生物学的ペースメーカー
【課題】心臓細胞の電気的挙動を変調させるための方法及びシステムの提供。
【解決手段】好ましい方法は、インビボでＫｉｒ２遺伝子の活性を抑制することで、心臓の収縮を変調させることができるポリヌクレオチド化合物又はペースメーカー機能を誘導又は変調させることが出来、且つ、胚性又は骨髄幹細胞から分化した心筋細胞に基づいた組成物を投与することを包含する。即ち、投与された組成物は生物学的ペースメーカーとして機能する。
【解決手段】好ましい方法は、インビボでＫｉｒ２遺伝子の活性を抑制することで、心臓の収縮を変調させることができるポリヌクレオチド化合物又はペースメーカー機能を誘導又は変調させることが出来、且つ、胚性又は骨髄幹細胞から分化した心筋細胞に基づいた組成物を投与することを包含する。即ち、投与された組成物は生物学的ペースメーカーとして機能する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本特許出願は、米国仮出願番号第６０／２８７，０８８号、２００１年４月２７日出願の優先権を主張するものであり、この出願は、参照することによってその全文が本明細書の一部としてとり入れられている。
（米国連邦政府の後援による研究の陳述）
本発明に対する財政的支援の一部が、国立衛生研究所による助成金Ｎｏ．ＮＩＨＰ５０ＨＬ５２３０７で米国政府によって提供された。それ故、米国政府は、本明細書に特許請求する発明において、及び発明に対して、一定の権利を有する。
【０００２】
本発明は、一般的に、心臓ペースメーカー機能を提供及び／又は調節する方法で特徴づけられる。好ましい態様において、本発明は、心室又は心房の発射数（単位時間当たりの活動電位発生頻度、以下、発射数という）を誘導又は調節する埋め込み可能な電子ペースメーカーに変わり得るもの又は補助として使用することのできる、遺伝子工学的ペースメーカーを提供する。
【背景技術】
【０００３】
自然発生の細胞の電気的リズムは、心臓の自立性拍動から呼吸リズム及び睡眠覚醒周期まで多数の生物学的プロセスを支配している。
【０００４】
特に哺乳類の心臓は、電気的刺激を作りだすことによって固有のリズムを維持していると理解されている。一般的に、刺激は、いわゆるペースメーカーに生じ、特定の心臓通導組織及び心筋内に伝搬する脱分極波を生成する。通常秩序立った波動は、心筋の調和した収縮を促進する。これらの収縮は身体中至るところに血液を送るエンジンである。一般的に、The Heart and Cardiovascular System. Scientific Foundations. (1986) (Fozzard, H.A. et al., eds) Raven Press, NY.を参照。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
このような事情で、心臓刺激は、認められた生理的機構によって制御されている。しかし、興奮性心臓組織の異常は心臓リズムの異常を導くという、長年にわたる認識があった。
【０００６】
そのような心臓リズムの異常は、米国中に顕著なそして浸透している種々の疾病及び障害に関連している。Bosch, R. et al., (1999) in Cardiovas. Res. 44: 121及び同書引用文献を参照。例えば、徐脈性不整脈は、米国において、年間２５５，０００以上の電子ペースメーカー埋め込みをもたらしている。
【０００７】
伝統的な治療方法には、患者の心臓に対し、頻度の固定された又は可変のペーシングパルスを送る埋め込み型ペースメーカーが含まれる。しかし、そのような埋め込み型装置は、感染、出血、肺虚脱及び著しく高価という、顕著な固有のリスクを有している。
【０００８】
それ故、所望の心臓収縮数（発射数）を提供する新しい方法を持つことが望まれている。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者等は、ここに、ペースメーカー機能を創出し、及び／又は内因性又は誘導された心臓ペースメーカー機能の活動を変調させることができる遺伝子導入及び細胞投与法を提供する。
【００１０】
本発明の方法は、内因性ペースメーカー（例えば、哺乳類の心臓の洞結節）及び／又は誘導性ペースメーカー（例えば、幹細胞又は変換された電気的静止状態の細胞から発生する生物学的ペースメーカー）の活動を創出及び／又は変調させるのに使用される。
【００１１】
更に詳しくは、本発明の好ましい態様において、静止状態の心臓細胞は、インビボウイルス遺伝子導入又は変性細胞導入（例えば、分化幹細胞）によってペースメーカー細胞に変換される。
【００１２】
更なる態様において、組成物が、存在する内因性又は誘導心臓ペースメーカー機能の頻度を変更する（即ち同調させる）ために患者に投与される。ポリヌクレオチド又は変性細胞は、投与するのに好ましい薬剤である。
【００１３】
本発明の好ましい方法は、自発的、律動的電気活動を作り出すための、心室におけるＫｉｒ２コード化カリウムチャンネルの優性ネガティブ抑制を含む。誘導されたペースメーカーの数は、β−アドレナリン作動性刺激で増加させることができる。それ故、本発明の方法により、心室筋細胞の潜在性ペースメーカー活動は、Ｋｉｒ２チャンネルの阻害によって解放することができる。
【００１４】
好ましい方法は、インビボでＫｉｒ２遺伝子の活性を抑制することができるポリヌクレオチド化合物を投与することを含む。種々の特別なアプローチが採用され得る。例えば、Ｋｉｒ２遺伝子の発現を抑制することができるアンチセンス化合物又はその他のポリヌクレオチド阻害剤を、哺乳類に投与することができる。遺伝子ノックアウトアプローチ、例えば、幹細胞に存在するＫｉｒ２遺伝子のノックアウトもまた採用することができる。例えば、Ｋｉｒ２．１、Ｋｉｒ２．２、Ｋｉｒ２．３及び／又はＫｉｒ２．４を含む、多くのＫｉｒ２遺伝子ファミリーメンバーのいずれも抑制され得る。
【００１５】
既に述べたように、変性細胞は、また、ペースメーカーを誘導又は変調させるために細胞又は患者に投与される。例えば、投与された変性細胞は、好適には、ペースメーカー機能を提供することができ、且つ、胚性又は骨髄幹細胞のような幹細胞から分化した心筋細胞である。後者は、幹細胞由来ペースメーカー細胞（自然及び／又は誘発分化による）及び／又はペースメーカー機能を提供するように変換される幹細胞由来筋細胞（例えば、心室細胞）である。
【００１６】
変性細胞は、レシピエント、即ち、細胞が投与される患者から採取される。例えば、骨髄幹細胞は、患者から採取され、ペースメーカー機能を有する心筋細胞に分化される。心臓細胞、例えば洞結節細胞は、カテーテル或いは他のプロトコールによる取り出しを通じて患者から採取され、例えば本明細書に開示されるような所望のポリヌクレオチド送達システムの挿入によって変性され、その後、形質転換細胞は患者に投与される。本明細書に示されるように、投与細胞は、好ましくは投与前に、例えば、幹細胞由来心筋細胞、又は本明細書に開示されたような発現系で形質転換された心筋細胞のように、何らかの形で変性される。
【００１７】
代わりの、又は補助的戦略において、過分極活性化サイクリック・ヌクレオチド・ゲート（ＨＣＮ）遺伝子発現が、適切なポリヌクレオチド化合物を哺乳類に投与することによって促進される。本発明者等は、特に、ＨＣＮ活性は陽性及び陰性方向の両方向に変調させることができ、例えば、それらの活性化閾値を所望のレベルにシフトすることができることを発見した。この故に、心臓ペーシング、及びそれに続く心拍数は、ヌクレオチドゲート（ＨＣＮ）遺伝子発現のそのような制御によって効果的に（増加及び減少の両方に）変調できる。例えば、ペーシングは、内因性ＨＣＮチャンネル活性の阻害によって、及び／又は、内因性レベル以上に活性閾値をシフトすることによって減速させることができる（代わりに、加速は、過剰発現を経た作動チャンネル数を増加させる、及び／又は、内因性レベル以下に活性閾値をシフトすることによって、達成することができる）。同様に、二次メッセンジャーｃＡＭＰに対する天然ペースメーカーの応答も、例えば、与えられた感度の遺伝子工学処理したチャンネルを使用することによって、また、変調させることができる。
【００１８】
特に好ましいのは、共発現ベクター中でＫｉｒ配列に結合するＨＣＮ構築体の使用である。ベクターは、ペースメーカー活性を誘導するため、及びペースメーカー数を変調させる又は制御するために、投与することができる。特に好ましいのは、共発現ベクターにおいて、Ｋｉｒ２．１ＡＡＡ配列とＨＣＮ構築体を結合することである。
【００１９】
投与されたポリペプチドは、少なくとも一つの心臓電気的性質を好適に誘導又は変調（増加又は減少）させる。本発明の好ましい使用は、心臓電気伝導を変調させることであり、好ましくは、心臓活動電位（ＡＰ）の全て又は一部を変更することができる。その使用は、所望の治療結果を達成することを助ける。正常な電気的機能の著しい崩壊は、本発明方法により通常減少し又はしばしば回避される。
【００２０】
好ましくは、本発明によるポリヌクレオチド又は変性細胞の心筋細胞への投与は、処置された心筋細胞の電気信号出力の数（心筋細胞又は心室発射数）において、識別できる相異（増加又は減少）を提供する。より詳しくは、好ましくは、投与は、処置した心筋細胞の発射数において、少なくとも約２、３、４又は５パーセントの増加又は減少、より好ましくは、少なくとも約１０、１５、２０、２５、３０、４０、５０又は１００パーセント（の増加又は減少）を提供する。処置した細胞の発射数は、標準法により、特に、以下に定義されるような、標準電気生理学的アッセーにより定量することができる。
【００２１】
好ましい投与経路、ポリヌクレオチド及びアッセーは、以下の考察において提供される。一般的に、本発明の使用を助けるポリヌクレオチド発現は、少なくとも標準電気生理学的アッセーの一つから得られる記録におけるシフト（ベースラインに対する相対値として）として明らかになる。好ましくは、本発明によるポリヌクレオチドの投与は、ベースライン機能に対し相対的に少なくとも約１０％まで電気的性質の増加又は減少を提供する。更に好ましくは、増加又は減少は、少なくとも約２０％であり、より好ましくは、少なくとも約３０％から約５０％又はそれ以上である。該ベースライン機能は、例えば、本発明方法の前に特定の哺乳類で電気生理学的アッセーを実施することによって、容易に確認することができる。代わりに、関連するベースライン機能は、本命のポリヌクレオチドの代わりに対照のポリヌクレオチドを投与する、平行実験を実施することによって、定量することができる。一度、信頼できるベースライン機能が確立されれば（或いは公知のデータ源から入手できれば）、実際の実施者によるベースライン機能の定量は必ずしも必要ではない。関連性のある電気的性質の例は公知であり、限定はされないが、少なくとも、心拍数、不応性、伝達速度、焦点自動能（focal automaticity）、及び空間的励起パターンの一つを包含する。好ましくは、心拍数又は収縮数（発射数）又は脈拍数が評価される。
【００２２】
心臓収縮数を変調させることにより、本発明は、広範囲の心臓に関連した疾病及び障害を治療又は予防（予防的治療）するのに使用することができる。例えば、本発明の方法は、心臓に関連した立ちくらみ、特にストークス−アダムス立ちくらみに罹患した、又は、罹り易い患者の治療に有用である。本発明の方法は、また、持続性洞徐脈、Ｓ−Ａウェンケバッハ（Wenckebach）として顕著な洞房（Ｓ−Ａ）ブロック、完全Ｓ−Ａブロック又は洞停止（洞刺激が心房を活性化できない）を包含する洞結節機能の種々の異常、及び高度房室ブロックに罹患した又は罹り易い患者の治療に有用である。本発明の方法は、また、徐脈頻脈症候群、及びその他の原因の徐脈に罹患した、又は、罹り易い患者の治療に有用である。
【００２３】
本発明の治療方法は、一般的に、本発明による、発射数変調組成物の有効量を哺乳類に投与することを含む。投与は、好ましくは、例えば毒性を回避するため、哺乳類の心臓組織標的領域内に限局される。そのような投与は、例えば、本明細書に開示したように、注射、カテーテルによる送達及びその他によって達成される。好ましくは、哺乳類は、先ず同定され、治療法が選択され、それから治療組成物が投与される。例えば、本明細書に開示したような疾病又は障害、例えば、心臓に関連した立ちくらみ、特にストークス・アダムス立ちくらみ；持続性洞徐脈、Ｓ−Ａウェンケバッハとして顕著な洞房（Ｓ−Ａ）ブロック、完全Ｓ−Ａブロック又は洞停止のような洞結節機能の異常、及び高度房室ブロック；又は徐脈頻脈症候群又はその他徐脈に関連する状態に罹患した、又は、罹り易い哺乳類を同定することができる。
【００２４】
別の態様において、本発明は、本明細書に開示した本発明の方法の一つ又はそれ以上の組合せを実施するためのキットを提供する。好ましくは、キットは、少なくとも一つの好適な心筋核酸送達システム、及び好ましくは少なくとも一つの所望のポリヌクレオチド及び／又は変性細胞組成物を包含する。好ましくは、そのポリヌクレオチドは、該システムに操作可能につながっている。即ち、ポリヌクレオチドを心臓に良好に投与することを可能にするのに充分であるように、機能的及び／又は物理的に関連している。更に好ましいキットは、哺乳類にポリヌクレオチド又は変性細胞を投与するための手段、例えば注射筒、カテーテルその他を包含する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２５】
上で論じたたように、本発明者等は、ここに、内因性又は誘導された心臓ペースメーカー機能の活動を、誘導及び／又は変調させる遺伝子導入及び細胞投与法を提供する。特に、本発明は、埋め込まれた電子ペースメーカーの代替及び／又は補足として遺伝子治療を用いる遺伝子工学的ペースメーカーの創出を提供する。本発明の好ましい態様において、静止状態の心筋細胞が、インビボでのウイルス遺伝子導入によってペースメーカーに変換される。それら変換された細胞の心臓収縮及び／又は電気的性質は、その後、本発明によって変調される。
【００２６】
更に詳しくは、本発明の第一の態様において、本発明の方法は、心筋細胞においてペースメーカー機能（心臓収縮）を示さない心筋細胞において、そのような性質、即ち、発射数が全くないか、少しあるか、又は不適当である静止状態の心筋細胞において、ペースメーカー機能を誘導するのに使用される。好ましくは、投与により、治療された心臓細胞に自発的な反復電気信号の発生を誘導し又はもたらす、即ち、発射数が少ないか又は全くない心筋細胞（１分当たり約２０、１５、１０、５回又はそれ以下の発射数）に対して、発射数又は電気信号出力の頻度は、好ましくは検出し得るレベルに増加し、特に投与後は、少なくとも約３、５、１０、１５、２０又は２５パーセントの発射数又は電気信号出力の増加が見られる。
【００２７】
更なる態様において、本発明の方法は、心筋細胞に存在する発射数を変調させ又は「調子を合わせる」のに使用される。この態様において、過剰の心室性ペーシングは、低い頻度又は発射数に減少し、或いは低すぎる心室性ペーシングが所望のレベルになる。本発明のこの態様は、患者に対し至適心拍数を提供するための埋め込み（電子）ペースメーカー効果で達成される効果を変調させるのに特に有用である。更に、本発明は、内因性の神経又はホルモンの入力で治療される組織の反応性を維持するのに利点を有する。
【００２８】
特に、本発明は、埋め込み電子ペースメーカーの効果を増強又は補足するのに使用することができる。埋め込み電子ペースメーカーを有する哺乳類は、本発明により治療され得る。即ち、ポリヌクレオチド又は変性細胞が哺乳類に投与され、埋め込まれた電子装置により提供されている心臓発射数を更に変調させる。そのような複合アプローチにより、精密で至適な発射数が達成される。更に、組成物は、哺乳類の心臓における電子ペースメーカーから離れている部位に投与することができ、例えば、組成物投与部位は、埋め込まれた電子装置から少なくとも約０．５、１、２、３、４又は５ｃｍ離れており、それによって、心臓組織の大きな領域に亘ってペースメーカーの効果を提供できる。
【００２９】
本発明の方法は、治療された患者の心臓発射数を、所望の発射数値の約１５又は１０パーセント以内、より好ましくは約８、５、４、３又は２パーセント以内に変調させるために、好適に使用される。
【００３０】
本発明の好適な方法は、コードしたポリヌクレオチド、特に、哺乳類の心臓の洞結節におけるようなペースメーカー細胞に導入されるポリヌクレオチドの投与、又は、幹細胞から創製された、又は電気的に静止化された細胞から変換されたペースメーカー細胞、或いは律動収縮又は心臓の興奮を発生するように適応された他の細胞のような、誘導し得る細胞の投与を包含する。上記で考察したように、好ましい方法は、心臓収縮（発射数）を変調させることのできる、少なくとも一つのポリヌクレオチド又は変性細胞の治療有効量を投与することを包含する。ポリヌクレオチド及び変性細胞は、また、心臓組織の標的領域内にそれらの薬剤を局所投与することが容易なため、本発明による投与に好ましい治療組成物である。
【００３１】
心筋細胞の発射数を変調させるために投与される好適な組成物は、簡単な試験で容易に同定することができる。即ち、ポリヌクレオチドのような候補薬剤を心筋細胞に投与し、投与された薬剤が、例えば以下に定義されるアッセーのような標準電気生理学的アッセーにより定量された、対照の心筋細胞（薬剤で未処置の同じ細胞）に比較して、発射数が変調するかどうかを定量することができる。
【００３２】
特に好ましい投与用ポリヌクレオチドは優性ネガティブ構築体である。これら構築体は、特に限定されないが、例えば、Ｋｉｒ２構築体、ＨＣＮ構築体、変異体、断片及びこれらの組合せである。
【００３３】
本発明の好適な実施態様において、優性ネガティブＫｉｒ２構築体の体性遺伝子導入は、心室における自発的ペースメーカー活動を生じ、動いている心筋内に存在する休眠ペースメーカーＩＫ１の局在的遺伝子抑制による生物学的ペースメーカーの創造をもたらす。
【００３４】
例えば、Ｋｉｒ２優性ネガティブ構築体は、例えば、Ｋｉｒ２．１の孔領域のアミノ酸残基をアラニンによって置換する（ＧＹＧ１４４−１４６→ＡＡＡ、又はＫｉｒ２．１ＡＡＡ）ことによって、作ることができる。そのような優性ネガティブ構築体は、野生型Ｋｉｒ２．１と共発現するとき電流束を抑制することができる。４量体Ｋｉｒチャンネル内に少なくとも約一つの単一変異体を取り込むことによって、機能をノックアウトするのに充分である。優性ネガティブ構築体、例えばＫｉｒ２．１ＡＡＡは、２シストロンベクターにパッケージすることができ、モルモットの左心室腔に注射される。好ましくは、およそ１ｃｍ２の領域のような局所領域では、心室筋細胞の少なくとも約１０％が形質導入され、より好ましくは、少なくとも約２０％の心室細胞が形質導入され、最も好ましくは、少なくとも約３０％、４０％又は５０％の心室細胞が形質導入される。ＩＫ１及びカルシウム電流の測定は、後述する実施例において詳細に記載されるようにして行われる。
【００３５】
形質導入された心筋細胞の上記活性は、後述する実施例に記載されるように、対照の心室細胞の自発活性と比較される。形質導入筋細胞が、例えば内因性のペースメーカー活性を有する初期胚心臓細胞又は洞結節の正常ペースメーカー細胞のような、ペースメーカー細胞で代表される自発活性を示すことが望ましい。
【００３６】
別の好ましい実施態様において、本発明は、Ｋｉｒ２遺伝子産物の発現を阻害するアンチセンス治療分子を提供する。治療応用において、オリゴヌクレオチドが、細胞／生物に望ましくない又は有害なタンパク質の合成を防止する、特異的ｍＲＮＡ類のインビボでの翻訳を阻害するのに成功裏に使用された。この翻訳のオリゴヌクレオチド介在ブロックの概念は、「アンチセンス」アプローチとして知られている。機構的には、ハイブリッドオリゴヌクレオチドは、翻訳プロセスに対し物理的なブロックを創製するか、二重鎖のｍＲＮＡ部分を特異的に分解する細胞酵素（ＲＮａｓｅＨ）を補充することによる効果を誘発すると考えられる。
【００３７】
広範な応用に有用なことに、オリゴヌクレオチドは、好ましくは、多くの異なった要求を満足している。アンチセンス治療において、例えば、有用なオリゴヌクレオチドは、細胞膜を透過することができなければならず、細胞外、細胞内ヌクレアーゼに抵抗性を有しなければならず、そして好ましくは、ＲＮａｓｅＨのような内因性酵素を補充する能力を有していなければならない。ＤＮＡに基づく診断及び分子生物学においては、例えば、ポリメラーゼ、キナーゼ、リガーゼ及びホスファターゼのように、天然の核酸に作用するよう進化した、広範囲の異なった酵素に対する有効な基質として作用するオリゴヌクレオチドの能力のような、その他の性質が重要である。アンチセンス治療分子として使用されるオリゴヌクレオチドは、標的ｍＲＮＡに対し、その翻訳を効率的に損なう高い親和性、及びその他のタンパク質の発現の故意でない阻害を避けるための高い特異性、の両者を有することが必要である。
【００３８】
特に、Ｋｉｒ２チャンネルを作る少なくとも約一つの成分、又はＫｉｒ２チャンネルを作るのに充分な成分の発現を阻害するアンチセンスオリゴヌクレオチドを有し、強く分極したＩＫ１の部分的抑制又は不存在によって測定されるように、心室心筋でペースメーカー活性を解放するのに充分なＫｉｒ２チャンネルを、特異的に抑制することが好ましい。
【００３９】
別の投与プロトコールも採用され得る。例えば、投与されたポリヌクレオチドが、おとりとして機能し、ここで、ポリヌクレオチドは常法により標的細胞又は遺伝子に導入され、遺伝子の活性化は、例えば、転写因子がおとり分子に転換されることによって翻訳される。より詳細には、Ｋｉｒ２チャンネル成分の発現を効果的に阻害するために、おとりを採用することができる。本明細書で使われるように、用語「おとり分子」又は他の類似の用語は、機能的に不活性なタンパク質を、又は機能的に活性なタンパク質と拮抗し、それ故に活性タンパク質によって促進された活性を阻害するタンパク質それ自身をコードする、ポリヌクレオチドの意味を含む。Ｋｉｒ２おとりタンパク質は、それ故、野生型Ｋｉｒ２タンパク質に対する拮抗阻害剤として作用することができ、それによってＫｉｒ２野生型チャンネルの形成を阻害し、内向き整流性カリウム電流（ＩＫ１）の抑制をもたらす。
【００４０】
好ましくは、優性ネガティブ構築体は、耐久性がなければならない。即ち、何ヶ月、何年間もの長期間効果があり、局所特異性であり、即ち、所望の組織のみを標的にし、選択的な機構で特異的に作用し、例えば、Ｋｉｒ２優性ネガティブ構築体は心室心筋においてペースメーカー活性を解放するのに充分なＫｉｒ２チャンネルを特異的に阻害する。
【００４１】
本発明により使用される優性ネガティブ構築体の別の例は、ＨＣＮ構築体、例えばＨＣＮ１構築体である。特に、そのような構築体においては、孔中の臨界残基ＧＹＧは、ＡＡＡに変換され（ＨＣＮ１−ＡＡＡを創製する）、それによって正常なＨＣＮコード化ペースメーカー電流を抑制することができる。
【００４２】
更には、後述する実施例で更に詳細に示すように、ペースメーカーチャンネルにおけるＧＹＧ選択的モチーフの機能的重要性が、ＨＣＮ１におけるトリプレットがアラニンと置換されることによって評価された（ＧＹＧ３６５−３６７ＡＡＡ）。ＨＣＮ１−ＡＡＡは、機能的電流を産生しない；ＨＣＮ１−ＡＡＡのＷＴＨＣＮ１との共発現は、通門性（定常状態活性化、活性化及び不活性化動態）又は透過性（反転電位）に影響せずに、優性ネガティブ方式における正常チャンネル活性を抑制する（ＷＴ：ＡＡＡ比、４：１、３：１、２：１、１：１及び１：２、−１４０ｍＶで、それぞれ電流減少、５５．２±３．２、６８．３±４．３、７８．７±１．６、９１．７±０．８、９７．９±０．２％）。統計解析は、単一ＨＣＮチャンネルは、４つの単量体サブユニットから成ることを明らかにした。興味あることには、ＨＣＮ１−ＡＡＡは、また、同様な効率で、優性ネガティブ方式におけるＨＣＮ２を阻害した。それ故、ＧＹＧモチーフは、ＨＣＮチャンネルに対しイオン透過の臨界決定因子であり、ＨＣＮ１及びＨＣＮ２はヘテロ四量体複合体を形成するために、容易に共会合すると信じられる。
【００４３】
上記に示したように、異なったＨＣＮアイソフォームの共会合を通して、内因性ＨＣＮ活性（例えば、活性化閾値及び発現電流増幅）は、双方向に変調され、それにより、上記で考察したように所望の値の好ましい範囲内で、心臓ペーシング又は発射数の効果的な変調が可能である。
【００４４】
本発明は、一般的に、インビボ又はエクスビボでの心臓への使用を意図することを含む、好適なポリヌクレオチドの投与経路の一つ又は組合せに適合性がある。心臓組織は、特に遺伝子導入技術に敏感に反応する分野であるとの理解がある。Donahue, J. et al., (1998) Gene Therapy 5: 630; Donahue, J. et al., PNAS (USA) 94: 4664（心臓への迅速、効率的な遺伝子導入を開示）；Akhter, S. et al., (1997), PNAS (USA) 94: 12100（心室心筋細胞への遺伝子導入を提示）；及びこれらに引用された文献を参照されたい。好ましい、核酸送達方法は、米国特許第６，３７６，４７１号に開示されている。
【００４５】
本発明による更なる好ましい投与経路は、心臓組織へポリヌクレオチドを導入し、それを発現させて、標準心電図（ＥＣＧ）記録により定量されるように、充分検出可能な程度に心拍数を減少させることを含む。好ましくは、心拍数の減少は、ベースラインに対して少なくとも約５％である。
【００４６】
本発明は、高度に柔軟性があり、好ましくは少なくとも一つの治療心臓タンパク質をコードするポリヌクレオチドの一つ又は組合せで使用することができる。
【００４７】
上で論じた好ましいポリヌクレオチドに加えて、本発明による投与用の好適なポリヌクレオチドは、限定されないが、少なくとも一つのチャンネルタンパク質、ギャップ結合タンパク質、Ｇタンパク質サブユニット、コネキシン、或いはこれらの機能性フラグメントをコードするものを包含する。より好ましくは、Ｋチャンネルサブユニット、Ｎａチャンネルサブユニット、Ｃａチャンネルサブユニット、阻害性Ｇタンパク質サブユニット、又は機能性フラグメントをコードするポリヌクレオチドである。更なる好ましいポリヌクレオチドは、そのような（同じか又は異なった）タンパク質の１、２又は３つをコードするであろう。
【００４８】
「フラグメント（断片）」、「機能性フラグメント」又は類似の用語は、対応する全長アミノ酸配列（又はその配列をコードするポリヌクレオチド）の機能の少なくとも約７０％、好ましくは少なくとも約８０％、より好ましくは少なくとも約９５％を有するアミノ酸配列（又はその配列をコードするポリヌクレオチド）の部分を意味する。そのようなフラグメントの機能性を検出及び定量する方法は公知であり、本明細書に開示する標準電気生理学的アッセーを包含する。
【００４９】
本発明を実施するのに適したポリヌクレオチドは、限定されないが、ＧｅｎＢａｎｋ（National Center for Biotechnology Information (ＮＣＢＩ)）ＥＭＢＬ data library, Ｓｗｉｓｓ−ＰＲＯＴ (University of Geneva, Switzerland), the ＰＩＲ−International database；及びthe American Type Culture Collection (ＡＴＣＣ) (10801 University Boulevard, Manassas, VA 20110-2209)を含む公的機関から得ることができる。一般的には、Benson, D. A. et al., (1997), Nucl. Acids Res. 25: 1 GenBankの記載を参照されたい。
【００５０】
本発明で使用される、より特別なポリヌクレオチドは、ＧｅｎＢａｎｋからの公的情報にアクセスすることによって容易に得ることができる。例えば、一つのアプローチとして、所望のポリヌクレオチド配列がＧｅｎＢａｎｋから得られる。ポリヌクレオチドそれ自体は、ＰＣＲに基づいた増幅を用いたものを含む通常のクローニング手順、及びクローニング技術の一つ又は組合せにより作ることができる。例えば、オリゴヌクレオチド配列の調製、適切なライブラリーのＰＣＲ増幅、プラスミドＤＮＡの調製、制限酵素でのＤＮＡ開裂、ＤＮＡの連結、ＤＮＡの好適な宿主細胞への導入、細胞の培養、及びクローン化ポリヌクレオチドの単離及び精製は公知の技術である。Sambrook et al., in Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2nd ed. 1989); Ausubel et al., (1989), Current Products in Molecular Biology, John Wiley & Sons, New Yorkを参照。
【００５１】
以下の表１は、本発明で使用されるＧｅｎＢａｎｋデータベースからの例示的なポリヌクレオチドを示したものである。
【００５２】
【表１】
【００５３】
本発明で使用される他のポリヌクレオチドは、以下の文献に報告されている。Wong et al., Nature 1991; 351(6321):63（本質的に活性なＧｉ２α）；De Jongh KS, et al., J. Biol. Chem. 1990, Sep. 5;265(25):14738（Ｎａ及びＣａチャンネルβサブユニット）；Perez-Reyes, E. et al., J. Biol. Chem. 1992, Jan 25;267(3):1792; Neuroscientist 2001 Feb;7(1):42（ナトリウムチャンネルβサブユニット情報を提供）；Isom, LL. et al., Science, 1992, May 8;256(5058):839（脳ナトリウムチャンネルのβ１サブユニットを提供）；及びIsom, LL. et al.,(1995), Cell 1995 Nov 3;83(3):433（脳ナトリウムチャンネルのβ２サブユニットを報告）。
【００５４】
本発明で使用される更なるポリヌクレオチドは、ＰＣＴ出願番号ＰＣＴ／ＵＳ９８／２３８７７（Ｍａｒｂａｎ，Ｅ．）に報告されている。
Ｅ．Ｍａｒｂａｎによる以下の文献も参照されたい。J. Gen. Physiol., 2001, Aug;118(2):171-82; Circ. Res., 2001, Jul 20;89(2):160-7; Circ. Res. 2001, Jul 20;89(2):101; Circ. Res., 2001, Jul 6;89(1):33-8; Circ. Res., 2001, Jun 22;88(12):1267-75; J. Biol. Chem., 2001, Aug 10;276(32):30423-8; Circulation., 2001, May 22;103(20):2447-52; Circulation, 2001, May 15;103(19):2361-4; Am. J. Physiol. Heart Circ. Physiol., 2001, Jun;280(6):H2623-30; Biochemistry, 2001, May 22;40(20):6002-8; J. Physiol., 2001, May 15;533(Pt. 1):127-33; Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 2001, Apr 24;98(9):5335-40; Circ. Res., 2001, Mar 30;88(6):570-7; Am. J. Physiol. Heart Circ. Physiol., 2001, Apr;280(4):H1882-8; and J. Mol. Cell Cardiol., 2000, Nov;32(11):1923-30.
【００５５】
好適なＣａチャンネルサブユニットの更なる例は、β１、又はＬ型Ｃａチャンネルからのα２−δサブユニットを包含する。好ましいＮａチャンネルサブユニットは、β１又はβ２である。いくつかの発明の実施態様において、以下に記載する標準電気生理学的アッセーによって定量される優性ネガティブ活性を有する、Ｎａ及びＣａチャンネルサブユニットを選択することが有用である。好ましくは、その活性は、アッセーで定量される対応する標準のＮａ又はＣａチャンネルサブユニットの活性の少なくとも約１０％を抑制する。
【００５６】
本発明による投与に特に適した構築体は、また、後述する実施例に開示される。
また、好ましいものとしては、ペースメーカー活性を変調させる補助戦略として阻害性Ｇタンパク質サブユニット（「Ｇαｉ２」）又はその機能性フラグメントが挙げられる。
【００５７】
本発明は、ギャップ結合タンパク質、特に心臓機能に包含されることが知られている又は想定されているものに使用するのに広範に適している。特別な例は、コネキシン４０、４３、４５及び機能性フラグメントを包含する。更に、予期されるのは、アッセーによって定量される優性ネガティブ活性、好ましくは、対応するコネキシン４０、４３又は４５に関して、少なくとも約１０％の抑制活性を有するコネキシンをコードするポリヌクレオチドである。コネキシンは、幹細胞又は静止状態の心臓組織で電気的結合を形成する誘導心筋細胞を誘導／誘引するのに特に有用である。
【００５８】
更に考察されるのは、検出し得るサプレッサー活性を有する優性ネガティブタンパク質（ムテイン）をコードするポリヌクレオチドのような変異体である。遺伝的に優性であるコード化されたタンパク質は、一般的には、他のタンパク質、特に野生型タンパク質と結合して複合体を形成することができるタンパク質の機能を阻害する。
【００５９】
本発明の更なるポリヌクレオチドは、完全ではないが本質的に全長タンパク質をコードする。タンパク質は全長配列の全ての成分を有してはいない。例えば、コードされたタンパク質は、完全又は完全に近いがしかし完全シグナル又はポリアデニル配列を欠いているコード化配列（ｃｄｓ）を包含する。本発明のタンパク質をコードするポリヌクレオチド及び特にｃＤＮＡは、少なくとも完全ｃｄｓを包含することが好ましい。好ましくは、該ｃｄｓは、約０．５と７０の間、好ましくは約５と６０の間、より好ましくは約１５、２０、２５、３０、３５、４０又は５０ｋＤの分子量を示すタンパク質をコードすることができる。その分子量は、好適なコンピューター支援プログラムによって、又はＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動によって容易に定量することができる。
【００６０】
ポリヌクレオチド及び特に全長タンパク質をコードするｃＤＮＡは、選択された細胞、組織又は器官にあるそのタンパク質の発現を変調させる、常法の組換えアプローチによって変性させることができる。
【００６１】
更に特異的には、好適なポリヌクレオチドは、コード化したタンパク質から１又はそれ以上の隣接又は非隣接アミノ酸を付加、置換又は除去することができる組換え法によって変性させることができる。一般には、実施される変性の型は、所望する発現の結果に関係する。
【００６２】
例えば、イオンチャンネルのような関心のあるタンパク質をコードするｃＤＮＡポリヌクレオチドは、全長タンパク質の発現に比較して、そのタンパク質を過剰発現するように変性させることができる（即ち対照アッセー）。一般的には、変性タンパク質は、全長タンパク質に関して少なくとも１０パーセント又はそれ以上の過剰発現、より好ましくは少なくとも２０パーセント又はそれ以上、更により好ましくは少なくとも約３０、４０、５０、６０、７０、８０、１００、１５０又は２００パーセント又はそれ以上の過剰発現を対照アッセーに比較して示す。
【００６３】
上記したように、ポリヌクレオチド（核酸断片）及び特にｃＤＮＡに対して更に予期される変性は、優性ネガティブタンパク質のそれである。
【００６４】
一般的に、種々の優性ネガティブタンパク質は、この分野で知られた方法によって作ることができる。例えば、イオンチャンネルタンパク質は、例えば、選択された膜貫通領域を除去することによって、優性ネガティブタンパク質が容易に作られる、一つのタンパク質ファミリーとして認識されている。殆どの場合、イオンチャンネル結合複合体の機能は、優性ネガティブイオンチャンネルタンパク質の相互作用によって、実質的に減少又は除去される。
【００６５】
いくつかの特別な戦略が、優性ネガティブタンパク質を作るために開発されている。そのような戦略の例としては、所望のタンパク質をコードするｃＤＮＡ配列の欠失を目標とし標的とするオリゴヌクレオチドが挙げられる。
【００６６】
優性ネガティブタンパク質の創造は、遺伝子欠失及びアンチセンスＲＮＡのような遺伝子操作の別の従来法とは同義ではないことが強調される。「優性ネガティブ」の意味は、正に、内因性タンパク質を不活性化する能力を有する優性ネガティブタンパク質を産生する適切なＤＮＡ構築によって駆動され得る（即ち、発現され得る）「ポイゾンピル（ｐｏｉｓｏｎ ｐｉｌｌ）」と特別にに呼ばれることがある。
【００６７】
例えば、一つのアプローチにおいて、一つ又はそれ以上の膜貫通領域を含むタンパク質をコードするｃＤＮＡが、少なくとも一つの、好ましくは、２、３、４、５、６又はそれ以上の膜貫通領域を除去するように変性される。好ましくは、得られた変性されたタンパク質は、少なくとも一つの別のタンパク質、及び通常は一つ以上のタンパク質と結合複合体を形成する。既述したように、変性されたタンパク質は、例えば、本明細書に記載された標準リガンド結合アッセー又は電気生理学的アッセーによってアッセーされる、結合複合体の正常の機能を阻害する。例示する結合複合体は、イオンチャンネルタンパク質複合体に生じるような電気荷電伝播に関与するものである。一般的には、優性ネガティブタンパク質は、全長タンパク質と比較して、結合複合体の活性の少なくとも１０パーセント又はそれ以上の阻害、より好ましくは少なくとも２０パーセント又はそれ以上、そして更により好ましくは、少なくとも約３０、４０、５０、６０、７０、８０又は１００パーセント又はそれ以上の、結合複合体の阻害を示す。
【００６８】
更なる例示として、本方法において使用される所望のタンパク質をコードするｃＤＮＡは、タンパク質の少なくとも一つのアミノ酸が欠失されるように、変性することができる。欠失したアミノ酸類は、全長タンパク質配列の長さの、本質的に約１％まで、より好ましくは少なくとも約５％、そして更により好ましくは約１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０又は９５％までの連続又は非連続欠失であり得る。
【００６９】
代わりに、所望のタンパク質をコードするｃＤＮＡは、コード化したタンパク質中の少なくとも一つのアミノ酸が保存又は非保存アミノ酸によって置換されるように、変性することができる。例えば、フェニルアラニンで置換されたチロシンアミノ酸は保存アミノ酸置換の例であり、これに対して、アラニンで置換されたアルギニンは非保存アミノ酸置換を示す。置換されたアミノ酸は、全長タンパク質配列の長さの、本質的に約１％まで、より好ましくは約５％、そして更に、より好ましくは約１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０又は９５％まで、連続又は非連続置換であり得る。
【００７０】
一般的にあまり好ましくはないが、所望のタンパク質をコードする核酸セグメントは、少なくとも一つのアミノ酸がコードされたタンパク質に加えられるように、変性することができる。アミノ酸付加は、ｃｄｓのＯＲＦを変えないことが好ましい。一般的には、約１〜５０個のアミノ酸、好ましくは約１〜２５個のアミノ酸、より好ましくは約２〜１０個のアミノ酸が、コードされたタンパク質に加えられる。特に好ましい付加部位は、選択されたタンパク質のＣ−又はＮ−末端である。
【００７１】
好ましい発明の実施は、上記のポリヌクレオチドの少なくとも一つを好適な心筋核酸送達システムを用いて投与することを包含する。一つの実施態様において、該システムは、ポリヌクレオチドに操作可能に結合した非ウイルスベクターを包含する。そのような非ウイルスベクターは、ポリヌクレオチド単独又は好適なタンパク質、多糖類又は脂質製剤との組合せを包含する。
【００７２】
本明細書で使用される、用語「操作可能に結合した」は、そのように記載された成分が通常の機能を遂行出来るように設定されている、要素の配置のことを意味する。それ故、コードされた配列に操作可能に結合した制御配列は、コードされた配列の発現に影響を与えることができる。制御配列は、それが配列を指している限り、コードされた配列に隣接している必要はない。それ故、例えば、介在する非翻訳であるが転写されている配列が、プロモーター配列とコード配列の間に存在することができ、そして、プロモーター配列は、依然として、コードされた配列に「操作可能に結合している」と考えることができる。
【００７３】
本明細書で使用される、用語「コードされた配列」又は特定のタンパク質を「コードする」は、適切な制御配列の制御下におかれた場合、インビトロ又はインビボで、転写され（ＤＮＡの場合）、ポリペプチドに翻訳される（ｍＲＮＡの場合）核酸配列である。コードされた配列の境界は、５’（アミノ）末端の開始コドンと３’（カルボキシ）末端の翻訳停止コドンによって決定される。コード配列は、限定されないが、原核又は真核ｍＲＮＡからのｃＤＮＡ、原核又は真核ＤＮＡからのゲノムＤＮＡ配列、及び合成ＤＮＡまでも包含することができる。転写終結配列は、通常、コード配列に対し３’に位置している。
【００７４】
本明細書で使用される、「核酸」配列は、ＤＮＡ又はＲＮＡ配列をいう。この用語は、また、限定されないが、４−アセチルシトシン、８−ヒドロキシ−Ｎ６−メチルアデノシン、アジリジニルシトシン、シュードイソシトシン、５−（カルボキシヒドロキシメチル）ウラシル、５−フルオロウラシル、５−ブロモウラシル、５−カルボキシメチルアミノメチル−２−チオウラシル、５−カルボキシメチルアミノメチルウラシル、ジヒドロウラシル、イノシン、Ｎ６−イソペンテニルアデニン、１−メチルアデニン、１−メチルシュードウラシル、１−メチルグアニン、１−メチルイノシン、２，２−ジメチルグアニン、２−メチルアデニン、２−メチルグアニン、３−メチルシトシン、５−メチルシトシン、Ｎ６−メチルアデニン、７−メチルグアニン、５−メチルアミノメチルウラシル、５−メトキシアミノメチル−２−チオウラシル、β−Ｄ−マンノシルキュエオシン、５’−メトキシカルボニルメチルウラシル、５−メトキシウラシル、２−メチルチオ−Ｎ６−イソペンテニルアデニン、ウラシル−５−オキシ酢酸メチルエステル、ウラシル−５−オキシ酢酸、オキシブトキソシン、シュードウラシル、キュエオシン、２−チオシトシン、５−メチル−２−チオウラシル、２−チオウラシル、４−チオウラシル、５−メチルウラシル、Ｎ−ウラシル−５−オキシ酢酸メチルエステル、ウラシル−５−オキシ酢酸、シュードウラシル、２−チオシトシン及び２，６−ジアミノプリンのような、ＤＮＡ及びＲＮＡの公知の塩基類縁体のいずれかを包含する配列をいう。
【００７５】
本明細書で使用される用語、「制御配列」は、レシピエント細胞におけるコードされた配列の複製、転写及び翻訳に対して集合的に与えられる、プロモーター配列、ポリアデニル化シグナル、転写終結配列、上流制御領域、複製起点、アイルス（ＩＲＥＳ）、エンハンサー、その他を集合的にいう。選択されたコード配列が、適切な宿主細胞内で複製され、転写され、そして翻訳されることができる限り、これらの制御配列の全てが必ずしも存在する必要はない。
【００７６】
本明細書で使用される、「プロモーター領域」は、普通の意味では、ＲＮＡポリメラーゼが結合し、下流（３’方向）コード配列の翻訳を開始するＤＮＡ制御配列をいう。
【００７７】
特別に好適な心筋核酸システム、特にＩＫ１のような、ある種の活性を抑制することが望ましい場合の、特別に好適な心筋核酸システムは、米国特許第６，２１４，６２０号（D. C. Johns and E. Marban）に記載され、その内容は、参照することによりその全文が本明細書の一部として取り入れられている。そのような構築は、誘導し得るプロモーターの使用によって制御される。そのようなプロモーターの例は、限定されないが、プロゲステロン、エクジソン及びグルココルチコイドのようなホルモン及びホルモン類縁体、更にテトラサイクリン、熱ショック、重金属イオン、インターフェロン及びラクトースオペロン活性化化合物によって制御されるプロモーターによって制御されるものを包含する。これらのシステムの総説は、Gingrich and Roder, 1998, Ann. Rev. Neurosci., 21, 377-405を参照されたい。非哺乳類誘導システムを使用するとき、誘導し得るプロモーター及びリガンドを誘導するためのレセプタータンパク質をコードする遺伝子が使用される。レセプタータンパク質は、一般的には誘導リガンドに結合し、誘導し得るプロモーターにおいて、直接又は間接的に転写を活性化する。
【００７８】
更に好適な心筋核酸送達システムは、アデノウイルス、アデノウイルス随伴ウイルス（ＡＡＶ）、ヘルパー依存性アデノウイルス、レトロウイルス又はセンダイウイルス−リポソーム（ＨＶＪ）複合体の少なくとも一つからの配列である、ウイルスベクターを包含する。好ましくは、ウイルスベクターは、ポリヌクレオチドに操作可能にリンクした強力な真核プロモーター、例えばサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーターを包含する。
【００７９】
更に好ましいベクターは、ウイルスベクター、融合ベクター、化学接合体を包含する。レトロウイルスベクターは、モロニーマウス白血病ウイルス及びＨＩＶに基づいたウイルスベクターを包含する。好ましいＨＩＶに基づいたウイルスベクターの一つは、ＨＩＶゲノムに由来するｇａｇ及びｐｏｌ遺伝子と、他のウイルスに由来するｅｎｖ遺伝子の、少なくとも二つのベクターを含んでいる。ＤＮＡウイルスベクター類が好ましい。これらのベクターは、オルトポックス又はアビポックスベクターのようなポックスベクター、単純ヘルペスＩウイルス（ＨＳＶ）ベクターのようなヘルペスウイルスベクター［Geller, A. I. et al., J. Neurochem, 64:487 (1995); Lim, F. et al. in DNA Cloning: Mammalian Systems, D. Glover, Ed. (Oxford Univ. Press, Oxford England)(1995); Geller, A. I. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90: 7603 (1993); Geller, A. I. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87:1149(1990)］］、アデノウイルスベクター［LeGal LaSalle et al., Science, 259:988(1993); Davidson, et al., Nat. Genet. 3: 219 (1993); Yang, et al., J. Virol. 69: 2004 (1995)］］及びアデノ随伴ウイルスベクター［Kaplitt, M. G. et al., Nat. Genet. 8: 148 (1994)］を包含する。
【００８０】
ポックスベクターは、遺伝子を細胞の細胞質に導入する。アビポックスベクターは、核酸の短期発現だけとなる。アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター及び単純ヘルペスＩウイルス（ＨＳＶ）ベクターは、いくつかの発明の実施態様についての示唆になるであろう。アデノウイルスベクターは、アデノ随伴ウイルスベクターよりも短い期間（例えば約１ヶ月より短い）の発現をもたらすが、ある実施態様では、より長い発現を示す。選択された特定のウイルスは、標的細胞及び処置条件に依存する。好ましいインビボ又はエクスビボ心臓投与技術に関しては、既に記載した。
【００８１】
本明細書に記載したポリヌクレオチドの操作及び取り扱いを単純化するため、核酸は、好ましくは、プロモーターに操作可能に結合したしたカセットに挿入される。プロモーターは所望の標的組織の細胞でタンパク質の発現を駆動できなければならない。適切なプロモーターの選択は、容易に達成できる。好ましくは、高発現プロモーターを使用する。好適なプロモーターの例は、７６３塩基対サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーターである。ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）（Davis, et al., Hum. Gene Ther. 4:151 (1993)）及びＭＭＴプロモーターも使用することができる。これら天然のプロモーターを使用して、ある種のタンパク質を発現させることができる。発現を増強するその他の要素は、エンハンサー又はｔａｔ遺伝子及びｔａｒ要素の如き高発現レベルをもたらすシステムのようなものも包含することができる。このカセットは、ベクター、例えばｐＵＣ１１８、ｐＢＲ３２２のようなプラスミドベクター、又は例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ複製起点を含む、公知のプラスミドベクターに挿入することができる。Sambrook, et al., Molecular Cloning: a Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, (1989)を参照。プラスミドベクターは、また、マーカーポリペプチドが、処理している生物の代謝に悪い影響を及ぼさない限り、アンピシリン抵抗性に対するβ−ラクタマーゼ遺伝子のような選択マーカーを包含し得る。カセットは、ＷＯ９５／２２６１８に開示されているシステムのような統合的な送達システムにおいて、核酸結合部分に結合することができる。
【００８２】
米国公開特許出願ＵＳ２００２００２２２５９Ａ１は、また、心臓細胞において遺伝子発現を促進し、幹細胞を心筋細胞に分化するポリヌクレオチドエンハンサー要素を報告している。
【００８３】
所望により、本発明のポリヌクレオチドは、陽イオン性リポソーム及びアデノウイルスベクターのようなミクロ送達システムと共に使用することができる。リポソームの調製、標的及び内容の送達についての手順のレビューは、以下を参照されたい。Mannino and Gould-Fogerite, BioTechniques, 6: 682 (1988). Felgner and Holm, Bethesda Res. Lab. Focus, 11 (2): 21 (1989) 及び Maurer, R. A., Bethesda Res. Lab. Focus, 11 (2): 25 (1989).
【００８４】
複製欠失組換えアデノウイルスベクターは、公知技術に従って産生することができる。Quantin, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89: 2581-2584 (1992); Stratford-Perricadet, et al., J. Clin. Invest. 90: 626-630 （1992); Rosenfeld, et al., Cell, 68: 143-155 (1992)を参照。
【００８５】
好ましい心筋送達システムの一つは、１又はそれ以上のポリヌクレオチド、好ましくは約一つのポリヌクレオチドを取り込む組換えウイルスベクターである。好ましくは、本発明方法において使用されるウイルスベクターは、約１０８〜約５×１０１０ｐｆｕのｐｆｕ（プラーク形成単位）を有する。ポリヌクレオチドが非ウイルスベクターと一緒に投与される実施態様において、約０．１ナノグラム〜約４，０００マイクログラムの間、例えば、約１ナノグラム〜約１００マイクログラムの使用がしばしば有用であろう。
【００８６】
特定の心筋送達システムの選択は、処置される条件及び所望の発現の量及び長さを含む認められたパラメーターによって導かれる。ヒトへの応用が許可されたウイルスベクター、例えばアデノウイルスの使用は、特に好ましい。
【００８７】
ここでの電気生理学的アッセーについてのリファランスは、心臓活動電位（ＡＰ）を測定するための従来のテストを意味する。一般的にはそのようなテストの実施に関して開示されているFogoros RN, Electrophysiologic Testing, Blackwell Science, Inc. (1999)を参照されたい。
【００８８】
「標準電気生理学的アッセー」についてのここでの特定のリファランスは、以下の一般的なアッセーを意味する。
１）哺乳類の心臓を用意し（インビボ又はエクスビボで）；
２）該心臓を、少なくとも一つの好適なポリヌクレオチドと、好ましくは適切な心筋核酸送達システムと組合せて、又は心筋細胞に分化した幹細胞のような本明細書に開示された変性細胞と組合わせて接触させ；
３）コードされたアミノ酸配列の発現を可能にする条件下で、ポリヌクレオチド又は変性細胞を該心臓に搬入し；
４）投与された（例えば、形質転換された）心臓の少なくとも一つの電気的性質、例えば、伝導、心室反応度、発射数及び／又は脈拍数の少なくとも一つ、好ましくは発射数又は脈拍数のベースライン値に対する変調（増加又は減少）を検出する。理解されるように、ベースライン値は、選択された特定のポリヌクレオチドに関して、しばしば変化する。発現のベースライン値又はタンパク質の定量方法は、ウエスタンブロット、定量ＰＣＲ、又は阻害Ｇタンパク質に対するアデニル酸シクラーゼアッセー、イオンチャンネル電流に対するパッチクランプ法のような機能的アッセーを包含する。電気生理学的（ＥＰ）効果は、インビボでＥＰカテーテルを使用して、心拍数、伝導速度又は不応期を測定することにより定量することができる。好ましい調整の程度は、ベースライン値から、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９又は１０パーセントの差異である。より大きなベースライン値からの増加又は減少、例えば、ベースライン値に対して、少なくとも約１２、１５、２０又は２５パーセントの心拍数又はその他の測定された性質の増加又は減少も、また、達成可能である。
【００８９】
本発明の特別な方法としては、上で論じた線に沿って、コードされたタンパク質を過剰発現させるのに充分なポリヌクレオチドの変性が挙げられる。更に好ましいのは、核酸が優性ネガティブ・イオンチャンネル・タンパク質を産生するように変性される方法である。イオンチャンネルタンパク質は、電位依存性イオンチャンネル（ナトリウム、カルシウム又はカリウムチャンネル）又はリガンド依存性イオンチャンネルであり得る。そのようなチャンネルタンパク質に関する更なる開示は、上記考察及び例えば米国特許第５，４３６，１２８号に見出すことができる。
【００９０】
本発明の実施は、一つ又は異なった投与（送達）システムの組合せと、広範に適合する。
【００９１】
特に、好適な投与経路の一つは、１又はそれ以上の適切なポリヌクレオチドを心筋に入れることを含む。代わりに、投与ステップは、ポリヌクレオチドを心臓の脈管構造中に灌流させることを包含する。所望により、更に投与ステップは、通常の手順、一般的には、遺伝子導入ベクターの投与前又は投与中に、少なくとも一つの血管透過性薬剤を投与する、通常の手順を使用する微小血管透過性増加法を包含する。特別な血管透過性薬剤の例は、１又はそれ以上の、次に示す薬剤を、好ましくは約５００マイクロモル以下のカルシウムを含有する溶液と組合せて投与することを含む：サブスタンスＰ、ヒスタミン、アセチルコリン、アデノシンヌクレオチド、アラキドン酸、ブラジキニン、エンドセリン、エンドトキシン、インターロイキン−２、ニトログリセリン、酸化窒素、ニトロプルシッド、ロイコトリエン、酸素ラジカル、ホスホリパーゼ、血小板活性化因子、プロタミン、セロトニン、腫瘍壊死化因子、血管内皮増殖因子、血管作動性アミン又は一酸化窒素合成酵素。特別なものとしては、セロトニン、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）、又は透過性を増加させる機能性ＶＥＧＦフラグメントがある。
【００９２】
本発明による一般的な灌流プロトコールは、一般に、ポリヌクレオチドを哺乳類の心筋の少なくとも約１０％まで移植するのに充分なものである。約０．５から約５００ｍｌの間の注入容量が好ましい。また、好ましくは、冠動脈血流量は、約０．５〜約５００ｍｌ／分の間である。更に好ましい灌流プロトコールは、ＡＶ結節動脈を含む。形質転換された心臓細胞、一般的にはポリヌクレオチドを含む心筋細胞は、ＡＶ結節又はその近くに好適に配置される。
【００９３】
形質転換心臓の変調を検出するための例示的な戦略は、例えば、上記Fogoros RNに開示されている。好ましい検出戦略は、常法の心電図（ＥＣＧ）の実施である。本発明の使用による心臓の電気的性質の変性は、ＥＣＧの検査で容易に観察される。
【００９４】
より一般的には、本発明は、選択された心臓組織において所望のイオンチャンネル、細胞外レセプター、又は細胞内シグナルタンパク質遺伝子を送達及び発現するのに使用することができる。特に組織の電気的性質の変性、例えば、心拍数の増加又は減少、その不応性の増加又は減少、伝導速度の増加又は減少、焦点自動性の増加又は減少、及び／又は興奮の空間的パターンの変更等に使用される。一般的な方法は、心臓の不整脈を治療するために、心筋の注射又は脈管（動脈、静脈）を通じた灌流による遺伝物質（ＤＮＡ、ＲＮＡ）の送達、又はウイルス（アデノウイルス、ＡＡＶ、レトロウイルス、ＨＶＪ、その他の組換えウイルス）又は非ウイルスベクター（プラスミド、リポソーム、タンパク質−ＤＮＡの組合せ、脂質−ＤＮＡ又は脂質−ウイルスの組合せ、その他の非ウイルスベクター）を用いて、心筋の標的部分に形質転換を促進するのに充分な別の近い物質による送達を含む。
【００９５】
実例として、心臓の発射数に影響を与えるために使用することができる遺伝子は、イオンチャンネル及びポンプ（以下のαサブユニット又は補助サブユニット：カリウムチャンネル、ナトリウムチャンネル、カルシウムチャンネル、塩素チャンネル、延伸で活性化されたカチオンチャンネル、ＨＣＮチャンネル、ナトリウム−カルシウム交換体、ナトリウム−水素交換体、ナトリウム−カリウムＡＴＰアーゼ、筋小胞体カルシウムＡＴＰアーゼ）、細胞レセプター及び細胞内シグナル経路（α又はβ−アドレナリンレセプター、コリンレセプター、アデノシンレセプター、抑制性Ｇタンパク質αサブユニット、促進性Ｇタンパク質αサブユニット、Ｇβγサブユニット）、又はこれらのタンパク質の発現、プロセッシング又は機能プロセッシングを含む。
【００９６】
上で論じたように、変性細胞は、また、細胞又は患者のペースメーカー活性を誘導又は変調させるために投与される。変性細胞の供給源は、胚性骨髄細胞のような分化した（自然に又は駆動された）幹細胞から発生した心筋細胞である。ペースメーカー機能を表す幹細胞由来心筋細胞は、標的心臓組織にカテーテル又は注射によって移植される。幹細胞由来心筋細胞を産生するのに適した方法は、米国公開特許出願ＵＳ２００１/００２４８２４Ａ１及び米国公開特許出願ＵＳ２００２/００２２２５９Ａ１に開示されている。
【００９７】
同様に、未変性の心筋細胞は、先に述べたように、エクスビボにて、所望のペースメーカーを提供するようにポリヌクレオチドの発現で形質転換され、患者の標的心臓組織に、例えばカテーテル又は注射によって移植される。好適には、未変性の心筋細胞は、変性（例えば、本明細書で開示したようにポリヌクレオチド発現系で形質転換される）及び再投与後に、これら細胞の移送を容易にするために、治療を受ける患者から採収される。
【００９８】
変性細胞はレシピエント、即ち、細胞が投与される患者から採収される。例えば、骨髄幹細胞は患者から採収され、ペースメーカー機能を有する心筋細胞に分化される。心臓の細胞、例えば洞結節細胞は、例えばカテーテル又はその他のプロトコールを経て除去されて患者から採収され、例えば本明細書に開示される所望のポリヌクレオチド送達システムの挿入により、変性され、そして患者に投与される。上で論じたように、本明細書で示される如く、投与された細胞は、好ましくは、投与前に幾つかの点で、例えば分化幹細胞又はポリヌクレオチド発現系での形質転換のように変性される；本明細書でいう、「変性され投与された細胞」は、幾つかの点に関して変性されていない単に移植されただけの心臓の細胞を包含しない。
【００９９】
本発明による治療のための好ましい対象は、飼い慣らされた動物、例えば、ブタ、ウマ、イヌ、ネコ、ヒツジ、ヤギ等；齧歯類、例えば、ラット、ハムスター及びマウス；ウサギ；及び霊長類、例えば、サル、チンパンジー等である。より好ましい哺乳類は、ヒトの患者、好ましくは、例えば本明細書に開示されているような、心臓のリズム障害を有する又は有する疑いがある患者である。
【０１００】
治療のための好ましい対象は、本明細書に開示されたような、以下の疾病又は障害に罹っている、又は感受性を有するもの：例えば、心臓に関連する立ちくらみ、特にストークス・アダム立ちくらみ；洞結節機能の異常、例えば、持続性の洞徐脈、ウェンケバッハＳ−Ａとして現れる洞房（Ｓ−Ａ）ブロック、完全Ｓ−Ａブロック又は洞停止、及び高度房室ブロック；或いは徐脈頻脈症候群又はその他の徐脈関連状態、を含む。
【０１０１】
核酸の有効量は、特定の発現タンパク質、特定の標的となる心臓不整脈、患者及びその臨床症状、体重、年齢、性別等の関数である。
【０１０２】
より特異的な本発明の効果は、局所効果を伝達する能力（集中的標的遺伝子送達による）、可逆性効果（限定はされないが、野生型又は変異イオンチャンネル遺伝子を発現するテトラサイクリン誘導可能プロモータを使用するアデノ随伴ウイルスベクターを含む、公知又は新世代のベクターを包含する、誘導し得るベクターの使用による）、等級化（上記したように誘導し得るベクターの使用によるが、ここで等級化は誘導薬剤の投与量を滴定することにより達成される）、遺伝子構築物の同定に基づいた治療の特異性、遺伝子構築物の同定に基づいた内因性メカニズムによる治療作用を制御する能力（神経又はホルモン）、及び随伴する費用及び罹患率に沿った、電子ペースメーカー及びＡＩＣＤ類を含む埋め込み可能なハードウエアの排除を包含する。
【０１０３】
以下の非限定的実施例は本発明の例示である。本明細書に挙げた全ての資料は、参照することにより本明細書の一部として取り入れられている。
【実施例１】
【０１０４】
心室筋細胞の潜在的ペースメーカー活動に対するＫｉｒ２チャンネルの阻害効果
［材料及び方法］
＜優性ネガティブ効果＞
ＩＫ１発現に対するＫｉｒ２．１ＡＡＡの優性ネガティブ効果は、Ｈｅｒｓｋｏｗｉｔｚのアプローチを使用して達成された。（例えば、Herskowitz, Nature 329, 219-22; (1987)を参照）ＧＹＧモチーフ、選択性及び孔機能に重要な役割を演じているカリウムチャンネルのＨ５領域における３つのアミノ酸を、Ｋｉｒ２．１において３つのアラニンに置換した。
【０１０５】
＜ベクター＞
増強した緑色蛍光タンパク質（ＥＧＦＰ、Clontech, Palo Alto, CA, USA）及びＫｉｒ２．１ＡＡＡの両者をコードした、２シストロンアデノウイルスベクターを、前記のようにして、アデノウイルスシャトルベクターｐＡｄＥＧＩ（D. C. Johns, H. B. Nuss, E. Marban, J. Biol. Chem. 272, 31598-603, (1997)）及びｐＡｄＣ−ＤＢＥｃＲ（U. C. Hoppe, et al., J. Clin. Invest. 105, 1077-84 (2000)）を用いて創製した。ヒトＫｉｒ２．１の全長コード配列（G. F. Tomaselli, Johns Hopkins Univ.から供給された）を、ｐＡｄＥＧＩの複数のクローニング部位にクローニングしてｐＡｄＥＧＩ−Ｋｉｒ２．１を生成した。優性ネガティブ変異ＧＹＧ→ＡＡＡを部位特異的突然変異誘発によりＫｉｒ２．１に導入し、ベクターｐＡｄＥＧＩ−Ｋｉｒ２．１ＡＡＡを創製した。アデノウイルスベクターは、記載されているようにして、精製５ウイルスＤＮＡ及びシャトルベクターＤＮＡのＣｒｅ−ｌｏｘ組換えにより創製した（D. C. Johns et al., J. Neurosci. 19, 1691-7 (1999)）。組換え産物は、プラーク精製し、拡張し、ＣｓＣｌ勾配で精製し、１ｍｌ当たり１０１０プラーク形成単位（ＰＦＵ）のオーダーに濃縮した。
【０１０６】
＜インビボ遺伝子送達＞
心臓内注射は、外側開胸後、大人のモルモット（２５０〜３００ｇ）の左心室腔に注射によって達成された。大動脈及び肺動脈を先ず交差クランプし、３０ゲージ針を頂端に挿入し、アデノウイルス溶液の左心室洞への注射を可能とした。アデノウイルス混合物総容積２２０μｌ［３ｘ１０１０ＰＦＵのＡｄＣ−ＤＢＥｃＲ及び２ｘ１０１０ＰＦＵのＡｄＥＧＩ（対照群）又は３ｘ１０１０ＰＦＵのＡｄＣ−ＤＢＥｃＲ及び３ｘ１０１０ＰＦＵのＡｄＥＧＩ−Ｋｉｒ２．１ＡＡＡ（ノックアウト群）を含む］を注射した。クランプ前４０〜６０秒間閉塞した大動脈及び肺動脈を解除した。この手順で、閉鎖系に対して心臓がポンピングしている間、ウイルスが冠状動脈中を循環することを可能にし、導入した細胞の広範な分布をもたらした。閉胸後、動物に非ステロイドエクジソン作用薬、ＧＳ−Ｅ（［Ｎ−メトキシ−２−エチルベンゾイル）−Ｎ’−（３，５−ジメチルベンゾイル）−Ｎ’−ｔｅｒブチルヒドラジン］；Rohm and Haas Co., Spring House, Pennsylvania, USAより供与された）４０ｍｇをＤＭＳＯ９０μｌ及びゴマ油３６０μに溶解して、腹腔内注射した。
【０１０７】
＜形質導入効果＞
形質導入効果は、ＡｄＣＭＶ−βｇａｌ（１６０μｌ、２ｘ１０１０ｐｆｕ／ｍｌ）をＬＶ腔に注射後４８時間の、顕微鏡切片の組織学的評価によって評価した。動物を殺処分した後、心臓を切除し、ＰＢＳで完全にリンスし、横断面で切断した。切片は、記載されているようにして、２％ホルムアルデヒド／０．２％グルタルアルデヒドで固定し、１．０ｍｇ／ｍｌの５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル− −Ｄ−ガラクトシド（Ｘ−ｇａｌ）を含有するＰＢＳ中で染色した（J. K. Donahue et al., Nat. Med. 6, 1395-8 (2000)）。切片はパラフィンに包埋し、５μｍ厚に切り出し、形質導入効果の目視評価のためにＸ−ｇａｌ溶液で染色した（J. K. Donahue et al., Nat. Med. 6, 1395-8 (2000)）。この遺伝子送達法により、およそ２０％の心室筋細胞がＬＶ壁を通過して形質導入が達成された。
【０１０８】
注射の６０〜７２時間後に、モルモット左心室筋細胞をＬａｎｇｅｎｄｏｒｆｆ灌流を用いて単離し、コラゲナーゼを用いて消化した（R. Mitra et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 83, 5340-4 (1986); U. C. Hoppe et al., Circ. Res. 84, 964-72 (1999)）。解離は、一般的には、６０〜７０％の生存心筋細胞を与えた。キセノンアークランプを使用してＧＦＰ蛍光、４８８／５３０ｎｍ（励起／照射）、を観察した。形質導入筋細胞は、エピフルオレッセンスを用いた緑蛍光によって同定された。ＬＶ腔注射アプローチを使用した形質導入及び生存単離筋細胞の収率（−２０％）は、直接心筋内注射よりも高かった（U. C. Hoppe et al., J. Clin. Invest. 105, 1077-84 (2000); U. C. Hoppe et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 98, 5335-40 (2001)）。
【０１０９】
細胞の記録は、Ａｘｏｐａｔｃｈ２００Ｂ増幅器（Axon Instruments, Foster City, California, USA）で全細胞パッチクランプ法（２４）、サンプリング１０ｋＨｚ（電流用）又は２ｋＨｚ（電圧記録用）及びフィルタリング２ｋＨｚを使用して実施された。内部記録溶液で満たしたとき、ピペットは先端抵抗２〜４ＭΩを有した。細胞は、１４０ｍＭ ＮａＣｌ、５ｍＭ ＫＣｌ、２ｍＭ ＣａＣｌ２、１０ｍＭ グルコース、１ｍＭ ＭｇＣｌ２、１０ｍＭ ＨＥＰＥＳを含有する生理食塩水で活性を維持した。ｐＨはＮａＯＨで７．４に調整した。ＩＫ１記録には、ＣａＣｌ２を１００ｐＭに減じ、ＣｄＣｌ２（２００μＭ）をＩｃａＬをブロックするために加えた、そしてＩＮａを、保持電圧−４０ｍＶを使用して、定常状態に不活性化した。バリウム（Ｂａ２＋）感受性電流としてＩＫ１を得るため、Ｂａ２＋（５００μＭ）添加後残存するバックグランド電流を、記録から減じた。ピペット溶液は、１３０ｍＭ Ｋ−グルタミン酸、１９ｍＭ ＫＣｌ、１０ｍＭ ＮａＨｅｐｅｓ、２ｍＭ ＥＧＴＡ、５ｍＭ Ｍｇ−ＡＴＰ、１ｍＭ ＭｇＣｌ２；から成り、ｐＨはＫＯＨで７．２に調整された。データは、測定された液体接合部電圧（junction potential）−１２ｍＶを補正しなかった。活動電位は、０．３３Ｈｚにて簡易脱分極電流パルス（２ｍｓ、５００〜８００ｐＡ、１１０％閾値）によって開始された。活動電位持続時間（ＡＰＤ）は、オーバーシュートから５０％又は９０％再分極までの時間（それぞれ、ＡＰＤ５０、ＡＰＤ９０）として測定された。ＩＣａ，Ｌ記録用に、細胞は、１４０ｍＭ Ｎ−メチル−Ｄ−グルカニン、５ｍＭ ＣｓＣｌ、２ｍＭ ＣａＣｌ２、１０ｍＭ グルコース、０．５ｍＭ ＭｇＣｌ２、１０ｍＭ ＨＥＰＥＳを含有する生理食塩水で活性を維持した；ｐＨはＨＣｌで７．４に調整された。ピペット溶液は、１２５ｍＭ ＣｓＣｌ、２０ｍＭ ＴＥＡ−Ｃｌ、２ｍＭ ＥＧＴＡ、４ｍＭ Ｍｇ−ＡＴＰ、１０ｍＭ ＨＥＰＥＳから成り、ｐＨはＣｓＯＨで７．３に調整された。報告したデータは、平均値±Ｓ．Ｅ．Ｍ．であり、Ｐ＜０．０５（ｔ−テスト）で統計学的有意差を示した。
【０１１０】
全ての記録は、生理的温度（３７℃）及びインビボ形質導入の６０〜７２時間後に行われた。アデノウイルス感染自体は、モルモット心筋細胞の電気生理を変性しないと仮定し（U. C. Hoppe et al., J. Clin. Inest. 105, 1077-84 (2000)）、ＡｄＥＧＩ−Ｋｉｒ２．１ＡＡＡを注射した動物（ＡＰＤ５０＝２３３．８±１０．５ｍｓ、ｎ＝６）から単離された非形質導入（緑でない）左心室筋細胞、及びＡｄＥＧＩを注射した心臓（ＡＰＤ５０＝２４７．６±１０．３ｍｓ、ｎ＝２４、Ｐ＝０．５２）から単離された緑細胞で行われたパッチクランプ法実験を、対照として使用した。
【０１１１】
＜心電図＞
表面ＥＣＧは、手術後直ぐ、及び既報のように心筋内注射の７２時間後に記録された（U. C. Hoppe et al., J. Clin. Invest. 105, 1077-84 (2000); U. C. Hoppe et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 98, 5335-40 (2001)）。モルモットを、イソフルランで鎮静し、針電極を皮下に設置した。電極の位置は、最大増幅記録を得るため至適化され、正確なＱＴ間隔が得られた。ＥＣＧは、標準リード１１、及び改良リードＩ及びＩＩＩで同時に記録された。針電極の位置を、記録後モルモットの皮膚上にマークし、７２時間後の位置を正確に同じにした。速度補正ＱＴ間隔（ＱＴｃ）を計算した（E. Hayes et al., J. Pharmacol. Toxicol. Methods 32, 201-7 (1994)）。
【０１１２】
＜結果＞
アラニンによるＫｉｒ２．１の孔領域における３つの臨界残基の置換（ＧＹＧ１４４−１４６→ＡＡＡ、又はＫｉｒ２．１ＡＡＡ）は、野生型Ｋｉｒ２．１と共発現するとき、電流束を抑制する優性ネガティブ構築体を創製する。卵母細胞において、Ｋｉｒ２．１ＡＡＡＲＮＡ単独の注射は電流を生じないが、野生型Ｋｉｒ２．１ＲＮＡと一緒に注射すると、ＩＫ１の抑制を生じる。４量体Ｋｉｒチャンネル内への単一変異体サブユニットの取り込みは、ノックアウト機能には充分である。Ｋｖ１．２電流はＫｉｒ２．１ＡＡＡＲＮＡと一緒に注射することによって減少しないので、優性ネガティブ効果は、カリウムチャンネルのＫｉｒファミリーに特異的である。Ｋｉｒ２．１ＡＡＡが、Ｋｉｒ２．１を安定的に発現している哺乳動物細胞株（ＨＥＫ）に、一過性に発現したとき、優性ネガティブ構築体はＩＫ１を約７０％減少した。
【０１１３】
Ｋｉｒ２．１ＡＡＡを２シストロン・アデノウイルス・ベクターにパッケージし、モルモット左心室腔に注射した。この送達方法は、心室筋細胞の〜２０％の形質導入を達成するのに充分であった（図１）。Ｋｉｒ２．１ＡＡＡでインビボ形質導入して３〜４日後に単離された筋細胞は、ＩＫ１の抑制を示した（図２Ｂ、Ｃ）が、カルシウム電流は変化せずに残存した（図２Ｅ、Ｆ）。
対照の心室筋細胞は自発活動を示さなかったが、脱分極外部刺激を与えると単一活動電位を発射した（図３Ａ）。対照的に、Ｋｉｒ２．１ＡＡＡ筋細胞は二つの表現型：即ち、外部刺激によって持続活動電位が惹起される安定静止電位（図３Ｃ、「長ＱＴ表現型」）、又は自発活動（図３Ｅ）のいずれかを示した。活動電位の持続は、心電図でのＱＴ間隔を長くすることが期待される（長ＱＴ表現型）が、これに対し、自発活動は真性のペースメーカー細胞のそれに似ている；最大拡張期電位は、段階的「フェーズ４」脱分極及びゆるやかなとり込みによって開始される、反復する、通常のそして絶え間ない電気活動と共に、相対的に脱分極される（表１）。異なる表現型は、ＩＫ１密度の３つの別個の範囲に対応する（図２Ｂ、Ｄ、Ｆ、Ｇ）。それ故、Ｋｉｒ２．１ＡＡＡ形質導入筋細胞は、特定の細胞にどれくらいのＩＫ１抑制が起こったかに依存して、長ＱＴ表現型又はペースメーカー表現型のいずれかを示す。ＩＫ１が０．４ｐＡ／ｐＦ以下（−５０ｍＶで）に抑制された筋細胞は、全て自発ＡＰを表し、ＩＫ１が０．４ｐＡ／ｐＦＩＫ１以上の筋細胞は、安定した休止膜電位及び持続的活動電位を有した。
【０１１４】
ペースメーカー表現型の細胞は、Ｎａチャンネルブロッカー、テトロドトキシンによって影響されなかった（図４Ａ、Ｂ）、しかし、カルシウムチャンネルブロッカーに曝露している間、自発発射は止まった（カドミウム、図４Ｃ、Ｄ；ニフェジピン、Ｅ、Ｆ）。それ故、自発活動電位が基礎にある興奮電流は、真性のペースメーカー細胞での場合のように、カルシウムチャンネルによって実行される。同様に、Ｋｉｒ２．１ＡＡＡ自発表現型細胞は、丁度、結節筋細胞が行うようにβアドレナリン刺激に応答し、心拍数を加速するペーシング速度を増加する（図５）。
【０１１５】
表２に、対照、長ＱＴ表現型Ｋｉｒ２．１ＡＡＡ、及びペースメーカー表現型Ｋｉｒ２．１ＡＡＡミオサイトにおける活動電位の物性値を示す。全ての対照（ｎ＝３０）及び長ＱＴ表現型Ｋｉｒ２．１ＡＡＡ細胞（Ｋｉｒ２．１ＡＡＡ細胞２２の中の７）において、電気刺激に応答して、安定な活動電位が誘発された。ペースメーカー表現型Ｋｉｒ２．１ＡＡＡ細胞（Ｋｉｒ２．１ＡＡＡ細胞２２の中の１５）は帰属刺激無しで自発活動電位を示した。
【０１１６】
【表２】
【０１１７】
表中のＡＰＤ５０及びＡＰＤ９０は、ＡＰが、５０％又は９０％再分極にオーバーシュートする活動電位持続時間を測定したものである。
【０１１８】
心電図は二つの表現型を表す。図６Ａは、ＱＴ間隔の持続を示す（図６Ａ）。それにも拘わらず、動物の４０％は、自発的心室病巣を示唆する変化した心臓リズムを示した（図６Ｂ）。心室起源の期外収縮は、その広い幅によって区別することができ、そして生理的洞ペースメーカーの脈拍とは無関係に、脈拍が「進行し続ける」のが見られる。正常な洞リズムにおいては、全てのＰ波の後は、ＱＲＳ複合が続く。しかしながら、もし誘導されたペースメーカーの病巣から異所性の脈拍が生じたら、心臓全体を心室から先導することができる。実際、Ｋｉｒ２．１ＡＡＡで形質導入して７２時間後動物５頭の内２頭において、心室自動能が発現していた。これら２頭の動物では、Ｐ波は、ＱＲＳ複合群に続いていなかった；Ｐ波とＱＲＳ複合群は、独立したリズムを保持していた。ＲＲ間隔は、ＰＰ間隔より短く、心室由来のリズム（自動能のために加速された心室リズム）を表わしていた。インビボでの二つの表現型は、独特な長ＱＴ及びペースメーカー細胞性表現型によく一致した。
優性ネガティブの結果は、本明細書において使用された方法の永続性及び特異性を明らかにしている。これらの結果は、Ｋｉｒ２チャンネルの特異的抑制が、心室筋細胞におけるペースメーカー活動を解放するのに充分であることを明らかにしている。これらの結果は、また、ペーシングに対する重要な因子は、特定の遺伝子の存在よりも、むしろ、単に強く分極したＩＫ１の不存在であることを明らかにしている（そのような遺伝子は、真性のペースメーカー細胞における重要な変調的役割を演じているのであろうが）。
【実施例２】
【０１１９】
ＨＣＮ１チャンネルを非機能性にした三重変異ＧＹＧ３６５−３６７ＡＡＡ
＜分子生物学及び異種性発現＞
ｍＨＣＮ１及びｍＨＣＮ２をｐＧＨ発現ベクターにサブクローニングした。（B. Santoro, et al., Cell, 93:717-29 (1998)）。重複した突然変異プライマーにより、部位特異的突然変異誘発をＰＣＲを用いて実施した。全ての構築について、所望の突然変異が存在することを確かめるために配列決定を行った。ｃＲＮＡを、ＨＣＮ１及びＨＣＮ２チャンネルのそれぞれに対してＴ７ＲＮＡポリメラーゼ（Promega, Madison, WI）を用いて、Ｎｈｅｌ−及びＳｐｈｌ−直線化ＤＮＡから転写した。チャンネル構築物は異種性に発現し、そしてツメガエルの卵母細胞で試験した。簡潔に記載すると、ＩＶ期からＶＩ期の卵母細胞を１％トリカイン（即ち３−アミノ安息香酸エチルエステル）中に液浸することにより麻酔した雌カエルから外科的に分離し、次いで、８８ｍＭ ＮａＣｌ、２ｍＭ ＫＣｌ、１ｍＭ ＭｇＣｌ２、及び５ｍＭ ＨＥＰＥＳ（ＮａＯＨでｐＨ７．６に調整）を含有するＯＲ−２中で、２ｍｇ／ｍｌコラゲナーゼで、３０〜６０分消化した。単離した卵母細胞は、示したように、ｃＲＮＡ（１ｎｇ／ｎｌ）を注射し、９６ｍＭ ＮａＣｌ、２ｍＭ ＫＣｌ、１．８ｍＭ ＣａＣｌ２、１ｍＭ ＭｇＣｌ２、及び５ｍＭ ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．６に調整）、５０μｇ／ｍｌゲンタマイシン、５ｍＭ ピルビン酸及び０．５ｍＭ テオフィリンを補足、を含むＮＤ９６溶液中に実験前１〜４日貯蔵した。１０〜２５ｎｇ／細胞が発現される電流の幅に直線的に比例する範囲に相当するのであるが、１細胞当たり５０〜１００ｎｇの総ｃＲＮＡの注射で、最大発現を達成するためには充分であることが見出された。
【０１２０】
＜電気生理＞
２電極の電圧固定法の記録を室温（２３〜２５℃）で、ＷａｒｎｅｒＯＣ−７２５Ｃ増幅器（Hamden, CT）を用いて実施した。寒天を詰めた電極（ＴＷ１２０Ｆ−６；World Precision Instruments）を、ＳｕｔｔｅｒＰ−８７水平引き手で引き、３ＭのＫＣｌを充填し、最終先端抵抗２〜４Ｍａを有していた。記録槽溶液は、９６ｍＭ ＫＣｌ、２ｍＭ ＮａＣｌ、１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、及び２ｍＭ ＭｇＣｌ２、（ＫＯＨでｐＨ７．５に調整）を含んでいた。電流は１０ｋＨｚでディジタル化し、１〜２ｋＨｚで低域フィルターした（−３ｄＢ）。電流記録の入手及び解析は、特注のソフトウエアを用いて行った。
【０１２１】
＜実験プロトコール及びデータ解析＞
定常状態の電流・電圧（Ｉ−Ｖ）の関係は、保持電位−３０ｍＶから１０ｍＶずつの増分で、−１５０から０ｍＶの範囲に亘る３秒パルスの最後に測定したＨＣＮ１電流をプロットすることによって定量された。ＨＣＮチャンネル活性化の電圧依存性は、記録された最大末尾電流（tail current）に標準化した先行する３秒テストパルスの関数として、−１４０ｍＶにパルス化した後、直ちに測定した末尾電流をプロットすることによって評価した。データは、非線形最小二乗法でＭａｒｑｕａｒｄｔ−Ｌｅｖｅｎｂｅｒｇアルゴリズムを用いて、Ｂｏｌｚｍａｎ関数に当てはめた：
ｍ ＝ １／｛１＋ｅｘｐ［（Ｖｔ−Ｖ１／２）／ｋ］｝
ここで、Ｖｔは試験電位、Ｖ１／２は関係の中点、及びｋ＝ＲＴ／ｚＦは傾斜係数である。
【０１２２】
反転電位（Ｅｒｅｖ）に関しては、３秒プレパルスを−１４０（図１１Ｂ参照）又は２０ｍＶのいずれかで先行し、−１００から＋４０ｍＶまでの範囲の試験電圧の群（ｆａｍｉｌｙ）に進めた後、直ちに末尾電流を記録した。二つのプレパルス電位から得た末尾電流の差を試験電位に対しプロットし、線形回帰に合わせてＥｒｅｖを得た。電流動態に関しては、巨視的電流及び末尾電流を単一指数関数にそれぞれ合わせて、活性化（τａｃｔ）及び不活性化（τｄｅａｃｔ）に対する時定数を評価した。
【０１２３】
データは、平均±ＳＥＭで示す。統計的有意差は、Ｓｔｕｄｅｎｔの不対ｔ−検定を用いて決定し、ｐ＜０．０５で有意水準を表した。
【０１２４】
チャンネル機能における三重ＨＣＮ１変異体ＧＹＧ３６５−３６７ＡＡＡ（ＨＣＮ１−ＡＡＡ）の効果を、個々に発現するＷＴ及び変異体チャンネル構築物により評価した。図８は、ＷＴＨＣＮ１ｃＲＮＡを注射した卵母細胞の過分極が、電位−４０ｍＶ以下に達して時間依存性内向き電流を引き出し、それが〜５００ｍｓ後に定常状態電流幅に達したことを示す。電流は、漸進性の過分極を有する幅で増加した。対照的に、注射しない卵母細胞及びＨＣＮ１ＡＡＡを注射した卵母細胞は、測定し得る電流を生じなかった、このことは三重アラニン置換は、ＨＣＮ１を完全に非機能性にしたことを示している。
【０１２５】
＜ＨＣＮ１ＡＡＡが優性ネガティブ様式でＷＴＨＣＮ１の正常活性を抑制する＞
前の研究では、正常及び欠失サブユニットを多重結合の複合体を形成するように共組み立てするとき、優性ネガティブ様式でチャンネル活性を無能化することができる多くのイオンチャンネル変異体を同定した。R. Li et al., J. Physiol, 533:127-33 (2001); J. Seharaseyon, J. Mol. Cell Cardiol. 32:1923-30 (2000); MT Perez-Garcia, J. Neurosci., 20: 5689-95 (2000); J. Seharseyon et al., J. Biol. Chem., 75: 17561-5 (2000); UC Hoppe et al., J. Clin. Invest. 105: 1077-84 (2000); MJ Lalli et al., Pflugers Arch. 436: 957-61 (1998); DC John et al., J. Biol. Chem. 272: 31598-603 (1997). ＨＣＮ１−ＡＡＡは、ＷＴＨＣＮ１サブユニットと結合するとき、優性ネガティブ効果を発揮することが予期された。図９は、５０ｎｌＷＴＨＣＮ１及び５０ｎｌＨＣＮ１−ＡＡＡｃＲＮＡ（濃度＝１ｎｇ／ｎｌ）と共注射された卵母細胞は、同じインキュベーション時間の後−１４９ｍＶで測定すると、ＷＴＨＣＮ１ｃＲＮＡのみ５０ｎｌ注射した細胞よりも電流が８５．２±１．９％（ｎ＝８）少なく発現されることを示している（ｐ＜０．０１；図９Ｂ）。そのような定量的相異は、それらの対応する定常状態電流−電圧関係により示されたように、ＨＣＮ１チャンネルの殆どの活動範囲を通して存在していた（図９Ｃ）。これらの観察は、ＨＣＮ１−ＡＡＡが、同じ数の機能性サブユニットの存在にも拘わらず、優性ネガティブ様式でＷＴＨＣＮ１チャンネルの正常活動を抑制することができることを明らかにしている（以前のＫ＋チャンネルの研究において普通であったのと等しいＲＮＡ安定性と翻訳効率を仮定した場合、Hille B. Ion channels of Excitable Membranes, 3rd Ed., Sunderland, Massachusetts, USA. Sinauer Associates, Inc. 2001; R. MacKinnon Nature, 1991; 350:232-5）。対照的に、５０ｎｌＷＴＨＣＮ１ｃＲＮＡと等量のｄＨ２Ｏの共注射は、５０ｎｌＷＴＨＣＮ１単独の注射と差がない大きさの電流が得られた（ｐ＞０．０５）。このことは、ＨＣＮ１−ＡＡＡで観察された優性ネガティブ抑制効果は、機械感受性効果のような非特異的機構によるものではないことを示唆している。本発明者等は、また、注射される総ｃＲＮＡを一定に保ちつつ（２５ｎｇを発現の飽和を防止するために使用した）ＷＴＨＣＮ１：ＨＣＮ１−ＡＡＡ及びＷＴＨＣＮ２：ＨＣＮ１−ＡＡＡの比率を変化した効果を研究した。優性ネガティブ機構から予測されたように、電流抑制はＨＣＮ１−ＡＡＡの増加に比例して増加した（ＷＴＨＣＮ１：ＨＣＮ１−ＡＡＡがそれぞれ、４：１、３：１、２：１、１：１及び１：２の比率に対して、５５．２±３．２、６８．３±４．３、７８．７±１．６、９１．７±０．８、９７．９±０．２％の電流減少が見られた；図１０）。
【０１２６】
＜優性ネガティブ構築体ＨＣＮ１−ＡＡＡ及びＷＴＨＣＮ１の共発現は、正常通門及び透過性を変更しなかった＞
電流振幅に対する優性ネガティブ抑制効果に加えて、通門及び透過性に対するＨＣＮ１−ＡＡＡとＷＴＨＣＮ１の共発現の効果を調べた。図１１Ａは、ＷＴＨＣＮ１単独の定常状態活動曲線から誘導された中点及び傾斜係数（Ｖ１／２＝−７６．７±０．８ｍＶ；ｋ＝１３．３±０．６ｍＶ；ｎ＝１５）及び、ＨＣＮ１−ＡＡＡで抑制後（比率＝１：１、Ｖ１／２＝−７７．０±１．７ｍＶ；ｋ＝１２．３±１．０ｍＶ；ｎ＝１２）のそれらの両者は同じである（ｐ＞０．０５）ことを示している。末尾電流−電圧関係も、また、全細胞電流はＨＣＮ１−ＡＡＡによって抑制されるが、反転電位は変化しない（ＷＴＨＣＮ１単独＝−４．５±１．４ｍＶ、ｎ＝８；ＷＴ＋ＡＡＡ＝−５．２５±０．８ｍＶ、ｎ＝５；ｐ＞０．０５；図１１Ｂ、Ｃ）ことを示唆している。同様に、電流活性化（τａｃｔ）及び不活化（τｄｅａｃｔ）時定数（その分布は、対応する定常状態活性化曲線から誘導されたのと比較して中点を有するベル型であった）も、また、研究した電圧範囲全体に亘ってＨＣＮ１−ＡＡＡ抑制後不変であった（ｐ＞０．０５；図１１Ｄ）。本発明者等の観察では、非抑制電流は正常通門及び透過性の表現型を表したことを示唆している。
【０１２７】
＜ＨＣＮ１ＡＡＡは、通門及び透過性を変えずにＷＴＨＣＮ２電流を抑制した＞
もし異なったＨＣＮイソフォームがヘテロメリックチャンネル複合体（heteromeric channel complexes）を形成するように共組み立てすることができれば、ＨＣＮ１−ＡＡＡも、また、本発明者等のＷＴＨＣＮ１での観察に類似した優性ネガティブ様式において、ＷＴＨＣＮ２の活性を抑制する筈である。図１２は、これがその場合であることを示している。５０ｎｌＷＴＨＣＮ２及び５０ｎｌＨＣＮ１−ＡＡＡｃＲＮＡを共注射した卵母細胞から記録した電流は、５０ｎｌＷＴＨＣＮ２単独又は５０ｎｌＷＴＨＣＮ２＋５０ｎｌｄＨ２Ｏを、同じインキュベーション時間の後に注射した卵母細胞において発現された電流より有意に小さかった（図１２Ａ−Ｃ）。事実、ＨＣＮ１−ＡＡＡによる抑制の程度は、研究した全ての他の比率について、ＷＴＨＣＮ１及びＨＣＮ２の両者に対して類似していた（図１０；注射した総ｃＲＮＡ＝２５ｎｇ）。これらを併せて考えると、これらの結果は、二つのアイソマーが、等しい効率で共組立てすることができたことを示唆している。ＨＣＮ１に類似して、非抑制ＨＣＮ２電流の定常状態活性化パラメーター、反転電位、及び通門動態は、ＨＣＮ１−ＡＡＡ共発現によって変化しなかった（ｐ＞０．０５；図１２Ｄ−Ｆ）。
【０１２８】
＜遺伝子工学処理したＨＣＮ１チャンネルは、陽性及び陰性方向に移動したチャンネル活性を表す＞
タンパク質工学によってＨＣＮチャンネル通門性質の変調を行った。図１３Ａ及びＢは、荷電中和置換したＥ２３５Ａは、定常状態チャンネル活性化において有意な脱分極移動（Ｖ１／２＝−５９．２±１．５ｍＶ；ｎ＝７；ｐ＜０．０５）及び傾斜係数における有意でない変化（ｋ＝１２．３±０．９ｍＶ、ｎ＝７；ｐ＞０．０５）を生じた。残基２３５の静電的役割と整合して、荷電復帰突然変異（charge- reversed mutation）Ｅ２３５Ｒは、より陽性側に定常状態活動曲線を移動した（５６．４±０．５ｍＶ、ｎ＝３；ｐ＜０．０５）。傾斜係数（７．９±０．８ｍＶ、ｎ＝３；ｐ＞０．０５）もＰ０，ｍｉｎ（１７．０％±１．９％、ｎ＝３；ｐ＞０．０５）もＥ２３５Ｒ（ｐ＞０．０５；図１３Ａ及びＣ）により影響されなかった。本発明者等は、次に、位置２５３におけるＳ４セリン変異体が、複数の置換によってＨＣＮ１チャンネルの特色ある活性化プロフィールの基礎になっているのかどうかを調べた（図８）。Ｓ２５３をアラニン（即ちＳ２５３Ａ）で置換すると、活性化及び不活性化の両者を遅くするが、定常状態活性化関係及び通門動態の電圧依存性において、平行した過分極移動を生じた（図１３Ｄ）。しかしながら、Ｓ２５３Ａは、Ｐ０，ｍｉｎを変えなかった。Ｓ２５３Ｋ及びＳ２５３Ｅの反対の荷電にも拘わらず、両置換体は、定常状態Ｉ−Ｖ関係を同じ過分極方向に移動させた。これらを総合すると、このことは、ＨＣＮチャンネル活性の活性化閾値（図１３）及び内因的に発現された電流幅（図８〜１２）が、変調し得ることを示している。
【０１２９】
本発明は、好ましい実施態様に関して詳細に記載されている。しかしながら、当業者が本開示を考察して、本発明の精神及び範囲内で、変形及び改良を行い得ることは認識されるであろう。
【図面の簡単な説明】
【０１３０】
【図１】遺伝子転移効力の評価。ＡｄＣＭＶ−ｇａｌをＬＶ腔へ注射して４８時間後の左心室（ＬＶ）の顕微鏡切片のＸ−ｇａｌ染色を形質導入効力の評価に使用した。形質導入細胞（青に染色）はＬＶ壁を通して観察した。この遺伝子送達法は、明らかな細胞損傷なしに心室筋細胞の２０％の形質導入を達成した。
【図２−１】Ｉｋ１抑制の特異性。（Ａ、Ｂ、Ｃ）Ｉｋ１の平均電流密度は、対照細胞に比較して、Ｋｉｒ２．１ＡＡＡ形質導入細胞（ｎ＝９）において有意に減少した（ｎ＝７、P＜０．０００１）。（Ｄ、Ｅ、Ｆ）更に、この結果は、主に変調する機能性Ｋｉｒ２．１チャンネル数の特異的効果の故に、Ｌ型カルシウム電流が、非形質導入細胞（−４．５±０．２ｐＡ／ｐＦ、ｎ＝６）に比べて、Ｋｉｒ２．１−ＡＡＡ形質導入心筋（−４．２±０．９ｐＡ／ｐＦ、ｎ＝４）においては変えられなかったことを示す。
【図２−２】Ｉｋ１抑制の特異性。（Ａ、Ｂ、Ｃ）Ｉｋ１の平均電流密度は、対照細胞に比較して、Ｋｉｒ２．１ＡＡＡ形質導入細胞（ｎ＝９）において有意に減少した（ｎ＝７、P＜０．０００１）。（Ｄ、Ｅ、Ｆ）更に、この結果は、主に変調する機能性Ｋｉｒ２．１チャンネル数の特異的効果の故に、Ｌ型カルシウム電流が、非形質導入細胞（−４．５±０．２ｐＡ／ｐＦ、ｎ＝６）に比べて、Ｋｉｒ２．１−ＡＡＡ形質導入心筋（−４．２±０．９ｐＡ／ｐＦ、ｎ＝４）においては変えられなかったことを示す。
【図３−１】活動電位表現型はＩｋ１密度によって決定される。（Ａ）安定ＡＰが、強いＩｋ１（Ｂ、−５０ｍＶで記録）で対照心室筋細胞における脱分極した外部刺激により誘発された。中程度に抑制されたＩｋ１（Ｄ）を有するＫｉｒ２．１ＡＡＡ形質導入筋細胞、長ＱＴ表現型を有するＡＰが誘発された。自発ＡＰ（Ｅ）が、著しく抑制されたＩｋ１密度（Ｆ）を有するＫｉｒ２．１ＡＡＡ細胞において観察された。３つの別個のＩｋ１密度（Ｇ）の範囲が認められた。Ｉｋ１が０．４ｐＡ／ｐＦ以下に抑制された筋細胞は、ペースメーカー表現型を示した。
【図３−２】活動電位表現型はＩｋ１密度によって決定される。（Ａ）安定ＡＰが、強いＩｋ１（Ｂ、−５０ｍＶで記録）で対照心室筋細胞における脱分極した外部刺激により誘発された。中程度に抑制されたＩｋ１（Ｄ）を有するＫｉｒ２．１ＡＡＡ形質導入筋細胞、長ＱＴ表現型を有するＡＰが誘発された。自発ＡＰ（Ｅ）が、著しく抑制されたＩｋ１密度（Ｆ）を有するＫｉｒ２．１ＡＡＡ細胞において観察された。３つの別個のＩｋ１密度（Ｇ）の範囲が認められた。Ｉｋ１が０．４ｐＡ／ｐＦ以下に抑制された筋細胞は、ペースメーカー表現型を示した。
【図３−３】活動電位表現型はＩｋ１密度によって決定される。（Ａ）安定ＡＰが、強いＩｋ１（Ｂ、−５０ｍＶで記録）で対照心室筋細胞における脱分極した外部刺激により誘発された。中程度に抑制されたＩｋ１（Ｄ）を有するＫｉｒ２．１ＡＡＡ形質導入筋細胞、長ＱＴ表現型を有するＡＰが誘発された。自発ＡＰ（Ｅ）が、著しく抑制されたＩｋ１密度（Ｆ）を有するＫｉｒ２．１ＡＡＡ細胞において観察された。３つの別個のＩｋ１密度（Ｇ）の範囲が認められた。Ｉｋ１が０．４ｐＡ／ｐＦ以下に抑制された筋細胞は、ペースメーカー表現型を示した。
【図３−４】活動電位表現型はＩｋ１密度によって決定される。（Ａ）安定ＡＰが、強いＩｋ１（Ｂ、−５０ｍＶで記録）で対照心室筋細胞における脱分極した外部刺激により誘発された。中程度に抑制されたＩｋ１（Ｄ）を有するＫｉｒ２．１ＡＡＡ形質導入筋細胞、長ＱＴ表現型を有するＡＰが誘発された。自発ＡＰ（Ｅ）が、著しく抑制されたＩｋ１密度（Ｆ）を有するＫｉｒ２．１ＡＡＡ細胞において観察された。３つの別個のＩｋ１密度（Ｇ）の範囲が認められた。Ｉｋ１が０．４ｐＡ／ｐＦ以下に抑制された筋細胞は、ペースメーカー表現型を示した。
【図４−１】カルシウム電流は、自発ＡＰの基礎にある興奮電流である。ペースメーカー表現型を有するＫｉｒ２．１ＡＡＡ形質導入細胞は、Ｎａチャンネルブロッカー、テトロドトキシンによって影響されなかった（１０μＭ、Ａ、Ｂ）が、自発発射は、カルシウムチャンネルブロッカーに曝露中は停止した（カドミウム２００μＭ、Ｃ、Ｄ；ニフェジピン１０μＭ、Ｅ、Ｆ）。
【図４−２】カルシウム電流は、自発ＡＰの基礎にある興奮電流である。ペースメーカー表現型を有するＫｉｒ２．１ＡＡＡ形質導入細胞は、Ｎａチャンネルブロッカー、テトロドトキシンによって影響されなかった（１０μＭ、Ａ、Ｂ）が、自発発射は、カルシウムチャンネルブロッカーに曝露中は停止した（カドミウム２００μＭ、Ｃ、Ｄ；ニフェジピン１０μＭ、Ｅ、Ｆ）。
【図４−３】カルシウム電流は、自発ＡＰの基礎にある興奮電流である。ペースメーカー表現型を有するＫｉｒ２．１ＡＡＡ形質導入細胞は、Ｎａチャンネルブロッカー、テトロドトキシンによって影響されなかった（１０μＭ、Ａ、Ｂ）が、自発発射は、カルシウムチャンネルブロッカーに曝露中は停止した（カドミウム２００μＭ、Ｃ、Ｄ；ニフェジピン１０μＭ、Ｅ、Ｆ）。
【図５】イソプレテレノール（１μＭ）の適用は、ペースメーカー活性を表す４つのＫｉｒ２．１ＡＡＡ形質導入細胞において、自発ＡＰの頻度を増加した（Ａ、Ｂ）。平均周期長は、イソプレテレノール曝露中に、ベースラインでの４３５±２７ｍｓから３５１±１８ｍｓ（ｎ＝４）に減少した（Ｐ＜０．０１）（Ｃ）。
【図６】遺伝子送達前後の心電図。（Ａ）動物５頭中３頭で、ＱＴ間隔が、Ｋｉｒ２．１ＡＡＡの遺伝子導入後７２時間延長された。（Ｂ）動物５頭中２頭で、心室リズムが促進された。融合拍動であるＶと記されたＱＲＳ群を除いて、Ｐ波（青Ａ及び矢印）及び広いＱＲＳ群（赤Ｖ及び矢印）はそれら独自のリズムへ向かって進行した。この動物のベースラインＥＣＧ記録は、正常な洞リズムであった（図示していないがパネルＡに類似）。
【図７】ＨＣＮコード化ペースメーカーチャンネルの推定される膜貫通トポロジーを示す。中央のパネル：ＨＣＮ１チャンネルの単量体サブユニットの６つの膜貫通セグメント（Ｓ１〜Ｓ６）を示す。ＧＹＧの印のモチーフのおよその所在位置を強調して示す。サイクリックヌクレオチド結合領域（ＣＮＢＤ）はＣ−末端領域にある。一番上のパネル：種々のＨＣＮのＳ５−Ｓ６Ｐループ及び脱分極活性化Ｋ＋チャンネルの上昇リムの配列比較。ＧＹＧトリプレット（強調した）は、稀な場合、例えばＨＥＲＧＫ＋チャンネル（この中央の位置はチロシンの代わりに保存された変異フェニルアラニンによって占められている）を除いて、知られている全てのＫ＋選択的チャンネルで保存されている。一番下のパネル：ＨＣＮイソフォーム１−４のＳ３−Ｓ４リンカー及びＳ４のアミノ酸配列を、過分極活性化されたウニ精子チャンネル（ＳＰＨ１）、植物Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ（ＫＡＴ１）からクローニングされた過分極活性化Ｋ＋チャンネル、及び脱分極活性化シェーカー（Shaker）及びＨＥＲＧＫ＋チャンネルと比較したものである。ＨＣＮチャンネルのＳ４は、６番目の位置を除いて（ここでは、カチオン性残基の代わりに中性のセリンが見出される）二つの疎水性アミノ酸によって、互いに規則的に間隔をとった９アミノ酸を含有している。ＳＰＩＨとＫＡＴ１チャンネルは、ＨＣＮチャンネルと比較してＳ４セグメントには一つの少ない塩基性残基を有しているが、Ｓ４を二つの部分に分けるセリンをここでも有している。このＳ４セリンは、Ｋｖチャンネルには見られず、そしてそれは、ＨＣＮ電圧検出モチーフを二つの領域に分割し、ユニークな過分極活性化ＨＣＮチャンネル開口の役割を持っていると仮定されている。
【図８−１】ＨＣＮ１において、ＧＹＧトリプレットをアラニンで置換した（ＧＹＧ３６５−３６７ＡＡＡ）場合の、ＨＣＮ１電流に対する効果を示す。Ａ）ＷＴＨＣＮ１及びＨＣＮ−ＡＡＡｃＲＮＡを注射した卵母細胞、又は、注射しない卵母細胞から記録された全細胞の電流の代表的な追跡。電流を取り出すために使われた電気生理のプロトコールは本文に示す。１０ｍＶの増分で、０から−１５０ｍＶまでの範囲で、３秒の電気パルス群を、保持電位−３０ｍＶから卵母細胞に適用した。末尾電流は−１４０ｍＶで記録した。過分極活性化時間依存性電流は、ＷＴＨＣＮ１を注射した卵母細胞には明らかであるが、同じプロトコールを使用したＨＣＮ１−ＡＡＡ注射細胞及び非注射細胞からは、測定し得る電流は見られなかった。Ｂ）ＷＴＨＣＮ１−ＡＡＡ及びＨＣＮ１−ＡＡＡを注射した（図で、それぞれ、実線の四角及び三角）、及び非注射（図で、白丸）の卵母細胞の定常状態での電流−電圧の関係。データは平均±ＳＥＭで示す。
【図８−２】ＨＣＮ１において、ＧＹＧトリプレットをアラニンで置換した（ＧＹＧ３６５−３６７ＡＡＡ）場合の、ＨＣＮ１電流に対する効果を示す。Ａ）ＷＴＨＣＮ１及びＨＣＮ−ＡＡＡｃＲＮＡを注射した卵母細胞、又は、注射しない卵母細胞から記録された全細胞の電流の代表的な追跡。電流を取り出すために使われた電気生理のプロトコールは本文に示す。１０ｍＶの増分で、０から−１５０ｍＶまでの範囲で、３秒の電気パルス群を、保持電位−３０ｍＶから卵母細胞に適用した。末尾電流は−１４０ｍＶで記録した。過分極活性化時間依存性電流は、ＷＴＨＣＮ１を注射した卵母細胞には明らかであるが、同じプロトコールを使用したＨＣＮ１−ＡＡＡ注射細胞及び非注射細胞からは、測定し得る電流は見られなかった。Ｂ）ＷＴＨＣＮ１−ＡＡＡ及びＨＣＮ１−ＡＡＡを注射した（図で、それぞれ、実線の四角及び三角）、及び非注射（図で、白丸）の卵母細胞の定常状態での電流−電圧の関係。データは平均±ＳＥＭで示す。
【図９−１】ＨＣＮ１ＡＡＡは、優性ネガティブ様式でＷＴＨＣＮ１の正常活性を抑制する。Ａ）５０ｎｌＷＴＨＣＮ１、５０ｎｌＷＴＨＣＮ１＋５０ｎｌｄＨ２Ｏ、及び５０ｎｌＷＴＨＣＮ１＋５０ｎｌＨＣＮ１−ＡＡＡｃＲＮＡ（濃度：１ｎｇ／ｎｌ）を注射した卵母細胞から記録した、代表的電流の追跡。図８と同じ電圧プロトコールを使用した。ＷＴＨＣＮ１とＨＣＮ１−ＡＡＡの共注射が、有意に正常チャンネル活性を抑制した。ＷＴＨＣＮ１末尾電流（図において、四角で囲んである）は、Ｄ）で拡大して示してある。Ｂ）各群の平均電流を拡大して要約した棒グラフ。各群は：Ａ）５０ｎｌＷＴＨＣＮ単独の保持電位に標準化した−３０ｍＶの保持電位から−１４０ｍＶまで、３秒のパルスの最後に測定。＊ｐ＜０．０１。Ｃ）Ａ）からの同じ群の定常状態での電流−電圧関係。Ｄ）−１４０ｍＶにおけるＷＴＨＣＮ１の末尾電流。単一指数関数にこれらの電流を合わせると、活性化に対する時間係数の推定が可能である（図１１Ｄを参照）。
【図９−２】ＨＣＮ１ＡＡＡは、優性ネガティブ様式でＷＴＨＣＮ１の正常活性を抑制する。Ａ）５０ｎｌＷＴＨＣＮ１、５０ｎｌＷＴＨＣＮ１＋５０ｎｌｄＨ２Ｏ、及び５０ｎｌＷＴＨＣＮ１＋５０ｎｌＨＣＮ１−ＡＡＡｃＲＮＡ（濃度：１ｎｇ／ｎｌ）を注射した卵母細胞から記録した、代表的電流の追跡。図８と同じ電圧プロトコールを使用した。ＷＴＨＣＮ１とＨＣＮ１−ＡＡＡの共注射が、有意に正常チャンネル活性を抑制した。ＷＴＨＣＮ１末尾電流（図において、四角で囲んである）は、Ｄ）で拡大して示してある。Ｂ）各群の平均電流を拡大して要約した棒グラフ。各群は：Ａ）５０ｎｌＷＴＨＣＮ単独の保持電位に標準化した−３０ｍＶの保持電位から−１４０ｍＶまで、３秒のパルスの最後に測定。＊ｐ＜０．０１。Ｃ）Ａ）からの同じ群の定常状態での電流−電圧関係。Ｄ）−１４０ｍＶにおけるＷＴＨＣＮ１の末尾電流。単一指数関数にこれらの電流を合わせると、活性化に対する時間係数の推定が可能である（図１１Ｄを参照）。
【図９−３】ＨＣＮ１ＡＡＡは、優性ネガティブ様式でＷＴＨＣＮ１の正常活性を抑制する。Ａ）５０ｎｌＷＴＨＣＮ１、５０ｎｌＷＴＨＣＮ１＋５０ｎｌｄＨ２Ｏ、及び５０ｎｌＷＴＨＣＮ１＋５０ｎｌＨＣＮ１−ＡＡＡｃＲＮＡ（濃度：１ｎｇ／ｎｌ）を注射した卵母細胞から記録した、代表的電流の追跡。図８と同じ電圧プロトコールを使用した。ＷＴＨＣＮ１とＨＣＮ１−ＡＡＡの共注射が、有意に正常チャンネル活性を抑制した。ＷＴＨＣＮ１末尾電流（図において、四角で囲んである）は、Ｄ）で拡大して示してある。Ｂ）各群の平均電流を拡大して要約した棒グラフ。各群は：Ａ）５０ｎｌＷＴＨＣＮ単独の保持電位に標準化した−３０ｍＶの保持電位から−１４０ｍＶまで、３秒のパルスの最後に測定。＊ｐ＜０．０１。Ｃ）Ａ）からの同じ群の定常状態での電流−電圧関係。Ｄ）−１４０ｍＶにおけるＷＴＨＣＮ１の末尾電流。単一指数関数にこれらの電流を合わせると、活性化に対する時間係数の推定が可能である（図１１Ｄを参照）。
【図９−４】ＨＣＮ１ＡＡＡは、優性ネガティブ様式でＷＴＨＣＮ１の正常活性を抑制する。Ａ）５０ｎｌＷＴＨＣＮ１、５０ｎｌＷＴＨＣＮ１＋５０ｎｌｄＨ２Ｏ、及び５０ｎｌＷＴＨＣＮ１＋５０ｎｌＨＣＮ１−ＡＡＡｃＲＮＡ（濃度：１ｎｇ／ｎｌ）を注射した卵母細胞から記録した、代表的電流の追跡。図８と同じ電圧プロトコールを使用した。ＷＴＨＣＮ１とＨＣＮ１−ＡＡＡの共注射が、有意に正常チャンネル活性を抑制した。ＷＴＨＣＮ１末尾電流（図において、四角で囲んである）は、Ｄ）で拡大して示してある。Ｂ）各群の平均電流を拡大して要約した棒グラフ。各群は：Ａ）５０ｎｌＷＴＨＣＮ単独の保持電位に標準化した−３０ｍＶの保持電位から−１４０ｍＶまで、３秒のパルスの最後に測定。＊ｐ＜０．０１。Ｃ）Ａ）からの同じ群の定常状態での電流−電圧関係。Ｄ）−１４０ｍＶにおけるＷＴＨＣＮ１の末尾電流。単一指数関数にこれらの電流を合わせると、活性化に対する時間係数の推定が可能である（図１１Ｄを参照）。
【図１０】ＷＴＨＣＮ１及び２に対する、ＷＴ：ＡＡＡの比率を変えた、ＨＣＮ１−ＡＡＡの優性ネガティブ効果を示す。 ＨＣＮ１−ＡＡＡによるＷＴＨＣＮ１及びＨＣＮ２の電流抑制を、注射したｃＲＮＡのＷＴ：ＡＡＡ比率に対してプロットした。ＨＣＮ１及びＨＣＮ２の両者の抑制は、ＷＴ：ＡＡＡ比の減少と共に増加した。破線は、指示したように、ＨＣＮ単量体の二量体化、三量体化、四量体化、及び五量体化から統計的に予測される抑制−比関係を示す。データは、また、内因性ＨＣＮチャンネル活性が、本明細書に開示された、ＡＡＡ構築体によって変調することができることを示している。
【図１１−１】ＨＣＮ１−ＡＡＡの優性ネガティブ抑制効果は、ＨＣＮ１チャンネルの通門及び透過性を変えなかったことを示す。 Ａ）ＷＴＨＣＮ１単独、及びＨＣＮ１ＡＡＡによって抑制された後の、定常状態での活性化曲線（比＝１：１）。末尾電流は、図９Ａと同じプロトコールを使用し−１４０ｍＶにパルスした後、直ちに測定し、記録された最大の末尾に対して標準化し、そして予め測定したプレパルス（prepulse）電位に対してプロットした。中点も傾斜係数も二つの群の間に差はなかった。
【図１１−２】Ｂ）−１４０ｍＶへの３秒のプレパルスの後に、１０ｍＶずつの漸増で−１００から＋４０ｍＶまでの段階的膜電位による末尾電流−電圧関係を得るために使用した電気生理プロトコール。１ｎｇ／ｎｌＷＴＨＣＮ１ｃＲＮＡの５０ｎｌを注射した卵母細胞から記録された末尾電流の代表的群（ｆａｍｉｌｙ）のみを示す。これらの電流の単一指数関数とあわせて、不活性化（τｄｅａｃｔ）の時間係数を推定することが可能になる。
【図１１−３】Ｃ）ＷＴＨＣＮ１単独注射又はＷＴＨＣＮ１及びＨＣＮ１−ＡＡＡ（比率＝１：１）を共注射した卵母細胞から測定される、末尾電流−電圧関係。全細胞電流は、ＨＣＮ１−ＡＡＡによって抑制されたが、反転電位は変化しなかった。
【図１１−４】Ｄ）ＷＴＨＣＮ１単独（黒塗り印）又はＷＴＨＣＮ１及びＨＣＮ１−ＡＡＡ（白抜き印）の両者（１：１）の共注射によって誘導された電流のτａｃｔ（四角）及びτｄｅａｃｔ（丸）の要約。ｉの分布は、対応する定常状態活性化曲線から誘導された図と類似して、中点を有するベル型であった。発現された電流の通門動態は、ＨＣＮ１−ＡＡＡ注射によって変わらなかった。
【図１２−１】ＨＣＮ２チャンネルに対するＨＣＮ１−ＡＡＡの効果を示す。（Ａ）５０ｎｌＷＴＨＣＮ２、５０ｎｌＷＴＨＣＮ２＋５０ｎｌｄＨ２Ｏ、及び５０ｎｌＷＴＨＣＮ２＋５０ｎｌＨＣＮ１−ＡＡＡｃＲＮＡを注射した卵母細胞から記録した、代表的電流の追跡。ＨＣＮ１−ＡＡＡは、また、ＷＴＨＣＮ２の活性を抑制した。（Ｂ）投与されたｃＲＮＡのＷＴＨＣＮ２：ＨＣＮ１−ＡＡＡ比に対してプロットされたＨＣＮ１−ＡＡＡによるＷＴＨＣＮ２の−１４０ｍＶにおける電流抑制。（Ｃ）Ａ）からの同じ群の定常状態での電流−電圧関係。単独で発現したＷＴＨＣＮ２及びＨＣＮ１−ＡＡＡとの共発現（比＝１：１）の、定常状態活性化（Ｄ）、反転電位（Ｅ）、及び活性化及び不活性化動態（Ｆ）は同じであった（ｐ＞０．０５）。
【図１２−２】ＨＣＮ２チャンネルに対するＨＣＮ１−ＡＡＡの効果を示す。（Ａ）５０ｎｌＷＴＨＣＮ２、５０ｎｌＷＴＨＣＮ２＋５０ｎｌｄＨ２Ｏ、及び５０ｎｌＷＴＨＣＮ２＋５０ｎｌＨＣＮ１−ＡＡＡｃＲＮＡを注射した卵母細胞から記録した、代表的電流の追跡。ＨＣＮ１−ＡＡＡは、また、ＷＴＨＣＮ２の活性を抑制した。（Ｂ）投与されたｃＲＮＡのＷＴＨＣＮ２：ＨＣＮ１−ＡＡＡ比に対してプロットされたＨＣＮ１−ＡＡＡによるＷＴＨＣＮ２の−１４０ｍＶにおける電流抑制。（Ｃ）Ａ）からの同じ群の定常状態での電流−電圧関係。単独で発現したＷＴＨＣＮ２及びＨＣＮ１−ＡＡＡとの共発現（比＝１：１）の、定常状態活性化（Ｄ）、反転電位（Ｅ）、及び活性化及び不活性化動態（Ｆ）は同じであった（ｐ＞０．０５）。
【図１２−３】ＨＣＮ２チャンネルに対するＨＣＮ１−ＡＡＡの効果を示す。（Ａ）５０ｎｌＷＴＨＣＮ２、５０ｎｌＷＴＨＣＮ２＋５０ｎｌｄＨ２Ｏ、及び５０ｎｌＷＴＨＣＮ２＋５０ｎｌＨＣＮ１−ＡＡＡｃＲＮＡを注射した卵母細胞から記録した、代表的電流の追跡。ＨＣＮ１−ＡＡＡは、また、ＷＴＨＣＮ２の活性を抑制した。（Ｂ）投与されたｃＲＮＡのＷＴＨＣＮ２：ＨＣＮ１−ＡＡＡ比に対してプロットされたＨＣＮ１−ＡＡＡによるＷＴＨＣＮ２の−１４０ｍＶにおける電流抑制。（Ｃ）Ａ）からの同じ群の定常状態での電流−電圧関係。単独で発現したＷＴＨＣＮ２及びＨＣＮ１−ＡＡＡとの共発現（比＝１：１）の、定常状態活性化（Ｄ）、反転電位（Ｅ）、及び活性化及び不活性化動態（Ｆ）は同じであった（ｐ＞０．０５）。
【図１２−４】ＨＣＮ２チャンネルに対するＨＣＮ１−ＡＡＡの効果を示す。（Ａ）５０ｎｌＷＴＨＣＮ２、５０ｎｌＷＴＨＣＮ２＋５０ｎｌｄＨ２Ｏ、及び５０ｎｌＷＴＨＣＮ２＋５０ｎｌＨＣＮ１−ＡＡＡｃＲＮＡを注射した卵母細胞から記録した、代表的電流の追跡。ＨＣＮ１−ＡＡＡは、また、ＷＴＨＣＮ２の活性を抑制した。（Ｂ）投与されたｃＲＮＡのＷＴＨＣＮ２：ＨＣＮ１−ＡＡＡ比に対してプロットされたＨＣＮ１−ＡＡＡによるＷＴＨＣＮ２の−１４０ｍＶにおける電流抑制。（Ｃ）Ａ）からの同じ群の定常状態での電流−電圧関係。単独で発現したＷＴＨＣＮ２及びＨＣＮ１−ＡＡＡとの共発現（比＝１：１）の、定常状態活性化（Ｄ）、反転電位（Ｅ）、及び活性化及び不活性化動態（Ｆ）は同じであった（ｐ＞０．０５）。
【図１２−５】ＨＣＮ２チャンネルに対するＨＣＮ１−ＡＡＡの効果を示す。（Ａ）５０ｎｌＷＴＨＣＮ２、５０ｎｌＷＴＨＣＮ２＋５０ｎｌｄＨ２Ｏ、及び５０ｎｌＷＴＨＣＮ２＋５０ｎｌＨＣＮ１−ＡＡＡｃＲＮＡを注射した卵母細胞から記録した、代表的電流の追跡。ＨＣＮ１−ＡＡＡは、また、ＷＴＨＣＮ２の活性を抑制した。（Ｂ）投与されたｃＲＮＡのＷＴＨＣＮ２：ＨＣＮ１−ＡＡＡ比に対してプロットされたＨＣＮ１−ＡＡＡによるＷＴＨＣＮ２の−１４０ｍＶにおける電流抑制。（Ｃ）Ａ）からの同じ群の定常状態での電流−電圧関係。単独で発現したＷＴＨＣＮ２及びＨＣＮ１−ＡＡＡとの共発現（比＝１：１）の、定常状態活性化（Ｄ）、反転電位（Ｅ）、及び活性化及び不活性化動態（Ｆ）は同じであった（ｐ＞０．０５）。
【図１３−１】ＨＣＮ１活性化通門に対するＥ２３５突然変異体の効果を示す。Ａ）図８における電圧プロトコールを使用して引き出した、Ｅ２３５Ａ及びＥ２３５ＲＨＣＮ１チャンネルを通る電流の代表的記録。Ｂ）ＷＴ及びＥ２３５Ａの定常状態活性化曲線。Ｅ２３５Ａの活性化曲線は、プラス側に移動する。Ｃ）ＷＴ及びＥ２３５Ｒの定常状態活性化曲線。Ｅ２３５Ｒの活性化曲線は、Ｅ２３５Ａよりもよりプラス側に移動する、このことは＋１に比較して＋２の実効電荷変化のより大きな効果を示す。Ｄ）ＷＴ、Ｓ２５３Ａ、Ｓ２５３Ｋ及びＳ２５３Ｅチャンネルの定常状態活性化曲線。保存的なＳ−ｔｏ−Ａ突然変異体は、活性の移動を示すが、保持された傾斜係数及びＰ０，ｍｉｎを有する。これらの置換の反対の荷電にも拘わらず、Ｓ２５３Ｋ及びＳ２５３Ｅについての活性化曲線は、よりマイナス側に移動する。これらを総合すると、このことは、ＨＣＮチャンネル活性の活性閾値（図１３）が、内因性発現電流幅と同じく変調できることを示している（図８−１２）。
【図１３−２】ＨＣＮ１活性化通門に対するＥ２３５突然変異体の効果を示す。Ａ）図８における電圧プロトコールを使用して引き出した、Ｅ２３５Ａ及びＥ２３５ＲＨＣＮ１チャンネルを通る電流の代表的記録。Ｂ）ＷＴ及びＥ２３５Ａの定常状態活性化曲線。Ｅ２３５Ａの活性化曲線は、プラス側に移動する。Ｃ）ＷＴ及びＥ２３５Ｒの定常状態活性化曲線。Ｅ２３５Ｒの活性化曲線は、Ｅ２３５Ａよりもよりプラス側に移動する、このことは＋１に比較して＋２の実効電荷変化のより大きな効果を示す。Ｄ）ＷＴ、Ｓ２５３Ａ、Ｓ２５３Ｋ及びＳ２５３Ｅチャンネルの定常状態活性化曲線。保存的なＳ−ｔｏ−Ａ突然変異体は、活性の移動を示すが、保持された傾斜係数及びＰ０，ｍｉｎを有する。これらの置換の反対の荷電にも拘わらず、Ｓ２５３Ｋ及びＳ２５３Ｅについての活性化曲線は、よりマイナス側に移動する。これらを総合すると、このことは、ＨＣＮチャンネル活性の活性閾値（図１３）が、内因性発現電流幅と同じく変調できることを示している（図８−１２）。
【図１３−３】ＨＣＮ１活性化通門に対するＥ２３５突然変異体の効果を示す。Ａ）図８における電圧プロトコールを使用して引き出した、Ｅ２３５Ａ及びＥ２３５ＲＨＣＮ１チャンネルを通る電流の代表的記録。Ｂ）ＷＴ及びＥ２３５Ａの定常状態活性化曲線。Ｅ２３５Ａの活性化曲線は、プラス側に移動する。Ｃ）ＷＴ及びＥ２３５Ｒの定常状態活性化曲線。Ｅ２３５Ｒの活性化曲線は、Ｅ２３５Ａよりもよりプラス側に移動する、このことは＋１に比較して＋２の実効電荷変化のより大きな効果を示す。Ｄ）ＷＴ、Ｓ２５３Ａ、Ｓ２５３Ｋ及びＳ２５３Ｅチャンネルの定常状態活性化曲線。保存的なＳ−ｔｏ−Ａ突然変異体は、活性の移動を示すが、保持された傾斜係数及びＰ０，ｍｉｎを有する。これらの置換の反対の荷電にも拘わらず、Ｓ２５３Ｋ及びＳ２５３Ｅについての活性化曲線は、よりマイナス側に移動する。これらを総合すると、このことは、ＨＣＮチャンネル活性の活性閾値（図１３）が、内因性発現電流幅と同じく変調できることを示している（図８−１２）。
【技術分野】
【０００１】
本特許出願は、米国仮出願番号第６０／２８７，０８８号、２００１年４月２７日出願の優先権を主張するものであり、この出願は、参照することによってその全文が本明細書の一部としてとり入れられている。
（米国連邦政府の後援による研究の陳述）
本発明に対する財政的支援の一部が、国立衛生研究所による助成金Ｎｏ．ＮＩＨＰ５０ＨＬ５２３０７で米国政府によって提供された。それ故、米国政府は、本明細書に特許請求する発明において、及び発明に対して、一定の権利を有する。
【０００２】
本発明は、一般的に、心臓ペースメーカー機能を提供及び／又は調節する方法で特徴づけられる。好ましい態様において、本発明は、心室又は心房の発射数（単位時間当たりの活動電位発生頻度、以下、発射数という）を誘導又は調節する埋め込み可能な電子ペースメーカーに変わり得るもの又は補助として使用することのできる、遺伝子工学的ペースメーカーを提供する。
【背景技術】
【０００３】
自然発生の細胞の電気的リズムは、心臓の自立性拍動から呼吸リズム及び睡眠覚醒周期まで多数の生物学的プロセスを支配している。
【０００４】
特に哺乳類の心臓は、電気的刺激を作りだすことによって固有のリズムを維持していると理解されている。一般的に、刺激は、いわゆるペースメーカーに生じ、特定の心臓通導組織及び心筋内に伝搬する脱分極波を生成する。通常秩序立った波動は、心筋の調和した収縮を促進する。これらの収縮は身体中至るところに血液を送るエンジンである。一般的に、The Heart and Cardiovascular System. Scientific Foundations. (1986) (Fozzard, H.A. et al., eds) Raven Press, NY.を参照。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
このような事情で、心臓刺激は、認められた生理的機構によって制御されている。しかし、興奮性心臓組織の異常は心臓リズムの異常を導くという、長年にわたる認識があった。
【０００６】
そのような心臓リズムの異常は、米国中に顕著なそして浸透している種々の疾病及び障害に関連している。Bosch, R. et al., (1999) in Cardiovas. Res. 44: 121及び同書引用文献を参照。例えば、徐脈性不整脈は、米国において、年間２５５，０００以上の電子ペースメーカー埋め込みをもたらしている。
【０００７】
伝統的な治療方法には、患者の心臓に対し、頻度の固定された又は可変のペーシングパルスを送る埋め込み型ペースメーカーが含まれる。しかし、そのような埋め込み型装置は、感染、出血、肺虚脱及び著しく高価という、顕著な固有のリスクを有している。
【０００８】
それ故、所望の心臓収縮数（発射数）を提供する新しい方法を持つことが望まれている。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者等は、ここに、ペースメーカー機能を創出し、及び／又は内因性又は誘導された心臓ペースメーカー機能の活動を変調させることができる遺伝子導入及び細胞投与法を提供する。
【００１０】
本発明の方法は、内因性ペースメーカー（例えば、哺乳類の心臓の洞結節）及び／又は誘導性ペースメーカー（例えば、幹細胞又は変換された電気的静止状態の細胞から発生する生物学的ペースメーカー）の活動を創出及び／又は変調させるのに使用される。
【００１１】
更に詳しくは、本発明の好ましい態様において、静止状態の心臓細胞は、インビボウイルス遺伝子導入又は変性細胞導入（例えば、分化幹細胞）によってペースメーカー細胞に変換される。
【００１２】
更なる態様において、組成物が、存在する内因性又は誘導心臓ペースメーカー機能の頻度を変更する（即ち同調させる）ために患者に投与される。ポリヌクレオチド又は変性細胞は、投与するのに好ましい薬剤である。
【００１３】
本発明の好ましい方法は、自発的、律動的電気活動を作り出すための、心室におけるＫｉｒ２コード化カリウムチャンネルの優性ネガティブ抑制を含む。誘導されたペースメーカーの数は、β−アドレナリン作動性刺激で増加させることができる。それ故、本発明の方法により、心室筋細胞の潜在性ペースメーカー活動は、Ｋｉｒ２チャンネルの阻害によって解放することができる。
【００１４】
好ましい方法は、インビボでＫｉｒ２遺伝子の活性を抑制することができるポリヌクレオチド化合物を投与することを含む。種々の特別なアプローチが採用され得る。例えば、Ｋｉｒ２遺伝子の発現を抑制することができるアンチセンス化合物又はその他のポリヌクレオチド阻害剤を、哺乳類に投与することができる。遺伝子ノックアウトアプローチ、例えば、幹細胞に存在するＫｉｒ２遺伝子のノックアウトもまた採用することができる。例えば、Ｋｉｒ２．１、Ｋｉｒ２．２、Ｋｉｒ２．３及び／又はＫｉｒ２．４を含む、多くのＫｉｒ２遺伝子ファミリーメンバーのいずれも抑制され得る。
【００１５】
既に述べたように、変性細胞は、また、ペースメーカーを誘導又は変調させるために細胞又は患者に投与される。例えば、投与された変性細胞は、好適には、ペースメーカー機能を提供することができ、且つ、胚性又は骨髄幹細胞のような幹細胞から分化した心筋細胞である。後者は、幹細胞由来ペースメーカー細胞（自然及び／又は誘発分化による）及び／又はペースメーカー機能を提供するように変換される幹細胞由来筋細胞（例えば、心室細胞）である。
【００１６】
変性細胞は、レシピエント、即ち、細胞が投与される患者から採取される。例えば、骨髄幹細胞は、患者から採取され、ペースメーカー機能を有する心筋細胞に分化される。心臓細胞、例えば洞結節細胞は、カテーテル或いは他のプロトコールによる取り出しを通じて患者から採取され、例えば本明細書に開示されるような所望のポリヌクレオチド送達システムの挿入によって変性され、その後、形質転換細胞は患者に投与される。本明細書に示されるように、投与細胞は、好ましくは投与前に、例えば、幹細胞由来心筋細胞、又は本明細書に開示されたような発現系で形質転換された心筋細胞のように、何らかの形で変性される。
【００１７】
代わりの、又は補助的戦略において、過分極活性化サイクリック・ヌクレオチド・ゲート（ＨＣＮ）遺伝子発現が、適切なポリヌクレオチド化合物を哺乳類に投与することによって促進される。本発明者等は、特に、ＨＣＮ活性は陽性及び陰性方向の両方向に変調させることができ、例えば、それらの活性化閾値を所望のレベルにシフトすることができることを発見した。この故に、心臓ペーシング、及びそれに続く心拍数は、ヌクレオチドゲート（ＨＣＮ）遺伝子発現のそのような制御によって効果的に（増加及び減少の両方に）変調できる。例えば、ペーシングは、内因性ＨＣＮチャンネル活性の阻害によって、及び／又は、内因性レベル以上に活性閾値をシフトすることによって減速させることができる（代わりに、加速は、過剰発現を経た作動チャンネル数を増加させる、及び／又は、内因性レベル以下に活性閾値をシフトすることによって、達成することができる）。同様に、二次メッセンジャーｃＡＭＰに対する天然ペースメーカーの応答も、例えば、与えられた感度の遺伝子工学処理したチャンネルを使用することによって、また、変調させることができる。
【００１８】
特に好ましいのは、共発現ベクター中でＫｉｒ配列に結合するＨＣＮ構築体の使用である。ベクターは、ペースメーカー活性を誘導するため、及びペースメーカー数を変調させる又は制御するために、投与することができる。特に好ましいのは、共発現ベクターにおいて、Ｋｉｒ２．１ＡＡＡ配列とＨＣＮ構築体を結合することである。
【００１９】
投与されたポリペプチドは、少なくとも一つの心臓電気的性質を好適に誘導又は変調（増加又は減少）させる。本発明の好ましい使用は、心臓電気伝導を変調させることであり、好ましくは、心臓活動電位（ＡＰ）の全て又は一部を変更することができる。その使用は、所望の治療結果を達成することを助ける。正常な電気的機能の著しい崩壊は、本発明方法により通常減少し又はしばしば回避される。
【００２０】
好ましくは、本発明によるポリヌクレオチド又は変性細胞の心筋細胞への投与は、処置された心筋細胞の電気信号出力の数（心筋細胞又は心室発射数）において、識別できる相異（増加又は減少）を提供する。より詳しくは、好ましくは、投与は、処置した心筋細胞の発射数において、少なくとも約２、３、４又は５パーセントの増加又は減少、より好ましくは、少なくとも約１０、１５、２０、２５、３０、４０、５０又は１００パーセント（の増加又は減少）を提供する。処置した細胞の発射数は、標準法により、特に、以下に定義されるような、標準電気生理学的アッセーにより定量することができる。
【００２１】
好ましい投与経路、ポリヌクレオチド及びアッセーは、以下の考察において提供される。一般的に、本発明の使用を助けるポリヌクレオチド発現は、少なくとも標準電気生理学的アッセーの一つから得られる記録におけるシフト（ベースラインに対する相対値として）として明らかになる。好ましくは、本発明によるポリヌクレオチドの投与は、ベースライン機能に対し相対的に少なくとも約１０％まで電気的性質の増加又は減少を提供する。更に好ましくは、増加又は減少は、少なくとも約２０％であり、より好ましくは、少なくとも約３０％から約５０％又はそれ以上である。該ベースライン機能は、例えば、本発明方法の前に特定の哺乳類で電気生理学的アッセーを実施することによって、容易に確認することができる。代わりに、関連するベースライン機能は、本命のポリヌクレオチドの代わりに対照のポリヌクレオチドを投与する、平行実験を実施することによって、定量することができる。一度、信頼できるベースライン機能が確立されれば（或いは公知のデータ源から入手できれば）、実際の実施者によるベースライン機能の定量は必ずしも必要ではない。関連性のある電気的性質の例は公知であり、限定はされないが、少なくとも、心拍数、不応性、伝達速度、焦点自動能（focal automaticity）、及び空間的励起パターンの一つを包含する。好ましくは、心拍数又は収縮数（発射数）又は脈拍数が評価される。
【００２２】
心臓収縮数を変調させることにより、本発明は、広範囲の心臓に関連した疾病及び障害を治療又は予防（予防的治療）するのに使用することができる。例えば、本発明の方法は、心臓に関連した立ちくらみ、特にストークス−アダムス立ちくらみに罹患した、又は、罹り易い患者の治療に有用である。本発明の方法は、また、持続性洞徐脈、Ｓ−Ａウェンケバッハ（Wenckebach）として顕著な洞房（Ｓ−Ａ）ブロック、完全Ｓ−Ａブロック又は洞停止（洞刺激が心房を活性化できない）を包含する洞結節機能の種々の異常、及び高度房室ブロックに罹患した又は罹り易い患者の治療に有用である。本発明の方法は、また、徐脈頻脈症候群、及びその他の原因の徐脈に罹患した、又は、罹り易い患者の治療に有用である。
【００２３】
本発明の治療方法は、一般的に、本発明による、発射数変調組成物の有効量を哺乳類に投与することを含む。投与は、好ましくは、例えば毒性を回避するため、哺乳類の心臓組織標的領域内に限局される。そのような投与は、例えば、本明細書に開示したように、注射、カテーテルによる送達及びその他によって達成される。好ましくは、哺乳類は、先ず同定され、治療法が選択され、それから治療組成物が投与される。例えば、本明細書に開示したような疾病又は障害、例えば、心臓に関連した立ちくらみ、特にストークス・アダムス立ちくらみ；持続性洞徐脈、Ｓ−Ａウェンケバッハとして顕著な洞房（Ｓ−Ａ）ブロック、完全Ｓ−Ａブロック又は洞停止のような洞結節機能の異常、及び高度房室ブロック；又は徐脈頻脈症候群又はその他徐脈に関連する状態に罹患した、又は、罹り易い哺乳類を同定することができる。
【００２４】
別の態様において、本発明は、本明細書に開示した本発明の方法の一つ又はそれ以上の組合せを実施するためのキットを提供する。好ましくは、キットは、少なくとも一つの好適な心筋核酸送達システム、及び好ましくは少なくとも一つの所望のポリヌクレオチド及び／又は変性細胞組成物を包含する。好ましくは、そのポリヌクレオチドは、該システムに操作可能につながっている。即ち、ポリヌクレオチドを心臓に良好に投与することを可能にするのに充分であるように、機能的及び／又は物理的に関連している。更に好ましいキットは、哺乳類にポリヌクレオチド又は変性細胞を投与するための手段、例えば注射筒、カテーテルその他を包含する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２５】
上で論じたたように、本発明者等は、ここに、内因性又は誘導された心臓ペースメーカー機能の活動を、誘導及び／又は変調させる遺伝子導入及び細胞投与法を提供する。特に、本発明は、埋め込まれた電子ペースメーカーの代替及び／又は補足として遺伝子治療を用いる遺伝子工学的ペースメーカーの創出を提供する。本発明の好ましい態様において、静止状態の心筋細胞が、インビボでのウイルス遺伝子導入によってペースメーカーに変換される。それら変換された細胞の心臓収縮及び／又は電気的性質は、その後、本発明によって変調される。
【００２６】
更に詳しくは、本発明の第一の態様において、本発明の方法は、心筋細胞においてペースメーカー機能（心臓収縮）を示さない心筋細胞において、そのような性質、即ち、発射数が全くないか、少しあるか、又は不適当である静止状態の心筋細胞において、ペースメーカー機能を誘導するのに使用される。好ましくは、投与により、治療された心臓細胞に自発的な反復電気信号の発生を誘導し又はもたらす、即ち、発射数が少ないか又は全くない心筋細胞（１分当たり約２０、１５、１０、５回又はそれ以下の発射数）に対して、発射数又は電気信号出力の頻度は、好ましくは検出し得るレベルに増加し、特に投与後は、少なくとも約３、５、１０、１５、２０又は２５パーセントの発射数又は電気信号出力の増加が見られる。
【００２７】
更なる態様において、本発明の方法は、心筋細胞に存在する発射数を変調させ又は「調子を合わせる」のに使用される。この態様において、過剰の心室性ペーシングは、低い頻度又は発射数に減少し、或いは低すぎる心室性ペーシングが所望のレベルになる。本発明のこの態様は、患者に対し至適心拍数を提供するための埋め込み（電子）ペースメーカー効果で達成される効果を変調させるのに特に有用である。更に、本発明は、内因性の神経又はホルモンの入力で治療される組織の反応性を維持するのに利点を有する。
【００２８】
特に、本発明は、埋め込み電子ペースメーカーの効果を増強又は補足するのに使用することができる。埋め込み電子ペースメーカーを有する哺乳類は、本発明により治療され得る。即ち、ポリヌクレオチド又は変性細胞が哺乳類に投与され、埋め込まれた電子装置により提供されている心臓発射数を更に変調させる。そのような複合アプローチにより、精密で至適な発射数が達成される。更に、組成物は、哺乳類の心臓における電子ペースメーカーから離れている部位に投与することができ、例えば、組成物投与部位は、埋め込まれた電子装置から少なくとも約０．５、１、２、３、４又は５ｃｍ離れており、それによって、心臓組織の大きな領域に亘ってペースメーカーの効果を提供できる。
【００２９】
本発明の方法は、治療された患者の心臓発射数を、所望の発射数値の約１５又は１０パーセント以内、より好ましくは約８、５、４、３又は２パーセント以内に変調させるために、好適に使用される。
【００３０】
本発明の好適な方法は、コードしたポリヌクレオチド、特に、哺乳類の心臓の洞結節におけるようなペースメーカー細胞に導入されるポリヌクレオチドの投与、又は、幹細胞から創製された、又は電気的に静止化された細胞から変換されたペースメーカー細胞、或いは律動収縮又は心臓の興奮を発生するように適応された他の細胞のような、誘導し得る細胞の投与を包含する。上記で考察したように、好ましい方法は、心臓収縮（発射数）を変調させることのできる、少なくとも一つのポリヌクレオチド又は変性細胞の治療有効量を投与することを包含する。ポリヌクレオチド及び変性細胞は、また、心臓組織の標的領域内にそれらの薬剤を局所投与することが容易なため、本発明による投与に好ましい治療組成物である。
【００３１】
心筋細胞の発射数を変調させるために投与される好適な組成物は、簡単な試験で容易に同定することができる。即ち、ポリヌクレオチドのような候補薬剤を心筋細胞に投与し、投与された薬剤が、例えば以下に定義されるアッセーのような標準電気生理学的アッセーにより定量された、対照の心筋細胞（薬剤で未処置の同じ細胞）に比較して、発射数が変調するかどうかを定量することができる。
【００３２】
特に好ましい投与用ポリヌクレオチドは優性ネガティブ構築体である。これら構築体は、特に限定されないが、例えば、Ｋｉｒ２構築体、ＨＣＮ構築体、変異体、断片及びこれらの組合せである。
【００３３】
本発明の好適な実施態様において、優性ネガティブＫｉｒ２構築体の体性遺伝子導入は、心室における自発的ペースメーカー活動を生じ、動いている心筋内に存在する休眠ペースメーカーＩＫ１の局在的遺伝子抑制による生物学的ペースメーカーの創造をもたらす。
【００３４】
例えば、Ｋｉｒ２優性ネガティブ構築体は、例えば、Ｋｉｒ２．１の孔領域のアミノ酸残基をアラニンによって置換する（ＧＹＧ１４４−１４６→ＡＡＡ、又はＫｉｒ２．１ＡＡＡ）ことによって、作ることができる。そのような優性ネガティブ構築体は、野生型Ｋｉｒ２．１と共発現するとき電流束を抑制することができる。４量体Ｋｉｒチャンネル内に少なくとも約一つの単一変異体を取り込むことによって、機能をノックアウトするのに充分である。優性ネガティブ構築体、例えばＫｉｒ２．１ＡＡＡは、２シストロンベクターにパッケージすることができ、モルモットの左心室腔に注射される。好ましくは、およそ１ｃｍ２の領域のような局所領域では、心室筋細胞の少なくとも約１０％が形質導入され、より好ましくは、少なくとも約２０％の心室細胞が形質導入され、最も好ましくは、少なくとも約３０％、４０％又は５０％の心室細胞が形質導入される。ＩＫ１及びカルシウム電流の測定は、後述する実施例において詳細に記載されるようにして行われる。
【００３５】
形質導入された心筋細胞の上記活性は、後述する実施例に記載されるように、対照の心室細胞の自発活性と比較される。形質導入筋細胞が、例えば内因性のペースメーカー活性を有する初期胚心臓細胞又は洞結節の正常ペースメーカー細胞のような、ペースメーカー細胞で代表される自発活性を示すことが望ましい。
【００３６】
別の好ましい実施態様において、本発明は、Ｋｉｒ２遺伝子産物の発現を阻害するアンチセンス治療分子を提供する。治療応用において、オリゴヌクレオチドが、細胞／生物に望ましくない又は有害なタンパク質の合成を防止する、特異的ｍＲＮＡ類のインビボでの翻訳を阻害するのに成功裏に使用された。この翻訳のオリゴヌクレオチド介在ブロックの概念は、「アンチセンス」アプローチとして知られている。機構的には、ハイブリッドオリゴヌクレオチドは、翻訳プロセスに対し物理的なブロックを創製するか、二重鎖のｍＲＮＡ部分を特異的に分解する細胞酵素（ＲＮａｓｅＨ）を補充することによる効果を誘発すると考えられる。
【００３７】
広範な応用に有用なことに、オリゴヌクレオチドは、好ましくは、多くの異なった要求を満足している。アンチセンス治療において、例えば、有用なオリゴヌクレオチドは、細胞膜を透過することができなければならず、細胞外、細胞内ヌクレアーゼに抵抗性を有しなければならず、そして好ましくは、ＲＮａｓｅＨのような内因性酵素を補充する能力を有していなければならない。ＤＮＡに基づく診断及び分子生物学においては、例えば、ポリメラーゼ、キナーゼ、リガーゼ及びホスファターゼのように、天然の核酸に作用するよう進化した、広範囲の異なった酵素に対する有効な基質として作用するオリゴヌクレオチドの能力のような、その他の性質が重要である。アンチセンス治療分子として使用されるオリゴヌクレオチドは、標的ｍＲＮＡに対し、その翻訳を効率的に損なう高い親和性、及びその他のタンパク質の発現の故意でない阻害を避けるための高い特異性、の両者を有することが必要である。
【００３８】
特に、Ｋｉｒ２チャンネルを作る少なくとも約一つの成分、又はＫｉｒ２チャンネルを作るのに充分な成分の発現を阻害するアンチセンスオリゴヌクレオチドを有し、強く分極したＩＫ１の部分的抑制又は不存在によって測定されるように、心室心筋でペースメーカー活性を解放するのに充分なＫｉｒ２チャンネルを、特異的に抑制することが好ましい。
【００３９】
別の投与プロトコールも採用され得る。例えば、投与されたポリヌクレオチドが、おとりとして機能し、ここで、ポリヌクレオチドは常法により標的細胞又は遺伝子に導入され、遺伝子の活性化は、例えば、転写因子がおとり分子に転換されることによって翻訳される。より詳細には、Ｋｉｒ２チャンネル成分の発現を効果的に阻害するために、おとりを採用することができる。本明細書で使われるように、用語「おとり分子」又は他の類似の用語は、機能的に不活性なタンパク質を、又は機能的に活性なタンパク質と拮抗し、それ故に活性タンパク質によって促進された活性を阻害するタンパク質それ自身をコードする、ポリヌクレオチドの意味を含む。Ｋｉｒ２おとりタンパク質は、それ故、野生型Ｋｉｒ２タンパク質に対する拮抗阻害剤として作用することができ、それによってＫｉｒ２野生型チャンネルの形成を阻害し、内向き整流性カリウム電流（ＩＫ１）の抑制をもたらす。
【００４０】
好ましくは、優性ネガティブ構築体は、耐久性がなければならない。即ち、何ヶ月、何年間もの長期間効果があり、局所特異性であり、即ち、所望の組織のみを標的にし、選択的な機構で特異的に作用し、例えば、Ｋｉｒ２優性ネガティブ構築体は心室心筋においてペースメーカー活性を解放するのに充分なＫｉｒ２チャンネルを特異的に阻害する。
【００４１】
本発明により使用される優性ネガティブ構築体の別の例は、ＨＣＮ構築体、例えばＨＣＮ１構築体である。特に、そのような構築体においては、孔中の臨界残基ＧＹＧは、ＡＡＡに変換され（ＨＣＮ１−ＡＡＡを創製する）、それによって正常なＨＣＮコード化ペースメーカー電流を抑制することができる。
【００４２】
更には、後述する実施例で更に詳細に示すように、ペースメーカーチャンネルにおけるＧＹＧ選択的モチーフの機能的重要性が、ＨＣＮ１におけるトリプレットがアラニンと置換されることによって評価された（ＧＹＧ３６５−３６７ＡＡＡ）。ＨＣＮ１−ＡＡＡは、機能的電流を産生しない；ＨＣＮ１−ＡＡＡのＷＴＨＣＮ１との共発現は、通門性（定常状態活性化、活性化及び不活性化動態）又は透過性（反転電位）に影響せずに、優性ネガティブ方式における正常チャンネル活性を抑制する（ＷＴ：ＡＡＡ比、４：１、３：１、２：１、１：１及び１：２、−１４０ｍＶで、それぞれ電流減少、５５．２±３．２、６８．３±４．３、７８．７±１．６、９１．７±０．８、９７．９±０．２％）。統計解析は、単一ＨＣＮチャンネルは、４つの単量体サブユニットから成ることを明らかにした。興味あることには、ＨＣＮ１−ＡＡＡは、また、同様な効率で、優性ネガティブ方式におけるＨＣＮ２を阻害した。それ故、ＧＹＧモチーフは、ＨＣＮチャンネルに対しイオン透過の臨界決定因子であり、ＨＣＮ１及びＨＣＮ２はヘテロ四量体複合体を形成するために、容易に共会合すると信じられる。
【００４３】
上記に示したように、異なったＨＣＮアイソフォームの共会合を通して、内因性ＨＣＮ活性（例えば、活性化閾値及び発現電流増幅）は、双方向に変調され、それにより、上記で考察したように所望の値の好ましい範囲内で、心臓ペーシング又は発射数の効果的な変調が可能である。
【００４４】
本発明は、一般的に、インビボ又はエクスビボでの心臓への使用を意図することを含む、好適なポリヌクレオチドの投与経路の一つ又は組合せに適合性がある。心臓組織は、特に遺伝子導入技術に敏感に反応する分野であるとの理解がある。Donahue, J. et al., (1998) Gene Therapy 5: 630; Donahue, J. et al., PNAS (USA) 94: 4664（心臓への迅速、効率的な遺伝子導入を開示）；Akhter, S. et al., (1997), PNAS (USA) 94: 12100（心室心筋細胞への遺伝子導入を提示）；及びこれらに引用された文献を参照されたい。好ましい、核酸送達方法は、米国特許第６，３７６，４７１号に開示されている。
【００４５】
本発明による更なる好ましい投与経路は、心臓組織へポリヌクレオチドを導入し、それを発現させて、標準心電図（ＥＣＧ）記録により定量されるように、充分検出可能な程度に心拍数を減少させることを含む。好ましくは、心拍数の減少は、ベースラインに対して少なくとも約５％である。
【００４６】
本発明は、高度に柔軟性があり、好ましくは少なくとも一つの治療心臓タンパク質をコードするポリヌクレオチドの一つ又は組合せで使用することができる。
【００４７】
上で論じた好ましいポリヌクレオチドに加えて、本発明による投与用の好適なポリヌクレオチドは、限定されないが、少なくとも一つのチャンネルタンパク質、ギャップ結合タンパク質、Ｇタンパク質サブユニット、コネキシン、或いはこれらの機能性フラグメントをコードするものを包含する。より好ましくは、Ｋチャンネルサブユニット、Ｎａチャンネルサブユニット、Ｃａチャンネルサブユニット、阻害性Ｇタンパク質サブユニット、又は機能性フラグメントをコードするポリヌクレオチドである。更なる好ましいポリヌクレオチドは、そのような（同じか又は異なった）タンパク質の１、２又は３つをコードするであろう。
【００４８】
「フラグメント（断片）」、「機能性フラグメント」又は類似の用語は、対応する全長アミノ酸配列（又はその配列をコードするポリヌクレオチド）の機能の少なくとも約７０％、好ましくは少なくとも約８０％、より好ましくは少なくとも約９５％を有するアミノ酸配列（又はその配列をコードするポリヌクレオチド）の部分を意味する。そのようなフラグメントの機能性を検出及び定量する方法は公知であり、本明細書に開示する標準電気生理学的アッセーを包含する。
【００４９】
本発明を実施するのに適したポリヌクレオチドは、限定されないが、ＧｅｎＢａｎｋ（National Center for Biotechnology Information (ＮＣＢＩ)）ＥＭＢＬ data library, Ｓｗｉｓｓ−ＰＲＯＴ (University of Geneva, Switzerland), the ＰＩＲ−International database；及びthe American Type Culture Collection (ＡＴＣＣ) (10801 University Boulevard, Manassas, VA 20110-2209)を含む公的機関から得ることができる。一般的には、Benson, D. A. et al., (1997), Nucl. Acids Res. 25: 1 GenBankの記載を参照されたい。
【００５０】
本発明で使用される、より特別なポリヌクレオチドは、ＧｅｎＢａｎｋからの公的情報にアクセスすることによって容易に得ることができる。例えば、一つのアプローチとして、所望のポリヌクレオチド配列がＧｅｎＢａｎｋから得られる。ポリヌクレオチドそれ自体は、ＰＣＲに基づいた増幅を用いたものを含む通常のクローニング手順、及びクローニング技術の一つ又は組合せにより作ることができる。例えば、オリゴヌクレオチド配列の調製、適切なライブラリーのＰＣＲ増幅、プラスミドＤＮＡの調製、制限酵素でのＤＮＡ開裂、ＤＮＡの連結、ＤＮＡの好適な宿主細胞への導入、細胞の培養、及びクローン化ポリヌクレオチドの単離及び精製は公知の技術である。Sambrook et al., in Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2nd ed. 1989); Ausubel et al., (1989), Current Products in Molecular Biology, John Wiley & Sons, New Yorkを参照。
【００５１】
以下の表１は、本発明で使用されるＧｅｎＢａｎｋデータベースからの例示的なポリヌクレオチドを示したものである。
【００５２】
【表１】
【００５３】
本発明で使用される他のポリヌクレオチドは、以下の文献に報告されている。Wong et al., Nature 1991; 351(6321):63（本質的に活性なＧｉ２α）；De Jongh KS, et al., J. Biol. Chem. 1990, Sep. 5;265(25):14738（Ｎａ及びＣａチャンネルβサブユニット）；Perez-Reyes, E. et al., J. Biol. Chem. 1992, Jan 25;267(3):1792; Neuroscientist 2001 Feb;7(1):42（ナトリウムチャンネルβサブユニット情報を提供）；Isom, LL. et al., Science, 1992, May 8;256(5058):839（脳ナトリウムチャンネルのβ１サブユニットを提供）；及びIsom, LL. et al.,(1995), Cell 1995 Nov 3;83(3):433（脳ナトリウムチャンネルのβ２サブユニットを報告）。
【００５４】
本発明で使用される更なるポリヌクレオチドは、ＰＣＴ出願番号ＰＣＴ／ＵＳ９８／２３８７７（Ｍａｒｂａｎ，Ｅ．）に報告されている。
Ｅ．Ｍａｒｂａｎによる以下の文献も参照されたい。J. Gen. Physiol., 2001, Aug;118(2):171-82; Circ. Res., 2001, Jul 20;89(2):160-7; Circ. Res. 2001, Jul 20;89(2):101; Circ. Res., 2001, Jul 6;89(1):33-8; Circ. Res., 2001, Jun 22;88(12):1267-75; J. Biol. Chem., 2001, Aug 10;276(32):30423-8; Circulation., 2001, May 22;103(20):2447-52; Circulation, 2001, May 15;103(19):2361-4; Am. J. Physiol. Heart Circ. Physiol., 2001, Jun;280(6):H2623-30; Biochemistry, 2001, May 22;40(20):6002-8; J. Physiol., 2001, May 15;533(Pt. 1):127-33; Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 2001, Apr 24;98(9):5335-40; Circ. Res., 2001, Mar 30;88(6):570-7; Am. J. Physiol. Heart Circ. Physiol., 2001, Apr;280(4):H1882-8; and J. Mol. Cell Cardiol., 2000, Nov;32(11):1923-30.
【００５５】
好適なＣａチャンネルサブユニットの更なる例は、β１、又はＬ型Ｃａチャンネルからのα２−δサブユニットを包含する。好ましいＮａチャンネルサブユニットは、β１又はβ２である。いくつかの発明の実施態様において、以下に記載する標準電気生理学的アッセーによって定量される優性ネガティブ活性を有する、Ｎａ及びＣａチャンネルサブユニットを選択することが有用である。好ましくは、その活性は、アッセーで定量される対応する標準のＮａ又はＣａチャンネルサブユニットの活性の少なくとも約１０％を抑制する。
【００５６】
本発明による投与に特に適した構築体は、また、後述する実施例に開示される。
また、好ましいものとしては、ペースメーカー活性を変調させる補助戦略として阻害性Ｇタンパク質サブユニット（「Ｇαｉ２」）又はその機能性フラグメントが挙げられる。
【００５７】
本発明は、ギャップ結合タンパク質、特に心臓機能に包含されることが知られている又は想定されているものに使用するのに広範に適している。特別な例は、コネキシン４０、４３、４５及び機能性フラグメントを包含する。更に、予期されるのは、アッセーによって定量される優性ネガティブ活性、好ましくは、対応するコネキシン４０、４３又は４５に関して、少なくとも約１０％の抑制活性を有するコネキシンをコードするポリヌクレオチドである。コネキシンは、幹細胞又は静止状態の心臓組織で電気的結合を形成する誘導心筋細胞を誘導／誘引するのに特に有用である。
【００５８】
更に考察されるのは、検出し得るサプレッサー活性を有する優性ネガティブタンパク質（ムテイン）をコードするポリヌクレオチドのような変異体である。遺伝的に優性であるコード化されたタンパク質は、一般的には、他のタンパク質、特に野生型タンパク質と結合して複合体を形成することができるタンパク質の機能を阻害する。
【００５９】
本発明の更なるポリヌクレオチドは、完全ではないが本質的に全長タンパク質をコードする。タンパク質は全長配列の全ての成分を有してはいない。例えば、コードされたタンパク質は、完全又は完全に近いがしかし完全シグナル又はポリアデニル配列を欠いているコード化配列（ｃｄｓ）を包含する。本発明のタンパク質をコードするポリヌクレオチド及び特にｃＤＮＡは、少なくとも完全ｃｄｓを包含することが好ましい。好ましくは、該ｃｄｓは、約０．５と７０の間、好ましくは約５と６０の間、より好ましくは約１５、２０、２５、３０、３５、４０又は５０ｋＤの分子量を示すタンパク質をコードすることができる。その分子量は、好適なコンピューター支援プログラムによって、又はＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動によって容易に定量することができる。
【００６０】
ポリヌクレオチド及び特に全長タンパク質をコードするｃＤＮＡは、選択された細胞、組織又は器官にあるそのタンパク質の発現を変調させる、常法の組換えアプローチによって変性させることができる。
【００６１】
更に特異的には、好適なポリヌクレオチドは、コード化したタンパク質から１又はそれ以上の隣接又は非隣接アミノ酸を付加、置換又は除去することができる組換え法によって変性させることができる。一般には、実施される変性の型は、所望する発現の結果に関係する。
【００６２】
例えば、イオンチャンネルのような関心のあるタンパク質をコードするｃＤＮＡポリヌクレオチドは、全長タンパク質の発現に比較して、そのタンパク質を過剰発現するように変性させることができる（即ち対照アッセー）。一般的には、変性タンパク質は、全長タンパク質に関して少なくとも１０パーセント又はそれ以上の過剰発現、より好ましくは少なくとも２０パーセント又はそれ以上、更により好ましくは少なくとも約３０、４０、５０、６０、７０、８０、１００、１５０又は２００パーセント又はそれ以上の過剰発現を対照アッセーに比較して示す。
【００６３】
上記したように、ポリヌクレオチド（核酸断片）及び特にｃＤＮＡに対して更に予期される変性は、優性ネガティブタンパク質のそれである。
【００６４】
一般的に、種々の優性ネガティブタンパク質は、この分野で知られた方法によって作ることができる。例えば、イオンチャンネルタンパク質は、例えば、選択された膜貫通領域を除去することによって、優性ネガティブタンパク質が容易に作られる、一つのタンパク質ファミリーとして認識されている。殆どの場合、イオンチャンネル結合複合体の機能は、優性ネガティブイオンチャンネルタンパク質の相互作用によって、実質的に減少又は除去される。
【００６５】
いくつかの特別な戦略が、優性ネガティブタンパク質を作るために開発されている。そのような戦略の例としては、所望のタンパク質をコードするｃＤＮＡ配列の欠失を目標とし標的とするオリゴヌクレオチドが挙げられる。
【００６６】
優性ネガティブタンパク質の創造は、遺伝子欠失及びアンチセンスＲＮＡのような遺伝子操作の別の従来法とは同義ではないことが強調される。「優性ネガティブ」の意味は、正に、内因性タンパク質を不活性化する能力を有する優性ネガティブタンパク質を産生する適切なＤＮＡ構築によって駆動され得る（即ち、発現され得る）「ポイゾンピル（ｐｏｉｓｏｎ ｐｉｌｌ）」と特別にに呼ばれることがある。
【００６７】
例えば、一つのアプローチにおいて、一つ又はそれ以上の膜貫通領域を含むタンパク質をコードするｃＤＮＡが、少なくとも一つの、好ましくは、２、３、４、５、６又はそれ以上の膜貫通領域を除去するように変性される。好ましくは、得られた変性されたタンパク質は、少なくとも一つの別のタンパク質、及び通常は一つ以上のタンパク質と結合複合体を形成する。既述したように、変性されたタンパク質は、例えば、本明細書に記載された標準リガンド結合アッセー又は電気生理学的アッセーによってアッセーされる、結合複合体の正常の機能を阻害する。例示する結合複合体は、イオンチャンネルタンパク質複合体に生じるような電気荷電伝播に関与するものである。一般的には、優性ネガティブタンパク質は、全長タンパク質と比較して、結合複合体の活性の少なくとも１０パーセント又はそれ以上の阻害、より好ましくは少なくとも２０パーセント又はそれ以上、そして更により好ましくは、少なくとも約３０、４０、５０、６０、７０、８０又は１００パーセント又はそれ以上の、結合複合体の阻害を示す。
【００６８】
更なる例示として、本方法において使用される所望のタンパク質をコードするｃＤＮＡは、タンパク質の少なくとも一つのアミノ酸が欠失されるように、変性することができる。欠失したアミノ酸類は、全長タンパク質配列の長さの、本質的に約１％まで、より好ましくは少なくとも約５％、そして更により好ましくは約１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０又は９５％までの連続又は非連続欠失であり得る。
【００６９】
代わりに、所望のタンパク質をコードするｃＤＮＡは、コード化したタンパク質中の少なくとも一つのアミノ酸が保存又は非保存アミノ酸によって置換されるように、変性することができる。例えば、フェニルアラニンで置換されたチロシンアミノ酸は保存アミノ酸置換の例であり、これに対して、アラニンで置換されたアルギニンは非保存アミノ酸置換を示す。置換されたアミノ酸は、全長タンパク質配列の長さの、本質的に約１％まで、より好ましくは約５％、そして更に、より好ましくは約１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０又は９５％まで、連続又は非連続置換であり得る。
【００７０】
一般的にあまり好ましくはないが、所望のタンパク質をコードする核酸セグメントは、少なくとも一つのアミノ酸がコードされたタンパク質に加えられるように、変性することができる。アミノ酸付加は、ｃｄｓのＯＲＦを変えないことが好ましい。一般的には、約１〜５０個のアミノ酸、好ましくは約１〜２５個のアミノ酸、より好ましくは約２〜１０個のアミノ酸が、コードされたタンパク質に加えられる。特に好ましい付加部位は、選択されたタンパク質のＣ−又はＮ−末端である。
【００７１】
好ましい発明の実施は、上記のポリヌクレオチドの少なくとも一つを好適な心筋核酸送達システムを用いて投与することを包含する。一つの実施態様において、該システムは、ポリヌクレオチドに操作可能に結合した非ウイルスベクターを包含する。そのような非ウイルスベクターは、ポリヌクレオチド単独又は好適なタンパク質、多糖類又は脂質製剤との組合せを包含する。
【００７２】
本明細書で使用される、用語「操作可能に結合した」は、そのように記載された成分が通常の機能を遂行出来るように設定されている、要素の配置のことを意味する。それ故、コードされた配列に操作可能に結合した制御配列は、コードされた配列の発現に影響を与えることができる。制御配列は、それが配列を指している限り、コードされた配列に隣接している必要はない。それ故、例えば、介在する非翻訳であるが転写されている配列が、プロモーター配列とコード配列の間に存在することができ、そして、プロモーター配列は、依然として、コードされた配列に「操作可能に結合している」と考えることができる。
【００７３】
本明細書で使用される、用語「コードされた配列」又は特定のタンパク質を「コードする」は、適切な制御配列の制御下におかれた場合、インビトロ又はインビボで、転写され（ＤＮＡの場合）、ポリペプチドに翻訳される（ｍＲＮＡの場合）核酸配列である。コードされた配列の境界は、５’（アミノ）末端の開始コドンと３’（カルボキシ）末端の翻訳停止コドンによって決定される。コード配列は、限定されないが、原核又は真核ｍＲＮＡからのｃＤＮＡ、原核又は真核ＤＮＡからのゲノムＤＮＡ配列、及び合成ＤＮＡまでも包含することができる。転写終結配列は、通常、コード配列に対し３’に位置している。
【００７４】
本明細書で使用される、「核酸」配列は、ＤＮＡ又はＲＮＡ配列をいう。この用語は、また、限定されないが、４−アセチルシトシン、８−ヒドロキシ−Ｎ６−メチルアデノシン、アジリジニルシトシン、シュードイソシトシン、５−（カルボキシヒドロキシメチル）ウラシル、５−フルオロウラシル、５−ブロモウラシル、５−カルボキシメチルアミノメチル−２−チオウラシル、５−カルボキシメチルアミノメチルウラシル、ジヒドロウラシル、イノシン、Ｎ６−イソペンテニルアデニン、１−メチルアデニン、１−メチルシュードウラシル、１−メチルグアニン、１−メチルイノシン、２，２−ジメチルグアニン、２−メチルアデニン、２−メチルグアニン、３−メチルシトシン、５−メチルシトシン、Ｎ６−メチルアデニン、７−メチルグアニン、５−メチルアミノメチルウラシル、５−メトキシアミノメチル−２−チオウラシル、β−Ｄ−マンノシルキュエオシン、５’−メトキシカルボニルメチルウラシル、５−メトキシウラシル、２−メチルチオ−Ｎ６−イソペンテニルアデニン、ウラシル−５−オキシ酢酸メチルエステル、ウラシル−５−オキシ酢酸、オキシブトキソシン、シュードウラシル、キュエオシン、２−チオシトシン、５−メチル−２−チオウラシル、２−チオウラシル、４−チオウラシル、５−メチルウラシル、Ｎ−ウラシル−５−オキシ酢酸メチルエステル、ウラシル−５−オキシ酢酸、シュードウラシル、２−チオシトシン及び２，６−ジアミノプリンのような、ＤＮＡ及びＲＮＡの公知の塩基類縁体のいずれかを包含する配列をいう。
【００７５】
本明細書で使用される用語、「制御配列」は、レシピエント細胞におけるコードされた配列の複製、転写及び翻訳に対して集合的に与えられる、プロモーター配列、ポリアデニル化シグナル、転写終結配列、上流制御領域、複製起点、アイルス（ＩＲＥＳ）、エンハンサー、その他を集合的にいう。選択されたコード配列が、適切な宿主細胞内で複製され、転写され、そして翻訳されることができる限り、これらの制御配列の全てが必ずしも存在する必要はない。
【００７６】
本明細書で使用される、「プロモーター領域」は、普通の意味では、ＲＮＡポリメラーゼが結合し、下流（３’方向）コード配列の翻訳を開始するＤＮＡ制御配列をいう。
【００７７】
特別に好適な心筋核酸システム、特にＩＫ１のような、ある種の活性を抑制することが望ましい場合の、特別に好適な心筋核酸システムは、米国特許第６，２１４，６２０号（D. C. Johns and E. Marban）に記載され、その内容は、参照することによりその全文が本明細書の一部として取り入れられている。そのような構築は、誘導し得るプロモーターの使用によって制御される。そのようなプロモーターの例は、限定されないが、プロゲステロン、エクジソン及びグルココルチコイドのようなホルモン及びホルモン類縁体、更にテトラサイクリン、熱ショック、重金属イオン、インターフェロン及びラクトースオペロン活性化化合物によって制御されるプロモーターによって制御されるものを包含する。これらのシステムの総説は、Gingrich and Roder, 1998, Ann. Rev. Neurosci., 21, 377-405を参照されたい。非哺乳類誘導システムを使用するとき、誘導し得るプロモーター及びリガンドを誘導するためのレセプタータンパク質をコードする遺伝子が使用される。レセプタータンパク質は、一般的には誘導リガンドに結合し、誘導し得るプロモーターにおいて、直接又は間接的に転写を活性化する。
【００７８】
更に好適な心筋核酸送達システムは、アデノウイルス、アデノウイルス随伴ウイルス（ＡＡＶ）、ヘルパー依存性アデノウイルス、レトロウイルス又はセンダイウイルス−リポソーム（ＨＶＪ）複合体の少なくとも一つからの配列である、ウイルスベクターを包含する。好ましくは、ウイルスベクターは、ポリヌクレオチドに操作可能にリンクした強力な真核プロモーター、例えばサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーターを包含する。
【００７９】
更に好ましいベクターは、ウイルスベクター、融合ベクター、化学接合体を包含する。レトロウイルスベクターは、モロニーマウス白血病ウイルス及びＨＩＶに基づいたウイルスベクターを包含する。好ましいＨＩＶに基づいたウイルスベクターの一つは、ＨＩＶゲノムに由来するｇａｇ及びｐｏｌ遺伝子と、他のウイルスに由来するｅｎｖ遺伝子の、少なくとも二つのベクターを含んでいる。ＤＮＡウイルスベクター類が好ましい。これらのベクターは、オルトポックス又はアビポックスベクターのようなポックスベクター、単純ヘルペスＩウイルス（ＨＳＶ）ベクターのようなヘルペスウイルスベクター［Geller, A. I. et al., J. Neurochem, 64:487 (1995); Lim, F. et al. in DNA Cloning: Mammalian Systems, D. Glover, Ed. (Oxford Univ. Press, Oxford England)(1995); Geller, A. I. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90: 7603 (1993); Geller, A. I. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87:1149(1990)］］、アデノウイルスベクター［LeGal LaSalle et al., Science, 259:988(1993); Davidson, et al., Nat. Genet. 3: 219 (1993); Yang, et al., J. Virol. 69: 2004 (1995)］］及びアデノ随伴ウイルスベクター［Kaplitt, M. G. et al., Nat. Genet. 8: 148 (1994)］を包含する。
【００８０】
ポックスベクターは、遺伝子を細胞の細胞質に導入する。アビポックスベクターは、核酸の短期発現だけとなる。アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター及び単純ヘルペスＩウイルス（ＨＳＶ）ベクターは、いくつかの発明の実施態様についての示唆になるであろう。アデノウイルスベクターは、アデノ随伴ウイルスベクターよりも短い期間（例えば約１ヶ月より短い）の発現をもたらすが、ある実施態様では、より長い発現を示す。選択された特定のウイルスは、標的細胞及び処置条件に依存する。好ましいインビボ又はエクスビボ心臓投与技術に関しては、既に記載した。
【００８１】
本明細書に記載したポリヌクレオチドの操作及び取り扱いを単純化するため、核酸は、好ましくは、プロモーターに操作可能に結合したしたカセットに挿入される。プロモーターは所望の標的組織の細胞でタンパク質の発現を駆動できなければならない。適切なプロモーターの選択は、容易に達成できる。好ましくは、高発現プロモーターを使用する。好適なプロモーターの例は、７６３塩基対サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーターである。ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）（Davis, et al., Hum. Gene Ther. 4:151 (1993)）及びＭＭＴプロモーターも使用することができる。これら天然のプロモーターを使用して、ある種のタンパク質を発現させることができる。発現を増強するその他の要素は、エンハンサー又はｔａｔ遺伝子及びｔａｒ要素の如き高発現レベルをもたらすシステムのようなものも包含することができる。このカセットは、ベクター、例えばｐＵＣ１１８、ｐＢＲ３２２のようなプラスミドベクター、又は例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ複製起点を含む、公知のプラスミドベクターに挿入することができる。Sambrook, et al., Molecular Cloning: a Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, (1989)を参照。プラスミドベクターは、また、マーカーポリペプチドが、処理している生物の代謝に悪い影響を及ぼさない限り、アンピシリン抵抗性に対するβ−ラクタマーゼ遺伝子のような選択マーカーを包含し得る。カセットは、ＷＯ９５／２２６１８に開示されているシステムのような統合的な送達システムにおいて、核酸結合部分に結合することができる。
【００８２】
米国公開特許出願ＵＳ２００２００２２２５９Ａ１は、また、心臓細胞において遺伝子発現を促進し、幹細胞を心筋細胞に分化するポリヌクレオチドエンハンサー要素を報告している。
【００８３】
所望により、本発明のポリヌクレオチドは、陽イオン性リポソーム及びアデノウイルスベクターのようなミクロ送達システムと共に使用することができる。リポソームの調製、標的及び内容の送達についての手順のレビューは、以下を参照されたい。Mannino and Gould-Fogerite, BioTechniques, 6: 682 (1988). Felgner and Holm, Bethesda Res. Lab. Focus, 11 (2): 21 (1989) 及び Maurer, R. A., Bethesda Res. Lab. Focus, 11 (2): 25 (1989).
【００８４】
複製欠失組換えアデノウイルスベクターは、公知技術に従って産生することができる。Quantin, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89: 2581-2584 (1992); Stratford-Perricadet, et al., J. Clin. Invest. 90: 626-630 （1992); Rosenfeld, et al., Cell, 68: 143-155 (1992)を参照。
【００８５】
好ましい心筋送達システムの一つは、１又はそれ以上のポリヌクレオチド、好ましくは約一つのポリヌクレオチドを取り込む組換えウイルスベクターである。好ましくは、本発明方法において使用されるウイルスベクターは、約１０８〜約５×１０１０ｐｆｕのｐｆｕ（プラーク形成単位）を有する。ポリヌクレオチドが非ウイルスベクターと一緒に投与される実施態様において、約０．１ナノグラム〜約４，０００マイクログラムの間、例えば、約１ナノグラム〜約１００マイクログラムの使用がしばしば有用であろう。
【００８６】
特定の心筋送達システムの選択は、処置される条件及び所望の発現の量及び長さを含む認められたパラメーターによって導かれる。ヒトへの応用が許可されたウイルスベクター、例えばアデノウイルスの使用は、特に好ましい。
【００８７】
ここでの電気生理学的アッセーについてのリファランスは、心臓活動電位（ＡＰ）を測定するための従来のテストを意味する。一般的にはそのようなテストの実施に関して開示されているFogoros RN, Electrophysiologic Testing, Blackwell Science, Inc. (1999)を参照されたい。
【００８８】
「標準電気生理学的アッセー」についてのここでの特定のリファランスは、以下の一般的なアッセーを意味する。
１）哺乳類の心臓を用意し（インビボ又はエクスビボで）；
２）該心臓を、少なくとも一つの好適なポリヌクレオチドと、好ましくは適切な心筋核酸送達システムと組合せて、又は心筋細胞に分化した幹細胞のような本明細書に開示された変性細胞と組合わせて接触させ；
３）コードされたアミノ酸配列の発現を可能にする条件下で、ポリヌクレオチド又は変性細胞を該心臓に搬入し；
４）投与された（例えば、形質転換された）心臓の少なくとも一つの電気的性質、例えば、伝導、心室反応度、発射数及び／又は脈拍数の少なくとも一つ、好ましくは発射数又は脈拍数のベースライン値に対する変調（増加又は減少）を検出する。理解されるように、ベースライン値は、選択された特定のポリヌクレオチドに関して、しばしば変化する。発現のベースライン値又はタンパク質の定量方法は、ウエスタンブロット、定量ＰＣＲ、又は阻害Ｇタンパク質に対するアデニル酸シクラーゼアッセー、イオンチャンネル電流に対するパッチクランプ法のような機能的アッセーを包含する。電気生理学的（ＥＰ）効果は、インビボでＥＰカテーテルを使用して、心拍数、伝導速度又は不応期を測定することにより定量することができる。好ましい調整の程度は、ベースライン値から、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９又は１０パーセントの差異である。より大きなベースライン値からの増加又は減少、例えば、ベースライン値に対して、少なくとも約１２、１５、２０又は２５パーセントの心拍数又はその他の測定された性質の増加又は減少も、また、達成可能である。
【００８９】
本発明の特別な方法としては、上で論じた線に沿って、コードされたタンパク質を過剰発現させるのに充分なポリヌクレオチドの変性が挙げられる。更に好ましいのは、核酸が優性ネガティブ・イオンチャンネル・タンパク質を産生するように変性される方法である。イオンチャンネルタンパク質は、電位依存性イオンチャンネル（ナトリウム、カルシウム又はカリウムチャンネル）又はリガンド依存性イオンチャンネルであり得る。そのようなチャンネルタンパク質に関する更なる開示は、上記考察及び例えば米国特許第５，４３６，１２８号に見出すことができる。
【００９０】
本発明の実施は、一つ又は異なった投与（送達）システムの組合せと、広範に適合する。
【００９１】
特に、好適な投与経路の一つは、１又はそれ以上の適切なポリヌクレオチドを心筋に入れることを含む。代わりに、投与ステップは、ポリヌクレオチドを心臓の脈管構造中に灌流させることを包含する。所望により、更に投与ステップは、通常の手順、一般的には、遺伝子導入ベクターの投与前又は投与中に、少なくとも一つの血管透過性薬剤を投与する、通常の手順を使用する微小血管透過性増加法を包含する。特別な血管透過性薬剤の例は、１又はそれ以上の、次に示す薬剤を、好ましくは約５００マイクロモル以下のカルシウムを含有する溶液と組合せて投与することを含む：サブスタンスＰ、ヒスタミン、アセチルコリン、アデノシンヌクレオチド、アラキドン酸、ブラジキニン、エンドセリン、エンドトキシン、インターロイキン−２、ニトログリセリン、酸化窒素、ニトロプルシッド、ロイコトリエン、酸素ラジカル、ホスホリパーゼ、血小板活性化因子、プロタミン、セロトニン、腫瘍壊死化因子、血管内皮増殖因子、血管作動性アミン又は一酸化窒素合成酵素。特別なものとしては、セロトニン、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）、又は透過性を増加させる機能性ＶＥＧＦフラグメントがある。
【００９２】
本発明による一般的な灌流プロトコールは、一般に、ポリヌクレオチドを哺乳類の心筋の少なくとも約１０％まで移植するのに充分なものである。約０．５から約５００ｍｌの間の注入容量が好ましい。また、好ましくは、冠動脈血流量は、約０．５〜約５００ｍｌ／分の間である。更に好ましい灌流プロトコールは、ＡＶ結節動脈を含む。形質転換された心臓細胞、一般的にはポリヌクレオチドを含む心筋細胞は、ＡＶ結節又はその近くに好適に配置される。
【００９３】
形質転換心臓の変調を検出するための例示的な戦略は、例えば、上記Fogoros RNに開示されている。好ましい検出戦略は、常法の心電図（ＥＣＧ）の実施である。本発明の使用による心臓の電気的性質の変性は、ＥＣＧの検査で容易に観察される。
【００９４】
より一般的には、本発明は、選択された心臓組織において所望のイオンチャンネル、細胞外レセプター、又は細胞内シグナルタンパク質遺伝子を送達及び発現するのに使用することができる。特に組織の電気的性質の変性、例えば、心拍数の増加又は減少、その不応性の増加又は減少、伝導速度の増加又は減少、焦点自動性の増加又は減少、及び／又は興奮の空間的パターンの変更等に使用される。一般的な方法は、心臓の不整脈を治療するために、心筋の注射又は脈管（動脈、静脈）を通じた灌流による遺伝物質（ＤＮＡ、ＲＮＡ）の送達、又はウイルス（アデノウイルス、ＡＡＶ、レトロウイルス、ＨＶＪ、その他の組換えウイルス）又は非ウイルスベクター（プラスミド、リポソーム、タンパク質−ＤＮＡの組合せ、脂質−ＤＮＡ又は脂質−ウイルスの組合せ、その他の非ウイルスベクター）を用いて、心筋の標的部分に形質転換を促進するのに充分な別の近い物質による送達を含む。
【００９５】
実例として、心臓の発射数に影響を与えるために使用することができる遺伝子は、イオンチャンネル及びポンプ（以下のαサブユニット又は補助サブユニット：カリウムチャンネル、ナトリウムチャンネル、カルシウムチャンネル、塩素チャンネル、延伸で活性化されたカチオンチャンネル、ＨＣＮチャンネル、ナトリウム−カルシウム交換体、ナトリウム−水素交換体、ナトリウム−カリウムＡＴＰアーゼ、筋小胞体カルシウムＡＴＰアーゼ）、細胞レセプター及び細胞内シグナル経路（α又はβ−アドレナリンレセプター、コリンレセプター、アデノシンレセプター、抑制性Ｇタンパク質αサブユニット、促進性Ｇタンパク質αサブユニット、Ｇβγサブユニット）、又はこれらのタンパク質の発現、プロセッシング又は機能プロセッシングを含む。
【００９６】
上で論じたように、変性細胞は、また、細胞又は患者のペースメーカー活性を誘導又は変調させるために投与される。変性細胞の供給源は、胚性骨髄細胞のような分化した（自然に又は駆動された）幹細胞から発生した心筋細胞である。ペースメーカー機能を表す幹細胞由来心筋細胞は、標的心臓組織にカテーテル又は注射によって移植される。幹細胞由来心筋細胞を産生するのに適した方法は、米国公開特許出願ＵＳ２００１/００２４８２４Ａ１及び米国公開特許出願ＵＳ２００２/００２２２５９Ａ１に開示されている。
【００９７】
同様に、未変性の心筋細胞は、先に述べたように、エクスビボにて、所望のペースメーカーを提供するようにポリヌクレオチドの発現で形質転換され、患者の標的心臓組織に、例えばカテーテル又は注射によって移植される。好適には、未変性の心筋細胞は、変性（例えば、本明細書で開示したようにポリヌクレオチド発現系で形質転換される）及び再投与後に、これら細胞の移送を容易にするために、治療を受ける患者から採収される。
【００９８】
変性細胞はレシピエント、即ち、細胞が投与される患者から採収される。例えば、骨髄幹細胞は患者から採収され、ペースメーカー機能を有する心筋細胞に分化される。心臓の細胞、例えば洞結節細胞は、例えばカテーテル又はその他のプロトコールを経て除去されて患者から採収され、例えば本明細書に開示される所望のポリヌクレオチド送達システムの挿入により、変性され、そして患者に投与される。上で論じたように、本明細書で示される如く、投与された細胞は、好ましくは、投与前に幾つかの点で、例えば分化幹細胞又はポリヌクレオチド発現系での形質転換のように変性される；本明細書でいう、「変性され投与された細胞」は、幾つかの点に関して変性されていない単に移植されただけの心臓の細胞を包含しない。
【００９９】
本発明による治療のための好ましい対象は、飼い慣らされた動物、例えば、ブタ、ウマ、イヌ、ネコ、ヒツジ、ヤギ等；齧歯類、例えば、ラット、ハムスター及びマウス；ウサギ；及び霊長類、例えば、サル、チンパンジー等である。より好ましい哺乳類は、ヒトの患者、好ましくは、例えば本明細書に開示されているような、心臓のリズム障害を有する又は有する疑いがある患者である。
【０１００】
治療のための好ましい対象は、本明細書に開示されたような、以下の疾病又は障害に罹っている、又は感受性を有するもの：例えば、心臓に関連する立ちくらみ、特にストークス・アダム立ちくらみ；洞結節機能の異常、例えば、持続性の洞徐脈、ウェンケバッハＳ−Ａとして現れる洞房（Ｓ−Ａ）ブロック、完全Ｓ−Ａブロック又は洞停止、及び高度房室ブロック；或いは徐脈頻脈症候群又はその他の徐脈関連状態、を含む。
【０１０１】
核酸の有効量は、特定の発現タンパク質、特定の標的となる心臓不整脈、患者及びその臨床症状、体重、年齢、性別等の関数である。
【０１０２】
より特異的な本発明の効果は、局所効果を伝達する能力（集中的標的遺伝子送達による）、可逆性効果（限定はされないが、野生型又は変異イオンチャンネル遺伝子を発現するテトラサイクリン誘導可能プロモータを使用するアデノ随伴ウイルスベクターを含む、公知又は新世代のベクターを包含する、誘導し得るベクターの使用による）、等級化（上記したように誘導し得るベクターの使用によるが、ここで等級化は誘導薬剤の投与量を滴定することにより達成される）、遺伝子構築物の同定に基づいた治療の特異性、遺伝子構築物の同定に基づいた内因性メカニズムによる治療作用を制御する能力（神経又はホルモン）、及び随伴する費用及び罹患率に沿った、電子ペースメーカー及びＡＩＣＤ類を含む埋め込み可能なハードウエアの排除を包含する。
【０１０３】
以下の非限定的実施例は本発明の例示である。本明細書に挙げた全ての資料は、参照することにより本明細書の一部として取り入れられている。
【実施例１】
【０１０４】
心室筋細胞の潜在的ペースメーカー活動に対するＫｉｒ２チャンネルの阻害効果
［材料及び方法］
＜優性ネガティブ効果＞
ＩＫ１発現に対するＫｉｒ２．１ＡＡＡの優性ネガティブ効果は、Ｈｅｒｓｋｏｗｉｔｚのアプローチを使用して達成された。（例えば、Herskowitz, Nature 329, 219-22; (1987)を参照）ＧＹＧモチーフ、選択性及び孔機能に重要な役割を演じているカリウムチャンネルのＨ５領域における３つのアミノ酸を、Ｋｉｒ２．１において３つのアラニンに置換した。
【０１０５】
＜ベクター＞
増強した緑色蛍光タンパク質（ＥＧＦＰ、Clontech, Palo Alto, CA, USA）及びＫｉｒ２．１ＡＡＡの両者をコードした、２シストロンアデノウイルスベクターを、前記のようにして、アデノウイルスシャトルベクターｐＡｄＥＧＩ（D. C. Johns, H. B. Nuss, E. Marban, J. Biol. Chem. 272, 31598-603, (1997)）及びｐＡｄＣ−ＤＢＥｃＲ（U. C. Hoppe, et al., J. Clin. Invest. 105, 1077-84 (2000)）を用いて創製した。ヒトＫｉｒ２．１の全長コード配列（G. F. Tomaselli, Johns Hopkins Univ.から供給された）を、ｐＡｄＥＧＩの複数のクローニング部位にクローニングしてｐＡｄＥＧＩ−Ｋｉｒ２．１を生成した。優性ネガティブ変異ＧＹＧ→ＡＡＡを部位特異的突然変異誘発によりＫｉｒ２．１に導入し、ベクターｐＡｄＥＧＩ−Ｋｉｒ２．１ＡＡＡを創製した。アデノウイルスベクターは、記載されているようにして、精製５ウイルスＤＮＡ及びシャトルベクターＤＮＡのＣｒｅ−ｌｏｘ組換えにより創製した（D. C. Johns et al., J. Neurosci. 19, 1691-7 (1999)）。組換え産物は、プラーク精製し、拡張し、ＣｓＣｌ勾配で精製し、１ｍｌ当たり１０１０プラーク形成単位（ＰＦＵ）のオーダーに濃縮した。
【０１０６】
＜インビボ遺伝子送達＞
心臓内注射は、外側開胸後、大人のモルモット（２５０〜３００ｇ）の左心室腔に注射によって達成された。大動脈及び肺動脈を先ず交差クランプし、３０ゲージ針を頂端に挿入し、アデノウイルス溶液の左心室洞への注射を可能とした。アデノウイルス混合物総容積２２０μｌ［３ｘ１０１０ＰＦＵのＡｄＣ−ＤＢＥｃＲ及び２ｘ１０１０ＰＦＵのＡｄＥＧＩ（対照群）又は３ｘ１０１０ＰＦＵのＡｄＣ−ＤＢＥｃＲ及び３ｘ１０１０ＰＦＵのＡｄＥＧＩ−Ｋｉｒ２．１ＡＡＡ（ノックアウト群）を含む］を注射した。クランプ前４０〜６０秒間閉塞した大動脈及び肺動脈を解除した。この手順で、閉鎖系に対して心臓がポンピングしている間、ウイルスが冠状動脈中を循環することを可能にし、導入した細胞の広範な分布をもたらした。閉胸後、動物に非ステロイドエクジソン作用薬、ＧＳ−Ｅ（［Ｎ−メトキシ−２−エチルベンゾイル）−Ｎ’−（３，５−ジメチルベンゾイル）−Ｎ’−ｔｅｒブチルヒドラジン］；Rohm and Haas Co., Spring House, Pennsylvania, USAより供与された）４０ｍｇをＤＭＳＯ９０μｌ及びゴマ油３６０μに溶解して、腹腔内注射した。
【０１０７】
＜形質導入効果＞
形質導入効果は、ＡｄＣＭＶ−βｇａｌ（１６０μｌ、２ｘ１０１０ｐｆｕ／ｍｌ）をＬＶ腔に注射後４８時間の、顕微鏡切片の組織学的評価によって評価した。動物を殺処分した後、心臓を切除し、ＰＢＳで完全にリンスし、横断面で切断した。切片は、記載されているようにして、２％ホルムアルデヒド／０．２％グルタルアルデヒドで固定し、１．０ｍｇ／ｍｌの５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル− −Ｄ−ガラクトシド（Ｘ−ｇａｌ）を含有するＰＢＳ中で染色した（J. K. Donahue et al., Nat. Med. 6, 1395-8 (2000)）。切片はパラフィンに包埋し、５μｍ厚に切り出し、形質導入効果の目視評価のためにＸ−ｇａｌ溶液で染色した（J. K. Donahue et al., Nat. Med. 6, 1395-8 (2000)）。この遺伝子送達法により、およそ２０％の心室筋細胞がＬＶ壁を通過して形質導入が達成された。
【０１０８】
注射の６０〜７２時間後に、モルモット左心室筋細胞をＬａｎｇｅｎｄｏｒｆｆ灌流を用いて単離し、コラゲナーゼを用いて消化した（R. Mitra et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 83, 5340-4 (1986); U. C. Hoppe et al., Circ. Res. 84, 964-72 (1999)）。解離は、一般的には、６０〜７０％の生存心筋細胞を与えた。キセノンアークランプを使用してＧＦＰ蛍光、４８８／５３０ｎｍ（励起／照射）、を観察した。形質導入筋細胞は、エピフルオレッセンスを用いた緑蛍光によって同定された。ＬＶ腔注射アプローチを使用した形質導入及び生存単離筋細胞の収率（−２０％）は、直接心筋内注射よりも高かった（U. C. Hoppe et al., J. Clin. Invest. 105, 1077-84 (2000); U. C. Hoppe et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 98, 5335-40 (2001)）。
【０１０９】
細胞の記録は、Ａｘｏｐａｔｃｈ２００Ｂ増幅器（Axon Instruments, Foster City, California, USA）で全細胞パッチクランプ法（２４）、サンプリング１０ｋＨｚ（電流用）又は２ｋＨｚ（電圧記録用）及びフィルタリング２ｋＨｚを使用して実施された。内部記録溶液で満たしたとき、ピペットは先端抵抗２〜４ＭΩを有した。細胞は、１４０ｍＭ ＮａＣｌ、５ｍＭ ＫＣｌ、２ｍＭ ＣａＣｌ２、１０ｍＭ グルコース、１ｍＭ ＭｇＣｌ２、１０ｍＭ ＨＥＰＥＳを含有する生理食塩水で活性を維持した。ｐＨはＮａＯＨで７．４に調整した。ＩＫ１記録には、ＣａＣｌ２を１００ｐＭに減じ、ＣｄＣｌ２（２００μＭ）をＩｃａＬをブロックするために加えた、そしてＩＮａを、保持電圧−４０ｍＶを使用して、定常状態に不活性化した。バリウム（Ｂａ２＋）感受性電流としてＩＫ１を得るため、Ｂａ２＋（５００μＭ）添加後残存するバックグランド電流を、記録から減じた。ピペット溶液は、１３０ｍＭ Ｋ−グルタミン酸、１９ｍＭ ＫＣｌ、１０ｍＭ ＮａＨｅｐｅｓ、２ｍＭ ＥＧＴＡ、５ｍＭ Ｍｇ−ＡＴＰ、１ｍＭ ＭｇＣｌ２；から成り、ｐＨはＫＯＨで７．２に調整された。データは、測定された液体接合部電圧（junction potential）−１２ｍＶを補正しなかった。活動電位は、０．３３Ｈｚにて簡易脱分極電流パルス（２ｍｓ、５００〜８００ｐＡ、１１０％閾値）によって開始された。活動電位持続時間（ＡＰＤ）は、オーバーシュートから５０％又は９０％再分極までの時間（それぞれ、ＡＰＤ５０、ＡＰＤ９０）として測定された。ＩＣａ，Ｌ記録用に、細胞は、１４０ｍＭ Ｎ−メチル−Ｄ−グルカニン、５ｍＭ ＣｓＣｌ、２ｍＭ ＣａＣｌ２、１０ｍＭ グルコース、０．５ｍＭ ＭｇＣｌ２、１０ｍＭ ＨＥＰＥＳを含有する生理食塩水で活性を維持した；ｐＨはＨＣｌで７．４に調整された。ピペット溶液は、１２５ｍＭ ＣｓＣｌ、２０ｍＭ ＴＥＡ−Ｃｌ、２ｍＭ ＥＧＴＡ、４ｍＭ Ｍｇ−ＡＴＰ、１０ｍＭ ＨＥＰＥＳから成り、ｐＨはＣｓＯＨで７．３に調整された。報告したデータは、平均値±Ｓ．Ｅ．Ｍ．であり、Ｐ＜０．０５（ｔ−テスト）で統計学的有意差を示した。
【０１１０】
全ての記録は、生理的温度（３７℃）及びインビボ形質導入の６０〜７２時間後に行われた。アデノウイルス感染自体は、モルモット心筋細胞の電気生理を変性しないと仮定し（U. C. Hoppe et al., J. Clin. Inest. 105, 1077-84 (2000)）、ＡｄＥＧＩ−Ｋｉｒ２．１ＡＡＡを注射した動物（ＡＰＤ５０＝２３３．８±１０．５ｍｓ、ｎ＝６）から単離された非形質導入（緑でない）左心室筋細胞、及びＡｄＥＧＩを注射した心臓（ＡＰＤ５０＝２４７．６±１０．３ｍｓ、ｎ＝２４、Ｐ＝０．５２）から単離された緑細胞で行われたパッチクランプ法実験を、対照として使用した。
【０１１１】
＜心電図＞
表面ＥＣＧは、手術後直ぐ、及び既報のように心筋内注射の７２時間後に記録された（U. C. Hoppe et al., J. Clin. Invest. 105, 1077-84 (2000); U. C. Hoppe et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 98, 5335-40 (2001)）。モルモットを、イソフルランで鎮静し、針電極を皮下に設置した。電極の位置は、最大増幅記録を得るため至適化され、正確なＱＴ間隔が得られた。ＥＣＧは、標準リード１１、及び改良リードＩ及びＩＩＩで同時に記録された。針電極の位置を、記録後モルモットの皮膚上にマークし、７２時間後の位置を正確に同じにした。速度補正ＱＴ間隔（ＱＴｃ）を計算した（E. Hayes et al., J. Pharmacol. Toxicol. Methods 32, 201-7 (1994)）。
【０１１２】
＜結果＞
アラニンによるＫｉｒ２．１の孔領域における３つの臨界残基の置換（ＧＹＧ１４４−１４６→ＡＡＡ、又はＫｉｒ２．１ＡＡＡ）は、野生型Ｋｉｒ２．１と共発現するとき、電流束を抑制する優性ネガティブ構築体を創製する。卵母細胞において、Ｋｉｒ２．１ＡＡＡＲＮＡ単独の注射は電流を生じないが、野生型Ｋｉｒ２．１ＲＮＡと一緒に注射すると、ＩＫ１の抑制を生じる。４量体Ｋｉｒチャンネル内への単一変異体サブユニットの取り込みは、ノックアウト機能には充分である。Ｋｖ１．２電流はＫｉｒ２．１ＡＡＡＲＮＡと一緒に注射することによって減少しないので、優性ネガティブ効果は、カリウムチャンネルのＫｉｒファミリーに特異的である。Ｋｉｒ２．１ＡＡＡが、Ｋｉｒ２．１を安定的に発現している哺乳動物細胞株（ＨＥＫ）に、一過性に発現したとき、優性ネガティブ構築体はＩＫ１を約７０％減少した。
【０１１３】
Ｋｉｒ２．１ＡＡＡを２シストロン・アデノウイルス・ベクターにパッケージし、モルモット左心室腔に注射した。この送達方法は、心室筋細胞の〜２０％の形質導入を達成するのに充分であった（図１）。Ｋｉｒ２．１ＡＡＡでインビボ形質導入して３〜４日後に単離された筋細胞は、ＩＫ１の抑制を示した（図２Ｂ、Ｃ）が、カルシウム電流は変化せずに残存した（図２Ｅ、Ｆ）。
対照の心室筋細胞は自発活動を示さなかったが、脱分極外部刺激を与えると単一活動電位を発射した（図３Ａ）。対照的に、Ｋｉｒ２．１ＡＡＡ筋細胞は二つの表現型：即ち、外部刺激によって持続活動電位が惹起される安定静止電位（図３Ｃ、「長ＱＴ表現型」）、又は自発活動（図３Ｅ）のいずれかを示した。活動電位の持続は、心電図でのＱＴ間隔を長くすることが期待される（長ＱＴ表現型）が、これに対し、自発活動は真性のペースメーカー細胞のそれに似ている；最大拡張期電位は、段階的「フェーズ４」脱分極及びゆるやかなとり込みによって開始される、反復する、通常のそして絶え間ない電気活動と共に、相対的に脱分極される（表１）。異なる表現型は、ＩＫ１密度の３つの別個の範囲に対応する（図２Ｂ、Ｄ、Ｆ、Ｇ）。それ故、Ｋｉｒ２．１ＡＡＡ形質導入筋細胞は、特定の細胞にどれくらいのＩＫ１抑制が起こったかに依存して、長ＱＴ表現型又はペースメーカー表現型のいずれかを示す。ＩＫ１が０．４ｐＡ／ｐＦ以下（−５０ｍＶで）に抑制された筋細胞は、全て自発ＡＰを表し、ＩＫ１が０．４ｐＡ／ｐＦＩＫ１以上の筋細胞は、安定した休止膜電位及び持続的活動電位を有した。
【０１１４】
ペースメーカー表現型の細胞は、Ｎａチャンネルブロッカー、テトロドトキシンによって影響されなかった（図４Ａ、Ｂ）、しかし、カルシウムチャンネルブロッカーに曝露している間、自発発射は止まった（カドミウム、図４Ｃ、Ｄ；ニフェジピン、Ｅ、Ｆ）。それ故、自発活動電位が基礎にある興奮電流は、真性のペースメーカー細胞での場合のように、カルシウムチャンネルによって実行される。同様に、Ｋｉｒ２．１ＡＡＡ自発表現型細胞は、丁度、結節筋細胞が行うようにβアドレナリン刺激に応答し、心拍数を加速するペーシング速度を増加する（図５）。
【０１１５】
表２に、対照、長ＱＴ表現型Ｋｉｒ２．１ＡＡＡ、及びペースメーカー表現型Ｋｉｒ２．１ＡＡＡミオサイトにおける活動電位の物性値を示す。全ての対照（ｎ＝３０）及び長ＱＴ表現型Ｋｉｒ２．１ＡＡＡ細胞（Ｋｉｒ２．１ＡＡＡ細胞２２の中の７）において、電気刺激に応答して、安定な活動電位が誘発された。ペースメーカー表現型Ｋｉｒ２．１ＡＡＡ細胞（Ｋｉｒ２．１ＡＡＡ細胞２２の中の１５）は帰属刺激無しで自発活動電位を示した。
【０１１６】
【表２】
【０１１７】
表中のＡＰＤ５０及びＡＰＤ９０は、ＡＰが、５０％又は９０％再分極にオーバーシュートする活動電位持続時間を測定したものである。
【０１１８】
心電図は二つの表現型を表す。図６Ａは、ＱＴ間隔の持続を示す（図６Ａ）。それにも拘わらず、動物の４０％は、自発的心室病巣を示唆する変化した心臓リズムを示した（図６Ｂ）。心室起源の期外収縮は、その広い幅によって区別することができ、そして生理的洞ペースメーカーの脈拍とは無関係に、脈拍が「進行し続ける」のが見られる。正常な洞リズムにおいては、全てのＰ波の後は、ＱＲＳ複合が続く。しかしながら、もし誘導されたペースメーカーの病巣から異所性の脈拍が生じたら、心臓全体を心室から先導することができる。実際、Ｋｉｒ２．１ＡＡＡで形質導入して７２時間後動物５頭の内２頭において、心室自動能が発現していた。これら２頭の動物では、Ｐ波は、ＱＲＳ複合群に続いていなかった；Ｐ波とＱＲＳ複合群は、独立したリズムを保持していた。ＲＲ間隔は、ＰＰ間隔より短く、心室由来のリズム（自動能のために加速された心室リズム）を表わしていた。インビボでの二つの表現型は、独特な長ＱＴ及びペースメーカー細胞性表現型によく一致した。
優性ネガティブの結果は、本明細書において使用された方法の永続性及び特異性を明らかにしている。これらの結果は、Ｋｉｒ２チャンネルの特異的抑制が、心室筋細胞におけるペースメーカー活動を解放するのに充分であることを明らかにしている。これらの結果は、また、ペーシングに対する重要な因子は、特定の遺伝子の存在よりも、むしろ、単に強く分極したＩＫ１の不存在であることを明らかにしている（そのような遺伝子は、真性のペースメーカー細胞における重要な変調的役割を演じているのであろうが）。
【実施例２】
【０１１９】
ＨＣＮ１チャンネルを非機能性にした三重変異ＧＹＧ３６５−３６７ＡＡＡ
＜分子生物学及び異種性発現＞
ｍＨＣＮ１及びｍＨＣＮ２をｐＧＨ発現ベクターにサブクローニングした。（B. Santoro, et al., Cell, 93:717-29 (1998)）。重複した突然変異プライマーにより、部位特異的突然変異誘発をＰＣＲを用いて実施した。全ての構築について、所望の突然変異が存在することを確かめるために配列決定を行った。ｃＲＮＡを、ＨＣＮ１及びＨＣＮ２チャンネルのそれぞれに対してＴ７ＲＮＡポリメラーゼ（Promega, Madison, WI）を用いて、Ｎｈｅｌ−及びＳｐｈｌ−直線化ＤＮＡから転写した。チャンネル構築物は異種性に発現し、そしてツメガエルの卵母細胞で試験した。簡潔に記載すると、ＩＶ期からＶＩ期の卵母細胞を１％トリカイン（即ち３−アミノ安息香酸エチルエステル）中に液浸することにより麻酔した雌カエルから外科的に分離し、次いで、８８ｍＭ ＮａＣｌ、２ｍＭ ＫＣｌ、１ｍＭ ＭｇＣｌ２、及び５ｍＭ ＨＥＰＥＳ（ＮａＯＨでｐＨ７．６に調整）を含有するＯＲ−２中で、２ｍｇ／ｍｌコラゲナーゼで、３０〜６０分消化した。単離した卵母細胞は、示したように、ｃＲＮＡ（１ｎｇ／ｎｌ）を注射し、９６ｍＭ ＮａＣｌ、２ｍＭ ＫＣｌ、１．８ｍＭ ＣａＣｌ２、１ｍＭ ＭｇＣｌ２、及び５ｍＭ ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．６に調整）、５０μｇ／ｍｌゲンタマイシン、５ｍＭ ピルビン酸及び０．５ｍＭ テオフィリンを補足、を含むＮＤ９６溶液中に実験前１〜４日貯蔵した。１０〜２５ｎｇ／細胞が発現される電流の幅に直線的に比例する範囲に相当するのであるが、１細胞当たり５０〜１００ｎｇの総ｃＲＮＡの注射で、最大発現を達成するためには充分であることが見出された。
【０１２０】
＜電気生理＞
２電極の電圧固定法の記録を室温（２３〜２５℃）で、ＷａｒｎｅｒＯＣ−７２５Ｃ増幅器（Hamden, CT）を用いて実施した。寒天を詰めた電極（ＴＷ１２０Ｆ−６；World Precision Instruments）を、ＳｕｔｔｅｒＰ−８７水平引き手で引き、３ＭのＫＣｌを充填し、最終先端抵抗２〜４Ｍａを有していた。記録槽溶液は、９６ｍＭ ＫＣｌ、２ｍＭ ＮａＣｌ、１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、及び２ｍＭ ＭｇＣｌ２、（ＫＯＨでｐＨ７．５に調整）を含んでいた。電流は１０ｋＨｚでディジタル化し、１〜２ｋＨｚで低域フィルターした（−３ｄＢ）。電流記録の入手及び解析は、特注のソフトウエアを用いて行った。
【０１２１】
＜実験プロトコール及びデータ解析＞
定常状態の電流・電圧（Ｉ−Ｖ）の関係は、保持電位−３０ｍＶから１０ｍＶずつの増分で、−１５０から０ｍＶの範囲に亘る３秒パルスの最後に測定したＨＣＮ１電流をプロットすることによって定量された。ＨＣＮチャンネル活性化の電圧依存性は、記録された最大末尾電流（tail current）に標準化した先行する３秒テストパルスの関数として、−１４０ｍＶにパルス化した後、直ちに測定した末尾電流をプロットすることによって評価した。データは、非線形最小二乗法でＭａｒｑｕａｒｄｔ−Ｌｅｖｅｎｂｅｒｇアルゴリズムを用いて、Ｂｏｌｚｍａｎ関数に当てはめた：
ｍ ＝ １／｛１＋ｅｘｐ［（Ｖｔ−Ｖ１／２）／ｋ］｝
ここで、Ｖｔは試験電位、Ｖ１／２は関係の中点、及びｋ＝ＲＴ／ｚＦは傾斜係数である。
【０１２２】
反転電位（Ｅｒｅｖ）に関しては、３秒プレパルスを−１４０（図１１Ｂ参照）又は２０ｍＶのいずれかで先行し、−１００から＋４０ｍＶまでの範囲の試験電圧の群（ｆａｍｉｌｙ）に進めた後、直ちに末尾電流を記録した。二つのプレパルス電位から得た末尾電流の差を試験電位に対しプロットし、線形回帰に合わせてＥｒｅｖを得た。電流動態に関しては、巨視的電流及び末尾電流を単一指数関数にそれぞれ合わせて、活性化（τａｃｔ）及び不活性化（τｄｅａｃｔ）に対する時定数を評価した。
【０１２３】
データは、平均±ＳＥＭで示す。統計的有意差は、Ｓｔｕｄｅｎｔの不対ｔ−検定を用いて決定し、ｐ＜０．０５で有意水準を表した。
【０１２４】
チャンネル機能における三重ＨＣＮ１変異体ＧＹＧ３６５−３６７ＡＡＡ（ＨＣＮ１−ＡＡＡ）の効果を、個々に発現するＷＴ及び変異体チャンネル構築物により評価した。図８は、ＷＴＨＣＮ１ｃＲＮＡを注射した卵母細胞の過分極が、電位−４０ｍＶ以下に達して時間依存性内向き電流を引き出し、それが〜５００ｍｓ後に定常状態電流幅に達したことを示す。電流は、漸進性の過分極を有する幅で増加した。対照的に、注射しない卵母細胞及びＨＣＮ１ＡＡＡを注射した卵母細胞は、測定し得る電流を生じなかった、このことは三重アラニン置換は、ＨＣＮ１を完全に非機能性にしたことを示している。
【０１２５】
＜ＨＣＮ１ＡＡＡが優性ネガティブ様式でＷＴＨＣＮ１の正常活性を抑制する＞
前の研究では、正常及び欠失サブユニットを多重結合の複合体を形成するように共組み立てするとき、優性ネガティブ様式でチャンネル活性を無能化することができる多くのイオンチャンネル変異体を同定した。R. Li et al., J. Physiol, 533:127-33 (2001); J. Seharaseyon, J. Mol. Cell Cardiol. 32:1923-30 (2000); MT Perez-Garcia, J. Neurosci., 20: 5689-95 (2000); J. Seharseyon et al., J. Biol. Chem., 75: 17561-5 (2000); UC Hoppe et al., J. Clin. Invest. 105: 1077-84 (2000); MJ Lalli et al., Pflugers Arch. 436: 957-61 (1998); DC John et al., J. Biol. Chem. 272: 31598-603 (1997). ＨＣＮ１−ＡＡＡは、ＷＴＨＣＮ１サブユニットと結合するとき、優性ネガティブ効果を発揮することが予期された。図９は、５０ｎｌＷＴＨＣＮ１及び５０ｎｌＨＣＮ１−ＡＡＡｃＲＮＡ（濃度＝１ｎｇ／ｎｌ）と共注射された卵母細胞は、同じインキュベーション時間の後−１４９ｍＶで測定すると、ＷＴＨＣＮ１ｃＲＮＡのみ５０ｎｌ注射した細胞よりも電流が８５．２±１．９％（ｎ＝８）少なく発現されることを示している（ｐ＜０．０１；図９Ｂ）。そのような定量的相異は、それらの対応する定常状態電流−電圧関係により示されたように、ＨＣＮ１チャンネルの殆どの活動範囲を通して存在していた（図９Ｃ）。これらの観察は、ＨＣＮ１−ＡＡＡが、同じ数の機能性サブユニットの存在にも拘わらず、優性ネガティブ様式でＷＴＨＣＮ１チャンネルの正常活動を抑制することができることを明らかにしている（以前のＫ＋チャンネルの研究において普通であったのと等しいＲＮＡ安定性と翻訳効率を仮定した場合、Hille B. Ion channels of Excitable Membranes, 3rd Ed., Sunderland, Massachusetts, USA. Sinauer Associates, Inc. 2001; R. MacKinnon Nature, 1991; 350:232-5）。対照的に、５０ｎｌＷＴＨＣＮ１ｃＲＮＡと等量のｄＨ２Ｏの共注射は、５０ｎｌＷＴＨＣＮ１単独の注射と差がない大きさの電流が得られた（ｐ＞０．０５）。このことは、ＨＣＮ１−ＡＡＡで観察された優性ネガティブ抑制効果は、機械感受性効果のような非特異的機構によるものではないことを示唆している。本発明者等は、また、注射される総ｃＲＮＡを一定に保ちつつ（２５ｎｇを発現の飽和を防止するために使用した）ＷＴＨＣＮ１：ＨＣＮ１−ＡＡＡ及びＷＴＨＣＮ２：ＨＣＮ１−ＡＡＡの比率を変化した効果を研究した。優性ネガティブ機構から予測されたように、電流抑制はＨＣＮ１−ＡＡＡの増加に比例して増加した（ＷＴＨＣＮ１：ＨＣＮ１−ＡＡＡがそれぞれ、４：１、３：１、２：１、１：１及び１：２の比率に対して、５５．２±３．２、６８．３±４．３、７８．７±１．６、９１．７±０．８、９７．９±０．２％の電流減少が見られた；図１０）。
【０１２６】
＜優性ネガティブ構築体ＨＣＮ１−ＡＡＡ及びＷＴＨＣＮ１の共発現は、正常通門及び透過性を変更しなかった＞
電流振幅に対する優性ネガティブ抑制効果に加えて、通門及び透過性に対するＨＣＮ１−ＡＡＡとＷＴＨＣＮ１の共発現の効果を調べた。図１１Ａは、ＷＴＨＣＮ１単独の定常状態活動曲線から誘導された中点及び傾斜係数（Ｖ１／２＝−７６．７±０．８ｍＶ；ｋ＝１３．３±０．６ｍＶ；ｎ＝１５）及び、ＨＣＮ１−ＡＡＡで抑制後（比率＝１：１、Ｖ１／２＝−７７．０±１．７ｍＶ；ｋ＝１２．３±１．０ｍＶ；ｎ＝１２）のそれらの両者は同じである（ｐ＞０．０５）ことを示している。末尾電流−電圧関係も、また、全細胞電流はＨＣＮ１−ＡＡＡによって抑制されるが、反転電位は変化しない（ＷＴＨＣＮ１単独＝−４．５±１．４ｍＶ、ｎ＝８；ＷＴ＋ＡＡＡ＝−５．２５±０．８ｍＶ、ｎ＝５；ｐ＞０．０５；図１１Ｂ、Ｃ）ことを示唆している。同様に、電流活性化（τａｃｔ）及び不活化（τｄｅａｃｔ）時定数（その分布は、対応する定常状態活性化曲線から誘導されたのと比較して中点を有するベル型であった）も、また、研究した電圧範囲全体に亘ってＨＣＮ１−ＡＡＡ抑制後不変であった（ｐ＞０．０５；図１１Ｄ）。本発明者等の観察では、非抑制電流は正常通門及び透過性の表現型を表したことを示唆している。
【０１２７】
＜ＨＣＮ１ＡＡＡは、通門及び透過性を変えずにＷＴＨＣＮ２電流を抑制した＞
もし異なったＨＣＮイソフォームがヘテロメリックチャンネル複合体（heteromeric channel complexes）を形成するように共組み立てすることができれば、ＨＣＮ１−ＡＡＡも、また、本発明者等のＷＴＨＣＮ１での観察に類似した優性ネガティブ様式において、ＷＴＨＣＮ２の活性を抑制する筈である。図１２は、これがその場合であることを示している。５０ｎｌＷＴＨＣＮ２及び５０ｎｌＨＣＮ１−ＡＡＡｃＲＮＡを共注射した卵母細胞から記録した電流は、５０ｎｌＷＴＨＣＮ２単独又は５０ｎｌＷＴＨＣＮ２＋５０ｎｌｄＨ２Ｏを、同じインキュベーション時間の後に注射した卵母細胞において発現された電流より有意に小さかった（図１２Ａ−Ｃ）。事実、ＨＣＮ１−ＡＡＡによる抑制の程度は、研究した全ての他の比率について、ＷＴＨＣＮ１及びＨＣＮ２の両者に対して類似していた（図１０；注射した総ｃＲＮＡ＝２５ｎｇ）。これらを併せて考えると、これらの結果は、二つのアイソマーが、等しい効率で共組立てすることができたことを示唆している。ＨＣＮ１に類似して、非抑制ＨＣＮ２電流の定常状態活性化パラメーター、反転電位、及び通門動態は、ＨＣＮ１−ＡＡＡ共発現によって変化しなかった（ｐ＞０．０５；図１２Ｄ−Ｆ）。
【０１２８】
＜遺伝子工学処理したＨＣＮ１チャンネルは、陽性及び陰性方向に移動したチャンネル活性を表す＞
タンパク質工学によってＨＣＮチャンネル通門性質の変調を行った。図１３Ａ及びＢは、荷電中和置換したＥ２３５Ａは、定常状態チャンネル活性化において有意な脱分極移動（Ｖ１／２＝−５９．２±１．５ｍＶ；ｎ＝７；ｐ＜０．０５）及び傾斜係数における有意でない変化（ｋ＝１２．３±０．９ｍＶ、ｎ＝７；ｐ＞０．０５）を生じた。残基２３５の静電的役割と整合して、荷電復帰突然変異（charge- reversed mutation）Ｅ２３５Ｒは、より陽性側に定常状態活動曲線を移動した（５６．４±０．５ｍＶ、ｎ＝３；ｐ＜０．０５）。傾斜係数（７．９±０．８ｍＶ、ｎ＝３；ｐ＞０．０５）もＰ０，ｍｉｎ（１７．０％±１．９％、ｎ＝３；ｐ＞０．０５）もＥ２３５Ｒ（ｐ＞０．０５；図１３Ａ及びＣ）により影響されなかった。本発明者等は、次に、位置２５３におけるＳ４セリン変異体が、複数の置換によってＨＣＮ１チャンネルの特色ある活性化プロフィールの基礎になっているのかどうかを調べた（図８）。Ｓ２５３をアラニン（即ちＳ２５３Ａ）で置換すると、活性化及び不活性化の両者を遅くするが、定常状態活性化関係及び通門動態の電圧依存性において、平行した過分極移動を生じた（図１３Ｄ）。しかしながら、Ｓ２５３Ａは、Ｐ０，ｍｉｎを変えなかった。Ｓ２５３Ｋ及びＳ２５３Ｅの反対の荷電にも拘わらず、両置換体は、定常状態Ｉ−Ｖ関係を同じ過分極方向に移動させた。これらを総合すると、このことは、ＨＣＮチャンネル活性の活性化閾値（図１３）及び内因的に発現された電流幅（図８〜１２）が、変調し得ることを示している。
【０１２９】
本発明は、好ましい実施態様に関して詳細に記載されている。しかしながら、当業者が本開示を考察して、本発明の精神及び範囲内で、変形及び改良を行い得ることは認識されるであろう。
【図面の簡単な説明】
【０１３０】
【図１】遺伝子転移効力の評価。ＡｄＣＭＶ−ｇａｌをＬＶ腔へ注射して４８時間後の左心室（ＬＶ）の顕微鏡切片のＸ−ｇａｌ染色を形質導入効力の評価に使用した。形質導入細胞（青に染色）はＬＶ壁を通して観察した。この遺伝子送達法は、明らかな細胞損傷なしに心室筋細胞の２０％の形質導入を達成した。
【図２−１】Ｉｋ１抑制の特異性。（Ａ、Ｂ、Ｃ）Ｉｋ１の平均電流密度は、対照細胞に比較して、Ｋｉｒ２．１ＡＡＡ形質導入細胞（ｎ＝９）において有意に減少した（ｎ＝７、P＜０．０００１）。（Ｄ、Ｅ、Ｆ）更に、この結果は、主に変調する機能性Ｋｉｒ２．１チャンネル数の特異的効果の故に、Ｌ型カルシウム電流が、非形質導入細胞（−４．５±０．２ｐＡ／ｐＦ、ｎ＝６）に比べて、Ｋｉｒ２．１−ＡＡＡ形質導入心筋（−４．２±０．９ｐＡ／ｐＦ、ｎ＝４）においては変えられなかったことを示す。
【図２−２】Ｉｋ１抑制の特異性。（Ａ、Ｂ、Ｃ）Ｉｋ１の平均電流密度は、対照細胞に比較して、Ｋｉｒ２．１ＡＡＡ形質導入細胞（ｎ＝９）において有意に減少した（ｎ＝７、P＜０．０００１）。（Ｄ、Ｅ、Ｆ）更に、この結果は、主に変調する機能性Ｋｉｒ２．１チャンネル数の特異的効果の故に、Ｌ型カルシウム電流が、非形質導入細胞（−４．５±０．２ｐＡ／ｐＦ、ｎ＝６）に比べて、Ｋｉｒ２．１−ＡＡＡ形質導入心筋（−４．２±０．９ｐＡ／ｐＦ、ｎ＝４）においては変えられなかったことを示す。
【図３−１】活動電位表現型はＩｋ１密度によって決定される。（Ａ）安定ＡＰが、強いＩｋ１（Ｂ、−５０ｍＶで記録）で対照心室筋細胞における脱分極した外部刺激により誘発された。中程度に抑制されたＩｋ１（Ｄ）を有するＫｉｒ２．１ＡＡＡ形質導入筋細胞、長ＱＴ表現型を有するＡＰが誘発された。自発ＡＰ（Ｅ）が、著しく抑制されたＩｋ１密度（Ｆ）を有するＫｉｒ２．１ＡＡＡ細胞において観察された。３つの別個のＩｋ１密度（Ｇ）の範囲が認められた。Ｉｋ１が０．４ｐＡ／ｐＦ以下に抑制された筋細胞は、ペースメーカー表現型を示した。
【図３−２】活動電位表現型はＩｋ１密度によって決定される。（Ａ）安定ＡＰが、強いＩｋ１（Ｂ、−５０ｍＶで記録）で対照心室筋細胞における脱分極した外部刺激により誘発された。中程度に抑制されたＩｋ１（Ｄ）を有するＫｉｒ２．１ＡＡＡ形質導入筋細胞、長ＱＴ表現型を有するＡＰが誘発された。自発ＡＰ（Ｅ）が、著しく抑制されたＩｋ１密度（Ｆ）を有するＫｉｒ２．１ＡＡＡ細胞において観察された。３つの別個のＩｋ１密度（Ｇ）の範囲が認められた。Ｉｋ１が０．４ｐＡ／ｐＦ以下に抑制された筋細胞は、ペースメーカー表現型を示した。
【図３−３】活動電位表現型はＩｋ１密度によって決定される。（Ａ）安定ＡＰが、強いＩｋ１（Ｂ、−５０ｍＶで記録）で対照心室筋細胞における脱分極した外部刺激により誘発された。中程度に抑制されたＩｋ１（Ｄ）を有するＫｉｒ２．１ＡＡＡ形質導入筋細胞、長ＱＴ表現型を有するＡＰが誘発された。自発ＡＰ（Ｅ）が、著しく抑制されたＩｋ１密度（Ｆ）を有するＫｉｒ２．１ＡＡＡ細胞において観察された。３つの別個のＩｋ１密度（Ｇ）の範囲が認められた。Ｉｋ１が０．４ｐＡ／ｐＦ以下に抑制された筋細胞は、ペースメーカー表現型を示した。
【図３−４】活動電位表現型はＩｋ１密度によって決定される。（Ａ）安定ＡＰが、強いＩｋ１（Ｂ、−５０ｍＶで記録）で対照心室筋細胞における脱分極した外部刺激により誘発された。中程度に抑制されたＩｋ１（Ｄ）を有するＫｉｒ２．１ＡＡＡ形質導入筋細胞、長ＱＴ表現型を有するＡＰが誘発された。自発ＡＰ（Ｅ）が、著しく抑制されたＩｋ１密度（Ｆ）を有するＫｉｒ２．１ＡＡＡ細胞において観察された。３つの別個のＩｋ１密度（Ｇ）の範囲が認められた。Ｉｋ１が０．４ｐＡ／ｐＦ以下に抑制された筋細胞は、ペースメーカー表現型を示した。
【図４−１】カルシウム電流は、自発ＡＰの基礎にある興奮電流である。ペースメーカー表現型を有するＫｉｒ２．１ＡＡＡ形質導入細胞は、Ｎａチャンネルブロッカー、テトロドトキシンによって影響されなかった（１０μＭ、Ａ、Ｂ）が、自発発射は、カルシウムチャンネルブロッカーに曝露中は停止した（カドミウム２００μＭ、Ｃ、Ｄ；ニフェジピン１０μＭ、Ｅ、Ｆ）。
【図４−２】カルシウム電流は、自発ＡＰの基礎にある興奮電流である。ペースメーカー表現型を有するＫｉｒ２．１ＡＡＡ形質導入細胞は、Ｎａチャンネルブロッカー、テトロドトキシンによって影響されなかった（１０μＭ、Ａ、Ｂ）が、自発発射は、カルシウムチャンネルブロッカーに曝露中は停止した（カドミウム２００μＭ、Ｃ、Ｄ；ニフェジピン１０μＭ、Ｅ、Ｆ）。
【図４−３】カルシウム電流は、自発ＡＰの基礎にある興奮電流である。ペースメーカー表現型を有するＫｉｒ２．１ＡＡＡ形質導入細胞は、Ｎａチャンネルブロッカー、テトロドトキシンによって影響されなかった（１０μＭ、Ａ、Ｂ）が、自発発射は、カルシウムチャンネルブロッカーに曝露中は停止した（カドミウム２００μＭ、Ｃ、Ｄ；ニフェジピン１０μＭ、Ｅ、Ｆ）。
【図５】イソプレテレノール（１μＭ）の適用は、ペースメーカー活性を表す４つのＫｉｒ２．１ＡＡＡ形質導入細胞において、自発ＡＰの頻度を増加した（Ａ、Ｂ）。平均周期長は、イソプレテレノール曝露中に、ベースラインでの４３５±２７ｍｓから３５１±１８ｍｓ（ｎ＝４）に減少した（Ｐ＜０．０１）（Ｃ）。
【図６】遺伝子送達前後の心電図。（Ａ）動物５頭中３頭で、ＱＴ間隔が、Ｋｉｒ２．１ＡＡＡの遺伝子導入後７２時間延長された。（Ｂ）動物５頭中２頭で、心室リズムが促進された。融合拍動であるＶと記されたＱＲＳ群を除いて、Ｐ波（青Ａ及び矢印）及び広いＱＲＳ群（赤Ｖ及び矢印）はそれら独自のリズムへ向かって進行した。この動物のベースラインＥＣＧ記録は、正常な洞リズムであった（図示していないがパネルＡに類似）。
【図７】ＨＣＮコード化ペースメーカーチャンネルの推定される膜貫通トポロジーを示す。中央のパネル：ＨＣＮ１チャンネルの単量体サブユニットの６つの膜貫通セグメント（Ｓ１〜Ｓ６）を示す。ＧＹＧの印のモチーフのおよその所在位置を強調して示す。サイクリックヌクレオチド結合領域（ＣＮＢＤ）はＣ−末端領域にある。一番上のパネル：種々のＨＣＮのＳ５−Ｓ６Ｐループ及び脱分極活性化Ｋ＋チャンネルの上昇リムの配列比較。ＧＹＧトリプレット（強調した）は、稀な場合、例えばＨＥＲＧＫ＋チャンネル（この中央の位置はチロシンの代わりに保存された変異フェニルアラニンによって占められている）を除いて、知られている全てのＫ＋選択的チャンネルで保存されている。一番下のパネル：ＨＣＮイソフォーム１−４のＳ３−Ｓ４リンカー及びＳ４のアミノ酸配列を、過分極活性化されたウニ精子チャンネル（ＳＰＨ１）、植物Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ（ＫＡＴ１）からクローニングされた過分極活性化Ｋ＋チャンネル、及び脱分極活性化シェーカー（Shaker）及びＨＥＲＧＫ＋チャンネルと比較したものである。ＨＣＮチャンネルのＳ４は、６番目の位置を除いて（ここでは、カチオン性残基の代わりに中性のセリンが見出される）二つの疎水性アミノ酸によって、互いに規則的に間隔をとった９アミノ酸を含有している。ＳＰＩＨとＫＡＴ１チャンネルは、ＨＣＮチャンネルと比較してＳ４セグメントには一つの少ない塩基性残基を有しているが、Ｓ４を二つの部分に分けるセリンをここでも有している。このＳ４セリンは、Ｋｖチャンネルには見られず、そしてそれは、ＨＣＮ電圧検出モチーフを二つの領域に分割し、ユニークな過分極活性化ＨＣＮチャンネル開口の役割を持っていると仮定されている。
【図８−１】ＨＣＮ１において、ＧＹＧトリプレットをアラニンで置換した（ＧＹＧ３６５−３６７ＡＡＡ）場合の、ＨＣＮ１電流に対する効果を示す。Ａ）ＷＴＨＣＮ１及びＨＣＮ−ＡＡＡｃＲＮＡを注射した卵母細胞、又は、注射しない卵母細胞から記録された全細胞の電流の代表的な追跡。電流を取り出すために使われた電気生理のプロトコールは本文に示す。１０ｍＶの増分で、０から−１５０ｍＶまでの範囲で、３秒の電気パルス群を、保持電位−３０ｍＶから卵母細胞に適用した。末尾電流は−１４０ｍＶで記録した。過分極活性化時間依存性電流は、ＷＴＨＣＮ１を注射した卵母細胞には明らかであるが、同じプロトコールを使用したＨＣＮ１−ＡＡＡ注射細胞及び非注射細胞からは、測定し得る電流は見られなかった。Ｂ）ＷＴＨＣＮ１−ＡＡＡ及びＨＣＮ１−ＡＡＡを注射した（図で、それぞれ、実線の四角及び三角）、及び非注射（図で、白丸）の卵母細胞の定常状態での電流−電圧の関係。データは平均±ＳＥＭで示す。
【図８−２】ＨＣＮ１において、ＧＹＧトリプレットをアラニンで置換した（ＧＹＧ３６５−３６７ＡＡＡ）場合の、ＨＣＮ１電流に対する効果を示す。Ａ）ＷＴＨＣＮ１及びＨＣＮ−ＡＡＡｃＲＮＡを注射した卵母細胞、又は、注射しない卵母細胞から記録された全細胞の電流の代表的な追跡。電流を取り出すために使われた電気生理のプロトコールは本文に示す。１０ｍＶの増分で、０から−１５０ｍＶまでの範囲で、３秒の電気パルス群を、保持電位−３０ｍＶから卵母細胞に適用した。末尾電流は−１４０ｍＶで記録した。過分極活性化時間依存性電流は、ＷＴＨＣＮ１を注射した卵母細胞には明らかであるが、同じプロトコールを使用したＨＣＮ１−ＡＡＡ注射細胞及び非注射細胞からは、測定し得る電流は見られなかった。Ｂ）ＷＴＨＣＮ１−ＡＡＡ及びＨＣＮ１−ＡＡＡを注射した（図で、それぞれ、実線の四角及び三角）、及び非注射（図で、白丸）の卵母細胞の定常状態での電流−電圧の関係。データは平均±ＳＥＭで示す。
【図９−１】ＨＣＮ１ＡＡＡは、優性ネガティブ様式でＷＴＨＣＮ１の正常活性を抑制する。Ａ）５０ｎｌＷＴＨＣＮ１、５０ｎｌＷＴＨＣＮ１＋５０ｎｌｄＨ２Ｏ、及び５０ｎｌＷＴＨＣＮ１＋５０ｎｌＨＣＮ１−ＡＡＡｃＲＮＡ（濃度：１ｎｇ／ｎｌ）を注射した卵母細胞から記録した、代表的電流の追跡。図８と同じ電圧プロトコールを使用した。ＷＴＨＣＮ１とＨＣＮ１−ＡＡＡの共注射が、有意に正常チャンネル活性を抑制した。ＷＴＨＣＮ１末尾電流（図において、四角で囲んである）は、Ｄ）で拡大して示してある。Ｂ）各群の平均電流を拡大して要約した棒グラフ。各群は：Ａ）５０ｎｌＷＴＨＣＮ単独の保持電位に標準化した−３０ｍＶの保持電位から−１４０ｍＶまで、３秒のパルスの最後に測定。＊ｐ＜０．０１。Ｃ）Ａ）からの同じ群の定常状態での電流−電圧関係。Ｄ）−１４０ｍＶにおけるＷＴＨＣＮ１の末尾電流。単一指数関数にこれらの電流を合わせると、活性化に対する時間係数の推定が可能である（図１１Ｄを参照）。
【図９−２】ＨＣＮ１ＡＡＡは、優性ネガティブ様式でＷＴＨＣＮ１の正常活性を抑制する。Ａ）５０ｎｌＷＴＨＣＮ１、５０ｎｌＷＴＨＣＮ１＋５０ｎｌｄＨ２Ｏ、及び５０ｎｌＷＴＨＣＮ１＋５０ｎｌＨＣＮ１−ＡＡＡｃＲＮＡ（濃度：１ｎｇ／ｎｌ）を注射した卵母細胞から記録した、代表的電流の追跡。図８と同じ電圧プロトコールを使用した。ＷＴＨＣＮ１とＨＣＮ１−ＡＡＡの共注射が、有意に正常チャンネル活性を抑制した。ＷＴＨＣＮ１末尾電流（図において、四角で囲んである）は、Ｄ）で拡大して示してある。Ｂ）各群の平均電流を拡大して要約した棒グラフ。各群は：Ａ）５０ｎｌＷＴＨＣＮ単独の保持電位に標準化した−３０ｍＶの保持電位から−１４０ｍＶまで、３秒のパルスの最後に測定。＊ｐ＜０．０１。Ｃ）Ａ）からの同じ群の定常状態での電流−電圧関係。Ｄ）−１４０ｍＶにおけるＷＴＨＣＮ１の末尾電流。単一指数関数にこれらの電流を合わせると、活性化に対する時間係数の推定が可能である（図１１Ｄを参照）。
【図９−３】ＨＣＮ１ＡＡＡは、優性ネガティブ様式でＷＴＨＣＮ１の正常活性を抑制する。Ａ）５０ｎｌＷＴＨＣＮ１、５０ｎｌＷＴＨＣＮ１＋５０ｎｌｄＨ２Ｏ、及び５０ｎｌＷＴＨＣＮ１＋５０ｎｌＨＣＮ１−ＡＡＡｃＲＮＡ（濃度：１ｎｇ／ｎｌ）を注射した卵母細胞から記録した、代表的電流の追跡。図８と同じ電圧プロトコールを使用した。ＷＴＨＣＮ１とＨＣＮ１−ＡＡＡの共注射が、有意に正常チャンネル活性を抑制した。ＷＴＨＣＮ１末尾電流（図において、四角で囲んである）は、Ｄ）で拡大して示してある。Ｂ）各群の平均電流を拡大して要約した棒グラフ。各群は：Ａ）５０ｎｌＷＴＨＣＮ単独の保持電位に標準化した−３０ｍＶの保持電位から−１４０ｍＶまで、３秒のパルスの最後に測定。＊ｐ＜０．０１。Ｃ）Ａ）からの同じ群の定常状態での電流−電圧関係。Ｄ）−１４０ｍＶにおけるＷＴＨＣＮ１の末尾電流。単一指数関数にこれらの電流を合わせると、活性化に対する時間係数の推定が可能である（図１１Ｄを参照）。
【図９−４】ＨＣＮ１ＡＡＡは、優性ネガティブ様式でＷＴＨＣＮ１の正常活性を抑制する。Ａ）５０ｎｌＷＴＨＣＮ１、５０ｎｌＷＴＨＣＮ１＋５０ｎｌｄＨ２Ｏ、及び５０ｎｌＷＴＨＣＮ１＋５０ｎｌＨＣＮ１−ＡＡＡｃＲＮＡ（濃度：１ｎｇ／ｎｌ）を注射した卵母細胞から記録した、代表的電流の追跡。図８と同じ電圧プロトコールを使用した。ＷＴＨＣＮ１とＨＣＮ１−ＡＡＡの共注射が、有意に正常チャンネル活性を抑制した。ＷＴＨＣＮ１末尾電流（図において、四角で囲んである）は、Ｄ）で拡大して示してある。Ｂ）各群の平均電流を拡大して要約した棒グラフ。各群は：Ａ）５０ｎｌＷＴＨＣＮ単独の保持電位に標準化した−３０ｍＶの保持電位から−１４０ｍＶまで、３秒のパルスの最後に測定。＊ｐ＜０．０１。Ｃ）Ａ）からの同じ群の定常状態での電流−電圧関係。Ｄ）−１４０ｍＶにおけるＷＴＨＣＮ１の末尾電流。単一指数関数にこれらの電流を合わせると、活性化に対する時間係数の推定が可能である（図１１Ｄを参照）。
【図１０】ＷＴＨＣＮ１及び２に対する、ＷＴ：ＡＡＡの比率を変えた、ＨＣＮ１−ＡＡＡの優性ネガティブ効果を示す。 ＨＣＮ１−ＡＡＡによるＷＴＨＣＮ１及びＨＣＮ２の電流抑制を、注射したｃＲＮＡのＷＴ：ＡＡＡ比率に対してプロットした。ＨＣＮ１及びＨＣＮ２の両者の抑制は、ＷＴ：ＡＡＡ比の減少と共に増加した。破線は、指示したように、ＨＣＮ単量体の二量体化、三量体化、四量体化、及び五量体化から統計的に予測される抑制−比関係を示す。データは、また、内因性ＨＣＮチャンネル活性が、本明細書に開示された、ＡＡＡ構築体によって変調することができることを示している。
【図１１−１】ＨＣＮ１−ＡＡＡの優性ネガティブ抑制効果は、ＨＣＮ１チャンネルの通門及び透過性を変えなかったことを示す。 Ａ）ＷＴＨＣＮ１単独、及びＨＣＮ１ＡＡＡによって抑制された後の、定常状態での活性化曲線（比＝１：１）。末尾電流は、図９Ａと同じプロトコールを使用し−１４０ｍＶにパルスした後、直ちに測定し、記録された最大の末尾に対して標準化し、そして予め測定したプレパルス（prepulse）電位に対してプロットした。中点も傾斜係数も二つの群の間に差はなかった。
【図１１−２】Ｂ）−１４０ｍＶへの３秒のプレパルスの後に、１０ｍＶずつの漸増で−１００から＋４０ｍＶまでの段階的膜電位による末尾電流−電圧関係を得るために使用した電気生理プロトコール。１ｎｇ／ｎｌＷＴＨＣＮ１ｃＲＮＡの５０ｎｌを注射した卵母細胞から記録された末尾電流の代表的群（ｆａｍｉｌｙ）のみを示す。これらの電流の単一指数関数とあわせて、不活性化（τｄｅａｃｔ）の時間係数を推定することが可能になる。
【図１１−３】Ｃ）ＷＴＨＣＮ１単独注射又はＷＴＨＣＮ１及びＨＣＮ１−ＡＡＡ（比率＝１：１）を共注射した卵母細胞から測定される、末尾電流−電圧関係。全細胞電流は、ＨＣＮ１−ＡＡＡによって抑制されたが、反転電位は変化しなかった。
【図１１−４】Ｄ）ＷＴＨＣＮ１単独（黒塗り印）又はＷＴＨＣＮ１及びＨＣＮ１−ＡＡＡ（白抜き印）の両者（１：１）の共注射によって誘導された電流のτａｃｔ（四角）及びτｄｅａｃｔ（丸）の要約。ｉの分布は、対応する定常状態活性化曲線から誘導された図と類似して、中点を有するベル型であった。発現された電流の通門動態は、ＨＣＮ１−ＡＡＡ注射によって変わらなかった。
【図１２−１】ＨＣＮ２チャンネルに対するＨＣＮ１−ＡＡＡの効果を示す。（Ａ）５０ｎｌＷＴＨＣＮ２、５０ｎｌＷＴＨＣＮ２＋５０ｎｌｄＨ２Ｏ、及び５０ｎｌＷＴＨＣＮ２＋５０ｎｌＨＣＮ１−ＡＡＡｃＲＮＡを注射した卵母細胞から記録した、代表的電流の追跡。ＨＣＮ１−ＡＡＡは、また、ＷＴＨＣＮ２の活性を抑制した。（Ｂ）投与されたｃＲＮＡのＷＴＨＣＮ２：ＨＣＮ１−ＡＡＡ比に対してプロットされたＨＣＮ１−ＡＡＡによるＷＴＨＣＮ２の−１４０ｍＶにおける電流抑制。（Ｃ）Ａ）からの同じ群の定常状態での電流−電圧関係。単独で発現したＷＴＨＣＮ２及びＨＣＮ１−ＡＡＡとの共発現（比＝１：１）の、定常状態活性化（Ｄ）、反転電位（Ｅ）、及び活性化及び不活性化動態（Ｆ）は同じであった（ｐ＞０．０５）。
【図１２−２】ＨＣＮ２チャンネルに対するＨＣＮ１−ＡＡＡの効果を示す。（Ａ）５０ｎｌＷＴＨＣＮ２、５０ｎｌＷＴＨＣＮ２＋５０ｎｌｄＨ２Ｏ、及び５０ｎｌＷＴＨＣＮ２＋５０ｎｌＨＣＮ１−ＡＡＡｃＲＮＡを注射した卵母細胞から記録した、代表的電流の追跡。ＨＣＮ１−ＡＡＡは、また、ＷＴＨＣＮ２の活性を抑制した。（Ｂ）投与されたｃＲＮＡのＷＴＨＣＮ２：ＨＣＮ１−ＡＡＡ比に対してプロットされたＨＣＮ１−ＡＡＡによるＷＴＨＣＮ２の−１４０ｍＶにおける電流抑制。（Ｃ）Ａ）からの同じ群の定常状態での電流−電圧関係。単独で発現したＷＴＨＣＮ２及びＨＣＮ１−ＡＡＡとの共発現（比＝１：１）の、定常状態活性化（Ｄ）、反転電位（Ｅ）、及び活性化及び不活性化動態（Ｆ）は同じであった（ｐ＞０．０５）。
【図１２−３】ＨＣＮ２チャンネルに対するＨＣＮ１−ＡＡＡの効果を示す。（Ａ）５０ｎｌＷＴＨＣＮ２、５０ｎｌＷＴＨＣＮ２＋５０ｎｌｄＨ２Ｏ、及び５０ｎｌＷＴＨＣＮ２＋５０ｎｌＨＣＮ１−ＡＡＡｃＲＮＡを注射した卵母細胞から記録した、代表的電流の追跡。ＨＣＮ１−ＡＡＡは、また、ＷＴＨＣＮ２の活性を抑制した。（Ｂ）投与されたｃＲＮＡのＷＴＨＣＮ２：ＨＣＮ１−ＡＡＡ比に対してプロットされたＨＣＮ１−ＡＡＡによるＷＴＨＣＮ２の−１４０ｍＶにおける電流抑制。（Ｃ）Ａ）からの同じ群の定常状態での電流−電圧関係。単独で発現したＷＴＨＣＮ２及びＨＣＮ１−ＡＡＡとの共発現（比＝１：１）の、定常状態活性化（Ｄ）、反転電位（Ｅ）、及び活性化及び不活性化動態（Ｆ）は同じであった（ｐ＞０．０５）。
【図１２−４】ＨＣＮ２チャンネルに対するＨＣＮ１−ＡＡＡの効果を示す。（Ａ）５０ｎｌＷＴＨＣＮ２、５０ｎｌＷＴＨＣＮ２＋５０ｎｌｄＨ２Ｏ、及び５０ｎｌＷＴＨＣＮ２＋５０ｎｌＨＣＮ１−ＡＡＡｃＲＮＡを注射した卵母細胞から記録した、代表的電流の追跡。ＨＣＮ１−ＡＡＡは、また、ＷＴＨＣＮ２の活性を抑制した。（Ｂ）投与されたｃＲＮＡのＷＴＨＣＮ２：ＨＣＮ１−ＡＡＡ比に対してプロットされたＨＣＮ１−ＡＡＡによるＷＴＨＣＮ２の−１４０ｍＶにおける電流抑制。（Ｃ）Ａ）からの同じ群の定常状態での電流−電圧関係。単独で発現したＷＴＨＣＮ２及びＨＣＮ１−ＡＡＡとの共発現（比＝１：１）の、定常状態活性化（Ｄ）、反転電位（Ｅ）、及び活性化及び不活性化動態（Ｆ）は同じであった（ｐ＞０．０５）。
【図１２−５】ＨＣＮ２チャンネルに対するＨＣＮ１−ＡＡＡの効果を示す。（Ａ）５０ｎｌＷＴＨＣＮ２、５０ｎｌＷＴＨＣＮ２＋５０ｎｌｄＨ２Ｏ、及び５０ｎｌＷＴＨＣＮ２＋５０ｎｌＨＣＮ１−ＡＡＡｃＲＮＡを注射した卵母細胞から記録した、代表的電流の追跡。ＨＣＮ１−ＡＡＡは、また、ＷＴＨＣＮ２の活性を抑制した。（Ｂ）投与されたｃＲＮＡのＷＴＨＣＮ２：ＨＣＮ１−ＡＡＡ比に対してプロットされたＨＣＮ１−ＡＡＡによるＷＴＨＣＮ２の−１４０ｍＶにおける電流抑制。（Ｃ）Ａ）からの同じ群の定常状態での電流−電圧関係。単独で発現したＷＴＨＣＮ２及びＨＣＮ１−ＡＡＡとの共発現（比＝１：１）の、定常状態活性化（Ｄ）、反転電位（Ｅ）、及び活性化及び不活性化動態（Ｆ）は同じであった（ｐ＞０．０５）。
【図１３−１】ＨＣＮ１活性化通門に対するＥ２３５突然変異体の効果を示す。Ａ）図８における電圧プロトコールを使用して引き出した、Ｅ２３５Ａ及びＥ２３５ＲＨＣＮ１チャンネルを通る電流の代表的記録。Ｂ）ＷＴ及びＥ２３５Ａの定常状態活性化曲線。Ｅ２３５Ａの活性化曲線は、プラス側に移動する。Ｃ）ＷＴ及びＥ２３５Ｒの定常状態活性化曲線。Ｅ２３５Ｒの活性化曲線は、Ｅ２３５Ａよりもよりプラス側に移動する、このことは＋１に比較して＋２の実効電荷変化のより大きな効果を示す。Ｄ）ＷＴ、Ｓ２５３Ａ、Ｓ２５３Ｋ及びＳ２５３Ｅチャンネルの定常状態活性化曲線。保存的なＳ−ｔｏ−Ａ突然変異体は、活性の移動を示すが、保持された傾斜係数及びＰ０，ｍｉｎを有する。これらの置換の反対の荷電にも拘わらず、Ｓ２５３Ｋ及びＳ２５３Ｅについての活性化曲線は、よりマイナス側に移動する。これらを総合すると、このことは、ＨＣＮチャンネル活性の活性閾値（図１３）が、内因性発現電流幅と同じく変調できることを示している（図８−１２）。
【図１３−２】ＨＣＮ１活性化通門に対するＥ２３５突然変異体の効果を示す。Ａ）図８における電圧プロトコールを使用して引き出した、Ｅ２３５Ａ及びＥ２３５ＲＨＣＮ１チャンネルを通る電流の代表的記録。Ｂ）ＷＴ及びＥ２３５Ａの定常状態活性化曲線。Ｅ２３５Ａの活性化曲線は、プラス側に移動する。Ｃ）ＷＴ及びＥ２３５Ｒの定常状態活性化曲線。Ｅ２３５Ｒの活性化曲線は、Ｅ２３５Ａよりもよりプラス側に移動する、このことは＋１に比較して＋２の実効電荷変化のより大きな効果を示す。Ｄ）ＷＴ、Ｓ２５３Ａ、Ｓ２５３Ｋ及びＳ２５３Ｅチャンネルの定常状態活性化曲線。保存的なＳ−ｔｏ−Ａ突然変異体は、活性の移動を示すが、保持された傾斜係数及びＰ０，ｍｉｎを有する。これらの置換の反対の荷電にも拘わらず、Ｓ２５３Ｋ及びＳ２５３Ｅについての活性化曲線は、よりマイナス側に移動する。これらを総合すると、このことは、ＨＣＮチャンネル活性の活性閾値（図１３）が、内因性発現電流幅と同じく変調できることを示している（図８−１２）。
【図１３−３】ＨＣＮ１活性化通門に対するＥ２３５突然変異体の効果を示す。Ａ）図８における電圧プロトコールを使用して引き出した、Ｅ２３５Ａ及びＥ２３５ＲＨＣＮ１チャンネルを通る電流の代表的記録。Ｂ）ＷＴ及びＥ２３５Ａの定常状態活性化曲線。Ｅ２３５Ａの活性化曲線は、プラス側に移動する。Ｃ）ＷＴ及びＥ２３５Ｒの定常状態活性化曲線。Ｅ２３５Ｒの活性化曲線は、Ｅ２３５Ａよりもよりプラス側に移動する、このことは＋１に比較して＋２の実効電荷変化のより大きな効果を示す。Ｄ）ＷＴ、Ｓ２５３Ａ、Ｓ２５３Ｋ及びＳ２５３Ｅチャンネルの定常状態活性化曲線。保存的なＳ−ｔｏ−Ａ突然変異体は、活性の移動を示すが、保持された傾斜係数及びＰ０，ｍｉｎを有する。これらの置換の反対の荷電にも拘わらず、Ｓ２５３Ｋ及びＳ２５３Ｅについての活性化曲線は、よりマイナス側に移動する。これらを総合すると、このことは、ＨＣＮチャンネル活性の活性閾値（図１３）が、内因性発現電流幅と同じく変調できることを示している（図８−１２）。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
心臓収縮機能又は心臓電気活動を調節させる方法であって、ポリヌクレオチド又は変性細胞を静止状態の心筋細胞に投与し、それによって投与後の心筋細胞が自発的な反復電気信号を発生する、ことを含んでなる該方法。
【請求項２】
投与後のポリヌクレオチドの発現が、細胞の電気信号出力の頻度において少なくとも約１０パーセントの変化を提供する、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
ポリヌクレオチドが優性ネガティブ構築体である、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
形質導入した心筋細胞が自発的、律動的な電気活動を生み出す、請求項１〜３の何れか一つに記載の方法。
【請求項５】
投与後のポリヌクレオチドの発現が、誘導し得るプロモーターによって駆動される、請求項１〜４の何れか一つに記載の方法。
【請求項６】
静止状態の心筋細胞が同定され、選択され、その後にポリヌクレオチドが投与される、請求項１〜５の何れか一つに記載の方法。
【請求項７】
心臓収縮機能を調節する方法であって、ポリヌクレオチド又は変性細胞を、不適切な頻度で電気信号を発生している心筋細胞に投与し、それによって、投与後の該心筋細胞が、投与前の細胞の電気信号頻度とは異なる、所望の増加又は減少した頻度で電気信号を発生する、ことを含んでなる該方法。
【請求項８】
投与後のポリヌクレオチドの発現が、細胞の電気信号出力の頻度において少なくとも約１０パーセントの変化を提供するものである、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
ポリヌクレオチドが優性ネガティブ構築体である、請求項７又は８に記載の方法。
【請求項１０】
投与後のポリヌクレオチドの発現が、誘導し得るプロモーターによって駆動される、請求項７〜９の何れか一つに記載の方法。
【請求項１１】
変性細胞が幹細胞である、請求項１〜１０の何れか一つに記載の方法。
【請求項１２】
細胞が体細胞である、請求項１〜１０の何れか一つに記載の方法。
【請求項１３】
心筋細胞が同定され、電気信号の活動又は頻度に基づいて選択され、その後にポリヌクレオチドが投与される、請求項１〜１２の何れか一つに記載の方法。
【請求項１４】
望ましくない心臓収縮又は心臓電気活動に罹患した、又は、罹り易い哺乳類を治療する方法であって、ポリヌクレオチド又は変性細胞を含む組成物の有効量を哺乳類に投与し、投与によって哺乳類の心臓収縮活動又は心臓電気活動が調節される、ことを含んでなる該方法。
【請求項１５】
組成物が、哺乳類の心臓細胞の電気信号出力の頻度において少なくとも約１０パーセントの変化を提供するものである、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
組成物が、哺乳類のＨＣＮチャンネルを変調させることができるものである、請求項１４又は１５に記載の方法。
【請求項１７】
投与される組成物がポリヌクレオチドを含んでなるものである、請求項１４〜１６の何れか一つに記載の方法。
【請求項１８】
投与される組成物が優性ネガティブ構築体を含んでなるものである、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
投与後のポリペプチドの発現が、誘導し得るプロモーターによって駆動される、請求項１７〜１９の何れか一つに記載の方法。
【請求項２０】
組成物が変性細胞を含んでなるものである、請求項１４〜１６の何れか一つに記載の方法。
【請求項２１】
哺乳類が埋め込みペースメーカーを有し、組成物の投与が、埋め込みペースメーカーと共同して心臓収縮回数を変調させる、請求項１４〜２０の何れか一つに記載の方法。
【請求項２２】
望ましくない心臓収縮に罹患した哺乳類が同定され、選択され、そして組成物が投与される、請求項１４〜２１の何れか一つに記載の方法。
【請求項２３】
心臓に関連する立ちくらみ、異常な洞結節機能、房室ブロック又は徐脈頻脈症候群に罹患した、又は、罹り易い哺乳類を治療する方法であって、ポリヌクレオチド又は変性細胞を含む組成物の有効量を哺乳類に投与し、投与によって哺乳類の心臓収縮活動が調節される、ことを含む該方法。
【請求項２４】
組成物の投与が、哺乳類の心臓細胞の電気信号出力の頻度において少なくとも約１０パーセントの変化を提供する、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
組成物が、哺乳類のＨＣＮチャンネルを変調させることができるものである、請求項２３又は２４に記載の方法。
【請求項２６】
投与される組成物がポリヌクレオチドを含んでなるものである、請求項２３〜２５の何れか一つに記載の方法。
【請求項２７】
投与される組成物が優性ネガティブ構築体を含んでなるものである、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
投与後のポリペプチドの発現が、誘導し得るプロモーターによって駆動される、請求項２５〜２７の何れか一つに記載の方法。
【請求項２９】
哺乳類が埋め込みペースメーカーを有し、組成物の投与が、埋め込みペースメーカーと共同して心臓収縮回数を変調させる、請求項２３〜２８の何れか一つに記載の方法。
【請求項３０】
障害に罹患した哺乳類が同定され、選択され、そして組成物が投与される、請求項２３〜２９の何れか一つに記載の方法。
【請求項３１】
Ｋチャンネルサブユニット、Ｎａチャンネルサブユニット、Ｃａチャンネルサブユニット、抑制性Ｇタンパク質サブユニット、コネキシン、又はこれらの機能性フラグメントをコードするポリヌクレオチドが哺乳類にさらに投与される、請求項２３〜３０の何れか一つに記載の方法。
【請求項３２】
Ｃａチャンネルサブユニットが、Ｌ型Ｃａチャンネルからのβ１又はα２−δサブユニットである、請求項３１に記載の方法。
【請求項３３】
Ｎａチャンネルサブユニットがβ１又はβ２である、請求項３１に記載の方法。
【請求項３４】
抑制性Ｇタンパク質サブユニットがＧαｉ２又はその機能性フラグメントである、請求項３１に記載の方法。
【請求項３５】
投与ステップが組成物を心筋に注射することを含む、請求項１〜３４の何れか一つに記載の方法。
【請求項３６】
投与ステップが組成物を心臓血管系に潅流することを含む、請求項１〜３５の何れか一つに記載の方法。
【請求項３７】
哺乳類がヒトである、請求項１〜３６の何れか一つに記載の方法。
【請求項３８】
望ましくない心臓収縮又は心臓電気活動に罹患した、又は、罹り易い哺乳類を治療する方法であって、ポリヌクレオチド又は変性細胞を含む組成物の有効量を哺乳類に投与し、該哺乳類が埋め込み型電子ペースメーカーを装着していて、該投与が電子ペースメーカーによって提供される心臓収縮活動又は心臓電気活動を改変する、ことを含む方法。
【請求項３９】
組成物が、埋め込まれたペースメーカーとは異なる部位の心臓組織に投与される、請求項３８に記載の方法。
【請求項４０】
優性ネガティブ構築体であるポリヌクレオチドが投与される、請求項３８又は３９に記載の方法。
【請求項１】
心臓収縮機能又は心臓電気活動を調節させる方法であって、ポリヌクレオチド又は変性細胞を静止状態の心筋細胞に投与し、それによって投与後の心筋細胞が自発的な反復電気信号を発生する、ことを含んでなる該方法。
【請求項２】
投与後のポリヌクレオチドの発現が、細胞の電気信号出力の頻度において少なくとも約１０パーセントの変化を提供する、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
ポリヌクレオチドが優性ネガティブ構築体である、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
形質導入した心筋細胞が自発的、律動的な電気活動を生み出す、請求項１〜３の何れか一つに記載の方法。
【請求項５】
投与後のポリヌクレオチドの発現が、誘導し得るプロモーターによって駆動される、請求項１〜４の何れか一つに記載の方法。
【請求項６】
静止状態の心筋細胞が同定され、選択され、その後にポリヌクレオチドが投与される、請求項１〜５の何れか一つに記載の方法。
【請求項７】
心臓収縮機能を調節する方法であって、ポリヌクレオチド又は変性細胞を、不適切な頻度で電気信号を発生している心筋細胞に投与し、それによって、投与後の該心筋細胞が、投与前の細胞の電気信号頻度とは異なる、所望の増加又は減少した頻度で電気信号を発生する、ことを含んでなる該方法。
【請求項８】
投与後のポリヌクレオチドの発現が、細胞の電気信号出力の頻度において少なくとも約１０パーセントの変化を提供するものである、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
ポリヌクレオチドが優性ネガティブ構築体である、請求項７又は８に記載の方法。
【請求項１０】
投与後のポリヌクレオチドの発現が、誘導し得るプロモーターによって駆動される、請求項７〜９の何れか一つに記載の方法。
【請求項１１】
変性細胞が幹細胞である、請求項１〜１０の何れか一つに記載の方法。
【請求項１２】
細胞が体細胞である、請求項１〜１０の何れか一つに記載の方法。
【請求項１３】
心筋細胞が同定され、電気信号の活動又は頻度に基づいて選択され、その後にポリヌクレオチドが投与される、請求項１〜１２の何れか一つに記載の方法。
【請求項１４】
望ましくない心臓収縮又は心臓電気活動に罹患した、又は、罹り易い哺乳類を治療する方法であって、ポリヌクレオチド又は変性細胞を含む組成物の有効量を哺乳類に投与し、投与によって哺乳類の心臓収縮活動又は心臓電気活動が調節される、ことを含んでなる該方法。
【請求項１５】
組成物が、哺乳類の心臓細胞の電気信号出力の頻度において少なくとも約１０パーセントの変化を提供するものである、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
組成物が、哺乳類のＨＣＮチャンネルを変調させることができるものである、請求項１４又は１５に記載の方法。
【請求項１７】
投与される組成物がポリヌクレオチドを含んでなるものである、請求項１４〜１６の何れか一つに記載の方法。
【請求項１８】
投与される組成物が優性ネガティブ構築体を含んでなるものである、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
投与後のポリペプチドの発現が、誘導し得るプロモーターによって駆動される、請求項１７〜１９の何れか一つに記載の方法。
【請求項２０】
組成物が変性細胞を含んでなるものである、請求項１４〜１６の何れか一つに記載の方法。
【請求項２１】
哺乳類が埋め込みペースメーカーを有し、組成物の投与が、埋め込みペースメーカーと共同して心臓収縮回数を変調させる、請求項１４〜２０の何れか一つに記載の方法。
【請求項２２】
望ましくない心臓収縮に罹患した哺乳類が同定され、選択され、そして組成物が投与される、請求項１４〜２１の何れか一つに記載の方法。
【請求項２３】
心臓に関連する立ちくらみ、異常な洞結節機能、房室ブロック又は徐脈頻脈症候群に罹患した、又は、罹り易い哺乳類を治療する方法であって、ポリヌクレオチド又は変性細胞を含む組成物の有効量を哺乳類に投与し、投与によって哺乳類の心臓収縮活動が調節される、ことを含む該方法。
【請求項２４】
組成物の投与が、哺乳類の心臓細胞の電気信号出力の頻度において少なくとも約１０パーセントの変化を提供する、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
組成物が、哺乳類のＨＣＮチャンネルを変調させることができるものである、請求項２３又は２４に記載の方法。
【請求項２６】
投与される組成物がポリヌクレオチドを含んでなるものである、請求項２３〜２５の何れか一つに記載の方法。
【請求項２７】
投与される組成物が優性ネガティブ構築体を含んでなるものである、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
投与後のポリペプチドの発現が、誘導し得るプロモーターによって駆動される、請求項２５〜２７の何れか一つに記載の方法。
【請求項２９】
哺乳類が埋め込みペースメーカーを有し、組成物の投与が、埋め込みペースメーカーと共同して心臓収縮回数を変調させる、請求項２３〜２８の何れか一つに記載の方法。
【請求項３０】
障害に罹患した哺乳類が同定され、選択され、そして組成物が投与される、請求項２３〜２９の何れか一つに記載の方法。
【請求項３１】
Ｋチャンネルサブユニット、Ｎａチャンネルサブユニット、Ｃａチャンネルサブユニット、抑制性Ｇタンパク質サブユニット、コネキシン、又はこれらの機能性フラグメントをコードするポリヌクレオチドが哺乳類にさらに投与される、請求項２３〜３０の何れか一つに記載の方法。
【請求項３２】
Ｃａチャンネルサブユニットが、Ｌ型Ｃａチャンネルからのβ１又はα２−δサブユニットである、請求項３１に記載の方法。
【請求項３３】
Ｎａチャンネルサブユニットがβ１又はβ２である、請求項３１に記載の方法。
【請求項３４】
抑制性Ｇタンパク質サブユニットがＧαｉ２又はその機能性フラグメントである、請求項３１に記載の方法。
【請求項３５】
投与ステップが組成物を心筋に注射することを含む、請求項１〜３４の何れか一つに記載の方法。
【請求項３６】
投与ステップが組成物を心臓血管系に潅流することを含む、請求項１〜３５の何れか一つに記載の方法。
【請求項３７】
哺乳類がヒトである、請求項１〜３６の何れか一つに記載の方法。
【請求項３８】
望ましくない心臓収縮又は心臓電気活動に罹患した、又は、罹り易い哺乳類を治療する方法であって、ポリヌクレオチド又は変性細胞を含む組成物の有効量を哺乳類に投与し、該哺乳類が埋め込み型電子ペースメーカーを装着していて、該投与が電子ペースメーカーによって提供される心臓収縮活動又は心臓電気活動を改変する、ことを含む方法。
【請求項３９】
組成物が、埋め込まれたペースメーカーとは異なる部位の心臓組織に投与される、請求項３８に記載の方法。
【請求項４０】
優性ネガティブ構築体であるポリヌクレオチドが投与される、請求項３８又は３９に記載の方法。
【図１】
【図２−１】
【図２−２】
【図３−１】
【図３−２】
【図３−３】
【図３−４】
【図４−１】
【図４−２】
【図４−３】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８−１】
【図８−２】
【図９−１】
【図９−２】
【図９−３】
【図９−４】
【図１０】
【図１１−１】
【図１１−２】
【図１１−３】
【図１１−４】
【図１２−１】
【図１２−２】
【図１２−３】
【図１２−４】
【図１２−５】
【図１３−１】
【図１３−２】
【図１３−３】
【図２−１】
【図２−２】
【図３−１】
【図３−２】
【図３−３】
【図３−４】
【図４−１】
【図４−２】
【図４−３】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８−１】
【図８−２】
【図９−１】
【図９−２】
【図９−３】
【図９−４】
【図１０】
【図１１−１】
【図１１−２】
【図１１−３】
【図１１−４】
【図１２−１】
【図１２−２】
【図１２−３】
【図１２−４】
【図１２−５】
【図１３−１】
【図１３−２】
【図１３−３】
【公開番号】特開２００９−１４８５７２（Ｐ２００９−１４８５７２Ａ）
【公開日】平成２１年７月９日（２００９．７．９）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００８−３２８１１４（Ｐ２００８−３２８１１４）
【出願日】平成２０年１２月２４日（２００８．１２．２４）
【分割の表示】特願２００２−５８４７７７（Ｐ２００２−５８４７７７）の分割
【原出願日】平成１４年４月２９日（２００２．４．２９）
【出願人】（５０３０７９３８７）ジョンズ・ホプキンス・ユニバーシティ (1)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２１年７月９日（２００９．７．９）
【国際特許分類】
【出願日】平成２０年１２月２４日（２００８．１２．２４）
【分割の表示】特願２００２−５８４７７７（Ｐ２００２−５８４７７７）の分割
【原出願日】平成１４年４月２９日（２００２．４．２９）
【出願人】（５０３０７９３８７）ジョンズ・ホプキンス・ユニバーシティ (1)
【Ｆターム（参考）】
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