドデシルメチルエチルアンモニウム・水酸化物、ジデシルメチルプロピルアンモニウム・水酸化物、ジドデシルエチルプロピルアンモニウム・水酸化物およびジステアリルジメチルアンモニウム・水酸化物が挙げられる。
【００２５】
塩交換に使用されるカルボン酸の強塩基性塩を構成するカルボン酸としては、上記に示したと同様のカルボン酸が挙げられ、好ましいものも同様である。
また、使用できるカルボン酸の強塩基性塩としては、カルボン酸を強塩基性化合物（例えば、水酸化ナトリウムおよび水酸化カリウムなどのアルカリ金属水酸化物、並びにテトラメチルアンモニウム水酸化物およびテトラエチルアンモニウム水酸化物などの４級アンモニウム水酸化物など）で中和した塩が挙げられる。
カルボン酸の強塩基性塩の具体例としては、酢酸ナトリウム、シュウ酸ナトリウム、シクロペンタンテトラカルボン酸ナトリウムおよびテトラメチルアンモニウム酢酸塩などが挙げられる。
【００２６】
４級アンモニウムカルボン酸塩型カチオン性界面活性剤（Ａ２）の製造における塩交換の方法としては、４級アンモニウムハロゲン化物または水酸化物に当量のカルボン酸の強塩基性塩を加えて、３０〜６０℃で０．３〜３時間撹拌し、副生する塩（ハロゲンアルカリまたはアルカリ金属水酸化物など）を除去して精製する方法が挙げられる。
精製の方法としては、目的物の溶剤抽出などが挙げられる。溶剤抽出に使用できる溶剤としては、非水溶性の溶剤、例えば炭素数６〜１２の脂肪族炭化水素系溶剤（ｎ−ヘキサン、シクロヘキサン、オクタンなど）、芳香族炭化水素系溶剤（トルエン、ベンゼンなど）およびエーテル系溶剤（ジエチルエーテルなど）が挙げられる。
塩交換の具体例としては、例えばジデシルジメチルアンモニウム・シクロペンタンテトラカルボン酸塩水溶液の例を挙げると、ジデシルジメチルアンモニウム・塩化物の水溶液に、当量のシクロペンタンテトラカルボン酸ナトリウム水溶液を加え、４０℃で１時間加熱攪拌し、３０℃まで放冷し、ジエチルエーテルで抽出し、脱塩（脱塩化ナトリウム）する方法を挙げることができる。
【００２７】
本発明の溶菌剤は、上記の４級アンモニウムカルボン酸塩型カチオン性界面活性剤のうちの（Ａ１）であっても、（Ａ２）であってもよいが、副生物が少なく、比較的高純度のものが得られるという観点から、好ましいのは（Ａ１）である。
【００２８】
本発明の溶菌剤は、上記の４級アンモニウムカルボン酸塩型カチオン性界面活性剤（Ａ１）および／または（Ａ２）のみを含むものでもよいが、本発明の効果を阻害しない範囲において、有機溶剤（Ｂ）、他の界面活性剤（Ｃ）および／または安定化剤（Ｄ）を含有していてもよい。
【００２９】
有機溶剤（Ｂ）としては、炭化水素系溶剤（キシレン、トルエンなど）、脂肪族アルコール系溶剤（メタノール、エタノールなど）、ケトン系溶剤（アセトン、メチルエチルケトンなど）およびカルボン酸エステル系溶剤（酢酸エチル、酢酸プロピル、ギ酸メチルなど）が挙げられる。
有機溶剤（Ｂ）の使用割合は、溶菌剤の重量に基づいて好ましくは１０重量％以下、さらに好ましくは５％以下（以下、特に限定しない限り％は重量％を表す）、特に好ましくは３％以下である。
【００３０】
他の界面活性剤（Ｃ）としては、下記の、非イオン性界面活性剤（Ｃ１）、（Ａ）以外のカチオン性界面活性剤（Ｃ２）、アニオン性界面活性剤（Ｃ３）、および両性界面活性剤（Ｃ４）から選ばれる１種以上が挙げられる。
【００３１】
非イオン性界面活性剤（Ｃ１）；
（Ｃ１１）高級アルコールアルキレンオキサイド（以下、ＡＯと略記）付加物：
炭素数８〜２４の高級アルコール（デシルアルコール、ドデシルアルコール、ヤシ油アルキルアルコール、オクタデシルアルコールおよびオレイルアルコールなど）のエチレンオキサイド（以下、ＥＯと略記）１〜２０モルおよび／またはプロピレンオキサイド（以下、ＰＯと略記）１〜２０モル付加物（ブロック付加物および／またはランダム付加物を含む。以下同様）［例えば、デシルアルコールのＥＯ８モル／ＰＯ７モルブロック付加物］が挙げられる。
（Ｃ１２）炭素数６〜２４のアルキルを有するアルキルフェノールのＡＯ付加物：
オクチルもしくはノニルフェノールのＥＯ１〜２０モルおよび／またはＰＯ１〜２０モル付加物（例えば、ＴＲＩＴＯＮ（登録商標）Ｘ−１００およびＴＲＩＴＯＮ（登録商標）Ｘ−１１４など）が挙げられる。
（Ｃ１３）ポリプロピレングリコールＥＯ付加物およびポリエチレングリコールＰＯ付加物：
プルロニック型界面活性剤などが挙げられる。
（Ｃ１３）脂肪酸ＡＯ付加物：
炭素数８〜２４の脂肪酸（デカン酸、ラウリン酸、ミリスチン酸、パルミチン酸、ステアリン酸、オレイン酸およびヤシ油脂肪酸など）のＥＯ１〜２０モルおよび／またはＰＯ１〜２０モル付加物などが挙げられる。
（Ｃ１４）多価アルコール型非イオン性界面活性剤：
炭素数３〜３６の２〜８価の多価アルコール（グリセリン、トリメチロールプロパン、ペンタエリスリトール、ソルビットおよびソルビタンなど）のＥＯおよび／またはＰＯ付加物；前記多価アルコールの脂肪酸エステルおよびそのＥＯ付加物（例えば、ＴＷＥＥＮ（登録商標）２０およびＴＷＥＥＮ（登録商標）８０など）；アルキルグルコシド（例えば、Ｎ−オクチル−β−Ｄ−マルトシド、ｎ−ドデカノイルスクロース、ｎ−オクチル−β−Ｄ−グルコピラノシドなど）；並びに、砂糖の脂肪酸エステル、脂肪酸アルカノールアミドおよびこれらのＡＯ付加物（ポリオキシエチレン脂肪酸アルカノールアミドなど）；が挙げられ、脂肪酸としては前記のものが挙げられる。
【００３２】
（Ａ）以外のカチオン性界面活性剤（Ｃ２）としては、対イオンとしてハロゲンアニオン、ヒドロキシアニオン、アルキル硫酸アニオンおよび超強酸アニオンから選ばれる１種以上の対イオンを有するカチオン性界面活性剤が挙げられる。
ハロゲンアニオンとしては、フッ化物イオン、塩化物イオン、臭化物イオン、ヨウ化物イオンなど、アルキル硫酸アニオンとしてはメチル硫酸イオン、エチル硫酸イオンなど、超強酸アニオンとしてはテトラフルオロホウ素酸イオン、トリフルオロメタンスルホン酸イオンなどが挙げられる。
なお、（Ｃ２）を構成するカチオン部分は、（Ａ）で挙げたものと同様のカチオン部分が挙げられる。
（Ｃ２）の具体例として、塩化ベンザルコニウムおよび臭化セチルトリメチルアンモニウムなどが挙げられる。
【００３３】
アニオン性界面活性剤（Ｃ３）としては、炭素数８〜２４の炭化水素基を有する、エーテルカルボン酸またはその塩、硫酸エステルもしくはエーテル硫酸エステルおよびそれらの塩、スルホン酸塩、スルホコハク酸塩、リン酸エステルもしくはエーテルリン酸エステルおよびそれらの塩、脂肪酸塩、アシル化アミノ酸塩、並びに天然由来のカルボン酸およびその塩（例えばケノデオキシコール酸、コール酸およびデオキシコール酸など）が挙げられる。
【００３４】
両性界面活性剤（Ｃ４）としては、ベタイン型両性界面活性剤およびアミノ酸型両性界面活性剤が挙げられる。
具体的には、アミドスルホベタイン、コールアミドプロピルジメチルアンモニオプロパンスルホン酸（ＣＨＡＰＳ）、コールアミドプロピルジメチルアンモニオ２−ヒドロキシプロパンスルホン酸（ＣＨＡＰＳＯ）、カルボキシベタイン、ラウロイルサルコシンおよびメチルベタインが挙げられる。
【００３５】
他の界面活性剤（Ｃ）の使用割合は、タンパク質の変性されにくさの観点から、溶菌剤の重量に基づいて好ましくは６０％以下、さらに好ましくは４０％以下、特に好ましくは２０％以下である。
また、（Ａ）の含有量に基づく（Ｃ）の含有量は、タンパク質の変性されにくさの観点から、好ましくは６０％以下、さらに好ましくは４０％以下である。
タンパク質の変性されにくさの観点から、（Ａ）の重量に基づく（Ｃ１）〜（Ｃ４）の含有量は以下の通りである。
（Ｃ１）は、好ましくは５０％以下、さらに好ましくは３０％以下、（Ｃ２）は、好ましくは２０％以下、さらに好ましくは１０％以下、（Ｃ３）は、好ましくは２０％以下、さらに好ましくは１０％以下、（Ｃ４）は、好ましくは２０％以下、さらに好ましくは１０％以下である。
【００３６】
安定化剤（Ｄ）としてはキレート剤、有機酸およびその塩、多価アルコールがあげられる。
キレート剤としては、エチレンジアミン四酢酸およびその塩、ポリリン酸およびその塩、メタリン酸およびその塩があげられる。
有機酸およびその塩としては、乳酸およびその塩、ヒアルロン酸およびその塩等があげられる。
多価アルコールとしては、グリセリン、ソルビトール、マンニトール、マルチトール、ペンタエリスリトール、キシリトール、ポリエチレングリコールおよびプロピレングリコールなどがあげられる。
【００３７】
本発明の溶菌剤における各成分の重量比（Ａ）／（Ｂ）／（Ｃ）／（Ｄ）は、タンパク質の変性のしにくさの観点から、好ましくは３０〜１００／０〜１０／０〜６０／０〜５０、さらに好ましくは５０〜１００／０〜５／０〜４０／０〜３０、特に好ましくは７０〜１００／０〜３／０〜２０／０〜２０である。
【００３８】
本発明の溶菌剤は、通常は液状である。
本発明の溶菌剤は、使用に当たっては、必要により水で稀釈して、水溶液状または水分散液状の溶菌剤水性稀釈液として用いることができる。
溶菌剤水性稀釈液における、水以外の成分の濃度は、対象となる菌体、有用物質の種類および抽出方法の種類によって適宜選択されるが、０．０１〜９９．９％、好ましくは０．１〜５０％である。
【００３９】
本発明の第３の実施態様は、上記の溶菌剤を使用して有用物質生産菌から有用物質を生産する方法である。
本発明の有用物質産生方法で得られる有用物質は、上記の溶菌方法で得られるため、従来よりも純度が高く、また溶菌力に優れているので高い収量を得ることができる。
本発明の有用物質の産生方法としては、例えば、以下のような順序の工程による産生方法が挙げられる。（有用物質が組み換えタンパク質の場合の１例）
（１）タンパク質の培養工程：大腸菌などのタンパク質生産体に組み換えタンパク質を培養させる。
（２）溶菌工程：溶菌剤の使用によってタンパク質生産体内のインクルージョンボディを取り出す。
（３）アンフォールディング工程；インクルージョンボディ懸濁液（例えば１０ｍｇタンパク質／ｍＬ）に０．５モル／Ｌ以上のアンフォールディング剤および２０ミリモル／Ｌ以下の還元剤を加え軽くかきまぜ室温で数時間放置する。
（４）リフォールディング工程：アンフォールディングされたタンパク質懸濁液に、０．２〜６モル／Ｌの濃度になるようにリフォールディング剤を加えて軽くかき混ぜ、室温で１晩放置する。またはリフォールディングバッファーで大希釈することによりリフォールディングを行う。
（５）分離・取り出し工程：懸濁液から目的とする正常なタンパク質をカラムクロマトグラフィーなどによって分離して取り出す。
【００４０】
上記の（１）のタンパク質の培養工程におけるタンパク質生産体としては、以下の細菌細胞、エシェリヒア属菌およびバチルス属菌などが挙げられる。
細菌細胞としては、連鎖球菌属（ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｉ）、ブドウ球菌属（ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｉ）、エシェリヒア属菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）、ストレプトミセス属菌（ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）およびバチルス属菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）細胞、真菌細胞：例えば酵母細胞およびアスペルギルス属（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）細胞、昆虫細胞：例えばドロソフィラＳ２（ＤｒｏｓｏｐｈｉｌａＳ２）、スポドプテラＳf９（ＳｐｏｄｏｐｔｅｒａＳｆ９）細胞、動物細胞：例えば、ＣＨＯ、ＣＯＳ、Ｈｅｌａ、Ｃ１２７、３Ｔ３、ＢＨＫ、２９３およびボウズ（Ｂｏｗｓ）メラノーマ細胞、ならびに植物細胞等が挙げられる。
エシェリヒア属菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）としては、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｋ１２ＤＨ１〔プロシージング・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンス（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．）６０巻、１６０頁（１９６８年）を参照〕、ＪＭ１０３〔ヌクレイック・アシッズ・リサーチ（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ）９巻、３０９頁（１９８１年）を参照〕、ＪＡ２２１〔ジャーナル・オブ・モレキュラー・バイオロジー（Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ）１２０巻、５１７頁（１９７８年）を参照〕、ＨＢ１０１〔ジャーナル・オブ・モレキュラー・バイオロジー（Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ）４１巻、４５９頁（１９６９年）を参照〕、Ｃ６００〔ジェネティックス（Ｇｅｎｅｔｉｃｓ）３９巻、４４０頁（１９５４年）を参照〕、ＭＭ２９４〔ネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ）２１７巻、１１１０頁（１９６８年）を参照〕などが挙げられる。
バチルス属菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）としては、枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓｓｕｂｔｉｌｉｓ）ＭＩ１１４〔ジーン、２４巻、２５５頁（１９８３年）を参照〕、２０７−２１〔ジャーナル・オブ・バイオケミストリー（Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）９５巻、８７頁（１９８４年）を参照〕などが挙げられる。
【００４１】
組み換えタンパク質の生産方法としては、具体的に次の方法がある。
（ｉ）目的タンパク産生細胞からメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）を分離し、該ｍＲＮＡから単鎖のｃＤＮＡを、次に二重鎖ＤＮＡを合成し、該相補ＤＮＡをファージまたはプラスミドに組み込む。
（ｉｉ）得られた組み換えファージまたはプラスミドで宿主を形質転換し、培養後、目的タンパクの一部をコードするＤＮＡプローブとのハイブリダイゼーション、あるいは抗体を用いたイムノアッセイ法により目的とするＤＮＡを含有するファージあるいはプラスミドを単離する。
（ｉｉｉ）その組み換えＤＮＡから目的とするクローン化ＤＮＡを切りだし、該クローン化ＤＮＡまたはその一部を発現ベクター中のプロモーターの下流に連結することによって製造することができる。
その後、適当な方法により、宿主を発現ベクターで形質転換し培養する。培養は通常１５〜４３℃で３〜２４時間行い、必要により通気、攪拌を加えることもできる。
【００４２】
アンフォールディング工程およびリフォールディング工程におけるタンパク質のリフォールディング方法としては、本発明の溶菌剤を用いたあとに、アンフォールディング剤でタンパクの３次元構造を崩し（アンフォールディング）、その後、希釈法、透析法、界面活性剤利用法、人工シャペロン利用法および特願２００５−２３５９８０記載の方法いずれの方法でもリフォールディングすることができる。特に特願２００５−２３５９８０記載の方法は生産性・汎用性の観点から好ましい。
【００４３】
アンフォールディング工程において使用されるアンフォールディング剤としては、塩酸グアニジン、尿素およびこれらの併用などが挙げられる。
なお、タンパク質が、分子内にＳ−Ｓ結合を含むタンパク質である場合には、還元剤として塩酸グアニジンおよび／または尿素以外に、さらに２−メルカプトエタノール、ジチオスレイトール、シスチンまたはチオフェノールなどを加えてもよい。
【００４４】
タンパク質の分離・取り出し工程におけるカラムクロマトグラフィーに使用される充填剤としてはシリカ、デキストラン、アガロース、セルロース、アクリルアミド、ビニルポリマーなどが挙げられ、市販品ではＳｅｐｈａｄｅｘシリーズ、Ｓｅｐｈａｃｒｙｌシリーズ、Ｓｅｐｈａｒｏｓｅシリーズ（以上、Ｐｈａｒｍａｃｉａ社）、Ｂｉｏ−Ｇｅｌシリーズ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ社）等があり入手可能である。
【００４５】
本発明の有用物質の生産方法における有用物質としては、タンパク質、アミノ酸、核酸、抗生物質、糖類またはビタミン類が挙げられる。
【００４６】
タンパク質としては、酵素と組み換えタンパク質が挙げられる。酵素としては、加水分解酵素、異性化酵素、酸化還元酵素、転移酵素、合成酵素および脱離酵素などが挙げられる。
加水分解酵素としては、プロテアーゼ、セリンプロテアーゼ、アミラーゼ、リパーゼ、セルラーゼ、グルコアミラーゼなどが挙げられる。
異性化酵素としては、グルコースイソメラーゼが挙げられる。
酸化還元酵素としては、ペルオキシダーゼなどが挙げられる。
転移酵素としては、アシルトランスフェラーゼ、スルホトランスフェラーゼなどが挙げられる。
合成酵素としては、脂肪酸シンターゼ、リン酸シンターゼ、クエン酸シンターゼなどが挙げられる。
脱離酵素としては、ペクチンリアーゼなどが挙げられる。
【００４７】
組み換えタンパク質としては、タンパク製剤、ワクチン等が挙げられる。
タンパク製剤としては、インターフェロンα、インターフェロンβ、インターロイキン１〜１２、成長ホルモン、エリスロポエチン、インスリン、顆粒状コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）、組織プラスミノーゲン活性化因子（ＴＰＡ）、ナトリウム利尿ペプチド、血液凝固第■因子、ソマトメジン、グルカゴン、成長ホルモン放出因子、血清アルブミン、カ
ルシトニン等が挙げられる。
ワクチンとしては、Ａ型肝炎ワクチン、Ｂ型肝炎ワクチン、Ｃ型肝炎ワクチン等が挙げられる。
【００４８】
アミノ酸としては、例えばグルタミン酸、トリプトファン、アラニン、およびジペプチドなどが挙げられる。
【００４９】
核酸としてはデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）、リボ核酸（ＲＮＡ）が挙げられる。
【００５０】
抗生物質としてはストレプトマイシンおよびバンコマイシンなどが挙げられる。
【００５１】
糖類としては、ヒアルロン酸、アルブミン、セラミド、エリスリトール、トレハロース、リポ多糖およびシクロデキストリンなどが挙げられる。
【００５２】
ビタミン類としては、ビタミンＡ類およびそれらの誘導体並びにその塩、ビタミンＢ６、ビタミンＢ１２等のビタミンＢ類およびそれらの誘導体並びにその塩、ビタミンＣ類およびそれらの誘導体並びにその塩が挙げられる。
これらのうち本発明の溶菌剤は、タンパク質およびアミノ酸、特にタンパク質の生産に適している。
【００５３】
本発明の他の実施態様は、上記の有用物質産生方法で得られたタンパク質、アミノ酸、核酸、抗生物質、糖類またはビタミン類であり、例えば上記のものが挙げられる。
これらのうち好ましいのはタンパク質およびアミノ酸、特にタンパク質である。
【００５４】
［実施例］
【００５５】
以下の実施例により本発明を更に説明するが、本発明はこれに限定されるものではない。
製造例１：
ジデシルジメチルアンモニウムのシクロペンタンテトラカルボン酸塩の製造；
５０ｍｌ三角フラスコに、ジデシルジメチルアンモニウムのメチル炭酸塩１６．０４ｇ（カチオン基として０．０４当量）を入れ、撹拌しながら、シクロペンタンテトラカルボン酸２．４６ｇ（カルボキシル基として０．０４当量）を少量ずつ加えた。撹拌機付き恒温槽で８０℃に加温しながら８時間撹拌し続けると、二酸化炭素およびメタノールが系外に放出され、ジデシルジメチルアンモニウムのシクロペンタンテトラカルボン酸塩１５．４９ｇ（収率９９．９％）を得た。
【００５６】
製造例２：
ジデシルジメチルアンモニウムのピロメリット酸塩の製造；
５０ｍｌ三角フラスコに、ジデシルジメチルアンモニウムの塩化物１４．４８ｇ（カチオン基として０．０４当量）を入れ、撹拌しながら、ピロメリット酸ナトリウム塩３．４２ｇ（カルボキシル基として０．０４当量）を少量ずつ加えた。撹拌機付き恒温槽で４０℃に加温しながら１時間攪拌し続け、３０℃まで放冷し、１００ｇのジエチルエーテルで抽出し脱塩（脱塩化ナトリウム）した。その後、ジエチルエーテルを蒸発することでジデシルジメチルアンモニウムのピロメリット酸塩１５．５４ｇ（収率９９．９％）を得た。
【００５７】
製造例３：
ジデシルジメチルアンモニウムのクエン酸塩の製造；
５０ｍｌ三角フラスコに、ジデシルジメチルアンモニウムの水酸化物塩１０．２９ｇ（カチオン基として０．０３当量）を入れ、撹拌しながら、クエン酸ナトリウム塩２．６０ｇ（カルボキシル基として０．０３当量）を少量ずつ加えた。撹拌機付き恒温槽で４０℃に加温しながら１時間攪拌し続け、３０℃まで放冷し、１００ｇのジエチルエーテルで抽出し脱アルカリ（脱水酸化ナトリウム）した。その後、ジエチルエーテルを蒸発することでジデシルジメチルアンモニウムのクエン酸塩１１．６９ｇ（収率９９．９％）を得た。
【００５８】
比較の溶菌剤として、ラウリルアミンＥＯ２モル付加物のキシレン溶液（キシレンが７０％）、テトラデシルおよびペンタデシルアルコール混合物（重量比６／４）ＥＯ２モル付加物、および塩化ジデシルジメチルアンモニウムを使用した。
【００５９】
以上の溶菌剤について、溶菌力、タンパク質の変性のされにくさ、および糖類の生産性を評価した。
評価方法は以下の通りである。
【００６０】
＜溶菌力＞
２ｍｌのスクリュー管に、菌体溶液０．５ｍｌ、および界面活性剤として５０％濃度になるように稀釈した溶菌剤水性稀釈液を５０μｌマイクロピペットで加え、手振り混合した。２０℃で３日間静置保存したものを試料として、超深度形状測定顕微鏡（KEYENCE社製、VK−８５００）で菌体数を測定した。溶菌力を以下の式で算出した。
なお、ブランクには溶菌剤水性稀釈液の代わりにイオン交換水５０μｌを用いた。
溶菌力（％）＝（１−試料中の菌体数／ブランクの菌体数）×１００
【００６１】
判定基準：
溶菌力≧８０％・・・・・・・５点
６０％≦溶菌力＜８０％・・・４点
４０％≦溶菌力＜６０％・・・３点
２０％≦溶菌力＜４０％・・・２点
溶菌力＜２０％・・・・・・・１点
【００６２】
＜タンパク質（酵素）の変性されにくさ＞
２ｍｌの遠心分離用チューブに、１％セチルメチルセルロース水分散液０．６ｍｌ、界面活性剤として０．２％濃度になるように稀釈した溶菌剤水性稀釈液０．６ｍｌ、さらに、セルラーゼ（ナガセ社製、セルライザーHT）の１００ｐｐｍ水溶液を１０μｌ加え、手振り混合した。３７℃で５分間静置後、遠心分離機（ベックマン社製Ｍｉｃｒｏｆｕｇｅ．１１）で遠心分離（１０，０００ｒｐｍ×３分）し、上層を分離して回収した。２０ｍｌ試験管に、上層０．２５ｍｌ、イオン交換水０．２５ｍｌおよび５％フェノール水溶液０．５ｍｌを入れて、混合した。
さらに濃硫酸を２．５ｍｌ加え、室温で１０分間静置後、混合し、その後２０分間２０℃で静置して試料溶液を得た。試料溶液の４９０ｎｍにおける吸光度（セチルメチルセルロースが酵素で分解された生成物の吸収）を紫外可視分光光度計（島津製作所社製ＵＶ−２５５０）で測定した。ブランクには溶菌剤水希釈液の代わりにイオン交換水０．６ｍｌを用いた。 溶菌の工程においてセルラーゼ（酵素）が変性されずに、活性が保たれて、セチルメチルセルロースが効率よく分解されている場合は、吸光度が大きくなる（ブランクに近い吸光度になる）。
タンパク質の変性されにくさは、以下の式で算出した。
タンパク質の変性されにくさ（％）＝（試料溶液の吸光度／ブランクの吸光度）×１００
【００６３】
判定基準
タンパク質の変性されにくさ≧９０％・・・・・・・５点
７０％≦タンパク質の変性されにくさ＜９０％・・・４点
５０％≦タンパク質の変性されにくさ＜７０％・・・３点
３０％≦タンパク質の変性されにくさ＜５０％・・・２点
タンパク質の変性されにくさ＜３０％・・・・・・・１点
【００６４】
＜糖類（ヒアルロン酸）の生産性＞
グルコース５％、リン酸第１カリウム０．２％、ポリペプトン１．０％、酵母エキス０．５％からなる培地１リットルを加熱殺菌後、ストレプトコッカス・ミュータンスを接種し、
３７℃で撹拌下２日間培養した。培養後の培地に、各溶菌剤を最終濃度０．４重量％となるように加え１時間攪拌し、遠心分離により菌体の破片をを除去した後、その上澄みを２回エタノール沈殿し、この沈殿を４０℃で真空乾燥し精製ヒアルロン酸を得た。
糖類の生産性は、ヒアルロン酸の収量で評価した。
【００６５】
判定基準
ヒアルロン酸の収量≧５（ｇ／Ｌ）・・・・・・・・・５点
３（ｇ／Ｌ）≦ヒアルロン酸の収量≧５（ｇ／Ｌ）・・３点
ヒアルロン酸の収量＜３（ｇ／Ｌ）・・・・・・・・・１点
【００６６】
【表１】
【産業上の利用可能性】
【００６７】
本発明の溶菌剤は、タンパク質などの有用物質を生産菌から抽出する工程において使用できる。有用物質としては、タンパク質、アミノ酸、核酸、抗生物質、糖類またはビタミン類が挙げられる。また、本発明の溶菌剤は、遺伝子を細胞に導入するためのベクターとしての利用ができ、さらには、本発明の溶菌剤と酵素等を併用して細胞破壊剤として利用することもできる。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
一般式（１）で表される４級アンモニウムアルキル炭酸塩をカルボン酸で塩交換して得られる４級アンモニウムカルボン酸塩型カチオン性界面活性剤（Ａ１）を含有することを特徴とする溶菌剤。
【化１】
（式中、Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3およびＲ4は、それぞれ炭素数１〜２２の直鎖または分岐の炭化水素基であって、Ｒ1〜Ｒ4のうちの少なくとも１個は炭素数６〜２２の炭化水素基であり、Ｒ1〜Ｒ4はそれぞれ同一でも異なっていてもよく、Ｒ5は炭素数１〜６のアルキル基である。）
【請求項２】
一般式（２）で表される４級アンモニウムハロゲン化物または４級アンモニウム水酸化物をカルボン酸の強塩基性塩で塩交換して得られる４級アンモニウムカルボン酸塩型カチオン性界面活性剤（Ａ２）を含有することを特徴とする溶菌剤。
【化２】
（式中、Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3およびＲ4は、それぞれ炭素数１〜２２の直鎖または分岐の炭化水素基であって、Ｒ1〜Ｒ4のうちの少なくとも１個は炭素数６〜２２の炭化水素基であり、Ｒ1〜Ｒ4はそれぞれ同一でも異なっていてもよく、Ｘはハロゲン原子または水酸基である。）
【請求項３】
カルボン酸が２価もしくは３〜８価の多価カルボン酸であることを特徴とする請求項１または２記載の溶菌剤。
【請求項４】
請求項１〜３のいずれか記載の溶菌剤を使用して微生物から有用物質を生産する方法。
【請求項５】
請求項４記載の有用物質を生産する方法によって生産されたタンパク質、アミノ酸、核酸、抗生物質、糖類またはビタミン類。
【請求項１】
一般式（１）で表される４級アンモニウムアルキル炭酸塩をカルボン酸で塩交換して得られる４級アンモニウムカルボン酸塩型カチオン性界面活性剤（Ａ１）を含有することを特徴とする溶菌剤。
【化１】
（式中、Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3およびＲ4は、それぞれ炭素数１〜２２の直鎖または分岐の炭化水素基であって、Ｒ1〜Ｒ4のうちの少なくとも１個は炭素数６〜２２の炭化水素基であり、Ｒ1〜Ｒ4はそれぞれ同一でも異なっていてもよく、Ｒ5は炭素数１〜６のアルキル基である。）
【請求項２】
一般式（２）で表される４級アンモニウムハロゲン化物または４級アンモニウム水酸化物をカルボン酸の強塩基性塩で塩交換して得られる４級アンモニウムカルボン酸塩型カチオン性界面活性剤（Ａ２）を含有することを特徴とする溶菌剤。
【化２】
（式中、Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3およびＲ4は、それぞれ炭素数１〜２２の直鎖または分岐の炭化水素基であって、Ｒ1〜Ｒ4のうちの少なくとも１個は炭素数６〜２２の炭化水素基であり、Ｒ1〜Ｒ4はそれぞれ同一でも異なっていてもよく、Ｘはハロゲン原子または水酸基である。）
【請求項３】
カルボン酸が２価もしくは３〜８価の多価カルボン酸であることを特徴とする請求項１または２記載の溶菌剤。
【請求項４】
請求項１〜３のいずれか記載の溶菌剤を使用して微生物から有用物質を生産する方法。
【請求項５】
請求項４記載の有用物質を生産する方法によって生産されたタンパク質、アミノ酸、核酸、抗生物質、糖類またはビタミン類。
【公開番号】特開２００７−１５９４７２（Ｐ２００７−１５９４７２Ａ）
【公開日】平成１９年６月２８日（２００７．６．２８）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００５−３５９３０９（Ｐ２００５−３５９３０９）
【出願日】平成１７年１２月１３日（２００５．１２．１３）
【出願人】（０００００２２８８）三洋化成工業株式会社 (1,719)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成１９年６月２８日（２００７．６．２８）
【国際特許分類】
【出願日】平成１７年１２月１３日（２００５．１２．１３）
【出願人】（０００００２２８８）三洋化成工業株式会社 (1,719)
【Ｆターム（参考）】
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