生体分子検出装置および生体分子検出方法
【課題】高感度な測定が可能な生体分子検出装置を提供する。
【解決手段】配向制御光の振動方向の切り替えにより、溶液中のフリー分子およびバインディング分子の配向方向を切り替え、フリー分子２０およびバインディング分子２２の１分子あたりの発光量を切り替えることが可能な構成とした。また、フリー分子２０およびバインディング分子２２は、配向制御光１１７の照射方向の切り替えに伴う配向方向の切り替えに要する時間に差が生じるため、それぞれの分子の発光量が増加するタイミングが異なる。従って、溶液中の全ての蛍光分子が蛍光を発生しても、フリー分子およびバインディング分子それぞれに付随した蛍光の寄与分を算出することができ、簡便な構成で検出対象物質の濃度を正確に測定することができる。
【解決手段】配向制御光の振動方向の切り替えにより、溶液中のフリー分子およびバインディング分子の配向方向を切り替え、フリー分子２０およびバインディング分子２２の１分子あたりの発光量を切り替えることが可能な構成とした。また、フリー分子２０およびバインディング分子２２は、配向制御光１１７の照射方向の切り替えに伴う配向方向の切り替えに要する時間に差が生じるため、それぞれの分子の発光量が増加するタイミングが異なる。従って、溶液中の全ての蛍光分子が蛍光を発生しても、フリー分子およびバインディング分子それぞれに付随した蛍光の寄与分を算出することができ、簡便な構成で検出対象物質の濃度を正確に測定することができる。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、溶液中の検出対象物質を検出する技術に係り、特に、検体内の生体分子、ウイルス、核酸、蛋白質および細菌等を検出可能な生体分子検出装置および生体分子検出方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、医師や技師等が診療の現場で生体分子検出を行い、その場で測定結果を得て診断や治療に役立てる生体分子検出法が注目されている。生体分子検出法は、抗原抗体反応等の特異的な反応を利用した高い選択性により、血液、尿、汗といった複数成分を有する体液の中から、検出対象物質だけを選択的に検出する方法である。特に、このような生体分子検出法は、ウイルス、核酸、蛋白質および細菌等の生体分子の微量検出、検査、定量および分析などに広く用いられている。
【０００３】
生体分子検出法として、ラジオイムノアッセイが実用化されている。ラジオイムノアッセイは、アイソトープで標識された抗原または抗体を用い、その抗原または抗体と特異的に結合する抗体または抗原の有無を検出するものである。ラジオイムノアッセイは、アイソトープの放射線量を測定することにより抗体または抗原等の検出対象物質を定量するもので、高感度な測定が可能である。
【０００４】
放射性物質を用いない生体分子検出法として蛍光イムノアッセイがある。蛍光イムノアッセイとしては、予め反応層に抗体を固定しておき（これを固相という）、当該反応層に、測定対象溶液および蛍光分子で標識された抗体を流し、反応層近傍の蛍光を測定することにより、抗体に特異的に結合した抗原の濃度を測定する装置が知られている（例えば特許文献１参照）。
【０００５】
しかしながら、固相を利用した蛍光イムノアッセイは、固相を作成するのにコストがかかるという問題があった。固相を用いず液体中で生体分子検出を行う（抗体等を固定せず液体中で生体分子検出を行うことを液相という）方法として、蛍光偏光法を利用して抗原抗体反応を確認する方法がある。蛍光偏光法は、蛍光標識した分子に別の分子が結合し分子の大きさが変化することにより生じる、ブラウン運動の変化に基づく蛍光偏光度の値の変化を検出する方法である。蛍光偏光法を利用した生体分子検出法は、検体中の検出対象物質の簡便かつ迅速な検知法として知られている（例えば特許文献２参照）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】特開平７−１２０３９７号公報
【特許文献２】特開２００８−２９８７４３号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
しかしながら、蛍光偏光法は、ランダムな運動であるブラウン運動の変化を利用しているため、測定感度に限界があるという問題がある。また、特許文献２の方法では、ブラウン運動の変化による影響を受ける程度に蛍光寿命が長い必要がある。しかし、蛍光寿命は検体内の成分によって影響を受けるため、特許文献２の方法による測定結果にばらつきが生じることがある。
【０００８】
本発明は上記事情に鑑みてなされたものであり、高感度測定が可能な生体分子検出装置および生体分子検出方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
上記目的を達成するために、本発明に係る生体分子検出方法は、
溶液中に存在する蛍光分子を励起するための、特定方向に直線偏光成分を有する励起光を照射するステップと、
検出対象物質に特異的に結合する物質と配向用標識とこの配向用標識の周囲に結合した複数の蛍光分子とを有する第１の複合体から発生する第１の蛍光を検出するステップと、
第１の複合体と検出対象物質とが結合した第２の複合体から発生する第２の蛍光を検出するステップと、
第１の複合体および第２の複合体を少なくとも２つの方向に切り換えて配向させるステップと、
検出された第１の蛍光および第２の蛍光に基づいて検出対象物質の検出または定量を行うステップとを具備する。
【００１０】
また、本発明に係る生体分子検出装置は、
上記の生体分子検出方法で使用される生体分子検出装置であって、
特定方向に直線偏光成分を有し蛍光分子を励起する励起光を照射する光源と、
蛍光分子から発せられた蛍光を検出する受光部と、
溶液中で第１の複合体および第２の複合体を少なくとも２つの方向に切り換えて配向させる配向制御手段と、
第１の複合体および第２の複合体の配向方向の切り替えに伴って蛍光分子から発生する蛍光の強度の時間変化から、第２の蛍光の強度を算出して検出対象物質の検出または定量を行う演算部とを具備する。
【００１１】
また、本発明に係る生体分子検出装置において、配向制御手段は、配向用標識の長手方向が特定方向と平行となる第１の方向、および、配向用標識の長手方向が上記特定方向と垂直となる第２の方向に、第１の複合体および第２の複合体に切り換えて配向させるものであることが好ましい。
【００１２】
また、本発明に係る生体分子検出装置において、配向制御手段は、第１の複合体および第２の複合体を所定の時間間隔で複数回切り替えて配向させるものであり、
演算部は、第１の複合体および第２の複合体が所定の時間間隔で複数回切り替えて配向したことによって得られた複数の第２の蛍光の強度の加算平均を行い、加算平均により得られた蛍光の強度に基づいて検出対象物質の検出または定量を行うものであることが好ましい。
【００１３】
また、本発明に係る生体分子検出装置において、上記所定の時間間隔は、検出対象物質、この検出対象物質と特異的に結合する物質、配向用標識および蛍光分子の質量または体積と、配向制御手段による配向制御の強度とに基づいて決定されることが好ましい。
【００１４】
また、本発明に係る生体分子検出装置において、配向制御手段は、直線偏光した光を照射する配向制御光源を備え、この配向制御光源から溶液に対して直線偏光した光を照射することにより、第１の複合体および第２の複合体を配向させるものであることが好ましい。
【００１５】
また、本発明に係る生体分子検出装置において、配向制御手段は、直線偏光した光の振動方向を切り替える波長板を有し、波長板を用いて直線偏光した光の振動方向を切り替えることにより、第１の複合体および第２の複合体を切り換えて配向させるものであることが好ましい。
【００１６】
また、本発明に係る生体分子検出装置において、配向制御光源は、溶液に対し直線偏光した光を複数の位置から照射するものであることが好ましい。
【００１７】
また、本発明に係る生体分子検出装置において、溶液は、少なくとも一部に平面を有する溶液保持部に保持されたものであることが好ましい。
【００１８】
また、本発明に係る生体分子検出装置において、配向制御光源は、溶液を通って溶液保持部の平面から出射する方向に、直線偏光した光を照射し、かつ、溶液と上記平面との界面において、直線偏光した光に焦点を結ばせるものであることが好ましい。
【００１９】
また、本発明に係る生体分子検出装置において、演算部は、前記第１の複合体および前記第２の複合体が一方の配向方向から他方の配向方向に切り替わる間における、前記第１の複合体から発生する蛍光の強度の時間変化と、前記第２の複合体から発生する蛍光の強度の時間変化とに差があることを利用して、前記第２の蛍光の強度を算出するものであることとが好ましい。
【００２０】
また、本発明に係る生体分子検出装置において、受光部は、光を分光する分光手段を備えることが好ましい。
【００２１】
また、本発明に係る生体分子検出装置において、分光手段は、特性の異なる複数のフィルタであり、
受光部は、蛍光分子から発生する蛍光の波長に応じて複数のフィルタを切り替えるものであることが好ましい。
【発明の効果】
【００２２】
本発明によれば、高感度な生体分子検出を行うことができる。
【図面の簡単な説明】
【００２３】
【図１Ａ】実施の形態１に係る生体分子検出装置の抗原抗体反応の概要を説明するための模式図である。
【図１Ｂ】実施の形態１に係る生体分子検出装置の抗原抗体反応の概要を説明するための模式図である。
【図２Ａ】フリー分子（抗原が結合していない抗体および蛍光分子）の模式図である。
【図２Ｂ】バインディング分子（抗原が結合した抗体および蛍光分子）の模式図である。
【図３Ａ】励起光の振動方向と蛍光分子の遷移モーメントとが互いに平行の場合を表す図である。
【図３Ｂ】励起光の振動方向と蛍光分子の遷移モーメントとが互いに垂直の場合を表す図である。
【図４Ａ】励起光の振動方向と配向用標識の長手方向とが互いに平行となる場合を示す図である。
【図４Ｂ】励起光の振動方向と配向用標識の長手方向とが互いに垂直となる場合を示す図である。
【図５Ａ】実施の形態１に係る生体分子検出装置の外観斜視図である。
【図５Ｂ】実施の形態１に係る生体分子検出装置の開閉部を開けたときの外観斜視図である。
【図６】生体分子検出装置の主要な構成を示すブロック図である。
【図７Ａ】配向制御光の振動方向とフリー分子およびバインディング分子の配向方向との関係を描いた図である。
【図７Ｂ】配向制御光の振動方向を切り替えた場合におけるフリー分子およびバインディング分子の動作を描いた図である。
【図７Ｃ】配向制御光の振動方向を切り替えフリー分子およびバインディング分子の配向が完了した場合を描いた図である。
【図８Ａ】配向したフリー分子およびバインディング分子と励起光の振動方向との関係を描いた図である。
【図８Ｂ】別の方向に配向したフリー分子およびバインディング分子と励起光の振動方向との関係を描いた図である。
【図９】実施の形態１に係る生体分子検出装置における受光部の詳細な構成を表した模式図である。
【図１０】検体の準備から廃棄までの流れを模式的に表した図である。
【図１１】実施の形態１に係る生体分子検出装置における１周期の配向制御信号、サンプリングクロック、ＰＤ出力およびＡ／Ｄ変換部出力を表したグラフである。
【図１２】実施の形態１に係る生体分子検出装置における配向制御信号を複数周期に亘って示したグラフである。
【図１３Ａ】実施の形態２に係る生体分子検出装置の抗原抗体反応の概要を説明するための模式図である。
【図１３Ｂ】実施の形態２に係る生体分子検出装置の抗原抗体反応の概要を説明するための模式図である。
【図１４】実施の形態２に係る生体分子検出装置の主要な構成を示すブロック図である。
【図１５】実施の形態２に係る生体分子検出装置における受光部の詳細な構成を表した模式図である。
【図１６Ａ】実施の形態２に係る生体分子検出装置を用いて一方の検出対象物質を検出する場合におけるＡ／Ｄ変換部出力を表したグラフである。
【図１６Ｂ】実施の形態２に係る生体分子検出装置を用いて他方の検出対象物質を検出する場合におけるＡ／Ｄ変換部出力を表したグラフである。
【図１７Ａ】一方からレーザーを照射した場合における、蛍光分子の遷移モーメントの方向とランダム偏光した励起光の振動方向との関係を表す概念図である。
【図１７Ｂ】他方からレーザーを照射した場合における、蛍光分子の遷移モーメントの方向とランダム偏光した励起光の振動方向との関係を表す概念図である。
【図１８Ａ】一方からレーザーを照射した場合における、蛍光分子の遷移モーメントの方向と２方向に直線偏光した励起光の振動方向との関係を表す概念図である。
【図１８Ｂ】他方からレーザーを照射した場合における、蛍光分子の遷移モーメントの方向と２方向に直線偏光した励起光の振動方向との関係を表す概念図である。
【図１９】蛍光分子の遷移モーメントの方向の変化に伴うフォトダイオード出力の変化を表したグラフである。
【図２０Ａ】レーザーの偏光軸の変化に伴うバインディング分子の配向の変化を説明するための概念図である。
【図２０Ｂ】レーザーの偏光軸の変化に伴うバインディング分子の配向の変化を説明するための概念図である。
【図２０Ｃ】レーザーの偏光軸の変化に伴うバインディング分子の配向の変化を説明するための概念図である。
【図２１】試薬カップの多点に直線偏光したレーザーを底面から入射させる場合を示す概念図である。
【図２２】直線偏光したレーザーを所定の方向から多点に入射させるための配向制御用光源部の構造を示す概念図である。
【図２３】直線偏光したレーザーを所定の方向から多点に入射させるための光学系の一例を示す概念図である。
【図２４】直線偏光したレーザーを所定の方向から多点に入射させるための光学系の別の例を示す概念図である。
【図２５】マイクロレンズアレイを示す概念図である。
【図２６】試薬カップの形状の一例を示す概念図である。
【図２７】集光されたレーザーの焦点と試薬カップとの位置関係の一例を示す概念図である。
【図２８】配向制御光の試薬カップに対する照射方向を切り替えることにより蛍光分子の遷移モーメントの方向を制御するための光学系を示す概念図である。
【発明を実施するための形態】
【００２４】
以下、添付図面を参照しながら本発明の実施の形態について説明する。生体分子検出には様々な特異的な反応が利用されるが、各実施の形態では、抗原および抗体の特異的な反応を利用し、当該抗体に結合する配向用標識に対して標識された蛍光分子から発生する蛍光を基に、抗体と反応した抗原を検出する装置を例にとって説明する。
【００２５】
（実施の形態１）
図１Ａおよび図１Ｂは、本発明の実施の形態１に係る生体分子検出装置における抗原抗体反応の概要を示した模式図である。図１Ａおよび１Ｂを用いて、液中での抗原抗体反応について説明する。実施の形態１では、１種類の抗体を使用し、均一溶液中で１種類の抗原を検出する。ここでは、円筒形の試薬カップ１０の中に乾燥した抗体１２が入れられている場合を考える。抗体１２は、円柱状の形状を有する配向用標識８に結合されている。配向用標識８の周囲には、複数の蛍光分子１４が固定されている。
【００２６】
本実施の形態においては、検体は全血から分離した血漿１６である。試薬カップ１０に血漿１６を分注して撹拌すると、血漿１６中に抗体１２と特異的に結合する抗原１８が存在する場合は、抗体１２と抗原１８との間で抗原抗体反応が起こり、図１Ｂに示すように抗原１２および抗体１８が特異的に結合する。抗体１２は抗原１８に対して十分に多い量が入れられているため、一部の抗体１２は抗原抗体反応をしないまま血漿１６中に残る。以下、抗原抗体反応で結合した抗体１２および抗原１８ならびに配向用標識８および蛍光分子１４が結合した複合体をバインディング分子、抗原１８と結合していない抗体１２、配向用標識８および蛍光分子１４が結合した複合体をフリー分子と呼ぶ。バインディング分子およびフリー分子は、血漿溶液中に混在している。なお、血漿中には抗原１８以外の成分も存在するが、説明を簡単にするため、図１Ａおよび１Ｂでは抗原１８以外の成分は省略して描いてある。
【００２７】
本発明の実施の形態１に係る生体分子検出装置は、液相であることによりフリー分子およびバインディング分子が混在している溶液に対し、励起光を照射し、フリー分子およびバインディング分子に付随する蛍光分子１４から発生する蛍光を受光して、抗原１８の検出および定量を行う。従って、抗原１８を含むバインディング分子から発生する蛍光のみを検出することが望ましいが、フリー分子およびバインディング分子は溶液中に混在しているため、溶液に励起光を照射するとフリー分子に付随する蛍光分子１４からも蛍光が発生して不要成分となる。そこで、本発明の実施の形態１に係る生体分子検出装置は、フリー分子およびバインディング分子の配向を光により切り替えつつ蛍光を検出し、配向の切り替えに伴う蛍光強度の変化に基づいて、全蛍光データの中からバインディング分子に付随する蛍光分子から発生する蛍光の寄与分を算出する。
【００２８】
本発明の実施の形態１に係る生体分子検出装置において、バインディング分子から発生する蛍光の寄与分とフリー分子から発生する蛍光の寄与分とを算出する原理を説明するために、実施の形態１に係る生体分子検出装置に用いるフリー分子およびバインディング分子の構造について図２Ａおよび２Ｂを用いて説明する。図２Ａはフリー分子２０の模式図を表す。フリー分子２０は、抗体１２、配向用標識８および蛍光分子１４を有する。一方、図２Ｂはバインディング分子２２の模式図を表す。バインディング分子２２は、抗体１２、配向用標識８および蛍光分子１４、並びに、抗体１２に結合した抗原１８を有する。
【００２９】
配向用標識８は、抗体１２および蛍光分子１４と結合し、抗体１２および蛍光分子１４を配向させるための標識である。配向用標識８は、細長い棒状の形状を有しており、光という外力を受けて特定の方向に配向する性質を有する。抗体１２および蛍光分子１４は、光により外力を受けて特定の方向に配向しようとするが、分子量が小さいと配向しない場合がある。そこで、本実施の形態では、抗体１２および蛍光分子１４に更に配向用標識８を結合させ、この配向用標識８を配向させることで、抗体１２および蛍光分子１４を配向させる。配向用標識８は、例えば、長手方向の長さが約３００ｎｍのＩ型コラーゲンを用いることができる。配向用標識８は、抗体１２および蛍光分子１４より十分大きい。なお、図２Ａおよび２Ｂでは、説明を分かりやすくするために配向用標識８を円柱状の形状で示した。コラーゲンと、抗体１２または蛍光分子１４との結合は、公知の任意の方法を用いることができる。
【００３０】
蛍光分子１４は、励起光を受けて蛍光を発する分子である。蛍光分子１４は、配向用標識８の両端面ならびに配向用標識８の側面に満遍なく放射状に結合されている。
【００３１】
抗体１２は、抗原１８と特異的に結合する物質であり、配向用標識８に結合されている。抗体１２は、ユーザーが検出したい検出対象物質と特異的に結合するものを使用する。
【００３２】
本実施の形態では、検体に全血を用い、検出対象物質である抗原１８としてＰＳＡ（Ｐｒｏｓｔａｔｅ Ｓｐｅｃｉｆｉｃ Ａｎｔｉｇｅｎ）を検出する場合を考え、検出対象物質と特異的に結合する物質である抗体１２として抗ＰＳＡ抗体を用いた場合について示す。蛍光分子１４としては、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ５６８（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ社の商品名）を用いた。Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ５６８は、波長６１０ｎｍ程度にピークを持ち、５５０ｎｍ−７００ｎｍ程度の波長を持った蛍光を発する。
【００３３】
蛍光分子１４（Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ５６８）のサイズは約１ｎｍである。従って、蛍光分子１４は配向用標識８に比べて十分に小さいため、配向用標識８の周囲に複数結合させることができる。なお、図２Ａおよび２Ｂでは、説明を分かりやすくするために蛍光分子１４のサイズを大きく描いてある。
【００３４】
蛍光分子１４は、光エネルギーを吸収すると励起状態に遷移し、基底状態に戻る過程で蛍光を発する。一般に、直線偏光した励起光で蛍光分子１４が励起された場合、蛍光分子１４は励起光の振動方向と同じ方向に偏光した蛍光を発する。蛍光分子１４から発生する蛍光の偏光度は、蛍光分子１４の回転速度に依存する。蛍光分子１４が回転運動していなければ、蛍光分子１４は励起光の振動方向と同じ方向に偏光した蛍光を発し、蛍光分子１４が速い回転運動をしているほど、蛍光分子１４は偏光していない蛍光を発する。なお本明細書において、光の「振動方向」とは電場の振動方向を意味し、光が偏光している場合にはその偏光方向と同義である。
【００３５】
蛍光分子１４が励起光により励起される場合、蛍光分子１４の分子構造によって決まる遷移モーメントという蛍光分子１４内のベクトルが励起光と相互作用する。遷移モーメントは、ある固有の方向を蛍光分子１４内で持っており、遷移モーメントの方向と励起光の振動方向との関係が蛍光分子１４の励起効率を決定する。具体的には、蛍光分子１４は、遷移モーメントと平行な方向に振動する光を選択的に吸収する。従って、図３Ａおよび３Ｂに示すように、励起光１９が紙面左右に振動しながら紙面下から上に進行して蛍光分子１４に当たる場合、直線偏光した励起光１９の振動方向が蛍光分子１４の遷移モーメントと平行な場合（図３Ａ）に最も励起効率が高くなり、直線偏光した励起光１９の振動方向と蛍光分子１４の遷移モーメントとのなす角が大きくなるほど励起効率は下がり、直線偏光した励起光１９の振動方向が蛍光分子１４の遷移モーメントと直交する場合（図３Ｂ）に励起効率が０となる。遷移モーメントの向きは、蛍光分子１４の向きによって変わるため、溶液中における蛍光分子１４の向きは、蛍光分子１４の励起効率に影響を与える。なお、ここでは説明を分かりやすくするために、蛍光分子１４の長手方向と蛍光分子１４の遷移モーメントの方向とが平行となっている場合を例にとって図示したが、蛍光分子の形状と遷移モーメントとの関係は必ずしも平行となる場合ばかりではない。
【００３６】
このように、蛍光分子１４の遷移モーメントと励起光１９の振動方向との関係は、蛍光分子１４の励起効率に影響を与えるが、このことは、フリー分子２０およびバインディング分子２２に結合している蛍光分子１４の遷移モーメントと励起光１９の振動方向との関係にも当てはまる。フリー分子２０およびバインディング分子２２が直線偏光（光の振動方向が同一平面内にある偏光）した励起光によって励起された場合の励起効率について図４Ａおよび４Ｂを用いて説明する。
【００３７】
図４Ａおよび４Ｂに示されるように本実施形態では、配向用標識８の側面に、配向用標識８の中心軸に対して放射状に蛍光分子１４が結合されている。したがって、これらの配向用標識８の側面に結合した蛍光分子１４の遷移モーメントの方向も配向用標識８の中心軸に対して放射状となっている。また、図４Ａおよび４Ｂでは、配向用標識８の両端面に結合している蛍光分子の遷移モーメントは、配向用標識８の長手方向と平行となっている。
【００３８】
図４Ａは、励起光１９の振動方向と配向用標識８の長手方向とが互いに平行となる場合を示す図である。この場合、バインディング分子２２が有する複数の蛍光分子１４の中で、励起される蛍光分子は、主に配向用標識８の両端面に結合した蛍光分子（破線で示す領域２４ａおよび領域２４ｂに含まれる蛍光分子）である。配向用標識８の側面に結合した蛍光分子は、遷移モーメントが励起光の振動方向と垂直となるため励起されない。
【００３９】
図４Ｂは、励起光１９の振動方向と配向用標識８の長手方向とが互いに垂直となる場合を示す図である。この場合、バインディング分子２２が有する複数の蛍光分子１４の中で、励起される蛍光分子は、配向用標識８の側面に放射状に結合した蛍光分子のうち、主に遷移モーメントが励起光１９の振動方向と垂直の関係になっていない蛍光分子（破線で示す領域２６ａおよび領域２６ｂに含まれる蛍光分子）である。配向用標識８の両端面に結合した蛍光分子は、遷移モーメントが励起光の振動方向と垂直となるため励起されない。また、配向用標識８の側面に放射状に結合した蛍光分子のうち、遷移モーメントが励起光１９の振動方向と垂直となる蛍光分子（例えば、蛍光分子１４ａおよび蛍光分子１４ｂ）は励起されない。
【００４０】
配向用標識８は細長い円柱状の形状を有しており、配向用標識８の側面の面積は配向用標識８の両端面の面積より大きいため、配向用標識８の側面には配向用標識８の両端面と比べて多くの蛍光分子が結合している。従って、励起光１９の振動方向と配向用標識８の長手方向とが互いに垂直の位置関係にある場合の方が、励起光１９の振動方向と配向用標識８の長手方向とが互いに平行の位置関係にある場合と比べて、より多くの蛍光分子を励起することができる。つまり、励起光１９の振動方向を一定としながら配向用標識８の配向方向（配向用標識８の長手方向）を変化させると、バインディング分子２２から発生する蛍光の総量も変化する。
【００４１】
なお、厳密には、励起光１９の振動方向と配向用標識８の長手方向とが互いに平行となる場合においても、配向用標識８の側面に結合した蛍光分子１４が斜めに結合していれば、遷移モーメントが励起光１９の振動方向と完全に垂直とはならず、配向用標識８の側面に結合した蛍光分子１４が励起される場合がある。しかし、配向用標識８の側面に結合し、遷移モーメントが励起光１９の振動方向と垂直とならない蛍光分子の個数は全体から見るとわずかな量しかない。したがって、バインディング分子２２全体として見ると、このレアケースのバインディング分子２２は、励起光１９の振動方向と配向用標識８の長手方向とが互いに垂直となる場合ほどの蛍光を発することはない。同様に、励起光１９の振動方向と配向用標識８の長手方向とが互いに垂直となる場合においても、配向用標識８の両端面に結合した蛍光分子のうち励起されるものが現れる場合があるが、バインディング分子２２全体として見るとそれらの割合は無視できるほどに少ない。
【００４２】
なお、図４Ａおよび４Ｂでは、バインディング分子２２を図示して説明したが、フリー分子２０の場合においても、励起光１９の振動方向と配向用標識８の長手方向との関係に応じてバインディング分子２２の場合と同じ位置にある蛍光分子が励起される。
【００４３】
溶液中における蛍光分子１４の向きを考えるため、溶液中におけるフリー分子２０およびバインディング分子２２の運動について説明する。フリー分子２０およびバインディング分子２２は、溶液中で不規則に運動（ブラウン運動）しており、溶液中の移動および回転運動を行っている。溶液中での分子のブラウン運動は、絶対温度、分子の体積、溶媒の粘度等の影響を受けることが知られている。バインディング分子２２は、抗原１８の分だけフリー分子２０より体積が大きく、溶液中でブラウン運動しにくい。溶液中でフリー分子２０およびバインディング分子２２のブラウン運動のしやすさが互いに異なることを利用して、ブラウン運動の変化からバインディング分子２２の検出を行う方法が知られているが、ブラウン運動というランダムな運動を利用しているため検出感度に限界がある。
【００４４】
そこで、本発明の実施の形態１に係る生体分子検出装置は、レーザーを利用して溶液中のフリー分子およびバインディング分子の配向を制御する。溶液中のフリー分子およびバインディング分子にレーザーを照射すると、主に配向用標識８が外力を受け、溶液中でランダムな運動をしていたフリー分子およびバインディング分子は、特定の一方向を向く（以下、このように外力の付加を受けて分子が特定の一方向を向いた状態を、分子の配向が完了した状態という）。フリー分子およびバインディング分子は、体積または質量の違いにより溶液中での移動および回転運動のしやすさが異なる。レーザーで溶液中の分子の配向を制御した場合においても、フリー分子とバインディング分子とでは、レーザーを照射されてからこれらの分子の配向が完了するまでに要する時間に差が生じる。本発明の実施の形態１に係る生体分子検出装置は、フリー分子およびバインディング分子のそれぞれの配向が完了するまでに要する時間の差を利用して、フリー分子およびバインディング分子それぞれに付随した蛍光分子１４の励起効率に差を生じさせ、バインディング分子から発生する蛍光の寄与分の算出を行う。
【００４５】
続いて、本発明の実施の形態１に係る生体分子検出装置１００の構成について説明する。図５Ａは、生体分子検出装置１００の外観斜視図である。生体分子検出装置１００の側面には、表示部１０２、ユーザー入力部１０４および開閉部１０６がある。表示部１０２は、測定結果等を表示する。ユーザー入力部１０４は、モードの設定および検体情報の入力等を行う。開閉部１０６は、上蓋の開閉が可能な構成となっており、検体のセット時には上蓋が開けられ、測定時には上蓋が閉じられる。この構成により、外部の光が測定に影響を与えることを防いでいる。
【００４６】
図５Ｂは、開閉部１０６を開いた場合における生体分子検出装置１００の外観斜視図である。開閉部１０６を開くと、中には試薬カップ１０８および保持台１１０がある。試薬カップ１０８は、保持台１１０に保持されており、保持台１１０から着脱可能となっている。試薬カップ１０８は、溶液を入れる円柱状の容器である。ユーザーは、試薬カップ１０８に検体を分注し、上蓋を閉じて測定を行う。図示しないが、生体分子検出装置１００内には試薬タンクおよび分注部があり、測定が開始されると、分注部は試薬タンク内から試薬を吸い上げて試薬カップ１０８内に分注する。
【００４７】
図６は、生体分子検出装置１００の主要な構成を説明するための機能ブロック図である。生体分子検出装置１００は、表示部１０２、ユーザー入力部１０４、試薬カップ１０８、試薬タンク１１２、分注部１１４、配向制御用光源部１１６、励起光源部１１８、偏光方向制御部１２０、ファンクションジェネレータ（ＦＧ）１２２、受光部１２４、増幅部１２６、Ａ／Ｄ変換部１２８、サンプリングクロック発生部１３０およびＣＰＵ１３２を有する。
【００４８】
試薬カップ１０８は、試薬タンク１１２に保存してある試薬と患者等から採取した検体とを反応させる容器である。試薬カップ１０８は、生体分子検出装置１００から着脱可能となっている。試薬カップ１０８の容量は、例えば約１２０μＬである。
【００４９】
試薬タンク１１２は、複数種類の試薬を貯めておくタンクである。フリー分子２０は試薬タンク１１２中試薬として保存されている。
【００５０】
分注部１１４は、着脱可能なピペットや吸引器によって構成される。分注部１１４は、ＣＰＵ１３２からの命令に従い、測定に使用する試薬を試薬タンク１１２からピペットで吸い上げ、試薬カップ１０８へ分注する。
【００５１】
配向制御用光源部１１６は、試薬カップ１０８の下部に設けられ、内部に備えた偏光子により直線偏光した配向制御光１１７を偏光方向制御部１２０に向けて照射し、試薬カップ１０８内の溶液中にあるフリー分子２０およびバインディング分子２２に外力を加えてこれらの分子の配向を制御する。配向制御光１１７としては、例えば波長１．３μｍ、出力７００ｍＷのレーザーを用いる。配向制御光１１７は、試薬カップ１０８の溶液全体を照らす程度の幅を有している。
【００５２】
励起光源部１１８は、試薬カップ１０８の下部に設けられ、内部に備えた偏光子により直線偏光した励起光１１９を試薬カップ１０８の下部から上部に向けて照射して蛍光分子１４を励起する。励起光としては、例えば波長５３２ｎｍ、出力１０ｍＷの光を用いる。
【００５３】
偏光方向制御部１２０は、配向制御光１１７の偏光方向（振動方向）を切り替えることで、フリー分子２０およびバインディング分子２２の配向方向を切り替える。なお、本明細書において、フリー分子およびバインディング分子に関して「配向方向」とは、配向が完了した状態における配向用標識８の長手方向を意味するものとする。偏光方向制御部１２０は、λ／２波長板を有する。λ／２波長板は、垂直な方向に振動する偏光の光路差を１／２波長変化させる機能を有する位相板であり、光の偏光面を回転操作するために用いられる。λ／２波長板の光学軸方向と平行な方向に直線偏光した光はλ／２波長板を素通りするが、λ／２波長板の光学軸方向と４５度の角度をなす方向に直線偏光した光は振動方向が９０度変化する。つまり、直線偏光した光に対するλ／２波長板の角度を切り替えることで、光を素通りさせる場合と、光の振動方向を９０度変化させる場合とを切り替えることができる。偏光方向制御部１２０は、ＦＧ１２２からの信号を受けてλ／２波長板を回転し、配向制御光１１７の振動方向を９０度切り替える。換言すれば、配向制御光１１７の振動方向は、ＦＧ１２２が発生する電圧信号によって決まる。
【００５４】
ＦＧ１２２は、様々な周波数と波形をもった電圧信号を発生させることのできる装置で、ＣＰＵ１３２からの命令を受けて、偏光方向制御部１２０およびサンプリングクロック発生部１３０へそれぞれ異なる電圧信号を出力する。以下、ＦＧ１２２から偏光方向制御部１２０へ出力される電圧信号を配向制御信号という。
【００５５】
ＣＰＵ１３２は、生体分子検出装置１００の各動作を統括的に制御し、測定結果の演算等を行う。ＣＰＵ１３２は、ＦＧ１２２が出力する配向制御信号を指定することで、偏光方向制御部１２０が配向制御光１１７の振動方向を切り替えるタイミングを制御する。
【００５６】
受光部１２４は、試薬カップ１０８の下部に設けられ、試薬カップ１０８内の蛍光分子１４から発生する蛍光１２３を試薬カップ１０８の下部で受光し、受光した光の信号をアナログ電気信号（アナログ蛍光データ）に変換して増幅部１２６へ出力する。
【００５７】
増幅部１２６は、受光部１２４から出力されたアナログ蛍光データを増幅してＡ／Ｄ変換部１２８へ出力する。
【００５８】
サンプリングクロック発生部１３０は、ＦＧ１２２から入力された電圧信号に基づいて、Ａ／Ｄ変換部１２８がアナログ蛍光データをサンプリングするタイミングを指定するサンプリングクロックをＡ／Ｄ変換部１２８へ出力する。
【００５９】
Ａ／Ｄ変換部１２８は、サンプリングクロック発生部１３０から出力されたサンプリングクロックに基づいて、増幅部１２６から出力されたアナログ蛍光データのサンプリングを行い、サンプリングしたアナログ蛍光データをデジタルデータに変換してＣＰＵ１３２へ出力する。
【００６０】
ＣＰＵ１３２は、Ａ／Ｄ変換部１２８から出力されたデジタルデータの演算を行い、その結果を表示部１０２へ出力する。また、ＣＰＵ１３２は、ユーザー入力部１０４から入力を受けて、配向制御用光源部１１６、励起光源部１１８、分注部１１４およびＦＧ１２２の動作の指示命令を行う。具体的には、ＣＰＵ１３２は、配向制御用光源部１１６および励起光源部１１８に対してはそのＯＮ／ＯＦＦ命令を行い、分注部１１４に対しては使用する試薬を指定する命令および分注動作開始命令を行い、ＦＧ１２２に対しては出力する電圧信号の波形の指示命令および出力命令を行う。
【００６１】
図７（Ａ）〜（Ｃ）に示す模式図を用いて、配向制御用光源部１１６から照射される配向制御光１１７の振動方向の切り替えに伴うフリー分子２０およびバインディング分子２２の動作を説明する。
【００６２】
配向制御用光源部１１６から照射された配向制御光１１７は、偏光方向制御部１２０を通って試薬カップ１０８へ照射される。偏光方向制御部１２０は、配向制御用光源部１１６から照射された配向制御光１１７の振動方向を２方向に切り替える。具体的には、偏光方向制御部１２０は、ＦＧ１２２から０Ｖの配向制御信号を受信した場合には配向制御光１１７を素通りさせ、ＦＧ１２２から５Ｖの配向制御信号を受信した場合には配向制御光１１７の振動方向を９０度切り替える。本実施形態では、偏光方向制御部１２０が配向制御光１１７を素通りさせた場合に試薬カップ１０８に入射する配向制御光１１７の振動方向は、励起光１１９の振動方向と平行となる。したがって、偏光方向制御部１２０が配向制御光１１７の振動方向を９０度切り替えた場合に試薬カップ１０８に入射する配向制御光１１７の振動方向は、励起光１１９の振動方向と垂直となる。
【００６３】
配向制御光１１７は、フリー分子２０およびバインディング分子２２に外力を加えることでこれらの分子を配向させる。配向制御光１１７による外力は、配向制御光１１７がフリー分子２０およびバインディング分子２２に当たって散乱する反作用として生じるものである。したがって、配向制御光１１７が振動する方向とフリー分子２０およびバインディング分子２２の向きとの関係によって、配向制御光１１７が力を及ぼす方向が決まる。フリー分子２０およびバインディング分子２２は、溶液中でランダムな方向を向いて分散しているが、配向制御光１１７を照射されると配向制御光１１７によって少し回転するような方向（回転方向）の力を受ける。そして、配向制御光１１７による作用を受けたフリー分子２０およびバインディング分子２２は、配向制御光１１７が及ぼす様々な方向への回転方向の力が釣り合う方向を向いて安定する。この場合、フリー分子２０およびバインディング分子２２が、配向制御光１１７が及ぼす回転方向の力が釣り合う方向を向くとは、配向用標識の長手方向が配向制御光１１７の振動方向と平行になることをいう。従って、配向制御光１１７の振動方向を変化させれば、フリー分子２０およびバインディング分子２２が配向する方向を変化させることができる。
【００６４】
図７Ａは、偏光方向制御部１２０が配向制御光１１７を素通りさせた場合におけるフリー分子２０およびバインディング分子２２の配向方向を示す図である。紙面左右方向に振動している配向制御光１１７が試薬カップ１０８に入射すると、フリー分子２０およびバインディング分子２２は、配向用標識８の長手方向が配向制御光１１７の振動方向と平行となるように配向する。
【００６５】
図７Ｂは、配向制御光１１７の振動方向を９０度切り替えて配向制御光１１７が紙面に垂直な方向に振動するようにした初期段階におけるフリー分子２０およびバインディング分子２２の動作を示す図である。ＦＧ１２２から５Ｖの配向制御信号が出力されると、偏光方向制御部１２０は、配向制御光１１７の振動方向を紙面に垂直な方向に切り替える。紙面に垂直な方向に振動する配向制御光１１７が試薬カップ１０８に入射すると、フリー分子２０およびバインディング分子２２は、配向用標識８の長手方向が配向制御光１１７の振動方向と平行となるように回転運動を行う。この場合、バインディング分子２２に比べて体積および質量が小さいフリー分子２０の方が速く回転運動し、その配向が完了するまでに要する時間が短い。バインディング分子２２の配向はフリー分子２０より遅れて完了する。
【００６６】
図７Ｃは、配向制御光１１７の紙面に垂直な方向に振動している場合における、それぞれ配向が完了したフリー分子２０およびバインディング分子２２の配向方向を示す図である。配向制御光１１７の振動方向が紙面に垂直な方向である場合、フリー分子２０およびバインディング分子２２は、配向用標識８の長手方向が紙面に垂直となる向きに配向する。
【００６７】
生体分子検出装置１００は、ＦＧ１２２からの配向制御信号の入力により偏光方向制御部１２０が有するλ／２波長板の向きを切り替えることで、配向制御光１１７の振動方向、並びに、フリー分子２０およびバインディング分子２２の配向方向を角度が９０度互いに異なる２つの方向にそれぞれ切り替えることができる。
【００６８】
フリー分子２０およびバインディング分子２２の配向方向と励起光１１９との関係について図８Ａおよび８Ｂを用いて説明する。
【００６９】
図８Ａは、ＦＧ１２２から偏光方向制御部１２０への配向制御信号の出力が０Ｖの場合における励起光１１９の振動方向とフリー分子２０およびバインディング分子２２の配向方向との関係を示した模式図である。
【００７０】
ＦＧ１２２から偏光方向制御部１２０への配向制御信号の出力が０Ｖの場合、励起光１１９の振動方向と配向用標識８の長手方向とが平行となる。この場合、フリー分子２０およびバインディング分子２２が有する複数の蛍光分子１４の中で、主に配向用標識８の両端面に結合した蛍光分子１４が励起される。これは、配向用標識８の両端面に結合した蛍光分子の遷移モーメントが、励起光１１９の振動方向と垂直とならないためである。配向用標識８の側面に結合した蛍光分子１４は、遷移モーメントが励起光１１９の遷移モーメントと垂直となるため励起されない。
【００７１】
図８Ｂは、ＦＧ１２２から偏光方向制御部１２０への配向制御信号の出力が５Ｖの場合における励起光１１９の振動方向とフリー分子２０およびバインディング分子２２の配向方向との関係を示した模式図である。
【００７２】
ＦＧ１２２から偏光方向制御部１２０への配向制御信号の出力が５Ｖの場合、励起光１１９の振動方向と配向用標識８の長手方向とが垂直となる。この場合、フリー分子２０およびバインディング分子２２が有する複数の蛍光分子１４の中で、主に配向用標識８の側面に結合した蛍光分子１４が励起される。これは、配向用標識８の側面に結合した蛍光分子１４の遷移モーメントが、原則励起光１１９の振動方向と垂直とならないためである。配向用標識８の両端面に結合した蛍光分子１４、ならびに、配向用標識８の側面に結合しかつ励起光１１９の振動方向と垂直な遷移モーメントを有する一部の蛍光分子１４は、遷移モーメントが励起光１１９の遷移モーメントと垂直となるため励起されない。
【００７３】
配向用標識８の側面には配向用標識８の両端面と比べて多くの蛍光分子１４が結合しているため、ＦＧ１２２から偏光方向制御部１２０への配向制御信号の出力が５Ｖの場合の方が０Ｖの場合と比べ、フリー分子２０またはバインディング分子２２の１分子あたりの発光量が多い。そのため、ＦＧ１２２から偏光方向制御部１２０への配向制御信号の出力が５Ｖの場合の方が、試薬カップ１０８内の溶液中から発生する蛍光の総量も多い。
【００７４】
このように、偏光方向制御部１２０による配向制御光１１７の振動方向の切り替えは、フリー分子２０およびバインディング分子２２の１分子あたりの発光量を切り替えることになる。一方、フリー分子２０およびバインディング分子２２は体積および質量が異なるため、配向制御光１１７の振動方向の切り替えに応じて配向が切り替わる速度は、これらの分子では互いに異なる。
【００７５】
フリー分子２０は、バインディング分子２２に比べて体積および質量が小さいため、配向制御光１１７の振動方向の切り替えに応じて、バインディング分子２２より早く配向を変化させる。つまり、バインディング分子２２より早くその配向が完了することで、１分子あたりの発光量が増加するタイミングがバインディング分子２２より早い。生体分子検出装置１００は、配向制御光１１７の振動方向の切り替えに伴ってフリー分子２０とバインディング分子２２との発光量が切り替わるタイミングが異なることを利用して、総発光量に対するフリー分子２０の寄与分とバインディング分子２２の寄与分との分離を行う。
【００７６】
続いて図９を用いて受光部１２４の詳細な構成について説明する。図９は、受光部１２４の詳細な構成を表した模式図である。受光部１２４は、レンズ１４２、フィルタ１４４、偏光子１４６、レンズ１４８およびＰＤ（フォトダイオード）１５０を含む。
【００７７】
受光部１２４は、試薬カップ１０８の底面側から蛍光を受光する。試薬カップ１０８内のフリー分子２０またはバインディング分子２２から発生して受光部１２４の紙面左側部分に入射する蛍光１４７および受光部１２４の紙面右側部分に入射する蛍光１４９は、レンズ１４２によって集光および平行化され、フィルタ１４４を通って偏光子１４６へ入射する。なお、図示しないが蛍光１４７と蛍光１４９との間にも蛍光が存在し、それらの挙動は当業者であれば予測可能であるので説明を省略する。
【００７８】
フィルタ１４４は、蛍光分子１４から発生する蛍光以外の光をカットするバンドパスフィルタであり、励起光等の蛍光以外の光がＰＤ１５０へ入射することを防いでいる。
【００７９】
偏光子１４６は、励起光１１９の振動方向と同じ方向に偏光した光のみを透過させる。配向が完了した蛍光分子、すなわちブラウン運動などの運動をしていない蛍光分子１４を直線偏光した励起光１１９で励起すると、蛍光分子１４から発生する蛍光も励起光の振動方向と同じ方向に直線偏光した光となる。そのため、配向が完了したフリー分子２０またはバインディング分子２２から発生した蛍光は、偏光子１４６を透過することができる。試薬カップ１０８内で散乱された励起光１１９や、配向方向を切り替えている途中のフリー分子２０またはバインディング分子２２に付随する蛍光分子１４から発生した蛍光は、振動方向が元々の励起光１１９の振動方向と異なっているため偏光子１４６を透過できない。このように、偏光子１４６は、配向が完了したフリー分子２０およびバインディング分子２２に付随する蛍光分子１４から発生する蛍光のみを透過させる。
【００８０】
ＰＤ１５０は、レンズ１４８によって集光された蛍光を受光し、受光した蛍光の強度に応じた電荷を発生させて増幅部１２６へ出力する。このようにして受光部１２４は、配向が完了した蛍光分子１４から発生した蛍光を電荷に変換する。
【００８１】
続いて生体分子検出装置１００の測定時における動作について説明する。図１０は、検体の準備から廃棄までの流れを模式的に表した図である。
【００８２】
測定の準備にあたり、まず患者から５０μＬ採集した全血１５６を遠心分離し、血漿１６を分離する。分離して取り出した血漿１６を、生体分子検出装置１００の検体セット部１５２にセットする。ここまでの作業はユーザーが行う。
【００８３】
生体分子検出装置１００は、検体セット部１５２にセットされた血漿１６を、試薬カップストック部１６０にストックしてある未使用の試薬カップ１０８の中に分注する。続いて、生体分子検出装置１００は、試薬タンク１１２の中にあるフリー分子２０をピペット１５８で吸い上げ、試薬カップ１０８の中に分注する。試薬カップ１０８内に血漿１６およびフリー分子２０を注入後、生体分子検出装置１００は、試薬カップ１０８を３７℃で温調しながら、内蔵したボルテックスミキサーによって振動させて抗原抗体反応を起こさせる。その後、生体分子検出装置１００は、励起光の照射および蛍光の検出を行い、蛍光の検出終了後に試薬カップ１０８を内蔵のごみ箱１５４へ廃棄する。
【００８４】
測定の際にＦＧ１２２が出力する配向制御信号、サンプリングクロック発生部１３０が出力するサンプリングクロック、ＰＤ１５０が出力するＰＤ出力およびＡ／Ｄ変換部１２８が出力するＡ／Ｄ変換部出力について、図１１を用いて説明する。図１１は、縦軸がそれぞれ生体分子検出装置１００における配向制御信号の電圧、サンプリングクロックの電圧、ＰＤ出力およびＡ／Ｄ変換部出力を表し、横軸が時間ｔを表したグラフである。なお、ここでは説明を容易にするため、ＰＤ出力およびＡ／Ｄ変換部出力については、グラフを模式的に示してある。
【００８５】
ＦＧ１２２から出力される配向制御信号は、測定前は０Ｖとなっている。測定前においては、配向制御光１１７を溶液中に照射してフリー分子２０およびバインディング分子２２を配向させておく。配向制御信号が０Ｖの場合、サンプリングクロックも０Ｖとなりサンプリングは行われない。サンプリングクロックが入力されないため、Ａ／Ｄ変換部出力も０となる。配向制御信号が０Ｖの場合、励起光を試薬カップ１０８に向けて照射すると、ＰＤ出力は、初めフリー分子２０およびバインディング分子２２が有する配向用標識８の両端面に結合した蛍光分子１４が発光したことによる出力と装置に起因するノイズとを加算したｉｚの値となる。
【００８６】
続いて、生体分子検出装置１００は、配向制御信号を５Ｖにする。配向制御信号を５Ｖとすると、サンプリングクロック発生部１３０は、サンプリングタイミングを表すサンプリングクロックとして５Ｖの信号を定期的に出力する。そして、Ａ／Ｄ変換部１２８はサンプリングクロックの５Ｖの信号を受信したタイミングでアナログ蛍光データのサンプリングをしてＡ／Ｄ変換を行う。
【００８７】
また、配向制御信号を５Ｖとすると、偏光方向制御部１２０が配向制御光１１７の振動方向を９０度切り替える。配向制御光１１７の振動方向の切り替えに伴い、試薬カップ１０８内のフリー分子２０およびバインディング分子２２の配向方向が９０度切り替わる。この場合、バインディング分子２２に比べて体積および質量の小さいフリー分子２０の方が配向方向の切り替えが速い。配向が切り替わる途中のフリー分子２０およびバインディング分子２２に付随する蛍光分子１４から発生した蛍光は、大半が偏光していないため偏光子１４６によって遮断される。
【００８８】
配向が完了したフリー分子２０は、配向が切り替わる前に比べて多くの蛍光を発する。配向が完了したフリー分子２０に付随する蛍光分子から発生した蛍光は、励起光と同じ方向に偏光しているため、偏光子１４６によって遮断されずＰＤ１５０に到達する。配向が完了したフリー分子２０が増加することに伴い、ＰＤ出力もｉｚから増加していく。時刻Ｔ１で全てのフリー分子２０の配向が完了すると、ＰＤ出力は値ｉｆで一旦飽和する。
【００８９】
その後、時刻Ｔ２でバインディング分子２２の配向が完了し始めることに伴い、ＰＤ出力は再び増加していく。配向が切り替わる途中のバインディング分子２２に付随する蛍光分子１４から発生した蛍光は、大半が偏光していないため偏光子１４６によって遮断される。時刻Ｔ３で全てのバインディング分子２２の配向が完了すると、ＰＤ出力は値ｉｔで飽和する。
【００９０】
Ａ／Ｄ変換部出力は、ＰＤ出力と同様に初めＤｚの値を出力し、徐々に増加して値Ｄｆで一旦飽和する。ＰＤ出力がｉｆから増加することに伴い、Ａ／Ｄ変換部出力も徐々に増加してＤｔで飽和する。このように、配向制御信号を０Ｖとしておき、その後配向制御信号を５Ｖとすれば、フリー分子２０に付随する蛍光分子から発生した蛍光による寄与分と、バインディング分子２２に付随する蛍光分子から発生した蛍光による寄与分とが時間差を伴ってＡ／Ｄ変換部出力に表れる。
【００９１】
配向制御信号は、５Ｖの出力がＴ秒間続いた後０Ｖとなる。このＴ秒は、少なくともＰＤ出力がｉｔで２度目の飽和をする以上の期間を取る。配向制御信号が５Ｖから０Ｖに切り替わることに伴い、サンプリングクロックは０Ｖとなる。配向制御信号が５Ｖから０Ｖに切り替わると、ＰＤ出力は、しばらくｉｔの値を出力した後ｉｚの値まで減少する。ＰＤ出力がｉｚとなる理由は、配向制御信号が０Ｖに切り替わったことに伴い、励起光１１９の振動方向とフリー分子２０およびバインディング分子２２が有する配向用標識８の長手方向とが平行となり、フリー分子２０およびバインディング分子２２の１分子あたりの発光量が減少するためである。ＰＤ出力がしばらくｉｔの値を出力する理由は、フリー分子２０およびバインディング分子２２の配向方向の切り替えが、配向制御信号の切り替えに対して少し遅れるためである。
【００９２】
ここで、配向制御信号を０Ｖとする期間は、配向制御信号を５Ｖとしていた期間と同じＴ秒とした。これは、配向制御光１１７の出力が一定という条件下では、溶液中のフリー分子２０およびバインディング分子２２の配向が完了するまでに要する時間は、配向制御信号を０Ｖから５Ｖにした場合と配向制御信号を５Ｖから０Ｖにした場合とで、ほぼ同じだからである。配向制御信号が０Ｖから５Ｖに変わって時間Ｔだけ経過し、配向制御信号が０Ｖに戻って時間Ｔだけ経過するまでが、生体分子検出装置１００における測定の１周期である。すなわち、生体分子検出装置１００における１周期の測定時間は２Ｔである。
【００９３】
図１２は、生体分子検出装置１００における配向制御信号を複数周期に亘って示したグラフである。生体分子検出装置１００は、図１２に示すように、配向制御信号を所定の間隔で切り替えて上記１周期の測定を複数回行い、得られた複数のＤｔ、ＤｆおよびＤｚの値についてそれぞれ加算平均を行って、Ｄｔ、ＤｆおよびＤｚの値の平均値を求める。本実施の形態では、上記１周期の測定を１０回行い、Ｄｔ、ＤｆおよびＤｚの値の平均値を求める。これにより、様々な要因により発生する測定結果のばらつきを平均化している。
【００９４】
ＣＰＵ１３２は、得られたＤｔ、Ｄｆ、Ｄｚの平均値から、バインディング分子２２の濃度を算出する。具体的には、初めに測定値Ｓを、次式（１）によって求める。
Ｓ＝（Ｄｔ−Ｄｆ）／（Ｄｔ−Ｄｚ）・・・（１）
【００９５】
式（１）において、（Ｄｔ−Ｄｆ）は、バインディング分子２２が配向方向を切り替えたことに伴い増加した蛍光の強度を表している。（Ｄｔ−Ｄｚ）は、得られたデータの最大値から当初のデータを減ずることで、フリー分子２０およびバインディング分子２２が配向方向を切り替えたことに伴い増加した蛍光の強度を表している。（Ｄｔ−Ｄｆ）を（Ｄｔ−Ｄｚ）で除算することで、光学系変動等の測定結果の再現性を悪化させる要因をキャンセルしている。
【００９６】
ＣＰＵ１３２は、ここで求めた測定値Ｓから、診断値Ｃ（検出対象物質の濃度）を求める。診断値Ｃは、次式によって求める。
Ｃ＝ｆ（Ｓ）・・・（２）
【００９７】
ここで、ｆ（Ｓ）は、検量線関数である。生体分子検出装置１００は、あらかじめ測定項目ごとに異なる検量線関数を持っておき、測定値Ｓを診断値Ｃに変換する。ＣＰＵ１３２は、得られた診断値Ｃを表示部１０２へ出力する。
【００９８】
以上説明したように、本発明の実施の形態１に係る生体分子検出装置１００によれば、配向制御光１１７の振動方向の切り替えにより、溶液中のフリー分子２０およびバインディング分子２２の配向方向を切り替えることが可能な構成とした。配向制御光１１７により切り替えるフリー分子２０およびバインディング分子２２の配向の状態としては、フリー分子２０およびバインディング分子２２が有する配向用標識８の長手方向が励起光１１９の振動方向に対して平行になる状態及び垂直になる状態の２つの状態がある。すなわち生体分子検出装置１００は、配向制御光１１７の振動方向の切り替えにより、フリー分子２０およびバインディング分子２２の１分子あたりの発光量を切り替える。また、フリー分子２０およびバインディング分子２２に関して、配向制御光１１７の照射方向の切り替え後これらの分子の配向がそれぞれ完了するまでに要する時間に差が生じるため、それぞれの分子の発光量が増加するタイミングが互いに異なる。従って生体分子検出装置１００は、溶液中の全ての蛍光分子から蛍光が発生しても、フリー分子およびバインディング分子それぞれに付随する蛍光の寄与分を算出することができ、簡便な構成で検出対象物質の濃度を正確に測定することができる。
【００９９】
また、以上の構成において、生体分子検出装置１００は、配向制御光１１７による外力によって、フリー分子２０およびバインディング分子２２の配向を全て同じ方向に切り替えるため、ブラウン運動というランダムな運動を利用して測定する場合に比べて、高感度な測定をすることができる。
【０１００】
また、フリー分子２０およびバインディング分子２２に配向用標識８を設けたため、配向制御光１１７により配向を変化させることができないほど抗体１２の分子量が小さい場合においても、配向制御光１１７によりフリー分子２０およびバインディング分子２２の配向を切り替えることができ、高感度な測定を行うことができる。また、抗原の分子量が十分に大きい場合においても、配向用標識８を用いることでＳ／Ｎを向上させることができる。
【０１０１】
なお、本実施の形態では、抗原抗体反応を利用する場合を例にとって説明したが、検出対象物質と検出対象物質に特異的に結合する物質との組み合わせは、ここで説明した場合に限られない。例えば本願発明は、抗原を用いて抗体を検出する場合や、特定の核酸を用いて当該核酸とハイブリダイゼーションをする核酸を検出する場合、核酸を用いて核酸結合性たんぱく質を結合する場合、リガンドを用いてレセプターを検出する場合、糖を用いてレクチンを検出する場合、プロテアーゼ検出を利用する場合、高次構造変化を用いる場合等にも適用することができる。
【０１０２】
また、本実施の形態では、測定結果から検出対象物質の濃度の算出までの説明を容易にするため、測定結果のグラフを模式的な図とした場合における検出対象物質の算出の説明を行ったが、必ずしもこのように算出する必要はない。例えば、グラフ中の変曲点に基づいて、フリー分子による蛍光とバインディング分子による蛍光との境目の点を決めて算出を行っても良い。
【０１０３】
また、配向制御信号を５Ｖまたは０Ｖとする期間は、フリー分子およびバインディング分子の体積や、溶媒の粘度、溶液の温度等に基づいて変化させることが望ましい。フリー分子およびバインディング分子に対する配向制御光の振動方向が切り替わった時からこれらの分子の配向が完了するまでに要する時間は、フリー分子およびバインディング分子の体積や、溶媒の粘度、溶液の温度等によって決まる溶液中におけるフリー分子およびバインディング分子の回転しやすさによって決まる。フリー分子およびバインディング分子が溶液中で回転しにくい場合には、フリー分子およびバインディング分子の配向が完了するまでに要する時間が長くなるため、配向制御信号を５Ｖまたは０Ｖとする期間を、配向が完了する程度まで長くすることが望ましい。
【０１０４】
また、本実施の形態では、配向制御光１１７として波長１．３μｍ、出力７００ｍＷのレーザーを用いたが、配向制御光１１７として用いるレーザーはこれに限られない。レーザーの波長および出力は、フリー分子およびバインディング分子の体積、質量等起因する溶液中での回転しやすさに基づいて決定することが望ましく、特に、フリー分子とバインディング分子との間に、それぞれの配向の完了までに要する時間に差が表れる程度の出力のレーザーを用いることが望ましい。
【０１０５】
また、本実施の形態では、励起光１１９として波長５３２ｎｍ、出力１０ｍＷの光を用いたが、励起光１１９として用いる光はこれに限られない。
【０１０６】
なお、本実施の形態では、繰り返し測定を行って測定結果の加算平均を求めたが、加算平均は必ずしも行う必要はなく、ユーザーが何を重視するかによって決定すれば良い。例えば、ユーザーが素早く測定を行いたい場合には、測定を１周期のみ行って結果を表示しても良いし、ユーザーがより高精度な測定を行いたい場合には、１周期の測定を何度も繰り返すことによって測定精度を向上させることもできる。
【０１０７】
（実施の形態２）
図１３Ａおよび１３Ｂは、本発明の実施の形態２に係る生体分子検出装置の抗原抗体反応の概要を示した模式図である。実施の形態２では、２種類の抗体を使用し、均一溶液中で２種類の抗原を検出する。試薬カップ３０の中に、抗体３２および抗体３４が入れられている場合を考える。抗体３２は、配向用標識３６および蛍光分子４０と結合してフリー分子を形成している（以下、フリー分子Ａという）。抗体３４は、配向用標識３８および蛍光分子４２と結合してフリー分子を形成している（以下、フリー分子Ｂという）。
【０１０８】
試薬カップ３０の中に検体４８を入れて撹拌すると、抗体３２と特異的に結合する抗原４４が検体４８中に存在する場合には、フリー分子Ａと抗原４４との間で抗原抗体反応が起こり、抗体３２および抗原４４が特異的に結合する。同様に抗体３４と特異的に結合する抗原４６が検体４８中に存在する場合には、フリー分子Ｂと抗原４６との間で抗原抗体反応が起こり、抗体３４および抗原４６が特異的に結合する。実施の形態１で説明した場合と同様に、一部の抗体は、抗原抗体反応をしないまま溶液中に存在する。以下、抗原抗体反応をしたフリー分子Ａおよび抗原４４をバインディング分子Ａ、抗原抗体反応をしたフリー分子Ｂおよび抗原４６をバインディング分子Ｂと呼ぶ。本実施の形態では、検出対象物質である抗原４４はＰＳＡ、抗原４６はＳＣＣ（Ｓｑｕａｍｏｕｓ Ｃｅｌｌ Ｃａｒｃｉｎｏｍａ）抗原とする。また、抗体３２としてＰＳＡと特異的に結合する抗ＰＳＡ抗体を用い、抗体３４としてＳＣＣ抗原と特異的に結合するＳＣＣ抗体を用いる。蛍光分子４０として、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ５６８（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ社の商品名）を用い、蛍光分子４２として、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ５５５（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ社の商品名）を用いた。Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ５５５は、５４０−７００ｎｍ程度の波長を持った蛍光を発し、５７０ｎｍ程度の波長の蛍光を最も強く発する。
【０１０９】
本発明の実施の形態２に係る生体分子検出装置は、２種類のフリー分子および２種類のバインディング分子が混在する溶液に励起光を照射し、目的のバインディング分子の検出または定量を行う。
【０１１０】
図１４は、本発明の実施の形態２に係る生体分子検出装置２００の主要な構成を示すブロック図である。なお、実施の形態１で示した生体分子検出装置１００と同一の構成要素には同一の符号を付し、その説明を省略する。
【０１１１】
生体分子検出装置２００は、実施の形態１で示した生体分子検出装置１００の構成に対して、受光部２０２、分注部２０４、試薬タンク２０６およびＣＰＵ２０８が主に異なる。
【０１１２】
分注部２０４は、複数の抗体がそれぞれ別の容器に入った試薬タンク２０６から２種類の抗体を吸い上げ、試薬カップ１０８内へ分注する。
【０１１３】
受光部２０２は、試薬カップ１０８内の蛍光分子から発生した蛍光を検出するが、ＣＰＵ２０８からの命令（Ｓ１）を受けて、蛍光分子４０および蛍光分子４２の蛍光を互いに分離して受光できるように構成されている。
【０１１４】
ＣＰＵ２０８は、Ａ／Ｄ変換部１２８から出力されたデジタルデータの演算を行い、その結果を表示部１０２へ出力する。また、ＣＰＵ２０８は、ユーザー入力部１０４から入力を受けて、配向制御用光源部１１６、励起光源部１１８、分注部２０４、ＦＧ１２２および受光部２０２の動作の指示命令を行う。具体的には、ＣＰＵ２０８は、配向制御用光源部１１６および励起光源部１１８に対してはそのＯＮ／ＯＦＦ命令を行い、分注部２０４に対しては使用する試薬を指定する命令および分注動作開始命令を行い、ＦＧ１２２に対しては出力する電圧信号の波形の指示命令および出力命令を行い、受光部２０２に対してはフィルタの切り替え命令を行う。
【０１１５】
受光部２０２の構成について、図１５を用いて具体的に説明する。図１５は、実施の形態２に係る生体分子検出装置２００における受光部２０２の詳細な構成を表した模式図である。受光部２０２内のフィルタ切替部２１０は、フィルタ２１２およびフィルタ２１４の２種類のフィルタを備えている。２種類のフィルタは、可動式となっており、レンズ１４２によって集光された光が通るフィルタを切り替えることができる。フィルタ切替部２１０は、ＣＰＵ２０８からの命令を受けて、使用するフィルタを切り替える。例えば、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ５６８から発生する蛍光を検出する場合は、フィルタ２１２を使用し、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ５５５から発生する蛍光を検出する場合はフィルタ２１４を使用する。これにより、不要な蛍光がフォトダイオード１５０に到達することを防いでいる。本実施の形態では、フィルタ２１２としてＳｐＲｅｄ−Ａフィルタ（Ｓｅｍｒｏｃｋ社の商品名）セットの受光側フィルタを用いる。ＳｐＲｅｄ−Ａフィルタセットの受光側フィルタは、６０５ｎｍ−６５０ｎｍ程度の波長の光を透過するバンドパスフィルタである。フィルタ２１４としてＳｐＯｒ−Ａフィルタ（Ｓｅｍｒｏｃｋ社の商品名）セットの受光側フィルタを用いる。ＳｐＯｒ−Ａフィルタセットの受光側フィルタは、５７５−６００ｎｍ程度の波長の光を透過させるバンドパスフィルタである。なお、本実施の形態では２種類のフィルタにより光を分光して不要な蛍光等がフォトダイオード１５０に到達することを防いだが、必ずしもフィルタを用いて光を分光する必要はない。例えば、回折格子やプリズムを用いて光を分光して、特定の波長を有する光のみを受光してもよい。
【０１１６】
続いて生体分子検出装置２００の測定動作について説明する。生体分子検出装置２００の測定動作は基本的には、実施の形態１で説明した生体分子検出装置１００の測定動作と同じであるが、細かな点で異なる。フリー分子とバインディング分子を分離して検出できる理由については実施の形態１で説明したため、ここでは２種類のバインディング分子を分離して検出する方法を説明する。
【０１１７】
生体分子検出装置２００は、初めに２種類のバインディング分子のどちらを先に検出するか決定する。これは、ユーザーが、ユーザー入力部１０４を通して入力する等して任意に決定することができる。ここでは、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ５６８を蛍光分子として持つバインディング分子Ａから先に測定を行う。ＣＰＵ２０８は、受光部２０２内のフィルタ切替部２１０に、フィルタ２１２の使用を指示する命令を出す。フィルタ切替部２１０は、ＣＰＵ２０８からの命令を受け、レンズ１４２で集光された光が通る位置にフィルタ２１２を移動させる。配向制御信号が５Ｖに変わり、試薬カップ１０８に向けて励起光が照射されると、溶液内の蛍光分子４０および蛍光分子４２のそれぞれから蛍光が発生する。蛍光分子４０および蛍光分子４２のそれぞれから発生した蛍光は、レンズ１４２によって集光され、フィルタ２１２へ入射する。フィルタ２１２は６０５ｎｍ−６５０ｎｍ程度の波長の光のみを通すため、蛍光分子４０から発生した蛍光は当該フィルタを透過し、蛍光分子４２から発生した蛍光は当該フィルタによりほぼ全て遮断される。このようにして、蛍光分子４０から発生した蛍光のみを検出することができる。
【０１１８】
実施の形態１と同様に、生体分子検出装置２００によって１周期の測定を行い、蛍光分子４０から発生した蛍光の検出を行った結果のＡ／Ｄ変換部出力を、図１６Ａに示す。なお、ここでは説明を容易にするためグラフを模式的に示してある。
【０１１９】
Ａ／Ｄ変換部出力は、測定開始段階ではフリー分子Ａおよびバインディング分子Ａが有する配向用標識８の両端面に結合した蛍光分子４０から発生した蛍光による出力および装置ノイズに起因する出力が加算された出力値Ｄ１ｚであり、徐々に増加して時刻Ｔ１１で値Ｄ１ｆとなって一旦飽和する。続いてＡ／Ｄ変換部出力は、時刻Ｔ１２で再び増加し、時刻Ｔ１３で値Ｄ１ｔとなって再び飽和する。
【０１２０】
生体分子検出装置２００は、配向制御信号を所定の間隔で切り替えて上記１周期の測定を複数回行い、得られた複数のＤ１ｔ、Ｄ１ｆおよびＤ１ｚの値についてそれぞれ加算平均を行って、Ｄ１ｔ、Ｄ１ｆおよびＤ１ｚの値の平均値を求める。
【０１２１】
続いて、ＣＰＵ２０８は、得られたＤ１ｔ、Ｄ１ｆ、Ｄ１ｚの平均値から、バインディング分子Ａの濃度を算出する。具体的には、実施の形態１で測定値Ｓを求めた場合と同じ演算を行い、測定値Ｓ１を求める。そして、検量線関数ｆ１（Ｓ）を用いて、測定値Ｓ１から濃度Ｃ１に変換する。ＣＰＵ２０８は、得られた濃度Ｃ１を表示部１０２へ出力する。
【０１２２】
次に、生体分子検出装置２００は、バインディング分子Ｂの測定を行う。ＣＰＵ２０８は、受光部２０２内のフィルタ切替部２１０に、フィルタ２１４の使用を指示する命令を出す。フィルタ切替部２１０は、ＣＰＵ２０８からの命令を受け、レンズ１４２で集光された光が通る位置にフィルタ２１４を移動させる。フィルタ２１４は５７５ｎｍ−６００ｎｍ程度の波長の光のみを通すため、蛍光分子４０から発生した蛍光は当該フィルタにより遮断され、蛍光分子４２から発生した蛍光は当該フィルタを透過する。このようにして、蛍光分子４２から発生した蛍光のみを検出することができる。
【０１２３】
生体分子検出装置２００によって１周期の測定を行い、蛍光分子４２から発生した蛍光の検出を行った結果のＡ／Ｄ変換部出力を、図１６Ｂに示す。なお、図１６Ｂにおいては、説明を容易にするためグラフを模式的に示してある。
【０１２４】
Ａ／Ｄ変換部出力は、測定開始段階ではフリー分子Ｂおよびバインディング分子Ｂが有する配向用標識８の両端面に結合した蛍光分子４２から発生した蛍光による出力および装置ノイズに起因する出力が加算された出力値Ｄ２ｚであり、徐々に増加して時刻Ｔ２１で値Ｄ２ｆとなって一旦飽和する。続いてＡ／Ｄ変換部出力は、時刻Ｔ２２で再び増加し、時刻Ｔ２３で値Ｄ２ｔとなって再び飽和する。
【０１２５】
生体分子検出装置２００は、配向制御信号を所定の間隔で切り替えて上記１周期の測定を複数回行い、得られた複数のＤ２ｔ、Ｄ２ｆおよびＤ２ｚの値についてそれぞれ加算平均を行って、Ｄ２ｔ、Ｄ２ｆおよびＤ２ｚの値の平均値を求める。
【０１２６】
バインディング分子Ｂを測定する場合の配向制御信号の切り替えタイミングは、バインディング分子Ａを測定する場合のものと異なる。これは、バインディング分子Ａ、フリー分子Ａ、バインディング分子Ｂおよびフリー分子Ｂそれぞれの体積および質量が異なるため、それぞれの分子の配向が完了するまでに要する時間が互いに異なるためである。
【０１２７】
図１６Ａおよび１６Ｂに示したように、バインディング分子Ａを測定する場合と、バインディング分子Ｂを測定する場合とでは、ＰＤ出力が増加したり飽和したりするタイミングは異なる。これは、バインディング分子Ａとバインディング分子Ｂとの、体積の違いによる溶液中での運動しやすさに起因する。
【０１２８】
続いて、ＣＰＵ２０８は、得られたＤ２ｔ、Ｄ２ｆ、Ｄ２ｚの平均値から、バインディング分子Ｂの濃度を算出する。具体的には、実施の形態１で測定値Ｓを求めた場合と同じ演算を行い、測定値Ｓ２を求める。そして、検量線関数ｆ２（Ｓ）を用いて、測定値Ｓ２から濃度Ｃ２に変換する。ＣＰＵ２０８は、得られた濃度Ｃ２を、表示部１０２へ出力する。
【０１２９】
以上説明したように、本発明の実施の形態２に係る生体分子検出装置２００によれば、実施の形態１で説明した生体分子検出装置１００の構成に加え、検出対象物質と特異的に結合する物質として２種類の抗体および蛍光分子を用い、フィルタ切替部２１０を２種類のフィルタの切り替えが可能な構成とした。そのため、検出対象物質を含むバインディング分子に付随した蛍光分子に対応したフィルタを使用することで、検出対象物質を含むバインディング分子に付随した蛍光分子から発生する蛍光のみを検出することができる。すなわち、一の検体に含まれる複数の検出対象物質のそれぞれの濃度を正確に測定することができる。
【０１３０】
また、一の検体から同時に複数の検出対象物質を測定できることは、診断の精度を上げる上で重要である。
【０１３１】
なお、本実施の形態では、蛍光分子をＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ５６８およびＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ５５５としたが、蛍光分子はこれに限られない。複数の検出対象物質のそれぞれとそれぞれ特異的に結合する複数の物質を、フィルタで分離できる程度に互いの蛍光波長が離れている複数の蛍光分子でそれぞれ標識すれば良い。
【０１３２】
なお、本実施の形態では、抗原抗体反応を利用する場合を例にとって説明したが、検出対象物質と検出対象物質に特異的に結合する物質との組み合わせは、これに限られない。例えば本願発明は、抗原を用いて抗体を検出する場合や、特定の核酸と当該核酸とハイブリダイゼーションをする核酸、核酸と核酸結合性たんぱく質、リガンドとレセプター、糖とレクチン、プロテアーゼ検出、高次構造変化等にも適用することができる。
【０１３３】
また、本実施の形態では検出対象物質が２種類の場合について説明したが、検出対象物質の種類は、それより多くても良い。その場合においても、複数の検出対象物質のそれぞれとそれぞれ特異的に結合する複数の物質を用い、それぞれ異なった複数の蛍光分子で標識し、それぞれの蛍光分子から発生する蛍光を、それぞれの蛍光に対応したフィルタで分離して検出することで、それぞれの検出対象物質を互いに分離して検出することができる。
【０１３４】
なお、検出対象物質の種類が増えるほど蛍光分子の種類も増え、複数の蛍光分子から発生する複数の蛍光が混在することになるため、フィルタのみで蛍光を分離することが困難となる場合がある。その場合は、励起光の種類を増やすことで蛍光の分離を容易にすることができる。蛍光分子の吸光度は励起光の波長に依存し、蛍光分子の種類ごとに吸収しやすい波長帯がある。そのため、励起光の波長を変えることで、一部の蛍光分子のみが蛍光を発生するようになり、フィルタでの蛍光の分離が容易となる。また、より狭い通過帯域を持つバンドパスフィルタを用いることで、目的の蛍光分子から発生する蛍光を検出しやすくすることができる。
【０１３５】
（実施の形態１および実施の形態２の設計変更）
なお、以上説明した本発明に係る各実施の形態は、本発明の一例を示すものであり、本発明の構成を限定するものではない。本発明に係る生体分子検出装置は、上記各実施の形態に限定されず、本発明の目的を逸脱しない範囲で種々変更して実施することが可能である。
【０１３６】
例えば、溶液中の分子の配向を切り替える方法は、レーザーによるものに限られず、フリー分子およびバインディング分子の配向が完了するまでに要する時間に差が生じる程度の外力を加えるものであれば、磁気的な方法や電気的な方法としても良い。
【０１３７】
また、本発明に係る各実施の形態では、互いに直交する２つの方向、つまり直線偏光した励起光の振動方向と平行となる方向、および、直線偏光した励起光の振動方向と垂直となる方向の間で、配向制御光の振動方向を切り替えたが、必ずしも互いに直交する２つの方向の間で切り替える必要はない。フリー分子およびバインディング分子は、配向する方向が異なればそれぞれが有する蛍光分子の励起効率が異なるため、フリー分子またはバインディング分子の１分子あたりの発光量が異なる。従って、フリー分子およびバインディング分子の配向方向を直交する２つの方向としなくとも、フリー分子およびバインディング分子を分離して算出することができる。配向制御光を振動させる２つの方向が直交していれば、フリー分子およびバインディング分子の配向が完了するまでに要する時間の差が最大となって最もＳ／Ｎが良くなる。一方で、例えば配向制御光のそれぞれの振動方向の成す角度が６０度であれば、直交する２つの方向に配向制御光の振動方向を切り替える場合と比べ、フリー分子およびバインディング分子の配向が完了するまでに要する時間が短くなり、測定に要する時間も短くなる。このように配向制御光が振動する２つの方向の成す角度が９０度より小さいほど、フリー分子およびバインディング分子の配向が完了するまでに要する時間が短くなり測定時間も短くなる。
【０１３８】
また、溶液中に検出対象物質が存在するか否か、すなわちバインディング分子が存在するかしないかのみを定性的に測定したい場合は、フリー分子およびバインディング分子の間で配向が完了するまでに要する時間に差が生じる程度だけ角度を変えた２つの方向で配向制御光の振動方向を切り替えれば良い。フリー分子およびバインディング分子の間で、配向が完了するまでに要する時間に差が生じれば、その差は蛍光データに表れるため、バインディング分子の存在を確認できる。
【０１３９】
また、本発明に係る各実施の形態では、配向制御光の振動方向の切り替えにλ／２波長板を用いたが、必ずしもλ／２波長板を使用する必要はない。例えばミラー等を使ってレーザーの振動方向を変える構成や、配向制御用光源部１１６を２つ設けてそれぞれ異なる方向に振動した配向制御光を照射する構成等が考えられる。
【０１４０】
また、本発明に係る各実施の形態では、生体分子検出装置内に試薬カップを１つ設ける場合を説明したが、必ずしも試薬カップは１つである必要はなく、装置内に複数の試薬カップを設けて複数の検体をセットできる構成としても良い。その場合は、装置が試薬カップを順に測定位置に移動させて測定を行う構成とすれば、自動で複数の検体を測定することができる。
【０１４１】
なお、本発明に係る各実施の形態では、蛍光分子および配向用標識と結合した抗体を用いた例を説明したが、必ずしも蛍光分子および配向用標識により標識済みの抗体を用いる必要はない。例えば、抗体および抗原の結合と、抗体、配向用標識および蛍光分子の結合とを同時に試薬カップ内で行っても良い。この場合、ユーザーは、抗体、配向用標識および蛍光分子をそれぞれ別の試薬タンクに用意しておく。測定時には、生体分子検出装置が、抗体、蛍光分子、配向用標識および検体をそれぞれ試薬カップへ分注して反応させる。
【０１４２】
また、配向制御用光源部１１６や励起光源部１１８は、着脱可能な構成として、検出対象物質および蛍光分子等に応じて適切なものに交換できるような構成としても良い。
【０１４３】
また、フリー分子およびバインディング分子の配向方向を所定の時間間隔で切り替え、得られた複数の蛍光データの加算平均を行って、上記検出対象物質の検出または定量を行うと、１周期の測定毎のノイズの影響を減少させることができ、より高精度な測定が可能となる。
【０１４４】
フリー分子およびバインディング分子の配向方向を切り替える所定の時間間隔は、検出対象物質、検出対象物質と特異的に結合する物質、配向用標識および蛍光分子の質量または体積と、配向制御手段による配向制御のための外力の強度とに基づいて、全てのフリー分子およびバインディング分子の配向が完了するまでに要する時間を求め、その時間を所定の時間間隔とすることが望ましい。この場合、全ての分子の配向が完了した後も同一方向にレーザーを照射することがなくなり、消費電力を削減することができる。また、不要な時まで測定を続けることがなくなり、測定時間を短くすることができる。
【０１４５】
全てのフリー分子およびバインディング分子の配向が完了するまでに要する時間は、ＰＤ出力やＡ／Ｄ変換部出力に基づいて求めてもよい。例えば、測定を何周期か繰り返せば、それぞれの出力が飽和するまでにどのくらいの時間を要するかおおよそ分かるため、それぞれの出力が飽和するまでに要する時間を加算平均等して、算出した時間を所定の時間間隔として決めれば良い。
【０１４６】
レーザーによる分子の配向制御を行う場合には、磁力等によって分子の配向を制御する場合に比べ複雑な機構が必要ない。例えば、磁力を用いて分子の配向を制御するためには、それぞれの分子が磁性を持ったものであるか、磁性を持った分子を用意して配向を制御したい分子に結合させる必要があり、測定にあたって準備が煩雑となる。
【０１４７】
なお、本発明に係る各実施の形態では、配向用標識としてコラーゲンを例にとって説明したが、配向用標識は必ずしもコラーゲンでなくても良い。配向用標識は、抗体および蛍光分子を自身の周囲に結合させることができ、溶液中で光により配向する棒状の物質であれば良く、例えば、アクチンフィラメント、金属ナノロッド（金、銀、銅、酸化鉄等）、プラスチック等を用いることができる。
【０１４８】
また、配向用標識の長手方向の長さは必ずしも３００ｎｍでなくても良く、周囲に複数の蛍光分子を結合させることができればどのような長さでも良い。
【０１４９】
なお、本発明に係る各実施の形態では、説明を容易にするため配向用標識に１つの抗体が結合している場合を例に取って説明したが、配向用標識に結合させる抗体は必ずしも１つである必要はない。
【０１５０】
なお、本発明に係る各実施の形態では、検体として全血を用いる場合を例にとって説明したが、検体は全血に限られず、検出対象物質が溶液中に分散していれば尿や隋液等の体液を検体とすることもできる。
【０１５１】
また、本発明に係る各実施の形態では、固相ではなく抗原、抗体および蛍光分子が液体中に分散している液相で測定ができるため、抗原等を反応層に固定して測定を行う固相での測定に比べ、前処理が簡単であるという利点がある。また、抗原、フリー分子共に溶液中を自由に動き回れるため、固相に比べて反応が早いという利点がある。
【０１５２】
また、本発明に係る各実施の形態は、従来の蛍光偏光法のようにブラウン運動の変化による蛍光の偏光度の変化を調べるものではないため、検体の成分が蛍光分子の蛍光寿命に影響を与えたとしても測定に与える影響は少ない。
【０１５３】
また、本発明に係る各実施の形態では、配向制御用光源部は必ずしも１つの照射方向に対して１つである必要はなく、複数の配向制御用光源部を設けて、同一方向に複数の配向制御光を照射しても良い。
【０１５４】
また、本発明に係る各実施の形態では、一方向に直線偏光した励起光１１９を溶液に照射する場合、すなわち偏光面が単一の励起光１１９を溶液に照射する場合を例にとって説明したが、励起光１１９は必ずしも単一の偏光面を有する直線偏光した光である必要はない。実施の形態１および実施の形態２の効果と同様の効果を奏するためには、励起光１１９が特定方向の直線偏光成分を少なくとも１つ有していれば良い。ここで、特定方向の直線偏光成分を有する光とは、蛍光分子の配向方向の変化により、蛍光分子の遷移モーメントと励起光の当該直線偏光成分の振動方向との関係が変化して、当該直線偏光成分による蛍光分子の励起効率に変化が生じる光である。例えば、ランダム偏光した励起光を照射し、受光部の前に検光子を設けて、蛍光分子から発生した蛍光から特定方向の直線偏光成分のみを受光するように構成しても良い。ここでランダム偏光とは、光の振動方向がランダムであり、様々な方向に振動する直線偏光成分が存在することをいう。
【０１５５】
図１７Ａは、振動方向２２２に直線偏光した配向制御光１１７が照射された際のバインディング分子２２の配向方向とランダム偏光した励起光２３０の振動方向とを表した概念図であり、図１７Ｂは振動方向２２４に直線偏光した配向制御光１１７が照射された際のバインディング分子２２の配向方向とランダム偏光した励起光２３０の振動方向とを表した概念図である。なお、図１７Ａは配向制御信号が０Ｖの場合の状態を示す図であり、図１７Ｂは配向制御信号が５Ｖの場合の状態を示す図である。励起光２３０の振動方向２３２ａ〜２３２ｄは、励起光２３０の進行方向に対して垂直な平面内における光の振動方向を表す。図１７Ａおよび図１７Ｂでは、振動方向２３２ａ〜２３２ｄによって励起光２３０の振動方向が様々な方向であることを表しているが、実際は、図示した成分だけでなく、あらゆる角度方向のより多くの成分が含まれている。一般に、溶液中で静止した蛍光分子を直線偏光した励起光で励起すると、蛍光分子は、励起光の偏光方向と同一の方向に偏光した蛍光を発生することが知られている。ランダム偏光した励起光２３０によって励起されると、バインディング分子２２に付随する蛍光分子１４からもランダム偏光した蛍光２３４が発生する。
【０１５６】
検光子２３６は、蛍光分子１４から発生したランダム偏光した蛍光２３４のうち特定の方向に振動する成分を透過させ、それ以外の方向に振動する成分を遮断する。換言すれば、検光子２３６を透過した光は特定の方向にのみ振動する光となる。検光子２３６を透過可能な特定の方向に振動する蛍光２３４の成分とは、励起光２３０のうち振動方向２３２ａに直線偏光した励起光成分によって励起されて発生した成分である。したがって、検光子２３６を透過した蛍光２３４の振動方向は、図１７ＡおよびＢにおいて振動方向２３２ａのみとなる。これにより、蛍光分子１４から発生した蛍光２３４のうち、励起光２３０のうち振動方向２３２ａに直線偏光した励起光成分によって励起された成分のみをフォトダイオード２３８に到達させることができる。このような構成にすることで、励起光２３０としてランダム偏光した光を用いても、特定の方向に振動する光に対して実施の形態１と同様の測定を行うことができる。なお、検光子２３６が透過させる特定の方向に振動する蛍光２３４の成分とは、必ずしもここで示した方向に振動する成分に限られず、蛍光分子１４の配向方向の変化に伴い蛍光分子１４に対する励起効率に差が生じる成分であれば何でも良い。
【０１５７】
また、図１７Ａおよび図１７Ｂでは励起光２３０がいずれの方向に振動する場合においても振幅が一定である例を示したが、必ずしも全ての方向において振幅が一定である必要はない。フォトダイオード２３８が受光する蛍光２３４の成分は、ランダム偏光した蛍光２３４のうち特定方向に振動する成分のみであるので、その他の方向に振動する成分は遮断される。
【０１５８】
図１７Ａに示すように配向制御信号が０Ｖの場合には、配向制御光１１７の振動方向２２２が、検光子２３６を透過可能な光の振動方向と平行になる。このとき、配向用標識８の長手方向が、検光子２３６を透過可能な光の振動方向に対して平行となる。したがって、振動方向２２２に直線偏光した配向制御光１１７により配向したバインディング分子２２に付随する大部分の蛍光分子１４（主に配向用標識８の側面に結合している蛍光分子１４）の遷移モーメントと検光子２３６を透過可能な光の振動方向２３２ａとは互いに垂直となる。すなわち、バインディング分子２２に付随する大部分の蛍光分子１４は、励起光２３０に含まれる振動方向２３２ａに振動する成分によって励起されない。つまり、励起光２３０に含まれる振動方向２３２ａに振動する成分によるバインディング分子２２の励起効率は最小となる。バインディング分子２２から発生する蛍光２３４のうち検光子２３６を透過する成分は、励起光２３０に含まれる振動方向２３２ａに振動する成分によって励起されて発生するため、蛍光２３４において検光子２３６を透過する成分は最小となり、フォトダイオード２３８の出力は最小となる。
【０１５９】
一方、図１７Ｂに示すように配向制御信号が５Ｖの場合には、配向制御光１１７の振動方向２２４が、検光子２３６を透過可能な光の振動方向と垂直になる。このとき、配向用標識８の長手方向が、検光子２３６を透過可能な光の振動方向に対して垂直となる。したがって、振動方向２２４に直線偏光した配向制御光１１７により配向したバインディング分子２２の側面に結合している多数の蛍光分子１４の遷移モーメントと検光子２３６を透過可能な光の振動方向とは互いに平行となる。この場合、励起光２３０に含まれる振動方向２３２ａに振動する成分によるバインディング分子２２の励起効率は最大となる。つまり、蛍光２３４において検光子２３６を透過する成分は最大となり、フォトダイオード２３８の出力は最大となる。
【０１６０】
このような構成とした場合においても、配向制御信号を０Ｖから５Ｖに変化させると、蛍光分子１４の配向方向が変化し、バインディング分子２２中の多数の蛍光分子１４の遷移モーメントの方向と検光子２３６を透過可能な光の振動方向とが徐々に平行に近づく。それに伴い、励起光２３０に含まれる検光子２３６を透過可能な方向に振動する成分によるバインディング分子２２の励起効率が増加し、バインディング分子２２に付随する蛍光分子１４から発生する蛍光２３４の成分であって検光子２３６を透過可能な方向に振動する成分が増加する。すなわち、フォトダイオード２３８において検出する蛍光強度は、実施の形態１と同様に徐々に増加する。ここではバインディング分子２２を用いて説明を行ったが、フリー分子に対してランダム偏光した励起光を照射しても同様のことが言える。この場合、フリー分子とバインディング分子とでは、配向が完了するまでに要する時間が互いに異なるため、フォトダイオード２３８が受光する蛍光強度が増加して飽和するタイミングも互いに異なる。そのため、このような構成とした場合においても、配向制御信号を０Ｖから５Ｖに変化させた際の、時間に対するフォトダイオード出力のグラフは、図１１と同様の形状となる。つまり、この場合においてもフォトダイオード出力のグラフについて実施の形態１と同様の計算を行うことにより、検出対象物質の濃度を測定することができる。
【０１６１】
また、図１８Ａおよび図１８Ｂに示す概念図のように、互いに直交する２つの方向にそれぞれ直線偏光した２つの成分のみを有する励起光２４０を用いてもよい。励起光２４０は、進行方向に対して垂直な平面内において振動方向２４２ａ、２４２ｂにそれぞれ直線偏光した２つの成分のみを有する。つまり、振動方向２４２ａと振動方向２４２ｂとは互いに直交している。このような励起光２４０によって励起された蛍光分子１４は、励起光２４０の振動方向と同一方向に振動する成分を有する蛍光２４４を発する。すなわち、蛍光２４４は振動方向２４２ａ、２４２ｂにそれぞれ直線偏光した２つの成分を有する。
【０１６２】
図１８Ａは、配向制御信号が０Ｖの場合の概念図である。配向制御信号が０Ｖの場合、振動方向２２２に直線偏光した配向制御光１１７が照射される。振動方向２２２に直線偏光した配向制御光１１７により配向されたバインディング分子中の大部分の蛍光分子１４（主に配向用標識８の側面に結合している蛍光分子１４）は、遷移モーメントの方向が振動方向２４２ａと垂直な方向となるように配向する。つまり、配向制御信号が０Ｖの場合、励起光２４０に含まれる振動方向２４２ａに振動する成分によるバインディング分子２２の励起効率は最小となる。一方、励起光２４０に含まれる振動方向２４２ｂに振動する成分によるバインディング分子２２の励起効率は最大となる。
【０１６３】
偏光ビームスプリッタ２４６は、蛍光２４４のうち振動方向２４２ａに振動する直線偏光成分２４４ａを透過させ、振動方向２４２ｂに振動する直線偏光成分２４４ｂを反射する。偏光ビームスプリッタ２４６を透過した蛍光２４４の直線偏光成分２４４ａは、フォトダイオード２４８に到達する。偏光ビームスプリッタ２４６で反射した蛍光２４４の直線偏光成分２４４ｂは、フォトダイオード２５０に到達する。配向制御信号が０Ｖの場合、励起光２４０に含まれる振動方向２４２ａに振動する成分によるバインディング分子２２の励起効率は最小となるため、バインディング分子２２から発生する蛍光２４４に含まれる振動方向２４２ａに振動する成分は最小となり、フォトダイオード２４８の出力は最小となる。一方、フォトダイオード２５０の出力は最大となる。
【０１６４】
図１８Ｂは、配向制御信号が５Ｖの場合の概念図である。配向制御信号が５Ｖの場合、振動方向２２４に直線偏光した配向制御光１１７が照射される。振動方向２２４に直線偏光した配向制御光１１７により配向されたバインディング分子中の大部分の蛍光分子１４（主に配向用標識８の側面に結合している蛍光分子１４）は、遷移モーメントの方向が振動方向２４２ｂと垂直な方向となるように配向する。つまり、励起光２４０に含まれる振動方向２４２ｂに振動する成分によるバインディング分子２２の励起効率は最小となる。一方、励起光２４０に含まれる振動方向２４２ａに振動する成分によるバインディング分子２２の励起効率は最大となる。
【０１６５】
図１９は、縦軸がそれぞれ配向制御信号の電圧、フォトダイオード２４８の出力、フォトダイオード２５０の出力および正規化したフォトダイオードの出力を表し、横軸が時間ｔを表したグラフである。なお、ここでは説明を容易にするため、フォトダイオード出力については、グラフを模式的に示してある。
【０１６６】
図１９においては、実施の形態１と同様に測定前の配向制御信号は０Ｖとなっている。測定前においては、振動方向２２２に直線偏光した配向制御光１１７を試薬カップ内の溶液中に照射して、フリー分子およびバインディング分子を同一方向に配向させておく。測定の開始に伴い、配向制御光１１７は振動方向２２２に直線偏光した状態から振動方向２２４に直線偏光した状態に切り替わる。
【０１６７】
偏光ビームスプリッタ２４６を透過した蛍光２４４の直線偏光成分２４４ａに着目する。この場合、励起光２４０の一方の成分の振動方向２４２ａと蛍光分子１４の遷移モーメントの方向との関係は実施の形態１の場合の関係と同様になる。そして、フォトダイオード２４８の出力の時間変化は、実施の形態１において説明した図１１に示したグラフと同様のグラフとなる。つまり、時刻Ｔ３１における配向制御光１１７の振動方向の切り替えに伴ってまずフリー分子の配向方向が切り替わり始め、フォトダイオード２４８の出力が当初の値ｉｚ３から増加する。フリー分子の配向が完了することによりフォトダイオード２４８の出力は、時刻Ｔ３２において値ｉｆ３となった後しばらく一定値となる。その後、バインディング分子の配向方向が切り替わり始めることに伴って時刻Ｔ３３でフォトダイオード２４８の出力は再び増加する。そして、全てのバインディング分子の配向が完了した時刻Ｔ３４において、フォトダイオード２４８の出力は値ｉｔ３で最大値となる。配向制御信号は５Ｖの出力がＴ秒間続いた後０Ｖとなる。配向制御信号が５Ｖから０Ｖに切り替わると、フォトダイオード２４８の出力は、しばらくｉｔ３の値であるが、その後ｉｚ３の値まで減少する。
【０１６８】
偏光ビームスプリッタ２４６で反射した蛍光２４４の直線偏光成分２４４ｂに着目する。この場合、励起光２４０の他方の成分の振動方向２４２ｂと蛍光分子１４の遷移モーメントの方向とが時刻Ｔ３１までは互いに平行であるため、励起光２４０の当該他方の成分による蛍光分子１４の励起効率は時刻Ｔ３１までは最大の状態である。すなわち、蛍光２４４の直線偏光成分２４４ｂの量が時刻Ｔ３１までは最大であるため、偏光ビームスプリッタ２４６で反射する蛍光２４４の直線偏光成分２４４ｂを受光するフォトダイオード２５０の出力も時刻Ｔ３１までは最大となる。時刻Ｔ３１における配向制御光１１７の振動方向の切り替えに伴ってまずフリー分子の配向方向が切り替わり始め、フォトダイオード２５０の出力が当初の値ｉｔ４から減少する。フリー分子の配向が完了することによりフォトダイオード２５０の出力は、時刻Ｔ３２において値ｉｆ４となった後しばらく一定値となる。その後、バインディング分子の配向方向が切り替わり始めることに伴って時刻Ｔ３３でフォトダイオード２５０の出力は再び減少する。そして、全てのバインディング分子の配向が完了した時刻Ｔ３４において、フォトダイオード２５０の出力は値ｉｚ４で最小値となる。配向制御信号は５Ｖの出力がＴ秒間続いた後０Ｖとなる。配向制御信号が５Ｖから０Ｖに切り替わると、フォトダイオード２５０の出力は、しばらくｉｚ４の値であるが、その後ｉｔ４の値まで増加する。これは、励起光２４０の当該他方の成分の振動方向２４２ｂと蛍光分子１４の遷移モーメントの方向とが互いに平行となる状態に戻るためである。
【０１６９】
そして、実施形態１と同様にＣＰＵは、フォトダイオード２４８の出力をＰｐ、フォトダイオード２５０の出力をＰｖとして、これらを次式（３）に従って正規化する。
Ｋ＝（Ｐｐ−Ｐｖ）／（Ｐｐ＋Ｐｖ）・・・（３）
【０１７０】
このように、２つのフォトダイオードの出力を正規化することで、フリー分子およびバインディング分子の濃度ばらつきや、光学系の励起パワー変動などの影響を低減させることができる。
【０１７１】
そして、正規化したフォトダイオード出力のグラフからバインディング分子の濃度を算出する。具体的には、測定値Ｓ３を次式（４）によって求める。
Ｓ３＝（ｉｔ５−ｉｆ５）／（ｉｔ５−ｉｚ５）・・・（４）
【０１７２】
ここで求めた測定値Ｓ３から、実施の形態１と同様に検量線関数を用いて診断値Ｃ３（検出対象物質の濃度）を求めることができる。
【０１７３】
また、本発明に係る各実施の形態のように、一方向に直線偏光した配向制御光の振動方向を制御することにより蛍光分子の遷移モーメントの方向を制御する場合において、進行方向に垂直な平面での配向制御光の断面形状はどのようなものであっても良い。例えば、図２０Ａに示すように、偏光軸３５２を有する直線偏光した配向制御光３５０が照射される場合を考える。この場合、配向制御光３５０は、進行方向に垂直な方向の断面形状が略長方形である。このとき、配向制御光３５０の中心に位置するバインディング分子３５４と配向制御光３５０の周縁部に位置するバインディング分子３５６の挙動を考える。
【０１７４】
図２０Ｂに示すように、配向制御光３５０を回転させると偏光軸３５２も回転し、回転軸（偏光軸３５２の回転中心）上に位置するバインディング分子３５４は、偏光軸３５２の回転にすぐに追従して回転する。一方、配向制御光３５０の周縁部に位置するバインディング分子３５６は、偏光軸３５２の回転にすぐには追従できず、偏光軸３５２から離れることになる。その後しばらくすると、バインディング分子３５６も、配向制御光３５０に引き込まれ、偏光軸３５２の回転に追従して回転を開始する。そして、図２０Ｃのように、配向制御光３５０の偏光軸３５２を図２０Ａの場合における偏光軸３５２に対して９０度回転させた場合、偏光軸３５２の回転の終了と同時にバインディング分子３５４の配向は完了し、一方、バインディング分子３５６が偏光軸３５２の回転にすぐには追従できないため、バインディング分子３５６の配向はバインディング分子３５４の配向の完了後しばらくしてから完了する。つまり、回転軸上に位置するバインディング分子３５４の動きは、配向制御光３５０の偏光軸３５２の回転に同期して自転する挙動となるが、配向制御光３５０の周縁部に位置するバインディング分子３５６の動きは、配向制御光３５０の偏光軸３５２の回転に同期せずかつ回転軸を中心として公転するような動きとなる。
【０１７５】
このように、配向制御光３５０の偏光軸３５２の回転に追従できないバインディング分子が存在すると測定に影響を与えることがある。そこで、このような影響を低減するため、配向制御光を所定の方向から同時に多点に入射させることが好ましい。例えば図２１（試薬カップ１０８の上面図）に示すように、３６０ａ〜３６０ｉの９点にそれぞれ対応した９本の配向制御光を試薬カップ１０８入射させるような態様でも良い。このようにすると、配向制御光の偏光軸の中心に位置するバインディング分子の数が増えるため、測定への影響を低減することができる。なお、ここでは９点に配向制御光を入射させる例を示したが、配向制御光を入射させる点は９点に限られず、９点より多くても少なくても良い。配向制御光を絞るほど、多くの点に入射させることが望ましい。これにより、複数箇所で配向制御光の回転に同期してバインディング分子を回転させることができる。その結果、突発的な蛍光強度の変動を低下させることができ、相対的な散らばりを表す指標である変動係数（Ｃｏｅｆｆｉｃｉｅｎｔ ｏｆ Ｖａｒｉａｔｉｏｎ）を改善することができる。
【０１７６】
このように、配向制御光を所定の方向から同時に多点に入射させるための配向制御用光源部４０２の構造について図２２に示す。配向制御用光源部４０２は、３×３の２次元レーザーアレイである。配向制御用光源部４０２は、発光点４０４ａ〜４０４ｉの９点が発光する。発光点の大きさは縦が１μｍで横が１００μｍである。発光点の間の距離は約１００μｍである。
【０１７７】
図２２に示される配向制御用光源部４０２を用いた光学系の一例を図２３に示す。なお図２３では、配向制御光および励起光の光学系以外の構成要素は省略して描いてある。
【０１７８】
配向制御用光源部４０２から出力された直線偏光した配向制御光４２２は、コリメータレンズ４０６を通って焦点において平行光線となる。コリメータレンズ４０６を通った配向制御光４２２は、ビームエキスパンダ４０８およびビームエキスパンダ４１０を通ってλ／２波長板４１２に入射する。ビームエキスパンダ４０８およびビームエキスパンダ４１０を通った配向制御光４２２は、特定の倍率の平行光束に広げられる。λ／２波長板４１２は回転ステージ上にあり、回転可能となっている。これにより配向制御光４２２の振動方向を回転することができる。λ／２波長板４１２を透過した配向制御光４２２は、ダイクロイックミラー４１８で反射してレンズ４２０により集光されて試薬カップ１０８の底面から上方に向かって入射する。
【０１７９】
光源部４１４から出力された励起光４２４は、レンズ４２６を通ってダイクロイックミラー４１６により反射される。ダイクロイックミラー４１６により反射された励起光４２４は、ダイクロイックミラー４１８を透過してレンズ４２０により集光されて試薬カップ１０８の底面から上方に向かって入射する。
【０１８０】
図２３に示される光学系において、コリメータレンズ４０６の焦点距離を３．１ｍｍ、レンズ４２０の焦点距離を４ｍｍとすると、倍率は１．２９倍となる。そのため、試薬カップ１０８の底面において、配向制御光４２２の大きさは約１．３μｍ×１３０μｍとなり、ピッチは約１２９μｍとなる。
【０１８１】
また、配向制御光を所定の方向から同時に多点に入射させるための別の光学系の例について図２４を用いて説明する。なお図２４においても、配向制御光および励起光の光学系以外は省略して描いてある。また、図２３と同一の構成要素には同一の符号を付し、その説明を省略する。
【０１８２】
図２４に示される光学系において、配向制御用光源部１１６は実施の形態１と同様のものである。配向制御光４３２は、コリメータレンズ４０６、ビームエキスパンダ４０８およびビームエキスパンダ４１０を通り、マイクロレンズアレイ４２８へ入射する。マイクロレンズアレイ４２８は、図２５に示されるように、複数のマイクロレンズ４２８ａを格子状に並べたものである。マイクロレンズアレイ４２８を通った配向制御光４３２は、複数の光源から照射された光のように、異なる位置で焦点を結ぶ複数の光束となる。配向制御光４３２は、ピンホールアレイ４３０によって絞られ、ダイクロイックミラー４１８で反射し、レンズ４２０を通って試薬カップ１０８の底面から上方に向かって入射する。このようにマイクロレンズアレイを用いても、配向制御光を所定の方向から同時に多点に入射させることができる。
【０１８３】
また、λ／２波長板４１２を用いて振動方向を変更する例を示したが、電気信号で制御可能な液晶位相変調デバイスを用いて振動方向を変更してもよい。
【０１８４】
また、上記各実施の形態では試薬カップを円柱状の形状としたが、試薬カップは必ずしも円柱状の形状とする必要は無い。例えば、図２６に示されるように、四角柱状の形状を有し、内部に四角柱状の溶液保持部を有する試薬カップ４３２を用いても良い。このような四角柱状の溶液保持部を有する試薬カップ４３２は、特に、配向制御光の進行方向に働く配向制御光による圧力を利用してフリー分子およびバインディング分子を試薬カップ４３２の内部側壁面に押しつける場合に適している。これは、フリー分子およびバインディング分子の質量が軽い場合に起こる現象であり、配向制御光による圧力を受けてフリー分子およびバインディング分子が溶液中を移動することが原因である。この場合、溶液保持部が四角柱であると、フリー分子およびバインディング分子は溶液と試薬カップ４３２との界面に押しつけられながら配向する。当該界面が平面でありかつ配向制御光による圧力が当該界面に垂直な方向に作用する場合には、フリー分子およびバインディング分子は当該界面に平行な方向に移動して配向制御光の照射範囲の外に出ることがない。
【０１８５】
また、フリー分子およびバインディング分子を試薬カップ４３２の内部側壁面に押しつける場合には、配向制御光の焦点の位置を工夫することによりこれらの分子をより容易に配向させることができる。図２７は、集光された配向制御光の焦点と試薬カップとの位置関係の一例を示す図である。配向制御光４３４は、レンズ４３６に入射し、血漿１６と試薬カップの側壁部４３２ｂとの界面（側壁部４３２ｂの内部側壁面）において焦点４３４ａを結ぶ。配向制御光４３４の焦点４３４ａの位置では、配向制御光４３４の強度が最も強いため、より強い圧力でフリー分子およびバインディング分子を押しつけることができる。従って、図２７のように配向制御光４３４を入射させると、焦点４３４ａの位置においてフリー分子およびバインディング分子を側壁部４３２ｂの内部側壁面に押しつけつつ、より効率的にフリー分子およびバインディング分子を配向させることができる。この場合においても、直線偏光した配向制御光４３４の振動方向を回転させることで、フリー分子およびバインディング分子の配向方向を焦点４３４ａの位置において変化させることができる。
【０１８６】
なお、溶液保持部は必ずしも四角柱状の形状を有している必要はなく、少なくとも一面に平面を有していれば良い。溶液を通ってその平面において焦点を結ぶように配向制御光を照射すれば、フリー分子およびバインディング分子は、当該平面に平行な方向に移動して配向制御光の照射範囲の外に出ることがなく平面に押しつけられながら配向する。
【０１８７】
また、本発明に係る各実施の形態では、直線偏光した配向制御光の振動方向を制御してフリー分子およびバインディング分子の配向状態を制御することにより、これらの分子に付随する蛍光分子の遷移モーメントの方向を制御する場合について説明したが、蛍光分子の遷移モーメントの方向を制御する方法はこれに限られない。例えば、光を照射された分子の配向状態が光の照射方向に応じて変化することを利用して、配向制御光の試薬カップに対する照射方向を切り替えることにより蛍光分子の遷移モーメントの方向を制御する方法を用いることもできる。このような場合、配向制御光は偏光していなくてもよい。
【０１８８】
配向制御光１１７の試薬カップ１０８に対する照射方向を切り替えることにより蛍光分子の遷移モーメントの方向を制御する方法について、図２８を用いてより詳細に説明する。図２８は、配向制御用光源部１１６から照射される配向制御光１１７の試薬カップ１０８に対する照射方向を切り替えるための光学系を試薬カップ１０８の上面側（カップ口側）から見た模式図である。配向制御用光源部１１６から照射された配向制御光１１７は、ＡＯＤ（Ａｃｏｕｓｔｏ Ｏｐｔｉｃ Ｄｅｆｌｅｃｔｏｒ）１２１を通って試薬カップ１０８へ照射される。配向制御光１１７は、試薬カップ１０８の溶液全体を照らす程度の幅を持っている。ＡＯＤ１２１は、配向制御用光源部１１６から照射された配向制御光１１７の照射方向を２方向に切り替える。具体的には、ＡＯＤ１２１は、ＦＧ１２２から５Ｖの配向制御信号が入力された場合には、配向制御光１１７を配向制御光１３４の方向へ進ませ、ＦＧ１２２から０Ｖの配向制御信号が入力された場合には、配向制御光１１７を配向制御光１３６の方向へ進ませる。配向制御光１３４は、試薬カップ１０８の側面に入射する。配向制御光１３６は、ダイクロイックミラー１３８によって反射され、配向制御光１３４の進行方向と垂直な方向に進んで試薬カップ１０８の側面に入射する。上面から見た試薬カップ１０８を時計の文字盤に例えると、配向制御光１３４は９時の位置から入射して３時の方向へ進行し、配向制御光１３６は６時の位置から入射して１２時の方向へ進行する。すなわち、配向制御光１３４の進行方向と配向制御光１３６の進行方向とは互いに直交する。ダイクロイックミラー１３８は、配向制御光１１７に用いた波長の光のみを反射し、その他の波長の光を透過する。励起光源部１１８から照射された励起光１１９は、ダイクロイックミラー１３８を透過し、ダイクロイックミラー１３８で反射した配向制御光１３６と同じ方向に進行して試薬カップ１０８の側面へ入射する。
【０１８９】
このような構成により、生体分子検出装置１００は、ＦＧ１２２からの配向制御信号の入力によりＡＯＤ１２１を制御することで、配向制御光１１７が試薬カップ１０８へ照射される方向を、角度が９０度異なる２つの方向に切り替えることができる。ＡＯＤ１２１と試薬カップ１０８との間には遮光板１４０があり、配向制御光１３４および配向制御光１３６が示す方向以外に進行する配向制御光は、試薬カップ１０８へ照射されないように構成されている。また、配向制御光１１７は、配向制御光１３４および配向制御光１３６のいずれの方向に進行した場合においても、円柱状の試薬カップ１０８の側面から入射する。試薬カップ１０８は円柱状であるため、配向制御光の進行方向が切り替わっても、試薬カップ１０８の配向制御光が入射する側面の形状は同じである。
【０１９０】
また、配向制御光を照射する方向を切り替えることにより蛍光分子の遷移モーメントの方向を制御する光学系においては、配向制御光のビーム径を細長く絞った場合に配向制御光で照射できる範囲が減少してしまうことを回避する観点から、配向制御光をある方向から同時に多点に照射して照射範囲をより広くするために、光学系を複数段用意しても良い。複数段の光学系は、少なくとも試薬カップに配向制御光が入射する前の段階で光路が複数存在していればよい。例えば、光源も含めた同様の光学系を３段重ねれば、３つの配向制御用光源部からそれぞれ配向制御光が照射され、試薬カップへある方向から３点に配向制御光を照射することができる。また例えば、光源が１つであっても２次元レーザーアレイやマイクロレンズアレイ等を用いて配向制御光を分岐すれば、分岐した分だけの複数の点で配向制御光を照射することができる。このような場合、配向制御光を同時に多点に照射することができ、複数の箇所で蛍光分子の遷移モーメントを回転させることができる。
【産業上の利用可能性】
【０１９１】
本発明に係る生体分子検出装置および生体分子検出方法は、例えば、検出対象物質と、その検出対象物質に特異的に結合する物質との相互作用を利用して、検出対象物質の検出又は定量を行う装置に利用することができる。
【符号の説明】
【０１９２】
１２ 抗体
１４ 蛍光分子
１６ 血漿
１８ 抗原
１００、２００ 生体分子検出装置
１１６ 配向制御用光源部
１１７ 配向制御光
１１８ 励起光源部
１１９ 励起光
１２０ 偏光方向制御部
１２３ 蛍光
１２４、２０２ 受光部
１４４、２１２、２１４ フィルタ
１４６ 偏光子
１５０ フォトダイオード
２１０ フィルタ切替部
【技術分野】
【０００１】
本発明は、溶液中の検出対象物質を検出する技術に係り、特に、検体内の生体分子、ウイルス、核酸、蛋白質および細菌等を検出可能な生体分子検出装置および生体分子検出方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、医師や技師等が診療の現場で生体分子検出を行い、その場で測定結果を得て診断や治療に役立てる生体分子検出法が注目されている。生体分子検出法は、抗原抗体反応等の特異的な反応を利用した高い選択性により、血液、尿、汗といった複数成分を有する体液の中から、検出対象物質だけを選択的に検出する方法である。特に、このような生体分子検出法は、ウイルス、核酸、蛋白質および細菌等の生体分子の微量検出、検査、定量および分析などに広く用いられている。
【０００３】
生体分子検出法として、ラジオイムノアッセイが実用化されている。ラジオイムノアッセイは、アイソトープで標識された抗原または抗体を用い、その抗原または抗体と特異的に結合する抗体または抗原の有無を検出するものである。ラジオイムノアッセイは、アイソトープの放射線量を測定することにより抗体または抗原等の検出対象物質を定量するもので、高感度な測定が可能である。
【０００４】
放射性物質を用いない生体分子検出法として蛍光イムノアッセイがある。蛍光イムノアッセイとしては、予め反応層に抗体を固定しておき（これを固相という）、当該反応層に、測定対象溶液および蛍光分子で標識された抗体を流し、反応層近傍の蛍光を測定することにより、抗体に特異的に結合した抗原の濃度を測定する装置が知られている（例えば特許文献１参照）。
【０００５】
しかしながら、固相を利用した蛍光イムノアッセイは、固相を作成するのにコストがかかるという問題があった。固相を用いず液体中で生体分子検出を行う（抗体等を固定せず液体中で生体分子検出を行うことを液相という）方法として、蛍光偏光法を利用して抗原抗体反応を確認する方法がある。蛍光偏光法は、蛍光標識した分子に別の分子が結合し分子の大きさが変化することにより生じる、ブラウン運動の変化に基づく蛍光偏光度の値の変化を検出する方法である。蛍光偏光法を利用した生体分子検出法は、検体中の検出対象物質の簡便かつ迅速な検知法として知られている（例えば特許文献２参照）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】特開平７−１２０３９７号公報
【特許文献２】特開２００８−２９８７４３号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
しかしながら、蛍光偏光法は、ランダムな運動であるブラウン運動の変化を利用しているため、測定感度に限界があるという問題がある。また、特許文献２の方法では、ブラウン運動の変化による影響を受ける程度に蛍光寿命が長い必要がある。しかし、蛍光寿命は検体内の成分によって影響を受けるため、特許文献２の方法による測定結果にばらつきが生じることがある。
【０００８】
本発明は上記事情に鑑みてなされたものであり、高感度測定が可能な生体分子検出装置および生体分子検出方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
上記目的を達成するために、本発明に係る生体分子検出方法は、
溶液中に存在する蛍光分子を励起するための、特定方向に直線偏光成分を有する励起光を照射するステップと、
検出対象物質に特異的に結合する物質と配向用標識とこの配向用標識の周囲に結合した複数の蛍光分子とを有する第１の複合体から発生する第１の蛍光を検出するステップと、
第１の複合体と検出対象物質とが結合した第２の複合体から発生する第２の蛍光を検出するステップと、
第１の複合体および第２の複合体を少なくとも２つの方向に切り換えて配向させるステップと、
検出された第１の蛍光および第２の蛍光に基づいて検出対象物質の検出または定量を行うステップとを具備する。
【００１０】
また、本発明に係る生体分子検出装置は、
上記の生体分子検出方法で使用される生体分子検出装置であって、
特定方向に直線偏光成分を有し蛍光分子を励起する励起光を照射する光源と、
蛍光分子から発せられた蛍光を検出する受光部と、
溶液中で第１の複合体および第２の複合体を少なくとも２つの方向に切り換えて配向させる配向制御手段と、
第１の複合体および第２の複合体の配向方向の切り替えに伴って蛍光分子から発生する蛍光の強度の時間変化から、第２の蛍光の強度を算出して検出対象物質の検出または定量を行う演算部とを具備する。
【００１１】
また、本発明に係る生体分子検出装置において、配向制御手段は、配向用標識の長手方向が特定方向と平行となる第１の方向、および、配向用標識の長手方向が上記特定方向と垂直となる第２の方向に、第１の複合体および第２の複合体に切り換えて配向させるものであることが好ましい。
【００１２】
また、本発明に係る生体分子検出装置において、配向制御手段は、第１の複合体および第２の複合体を所定の時間間隔で複数回切り替えて配向させるものであり、
演算部は、第１の複合体および第２の複合体が所定の時間間隔で複数回切り替えて配向したことによって得られた複数の第２の蛍光の強度の加算平均を行い、加算平均により得られた蛍光の強度に基づいて検出対象物質の検出または定量を行うものであることが好ましい。
【００１３】
また、本発明に係る生体分子検出装置において、上記所定の時間間隔は、検出対象物質、この検出対象物質と特異的に結合する物質、配向用標識および蛍光分子の質量または体積と、配向制御手段による配向制御の強度とに基づいて決定されることが好ましい。
【００１４】
また、本発明に係る生体分子検出装置において、配向制御手段は、直線偏光した光を照射する配向制御光源を備え、この配向制御光源から溶液に対して直線偏光した光を照射することにより、第１の複合体および第２の複合体を配向させるものであることが好ましい。
【００１５】
また、本発明に係る生体分子検出装置において、配向制御手段は、直線偏光した光の振動方向を切り替える波長板を有し、波長板を用いて直線偏光した光の振動方向を切り替えることにより、第１の複合体および第２の複合体を切り換えて配向させるものであることが好ましい。
【００１６】
また、本発明に係る生体分子検出装置において、配向制御光源は、溶液に対し直線偏光した光を複数の位置から照射するものであることが好ましい。
【００１７】
また、本発明に係る生体分子検出装置において、溶液は、少なくとも一部に平面を有する溶液保持部に保持されたものであることが好ましい。
【００１８】
また、本発明に係る生体分子検出装置において、配向制御光源は、溶液を通って溶液保持部の平面から出射する方向に、直線偏光した光を照射し、かつ、溶液と上記平面との界面において、直線偏光した光に焦点を結ばせるものであることが好ましい。
【００１９】
また、本発明に係る生体分子検出装置において、演算部は、前記第１の複合体および前記第２の複合体が一方の配向方向から他方の配向方向に切り替わる間における、前記第１の複合体から発生する蛍光の強度の時間変化と、前記第２の複合体から発生する蛍光の強度の時間変化とに差があることを利用して、前記第２の蛍光の強度を算出するものであることとが好ましい。
【００２０】
また、本発明に係る生体分子検出装置において、受光部は、光を分光する分光手段を備えることが好ましい。
【００２１】
また、本発明に係る生体分子検出装置において、分光手段は、特性の異なる複数のフィルタであり、
受光部は、蛍光分子から発生する蛍光の波長に応じて複数のフィルタを切り替えるものであることが好ましい。
【発明の効果】
【００２２】
本発明によれば、高感度な生体分子検出を行うことができる。
【図面の簡単な説明】
【００２３】
【図１Ａ】実施の形態１に係る生体分子検出装置の抗原抗体反応の概要を説明するための模式図である。
【図１Ｂ】実施の形態１に係る生体分子検出装置の抗原抗体反応の概要を説明するための模式図である。
【図２Ａ】フリー分子（抗原が結合していない抗体および蛍光分子）の模式図である。
【図２Ｂ】バインディング分子（抗原が結合した抗体および蛍光分子）の模式図である。
【図３Ａ】励起光の振動方向と蛍光分子の遷移モーメントとが互いに平行の場合を表す図である。
【図３Ｂ】励起光の振動方向と蛍光分子の遷移モーメントとが互いに垂直の場合を表す図である。
【図４Ａ】励起光の振動方向と配向用標識の長手方向とが互いに平行となる場合を示す図である。
【図４Ｂ】励起光の振動方向と配向用標識の長手方向とが互いに垂直となる場合を示す図である。
【図５Ａ】実施の形態１に係る生体分子検出装置の外観斜視図である。
【図５Ｂ】実施の形態１に係る生体分子検出装置の開閉部を開けたときの外観斜視図である。
【図６】生体分子検出装置の主要な構成を示すブロック図である。
【図７Ａ】配向制御光の振動方向とフリー分子およびバインディング分子の配向方向との関係を描いた図である。
【図７Ｂ】配向制御光の振動方向を切り替えた場合におけるフリー分子およびバインディング分子の動作を描いた図である。
【図７Ｃ】配向制御光の振動方向を切り替えフリー分子およびバインディング分子の配向が完了した場合を描いた図である。
【図８Ａ】配向したフリー分子およびバインディング分子と励起光の振動方向との関係を描いた図である。
【図８Ｂ】別の方向に配向したフリー分子およびバインディング分子と励起光の振動方向との関係を描いた図である。
【図９】実施の形態１に係る生体分子検出装置における受光部の詳細な構成を表した模式図である。
【図１０】検体の準備から廃棄までの流れを模式的に表した図である。
【図１１】実施の形態１に係る生体分子検出装置における１周期の配向制御信号、サンプリングクロック、ＰＤ出力およびＡ／Ｄ変換部出力を表したグラフである。
【図１２】実施の形態１に係る生体分子検出装置における配向制御信号を複数周期に亘って示したグラフである。
【図１３Ａ】実施の形態２に係る生体分子検出装置の抗原抗体反応の概要を説明するための模式図である。
【図１３Ｂ】実施の形態２に係る生体分子検出装置の抗原抗体反応の概要を説明するための模式図である。
【図１４】実施の形態２に係る生体分子検出装置の主要な構成を示すブロック図である。
【図１５】実施の形態２に係る生体分子検出装置における受光部の詳細な構成を表した模式図である。
【図１６Ａ】実施の形態２に係る生体分子検出装置を用いて一方の検出対象物質を検出する場合におけるＡ／Ｄ変換部出力を表したグラフである。
【図１６Ｂ】実施の形態２に係る生体分子検出装置を用いて他方の検出対象物質を検出する場合におけるＡ／Ｄ変換部出力を表したグラフである。
【図１７Ａ】一方からレーザーを照射した場合における、蛍光分子の遷移モーメントの方向とランダム偏光した励起光の振動方向との関係を表す概念図である。
【図１７Ｂ】他方からレーザーを照射した場合における、蛍光分子の遷移モーメントの方向とランダム偏光した励起光の振動方向との関係を表す概念図である。
【図１８Ａ】一方からレーザーを照射した場合における、蛍光分子の遷移モーメントの方向と２方向に直線偏光した励起光の振動方向との関係を表す概念図である。
【図１８Ｂ】他方からレーザーを照射した場合における、蛍光分子の遷移モーメントの方向と２方向に直線偏光した励起光の振動方向との関係を表す概念図である。
【図１９】蛍光分子の遷移モーメントの方向の変化に伴うフォトダイオード出力の変化を表したグラフである。
【図２０Ａ】レーザーの偏光軸の変化に伴うバインディング分子の配向の変化を説明するための概念図である。
【図２０Ｂ】レーザーの偏光軸の変化に伴うバインディング分子の配向の変化を説明するための概念図である。
【図２０Ｃ】レーザーの偏光軸の変化に伴うバインディング分子の配向の変化を説明するための概念図である。
【図２１】試薬カップの多点に直線偏光したレーザーを底面から入射させる場合を示す概念図である。
【図２２】直線偏光したレーザーを所定の方向から多点に入射させるための配向制御用光源部の構造を示す概念図である。
【図２３】直線偏光したレーザーを所定の方向から多点に入射させるための光学系の一例を示す概念図である。
【図２４】直線偏光したレーザーを所定の方向から多点に入射させるための光学系の別の例を示す概念図である。
【図２５】マイクロレンズアレイを示す概念図である。
【図２６】試薬カップの形状の一例を示す概念図である。
【図２７】集光されたレーザーの焦点と試薬カップとの位置関係の一例を示す概念図である。
【図２８】配向制御光の試薬カップに対する照射方向を切り替えることにより蛍光分子の遷移モーメントの方向を制御するための光学系を示す概念図である。
【発明を実施するための形態】
【００２４】
以下、添付図面を参照しながら本発明の実施の形態について説明する。生体分子検出には様々な特異的な反応が利用されるが、各実施の形態では、抗原および抗体の特異的な反応を利用し、当該抗体に結合する配向用標識に対して標識された蛍光分子から発生する蛍光を基に、抗体と反応した抗原を検出する装置を例にとって説明する。
【００２５】
（実施の形態１）
図１Ａおよび図１Ｂは、本発明の実施の形態１に係る生体分子検出装置における抗原抗体反応の概要を示した模式図である。図１Ａおよび１Ｂを用いて、液中での抗原抗体反応について説明する。実施の形態１では、１種類の抗体を使用し、均一溶液中で１種類の抗原を検出する。ここでは、円筒形の試薬カップ１０の中に乾燥した抗体１２が入れられている場合を考える。抗体１２は、円柱状の形状を有する配向用標識８に結合されている。配向用標識８の周囲には、複数の蛍光分子１４が固定されている。
【００２６】
本実施の形態においては、検体は全血から分離した血漿１６である。試薬カップ１０に血漿１６を分注して撹拌すると、血漿１６中に抗体１２と特異的に結合する抗原１８が存在する場合は、抗体１２と抗原１８との間で抗原抗体反応が起こり、図１Ｂに示すように抗原１２および抗体１８が特異的に結合する。抗体１２は抗原１８に対して十分に多い量が入れられているため、一部の抗体１２は抗原抗体反応をしないまま血漿１６中に残る。以下、抗原抗体反応で結合した抗体１２および抗原１８ならびに配向用標識８および蛍光分子１４が結合した複合体をバインディング分子、抗原１８と結合していない抗体１２、配向用標識８および蛍光分子１４が結合した複合体をフリー分子と呼ぶ。バインディング分子およびフリー分子は、血漿溶液中に混在している。なお、血漿中には抗原１８以外の成分も存在するが、説明を簡単にするため、図１Ａおよび１Ｂでは抗原１８以外の成分は省略して描いてある。
【００２７】
本発明の実施の形態１に係る生体分子検出装置は、液相であることによりフリー分子およびバインディング分子が混在している溶液に対し、励起光を照射し、フリー分子およびバインディング分子に付随する蛍光分子１４から発生する蛍光を受光して、抗原１８の検出および定量を行う。従って、抗原１８を含むバインディング分子から発生する蛍光のみを検出することが望ましいが、フリー分子およびバインディング分子は溶液中に混在しているため、溶液に励起光を照射するとフリー分子に付随する蛍光分子１４からも蛍光が発生して不要成分となる。そこで、本発明の実施の形態１に係る生体分子検出装置は、フリー分子およびバインディング分子の配向を光により切り替えつつ蛍光を検出し、配向の切り替えに伴う蛍光強度の変化に基づいて、全蛍光データの中からバインディング分子に付随する蛍光分子から発生する蛍光の寄与分を算出する。
【００２８】
本発明の実施の形態１に係る生体分子検出装置において、バインディング分子から発生する蛍光の寄与分とフリー分子から発生する蛍光の寄与分とを算出する原理を説明するために、実施の形態１に係る生体分子検出装置に用いるフリー分子およびバインディング分子の構造について図２Ａおよび２Ｂを用いて説明する。図２Ａはフリー分子２０の模式図を表す。フリー分子２０は、抗体１２、配向用標識８および蛍光分子１４を有する。一方、図２Ｂはバインディング分子２２の模式図を表す。バインディング分子２２は、抗体１２、配向用標識８および蛍光分子１４、並びに、抗体１２に結合した抗原１８を有する。
【００２９】
配向用標識８は、抗体１２および蛍光分子１４と結合し、抗体１２および蛍光分子１４を配向させるための標識である。配向用標識８は、細長い棒状の形状を有しており、光という外力を受けて特定の方向に配向する性質を有する。抗体１２および蛍光分子１４は、光により外力を受けて特定の方向に配向しようとするが、分子量が小さいと配向しない場合がある。そこで、本実施の形態では、抗体１２および蛍光分子１４に更に配向用標識８を結合させ、この配向用標識８を配向させることで、抗体１２および蛍光分子１４を配向させる。配向用標識８は、例えば、長手方向の長さが約３００ｎｍのＩ型コラーゲンを用いることができる。配向用標識８は、抗体１２および蛍光分子１４より十分大きい。なお、図２Ａおよび２Ｂでは、説明を分かりやすくするために配向用標識８を円柱状の形状で示した。コラーゲンと、抗体１２または蛍光分子１４との結合は、公知の任意の方法を用いることができる。
【００３０】
蛍光分子１４は、励起光を受けて蛍光を発する分子である。蛍光分子１４は、配向用標識８の両端面ならびに配向用標識８の側面に満遍なく放射状に結合されている。
【００３１】
抗体１２は、抗原１８と特異的に結合する物質であり、配向用標識８に結合されている。抗体１２は、ユーザーが検出したい検出対象物質と特異的に結合するものを使用する。
【００３２】
本実施の形態では、検体に全血を用い、検出対象物質である抗原１８としてＰＳＡ（Ｐｒｏｓｔａｔｅ Ｓｐｅｃｉｆｉｃ Ａｎｔｉｇｅｎ）を検出する場合を考え、検出対象物質と特異的に結合する物質である抗体１２として抗ＰＳＡ抗体を用いた場合について示す。蛍光分子１４としては、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ５６８（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ社の商品名）を用いた。Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ５６８は、波長６１０ｎｍ程度にピークを持ち、５５０ｎｍ−７００ｎｍ程度の波長を持った蛍光を発する。
【００３３】
蛍光分子１４（Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ５６８）のサイズは約１ｎｍである。従って、蛍光分子１４は配向用標識８に比べて十分に小さいため、配向用標識８の周囲に複数結合させることができる。なお、図２Ａおよび２Ｂでは、説明を分かりやすくするために蛍光分子１４のサイズを大きく描いてある。
【００３４】
蛍光分子１４は、光エネルギーを吸収すると励起状態に遷移し、基底状態に戻る過程で蛍光を発する。一般に、直線偏光した励起光で蛍光分子１４が励起された場合、蛍光分子１４は励起光の振動方向と同じ方向に偏光した蛍光を発する。蛍光分子１４から発生する蛍光の偏光度は、蛍光分子１４の回転速度に依存する。蛍光分子１４が回転運動していなければ、蛍光分子１４は励起光の振動方向と同じ方向に偏光した蛍光を発し、蛍光分子１４が速い回転運動をしているほど、蛍光分子１４は偏光していない蛍光を発する。なお本明細書において、光の「振動方向」とは電場の振動方向を意味し、光が偏光している場合にはその偏光方向と同義である。
【００３５】
蛍光分子１４が励起光により励起される場合、蛍光分子１４の分子構造によって決まる遷移モーメントという蛍光分子１４内のベクトルが励起光と相互作用する。遷移モーメントは、ある固有の方向を蛍光分子１４内で持っており、遷移モーメントの方向と励起光の振動方向との関係が蛍光分子１４の励起効率を決定する。具体的には、蛍光分子１４は、遷移モーメントと平行な方向に振動する光を選択的に吸収する。従って、図３Ａおよび３Ｂに示すように、励起光１９が紙面左右に振動しながら紙面下から上に進行して蛍光分子１４に当たる場合、直線偏光した励起光１９の振動方向が蛍光分子１４の遷移モーメントと平行な場合（図３Ａ）に最も励起効率が高くなり、直線偏光した励起光１９の振動方向と蛍光分子１４の遷移モーメントとのなす角が大きくなるほど励起効率は下がり、直線偏光した励起光１９の振動方向が蛍光分子１４の遷移モーメントと直交する場合（図３Ｂ）に励起効率が０となる。遷移モーメントの向きは、蛍光分子１４の向きによって変わるため、溶液中における蛍光分子１４の向きは、蛍光分子１４の励起効率に影響を与える。なお、ここでは説明を分かりやすくするために、蛍光分子１４の長手方向と蛍光分子１４の遷移モーメントの方向とが平行となっている場合を例にとって図示したが、蛍光分子の形状と遷移モーメントとの関係は必ずしも平行となる場合ばかりではない。
【００３６】
このように、蛍光分子１４の遷移モーメントと励起光１９の振動方向との関係は、蛍光分子１４の励起効率に影響を与えるが、このことは、フリー分子２０およびバインディング分子２２に結合している蛍光分子１４の遷移モーメントと励起光１９の振動方向との関係にも当てはまる。フリー分子２０およびバインディング分子２２が直線偏光（光の振動方向が同一平面内にある偏光）した励起光によって励起された場合の励起効率について図４Ａおよび４Ｂを用いて説明する。
【００３７】
図４Ａおよび４Ｂに示されるように本実施形態では、配向用標識８の側面に、配向用標識８の中心軸に対して放射状に蛍光分子１４が結合されている。したがって、これらの配向用標識８の側面に結合した蛍光分子１４の遷移モーメントの方向も配向用標識８の中心軸に対して放射状となっている。また、図４Ａおよび４Ｂでは、配向用標識８の両端面に結合している蛍光分子の遷移モーメントは、配向用標識８の長手方向と平行となっている。
【００３８】
図４Ａは、励起光１９の振動方向と配向用標識８の長手方向とが互いに平行となる場合を示す図である。この場合、バインディング分子２２が有する複数の蛍光分子１４の中で、励起される蛍光分子は、主に配向用標識８の両端面に結合した蛍光分子（破線で示す領域２４ａおよび領域２４ｂに含まれる蛍光分子）である。配向用標識８の側面に結合した蛍光分子は、遷移モーメントが励起光の振動方向と垂直となるため励起されない。
【００３９】
図４Ｂは、励起光１９の振動方向と配向用標識８の長手方向とが互いに垂直となる場合を示す図である。この場合、バインディング分子２２が有する複数の蛍光分子１４の中で、励起される蛍光分子は、配向用標識８の側面に放射状に結合した蛍光分子のうち、主に遷移モーメントが励起光１９の振動方向と垂直の関係になっていない蛍光分子（破線で示す領域２６ａおよび領域２６ｂに含まれる蛍光分子）である。配向用標識８の両端面に結合した蛍光分子は、遷移モーメントが励起光の振動方向と垂直となるため励起されない。また、配向用標識８の側面に放射状に結合した蛍光分子のうち、遷移モーメントが励起光１９の振動方向と垂直となる蛍光分子（例えば、蛍光分子１４ａおよび蛍光分子１４ｂ）は励起されない。
【００４０】
配向用標識８は細長い円柱状の形状を有しており、配向用標識８の側面の面積は配向用標識８の両端面の面積より大きいため、配向用標識８の側面には配向用標識８の両端面と比べて多くの蛍光分子が結合している。従って、励起光１９の振動方向と配向用標識８の長手方向とが互いに垂直の位置関係にある場合の方が、励起光１９の振動方向と配向用標識８の長手方向とが互いに平行の位置関係にある場合と比べて、より多くの蛍光分子を励起することができる。つまり、励起光１９の振動方向を一定としながら配向用標識８の配向方向（配向用標識８の長手方向）を変化させると、バインディング分子２２から発生する蛍光の総量も変化する。
【００４１】
なお、厳密には、励起光１９の振動方向と配向用標識８の長手方向とが互いに平行となる場合においても、配向用標識８の側面に結合した蛍光分子１４が斜めに結合していれば、遷移モーメントが励起光１９の振動方向と完全に垂直とはならず、配向用標識８の側面に結合した蛍光分子１４が励起される場合がある。しかし、配向用標識８の側面に結合し、遷移モーメントが励起光１９の振動方向と垂直とならない蛍光分子の個数は全体から見るとわずかな量しかない。したがって、バインディング分子２２全体として見ると、このレアケースのバインディング分子２２は、励起光１９の振動方向と配向用標識８の長手方向とが互いに垂直となる場合ほどの蛍光を発することはない。同様に、励起光１９の振動方向と配向用標識８の長手方向とが互いに垂直となる場合においても、配向用標識８の両端面に結合した蛍光分子のうち励起されるものが現れる場合があるが、バインディング分子２２全体として見るとそれらの割合は無視できるほどに少ない。
【００４２】
なお、図４Ａおよび４Ｂでは、バインディング分子２２を図示して説明したが、フリー分子２０の場合においても、励起光１９の振動方向と配向用標識８の長手方向との関係に応じてバインディング分子２２の場合と同じ位置にある蛍光分子が励起される。
【００４３】
溶液中における蛍光分子１４の向きを考えるため、溶液中におけるフリー分子２０およびバインディング分子２２の運動について説明する。フリー分子２０およびバインディング分子２２は、溶液中で不規則に運動（ブラウン運動）しており、溶液中の移動および回転運動を行っている。溶液中での分子のブラウン運動は、絶対温度、分子の体積、溶媒の粘度等の影響を受けることが知られている。バインディング分子２２は、抗原１８の分だけフリー分子２０より体積が大きく、溶液中でブラウン運動しにくい。溶液中でフリー分子２０およびバインディング分子２２のブラウン運動のしやすさが互いに異なることを利用して、ブラウン運動の変化からバインディング分子２２の検出を行う方法が知られているが、ブラウン運動というランダムな運動を利用しているため検出感度に限界がある。
【００４４】
そこで、本発明の実施の形態１に係る生体分子検出装置は、レーザーを利用して溶液中のフリー分子およびバインディング分子の配向を制御する。溶液中のフリー分子およびバインディング分子にレーザーを照射すると、主に配向用標識８が外力を受け、溶液中でランダムな運動をしていたフリー分子およびバインディング分子は、特定の一方向を向く（以下、このように外力の付加を受けて分子が特定の一方向を向いた状態を、分子の配向が完了した状態という）。フリー分子およびバインディング分子は、体積または質量の違いにより溶液中での移動および回転運動のしやすさが異なる。レーザーで溶液中の分子の配向を制御した場合においても、フリー分子とバインディング分子とでは、レーザーを照射されてからこれらの分子の配向が完了するまでに要する時間に差が生じる。本発明の実施の形態１に係る生体分子検出装置は、フリー分子およびバインディング分子のそれぞれの配向が完了するまでに要する時間の差を利用して、フリー分子およびバインディング分子それぞれに付随した蛍光分子１４の励起効率に差を生じさせ、バインディング分子から発生する蛍光の寄与分の算出を行う。
【００４５】
続いて、本発明の実施の形態１に係る生体分子検出装置１００の構成について説明する。図５Ａは、生体分子検出装置１００の外観斜視図である。生体分子検出装置１００の側面には、表示部１０２、ユーザー入力部１０４および開閉部１０６がある。表示部１０２は、測定結果等を表示する。ユーザー入力部１０４は、モードの設定および検体情報の入力等を行う。開閉部１０６は、上蓋の開閉が可能な構成となっており、検体のセット時には上蓋が開けられ、測定時には上蓋が閉じられる。この構成により、外部の光が測定に影響を与えることを防いでいる。
【００４６】
図５Ｂは、開閉部１０６を開いた場合における生体分子検出装置１００の外観斜視図である。開閉部１０６を開くと、中には試薬カップ１０８および保持台１１０がある。試薬カップ１０８は、保持台１１０に保持されており、保持台１１０から着脱可能となっている。試薬カップ１０８は、溶液を入れる円柱状の容器である。ユーザーは、試薬カップ１０８に検体を分注し、上蓋を閉じて測定を行う。図示しないが、生体分子検出装置１００内には試薬タンクおよび分注部があり、測定が開始されると、分注部は試薬タンク内から試薬を吸い上げて試薬カップ１０８内に分注する。
【００４７】
図６は、生体分子検出装置１００の主要な構成を説明するための機能ブロック図である。生体分子検出装置１００は、表示部１０２、ユーザー入力部１０４、試薬カップ１０８、試薬タンク１１２、分注部１１４、配向制御用光源部１１６、励起光源部１１８、偏光方向制御部１２０、ファンクションジェネレータ（ＦＧ）１２２、受光部１２４、増幅部１２６、Ａ／Ｄ変換部１２８、サンプリングクロック発生部１３０およびＣＰＵ１３２を有する。
【００４８】
試薬カップ１０８は、試薬タンク１１２に保存してある試薬と患者等から採取した検体とを反応させる容器である。試薬カップ１０８は、生体分子検出装置１００から着脱可能となっている。試薬カップ１０８の容量は、例えば約１２０μＬである。
【００４９】
試薬タンク１１２は、複数種類の試薬を貯めておくタンクである。フリー分子２０は試薬タンク１１２中試薬として保存されている。
【００５０】
分注部１１４は、着脱可能なピペットや吸引器によって構成される。分注部１１４は、ＣＰＵ１３２からの命令に従い、測定に使用する試薬を試薬タンク１１２からピペットで吸い上げ、試薬カップ１０８へ分注する。
【００５１】
配向制御用光源部１１６は、試薬カップ１０８の下部に設けられ、内部に備えた偏光子により直線偏光した配向制御光１１７を偏光方向制御部１２０に向けて照射し、試薬カップ１０８内の溶液中にあるフリー分子２０およびバインディング分子２２に外力を加えてこれらの分子の配向を制御する。配向制御光１１７としては、例えば波長１．３μｍ、出力７００ｍＷのレーザーを用いる。配向制御光１１７は、試薬カップ１０８の溶液全体を照らす程度の幅を有している。
【００５２】
励起光源部１１８は、試薬カップ１０８の下部に設けられ、内部に備えた偏光子により直線偏光した励起光１１９を試薬カップ１０８の下部から上部に向けて照射して蛍光分子１４を励起する。励起光としては、例えば波長５３２ｎｍ、出力１０ｍＷの光を用いる。
【００５３】
偏光方向制御部１２０は、配向制御光１１７の偏光方向（振動方向）を切り替えることで、フリー分子２０およびバインディング分子２２の配向方向を切り替える。なお、本明細書において、フリー分子およびバインディング分子に関して「配向方向」とは、配向が完了した状態における配向用標識８の長手方向を意味するものとする。偏光方向制御部１２０は、λ／２波長板を有する。λ／２波長板は、垂直な方向に振動する偏光の光路差を１／２波長変化させる機能を有する位相板であり、光の偏光面を回転操作するために用いられる。λ／２波長板の光学軸方向と平行な方向に直線偏光した光はλ／２波長板を素通りするが、λ／２波長板の光学軸方向と４５度の角度をなす方向に直線偏光した光は振動方向が９０度変化する。つまり、直線偏光した光に対するλ／２波長板の角度を切り替えることで、光を素通りさせる場合と、光の振動方向を９０度変化させる場合とを切り替えることができる。偏光方向制御部１２０は、ＦＧ１２２からの信号を受けてλ／２波長板を回転し、配向制御光１１７の振動方向を９０度切り替える。換言すれば、配向制御光１１７の振動方向は、ＦＧ１２２が発生する電圧信号によって決まる。
【００５４】
ＦＧ１２２は、様々な周波数と波形をもった電圧信号を発生させることのできる装置で、ＣＰＵ１３２からの命令を受けて、偏光方向制御部１２０およびサンプリングクロック発生部１３０へそれぞれ異なる電圧信号を出力する。以下、ＦＧ１２２から偏光方向制御部１２０へ出力される電圧信号を配向制御信号という。
【００５５】
ＣＰＵ１３２は、生体分子検出装置１００の各動作を統括的に制御し、測定結果の演算等を行う。ＣＰＵ１３２は、ＦＧ１２２が出力する配向制御信号を指定することで、偏光方向制御部１２０が配向制御光１１７の振動方向を切り替えるタイミングを制御する。
【００５６】
受光部１２４は、試薬カップ１０８の下部に設けられ、試薬カップ１０８内の蛍光分子１４から発生する蛍光１２３を試薬カップ１０８の下部で受光し、受光した光の信号をアナログ電気信号（アナログ蛍光データ）に変換して増幅部１２６へ出力する。
【００５７】
増幅部１２６は、受光部１２４から出力されたアナログ蛍光データを増幅してＡ／Ｄ変換部１２８へ出力する。
【００５８】
サンプリングクロック発生部１３０は、ＦＧ１２２から入力された電圧信号に基づいて、Ａ／Ｄ変換部１２８がアナログ蛍光データをサンプリングするタイミングを指定するサンプリングクロックをＡ／Ｄ変換部１２８へ出力する。
【００５９】
Ａ／Ｄ変換部１２８は、サンプリングクロック発生部１３０から出力されたサンプリングクロックに基づいて、増幅部１２６から出力されたアナログ蛍光データのサンプリングを行い、サンプリングしたアナログ蛍光データをデジタルデータに変換してＣＰＵ１３２へ出力する。
【００６０】
ＣＰＵ１３２は、Ａ／Ｄ変換部１２８から出力されたデジタルデータの演算を行い、その結果を表示部１０２へ出力する。また、ＣＰＵ１３２は、ユーザー入力部１０４から入力を受けて、配向制御用光源部１１６、励起光源部１１８、分注部１１４およびＦＧ１２２の動作の指示命令を行う。具体的には、ＣＰＵ１３２は、配向制御用光源部１１６および励起光源部１１８に対してはそのＯＮ／ＯＦＦ命令を行い、分注部１１４に対しては使用する試薬を指定する命令および分注動作開始命令を行い、ＦＧ１２２に対しては出力する電圧信号の波形の指示命令および出力命令を行う。
【００６１】
図７（Ａ）〜（Ｃ）に示す模式図を用いて、配向制御用光源部１１６から照射される配向制御光１１７の振動方向の切り替えに伴うフリー分子２０およびバインディング分子２２の動作を説明する。
【００６２】
配向制御用光源部１１６から照射された配向制御光１１７は、偏光方向制御部１２０を通って試薬カップ１０８へ照射される。偏光方向制御部１２０は、配向制御用光源部１１６から照射された配向制御光１１７の振動方向を２方向に切り替える。具体的には、偏光方向制御部１２０は、ＦＧ１２２から０Ｖの配向制御信号を受信した場合には配向制御光１１７を素通りさせ、ＦＧ１２２から５Ｖの配向制御信号を受信した場合には配向制御光１１７の振動方向を９０度切り替える。本実施形態では、偏光方向制御部１２０が配向制御光１１７を素通りさせた場合に試薬カップ１０８に入射する配向制御光１１７の振動方向は、励起光１１９の振動方向と平行となる。したがって、偏光方向制御部１２０が配向制御光１１７の振動方向を９０度切り替えた場合に試薬カップ１０８に入射する配向制御光１１７の振動方向は、励起光１１９の振動方向と垂直となる。
【００６３】
配向制御光１１７は、フリー分子２０およびバインディング分子２２に外力を加えることでこれらの分子を配向させる。配向制御光１１７による外力は、配向制御光１１７がフリー分子２０およびバインディング分子２２に当たって散乱する反作用として生じるものである。したがって、配向制御光１１７が振動する方向とフリー分子２０およびバインディング分子２２の向きとの関係によって、配向制御光１１７が力を及ぼす方向が決まる。フリー分子２０およびバインディング分子２２は、溶液中でランダムな方向を向いて分散しているが、配向制御光１１７を照射されると配向制御光１１７によって少し回転するような方向（回転方向）の力を受ける。そして、配向制御光１１７による作用を受けたフリー分子２０およびバインディング分子２２は、配向制御光１１７が及ぼす様々な方向への回転方向の力が釣り合う方向を向いて安定する。この場合、フリー分子２０およびバインディング分子２２が、配向制御光１１７が及ぼす回転方向の力が釣り合う方向を向くとは、配向用標識の長手方向が配向制御光１１７の振動方向と平行になることをいう。従って、配向制御光１１７の振動方向を変化させれば、フリー分子２０およびバインディング分子２２が配向する方向を変化させることができる。
【００６４】
図７Ａは、偏光方向制御部１２０が配向制御光１１７を素通りさせた場合におけるフリー分子２０およびバインディング分子２２の配向方向を示す図である。紙面左右方向に振動している配向制御光１１７が試薬カップ１０８に入射すると、フリー分子２０およびバインディング分子２２は、配向用標識８の長手方向が配向制御光１１７の振動方向と平行となるように配向する。
【００６５】
図７Ｂは、配向制御光１１７の振動方向を９０度切り替えて配向制御光１１７が紙面に垂直な方向に振動するようにした初期段階におけるフリー分子２０およびバインディング分子２２の動作を示す図である。ＦＧ１２２から５Ｖの配向制御信号が出力されると、偏光方向制御部１２０は、配向制御光１１７の振動方向を紙面に垂直な方向に切り替える。紙面に垂直な方向に振動する配向制御光１１７が試薬カップ１０８に入射すると、フリー分子２０およびバインディング分子２２は、配向用標識８の長手方向が配向制御光１１７の振動方向と平行となるように回転運動を行う。この場合、バインディング分子２２に比べて体積および質量が小さいフリー分子２０の方が速く回転運動し、その配向が完了するまでに要する時間が短い。バインディング分子２２の配向はフリー分子２０より遅れて完了する。
【００６６】
図７Ｃは、配向制御光１１７の紙面に垂直な方向に振動している場合における、それぞれ配向が完了したフリー分子２０およびバインディング分子２２の配向方向を示す図である。配向制御光１１７の振動方向が紙面に垂直な方向である場合、フリー分子２０およびバインディング分子２２は、配向用標識８の長手方向が紙面に垂直となる向きに配向する。
【００６７】
生体分子検出装置１００は、ＦＧ１２２からの配向制御信号の入力により偏光方向制御部１２０が有するλ／２波長板の向きを切り替えることで、配向制御光１１７の振動方向、並びに、フリー分子２０およびバインディング分子２２の配向方向を角度が９０度互いに異なる２つの方向にそれぞれ切り替えることができる。
【００６８】
フリー分子２０およびバインディング分子２２の配向方向と励起光１１９との関係について図８Ａおよび８Ｂを用いて説明する。
【００６９】
図８Ａは、ＦＧ１２２から偏光方向制御部１２０への配向制御信号の出力が０Ｖの場合における励起光１１９の振動方向とフリー分子２０およびバインディング分子２２の配向方向との関係を示した模式図である。
【００７０】
ＦＧ１２２から偏光方向制御部１２０への配向制御信号の出力が０Ｖの場合、励起光１１９の振動方向と配向用標識８の長手方向とが平行となる。この場合、フリー分子２０およびバインディング分子２２が有する複数の蛍光分子１４の中で、主に配向用標識８の両端面に結合した蛍光分子１４が励起される。これは、配向用標識８の両端面に結合した蛍光分子の遷移モーメントが、励起光１１９の振動方向と垂直とならないためである。配向用標識８の側面に結合した蛍光分子１４は、遷移モーメントが励起光１１９の遷移モーメントと垂直となるため励起されない。
【００７１】
図８Ｂは、ＦＧ１２２から偏光方向制御部１２０への配向制御信号の出力が５Ｖの場合における励起光１１９の振動方向とフリー分子２０およびバインディング分子２２の配向方向との関係を示した模式図である。
【００７２】
ＦＧ１２２から偏光方向制御部１２０への配向制御信号の出力が５Ｖの場合、励起光１１９の振動方向と配向用標識８の長手方向とが垂直となる。この場合、フリー分子２０およびバインディング分子２２が有する複数の蛍光分子１４の中で、主に配向用標識８の側面に結合した蛍光分子１４が励起される。これは、配向用標識８の側面に結合した蛍光分子１４の遷移モーメントが、原則励起光１１９の振動方向と垂直とならないためである。配向用標識８の両端面に結合した蛍光分子１４、ならびに、配向用標識８の側面に結合しかつ励起光１１９の振動方向と垂直な遷移モーメントを有する一部の蛍光分子１４は、遷移モーメントが励起光１１９の遷移モーメントと垂直となるため励起されない。
【００７３】
配向用標識８の側面には配向用標識８の両端面と比べて多くの蛍光分子１４が結合しているため、ＦＧ１２２から偏光方向制御部１２０への配向制御信号の出力が５Ｖの場合の方が０Ｖの場合と比べ、フリー分子２０またはバインディング分子２２の１分子あたりの発光量が多い。そのため、ＦＧ１２２から偏光方向制御部１２０への配向制御信号の出力が５Ｖの場合の方が、試薬カップ１０８内の溶液中から発生する蛍光の総量も多い。
【００７４】
このように、偏光方向制御部１２０による配向制御光１１７の振動方向の切り替えは、フリー分子２０およびバインディング分子２２の１分子あたりの発光量を切り替えることになる。一方、フリー分子２０およびバインディング分子２２は体積および質量が異なるため、配向制御光１１７の振動方向の切り替えに応じて配向が切り替わる速度は、これらの分子では互いに異なる。
【００７５】
フリー分子２０は、バインディング分子２２に比べて体積および質量が小さいため、配向制御光１１７の振動方向の切り替えに応じて、バインディング分子２２より早く配向を変化させる。つまり、バインディング分子２２より早くその配向が完了することで、１分子あたりの発光量が増加するタイミングがバインディング分子２２より早い。生体分子検出装置１００は、配向制御光１１７の振動方向の切り替えに伴ってフリー分子２０とバインディング分子２２との発光量が切り替わるタイミングが異なることを利用して、総発光量に対するフリー分子２０の寄与分とバインディング分子２２の寄与分との分離を行う。
【００７６】
続いて図９を用いて受光部１２４の詳細な構成について説明する。図９は、受光部１２４の詳細な構成を表した模式図である。受光部１２４は、レンズ１４２、フィルタ１４４、偏光子１４６、レンズ１４８およびＰＤ（フォトダイオード）１５０を含む。
【００７７】
受光部１２４は、試薬カップ１０８の底面側から蛍光を受光する。試薬カップ１０８内のフリー分子２０またはバインディング分子２２から発生して受光部１２４の紙面左側部分に入射する蛍光１４７および受光部１２４の紙面右側部分に入射する蛍光１４９は、レンズ１４２によって集光および平行化され、フィルタ１４４を通って偏光子１４６へ入射する。なお、図示しないが蛍光１４７と蛍光１４９との間にも蛍光が存在し、それらの挙動は当業者であれば予測可能であるので説明を省略する。
【００７８】
フィルタ１４４は、蛍光分子１４から発生する蛍光以外の光をカットするバンドパスフィルタであり、励起光等の蛍光以外の光がＰＤ１５０へ入射することを防いでいる。
【００７９】
偏光子１４６は、励起光１１９の振動方向と同じ方向に偏光した光のみを透過させる。配向が完了した蛍光分子、すなわちブラウン運動などの運動をしていない蛍光分子１４を直線偏光した励起光１１９で励起すると、蛍光分子１４から発生する蛍光も励起光の振動方向と同じ方向に直線偏光した光となる。そのため、配向が完了したフリー分子２０またはバインディング分子２２から発生した蛍光は、偏光子１４６を透過することができる。試薬カップ１０８内で散乱された励起光１１９や、配向方向を切り替えている途中のフリー分子２０またはバインディング分子２２に付随する蛍光分子１４から発生した蛍光は、振動方向が元々の励起光１１９の振動方向と異なっているため偏光子１４６を透過できない。このように、偏光子１４６は、配向が完了したフリー分子２０およびバインディング分子２２に付随する蛍光分子１４から発生する蛍光のみを透過させる。
【００８０】
ＰＤ１５０は、レンズ１４８によって集光された蛍光を受光し、受光した蛍光の強度に応じた電荷を発生させて増幅部１２６へ出力する。このようにして受光部１２４は、配向が完了した蛍光分子１４から発生した蛍光を電荷に変換する。
【００８１】
続いて生体分子検出装置１００の測定時における動作について説明する。図１０は、検体の準備から廃棄までの流れを模式的に表した図である。
【００８２】
測定の準備にあたり、まず患者から５０μＬ採集した全血１５６を遠心分離し、血漿１６を分離する。分離して取り出した血漿１６を、生体分子検出装置１００の検体セット部１５２にセットする。ここまでの作業はユーザーが行う。
【００８３】
生体分子検出装置１００は、検体セット部１５２にセットされた血漿１６を、試薬カップストック部１６０にストックしてある未使用の試薬カップ１０８の中に分注する。続いて、生体分子検出装置１００は、試薬タンク１１２の中にあるフリー分子２０をピペット１５８で吸い上げ、試薬カップ１０８の中に分注する。試薬カップ１０８内に血漿１６およびフリー分子２０を注入後、生体分子検出装置１００は、試薬カップ１０８を３７℃で温調しながら、内蔵したボルテックスミキサーによって振動させて抗原抗体反応を起こさせる。その後、生体分子検出装置１００は、励起光の照射および蛍光の検出を行い、蛍光の検出終了後に試薬カップ１０８を内蔵のごみ箱１５４へ廃棄する。
【００８４】
測定の際にＦＧ１２２が出力する配向制御信号、サンプリングクロック発生部１３０が出力するサンプリングクロック、ＰＤ１５０が出力するＰＤ出力およびＡ／Ｄ変換部１２８が出力するＡ／Ｄ変換部出力について、図１１を用いて説明する。図１１は、縦軸がそれぞれ生体分子検出装置１００における配向制御信号の電圧、サンプリングクロックの電圧、ＰＤ出力およびＡ／Ｄ変換部出力を表し、横軸が時間ｔを表したグラフである。なお、ここでは説明を容易にするため、ＰＤ出力およびＡ／Ｄ変換部出力については、グラフを模式的に示してある。
【００８５】
ＦＧ１２２から出力される配向制御信号は、測定前は０Ｖとなっている。測定前においては、配向制御光１１７を溶液中に照射してフリー分子２０およびバインディング分子２２を配向させておく。配向制御信号が０Ｖの場合、サンプリングクロックも０Ｖとなりサンプリングは行われない。サンプリングクロックが入力されないため、Ａ／Ｄ変換部出力も０となる。配向制御信号が０Ｖの場合、励起光を試薬カップ１０８に向けて照射すると、ＰＤ出力は、初めフリー分子２０およびバインディング分子２２が有する配向用標識８の両端面に結合した蛍光分子１４が発光したことによる出力と装置に起因するノイズとを加算したｉｚの値となる。
【００８６】
続いて、生体分子検出装置１００は、配向制御信号を５Ｖにする。配向制御信号を５Ｖとすると、サンプリングクロック発生部１３０は、サンプリングタイミングを表すサンプリングクロックとして５Ｖの信号を定期的に出力する。そして、Ａ／Ｄ変換部１２８はサンプリングクロックの５Ｖの信号を受信したタイミングでアナログ蛍光データのサンプリングをしてＡ／Ｄ変換を行う。
【００８７】
また、配向制御信号を５Ｖとすると、偏光方向制御部１２０が配向制御光１１７の振動方向を９０度切り替える。配向制御光１１７の振動方向の切り替えに伴い、試薬カップ１０８内のフリー分子２０およびバインディング分子２２の配向方向が９０度切り替わる。この場合、バインディング分子２２に比べて体積および質量の小さいフリー分子２０の方が配向方向の切り替えが速い。配向が切り替わる途中のフリー分子２０およびバインディング分子２２に付随する蛍光分子１４から発生した蛍光は、大半が偏光していないため偏光子１４６によって遮断される。
【００８８】
配向が完了したフリー分子２０は、配向が切り替わる前に比べて多くの蛍光を発する。配向が完了したフリー分子２０に付随する蛍光分子から発生した蛍光は、励起光と同じ方向に偏光しているため、偏光子１４６によって遮断されずＰＤ１５０に到達する。配向が完了したフリー分子２０が増加することに伴い、ＰＤ出力もｉｚから増加していく。時刻Ｔ１で全てのフリー分子２０の配向が完了すると、ＰＤ出力は値ｉｆで一旦飽和する。
【００８９】
その後、時刻Ｔ２でバインディング分子２２の配向が完了し始めることに伴い、ＰＤ出力は再び増加していく。配向が切り替わる途中のバインディング分子２２に付随する蛍光分子１４から発生した蛍光は、大半が偏光していないため偏光子１４６によって遮断される。時刻Ｔ３で全てのバインディング分子２２の配向が完了すると、ＰＤ出力は値ｉｔで飽和する。
【００９０】
Ａ／Ｄ変換部出力は、ＰＤ出力と同様に初めＤｚの値を出力し、徐々に増加して値Ｄｆで一旦飽和する。ＰＤ出力がｉｆから増加することに伴い、Ａ／Ｄ変換部出力も徐々に増加してＤｔで飽和する。このように、配向制御信号を０Ｖとしておき、その後配向制御信号を５Ｖとすれば、フリー分子２０に付随する蛍光分子から発生した蛍光による寄与分と、バインディング分子２２に付随する蛍光分子から発生した蛍光による寄与分とが時間差を伴ってＡ／Ｄ変換部出力に表れる。
【００９１】
配向制御信号は、５Ｖの出力がＴ秒間続いた後０Ｖとなる。このＴ秒は、少なくともＰＤ出力がｉｔで２度目の飽和をする以上の期間を取る。配向制御信号が５Ｖから０Ｖに切り替わることに伴い、サンプリングクロックは０Ｖとなる。配向制御信号が５Ｖから０Ｖに切り替わると、ＰＤ出力は、しばらくｉｔの値を出力した後ｉｚの値まで減少する。ＰＤ出力がｉｚとなる理由は、配向制御信号が０Ｖに切り替わったことに伴い、励起光１１９の振動方向とフリー分子２０およびバインディング分子２２が有する配向用標識８の長手方向とが平行となり、フリー分子２０およびバインディング分子２２の１分子あたりの発光量が減少するためである。ＰＤ出力がしばらくｉｔの値を出力する理由は、フリー分子２０およびバインディング分子２２の配向方向の切り替えが、配向制御信号の切り替えに対して少し遅れるためである。
【００９２】
ここで、配向制御信号を０Ｖとする期間は、配向制御信号を５Ｖとしていた期間と同じＴ秒とした。これは、配向制御光１１７の出力が一定という条件下では、溶液中のフリー分子２０およびバインディング分子２２の配向が完了するまでに要する時間は、配向制御信号を０Ｖから５Ｖにした場合と配向制御信号を５Ｖから０Ｖにした場合とで、ほぼ同じだからである。配向制御信号が０Ｖから５Ｖに変わって時間Ｔだけ経過し、配向制御信号が０Ｖに戻って時間Ｔだけ経過するまでが、生体分子検出装置１００における測定の１周期である。すなわち、生体分子検出装置１００における１周期の測定時間は２Ｔである。
【００９３】
図１２は、生体分子検出装置１００における配向制御信号を複数周期に亘って示したグラフである。生体分子検出装置１００は、図１２に示すように、配向制御信号を所定の間隔で切り替えて上記１周期の測定を複数回行い、得られた複数のＤｔ、ＤｆおよびＤｚの値についてそれぞれ加算平均を行って、Ｄｔ、ＤｆおよびＤｚの値の平均値を求める。本実施の形態では、上記１周期の測定を１０回行い、Ｄｔ、ＤｆおよびＤｚの値の平均値を求める。これにより、様々な要因により発生する測定結果のばらつきを平均化している。
【００９４】
ＣＰＵ１３２は、得られたＤｔ、Ｄｆ、Ｄｚの平均値から、バインディング分子２２の濃度を算出する。具体的には、初めに測定値Ｓを、次式（１）によって求める。
Ｓ＝（Ｄｔ−Ｄｆ）／（Ｄｔ−Ｄｚ）・・・（１）
【００９５】
式（１）において、（Ｄｔ−Ｄｆ）は、バインディング分子２２が配向方向を切り替えたことに伴い増加した蛍光の強度を表している。（Ｄｔ−Ｄｚ）は、得られたデータの最大値から当初のデータを減ずることで、フリー分子２０およびバインディング分子２２が配向方向を切り替えたことに伴い増加した蛍光の強度を表している。（Ｄｔ−Ｄｆ）を（Ｄｔ−Ｄｚ）で除算することで、光学系変動等の測定結果の再現性を悪化させる要因をキャンセルしている。
【００９６】
ＣＰＵ１３２は、ここで求めた測定値Ｓから、診断値Ｃ（検出対象物質の濃度）を求める。診断値Ｃは、次式によって求める。
Ｃ＝ｆ（Ｓ）・・・（２）
【００９７】
ここで、ｆ（Ｓ）は、検量線関数である。生体分子検出装置１００は、あらかじめ測定項目ごとに異なる検量線関数を持っておき、測定値Ｓを診断値Ｃに変換する。ＣＰＵ１３２は、得られた診断値Ｃを表示部１０２へ出力する。
【００９８】
以上説明したように、本発明の実施の形態１に係る生体分子検出装置１００によれば、配向制御光１１７の振動方向の切り替えにより、溶液中のフリー分子２０およびバインディング分子２２の配向方向を切り替えることが可能な構成とした。配向制御光１１７により切り替えるフリー分子２０およびバインディング分子２２の配向の状態としては、フリー分子２０およびバインディング分子２２が有する配向用標識８の長手方向が励起光１１９の振動方向に対して平行になる状態及び垂直になる状態の２つの状態がある。すなわち生体分子検出装置１００は、配向制御光１１７の振動方向の切り替えにより、フリー分子２０およびバインディング分子２２の１分子あたりの発光量を切り替える。また、フリー分子２０およびバインディング分子２２に関して、配向制御光１１７の照射方向の切り替え後これらの分子の配向がそれぞれ完了するまでに要する時間に差が生じるため、それぞれの分子の発光量が増加するタイミングが互いに異なる。従って生体分子検出装置１００は、溶液中の全ての蛍光分子から蛍光が発生しても、フリー分子およびバインディング分子それぞれに付随する蛍光の寄与分を算出することができ、簡便な構成で検出対象物質の濃度を正確に測定することができる。
【００９９】
また、以上の構成において、生体分子検出装置１００は、配向制御光１１７による外力によって、フリー分子２０およびバインディング分子２２の配向を全て同じ方向に切り替えるため、ブラウン運動というランダムな運動を利用して測定する場合に比べて、高感度な測定をすることができる。
【０１００】
また、フリー分子２０およびバインディング分子２２に配向用標識８を設けたため、配向制御光１１７により配向を変化させることができないほど抗体１２の分子量が小さい場合においても、配向制御光１１７によりフリー分子２０およびバインディング分子２２の配向を切り替えることができ、高感度な測定を行うことができる。また、抗原の分子量が十分に大きい場合においても、配向用標識８を用いることでＳ／Ｎを向上させることができる。
【０１０１】
なお、本実施の形態では、抗原抗体反応を利用する場合を例にとって説明したが、検出対象物質と検出対象物質に特異的に結合する物質との組み合わせは、ここで説明した場合に限られない。例えば本願発明は、抗原を用いて抗体を検出する場合や、特定の核酸を用いて当該核酸とハイブリダイゼーションをする核酸を検出する場合、核酸を用いて核酸結合性たんぱく質を結合する場合、リガンドを用いてレセプターを検出する場合、糖を用いてレクチンを検出する場合、プロテアーゼ検出を利用する場合、高次構造変化を用いる場合等にも適用することができる。
【０１０２】
また、本実施の形態では、測定結果から検出対象物質の濃度の算出までの説明を容易にするため、測定結果のグラフを模式的な図とした場合における検出対象物質の算出の説明を行ったが、必ずしもこのように算出する必要はない。例えば、グラフ中の変曲点に基づいて、フリー分子による蛍光とバインディング分子による蛍光との境目の点を決めて算出を行っても良い。
【０１０３】
また、配向制御信号を５Ｖまたは０Ｖとする期間は、フリー分子およびバインディング分子の体積や、溶媒の粘度、溶液の温度等に基づいて変化させることが望ましい。フリー分子およびバインディング分子に対する配向制御光の振動方向が切り替わった時からこれらの分子の配向が完了するまでに要する時間は、フリー分子およびバインディング分子の体積や、溶媒の粘度、溶液の温度等によって決まる溶液中におけるフリー分子およびバインディング分子の回転しやすさによって決まる。フリー分子およびバインディング分子が溶液中で回転しにくい場合には、フリー分子およびバインディング分子の配向が完了するまでに要する時間が長くなるため、配向制御信号を５Ｖまたは０Ｖとする期間を、配向が完了する程度まで長くすることが望ましい。
【０１０４】
また、本実施の形態では、配向制御光１１７として波長１．３μｍ、出力７００ｍＷのレーザーを用いたが、配向制御光１１７として用いるレーザーはこれに限られない。レーザーの波長および出力は、フリー分子およびバインディング分子の体積、質量等起因する溶液中での回転しやすさに基づいて決定することが望ましく、特に、フリー分子とバインディング分子との間に、それぞれの配向の完了までに要する時間に差が表れる程度の出力のレーザーを用いることが望ましい。
【０１０５】
また、本実施の形態では、励起光１１９として波長５３２ｎｍ、出力１０ｍＷの光を用いたが、励起光１１９として用いる光はこれに限られない。
【０１０６】
なお、本実施の形態では、繰り返し測定を行って測定結果の加算平均を求めたが、加算平均は必ずしも行う必要はなく、ユーザーが何を重視するかによって決定すれば良い。例えば、ユーザーが素早く測定を行いたい場合には、測定を１周期のみ行って結果を表示しても良いし、ユーザーがより高精度な測定を行いたい場合には、１周期の測定を何度も繰り返すことによって測定精度を向上させることもできる。
【０１０７】
（実施の形態２）
図１３Ａおよび１３Ｂは、本発明の実施の形態２に係る生体分子検出装置の抗原抗体反応の概要を示した模式図である。実施の形態２では、２種類の抗体を使用し、均一溶液中で２種類の抗原を検出する。試薬カップ３０の中に、抗体３２および抗体３４が入れられている場合を考える。抗体３２は、配向用標識３６および蛍光分子４０と結合してフリー分子を形成している（以下、フリー分子Ａという）。抗体３４は、配向用標識３８および蛍光分子４２と結合してフリー分子を形成している（以下、フリー分子Ｂという）。
【０１０８】
試薬カップ３０の中に検体４８を入れて撹拌すると、抗体３２と特異的に結合する抗原４４が検体４８中に存在する場合には、フリー分子Ａと抗原４４との間で抗原抗体反応が起こり、抗体３２および抗原４４が特異的に結合する。同様に抗体３４と特異的に結合する抗原４６が検体４８中に存在する場合には、フリー分子Ｂと抗原４６との間で抗原抗体反応が起こり、抗体３４および抗原４６が特異的に結合する。実施の形態１で説明した場合と同様に、一部の抗体は、抗原抗体反応をしないまま溶液中に存在する。以下、抗原抗体反応をしたフリー分子Ａおよび抗原４４をバインディング分子Ａ、抗原抗体反応をしたフリー分子Ｂおよび抗原４６をバインディング分子Ｂと呼ぶ。本実施の形態では、検出対象物質である抗原４４はＰＳＡ、抗原４６はＳＣＣ（Ｓｑｕａｍｏｕｓ Ｃｅｌｌ Ｃａｒｃｉｎｏｍａ）抗原とする。また、抗体３２としてＰＳＡと特異的に結合する抗ＰＳＡ抗体を用い、抗体３４としてＳＣＣ抗原と特異的に結合するＳＣＣ抗体を用いる。蛍光分子４０として、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ５６８（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ社の商品名）を用い、蛍光分子４２として、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ５５５（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ社の商品名）を用いた。Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ５５５は、５４０−７００ｎｍ程度の波長を持った蛍光を発し、５７０ｎｍ程度の波長の蛍光を最も強く発する。
【０１０９】
本発明の実施の形態２に係る生体分子検出装置は、２種類のフリー分子および２種類のバインディング分子が混在する溶液に励起光を照射し、目的のバインディング分子の検出または定量を行う。
【０１１０】
図１４は、本発明の実施の形態２に係る生体分子検出装置２００の主要な構成を示すブロック図である。なお、実施の形態１で示した生体分子検出装置１００と同一の構成要素には同一の符号を付し、その説明を省略する。
【０１１１】
生体分子検出装置２００は、実施の形態１で示した生体分子検出装置１００の構成に対して、受光部２０２、分注部２０４、試薬タンク２０６およびＣＰＵ２０８が主に異なる。
【０１１２】
分注部２０４は、複数の抗体がそれぞれ別の容器に入った試薬タンク２０６から２種類の抗体を吸い上げ、試薬カップ１０８内へ分注する。
【０１１３】
受光部２０２は、試薬カップ１０８内の蛍光分子から発生した蛍光を検出するが、ＣＰＵ２０８からの命令（Ｓ１）を受けて、蛍光分子４０および蛍光分子４２の蛍光を互いに分離して受光できるように構成されている。
【０１１４】
ＣＰＵ２０８は、Ａ／Ｄ変換部１２８から出力されたデジタルデータの演算を行い、その結果を表示部１０２へ出力する。また、ＣＰＵ２０８は、ユーザー入力部１０４から入力を受けて、配向制御用光源部１１６、励起光源部１１８、分注部２０４、ＦＧ１２２および受光部２０２の動作の指示命令を行う。具体的には、ＣＰＵ２０８は、配向制御用光源部１１６および励起光源部１１８に対してはそのＯＮ／ＯＦＦ命令を行い、分注部２０４に対しては使用する試薬を指定する命令および分注動作開始命令を行い、ＦＧ１２２に対しては出力する電圧信号の波形の指示命令および出力命令を行い、受光部２０２に対してはフィルタの切り替え命令を行う。
【０１１５】
受光部２０２の構成について、図１５を用いて具体的に説明する。図１５は、実施の形態２に係る生体分子検出装置２００における受光部２０２の詳細な構成を表した模式図である。受光部２０２内のフィルタ切替部２１０は、フィルタ２１２およびフィルタ２１４の２種類のフィルタを備えている。２種類のフィルタは、可動式となっており、レンズ１４２によって集光された光が通るフィルタを切り替えることができる。フィルタ切替部２１０は、ＣＰＵ２０８からの命令を受けて、使用するフィルタを切り替える。例えば、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ５６８から発生する蛍光を検出する場合は、フィルタ２１２を使用し、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ５５５から発生する蛍光を検出する場合はフィルタ２１４を使用する。これにより、不要な蛍光がフォトダイオード１５０に到達することを防いでいる。本実施の形態では、フィルタ２１２としてＳｐＲｅｄ−Ａフィルタ（Ｓｅｍｒｏｃｋ社の商品名）セットの受光側フィルタを用いる。ＳｐＲｅｄ−Ａフィルタセットの受光側フィルタは、６０５ｎｍ−６５０ｎｍ程度の波長の光を透過するバンドパスフィルタである。フィルタ２１４としてＳｐＯｒ−Ａフィルタ（Ｓｅｍｒｏｃｋ社の商品名）セットの受光側フィルタを用いる。ＳｐＯｒ−Ａフィルタセットの受光側フィルタは、５７５−６００ｎｍ程度の波長の光を透過させるバンドパスフィルタである。なお、本実施の形態では２種類のフィルタにより光を分光して不要な蛍光等がフォトダイオード１５０に到達することを防いだが、必ずしもフィルタを用いて光を分光する必要はない。例えば、回折格子やプリズムを用いて光を分光して、特定の波長を有する光のみを受光してもよい。
【０１１６】
続いて生体分子検出装置２００の測定動作について説明する。生体分子検出装置２００の測定動作は基本的には、実施の形態１で説明した生体分子検出装置１００の測定動作と同じであるが、細かな点で異なる。フリー分子とバインディング分子を分離して検出できる理由については実施の形態１で説明したため、ここでは２種類のバインディング分子を分離して検出する方法を説明する。
【０１１７】
生体分子検出装置２００は、初めに２種類のバインディング分子のどちらを先に検出するか決定する。これは、ユーザーが、ユーザー入力部１０４を通して入力する等して任意に決定することができる。ここでは、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ５６８を蛍光分子として持つバインディング分子Ａから先に測定を行う。ＣＰＵ２０８は、受光部２０２内のフィルタ切替部２１０に、フィルタ２１２の使用を指示する命令を出す。フィルタ切替部２１０は、ＣＰＵ２０８からの命令を受け、レンズ１４２で集光された光が通る位置にフィルタ２１２を移動させる。配向制御信号が５Ｖに変わり、試薬カップ１０８に向けて励起光が照射されると、溶液内の蛍光分子４０および蛍光分子４２のそれぞれから蛍光が発生する。蛍光分子４０および蛍光分子４２のそれぞれから発生した蛍光は、レンズ１４２によって集光され、フィルタ２１２へ入射する。フィルタ２１２は６０５ｎｍ−６５０ｎｍ程度の波長の光のみを通すため、蛍光分子４０から発生した蛍光は当該フィルタを透過し、蛍光分子４２から発生した蛍光は当該フィルタによりほぼ全て遮断される。このようにして、蛍光分子４０から発生した蛍光のみを検出することができる。
【０１１８】
実施の形態１と同様に、生体分子検出装置２００によって１周期の測定を行い、蛍光分子４０から発生した蛍光の検出を行った結果のＡ／Ｄ変換部出力を、図１６Ａに示す。なお、ここでは説明を容易にするためグラフを模式的に示してある。
【０１１９】
Ａ／Ｄ変換部出力は、測定開始段階ではフリー分子Ａおよびバインディング分子Ａが有する配向用標識８の両端面に結合した蛍光分子４０から発生した蛍光による出力および装置ノイズに起因する出力が加算された出力値Ｄ１ｚであり、徐々に増加して時刻Ｔ１１で値Ｄ１ｆとなって一旦飽和する。続いてＡ／Ｄ変換部出力は、時刻Ｔ１２で再び増加し、時刻Ｔ１３で値Ｄ１ｔとなって再び飽和する。
【０１２０】
生体分子検出装置２００は、配向制御信号を所定の間隔で切り替えて上記１周期の測定を複数回行い、得られた複数のＤ１ｔ、Ｄ１ｆおよびＤ１ｚの値についてそれぞれ加算平均を行って、Ｄ１ｔ、Ｄ１ｆおよびＤ１ｚの値の平均値を求める。
【０１２１】
続いて、ＣＰＵ２０８は、得られたＤ１ｔ、Ｄ１ｆ、Ｄ１ｚの平均値から、バインディング分子Ａの濃度を算出する。具体的には、実施の形態１で測定値Ｓを求めた場合と同じ演算を行い、測定値Ｓ１を求める。そして、検量線関数ｆ１（Ｓ）を用いて、測定値Ｓ１から濃度Ｃ１に変換する。ＣＰＵ２０８は、得られた濃度Ｃ１を表示部１０２へ出力する。
【０１２２】
次に、生体分子検出装置２００は、バインディング分子Ｂの測定を行う。ＣＰＵ２０８は、受光部２０２内のフィルタ切替部２１０に、フィルタ２１４の使用を指示する命令を出す。フィルタ切替部２１０は、ＣＰＵ２０８からの命令を受け、レンズ１４２で集光された光が通る位置にフィルタ２１４を移動させる。フィルタ２１４は５７５ｎｍ−６００ｎｍ程度の波長の光のみを通すため、蛍光分子４０から発生した蛍光は当該フィルタにより遮断され、蛍光分子４２から発生した蛍光は当該フィルタを透過する。このようにして、蛍光分子４２から発生した蛍光のみを検出することができる。
【０１２３】
生体分子検出装置２００によって１周期の測定を行い、蛍光分子４２から発生した蛍光の検出を行った結果のＡ／Ｄ変換部出力を、図１６Ｂに示す。なお、図１６Ｂにおいては、説明を容易にするためグラフを模式的に示してある。
【０１２４】
Ａ／Ｄ変換部出力は、測定開始段階ではフリー分子Ｂおよびバインディング分子Ｂが有する配向用標識８の両端面に結合した蛍光分子４２から発生した蛍光による出力および装置ノイズに起因する出力が加算された出力値Ｄ２ｚであり、徐々に増加して時刻Ｔ２１で値Ｄ２ｆとなって一旦飽和する。続いてＡ／Ｄ変換部出力は、時刻Ｔ２２で再び増加し、時刻Ｔ２３で値Ｄ２ｔとなって再び飽和する。
【０１２５】
生体分子検出装置２００は、配向制御信号を所定の間隔で切り替えて上記１周期の測定を複数回行い、得られた複数のＤ２ｔ、Ｄ２ｆおよびＤ２ｚの値についてそれぞれ加算平均を行って、Ｄ２ｔ、Ｄ２ｆおよびＤ２ｚの値の平均値を求める。
【０１２６】
バインディング分子Ｂを測定する場合の配向制御信号の切り替えタイミングは、バインディング分子Ａを測定する場合のものと異なる。これは、バインディング分子Ａ、フリー分子Ａ、バインディング分子Ｂおよびフリー分子Ｂそれぞれの体積および質量が異なるため、それぞれの分子の配向が完了するまでに要する時間が互いに異なるためである。
【０１２７】
図１６Ａおよび１６Ｂに示したように、バインディング分子Ａを測定する場合と、バインディング分子Ｂを測定する場合とでは、ＰＤ出力が増加したり飽和したりするタイミングは異なる。これは、バインディング分子Ａとバインディング分子Ｂとの、体積の違いによる溶液中での運動しやすさに起因する。
【０１２８】
続いて、ＣＰＵ２０８は、得られたＤ２ｔ、Ｄ２ｆ、Ｄ２ｚの平均値から、バインディング分子Ｂの濃度を算出する。具体的には、実施の形態１で測定値Ｓを求めた場合と同じ演算を行い、測定値Ｓ２を求める。そして、検量線関数ｆ２（Ｓ）を用いて、測定値Ｓ２から濃度Ｃ２に変換する。ＣＰＵ２０８は、得られた濃度Ｃ２を、表示部１０２へ出力する。
【０１２９】
以上説明したように、本発明の実施の形態２に係る生体分子検出装置２００によれば、実施の形態１で説明した生体分子検出装置１００の構成に加え、検出対象物質と特異的に結合する物質として２種類の抗体および蛍光分子を用い、フィルタ切替部２１０を２種類のフィルタの切り替えが可能な構成とした。そのため、検出対象物質を含むバインディング分子に付随した蛍光分子に対応したフィルタを使用することで、検出対象物質を含むバインディング分子に付随した蛍光分子から発生する蛍光のみを検出することができる。すなわち、一の検体に含まれる複数の検出対象物質のそれぞれの濃度を正確に測定することができる。
【０１３０】
また、一の検体から同時に複数の検出対象物質を測定できることは、診断の精度を上げる上で重要である。
【０１３１】
なお、本実施の形態では、蛍光分子をＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ５６８およびＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ５５５としたが、蛍光分子はこれに限られない。複数の検出対象物質のそれぞれとそれぞれ特異的に結合する複数の物質を、フィルタで分離できる程度に互いの蛍光波長が離れている複数の蛍光分子でそれぞれ標識すれば良い。
【０１３２】
なお、本実施の形態では、抗原抗体反応を利用する場合を例にとって説明したが、検出対象物質と検出対象物質に特異的に結合する物質との組み合わせは、これに限られない。例えば本願発明は、抗原を用いて抗体を検出する場合や、特定の核酸と当該核酸とハイブリダイゼーションをする核酸、核酸と核酸結合性たんぱく質、リガンドとレセプター、糖とレクチン、プロテアーゼ検出、高次構造変化等にも適用することができる。
【０１３３】
また、本実施の形態では検出対象物質が２種類の場合について説明したが、検出対象物質の種類は、それより多くても良い。その場合においても、複数の検出対象物質のそれぞれとそれぞれ特異的に結合する複数の物質を用い、それぞれ異なった複数の蛍光分子で標識し、それぞれの蛍光分子から発生する蛍光を、それぞれの蛍光に対応したフィルタで分離して検出することで、それぞれの検出対象物質を互いに分離して検出することができる。
【０１３４】
なお、検出対象物質の種類が増えるほど蛍光分子の種類も増え、複数の蛍光分子から発生する複数の蛍光が混在することになるため、フィルタのみで蛍光を分離することが困難となる場合がある。その場合は、励起光の種類を増やすことで蛍光の分離を容易にすることができる。蛍光分子の吸光度は励起光の波長に依存し、蛍光分子の種類ごとに吸収しやすい波長帯がある。そのため、励起光の波長を変えることで、一部の蛍光分子のみが蛍光を発生するようになり、フィルタでの蛍光の分離が容易となる。また、より狭い通過帯域を持つバンドパスフィルタを用いることで、目的の蛍光分子から発生する蛍光を検出しやすくすることができる。
【０１３５】
（実施の形態１および実施の形態２の設計変更）
なお、以上説明した本発明に係る各実施の形態は、本発明の一例を示すものであり、本発明の構成を限定するものではない。本発明に係る生体分子検出装置は、上記各実施の形態に限定されず、本発明の目的を逸脱しない範囲で種々変更して実施することが可能である。
【０１３６】
例えば、溶液中の分子の配向を切り替える方法は、レーザーによるものに限られず、フリー分子およびバインディング分子の配向が完了するまでに要する時間に差が生じる程度の外力を加えるものであれば、磁気的な方法や電気的な方法としても良い。
【０１３７】
また、本発明に係る各実施の形態では、互いに直交する２つの方向、つまり直線偏光した励起光の振動方向と平行となる方向、および、直線偏光した励起光の振動方向と垂直となる方向の間で、配向制御光の振動方向を切り替えたが、必ずしも互いに直交する２つの方向の間で切り替える必要はない。フリー分子およびバインディング分子は、配向する方向が異なればそれぞれが有する蛍光分子の励起効率が異なるため、フリー分子またはバインディング分子の１分子あたりの発光量が異なる。従って、フリー分子およびバインディング分子の配向方向を直交する２つの方向としなくとも、フリー分子およびバインディング分子を分離して算出することができる。配向制御光を振動させる２つの方向が直交していれば、フリー分子およびバインディング分子の配向が完了するまでに要する時間の差が最大となって最もＳ／Ｎが良くなる。一方で、例えば配向制御光のそれぞれの振動方向の成す角度が６０度であれば、直交する２つの方向に配向制御光の振動方向を切り替える場合と比べ、フリー分子およびバインディング分子の配向が完了するまでに要する時間が短くなり、測定に要する時間も短くなる。このように配向制御光が振動する２つの方向の成す角度が９０度より小さいほど、フリー分子およびバインディング分子の配向が完了するまでに要する時間が短くなり測定時間も短くなる。
【０１３８】
また、溶液中に検出対象物質が存在するか否か、すなわちバインディング分子が存在するかしないかのみを定性的に測定したい場合は、フリー分子およびバインディング分子の間で配向が完了するまでに要する時間に差が生じる程度だけ角度を変えた２つの方向で配向制御光の振動方向を切り替えれば良い。フリー分子およびバインディング分子の間で、配向が完了するまでに要する時間に差が生じれば、その差は蛍光データに表れるため、バインディング分子の存在を確認できる。
【０１３９】
また、本発明に係る各実施の形態では、配向制御光の振動方向の切り替えにλ／２波長板を用いたが、必ずしもλ／２波長板を使用する必要はない。例えばミラー等を使ってレーザーの振動方向を変える構成や、配向制御用光源部１１６を２つ設けてそれぞれ異なる方向に振動した配向制御光を照射する構成等が考えられる。
【０１４０】
また、本発明に係る各実施の形態では、生体分子検出装置内に試薬カップを１つ設ける場合を説明したが、必ずしも試薬カップは１つである必要はなく、装置内に複数の試薬カップを設けて複数の検体をセットできる構成としても良い。その場合は、装置が試薬カップを順に測定位置に移動させて測定を行う構成とすれば、自動で複数の検体を測定することができる。
【０１４１】
なお、本発明に係る各実施の形態では、蛍光分子および配向用標識と結合した抗体を用いた例を説明したが、必ずしも蛍光分子および配向用標識により標識済みの抗体を用いる必要はない。例えば、抗体および抗原の結合と、抗体、配向用標識および蛍光分子の結合とを同時に試薬カップ内で行っても良い。この場合、ユーザーは、抗体、配向用標識および蛍光分子をそれぞれ別の試薬タンクに用意しておく。測定時には、生体分子検出装置が、抗体、蛍光分子、配向用標識および検体をそれぞれ試薬カップへ分注して反応させる。
【０１４２】
また、配向制御用光源部１１６や励起光源部１１８は、着脱可能な構成として、検出対象物質および蛍光分子等に応じて適切なものに交換できるような構成としても良い。
【０１４３】
また、フリー分子およびバインディング分子の配向方向を所定の時間間隔で切り替え、得られた複数の蛍光データの加算平均を行って、上記検出対象物質の検出または定量を行うと、１周期の測定毎のノイズの影響を減少させることができ、より高精度な測定が可能となる。
【０１４４】
フリー分子およびバインディング分子の配向方向を切り替える所定の時間間隔は、検出対象物質、検出対象物質と特異的に結合する物質、配向用標識および蛍光分子の質量または体積と、配向制御手段による配向制御のための外力の強度とに基づいて、全てのフリー分子およびバインディング分子の配向が完了するまでに要する時間を求め、その時間を所定の時間間隔とすることが望ましい。この場合、全ての分子の配向が完了した後も同一方向にレーザーを照射することがなくなり、消費電力を削減することができる。また、不要な時まで測定を続けることがなくなり、測定時間を短くすることができる。
【０１４５】
全てのフリー分子およびバインディング分子の配向が完了するまでに要する時間は、ＰＤ出力やＡ／Ｄ変換部出力に基づいて求めてもよい。例えば、測定を何周期か繰り返せば、それぞれの出力が飽和するまでにどのくらいの時間を要するかおおよそ分かるため、それぞれの出力が飽和するまでに要する時間を加算平均等して、算出した時間を所定の時間間隔として決めれば良い。
【０１４６】
レーザーによる分子の配向制御を行う場合には、磁力等によって分子の配向を制御する場合に比べ複雑な機構が必要ない。例えば、磁力を用いて分子の配向を制御するためには、それぞれの分子が磁性を持ったものであるか、磁性を持った分子を用意して配向を制御したい分子に結合させる必要があり、測定にあたって準備が煩雑となる。
【０１４７】
なお、本発明に係る各実施の形態では、配向用標識としてコラーゲンを例にとって説明したが、配向用標識は必ずしもコラーゲンでなくても良い。配向用標識は、抗体および蛍光分子を自身の周囲に結合させることができ、溶液中で光により配向する棒状の物質であれば良く、例えば、アクチンフィラメント、金属ナノロッド（金、銀、銅、酸化鉄等）、プラスチック等を用いることができる。
【０１４８】
また、配向用標識の長手方向の長さは必ずしも３００ｎｍでなくても良く、周囲に複数の蛍光分子を結合させることができればどのような長さでも良い。
【０１４９】
なお、本発明に係る各実施の形態では、説明を容易にするため配向用標識に１つの抗体が結合している場合を例に取って説明したが、配向用標識に結合させる抗体は必ずしも１つである必要はない。
【０１５０】
なお、本発明に係る各実施の形態では、検体として全血を用いる場合を例にとって説明したが、検体は全血に限られず、検出対象物質が溶液中に分散していれば尿や隋液等の体液を検体とすることもできる。
【０１５１】
また、本発明に係る各実施の形態では、固相ではなく抗原、抗体および蛍光分子が液体中に分散している液相で測定ができるため、抗原等を反応層に固定して測定を行う固相での測定に比べ、前処理が簡単であるという利点がある。また、抗原、フリー分子共に溶液中を自由に動き回れるため、固相に比べて反応が早いという利点がある。
【０１５２】
また、本発明に係る各実施の形態は、従来の蛍光偏光法のようにブラウン運動の変化による蛍光の偏光度の変化を調べるものではないため、検体の成分が蛍光分子の蛍光寿命に影響を与えたとしても測定に与える影響は少ない。
【０１５３】
また、本発明に係る各実施の形態では、配向制御用光源部は必ずしも１つの照射方向に対して１つである必要はなく、複数の配向制御用光源部を設けて、同一方向に複数の配向制御光を照射しても良い。
【０１５４】
また、本発明に係る各実施の形態では、一方向に直線偏光した励起光１１９を溶液に照射する場合、すなわち偏光面が単一の励起光１１９を溶液に照射する場合を例にとって説明したが、励起光１１９は必ずしも単一の偏光面を有する直線偏光した光である必要はない。実施の形態１および実施の形態２の効果と同様の効果を奏するためには、励起光１１９が特定方向の直線偏光成分を少なくとも１つ有していれば良い。ここで、特定方向の直線偏光成分を有する光とは、蛍光分子の配向方向の変化により、蛍光分子の遷移モーメントと励起光の当該直線偏光成分の振動方向との関係が変化して、当該直線偏光成分による蛍光分子の励起効率に変化が生じる光である。例えば、ランダム偏光した励起光を照射し、受光部の前に検光子を設けて、蛍光分子から発生した蛍光から特定方向の直線偏光成分のみを受光するように構成しても良い。ここでランダム偏光とは、光の振動方向がランダムであり、様々な方向に振動する直線偏光成分が存在することをいう。
【０１５５】
図１７Ａは、振動方向２２２に直線偏光した配向制御光１１７が照射された際のバインディング分子２２の配向方向とランダム偏光した励起光２３０の振動方向とを表した概念図であり、図１７Ｂは振動方向２２４に直線偏光した配向制御光１１７が照射された際のバインディング分子２２の配向方向とランダム偏光した励起光２３０の振動方向とを表した概念図である。なお、図１７Ａは配向制御信号が０Ｖの場合の状態を示す図であり、図１７Ｂは配向制御信号が５Ｖの場合の状態を示す図である。励起光２３０の振動方向２３２ａ〜２３２ｄは、励起光２３０の進行方向に対して垂直な平面内における光の振動方向を表す。図１７Ａおよび図１７Ｂでは、振動方向２３２ａ〜２３２ｄによって励起光２３０の振動方向が様々な方向であることを表しているが、実際は、図示した成分だけでなく、あらゆる角度方向のより多くの成分が含まれている。一般に、溶液中で静止した蛍光分子を直線偏光した励起光で励起すると、蛍光分子は、励起光の偏光方向と同一の方向に偏光した蛍光を発生することが知られている。ランダム偏光した励起光２３０によって励起されると、バインディング分子２２に付随する蛍光分子１４からもランダム偏光した蛍光２３４が発生する。
【０１５６】
検光子２３６は、蛍光分子１４から発生したランダム偏光した蛍光２３４のうち特定の方向に振動する成分を透過させ、それ以外の方向に振動する成分を遮断する。換言すれば、検光子２３６を透過した光は特定の方向にのみ振動する光となる。検光子２３６を透過可能な特定の方向に振動する蛍光２３４の成分とは、励起光２３０のうち振動方向２３２ａに直線偏光した励起光成分によって励起されて発生した成分である。したがって、検光子２３６を透過した蛍光２３４の振動方向は、図１７ＡおよびＢにおいて振動方向２３２ａのみとなる。これにより、蛍光分子１４から発生した蛍光２３４のうち、励起光２３０のうち振動方向２３２ａに直線偏光した励起光成分によって励起された成分のみをフォトダイオード２３８に到達させることができる。このような構成にすることで、励起光２３０としてランダム偏光した光を用いても、特定の方向に振動する光に対して実施の形態１と同様の測定を行うことができる。なお、検光子２３６が透過させる特定の方向に振動する蛍光２３４の成分とは、必ずしもここで示した方向に振動する成分に限られず、蛍光分子１４の配向方向の変化に伴い蛍光分子１４に対する励起効率に差が生じる成分であれば何でも良い。
【０１５７】
また、図１７Ａおよび図１７Ｂでは励起光２３０がいずれの方向に振動する場合においても振幅が一定である例を示したが、必ずしも全ての方向において振幅が一定である必要はない。フォトダイオード２３８が受光する蛍光２３４の成分は、ランダム偏光した蛍光２３４のうち特定方向に振動する成分のみであるので、その他の方向に振動する成分は遮断される。
【０１５８】
図１７Ａに示すように配向制御信号が０Ｖの場合には、配向制御光１１７の振動方向２２２が、検光子２３６を透過可能な光の振動方向と平行になる。このとき、配向用標識８の長手方向が、検光子２３６を透過可能な光の振動方向に対して平行となる。したがって、振動方向２２２に直線偏光した配向制御光１１７により配向したバインディング分子２２に付随する大部分の蛍光分子１４（主に配向用標識８の側面に結合している蛍光分子１４）の遷移モーメントと検光子２３６を透過可能な光の振動方向２３２ａとは互いに垂直となる。すなわち、バインディング分子２２に付随する大部分の蛍光分子１４は、励起光２３０に含まれる振動方向２３２ａに振動する成分によって励起されない。つまり、励起光２３０に含まれる振動方向２３２ａに振動する成分によるバインディング分子２２の励起効率は最小となる。バインディング分子２２から発生する蛍光２３４のうち検光子２３６を透過する成分は、励起光２３０に含まれる振動方向２３２ａに振動する成分によって励起されて発生するため、蛍光２３４において検光子２３６を透過する成分は最小となり、フォトダイオード２３８の出力は最小となる。
【０１５９】
一方、図１７Ｂに示すように配向制御信号が５Ｖの場合には、配向制御光１１７の振動方向２２４が、検光子２３６を透過可能な光の振動方向と垂直になる。このとき、配向用標識８の長手方向が、検光子２３６を透過可能な光の振動方向に対して垂直となる。したがって、振動方向２２４に直線偏光した配向制御光１１７により配向したバインディング分子２２の側面に結合している多数の蛍光分子１４の遷移モーメントと検光子２３６を透過可能な光の振動方向とは互いに平行となる。この場合、励起光２３０に含まれる振動方向２３２ａに振動する成分によるバインディング分子２２の励起効率は最大となる。つまり、蛍光２３４において検光子２３６を透過する成分は最大となり、フォトダイオード２３８の出力は最大となる。
【０１６０】
このような構成とした場合においても、配向制御信号を０Ｖから５Ｖに変化させると、蛍光分子１４の配向方向が変化し、バインディング分子２２中の多数の蛍光分子１４の遷移モーメントの方向と検光子２３６を透過可能な光の振動方向とが徐々に平行に近づく。それに伴い、励起光２３０に含まれる検光子２３６を透過可能な方向に振動する成分によるバインディング分子２２の励起効率が増加し、バインディング分子２２に付随する蛍光分子１４から発生する蛍光２３４の成分であって検光子２３６を透過可能な方向に振動する成分が増加する。すなわち、フォトダイオード２３８において検出する蛍光強度は、実施の形態１と同様に徐々に増加する。ここではバインディング分子２２を用いて説明を行ったが、フリー分子に対してランダム偏光した励起光を照射しても同様のことが言える。この場合、フリー分子とバインディング分子とでは、配向が完了するまでに要する時間が互いに異なるため、フォトダイオード２３８が受光する蛍光強度が増加して飽和するタイミングも互いに異なる。そのため、このような構成とした場合においても、配向制御信号を０Ｖから５Ｖに変化させた際の、時間に対するフォトダイオード出力のグラフは、図１１と同様の形状となる。つまり、この場合においてもフォトダイオード出力のグラフについて実施の形態１と同様の計算を行うことにより、検出対象物質の濃度を測定することができる。
【０１６１】
また、図１８Ａおよび図１８Ｂに示す概念図のように、互いに直交する２つの方向にそれぞれ直線偏光した２つの成分のみを有する励起光２４０を用いてもよい。励起光２４０は、進行方向に対して垂直な平面内において振動方向２４２ａ、２４２ｂにそれぞれ直線偏光した２つの成分のみを有する。つまり、振動方向２４２ａと振動方向２４２ｂとは互いに直交している。このような励起光２４０によって励起された蛍光分子１４は、励起光２４０の振動方向と同一方向に振動する成分を有する蛍光２４４を発する。すなわち、蛍光２４４は振動方向２４２ａ、２４２ｂにそれぞれ直線偏光した２つの成分を有する。
【０１６２】
図１８Ａは、配向制御信号が０Ｖの場合の概念図である。配向制御信号が０Ｖの場合、振動方向２２２に直線偏光した配向制御光１１７が照射される。振動方向２２２に直線偏光した配向制御光１１７により配向されたバインディング分子中の大部分の蛍光分子１４（主に配向用標識８の側面に結合している蛍光分子１４）は、遷移モーメントの方向が振動方向２４２ａと垂直な方向となるように配向する。つまり、配向制御信号が０Ｖの場合、励起光２４０に含まれる振動方向２４２ａに振動する成分によるバインディング分子２２の励起効率は最小となる。一方、励起光２４０に含まれる振動方向２４２ｂに振動する成分によるバインディング分子２２の励起効率は最大となる。
【０１６３】
偏光ビームスプリッタ２４６は、蛍光２４４のうち振動方向２４２ａに振動する直線偏光成分２４４ａを透過させ、振動方向２４２ｂに振動する直線偏光成分２４４ｂを反射する。偏光ビームスプリッタ２４６を透過した蛍光２４４の直線偏光成分２４４ａは、フォトダイオード２４８に到達する。偏光ビームスプリッタ２４６で反射した蛍光２４４の直線偏光成分２４４ｂは、フォトダイオード２５０に到達する。配向制御信号が０Ｖの場合、励起光２４０に含まれる振動方向２４２ａに振動する成分によるバインディング分子２２の励起効率は最小となるため、バインディング分子２２から発生する蛍光２４４に含まれる振動方向２４２ａに振動する成分は最小となり、フォトダイオード２４８の出力は最小となる。一方、フォトダイオード２５０の出力は最大となる。
【０１６４】
図１８Ｂは、配向制御信号が５Ｖの場合の概念図である。配向制御信号が５Ｖの場合、振動方向２２４に直線偏光した配向制御光１１７が照射される。振動方向２２４に直線偏光した配向制御光１１７により配向されたバインディング分子中の大部分の蛍光分子１４（主に配向用標識８の側面に結合している蛍光分子１４）は、遷移モーメントの方向が振動方向２４２ｂと垂直な方向となるように配向する。つまり、励起光２４０に含まれる振動方向２４２ｂに振動する成分によるバインディング分子２２の励起効率は最小となる。一方、励起光２４０に含まれる振動方向２４２ａに振動する成分によるバインディング分子２２の励起効率は最大となる。
【０１６５】
図１９は、縦軸がそれぞれ配向制御信号の電圧、フォトダイオード２４８の出力、フォトダイオード２５０の出力および正規化したフォトダイオードの出力を表し、横軸が時間ｔを表したグラフである。なお、ここでは説明を容易にするため、フォトダイオード出力については、グラフを模式的に示してある。
【０１６６】
図１９においては、実施の形態１と同様に測定前の配向制御信号は０Ｖとなっている。測定前においては、振動方向２２２に直線偏光した配向制御光１１７を試薬カップ内の溶液中に照射して、フリー分子およびバインディング分子を同一方向に配向させておく。測定の開始に伴い、配向制御光１１７は振動方向２２２に直線偏光した状態から振動方向２２４に直線偏光した状態に切り替わる。
【０１６７】
偏光ビームスプリッタ２４６を透過した蛍光２４４の直線偏光成分２４４ａに着目する。この場合、励起光２４０の一方の成分の振動方向２４２ａと蛍光分子１４の遷移モーメントの方向との関係は実施の形態１の場合の関係と同様になる。そして、フォトダイオード２４８の出力の時間変化は、実施の形態１において説明した図１１に示したグラフと同様のグラフとなる。つまり、時刻Ｔ３１における配向制御光１１７の振動方向の切り替えに伴ってまずフリー分子の配向方向が切り替わり始め、フォトダイオード２４８の出力が当初の値ｉｚ３から増加する。フリー分子の配向が完了することによりフォトダイオード２４８の出力は、時刻Ｔ３２において値ｉｆ３となった後しばらく一定値となる。その後、バインディング分子の配向方向が切り替わり始めることに伴って時刻Ｔ３３でフォトダイオード２４８の出力は再び増加する。そして、全てのバインディング分子の配向が完了した時刻Ｔ３４において、フォトダイオード２４８の出力は値ｉｔ３で最大値となる。配向制御信号は５Ｖの出力がＴ秒間続いた後０Ｖとなる。配向制御信号が５Ｖから０Ｖに切り替わると、フォトダイオード２４８の出力は、しばらくｉｔ３の値であるが、その後ｉｚ３の値まで減少する。
【０１６８】
偏光ビームスプリッタ２４６で反射した蛍光２４４の直線偏光成分２４４ｂに着目する。この場合、励起光２４０の他方の成分の振動方向２４２ｂと蛍光分子１４の遷移モーメントの方向とが時刻Ｔ３１までは互いに平行であるため、励起光２４０の当該他方の成分による蛍光分子１４の励起効率は時刻Ｔ３１までは最大の状態である。すなわち、蛍光２４４の直線偏光成分２４４ｂの量が時刻Ｔ３１までは最大であるため、偏光ビームスプリッタ２４６で反射する蛍光２４４の直線偏光成分２４４ｂを受光するフォトダイオード２５０の出力も時刻Ｔ３１までは最大となる。時刻Ｔ３１における配向制御光１１７の振動方向の切り替えに伴ってまずフリー分子の配向方向が切り替わり始め、フォトダイオード２５０の出力が当初の値ｉｔ４から減少する。フリー分子の配向が完了することによりフォトダイオード２５０の出力は、時刻Ｔ３２において値ｉｆ４となった後しばらく一定値となる。その後、バインディング分子の配向方向が切り替わり始めることに伴って時刻Ｔ３３でフォトダイオード２５０の出力は再び減少する。そして、全てのバインディング分子の配向が完了した時刻Ｔ３４において、フォトダイオード２５０の出力は値ｉｚ４で最小値となる。配向制御信号は５Ｖの出力がＴ秒間続いた後０Ｖとなる。配向制御信号が５Ｖから０Ｖに切り替わると、フォトダイオード２５０の出力は、しばらくｉｚ４の値であるが、その後ｉｔ４の値まで増加する。これは、励起光２４０の当該他方の成分の振動方向２４２ｂと蛍光分子１４の遷移モーメントの方向とが互いに平行となる状態に戻るためである。
【０１６９】
そして、実施形態１と同様にＣＰＵは、フォトダイオード２４８の出力をＰｐ、フォトダイオード２５０の出力をＰｖとして、これらを次式（３）に従って正規化する。
Ｋ＝（Ｐｐ−Ｐｖ）／（Ｐｐ＋Ｐｖ）・・・（３）
【０１７０】
このように、２つのフォトダイオードの出力を正規化することで、フリー分子およびバインディング分子の濃度ばらつきや、光学系の励起パワー変動などの影響を低減させることができる。
【０１７１】
そして、正規化したフォトダイオード出力のグラフからバインディング分子の濃度を算出する。具体的には、測定値Ｓ３を次式（４）によって求める。
Ｓ３＝（ｉｔ５−ｉｆ５）／（ｉｔ５−ｉｚ５）・・・（４）
【０１７２】
ここで求めた測定値Ｓ３から、実施の形態１と同様に検量線関数を用いて診断値Ｃ３（検出対象物質の濃度）を求めることができる。
【０１７３】
また、本発明に係る各実施の形態のように、一方向に直線偏光した配向制御光の振動方向を制御することにより蛍光分子の遷移モーメントの方向を制御する場合において、進行方向に垂直な平面での配向制御光の断面形状はどのようなものであっても良い。例えば、図２０Ａに示すように、偏光軸３５２を有する直線偏光した配向制御光３５０が照射される場合を考える。この場合、配向制御光３５０は、進行方向に垂直な方向の断面形状が略長方形である。このとき、配向制御光３５０の中心に位置するバインディング分子３５４と配向制御光３５０の周縁部に位置するバインディング分子３５６の挙動を考える。
【０１７４】
図２０Ｂに示すように、配向制御光３５０を回転させると偏光軸３５２も回転し、回転軸（偏光軸３５２の回転中心）上に位置するバインディング分子３５４は、偏光軸３５２の回転にすぐに追従して回転する。一方、配向制御光３５０の周縁部に位置するバインディング分子３５６は、偏光軸３５２の回転にすぐには追従できず、偏光軸３５２から離れることになる。その後しばらくすると、バインディング分子３５６も、配向制御光３５０に引き込まれ、偏光軸３５２の回転に追従して回転を開始する。そして、図２０Ｃのように、配向制御光３５０の偏光軸３５２を図２０Ａの場合における偏光軸３５２に対して９０度回転させた場合、偏光軸３５２の回転の終了と同時にバインディング分子３５４の配向は完了し、一方、バインディング分子３５６が偏光軸３５２の回転にすぐには追従できないため、バインディング分子３５６の配向はバインディング分子３５４の配向の完了後しばらくしてから完了する。つまり、回転軸上に位置するバインディング分子３５４の動きは、配向制御光３５０の偏光軸３５２の回転に同期して自転する挙動となるが、配向制御光３５０の周縁部に位置するバインディング分子３５６の動きは、配向制御光３５０の偏光軸３５２の回転に同期せずかつ回転軸を中心として公転するような動きとなる。
【０１７５】
このように、配向制御光３５０の偏光軸３５２の回転に追従できないバインディング分子が存在すると測定に影響を与えることがある。そこで、このような影響を低減するため、配向制御光を所定の方向から同時に多点に入射させることが好ましい。例えば図２１（試薬カップ１０８の上面図）に示すように、３６０ａ〜３６０ｉの９点にそれぞれ対応した９本の配向制御光を試薬カップ１０８入射させるような態様でも良い。このようにすると、配向制御光の偏光軸の中心に位置するバインディング分子の数が増えるため、測定への影響を低減することができる。なお、ここでは９点に配向制御光を入射させる例を示したが、配向制御光を入射させる点は９点に限られず、９点より多くても少なくても良い。配向制御光を絞るほど、多くの点に入射させることが望ましい。これにより、複数箇所で配向制御光の回転に同期してバインディング分子を回転させることができる。その結果、突発的な蛍光強度の変動を低下させることができ、相対的な散らばりを表す指標である変動係数（Ｃｏｅｆｆｉｃｉｅｎｔ ｏｆ Ｖａｒｉａｔｉｏｎ）を改善することができる。
【０１７６】
このように、配向制御光を所定の方向から同時に多点に入射させるための配向制御用光源部４０２の構造について図２２に示す。配向制御用光源部４０２は、３×３の２次元レーザーアレイである。配向制御用光源部４０２は、発光点４０４ａ〜４０４ｉの９点が発光する。発光点の大きさは縦が１μｍで横が１００μｍである。発光点の間の距離は約１００μｍである。
【０１７７】
図２２に示される配向制御用光源部４０２を用いた光学系の一例を図２３に示す。なお図２３では、配向制御光および励起光の光学系以外の構成要素は省略して描いてある。
【０１７８】
配向制御用光源部４０２から出力された直線偏光した配向制御光４２２は、コリメータレンズ４０６を通って焦点において平行光線となる。コリメータレンズ４０６を通った配向制御光４２２は、ビームエキスパンダ４０８およびビームエキスパンダ４１０を通ってλ／２波長板４１２に入射する。ビームエキスパンダ４０８およびビームエキスパンダ４１０を通った配向制御光４２２は、特定の倍率の平行光束に広げられる。λ／２波長板４１２は回転ステージ上にあり、回転可能となっている。これにより配向制御光４２２の振動方向を回転することができる。λ／２波長板４１２を透過した配向制御光４２２は、ダイクロイックミラー４１８で反射してレンズ４２０により集光されて試薬カップ１０８の底面から上方に向かって入射する。
【０１７９】
光源部４１４から出力された励起光４２４は、レンズ４２６を通ってダイクロイックミラー４１６により反射される。ダイクロイックミラー４１６により反射された励起光４２４は、ダイクロイックミラー４１８を透過してレンズ４２０により集光されて試薬カップ１０８の底面から上方に向かって入射する。
【０１８０】
図２３に示される光学系において、コリメータレンズ４０６の焦点距離を３．１ｍｍ、レンズ４２０の焦点距離を４ｍｍとすると、倍率は１．２９倍となる。そのため、試薬カップ１０８の底面において、配向制御光４２２の大きさは約１．３μｍ×１３０μｍとなり、ピッチは約１２９μｍとなる。
【０１８１】
また、配向制御光を所定の方向から同時に多点に入射させるための別の光学系の例について図２４を用いて説明する。なお図２４においても、配向制御光および励起光の光学系以外は省略して描いてある。また、図２３と同一の構成要素には同一の符号を付し、その説明を省略する。
【０１８２】
図２４に示される光学系において、配向制御用光源部１１６は実施の形態１と同様のものである。配向制御光４３２は、コリメータレンズ４０６、ビームエキスパンダ４０８およびビームエキスパンダ４１０を通り、マイクロレンズアレイ４２８へ入射する。マイクロレンズアレイ４２８は、図２５に示されるように、複数のマイクロレンズ４２８ａを格子状に並べたものである。マイクロレンズアレイ４２８を通った配向制御光４３２は、複数の光源から照射された光のように、異なる位置で焦点を結ぶ複数の光束となる。配向制御光４３２は、ピンホールアレイ４３０によって絞られ、ダイクロイックミラー４１８で反射し、レンズ４２０を通って試薬カップ１０８の底面から上方に向かって入射する。このようにマイクロレンズアレイを用いても、配向制御光を所定の方向から同時に多点に入射させることができる。
【０１８３】
また、λ／２波長板４１２を用いて振動方向を変更する例を示したが、電気信号で制御可能な液晶位相変調デバイスを用いて振動方向を変更してもよい。
【０１８４】
また、上記各実施の形態では試薬カップを円柱状の形状としたが、試薬カップは必ずしも円柱状の形状とする必要は無い。例えば、図２６に示されるように、四角柱状の形状を有し、内部に四角柱状の溶液保持部を有する試薬カップ４３２を用いても良い。このような四角柱状の溶液保持部を有する試薬カップ４３２は、特に、配向制御光の進行方向に働く配向制御光による圧力を利用してフリー分子およびバインディング分子を試薬カップ４３２の内部側壁面に押しつける場合に適している。これは、フリー分子およびバインディング分子の質量が軽い場合に起こる現象であり、配向制御光による圧力を受けてフリー分子およびバインディング分子が溶液中を移動することが原因である。この場合、溶液保持部が四角柱であると、フリー分子およびバインディング分子は溶液と試薬カップ４３２との界面に押しつけられながら配向する。当該界面が平面でありかつ配向制御光による圧力が当該界面に垂直な方向に作用する場合には、フリー分子およびバインディング分子は当該界面に平行な方向に移動して配向制御光の照射範囲の外に出ることがない。
【０１８５】
また、フリー分子およびバインディング分子を試薬カップ４３２の内部側壁面に押しつける場合には、配向制御光の焦点の位置を工夫することによりこれらの分子をより容易に配向させることができる。図２７は、集光された配向制御光の焦点と試薬カップとの位置関係の一例を示す図である。配向制御光４３４は、レンズ４３６に入射し、血漿１６と試薬カップの側壁部４３２ｂとの界面（側壁部４３２ｂの内部側壁面）において焦点４３４ａを結ぶ。配向制御光４３４の焦点４３４ａの位置では、配向制御光４３４の強度が最も強いため、より強い圧力でフリー分子およびバインディング分子を押しつけることができる。従って、図２７のように配向制御光４３４を入射させると、焦点４３４ａの位置においてフリー分子およびバインディング分子を側壁部４３２ｂの内部側壁面に押しつけつつ、より効率的にフリー分子およびバインディング分子を配向させることができる。この場合においても、直線偏光した配向制御光４３４の振動方向を回転させることで、フリー分子およびバインディング分子の配向方向を焦点４３４ａの位置において変化させることができる。
【０１８６】
なお、溶液保持部は必ずしも四角柱状の形状を有している必要はなく、少なくとも一面に平面を有していれば良い。溶液を通ってその平面において焦点を結ぶように配向制御光を照射すれば、フリー分子およびバインディング分子は、当該平面に平行な方向に移動して配向制御光の照射範囲の外に出ることがなく平面に押しつけられながら配向する。
【０１８７】
また、本発明に係る各実施の形態では、直線偏光した配向制御光の振動方向を制御してフリー分子およびバインディング分子の配向状態を制御することにより、これらの分子に付随する蛍光分子の遷移モーメントの方向を制御する場合について説明したが、蛍光分子の遷移モーメントの方向を制御する方法はこれに限られない。例えば、光を照射された分子の配向状態が光の照射方向に応じて変化することを利用して、配向制御光の試薬カップに対する照射方向を切り替えることにより蛍光分子の遷移モーメントの方向を制御する方法を用いることもできる。このような場合、配向制御光は偏光していなくてもよい。
【０１８８】
配向制御光１１７の試薬カップ１０８に対する照射方向を切り替えることにより蛍光分子の遷移モーメントの方向を制御する方法について、図２８を用いてより詳細に説明する。図２８は、配向制御用光源部１１６から照射される配向制御光１１７の試薬カップ１０８に対する照射方向を切り替えるための光学系を試薬カップ１０８の上面側（カップ口側）から見た模式図である。配向制御用光源部１１６から照射された配向制御光１１７は、ＡＯＤ（Ａｃｏｕｓｔｏ Ｏｐｔｉｃ Ｄｅｆｌｅｃｔｏｒ）１２１を通って試薬カップ１０８へ照射される。配向制御光１１７は、試薬カップ１０８の溶液全体を照らす程度の幅を持っている。ＡＯＤ１２１は、配向制御用光源部１１６から照射された配向制御光１１７の照射方向を２方向に切り替える。具体的には、ＡＯＤ１２１は、ＦＧ１２２から５Ｖの配向制御信号が入力された場合には、配向制御光１１７を配向制御光１３４の方向へ進ませ、ＦＧ１２２から０Ｖの配向制御信号が入力された場合には、配向制御光１１７を配向制御光１３６の方向へ進ませる。配向制御光１３４は、試薬カップ１０８の側面に入射する。配向制御光１３６は、ダイクロイックミラー１３８によって反射され、配向制御光１３４の進行方向と垂直な方向に進んで試薬カップ１０８の側面に入射する。上面から見た試薬カップ１０８を時計の文字盤に例えると、配向制御光１３４は９時の位置から入射して３時の方向へ進行し、配向制御光１３６は６時の位置から入射して１２時の方向へ進行する。すなわち、配向制御光１３４の進行方向と配向制御光１３６の進行方向とは互いに直交する。ダイクロイックミラー１３８は、配向制御光１１７に用いた波長の光のみを反射し、その他の波長の光を透過する。励起光源部１１８から照射された励起光１１９は、ダイクロイックミラー１３８を透過し、ダイクロイックミラー１３８で反射した配向制御光１３６と同じ方向に進行して試薬カップ１０８の側面へ入射する。
【０１８９】
このような構成により、生体分子検出装置１００は、ＦＧ１２２からの配向制御信号の入力によりＡＯＤ１２１を制御することで、配向制御光１１７が試薬カップ１０８へ照射される方向を、角度が９０度異なる２つの方向に切り替えることができる。ＡＯＤ１２１と試薬カップ１０８との間には遮光板１４０があり、配向制御光１３４および配向制御光１３６が示す方向以外に進行する配向制御光は、試薬カップ１０８へ照射されないように構成されている。また、配向制御光１１７は、配向制御光１３４および配向制御光１３６のいずれの方向に進行した場合においても、円柱状の試薬カップ１０８の側面から入射する。試薬カップ１０８は円柱状であるため、配向制御光の進行方向が切り替わっても、試薬カップ１０８の配向制御光が入射する側面の形状は同じである。
【０１９０】
また、配向制御光を照射する方向を切り替えることにより蛍光分子の遷移モーメントの方向を制御する光学系においては、配向制御光のビーム径を細長く絞った場合に配向制御光で照射できる範囲が減少してしまうことを回避する観点から、配向制御光をある方向から同時に多点に照射して照射範囲をより広くするために、光学系を複数段用意しても良い。複数段の光学系は、少なくとも試薬カップに配向制御光が入射する前の段階で光路が複数存在していればよい。例えば、光源も含めた同様の光学系を３段重ねれば、３つの配向制御用光源部からそれぞれ配向制御光が照射され、試薬カップへある方向から３点に配向制御光を照射することができる。また例えば、光源が１つであっても２次元レーザーアレイやマイクロレンズアレイ等を用いて配向制御光を分岐すれば、分岐した分だけの複数の点で配向制御光を照射することができる。このような場合、配向制御光を同時に多点に照射することができ、複数の箇所で蛍光分子の遷移モーメントを回転させることができる。
【産業上の利用可能性】
【０１９１】
本発明に係る生体分子検出装置および生体分子検出方法は、例えば、検出対象物質と、その検出対象物質に特異的に結合する物質との相互作用を利用して、検出対象物質の検出又は定量を行う装置に利用することができる。
【符号の説明】
【０１９２】
１２ 抗体
１４ 蛍光分子
１６ 血漿
１８ 抗原
１００、２００ 生体分子検出装置
１１６ 配向制御用光源部
１１７ 配向制御光
１１８ 励起光源部
１１９ 励起光
１２０ 偏光方向制御部
１２３ 蛍光
１２４、２０２ 受光部
１４４、２１２、２１４ フィルタ
１４６ 偏光子
１５０ フォトダイオード
２１０ フィルタ切替部
【特許請求の範囲】
【請求項１】
溶液中に存在する蛍光分子を励起するための、特定方向に直線偏光成分を有する励起光を照射するステップと、
検出対象物質に特異的に結合する物質と配向用標識と該配向用標識の周囲に結合した複数の前記蛍光分子とを有する第１の複合体から発生する第１の蛍光を検出するステップと、
前記第１の複合体と前記検出対象物質とが結合した第２の複合体から発生する第２の蛍光を検出するステップと、
前記第１の複合体および前記第２の複合体を少なくとも２つの方向に切り換えて配向させるステップと、
検出された前記第１の蛍光および前記第２の蛍光に基づいて前記検出対象物質の検出または定量を行うステップとを備えたことを特徴とする生体分子検出方法。
【請求項２】
請求項１記載の生体分子検出方法で使用される生体分子検出装置であって、
特定方向に直線偏光成分を有し前記蛍光分子を励起する励起光を照射する光源と、
前記蛍光分子から発せられた蛍光を検出する受光部と、
前記溶液中で前記第１の複合体および前記第２の複合体を少なくとも２つの方向に切り換えて配向させる配向制御手段と、
前記第１の複合体および前記第２の複合体の配向方向の切り替えに伴って前記蛍光分子から発生する蛍光の強度の時間変化から、前記第２の蛍光の強度を算出して前記検出対象物質の検出または定量を行う演算部とを備えたことを特徴とする生体分子検出装置。
【請求項３】
前記配向制御手段は、前記配向用標識の長手方向が前記特定方向と平行となる第１の方向、および、前記配向用標識の長手方向が前記特定方向と垂直となる第２の方向に、前記第１の複合体および前記第２の複合体を切り換えて配向させるものであることを特徴とする請求項２に記載の生体分子検出装置。
【請求項４】
前記配向制御手段は、前記第１の複合体および前記第２の複合体を所定の時間間隔で複数回切り替えて配向させるものであり、
前記演算部は、前記第１の複合体および前記第２の複合体が複数回切り替えて配向したことによって得られた複数の前記第２の蛍光の強度の加算平均を行い、加算平均により得られた蛍光の強度に基づいて前記検出対象物質の検出または定量を行うものであることを特徴とする請求項２または３に記載の生体分子検出装置。
【請求項５】
前記所定の時間間隔は、前記検出対象物質、該検出対象物質と特異的に結合する物質、前記配向用標識および蛍光分子の質量または体積と、前記配向制御手段による配向制御の強度とに基づいて決定されることを特徴とする請求項４に記載の生体分子検出装置。
【請求項６】
前記配向制御手段は、直線偏光した光を照射する配向制御光源を備え、該配向制御光源から前記溶液に対して前記直線偏光した光を照射することにより、前記第１の複合体および前記第２の複合体を配向させるものであることを特徴とする請求項２乃至５のいずれか１項に記載の生体分子検出装置。
【請求項７】
前記配向制御手段は、前記直線偏光した光の振動方向を切り替える波長板を有し、該波長板を用いて前記直線偏光した光の振動方向を切り替えることにより、前記第１の複合体および前記第２の複合体を切り換えて配向させるものであることを特徴とする請求項６に記載の生体分子検出装置。
【請求項８】
前記配向制御光源は、前記溶液に対し前記直線偏光した光を複数の位置から照射するものであることを特徴とする請求項６または７に記載の生体分子検出装置。
【請求項９】
前記溶液は、少なくとも一部に平面を有する溶液保持部に保持されたものであることを特徴とする請求項６乃至８のいずれか１項に記載の生体分子検出装置。
【請求項１０】
前記配向制御光源は、前記溶液を通って前記溶液保持部の平面から出射する方向に、前記直線偏光した光を照射し、かつ、前記溶液と前記平面との界面において、前記直線偏光した光に焦点を結ばせるものであることを特徴とする請求項９に記載の生体分子検出装置。
【請求項１１】
前記演算部は、前記第１の複合体および前記第２の複合体が一方の配向方向から他方の配向方向に切り替わる間における、前記第１の複合体から発生する蛍光の強度の時間変化と、前記第２の複合体から発生する蛍光の強度の時間変化とに差があることを利用して、前記第２の蛍光の強度を算出するものであることを特徴とする請求項２乃至１０のいずれか１項に記載の生体分子検出装置。
【請求項１２】
前記受光部は、光を分光する分光手段を備えることを特徴とする請求項２乃至１１のいずれか１項に記載の生体分子検出装置。
【請求項１３】
前記分光手段は、特性の異なる複数のフィルタであり、
前記受光部は、前記蛍光分子から発生する蛍光の波長に応じて前記複数のフィルタを切り替えるものであることを特徴とする請求項１２に記載の生体分子検出装置。
【請求項１】
溶液中に存在する蛍光分子を励起するための、特定方向に直線偏光成分を有する励起光を照射するステップと、
検出対象物質に特異的に結合する物質と配向用標識と該配向用標識の周囲に結合した複数の前記蛍光分子とを有する第１の複合体から発生する第１の蛍光を検出するステップと、
前記第１の複合体と前記検出対象物質とが結合した第２の複合体から発生する第２の蛍光を検出するステップと、
前記第１の複合体および前記第２の複合体を少なくとも２つの方向に切り換えて配向させるステップと、
検出された前記第１の蛍光および前記第２の蛍光に基づいて前記検出対象物質の検出または定量を行うステップとを備えたことを特徴とする生体分子検出方法。
【請求項２】
請求項１記載の生体分子検出方法で使用される生体分子検出装置であって、
特定方向に直線偏光成分を有し前記蛍光分子を励起する励起光を照射する光源と、
前記蛍光分子から発せられた蛍光を検出する受光部と、
前記溶液中で前記第１の複合体および前記第２の複合体を少なくとも２つの方向に切り換えて配向させる配向制御手段と、
前記第１の複合体および前記第２の複合体の配向方向の切り替えに伴って前記蛍光分子から発生する蛍光の強度の時間変化から、前記第２の蛍光の強度を算出して前記検出対象物質の検出または定量を行う演算部とを備えたことを特徴とする生体分子検出装置。
【請求項３】
前記配向制御手段は、前記配向用標識の長手方向が前記特定方向と平行となる第１の方向、および、前記配向用標識の長手方向が前記特定方向と垂直となる第２の方向に、前記第１の複合体および前記第２の複合体を切り換えて配向させるものであることを特徴とする請求項２に記載の生体分子検出装置。
【請求項４】
前記配向制御手段は、前記第１の複合体および前記第２の複合体を所定の時間間隔で複数回切り替えて配向させるものであり、
前記演算部は、前記第１の複合体および前記第２の複合体が複数回切り替えて配向したことによって得られた複数の前記第２の蛍光の強度の加算平均を行い、加算平均により得られた蛍光の強度に基づいて前記検出対象物質の検出または定量を行うものであることを特徴とする請求項２または３に記載の生体分子検出装置。
【請求項５】
前記所定の時間間隔は、前記検出対象物質、該検出対象物質と特異的に結合する物質、前記配向用標識および蛍光分子の質量または体積と、前記配向制御手段による配向制御の強度とに基づいて決定されることを特徴とする請求項４に記載の生体分子検出装置。
【請求項６】
前記配向制御手段は、直線偏光した光を照射する配向制御光源を備え、該配向制御光源から前記溶液に対して前記直線偏光した光を照射することにより、前記第１の複合体および前記第２の複合体を配向させるものであることを特徴とする請求項２乃至５のいずれか１項に記載の生体分子検出装置。
【請求項７】
前記配向制御手段は、前記直線偏光した光の振動方向を切り替える波長板を有し、該波長板を用いて前記直線偏光した光の振動方向を切り替えることにより、前記第１の複合体および前記第２の複合体を切り換えて配向させるものであることを特徴とする請求項６に記載の生体分子検出装置。
【請求項８】
前記配向制御光源は、前記溶液に対し前記直線偏光した光を複数の位置から照射するものであることを特徴とする請求項６または７に記載の生体分子検出装置。
【請求項９】
前記溶液は、少なくとも一部に平面を有する溶液保持部に保持されたものであることを特徴とする請求項６乃至８のいずれか１項に記載の生体分子検出装置。
【請求項１０】
前記配向制御光源は、前記溶液を通って前記溶液保持部の平面から出射する方向に、前記直線偏光した光を照射し、かつ、前記溶液と前記平面との界面において、前記直線偏光した光に焦点を結ばせるものであることを特徴とする請求項９に記載の生体分子検出装置。
【請求項１１】
前記演算部は、前記第１の複合体および前記第２の複合体が一方の配向方向から他方の配向方向に切り替わる間における、前記第１の複合体から発生する蛍光の強度の時間変化と、前記第２の複合体から発生する蛍光の強度の時間変化とに差があることを利用して、前記第２の蛍光の強度を算出するものであることを特徴とする請求項２乃至１０のいずれか１項に記載の生体分子検出装置。
【請求項１２】
前記受光部は、光を分光する分光手段を備えることを特徴とする請求項２乃至１１のいずれか１項に記載の生体分子検出装置。
【請求項１３】
前記分光手段は、特性の異なる複数のフィルタであり、
前記受光部は、前記蛍光分子から発生する蛍光の波長に応じて前記複数のフィルタを切り替えるものであることを特徴とする請求項１２に記載の生体分子検出装置。
【図１Ａ】
【図１Ｂ】
【図２Ａ】
【図２Ｂ】
【図３Ａ】
【図３Ｂ】
【図４Ａ】
【図４Ｂ】
【図５Ａ】
【図５Ｂ】
【図６】
【図７Ａ】
【図７Ｂ】
【図７Ｃ】
【図８Ａ】
【図８Ｂ】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３Ａ】
【図１３Ｂ】
【図１４】
【図１５】
【図１６Ａ】
【図１６Ｂ】
【図１７Ａ】
【図１７Ｂ】
【図１８Ａ】
【図１８Ｂ】
【図１９】
【図２０Ａ】
【図２０Ｂ】
【図２０Ｃ】
【図２１】
【図２２】
【図２３】
【図２４】
【図２５】
【図２６】
【図２７】
【図２８】
【図１Ｂ】
【図２Ａ】
【図２Ｂ】
【図３Ａ】
【図３Ｂ】
【図４Ａ】
【図４Ｂ】
【図５Ａ】
【図５Ｂ】
【図６】
【図７Ａ】
【図７Ｂ】
【図７Ｃ】
【図８Ａ】
【図８Ｂ】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３Ａ】
【図１３Ｂ】
【図１４】
【図１５】
【図１６Ａ】
【図１６Ｂ】
【図１７Ａ】
【図１７Ｂ】
【図１８Ａ】
【図１８Ｂ】
【図１９】
【図２０Ａ】
【図２０Ｂ】
【図２０Ｃ】
【図２１】
【図２２】
【図２３】
【図２４】
【図２５】
【図２６】
【図２７】
【図２８】
【公開番号】特開２０１２−９３３３６（Ｐ２０１２−９３３３６Ａ）
【公開日】平成２４年５月１７日（２０１２．５．１７）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１１−１１５４７４（Ｐ２０１１−１１５４７４）
【出願日】平成２３年５月２４日（２０１１．５．２４）
【出願人】（３０６０３７３１１）富士フイルム株式会社 (25,513)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２４年５月１７日（２０１２．５．１７）
【国際特許分類】
【出願日】平成２３年５月２４日（２０１１．５．２４）
【出願人】（３０６０３７３１１）富士フイルム株式会社 (25,513)
【Ｆターム（参考）】
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