疾患の処置のためのトリシクロ−ＤＮＡアンチセンスオリゴヌクレオチド、組成物及び方法
プレ−ｍＲＮＡのプロセッシング過程において生じるスプライシングイベントを改変するための、トリシクロ−ＤＮＡ（ｔｃ−ＤＮＡ）ＡＯＮ及びｔｃ−ＤＮＡ ＡＯＮを用いる方法を提供する。プレ−ｍＲＮＡのプロセッシング過程におけるエクソンスキッピングを促進するために、あるいは、イントロンサイレンサー配列及び／又は末端ステムループ配列をマスキングするために、並びに、プロセッシングされたｍＲＮＡのＲＮａｓｅ介在破壊を標的化するために使用することができるトリシクロ−ＤＮＡ（ｔｃ−ＤＮＡ）ＡＯＮが記載される。本明細書に記載のｔｃ−ＤＮＡ ＡＯＮは、ジストロフィンタンパク質の機能を修復するための、ジストロフィン遺伝子内の突然変異エクソン２３又はエクソン５１をスキッピングすることによる、デュシェンヌ型筋ジストロフィーを処置するための方法；非機能性ＳＭＮ１タンパク質を少なくとも部分的に補完することができる、エクソン７によりコードされるアミノ酸配列を含む修飾された機能性ＳＭＮ２タンパク質を生成するための、ＳＭＮ２遺伝子内のイントロンサイレンシング配列及び／又は末端ステムループ配列をマスキングすることによる、脊髄性筋萎縮症を処置するための方法；並びに、３’−末端のＣＵＧ反復配列を含む突然変異ＤＭ１のｍＲＮＡの破壊を標的化することによる、スタイナート筋緊張性ジストロフィーを処置するための方法で使用することができる。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本開示は、一般的に、プレ−ｍＲＮＡのプロセッシング過程において生じるスプライシングイベントを改変するための、あるいは、例えば、３’又は５’ＣＵＧ、ＣＡＧ及び／又はＣＣＵＧなどの反復配列を含有する突然変異ｍＲＮＡの発現をダウンレギュレーションするための、合成アンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＯＮ）、並びに、アンチセンスオリゴヌクレオチドを用いる方法に関する。さらに具体的には、プレ−ｍＲＮＡのプロセッシング過程におけるエクソンスキッピングの促進に、プレ−ｍＲＮＡにおけるイントロンサイレンサー配列及び／又はステムループ配列のマスキングに、並びに、ｍＲＮＡのＲＮａｓｅ介在破壊の標的化に有効なトリシクロ−ＤＮＡ（ｔｃ−ＤＮＡ）ＡＯＮが本明細書で開示される。ジストロフィンタンパク質の機能を修復するための、ジストロフィン遺伝子内の突然変異エクソン２３又はエクソン５１などの突然変異エクソンをスキッピングすることによる、デュシェンヌ型筋ジストロフィーを処置するための方法で使用することができるｔｃ−ＤＮＡ ＡＯＮが本明細書で記載される。また、非機能性ＳＭＮ１タンパク質を少なくとも部分的に補完することができるエクソン７によりコードされるアミノ酸配列を含む、修飾された機能性ＳＭＮ２タンパク質を生成するための、ＳＭＮ２遺伝子内のイントロンサイレンシング配列及び／又は末端ステムループ配列をマスキングすることによる、脊髄性筋萎縮症を処置するための方法で使用することができるｔｃ−ＤＮＡ ＡＯＮが記載される。また、さらに、本明細書に記載のｔｃ−ＤＮＡ ＡＯＮは、３’−末端ＣＵＧ反復配列を含む突然変異ＤＭ１のｍＲＮＡの破壊を標的化することによる、スタイナート筋緊張性ジストロフィーを処置するための方法で使用することができる。従って、ｔｃ−ＤＮＡ ＡＯＮ及び１つ以上の前述のアプローチ法を、ミオパチーに関連するタンパク質の機能を修復するために使用することができる。
【背景技術】
【０００２】
デュシェンヌ型筋ジストロフィー（ＤＭＤ）は、民族に関係なく、男児の３，５００人に１人が冒される最も一般的な遺伝性ミオパチーである。頻度は低いが、女児及び女性がマニフェスティングキャリアーでデュシェンヌ様症状を呈する可能性もある。ＤＭＤによる最も重要な影響は、筋線維が非常にもろくなり、そして、通常の筋活動が筋組織に全般的な損傷を引き起こすことである。ＤＭＤ、並びに、多くの筋ジストロフィーで観察される終点は、変性がゆっくり進行してほぼ完全に脂肪浸潤を伴う線維症に至ることである。脊椎変形及び呼吸困難により、１９６０年代の平均余命は約１５年であった。心臓合併症がない場合では、現在、管理方法（即ち、関節固定及び気管切開換気法）の改善により平均余命が３０年に伸びた。
【０００３】
ＤＭＤの臨床症状は１８か月〜３歳で現れ、歩行や登る能力の遅延、床からの起立困難、異常に肥大したふくらはぎなどが見られる。約５〜６年で、筋収縮が足、膝及び股関節に起こる。疾患の進行は継続的な筋萎縮を特徴とし、約９〜１２年で歩行不能となる。さらに、デュシェンヌ型の男児の中には精神遅滞を呈するものもあり、これにより、欠損タンパク質が中枢神経系にも関与していることが示唆される。
【０００４】
デュシェンヌ型筋ジストロフィーは、Ｘ染色体連鎖劣性欠損症である。ＤＭＤ遺伝子座は、１９８６年、ジストロフィンと呼ばれるタンパク質をコードする遺伝子のポジショナルクローニングアプローチ法により、Ｘ染色体（Ｘｐ２１．２−ＯＭＩＭｉｄ：３１０２００）上に確認された。ジストロフィン遺伝子で突然変異が起こると、横紋筋でジストロフィンの産生ができなくなる。罹患男児の母の２／３が、ジストロフィン突然変異のキャリアーである可能性があり、一方で、患者の約１／３がデノボ突然変異を有する。ＤＭＤの男児の半数以上が、複数のエクソンが含まれる大きなゲノム欠失を示し；これらの数人は、大きな配列重複を有する。また、確認が困難な点突然変異又は極めて小さな欠失若しくは重複を有する場合もある。
【０００５】
しかし、突然変異の程度は、表現型の重症度と直接関係していない。中途終止コドン及びその後の翻訳の失敗をもたらすアウトオブフレーム欠失又はナンセンス突然変異は、重症の表現型を特徴とするジストロフィン欠損を生じる。インフレーム欠失は、ベッカー型筋ジストロフィー（ＢＭＤ）として知られる軽症のミオパシーに関与している。
【０００６】
約２．５百万塩基対のＤＭＤ遺伝子座は、これまでに検出された最も長い遺伝子であるが、わずか約１４，０００塩基対が、７９個のエクソンに広がるコード配列を含有する。完全長ジストロフィン（ＤＰ４２７）は、全ての筋肉で発現される４２７kDaの細胞骨格タンパク質であるが、様々なタンパク質アイソトープ（ＤＰ２６０、ＤＰ１４０、ＤＰ１１６、ＤＰ７１）が、それぞれ、イントロン２９、４３、５５及び６２に位置する４つの内部プロモーターにより、組織特異的に、異なる使用頻度（網膜、中枢神経系、末梢神経系及び非筋肉組織）で生成される。
【０００７】
完全長ジストロフィンは、筋原線維細胞骨格を細胞外マトリックスに結合させることによる筋線維の膜完全性の維持に関与する筋細胞膜−糖タンパク質複合体（ＳＧＣ）に不可欠な成分である。配列解析から、ジストロフィンタンパク質にはいくつかのドメイン及び反復配列が必要であることが予測された。概略すると、Ｎ−末端のアクチンハイブリダイズ部位（Ｎ−ＡＢＤ）；フレキシビリティを付与しうる４個のヒンジセグメント（Ｈ）を含有する中心桿状ドメイン（ＲＤ；２４個のスペクトリン様反復配列を有する）；及び、Ｃ−末端（ＣＴ）近傍のＤＰＣの他のメンバーに結合するシステインリッチドメイン（ＣＲＤ）が存在する。
【０００８】
構造／機能解析により、タンパク質機能に極めて重要なドメインが同定された。これは、エクソン１７〜４８（コード配列の４６％）の欠失が含まれる軽度の疾患を有する患者において生じる内部欠失により実証された（England et al., Nature 343(6254):180-2 (1990）)。これは、過去１０年間、遺伝子導入実験で幅広く使用された機能性「ミニジストロフィン」の概念をもたらした。現在、ＣＲＤが不可欠である一方で、Ｎ−ＡＢＤ及びＣＴドメインが除去されると中程度の機能喪失が引き起こされることが認められている。ＲＤの変化は、トランケートの程度及び性質に依存して多様な表現型をもたらす。例えば、ＲＤが欠損したジストロフィン（ΔＲ１−Ｒ２４）は機能的ではないが、一方で、２４個の内８個の完全なスペクトリン様反復配列を保持するトランケートされたジストロフィン（ΔＨ２−Ｒ１９）は、完全な活性を有するタンパク質を生じる。
【０００９】
デュシェンヌ型筋ジストロフィーのための十分に特徴づけられた２種類の遺伝子動物モデルがある。ｍｄｘマウスは、ジストロフィン遺伝子のエクソン２３に、完全長の野生型ジストロフィンタンパク質合成を妨げるナンセンス突然変異を有する。ｍｄｘマウスは、機構損傷を修復するための再生過程を維持することができる、変性を抑制する代償機構を示す。ｍｄｘマウスは、ＤＭＤの症状を示さず、その生存期間はほとんど正常である。
【００１０】
ＧＲＭＤ（ゴールデンレトリーバ筋ジストロフィー）イヌは、イントロン６に、リーディングフレームを破壊するスプライス部位突然変異を有することにより機能性ジストロフィンが欠如している。ＧＲＭＤは、ヒトのＤＭＤと同様に、進行性の線維変性によって、顕著な筋内膜及び筋周囲線維化を伴う骨格筋萎縮に必然的に至る。ＧＲＭＤは、ＤＭＤ様の表現型をもつことから、依然としてＤＭＤの潜在的治療法の評価のための最も有用なモデルとなっている。
【００１１】
ＤＭＤの発症に関連するジストロフィン遺伝子の突然変異が同定及び特徴づけられ、そして、有望な治療薬剤を試験するための適切な動物モデル系が利用可能であるにも関わらず、この疾患を処置するための組成物及び方法が当技術分野において引き続き求められている。過去１０年にわたる研究の中には、デュシェンヌ型の男児においてステロイド処置（プレドニゾン及びデフラザコート）の有効性を支持しているものもあるが、広範な統計学的評価はまだ十分に完了していない。また、ゲンタマイシン薬物を用いて中途終止コドン突然変異を薬理学的に誘導させたリードスルーは、５％以下のＤＭＤ患者に有効である可能性がある。ｍｄｘマウスモデルの前臨床試験の結果が論争中であるにも関わらず、臨床試験がアメリカ及びイタリアで実施されている。PTC Therapeuticsにより開発された新規な薬物（ＰＴＣ１２４）がより有望であると思われる。また、喪失したジストロフィンの機能を補完することができる薬物、その成分であるジストロフィン様タンパク質のユートロフィンを使用してユートロフィン遺伝子をアップレギュレーションする研究が進行中である。
【００１２】
他にも多くの調査手段がある；例としては、最近、ブロッキング抗体を使用することによりミオスタチンに拮抗させて、ｍｄｘマウスの筋力を向上させることができたことが示された。このアプローチ法は、最初、正常筋芽細胞を罹患筋肉に複数回注射することに基づいていた（Partridge et al., Nature 337(6203):176-9 (1989)）。その後の臨床試験（１９９１〜９８年）は失敗に終わったが、細胞製造及び送達手順の改良によりカナダにおいて新たな第１相試験が可能になった（２００２年）。また、最近の進展において、遺伝子修復の詳細がまだ不確かであるにも関わらず、骨髄又は血管のいずれかに由来する幹細胞が、全身経路を介して骨格筋を標的化することができる証拠が提供された。
【００１３】
ＤＭＤの遺伝子療法は、媒体として遺伝子ベクターを使用する、骨格線維へのジストロフィンミニ遺伝子のin situ送達に依存している。ネイキッド完全長ｃＤＮＡを入れたプラスミドベクターを使用した最初の予備研究が、フランスで実施された（２０００〜０３年）。筋遺伝子療法で試験された様々なタイプのベクターの中で、アデノウィルス随伴ウィルス（ＡＡＶ）誘導ベクターが最も有望であると思われる。ＡＡＶベクターは、多くの利点を有する：（ｉ）これらは、筋線維を含む様々な種類の細胞に感染することができる；（ｉｉ）これらは、全てのウィルス遺伝子を欠損しており、さらに、その野生型ウィルスが今までにヒトのどんな病状とも関連していないことから安全であると思われる；（ｉｉｉ）宿主細胞のゲノムに組み込まれる野生型ＡＡＶとは反対に、複製欠損性ＡＡＶベクターは、通常、エピソームとして残存し、従って、挿入突然変異のリスク又は癌遺伝子の活性化を制限する；そして、（ｉｖ）他のベクター系とは対照的に、ＡＡＶベクターは、重大な免疫応答を引き起こさないため、治療導入遺伝子が長期間発現される（ただし、これらの遺伝子産物が拒絶されなかった場合）。ＡＡＶベクターは、また、高力価で産生することができ、少なくとも齧歯動物においては、強制動脈注射を行うことで、単回注射で多くの筋肉領域に遺伝子を導入することが可能となる。ＡＡＶベクターは、全てのウィルス遺伝子を欠損しているが、これらの送達積荷は、４．５kbまでに限られる。その理由から、ＡＡＶを選択すると、完全長ジストロフィン（１４kb）の代わりに約４kbのμ−ジストロフィン変異体を開発する結果に至った。これらの変異体のいくつかは、形質転換又は遺伝子導入のいずれかによりｍｄｘモデルで有利に試験された。
【００１４】
多くのＤＭＤ患者、並びに、ｍｄｘマウス及びＧＲＭＤイヌでは、珍しいジストロフィン陽性線維が報告された。復帰突然変異線維は時間に比例して増加するが、残念なことに、これらの復帰突然変異線維の数は有意な臨床的効果を付与するには少なすぎる。リーディングフレームがエクソンスキッピングにより修復されうることが研究により示唆されてはいるが、これらの復帰突然変異線維が生じる機構は、依然未知のままである。このような自然現象から、スプライシングに干渉、従って、エクソンスキッピングを誘導するための２’−Ｏ−メチルアンチセンスオリゴリボヌクレオチド並びにモルフォリノの使用に基づく、遺伝子修復／改変のための戦略の設計に向けた調査が促された。実際に、このアプローチ法は、in vitroのｍｄｘ、ＧＲＭＤ及びＤＭＤ筋肉細胞、さらに、in vivoで使用することに成功した（２’−Ｏ−メチルの場合では、ニュージーランドで第１相臨床試験が成功；モルフォリノを用いた第１相臨床試験は、ＵＫで進行中である）。しかし、このアプローチ法には、合成ＡＯの定期的な投与が必要であり、そして、全身送達が十分に達成されなかったという欠点がある。
【００１５】
代わりのアプローチ法は、アンチセンスＲＮＡ分子としてベクターからin situで対象配列を合成することである。しかし、「治療」アンチセンスＲＮＡ分子のin vivo産生は、安定性及び細胞内局在性などの多くの問題がある。スプライシング反応に関与することが知られている核内低分子ＲＮＡ（ｓｎＲＮＡ）を、キャリアーとして使用して、これらの制限を克服することができる。最近の報告では、ジストロフィン遺伝子のエクソン２３又はエクソン５１のいずれかのスプライス部位に対するアンチセンス配列を有するＵ７ ｓｎＲＮＡが、ｍｄｘ及びΔ４８−５０ＤＭＤ細胞のそれぞれにおいて、in vitro並びにin vivoでジストロフィン合成を誘導することが示された。
【００１６】
欠失に隣接する（いずれかの側の）単一エクソンのスキッピングが理論的に有効とされる、アウトオブフレーム欠失を有する全てのＤＭＤ患者でin silico研究が行われた。興味深いことに、エクソン５１のスキッピングは、事例（即ち、Δ４５−５０、Δ４７−５０、Δ４８−５０、Δ４９−５０、Δ５０及びΔ５２）の２２％において、ミニジストロフィンを修復することが予測される。結果として得られるトランケートされたタンパク質が、これらがいくつかのＢＭＤ患者で確認される欠失に相当することから、少なくとも部分的に機能的であることが期待される。さらに、わずかではあるが、Δ５１−５２及びΔ４８−５１のインフレーム欠失を有する健常男性が確認された。選択患者のエクソン５１のスキッピングにより、機能的なより短いジストロフィンが産生され、これによって、表現型が改善されるだろう。
【００１７】
精神遅滞は、ＤＭＤと関連することが多い症状であり、神経細胞においてジストロフィンが欠乏することにより引き起こされる。従って、脳において半機能性ジストロフィンをレスキューすることで、認識障害を修復又は改善することができる。
【００１８】
脊髄性筋萎縮症（ＳＭＡ）は、一般的に、１９９０年、５番染色体ｑ１１．２−１３．３上にマッピングされた生存運動ニューロン（ＳＭＮ）遺伝子において共通する遺伝子欠損から生じる様々な障害を指す。ヒトの５番染色体は、ＳＭＮ遺伝子の２コピー、ＳＭＮ１及びＳＭＮ２の大きな重複を含有する。
【００１９】
ＳＭＡは、遺伝的な新生児死亡の最も一般的な要因である。ＳＭＮが関連するＳＭＡの全ての形態は、約１／６，０００の合計発生率を有する。遺伝子頻度はおよそ１：８０であり、約４０人に１人がキャリアーである。キャリアーの健康への影響は知られておらず、その可能性を検討するために知りうる唯一の方法は、血縁者が罹患することである。
【００２０】
ＳＭＡは、脊髄及び脳幹の運動ニューロンの喪失を特徴とする。一般的に、症状が早い段階で現れるほど、予想される寿命は短くなる。一度症状が現れると、運動ニューロン細胞が急速に壊死する。ＳＭＡの全ての形態が、共通して、脱神経により引き起こされる筋力低下、即ち、神経刺激の喪失に起因して収縮シグナルが失われることによる筋萎縮を有する。脊髄性筋萎縮症は、運動ニューロンのみが冒される。感覚脱失に起因する感覚障害及び運動神経喪失に起因する筋力低下の両方を一緒に引き起こす遺伝性障害が、シャルコー・マリー・トゥース又は遺伝性運動感覚性ニューロパシーに包括的に分類されることが知られている。
【００２１】
ＳＭＡの進行は、筋力低下の重症度に直接関連する。ＳＭＡの重症型の幼児は、呼吸を維持する筋肉の脆弱が原因の呼吸器疾患で死亡することが多い。ＳＭＡの軽症型の子供は、生来かなり長く生きることができるが、特に、軽症型の中でもより重症者は広範な医療サポートが必要であろう。
【００２２】
重度の小児ＳＭＡ又はウェルドニッヒ・ホフマン病としても知られているＩ型ＳＭＡは最も重症であり、生後１年以内に現れる。この型は、一般的に、生後早く、そして突然発症する；Ｉ型ＳＭＡであると診断された新生児は、一般的に、１年以上生存することはできない。肺炎は、生存運動ニューロンの壊死に起因する最終的な死亡原因と考えられる；運動ニューロン死は、主要な身体の器官システム、特に、呼吸器（例えば、呼吸及び肺内に溜まった分泌物の除去）の機能不全を引き起こす。ＩＩ型ＳＭＡ（又は中間ＳＭＡ）では、子供は、起立及び歩行はできないが、一生の一定期間は座位を維持することができることが記載される。筋力低下の発生は、通常、６〜１８か月の時期に認められる。筋力低下は、個体の一生にわたってゆっくりと徐々に拡大する。ＩＩＩ型ＳＭＡ患者は、少しは歩行することができる。
【００２３】
ＳＭＡは、典型的に、機能性ＳＭＮ１遺伝子が少なくとも１コピーあるかどうかを決定する生存運動ニューロン（ＳＭＮ）遺伝子試験で診断される。ＳＭＮ１遺伝子は、完全にプロセッシングされたｍＲＮＡにおいてエクソン７及び８が存在するかどうかにより、よく類似するＳＭＮ２遺伝子と区別される。ＳＭＮ２遺伝子は、また、低レベルであるがタンパク質製造の効率を低下させる突然変異を含有する。ＳＭＡは、両方の染色体からのＳＭＮ１遺伝子の喪失及び機能性ＳＭＮ１タンパク質の喪失を補完するＳＭＮ２タンパク質の機能不全により引き起こされる。
【００２４】
ＳＭＡ治療薬を開発するための現在の戦略には、ＳＭＮ２レベルを増大させるか、残りのＳＭＮ２機能を増強させるか、あるいは、ＳＭＮ１活性の喪失を補完する薬物の同定が挙げられる。ブチラート、バルプロ酸、ヒドロキシウレア及びリルゾール（Rilutek（登録商標）、Sanofi Aventis）などの薬物が、ＳＭＡを処置するための臨床研究段階にある。遺伝子置換戦略が動物で試験されているが、現在のＳＭＡの処置は、慢性的な運動ユニット喪失の二次的な影響を予防及び管理することからなる。現在のところ、ＳＭＡの進行を修正する公知の薬物はなく、そして、ＳＭＡの遺伝子置換は、ヒトに応用することができるまでにさらに何年もの調査期間が必要となる可能性が高い。
【００２５】
筋緊張性ジストロフィー（ＤＭ）は、生後〜老齢期までのいずれの年齢においても現れる可能性のある慢性的でゆっくり進行する、非常に多様な遺伝性多臓器疾患である。筋緊張性ジストロフィーは、成人が発症する筋ジストロフィーの最も一般的な型であり、デュシェンヌ型筋ジストロフィー後のいずれかの骨格筋疾患で二番目に最も一般的な型である。ＤＭは、筋肉の萎縮（筋ジストロフィー）、後嚢下虹色白内障（眼のレンズの混濁）、心伝導系障害、内分泌変化及びミオトニー（筋肉の弛緩困難）を特徴とする。
【００２６】
現在、ＤＮＡ解析により同定可能な２つのよく知られたタイプの成人発症ＤＭがある：筋緊張性ジストロフィー１型（ＤＭ１）は、一般的に、新生児で重症化しうる先天性型及び子供が発症する型を有するシュタイネルト病と呼ばれる。筋緊張性ジストロフィー２型（ＤＭ２）は、ＰＲＯＭＭ又は近位型筋緊張性ミオパチーとしても知られている。筋緊張性ジストロフィーのさらなる型（例えば、ＤＭ３、ＤＭ４、ＤＭＸ）も疑われるが、これらの存在は未だ確認されていない。ＤＭ１及びＤＭ２は、両方とも緩徐な変性状態を示すと考えられるが、ＤＭ２は、一般的にＤＭ１よりも軽症であると考えられる。
【００２７】
症状の兆候は、型（ＤＭ１／ＤＭ２）、重症度、そして異常なＤＭ２表現型によって大きく変化する。ＤＭ１患者は、ミオトニー、重症の遠位筋力低下及び重度の認知障害を呈することが多い。ＤＭ２患者は、一般的に、筋肉痛、凝り、疲労又は下肢近位脱力の発症を呈する（Day et al. Neurology 60(4): 657-64 (2003)）。筋力低下の特徴的なパターンは、ＤＭ１とＤＭ２の場合で異なる。ＤＭ１では、顔及び顎筋、眼瞼下垂（眼瞼下垂症）、頸筋の筋力低下、手及び下肢で見られる。ＤＭ２では、筋力低下は、近位筋、即ち、身体の胴体、頸、肩、股関節屈筋及び太股に近い筋肉でより顕著である。
【００２８】
ＤＭ１の症状には、睡眠過剰（日中の眠気）、筋萎縮、嚥下障害及び呼吸不全が含まれる。ＤＭ１患者は、ＤＭ２患者よりも多様な認知障害を経験しうる。何型を有するか、そして、重症度に依存して、ＤＭ１の認知障害は、発育遅延、学習障害、言語、会話、挙動、無気力症又は睡眠過剰に及びうる。ＤＭ２の認知症状には、実行機能（即ち、組織化、集中、単語発見など）及び睡眠過剰に関する障害が含まれる。
【００２９】
ＤＭ１では、疾患遺伝子は、ＤＭＰＫ（筋緊張性ジストロフィープロテインキナーゼ）と呼ばれ、骨格筋で発現するセリン／トレオニンプロテインキナーゼをコードする。その遺伝子は、１９番染色体の長腕に位置する。ＤＭ１では、ＤＭＰＫ遺伝子は、シトシン−チミン−グアニン（ＣＴＧ）の三塩基反復配列を特徴とする。反復配列の数は、ヒトによって大きく変化するが、健常者の平均は５〜３７である。ＤＮＡの反復配列が細胞分裂の間に修復又は複製される時、細胞機構がずれ、三塩基反復配列の余分なコピーが配列に追加されることがある。ＤＭＰＫ遺伝子に３７を超える三塩基反復配列があると、その配列は不安定になりずれがよく起こるようになる。
【００３０】
ＤＭ１患者は５０を超える、そして、２０００ものＣＴＧ反復配列を有しうる。その結果、ＤＭ１を有する個体の反復配列のサイズが、配偶子形成又は初期胚発生過程で一般的により大きくなり、これにより、罹患した成人の子供が、典型的に、配偶子形成過程でのずれに起因してその親よりも大きな伸長を示す（この現象は表現促進と呼ばれる）。より大きな伸長を示す個体は障害の発症がより早く、より重度の表現型を呈する。
【００３１】
ＤＭ２は、同様に３番染色体ｑ２１上のＺＮＦ９遺伝子の欠損により引き起こされる。ＤＭ２の反復配列の伸長は、ＤＭ１の場合に比べ極めて大きく（７５〜１１，０００を超える反復配列）、そして４つのヌクレオチドの反復配列が関係する。しかし、ＤＭ１とは異なり、ＤＭ２においては、反復ＤＮＡの伸長のサイズは、発症の年齢又は疾患の重症度に影響があるように思われない。表現促進は、ＤＭ２では重要でないように思われる。
【００３２】
現在のところ、筋緊張性ジストロフィーに特化した治療又は処置法はない。心臓障害、白内障及びその症状を伴う他の異常は処置することができるが、治癒することはできない。しかし、ミオトニー、疼痛及び過剰な眠気などの症状のいくつかを軽減することができる医学的介入及び薬物治療がある。ハイスループットスクリーニング及びアンチセンス療法などの分野の研究は、将来に向けてより効果的な標的処置に希望を与えている。筋肉特異的クロライドチャネル１（ＣｌＣ−１）の改変スプライシングは、ＤＭ１の筋緊張性の表現型に影響を与え、ＣｌＣ−１のｍＲＮＡのスプライシングを改変するモルフォリノアンチセンスオリゴヌクレオチドを使用したマウスモデルにおいては可逆的である（Wheeler et al., J. Clin. Invest. 117(12):3952-7 (2007)）。
【００３３】
デュシェンヌ型筋ジストロフィー、脊髄性筋萎縮症及びスタイナート筋緊張性ジストロフィーに対する治療モダリティの研究が進行中であるにもかかわらず、これらの疾患を処置するための有効な化合物及び治療方法が緊急に求められている。
【００３４】
本開示の概要
本開示は、デュシェンヌ型筋ジストロフィー、脊髄性筋萎縮症及びスタイナート筋緊張性ジストロフィーなどの疾患を処置するための、トリシクロ−ＤＮＡ（ｔｃ−ＤＮＡ）アンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＯＮ）及びｔｃ−ＤＮＡ ＡＯＮを用いる方法を提供することによりこれらの及び他の関連する必要性を満たす。
【００３５】
本発明は、また、一般的に、対象にｔｃ−ＤＮＡアンチセンスオリゴヌクレオチドを投与することを含む、前記対象の中枢神経系の細胞における異常遺伝子発現を修正する方法であって、前記ｔｃ−ＤＮＡアンチセンスオリゴヌクレオチドが、前記遺伝子によりコードされるＲＮＡの一部に相補的であり、そして、前記ｔｃ−ＤＮＡアンチセンスオリゴヌクレオチドが、前記異常発現を修正するのに十分な量で対象に末梢投与される、方法に関する。
【００３６】
本発明は、また、対象にｔｃ−ＤＮＡアンチセンスオリゴヌクレオチドを投与することを含む、前記対象の中枢神経系における異常遺伝子発現により引き起こされる遺伝子疾患を処置するための方法であって、前記ｔｃ−ＤＮＡアンチセンスオリゴヌクレオチドが、前記遺伝子によりコードされるＲＮＡの一部に相補的であり、そして、前記ｔｃ−ＤＮＡアンチセンスオリゴヌクレオチドが、前記異常発現を修正するのに有効な量で対象に末梢投与される、方法に関する。
【００３７】
本発明は、また、ｔｃ−ＤＮＡアンチセンスオリゴヌクレオチドを含む医薬組成物であって、前記ｔｃ−ＤＮＡアンチセンスオリゴヌクレオチドが、ヒト遺伝子によりコードされるＲＮＡの一部に相補的であり、そして、前記組成物が薬学的に許容しうる賦形剤をさらに含む、医薬組成物に関する。
【００３８】
本発明は、また、対象の中枢神経系における異常遺伝子発現により引き起こされる遺伝子疾患の処置に使用するためのｔｃ−ＤＮＡアンチセンスオリゴヌクレオチドであって、前記ｔｃ−ＤＮＡアンチセンスオリゴヌクレオチドが、前記遺伝子によりコードされるＲＮＡの一部に相補的であり、そして、前記ｔｃ−ＤＮＡアンチセンスオリゴヌクレオチドが、前記異常発現を修正するのに有効な量で対象に末梢投与される、ｔｃ−ＤＮＡアンチセンスオリゴヌクレオチドに関する。
【００３９】
本明細書で使用される、用語「末梢投与」は、処置を必要とする対象の中枢神経系に直接注射することを意図しない任意の投与経路を含むがこれらに限定されない。さらに具体的には、末梢投与は、筋肉内（ｉ．ｍ．）、静脈内（ｉ．ｖ．）、腹腔内（ｉ．ｐ．）、動脈内、皮下又は経皮注射などの全身注射を含む。
【００４０】
本発明は、また、神経筋疾患又は筋骨格疾患の処置に使用するためのｔｃ−ＤＮＡアンチセンスオリゴヌクレオチドに関する。用いられるｔｃ−ＤＮＡアンチセンスオリゴヌクレオチドは、本明細書下記でさらに詳細に記載する。さらに具体的には、該ｔｃ−ＤＮＡアンチセンスオリゴヌクレオチドは、本明細書で示される特定のｔｃ−ＤＮＡの一つであることができる。
【００４１】
神経筋疾患又は筋骨格疾患は、遺伝子の変化から生じうるものであって、前記変化は、
エクソンのインフレーム突然変異、遺伝子の翻訳リーディングフレームを破壊する突然変異、
前記遺伝子によりコードされるｍＲＮＡにおける異常エクソンのインクルージョンにより補完されうる有害突然変異であって、ｔｃ−ＤＮＡは、前記遺伝子によりコードされるプレ−ｍＲＮＡに存在するＩＳＳ又はＴＳＬに相補的であり、そして、異常エクソンのインクルージョンを促進する、突然変異、又は、
前記遺伝子によりコードされるｍＲＮＡにおいて有害な３’ＣＵＧ増幅を生じる突然変異である。
【００４２】
特定の実施態様においては、変化がエクソンのインフレーム突然変異である場合、前記ｔｃ−ＤＮＡは、前記エクソンのスキッピングを促進することができる。別の実施態様においては、変化が遺伝子の翻訳リーディングフレームを破壊する突然変異である場合、前記ｔｃ−ＤＮＡは、遺伝子のリーディングフレームを修復するためにエクソンのスキッピングを促進することができる。別の実施態様においては、変化が前記遺伝子によりコードされるｍＲＮＡにおいて有害な３’ＣＵＧ増幅を生じる突然変異である場合、前記ｔｃ−ＤＮＡ ＡＯＮは、前記増幅を含有するｍＲＮＡを破壊することができる。
【００４３】
本明細書に示されるｔｃ−ＤＮＡ ＡＯＮは、例えば、より慣習的な２’−Ｏ−メチル−ホスホロチオエート又はモルフォリノ化学を用いるＤＮＡ ＡＯＮと比較して、相補的プレ−ｍＲＮＡとの向上したハイブリダイゼーション特性を示す拘束されたＤＮＡ ＡＯＮである。２’−Ｏ−メチル−ホスホロチオエート又はモルフォリノＤＮＡ ＡＯＮは、典型的に、特異的なプレ−ｍＲＮＡ標的ハイブリダイゼーションを達成するために２０〜２４ヌクレオチドを必要とするが、本開示のｔｃ−ＤＮＡ ＡＯＮは、１０〜１８ヌクレオチド長、より広範には、約６〜約２２ヌクレオチド長、特に、８〜２０ヌクレオチド長で特異的なプレ−ｍＲＮＡ標的ハイブリダイゼーションを可能にする。
【００４４】
以下により詳細に記載するように、エクソンスキッピングは、核内で、プレ−ｍＲＮＡの成熟過程において達成される。それは、プレ−ｍＲＮＡ内のエクソン決定配列に相補的であるアンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＯＮ）を使用することによる、標的エクソンのスプライシングに関与する鍵配列のマスキングを含む。本明細書においては、ジストロフィンプレ−ｍＲＮＡ内のイントロン−エクソン接合部におけるスプライス部位、あるいは、より一般的には、エクソン決定に使用される部位のマスキングによるエクソンスキッピングに適切に用いることができ、これにより、プレ−ｍＲＮＡから成熟ｍＲＮＡへのプロセッシング過程において有害なエクソンの除去が促進される、ｔｃ−ＤＮＡ ＡＯＮが提供される。このようなｔｃ−ＤＮＡ ＡＯＮは、ナンセンス、終始、フレームシフト突然変異を含有するエクソン配列又は有害な潜在性エクソンを含有するイントロン配列を含む突然変異ジストロフィン遺伝子のオープンリーディングフレームを修復することによりデュシェンヌ型筋ジストロフィーの処置で使用することができるであろう。
【００４５】
例えば、ジストロフィン遺伝子のエクソン２３又はエクソン５１内のナンセンス突然変異又はフレームシフト突然変異は、カルボキシ末端がトランケートされた、非機能性ジストロフィンタンパク質を生成する。本明細書に開示のｔｃ−ＤＮＡ ＡＯＮは、イントロン２３又はイントロン５１におけるジストロフィンプレ−ｍＲＮＡのスプライスドナー部位を含むヌクレオチド、そして、エクソン２３又はエクソン５１に隣接する５’ヌクレオチドにハイブリダイズすることにより、突然変異エクソン２３又はエクソン５１の成熟ｍＲＮＡ転写産物へのインクルージョンを抑制することができる。その成熟ｍＲＮＡ転写産物の発現により、エクソン２３又はエクソン５１によりコードされるアミノ酸が欠失しているが、これらの欠失アミノ酸のＮ−末端及びＣ−末端側の両方にジストロフィンアミノ酸を含有する機能性ジストロフィンタンパク質が生成され、従って、半機能性「擬ジストロフィン」が構成される。
【００４６】
ジストロフィンプレ−ｍＲＮＡのプロセッシング過程においてエクソンをスキッピングするための、本明細書に開示のｔｃ−ＤＮＡ ＡＯＮは、約６〜約２２ヌクレオチド、特に、約８〜２０トリシクロヌクレオチド、特に、１０〜１８トリシクロヌクレオチドを含有し、ｔｃ−ＤＮＡ ＡＯＮの８〜１６ヌクレオチドは、ジストロフィンプレ−ｍＲＮＡのイントロンスプライスドナー部位に相補的であり、ｔｃ−ＤＮＡ ＡＯＮの２〜８ヌクレオチドは、ジストロフィンプレ−ｍＲＮＡのエクソン領域に相補的であり、そして、イントロンスプライスドナー部位は、エクソン領域の５’側に隣接している。特定の態様の範囲内において、ｔｃ−ＤＮＡ ＡＯＮは、１２〜１６ヌクレオチド又は１３〜１５ヌクレオチドであり、イントロンスプライスドナー部位に相補的である６〜１４ヌクレオチド及びエクソン領域に相補的である２〜５ヌクレオチドを含む。しかし、より長いｔｃ−ＤＮＡ ＡＯＮを、ジストロフィンプレ−ｍＲＮＡのプロセッシング過程におけるエクソンスキッピングを達成するために適切に用いることができることが理解されるであろう。
【００４７】
本明細書において、ジストロフィンプレ−ｍＲＮＡ内の突然変異エクソン２３のスキッピングのために設計されたｔｃ−ＤＮＡ ＡＯＮが例示される。ｔｃ−ＤＮＡ ＡＯＮは、ヌクレオチド配列５’−ＡＡＣＣＴＣＧＧＣＴＴＡＣＣＴ−３’（Ｍ２３Ｄ（＋０２−１３）、配列番号１）を含み、ジストロフィンプレ−ｍＲＮＡのイントロン２３の３’末端でヌクレオチドに、そして、ジストロフィンプレ−ｍＲＮＡのエクソン２３に隣接する５’末端でヌクレオチドと特異的にハイブリダイズする。また、ジストロフィンプレ−ｍＲＮＡ内の突然変異エクソン５１のスキッピングのために設計されたｔｃ−ＤＮＡ ＡＯＮが提供される。ｔｃ−ＤＮＡ ＡＯＮは、５’−ＡＧＡＡＡＴＧＣＣＡＴＣＴＴＣ−３’（Ｈ５１（＋６８＋８２）、配列番号２）、５’−ＡＡＡＴＧＣＣＡＴＣＴＴＣＣＴ−３’（Ｈ５１（＋７０＋８４）、配列番号３）及び５’−ＴＧＣＣＡＴＣＴＴＣＣＴＴＧＡ−３’（Ｈ５１（＋７３＋８７）、配列番号４）からなる群より選択されるヌクレオチド配列を含み、ジストロフィンプレ−ｍＲＮＡのイントロン５１の３’末端でヌクレオチドに、そして、ジストロフィンプレ−ｍＲＮＡのエクソン５１の５’末端でヌクレオチドに特異的にハイブリダイズする。
【００４８】
下記の命名が本明細書で使用される：「Ｍ」は、マウスを指し、「Ｈ」は、ヒトを指し、「２３」及び「５１」は、特定のエクソンを指し、「Ｄ」は、ドナー部位を指し、「Ａ」は、アクセプター部位を指し、「＋」の後の数字は、エクソン配列のヌクレオチドの数を示し、そして、「−」の後の数字は、フランキングエクソンのヌクレオチドの数を示す。従って、例えば、Ｍ２３Ｄ（＋０２−１３）は、ｔｃ−ＤＮＡ ＡＯＮが、エクソン２３の３’−末端ヌクレオチドを２個及びイントロン２３の５’−末端ヌクレオチドを１３個包含し、ＡＯＮが、マウスジストロフィンのエクソン２３のドナースプライス部位をマスキングすることができることを表し、Ｈ５１（＋６８＋８２）は、ｔｃ−ＤＮＡ ＡＯＮが、ヒトジストロフィンのエクソン５１のヌクレオチド数６８〜ヌクレオチド数８２にわたることを表す。
【００４９】
本開示の他の態様は、生存運動ニューロン２（ＳＭＮ２）プレ−ｍＲＮＡ内のイントロンサイレンシング配列（ＩＳＳ）又は末端ステムループ（ＴＳＬ）をマスキングするために適切に用いることができるｔｃ−ＤＮＡ ＡＯＮを提供する。このようなｔｃ−ＤＮＡ ＡＯＮは、ＳＭＮ２プレ−ｍＲＮＡの成熟ｍＲＮＡへのプロセッシング過程における異常エクソンのインクルージョンを促進する。結果として得られる修飾された機能性ＳＭＮ２タンパク質は、インクルージョンされた異常エクソンによりコードされるアミノ酸配列を含有する。このような修飾された機能性ＳＭＮ２タンパク質は、非機能性ＳＭＮ１タンパク質を補完することができ、そして、in vivoで発現される場合、ＳＭＮ１遺伝子の突然変異により引き起こされる脊髄性筋萎縮症を少なくとも部分的に改善することができる。
【００５０】
例えば、ＳＭＮ２のエクソン７は、典型的に、対応するプレ−ｍＲＮＡのプロセッシングにより成熟ｍＲＮＡ転写産物から除かれるが、エクソン７の付加は、突然変異ＳＭＮ１タンパク質に対し機能性を補完することができる修飾された機能性ＳＭＮ２タンパク質を生成する。ｔｃ−ＤＮＡ ＡＯＮは、ＳＭＮ２プレ−ｍＲＮＡ内のＳＭＮ２のＩＳＳ又はＴＳＬを含むヌクレオチドにハイブリダイズすることにより、エクソン７の成熟ｍＲＮＡ転写産物へのインクルージョンを促進することができる。その成熟ｍＲＮＡ転写産物の発現により、エクソン７によりコードされるアミノ酸並びに含まれるアミノ酸のＮ−末端及びＣ−末端側の両方に他の全てのＳＭＮ２アミノ酸を含む修飾された機能性ＳＭＮ２タンパク質が生成される。
【００５１】
従って、本開示は、ＳＭＮ２プレ−ｍＲＮＡのプロセッシング過程におけるエクソン７のインクルージョンを促進するためのｔｃ−ＤＮＡ ＡＯＮであって、ｔｃ−ＤＮＡ ＡＯＮが、６〜２２トリシクロヌクレオチド長、具体的には、８〜２０トリシクロヌクレオチド長、さらに具体的には、１０〜１８トリシクロヌクレオチド長であり、そして、ｔｃ−ＤＮＡ ＡＯＮが、ＳＭＮ２プレ−ｍＲＮＡのイントロンサイレンサー配列（ＩＳＳ）又は末端ステムループ（ＴＳＬ）に相補的である、ｔｃ−ＤＮＡ ＡＯＮを提供する。このようなｔｃ−ＤＮＡ ＡＯＮは、１３〜１７ヌクレオチド、１２〜１６ヌクレオチド又は１３〜１５ヌクレオチドであることができる。本明細書において、ＳＭＮ２プレ−ｍＲＮＡのＩＳＳに相補的であり、そして、エクソン７のプロセッシングされたＳＭＮ２のｍＲＮＡへのインクルージョンを促進するために用いることができる、１５−ヌクレオチド配列５’−ＣＵＵＵＣＡＵＡＡＵＧＣＵＧＧ−３’（ＳＭＮ２ｉ７（１０；２５）、配列番号５）を含むｔｃ−ＤＮＡ ＡＯＮが例示される。また、本明細書において、ＳＭＮ２プレ−ｍＲＮＡのＴＳＬ２に相補的であり、そして、エクソン７のプロセッシングされたＳＭＮ２のｍＲＮＡへのインクルージョンを促進するために用いることができる、１３−ヌクレオチド配列５’−ＵＵＡＡＵＵＵＡＡＧＧＡＡ−３’（ＳＭＮ２ｅ７（３９；５１）、配列番号６）を含むｔｃ−ＤＮＡ ＡＯＮが例示される。また、本明細書に示されるｔｃ−ＤＮＡ ＡＯＮの組み合わせを用いることができることが理解されるであろう。
【００５２】
本開示のなおさらなる態様は、突然変異ＤＭ１のｍＲＮＡの破壊を促進するために適切に用いることができるｔｃ−ＤＮＡ ＡＯＮを提供する。このようなｔｃ−ＤＮＡ ＡＯＮは、９〜２７トリシクロヌクレオチドを含み、ｔｃ−ＤＮＡ ＡＯＮは、有害な３’ＣＵＧ増幅（ｎ＞５０）を含む突然変異ＤＭ１のｍＲＮＡに相補的であり、そして、ｔｃ−ＤＮＡ ＡＯＮは、前記ＤＭ１のｍＲＮＡのＲＮａｓｅ介在破壊を促進することができる。ｔｃ−ＤＮＡ ＡＯＮは、ヌクレオチド配列５’−ＣＡＧ−３’（配列番号７）の３〜９；４〜８；又は５、６若しくは７の連続反復配列を含むことができる。突然変異ＤＭ１の破壊を促進するための典型的なｔｃ−ＤＮＡ ＡＯＮは、１５−ヌクレオチド配列５’−ＣＡＧＣＡＧＣＡＧＣＡＧＣＡＧ−３’（ＤＭ１（ＣＡＧ５）、配列番号８）を含む。突然変異ＤＭ１の破壊を促進するための別の典型的なｔｃ−ＤＮＡ ＡＯＮは、２１−ヌクレオチド配列５’−ＣＡＧＣＡＧＣＡＧＣＡＧＣＡＧＣＡＧＣＡＧ−３’（ＤＭ１（ＣＡＧ７）、配列番号９）を含む。
【００５３】
他の態様においては、本開示は、ジストロフィンｍＲＮＡから突然変異エクソンを除去するための方法、ＳＭＮ２のｍＲＮＡ内における異常エクソンをインクルーディングするための方法及び細胞において病理数の３’ＣＵＧ増幅を含むＤＭ１のｍＲＮＡを破壊するための方法を提供する。これらの各方法は、細胞を、本明細書に開示されるようなｔｃ−ＤＮＡ ＡＯＮと接触させる工程を含む。
【００５４】
特定の実施態様の範囲内において、ジストロフィンプレ−ｍＲＮＡを発現する細胞を、６〜２２トリシクロヌクレオチド長、具体的には、８〜２０トリシクロヌクレオチド、さらに具体的には、１０〜１８トリシクロヌクレオチドを含有するｔｃ−ＤＮＡ ＡＯＮと接触させる工程を含む、ジストロフィンｍＲＮＡから突然変異エクソンを除去するための方法であって、ｔｃ−ＤＮＡ ＡＯＮの８〜１６ヌクレオチドが、ジストロフィンプレ−ｍＲＮＡのイントロンスプライスドナー部位に相補的であり、ｔｃ−ＤＮＡ ＡＯＮの２〜８ヌクレオチドが、ジストロフィンプレ−ｍＲＮＡのエクソン領域に相補的であり、そして、エクソン領域が、イントロンスプライスドナー部位の３’側に隣接している、方法が提供される。典型的な方法は、細胞を、１２〜１６ヌクレオチド又は１３〜１５ヌクレオチドのｔｃ−ＤＮＡ ＡＯＮと接触させる工程を含む。このような方法での使用に適切なｔｃ−ＤＮＡ ＡＯＮは、ヌクレオチド配列５’−ＡＡＣＣＴＣＧＧＣＴＴＡＣＣＴ−３’（Ｍ２３Ｄ（＋０２−１３）、配列番号１）；５’−ＡＧＡＡＡＴＧＣＣＡＴＣＴＴＣ−３’（Ｈ５１（＋６８＋８２）、配列番号２）、５’−ＡＡＡＴＧＣＣＡＴＣＴＴＣＣＴ−３’（Ｈ５１（＋７０＋８４）、配列番号３）及び５’−ＴＧＣＣＡＴＣＴＴＣＣＴＴＧＡ−３’（Ｈ５１（＋７３＋８７）、配列番号４）を含む。
【００５５】
他の実施態様の範囲内において、ＳＭＮ２プレ−ｍＲＮＡを発現している細胞を、６〜２２トリシクロヌクレオチド長、具体的には、８〜２０トリシクロヌクレオチド、さらに具体的には、１０〜１８又は１１〜１８トリシクロヌクレオチドを含有するｔｃ−ＤＮＡ ＡＯＮと接触させる工程を含む、ＳＭＮ２のｍＲＮＡ内における異常エクソンをインクルーディングするための方法であって、ｔｃ−ＤＮＡ ＡＯＮが、イントロン７内のＩＳＳ−Ｎ１などのＳＭＮ２プレ−ｍＲＮＡのイントロンサイレンサー配列（ＩＳＳ）に相補的である、方法が提供される。典型的な方法は、細胞を、１２〜１６ヌクレオチド又は１３〜１５ヌクレオチドのｔｃ−ＤＮＡ ＡＯＮと接触させる工程を含む。このような方法での使用に適切なｔｃ−ＤＮＡ ＡＯＮは、１５−ヌクレオチド配列５’−ＣＵＵＵＣＡＵＡＡＵＧＣＵＧＧ−３’（ＳＭＮ２ｉ７（１０；２５）、配列番号５）を含む。関連する方法の範囲内において、ｔｃ−ＤＮＡ ＡＯＮは、エクソン７内のＴＳＬ−２などのＳＭＮ２プレ−ｍＲＮＡの末端ステムループ（ＴＳＬ）に相補的である。このような方法での使用に適切なｔｃ−ＤＮＡ ＡＯＮは、１３−ヌクレオチド配列５’−ＵＵＡＡＵＵＵＡＡＧＧＡＡ−３’（ＳＭＮ２ｅ７（３９；５１）、配列番号６）を含む。
【００５６】
なおさらなる実施態様の範囲内において、細胞を、９〜２７トリシクロヌクレオチドを含むｔｃ−ＤＮＡ ＡＯＮと接触させる工程を含む、細胞において１以上の３’ＣＵＧ増幅を含むＤＭ１のｍＲＮＡを破壊するための方法であって、ｔｃ−ＤＮＡ ＡＯＮが、１以上の３’ＣＵＧ増幅を含む突然変異ＤＭ１のｍＲＮＡに相補的であり、そして、ｔｃ−ＤＮＡ ＡＯＮが、ＤＭ１のｍＲＮＡのＲＮａｓｅ介在破壊を促進することができる、方法が提供される。このような方法での使用に適切なｔｃ−ＤＮＡ ＡＯＮは、ヌクレオチド配列５’−ＣＡＧ−３’（配列番号７）の３〜９；４〜８；又は５、６若しくは７の連続反復配列を含み、１５−ヌクレオチド配列５’−ＣＡＧＣＡＧＣＡＧＣＡＧＣＡＧ−３’（ＤＭ１（ＣＡＧ５）、配列番号８）を含むｔｃ−ＤＮＡ ＡＯＮにより例示される。突然変異ＤＭ１の破壊を促進する別の典型的なｔｃ−ＤＮＡ ＡＯＮは、２１−ヌクレオチド配列５’−ＣＡＧＣＡＧＣＡＧＣＡＧＣＡＧＣＡＧＣＡＧ−３’（ＤＭ１（ＣＡＧ７）、配列番号９）を含む。
【００５７】
他の態様においては、本開示は、デュシェンヌ型筋ジストロフィー（ＤＭＤ）を処置するための方法、脊髄性筋萎縮症（ＳＭＡ）を処置するための方法及びスタイナート筋緊張性ジストロフィー（ＳＤ）を処置するための方法を提供する。これらの各方法は、患者に、ジストロフィンｍＲＮＡから突然変異エクソンを除去するために、ＳＭＮ２のｍＲＮＡ内における異常エクソンをインクルーディングするために、又は、１以上の３’ＣＵＧ増幅を含むＤＭ１のｍＲＮＡを破壊するために、本明細書に開示されるようなｔｃ−ＤＮＡ ＡＯＮを投与する工程を用いる。
【００５８】
本開示のこれらの及び他の実施態様、特徴並びに利点は、本明細書以下に記載する詳細な説明及び添付の特許請求の範囲から明らかとなるであろう。
【図面の簡単な説明】
【００５９】
【図１】図１は、アンチセンスオリゴヌクレオチドの作製で使用される様々な合成ヌクレオチドの表である。
【図２】図２は、トリシクロ−ＤＮＡ（ｔｃ−ＤＮＡ）の構造を表す。
【図３】図３は、ｍｄｘマウスが、ジストロフィン遺伝子のエクソン２３に機能性ジストロフィンの合成を妨げるナンセンス突然変異を有することを示すダイアグラムである。エクソン２３は、ＣからＴの突然変異が終始コドン（ＴＡＡ）を作製する反復配列Ｒ６及びＲ７を一部コードする。Ｍ２３Ｄ（＋０２−１３）で示される、エクソン２３の下流のドナースプライス部位におけるエクソンスキッピングのための１５ヌクレオチドのｔｃ−ＤＮＡ ＡＯＮは、ヌクレオチド配列５’−ＡＡＣＣＴＣＧＧＣＴＴＡＣＣＴ−３’（配列番号１）を有し、配列５’−エクソン２３…ＴＣＡＧｇｔａａｇｃｃｇａｇｇｔｔｔｇｇｃｃ…イントロン２３−３’（配列番号２）（大文字はエクソンヌクレオチドを表し、小文字はイントロンヌクレオチドを表す）で定義される標的のジストロフィンプレ−ｍＲＮＡのエクソン２３／イントロン２３接合部にハイブリダイズする。
【図４】図４は、オリゴフェクタミンの添加又は非添加で、１、２及び１０μgのｔｃ−ＤＮＡ ＡＯＮ Ｍ２３Ｄ（＋０２−１３）を用いてトランスフェクトしたｍｄｘの筋管における、ジストロフィンプレ−ｍＲＮＡのエクソン２３のスキッピングを示すネステッドＲＴ−ＰＣＲ反応のアガロースゲルである。４８時間後、培養物を回収、処理してｍＲＮＡを抽出した。
【図５】図５は、オリゴフェクタミンの存在下で、０．５、１、２、５及び１０μgのｔｃ−ＤＮＡ ＡＯＮ Ｍ２３Ｄ（＋０２−１３）を用いてトランスフェクトしたｍｄｘの筋管における、ジストロフィンプレ−ｍＲＮＡのエクソン２３のスキッピングを示すネステッドＲＴ−ＰＣＲ反応のアガロースゲルである。４８時間後、培養物を回収、処理してｍＲＮＡを抽出した。
【図６】図６は、オリゴフェクタミンの存在下で、５μgのｔｃ−ＤＮＡ ＡＯＮ Ｍ２３Ｄ（＋０２−１３）を用いてトランスフェクトしたｍｄｘの筋管における、ジストロフィンプレ−ｍＲＮＡのエクソン２３のスキッピングを示すネステッドＲＴ−ＰＣＲ反応のアガロースゲルである。トランスフェクション後０日目〜１５日目の培養物を回収、処理してｍＲＮＡを抽出した。
【図７】図７は、１００、８０、４０、２０、１０及び５μgのｔｃ−ＤＮＡ ＡＯＮ Ｍ２３Ｄ（＋０２−１３）を含有する５０μlのＰＢＳ（リン酸緩衝食塩水）を前脛骨筋に注射した８週齢のｍｄｘマウスにおける、ジストロフィンプレ−ｍＲＮＡのエクソン２３のスキッピングを示すネステッドＲＴ−ＰＣＲ反応のアガロースゲルである。３週間後に動物を屠殺し、筋肉試料を処理してｍＲＮＡ解析を行った。
【図８】図８は、１０μgのｔｃ−ＤＮＡ ＡＯＮ Ｍ２３Ｄ（＋０２−１３）を含有する５０μlのＰＢＳ（リン酸緩衝食塩水）を前脛骨筋に注射した８週齢のｍｄｘマウスにおける、ジストロフィンプレ−ｍＲＮＡのエクソン２３のスキッピングを示すＲＴ−ＰＣＲ反応のアガロースゲルである。４、１０及び２０週間後に動物を屠殺し、筋肉試料を処理してｍＲＮＡ解析を行った。
【図９】図９は、１０μgのｔｃ−ＤＮＡ ＡＯＮ Ｍ２３Ｄ（＋０２−１３）を含有する５０μlのＰＢＳ（リン酸緩衝食塩水）を注射した８週齢のｍｄｘマウス由来の前脛骨筋組織の横断面における、ジストロフィンの免疫染色の顕微鏡写真である。４、１０及び２０週間後に動物を屠殺し、筋肉試料を処理して免疫染色を行った。
【図１０】図１０は、正常マウス及びｔｃ−ＤＮＡ ＡＯＮ Ｍ２３Ｄ（＋０２−１３）を海馬又は脳脊髄液内に注射したｍｄｘマウスのＣＮＳにおける、ジストロフィンの免疫染色である。Ａ−Ｂ−Ｃは、正常、ｍｄｘ及び２０μgのｔｃ−ＤＮＡ Ｍ２３Ｄ（＋０２−１３）で処理した、単回髄腔内注射１か月後のｍｄｘの海馬レベルを示す断面である。Ｄ−Ｅ−Ｆは、正常、ｍｄｘ及び２００μgのｔｃ−ＤＮＡ Ｍ２３Ｄ（＋０２−１３）で処理した、脳脊髄液内に送達した１か月後のｍｄｘの小脳レベルを示す断面である。核は、ＤＡＰＩで対比染色する。
【図１１】図１１は、プレ−ｍＲＮＡの成熟ｍＲＮＡへの一般的なプロセッシングのダイアグラム表示である。
【図１２】図１２は、様々なｔｃ−ＤＮＡ ＡＯＮを含有する５０μlのＰＢＳ（リン酸緩衝食塩水）を前脛骨筋に注射した８〜１０週齢のｈＤＭＤマウスにおける、ジストロフィンプレ−ｍＲＮＡのエクソン５１のスキッピングを示すネステッドＲＴ−ＰＣＲ反応のアガロースゲルである。
【図１３】図１３は、ＳＭＮ１及びＳＭＮ２遺伝子のイントロン−エクソン構造及び染色体上の位置のダイアグラム表示である。
【図１４】図１４は、ｍＲＮＡスプライシングに影響するエクソン７を主に欠損するＳＭＮ２における点突然変異（Ｃ６Ｔ）のダイアグラム表示である。
【図１５】図１５は、イントロン６−エクソン７境界でのスプライスアクセプター（「ＳＡ」）７及びエクソン７−イントロン７境界でのスプライスドナー（ＳＤ）７の使用を改良することにより、ＳＭＮ２において、増加したエクソン７のインクルージョンのダイアグラム表示である。
【図１６】図１６は、ＳＭＮ１及びＳＭＮ２のエクソン７の構造のダイアグラム表示である。
【図１７】図１７は、ＳＭＮ１及びＳＭＮ２のエクソン７の構造におけるｔｃ−ＤＮＡ ＡＯＮ ＳＭＮ２ｅ７（３９；５１）（配列番号６）の標的配列及び相加効果のダイアグラム表示である。配列５’−ＵＵＡＡＵＵＵＡＡＧＧＡＡＵＧＵＧ−３’を有するｔｃ−ＤＮＡ ＡＯＮ ＳＭＮ２ｅ７（３９；５１）は、ＳＭＮ２における末端ステムループ２の構造を破壊する可能性が高く、これにより、ＳＭＮ１及びＳＭＮ２におけるエクソン７のインクルージョンが増加する。
【図１８】図１８は、ＳＭＮ１及びＳＭＮ２のエクソン７のインクルージョンにおけるｔｃ−ＤＮＡ ＡＯＮ ＳＭＮ２ｉ７（１０；２５）（配列番号５）の標的配列及び相加効果のダイアグラム表示である。配列５’−ＣＡＣＵＵＵＣＡＵＡＡＵＧＣＵＧＧ−３’を有するｔｃ−ＤＮＡ ＡＯＮ ＳＭＮ２ｉ７（１０；２５）は、イントロンサイレンサー配列（「ＩＳＳ」）−Ｎ１の認識を妨げる可能性が高く、エクソン７−イントロン７境界での５’スプライス部位の認識を可能にする。ＥＸＩＮＣＴは、拡張阻害状況（EXtended INhibitory ContexT）を指す。広範な突然変異解析に基づき、Ｃ６Ｕは、エクソン７決定に影響する拡張阻害状況を生成することが示された。
【図１９Ａ】図１９は、ＳＭＡ患者由来の線維芽細胞（Ｇ０３８１３細胞株）のＳＭＮ２におけるエクソン７のインクルージョンを示す、ＲＴ−ＰＣＲ反応のアガロースゲル（パネルＢ）及び正規化プロット（パネルＡ）である。４８時間後、培養物を回収、処理してｍＲＮＡを抽出した。単純線は、疑似処理した（mock treated）コントロール細胞に相当し、破線は、ｔｃ−ＤＮＡ ＡＯＮ ＳＭＮ２ｉ７（１０；２５）（ｔｃ−Ｉ７と呼ばれる）処理細胞に相当し、点線は、ｔｃ−ＤＮＡ ＡＯＮ ＳＭＮ２ｅ７（３９；５１）（ｔｃ−ＴＳＬと呼ばれる）処理細胞に相当する。各線おいて、プロットを、ＳＭＮ１＋ＳＭＮ２（完全長）＋ＳＭＮ２（Δ７）の総数に従って正規化した。
【図１９Ｂ】図１９は、ＳＭＡ患者由来の線維芽細胞（Ｇ０３８１３細胞株）のＳＭＮ２におけるエクソン７のインクルージョンを示す、ＲＴ−ＰＣＲ反応のアガロースゲル（パネルＢ）及び正規化プロット（パネルＡ）である。４８時間後、培養物を回収、処理してｍＲＮＡを抽出した。単純線は、疑似処理した（mock treated）コントロール細胞に相当し、破線は、ｔｃ−ＤＮＡ ＡＯＮ ＳＭＮ２ｉ７（１０；２５）（ｔｃ−Ｉ７と呼ばれる）処理細胞に相当し、点線は、ｔｃ−ＤＮＡ ＡＯＮ ＳＭＮ２ｅ７（３９；５１）（ｔｃ−ＴＳＬと呼ばれる）処理細胞に相当する。各線おいて、プロットを、ＳＭＮ１＋ＳＭＮ２（完全長）＋ＳＭＮ２（Δ７）の総数に従って正規化した。
【図１９Ｃ】パネルＣは、指定のｔｃ−ＤＮＡオリゴヌクレオチドでトランスフェクトしたＧ０３８１３細胞におけるＳＭＮレベルを示すウエスタンブロットである。アクチンは、ローディングコントロールとして示される。注目すべきは、ｔｃ−ＤＮＡ ＡＯＮ ＳＭＮ２ｉ７（１０；２５）（ｔｃ−ＩＳＳ７と呼ばれる）及びｔｃ−ＤＮＡ ＡＯＮ ＳＭＮ２ｅ７（３９；５１）（ｔｃ−ＴＳＬと呼ばれる）のＳＭＮ２産生に及ぼす相加効果である。
【図１９Ｄ】パネルＤは、ｔｃ−ＴＳＬ処理細胞におけるＳＭＮの核局在化（黒色ドット）を示す顕微鏡写真である。核は、ＤＡＰＩで対比染色する。
【図２０Ａ】図２０（パネルＡ）は、in vitroでＤＭ１筋芽細胞にトランスフェクトされるｔｃ−ＤＮＡ ＡＯＮ ＤＭ１（ＣＡＧ７）（ｔｃ−ＤＮＡ（ＣＡＧ）７と呼ばれる）の量の増加とともに、減少する変異体ヒトＤＭＰＫのｍＲＮＡレベルを示すノーザンブロットである。３日後、培養物を回収、処理してｍＲＮＡを抽出し、ノーザンブロット解析を行った。
【図２０Ｂ】パネルＢは、変異体ＤＭＰＫのｍＲＮＡの正常ＤＭＰＫのｍＲＮＡに対する比を反映する定量プロットである。
【図２１Ａ】図２１（パネルＡ）は、７００ＣＵＧ反復配列を有するヒトＤＭＰＫのｍＲＮＡを発現するＤＭ１マウスのＴＡ筋肉に注射される、配列５’−ＣＡＧＣＡＧＣＡＧＣＡＧＣＡＧＣＡＧＣＡＧ−３’（配列番号９）を有するｔｃ−ＤＮＡ ＡＯＮ ＤＭ１（ＣＡＧ７）（ｔｃ−ＤＮＡ（ＣＡＧ）７と呼ばれる）の量の増加とともに、減少する変異体ヒトＤＭＰＫのｍＲＮＡレベルを示すノーザンブロットである。
【図２１Ｂ】パネルＢ及びＤは、それぞれ、パネルＡ及びＣからのノーザンブロットにおける、変異体ヒトＤＭＰＫのｍＲＮＡのマウスＤＭＰＫのｍＲＮＡに対する比を反映する定量プロットである。
【図２１Ｃ】パネルＣは、３０又は６０μgのｔｃ−ＤＮＡ ＡＯＮ ＤＭ１（ＣＡＧ７）がＤＭ１マウス（ｎ＝４）のＴＡ筋肉に注射された場合の、減少した変異体ヒトＤＭＰＫのｍＲＮＡレベルを示すノーザンブロットである。
【図２１Ｄ】パネルＢ及びＤは、それぞれ、パネルＡ及びＣからのノーザンブロットにおける、変異体ヒトＤＭＰＫのｍＲＮＡのマウスＤＭＰＫのｍＲＮＡに対する比を反映する定量プロットである。
【００６０】
発明の詳細な説明
本開示は、トリシクロ−ＤＮＡ（ｔｃ−ＤＮＡ）アンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＯＮ）を、ジストロフィン遺伝子内のプレ−ｍＲＮＡスプライス部位をマスキングするために、ＳＭＮ２遺伝子内のイントロンサイレンシング配列又は末端ステムループ配列をマスキングするために、又は、１以上の３’ＣＵＧ増幅を含むＤＭ１のｍＲＮＡを破壊するために適切に用いることができる予想外の発見に基づく。これらの発見は、一般的に、遺伝子疾患の処置において、さらに具体的には、デュシェンヌ型筋ジストロフィー、脊髄性筋萎縮症及びスタイナート筋緊張性ジストロフィーの処置において広範に適用される。
【００６１】
トリシクロ−ＤＮＡ（ｔｃ−ＤＮＡ）は、相補的ＲＮＡに対して向上したハイブリダイズ能力を示す新しいクラスの拘束されたＤＮＡ類似体に属する（Ittig et al., Nucleic Acids Res. 32:346-353 (2004); Ittig et al., Prague, Academy of Sciences of the Czech Republic. 7:21-26 (Coll. Symp. Series, Hocec, M., 2005); Ivanova et al., Oligonucleotide 17:54-65 (2007); Renneberg et al., Nucleic Acids Res. 30:2751-2757 (2002); Renneberg et al., Chembiochem. 5:1114-1118 (2004);及びRenneberg et al., JACS. 124:5993-6002 (2002)）。本明細書に開示のプレ−ｍＲＮＡ／ｔｃ−ＤＮＡ ＡＯＮヘテロ二本鎖はＲＮａｓｅＨに耐性を示し、結果として、標的プレ−ｍＲＮＡの破壊が抑制される。トリシクロ−ＤＮＡ化学の利点は、その骨格の構造的特性により、相補的ヌクレオチド配列との高親和性及び高特異的なハイブリダイゼーションを保持しながらＡＯＮの長さを短くすることができることである。予想外にも、ｔｃ−ＤＮＡ ＡＯＮは、in vivo環境で、筋肉内適用を用いて、マイクログラム用量で有利に使用することができる。これは、従来のアンチセンスオリゴヌクレオチド技術に必要な用量の少なくとも１０倍低い用量である。さらに、ｔｃ−ＤＮＡは、短いアンチセンス長で十分な活性を保持する。従って、例えば、１３〜１５ヌクレオチドのｔｃ−ＤＮＡ ＡＯＮは、本開示で例示するように、ex vivo及びin vivo適用において極めて有効である。
【００６２】
本明細書に記載のｔｃ−ＤＮＡ ＡＯＮは、また、例えば、２’−Ｏ−メチル−ホスホロチオエート又はモルフォリノ化学などの既存のアンチセンスオリゴヌクレオチド化学と比較して、増加したin vivo安定性を示す。従って、例えば、本開示のｔｃ−ＤＮＡ ＡＯＮの単回筋肉内注射は、in vivoにおいて、投与後２０週間以上効果が維持される。
【００６３】
さらに、そして、実に驚くべきことに、Ｍ２３Ｄ（＋０２−１３）で示されるｔｃ−ＤＮＡ ＡＯＮで例示されるような、本開示のｔｃ−ＤＮＡ ＡＯＮは、実質内若しくは脳室内投与を介して又はクモ膜下腔への投与のいずれかにより、中枢神経系（ＣＮＳ）に送達され、海馬ＣＡ１のニューロン内又は脳又は小脳皮質のニューロン内の突然変異ジストロフィン遺伝子などの突然変異遺伝子を修復することができる。従って、本明細書に記載のｔｃ−ＤＮＡ ＡＯＮは、上衣境界を効率的に横断することができることが示される。
【００６４】
本開示は、下記の定義を参照することにより最もよく理解できるであろう：
【００６５】
定義
本明細書で使用される、用語「トリシクロ−ＤＮＡ（ｔｃ−ＤＮＡ）」は、各ヌクレオチドが、シクロプロパン環の導入により修飾され、骨格の立体配置フレキシビリティが制限され、そして、ねじれ角γの骨格配置が最適化された、拘束されたＤＮＡ類似体のクラスを指す。ホモ塩基アデニン及びチミン含有ｔｃ−ＤＮＡは、相補的ＲＮＡと非常に安定なＡ−Ｔ塩基対合を形成する。
【００６６】
本明細書で使用される、用語「アンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＯＮ）」は、相補的ヌクレオチド配列を有するプレ−ｍＲＮＡ又はｍＲＮＡと相互作用及び／又はハイブリダイズし、それによって遺伝子発現を改変することができるオリゴヌクレオチドを指す。酵素依存性アンチセンスオリゴヌクレオチドは、標的ｍＲＮＡを分解するＲＮａｓｅＨ活性に依存性であり、一本鎖ＤＮＡ、ＲＮＡ及びホスホロチオエートアンチセンスの形態を含む。立体ブロッキングアンチセンスオリゴヌクレオチド（ＲＮａｓｅＨ非依存性アンチセンス）は、ｍＲＮＡの標的配列と結合することにより、遺伝子発現又は他のｍＲＮＡ依存性細胞プロセスに干渉する。立体ブロッキングアンチセンスには、２’−Ｏ−アルキルアンチセンスオリゴヌクレオチド、モルフォリノアンチセンスオリゴヌクレオチド及びトリシクロ−ＤＮＡアンチセンスオリゴヌクレオチドが含まれる。本明細書に記載するように、特定の適用の範囲内で、ｔｃ−ＤＮＡアンチセンスオリゴヌクレオチドは、例えば、１以上の３’ＣＵＧ増幅を含むＤＭ１のｍＲＮＡのＲＮａｓｅ介在破壊などの酵素依存性適用に用いることができる。
【００６７】
本明細書で使用される、「相補的」は、核酸分子が、別の核酸分子と相補的ヌクレオシド又はヌクレオチド間で、従来のワトソン−クリック塩基対合又は他の非従来型の対合（例えば、Hoogsteen又は逆Hoogsteen水素結合）のいずれかにより、水素結合を形成することができることを指す。本開示のｔｃ−ＤＮＡ ＡＯＮに関して、ｔｃ−ＤＮＡ ＡＯＮのその相補的配列との結合自由エネルギーは、ｔｃ−ＤＮＡ ＡＯＮの適切な機能を進行させるのに十分であり、そして、特異的結合が求められる条件下、即ち、ex vivo又はin vivo治療的処置の場合では、生理学的条件下で、ｔｃ−ＤＮＡ ＡＯＮの非標的配列への非特異的結合を回避するために十分な相補性レベルがある。核酸分子の結合自由エネルギーの決定は、当技術分野で公知である（例えば、Turner et al., CSH Symp. Quant. Biol. LII:123-133 (1987); Frier et al., Proc. Nat. Acad. Sci. USA 83:9373-77 (1986);及びTurner et al., J. Am. Chem. Soc. 109:3783-3785 (1987)参照）。従って、「相補的」（又は特異的にハイブリダイズ可能な）は、ｔｃ−ＤＮＡ ＡＯＮとプレ−ｍＲＮＡ又はｍＲＮＡ標的間で、安定で特異的な結合が形成されるように、十分な相補性又は正確な塩基対合のレベルを示す用語である。
【００６８】
核酸分子が、特異的にハイブリダイズ可能であるために標的核酸配列に１００％相補的である必要はないことは当技術分野で理解されている。つまり、２つ以上の核酸分子が、完全に相補的でなくてもよい。相補性は、第二の核酸分子と水素結合を形成することができる核酸分子の隣接残基のパーセンテージで示される。例えば、第一の核酸分子が１０ヌクレオチドであり、第二の核酸分子が１０ヌクレオチドである場合、第一及び第二の核酸分子間の５、６、７、８、９又は１０ヌクレオチドの塩基対合は、それぞれ、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％及び１００％の相補性を表す。「完璧（Perfectly）」又は「完全（fully）」に相補的な核酸分子は、第一の核酸分子の隣接残基の全てが、第二の核酸分子の同じ数の隣接残基と水素結合する核酸分子を意味し、ここで、核酸分子の両方が同じ数のヌクレオチドを有する（即ち、同じ長さを有する）か又は２つの分子が異なる長さを有する。
【００６９】
本明細書で使用される、用語「前駆体ｍＲＮＡ」又は「プレ−ｍＲＮＡ」は、１以上の介在配列（イントロン）を含有する未熟な一本鎖メッセンジャーリボ核酸（ｍＲＮＡ）を指す。プレ−ｍＲＮＡは、細胞核内で、ＲＮＡポリメラーゼにより鋳型ＤＮＡから転写され、それは、イントロン及びコード領域（エクソン）の交互配列からなる。プレ−ｍＲＮＡが、イントロンのスプライシング除去及びエクソンの連結により完全にプロセッシングされると、それは、エクソンのみからなるＲＮＡである「メッセンジャーＲＮＡ」又は「ｍＲＮＡ」と呼ばれる。真核生物のプレ−ｍＲＮＡは、完全にｍＲＮＡにプロセッシングされる前に一時的にのみ存在する。プレ−ｍＲＮＡが、ｍＲＮＡ配列に適切にプロセッシングされると、核外に輸送され、最終的に細胞質内でリボソームによりタンパク質へと翻訳される。
【００７０】
本明細書で使用される、用語「スプライシング」及び「プロセッシング」は、イントロンが除去されエクソンが連結される、転写後のプレ−ｍＲＮＡの修飾を指す（図１１参照）。スプライシングは、スプライセオソームと呼ばれる５つの核内低分子リボヌクレオタンパク質（ｓｎＲＮＰ）からなる巨大なＲＮＡ−タンパク質複合体に触媒される一連の反応で起こる。イントロン内で、３’スプライス部位、５’スプライス部位及びブランチ部位がスプライシングに必要である。ｓｎＲＮＰのＲＮＡ成分がイントロンと相互作用し、触媒に関与することができる。
【００７１】
プレ−ｍＲＮＡスプライシングは、２つの連続した生化学反応である。両方の反応が、スプライセオソームによるＲＮＡヌクレオチド間のエステル交換を含む。第一の反応では、スプライセオソーム会合の間に決定されるイントロン内の特異的なブランチポイントヌクレオチドの２’−ＯＨが、イントロンの第一のヌクレオチド上の５’スプライス部位で求核攻撃を行いラリアット中間体が形成される。第二の反応では、解放された５’エクソンの３’−ＯＨが、イントロンの最後のヌクレオチドの３’スプライス部位で求核攻撃を行い、それによって、エクソンが連結しイントロンラリアットが切り出される。プレ−ｍＲＮＡスプライシングは、イントロンサイレンサー配列（ＩＳＳ）及び末端ステムループ（ＴＳＬ）配列により制御される。
【００７２】
本明細書で使用される、用語「イントロンサイレンサー配列（ＩＳＳ）」及び「末端ステムループ（ＴＳＬ）」は、それぞれ、プレ−ｍＲＮＡ内でトランス作用タンパク質ファクターの結合により選択的スプライシングをコントロールし、それによって、スプライス部位の特異的使用をもたらす、イントロン及びエクソン内の配列エレメントを指す。典型的には、イントロンサイレンサー配列は８〜１６ヌクレオチドであり、エクソン−イントロン接合部でスプライス部位より保存されていない。末端ステムループ配列は、典型的には、１２〜２４ヌクレオチドであり、相補性、従って、結合により、１２〜２４ヌクレオチド配列内で第二のループ構造を形成する。
【００７３】
本明細書で使用される、用語「脊髄性筋萎縮症（ＳＭＡ）」は、それぞれが、共通して脊髄及び脳幹の運動ニューロンの喪失に起因する遺伝的要因及び筋力低下の兆候を有する、様々な臨床型の５番染色体連鎖ＳＭＡを指す。脊髄性筋萎縮症は、生存運動ニューロン遺伝子ＳＭＮ１内の突然変異により引き起される。ＳＭＮ１遺伝子の少なくとも１つの正常な対立遺伝子が正常な機能に必要である。
【００７４】
ＳＭＮ（生存運動ニューロン）遺伝子を含有する５番染色体の領域は、大きな重複を有する。複数の遺伝子を含有する大きな配列が隣接セグメントに２回現れる。従って、その遺伝子の２コピー、ＳＭＮ１及びＳＭＮ２が存在する。ＳＭＮ２遺伝子は、低レベルであるがタンパク質製造の効率を低下させるさらなる突然変異を有する。ＳＭＡは、両方の染色体からＳＭＮ１遺伝子が喪失することにより引き起こされる。ＳＭＡ（ＳＭＡ１〜ＳＭＡ３）の重症度は、残りのＳＭＮ２遺伝子がＳＭＮ１の喪失をどの程度補完することができるかに一部関係している。しばしば、ＳＭＮ２のさらなるコピーが存在し、ＳＭＮ２のコピー数の増加が重症度の低い疾患に関係している。
【００７５】
「対象」は、移植細胞のドナー若しくはレシピエントである生物又は細胞自体を意味する。「対象」は、また、本開示の核酸分子を投与することができる生物を指す。一実施態様においては、対象は、哺乳類又は哺乳類細胞である。別の実施態様においては、対象は、ヒト又はヒト細胞である。
【００７６】
本明細書で使用される、用語「治療有効量」は、投与される対象（例えば、ヒト）において、言及された疾患、障害若しくは状態を治療又は予防するのに十分なｔｃ−ＤＮＡ ＡＯＮの量を意味する。本開示のｔｃ−ＤＮＡ ＡＯＮは、個別に、あるいは、他の薬物と組み合わせて又は併用して、本明細書で論じられる疾患又は状態を処置するために使用することができる。例えば、特定の疾患、障害又は状態を処置するために、ｔｃ−ＤＮＡ ＡＯＮを、処置に適切な条件下で、個別に、あるいは、１以上の薬物と組み合わせて、患者に投与することができるか、あるいは、当業者によく知られた他の適切な細胞に投与することができる。
【００７７】
本明細書で使用される、語句「薬学的に許容しうる」は、分子エンティティ及び組成物が、生理学的に許容され、そして、ヒトに投与される場合、例えば、異常亢進、目まいなどのアレルギー又は同様の有害な反応を典型的に起こさないことを指す。好ましくは、本明細書で使用される、用語「薬学的に許容しうる」は、動物、さらに具体的には、ヒトでの使用で、連邦管理機関又は州政府で承認される、あるいは、米国薬局方又は他の一般的に認定された薬局方に記載されることを意味する。
【００７８】
本明細書で使用される、用語「単離された」は、言及された物質がその自然環境、例えば、細胞から除去されることを意味する。従って、単離された生体物質は、細胞成分、即ち、天然物質が自然に生じる細胞の成分（例えば、細胞質又は膜成分）の一部又は全てを含有しないことであることができる。
【００７９】
本明細書で使用される、用語「精製された」は、物質が、無関係な物質、即ち、不純物（物質が得られる天然物質など）の存在を低減又は除去する条件下で単離されることを指す。例えば、精製されたｔｃ−ＤＮＡ ＡＯＮは、好ましくは、細胞又は培養成分、例えば、組織培養成分、不純物などを実質的に含有しない。本明細書で使用される、用語「実質的に含有しない」は、物質の分析試験に関連して適宜使用される。好ましくは、不純物を実質的に含有しない精製された物質は、少なくとも５０％純粋、より好ましくは、少なくとも９０％純粋、さらにより好ましくは、少なくとも９９％純粋である。純度は、クロマトグラフィー、ゲル電気泳動、イムノアッセイ、組成分析、バイオアッセイ及び当技術分野で公知の他の方法により評価することができる。
【００８０】
本明細書において、任意の濃度範囲、パーセント範囲、比率範囲又は整数範囲は、特に明記しない限り、列挙される範囲内の任意の整数の値を含み、そして、必要に応じて、その分数（整数の１／１０及び１／１００など）を含むものと理解される。また、ポリマーのサブユニット、サイズ又は厚さ（thickness）などの任意の物理的性質に関係する、本明細書で列挙される任意の数字範囲は、特に明記しない限り、列挙される範囲内の任意の整数を含むものと理解される。本明細書で使用される、「約」又は「から本質的になる」は、特に明記しない限り、指定の範囲、値又は構造の±２０％を意味する。
【００８１】
本明細書で使用される、用語「含む（include）」及び「含む（comprise）」は、同義的に使用される。本明細書で使用される、用語「ａ」及び「ａｎ」は、列挙される要素の「１以上」を指すことを理解されたい。選択肢（例えば、「又は」）の使用は、選択肢の１つ、両方又はその任意の組み合わせのいずれかを意味することを理解されたい。
【００８２】
用語「約」又は「およそ」は、統計学的に有意な範囲の値内を意味する。このような範囲は、所定の値又は範囲の、好ましくは、その５０％以内、より好ましくは、その２０％以内、さらにより好ましくは、その１０％以内、なおさらに好ましくは、その５％以内であることができる。用語「約」又は「およそ」に包含される許容偏差は、研究対象の特定の系に依存し、当業者は容易に理解することができる。
【００８３】
デュシェンヌ型筋ジストロフィーを処置するためのトリシクロ−ＤＮＡアンチセンスオリゴヌクレオチド
上述するように、特定の実施態様の範囲内において、本開示は、筋肉変性が急速に進行することにより、最終的に、歩行障害、麻痺、そして死に至ることを特徴とする筋ジストロフィーの重度のＸ連鎖劣性型である、デュシェンヌ型筋ジストロフィー（ＤＭＤ）の処置に適切に用いることができるｔｃ−ＤＮＡ ＡＯＮを提供する。ＤＭＤは、ヒトＸ染色体に位置するジストロフィン遺伝子内の、ナンセンス突然変異又はフレームシフト突然変異などの突然変異により引き起こされる。ジストロフィン遺伝子は、細胞膜に位置する筋線維鞘並びにジストログリカン複合体（ＤＧＣ）に構造安定性をもたらす、筋肉組織内の重要な構造成分であるジストロフィンタンパク質をコードする。ナンセンス突然変異又はフレームシフト突然変異は、翻訳の未完終了をもたらし、従って、Ｃ−末端がトランケートされたジストロフィンタンパク質が生じる。
【００８４】
１以上の停止突然変異又はフレームシフト突然変異により引き起こされるＤＭＤは、翻訳リーディングフレームを修復するために１以上のエクソンを除去することにより、突然変異のｍＲＮＡ配列下流が修復され、緩和することができる。これを達成するために、本開示の一部として、１以上のエクソンのスプライセオソーム認識をマスキングすることができるプレ−ｍＲＮＡ内の領域を標的化するｔｃ−ＤＮＡ ＡＯＮが開発された。これらの領域をｔｃ−ＤＮＡ ＡＯＮで標的化することにより、エクソンを選択的スプライシングで除去し成熟機能性ジストロフィンｍＲＮＡを生成することができる。
【００８５】
従って、本明細書に記載のｔｃ−ＤＮＡ ＡＯＮは、ジストロフィンプレ−ｍＲＮＡのプロセッシング過程における、ジストロフィン遺伝子の１以上の突然変異エクソンのスキッピングを促進し、これにより、得られるジストロフィンｍＲＮＡの適切なリーディングフレームを修復するのに効果的であり、これが翻訳されると、機能性ジストロフィンタンパク質を生成する。従って、本明細書に開示のｔｃ−ＤＮＡ ＡＯＮは、ＤＭＤ罹患患者に治療的に使用することができる。
【００８６】
本明細書で使用される、用語「エクソンスキッピング」は、１以上の相補的アンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＯＮ）で、プレ−ｍＲＮＡ内のスプライスドナー及び／又はアクセプター部位を標的化することによるプレ−ｍＲＮＡスプライシングの修飾を指す。１以上のスプライスドナー又はアクセプター部位へのスプライセオソームのアクセスをブロックすることにより、ＡＯＮはスプライシング反応を妨害することができ、それによって、完全にプロセッシングされたｍＲＮＡから１以上のエクソンの欠損を引き起こすことができる。エクソンスキッピングは、核内で、プレ−ｍＲＮＡの成熟過程において達成される。それは、プレ−ｍＲＮＡ内のスプライスドナー配列に相補的であるアンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＯＮ）を使用することによる、標的エクソンのスプライシングに関与する鍵配列のマスキングを含む。本明細書で提供されるｔｃ−ＤＮＡ ＡＯＮは、ジストロフィンプレ−ｍＲＮＡ内のイントロン−エクソン接合部におけるスプライス部位のマスキングによるエクソンスキッピングに適切に用いることができ、これにより、プレ−ｍＲＮＡの成熟ｍＲＮＡへのプロセッシング過程において突然変異エクソンの除去が促進される。
【００８７】
例えば、ジストロフィン遺伝子のエクソン２３又はエクソン５０内のナンセンス突然変異又はフレームシフト突然変異は、カルボキシ末端がトランケートされた非機能性ジストロフィンタンパク質を生成する。本明細書に開示のｔｃ−ＤＮＡ ＡＯＮは、それぞれ、イントロン２３又はイントロン５１におけるジストロフィンプレ−ｍＲＮＡのスプライスドナー部位を含むヌクレオチドに、そして、エクソン２３又はエクソン５１に隣接する５’ヌクレオチドにハイブリダイズすることにより、突然変異エクソン２３又はエクソン５１の成熟ｍＲＮＡ転写産物へのインクルージョンを抑制することができる。その成熟ｍＲＮＡ転写産物の発現により、エクソン２３又はエクソン５０及び５１によりコードされるアミノ酸が欠損しているが、これら欠損アミノ酸のＮ−末端及びＣ−末端側の両方にジストロフィンアミノ酸を含む機能性ジストロフィンタンパク質が生成される。
【００８８】
ジストロフィンプレ−ｍＲＮＡのプロセッシング過程においてエクソンをスキッピングするための本明細書に開示のｔｃ−ＤＮＡ ＡＯＮは、典型的には、６〜２２連続トリシクロヌクレオチド、具体的には、８〜２０トリシクロヌクレオチド、さらに具体的には、１０〜１８連続トリシクロヌクレオチドを含有し、ｔｃ−ＤＮＡ ＡＯＮの６〜１６ヌクレオチド、特に、８〜１６ヌクレオチドは、ジストロフィンプレ−ｍＲＮＡのイントロンスプライスドナー部位に相補的であり、ｔｃ−ＤＮＡ ＡＯＮの２〜８ヌクレオチドは、ジストロフィンプレ−ｍＲＮＡのエクソン領域に相補的であり、そして、イントロンスプライスドナー部位は、エクソン領域の５’側に隣接している。目的とする適用の精度に依存して、ｔｃ−ＤＮＡ ＡＯＮは、１２〜１６ヌクレオチド又は１３〜１５ヌクレオチドであってもよく、イントロンスプライスドナー部位に相補的な６〜１４ヌクレオチド及びエクソン領域に相補的な２〜５ヌクレオチドを含むことができる。
【００８９】
本明細書において、ジストロフィンプレ−ｍＲＮＡ内の突然変異エクソン２３をスキッピングするために設計されたｔｃ−ＤＮＡ ＡＯＮが例示される。ｔｃ−ＤＮＡ ＡＯＮは、ヌクレオチド配列５’−ＡＡＣＣＴＣＧＧＣＴＴＡＣＣＴ−３’（Ｍ２３Ｄ（＋０２−１３）、配列番号１）を含み、ジストロフィンプレ−ｍＲＮＡのイントロン２３の３’末端でヌクレオチドに、そして、ジストロフィンプレ−ｍＲＮＡのエクソン２３に隣接する５’末端でヌクレオチドに特異的にハイブリダイズする。また、ジストロフィンプレ−ｍＲＮＡ内の突然変異エクソン５１をスキッピングするために設計されたｔｃ−ＤＮＡ ＡＯＮも提供される。ｔｃ−ＤＮＡ ＡＯＮは、５’−ＡＧＡＡＡＴＧＣＣＡＴＣＴＴＣ−３’（Ｈ５１（＋６８＋８２）、配列番号２）、５’−ＡＡＡＴＧＣＣＡＴＣＴＴＣＣＴ−３’（Ｈ５１（＋７０＋８４）、配列番号３）及び５’−ＴＧＣＣＡＴＣＴＴＣＣＴＴＧＡ−３’（Ｈ５１（＋７３＋８７）、配列番号４）からなる群より選択されるヌクレオチド配列を含み、ジストロフィンプレ−ｍＲＮＡのイントロン５１の３’末端でヌクレオチドに、そして、ジストロフィンプレ−ｍＲＮＡのエクソン５１の５’末端でヌクレオチドに特異的にハイブリダイズする。
【００９０】
脊髄性筋萎縮症を処置するためのトリシクロ−ＤＮＡアンチセンスオリゴヌクレオチド
他の実施態様の範囲内において、本開示は、脊髄性筋萎縮症（ＳＭＡ）の処置に適切に用いることができるｔｃ−ＤＮＡ ＡＯＮを提供する。ＳＭＡは、正常細胞においては、エクソン７及び８が完全にプロセッシングされたｍＲＮＡ内に存在することを特徴とする、ＳＭＮ１遺伝子の両方のコピーの突然変異により引き起こされる。正常にプロセッシングされたＳＭＮ２のｍＲＮＡがエクソン７又は８を含有しないため、ＳＭＮ２タンパク質は、機能性ＳＭＮ１タンパク質の喪失を補完することができない。ＳＭＮ２プレ−ｍＲＮＡ内のイントロンサイレンシング配列（ＩＳＳ）及び／又は末端ステムループ（ＴＳＬ）をマスキングすることにより、本明細書に記載のｔｃ−ＤＮＡ ＡＯＮは、機能性ＳＭＮ１タンパク質の喪失を補完することができる修飾された機能性ＳＭＮ２タンパク質へと翻訳される、プロセッシングされたＳＭＮ２プレ−ｍＲＮＡへの異常エクソン７又はエクソン８のインクルージョンを促進することができ、そして、in vivoで発現される場合、修飾された機能性ＳＭＮ２は、ＳＭＮ１遺伝子の突然変異により引き起こされる脊髄性筋萎縮症を少なくとも部分的に改善させることができる。
【００９１】
従って、本開示は、ＳＭＮ２プレ−ｍＲＮＡのプロセッシング過程における異常エクソンのインクルージョンを促進するためのｔｃ−ＤＮＡ ＡＯＮであって、ｔｃ−ＤＮＡ ＡＯＮが、６〜２２トリシクロヌクレオチド長、具体的には、８〜２０トリシクロヌクレオチド長、さらに具体的には、１０〜１８トリシクロヌクレオチド長であり、そして、ｔｃ−ＤＮＡ ＡＯＮが、ＳＭＮ２プレ−ｍＲＮＡのイントロンサイレンサー配列（ＩＳＳ）又は末端ステムループ（ＴＳＬ）に相補的であるｔｃ−ＤＮＡ ＡＯＮを提供する。このようなｔｃ−ＤＮＡ ＡＯＮは、１３〜１７ヌクレオチド、１２〜１６ヌクレオチド又は１３〜１５ヌクレオチドであることができる。
【００９２】
本明細書において、ＳＭＮ２プレ−ｍＲＮＡのＩＳＳに相補的であり、そして、異常エクソン７のプロセッシングされたＳＭＮ２のｍＲＮＡへのインクルージョンを促進するために用いることができる、１５−ヌクレオチド配列５’−ＣＵＵＵＣＡＵＡＡＵＧＣＵＧＧ−３’（ＳＭＮ２ｉ７（１０；２５）、配列番号５）を含むｔｃ−ＤＮＡ ＡＯＮが例示される。また、本明細書において、ＳＭＮ２プレ−ｍＲＮＡのＴＳＬ２に相補的であり、そして、また、エクソン７のプロセッシングされたＳＭＮ２のｍＲＮＡへのインクルージョンを促進するために用いることができる、１３−ヌクレオチド配列５’−ＵＵＡＡＵＵＵＡＡＧＧＡＡ−３’（ＳＭＮ２ｅ７（３９；５１）、配列番号６）を含むｔｃ−ＤＮＡ ＡＯＮが例示される。
【００９３】
スタイナート筋緊張性ジストロフィーを処置するためのトリシクロ−ＤＮＡアンチセンスオリゴヌクレオチド
なおさらなる実施態様の範囲内において、本開示は、ＤＭ１をコードするｍＲＮＡの３’末端でのＣＵＧ増幅から引き起こされるスタイナート筋緊張性ジストロフィーの処置に適切に用いることができるｔｃ−ＤＮＡ ＡＯＮを提供する。過剰のＣＵＧ増幅を含有する突然変異ＤＭ１のｍＲＮＡが、核内に隔離され蓄積して、核焦点を形成すると考えられている。これらの焦点は安定であり、スプライシング機構に関与するファクターに結合し、それによって、トランスクリプトームに大きく影響を与えると考えられている。本開示の一部として、Ｕ７ ｓｎＲＮＡ系を使用することにより、ｔｃ−ＤＮＡ ＡＯＮを用いてＣＵＧ配列を標的化し、突然変異ＤＭ１のｍＲＮＡの破壊を促進することができ、それによって、スプライシングファクターの放出及び核焦点の除去を導くことが示される。特定の機械論に束縛されることはないが、実に驚くべきことに、さらに、本明細書に開示のｔｃ−ＤＮＡ ＡＯＮは、過剰のＣＵＧ増幅を含有するｍＲＮＡの破壊を促進することができると考えられる。
【００９４】
従って、過剰のＣＵＧ増幅を含有する突然変異ＤＭ１のｍＲＮＡの破壊を促進するために適切に用いることができるｔｃ−ＤＮＡ ＡＯＮが記載される。このようなｔｃ−ＤＮＡ ＡＯＮは、９〜２７トリシクロヌクレオチドを含み、ｔｃ−ＤＮＡ ＡＯＮは、１以上の３’ＣＵＧ増幅を含む突然変異ＤＭ１のｍＲＮＡに相補的であり、そして、ｔｃ−ＤＮＡ ＡＯＮは、ＤＭ１のｍＲＮＡの破壊を促進することができる。目的とする適用の精度に依存して、ｔｃ−ＤＮＡ ＡＯＮは、ヌクレオチド配列５’−ＣＡＧ−３’（配列番号７）の３〜９；４〜８；又は５、６若しくは７の連続反復配列を含むことができる。突然変異ＤＭ１の破壊を促進するための典型的なｔｃ−ＤＮＡ ＡＯＮは、１５−ヌクレオチド配列５’−ＣＡＧＣＡＧＣＡＧＣＡＧＣＡＧ−３’（ＤＭ１（ＣＡＧ５）、配列番号８）を含む。突然変異ＤＭ１の破壊を促進するための別の典型的なｔｃ−ＤＮＡ ＡＯＮは、１５−ヌクレオチド配列５’−ＣＡＧＣＡＧＣＡＧＣＡＧＣＡＧＣＡＧＣＡＧ−３’（ＤＭ１（ＣＡＧ７）、配列番号９）を含む。
【００９５】
トリシクロ−ＤＮＡアンチセンスオリゴヌクレオチドの合成及び単離
ｔｃ−ＤＮＡ ＡＯＮは、例えば、Caruthers et al., Methods in Enzymol. 211:3-19 (1992); Thompson et al., 国際公開公報第99/54459号; Wincott et al., Nucleic Acids Res. 23:2677-2684 (1995); Wincott et al., Methods Mol. Bio. 74:59 (1997); Brennan et al., Biotechnol Bioeng. 61:33-45 (1998);及びBrennan, 米国特許第6,001,311号に記載の当技術分野で公知のプロトコールを使用して合成することができる。
【００９６】
ｔｃ−ＤＮＡ及びｔｃ−ＤＮＡ ＡＯＮを合成するための方法がこれまでに記載されており、当技術分野でよく知られている。例えば、Steffens and Leumann, J. Am. Chem. Soc. 121(14):3249-3255 (1999); Steffens and Leumann, J.Am.Chem.Soc. 119:11548-11549 (1997);及びWengel, 米国特許第7,034,133号を参照されたい。ｔｃ−ＤＮＡは、市販のＤＮＡシンセサイザーを用いて、従来の固相シアノエチルホスホルアミダイト化学により製造するホスホルアミダイトから合成することができる。ｔｃ−ＤＮＡホスホルアミダイト構成単位は、Steffens and Leumann, C. Helv. Chim. Acta 80:2426-2439 (1997)に記載のように合成することができる。鎖伸長サイクルは、天然オリゴデオキシヌクレオチドの合成の場合と基本的に同じである。Pharmacia LKB社のユーザーマニュアル(56-1111-56) (Gene Assembler Special/4 Primers)を参照されたい。
【００９７】
例えば、ｔｃ−ＤＮＡ ＡＯＮの合成は、パソコンに接続したPharmacia LKB社のGene Assembler Special instrument又はApplied Biosystems社のPCR-MATE EP DNAシンセサイザー（モデル３９１）を使用して、固相ホスホルアミダイト法により達成することができる。試薬液は、製造業者のプロトコールに従って調製することができる。Applied Biosystems社、PCR-MATE EP DNAシンセサイザー（モデル３９１（１９８９））のユーザーマニュアル及びPharmacia LKB社のユーザーマニュアル(56-1111-56) (Gene Assembler Special/4 Primers)を参照されたい。１Ｈ−テトラゾール（ＭｅＣＮの０．４５Ｍ溶液）は、Flukaから入手することができる。
【００９８】
トリシクロ−ＤＮＡ ＡＯＮは、溶解度が低いことから、カップリング時間の延長（例えば、６分間）、１１倍の過剰ホスホルアミダイト、そして、０．１Ｍの代わりに０．０７Ｍのトリシクロアデノシン構成単位溶液の使用を採用することができる他は、標準的な合成サイクルに従って構築することができる。ＬＣＡＡ−ＣＰＧ（Sigma）又はポリスチレン（Pharmacia）結合天然ヌクレオシドのいずれかを、開始単位として使用することができる。
【００９９】
合成は、５’−脱トリチルオリゴマーで終了するトリチルオフモードで実施することができる。カップリング効率は、オンライントリチルアッセイでモニタリングすることができ、典型的には、９０〜９９％である。合成した後、固体支持体を濃ＮＨ３溶液中で懸濁し、５５℃で１５時間又は室温で２時間放置してもよい。
【０１００】
粗ｔｃ−ＤＮＡ ＡＯＮは、例えば、限外濾過、ゲル電気泳動又はクロマトグラフィーなどの当技術分野で公知の数多くの方法のいずれかにより精製することができる。イオン交換ＨＰＬＣは、Nucleogen DEAE 60-7（１２５×４mm）カラムを用いて達成することができる。単離したオリゴヌクレオチドは、Sambrook等の「Molecular Cloning: A Laboratory Manual」11.29 (Cold Spring Harbor Laboratory Press, Plainview, NY, 1989）に記載のように、SP-PAK C-18カートリッジ（Waters）で脱塩することができる。精製したｔｃ−ＤＮＡ ＡＯＮを、１５０mMＮａＣｌ、１０mMトリス−ＨＣｌ（pH７．０）に溶解させ、アルカリホスファターゼ（１mg/ml）及びホスホジエステラーゼ（２mg/ml）とともに３７℃でインキュベートすることができる。５時間後、溶液をＨＰＬＣ精製に付することができる。
【０１０１】
置換又は修飾（塩基、糖又はリン酸エステル）された化学合成核酸分子は、血清のリボヌクレアーゼによる分解を防ぎ、その効力を増加させることができる。例えば、Eckstein et al., 国際公開公報第92/07065号; Perrault et al., Nature 344:565 (1990); Pieken et al., Science 253:314 (1991); Usman and Cedergren, Trends in Biochem. Sci. 17:334 (1992); Usman et al., 国際公開公報第93/15187号;及びRossi et al., 国際公開公報第91/03162号; Sproat, 米国特許第5,334,711号; Gold et al., 米国特許第6,300,074号を参照されたい。上記の参考文献は全て、本明細書に記載のｔｃ−ＤＮＡ ＡＯＮの塩基、リン酸エステル又は糖部分に用いることができる様々な化学修飾を記載している。
【０１０２】
in vivo投与のためのトリシクロ−ＤＮＡの製剤化
本明細書に記載のｔｃ−ＤＮＡ ＡＯＮは、水性懸濁剤を製造するために適切な賦形剤との混合物であってもよい。このような賦形剤は、懸濁化剤、例えば、カルボキシメチルセルロースナトリウム、メチルセルロース、ヒドロプロピル−メチルセルロース、アルギン酸ナトリウム、ポリビニルピロリドン、トラガカントゴム及びアカシアゴムであり；分散剤又は湿潤剤、天然リン脂質、例えば、レシチン、又はアルキレンオキサイドと脂肪酸との縮合物、例えば、ステアリン酸ポリオキシエチレン、又はエチレンオキサイドと長鎖脂肪族アルコールとの縮合物、例えば、ヘプタデカエチレンオキシセタノール、又はエチレンオキサイドと脂肪酸及びヘキシトールから誘導される部分エステルとの縮合物、例えば、ポリオキシエチレンソルビトールオレイン酸モノエステル、又はエチレンオキサイドと脂肪酸及びヘキシトール無水物から誘導される部分エステルとの縮合物、例えば、ポリエチレンソルビタンオレイン酸モノエステルであってもよい。水性懸濁剤は、また、１以上の防腐剤、例えば、ｐ−ヒドロキシ安息香酸エチル又はｎ−プロピルを含有してもよい。水を添加して水性懸濁剤を調製するために適切な分散性粉剤及び顆粒剤は、分散剤又は湿潤剤、懸濁化剤及び１以上の防腐剤との混合物の活性成分で提供される。
【０１０３】
ｔｃ−ＤＮＡ ＡＯＮ組成物は、無菌の注射可能な水性又は油性懸濁剤の形態であってもよい。懸濁剤は、上述した適切な分散剤又は湿潤剤及び懸濁化剤を使用し、当技術分野でよく知られているように製剤化することができる。無菌の注射製剤は、また、非毒性の非経口的（parentally）に許容しうる希釈剤又は溶媒に溶かした無菌の注射可能な液剤又は懸濁剤、例えば、１，３−ブタンジオール溶液であってもよい。使用することができる許容しうる溶剤及び溶媒には、水、Ringer溶液及び生理食塩液がある。さらに、無菌の固定油を、通常、溶媒又は懸濁媒体として使用することができる。この目的のために、合成モノ又はジグリセリドなどの任意の無菌の固定油を使用することができる。さらに、オレイン酸などの脂肪酸が注射剤の調製に使用される。
【０１０４】
本開示は、また、薬学的に許容しうる担体又は希釈剤に薬学的に有効な量の所望の化合物を含む、保存又は投与のために調製されるｔｃ−ＤＮＡ ＡＯＮ組成物を含む。治療用途のための許容しうる担体又は希釈剤は、医薬品分野でよく知られており、例えば、Remington's Pharmaceutical Sciences (Mack Publishing Co., A.R. Gennaro edit., 1985)に記載されている。例えば、防腐剤及び安定剤が提供されうる。これらは、安息香酸ナトリウム、ソルビン酸及びｐ−ヒドロキシ安息香酸エステルを含む。さらに、抗酸化剤及び懸濁化剤を使用してもよい。
【０１０５】
本開示は、プレ−ｍＲＮＡ内のエクソンスキッピングを促進するための、あるいは、イントロンサイレンシング又は末端ステムループをマスキングするための、あるいは、細胞又は生物におけるｍＲＮＡの破壊を標的化するための、ｔｃ−ＤＮＡ ＡＯＮ組成物並びに方法を提供する。関連する実施態様においては、本開示は、本明細書に上述されるような疾患又は疾患を発症するリスクを有するヒト細胞、組織又は個体などの対象を処置するための方法及びｔｃ−ＤＮＡ ＡＯＮ組成物を提供する。一実施態様においては、本方法は、プレ−ｍＲＮＡのプロセッシングが修飾されるか、あるいは、ｍＲＮＡの破壊を標的化するように、哺乳類などの細胞又は生物に、本開示のｔｃ−ＤＮＡ ＡＯＮ又はｔｃ−ＤＮＡ ＡＯＮを含有する医薬組成物を投与することを含む。本開示の組成物及び方法を使用した処置を許容可能な哺乳類の対象は、例えば、デュシェンヌ型筋ジストロフィー、脊髄性筋萎縮症又はスタイナート筋緊張性ジストロフィーなどの、このような処置を許容可能な１以上の障害を有する対象を含む。
【０１０６】
本開示のｔｃ−ＤＮＡ ＡＯＮ組成物は、薬学的に許容しうる製剤として効果的に用いることができる。薬学的に許容しうる製剤は、患者の病状又は他の有害な状態、その発生又は重症化を予防、変化、あるいは、患者の病状又は有害な状態を処置（検出可能又は測定可能な程度に１以上の症状を緩和）する。薬学的に許容しうる製剤は、上記化合物の塩、例えば、塩酸、臭化水素酸、酢酸及びベンゼンスルホン酸の塩などの酸付加塩を含む。医薬組成物又は製剤は、細胞又は患者、例えば、ヒトへの全身投与などの投与に適切な形態の組成物又は製剤を指す。適切な形態は、その使用又は投与経路、例えば、経皮的又は注射に一部依存する。このような形態は、組成物又は製剤が標的細胞（即ち、ｔｃ−ＤＮＡ ＡＯＮを送達するのに望ましい細胞）に到達することを妨げてはならない。例えば、血流に注入される医薬組成物は、可溶性である必要がある。他のファクターは、当技術分野で公知であり、毒性及び組成物又は製剤がその効果を発揮することを妨げる形態などの事項が含まれる。
【０１０７】
本開示の医薬組成物は、また、水中油型乳剤の形態であってもよい。油相は、植物油若しくは鉱油又はこれらの混合物であることができる。適切な乳化剤は、天然ゴム、例えば、アカシアゴム又はトラガカントゴム、天然リン脂質、例えば、大豆、レシチン、脂肪酸及びヘキシトール、無水物から誘導されるエステル又は部分エステル、例えば、ソルビタンオレイン酸モノエステル、並びに、前記部分エステルとエチレンオキサイドとの縮合物、例えば、ポリオキシエチレンソルビタンオレイン酸モノエステルであることができる。
【０１０８】
本開示のｔｃ−ＤＮＡ ＡＯＮは、処置に適切な組成物の形態にするために、安定剤、緩衝剤などを添加して、又は添加しないで、任意の標準的な手段により患者に投与することができる。リポソーム送達機構を使用することが望まれる場合、標準プロトコールに従ってリポソームを生成することができる。従って、本開示のｔｃ−ＤＮＡ ＡＯＮは、任意の形態、例えば、経皮的、あるいは、局所、全身又は髄腔内注射により投与することができる。
【０１０９】
本開示は、また、ポリ（エチレングリコール）脂質を含有する表面修飾リポソーム（ＰＥＧ修飾された若しくは血中滞留性のリポソーム又はステルスリポソーム）を含むｔｃ−ＤＮＡ ＡＯＮ組成物の使用を特徴とする。これらの製剤は、標的組織内でｔｃ−ＤＮＡ ＡＯＮの蓄積を増加させる方法を提供する。この種類の薬物担体は、単核性食細胞系（ＭＰＳ又はＲＥＳ）によるオプソニン作用及び排出に耐性を示し、それによって、封入ｔｃ−ＤＮＡ ＡＯＮの長期間の血中滞留を可能にし、組織への曝露を増大させることができる（Lasic et al., Chem. Rev. 95:2601-2627 (1995) and Ishiwata et al., Chem. Pharm. Bull. 43:1005-1011 (1995）)。血中滞留性リポソームは、特に、ＭＰＳの組織に蓄積することが知られている従来のカチオン性リポソームと比較して、ｔｃ−ＤＮＡ ＡＯＮの薬物動態及び薬力学を増大させる（Liu et al., J. Biol. Chem. 42:24864-24870 (1995); Choi et al., 国際公開公報第96/10391号; Ansell et al., 国際公開公報第96/10390号; Holland et al., 国際公開公報第96/10392号）。血中滞留性リポソームは、また、肝臓及び脾臓などの代謝的に活動的なＭＰＳ組織への蓄積を回避する能力に基づいて、カチオン性リポソームと比較し、ヌクレアーゼ分解からｔｃ−ＤＮＡ ＡＯＮをより強く保護する可能性が高い。
【０１１０】
薬学的に有効な用量は、病状の発生の予防、抑制又は病状の処置（症状をある程度、好ましくは、症状の全てを緩和）するために必要な用量である。薬学的に有効な用量は、疾患の種類、使用する組成物、投与経路、処置される哺乳類の種類、検討する特定の哺乳類の身体的特性、併用薬物及び医学分野の技術者が認識する他の要因に依存する。例えば、本開示のｔｃ−ＤＮＡ ＡＯＮの効力に依存して、０．１mg/kg〜１００mg/kg体重/日の活性成分量が投与される。
【０１１１】
約０．１mg〜約１４０mg/kg体重/日のオーダーの用量レベルが、上記の状態の処置に有用である（約０．５mg〜約７ｇ/患者/日）。単位剤形を製造するために担体材料と組み合わせることができる活性成分量は、処置されるホスト及び特定の投与形態に依存して変更される。用量単位形態は、一般的に、約１mg〜約５００mgの活性成分を含有する。
【０１１２】
任意の特定の患者の特定の用量レベルは、用いられる特定の化合物の活性、年齢、体重、総体的な健康状態、性別、食事、投与回数、投与経路及び排出速度、薬物併用並びに治療中の特定の疾患の重症度などの様々な要因に依存することが理解される。本開示の製剤及び方法によるｔｃ−ＤＮＡ ＡＯＮ組成物の投与を受けて、試験対象は、処置される疾患又は障害に関連する１以上の症状において、プラセボ処置又は他の適切なコントロール対象と比較し、約１０％〜最大約９９％の減少を示す。
【０１１３】
ｔｃ−ＤＮＡ ＡＯＮを、ｔｃ−ＤＮＡ ＡＯＮ単独を含む製剤又は薬学的に許容しうる担体、希釈剤、賦形剤、アジュバント、乳化剤、緩衝剤、安定剤、防腐剤などの１以上の追加の成分をさらに含む製剤としての投与を含む、当業者に公知の様々な方法により細胞に投与することができる。特定の実施態様においては、ｔｃ−ＤＮＡ ＡＯＮは、リポソームに封入するか、イオン導入により投与するか、あるいは、ヒドロゲル、シクロデキストリン、生分解性ナノカプセル、生体接着性ミクロスフェア又はタンパク性ベクターなどの他のビヒクルに組み込むことができる（例えば、国際公開公報第00/53722号参照）。
【０１１４】
本開示のｔｃ−ＤＮＡ ＡＯＮの直接注入は、皮下、筋肉内又は皮内に関わらず、Conry et al., Clin. Cancer Res. 5:2330-2337 (1999)及び国際公開公報第99/31262号に記載されるように、標準的な針及びシリンジを用いる方法又は無針技術を用いて行うことができる。
【０１１５】
本開示のｔｃ−ＤＮＡ ＡＯＮなどの核酸分子を送達すためのさらなる方法は、例えば、Boado et al., J. Pharm. Sci. 87:1308-1315 (1998); Tyler et al., FEBS Lett. 421:280-284 (1999); Pardridge et al., Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 92:5592-5596 (1995); Boado, Adv. Drug Delivery Rev. 15:73-107 (1995); Aldrian-Herrada et al., Nucleic Acids Res. 26:4910-4916 (1998); Tyler et al., Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 96:7053-7058 (1999); Akhtar et al., Trends Cell Bio. 2:139 (1992); 「Delivery Strategies for Antisense Oligonucleotide Therapeutics」, (ed. Akhtar, 1995); Maurer et al., Mol. Membr. Biol. 16:129-140 (1999); Hofland and Huang, Handb. Exp. Pharmacol 137:165-192 (1999);及びLee et al., ACS Symp. Ser. 752:184-192 (2000)に記載される。これらのプロトコールを利用して、本開示の範囲内で意図されるあらゆるｔｃ−ＤＮＡ ＡＯＮの送達を補足又は補完することができる。
【０１１６】
実施例
上記の開示は、一般的に、下記実施例によりさらに例示される本開示を記載する。これらの特定の実施例は、単に、例示の目的で記載され、そして、本開示の範囲を限定するものではない。本明細書において、特定の対象、用語及び値が用いられているが、このような対象、用語及び値は、同様に、典型例であり、本開示の範囲を限定するものでないことが理解されるであろう。
【０１１７】
実施例１
ジストロフィン筋線維症におけるジストロフィンをレスキューするためのトリシクロ−ＤＮＡアンチセンスオリゴヌクレオチドの使用
デュシェンヌ型筋ジストロフィー（ＤＭＤ）は、ジストロフィンコード遺伝子の突然変異から引き起こされるＸ染色体連鎖劣性欠損症である。トランケートされたジストロフィンタンパク質欠損をコードするジストロフィン遺伝子内のアウトオブフレーム欠失は、重度のＤＭＤ表現型をもたらす。トリシクロ−ＤＮＡ（ｔｃ−ＤＮＡ）アンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＯＮ）を使用するエクソンスキッピング戦略が開発され、ジストロフィン遺伝子のアウトオブフレーム突然変異を効果的にレスキューすることが可能となり、これにより、翻訳リーディングフレームが修復され、従って、機能的に活性なジストロフィンタンパク質が産生された。例えば、エクソン２３が、得られるプロセッシングされたｍＲＮＡからスプライス除去されるように、エクソン２３／イントロン２３接合部にハイブリダイズし、そして、プレ−ｍＲＮＡプロセッシングに干渉するｔｃ−ＤＮＡ ＡＯＮが記載される。また、エクソン５１／イントロン５１接合部にハイブリダイズするｔｃ−ＤＮＡ ＡＯＮは、同様に、エクソン５１がプロセッシングされたｍＲＮＡからスプライス除去されるように、プレ−ｍＲＮＡプロセッシングに干渉する。従って、得られるジストロフィンタンパク質は、それぞれ、エクソン２３又はエクソン５１によりコードされるアミノ酸配列が欠損しているが、重度のＤＭＤ表現型が回復するように依然十分な機能性を保持している。
【０１１８】
実施例２
ｍｄｘマウスモデル
ｍｄｘマウスは、完全長ジストロフィンタンパク質を欠損するが、より短いジストロフィンアイソフォームの全てを保持するＤＭＤのマウスモデルである（Bulfield et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:1189-1192 (1984)）。ｍｄｘマウスは、ジストロフィン遺伝子のエクソン２３に機能性ジストロフィンの合成を妨げるナンセンス突然変異を有する（図３参照）。エクソン２３は、ＣからＴの突然変異が終始コドン（ＴＡＡ）を作製する反復配列Ｒ６及びＲ７を一部コードする。
【０１１９】
実施例３
in vitro研究
本実施例は、ヌクレオチド配列５’−ＡＡＣＣＴＣＧＧＣＴＴＡＣＣＴ−３’を有する、Ｍ２３Ｄ（＋０２−１３）で示される１５−ヌクレオチドのｔｃ−ＤＮＡ ＡＯＮでトランスフェクトしたｍｄｘの筋管において、ジストロフィンプレ−ｍＲＮＡが、エクソン２３を欠失するｍＲＮＡにプロセッシングされるように、エクソン２３の下流のドナースプライス部位でエクソンスキッピングが起こることを示す。
【０１２０】
Ｍ２３Ｄ（＋０２−１３）で示されるｔｃ−ＤＮＡ ＡＯＮは、エクソン２３／イントロン２３スプライス部位で、標的配列のイントロン２２−ｔｔｔｔｇａｇ［ＧＣＴＣ…エクソン２３…ＴＣＡＧ］ｇｔａａｇｃｃｇａｇｇｔｔｔｇｇｃｃ−イントロン２３にハイブリダイズするように設計された。
【０１２１】
ｍｄｘの筋管を、オリゴフェクタミンを添加又は非添加で、ｔｃ−ＤＮＡ ＡＯＮ Ｍ２３Ｄ（＋０２−１３）（１、２及び１０μg）でトランスフェクトした。一つの未処理試料をネガティブコントロールとした。４８時間後、培養物を回収し、RNeasy mini kit（Qiagen）を使用してｍＲＮＡを抽出した。次に、ｍＲＮＡを下記のように逆転写した。８μlの抽出ＲＮＡ（５００ng〜１μg）を、１μLのｄＮＴＰ及び１μLのランダムヘキサマーと混合し、混合物を６５℃で５分間インキュベートした。次に、混合物を氷上で冷却した。２５mMＭｇＣｌ２（４μL）、０．１ＭＤＴＴ（２μL）、１μＬのRNase outリボヌクレアーゼ阻害剤（４０U/μL）、１×Tampon（２μLの１０×ストック）及び５０ＵSuperScript逆転写酵素を混合物に添加し、反応物の最終容量を２０μLにした。次に、反応物を２５℃で１０分間インキュベートし、その後、４２℃で５０分間インキュベートした。次に、反応物を７０℃で１５分間加熱して不活化した。次に、反応物を氷上に置きボルテックスした。次に、１μLのＲＮａｓｅＨを反応物に添加し、３７℃で２０分間インキュベートした。
【０１２２】
次に、エクソン２３のスキッピングを、下記の条件を用いて、ネステッドＰＣＲでアッセイした。２５μLのPCR master mix（Ｔａｑポリメラーゼ５０U/μL、４００μMｄＮＴＰ、３mMＭｇＣｌ２）を、３μLのｃＤＮＡ、２２μLのＨ２Ｏ及び各１μLの下記の２つのプレイマー（１００μMのストック濃度）と混合した。
【０１２３】
【化１】
【０１２４】
次に、反応物を、下記の熱サイクルパラメーター条件下に付した。９４℃で５分間、その後、９４℃で３０秒間、５５℃で１分間、そして、７２℃で２分間を３０サイクル。最後に、反応物を７２℃で５分間のインキュベートに付した。
【０１２５】
２μlのＰＣＲ産物をテンプレートとして、１μLの下記プライマー（１００μMのストック濃度）を使用する別のＰＣＲ反応液に添加した。反応物には、また、２５μLのPCR master mix及び２３μLのＨ２Ｏを添加した。
【０１２６】
【化２】
【０１２７】
反応物を、下記の熱サイクルパラメーター条件下に付した。９４℃で５分間、その後、９４℃で３０秒間、５５℃で１分間、そして、７２℃で２分間を２５サイクル。最後に、反応物を７２℃で５分間のインキュベートに付した。
【０１２８】
図４に示されるデータは、（１）１５ヌクレオチドのｔｃ−ＤＮＡ ＡＯＮ Ｍ２３Ｄ（＋０２−１３）が、ex vivoで、ｍｄｘのジストロフィンｍＲＮＡ内の突然変異エクソン２３のスキッピングを達成することができ、そして、（２）オリゴフェクタミンが、ex vivoにおけるｔｃ−ＤＮＡ ＡＯＮの取り込みを向上させることを示す。
【０１２９】
Ｍｄｘの筋管を、オリゴフェクタミンの存在下、ｔｃ−ＤＮＡ ＡＯＮ Ｍ２３Ｄ（＋０２−１３）（０．５、１、２、５及び１０μg）でトランスフェクトした。培養物を上述のように処理した。図５に示されるデータは、２μgのｔｃ−ＤＮＡ ＡＯＮ Ｍ２３Ｄ（＋０２−１３）の存在下でスキッピングが顕著であることを示す。
【０１３０】
ｍｄｘの筋管を、オリゴフェクタミンの存在下、５μgのｔｃ−ＤＮＡ ＡＯＮ Ｍ２３Ｄ（＋０２−１３）でトランスフェクトした。トランスフェクト後、異なる時点（０日目〜１５日目）で培養物を上述のように処理した。図６に示されるデータは、（１）３日目でスキッピングが観察され（Ｄ３）、そして、（２）１５日目でもまだスキッピングが検出可能であったが（Ｄ１５）、７日目から減少したことを示す（Ｄ７）。
【０１３１】
実施例４
in vivo研究
本実施例は、ヌクレオチド配列５’−ＡＡＣＣＴＣＧＧＣＴＴＡＣＣＴ−３’を有するＭ２３Ｄ（＋０２−１３）で示される１５−ヌクレオチドのｔｃ−ＤＮＡ ＡＯＮを注射したｍｄｘマウスにおいて、ジストロフィンプレ−ｍＲＮＡが、エクソン２３を欠失するｍＲＮＡにプロセッシングされるように、エクソン２３の下流のドナースプライス部位でエクソンスキッピングが起こることを示す。
【０１３２】
８週齢のｍｄｘマウスの前脛骨筋に、１００、８０、４０、２０、１０及び５μgのｔｃ−ＤＮＡ ＡＯＮ Ｍ２３Ｄ（＋０２−１３）を含有する５０μlのＰＢＳ（リン酸緩衝食塩水）を注射した。３週間後に動物を屠殺した。筋肉試料を処理して、上記実施例３と同じパラメーターを使用してｍＲＮＡ解析を行った。結果を図７に示す。
【０１３３】
図７に示されるデータは、エクソンスキッピングが試験した全ての条件で起こったことを示す。また、有意なジストロフィンタンパク質レベルが横断面で検出された（示さず）。２μgのｔｃ−ＤＮＡ ＡＯＮ Ｍ２３Ｄ（＋０２−１３）の注射は、５μgのｔｃ−ＤＮＡ ＡＯＮ Ｍ２３Ｄ（＋０２−１３）を注射した場合と同じ結果であった（示さず）。
【０１３４】
８週齢のｍｄｘマウスに、１０μgのｔｃ−ＤＮＡ ＡＯＮ Ｍ２３Ｄ（＋０２−１３）を含有する５０μlのＰＢＳを筋肉内注射した。注射の４、１０及び２０週間後に動物を屠殺した。筋肉試料及び横断面で、ジストロフィンｍＲＮＡについて上述のようにアッセイした。結果を図８に示す。
【０１３５】
筋肉横断面で、下記のように免疫染色を用いて、ジストロフィンタンパク質発現についてアッセイした。一次モノクローナル抗体ＮＣＬ−Ｄｙｓ２（１：１００希釈）を、Ｍ．Ｏ．Ｍ．（マウスオンマウス）キットを使用して試料に添加した。次に、試料をＰＢＳで３回洗浄した。次に、試料を、Alexa Fluor 488（Molecular Probes）で標識したヤギ抗マウスＩｇＧ二次抗体と２時間インキュベートし、その後、ＰＢＳで洗浄し、０．０１％TritonXで洗浄し、最後に、ＰＢＳで洗浄した。この実験の結果を図９に示す。
【０１３６】
図８及び９に示されるデータは、（１）エクソンスキッピングが、４及び１０週目で現れたが、２０週目では観察されなかった；（２）ジストロフィンは、４週目〜２０週目で明瞭に検出可能である；そして、（３）ｔｃ−ＤＮＡ ＡＯＮ Ｍ２３Ｄ（＋０２−１３）が、ex vivoよりin vivoで効果的であるように思われることを示す。
【０１３７】
実施例５
脳の免疫染色
８週齢のｍｄｘマウスの海馬又は脳脊髄液（髄腔内注射）に、２０μg（海馬）又は２００μg（髄腔内）のｔｃ−ＤＮＡ ＡＯＮ Ｍ２３Ｄ（＋０２−１３）を含有する５０μlのＰＢＳを注射した。注射の１か月後に動物を屠殺した。脳断片（パネルＡ、Ｂ、Ｃ）及び小脳断片（パネルＤ、Ｅ、Ｆ）で、上記実施例４に記載するようにジストロフィンタンパク質についてアッセイした。結果を図１０に示す。パネルＡ及びＤは、マウスを処理しなかったネガティブコントロールに相当する。パネルＢ及びＥは、ｍｄｘマウス由来の未処理断片に相当する。パネルＣは、海馬処理したｍｄｘマウス（Ｃ）に相当し、パネル（Ｆ）は、ｍｄｘマウスの髄腔内処理した小脳の結果を示す。核はＤＡＰＩで対比染色した。
【０１３８】
実施例６
送達（予測）
ｔｃ−ＤＮＡ ＡＯＮ Ｍ２３Ｄ（＋０１−１３）は、腹腔内及び皮下注射により送達することができる（１g/kg以下から）。
【０１３９】
実施例７
ＤＭＤマウスにおけるジストロフィンをレスキューするためのトリシクロ−ＤＮＡアンチセンスオリゴヌクレオチド
本実施例は、配列５’−ＡＧＡＡＡＴＧＣＣＡＴＣＴＴＣ−３’（「ｔｃ−ＤＮＡ ＡＯＮ Ｈ５１（＋６８＋８２）」；配列番号２）、５’−ＡＡＡＴＧＣＣＡＴＣＴＴＣＣＴ−３’（「ｔｃ−ＤＮＡ ＡＯＮ Ｈ５１（＋７０＋８４）」；配列番号３）及び５’−ＴＧＣＣＡＴＣＴＴＣＣＴＴＧＡ−３’（「ｔｃ−ＤＮＡ ＡＯＮ Ｈ５１（＋７３＋８７）」；配列番号４）を有するジストロフィンのエクソン５１／イントロン５１接合部用に設計されたｔｃ−ＤＮＡ ＡＯＮが、完全ヒトジストロフィン遺伝子を発現するマウス（「ｈＤＭＤマウス」）由来の筋肉細胞において、エクソン５１のスキッピングに効果的に関与したことを示す。
【０１４０】
８〜１０週齢のｈＤＭＤマウスの前脛骨筋に、１０μgのｔｃ−ＤＮＡ ＡＯＮ Ｈ５１（＋６８＋８２）（ｔｃ−ＤＮＡ ｅｘ５１ ＥＳＥａとも呼ばれる）、ｔｃ−ＤＮＡ ＡＯＮ Ｈ５１（＋７０＋８４）（ｔｃ−ＤＮＡ ｅｘ５１ ＥＳＥｂとも呼ばれる）又はｔｃ−ＤＮＡ ＡＯＮ Ｈ５１（＋７３＋８７）（ｔｃ−ＤＮＡ ｅｘ５１ ＥＳＥｃとも呼ばれる）を含有する５０μlのＰＢＳを注射した。４週間後に動物を屠殺した。筋肉試料を処理して、上記実施例３と同じパラメーターを使用してｍＲＮＡ解析を行った。結果を図１２に示す。
【０１４１】
エクソン５１のスキッピングを、下記の条件下でネステッドＰＣＲによりアッセイした。５００ngのトータルＲＮＡを使用し、Access RT-PCR System（Promega）を用いて、５０μLの反応液で下記の外部プライマーを使用してＲＴ−ＰＣＲを行った：
【０１４２】
【化３】
【０１４３】
ｃＤＮＡ合成を、４５℃で４５分間実施し、直後に下記パラメーターを用いて２０サイクルの第一のＰＣＲを行った：９４℃で４０秒間、６０℃で４０秒間、そして、７２℃で４０秒間を２０サイクル。
【０１４４】
２μｌのＰＣＲ産物をテンプレートとして、下記のプライマー（１００μＭのストック濃度）を使用する別のＰＣＲ反応液に添加した。
【０１４５】
【化４】
【０１４６】
反応物を、下記の熱サイクルパラメーター条件下に付した：９４℃で５分間、その後、９４℃で４０秒間、６０℃で４０秒間、そして７２℃で４０秒間を３０サイクル。最後に、反応物を７２℃で５分間のインキュベートに付した。
【０１４７】
図１２に示されるデータは、試験した各ｔｃ−ＤＮＡ ＡＯＮ Ｈ５１構築物（ｔｃ−ＤＮＡ ＡＯＮ Ｈ５１（＋６８＋８２）、ｔｃ−ＤＮＡ ＡＯＮ Ｈ５１（＋７０＋８４）及びｔｃ−ＤＮＡ ＡＯＮ Ｈ５１（＋７３＋８７））が、エクソン５１のスキッピングの増加をもたらしたことを示す。
【０１４８】
実施例８
ＳＭＮのエクソン７／イントロン７接合部及びイントロン７のＩＳＳを対象とするトリシクロ−ＤＮＡアンチセンスオリゴヌクレオチドが、ＳＭＮ２におけるエクソン７のインクルージョンを促進する
本実施例は、ＳＭＮのエクソン７／イントロン７接合部及びイントロン７のＩＳＳ（それぞれ、「ｔｃ−ＤＮＡ ＡＯＮ ＳＭＮ２ｅ７（３９；５１）」及び「ｔｃ−ＤＮＡ ＡＯＮ ＳＭＮ２ｉ７（１０；２５）」）用に設計されたｔｃ−ＤＮＡ ＡＯＮが、ＳＭＡ患者から単離された線維芽細胞（Ｇ０３８１３細胞株）のＳＭＮ２において、エクソン７のインクルージョンに効果的に関与することを示す。
【０１４９】
【化５】
【０１５０】
Ｇ０３８１３細胞株は、ＳＭＮ２の２コピーを有する３歳のＩ型ＳＭＡ患者に由来する。ＧＭ０３８１３細胞を、２０％ウシ胎仔血清及び１％ペニシリン−ストレプトマイシン（１００U/ml）を添加したダルベッコ変法イーグル培地（ＤＭＥＭ）で培養した。ｔｃＤＮＡ ＡＯＮ（ｔｃ−ＤＮＡ ＡＯＮ ＳＭＮ２ｉ７（１０；２５）及びｔｃ−ＤＮＡ ＡＯＮ ＳＭＮ２ｅ７（３９；５１））を、オリゴフェクタミン（Invitrogen）を使用し、血清及び抗生物質不含の培地で４８時間トランスフェクションした。トランスフェクションの４８時後に、TRIzol試薬（Invitrogen）を使用してトータルＲＮＡを抽出し、ファーストストランドｃＤＮＡを、SuperScript II（Invitrogen）及びランダムヘキサマーを使用して合成した。ＰＣＲを、Master Mix 2× Phusion GC（Finnzymes）を使用して、１１μＬのｃＤＮＡ並びに各１０μMのSMN-Ex6-FW及びSMN-Ex8-Reプライマーの総量５０μLで実施した。次に、ＰＣＲ産物を３％アガロースゲル電気泳動で分離した。
【０１５１】
【化６】
【０１５２】
図１９に示されるデータは、ｔｃ−ＤＮＡ ＡＯＮ ＳＭＮ２ｅ７（３９；５１）及びｔｃ−ＤＮＡ ＡＯＮ ＳＭＮ２ｉ７（１０；２５）の両方が、ＳＭＮ２のｍＲＮＡにおけるエクソン７のインクルージョンを促進することを示す。パネルＡは、指定のｔｃ−ＤＮＡオリゴヌクレオチドで処理したＧＭ０３８１３細胞由来のＲＮＡのＲＴ−ＰＣＲ分析を示す。両方のｔｃ−ＤＮＡオリゴヌクレオチドで処理した、エクソン７を含まないＳＭＮ２（「ＳＭＮ２（Δ７）」）に相当するバンド（レーン３及び４）は、未処理レーン（レーン２）のバンドと比較しバンド強度が低い。パネルＢは、ｔｃ−ＤＮＡ ＡＯＮをトランスフェトした後、ＳＭＮ１＋完全長ＳＭＮ２に相当する上のバンドが増加し、一方で、ＳＭＮ２（Δ７）に相当する下のバンドが大きく減少したことを示すゲルの正規化定量プロットである。
【０１５３】
パネルＣは、野生型線維芽細胞及び指定のｔｃ−ＤＮＡオリゴヌクレオチドでトランスフェクトしたＧＭ０３８１３細胞から得られたライセートのウエスタンブロットを示す。ライシスバッファー（１０mmol/lＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．９）、１００mmol/lＫＣｌ、１mmol/lＥＤＴＡ、１mmol/l１，４−ジチオスレイトール、１×コンプリートプロテアーゼ阻害カクテル（Roche）、０．５％ＮＰ−４０）で処理してタンパク質抽出物を得た。等量のタンパク質（ブラッドフォードタンパク質アッセイ（Pierce）で測定）を、２×ローディングバッファー（１２５mmol/lトリス（ｐＨ６．８）、２％ドデシル硫酸ナトリウム、１０％グリセロール、０．０１％ブロモフェノールブルー、１０％β−メルカプトエタノール）と混合し、タンパク質濃度を、ブラッドフォードタンパク質アッセイ（Pierce）を用いて測定した。１０μgの各タンパク質試料を、４〜１２％ビス−トリスゲル（Invitrogen）のＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離し、ニトロセルロース膜に転写した。１０％ミルク／ＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎバッファーで膜をブロッキングし、ＳＭＮ１、ＳＭＮ２及びＳＭＮ２のトランケート型を認識するウサギポリクローナルＳＭＮ抗体（希釈１：５００；h-195、Santa Cruz）でプローブし、次に、西洋ワサビペルオキシダーゼ結合−ヤギ抗ウサギ二次抗体（１：５０，０００）とインキュベートした。スーパーシグナルウエストピコ化学発光キット（ThermoScientific）でシグナルを検出した。タンパク質のイコールローディング（equal loading）を確認するために、膜を洗浄し、再度ブロッキングし、そして、マウスモノクローナル抗アクチン抗体でプローブした後、西洋ワサビペルオキシダーゼ結合−ヒツジ抗マウス二次抗体（１：１５，０００）とインキュベートした。シグナルを上述のように検出した。レーン１：ｔｃ−ＤＮＡ ＡＯＮ ＳＭＮ２ｉ７（１０；２５）でトランスフェクトしたＧＭ０３８１３細胞；レーン２：ｔｃ−ＤＮＡ ＡＯＮ ＳＭＮ２ｅ７（３９；５１）でトランスフェクトしたＧＭ０３８１３細胞；レーン３：ｔｃ−ＤＮＡ ＡＯＮ ＳＭＮ２ｉ７（１０；２５）及びｔｃ−ＤＮＡ ＡＯＮ ＳＭＮ２ｅ７（３９；５１）の両方でトランスフェクトしたＧＭ０３８１３細胞；レーン４：野生型線維芽細胞；レーン５：非トランスフェクトのＧＭ０３８１３細胞。
【０１５４】
パネルＣのデータは、ｃ−ＤＮＡオリゴヌクレオチドを用いてトランスフェクトすることによりＳＭＮ２のｍＲＮＡにおけるエクソン７のインクルージョンに起因してＧＭ０３８１３細胞のＳＭＮレベルがレスキューされたことを示す。コントロールのＧＭ０３８１３細胞は、ＳＭＮ２におけるエクソン７の散発性の自然インクルージョンに起因するいくつかのＳＭＮタンパク質を表す。
【０１５５】
パネルＤは、３０μgのｔｃ−ＴＳＬでトランスフェクトし、その後、ＳＭＮ抗体で染色したＧＭ０３８１３細胞の顕微鏡写真を示す。スライド上のトランスフェクトしたＧＭ０３８１３細胞をアセトン／メタノール（容積／容積）で固定した。固定した細胞を、ＰＢＳ＋５％ＢＳＡで１時間ブロッキングし、その後、ウサギポリクローナルＳＭＮ抗体（ＰＢＳ＋１％ＢＳＡ中１：１００；h-195、Santa Cruz）と１時間インキュベートした。細胞をＰＢＳで洗浄し、Alexa 594結合−抗ウサギ二次抗体と１時間インキュベートした。次に、細胞をＰＢＳで洗浄し、ＤＡＰＩ（１：５０，０００）と５分間インキュベートした。スライドに、Fluoromount-G（SouthernBiotech）を使用してカバースリップをのせ、４℃で一晩インキュベートした。顕微鏡写真は、ｔｃ−ＤＮＡ ＴＳＬでトランスフェクトしたＧＭ０３８１３細胞の核（青）で、ＳＭＮ（赤）レベルが増加したことを示す。
【０１５６】
実施例９
ＣＵＧ反復配列を対象とするトリシクロ−ＤＮＡアンチセンスオリゴヌクレオチドが、ＤＭ１筋芽細胞における突然変異ＤＭＰＫのｍＲＮＡの発現を減少させる
本実施例は、配列５’−ＣＡＧＣＡＧＣＡＧＣＡＧＣＡＧＣＡＧＣＡＧ’３’（「ｔｃ−ＤＮＡ ＡＯＮ ＤＭ１（ＣＡＧ７）」；配列番号９）を有する、突然変異ＤＭＰＫのｍＲＮＡにおけるＣＵＧ反復配列用に設計されたｔｃ−ＤＮＡ ＡＯＮが、Tissue Bank for Research「Myobank」の筋生検から単離したヒトＤＭ１筋芽細胞において８００ＣＵＧ反復配列を有する突然変異ＤＭＰＫのｍＲＮＡの発現を効果的に減少させることを示す。
【０１５７】
ＤＭ１筋芽細胞を、リポフェクタミン（Invitrogen）を使用して、増加量のｔｃ−ＤＮＡ ＡＯＮ ＤＭ１（ＣＡＧ７）（０、３．５μg、１０μg及び２０μg）でトランスフェクトした。トランスフェクトの３日後、野生型及び突然変異のＤＭＰＫのｍＲＮＡの発現をノーザンブロットにより検出した。簡単に述べると、５〜１０μgのトータルＲＮＡを、０．６６Ｍホルムアルデヒドを含有する１．３％アガロースＭＯＰＳゲルで分離し、１０×ＳＳＣを用いて毛細管輸送により、Ｈｙｂｏｎｄ−Ｎ＋膜（Amersham Pharmacia Biotech）に転写した。ブロットを、ランダムプライムド３２Ｐ−標識（ＤＭＰＫ ｃＤＮＡのBgl II-Sac Iフラグメント）プローブを用いて、ハイブリダイゼーションバッファー（２％ＳＤＳ、１０％硫酸デキストラン、１×ＳＳＰＥ、１００μg/mlサケ精子ＤＮＡ、２％Denhart's）中、６８℃で一晩ハイブリダイズした。シグナルを、ホスホイメージャー（Molecular Imager FX、Bio-Rad）で解析し、Ｑuantity One（Bio-Rad）を使用して定量した。
【０１５８】
図２０のパネルＡは、トランスフェクトされたｔｃ−ＤＮＡ ＡＯＮ ＤＭ１（ＣＡＧ７）の量の増加とともに突然変異ＤＭＰＫのレベルが減少したことを示す。重要なことに、野生型ＤＭＰＫのレベルは変化しなかった。１８Ｓ ＲＮＡをローディングコントロールとして使用した。パネルＢは、パネルＡから得られたノーザンブロットの定量プロットである。定量は、突然変異ＤＭＰＫの野生型ＤＭＰＫに対するバンド強度比を測定することにより行った。
【０１５９】
実施例１０
ＣＵＧ反復配列を対象とするｔｃ−ＤＮＡが、ＤＭ１マウスにおける突然変異ＤＭＰＫのｍＲＮＡの発現を減少させる
本実施例は、ｔｃ−ＤＮＡ ＡＯＮ ＤＭ１（ＣＡＧ７）が、ＤＭ１マウスのＴＡ筋肉で発現される７００ＣＵＧ反復配列を有する突然変異ヒトＤＭＰＫのｍＲＮＡのレベルを効果的に減少させることを示す。
【０１６０】
７００ＣＵＧ反復配列を有するヒトＤＭＰＫのｍＲＮＡを発現するＤＭ１マウスのＴＡ筋肉に、増加量のｔｃ−ＤＮＡ ＡＯＮ ＤＭ１（ＣＡＧ７）を注射した。１週間後、TRIzol試薬（Invitrogen）を使用して、トータルＲＮＡを抽出した。ヒトＤＭＰＫ及びマウスＤＭＰＫのｍＲＮＡをノーザンブロットにより検出した。簡単に述べると、８〜１０μgのトータルＲＮＡを、０．６６Ｍホルムアルデヒドを含有する１．３％アガロースＭＯＰＳゲルで分離し、１０×ＳＳＣを用いて毛細管輸送により、Ｈｙｂｏｎｄ−Ｎ＋膜（Amersham Pharmacia Biotech）に転写した。ブロットを、ランダムプライムド３２Ｐ−標識（ＤＭＰＫ ｃＤＮＡのBgl II-Sac Iフラグメント）プローブを用いて、ハイブリダイゼーションバッファー（２％ＳＤＳ、１０％硫酸デキストラン、１×ＳＳＰＥ、１００μg/mlサケ精子ＤＮＡ、２％Denhart's）中、６８℃で一晩ハイブリダイズした。シグナルを、ホスホイメージャー（Molecular Imager FX、Bio-Rad）で解析し、Ｑuantity One（Bio-Rad）を使用して定量した。
【０１６１】
図２１のパネルＡ及びＣは、トランスフェクトされたｔｃ−ＤＮＡ ＡＯＮ ＤＭ１（ＣＡＧ７）の量の増加とともに突然変異ヒトＤＭＰＫのレベルが減少したことを示す。パネルＢ及びＤは、それぞれ、パネルＡ及びＣから得られたノーザンブロットの定量プロットである。定量は、突然変異ヒトＤＭＰＫの野生型マウスＤＭＰＫに対するバンド強度比を測定することにより行った。
【０１６２】
本開示を、その様々な実施態様の各々で記載しているが、それに対する特定の変更を、前述の説明に記載するような、そして、下記の特許請求の範囲でさらに具体化されるような本開示の真の精神及び範囲から逸脱することなく、当業者が実施及び達成することができることが予想される。本開示は、本明細書に記載の特定の実施態様により制限されるものではない。実際、本明細書に記載される変更に加え本開示の様々な変更は、前述の説明及び添付の図から当業者には明らかになるであろう。このような改変は、添付の特許請求の範囲内であることが意図される。さらに、全ての値が概算値であり、説明のために提供されることが理解される。
【０１６３】
本明細書で参照される米国特許、米国公開特許公報、米国特許出願、外国特許、外国特許出願、非特許公報、図、表及びウェブサイトの全ては、参照することによりその全体が、本明細書に明示的に組み込まれる。
【０１６４】
【表１】
【技術分野】
【０００１】
本開示は、一般的に、プレ−ｍＲＮＡのプロセッシング過程において生じるスプライシングイベントを改変するための、あるいは、例えば、３’又は５’ＣＵＧ、ＣＡＧ及び／又はＣＣＵＧなどの反復配列を含有する突然変異ｍＲＮＡの発現をダウンレギュレーションするための、合成アンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＯＮ）、並びに、アンチセンスオリゴヌクレオチドを用いる方法に関する。さらに具体的には、プレ−ｍＲＮＡのプロセッシング過程におけるエクソンスキッピングの促進に、プレ−ｍＲＮＡにおけるイントロンサイレンサー配列及び／又はステムループ配列のマスキングに、並びに、ｍＲＮＡのＲＮａｓｅ介在破壊の標的化に有効なトリシクロ−ＤＮＡ（ｔｃ−ＤＮＡ）ＡＯＮが本明細書で開示される。ジストロフィンタンパク質の機能を修復するための、ジストロフィン遺伝子内の突然変異エクソン２３又はエクソン５１などの突然変異エクソンをスキッピングすることによる、デュシェンヌ型筋ジストロフィーを処置するための方法で使用することができるｔｃ−ＤＮＡ ＡＯＮが本明細書で記載される。また、非機能性ＳＭＮ１タンパク質を少なくとも部分的に補完することができるエクソン７によりコードされるアミノ酸配列を含む、修飾された機能性ＳＭＮ２タンパク質を生成するための、ＳＭＮ２遺伝子内のイントロンサイレンシング配列及び／又は末端ステムループ配列をマスキングすることによる、脊髄性筋萎縮症を処置するための方法で使用することができるｔｃ−ＤＮＡ ＡＯＮが記載される。また、さらに、本明細書に記載のｔｃ−ＤＮＡ ＡＯＮは、３’−末端ＣＵＧ反復配列を含む突然変異ＤＭ１のｍＲＮＡの破壊を標的化することによる、スタイナート筋緊張性ジストロフィーを処置するための方法で使用することができる。従って、ｔｃ−ＤＮＡ ＡＯＮ及び１つ以上の前述のアプローチ法を、ミオパチーに関連するタンパク質の機能を修復するために使用することができる。
【背景技術】
【０００２】
デュシェンヌ型筋ジストロフィー（ＤＭＤ）は、民族に関係なく、男児の３，５００人に１人が冒される最も一般的な遺伝性ミオパチーである。頻度は低いが、女児及び女性がマニフェスティングキャリアーでデュシェンヌ様症状を呈する可能性もある。ＤＭＤによる最も重要な影響は、筋線維が非常にもろくなり、そして、通常の筋活動が筋組織に全般的な損傷を引き起こすことである。ＤＭＤ、並びに、多くの筋ジストロフィーで観察される終点は、変性がゆっくり進行してほぼ完全に脂肪浸潤を伴う線維症に至ることである。脊椎変形及び呼吸困難により、１９６０年代の平均余命は約１５年であった。心臓合併症がない場合では、現在、管理方法（即ち、関節固定及び気管切開換気法）の改善により平均余命が３０年に伸びた。
【０００３】
ＤＭＤの臨床症状は１８か月〜３歳で現れ、歩行や登る能力の遅延、床からの起立困難、異常に肥大したふくらはぎなどが見られる。約５〜６年で、筋収縮が足、膝及び股関節に起こる。疾患の進行は継続的な筋萎縮を特徴とし、約９〜１２年で歩行不能となる。さらに、デュシェンヌ型の男児の中には精神遅滞を呈するものもあり、これにより、欠損タンパク質が中枢神経系にも関与していることが示唆される。
【０００４】
デュシェンヌ型筋ジストロフィーは、Ｘ染色体連鎖劣性欠損症である。ＤＭＤ遺伝子座は、１９８６年、ジストロフィンと呼ばれるタンパク質をコードする遺伝子のポジショナルクローニングアプローチ法により、Ｘ染色体（Ｘｐ２１．２−ＯＭＩＭｉｄ：３１０２００）上に確認された。ジストロフィン遺伝子で突然変異が起こると、横紋筋でジストロフィンの産生ができなくなる。罹患男児の母の２／３が、ジストロフィン突然変異のキャリアーである可能性があり、一方で、患者の約１／３がデノボ突然変異を有する。ＤＭＤの男児の半数以上が、複数のエクソンが含まれる大きなゲノム欠失を示し；これらの数人は、大きな配列重複を有する。また、確認が困難な点突然変異又は極めて小さな欠失若しくは重複を有する場合もある。
【０００５】
しかし、突然変異の程度は、表現型の重症度と直接関係していない。中途終止コドン及びその後の翻訳の失敗をもたらすアウトオブフレーム欠失又はナンセンス突然変異は、重症の表現型を特徴とするジストロフィン欠損を生じる。インフレーム欠失は、ベッカー型筋ジストロフィー（ＢＭＤ）として知られる軽症のミオパシーに関与している。
【０００６】
約２．５百万塩基対のＤＭＤ遺伝子座は、これまでに検出された最も長い遺伝子であるが、わずか約１４，０００塩基対が、７９個のエクソンに広がるコード配列を含有する。完全長ジストロフィン（ＤＰ４２７）は、全ての筋肉で発現される４２７kDaの細胞骨格タンパク質であるが、様々なタンパク質アイソトープ（ＤＰ２６０、ＤＰ１４０、ＤＰ１１６、ＤＰ７１）が、それぞれ、イントロン２９、４３、５５及び６２に位置する４つの内部プロモーターにより、組織特異的に、異なる使用頻度（網膜、中枢神経系、末梢神経系及び非筋肉組織）で生成される。
【０００７】
完全長ジストロフィンは、筋原線維細胞骨格を細胞外マトリックスに結合させることによる筋線維の膜完全性の維持に関与する筋細胞膜−糖タンパク質複合体（ＳＧＣ）に不可欠な成分である。配列解析から、ジストロフィンタンパク質にはいくつかのドメイン及び反復配列が必要であることが予測された。概略すると、Ｎ−末端のアクチンハイブリダイズ部位（Ｎ−ＡＢＤ）；フレキシビリティを付与しうる４個のヒンジセグメント（Ｈ）を含有する中心桿状ドメイン（ＲＤ；２４個のスペクトリン様反復配列を有する）；及び、Ｃ−末端（ＣＴ）近傍のＤＰＣの他のメンバーに結合するシステインリッチドメイン（ＣＲＤ）が存在する。
【０００８】
構造／機能解析により、タンパク質機能に極めて重要なドメインが同定された。これは、エクソン１７〜４８（コード配列の４６％）の欠失が含まれる軽度の疾患を有する患者において生じる内部欠失により実証された（England et al., Nature 343(6254):180-2 (1990）)。これは、過去１０年間、遺伝子導入実験で幅広く使用された機能性「ミニジストロフィン」の概念をもたらした。現在、ＣＲＤが不可欠である一方で、Ｎ−ＡＢＤ及びＣＴドメインが除去されると中程度の機能喪失が引き起こされることが認められている。ＲＤの変化は、トランケートの程度及び性質に依存して多様な表現型をもたらす。例えば、ＲＤが欠損したジストロフィン（ΔＲ１−Ｒ２４）は機能的ではないが、一方で、２４個の内８個の完全なスペクトリン様反復配列を保持するトランケートされたジストロフィン（ΔＨ２−Ｒ１９）は、完全な活性を有するタンパク質を生じる。
【０００９】
デュシェンヌ型筋ジストロフィーのための十分に特徴づけられた２種類の遺伝子動物モデルがある。ｍｄｘマウスは、ジストロフィン遺伝子のエクソン２３に、完全長の野生型ジストロフィンタンパク質合成を妨げるナンセンス突然変異を有する。ｍｄｘマウスは、機構損傷を修復するための再生過程を維持することができる、変性を抑制する代償機構を示す。ｍｄｘマウスは、ＤＭＤの症状を示さず、その生存期間はほとんど正常である。
【００１０】
ＧＲＭＤ（ゴールデンレトリーバ筋ジストロフィー）イヌは、イントロン６に、リーディングフレームを破壊するスプライス部位突然変異を有することにより機能性ジストロフィンが欠如している。ＧＲＭＤは、ヒトのＤＭＤと同様に、進行性の線維変性によって、顕著な筋内膜及び筋周囲線維化を伴う骨格筋萎縮に必然的に至る。ＧＲＭＤは、ＤＭＤ様の表現型をもつことから、依然としてＤＭＤの潜在的治療法の評価のための最も有用なモデルとなっている。
【００１１】
ＤＭＤの発症に関連するジストロフィン遺伝子の突然変異が同定及び特徴づけられ、そして、有望な治療薬剤を試験するための適切な動物モデル系が利用可能であるにも関わらず、この疾患を処置するための組成物及び方法が当技術分野において引き続き求められている。過去１０年にわたる研究の中には、デュシェンヌ型の男児においてステロイド処置（プレドニゾン及びデフラザコート）の有効性を支持しているものもあるが、広範な統計学的評価はまだ十分に完了していない。また、ゲンタマイシン薬物を用いて中途終止コドン突然変異を薬理学的に誘導させたリードスルーは、５％以下のＤＭＤ患者に有効である可能性がある。ｍｄｘマウスモデルの前臨床試験の結果が論争中であるにも関わらず、臨床試験がアメリカ及びイタリアで実施されている。PTC Therapeuticsにより開発された新規な薬物（ＰＴＣ１２４）がより有望であると思われる。また、喪失したジストロフィンの機能を補完することができる薬物、その成分であるジストロフィン様タンパク質のユートロフィンを使用してユートロフィン遺伝子をアップレギュレーションする研究が進行中である。
【００１２】
他にも多くの調査手段がある；例としては、最近、ブロッキング抗体を使用することによりミオスタチンに拮抗させて、ｍｄｘマウスの筋力を向上させることができたことが示された。このアプローチ法は、最初、正常筋芽細胞を罹患筋肉に複数回注射することに基づいていた（Partridge et al., Nature 337(6203):176-9 (1989)）。その後の臨床試験（１９９１〜９８年）は失敗に終わったが、細胞製造及び送達手順の改良によりカナダにおいて新たな第１相試験が可能になった（２００２年）。また、最近の進展において、遺伝子修復の詳細がまだ不確かであるにも関わらず、骨髄又は血管のいずれかに由来する幹細胞が、全身経路を介して骨格筋を標的化することができる証拠が提供された。
【００１３】
ＤＭＤの遺伝子療法は、媒体として遺伝子ベクターを使用する、骨格線維へのジストロフィンミニ遺伝子のin situ送達に依存している。ネイキッド完全長ｃＤＮＡを入れたプラスミドベクターを使用した最初の予備研究が、フランスで実施された（２０００〜０３年）。筋遺伝子療法で試験された様々なタイプのベクターの中で、アデノウィルス随伴ウィルス（ＡＡＶ）誘導ベクターが最も有望であると思われる。ＡＡＶベクターは、多くの利点を有する：（ｉ）これらは、筋線維を含む様々な種類の細胞に感染することができる；（ｉｉ）これらは、全てのウィルス遺伝子を欠損しており、さらに、その野生型ウィルスが今までにヒトのどんな病状とも関連していないことから安全であると思われる；（ｉｉｉ）宿主細胞のゲノムに組み込まれる野生型ＡＡＶとは反対に、複製欠損性ＡＡＶベクターは、通常、エピソームとして残存し、従って、挿入突然変異のリスク又は癌遺伝子の活性化を制限する；そして、（ｉｖ）他のベクター系とは対照的に、ＡＡＶベクターは、重大な免疫応答を引き起こさないため、治療導入遺伝子が長期間発現される（ただし、これらの遺伝子産物が拒絶されなかった場合）。ＡＡＶベクターは、また、高力価で産生することができ、少なくとも齧歯動物においては、強制動脈注射を行うことで、単回注射で多くの筋肉領域に遺伝子を導入することが可能となる。ＡＡＶベクターは、全てのウィルス遺伝子を欠損しているが、これらの送達積荷は、４．５kbまでに限られる。その理由から、ＡＡＶを選択すると、完全長ジストロフィン（１４kb）の代わりに約４kbのμ−ジストロフィン変異体を開発する結果に至った。これらの変異体のいくつかは、形質転換又は遺伝子導入のいずれかによりｍｄｘモデルで有利に試験された。
【００１４】
多くのＤＭＤ患者、並びに、ｍｄｘマウス及びＧＲＭＤイヌでは、珍しいジストロフィン陽性線維が報告された。復帰突然変異線維は時間に比例して増加するが、残念なことに、これらの復帰突然変異線維の数は有意な臨床的効果を付与するには少なすぎる。リーディングフレームがエクソンスキッピングにより修復されうることが研究により示唆されてはいるが、これらの復帰突然変異線維が生じる機構は、依然未知のままである。このような自然現象から、スプライシングに干渉、従って、エクソンスキッピングを誘導するための２’−Ｏ−メチルアンチセンスオリゴリボヌクレオチド並びにモルフォリノの使用に基づく、遺伝子修復／改変のための戦略の設計に向けた調査が促された。実際に、このアプローチ法は、in vitroのｍｄｘ、ＧＲＭＤ及びＤＭＤ筋肉細胞、さらに、in vivoで使用することに成功した（２’−Ｏ−メチルの場合では、ニュージーランドで第１相臨床試験が成功；モルフォリノを用いた第１相臨床試験は、ＵＫで進行中である）。しかし、このアプローチ法には、合成ＡＯの定期的な投与が必要であり、そして、全身送達が十分に達成されなかったという欠点がある。
【００１５】
代わりのアプローチ法は、アンチセンスＲＮＡ分子としてベクターからin situで対象配列を合成することである。しかし、「治療」アンチセンスＲＮＡ分子のin vivo産生は、安定性及び細胞内局在性などの多くの問題がある。スプライシング反応に関与することが知られている核内低分子ＲＮＡ（ｓｎＲＮＡ）を、キャリアーとして使用して、これらの制限を克服することができる。最近の報告では、ジストロフィン遺伝子のエクソン２３又はエクソン５１のいずれかのスプライス部位に対するアンチセンス配列を有するＵ７ ｓｎＲＮＡが、ｍｄｘ及びΔ４８−５０ＤＭＤ細胞のそれぞれにおいて、in vitro並びにin vivoでジストロフィン合成を誘導することが示された。
【００１６】
欠失に隣接する（いずれかの側の）単一エクソンのスキッピングが理論的に有効とされる、アウトオブフレーム欠失を有する全てのＤＭＤ患者でin silico研究が行われた。興味深いことに、エクソン５１のスキッピングは、事例（即ち、Δ４５−５０、Δ４７−５０、Δ４８−５０、Δ４９−５０、Δ５０及びΔ５２）の２２％において、ミニジストロフィンを修復することが予測される。結果として得られるトランケートされたタンパク質が、これらがいくつかのＢＭＤ患者で確認される欠失に相当することから、少なくとも部分的に機能的であることが期待される。さらに、わずかではあるが、Δ５１−５２及びΔ４８−５１のインフレーム欠失を有する健常男性が確認された。選択患者のエクソン５１のスキッピングにより、機能的なより短いジストロフィンが産生され、これによって、表現型が改善されるだろう。
【００１７】
精神遅滞は、ＤＭＤと関連することが多い症状であり、神経細胞においてジストロフィンが欠乏することにより引き起こされる。従って、脳において半機能性ジストロフィンをレスキューすることで、認識障害を修復又は改善することができる。
【００１８】
脊髄性筋萎縮症（ＳＭＡ）は、一般的に、１９９０年、５番染色体ｑ１１．２−１３．３上にマッピングされた生存運動ニューロン（ＳＭＮ）遺伝子において共通する遺伝子欠損から生じる様々な障害を指す。ヒトの５番染色体は、ＳＭＮ遺伝子の２コピー、ＳＭＮ１及びＳＭＮ２の大きな重複を含有する。
【００１９】
ＳＭＡは、遺伝的な新生児死亡の最も一般的な要因である。ＳＭＮが関連するＳＭＡの全ての形態は、約１／６，０００の合計発生率を有する。遺伝子頻度はおよそ１：８０であり、約４０人に１人がキャリアーである。キャリアーの健康への影響は知られておらず、その可能性を検討するために知りうる唯一の方法は、血縁者が罹患することである。
【００２０】
ＳＭＡは、脊髄及び脳幹の運動ニューロンの喪失を特徴とする。一般的に、症状が早い段階で現れるほど、予想される寿命は短くなる。一度症状が現れると、運動ニューロン細胞が急速に壊死する。ＳＭＡの全ての形態が、共通して、脱神経により引き起こされる筋力低下、即ち、神経刺激の喪失に起因して収縮シグナルが失われることによる筋萎縮を有する。脊髄性筋萎縮症は、運動ニューロンのみが冒される。感覚脱失に起因する感覚障害及び運動神経喪失に起因する筋力低下の両方を一緒に引き起こす遺伝性障害が、シャルコー・マリー・トゥース又は遺伝性運動感覚性ニューロパシーに包括的に分類されることが知られている。
【００２１】
ＳＭＡの進行は、筋力低下の重症度に直接関連する。ＳＭＡの重症型の幼児は、呼吸を維持する筋肉の脆弱が原因の呼吸器疾患で死亡することが多い。ＳＭＡの軽症型の子供は、生来かなり長く生きることができるが、特に、軽症型の中でもより重症者は広範な医療サポートが必要であろう。
【００２２】
重度の小児ＳＭＡ又はウェルドニッヒ・ホフマン病としても知られているＩ型ＳＭＡは最も重症であり、生後１年以内に現れる。この型は、一般的に、生後早く、そして突然発症する；Ｉ型ＳＭＡであると診断された新生児は、一般的に、１年以上生存することはできない。肺炎は、生存運動ニューロンの壊死に起因する最終的な死亡原因と考えられる；運動ニューロン死は、主要な身体の器官システム、特に、呼吸器（例えば、呼吸及び肺内に溜まった分泌物の除去）の機能不全を引き起こす。ＩＩ型ＳＭＡ（又は中間ＳＭＡ）では、子供は、起立及び歩行はできないが、一生の一定期間は座位を維持することができることが記載される。筋力低下の発生は、通常、６〜１８か月の時期に認められる。筋力低下は、個体の一生にわたってゆっくりと徐々に拡大する。ＩＩＩ型ＳＭＡ患者は、少しは歩行することができる。
【００２３】
ＳＭＡは、典型的に、機能性ＳＭＮ１遺伝子が少なくとも１コピーあるかどうかを決定する生存運動ニューロン（ＳＭＮ）遺伝子試験で診断される。ＳＭＮ１遺伝子は、完全にプロセッシングされたｍＲＮＡにおいてエクソン７及び８が存在するかどうかにより、よく類似するＳＭＮ２遺伝子と区別される。ＳＭＮ２遺伝子は、また、低レベルであるがタンパク質製造の効率を低下させる突然変異を含有する。ＳＭＡは、両方の染色体からのＳＭＮ１遺伝子の喪失及び機能性ＳＭＮ１タンパク質の喪失を補完するＳＭＮ２タンパク質の機能不全により引き起こされる。
【００２４】
ＳＭＡ治療薬を開発するための現在の戦略には、ＳＭＮ２レベルを増大させるか、残りのＳＭＮ２機能を増強させるか、あるいは、ＳＭＮ１活性の喪失を補完する薬物の同定が挙げられる。ブチラート、バルプロ酸、ヒドロキシウレア及びリルゾール（Rilutek（登録商標）、Sanofi Aventis）などの薬物が、ＳＭＡを処置するための臨床研究段階にある。遺伝子置換戦略が動物で試験されているが、現在のＳＭＡの処置は、慢性的な運動ユニット喪失の二次的な影響を予防及び管理することからなる。現在のところ、ＳＭＡの進行を修正する公知の薬物はなく、そして、ＳＭＡの遺伝子置換は、ヒトに応用することができるまでにさらに何年もの調査期間が必要となる可能性が高い。
【００２５】
筋緊張性ジストロフィー（ＤＭ）は、生後〜老齢期までのいずれの年齢においても現れる可能性のある慢性的でゆっくり進行する、非常に多様な遺伝性多臓器疾患である。筋緊張性ジストロフィーは、成人が発症する筋ジストロフィーの最も一般的な型であり、デュシェンヌ型筋ジストロフィー後のいずれかの骨格筋疾患で二番目に最も一般的な型である。ＤＭは、筋肉の萎縮（筋ジストロフィー）、後嚢下虹色白内障（眼のレンズの混濁）、心伝導系障害、内分泌変化及びミオトニー（筋肉の弛緩困難）を特徴とする。
【００２６】
現在、ＤＮＡ解析により同定可能な２つのよく知られたタイプの成人発症ＤＭがある：筋緊張性ジストロフィー１型（ＤＭ１）は、一般的に、新生児で重症化しうる先天性型及び子供が発症する型を有するシュタイネルト病と呼ばれる。筋緊張性ジストロフィー２型（ＤＭ２）は、ＰＲＯＭＭ又は近位型筋緊張性ミオパチーとしても知られている。筋緊張性ジストロフィーのさらなる型（例えば、ＤＭ３、ＤＭ４、ＤＭＸ）も疑われるが、これらの存在は未だ確認されていない。ＤＭ１及びＤＭ２は、両方とも緩徐な変性状態を示すと考えられるが、ＤＭ２は、一般的にＤＭ１よりも軽症であると考えられる。
【００２７】
症状の兆候は、型（ＤＭ１／ＤＭ２）、重症度、そして異常なＤＭ２表現型によって大きく変化する。ＤＭ１患者は、ミオトニー、重症の遠位筋力低下及び重度の認知障害を呈することが多い。ＤＭ２患者は、一般的に、筋肉痛、凝り、疲労又は下肢近位脱力の発症を呈する（Day et al. Neurology 60(4): 657-64 (2003)）。筋力低下の特徴的なパターンは、ＤＭ１とＤＭ２の場合で異なる。ＤＭ１では、顔及び顎筋、眼瞼下垂（眼瞼下垂症）、頸筋の筋力低下、手及び下肢で見られる。ＤＭ２では、筋力低下は、近位筋、即ち、身体の胴体、頸、肩、股関節屈筋及び太股に近い筋肉でより顕著である。
【００２８】
ＤＭ１の症状には、睡眠過剰（日中の眠気）、筋萎縮、嚥下障害及び呼吸不全が含まれる。ＤＭ１患者は、ＤＭ２患者よりも多様な認知障害を経験しうる。何型を有するか、そして、重症度に依存して、ＤＭ１の認知障害は、発育遅延、学習障害、言語、会話、挙動、無気力症又は睡眠過剰に及びうる。ＤＭ２の認知症状には、実行機能（即ち、組織化、集中、単語発見など）及び睡眠過剰に関する障害が含まれる。
【００２９】
ＤＭ１では、疾患遺伝子は、ＤＭＰＫ（筋緊張性ジストロフィープロテインキナーゼ）と呼ばれ、骨格筋で発現するセリン／トレオニンプロテインキナーゼをコードする。その遺伝子は、１９番染色体の長腕に位置する。ＤＭ１では、ＤＭＰＫ遺伝子は、シトシン−チミン−グアニン（ＣＴＧ）の三塩基反復配列を特徴とする。反復配列の数は、ヒトによって大きく変化するが、健常者の平均は５〜３７である。ＤＮＡの反復配列が細胞分裂の間に修復又は複製される時、細胞機構がずれ、三塩基反復配列の余分なコピーが配列に追加されることがある。ＤＭＰＫ遺伝子に３７を超える三塩基反復配列があると、その配列は不安定になりずれがよく起こるようになる。
【００３０】
ＤＭ１患者は５０を超える、そして、２０００ものＣＴＧ反復配列を有しうる。その結果、ＤＭ１を有する個体の反復配列のサイズが、配偶子形成又は初期胚発生過程で一般的により大きくなり、これにより、罹患した成人の子供が、典型的に、配偶子形成過程でのずれに起因してその親よりも大きな伸長を示す（この現象は表現促進と呼ばれる）。より大きな伸長を示す個体は障害の発症がより早く、より重度の表現型を呈する。
【００３１】
ＤＭ２は、同様に３番染色体ｑ２１上のＺＮＦ９遺伝子の欠損により引き起こされる。ＤＭ２の反復配列の伸長は、ＤＭ１の場合に比べ極めて大きく（７５〜１１，０００を超える反復配列）、そして４つのヌクレオチドの反復配列が関係する。しかし、ＤＭ１とは異なり、ＤＭ２においては、反復ＤＮＡの伸長のサイズは、発症の年齢又は疾患の重症度に影響があるように思われない。表現促進は、ＤＭ２では重要でないように思われる。
【００３２】
現在のところ、筋緊張性ジストロフィーに特化した治療又は処置法はない。心臓障害、白内障及びその症状を伴う他の異常は処置することができるが、治癒することはできない。しかし、ミオトニー、疼痛及び過剰な眠気などの症状のいくつかを軽減することができる医学的介入及び薬物治療がある。ハイスループットスクリーニング及びアンチセンス療法などの分野の研究は、将来に向けてより効果的な標的処置に希望を与えている。筋肉特異的クロライドチャネル１（ＣｌＣ−１）の改変スプライシングは、ＤＭ１の筋緊張性の表現型に影響を与え、ＣｌＣ−１のｍＲＮＡのスプライシングを改変するモルフォリノアンチセンスオリゴヌクレオチドを使用したマウスモデルにおいては可逆的である（Wheeler et al., J. Clin. Invest. 117(12):3952-7 (2007)）。
【００３３】
デュシェンヌ型筋ジストロフィー、脊髄性筋萎縮症及びスタイナート筋緊張性ジストロフィーに対する治療モダリティの研究が進行中であるにもかかわらず、これらの疾患を処置するための有効な化合物及び治療方法が緊急に求められている。
【００３４】
本開示の概要
本開示は、デュシェンヌ型筋ジストロフィー、脊髄性筋萎縮症及びスタイナート筋緊張性ジストロフィーなどの疾患を処置するための、トリシクロ−ＤＮＡ（ｔｃ−ＤＮＡ）アンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＯＮ）及びｔｃ−ＤＮＡ ＡＯＮを用いる方法を提供することによりこれらの及び他の関連する必要性を満たす。
【００３５】
本発明は、また、一般的に、対象にｔｃ−ＤＮＡアンチセンスオリゴヌクレオチドを投与することを含む、前記対象の中枢神経系の細胞における異常遺伝子発現を修正する方法であって、前記ｔｃ−ＤＮＡアンチセンスオリゴヌクレオチドが、前記遺伝子によりコードされるＲＮＡの一部に相補的であり、そして、前記ｔｃ−ＤＮＡアンチセンスオリゴヌクレオチドが、前記異常発現を修正するのに十分な量で対象に末梢投与される、方法に関する。
【００３６】
本発明は、また、対象にｔｃ−ＤＮＡアンチセンスオリゴヌクレオチドを投与することを含む、前記対象の中枢神経系における異常遺伝子発現により引き起こされる遺伝子疾患を処置するための方法であって、前記ｔｃ−ＤＮＡアンチセンスオリゴヌクレオチドが、前記遺伝子によりコードされるＲＮＡの一部に相補的であり、そして、前記ｔｃ−ＤＮＡアンチセンスオリゴヌクレオチドが、前記異常発現を修正するのに有効な量で対象に末梢投与される、方法に関する。
【００３７】
本発明は、また、ｔｃ−ＤＮＡアンチセンスオリゴヌクレオチドを含む医薬組成物であって、前記ｔｃ−ＤＮＡアンチセンスオリゴヌクレオチドが、ヒト遺伝子によりコードされるＲＮＡの一部に相補的であり、そして、前記組成物が薬学的に許容しうる賦形剤をさらに含む、医薬組成物に関する。
【００３８】
本発明は、また、対象の中枢神経系における異常遺伝子発現により引き起こされる遺伝子疾患の処置に使用するためのｔｃ−ＤＮＡアンチセンスオリゴヌクレオチドであって、前記ｔｃ−ＤＮＡアンチセンスオリゴヌクレオチドが、前記遺伝子によりコードされるＲＮＡの一部に相補的であり、そして、前記ｔｃ−ＤＮＡアンチセンスオリゴヌクレオチドが、前記異常発現を修正するのに有効な量で対象に末梢投与される、ｔｃ−ＤＮＡアンチセンスオリゴヌクレオチドに関する。
【００３９】
本明細書で使用される、用語「末梢投与」は、処置を必要とする対象の中枢神経系に直接注射することを意図しない任意の投与経路を含むがこれらに限定されない。さらに具体的には、末梢投与は、筋肉内（ｉ．ｍ．）、静脈内（ｉ．ｖ．）、腹腔内（ｉ．ｐ．）、動脈内、皮下又は経皮注射などの全身注射を含む。
【００４０】
本発明は、また、神経筋疾患又は筋骨格疾患の処置に使用するためのｔｃ−ＤＮＡアンチセンスオリゴヌクレオチドに関する。用いられるｔｃ−ＤＮＡアンチセンスオリゴヌクレオチドは、本明細書下記でさらに詳細に記載する。さらに具体的には、該ｔｃ−ＤＮＡアンチセンスオリゴヌクレオチドは、本明細書で示される特定のｔｃ−ＤＮＡの一つであることができる。
【００４１】
神経筋疾患又は筋骨格疾患は、遺伝子の変化から生じうるものであって、前記変化は、
エクソンのインフレーム突然変異、遺伝子の翻訳リーディングフレームを破壊する突然変異、
前記遺伝子によりコードされるｍＲＮＡにおける異常エクソンのインクルージョンにより補完されうる有害突然変異であって、ｔｃ−ＤＮＡは、前記遺伝子によりコードされるプレ−ｍＲＮＡに存在するＩＳＳ又はＴＳＬに相補的であり、そして、異常エクソンのインクルージョンを促進する、突然変異、又は、
前記遺伝子によりコードされるｍＲＮＡにおいて有害な３’ＣＵＧ増幅を生じる突然変異である。
【００４２】
特定の実施態様においては、変化がエクソンのインフレーム突然変異である場合、前記ｔｃ−ＤＮＡは、前記エクソンのスキッピングを促進することができる。別の実施態様においては、変化が遺伝子の翻訳リーディングフレームを破壊する突然変異である場合、前記ｔｃ−ＤＮＡは、遺伝子のリーディングフレームを修復するためにエクソンのスキッピングを促進することができる。別の実施態様においては、変化が前記遺伝子によりコードされるｍＲＮＡにおいて有害な３’ＣＵＧ増幅を生じる突然変異である場合、前記ｔｃ−ＤＮＡ ＡＯＮは、前記増幅を含有するｍＲＮＡを破壊することができる。
【００４３】
本明細書に示されるｔｃ−ＤＮＡ ＡＯＮは、例えば、より慣習的な２’−Ｏ−メチル−ホスホロチオエート又はモルフォリノ化学を用いるＤＮＡ ＡＯＮと比較して、相補的プレ−ｍＲＮＡとの向上したハイブリダイゼーション特性を示す拘束されたＤＮＡ ＡＯＮである。２’−Ｏ−メチル−ホスホロチオエート又はモルフォリノＤＮＡ ＡＯＮは、典型的に、特異的なプレ−ｍＲＮＡ標的ハイブリダイゼーションを達成するために２０〜２４ヌクレオチドを必要とするが、本開示のｔｃ−ＤＮＡ ＡＯＮは、１０〜１８ヌクレオチド長、より広範には、約６〜約２２ヌクレオチド長、特に、８〜２０ヌクレオチド長で特異的なプレ−ｍＲＮＡ標的ハイブリダイゼーションを可能にする。
【００４４】
以下により詳細に記載するように、エクソンスキッピングは、核内で、プレ−ｍＲＮＡの成熟過程において達成される。それは、プレ−ｍＲＮＡ内のエクソン決定配列に相補的であるアンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＯＮ）を使用することによる、標的エクソンのスプライシングに関与する鍵配列のマスキングを含む。本明細書においては、ジストロフィンプレ−ｍＲＮＡ内のイントロン−エクソン接合部におけるスプライス部位、あるいは、より一般的には、エクソン決定に使用される部位のマスキングによるエクソンスキッピングに適切に用いることができ、これにより、プレ−ｍＲＮＡから成熟ｍＲＮＡへのプロセッシング過程において有害なエクソンの除去が促進される、ｔｃ−ＤＮＡ ＡＯＮが提供される。このようなｔｃ−ＤＮＡ ＡＯＮは、ナンセンス、終始、フレームシフト突然変異を含有するエクソン配列又は有害な潜在性エクソンを含有するイントロン配列を含む突然変異ジストロフィン遺伝子のオープンリーディングフレームを修復することによりデュシェンヌ型筋ジストロフィーの処置で使用することができるであろう。
【００４５】
例えば、ジストロフィン遺伝子のエクソン２３又はエクソン５１内のナンセンス突然変異又はフレームシフト突然変異は、カルボキシ末端がトランケートされた、非機能性ジストロフィンタンパク質を生成する。本明細書に開示のｔｃ−ＤＮＡ ＡＯＮは、イントロン２３又はイントロン５１におけるジストロフィンプレ−ｍＲＮＡのスプライスドナー部位を含むヌクレオチド、そして、エクソン２３又はエクソン５１に隣接する５’ヌクレオチドにハイブリダイズすることにより、突然変異エクソン２３又はエクソン５１の成熟ｍＲＮＡ転写産物へのインクルージョンを抑制することができる。その成熟ｍＲＮＡ転写産物の発現により、エクソン２３又はエクソン５１によりコードされるアミノ酸が欠失しているが、これらの欠失アミノ酸のＮ−末端及びＣ−末端側の両方にジストロフィンアミノ酸を含有する機能性ジストロフィンタンパク質が生成され、従って、半機能性「擬ジストロフィン」が構成される。
【００４６】
ジストロフィンプレ−ｍＲＮＡのプロセッシング過程においてエクソンをスキッピングするための、本明細書に開示のｔｃ−ＤＮＡ ＡＯＮは、約６〜約２２ヌクレオチド、特に、約８〜２０トリシクロヌクレオチド、特に、１０〜１８トリシクロヌクレオチドを含有し、ｔｃ−ＤＮＡ ＡＯＮの８〜１６ヌクレオチドは、ジストロフィンプレ−ｍＲＮＡのイントロンスプライスドナー部位に相補的であり、ｔｃ−ＤＮＡ ＡＯＮの２〜８ヌクレオチドは、ジストロフィンプレ−ｍＲＮＡのエクソン領域に相補的であり、そして、イントロンスプライスドナー部位は、エクソン領域の５’側に隣接している。特定の態様の範囲内において、ｔｃ−ＤＮＡ ＡＯＮは、１２〜１６ヌクレオチド又は１３〜１５ヌクレオチドであり、イントロンスプライスドナー部位に相補的である６〜１４ヌクレオチド及びエクソン領域に相補的である２〜５ヌクレオチドを含む。しかし、より長いｔｃ−ＤＮＡ ＡＯＮを、ジストロフィンプレ−ｍＲＮＡのプロセッシング過程におけるエクソンスキッピングを達成するために適切に用いることができることが理解されるであろう。
【００４７】
本明細書において、ジストロフィンプレ−ｍＲＮＡ内の突然変異エクソン２３のスキッピングのために設計されたｔｃ−ＤＮＡ ＡＯＮが例示される。ｔｃ−ＤＮＡ ＡＯＮは、ヌクレオチド配列５’−ＡＡＣＣＴＣＧＧＣＴＴＡＣＣＴ−３’（Ｍ２３Ｄ（＋０２−１３）、配列番号１）を含み、ジストロフィンプレ−ｍＲＮＡのイントロン２３の３’末端でヌクレオチドに、そして、ジストロフィンプレ−ｍＲＮＡのエクソン２３に隣接する５’末端でヌクレオチドと特異的にハイブリダイズする。また、ジストロフィンプレ−ｍＲＮＡ内の突然変異エクソン５１のスキッピングのために設計されたｔｃ−ＤＮＡ ＡＯＮが提供される。ｔｃ−ＤＮＡ ＡＯＮは、５’−ＡＧＡＡＡＴＧＣＣＡＴＣＴＴＣ−３’（Ｈ５１（＋６８＋８２）、配列番号２）、５’−ＡＡＡＴＧＣＣＡＴＣＴＴＣＣＴ−３’（Ｈ５１（＋７０＋８４）、配列番号３）及び５’−ＴＧＣＣＡＴＣＴＴＣＣＴＴＧＡ−３’（Ｈ５１（＋７３＋８７）、配列番号４）からなる群より選択されるヌクレオチド配列を含み、ジストロフィンプレ−ｍＲＮＡのイントロン５１の３’末端でヌクレオチドに、そして、ジストロフィンプレ−ｍＲＮＡのエクソン５１の５’末端でヌクレオチドに特異的にハイブリダイズする。
【００４８】
下記の命名が本明細書で使用される：「Ｍ」は、マウスを指し、「Ｈ」は、ヒトを指し、「２３」及び「５１」は、特定のエクソンを指し、「Ｄ」は、ドナー部位を指し、「Ａ」は、アクセプター部位を指し、「＋」の後の数字は、エクソン配列のヌクレオチドの数を示し、そして、「−」の後の数字は、フランキングエクソンのヌクレオチドの数を示す。従って、例えば、Ｍ２３Ｄ（＋０２−１３）は、ｔｃ−ＤＮＡ ＡＯＮが、エクソン２３の３’−末端ヌクレオチドを２個及びイントロン２３の５’−末端ヌクレオチドを１３個包含し、ＡＯＮが、マウスジストロフィンのエクソン２３のドナースプライス部位をマスキングすることができることを表し、Ｈ５１（＋６８＋８２）は、ｔｃ−ＤＮＡ ＡＯＮが、ヒトジストロフィンのエクソン５１のヌクレオチド数６８〜ヌクレオチド数８２にわたることを表す。
【００４９】
本開示の他の態様は、生存運動ニューロン２（ＳＭＮ２）プレ−ｍＲＮＡ内のイントロンサイレンシング配列（ＩＳＳ）又は末端ステムループ（ＴＳＬ）をマスキングするために適切に用いることができるｔｃ−ＤＮＡ ＡＯＮを提供する。このようなｔｃ−ＤＮＡ ＡＯＮは、ＳＭＮ２プレ−ｍＲＮＡの成熟ｍＲＮＡへのプロセッシング過程における異常エクソンのインクルージョンを促進する。結果として得られる修飾された機能性ＳＭＮ２タンパク質は、インクルージョンされた異常エクソンによりコードされるアミノ酸配列を含有する。このような修飾された機能性ＳＭＮ２タンパク質は、非機能性ＳＭＮ１タンパク質を補完することができ、そして、in vivoで発現される場合、ＳＭＮ１遺伝子の突然変異により引き起こされる脊髄性筋萎縮症を少なくとも部分的に改善することができる。
【００５０】
例えば、ＳＭＮ２のエクソン７は、典型的に、対応するプレ−ｍＲＮＡのプロセッシングにより成熟ｍＲＮＡ転写産物から除かれるが、エクソン７の付加は、突然変異ＳＭＮ１タンパク質に対し機能性を補完することができる修飾された機能性ＳＭＮ２タンパク質を生成する。ｔｃ−ＤＮＡ ＡＯＮは、ＳＭＮ２プレ−ｍＲＮＡ内のＳＭＮ２のＩＳＳ又はＴＳＬを含むヌクレオチドにハイブリダイズすることにより、エクソン７の成熟ｍＲＮＡ転写産物へのインクルージョンを促進することができる。その成熟ｍＲＮＡ転写産物の発現により、エクソン７によりコードされるアミノ酸並びに含まれるアミノ酸のＮ−末端及びＣ−末端側の両方に他の全てのＳＭＮ２アミノ酸を含む修飾された機能性ＳＭＮ２タンパク質が生成される。
【００５１】
従って、本開示は、ＳＭＮ２プレ−ｍＲＮＡのプロセッシング過程におけるエクソン７のインクルージョンを促進するためのｔｃ−ＤＮＡ ＡＯＮであって、ｔｃ−ＤＮＡ ＡＯＮが、６〜２２トリシクロヌクレオチド長、具体的には、８〜２０トリシクロヌクレオチド長、さらに具体的には、１０〜１８トリシクロヌクレオチド長であり、そして、ｔｃ−ＤＮＡ ＡＯＮが、ＳＭＮ２プレ−ｍＲＮＡのイントロンサイレンサー配列（ＩＳＳ）又は末端ステムループ（ＴＳＬ）に相補的である、ｔｃ−ＤＮＡ ＡＯＮを提供する。このようなｔｃ−ＤＮＡ ＡＯＮは、１３〜１７ヌクレオチド、１２〜１６ヌクレオチド又は１３〜１５ヌクレオチドであることができる。本明細書において、ＳＭＮ２プレ−ｍＲＮＡのＩＳＳに相補的であり、そして、エクソン７のプロセッシングされたＳＭＮ２のｍＲＮＡへのインクルージョンを促進するために用いることができる、１５−ヌクレオチド配列５’−ＣＵＵＵＣＡＵＡＡＵＧＣＵＧＧ−３’（ＳＭＮ２ｉ７（１０；２５）、配列番号５）を含むｔｃ−ＤＮＡ ＡＯＮが例示される。また、本明細書において、ＳＭＮ２プレ−ｍＲＮＡのＴＳＬ２に相補的であり、そして、エクソン７のプロセッシングされたＳＭＮ２のｍＲＮＡへのインクルージョンを促進するために用いることができる、１３−ヌクレオチド配列５’−ＵＵＡＡＵＵＵＡＡＧＧＡＡ−３’（ＳＭＮ２ｅ７（３９；５１）、配列番号６）を含むｔｃ−ＤＮＡ ＡＯＮが例示される。また、本明細書に示されるｔｃ−ＤＮＡ ＡＯＮの組み合わせを用いることができることが理解されるであろう。
【００５２】
本開示のなおさらなる態様は、突然変異ＤＭ１のｍＲＮＡの破壊を促進するために適切に用いることができるｔｃ−ＤＮＡ ＡＯＮを提供する。このようなｔｃ−ＤＮＡ ＡＯＮは、９〜２７トリシクロヌクレオチドを含み、ｔｃ−ＤＮＡ ＡＯＮは、有害な３’ＣＵＧ増幅（ｎ＞５０）を含む突然変異ＤＭ１のｍＲＮＡに相補的であり、そして、ｔｃ−ＤＮＡ ＡＯＮは、前記ＤＭ１のｍＲＮＡのＲＮａｓｅ介在破壊を促進することができる。ｔｃ−ＤＮＡ ＡＯＮは、ヌクレオチド配列５’−ＣＡＧ−３’（配列番号７）の３〜９；４〜８；又は５、６若しくは７の連続反復配列を含むことができる。突然変異ＤＭ１の破壊を促進するための典型的なｔｃ−ＤＮＡ ＡＯＮは、１５−ヌクレオチド配列５’−ＣＡＧＣＡＧＣＡＧＣＡＧＣＡＧ−３’（ＤＭ１（ＣＡＧ５）、配列番号８）を含む。突然変異ＤＭ１の破壊を促進するための別の典型的なｔｃ−ＤＮＡ ＡＯＮは、２１−ヌクレオチド配列５’−ＣＡＧＣＡＧＣＡＧＣＡＧＣＡＧＣＡＧＣＡＧ−３’（ＤＭ１（ＣＡＧ７）、配列番号９）を含む。
【００５３】
他の態様においては、本開示は、ジストロフィンｍＲＮＡから突然変異エクソンを除去するための方法、ＳＭＮ２のｍＲＮＡ内における異常エクソンをインクルーディングするための方法及び細胞において病理数の３’ＣＵＧ増幅を含むＤＭ１のｍＲＮＡを破壊するための方法を提供する。これらの各方法は、細胞を、本明細書に開示されるようなｔｃ−ＤＮＡ ＡＯＮと接触させる工程を含む。
【００５４】
特定の実施態様の範囲内において、ジストロフィンプレ−ｍＲＮＡを発現する細胞を、６〜２２トリシクロヌクレオチド長、具体的には、８〜２０トリシクロヌクレオチド、さらに具体的には、１０〜１８トリシクロヌクレオチドを含有するｔｃ−ＤＮＡ ＡＯＮと接触させる工程を含む、ジストロフィンｍＲＮＡから突然変異エクソンを除去するための方法であって、ｔｃ−ＤＮＡ ＡＯＮの８〜１６ヌクレオチドが、ジストロフィンプレ−ｍＲＮＡのイントロンスプライスドナー部位に相補的であり、ｔｃ−ＤＮＡ ＡＯＮの２〜８ヌクレオチドが、ジストロフィンプレ−ｍＲＮＡのエクソン領域に相補的であり、そして、エクソン領域が、イントロンスプライスドナー部位の３’側に隣接している、方法が提供される。典型的な方法は、細胞を、１２〜１６ヌクレオチド又は１３〜１５ヌクレオチドのｔｃ−ＤＮＡ ＡＯＮと接触させる工程を含む。このような方法での使用に適切なｔｃ−ＤＮＡ ＡＯＮは、ヌクレオチド配列５’−ＡＡＣＣＴＣＧＧＣＴＴＡＣＣＴ−３’（Ｍ２３Ｄ（＋０２−１３）、配列番号１）；５’−ＡＧＡＡＡＴＧＣＣＡＴＣＴＴＣ−３’（Ｈ５１（＋６８＋８２）、配列番号２）、５’−ＡＡＡＴＧＣＣＡＴＣＴＴＣＣＴ−３’（Ｈ５１（＋７０＋８４）、配列番号３）及び５’−ＴＧＣＣＡＴＣＴＴＣＣＴＴＧＡ−３’（Ｈ５１（＋７３＋８７）、配列番号４）を含む。
【００５５】
他の実施態様の範囲内において、ＳＭＮ２プレ−ｍＲＮＡを発現している細胞を、６〜２２トリシクロヌクレオチド長、具体的には、８〜２０トリシクロヌクレオチド、さらに具体的には、１０〜１８又は１１〜１８トリシクロヌクレオチドを含有するｔｃ−ＤＮＡ ＡＯＮと接触させる工程を含む、ＳＭＮ２のｍＲＮＡ内における異常エクソンをインクルーディングするための方法であって、ｔｃ−ＤＮＡ ＡＯＮが、イントロン７内のＩＳＳ−Ｎ１などのＳＭＮ２プレ−ｍＲＮＡのイントロンサイレンサー配列（ＩＳＳ）に相補的である、方法が提供される。典型的な方法は、細胞を、１２〜１６ヌクレオチド又は１３〜１５ヌクレオチドのｔｃ−ＤＮＡ ＡＯＮと接触させる工程を含む。このような方法での使用に適切なｔｃ−ＤＮＡ ＡＯＮは、１５−ヌクレオチド配列５’−ＣＵＵＵＣＡＵＡＡＵＧＣＵＧＧ−３’（ＳＭＮ２ｉ７（１０；２５）、配列番号５）を含む。関連する方法の範囲内において、ｔｃ−ＤＮＡ ＡＯＮは、エクソン７内のＴＳＬ−２などのＳＭＮ２プレ−ｍＲＮＡの末端ステムループ（ＴＳＬ）に相補的である。このような方法での使用に適切なｔｃ−ＤＮＡ ＡＯＮは、１３−ヌクレオチド配列５’−ＵＵＡＡＵＵＵＡＡＧＧＡＡ−３’（ＳＭＮ２ｅ７（３９；５１）、配列番号６）を含む。
【００５６】
なおさらなる実施態様の範囲内において、細胞を、９〜２７トリシクロヌクレオチドを含むｔｃ−ＤＮＡ ＡＯＮと接触させる工程を含む、細胞において１以上の３’ＣＵＧ増幅を含むＤＭ１のｍＲＮＡを破壊するための方法であって、ｔｃ−ＤＮＡ ＡＯＮが、１以上の３’ＣＵＧ増幅を含む突然変異ＤＭ１のｍＲＮＡに相補的であり、そして、ｔｃ−ＤＮＡ ＡＯＮが、ＤＭ１のｍＲＮＡのＲＮａｓｅ介在破壊を促進することができる、方法が提供される。このような方法での使用に適切なｔｃ−ＤＮＡ ＡＯＮは、ヌクレオチド配列５’−ＣＡＧ−３’（配列番号７）の３〜９；４〜８；又は５、６若しくは７の連続反復配列を含み、１５−ヌクレオチド配列５’−ＣＡＧＣＡＧＣＡＧＣＡＧＣＡＧ−３’（ＤＭ１（ＣＡＧ５）、配列番号８）を含むｔｃ−ＤＮＡ ＡＯＮにより例示される。突然変異ＤＭ１の破壊を促進する別の典型的なｔｃ−ＤＮＡ ＡＯＮは、２１−ヌクレオチド配列５’−ＣＡＧＣＡＧＣＡＧＣＡＧＣＡＧＣＡＧＣＡＧ−３’（ＤＭ１（ＣＡＧ７）、配列番号９）を含む。
【００５７】
他の態様においては、本開示は、デュシェンヌ型筋ジストロフィー（ＤＭＤ）を処置するための方法、脊髄性筋萎縮症（ＳＭＡ）を処置するための方法及びスタイナート筋緊張性ジストロフィー（ＳＤ）を処置するための方法を提供する。これらの各方法は、患者に、ジストロフィンｍＲＮＡから突然変異エクソンを除去するために、ＳＭＮ２のｍＲＮＡ内における異常エクソンをインクルーディングするために、又は、１以上の３’ＣＵＧ増幅を含むＤＭ１のｍＲＮＡを破壊するために、本明細書に開示されるようなｔｃ−ＤＮＡ ＡＯＮを投与する工程を用いる。
【００５８】
本開示のこれらの及び他の実施態様、特徴並びに利点は、本明細書以下に記載する詳細な説明及び添付の特許請求の範囲から明らかとなるであろう。
【図面の簡単な説明】
【００５９】
【図１】図１は、アンチセンスオリゴヌクレオチドの作製で使用される様々な合成ヌクレオチドの表である。
【図２】図２は、トリシクロ−ＤＮＡ（ｔｃ−ＤＮＡ）の構造を表す。
【図３】図３は、ｍｄｘマウスが、ジストロフィン遺伝子のエクソン２３に機能性ジストロフィンの合成を妨げるナンセンス突然変異を有することを示すダイアグラムである。エクソン２３は、ＣからＴの突然変異が終始コドン（ＴＡＡ）を作製する反復配列Ｒ６及びＲ７を一部コードする。Ｍ２３Ｄ（＋０２−１３）で示される、エクソン２３の下流のドナースプライス部位におけるエクソンスキッピングのための１５ヌクレオチドのｔｃ−ＤＮＡ ＡＯＮは、ヌクレオチド配列５’−ＡＡＣＣＴＣＧＧＣＴＴＡＣＣＴ−３’（配列番号１）を有し、配列５’−エクソン２３…ＴＣＡＧｇｔａａｇｃｃｇａｇｇｔｔｔｇｇｃｃ…イントロン２３−３’（配列番号２）（大文字はエクソンヌクレオチドを表し、小文字はイントロンヌクレオチドを表す）で定義される標的のジストロフィンプレ−ｍＲＮＡのエクソン２３／イントロン２３接合部にハイブリダイズする。
【図４】図４は、オリゴフェクタミンの添加又は非添加で、１、２及び１０μgのｔｃ−ＤＮＡ ＡＯＮ Ｍ２３Ｄ（＋０２−１３）を用いてトランスフェクトしたｍｄｘの筋管における、ジストロフィンプレ−ｍＲＮＡのエクソン２３のスキッピングを示すネステッドＲＴ−ＰＣＲ反応のアガロースゲルである。４８時間後、培養物を回収、処理してｍＲＮＡを抽出した。
【図５】図５は、オリゴフェクタミンの存在下で、０．５、１、２、５及び１０μgのｔｃ−ＤＮＡ ＡＯＮ Ｍ２３Ｄ（＋０２−１３）を用いてトランスフェクトしたｍｄｘの筋管における、ジストロフィンプレ−ｍＲＮＡのエクソン２３のスキッピングを示すネステッドＲＴ−ＰＣＲ反応のアガロースゲルである。４８時間後、培養物を回収、処理してｍＲＮＡを抽出した。
【図６】図６は、オリゴフェクタミンの存在下で、５μgのｔｃ−ＤＮＡ ＡＯＮ Ｍ２３Ｄ（＋０２−１３）を用いてトランスフェクトしたｍｄｘの筋管における、ジストロフィンプレ−ｍＲＮＡのエクソン２３のスキッピングを示すネステッドＲＴ−ＰＣＲ反応のアガロースゲルである。トランスフェクション後０日目〜１５日目の培養物を回収、処理してｍＲＮＡを抽出した。
【図７】図７は、１００、８０、４０、２０、１０及び５μgのｔｃ−ＤＮＡ ＡＯＮ Ｍ２３Ｄ（＋０２−１３）を含有する５０μlのＰＢＳ（リン酸緩衝食塩水）を前脛骨筋に注射した８週齢のｍｄｘマウスにおける、ジストロフィンプレ−ｍＲＮＡのエクソン２３のスキッピングを示すネステッドＲＴ−ＰＣＲ反応のアガロースゲルである。３週間後に動物を屠殺し、筋肉試料を処理してｍＲＮＡ解析を行った。
【図８】図８は、１０μgのｔｃ−ＤＮＡ ＡＯＮ Ｍ２３Ｄ（＋０２−１３）を含有する５０μlのＰＢＳ（リン酸緩衝食塩水）を前脛骨筋に注射した８週齢のｍｄｘマウスにおける、ジストロフィンプレ−ｍＲＮＡのエクソン２３のスキッピングを示すＲＴ−ＰＣＲ反応のアガロースゲルである。４、１０及び２０週間後に動物を屠殺し、筋肉試料を処理してｍＲＮＡ解析を行った。
【図９】図９は、１０μgのｔｃ−ＤＮＡ ＡＯＮ Ｍ２３Ｄ（＋０２−１３）を含有する５０μlのＰＢＳ（リン酸緩衝食塩水）を注射した８週齢のｍｄｘマウス由来の前脛骨筋組織の横断面における、ジストロフィンの免疫染色の顕微鏡写真である。４、１０及び２０週間後に動物を屠殺し、筋肉試料を処理して免疫染色を行った。
【図１０】図１０は、正常マウス及びｔｃ−ＤＮＡ ＡＯＮ Ｍ２３Ｄ（＋０２−１３）を海馬又は脳脊髄液内に注射したｍｄｘマウスのＣＮＳにおける、ジストロフィンの免疫染色である。Ａ−Ｂ−Ｃは、正常、ｍｄｘ及び２０μgのｔｃ−ＤＮＡ Ｍ２３Ｄ（＋０２−１３）で処理した、単回髄腔内注射１か月後のｍｄｘの海馬レベルを示す断面である。Ｄ−Ｅ−Ｆは、正常、ｍｄｘ及び２００μgのｔｃ−ＤＮＡ Ｍ２３Ｄ（＋０２−１３）で処理した、脳脊髄液内に送達した１か月後のｍｄｘの小脳レベルを示す断面である。核は、ＤＡＰＩで対比染色する。
【図１１】図１１は、プレ−ｍＲＮＡの成熟ｍＲＮＡへの一般的なプロセッシングのダイアグラム表示である。
【図１２】図１２は、様々なｔｃ−ＤＮＡ ＡＯＮを含有する５０μlのＰＢＳ（リン酸緩衝食塩水）を前脛骨筋に注射した８〜１０週齢のｈＤＭＤマウスにおける、ジストロフィンプレ−ｍＲＮＡのエクソン５１のスキッピングを示すネステッドＲＴ−ＰＣＲ反応のアガロースゲルである。
【図１３】図１３は、ＳＭＮ１及びＳＭＮ２遺伝子のイントロン−エクソン構造及び染色体上の位置のダイアグラム表示である。
【図１４】図１４は、ｍＲＮＡスプライシングに影響するエクソン７を主に欠損するＳＭＮ２における点突然変異（Ｃ６Ｔ）のダイアグラム表示である。
【図１５】図１５は、イントロン６−エクソン７境界でのスプライスアクセプター（「ＳＡ」）７及びエクソン７−イントロン７境界でのスプライスドナー（ＳＤ）７の使用を改良することにより、ＳＭＮ２において、増加したエクソン７のインクルージョンのダイアグラム表示である。
【図１６】図１６は、ＳＭＮ１及びＳＭＮ２のエクソン７の構造のダイアグラム表示である。
【図１７】図１７は、ＳＭＮ１及びＳＭＮ２のエクソン７の構造におけるｔｃ−ＤＮＡ ＡＯＮ ＳＭＮ２ｅ７（３９；５１）（配列番号６）の標的配列及び相加効果のダイアグラム表示である。配列５’−ＵＵＡＡＵＵＵＡＡＧＧＡＡＵＧＵＧ−３’を有するｔｃ−ＤＮＡ ＡＯＮ ＳＭＮ２ｅ７（３９；５１）は、ＳＭＮ２における末端ステムループ２の構造を破壊する可能性が高く、これにより、ＳＭＮ１及びＳＭＮ２におけるエクソン７のインクルージョンが増加する。
【図１８】図１８は、ＳＭＮ１及びＳＭＮ２のエクソン７のインクルージョンにおけるｔｃ−ＤＮＡ ＡＯＮ ＳＭＮ２ｉ７（１０；２５）（配列番号５）の標的配列及び相加効果のダイアグラム表示である。配列５’−ＣＡＣＵＵＵＣＡＵＡＡＵＧＣＵＧＧ−３’を有するｔｃ−ＤＮＡ ＡＯＮ ＳＭＮ２ｉ７（１０；２５）は、イントロンサイレンサー配列（「ＩＳＳ」）−Ｎ１の認識を妨げる可能性が高く、エクソン７−イントロン７境界での５’スプライス部位の認識を可能にする。ＥＸＩＮＣＴは、拡張阻害状況（EXtended INhibitory ContexT）を指す。広範な突然変異解析に基づき、Ｃ６Ｕは、エクソン７決定に影響する拡張阻害状況を生成することが示された。
【図１９Ａ】図１９は、ＳＭＡ患者由来の線維芽細胞（Ｇ０３８１３細胞株）のＳＭＮ２におけるエクソン７のインクルージョンを示す、ＲＴ−ＰＣＲ反応のアガロースゲル（パネルＢ）及び正規化プロット（パネルＡ）である。４８時間後、培養物を回収、処理してｍＲＮＡを抽出した。単純線は、疑似処理した（mock treated）コントロール細胞に相当し、破線は、ｔｃ−ＤＮＡ ＡＯＮ ＳＭＮ２ｉ７（１０；２５）（ｔｃ−Ｉ７と呼ばれる）処理細胞に相当し、点線は、ｔｃ−ＤＮＡ ＡＯＮ ＳＭＮ２ｅ７（３９；５１）（ｔｃ−ＴＳＬと呼ばれる）処理細胞に相当する。各線おいて、プロットを、ＳＭＮ１＋ＳＭＮ２（完全長）＋ＳＭＮ２（Δ７）の総数に従って正規化した。
【図１９Ｂ】図１９は、ＳＭＡ患者由来の線維芽細胞（Ｇ０３８１３細胞株）のＳＭＮ２におけるエクソン７のインクルージョンを示す、ＲＴ−ＰＣＲ反応のアガロースゲル（パネルＢ）及び正規化プロット（パネルＡ）である。４８時間後、培養物を回収、処理してｍＲＮＡを抽出した。単純線は、疑似処理した（mock treated）コントロール細胞に相当し、破線は、ｔｃ−ＤＮＡ ＡＯＮ ＳＭＮ２ｉ７（１０；２５）（ｔｃ−Ｉ７と呼ばれる）処理細胞に相当し、点線は、ｔｃ−ＤＮＡ ＡＯＮ ＳＭＮ２ｅ７（３９；５１）（ｔｃ−ＴＳＬと呼ばれる）処理細胞に相当する。各線おいて、プロットを、ＳＭＮ１＋ＳＭＮ２（完全長）＋ＳＭＮ２（Δ７）の総数に従って正規化した。
【図１９Ｃ】パネルＣは、指定のｔｃ−ＤＮＡオリゴヌクレオチドでトランスフェクトしたＧ０３８１３細胞におけるＳＭＮレベルを示すウエスタンブロットである。アクチンは、ローディングコントロールとして示される。注目すべきは、ｔｃ−ＤＮＡ ＡＯＮ ＳＭＮ２ｉ７（１０；２５）（ｔｃ−ＩＳＳ７と呼ばれる）及びｔｃ−ＤＮＡ ＡＯＮ ＳＭＮ２ｅ７（３９；５１）（ｔｃ−ＴＳＬと呼ばれる）のＳＭＮ２産生に及ぼす相加効果である。
【図１９Ｄ】パネルＤは、ｔｃ−ＴＳＬ処理細胞におけるＳＭＮの核局在化（黒色ドット）を示す顕微鏡写真である。核は、ＤＡＰＩで対比染色する。
【図２０Ａ】図２０（パネルＡ）は、in vitroでＤＭ１筋芽細胞にトランスフェクトされるｔｃ−ＤＮＡ ＡＯＮ ＤＭ１（ＣＡＧ７）（ｔｃ−ＤＮＡ（ＣＡＧ）７と呼ばれる）の量の増加とともに、減少する変異体ヒトＤＭＰＫのｍＲＮＡレベルを示すノーザンブロットである。３日後、培養物を回収、処理してｍＲＮＡを抽出し、ノーザンブロット解析を行った。
【図２０Ｂ】パネルＢは、変異体ＤＭＰＫのｍＲＮＡの正常ＤＭＰＫのｍＲＮＡに対する比を反映する定量プロットである。
【図２１Ａ】図２１（パネルＡ）は、７００ＣＵＧ反復配列を有するヒトＤＭＰＫのｍＲＮＡを発現するＤＭ１マウスのＴＡ筋肉に注射される、配列５’−ＣＡＧＣＡＧＣＡＧＣＡＧＣＡＧＣＡＧＣＡＧ−３’（配列番号９）を有するｔｃ−ＤＮＡ ＡＯＮ ＤＭ１（ＣＡＧ７）（ｔｃ−ＤＮＡ（ＣＡＧ）７と呼ばれる）の量の増加とともに、減少する変異体ヒトＤＭＰＫのｍＲＮＡレベルを示すノーザンブロットである。
【図２１Ｂ】パネルＢ及びＤは、それぞれ、パネルＡ及びＣからのノーザンブロットにおける、変異体ヒトＤＭＰＫのｍＲＮＡのマウスＤＭＰＫのｍＲＮＡに対する比を反映する定量プロットである。
【図２１Ｃ】パネルＣは、３０又は６０μgのｔｃ−ＤＮＡ ＡＯＮ ＤＭ１（ＣＡＧ７）がＤＭ１マウス（ｎ＝４）のＴＡ筋肉に注射された場合の、減少した変異体ヒトＤＭＰＫのｍＲＮＡレベルを示すノーザンブロットである。
【図２１Ｄ】パネルＢ及びＤは、それぞれ、パネルＡ及びＣからのノーザンブロットにおける、変異体ヒトＤＭＰＫのｍＲＮＡのマウスＤＭＰＫのｍＲＮＡに対する比を反映する定量プロットである。
【００６０】
発明の詳細な説明
本開示は、トリシクロ−ＤＮＡ（ｔｃ−ＤＮＡ）アンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＯＮ）を、ジストロフィン遺伝子内のプレ−ｍＲＮＡスプライス部位をマスキングするために、ＳＭＮ２遺伝子内のイントロンサイレンシング配列又は末端ステムループ配列をマスキングするために、又は、１以上の３’ＣＵＧ増幅を含むＤＭ１のｍＲＮＡを破壊するために適切に用いることができる予想外の発見に基づく。これらの発見は、一般的に、遺伝子疾患の処置において、さらに具体的には、デュシェンヌ型筋ジストロフィー、脊髄性筋萎縮症及びスタイナート筋緊張性ジストロフィーの処置において広範に適用される。
【００６１】
トリシクロ−ＤＮＡ（ｔｃ−ＤＮＡ）は、相補的ＲＮＡに対して向上したハイブリダイズ能力を示す新しいクラスの拘束されたＤＮＡ類似体に属する（Ittig et al., Nucleic Acids Res. 32:346-353 (2004); Ittig et al., Prague, Academy of Sciences of the Czech Republic. 7:21-26 (Coll. Symp. Series, Hocec, M., 2005); Ivanova et al., Oligonucleotide 17:54-65 (2007); Renneberg et al., Nucleic Acids Res. 30:2751-2757 (2002); Renneberg et al., Chembiochem. 5:1114-1118 (2004);及びRenneberg et al., JACS. 124:5993-6002 (2002)）。本明細書に開示のプレ−ｍＲＮＡ／ｔｃ−ＤＮＡ ＡＯＮヘテロ二本鎖はＲＮａｓｅＨに耐性を示し、結果として、標的プレ−ｍＲＮＡの破壊が抑制される。トリシクロ−ＤＮＡ化学の利点は、その骨格の構造的特性により、相補的ヌクレオチド配列との高親和性及び高特異的なハイブリダイゼーションを保持しながらＡＯＮの長さを短くすることができることである。予想外にも、ｔｃ−ＤＮＡ ＡＯＮは、in vivo環境で、筋肉内適用を用いて、マイクログラム用量で有利に使用することができる。これは、従来のアンチセンスオリゴヌクレオチド技術に必要な用量の少なくとも１０倍低い用量である。さらに、ｔｃ−ＤＮＡは、短いアンチセンス長で十分な活性を保持する。従って、例えば、１３〜１５ヌクレオチドのｔｃ−ＤＮＡ ＡＯＮは、本開示で例示するように、ex vivo及びin vivo適用において極めて有効である。
【００６２】
本明細書に記載のｔｃ−ＤＮＡ ＡＯＮは、また、例えば、２’−Ｏ−メチル−ホスホロチオエート又はモルフォリノ化学などの既存のアンチセンスオリゴヌクレオチド化学と比較して、増加したin vivo安定性を示す。従って、例えば、本開示のｔｃ−ＤＮＡ ＡＯＮの単回筋肉内注射は、in vivoにおいて、投与後２０週間以上効果が維持される。
【００６３】
さらに、そして、実に驚くべきことに、Ｍ２３Ｄ（＋０２−１３）で示されるｔｃ−ＤＮＡ ＡＯＮで例示されるような、本開示のｔｃ−ＤＮＡ ＡＯＮは、実質内若しくは脳室内投与を介して又はクモ膜下腔への投与のいずれかにより、中枢神経系（ＣＮＳ）に送達され、海馬ＣＡ１のニューロン内又は脳又は小脳皮質のニューロン内の突然変異ジストロフィン遺伝子などの突然変異遺伝子を修復することができる。従って、本明細書に記載のｔｃ−ＤＮＡ ＡＯＮは、上衣境界を効率的に横断することができることが示される。
【００６４】
本開示は、下記の定義を参照することにより最もよく理解できるであろう：
【００６５】
定義
本明細書で使用される、用語「トリシクロ−ＤＮＡ（ｔｃ−ＤＮＡ）」は、各ヌクレオチドが、シクロプロパン環の導入により修飾され、骨格の立体配置フレキシビリティが制限され、そして、ねじれ角γの骨格配置が最適化された、拘束されたＤＮＡ類似体のクラスを指す。ホモ塩基アデニン及びチミン含有ｔｃ−ＤＮＡは、相補的ＲＮＡと非常に安定なＡ−Ｔ塩基対合を形成する。
【００６６】
本明細書で使用される、用語「アンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＯＮ）」は、相補的ヌクレオチド配列を有するプレ−ｍＲＮＡ又はｍＲＮＡと相互作用及び／又はハイブリダイズし、それによって遺伝子発現を改変することができるオリゴヌクレオチドを指す。酵素依存性アンチセンスオリゴヌクレオチドは、標的ｍＲＮＡを分解するＲＮａｓｅＨ活性に依存性であり、一本鎖ＤＮＡ、ＲＮＡ及びホスホロチオエートアンチセンスの形態を含む。立体ブロッキングアンチセンスオリゴヌクレオチド（ＲＮａｓｅＨ非依存性アンチセンス）は、ｍＲＮＡの標的配列と結合することにより、遺伝子発現又は他のｍＲＮＡ依存性細胞プロセスに干渉する。立体ブロッキングアンチセンスには、２’−Ｏ−アルキルアンチセンスオリゴヌクレオチド、モルフォリノアンチセンスオリゴヌクレオチド及びトリシクロ−ＤＮＡアンチセンスオリゴヌクレオチドが含まれる。本明細書に記載するように、特定の適用の範囲内で、ｔｃ−ＤＮＡアンチセンスオリゴヌクレオチドは、例えば、１以上の３’ＣＵＧ増幅を含むＤＭ１のｍＲＮＡのＲＮａｓｅ介在破壊などの酵素依存性適用に用いることができる。
【００６７】
本明細書で使用される、「相補的」は、核酸分子が、別の核酸分子と相補的ヌクレオシド又はヌクレオチド間で、従来のワトソン−クリック塩基対合又は他の非従来型の対合（例えば、Hoogsteen又は逆Hoogsteen水素結合）のいずれかにより、水素結合を形成することができることを指す。本開示のｔｃ−ＤＮＡ ＡＯＮに関して、ｔｃ−ＤＮＡ ＡＯＮのその相補的配列との結合自由エネルギーは、ｔｃ−ＤＮＡ ＡＯＮの適切な機能を進行させるのに十分であり、そして、特異的結合が求められる条件下、即ち、ex vivo又はin vivo治療的処置の場合では、生理学的条件下で、ｔｃ−ＤＮＡ ＡＯＮの非標的配列への非特異的結合を回避するために十分な相補性レベルがある。核酸分子の結合自由エネルギーの決定は、当技術分野で公知である（例えば、Turner et al., CSH Symp. Quant. Biol. LII:123-133 (1987); Frier et al., Proc. Nat. Acad. Sci. USA 83:9373-77 (1986);及びTurner et al., J. Am. Chem. Soc. 109:3783-3785 (1987)参照）。従って、「相補的」（又は特異的にハイブリダイズ可能な）は、ｔｃ−ＤＮＡ ＡＯＮとプレ−ｍＲＮＡ又はｍＲＮＡ標的間で、安定で特異的な結合が形成されるように、十分な相補性又は正確な塩基対合のレベルを示す用語である。
【００６８】
核酸分子が、特異的にハイブリダイズ可能であるために標的核酸配列に１００％相補的である必要はないことは当技術分野で理解されている。つまり、２つ以上の核酸分子が、完全に相補的でなくてもよい。相補性は、第二の核酸分子と水素結合を形成することができる核酸分子の隣接残基のパーセンテージで示される。例えば、第一の核酸分子が１０ヌクレオチドであり、第二の核酸分子が１０ヌクレオチドである場合、第一及び第二の核酸分子間の５、６、７、８、９又は１０ヌクレオチドの塩基対合は、それぞれ、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％及び１００％の相補性を表す。「完璧（Perfectly）」又は「完全（fully）」に相補的な核酸分子は、第一の核酸分子の隣接残基の全てが、第二の核酸分子の同じ数の隣接残基と水素結合する核酸分子を意味し、ここで、核酸分子の両方が同じ数のヌクレオチドを有する（即ち、同じ長さを有する）か又は２つの分子が異なる長さを有する。
【００６９】
本明細書で使用される、用語「前駆体ｍＲＮＡ」又は「プレ−ｍＲＮＡ」は、１以上の介在配列（イントロン）を含有する未熟な一本鎖メッセンジャーリボ核酸（ｍＲＮＡ）を指す。プレ−ｍＲＮＡは、細胞核内で、ＲＮＡポリメラーゼにより鋳型ＤＮＡから転写され、それは、イントロン及びコード領域（エクソン）の交互配列からなる。プレ−ｍＲＮＡが、イントロンのスプライシング除去及びエクソンの連結により完全にプロセッシングされると、それは、エクソンのみからなるＲＮＡである「メッセンジャーＲＮＡ」又は「ｍＲＮＡ」と呼ばれる。真核生物のプレ−ｍＲＮＡは、完全にｍＲＮＡにプロセッシングされる前に一時的にのみ存在する。プレ−ｍＲＮＡが、ｍＲＮＡ配列に適切にプロセッシングされると、核外に輸送され、最終的に細胞質内でリボソームによりタンパク質へと翻訳される。
【００７０】
本明細書で使用される、用語「スプライシング」及び「プロセッシング」は、イントロンが除去されエクソンが連結される、転写後のプレ−ｍＲＮＡの修飾を指す（図１１参照）。スプライシングは、スプライセオソームと呼ばれる５つの核内低分子リボヌクレオタンパク質（ｓｎＲＮＰ）からなる巨大なＲＮＡ−タンパク質複合体に触媒される一連の反応で起こる。イントロン内で、３’スプライス部位、５’スプライス部位及びブランチ部位がスプライシングに必要である。ｓｎＲＮＰのＲＮＡ成分がイントロンと相互作用し、触媒に関与することができる。
【００７１】
プレ−ｍＲＮＡスプライシングは、２つの連続した生化学反応である。両方の反応が、スプライセオソームによるＲＮＡヌクレオチド間のエステル交換を含む。第一の反応では、スプライセオソーム会合の間に決定されるイントロン内の特異的なブランチポイントヌクレオチドの２’−ＯＨが、イントロンの第一のヌクレオチド上の５’スプライス部位で求核攻撃を行いラリアット中間体が形成される。第二の反応では、解放された５’エクソンの３’−ＯＨが、イントロンの最後のヌクレオチドの３’スプライス部位で求核攻撃を行い、それによって、エクソンが連結しイントロンラリアットが切り出される。プレ−ｍＲＮＡスプライシングは、イントロンサイレンサー配列（ＩＳＳ）及び末端ステムループ（ＴＳＬ）配列により制御される。
【００７２】
本明細書で使用される、用語「イントロンサイレンサー配列（ＩＳＳ）」及び「末端ステムループ（ＴＳＬ）」は、それぞれ、プレ−ｍＲＮＡ内でトランス作用タンパク質ファクターの結合により選択的スプライシングをコントロールし、それによって、スプライス部位の特異的使用をもたらす、イントロン及びエクソン内の配列エレメントを指す。典型的には、イントロンサイレンサー配列は８〜１６ヌクレオチドであり、エクソン−イントロン接合部でスプライス部位より保存されていない。末端ステムループ配列は、典型的には、１２〜２４ヌクレオチドであり、相補性、従って、結合により、１２〜２４ヌクレオチド配列内で第二のループ構造を形成する。
【００７３】
本明細書で使用される、用語「脊髄性筋萎縮症（ＳＭＡ）」は、それぞれが、共通して脊髄及び脳幹の運動ニューロンの喪失に起因する遺伝的要因及び筋力低下の兆候を有する、様々な臨床型の５番染色体連鎖ＳＭＡを指す。脊髄性筋萎縮症は、生存運動ニューロン遺伝子ＳＭＮ１内の突然変異により引き起される。ＳＭＮ１遺伝子の少なくとも１つの正常な対立遺伝子が正常な機能に必要である。
【００７４】
ＳＭＮ（生存運動ニューロン）遺伝子を含有する５番染色体の領域は、大きな重複を有する。複数の遺伝子を含有する大きな配列が隣接セグメントに２回現れる。従って、その遺伝子の２コピー、ＳＭＮ１及びＳＭＮ２が存在する。ＳＭＮ２遺伝子は、低レベルであるがタンパク質製造の効率を低下させるさらなる突然変異を有する。ＳＭＡは、両方の染色体からＳＭＮ１遺伝子が喪失することにより引き起こされる。ＳＭＡ（ＳＭＡ１〜ＳＭＡ３）の重症度は、残りのＳＭＮ２遺伝子がＳＭＮ１の喪失をどの程度補完することができるかに一部関係している。しばしば、ＳＭＮ２のさらなるコピーが存在し、ＳＭＮ２のコピー数の増加が重症度の低い疾患に関係している。
【００７５】
「対象」は、移植細胞のドナー若しくはレシピエントである生物又は細胞自体を意味する。「対象」は、また、本開示の核酸分子を投与することができる生物を指す。一実施態様においては、対象は、哺乳類又は哺乳類細胞である。別の実施態様においては、対象は、ヒト又はヒト細胞である。
【００７６】
本明細書で使用される、用語「治療有効量」は、投与される対象（例えば、ヒト）において、言及された疾患、障害若しくは状態を治療又は予防するのに十分なｔｃ−ＤＮＡ ＡＯＮの量を意味する。本開示のｔｃ−ＤＮＡ ＡＯＮは、個別に、あるいは、他の薬物と組み合わせて又は併用して、本明細書で論じられる疾患又は状態を処置するために使用することができる。例えば、特定の疾患、障害又は状態を処置するために、ｔｃ−ＤＮＡ ＡＯＮを、処置に適切な条件下で、個別に、あるいは、１以上の薬物と組み合わせて、患者に投与することができるか、あるいは、当業者によく知られた他の適切な細胞に投与することができる。
【００７７】
本明細書で使用される、語句「薬学的に許容しうる」は、分子エンティティ及び組成物が、生理学的に許容され、そして、ヒトに投与される場合、例えば、異常亢進、目まいなどのアレルギー又は同様の有害な反応を典型的に起こさないことを指す。好ましくは、本明細書で使用される、用語「薬学的に許容しうる」は、動物、さらに具体的には、ヒトでの使用で、連邦管理機関又は州政府で承認される、あるいは、米国薬局方又は他の一般的に認定された薬局方に記載されることを意味する。
【００７８】
本明細書で使用される、用語「単離された」は、言及された物質がその自然環境、例えば、細胞から除去されることを意味する。従って、単離された生体物質は、細胞成分、即ち、天然物質が自然に生じる細胞の成分（例えば、細胞質又は膜成分）の一部又は全てを含有しないことであることができる。
【００７９】
本明細書で使用される、用語「精製された」は、物質が、無関係な物質、即ち、不純物（物質が得られる天然物質など）の存在を低減又は除去する条件下で単離されることを指す。例えば、精製されたｔｃ−ＤＮＡ ＡＯＮは、好ましくは、細胞又は培養成分、例えば、組織培養成分、不純物などを実質的に含有しない。本明細書で使用される、用語「実質的に含有しない」は、物質の分析試験に関連して適宜使用される。好ましくは、不純物を実質的に含有しない精製された物質は、少なくとも５０％純粋、より好ましくは、少なくとも９０％純粋、さらにより好ましくは、少なくとも９９％純粋である。純度は、クロマトグラフィー、ゲル電気泳動、イムノアッセイ、組成分析、バイオアッセイ及び当技術分野で公知の他の方法により評価することができる。
【００８０】
本明細書において、任意の濃度範囲、パーセント範囲、比率範囲又は整数範囲は、特に明記しない限り、列挙される範囲内の任意の整数の値を含み、そして、必要に応じて、その分数（整数の１／１０及び１／１００など）を含むものと理解される。また、ポリマーのサブユニット、サイズ又は厚さ（thickness）などの任意の物理的性質に関係する、本明細書で列挙される任意の数字範囲は、特に明記しない限り、列挙される範囲内の任意の整数を含むものと理解される。本明細書で使用される、「約」又は「から本質的になる」は、特に明記しない限り、指定の範囲、値又は構造の±２０％を意味する。
【００８１】
本明細書で使用される、用語「含む（include）」及び「含む（comprise）」は、同義的に使用される。本明細書で使用される、用語「ａ」及び「ａｎ」は、列挙される要素の「１以上」を指すことを理解されたい。選択肢（例えば、「又は」）の使用は、選択肢の１つ、両方又はその任意の組み合わせのいずれかを意味することを理解されたい。
【００８２】
用語「約」又は「およそ」は、統計学的に有意な範囲の値内を意味する。このような範囲は、所定の値又は範囲の、好ましくは、その５０％以内、より好ましくは、その２０％以内、さらにより好ましくは、その１０％以内、なおさらに好ましくは、その５％以内であることができる。用語「約」又は「およそ」に包含される許容偏差は、研究対象の特定の系に依存し、当業者は容易に理解することができる。
【００８３】
デュシェンヌ型筋ジストロフィーを処置するためのトリシクロ−ＤＮＡアンチセンスオリゴヌクレオチド
上述するように、特定の実施態様の範囲内において、本開示は、筋肉変性が急速に進行することにより、最終的に、歩行障害、麻痺、そして死に至ることを特徴とする筋ジストロフィーの重度のＸ連鎖劣性型である、デュシェンヌ型筋ジストロフィー（ＤＭＤ）の処置に適切に用いることができるｔｃ−ＤＮＡ ＡＯＮを提供する。ＤＭＤは、ヒトＸ染色体に位置するジストロフィン遺伝子内の、ナンセンス突然変異又はフレームシフト突然変異などの突然変異により引き起こされる。ジストロフィン遺伝子は、細胞膜に位置する筋線維鞘並びにジストログリカン複合体（ＤＧＣ）に構造安定性をもたらす、筋肉組織内の重要な構造成分であるジストロフィンタンパク質をコードする。ナンセンス突然変異又はフレームシフト突然変異は、翻訳の未完終了をもたらし、従って、Ｃ−末端がトランケートされたジストロフィンタンパク質が生じる。
【００８４】
１以上の停止突然変異又はフレームシフト突然変異により引き起こされるＤＭＤは、翻訳リーディングフレームを修復するために１以上のエクソンを除去することにより、突然変異のｍＲＮＡ配列下流が修復され、緩和することができる。これを達成するために、本開示の一部として、１以上のエクソンのスプライセオソーム認識をマスキングすることができるプレ−ｍＲＮＡ内の領域を標的化するｔｃ−ＤＮＡ ＡＯＮが開発された。これらの領域をｔｃ−ＤＮＡ ＡＯＮで標的化することにより、エクソンを選択的スプライシングで除去し成熟機能性ジストロフィンｍＲＮＡを生成することができる。
【００８５】
従って、本明細書に記載のｔｃ−ＤＮＡ ＡＯＮは、ジストロフィンプレ−ｍＲＮＡのプロセッシング過程における、ジストロフィン遺伝子の１以上の突然変異エクソンのスキッピングを促進し、これにより、得られるジストロフィンｍＲＮＡの適切なリーディングフレームを修復するのに効果的であり、これが翻訳されると、機能性ジストロフィンタンパク質を生成する。従って、本明細書に開示のｔｃ−ＤＮＡ ＡＯＮは、ＤＭＤ罹患患者に治療的に使用することができる。
【００８６】
本明細書で使用される、用語「エクソンスキッピング」は、１以上の相補的アンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＯＮ）で、プレ−ｍＲＮＡ内のスプライスドナー及び／又はアクセプター部位を標的化することによるプレ−ｍＲＮＡスプライシングの修飾を指す。１以上のスプライスドナー又はアクセプター部位へのスプライセオソームのアクセスをブロックすることにより、ＡＯＮはスプライシング反応を妨害することができ、それによって、完全にプロセッシングされたｍＲＮＡから１以上のエクソンの欠損を引き起こすことができる。エクソンスキッピングは、核内で、プレ−ｍＲＮＡの成熟過程において達成される。それは、プレ−ｍＲＮＡ内のスプライスドナー配列に相補的であるアンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＯＮ）を使用することによる、標的エクソンのスプライシングに関与する鍵配列のマスキングを含む。本明細書で提供されるｔｃ−ＤＮＡ ＡＯＮは、ジストロフィンプレ−ｍＲＮＡ内のイントロン−エクソン接合部におけるスプライス部位のマスキングによるエクソンスキッピングに適切に用いることができ、これにより、プレ−ｍＲＮＡの成熟ｍＲＮＡへのプロセッシング過程において突然変異エクソンの除去が促進される。
【００８７】
例えば、ジストロフィン遺伝子のエクソン２３又はエクソン５０内のナンセンス突然変異又はフレームシフト突然変異は、カルボキシ末端がトランケートされた非機能性ジストロフィンタンパク質を生成する。本明細書に開示のｔｃ−ＤＮＡ ＡＯＮは、それぞれ、イントロン２３又はイントロン５１におけるジストロフィンプレ−ｍＲＮＡのスプライスドナー部位を含むヌクレオチドに、そして、エクソン２３又はエクソン５１に隣接する５’ヌクレオチドにハイブリダイズすることにより、突然変異エクソン２３又はエクソン５１の成熟ｍＲＮＡ転写産物へのインクルージョンを抑制することができる。その成熟ｍＲＮＡ転写産物の発現により、エクソン２３又はエクソン５０及び５１によりコードされるアミノ酸が欠損しているが、これら欠損アミノ酸のＮ−末端及びＣ−末端側の両方にジストロフィンアミノ酸を含む機能性ジストロフィンタンパク質が生成される。
【００８８】
ジストロフィンプレ−ｍＲＮＡのプロセッシング過程においてエクソンをスキッピングするための本明細書に開示のｔｃ−ＤＮＡ ＡＯＮは、典型的には、６〜２２連続トリシクロヌクレオチド、具体的には、８〜２０トリシクロヌクレオチド、さらに具体的には、１０〜１８連続トリシクロヌクレオチドを含有し、ｔｃ−ＤＮＡ ＡＯＮの６〜１６ヌクレオチド、特に、８〜１６ヌクレオチドは、ジストロフィンプレ−ｍＲＮＡのイントロンスプライスドナー部位に相補的であり、ｔｃ−ＤＮＡ ＡＯＮの２〜８ヌクレオチドは、ジストロフィンプレ−ｍＲＮＡのエクソン領域に相補的であり、そして、イントロンスプライスドナー部位は、エクソン領域の５’側に隣接している。目的とする適用の精度に依存して、ｔｃ−ＤＮＡ ＡＯＮは、１２〜１６ヌクレオチド又は１３〜１５ヌクレオチドであってもよく、イントロンスプライスドナー部位に相補的な６〜１４ヌクレオチド及びエクソン領域に相補的な２〜５ヌクレオチドを含むことができる。
【００８９】
本明細書において、ジストロフィンプレ−ｍＲＮＡ内の突然変異エクソン２３をスキッピングするために設計されたｔｃ−ＤＮＡ ＡＯＮが例示される。ｔｃ−ＤＮＡ ＡＯＮは、ヌクレオチド配列５’−ＡＡＣＣＴＣＧＧＣＴＴＡＣＣＴ−３’（Ｍ２３Ｄ（＋０２−１３）、配列番号１）を含み、ジストロフィンプレ−ｍＲＮＡのイントロン２３の３’末端でヌクレオチドに、そして、ジストロフィンプレ−ｍＲＮＡのエクソン２３に隣接する５’末端でヌクレオチドに特異的にハイブリダイズする。また、ジストロフィンプレ−ｍＲＮＡ内の突然変異エクソン５１をスキッピングするために設計されたｔｃ−ＤＮＡ ＡＯＮも提供される。ｔｃ−ＤＮＡ ＡＯＮは、５’−ＡＧＡＡＡＴＧＣＣＡＴＣＴＴＣ−３’（Ｈ５１（＋６８＋８２）、配列番号２）、５’−ＡＡＡＴＧＣＣＡＴＣＴＴＣＣＴ−３’（Ｈ５１（＋７０＋８４）、配列番号３）及び５’−ＴＧＣＣＡＴＣＴＴＣＣＴＴＧＡ−３’（Ｈ５１（＋７３＋８７）、配列番号４）からなる群より選択されるヌクレオチド配列を含み、ジストロフィンプレ−ｍＲＮＡのイントロン５１の３’末端でヌクレオチドに、そして、ジストロフィンプレ−ｍＲＮＡのエクソン５１の５’末端でヌクレオチドに特異的にハイブリダイズする。
【００９０】
脊髄性筋萎縮症を処置するためのトリシクロ−ＤＮＡアンチセンスオリゴヌクレオチド
他の実施態様の範囲内において、本開示は、脊髄性筋萎縮症（ＳＭＡ）の処置に適切に用いることができるｔｃ−ＤＮＡ ＡＯＮを提供する。ＳＭＡは、正常細胞においては、エクソン７及び８が完全にプロセッシングされたｍＲＮＡ内に存在することを特徴とする、ＳＭＮ１遺伝子の両方のコピーの突然変異により引き起こされる。正常にプロセッシングされたＳＭＮ２のｍＲＮＡがエクソン７又は８を含有しないため、ＳＭＮ２タンパク質は、機能性ＳＭＮ１タンパク質の喪失を補完することができない。ＳＭＮ２プレ−ｍＲＮＡ内のイントロンサイレンシング配列（ＩＳＳ）及び／又は末端ステムループ（ＴＳＬ）をマスキングすることにより、本明細書に記載のｔｃ−ＤＮＡ ＡＯＮは、機能性ＳＭＮ１タンパク質の喪失を補完することができる修飾された機能性ＳＭＮ２タンパク質へと翻訳される、プロセッシングされたＳＭＮ２プレ−ｍＲＮＡへの異常エクソン７又はエクソン８のインクルージョンを促進することができ、そして、in vivoで発現される場合、修飾された機能性ＳＭＮ２は、ＳＭＮ１遺伝子の突然変異により引き起こされる脊髄性筋萎縮症を少なくとも部分的に改善させることができる。
【００９１】
従って、本開示は、ＳＭＮ２プレ−ｍＲＮＡのプロセッシング過程における異常エクソンのインクルージョンを促進するためのｔｃ−ＤＮＡ ＡＯＮであって、ｔｃ−ＤＮＡ ＡＯＮが、６〜２２トリシクロヌクレオチド長、具体的には、８〜２０トリシクロヌクレオチド長、さらに具体的には、１０〜１８トリシクロヌクレオチド長であり、そして、ｔｃ−ＤＮＡ ＡＯＮが、ＳＭＮ２プレ−ｍＲＮＡのイントロンサイレンサー配列（ＩＳＳ）又は末端ステムループ（ＴＳＬ）に相補的であるｔｃ−ＤＮＡ ＡＯＮを提供する。このようなｔｃ−ＤＮＡ ＡＯＮは、１３〜１７ヌクレオチド、１２〜１６ヌクレオチド又は１３〜１５ヌクレオチドであることができる。
【００９２】
本明細書において、ＳＭＮ２プレ−ｍＲＮＡのＩＳＳに相補的であり、そして、異常エクソン７のプロセッシングされたＳＭＮ２のｍＲＮＡへのインクルージョンを促進するために用いることができる、１５−ヌクレオチド配列５’−ＣＵＵＵＣＡＵＡＡＵＧＣＵＧＧ−３’（ＳＭＮ２ｉ７（１０；２５）、配列番号５）を含むｔｃ−ＤＮＡ ＡＯＮが例示される。また、本明細書において、ＳＭＮ２プレ−ｍＲＮＡのＴＳＬ２に相補的であり、そして、また、エクソン７のプロセッシングされたＳＭＮ２のｍＲＮＡへのインクルージョンを促進するために用いることができる、１３−ヌクレオチド配列５’−ＵＵＡＡＵＵＵＡＡＧＧＡＡ−３’（ＳＭＮ２ｅ７（３９；５１）、配列番号６）を含むｔｃ−ＤＮＡ ＡＯＮが例示される。
【００９３】
スタイナート筋緊張性ジストロフィーを処置するためのトリシクロ−ＤＮＡアンチセンスオリゴヌクレオチド
なおさらなる実施態様の範囲内において、本開示は、ＤＭ１をコードするｍＲＮＡの３’末端でのＣＵＧ増幅から引き起こされるスタイナート筋緊張性ジストロフィーの処置に適切に用いることができるｔｃ−ＤＮＡ ＡＯＮを提供する。過剰のＣＵＧ増幅を含有する突然変異ＤＭ１のｍＲＮＡが、核内に隔離され蓄積して、核焦点を形成すると考えられている。これらの焦点は安定であり、スプライシング機構に関与するファクターに結合し、それによって、トランスクリプトームに大きく影響を与えると考えられている。本開示の一部として、Ｕ７ ｓｎＲＮＡ系を使用することにより、ｔｃ−ＤＮＡ ＡＯＮを用いてＣＵＧ配列を標的化し、突然変異ＤＭ１のｍＲＮＡの破壊を促進することができ、それによって、スプライシングファクターの放出及び核焦点の除去を導くことが示される。特定の機械論に束縛されることはないが、実に驚くべきことに、さらに、本明細書に開示のｔｃ−ＤＮＡ ＡＯＮは、過剰のＣＵＧ増幅を含有するｍＲＮＡの破壊を促進することができると考えられる。
【００９４】
従って、過剰のＣＵＧ増幅を含有する突然変異ＤＭ１のｍＲＮＡの破壊を促進するために適切に用いることができるｔｃ−ＤＮＡ ＡＯＮが記載される。このようなｔｃ−ＤＮＡ ＡＯＮは、９〜２７トリシクロヌクレオチドを含み、ｔｃ−ＤＮＡ ＡＯＮは、１以上の３’ＣＵＧ増幅を含む突然変異ＤＭ１のｍＲＮＡに相補的であり、そして、ｔｃ−ＤＮＡ ＡＯＮは、ＤＭ１のｍＲＮＡの破壊を促進することができる。目的とする適用の精度に依存して、ｔｃ−ＤＮＡ ＡＯＮは、ヌクレオチド配列５’−ＣＡＧ−３’（配列番号７）の３〜９；４〜８；又は５、６若しくは７の連続反復配列を含むことができる。突然変異ＤＭ１の破壊を促進するための典型的なｔｃ−ＤＮＡ ＡＯＮは、１５−ヌクレオチド配列５’−ＣＡＧＣＡＧＣＡＧＣＡＧＣＡＧ−３’（ＤＭ１（ＣＡＧ５）、配列番号８）を含む。突然変異ＤＭ１の破壊を促進するための別の典型的なｔｃ−ＤＮＡ ＡＯＮは、１５−ヌクレオチド配列５’−ＣＡＧＣＡＧＣＡＧＣＡＧＣＡＧＣＡＧＣＡＧ−３’（ＤＭ１（ＣＡＧ７）、配列番号９）を含む。
【００９５】
トリシクロ−ＤＮＡアンチセンスオリゴヌクレオチドの合成及び単離
ｔｃ−ＤＮＡ ＡＯＮは、例えば、Caruthers et al., Methods in Enzymol. 211:3-19 (1992); Thompson et al., 国際公開公報第99/54459号; Wincott et al., Nucleic Acids Res. 23:2677-2684 (1995); Wincott et al., Methods Mol. Bio. 74:59 (1997); Brennan et al., Biotechnol Bioeng. 61:33-45 (1998);及びBrennan, 米国特許第6,001,311号に記載の当技術分野で公知のプロトコールを使用して合成することができる。
【００９６】
ｔｃ−ＤＮＡ及びｔｃ−ＤＮＡ ＡＯＮを合成するための方法がこれまでに記載されており、当技術分野でよく知られている。例えば、Steffens and Leumann, J. Am. Chem. Soc. 121(14):3249-3255 (1999); Steffens and Leumann, J.Am.Chem.Soc. 119:11548-11549 (1997);及びWengel, 米国特許第7,034,133号を参照されたい。ｔｃ−ＤＮＡは、市販のＤＮＡシンセサイザーを用いて、従来の固相シアノエチルホスホルアミダイト化学により製造するホスホルアミダイトから合成することができる。ｔｃ−ＤＮＡホスホルアミダイト構成単位は、Steffens and Leumann, C. Helv. Chim. Acta 80:2426-2439 (1997)に記載のように合成することができる。鎖伸長サイクルは、天然オリゴデオキシヌクレオチドの合成の場合と基本的に同じである。Pharmacia LKB社のユーザーマニュアル(56-1111-56) (Gene Assembler Special/4 Primers)を参照されたい。
【００９７】
例えば、ｔｃ−ＤＮＡ ＡＯＮの合成は、パソコンに接続したPharmacia LKB社のGene Assembler Special instrument又はApplied Biosystems社のPCR-MATE EP DNAシンセサイザー（モデル３９１）を使用して、固相ホスホルアミダイト法により達成することができる。試薬液は、製造業者のプロトコールに従って調製することができる。Applied Biosystems社、PCR-MATE EP DNAシンセサイザー（モデル３９１（１９８９））のユーザーマニュアル及びPharmacia LKB社のユーザーマニュアル(56-1111-56) (Gene Assembler Special/4 Primers)を参照されたい。１Ｈ−テトラゾール（ＭｅＣＮの０．４５Ｍ溶液）は、Flukaから入手することができる。
【００９８】
トリシクロ−ＤＮＡ ＡＯＮは、溶解度が低いことから、カップリング時間の延長（例えば、６分間）、１１倍の過剰ホスホルアミダイト、そして、０．１Ｍの代わりに０．０７Ｍのトリシクロアデノシン構成単位溶液の使用を採用することができる他は、標準的な合成サイクルに従って構築することができる。ＬＣＡＡ−ＣＰＧ（Sigma）又はポリスチレン（Pharmacia）結合天然ヌクレオシドのいずれかを、開始単位として使用することができる。
【００９９】
合成は、５’−脱トリチルオリゴマーで終了するトリチルオフモードで実施することができる。カップリング効率は、オンライントリチルアッセイでモニタリングすることができ、典型的には、９０〜９９％である。合成した後、固体支持体を濃ＮＨ３溶液中で懸濁し、５５℃で１５時間又は室温で２時間放置してもよい。
【０１００】
粗ｔｃ−ＤＮＡ ＡＯＮは、例えば、限外濾過、ゲル電気泳動又はクロマトグラフィーなどの当技術分野で公知の数多くの方法のいずれかにより精製することができる。イオン交換ＨＰＬＣは、Nucleogen DEAE 60-7（１２５×４mm）カラムを用いて達成することができる。単離したオリゴヌクレオチドは、Sambrook等の「Molecular Cloning: A Laboratory Manual」11.29 (Cold Spring Harbor Laboratory Press, Plainview, NY, 1989）に記載のように、SP-PAK C-18カートリッジ（Waters）で脱塩することができる。精製したｔｃ−ＤＮＡ ＡＯＮを、１５０mMＮａＣｌ、１０mMトリス−ＨＣｌ（pH７．０）に溶解させ、アルカリホスファターゼ（１mg/ml）及びホスホジエステラーゼ（２mg/ml）とともに３７℃でインキュベートすることができる。５時間後、溶液をＨＰＬＣ精製に付することができる。
【０１０１】
置換又は修飾（塩基、糖又はリン酸エステル）された化学合成核酸分子は、血清のリボヌクレアーゼによる分解を防ぎ、その効力を増加させることができる。例えば、Eckstein et al., 国際公開公報第92/07065号; Perrault et al., Nature 344:565 (1990); Pieken et al., Science 253:314 (1991); Usman and Cedergren, Trends in Biochem. Sci. 17:334 (1992); Usman et al., 国際公開公報第93/15187号;及びRossi et al., 国際公開公報第91/03162号; Sproat, 米国特許第5,334,711号; Gold et al., 米国特許第6,300,074号を参照されたい。上記の参考文献は全て、本明細書に記載のｔｃ−ＤＮＡ ＡＯＮの塩基、リン酸エステル又は糖部分に用いることができる様々な化学修飾を記載している。
【０１０２】
in vivo投与のためのトリシクロ−ＤＮＡの製剤化
本明細書に記載のｔｃ−ＤＮＡ ＡＯＮは、水性懸濁剤を製造するために適切な賦形剤との混合物であってもよい。このような賦形剤は、懸濁化剤、例えば、カルボキシメチルセルロースナトリウム、メチルセルロース、ヒドロプロピル−メチルセルロース、アルギン酸ナトリウム、ポリビニルピロリドン、トラガカントゴム及びアカシアゴムであり；分散剤又は湿潤剤、天然リン脂質、例えば、レシチン、又はアルキレンオキサイドと脂肪酸との縮合物、例えば、ステアリン酸ポリオキシエチレン、又はエチレンオキサイドと長鎖脂肪族アルコールとの縮合物、例えば、ヘプタデカエチレンオキシセタノール、又はエチレンオキサイドと脂肪酸及びヘキシトールから誘導される部分エステルとの縮合物、例えば、ポリオキシエチレンソルビトールオレイン酸モノエステル、又はエチレンオキサイドと脂肪酸及びヘキシトール無水物から誘導される部分エステルとの縮合物、例えば、ポリエチレンソルビタンオレイン酸モノエステルであってもよい。水性懸濁剤は、また、１以上の防腐剤、例えば、ｐ−ヒドロキシ安息香酸エチル又はｎ−プロピルを含有してもよい。水を添加して水性懸濁剤を調製するために適切な分散性粉剤及び顆粒剤は、分散剤又は湿潤剤、懸濁化剤及び１以上の防腐剤との混合物の活性成分で提供される。
【０１０３】
ｔｃ−ＤＮＡ ＡＯＮ組成物は、無菌の注射可能な水性又は油性懸濁剤の形態であってもよい。懸濁剤は、上述した適切な分散剤又は湿潤剤及び懸濁化剤を使用し、当技術分野でよく知られているように製剤化することができる。無菌の注射製剤は、また、非毒性の非経口的（parentally）に許容しうる希釈剤又は溶媒に溶かした無菌の注射可能な液剤又は懸濁剤、例えば、１，３−ブタンジオール溶液であってもよい。使用することができる許容しうる溶剤及び溶媒には、水、Ringer溶液及び生理食塩液がある。さらに、無菌の固定油を、通常、溶媒又は懸濁媒体として使用することができる。この目的のために、合成モノ又はジグリセリドなどの任意の無菌の固定油を使用することができる。さらに、オレイン酸などの脂肪酸が注射剤の調製に使用される。
【０１０４】
本開示は、また、薬学的に許容しうる担体又は希釈剤に薬学的に有効な量の所望の化合物を含む、保存又は投与のために調製されるｔｃ−ＤＮＡ ＡＯＮ組成物を含む。治療用途のための許容しうる担体又は希釈剤は、医薬品分野でよく知られており、例えば、Remington's Pharmaceutical Sciences (Mack Publishing Co., A.R. Gennaro edit., 1985)に記載されている。例えば、防腐剤及び安定剤が提供されうる。これらは、安息香酸ナトリウム、ソルビン酸及びｐ−ヒドロキシ安息香酸エステルを含む。さらに、抗酸化剤及び懸濁化剤を使用してもよい。
【０１０５】
本開示は、プレ−ｍＲＮＡ内のエクソンスキッピングを促進するための、あるいは、イントロンサイレンシング又は末端ステムループをマスキングするための、あるいは、細胞又は生物におけるｍＲＮＡの破壊を標的化するための、ｔｃ−ＤＮＡ ＡＯＮ組成物並びに方法を提供する。関連する実施態様においては、本開示は、本明細書に上述されるような疾患又は疾患を発症するリスクを有するヒト細胞、組織又は個体などの対象を処置するための方法及びｔｃ−ＤＮＡ ＡＯＮ組成物を提供する。一実施態様においては、本方法は、プレ−ｍＲＮＡのプロセッシングが修飾されるか、あるいは、ｍＲＮＡの破壊を標的化するように、哺乳類などの細胞又は生物に、本開示のｔｃ−ＤＮＡ ＡＯＮ又はｔｃ−ＤＮＡ ＡＯＮを含有する医薬組成物を投与することを含む。本開示の組成物及び方法を使用した処置を許容可能な哺乳類の対象は、例えば、デュシェンヌ型筋ジストロフィー、脊髄性筋萎縮症又はスタイナート筋緊張性ジストロフィーなどの、このような処置を許容可能な１以上の障害を有する対象を含む。
【０１０６】
本開示のｔｃ−ＤＮＡ ＡＯＮ組成物は、薬学的に許容しうる製剤として効果的に用いることができる。薬学的に許容しうる製剤は、患者の病状又は他の有害な状態、その発生又は重症化を予防、変化、あるいは、患者の病状又は有害な状態を処置（検出可能又は測定可能な程度に１以上の症状を緩和）する。薬学的に許容しうる製剤は、上記化合物の塩、例えば、塩酸、臭化水素酸、酢酸及びベンゼンスルホン酸の塩などの酸付加塩を含む。医薬組成物又は製剤は、細胞又は患者、例えば、ヒトへの全身投与などの投与に適切な形態の組成物又は製剤を指す。適切な形態は、その使用又は投与経路、例えば、経皮的又は注射に一部依存する。このような形態は、組成物又は製剤が標的細胞（即ち、ｔｃ−ＤＮＡ ＡＯＮを送達するのに望ましい細胞）に到達することを妨げてはならない。例えば、血流に注入される医薬組成物は、可溶性である必要がある。他のファクターは、当技術分野で公知であり、毒性及び組成物又は製剤がその効果を発揮することを妨げる形態などの事項が含まれる。
【０１０７】
本開示の医薬組成物は、また、水中油型乳剤の形態であってもよい。油相は、植物油若しくは鉱油又はこれらの混合物であることができる。適切な乳化剤は、天然ゴム、例えば、アカシアゴム又はトラガカントゴム、天然リン脂質、例えば、大豆、レシチン、脂肪酸及びヘキシトール、無水物から誘導されるエステル又は部分エステル、例えば、ソルビタンオレイン酸モノエステル、並びに、前記部分エステルとエチレンオキサイドとの縮合物、例えば、ポリオキシエチレンソルビタンオレイン酸モノエステルであることができる。
【０１０８】
本開示のｔｃ−ＤＮＡ ＡＯＮは、処置に適切な組成物の形態にするために、安定剤、緩衝剤などを添加して、又は添加しないで、任意の標準的な手段により患者に投与することができる。リポソーム送達機構を使用することが望まれる場合、標準プロトコールに従ってリポソームを生成することができる。従って、本開示のｔｃ−ＤＮＡ ＡＯＮは、任意の形態、例えば、経皮的、あるいは、局所、全身又は髄腔内注射により投与することができる。
【０１０９】
本開示は、また、ポリ（エチレングリコール）脂質を含有する表面修飾リポソーム（ＰＥＧ修飾された若しくは血中滞留性のリポソーム又はステルスリポソーム）を含むｔｃ−ＤＮＡ ＡＯＮ組成物の使用を特徴とする。これらの製剤は、標的組織内でｔｃ−ＤＮＡ ＡＯＮの蓄積を増加させる方法を提供する。この種類の薬物担体は、単核性食細胞系（ＭＰＳ又はＲＥＳ）によるオプソニン作用及び排出に耐性を示し、それによって、封入ｔｃ−ＤＮＡ ＡＯＮの長期間の血中滞留を可能にし、組織への曝露を増大させることができる（Lasic et al., Chem. Rev. 95:2601-2627 (1995) and Ishiwata et al., Chem. Pharm. Bull. 43:1005-1011 (1995）)。血中滞留性リポソームは、特に、ＭＰＳの組織に蓄積することが知られている従来のカチオン性リポソームと比較して、ｔｃ−ＤＮＡ ＡＯＮの薬物動態及び薬力学を増大させる（Liu et al., J. Biol. Chem. 42:24864-24870 (1995); Choi et al., 国際公開公報第96/10391号; Ansell et al., 国際公開公報第96/10390号; Holland et al., 国際公開公報第96/10392号）。血中滞留性リポソームは、また、肝臓及び脾臓などの代謝的に活動的なＭＰＳ組織への蓄積を回避する能力に基づいて、カチオン性リポソームと比較し、ヌクレアーゼ分解からｔｃ−ＤＮＡ ＡＯＮをより強く保護する可能性が高い。
【０１１０】
薬学的に有効な用量は、病状の発生の予防、抑制又は病状の処置（症状をある程度、好ましくは、症状の全てを緩和）するために必要な用量である。薬学的に有効な用量は、疾患の種類、使用する組成物、投与経路、処置される哺乳類の種類、検討する特定の哺乳類の身体的特性、併用薬物及び医学分野の技術者が認識する他の要因に依存する。例えば、本開示のｔｃ−ＤＮＡ ＡＯＮの効力に依存して、０．１mg/kg〜１００mg/kg体重/日の活性成分量が投与される。
【０１１１】
約０．１mg〜約１４０mg/kg体重/日のオーダーの用量レベルが、上記の状態の処置に有用である（約０．５mg〜約７ｇ/患者/日）。単位剤形を製造するために担体材料と組み合わせることができる活性成分量は、処置されるホスト及び特定の投与形態に依存して変更される。用量単位形態は、一般的に、約１mg〜約５００mgの活性成分を含有する。
【０１１２】
任意の特定の患者の特定の用量レベルは、用いられる特定の化合物の活性、年齢、体重、総体的な健康状態、性別、食事、投与回数、投与経路及び排出速度、薬物併用並びに治療中の特定の疾患の重症度などの様々な要因に依存することが理解される。本開示の製剤及び方法によるｔｃ−ＤＮＡ ＡＯＮ組成物の投与を受けて、試験対象は、処置される疾患又は障害に関連する１以上の症状において、プラセボ処置又は他の適切なコントロール対象と比較し、約１０％〜最大約９９％の減少を示す。
【０１１３】
ｔｃ−ＤＮＡ ＡＯＮを、ｔｃ−ＤＮＡ ＡＯＮ単独を含む製剤又は薬学的に許容しうる担体、希釈剤、賦形剤、アジュバント、乳化剤、緩衝剤、安定剤、防腐剤などの１以上の追加の成分をさらに含む製剤としての投与を含む、当業者に公知の様々な方法により細胞に投与することができる。特定の実施態様においては、ｔｃ−ＤＮＡ ＡＯＮは、リポソームに封入するか、イオン導入により投与するか、あるいは、ヒドロゲル、シクロデキストリン、生分解性ナノカプセル、生体接着性ミクロスフェア又はタンパク性ベクターなどの他のビヒクルに組み込むことができる（例えば、国際公開公報第00/53722号参照）。
【０１１４】
本開示のｔｃ−ＤＮＡ ＡＯＮの直接注入は、皮下、筋肉内又は皮内に関わらず、Conry et al., Clin. Cancer Res. 5:2330-2337 (1999)及び国際公開公報第99/31262号に記載されるように、標準的な針及びシリンジを用いる方法又は無針技術を用いて行うことができる。
【０１１５】
本開示のｔｃ−ＤＮＡ ＡＯＮなどの核酸分子を送達すためのさらなる方法は、例えば、Boado et al., J. Pharm. Sci. 87:1308-1315 (1998); Tyler et al., FEBS Lett. 421:280-284 (1999); Pardridge et al., Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 92:5592-5596 (1995); Boado, Adv. Drug Delivery Rev. 15:73-107 (1995); Aldrian-Herrada et al., Nucleic Acids Res. 26:4910-4916 (1998); Tyler et al., Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 96:7053-7058 (1999); Akhtar et al., Trends Cell Bio. 2:139 (1992); 「Delivery Strategies for Antisense Oligonucleotide Therapeutics」, (ed. Akhtar, 1995); Maurer et al., Mol. Membr. Biol. 16:129-140 (1999); Hofland and Huang, Handb. Exp. Pharmacol 137:165-192 (1999);及びLee et al., ACS Symp. Ser. 752:184-192 (2000)に記載される。これらのプロトコールを利用して、本開示の範囲内で意図されるあらゆるｔｃ−ＤＮＡ ＡＯＮの送達を補足又は補完することができる。
【０１１６】
実施例
上記の開示は、一般的に、下記実施例によりさらに例示される本開示を記載する。これらの特定の実施例は、単に、例示の目的で記載され、そして、本開示の範囲を限定するものではない。本明細書において、特定の対象、用語及び値が用いられているが、このような対象、用語及び値は、同様に、典型例であり、本開示の範囲を限定するものでないことが理解されるであろう。
【０１１７】
実施例１
ジストロフィン筋線維症におけるジストロフィンをレスキューするためのトリシクロ−ＤＮＡアンチセンスオリゴヌクレオチドの使用
デュシェンヌ型筋ジストロフィー（ＤＭＤ）は、ジストロフィンコード遺伝子の突然変異から引き起こされるＸ染色体連鎖劣性欠損症である。トランケートされたジストロフィンタンパク質欠損をコードするジストロフィン遺伝子内のアウトオブフレーム欠失は、重度のＤＭＤ表現型をもたらす。トリシクロ−ＤＮＡ（ｔｃ−ＤＮＡ）アンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＯＮ）を使用するエクソンスキッピング戦略が開発され、ジストロフィン遺伝子のアウトオブフレーム突然変異を効果的にレスキューすることが可能となり、これにより、翻訳リーディングフレームが修復され、従って、機能的に活性なジストロフィンタンパク質が産生された。例えば、エクソン２３が、得られるプロセッシングされたｍＲＮＡからスプライス除去されるように、エクソン２３／イントロン２３接合部にハイブリダイズし、そして、プレ−ｍＲＮＡプロセッシングに干渉するｔｃ−ＤＮＡ ＡＯＮが記載される。また、エクソン５１／イントロン５１接合部にハイブリダイズするｔｃ−ＤＮＡ ＡＯＮは、同様に、エクソン５１がプロセッシングされたｍＲＮＡからスプライス除去されるように、プレ−ｍＲＮＡプロセッシングに干渉する。従って、得られるジストロフィンタンパク質は、それぞれ、エクソン２３又はエクソン５１によりコードされるアミノ酸配列が欠損しているが、重度のＤＭＤ表現型が回復するように依然十分な機能性を保持している。
【０１１８】
実施例２
ｍｄｘマウスモデル
ｍｄｘマウスは、完全長ジストロフィンタンパク質を欠損するが、より短いジストロフィンアイソフォームの全てを保持するＤＭＤのマウスモデルである（Bulfield et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:1189-1192 (1984)）。ｍｄｘマウスは、ジストロフィン遺伝子のエクソン２３に機能性ジストロフィンの合成を妨げるナンセンス突然変異を有する（図３参照）。エクソン２３は、ＣからＴの突然変異が終始コドン（ＴＡＡ）を作製する反復配列Ｒ６及びＲ７を一部コードする。
【０１１９】
実施例３
in vitro研究
本実施例は、ヌクレオチド配列５’−ＡＡＣＣＴＣＧＧＣＴＴＡＣＣＴ−３’を有する、Ｍ２３Ｄ（＋０２−１３）で示される１５−ヌクレオチドのｔｃ−ＤＮＡ ＡＯＮでトランスフェクトしたｍｄｘの筋管において、ジストロフィンプレ−ｍＲＮＡが、エクソン２３を欠失するｍＲＮＡにプロセッシングされるように、エクソン２３の下流のドナースプライス部位でエクソンスキッピングが起こることを示す。
【０１２０】
Ｍ２３Ｄ（＋０２−１３）で示されるｔｃ−ＤＮＡ ＡＯＮは、エクソン２３／イントロン２３スプライス部位で、標的配列のイントロン２２−ｔｔｔｔｇａｇ［ＧＣＴＣ…エクソン２３…ＴＣＡＧ］ｇｔａａｇｃｃｇａｇｇｔｔｔｇｇｃｃ−イントロン２３にハイブリダイズするように設計された。
【０１２１】
ｍｄｘの筋管を、オリゴフェクタミンを添加又は非添加で、ｔｃ−ＤＮＡ ＡＯＮ Ｍ２３Ｄ（＋０２−１３）（１、２及び１０μg）でトランスフェクトした。一つの未処理試料をネガティブコントロールとした。４８時間後、培養物を回収し、RNeasy mini kit（Qiagen）を使用してｍＲＮＡを抽出した。次に、ｍＲＮＡを下記のように逆転写した。８μlの抽出ＲＮＡ（５００ng〜１μg）を、１μLのｄＮＴＰ及び１μLのランダムヘキサマーと混合し、混合物を６５℃で５分間インキュベートした。次に、混合物を氷上で冷却した。２５mMＭｇＣｌ２（４μL）、０．１ＭＤＴＴ（２μL）、１μＬのRNase outリボヌクレアーゼ阻害剤（４０U/μL）、１×Tampon（２μLの１０×ストック）及び５０ＵSuperScript逆転写酵素を混合物に添加し、反応物の最終容量を２０μLにした。次に、反応物を２５℃で１０分間インキュベートし、その後、４２℃で５０分間インキュベートした。次に、反応物を７０℃で１５分間加熱して不活化した。次に、反応物を氷上に置きボルテックスした。次に、１μLのＲＮａｓｅＨを反応物に添加し、３７℃で２０分間インキュベートした。
【０１２２】
次に、エクソン２３のスキッピングを、下記の条件を用いて、ネステッドＰＣＲでアッセイした。２５μLのPCR master mix（Ｔａｑポリメラーゼ５０U/μL、４００μMｄＮＴＰ、３mMＭｇＣｌ２）を、３μLのｃＤＮＡ、２２μLのＨ２Ｏ及び各１μLの下記の２つのプレイマー（１００μMのストック濃度）と混合した。
【０１２３】
【化１】
【０１２４】
次に、反応物を、下記の熱サイクルパラメーター条件下に付した。９４℃で５分間、その後、９４℃で３０秒間、５５℃で１分間、そして、７２℃で２分間を３０サイクル。最後に、反応物を７２℃で５分間のインキュベートに付した。
【０１２５】
２μlのＰＣＲ産物をテンプレートとして、１μLの下記プライマー（１００μMのストック濃度）を使用する別のＰＣＲ反応液に添加した。反応物には、また、２５μLのPCR master mix及び２３μLのＨ２Ｏを添加した。
【０１２６】
【化２】
【０１２７】
反応物を、下記の熱サイクルパラメーター条件下に付した。９４℃で５分間、その後、９４℃で３０秒間、５５℃で１分間、そして、７２℃で２分間を２５サイクル。最後に、反応物を７２℃で５分間のインキュベートに付した。
【０１２８】
図４に示されるデータは、（１）１５ヌクレオチドのｔｃ−ＤＮＡ ＡＯＮ Ｍ２３Ｄ（＋０２−１３）が、ex vivoで、ｍｄｘのジストロフィンｍＲＮＡ内の突然変異エクソン２３のスキッピングを達成することができ、そして、（２）オリゴフェクタミンが、ex vivoにおけるｔｃ−ＤＮＡ ＡＯＮの取り込みを向上させることを示す。
【０１２９】
Ｍｄｘの筋管を、オリゴフェクタミンの存在下、ｔｃ−ＤＮＡ ＡＯＮ Ｍ２３Ｄ（＋０２−１３）（０．５、１、２、５及び１０μg）でトランスフェクトした。培養物を上述のように処理した。図５に示されるデータは、２μgのｔｃ−ＤＮＡ ＡＯＮ Ｍ２３Ｄ（＋０２−１３）の存在下でスキッピングが顕著であることを示す。
【０１３０】
ｍｄｘの筋管を、オリゴフェクタミンの存在下、５μgのｔｃ−ＤＮＡ ＡＯＮ Ｍ２３Ｄ（＋０２−１３）でトランスフェクトした。トランスフェクト後、異なる時点（０日目〜１５日目）で培養物を上述のように処理した。図６に示されるデータは、（１）３日目でスキッピングが観察され（Ｄ３）、そして、（２）１５日目でもまだスキッピングが検出可能であったが（Ｄ１５）、７日目から減少したことを示す（Ｄ７）。
【０１３１】
実施例４
in vivo研究
本実施例は、ヌクレオチド配列５’−ＡＡＣＣＴＣＧＧＣＴＴＡＣＣＴ−３’を有するＭ２３Ｄ（＋０２−１３）で示される１５−ヌクレオチドのｔｃ−ＤＮＡ ＡＯＮを注射したｍｄｘマウスにおいて、ジストロフィンプレ−ｍＲＮＡが、エクソン２３を欠失するｍＲＮＡにプロセッシングされるように、エクソン２３の下流のドナースプライス部位でエクソンスキッピングが起こることを示す。
【０１３２】
８週齢のｍｄｘマウスの前脛骨筋に、１００、８０、４０、２０、１０及び５μgのｔｃ−ＤＮＡ ＡＯＮ Ｍ２３Ｄ（＋０２−１３）を含有する５０μlのＰＢＳ（リン酸緩衝食塩水）を注射した。３週間後に動物を屠殺した。筋肉試料を処理して、上記実施例３と同じパラメーターを使用してｍＲＮＡ解析を行った。結果を図７に示す。
【０１３３】
図７に示されるデータは、エクソンスキッピングが試験した全ての条件で起こったことを示す。また、有意なジストロフィンタンパク質レベルが横断面で検出された（示さず）。２μgのｔｃ−ＤＮＡ ＡＯＮ Ｍ２３Ｄ（＋０２−１３）の注射は、５μgのｔｃ−ＤＮＡ ＡＯＮ Ｍ２３Ｄ（＋０２−１３）を注射した場合と同じ結果であった（示さず）。
【０１３４】
８週齢のｍｄｘマウスに、１０μgのｔｃ−ＤＮＡ ＡＯＮ Ｍ２３Ｄ（＋０２−１３）を含有する５０μlのＰＢＳを筋肉内注射した。注射の４、１０及び２０週間後に動物を屠殺した。筋肉試料及び横断面で、ジストロフィンｍＲＮＡについて上述のようにアッセイした。結果を図８に示す。
【０１３５】
筋肉横断面で、下記のように免疫染色を用いて、ジストロフィンタンパク質発現についてアッセイした。一次モノクローナル抗体ＮＣＬ−Ｄｙｓ２（１：１００希釈）を、Ｍ．Ｏ．Ｍ．（マウスオンマウス）キットを使用して試料に添加した。次に、試料をＰＢＳで３回洗浄した。次に、試料を、Alexa Fluor 488（Molecular Probes）で標識したヤギ抗マウスＩｇＧ二次抗体と２時間インキュベートし、その後、ＰＢＳで洗浄し、０．０１％TritonXで洗浄し、最後に、ＰＢＳで洗浄した。この実験の結果を図９に示す。
【０１３６】
図８及び９に示されるデータは、（１）エクソンスキッピングが、４及び１０週目で現れたが、２０週目では観察されなかった；（２）ジストロフィンは、４週目〜２０週目で明瞭に検出可能である；そして、（３）ｔｃ−ＤＮＡ ＡＯＮ Ｍ２３Ｄ（＋０２−１３）が、ex vivoよりin vivoで効果的であるように思われることを示す。
【０１３７】
実施例５
脳の免疫染色
８週齢のｍｄｘマウスの海馬又は脳脊髄液（髄腔内注射）に、２０μg（海馬）又は２００μg（髄腔内）のｔｃ−ＤＮＡ ＡＯＮ Ｍ２３Ｄ（＋０２−１３）を含有する５０μlのＰＢＳを注射した。注射の１か月後に動物を屠殺した。脳断片（パネルＡ、Ｂ、Ｃ）及び小脳断片（パネルＤ、Ｅ、Ｆ）で、上記実施例４に記載するようにジストロフィンタンパク質についてアッセイした。結果を図１０に示す。パネルＡ及びＤは、マウスを処理しなかったネガティブコントロールに相当する。パネルＢ及びＥは、ｍｄｘマウス由来の未処理断片に相当する。パネルＣは、海馬処理したｍｄｘマウス（Ｃ）に相当し、パネル（Ｆ）は、ｍｄｘマウスの髄腔内処理した小脳の結果を示す。核はＤＡＰＩで対比染色した。
【０１３８】
実施例６
送達（予測）
ｔｃ−ＤＮＡ ＡＯＮ Ｍ２３Ｄ（＋０１−１３）は、腹腔内及び皮下注射により送達することができる（１g/kg以下から）。
【０１３９】
実施例７
ＤＭＤマウスにおけるジストロフィンをレスキューするためのトリシクロ−ＤＮＡアンチセンスオリゴヌクレオチド
本実施例は、配列５’−ＡＧＡＡＡＴＧＣＣＡＴＣＴＴＣ−３’（「ｔｃ−ＤＮＡ ＡＯＮ Ｈ５１（＋６８＋８２）」；配列番号２）、５’−ＡＡＡＴＧＣＣＡＴＣＴＴＣＣＴ−３’（「ｔｃ−ＤＮＡ ＡＯＮ Ｈ５１（＋７０＋８４）」；配列番号３）及び５’−ＴＧＣＣＡＴＣＴＴＣＣＴＴＧＡ−３’（「ｔｃ−ＤＮＡ ＡＯＮ Ｈ５１（＋７３＋８７）」；配列番号４）を有するジストロフィンのエクソン５１／イントロン５１接合部用に設計されたｔｃ−ＤＮＡ ＡＯＮが、完全ヒトジストロフィン遺伝子を発現するマウス（「ｈＤＭＤマウス」）由来の筋肉細胞において、エクソン５１のスキッピングに効果的に関与したことを示す。
【０１４０】
８〜１０週齢のｈＤＭＤマウスの前脛骨筋に、１０μgのｔｃ−ＤＮＡ ＡＯＮ Ｈ５１（＋６８＋８２）（ｔｃ−ＤＮＡ ｅｘ５１ ＥＳＥａとも呼ばれる）、ｔｃ−ＤＮＡ ＡＯＮ Ｈ５１（＋７０＋８４）（ｔｃ−ＤＮＡ ｅｘ５１ ＥＳＥｂとも呼ばれる）又はｔｃ−ＤＮＡ ＡＯＮ Ｈ５１（＋７３＋８７）（ｔｃ−ＤＮＡ ｅｘ５１ ＥＳＥｃとも呼ばれる）を含有する５０μlのＰＢＳを注射した。４週間後に動物を屠殺した。筋肉試料を処理して、上記実施例３と同じパラメーターを使用してｍＲＮＡ解析を行った。結果を図１２に示す。
【０１４１】
エクソン５１のスキッピングを、下記の条件下でネステッドＰＣＲによりアッセイした。５００ngのトータルＲＮＡを使用し、Access RT-PCR System（Promega）を用いて、５０μLの反応液で下記の外部プライマーを使用してＲＴ−ＰＣＲを行った：
【０１４２】
【化３】
【０１４３】
ｃＤＮＡ合成を、４５℃で４５分間実施し、直後に下記パラメーターを用いて２０サイクルの第一のＰＣＲを行った：９４℃で４０秒間、６０℃で４０秒間、そして、７２℃で４０秒間を２０サイクル。
【０１４４】
２μｌのＰＣＲ産物をテンプレートとして、下記のプライマー（１００μＭのストック濃度）を使用する別のＰＣＲ反応液に添加した。
【０１４５】
【化４】
【０１４６】
反応物を、下記の熱サイクルパラメーター条件下に付した：９４℃で５分間、その後、９４℃で４０秒間、６０℃で４０秒間、そして７２℃で４０秒間を３０サイクル。最後に、反応物を７２℃で５分間のインキュベートに付した。
【０１４７】
図１２に示されるデータは、試験した各ｔｃ−ＤＮＡ ＡＯＮ Ｈ５１構築物（ｔｃ−ＤＮＡ ＡＯＮ Ｈ５１（＋６８＋８２）、ｔｃ−ＤＮＡ ＡＯＮ Ｈ５１（＋７０＋８４）及びｔｃ−ＤＮＡ ＡＯＮ Ｈ５１（＋７３＋８７））が、エクソン５１のスキッピングの増加をもたらしたことを示す。
【０１４８】
実施例８
ＳＭＮのエクソン７／イントロン７接合部及びイントロン７のＩＳＳを対象とするトリシクロ−ＤＮＡアンチセンスオリゴヌクレオチドが、ＳＭＮ２におけるエクソン７のインクルージョンを促進する
本実施例は、ＳＭＮのエクソン７／イントロン７接合部及びイントロン７のＩＳＳ（それぞれ、「ｔｃ−ＤＮＡ ＡＯＮ ＳＭＮ２ｅ７（３９；５１）」及び「ｔｃ−ＤＮＡ ＡＯＮ ＳＭＮ２ｉ７（１０；２５）」）用に設計されたｔｃ−ＤＮＡ ＡＯＮが、ＳＭＡ患者から単離された線維芽細胞（Ｇ０３８１３細胞株）のＳＭＮ２において、エクソン７のインクルージョンに効果的に関与することを示す。
【０１４９】
【化５】
【０１５０】
Ｇ０３８１３細胞株は、ＳＭＮ２の２コピーを有する３歳のＩ型ＳＭＡ患者に由来する。ＧＭ０３８１３細胞を、２０％ウシ胎仔血清及び１％ペニシリン−ストレプトマイシン（１００U/ml）を添加したダルベッコ変法イーグル培地（ＤＭＥＭ）で培養した。ｔｃＤＮＡ ＡＯＮ（ｔｃ−ＤＮＡ ＡＯＮ ＳＭＮ２ｉ７（１０；２５）及びｔｃ−ＤＮＡ ＡＯＮ ＳＭＮ２ｅ７（３９；５１））を、オリゴフェクタミン（Invitrogen）を使用し、血清及び抗生物質不含の培地で４８時間トランスフェクションした。トランスフェクションの４８時後に、TRIzol試薬（Invitrogen）を使用してトータルＲＮＡを抽出し、ファーストストランドｃＤＮＡを、SuperScript II（Invitrogen）及びランダムヘキサマーを使用して合成した。ＰＣＲを、Master Mix 2× Phusion GC（Finnzymes）を使用して、１１μＬのｃＤＮＡ並びに各１０μMのSMN-Ex6-FW及びSMN-Ex8-Reプライマーの総量５０μLで実施した。次に、ＰＣＲ産物を３％アガロースゲル電気泳動で分離した。
【０１５１】
【化６】
【０１５２】
図１９に示されるデータは、ｔｃ−ＤＮＡ ＡＯＮ ＳＭＮ２ｅ７（３９；５１）及びｔｃ−ＤＮＡ ＡＯＮ ＳＭＮ２ｉ７（１０；２５）の両方が、ＳＭＮ２のｍＲＮＡにおけるエクソン７のインクルージョンを促進することを示す。パネルＡは、指定のｔｃ−ＤＮＡオリゴヌクレオチドで処理したＧＭ０３８１３細胞由来のＲＮＡのＲＴ−ＰＣＲ分析を示す。両方のｔｃ−ＤＮＡオリゴヌクレオチドで処理した、エクソン７を含まないＳＭＮ２（「ＳＭＮ２（Δ７）」）に相当するバンド（レーン３及び４）は、未処理レーン（レーン２）のバンドと比較しバンド強度が低い。パネルＢは、ｔｃ−ＤＮＡ ＡＯＮをトランスフェトした後、ＳＭＮ１＋完全長ＳＭＮ２に相当する上のバンドが増加し、一方で、ＳＭＮ２（Δ７）に相当する下のバンドが大きく減少したことを示すゲルの正規化定量プロットである。
【０１５３】
パネルＣは、野生型線維芽細胞及び指定のｔｃ−ＤＮＡオリゴヌクレオチドでトランスフェクトしたＧＭ０３８１３細胞から得られたライセートのウエスタンブロットを示す。ライシスバッファー（１０mmol/lＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．９）、１００mmol/lＫＣｌ、１mmol/lＥＤＴＡ、１mmol/l１，４−ジチオスレイトール、１×コンプリートプロテアーゼ阻害カクテル（Roche）、０．５％ＮＰ−４０）で処理してタンパク質抽出物を得た。等量のタンパク質（ブラッドフォードタンパク質アッセイ（Pierce）で測定）を、２×ローディングバッファー（１２５mmol/lトリス（ｐＨ６．８）、２％ドデシル硫酸ナトリウム、１０％グリセロール、０．０１％ブロモフェノールブルー、１０％β−メルカプトエタノール）と混合し、タンパク質濃度を、ブラッドフォードタンパク質アッセイ（Pierce）を用いて測定した。１０μgの各タンパク質試料を、４〜１２％ビス−トリスゲル（Invitrogen）のＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離し、ニトロセルロース膜に転写した。１０％ミルク／ＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎバッファーで膜をブロッキングし、ＳＭＮ１、ＳＭＮ２及びＳＭＮ２のトランケート型を認識するウサギポリクローナルＳＭＮ抗体（希釈１：５００；h-195、Santa Cruz）でプローブし、次に、西洋ワサビペルオキシダーゼ結合−ヤギ抗ウサギ二次抗体（１：５０，０００）とインキュベートした。スーパーシグナルウエストピコ化学発光キット（ThermoScientific）でシグナルを検出した。タンパク質のイコールローディング（equal loading）を確認するために、膜を洗浄し、再度ブロッキングし、そして、マウスモノクローナル抗アクチン抗体でプローブした後、西洋ワサビペルオキシダーゼ結合−ヒツジ抗マウス二次抗体（１：１５，０００）とインキュベートした。シグナルを上述のように検出した。レーン１：ｔｃ−ＤＮＡ ＡＯＮ ＳＭＮ２ｉ７（１０；２５）でトランスフェクトしたＧＭ０３８１３細胞；レーン２：ｔｃ−ＤＮＡ ＡＯＮ ＳＭＮ２ｅ７（３９；５１）でトランスフェクトしたＧＭ０３８１３細胞；レーン３：ｔｃ−ＤＮＡ ＡＯＮ ＳＭＮ２ｉ７（１０；２５）及びｔｃ−ＤＮＡ ＡＯＮ ＳＭＮ２ｅ７（３９；５１）の両方でトランスフェクトしたＧＭ０３８１３細胞；レーン４：野生型線維芽細胞；レーン５：非トランスフェクトのＧＭ０３８１３細胞。
【０１５４】
パネルＣのデータは、ｃ−ＤＮＡオリゴヌクレオチドを用いてトランスフェクトすることによりＳＭＮ２のｍＲＮＡにおけるエクソン７のインクルージョンに起因してＧＭ０３８１３細胞のＳＭＮレベルがレスキューされたことを示す。コントロールのＧＭ０３８１３細胞は、ＳＭＮ２におけるエクソン７の散発性の自然インクルージョンに起因するいくつかのＳＭＮタンパク質を表す。
【０１５５】
パネルＤは、３０μgのｔｃ−ＴＳＬでトランスフェクトし、その後、ＳＭＮ抗体で染色したＧＭ０３８１３細胞の顕微鏡写真を示す。スライド上のトランスフェクトしたＧＭ０３８１３細胞をアセトン／メタノール（容積／容積）で固定した。固定した細胞を、ＰＢＳ＋５％ＢＳＡで１時間ブロッキングし、その後、ウサギポリクローナルＳＭＮ抗体（ＰＢＳ＋１％ＢＳＡ中１：１００；h-195、Santa Cruz）と１時間インキュベートした。細胞をＰＢＳで洗浄し、Alexa 594結合−抗ウサギ二次抗体と１時間インキュベートした。次に、細胞をＰＢＳで洗浄し、ＤＡＰＩ（１：５０，０００）と５分間インキュベートした。スライドに、Fluoromount-G（SouthernBiotech）を使用してカバースリップをのせ、４℃で一晩インキュベートした。顕微鏡写真は、ｔｃ−ＤＮＡ ＴＳＬでトランスフェクトしたＧＭ０３８１３細胞の核（青）で、ＳＭＮ（赤）レベルが増加したことを示す。
【０１５６】
実施例９
ＣＵＧ反復配列を対象とするトリシクロ−ＤＮＡアンチセンスオリゴヌクレオチドが、ＤＭ１筋芽細胞における突然変異ＤＭＰＫのｍＲＮＡの発現を減少させる
本実施例は、配列５’−ＣＡＧＣＡＧＣＡＧＣＡＧＣＡＧＣＡＧＣＡＧ’３’（「ｔｃ−ＤＮＡ ＡＯＮ ＤＭ１（ＣＡＧ７）」；配列番号９）を有する、突然変異ＤＭＰＫのｍＲＮＡにおけるＣＵＧ反復配列用に設計されたｔｃ−ＤＮＡ ＡＯＮが、Tissue Bank for Research「Myobank」の筋生検から単離したヒトＤＭ１筋芽細胞において８００ＣＵＧ反復配列を有する突然変異ＤＭＰＫのｍＲＮＡの発現を効果的に減少させることを示す。
【０１５７】
ＤＭ１筋芽細胞を、リポフェクタミン（Invitrogen）を使用して、増加量のｔｃ−ＤＮＡ ＡＯＮ ＤＭ１（ＣＡＧ７）（０、３．５μg、１０μg及び２０μg）でトランスフェクトした。トランスフェクトの３日後、野生型及び突然変異のＤＭＰＫのｍＲＮＡの発現をノーザンブロットにより検出した。簡単に述べると、５〜１０μgのトータルＲＮＡを、０．６６Ｍホルムアルデヒドを含有する１．３％アガロースＭＯＰＳゲルで分離し、１０×ＳＳＣを用いて毛細管輸送により、Ｈｙｂｏｎｄ−Ｎ＋膜（Amersham Pharmacia Biotech）に転写した。ブロットを、ランダムプライムド３２Ｐ−標識（ＤＭＰＫ ｃＤＮＡのBgl II-Sac Iフラグメント）プローブを用いて、ハイブリダイゼーションバッファー（２％ＳＤＳ、１０％硫酸デキストラン、１×ＳＳＰＥ、１００μg/mlサケ精子ＤＮＡ、２％Denhart's）中、６８℃で一晩ハイブリダイズした。シグナルを、ホスホイメージャー（Molecular Imager FX、Bio-Rad）で解析し、Ｑuantity One（Bio-Rad）を使用して定量した。
【０１５８】
図２０のパネルＡは、トランスフェクトされたｔｃ−ＤＮＡ ＡＯＮ ＤＭ１（ＣＡＧ７）の量の増加とともに突然変異ＤＭＰＫのレベルが減少したことを示す。重要なことに、野生型ＤＭＰＫのレベルは変化しなかった。１８Ｓ ＲＮＡをローディングコントロールとして使用した。パネルＢは、パネルＡから得られたノーザンブロットの定量プロットである。定量は、突然変異ＤＭＰＫの野生型ＤＭＰＫに対するバンド強度比を測定することにより行った。
【０１５９】
実施例１０
ＣＵＧ反復配列を対象とするｔｃ−ＤＮＡが、ＤＭ１マウスにおける突然変異ＤＭＰＫのｍＲＮＡの発現を減少させる
本実施例は、ｔｃ−ＤＮＡ ＡＯＮ ＤＭ１（ＣＡＧ７）が、ＤＭ１マウスのＴＡ筋肉で発現される７００ＣＵＧ反復配列を有する突然変異ヒトＤＭＰＫのｍＲＮＡのレベルを効果的に減少させることを示す。
【０１６０】
７００ＣＵＧ反復配列を有するヒトＤＭＰＫのｍＲＮＡを発現するＤＭ１マウスのＴＡ筋肉に、増加量のｔｃ−ＤＮＡ ＡＯＮ ＤＭ１（ＣＡＧ７）を注射した。１週間後、TRIzol試薬（Invitrogen）を使用して、トータルＲＮＡを抽出した。ヒトＤＭＰＫ及びマウスＤＭＰＫのｍＲＮＡをノーザンブロットにより検出した。簡単に述べると、８〜１０μgのトータルＲＮＡを、０．６６Ｍホルムアルデヒドを含有する１．３％アガロースＭＯＰＳゲルで分離し、１０×ＳＳＣを用いて毛細管輸送により、Ｈｙｂｏｎｄ−Ｎ＋膜（Amersham Pharmacia Biotech）に転写した。ブロットを、ランダムプライムド３２Ｐ−標識（ＤＭＰＫ ｃＤＮＡのBgl II-Sac Iフラグメント）プローブを用いて、ハイブリダイゼーションバッファー（２％ＳＤＳ、１０％硫酸デキストラン、１×ＳＳＰＥ、１００μg/mlサケ精子ＤＮＡ、２％Denhart's）中、６８℃で一晩ハイブリダイズした。シグナルを、ホスホイメージャー（Molecular Imager FX、Bio-Rad）で解析し、Ｑuantity One（Bio-Rad）を使用して定量した。
【０１６１】
図２１のパネルＡ及びＣは、トランスフェクトされたｔｃ−ＤＮＡ ＡＯＮ ＤＭ１（ＣＡＧ７）の量の増加とともに突然変異ヒトＤＭＰＫのレベルが減少したことを示す。パネルＢ及びＤは、それぞれ、パネルＡ及びＣから得られたノーザンブロットの定量プロットである。定量は、突然変異ヒトＤＭＰＫの野生型マウスＤＭＰＫに対するバンド強度比を測定することにより行った。
【０１６２】
本開示を、その様々な実施態様の各々で記載しているが、それに対する特定の変更を、前述の説明に記載するような、そして、下記の特許請求の範囲でさらに具体化されるような本開示の真の精神及び範囲から逸脱することなく、当業者が実施及び達成することができることが予想される。本開示は、本明細書に記載の特定の実施態様により制限されるものではない。実際、本明細書に記載される変更に加え本開示の様々な変更は、前述の説明及び添付の図から当業者には明らかになるであろう。このような改変は、添付の特許請求の範囲内であることが意図される。さらに、全ての値が概算値であり、説明のために提供されることが理解される。
【０１６３】
本明細書で参照される米国特許、米国公開特許公報、米国特許出願、外国特許、外国特許出願、非特許公報、図、表及びウェブサイトの全ては、参照することによりその全体が、本明細書に明示的に組み込まれる。
【０１６４】
【表１】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
１０〜１８トリシクロヌクレオチドを含有する、ジストロフィンプレ−ｍＲＮＡのプロセッシング過程におけるエクソンのスキッピングを促進するためのトリシクロ−ＤＮＡアンチセンスオリゴヌクレオチド（ｔｃ−ＤＮＡ ＡＯＮ）であって、前記ｔｃ−ＤＮＡ ＡＯＮの８〜１６又は６〜１４ヌクレオチドが、ジストロフィンプレ−ｍＲＮＡのイントロンスプライスドナー部位に相補的であり、前記ｔｃ−ＤＮＡ ＡＯＮの２〜８ヌクレオチドが、ジストロフィンプレ−ｍＲＮＡのエクソン領域に相補的であり、そして、前記イントロンスプライスドナー部位が、前記エクソン領域の５’側に隣接している、ｔｃ−ＤＮＡ ＡＯＮ。
【請求項２】
前記ｔｃ−ＤＮＡ ＡＯＮが、（ｉ）１２〜１６ヌクレオチド；（ｉｉ）１３〜１５ヌクレオチド；及び（ｉｉｉ）１５ヌクレオチドからなる群より選択される長さを有する、請求項１に記載のｔｃ−ＤＮＡ ＡＯＮ。
【請求項３】
前記ｔｃ−ＤＮＡ ＡＯＮが、前記イントロンスプライスドナー部位に相補的である６〜１４ヌクレオチドを含む、請求項１に記載のｔｃ−ＤＮＡ ＡＯＮ。
【請求項４】
前記ｔｃ−ＤＮＡ ＡＯＮが、前記エクソン領域に相補的である２〜５ヌクレオチドを含む、請求項１に記載のｔｃ−ＤＮＡ ＡＯＮ。
【請求項５】
前記ジストロフィンプレ−ｍＲＮＡのプロセッシング過程においてスキッピングされるエクソンが、エクソン２３又はエクソン５１である、請求項１に記載のｔｃ−ＤＮＡ ＡＯＮ。
【請求項６】
スキッピングされるエクソンがエクソン２３である場合、ヌクレオチド配列５’−ＡＡＣＣＴＣＧＧＣＴＴＡＣＣＴ−３’（配列番号１）を含むか、あるいは、Ｍ２３Ｄ（＋０２−１３）（配列番号１）であり、そして、スキッピングされるエクソンがエクソン５１である場合、５’−ＡＧＡＡＡＴＧＣＣＡＴＣＴＴＣ−３’（配列番号２）、５’−ＡＡＡＴＧＣＣＡＴＣＴＴＣＣＴ−３’（配列番号３）及び５’−ＴＧＣＣＡＴＣＴＴＣＣＴＴＧＡ−３’（配列番号４）からなる群より選択されるヌクレオチド配列を含むか、あるいは、Ｈ５１（＋６８＋８２）（配列番号２）、Ｈ５１（＋７０＋８４）（配列番号３）又はＨ５１（＋７３＋８７）（配列番号４）である、請求項５に記載のｔｃ−ＤＮＡ ＡＯＮ。
【請求項７】
１０〜１８トリシクロヌクレオチドを含有する、ＳＭＮ２プレ−ｍＲＮＡのプロセッシング過程における異常エクソンのインクルージョンを促進するためのトリシクロ−ＤＮＡアンチセンスオリゴヌクレオチド（ｔｃ−ＤＮＡ ＡＯＮ）であって、前記ｔｃ−ＤＮＡ ＡＯＮが、ＳＭＮ２プレ−ｍＲＮＡのイントロンサイレンサー配列（ＩＳＳ）に相補的である、ｔｃ−ＤＮＡ ＡＯＮ。
【請求項８】
前記ｔｃ−ＤＮＡ ＡＯＮが、（ｉ）１２〜１６ヌクレオチド；（ｉｉ）１３〜１５ヌクレオチド；及び（ｉｉｉ）１５ヌクレオチドからなる群より選択される長さを有する、請求項７に記載のｔｃ−ＤＮＡ ＡＯＮ。
【請求項９】
前記ＳＭＮ２プレ−ｍＲＮＡにおける前記異常エクソンがエクソン７であり、そして、前記イントロンサイレンサー配列がＩＳＳ−Ｎ１である、請求項７に記載のｔｃ−ＤＮＡ ＡＯＮ。
【請求項１０】
前記ｔｃ−ＤＮＡ ＡＯＮが、ヌクレオチド配列５’−ＣＵＵＵＣＡＵＡＡＵＧＣＵＧＧ−３’（配列番号５）を含むか、あるいは、ＳＭＮ２ｉ７（１０；２５）（配列番号５）である、請求項９に記載のｔｃ−ＤＮＡ ＡＯＮ。
【請求項１１】
１０〜１８トリシクロヌクレオチドからなる、ＳＭＮ２プレ−ｍＲＮＡのプロセッシング過程における異常エクソンのインクルージョンを促進するためのトリシクロ−ＤＮＡアンチセンスオリゴヌクレオチド（ｔｃ−ＤＮＡ ＡＯＮ）であって、前記ｔｃ−ＤＮＡ ＡＯＮが、ＳＭＮ２プレ−ｍＲＮＡの末端ステムループ（ＴＳＬ）に相補的である、ｔｃ−ＤＮＡ ＡＯＮ。
【請求項１２】
前記ｔｃ−ＤＮＡ ＡＯＮが、（ｉ）１２〜１６ヌクレオチド；（ｉｉ）１３〜１５ヌクレオチド；及び（ｉｉｉ）１３ヌクレオチドからなる群より選択される長さを有する、請求項１１に記載のｔｃ−ＤＮＡ ＡＯＮ。
【請求項１３】
前記ＳＭＮ２プレ−ｍＲＮＡにおける前記異常エクソンがエクソン７であり、そして、前記末端ステムループがＴＳＬ２である、請求項１１に記載のｔｃ−ＤＮＡ ＡＯＮ。
【請求項１４】
前記ｔｃ−ＤＮＡ ＡＯＮが、ヌクレオチド配列５’−ＵＵＡＡＵＵＵＡＡＧＧＡＡ−３’（配列番号６）を含むか、あるいは、ＳＭＮ２ｅ７（３９；５１）（配列番号６）である、請求項１３に記載のｔｃ−ＤＮＡ ＡＯＮ。
【請求項１５】
ジストロフィンプレ−ｍＲＮＡのプロセッシング過程におけるエクソンのスキッピングを促進するための組成物であって、
（ａ）１０〜１８トリシクロヌクレオチドを含有するトリシクロ−ＤＮＡアンチセンスオリゴヌクレオチド（ｔｃ−ＤＮＡ ＡＯＮ）であって、前記ｔｃ−ＤＮＡ ＡＯＮの８〜１６ヌクレオチドが、ジストロフィンプレ−ｍＲＮＡのイントロンスプライスドナー部位に相補的であり、前記ｔｃ−ＤＮＡ ＡＯＮの２〜８ヌクレオチドが、ジストロフィンプレ−ｍＲＮＡのエクソン領域に相補的であり、そして、前記エクソン領域が、前記イントロンスプライスドナー部位の３’側に隣接している、ｔｃ−ＤＮＡ ＡＯＮ；及び
（ｂ）細胞デリバリー剤
を含む組成物。
【請求項１６】
ＳＭＮ２プレ−ｍＲＮＡのプロセッシング過程における異常エクソンのインクルージョンを促進するための組成物であって、
（ａ）１０〜１８トリシクロヌクレオチドを含有するトリシクロ−ＤＮＡアンチセンスオリゴヌクレオチド（ｔｃ−ＤＮＡ ＡＯＮ）であって、前記ｔｃ−ＤＮＡ ＡＯＮが、ＳＭＮ２プレ−ｍＲＮＡのイントロンサイレンサー配列（ＩＳＳ）に相補的である、ｔｃ−ＤＮＡ ＡＯＮ；及び
（ｂ）細胞デリバリー剤
を含む組成物。
【請求項１７】
ＳＭＮ２プレ−ｍＲＮＡのプロセッシング過程における異常エクソンのインクルージョンを促進するための組成物であって、
（ａ）１０〜１８トリシクロヌクレオチドを含有するトリシクロ−ＤＮＡアンチセンスオリゴヌクレオチド（ｔｃ−ＤＮＡ ＡＯＮ）であって、前記ｔｃ−ＤＮＡ ＡＯＮが、ＳＭＮ２プレ−ｍＲＮＡの末端ステムループ（ＴＳＬ）に相補的である、ｔｃ−ＤＮＡ ＡＯＮ；及び
（ｂ）細胞デリバリー剤
を含む組成物。
【請求項１８】
ジストロフィンプレ−ｍＲＮＡを発現する細胞を、１０〜１８トリシクロヌクレオチドを含有するトリシクロ−ＤＮＡアンチセンスオリゴヌクレオチド（ｔｃ−ＤＮＡ ＡＯＮ）と接触させる工程を含む、ジストロフィンｍＲＮＡから突然変異エクソンを除去するための方法であって、前記ｔｃ−ＤＮＡ ＡＯＮの８〜１６ヌクレオチドが、ジストロフィンプレ−ｍＲＮＡのイントロンスプライスドナー部位に相補的であり、前記ｔｃ−ＤＮＡ ＡＯＮの２〜８ヌクレオチドが、ジストロフィンプレ−ｍＲＮＡのエクソン領域に相補的であり、そして、前記エクソン領域が、前記イントロンスプライスドナー部位の３’側に隣接している、方法。
【請求項１９】
前記ｔｃ−ＤＮＡ ＡＯＮが、（ｉ）１２〜１６ヌクレオチド；（ｉｉ）１３〜１５ヌクレオチド；及び（ｉｉｉ）１５ヌクレオチドからなる群より選択される長さを有する、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
前記ジストロフィンプレ−ｍＲＮＡのプロセッシング過程においてスキッピングされるエクソンがエクソン２３である、請求項１８に記載の方法。
【請求項２１】
前記ｔｃ−ＤＮＡ ＡＯＮが、ヌクレオチド配列５’−ＡＡＣＣＴＣＧＧＣＴＴＡＣＣＴ−３’（配列番号１）を含むか、あるいは、Ｍ２３Ｄ（＋０２−１３）（配列番号１）である、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
前記ジストロフィンプレ−ｍＲＮＡのプロセッシング過程においてスキッピングされる前記エクソンがエクソン５１である、請求項１８に記載の方法。
【請求項２３】
前記ｔｃ−ＤＮＡ ＡＯＮが、５’−ＡＧＡＡＡＴＧＣＣＡＴＣＴＴＣ−３’（配列番号２）、５’−ＡＡＡＴＧＣＣＡＴＣＴＴＣＣＴ−３’（配列番号３）及び５’−ＴＧＣＣＡＴＣＴＴＣＣＴＴＧＡ−３’（配列番号４）からなる群より選択されるヌクレオチド配列を含むか、あるいは、Ｈ５１（＋６８＋８２）（配列番号２）、Ｈ５１（＋７０＋８４）（配列番号３）又はＨ５１（＋７３＋８７）（配列番号４）である、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
ＳＭＮ２プレ−ｍＲＮＡを発現している細胞を、１１〜１８ヌクレオチドを含有するｔｃ−ＤＮＡ ＡＯＮと接触させる工程を含む、ＳＭＮ２のｍＲＮＡ内における異常エクソンをインクルーディングするための方法であって、前記ｔｃ−ＤＮＡ ＡＯＮが、ＳＭＮ２プレ−ｍＲＮＡのイントロンサイレンサー配列（ＩＳＳ）に相補的である、方法。
【請求項２５】
前記ｔｃ−ＤＮＡ ＡＯＮが、（ｉ）１２〜１６ヌクレオチド；（ｉｉ）１３〜１５ヌクレオチド；及び（ｉｉｉ）１５ヌクレオチドからなる群より選択される長さを有する、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
前記ＳＭＮ２プレ−ｍＲＮＡにおける前記異常エクソンがエクソン７である、請求項２４に記載の方法。
【請求項２７】
前記イントロンサイレンサー配列がＩＳＳ−Ｎ１である、請求項２４に記載の方法。
【請求項２８】
前記ｔｃ−ＤＮＡ ＡＯＮが、ヌクレオチド配列５’−ＣＵＵＵＣＡＵＡＡＵＧＣＵＧＧ−３’（配列番号５）を含むか、あるいは、ＳＭＮ２ｉ７（１０；２５）（配列番号５）である、請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
ＳＭＮ２プレ−ｍＲＮＡを発現している細胞を、１１〜１８ヌクレオチドを含有するｔｃ−ＤＮＡ ＡＯＮと接触させる工程を含む、ＳＭＮ２のｍＲＮＡ内における異常エクソンをインクルーディングするための方法であって、前記ｔｃ−ＤＮＡ ＡＯＮが、ＳＭＮ２プレ−ｍＲＮＡの末端ステムループ（ＴＳＬ）に相補的である、方法。
【請求項３０】
前記ｔｃ−ＤＮＡ ＡＯＮが、（ｉ）１２〜１６ヌクレオチド；（ｉｉ）１３〜１５ヌクレオチド；及び（ｉｉｉ）１３ヌクレオチドからなる群より選択される長さを有する、請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
前記ＳＭＮ２プレ−ｍＲＮＡにおける前記異常エクソンがエクソン７である、請求項２９に記載の方法。
【請求項３２】
前記末端ステムループがＴＳＬ２である、請求項２９に記載の方法。
【請求項３３】
前記ｔｃ−ＤＮＡ ＡＯＮが、ヌクレオチド配列５’−ＵＵＡＡＵＵＵＡＡＧＧＡＡ−３’（配列番号６）を含むか、あるいは、ＳＭＮ２ｅ７（３９；５１）（配列番号６）である、請求項３２に記載の方法。
【請求項３４】
患者にトリシクロ−ＤＮＡ（ｔｃ−ＤＮＡ）アンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＯＮ）を投与する工程を含む、前記患者におけるデュシェンヌ型筋ジストロフィー（ＤＭＤ）を処置するための方法であって、
前記ｔｃ−ＤＮＡ ＡＯＮが、ジストロフィンプレ−ｍＲＮＡのイントロン−エクソン接合部に相補的であるヌクレオチド配列を含み；
前記イントロン−エクソン接合部が、エクソンの５’側にあるイントロンスプライスドナー部位を含み；
前記エクソンが、野生型ヌクレオチド配列を有するエクソンと比較して、ナンセンス突然変異又はフレームシフト突然変異を含み；
前記ｔｃ−ＤＮＡ ＡＯＮが、前記ジストロフィンプレ−ｍＲＮＡの成熟ｍＲＮＡへのプロセッシング過程における前記エクソンのスキッピングを促進する、方法。
【請求項３５】
前記ｔｃ−ＤＮＡ ＡＯＮが、（ｉ）１１〜１８ヌクレオチド又は（ｉｉ）１５ヌクレオチドからなる群より選択される長さを有する、請求項３４に記載の方法。
【請求項３６】
前記トリシクロ−ＤＮＡオリゴヌクレオチドが、イントロン内のスプライスドナー部位に相補的である６〜１０ヌクレオチドを含む、請求項３４に記載の方法。
【請求項３７】
前記トリシクロ−ＤＮＡオリゴヌクレオチドが、前記エクソン内の５’ヌクレオチドに相補的である６〜１０ヌクレオチドを含む、請求項３４に記載の方法。
【請求項３８】
前記エクソンにおける前記突然変異が、ナンセンス突然変異又はフレームシフト突然変異である、請求項３４に記載の方法。
【請求項３９】
患者にトリシクロ−ＤＮＡオリゴヌクレオチドを投与する工程を含む、前記患者におけるデュシェンヌ型筋ジストロフィーを処置するための方法であって、
前記トリシクロ−ＤＮＡオリゴヌクレオチドが、ジストロフィンプレ−ｍＲＮＡ内のイントロン−エクソン接合部に相補的であるヌクレオチド配列を含み、
前記イントロン−エクソン接合部が、前記ジストロフィンプレ−ｍＲＮＡのイントロン５１内にスプライスドナー部位、そして、隣接するエクソン５１内に５’ヌクレオチドを含み、
前記ジストロフィンプレ−ｍＲＮＡが、前記エクソン５１において突然変異を含み、そして、
前記トリシクロ−ＤＮＡオリゴヌクレオチドが、前記エクソン５１のスキッピングに介在することができる、方法。
【請求項４０】
前記イントロン−エクソン接合部が、配列番号１の配列を含む、請求項３９に記載の方法。
【請求項４１】
前記トリシクロ−ＤＮＡオリゴヌクレオチドが、１２〜２０ヌクレオチドを含む、請求項３９に記載の方法。
【請求項４２】
前記トリシクロ−ＤＮＡオリゴヌクレオチドが、１５ヌクレオチドである、請求項４１に記載の方法。
【請求項４３】
前記エクソン５１における前記突然変異が、ナンセンス突然変異又はフレームシフト突然変異である、請求項３９に記載の方法。
【請求項４４】
前記トリシクロ−ＤＮＡオリゴヌクレオチドが、配列番号２の配列を含む、請求項３９に記載の方法。
【請求項４５】
１２〜２１トリシクロヌクレオチドを含む、突然変異ＤＭ１のｍＲＮＡの破壊を促進するためのトリシクロ−ＤＮＡアンチセンスオリゴヌクレオチド（ｔｃ−ＤＮＡ ＡＯＮ）であって、前記ｔｃ−ＤＮＡ ＡＯＮが、１以上の３’ＣＵＧ増幅を含む突然変異ＤＭ１のｍＲＮＡに相補的であり、そして、前記ｔｃ−ＤＮＡ ＡＯＮが、前記ＤＭ１のｍＲＮＡのＲＮａｓｅＨ介在破壊を促進することができる、ｔｃ−ＤＮＡ ＡＯＮ。
【請求項４６】
前記ｔｃ−ＤＮＡ ＡＯＮが、ヌクレオチド配列５’−ＣＡＧ−３’（配列番号７）の４〜７の連続反復配列を含む、請求項４５に記載のｔｃ−ＤＮＡ ＡＯＮ。
【請求項４７】
前記ｔｃ−ＤＮＡ ＡＯＮが、ヌクレオチド配列５’−ＣＡＧＣＡＧＣＡＧＣＡＧＣＡＧ−３’（配列番号８）を含む、請求項４６に記載のｔｃ−ＤＮＡ ＡＯＮ。
【請求項４８】
前記ｔｃ−ＤＮＡ ＡＯＮが、ＤＭ１（ＣＡＧ５）（配列番号８）である、請求項４７に記載のｔｃ−ＤＮＡ ＡＯＮ。
【請求項４９】
前記ｔｃ−ＤＮＡ ＡＯＮが、ヌクレオチド配列５’−ＣＡＧＣＡＧＣＡＧＣＡＧＣＡＧＣＡＧＣＡＧ−３’（配列番号９）を含むか、あるいは、ＤＭ１（ＣＡＧ７）（配列番号９）である、請求項４６に記載のｔｃ−ＤＮＡ ＡＯＮ。
【請求項５０】
細胞を、１２〜２１トリシクロヌクレオチドを含むｔｃ−ＤＮＡ ＡＯＮと接触させる工程を含む、前記細胞における１以上の３’ＣＵＧ増幅を含むＤＭ１のｍＲＮＡを破壊するための方法であって、前記ｔｃ−ＤＮＡ ＡＯＮが、１以上の３’ＣＵＧ増幅を含む突然変異ＤＭ１のｍＲＮＡに相補的であり、そして、前記ｔｃ−ＤＮＡ ＡＯＮが、前記ＤＭ１のｍＲＮＡのＲＮａｓｅＨ介在破壊を促進することができる、方法。
【請求項５１】
患者に、１２〜２１トリシクロヌクレオチドを含むｔｃ−ＤＮＡ ＡＯＮを投与する工程を含む、前記患者におけるスタイナート筋緊張性ジストロフィーを処置するための方法であって、前記ｔｃ−ＤＮＡ ＡＯＮが、１以上の３’ＣＵＧ増幅を含む突然変異ＤＭ１のｍＲＮＡに相補的であり、そして、前記ｔｃ−ＤＮＡ ＡＯＮが、前記ＤＭ１のｍＲＮＡのＲＮａｓｅＨ介在破壊を促進することができる、方法。
【請求項５２】
対象に、ｔｃ−ＤＮＡアンチセンスオリゴヌクレオチドを投与することを含む、前記対象の中枢神経系の細胞における異常遺伝子発現を修正するための方法であって、前記ｔｃ−ＤＮＡアンチセンスオリゴヌクレオチドが、前記遺伝子によりコードされるＲＮＡの一部に相補的であり、そして、前記ｔｃ−ＤＮＡアンチセンスオリゴヌクレオチドが、前記異常発現を修正するのに十分な量で対象に末梢投与される、方法。
【請求項５３】
対象に、ｔｃ−ＤＮＡアンチセンスオリゴヌクレオチドを投与することを含む、前記対象の中枢神経系における異常遺伝子発現により引き起こされる遺伝子疾患を処置するための方法であって、前記ｔｃ−ＤＮＡアンチセンスオリゴヌクレオチドが、前記遺伝子によりコードされるＲＮＡの一部に相補的であり、そして、前記ｔｃ−ＤＮＡアンチセンスオリゴヌクレオチドが、前記異常発現を修正するのに有効な量で対象に末梢投与される、方法。
【請求項５４】
ｔｃ−ＤＮＡアンチセンスオリゴヌクレオチドを含む医薬組成物であって、前記ｔｃ−ＤＮＡアンチセンスオリゴヌクレオチドが、ヒト遺伝子によりコードされるＲＮＡの一部に相補的であり、そして、前記組成物が、薬学的に許容しうる賦形剤をさらに含む、医薬組成物。
【請求項５５】
対象の中枢神経系における異常遺伝子発現により引き起こされる遺伝子疾患の処置に使用するための、ｔｃ−ＤＮＡアンチセンスオリゴヌクレオチドを含む医薬組成物であって、前記ｔｃ−ＤＮＡアンチセンスオリゴヌクレオチドが、前記遺伝子によりコードされるＲＮＡの一部に相補的であり、そして、前記ｔｃ−ＤＮＡアンチセンスオリゴヌクレオチドが、前記異常発現を修正するのに有効な量で対象に末梢投与される、医薬組成物。
【請求項５６】
前記異常遺伝子発現が、神経筋障害又は筋骨格障害をもたらす、請求項５２に記載の方法。
【請求項５７】
前記疾患が神経筋障害又は筋骨格障害である、請求項５３に記載の方法。
【請求項５８】
神経筋疾患又は筋骨格疾患の処置に使用するためのｔｃ−ＤＮＡ ＡＯＮ。
【請求項５９】
神経筋疾患又は筋骨格疾患が遺伝子の変化により生じる、請求項５８に記載のｔｃ−ＤＮＡ ＡＯＮであって、前記変化が、
エクソンのインフレーム突然変異、
遺伝子の翻訳リーディングフレームを破壊する突然変異であって、ｔｃ−ＤＮＡが、リーディングフレームを修復するためにエクソンのスキッピングを促進する、突然変異；
前記遺伝子によりコードされるｍＲＮＡにおける異常エクソンのインクルージョンにより補完されうる有害突然変異であって、ｔｃ−ＤＮＡが、前記遺伝子によりコードされるプレ−ｍＲＮＡに存在するＩＳＳ又はＴＳＬに相補的であり、そして、異常エクソンのインクルージョンを促進する、突然変異、又は、
前記遺伝子によりコードされるｍＲＮＡにおいて有害な３’ＣＵＧ増幅を生じる突然変異である、ｔｃ−ＤＮＡ ＡＯＮ。
【請求項６０】
前記変化が、エクソンのインフレーム突然変異であり、前記エクソンのスキッピングを促進する、請求項５９に記載のｔｃ−ＤＮＡ ＡＯＮ。
【請求項６１】
前記変化が、遺伝子の翻訳リーディングフレームを破壊する突然変異であり、遺伝子のリーディングフレームを修復するためにエクソンのスキッピングを促進する、請求項５９に記載のｔｃ−ＤＮＡ ＡＯＮ。
【請求項６２】
前記変化が、前記遺伝子によりコードされるｍＲＮＡにおける異常エクソンのインクルージョンにより補完されうる有害突然変異であり、そして、ｔｃ−ＤＮＡ ＡＯＮが、（ｉ）前記遺伝子によりコードされるプレ−ｍＲＮＡに存在するＩＳＳ又はＴＳＬに相補的であり、そして、（ｉｉ）異常エクソンのインクルージョンを促進する、請求項５９に記載のｔｃ−ＤＮＡ ＡＯＮ。
【請求項６３】
前記変化が、前記遺伝子によりコードされるｍＲＮＡにおいて有害な３’ＣＵＧ増幅を生じる突然変異であり、そして、前記ｔｃ−ＤＮＡ ＡＯＮが、前記増幅を含有するｍＲＮＡを破壊する、請求項５９に記載のｔｃ−ＤＮＡ ＡＯＮ。
【請求項６４】
前記異常遺伝子発現が、
エクソンのインフレーム突然変異、
遺伝子の翻訳リーディングフレームを破壊する突然変異であって、ｔｃ−ＤＮＡが、リーディングフレームを修復するためにエクソンのスキッピングを促進する、突然変異；
前記遺伝子によりコードされるｍＲＮＡにおける異常エクソンのインクルージョンにより補完されうる有害突然変異であって、ｔｃ−ＤＮＡが、前記遺伝子によりコードされるプレ−ｍＲＮＡに存在するＩＳＳ又はＴＳＬに相補的であり、そして、異常エクソンのインクルージョンを促進する、突然変異、又は、
前記遺伝子によりコードされるｍＲＮＡにおいて有害な３’ＣＵＧ増幅の存在を生じる突然変異から引き起こされる、請求項５２〜５４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６５】
前記ｔｃ−ＤＮＡアンチセンスオリゴヌクレオチドが、請求項１〜１４及び４５〜４９のいずれか一項に記載されるとおりである、請求項５２若しくは５３に記載の方法又は請求項５８に記載の使用。
【請求項１】
１０〜１８トリシクロヌクレオチドを含有する、ジストロフィンプレ−ｍＲＮＡのプロセッシング過程におけるエクソンのスキッピングを促進するためのトリシクロ−ＤＮＡアンチセンスオリゴヌクレオチド（ｔｃ−ＤＮＡ ＡＯＮ）であって、前記ｔｃ−ＤＮＡ ＡＯＮの８〜１６又は６〜１４ヌクレオチドが、ジストロフィンプレ−ｍＲＮＡのイントロンスプライスドナー部位に相補的であり、前記ｔｃ−ＤＮＡ ＡＯＮの２〜８ヌクレオチドが、ジストロフィンプレ−ｍＲＮＡのエクソン領域に相補的であり、そして、前記イントロンスプライスドナー部位が、前記エクソン領域の５’側に隣接している、ｔｃ−ＤＮＡ ＡＯＮ。
【請求項２】
前記ｔｃ−ＤＮＡ ＡＯＮが、（ｉ）１２〜１６ヌクレオチド；（ｉｉ）１３〜１５ヌクレオチド；及び（ｉｉｉ）１５ヌクレオチドからなる群より選択される長さを有する、請求項１に記載のｔｃ−ＤＮＡ ＡＯＮ。
【請求項３】
前記ｔｃ−ＤＮＡ ＡＯＮが、前記イントロンスプライスドナー部位に相補的である６〜１４ヌクレオチドを含む、請求項１に記載のｔｃ−ＤＮＡ ＡＯＮ。
【請求項４】
前記ｔｃ−ＤＮＡ ＡＯＮが、前記エクソン領域に相補的である２〜５ヌクレオチドを含む、請求項１に記載のｔｃ−ＤＮＡ ＡＯＮ。
【請求項５】
前記ジストロフィンプレ−ｍＲＮＡのプロセッシング過程においてスキッピングされるエクソンが、エクソン２３又はエクソン５１である、請求項１に記載のｔｃ−ＤＮＡ ＡＯＮ。
【請求項６】
スキッピングされるエクソンがエクソン２３である場合、ヌクレオチド配列５’−ＡＡＣＣＴＣＧＧＣＴＴＡＣＣＴ−３’（配列番号１）を含むか、あるいは、Ｍ２３Ｄ（＋０２−１３）（配列番号１）であり、そして、スキッピングされるエクソンがエクソン５１である場合、５’−ＡＧＡＡＡＴＧＣＣＡＴＣＴＴＣ−３’（配列番号２）、５’−ＡＡＡＴＧＣＣＡＴＣＴＴＣＣＴ−３’（配列番号３）及び５’−ＴＧＣＣＡＴＣＴＴＣＣＴＴＧＡ−３’（配列番号４）からなる群より選択されるヌクレオチド配列を含むか、あるいは、Ｈ５１（＋６８＋８２）（配列番号２）、Ｈ５１（＋７０＋８４）（配列番号３）又はＨ５１（＋７３＋８７）（配列番号４）である、請求項５に記載のｔｃ−ＤＮＡ ＡＯＮ。
【請求項７】
１０〜１８トリシクロヌクレオチドを含有する、ＳＭＮ２プレ−ｍＲＮＡのプロセッシング過程における異常エクソンのインクルージョンを促進するためのトリシクロ−ＤＮＡアンチセンスオリゴヌクレオチド（ｔｃ−ＤＮＡ ＡＯＮ）であって、前記ｔｃ−ＤＮＡ ＡＯＮが、ＳＭＮ２プレ−ｍＲＮＡのイントロンサイレンサー配列（ＩＳＳ）に相補的である、ｔｃ−ＤＮＡ ＡＯＮ。
【請求項８】
前記ｔｃ−ＤＮＡ ＡＯＮが、（ｉ）１２〜１６ヌクレオチド；（ｉｉ）１３〜１５ヌクレオチド；及び（ｉｉｉ）１５ヌクレオチドからなる群より選択される長さを有する、請求項７に記載のｔｃ−ＤＮＡ ＡＯＮ。
【請求項９】
前記ＳＭＮ２プレ−ｍＲＮＡにおける前記異常エクソンがエクソン７であり、そして、前記イントロンサイレンサー配列がＩＳＳ−Ｎ１である、請求項７に記載のｔｃ−ＤＮＡ ＡＯＮ。
【請求項１０】
前記ｔｃ−ＤＮＡ ＡＯＮが、ヌクレオチド配列５’−ＣＵＵＵＣＡＵＡＡＵＧＣＵＧＧ−３’（配列番号５）を含むか、あるいは、ＳＭＮ２ｉ７（１０；２５）（配列番号５）である、請求項９に記載のｔｃ−ＤＮＡ ＡＯＮ。
【請求項１１】
１０〜１８トリシクロヌクレオチドからなる、ＳＭＮ２プレ−ｍＲＮＡのプロセッシング過程における異常エクソンのインクルージョンを促進するためのトリシクロ−ＤＮＡアンチセンスオリゴヌクレオチド（ｔｃ−ＤＮＡ ＡＯＮ）であって、前記ｔｃ−ＤＮＡ ＡＯＮが、ＳＭＮ２プレ−ｍＲＮＡの末端ステムループ（ＴＳＬ）に相補的である、ｔｃ−ＤＮＡ ＡＯＮ。
【請求項１２】
前記ｔｃ−ＤＮＡ ＡＯＮが、（ｉ）１２〜１６ヌクレオチド；（ｉｉ）１３〜１５ヌクレオチド；及び（ｉｉｉ）１３ヌクレオチドからなる群より選択される長さを有する、請求項１１に記載のｔｃ−ＤＮＡ ＡＯＮ。
【請求項１３】
前記ＳＭＮ２プレ−ｍＲＮＡにおける前記異常エクソンがエクソン７であり、そして、前記末端ステムループがＴＳＬ２である、請求項１１に記載のｔｃ−ＤＮＡ ＡＯＮ。
【請求項１４】
前記ｔｃ−ＤＮＡ ＡＯＮが、ヌクレオチド配列５’−ＵＵＡＡＵＵＵＡＡＧＧＡＡ−３’（配列番号６）を含むか、あるいは、ＳＭＮ２ｅ７（３９；５１）（配列番号６）である、請求項１３に記載のｔｃ−ＤＮＡ ＡＯＮ。
【請求項１５】
ジストロフィンプレ−ｍＲＮＡのプロセッシング過程におけるエクソンのスキッピングを促進するための組成物であって、
（ａ）１０〜１８トリシクロヌクレオチドを含有するトリシクロ−ＤＮＡアンチセンスオリゴヌクレオチド（ｔｃ−ＤＮＡ ＡＯＮ）であって、前記ｔｃ−ＤＮＡ ＡＯＮの８〜１６ヌクレオチドが、ジストロフィンプレ−ｍＲＮＡのイントロンスプライスドナー部位に相補的であり、前記ｔｃ−ＤＮＡ ＡＯＮの２〜８ヌクレオチドが、ジストロフィンプレ−ｍＲＮＡのエクソン領域に相補的であり、そして、前記エクソン領域が、前記イントロンスプライスドナー部位の３’側に隣接している、ｔｃ−ＤＮＡ ＡＯＮ；及び
（ｂ）細胞デリバリー剤
を含む組成物。
【請求項１６】
ＳＭＮ２プレ−ｍＲＮＡのプロセッシング過程における異常エクソンのインクルージョンを促進するための組成物であって、
（ａ）１０〜１８トリシクロヌクレオチドを含有するトリシクロ−ＤＮＡアンチセンスオリゴヌクレオチド（ｔｃ−ＤＮＡ ＡＯＮ）であって、前記ｔｃ−ＤＮＡ ＡＯＮが、ＳＭＮ２プレ−ｍＲＮＡのイントロンサイレンサー配列（ＩＳＳ）に相補的である、ｔｃ−ＤＮＡ ＡＯＮ；及び
（ｂ）細胞デリバリー剤
を含む組成物。
【請求項１７】
ＳＭＮ２プレ−ｍＲＮＡのプロセッシング過程における異常エクソンのインクルージョンを促進するための組成物であって、
（ａ）１０〜１８トリシクロヌクレオチドを含有するトリシクロ−ＤＮＡアンチセンスオリゴヌクレオチド（ｔｃ−ＤＮＡ ＡＯＮ）であって、前記ｔｃ−ＤＮＡ ＡＯＮが、ＳＭＮ２プレ−ｍＲＮＡの末端ステムループ（ＴＳＬ）に相補的である、ｔｃ−ＤＮＡ ＡＯＮ；及び
（ｂ）細胞デリバリー剤
を含む組成物。
【請求項１８】
ジストロフィンプレ−ｍＲＮＡを発現する細胞を、１０〜１８トリシクロヌクレオチドを含有するトリシクロ−ＤＮＡアンチセンスオリゴヌクレオチド（ｔｃ−ＤＮＡ ＡＯＮ）と接触させる工程を含む、ジストロフィンｍＲＮＡから突然変異エクソンを除去するための方法であって、前記ｔｃ−ＤＮＡ ＡＯＮの８〜１６ヌクレオチドが、ジストロフィンプレ−ｍＲＮＡのイントロンスプライスドナー部位に相補的であり、前記ｔｃ−ＤＮＡ ＡＯＮの２〜８ヌクレオチドが、ジストロフィンプレ−ｍＲＮＡのエクソン領域に相補的であり、そして、前記エクソン領域が、前記イントロンスプライスドナー部位の３’側に隣接している、方法。
【請求項１９】
前記ｔｃ−ＤＮＡ ＡＯＮが、（ｉ）１２〜１６ヌクレオチド；（ｉｉ）１３〜１５ヌクレオチド；及び（ｉｉｉ）１５ヌクレオチドからなる群より選択される長さを有する、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
前記ジストロフィンプレ−ｍＲＮＡのプロセッシング過程においてスキッピングされるエクソンがエクソン２３である、請求項１８に記載の方法。
【請求項２１】
前記ｔｃ−ＤＮＡ ＡＯＮが、ヌクレオチド配列５’−ＡＡＣＣＴＣＧＧＣＴＴＡＣＣＴ−３’（配列番号１）を含むか、あるいは、Ｍ２３Ｄ（＋０２−１３）（配列番号１）である、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
前記ジストロフィンプレ−ｍＲＮＡのプロセッシング過程においてスキッピングされる前記エクソンがエクソン５１である、請求項１８に記載の方法。
【請求項２３】
前記ｔｃ−ＤＮＡ ＡＯＮが、５’−ＡＧＡＡＡＴＧＣＣＡＴＣＴＴＣ−３’（配列番号２）、５’−ＡＡＡＴＧＣＣＡＴＣＴＴＣＣＴ−３’（配列番号３）及び５’−ＴＧＣＣＡＴＣＴＴＣＣＴＴＧＡ−３’（配列番号４）からなる群より選択されるヌクレオチド配列を含むか、あるいは、Ｈ５１（＋６８＋８２）（配列番号２）、Ｈ５１（＋７０＋８４）（配列番号３）又はＨ５１（＋７３＋８７）（配列番号４）である、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
ＳＭＮ２プレ−ｍＲＮＡを発現している細胞を、１１〜１８ヌクレオチドを含有するｔｃ−ＤＮＡ ＡＯＮと接触させる工程を含む、ＳＭＮ２のｍＲＮＡ内における異常エクソンをインクルーディングするための方法であって、前記ｔｃ−ＤＮＡ ＡＯＮが、ＳＭＮ２プレ−ｍＲＮＡのイントロンサイレンサー配列（ＩＳＳ）に相補的である、方法。
【請求項２５】
前記ｔｃ−ＤＮＡ ＡＯＮが、（ｉ）１２〜１６ヌクレオチド；（ｉｉ）１３〜１５ヌクレオチド；及び（ｉｉｉ）１５ヌクレオチドからなる群より選択される長さを有する、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
前記ＳＭＮ２プレ−ｍＲＮＡにおける前記異常エクソンがエクソン７である、請求項２４に記載の方法。
【請求項２７】
前記イントロンサイレンサー配列がＩＳＳ−Ｎ１である、請求項２４に記載の方法。
【請求項２８】
前記ｔｃ−ＤＮＡ ＡＯＮが、ヌクレオチド配列５’−ＣＵＵＵＣＡＵＡＡＵＧＣＵＧＧ−３’（配列番号５）を含むか、あるいは、ＳＭＮ２ｉ７（１０；２５）（配列番号５）である、請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
ＳＭＮ２プレ−ｍＲＮＡを発現している細胞を、１１〜１８ヌクレオチドを含有するｔｃ−ＤＮＡ ＡＯＮと接触させる工程を含む、ＳＭＮ２のｍＲＮＡ内における異常エクソンをインクルーディングするための方法であって、前記ｔｃ−ＤＮＡ ＡＯＮが、ＳＭＮ２プレ−ｍＲＮＡの末端ステムループ（ＴＳＬ）に相補的である、方法。
【請求項３０】
前記ｔｃ−ＤＮＡ ＡＯＮが、（ｉ）１２〜１６ヌクレオチド；（ｉｉ）１３〜１５ヌクレオチド；及び（ｉｉｉ）１３ヌクレオチドからなる群より選択される長さを有する、請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
前記ＳＭＮ２プレ−ｍＲＮＡにおける前記異常エクソンがエクソン７である、請求項２９に記載の方法。
【請求項３２】
前記末端ステムループがＴＳＬ２である、請求項２９に記載の方法。
【請求項３３】
前記ｔｃ−ＤＮＡ ＡＯＮが、ヌクレオチド配列５’−ＵＵＡＡＵＵＵＡＡＧＧＡＡ−３’（配列番号６）を含むか、あるいは、ＳＭＮ２ｅ７（３９；５１）（配列番号６）である、請求項３２に記載の方法。
【請求項３４】
患者にトリシクロ−ＤＮＡ（ｔｃ−ＤＮＡ）アンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＯＮ）を投与する工程を含む、前記患者におけるデュシェンヌ型筋ジストロフィー（ＤＭＤ）を処置するための方法であって、
前記ｔｃ−ＤＮＡ ＡＯＮが、ジストロフィンプレ−ｍＲＮＡのイントロン−エクソン接合部に相補的であるヌクレオチド配列を含み；
前記イントロン−エクソン接合部が、エクソンの５’側にあるイントロンスプライスドナー部位を含み；
前記エクソンが、野生型ヌクレオチド配列を有するエクソンと比較して、ナンセンス突然変異又はフレームシフト突然変異を含み；
前記ｔｃ−ＤＮＡ ＡＯＮが、前記ジストロフィンプレ−ｍＲＮＡの成熟ｍＲＮＡへのプロセッシング過程における前記エクソンのスキッピングを促進する、方法。
【請求項３５】
前記ｔｃ−ＤＮＡ ＡＯＮが、（ｉ）１１〜１８ヌクレオチド又は（ｉｉ）１５ヌクレオチドからなる群より選択される長さを有する、請求項３４に記載の方法。
【請求項３６】
前記トリシクロ−ＤＮＡオリゴヌクレオチドが、イントロン内のスプライスドナー部位に相補的である６〜１０ヌクレオチドを含む、請求項３４に記載の方法。
【請求項３７】
前記トリシクロ−ＤＮＡオリゴヌクレオチドが、前記エクソン内の５’ヌクレオチドに相補的である６〜１０ヌクレオチドを含む、請求項３４に記載の方法。
【請求項３８】
前記エクソンにおける前記突然変異が、ナンセンス突然変異又はフレームシフト突然変異である、請求項３４に記載の方法。
【請求項３９】
患者にトリシクロ−ＤＮＡオリゴヌクレオチドを投与する工程を含む、前記患者におけるデュシェンヌ型筋ジストロフィーを処置するための方法であって、
前記トリシクロ−ＤＮＡオリゴヌクレオチドが、ジストロフィンプレ−ｍＲＮＡ内のイントロン−エクソン接合部に相補的であるヌクレオチド配列を含み、
前記イントロン−エクソン接合部が、前記ジストロフィンプレ−ｍＲＮＡのイントロン５１内にスプライスドナー部位、そして、隣接するエクソン５１内に５’ヌクレオチドを含み、
前記ジストロフィンプレ−ｍＲＮＡが、前記エクソン５１において突然変異を含み、そして、
前記トリシクロ−ＤＮＡオリゴヌクレオチドが、前記エクソン５１のスキッピングに介在することができる、方法。
【請求項４０】
前記イントロン−エクソン接合部が、配列番号１の配列を含む、請求項３９に記載の方法。
【請求項４１】
前記トリシクロ−ＤＮＡオリゴヌクレオチドが、１２〜２０ヌクレオチドを含む、請求項３９に記載の方法。
【請求項４２】
前記トリシクロ−ＤＮＡオリゴヌクレオチドが、１５ヌクレオチドである、請求項４１に記載の方法。
【請求項４３】
前記エクソン５１における前記突然変異が、ナンセンス突然変異又はフレームシフト突然変異である、請求項３９に記載の方法。
【請求項４４】
前記トリシクロ−ＤＮＡオリゴヌクレオチドが、配列番号２の配列を含む、請求項３９に記載の方法。
【請求項４５】
１２〜２１トリシクロヌクレオチドを含む、突然変異ＤＭ１のｍＲＮＡの破壊を促進するためのトリシクロ−ＤＮＡアンチセンスオリゴヌクレオチド（ｔｃ−ＤＮＡ ＡＯＮ）であって、前記ｔｃ−ＤＮＡ ＡＯＮが、１以上の３’ＣＵＧ増幅を含む突然変異ＤＭ１のｍＲＮＡに相補的であり、そして、前記ｔｃ−ＤＮＡ ＡＯＮが、前記ＤＭ１のｍＲＮＡのＲＮａｓｅＨ介在破壊を促進することができる、ｔｃ−ＤＮＡ ＡＯＮ。
【請求項４６】
前記ｔｃ−ＤＮＡ ＡＯＮが、ヌクレオチド配列５’−ＣＡＧ−３’（配列番号７）の４〜７の連続反復配列を含む、請求項４５に記載のｔｃ−ＤＮＡ ＡＯＮ。
【請求項４７】
前記ｔｃ−ＤＮＡ ＡＯＮが、ヌクレオチド配列５’−ＣＡＧＣＡＧＣＡＧＣＡＧＣＡＧ−３’（配列番号８）を含む、請求項４６に記載のｔｃ−ＤＮＡ ＡＯＮ。
【請求項４８】
前記ｔｃ−ＤＮＡ ＡＯＮが、ＤＭ１（ＣＡＧ５）（配列番号８）である、請求項４７に記載のｔｃ−ＤＮＡ ＡＯＮ。
【請求項４９】
前記ｔｃ−ＤＮＡ ＡＯＮが、ヌクレオチド配列５’−ＣＡＧＣＡＧＣＡＧＣＡＧＣＡＧＣＡＧＣＡＧ−３’（配列番号９）を含むか、あるいは、ＤＭ１（ＣＡＧ７）（配列番号９）である、請求項４６に記載のｔｃ−ＤＮＡ ＡＯＮ。
【請求項５０】
細胞を、１２〜２１トリシクロヌクレオチドを含むｔｃ−ＤＮＡ ＡＯＮと接触させる工程を含む、前記細胞における１以上の３’ＣＵＧ増幅を含むＤＭ１のｍＲＮＡを破壊するための方法であって、前記ｔｃ−ＤＮＡ ＡＯＮが、１以上の３’ＣＵＧ増幅を含む突然変異ＤＭ１のｍＲＮＡに相補的であり、そして、前記ｔｃ−ＤＮＡ ＡＯＮが、前記ＤＭ１のｍＲＮＡのＲＮａｓｅＨ介在破壊を促進することができる、方法。
【請求項５１】
患者に、１２〜２１トリシクロヌクレオチドを含むｔｃ−ＤＮＡ ＡＯＮを投与する工程を含む、前記患者におけるスタイナート筋緊張性ジストロフィーを処置するための方法であって、前記ｔｃ−ＤＮＡ ＡＯＮが、１以上の３’ＣＵＧ増幅を含む突然変異ＤＭ１のｍＲＮＡに相補的であり、そして、前記ｔｃ−ＤＮＡ ＡＯＮが、前記ＤＭ１のｍＲＮＡのＲＮａｓｅＨ介在破壊を促進することができる、方法。
【請求項５２】
対象に、ｔｃ−ＤＮＡアンチセンスオリゴヌクレオチドを投与することを含む、前記対象の中枢神経系の細胞における異常遺伝子発現を修正するための方法であって、前記ｔｃ−ＤＮＡアンチセンスオリゴヌクレオチドが、前記遺伝子によりコードされるＲＮＡの一部に相補的であり、そして、前記ｔｃ−ＤＮＡアンチセンスオリゴヌクレオチドが、前記異常発現を修正するのに十分な量で対象に末梢投与される、方法。
【請求項５３】
対象に、ｔｃ−ＤＮＡアンチセンスオリゴヌクレオチドを投与することを含む、前記対象の中枢神経系における異常遺伝子発現により引き起こされる遺伝子疾患を処置するための方法であって、前記ｔｃ−ＤＮＡアンチセンスオリゴヌクレオチドが、前記遺伝子によりコードされるＲＮＡの一部に相補的であり、そして、前記ｔｃ−ＤＮＡアンチセンスオリゴヌクレオチドが、前記異常発現を修正するのに有効な量で対象に末梢投与される、方法。
【請求項５４】
ｔｃ−ＤＮＡアンチセンスオリゴヌクレオチドを含む医薬組成物であって、前記ｔｃ−ＤＮＡアンチセンスオリゴヌクレオチドが、ヒト遺伝子によりコードされるＲＮＡの一部に相補的であり、そして、前記組成物が、薬学的に許容しうる賦形剤をさらに含む、医薬組成物。
【請求項５５】
対象の中枢神経系における異常遺伝子発現により引き起こされる遺伝子疾患の処置に使用するための、ｔｃ−ＤＮＡアンチセンスオリゴヌクレオチドを含む医薬組成物であって、前記ｔｃ−ＤＮＡアンチセンスオリゴヌクレオチドが、前記遺伝子によりコードされるＲＮＡの一部に相補的であり、そして、前記ｔｃ−ＤＮＡアンチセンスオリゴヌクレオチドが、前記異常発現を修正するのに有効な量で対象に末梢投与される、医薬組成物。
【請求項５６】
前記異常遺伝子発現が、神経筋障害又は筋骨格障害をもたらす、請求項５２に記載の方法。
【請求項５７】
前記疾患が神経筋障害又は筋骨格障害である、請求項５３に記載の方法。
【請求項５８】
神経筋疾患又は筋骨格疾患の処置に使用するためのｔｃ−ＤＮＡ ＡＯＮ。
【請求項５９】
神経筋疾患又は筋骨格疾患が遺伝子の変化により生じる、請求項５８に記載のｔｃ−ＤＮＡ ＡＯＮであって、前記変化が、
エクソンのインフレーム突然変異、
遺伝子の翻訳リーディングフレームを破壊する突然変異であって、ｔｃ−ＤＮＡが、リーディングフレームを修復するためにエクソンのスキッピングを促進する、突然変異；
前記遺伝子によりコードされるｍＲＮＡにおける異常エクソンのインクルージョンにより補完されうる有害突然変異であって、ｔｃ−ＤＮＡが、前記遺伝子によりコードされるプレ−ｍＲＮＡに存在するＩＳＳ又はＴＳＬに相補的であり、そして、異常エクソンのインクルージョンを促進する、突然変異、又は、
前記遺伝子によりコードされるｍＲＮＡにおいて有害な３’ＣＵＧ増幅を生じる突然変異である、ｔｃ−ＤＮＡ ＡＯＮ。
【請求項６０】
前記変化が、エクソンのインフレーム突然変異であり、前記エクソンのスキッピングを促進する、請求項５９に記載のｔｃ−ＤＮＡ ＡＯＮ。
【請求項６１】
前記変化が、遺伝子の翻訳リーディングフレームを破壊する突然変異であり、遺伝子のリーディングフレームを修復するためにエクソンのスキッピングを促進する、請求項５９に記載のｔｃ−ＤＮＡ ＡＯＮ。
【請求項６２】
前記変化が、前記遺伝子によりコードされるｍＲＮＡにおける異常エクソンのインクルージョンにより補完されうる有害突然変異であり、そして、ｔｃ−ＤＮＡ ＡＯＮが、（ｉ）前記遺伝子によりコードされるプレ−ｍＲＮＡに存在するＩＳＳ又はＴＳＬに相補的であり、そして、（ｉｉ）異常エクソンのインクルージョンを促進する、請求項５９に記載のｔｃ−ＤＮＡ ＡＯＮ。
【請求項６３】
前記変化が、前記遺伝子によりコードされるｍＲＮＡにおいて有害な３’ＣＵＧ増幅を生じる突然変異であり、そして、前記ｔｃ−ＤＮＡ ＡＯＮが、前記増幅を含有するｍＲＮＡを破壊する、請求項５９に記載のｔｃ−ＤＮＡ ＡＯＮ。
【請求項６４】
前記異常遺伝子発現が、
エクソンのインフレーム突然変異、
遺伝子の翻訳リーディングフレームを破壊する突然変異であって、ｔｃ−ＤＮＡが、リーディングフレームを修復するためにエクソンのスキッピングを促進する、突然変異；
前記遺伝子によりコードされるｍＲＮＡにおける異常エクソンのインクルージョンにより補完されうる有害突然変異であって、ｔｃ−ＤＮＡが、前記遺伝子によりコードされるプレ−ｍＲＮＡに存在するＩＳＳ又はＴＳＬに相補的であり、そして、異常エクソンのインクルージョンを促進する、突然変異、又は、
前記遺伝子によりコードされるｍＲＮＡにおいて有害な３’ＣＵＧ増幅の存在を生じる突然変異から引き起こされる、請求項５２〜５４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６５】
前記ｔｃ−ＤＮＡアンチセンスオリゴヌクレオチドが、請求項１〜１４及び４５〜４９のいずれか一項に記載されるとおりである、請求項５２若しくは５３に記載の方法又は請求項５８に記載の使用。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０Ａ】
【図１０Ｂ】
【図１０Ｃ】
【図１０Ｄ】
【図１０Ｅ】
【図１０Ｆ】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図１６】
【図１７】
【図１８】
【図１９Ａ】
【図１９Ｂ】
【図１９Ｃ】
【図１９Ｄ】
【図２０Ａ】
【図２０Ｂ】
【図２１Ａ】
【図２１Ｂ】
【図２１Ｃ】
【図２１Ｄ】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０Ａ】
【図１０Ｂ】
【図１０Ｃ】
【図１０Ｄ】
【図１０Ｅ】
【図１０Ｆ】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図１６】
【図１７】
【図１８】
【図１９Ａ】
【図１９Ｂ】
【図１９Ｃ】
【図１９Ｄ】
【図２０Ａ】
【図２０Ｂ】
【図２１Ａ】
【図２１Ｂ】
【図２１Ｃ】
【図２１Ｄ】
【公表番号】特表２０１２−５２３２２５（Ｐ２０１２−５２３２２５Ａ）
【公表日】平成２４年１０月４日（２０１２．１０．４）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１２−５０４０３４（Ｐ２０１２−５０４０３４）
【出願日】平成２２年４月９日（２０１０．４．９）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＥＰ２０１０／０５４７３５
【国際公開番号】ＷＯ２０１０／１１５９９３
【国際公開日】平成２２年１０月１４日（２０１０．１０．１４）
【出願人】（５１１２４４３２２）
【氏名又は名称原語表記】ＡＳＳＯＣＩＡＴＩＯＮ ＩＮＳＴＩＴＵＴ ＤＥ ＭＹＯＬＯＧＩＥ
【出願人】（５００５５５０１１）ユニベルシテ・ピエール・エ・マリー・キユリー (4)
【出願人】（５０５３５３５０４）
【氏名又は名称原語表記】Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔａｔ Ｂｅｒｎ
【出願人】（５９５０４０７４４）サントル・ナショナル・ドゥ・ラ・ルシェルシュ・シャンティフィク (88)
【氏名又は名称原語表記】ＣＥＮＴＲＥ ＮＡＴＩＯＮＡＬ ＤＥ ＬＡ ＲＥＣＨＥＲＣＨＥ ＳＣＩＥＮＴＩＦＩＱＵＥ
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２４年１０月４日（２０１２．１０．４）
【国際特許分類】
【出願日】平成２２年４月９日（２０１０．４．９）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＥＰ２０１０／０５４７３５
【国際公開番号】ＷＯ２０１０／１１５９９３
【国際公開日】平成２２年１０月１４日（２０１０．１０．１４）
【出願人】（５１１２４４３２２）
【氏名又は名称原語表記】ＡＳＳＯＣＩＡＴＩＯＮ ＩＮＳＴＩＴＵＴ ＤＥ ＭＹＯＬＯＧＩＥ
【出願人】（５００５５５０１１）ユニベルシテ・ピエール・エ・マリー・キユリー (4)
【出願人】（５０５３５３５０４）
【氏名又は名称原語表記】Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔａｔ Ｂｅｒｎ
【出願人】（５９５０４０７４４）サントル・ナショナル・ドゥ・ラ・ルシェルシュ・シャンティフィク (88)
【氏名又は名称原語表記】ＣＥＮＴＲＥ ＮＡＴＩＯＮＡＬ ＤＥ ＬＡ ＲＥＣＨＥＲＣＨＥ ＳＣＩＥＮＴＩＦＩＱＵＥ
【Ｆターム（参考）】
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