環状ペプチド及びその修飾ペプチド並びにＫｅｌｃｈ様ＥＣＨ結合タンパク質１の結合阻害物質のスクリーニング方法
【課題】分子量が小さく、かつ、Ｎｒｆ２とＫＢＤを介して結合する新規環状ペプチド及びこれを用いたＫｅａｐ１結合阻害物質のスクリーニング方法を提供する。
【解決手段】以下の一般式（Ｉ）で示されるペプチドを含む環状ペプチド又はその薬理学的に許容される塩。Ｙ１−Ｙ２−Ｇｌｕ−Ｙ３−Ｇｌｙ−Ｇｌｕ・・・（Ｉ）[式中、Ｙ１は、アスパラギン残基又はアスパラギン酸残基を表し、Ｙ２は、アミノ酸残基を表し、Ｙ３は、スレオニン残基、セリン残基、アスパラギン残基又はアスパラギン酸残基を表す。］
【解決手段】以下の一般式（Ｉ）で示されるペプチドを含む環状ペプチド又はその薬理学的に許容される塩。Ｙ１−Ｙ２−Ｇｌｕ−Ｙ３−Ｇｌｙ−Ｇｌｕ・・・（Ｉ）[式中、Ｙ１は、アスパラギン残基又はアスパラギン酸残基を表し、Ｙ２は、アミノ酸残基を表し、Ｙ３は、スレオニン残基、セリン残基、アスパラギン残基又はアスパラギン酸残基を表す。］
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、環状ペプチド及びその修飾ペプチド並びにＫｅｌｃｈ様ＥＣＨ結合タンパク質１の結合阻害物質のスクリーニング方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
生体は、酸化と抗酸化のバランスを調節し、細胞内酸化還元状態を一定に維持して機能している。この酸化と抗酸化のバランスが酸化方向に傾いた状態を酸化ストレスという。
【０００３】
酸化ストレスは、脂質、ＤＮＡ、タンパク質等の生体高分子に修飾や障害を与え、細胞機能障害や細胞死を引き起こすことが知られ、発癌、高血圧、動脈硬化、脳神経変性疾患、炎症性疾患、喘息、皮膚疾患、加齢黄斑変性、白内障といった加齢に伴う慢性疾患の発症や進行にも深く関与していると言われている。このため、酸化ストレスの防御機構は、生体にとって必須の生体防御システムであり、酸化ストレスに対する防御能力を高めることは、上記の慢性疾患の予防や治療に有用であると考えられている（非特許文献１）。
【０００４】
近年、ＮＦ−Ｅ２関連因子２（ＮＦ−Ｅ２−ｒｅｌａｔｅｄ ｆａｃｔｏｒ ２；以下、Ｎｒｆ２と略すことがある。）が、哺乳類の酸化ストレス防御機構において中心的な役割を果たすことが明らかとなった。
【０００５】
Ｎｒｆ２は、親電子性物質を直接解毒する異物代謝系第２相酵素（例えば、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ、キノンオキシドレダクターゼ）や抗酸化酵素（例えば、ヘムオキシゲナーゼ、ペルオキシレドキシン）といった解毒酵素群の遺伝子発現を制御する転写因子である。Ｎｒｆ２は、定常状態では、細胞内でＫｅｌｃｈ様ＥＣＨ結合タンパク質１（Ｋｅｌｃｈ−ｌｉｋｅ ＥＣＨ ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ １；以下、Ｋｅａｐ１と略すことがある。）と複合体を形成して不活化状態となっており、さらにこの複合体は速やかにユビキチン化され分解されることにより負に制御されている。
【０００６】
ところが、生体が親電子性物質や活性酸素種等の非特異的な酸化ストレスに暴露されると、Ｎｒｆ２はＫｅａｐ１から解離することにより活性化され、核へ移行することとなる。核に移行したＮｒｆ２は、抗酸化剤応答配列（ａｎｔｉｏｘｉｄａｎｔ ｒｅｓｐｏｎｓｉｖｅ ｅｌｅｍｅｎｔ：以下、ＡＲＥ）と呼ばれるプロモーター配列に結合し、上記の解毒酵素群の遺伝子の発現を誘導することによって生体異物の解毒・排泄を導き、酸化ストレスから生体を防御するために機能している（非特許文献２）。
【０００７】
一方、Ｎｒｆ２は、Ｋｅａｐ１と結合するＫｅａｐ１結合ドメイン（Ｋｅａｐ１ ｂｉｎｄｉｎｇ ｄｏｍａｉｎ；以下、ＫＢＤと略すことがある。)と、ＡＲＥと結合するＡＲＥ結合ドメインとから構成されていることが知られており、Ｎｒｆ２のＫＢＤのみからなる切断型のリコンビナントタンパク質を強制発現させた細胞では、酸化ストレスに暴露されなくても、Ｎｒｆ２がＫｅａｐ１と解離して酸化ストレスに対する防御機構が活性化されることが知られている（非特許文献３）。このことは、Ｋｅａｐ１と結合し、Ｎｒｆ２とＫｅａｐ１との結合を阻害する物質は、Ｎｒｆ２によって引き起こされる酸化ストレスの防御機構を活性化させる作用を有していることを示している。
【０００８】
したがって、Ｋｅａｐ１とＮｒｆ２との結合を阻害する物質（以下、Ｋｅａｐ１結合阻害物質と略すことがある。）は、非特異的な酸化ストレスを与えなくても、Ｎｒｆ２の転写因子活性を誘導し、細胞の酸化ストレスに対する防御機構を活性化し、酸化ストレスに起因する疾患の治療又は予防に有効な薬物になると期待されている。Ｋｅａｐ１と結合する物質としては、Ｎｒｆ２のＫＢＤの一部のアミノ酸配列を有するペプチド（以下、Ｎｒｆ２部分ペプチドと略すことがある。）及びそのホモログについての報告がある。（非特許文献４）。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００９】
【非特許文献１】Ｃａｒｌｏｓ Ｆｅｒｒａｒｉら、Ｂｉｏｍｅｄｉｃｉｎｅ Ｐｈａｒｍａｃｏｔｈｅｒａｐｙ、２００３年、５７巻、p.２５１〜２６０
【非特許文献２】Ｔｒｕｙｅｎ Ｎｇｕｙｅｎら、Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、 ２００９年、２８４巻、２０号、ｐ．１３２９１〜１３２９５
【非特許文献３】Ｍａｓａａｋｉ Ｋｏｍａｔｓｕら、Ｎａｔｕｒｅ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ、２０１０年、１２巻、３号、ｐ．２１３〜２２４
【非特許文献４】Ｓｈｉｈ−Ｃｈｉｎｇ Ｌｏら、Ｔｈｅ ＥＭＢＯ Ｊｏｕｒｎａｌ、２００６年、２５巻、１５号、ｐ．３６０５〜３６１７
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
しかしながら、Ｋｅａｐ１結合阻害物質を同定するためには、Ｎｒｆ２とＫｅａｐ１との結合阻害活性を感度よく検出するスクリーニング系を構築する必要がある。その一方で、生体内では、Ｎｒｆ２はＫｅａｐ１と結合して速やかに消失してしまうため、機能を保持したＮｒｆ２を単離することは困難であり、また単離された報告もない。
【００１１】
また、Ｎｒｆ２部分ペプチド及びそのホモログは、安定性が悪く、分子量も大きいため、蛍光偏光減少法や１分子蛍光測定法等のハイスループットスクリーニング法（以下、ＨＴＳ法と略すことがある。）には不向きであり、検出感度も悪いためにＫｅａｐ１結合阻害物質のスクリーニングに使用するのは困難であった。
【００１２】
そこで本発明は、分子量が小さく、かつ、Ｎｒｆ２とＫＢＤを介して結合する新規環状ペプチド及びこれを用いたＫｅａｐ１結合阻害物質のスクリーニング方法を提供することを目的としている。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
本発明者らは、上記課題を解決するため鋭意検討した結果、新規な環状ペプチドがＫｅａｐ１結合阻害物質のスクリーニングに適していることを見出し、本発明を完成させるに至った。
【００１４】
すなわち、本発明は、以下の一般式（Ｉ）で示されるペプチドを含む環状ペプチド又はその薬理学的に許容される塩を提供する。
Ｙ１−Ｙ２−Ｇｌｕ−Ｙ３−Ｇｌｙ−Ｇｌｕ・・・（Ｉ）
[式中、Ｙ１は、アスパラギン残基又はアスパラギン酸残基を表し、Ｙ２は、アミノ酸残基を表し、Ｙ３は、スレオニン残基、セリン残基、アスパラギン残基又はアスパラギン酸残基を表す。］
【００１５】
上記環状ペプチド又はその薬理学的に許容される塩は、以下の一般式（ＩＩ）で示されることが好ましい。
【化１】
[式中、Ｘは、直接のアミド結合、アミノ酸残基又は２〜６個のアミノ酸残基からなるペプチド表し、Ｙ１は、アスパラギン残基又はアスパラギン酸残基を表し、Ｙ２は、アミノ酸残基を表し、Ｙ３は、スレオニン残基、セリン残基、アスパラギン残基又はアスパラギン酸残基を表し、Ｚは、直接の共有結合、−ＳＳ−、−ＮＨＣＯ−、−ＣＯＮＨ−、−Ｎ（ＣＨ３）ＣＯ−、−ＣＯＮ（ＣＨ３）−、−Ｓ−、−Ｏ−、−ＣＯ−又は−ＮＨ−を表し、Ｒ１は、ＣＯＮＨ−、ＮＨ２−、又は水素原子を表し、Ｒ２は、−ＣＯＯＨ、−ＣＯＮＨ２、又は水素原子を表し、ｍ及びｎは、それぞれ独立して、０〜４を表す。］
【００１６】
また上記環状ペプチドは、一般式（ＩＩ）において、Ｚが−ＳＳ−を表し、Ｒ１がＣＯＮＨ−又はＮＨ２−を表し、Ｒ２が−ＣＯＯＨ又は−ＣＯＮＨ２を表し、かつ、ｍ及びｎが１を表すか、Ｚが−ＮＨＣＯ−を表し、ｍが３又は４を表し、かつ、ｎが２又は３を表すか、又は、Ｚが−ＣＯＮＨ−を表し、ｍが２又は３を表し、ｎが３又は４を表すことが好ましい。
【００１７】
さらに上記環状ペプチドは、一般式（ＩＩ）において、Ｘが、直接のアミド結合又は２個のアミノ酸残基からなるペプチド表すか、Ｙ２が、プロリン残基であるか、Ｙ３が、スレオニン残基であることが好ましく、配列表の配列番号１〜４で示されるアミノ酸配列のいずれかを含むことがさらに好ましい。
【００１８】
上記環状ペプチドは、酸化ストレスに影響を与える物質を評価するためのさまざまな実験系において、ｋｅａｐ１結合阻害リガンド、すなわち、酸化ストレスを与えることなく、Ｎｒｆ２とｋｅａｐ１との結合を阻害するリガンドとして使用できる。特異に、生体及び細胞における酸化ストレスの防御機構を解明するためのツール、酸化ストレス応答能を測定するための検出ツール又は酸化ストレスの診断用ツールとしての使用に適している。
【００１９】
また本発明は、上記の環状ペプチドの修飾ペプチドを提供する。
【００２０】
上記の修飾ペプチドは、配列表の配列番号５で示されるアミノ酸配列を含む環状の修飾ペプチドであることが好ましい。上記の修飾ペプチドは、ｋｅａｐ１との結合に関与しないアミノ（Ｎ）末端又はカルボキシ（Ｃ）末端を蛍光基で修飾されていることがさらに好ましく、蛍光基が発する蛍光を指標とすることで、Ｋｅｌｃｈ様ＥＣＨ結合タンパク質１の結合阻害物質のスクリーニングに好適に使用できる。
【００２１】
さらに本発明は、Ｋｅｌｃｈ様ＥＣＨ結合タンパク質１の結合阻害物質のスクリーニング方法であって、被験物質の存在下及び非存在下において、上記の環状の修飾ペプチドとＫｅｌｃｈ様ＥＣＨ結合タンパク質１とを溶液中で接触させ、この修飾ペプチドとＫｅｌｃｈ様ＥＣＨ結合タンパク質１との結合量を測定する測定ステップと、上記被験物質の存在下における上記修飾ペプチドとＫｅｌｃｈ様ＥＣＨ結合タンパク質１との結合量（ＢＴ）と、上記被験物質の非存在下における上記修飾ペプチドとＫｅｌｃｈ様ＥＣＨ結合タンパク質１との結合量（ＢＣ）とを比較する比較ステップと、上記ＢＴが、上記ＢＣよりも少ない場合に、上記被験物質はＫｅｌｃｈ様ＥＣＨ結合タンパク質１の結合阻害物質であると判定する判定ステップと、を備えるスクリーニング方法を提供する。
【００２２】
上記スクリーニング方法における結合量の測定法としては、例えば、蛍光偏光解消法、１分子蛍光測定法、酵素免疫測定(Ｅｎｚｙｍｅ ｌｉｎｋｅｄ ｉｍｍｕｎｏｓｏｌｖｅｎｔ ａｓｓａｙ；ＥＩＡ)法、表面プラズモン共鳴（Ｓｕｒｆａｃｅ ｐｌａｚｍｏｎ ｒｅｓｏｎａｎｃｅ；ＳＰＲ）法、等温滴定型熱量測定（Ｉｓｏｔｈｅｒｍａｌ Ｔｉｔｒａｔｉｏｎ Ｃａｌｏｒｉｍｅｔｅｒ；ＩＴＣ）法が適しており、使用する環状ペプチドは、ＦＬＡＧタグやビオチンで修飾した環状ペプチドが適している。
【発明の効果】
【００２３】
本発明の環状ペプチドは、ｋｅａｐ１結合阻害化合物の同定を効率的に行うことを可能とし、酸化ストレスによって引き起こされる疾患の新規な治療薬及び予防薬のスクリーニングに使用できる。また本発明の環状ペプチドは、Ｎｒｆ２及びＮｒｆ２部分ペプチドに比べて、血漿中及び肝ミクロソーム中においての安定性が高いため、未精製のｋｅａｐ１含有溶液を用いた場合であっても、ｋｅａｐ１結合阻害化合物のスクリーニングを簡便かつ高感度に実施することができる。
【図面の簡単な説明】
【００２４】
【図１】Ｎｒｆ２部分ペプチドである直鎖ペプチド１のアミノ酸配列と化学構造式を示した図である。
【図２】Ｎｒｆ２部分ペプチドである直鎖ペプチド１のラマチャンドランプロットを示した図である。
【発明を実施するための形態】
【００２５】
本発明の環状ペプチド又はその薬理学的に許容される塩は、以下の一般式（Ｉ）で示されるペプチドを含むことを特徴としている。
Ｙ１−Ｙ２−Ｇｌｕ−Ｙ３−Ｇｌｙ−Ｇｌｕ・・・（Ｉ）
[式中、Ｙ１は、アスパラギン残基又はアスパラギン酸残基を表し、Ｙ２は、アミノ酸残基を表し、Ｙ３は、スレオニン残基、セリン残基、アスパラギン残基又はアスパラギン酸残基を表す。］
【００２６】
「環状ペプチド」とは、アミノ酸がペプチド結合でつながってできるポリペプチドのＮ末端とＣ末端が、ペプチド結合又はアミノ酸残基以外の分子を介してアミド結合でつながってできる環化したポリペプチドのことをいう。環状ペプチドを構成するアミノ酸は、天然型アミノ酸のみならず、非天然型アミノ酸であってもよく、不斉中心を有するアミノ酸残の場合には、エナンチオマー、ジアステレオマー又はそれらの混合物のいずれもが含まれ得る。
【００２７】
また、ポリペプチドのＮ末端とＣ末端の結合には、リンカーを介して結合させることが可能であり、この場合のリンカーには、２つ以上の官能基を有し、ペプチドのＮ末端又はＣ末端とアミド結合可能な官能基少なくとも１つ以上を有する原子団（ビルディングブロック）であれば使用できる。ビルディングブロックとしては、例えば、アミノ酸、ペプチド、ジアミン、ジカルボキシル、メルカプトカルボキシルが挙げられる。
【００２８】
「薬理学的に許容される塩」としては、例えば、硫酸、塩酸、燐酸等の鉱酸との塩、酢酸、シュウ酸、乳酸、酒石酸、フマル酸、マレイン酸、メタンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸等の有機酸との塩、トリメチルアミン、メチルアミン等のアミンとの塩又はナトリウムイオン、カリウムイオン、カルシウムイオン等の金属イオンとの塩が挙げられる。
【００２９】
上記の環状ペプチドは、当業者であれば使用なペプチド合成の常法手段（「ペプチド合成の基礎と実験」、１９８５年、丸善（株）に記載の方法）で製造でき、液相合成法又は固相合成法のいずれの方法を使用しても合成できる。例えば、ペプチド自動合成装置を使用して、固相上でＣ末端からＮ末端方向に向けて順次アミド化反応によるアミノ酸の付加とＮ末端保護基の脱保護を繰り返して上記の一般式（Ｉ）で示されるペプチドを含むペプチドを合成し、アミノ酸側鎖の保護基の脱保護と固相からの切り出しを行った後に縮合剤を添加して分子内環化反応を行えば、上記の環状ペプチドを得ることができる。
【００３０】
上記の脱保護及び固相からの切り出しに用いる試薬としては、例えば、トリフルオロ酢酸、臭化水素酸−酢酸混合溶液、ピペリジン又は接触還元法が挙げられる。
【００３１】
分子内環化反応としては、例えば、システイン残基とシステイン残基の間を公知の方法でＳ−Ｓ結合させることにより行なうことができる。具体的には、５，５’―ジチオビス（２−ニトロ安息香酸）を使用したＤＴＮＢ法や、銅等の金属触媒の存在下での空気酸化によって、環化することができる。
【００３２】
このようにして製造された環状ペプチドは、反応終了後、ペプチドの分離精製手段、例えば、溶媒抽出、蒸留、分配、再沈殿、再結晶、カラムクロマトグラフィー、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）、ゲル濾過、イオン交換クロマトグラフィー等を組み合わせて採取すればよい。
【００３３】
上記環状ペプチド又はその薬理学的に許容される塩は、以下の一般式（ＩＩ）で示されることが好ましい。
【化２】
[式中、Ｘは、直接のアミド結合、アミノ酸残基又は２〜６個のアミノ酸残基からなるペプチド表し、Ｙ１は、アスパラギン残基又はアスパラギン酸残基を表し、Ｙ２は、アミノ酸残基を表し、Ｙ３は、スレオニン残基、セリン残基、アスパラギン残基又はアスパラギン酸残基を表し、Ｚは、直接の共有結合、−ＳＳ−、−ＮＨＣＯ−、−ＣＯＮＨ−、−Ｎ（ＣＨ３）ＣＯ−、−ＣＯＮ（ＣＨ３）−、−Ｓ−、−Ｏ−、−ＣＯ−又は−ＮＨ−を表し、Ｒ１は、ＣＯＮＨ−、ＮＨ２−、又は水素原子を表し、Ｒ２は、−ＣＯＯＨ、−ＣＯＮＨ２、又は水素原子を表し、ｍ及びｎは、それぞれ独立して、０〜４を表す。］
【００３４】
9月Ｎｒｆ２部分ペプチドの両末端はβシート構造を形成し、Ｎ末端とＣ末端のペプチド主鎖間の距離をβシート構造形成に適切な距離に保っているので、Ｋｅｌｃｈ様ＥＣＨ結合タンパク質１との結合するためには、一般式（ＩＩ）におけるｍ及びｎは炭素数０〜４個からなるメチレン鎖であることが好ましい。また、一般式（ＩＩ）において、Ｙ１−Ｙ２−Ｇｌｕ−Ｙ３部分はγターン構造を形成し、Ｇｌｙ−Ｇｌｕ部分はβバルシ構造を形成しており、Ｋｅｌｃｈ様ＥＣＨ結合タンパク質１との結合時にこれら構造を保持したままでＺ部分を共有結合で結んで環状ペプチドとするには、Ｘは０〜６残基のアミノ酸で構成されることが好ましい。さらに、Ｙ３のアミノ酸残基の側鎖は、グリシン残基主鎖のＮＨ基と水素結合してβバルジ構造を安定化する効果を有するスレオニン残基、セリン残基、アスパラギン残基又はアスパラギン酸残基であることが好ましい。
【００３５】
また上記環状ペプチドは、一般式（ＩＩ）において、Ｚが−ＳＳ−を表し、Ｒ１がＣＯＮＨ−又はＮＨ２−を表し、Ｒ２が−ＣＯＯＨ又は−ＣＯＮＨ２を表し、かつ、ｍ及びｎが１を表すか、Ｚが−ＮＨＣＯ−を表し、ｍが３又は４を表し、かつ、ｎが２又は３を表すか、又は、Ｚが−ＣＯＮＨ−を表し、ｍが２又は３を表し、かつ、ｎが３又は４を表すことが好ましい。
【００３６】
一般式（ＩＩ）において、Ｚが−ＳＳ−で表され、Ｒ１がＣＯＮＨ−又はＮＨ２−で表され、Ｒ２が−ＣＯＯＨ又は−ＣＯＮＨ２で表され、かつ、ｍ及びｎが１で表される環状ペプチドを合成する場合には、Ｎ末端及びＣ末端にシステイン残基を用い、上記の分子内環化反応によって環化することができる。また、Ｚが−ＮＨＣＯ−で表され、Ｒ１がＣＯＮＨ−又はＮＨ２−で表され、Ｒ２が−ＣＯＯＨ又は−ＣＯＮＨ２で表され、ｍが３又は４で表され、かつ、ｎが２又は３で表される環状ペプチドは、Ｎ末端にリジン残基又はオルニチン残基を用い、かつ、Ｃ末端にアスパラギン酸残基又はグルタミン酸残基を用いて、合成することができる。さらに、Ｚが−ＣＯＮＨ−で表され、Ｒ１がＣＯＮＨ−又はＮＨ２−で表され、Ｒ２が−ＣＯＯＨ又は−ＣＯＮＨ２で表され、ｍが２又は３で表され、かつ、ｎが３又は４で表される環状ペプチドは、Ｎ末端にアスパラギン酸残基又はグルタミン酸残基を用い、かつＣ末端にリジン残基又はオルニチン残基を用いて、合成することができる。例えば、実施例３に記載した方法と同様に、これらＮ末端及びＣ末端のアミノ酸の側鎖を予め選択的に脱保護できる適切な保護基で保護しておき、他のアミノ酸側鎖の保護基が脱保護されない条件で脱保護し、脱保護された側鎖間を縮合反応させることで、環化することができる。
【００３７】
さらに上記環状ペプチドは、一般式（ＩＩ）において、Ｘが、直接のアミド結合又は２個のアミノ酸残基からなるペプチド表すか、Ｙ２が、プロリン残基であるか、Ｙ３が、スレオニン残基であることが好ましく、配列表の配列番号１〜４で示されるアミノ酸配列のいずれかを含むことがさらに好ましい。
【００３８】
一般式（ＩＩ）において、Ｘが直接のアミド結合又は２個のアミノ酸残基からなるペプチドであることは、ペプチドがＫｅｌｃｈ様ＥＣＨ結合タンパク質１との結合時の立体構造であるγターン及びβバルジ構造を形成したときに、Ｎ末端側のメチレン鎖（ＣＨ３）ｍとＣ末端側のメチレン鎖（ＣＨ３）ｎが、互いに丁度向かい合う位置にくることができる点で好まししい。一般式（ＩＩ）において、Ｙ２がプロリン残基であることは、γターン形成に必要なペプチド主鎖の２面角を安定させる効果があり、特に好ましい。また、Ｙ３のアミノ酸残基の側鎖は、Ｇｌｙ主鎖のＮＨ基と水素結合してβバルジ構造を安定化する効果が高いスレオニン残基であることが特に好ましい。さらに、Ｙ１はＧｌｕ−Ｙ３部分のペプチド主鎖の２つのＮＨ基と水素結合を形成できる側鎖を有するアスパラギン酸残基であることが、Ｋｅｌｃｈ様ＥＣＨ結合タンパク質１との結合を高める上で、好都合である。
【００３９】
また本発明の修飾ペプチドは、上記の環状ペプチドが修飾されていることを特徴としており、蛍光強度を指標とするスクリーニング方法において使用する場合には、環状ペプチドを蛍光基で修飾した修飾ペプチドであることが好ましい。抗体を利用したスクリーニング方法において使用する場合には、抗体で認識されるペプチド、例えば、ヒスチジン６残基からなるペプチド（Ｈｉｓ−ｔａｇ）やＦＬＡＧ配列ペプチド等のスクリーニングにおいて汎用される抗体で認識される配列を有するペプチドで修飾することが好ましい。また、ビオチンとアビジンの結合を利用したスクリーニング方法において使用する場合には、ビオチンで修飾した環状ペプチドを使用することができる。さらに、本発明の環状ペプチドのＮ末端およびＣ末端は、Ｋｅｌｃｈ様ＥＣＨ結合タンパク質１との結合に直接関与していないため、Ｎ末端およびＣ末端に様々な修飾を加えても、結合活性は保持されるため、スクリーニングで使用する測定方法に応じて、環状ペプチドに修飾を加える部位としては、Ｎ末端およびＣ末端が特に好都合である。配列表の配列番号５で示されるアミノ酸配列を含む、蛍光基でＮ末端を修飾した環状ペプチドは、修飾によってＫｅｌｃｈ様ＥＣＨ結合タンパク質１との結合が減弱することが無く、蛍光強度を指標とするスクリーニング方法での利用に特に適している。
【００４０】
「修飾ペプチド」とは、上記の環状ペプチドを構成する上記の一般式（Ｉ）で示されるペプチドを含むペプチド鎖のＮ末端、Ｃ末端、アミノ酸側鎖又はアミド結合している窒素原子のうちの１箇所以上が、化学結合によって修飾されている環状ペプチドを意味する。修飾で付加される化学構造には、例えば、蛍光基、ペプチド、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ビオチン、ヨウ素原子等が挙げられる。
【００４１】
「蛍光基」とは、特定の波長領域の光を吸収し、特定の波長領域の蛍光を発する原子団を意味する。例えば、フルオロセインイソシアネート（ＦＩＴＣ）、ローダミン等が挙げられる。以下に記載する蛍光偏光解消法や１分子蛍光測定法等を利用し、蛍光を指標としたｋｅａｐ１結合阻害化合物スクリーニングで使用するには、蛍光基で修飾されていることが好ましいく、この場合には、ｋｅａｐ１との結合に関与しないアミノ（Ｎ）末端又はカルボキシ（Ｃ）末端を蛍光基で修飾することとなる。具体的には、Ｎ末端のアミノ基を、フルオロセインイソシアネート（ＦＩＴＣ）やカルボキシルフルオロセイン（ＦＡＭ）等の蛍光基で修飾したペプチドは、蛍光を指標としたスクリーニングでの使用に適している。
【００４２】
また本発明のＫｅｌｃｈ様ＥＣＨ結合タンパク質１の結合阻害物質のスクリーニング方法は、被スクリーニング物質の存在下及び非存在下において、上記の環状の修飾ペプチドとＫｅｌｃｈ様ＥＣＨ結合タンパク質１とを溶液中で接触させ、この修飾ペプチドとＫｅｌｃｈ様ＥＣＨ結合タンパク質１との結合量を測定する測定ステップと、上記被スクリーニング物質の存在下における上記修飾ペプチドとＫｅｌｃｈ様ＥＣＨ結合タンパク質１との結合量（ＡＴ）と、上記被スクリーニング物質の非存在下における上記修飾ペプチドとＫｅｌｃｈ様ＥＣＨ結合タンパク質１との結合量（ＡＣ）とを比較する比較ステップと、上記ＡＴが、上記ＡＣよりも少ない場合に、上記被スクリーニング物質はＫｅｌｃｈ様ＥＣＨ結合タンパク質１の結合阻害物質であると判定する判定ステップと、を備えることを特徴としている。
【００４３】
以下に上記の環状ペプチドを用いたｋｅａｐ１結合阻害化合物のスクリーニング方法について説明する。
【００４４】
上記のスクリーニング方法におけるｋｅａｐ１の結合阻害の測定法としては、例えば、蛍光偏光解消法、１分子蛍光測定法、酵素免疫測定（Ｅｎｚｙｍｅ ｌｉｎｋｅｄ ｉｍｍｕｎｏｓｏｌｖｅｎｔ ａｓｓａｙ；ＥＩＡ）法、表面プラズモン共鳴（Ｓｕｒｆａｃｅ ｐｌａｚｍｏｎ ｒｅｓｏｎａｎｃｅ；ＳＰＲ）法が挙げられ、いずれの方法も測定シグナル強度がＫｅｌｃｈ様ＥＣＨ結合タンパク質１と環状ペプチドとの結合量Ａに比例する方法であるため、被スクリーニング物質存在下での環状ペプチドの結合量ＡＣ及び被スクリーニング物質非存在下での環状ペプチドの結合量ＡＴの測定に好適に使用できる。
【００４５】
特に、蛍光偏光解消法は、血漿中の薬物濃度を定量する蛍光偏光免疫測定法（Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ Ｐｏｌａｒｉｚａｔｉｏｎ Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ；ＦＰＩＡ）でも使用される測定法で、血漿や細胞ホモジネートの上清等の夾雑物存在下でも感度よく測定できることが知られており、上記のｋｅａｐ１結合阻害化合物のスクリーニングにおいて精製したｋｅａｐ１を必要としない点で優れている。
また、蛍光偏光解消法は、結合物（Ｂ）と非結合物（Ｆ）との分離、いわゆるＢ／Ｆ分離を必要とせず、標的タンパク質及びペプチドのいずれも固相上に担持する必要がない。このため、Ｂ／Ｆ分離を必要とする放射性同位元素を用いた評価方法及びＥＩＡ法や、標的タンパク質又はペプチドのいずれかを固相上に担持する必要のあるＥＩＡ法やＳＰＡ法等の評価方法に比べて、より簡便にスクリーニングできる。
【００４６】
蛍光偏光解消法のスクリーニングに使用するｋｅａｐ１は、全長のｋｅａｐ１の代わりに下記実施例記載のｋｅａｐ１−ＤＣと呼ばれるアミノ酸残基番号３２１−６０９からなるｋｅａｐ１がＮｒｆ２と結合する領域（非特許文献３を参照）を発現し、精製して用いることができるが、未精製のｋｅａｐ１を用いてもよい。さらに、ｋｅａｐ１を発現している細胞のホモジネートの上清でもよい。例えば、培養したヒト肝がん細胞由来株化細胞Ｈｕｈ−７を氷冷バッファー（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．４）にてホモジナイズした後、遠心分離（１２，０００×ｇ、２０分、４℃）し、回収した上清をスクリーニングに用いることができる。
【００４７】
蛍光偏光解消法に用いる環状ペプチドは、蛍光基で修飾した環状ペプチドを用いる。下記実施例では、蛍光基として環状ペプチドのＮ末端のアミノ基に容易に修飾できるＦＡＭを用いた。蛍光基としては、蛍光偏光解消法で一般に使用されている蛍光基、例えばＦＩＴＣ，ローダミン等を使用でき、プレートリーダーで測定可能な励起及び吸収波長を有するものを選択して、使用する。
【００４８】
蛍光偏光解消法に用いる測定装置としては、蛍光偏光解消法測定に対応している、９６穴又は３８６穴プレート対応の市販のプレートリーダーを用いることができる。
【００４９】
被スクリーニング化合物のｋｅａｐ１阻害能は、以下ようにして算出できる。
【００５０】
まず、蛍光基で修飾した環状ペプチドの蛍光偏光強度（Ｉ０）を測定する。次に、ｋｅａｐ１添加時の蛍光偏光強度（Ｉｍａｘ）を測定する。その後、被スクリーニング化合物を添加し、蛍光偏光強度（Ｉｏｂｓ）を測定する。被スクリーニング化合物が蛍光基で修飾した環状ペプチドとｋｅａｐ１との結合を阻害した割合は、被スクリーニング化合物添加によって減少した蛍光偏光強度（Ｉｍａｘ−Ｉｏｂｓと被スクリーニング化合物添加前のｋｅａｐ１添加によって増加した蛍光偏光強度（Ｉｍａｘ−Ｉ０）の比、すなわち（Ｉｍａｘ−Ｉｏｂｓ）／（Ｉｍａｘ−Ｉ０）から算出される。さらに、被スクリーニング化合物の濃度範囲を変化させて測定することで、被スクリーニング化合物のｋｅａｐ１と環状ペプチドとの結合を５０％阻害する濃度（ＩＣ５０）を求めことができる。
【実施例】
【００５１】
本発明者らは公知のＮｒｆ２部分ペプチドがｋｅａｐ１結合時にγターンと呼ばれる立体構造を取っていることに着目し、本発明の環状ペプチドを設計した。一般に生理活性ペプチドはアミノ酸残基数を短くすればするほど、その生理活性が弱くなることが知られている。生理活性ペプチドを短くすると活性が弱くなる原因は、主に２つある。ひとつは、ペプチドを短くすることで生理活性発現に必要な官能基までが削られてしまうためで、もうひとつは、ペプチドが短くなることで生理活性発現に必要な立体構造を安定にとり得なくなるためである。当該Ｎｒｆ２部分ペプチドも１６残基から９残基に短くすると、ｋｅａｐ１への結合親和性が著しく低下することが知られている（非特許文献４）。本発明者らは、Ｎｒｆ２部分ペプチドとｋｅａｐ１との複合体のＸ線結晶構造（非特許文献４）を詳細に解析した結果、9残基からなるペプチドの結合親和性低下がｋｅａｐ１との結合に必要な官能基が削られたことに起因するのではなく、ｋｅａｐ１結合時に取るべき立体構造であるγターンを取りにくくなったことに起因すると推定した。
【００５２】
ペプチドは、残基数が短い程、合成ステップが短く、短期間かつ高収率で合成できるだけでなく、結合に直接関与しない部分がなくなることによって、標的としているタンパク質以外の物質への非特異的結合が減少させることができる利点がある。その上、ペプチダーゼ等の分解酵素によって、認識される配列が減るため、代謝や生分解に対してより安定になる。また、蛍光偏光減少法や１分子蛍光測定法等に代表される、分子の運動性の差、すなわちペプチド単独の運動性とペプチドがタンパク質に結合したときの運動性との差を検出する測定方法においては、分子量の小さいペプチド程ペプチド単独の運動性が高くなり、分子量の大きなタンパク質に結合したときの運動性との差が大きくなるため、検出感度、すなわちシグナル／ノイズ比（Ｓ／Ｎ比）が高くなる利点がある。
【００５３】
さらに、一般に環状ペプチドでは、ペプチダーゼ等の分解酵素によって、認識されにくくなり、代謝や生分解に対してより安定になる。また、同じ分子量のペプチドでも、環状になることによって、さらに運動性が上がり、上述の運動性の差を検出する測定系において有利になる。
【００５４】
このような利点を持たすために、Ｎｒｆ２部分ペプチドよりも短い環状ペプチドの設計を試みた。上述の短くしたＮｒｆ２部分ペプチドの結合親和性低下の原因推定結果に基づき、Ｎｒｆ２部分ペプチドを改変し、γターン構造をより安定化する工夫を施した。具体的には、その第１の工夫は、ｋｅａｐ１との結合に必要な官能基及びその空間配置を損なうことなく、γターン及びそれに続くβバルジ部分のアミノ酸は置換せず、その両端のβシートを形成しているアミノ酸残基側鎖間に共有結合を導入し、環状化することによって、γターンを安定化させたことにある（図１）。第２の工夫は、Ｎｒｆ２部分ペプチドの主鎖の２面角の分布図（図２）を解析し、唯一Ｐｒｏ残基を導入可能な位置にＰｒｏ残基を導入し、主鎖2面角の回転自由度を制限し、γターンを安定化させたことである。
【００５５】
ここで、Ｇｌｕ１１とＧｌｕ１４のカルボキシル基は、ｋｅａｐ１との結合に必須であるため変換せず保存した。また、βバルジを形成しているＧｌｙ１３は主鎖の２面角の分布図上、Ｇｌｙが特に安定に存在しうる領域にあり、βバルジ形成に有利と考え、保存した。また、Ａｓｐ９の側鎖のカルボキシル基及びＴｈｒ１２の側鎖の水酸基は、主鎖のアミドのＮＨ基と水素結合して、それぞれγターン及びβバルジを安定化しているため、Ａｓｐ９及びＴｈｒ１２の位置には、側鎖に水素結合受容基である官能基、水酸基又はカルボニル基又はカルボキシル基を有するアミノ酸（Ａｓｐ、Ａｓｎ、Ｔｈｒ、Ｓｅｒ）があることが望ましいと考え、これらのアミノ酸に限定した。
【００５６】
図１の化学構造式中、点線枠内は立体構造上、それぞれγターン、βバルジ、βシートを形成している領域を示している。
【００５７】
また、図２の左上のＧｅｎｅｒａｌは、Ｎｒｆ２部分ペプチドの主鎖の２面角の分布を示し、線の内側はプロリン、グリシン、プロリン１残基前のアミノ酸を除く通常のアミノ酸で許容される２面角範囲を示し、内側の線内は、これらアミノ酸が安定に取りうる２面角範囲を示している。右上のＰｒｅ−Ｐｒｏｌｉｎｅは、Ａｓｐ１０の主鎖の２面角プロットを示し、内側の線と外側の線は、それぞれプロリン残基の１残基前のアミノ酸が安定に取りうる２面角範囲及び許容範囲を示している。左下のＧｌｙｃｉｎｅは、Ｇｌｙ１３の主鎖の２面角プロットを示し、内側の線と外側の線は、グリシン残基が安定に取りうる２面角範囲及び許容範囲を示している。右下のｐｒｏｌｉｎｅは、プロリンを導入したＧｌｕ１０の２面角プロットを示し、内側の線と外側の線は、プロリン残基が安定に取りうる２面角範囲及び許容範囲を示している。
【００５８】
Ｎｒｆ２部分ペプチドのγターン構造を安定化するこれらの工夫を加えた環状ペプチドは、残基数を短くしても結合親和性が低下することなく、驚くべきことに元の１６残基のＮｒｆ２ペプチドよりも結合親和性が向上していることがわかった。のみならず、本環状ペプチドは、蛍光基で修飾しても結合親和性が減弱せず、さらに血漿中及び肝ミクロソーム中でも代謝されることなく、安定に存在することが明らかになった。
【００５９】
また、当該環状ペプチドは、ｋｅａｐ１と結合し、Ｎｒｆ２とｋｅａｐ１との結合を阻害する働きを有するため、実際の酸化ストレスを与えることなく、Ｎｒｆ２とｋｅａｐ１との結合阻害するリガンド（ｋｅａｐ１結合阻害リガンド）として使用できる。代謝に対して安定なｋｅａｐ１結合阻害リガンドは、生体及び組織及び細胞における酸化ストレス防御機構の解明のためツールとして有用であるばかりでなく、酸化ストレスに対して、生体及び組織及び細胞が、当該酸化ストレス防御機構によって対処できる能力（酸化ストレス応答能）を測定するための検出ツール及び診断ツールとしても有用である。
【００６０】
そして、蛍光基で修飾した当該環状ペプチドは、被験物質のｋｅａｐ１結合阻害活性を、蛍光偏光解消法測定によって、効率よく定量的にスクリーニングするためのスクリーニングツールとして有用であることが明らかになった。
【００６１】
蛍光偏光解消法はハイスループットスクリーニング（ＨＴＳ）に適した測定方法であり、本発明の環状ペプチドは、例えばＨＴＳのように多数の化合物を一度にスクリーニングする際にも有効に用いることができる。本発明の環状ペプチドを用いたｋｅａｐ１結合阻害化合物のスクリーニングにより、細胞の酸化ストレス防御機構を促進し、酸化ストレスによって引き起こされる疾患の治療又は予防に有効な化合物（薬物）の候補化合物を効率良く同定することができる。
【００６２】
以下、実施例を挙げて本発明を具体的に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。また、実施例中に記載された略号は次の通りである。
Ｆｍｏｃ： ９−フルオレニルメトキシカルボニル
ＦＡＭ： カルボキシルフルオロセイン
ａｌｋｏ： アルコキシベンジルアルコール
ＯｔＢｕ： ｔ−ブトキシカルボニル
ＯＢｚｌ： ベンジルエステル
Ｃｂｚ： ベンジルオキシカルボニル
ｔＢｕ： ｔ−ブチル
Ｔｒｔ： トリフェニルメチル
ＴＦＡ： トリフルオロ酢酸
ＴＩＳ： トリイソプロピルシラン
ＤＭＳＯ： ジメチルスルホキシド
ＤＴＮＢ： ５，５’―ジチオビス（２−ニトロ安息香酸）
ＴｒｔＡ−ＰＥＧ： トリチルアミドメチルエステルポリエチレングリコール
なお、アミノ酸に光学異性体があり得る場合は、特に明示しなければＬ体を示すものとする。
【００６３】
（実施例１）Ａｌａ−Ｐｈｅ−Ｐｈｅ−Ａｌａ−Ｇｌｎ−Ｌｅｕ−Ｇｌｎ−Ｌｅｕ−Ａｓｐ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−Ｔｈｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｕ−Ｐｈｅ−Ｌｅｕ（直鎖ペプチド１；配列番号６で示される。）の合成：
非特許文献４に記載のＮｒｆ２のＫＢＤの一部のアミノ酸配列を有するペプチド（Ｎｒｆ２部分ペプチド）及びそのホモログのうち、Ｋｅａｐ１との結合親和性が最も高いと報告されているＡｌａ−Ｐｈｅ−Ｐｈｅ−Ａｌａ−Ｇｌｎ−Ｌｅｕ−Ｇｌｎ−Ｌｅｕ−Ａｓｐ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−Ｔｈｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｕ−Ｐｈｅ−Ｌｅｕ（直鎖ペプチド１）を下記工程にて合成した。
【００６４】
市販のＦｍｏｃ−Ｌｅｕ−ａｌｋｏ ｒｅｓｉｎ（渡辺化学）を用い、マルチペプチドシンセサイザーＡＣＴ−３９６によりペプチド鎖を伸長し、Ｆｍｏｃ−Ａｌａ−Ｐｈｅ−Ｐｈｅ−Ａｌａ−Ｇｌｎ（ＯｔＢｕ)−Ｌｅｕ−Ｇｌｎ−Ｌｅｕ−Ａｓｐ（ＯｔＢｕ）−Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）−Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）−Ｔｈｒ(ｔＢｕ）−Ｇｌｙ−Ｇｌｕ(ＯｔＢｕ)−Ｐｈｅ−Ｌｅｕ−ａｌｋｏ ｒｅｓｉｎを得た。
【００６５】
次に、脱保護及びｒｅｓｉｎからの切り出しを行った。すなわち、ＴＦＡ／ＴＩＳ／水（９５：２．５：２．５）２００μＬを加え２時間振盪し、その反応溶液にジエチルエーテルを加え沈殿を得、遠心分離後、上清を除く操作を繰り返して洗浄を行い、残渣を酢酸水溶液で抽出、濾過により樹脂を除いた。その後、下記の条件で分取高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）により精製し、目的物を含む分画を集め凍結乾燥し白色粉末を得た。質量分析による（Ｍ＋Ｈ）＋は１８５６．８（計算値１８５６．９)であった。
【００６６】
分取ＨＰＬＣの条件は、以下の通りである。
・カラム： Ｉｎｅｒｔｓｉｌ ＯＤＳ−３（４．６×２５０ｍｍ）
・移動相： Ａ液：０．１％ＴＦＡ／水、Ｂ液：アセトニトリル
・溶出条件： Ａ／Ｂ：９５／５〜３５／６５への直線型濃度勾配溶出（３０分）
・流速： １．５ｍｌ／分
・溶出時間： １９．８６分
【００６７】
（実施例２）ｃｙｃｌｏ［−Ｃｙｓ−Ａｓｐ−Ｐｒｏ−Ｇｌｕ−Ｔｈｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｕ−Ｃｙｓ−］（環状ペプチド１；配列番号１）の合成：
本発明の環状ペプチド１を下記工程にて合成した。まず、市販のＦｍｏｃ−Ｃｙｓ（Ｔｒｔ）−ＴｒｔＡ−ＰＥＧ ｒｅｓｉｎ（渡辺化学社）を用い、マルチペプチドシンセサイザーＡＣＴ−３９６によりペプチド鎖を伸長し、Ｆｍｏｃ−Ｃｙｓ（Ｔｒｔ）−Ａｓｐ（ＯｔＢｕ）−Ｐｒｏ−Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）−Ｔｈｒ（ｔＢｕ）−Ｇｌｙ−Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）−Ｃｙｓ（Ｔｒｔ）−ＴｒｔＡ−ＰＥＧ ｒｅｓｉｎを合成した。次に、実施例１に記載の方法で、脱保護及びｒｅｓｉｎからの切り出しを行った。得られた未精製ペプチドを、ＤＭＳＯ ２０μＬに溶解し、さらに水８０μＬを添加し、ＤＴＮＢを用いて環化した。
【００６８】
その後、下記の条件で分取高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）により精製し、目的物を含む分画を集め凍結乾燥し白色粉末を得た。質量分析による（Ｍ＋Ｈ）＋は８９７．３（計算値８９７．３)であった。
【００６９】
分取ＨＰＬＣの条件は、以下の通りである。
・カラム： Ｉｎｅｒｔｓｉｌ ＯＤＳ−３（４．６×２５０ｍｍ）
・移動相： Ａ液：０．１％ＴＦＡ／水、Ｂ液：アセトニトリル
・溶出条件： Ａ／Ｂ：９５／５〜３５／６５への直線型濃度勾配溶出（３０分）
・流速： １．５ｍｌ／分
・溶出時間： ９．３５分
【００７０】
（実施例３）ｃｙｃｌｏ［−Ｌｙｓ−Ａｓｐ−Ａｌａ−Ｇｌｕ−Ｔｈｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｕ−Ａｓｐ−］−ＮＨ２（環状ペプチド２;配列番号２で示される。）の合成
本発明の環状ペプチド２を下記工程にて合成した。まず、市販のＦｍｏｃ−Ａｓｐ（ＯＢｚｌ）−ＮＨ２−ａｌｋｏ ｒｅｓｉｎ（渡辺化学）を用い、マルチペプチドシンセサイザーＡＣＴ−３９６によりペプチド鎖を伸長し、Ｆｍｏｃ−Ｌｙｓ（Ｃｂｚ）−Ａｓｐ（ＯｔＢｕ）−Ａｌａ−Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）−Ｔｈｒ（ｔＢｕ）−Ｇｌｙ−Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）−Ａｓｐ（ＯＢｚｌ）−ＮＨ２−ａｌｋｏ ｒｅｓｉｎを合成した。Ｎａ／ＮＨ３を加え、ＯＢｚｌ及びＣｂｚのみを選択的に脱保護し、環化した。次に、実施例１に記載の方法で、脱保護及びｒｅｓｉｎからの切り出しを行った。
【００７１】
その後、下記の条件で分取高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）により精製し、目的物を含む分画を集め凍結乾燥し白色粉末を得た。質量分析による（Ｍ＋Ｈ）＋は ８７１．５（計算値８７１．４）であった。
【００７２】
分取ＨＰＬＣの条件は、以下の通りである。
・カラム: Ｉｎｅｒｔｓｉｌ ＯＤＳ−３（４．６×２５０ｍｍ）
・移動相： Ａ液：０．１％ＴＦＡ／水、Ｂ液：アセトニトリル
・溶出条件： Ａ／Ｂ：９５／５〜３５／６５へ直線型濃度勾配溶出（３０分）
・流速: １．５ｍｌ／分
・溶出時間： ６．８８分
【００７３】
（実施例４）ｃｙｃｌｏ［−Ｃｙｓ−Ａｓｎ−Ｐｒｏ−Ｇｌｕ−Ｔｈｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｕ−Ｃｙｓ−］（環状ペプチド３；配列番号３で示される。）、ｃｙｃｌｏ［−Ｃｙｓ−Ｇｌｎ−Ｌｅｕ−Ａｓｐ−Ｐｒｏ−Ｇｌｕ−Ｔｈｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｕ−Ｃｙｓ−］−Ｌｅｕ（環状ペプチド４；配列番号４で示される。）、ＦＡＭ−ｃｙｃｌｏ［−Ｃｙｓ−Ａｓｐ−Ｐｒｏ−Ｇｌｕ−Ｔｈｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｕ−Ｃｙｓ−］（環状ペプチド５；配列番号５）の合成：
本発明の環状ペプチド３、４及び５を下記工程にて合成した。まず、市販のＦｍｏｃ−Ｃｙｓ（Ｔｒｔ）−ＴｒｔＡ−ＰＥＧ ｒｅｓｉｎ（渡辺化学）、Ｆｍｏｃ−Ｌｅｕ−ａｌｋｏ ｒｅｓｉｎ（渡辺化学）及びＦｍｏｃ−Ｃｙｓ（Ｔｒｔ）−ＴｒｔＡ−ＰＥＧ ｒｅｓｉｎ（渡辺化学）を用い、マルチペプチドシンセサイザーＡＣＴ−３９６によりペプチド鎖を伸長し、それぞれＦｍｏｃ−Ｃｙｓ（Ｔｒｔ）−Ａｓｎ−Ｐｒｏ−Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）−Ｔｈｒ（ｔＢｕ）−Ｇｌｙ−Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）−Ｃｙｓ（Ｔｒｔ）−ＴｒｔＡ−ＰＥＧ ｒｅｓｉｎ、Ｆｍｏｃ−Ｃｙｓ（Ｔｒｔ）−Ｇｌｎ−Ｌｅｕ−Ａｓｐ（ＯｔＢｕ）−Ｐｒｏ−Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）−Ｔｈｒ（ｔＢｕ）−Ｇｌｙ−Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）−Ｃｙｓ（Ｔｒｔ）−Ｌｅｕ−ａｌｋｏ ｒｅｓｉｎ、ＦＡＭ−Ｃｙｓ（Ｔｒｔ）−Ａｓｐ（ＯｔＢｕ）−Ｐｒｏ−Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）−Ｔｈｒ（ｔＢｕ）−Ｇｌｙ−Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）−Ｃｙｓ（Ｔｒｔ）−ＴｒｔＡ−ＰＥＧ ｒｅｓｉｎを合成した。次に、実施例１に記載の方法で、脱保護及び切り出しを行った。得られた未精製ペプチドを、２０μＬのＤＭＳＯに溶解し、さらに水８０μＬを添加し、ＤＴＮＢを用いて環化した。
【００７４】
その後、下記の条件で分取高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）により精製し、目的物を含む分画を集め凍結乾燥し白色粉末を得た。
【００７５】
各ペプチドの分析値及び分取ＨＰＬＣの条件は以下の通りである。
（１）環状ペプチド３（ｃｙｃｌｏ［−Ｃｙｓ−Ａｓｎ−Ｐｒｏ−Ｇｌｕ−Ｔｈｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｕ−Ｃｙｓ−］）：
ａ）質量分析による（Ｍ＋Ｈ）＋： ８９６．３（計算値８９６．３）
ｂ）分取ＨＰＬＣ条件
・カラム： Ｉｎｅｒｔｓｉｌ ＯＤＳ−３（４．６×２５０ｍｍ）
・移動相： Ａ液：０．１％ＴＦＡ／水、Ｂ液：アセトニトリル
・溶出条件： Ａ／Ｂ：９５／５〜３５／６５への直線型濃度勾配溶出（３０分）
・流速： １．５ｍｌ／分
・溶出時間: ８．８０分
（２）環状ペプチド４（ｃｙｃｌｏ［−Ｃｙｓ−Ｇｌｎ−Ｌｅｕ−Ａｓｐ−Ｐｒｏ−Ｇｌｕ−Ｔｈｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｕ−Ｃｙｓ−］−Ｌｅｕ）：
ａ）質量分による（Ｍ＋Ｈ）＋： １２０５．５（計算値１２０５．５）
ｂ）分取ＨＰＬＣ条件：
・カラム： Ｉｎｅｒｔｓｉｌ ＯＤＳ−３（４．６×２５０ｍｍ）
・移動相：Ａ液： ０．１％ＴＦＡ／水、Ｂ液：アセトニトリル
・溶出条件： Ａ／Ｂ：９５／５〜３５／６５への直線型濃度勾配溶出（３０分）
・流速： １．５ｍｌ／分
・溶出時間： １２．５８分
（３）環状ペプチド５（ＦＡＭ−ｃｙｃｌｏ［−Ｃｙｓ−Ａｓｐ−Ｐｒｏ−Ｇｌｕ−Ｔｈｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｕ−Ｃｙｓ−］）：
ａ）質量分析による（Ｍ＋Ｈ）＋： １２５５．２（計算値１２５５．３）
ｂ）分取ＨＰＬＣ条件
・カラム： Ｉｎｅｒｔｓｉｌ ＯＤＳ−３（４．６×２５０ｍｍ）
・移動相： Ａ液：０．１％ＴＦＡ／水、Ｂ液：アセトニトリル
・溶出条件： Ａ／Ｂ：９５／５〜３５／６５への直線型濃度勾配溶出（３０分）
・流速： １．５ｍｌ／分
・溶出時間： １１．１２分
【００７６】
（実施例５）ヒトＫｅａｐ１−ＤＣタンパク質の発現及び精製
（１）ヒトＫｅａｐ１−ＤＣ（アミノ酸残基番号３２１−６０９)が組み込まれた発現ベクターの作製：
ヒトＫｅａｐ１−ＤＣ（アミノ酸残基番号３２１−６０９)は、下記工程にてＰＣＲ法を用いてクローニングし、発現ベクターを作製した。
ヒト肝細胞がん由来Ｈｕｈ７細胞から抽出した全ＲＮＡからｃＤＮＡを作製し、これを鋳型として、ヒトＫｅａｐ１の塩基配列に基づき設計したプライマーを用いて、ＰＣＲを行った。なお、ヒトＫｅａｐ１の塩基配列は、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（ＮＣＢＩ；ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／）の受入番号ＮＭ＿２０３５００として公開されており、この塩基配列情報を用いてプライマー設計した。用いたプライマーは、フォワード側：５'−ａｃｃｃｔｇｃａｃａａｇｃｃｃａｃｇｃ−３'（配列番号７）であり、リバース側:５'−ｔｃａａｃａｇｇｔａｃａｇｔｔｃｔｇｃｔｇｇ−３'（配列番号８）である。ＰＣＲで得られたＤＮＡ断片をｐＧＥＭ−Ｔ（Ｅａｓｙ）Ｖｅｃｔｏｒ（Ｐｒｏｍｅｇａ社）にサブクローニングし、ポジティブクローンの塩基配列を調べ、確かにヒトＫｅａｐ１−ＤＣをコードしていることを確認した。
【００７７】
その後、目的のヒトＫｅａｐ１−ＤＣの塩基配列の末端に制限酵素ＮｄｅＩ及びＢａｍＨＩ認識配列が付加されたＤＮＡ断片を取得できるように設計したプライマーを用いてＰＣＲした。用いたプライマーは、フォワード側：５'−ｃａｔａｔｇｇｃｇｃｃｃａａｇｇｔｇｇｇｃｃｇｃｃｔｇ−３'（配列番号９）であり、リバース側: ５'−ｇｇａｔｃｃｔｃａｇｇｔｇａｃａｇｃｃａｃｇｃｃｃａｃｃｃｃａｃ−３’（配列番号１０）である。ＰＣＲで得られたＤＮＡ断片をｐＴＡ２ Ｖｅｃｔｏｒにサブクローニングし、ヒトＫｅａｐ１−ＤＣが挿入されたｈＫｅａｐ１−ＤＣ／ｐＴＡ２を得た。
【００７８】
得られたｈＫｅａｐ１−ＤＣ／ｐＴＡ２を、制限酵素ＮｄｅＩ及びＢａｍＨＩで切断し、ヒトＫｅａｐ１−ＤＣを含むＤＮＡ断片をｐＥＴ−１５ｂ ＶｅｃｔｏｒのＮｄｅＩ／ＢａｍＨＩ開裂部位に挿入し、ヒトＫｅａｐ１−ＤＣが挿入されたｈＫｅａｐ１−ＤＣ／ｐＥＴ−１５ｂを得た。
【００７９】
さらに、得られたｈＫｅａｐ１−ＤＣ／ｐＥＴ−１５ｂを制限酵素ＮｄｅＩ及びＢａｍＨＩで切断し、ヒトＫｅａｐ１−ＤＣを含むＤＮＡ断片をｐＥＴ−１９ｂ Ｖｅｃｔｏｒ（Ｎｏｖａｇｅｎ社）のＮｄｅＩ／ＢａｍＨＩ開裂部位に挿入し、ｈＫｅａｐ１−ＤＣ／ｐＥＴ−１９ｂを得た。
【００８０】
（２）ヒトＫｅａｐ１−ＤＣタンパク質発現：
ｈＫｅａｐ１−ＤＣ／ｐＥＴ−１９ｂを大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）（Ｎｏｖａｇｅｎ社）へ形質転換した。カルベニシリン（以下、Ｃａｒ；ナカライテスク社）による薬剤選別により得られた単一コロニーを１０ｍＬのＬＢ／Ｃａｒ培地で３７℃にて一晩培養した。翌日、この培養液２ｍＬを１００ｍＬのＰｌｕｓｇｒｏｗ（ナカライテスク社）／Ｃａｒ培地に加え、３７℃にてＯＤ６００＞０．５になるまで培養を行った。２０℃にて３０分間静置した後、終濃度０．２ｍｍｏｌ／ＬとなるようＩＰＴＧ（ナカライテスク社）を培地に添加し、２０℃にてタンパク質誘導を一晩行った。
【００８１】
（３）ヒトＫｅａｐ１−ＤＣタンパク質の精製：
上記（２）にてタンパク質誘導を行った大腸菌培養液を２等分に分け、４℃にて５，０００×ｇ、２０分間遠心して大腸菌を回収した。その内の１本をＢｕｇＢｕｓｔｅｒ ＨＴ（Ｎｏｖａｇｅｎ社）を用いて溶菌し、４℃にて２０，０００×ｇ、２０分間遠心して可溶画分を回収した。終濃度１０ｍｍｏｌ／Ｌになるようにイミダゾール（ナカライテスク社）を添加して０．４５μｍのＰＶＤＦフィルター（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社）でろ過した。結合バッファー（２０ｍｍｏｌ／Ｌ Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｂｕｆｆｅｒ ｐＨ７．４（Ｗａｋｏ社）、５００ｍｍｏｌ／Ｌ ＮａＣｌ（Ｗａｋｏ社）、１０ｍｍｏｌ／Ｌ イミダゾール）で平衡化したＨｉｓＴｒａｐ ＨＰ １ｍＬカラム（ＧＥ ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社）に上記ろ液を添加した。５カラム容量の洗浄バッファー（２０ｍｍｏｌ／Ｌ Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｂｕｆｆｅｒ ｐＨ７．４、５００ｍｍｏｌ／Ｌ ＮａＣｌ、１００ｍｍｏｌ／Ｌ イミダゾール）でカラムを洗浄後、５カラム容量の溶出バッファー（２０ｍｍｏｌ／Ｌ Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｂｕｆｆｅｒ、ｐＨ７．４、５００ｍｍｏｌ／Ｌ ＮａＣｌ、１ｍｏｌ／Ｌイミダゾール）でタンパク質を溶出した。
【００８２】
Ａｍｉｃｏｎ Ｕｌｔｒａ−１５（ＭＷＣＯ＝１０，０００；Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社）を用いてタンパク質を濃縮し、１０ｍｍｏｌ／Ｌ ＤＴＴ（Ｗａｋｏ社）を含むＰＢＳ（ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｂｕｆｆｅｒｄ ｓａｌｉｎｅ；Ｔａｋａｒａ社）へのバッファー交換を行い、ＯＤ２８０を測定した。ヒトＫｅａｐ１−ＤＣのモル吸光係数（ε２８０＝５８，３３０ｃｍ−１Ｍ−１）及び分子量（３４．５ｋＤａ）からタンパク濃度を算出した。得られたタンパク質は、終濃度１０％になるようにグリセロール（Ｗａｋｏ）を加え、−３０℃にて保存した。
【００８３】
（４）ヒトＫｅａｐ１−ＤＣタンパク質の確認：
上記（３）にて得られたタンパク質について、ＳＤＳ−ＰＡＧＥを行った。得られたタンパク質溶液にＮｕＰＡＧＥ ＬＤＳ Ｓａｍｐｌｅ Ｂｕｆｆｅ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）及びＮｕＰＡＧＥ Ｓａｍｐｌｅ Ｒｅｄｕｃｉｎｇ Ａｇｅｎｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を加えて１００℃にて５分間、タンパクを加熱変性させた。ＮｕＰＡＧＥ ４−１２％ Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ ｇｅｌ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）及びＮｕＰＡＧＥ ＭＥＳ ＳＤＳ Ｒｕｎｎｉｎｇ緩衝液（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を用いて２００Ｖ、３５分間泳動した。なお、分子量マーカーにはＮｏｖｅｘ Ｓｈａｒｐ Ｐｒｅ−ｓｔａｉｎｅｄ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｔａｎｄａｒｄ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を用いた。泳動終了後、ＳｉｍｐｌｙＢｌｕｅ Ｓａｆｅ Ｓｔａｉｎ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を用いてゲルをＣＢＢ染色し、ヒトＫｅａｐ１−ＤＣの分子量相当位置にバンドを確認した。
【００８４】
（実施例６）環状ペプチド５のＫｅａｐ１結合試験：
環状ペプチド５について、蛍光偏光解消法を用い、Ｋｅａｐ１結合試験を行った。実施例５で得られたヒトＫｅａｐ１−ＤＣタンパク質（最終濃度０、０．１、０．３、１．０、３．０、１０、３０、１００ｎＭ）と環状ペプチド５（最終濃度３ｎＭ）を含むＰＢＳバッファー溶液５０μＬを、プレートリーダー用９６穴プレートに添加し、プレートシールをして室温、暗所にて１時間静置後、プレートリーダー（ＦＬＩＰＲ ＴＥＴＲＡ；Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ社）で、蛍光偏光強度(励起波長４８８ｎｍ、観測波長５３０±１５ｎｍ)を測定した。測定は２度行い、その蛍光偏光強度の平均値を算出した。
【００８５】
ヒトＫｅａｐ１−ＤＣタンパク質無添加時の蛍光偏光強度の平均値から、各濃度のヒトＫｅａｐ１−ＤＣタンパク質を添加したときの蛍光偏光強度平均値を差し引くことにより、環状ペプチド５の結合濃度（Ｂ）及び非結合濃度（Ｆ）を算出した。表計算ソフトＭｉｃｒｏｓｏｆｔ Ｅｘｃｅｌ（Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ社）により、算出した各濃度におけるＢ／Ｆ及びＢをプロットし、直線回帰した直線の傾きから解離定数(Ｋｄ)を求めた。その結果、環状ペプチド５の解離定数（Ｋｄ）２．０ｎＭであった。したがって、環状ペプチド５が、ヒトＫｅａｐ１−ＤＣタンパク質との強い結合能を有することが示された。
【００８６】
（実施例７）
環状ペプチド５を用いたＫｅａｐ１結合阻害物質のスクリーニング
環状ペプチド５を用いて、蛍光偏光解消法を用い、Ｋｅａｐ１結合阻害物質のスクリーニングを行った。被験物質として、直鎖ペプチド１及び環状ペプチド１〜４を用いた。
実施例５で得られたヒトＫｅａｐ１−ＤＣタンパク質（最終濃度１０ｎＭ）、環状ペプチド５（最終濃度３ｎＭ）及び被験物質（最終濃度０．３〜３００ｎＭ）を含むＰＢＳバッファー溶液１２μＬをプレートリーダー用３８４穴プレートに添加し、プレートシールをして室温、暗所にて１時間静置後、プレートリーダー（ＦＬＩＰＲ ＴＥＴＲＡ；Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ社）で、蛍光偏光強度（励起波長４８８ｎｍ、観測波長５３０±１５ｎｍ）を測定した。測定は被験物質濃度毎に２度行い、その蛍光偏光強度の平均値を算出した。被験物質無添加時の蛍光偏光強度の平均値から、被験物質添加時の蛍光偏光強度平均値を差し引くことにより、結合率を算出した。被験物質の蛍光偏光を５０％阻害する被験物質の濃度（ＩＣ５０）は、表計算ソフトＭｉｃｒｏｓｏｆｔ Ｅｘｃｅｌ（Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ社）により、５０％に最も近い点とそれを挟む２点の計３点で直線回帰することにより算出した。その結果を表１に示す。
【００８７】
【表１】
【００８８】
測定した環状ペプチド１〜４はすべて、Ｎｒｆ２部分ペプチドである直鎖ペプチド１よりも強いＫｅａｐ１結合阻害活性を有することが示された。また、環状ペプチド５が、市販のプレートリーダーを用いた簡便な測定によるＫｅａｐ１結合阻害物質のスクリーニングに使用でできることが示された。
【００８９】
（実施例８）血漿中安定性試験：
直鎖ペプチド１、環状ペプチド１及び４について、血漿中消失量を測定した。へパリン添加ヒト血漿をリン酸緩衝生理食塩水希釈して、１０％希釈ヒト血漿を調製した。次いで、被験ペプチドの１０ｍＭ ＤＭＳＯ溶液を１０％希釈ヒト血漿に加え、被験ペプチド最終濃度２０μＭの試験溶液（２００μＬ）を調製した。試験溶液を３７℃で保温し、０、５、１０、２０、２４０分後にそれぞれ冷却したアセトニトリル２００μＬを加え反応を止めた。これを３０００ｒｐｍ、１０分の条件で遠心分離し、得られた上清をフィルターでろ過した後、ろ液４０μＬを超高速液体クロマトグラフィー（Ｕｌｔｒａ Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ Ｌｉｑｕｉｄ Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ；ＵＰＬＣ）で分析した。
【００９０】
ＵＰＬＣはＡＣＱＵＩＴＹ（登録商標）ＵＰＬＣ（日本ウォーターズ社）を用い、検出器には、ＡＣＱＵＩＴＹ（登録商標）ＵＰＬＣフォトダイオードアレイ（Ｐｈｏｔｏｄｉｏｄｅ Ａｒｒａｙ；以下、ＰＤＡ）検出器２９９６ＰＤＡ（日本ウォーターズ社）を用いた。検出波長は２１０〜３５０ｎｍとし、分析対象物にとって最適な波長を選択した。解析ソフトはＥｍｐｏｗｅｒ２（日本ウォーターズ社）を使用した。カラムはＣＡＰＣＥＬＬ ＰＡＫ Ｃ１８ ＭＧＩＩＩ、５μＭ、２．１ｍｍ ＩＤ×５０ｍｍ（資生堂社）を使用し、移動相には０．０８％トリフルオロ酢酸／Ｈ２Ｏとアセトニトリルを用い、流速０．５ｍＬ／分で、４分間でアセトニトリルを直線勾配（１→６０％）で増加させた。その結果を表２に示す。
【００９１】
【表２】
【００９２】
環状ペプチド１及び４の残存率は、２４０分後で７８及び８９％で、血漿中でほとんど分解されることがなかった。一方、直鎖ペプチド１の残存率は、１２％であった。これらの結果から、Ｎｒｆ２部分ペプチドである直鎖ペプチド１に比べて、環状ペプチド１及び４は顕著な血漿中安定性を有し、血漿中で極めて安定に存在することは明らかである。
【産業上の利用可能性】
【００９３】
本発明の新規環状ペプチドを使用すれば、Ｋｅａｐ１結合阻害化合物を効率よく簡便にスクリーニングすることができ、当該スクリーニングにより得られるＫｅａｐ１結合阻害化合物は、細胞の酸化ストレス防御機構を促進し、酸化ストレスによって引き起こされる疾患の治療又は予防に有効な治療薬となり得る。
【配列表フリーテキスト】
【００９４】
配列番号１、３及び4：環状ペプチド
配列番号２：環状ペプチド；そのC末端は、アミド（−ＣＯＮＨ２）型で、リジン残基の側鎖のアミノ基とアスパラギン酸残基の側鎖のカルボキシル基とは、アミド結合でクロスリンクしている。
配列番号５：環状ペプチド；そのＮ末端は、カルボキシルフルオロセインで標識されている。
配列番号６：合成ペプチド
配列番号７〜１０：ＰＣＲプライマー
【技術分野】
【０００１】
本発明は、環状ペプチド及びその修飾ペプチド並びにＫｅｌｃｈ様ＥＣＨ結合タンパク質１の結合阻害物質のスクリーニング方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
生体は、酸化と抗酸化のバランスを調節し、細胞内酸化還元状態を一定に維持して機能している。この酸化と抗酸化のバランスが酸化方向に傾いた状態を酸化ストレスという。
【０００３】
酸化ストレスは、脂質、ＤＮＡ、タンパク質等の生体高分子に修飾や障害を与え、細胞機能障害や細胞死を引き起こすことが知られ、発癌、高血圧、動脈硬化、脳神経変性疾患、炎症性疾患、喘息、皮膚疾患、加齢黄斑変性、白内障といった加齢に伴う慢性疾患の発症や進行にも深く関与していると言われている。このため、酸化ストレスの防御機構は、生体にとって必須の生体防御システムであり、酸化ストレスに対する防御能力を高めることは、上記の慢性疾患の予防や治療に有用であると考えられている（非特許文献１）。
【０００４】
近年、ＮＦ−Ｅ２関連因子２（ＮＦ−Ｅ２−ｒｅｌａｔｅｄ ｆａｃｔｏｒ ２；以下、Ｎｒｆ２と略すことがある。）が、哺乳類の酸化ストレス防御機構において中心的な役割を果たすことが明らかとなった。
【０００５】
Ｎｒｆ２は、親電子性物質を直接解毒する異物代謝系第２相酵素（例えば、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ、キノンオキシドレダクターゼ）や抗酸化酵素（例えば、ヘムオキシゲナーゼ、ペルオキシレドキシン）といった解毒酵素群の遺伝子発現を制御する転写因子である。Ｎｒｆ２は、定常状態では、細胞内でＫｅｌｃｈ様ＥＣＨ結合タンパク質１（Ｋｅｌｃｈ−ｌｉｋｅ ＥＣＨ ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ １；以下、Ｋｅａｐ１と略すことがある。）と複合体を形成して不活化状態となっており、さらにこの複合体は速やかにユビキチン化され分解されることにより負に制御されている。
【０００６】
ところが、生体が親電子性物質や活性酸素種等の非特異的な酸化ストレスに暴露されると、Ｎｒｆ２はＫｅａｐ１から解離することにより活性化され、核へ移行することとなる。核に移行したＮｒｆ２は、抗酸化剤応答配列（ａｎｔｉｏｘｉｄａｎｔ ｒｅｓｐｏｎｓｉｖｅ ｅｌｅｍｅｎｔ：以下、ＡＲＥ）と呼ばれるプロモーター配列に結合し、上記の解毒酵素群の遺伝子の発現を誘導することによって生体異物の解毒・排泄を導き、酸化ストレスから生体を防御するために機能している（非特許文献２）。
【０００７】
一方、Ｎｒｆ２は、Ｋｅａｐ１と結合するＫｅａｐ１結合ドメイン（Ｋｅａｐ１ ｂｉｎｄｉｎｇ ｄｏｍａｉｎ；以下、ＫＢＤと略すことがある。)と、ＡＲＥと結合するＡＲＥ結合ドメインとから構成されていることが知られており、Ｎｒｆ２のＫＢＤのみからなる切断型のリコンビナントタンパク質を強制発現させた細胞では、酸化ストレスに暴露されなくても、Ｎｒｆ２がＫｅａｐ１と解離して酸化ストレスに対する防御機構が活性化されることが知られている（非特許文献３）。このことは、Ｋｅａｐ１と結合し、Ｎｒｆ２とＫｅａｐ１との結合を阻害する物質は、Ｎｒｆ２によって引き起こされる酸化ストレスの防御機構を活性化させる作用を有していることを示している。
【０００８】
したがって、Ｋｅａｐ１とＮｒｆ２との結合を阻害する物質（以下、Ｋｅａｐ１結合阻害物質と略すことがある。）は、非特異的な酸化ストレスを与えなくても、Ｎｒｆ２の転写因子活性を誘導し、細胞の酸化ストレスに対する防御機構を活性化し、酸化ストレスに起因する疾患の治療又は予防に有効な薬物になると期待されている。Ｋｅａｐ１と結合する物質としては、Ｎｒｆ２のＫＢＤの一部のアミノ酸配列を有するペプチド（以下、Ｎｒｆ２部分ペプチドと略すことがある。）及びそのホモログについての報告がある。（非特許文献４）。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００９】
【非特許文献１】Ｃａｒｌｏｓ Ｆｅｒｒａｒｉら、Ｂｉｏｍｅｄｉｃｉｎｅ Ｐｈａｒｍａｃｏｔｈｅｒａｐｙ、２００３年、５７巻、p.２５１〜２６０
【非特許文献２】Ｔｒｕｙｅｎ Ｎｇｕｙｅｎら、Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、 ２００９年、２８４巻、２０号、ｐ．１３２９１〜１３２９５
【非特許文献３】Ｍａｓａａｋｉ Ｋｏｍａｔｓｕら、Ｎａｔｕｒｅ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ、２０１０年、１２巻、３号、ｐ．２１３〜２２４
【非特許文献４】Ｓｈｉｈ−Ｃｈｉｎｇ Ｌｏら、Ｔｈｅ ＥＭＢＯ Ｊｏｕｒｎａｌ、２００６年、２５巻、１５号、ｐ．３６０５〜３６１７
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
しかしながら、Ｋｅａｐ１結合阻害物質を同定するためには、Ｎｒｆ２とＫｅａｐ１との結合阻害活性を感度よく検出するスクリーニング系を構築する必要がある。その一方で、生体内では、Ｎｒｆ２はＫｅａｐ１と結合して速やかに消失してしまうため、機能を保持したＮｒｆ２を単離することは困難であり、また単離された報告もない。
【００１１】
また、Ｎｒｆ２部分ペプチド及びそのホモログは、安定性が悪く、分子量も大きいため、蛍光偏光減少法や１分子蛍光測定法等のハイスループットスクリーニング法（以下、ＨＴＳ法と略すことがある。）には不向きであり、検出感度も悪いためにＫｅａｐ１結合阻害物質のスクリーニングに使用するのは困難であった。
【００１２】
そこで本発明は、分子量が小さく、かつ、Ｎｒｆ２とＫＢＤを介して結合する新規環状ペプチド及びこれを用いたＫｅａｐ１結合阻害物質のスクリーニング方法を提供することを目的としている。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
本発明者らは、上記課題を解決するため鋭意検討した結果、新規な環状ペプチドがＫｅａｐ１結合阻害物質のスクリーニングに適していることを見出し、本発明を完成させるに至った。
【００１４】
すなわち、本発明は、以下の一般式（Ｉ）で示されるペプチドを含む環状ペプチド又はその薬理学的に許容される塩を提供する。
Ｙ１−Ｙ２−Ｇｌｕ−Ｙ３−Ｇｌｙ−Ｇｌｕ・・・（Ｉ）
[式中、Ｙ１は、アスパラギン残基又はアスパラギン酸残基を表し、Ｙ２は、アミノ酸残基を表し、Ｙ３は、スレオニン残基、セリン残基、アスパラギン残基又はアスパラギン酸残基を表す。］
【００１５】
上記環状ペプチド又はその薬理学的に許容される塩は、以下の一般式（ＩＩ）で示されることが好ましい。
【化１】
[式中、Ｘは、直接のアミド結合、アミノ酸残基又は２〜６個のアミノ酸残基からなるペプチド表し、Ｙ１は、アスパラギン残基又はアスパラギン酸残基を表し、Ｙ２は、アミノ酸残基を表し、Ｙ３は、スレオニン残基、セリン残基、アスパラギン残基又はアスパラギン酸残基を表し、Ｚは、直接の共有結合、−ＳＳ−、−ＮＨＣＯ−、−ＣＯＮＨ−、−Ｎ（ＣＨ３）ＣＯ−、−ＣＯＮ（ＣＨ３）−、−Ｓ−、−Ｏ−、−ＣＯ−又は−ＮＨ−を表し、Ｒ１は、ＣＯＮＨ−、ＮＨ２−、又は水素原子を表し、Ｒ２は、−ＣＯＯＨ、−ＣＯＮＨ２、又は水素原子を表し、ｍ及びｎは、それぞれ独立して、０〜４を表す。］
【００１６】
また上記環状ペプチドは、一般式（ＩＩ）において、Ｚが−ＳＳ−を表し、Ｒ１がＣＯＮＨ−又はＮＨ２−を表し、Ｒ２が−ＣＯＯＨ又は−ＣＯＮＨ２を表し、かつ、ｍ及びｎが１を表すか、Ｚが−ＮＨＣＯ−を表し、ｍが３又は４を表し、かつ、ｎが２又は３を表すか、又は、Ｚが−ＣＯＮＨ−を表し、ｍが２又は３を表し、ｎが３又は４を表すことが好ましい。
【００１７】
さらに上記環状ペプチドは、一般式（ＩＩ）において、Ｘが、直接のアミド結合又は２個のアミノ酸残基からなるペプチド表すか、Ｙ２が、プロリン残基であるか、Ｙ３が、スレオニン残基であることが好ましく、配列表の配列番号１〜４で示されるアミノ酸配列のいずれかを含むことがさらに好ましい。
【００１８】
上記環状ペプチドは、酸化ストレスに影響を与える物質を評価するためのさまざまな実験系において、ｋｅａｐ１結合阻害リガンド、すなわち、酸化ストレスを与えることなく、Ｎｒｆ２とｋｅａｐ１との結合を阻害するリガンドとして使用できる。特異に、生体及び細胞における酸化ストレスの防御機構を解明するためのツール、酸化ストレス応答能を測定するための検出ツール又は酸化ストレスの診断用ツールとしての使用に適している。
【００１９】
また本発明は、上記の環状ペプチドの修飾ペプチドを提供する。
【００２０】
上記の修飾ペプチドは、配列表の配列番号５で示されるアミノ酸配列を含む環状の修飾ペプチドであることが好ましい。上記の修飾ペプチドは、ｋｅａｐ１との結合に関与しないアミノ（Ｎ）末端又はカルボキシ（Ｃ）末端を蛍光基で修飾されていることがさらに好ましく、蛍光基が発する蛍光を指標とすることで、Ｋｅｌｃｈ様ＥＣＨ結合タンパク質１の結合阻害物質のスクリーニングに好適に使用できる。
【００２１】
さらに本発明は、Ｋｅｌｃｈ様ＥＣＨ結合タンパク質１の結合阻害物質のスクリーニング方法であって、被験物質の存在下及び非存在下において、上記の環状の修飾ペプチドとＫｅｌｃｈ様ＥＣＨ結合タンパク質１とを溶液中で接触させ、この修飾ペプチドとＫｅｌｃｈ様ＥＣＨ結合タンパク質１との結合量を測定する測定ステップと、上記被験物質の存在下における上記修飾ペプチドとＫｅｌｃｈ様ＥＣＨ結合タンパク質１との結合量（ＢＴ）と、上記被験物質の非存在下における上記修飾ペプチドとＫｅｌｃｈ様ＥＣＨ結合タンパク質１との結合量（ＢＣ）とを比較する比較ステップと、上記ＢＴが、上記ＢＣよりも少ない場合に、上記被験物質はＫｅｌｃｈ様ＥＣＨ結合タンパク質１の結合阻害物質であると判定する判定ステップと、を備えるスクリーニング方法を提供する。
【００２２】
上記スクリーニング方法における結合量の測定法としては、例えば、蛍光偏光解消法、１分子蛍光測定法、酵素免疫測定(Ｅｎｚｙｍｅ ｌｉｎｋｅｄ ｉｍｍｕｎｏｓｏｌｖｅｎｔ ａｓｓａｙ；ＥＩＡ)法、表面プラズモン共鳴（Ｓｕｒｆａｃｅ ｐｌａｚｍｏｎ ｒｅｓｏｎａｎｃｅ；ＳＰＲ）法、等温滴定型熱量測定（Ｉｓｏｔｈｅｒｍａｌ Ｔｉｔｒａｔｉｏｎ Ｃａｌｏｒｉｍｅｔｅｒ；ＩＴＣ）法が適しており、使用する環状ペプチドは、ＦＬＡＧタグやビオチンで修飾した環状ペプチドが適している。
【発明の効果】
【００２３】
本発明の環状ペプチドは、ｋｅａｐ１結合阻害化合物の同定を効率的に行うことを可能とし、酸化ストレスによって引き起こされる疾患の新規な治療薬及び予防薬のスクリーニングに使用できる。また本発明の環状ペプチドは、Ｎｒｆ２及びＮｒｆ２部分ペプチドに比べて、血漿中及び肝ミクロソーム中においての安定性が高いため、未精製のｋｅａｐ１含有溶液を用いた場合であっても、ｋｅａｐ１結合阻害化合物のスクリーニングを簡便かつ高感度に実施することができる。
【図面の簡単な説明】
【００２４】
【図１】Ｎｒｆ２部分ペプチドである直鎖ペプチド１のアミノ酸配列と化学構造式を示した図である。
【図２】Ｎｒｆ２部分ペプチドである直鎖ペプチド１のラマチャンドランプロットを示した図である。
【発明を実施するための形態】
【００２５】
本発明の環状ペプチド又はその薬理学的に許容される塩は、以下の一般式（Ｉ）で示されるペプチドを含むことを特徴としている。
Ｙ１−Ｙ２−Ｇｌｕ−Ｙ３−Ｇｌｙ−Ｇｌｕ・・・（Ｉ）
[式中、Ｙ１は、アスパラギン残基又はアスパラギン酸残基を表し、Ｙ２は、アミノ酸残基を表し、Ｙ３は、スレオニン残基、セリン残基、アスパラギン残基又はアスパラギン酸残基を表す。］
【００２６】
「環状ペプチド」とは、アミノ酸がペプチド結合でつながってできるポリペプチドのＮ末端とＣ末端が、ペプチド結合又はアミノ酸残基以外の分子を介してアミド結合でつながってできる環化したポリペプチドのことをいう。環状ペプチドを構成するアミノ酸は、天然型アミノ酸のみならず、非天然型アミノ酸であってもよく、不斉中心を有するアミノ酸残の場合には、エナンチオマー、ジアステレオマー又はそれらの混合物のいずれもが含まれ得る。
【００２７】
また、ポリペプチドのＮ末端とＣ末端の結合には、リンカーを介して結合させることが可能であり、この場合のリンカーには、２つ以上の官能基を有し、ペプチドのＮ末端又はＣ末端とアミド結合可能な官能基少なくとも１つ以上を有する原子団（ビルディングブロック）であれば使用できる。ビルディングブロックとしては、例えば、アミノ酸、ペプチド、ジアミン、ジカルボキシル、メルカプトカルボキシルが挙げられる。
【００２８】
「薬理学的に許容される塩」としては、例えば、硫酸、塩酸、燐酸等の鉱酸との塩、酢酸、シュウ酸、乳酸、酒石酸、フマル酸、マレイン酸、メタンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸等の有機酸との塩、トリメチルアミン、メチルアミン等のアミンとの塩又はナトリウムイオン、カリウムイオン、カルシウムイオン等の金属イオンとの塩が挙げられる。
【００２９】
上記の環状ペプチドは、当業者であれば使用なペプチド合成の常法手段（「ペプチド合成の基礎と実験」、１９８５年、丸善（株）に記載の方法）で製造でき、液相合成法又は固相合成法のいずれの方法を使用しても合成できる。例えば、ペプチド自動合成装置を使用して、固相上でＣ末端からＮ末端方向に向けて順次アミド化反応によるアミノ酸の付加とＮ末端保護基の脱保護を繰り返して上記の一般式（Ｉ）で示されるペプチドを含むペプチドを合成し、アミノ酸側鎖の保護基の脱保護と固相からの切り出しを行った後に縮合剤を添加して分子内環化反応を行えば、上記の環状ペプチドを得ることができる。
【００３０】
上記の脱保護及び固相からの切り出しに用いる試薬としては、例えば、トリフルオロ酢酸、臭化水素酸−酢酸混合溶液、ピペリジン又は接触還元法が挙げられる。
【００３１】
分子内環化反応としては、例えば、システイン残基とシステイン残基の間を公知の方法でＳ−Ｓ結合させることにより行なうことができる。具体的には、５，５’―ジチオビス（２−ニトロ安息香酸）を使用したＤＴＮＢ法や、銅等の金属触媒の存在下での空気酸化によって、環化することができる。
【００３２】
このようにして製造された環状ペプチドは、反応終了後、ペプチドの分離精製手段、例えば、溶媒抽出、蒸留、分配、再沈殿、再結晶、カラムクロマトグラフィー、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）、ゲル濾過、イオン交換クロマトグラフィー等を組み合わせて採取すればよい。
【００３３】
上記環状ペプチド又はその薬理学的に許容される塩は、以下の一般式（ＩＩ）で示されることが好ましい。
【化２】
[式中、Ｘは、直接のアミド結合、アミノ酸残基又は２〜６個のアミノ酸残基からなるペプチド表し、Ｙ１は、アスパラギン残基又はアスパラギン酸残基を表し、Ｙ２は、アミノ酸残基を表し、Ｙ３は、スレオニン残基、セリン残基、アスパラギン残基又はアスパラギン酸残基を表し、Ｚは、直接の共有結合、−ＳＳ−、−ＮＨＣＯ−、−ＣＯＮＨ−、−Ｎ（ＣＨ３）ＣＯ−、−ＣＯＮ（ＣＨ３）−、−Ｓ−、−Ｏ−、−ＣＯ−又は−ＮＨ−を表し、Ｒ１は、ＣＯＮＨ−、ＮＨ２−、又は水素原子を表し、Ｒ２は、−ＣＯＯＨ、−ＣＯＮＨ２、又は水素原子を表し、ｍ及びｎは、それぞれ独立して、０〜４を表す。］
【００３４】
9月Ｎｒｆ２部分ペプチドの両末端はβシート構造を形成し、Ｎ末端とＣ末端のペプチド主鎖間の距離をβシート構造形成に適切な距離に保っているので、Ｋｅｌｃｈ様ＥＣＨ結合タンパク質１との結合するためには、一般式（ＩＩ）におけるｍ及びｎは炭素数０〜４個からなるメチレン鎖であることが好ましい。また、一般式（ＩＩ）において、Ｙ１−Ｙ２−Ｇｌｕ−Ｙ３部分はγターン構造を形成し、Ｇｌｙ−Ｇｌｕ部分はβバルシ構造を形成しており、Ｋｅｌｃｈ様ＥＣＨ結合タンパク質１との結合時にこれら構造を保持したままでＺ部分を共有結合で結んで環状ペプチドとするには、Ｘは０〜６残基のアミノ酸で構成されることが好ましい。さらに、Ｙ３のアミノ酸残基の側鎖は、グリシン残基主鎖のＮＨ基と水素結合してβバルジ構造を安定化する効果を有するスレオニン残基、セリン残基、アスパラギン残基又はアスパラギン酸残基であることが好ましい。
【００３５】
また上記環状ペプチドは、一般式（ＩＩ）において、Ｚが−ＳＳ−を表し、Ｒ１がＣＯＮＨ−又はＮＨ２−を表し、Ｒ２が−ＣＯＯＨ又は−ＣＯＮＨ２を表し、かつ、ｍ及びｎが１を表すか、Ｚが−ＮＨＣＯ−を表し、ｍが３又は４を表し、かつ、ｎが２又は３を表すか、又は、Ｚが−ＣＯＮＨ−を表し、ｍが２又は３を表し、かつ、ｎが３又は４を表すことが好ましい。
【００３６】
一般式（ＩＩ）において、Ｚが−ＳＳ−で表され、Ｒ１がＣＯＮＨ−又はＮＨ２−で表され、Ｒ２が−ＣＯＯＨ又は−ＣＯＮＨ２で表され、かつ、ｍ及びｎが１で表される環状ペプチドを合成する場合には、Ｎ末端及びＣ末端にシステイン残基を用い、上記の分子内環化反応によって環化することができる。また、Ｚが−ＮＨＣＯ−で表され、Ｒ１がＣＯＮＨ−又はＮＨ２−で表され、Ｒ２が−ＣＯＯＨ又は−ＣＯＮＨ２で表され、ｍが３又は４で表され、かつ、ｎが２又は３で表される環状ペプチドは、Ｎ末端にリジン残基又はオルニチン残基を用い、かつ、Ｃ末端にアスパラギン酸残基又はグルタミン酸残基を用いて、合成することができる。さらに、Ｚが−ＣＯＮＨ−で表され、Ｒ１がＣＯＮＨ−又はＮＨ２−で表され、Ｒ２が−ＣＯＯＨ又は−ＣＯＮＨ２で表され、ｍが２又は３で表され、かつ、ｎが３又は４で表される環状ペプチドは、Ｎ末端にアスパラギン酸残基又はグルタミン酸残基を用い、かつＣ末端にリジン残基又はオルニチン残基を用いて、合成することができる。例えば、実施例３に記載した方法と同様に、これらＮ末端及びＣ末端のアミノ酸の側鎖を予め選択的に脱保護できる適切な保護基で保護しておき、他のアミノ酸側鎖の保護基が脱保護されない条件で脱保護し、脱保護された側鎖間を縮合反応させることで、環化することができる。
【００３７】
さらに上記環状ペプチドは、一般式（ＩＩ）において、Ｘが、直接のアミド結合又は２個のアミノ酸残基からなるペプチド表すか、Ｙ２が、プロリン残基であるか、Ｙ３が、スレオニン残基であることが好ましく、配列表の配列番号１〜４で示されるアミノ酸配列のいずれかを含むことがさらに好ましい。
【００３８】
一般式（ＩＩ）において、Ｘが直接のアミド結合又は２個のアミノ酸残基からなるペプチドであることは、ペプチドがＫｅｌｃｈ様ＥＣＨ結合タンパク質１との結合時の立体構造であるγターン及びβバルジ構造を形成したときに、Ｎ末端側のメチレン鎖（ＣＨ３）ｍとＣ末端側のメチレン鎖（ＣＨ３）ｎが、互いに丁度向かい合う位置にくることができる点で好まししい。一般式（ＩＩ）において、Ｙ２がプロリン残基であることは、γターン形成に必要なペプチド主鎖の２面角を安定させる効果があり、特に好ましい。また、Ｙ３のアミノ酸残基の側鎖は、Ｇｌｙ主鎖のＮＨ基と水素結合してβバルジ構造を安定化する効果が高いスレオニン残基であることが特に好ましい。さらに、Ｙ１はＧｌｕ−Ｙ３部分のペプチド主鎖の２つのＮＨ基と水素結合を形成できる側鎖を有するアスパラギン酸残基であることが、Ｋｅｌｃｈ様ＥＣＨ結合タンパク質１との結合を高める上で、好都合である。
【００３９】
また本発明の修飾ペプチドは、上記の環状ペプチドが修飾されていることを特徴としており、蛍光強度を指標とするスクリーニング方法において使用する場合には、環状ペプチドを蛍光基で修飾した修飾ペプチドであることが好ましい。抗体を利用したスクリーニング方法において使用する場合には、抗体で認識されるペプチド、例えば、ヒスチジン６残基からなるペプチド（Ｈｉｓ−ｔａｇ）やＦＬＡＧ配列ペプチド等のスクリーニングにおいて汎用される抗体で認識される配列を有するペプチドで修飾することが好ましい。また、ビオチンとアビジンの結合を利用したスクリーニング方法において使用する場合には、ビオチンで修飾した環状ペプチドを使用することができる。さらに、本発明の環状ペプチドのＮ末端およびＣ末端は、Ｋｅｌｃｈ様ＥＣＨ結合タンパク質１との結合に直接関与していないため、Ｎ末端およびＣ末端に様々な修飾を加えても、結合活性は保持されるため、スクリーニングで使用する測定方法に応じて、環状ペプチドに修飾を加える部位としては、Ｎ末端およびＣ末端が特に好都合である。配列表の配列番号５で示されるアミノ酸配列を含む、蛍光基でＮ末端を修飾した環状ペプチドは、修飾によってＫｅｌｃｈ様ＥＣＨ結合タンパク質１との結合が減弱することが無く、蛍光強度を指標とするスクリーニング方法での利用に特に適している。
【００４０】
「修飾ペプチド」とは、上記の環状ペプチドを構成する上記の一般式（Ｉ）で示されるペプチドを含むペプチド鎖のＮ末端、Ｃ末端、アミノ酸側鎖又はアミド結合している窒素原子のうちの１箇所以上が、化学結合によって修飾されている環状ペプチドを意味する。修飾で付加される化学構造には、例えば、蛍光基、ペプチド、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ビオチン、ヨウ素原子等が挙げられる。
【００４１】
「蛍光基」とは、特定の波長領域の光を吸収し、特定の波長領域の蛍光を発する原子団を意味する。例えば、フルオロセインイソシアネート（ＦＩＴＣ）、ローダミン等が挙げられる。以下に記載する蛍光偏光解消法や１分子蛍光測定法等を利用し、蛍光を指標としたｋｅａｐ１結合阻害化合物スクリーニングで使用するには、蛍光基で修飾されていることが好ましいく、この場合には、ｋｅａｐ１との結合に関与しないアミノ（Ｎ）末端又はカルボキシ（Ｃ）末端を蛍光基で修飾することとなる。具体的には、Ｎ末端のアミノ基を、フルオロセインイソシアネート（ＦＩＴＣ）やカルボキシルフルオロセイン（ＦＡＭ）等の蛍光基で修飾したペプチドは、蛍光を指標としたスクリーニングでの使用に適している。
【００４２】
また本発明のＫｅｌｃｈ様ＥＣＨ結合タンパク質１の結合阻害物質のスクリーニング方法は、被スクリーニング物質の存在下及び非存在下において、上記の環状の修飾ペプチドとＫｅｌｃｈ様ＥＣＨ結合タンパク質１とを溶液中で接触させ、この修飾ペプチドとＫｅｌｃｈ様ＥＣＨ結合タンパク質１との結合量を測定する測定ステップと、上記被スクリーニング物質の存在下における上記修飾ペプチドとＫｅｌｃｈ様ＥＣＨ結合タンパク質１との結合量（ＡＴ）と、上記被スクリーニング物質の非存在下における上記修飾ペプチドとＫｅｌｃｈ様ＥＣＨ結合タンパク質１との結合量（ＡＣ）とを比較する比較ステップと、上記ＡＴが、上記ＡＣよりも少ない場合に、上記被スクリーニング物質はＫｅｌｃｈ様ＥＣＨ結合タンパク質１の結合阻害物質であると判定する判定ステップと、を備えることを特徴としている。
【００４３】
以下に上記の環状ペプチドを用いたｋｅａｐ１結合阻害化合物のスクリーニング方法について説明する。
【００４４】
上記のスクリーニング方法におけるｋｅａｐ１の結合阻害の測定法としては、例えば、蛍光偏光解消法、１分子蛍光測定法、酵素免疫測定（Ｅｎｚｙｍｅ ｌｉｎｋｅｄ ｉｍｍｕｎｏｓｏｌｖｅｎｔ ａｓｓａｙ；ＥＩＡ）法、表面プラズモン共鳴（Ｓｕｒｆａｃｅ ｐｌａｚｍｏｎ ｒｅｓｏｎａｎｃｅ；ＳＰＲ）法が挙げられ、いずれの方法も測定シグナル強度がＫｅｌｃｈ様ＥＣＨ結合タンパク質１と環状ペプチドとの結合量Ａに比例する方法であるため、被スクリーニング物質存在下での環状ペプチドの結合量ＡＣ及び被スクリーニング物質非存在下での環状ペプチドの結合量ＡＴの測定に好適に使用できる。
【００４５】
特に、蛍光偏光解消法は、血漿中の薬物濃度を定量する蛍光偏光免疫測定法（Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ Ｐｏｌａｒｉｚａｔｉｏｎ Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ；ＦＰＩＡ）でも使用される測定法で、血漿や細胞ホモジネートの上清等の夾雑物存在下でも感度よく測定できることが知られており、上記のｋｅａｐ１結合阻害化合物のスクリーニングにおいて精製したｋｅａｐ１を必要としない点で優れている。
また、蛍光偏光解消法は、結合物（Ｂ）と非結合物（Ｆ）との分離、いわゆるＢ／Ｆ分離を必要とせず、標的タンパク質及びペプチドのいずれも固相上に担持する必要がない。このため、Ｂ／Ｆ分離を必要とする放射性同位元素を用いた評価方法及びＥＩＡ法や、標的タンパク質又はペプチドのいずれかを固相上に担持する必要のあるＥＩＡ法やＳＰＡ法等の評価方法に比べて、より簡便にスクリーニングできる。
【００４６】
蛍光偏光解消法のスクリーニングに使用するｋｅａｐ１は、全長のｋｅａｐ１の代わりに下記実施例記載のｋｅａｐ１−ＤＣと呼ばれるアミノ酸残基番号３２１−６０９からなるｋｅａｐ１がＮｒｆ２と結合する領域（非特許文献３を参照）を発現し、精製して用いることができるが、未精製のｋｅａｐ１を用いてもよい。さらに、ｋｅａｐ１を発現している細胞のホモジネートの上清でもよい。例えば、培養したヒト肝がん細胞由来株化細胞Ｈｕｈ−７を氷冷バッファー（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．４）にてホモジナイズした後、遠心分離（１２，０００×ｇ、２０分、４℃）し、回収した上清をスクリーニングに用いることができる。
【００４７】
蛍光偏光解消法に用いる環状ペプチドは、蛍光基で修飾した環状ペプチドを用いる。下記実施例では、蛍光基として環状ペプチドのＮ末端のアミノ基に容易に修飾できるＦＡＭを用いた。蛍光基としては、蛍光偏光解消法で一般に使用されている蛍光基、例えばＦＩＴＣ，ローダミン等を使用でき、プレートリーダーで測定可能な励起及び吸収波長を有するものを選択して、使用する。
【００４８】
蛍光偏光解消法に用いる測定装置としては、蛍光偏光解消法測定に対応している、９６穴又は３８６穴プレート対応の市販のプレートリーダーを用いることができる。
【００４９】
被スクリーニング化合物のｋｅａｐ１阻害能は、以下ようにして算出できる。
【００５０】
まず、蛍光基で修飾した環状ペプチドの蛍光偏光強度（Ｉ０）を測定する。次に、ｋｅａｐ１添加時の蛍光偏光強度（Ｉｍａｘ）を測定する。その後、被スクリーニング化合物を添加し、蛍光偏光強度（Ｉｏｂｓ）を測定する。被スクリーニング化合物が蛍光基で修飾した環状ペプチドとｋｅａｐ１との結合を阻害した割合は、被スクリーニング化合物添加によって減少した蛍光偏光強度（Ｉｍａｘ−Ｉｏｂｓと被スクリーニング化合物添加前のｋｅａｐ１添加によって増加した蛍光偏光強度（Ｉｍａｘ−Ｉ０）の比、すなわち（Ｉｍａｘ−Ｉｏｂｓ）／（Ｉｍａｘ−Ｉ０）から算出される。さらに、被スクリーニング化合物の濃度範囲を変化させて測定することで、被スクリーニング化合物のｋｅａｐ１と環状ペプチドとの結合を５０％阻害する濃度（ＩＣ５０）を求めことができる。
【実施例】
【００５１】
本発明者らは公知のＮｒｆ２部分ペプチドがｋｅａｐ１結合時にγターンと呼ばれる立体構造を取っていることに着目し、本発明の環状ペプチドを設計した。一般に生理活性ペプチドはアミノ酸残基数を短くすればするほど、その生理活性が弱くなることが知られている。生理活性ペプチドを短くすると活性が弱くなる原因は、主に２つある。ひとつは、ペプチドを短くすることで生理活性発現に必要な官能基までが削られてしまうためで、もうひとつは、ペプチドが短くなることで生理活性発現に必要な立体構造を安定にとり得なくなるためである。当該Ｎｒｆ２部分ペプチドも１６残基から９残基に短くすると、ｋｅａｐ１への結合親和性が著しく低下することが知られている（非特許文献４）。本発明者らは、Ｎｒｆ２部分ペプチドとｋｅａｐ１との複合体のＸ線結晶構造（非特許文献４）を詳細に解析した結果、9残基からなるペプチドの結合親和性低下がｋｅａｐ１との結合に必要な官能基が削られたことに起因するのではなく、ｋｅａｐ１結合時に取るべき立体構造であるγターンを取りにくくなったことに起因すると推定した。
【００５２】
ペプチドは、残基数が短い程、合成ステップが短く、短期間かつ高収率で合成できるだけでなく、結合に直接関与しない部分がなくなることによって、標的としているタンパク質以外の物質への非特異的結合が減少させることができる利点がある。その上、ペプチダーゼ等の分解酵素によって、認識される配列が減るため、代謝や生分解に対してより安定になる。また、蛍光偏光減少法や１分子蛍光測定法等に代表される、分子の運動性の差、すなわちペプチド単独の運動性とペプチドがタンパク質に結合したときの運動性との差を検出する測定方法においては、分子量の小さいペプチド程ペプチド単独の運動性が高くなり、分子量の大きなタンパク質に結合したときの運動性との差が大きくなるため、検出感度、すなわちシグナル／ノイズ比（Ｓ／Ｎ比）が高くなる利点がある。
【００５３】
さらに、一般に環状ペプチドでは、ペプチダーゼ等の分解酵素によって、認識されにくくなり、代謝や生分解に対してより安定になる。また、同じ分子量のペプチドでも、環状になることによって、さらに運動性が上がり、上述の運動性の差を検出する測定系において有利になる。
【００５４】
このような利点を持たすために、Ｎｒｆ２部分ペプチドよりも短い環状ペプチドの設計を試みた。上述の短くしたＮｒｆ２部分ペプチドの結合親和性低下の原因推定結果に基づき、Ｎｒｆ２部分ペプチドを改変し、γターン構造をより安定化する工夫を施した。具体的には、その第１の工夫は、ｋｅａｐ１との結合に必要な官能基及びその空間配置を損なうことなく、γターン及びそれに続くβバルジ部分のアミノ酸は置換せず、その両端のβシートを形成しているアミノ酸残基側鎖間に共有結合を導入し、環状化することによって、γターンを安定化させたことにある（図１）。第２の工夫は、Ｎｒｆ２部分ペプチドの主鎖の２面角の分布図（図２）を解析し、唯一Ｐｒｏ残基を導入可能な位置にＰｒｏ残基を導入し、主鎖2面角の回転自由度を制限し、γターンを安定化させたことである。
【００５５】
ここで、Ｇｌｕ１１とＧｌｕ１４のカルボキシル基は、ｋｅａｐ１との結合に必須であるため変換せず保存した。また、βバルジを形成しているＧｌｙ１３は主鎖の２面角の分布図上、Ｇｌｙが特に安定に存在しうる領域にあり、βバルジ形成に有利と考え、保存した。また、Ａｓｐ９の側鎖のカルボキシル基及びＴｈｒ１２の側鎖の水酸基は、主鎖のアミドのＮＨ基と水素結合して、それぞれγターン及びβバルジを安定化しているため、Ａｓｐ９及びＴｈｒ１２の位置には、側鎖に水素結合受容基である官能基、水酸基又はカルボニル基又はカルボキシル基を有するアミノ酸（Ａｓｐ、Ａｓｎ、Ｔｈｒ、Ｓｅｒ）があることが望ましいと考え、これらのアミノ酸に限定した。
【００５６】
図１の化学構造式中、点線枠内は立体構造上、それぞれγターン、βバルジ、βシートを形成している領域を示している。
【００５７】
また、図２の左上のＧｅｎｅｒａｌは、Ｎｒｆ２部分ペプチドの主鎖の２面角の分布を示し、線の内側はプロリン、グリシン、プロリン１残基前のアミノ酸を除く通常のアミノ酸で許容される２面角範囲を示し、内側の線内は、これらアミノ酸が安定に取りうる２面角範囲を示している。右上のＰｒｅ−Ｐｒｏｌｉｎｅは、Ａｓｐ１０の主鎖の２面角プロットを示し、内側の線と外側の線は、それぞれプロリン残基の１残基前のアミノ酸が安定に取りうる２面角範囲及び許容範囲を示している。左下のＧｌｙｃｉｎｅは、Ｇｌｙ１３の主鎖の２面角プロットを示し、内側の線と外側の線は、グリシン残基が安定に取りうる２面角範囲及び許容範囲を示している。右下のｐｒｏｌｉｎｅは、プロリンを導入したＧｌｕ１０の２面角プロットを示し、内側の線と外側の線は、プロリン残基が安定に取りうる２面角範囲及び許容範囲を示している。
【００５８】
Ｎｒｆ２部分ペプチドのγターン構造を安定化するこれらの工夫を加えた環状ペプチドは、残基数を短くしても結合親和性が低下することなく、驚くべきことに元の１６残基のＮｒｆ２ペプチドよりも結合親和性が向上していることがわかった。のみならず、本環状ペプチドは、蛍光基で修飾しても結合親和性が減弱せず、さらに血漿中及び肝ミクロソーム中でも代謝されることなく、安定に存在することが明らかになった。
【００５９】
また、当該環状ペプチドは、ｋｅａｐ１と結合し、Ｎｒｆ２とｋｅａｐ１との結合を阻害する働きを有するため、実際の酸化ストレスを与えることなく、Ｎｒｆ２とｋｅａｐ１との結合阻害するリガンド（ｋｅａｐ１結合阻害リガンド）として使用できる。代謝に対して安定なｋｅａｐ１結合阻害リガンドは、生体及び組織及び細胞における酸化ストレス防御機構の解明のためツールとして有用であるばかりでなく、酸化ストレスに対して、生体及び組織及び細胞が、当該酸化ストレス防御機構によって対処できる能力（酸化ストレス応答能）を測定するための検出ツール及び診断ツールとしても有用である。
【００６０】
そして、蛍光基で修飾した当該環状ペプチドは、被験物質のｋｅａｐ１結合阻害活性を、蛍光偏光解消法測定によって、効率よく定量的にスクリーニングするためのスクリーニングツールとして有用であることが明らかになった。
【００６１】
蛍光偏光解消法はハイスループットスクリーニング（ＨＴＳ）に適した測定方法であり、本発明の環状ペプチドは、例えばＨＴＳのように多数の化合物を一度にスクリーニングする際にも有効に用いることができる。本発明の環状ペプチドを用いたｋｅａｐ１結合阻害化合物のスクリーニングにより、細胞の酸化ストレス防御機構を促進し、酸化ストレスによって引き起こされる疾患の治療又は予防に有効な化合物（薬物）の候補化合物を効率良く同定することができる。
【００６２】
以下、実施例を挙げて本発明を具体的に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。また、実施例中に記載された略号は次の通りである。
Ｆｍｏｃ： ９−フルオレニルメトキシカルボニル
ＦＡＭ： カルボキシルフルオロセイン
ａｌｋｏ： アルコキシベンジルアルコール
ＯｔＢｕ： ｔ−ブトキシカルボニル
ＯＢｚｌ： ベンジルエステル
Ｃｂｚ： ベンジルオキシカルボニル
ｔＢｕ： ｔ−ブチル
Ｔｒｔ： トリフェニルメチル
ＴＦＡ： トリフルオロ酢酸
ＴＩＳ： トリイソプロピルシラン
ＤＭＳＯ： ジメチルスルホキシド
ＤＴＮＢ： ５，５’―ジチオビス（２−ニトロ安息香酸）
ＴｒｔＡ−ＰＥＧ： トリチルアミドメチルエステルポリエチレングリコール
なお、アミノ酸に光学異性体があり得る場合は、特に明示しなければＬ体を示すものとする。
【００６３】
（実施例１）Ａｌａ−Ｐｈｅ−Ｐｈｅ−Ａｌａ−Ｇｌｎ−Ｌｅｕ−Ｇｌｎ−Ｌｅｕ−Ａｓｐ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−Ｔｈｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｕ−Ｐｈｅ−Ｌｅｕ（直鎖ペプチド１；配列番号６で示される。）の合成：
非特許文献４に記載のＮｒｆ２のＫＢＤの一部のアミノ酸配列を有するペプチド（Ｎｒｆ２部分ペプチド）及びそのホモログのうち、Ｋｅａｐ１との結合親和性が最も高いと報告されているＡｌａ−Ｐｈｅ−Ｐｈｅ−Ａｌａ−Ｇｌｎ−Ｌｅｕ−Ｇｌｎ−Ｌｅｕ−Ａｓｐ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−Ｔｈｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｕ−Ｐｈｅ−Ｌｅｕ（直鎖ペプチド１）を下記工程にて合成した。
【００６４】
市販のＦｍｏｃ−Ｌｅｕ−ａｌｋｏ ｒｅｓｉｎ（渡辺化学）を用い、マルチペプチドシンセサイザーＡＣＴ−３９６によりペプチド鎖を伸長し、Ｆｍｏｃ−Ａｌａ−Ｐｈｅ−Ｐｈｅ−Ａｌａ−Ｇｌｎ（ＯｔＢｕ)−Ｌｅｕ−Ｇｌｎ−Ｌｅｕ−Ａｓｐ（ＯｔＢｕ）−Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）−Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）−Ｔｈｒ(ｔＢｕ）−Ｇｌｙ−Ｇｌｕ(ＯｔＢｕ)−Ｐｈｅ−Ｌｅｕ−ａｌｋｏ ｒｅｓｉｎを得た。
【００６５】
次に、脱保護及びｒｅｓｉｎからの切り出しを行った。すなわち、ＴＦＡ／ＴＩＳ／水（９５：２．５：２．５）２００μＬを加え２時間振盪し、その反応溶液にジエチルエーテルを加え沈殿を得、遠心分離後、上清を除く操作を繰り返して洗浄を行い、残渣を酢酸水溶液で抽出、濾過により樹脂を除いた。その後、下記の条件で分取高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）により精製し、目的物を含む分画を集め凍結乾燥し白色粉末を得た。質量分析による（Ｍ＋Ｈ）＋は１８５６．８（計算値１８５６．９)であった。
【００６６】
分取ＨＰＬＣの条件は、以下の通りである。
・カラム： Ｉｎｅｒｔｓｉｌ ＯＤＳ−３（４．６×２５０ｍｍ）
・移動相： Ａ液：０．１％ＴＦＡ／水、Ｂ液：アセトニトリル
・溶出条件： Ａ／Ｂ：９５／５〜３５／６５への直線型濃度勾配溶出（３０分）
・流速： １．５ｍｌ／分
・溶出時間： １９．８６分
【００６７】
（実施例２）ｃｙｃｌｏ［−Ｃｙｓ−Ａｓｐ−Ｐｒｏ−Ｇｌｕ−Ｔｈｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｕ−Ｃｙｓ−］（環状ペプチド１；配列番号１）の合成：
本発明の環状ペプチド１を下記工程にて合成した。まず、市販のＦｍｏｃ−Ｃｙｓ（Ｔｒｔ）−ＴｒｔＡ−ＰＥＧ ｒｅｓｉｎ（渡辺化学社）を用い、マルチペプチドシンセサイザーＡＣＴ−３９６によりペプチド鎖を伸長し、Ｆｍｏｃ−Ｃｙｓ（Ｔｒｔ）−Ａｓｐ（ＯｔＢｕ）−Ｐｒｏ−Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）−Ｔｈｒ（ｔＢｕ）−Ｇｌｙ−Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）−Ｃｙｓ（Ｔｒｔ）−ＴｒｔＡ−ＰＥＧ ｒｅｓｉｎを合成した。次に、実施例１に記載の方法で、脱保護及びｒｅｓｉｎからの切り出しを行った。得られた未精製ペプチドを、ＤＭＳＯ ２０μＬに溶解し、さらに水８０μＬを添加し、ＤＴＮＢを用いて環化した。
【００６８】
その後、下記の条件で分取高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）により精製し、目的物を含む分画を集め凍結乾燥し白色粉末を得た。質量分析による（Ｍ＋Ｈ）＋は８９７．３（計算値８９７．３)であった。
【００６９】
分取ＨＰＬＣの条件は、以下の通りである。
・カラム： Ｉｎｅｒｔｓｉｌ ＯＤＳ−３（４．６×２５０ｍｍ）
・移動相： Ａ液：０．１％ＴＦＡ／水、Ｂ液：アセトニトリル
・溶出条件： Ａ／Ｂ：９５／５〜３５／６５への直線型濃度勾配溶出（３０分）
・流速： １．５ｍｌ／分
・溶出時間： ９．３５分
【００７０】
（実施例３）ｃｙｃｌｏ［−Ｌｙｓ−Ａｓｐ−Ａｌａ−Ｇｌｕ−Ｔｈｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｕ−Ａｓｐ−］−ＮＨ２（環状ペプチド２;配列番号２で示される。）の合成
本発明の環状ペプチド２を下記工程にて合成した。まず、市販のＦｍｏｃ−Ａｓｐ（ＯＢｚｌ）−ＮＨ２−ａｌｋｏ ｒｅｓｉｎ（渡辺化学）を用い、マルチペプチドシンセサイザーＡＣＴ−３９６によりペプチド鎖を伸長し、Ｆｍｏｃ−Ｌｙｓ（Ｃｂｚ）−Ａｓｐ（ＯｔＢｕ）−Ａｌａ−Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）−Ｔｈｒ（ｔＢｕ）−Ｇｌｙ−Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）−Ａｓｐ（ＯＢｚｌ）−ＮＨ２−ａｌｋｏ ｒｅｓｉｎを合成した。Ｎａ／ＮＨ３を加え、ＯＢｚｌ及びＣｂｚのみを選択的に脱保護し、環化した。次に、実施例１に記載の方法で、脱保護及びｒｅｓｉｎからの切り出しを行った。
【００７１】
その後、下記の条件で分取高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）により精製し、目的物を含む分画を集め凍結乾燥し白色粉末を得た。質量分析による（Ｍ＋Ｈ）＋は ８７１．５（計算値８７１．４）であった。
【００７２】
分取ＨＰＬＣの条件は、以下の通りである。
・カラム: Ｉｎｅｒｔｓｉｌ ＯＤＳ−３（４．６×２５０ｍｍ）
・移動相： Ａ液：０．１％ＴＦＡ／水、Ｂ液：アセトニトリル
・溶出条件： Ａ／Ｂ：９５／５〜３５／６５へ直線型濃度勾配溶出（３０分）
・流速: １．５ｍｌ／分
・溶出時間： ６．８８分
【００７３】
（実施例４）ｃｙｃｌｏ［−Ｃｙｓ−Ａｓｎ−Ｐｒｏ−Ｇｌｕ−Ｔｈｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｕ−Ｃｙｓ−］（環状ペプチド３；配列番号３で示される。）、ｃｙｃｌｏ［−Ｃｙｓ−Ｇｌｎ−Ｌｅｕ−Ａｓｐ−Ｐｒｏ−Ｇｌｕ−Ｔｈｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｕ−Ｃｙｓ−］−Ｌｅｕ（環状ペプチド４；配列番号４で示される。）、ＦＡＭ−ｃｙｃｌｏ［−Ｃｙｓ−Ａｓｐ−Ｐｒｏ−Ｇｌｕ−Ｔｈｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｕ−Ｃｙｓ−］（環状ペプチド５；配列番号５）の合成：
本発明の環状ペプチド３、４及び５を下記工程にて合成した。まず、市販のＦｍｏｃ−Ｃｙｓ（Ｔｒｔ）−ＴｒｔＡ−ＰＥＧ ｒｅｓｉｎ（渡辺化学）、Ｆｍｏｃ−Ｌｅｕ−ａｌｋｏ ｒｅｓｉｎ（渡辺化学）及びＦｍｏｃ−Ｃｙｓ（Ｔｒｔ）−ＴｒｔＡ−ＰＥＧ ｒｅｓｉｎ（渡辺化学）を用い、マルチペプチドシンセサイザーＡＣＴ−３９６によりペプチド鎖を伸長し、それぞれＦｍｏｃ−Ｃｙｓ（Ｔｒｔ）−Ａｓｎ−Ｐｒｏ−Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）−Ｔｈｒ（ｔＢｕ）−Ｇｌｙ−Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）−Ｃｙｓ（Ｔｒｔ）−ＴｒｔＡ−ＰＥＧ ｒｅｓｉｎ、Ｆｍｏｃ−Ｃｙｓ（Ｔｒｔ）−Ｇｌｎ−Ｌｅｕ−Ａｓｐ（ＯｔＢｕ）−Ｐｒｏ−Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）−Ｔｈｒ（ｔＢｕ）−Ｇｌｙ−Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）−Ｃｙｓ（Ｔｒｔ）−Ｌｅｕ−ａｌｋｏ ｒｅｓｉｎ、ＦＡＭ−Ｃｙｓ（Ｔｒｔ）−Ａｓｐ（ＯｔＢｕ）−Ｐｒｏ−Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）−Ｔｈｒ（ｔＢｕ）−Ｇｌｙ−Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）−Ｃｙｓ（Ｔｒｔ）−ＴｒｔＡ−ＰＥＧ ｒｅｓｉｎを合成した。次に、実施例１に記載の方法で、脱保護及び切り出しを行った。得られた未精製ペプチドを、２０μＬのＤＭＳＯに溶解し、さらに水８０μＬを添加し、ＤＴＮＢを用いて環化した。
【００７４】
その後、下記の条件で分取高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）により精製し、目的物を含む分画を集め凍結乾燥し白色粉末を得た。
【００７５】
各ペプチドの分析値及び分取ＨＰＬＣの条件は以下の通りである。
（１）環状ペプチド３（ｃｙｃｌｏ［−Ｃｙｓ−Ａｓｎ−Ｐｒｏ−Ｇｌｕ−Ｔｈｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｕ−Ｃｙｓ−］）：
ａ）質量分析による（Ｍ＋Ｈ）＋： ８９６．３（計算値８９６．３）
ｂ）分取ＨＰＬＣ条件
・カラム： Ｉｎｅｒｔｓｉｌ ＯＤＳ−３（４．６×２５０ｍｍ）
・移動相： Ａ液：０．１％ＴＦＡ／水、Ｂ液：アセトニトリル
・溶出条件： Ａ／Ｂ：９５／５〜３５／６５への直線型濃度勾配溶出（３０分）
・流速： １．５ｍｌ／分
・溶出時間: ８．８０分
（２）環状ペプチド４（ｃｙｃｌｏ［−Ｃｙｓ−Ｇｌｎ−Ｌｅｕ−Ａｓｐ−Ｐｒｏ−Ｇｌｕ−Ｔｈｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｕ−Ｃｙｓ−］−Ｌｅｕ）：
ａ）質量分による（Ｍ＋Ｈ）＋： １２０５．５（計算値１２０５．５）
ｂ）分取ＨＰＬＣ条件：
・カラム： Ｉｎｅｒｔｓｉｌ ＯＤＳ−３（４．６×２５０ｍｍ）
・移動相：Ａ液： ０．１％ＴＦＡ／水、Ｂ液：アセトニトリル
・溶出条件： Ａ／Ｂ：９５／５〜３５／６５への直線型濃度勾配溶出（３０分）
・流速： １．５ｍｌ／分
・溶出時間： １２．５８分
（３）環状ペプチド５（ＦＡＭ−ｃｙｃｌｏ［−Ｃｙｓ−Ａｓｐ−Ｐｒｏ−Ｇｌｕ−Ｔｈｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｕ−Ｃｙｓ−］）：
ａ）質量分析による（Ｍ＋Ｈ）＋： １２５５．２（計算値１２５５．３）
ｂ）分取ＨＰＬＣ条件
・カラム： Ｉｎｅｒｔｓｉｌ ＯＤＳ−３（４．６×２５０ｍｍ）
・移動相： Ａ液：０．１％ＴＦＡ／水、Ｂ液：アセトニトリル
・溶出条件： Ａ／Ｂ：９５／５〜３５／６５への直線型濃度勾配溶出（３０分）
・流速： １．５ｍｌ／分
・溶出時間： １１．１２分
【００７６】
（実施例５）ヒトＫｅａｐ１−ＤＣタンパク質の発現及び精製
（１）ヒトＫｅａｐ１−ＤＣ（アミノ酸残基番号３２１−６０９)が組み込まれた発現ベクターの作製：
ヒトＫｅａｐ１−ＤＣ（アミノ酸残基番号３２１−６０９)は、下記工程にてＰＣＲ法を用いてクローニングし、発現ベクターを作製した。
ヒト肝細胞がん由来Ｈｕｈ７細胞から抽出した全ＲＮＡからｃＤＮＡを作製し、これを鋳型として、ヒトＫｅａｐ１の塩基配列に基づき設計したプライマーを用いて、ＰＣＲを行った。なお、ヒトＫｅａｐ１の塩基配列は、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（ＮＣＢＩ；ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／）の受入番号ＮＭ＿２０３５００として公開されており、この塩基配列情報を用いてプライマー設計した。用いたプライマーは、フォワード側：５'−ａｃｃｃｔｇｃａｃａａｇｃｃｃａｃｇｃ−３'（配列番号７）であり、リバース側:５'−ｔｃａａｃａｇｇｔａｃａｇｔｔｃｔｇｃｔｇｇ−３'（配列番号８）である。ＰＣＲで得られたＤＮＡ断片をｐＧＥＭ−Ｔ（Ｅａｓｙ）Ｖｅｃｔｏｒ（Ｐｒｏｍｅｇａ社）にサブクローニングし、ポジティブクローンの塩基配列を調べ、確かにヒトＫｅａｐ１−ＤＣをコードしていることを確認した。
【００７７】
その後、目的のヒトＫｅａｐ１−ＤＣの塩基配列の末端に制限酵素ＮｄｅＩ及びＢａｍＨＩ認識配列が付加されたＤＮＡ断片を取得できるように設計したプライマーを用いてＰＣＲした。用いたプライマーは、フォワード側：５'−ｃａｔａｔｇｇｃｇｃｃｃａａｇｇｔｇｇｇｃｃｇｃｃｔｇ−３'（配列番号９）であり、リバース側: ５'−ｇｇａｔｃｃｔｃａｇｇｔｇａｃａｇｃｃａｃｇｃｃｃａｃｃｃｃａｃ−３’（配列番号１０）である。ＰＣＲで得られたＤＮＡ断片をｐＴＡ２ Ｖｅｃｔｏｒにサブクローニングし、ヒトＫｅａｐ１−ＤＣが挿入されたｈＫｅａｐ１−ＤＣ／ｐＴＡ２を得た。
【００７８】
得られたｈＫｅａｐ１−ＤＣ／ｐＴＡ２を、制限酵素ＮｄｅＩ及びＢａｍＨＩで切断し、ヒトＫｅａｐ１−ＤＣを含むＤＮＡ断片をｐＥＴ−１５ｂ ＶｅｃｔｏｒのＮｄｅＩ／ＢａｍＨＩ開裂部位に挿入し、ヒトＫｅａｐ１−ＤＣが挿入されたｈＫｅａｐ１−ＤＣ／ｐＥＴ−１５ｂを得た。
【００７９】
さらに、得られたｈＫｅａｐ１−ＤＣ／ｐＥＴ−１５ｂを制限酵素ＮｄｅＩ及びＢａｍＨＩで切断し、ヒトＫｅａｐ１−ＤＣを含むＤＮＡ断片をｐＥＴ−１９ｂ Ｖｅｃｔｏｒ（Ｎｏｖａｇｅｎ社）のＮｄｅＩ／ＢａｍＨＩ開裂部位に挿入し、ｈＫｅａｐ１−ＤＣ／ｐＥＴ−１９ｂを得た。
【００８０】
（２）ヒトＫｅａｐ１−ＤＣタンパク質発現：
ｈＫｅａｐ１−ＤＣ／ｐＥＴ−１９ｂを大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）（Ｎｏｖａｇｅｎ社）へ形質転換した。カルベニシリン（以下、Ｃａｒ；ナカライテスク社）による薬剤選別により得られた単一コロニーを１０ｍＬのＬＢ／Ｃａｒ培地で３７℃にて一晩培養した。翌日、この培養液２ｍＬを１００ｍＬのＰｌｕｓｇｒｏｗ（ナカライテスク社）／Ｃａｒ培地に加え、３７℃にてＯＤ６００＞０．５になるまで培養を行った。２０℃にて３０分間静置した後、終濃度０．２ｍｍｏｌ／ＬとなるようＩＰＴＧ（ナカライテスク社）を培地に添加し、２０℃にてタンパク質誘導を一晩行った。
【００８１】
（３）ヒトＫｅａｐ１−ＤＣタンパク質の精製：
上記（２）にてタンパク質誘導を行った大腸菌培養液を２等分に分け、４℃にて５，０００×ｇ、２０分間遠心して大腸菌を回収した。その内の１本をＢｕｇＢｕｓｔｅｒ ＨＴ（Ｎｏｖａｇｅｎ社）を用いて溶菌し、４℃にて２０，０００×ｇ、２０分間遠心して可溶画分を回収した。終濃度１０ｍｍｏｌ／Ｌになるようにイミダゾール（ナカライテスク社）を添加して０．４５μｍのＰＶＤＦフィルター（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社）でろ過した。結合バッファー（２０ｍｍｏｌ／Ｌ Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｂｕｆｆｅｒ ｐＨ７．４（Ｗａｋｏ社）、５００ｍｍｏｌ／Ｌ ＮａＣｌ（Ｗａｋｏ社）、１０ｍｍｏｌ／Ｌ イミダゾール）で平衡化したＨｉｓＴｒａｐ ＨＰ １ｍＬカラム（ＧＥ ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社）に上記ろ液を添加した。５カラム容量の洗浄バッファー（２０ｍｍｏｌ／Ｌ Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｂｕｆｆｅｒ ｐＨ７．４、５００ｍｍｏｌ／Ｌ ＮａＣｌ、１００ｍｍｏｌ／Ｌ イミダゾール）でカラムを洗浄後、５カラム容量の溶出バッファー（２０ｍｍｏｌ／Ｌ Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｂｕｆｆｅｒ、ｐＨ７．４、５００ｍｍｏｌ／Ｌ ＮａＣｌ、１ｍｏｌ／Ｌイミダゾール）でタンパク質を溶出した。
【００８２】
Ａｍｉｃｏｎ Ｕｌｔｒａ−１５（ＭＷＣＯ＝１０，０００；Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社）を用いてタンパク質を濃縮し、１０ｍｍｏｌ／Ｌ ＤＴＴ（Ｗａｋｏ社）を含むＰＢＳ（ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｂｕｆｆｅｒｄ ｓａｌｉｎｅ；Ｔａｋａｒａ社）へのバッファー交換を行い、ＯＤ２８０を測定した。ヒトＫｅａｐ１−ＤＣのモル吸光係数（ε２８０＝５８，３３０ｃｍ−１Ｍ−１）及び分子量（３４．５ｋＤａ）からタンパク濃度を算出した。得られたタンパク質は、終濃度１０％になるようにグリセロール（Ｗａｋｏ）を加え、−３０℃にて保存した。
【００８３】
（４）ヒトＫｅａｐ１−ＤＣタンパク質の確認：
上記（３）にて得られたタンパク質について、ＳＤＳ−ＰＡＧＥを行った。得られたタンパク質溶液にＮｕＰＡＧＥ ＬＤＳ Ｓａｍｐｌｅ Ｂｕｆｆｅ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）及びＮｕＰＡＧＥ Ｓａｍｐｌｅ Ｒｅｄｕｃｉｎｇ Ａｇｅｎｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を加えて１００℃にて５分間、タンパクを加熱変性させた。ＮｕＰＡＧＥ ４−１２％ Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ ｇｅｌ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）及びＮｕＰＡＧＥ ＭＥＳ ＳＤＳ Ｒｕｎｎｉｎｇ緩衝液（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を用いて２００Ｖ、３５分間泳動した。なお、分子量マーカーにはＮｏｖｅｘ Ｓｈａｒｐ Ｐｒｅ−ｓｔａｉｎｅｄ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｔａｎｄａｒｄ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を用いた。泳動終了後、ＳｉｍｐｌｙＢｌｕｅ Ｓａｆｅ Ｓｔａｉｎ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を用いてゲルをＣＢＢ染色し、ヒトＫｅａｐ１−ＤＣの分子量相当位置にバンドを確認した。
【００８４】
（実施例６）環状ペプチド５のＫｅａｐ１結合試験：
環状ペプチド５について、蛍光偏光解消法を用い、Ｋｅａｐ１結合試験を行った。実施例５で得られたヒトＫｅａｐ１−ＤＣタンパク質（最終濃度０、０．１、０．３、１．０、３．０、１０、３０、１００ｎＭ）と環状ペプチド５（最終濃度３ｎＭ）を含むＰＢＳバッファー溶液５０μＬを、プレートリーダー用９６穴プレートに添加し、プレートシールをして室温、暗所にて１時間静置後、プレートリーダー（ＦＬＩＰＲ ＴＥＴＲＡ；Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ社）で、蛍光偏光強度(励起波長４８８ｎｍ、観測波長５３０±１５ｎｍ)を測定した。測定は２度行い、その蛍光偏光強度の平均値を算出した。
【００８５】
ヒトＫｅａｐ１−ＤＣタンパク質無添加時の蛍光偏光強度の平均値から、各濃度のヒトＫｅａｐ１−ＤＣタンパク質を添加したときの蛍光偏光強度平均値を差し引くことにより、環状ペプチド５の結合濃度（Ｂ）及び非結合濃度（Ｆ）を算出した。表計算ソフトＭｉｃｒｏｓｏｆｔ Ｅｘｃｅｌ（Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ社）により、算出した各濃度におけるＢ／Ｆ及びＢをプロットし、直線回帰した直線の傾きから解離定数(Ｋｄ)を求めた。その結果、環状ペプチド５の解離定数（Ｋｄ）２．０ｎＭであった。したがって、環状ペプチド５が、ヒトＫｅａｐ１−ＤＣタンパク質との強い結合能を有することが示された。
【００８６】
（実施例７）
環状ペプチド５を用いたＫｅａｐ１結合阻害物質のスクリーニング
環状ペプチド５を用いて、蛍光偏光解消法を用い、Ｋｅａｐ１結合阻害物質のスクリーニングを行った。被験物質として、直鎖ペプチド１及び環状ペプチド１〜４を用いた。
実施例５で得られたヒトＫｅａｐ１−ＤＣタンパク質（最終濃度１０ｎＭ）、環状ペプチド５（最終濃度３ｎＭ）及び被験物質（最終濃度０．３〜３００ｎＭ）を含むＰＢＳバッファー溶液１２μＬをプレートリーダー用３８４穴プレートに添加し、プレートシールをして室温、暗所にて１時間静置後、プレートリーダー（ＦＬＩＰＲ ＴＥＴＲＡ；Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ社）で、蛍光偏光強度（励起波長４８８ｎｍ、観測波長５３０±１５ｎｍ）を測定した。測定は被験物質濃度毎に２度行い、その蛍光偏光強度の平均値を算出した。被験物質無添加時の蛍光偏光強度の平均値から、被験物質添加時の蛍光偏光強度平均値を差し引くことにより、結合率を算出した。被験物質の蛍光偏光を５０％阻害する被験物質の濃度（ＩＣ５０）は、表計算ソフトＭｉｃｒｏｓｏｆｔ Ｅｘｃｅｌ（Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ社）により、５０％に最も近い点とそれを挟む２点の計３点で直線回帰することにより算出した。その結果を表１に示す。
【００８７】
【表１】
【００８８】
測定した環状ペプチド１〜４はすべて、Ｎｒｆ２部分ペプチドである直鎖ペプチド１よりも強いＫｅａｐ１結合阻害活性を有することが示された。また、環状ペプチド５が、市販のプレートリーダーを用いた簡便な測定によるＫｅａｐ１結合阻害物質のスクリーニングに使用でできることが示された。
【００８９】
（実施例８）血漿中安定性試験：
直鎖ペプチド１、環状ペプチド１及び４について、血漿中消失量を測定した。へパリン添加ヒト血漿をリン酸緩衝生理食塩水希釈して、１０％希釈ヒト血漿を調製した。次いで、被験ペプチドの１０ｍＭ ＤＭＳＯ溶液を１０％希釈ヒト血漿に加え、被験ペプチド最終濃度２０μＭの試験溶液（２００μＬ）を調製した。試験溶液を３７℃で保温し、０、５、１０、２０、２４０分後にそれぞれ冷却したアセトニトリル２００μＬを加え反応を止めた。これを３０００ｒｐｍ、１０分の条件で遠心分離し、得られた上清をフィルターでろ過した後、ろ液４０μＬを超高速液体クロマトグラフィー（Ｕｌｔｒａ Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ Ｌｉｑｕｉｄ Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ；ＵＰＬＣ）で分析した。
【００９０】
ＵＰＬＣはＡＣＱＵＩＴＹ（登録商標）ＵＰＬＣ（日本ウォーターズ社）を用い、検出器には、ＡＣＱＵＩＴＹ（登録商標）ＵＰＬＣフォトダイオードアレイ（Ｐｈｏｔｏｄｉｏｄｅ Ａｒｒａｙ；以下、ＰＤＡ）検出器２９９６ＰＤＡ（日本ウォーターズ社）を用いた。検出波長は２１０〜３５０ｎｍとし、分析対象物にとって最適な波長を選択した。解析ソフトはＥｍｐｏｗｅｒ２（日本ウォーターズ社）を使用した。カラムはＣＡＰＣＥＬＬ ＰＡＫ Ｃ１８ ＭＧＩＩＩ、５μＭ、２．１ｍｍ ＩＤ×５０ｍｍ（資生堂社）を使用し、移動相には０．０８％トリフルオロ酢酸／Ｈ２Ｏとアセトニトリルを用い、流速０．５ｍＬ／分で、４分間でアセトニトリルを直線勾配（１→６０％）で増加させた。その結果を表２に示す。
【００９１】
【表２】
【００９２】
環状ペプチド１及び４の残存率は、２４０分後で７８及び８９％で、血漿中でほとんど分解されることがなかった。一方、直鎖ペプチド１の残存率は、１２％であった。これらの結果から、Ｎｒｆ２部分ペプチドである直鎖ペプチド１に比べて、環状ペプチド１及び４は顕著な血漿中安定性を有し、血漿中で極めて安定に存在することは明らかである。
【産業上の利用可能性】
【００９３】
本発明の新規環状ペプチドを使用すれば、Ｋｅａｐ１結合阻害化合物を効率よく簡便にスクリーニングすることができ、当該スクリーニングにより得られるＫｅａｐ１結合阻害化合物は、細胞の酸化ストレス防御機構を促進し、酸化ストレスによって引き起こされる疾患の治療又は予防に有効な治療薬となり得る。
【配列表フリーテキスト】
【００９４】
配列番号１、３及び4：環状ペプチド
配列番号２：環状ペプチド；そのC末端は、アミド（−ＣＯＮＨ２）型で、リジン残基の側鎖のアミノ基とアスパラギン酸残基の側鎖のカルボキシル基とは、アミド結合でクロスリンクしている。
配列番号５：環状ペプチド；そのＮ末端は、カルボキシルフルオロセインで標識されている。
配列番号６：合成ペプチド
配列番号７〜１０：ＰＣＲプライマー
【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の一般式（Ｉ）で示されるペプチドを含む環状ペプチド又はその薬理学的に許容される塩。
Ｙ１−Ｙ２−Ｇｌｕ−Ｙ３−Ｇｌｙ−Ｇｌｕ・・・（Ｉ）
[式中、Ｙ１は、アスパラギン残基又はアスパラギン酸残基を表し、Ｙ２は、アミノ酸残基を表し、Ｙ３は、スレオニン残基、セリン残基、アスパラギン残基又はアスパラギン酸残基を表す。］
【請求項２】
以下の一般式（ＩＩ）で示される、請求項１記載の環状ペプチド又はその薬理学的に許容される塩。
【化１】
[式中、Ｘは、直接のアミド結合、アミノ酸残基又は２〜６個のアミノ酸残基からなるペプチド表し、Ｙ１は、アスパラギン残基又はアスパラギン酸残基を表し、Ｙ２は、アミノ酸残基を表し、Ｙ３は、スレオニン残基、セリン残基、アスパラギン残基又はアスパラギン酸残基を表し、Ｚは、直接の共有結合、−ＳＳ−、−ＮＨＣＯ−、−ＣＯＮＨ−、−Ｎ（ＣＨ３）ＣＯ−、−ＣＯＮ（ＣＨ３）−、−Ｓ−、−Ｏ−、−ＣＯ−又は−ＮＨ−を表し、Ｒ１は、ＣＯＮＨ−、ＮＨ２−、又は水素原子を表し、Ｒ２は、−ＣＯＯＨ、−ＣＯＮＨ２、又は水素原子を表し、ｍ及びｎは、それぞれ独立して、０〜４を表す。］
【請求項３】
Ｚは、−ＳＳ−を表し、Ｒ１は、ＣＯＮＨ−又はＮＨ２−を表し、Ｒ２は−ＣＯＯＨ又は−ＣＯＮＨ２を表し、ｍ及びｎは１を表す、請求項２記載の環状ペプチド又はその薬理学的に許容される塩。
【請求項４】
Ｚは、−ＮＨＣＯ−を表し、ｍは、３又は４を表し、ｎは、２又は３を表す、請求項２記載の環状ペプチド又はその薬理学的に許容される塩。
【請求項５】
Ｚは、−ＣＯＮＨ−を表し、ｍは、２又は３を表し、ｎは、３又は４を表す、請求項２記載の環状ペプチド又はその薬理学的に許容される塩。
【請求項６】
Ｘは、直接のアミド結合又は２個のアミノ酸残基からなるペプチド表す、請求項２〜５のいずれか一項記載の環状ペプチド又はその薬理学的に許容される塩。
【請求項７】
Ｙ２は、プロリン残基である、請求項１〜６のいずれか一項記載の環状ペプチド又はその薬理学的に許容される塩。
【請求項８】
Ｙ３は、スレオニン残基である、請求項１〜７のいずれか一項記載の環状ペプチド又はその薬理学的に許容される塩。
【請求項９】
請求項１〜９のいずれか一項記載の環状ペプチドの修飾ペプチド。
修飾ペプチド。
【請求項１０】
Ｋｅｌｃｈ様ＥＣＨ結合タンパク質１の結合阻害物質のスクリーニング方法であって、
被スクリーニング物質の存在下及び非存在下において、請求項９記載の修飾ペプチドとＫｅｌｃｈ様ＥＣＨ結合タンパク質１とを溶液中で接触させ、前記修飾ペプチドとＫｅｌｃｈ様ＥＣＨ結合タンパク質１との結合量を測定する測定ステップと、
前記被スクリーニング物質の存在下における前記修飾ペプチドとＫｅｌｃｈ様ＥＣＨ結合タンパク質１との結合量（ＡＴ）と、前記被スクリーニング物質の非存在下における前記修飾ペプチドとＫｅｌｃｈ様ＥＣＨ結合タンパク質１との結合量（ＡＣ）とを比較する比較ステップと、
前記ＢＴが、前記ＢＣよりも少ない場合に、前記被スクリーニング物質はＫｅｌｃｈ様ＥＣＨ結合タンパク質１の結合阻害物質であると判定する判定ステップと、
を備えるスクリーニング方法。
【請求項１】
以下の一般式（Ｉ）で示されるペプチドを含む環状ペプチド又はその薬理学的に許容される塩。
Ｙ１−Ｙ２−Ｇｌｕ−Ｙ３−Ｇｌｙ−Ｇｌｕ・・・（Ｉ）
[式中、Ｙ１は、アスパラギン残基又はアスパラギン酸残基を表し、Ｙ２は、アミノ酸残基を表し、Ｙ３は、スレオニン残基、セリン残基、アスパラギン残基又はアスパラギン酸残基を表す。］
【請求項２】
以下の一般式（ＩＩ）で示される、請求項１記載の環状ペプチド又はその薬理学的に許容される塩。
【化１】
[式中、Ｘは、直接のアミド結合、アミノ酸残基又は２〜６個のアミノ酸残基からなるペプチド表し、Ｙ１は、アスパラギン残基又はアスパラギン酸残基を表し、Ｙ２は、アミノ酸残基を表し、Ｙ３は、スレオニン残基、セリン残基、アスパラギン残基又はアスパラギン酸残基を表し、Ｚは、直接の共有結合、−ＳＳ−、−ＮＨＣＯ−、−ＣＯＮＨ−、−Ｎ（ＣＨ３）ＣＯ−、−ＣＯＮ（ＣＨ３）−、−Ｓ−、−Ｏ−、−ＣＯ−又は−ＮＨ−を表し、Ｒ１は、ＣＯＮＨ−、ＮＨ２−、又は水素原子を表し、Ｒ２は、−ＣＯＯＨ、−ＣＯＮＨ２、又は水素原子を表し、ｍ及びｎは、それぞれ独立して、０〜４を表す。］
【請求項３】
Ｚは、−ＳＳ−を表し、Ｒ１は、ＣＯＮＨ−又はＮＨ２−を表し、Ｒ２は−ＣＯＯＨ又は−ＣＯＮＨ２を表し、ｍ及びｎは１を表す、請求項２記載の環状ペプチド又はその薬理学的に許容される塩。
【請求項４】
Ｚは、−ＮＨＣＯ−を表し、ｍは、３又は４を表し、ｎは、２又は３を表す、請求項２記載の環状ペプチド又はその薬理学的に許容される塩。
【請求項５】
Ｚは、−ＣＯＮＨ−を表し、ｍは、２又は３を表し、ｎは、３又は４を表す、請求項２記載の環状ペプチド又はその薬理学的に許容される塩。
【請求項６】
Ｘは、直接のアミド結合又は２個のアミノ酸残基からなるペプチド表す、請求項２〜５のいずれか一項記載の環状ペプチド又はその薬理学的に許容される塩。
【請求項７】
Ｙ２は、プロリン残基である、請求項１〜６のいずれか一項記載の環状ペプチド又はその薬理学的に許容される塩。
【請求項８】
Ｙ３は、スレオニン残基である、請求項１〜７のいずれか一項記載の環状ペプチド又はその薬理学的に許容される塩。
【請求項９】
請求項１〜９のいずれか一項記載の環状ペプチドの修飾ペプチド。
修飾ペプチド。
【請求項１０】
Ｋｅｌｃｈ様ＥＣＨ結合タンパク質１の結合阻害物質のスクリーニング方法であって、
被スクリーニング物質の存在下及び非存在下において、請求項９記載の修飾ペプチドとＫｅｌｃｈ様ＥＣＨ結合タンパク質１とを溶液中で接触させ、前記修飾ペプチドとＫｅｌｃｈ様ＥＣＨ結合タンパク質１との結合量を測定する測定ステップと、
前記被スクリーニング物質の存在下における前記修飾ペプチドとＫｅｌｃｈ様ＥＣＨ結合タンパク質１との結合量（ＡＴ）と、前記被スクリーニング物質の非存在下における前記修飾ペプチドとＫｅｌｃｈ様ＥＣＨ結合タンパク質１との結合量（ＡＣ）とを比較する比較ステップと、
前記ＢＴが、前記ＢＣよりも少ない場合に、前記被スクリーニング物質はＫｅｌｃｈ様ＥＣＨ結合タンパク質１の結合阻害物質であると判定する判定ステップと、
を備えるスクリーニング方法。
【図１】
【図２】
【図２】
【公開番号】特開２０１２−５１８２６（Ｐ２０１２−５１８２６Ａ）
【公開日】平成２４年３月１５日（２０１２．３．１５）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１０−１９４３５６（Ｐ２０１０−１９４３５６）
【出願日】平成２２年８月３１日（２０１０．８．３１）
【出願人】（０００００３１５９）東レ株式会社 (7,677)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２４年３月１５日（２０１２．３．１５）
【国際特許分類】
【出願日】平成２２年８月３１日（２０１０．８．３１）
【出願人】（０００００３１５９）東レ株式会社 (7,677)
【Ｆターム（参考）】
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