生菌剤
【課題】実際に動物に投与した場合にも、望ましい腸管感染症予防効果等が得られる細菌を提供すること。
【解決手段】本発明の生菌剤は、ラクトバチルス・ロイテリ（Lactobacillus reuteri）及びラクトバチルス・クリスパータス（Lactobacillus crispatus）の生菌体を有効成分として含む。あるいは、本発明の生菌剤は、ラクトバチルス・ロイテリCE5株及びラクトバチルス・クリスパータスJCM5810株の少なくともいずれか一方の生菌体を有効成分として含む。
【解決手段】本発明の生菌剤は、ラクトバチルス・ロイテリ（Lactobacillus reuteri）及びラクトバチルス・クリスパータス（Lactobacillus crispatus）の生菌体を有効成分として含む。あるいは、本発明の生菌剤は、ラクトバチルス・ロイテリCE5株及びラクトバチルス・クリスパータスJCM5810株の少なくともいずれか一方の生菌体を有効成分として含む。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、増体重の促進や腸管感染症の防止等に有用な生菌剤及び該生菌剤に利用可能な細菌のスクリーニング方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
腸管感染症では病原菌の上皮細胞への付着が発症の第一段階として重要である。付着は細菌側の付着因子（アドへシン）が上皮細胞側のレセプターに結合することにより起こる。従って、その付着を阻止することができれば、病原菌の腸内への定着を防いで感染症を予防することができると考えられる。このような考えに基づき、現在までに、腸管の上皮細胞側のレセプターに対し病原菌と拮抗的に結合する乳酸菌等の細菌を利用して家畜の腸管感染症を予防しようとする種々の試みがなされており、特定の乳酸菌株の生菌体を含む感染防御剤等の生菌剤が報告されている（特許文献１等）。
【０００３】
生菌剤として利用する菌株は、通常、動物の腸内常在菌からのスクリーニングにより取得する。多くの場合、動物腸内からの分離菌の付着性は、培養細胞株を用いて検討されている。そのため、実際に動物に投与しても、動物腸内への定着性が十分ではなく、満足いく効果が得られない場合も多い。従って、より効果の高い菌株を取得することが常に望まれている。
【０００４】
【特許文献１】特許第３００４８９０号公報
【特許文献２】特開２００４−３５７５２８号公報
【特許文献３】特表２００６−５０１３１１号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
従って、本発明の目的は、実際に動物に対して用いた場合にも望ましい感染予防効果等が得られる細菌を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本願発明者らは、腸内常在菌の中から病原菌の付着を阻害する乳酸菌株を腸上皮下組織モデル等を用いてスクリーニングする手法の開発を進めているが、サルモネラを用いた腸管付着阻害試験においては腸上皮下組織モデルとしてそ嚢組織が特に適していることを見出した。そして、そ嚢組織を用いたスクリーニングにより、サルモネラの付着阻害効果が高い乳酸菌株を見出し、これらの乳酸菌株が動物に適用された場合にも望ましく感染防止効果等を発揮できることを見出すことにより、本願発明を完成した。
【０００７】
すなわち、本発明は、Lactobacillus reuteri（ラクトバチルス・ロイテリ）及びLactobacillus crispatus（ラクトバチルス・クリスパータス）の生菌体を有効成分として含む生菌剤を提供する。また、本発明は、ラクトバチルス・ロイテリCE5株（受領番号FERM AP-21524）及びラクトバチルス・クリスパータスJCM5810株（受領番号FERM AP-21523）の少なくともいずれか一方の生菌体を有効成分として含む生菌剤を提供する。さらに、本発明は、鶏の腸内から分離された分離菌を鶏そ嚢切片と接触させて、該分離菌の中から、そ嚢切片への付着性を有する分離菌を選択し、次いで、選択された分離菌をサルモネラと同時にそ嚢切片に接触させて、該分離菌の中から、サルモネラのそ嚢切片への付着を阻害する作用を有する分離菌を選択することを含む、鶏のサルモネラ感染症の防止作用を有する細菌のスクリーニング方法を提供する。さらに、本発明は、上記本発明の方法でスクリーニングされた細菌を提供する。さらに、本発明は、上記本発明の細菌の生菌体を有効成分として含む生菌剤を提供する。
【発明の効果】
【０００８】
本発明により、腸管感染の防止等に有用な、新規な乳酸菌の組み合わせ及び新規乳酸菌株を含む生菌剤が提供された。本発明の生菌剤は、鶏においてサルモネラ感染を予防し、さらに、ひなの増体重を促進する効果を望ましく発揮できる。また、本発明のスクリーニング方法によれば、実際に動物に投与した際にも望ましく感染症を防止できる菌株を分離することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００９】
本発明の生菌剤は、ラクトバチルス・ロイテリ及びラクトバチルス・クリスパータスの生菌体を有効成分として含む。有効成分として用いられるロイテリ及びクリスパータスは、鶏腸管上皮へ付着し、サルモネラ等の病原菌の腸内への定着を阻害する能力を有するものである。病原菌の定着阻害能は、例えば、下記実施例に詳述されるように、そ嚢などの腸管組織に対し、乳酸菌と病原菌とを同時に接触させ、腸管組織に病原菌がどの程度付着するかを調べることで評価できる。
【００１０】
ロイテリとしては、下記実施例で鶏盲腸内容物から分離されたCE5株が好ましい。クリスパータスとしては、鶏糞便から分離されたJCM5810株が好ましい。これらの菌株は、独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターに寄託されており、CE5株の受領番号はFERM AP-21524、JCM5810株はFERM AP-21523である。これらの菌株は、公知の乳酸菌と同様に、例えばMRSブロス中で37℃、20時間程度の嫌気培養をすることにより、容易に増殖させることができる。
【００１１】
本発明の生菌剤は家禽用であり、好ましくは鶏用である。下記実施例に示される通り、鶏ひなに本発明の生菌剤を投与すると、サルモネラ等の病原菌の腸内への定着を阻害することができる。従って、本発明の生菌剤は、サルモネラ感染症等の腸管感染症の防止剤として用いることができる。また、本発明の生菌剤は、下記実施例に示される通り、鶏ひなの増体重を促進する効果も有するので、増体重促進剤として用いることもできる。なお、「感染症の防止」には、感染症の予防と治療の両者が包含される。
【００１２】
なお、上記したCE5株及びJCM5810株は、それぞれを単独で用いても、鶏ひな腸内へのサルモネラの定着を阻害でき、また、鶏ひなの増体重を促進することができる。従って、これらの菌株は、単独でも本発明の生菌剤の調製に有用である。すなわち、本発明の生菌剤は、CE5株及びJCM5810株のいずれか一方のみを含むものであってよい。
【００１３】
本発明の生菌剤は、上記乳酸菌のみから成るものであってもよいし、所望により、上記乳酸菌の活性を保持するため等に有用な他の成分を含んでいてもよい。そのような生菌剤は、この分野で周知の常法により容易に調製することができ、いかなる形態であってもよい。生菌剤に含まれる生菌体は、培養物から回収した菌体の状態でもよいし、また、凍結乾燥菌体であってもよい。本発明の生菌剤は、そのまま鶏等の家禽に投与することができ、また、飼料に添加して用いることもできる。使用量は、例えば、鶏ひなに対しては１羽当たり105〜107 CFU程度で用いると、サルモネラ感染の予防及び増体重効果が得られる。
【００１４】
ラクトバチルス・ロイテリCE5株は、下記実施例に記載されるスクリーニング方法により、鶏盲腸内容物から分離された菌株である。本発明は、該CE5株乳酸菌の分離に採用された、鶏のサルモネラ感染症の防止作用を有する細菌をスクリーニングする方法をも提供する。
【００１５】
該スクリーニング方法は、鶏の腸内から分離された分離菌を鶏そ嚢切片と接触させて、該分離菌の中から、そ嚢切片への付着性を有する分離菌を選択し、次いで、選択された分離菌をサルモネラと同時にそ嚢切片に接触させて、該分離菌の中から、サルモネラのそ嚢切片への付着を阻害する作用を有する分離菌を選択することを含む。
【００１６】
腸内から分離された分離菌は、公知の分離菌であってもよいし、別途鶏から分離して得てもよい。腸内に存在する細菌の分離は、例えば、鶏の盲腸内容物や糞便等を常法により段階希釈して培養することにより行なうことができる。分離した細菌の中から、必要に応じ、所望の種の細菌を選択してもよい。例えば、乳酸菌の分離株を取得したい場合であれば、グラム陽性、非運動性、カタラーゼ活性陰性の桿菌を選択すればよい。その他の種の細菌を選択する際に指標とすべき性状は、この分野で公知であり、当業者であれば容易に所望の種の細菌を分離することができる。
【００１７】
次いで、腸内から分離した細菌をそ嚢組織切片の管腔側と接触させた後に洗浄し、切片に付着しなかった細菌を除去する。これにより、そ嚢への付着性を有する細菌を選択することができる。そ嚢切片は、生のそ嚢から切り出したものをそのまま用いることができる。スライドグラス等に管腔側を上にして貼り付けて用いると、細菌との接触操作や洗浄操作を容易に行なうことができる。細菌は、109 CFU/mL程度の濃度の懸濁液にして用いることができるが、特に限定されない。そ嚢切片に付着した分離菌は、例えば、界面活性剤を含む緩衝液でそ嚢切片を洗浄することにより回収することができる。
【００１８】
上記の通りに選択された、そ嚢への付着性を有する分離菌を、次いで、サルモネラと同時にそ嚢切片に接触させる。分離菌の濃度は、特に限定されないが、サルモネラと同程度の濃度のみならず、102倍〜105倍程度の濃度も検討することが好ましい。分離菌及びサルモネラと接触させたそ嚢切片を、適当な緩衝液で洗浄して余分な細菌を除去した後、界面活性剤を含む緩衝液で洗浄することにより、そ嚢切片に付着した分離菌及びサルモネラを回収することができる。回収した細菌の数（すなわち、そ嚢切片に付着した分離菌及びサルモネラの菌数）は、常法の段階希釈法等により容易に測定することができる。分離したい菌とサルモネラは、界面活性剤を含む洗い液中に混合して存在するが、例えば分離したい菌が乳酸菌である場合、洗い液をMRS寒天培地等の培地上で嫌気培養すれば乳酸菌を計数でき、洗い液をBHI寒天培地等の培地上で好気培養すればサルモネラを計数できる。サルモネラ単独でそ嚢切片に接触させたときのサルモネラ付着数と比較して、分離菌と共にそ嚢切片に接触させたときのサルモネラ付着数が有意に減少している場合、該分離菌はサルモネラ付着阻害作用を有すると判断することができる。
【００１９】
本発明のスクリーニング方法で選択される細菌は、特に限定されないが、好ましくは乳酸菌である。該方法でスクリーニングされた分離菌は、鶏のサルモネラ感染症を予防する作用があると考えられる。また、このようなスクリーニング方法で分離された乳酸菌であるラクトバチルス・ロイテリCE5株は、鶏ひなの増体重を促進する効果もあるため、本発明のスクリーニング方法で分離された細菌、好ましくは乳酸菌は、鶏の増体重促進作用も有すると考えられる。従って、本発明の方法でスクリーニングされた分離菌を有効成分として含む生菌剤は、鶏のサルモネラ感染症の予防や増体重の促進に有用である。
【実施例】
【００２０】
以下、本発明を実施例に基づきより具体的に説明する。
【００２１】
実施例１ 乳酸菌分離株の腸管付着性およびサルモネラ付着阻害能評価
［材料及び方法］
(1) 鶏からの乳酸菌株の分離
SPF鶏の盲腸内容物を採取し、これにリン酸緩衝食塩水（PBS）を加えて階段希釈した液を変法LBS寒天培地に塗抹した。37℃で48時間嫌気培養（三菱ガス化学、アネロパックケンキ）後、生じたコロニーをMRS寒天培地（Merck）上に画線塗抹し、37℃で48時間嫌気培養した。分離後の菌はグリセロールストックとして−80℃で保存した。
【００２２】
(2) 乳酸菌の同定
分離株の中でグラム陽性、非運動性、カタラーゼ活性陰性の桿菌であるものを、Lactobacillus sp.と同定した。Lactobacillus sp.と同定された株について、ガス産生の有無、15℃での発育の有無および糖の発酵性（リボース、ガラクトース、セロビオース、ラクトース、トレハロース、メリビオース、ラフィノース、マンニトール、ソルビトール）を試験し、Bergey's Manual of Systematic Bacteriology Vol. 2 (1986)に記載されている各乳酸菌種の性状と比較して菌種（属）を同定した。同定試験の参考株としてL. reuteri JCM 1112Tを用いた。
【００２３】
(3) 鶏ひな腸管切片の調製
初生ひなに1日間、抗生物質（アンフォテリシンB 2.5μg/mL、ストレプトマイシン 100μg/mL、ペニシリン 100U/mL）を添加した水のみを与えた後、ネンブタール0.3mLを腹腔内に注射し安楽死させた。ついでそ嚢および盲腸を摘出し、長軸方向に開いた。これから、直径約5mmの切片を切り出し、直径15mmの円形カバーガラス（松浪ガラス）上に管腔側を上にして瞬間接着剤で固定した。円形カバーガラス1枚当たり、3枚の切片を固定した。切片を固定した円形カバーガラスを24穴マルチプレート（住友ベークライト）に入れ、実験まで-30℃で保存した。本実験は弘前大学動物実験委員会の承認を得て行った。
【００２４】
(4) 付着試験
乳酸菌としてSPF鶏盲腸内容物から分離した10株、成鶏糞便から分離した1株（理研バイオリソースセンターより入手）、および理化学研究所微生物系統保存施設（JCM）から購入した3株の合わせて14株の乳酸菌を用いた。
【００２５】
乳酸菌はMRS寒天培地上37℃で1夜嫌気培養した。サルモネラはJCMから購入したSalmonella Typhimurium JCM 1652およびヒト食中毒由来の分離株EF85-9の２株を用い、ブレインハートインヒュージョン（BHI）寒天培地（日水製薬）上で37℃にて1夜好気培養した。寒天培地上のコロニーをコンラージ棒により集め、菌体をPBSで3回洗浄した。次いで、寒天平板１枚から回収された菌を1mLのPBSに再分散させた。PBSで適宜希釈し、バクテリアカウンターで総菌数を計数した。菌懸濁液をPBSで希釈し１×10９/mLとした菌懸濁液を調製した。
【００２６】
１×10９/mLとした菌懸濁液2mLをそ嚢切片が貼付されたウェルに注加した。マイクロプレートに蓋をしてマイルドミキサー（タイテック）上に置き、室温で1時間ゆるく振盪した。菌懸濁液をピペットで吸引除去後、付着していない菌体を除くためにウェルを2mLのPBSで3回洗浄した。次いで、0.5% Triton X-100水溶液1mLでピペッティングを繰り返し、そ嚢切片に付着した菌体を回収した。この液をPBSで階段希釈した。階段希釈液を用いて、生菌数を測定した。乳酸桿菌の場合はMRS寒天培地上で嫌気培養し、サルモネラの場合はBHI寒天培地上で好気培養した。培養温度は37℃とした。
【００２７】
１×10９/mLとした菌懸濁液中の生菌数についても、MRS寒天培地およびBHI寒天培地を用いて測定した。
【００２８】
被検菌の付着の程度は以下のようにして求めた付着率で表した。なお、「負荷菌数」とは、切片に添加した上記菌懸濁液2mL中に含まれる生菌数である。
付着率（％）＝付着菌数（CFU/well）／負荷菌数（CFU/well）
【００２９】
(5) 付着阻害試験
菌懸濁液は前項と同様にして調製した。但し、総菌数として乳酸桿菌の濃度は2×10９/mLおよび2×1010/mLに、サルモネラの濃度は2×10８/mLに調整した。
【００３０】
乳酸菌懸濁液及びサルモネラ懸濁液各1mLをそ嚢切片が貼付されたウェルに注加した。マイクロプレートに蓋をしてマイルドミキサー上に置き、室温で30分間ゆるく振盪した。付着したサルモネラ菌数を前項と同様にして計数し、付着菌数（CFU/well）として表した。負荷生菌数も前項と同様にして計数し、CFU/wellとして表した。
［結果及び考察］
(1) SPF鶏盲腸内容物から分離した乳酸菌株の同定
糖の発酵パターンから分離菌株10株を表１のように同定した。
【００３１】
【表１−１】
【００３２】
【表１−２】
※ グラム染色
＋：陽性 −：陰性
※ 運動性、カタラーゼ活性、ガス産生、15℃発育、好気性発育
＋：陽性 −：陰性
※ グルコン酸の資化性、糖分解性状
菌の発育度に合わせて−、＋、＋＋及び＋＋＋で示した。
【００３３】
(2) 鶏ひなそ嚢切片への乳酸菌およびサルモネラの付着性
表２に示したように、L. reuteri CE5のみで高い付着率（20.6％）を示した。一方、Lactobacillus salivarius/agilis CE10および菌株保存機関から入手したすべての乳酸菌株(4株)については低い付着率(1.0％以下)であった。これ以外のSPF鶏盲腸内容物分離株は中程度の付着率（5〜10％）を示した。
【００３４】
なおサルモネラの付着率は、試験した２株とも低い付着率(1.0％以下)であった。
【００３５】
【表２】
a付着率（％）＝1ウェル当たりの付着菌数（CFU）／1ウェル当たりの負荷菌数（CFU）
b1ウェル当たりの付着菌数（CFU）で表した。
【００３６】
(3) 鶏ひな盲腸切片への乳酸菌およびサルモネラの付着性
乳酸菌ではそ嚢切片に高い付着率を示したL. reuteri CE5および低い付着率を示したL. crispatus JCM 5810を用いて付着試験を行った。その結果、表3に示したようにL. reuteri CE5の盲腸への付着率は3.0％と中程度であったが、付着菌数はそ嚢と同程度であった。L. crispatus JCM 5810は付着率および付着菌数とも低く、L. reuteri CE5の10分の1程度であった。
【００３７】
なおサルモネラは2株とも付着率は0.1%以下で非常に低く、付着菌数も低かった。このためサルモネラ付着阻害試験のモデルには盲腸切片よりもそ嚢切片が適していると考えられた。
【００３８】
【表３】
a付着率（％）＝1ウェル当たりの付着菌数（CFU）／1ウェル当たりの負荷菌数（CFU）
b1ウェル当たりの付着菌数（CFU）で表した。
【００３９】
(4) 鶏ひなそ嚢切片へのサルモネラの付着に対する乳酸菌の影響
L. reuteri CE5は図１に示したように、サルモネラ菌量の10倍量および100倍量の菌量を添加すると、S. Typhimurium JCM 1652のそ嚢切片への付着をそれぞれ、15％および82％阻害した。S. Typhimurium EF85-9に対しては、10倍量の菌量でも、80％付着を阻害した。このためそ嚢切片への付着性が高い乳酸菌株であるL. reuteri CE5はサルモネラの付着を抑制できることがin vitroの実験系で確認された。
【００４０】
一方、そ嚢切片への付着性が低かったL. crispatus JCM 5810を使って、サルモネラに対する付着阻害効果を見た結果を図２に示す。いずれのサルモネラ菌株に対しても総菌数で10倍量の添加で、付着を80％程度阻害した。これはL. reuteri CE5よりも強い活性であった。
【００４１】
実施例２ 乳酸菌分離株の増体重作用の検討（その１）
実施例１で分離した乳酸菌の給与が鶏ひなの体重に与える影響を調査した。試験は3回実施した。
【００４２】
1．試験方法
(1) 供試ひなおよび飼養管理
1日齢のレイヤー抜きオス(レイヤー種のオス、デカルブホワイトおよびローラ)を使用した。供試ひなは体重の分布がほぼ均等となるように各試験区10羽ずつ区分けし、動物飼育装置(東洋理工製)内で試験区ごとにケージ飼育した。飼料はγ線滅菌済みの試験用飼料(日本クレア SDL No.1)を、飲水は水道水を与え、それぞれ自由摂取とした。
【００４３】
(2) 供試乳酸菌
L. crispatus JCM5810株およびL. reuteri CE5株を使用した。使用の前日にネジ口試験管に入れたMRSブロスで37℃・20時間培養し、培養終了後、適当な菌数となるように滅菌蒸留水で希釈した。給与した菌数はMRS平板を用いて計数した。
【００４４】
(3)試験スケジュール
1日齢時に、適当な菌数となるように希釈した乳酸菌液を、ゾンデを用いて1羽につき1mLずつ経口的に給与した。乳酸菌を給与しない陰性対照区には同様の方法で滅菌蒸留水を1mLずつ給与した。8日齢時に、鶏ひなの体重および飼料摂取量(2回目、3回目のみ)を測定した。
【００４５】
2．試験結果
(1) 1回目
乳酸菌給与菌数は、JCM5810株給与区が2.4×10７CFU/羽、CE5株給与区が2.2×10７CFU/羽であった。
【００４６】
【表４】
注Ａ：統計処理は、スチューデントのt-検定を行なった。**は陰性対照区に対して有意差あり(P＜0.01)。
注Ｂ：飼育期間中に1羽事故死した。
【００４７】
1日齢時の鶏ひな体重は36.0〜36.2gであり、すべての試験区で差はなかった。8日齢時のひな体重は陰性対照区が70.5gであった。一方JCM5810株給与区およびCE5株給与区の体重はそれぞれ75.2g、79.3gと大きくなり、特にCE5株給与区においては陰性対照区に対して有意差が見られた。
【００４８】
(2) 2回目
乳酸菌給与菌数は、JCM5810株給与区が1.4×10５CFU/羽、CE5株給与区が1.2×10５CFU /羽であった。
【００４９】
【表５】
注Ａ：統計処理は、スチューデントのt-検定を行なった。*は陰性対照区に対して有意差あり(P＜0.05)。
【００５０】
1日齢時の鶏ひな体重は35.9〜36.2gであり、すべての試験区で差はなかった。8日齢時のひな体重は陰性対照区が73.4gであった。一方JCM5810株給与区およびCE5株給与区の体重はそれぞれ77.0g、78.5gと大きくなり、特にCE5株給与区においては陰性対照区に対して有意差が見られた。
【００５１】
【表６】
【００５２】
JCM5810株給与区、CE5株給与区とも、飼料摂取量が増加する傾向が見られた。なお飼料効率も改善する傾向が見られた。
【００５３】
(3) 3回目
乳酸菌給与菌数は、JCM5810株給与区が1.1×10５CFU/羽、CE5株給与区が0.9×10５CFU /羽であった。
【００５４】
【表７】
【００５５】
1日齢時の鶏ひな体重は38.3〜38.4gであり、すべての試験区で差はなかった。8日齢時のひな体重は陰性対照区が76.5gであった。一方JCM5810株給与区およびCE5株給与区の体重はそれぞれ78.6g、82.0gと大きくなる傾向が見られた。
【００５６】
【表８】
【００５７】
JCM5810株給与区、CE5株給与区とも、飼料摂取量が増加する傾向が見られた。なお飼料効率も改善する傾向が見られた。
【００５８】
(4) 鶏ひな体重における3回の総合成績
【００５９】
【表９】
注Ａ：統計処理は、スチューデントのt-検定を行なった。**は陰性対照区に対して有意差あり(P＜0.01)。*は陰性対照区に対して有意差あり(P＜0.05)。
【００６０】
上記3回の試験結果について鶏ひな体重の結果を総合したところ、1日齢時の鶏ひな体重は36.8〜36.9gであり、すべての試験区で差はなかった。
【００６１】
8日齢時のひな体重は陰性対照区が73.5gであった。一方JCM5810株給与区およびCE5株給与区の体重はそれぞれ76.9g、79.9g となり、陰性対照区と比較してそれぞれ5％および9％程度体重が増加した。またJCM5810株給与区、CE5株給与区ともに陰性対照区に対して有意差が見られた。
【００６２】
この結果より、乳酸菌JCM5810株およびCE5株を1日齢時に約10５〜７CFU/mL/羽を給与したひなにおいては体重が大きく増加することが明らかとなり、飼養成績に良い影響を及ぼすものと考えられた。
【００６３】
実施例３ 乳酸菌分離株の増体重作用の検討（その２）
実施例２で確認した増体重作用をより詳細に確認するため、さらにより規模の大きい飼養試験を行った。
【００６４】
１．材料及び方法
(1) 乳酸菌
L. crispatus JCM5810株およびL. reuteri CE5株を使用した。使用の前日にブイヨン培地(グルコース１％、酵母エキス２％、ペプトン２％、フラクトオリゴ糖１％)で37℃・20時間培養し、培養終了後、適当な菌数となるように滅菌蒸留水で希釈した。1羽あたりの乳酸菌投与菌数は、JCM5810が2.6×10６CFU/羽、CE5が5.5×10６CFU/羽であり、各個体に両菌株を同時投与した。
【００６５】
(2) 供試動物
ブロイラー専用種（チャンキー）初生雄雛を250羽導入し、体重の近似した個体を180羽選抜して供試した。
【００６６】
(3) 試験区の設定
区分け時に胃ゾンデを用いてそ嚢内に滅菌水を1羽あたり0.5mLずつ単回強制経口投与する対照区と、同様に乳酸菌を投与する試験区の計2区を設定した。
供試鶏を体重の分布がほぼ均等となるように30羽ずつ割付けた6群に区分し、両区に3反復群ずつ割付けて4週間飼育した。
供試飼料の配合割合は表１０に示したとおりである。
【００６７】
【表１０】
【００６８】
(4) 飼養管理
供試鶏は、電熱給温、強制換気式の無窓鶏舎内で群飼した。各群あたりの飼育面積は、給餌器および給水器を除いて約2m2とした。
敷料はオガクズを用い、試験終了時まで排泄物を堆積させた。照明は終日点灯した。
飼料および飲水は自由摂取させた。
ワクチネーションは、初生時にマレックおよび鶏痘生ワクチン接種済みの雛を導入し、4日齢および14日齢にNB生ワクチンを、21日齢に鶏痘生ワクチンを追加接種した。
【００６９】
(5) 調査項目
(i) 体重および増体量
区分け時より1週間間隔で個体別体重を測定し、毎週の増体量および試験期間を通算した増体量を算出した。
(ii) 飼料摂取量および飼料要求率
毎週の飼料摂取量を群毎に測定し、増体量と同様に集計して、1羽あたりの飼料摂取量および飼料要求率を算出した。
(iii) 健康状態
健康状態を毎日一定時刻に観察して記録した。
【００７０】
(6) 結果の解析
試験期間中の増体量、飼料摂取量および飼料要求率について、一元配置法により分散分析し、両区間の差の有意性について検討した。なお、試験開始から各体重測定時点の増体量について群毎に棄却検定を行って異常値と判定された個体および試験中に淘汰、斃死した個体は、試験開始時に遡って除外して各成績を取りまとめた。
【００７１】
２．試験結果
毎週の増体量、飼料摂取量および飼料要求率を表11-1に、試験期間を通算した増体量、飼料摂取量および飼料要求率を表11-2に示した。
【００７２】
増体量および飼料摂取量は、試験開始から2週目までは両区間に差が認められなかったが、3週目以降では乳酸菌投与区が対照区より増加する傾向を示し、4週目では両区間に有意差（p<0.05）が認められた。試験期間を通算した増体量および飼料摂取量も乳酸菌投与区が対照区より高い値を示し、増体量では両区間に有意差（p<0.05）が認められた。
【００７３】
飼料要求率も、試験開始から2週目までは両区間に差が認められなかったが、3週目以降では乳酸菌投与区がすぐれる傾向を示し、試験期間を通算した飼料要求率も乳酸菌投与区がすぐれる傾向を示した。
【００７４】
斃死、淘汰の原因および発生数等は表１２に示したとおりであり、両区間に差は認められず、育成率も各区間に有意差は認められなかった。また、対照区および乳酸菌投与区とも、いずれの供試鶏においても、健康状態には異常が観察されなかった。
【００７５】
【表１１−１】
【００７６】
【表１１−２】
【００７７】
【表１２】
【００７８】
実施例４ 乳酸菌分離株のサルモネラ定着阻害作用の検討
乳酸菌の給与が鶏ひなのサルモネラ定着阻害に与える影響を調査した。試験は2回実施した。
【００７９】
1．試験1
(1) 試験方法
(i) 供試ひなおよび飼養管理
1日齢のレイヤー (ローラ抜きオス)を使用した。供試ひな導入時に使用した輸送箱の敷料についてサルモネラ検査を行い、サルモネラ陰性を確認した。供試ひなは体重の分布がほぼ均等となるように各試験区10羽ずつ区分けし、動物飼育装置(東洋理工製)内で試験区ごとにケージ飼育した。飼料はγ線滅菌済みの試験用飼料(日本クレア SDL No.1)を与えた。飲水は滅菌水道水を与え、それぞれ自由摂取とした。
【００８０】
(ii) 供試乳酸菌
L. crispatus JCM5810株およびL. reuteri CE5株を使用した。使用の前日にネジ口試験管に入れたMRSブロスで37℃・20時間培養し、培養終了後、適当な菌数となるように滅菌蒸留水で希釈した。
1日齢時に、L. crispatus JCM5810株およびL. reuteri CE5株の菌液を、ゾンデを用いて1羽につき1mLずつ経口的に給与した。給与した菌数はMRS平板を用いて計数し、L. crispatus JCM5810株の給与菌数は1.4×10５CFU/mL/羽、L. reuteri CE5株の給与菌数は1.2×10５CFU/mL/羽であった。
乳酸菌を給与しない陰性対照区には同様の方法で滅菌蒸留水を1mLずつ給与した。
【００８１】
(iii) 感染サルモネラ
サルモネラはナリジクス酸耐性のS. Typhimurium EF85-9株を使用し、ひなへの感染は乳酸菌投与の24時間後に行なった。ドルセット卵培地で冷蔵保存したサルモネラEF85-9株をトリプトソーヤ平板寒天培地に画線し、37℃・20時間培養した。独立した白色スムースコロニーを釣菌し、サルモネラO多価抗原とのスライド凝集反応およびナリジクス酸50μg/mL添加MLCB平板培地上でのコロニー形状により供試サルモネラであることを確認した。その後、トリプトソーヤ液体培地に接種し、37℃・18時間培養し、培養後の菌液は0.1％ペプトン水で希釈した。このサルモネラ新鮮培養菌希釈液0.5mLをゾンデを用いて経口感染させた。感染サルモネラ菌数は1.1×10３CFU/0.5mL/羽であった。
【００８２】
(iv) 感染サルモネラの菌数測定法
感染6日後に供試ひなを剖検し、盲腸内容物中のサルモネラ菌数および陽性率を測定した。サンプリングした盲腸内容物はハーナテトラチオネート増菌培地および0.1％ペプトン水で10倍階段希釈し、50μg/mLナリジクス酸添加MLCB平板に塗沫、37℃で24時間培養後に中心黒色の典型的なサルモネラコロニー数を計数し、サルモネラO多価抗原とのスライド凝集反応によりサルモネラであることを確認した。
ハーナテトラチオネート増菌培地は1次増菌検査(41.5℃で20時間培養)および2次増菌検査(さらに室温で5日間放置後、新しいハーナテトラチオネート増菌培地に接種・培養)にてサルモネラの検出を試みた。1次増菌でサルモネラ陽性の場合、菌数測定の検出限界値を菌数とし、1次増菌でサルモネラ陰性だが2次増菌で陽性の場合は菌数を10とした。2次増菌でもサルモネラ陰性のものを菌数0とした。
【００８３】
(2) 試験結果
(i) 感染サルモネラ菌数
盲腸内サルモネラ菌数の結果は以下の表にまとめた。
【００８４】
【表１３】
注：統計処理は、菌数についてはスチューデントのt-検定を行なった。
*は1区に対して有意差あり(P＜0.05)。
【００８５】
乳酸菌を投与しなかった感染対照区においては盲腸内サルモネラ菌数（log CFU/g）は8.25と非常に高い結果となった。一方、JCM5810株給与区およびCE5株給与区においては、盲腸内サルモネラ菌数は感染対照区に比べて3分の1程度に低下しており、統計的にも有意差が認められた。
【００８６】
2．試験2
(1) 試験方法
(i) 供試ひなおよび飼養管理
1日齢のレイヤー(デカルブホワイト抜きオス)を使用した。供試ひな導入時に使用した輸送箱の敷料についてサルモネラ検査を行い、サルモネラ陰性を確認した。供試ひなは体重の分布がほぼ均等となるように各試験区10羽ずつ区分けし、動物飼育装置(東洋理工製)内で試験区ごとにケージ飼育した。
飼料はγ線滅菌済みの試験用飼料(日本クレア SDL No.1)を与えた。飲水は水道水を与え、それぞれ自由摂取とした。
また1日齢鶏ひなの腸内細菌叢を確立するために、市販の鶏盲腸内容物培養飼料(CEテクト：(株)科学飼料研究所製)を標準的な使用量の4分の1量となるように経口給与した。
【００８７】
(ii) 供試乳酸菌
L. crispatus JCM5810株およびL. reuteri CE5株を使用した。使用の前日にネジ口試験管に入れたMRSブロスで37℃・20時間培養し、培養終了後、適当な菌数となるように滅菌蒸留水で希釈した。1日齢時に、L. crispatus JCM5810株およびL. reuteri CE5株の菌液を、ゾンデを用いて1羽につき1mLずつ経口的に給与した。
給与した菌数はMRS平板を用いて計数し、L. crispatus JCM5810株の給与菌数は2.4×10７CFU/mL/羽、L. reuteri CE5株の給与菌数は2.2×10７CFU/mL/羽であった。
乳酸菌を給与しない陰性対照区には同様の方法で滅菌蒸留水を1mLずつ給与した。
【００８８】
(iii) 感染サルモネラ
試験1と同様に行なった。感染サルモネラ菌数は1.3×10３CFU/0.5mL/羽であった。
【００８９】
(iv) 感染サルモネラの菌数測定法
試験1と同様に行なった。
(4) 試験結果
(i) 感染サルモネラ菌数
盲腸内サルモネラ菌数の結果は以下の表にまとめた。
【００９０】
【表１４】
注Ａ：飼育期間中に1羽事故死した。
【００９１】
感染対照区の盲腸内サルモネラ菌数および陽性率は2.04、40％であった。CE5株給与区においては、感染対照区と同程度の結果であったが、JCM5810株給与区においては、統計的な有意差は見られないものの、サルモネラ菌数は100分の1程度に減少し、サルモネラ陽性率も4分の1と大きく低下した。
【図面の簡単な説明】
【００９２】
【図１】鶏ひなそ嚢切片へのサルモネラの付着に対し乳酸菌L. reuteri CE5株が及ぼす阻害効果を示すグラフである。
【図２】鶏ひなそ嚢切片へのサルモネラの付着に対し乳酸菌L. crispatus JCM5810株が及ぼす阻害効果を示すグラフである。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、増体重の促進や腸管感染症の防止等に有用な生菌剤及び該生菌剤に利用可能な細菌のスクリーニング方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
腸管感染症では病原菌の上皮細胞への付着が発症の第一段階として重要である。付着は細菌側の付着因子（アドへシン）が上皮細胞側のレセプターに結合することにより起こる。従って、その付着を阻止することができれば、病原菌の腸内への定着を防いで感染症を予防することができると考えられる。このような考えに基づき、現在までに、腸管の上皮細胞側のレセプターに対し病原菌と拮抗的に結合する乳酸菌等の細菌を利用して家畜の腸管感染症を予防しようとする種々の試みがなされており、特定の乳酸菌株の生菌体を含む感染防御剤等の生菌剤が報告されている（特許文献１等）。
【０００３】
生菌剤として利用する菌株は、通常、動物の腸内常在菌からのスクリーニングにより取得する。多くの場合、動物腸内からの分離菌の付着性は、培養細胞株を用いて検討されている。そのため、実際に動物に投与しても、動物腸内への定着性が十分ではなく、満足いく効果が得られない場合も多い。従って、より効果の高い菌株を取得することが常に望まれている。
【０００４】
【特許文献１】特許第３００４８９０号公報
【特許文献２】特開２００４−３５７５２８号公報
【特許文献３】特表２００６−５０１３１１号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
従って、本発明の目的は、実際に動物に対して用いた場合にも望ましい感染予防効果等が得られる細菌を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本願発明者らは、腸内常在菌の中から病原菌の付着を阻害する乳酸菌株を腸上皮下組織モデル等を用いてスクリーニングする手法の開発を進めているが、サルモネラを用いた腸管付着阻害試験においては腸上皮下組織モデルとしてそ嚢組織が特に適していることを見出した。そして、そ嚢組織を用いたスクリーニングにより、サルモネラの付着阻害効果が高い乳酸菌株を見出し、これらの乳酸菌株が動物に適用された場合にも望ましく感染防止効果等を発揮できることを見出すことにより、本願発明を完成した。
【０００７】
すなわち、本発明は、Lactobacillus reuteri（ラクトバチルス・ロイテリ）及びLactobacillus crispatus（ラクトバチルス・クリスパータス）の生菌体を有効成分として含む生菌剤を提供する。また、本発明は、ラクトバチルス・ロイテリCE5株（受領番号FERM AP-21524）及びラクトバチルス・クリスパータスJCM5810株（受領番号FERM AP-21523）の少なくともいずれか一方の生菌体を有効成分として含む生菌剤を提供する。さらに、本発明は、鶏の腸内から分離された分離菌を鶏そ嚢切片と接触させて、該分離菌の中から、そ嚢切片への付着性を有する分離菌を選択し、次いで、選択された分離菌をサルモネラと同時にそ嚢切片に接触させて、該分離菌の中から、サルモネラのそ嚢切片への付着を阻害する作用を有する分離菌を選択することを含む、鶏のサルモネラ感染症の防止作用を有する細菌のスクリーニング方法を提供する。さらに、本発明は、上記本発明の方法でスクリーニングされた細菌を提供する。さらに、本発明は、上記本発明の細菌の生菌体を有効成分として含む生菌剤を提供する。
【発明の効果】
【０００８】
本発明により、腸管感染の防止等に有用な、新規な乳酸菌の組み合わせ及び新規乳酸菌株を含む生菌剤が提供された。本発明の生菌剤は、鶏においてサルモネラ感染を予防し、さらに、ひなの増体重を促進する効果を望ましく発揮できる。また、本発明のスクリーニング方法によれば、実際に動物に投与した際にも望ましく感染症を防止できる菌株を分離することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００９】
本発明の生菌剤は、ラクトバチルス・ロイテリ及びラクトバチルス・クリスパータスの生菌体を有効成分として含む。有効成分として用いられるロイテリ及びクリスパータスは、鶏腸管上皮へ付着し、サルモネラ等の病原菌の腸内への定着を阻害する能力を有するものである。病原菌の定着阻害能は、例えば、下記実施例に詳述されるように、そ嚢などの腸管組織に対し、乳酸菌と病原菌とを同時に接触させ、腸管組織に病原菌がどの程度付着するかを調べることで評価できる。
【００１０】
ロイテリとしては、下記実施例で鶏盲腸内容物から分離されたCE5株が好ましい。クリスパータスとしては、鶏糞便から分離されたJCM5810株が好ましい。これらの菌株は、独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターに寄託されており、CE5株の受領番号はFERM AP-21524、JCM5810株はFERM AP-21523である。これらの菌株は、公知の乳酸菌と同様に、例えばMRSブロス中で37℃、20時間程度の嫌気培養をすることにより、容易に増殖させることができる。
【００１１】
本発明の生菌剤は家禽用であり、好ましくは鶏用である。下記実施例に示される通り、鶏ひなに本発明の生菌剤を投与すると、サルモネラ等の病原菌の腸内への定着を阻害することができる。従って、本発明の生菌剤は、サルモネラ感染症等の腸管感染症の防止剤として用いることができる。また、本発明の生菌剤は、下記実施例に示される通り、鶏ひなの増体重を促進する効果も有するので、増体重促進剤として用いることもできる。なお、「感染症の防止」には、感染症の予防と治療の両者が包含される。
【００１２】
なお、上記したCE5株及びJCM5810株は、それぞれを単独で用いても、鶏ひな腸内へのサルモネラの定着を阻害でき、また、鶏ひなの増体重を促進することができる。従って、これらの菌株は、単独でも本発明の生菌剤の調製に有用である。すなわち、本発明の生菌剤は、CE5株及びJCM5810株のいずれか一方のみを含むものであってよい。
【００１３】
本発明の生菌剤は、上記乳酸菌のみから成るものであってもよいし、所望により、上記乳酸菌の活性を保持するため等に有用な他の成分を含んでいてもよい。そのような生菌剤は、この分野で周知の常法により容易に調製することができ、いかなる形態であってもよい。生菌剤に含まれる生菌体は、培養物から回収した菌体の状態でもよいし、また、凍結乾燥菌体であってもよい。本発明の生菌剤は、そのまま鶏等の家禽に投与することができ、また、飼料に添加して用いることもできる。使用量は、例えば、鶏ひなに対しては１羽当たり105〜107 CFU程度で用いると、サルモネラ感染の予防及び増体重効果が得られる。
【００１４】
ラクトバチルス・ロイテリCE5株は、下記実施例に記載されるスクリーニング方法により、鶏盲腸内容物から分離された菌株である。本発明は、該CE5株乳酸菌の分離に採用された、鶏のサルモネラ感染症の防止作用を有する細菌をスクリーニングする方法をも提供する。
【００１５】
該スクリーニング方法は、鶏の腸内から分離された分離菌を鶏そ嚢切片と接触させて、該分離菌の中から、そ嚢切片への付着性を有する分離菌を選択し、次いで、選択された分離菌をサルモネラと同時にそ嚢切片に接触させて、該分離菌の中から、サルモネラのそ嚢切片への付着を阻害する作用を有する分離菌を選択することを含む。
【００１６】
腸内から分離された分離菌は、公知の分離菌であってもよいし、別途鶏から分離して得てもよい。腸内に存在する細菌の分離は、例えば、鶏の盲腸内容物や糞便等を常法により段階希釈して培養することにより行なうことができる。分離した細菌の中から、必要に応じ、所望の種の細菌を選択してもよい。例えば、乳酸菌の分離株を取得したい場合であれば、グラム陽性、非運動性、カタラーゼ活性陰性の桿菌を選択すればよい。その他の種の細菌を選択する際に指標とすべき性状は、この分野で公知であり、当業者であれば容易に所望の種の細菌を分離することができる。
【００１７】
次いで、腸内から分離した細菌をそ嚢組織切片の管腔側と接触させた後に洗浄し、切片に付着しなかった細菌を除去する。これにより、そ嚢への付着性を有する細菌を選択することができる。そ嚢切片は、生のそ嚢から切り出したものをそのまま用いることができる。スライドグラス等に管腔側を上にして貼り付けて用いると、細菌との接触操作や洗浄操作を容易に行なうことができる。細菌は、109 CFU/mL程度の濃度の懸濁液にして用いることができるが、特に限定されない。そ嚢切片に付着した分離菌は、例えば、界面活性剤を含む緩衝液でそ嚢切片を洗浄することにより回収することができる。
【００１８】
上記の通りに選択された、そ嚢への付着性を有する分離菌を、次いで、サルモネラと同時にそ嚢切片に接触させる。分離菌の濃度は、特に限定されないが、サルモネラと同程度の濃度のみならず、102倍〜105倍程度の濃度も検討することが好ましい。分離菌及びサルモネラと接触させたそ嚢切片を、適当な緩衝液で洗浄して余分な細菌を除去した後、界面活性剤を含む緩衝液で洗浄することにより、そ嚢切片に付着した分離菌及びサルモネラを回収することができる。回収した細菌の数（すなわち、そ嚢切片に付着した分離菌及びサルモネラの菌数）は、常法の段階希釈法等により容易に測定することができる。分離したい菌とサルモネラは、界面活性剤を含む洗い液中に混合して存在するが、例えば分離したい菌が乳酸菌である場合、洗い液をMRS寒天培地等の培地上で嫌気培養すれば乳酸菌を計数でき、洗い液をBHI寒天培地等の培地上で好気培養すればサルモネラを計数できる。サルモネラ単独でそ嚢切片に接触させたときのサルモネラ付着数と比較して、分離菌と共にそ嚢切片に接触させたときのサルモネラ付着数が有意に減少している場合、該分離菌はサルモネラ付着阻害作用を有すると判断することができる。
【００１９】
本発明のスクリーニング方法で選択される細菌は、特に限定されないが、好ましくは乳酸菌である。該方法でスクリーニングされた分離菌は、鶏のサルモネラ感染症を予防する作用があると考えられる。また、このようなスクリーニング方法で分離された乳酸菌であるラクトバチルス・ロイテリCE5株は、鶏ひなの増体重を促進する効果もあるため、本発明のスクリーニング方法で分離された細菌、好ましくは乳酸菌は、鶏の増体重促進作用も有すると考えられる。従って、本発明の方法でスクリーニングされた分離菌を有効成分として含む生菌剤は、鶏のサルモネラ感染症の予防や増体重の促進に有用である。
【実施例】
【００２０】
以下、本発明を実施例に基づきより具体的に説明する。
【００２１】
実施例１ 乳酸菌分離株の腸管付着性およびサルモネラ付着阻害能評価
［材料及び方法］
(1) 鶏からの乳酸菌株の分離
SPF鶏の盲腸内容物を採取し、これにリン酸緩衝食塩水（PBS）を加えて階段希釈した液を変法LBS寒天培地に塗抹した。37℃で48時間嫌気培養（三菱ガス化学、アネロパックケンキ）後、生じたコロニーをMRS寒天培地（Merck）上に画線塗抹し、37℃で48時間嫌気培養した。分離後の菌はグリセロールストックとして−80℃で保存した。
【００２２】
(2) 乳酸菌の同定
分離株の中でグラム陽性、非運動性、カタラーゼ活性陰性の桿菌であるものを、Lactobacillus sp.と同定した。Lactobacillus sp.と同定された株について、ガス産生の有無、15℃での発育の有無および糖の発酵性（リボース、ガラクトース、セロビオース、ラクトース、トレハロース、メリビオース、ラフィノース、マンニトール、ソルビトール）を試験し、Bergey's Manual of Systematic Bacteriology Vol. 2 (1986)に記載されている各乳酸菌種の性状と比較して菌種（属）を同定した。同定試験の参考株としてL. reuteri JCM 1112Tを用いた。
【００２３】
(3) 鶏ひな腸管切片の調製
初生ひなに1日間、抗生物質（アンフォテリシンB 2.5μg/mL、ストレプトマイシン 100μg/mL、ペニシリン 100U/mL）を添加した水のみを与えた後、ネンブタール0.3mLを腹腔内に注射し安楽死させた。ついでそ嚢および盲腸を摘出し、長軸方向に開いた。これから、直径約5mmの切片を切り出し、直径15mmの円形カバーガラス（松浪ガラス）上に管腔側を上にして瞬間接着剤で固定した。円形カバーガラス1枚当たり、3枚の切片を固定した。切片を固定した円形カバーガラスを24穴マルチプレート（住友ベークライト）に入れ、実験まで-30℃で保存した。本実験は弘前大学動物実験委員会の承認を得て行った。
【００２４】
(4) 付着試験
乳酸菌としてSPF鶏盲腸内容物から分離した10株、成鶏糞便から分離した1株（理研バイオリソースセンターより入手）、および理化学研究所微生物系統保存施設（JCM）から購入した3株の合わせて14株の乳酸菌を用いた。
【００２５】
乳酸菌はMRS寒天培地上37℃で1夜嫌気培養した。サルモネラはJCMから購入したSalmonella Typhimurium JCM 1652およびヒト食中毒由来の分離株EF85-9の２株を用い、ブレインハートインヒュージョン（BHI）寒天培地（日水製薬）上で37℃にて1夜好気培養した。寒天培地上のコロニーをコンラージ棒により集め、菌体をPBSで3回洗浄した。次いで、寒天平板１枚から回収された菌を1mLのPBSに再分散させた。PBSで適宜希釈し、バクテリアカウンターで総菌数を計数した。菌懸濁液をPBSで希釈し１×10９/mLとした菌懸濁液を調製した。
【００２６】
１×10９/mLとした菌懸濁液2mLをそ嚢切片が貼付されたウェルに注加した。マイクロプレートに蓋をしてマイルドミキサー（タイテック）上に置き、室温で1時間ゆるく振盪した。菌懸濁液をピペットで吸引除去後、付着していない菌体を除くためにウェルを2mLのPBSで3回洗浄した。次いで、0.5% Triton X-100水溶液1mLでピペッティングを繰り返し、そ嚢切片に付着した菌体を回収した。この液をPBSで階段希釈した。階段希釈液を用いて、生菌数を測定した。乳酸桿菌の場合はMRS寒天培地上で嫌気培養し、サルモネラの場合はBHI寒天培地上で好気培養した。培養温度は37℃とした。
【００２７】
１×10９/mLとした菌懸濁液中の生菌数についても、MRS寒天培地およびBHI寒天培地を用いて測定した。
【００２８】
被検菌の付着の程度は以下のようにして求めた付着率で表した。なお、「負荷菌数」とは、切片に添加した上記菌懸濁液2mL中に含まれる生菌数である。
付着率（％）＝付着菌数（CFU/well）／負荷菌数（CFU/well）
【００２９】
(5) 付着阻害試験
菌懸濁液は前項と同様にして調製した。但し、総菌数として乳酸桿菌の濃度は2×10９/mLおよび2×1010/mLに、サルモネラの濃度は2×10８/mLに調整した。
【００３０】
乳酸菌懸濁液及びサルモネラ懸濁液各1mLをそ嚢切片が貼付されたウェルに注加した。マイクロプレートに蓋をしてマイルドミキサー上に置き、室温で30分間ゆるく振盪した。付着したサルモネラ菌数を前項と同様にして計数し、付着菌数（CFU/well）として表した。負荷生菌数も前項と同様にして計数し、CFU/wellとして表した。
［結果及び考察］
(1) SPF鶏盲腸内容物から分離した乳酸菌株の同定
糖の発酵パターンから分離菌株10株を表１のように同定した。
【００３１】
【表１−１】
【００３２】
【表１−２】
※ グラム染色
＋：陽性 −：陰性
※ 運動性、カタラーゼ活性、ガス産生、15℃発育、好気性発育
＋：陽性 −：陰性
※ グルコン酸の資化性、糖分解性状
菌の発育度に合わせて−、＋、＋＋及び＋＋＋で示した。
【００３３】
(2) 鶏ひなそ嚢切片への乳酸菌およびサルモネラの付着性
表２に示したように、L. reuteri CE5のみで高い付着率（20.6％）を示した。一方、Lactobacillus salivarius/agilis CE10および菌株保存機関から入手したすべての乳酸菌株(4株)については低い付着率(1.0％以下)であった。これ以外のSPF鶏盲腸内容物分離株は中程度の付着率（5〜10％）を示した。
【００３４】
なおサルモネラの付着率は、試験した２株とも低い付着率(1.0％以下)であった。
【００３５】
【表２】
a付着率（％）＝1ウェル当たりの付着菌数（CFU）／1ウェル当たりの負荷菌数（CFU）
b1ウェル当たりの付着菌数（CFU）で表した。
【００３６】
(3) 鶏ひな盲腸切片への乳酸菌およびサルモネラの付着性
乳酸菌ではそ嚢切片に高い付着率を示したL. reuteri CE5および低い付着率を示したL. crispatus JCM 5810を用いて付着試験を行った。その結果、表3に示したようにL. reuteri CE5の盲腸への付着率は3.0％と中程度であったが、付着菌数はそ嚢と同程度であった。L. crispatus JCM 5810は付着率および付着菌数とも低く、L. reuteri CE5の10分の1程度であった。
【００３７】
なおサルモネラは2株とも付着率は0.1%以下で非常に低く、付着菌数も低かった。このためサルモネラ付着阻害試験のモデルには盲腸切片よりもそ嚢切片が適していると考えられた。
【００３８】
【表３】
a付着率（％）＝1ウェル当たりの付着菌数（CFU）／1ウェル当たりの負荷菌数（CFU）
b1ウェル当たりの付着菌数（CFU）で表した。
【００３９】
(4) 鶏ひなそ嚢切片へのサルモネラの付着に対する乳酸菌の影響
L. reuteri CE5は図１に示したように、サルモネラ菌量の10倍量および100倍量の菌量を添加すると、S. Typhimurium JCM 1652のそ嚢切片への付着をそれぞれ、15％および82％阻害した。S. Typhimurium EF85-9に対しては、10倍量の菌量でも、80％付着を阻害した。このためそ嚢切片への付着性が高い乳酸菌株であるL. reuteri CE5はサルモネラの付着を抑制できることがin vitroの実験系で確認された。
【００４０】
一方、そ嚢切片への付着性が低かったL. crispatus JCM 5810を使って、サルモネラに対する付着阻害効果を見た結果を図２に示す。いずれのサルモネラ菌株に対しても総菌数で10倍量の添加で、付着を80％程度阻害した。これはL. reuteri CE5よりも強い活性であった。
【００４１】
実施例２ 乳酸菌分離株の増体重作用の検討（その１）
実施例１で分離した乳酸菌の給与が鶏ひなの体重に与える影響を調査した。試験は3回実施した。
【００４２】
1．試験方法
(1) 供試ひなおよび飼養管理
1日齢のレイヤー抜きオス(レイヤー種のオス、デカルブホワイトおよびローラ)を使用した。供試ひなは体重の分布がほぼ均等となるように各試験区10羽ずつ区分けし、動物飼育装置(東洋理工製)内で試験区ごとにケージ飼育した。飼料はγ線滅菌済みの試験用飼料(日本クレア SDL No.1)を、飲水は水道水を与え、それぞれ自由摂取とした。
【００４３】
(2) 供試乳酸菌
L. crispatus JCM5810株およびL. reuteri CE5株を使用した。使用の前日にネジ口試験管に入れたMRSブロスで37℃・20時間培養し、培養終了後、適当な菌数となるように滅菌蒸留水で希釈した。給与した菌数はMRS平板を用いて計数した。
【００４４】
(3)試験スケジュール
1日齢時に、適当な菌数となるように希釈した乳酸菌液を、ゾンデを用いて1羽につき1mLずつ経口的に給与した。乳酸菌を給与しない陰性対照区には同様の方法で滅菌蒸留水を1mLずつ給与した。8日齢時に、鶏ひなの体重および飼料摂取量(2回目、3回目のみ)を測定した。
【００４５】
2．試験結果
(1) 1回目
乳酸菌給与菌数は、JCM5810株給与区が2.4×10７CFU/羽、CE5株給与区が2.2×10７CFU/羽であった。
【００４６】
【表４】
注Ａ：統計処理は、スチューデントのt-検定を行なった。**は陰性対照区に対して有意差あり(P＜0.01)。
注Ｂ：飼育期間中に1羽事故死した。
【００４７】
1日齢時の鶏ひな体重は36.0〜36.2gであり、すべての試験区で差はなかった。8日齢時のひな体重は陰性対照区が70.5gであった。一方JCM5810株給与区およびCE5株給与区の体重はそれぞれ75.2g、79.3gと大きくなり、特にCE5株給与区においては陰性対照区に対して有意差が見られた。
【００４８】
(2) 2回目
乳酸菌給与菌数は、JCM5810株給与区が1.4×10５CFU/羽、CE5株給与区が1.2×10５CFU /羽であった。
【００４９】
【表５】
注Ａ：統計処理は、スチューデントのt-検定を行なった。*は陰性対照区に対して有意差あり(P＜0.05)。
【００５０】
1日齢時の鶏ひな体重は35.9〜36.2gであり、すべての試験区で差はなかった。8日齢時のひな体重は陰性対照区が73.4gであった。一方JCM5810株給与区およびCE5株給与区の体重はそれぞれ77.0g、78.5gと大きくなり、特にCE5株給与区においては陰性対照区に対して有意差が見られた。
【００５１】
【表６】
【００５２】
JCM5810株給与区、CE5株給与区とも、飼料摂取量が増加する傾向が見られた。なお飼料効率も改善する傾向が見られた。
【００５３】
(3) 3回目
乳酸菌給与菌数は、JCM5810株給与区が1.1×10５CFU/羽、CE5株給与区が0.9×10５CFU /羽であった。
【００５４】
【表７】
【００５５】
1日齢時の鶏ひな体重は38.3〜38.4gであり、すべての試験区で差はなかった。8日齢時のひな体重は陰性対照区が76.5gであった。一方JCM5810株給与区およびCE5株給与区の体重はそれぞれ78.6g、82.0gと大きくなる傾向が見られた。
【００５６】
【表８】
【００５７】
JCM5810株給与区、CE5株給与区とも、飼料摂取量が増加する傾向が見られた。なお飼料効率も改善する傾向が見られた。
【００５８】
(4) 鶏ひな体重における3回の総合成績
【００５９】
【表９】
注Ａ：統計処理は、スチューデントのt-検定を行なった。**は陰性対照区に対して有意差あり(P＜0.01)。*は陰性対照区に対して有意差あり(P＜0.05)。
【００６０】
上記3回の試験結果について鶏ひな体重の結果を総合したところ、1日齢時の鶏ひな体重は36.8〜36.9gであり、すべての試験区で差はなかった。
【００６１】
8日齢時のひな体重は陰性対照区が73.5gであった。一方JCM5810株給与区およびCE5株給与区の体重はそれぞれ76.9g、79.9g となり、陰性対照区と比較してそれぞれ5％および9％程度体重が増加した。またJCM5810株給与区、CE5株給与区ともに陰性対照区に対して有意差が見られた。
【００６２】
この結果より、乳酸菌JCM5810株およびCE5株を1日齢時に約10５〜７CFU/mL/羽を給与したひなにおいては体重が大きく増加することが明らかとなり、飼養成績に良い影響を及ぼすものと考えられた。
【００６３】
実施例３ 乳酸菌分離株の増体重作用の検討（その２）
実施例２で確認した増体重作用をより詳細に確認するため、さらにより規模の大きい飼養試験を行った。
【００６４】
１．材料及び方法
(1) 乳酸菌
L. crispatus JCM5810株およびL. reuteri CE5株を使用した。使用の前日にブイヨン培地(グルコース１％、酵母エキス２％、ペプトン２％、フラクトオリゴ糖１％)で37℃・20時間培養し、培養終了後、適当な菌数となるように滅菌蒸留水で希釈した。1羽あたりの乳酸菌投与菌数は、JCM5810が2.6×10６CFU/羽、CE5が5.5×10６CFU/羽であり、各個体に両菌株を同時投与した。
【００６５】
(2) 供試動物
ブロイラー専用種（チャンキー）初生雄雛を250羽導入し、体重の近似した個体を180羽選抜して供試した。
【００６６】
(3) 試験区の設定
区分け時に胃ゾンデを用いてそ嚢内に滅菌水を1羽あたり0.5mLずつ単回強制経口投与する対照区と、同様に乳酸菌を投与する試験区の計2区を設定した。
供試鶏を体重の分布がほぼ均等となるように30羽ずつ割付けた6群に区分し、両区に3反復群ずつ割付けて4週間飼育した。
供試飼料の配合割合は表１０に示したとおりである。
【００６７】
【表１０】
【００６８】
(4) 飼養管理
供試鶏は、電熱給温、強制換気式の無窓鶏舎内で群飼した。各群あたりの飼育面積は、給餌器および給水器を除いて約2m2とした。
敷料はオガクズを用い、試験終了時まで排泄物を堆積させた。照明は終日点灯した。
飼料および飲水は自由摂取させた。
ワクチネーションは、初生時にマレックおよび鶏痘生ワクチン接種済みの雛を導入し、4日齢および14日齢にNB生ワクチンを、21日齢に鶏痘生ワクチンを追加接種した。
【００６９】
(5) 調査項目
(i) 体重および増体量
区分け時より1週間間隔で個体別体重を測定し、毎週の増体量および試験期間を通算した増体量を算出した。
(ii) 飼料摂取量および飼料要求率
毎週の飼料摂取量を群毎に測定し、増体量と同様に集計して、1羽あたりの飼料摂取量および飼料要求率を算出した。
(iii) 健康状態
健康状態を毎日一定時刻に観察して記録した。
【００７０】
(6) 結果の解析
試験期間中の増体量、飼料摂取量および飼料要求率について、一元配置法により分散分析し、両区間の差の有意性について検討した。なお、試験開始から各体重測定時点の増体量について群毎に棄却検定を行って異常値と判定された個体および試験中に淘汰、斃死した個体は、試験開始時に遡って除外して各成績を取りまとめた。
【００７１】
２．試験結果
毎週の増体量、飼料摂取量および飼料要求率を表11-1に、試験期間を通算した増体量、飼料摂取量および飼料要求率を表11-2に示した。
【００７２】
増体量および飼料摂取量は、試験開始から2週目までは両区間に差が認められなかったが、3週目以降では乳酸菌投与区が対照区より増加する傾向を示し、4週目では両区間に有意差（p<0.05）が認められた。試験期間を通算した増体量および飼料摂取量も乳酸菌投与区が対照区より高い値を示し、増体量では両区間に有意差（p<0.05）が認められた。
【００７３】
飼料要求率も、試験開始から2週目までは両区間に差が認められなかったが、3週目以降では乳酸菌投与区がすぐれる傾向を示し、試験期間を通算した飼料要求率も乳酸菌投与区がすぐれる傾向を示した。
【００７４】
斃死、淘汰の原因および発生数等は表１２に示したとおりであり、両区間に差は認められず、育成率も各区間に有意差は認められなかった。また、対照区および乳酸菌投与区とも、いずれの供試鶏においても、健康状態には異常が観察されなかった。
【００７５】
【表１１−１】
【００７６】
【表１１−２】
【００７７】
【表１２】
【００７８】
実施例４ 乳酸菌分離株のサルモネラ定着阻害作用の検討
乳酸菌の給与が鶏ひなのサルモネラ定着阻害に与える影響を調査した。試験は2回実施した。
【００７９】
1．試験1
(1) 試験方法
(i) 供試ひなおよび飼養管理
1日齢のレイヤー (ローラ抜きオス)を使用した。供試ひな導入時に使用した輸送箱の敷料についてサルモネラ検査を行い、サルモネラ陰性を確認した。供試ひなは体重の分布がほぼ均等となるように各試験区10羽ずつ区分けし、動物飼育装置(東洋理工製)内で試験区ごとにケージ飼育した。飼料はγ線滅菌済みの試験用飼料(日本クレア SDL No.1)を与えた。飲水は滅菌水道水を与え、それぞれ自由摂取とした。
【００８０】
(ii) 供試乳酸菌
L. crispatus JCM5810株およびL. reuteri CE5株を使用した。使用の前日にネジ口試験管に入れたMRSブロスで37℃・20時間培養し、培養終了後、適当な菌数となるように滅菌蒸留水で希釈した。
1日齢時に、L. crispatus JCM5810株およびL. reuteri CE5株の菌液を、ゾンデを用いて1羽につき1mLずつ経口的に給与した。給与した菌数はMRS平板を用いて計数し、L. crispatus JCM5810株の給与菌数は1.4×10５CFU/mL/羽、L. reuteri CE5株の給与菌数は1.2×10５CFU/mL/羽であった。
乳酸菌を給与しない陰性対照区には同様の方法で滅菌蒸留水を1mLずつ給与した。
【００８１】
(iii) 感染サルモネラ
サルモネラはナリジクス酸耐性のS. Typhimurium EF85-9株を使用し、ひなへの感染は乳酸菌投与の24時間後に行なった。ドルセット卵培地で冷蔵保存したサルモネラEF85-9株をトリプトソーヤ平板寒天培地に画線し、37℃・20時間培養した。独立した白色スムースコロニーを釣菌し、サルモネラO多価抗原とのスライド凝集反応およびナリジクス酸50μg/mL添加MLCB平板培地上でのコロニー形状により供試サルモネラであることを確認した。その後、トリプトソーヤ液体培地に接種し、37℃・18時間培養し、培養後の菌液は0.1％ペプトン水で希釈した。このサルモネラ新鮮培養菌希釈液0.5mLをゾンデを用いて経口感染させた。感染サルモネラ菌数は1.1×10３CFU/0.5mL/羽であった。
【００８２】
(iv) 感染サルモネラの菌数測定法
感染6日後に供試ひなを剖検し、盲腸内容物中のサルモネラ菌数および陽性率を測定した。サンプリングした盲腸内容物はハーナテトラチオネート増菌培地および0.1％ペプトン水で10倍階段希釈し、50μg/mLナリジクス酸添加MLCB平板に塗沫、37℃で24時間培養後に中心黒色の典型的なサルモネラコロニー数を計数し、サルモネラO多価抗原とのスライド凝集反応によりサルモネラであることを確認した。
ハーナテトラチオネート増菌培地は1次増菌検査(41.5℃で20時間培養)および2次増菌検査(さらに室温で5日間放置後、新しいハーナテトラチオネート増菌培地に接種・培養)にてサルモネラの検出を試みた。1次増菌でサルモネラ陽性の場合、菌数測定の検出限界値を菌数とし、1次増菌でサルモネラ陰性だが2次増菌で陽性の場合は菌数を10とした。2次増菌でもサルモネラ陰性のものを菌数0とした。
【００８３】
(2) 試験結果
(i) 感染サルモネラ菌数
盲腸内サルモネラ菌数の結果は以下の表にまとめた。
【００８４】
【表１３】
注：統計処理は、菌数についてはスチューデントのt-検定を行なった。
*は1区に対して有意差あり(P＜0.05)。
【００８５】
乳酸菌を投与しなかった感染対照区においては盲腸内サルモネラ菌数（log CFU/g）は8.25と非常に高い結果となった。一方、JCM5810株給与区およびCE5株給与区においては、盲腸内サルモネラ菌数は感染対照区に比べて3分の1程度に低下しており、統計的にも有意差が認められた。
【００８６】
2．試験2
(1) 試験方法
(i) 供試ひなおよび飼養管理
1日齢のレイヤー(デカルブホワイト抜きオス)を使用した。供試ひな導入時に使用した輸送箱の敷料についてサルモネラ検査を行い、サルモネラ陰性を確認した。供試ひなは体重の分布がほぼ均等となるように各試験区10羽ずつ区分けし、動物飼育装置(東洋理工製)内で試験区ごとにケージ飼育した。
飼料はγ線滅菌済みの試験用飼料(日本クレア SDL No.1)を与えた。飲水は水道水を与え、それぞれ自由摂取とした。
また1日齢鶏ひなの腸内細菌叢を確立するために、市販の鶏盲腸内容物培養飼料(CEテクト：(株)科学飼料研究所製)を標準的な使用量の4分の1量となるように経口給与した。
【００８７】
(ii) 供試乳酸菌
L. crispatus JCM5810株およびL. reuteri CE5株を使用した。使用の前日にネジ口試験管に入れたMRSブロスで37℃・20時間培養し、培養終了後、適当な菌数となるように滅菌蒸留水で希釈した。1日齢時に、L. crispatus JCM5810株およびL. reuteri CE5株の菌液を、ゾンデを用いて1羽につき1mLずつ経口的に給与した。
給与した菌数はMRS平板を用いて計数し、L. crispatus JCM5810株の給与菌数は2.4×10７CFU/mL/羽、L. reuteri CE5株の給与菌数は2.2×10７CFU/mL/羽であった。
乳酸菌を給与しない陰性対照区には同様の方法で滅菌蒸留水を1mLずつ給与した。
【００８８】
(iii) 感染サルモネラ
試験1と同様に行なった。感染サルモネラ菌数は1.3×10３CFU/0.5mL/羽であった。
【００８９】
(iv) 感染サルモネラの菌数測定法
試験1と同様に行なった。
(4) 試験結果
(i) 感染サルモネラ菌数
盲腸内サルモネラ菌数の結果は以下の表にまとめた。
【００９０】
【表１４】
注Ａ：飼育期間中に1羽事故死した。
【００９１】
感染対照区の盲腸内サルモネラ菌数および陽性率は2.04、40％であった。CE5株給与区においては、感染対照区と同程度の結果であったが、JCM5810株給与区においては、統計的な有意差は見られないものの、サルモネラ菌数は100分の1程度に減少し、サルモネラ陽性率も4分の1と大きく低下した。
【図面の簡単な説明】
【００９２】
【図１】鶏ひなそ嚢切片へのサルモネラの付着に対し乳酸菌L. reuteri CE5株が及ぼす阻害効果を示すグラフである。
【図２】鶏ひなそ嚢切片へのサルモネラの付着に対し乳酸菌L. crispatus JCM5810株が及ぼす阻害効果を示すグラフである。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ラクトバチルス・ロイテリ（Lactobacillus reuteri）及びラクトバチルス・クリスパータス（Lactobacillus crispatus）の生菌体を有効成分として含む生菌剤。
【請求項２】
ラクトバチルス・ロイテリCE5株（受領番号FERM AP-21524）及びラクトバチルス・クリスパータスJCM5810株（受領番号FERM AP-21523）の少なくともいずれか一方の生菌体を有効成分として含む生菌剤。
【請求項３】
前記CE5株及び前記JCM5810株の生菌体を有効成分として含む請求項２記載の生菌剤。
【請求項４】
鶏用である請求項１ないし３のいずれか１項に記載の生菌剤。
【請求項５】
増体重促進剤である請求項１ないし４のいずれか１項に記載の生菌剤。
【請求項６】
腸管感染症の防止剤である請求項１ないし４のいずれか１項に記載の生菌剤。
【請求項７】
前記感染症がサルモネラ感染症である請求項６記載の生菌剤。
【請求項８】
鶏の腸内から分離された分離菌を鶏そ嚢切片と接触させて、該分離菌の中から、そ嚢切片への付着性を有する分離菌を選択し、次いで、選択された分離菌をサルモネラと同時にそ嚢切片に接触させて、該分離菌の中から、サルモネラのそ嚢切片への付着を阻害する作用を有する分離菌を選択することを含む、鶏のサルモネラ感染症の防止作用を有する細菌のスクリーニング方法。
【請求項９】
前記細菌が乳酸菌である請求項８記載の方法。
【請求項１０】
請求項８又は９記載の方法でスクリーニングされた細菌。
【請求項１１】
請求項１０記載の細菌の生菌体を有効成分として含む生菌剤。
【請求項１】
ラクトバチルス・ロイテリ（Lactobacillus reuteri）及びラクトバチルス・クリスパータス（Lactobacillus crispatus）の生菌体を有効成分として含む生菌剤。
【請求項２】
ラクトバチルス・ロイテリCE5株（受領番号FERM AP-21524）及びラクトバチルス・クリスパータスJCM5810株（受領番号FERM AP-21523）の少なくともいずれか一方の生菌体を有効成分として含む生菌剤。
【請求項３】
前記CE5株及び前記JCM5810株の生菌体を有効成分として含む請求項２記載の生菌剤。
【請求項４】
鶏用である請求項１ないし３のいずれか１項に記載の生菌剤。
【請求項５】
増体重促進剤である請求項１ないし４のいずれか１項に記載の生菌剤。
【請求項６】
腸管感染症の防止剤である請求項１ないし４のいずれか１項に記載の生菌剤。
【請求項７】
前記感染症がサルモネラ感染症である請求項６記載の生菌剤。
【請求項８】
鶏の腸内から分離された分離菌を鶏そ嚢切片と接触させて、該分離菌の中から、そ嚢切片への付着性を有する分離菌を選択し、次いで、選択された分離菌をサルモネラと同時にそ嚢切片に接触させて、該分離菌の中から、サルモネラのそ嚢切片への付着を阻害する作用を有する分離菌を選択することを含む、鶏のサルモネラ感染症の防止作用を有する細菌のスクリーニング方法。
【請求項９】
前記細菌が乳酸菌である請求項８記載の方法。
【請求項１０】
請求項８又は９記載の方法でスクリーニングされた細菌。
【請求項１１】
請求項１０記載の細菌の生菌体を有効成分として含む生菌剤。
【図１】
【図２】
【図２】
【公開番号】特開２００９−２４２２７５（Ｐ２００９−２４２２７５Ａ）
【公開日】平成２１年１０月２２日（２００９．１０．２２）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００８−８９３１３（Ｐ２００８−８９３１３）
【出願日】平成２０年３月３１日（２００８．３．３１）
【出願人】（５９１２２０７４６）株式会社科学飼料研究所 (11)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２１年１０月２２日（２００９．１０．２２）
【国際特許分類】
【出願日】平成２０年３月３１日（２００８．３．３１）
【出願人】（５９１２２０７４６）株式会社科学飼料研究所 (11)
【Ｆターム（参考）】
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