生体試料解析方法
【課題】厚みのある生きた組織のような生体試料を、当該生体試料にダメージを与えずに鮮明に捉えることができ、その結果、生体試料を正確且つ詳細に解析することができる生体試料解析方法を提供することを課題とする。
【解決手段】本発明の生体試料解析方法は、ＣＣＤカメラで、生物発光タンパク質を有する微生物を含む生体試料の発光画像ならびに明視野画像および／または蛍光画像を繰り返し撮像し、パーソナルコンピュータで、ＣＣＤカメラで撮像した各発光画像と各明視野画像および／または各蛍光画像とを重ね合わせた複数の重ね合わせ画像に基づいて生体試料内の微生物の生態の変化を解析する。
【解決手段】本発明の生体試料解析方法は、ＣＣＤカメラで、生物発光タンパク質を有する微生物を含む生体試料の発光画像ならびに明視野画像および／または蛍光画像を繰り返し撮像し、パーソナルコンピュータで、ＣＣＤカメラで撮像した各発光画像と各明視野画像および／または各蛍光画像とを重ね合わせた複数の重ね合わせ画像に基づいて生体試料内の微生物の生態の変化を解析する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、細胞、組織、個体などの生体試料を解析する生体試料解析方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
特許文献１には、微生物の検出方法などが開示されている。具体的には、試料に存在する目的微生物を特異的に捕捉する物質を結合した基板材を用いて当該目的微生物を捕捉し、当該基板材上に捕捉された目的微生物を光学的に検出する装置および方法が開示されている。
【０００３】
非特許文献１には、微生物を蛍光標識して組織内の感染の様子を観察する方法、および電子顕微鏡を用いて微生物の感染を観察する方法が開示されている。
【０００４】
【特許文献１】特開２００５−１７２６８０号公報
【非特許文献１】Ｆｅｎｇｗｕ Ｌｉ ｅｔ ａｌ．，「Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ Ｏｏｋｉｎａｔｅ−ｓｅｃｒｅｔｅｄ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ Ｓｅｃｒｅｔｅｄ ｔｈｒｏｕｇｈ ａ Ｃｏｍｍｏｎ Ｍｉｃｒｏｎｅｍａｌ Ｐａｔｈｗａｙ Ａｒｅ Ｔａｒｇｅｔｓ ｏｆ Ｂｌｏｃｋｉｎｇ Ｍａｌａｒｉａ Ｔｒａｎｓｍｉｓｓｉｏｎ」，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，Ｖｏｌ．２７９，Ｎｏ．２５，Ｊｕｎ １８，ｐｐ．２６６３５−２６６４４，２００４
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
しかしながら、特許文献１によれば、血液や糞便、食品などの非組織を対象とし、これらから特定の微生物を捕捉するので、組織内の微生物を、当該組織から取り出すことなく当該組織内に存在させた状態で検出することができないという問題点があった。
【０００６】
また、非特許文献１によれば、蛍光を用いるが故に、自家蛍光に因るバックグラウンドが高く、ノイズも大きいので、組織内の微生物を鮮明に捉えることができないという問題点があった。また、非特許文献１によれば、蛍光を用いるが故に、厚みのある組織に対してはレーザーの透過性が低いので、厚みのある組織内の微生物を鮮明に捉えることができないという問題点があった。また、非特許文献１によれば、蛍光を用いるので、レーザー照射に因る組織へのダメージを避けることができないという問題点があった。また、非特許文献１によれば、電子顕微鏡を用いるので、装置や設備が大掛かりになるうえ、組織を生きた状態で観察することができないという問題点があった。
【０００７】
本発明は、上記問題点に鑑みてなされたものであって、厚みのある生きた組織のような生体試料を、当該生体試料にダメージを与えずに鮮明に捉えることができ、その結果、生体試料を正確且つ詳細に解析することができる生体試料解析方法を提供することを目的とする。
また、本発明は、簡易な装置構成で生体試料を解析することができる生体試料解析方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
上述した課題を解決し、目的を達成するために、本発明にかかる請求項１に記載の生体試料解析方法は、少なくとも１つが宿主であり、少なくとも１つが微生物である複数の生体試料のうち少なくとも１つから発せられた微弱光を選択的に検出することで、少なくとも１つの前記生体試料の発光画像を撮像する撮像工程と、前記撮像工程で撮像した前記発光画像に基づいて前記生体試料を解析する解析工程とを含むことを特徴とする。
【０００９】
また、本発明にかかる請求項２に記載の生体試料解析方法は、請求項１に記載の生体試料解析方法において、前記撮像工程では、前記発光画像を繰り返し撮像し、前記解析工程では、複数の前記発光画像に基づいて前記生体試料の変化を解析することを特徴とする。
【００１０】
また、本発明にかかる請求項３に記載の生体試料解析方法は、請求項１に記載の生体試料解析方法において、前記撮像工程では、前記発光画像の他に、前記生体試料の明視野画像および／または前記生体試料の蛍光画像をさらに撮像し、前記解析工程では、前記撮像工程で撮像した前記発光画像と前記明視野画像および／または前記蛍光画像とを重ね合わせた画像である重ね合わせ画像に基づいて前記生体試料を解析することを特徴とする。
【００１１】
また、本発明にかかる請求項４に記載の生体試料解析方法は、請求項３に記載の生体試料解析方法において、前記撮像工程では、前記発光画像ならびに前記明視野画像および／または前記蛍光画像を繰り返し撮像し、前記解析工程では、複数の前記重ね合わせ画像に基づいて前記生体試料の変化を解析することを特徴とする。
【００１２】
また、本発明にかかる請求項５に記載の生体試料解析方法は、請求項１から４のいずれか１つに記載の生体試料解析方法において、前記撮像工程では、冷却電荷結合光検出素子で、少なくとも前記発光画像を撮像することを特徴とする。
【００１３】
また、本発明にかかる請求項６に記載の生体試料解析方法は、請求項１から５のいずれか１つに記載の生体試料解析方法において、前記撮像工程では、開口数（ＮＡ）および投影倍率（β）で表される（ＮＡ÷β）2の値が０．０１以上である対物レンズを用いて、少なくとも前記発光画像を撮像することを特徴とする。
【００１４】
また、本発明にかかる請求項７に記載の生体試料解析方法は、請求項６に記載の生体試料解析方法において、前記対物レンズの前記（ＮＡ÷β）2の前記値が０．０３９以上であることを特徴とする。
【００１５】
また、本発明にかかる請求項８に記載の生体試料解析方法は、請求項７に記載の生体試料解析方法において、前記対物レンズの前記（ＮＡ÷β）2の前記値が０．０７１以上であることを特徴とする。
【００１６】
また、本発明にかかる請求項９に記載の生体試料解析方法は、請求項１から８のいずれか１つに記載の生体試料解析方法において、前記宿主は、細胞、組織、個体のいずれか１つであることを特徴とする。
【００１７】
また、本発明にかかる請求項１０に記載の生体試料解析方法は、請求項１から９のいずれか１つに記載の生体試料解析方法において、前記微生物は、生物発光タンパク質を有するものであることを特徴とする。
【発明の効果】
【００１８】
本発明では、少なくとも１つが宿主であり、少なくとも１つが（他方が）微生物である複数の生体試料のうち少なくとも１つから発せられた微弱光を選択的に検出することで、少なくとも１つの生体試料の発光画像を撮像し、撮像した発光画像に基づいて生体試料を解析するので、生体試料にダメージを与えずに鮮明に捉えることができ、その結果、生体試料を正確且つ詳細に解析することができるという効果を奏する。また、本発明では、簡易な装置構成で生体試料を解析することができるという効果を奏する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１９】
以下に、本発明にかかる生体試料解析方法の実施の形態を図面に基づいて詳細に説明する。なお、この実施の形態によりこの発明が限定されるものではない。
【００２０】
まず、本発明では、生体試料として、少なくとも１種類の宿主と少なくとも１種類の微生物を対象とする。本発明では、撮像する対象は、少なくとも２種類の異なる生体試料のうち、少なくとも１種類のものであればよい。例えば、動物または植物組織とそれに感染する１種類以上の微生物の組み合わせなどが挙げられる。これらの対象を用いることにより、微生物が感染している様子などを検出することができる。また、動物または植物組織とそれに感染する遺伝子変異を起こした１種類以上の微生物の組み合わせなどの例が挙げられる。遺伝子変異を起こした微生物とは、ノックアウト遺伝子、キメラ遺伝子、特定タンパク質過剰発現遺伝子、ＲＮＡ干渉など、一般的に用いられる遺伝子操作により特定の遺伝子の発現量が調整された微生物のことであり、それらの微生物を用いることにより、発現が調整された遺伝子の組織および／または微生物に対する効果を検出することができる。
【００２１】
また、本発明において、微弱光とは、典型的には生物発光による遺伝学的な発現量を表すような肉眼では見えない程度の極めて微弱な光シグナルを指す。なお、本発明における微弱光としては、生物発光以外にも、当該生物発光と同等レベルに微弱な光シグナルを発する蛍光や化学発光などを含む。例えば、ＢＲＥＴ（生物発光共鳴エネルギー転移）における蛍光は、基質による生物発光の微弱エネルギーにより発するので、生物発光に含める。本発明では、少なくとも２種類の生体試料を対象とするので、少なくとも１種の生体試料が微弱光を発生していれば当該微弱光を検出して画像化すればよいが、残りの他の生体試料についても識別可能な光シグナル、つまりは微弱光を発生していれば当該微弱光も検出して画像化してもよい。
【００２２】
つぎに、本発明にかかる生体試料解析方法を実施するための装置である生体試料解析装置１００の構成について図１を参照して説明する。図１は生体試料解析装置１００の構成を示す図である。図１に示すように、生体試料解析装置１００は、試料ステージ１０２と、ヒートプレート１０４と、プレート温度コントローラー１０６と、ガス供給機構１０８と、水供給機構１１０と、対物レンズ１１２と、対物レンズヒーター１１４と、ヒーター温度コントローラー１１６と、対物レンズＺ軸駆動機構１１８と、赤外線カットフィルター１２０と、ＣＣＤカメラ１２２と、ＣＣＤカメラ冷却装置１２４と、パーソナルコンピュータ１２８と、で構成されている。試料ステージ１０２、ヒートプレート１０４、対物レンズ１１２、対物レンズヒーター１１４、対物レンズＺ軸駆動機構１１８、赤外線カットフィルター１２０、ＣＣＤカメラ１２２およびＣＣＤカメラ冷却装置１２４は、図示の如く、フタ付き遮光ボックス１３０で覆われている。フタ付き遮光ボックス１３０は例えばアルミニウムのような遮光性の部材からなり、当該部材の表面には、当該フタ付き遮光ボックスの外部の光がその内部に入り込まないように黒色の塗装処理がされている。フタ付き遮光ボックス１３０の上面には、蝶番を介して、開閉自在のフタ１３０ａが取り付けられている。実験者は、フタ１３０ａを開閉して、試料Ｓの設置や除去などを行なう。
なお、本実施の形態で必須とする構成は、これらの装置構成のうち、後述するような光学条件（具体的には開口数（ＮＡ）および投影倍率（β）で表される（ＮＡ÷β）2の値に関する条件）を満たす対物レンズ１１２と、フタ付き遮光ボックス１３０のような適宜の遮光環境と、ＣＣＤカメラ１２２とであり、簡易なものである。
【００２３】
試料ステージ１０２は試料Ｓを配置するためのものであり、その上にはヒートプレート１０４が重ねて置かれている。試料ステージ１０２はネジ操作により水平方向（ＸＹ方向）に移動することができる。ヒートプレート１０４の上には水槽Ｔが配置されている。ヒートプレート１０４は、プレート温度コントローラー１０６と接続されており、当該プレート温度コントローラーにより０．５℃間隔で微生物の生育に適した環境温度（例えば３７℃程度）の設定が行なわれている。
【００２４】
水槽Ｔの中には、試料Ｓを保持するための容器である試料容器Ｃが配置されており、さらに、試料容器Ｃ内の湿度を保つために純水Ｗが張られている。試料容器Ｃには試料Ｓが配置されている。試料容器Ｃ周囲の拡大図を図２に示す。図２は試料容器Ｃ周囲の拡大図である。試料Ｓはシャーレなどから成る試料容器Ｃに入れられ、培養液Ｃｓに浸されている。試料容器Ｃには試料容器カバーＣｖが取り付けられており、その中の試料Ｓが乾燥したり、ゴミなどが試料容器Ｃに混入したりするのを防いでいる。図１に戻り、試料容器Ｃにおいて少なくともその底面は、通常の対物レンズが対応できるよう、光学的に透明になっており、顕微鏡用カバーガラスと同じ材質でその厚さは０．１７ｍｍである。水槽Ｔに張られている純水Ｗは、水供給機構１１０を構成するノズル１１０ａを通して供給されている。水槽Ｔの上方には、ガス供給機構１０８を構成するガスボンベ１０８ａ内の混合ガス（ＣＯ2を５％、Ｏ2を９５％含有するガス）が、ガス供給機構１０８を構成するガス供給チューブ１０８ｂを通して５０ｍＬ／ｍｉｎの流速で供給される。
【００２５】
ここで、試料Ｓは、生物発光タンパク質を有する微生物を含む生体試料であり、微生物に対する宿主である。宿主には、個体、組織、細胞などが挙げられる。個体は、動物や植物などである。これにより、様々な物を対象として微生物の生態の解析を行うことができる。なお、個体は動物や植物などである。動物は、微生物が感染する可能性のある全てのものであり、例えば哺乳類や昆虫類などである。植物は、微生物が感染する可能性のある全てのものであり、例えばタバコ、トマト、ナスなどである。組織は、微生物が感染する可能性のある全てのものであり、例えば脳や腎臓、腸などである。細胞は、微生物が感染する可能性のある全てのものであり、例えばＨｅＬａ細胞、ＣＨＯ細胞などの培養細胞、初代神経細胞などの個体または組織から採取した細胞などが挙げられる。さらに、試料Ｓは外科的に摘出されたものでもよく、摘出されずに外科的に露呈された個体の一部であってもよい。また、微生物を選択的に撮像するのであれば、試料Ｓは必ずしも生きている必要は無く、微生物のみが試料Ｓ中において生きていればよい。なお、微生物を選択的に撮像する場合、微生物は、試料Ｓ中の成分または培養溶液によって適宜の培養環境に置かれているのが好ましい。
【００２６】
生物発光タンパク質には、いつくかの種類が知られている。例えば、ルシフェラーゼ系（ｌｕｃ）の生物発光タンパク質を含有する代表的な生物はホタルやコメツキムシであり、これらは緑色や黄緑色、黄色、橙色の光を放射するが、中でも橙色の光は、他の短い波長の光よりも容易に組織を貫通する波長をもつので、好適である。なお、ルシフェラーゼ酵素を発光させるには、発光基質を当該ルシフェラーゼ酵素に供給しなければならない。使用する発光基質は、生物発光タンパク質に合わせて選択する。例えば、生物発光タンパク質がホタルルシフェラーゼである場合にはルシフェリンを発光基質として選択し、生物発光タンパク質がウミシイタケルシフェラーゼである場合にはセレンテラジンを発光基質として選択する。
【００２７】
微生物は、寄生虫や原虫、細菌、真菌、ウイルスなどである。寄生虫は、組織や個体（具体的には動物）内で感染形態をとる全てのものであり、例えばアニキサス、シュードテラノーバ、旋毛虫などである。原虫は、組織や個体（具体的には動物）内で感染形態をとる全てのものであり、例えばクリプトスポリジウムやネオスポラ、マラリア、トキソプラズマ、イソスボーラ、サイクロスボーラなどである。細菌は、細胞や組織や個体（動物または植物）内で感染形態をとる全てのものであり、例えばチフス菌やサルモネラ菌、炭素菌、セレウス菌、結核菌、アグロバクテリウムなどである。真菌は、細胞や組織や個体（具体的には動物）内で感染形態をとる全てのものであり、例えばアスペルギルス属真菌やムコール・リゾプス属真菌、ペニシリウム属真菌、アクレモニウム属真菌などである。ウイルスは、細胞や組織や個体（具体的には動物）内で感染形態をとる全てのものであり、ノロウイルス、タロウイルス、インフルエンザウイルスなどである。
【００２８】
宿主と微生物との組み合わせは以上の通りである。宿主が個体または組織の場合、微生物は主に寄生虫、原虫、真菌、細菌、ウイルスが用いられる。宿主が細胞の場合、微生物は主に真菌、細菌、ウイルスが用いられる。
【００２９】
図１の説明に戻り、試料ステージ１０２の下方には、対物レンズ１１２が倒立に配置されている。対物レンズ１１２の周囲には対物レンズヒーター１１４が取り付けられており、対物レンズ１１２と対物レンズヒーター１１４とは接触している。ここで、本出願人は、対物レンズの開口数（ＮＡ）を、従来の蛍光撮像用顕微鏡などで常識的に用いられている開口数を基準にして変更することにより、生物発光のような微弱な発光成分を撮像して短い時間（例えば１分〜２０分程度）でその発光画像を得ることができることを明らかにした（ＷＯ２００６／０８８１０９参照）。具体的には、本出願人は、生物発光を容易に画像化するための対物レンズとして、開口数（ＮＡ）および投影倍率（β）で表される（ＮＡ÷β）2の値が０．０１以上であるものが好ましく、その値が０．０３９以上であるものがより好ましいことを明らかにした（ＷＯ２００６／０８８１０９参照）。さらには、本出願人は、鋭意検討の結果、５分以内（場合によっては１分程度）で視認可能且つ解析可能な発光画像を得るための対物レンズとして、（ＮＡ÷β）2の値が０．０７１以上であるものが好ましいことを明らかにした（ＷＯ２００６／０８８１０９参照）。したがって、本実施の形態で用いる対物レンズ１１２としては、（ＮＡ÷β）2の値が０．０１以上であるものが好ましく、その値が０．０３９以上であるものがより好ましく、その値が０．０７１以上であるものがさらに好ましい。
【００３０】
対物レンズヒーター１１４は、ヒーター温度コントローラー１１６と接続されており、対物レンズ１１２を外側から一定温度に保持するため、当該ヒーター温度コントローラーにより０．５℃間隔で温度の設定が行なわれている。また、対物レンズヒーター１１４の周囲には、対物レンズをＺ軸（光軸方向）に沿って駆動する対物レンズＺ軸駆動機構１１８が備えられている。対物レンズＺ軸駆動機構１１８の操作は、コンピューターにより制御される。
【００３１】
対物レンズ１１４の下方には、その受光面のほぼ中心が光軸に合うように、光検出器としてのＣＣＤカメラ１２２が置かれている。ＣＣＤカメラ１２２により、試料Ｓから発せられる光を２次元画像として検出する。試料Ｓから発せられた光は微弱光であるため、ＣＣＤカメラ１２２はできる限り高感度のものを用いる。ＣＣＤカメラ１２２の画素数は１，３６０×１，０２４である。本実施の形態では、試料Ｓ内からの微弱な光を妥当な時間で（好ましくは約３０分以内に）撮像することができるような（換言すると、試料Ｓから検出した信号を使って妥当な時間で（好ましくは約３０分以内に）画像を構築することができるような）感度の高い光検出器を用いる。具体的には、本実施の形態では、極めて弱い発光成分を検出するため、例えば浜松ホトニクス社製のＯＲＣＡ−ＡＧやＯＲＣＡ−ＩＩＥＲ、オリンパス社製のＤＰ３０ＢＷなどのような高感度の光検出器である冷却電荷結合光検出素子を用いる。なお、極めて明るい発光成分を検出する場合には、一般的な高感度ビデオカメラ（例えば暗視ゴーグルや例えば浜松ホトニクス社製のシリコン増倍管（ＳＩＴ）カメラなど）を用いればよい。ＣＣＤカメラ１２２は３板式カラーカメラとして、カラーの明視野像が得られるようにしてもよい。本実施の形態では、ＣＣＤカメラに限ることなく、例えばＣＭＯＳイメージセンサーなどを用いてもよい。
【００３２】
ＣＣＤカメラ１２２から発する暗電流を抑えるために、ＣＣＤカメラ１２２の底部にはペルチエ素子から成るＣＣＤカメラ冷却装置１２４が設置されており、ＣＣＤカメラ１２２の温度を０℃程度で冷却保温する。ＣＣＤカメラ１２２の受光面の上方には赤外線カットフィルター１２０が配置されており、当該赤外線カットフィルターにより、背景光となる信号光に関係しない赤外光を遮断する。ＣＣＤカメラ１２２には、信号ケーブルを通して、モニタを含むパーソナルコンピュータ１２８が接続されている。パーソナルコンピュータ１２８のモニタの画面上には、試料Ｓの画像が描出される。
【００３３】
パーソナルコンピュータ１２８は、ＣＣＤカメラ１２２のような高感度光子計数カメラを含むシステムの一部として、例えばフォトメトリクス社や浜松ホトニクス社などで販売されているものである。パーソナルコンピュータ１２８は、ＣＣＤカメラ１２２で撮像した画像（具体的には発光画像や蛍光画像、明視野画像など）をデジタルファイルの形式に処理する機能を有し、このデジタル画像を、当該パーソナルコンピュータに予め設定された様々な画像処理プログラムで操作したり、当該パーソナルコンピュータと予め接続されたプリンタで印刷したりすることができる。
【００３４】
具体的には、パーソナルコンピュータ１２８は、ＣＣＤカメラ１２２で撮像した発光画像を解析して試料Ｓに含まれる微生物の生態に関する情報を生成したり、ＣＣＤカメラ１２２で撮像した発光画像と明視野画像および／または蛍光画像とを重ね合わせることで重ね合わせ画像を作成し、作成した重ね合わせ画像を解析して試料Ｓに含まれる微生物の生態に関する情報を生成したりする。これにより、発光画像や重ね合わせ画像から、微生物の挙動や形態、局在、生死などの微生物の生態に関する情報を得ることができる。また、具体的には、パーソナルコンピュータ１２８は、ＣＣＤカメラ１２２により所定の時間間隔で繰り返し撮像した複数の発光画像を解析して試料Ｓに含まれる微生物の生態の変化に関する情報を生成したり、ＣＣＤカメラ１２２により所定の時間間隔で繰り返し撮像した各発光画像と各明視野画像および／または各蛍光画像とを重ね合わせることで複数の重ね合わせ画像を作成し、作成した複数の重ね合わせ画像を解析して試料Ｓに含まれる微生物の生態の変化に関する情報を生成したりする。これにより、時系列の発光画像や重ね合わせ画像から、微生物の挙動や形態、局在、生死、増殖、減少などの微生物の生態の変化に関する情報を得ることができる。換言すると、時系列の発光画像や重ね合わせ画像から、微生物の挙動や形態、局在、生死、増殖、減少を経時的に追跡することができる。なお、上述した所定の時間間隔は、例えば数分程度の短いものから数日または数週間程度の長いものまで、任意に設定してよい。
【００３５】
つぎに、生体試料解析装置１００で行うメイン処理の一例について図３を参照して説明する。実験者が、試料Ｓを培養液Ｃｓと共に試料容器Ｃに入れ、当該試料容器Ｃを純水で満たされている水槽Ｔに入れ、当該水槽Ｔをヒートプレート１０４の上に置き、パーソナルコンピュータ１２８に対してメイン処理の開始を指示すると、生体試料解析装置１００はパーソナルコンピュータ１２８を中心として以下のメイン処理を実行する。なお、ここでは、発光画像ならびに明視野画像および／または蛍光画像を経時的に撮像した場合のメイン処理を一例として説明する。
【００３６】
まず、パーソナルコンピュータ１２８はＣＣＤカメラ１２２に対して撮像実行を指示すると共に、当該指示した時の時刻を、ＣＣＤカメラ１２２で画像を撮像した時の時刻（撮像時刻）として当該パーソナルコンピュータの所定の記憶領域に格納する（ステップＳＡ−１）。
【００３７】
つぎに、ＣＣＤカメラ１２２は、パーソナルコンピュータ１２８からの指示を受けると、試料Ｓの撮像を実行して試料Ｓの発光画像ならびに明視野画像および／または蛍光画像を取得する（ステップＳＡ−２：撮像工程）。
【００３８】
つぎに、ＣＣＤカメラ１２２は、ステップＳＡ−２で撮像した発光画像ならびに明視野画像および／または蛍光画像をパーソナルコンピュータ１２８へ転送する（ステップＳＡ−３）。
【００３９】
つぎに、パーソナルコンピュータ１２８は、ステップＳＡ−３で転送した発光画像ならびに明視野画像および／または蛍光画像を取得し、取得した発光画像ならびに明視野画像および／または蛍光画像を、ステップＳＡ−１で格納した撮像時刻と対応付けて当該パーソナルコンピュータの所定の記憶領域に格納する（ステップＳＡ−４）。
【００４０】
つぎに、パーソナルコンピュータ１２８は、ステップＳＡ−４で格納した発光画像と明視野画像および／または蛍光画像とが重ね合わされた画像である重ね合わせ画像を作成する（ステップＳＡ−５）。
【００４１】
つぎに、パーソナルコンピュータ１２８は、ステップＳＡ−５で作成した重ね合わせ画像を解析して、微生物の生態に関する情報を生成する（ステップＳＡ−６：解析工程）。
【００４２】
つぎに、パーソナルコンピュータ１２８は、ステップＳＡ−６で生成した微生物の生態に関する情報を、ステップＳＡ−５で作成した重ね合わせ画像や、ステップＳＡ−４で格納した発光画像ならびに明視野画像および／または蛍光画像や、ステップＳＡ−１で格納した撮像時刻と共に、当該パーソナルコンピュータのモニタにサムネイル表示する（ステップＳＡ−７）。
【００４３】
つぎに、パーソナルコンピュータ１２８は、ステップＳＡ−１で格納した撮像時刻からの経過時間を計時し、当該撮像時刻から所定の時間が経過した時（ステップＳＡ−８：Ｙｅｓ）にステップＳＡ−９へ進む。
【００４４】
そして、パーソナルコンピュータ１２８は、初回の撮像時刻から所定の時間が経過するまで又は所定の回数の撮像を終える（ステップＳＡ−９：Ｙｅｓ）まで、当該パーソナルコンピュータを中心として上記の処理を繰り返し実行することで、微生物の生態の変化に関する情報を生成する。
【００４５】
以上、詳細に説明したように、生体試料解析装置１００によれば、生物発光タンパク質を有する微生物を含む生体試料である試料Ｓの発光画像と明視野画像および／または蛍光画像を撮像し、撮像した発光画像と明視野画像および／または蛍光画像とを重ね合わせた重ね合わせ画像に基づいて微生物の生態を解析するので、厚みのある生きた組織のような生体試料内の微生物を、当該微生物を当該生体試料から取り出すことなく当該生体試料に存在させた状態で、当該生体試料にダメージを与えずに簡易な装置構成で鮮明に捉えることができ、その結果、生体試料内の微生物の生態、具体的には生体試料内の微生物の挙動や形態、局在、生死などを正確且つ詳細に解析する（知る）ことができる。換言すると、発光画像と明視野画像および／または蛍光画像とを重ね合わせることによって、厚みのある生体試料からの光シグナルを、バックグラウンドがなく組織へのダメージがなく感度よく測定することができ、その結果、生体試料内の微生物の挙動、形態、局在、生死などの生態を正確且つ詳細に解析することができる。
【００４６】
また、生体試料解析装置１００によれば、発光画像ならびに明視野画像および／または蛍光画像を経時的に撮像し、撮像した各発光画像と各明視野画像および／または各蛍光画像とを重ね合わせた複数の重ね合わせ画像に基づいて微生物の生態の変化を解析するので、厚みのある生きた組織のような生体試料内の微生物を、当該微生物を当該生体試料から取り出すことなく当該生体試料に存在させた状態で、当該生体試料にダメージを与えずに簡易な装置構成で鮮明に捉えることができ、その結果、生体試料内の微生物の生態の変化、具体的には生体試料内の微生物の挙動や局在、生死、増殖、減少などを正確且つ詳細に経時的に解析（追跡）することができる。換言すると、光シグナルによる画像をタイムラプス観察することによって、厚みのある生体試料からの光シグナルを、バックグラウンドがなく組織へのダメージがなく感度よく経時的に測定（追跡）することができ、その結果、生体試料内の微生物の挙動、局在、生死、増殖、減少などの生態変化を経時的に正確且つ詳細に解析することができる。
【００４７】
また、生体試料解析装置１００によれば、冷却電荷結合光検出素子で、発光画像や明視野画像、蛍光画像を撮像するので、高感度の画像を得ることができ、その結果、生体試料内の微生物の生態やその変化をより正確且つ詳細に解析することができる。また、生体試料解析装置１００によれば、開口数（ＮＡ）および投影倍率（β）で表される（ＮＡ÷β）2の値が０．０１以上、好ましくは０．０３９以上、さらに好ましくは０．０７１以上である対物レンズを用いて、発光画像や明視野画像、蛍光画像を撮像するので、高感度の画像を得ることができ、その結果、生体試料内の微生物の生態やその変化をより正確且つ詳細に解析することができる。
【００４８】
また、実験者は、生物発光タンパク質を様々な方法で微生物に投与し、当該微生物をさらに動物などの個体に投与し、当該個体に対し発光基質を加えた後、生体試料解析装置１００で、当該個体内または当該個体の組織内に存在する微生物から発せられる発光を撮像してもよい。
【００４９】
なお、本実施の形態において、発光シグナルの測定は数十分間続く（具体的には撮像の際の露光時間は数十分になる）場合もあるので、撮像中は、細胞や組織や個体などの試料を固定しておくことが望ましい。また、発光シグナル成分の撮像には、極めて低レベルの光を検出することができる冷却電荷結合光検出素子を用いるのが望ましい。
【実施例１】
【００５０】
実施例１では、マウスの小腸の断片を試料として、発光観察および明視野観察を行った。
（１）試料の準備
まず、ルシフェラーゼ遺伝子恒常発現ベクターをエレクトロポレーションによりクリプトスポリジウムに導入した。そして、オーシスト形態をとったルシフェラーゼ発現クリプトスポリジウムをマウスに経口感染させ、腸内でクリプトスポリジウムを増殖させた。そして、マウスの小腸の断片を採取し、ルシフェリンを１ｍＭ含有するＰＢＳ（Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ Ｂｕｆｆｅｒｅｄ Ｓａｌｉｎｅ：リン酸緩衝塩類溶液）が入っている３５ｍｍカバーガラスディッシュに、採取した断片を入れた。
（２）試料の観察
実施例１では、発光イメージングシステムＬＵＭＩＮＯＶＩＥＷ ＬＶ１００（オリンパス社製）を用いて、カバーガラスディッシュ内の断片を観察した。なお、実施例１で用いた対物レンズは、市販の顕微鏡用のものであり、２０倍・ＮＡ０．７５の仕様のものである。倍率Ｍｇに対応する総合倍率は４倍である。実施例１で用いたＣＣＤカメラは、−３０℃冷却の顕微鏡用デジタルカメラＯＲＣＡ−ＡＧ（浜松ホトニクス社製）であり、ＣＣＤ３としてのＣＣＤ素子は２／３インチ型で、画素数は１，３６０×１，０２４、画素サイズは６．４５μｍ角である。実施例１では、自己発光による標本の像を１分間露光して撮像した。試料の観察は、試料（標本）がインキュベータ内に載置されるため、３７℃の環境で行った。
（３）観察結果
図４に示すように、クリプトスポリジウムが、マウスの小腸内でオーシスト形態をとり感染している様子を確認することができた。図４は、マウスの小腸の断片を撮像したときの明視野画像、発光画像および重ね合わせ画像の一例を示す図である。
【実施例２】
【００５１】
実施例２では、マウスの小腸の断片を試料として経時的に発光観察および明視野観察を行うことで、マウス腸内におけるクリプトスポリジウムの増殖の様子を観察した。なお、クリプトスポリジウムの調整、マウスの調整、発光イメージングシステム、対物レンズ、ＣＣＤカメラおよび撮像条件は、実施例１と同じである。実施例２では、撮像間隔を３０分とし、２４時間のタイムラプス撮像を行った。その結果、クリプトスポリジウムが経時的に増殖している様子を捉えることができた。
【産業上の利用可能性】
【００５２】
以上のように、本発明にかかる生体試料解析方法は、例えば医療やバイオテクノロジー、食品分析などの分野において好適に用いることができる。
【図面の簡単な説明】
【００５３】
【図１】生体試料解析装置１００の構成を示す図である。
【図２】生体試料解析装置１００の構成を示す図である。
【図３】生体試料解析装置１００が行うメイン処理の一例を示すフローチャートである。
【図４】マウスの小腸の断片を撮像したときの明視野画像、発光画像および重ね合わせ画像の一例を示す図である。
【符号の説明】
【００５４】
１００ 生体試料解析装置
１１２ 対物レンズ
１２２ ＣＣＤカメラ
１２４ ＣＣＤカメラ冷却装置
１２８ パーソナルコンピュータ
【技術分野】
【０００１】
本発明は、細胞、組織、個体などの生体試料を解析する生体試料解析方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
特許文献１には、微生物の検出方法などが開示されている。具体的には、試料に存在する目的微生物を特異的に捕捉する物質を結合した基板材を用いて当該目的微生物を捕捉し、当該基板材上に捕捉された目的微生物を光学的に検出する装置および方法が開示されている。
【０００３】
非特許文献１には、微生物を蛍光標識して組織内の感染の様子を観察する方法、および電子顕微鏡を用いて微生物の感染を観察する方法が開示されている。
【０００４】
【特許文献１】特開２００５−１７２６８０号公報
【非特許文献１】Ｆｅｎｇｗｕ Ｌｉ ｅｔ ａｌ．，「Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ Ｏｏｋｉｎａｔｅ−ｓｅｃｒｅｔｅｄ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ Ｓｅｃｒｅｔｅｄ ｔｈｒｏｕｇｈ ａ Ｃｏｍｍｏｎ Ｍｉｃｒｏｎｅｍａｌ Ｐａｔｈｗａｙ Ａｒｅ Ｔａｒｇｅｔｓ ｏｆ Ｂｌｏｃｋｉｎｇ Ｍａｌａｒｉａ Ｔｒａｎｓｍｉｓｓｉｏｎ」，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，Ｖｏｌ．２７９，Ｎｏ．２５，Ｊｕｎ １８，ｐｐ．２６６３５−２６６４４，２００４
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
しかしながら、特許文献１によれば、血液や糞便、食品などの非組織を対象とし、これらから特定の微生物を捕捉するので、組織内の微生物を、当該組織から取り出すことなく当該組織内に存在させた状態で検出することができないという問題点があった。
【０００６】
また、非特許文献１によれば、蛍光を用いるが故に、自家蛍光に因るバックグラウンドが高く、ノイズも大きいので、組織内の微生物を鮮明に捉えることができないという問題点があった。また、非特許文献１によれば、蛍光を用いるが故に、厚みのある組織に対してはレーザーの透過性が低いので、厚みのある組織内の微生物を鮮明に捉えることができないという問題点があった。また、非特許文献１によれば、蛍光を用いるので、レーザー照射に因る組織へのダメージを避けることができないという問題点があった。また、非特許文献１によれば、電子顕微鏡を用いるので、装置や設備が大掛かりになるうえ、組織を生きた状態で観察することができないという問題点があった。
【０００７】
本発明は、上記問題点に鑑みてなされたものであって、厚みのある生きた組織のような生体試料を、当該生体試料にダメージを与えずに鮮明に捉えることができ、その結果、生体試料を正確且つ詳細に解析することができる生体試料解析方法を提供することを目的とする。
また、本発明は、簡易な装置構成で生体試料を解析することができる生体試料解析方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
上述した課題を解決し、目的を達成するために、本発明にかかる請求項１に記載の生体試料解析方法は、少なくとも１つが宿主であり、少なくとも１つが微生物である複数の生体試料のうち少なくとも１つから発せられた微弱光を選択的に検出することで、少なくとも１つの前記生体試料の発光画像を撮像する撮像工程と、前記撮像工程で撮像した前記発光画像に基づいて前記生体試料を解析する解析工程とを含むことを特徴とする。
【０００９】
また、本発明にかかる請求項２に記載の生体試料解析方法は、請求項１に記載の生体試料解析方法において、前記撮像工程では、前記発光画像を繰り返し撮像し、前記解析工程では、複数の前記発光画像に基づいて前記生体試料の変化を解析することを特徴とする。
【００１０】
また、本発明にかかる請求項３に記載の生体試料解析方法は、請求項１に記載の生体試料解析方法において、前記撮像工程では、前記発光画像の他に、前記生体試料の明視野画像および／または前記生体試料の蛍光画像をさらに撮像し、前記解析工程では、前記撮像工程で撮像した前記発光画像と前記明視野画像および／または前記蛍光画像とを重ね合わせた画像である重ね合わせ画像に基づいて前記生体試料を解析することを特徴とする。
【００１１】
また、本発明にかかる請求項４に記載の生体試料解析方法は、請求項３に記載の生体試料解析方法において、前記撮像工程では、前記発光画像ならびに前記明視野画像および／または前記蛍光画像を繰り返し撮像し、前記解析工程では、複数の前記重ね合わせ画像に基づいて前記生体試料の変化を解析することを特徴とする。
【００１２】
また、本発明にかかる請求項５に記載の生体試料解析方法は、請求項１から４のいずれか１つに記載の生体試料解析方法において、前記撮像工程では、冷却電荷結合光検出素子で、少なくとも前記発光画像を撮像することを特徴とする。
【００１３】
また、本発明にかかる請求項６に記載の生体試料解析方法は、請求項１から５のいずれか１つに記載の生体試料解析方法において、前記撮像工程では、開口数（ＮＡ）および投影倍率（β）で表される（ＮＡ÷β）2の値が０．０１以上である対物レンズを用いて、少なくとも前記発光画像を撮像することを特徴とする。
【００１４】
また、本発明にかかる請求項７に記載の生体試料解析方法は、請求項６に記載の生体試料解析方法において、前記対物レンズの前記（ＮＡ÷β）2の前記値が０．０３９以上であることを特徴とする。
【００１５】
また、本発明にかかる請求項８に記載の生体試料解析方法は、請求項７に記載の生体試料解析方法において、前記対物レンズの前記（ＮＡ÷β）2の前記値が０．０７１以上であることを特徴とする。
【００１６】
また、本発明にかかる請求項９に記載の生体試料解析方法は、請求項１から８のいずれか１つに記載の生体試料解析方法において、前記宿主は、細胞、組織、個体のいずれか１つであることを特徴とする。
【００１７】
また、本発明にかかる請求項１０に記載の生体試料解析方法は、請求項１から９のいずれか１つに記載の生体試料解析方法において、前記微生物は、生物発光タンパク質を有するものであることを特徴とする。
【発明の効果】
【００１８】
本発明では、少なくとも１つが宿主であり、少なくとも１つが（他方が）微生物である複数の生体試料のうち少なくとも１つから発せられた微弱光を選択的に検出することで、少なくとも１つの生体試料の発光画像を撮像し、撮像した発光画像に基づいて生体試料を解析するので、生体試料にダメージを与えずに鮮明に捉えることができ、その結果、生体試料を正確且つ詳細に解析することができるという効果を奏する。また、本発明では、簡易な装置構成で生体試料を解析することができるという効果を奏する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１９】
以下に、本発明にかかる生体試料解析方法の実施の形態を図面に基づいて詳細に説明する。なお、この実施の形態によりこの発明が限定されるものではない。
【００２０】
まず、本発明では、生体試料として、少なくとも１種類の宿主と少なくとも１種類の微生物を対象とする。本発明では、撮像する対象は、少なくとも２種類の異なる生体試料のうち、少なくとも１種類のものであればよい。例えば、動物または植物組織とそれに感染する１種類以上の微生物の組み合わせなどが挙げられる。これらの対象を用いることにより、微生物が感染している様子などを検出することができる。また、動物または植物組織とそれに感染する遺伝子変異を起こした１種類以上の微生物の組み合わせなどの例が挙げられる。遺伝子変異を起こした微生物とは、ノックアウト遺伝子、キメラ遺伝子、特定タンパク質過剰発現遺伝子、ＲＮＡ干渉など、一般的に用いられる遺伝子操作により特定の遺伝子の発現量が調整された微生物のことであり、それらの微生物を用いることにより、発現が調整された遺伝子の組織および／または微生物に対する効果を検出することができる。
【００２１】
また、本発明において、微弱光とは、典型的には生物発光による遺伝学的な発現量を表すような肉眼では見えない程度の極めて微弱な光シグナルを指す。なお、本発明における微弱光としては、生物発光以外にも、当該生物発光と同等レベルに微弱な光シグナルを発する蛍光や化学発光などを含む。例えば、ＢＲＥＴ（生物発光共鳴エネルギー転移）における蛍光は、基質による生物発光の微弱エネルギーにより発するので、生物発光に含める。本発明では、少なくとも２種類の生体試料を対象とするので、少なくとも１種の生体試料が微弱光を発生していれば当該微弱光を検出して画像化すればよいが、残りの他の生体試料についても識別可能な光シグナル、つまりは微弱光を発生していれば当該微弱光も検出して画像化してもよい。
【００２２】
つぎに、本発明にかかる生体試料解析方法を実施するための装置である生体試料解析装置１００の構成について図１を参照して説明する。図１は生体試料解析装置１００の構成を示す図である。図１に示すように、生体試料解析装置１００は、試料ステージ１０２と、ヒートプレート１０４と、プレート温度コントローラー１０６と、ガス供給機構１０８と、水供給機構１１０と、対物レンズ１１２と、対物レンズヒーター１１４と、ヒーター温度コントローラー１１６と、対物レンズＺ軸駆動機構１１８と、赤外線カットフィルター１２０と、ＣＣＤカメラ１２２と、ＣＣＤカメラ冷却装置１２４と、パーソナルコンピュータ１２８と、で構成されている。試料ステージ１０２、ヒートプレート１０４、対物レンズ１１２、対物レンズヒーター１１４、対物レンズＺ軸駆動機構１１８、赤外線カットフィルター１２０、ＣＣＤカメラ１２２およびＣＣＤカメラ冷却装置１２４は、図示の如く、フタ付き遮光ボックス１３０で覆われている。フタ付き遮光ボックス１３０は例えばアルミニウムのような遮光性の部材からなり、当該部材の表面には、当該フタ付き遮光ボックスの外部の光がその内部に入り込まないように黒色の塗装処理がされている。フタ付き遮光ボックス１３０の上面には、蝶番を介して、開閉自在のフタ１３０ａが取り付けられている。実験者は、フタ１３０ａを開閉して、試料Ｓの設置や除去などを行なう。
なお、本実施の形態で必須とする構成は、これらの装置構成のうち、後述するような光学条件（具体的には開口数（ＮＡ）および投影倍率（β）で表される（ＮＡ÷β）2の値に関する条件）を満たす対物レンズ１１２と、フタ付き遮光ボックス１３０のような適宜の遮光環境と、ＣＣＤカメラ１２２とであり、簡易なものである。
【００２３】
試料ステージ１０２は試料Ｓを配置するためのものであり、その上にはヒートプレート１０４が重ねて置かれている。試料ステージ１０２はネジ操作により水平方向（ＸＹ方向）に移動することができる。ヒートプレート１０４の上には水槽Ｔが配置されている。ヒートプレート１０４は、プレート温度コントローラー１０６と接続されており、当該プレート温度コントローラーにより０．５℃間隔で微生物の生育に適した環境温度（例えば３７℃程度）の設定が行なわれている。
【００２４】
水槽Ｔの中には、試料Ｓを保持するための容器である試料容器Ｃが配置されており、さらに、試料容器Ｃ内の湿度を保つために純水Ｗが張られている。試料容器Ｃには試料Ｓが配置されている。試料容器Ｃ周囲の拡大図を図２に示す。図２は試料容器Ｃ周囲の拡大図である。試料Ｓはシャーレなどから成る試料容器Ｃに入れられ、培養液Ｃｓに浸されている。試料容器Ｃには試料容器カバーＣｖが取り付けられており、その中の試料Ｓが乾燥したり、ゴミなどが試料容器Ｃに混入したりするのを防いでいる。図１に戻り、試料容器Ｃにおいて少なくともその底面は、通常の対物レンズが対応できるよう、光学的に透明になっており、顕微鏡用カバーガラスと同じ材質でその厚さは０．１７ｍｍである。水槽Ｔに張られている純水Ｗは、水供給機構１１０を構成するノズル１１０ａを通して供給されている。水槽Ｔの上方には、ガス供給機構１０８を構成するガスボンベ１０８ａ内の混合ガス（ＣＯ2を５％、Ｏ2を９５％含有するガス）が、ガス供給機構１０８を構成するガス供給チューブ１０８ｂを通して５０ｍＬ／ｍｉｎの流速で供給される。
【００２５】
ここで、試料Ｓは、生物発光タンパク質を有する微生物を含む生体試料であり、微生物に対する宿主である。宿主には、個体、組織、細胞などが挙げられる。個体は、動物や植物などである。これにより、様々な物を対象として微生物の生態の解析を行うことができる。なお、個体は動物や植物などである。動物は、微生物が感染する可能性のある全てのものであり、例えば哺乳類や昆虫類などである。植物は、微生物が感染する可能性のある全てのものであり、例えばタバコ、トマト、ナスなどである。組織は、微生物が感染する可能性のある全てのものであり、例えば脳や腎臓、腸などである。細胞は、微生物が感染する可能性のある全てのものであり、例えばＨｅＬａ細胞、ＣＨＯ細胞などの培養細胞、初代神経細胞などの個体または組織から採取した細胞などが挙げられる。さらに、試料Ｓは外科的に摘出されたものでもよく、摘出されずに外科的に露呈された個体の一部であってもよい。また、微生物を選択的に撮像するのであれば、試料Ｓは必ずしも生きている必要は無く、微生物のみが試料Ｓ中において生きていればよい。なお、微生物を選択的に撮像する場合、微生物は、試料Ｓ中の成分または培養溶液によって適宜の培養環境に置かれているのが好ましい。
【００２６】
生物発光タンパク質には、いつくかの種類が知られている。例えば、ルシフェラーゼ系（ｌｕｃ）の生物発光タンパク質を含有する代表的な生物はホタルやコメツキムシであり、これらは緑色や黄緑色、黄色、橙色の光を放射するが、中でも橙色の光は、他の短い波長の光よりも容易に組織を貫通する波長をもつので、好適である。なお、ルシフェラーゼ酵素を発光させるには、発光基質を当該ルシフェラーゼ酵素に供給しなければならない。使用する発光基質は、生物発光タンパク質に合わせて選択する。例えば、生物発光タンパク質がホタルルシフェラーゼである場合にはルシフェリンを発光基質として選択し、生物発光タンパク質がウミシイタケルシフェラーゼである場合にはセレンテラジンを発光基質として選択する。
【００２７】
微生物は、寄生虫や原虫、細菌、真菌、ウイルスなどである。寄生虫は、組織や個体（具体的には動物）内で感染形態をとる全てのものであり、例えばアニキサス、シュードテラノーバ、旋毛虫などである。原虫は、組織や個体（具体的には動物）内で感染形態をとる全てのものであり、例えばクリプトスポリジウムやネオスポラ、マラリア、トキソプラズマ、イソスボーラ、サイクロスボーラなどである。細菌は、細胞や組織や個体（動物または植物）内で感染形態をとる全てのものであり、例えばチフス菌やサルモネラ菌、炭素菌、セレウス菌、結核菌、アグロバクテリウムなどである。真菌は、細胞や組織や個体（具体的には動物）内で感染形態をとる全てのものであり、例えばアスペルギルス属真菌やムコール・リゾプス属真菌、ペニシリウム属真菌、アクレモニウム属真菌などである。ウイルスは、細胞や組織や個体（具体的には動物）内で感染形態をとる全てのものであり、ノロウイルス、タロウイルス、インフルエンザウイルスなどである。
【００２８】
宿主と微生物との組み合わせは以上の通りである。宿主が個体または組織の場合、微生物は主に寄生虫、原虫、真菌、細菌、ウイルスが用いられる。宿主が細胞の場合、微生物は主に真菌、細菌、ウイルスが用いられる。
【００２９】
図１の説明に戻り、試料ステージ１０２の下方には、対物レンズ１１２が倒立に配置されている。対物レンズ１１２の周囲には対物レンズヒーター１１４が取り付けられており、対物レンズ１１２と対物レンズヒーター１１４とは接触している。ここで、本出願人は、対物レンズの開口数（ＮＡ）を、従来の蛍光撮像用顕微鏡などで常識的に用いられている開口数を基準にして変更することにより、生物発光のような微弱な発光成分を撮像して短い時間（例えば１分〜２０分程度）でその発光画像を得ることができることを明らかにした（ＷＯ２００６／０８８１０９参照）。具体的には、本出願人は、生物発光を容易に画像化するための対物レンズとして、開口数（ＮＡ）および投影倍率（β）で表される（ＮＡ÷β）2の値が０．０１以上であるものが好ましく、その値が０．０３９以上であるものがより好ましいことを明らかにした（ＷＯ２００６／０８８１０９参照）。さらには、本出願人は、鋭意検討の結果、５分以内（場合によっては１分程度）で視認可能且つ解析可能な発光画像を得るための対物レンズとして、（ＮＡ÷β）2の値が０．０７１以上であるものが好ましいことを明らかにした（ＷＯ２００６／０８８１０９参照）。したがって、本実施の形態で用いる対物レンズ１１２としては、（ＮＡ÷β）2の値が０．０１以上であるものが好ましく、その値が０．０３９以上であるものがより好ましく、その値が０．０７１以上であるものがさらに好ましい。
【００３０】
対物レンズヒーター１１４は、ヒーター温度コントローラー１１６と接続されており、対物レンズ１１２を外側から一定温度に保持するため、当該ヒーター温度コントローラーにより０．５℃間隔で温度の設定が行なわれている。また、対物レンズヒーター１１４の周囲には、対物レンズをＺ軸（光軸方向）に沿って駆動する対物レンズＺ軸駆動機構１１８が備えられている。対物レンズＺ軸駆動機構１１８の操作は、コンピューターにより制御される。
【００３１】
対物レンズ１１４の下方には、その受光面のほぼ中心が光軸に合うように、光検出器としてのＣＣＤカメラ１２２が置かれている。ＣＣＤカメラ１２２により、試料Ｓから発せられる光を２次元画像として検出する。試料Ｓから発せられた光は微弱光であるため、ＣＣＤカメラ１２２はできる限り高感度のものを用いる。ＣＣＤカメラ１２２の画素数は１，３６０×１，０２４である。本実施の形態では、試料Ｓ内からの微弱な光を妥当な時間で（好ましくは約３０分以内に）撮像することができるような（換言すると、試料Ｓから検出した信号を使って妥当な時間で（好ましくは約３０分以内に）画像を構築することができるような）感度の高い光検出器を用いる。具体的には、本実施の形態では、極めて弱い発光成分を検出するため、例えば浜松ホトニクス社製のＯＲＣＡ−ＡＧやＯＲＣＡ−ＩＩＥＲ、オリンパス社製のＤＰ３０ＢＷなどのような高感度の光検出器である冷却電荷結合光検出素子を用いる。なお、極めて明るい発光成分を検出する場合には、一般的な高感度ビデオカメラ（例えば暗視ゴーグルや例えば浜松ホトニクス社製のシリコン増倍管（ＳＩＴ）カメラなど）を用いればよい。ＣＣＤカメラ１２２は３板式カラーカメラとして、カラーの明視野像が得られるようにしてもよい。本実施の形態では、ＣＣＤカメラに限ることなく、例えばＣＭＯＳイメージセンサーなどを用いてもよい。
【００３２】
ＣＣＤカメラ１２２から発する暗電流を抑えるために、ＣＣＤカメラ１２２の底部にはペルチエ素子から成るＣＣＤカメラ冷却装置１２４が設置されており、ＣＣＤカメラ１２２の温度を０℃程度で冷却保温する。ＣＣＤカメラ１２２の受光面の上方には赤外線カットフィルター１２０が配置されており、当該赤外線カットフィルターにより、背景光となる信号光に関係しない赤外光を遮断する。ＣＣＤカメラ１２２には、信号ケーブルを通して、モニタを含むパーソナルコンピュータ１２８が接続されている。パーソナルコンピュータ１２８のモニタの画面上には、試料Ｓの画像が描出される。
【００３３】
パーソナルコンピュータ１２８は、ＣＣＤカメラ１２２のような高感度光子計数カメラを含むシステムの一部として、例えばフォトメトリクス社や浜松ホトニクス社などで販売されているものである。パーソナルコンピュータ１２８は、ＣＣＤカメラ１２２で撮像した画像（具体的には発光画像や蛍光画像、明視野画像など）をデジタルファイルの形式に処理する機能を有し、このデジタル画像を、当該パーソナルコンピュータに予め設定された様々な画像処理プログラムで操作したり、当該パーソナルコンピュータと予め接続されたプリンタで印刷したりすることができる。
【００３４】
具体的には、パーソナルコンピュータ１２８は、ＣＣＤカメラ１２２で撮像した発光画像を解析して試料Ｓに含まれる微生物の生態に関する情報を生成したり、ＣＣＤカメラ１２２で撮像した発光画像と明視野画像および／または蛍光画像とを重ね合わせることで重ね合わせ画像を作成し、作成した重ね合わせ画像を解析して試料Ｓに含まれる微生物の生態に関する情報を生成したりする。これにより、発光画像や重ね合わせ画像から、微生物の挙動や形態、局在、生死などの微生物の生態に関する情報を得ることができる。また、具体的には、パーソナルコンピュータ１２８は、ＣＣＤカメラ１２２により所定の時間間隔で繰り返し撮像した複数の発光画像を解析して試料Ｓに含まれる微生物の生態の変化に関する情報を生成したり、ＣＣＤカメラ１２２により所定の時間間隔で繰り返し撮像した各発光画像と各明視野画像および／または各蛍光画像とを重ね合わせることで複数の重ね合わせ画像を作成し、作成した複数の重ね合わせ画像を解析して試料Ｓに含まれる微生物の生態の変化に関する情報を生成したりする。これにより、時系列の発光画像や重ね合わせ画像から、微生物の挙動や形態、局在、生死、増殖、減少などの微生物の生態の変化に関する情報を得ることができる。換言すると、時系列の発光画像や重ね合わせ画像から、微生物の挙動や形態、局在、生死、増殖、減少を経時的に追跡することができる。なお、上述した所定の時間間隔は、例えば数分程度の短いものから数日または数週間程度の長いものまで、任意に設定してよい。
【００３５】
つぎに、生体試料解析装置１００で行うメイン処理の一例について図３を参照して説明する。実験者が、試料Ｓを培養液Ｃｓと共に試料容器Ｃに入れ、当該試料容器Ｃを純水で満たされている水槽Ｔに入れ、当該水槽Ｔをヒートプレート１０４の上に置き、パーソナルコンピュータ１２８に対してメイン処理の開始を指示すると、生体試料解析装置１００はパーソナルコンピュータ１２８を中心として以下のメイン処理を実行する。なお、ここでは、発光画像ならびに明視野画像および／または蛍光画像を経時的に撮像した場合のメイン処理を一例として説明する。
【００３６】
まず、パーソナルコンピュータ１２８はＣＣＤカメラ１２２に対して撮像実行を指示すると共に、当該指示した時の時刻を、ＣＣＤカメラ１２２で画像を撮像した時の時刻（撮像時刻）として当該パーソナルコンピュータの所定の記憶領域に格納する（ステップＳＡ−１）。
【００３７】
つぎに、ＣＣＤカメラ１２２は、パーソナルコンピュータ１２８からの指示を受けると、試料Ｓの撮像を実行して試料Ｓの発光画像ならびに明視野画像および／または蛍光画像を取得する（ステップＳＡ−２：撮像工程）。
【００３８】
つぎに、ＣＣＤカメラ１２２は、ステップＳＡ−２で撮像した発光画像ならびに明視野画像および／または蛍光画像をパーソナルコンピュータ１２８へ転送する（ステップＳＡ−３）。
【００３９】
つぎに、パーソナルコンピュータ１２８は、ステップＳＡ−３で転送した発光画像ならびに明視野画像および／または蛍光画像を取得し、取得した発光画像ならびに明視野画像および／または蛍光画像を、ステップＳＡ−１で格納した撮像時刻と対応付けて当該パーソナルコンピュータの所定の記憶領域に格納する（ステップＳＡ−４）。
【００４０】
つぎに、パーソナルコンピュータ１２８は、ステップＳＡ−４で格納した発光画像と明視野画像および／または蛍光画像とが重ね合わされた画像である重ね合わせ画像を作成する（ステップＳＡ−５）。
【００４１】
つぎに、パーソナルコンピュータ１２８は、ステップＳＡ−５で作成した重ね合わせ画像を解析して、微生物の生態に関する情報を生成する（ステップＳＡ−６：解析工程）。
【００４２】
つぎに、パーソナルコンピュータ１２８は、ステップＳＡ−６で生成した微生物の生態に関する情報を、ステップＳＡ−５で作成した重ね合わせ画像や、ステップＳＡ−４で格納した発光画像ならびに明視野画像および／または蛍光画像や、ステップＳＡ−１で格納した撮像時刻と共に、当該パーソナルコンピュータのモニタにサムネイル表示する（ステップＳＡ−７）。
【００４３】
つぎに、パーソナルコンピュータ１２８は、ステップＳＡ−１で格納した撮像時刻からの経過時間を計時し、当該撮像時刻から所定の時間が経過した時（ステップＳＡ−８：Ｙｅｓ）にステップＳＡ−９へ進む。
【００４４】
そして、パーソナルコンピュータ１２８は、初回の撮像時刻から所定の時間が経過するまで又は所定の回数の撮像を終える（ステップＳＡ−９：Ｙｅｓ）まで、当該パーソナルコンピュータを中心として上記の処理を繰り返し実行することで、微生物の生態の変化に関する情報を生成する。
【００４５】
以上、詳細に説明したように、生体試料解析装置１００によれば、生物発光タンパク質を有する微生物を含む生体試料である試料Ｓの発光画像と明視野画像および／または蛍光画像を撮像し、撮像した発光画像と明視野画像および／または蛍光画像とを重ね合わせた重ね合わせ画像に基づいて微生物の生態を解析するので、厚みのある生きた組織のような生体試料内の微生物を、当該微生物を当該生体試料から取り出すことなく当該生体試料に存在させた状態で、当該生体試料にダメージを与えずに簡易な装置構成で鮮明に捉えることができ、その結果、生体試料内の微生物の生態、具体的には生体試料内の微生物の挙動や形態、局在、生死などを正確且つ詳細に解析する（知る）ことができる。換言すると、発光画像と明視野画像および／または蛍光画像とを重ね合わせることによって、厚みのある生体試料からの光シグナルを、バックグラウンドがなく組織へのダメージがなく感度よく測定することができ、その結果、生体試料内の微生物の挙動、形態、局在、生死などの生態を正確且つ詳細に解析することができる。
【００４６】
また、生体試料解析装置１００によれば、発光画像ならびに明視野画像および／または蛍光画像を経時的に撮像し、撮像した各発光画像と各明視野画像および／または各蛍光画像とを重ね合わせた複数の重ね合わせ画像に基づいて微生物の生態の変化を解析するので、厚みのある生きた組織のような生体試料内の微生物を、当該微生物を当該生体試料から取り出すことなく当該生体試料に存在させた状態で、当該生体試料にダメージを与えずに簡易な装置構成で鮮明に捉えることができ、その結果、生体試料内の微生物の生態の変化、具体的には生体試料内の微生物の挙動や局在、生死、増殖、減少などを正確且つ詳細に経時的に解析（追跡）することができる。換言すると、光シグナルによる画像をタイムラプス観察することによって、厚みのある生体試料からの光シグナルを、バックグラウンドがなく組織へのダメージがなく感度よく経時的に測定（追跡）することができ、その結果、生体試料内の微生物の挙動、局在、生死、増殖、減少などの生態変化を経時的に正確且つ詳細に解析することができる。
【００４７】
また、生体試料解析装置１００によれば、冷却電荷結合光検出素子で、発光画像や明視野画像、蛍光画像を撮像するので、高感度の画像を得ることができ、その結果、生体試料内の微生物の生態やその変化をより正確且つ詳細に解析することができる。また、生体試料解析装置１００によれば、開口数（ＮＡ）および投影倍率（β）で表される（ＮＡ÷β）2の値が０．０１以上、好ましくは０．０３９以上、さらに好ましくは０．０７１以上である対物レンズを用いて、発光画像や明視野画像、蛍光画像を撮像するので、高感度の画像を得ることができ、その結果、生体試料内の微生物の生態やその変化をより正確且つ詳細に解析することができる。
【００４８】
また、実験者は、生物発光タンパク質を様々な方法で微生物に投与し、当該微生物をさらに動物などの個体に投与し、当該個体に対し発光基質を加えた後、生体試料解析装置１００で、当該個体内または当該個体の組織内に存在する微生物から発せられる発光を撮像してもよい。
【００４９】
なお、本実施の形態において、発光シグナルの測定は数十分間続く（具体的には撮像の際の露光時間は数十分になる）場合もあるので、撮像中は、細胞や組織や個体などの試料を固定しておくことが望ましい。また、発光シグナル成分の撮像には、極めて低レベルの光を検出することができる冷却電荷結合光検出素子を用いるのが望ましい。
【実施例１】
【００５０】
実施例１では、マウスの小腸の断片を試料として、発光観察および明視野観察を行った。
（１）試料の準備
まず、ルシフェラーゼ遺伝子恒常発現ベクターをエレクトロポレーションによりクリプトスポリジウムに導入した。そして、オーシスト形態をとったルシフェラーゼ発現クリプトスポリジウムをマウスに経口感染させ、腸内でクリプトスポリジウムを増殖させた。そして、マウスの小腸の断片を採取し、ルシフェリンを１ｍＭ含有するＰＢＳ（Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ Ｂｕｆｆｅｒｅｄ Ｓａｌｉｎｅ：リン酸緩衝塩類溶液）が入っている３５ｍｍカバーガラスディッシュに、採取した断片を入れた。
（２）試料の観察
実施例１では、発光イメージングシステムＬＵＭＩＮＯＶＩＥＷ ＬＶ１００（オリンパス社製）を用いて、カバーガラスディッシュ内の断片を観察した。なお、実施例１で用いた対物レンズは、市販の顕微鏡用のものであり、２０倍・ＮＡ０．７５の仕様のものである。倍率Ｍｇに対応する総合倍率は４倍である。実施例１で用いたＣＣＤカメラは、−３０℃冷却の顕微鏡用デジタルカメラＯＲＣＡ−ＡＧ（浜松ホトニクス社製）であり、ＣＣＤ３としてのＣＣＤ素子は２／３インチ型で、画素数は１，３６０×１，０２４、画素サイズは６．４５μｍ角である。実施例１では、自己発光による標本の像を１分間露光して撮像した。試料の観察は、試料（標本）がインキュベータ内に載置されるため、３７℃の環境で行った。
（３）観察結果
図４に示すように、クリプトスポリジウムが、マウスの小腸内でオーシスト形態をとり感染している様子を確認することができた。図４は、マウスの小腸の断片を撮像したときの明視野画像、発光画像および重ね合わせ画像の一例を示す図である。
【実施例２】
【００５１】
実施例２では、マウスの小腸の断片を試料として経時的に発光観察および明視野観察を行うことで、マウス腸内におけるクリプトスポリジウムの増殖の様子を観察した。なお、クリプトスポリジウムの調整、マウスの調整、発光イメージングシステム、対物レンズ、ＣＣＤカメラおよび撮像条件は、実施例１と同じである。実施例２では、撮像間隔を３０分とし、２４時間のタイムラプス撮像を行った。その結果、クリプトスポリジウムが経時的に増殖している様子を捉えることができた。
【産業上の利用可能性】
【００５２】
以上のように、本発明にかかる生体試料解析方法は、例えば医療やバイオテクノロジー、食品分析などの分野において好適に用いることができる。
【図面の簡単な説明】
【００５３】
【図１】生体試料解析装置１００の構成を示す図である。
【図２】生体試料解析装置１００の構成を示す図である。
【図３】生体試料解析装置１００が行うメイン処理の一例を示すフローチャートである。
【図４】マウスの小腸の断片を撮像したときの明視野画像、発光画像および重ね合わせ画像の一例を示す図である。
【符号の説明】
【００５４】
１００ 生体試料解析装置
１１２ 対物レンズ
１２２ ＣＣＤカメラ
１２４ ＣＣＤカメラ冷却装置
１２８ パーソナルコンピュータ
【特許請求の範囲】
【請求項１】
少なくとも１つが宿主であり、少なくとも１つが微生物である複数の生体試料のうち、少なくとも１つから発せられた微弱光を選択的に検出することで、少なくとも１つの前記生体試料の発光画像を撮像する撮像工程と、
前記撮像工程で撮像した前記発光画像に基づいて前記生体試料を解析する解析工程と
を含むことを特徴とする生体試料解析方法。
【請求項２】
前記撮像工程では、前記発光画像を繰り返し撮像し、
前記解析工程では、複数の前記発光画像に基づいて前記生体試料の変化を解析すること
を特徴とする請求項１に記載の生体試料解析方法。
【請求項３】
前記撮像工程では、前記発光画像の他に、前記生体試料の明視野画像および／または前記生体試料の蛍光画像をさらに撮像し、
前記解析工程では、前記撮像工程で撮像した前記発光画像と前記明視野画像および／または前記蛍光画像とを重ね合わせた画像である重ね合わせ画像に基づいて前記生体試料を解析すること
を特徴とする請求項１に記載の生体試料解析方法。
【請求項４】
前記撮像工程では、前記発光画像ならびに前記明視野画像および／または前記蛍光画像を繰り返し撮像し、
前記解析工程では、複数の前記重ね合わせ画像に基づいて前記生体試料の変化を解析すること
を特徴とする請求項３に記載の生体試料解析方法。
【請求項５】
前記撮像工程では、電荷結合光検出素子で、少なくとも前記発光画像を撮像すること
を特徴とする請求項１から４のいずれか１つに記載の生体試料解析方法。
【請求項６】
前記撮像工程では、開口数（ＮＡ）および投影倍率（β）で表される（ＮＡ÷β）2の値が０．０１以上である対物レンズを用いて、少なくとも前記発光画像を撮像すること
を特徴とする請求項１から５のいずれか１つに記載の生体試料解析方法。
【請求項７】
前記対物レンズの前記（ＮＡ÷β）2の前記値が０．０３９以上であること
を特徴とする請求項６に記載の生体試料解析方法。
【請求項８】
前記対物レンズの前記（ＮＡ÷β）2の前記値が０．０７１以上であること
を特徴とする請求項７に記載の生体試料解析方法。
【請求項９】
前記宿主は、細胞、組織、個体のいずれか１つであること
を特徴とする請求項１から８のいずれか１つに記載の生体試料解析方法。
【請求項１０】
前記微生物は、生物発光タンパク質を有するものであること
を特徴とする請求項１から９のいずれか１つに記載の生体試料解析方法。
【請求項１】
少なくとも１つが宿主であり、少なくとも１つが微生物である複数の生体試料のうち、少なくとも１つから発せられた微弱光を選択的に検出することで、少なくとも１つの前記生体試料の発光画像を撮像する撮像工程と、
前記撮像工程で撮像した前記発光画像に基づいて前記生体試料を解析する解析工程と
を含むことを特徴とする生体試料解析方法。
【請求項２】
前記撮像工程では、前記発光画像を繰り返し撮像し、
前記解析工程では、複数の前記発光画像に基づいて前記生体試料の変化を解析すること
を特徴とする請求項１に記載の生体試料解析方法。
【請求項３】
前記撮像工程では、前記発光画像の他に、前記生体試料の明視野画像および／または前記生体試料の蛍光画像をさらに撮像し、
前記解析工程では、前記撮像工程で撮像した前記発光画像と前記明視野画像および／または前記蛍光画像とを重ね合わせた画像である重ね合わせ画像に基づいて前記生体試料を解析すること
を特徴とする請求項１に記載の生体試料解析方法。
【請求項４】
前記撮像工程では、前記発光画像ならびに前記明視野画像および／または前記蛍光画像を繰り返し撮像し、
前記解析工程では、複数の前記重ね合わせ画像に基づいて前記生体試料の変化を解析すること
を特徴とする請求項３に記載の生体試料解析方法。
【請求項５】
前記撮像工程では、電荷結合光検出素子で、少なくとも前記発光画像を撮像すること
を特徴とする請求項１から４のいずれか１つに記載の生体試料解析方法。
【請求項６】
前記撮像工程では、開口数（ＮＡ）および投影倍率（β）で表される（ＮＡ÷β）2の値が０．０１以上である対物レンズを用いて、少なくとも前記発光画像を撮像すること
を特徴とする請求項１から５のいずれか１つに記載の生体試料解析方法。
【請求項７】
前記対物レンズの前記（ＮＡ÷β）2の前記値が０．０３９以上であること
を特徴とする請求項６に記載の生体試料解析方法。
【請求項８】
前記対物レンズの前記（ＮＡ÷β）2の前記値が０．０７１以上であること
を特徴とする請求項７に記載の生体試料解析方法。
【請求項９】
前記宿主は、細胞、組織、個体のいずれか１つであること
を特徴とする請求項１から８のいずれか１つに記載の生体試料解析方法。
【請求項１０】
前記微生物は、生物発光タンパク質を有するものであること
を特徴とする請求項１から９のいずれか１つに記載の生体試料解析方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図２】
【図３】
【図４】
【公開番号】特開２００８−９６２６６（Ｐ２００８−９６２６６Ａ）
【公開日】平成２０年４月２４日（２００８．４．２４）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００６−２７８０３９（Ｐ２００６−２７８０３９）
【出願日】平成１８年１０月１１日（２００６．１０．１１）
【出願人】（００００００３７６）オリンパス株式会社 (11,466)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２０年４月２４日（２００８．４．２４）
【国際特許分類】
【出願日】平成１８年１０月１１日（２００６．１０．１１）
【出願人】（００００００３７６）オリンパス株式会社 (11,466)
【Ｆターム（参考）】
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