炎症性疾患予防改善剤
【課題】 抗炎症作用と免疫調整作用に由来して、炎症性疾患に対する優れた抑制及び治療効果を有し、副作用を生じる可能性が低い炎症性疾患予防改善剤を提供する。
【解決手段】 有効成分としてPleurotus nebrodensis及び／又はその抽出物を含むことを特徴とする炎症性疾患予防改善剤。
前記炎症性疾患予防改善剤において、Pleurotus nebrodensisが受託番号ＦＥＲＭ Ｐ−１９３７０のPleurotus nebrodensis株であることが好適である。
特に、Pleurotus nebrodensisの水又はメタノール抽出物を有効成分とすることが好適である。
【解決手段】 有効成分としてPleurotus nebrodensis及び／又はその抽出物を含むことを特徴とする炎症性疾患予防改善剤。
前記炎症性疾患予防改善剤において、Pleurotus nebrodensisが受託番号ＦＥＲＭ Ｐ−１９３７０のPleurotus nebrodensis株であることが好適である。
特に、Pleurotus nebrodensisの水又はメタノール抽出物を有効成分とすることが好適である。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は炎症性疾患予防改善剤、特に機能性食品を用いた炎症性疾患予防改善剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
生体に何らかの外的・内的刺激が加わる際、生体防御反応として炎症反応が生じる。これの炎症反応は、複雑な過程を経て様々な炎症性疾患を発症させる。例えば、関節炎は、アラキドン酸の代謝に関連するホスホリパーゼＡ２の過剰な活性化や、血小板凝集、活性酸素やラジカルの生成等に起因して生じることが報告されている。
また、自己免疫疾患は、免疫異常により、生体防御機構である免疫系が自己細胞を攻撃し、炎症性疾患を発症させる現象である。
【０００３】
これまで炎症性疾患の薬物療法としては、非ステロイド性消炎鎮痛剤が長く使われてきたが、胃粘膜障害等の副作用がある上、効果の面でも不十分なため、その役割は縮小されつつある。一方、ステロイド剤や免疫抑制剤は、一定の効果はあるものの、いずれも強い副作用のため長期にわたる使用は困難である。このため、副作用を生じる可能性が低い機能性食品に対する関心も高まっている。
例えば、乳酸菌とサッカロミセス・セレビシエとの混合培養物を用いた炎症性疾患改善剤（特許文献１）や、ケールを用いた炎症性疾患予防治療剤（特許文献２）等が開発されている。
【特許文献１】特開２００４−９１４３３号公報
【特許文献２】特開２００４−４３３８１号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
しかしながら、上記技術においては、炎症性疾患に対する予防あるいは治療効果が十分ではなく、より優れた機能性食品が要望されていた。
本発明は、上記従来技術の課題に鑑みなされたものであり、その目的は、抗炎症作用と免疫調整作用に由来して、炎症性疾患に対する優れた抑制及び治療効果を有し、副作用を生じる可能性が低い炎症性疾患予防改善剤を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
上記事情を鑑み、本発明者等が鋭意検討を行った結果、Pleurotus nebrodensis及び／又はその抽出物が、炎症性疾患の抑制及び治療効果に優れていることを見出し、本発明を完成するに至った。
すなわち、本発明の炎症性疾患予防改善剤は、有効成分としてPleurotus nebrodensis及び／又はその抽出物を含むことを特徴とする。
前記炎症性疾患予防改善剤において、Pleurotus nebrodensisが受託番号ＦＥＲＭ Ｐ−１９３７０のPleurotus nebrodensis株であることが好適である。
特に、Pleurotus nebrodensisの水又はメタノール抽出物を有効成分とすることが好適である。
【発明の効果】
【０００６】
本発明の炎症性疾患予防改善剤は、Pleurotus nebrodensis及び／又はその抽出物を用いることにより、副作用がなく、且つ優れた炎症性疾患予防及び治療効果を有するものとなる。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００７】
以下、本発明の実施の形態について詳述する。
本発明の炎症性疾患予防改善剤は、有効成分としてPleurotus nebrodensis及び／又はその抽出物を含むことを特徴とする。
本発明おいて、特に好適に用いられるPleurotus nebrodensisは、受託番号ＦＥＲＭ Ｐ−１９３７０であるPleurotus nebrodensis株であり、本株は平成１５年５月２２日付で、本特許出願人の一人である江口文陽により、産業技術総合研究所に寄託されている。
科学的性質等は以下の通りである。
１．科学的性質…菌の特徴：炭素源と窒素源を含む栄養培地下において、白色のコロニーを形成する。また、光学顕微鏡下において、クランプコネクション（かすがい連結）が観察される。
【０００８】
２．分類学上の位置
担子菌
３．培養条件
＜培地名＞
ＳＭＹＡ培地
（Ｓ:サッカロース、Ｍ:マルトエキストラクト、Ｙ:イーストエキストラクト、Ａ:寒天）
Ｓ，Ａ→市販品 Ｍ，Ｙ→ディフコ社製（Ｄｉｆｃｏ）
＜培地の組成＞
培地１０００ｍｌ当たり
1％ サッカロース １０ｇ
１％ マルトエキストラクト １０ｇ
０．４％ イーストエキストラクト ４ｇ
２％ 寒天 ２０ｇ
【０００９】
＜培地のｐＨ＞
５．０〜７．０（最適ｐＨ５．５）
＜培地の殺菌条件＞
１２１℃ ２０分
＜培地温度＞
２８℃
＜培養期間＞
１０日間
＜酸素要求性＞
好気性
【００１０】
４．保管条件
凍結法にて保管できる。
＜凍結条件＞
−８０℃
＜保護剤＞
１０〜２０％グリセリン水溶液（最適は２０％）
＜凍結後の復元率＞
１年で１００％、３年で９９％
【００１１】
５．生存試験の条件
＜微生物の復元＞
４０℃
＜接種・培養・確認法＞
培養条件と同一条件による。
【００１２】
Pleurotus nebrodensisの抽出物を用いる場合、その抽出方法としては特に制限はないが、好適な方法について以下に詳述する。
本発明では、Pleurotus nebrodensisの子実体を用いる。子実体は生のままあるいは乾燥したもののいずれでもよいが、取り扱い性、保存性および抽出効率等の点から乾燥子実体が望ましい。
抽出物を得るに先立ち、Pleurotus nebrodensisの組織を破壊処理することが好適である。これによって効率よく抽出することが出来る。Pleurotus nebrodensisの組織を破壊する手段としては、ビーズミル、ワーリングブレンダー、ホモジナイザー等の各種粉砕混合機による粉砕処理、爆砕機等による衝撃破砕処理、凍結処理、超音波処理等の物理的処理、水酸化ナトリウム等の水溶液によるアルカリ処理、セルラーゼやペクチナーゼ等の細胞壁分解作用のある酵素による処理、浸透圧処理等の化学的処理があり、これらを単独であるいは適宜に組み合わせて行うことができる。これらの組織破壊処理のうち、特に粉砕処理が好適である。
【００１３】
本発明のPleurotus nebrodensis抽出物を得るためには、前述のように組織を破壊処理したPleurotus nebrodensisに、水、低級アルコール等の抽出溶媒を加え適宜攪拌し、抽出処理すればよい。ここで、抽出溶媒としては、特に水又はメタノールが好適である。また、抽出操作は常圧下、常温下で行ってもよいが、１〜５気圧、６０〜１５０℃の加圧、加熱下で抽出することもできる。
なお、熱水抽出による回収率は、乾燥粉末に対し、固形分で６０％程度である。
このようにして得られる抽出液を、減圧濃縮、凍結乾燥、スプレードライ等の処理に供して抽出溶媒を除去し、Pleurotus nebrodensis抽出物を得ることができる。
【００１４】
炎症性疾患予防改善剤として用いる際の摂取量としては、症状等により異なり特に限定されないが、成人１日当たりPleurotus nebrodensis乾燥粉末に換算して１〜３０ｇ、特に１０〜２０ｇを摂取すれば十分に効果が期待できる。
【００１５】
本発明の炎症性疾患予防改善剤は、通常内服薬として投与される。
内服薬の場合には、常法により散剤、錠剤、カプセル剤、顆粒剤、茶剤、懸濁化剤、流エキス剤、液剤、シロップ剤等とすることができる。なお、製剤化の際には、通常の製剤化担体、例えば、賦形剤、結合剤、崩壊剤、滑沢剤、着色剤、矯味矯臭剤、賦香剤等を必要に応じて用いることができる。また、必要に応じて適当なコーティング剤等で剤皮を施すこともできる。
また、皮膚疾患に対しては、皮膚への外用も有効であると考えられる。
【００１６】
本発明において炎症性疾患としては、例えば、全身性エリテマトーデス、慢性関節リウマチ、シェーグレン症候群、潰瘍性大腸炎、原発性胆汁性肝硬変、特発性血小板減少性紫斑病、自己免疫性溶血性貧血、悪性貧血、無症筋無力症、交感性眼炎、糸球体腎炎、橋本病等の自己免疫疾患の他、アトピー性皮膚炎、接触性皮膚炎、強皮症、皮膚筋炎、じんま疹、鼻炎、花粉症、結膜炎、腎炎、肝炎、甲状腺炎等が挙げられる。
本発明について以下に実施例を挙げてさらに詳述するが、本発明はこれにより何ら限定されるものではない。配合量は特記しない限り、その成分が配合される系に対する質量％で示す。
【実施例】
【００１７】
（１）試料（Pleurotus nebrodensis抽出物）の調製方法（図１）
I. 熱水抽出物
受託番号ＦＥＲＭ Ｐ−１９３７０のPleurotus nebrodensisの子実体乾燥粉末５ｇに、水１００ｍＬを加え、８５℃で２時間抽出を行い、濾過により抽出液と残渣に分離し、該抽出液を凍結乾燥した。
II. エタノール抽出物
受託番号ＦＥＲＭ Ｐ−１９３７０のPleurotus nebrodensisの子実体乾燥粉末５ｇに、エタノール１００ｍＬを加えて抽出を行い、濾過により抽出液と残渣に分離し、該抽出液を凍結乾燥した。
III. メタノール抽出物
IIと同様にして、エタノールの代わりにメタノールを使用して抽出物を得た。
IV. 熱水抽出物のエタノール可溶分
Iと同様にして、熱水抽出物を得た後、５倍量のエタノールを加えて抽出を行い、濾過により抽出液と残渣に分離し、該抽出液を凍結乾燥した。
V. 熱水抽出物のエタノール不溶分
Iと同様にして、熱水抽出物を得た後、５倍量のエタノールを加えて抽出を行い、濾過により抽出液と残渣に分離し、該残渣を凍結乾燥した。
【００１８】
（２）血小板凝集抑制試験
種々の炎症性皮膚疾患の発症には、アラキドン酸やその代謝物が関与していることが明らかにされている。そこで、上記各抽出物について、ＰＡＦ（血小板活性因子）及びアラキドン酸ナトリウム惹起血小板凝集抑制効果を調べた。
【００１９】
（試験方法）
ヒト血液を室温にて１１００ｒｐｍで２０分間遠心し、多血小板血漿（ＰＲＰ）を分取した後、さらに３０００ｒｐｍで５分間遠心して乏血小板血漿（ＰＰＰ）を分取した。ＰＲＰ ２２３μＬを３７℃にて予備加温した後、被験試料として上記抽出物の２％ＤＭＳＯ溶液、又は対照としてイオン交換水をそれぞれ２μＬ添加し、さらに３分間３７℃でインキュベートした後、凝集誘発物質であるＰＡＦ水溶液（５００ｎＭ）を２５μＬ添加した。
惹起された凝集は、アグリゴメーター（ＭＣＭヘマトレーサー ＭＣＭメディカル株式会社製）を用いて測定し、被験試料の最大凝集率（ＰＰＰの値を１００として被験試料の凝集曲線より求められた最大値）を対照の最大凝集率と比較することにより、ＰＡＦ惹起血小板凝集に対する抑制作用を評価した。
また、アラキドン酸に対する血小板凝集に対する抑制作用も、上記のＰＡＦ水溶液のかわりにアラキドン酸ナトリウム水溶液（５００μＭ）を用いることにより、同様に評価した（図２）。
【００２０】
図３の右側はＰＡＦ惹起、左側はアラキドン酸惹起による血小板凝集に対する抑制効果を示している。いずれの抽出物も血小板凝集抑制効果を有することが確認されたが、特に、熱水抽出物（Ａ群）、メタノール抽出物（Ｃ群）、及び熱水抽出物のエタノール可溶部（Ｄ群）に優れた血小板凝集抑制作用が認められた。
以上のことから、Pleurotus nebrodensis及び／又はその抽出物を摂取することにより、血小板凝集を抑制でき、炎症性疾患の改善・予防効果が発揮されるものと考えられる。また、皮膚疾患に対しては、皮膚への外用も有効であると考えられる。
【００２１】
（３）ケモカイン遺伝子発現抑制試験
種々の炎症性皮膚疾患の発症には、インターロイキン−８（ＩＬ−８）等のケモカインが強く関与することが明らかにされている。従って、ケモカインの発現の抑制は、これらの炎症性疾患症状の改善や予防に有効であると考えられる。
そこで、上記各抽出物についてケモカイン遺伝子発現抑制作用を調べた。
（試験方法）
ヒト皮膚線維芽細胞を直径６ｃｍの培養皿で、１０％ウシ胎児血清を含むＤＭＥＭ培地（ダルベッコ変法イーグル培地）でコンフルエントになるまで培養し、被験培地として実験に供した。
被験培地に、被検試料として上記各抽出物、又は陽性対照としてハイドロコルチゾン（）を添加した。上記抽出物及びハイドロコルチゾンの終濃度はそれぞれ０．０１％（乾燥質量）及び１０−７Ｍとした。
【００２２】
さらに、ケモカイン遺伝子発現を促進することが知られている腫瘍壊死因子ＴＮＦ−α（１ｎｇ／ｍｌ）を添加し、３７℃で６時間培養した。
次に常法に従って、細胞からＲＮＡを単離し、ｃＤＮＡを合成したのち、定量的ＰＣＲ法（ＴａｑＭａｎ ＰＣＲ法）により、ＩＬ−８遺伝子の発現量を測定し、被験培地に何も添加しない場合の発現量との比を算出した。内部標準遺伝子としてＧＡＰＤＨ（グリセルアルデヒド３リン酸脱水素酵素）遺伝子を用い、得られたデータを補正した（図４）。
なお、ヒト皮膚線維芽細胞は市販品として、例えば倉敷紡績株式会社から入手可能である。また、ヒト線維芽細胞の培養は、動物細胞を培養するための常法に従って行えばよいが、１０％ウシ胎児血清を含むＤＭＥＭ培地が特に好ましい。
【００２３】
結果を図５に示す。いずれの抽出物もケモカイン遺伝子発現の抑制作用を有することが確認されたが、特に、熱水抽出物（Ａ群）、メタノール抽出物（Ｃ群）、及び熱水抽出物のエタノール可溶部（Ｄ群）に優れた抑制作用が認められた。
陽性対象であるハイドロコルチゾンは、抑制効果が強かったが、ステロイドホルモンであるため、組織障害、潰瘍形成等の副作用が引き起こされる可能性がある。これに対して、本発明のPleurotus nebrodensis抽出物は、抑制効果はハイドロコルチゾンには及ばないが十分であり、副作用の心配がないので長期連用が可能である。
以上のことから、Pleurotus nebrodensis及び／又はその抽出物を摂取することにより、ケモカイン遺伝子発現を抑制でき、副作用なしに、炎症性疾患の改善・予防効果が発揮されるものと考えられる。
【００２４】
（４）in vivo試験
ＭＲＬ／Ｍｐ−ｌｐｒ／ｌｐマウス（ＭＲＬマウス）は、急性及び慢性炎症が同時に生じ、糸球体腎炎、肉芽腫性血管炎、多発性関節炎、リンパ腫、自己抗体の産生を自然発症する。この発症はヒト全身性エリテマトーデス、慢性関節リウマチに類似しており、炎症性疾患の病態の解析や薬効開発に有用なモデル動物として汎用されている。
そこで、このＭＲＬマウスと、比較として正常なＩＣＲマウスを用いて、上記各抽出物のうち特に効果のあった抽出物I,III,IVについて、抗炎症効果及び免疫調整効果を試験した。
【００２５】
（１）試験マウスの予備飼育（４〜７週齢）
日本チャールスリバー（株）より購入した４週齢の雄性ＭＲＬマウス、及び雄性ＩＣＲマウスを、室温２２±１℃、湿度６０±１０％に調節された飼育室において、白色蛍光灯で１日１２時間（７〜１９時明期）の光調節を行い、飼料及び水道水を自由摂取させ３週間予備飼育した。
予備飼育後、各個体の体重測定を行い、１群１０頭とし、体重の平均値がほぼ等しくなるようにＭＲＬマウスをＡ〜Ｄ群に分類し、ＩＣＲマウスをＥ群とした。
【００２６】
２．試料の投与方法（７〜１９週齢）
下記の要領で、各群のマウスに抽出物を投与し、さらに１２週間、１９週齢まで飼育した。投与量は、体重６０ｋｇの成人が、子実体換算で１日２０ｇ接種することに相当するように調整した。各抽出物はすべて経口投与とし、毎日午前１０時より施行した。投与後は滅菌水を自由摂取させた。
固形飼料(MF：オリエンタル酵母工業株式会社製)と水道水は、各群とも自由摂取させた。飼育室の環境は、温度２０±２℃、湿度６０±１０％、白色蛍光灯で１日１２時間の採光下（７〜１９時明期）とした。
【００２７】
（ＭＲＬマウス）
Ａ群：I.熱水抽出物投与
Ｂ群：III.メタノール抽出物投与
Ｃ群：IV.熱水抽出物のエタノール可溶分投与
Ｄ群：無投与
（ＩＣＲマウス）
Ｅ群：無投与
【００２８】
３．血液検査
実験最終日の前日に全マウスを絶食させ、翌日に深麻酔（ネンブタール,45mg/kg,i.p.）し、左心室から20Ｇ採血針で可能な限り採血を行った。
採取した血液を用いて、下記の項目において生化学的検査を行った。得られた成績は、群間比較をWilcoxon U-testで解析し、５％以内の危険率を持って有意な差があると判定した（ｐ＜０．０５）。なお、すべての値は平均値と標準誤差値で表示した。
【００２９】
＜抗炎症作用について＞
乳酸脱水素酵素（ＬＤＨ）は、心筋、骨格筋、肝臓、腎臓、赤血球等、生体に広く分布し、組織の細胞膜の透過性亢進あるいは細胞破壊によって血中に遊出してくる逸脱酵素である。その活性値上昇から、炎症の程度を知ることができる。
試験方法：ＬＤＨは、ピルビン酸を基質として乳酸を生成すると同時に、補酵素である還元型ニコチンアミドアデノシンジヌクレオチド（ＮＡＤＨ）は酸化型に変化する。ＮＡＤＨは３４０ｎｍに吸収極大を持つので、吸光度の減少速度を測定して、ＬＤＨの活性値を算定した。
【００３０】
Ｃ−反応性蛋白（ＣＲＰ）は、代表的な急性期反応蛋白であり、体内に炎症や組織の壊死がある場合に増加する血漿蛋白である。その活性値上昇から、炎症の程度を知ることができる。
試験方法：ＣＲＰ値は、分光光度計を用いた免疫比濁法（ピュアオートＳＣＲＰTM：第一化学薬品）で測定した。ＣＲＰに対する特異抗体とマウス血清を加えた抗原抗体複合物は濁度を生じるため、その濁度の強さを吸光度変化として測定した。
【００３１】
リウマトノイド因子（ＲＦ）は、リウマチ性多発性関節炎患者の血中に見られ、免疫グロブリンに対する自己抗体群である。慢性関節リウマチ(ＲＡ)では、末梢血や罹患部に存在するＢリンパ球がＲＦを産生すると考えられている。よってＲＦ値上昇から、炎症の程度を知ることができる。
試験方法：ＲＦ値は、熱変性γ−グロブリンと反応するＲＦを免疫比濁法（日本製薬）によって測定した。複合物は濁度を生じるため、その濁度の強さを吸光度変化として測定した。
【００３２】
図６に、ＬＤＨ、ＣＲＰ及びＲＦの測定結果（抗炎症作用）を示す。
ＩＣＲマウスにおいては、ＬＤＨ値は低く、ＣＲＰ及びＲＦ値は０であった。
これに対し、ＭＲＬマウスでは、これらの値が高かった。しかしながら、ＭＲＬマウスにおいては、無投与群（Ｄ群）と比較して、抽出物投与群（Ａ〜Ｃ群）では、これらのパラメーターの低下が見られた。
このように、ＬＤＨ、ＣＲＰ及びＲＦの値から、Pleurotus nebrodensisの抗炎症効果が確認された。
【００３３】
＜免疫調整作用について＞
ＣＤ４及びＣＤ８は、リンパ球上に存在する表面抗原分子の一つである。ＣＤ４は、主要組織適合抗原クラスII（MHC-II）抗原と複合体を形成し、抗原認識を指示する機能があり、ＣＤ８は、主要組織適合抗原クラスI（MHC-I）抗原と複合体を形成し、抗原認識を補助する機能がある。そのバランス（ＣＤ４／ＣＤ８）は、免疫不全状態で低下し、自己免疫性疾患などで上昇が認められる。
試験方法：ＣＤ４／ＣＤ８は、以下のようにして測定した。
脾組織よりＴ細胞を単離して、Lysing Regentで溶解させ、ナイロンメッシュを通した。ＯＫＴ４（ＣＤ４）、ＯＫＴ８（ＣＤ８）を用いて、ヘルパー／インデューサーＴ細胞、サプレッサー／細胞障害型Ｔリンパ球と反応させた。実験はＯＫＴ４（ＦＩＴＣラベル）、ＯＫＴ８（ＰＥラベル）標識モノクロナール抗体の組み合わせでＴ細胞と反応させ、フローサイトメーター（Profile;Coulter, Hialeah,FL,USA）で解析した。
【００３４】
ＲＦ−ＩｇＧは、ＩｇＧ（最も多く血中に存在し、抗原抗体反応の中心となっている免疫グロブリン）に対する自己抗体群である。ＲＦ−ＩｇＧは、関節外症状の強いＲＡで認められることが多く、関節炎よりも血管炎に関連しており、その値から、免疫の異常を予測することができる。
試験方法：ＲＦ−ＩｇＧ値は、熱変性γ−グロブリンと反応するＲＦを免疫比濁法（日本製薬）によって測定した。複合物は濁度を生じるため、その濁度の強さを吸光度変化として測定した。
【００３５】
図７に、ＣＤ４／ＣＤ８、ＲＦ−ＩｇＧの測定結果（免疫調整作用）を示す。
前述のように、ＣＤ４／ＣＤ８は、自己免疫性疾患等で上昇が認められる値である。正常のＩＣＲマウスと比較して、ＭＲＬマウスでは、この値が高かった。しかしながら、ＭＲＬマウスにおいては、無投与群（Ｄ群）と比較して、抽出物投与群（Ａ〜Ｃ群）では、低下が見られた。
また、ＲＦ−ＩｇＧは自己抗体群であるが、ＩＣＲマウスにおいては、この値が０であった。これに対し、ＭＲＬマウスでは、ＲＦ−ＩｇＧの値が高かった。しかしながら、ＭＲＬマウスにおいては、無投与群（Ｄ群）と比較して、抽出物投与群（Ａ〜Ｃ群）では、低下が見られた。
このように、ＣＤ４／ＣＤ８、ＲＦ−ＩｇＧから、Pleurotus nebrodensisの免疫調整効果が確認された。
【００３６】
＜血中タンパクへの影響について＞
総タンパクは、約100種類に及ぶ血中蛋白質の総称であり、糖質や脂質と結合し複合蛋白を形成している。
Ａ／Ｇ比は、血漿タンパクであるアルブミン（Alb）と総グロブリン（Glob）の比率であり、その値はAlbとGlobの相対的変動に依存する。
総タンパク値及びＡ／Ｇ比は、体内のタンパク代謝の指標として利用され、全身の一般状態を推測することができる。
試験方法：これらの値は、自動化学分析装置（Auto Lab, Radio lmmuno Assay 法）にて分析を行った。
【００３７】
図８に、総タンパク、Ａ／Ｇの測定結果（血中タンパクへの影響について）を示す。
正常のＩＣＲマウスと比較して、ＭＲＬマウスでは、総タンパク値が高く、Ａ／Ｇ値が低かった。しかしながら、ＭＲＬマウスにおいては、無投与群（Ｄ群）と比較して、抽出物投与群（Ａ〜Ｃ群）では、これらのパラメーターにおいて改善が見られ、正常ラット（Ｅ群）の値とほぼ等しくなった。
このことから、抗炎症効果及び免疫調整効果に加えて、タンパク代謝も改善されることが確認された。
【００３８】
＜腎機能への影響について＞
尿素窒素は、蛋白の最終代謝産物である尿素中の窒素のことである。尿素は肝で尿素サイクルを経て生成する窒素成分で、血中に放出され腎臓から排泄される。
クレアチニンは、血中非蛋白性窒素化合物の1つであり、尿素や尿酸等と同様に腎を介して尿中に排泄される。
尿酸は、肝臓、筋肉、骨髄で生成される核酸構成成分であるプリン体の最終代謝産物である。尿酸は組織で分解され、少量は胆汁・腸に、大部分（60〜80％）は尿中に排泄される。
尿素窒素、クレアチニン、及び尿酸の測定は、腎機能の指標に用いられる。
試験方法：これらの値は、自動化学分析装置（Auto Lab, Radio lmmuno Assay 法）にて分析を行った。
【００３９】
図９に、尿素窒素、クレアチニン、尿酸の測定結果（腎機能への影響について）を示す。
正常のＩＣＲマウスと比較して、ＭＲＬマウスでは、尿酸値が高く、尿素窒素値及びクレアチニン値が低かった。しかしながら、ＭＲＬマウスにおいては、無投与群（Ｄ群）と比較して、抽出物投与群（Ａ〜Ｃ群）では、これらのパラメーターにおいて改善が見られ、正常ラット（Ｅ群）の値に近づく傾向が見られた。
このことから、抗炎症効果及び免疫調整効果に加えて、腎機能も改善されることが確認された。
【００４０】
以上のように、in vivo試験においても、Pleurotus nebrodensis及び／又はその抽出物には、抗炎症作用と免疫調整作用の両方に由来する炎症性疾患発症の抑制及び治療効果があることが確認された。
なお、特に効果が高かった抽出部分は、熱水抽出物（及びそのエタノール可溶部）と、メタノール抽出物であった。今回の試験においては、有効成分の解明には至らなかったが、メタノール抽出物とエタノール抽出物とでは、活性に明らかな差が見られたこと、及び熱水抽出物の有機溶剤可溶部に活性が見られたことから、有効成分と作用機序解明に有効であると考えられる。
【図面の簡単な説明】
【００４１】
【図１】本発明に用いた抽出物の調製方法を示す図である。
【図２】本発明における血小板凝集抑制作用の試験方法を示す図である。
【図３】本発明における血小板凝集抑制作用の試験結果を示す図である。
【図４】本発明におけるケモカイン遺伝子発現抑制作用の試験方法を示す図である。
【図５】本発明におけるケモカイン遺伝子発現抑制作用の試験結果を示す図である。
【図６】本発明における血液検査の結果（抗炎症作用）を示す図である。
【図７】本発明における血液検査の結果（免疫調整作用）を示す図である。
【図８】本発明における血液検査の結果（血中タンパクへの影響）を示す図である。
【図９】本発明における血液検査の結果（腎機能への影響）を示す図である。
【技術分野】
【０００１】
本発明は炎症性疾患予防改善剤、特に機能性食品を用いた炎症性疾患予防改善剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
生体に何らかの外的・内的刺激が加わる際、生体防御反応として炎症反応が生じる。これの炎症反応は、複雑な過程を経て様々な炎症性疾患を発症させる。例えば、関節炎は、アラキドン酸の代謝に関連するホスホリパーゼＡ２の過剰な活性化や、血小板凝集、活性酸素やラジカルの生成等に起因して生じることが報告されている。
また、自己免疫疾患は、免疫異常により、生体防御機構である免疫系が自己細胞を攻撃し、炎症性疾患を発症させる現象である。
【０００３】
これまで炎症性疾患の薬物療法としては、非ステロイド性消炎鎮痛剤が長く使われてきたが、胃粘膜障害等の副作用がある上、効果の面でも不十分なため、その役割は縮小されつつある。一方、ステロイド剤や免疫抑制剤は、一定の効果はあるものの、いずれも強い副作用のため長期にわたる使用は困難である。このため、副作用を生じる可能性が低い機能性食品に対する関心も高まっている。
例えば、乳酸菌とサッカロミセス・セレビシエとの混合培養物を用いた炎症性疾患改善剤（特許文献１）や、ケールを用いた炎症性疾患予防治療剤（特許文献２）等が開発されている。
【特許文献１】特開２００４−９１４３３号公報
【特許文献２】特開２００４−４３３８１号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
しかしながら、上記技術においては、炎症性疾患に対する予防あるいは治療効果が十分ではなく、より優れた機能性食品が要望されていた。
本発明は、上記従来技術の課題に鑑みなされたものであり、その目的は、抗炎症作用と免疫調整作用に由来して、炎症性疾患に対する優れた抑制及び治療効果を有し、副作用を生じる可能性が低い炎症性疾患予防改善剤を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
上記事情を鑑み、本発明者等が鋭意検討を行った結果、Pleurotus nebrodensis及び／又はその抽出物が、炎症性疾患の抑制及び治療効果に優れていることを見出し、本発明を完成するに至った。
すなわち、本発明の炎症性疾患予防改善剤は、有効成分としてPleurotus nebrodensis及び／又はその抽出物を含むことを特徴とする。
前記炎症性疾患予防改善剤において、Pleurotus nebrodensisが受託番号ＦＥＲＭ Ｐ−１９３７０のPleurotus nebrodensis株であることが好適である。
特に、Pleurotus nebrodensisの水又はメタノール抽出物を有効成分とすることが好適である。
【発明の効果】
【０００６】
本発明の炎症性疾患予防改善剤は、Pleurotus nebrodensis及び／又はその抽出物を用いることにより、副作用がなく、且つ優れた炎症性疾患予防及び治療効果を有するものとなる。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００７】
以下、本発明の実施の形態について詳述する。
本発明の炎症性疾患予防改善剤は、有効成分としてPleurotus nebrodensis及び／又はその抽出物を含むことを特徴とする。
本発明おいて、特に好適に用いられるPleurotus nebrodensisは、受託番号ＦＥＲＭ Ｐ−１９３７０であるPleurotus nebrodensis株であり、本株は平成１５年５月２２日付で、本特許出願人の一人である江口文陽により、産業技術総合研究所に寄託されている。
科学的性質等は以下の通りである。
１．科学的性質…菌の特徴：炭素源と窒素源を含む栄養培地下において、白色のコロニーを形成する。また、光学顕微鏡下において、クランプコネクション（かすがい連結）が観察される。
【０００８】
２．分類学上の位置
担子菌
３．培養条件
＜培地名＞
ＳＭＹＡ培地
（Ｓ:サッカロース、Ｍ:マルトエキストラクト、Ｙ:イーストエキストラクト、Ａ:寒天）
Ｓ，Ａ→市販品 Ｍ，Ｙ→ディフコ社製（Ｄｉｆｃｏ）
＜培地の組成＞
培地１０００ｍｌ当たり
1％ サッカロース １０ｇ
１％ マルトエキストラクト １０ｇ
０．４％ イーストエキストラクト ４ｇ
２％ 寒天 ２０ｇ
【０００９】
＜培地のｐＨ＞
５．０〜７．０（最適ｐＨ５．５）
＜培地の殺菌条件＞
１２１℃ ２０分
＜培地温度＞
２８℃
＜培養期間＞
１０日間
＜酸素要求性＞
好気性
【００１０】
４．保管条件
凍結法にて保管できる。
＜凍結条件＞
−８０℃
＜保護剤＞
１０〜２０％グリセリン水溶液（最適は２０％）
＜凍結後の復元率＞
１年で１００％、３年で９９％
【００１１】
５．生存試験の条件
＜微生物の復元＞
４０℃
＜接種・培養・確認法＞
培養条件と同一条件による。
【００１２】
Pleurotus nebrodensisの抽出物を用いる場合、その抽出方法としては特に制限はないが、好適な方法について以下に詳述する。
本発明では、Pleurotus nebrodensisの子実体を用いる。子実体は生のままあるいは乾燥したもののいずれでもよいが、取り扱い性、保存性および抽出効率等の点から乾燥子実体が望ましい。
抽出物を得るに先立ち、Pleurotus nebrodensisの組織を破壊処理することが好適である。これによって効率よく抽出することが出来る。Pleurotus nebrodensisの組織を破壊する手段としては、ビーズミル、ワーリングブレンダー、ホモジナイザー等の各種粉砕混合機による粉砕処理、爆砕機等による衝撃破砕処理、凍結処理、超音波処理等の物理的処理、水酸化ナトリウム等の水溶液によるアルカリ処理、セルラーゼやペクチナーゼ等の細胞壁分解作用のある酵素による処理、浸透圧処理等の化学的処理があり、これらを単独であるいは適宜に組み合わせて行うことができる。これらの組織破壊処理のうち、特に粉砕処理が好適である。
【００１３】
本発明のPleurotus nebrodensis抽出物を得るためには、前述のように組織を破壊処理したPleurotus nebrodensisに、水、低級アルコール等の抽出溶媒を加え適宜攪拌し、抽出処理すればよい。ここで、抽出溶媒としては、特に水又はメタノールが好適である。また、抽出操作は常圧下、常温下で行ってもよいが、１〜５気圧、６０〜１５０℃の加圧、加熱下で抽出することもできる。
なお、熱水抽出による回収率は、乾燥粉末に対し、固形分で６０％程度である。
このようにして得られる抽出液を、減圧濃縮、凍結乾燥、スプレードライ等の処理に供して抽出溶媒を除去し、Pleurotus nebrodensis抽出物を得ることができる。
【００１４】
炎症性疾患予防改善剤として用いる際の摂取量としては、症状等により異なり特に限定されないが、成人１日当たりPleurotus nebrodensis乾燥粉末に換算して１〜３０ｇ、特に１０〜２０ｇを摂取すれば十分に効果が期待できる。
【００１５】
本発明の炎症性疾患予防改善剤は、通常内服薬として投与される。
内服薬の場合には、常法により散剤、錠剤、カプセル剤、顆粒剤、茶剤、懸濁化剤、流エキス剤、液剤、シロップ剤等とすることができる。なお、製剤化の際には、通常の製剤化担体、例えば、賦形剤、結合剤、崩壊剤、滑沢剤、着色剤、矯味矯臭剤、賦香剤等を必要に応じて用いることができる。また、必要に応じて適当なコーティング剤等で剤皮を施すこともできる。
また、皮膚疾患に対しては、皮膚への外用も有効であると考えられる。
【００１６】
本発明において炎症性疾患としては、例えば、全身性エリテマトーデス、慢性関節リウマチ、シェーグレン症候群、潰瘍性大腸炎、原発性胆汁性肝硬変、特発性血小板減少性紫斑病、自己免疫性溶血性貧血、悪性貧血、無症筋無力症、交感性眼炎、糸球体腎炎、橋本病等の自己免疫疾患の他、アトピー性皮膚炎、接触性皮膚炎、強皮症、皮膚筋炎、じんま疹、鼻炎、花粉症、結膜炎、腎炎、肝炎、甲状腺炎等が挙げられる。
本発明について以下に実施例を挙げてさらに詳述するが、本発明はこれにより何ら限定されるものではない。配合量は特記しない限り、その成分が配合される系に対する質量％で示す。
【実施例】
【００１７】
（１）試料（Pleurotus nebrodensis抽出物）の調製方法（図１）
I. 熱水抽出物
受託番号ＦＥＲＭ Ｐ−１９３７０のPleurotus nebrodensisの子実体乾燥粉末５ｇに、水１００ｍＬを加え、８５℃で２時間抽出を行い、濾過により抽出液と残渣に分離し、該抽出液を凍結乾燥した。
II. エタノール抽出物
受託番号ＦＥＲＭ Ｐ−１９３７０のPleurotus nebrodensisの子実体乾燥粉末５ｇに、エタノール１００ｍＬを加えて抽出を行い、濾過により抽出液と残渣に分離し、該抽出液を凍結乾燥した。
III. メタノール抽出物
IIと同様にして、エタノールの代わりにメタノールを使用して抽出物を得た。
IV. 熱水抽出物のエタノール可溶分
Iと同様にして、熱水抽出物を得た後、５倍量のエタノールを加えて抽出を行い、濾過により抽出液と残渣に分離し、該抽出液を凍結乾燥した。
V. 熱水抽出物のエタノール不溶分
Iと同様にして、熱水抽出物を得た後、５倍量のエタノールを加えて抽出を行い、濾過により抽出液と残渣に分離し、該残渣を凍結乾燥した。
【００１８】
（２）血小板凝集抑制試験
種々の炎症性皮膚疾患の発症には、アラキドン酸やその代謝物が関与していることが明らかにされている。そこで、上記各抽出物について、ＰＡＦ（血小板活性因子）及びアラキドン酸ナトリウム惹起血小板凝集抑制効果を調べた。
【００１９】
（試験方法）
ヒト血液を室温にて１１００ｒｐｍで２０分間遠心し、多血小板血漿（ＰＲＰ）を分取した後、さらに３０００ｒｐｍで５分間遠心して乏血小板血漿（ＰＰＰ）を分取した。ＰＲＰ ２２３μＬを３７℃にて予備加温した後、被験試料として上記抽出物の２％ＤＭＳＯ溶液、又は対照としてイオン交換水をそれぞれ２μＬ添加し、さらに３分間３７℃でインキュベートした後、凝集誘発物質であるＰＡＦ水溶液（５００ｎＭ）を２５μＬ添加した。
惹起された凝集は、アグリゴメーター（ＭＣＭヘマトレーサー ＭＣＭメディカル株式会社製）を用いて測定し、被験試料の最大凝集率（ＰＰＰの値を１００として被験試料の凝集曲線より求められた最大値）を対照の最大凝集率と比較することにより、ＰＡＦ惹起血小板凝集に対する抑制作用を評価した。
また、アラキドン酸に対する血小板凝集に対する抑制作用も、上記のＰＡＦ水溶液のかわりにアラキドン酸ナトリウム水溶液（５００μＭ）を用いることにより、同様に評価した（図２）。
【００２０】
図３の右側はＰＡＦ惹起、左側はアラキドン酸惹起による血小板凝集に対する抑制効果を示している。いずれの抽出物も血小板凝集抑制効果を有することが確認されたが、特に、熱水抽出物（Ａ群）、メタノール抽出物（Ｃ群）、及び熱水抽出物のエタノール可溶部（Ｄ群）に優れた血小板凝集抑制作用が認められた。
以上のことから、Pleurotus nebrodensis及び／又はその抽出物を摂取することにより、血小板凝集を抑制でき、炎症性疾患の改善・予防効果が発揮されるものと考えられる。また、皮膚疾患に対しては、皮膚への外用も有効であると考えられる。
【００２１】
（３）ケモカイン遺伝子発現抑制試験
種々の炎症性皮膚疾患の発症には、インターロイキン−８（ＩＬ−８）等のケモカインが強く関与することが明らかにされている。従って、ケモカインの発現の抑制は、これらの炎症性疾患症状の改善や予防に有効であると考えられる。
そこで、上記各抽出物についてケモカイン遺伝子発現抑制作用を調べた。
（試験方法）
ヒト皮膚線維芽細胞を直径６ｃｍの培養皿で、１０％ウシ胎児血清を含むＤＭＥＭ培地（ダルベッコ変法イーグル培地）でコンフルエントになるまで培養し、被験培地として実験に供した。
被験培地に、被検試料として上記各抽出物、又は陽性対照としてハイドロコルチゾン（）を添加した。上記抽出物及びハイドロコルチゾンの終濃度はそれぞれ０．０１％（乾燥質量）及び１０−７Ｍとした。
【００２２】
さらに、ケモカイン遺伝子発現を促進することが知られている腫瘍壊死因子ＴＮＦ−α（１ｎｇ／ｍｌ）を添加し、３７℃で６時間培養した。
次に常法に従って、細胞からＲＮＡを単離し、ｃＤＮＡを合成したのち、定量的ＰＣＲ法（ＴａｑＭａｎ ＰＣＲ法）により、ＩＬ−８遺伝子の発現量を測定し、被験培地に何も添加しない場合の発現量との比を算出した。内部標準遺伝子としてＧＡＰＤＨ（グリセルアルデヒド３リン酸脱水素酵素）遺伝子を用い、得られたデータを補正した（図４）。
なお、ヒト皮膚線維芽細胞は市販品として、例えば倉敷紡績株式会社から入手可能である。また、ヒト線維芽細胞の培養は、動物細胞を培養するための常法に従って行えばよいが、１０％ウシ胎児血清を含むＤＭＥＭ培地が特に好ましい。
【００２３】
結果を図５に示す。いずれの抽出物もケモカイン遺伝子発現の抑制作用を有することが確認されたが、特に、熱水抽出物（Ａ群）、メタノール抽出物（Ｃ群）、及び熱水抽出物のエタノール可溶部（Ｄ群）に優れた抑制作用が認められた。
陽性対象であるハイドロコルチゾンは、抑制効果が強かったが、ステロイドホルモンであるため、組織障害、潰瘍形成等の副作用が引き起こされる可能性がある。これに対して、本発明のPleurotus nebrodensis抽出物は、抑制効果はハイドロコルチゾンには及ばないが十分であり、副作用の心配がないので長期連用が可能である。
以上のことから、Pleurotus nebrodensis及び／又はその抽出物を摂取することにより、ケモカイン遺伝子発現を抑制でき、副作用なしに、炎症性疾患の改善・予防効果が発揮されるものと考えられる。
【００２４】
（４）in vivo試験
ＭＲＬ／Ｍｐ−ｌｐｒ／ｌｐマウス（ＭＲＬマウス）は、急性及び慢性炎症が同時に生じ、糸球体腎炎、肉芽腫性血管炎、多発性関節炎、リンパ腫、自己抗体の産生を自然発症する。この発症はヒト全身性エリテマトーデス、慢性関節リウマチに類似しており、炎症性疾患の病態の解析や薬効開発に有用なモデル動物として汎用されている。
そこで、このＭＲＬマウスと、比較として正常なＩＣＲマウスを用いて、上記各抽出物のうち特に効果のあった抽出物I,III,IVについて、抗炎症効果及び免疫調整効果を試験した。
【００２５】
（１）試験マウスの予備飼育（４〜７週齢）
日本チャールスリバー（株）より購入した４週齢の雄性ＭＲＬマウス、及び雄性ＩＣＲマウスを、室温２２±１℃、湿度６０±１０％に調節された飼育室において、白色蛍光灯で１日１２時間（７〜１９時明期）の光調節を行い、飼料及び水道水を自由摂取させ３週間予備飼育した。
予備飼育後、各個体の体重測定を行い、１群１０頭とし、体重の平均値がほぼ等しくなるようにＭＲＬマウスをＡ〜Ｄ群に分類し、ＩＣＲマウスをＥ群とした。
【００２６】
２．試料の投与方法（７〜１９週齢）
下記の要領で、各群のマウスに抽出物を投与し、さらに１２週間、１９週齢まで飼育した。投与量は、体重６０ｋｇの成人が、子実体換算で１日２０ｇ接種することに相当するように調整した。各抽出物はすべて経口投与とし、毎日午前１０時より施行した。投与後は滅菌水を自由摂取させた。
固形飼料(MF：オリエンタル酵母工業株式会社製)と水道水は、各群とも自由摂取させた。飼育室の環境は、温度２０±２℃、湿度６０±１０％、白色蛍光灯で１日１２時間の採光下（７〜１９時明期）とした。
【００２７】
（ＭＲＬマウス）
Ａ群：I.熱水抽出物投与
Ｂ群：III.メタノール抽出物投与
Ｃ群：IV.熱水抽出物のエタノール可溶分投与
Ｄ群：無投与
（ＩＣＲマウス）
Ｅ群：無投与
【００２８】
３．血液検査
実験最終日の前日に全マウスを絶食させ、翌日に深麻酔（ネンブタール,45mg/kg,i.p.）し、左心室から20Ｇ採血針で可能な限り採血を行った。
採取した血液を用いて、下記の項目において生化学的検査を行った。得られた成績は、群間比較をWilcoxon U-testで解析し、５％以内の危険率を持って有意な差があると判定した（ｐ＜０．０５）。なお、すべての値は平均値と標準誤差値で表示した。
【００２９】
＜抗炎症作用について＞
乳酸脱水素酵素（ＬＤＨ）は、心筋、骨格筋、肝臓、腎臓、赤血球等、生体に広く分布し、組織の細胞膜の透過性亢進あるいは細胞破壊によって血中に遊出してくる逸脱酵素である。その活性値上昇から、炎症の程度を知ることができる。
試験方法：ＬＤＨは、ピルビン酸を基質として乳酸を生成すると同時に、補酵素である還元型ニコチンアミドアデノシンジヌクレオチド（ＮＡＤＨ）は酸化型に変化する。ＮＡＤＨは３４０ｎｍに吸収極大を持つので、吸光度の減少速度を測定して、ＬＤＨの活性値を算定した。
【００３０】
Ｃ−反応性蛋白（ＣＲＰ）は、代表的な急性期反応蛋白であり、体内に炎症や組織の壊死がある場合に増加する血漿蛋白である。その活性値上昇から、炎症の程度を知ることができる。
試験方法：ＣＲＰ値は、分光光度計を用いた免疫比濁法（ピュアオートＳＣＲＰTM：第一化学薬品）で測定した。ＣＲＰに対する特異抗体とマウス血清を加えた抗原抗体複合物は濁度を生じるため、その濁度の強さを吸光度変化として測定した。
【００３１】
リウマトノイド因子（ＲＦ）は、リウマチ性多発性関節炎患者の血中に見られ、免疫グロブリンに対する自己抗体群である。慢性関節リウマチ(ＲＡ)では、末梢血や罹患部に存在するＢリンパ球がＲＦを産生すると考えられている。よってＲＦ値上昇から、炎症の程度を知ることができる。
試験方法：ＲＦ値は、熱変性γ−グロブリンと反応するＲＦを免疫比濁法（日本製薬）によって測定した。複合物は濁度を生じるため、その濁度の強さを吸光度変化として測定した。
【００３２】
図６に、ＬＤＨ、ＣＲＰ及びＲＦの測定結果（抗炎症作用）を示す。
ＩＣＲマウスにおいては、ＬＤＨ値は低く、ＣＲＰ及びＲＦ値は０であった。
これに対し、ＭＲＬマウスでは、これらの値が高かった。しかしながら、ＭＲＬマウスにおいては、無投与群（Ｄ群）と比較して、抽出物投与群（Ａ〜Ｃ群）では、これらのパラメーターの低下が見られた。
このように、ＬＤＨ、ＣＲＰ及びＲＦの値から、Pleurotus nebrodensisの抗炎症効果が確認された。
【００３３】
＜免疫調整作用について＞
ＣＤ４及びＣＤ８は、リンパ球上に存在する表面抗原分子の一つである。ＣＤ４は、主要組織適合抗原クラスII（MHC-II）抗原と複合体を形成し、抗原認識を指示する機能があり、ＣＤ８は、主要組織適合抗原クラスI（MHC-I）抗原と複合体を形成し、抗原認識を補助する機能がある。そのバランス（ＣＤ４／ＣＤ８）は、免疫不全状態で低下し、自己免疫性疾患などで上昇が認められる。
試験方法：ＣＤ４／ＣＤ８は、以下のようにして測定した。
脾組織よりＴ細胞を単離して、Lysing Regentで溶解させ、ナイロンメッシュを通した。ＯＫＴ４（ＣＤ４）、ＯＫＴ８（ＣＤ８）を用いて、ヘルパー／インデューサーＴ細胞、サプレッサー／細胞障害型Ｔリンパ球と反応させた。実験はＯＫＴ４（ＦＩＴＣラベル）、ＯＫＴ８（ＰＥラベル）標識モノクロナール抗体の組み合わせでＴ細胞と反応させ、フローサイトメーター（Profile;Coulter, Hialeah,FL,USA）で解析した。
【００３４】
ＲＦ−ＩｇＧは、ＩｇＧ（最も多く血中に存在し、抗原抗体反応の中心となっている免疫グロブリン）に対する自己抗体群である。ＲＦ−ＩｇＧは、関節外症状の強いＲＡで認められることが多く、関節炎よりも血管炎に関連しており、その値から、免疫の異常を予測することができる。
試験方法：ＲＦ−ＩｇＧ値は、熱変性γ−グロブリンと反応するＲＦを免疫比濁法（日本製薬）によって測定した。複合物は濁度を生じるため、その濁度の強さを吸光度変化として測定した。
【００３５】
図７に、ＣＤ４／ＣＤ８、ＲＦ−ＩｇＧの測定結果（免疫調整作用）を示す。
前述のように、ＣＤ４／ＣＤ８は、自己免疫性疾患等で上昇が認められる値である。正常のＩＣＲマウスと比較して、ＭＲＬマウスでは、この値が高かった。しかしながら、ＭＲＬマウスにおいては、無投与群（Ｄ群）と比較して、抽出物投与群（Ａ〜Ｃ群）では、低下が見られた。
また、ＲＦ−ＩｇＧは自己抗体群であるが、ＩＣＲマウスにおいては、この値が０であった。これに対し、ＭＲＬマウスでは、ＲＦ−ＩｇＧの値が高かった。しかしながら、ＭＲＬマウスにおいては、無投与群（Ｄ群）と比較して、抽出物投与群（Ａ〜Ｃ群）では、低下が見られた。
このように、ＣＤ４／ＣＤ８、ＲＦ−ＩｇＧから、Pleurotus nebrodensisの免疫調整効果が確認された。
【００３６】
＜血中タンパクへの影響について＞
総タンパクは、約100種類に及ぶ血中蛋白質の総称であり、糖質や脂質と結合し複合蛋白を形成している。
Ａ／Ｇ比は、血漿タンパクであるアルブミン（Alb）と総グロブリン（Glob）の比率であり、その値はAlbとGlobの相対的変動に依存する。
総タンパク値及びＡ／Ｇ比は、体内のタンパク代謝の指標として利用され、全身の一般状態を推測することができる。
試験方法：これらの値は、自動化学分析装置（Auto Lab, Radio lmmuno Assay 法）にて分析を行った。
【００３７】
図８に、総タンパク、Ａ／Ｇの測定結果（血中タンパクへの影響について）を示す。
正常のＩＣＲマウスと比較して、ＭＲＬマウスでは、総タンパク値が高く、Ａ／Ｇ値が低かった。しかしながら、ＭＲＬマウスにおいては、無投与群（Ｄ群）と比較して、抽出物投与群（Ａ〜Ｃ群）では、これらのパラメーターにおいて改善が見られ、正常ラット（Ｅ群）の値とほぼ等しくなった。
このことから、抗炎症効果及び免疫調整効果に加えて、タンパク代謝も改善されることが確認された。
【００３８】
＜腎機能への影響について＞
尿素窒素は、蛋白の最終代謝産物である尿素中の窒素のことである。尿素は肝で尿素サイクルを経て生成する窒素成分で、血中に放出され腎臓から排泄される。
クレアチニンは、血中非蛋白性窒素化合物の1つであり、尿素や尿酸等と同様に腎を介して尿中に排泄される。
尿酸は、肝臓、筋肉、骨髄で生成される核酸構成成分であるプリン体の最終代謝産物である。尿酸は組織で分解され、少量は胆汁・腸に、大部分（60〜80％）は尿中に排泄される。
尿素窒素、クレアチニン、及び尿酸の測定は、腎機能の指標に用いられる。
試験方法：これらの値は、自動化学分析装置（Auto Lab, Radio lmmuno Assay 法）にて分析を行った。
【００３９】
図９に、尿素窒素、クレアチニン、尿酸の測定結果（腎機能への影響について）を示す。
正常のＩＣＲマウスと比較して、ＭＲＬマウスでは、尿酸値が高く、尿素窒素値及びクレアチニン値が低かった。しかしながら、ＭＲＬマウスにおいては、無投与群（Ｄ群）と比較して、抽出物投与群（Ａ〜Ｃ群）では、これらのパラメーターにおいて改善が見られ、正常ラット（Ｅ群）の値に近づく傾向が見られた。
このことから、抗炎症効果及び免疫調整効果に加えて、腎機能も改善されることが確認された。
【００４０】
以上のように、in vivo試験においても、Pleurotus nebrodensis及び／又はその抽出物には、抗炎症作用と免疫調整作用の両方に由来する炎症性疾患発症の抑制及び治療効果があることが確認された。
なお、特に効果が高かった抽出部分は、熱水抽出物（及びそのエタノール可溶部）と、メタノール抽出物であった。今回の試験においては、有効成分の解明には至らなかったが、メタノール抽出物とエタノール抽出物とでは、活性に明らかな差が見られたこと、及び熱水抽出物の有機溶剤可溶部に活性が見られたことから、有効成分と作用機序解明に有効であると考えられる。
【図面の簡単な説明】
【００４１】
【図１】本発明に用いた抽出物の調製方法を示す図である。
【図２】本発明における血小板凝集抑制作用の試験方法を示す図である。
【図３】本発明における血小板凝集抑制作用の試験結果を示す図である。
【図４】本発明におけるケモカイン遺伝子発現抑制作用の試験方法を示す図である。
【図５】本発明におけるケモカイン遺伝子発現抑制作用の試験結果を示す図である。
【図６】本発明における血液検査の結果（抗炎症作用）を示す図である。
【図７】本発明における血液検査の結果（免疫調整作用）を示す図である。
【図８】本発明における血液検査の結果（血中タンパクへの影響）を示す図である。
【図９】本発明における血液検査の結果（腎機能への影響）を示す図である。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
有効成分としてPleurotus nebrodensis及び／又はその抽出物を含むことを特徴とする炎症性疾患予防改善剤。
【請求項２】
請求項１に記載の予防改善剤において、Pleurotus nebrodensisが受託番号ＦＥＲＭ Ｐ−１９３７０のPleurotus nebrodensis株であることを特徴とする炎症性疾患予防改善剤。
【請求項３】
請求項１又は２に記載の予防改善剤において、Pleurotus nebrodensisの水又はメタノール抽出物を有効成分とすることを特徴とする炎症性疾患予防改善剤。
【請求項１】
有効成分としてPleurotus nebrodensis及び／又はその抽出物を含むことを特徴とする炎症性疾患予防改善剤。
【請求項２】
請求項１に記載の予防改善剤において、Pleurotus nebrodensisが受託番号ＦＥＲＭ Ｐ−１９３７０のPleurotus nebrodensis株であることを特徴とする炎症性疾患予防改善剤。
【請求項３】
請求項１又は２に記載の予防改善剤において、Pleurotus nebrodensisの水又はメタノール抽出物を有効成分とすることを特徴とする炎症性疾患予防改善剤。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【公開番号】特開２００６−２４１１１５（Ｐ２００６−２４１１１５Ａ）
【公開日】平成１８年９月１４日（２００６．９．１４）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００５−６２０２７（Ｐ２００５−６２０２７）
【出願日】平成１７年３月７日（２００５．３．７）
【出願人】（５９９１１９３６３）
【出願人】（５０３１９０４５３）
【出願人】（５０３００８８６０）農事組合法人ネオプランツ (1)
【出願人】（５９２００３３７１）有限会社柄澤産業 (5)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成１８年９月１４日（２００６．９．１４）
【国際特許分類】
【出願日】平成１７年３月７日（２００５．３．７）
【出願人】（５９９１１９３６３）
【出願人】（５０３１９０４５３）
【出願人】（５０３００８８６０）農事組合法人ネオプランツ (1)
【出願人】（５９２００３３７１）有限会社柄澤産業 (5)
【Ｆターム（参考）】
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