生殖の医学および生物学のためのバイオマーカー
本発明は、生殖の医学および生物学のための、特に体外受精（ＩＶＦ）の結果のための新しいバイオマーカーに関する。それは、ＩＶＦの結果を予測するため、および、ＩＶＦのための対象を選択するための方法に関する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は生殖の医学および生物学に関する。本発明は、特に体外受精後の、着床不全および満期妊娠の成功の予測マーカーに関する。
【０００２】
発明の背景
不妊症の診断および管理は、若年成人においてよく見られる健康上の懸念である。体外受精（ＩＶＦ）技術の継続的な進歩は、不妊夫婦にとって難易度の高い生殖の選択肢である。体外受精は、それにもかかわらず、多子出産、子宮外妊娠、自然流産、および早期分娩のリスクを含む、女性におけるそれらの適応に対する欠点を表す臨床上の合併症のリスク増加に関連する。これらの臨床上のリスク、およびこれらの進歩した技術の高い経済コストを考慮すると、ＩＶＦ処置は依然として不妊夫婦にとって利用が難しい。受精および着床に影響を与える機構のより良い理解によって、体外受精の成功に関連するパラメーターのより正確な見解が提供されてきたが、処置の開始前に、ＩＶＦ後の妊娠問題を予測しうるバイオマーカーの探索が依然として主な課題である。胚着床または流産を予測するマーカーの大半が（Tong et al., 2004）ＩＶＦ処置の開始後に起こり、このようにカウンセリングによって妊娠の失敗に関連するストレスおよび臨床問題を予測することが制限される。不妊女性がＩＶＦ処置後に生存可能な乳児を出産する可能性の予測は、このように、不妊夫婦の増加する要求に対する医療対応の最適化における主な問題である。
【０００３】
したがって、ＩＶＦ処置を開始するための決定に先行する段階で、ＩＶＦに関連する流産および着床不全率および関連する臨床上の合併症の関与の予測因子として、不妊夫婦のカウンセリングを改善しうるマーカーが強く必要とされる。
【０００４】
胚着床は、着床するための十分な質を保持する胚の移植により成功する。胚の能力は、主に胚の形態および分裂の動態で評価される。胚盤胞の工程までの胚の培養は、いくつかの潜在的な利点を有し、とりわけ最も生存可能で、着床するための最高の可能性を有する胚の選択、同期化胚−子宮、複数の着床不全の場合における胚発生の能力を評価する可能性である。移植を良質（形態学的側面および発生速度で定義した質）の胚で実施した場合、後者を着床させて、妊娠を可能にすることが期待できる。子宮内膜内でのその着床を支持する一連のシグナルを放出するための胚の内因性能力の評価は、依然として評価することが難しい。
【０００５】
したがって、胚の質、その生存能力、および着床するためのその能力を評価するために有用となりうるマーカーが強く必要とされる。
【０００６】
発明の概要
本発明は、ＩＶＦの結果の非侵襲性な評価および予測を可能にするバイオマーカーを初めて提供する。その予後的な価値の他、このバイオマーカーの主な価値は、女性ホルモン前処置の開始前でのその投与量の可能性である。このバイオマーカーの使用によって、カウンセリングまたはＩＶＦ関連リスクの管理が改善され、ひいては不妊女性の健康管理のために結果的な利益を提供する。加えて、本発明者らは、不妊および妊娠合併症のマーカーとしてＭＩＣＡ（ＭＨＣクラスＩ鎖関連タンパク質Ａ）を同定した。したがって、本発明は、生殖の医学および生物学におけるバイオマーカーとしてのＭＩＣＡに関する。
【０００７】
第１の態様において、本発明は、サンプル中のＭＩＣＡについてのインビトロアッセイを含む、体外受精（ＩＶＦ）の結果を判断するための方法に関し、ＭＩＣＡレベルはＩＶＦの結果を示し、特に着床不全率、ＩＶＦの失敗、および／または流産を示す。好ましくは、サンプルは：
− 移植胚を受ける女性からの、血液、血漿、血清、子宮内膜生検、子宮液、腟および子宮頸管の分泌物、頸管粘液、ダグラス窩、および腹腔鏡探索の場合（子宮内膜症、付着胎盤、感染性の続発症）は腹水のサンプル；
− 精液を提供する男性からの血液、血漿、血清、および精液のサンプル；卵母細胞を提供する女性からの、血液、血漿、血清、子宮内膜生検、子宮液、腟および子宮頸管の分泌物、頸管粘液、ダグラス窩、および腹腔鏡探索の場合（子宮内膜症、付着胎盤、感染性の続発症）は腹水のサンプル；および
− 胚上清または胚培養液のサンプル
からなる群より選択される。
【０００８】
第２の態様において、本発明は、サンプル中のＭＩＣＡについてのインビトロアッセイを含む、ＩＶＦのための対象を選択するため、および、ＩＶＦの成功の確率を示すＭＩＣＡレベルを有する対象を選択するための方法に関する。好ましくは、サンプルは、血液、血漿、血清、子宮内膜生検、子宮液、腟および子宮頸管の分泌物、頸管粘液、ダグラス窩、および腹腔鏡探索の場合（子宮内膜症、付着胎盤、感染性の続発症）は腹水のサンプルからなる群より選択される。
【０００９】
第３の態様において、本発明は、対象からの血液、血清、血漿、または精液サンプル中のＭＩＣＡについてのインビトロアッセイを含む、精液または精子の質を判断するため、または、対象において男性不妊の確率を判断するための方法に関し、ＭＩＣＡレベルは精液または精子の質または男性不妊を示す。
【００１０】
第４の態様において、本発明は、胚培養液または上精中でのＭＩＣＡについてのインビトロアッセイを含む、胚の質を判断するため、または、胚移植、体外受精、または着床のために適切な胚を選択するための方法に関し、ＭＩＣＡレベルは胚の質または胚移植、体外受精、もしくは着床のための胚の適切性を示す。
【００１１】
第５の態様において、本発明は、サンプル中のＭＩＣＡについてのインビトロアッセイを含む、対象において不妊症の予後診断および流産、血管性妊娠病（ＶＰＤ）、子癇前症（ＰＥ）、子癇前症に関連する、または、関連しない子宮内発育遅延（ＩＵＧＲ）、ＨＥＬＬＰ症候群、妊娠性脂肪症、妊娠性ネフロパシーまたは子宮内胎児死亡、自己免疫性病理に関連する妊娠病または不妊性を含む妊娠合併症の確率を判断するための方法に関し、ＭＩＣＡレベルは妊娠合併症の確率を示す。
【００１２】
好ましい態様において、サンプル中のＭＩＣＡについてのアッセイの工程は：
− サンプル中の可溶性ＭＩＣＡタンパク質のアッセイ；
− ＭＩＣＡをコード化する無細胞核酸のアッセイ；および
− サンプル中に存在する抗ＭＩＣＡ抗体のアッセイ
から選択される工程を含む。
【００１３】
最も好ましい態様において、サンプル中のＭＩＣＡについてのアッセイの工程は、サンプルを抗ＭＩＣＡ抗体、好ましくはモノクローナル抗体、より好ましくはＳＲ９９、ＳＲ１０４、およびＳＲ１１６からなる群より選択される抗体と接触させることを含む。任意に、サンプル中の可溶性ＭＩＣＡについてのアッセイの工程は、ＥＬＩＳＡアッセイ、好ましくはサンドイッチＥＬＩＳＡアッセイにより実施できる。
【００１４】
第６の態様において、本発明は、生殖の医学および生物学における、抗ＭＩＣＡ抗体、ＭＩＣＡをコード化する核酸に特異的な一連のプライマー、ＭＩＣＡをコード化する核酸に特異的なプローブ、およびＭＩＣタンパク質、好ましくはＭＩＣＡタンパク質から選択される少なくとも１つのエレメントを含むキットのインビトロでの使用に関する。好ましくは、キットは、ＩＶＦのために適切な対象を選択するため、体外受精（ＩＶＦ）の結果を判断するため、精液または精子の質を判断するため、ＩＶＦのために適切な精液または精子を選択するため、対象において男性不妊症の確率を判断するため、胚の質を判断するため、胚移植、体外受精、または着床のために適切な胚を選択するため、妊娠中に高い合併症リスクを有する対象、特に流産、血管性妊娠病、子癇前症、子癇前症に関連する、または、関連しない子宮内発育遅延（ＩＵＧＲ）、ＨＥＬＬＰ症候群、妊娠性脂肪症、妊娠性ネフロパシーまたは子宮内胎児死亡に感受性の高い対象を同定するために使用する。
【００１５】
好ましくは、抗ＭＩＣＡ抗体は、好ましくはＳＲ９９、ＳＲ１０４、およびＳＲ１１６からなる群より選択されるモノクローナル抗体である。任意に、キットは可溶性ＭＩＣＡタンパク質をさらに含む。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１】患者における平均ｓＭＩＣ血清レベルは、着床の成功およびＩＶＦ問題に応じて異なる。ｓＭＩＣ血清レベルの評価は、ＩＶＦ志願者である１７０人の不妊女性においてＩＶＦ開始に先行するサイクルの卵胞期中に得られた。ｓＭＩＣレベルはng/mlである。ドットプロットは、ｓＭＩＣ陽性血液サンプルにおける中央値を、エラーバーは中央値の２５−７５四分位範囲を表す。ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ Ｖｅｒｓｉｏｎ ４ Ｓｏｆｔｗａｒｅを使用してグラフを得た。群は、ＩＶＦ後に着床に失敗した女性（ＩＭＰ−）を、ＩＶＦ後に着床の成功を経験した女性（ＩＭＰ＋）で表される。ＩＭＰ＋群を２群にさらに細分する：ＩＶＦ後に乳児を出産する女性（ＢＢａｂｙ）または着床の成功後に流産を経験する女性（ＭＩＳ）。（着床不全または流産のいずれかの理由で）出産に失敗する女性におけるｓＭＩＣの中央値もＩＭＰ−またはＭＩＳで表される。血液サンプルの採取時に妊娠していない、過去に少なくとも２回の妊娠の成功を経験した、妊娠可能な女性の対照ドナーの群もｓＭＩＣについて評価した（Ｆｅｒｔ Ｃｔｌ）。
【図２】正常妊娠を経験し、期間について対応させた女性（ＮＰ）を参照し、血管性妊娠病（ＶＰＤ）を伴う女性のＭＩＣ＋陽性サンプルにおいて、より高レベルのＭＩＣが見出される。血管性妊娠病は、子宮内発育遅延（ＩＵＧＲ）、子癇前症（ＰＥ）、および子宮内胎児死亡（ＩＵＦＤ）にさらに細分した。
【図３Ａ】（図３Ａ）ｓＭＩＣ状態に依存する子癇前症群における１日当たりのタンパク尿の中央値および四分位範囲 ｓＭＩＣ陽性およびｓＭＩＣ陰性の血漿の間の比較は、ノンパラメトリックなマンホイットニー検定を使用して実施した。（図３Ｂ）子癇前症患者からの子癇前症ｓＭＩＣ陽性群およびｓＭＩＣ陰性血漿における両側性子宮拡張早期切痕（bilateral early diastolic uterine notch）の頻度。
【図３Ｂ】（図３Ａ）ｓＭＩＣ状態に依存する子癇前症群における１日当たりのタンパク尿の中央値および四分位範囲 ｓＭＩＣ陽性およびｓＭＩＣ陰性の血漿の間の比較は、ノンパラメトリックなマンホイットニー検定を使用して実施した。（図３Ｂ）子癇前症患者からの子癇前症ｓＭＩＣ陽性群およびｓＭＩＣ陰性血漿における両側性子宮拡張早期切痕（bilateral early diastolic uterine notch）の頻度。
【００１７】
発明の詳細な説明
本発明は、生殖の医学および生物学の分野におけるバイオマーカーの同定に基づく。実際に、これらは、ＭＩＣＡレベルを使用して、ＩＶＦの結果を予測でき、特にＩＶＦの成功または失敗、胚着床の成功または失敗、および流産の確率を判断できた。加えて、このマーカーは、精液の受精能を評価し、最も生存能力の高い、着床の最高の確率を有する胚を選択するために有用である。このマーカーは妊娠合併症にも関連する。特に、それは、子宮内発育遅延（ＩＵＧＲ）、子宮内胎児死亡、妊娠病、自己免疫病理に関連する不妊症、妊娠性血管病、および子癇前症の確率を定義するために使用できる。
【００１８】
ＭＩＣＡは特許出願国際公開第９８／１９１６７号および国際公開第０３／０８９６１６号において広範囲に記載されており、その開示は参照により本明細書に組み入れられる。ＭＩＣＡのためのＵｎｉｇｅｎｅ ＣｌｕｓｔｅｒはＨｓ．５４９０５３であり、代表的な配列はＥｍｂｌ Ｑ９ＵＤＺ９中でよい。可溶性ＭＩＣＡは切断型タンパク質である。可溶性ＭＩＣＡは膜貫通ドメインおよび細胞質尾部を欠き、３つの細胞外ドメインを含む。
【００１９】
したがって、本発明は、サンプル中のＭＩＣＡについてのインビトロアッセイを含む、体外受精（ＩＶＦ）の結果を判断するための方法に関し、ＭＩＣＡレベルはＩＶＦの結果を示す。方法は、サンプルを提供する前工程を含んでよい。
【００２０】
ＩＶＦの結果は、乳児の出生、着床不全、または流産でよい。
【００２１】
好ましい態様において、方法は、サンプル中の可溶性ＭＩＣＡタンパク質についてのアッセイを含む。別の好ましい態様において、方法は、ＭＩＣＡをコード化する無細胞核酸についてのアッセイを含む。「無細胞」により、細胞中に含まれない核酸を意図する。追加の好ましい態様において、方法は間接的ＭＩＣＡアッセイを含み、サンプル中に存在する抗ＭＩＣＡ抗体のアッセイを含む。
【００２２】
サンプルは対象から提供できる。
【００２３】
第１の態様において、対象は移植胚を受ける女性である。対象は卵母細胞提供者でもよい。好ましい態様において、サンプルは、血液、血漿、血清、子宮内膜生検、子宮液、腟および子宮頸管の分泌物、頸管粘液、ダグラス窩、および腹腔鏡探索の場合（子宮内膜症、付着胎盤、感染性の続発症）は腹水のサンプルからなる群より選択される。好ましい態様において、サンプルは、血液、血漿、または血清のサンプル、好ましくは血清サンプルである。
【００２４】
好ましくは、可溶性ＭＩＣＡレベルは、ホルモン前処置の開始前に測定する。第１の特定の態様において、ホルモン前処置の開始前に、血清サンプル中の２．４５ng/mlを上回るＭＩＣＡレベルがより高い着床不全率を示す。したがって、本発明は、対象が移植胚を受けることを意図する女性であって、可溶性ＭＩＣＡレベルがホルモン前処置の開始前に測定され、血清サンプル中の２．４５ng/mlを上回るＭＩＣＡレベルがより高い着床不全率を示す方法に関する。第２の特定の態様において、ホルモン前処置の開始前に、血清サンプル中の２８ng/mlを上回るＭＩＣＡレベルがＩＶＦの失敗の高い確率を示す。したがって、本発明は、対象が移植胚を受けることを意図する女性であって、可溶性ＭＩＣＡレベルがホルモン前処置の開始前に測定され、血清サンプル中の２８ng/mlを上回るＭＩＣＡレベルがＩＶＦの失敗の高い確率を示す方法に関する。第３の特定の態様において、ホルモン前処置の開始前に、血清サンプル中の６ng/mlを上回るＭＩＣＡレベルが流産の高い確率を示す。したがって、本発明は、対象が移植胚を受けることを意図する女性であって、可溶性ＭＩＣＡレベルがホルモン前処置の開始前に測定され、血清サンプル中の６ng/mlを上回るＭＩＣＡレベルが流産の高い確率を示す方法に関する。
【００２５】
可溶性ＭＩＣＡタンパク質のレベルは、着床後にも測定できる。したがって、第４の特定の態様において、着床後、血清サンプル中の３．２ng/mlを上回るＭＩＣＡレベルが流産の高い確率を示す。したがって、本発明は、対象が移植胚を受ける女性であって、可溶性ＭＩＣＡタンパク質のレベルが着床後にも測定でき、血清サンプル中の３．２ng/mlを上回るＭＩＣＡレベルが流産の高い確率を示す方法に関する。
【００２６】
第５の特定の態様において、低いＭＩＣＡレベルはＩＶＦの成功の高い確率を示す。特に、ホルモン前処置前に、２８ng/ml未満、好ましくは６ng/ml未満、より好ましくは２．４５ng/ml未満の血清サンプル中のＭＩＣＡレベルが、ＩＶＦの成功、好ましくはＩＶＦの成功の高い確率を示す。
【００２７】
したがって、本発明は、対象のサンプル中のＭＩＣＡについてのインビトロアッセイおよびＩＶＦの成功の確率を示すＭＩＣＡレベルを有する対象を選択することを含む、ＩＶＦのために適切な対象を選択するための方法に関する。方法は、対象からのサンプルを提供する前工程を含んでよい。対象は、特に、ＮＦのための志願者である女性である。サンプルは、血液、血漿、血清、子宮内膜生検、子宮液、腟および子宮頸管の分泌物、頸管粘液、ダグラス窩、および腹腔鏡探索の場合（子宮内膜症、付着胎盤、感染性の続発症）は腹水のサンプルからなる群より選択できる。好ましい態様において、サンプルは、血液、血漿、または血清のサンプル、好ましくは血清サンプルである。サンプルは直接的に使用できる、または、前処置にかけることができる。
【００２８】
ＩＶＦのために適切な対象を選択するための方法の好ましい態様において、方法はサンプル中の可溶性ＭＩＣＡタンパク質についてのアッセイを含む。可溶性ＭＩＣＡレベルは、好ましくは、ホルモン前処置の開始前に測定される。例えば、２８ng/ml未満、好ましくは６ng/ml未満、より好ましくは２．４５ng/ml未満の血清サンプル中の可溶性ＭＩＣＡレベルは、ＩＶＦの成功の確率を示す。他の好ましい態様において、方法は、ＭＩＣＡをコード化する無細胞核酸についてのアッセイを含む。「無細胞」により、細胞中に含まれない核酸を意図する。追加の好ましい態様において、方法は間接的ＭＩＣＡアッセイを含み、サンプル中に存在する抗ＭＩＣＡ抗体のアッセイを含む。サンプル中のＭＩＣＡレベルは、好ましくは、ホルモン前処置の開始前に測定される。
【００２９】
第２の態様において、対象は、精液を提供する男性である。この態様において、サンプルは、血液、血漿、血清、および精液のサンプルからなる群より選択できる。新鮮な射精された精液、精子の受精能獲得のための調製後の新鮮な精液、凍結前または後の精巣上体精子、および凍結前または後の精巣の精子からなる群より選択できる。実際に、サンプル中のＭＩＣＡの存在は、低い受精能を示す。好ましい態様において、方法は、サンプル中の可溶性ＭＩＣＡについてのアッセイを含む。別の好ましい態様において、方法は、ＭＩＣＡをコード化する無細胞核酸についてのアッセイを含む。
【００３０】
したがって、本発明は、精液を提供する男性の血液、血漿、血清、または精液のサンプル中のＭＩＣＡレベルを測定することによる精液または精子の質を判断するための方法にも関する。方法は、対象からのサンプルを提供する前工程を含んでよい。好ましい態様において、方法は、サンプル中の可溶性ＭＩＣＡタンパク質についてのアッセイを含む。別の好ましい態様において、方法は、ＭＩＣＡをコード化する無細胞核酸についてのアッセイを含む。特に、精液または精子の質を使用し、その受精能を判断する。好ましくは、サンプル中のＭＩＣＡレベルは、精液または精子の質、ひいてはＩＶＦの成功の確率を示す。好ましくは、ＭＩＣＡレベルが高いほど、精液または精子の質、ひいてはＩＶＦの成功の確率は低い。
【００３１】
本発明は、さらに、精液を提供する男性の血液、血漿、血清、または精液のサンプル中のＭＩＣＡレベルを測定することを含む、卵母細胞のＩＶＦのために適切な精液または精子を選択するための方法に関する。方法は、対象からのサンプルを提供する前工程を含んでよい。実際に、ＭＩＣＡの存在は着床不全に関連してきた。好ましくは、最低のＭＩＣＡレベルを示すサンプルをＩＶＦのために選択する。好ましい態様において、方法は、サンプル中の可溶性ＭＩＣＡタンパク質についてのアッセイを含む。別の好ましい態様において、方法は、ＭＩＣＡをコード化する無細胞核酸についてのアッセイを含む。
【００３２】
加えて、本発明は、対象からの血液、血漿、血清、または精液のサンプル中のＭＩＣＡレベルを測定することを含む、対象において男性不妊の確率を判断するための方法に関する。方法は、対象からの血液、血漿、血清、または精液のサンプルを提供する前工程を含んでよい。実際に、ＭＩＣＡの存在は男性不妊に関連してきた。好ましい態様において、方法は、サンプル中の可溶性ＭＩＣＡタンパク質についてのアッセイを含む。別の好ましい態様において、方法は、ＭＩＣＡをコード化する無細胞核酸についてのアッセイを含む。
【００３３】
第３の態様において、対象は、卵母細胞を提供する女性である。対象は受ける女性でもよい。実際に、ＭＩＣＡの存在は、卵母細胞、ひいては胚の質を評価するために利用でき、ＭＩＣＡの存在は生存および／または着床の低い確率を示す。好ましい態様において、サンプルは、血液、血漿、血清、子宮内膜生検、子宮液、腟および子宮頸管の分泌物、頸管粘液、ダグラス窩、および腹腔鏡探索の場合（子宮内膜症、付着胎盤、感染性の続発症）は腹水のサンプルからなる群より選択される。特に、サンプルは、卵胞液、例えば卵母細胞回収後の卵胞穿刺により得られる卵胞液でよい。この液は、ＨＣＧによる排卵誘発後の膣穿刺により提供できる。
【００３４】
サンプルは、胚上精または胚培養液からも提供できる。特定の態様において、上精または培養液は、移植すること、または、凍結することを目的とする胚に由来する。
【００３５】
サンプルは、直接的に使用でき、または、凍結、精製、加熱、濃縮、希釈などの前処置にかけてよい。
【００３６】
したがって、本発明は、胚の培養液または上精中のＭＩＣＡレベルを測定することにより胚の質を判断するための方法にも関する。ＭＩＣＡレベルは、受精から少なくとも４４〜４６時間後、好ましくは、受精から６０、７０、８０、または９０時間後に測定する。好ましい態様において、方法は、サンプル中の可溶性ＭＩＣＡタンパク質についてのアッセイを含む。別の好ましい態様において、方法は、ＭＩＣＡをコード化する無細胞核酸についてのアッセイを含む。特に、胚の質を使用して、胚の着床の成功の潜在能力を判断する。好ましくは、胚の培養液または上精中のＭＩＣＡレベルは、胚の質、ひいては胚の着床の成功の確率を示す。好ましくは、ＭＩＣＡレベルが高いほど、胚の質、ひいては胚の着床の成功の確率は低い。
【００３７】
本発明は、胚移植、体外受精、または着床のために適切な胚を選択するための方法にも関し、方法は胚の培養液または上精中のＭＩＣＡレベルを測定することを含む。特に、ＭＩＣＡレベルは、胚移植、体外受精、または着床のための胚の適切性を示す。好ましくは、培養液中で最低のＭＩＣＡレベルを示す胚を、胚移植、体外受精、または着床のために選択する。実際に、ＭＩＣＡの存在は着床不全に関連してきた。好ましい態様において、方法は、サンプル中の可溶性ＭＩＣＡタンパク質についてのアッセイを含む。別の好ましい態様において、方法は、ＭＩＣＡをコード化する無細胞核酸についてのアッセイを含む。
【００３８】
本発明は、さらに、本発明の方法で胚を選択すること、および、適合性のあるヒト子宮内に胚を移植することを含む、ＩＶＦの方法に関する。
【００３９】
別の局面において、本発明は、サンプル中のＭＩＣＡについてのインビトロアッセイを含む、対象において流産、血管性妊娠病、子癇前症、子癇前症に関連する、または、関連しない血管性または非血管性の子宮内発育遅延（ＩＵＧＲ）、ＨＥＬＬＰ症候群、妊娠性脂肪症、妊娠性ネフロパシーまたは子宮内胎児死亡を含む妊娠合併症の確率を判断するための方法に関し、ＭＩＣＡレベルは、流産、血管性妊娠病、子癇前症、子癇前症に関連する、または、関連しない血管性または非血管性の子宮内発育遅延（ＩＵＧＲ）、ＨＥＬＬＰ症候群、妊娠性脂肪症、妊娠性ネフロパシーまたは子宮内胎児死亡を含む妊娠合併症の確率を示す。特に、本発明は、子癇前症の重症度を判断するために有用である。したがって、本発明は、サンプル中のＭＩＣＡについてのインビトロアッセイを含む、対象において重度の子癇前症の確率を判断するための方法に関し、ＭＩＣＡレベルは重度の子癇前症の確率を示す。
【００４０】
方法は、サンプルを提供する前工程を含んでよい。
【００４１】
この方法において使用するサンプルは、血液、血漿、血清、胎盤、臍帯血、内皮細胞、および羊水のサンプルからなる群より選択できる。好ましい態様において、サンプルは、血液、血漿、または血清のサンプル、好ましくは血清サンプルである。サンプルは直接的に使用できる、または、前処置にかけることができる。
【００４２】
対象は、好ましくは、妊娠した女性または妊娠することを望む女性である。
【００４３】
好ましい態様において、方法は、サンプル中の可溶性ＭＩＣＡタンパク質についてのアッセイを含む。別の好ましい態様において、方法は、ＭＩＣＡをコード化する無細胞核酸についてのアッセイを含む。追加の好ましい態様において、方法は間接的なＭＩＣＡアッセイを含み、サンプル中に存在する抗ＭＩＣＡ抗体のアッセイを含む。
【００４４】
好ましくは、可溶性ＭＩＣＡレベルは胚着床後に測定する。
【００４５】
好ましくは、例えば少なくとも０．３ng/ml、０．５ng/ml、０．７５ng/ml、または１ng/mlの血清サンプル中の可溶性ＭＩＣＡの検出は、流産、血管性妊娠病、子癇前症、子癇前症に関連する、または、関連しない血管性または非血管性の子宮内発育遅延（ＩＵＧＲ）、ＨＥＬＬＰ症候群、妊娠性脂肪症、妊娠性ネフロパシーまたは子宮内胎児死亡を含む異常妊娠、より好ましくはＶＰＤ、子癇前症、血管性ＩＵＧＲ、ＩＵＦＤ、およびそれらの組み合わせからなる群より選択される病理のより高い確率を示す。好ましくは、例えば少なくとも０．３ng/ml、０．５ng/ml、０．７５ng/ml、または１ng/mlの血清サンプル中の可溶性ＭＩＣＡの検出も、重度の子癇前症、特に腎不全および／または胎盤機能不全の反映である両側性子宮拡張早期切痕を反映するタンパク尿に関連する子癇前症のより高い確率を示す。特定の態様において、２．５ng/mlまたは１０ng/mlを上回る血清サンプル中の可溶性ＭＩＣＡレベルは、流産、血管性妊娠病、子癇前症、子癇前症に関連する、または、関連しない子宮内発育遅延（ＩＵＧＲ）、ＨＥＬＬＰ症候群、妊娠性脂肪症、妊娠性ネフロパシーまたは子宮内胎児死亡を含む異常妊娠のより高い確率を示す。
【００４６】
本発明は、サンプル中のＭＩＣＡについてのインビトロアッセイを含む、対象において非血管性の子宮内発育遅延（ＩＵＧＲ）から血管性の子宮内発育遅延（ＩＵＧＲ）を識別するための方法にも関し、ＭＩＣＡレベルは血管性ＩＵＧＲの確率を示す。好ましくは、サンプルは、血液、血漿、または血清のサンプル、好ましくは血清サンプルである。より好ましくは、好ましくは少なくとも０．３ng/ml、０．５ng/ml、０．７５ng/ml、または１ng/mlのサンプル中の可溶性ＭＩＣＡの検出が、血管性ＩＵＧＲを示す。好ましくは、可溶性ＭＩＣＡレベルは胚着床後に判断する。
【００４７】
上に示す通り、ＭＩＣＡをアッセイする工程は、サンプル中の可溶性ＭＩＣＡタンパク質のアッセイを含んでよい。好ましい態様において、体液サンプル中の可溶性ＭＩＣＡタンパク質についてのアッセイの工程は、サンプルを抗ＭＩＣＡ抗体と接触させることを含む。好ましい態様において、サンプル中の可溶性ＭＩＣＡについてのアッセイの工程は、ＥＬＩＳＡアッセイ、好ましくはサンドイッチＥＬＩＳＡアッセイにより実施できる。タンパク質、特に可溶性タンパク質の分析および定量化のためのＥＬＩＳＡ技術は、当業者に周知である。代わりの態様において、サンプル中の可溶性ＭＩＣＡについてのアッセイの工程は、抗体のマイクロビーズ（Luminex technology）への結合、ウエスタンブロット、ドットブロット、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、ＦＡＣＳ分析、および当業者に周知の他のイムノアッセイ技術により実施する。
【００４８】
例えば、ＥＬＩＳＡアッセイは以下の通りに実施できる：試験サンプルをポリスチレンマイクロタイタープレートのウェル上に固定する；抗ＭＩＣＡ抗体をウェルに添加する；結合および非特異的結合を除去するための洗浄後、結合した抗ＭＩＣＡ抗体を検出する。検出は、抗ＭＩＣＡ抗体に特異的な検出可能な抗体の添加により達成できることが多い。例えば、それは二次抗体（例えば、ヤギからの抗マウスＩｇＧ抗体）のＦｃ部分に対する三次抗体により検出できる。あるいは、抗ＭＩＣＡ抗体を標識できる。
【００４９】
好ましくは、サンドイッチＥＬＩＳＡアッセイは以下の通りに実施できる：抗ＭＩＣＡ抗体をポリスチレンマイクロタイタープレートのウェル上に固定する；試験サンプルをウェルに添加する；結合および非特異的結合を除去するための洗浄後、結合したＭＩＣＡを抗ＭＩＣＡ二次抗体により検出する。検出は、抗ＭＩＣＡ抗体に特異的な検出可能な抗体の添加により達成できることが多い。例えば、それは二次抗体（例えば、ヤギからの抗マウスＩｇＧ抗体）のＦｃ部分に対する三次抗体により検出できる。あるいは、抗ＭＩＣＡ二次抗体を標識できる。
【００５０】
本発明のおいて有用な抗ＭＩＣＡ抗体は、ポリクローナルまたはモノクローナルでよい。抗体は、任意のクラス、好ましくはＩｇＧ１またはＩｇＧ２ａでよい。それらは、ＭＩＣＡ、特に可溶性ＭＩＣＡに特異的でよい。これらの抗体は、ＭＩＣＡの細胞外部分に結合できる。あるいは、それらはＭＩＣＡおよびＭＩＣＢの両方に結合できる。
【００５１】
抗体を調製および特性付けするための手段は、当技術分野において周知である（Harlow and Lane, Antibodies: A Laboratory Manual., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY (1988)）。抗体のより具体的な例は以下である：国際公開第０３／０８９６１６号における２Ｃ１０、６Ｄ４、６Ｇ６、ならびに３Ｈ５、および、Hue et al. (2003)におけるＳＲ９９、ＳＲ１０４、ならびにＳＲ１１６。好ましくは、抗ＭＩＣＡ抗体は、好ましくはＳＲ９９、ＳＲ１０４、およびＳＲ１１６からなる群より選択されるモノクローナル抗体である。
【００５２】
抗ＭＩＣＡ抗体は標識できる。標識は、放射能、蛍光、化学発光、酵素、またはリガンドでよい。抗ＭＩＣＡ抗体は非標識でもよく、標識される検出剤と併用できる。例えば、それらは抗ＭＩＣＡ抗体（例えば、ヤギからの抗マウスＩｇＧ抗体）のＦｃ部分に対する二次抗体により検出できる。
【００５３】
上に示した通り、ＭＩＣＡをアッセイする工程は、ＭＩＣＡをコード化する無細胞核酸のアッセイを含んでよい。ＭＩＣＡをコード化する核酸はＲＮＡまたはＤＮＡでよい。ホモサピエンスＭＩＣＡをコード化するｍＲＮＡのＧｅｎｂａｎｋエントリーは、ＮＭ＿０００２４７である。ホモサピエンスＭＩＣＡのＧｅｎｅＩＤは４２７６である。ＭＩＣＡをコード化するそのような無細胞核酸は体液サンプル中で遊離でき、および／または、循環マイクロ粒子、特に血液または血清のサンプル中に存在するマイクロ粒子中に含まれてよい。ＭＩＣＡをコード化する核酸は、当業者により周知の任意の手段によりアッセイできる。例えば、それは、リアルタイム定量的ＰＣＲ、ＲＴ−ＰＣＲにより、適切なプライマーおよびプローブを使用することによるサザンブロットもしくはノーザンブロットまたはそれらの組み合わせによりアッセイできる。好ましい態様において、それは、定量的ＰＣＲまたはＲＴ−ＰＣＲによりアッセイする。当業者は、適切なプライマー対を容易にデザインできる。例えば、ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎによる定量的ＲＴ−ＰＣＲによりＭＩＣＡ ＲＮＡをアッセイするために適切なプライマー対は以下でよい：ＭＩＣＡ ９７０ＦおよびＭＩＣＡ １１２７Ｒ。
【００５４】
【表１】
【００５５】
これらの技術を適用する前に、サンプルの核酸を精製または濃縮できる。ＭＩＣＡをコード化する核酸の検出は、特許出願国際公開第９８／１９１６７号において広範囲に記載されており、その開示は参照により本明細書によって組み入れられる。
【００５６】
上に示す通り、ＭＩＣＡをアッセイする工程は、サンプル中に存在する抗ＭＩＣＡ抗体を含んでよい。例えば、抗ＭＩＣＡ抗体は、ＭＩＣＡタンパク質、好ましくは組み換えＭＩＣＡタンパク質を使用してＥＬＩＳＡアッセイにより検出できる。そのようなＭＩＣＡタンパク質を調製するための方法は、特許出願国際公開第９８／１９１６７号および国際公開第０３／０８９６１６号において広範囲に記載されており、その開示は参照により本明細書によって組み入れられる。あるいは、サンプル中の抗ＭＩＣＡ抗体をアッセイする工程は、ＭＩＣ、好ましくはＭＩＣＡのマイクロビーズ（Luminex technology）への結合により実施できる。市販キットＬａｂｓｃｒｅｅｎ（Ｏｎｅ Ｌａｍｂｄａ， ｒｅｆ ＬＳＭＩＣＡ００１）は、Ｌｕｍｉｎｅｘにより血清サンプル中の抗ＭＩＣ抗体をアッセイするために有用である。抗ＭＩＣ抗体のためのそのようなアッセイは、不妊に関連する自己免疫病理（セリアック病、ＡＰＳ・・・）における自己抗体アッセイのために有効になりうる。このアッセイは、免疫学的病因（子癇前症、習慣流産）を伴う妊娠性病理を有する女性の場合にも価値がある。
【００５７】
加えて、本発明は、対象からのサンプル中のＭＩＣＡレベルを測定することを含む、自己免疫疾患または異常を患う対象において不妊の確率を判断するための方法に関し、ＭＩＣＡレベルは対象での不妊の確率を示す。任意に、方法は、対象からのサンプルを提供する前工程を含んでよい。サンプルは、血液、血漿、血清、子宮内膜生検、子宮液、腟および子宮頸管の分泌物、頸管粘液、ダグラス窩、卵胞液、腹腔鏡探索の場合は腹水、および精液からなる群より選択できる。好ましい態様において、方法は、サンプル中の可溶性ＭＩＣＡタンパク質についてのアッセイを含む。別の好ましい態様において、方法は、ＭＩＣＡをコード化する無細胞核酸についてのアッセイを含む。追加の好ましい態様において、方法は、サンプル中に存在する抗ＭＩＣＡ抗体のアッセイを含む。
【００５８】
本発明は、生殖の医学および生物学における、抗ＭＩＣＡ抗体、ＭＩＣＡをコード化する核酸に特異的な一連のプライマー、ＭＩＣＡをコード化する核酸に特異的なプローブ、およびＭＩＣＡタンパク質からなる群より選択される少なくとも１つのエレメントを含むキットの使用にも関する。それは、抗ＭＩＣＡ抗体、ＭＩＣＡをコード化する核酸に特異的な一連のプライマー、ＭＩＣＡをコード化する核酸に特異的なプローブ、およびＭＩＣＡタンパク質からなる群より選択される少なくとも１つのエレメントを含む、生殖の医学および生物学のためのキットにも関する。ＭＩＣＡタンパク質は可溶性ＭＩＣＡでよい。キットは、説明書、任意の適切な陰性および陽性対照、標準タンパク質、および／または検出試薬をさらに含んでよい。
【００５９】
好ましい態様において、キットは抗ＭＩＣＡ抗体を含む。キットは、可溶性ＭＩＣタンパク質、好ましくはＭＩＣＡタンパク質をさらに含んでよい。可溶性ＭＩＣＡは、切断型ＭＩＣＡの組み換え発現により産生できる。可溶性ＭＩＣＡは、細菌、酵母、哺乳動物、昆虫の細胞などの適切な宿主細胞から発現できる。精製を容易にするために、ＭｙｃまたはＨｉｓタグなどのタグをコード配列中に含めてよい。そのような可溶性ＭＩＣＡは、陽性対照のために利用できる。組み換え可溶性ＭＩＣＡ分子は、Hue et al., 2003 (p. 1910)において記載の通りに調製でき、その開示は参照により本明細書に組み入れられる。キットは、任意にマイクロタイタープレートのウェル上に固定した抗ＭＩＣＡ抗体を有するマイクロタイタープレートをさらに含んでよい。最後に、キットは、任意の適切な免疫検出試薬または溶剤を含んでよい。本発明は、特に、体外受精（ＩＶＦ）の失敗、胚着床不全、流産、子宮内発育遅延、および子癇前症の確率のためのキットの使用にも関する。好ましくは、抗ＭＩＣＡ抗体は、好ましくはＳＲ９９、ＳＲ１０４、およびＳＲ１１６からなる群より選択されるモノクローナル抗体である。特定の態様において、キットはさらに可溶性ＭＩＣＡタンパク質を含む。
【００６０】
本発明は、ＩＶＦのために適切な対象を選択するため、体外受精（ＩＶＦ）の結果を判断するため、精液または精子の質を判断するため、ＩＶＦのために適切な精液または精子を選択するため、対象において男性不妊の確率を判断するため、胚の質を判断するため、胚移植、体外受精、または着床のために適切な胚を選択するため、妊娠中に高い合併症リスクを有する対象、特に流産、血管性妊娠病、子癇前症、子癇前症に関連する、または、関連しない子宮内発育遅延（ＩＵＧＲ）、ＨＥＬＬＰ症候群、妊娠性脂肪症、妊娠性ネフロパシーまたは子宮内胎児死亡に感受性の高い対象を同定するため、子癇前症の重症度を判断するため、または非血管性の子宮内発育遅延（ＩＵＧＲ）から血管性の子宮内発育遅延（ＩＵＧＲ）を識別するため、および自己免疫疾患、特にセリアック病または抗リン脂質抗体症候群（ＡＰＳ）を有する対象において不妊症の確率を判断するための本発明のキットの使用にも関する。
【００６１】
本発明は、ＳＲ９９、ＳＲ１０４、およびＳＲ１１６からなる群より選択される少なくとも１つの抗ＭＩＣＡ抗体を含む、可溶性ＭＩＣＡをアッセイするためのキットにも関する。好ましくは、キットは、２つの抗ＭＩＣＡ抗体、特にＳＲ９９およびＳＲ１０４を含む。任意に、２つの抗体の１つを標識する（例、ビオチン化抗体）。好ましい態様において、キットはサンドイッチＥＬＩＳＡアッセイのために適切である。本発明は、さらに、本発明の方法におけるこのキットの使用に関する。
【００６２】
追加で、本発明の方法および使用のいずれか１つにおけるＭＩＣＡのアッセイは、当技術分野において公知の他のマーカーのアッセイと組み合わせることができる。いくつかのマーカーの組み合わせによって、予測可能性をさらに増加できる。例えば、これらの追加マーカーは、ＨＬＡ−Ｇならびにエンドグリン、ＰＩＧＦ、およびｓＦＬＴ１などの血管新生マーカーからなる群において選択できる。これらの追加マーカーをアッセイするために、キットは、抗体、プライマー、ＨＬＡ−Ｇ、エンドグリン、ＰＩＧＦおよび／またはｓＦＬＴ１抗体などの１または複数の追加マーカーに特異的なプローブ、ＨＬＡ−Ｇ、エンドグリン、ＰＩＧＦまたはｓＦＬＴ１をコード化する核酸に特異的な一連のプライマー、および／またはＨＬＡ−Ｇ、エンドグリン、ＰＩＧＦまたはｓＦＬＴ１をコード化する核酸に特異的なプローブからなる群より選択される１または複数の追加エレメントを含んでよい。
【００６３】
本発明のさらなる局面および利点が、以下の実験の項において開示され、それらは説明と見なされるべきであり、本発明の範囲を限定しない。本明細書および実施例において引用する文献、特許、および特許出願を含む、すべての参考文献の内容は、すべて参照により本明細書に組み入れられる。
【００６４】
実施例
実施例１：可溶性ＭＩＣの血清レベルは、体外受精後の着床不全および満期妊娠の成功の予測マーカーである。
【００６５】
子宮ＮＫ（ｕＮＫ）は、胚着床部位で見出される主要なリンパ球系細胞集団であり、妊娠中期後に次第に消失する。母親において機能する自然免疫機構は、このように半同種異系胎児の許容性において強力な影響を有すると考えられる。特に、ｕＮＫ受容体は父親の／トロホブラスのトリガンドを認識し、それによって母親の免疫系による胎児攻撃が防がれる。
【００６６】
通常は胎児母体接触面で発現する既知のＮＫ阻害リガンドである可溶性ＨＬＡ−Ｇの存在は、胚上精において、体外受精（ＩＶＦ）後のより高い胚着床率と相関する（Fuzzi et al., 2002; Warner et al., 2004）。ｕＮＫ上の母親のキラー免疫グロブリン受容体（ＫＩＲ）と胎児ＨＬＡ−Ｃの間の相互作用も生殖の成功に影響を及ぼす（Hiby et al., 2004; Parham, 2004; Wu et al., 2004）。加えて、ｕＮＫ細胞は、着床および胎盤形成に有利となる血管新生因子およびサイトカインを分泌する（Ashkar et al., 2003; Coulam et al., 2003; Hanna et al., 2006; Ledee-Bataille et al., 2004; Moffett-King, 2002）。
【００６７】
したがって、発明者らは、ｕＮＫ細胞の任意の機能障害が、このように着床および妊娠の成功を妨げるはずであると推定した。
【００６８】
ｓＭＩＣストレス誘導性ＭＨＣクラスＩ関連分子の発現の機能上の意味が、腫瘍学（Carbone et ai., 2005; Groh et al., 2005; Groh et al., 1998）および自己免疫（Hue et ai., 2004; Meresse et al., 2004）において広く探索されてきた。同種異系または自己細胞上でのストレス誘導性ＮＫＧ２Ｄリガンド発現は、ＮＫ細胞の細胞毒性およびサイトカイン／ケモカインの産生を標的とすることが示されてきた（Andre et al., 2004; Lanier, 2005; Meresse et al., 2004; Raulet et al., 2003; Sutherland et al., 2002）。活性化および刺激の二重機構が、ＮＫＧ２Ｄ受容体による可溶性ＭＩＣの関与に関連付けられてきた。実際に、一部の癌患者の血清中の可溶型ＭＩＣ（ｓＭＩＣ）の放出が、刺激性ＮＫＧ２Ｄ受容体のエフェクターＮＫおよびＴリンパ球における内在化を誘導することが示されており、このように、先天性および適応性の抗腫瘍免疫応答ならびに腫瘍増殖に有利となる逸脱機構の両方を損なう（Groh et al., 2002; Wu et al., 2004）。胎盤由来ｓＭＩＣによるＮＫＧ２Ｄのそのような下方制御も、妊娠中に母親の免疫応答を下方制御しうる免疫逸脱機構として近年示されてきた（Mincheva-Nilsson et al., 2006）。
【００６９】
しかし、ｓＭＩＣストレス誘導性ＭＨＣクラスＩ関連分子は、生殖不全に関して全く研究されてこなかった。初めて、発明者らは、体外受精（ＩＶＦ）後に妊娠できない、または、生存能力のある乳児を産めない女性において血清ｓＭＩＣＡを証明できるか否かについて研究した。
【００７０】
材料および方法
対象および方法
【００７１】
現地の倫理委員会により承認された今回の前向き試験は、マルセイユのLa Conception HospitalのCenter of Assisted Reproductive MedicineでＩＶＦまたはＩＣＳＩを受けた連続的な一連の不妊患者で実施された（２００４年１月〜２００５年１０月）。１７０人の不妊女性のコホートは、すべてＩＶＦのための志願者であり、所定の同意後に本試験のために募集された。臨床的適応症は、原因不明の不妊、男性不妊、および卵管要因であった。含まれた女性のいずれも過去の妊娠歴は有さなかった。ＩＶＦに先立つサイクルの卵胞期中に血漿サンプルを採取した。すべての患者が同様の刺激措置を受けた。卵巣刺激は、Ｇｎｒｈアゴニストアナログでの下垂体の下方制御後に開始した組み換えＦＳＨ（Gonal F（登録商標）, Serono Pharma, Paris, France; Puregon（登録商標）, Organon France, Paris, France）を使用することにより実施した。完全な下垂体脱感作が、５０pg/ml未満の低い血漿中エストラジオール、および卵巣嚢腫を除外するための超音波検査の両方により確認され、５mm未満の子宮内膜厚が確認された。少なくとも３個の卵胞の直径が１６mmを超えた時にヒト絨毛膜性ゴナドトロピン１００００UI（ＨＣＧ）を投与した。卵母細胞の回収は、ＨＣＧ投与から３２〜３４時間後に経腟超音波誘導および全身麻酔により実施した。黄体期は、胚移植日から天然プロゲステロンで支持した。胚移植は、卵母細胞の採取後２日目または３日目に実施した。胚移植から１５日後に血清ＨＣＧ測定を１回実施した。臨床上の妊娠は、胎児の心拍を伴う子宮内胎嚢が経腟超音波検査により検出された場合に定義した。
【００７２】
採取した卵母細胞は、血清代替サプリメントを加えた６００μlの培養液を伴う４ウェルマルチディッシュ中で培養した。各ウェルは１から４個の卵母細胞を含んだ。ＩＶＦまたはＩＣＳＩ技術を精子注入のために使用した。卵母細胞の受精が倒立顕微鏡下で精液注入から１６〜１８時間後に観察され、受精率を算出した。胚は培養において４８時間または７２時間後に試験し、切断率を評価し、４個までの胚を移植のために選んだ。割球の数および断片化の量に従って、胚を工程分けした。使用した工程は：工程１（断片なし）、工程２（＜２０%）、工程３（２０〜５０%断片化）、工程４（＞５０%断片化）。
【００７３】
血漿中の可溶性ＭＩＣレベルのＥＬＩＳＡアッセイ
可溶性ＭＩＣＡ分子の構築、発現、および精製：組み換え可溶性ＭＩＣＡ分子をHue et al., 2003 (p. 1910)において記載の通りに調製しているが、その開示は参照により本明細書に組み入れられる。
【００７４】
抗ＭＩＣＡ ｍＡｂの産生：抗ＭＩＣＡモノクローナル抗体をHue et al., 2003 (p. 1910)において記載の通りに調製しているが、その開示は参照により本明細書に組み入れられる。
【００７５】
ＥＬＩＳＡによる可溶性ＭＩＣＡの検出：血清中の可溶性ＭＩＣＡを検出するために、２つの異なる抗ＭＩＣ ｍＡｂをサンドイッチＥＬＩＳＡにおいて使用した。高結合ポリスチレンプレート（Greiner; Sigma-Aldrich）を捕捉ＳＲ９９ Ａｂ（ＰＢＳ中５μg/ml、１００μl／ウェル）で、４℃で１２時間コーティングし、ＰＢＳ＋０．０５%Ｔｗｅｅｎ２０で５回洗浄し、１００μｌの５%ＢＳＡの添加により２２℃で１時間ブロッキングし、ＰＢＳ−０．０５%Ｔｗｅｅｎ２０中で洗浄した。スタンダード（ＰＢＳ−０．０５%Ｔｗｅｅｎ２０中の１００μg/mlから０．１ng/mlの可溶性ｒＭＩＣＡの連続希釈）および血清サンプル（１００μl／ウェル）を次に室温で２時間添加した。５回の洗浄後、ビオチン化ＳＲ１０４検出Ａｂ（ＰＢＳ中１５０ng/ml、１００μl／ウェル）を室温で１時間添加した。プレートを洗浄し、ストレプトアビジン抱合ＨＲＰ（１／３０，０００；Amersham Pharmacia Biotech）と室温で２０分間インキュベートし、洗浄し、テトラメチルベンジジン基質（Sigma-Aldrich）と３７℃で１５分間反応した。反応を０．５M Ｈ２ＳＯ４（５０μl／ウェル）で停止した。吸光度を４５０nmで測定した。組み換え可溶性ＭＩＣＡタンパク質の検出閾値は０．１ng/mlであった。
【００７６】
統計分析
群間の差は、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ ｓｏｆｔｗａｒｅ ｖｅｒｓｉｏｎ ４．０ｂを使用して、データが正規分布しているか否かに応じて、ｏｎｅｗａｙ ＡＮＯＶＡ、スチューデントのｔ−検定、またはマンホイットニー順位和検定による統計的有意性について評価した。カイ二乗分析を使用して、様々な独立群間でのｓＭＩＣの頻度を比較した。受信者動作特性曲線（ＲＯＣ）分析を使用して、ＳＭＩＣＡ濃度のカットオフポイントおよびそれらの感度／特異性を分析した。測定したカットオフをさらに使用して、相対リスクおよびオッズ比を評価した。有意なｐ値は＜０．０５に設定した。
【００７７】
結果
より高いｓＭＩＣ血清レベルが、ＩＶＦ後に着床不全を経験する不妊女性において見出される。
【００７８】
含まれた患者１７０人の内、３８人がＩＶＦ後に胚着床の成功を経験したが、その内の妊娠中の３０人が期間終了時に生存可能な乳児を生み、着床の成功後に８の流産が起こった。３人の患者が８ＳＡに、２人の患者が９ＳＡに、２人の患者が６ＳＡに、１人の患者が７ＳＡに流産を経験した。病理報告（＞８ＳＡの喪失について実現）は、遺伝子喪失を支持しなかった。患者の特徴を表１においてまとめる。
【００７９】
血清ｓＭＩＣを記載の通りに（Hue et al., 2004）サンドイッチＥＬＩＳＡを使用して測定した。ＩＶＦを経験した６４人（３８%）の患者が、検出可能なｓＭＩＣ血清レベルを有していた（平均＝１５．２８ng/ml、上下９５%範囲＝１０．７〜１９．９ng/ml）。
【００８０】
これらの群において正規化した場合にパラメーターがＩＶＦの結果に関連するとの事実にもかかわらず（表１）、陽性患者における平均ｓＭＩＣレベルは、着床不全群と比較し、胚着床の成功を有する女性（中央値＝２．５、２５−７５%パーセンタイル範囲：１．５−９．７）において有意に異なった（１２．０，３−２４．２，ｐ＜０．０２１）。発明者らは、このように、ｓＭＩＣレベルの値がｓＭＩＣ陽性女性における着床不全の予測に有用となりうるか否かについてさらに研究した。彼らはこのように２．４５ng/mlのカットオフ値を定義し、ＲＯＣ分析によるリスク評価を可能にした（感度８２、特異性５０%）。ｓＭＩＣ＞２．４５は、着床不全に関連した（オッズ比：４．６，９５%ＣＩ１．０８−１９．７９，ｐ＝０．０３１）。＞２７．７ng/mlのｓＭＩＣ血清レベルは常にＩＶＦ後の胚着床の欠如に関連した（図１）。
【００８１】
【表２】
【００８２】
ｓＭＩＣ血清レベルは、ＩＶＦ後の期間終了時に生存可能な生まれた乳児を有するチャンスを予測する。
着床不全を予測することに加えて、発明者らは、さらに、増加したｓＭＩＣレベルが生きた乳児の誕生としてのＩＶＦの結果を予測できるか否かを前向きアッセイした。実際に、着床が成功であった後（女性３８人）、８人の女性がＩＶＦ後に流産を経験し、３０人が生存可能な乳児を出産した。陽性の場合、ＩＶＦ前に観察された可溶性血清ＭＩＣ値は、ＩＶＦ後に流産または着床不全を経験した女性を参照し（中央値＝１１ng/ml，ｍｉｎ−ｍａｘ：０．１−９６ng/ml，図１）、ＩＶＦ後に出産した女性の群において有意に低い（中央値＝２ng/ml，ｍｉｎ．−ｍａｘ．範囲：１−６ng/ml）ことが見出された。発明者らは、このように、流産または着床不全の代わりに妊娠の成功を達成する可能性を予測しうるｓＭＩＣの値をさらに評価した。２．４５ng/mlの同じカットオフを使用し（感度＝８２%および特異性＝７５%）、生存可能な乳児を有する可能性は、ＩＶＦ前にｓＭＩＣ血清レベルにより予測した場合により高く、２．４５ng/mlの閾値よりも低かった（オッズ比＝１３．８，ＣＩ９５%＝２．０３−１１８，ｐ＝０．００２）。進行中の妊娠を達成した女性において観察されたｓＭＩＣの最高値は、６ng/mlであった（図１）。
【００８３】
ｓＭＩＣの高値は、着床成功後の流産に関連する。
着床が成功した場合（３８例）、ｓＭＩＣ陽性の女性の頻度は着床の成功との関係において有意に異ならなかったが（着床成功群における３６%対着床不全群における３８%）、ｓＭＩＣ陽性の頻度は、満期妊娠の成功を伴う群（２６%）よりも、流産を経験した女性の群（７５%）において高かった（ｐ＝０．０３）。さらに、陽性の場合、ＩＶＦ前のｓＭＩＣ血清レベルの中央値は、妊娠の達成に成功した群（中央値＝２．１，ｍｉｎ．−ｍａｘ範囲１−６ng/ml）よりも、ＩＶＦ後に流産を経験した群（中央値＝９．７，ｍｉｎ．−ｍａｘ．観察値＝２．５−２４ng/ml）においてより高いことが示された。発明者らは、このように、流産のリスクがｓＭＩＣ血清レベルから予測できるか否かをさらに評価した。より高いｓＭＩＣ血清レベルは、ＩＶＦの非存在下において、妊娠女性の総集団における流産の発生に関連しなかったが、発明者は、着床がＩＶＦ後に成功である場合、より高いｓＭＩＣがＩＶＦ後に得られる妊娠中に発生する流産に関連することを示すことができた。実際に、＞３．２ng/mlのｓＭＩＣ血清レベルのカットオフ値を使用し（感度８３%および特異性７５%）、満期妊娠と比較した場合、ｓＭＩＣによって着床の成功後の流産を予測できた（オッズ比＝３５，ｐ＝０．０２６，９５%ＣＩ１．７４−７０３）。女性が＞６ng/mlのｓＭＩＣ血清レベルを有した場合、期間終了時に出産は観察されなかった。
【００８４】
考察
ｓＭＩＣが胚着床に影響を及ぼす機構は依然として不明である。ナチュラルキラー細胞は、それらがサイトカイン／ケモカイン／血管新生因子の産生およびトロホブラストモデリングを調節する主要な免疫パートナーを表すため、着床の早期工程で本質的な役割を果たす（Sargent et al., 2006）。ｓＭＩＣは、活性化ＮＫＧ２Ｄ受容体のための多数のリガンドの１つであり、ＮＫおよびＣＤ８およびγδＴリンパ球上で広く発現される。ＮＫＧ２Ｄリガンド、とりわけ可溶性MICによる活性化ＮＫＧ２Ｄ受容体の関与は、ＮＫ媒介性の細胞毒性活性、増殖、およびサイトカイン産生のための共刺激シグナルである（Andre et al., 2004; Bryceson et al., 2006; Raulet et al., 2003; Sutherland et al. , 2002; Upshaw et al., 2006）。あるいは、そのＮＫＧ２Ｄ受容体のｓＭＩＣ誘導性内在化は、抗腫瘍ＮＫ細胞活性を下方制御する機構として記載されてきた（Wu et al., 2004）。胎盤由来の可溶性ＭＩＣによるＮＫＧ２Ｄの下方制御は、近年、胎児の生存に有利となる免疫回避機構として示されてきた（Mincheva-Nilsson et al., 2006）。このように、ＮＫＧ２Ｄ受容体とそのリガンドの間の相互作用に起因するｕＮＫ細胞のサイトカインレパートリーまたは溶解活性の調節は、着床環境に影響を及ぼし、ＩＶＦ後の妊娠の成功に有害となりうる。
【００８５】
発明者らの主な知見は、このように、ストレス誘発性の免疫刺激ＭＨＣクラスＩ鎖関連分子が、着床および妊娠の失敗を経験する女性においてＩＶＦ前によく見られることである。２．４５ng/mlを上回るｓＭＩＣの血清レベルは、より高い着床不全率のマトリクスを予測し、＞６ng/mlのｓＭＩＣ血清レベルは進化中の満期妊娠を決してもたらさず、＞２８ng/mlのレベルは常にＩＶＦの失敗に関連した。さらに、着床の成功後、＞３．２ng/mlのｓＭＩＣレベルを持つ女性ではＩＶＦ後に流産を経験するリスクが高い。ＩＶＦの失敗後に妊娠の成功を達成しない女性の血清中のｓＭＩＣタンパク質レベルの増強に寄与しうる由来および不妊状態に関連する機構は、依然として未解明である。ＭＩＣ発現細胞の膜からのｓＭＩＣの放出には、メタロプロテイナーゼによる切断が含まれると報告されてきた（Waldhauer et al., 2006）。メタロプロテイナーゼ活性の変化が、再発性の着床不全を伴うＩＶＦ患者において報告されてきた（Shibahara et al., 2005）。可溶性ＭＩＣを生成する機構およびＩＶＦ後の着床不全または妊娠喪失に関連する免疫機能に及ぼすｓＭＩＣの影響のさらなる研究は、今日、探索が困難な問題である。セリアック病における本研究（Hue et al., 2004）の共著者により寄稿された通り、不妊症のより高い有病率が報告されており（Meloni et al., 1999）、ｓＭＩＣが自己および同種免疫過程のマーカーでもあるとの事実は、ｓＭＩＣが胎児胚を拒絶するための母親のより高い自己または同種反応の潜在能力の兆候となりうることを示す。
【００８６】
要するに、ＩＶＦの高い経済的および心理学的な意味を考慮すると、本研究は、ｓｅｒｉｃ ｓＭＩＣの定量化が、ＩＶＦの結果の非侵襲性評価および予測における適用を伴う新規パラメーターと見なされうるとの議論を提供する初めてのものである。その予後値の他、このバイオマーカーの主な値は、女性ホルモン前処置の開始前でのその投与量の可能性である。これらの特色は、このように、ＩＶＦ関連リスクのカウンセリングまたは管理を改善し、ひいては不妊女性の健康管理のための結果的な利益を提供するはずである。
【００８７】
実施例２：可溶性ＭＩＣは、血管性妊娠病を伴う女性の血漿中でより高頻度に見いだされる。
妊娠は、広範な血管新生および母親の免疫寛容の確立が胎児および胎盤の発生の成功を可能するという特有の状況を作り出す。トロホブラスト胎児細胞と母親の免疫細胞の間のクロストークによって、胎児での妊娠早期の胎盤発生、脈管形成、および免疫寛容が制御される。不適切な胎盤形成は、子癇前症（ＰＥ）、子宮内発育遅延（ＩＵＧＲ）、および再発性妊娠喪失を含む血管性妊娠病（ＶＰＤ）を招き、それらは胎児母体の罹患および死亡の主要な原因を表す。子癇前症は、妊娠から２０週後の高血圧およびタンパク尿を特徴とする。胎盤の血管新生反応（不完全ならせん動脈の再構築）がどの程度不適切な血管性妊娠病を招きうるかについての理解における最近の進歩にもかかわらず、それらの予後は依然として重篤であり、胎盤除去が依然として重篤の子癇前症および主な子宮内発育制限を管理するための唯一の処置である。
【００８８】
実施例２ａ
材料および方法
対象
可溶性ＭＩＣの血漿レベルを、血管性子宮内発育遅延（ＩＶＧＲ）、子癇前症（ＰＥ）、または子宮内胎児死亡（ＩＵＦＤ）を含む血管性妊娠病（ＶＰＤ）を経験した４９人の女性において評価され、妊娠期間（平均２９週間）について対応させた正常な進行中の妊娠を伴う５３人の女性からの血漿の対照群と比較した。
【００８９】
方法
ＰＥは、タンパク尿（３００mg／２４ｈ超）に関連する、９０mmHgを上回る拡張期動脈圧、および１４０mmHgを上回る収縮期血圧と定義した。加えて、母親および胎児の両方での有害結果のリスク増加に関連する、特にＨＥＬＬＰ症候群（Ｈ＝溶血；ＥＬ＝肝酵素の上昇；およびＬＰ＝低い血小板数）（Weinstein et al., 2005）および腎不全を招く乏尿に関連する、母親の重度合併症が報告された。
【００９０】
血管性ＩＵＧＲは、異常子宮としての「胎盤機能不全」の少なくとも１つの生物学的または超音波診断マーカーに関連する妊娠期間についての＜２．５ｔｈパーセンタイルの超音波測定値、または臍動脈ドップラー（Chien et al., 2000）、または血漿中フィブロネクチンレベルの上昇（Ostlund et al., 2001）として定義された。血管性ＩＵＧＲ群の除外基準は、胎児における先天性奇形または染色体異常の存在、最近のサイトメガロウイルスまたはトキソプラズマ感染、外傷、妊娠中の薬物またはアルコールの乱用、および妊娠期間のわりに体格の小さな胎児であった。
【００９１】
ＩＵＦＤは、超音波検査により、重度の成長遅延後に起こる、妊娠１２週目に心臓活動のない、期間に応じた胎児の生体計測を伴う目に見える胎児と定義した。
【００９２】
結果
【００９３】
【表３】
【００９４】
図２に示す通り、ＭＩＣのより高いレベルが、血管性妊娠病を伴う女性のＭＩＣ＋陽性サンプルにおいて見出されている。
【００９５】
実施例２ｂ
材料および方法
対象
インフォームドコンセントに続き、１６９人の女性が２年間（２００４〜２００６年）にわたり実施された試験において連続的に含まれた。
【００９６】
８１人の患者が血管性妊娠病（ＶＰＤ）を呈し、それをさらに３群に分割した：ＰＥを伴う４０人の患者、血管性ＩＵＧＲを伴う２３人の患者、子宮内胎児死亡（ＩＵＦＤ）を伴う１８人の患者。ＰＥ、ＩＵＧＲ、ＩＵＦＤは、実施例２ａにおいて上に記載した通りに定義した。
【００９７】
２５人の患者が孤立性の非血管性ＩＵＧＲを呈し、４症例において胎児の染色体異数性、８症例において胎児の多発性奇形症候群、３症例において毒性または感染性の由来、および残りの１０症例において妊娠期間のわりに小さな胎児に関連した。非血管性ＩＵＧＲは、妊娠期間について＜２．５ｔｈパーセンタイルの超音波測定値として診断され、フィブロネクチンレベル、子宮および臍動脈のドップラー速度は正常であった。
【００９８】
対照群は、定期的な婦人科検査で見られ、正常妊娠（ＮＰ）の結果を確認するために分娩まで追跡調査した６３人の健常な妊娠女性から成った。正常妊娠を妊娠１７から４１週目の間に募集し、正常妊娠の期間とＶＰＤを伴う患者のそれを対応させた。
【００９９】
血漿の採取
血管性妊娠病または孤立性ＩＵＧＲの診断時、および、期間を対応させた正常妊娠の対照群での産科検査時に血液サンプルを採取した。サンプルを０．１２９mol/lクエン酸ナトリウム（３．８%）中に採取し、遠心分離し、標準手順に従って−８０℃で保存した。
【０１００】
ｓＭＩＣＡ／ＢについてのキャプチャーＥＬＩＳＡ
先に記載した通りに（Ｈｕｅ ｅｔ ａｌ．， ２００４）、サンドイッチ酵素結合免疫測定法を使用して血漿中の可溶性ＭＩＣ濃度を測定した。各実験において標準物質として使用した組み換え可溶性ＭＩＣＡタンパク質の検出閾値は０．１ng/mlで、０．３ng/mlより高い血漿レベルを陽性と見なした。
【０１０１】
統計
Ｐｒｉｓｍソフトウェア（ＧｒａｐｈＰａｄ ４．０ｂ， ＧｒａｐｈＰａｄ， Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ， ＣＡ）により分析を実施し、ノンパラメトリックなクラスカル・ワリス検定、それに続く３またはそれ以上の連続変数を比較するためのＤｕｎｎ ｐｏｓｔ−ｔｅｓｔ、対応のない２群を比較するためのマンホイットニー検定、およびＮＫＧ２Ｄ発現およびＣＤ１０７ａ脱顆粒アッセイ結果についてのウイルコクソンの順位検定を実施した。データは、分布に応じて、中央値［範囲］および平均値（ＳＤ）で表した。ピアソンカイ二乗による（およびｎ＜５の場合、フィッシャーの正確検定による）クロス集計後にカテゴリー変数間の関連を試験した。相関関係をスピアマン検定により改善した。９５%信頼区間（ｐ＜０．０５）を有意と見なした。
【０１０２】
経産回数、妊娠、収縮期および拡張期血圧、サンプリング時の妊娠期間、分娩の期間、および出生時の乳児の体重のパラメーターの多変量分析を実施し、血漿中の可溶性ＭＩＣの検出に関連する独立マーカーを同定した。
【０１０３】
結果
血管性妊娠病を伴う女性における血漿ｓＭＩＣの頻度増加
【０１０４】
ＮＰ、ＶＰＤ、または非血管性ＩＵＧＲを伴う、期間を対応させた女性の３群においてｓＭＩＣの血漿レベルを評価した。正常妊娠、ＶＰＤおよび非血管性ＩＵＧＲの間に、年齢、妊娠回数、体格指数、およびサンプリング時の妊娠期間において有意差は見出されなかった。収縮期および拡張期血圧は、ＶＰＤを伴う女性において有意に高かった。予期した通り、乳児の出生時体重および分娩時の妊娠期間の中央値は、正常妊娠と比較し、ＶＰＤおよび非血管性ＩＵＧＲを伴う群において有意に低かった（ｐ＜０．００１）。これらの患者の主な臨床的および生物学的な特徴を表３においてまとめる。
【０１０５】
【表４】
【０１０６】
出生時の乳児の体重群間の比較は、ノンパラメトリックなクラスカル・ワリス検定、それに続くＤｕｎｎ ｐｏｓｔ−ｔｅｓｔにより実施した。値は中央値［２５−７５四分位範囲］
＊血管性妊娠病と他の群の間のｐ＜０．００１
§正常妊娠と他の群の間のｐ＜０．００１
【０１０７】
ＮＰ群において、女性６３人中１人のみが血漿中の低いｓＭＩＣレベルを有した（０．５ng/ml）。しかし、この患者は全身性エリテマトーデスについて追跡調査され、正常な妊娠進化を伴ったことに注目する必要がある。非血管性ＩＵＧＲを伴う女性２５人中１人が検出可能なｓＭＩＣ血漿レベルを有していた（１．６３ng/ml）。対照的に、ｓＭＩＣ分子はＶＰＤ群における患者８１人中２６人（３２%）において検出された（ＮＰに関連してｐ＜０．０００１）。さらに、ｓＭＩＣレベルは、ＩＵＦＤ（２．１８ng/ml、０．８６−７．５８、ｐ＜０．０１）および血管性ＩＵＧＲ（１．６３ng/ml、０．８６−５．２、ｐ＜０．０５）においてよりも、子癇前症患者（中央値、２５−７５四分位範囲：７．５ng/ml、１．３７−３２．６９）において有意に高かった（表４）。
【０１０８】
【表５】
【０１０９】
血漿中ｓＭＩＣの存在によって重度の子癇前症のサブグループが同定される。
次に、母親の血漿中ｓＭＩＣの存在が、診断時の期間に応じて子癇前症の重症度を特性付けする臨床的、生物学的、または超音波的マーカー、収縮期または拡張期血圧、タンパク尿の定量化、尿酸およびフィブロネクチンの血漿レベル、臍動脈および子宮動脈のドップラー速度の波形解析、分娩期間、および乳児の出生時体重に関連するか否かを判断した（表３）。収縮期または拡張期の血圧、フィブロネクチンおよび尿酸レベルについて、ｓＭＩＣ陽性および陰性の患者の間の差はなかった。しかし、腎不全を反映する１日当たりのタンパク尿の中央値は、検出可能なｓＭＩＣを伴わないＰＥ女性においてよりもｓＭＩＣ陽性血漿を伴うＰＥ女性において有意に高かった（ｐ＝０．０４、図３Ａ）。経産回数、妊娠、収縮期および拡張期血圧、サンプリング時の妊娠期間、分娩の期間、および出生時の乳児の体重の多変量分析によって、タンパク尿がｓＭＩＣの存在に独立して関連することがさらに確認された。加えて、ＰＥ時に実施した母親の子宮動脈のドップラー速度の超音波分析によって、胎盤不全の反映である両側性子宮拡張早期切痕がＰＥのｓＭＩＣ陽性群においてより頻繁であることが示された（ｐ＝０．０３７、図３Ｂ）。ｓＭＩＣ血漿検出に関連する、ＰＥ患者における母親の重度合併症の頻度を次に試験した。ｓＭＩＣ陽性血漿を伴うＰＥ女性９人中３人（３３%）が、検出可能な血漿ｓＭＩＣを伴わないＰＥ女性３１人中１人（３．２%）と比較し、急性腎不全を伴う乏尿を呈した（ｐ＝０．０３）。さらに、ＨＥＬＬＰ症候群の頻度は、ｓＭＩＣ陰性ＰＥ群（患者３１人中１人、３．２%）と比較して、ｓＭＩＣ陽性ＰＥ群（患者９人中２人、２２．２%）においてより上昇する傾向があった（ｐ＝０．１）。
【０１１０】
血漿中のｓＭＩＣの存在は血管性ＩＵＧＲに関連する。
血漿ｓＭＩＣの存在がＩＵＧＲの血管由来に関連するか否かに取り組むために、発明者らは血管性および非血管性ＩＵＧＲを伴う女性においてｓＭＩＣレベルを比較した。血管性ＩＵＧＲを伴う患者２３人中９人（３９%）が、非血管性ＩＵＧＲを伴う２５人中１人のみ（４%）と比較し、検出可能な血漿ｓＭＩＣを有した（ＯＲ＝１５．４３ ［１．７６３−１３５］， ｐ＝０．００３８）。このように、年齢、サンプリング時の期間、乳児の出生時体重、および分娩期間が２群間で異ならなかったが、母親の血漿中ｓＭＩＣの存在は血管性ＩＵＧＲに有意に関連する。さらに、陽性ｓＭＩＣ血漿によってＩＵＧＲの血管病因が予測され、陽性予測値９０%（特異性９６%および感度３９%）および陰性予測値６３%であった。
【０１１１】
考察
発明者らの結果は、可溶性ＭＩＣ分子が、妊娠期間について対応させた正常妊娠を伴う女性よりも、血管性妊娠病を伴う女性からの血漿においてより頻繁に検出されることを示す。さらに、ｓＭＩＣの血漿レベルは子癇前症の重症度と相関し、血管性ＩＵＧＲの特異的マーカーであると思われる。
【０１１２】
子癇前症は、ヒトの妊娠に特有である原因不明の多臓器障害である。その中でも、先天性血栓欠損症はＶＰＤの発生と関連付けられてきた。新規の炎症および血栓マーカーが、臨床応用なしに同定されてきた（Levine et al., 2006, Bretelle et al., 2003 and 2005）。さらに、高タンパク尿は、有害な母親および胎児の結果のリスク増加に関連する（Chan et al., 2005）。しかし、タンパク尿は単独で有害結果を予測せず、タンパク質分泌の閾値によって重度の子癇前症の合併症は予測できない可能性がある。最新技術において、ＰＥの臨床データ関連マーカーは同定されていない。
【０１１３】
発明者らの結果を考慮すると、母親の血漿中ｓＭＩＣの存在は、ＰＥの重症度の新規の臨床関連マーカーを提供する。任意に、必要に応じて、子癇前症を予測するための感度レベルを増加するために、このパラメーターを他のパラメーターと併用することもできる。
【０１１４】
母親の血漿中ｓＭＩＣの存在も、ＩＵＧＲ、多臓器由来の血管病の別のサブタイプに関連し、その予後は原因、重症度、および診断期間に依存する。胎盤形成異常に起因する胎盤不全は、血管性ＩＵＧＲと呼ばれるＩＵＧＲの主な原因を構成する。大半の血管性ＩＵＧＲがＰＥに関連しており、同じ生理病理学を共有する。対照的に、患者がそのような場合において妊娠中絶を要求しうるように、孤立性ＩＵＧＲは、異常な神経学的結果に関連する重度の胎児感染症、異数性、または遺伝子症候群の超音波兆候のみを表しうる。血管性ＩＵＧＲは、ＰＥ、母親の血管マーカー（フィブロネクチン、高尿酸レベル）、または子宮のドップラー速度測定波形の変化の存在下において容易に診断されることがある。しかし、最新技術において、非血管性ＩＵＧＲから血管性ＩＵＧＲを識別可能にする非侵襲性かつ特異的なマーカーが欠如していた。例えば、ＩＵＧＲにおいて胎盤低酸素−虚血病変の予報において使用する子宮のドップラー速度測定の指標は、９７%の感度について６３%の特異性を示す。明らかなＩＵＧＲ病因の非存在下において、無視できない率の未熟分娩および後期胎児喪失を伴う胎児の予後を判断するために、侵襲性の胎児探索が必要とされる。
【０１１５】
発明者らの結果は、女性の血漿中でのｓＭＩＣ検出によって、９６%の特異性でＩＵＧＲの血管由来が予測可能になることを示す。したがって、ＩＵＧＲ診断時でのｓＭＩＣの定量化は、特発性ＩＵＧＲの管理を改善するための有用な非侵襲性ツールを構成する。
【０１１６】
これらの結果は、女性の血漿中でのｓＭＩＣ分子の定量化が、妊娠中の血管性合併症の切迫した発症を予測するための有用な非侵襲性ツールであることを示す。
【０１１７】
実施例３：可溶性ＭＩＣは、卵胞液、胚上精、精液および着床不全の場合における胚移植のために使用するカテーテルにおいて高頻度で見いだされる。
可溶性ＭＩＣレベルは、卵胞液（ＦＦ）、移植胚上精（Ｔ胚）または未移植胚上精（ＵＴ）、ＩＶＦのために使用する（Ｔ）または使用しない（ＵＴ）精液、および胚移植のために使用するカテーテル（ＫＴ）において評価されてきた。可溶性ＭＩＣの存在は、表５に示す通り、着床不全の場合においてより頻繁に観察されてきた。
【０１１８】
【表６】
【０１１９】
【表７】
【技術分野】
【０００１】
本発明は生殖の医学および生物学に関する。本発明は、特に体外受精後の、着床不全および満期妊娠の成功の予測マーカーに関する。
【０００２】
発明の背景
不妊症の診断および管理は、若年成人においてよく見られる健康上の懸念である。体外受精（ＩＶＦ）技術の継続的な進歩は、不妊夫婦にとって難易度の高い生殖の選択肢である。体外受精は、それにもかかわらず、多子出産、子宮外妊娠、自然流産、および早期分娩のリスクを含む、女性におけるそれらの適応に対する欠点を表す臨床上の合併症のリスク増加に関連する。これらの臨床上のリスク、およびこれらの進歩した技術の高い経済コストを考慮すると、ＩＶＦ処置は依然として不妊夫婦にとって利用が難しい。受精および着床に影響を与える機構のより良い理解によって、体外受精の成功に関連するパラメーターのより正確な見解が提供されてきたが、処置の開始前に、ＩＶＦ後の妊娠問題を予測しうるバイオマーカーの探索が依然として主な課題である。胚着床または流産を予測するマーカーの大半が（Tong et al., 2004）ＩＶＦ処置の開始後に起こり、このようにカウンセリングによって妊娠の失敗に関連するストレスおよび臨床問題を予測することが制限される。不妊女性がＩＶＦ処置後に生存可能な乳児を出産する可能性の予測は、このように、不妊夫婦の増加する要求に対する医療対応の最適化における主な問題である。
【０００３】
したがって、ＩＶＦ処置を開始するための決定に先行する段階で、ＩＶＦに関連する流産および着床不全率および関連する臨床上の合併症の関与の予測因子として、不妊夫婦のカウンセリングを改善しうるマーカーが強く必要とされる。
【０００４】
胚着床は、着床するための十分な質を保持する胚の移植により成功する。胚の能力は、主に胚の形態および分裂の動態で評価される。胚盤胞の工程までの胚の培養は、いくつかの潜在的な利点を有し、とりわけ最も生存可能で、着床するための最高の可能性を有する胚の選択、同期化胚−子宮、複数の着床不全の場合における胚発生の能力を評価する可能性である。移植を良質（形態学的側面および発生速度で定義した質）の胚で実施した場合、後者を着床させて、妊娠を可能にすることが期待できる。子宮内膜内でのその着床を支持する一連のシグナルを放出するための胚の内因性能力の評価は、依然として評価することが難しい。
【０００５】
したがって、胚の質、その生存能力、および着床するためのその能力を評価するために有用となりうるマーカーが強く必要とされる。
【０００６】
発明の概要
本発明は、ＩＶＦの結果の非侵襲性な評価および予測を可能にするバイオマーカーを初めて提供する。その予後的な価値の他、このバイオマーカーの主な価値は、女性ホルモン前処置の開始前でのその投与量の可能性である。このバイオマーカーの使用によって、カウンセリングまたはＩＶＦ関連リスクの管理が改善され、ひいては不妊女性の健康管理のために結果的な利益を提供する。加えて、本発明者らは、不妊および妊娠合併症のマーカーとしてＭＩＣＡ（ＭＨＣクラスＩ鎖関連タンパク質Ａ）を同定した。したがって、本発明は、生殖の医学および生物学におけるバイオマーカーとしてのＭＩＣＡに関する。
【０００７】
第１の態様において、本発明は、サンプル中のＭＩＣＡについてのインビトロアッセイを含む、体外受精（ＩＶＦ）の結果を判断するための方法に関し、ＭＩＣＡレベルはＩＶＦの結果を示し、特に着床不全率、ＩＶＦの失敗、および／または流産を示す。好ましくは、サンプルは：
− 移植胚を受ける女性からの、血液、血漿、血清、子宮内膜生検、子宮液、腟および子宮頸管の分泌物、頸管粘液、ダグラス窩、および腹腔鏡探索の場合（子宮内膜症、付着胎盤、感染性の続発症）は腹水のサンプル；
− 精液を提供する男性からの血液、血漿、血清、および精液のサンプル；卵母細胞を提供する女性からの、血液、血漿、血清、子宮内膜生検、子宮液、腟および子宮頸管の分泌物、頸管粘液、ダグラス窩、および腹腔鏡探索の場合（子宮内膜症、付着胎盤、感染性の続発症）は腹水のサンプル；および
− 胚上清または胚培養液のサンプル
からなる群より選択される。
【０００８】
第２の態様において、本発明は、サンプル中のＭＩＣＡについてのインビトロアッセイを含む、ＩＶＦのための対象を選択するため、および、ＩＶＦの成功の確率を示すＭＩＣＡレベルを有する対象を選択するための方法に関する。好ましくは、サンプルは、血液、血漿、血清、子宮内膜生検、子宮液、腟および子宮頸管の分泌物、頸管粘液、ダグラス窩、および腹腔鏡探索の場合（子宮内膜症、付着胎盤、感染性の続発症）は腹水のサンプルからなる群より選択される。
【０００９】
第３の態様において、本発明は、対象からの血液、血清、血漿、または精液サンプル中のＭＩＣＡについてのインビトロアッセイを含む、精液または精子の質を判断するため、または、対象において男性不妊の確率を判断するための方法に関し、ＭＩＣＡレベルは精液または精子の質または男性不妊を示す。
【００１０】
第４の態様において、本発明は、胚培養液または上精中でのＭＩＣＡについてのインビトロアッセイを含む、胚の質を判断するため、または、胚移植、体外受精、または着床のために適切な胚を選択するための方法に関し、ＭＩＣＡレベルは胚の質または胚移植、体外受精、もしくは着床のための胚の適切性を示す。
【００１１】
第５の態様において、本発明は、サンプル中のＭＩＣＡについてのインビトロアッセイを含む、対象において不妊症の予後診断および流産、血管性妊娠病（ＶＰＤ）、子癇前症（ＰＥ）、子癇前症に関連する、または、関連しない子宮内発育遅延（ＩＵＧＲ）、ＨＥＬＬＰ症候群、妊娠性脂肪症、妊娠性ネフロパシーまたは子宮内胎児死亡、自己免疫性病理に関連する妊娠病または不妊性を含む妊娠合併症の確率を判断するための方法に関し、ＭＩＣＡレベルは妊娠合併症の確率を示す。
【００１２】
好ましい態様において、サンプル中のＭＩＣＡについてのアッセイの工程は：
− サンプル中の可溶性ＭＩＣＡタンパク質のアッセイ；
− ＭＩＣＡをコード化する無細胞核酸のアッセイ；および
− サンプル中に存在する抗ＭＩＣＡ抗体のアッセイ
から選択される工程を含む。
【００１３】
最も好ましい態様において、サンプル中のＭＩＣＡについてのアッセイの工程は、サンプルを抗ＭＩＣＡ抗体、好ましくはモノクローナル抗体、より好ましくはＳＲ９９、ＳＲ１０４、およびＳＲ１１６からなる群より選択される抗体と接触させることを含む。任意に、サンプル中の可溶性ＭＩＣＡについてのアッセイの工程は、ＥＬＩＳＡアッセイ、好ましくはサンドイッチＥＬＩＳＡアッセイにより実施できる。
【００１４】
第６の態様において、本発明は、生殖の医学および生物学における、抗ＭＩＣＡ抗体、ＭＩＣＡをコード化する核酸に特異的な一連のプライマー、ＭＩＣＡをコード化する核酸に特異的なプローブ、およびＭＩＣタンパク質、好ましくはＭＩＣＡタンパク質から選択される少なくとも１つのエレメントを含むキットのインビトロでの使用に関する。好ましくは、キットは、ＩＶＦのために適切な対象を選択するため、体外受精（ＩＶＦ）の結果を判断するため、精液または精子の質を判断するため、ＩＶＦのために適切な精液または精子を選択するため、対象において男性不妊症の確率を判断するため、胚の質を判断するため、胚移植、体外受精、または着床のために適切な胚を選択するため、妊娠中に高い合併症リスクを有する対象、特に流産、血管性妊娠病、子癇前症、子癇前症に関連する、または、関連しない子宮内発育遅延（ＩＵＧＲ）、ＨＥＬＬＰ症候群、妊娠性脂肪症、妊娠性ネフロパシーまたは子宮内胎児死亡に感受性の高い対象を同定するために使用する。
【００１５】
好ましくは、抗ＭＩＣＡ抗体は、好ましくはＳＲ９９、ＳＲ１０４、およびＳＲ１１６からなる群より選択されるモノクローナル抗体である。任意に、キットは可溶性ＭＩＣＡタンパク質をさらに含む。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１】患者における平均ｓＭＩＣ血清レベルは、着床の成功およびＩＶＦ問題に応じて異なる。ｓＭＩＣ血清レベルの評価は、ＩＶＦ志願者である１７０人の不妊女性においてＩＶＦ開始に先行するサイクルの卵胞期中に得られた。ｓＭＩＣレベルはng/mlである。ドットプロットは、ｓＭＩＣ陽性血液サンプルにおける中央値を、エラーバーは中央値の２５−７５四分位範囲を表す。ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ Ｖｅｒｓｉｏｎ ４ Ｓｏｆｔｗａｒｅを使用してグラフを得た。群は、ＩＶＦ後に着床に失敗した女性（ＩＭＰ−）を、ＩＶＦ後に着床の成功を経験した女性（ＩＭＰ＋）で表される。ＩＭＰ＋群を２群にさらに細分する：ＩＶＦ後に乳児を出産する女性（ＢＢａｂｙ）または着床の成功後に流産を経験する女性（ＭＩＳ）。（着床不全または流産のいずれかの理由で）出産に失敗する女性におけるｓＭＩＣの中央値もＩＭＰ−またはＭＩＳで表される。血液サンプルの採取時に妊娠していない、過去に少なくとも２回の妊娠の成功を経験した、妊娠可能な女性の対照ドナーの群もｓＭＩＣについて評価した（Ｆｅｒｔ Ｃｔｌ）。
【図２】正常妊娠を経験し、期間について対応させた女性（ＮＰ）を参照し、血管性妊娠病（ＶＰＤ）を伴う女性のＭＩＣ＋陽性サンプルにおいて、より高レベルのＭＩＣが見出される。血管性妊娠病は、子宮内発育遅延（ＩＵＧＲ）、子癇前症（ＰＥ）、および子宮内胎児死亡（ＩＵＦＤ）にさらに細分した。
【図３Ａ】（図３Ａ）ｓＭＩＣ状態に依存する子癇前症群における１日当たりのタンパク尿の中央値および四分位範囲 ｓＭＩＣ陽性およびｓＭＩＣ陰性の血漿の間の比較は、ノンパラメトリックなマンホイットニー検定を使用して実施した。（図３Ｂ）子癇前症患者からの子癇前症ｓＭＩＣ陽性群およびｓＭＩＣ陰性血漿における両側性子宮拡張早期切痕（bilateral early diastolic uterine notch）の頻度。
【図３Ｂ】（図３Ａ）ｓＭＩＣ状態に依存する子癇前症群における１日当たりのタンパク尿の中央値および四分位範囲 ｓＭＩＣ陽性およびｓＭＩＣ陰性の血漿の間の比較は、ノンパラメトリックなマンホイットニー検定を使用して実施した。（図３Ｂ）子癇前症患者からの子癇前症ｓＭＩＣ陽性群およびｓＭＩＣ陰性血漿における両側性子宮拡張早期切痕（bilateral early diastolic uterine notch）の頻度。
【００１７】
発明の詳細な説明
本発明は、生殖の医学および生物学の分野におけるバイオマーカーの同定に基づく。実際に、これらは、ＭＩＣＡレベルを使用して、ＩＶＦの結果を予測でき、特にＩＶＦの成功または失敗、胚着床の成功または失敗、および流産の確率を判断できた。加えて、このマーカーは、精液の受精能を評価し、最も生存能力の高い、着床の最高の確率を有する胚を選択するために有用である。このマーカーは妊娠合併症にも関連する。特に、それは、子宮内発育遅延（ＩＵＧＲ）、子宮内胎児死亡、妊娠病、自己免疫病理に関連する不妊症、妊娠性血管病、および子癇前症の確率を定義するために使用できる。
【００１８】
ＭＩＣＡは特許出願国際公開第９８／１９１６７号および国際公開第０３／０８９６１６号において広範囲に記載されており、その開示は参照により本明細書に組み入れられる。ＭＩＣＡのためのＵｎｉｇｅｎｅ ＣｌｕｓｔｅｒはＨｓ．５４９０５３であり、代表的な配列はＥｍｂｌ Ｑ９ＵＤＺ９中でよい。可溶性ＭＩＣＡは切断型タンパク質である。可溶性ＭＩＣＡは膜貫通ドメインおよび細胞質尾部を欠き、３つの細胞外ドメインを含む。
【００１９】
したがって、本発明は、サンプル中のＭＩＣＡについてのインビトロアッセイを含む、体外受精（ＩＶＦ）の結果を判断するための方法に関し、ＭＩＣＡレベルはＩＶＦの結果を示す。方法は、サンプルを提供する前工程を含んでよい。
【００２０】
ＩＶＦの結果は、乳児の出生、着床不全、または流産でよい。
【００２１】
好ましい態様において、方法は、サンプル中の可溶性ＭＩＣＡタンパク質についてのアッセイを含む。別の好ましい態様において、方法は、ＭＩＣＡをコード化する無細胞核酸についてのアッセイを含む。「無細胞」により、細胞中に含まれない核酸を意図する。追加の好ましい態様において、方法は間接的ＭＩＣＡアッセイを含み、サンプル中に存在する抗ＭＩＣＡ抗体のアッセイを含む。
【００２２】
サンプルは対象から提供できる。
【００２３】
第１の態様において、対象は移植胚を受ける女性である。対象は卵母細胞提供者でもよい。好ましい態様において、サンプルは、血液、血漿、血清、子宮内膜生検、子宮液、腟および子宮頸管の分泌物、頸管粘液、ダグラス窩、および腹腔鏡探索の場合（子宮内膜症、付着胎盤、感染性の続発症）は腹水のサンプルからなる群より選択される。好ましい態様において、サンプルは、血液、血漿、または血清のサンプル、好ましくは血清サンプルである。
【００２４】
好ましくは、可溶性ＭＩＣＡレベルは、ホルモン前処置の開始前に測定する。第１の特定の態様において、ホルモン前処置の開始前に、血清サンプル中の２．４５ng/mlを上回るＭＩＣＡレベルがより高い着床不全率を示す。したがって、本発明は、対象が移植胚を受けることを意図する女性であって、可溶性ＭＩＣＡレベルがホルモン前処置の開始前に測定され、血清サンプル中の２．４５ng/mlを上回るＭＩＣＡレベルがより高い着床不全率を示す方法に関する。第２の特定の態様において、ホルモン前処置の開始前に、血清サンプル中の２８ng/mlを上回るＭＩＣＡレベルがＩＶＦの失敗の高い確率を示す。したがって、本発明は、対象が移植胚を受けることを意図する女性であって、可溶性ＭＩＣＡレベルがホルモン前処置の開始前に測定され、血清サンプル中の２８ng/mlを上回るＭＩＣＡレベルがＩＶＦの失敗の高い確率を示す方法に関する。第３の特定の態様において、ホルモン前処置の開始前に、血清サンプル中の６ng/mlを上回るＭＩＣＡレベルが流産の高い確率を示す。したがって、本発明は、対象が移植胚を受けることを意図する女性であって、可溶性ＭＩＣＡレベルがホルモン前処置の開始前に測定され、血清サンプル中の６ng/mlを上回るＭＩＣＡレベルが流産の高い確率を示す方法に関する。
【００２５】
可溶性ＭＩＣＡタンパク質のレベルは、着床後にも測定できる。したがって、第４の特定の態様において、着床後、血清サンプル中の３．２ng/mlを上回るＭＩＣＡレベルが流産の高い確率を示す。したがって、本発明は、対象が移植胚を受ける女性であって、可溶性ＭＩＣＡタンパク質のレベルが着床後にも測定でき、血清サンプル中の３．２ng/mlを上回るＭＩＣＡレベルが流産の高い確率を示す方法に関する。
【００２６】
第５の特定の態様において、低いＭＩＣＡレベルはＩＶＦの成功の高い確率を示す。特に、ホルモン前処置前に、２８ng/ml未満、好ましくは６ng/ml未満、より好ましくは２．４５ng/ml未満の血清サンプル中のＭＩＣＡレベルが、ＩＶＦの成功、好ましくはＩＶＦの成功の高い確率を示す。
【００２７】
したがって、本発明は、対象のサンプル中のＭＩＣＡについてのインビトロアッセイおよびＩＶＦの成功の確率を示すＭＩＣＡレベルを有する対象を選択することを含む、ＩＶＦのために適切な対象を選択するための方法に関する。方法は、対象からのサンプルを提供する前工程を含んでよい。対象は、特に、ＮＦのための志願者である女性である。サンプルは、血液、血漿、血清、子宮内膜生検、子宮液、腟および子宮頸管の分泌物、頸管粘液、ダグラス窩、および腹腔鏡探索の場合（子宮内膜症、付着胎盤、感染性の続発症）は腹水のサンプルからなる群より選択できる。好ましい態様において、サンプルは、血液、血漿、または血清のサンプル、好ましくは血清サンプルである。サンプルは直接的に使用できる、または、前処置にかけることができる。
【００２８】
ＩＶＦのために適切な対象を選択するための方法の好ましい態様において、方法はサンプル中の可溶性ＭＩＣＡタンパク質についてのアッセイを含む。可溶性ＭＩＣＡレベルは、好ましくは、ホルモン前処置の開始前に測定される。例えば、２８ng/ml未満、好ましくは６ng/ml未満、より好ましくは２．４５ng/ml未満の血清サンプル中の可溶性ＭＩＣＡレベルは、ＩＶＦの成功の確率を示す。他の好ましい態様において、方法は、ＭＩＣＡをコード化する無細胞核酸についてのアッセイを含む。「無細胞」により、細胞中に含まれない核酸を意図する。追加の好ましい態様において、方法は間接的ＭＩＣＡアッセイを含み、サンプル中に存在する抗ＭＩＣＡ抗体のアッセイを含む。サンプル中のＭＩＣＡレベルは、好ましくは、ホルモン前処置の開始前に測定される。
【００２９】
第２の態様において、対象は、精液を提供する男性である。この態様において、サンプルは、血液、血漿、血清、および精液のサンプルからなる群より選択できる。新鮮な射精された精液、精子の受精能獲得のための調製後の新鮮な精液、凍結前または後の精巣上体精子、および凍結前または後の精巣の精子からなる群より選択できる。実際に、サンプル中のＭＩＣＡの存在は、低い受精能を示す。好ましい態様において、方法は、サンプル中の可溶性ＭＩＣＡについてのアッセイを含む。別の好ましい態様において、方法は、ＭＩＣＡをコード化する無細胞核酸についてのアッセイを含む。
【００３０】
したがって、本発明は、精液を提供する男性の血液、血漿、血清、または精液のサンプル中のＭＩＣＡレベルを測定することによる精液または精子の質を判断するための方法にも関する。方法は、対象からのサンプルを提供する前工程を含んでよい。好ましい態様において、方法は、サンプル中の可溶性ＭＩＣＡタンパク質についてのアッセイを含む。別の好ましい態様において、方法は、ＭＩＣＡをコード化する無細胞核酸についてのアッセイを含む。特に、精液または精子の質を使用し、その受精能を判断する。好ましくは、サンプル中のＭＩＣＡレベルは、精液または精子の質、ひいてはＩＶＦの成功の確率を示す。好ましくは、ＭＩＣＡレベルが高いほど、精液または精子の質、ひいてはＩＶＦの成功の確率は低い。
【００３１】
本発明は、さらに、精液を提供する男性の血液、血漿、血清、または精液のサンプル中のＭＩＣＡレベルを測定することを含む、卵母細胞のＩＶＦのために適切な精液または精子を選択するための方法に関する。方法は、対象からのサンプルを提供する前工程を含んでよい。実際に、ＭＩＣＡの存在は着床不全に関連してきた。好ましくは、最低のＭＩＣＡレベルを示すサンプルをＩＶＦのために選択する。好ましい態様において、方法は、サンプル中の可溶性ＭＩＣＡタンパク質についてのアッセイを含む。別の好ましい態様において、方法は、ＭＩＣＡをコード化する無細胞核酸についてのアッセイを含む。
【００３２】
加えて、本発明は、対象からの血液、血漿、血清、または精液のサンプル中のＭＩＣＡレベルを測定することを含む、対象において男性不妊の確率を判断するための方法に関する。方法は、対象からの血液、血漿、血清、または精液のサンプルを提供する前工程を含んでよい。実際に、ＭＩＣＡの存在は男性不妊に関連してきた。好ましい態様において、方法は、サンプル中の可溶性ＭＩＣＡタンパク質についてのアッセイを含む。別の好ましい態様において、方法は、ＭＩＣＡをコード化する無細胞核酸についてのアッセイを含む。
【００３３】
第３の態様において、対象は、卵母細胞を提供する女性である。対象は受ける女性でもよい。実際に、ＭＩＣＡの存在は、卵母細胞、ひいては胚の質を評価するために利用でき、ＭＩＣＡの存在は生存および／または着床の低い確率を示す。好ましい態様において、サンプルは、血液、血漿、血清、子宮内膜生検、子宮液、腟および子宮頸管の分泌物、頸管粘液、ダグラス窩、および腹腔鏡探索の場合（子宮内膜症、付着胎盤、感染性の続発症）は腹水のサンプルからなる群より選択される。特に、サンプルは、卵胞液、例えば卵母細胞回収後の卵胞穿刺により得られる卵胞液でよい。この液は、ＨＣＧによる排卵誘発後の膣穿刺により提供できる。
【００３４】
サンプルは、胚上精または胚培養液からも提供できる。特定の態様において、上精または培養液は、移植すること、または、凍結することを目的とする胚に由来する。
【００３５】
サンプルは、直接的に使用でき、または、凍結、精製、加熱、濃縮、希釈などの前処置にかけてよい。
【００３６】
したがって、本発明は、胚の培養液または上精中のＭＩＣＡレベルを測定することにより胚の質を判断するための方法にも関する。ＭＩＣＡレベルは、受精から少なくとも４４〜４６時間後、好ましくは、受精から６０、７０、８０、または９０時間後に測定する。好ましい態様において、方法は、サンプル中の可溶性ＭＩＣＡタンパク質についてのアッセイを含む。別の好ましい態様において、方法は、ＭＩＣＡをコード化する無細胞核酸についてのアッセイを含む。特に、胚の質を使用して、胚の着床の成功の潜在能力を判断する。好ましくは、胚の培養液または上精中のＭＩＣＡレベルは、胚の質、ひいては胚の着床の成功の確率を示す。好ましくは、ＭＩＣＡレベルが高いほど、胚の質、ひいては胚の着床の成功の確率は低い。
【００３７】
本発明は、胚移植、体外受精、または着床のために適切な胚を選択するための方法にも関し、方法は胚の培養液または上精中のＭＩＣＡレベルを測定することを含む。特に、ＭＩＣＡレベルは、胚移植、体外受精、または着床のための胚の適切性を示す。好ましくは、培養液中で最低のＭＩＣＡレベルを示す胚を、胚移植、体外受精、または着床のために選択する。実際に、ＭＩＣＡの存在は着床不全に関連してきた。好ましい態様において、方法は、サンプル中の可溶性ＭＩＣＡタンパク質についてのアッセイを含む。別の好ましい態様において、方法は、ＭＩＣＡをコード化する無細胞核酸についてのアッセイを含む。
【００３８】
本発明は、さらに、本発明の方法で胚を選択すること、および、適合性のあるヒト子宮内に胚を移植することを含む、ＩＶＦの方法に関する。
【００３９】
別の局面において、本発明は、サンプル中のＭＩＣＡについてのインビトロアッセイを含む、対象において流産、血管性妊娠病、子癇前症、子癇前症に関連する、または、関連しない血管性または非血管性の子宮内発育遅延（ＩＵＧＲ）、ＨＥＬＬＰ症候群、妊娠性脂肪症、妊娠性ネフロパシーまたは子宮内胎児死亡を含む妊娠合併症の確率を判断するための方法に関し、ＭＩＣＡレベルは、流産、血管性妊娠病、子癇前症、子癇前症に関連する、または、関連しない血管性または非血管性の子宮内発育遅延（ＩＵＧＲ）、ＨＥＬＬＰ症候群、妊娠性脂肪症、妊娠性ネフロパシーまたは子宮内胎児死亡を含む妊娠合併症の確率を示す。特に、本発明は、子癇前症の重症度を判断するために有用である。したがって、本発明は、サンプル中のＭＩＣＡについてのインビトロアッセイを含む、対象において重度の子癇前症の確率を判断するための方法に関し、ＭＩＣＡレベルは重度の子癇前症の確率を示す。
【００４０】
方法は、サンプルを提供する前工程を含んでよい。
【００４１】
この方法において使用するサンプルは、血液、血漿、血清、胎盤、臍帯血、内皮細胞、および羊水のサンプルからなる群より選択できる。好ましい態様において、サンプルは、血液、血漿、または血清のサンプル、好ましくは血清サンプルである。サンプルは直接的に使用できる、または、前処置にかけることができる。
【００４２】
対象は、好ましくは、妊娠した女性または妊娠することを望む女性である。
【００４３】
好ましい態様において、方法は、サンプル中の可溶性ＭＩＣＡタンパク質についてのアッセイを含む。別の好ましい態様において、方法は、ＭＩＣＡをコード化する無細胞核酸についてのアッセイを含む。追加の好ましい態様において、方法は間接的なＭＩＣＡアッセイを含み、サンプル中に存在する抗ＭＩＣＡ抗体のアッセイを含む。
【００４４】
好ましくは、可溶性ＭＩＣＡレベルは胚着床後に測定する。
【００４５】
好ましくは、例えば少なくとも０．３ng/ml、０．５ng/ml、０．７５ng/ml、または１ng/mlの血清サンプル中の可溶性ＭＩＣＡの検出は、流産、血管性妊娠病、子癇前症、子癇前症に関連する、または、関連しない血管性または非血管性の子宮内発育遅延（ＩＵＧＲ）、ＨＥＬＬＰ症候群、妊娠性脂肪症、妊娠性ネフロパシーまたは子宮内胎児死亡を含む異常妊娠、より好ましくはＶＰＤ、子癇前症、血管性ＩＵＧＲ、ＩＵＦＤ、およびそれらの組み合わせからなる群より選択される病理のより高い確率を示す。好ましくは、例えば少なくとも０．３ng/ml、０．５ng/ml、０．７５ng/ml、または１ng/mlの血清サンプル中の可溶性ＭＩＣＡの検出も、重度の子癇前症、特に腎不全および／または胎盤機能不全の反映である両側性子宮拡張早期切痕を反映するタンパク尿に関連する子癇前症のより高い確率を示す。特定の態様において、２．５ng/mlまたは１０ng/mlを上回る血清サンプル中の可溶性ＭＩＣＡレベルは、流産、血管性妊娠病、子癇前症、子癇前症に関連する、または、関連しない子宮内発育遅延（ＩＵＧＲ）、ＨＥＬＬＰ症候群、妊娠性脂肪症、妊娠性ネフロパシーまたは子宮内胎児死亡を含む異常妊娠のより高い確率を示す。
【００４６】
本発明は、サンプル中のＭＩＣＡについてのインビトロアッセイを含む、対象において非血管性の子宮内発育遅延（ＩＵＧＲ）から血管性の子宮内発育遅延（ＩＵＧＲ）を識別するための方法にも関し、ＭＩＣＡレベルは血管性ＩＵＧＲの確率を示す。好ましくは、サンプルは、血液、血漿、または血清のサンプル、好ましくは血清サンプルである。より好ましくは、好ましくは少なくとも０．３ng/ml、０．５ng/ml、０．７５ng/ml、または１ng/mlのサンプル中の可溶性ＭＩＣＡの検出が、血管性ＩＵＧＲを示す。好ましくは、可溶性ＭＩＣＡレベルは胚着床後に判断する。
【００４７】
上に示す通り、ＭＩＣＡをアッセイする工程は、サンプル中の可溶性ＭＩＣＡタンパク質のアッセイを含んでよい。好ましい態様において、体液サンプル中の可溶性ＭＩＣＡタンパク質についてのアッセイの工程は、サンプルを抗ＭＩＣＡ抗体と接触させることを含む。好ましい態様において、サンプル中の可溶性ＭＩＣＡについてのアッセイの工程は、ＥＬＩＳＡアッセイ、好ましくはサンドイッチＥＬＩＳＡアッセイにより実施できる。タンパク質、特に可溶性タンパク質の分析および定量化のためのＥＬＩＳＡ技術は、当業者に周知である。代わりの態様において、サンプル中の可溶性ＭＩＣＡについてのアッセイの工程は、抗体のマイクロビーズ（Luminex technology）への結合、ウエスタンブロット、ドットブロット、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、ＦＡＣＳ分析、および当業者に周知の他のイムノアッセイ技術により実施する。
【００４８】
例えば、ＥＬＩＳＡアッセイは以下の通りに実施できる：試験サンプルをポリスチレンマイクロタイタープレートのウェル上に固定する；抗ＭＩＣＡ抗体をウェルに添加する；結合および非特異的結合を除去するための洗浄後、結合した抗ＭＩＣＡ抗体を検出する。検出は、抗ＭＩＣＡ抗体に特異的な検出可能な抗体の添加により達成できることが多い。例えば、それは二次抗体（例えば、ヤギからの抗マウスＩｇＧ抗体）のＦｃ部分に対する三次抗体により検出できる。あるいは、抗ＭＩＣＡ抗体を標識できる。
【００４９】
好ましくは、サンドイッチＥＬＩＳＡアッセイは以下の通りに実施できる：抗ＭＩＣＡ抗体をポリスチレンマイクロタイタープレートのウェル上に固定する；試験サンプルをウェルに添加する；結合および非特異的結合を除去するための洗浄後、結合したＭＩＣＡを抗ＭＩＣＡ二次抗体により検出する。検出は、抗ＭＩＣＡ抗体に特異的な検出可能な抗体の添加により達成できることが多い。例えば、それは二次抗体（例えば、ヤギからの抗マウスＩｇＧ抗体）のＦｃ部分に対する三次抗体により検出できる。あるいは、抗ＭＩＣＡ二次抗体を標識できる。
【００５０】
本発明のおいて有用な抗ＭＩＣＡ抗体は、ポリクローナルまたはモノクローナルでよい。抗体は、任意のクラス、好ましくはＩｇＧ１またはＩｇＧ２ａでよい。それらは、ＭＩＣＡ、特に可溶性ＭＩＣＡに特異的でよい。これらの抗体は、ＭＩＣＡの細胞外部分に結合できる。あるいは、それらはＭＩＣＡおよびＭＩＣＢの両方に結合できる。
【００５１】
抗体を調製および特性付けするための手段は、当技術分野において周知である（Harlow and Lane, Antibodies: A Laboratory Manual., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY (1988)）。抗体のより具体的な例は以下である：国際公開第０３／０８９６１６号における２Ｃ１０、６Ｄ４、６Ｇ６、ならびに３Ｈ５、および、Hue et al. (2003)におけるＳＲ９９、ＳＲ１０４、ならびにＳＲ１１６。好ましくは、抗ＭＩＣＡ抗体は、好ましくはＳＲ９９、ＳＲ１０４、およびＳＲ１１６からなる群より選択されるモノクローナル抗体である。
【００５２】
抗ＭＩＣＡ抗体は標識できる。標識は、放射能、蛍光、化学発光、酵素、またはリガンドでよい。抗ＭＩＣＡ抗体は非標識でもよく、標識される検出剤と併用できる。例えば、それらは抗ＭＩＣＡ抗体（例えば、ヤギからの抗マウスＩｇＧ抗体）のＦｃ部分に対する二次抗体により検出できる。
【００５３】
上に示した通り、ＭＩＣＡをアッセイする工程は、ＭＩＣＡをコード化する無細胞核酸のアッセイを含んでよい。ＭＩＣＡをコード化する核酸はＲＮＡまたはＤＮＡでよい。ホモサピエンスＭＩＣＡをコード化するｍＲＮＡのＧｅｎｂａｎｋエントリーは、ＮＭ＿０００２４７である。ホモサピエンスＭＩＣＡのＧｅｎｅＩＤは４２７６である。ＭＩＣＡをコード化するそのような無細胞核酸は体液サンプル中で遊離でき、および／または、循環マイクロ粒子、特に血液または血清のサンプル中に存在するマイクロ粒子中に含まれてよい。ＭＩＣＡをコード化する核酸は、当業者により周知の任意の手段によりアッセイできる。例えば、それは、リアルタイム定量的ＰＣＲ、ＲＴ−ＰＣＲにより、適切なプライマーおよびプローブを使用することによるサザンブロットもしくはノーザンブロットまたはそれらの組み合わせによりアッセイできる。好ましい態様において、それは、定量的ＰＣＲまたはＲＴ−ＰＣＲによりアッセイする。当業者は、適切なプライマー対を容易にデザインできる。例えば、ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎによる定量的ＲＴ−ＰＣＲによりＭＩＣＡ ＲＮＡをアッセイするために適切なプライマー対は以下でよい：ＭＩＣＡ ９７０ＦおよびＭＩＣＡ １１２７Ｒ。
【００５４】
【表１】
【００５５】
これらの技術を適用する前に、サンプルの核酸を精製または濃縮できる。ＭＩＣＡをコード化する核酸の検出は、特許出願国際公開第９８／１９１６７号において広範囲に記載されており、その開示は参照により本明細書によって組み入れられる。
【００５６】
上に示す通り、ＭＩＣＡをアッセイする工程は、サンプル中に存在する抗ＭＩＣＡ抗体を含んでよい。例えば、抗ＭＩＣＡ抗体は、ＭＩＣＡタンパク質、好ましくは組み換えＭＩＣＡタンパク質を使用してＥＬＩＳＡアッセイにより検出できる。そのようなＭＩＣＡタンパク質を調製するための方法は、特許出願国際公開第９８／１９１６７号および国際公開第０３／０８９６１６号において広範囲に記載されており、その開示は参照により本明細書によって組み入れられる。あるいは、サンプル中の抗ＭＩＣＡ抗体をアッセイする工程は、ＭＩＣ、好ましくはＭＩＣＡのマイクロビーズ（Luminex technology）への結合により実施できる。市販キットＬａｂｓｃｒｅｅｎ（Ｏｎｅ Ｌａｍｂｄａ， ｒｅｆ ＬＳＭＩＣＡ００１）は、Ｌｕｍｉｎｅｘにより血清サンプル中の抗ＭＩＣ抗体をアッセイするために有用である。抗ＭＩＣ抗体のためのそのようなアッセイは、不妊に関連する自己免疫病理（セリアック病、ＡＰＳ・・・）における自己抗体アッセイのために有効になりうる。このアッセイは、免疫学的病因（子癇前症、習慣流産）を伴う妊娠性病理を有する女性の場合にも価値がある。
【００５７】
加えて、本発明は、対象からのサンプル中のＭＩＣＡレベルを測定することを含む、自己免疫疾患または異常を患う対象において不妊の確率を判断するための方法に関し、ＭＩＣＡレベルは対象での不妊の確率を示す。任意に、方法は、対象からのサンプルを提供する前工程を含んでよい。サンプルは、血液、血漿、血清、子宮内膜生検、子宮液、腟および子宮頸管の分泌物、頸管粘液、ダグラス窩、卵胞液、腹腔鏡探索の場合は腹水、および精液からなる群より選択できる。好ましい態様において、方法は、サンプル中の可溶性ＭＩＣＡタンパク質についてのアッセイを含む。別の好ましい態様において、方法は、ＭＩＣＡをコード化する無細胞核酸についてのアッセイを含む。追加の好ましい態様において、方法は、サンプル中に存在する抗ＭＩＣＡ抗体のアッセイを含む。
【００５８】
本発明は、生殖の医学および生物学における、抗ＭＩＣＡ抗体、ＭＩＣＡをコード化する核酸に特異的な一連のプライマー、ＭＩＣＡをコード化する核酸に特異的なプローブ、およびＭＩＣＡタンパク質からなる群より選択される少なくとも１つのエレメントを含むキットの使用にも関する。それは、抗ＭＩＣＡ抗体、ＭＩＣＡをコード化する核酸に特異的な一連のプライマー、ＭＩＣＡをコード化する核酸に特異的なプローブ、およびＭＩＣＡタンパク質からなる群より選択される少なくとも１つのエレメントを含む、生殖の医学および生物学のためのキットにも関する。ＭＩＣＡタンパク質は可溶性ＭＩＣＡでよい。キットは、説明書、任意の適切な陰性および陽性対照、標準タンパク質、および／または検出試薬をさらに含んでよい。
【００５９】
好ましい態様において、キットは抗ＭＩＣＡ抗体を含む。キットは、可溶性ＭＩＣタンパク質、好ましくはＭＩＣＡタンパク質をさらに含んでよい。可溶性ＭＩＣＡは、切断型ＭＩＣＡの組み換え発現により産生できる。可溶性ＭＩＣＡは、細菌、酵母、哺乳動物、昆虫の細胞などの適切な宿主細胞から発現できる。精製を容易にするために、ＭｙｃまたはＨｉｓタグなどのタグをコード配列中に含めてよい。そのような可溶性ＭＩＣＡは、陽性対照のために利用できる。組み換え可溶性ＭＩＣＡ分子は、Hue et al., 2003 (p. 1910)において記載の通りに調製でき、その開示は参照により本明細書に組み入れられる。キットは、任意にマイクロタイタープレートのウェル上に固定した抗ＭＩＣＡ抗体を有するマイクロタイタープレートをさらに含んでよい。最後に、キットは、任意の適切な免疫検出試薬または溶剤を含んでよい。本発明は、特に、体外受精（ＩＶＦ）の失敗、胚着床不全、流産、子宮内発育遅延、および子癇前症の確率のためのキットの使用にも関する。好ましくは、抗ＭＩＣＡ抗体は、好ましくはＳＲ９９、ＳＲ１０４、およびＳＲ１１６からなる群より選択されるモノクローナル抗体である。特定の態様において、キットはさらに可溶性ＭＩＣＡタンパク質を含む。
【００６０】
本発明は、ＩＶＦのために適切な対象を選択するため、体外受精（ＩＶＦ）の結果を判断するため、精液または精子の質を判断するため、ＩＶＦのために適切な精液または精子を選択するため、対象において男性不妊の確率を判断するため、胚の質を判断するため、胚移植、体外受精、または着床のために適切な胚を選択するため、妊娠中に高い合併症リスクを有する対象、特に流産、血管性妊娠病、子癇前症、子癇前症に関連する、または、関連しない子宮内発育遅延（ＩＵＧＲ）、ＨＥＬＬＰ症候群、妊娠性脂肪症、妊娠性ネフロパシーまたは子宮内胎児死亡に感受性の高い対象を同定するため、子癇前症の重症度を判断するため、または非血管性の子宮内発育遅延（ＩＵＧＲ）から血管性の子宮内発育遅延（ＩＵＧＲ）を識別するため、および自己免疫疾患、特にセリアック病または抗リン脂質抗体症候群（ＡＰＳ）を有する対象において不妊症の確率を判断するための本発明のキットの使用にも関する。
【００６１】
本発明は、ＳＲ９９、ＳＲ１０４、およびＳＲ１１６からなる群より選択される少なくとも１つの抗ＭＩＣＡ抗体を含む、可溶性ＭＩＣＡをアッセイするためのキットにも関する。好ましくは、キットは、２つの抗ＭＩＣＡ抗体、特にＳＲ９９およびＳＲ１０４を含む。任意に、２つの抗体の１つを標識する（例、ビオチン化抗体）。好ましい態様において、キットはサンドイッチＥＬＩＳＡアッセイのために適切である。本発明は、さらに、本発明の方法におけるこのキットの使用に関する。
【００６２】
追加で、本発明の方法および使用のいずれか１つにおけるＭＩＣＡのアッセイは、当技術分野において公知の他のマーカーのアッセイと組み合わせることができる。いくつかのマーカーの組み合わせによって、予測可能性をさらに増加できる。例えば、これらの追加マーカーは、ＨＬＡ−Ｇならびにエンドグリン、ＰＩＧＦ、およびｓＦＬＴ１などの血管新生マーカーからなる群において選択できる。これらの追加マーカーをアッセイするために、キットは、抗体、プライマー、ＨＬＡ−Ｇ、エンドグリン、ＰＩＧＦおよび／またはｓＦＬＴ１抗体などの１または複数の追加マーカーに特異的なプローブ、ＨＬＡ−Ｇ、エンドグリン、ＰＩＧＦまたはｓＦＬＴ１をコード化する核酸に特異的な一連のプライマー、および／またはＨＬＡ−Ｇ、エンドグリン、ＰＩＧＦまたはｓＦＬＴ１をコード化する核酸に特異的なプローブからなる群より選択される１または複数の追加エレメントを含んでよい。
【００６３】
本発明のさらなる局面および利点が、以下の実験の項において開示され、それらは説明と見なされるべきであり、本発明の範囲を限定しない。本明細書および実施例において引用する文献、特許、および特許出願を含む、すべての参考文献の内容は、すべて参照により本明細書に組み入れられる。
【００６４】
実施例
実施例１：可溶性ＭＩＣの血清レベルは、体外受精後の着床不全および満期妊娠の成功の予測マーカーである。
【００６５】
子宮ＮＫ（ｕＮＫ）は、胚着床部位で見出される主要なリンパ球系細胞集団であり、妊娠中期後に次第に消失する。母親において機能する自然免疫機構は、このように半同種異系胎児の許容性において強力な影響を有すると考えられる。特に、ｕＮＫ受容体は父親の／トロホブラスのトリガンドを認識し、それによって母親の免疫系による胎児攻撃が防がれる。
【００６６】
通常は胎児母体接触面で発現する既知のＮＫ阻害リガンドである可溶性ＨＬＡ−Ｇの存在は、胚上精において、体外受精（ＩＶＦ）後のより高い胚着床率と相関する（Fuzzi et al., 2002; Warner et al., 2004）。ｕＮＫ上の母親のキラー免疫グロブリン受容体（ＫＩＲ）と胎児ＨＬＡ−Ｃの間の相互作用も生殖の成功に影響を及ぼす（Hiby et al., 2004; Parham, 2004; Wu et al., 2004）。加えて、ｕＮＫ細胞は、着床および胎盤形成に有利となる血管新生因子およびサイトカインを分泌する（Ashkar et al., 2003; Coulam et al., 2003; Hanna et al., 2006; Ledee-Bataille et al., 2004; Moffett-King, 2002）。
【００６７】
したがって、発明者らは、ｕＮＫ細胞の任意の機能障害が、このように着床および妊娠の成功を妨げるはずであると推定した。
【００６８】
ｓＭＩＣストレス誘導性ＭＨＣクラスＩ関連分子の発現の機能上の意味が、腫瘍学（Carbone et ai., 2005; Groh et al., 2005; Groh et al., 1998）および自己免疫（Hue et ai., 2004; Meresse et al., 2004）において広く探索されてきた。同種異系または自己細胞上でのストレス誘導性ＮＫＧ２Ｄリガンド発現は、ＮＫ細胞の細胞毒性およびサイトカイン／ケモカインの産生を標的とすることが示されてきた（Andre et al., 2004; Lanier, 2005; Meresse et al., 2004; Raulet et al., 2003; Sutherland et al., 2002）。活性化および刺激の二重機構が、ＮＫＧ２Ｄ受容体による可溶性ＭＩＣの関与に関連付けられてきた。実際に、一部の癌患者の血清中の可溶型ＭＩＣ（ｓＭＩＣ）の放出が、刺激性ＮＫＧ２Ｄ受容体のエフェクターＮＫおよびＴリンパ球における内在化を誘導することが示されており、このように、先天性および適応性の抗腫瘍免疫応答ならびに腫瘍増殖に有利となる逸脱機構の両方を損なう（Groh et al., 2002; Wu et al., 2004）。胎盤由来ｓＭＩＣによるＮＫＧ２Ｄのそのような下方制御も、妊娠中に母親の免疫応答を下方制御しうる免疫逸脱機構として近年示されてきた（Mincheva-Nilsson et al., 2006）。
【００６９】
しかし、ｓＭＩＣストレス誘導性ＭＨＣクラスＩ関連分子は、生殖不全に関して全く研究されてこなかった。初めて、発明者らは、体外受精（ＩＶＦ）後に妊娠できない、または、生存能力のある乳児を産めない女性において血清ｓＭＩＣＡを証明できるか否かについて研究した。
【００７０】
材料および方法
対象および方法
【００７１】
現地の倫理委員会により承認された今回の前向き試験は、マルセイユのLa Conception HospitalのCenter of Assisted Reproductive MedicineでＩＶＦまたはＩＣＳＩを受けた連続的な一連の不妊患者で実施された（２００４年１月〜２００５年１０月）。１７０人の不妊女性のコホートは、すべてＩＶＦのための志願者であり、所定の同意後に本試験のために募集された。臨床的適応症は、原因不明の不妊、男性不妊、および卵管要因であった。含まれた女性のいずれも過去の妊娠歴は有さなかった。ＩＶＦに先立つサイクルの卵胞期中に血漿サンプルを採取した。すべての患者が同様の刺激措置を受けた。卵巣刺激は、Ｇｎｒｈアゴニストアナログでの下垂体の下方制御後に開始した組み換えＦＳＨ（Gonal F（登録商標）, Serono Pharma, Paris, France; Puregon（登録商標）, Organon France, Paris, France）を使用することにより実施した。完全な下垂体脱感作が、５０pg/ml未満の低い血漿中エストラジオール、および卵巣嚢腫を除外するための超音波検査の両方により確認され、５mm未満の子宮内膜厚が確認された。少なくとも３個の卵胞の直径が１６mmを超えた時にヒト絨毛膜性ゴナドトロピン１００００UI（ＨＣＧ）を投与した。卵母細胞の回収は、ＨＣＧ投与から３２〜３４時間後に経腟超音波誘導および全身麻酔により実施した。黄体期は、胚移植日から天然プロゲステロンで支持した。胚移植は、卵母細胞の採取後２日目または３日目に実施した。胚移植から１５日後に血清ＨＣＧ測定を１回実施した。臨床上の妊娠は、胎児の心拍を伴う子宮内胎嚢が経腟超音波検査により検出された場合に定義した。
【００７２】
採取した卵母細胞は、血清代替サプリメントを加えた６００μlの培養液を伴う４ウェルマルチディッシュ中で培養した。各ウェルは１から４個の卵母細胞を含んだ。ＩＶＦまたはＩＣＳＩ技術を精子注入のために使用した。卵母細胞の受精が倒立顕微鏡下で精液注入から１６〜１８時間後に観察され、受精率を算出した。胚は培養において４８時間または７２時間後に試験し、切断率を評価し、４個までの胚を移植のために選んだ。割球の数および断片化の量に従って、胚を工程分けした。使用した工程は：工程１（断片なし）、工程２（＜２０%）、工程３（２０〜５０%断片化）、工程４（＞５０%断片化）。
【００７３】
血漿中の可溶性ＭＩＣレベルのＥＬＩＳＡアッセイ
可溶性ＭＩＣＡ分子の構築、発現、および精製：組み換え可溶性ＭＩＣＡ分子をHue et al., 2003 (p. 1910)において記載の通りに調製しているが、その開示は参照により本明細書に組み入れられる。
【００７４】
抗ＭＩＣＡ ｍＡｂの産生：抗ＭＩＣＡモノクローナル抗体をHue et al., 2003 (p. 1910)において記載の通りに調製しているが、その開示は参照により本明細書に組み入れられる。
【００７５】
ＥＬＩＳＡによる可溶性ＭＩＣＡの検出：血清中の可溶性ＭＩＣＡを検出するために、２つの異なる抗ＭＩＣ ｍＡｂをサンドイッチＥＬＩＳＡにおいて使用した。高結合ポリスチレンプレート（Greiner; Sigma-Aldrich）を捕捉ＳＲ９９ Ａｂ（ＰＢＳ中５μg/ml、１００μl／ウェル）で、４℃で１２時間コーティングし、ＰＢＳ＋０．０５%Ｔｗｅｅｎ２０で５回洗浄し、１００μｌの５%ＢＳＡの添加により２２℃で１時間ブロッキングし、ＰＢＳ−０．０５%Ｔｗｅｅｎ２０中で洗浄した。スタンダード（ＰＢＳ−０．０５%Ｔｗｅｅｎ２０中の１００μg/mlから０．１ng/mlの可溶性ｒＭＩＣＡの連続希釈）および血清サンプル（１００μl／ウェル）を次に室温で２時間添加した。５回の洗浄後、ビオチン化ＳＲ１０４検出Ａｂ（ＰＢＳ中１５０ng/ml、１００μl／ウェル）を室温で１時間添加した。プレートを洗浄し、ストレプトアビジン抱合ＨＲＰ（１／３０，０００；Amersham Pharmacia Biotech）と室温で２０分間インキュベートし、洗浄し、テトラメチルベンジジン基質（Sigma-Aldrich）と３７℃で１５分間反応した。反応を０．５M Ｈ２ＳＯ４（５０μl／ウェル）で停止した。吸光度を４５０nmで測定した。組み換え可溶性ＭＩＣＡタンパク質の検出閾値は０．１ng/mlであった。
【００７６】
統計分析
群間の差は、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ ｓｏｆｔｗａｒｅ ｖｅｒｓｉｏｎ ４．０ｂを使用して、データが正規分布しているか否かに応じて、ｏｎｅｗａｙ ＡＮＯＶＡ、スチューデントのｔ−検定、またはマンホイットニー順位和検定による統計的有意性について評価した。カイ二乗分析を使用して、様々な独立群間でのｓＭＩＣの頻度を比較した。受信者動作特性曲線（ＲＯＣ）分析を使用して、ＳＭＩＣＡ濃度のカットオフポイントおよびそれらの感度／特異性を分析した。測定したカットオフをさらに使用して、相対リスクおよびオッズ比を評価した。有意なｐ値は＜０．０５に設定した。
【００７７】
結果
より高いｓＭＩＣ血清レベルが、ＩＶＦ後に着床不全を経験する不妊女性において見出される。
【００７８】
含まれた患者１７０人の内、３８人がＩＶＦ後に胚着床の成功を経験したが、その内の妊娠中の３０人が期間終了時に生存可能な乳児を生み、着床の成功後に８の流産が起こった。３人の患者が８ＳＡに、２人の患者が９ＳＡに、２人の患者が６ＳＡに、１人の患者が７ＳＡに流産を経験した。病理報告（＞８ＳＡの喪失について実現）は、遺伝子喪失を支持しなかった。患者の特徴を表１においてまとめる。
【００７９】
血清ｓＭＩＣを記載の通りに（Hue et al., 2004）サンドイッチＥＬＩＳＡを使用して測定した。ＩＶＦを経験した６４人（３８%）の患者が、検出可能なｓＭＩＣ血清レベルを有していた（平均＝１５．２８ng/ml、上下９５%範囲＝１０．７〜１９．９ng/ml）。
【００８０】
これらの群において正規化した場合にパラメーターがＩＶＦの結果に関連するとの事実にもかかわらず（表１）、陽性患者における平均ｓＭＩＣレベルは、着床不全群と比較し、胚着床の成功を有する女性（中央値＝２．５、２５−７５%パーセンタイル範囲：１．５−９．７）において有意に異なった（１２．０，３−２４．２，ｐ＜０．０２１）。発明者らは、このように、ｓＭＩＣレベルの値がｓＭＩＣ陽性女性における着床不全の予測に有用となりうるか否かについてさらに研究した。彼らはこのように２．４５ng/mlのカットオフ値を定義し、ＲＯＣ分析によるリスク評価を可能にした（感度８２、特異性５０%）。ｓＭＩＣ＞２．４５は、着床不全に関連した（オッズ比：４．６，９５%ＣＩ１．０８−１９．７９，ｐ＝０．０３１）。＞２７．７ng/mlのｓＭＩＣ血清レベルは常にＩＶＦ後の胚着床の欠如に関連した（図１）。
【００８１】
【表２】
【００８２】
ｓＭＩＣ血清レベルは、ＩＶＦ後の期間終了時に生存可能な生まれた乳児を有するチャンスを予測する。
着床不全を予測することに加えて、発明者らは、さらに、増加したｓＭＩＣレベルが生きた乳児の誕生としてのＩＶＦの結果を予測できるか否かを前向きアッセイした。実際に、着床が成功であった後（女性３８人）、８人の女性がＩＶＦ後に流産を経験し、３０人が生存可能な乳児を出産した。陽性の場合、ＩＶＦ前に観察された可溶性血清ＭＩＣ値は、ＩＶＦ後に流産または着床不全を経験した女性を参照し（中央値＝１１ng/ml，ｍｉｎ−ｍａｘ：０．１−９６ng/ml，図１）、ＩＶＦ後に出産した女性の群において有意に低い（中央値＝２ng/ml，ｍｉｎ．−ｍａｘ．範囲：１−６ng/ml）ことが見出された。発明者らは、このように、流産または着床不全の代わりに妊娠の成功を達成する可能性を予測しうるｓＭＩＣの値をさらに評価した。２．４５ng/mlの同じカットオフを使用し（感度＝８２%および特異性＝７５%）、生存可能な乳児を有する可能性は、ＩＶＦ前にｓＭＩＣ血清レベルにより予測した場合により高く、２．４５ng/mlの閾値よりも低かった（オッズ比＝１３．８，ＣＩ９５%＝２．０３−１１８，ｐ＝０．００２）。進行中の妊娠を達成した女性において観察されたｓＭＩＣの最高値は、６ng/mlであった（図１）。
【００８３】
ｓＭＩＣの高値は、着床成功後の流産に関連する。
着床が成功した場合（３８例）、ｓＭＩＣ陽性の女性の頻度は着床の成功との関係において有意に異ならなかったが（着床成功群における３６%対着床不全群における３８%）、ｓＭＩＣ陽性の頻度は、満期妊娠の成功を伴う群（２６%）よりも、流産を経験した女性の群（７５%）において高かった（ｐ＝０．０３）。さらに、陽性の場合、ＩＶＦ前のｓＭＩＣ血清レベルの中央値は、妊娠の達成に成功した群（中央値＝２．１，ｍｉｎ．−ｍａｘ範囲１−６ng/ml）よりも、ＩＶＦ後に流産を経験した群（中央値＝９．７，ｍｉｎ．−ｍａｘ．観察値＝２．５−２４ng/ml）においてより高いことが示された。発明者らは、このように、流産のリスクがｓＭＩＣ血清レベルから予測できるか否かをさらに評価した。より高いｓＭＩＣ血清レベルは、ＩＶＦの非存在下において、妊娠女性の総集団における流産の発生に関連しなかったが、発明者は、着床がＩＶＦ後に成功である場合、より高いｓＭＩＣがＩＶＦ後に得られる妊娠中に発生する流産に関連することを示すことができた。実際に、＞３．２ng/mlのｓＭＩＣ血清レベルのカットオフ値を使用し（感度８３%および特異性７５%）、満期妊娠と比較した場合、ｓＭＩＣによって着床の成功後の流産を予測できた（オッズ比＝３５，ｐ＝０．０２６，９５%ＣＩ１．７４−７０３）。女性が＞６ng/mlのｓＭＩＣ血清レベルを有した場合、期間終了時に出産は観察されなかった。
【００８４】
考察
ｓＭＩＣが胚着床に影響を及ぼす機構は依然として不明である。ナチュラルキラー細胞は、それらがサイトカイン／ケモカイン／血管新生因子の産生およびトロホブラストモデリングを調節する主要な免疫パートナーを表すため、着床の早期工程で本質的な役割を果たす（Sargent et al., 2006）。ｓＭＩＣは、活性化ＮＫＧ２Ｄ受容体のための多数のリガンドの１つであり、ＮＫおよびＣＤ８およびγδＴリンパ球上で広く発現される。ＮＫＧ２Ｄリガンド、とりわけ可溶性MICによる活性化ＮＫＧ２Ｄ受容体の関与は、ＮＫ媒介性の細胞毒性活性、増殖、およびサイトカイン産生のための共刺激シグナルである（Andre et al., 2004; Bryceson et al., 2006; Raulet et al., 2003; Sutherland et al. , 2002; Upshaw et al., 2006）。あるいは、そのＮＫＧ２Ｄ受容体のｓＭＩＣ誘導性内在化は、抗腫瘍ＮＫ細胞活性を下方制御する機構として記載されてきた（Wu et al., 2004）。胎盤由来の可溶性ＭＩＣによるＮＫＧ２Ｄの下方制御は、近年、胎児の生存に有利となる免疫回避機構として示されてきた（Mincheva-Nilsson et al., 2006）。このように、ＮＫＧ２Ｄ受容体とそのリガンドの間の相互作用に起因するｕＮＫ細胞のサイトカインレパートリーまたは溶解活性の調節は、着床環境に影響を及ぼし、ＩＶＦ後の妊娠の成功に有害となりうる。
【００８５】
発明者らの主な知見は、このように、ストレス誘発性の免疫刺激ＭＨＣクラスＩ鎖関連分子が、着床および妊娠の失敗を経験する女性においてＩＶＦ前によく見られることである。２．４５ng/mlを上回るｓＭＩＣの血清レベルは、より高い着床不全率のマトリクスを予測し、＞６ng/mlのｓＭＩＣ血清レベルは進化中の満期妊娠を決してもたらさず、＞２８ng/mlのレベルは常にＩＶＦの失敗に関連した。さらに、着床の成功後、＞３．２ng/mlのｓＭＩＣレベルを持つ女性ではＩＶＦ後に流産を経験するリスクが高い。ＩＶＦの失敗後に妊娠の成功を達成しない女性の血清中のｓＭＩＣタンパク質レベルの増強に寄与しうる由来および不妊状態に関連する機構は、依然として未解明である。ＭＩＣ発現細胞の膜からのｓＭＩＣの放出には、メタロプロテイナーゼによる切断が含まれると報告されてきた（Waldhauer et al., 2006）。メタロプロテイナーゼ活性の変化が、再発性の着床不全を伴うＩＶＦ患者において報告されてきた（Shibahara et al., 2005）。可溶性ＭＩＣを生成する機構およびＩＶＦ後の着床不全または妊娠喪失に関連する免疫機能に及ぼすｓＭＩＣの影響のさらなる研究は、今日、探索が困難な問題である。セリアック病における本研究（Hue et al., 2004）の共著者により寄稿された通り、不妊症のより高い有病率が報告されており（Meloni et al., 1999）、ｓＭＩＣが自己および同種免疫過程のマーカーでもあるとの事実は、ｓＭＩＣが胎児胚を拒絶するための母親のより高い自己または同種反応の潜在能力の兆候となりうることを示す。
【００８６】
要するに、ＩＶＦの高い経済的および心理学的な意味を考慮すると、本研究は、ｓｅｒｉｃ ｓＭＩＣの定量化が、ＩＶＦの結果の非侵襲性評価および予測における適用を伴う新規パラメーターと見なされうるとの議論を提供する初めてのものである。その予後値の他、このバイオマーカーの主な値は、女性ホルモン前処置の開始前でのその投与量の可能性である。これらの特色は、このように、ＩＶＦ関連リスクのカウンセリングまたは管理を改善し、ひいては不妊女性の健康管理のための結果的な利益を提供するはずである。
【００８７】
実施例２：可溶性ＭＩＣは、血管性妊娠病を伴う女性の血漿中でより高頻度に見いだされる。
妊娠は、広範な血管新生および母親の免疫寛容の確立が胎児および胎盤の発生の成功を可能するという特有の状況を作り出す。トロホブラスト胎児細胞と母親の免疫細胞の間のクロストークによって、胎児での妊娠早期の胎盤発生、脈管形成、および免疫寛容が制御される。不適切な胎盤形成は、子癇前症（ＰＥ）、子宮内発育遅延（ＩＵＧＲ）、および再発性妊娠喪失を含む血管性妊娠病（ＶＰＤ）を招き、それらは胎児母体の罹患および死亡の主要な原因を表す。子癇前症は、妊娠から２０週後の高血圧およびタンパク尿を特徴とする。胎盤の血管新生反応（不完全ならせん動脈の再構築）がどの程度不適切な血管性妊娠病を招きうるかについての理解における最近の進歩にもかかわらず、それらの予後は依然として重篤であり、胎盤除去が依然として重篤の子癇前症および主な子宮内発育制限を管理するための唯一の処置である。
【００８８】
実施例２ａ
材料および方法
対象
可溶性ＭＩＣの血漿レベルを、血管性子宮内発育遅延（ＩＶＧＲ）、子癇前症（ＰＥ）、または子宮内胎児死亡（ＩＵＦＤ）を含む血管性妊娠病（ＶＰＤ）を経験した４９人の女性において評価され、妊娠期間（平均２９週間）について対応させた正常な進行中の妊娠を伴う５３人の女性からの血漿の対照群と比較した。
【００８９】
方法
ＰＥは、タンパク尿（３００mg／２４ｈ超）に関連する、９０mmHgを上回る拡張期動脈圧、および１４０mmHgを上回る収縮期血圧と定義した。加えて、母親および胎児の両方での有害結果のリスク増加に関連する、特にＨＥＬＬＰ症候群（Ｈ＝溶血；ＥＬ＝肝酵素の上昇；およびＬＰ＝低い血小板数）（Weinstein et al., 2005）および腎不全を招く乏尿に関連する、母親の重度合併症が報告された。
【００９０】
血管性ＩＵＧＲは、異常子宮としての「胎盤機能不全」の少なくとも１つの生物学的または超音波診断マーカーに関連する妊娠期間についての＜２．５ｔｈパーセンタイルの超音波測定値、または臍動脈ドップラー（Chien et al., 2000）、または血漿中フィブロネクチンレベルの上昇（Ostlund et al., 2001）として定義された。血管性ＩＵＧＲ群の除外基準は、胎児における先天性奇形または染色体異常の存在、最近のサイトメガロウイルスまたはトキソプラズマ感染、外傷、妊娠中の薬物またはアルコールの乱用、および妊娠期間のわりに体格の小さな胎児であった。
【００９１】
ＩＵＦＤは、超音波検査により、重度の成長遅延後に起こる、妊娠１２週目に心臓活動のない、期間に応じた胎児の生体計測を伴う目に見える胎児と定義した。
【００９２】
結果
【００９３】
【表３】
【００９４】
図２に示す通り、ＭＩＣのより高いレベルが、血管性妊娠病を伴う女性のＭＩＣ＋陽性サンプルにおいて見出されている。
【００９５】
実施例２ｂ
材料および方法
対象
インフォームドコンセントに続き、１６９人の女性が２年間（２００４〜２００６年）にわたり実施された試験において連続的に含まれた。
【００９６】
８１人の患者が血管性妊娠病（ＶＰＤ）を呈し、それをさらに３群に分割した：ＰＥを伴う４０人の患者、血管性ＩＵＧＲを伴う２３人の患者、子宮内胎児死亡（ＩＵＦＤ）を伴う１８人の患者。ＰＥ、ＩＵＧＲ、ＩＵＦＤは、実施例２ａにおいて上に記載した通りに定義した。
【００９７】
２５人の患者が孤立性の非血管性ＩＵＧＲを呈し、４症例において胎児の染色体異数性、８症例において胎児の多発性奇形症候群、３症例において毒性または感染性の由来、および残りの１０症例において妊娠期間のわりに小さな胎児に関連した。非血管性ＩＵＧＲは、妊娠期間について＜２．５ｔｈパーセンタイルの超音波測定値として診断され、フィブロネクチンレベル、子宮および臍動脈のドップラー速度は正常であった。
【００９８】
対照群は、定期的な婦人科検査で見られ、正常妊娠（ＮＰ）の結果を確認するために分娩まで追跡調査した６３人の健常な妊娠女性から成った。正常妊娠を妊娠１７から４１週目の間に募集し、正常妊娠の期間とＶＰＤを伴う患者のそれを対応させた。
【００９９】
血漿の採取
血管性妊娠病または孤立性ＩＵＧＲの診断時、および、期間を対応させた正常妊娠の対照群での産科検査時に血液サンプルを採取した。サンプルを０．１２９mol/lクエン酸ナトリウム（３．８%）中に採取し、遠心分離し、標準手順に従って−８０℃で保存した。
【０１００】
ｓＭＩＣＡ／ＢについてのキャプチャーＥＬＩＳＡ
先に記載した通りに（Ｈｕｅ ｅｔ ａｌ．， ２００４）、サンドイッチ酵素結合免疫測定法を使用して血漿中の可溶性ＭＩＣ濃度を測定した。各実験において標準物質として使用した組み換え可溶性ＭＩＣＡタンパク質の検出閾値は０．１ng/mlで、０．３ng/mlより高い血漿レベルを陽性と見なした。
【０１０１】
統計
Ｐｒｉｓｍソフトウェア（ＧｒａｐｈＰａｄ ４．０ｂ， ＧｒａｐｈＰａｄ， Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ， ＣＡ）により分析を実施し、ノンパラメトリックなクラスカル・ワリス検定、それに続く３またはそれ以上の連続変数を比較するためのＤｕｎｎ ｐｏｓｔ−ｔｅｓｔ、対応のない２群を比較するためのマンホイットニー検定、およびＮＫＧ２Ｄ発現およびＣＤ１０７ａ脱顆粒アッセイ結果についてのウイルコクソンの順位検定を実施した。データは、分布に応じて、中央値［範囲］および平均値（ＳＤ）で表した。ピアソンカイ二乗による（およびｎ＜５の場合、フィッシャーの正確検定による）クロス集計後にカテゴリー変数間の関連を試験した。相関関係をスピアマン検定により改善した。９５%信頼区間（ｐ＜０．０５）を有意と見なした。
【０１０２】
経産回数、妊娠、収縮期および拡張期血圧、サンプリング時の妊娠期間、分娩の期間、および出生時の乳児の体重のパラメーターの多変量分析を実施し、血漿中の可溶性ＭＩＣの検出に関連する独立マーカーを同定した。
【０１０３】
結果
血管性妊娠病を伴う女性における血漿ｓＭＩＣの頻度増加
【０１０４】
ＮＰ、ＶＰＤ、または非血管性ＩＵＧＲを伴う、期間を対応させた女性の３群においてｓＭＩＣの血漿レベルを評価した。正常妊娠、ＶＰＤおよび非血管性ＩＵＧＲの間に、年齢、妊娠回数、体格指数、およびサンプリング時の妊娠期間において有意差は見出されなかった。収縮期および拡張期血圧は、ＶＰＤを伴う女性において有意に高かった。予期した通り、乳児の出生時体重および分娩時の妊娠期間の中央値は、正常妊娠と比較し、ＶＰＤおよび非血管性ＩＵＧＲを伴う群において有意に低かった（ｐ＜０．００１）。これらの患者の主な臨床的および生物学的な特徴を表３においてまとめる。
【０１０５】
【表４】
【０１０６】
出生時の乳児の体重群間の比較は、ノンパラメトリックなクラスカル・ワリス検定、それに続くＤｕｎｎ ｐｏｓｔ−ｔｅｓｔにより実施した。値は中央値［２５−７５四分位範囲］
＊血管性妊娠病と他の群の間のｐ＜０．００１
§正常妊娠と他の群の間のｐ＜０．００１
【０１０７】
ＮＰ群において、女性６３人中１人のみが血漿中の低いｓＭＩＣレベルを有した（０．５ng/ml）。しかし、この患者は全身性エリテマトーデスについて追跡調査され、正常な妊娠進化を伴ったことに注目する必要がある。非血管性ＩＵＧＲを伴う女性２５人中１人が検出可能なｓＭＩＣ血漿レベルを有していた（１．６３ng/ml）。対照的に、ｓＭＩＣ分子はＶＰＤ群における患者８１人中２６人（３２%）において検出された（ＮＰに関連してｐ＜０．０００１）。さらに、ｓＭＩＣレベルは、ＩＵＦＤ（２．１８ng/ml、０．８６−７．５８、ｐ＜０．０１）および血管性ＩＵＧＲ（１．６３ng/ml、０．８６−５．２、ｐ＜０．０５）においてよりも、子癇前症患者（中央値、２５−７５四分位範囲：７．５ng/ml、１．３７−３２．６９）において有意に高かった（表４）。
【０１０８】
【表５】
【０１０９】
血漿中ｓＭＩＣの存在によって重度の子癇前症のサブグループが同定される。
次に、母親の血漿中ｓＭＩＣの存在が、診断時の期間に応じて子癇前症の重症度を特性付けする臨床的、生物学的、または超音波的マーカー、収縮期または拡張期血圧、タンパク尿の定量化、尿酸およびフィブロネクチンの血漿レベル、臍動脈および子宮動脈のドップラー速度の波形解析、分娩期間、および乳児の出生時体重に関連するか否かを判断した（表３）。収縮期または拡張期の血圧、フィブロネクチンおよび尿酸レベルについて、ｓＭＩＣ陽性および陰性の患者の間の差はなかった。しかし、腎不全を反映する１日当たりのタンパク尿の中央値は、検出可能なｓＭＩＣを伴わないＰＥ女性においてよりもｓＭＩＣ陽性血漿を伴うＰＥ女性において有意に高かった（ｐ＝０．０４、図３Ａ）。経産回数、妊娠、収縮期および拡張期血圧、サンプリング時の妊娠期間、分娩の期間、および出生時の乳児の体重の多変量分析によって、タンパク尿がｓＭＩＣの存在に独立して関連することがさらに確認された。加えて、ＰＥ時に実施した母親の子宮動脈のドップラー速度の超音波分析によって、胎盤不全の反映である両側性子宮拡張早期切痕がＰＥのｓＭＩＣ陽性群においてより頻繁であることが示された（ｐ＝０．０３７、図３Ｂ）。ｓＭＩＣ血漿検出に関連する、ＰＥ患者における母親の重度合併症の頻度を次に試験した。ｓＭＩＣ陽性血漿を伴うＰＥ女性９人中３人（３３%）が、検出可能な血漿ｓＭＩＣを伴わないＰＥ女性３１人中１人（３．２%）と比較し、急性腎不全を伴う乏尿を呈した（ｐ＝０．０３）。さらに、ＨＥＬＬＰ症候群の頻度は、ｓＭＩＣ陰性ＰＥ群（患者３１人中１人、３．２%）と比較して、ｓＭＩＣ陽性ＰＥ群（患者９人中２人、２２．２%）においてより上昇する傾向があった（ｐ＝０．１）。
【０１１０】
血漿中のｓＭＩＣの存在は血管性ＩＵＧＲに関連する。
血漿ｓＭＩＣの存在がＩＵＧＲの血管由来に関連するか否かに取り組むために、発明者らは血管性および非血管性ＩＵＧＲを伴う女性においてｓＭＩＣレベルを比較した。血管性ＩＵＧＲを伴う患者２３人中９人（３９%）が、非血管性ＩＵＧＲを伴う２５人中１人のみ（４%）と比較し、検出可能な血漿ｓＭＩＣを有した（ＯＲ＝１５．４３ ［１．７６３−１３５］， ｐ＝０．００３８）。このように、年齢、サンプリング時の期間、乳児の出生時体重、および分娩期間が２群間で異ならなかったが、母親の血漿中ｓＭＩＣの存在は血管性ＩＵＧＲに有意に関連する。さらに、陽性ｓＭＩＣ血漿によってＩＵＧＲの血管病因が予測され、陽性予測値９０%（特異性９６%および感度３９%）および陰性予測値６３%であった。
【０１１１】
考察
発明者らの結果は、可溶性ＭＩＣ分子が、妊娠期間について対応させた正常妊娠を伴う女性よりも、血管性妊娠病を伴う女性からの血漿においてより頻繁に検出されることを示す。さらに、ｓＭＩＣの血漿レベルは子癇前症の重症度と相関し、血管性ＩＵＧＲの特異的マーカーであると思われる。
【０１１２】
子癇前症は、ヒトの妊娠に特有である原因不明の多臓器障害である。その中でも、先天性血栓欠損症はＶＰＤの発生と関連付けられてきた。新規の炎症および血栓マーカーが、臨床応用なしに同定されてきた（Levine et al., 2006, Bretelle et al., 2003 and 2005）。さらに、高タンパク尿は、有害な母親および胎児の結果のリスク増加に関連する（Chan et al., 2005）。しかし、タンパク尿は単独で有害結果を予測せず、タンパク質分泌の閾値によって重度の子癇前症の合併症は予測できない可能性がある。最新技術において、ＰＥの臨床データ関連マーカーは同定されていない。
【０１１３】
発明者らの結果を考慮すると、母親の血漿中ｓＭＩＣの存在は、ＰＥの重症度の新規の臨床関連マーカーを提供する。任意に、必要に応じて、子癇前症を予測するための感度レベルを増加するために、このパラメーターを他のパラメーターと併用することもできる。
【０１１４】
母親の血漿中ｓＭＩＣの存在も、ＩＵＧＲ、多臓器由来の血管病の別のサブタイプに関連し、その予後は原因、重症度、および診断期間に依存する。胎盤形成異常に起因する胎盤不全は、血管性ＩＵＧＲと呼ばれるＩＵＧＲの主な原因を構成する。大半の血管性ＩＵＧＲがＰＥに関連しており、同じ生理病理学を共有する。対照的に、患者がそのような場合において妊娠中絶を要求しうるように、孤立性ＩＵＧＲは、異常な神経学的結果に関連する重度の胎児感染症、異数性、または遺伝子症候群の超音波兆候のみを表しうる。血管性ＩＵＧＲは、ＰＥ、母親の血管マーカー（フィブロネクチン、高尿酸レベル）、または子宮のドップラー速度測定波形の変化の存在下において容易に診断されることがある。しかし、最新技術において、非血管性ＩＵＧＲから血管性ＩＵＧＲを識別可能にする非侵襲性かつ特異的なマーカーが欠如していた。例えば、ＩＵＧＲにおいて胎盤低酸素−虚血病変の予報において使用する子宮のドップラー速度測定の指標は、９７%の感度について６３%の特異性を示す。明らかなＩＵＧＲ病因の非存在下において、無視できない率の未熟分娩および後期胎児喪失を伴う胎児の予後を判断するために、侵襲性の胎児探索が必要とされる。
【０１１５】
発明者らの結果は、女性の血漿中でのｓＭＩＣ検出によって、９６%の特異性でＩＵＧＲの血管由来が予測可能になることを示す。したがって、ＩＵＧＲ診断時でのｓＭＩＣの定量化は、特発性ＩＵＧＲの管理を改善するための有用な非侵襲性ツールを構成する。
【０１１６】
これらの結果は、女性の血漿中でのｓＭＩＣ分子の定量化が、妊娠中の血管性合併症の切迫した発症を予測するための有用な非侵襲性ツールであることを示す。
【０１１７】
実施例３：可溶性ＭＩＣは、卵胞液、胚上精、精液および着床不全の場合における胚移植のために使用するカテーテルにおいて高頻度で見いだされる。
可溶性ＭＩＣレベルは、卵胞液（ＦＦ）、移植胚上精（Ｔ胚）または未移植胚上精（ＵＴ）、ＩＶＦのために使用する（Ｔ）または使用しない（ＵＴ）精液、および胚移植のために使用するカテーテル（ＫＴ）において評価されてきた。可溶性ＭＩＣの存在は、表５に示す通り、着床不全の場合においてより頻繁に観察されてきた。
【０１１８】
【表６】
【０１１９】
【表７】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
サンプル中のＭＩＣＡ（ＭＨＣクラスＩ鎖関連タンパク質Ａ）をインビトロでアッセイすることを含む、体外受精（ＩＶＦ）の結果を判断するための方法であって、ＭＩＣＡレベルが、ＩＶＦの結果を示し、特に着床不全率、ＩＶＦの失敗、および／または流産を示す方法。
【請求項２】
サンプルが：
移植胚を受ける女性からの、血液、血漿、血清、子宮内膜生検、子宮液、腟および子宮頸管の分泌物、頸管粘液、ダグラス窩、および腹腔鏡探索の場合（子宮内膜症、付着胎盤、感染性続発症）は腹水のサンプル；
精液を提供する男性からの血液、血漿、血清、および精液のサンプル；
卵母細胞を提供する女性からの、血液、血漿、血清、子宮内膜生検、子宮液、腟および子宮頸管の分泌物、頸管粘液、ダグラス窩、濾胞液および腹腔鏡探索の場合（子宮内膜症、付着胎盤、感染性続発症）は腹水のサンプル；および
胚上清または胚培養液のサンプル
からなる群より選択される、請求項１記載の方法。
【請求項３】
サンプルが、血液、血漿、または血清のサンプル、好ましくは血清サンプルである、請求項１または２記載の方法。
【請求項４】
対象が、移植胚を受けることを意図する女性であって、可溶性ＭＩＣＡレベルが、ホルモン前処置の開始前に測定され、血清サンプル中の２．４５ng/mlを上回るＭＩＣＡレベルが、より高い着床不全率を示す、請求項３記載の方法。
【請求項５】
対象が、移植胚を受けることを意図する女性であって、可溶性ＭＩＣＡレベルが、ホルモン前処置の開始前に測定され、血清サンプル中の２８ng/mlを上回るＭＩＣＡレベルが、ＩＶＦの失敗の高い確率を示す、請求項３記載の方法。
【請求項６】
対象が、移植胚を受けることを意図する女性であって、可溶性ＭＩＣＡレベルがホルモン前処置の開始前に測定され、血清サンプル中の６ng/mlを上回るＭＩＣＡレベルが、流産の高い確率を示す、請求項３記載の方法。
【請求項７】
対象が、移植胚を受ける女性であって、可溶性ＭＩＣＡタンパク質のレベルが、着床後にも測定でき、血清サンプル中の３．２ng/mlを上回るＭＩＣＡレベルが、流産の高い確率を示す、請求項３記載の方法。
【請求項８】
サンプル中のＭＩＣＡについてインビトロでアッセイすること、および、ＩＶＦの成功の確率を示すＭＩＣＡレベルを有する対象を選択することを含む、ＩＶＦのための対象を選択するための方法。
【請求項９】
サンプルが、血液、血漿、血清、子宮内膜生検、子宮液、腟および子宮頸管の分泌物、頸管粘液、ダグラス窩、および腹腔鏡探索の場合（子宮内膜症、付着胎盤、感染性続発症）は腹水のサンプルからなる群より選択される、請求項８記載の方法。
【請求項１０】
サンプルが、血液、血漿、または血清のサンプル、好ましくは血清サンプルである、請求項８または９記載の方法。
【請求項１１】
可溶性ＭＩＣＡレベルが、ホルモン前処置の開始前に測定され、血清サンプル中の２８ng/ml未満、好ましくは６ng/ml未満、より好ましくは２．４５ng/ml未満のＭＩＣＡレベルが、ＩＶＦの成功の確率を示す、請求項１０記載の方法。
【請求項１２】
対象からの血液、血清、血漿、または精液サンプル中のＭＩＣＡについてインビトロでアッセイすることを含む、精液または精子の質を判断するため、または、対象における男性不妊の確率を判断するための方法であって、ＭＩＣＡレベルが、精液または精子の質または男性不妊を示す方法。
【請求項１３】
胚培養液または上精中でのＭＩＣＡについてインビトロでアッセイすることを含む、胚の質を判断するため、または、胚移植、体外受精、または着床のために適切な胚を選択するための方法であって、ＭＩＣＡレベルが、胚の質または胚移植、体外受精、もしくは着床のための胚の適切性を示す方法。
【請求項１４】
サンプル中のＭＩＣＡについてインビトロでアッセイすることを含む、対象における流産、血管性妊娠病（ＶＰＤ）、子癇前症（ＰＥ）、子癇前症に関連するかまたは関連しない、血管性の子宮内発育遅延（ＩＵＧＲ）、ＨＥＬＬＰ症候群、妊娠性脂肪症、妊娠性ネフロパシーまたは子宮内胎児死亡（ＩＵＦＤ）、自己免疫性病理に関連する妊娠病または不妊性を含む、妊娠合併症の確率を判断するための方法であって、ＭＩＣＡレベルが、妊娠合併症の確率を示す方法。
【請求項１５】
サンプル中のＭＩＣＡについてインビトロでアッセイすることを含む、対象における重度の子癇前症の確率を判断するための方法であって、ＭＩＣＡレベルが、重度の子癇前症の確率を示す方法。
【請求項１６】
サンプルが、血液、血漿、血清、胎盤、臍帯血、内皮細胞および羊水のサンプルからなる群より選択される、請求項１４または１５記載の方法。
【請求項１７】
サンプルが、血液、血漿または血清のサンプル、好ましくは血清サンプルである、請求項１６記載の方法。
【請求項１８】
好ましくは少なくとも０．３ng/mlのサンプル中の可溶性ＭＩＣＡの検出が、ＶＰＤ、子癇前症、血管性ＩＵＧＲおよび／またはＩＵＦＤのより高い確率を示す、請求項１７記載の方法。
【請求項１９】
サンプル中のＭＩＣＡについてインビトロでアッセイすることを含む、対象における非血管性の子宮内発育遅延（ＩＵＧＲ）から血管性の子宮内発育遅延（ＩＵＧＲ）を識別するための方法であって、ＭＩＣＡレベルが、血管性ＩＵＧＲの確率を示す方法。
【請求項２０】
サンプルが、血液、血漿または血清のサンプル、好ましくは血清サンプルである、請求項１９記載の方法。
【請求項２１】
好ましくは少なくとも０．３ng/mlのサンプル中の可溶性ＭＩＣＡの検出が、血管性ＩＵＧＲを示す、請求項２０記載の方法。
【請求項２２】
サンプル中のＭＩＣＡについてアッセイする工程が：
サンプル中の可溶性ＭＩＣＡタンパク質をアッセイすること；
ＭＩＣＡをコード化する無細胞核酸をアッセイすること；および
サンプル中に存在する抗ＭＩＣＡ抗体をアッセイすること
から選択される工程を含む、請求項１〜４、８〜１０、１２〜１７および１９〜２０のいずれか一項記載の方法。
【請求項２３】
サンプル中のＭＩＣＡについてアッセイする工程が、サンプルを抗ＭＩＣＡ抗体、好ましくはモノクローナル抗ＭＩＣＡ抗体と接触させることを含む、請求項１〜２１のいずれか一項記載の方法。
【請求項２４】
サンプル中の可溶性ＭＩＣＡについてアッセイする工程が、ＥＬＩＳＡアッセイ、好ましくはサンドイッチＥＬＩＳＡアッセイにより実施される、請求項２３記載の方法。
【請求項２５】
ＭＩＣＡのアッセイが、１または複数の追加マーカーのアッセイと組み合わされる、請求項１から２４のいずれか一項記載の方法。
【請求項２６】
前記の追加マーカーが、ＨＬＡ−Ｇおよび血管新生マーカーからなる群より選択される、請求項２５記載の方法。
【請求項２７】
前記の血管新生マーカーが、エンドグリン、ＰＩＧＦおよびｓＦＬＴ１からなる群より選択される、請求項２６記載の方法。
【請求項２８】
生殖の医学および生物学における、抗ＭＩＣＡ抗体、ＭＩＣＡをコード化する核酸に特異的な一セットのプライマー、ＭＩＣＡをコード化する核酸に特異的なプローブ、およびＭＩＣタンパク質、好ましくはＭＩＣＡタンパク質からなる群より選択される少なくとも１つのエレメントを含むキットの使用。
【請求項２９】
ＩＶＦのために適切な対象を選択するため、体外受精（ＩＶＦ）の結果を判断するため、精液または精子の質を判断するため、ＩＶＦのために適切な精液または精子を選択するため、対象における男性不妊の確率を判断するため、胚の質を判断するため、胚移植、体外受精、または着床のために適切な胚を選択するため、妊娠中に高い合併症リスクを有する対象、特に流産、血管性妊娠病、子癇前症、子癇前症に関連するかまたは関連しない子宮内発育遅延（ＩＵＧＲ）、ＨＥＬＬＰ症候群、妊娠性脂肪症、妊娠性ネフロパシーまたは子宮内胎児死亡に感受性の高い対象を同定するため、子癇前症の重症度を判断するため、または非血管性の子宮内発育遅延（ＩＵＧＲ）から血管性の子宮内発育遅延（ＩＵＧＲ）を識別するための、請求項２８記載の使用。
【請求項３０】
抗ＭＩＣＡ抗体が、モノクローナル抗体である、請求項２８または２９記載の使用。
【請求項３１】
キットが、可溶性ＭＩＣＡタンパク質をさらに含む、請求項２８〜３０のいずれか一項記載の使用。
【請求項３２】
キットが、抗体、プライマー、および１または複数の追加マーカーに特異的なプローブからなる群より選択される１または複数のエレメントをさらに含む、請求項２８から３１のいずれか一項記載の使用。
【請求項３３】
前記の追加マーカーが、ＨＬＡ−Ｇおよび血管新生マーカーからなる群より選択される、請求項３２記載の使用。
【請求項３４】
前記の血管新生マーカーが、エンドグリン、ＰＩＧＦおよびｓＦＬＴ１からなる群より選択される、請求項３３記載の使用。
【請求項３５】
１または複数の追加マーカーをアッセイするための前記のエレメントが、ＨＬＡ−Ｇ、エンドグリン、ＰＩＧＦまたはｓＦＬＴ１抗体、ＨＬＡ−Ｇ、エンドグリン、ＰＩＧＦまたはｓＦＬＴ１をコード化する核酸に特異的な一セットのプライマー、およびＨＬＡ−Ｇ、エンドグリン、ＰＩＧＦまたはｓＦＬＴ１をコード化する核酸に特異的なプローブからなる群より選択される、請求３２から３４のいずれか一項記載の使用。
【請求項１】
サンプル中のＭＩＣＡ（ＭＨＣクラスＩ鎖関連タンパク質Ａ）をインビトロでアッセイすることを含む、体外受精（ＩＶＦ）の結果を判断するための方法であって、ＭＩＣＡレベルが、ＩＶＦの結果を示し、特に着床不全率、ＩＶＦの失敗、および／または流産を示す方法。
【請求項２】
サンプルが：
移植胚を受ける女性からの、血液、血漿、血清、子宮内膜生検、子宮液、腟および子宮頸管の分泌物、頸管粘液、ダグラス窩、および腹腔鏡探索の場合（子宮内膜症、付着胎盤、感染性続発症）は腹水のサンプル；
精液を提供する男性からの血液、血漿、血清、および精液のサンプル；
卵母細胞を提供する女性からの、血液、血漿、血清、子宮内膜生検、子宮液、腟および子宮頸管の分泌物、頸管粘液、ダグラス窩、濾胞液および腹腔鏡探索の場合（子宮内膜症、付着胎盤、感染性続発症）は腹水のサンプル；および
胚上清または胚培養液のサンプル
からなる群より選択される、請求項１記載の方法。
【請求項３】
サンプルが、血液、血漿、または血清のサンプル、好ましくは血清サンプルである、請求項１または２記載の方法。
【請求項４】
対象が、移植胚を受けることを意図する女性であって、可溶性ＭＩＣＡレベルが、ホルモン前処置の開始前に測定され、血清サンプル中の２．４５ng/mlを上回るＭＩＣＡレベルが、より高い着床不全率を示す、請求項３記載の方法。
【請求項５】
対象が、移植胚を受けることを意図する女性であって、可溶性ＭＩＣＡレベルが、ホルモン前処置の開始前に測定され、血清サンプル中の２８ng/mlを上回るＭＩＣＡレベルが、ＩＶＦの失敗の高い確率を示す、請求項３記載の方法。
【請求項６】
対象が、移植胚を受けることを意図する女性であって、可溶性ＭＩＣＡレベルがホルモン前処置の開始前に測定され、血清サンプル中の６ng/mlを上回るＭＩＣＡレベルが、流産の高い確率を示す、請求項３記載の方法。
【請求項７】
対象が、移植胚を受ける女性であって、可溶性ＭＩＣＡタンパク質のレベルが、着床後にも測定でき、血清サンプル中の３．２ng/mlを上回るＭＩＣＡレベルが、流産の高い確率を示す、請求項３記載の方法。
【請求項８】
サンプル中のＭＩＣＡについてインビトロでアッセイすること、および、ＩＶＦの成功の確率を示すＭＩＣＡレベルを有する対象を選択することを含む、ＩＶＦのための対象を選択するための方法。
【請求項９】
サンプルが、血液、血漿、血清、子宮内膜生検、子宮液、腟および子宮頸管の分泌物、頸管粘液、ダグラス窩、および腹腔鏡探索の場合（子宮内膜症、付着胎盤、感染性続発症）は腹水のサンプルからなる群より選択される、請求項８記載の方法。
【請求項１０】
サンプルが、血液、血漿、または血清のサンプル、好ましくは血清サンプルである、請求項８または９記載の方法。
【請求項１１】
可溶性ＭＩＣＡレベルが、ホルモン前処置の開始前に測定され、血清サンプル中の２８ng/ml未満、好ましくは６ng/ml未満、より好ましくは２．４５ng/ml未満のＭＩＣＡレベルが、ＩＶＦの成功の確率を示す、請求項１０記載の方法。
【請求項１２】
対象からの血液、血清、血漿、または精液サンプル中のＭＩＣＡについてインビトロでアッセイすることを含む、精液または精子の質を判断するため、または、対象における男性不妊の確率を判断するための方法であって、ＭＩＣＡレベルが、精液または精子の質または男性不妊を示す方法。
【請求項１３】
胚培養液または上精中でのＭＩＣＡについてインビトロでアッセイすることを含む、胚の質を判断するため、または、胚移植、体外受精、または着床のために適切な胚を選択するための方法であって、ＭＩＣＡレベルが、胚の質または胚移植、体外受精、もしくは着床のための胚の適切性を示す方法。
【請求項１４】
サンプル中のＭＩＣＡについてインビトロでアッセイすることを含む、対象における流産、血管性妊娠病（ＶＰＤ）、子癇前症（ＰＥ）、子癇前症に関連するかまたは関連しない、血管性の子宮内発育遅延（ＩＵＧＲ）、ＨＥＬＬＰ症候群、妊娠性脂肪症、妊娠性ネフロパシーまたは子宮内胎児死亡（ＩＵＦＤ）、自己免疫性病理に関連する妊娠病または不妊性を含む、妊娠合併症の確率を判断するための方法であって、ＭＩＣＡレベルが、妊娠合併症の確率を示す方法。
【請求項１５】
サンプル中のＭＩＣＡについてインビトロでアッセイすることを含む、対象における重度の子癇前症の確率を判断するための方法であって、ＭＩＣＡレベルが、重度の子癇前症の確率を示す方法。
【請求項１６】
サンプルが、血液、血漿、血清、胎盤、臍帯血、内皮細胞および羊水のサンプルからなる群より選択される、請求項１４または１５記載の方法。
【請求項１７】
サンプルが、血液、血漿または血清のサンプル、好ましくは血清サンプルである、請求項１６記載の方法。
【請求項１８】
好ましくは少なくとも０．３ng/mlのサンプル中の可溶性ＭＩＣＡの検出が、ＶＰＤ、子癇前症、血管性ＩＵＧＲおよび／またはＩＵＦＤのより高い確率を示す、請求項１７記載の方法。
【請求項１９】
サンプル中のＭＩＣＡについてインビトロでアッセイすることを含む、対象における非血管性の子宮内発育遅延（ＩＵＧＲ）から血管性の子宮内発育遅延（ＩＵＧＲ）を識別するための方法であって、ＭＩＣＡレベルが、血管性ＩＵＧＲの確率を示す方法。
【請求項２０】
サンプルが、血液、血漿または血清のサンプル、好ましくは血清サンプルである、請求項１９記載の方法。
【請求項２１】
好ましくは少なくとも０．３ng/mlのサンプル中の可溶性ＭＩＣＡの検出が、血管性ＩＵＧＲを示す、請求項２０記載の方法。
【請求項２２】
サンプル中のＭＩＣＡについてアッセイする工程が：
サンプル中の可溶性ＭＩＣＡタンパク質をアッセイすること；
ＭＩＣＡをコード化する無細胞核酸をアッセイすること；および
サンプル中に存在する抗ＭＩＣＡ抗体をアッセイすること
から選択される工程を含む、請求項１〜４、８〜１０、１２〜１７および１９〜２０のいずれか一項記載の方法。
【請求項２３】
サンプル中のＭＩＣＡについてアッセイする工程が、サンプルを抗ＭＩＣＡ抗体、好ましくはモノクローナル抗ＭＩＣＡ抗体と接触させることを含む、請求項１〜２１のいずれか一項記載の方法。
【請求項２４】
サンプル中の可溶性ＭＩＣＡについてアッセイする工程が、ＥＬＩＳＡアッセイ、好ましくはサンドイッチＥＬＩＳＡアッセイにより実施される、請求項２３記載の方法。
【請求項２５】
ＭＩＣＡのアッセイが、１または複数の追加マーカーのアッセイと組み合わされる、請求項１から２４のいずれか一項記載の方法。
【請求項２６】
前記の追加マーカーが、ＨＬＡ−Ｇおよび血管新生マーカーからなる群より選択される、請求項２５記載の方法。
【請求項２７】
前記の血管新生マーカーが、エンドグリン、ＰＩＧＦおよびｓＦＬＴ１からなる群より選択される、請求項２６記載の方法。
【請求項２８】
生殖の医学および生物学における、抗ＭＩＣＡ抗体、ＭＩＣＡをコード化する核酸に特異的な一セットのプライマー、ＭＩＣＡをコード化する核酸に特異的なプローブ、およびＭＩＣタンパク質、好ましくはＭＩＣＡタンパク質からなる群より選択される少なくとも１つのエレメントを含むキットの使用。
【請求項２９】
ＩＶＦのために適切な対象を選択するため、体外受精（ＩＶＦ）の結果を判断するため、精液または精子の質を判断するため、ＩＶＦのために適切な精液または精子を選択するため、対象における男性不妊の確率を判断するため、胚の質を判断するため、胚移植、体外受精、または着床のために適切な胚を選択するため、妊娠中に高い合併症リスクを有する対象、特に流産、血管性妊娠病、子癇前症、子癇前症に関連するかまたは関連しない子宮内発育遅延（ＩＵＧＲ）、ＨＥＬＬＰ症候群、妊娠性脂肪症、妊娠性ネフロパシーまたは子宮内胎児死亡に感受性の高い対象を同定するため、子癇前症の重症度を判断するため、または非血管性の子宮内発育遅延（ＩＵＧＲ）から血管性の子宮内発育遅延（ＩＵＧＲ）を識別するための、請求項２８記載の使用。
【請求項３０】
抗ＭＩＣＡ抗体が、モノクローナル抗体である、請求項２８または２９記載の使用。
【請求項３１】
キットが、可溶性ＭＩＣＡタンパク質をさらに含む、請求項２８〜３０のいずれか一項記載の使用。
【請求項３２】
キットが、抗体、プライマー、および１または複数の追加マーカーに特異的なプローブからなる群より選択される１または複数のエレメントをさらに含む、請求項２８から３１のいずれか一項記載の使用。
【請求項３３】
前記の追加マーカーが、ＨＬＡ−Ｇおよび血管新生マーカーからなる群より選択される、請求項３２記載の使用。
【請求項３４】
前記の血管新生マーカーが、エンドグリン、ＰＩＧＦおよびｓＦＬＴ１からなる群より選択される、請求項３３記載の使用。
【請求項３５】
１または複数の追加マーカーをアッセイするための前記のエレメントが、ＨＬＡ−Ｇ、エンドグリン、ＰＩＧＦまたはｓＦＬＴ１抗体、ＨＬＡ−Ｇ、エンドグリン、ＰＩＧＦまたはｓＦＬＴ１をコード化する核酸に特異的な一セットのプライマー、およびＨＬＡ−Ｇ、エンドグリン、ＰＩＧＦまたはｓＦＬＴ１をコード化する核酸に特異的なプローブからなる群より選択される、請求３２から３４のいずれか一項記載の使用。
【図１】
【図２】
【図３Ａ】
【図３Ｂ】
【図２】
【図３Ａ】
【図３Ｂ】
【公表番号】特表２０１０−５１５９０９（Ｐ２０１０−５１５９０９Ａ）
【公表日】平成２２年５月１３日（２０１０．５．１３）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００９−５４５１９１（Ｐ２００９−５４５１９１）
【出願日】平成２０年１月１１日（２００８．１．１１）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＥＰ２００８／０５０３０４
【国際公開番号】ＷＯ２００８／０８４１０５
【国際公開日】平成２０年７月１７日（２００８．７．１７）
【出願人】（５０３２８５６１２）ユニヴェルシテ・ドゥ・ラ・メディテラネ (15)
【氏名又は名称原語表記】ＵＮＩＶＥＲＳＩＴＥ ＤＥ ＬＡ ＭＥＤＩＴＥＲＲＡＮＥＥ
【出願人】（５００３６６５９８）インセルム（アンスティチュ・ナショナル・ドゥ・ラ・サンテ・エ・ドゥ・ラ・ルシェルシュ・メディカル） (17)
【氏名又は名称原語表記】ＩＮＳＥＲＭ（ＩＮＳＴＩＴＵＴ ＮＡＴＩＯＮＡＬ ＤＥ ＬＡ ＳＡＮＴＥ ＥＴ ＤＥ ＬＡ ＲＥＣＨＥＲＣＨＥ ＭＥＤＩＣＡＬＥ）
【出願人】（５０９０３３０３３）ユニベルシテ・パリ・デカルト (5)
【氏名又は名称原語表記】ＵＮＩＶＥＲＳＩＴＥ ＰＡＲＩＳ ＤＥＳＣＡＲＴＥＳ
【出願人】（５０９１９６０６２）
【氏名又は名称原語表記】ＡＳＳＩＳＴＡＮＣＥ ＰＵＢＬＩＱＵＥ ＤＥＳ ＨＯＰＩＴＡＵＸ ＤＥ ＭＡＲＳＥＩＬＬＥ
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２２年５月１３日（２０１０．５．１３）
【国際特許分類】
【出願日】平成２０年１月１１日（２００８．１．１１）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＥＰ２００８／０５０３０４
【国際公開番号】ＷＯ２００８／０８４１０５
【国際公開日】平成２０年７月１７日（２００８．７．１７）
【出願人】（５０３２８５６１２）ユニヴェルシテ・ドゥ・ラ・メディテラネ (15)
【氏名又は名称原語表記】ＵＮＩＶＥＲＳＩＴＥ ＤＥ ＬＡ ＭＥＤＩＴＥＲＲＡＮＥＥ
【出願人】（５００３６６５９８）インセルム（アンスティチュ・ナショナル・ドゥ・ラ・サンテ・エ・ドゥ・ラ・ルシェルシュ・メディカル） (17)
【氏名又は名称原語表記】ＩＮＳＥＲＭ（ＩＮＳＴＩＴＵＴ ＮＡＴＩＯＮＡＬ ＤＥ ＬＡ ＳＡＮＴＥ ＥＴ ＤＥ ＬＡ ＲＥＣＨＥＲＣＨＥ ＭＥＤＩＣＡＬＥ）
【出願人】（５０９０３３０３３）ユニベルシテ・パリ・デカルト (5)
【氏名又は名称原語表記】ＵＮＩＶＥＲＳＩＴＥ ＰＡＲＩＳ ＤＥＳＣＡＲＴＥＳ
【出願人】（５０９１９６０６２）
【氏名又は名称原語表記】ＡＳＳＩＳＴＡＮＣＥ ＰＵＢＬＩＱＵＥ ＤＥＳ ＨＯＰＩＴＡＵＸ ＤＥ ＭＡＲＳＥＩＬＬＥ
【Ｆターム（参考）】
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