病原体検出方法
【課題】複数種類の病原体マーカーを、簡便に且つ短時間で同時に検出することが可能な、病原体検出チップを用いた病原体検出方法の提供。
【解決手段】（ａ）検出対象とする病原体から放出される病原体マーカーと特異的に結合し得る２種類以上の補足物質を基板上に配置して固定し、病原体検出チップを作製する工程と、（ｂ）宿主から採取した試料溶液を前記病原体検出チップに導入する工程と、（ｃ）前記試料溶液中に含まれる病原体マーカーと、前記補足物質とを吸着させ、生じた反応信号を検出する工程と、（ｄ）標準反応信号情報を用いて、検出された前記反応信号から病原体を判別する工程と、を有することを特徴とする病原体検出方法。
【解決手段】（ａ）検出対象とする病原体から放出される病原体マーカーと特異的に結合し得る２種類以上の補足物質を基板上に配置して固定し、病原体検出チップを作製する工程と、（ｂ）宿主から採取した試料溶液を前記病原体検出チップに導入する工程と、（ｃ）前記試料溶液中に含まれる病原体マーカーと、前記補足物質とを吸着させ、生じた反応信号を検出する工程と、（ｄ）標準反応信号情報を用いて、検出された前記反応信号から病原体を判別する工程と、を有することを特徴とする病原体検出方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、農場、食品工場、医療現場などの現場で迅速且つ簡便に病原菌の有無の特定を、精度よく実施することが可能な病原体検出チップを用いた病原体検出方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
人・家畜を含む動物の疾病に対し効果的な対策を実施するため、中規模・小規模の病院施設や家畜を保有する農場など、現場・オンサイトで病原体の有無の判断が可能となる簡便な技術への要求がある。
【０００３】
乳牛は病原体感染により乳房炎を発症し、原因となる病原体をいち早く特定することで、損失を抑えることができる。乳房炎の原因となる病原体は極めて多種存在するが、その中でも、黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ；ＳＡ）、コアグラーゼ陰性ブドウ球菌（ＣＮＳ）、レンサ球菌（Ｓｔｒｅｐ）、無乳性レンサ球菌（ＳＡＧ）、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）、肺炎桿菌（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ）等の細菌については、発生頻度や伝染性・迅速進行性などから、早期発見と対処が求められる病原体である。
人についても、病院の入院患者の死亡原因として頻繁に現れる敗血症は、病原体に感染し、その病原体が体内で増殖した結果現れる全身症である。特に、入院中の免疫低下した患者にとっては致命的となる場合がある。原因病原体としては、コアグラーゼ陰性ブドウ球菌、黄色ブドウ球菌、腸球菌、カンジタ属菌、ほかに大腸菌などのグラム陰性桿菌、真菌、肺炎球菌、髄膜炎菌等である。容態が急変した患者において、迅速に感染菌の存在を確定できれば、早期に抗生剤投与の治療方針を確定させることができ、全身性症状や敗血症性ショック症状に至らずにすむと考えられる。
【０００４】
従来、病原体の有無や特定のために用いられてきた手法が培養法である（非特許文献１参照）。培養法は、試料を動物より採取し、専用の培地に塗布後、２４時間以上にわたって試料中に含まれていた病原体（病原菌）を培養して増殖させ、コロニー形成数や状態を目視および計数器を用いて計測する方法である。この方法の問題点は、短時間で結果を得ることができないことと、また、危険性の高い菌を増殖させてしまう可能性があるため、菌漏洩のリスクから現場で実施することが好ましくないことである。
他に、ＰＣＲ法を用い、病原体のＤＮＡを増幅し特定する方法も用いられている（非特許文献２参照）。ＰＣＲ法は、測定操作は煩雑かつ装置も高価であることから、迅速・簡便診断技術としては不適である。
【０００５】
一方、病原体が動物に感染すると、宿主である動物中に多種類の病原体感染由来物質（病原体マーカー）を放出することが知られている。病原体マーカーとなり得る物質は、病原体の一部や病原体の放出する毒素や酵素が知られる。これら病原体マーカーを生体サンプルより検出することで、試料の由来する動物が感染している病原菌の特定を実施することも可能と考えられる。動物が病原体に感染した場合、感染した動物の健康状態や病原体そのものの遺伝子レベルの差により、生体試料中に放出されるマーカーの種類や濃度には差があることもよく知られている。よって、病原体マーカーによって病原体の存在有無および特定を実施する場合、複数の病原体マーカーを同時に検査することで、病原体検出の確度が向上することになる。
【０００６】
病原体マーカーとなる分子の従来の測定法にＥｎｚｙｍｅ Ｌｉｎｋｅｄ Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ（ＥＬＩＳＡ）がある（非特許文献３参照）。ＥＬＩＳＡでは、病原体マーカーに選択的に結合する抗体を用意し、プレートに並ぶ数百μＬの容量を有するウェル内で病原体マーカーの抗体と抗原たる病原体マーカーを含む可能性のあるサンプルとを反応させ、反応物あるいは２次反応物を、存在濃度と相関する吸光・発光物質に化学的に変換して読み取る方法である。最適化されたプロトコルを用いることで、ＥＬＩＳＡは一つのターゲット分子に対し高感度な検出を可能とし、また、一般に９６ウェルプレートを用いることから、多数のサンプルを一度に測定することができる。ただし、一種類のプレートで測定できる病原体マーカーの種類は一種、あるいは、極めて類似の特性を持つ一群に限られる。特に、食品や製薬製品中に混入可能性のある毒素といった病原体マーカーそのものに重要な意味のある場合、ＥＬＩＳＡを用いた検査が有効である。
【０００７】
しかしながら、測定のためのプレート準備、洗浄、反応に要する操作は煩雑で数時間〜２日の時間を要する。複数の異なる特性を持つ病原体マーカーの検出を実施するためには、複数のＥＬＩＳＡプロトコルを順に、あるいは人数をかけて平行して実施することとなり、特にオンサイトにおける迅速・簡易検出技術としては不適である。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】家畜共済における臨床病理検査要領；平成１７年改定 全国農業共済協会編、第９節 細菌検査、６分離培養検査、Ｐ．３０１−３０７
【非特許文献２】Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、ｖｏｌ．５０、ｎｏ．９、ｐ．１６７３−１６７４
【非特許文献３】Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ Ｄｉｓｅａｓｅ、ｖｏｌ．４２、ｐ．９−１５、２００２年
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明は上記事情に鑑みてなされたものであって、複数種類の病原体マーカーを、簡便に且つ短時間で同時に検出することが可能な、病原体検出チップを用いた病原体検出方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明の請求項１に記載の病原体検出方法は、（ａ）検出対象とする病原体から放出される病原体マーカーと特異的に結合し得る２種類以上の補足物質を基板上に配置して固定し、病原体検出チップを作製する工程と、（ｂ）宿主から採取した試料溶液を前記病原体検出チップに導入する工程と、（ｃ）前記試料溶液中に含まれる病原体マーカーと、前記補足物質とを吸着させ、生じた反応信号を検出する工程と、（ｄ）標準反応信号情報を用いて、検出された前記反応信号から病原体を判別する工程と、を有し、前記標準反応信号情報は、（ｂ’）既知の病原体感染宿主及び／又は非感染宿主から採取した標準試料溶液を、前記病原体検出チップに導入する工程と、（ｃ’）前記標準試料溶液中に含まれる病原体マーカーと、前記補足物質とを吸着させ、生じた標準反応信号を検出し、標準反応信号情報として蓄積する工程と、により、得られたものであることを特徴とする。
本発明の請求項２に記載の病原体検出方法は、請求項１において、前記補足物質が、抗体、抗体フラグメント、酵素、抗血清、血球抽出成分、培養上清、腹水、又はインプリンティングポリマーであることを特徴とする。
本発明の請求項３に記載の病原体検出方法は、請求項１又は２において、前記反応信号及び／又は前記標準反応信号が、表面プラズモン共鳴信号であることを特徴とする。
本発明の請求項４に記載の病原体検出方法は、請求項１〜３のいずれかにおいて、前記病原体が細菌であり、動物を宿主とするものであることを特徴とする。
本発明の請求項５に記載の病原体検出方法は、請求項４において、前記細菌が、黄色ブドウ球菌、非黄色ブドウ球菌、レンサ球菌、無乳性レンサ球菌、大腸菌、および肺炎桿菌からなる群から選ばれる１種以上を含有することを特徴とする。
本発明の請求項６に記載の病原体検出方法は、請求項１〜５のいずれかにおいて、前記反応信号及び／又は前記標準反応信号の解析において、横軸を時間、縦軸を測定シグナルとした際に、下記数式（１）又は数式（２）のいずれかを用いて補足物質と病原体マーカーとの結合の開始時刻における応答傾きｐ値を求めた後、得られたｐ値を用いることを特徴とする。
【００１１】
【数１】
（ただし、ΔＭは単位時間あたりにおける病原体マーカー吸着量の増加分、ΔＭｍａｘは病原体マーカーの平衡（最大）吸着量、τは時定数である。）
【００１２】
【数２】
（ただし、ΔＭは単位時間あたりにおける病原体マーカー吸着量の増加分、ΔＭｍａｘは病原体マーカーの平衡（最大）吸着量、τは時定数である。）
【００１３】
本発明の請求項７に記載の病原体検出方法は、請求項６において、既知の病原体感染宿主及び／又は非感染宿主の前記標準試料溶液から得た前記ｐ値を用いて生成された、予め複数のランクに分類されたニューラルネットワークにより、試料溶液中の未知の病原体の種類の判別を行うことを特徴とする。
本発明の請求項８に記載の病原体検出方法は、請求項７において、前記ニューラルネットワークがＳＯＭ(自己組織化マップ)で、前記病原体にランク付けされたベクトルを持つニューロンを複数有し、ＳＯＭの学習時に、病原体が既知のデータのベクトルの各々に対して、近接したウェイトベクトルを持つニューロンを割り当てた後に、割り当てたニューロンの周囲の他のニューロンのウェイトベクトルを変更して学習するようにしたことを特徴とする。
【発明の効果】
【００１４】
本発明により、培養という時間および感染拡大のリスクを有する手段、あるいは、ＥＬＩＳＡやＰＣＲに代表されるような測定操作が煩雑な手段を用いなくても、簡便に且つ迅速に複数の病原体マーカーを同時に検出することができ、精度よく病原体感染の判別を行うことが可能となる。
特に、病原体マーカーと捕捉物質との結合を測定する際に、例えば測定装置として表面プラズモン共鳴測定装置（以下、ＳＰＲ測定装置ということがある）を用いた場合、測定操作が一検体につき１５分程度で終了することから、従来の測定方法と比べ、飛躍的に短時間で病原体の有無を検出することができる。更に、ＳＰＲ測定装置としてポータブルな小型装置を適用可能であることから、オンサイトでの病原体感染の判別を迅速に行うことが可能となる。また、リアルタイムで試料中に含まれる病原体マーカーの濃度の推定が可能となる。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１】本発明における病原体検出チップの一例を模式的に示す（Ａ）側面図および（Ｂ）上面図である。
【図２】本発明における表面プラズモン共鳴測定装置の構成を模式的に示す側面図である。
【図３】病原体感染牛から採取した生乳試料における表面プラズモン共鳴測定装置による測定結果の一例を示したグラフである。
【図４】病原体感染牛から採取した生乳試料における、表面プラズモン共鳴測定装置による測定により求められた病原体ごとのｐ値の一例を示したグラフである。
【図５】本発明における病原体検出システム１００の構成例を示すブロック図である。
【図６】標準反応信号情報作成のための一連の流れの一例を示すフロー図である。
【図７】本発明における病原体検出の一連の流れの一例を示すフロー図である。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
以下、本発明を詳細に説明するが、本発明はこれに限定されるものではなく、本発明の趣旨を逸脱しない範囲において種々の変更が可能である。
【００１７】
本発明の病原体検出方法は、下記工程（ａ）〜（ｄ）を有する。
（ａ）検出対象とする病原体から放出される病原体マーカーと特異的に結合し得る２種類以上の補足物質を基板上に配置して固定し、病原体検出チップを作製する工程と、
（ｂ）宿主から採取した試料溶液を前記病原体検出チップに導入する工程と、
（ｃ）前記試料溶液中に含まれる病原体マーカーと、前記補足物質とを吸着させ、生じた反応信号を検出する工程と、
（ｄ）標準反応信号情報を用いて、検出された前記反応信号から病原体を判別する工程。
以下、工程ごとに説明する。
【００１８】
［工程（ａ）］
まず、工程（ａ）として、検出対象とする病原体から放出される病原体マーカーと特異的に結合し得る２種類以上の補足物質を基板上に配置して固定し、病原体検出チップを作製する。
【００１９】
本発明において、病原体とは、宿主に対して病原性を有した細菌、ウイルス、寄生虫等であり、特に限定されるものではないが、病原性細菌であることが好ましく、黄色ブドウ球菌、非黄色ブドウ球菌、レンサ球菌、無乳性レンサ球菌、大腸菌、および肺炎桿菌からなる群から選ばれる１種以上であることが好ましい。
【００２０】
ここで、宿主は、動物であれば特に限定されるものではないが、ヒトまたは食用動物であることが好ましい。食用動物としては、ウシ、ヤギ、ヒツジ、ブタ、ウマ、魚、鳥等が挙げられ、なかでもウシ、ヤギ、ヒツジ、ブタ、ウマ等の家畜であることが好ましい。
【００２１】
本発明において、病原体マーカーは、これら病原体が宿主に感染した際に、宿主に放出される病原体特有のタンパク質や核酸等の生体成分である。病原体特有のタンパク質としては、例えば病原体が黄色ブドウ球菌や表皮ブドウ球菌等のブドウ球菌であった場合、黄色ブドウ球菌あるいは表皮ブドウ球菌等に特異的なプロテインＡや耐熱性のエンテロトキシン（エンテロトキシンＢ、エンテロトキシンＣ及びエンテロトキシンＤ）、ＴＳＳＴ−１、ロイコシジン、ヘモリシン、スタフィロキナーゼ等が挙げられる。また、病原体がレンサ球菌であった場合、病原体特有のタンパク質としては溶血毒素、エキソトキシン等が挙げられる。
【００２２】
本発明において、補足物質は、病原体から放出された病原体マーカーと特異的に結合し得るものが選択される。本発明では、病原体マーカーと特異的に結合し得る２種類以上の捕捉物質が用いられる。ここで捕捉物質としては、抗体、抗体フラグメント、酵素、抗血清、血球抽出成分、培養上清、腹水、又はインプリンティングポリマー（合成ポリマー）であることが好ましい。
ここで、抗血清としては、上述した宿主由来のものを用いることができる。
血球抽出成分は、例えば、カブトガニやアメボサイトのライゼートを用いることができ、アメボサイトに蒸留水を加え、４℃にてテーブル上で一晩旋回して振とうすることで、該アメボサイトを破裂され、その上澄み液を用いることができる。あるいは、カブトガニやアメボサイトの０．０２Ｍのトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）を加えてホモジナイザーで破砕・抽出し、その上澄み液を採取して用いることができる。
培養上清や腹水としては、これら培養上清や腹水中に存在し、特異抗体を介して病原体マーカーと選択的に吸着をするタンパク質を用いることができる。
培養上清は、例えば、病原体マーカーの一つをマウスに免疫させて得られるハイブリドーマを培養し、該培養に用いた培養液を、培養上清として用いることができる。培養上清を用いる際は、例えば、基板上にあらかじめ抗マウスＩｇＧ抗体を固定し、その上に該培養上清を滴下して、目的とする抗体（マウスに免疫させた病原体マーカーに対する抗体）を、前記抗マウスＩｇＧ抗体を介して基板上に固定させて用いることができる。
また、腹水は、例えば、病原体マーカーの一つをマウスに免疫させて得られるハイブリドーマをマウスに移植し、腹水を採取することで得られる。腹水を用いる際は、例えば、培養上清の際と同様に、基板上にあらかじめ抗マウスＩｇＧ抗体を固定し、その上に腹水を滴下して、目的とする抗体（マウスに免疫させた病原体マーカーに対する抗体）を、前記抗マウスＩｇＧ抗体を介して基板上に固定させて用いることができる。
インプリンティングポリマーは、病原体マーカーそのものをポリマー内に担持させて作製されたものが好ましい。
【００２３】
例えば、牛乳房炎の診断に適用する場合、主要な病原体の一つが黄色ブドウ球菌となるため、黄色ブドウ球菌の病原体マーカー（プロテインＡや耐熱性のエンテロトキシン（エンテロトキシンＢ、エンテロトキシンＣ及びエンテロトキシンＤ）、ＴＳＳＴ−１、ロイコシジン、ヘモリシン、スタフィロキナーゼ）を特異的に検出し得る捕捉物質を基板上に配置して固定し、病原体としてレンサ球菌を検出する際は、上述したレンサ球菌の病原体マーカー（溶血毒素、エキソトキシン等）を特異的に検出し得る捕捉物質を選択する。
【００２４】
従来は、１種類の捕捉物質で１種類あるいは多種類の病原体マーカーを検出していたため、試料の状態や測定状況に応じて検出感度に劣る虞があった。本発明によれば、複数の病原体マーカーを別個に検出する捕捉物質が基板上に配置されているため、病原体の判別をより確度よく行うことが可能となる。
【００２５】
本発明における病原体検出チップは、上記２種類以上の補足物質が基板上に配置して固定されたものであり、後述する工程（ｃ）において、試料溶液中の病原体マーカーと補足物質とが好適に吸着し、且つ、それにより生じる反応信号を好適に検出し得るものであれば、特に限定されるものではない。以下、病原体検出チップに関して、図を用いて詳細に説明するが、本発明の病原体検出チップはこれに限定されるものではない。
【００２６】
表面プラズモン共鳴センサ（ＳＰＲセンサ）においては、基板とプリズムとの間に光学的マッチングをとる必要がある。そうしなければ、入射光が基板/プリズム界面にて反射され、効率の良い測定ができなくなるからである。そこで、ガラスあるいはプラスチックの基板とプリズム（図１、２）との光学的マッチングを保つため、弾性を有する架橋ポリマーからなるマッチングシートが基板の裏部に形成されている。マッチングシートの屈折率は、プリズムおよび基板の屈折率と極めて近い値の屈折率に調整されている。マッチングシートはガラス基板、プラスチック基板の両者に付与することができる。一般的に知られる方法、ＳＰＲセンサのプリズム上に市販の屈折率マッチングオイルを滴下して基板を押し付ける方法でも同じ効果は得られる。しかし、基板の取り外しの際、マッチングオイルはプリズム上に残渣として残るため、有機溶媒や粘着性シートでふき取る洗浄作業が必要となる。一方で、マッチングシートが付与された基板を用いれば、基板を取り外すと同時にマッチングシートも取り外され、次の測定の前にプリズムを洗浄する作業が不要である。
図１は、本発明における病原体検出チップ１０の一例を模式的に示す図であり、図１（Ａ）は、病原体検出チップ１０の側面図であり、図１（Ｂ）は病原体検出チップ１０の上面図である。
病原体検出チップ１０は、病原体から放出される病原体マーカーを特異的に検出し得る２種類以上の捕捉物質が、基板３上のスポット４に配置され、固定されている。また、基板３の少なくともスポット４が露呈するように、開口部を設けたシート体（図示せず）が基板３の一面に配されていてもよい。そして、このシート体上には、開口部を覆うように蓋体（図示せず）が配され、開口部と外部とを連通する貫通孔（図示せず）が設けられていてもよい。また、基板３の下には望ましくは架橋ポリマーからなるマッチングシート５が配されている。さらに、基板３の上面には、望ましくは毛細管現象を利用して試料を送液する毛細管型液送部６が配されている。
捕捉物質は、基板３上のスポット４にアレイ状に配置して固定することができる。２種類以上の捕捉物質をアレイ状に配置することで、少量の試料溶液で一度に複数種の病原体マーカーの検出が可能となる。
また、２種類以上の捕捉物質のうち、少なくとも１種類の捕捉物質が、２箇所以上の分割された領域に配置されていることが好ましい。各々の領域で得られた測定結果の平均を算出することで、より精確に病原体マーカーの検出を行うことができる。
【００２７】
病原体マーカーの検出に表面プラズモン共鳴測定装置（以下、ＳＰＲ測定装置ということがある）を用いる際は、２種類以上の捕捉物質は、基板３上に直線状に隣接して配されていることが好ましい。同時に複数の病原体マーカーの検出が可能となり、検出時間の短縮化が図れると共に、測定に必要とする試料溶液の量を削減することができる。
【００２８】
基板３は、透明性を有した第一基板１と、第一基板１の一面の少なくとも一部に配された金属薄膜２とから構成されていてもよい。第一基板１としては、例えばガラス、プラスチック等を用いることができ、その厚さは、例えば０．５ｍｍ以上８ｍｍ以下である。金属薄膜２としては、例えば金からなり、平板状の薄膜であるものを用いることができ、病原体検出チップ１０をＳＰＲ測定装置に適用する際は、エバネッセント波の染みだしが必要であるため、金属薄膜２の厚さは２０ｎｍ以上１００ｎｍ以下とすることが好ましい。
また、基板３の一面には、少なくとも捕捉物質が配されたスポット４が露呈するように開口部を設けたシート体が配されていてもよく、このシート体上には、開口部を覆うように蓋体が配され、開口部と外部とを連通し、後述する試料溶液を導入及び排出する貫通孔が設けられていることが好ましい。さらに、試料溶液の送液用に、周辺装置として、シリンダーやプランジャーを利用した小型の送液ポンプ装置を用いるほか、吸収パッドを利用した試料を送液する機構、チップに統合可能なサイズのマイクロフルイディクスを利用したポンプ機構を備えたチップを用いることができる。
シート体としては、例えばＰＤＭＳ、ポリアクリル酸、ポリエチレンテレフタレート、ポリスチレン、ポリオレフィン、ポリ塩化ビニル、ポリエステル、ポリウレタン、ポリアクリロニトリル、シラン架橋ポリオレフィン等のポリマーが適用可能である。また、その厚さは例えば１０μｍ〜１ｍｍ程度であることが好ましい。
蓋体としては、シート体と同様に例えばＰＤＭＳ、ポリアクリル酸、ポリエチレンテレフタレート、ポリスチレン、ポリオレフィン、ポリ塩化ビニル、ポリエステル、ポリウレタン、ポリアクリロニトリル、シラン架橋ポリオレフィン等のポリマーが適用可能である。この蓋体に貫通孔が形成される場合、その大きさとしては、例えばその直径が０．５ｍｍ〜２ｍｍ程度であることが好ましい。
【００２９】
補足物質を基板３上に固定する方法は、特に限定されるものではなく、通常、抗体等の基板への固定化に用いる方法を用いて行うことができる。例えば、補足物質が抗体である場合、抗体を含む溶液を金属薄膜２上に滴下することで、該抗体のチオール基が金薄膜２と共有結合し、固定することができる。また、固定化の後、適宜、ブロッキング等の工程を行ってもよい。
【００３０】
［工程（ｂ）］
次いで、工程（ｂ）として、宿主から採取した試料溶液を前記病原体検出チップに導入する。
試料溶液としては、上記宿主の生体試料や、上記宿主の生体試料から得られた培養物、及びこれらから抽出した試料溶液であってもよい。生体試料としては、例えば乳や唾液、血液、尿、母乳等が挙げられる。
試料溶液を病原体検出チップに導入する方法は、該試料溶液中の病原体マーカーと補足物質とが好適に吸着するものであれば特に限定されるものではなく、後述する（ｃ）工程において用いる機器等に応じて適宜決定できる。
【００３１】
［工程（ｃ）］
さらに、工程（ｃ）として、前記試料溶液中に含まれる病原体マーカーと、前記補足物質とを吸着させ、生じた反応信号を検出する。
検出に用いる測定装置としては、金属薄膜２が配された基板３上において、タンパク質の吸着現象を測定できる装置が適用できる。この装置としては、例えば全反射光学系を有しアレイを個々に測定可能な紫外光測定装置、赤外光測定装置を用いることもできるが、望ましくは、ＳＰＲ測定装置を用いる。
ＳＰＲ測定装置を用いた場合、検出感度に優れるため、測定操作が一検体につき１５分程度で終了することから、従来の病原体検出方法と比べ、飛躍的に短時間で病原体の有無を検出することができる。また、操作が簡便であることから作業性に優れている。そのため、短時間で測定できることと合わせ、所定時間内により多くの試料溶液を測定することができる。また、リアルタイムで病原体マーカーの検出が行えることから、測定中に試料溶液中に含まれる病原体マーカーの濃度の推定が可能となる。
特に、ＳＰＲ測定装置として小型のポータブルタイプのＳＰＲ測定装置を用いることで、オンサイトでの迅速診断が可能となる。
【００３２】
図２は、本発明の病原体検出チップ１０と、測定装置としてＳＰＲ測定装置２０とを用いて病原体マーカーを検出する際の様子を模式的に示した図である。
ＳＰＲ測定装置２０は、病原体検出チップ１０の金属薄膜表面から数百ｎｍの範囲の屈折率の変化を検出できるもので、光を試料の反対面からある角度で入射し、そのエバネッセンス波と表面プラズモンとが共鳴する角度を測定する。
より具体的には、光源２１から発した出射光２５はくさび形の光に集光し、半円柱状のプリズム２２に入射する。プリズムの底部には、屈折率を合わせるためのマッチングオイルを介して被測定部分βを配置し、この被測定部分βに全反射の条件下で光を照射する。
金属薄膜の捕捉物質が配された側に生じるエバネッセンス波と表面プラズモン波とは、ある入射角で共鳴を起こす。この時、２次元ＣＣＤカメラ２４によって反射光２６の強度を測定すると、共鳴が起こる角度で反射率の低い谷が観察される。共鳴が起こる角度は、金属薄膜表面の屈折率に依存するため、病原体マーカーと捕捉物質とが結合すると金属薄膜２表面の屈折率が変化し、谷の現れる角度が変化する。病原体検出チップ上の補足物質それぞれから得られるこの経時変化を反応信号として検出し、後述する工程（ｄ）において標準反応信号情報を用いることにより、試料溶液中の病原体の判別を行うことができる。
【００３３】
［工程（ｄ）］
次いで、工程（ｄ）として、標準反応信号情報を用いて、検出された前記反応信号から病原体を判別する。
まず、前記工程（ｃ）において得られた反応信号から、それぞれの補足物質と病原体マーカーとの吸着速度に依存する値であるｐ値を求める。
抗原抗体反応を含む病原体マーカーと捕捉物質との吸着現象は、捕捉物質への吸着物（病原体マーカー）の吸着量が測定できる場合、吸着物がある一定濃度で存在すると、その吸着量は吸着時間に伴い吸着式にのっとって増加していくと考えられる。
例えばＬａｎｇｍｕｉｒ型の吸着式を使うと、吸着サイトの濃度が一定の条件にある場合、すなわち、抗体が固定化された病原体検出チップのように、吸着サイトが基板３上に固定されている場合、単位時間あたりの吸着量の増加分ΔＭは、平衡（最大）吸着量ΔＭｍａｘと時定数τを使って次の数式（１）のように表される。
【００３４】
【数３】
（ただし、ΔＭは単位時間あたりにおける病原体マーカー吸着量の増加分、ΔＭｍａｘは病原体マーカーの平衡（最大）吸着量、τは時定数である。）
【００３５】
また、Ｌａｎｇｍｕｉｒ式以外として、次式の数式（２）で表される擬２次速度式を用いてもよい。
【００３６】
【数４】
（ただし、ΔＭは単位時間あたりにおける病原体マーカー吸着量の増加分、ΔＭｍａｘは病原体マーカーの平衡（最大）吸着量、τは時定数である。）
【００３７】
捕捉物質それぞれの応答を、上記いずれかの式にフィッティングし、捕捉物質と病原体マーカーとの結合の開始時刻における応答傾きを求めて、この値をパラメータｐ値とする。この際、ｐ値は吸着物の濃度に依存する値である。例えば、図３は、ある試料溶液における上記数式（１）あるいは数式（２）で求められた、応答傾きであるパラメータｐを求める際の概念図である。すなわち、１３種類の補足物質（抗体）により、それぞれの補足物質と病原体マーカーとの、１３個のパラメータｐを得ることで、各試料溶液において１３次元の特徴データ（応答パターン）が得られる。図３の横軸は、時間（秒）であり、縦軸はセンサシグナルの強度を示している。
また、図４はＳＡ、ＣＮＳ、Ｓｔｒｅｐそれぞれの２つずつの試料溶液の１３次元の応答パターンを示している。
【００３８】
上述したように、吸着速度に依存するｐ値の集合として、一つの測定から応答パターンを得ることができる。病原体の判別を行うためには、既知の病原体に感染した宿主由来の試料溶液を用いて上記検出を行うことにより得た応答パターンを標準反応信号情報として用いる必要がある。
【００３９】
本発明において、標準反応信号情報とは、下記工程により得られたものである。
（ｂ’）既知の病原体感染宿主及び／又は非感染宿主から採取した標準試料溶液を、前記病原体検出チップに導入する工程と、
（ｃ’）前記標準試料溶液中に含まれる病原体マーカーと、前記補足物質とを吸着させ、生じた標準反応信号を検出し、標準反応信号情報として蓄積する工程。
【００４０】
工程（ｂ’）において、宿主は、上記工程（ｂ）における宿主と同じであることが好ましい。また、既知の病原体は、上記工程（ａ）において検出対象とする病原体である。
また、病原体検出チップとしては、上記（ａ）工程において作製したものと同じものが用いられる。
標準試料溶液としては、上記宿主の生体試料や、上記宿主の生体試料から得られた培養物、及びこれらから抽出した試料溶液であってもよく、上記（ｂ）工程において用いる試料溶液と同様の試料溶液であることが好ましい。
試料溶液を病原体検出チップに導入する方法は、上記（ｂ）工程において用いられる方法と同様の方法であることが好ましい。
【００４１】
工程（ｃ’）において、検出に用いる測定装置および検出方法は、上記（ｃ）工程と同じものが選択される。
上記により得られた標準反応信号から、上記式（１）または（２）を用いて、ｐ値を求める。
【００４２】
＜本発明の一実施形態における病原体検出システムの説明＞
すでに説明したように、ｎ個の補足物質を用いた測定により、各補足物質からｐ値が１つずつ算出されることから、各試料溶液毎にｎ次元の応答パターンが生成される。以下に、標準試料溶液を用いた標準反応信号情報の生成、及び試料中の病原体の判別について説明する。図５に本発明における病原体検出システム１００の構成例を示す。
【００４３】
ｐ値算出部１０１は、各補足物質から得られる時間経過に伴うセンシングシグナルの強度変化から、各補足物質と、試料溶液中の病原体マーカーとの応答傾きのパラメータｐからなる応答パターンを求める。このとき、ｐ値算出部１０１は、図３に示す補足物質単位に時間経過毎のセンシングシグナルの強度変化を、数式（１）または数式（２）の増加分ΔＭに対応するようにフィッティングして、単位時間当たりの強度変化、すなわち応答速度の傾きを算出して、各補足物質のパラメータｐとし、試料溶液毎に付与された識別情報と、この識別情報の試料溶液の応答パターンとを対応付けて検証データベース１０２に書き込み、記憶させる。たとえば、ｐ値算出部１０１は、ＳＡ、ＣＮＳ、Ｓｔｒｅｐ、感染なしとラベルされた試料溶液を、それぞれｎ１、ｎ２、ｎ３、ｎ４個ずつのサンプル数として、ｎ＊＝ｎ１＋ｎ２＋ｎ３＋ｎ４個の上述した応答パターンを求めて、各試料溶液の識別番号に対応付けて検証データベース１０２に書き込み、記憶させる。
【００４４】
主成分分析部１０３は、検証データベース１０２から上記ｎ＊個の応答パターンについて主成分分析（Principal Component Analysis）を行い、応答パターンのパラメータｐの次元数に比較して、低次元の平面あるいは空間への写像を行う。すなわち、主成分分析部１０３は、主成分１および主成分２を軸とする２次元平面（２次元空間）、あるいは主成分１、主成分２および主成分３を軸とする３次元空間への写像を行い、パラメータ数の低減を行う。この平面および空間はＰＣＡ（Principal Component Analysis）空間である。また、応答パターンの次元数を圧縮して低減する方法としては、上述した主成分分析だけでなく、多重判別分析（Multiple Discriminant Analysis）を適用しても良い。主成分分析部１０３は、各主成分のスコアを新たな試料溶液の応答パターンとし、各試料溶液の識別番号に対応付けて検証データベース１０２へ書き込んで記憶させる。
【００４５】
自己組織化部１０４は、ｎ＊個の標準試料溶液（ｎＴ個の教師データとｎＩ個の検査データ）を用いて、自己組織化法によりＳＯＭ（Self-organizing feature map）を生成する。ここで、例えば、ｎ＊個の標準試料溶液の応答パターンは２次元で表現され、ｎ＊個の応答パターンの集合（ｘ＝[ｘ１，ｘ２]ｎ＊）と、ニューロンｊのウェイトベクトルｗ（ｗｊ＝[ｗｊ１，ｗｊ２］）として説明する。ＳＯＭは入力層と競合層との２層構造である。この競合層には、ｍ個のニューロンが２次元グリッド上に形成され、各ニューロンは上記ウェイトベクトルを有している。このＳＯＭは、後述するウェイトベクトルとランク（ＳＡ、ＣＮＳ、Ｓｔｒｅｐ、感染なしの各ラベルに対応してランク付けされたもの）との関連を示す判別用マップの構成を有している。
【００４６】
自己組織化部１０４は、検証データベース１０２から、識別番号順に応答パターンｘを読み出し、この読み出した応答パターンｘとのユークリッド距離が最も短い最近隣の重みベクトルを有するニューロンを、この応答パターンｘに最も適合しているニューロンｉ（ｘ）として、学習データベース１０６から抽出する。すなわち、自己組織化部１０４は、学習データベース１０６に記憶された競合層の各ニューロンを番号順に読み出し、読み出したニューロンのウェイトベクトルｗと応答パターンｘとのユークリッド距離を計算し、最もユークリッド距離が小さくなるウェイトベクトルｗを抽出する。
【００４７】
自己組織化部１０４は、競合層の全てのニューロンのウェイトベクタｗを、学習データベース１０５からニューロンを番号順に読み出し、順次、各ニューロンのウェイトベクタを以下の数式（３）により更新し、変更したウェイトベクタを番号に対応し、学習データベース１０５におけるウェイトベクトルｗのデータに上書きする。自己組織化部１０４は、この更新をｎ＊個全ての標準試料溶液に対応して行う。このとき、自己組織化部１０４は、最も近いウェイトベクトルを有するニューロンに対して、標準試料溶液のラベルを付与し、判別用マップＭ＝｛ｗｊ，θｗｊ｝として、各ニューロンの番号に対応して学習データベース１０６に書き込み、記憶させる。
ｗｊ（t＋１）＝ｗｊ（t）＋η（j）ｈｊ，ｉ（ｘ）（t）（ｘ（t）−ｗｊt））…（３）
【００４８】
自己組織化部１０４は、変更前と変更後とにおけるウェイトベクトルの差分が、予め設定した閾値以下となるまで、数式（３）による、各ニューロンのウェイトベクトルの更新を繰り返し行う。
ここで、ＳＯＭにおいては、入力される上記応答パターンの自己組織化のステップ（あるいは時間、例えば時間ｔとする）が経過するとともに、数式（３）における２次元平面上における近隣係数ｈｊ，ｉ（ｘ）（t）が減少すると定義し、自己組織化が進行する。そのため、時間とともにエクスポーネンシャル（exponential）に減少する関数σ（＝σ０Exp（ｔ／τ１）、ここで、σ０及びτ１は定数）とし、ステップｔとともに変化する係数としたとき、近隣係数ｈｊ，ｉ（ｘ）（t）は、以下の数式（４）により定義される。
ｈｊ，ｉ＝Exp（−ｄｉ，ｊ２／２σ２（t）） …（４）
数式（４）において、ｔ＝０，１，２，３，…であり、ｄｉ，ｊは応答パターンｘとｊ番目のウェイトベクトルとのユークリッド距離である。
【００４９】
また、学習パラメータηについても、ステップｔとともに変化する係数として、以下の数式（５）により定義される。
η＝η０Exp（−ｔ／τ２） …（５）
数式（５）において、η０及びτ２は定数である。
学習ベクトル量子化部１０７は、自己組織化部１０４が生成したＳＯＭにより、以下に示す教師データ及び検査データを用いて、後述する学習ベクトル量子化処理を行う。
【００５０】
学習ベクトル量子化部１０７は、検証データベース１０２から、ＳＡ、ＣＮＳ、Ｓｔｒｅｐ、感染者なしとラベルされた試料溶液のサンプルを、それぞれのラベルの集団から各ラベルの集団のサンプル数の役半分に相当する数、すなわち０．５×ｎｘ（ｘ＝１，２，３，４）個以下の最大整数個をランダムに抽出して、ｎ＊個のなかからｎＴ個の教師データを選択し、教師グループとして教師データベース１０５に、それぞれの標準試料溶液の識別番号とともに書き込んで記憶させる。ここで、全ｎ＊個のなかで、上記教師データとして選択されなかったｎＩ（＝ｎ＊−ｎＴ）個を検査グループとする。すなわち、学習ベクトル量子化部１０７は、予めラベルされた試料溶液である標準試料溶液の応答パターンｎ＊個を、ｎＴ個の教師データとｎＩ個の検査データとに分離する。ここで、学習ベクトル量子化部１０７は、教師グループに含まれる各教師データの応答パターンをそれぞれの標準試料溶液の識別情報とともに、教師データベース１０５Ａに書き込んで記憶させるとともに、検査グループに含まれる各検査データの応答パターンをそれぞれの標準試料溶液の識別情報とともに、検査データベース１０５Ｂに書き込んで記憶させる。
【００５１】
学習ベクトル量子化部１０７は、教師データベース１０５Ａから教師データを順次読み込み、学習ベクトル量子化処理を行う。ここで、学習ベクトル量子化部１０７が教師データベース１０５Ａから読み込む教師データｘ＝［ｘ１，ｘ２］ｎＴは、正解となるクラス（ＳＡ、ＣＮＳ、Ｓｔｒｅｐ、感染菌なし）が、上記判別用マップとしてラベルされている。すなわち、自己組織化部１０４が行った最近燐法でのＳＯＭ生成において、ＳＯＭとして生成した各ニューロンは所属するクラスが決定され、判別用マップＭ＝｛ｗｊ，θｗｊ｝として学習データベース１０６に記憶されている。これは、同一ラベルの試料溶液の応答パラメータが近傍のニューロンのウェイトベクトルと近いために、同一ラベルの標準試料溶液に対応するニューロンが連続した領域に配置され、それぞれのラベルに対応したクラスにクラスタリングされていることによる。
【００５２】
学習ベクトル量子化部１０７は、教師データベース１０５から、順次、識別番号順に、教師データｘｉを読み出す。学習ベクトル量子化部１０７は、読みだした教師データｘｉの応答パターンと、順次番号順に読み出すニューロンのウェイトベクトルとのユークリッド距離を算出し、最もユークリッド距離が小さなニューロンを、最も近隣のサポートベクターｗｃとして抽出する。
ここで、学習ベクトル量子化部１０７は、以下のルールによりウェイトベクタｗｃの２次元空間上での位置の微調整を行う。
（ｉ）ウェイトベクトルｗｃのニューロンのクラス（＝θｗｃ）と、入力された検査データｘｉとのクラスが等しいとき、以下の数式（６）により検査データｘｉの応答パターンと、ウェイトベクトルｗｃとの距離を近づける更新を行う。
（ii）ウェイトベクトルｗｃのニューロンのクラスと、入力された検査データｘｉとのクラスが異なるとき、以下の数式（７）により検査データｘｉの応答パターンと、ウェイトベクトルｗｃとの距離を遠ざける更新を行う。
ｗｃ（t＋１）＝ｗｃ（t）＋αｔ[ｘｉ−ｗｃ（ｔ）] …（６）
ｗｃ（t＋１）＝ｗｃ（t）−αｔ[ｘｉ−ｗｃ（ｔ）] …（７）
数式（６）及び（７）において、係数αｔは、ステップｔとともに減少する０＜αｔ＜１の値とする。
【００５３】
学習ベクトル量子化部１０７は、更新したウェイトベクトルｗｃを、そのニューロンのラベルとともに、判別用マップＭ＝｛ｗｃ，θｗｃ｝として、各ニューロンの番号に対応付けて、学習データベース１０６に書き込み、記憶させる。
学習ベクトル量子化部１０７は、順次検査データを検証データベース１０２から読み出し、読み出した検証データを仮の未知データとする。
学習ベクトル量子化部１０７は、読み出した仮の未知データの応答パターンと、順次番号順に学習データベース１０６から読み出すニューロンのウェイトベクトルｗｃとのユークリッド距離を算出し、最もユークリッド距離の小さいニューロンを最近隣のサポートベクターとし、そのニューロンのラベルを仮の未知データに付与する。
【００５４】
学習ベクトル量子化部１０７は、仮の未知データの識別番号と同一の識別番号の検証データのラベルを検証データベース１０２から順次読み出し、それぞれ読み出したラベルと仮の未知データに付与されたラベルとを比較し、一致する検証データの数をカウントする。
学習ベクトル量子化部１０７は、ｎＩ個の検証データにおける上記カウントした数の割合（正答する割合）を算出し、この割合が予め設定した正答率あるいは予め設定したステップ数のいずれかを超えるまで、上述した教師データを用いた更新処理を継続する。このように、ＳＯＭの学習時に、病原体が既知のデータのベクトルの各々に対して、近接したウェイトベクトルを持つニューロンを割り当てた後に、割り当てたニューロンの周囲の他のニューロンのウェイトベクトルを変更して学習する。
【００５５】
学習ベクトル量子化部１０７は、最終的な判別用マップＭ＝｛ｗｆ，θｗｆ｝を求め、学習データベース１０６に各ニューロンの番号に対応して書き込み、記憶させる。
データ判別部１０８は、検証データベース１０２に記憶されている未知の試料溶液の応答パターンと、順次番号順に学習データベース１０６から読み出すニューロンのウェイトベクトルｗｆとのユークリッド距離を算出し、最も小さなユークリッド距離を有するニューロンのラベルを、応答パターンに対応する試料溶液に対して付与する。学習データベース１０６に形成されているテーブルは、学習ベクトル化処理により最終的に生成された各ニューロンのウェイトベクトルｗｆとそのクラスの集合である判別用マップ、Ｗ＝｛ｗｆ，θｗｆ｝である。データ判別部１０８は、この判別用マップにより、ウェイトベクトルｗｆを有するニューロンに付与されているラベルを、近隣と判定された応答パターンを有する試料溶液に付与する。
【実施例】
【００５６】
＜病原体検出チップの作製＞
図１に示す病原体検出チップを作製した。ガラス又はプラスチック（双方のいずれもが使用可能であり、プラスチックは安価であり、両者に性能上の差は無い）上に金属膜を５０ｎｍの厚さで形成して基板を形成した。その後、基板（金属膜）上に、黄色ブドウ球菌（ＳＡ）に関連する病原体マーカーに対する抗体７種類（エンテロトキシン抗体。なお、エンテロトキシンには、A,B,C1,C2,C3,D,E,,,と多数あり、単一毒素にのみ応答性を持つ抗体と、反応性が混じったもの（例：B 40%+D 40%+C 20%）を混ぜ合わせて7種類使用）、コアグラーゼ陰性ブドウ球菌（ＣＮＳ）に関連する病原体マーカーに対する抗体１種類（コアグラーゼ関連物質抗体）、およびレンサ球菌（Ｓｔｒｅｐ）に関連する病原体マーカーに対する抗体５種類（エキソトキシンA,B,C抗体、ストレプトリシン抗体）を以下の方法により固定化した。まず、それぞれの抗体を含む緩衝液を、各液滴が混ざらないようにピペット又はスポット装置を用いて滴下し、３０分以上、軽く振動させながら固定化させた。次に、抗体を含む緩衝液を取り除き、緩衝液を用いて抗体が固定化された基板の表面を洗浄した後、ブロッキング剤（Ｐｒｏｔｅｉｎ−Ｆｒｅｅ Ｔ２０（ＴＢＳ） Ｂｌｏｃｋｉｎｇ Ｂｕｆｆｅｒ）を滴下して一晩静置し、洗浄後、筐体、毛細管型送液部を組み合わせてチップを作製した。
【００５７】
＜標準反応信号情報の作製＞
標準試料溶液として、黄色ブドウ球菌（ＳＡ）感染牛、コアグラーゼ陰性ブドウ球菌（ＣＮＳ）感染牛、レンサ球菌（Ｓｔｒｅｐ）感染牛、病原体非感染牛のそれぞれから採取した生乳サンプルを用いた。これら標準試料溶液は、「家畜共済における臨床病理検査要領」のＰ．３０１−３０７に記載の培養法により、病原体の有無及び種別があらかじめ確認されたものである。
以下に、ニューラルネットワークにより、ＳＡ、ＣＮＳ、Ｓｔｒｅｐ、感染菌なしの４分類へと判別するために用いる判別用マップの生成について、図６を用いて説明する。図６は、判別用マップの生成をｎ＊個の標準試料溶液を用いて行う処理の流れを示すフローチャートである。このｎ＊個は、例えば、ＳＡのｎ１個のサンプル、ＣＮＳのｎ２個のサンプル、Ｓｔｒｅｐのｎ３個のサンプル、感染なしのｎ４個のサンプルからなる。
【００５８】
測定装置としては、図２に示すような小型ＳＰＲを用い、上記チップ（抗体アレイチップ）を小型ＳＰＲに装着する（ステップＳ１）。これら標準試料溶液をシリンジポンプにより５μＬ・ｍｉｎ−１の流速で毛細管型送液部に導入し（ステップＳ２）、マルチチャンネル表面プラズモン共鳴の測定を予め設定した測定時間間隔にて予め設定した時間範囲で繰り返して行い、測定時間間隔毎の反応信号（センサシグナルの強度データ）を、反応信号の経過変化を示す標準反応信号の検出を行う（ステップＳ３）。
【００５９】
そして、ｐ値算出部１０１は、標準反応信号から各補足物質のパラメータｐ（例えば、１３個の補足物質を用いた場合、１３次元）を算出し、標準試料溶液の応答パターンを生成し、この標準試料溶液に対して識別情報（例えば、標準試料溶液の試料番号など）を付与し、この識別情報とともに、この識別情報に対応付けて応答パターンを検証データベース１０２に書き込んで記憶させる（ステップＳ４）。
【００６０】
次に、測定された標準試料溶液の数がｎ＊でない場合、ステップＳ１に戻り次の標準試料溶液の測定を行い、測定された標準試料の数がｎ＊となると処理をステップＳ６へ進める（ステップＳ５）。
次に、主成分分析部１０３は、ｎ＊個の標準試料溶液の応答パターンを検証データベース１０２から読み出し、これら応答パターンの各次元のパラメータｐに対する主成分分析を行う（ステップＳ６）。すなわち、主成分分析部１０３は、パラメータｐの上記１３次元の応答パターンを、より低次元、例えば主成分１及び主成分２を軸とする２次元へ写像し、応答パターンの次元の圧縮を行い（後に説明する自己組織化処理及び学習ベクトル化処理に用いる応答パターンは、次元圧縮を行った次元のデータである）、処理をステップＳ７へ進める。また、主成分分析部１０３は、ｎ＊個の標準試料溶液の応答パターンを、それぞれの識別情報に対応付けて、検証データベース１０２に書き込み、記憶させる。これにより、応答パターンは、主成分１及び主成分２のスコアからなる２次元ベクトルに次元圧縮されることになる。
【００６１】
次元圧縮が行われた後、自己組織化部１０４は、検証データベース１０２から標準試料溶液の次元圧縮された応答パターンを順次読み出す。
そして、自己組織化部１０４は、すでに述べたｋ最近隣法を用いた自己組織化処理（競合層におけるニューロンのクラスタリング処理）により、ｎ＊個の標準試料溶液の応答パターンに基づくＳＯＭを生成し、学習データベース１０６に書き込む（ステップＳ７）。
【００６２】
次に、学習ベクトル量子化部１０７は、検証データベース１０２における標準試料溶液のＳＡ、ＣＮＳ、Ｓｔｒｅｐ、感染なしの各サンプル数の半数を教師グループとし、残りの半数を検査グループとする。
そして、学習ベクトル量子化部１０７は、教師グループの応答パターンをそれぞれの標準試料溶液の識別情報とともに、教師データベース１０５Ａに書き込んで記憶させ、また、検査グループの応答パターンをそれぞれの標準試料溶液の識別情報とともに、検査データベース１０５Ｂに書き込んで記憶させる。
【００６３】
次に、学習ベクトル量子化部１０７は、順次学習データベース１０６からニューロンのウェイトベクトルｗｃを順次読み込み、教師データの応答ベクトルに対し、最近隣のニューロンのウェイトベクトルｗｃを抽出する。
そして、学習ベクトル量子化部１０７は、学習データベース１０６を参照して、各ニューロンの番号に対応したＷ＝｛ｗｃ，θｗｃ｝の判別用マップにより、最近隣のウェイトベクトルｗｃを有するニューロンが教師データと同一か否かの判定を行い、同一である場合ウェイトベクトルｗｃをより応答ベクトルに近づけ、同一でない場合に応答ベクトルから離す更新処理を、全ての教師データの応答ベクトルを用いて行う。
【００６４】
次に、学習ベクトル量子化部１０７は、検査データベース１０５Ｂから、検査データを読み出し、この検査データの応答ベクトルに対して最近隣のウェイトベクトルを有するニューロンを、学習データベース１０６から抽出する。そして、学習ベクトル量子化部１０７は、抽出されたニューロンのクラスが検査データと一致するか否かの判定を全ての検査データに対して行い、検査グループの全検査データに対する正答率を上記判別用マップを参照して求める。学習ベクトル量子化部１０７は、予め設定した正答率となるまで、教師データによる微調整と、検査データによる正答率の判定の処理を繰り返して行い、最終的な判別用マップＭ＝｛ｗｆ，θｗｆ｝を求め、学習データベース１０６に各ニューロンの番号に対応して書き込み、記憶させる。
【００６５】
＜試料中の病原体の判別＞
以下に、上記判別用マップを用いて、ニューラルネットワークにより、ＳＡ、ＣＮＳ、Ｓｔｒｅｐ、感染菌なしの４分類へと判別する処理について、図７を用いて説明する。図７は、判別用マップを用いて未知データの感染有無の検出の処理の流れを示すフローチャートである。
試料溶液として、上記標準試料溶液を採取した牛とは異なる農場の牛９９頭から採取した生乳サンプル９９例を用い、上記測定装置を用いて、反応信号の検出を行った（ステップＳ１１、Ｓ１２、Ｓ１３）。この処理は、試料溶液が標準試料溶液でなく未知データである以外、処理としては、図６のステップＳ１、Ｓ２、Ｓ３と同様である。
【００６６】
そして、ｐ値算出部１０１は、標準反応信号から各補足物質のパラメータｐ（例えば、１３個の補足物質を用いた場合、１３次元）を算出し、試料溶液の応答パターンを生成し、この試料溶液に対して識別情報（例えば、試料溶液の試料番号など）を付与し、この識別情報とともに、この識別情報に対応付けて応答パターンを検証データベース１０２に書き込んで記憶させる（ステップＳ１４）。
【００６７】
次に、主成分分析部１０３は、未知データの試料溶液の応答パターンと、ｎ＊個の標準試料溶液を検証データベース１０２から識別番号とともに読み出し、これらの応答パターンの各次元のパラメータｐに対する主成分分析を行う（ステップＳ１５）。
そして、主成分分析部１０３は、低次元化された未知データの試料溶液の応答パターンを、この未知データの識別番号に対応付けて、検証データベース１０２に書き込み、記憶させる。
【００６８】
次に、データ判別部１０８は、識別番号により未知データの応答パターンを読み出し、この応答パターンと最近隣のウェイトベクトルを有するニューロンを、学習データベース１０６から抽出する。
そして、データ判別部１０８は、最近隣のウェイトベクトルを有するニューロンの判別用マップＭ＝｛ｗｆ，θｗｆ｝を学習データベース１０６から読み出し、このニューロンのクラスのラベルを未知データに付与し、この未知データの識別情報に対応付けて、検証データベース１０２にラベルを書き込み、記憶させる（ステップＳ１６）。
【００６９】
上記による未知試料溶液の判別結果と、培養法により判別されたこれら試料溶液の判別結果とを比較した。培養法で黄色ブドウ球菌（ＳＡ）感染と判別された試料溶液の全てについて、本発明の病原体検出方法でも黄色ブドウ球菌感染との判別がなされ、正答率は１００％であった。また、培養法でコアグラーゼ陰性ブドウ球菌（ＣＮＳ）感染、レンサ球菌（Ｓｔｒｅｐ）感染と判別された試料溶液については、本発明の病原体検出方法の正答率は、それぞれ５４％、６６％であった。
上記結果から、本発明の病原体検出方法が、簡便に且つ迅速に複数の病原体マーカーを同時に検出することができ、精度よく病原体の感染の有無の診断及び病原体の判別を行えることが確認できた。
【産業上の利用可能性】
【００７０】
本発明の病原体検出方法は、生体から採取される試料中に含まれる病原体の判別に好適に適用可能である。特に、オンサイトにおける病原体の検出に対してより好適に適用することができる。
【符号の説明】
【００７１】
１ 第一基板
２ 金属薄膜
３ 基板
４ スポット
５ マッチングシート
６ 毛細管型液送部
１０ 病原体検出チップ
２０ ＳＰＲ測定装置
２１ 光源
２２ プリズム
２３ 偏光子
２４ ２次元ＣＣＤカメラ
２５ 出射光
２６ 反射光
β 被測定部分
【技術分野】
【０００１】
本発明は、農場、食品工場、医療現場などの現場で迅速且つ簡便に病原菌の有無の特定を、精度よく実施することが可能な病原体検出チップを用いた病原体検出方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
人・家畜を含む動物の疾病に対し効果的な対策を実施するため、中規模・小規模の病院施設や家畜を保有する農場など、現場・オンサイトで病原体の有無の判断が可能となる簡便な技術への要求がある。
【０００３】
乳牛は病原体感染により乳房炎を発症し、原因となる病原体をいち早く特定することで、損失を抑えることができる。乳房炎の原因となる病原体は極めて多種存在するが、その中でも、黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ；ＳＡ）、コアグラーゼ陰性ブドウ球菌（ＣＮＳ）、レンサ球菌（Ｓｔｒｅｐ）、無乳性レンサ球菌（ＳＡＧ）、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）、肺炎桿菌（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ）等の細菌については、発生頻度や伝染性・迅速進行性などから、早期発見と対処が求められる病原体である。
人についても、病院の入院患者の死亡原因として頻繁に現れる敗血症は、病原体に感染し、その病原体が体内で増殖した結果現れる全身症である。特に、入院中の免疫低下した患者にとっては致命的となる場合がある。原因病原体としては、コアグラーゼ陰性ブドウ球菌、黄色ブドウ球菌、腸球菌、カンジタ属菌、ほかに大腸菌などのグラム陰性桿菌、真菌、肺炎球菌、髄膜炎菌等である。容態が急変した患者において、迅速に感染菌の存在を確定できれば、早期に抗生剤投与の治療方針を確定させることができ、全身性症状や敗血症性ショック症状に至らずにすむと考えられる。
【０００４】
従来、病原体の有無や特定のために用いられてきた手法が培養法である（非特許文献１参照）。培養法は、試料を動物より採取し、専用の培地に塗布後、２４時間以上にわたって試料中に含まれていた病原体（病原菌）を培養して増殖させ、コロニー形成数や状態を目視および計数器を用いて計測する方法である。この方法の問題点は、短時間で結果を得ることができないことと、また、危険性の高い菌を増殖させてしまう可能性があるため、菌漏洩のリスクから現場で実施することが好ましくないことである。
他に、ＰＣＲ法を用い、病原体のＤＮＡを増幅し特定する方法も用いられている（非特許文献２参照）。ＰＣＲ法は、測定操作は煩雑かつ装置も高価であることから、迅速・簡便診断技術としては不適である。
【０００５】
一方、病原体が動物に感染すると、宿主である動物中に多種類の病原体感染由来物質（病原体マーカー）を放出することが知られている。病原体マーカーとなり得る物質は、病原体の一部や病原体の放出する毒素や酵素が知られる。これら病原体マーカーを生体サンプルより検出することで、試料の由来する動物が感染している病原菌の特定を実施することも可能と考えられる。動物が病原体に感染した場合、感染した動物の健康状態や病原体そのものの遺伝子レベルの差により、生体試料中に放出されるマーカーの種類や濃度には差があることもよく知られている。よって、病原体マーカーによって病原体の存在有無および特定を実施する場合、複数の病原体マーカーを同時に検査することで、病原体検出の確度が向上することになる。
【０００６】
病原体マーカーとなる分子の従来の測定法にＥｎｚｙｍｅ Ｌｉｎｋｅｄ Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ（ＥＬＩＳＡ）がある（非特許文献３参照）。ＥＬＩＳＡでは、病原体マーカーに選択的に結合する抗体を用意し、プレートに並ぶ数百μＬの容量を有するウェル内で病原体マーカーの抗体と抗原たる病原体マーカーを含む可能性のあるサンプルとを反応させ、反応物あるいは２次反応物を、存在濃度と相関する吸光・発光物質に化学的に変換して読み取る方法である。最適化されたプロトコルを用いることで、ＥＬＩＳＡは一つのターゲット分子に対し高感度な検出を可能とし、また、一般に９６ウェルプレートを用いることから、多数のサンプルを一度に測定することができる。ただし、一種類のプレートで測定できる病原体マーカーの種類は一種、あるいは、極めて類似の特性を持つ一群に限られる。特に、食品や製薬製品中に混入可能性のある毒素といった病原体マーカーそのものに重要な意味のある場合、ＥＬＩＳＡを用いた検査が有効である。
【０００７】
しかしながら、測定のためのプレート準備、洗浄、反応に要する操作は煩雑で数時間〜２日の時間を要する。複数の異なる特性を持つ病原体マーカーの検出を実施するためには、複数のＥＬＩＳＡプロトコルを順に、あるいは人数をかけて平行して実施することとなり、特にオンサイトにおける迅速・簡易検出技術としては不適である。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】家畜共済における臨床病理検査要領；平成１７年改定 全国農業共済協会編、第９節 細菌検査、６分離培養検査、Ｐ．３０１−３０７
【非特許文献２】Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、ｖｏｌ．５０、ｎｏ．９、ｐ．１６７３−１６７４
【非特許文献３】Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ Ｄｉｓｅａｓｅ、ｖｏｌ．４２、ｐ．９−１５、２００２年
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明は上記事情に鑑みてなされたものであって、複数種類の病原体マーカーを、簡便に且つ短時間で同時に検出することが可能な、病原体検出チップを用いた病原体検出方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明の請求項１に記載の病原体検出方法は、（ａ）検出対象とする病原体から放出される病原体マーカーと特異的に結合し得る２種類以上の補足物質を基板上に配置して固定し、病原体検出チップを作製する工程と、（ｂ）宿主から採取した試料溶液を前記病原体検出チップに導入する工程と、（ｃ）前記試料溶液中に含まれる病原体マーカーと、前記補足物質とを吸着させ、生じた反応信号を検出する工程と、（ｄ）標準反応信号情報を用いて、検出された前記反応信号から病原体を判別する工程と、を有し、前記標準反応信号情報は、（ｂ’）既知の病原体感染宿主及び／又は非感染宿主から採取した標準試料溶液を、前記病原体検出チップに導入する工程と、（ｃ’）前記標準試料溶液中に含まれる病原体マーカーと、前記補足物質とを吸着させ、生じた標準反応信号を検出し、標準反応信号情報として蓄積する工程と、により、得られたものであることを特徴とする。
本発明の請求項２に記載の病原体検出方法は、請求項１において、前記補足物質が、抗体、抗体フラグメント、酵素、抗血清、血球抽出成分、培養上清、腹水、又はインプリンティングポリマーであることを特徴とする。
本発明の請求項３に記載の病原体検出方法は、請求項１又は２において、前記反応信号及び／又は前記標準反応信号が、表面プラズモン共鳴信号であることを特徴とする。
本発明の請求項４に記載の病原体検出方法は、請求項１〜３のいずれかにおいて、前記病原体が細菌であり、動物を宿主とするものであることを特徴とする。
本発明の請求項５に記載の病原体検出方法は、請求項４において、前記細菌が、黄色ブドウ球菌、非黄色ブドウ球菌、レンサ球菌、無乳性レンサ球菌、大腸菌、および肺炎桿菌からなる群から選ばれる１種以上を含有することを特徴とする。
本発明の請求項６に記載の病原体検出方法は、請求項１〜５のいずれかにおいて、前記反応信号及び／又は前記標準反応信号の解析において、横軸を時間、縦軸を測定シグナルとした際に、下記数式（１）又は数式（２）のいずれかを用いて補足物質と病原体マーカーとの結合の開始時刻における応答傾きｐ値を求めた後、得られたｐ値を用いることを特徴とする。
【００１１】
【数１】
（ただし、ΔＭは単位時間あたりにおける病原体マーカー吸着量の増加分、ΔＭｍａｘは病原体マーカーの平衡（最大）吸着量、τは時定数である。）
【００１２】
【数２】
（ただし、ΔＭは単位時間あたりにおける病原体マーカー吸着量の増加分、ΔＭｍａｘは病原体マーカーの平衡（最大）吸着量、τは時定数である。）
【００１３】
本発明の請求項７に記載の病原体検出方法は、請求項６において、既知の病原体感染宿主及び／又は非感染宿主の前記標準試料溶液から得た前記ｐ値を用いて生成された、予め複数のランクに分類されたニューラルネットワークにより、試料溶液中の未知の病原体の種類の判別を行うことを特徴とする。
本発明の請求項８に記載の病原体検出方法は、請求項７において、前記ニューラルネットワークがＳＯＭ(自己組織化マップ)で、前記病原体にランク付けされたベクトルを持つニューロンを複数有し、ＳＯＭの学習時に、病原体が既知のデータのベクトルの各々に対して、近接したウェイトベクトルを持つニューロンを割り当てた後に、割り当てたニューロンの周囲の他のニューロンのウェイトベクトルを変更して学習するようにしたことを特徴とする。
【発明の効果】
【００１４】
本発明により、培養という時間および感染拡大のリスクを有する手段、あるいは、ＥＬＩＳＡやＰＣＲに代表されるような測定操作が煩雑な手段を用いなくても、簡便に且つ迅速に複数の病原体マーカーを同時に検出することができ、精度よく病原体感染の判別を行うことが可能となる。
特に、病原体マーカーと捕捉物質との結合を測定する際に、例えば測定装置として表面プラズモン共鳴測定装置（以下、ＳＰＲ測定装置ということがある）を用いた場合、測定操作が一検体につき１５分程度で終了することから、従来の測定方法と比べ、飛躍的に短時間で病原体の有無を検出することができる。更に、ＳＰＲ測定装置としてポータブルな小型装置を適用可能であることから、オンサイトでの病原体感染の判別を迅速に行うことが可能となる。また、リアルタイムで試料中に含まれる病原体マーカーの濃度の推定が可能となる。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１】本発明における病原体検出チップの一例を模式的に示す（Ａ）側面図および（Ｂ）上面図である。
【図２】本発明における表面プラズモン共鳴測定装置の構成を模式的に示す側面図である。
【図３】病原体感染牛から採取した生乳試料における表面プラズモン共鳴測定装置による測定結果の一例を示したグラフである。
【図４】病原体感染牛から採取した生乳試料における、表面プラズモン共鳴測定装置による測定により求められた病原体ごとのｐ値の一例を示したグラフである。
【図５】本発明における病原体検出システム１００の構成例を示すブロック図である。
【図６】標準反応信号情報作成のための一連の流れの一例を示すフロー図である。
【図７】本発明における病原体検出の一連の流れの一例を示すフロー図である。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
以下、本発明を詳細に説明するが、本発明はこれに限定されるものではなく、本発明の趣旨を逸脱しない範囲において種々の変更が可能である。
【００１７】
本発明の病原体検出方法は、下記工程（ａ）〜（ｄ）を有する。
（ａ）検出対象とする病原体から放出される病原体マーカーと特異的に結合し得る２種類以上の補足物質を基板上に配置して固定し、病原体検出チップを作製する工程と、
（ｂ）宿主から採取した試料溶液を前記病原体検出チップに導入する工程と、
（ｃ）前記試料溶液中に含まれる病原体マーカーと、前記補足物質とを吸着させ、生じた反応信号を検出する工程と、
（ｄ）標準反応信号情報を用いて、検出された前記反応信号から病原体を判別する工程。
以下、工程ごとに説明する。
【００１８】
［工程（ａ）］
まず、工程（ａ）として、検出対象とする病原体から放出される病原体マーカーと特異的に結合し得る２種類以上の補足物質を基板上に配置して固定し、病原体検出チップを作製する。
【００１９】
本発明において、病原体とは、宿主に対して病原性を有した細菌、ウイルス、寄生虫等であり、特に限定されるものではないが、病原性細菌であることが好ましく、黄色ブドウ球菌、非黄色ブドウ球菌、レンサ球菌、無乳性レンサ球菌、大腸菌、および肺炎桿菌からなる群から選ばれる１種以上であることが好ましい。
【００２０】
ここで、宿主は、動物であれば特に限定されるものではないが、ヒトまたは食用動物であることが好ましい。食用動物としては、ウシ、ヤギ、ヒツジ、ブタ、ウマ、魚、鳥等が挙げられ、なかでもウシ、ヤギ、ヒツジ、ブタ、ウマ等の家畜であることが好ましい。
【００２１】
本発明において、病原体マーカーは、これら病原体が宿主に感染した際に、宿主に放出される病原体特有のタンパク質や核酸等の生体成分である。病原体特有のタンパク質としては、例えば病原体が黄色ブドウ球菌や表皮ブドウ球菌等のブドウ球菌であった場合、黄色ブドウ球菌あるいは表皮ブドウ球菌等に特異的なプロテインＡや耐熱性のエンテロトキシン（エンテロトキシンＢ、エンテロトキシンＣ及びエンテロトキシンＤ）、ＴＳＳＴ−１、ロイコシジン、ヘモリシン、スタフィロキナーゼ等が挙げられる。また、病原体がレンサ球菌であった場合、病原体特有のタンパク質としては溶血毒素、エキソトキシン等が挙げられる。
【００２２】
本発明において、補足物質は、病原体から放出された病原体マーカーと特異的に結合し得るものが選択される。本発明では、病原体マーカーと特異的に結合し得る２種類以上の捕捉物質が用いられる。ここで捕捉物質としては、抗体、抗体フラグメント、酵素、抗血清、血球抽出成分、培養上清、腹水、又はインプリンティングポリマー（合成ポリマー）であることが好ましい。
ここで、抗血清としては、上述した宿主由来のものを用いることができる。
血球抽出成分は、例えば、カブトガニやアメボサイトのライゼートを用いることができ、アメボサイトに蒸留水を加え、４℃にてテーブル上で一晩旋回して振とうすることで、該アメボサイトを破裂され、その上澄み液を用いることができる。あるいは、カブトガニやアメボサイトの０．０２Ｍのトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）を加えてホモジナイザーで破砕・抽出し、その上澄み液を採取して用いることができる。
培養上清や腹水としては、これら培養上清や腹水中に存在し、特異抗体を介して病原体マーカーと選択的に吸着をするタンパク質を用いることができる。
培養上清は、例えば、病原体マーカーの一つをマウスに免疫させて得られるハイブリドーマを培養し、該培養に用いた培養液を、培養上清として用いることができる。培養上清を用いる際は、例えば、基板上にあらかじめ抗マウスＩｇＧ抗体を固定し、その上に該培養上清を滴下して、目的とする抗体（マウスに免疫させた病原体マーカーに対する抗体）を、前記抗マウスＩｇＧ抗体を介して基板上に固定させて用いることができる。
また、腹水は、例えば、病原体マーカーの一つをマウスに免疫させて得られるハイブリドーマをマウスに移植し、腹水を採取することで得られる。腹水を用いる際は、例えば、培養上清の際と同様に、基板上にあらかじめ抗マウスＩｇＧ抗体を固定し、その上に腹水を滴下して、目的とする抗体（マウスに免疫させた病原体マーカーに対する抗体）を、前記抗マウスＩｇＧ抗体を介して基板上に固定させて用いることができる。
インプリンティングポリマーは、病原体マーカーそのものをポリマー内に担持させて作製されたものが好ましい。
【００２３】
例えば、牛乳房炎の診断に適用する場合、主要な病原体の一つが黄色ブドウ球菌となるため、黄色ブドウ球菌の病原体マーカー（プロテインＡや耐熱性のエンテロトキシン（エンテロトキシンＢ、エンテロトキシンＣ及びエンテロトキシンＤ）、ＴＳＳＴ−１、ロイコシジン、ヘモリシン、スタフィロキナーゼ）を特異的に検出し得る捕捉物質を基板上に配置して固定し、病原体としてレンサ球菌を検出する際は、上述したレンサ球菌の病原体マーカー（溶血毒素、エキソトキシン等）を特異的に検出し得る捕捉物質を選択する。
【００２４】
従来は、１種類の捕捉物質で１種類あるいは多種類の病原体マーカーを検出していたため、試料の状態や測定状況に応じて検出感度に劣る虞があった。本発明によれば、複数の病原体マーカーを別個に検出する捕捉物質が基板上に配置されているため、病原体の判別をより確度よく行うことが可能となる。
【００２５】
本発明における病原体検出チップは、上記２種類以上の補足物質が基板上に配置して固定されたものであり、後述する工程（ｃ）において、試料溶液中の病原体マーカーと補足物質とが好適に吸着し、且つ、それにより生じる反応信号を好適に検出し得るものであれば、特に限定されるものではない。以下、病原体検出チップに関して、図を用いて詳細に説明するが、本発明の病原体検出チップはこれに限定されるものではない。
【００２６】
表面プラズモン共鳴センサ（ＳＰＲセンサ）においては、基板とプリズムとの間に光学的マッチングをとる必要がある。そうしなければ、入射光が基板/プリズム界面にて反射され、効率の良い測定ができなくなるからである。そこで、ガラスあるいはプラスチックの基板とプリズム（図１、２）との光学的マッチングを保つため、弾性を有する架橋ポリマーからなるマッチングシートが基板の裏部に形成されている。マッチングシートの屈折率は、プリズムおよび基板の屈折率と極めて近い値の屈折率に調整されている。マッチングシートはガラス基板、プラスチック基板の両者に付与することができる。一般的に知られる方法、ＳＰＲセンサのプリズム上に市販の屈折率マッチングオイルを滴下して基板を押し付ける方法でも同じ効果は得られる。しかし、基板の取り外しの際、マッチングオイルはプリズム上に残渣として残るため、有機溶媒や粘着性シートでふき取る洗浄作業が必要となる。一方で、マッチングシートが付与された基板を用いれば、基板を取り外すと同時にマッチングシートも取り外され、次の測定の前にプリズムを洗浄する作業が不要である。
図１は、本発明における病原体検出チップ１０の一例を模式的に示す図であり、図１（Ａ）は、病原体検出チップ１０の側面図であり、図１（Ｂ）は病原体検出チップ１０の上面図である。
病原体検出チップ１０は、病原体から放出される病原体マーカーを特異的に検出し得る２種類以上の捕捉物質が、基板３上のスポット４に配置され、固定されている。また、基板３の少なくともスポット４が露呈するように、開口部を設けたシート体（図示せず）が基板３の一面に配されていてもよい。そして、このシート体上には、開口部を覆うように蓋体（図示せず）が配され、開口部と外部とを連通する貫通孔（図示せず）が設けられていてもよい。また、基板３の下には望ましくは架橋ポリマーからなるマッチングシート５が配されている。さらに、基板３の上面には、望ましくは毛細管現象を利用して試料を送液する毛細管型液送部６が配されている。
捕捉物質は、基板３上のスポット４にアレイ状に配置して固定することができる。２種類以上の捕捉物質をアレイ状に配置することで、少量の試料溶液で一度に複数種の病原体マーカーの検出が可能となる。
また、２種類以上の捕捉物質のうち、少なくとも１種類の捕捉物質が、２箇所以上の分割された領域に配置されていることが好ましい。各々の領域で得られた測定結果の平均を算出することで、より精確に病原体マーカーの検出を行うことができる。
【００２７】
病原体マーカーの検出に表面プラズモン共鳴測定装置（以下、ＳＰＲ測定装置ということがある）を用いる際は、２種類以上の捕捉物質は、基板３上に直線状に隣接して配されていることが好ましい。同時に複数の病原体マーカーの検出が可能となり、検出時間の短縮化が図れると共に、測定に必要とする試料溶液の量を削減することができる。
【００２８】
基板３は、透明性を有した第一基板１と、第一基板１の一面の少なくとも一部に配された金属薄膜２とから構成されていてもよい。第一基板１としては、例えばガラス、プラスチック等を用いることができ、その厚さは、例えば０．５ｍｍ以上８ｍｍ以下である。金属薄膜２としては、例えば金からなり、平板状の薄膜であるものを用いることができ、病原体検出チップ１０をＳＰＲ測定装置に適用する際は、エバネッセント波の染みだしが必要であるため、金属薄膜２の厚さは２０ｎｍ以上１００ｎｍ以下とすることが好ましい。
また、基板３の一面には、少なくとも捕捉物質が配されたスポット４が露呈するように開口部を設けたシート体が配されていてもよく、このシート体上には、開口部を覆うように蓋体が配され、開口部と外部とを連通し、後述する試料溶液を導入及び排出する貫通孔が設けられていることが好ましい。さらに、試料溶液の送液用に、周辺装置として、シリンダーやプランジャーを利用した小型の送液ポンプ装置を用いるほか、吸収パッドを利用した試料を送液する機構、チップに統合可能なサイズのマイクロフルイディクスを利用したポンプ機構を備えたチップを用いることができる。
シート体としては、例えばＰＤＭＳ、ポリアクリル酸、ポリエチレンテレフタレート、ポリスチレン、ポリオレフィン、ポリ塩化ビニル、ポリエステル、ポリウレタン、ポリアクリロニトリル、シラン架橋ポリオレフィン等のポリマーが適用可能である。また、その厚さは例えば１０μｍ〜１ｍｍ程度であることが好ましい。
蓋体としては、シート体と同様に例えばＰＤＭＳ、ポリアクリル酸、ポリエチレンテレフタレート、ポリスチレン、ポリオレフィン、ポリ塩化ビニル、ポリエステル、ポリウレタン、ポリアクリロニトリル、シラン架橋ポリオレフィン等のポリマーが適用可能である。この蓋体に貫通孔が形成される場合、その大きさとしては、例えばその直径が０．５ｍｍ〜２ｍｍ程度であることが好ましい。
【００２９】
補足物質を基板３上に固定する方法は、特に限定されるものではなく、通常、抗体等の基板への固定化に用いる方法を用いて行うことができる。例えば、補足物質が抗体である場合、抗体を含む溶液を金属薄膜２上に滴下することで、該抗体のチオール基が金薄膜２と共有結合し、固定することができる。また、固定化の後、適宜、ブロッキング等の工程を行ってもよい。
【００３０】
［工程（ｂ）］
次いで、工程（ｂ）として、宿主から採取した試料溶液を前記病原体検出チップに導入する。
試料溶液としては、上記宿主の生体試料や、上記宿主の生体試料から得られた培養物、及びこれらから抽出した試料溶液であってもよい。生体試料としては、例えば乳や唾液、血液、尿、母乳等が挙げられる。
試料溶液を病原体検出チップに導入する方法は、該試料溶液中の病原体マーカーと補足物質とが好適に吸着するものであれば特に限定されるものではなく、後述する（ｃ）工程において用いる機器等に応じて適宜決定できる。
【００３１】
［工程（ｃ）］
さらに、工程（ｃ）として、前記試料溶液中に含まれる病原体マーカーと、前記補足物質とを吸着させ、生じた反応信号を検出する。
検出に用いる測定装置としては、金属薄膜２が配された基板３上において、タンパク質の吸着現象を測定できる装置が適用できる。この装置としては、例えば全反射光学系を有しアレイを個々に測定可能な紫外光測定装置、赤外光測定装置を用いることもできるが、望ましくは、ＳＰＲ測定装置を用いる。
ＳＰＲ測定装置を用いた場合、検出感度に優れるため、測定操作が一検体につき１５分程度で終了することから、従来の病原体検出方法と比べ、飛躍的に短時間で病原体の有無を検出することができる。また、操作が簡便であることから作業性に優れている。そのため、短時間で測定できることと合わせ、所定時間内により多くの試料溶液を測定することができる。また、リアルタイムで病原体マーカーの検出が行えることから、測定中に試料溶液中に含まれる病原体マーカーの濃度の推定が可能となる。
特に、ＳＰＲ測定装置として小型のポータブルタイプのＳＰＲ測定装置を用いることで、オンサイトでの迅速診断が可能となる。
【００３２】
図２は、本発明の病原体検出チップ１０と、測定装置としてＳＰＲ測定装置２０とを用いて病原体マーカーを検出する際の様子を模式的に示した図である。
ＳＰＲ測定装置２０は、病原体検出チップ１０の金属薄膜表面から数百ｎｍの範囲の屈折率の変化を検出できるもので、光を試料の反対面からある角度で入射し、そのエバネッセンス波と表面プラズモンとが共鳴する角度を測定する。
より具体的には、光源２１から発した出射光２５はくさび形の光に集光し、半円柱状のプリズム２２に入射する。プリズムの底部には、屈折率を合わせるためのマッチングオイルを介して被測定部分βを配置し、この被測定部分βに全反射の条件下で光を照射する。
金属薄膜の捕捉物質が配された側に生じるエバネッセンス波と表面プラズモン波とは、ある入射角で共鳴を起こす。この時、２次元ＣＣＤカメラ２４によって反射光２６の強度を測定すると、共鳴が起こる角度で反射率の低い谷が観察される。共鳴が起こる角度は、金属薄膜表面の屈折率に依存するため、病原体マーカーと捕捉物質とが結合すると金属薄膜２表面の屈折率が変化し、谷の現れる角度が変化する。病原体検出チップ上の補足物質それぞれから得られるこの経時変化を反応信号として検出し、後述する工程（ｄ）において標準反応信号情報を用いることにより、試料溶液中の病原体の判別を行うことができる。
【００３３】
［工程（ｄ）］
次いで、工程（ｄ）として、標準反応信号情報を用いて、検出された前記反応信号から病原体を判別する。
まず、前記工程（ｃ）において得られた反応信号から、それぞれの補足物質と病原体マーカーとの吸着速度に依存する値であるｐ値を求める。
抗原抗体反応を含む病原体マーカーと捕捉物質との吸着現象は、捕捉物質への吸着物（病原体マーカー）の吸着量が測定できる場合、吸着物がある一定濃度で存在すると、その吸着量は吸着時間に伴い吸着式にのっとって増加していくと考えられる。
例えばＬａｎｇｍｕｉｒ型の吸着式を使うと、吸着サイトの濃度が一定の条件にある場合、すなわち、抗体が固定化された病原体検出チップのように、吸着サイトが基板３上に固定されている場合、単位時間あたりの吸着量の増加分ΔＭは、平衡（最大）吸着量ΔＭｍａｘと時定数τを使って次の数式（１）のように表される。
【００３４】
【数３】
（ただし、ΔＭは単位時間あたりにおける病原体マーカー吸着量の増加分、ΔＭｍａｘは病原体マーカーの平衡（最大）吸着量、τは時定数である。）
【００３５】
また、Ｌａｎｇｍｕｉｒ式以外として、次式の数式（２）で表される擬２次速度式を用いてもよい。
【００３６】
【数４】
（ただし、ΔＭは単位時間あたりにおける病原体マーカー吸着量の増加分、ΔＭｍａｘは病原体マーカーの平衡（最大）吸着量、τは時定数である。）
【００３７】
捕捉物質それぞれの応答を、上記いずれかの式にフィッティングし、捕捉物質と病原体マーカーとの結合の開始時刻における応答傾きを求めて、この値をパラメータｐ値とする。この際、ｐ値は吸着物の濃度に依存する値である。例えば、図３は、ある試料溶液における上記数式（１）あるいは数式（２）で求められた、応答傾きであるパラメータｐを求める際の概念図である。すなわち、１３種類の補足物質（抗体）により、それぞれの補足物質と病原体マーカーとの、１３個のパラメータｐを得ることで、各試料溶液において１３次元の特徴データ（応答パターン）が得られる。図３の横軸は、時間（秒）であり、縦軸はセンサシグナルの強度を示している。
また、図４はＳＡ、ＣＮＳ、Ｓｔｒｅｐそれぞれの２つずつの試料溶液の１３次元の応答パターンを示している。
【００３８】
上述したように、吸着速度に依存するｐ値の集合として、一つの測定から応答パターンを得ることができる。病原体の判別を行うためには、既知の病原体に感染した宿主由来の試料溶液を用いて上記検出を行うことにより得た応答パターンを標準反応信号情報として用いる必要がある。
【００３９】
本発明において、標準反応信号情報とは、下記工程により得られたものである。
（ｂ’）既知の病原体感染宿主及び／又は非感染宿主から採取した標準試料溶液を、前記病原体検出チップに導入する工程と、
（ｃ’）前記標準試料溶液中に含まれる病原体マーカーと、前記補足物質とを吸着させ、生じた標準反応信号を検出し、標準反応信号情報として蓄積する工程。
【００４０】
工程（ｂ’）において、宿主は、上記工程（ｂ）における宿主と同じであることが好ましい。また、既知の病原体は、上記工程（ａ）において検出対象とする病原体である。
また、病原体検出チップとしては、上記（ａ）工程において作製したものと同じものが用いられる。
標準試料溶液としては、上記宿主の生体試料や、上記宿主の生体試料から得られた培養物、及びこれらから抽出した試料溶液であってもよく、上記（ｂ）工程において用いる試料溶液と同様の試料溶液であることが好ましい。
試料溶液を病原体検出チップに導入する方法は、上記（ｂ）工程において用いられる方法と同様の方法であることが好ましい。
【００４１】
工程（ｃ’）において、検出に用いる測定装置および検出方法は、上記（ｃ）工程と同じものが選択される。
上記により得られた標準反応信号から、上記式（１）または（２）を用いて、ｐ値を求める。
【００４２】
＜本発明の一実施形態における病原体検出システムの説明＞
すでに説明したように、ｎ個の補足物質を用いた測定により、各補足物質からｐ値が１つずつ算出されることから、各試料溶液毎にｎ次元の応答パターンが生成される。以下に、標準試料溶液を用いた標準反応信号情報の生成、及び試料中の病原体の判別について説明する。図５に本発明における病原体検出システム１００の構成例を示す。
【００４３】
ｐ値算出部１０１は、各補足物質から得られる時間経過に伴うセンシングシグナルの強度変化から、各補足物質と、試料溶液中の病原体マーカーとの応答傾きのパラメータｐからなる応答パターンを求める。このとき、ｐ値算出部１０１は、図３に示す補足物質単位に時間経過毎のセンシングシグナルの強度変化を、数式（１）または数式（２）の増加分ΔＭに対応するようにフィッティングして、単位時間当たりの強度変化、すなわち応答速度の傾きを算出して、各補足物質のパラメータｐとし、試料溶液毎に付与された識別情報と、この識別情報の試料溶液の応答パターンとを対応付けて検証データベース１０２に書き込み、記憶させる。たとえば、ｐ値算出部１０１は、ＳＡ、ＣＮＳ、Ｓｔｒｅｐ、感染なしとラベルされた試料溶液を、それぞれｎ１、ｎ２、ｎ３、ｎ４個ずつのサンプル数として、ｎ＊＝ｎ１＋ｎ２＋ｎ３＋ｎ４個の上述した応答パターンを求めて、各試料溶液の識別番号に対応付けて検証データベース１０２に書き込み、記憶させる。
【００４４】
主成分分析部１０３は、検証データベース１０２から上記ｎ＊個の応答パターンについて主成分分析（Principal Component Analysis）を行い、応答パターンのパラメータｐの次元数に比較して、低次元の平面あるいは空間への写像を行う。すなわち、主成分分析部１０３は、主成分１および主成分２を軸とする２次元平面（２次元空間）、あるいは主成分１、主成分２および主成分３を軸とする３次元空間への写像を行い、パラメータ数の低減を行う。この平面および空間はＰＣＡ（Principal Component Analysis）空間である。また、応答パターンの次元数を圧縮して低減する方法としては、上述した主成分分析だけでなく、多重判別分析（Multiple Discriminant Analysis）を適用しても良い。主成分分析部１０３は、各主成分のスコアを新たな試料溶液の応答パターンとし、各試料溶液の識別番号に対応付けて検証データベース１０２へ書き込んで記憶させる。
【００４５】
自己組織化部１０４は、ｎ＊個の標準試料溶液（ｎＴ個の教師データとｎＩ個の検査データ）を用いて、自己組織化法によりＳＯＭ（Self-organizing feature map）を生成する。ここで、例えば、ｎ＊個の標準試料溶液の応答パターンは２次元で表現され、ｎ＊個の応答パターンの集合（ｘ＝[ｘ１，ｘ２]ｎ＊）と、ニューロンｊのウェイトベクトルｗ（ｗｊ＝[ｗｊ１，ｗｊ２］）として説明する。ＳＯＭは入力層と競合層との２層構造である。この競合層には、ｍ個のニューロンが２次元グリッド上に形成され、各ニューロンは上記ウェイトベクトルを有している。このＳＯＭは、後述するウェイトベクトルとランク（ＳＡ、ＣＮＳ、Ｓｔｒｅｐ、感染なしの各ラベルに対応してランク付けされたもの）との関連を示す判別用マップの構成を有している。
【００４６】
自己組織化部１０４は、検証データベース１０２から、識別番号順に応答パターンｘを読み出し、この読み出した応答パターンｘとのユークリッド距離が最も短い最近隣の重みベクトルを有するニューロンを、この応答パターンｘに最も適合しているニューロンｉ（ｘ）として、学習データベース１０６から抽出する。すなわち、自己組織化部１０４は、学習データベース１０６に記憶された競合層の各ニューロンを番号順に読み出し、読み出したニューロンのウェイトベクトルｗと応答パターンｘとのユークリッド距離を計算し、最もユークリッド距離が小さくなるウェイトベクトルｗを抽出する。
【００４７】
自己組織化部１０４は、競合層の全てのニューロンのウェイトベクタｗを、学習データベース１０５からニューロンを番号順に読み出し、順次、各ニューロンのウェイトベクタを以下の数式（３）により更新し、変更したウェイトベクタを番号に対応し、学習データベース１０５におけるウェイトベクトルｗのデータに上書きする。自己組織化部１０４は、この更新をｎ＊個全ての標準試料溶液に対応して行う。このとき、自己組織化部１０４は、最も近いウェイトベクトルを有するニューロンに対して、標準試料溶液のラベルを付与し、判別用マップＭ＝｛ｗｊ，θｗｊ｝として、各ニューロンの番号に対応して学習データベース１０６に書き込み、記憶させる。
ｗｊ（t＋１）＝ｗｊ（t）＋η（j）ｈｊ，ｉ（ｘ）（t）（ｘ（t）−ｗｊt））…（３）
【００４８】
自己組織化部１０４は、変更前と変更後とにおけるウェイトベクトルの差分が、予め設定した閾値以下となるまで、数式（３）による、各ニューロンのウェイトベクトルの更新を繰り返し行う。
ここで、ＳＯＭにおいては、入力される上記応答パターンの自己組織化のステップ（あるいは時間、例えば時間ｔとする）が経過するとともに、数式（３）における２次元平面上における近隣係数ｈｊ，ｉ（ｘ）（t）が減少すると定義し、自己組織化が進行する。そのため、時間とともにエクスポーネンシャル（exponential）に減少する関数σ（＝σ０Exp（ｔ／τ１）、ここで、σ０及びτ１は定数）とし、ステップｔとともに変化する係数としたとき、近隣係数ｈｊ，ｉ（ｘ）（t）は、以下の数式（４）により定義される。
ｈｊ，ｉ＝Exp（−ｄｉ，ｊ２／２σ２（t）） …（４）
数式（４）において、ｔ＝０，１，２，３，…であり、ｄｉ，ｊは応答パターンｘとｊ番目のウェイトベクトルとのユークリッド距離である。
【００４９】
また、学習パラメータηについても、ステップｔとともに変化する係数として、以下の数式（５）により定義される。
η＝η０Exp（−ｔ／τ２） …（５）
数式（５）において、η０及びτ２は定数である。
学習ベクトル量子化部１０７は、自己組織化部１０４が生成したＳＯＭにより、以下に示す教師データ及び検査データを用いて、後述する学習ベクトル量子化処理を行う。
【００５０】
学習ベクトル量子化部１０７は、検証データベース１０２から、ＳＡ、ＣＮＳ、Ｓｔｒｅｐ、感染者なしとラベルされた試料溶液のサンプルを、それぞれのラベルの集団から各ラベルの集団のサンプル数の役半分に相当する数、すなわち０．５×ｎｘ（ｘ＝１，２，３，４）個以下の最大整数個をランダムに抽出して、ｎ＊個のなかからｎＴ個の教師データを選択し、教師グループとして教師データベース１０５に、それぞれの標準試料溶液の識別番号とともに書き込んで記憶させる。ここで、全ｎ＊個のなかで、上記教師データとして選択されなかったｎＩ（＝ｎ＊−ｎＴ）個を検査グループとする。すなわち、学習ベクトル量子化部１０７は、予めラベルされた試料溶液である標準試料溶液の応答パターンｎ＊個を、ｎＴ個の教師データとｎＩ個の検査データとに分離する。ここで、学習ベクトル量子化部１０７は、教師グループに含まれる各教師データの応答パターンをそれぞれの標準試料溶液の識別情報とともに、教師データベース１０５Ａに書き込んで記憶させるとともに、検査グループに含まれる各検査データの応答パターンをそれぞれの標準試料溶液の識別情報とともに、検査データベース１０５Ｂに書き込んで記憶させる。
【００５１】
学習ベクトル量子化部１０７は、教師データベース１０５Ａから教師データを順次読み込み、学習ベクトル量子化処理を行う。ここで、学習ベクトル量子化部１０７が教師データベース１０５Ａから読み込む教師データｘ＝［ｘ１，ｘ２］ｎＴは、正解となるクラス（ＳＡ、ＣＮＳ、Ｓｔｒｅｐ、感染菌なし）が、上記判別用マップとしてラベルされている。すなわち、自己組織化部１０４が行った最近燐法でのＳＯＭ生成において、ＳＯＭとして生成した各ニューロンは所属するクラスが決定され、判別用マップＭ＝｛ｗｊ，θｗｊ｝として学習データベース１０６に記憶されている。これは、同一ラベルの試料溶液の応答パラメータが近傍のニューロンのウェイトベクトルと近いために、同一ラベルの標準試料溶液に対応するニューロンが連続した領域に配置され、それぞれのラベルに対応したクラスにクラスタリングされていることによる。
【００５２】
学習ベクトル量子化部１０７は、教師データベース１０５から、順次、識別番号順に、教師データｘｉを読み出す。学習ベクトル量子化部１０７は、読みだした教師データｘｉの応答パターンと、順次番号順に読み出すニューロンのウェイトベクトルとのユークリッド距離を算出し、最もユークリッド距離が小さなニューロンを、最も近隣のサポートベクターｗｃとして抽出する。
ここで、学習ベクトル量子化部１０７は、以下のルールによりウェイトベクタｗｃの２次元空間上での位置の微調整を行う。
（ｉ）ウェイトベクトルｗｃのニューロンのクラス（＝θｗｃ）と、入力された検査データｘｉとのクラスが等しいとき、以下の数式（６）により検査データｘｉの応答パターンと、ウェイトベクトルｗｃとの距離を近づける更新を行う。
（ii）ウェイトベクトルｗｃのニューロンのクラスと、入力された検査データｘｉとのクラスが異なるとき、以下の数式（７）により検査データｘｉの応答パターンと、ウェイトベクトルｗｃとの距離を遠ざける更新を行う。
ｗｃ（t＋１）＝ｗｃ（t）＋αｔ[ｘｉ−ｗｃ（ｔ）] …（６）
ｗｃ（t＋１）＝ｗｃ（t）−αｔ[ｘｉ−ｗｃ（ｔ）] …（７）
数式（６）及び（７）において、係数αｔは、ステップｔとともに減少する０＜αｔ＜１の値とする。
【００５３】
学習ベクトル量子化部１０７は、更新したウェイトベクトルｗｃを、そのニューロンのラベルとともに、判別用マップＭ＝｛ｗｃ，θｗｃ｝として、各ニューロンの番号に対応付けて、学習データベース１０６に書き込み、記憶させる。
学習ベクトル量子化部１０７は、順次検査データを検証データベース１０２から読み出し、読み出した検証データを仮の未知データとする。
学習ベクトル量子化部１０７は、読み出した仮の未知データの応答パターンと、順次番号順に学習データベース１０６から読み出すニューロンのウェイトベクトルｗｃとのユークリッド距離を算出し、最もユークリッド距離の小さいニューロンを最近隣のサポートベクターとし、そのニューロンのラベルを仮の未知データに付与する。
【００５４】
学習ベクトル量子化部１０７は、仮の未知データの識別番号と同一の識別番号の検証データのラベルを検証データベース１０２から順次読み出し、それぞれ読み出したラベルと仮の未知データに付与されたラベルとを比較し、一致する検証データの数をカウントする。
学習ベクトル量子化部１０７は、ｎＩ個の検証データにおける上記カウントした数の割合（正答する割合）を算出し、この割合が予め設定した正答率あるいは予め設定したステップ数のいずれかを超えるまで、上述した教師データを用いた更新処理を継続する。このように、ＳＯＭの学習時に、病原体が既知のデータのベクトルの各々に対して、近接したウェイトベクトルを持つニューロンを割り当てた後に、割り当てたニューロンの周囲の他のニューロンのウェイトベクトルを変更して学習する。
【００５５】
学習ベクトル量子化部１０７は、最終的な判別用マップＭ＝｛ｗｆ，θｗｆ｝を求め、学習データベース１０６に各ニューロンの番号に対応して書き込み、記憶させる。
データ判別部１０８は、検証データベース１０２に記憶されている未知の試料溶液の応答パターンと、順次番号順に学習データベース１０６から読み出すニューロンのウェイトベクトルｗｆとのユークリッド距離を算出し、最も小さなユークリッド距離を有するニューロンのラベルを、応答パターンに対応する試料溶液に対して付与する。学習データベース１０６に形成されているテーブルは、学習ベクトル化処理により最終的に生成された各ニューロンのウェイトベクトルｗｆとそのクラスの集合である判別用マップ、Ｗ＝｛ｗｆ，θｗｆ｝である。データ判別部１０８は、この判別用マップにより、ウェイトベクトルｗｆを有するニューロンに付与されているラベルを、近隣と判定された応答パターンを有する試料溶液に付与する。
【実施例】
【００５６】
＜病原体検出チップの作製＞
図１に示す病原体検出チップを作製した。ガラス又はプラスチック（双方のいずれもが使用可能であり、プラスチックは安価であり、両者に性能上の差は無い）上に金属膜を５０ｎｍの厚さで形成して基板を形成した。その後、基板（金属膜）上に、黄色ブドウ球菌（ＳＡ）に関連する病原体マーカーに対する抗体７種類（エンテロトキシン抗体。なお、エンテロトキシンには、A,B,C1,C2,C3,D,E,,,と多数あり、単一毒素にのみ応答性を持つ抗体と、反応性が混じったもの（例：B 40%+D 40%+C 20%）を混ぜ合わせて7種類使用）、コアグラーゼ陰性ブドウ球菌（ＣＮＳ）に関連する病原体マーカーに対する抗体１種類（コアグラーゼ関連物質抗体）、およびレンサ球菌（Ｓｔｒｅｐ）に関連する病原体マーカーに対する抗体５種類（エキソトキシンA,B,C抗体、ストレプトリシン抗体）を以下の方法により固定化した。まず、それぞれの抗体を含む緩衝液を、各液滴が混ざらないようにピペット又はスポット装置を用いて滴下し、３０分以上、軽く振動させながら固定化させた。次に、抗体を含む緩衝液を取り除き、緩衝液を用いて抗体が固定化された基板の表面を洗浄した後、ブロッキング剤（Ｐｒｏｔｅｉｎ−Ｆｒｅｅ Ｔ２０（ＴＢＳ） Ｂｌｏｃｋｉｎｇ Ｂｕｆｆｅｒ）を滴下して一晩静置し、洗浄後、筐体、毛細管型送液部を組み合わせてチップを作製した。
【００５７】
＜標準反応信号情報の作製＞
標準試料溶液として、黄色ブドウ球菌（ＳＡ）感染牛、コアグラーゼ陰性ブドウ球菌（ＣＮＳ）感染牛、レンサ球菌（Ｓｔｒｅｐ）感染牛、病原体非感染牛のそれぞれから採取した生乳サンプルを用いた。これら標準試料溶液は、「家畜共済における臨床病理検査要領」のＰ．３０１−３０７に記載の培養法により、病原体の有無及び種別があらかじめ確認されたものである。
以下に、ニューラルネットワークにより、ＳＡ、ＣＮＳ、Ｓｔｒｅｐ、感染菌なしの４分類へと判別するために用いる判別用マップの生成について、図６を用いて説明する。図６は、判別用マップの生成をｎ＊個の標準試料溶液を用いて行う処理の流れを示すフローチャートである。このｎ＊個は、例えば、ＳＡのｎ１個のサンプル、ＣＮＳのｎ２個のサンプル、Ｓｔｒｅｐのｎ３個のサンプル、感染なしのｎ４個のサンプルからなる。
【００５８】
測定装置としては、図２に示すような小型ＳＰＲを用い、上記チップ（抗体アレイチップ）を小型ＳＰＲに装着する（ステップＳ１）。これら標準試料溶液をシリンジポンプにより５μＬ・ｍｉｎ−１の流速で毛細管型送液部に導入し（ステップＳ２）、マルチチャンネル表面プラズモン共鳴の測定を予め設定した測定時間間隔にて予め設定した時間範囲で繰り返して行い、測定時間間隔毎の反応信号（センサシグナルの強度データ）を、反応信号の経過変化を示す標準反応信号の検出を行う（ステップＳ３）。
【００５９】
そして、ｐ値算出部１０１は、標準反応信号から各補足物質のパラメータｐ（例えば、１３個の補足物質を用いた場合、１３次元）を算出し、標準試料溶液の応答パターンを生成し、この標準試料溶液に対して識別情報（例えば、標準試料溶液の試料番号など）を付与し、この識別情報とともに、この識別情報に対応付けて応答パターンを検証データベース１０２に書き込んで記憶させる（ステップＳ４）。
【００６０】
次に、測定された標準試料溶液の数がｎ＊でない場合、ステップＳ１に戻り次の標準試料溶液の測定を行い、測定された標準試料の数がｎ＊となると処理をステップＳ６へ進める（ステップＳ５）。
次に、主成分分析部１０３は、ｎ＊個の標準試料溶液の応答パターンを検証データベース１０２から読み出し、これら応答パターンの各次元のパラメータｐに対する主成分分析を行う（ステップＳ６）。すなわち、主成分分析部１０３は、パラメータｐの上記１３次元の応答パターンを、より低次元、例えば主成分１及び主成分２を軸とする２次元へ写像し、応答パターンの次元の圧縮を行い（後に説明する自己組織化処理及び学習ベクトル化処理に用いる応答パターンは、次元圧縮を行った次元のデータである）、処理をステップＳ７へ進める。また、主成分分析部１０３は、ｎ＊個の標準試料溶液の応答パターンを、それぞれの識別情報に対応付けて、検証データベース１０２に書き込み、記憶させる。これにより、応答パターンは、主成分１及び主成分２のスコアからなる２次元ベクトルに次元圧縮されることになる。
【００６１】
次元圧縮が行われた後、自己組織化部１０４は、検証データベース１０２から標準試料溶液の次元圧縮された応答パターンを順次読み出す。
そして、自己組織化部１０４は、すでに述べたｋ最近隣法を用いた自己組織化処理（競合層におけるニューロンのクラスタリング処理）により、ｎ＊個の標準試料溶液の応答パターンに基づくＳＯＭを生成し、学習データベース１０６に書き込む（ステップＳ７）。
【００６２】
次に、学習ベクトル量子化部１０７は、検証データベース１０２における標準試料溶液のＳＡ、ＣＮＳ、Ｓｔｒｅｐ、感染なしの各サンプル数の半数を教師グループとし、残りの半数を検査グループとする。
そして、学習ベクトル量子化部１０７は、教師グループの応答パターンをそれぞれの標準試料溶液の識別情報とともに、教師データベース１０５Ａに書き込んで記憶させ、また、検査グループの応答パターンをそれぞれの標準試料溶液の識別情報とともに、検査データベース１０５Ｂに書き込んで記憶させる。
【００６３】
次に、学習ベクトル量子化部１０７は、順次学習データベース１０６からニューロンのウェイトベクトルｗｃを順次読み込み、教師データの応答ベクトルに対し、最近隣のニューロンのウェイトベクトルｗｃを抽出する。
そして、学習ベクトル量子化部１０７は、学習データベース１０６を参照して、各ニューロンの番号に対応したＷ＝｛ｗｃ，θｗｃ｝の判別用マップにより、最近隣のウェイトベクトルｗｃを有するニューロンが教師データと同一か否かの判定を行い、同一である場合ウェイトベクトルｗｃをより応答ベクトルに近づけ、同一でない場合に応答ベクトルから離す更新処理を、全ての教師データの応答ベクトルを用いて行う。
【００６４】
次に、学習ベクトル量子化部１０７は、検査データベース１０５Ｂから、検査データを読み出し、この検査データの応答ベクトルに対して最近隣のウェイトベクトルを有するニューロンを、学習データベース１０６から抽出する。そして、学習ベクトル量子化部１０７は、抽出されたニューロンのクラスが検査データと一致するか否かの判定を全ての検査データに対して行い、検査グループの全検査データに対する正答率を上記判別用マップを参照して求める。学習ベクトル量子化部１０７は、予め設定した正答率となるまで、教師データによる微調整と、検査データによる正答率の判定の処理を繰り返して行い、最終的な判別用マップＭ＝｛ｗｆ，θｗｆ｝を求め、学習データベース１０６に各ニューロンの番号に対応して書き込み、記憶させる。
【００６５】
＜試料中の病原体の判別＞
以下に、上記判別用マップを用いて、ニューラルネットワークにより、ＳＡ、ＣＮＳ、Ｓｔｒｅｐ、感染菌なしの４分類へと判別する処理について、図７を用いて説明する。図７は、判別用マップを用いて未知データの感染有無の検出の処理の流れを示すフローチャートである。
試料溶液として、上記標準試料溶液を採取した牛とは異なる農場の牛９９頭から採取した生乳サンプル９９例を用い、上記測定装置を用いて、反応信号の検出を行った（ステップＳ１１、Ｓ１２、Ｓ１３）。この処理は、試料溶液が標準試料溶液でなく未知データである以外、処理としては、図６のステップＳ１、Ｓ２、Ｓ３と同様である。
【００６６】
そして、ｐ値算出部１０１は、標準反応信号から各補足物質のパラメータｐ（例えば、１３個の補足物質を用いた場合、１３次元）を算出し、試料溶液の応答パターンを生成し、この試料溶液に対して識別情報（例えば、試料溶液の試料番号など）を付与し、この識別情報とともに、この識別情報に対応付けて応答パターンを検証データベース１０２に書き込んで記憶させる（ステップＳ１４）。
【００６７】
次に、主成分分析部１０３は、未知データの試料溶液の応答パターンと、ｎ＊個の標準試料溶液を検証データベース１０２から識別番号とともに読み出し、これらの応答パターンの各次元のパラメータｐに対する主成分分析を行う（ステップＳ１５）。
そして、主成分分析部１０３は、低次元化された未知データの試料溶液の応答パターンを、この未知データの識別番号に対応付けて、検証データベース１０２に書き込み、記憶させる。
【００６８】
次に、データ判別部１０８は、識別番号により未知データの応答パターンを読み出し、この応答パターンと最近隣のウェイトベクトルを有するニューロンを、学習データベース１０６から抽出する。
そして、データ判別部１０８は、最近隣のウェイトベクトルを有するニューロンの判別用マップＭ＝｛ｗｆ，θｗｆ｝を学習データベース１０６から読み出し、このニューロンのクラスのラベルを未知データに付与し、この未知データの識別情報に対応付けて、検証データベース１０２にラベルを書き込み、記憶させる（ステップＳ１６）。
【００６９】
上記による未知試料溶液の判別結果と、培養法により判別されたこれら試料溶液の判別結果とを比較した。培養法で黄色ブドウ球菌（ＳＡ）感染と判別された試料溶液の全てについて、本発明の病原体検出方法でも黄色ブドウ球菌感染との判別がなされ、正答率は１００％であった。また、培養法でコアグラーゼ陰性ブドウ球菌（ＣＮＳ）感染、レンサ球菌（Ｓｔｒｅｐ）感染と判別された試料溶液については、本発明の病原体検出方法の正答率は、それぞれ５４％、６６％であった。
上記結果から、本発明の病原体検出方法が、簡便に且つ迅速に複数の病原体マーカーを同時に検出することができ、精度よく病原体の感染の有無の診断及び病原体の判別を行えることが確認できた。
【産業上の利用可能性】
【００７０】
本発明の病原体検出方法は、生体から採取される試料中に含まれる病原体の判別に好適に適用可能である。特に、オンサイトにおける病原体の検出に対してより好適に適用することができる。
【符号の説明】
【００７１】
１ 第一基板
２ 金属薄膜
３ 基板
４ スポット
５ マッチングシート
６ 毛細管型液送部
１０ 病原体検出チップ
２０ ＳＰＲ測定装置
２１ 光源
２２ プリズム
２３ 偏光子
２４ ２次元ＣＣＤカメラ
２５ 出射光
２６ 反射光
β 被測定部分
【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）検出対象とする病原体から放出される病原体マーカーと特異的に結合し得る２種類以上の補足物質を基板上に配置して固定し、病原体検出チップを作製する工程と、
（ｂ）宿主から採取した試料溶液を前記病原体検出チップに導入する工程と、
（ｃ）前記試料溶液中に含まれる病原体マーカーと、前記補足物質とを吸着させ、生じた反応信号を検出する工程と、
（ｄ）標準反応信号情報を用いて、検出された前記反応信号から病原体を判別する工程と、
を有し、
前記標準反応信号情報は、
（ｂ’）既知の病原体感染宿主及び／又は非感染宿主から採取した標準試料溶液を、前記病原体検出チップに導入する工程と、
（ｃ’）前記標準試料溶液中に含まれる病原体マーカーと、前記補足物質とを吸着させ、生じた標準反応信号を検出し、標準反応信号情報として蓄積する工程と、
により、得られたものであることを特徴とする病原体検出方法。
【請求項２】
前記補足物質が、抗体、抗体フラグメント、酵素、抗血清、血球抽出成分、培養上清、腹水、又はインプリンティングポリマーであることを特徴とする請求項１記載の病原体検出方法。
【請求項３】
前記反応信号及び／又は前記標準反応信号が、表面プラズモン共鳴信号であることを特徴とする請求項１又は２記載の病原体検出方法。
【請求項４】
前記病原体が細菌であり、動物を宿主とするものであることを特徴とする請求項１〜３のいずれか一項記載の病原体検出方法。
【請求項５】
前記細菌が、黄色ブドウ球菌、非黄色ブドウ球菌、レンサ球菌、無乳性レンサ球菌、大腸菌、および肺炎桿菌からなる群から選ばれる１種以上を含有することを特徴とする請求項４記載の病原体検出方法。
【請求項６】
前記反応信号及び／又は前記標準反応信号の解析において、
横軸を時間、縦軸を測定シグナルとした際に、下記数式（１）又は数式（２）のいずれかを用いて補足物質と病原体マーカーとの結合の開始時刻における応答傾きｐ値を求めた後、得られたｐ値を用いることを特徴とする請求項１〜５のいずれか一項記載の病原体検出方法。
【数１】
（ただし、ΔＭは単位時間あたりにおける病原体マーカー吸着量の増加分、ΔＭｍａｘは病原体マーカーの平衡（最大）吸着量、τは時定数である。）
【数２】
（ただし、ΔＭは単位時間あたりにおける病原体マーカー吸着量の増加分、ΔＭｍａｘは病原体マーカーの平衡（最大）吸着量、τは時定数である。）
【請求項７】
既知の病原体感染宿主及び／又は非感染宿主の前記標準試料溶液から得た前記ｐ値を用いて生成された、予め複数のランクに分類されたニューラルネットワークにより、試料溶液中の未知の病原体の種類の判別を行うことを特徴とする請求項６に記載の病原体検出方法。
【請求項８】
前記ニューラルネットワークがＳＯＭ(自己組織化マップ)で、前記病原体にランク付けされたベクトルを持つニューロンを複数有し、ＳＯＭの学習時に、病原体が既知のデータのベクトルの各々に対して、近接したウェイトベクトルを持つニューロンを割り当てた後に、割り当てたニューロンの周囲の他のニューロンのウェイトベクトルを変更して学習するようにしたことを特徴とする請求項７に記載の病原体検出方法。
【請求項１】
（ａ）検出対象とする病原体から放出される病原体マーカーと特異的に結合し得る２種類以上の補足物質を基板上に配置して固定し、病原体検出チップを作製する工程と、
（ｂ）宿主から採取した試料溶液を前記病原体検出チップに導入する工程と、
（ｃ）前記試料溶液中に含まれる病原体マーカーと、前記補足物質とを吸着させ、生じた反応信号を検出する工程と、
（ｄ）標準反応信号情報を用いて、検出された前記反応信号から病原体を判別する工程と、
を有し、
前記標準反応信号情報は、
（ｂ’）既知の病原体感染宿主及び／又は非感染宿主から採取した標準試料溶液を、前記病原体検出チップに導入する工程と、
（ｃ’）前記標準試料溶液中に含まれる病原体マーカーと、前記補足物質とを吸着させ、生じた標準反応信号を検出し、標準反応信号情報として蓄積する工程と、
により、得られたものであることを特徴とする病原体検出方法。
【請求項２】
前記補足物質が、抗体、抗体フラグメント、酵素、抗血清、血球抽出成分、培養上清、腹水、又はインプリンティングポリマーであることを特徴とする請求項１記載の病原体検出方法。
【請求項３】
前記反応信号及び／又は前記標準反応信号が、表面プラズモン共鳴信号であることを特徴とする請求項１又は２記載の病原体検出方法。
【請求項４】
前記病原体が細菌であり、動物を宿主とするものであることを特徴とする請求項１〜３のいずれか一項記載の病原体検出方法。
【請求項５】
前記細菌が、黄色ブドウ球菌、非黄色ブドウ球菌、レンサ球菌、無乳性レンサ球菌、大腸菌、および肺炎桿菌からなる群から選ばれる１種以上を含有することを特徴とする請求項４記載の病原体検出方法。
【請求項６】
前記反応信号及び／又は前記標準反応信号の解析において、
横軸を時間、縦軸を測定シグナルとした際に、下記数式（１）又は数式（２）のいずれかを用いて補足物質と病原体マーカーとの結合の開始時刻における応答傾きｐ値を求めた後、得られたｐ値を用いることを特徴とする請求項１〜５のいずれか一項記載の病原体検出方法。
【数１】
（ただし、ΔＭは単位時間あたりにおける病原体マーカー吸着量の増加分、ΔＭｍａｘは病原体マーカーの平衡（最大）吸着量、τは時定数である。）
【数２】
（ただし、ΔＭは単位時間あたりにおける病原体マーカー吸着量の増加分、ΔＭｍａｘは病原体マーカーの平衡（最大）吸着量、τは時定数である。）
【請求項７】
既知の病原体感染宿主及び／又は非感染宿主の前記標準試料溶液から得た前記ｐ値を用いて生成された、予め複数のランクに分類されたニューラルネットワークにより、試料溶液中の未知の病原体の種類の判別を行うことを特徴とする請求項６に記載の病原体検出方法。
【請求項８】
前記ニューラルネットワークがＳＯＭ(自己組織化マップ)で、前記病原体にランク付けされたベクトルを持つニューロンを複数有し、ＳＯＭの学習時に、病原体が既知のデータのベクトルの各々に対して、近接したウェイトベクトルを持つニューロンを割り当てた後に、割り当てたニューロンの周囲の他のニューロンのウェイトベクトルを変更して学習するようにしたことを特徴とする請求項７に記載の病原体検出方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【公開番号】特開２０１１−４７７１４（Ｐ２０１１−４７７１４Ａ）
【公開日】平成２３年３月１０日（２０１１．３．１０）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００９−１９４６８５（Ｐ２００９−１９４６８５）
【出願日】平成２１年８月２５日（２００９．８．２５）
【新規性喪失の例外の表示】特許法第３０条第１項適用申請有り 平成２１年３月３０日 社団法人応用物理学会発行の「２００９年（平成２１年）春季 第５６回応用物理学関係連合講演会 講演予稿集 Ｎｏ．３」に発表
【出願人】（０００００４２２６）日本電信電話株式会社 (13,992)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２３年３月１０日（２０１１．３．１０）
【国際特許分類】
【出願日】平成２１年８月２５日（２００９．８．２５）
【新規性喪失の例外の表示】特許法第３０条第１項適用申請有り 平成２１年３月３０日 社団法人応用物理学会発行の「２００９年（平成２１年）春季 第５６回応用物理学関係連合講演会 講演予稿集 Ｎｏ．３」に発表
【出願人】（０００００４２２６）日本電信電話株式会社 (13,992)
【Ｆターム（参考）】
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