癌の検出のための尿遺伝子発現比
本発明は、低発現腫瘍マーカー（ＴＭ）および少なくとも一つの他のＴＭの発現レベルの分析に基づき、対象における癌の存在を判定する方法に関する。具体的には本発明は、少なくとも一つの低発現ＴＭ、詳しくは低発現膀胱ＴＭ（ＢＴＭ）および少なくとも一つの過剰発現ＴＭ、詳しくは過剰発現ＢＴＭ、の発現レベルの、比、回帰または分類分析を行うことによる、癌、特に膀胱癌の判定に関する。種々の態様では、本発明は、これらの方法を実施するためのキットおよび装置に関する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、癌の検出に関する。具体的には、本発明は膀胱癌の検出のためのマーカーの使用に関する。より具体的には、本発明は、膀胱癌検出のため、低発現（under-expressed）マーカーを少なくとも一つの他のマーカーと組み合わせた使用に関する。
【０００２】
背景
癌患者の生存は、癌を初期に治療すると、大きく増大する。膀胱癌の場合、進行した疾患と診断された患者の約１５〜３０％と比較して、疾患の初期段階と診断された患者は、＞９０％以上の５年生存率を有する。それ故、膀胱癌の早期診断につながる進歩によって、患者の予後の改善がもたらされる。尿試料を用いた、実施されている膀胱癌検出方法は、細胞診断である。しかしながら、細胞診断は、浸潤性膀胱癌の検出には７５％感度、および表在性膀胱癌の検出にはたった約２５％の感度であることが知られている(Lotan and Roehrborn, Urology 61 , 109-118 (2003))。
【０００３】
尿中の特異的なマーカーの同定によって、癌の早期診断のための価値ある方法が提供でき、早期治療と予後の改善につながる。特異的な癌マーカーはまた、疾患の進行を監視する方法を提供し、外科、放射線療法、化学療法治療の有効性を監視することが可能になる。
【０００４】
現在、膀胱癌を検出するための最も信頼できる方法は、生検病変部の組織学的検査を伴う細胞検査である。しかしながら、この技法は時間がかかり、侵襲的であり、その感度は約９０％であるに過ぎず、癌の約１０％はこの方法を用いても検出されないことを意味する。非侵襲的な方法としては、剥脱した悪性細胞を顕微鏡的に検出する尿の細胞診断が、現在の好まれる方法である。細胞診断は約９５％の特異性を有するが、低段階の病変部については感度（９〜２５％）が不十分であり、試料の品質に非常に依存し、観察者間での変異が大きいことに悩まされている。
【０００５】
幾つかの尿タンパクマーカーが知られている。これらマーカーに関する試験は、細胞診断よりも感度が良好であるが、これらマーカー値の上昇はまた、炎症、尿路結石症および良性前立腺肥大を含む、非悪性疾患を有する患者において一般に観察されることから、特異性が不十分であることに悩まされる傾向がある。例えば、特異的核マトリックスタンパクを検出するＮＭＰ２２は、４７〜８７％の感度および５８〜９１％の特異性を有する。
【０００６】
尿検査に付随する一つの欠陥は、個々のマーカー値は、以下によって有意に変化する可能性があることである：(i)異なった尿採取方法（カテーテル採取尿、排尿、尿沈殿物）；(ii)尿採取の日周タイミング；(iii)排尿時の採取点（例えば中間点対終了時点の試料）；および(iv)変動する液体摂取、腎臓機能および血漿体積に影響する疾患、に伴う尿の濃度。これらの変動によって、擬陽性および擬陰性を招く可能性がある。この変動の幾つかは厳密な標準的操作手法を用いて減少させることができるが、これらの手法を患者が順守することは信頼できない可能性がある。変動する尿濃度の影響は、ある症例では、尿クレアチニンに対する相対的なマーカーレベルを評価することにより、説明できるが、これは、特に試料調製または貯蔵方法がマーカー検出とクレアチニン測定で異なる場合、試験コストを増大させ、試験がさらに複雑になる。
【０００７】
癌の早期検出と診断のための簡単なツールが必要である。本発明は、膀胱癌の検出および診断に役立つための、マーカーに基づく、特に膀胱癌マーカーの比、回帰または分類分析に基づく方法、装置およびキットをさらに提供する。
【０００８】
発明の要約
本発明は、以下のステップを含む、対象における癌の存在を決定する方法、を提供する：
（ａ） 対象からの試料を提供するステップ；
（ｂ） 前記試料中の、少なくとも一つの腫瘍マーカー（ＴＭ）が低発現ＴＭである、少なくとも二つのＴＭファミリーメンバーの発現レベルを検出するステップ；および
（ｃ） あらかじめ定めた閾値に従って、患者が癌を有するかを立証するステップ。
【０００９】
ステップ（ｃ）は、前記ＴＭの発現比を測定することによって、またはＴＭ発現レベルの回帰または分類分析を行うことによって行うことができる。
【００１０】
ＴＭはＢＴＭであることが可能である。検出される癌は膀胱癌であることがあり得るし、ある特定の実施態様では、ＴＭの少なくとも一つは過剰発現ＢＴＭである。過剰発現ＢＴＭは、図１１または図１２に要約された群から選択してもよい。
【００１１】
ある特定の実施態様では、少なくとも一つの低発現ＴＭは、図３または図４に概要を述べた群から選択してもよい。
【００１２】
本発明の他の実施態様では、検出ステップは、ＢＴＭ ｍＲＮＡ、ＢＴＭタンパクまたはＢＴＭペプチドの過剰発現を検出することによって行う。
【００１３】
試料は、生検、血液、血清、腹膜洗浄液、脳脊髄液、尿および便試料のいずれかであり得る。
【００１４】
本発明はまた、以下を含む、ＴＭを検出するための装置を提供する：
その上にＴＭキャプチャー試薬を有する基材；および
該基材に付随する検出器であって、該キャプチャー試薬に結合している低発現ＴＭを検出することができる該検出器。
【００１５】
ＴＭはＢＴＭであることが可能である。
【００１６】
ＴＭキャプチャー試薬がオリゴヌクレオチドまたは抗体であることが可能である。
【００１７】
ある特定の実施態様では、ＴＭは図３または図４に概要を述べた群から選択されるＢＴＭであることが可能である。
【００１８】
本発明はまた、以下を含む、対象における癌の存在を判定するためのキットを提供する：
基材；
少なくとも一つのＴＭが低発現ＴＭである、少なくとも二つのＴＭキャプチャー試薬；
および
使用のための取扱説明書。
【００１９】
ＴＭはＢＴＭであることが可能である。
【００２０】
ＴＭキャプチャー試薬は、ＴＭ特異的オリゴヌクレオチドまたはＴＭ特異的な抗体であってもよい。
【００２１】
キットによって検出されるＴＭは、図３または図４に概要を述べた群から選択されるＢＴＭであってもよい。
【００２２】
キットによって検出される少なくとも一つのＴＭは、過剰発現ＴＭまたは過剰発現ＢＴＭであってもよい。過剰発現ＢＴＭは、図１１または図１２に概要を述べた群から選択されてもよい。
【００２３】
発明の詳細な説明
定義
用語「マーカー」は、生物現象の存在と定量的に、または定性的に関連する分子を意味する。マーカーの例としては、遺伝子、遺伝子断片、ＲＮＡまたはＲＮＡ断片のようなポリヌクレオチド；ペプチド、オリゴペプチド、タンパクまたはタンパク断片のようなポリペプチドを含む遺伝子産物；または現象の基礎となるメカニズムに直接的に関係していようが、間接的に関係していようが、関連代謝物、副産物または抗体または抗体断片のような他の識別分子が挙げられる。本発明のマーカーとしては、本明細書に開示した核酸配列（例えばGenBank配列）、具体的には全長配列、任意のコード配列、ノンコード配列および断片、またはそれらの任意の相補体、および上に規定したような任意の測定可能なそれらのマーカーが挙げられる。
【００２４】
用語「感度」は、試験で陽性（モデルによっては）である、疾患を有する個人の比率を意味する。従って、感度が増加することは、試験結果に擬陰性がより少ないことを意味する。
【００２５】
用語「特異性」は、試験で陰性（モデルによっては）である、疾患を有しない個人の比率を意味する。従って特異性が増加することは、試験結果に擬陽性がより少ないことを意味する。
【００２６】
用語「発現」は、ポリヌクレオチドおよびポリペプチドの生産、具体的には遺伝子または遺伝子の部分からのＲＮＡ（例えばｍＲＮＡ）の生産を含み、ならびにＲＮＡまたは遺伝子または遺伝子の部分によってコードされるポリペプチドの生産を含み、発現と関連する検出可能な物質の出現を含む。例えば、ポリペプチド-ポリペプチド相互作用、ポリペプチド-ヌクレオチド相互作用等からの複合体の形成は、用語「発現」の範囲内に含まれる。別の例としては、ハイブリダイゼーションプローブまたは抗体のような結合リガンドの、遺伝子もしくは他のポリヌクレオチド、ポリペプチドもしくはタンパク断片との結合、および結合リガンドの可視化も含まれる。従って、マイクロアレイ上の、ノーザンブロットのようなハイブリダイゼーションブロット上の、またはウエスタンブロットのような免疫ブロット上の、またはビーズアレイ上の、またはＰＣＲ分析による、スポットの密度は、根本的な生物分子の用語「発現」の範囲内に含まれる。
【００２７】
用語「過剰発現」は、ある細胞または細胞型におけるマーカーの発現が、他の同等の細胞または細胞型におけるマーカーの発現よりも多い場合に用いる。
【００２８】
用語「低発現」は、ある細胞または細胞型におけるマーカーの発現が、他の同等の細胞または細胞型におけるマーカーの発現よりも少ない場合に用いる。
【００２９】
用語「ＴＭ」または「腫瘍マーカー」または「ＴＭファミリーメンバー」は、特定の癌に関連するマーカーを意味する。用語ＴＭはまた、その組み合わせが癌の検出の感度および特異性を改良する、個々のマーカーの組み合わせをも含む。当然のことながら、用語「ＴＭ」は、マーカーが特定の腫瘍にのみ特異的であることは必要としない。むしろ、ＴＭの発現は、他の型の細胞、疾患細胞、悪性腫瘍を含む腫瘍において変化することが可能である。
【００３０】
ＴＭは、膀胱癌を有すると疑われる患者からの組織試料からＲＮＡを抽出し、その上に多くのオリゴヌクレオチドを有するマイクロアレイにＲＮＡまたはｃＤＮＡコピーを加え、アレイ上のオリゴヌクレオチドに試料ＲＮＡをハイブリダイズさせ、各アレイスポットに結合した測定ＲＮＡのレベルを定量することにより、同定することができる。もしマーカーの存在が、マイクロアレイ法を用いて、正常、非悪性組織において見出される値の少なくとも約１．２倍に閾値より低い場合は、マーカーは低発現ＴＭであると考えられる。代わりに、閾値は、正常値の約２倍より低い、正常値の約３分の１、正常値の約４分の１または約５分の１であることも可能である。「正常」は、ここでは正常の集団の９０パーセンタイルより小さいことを意味する。他の場合、正常とは、９５パーセンタイル（すなわち平均値から約２標準偏差（ＳＤ））の存在のレベルを意味することも可能であり、また他の場合、約９７．５パーセンタイル未満（すなわち約３ＳＤ）または９９パーセンタイルであることも可能である。
【００３１】
用語「低発現ＴＭ」は、非悪性膀胱組織におけるよりも膀胱腫瘍において低い発現を示すマーカーを意味する。
【００３２】
用語「過剰発現ＴＭ」は、非悪性膀胱組織におけるよりも膀胱腫瘍において高い発現を示すマーカーを意味する。
【００３３】
用語「ＢＴＭ」または「膀胱腫瘍マーカー」または「ＢＴＭファミリーメンバー」は、膀胱癌に関連するＴＭを意味する。用語ＢＴＭはまた、その組み合わせが膀胱癌検出の感度および特異性を改良する、個々のマーカーの組み合わせを含む。当然のことながら、用語ＢＴＭは、マーカーが膀胱腫瘍に対してのみ特異的であることを必要としない。むしろ、ＢＴＭの発現は、他の型の細胞、疾患細胞、悪性腫瘍を含む腫瘍において変化することができる。
【００３４】
用語「低発現ＢＴＭ」は、非悪性膀胱組織においてよりも、膀胱腫瘍において低い発現を示すマーカーを意味する。
【００３５】
用語「過剰発現ＢＴＭ」は、非悪性膀胱組織においてよりも、膀胱腫瘍において高い発現を示すマーカーを意味する。
【００３６】
用語「ｑＰＣＲ」は、定量的ポリメラーゼ連鎖反応を意味する。用語「ｑＰＣＲ」又は「ＱＰＣＲ」は、例えばPCR Technique: Quantitative PCR, J.W. Larrick, ed., Eaton Publishing, 1997 および A-Z of Quantitative PCR, S. Bustin, ed., IUL Press, 2004に記載する定量的ポリメラーゼ連鎖反応を言う。
【００３７】
用語「ＴＣＣ」は、膀胱の移行上皮細胞癌を意味する。ＴＣＣは全膀胱癌の〜９５％を占める。
【００３８】
本明細書では、「抗体」および同様の用語は、免疫グロブリン分子および免疫グロブリン（Ｉｇ）分子の免疫学的に活性な部分、すなわち抗原と特異的に結合する（免疫反応する）抗原結合部位を含む分子、を言う。これらにとしては、限定されないが、多クローン抗体、単クローン抗体、キメラ、単鎖、Ｆｃ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’およびＦａｂ２断片、ならびにＦａｂ発現ライブラリーが挙げられる。抗体分子は、クラスＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＥおよびＩｇＤのいずれかに関連しており、それらは分子中に存在する重鎖の性質によって互いに異なっている。これらはＩｇＧ１、ＩｇＧ２、およびその他のようなサブクラスを含む。軽鎖は、カッパ鎖またはラムダ鎖であってもよい。本明細書における抗体の参照には、全てのクラス、サブクラスおよびタイプに対する参照が含まれる。更に、例えばマウスまたはヒトの配列のように一つを越える供給源に対して特異的である単クローン抗体またはその断片のようなキメラ抗体も含まれる。更にまた、ラクダ科動物の抗体、サメの抗体またはナノボディも含まれる。
【００３９】
用語「癌」および「癌性の」は、異常なまたは制御されない細胞増殖を通常、特徴とする哺乳動物における生理的状態を言うか、または述べている。癌および癌の病理は、例えば、転移；隣接する細胞の正常機能に対する阻害；サイトカインまたは他の分泌産物の異常量の放出；炎症または免疫反応の抑制または悪化；腫瘍形成；前悪性の状態；悪性の状態；リンパ節等の周縁または遠隔組織または器官の侵入；に関与する可能性がある。
【００４０】
用語「腫瘍」は、悪性であろうと良性であろうと、全ての腫瘍性の細胞成長および増殖、ならびに全ての前癌および癌細胞および組織を言う。
【００４１】
用語「マイクロアレイ」は、キャプチャー剤、好ましくはポリヌクレオチド（例えばプローブ）またはポリペプチドが基質上に規則的に、または不規則に配置したものを言う。例えば、Microarray Analysis, M. Schena, John Wiley & Sons, 2002; Microarray Biochip Technology, M. Schena, ed., Eaton Publishing, 2000; Guide to Analysis of ＤＮＡ Microarray Data, S. Knudsen, John Wiley & Sons, 2004; and Protein Microarray Technology, D. Kambhampati, ed., John Wiley & Sons, 2004を参照のこと。
【００４２】
用語「オリゴヌクレオチド」は、ポリヌクレオチド、通常はプローブまたはプライマーを言い、限定されないが、一本鎖デオキシリボヌクレオチド、一本鎖または二本鎖のリボヌクレオチド、ＲＮＡ：ＤＮＡハイブリッドおよび二本鎖ＤＮＡが挙げられる。一本鎖ＤＮＡプローブオリゴヌクレオチドのようなオリゴヌクレオチドは、化学的方法、例えば市販の自動化オリゴヌクレオチド合成装置を用いて、またはインビトロ発現システム、組み換え技術、ならびに細胞および生物における発現を含む種々の他の方法により、しばしば合成される。
【００４３】
用語「ポリヌクレオチド」は、単数または複数形で用いられた時、いずれかのポリヌクレオチドまたはポリデオキシヌクレオチドを言い、それらは改変されないＲＮＡもしくはＤＮＡ、または改変されたＲＮＡもしくはＤＮＡであってもよい。これは、非限定的に、一本鎖および二本鎖ＤＮＡ、一本鎖および二本鎖領域を含むＤＮＡ、一本鎖および二本鎖ＲＮＡ、ならびに一本鎖および二本鎖領域を含むＲＮＡ、一本鎖もしくは、より一般的には二本鎖であってもよい、または一本鎖および二本鎖領域を含む、ＤＮＡおよびＲＮＡを含むハイブリド分子を含む。更に、ＲＮＡもしくはＤＮＡ、またはＲＮＡおよびＤＮＡの両方を含む三本鎖領域も含まれる。ｍＲＮＡ、ｃＤＮＡおよびゲノムＤＮＡおよびそれらの断片が、特に含まれる。この用語は、トリチウム標識された塩基またはイノシンのような異常塩基などの改変された一つ以上の塩基を含有するＤＮＡおよびＲＮＡを含む。本発明のポリヌクレオチドは、コーディングまたはアンチコーディング配列もしくはセンスまたはアンチセンス配列を包含することができる。当然のことながら、本明細書で、「ポリヌクレオチド」または同様な用語の参照には、全長配列ならびにそれらのいずれかの断片、誘導体または変異体を含まれる。
【００４４】
本明細書で用いる「ポリペプチド」は、オリゴペプチド、ペプチドもしくはタンパク配列、またはそれらの断片、および天然分子、組み換え分子、合成または半合成分子を言う。天然に存在するタンパク分子のアミノ酸配列に言及するために、「ポリペプチド」を本明細書に列挙する場合、「ポリペプチド」または同様な用語は、アミノ酸配列を全長分子の完全な天然アミノ酸配列に限定することを意味するものではない。当然のことながら、本明細書において、「ポリペプチド」または同様な用語の各参照には、全列配列ならびにそれらの任意の断片、誘導体または変異体が含まれるであろう。
【００４５】
ハイブリダイゼーション反応の「ストリンジェンシー」は当業者により容易に決定でき、一般的に、プローブの長さ、洗浄温度および塩濃度に依存した経験的な計算でなされる。一般的に、プローブが長くなると適切なアニ―リングのために、より高い温度が必要となり、一方プローブが短くなると、より低い温度が必要となる。ハイブリダイゼーションは、一般的に、その融点より低い環境に相補鎖が存在する場合、変性したＤＮＡが再アニーリングする能力に依存する。プローブとハイブリダイズさせる配列間の所望の相同性の度合いが高いほど、適用することができる相対温度は高くなる。その結果、相対温度が高いほど、反応条件がよりストリンジェントになるであろうし、一方相対温度が低いほどストリンジェンシーはより少なくなる。ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーの更なる詳細および説明は、例えば、Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, Wiley lnterscience Publishers, (1995)に見られる。
【００４６】
「ストリンジェントな条件」または「高度なストリンジェンシー条件」は、本明細書では、通常は（１）洗浄において低イオン強度および高温を用い、例としては０．０１５M塩化ナトリウム／０．００１５Mクエン酸ナトリウム／０．１％ドデシル硫酸ナトリウム、５０℃；（２）ホルムアミドのような変性剤をハイブリダイゼーション中に用い、例としては、５０％（ｖ／ｖ）ホルムアミドを０．１％ウシ血清アルブミン／０．１％Ｆｉｃｏｌｌ／０．１％ポリビニルピロリドン／５０mMリン酸ナトリウムバッファー、ｐＨ６．５、７５０mM塩化ナトリウム、７５mMクエン酸ナトリウム中に、４２℃；または（３）５０％ホルムアミド、５ＸＳＳＣ（０．７５M ＮａＣｌ、０．０７５Ｍクエン酸ナトリウム）、５０mMリン酸ナトリウム（ｐＨ６．８）、０．１％ピロリン酸ナトリウム、５Ｘ Denhardt's溶液、超音波処理サケ精子ＤＮＡ（５０μg／ml）、０．１％ＳＤＳ、および１０％デキストラン硫酸、４２℃を用い、洗浄は４２℃において、０．２ＸＳＳＣ（塩化ナトリウム／クエン酸ナトリウム）および５０％ホルムアミドで５５℃、次いでＥＤＴＡを含む０．１ＸＳＳＣで５５℃から成る高ストリンジェンシー洗浄を行う。
【００４７】
「中程度にストリンジェントな条件」は、Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, New York: Cold Spring Harbor Press, 1989に記載されたものを参照としても良く、上記のものよりはストリンジェンシーの低い洗浄溶液およびハイブリダイゼーション条件（例えば、温度、イオン強度およびＳＤＳ％）の使用を含む。中程度にストリンジェントな条件の例としては、２０％ホルムアミド、５ＸＳＳＣ（１５０mM ＮａＣｌ、１５mMクエン酸酸三ナトリウム）、５０mMリン酸ナトリウム（ｐＨ７．６）、５ＸＤｅｎｈａｒｄｔ’ｓ溶液、１０％デキストラン硫酸、および２０mg／mlの変性、せん断したＤＮＡを含む溶液中で３７℃一夜インキュベートし、次いでフィルターを１ＸＳＳＣ中で約３７〜５０℃にて洗浄する。当業者であれば、温度、イオン強度等を、プローブの長さ等のような因子に適応するため必要に応じて、調整する方法を認識するであろう。
【００４８】
本発明の実施には、別段指定のない限り、当技術分野の範囲にある、分子生物学（組み換え技術を含む）、微生物学、細胞生物学および生化学の通常の技術が用いられるであろう。そのような技術はMolecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd edition, Sambrook et al., 1989; Oligonucleotide Synthesis, MJ Gait, ed., 1984; Animal Cell Culture, R.I. Freshney, ed., 1987; Methods in Enzymology, Academic Press, Inc.; Handbook of Experimental Immunology, 4th edition, D .M. Weir & CC. Blackwell, eds., Blackwell Science Inc., 1987; Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells, J. M. Miller & M.P. Calos, eds., 1987; Current Protocols in Molecular Biology, F.M. Ausubel et al., eds., 1987; および PCR: The Polymerase Chain Reaction, Mullis et al., eds., 1994、のような文献に十分に説明している。
【００４９】
本発明の実施態様の説明
マイクロアレイ分析および定量的ポリメラーゼ連鎖反応（ｑＰＣＲ）の組み合わせを用いて、腫瘍において低発現の、膀胱の移行上皮細胞癌（ＴＣＣ）のマーカーを同定した。驚くべきことには、これらのマーカー、および他の膀胱腫瘍マーカー（ＢＴＭ）、特に腫瘍において過剰発現しているマーカーとの間の比は、膀胱癌の診断に関するものであることを見出した。
【００５０】
比（マーカーの絶対値を測定するよりもむしろ）は、膀胱癌細胞の特徴を表している、単純な遺伝子発現「兆候」を同定し、驚くべきことに、試料採取技術または尿濃度の変動に対して、より耐性がある。更に、低発現マーカーと過剰発現マーカーを組み合わせると、患者から試料と非悪性コントロールからの試料の間の差が最大になり、試験の信頼性が向上する。本明細書に記載する低発現マーカーは、(i)ＴＣＣにおける強く、一貫した下方制御、(ii)正常組織における高発現、および(iii)血尿を呈する患者での擬陽性のリスクを最小にするため、全血における発現がわずかであること、に基づいて選択した。
【００５１】
二つのＢＴＭ比の測定の代用として、低発現および過剰発現ＢＴＭを回帰分析または線形識別分析を含む分類分析で分析できることも発見され、これらの分析の結果はまた、膀胱癌の存在の指標である。
【００５２】
試験には、癌を有すると疑われる、または癌を有するリスクのある患者からの試料中の、ＢＴＭのようなＴＭマーカーの少なくとも二つの測定が含まれており、ＴＭの少なくとも一つは低発現ＴＭである。低発現ＴＭと他のＴＭの比は癌の存在の指標である。第二のＴＭは当技術分野で知られている任意のＴＭでも可能であるが、好ましくは過剰発現ＢＴＭである。図３は、本発明で使用適性のある多くの低発現マーカーを示す。
【００５３】
試験は、一つの低発現ＴＭを一つの過剰発現ＴＭと組み合わせて使用して行うのが最良である。例えば任意の過剰発現ＴＭも使用することができる。浸潤性膀胱腫瘍（本明細書ではステージ１以上の腫瘍として規定される）から特定された既知の過剰発現ＢＴＭは、表１１に概要を述べてあり、表在性膀胱腫瘍（本明細書ではステージＴａおよびＴｉｓ腫瘍として規定される）から特定された過剰発現ＢＴＭを図１２に示す。
【００５４】
本発明に使用する好ましい低発現ＢＴＭは、全血において有意には上昇しておらず、腫瘍細胞および非悪性膀胱細胞の両方において十分に高いコピー数存在することが立証されたことはまた驚くべきことである。図４に好ましい低発現ＢＴＭの概要を述べる。
【００５５】
癌マーカーは、任意の適切な技術を用いて試料中に検出することができ、限定されないが、オリゴヌクレオチドプロ−ブ、ｑＰＣＲまたは癌マーカーに対する抗体、が含まれる。
【００５６】
当然のことながら、試験される試料は、腫瘍であると疑われる組織の試料に限定されない。マーカーは、血清中に分泌され、細胞膜から脱落し、溶解した細胞から放出され、または尿中へと失われる細胞に付着している可能性がある。それ故、試料としては任意の身体試料を含み、生検試料、血液、血清、腹膜洗浄液、脳精髄液、尿および便試料が挙げられる。
【００５７】
当然のことながら、本発明はヒトにおける癌の検出に限られておらず、限定されないが、イヌ、ネコ、ウマ、ウシ、ヒツジ、シカ、ブタおよび癌に罹患することが知られている任意の他の動物を含む、任意の動物において癌の検出に適している。
【００５８】
癌検出の一般的方法
以下の方法は、ＴＭを測定するために用いることができる非限定的な方法である。個々のＴＭの測定後、高および低発現ＢＴＭファミリーメンバーの間の比を測定する。これらの比は癌が存在するかしないかを予測するために使用する。
【００５９】
あるいは、ＴＭの高および低発現は、回帰または分類分析に用いる。これらの分析結果もまた、癌が存在するかしないかを予測するために使用する。
【００６０】
当然のことながら、発現レベルを測定するどのような方法も適切であろうが、発現レベルを測定する一般方法の概要を以下に述べる。
【００６１】
定量的ＰＣＲ（ｑＰＣＲ）
定量的ＰＣＲ（ｑＰＣＲ）は、ＢＴＭ特異的プライマーおよびプローブを用いて、腫瘍試料、血清、血漿および尿試料について行うことができる。コントロール反応において、ＰＣＲ反応で生成した産物の量は、出発テンプレートの量と相関する(Sambrook, J., E Fritsch, E. and T Maniatis, Molecular Cloning: A Laboratory Manual 3rd. Cold Spring Harbor Laboratory Press: Cold Spring Harbor (2001))。ＰＣＲ産物の定量化は、試薬が律速になる前に、対数期にある時にＰＣＲ反応を停止させることによって行うことができる。それからＰＣＲ産物をアガロースまたはポリアクリルアミドゲル中で電気泳動させ、臭化エチジウム染色または同等のＤＮＡ染色を行い、染色の強度をデンシトメトリーによって測定する。または、ＰＣＲ反応の進行を、産物の蓄積をリアルタイムで測定するApplied Biosystems1 Prism 7000または the Roche LightCyclerのようなＰＣＲ装置を用いて測定することができる。リアルタイムＰＣＲは、Sybr Greenのような色素を合成ＰＣＲ産物へ挿入してＤＮＡ蛍光を測定するか、または消光分子から切断された時に、レポーター分子によって放出される蛍光を測定する；レポーターおよび消光分子は、プライマーオリゴヌクレオチドからのＤＮＡ鎖伸長の後、標的ＤＮＡ分子にハイブリダイズさせるオリゴヌクレオチドプローブに組み込ませておく。オリゴヌクレオチドプローブは、次のＰＣＲサイクルにおいてＴａｑポリメラーゼの酵素作用により、置換されかつ分解され、消光分子からレポーターを放出させる。Scorpion（登録商標）として知られる一つの変法においては、プローブはプライマーに共有結合している。
【００６２】
逆転写ＰＣＲ（ＲＴ−ＰＣＲ）
ＲＴ−ＰＣＲは、薬剤治療を受ける、または受けない正常および腫瘍組織において、異なった試料群におけるＲＮＡレベルを比較し、発現の型を特徴づけ、近縁関係にあるＲＮＡを識別し、ＲＮＡ構造を分析するために用いることができる。
【００６３】
ＲＴ−ＰＣＲについては、最初のステップは標的試料からＲＮＡを分離することである。出発物質は、通常は、ヒトの腫瘍または腫瘍細胞株、およびそれぞれに対応する正常組織または細胞株である。ＲＮＡは、乳房、肺、結腸（例えば大腸または小腸）、結腸直腸、胃、食道、肛門、直腸、前立腺、脳、肝臓、すい臓、脾臓、胸腺、精巣、卵巣、子宮、膀胱等からの腫瘍試料、原発性腫瘍または腫瘍細胞株からの、および健常提供者からのプールさた組織、のような種々の試料から分離することができる。もしＲＮＡ源が腫瘍ならば、ＲＮＡは、例えば、凍結したまたは保存したパラフィン包埋および固定（ホルマリン固定）した組織試料から抽出することができる。
【００６４】
ＲＴ−ＰＣＲによる遺伝子発現プロファイリングの最初のステップは、ＲＮＡテンプレートのｃＤＮＡへの逆転写であり、次いでＰＣＲ反応における指数関数的な増幅を行う。二つの最も普通に使用されている逆転写酵素はトリ骨髄芽球症ウイルスの逆転写酵素（ＡＭＶ−ＲＴ）およびＭｏｌｏｎｅｙマウス白血病ウイルス逆転写酵素（ＭＭＬＶ−ＲＴ）である。逆転写ステップは、通常は、状況と発現プロファイリングの目的に応じて、特異的なプライマー、ランダムヘキサマーまたはオリゴｄＴプライマーを用いて開始する。例えば、抽出されたＲＮＡは、GeneAmp RNA PCR キット (Perkin Elmer, CA, USA)を用いて、メーカーの指示に従って、逆転写することができる。得られたｃＤＮＡを次のＰＣＲ反応におけるテンプレートとして用いることができる。
【００６５】
ＰＣＲステップは種々の熱安定性のＤＮＡ依存ＤＮＡポリメラーゼを用いることができるが、通常は、５’‐３’ヌクレーゼ活性を有するが、３’‐５’プルーフリーディングエンドヌクレアーゼ活性を欠くＴａｑＤＮＡポリメラーゼを用いる。従って、ＴａｑＭａｎ（ｑ）ＰＣＲは通常は、ＴａｑまたはＴｔｈポリメラーゼの５’ヌクレアーゼ活性を、標的アンプリコン結合しているハイブリダイゼーションプローブを加水分解するために用いるが、同等の５’ヌクレアーゼ活性を有するいかなる酵素も用いることができる。
【００６６】
二つのオリゴヌクレオチドプライマーが、ＰＣＲ反応に典型的なアンプリコンを生成するために用いる。第三のオリゴヌクレオチドまたはプローブは、二つのＰＣＲプライマーの間に存在するヌクレオチド配列を検出するために設計される。プローブはＴａｑＤＮＡポリメラーゼ酵素によっては伸長されず、レポーター蛍光色素および消光蛍光色素で標識されている。二つの色素が、プローブ上でのように接近して存在する場合、レポーター色素からの、いかなるレーザー誘導発光も消光色素によって消光される。増幅反応の間、ＴａｑＤＮＡポリメラーゼ酵素はプローブを、テンプレート依存的に切断する。その結果のプローブ断片は、溶液中に分散し、放出されたレポーター色素からのシグナルは、第二のフルオロフォアの消光効果を受けない。新分子が合成されるごとに、レポーター色素１分子が放出され、消光されないレポーター色素の検出により、データの定量的解釈の基盤が与えられる。
【００６７】
ＴａｑＭａｎＲＴＰＣＲは、例えばABI PRISM 7700 Sequence Detection System (Perkin-Elmer-Applied Biosystems, Foster City, CA, USA), または Lightcycler (Roche Molecular Biochemicals, Mannheim, Germany)のような市販の装置を用いて行うことができる。好ましい一実施態様では、５’ヌクレアーゼ手順は、ABI PRISM 7700tam Sequence Detection Systemのようなリアルタイム定量ＰＣＲ装置で行われる。システムは、サーモサイクラー、レーザー、チャージカップル装置（ＣＣＤ）、カメラおよびコンピュータから成る。システムは、サーモサイクラー上の９６穴型中の試料を増幅する。増幅中、レーザー誘導蛍光シグナルをリアルタイムで、光ファイバーケーブルを通じて全９６穴から集め、ＣＣＤで検出する。システムは機器の操作とデータ分析のためのソフトウエアを含む。
【００６８】
５’ヌクレアーゼアッセイデータは、はじめにＣｔまたは閾値サイクルとしてとして表される。上に考察したように、蛍光値は、各サイクルの間記録され、増幅反応におけるその時点での増幅された産物の量を表す。蛍光シグナルが、統計的に有意であると最初に記録された時点が、閾値サイクルである。
【００６９】
リアルタイム定量ＰＣＲ（ｑＰＣＲ）
ＲＴ−ＰＣＲ技術の最近の変種は、二重標識蛍光プローブ（すなわちＴａｑＭａｎプローブ）によって、ＰＣＲ産物の蓄積を測定するリアルタイム定量ＰＣＲである。リアルタイムＰＣＲは、競合定量ＰＣＲと相対定量ＰＣＲの両方に適合する。前者は、基準化のために各標的配列に対して内部競合剤を用い、一方後者は、試料中に含まれる基準化遺伝子、またはＲＴ−ＰＣＲについてはハウスキーピング遺伝子を用いる。更なる詳細は、例えばHeld et al., Genome Research 6: 986-994 (1996)によって与えられる。
【００７０】
発現レベルは、ＲＮＡ源として固定したパラフィン包埋組織を用いて測定可能である。
本発明の一態様によれば、ＰＣＲプライマーおよびプローブは、増幅されるべき遺伝子のイントロン配列に基づいて設計する。この実施態様では、プライマー／プローブ設計の第一段階は遺伝子内のイントロン配列の描写である。これは、Kent, W. J., Genome Res. 12 (4): 656-64 (2002)が開発したＤＮＡ ＢＬＡＴソフトウエアのような公的に入手可能なソフトウエア、またはその変種を含むＢＬＡＳＴソフトウエアによって行うことができる。その後の段階として、ＰＣＲプライマーおよびプローブ設計についての定評のある方法が続く。
【００７１】
非特異的なシグナルを避けるためにプライマーおよびプローブを設計する時にイントロン内の反復配列をマスクすることが有用である。これは、ベイラー医科大学を通じてオンラインで得られるRepeat Maskerプログラムを用いて容易に実施することができ、このプログラムはＤＮＡ配列を反復要素のライブラリーに対してスクリーニングし、反復要素がマスクされたクエリー配列を返す。マスクされた配列を、Primer Express (Applied Biosystems)；MGB assay-by-design (Applied Biosystems)；Primer3 (Steve Rozen and Helen J. Skaletsky (2000)、のような、いずれかの市販のまたは公的に得られるプライマー／プローブパッケジを用いて、プライマーおよびプローブを設計するために用いることができる。Primer3は一般利用者のためにはＷＷＷにあり、生物学プログラマーのために
Krawetz S, Misener S (eds) Bioinformatics Methods and Protocols: Methods in Molecular Biology. Humana Press, Totowa, NJ, pp 365-386)に記載している。
【００７２】
ＰＣＲプライマー設計において考慮すべき最も重要な要素としては、プライマー長、融点（Ｔｍ）およびＧ／Ｃ含量、特異性、相補的プライマー配列および３’末端配列が挙げられる。一般的に、最適ＰＣＲプライマーは、一般的に１７〜３０塩基長であり、約２０〜８０％、例えば約５０〜６０％Ｇ＋Ｃ塩基を含む。融点は５０と８０℃の間、例えば約５０から７０℃が通常、好まれる。ＰＣＲプライマーおよびプローブ設計に関する更なる指針としては、例えばDieffenbach, C. W. et al., General Concepts for PCR Primer Design in: PCR Primer, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York, 1995, pp. 133-155; lnnis and Gelfand, Optimization of PCRs in: PCR Protocols, A Guide to Methods and Applications, CRC Press, London, 1994, pp. 5-11 ; and Plasterer, T. N. Primerselect: Primer and probe design. Methods MoI. Biol. 70: 520-527 (1997)を参照されたい。これらの全開示内容は、参照により本明細書に明確に援用される。
【００７３】
マイクロアレイ分析
差次的発現はまた、マイクロアレイ技術を用いて同定または確認することができる。従って、ＣＣＰＭｓの発現プロフィールは、新鮮腫瘍組織またはパラフィン包埋腫瘍組織のどちらかで、マイクロアレイ技術を用いて測定することができる。この方法では、対象となるポリヌクレオチド配列（ｃＤＮＡおよびオリゴヌクレオチド）をマイクロチップ基材上に蒔く、または整列させる。整列した配列（すなわちキャプチャープローブ）は、対象となる細胞または組織（すなわち標的）からの特定のポリヌクレオチドとハイブリダイゼ−ションさせる。ＲＴ−ＰＣＲ法におけるように、ＲＮＡの源は、通常、ヒト腫瘍または腫瘍細胞株、および対応する正常組織または細胞株から分離した全ＲＮＡである。従って、ＲＮＡは、種々の原発腫瘍または腫瘍細胞株から分離することができる。もしＲＮＡ源が原発腫瘍である場合は、ＲＮＡは、日常の診療において常に調製し保存している、例えば凍結した、または保存したホルマリン固定パラフィン包埋（ＦＦＰＥ）組織試料および固定(例えばホルマリン固定)組織試料から抽出することができる。
【００７４】
マイクロアレイ技術の具体的な実施態様では、ｃＤＮＡクローンのＰＣＲ増幅された挿入断片を基材に添加する。基材は、１、２、５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、または７５までのヌクレオチド配列を含むことができる。他の態様では、基材は少なくとも１０，０００ヌクレオチド配列を含むことができる。マイクロアレイの配列は、マイクロチップ上に固定され、ストリンジェントな条件下でハイブリダイゼ−ションを行うのに適している。他の実施態様として、マイクロアレイの標的は、少なくとも５０、１００、２００、４００、５００、１０００、または２０００塩基長；または５０〜１００、１００〜２００、１００〜５００、１００〜１０００、１００〜２０００または５００〜５０００塩基長であり得る。更なる実施態様として、マイクロアレイのためのキャプチャープローブは、少なくとも１０、１５、２０、２５、５０、７５、８０、または１００塩基長：または１０〜１５、１０〜２０、１０〜２５、１０〜５０、１０〜７５、１０〜８０または２０〜８０塩基長であり得る。
【００７５】
蛍光標識ｃＤＮＡプローブは、対象となる組織から抽出されたＲＮＡの逆転写による蛍光ヌクレオチドの組み込みによって作製してもよい。チップに添加された標識ｃＤＮＡプローブは、アレイ上のＤＮＡの各スポットに、特異性をもってハイブリダイゼ−ションする。非特異的に結合したプローブを除去するためのストリンジェントな洗浄の後、共焦点レーザー顕微鏡またはＣＣＤカメラのような別の検出方法で、チップを走査する。各アレイの要素のハイブリダイゼ−ションの定量によって、対応するｍＲＮＡの存在量の評価が可能になる。二つの源からのＲＮＡから作製した、二重蛍光色で別々に標識されたｃＤＮＡプローブは、対としてアレイとハイブリダイゼ−ションさせる。それぞれの特定遺伝子に対応する二つの源からの転写物の相対的な存在量を、このようにして同時に測定する。このための代表的なプロトコルは、実施例４に詳細に記述する。
【００７６】
ハイブリダイゼ−ションの小型化によって、膨大な遺伝子の発現型の便利で迅速な評価が利用可能になる。該方法は、細胞あたり数コピーで発現する、稀有な転写物を検出するために、および発現レベルにおける約２倍の差を再現性良く検出するために、必要となる感度を有することが示された(Schena et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93 (2): 106-149 (1996))。マイクロアレイ分析は、Affymetrix GenChip technology, lllumina microarray technology またはIncyte's microarray technologyのような市販の装置によって、メーカーのプロトコルに従って行うことができる。遺伝子発現の大規模分析のためのマイクロアレイ法の開発によって、癌分類の分子マーカーを体系的に探査すること、種々の腫瘍型における効果予測することが可能になる。
【００７７】
ＲＮＡの分離、精製および増幅
当技術分野においてｍＲＮＡ抽出のための一般的方法は良く知られており、Ausubel et al., Current Protocols of Molecular Biology, John Wiley and Sons (1997)を含む標準的な分子生物学の教科書に開示されている。パラフィン包埋組織からのＲＮＡ抽出法は例えばRupp and Locker, Lab Invest. 56: A67 (1987), and De Sandres et al., BioTechniques 18: 42044 (1995)に開示している。特に、ＲＮＡ抽出は、Ｑｉａｇｅｎのような業者からの精製キット、バッファーセットおよびプロテアーゼを用いて、メーカーの指示に従って行うことができる。例えば、培養細胞らの全ＲＮＡはQiagen RNeasy mini-columnsを用いて分離することができる。他の市販のＲＮＡ分離キットとしては、MasterPure Complete ＤＮＡ and ＲＮＡ Purification Kit (EPICENTRE (D, Madison, Wl)およびParaffin Block ＲＮＡ Isolation Kit (Ambion, Inc.)が挙げられる。
組織試料からの全ＲＮＡは、ＲＮＡ Stat-60 (Tel- Test)を用いて分離することができる。腫瘍から調製されたＲＮＡは、塩化セシウム密度勾配遠心法によって分離できる。
【００７８】
固定パラフィン包埋組織をＲＮＡ源として用い、ｍＲＮＡ分離、精製、プライマー伸長および増幅を含む、遺伝子発現のプロファイリングのための代表的なプロトコルのステップは、種々の公刊された雑誌の論文に与えられている(例えば: T. E. Godfrey et al. J. Molec. Diagnostics 2: 84-91 (2000); K. Specht et al., Am. J. Pathol. 158: 419-29 (2001))。手短に説明すれば、代表的な手順は、パラフィン包埋腫瘍組織試料の約１０μｍ厚の切片を切ることから始まる。それからＲＮＡを抽出し、タンパクとＤＮＡを除去する。ＲＮＡの濃度の分析後、必要であれば、ＲＮＡ修復および／または増幅ステップを含めても良く、それからＲＮＡを、遺伝子特異的なプロモータを用いて逆転写し次いでＲＴ−ＰＣＲを行う。最後に、データを分析し、検査した腫瘍試料において同定された特徴的な遺伝子発現パターンに基づき、患者が得られる最良の治療の選択を明らかにする。
【００７９】
免疫組織化学およびプロテオミクス
免疫組織化学法はまた、本発明の増殖マーカーの発現レベルを検出するのに適している。従って、各マーカーに特異的な、抗体または抗血清、好ましくはポリクロナール抗血清、最も好ましくはモノクロナール抗体を、発現を検出するために用いる。抗体は、例えば放射線標識、蛍光標識、ビオチンのようなハプテン標識、またはセイヨウワサビペルオキシダーゼまたはアルカリホスファターゼのような酵素での、抗体自身の直接標識によって検出することができる。あるいは、未標識の第一次抗体を、第一次抗体に特異的な抗血清、ポリクロナール抗血清またはモノクロナール抗体を含む標識された第二次抗体と組み合わせて用いる。免疫組織化学プロトコルおよびキットは当技術分野で良く知られており、市販されている。
【００８０】
プロテオミックスは、試料中（例えば、組織、器官または培養細胞）に存在するポリペプチドをある時点において分析するために用いることができる。特に、プロテオミック技術は試料中のポリペプチド発現の包括的な変化の評価をするために用いることができる（発現プロテオミックスとも呼ばれる）。プロテオミック分析は、通常は：（１）二次元ゲル電気泳動法（２−ＤＰＡＧＥ）による試料中の個々のポリペプチドの分離；（２）ゲルから回収された個々のポリペプチドの同定、例えば質量分光分析またはＮ末端配列決定による；および（３）生物情報科学を用いての分析を含む。プロテオミックス法は、単独で、または本発明の増殖マーカーの産物を検出するための他の方法と組み合わせて、遺伝子発現プロファイリングの他の方法に対する貴重な補助である。
【００８１】
マーカーに対して選択的である核酸プローブを用いたハイブリダイゼ−ション方法
これらの方法は、核酸プローブを支持体に結合させ、試験試料から由来したＲＮＡまたはｃＤＮＡと適切な条件下でハイブリダイゼ−ションさせることを含む(Sambrook, J., E Fritsch, E. and T Maniatis, Molecular Cloning: A Laboratory Manual 3rd. Cold Spring Harbor Laboratory Press: Cold Spring Harbor (2001))。これらの方法は、組織または液体試料から由来したＢＴＭに適用することができる。ＲＮＡまたはｃＤＮＡ製剤は、通常は検出と定量を可能にするために、蛍光または放射性分子で標識されている。いくつかの応用では、ハイブリダイゼ−ションするＤＮＡは、シグナル強度を増強するために、分岐した蛍光標識構造でタグを付けることができる(Nolte, F.S., Branched ＤＮＡ signal amplification for direct quantitation of nucleic acid sequences in clinical specimens. Adv. Clin. Chem. 33, 201- 35 (1998))。ハイブリダイゼ−ションしない標識は、蛍光検出またはゲル像のデンシトメトリーによってハイブリダイゼ−ションの量を定量する前に、０．１ＸＳＳＣ、０．５％ＳＤＳのような低塩溶液中での強い洗浄によって除去する。支持体はナイロンまたはニトロセルロースのような固体であっても、液体懸濁状態でハイブリダイゼ−ションする小球体またはビーズであってもよい。洗浄と精製を可能にするために、ビーズは磁石であってもよいし(Haukanes, B-I and Kvam, C, Application of magnetic beads in bioassays. Bio/Technology 11, 60-63 (1993))、またはフローサイトメトリーを可能にするために蛍光標識されていてもよい(例えば: Spiro, A., Lowe, M. and Brown, D., A Bead-Based Method for Multiplexed Identification and Quantitation of ＤＮＡ Sequences Using Flow Cytometry. Appl. Env. Micro. 66, 4258-4265 (2000)を参照)。
【００８２】
ハイブリダイゼ−ション技術の変種は、蛍光ビーズ支持体と分岐ＤＮＡシグナル増幅を組み合わせたQuantiGene Plex（登録商標）アッセイ(Genospectra, Fremont)である。ハイブリダイゼ−ション技術の更に別の変種は、Quantikine（登録商標）ｍＲＮＡアッセイ (R&D Systems, Minneapolis)である。方法はメーカーの指示書中に記述してある。簡単に説明すれば、このアッセイは、ジゴキシゲニンと結合したオリゴヌクレオチドハイブリダイゼ−ションプローブを用いる。ハイブリダイゼ−ションは、呈色反応アッセイにおいて、アルカリホスファターゼと結合した抗ジゴキシゲニン抗体を用いて検出される。
【００８３】
追加の方法は、当技術において周知であり、本明細書にさらに記述する必要はない。
【００８４】
酵素結合免疫アッセイ（ＥＬＩＳＡ）
簡単に説明すれば、サンドイッチＥＬＩＳＡアッセイにおいては、ＢＴＭに対するポリクローンまたはモノクローン抗体は固体の支持体(Crowther, J. R. The ELISA guidebook. Humana Press: New Jersey (2000); Harlow, E. and Lane, D., Using antibodies: a laboratory manual. Cold Spring Harbor Laboratory Press: Cold Spring Harbor (1999))、または懸濁ビーズに結合している。他の方法は当技術分野において周知であり、更に本明細書で説明する必要はない。モノクロナール抗体は、ハイブリドーマ由来であることもできるし、またはファージ抗体ライブラリーから選択することができる(Hust M. and Dubel S., Phage display vectors for the in vitro generation of human antibody fragments. Methods MoI Biol. 295:71-96 (2005))。非特異的な結合部位は、非標的タンパク製剤および界面活性剤でブロックされる。それからキャプチャー抗体を、ＢＴＭ抗原を含む尿または組織の調製物とインキュベートする。抗体／抗原複合体を、標的ＢＴＭを検出する第二の抗体とインキュベートする前に、混合物を洗浄する。第二の抗体は通常は、酵素反応またはレポーターと結合している第三の抗体のいずれかによって検出される、蛍光分子または他のレポーター分子と結合している(Crowther, Id.)。または、直接ＥＬＩＳＡにおいては、ＢＴＭを含む調製物は、支持体またはビーズに結合でき、標的抗原は抗体―レポーター抱合体で直接検出される(Crowther, Id.)。
【００８５】
モノクロナール抗体およびポリクロナール抗血清を製造する方法は当技術分野においては公知であり、本明細書で更に説明する必要はない。
【００８６】
免疫検出
腫瘍を除くための手術の前後に採取された膀胱癌患者からの血清または血漿におけるマーカーファミリーメンバーの免疫検出；限定されないが、結腸直腸、膵臓、卵巣、黒色肉腫、肝臓、食道、胃、子宮内膜および脳を含む、他の癌を有する患者におけるマーカーファミリーメンバーの免疫検出；および膀胱癌患者からの尿および便試料におけるマーカーファミリーメンバーの免疫検出；のために、本方法を用いることもできる。
【００８７】
ＢＴＭはまた、免疫ブロッティングまたは免疫沈降のような他の標準的な免疫検出法を用いて、組織または尿中で検出することができる(Harlow, E. and Lane, D., Using antibodies: a laboratory manual. Cold Spring Harbor Laboratory Press: Cold Spring Harbor (1999))。免疫ブロッティングにおいては、ＢＴＭを含む組織または液体からのタンパク調製物を、変性または非変性状態で、ポリアクリルアミドゲルを介して電気泳動する。それからタンパクを、ナイロンのような膜状支持体に移動させる。その後、ＢＴＭを直接または間接的に、免疫組織化学について記述したように、モノクロナール抗体またはポリクロナール抗体と反応させる。あるいは、ある調製物では、タンパクを先に電気泳動分離することなしに膜に直接スポットすることができる。シグナルはデンシトメトリーにより定量することができる。
【００８８】
免疫沈降において、ＢＴＭを含む可溶性の調製物をＢＴＭに対するモノクロナール抗体またはポリクロナール抗体とインキュベートする。反応混合物を、それから共有結合したプロテインＡまたはプロテインＧを有するアガロースまたはポリアクリルアミドからなる不活性なビーズとインキュベートする。プロテインＡまたはプロテインＧビーズは、ビーズに結合した抗体−ＢＴＭ−抗原の固定された複合体を形成する抗体と特異的に相互作用する。洗浄後、結合したＢＴＭは免疫ブロッティングまたはＥＬＩＳＡによって検出および定量することができる。
【００８９】
閾値の決定
下方制御されたＢＴＭを用いた、比率または回帰分析のいずれかにおける試験のために、試料をＴＣＣに関して陽性または陰性と呼ぶことを可能にする、閾値を誘導する。これらの閾値は、ＴＣＣの存在を調査されている患者のコホートの分析によって決定されるであろう。閾値は異なった試験の適用により変動する可能性がある；例えば集団のスクリーニングにおける試験に使用する閾値は、主として泌尿器症状の無い患者のコホートを用いて決定されるであろうし、これらの閾値は、ＴＣＣ再発の監視下にある患者、または血尿のような泌尿器症状の存在を調査される患者に対する試験に用いる閾値とは異なっている可能性がある。閾値は、要求される臨床状況において試験の特異性の実用的なレベルを提供するために選択することができる；すなわち擬陽性の結果を受ける患者の数が過剰ではないような、適度な感度を可能にする特異性である。この特異性は８０〜９０％の範囲内にあればよい。試験の閾値を得る代替法の一つは、異なった試験の閾値について、感度を特異性に対してプロットし（ＲＯＣ曲線）、それから曲線の変曲点を選択する方法である。
【００９０】
単一閾値の代用として、試験は、疾患の存在の可能性の程度が異なる、およびそれらに関連した臨床結果が異なる、試験区間を用いてもよい。例えば、試験は三つの区間を有してもよい：一つはＴＣＣの存在の高リスク（例えば９０％）と関連する区間、第二はＴＣＣの低リスクと関連する区間、および第三は疾患の疑いがあると見なされる区間である。「疑わしい区間」は、規定された期間での再試験の推奨と関連し得る。
【００９１】
尿中の膀胱癌マーカーを検出する方法
いくつかの実施態様では、ＢＴＭに関するアッセイは、尿試料について行うことできることが望ましい。一般的に、これらの液体中のオリゴヌクレオチド、タンパクおよびペプチドに関するアッセイ方法は当技術分野では知られている。しかしながら、例示の目的で、ＢＴＭの尿レベルはサンドイッチ型酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）を用いて定量することができる。血漿または血清アッセイのために、適切に希釈した試料または段階希釈した標準ＢＴＭ５μl、およびペルオキシダーゼ抱合抗ヒトＢＴＭ抗体７５μlを、マイクロタイタープレートのウエルに加える。３０分間３０℃のインキュベーション期間の後、結合していない抗体を除くために、ウエルをリン酸バッファー食塩水（ＰＢＳ）中０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０で洗浄する。ＢＴＭと抗ＢＴＭ抗体の結合した複合体は、それからＨ２Ｏ２を含むo-フェニレンジアミンと１５分間３０℃でインキュベートする。当然のことながら、反応を１M Ｈ２ＳＯ４を加えて停止し、４９２nmでの吸光度をマイクロタ-イタープレートリーダーで測定する。抗ＢＴＭ抗体は、モノクロナール抗体またはポリクロナール抗体であり得る。
【００９２】
多くのタンパクは、（１）細胞によって分泌され、（２）細胞膜から切断され、（３）細胞死時に細胞から喪失するか、または（４）脱落した細胞内に含まれる、のいずれかであることから、当然のことながら、ＢＴＭは尿中で検出される可能性もある。更に加えて、膀胱癌の診断は、試料中のＢＴＭの発現、または試料中のＢＴＭの蓄積のいずれかを測定することにより決定することができる。診断の先行技術における方法には、膀胱鏡検査、細胞学的検査およびこれらの処置の間に抽出された細胞の検査が挙げられる。該方法は、尿中または尿路上皮のこすり取った試料中の、又は他の症例の場合、膀胱壁の生検試料中の腫瘍細胞の同定に依存した。これらの方法は、試料採取の誤り、観察者間の同定における誤差等を含む、数種類の誤差を被る。
【００９３】
膀胱腫瘍マーカーに対する抗体
更なる態様では、本発明は、ＢＴＭに対する抗体の製造を含む。本明細書に記載する方法を用いて、新規のＢＴＭを、マイクロアレイおよび／またはｑＰＣＲを用いて同定することができる。ひとたび推定マーカーが同定されると、免疫反応を誘発するのに十分な量の推定マーカーを製造することができる。場合によっては、全長ＢＴＭを用いることができ、他の場合は、免疫原としてＢＴＭのペプチド断片が十分であるかも知れない。免疫原は、適切な宿主（例えば、マウス、ウサギ等）に注射することができ、必要に応じて、完全フロイントアジュバント、フロイント不完全アジュバントのようなアジュバントを、免疫反応を増強させるために注射することができる。当然のことながら、免疫技術においては抗体を作成することは、ルーチンであり、本明細書でさらに記述する必要はない。その結果、本明細書に記載した方法を用いて、同定されたＢＴＭに対する抗体を製造することができる。
【００９４】
更なる実施態様では、本明細書で同定された腫瘍マーカーのタンパクまたはタンパクコアに対して、またはＢＴＭに特有のオリゴヌクレオチド配列に対して、抗体を作製することができる。ある種のタンパクはグリコシル化が可能であるが、グリコシル化のパターンの変種は、ある状況下においては、通常のグリコシル化パターンを欠いたＢＴＭの形を検出間違いする可能性がある。従って、本発明のある態様では、ＢＴＭ免疫原は、脱グリコシルＢＴＭまたは脱グリコシルＢＴＭ断片を含むことができる。脱グリコシル化は、当技術分野において知られる一つ以上のグリコシダーゼを用いて達成することができる。あるいは、ＢＴＭｃＤＮＡを、大腸菌等を含む原核生物細胞株のようなグリコシル化欠損細胞株において発現させることができる。
【００９５】
ＢＴＭをコードするオリゴヌクレオチドを有するベクターを作成することができる。多くのそのようなベクターは、当技術分野において周知の公知の標準ベクターを基礎とすることができる。ベクターは、種々の細胞株をトランスフェクトして、ＢＴＭを製造する細胞株を作製するために用いることができる。特異的抗体、またはＢＴＭ検出用の他の試薬を開発するため、またはＢＴＭに対して開発されたアッセイを基準化するため、ＢＴＭを製造する細胞株を用いて、所望量のＢＴＭを製造することができる。
【００９６】
キット
本発明の発見に基づいて、数種のタイプの試験キットを想定し製造することができる。第一に、検出分子（またはキャプチャー試薬）を予め搭載した検出装置を有するキットを作製できる。ＢＴＭｍＲＮＡの検出に関する実施態様では、該装置は、基材（例えば、ガラス、シリコン、石英、金属等）を含むことが可能であり、基材の上には、検出されるべきｍＲＮＡとハイブリダイゼ−ションするオリゴヌクレオチドがキャプチャー試薬として結合している。いくつかの実施態様では、ｍＲＮＡの直接検出は、ｍＲＮＡ（ｃｙ３、ｃｙ５、放射線標識または他の標識で標識されている）を基材上のオリゴヌクレオチドにハイブリダイゼ−ションさせることにより達成することが可能である。他の実施態様では、ｍＲＮＡの検出は、所望のｍＲＮＡに対する相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）をまず作製することによって達成可能である。それから、標識ｃＤＮＡを、基質上のオリゴヌクレオチドとハイブリダイゼ−ションさせ、検出できる。
【００９７】
抗体をキット中でキャプチャー試薬として用いることもできる。いくつかの実施態様では、基材（例えばマルチウエルプレート）はそこに付着した特異的ＢＴＭキャプチャー試薬を有することが可能である。いくつかの実施態様では、キットにブロッキング試薬を含ませることも可能である。ブロッキング試薬は非特異的な結合を減少させるために使用できる。例えば、非特異的なオリゴヌクレオチド結合は、サケ精子ＤＮＡのようなＢＴＭオリゴヌクレオチドを含まない、任意の都合の良い供給源からのＤＮＡの過剰量を用いて減少させることができる。非特異的な抗体の結合は、血清アルブミンのようなブロッキングタンパクの過剰量を用いて減少させることができる。当然のことながら、オリゴヌクレオチドおよびタンパクを検出するための数多くの方法が、当技術分野で知られており、ＢＴＭ関連分子を特異的に検出することが可能ないかなる戦略も使用することができ、本発明の範囲内にあると考えることができる。
【００９８】
基材に加えて、試験キットはキャプチャー試薬（プローブのような）、洗浄液（例えばＳＳＣ、他の塩、バッファー、洗剤等）ならびに検出部分（例えば、ｃｙ３、ｃｙ５、放射線標識等）を含むことができる。キットはまた、使用のための取扱説明書および包装を含むことができる。
【００９９】
膀胱癌Ｉの検出のために用いるＢＴＭ比
一連の実施態様では、過剰発現するＢＴＭと組み合わせてＢＴＭＬＴＢＤＨ４を検査するための試薬は、膀胱癌を検出するための、分画されない尿または尿細胞沈殿物の試験のためのキットに組み込むことができる。尿試料は、疾患の進行または治療に対する反応の監視を必要とする、膀胱癌と診断された患者、肉眼または顕微鏡的な血尿を含む泌尿器症状を有する個人、または無症状の個人、から採取することができる。分画されない尿中のＢＴＭを測定するキットを用いて試験される患者または個人については、試験用に尿の約２mlを採取して試験することができる。尿の沈殿物に関する試験については、＞１０mlの尿を採取することができる。
【０１００】
適切なキットとして：(i)使用および結果の解釈のための取扱説明書、(ii)任意の回帰分析分類子または式を含む、多遺伝子分析の解釈のためのソフトウエア、(iii)未分画の尿または尿沈殿物からのＲＮＡの安定化および精製のための試薬、(iv)ｄＮＴＰおよび逆転写酵素を含む、ｃＤＮＡの合成のための試薬、および(v)ＢＴＭｃＤＮＡの定量化のための試薬、が挙げられる。一つの形では、これらの試薬は、定量ＰＣＲに用いても良く、ＰＣＲに必要とされる、特異的なエクソンにまたがるオリゴヌクレオチドプライマー、検出のためのプローブで標識された第三のオリゴヌクレオチド、Ｔａｑポリメラーゼおよび他のバッファー、塩およびｄＮＴＰｓを含む。キットは、標識プローブまたは分岐ＤＮＡ技術によるＢＴＭ ＲＮＡの直接ハイブリダイゼ−ションのような転写物の検出のための他の方法；および(vi)品質管理測定としての機能を果たす、βアクチンのような高度に転写される遺伝子からの転写物を検出するためのオリゴヌクレオチドおよびプローブ、も使用できる。
【０１０１】
ＢＴＭ比を用いた膀胱癌の進行の評価
膀胱腫瘍の進行を評価するために、組織試料を膀胱壁の生検によって得、または膀胱癌を有する患者から尿試料を長い時間をかけて採取する。ＢＴＭまたはそれらの組み合わせの比の評価を、異なった時間に採取された試料について行う。特定の範囲内のＢＴＭ比は膀胱癌の進行を示す。
【０１０２】
ＢＴＭ比を用いた膀胱癌の治療の評価
膀胱腫瘍のための治療の効果を評価するために、組織および／または尿の試料を治療開始前に得る。一つ以上のＢＴＭのベースライン値を、互いに関して種々のＢＴＭの比を測定するのと同じように、測定する。治療を開始し、治療には、疾患の種類と段階に応じて、手術、放射線治療または化学療法を含めて、当技術分野において知られている任意の治療法を挙げることができる。治療過程の間、組織および／または尿の試料を採取し、ＢＴＭの存在および量を分析する。種々のＢＴＭの比を測定し、結果を（１）治療前の患者のベースライン値、または（２）膀胱癌を有しない個人の集団から得た正常値と比較する。
【０１０３】
ＴＣＣ療法の進行を監視するためのＢＴＭ比の使用
ＴＣＣの迅速診断および早期検出に加えて、組織、血清または尿において検出されたＢＴＭマーカー比は、治療に対する患者の反応を監視するために使用することができる。これらの応用において、尿および／または血清試料は、全身、小胞内または血管内化学療法、放射線療法または免疫療法の開始後、周期的に採取することができる。マーカー比の変化は、有効な治療を示す腫瘍サイズの減少を示す可能性がある。変化の比率は各患者または治療法のための最良の治療用量を予想するために用いることができる。
【０１０４】
ＢＴＭ回帰分析の利用
ＢＴＭ比に加えて、高および低発現ＢＴＭファミリーメンバーを含む、回帰または分類分析は上記の応用に用いることができる。
【０１０５】
評価したマーカーは、既知のヒト遺伝子から選択する。評価した遺伝子は図３および４に示す。図３および４に含まれるものは、遺伝子名、ＨＵＧＯ識別子、ＭＷＧオリゴ数、ＮＣＢＩ ｍＲＮＡ参照配列番号およびタンパク参照番号である。全長配列は、http://www.ncbi.nlm. nih.gov/entrez/に見出すことができる。
【０１０６】
実施例
本明細書で記述した実施例は本発明の実施態様を例示するためのものであって、本発明の範囲を制限する意図はない。他の実施態様、方法および分析の方法は分子診断技術における当業者の範囲内にあり、本明細書において詳細に記述する必要はない。本明細書の教えに基づく当技術分野の範囲内にある他の実施態様は、本発明の部分であると考えられる。
【０１０７】
方法
腫瘍の採取
膀胱腫瘍試料および非悪性尿路上皮試料は日本の京都大学病院において切除された外科手術標本から採取した。
【０１０８】
尿の採取
非悪性コントロールおよび膀胱癌患者からの尿試料は、日本の京都大学病院から得た。健常コントロール試料は日本人志願者から得た（図１）。
【０１０９】
ＲＮＡ抽出
腫瘍組織はTriReagent：水（３：１）混合物中でホモゲナイズし、それからクロロホルムで抽出した。その後、全ＲＮＡはそれからRNeasy（商標）手順(Qiagen)を用いて水相から精製した。ＲＮＡは、また１６の癌細胞株からも抽出し、参照ＲＮＡとして役立つようにプールした。
【０１１０】
ＲＮＡは、尿試料を等量の溶解バッファー（５．６４Ｍグアニジン−塩酸、０．５％サルコシル、５０ｍＭ酢酸ナトリウム（ｐＨ６．５）、および１mM β−メルカプトエタノール；ｐＨは７．０に１．５M Ｈｅｐｅｓ ｐＨ８で調整）と混合することにより、尿から抽出した。尿中のＲＮＡ量が低いことから、担体として作用させるために、全バクテリアＲＮＡ７．５μgを尿／溶解バッファー混合物に加えた。それから全ＲＮＡを、ＴｒｉｚｏｌおよびRNeasy（商標）手順を用いて抽出した。ＲＮＡ調製品は、Qiagen QIAquick（商標）PCR精製キットを用いて、ｃＤＮＡ合成の前に更に精製した。
【０１１１】
ＲＮＡは、３人の健常な志願者の血液から、３．６％デキストランにおける沈降を用いて全血から濃縮した細胞についてTrizol/RNeasy（商標）抽出を行うことにより抽出した。
【０１１２】
マイクロアレイスライドの調製
エポキシコーティングしたガラススライド(MWG Biotech)を、Gene Machinesマイクロアレイ作製ロボットを用いて、メーカーのプロトコルに従って、〜３０，０００の５０merオリゴヌクレオチド(MWG Biotech)でプリントした。
【０１１３】
ＲＮＡ標識およびハイブリダイゼーション
ｃＤＮＡは、５μg全ＲＮＡから、５−（３−アミノアリル）−２’デオキシウリジン−５’−三リン酸を含む反応において、Superscript II（商標）逆転写酵素(Invitrogen)を用いて転写した。反応混合物を、Ｃｙ３またはＣｙ５と炭酸水素塩バッファー中で１時間室温にてインキュベートする前に、Microconカラムで脱イオン化した。組み込まれていない色素はQiaquick カラム(Qiagen)を用いて除去し、SpeedVac中で試料を１５μlに濃縮した。Ｃｙ３およびＣｙ５で標識されたｃＤＮＡは、それからAmbion ULTRAhyb（商標）バッファーと混合し、１００℃、２分間で変性させ、ハイブリダイゼ−ションチェンバー内のマイクロアレイスライドと４２℃で１６時間ハイブリダイゼ−ションさせた。それからスライドを洗浄し、Axon 4000A（商標）スキャナー内で、２出力セッティングで２回走査した。
【０１１４】
癌マーカー遺伝子のマイクロアレイ分析
５３の膀胱腫瘍および２０の非悪性（「正常」）膀胱組織試料からのＲＮＡをＣｙ５で標識し、Ｃｙ３標識参照ＲＮＡと二重または三重でハイブリダイゼ−ションさせた。標準化した後、２９，７１８遺伝子のそれぞれの発現の変化を、倍変化率および統計的確率によって推定した。
【０１１５】
標準化手順
Genepix（商標）ソフトウエアにより検出した蛍光強度の中央値を、局所的なバックグラウンド強度を引き算することにより補正した。バックグラウンド補正強度がゼロ未満のスポットは排除した。標準化を容易にするために、強度比および総合的スポット強度を対数変換した。対数化した強度比は、LOCFIT（商標）パッケージで実施した局所回帰を用いて、色素および空間的バイアスに関して補正した。対数化した強度比は、総合的スポット強度および場所に関して同時に回帰させた。局所回帰の残余は、補正された対数化した倍変化率を与えた。品質管理のために、各標準化されたマイクロアレイの比をスポットの強度および局在化に関してプロットした。プロットをその後、人為産物の残余のいずれかが存在するかを肉眼的に検査した。更にANOVA モデルをpin-tipバイアスを検出するために適用した。統計分析のために、標準化の全ての結果およびパラメータをPostgresデータベースに挿入した。
【０１１６】
統計分析
アレイ間の測定倍変化率の比較を改良するために、log2(比)を、アレイ当たり同じ総合的標準偏差を有するように、率に応じて決めた。この標準化は平均組織内クラス変動率を減少させた。それから倍変化率に基づくランク検定を、ノイズロバスト性を改善するために用いた。この検定は、(i)アレイ内の倍変化率のランク（Rfc）の計算、およびii)腫瘍組織の(Rfc)中央値から正常組織の(Rfc)中央値を引く、と言う２段階より成る。両ランクの中央値の差は、倍変化率のランクのスコアを規定する。更に三つの統計検定を、標準化されたデータについて行った：１）２サンプルステューデントt-検定、２）Wilcoxon検定、および３）マイクロアレイの統計分析（SAM）。各統計方法で（ランク倍変化率、t-検定、Wilcoxon検定およびSAM）最も有意に下方制御された遺伝子は、各検定においてランクスコアを与えられた。全てのランクスコアを加えて、一つの合計ランクスコアにした。
【０１１７】
尿ＲＮＡからのｃＤＮＡ合成
全尿ＲＮＡは、順方向プライマーを０．０１μg含む５０μlの反応液において、７０℃でインキュベートし、それから氷上で２分間冷却することにより、膀胱腫瘍マーカーのそれぞれに対して遺伝子特異的なプライマーとアニールさせた。各ｃＤＮＡ反応液には、最終容積２０μl中、アニールしたＲＮＡおよび5x Superscript Il逆転写酵素バッファー(Invitrogen, USA)４μl、０．１ＭＤＴＴ(Invitrogen, USA) ２μl、ＲＮａｓｅ ｏｕｔ（４０Ｕ／μl(Invitrogen, USA)０．５μl、１０mM ｄＮＴＰ(Invitrogen, USA) ４μlおよびSuperscript Il逆転写酵素（２００Ｕ／μl）(Invitrogen, USA)０．５μlが含まれていた。反応液を４２℃で1時間、７０℃で１０分および８０℃で１分インキュベートした。ｑＰＣＲに先立って、反応液をQiagen QIAquick PCR精製カラム(Qiagen, Victoria, Australia)で精製し、−８０℃で保存した。
【０１１８】
定量的リアルタイムＰＣＲ
リアルタイムまたは定量ＰＣＴＲ（ｑＰＣＲ）は、ＰＣＲテンプレートコピー数の絶対的または相対的定量のために用いた。Taqman（商標）プローブおよびプライマーセットは、Primer Express V 2.0（商標）(Applied Biosystems)を用いて設計した。可能であれば、全ての潜在的スプライス変種は、結果として得られるアンプリコンに含め、アンプリコン優先権は、MWG-Biotech-由来マイクロアレイオリゴヌクレオチドによって包含される領域に与えた。プライマーおよびプローブの配列は図２に示す。あるいは、もし標的遺伝子が、所望のアンプリコンを包含して、Assay-on-Demand（商標）発現アッセイ(Applied Biosystems)によって表される場合は、それらを用いた。自家設計アッセイにおいて、プライマー濃度は、SYBR green標識プロトコルおよび参照ＲＮＡから作製したｃＤＮＡを用いて、滴定した。増幅はABI Prism（商標）7000配列検出システムで、標準的なサイクリング条件で行った。解離曲線において単一の増幅産物を観察した場合は、最適プライマー濃度および5’FAM - 3’TAMRA リン酸塩 Taqman（商標）プローブ(Proligo)を最終濃度２５０nMで用いて、６２５倍の濃度範囲にわたって標準曲線を作出した。０．９８を越える回帰係数を有する標準曲線を与えるアッセイを、次の分析に用いた。
【０１１９】
アッセイは９６穴プレートで行った。各プレートは、６２５倍の濃度範囲にわたって、参照ｃＤＮＡ標準曲線を含んだ。尿ｑＰＣＲについては、各反応において〜５mlの未分画尿から抽出した全ＲＮＡを用いた。ΔＣｔ（標的遺伝子Ｃｔ−平均参照ｃＤＮＡ Ｃｔ）を、各マーカーについて計算し、それに続く比率、回帰または分類分析において用いた。
【０１２０】
血液におけるマーカーの発現
図３および４に示すマーカーの全血における発現を、コンピュータシミュレーションで決定した。マイクロアレイプローブは、それらの標的ｍＲＮＡのGenBank登録番号を介してUniGeneクラスターに接続し、UniGeneからの組織発現プロフィールを、血液ライブラリーにおける発現配列タグ（ＥＳＴｓ）の数を決定するために用いた。０または１個の発現配列タグ（ＥＳＴ）を有する遺伝子のみを図４に示す。全血におけるＬＴＢ４ＤＨの低発現を確認するために、図２に示すプライマーおよびプローブを用いて、全血から抽出された全ＲＮＡについて、ＲＴ−ｑＰＣＲを実施した。有意な発現は観察されなかった（結果は示さず）。
【０１２１】
下方制御された膀胱癌マーカーの同定
膀胱癌の下方制御されたマーカーを同定するために、３０，０００オリゴヌクレオチドチップを用いて、５３の膀胱腫瘍および２０の非悪性膀胱組織試料からのＲＮＡについて、マイクロアレイ研究を、我々は行った。図３は、非悪性膀胱組織と比較して、膀胱癌組織において有意な下方制御を示す３００の遺伝子に関するマイクロアレイデータの統計分析を示す。図３は、ＨＵＧＯ遺伝子名および略語、タンパク参照配列番号、ＮＣＢＩｍＲＮＡ参照配列番号、MWG Biotechプローブオリゴヌクレオチド番号、腫瘍および非悪性組織の間の遺伝子発現における倍変化率中央値、本来の補正されないＳｔｕｄｅｎｔのｔ検定の結果、２-サンプルＷｉｌｃｏｘｏｎ検定の結果、ＳＡＭ検定の結果および合計ランクスコアを含む。
【０１２２】
膀胱癌のための尿試験における、好ましい低発現膀胱腫瘍マーカーの同定
血尿は、膀胱癌に伴う普通の共出現症状であることから、膀胱癌マーカーが全血において有意に上昇していないことが、有利である。更に、下方制御されるマーカーは、比率、回帰または分類分析に用いることから、それらが、腫瘍細胞および非悪性膀胱細胞に十分に高いコピー数で存在することは、尿における信頼性のある検出を可能にするために、有利である。適切なマーカーを同定するために、我々は、血液ＥＳＴライブラリーにおいてはほとんど、または全く代表されておらず、かつ非悪性組織において中央値よりも高い発現を有する、サブセットについて、図３における遺伝子をスクリーニングした。発現中央値は、アレイ上の３０，０００オリゴヌクレオチドを、マイクロアレイ試験において分析された試料における、それらの強度の中央値によってランク付けを行うことにより推測した。この基準に合うマーカーを図４に示す。図４は、ＨＵＧＯ遺伝子名および略語、タンパク参照配列番号、ＮＣＢＩｍＲＮＡ参照配列番号、倍変化率中央値、ランクスコア、腫瘍組織および非悪性組織におけるマイクロアレイスポット強度のランクの中央値、および血液ＥＳＴライブラリーに存在するＥＳＴ数を含む。
【０１２３】
アレイデータで観察した下方制御は、図４に示す三つの遺伝子、ＬＴＢ４ＤＨ、ＢＡＧ１およびＦＬＪ２１５１１について、ｑＰＣＲによって確証された。これらの遺伝子は、１０の腫瘍試料および１０の非悪性試料からの全ＲＮＡについて試験した。ＬＴＢ４ＤＨ、ＢＡＧ１およびＦＬＪ２１５１１は、これらの試料において、それぞれ２．５倍、１．４倍および６．１、倍の非悪性組織と比較して、膀胱癌において平均下方制御を示した。
【０１２４】
ＬＴＢ４ＤＨを用いた尿のｑＰＣＲ分析
ＴＣＣ患者および非悪性泌尿器状態を有するコントロールからの尿を、排尿またはカテーテルによって採取した。全ＲＮＡを、４２のコントロールの排尿採取尿、および３７のＴＣＣ患者の排尿採取尿またはカテーテル採取尿から抽出し、ＬＴＢ４ＤＨおよび三つの過剰発現マーカー、ＩＧＦＢＰ５、ＭＤＫおよびＨｏｘＡ１３に対するプライマーとプローブを用いる定量ＲＴ−ＰＣＲにおいて使用した。ΔＣｔ比を、ＩＧＦＢＰ５／ＬＴＢ４ＤＨ、ＭＤＫ／ＬＴＢ４ＤＨおよびＨｏｘＡ１３／ＬＴＢ４ＤＨについて決定した。このデータは図５のボックスプロットよって図示され、３回の検定のそれぞれにおけるコントロールおよびＴＣＣ患者からの尿試料の間のデータの広がりに明瞭な差を示す。最も正確な検定は、試料コホートにおいてそれぞれ８７％と８８％の感度および特異性を示したＩＧＦＢＰ５／ＬＴＢ４ＤＨであった(図６ａ)。これらの検定のそれぞれに関する、感度と特異性の間の対応を図示するために、ＲＯＣ曲線を図７に示す。ＩＧＦＢＰ５／ＬＴＢ４ＤＨ、ＭＤＫ／ＬＴＢ４ＤＨおよびＨｏｘＡ１３／ＬＴＢ４ＤＨに関する曲線下の面積は、それぞれ０．９２２３、０．９１９９および０．７４９７である。検定の正確さを測定するこれらの面積は、全ての３つのＬＴＢ４ＤＨとの比率が有用なこと、特にＩＧＦＢＰ５／ＬＴＢ４ＤＨおよびＭＤＫ／ＬＴＢ４ＤＨが有用なことを示している。
【０１２５】
ＴＣＣ検出の感度と特異性を増加させるために、二つの検定の組み合わせを用いた。これらの検定の組み合わせの最適感度および特異性を図６ｂに示す。図８ａ−ｆは、ＬＴＢ４ＤＨおよびＢＡＧ１を用いる三つの検定のそれぞれについての２次元空間でのデータ分離を示す。このデータは、下方制御ＢＴＭであるＬＴＢ４ＤＨまたはＢＡＧ１のいずれかを含む二つ以上の検定の組み合わせが、９０％を越える感度と特異性を達成することができることを示す。更に、これらの検定は単純な遺伝子発現シグニチャー（signature）を測定し、マーカーの絶対レベルを測定するのではないことから、これらは尿濃度の変動に対して耐性があるであろう。
【０１２６】
ＬＴＢ４ＤＨとの比が関与した検定の、尿濃度に対するロバスト性を示すために、ＩＧＢＰ５単一(ΔＣｔ)およびＩＧＦＢＰ５／ＬＴＢ４ＤＨのレベルを、尿濃度の関数としてプロットし（図９ａ−ｂ）、データにトレンドラインをフィットさせた。非悪性コントロールおよびＴＣＣを有する患者からのつのｒｙｏｕ尿試料について、尿濃度の増加に伴い、ＩＧＦＢＰ５ΔＣｔが減少することが分かるが、これはＩＧＦＢＰ５／ＬＴＢ４ＤＨ比に関しては存在しない。この効果は非悪性試料について最も顕著であったが、これはＩＧＦＢＰ５およびＬＴＢ４ＤＨの発現においては腫瘍の大きさおよび腫瘍の不均一さのような他の影響がないからである。
【０１２７】
場合によっては、膀胱癌アッセイにおいて単一マーカーを用いた時、尿試料採取の方法は、採取された脱落膀胱細胞の数の変動により、検出されるべきマーカーの量に影響し得る。このバイアスは、試料の少ない割合で、擬陽性または擬陰性の結果になり得る。ＬＴＢ４ＤＨまたは他の低発現遺伝子を含む比を使用は、異なった方法を補償するための方法を提供するはずである。この仮説を検証するために、単純な排尿採取(９試料)またはカテーテルによる採取（２８試料）によるＴＣＣ患者からの採取試料を、ＴＣＣマーカーおよびＬＴＢ４ＤＨの存在について検定した。ＴＣＣマーカー単独での分析により、排尿採取試料は、データの範囲の低い端に（より高いＣｔ）より多く代表されていることが示され、カテーテル採取試料に比べて、これらの試料中に脱落細胞の平均数がより少ないことと一致している。このことは、図１０ａ−ｃに、ＩＧＦＢＰ５、ＭＤＫおよびＨｏｘＡ１３に関する自己散乱プロットで図示している。対照的に、これらのマーカーとＬＴＢ４ＤＨの間の比率を計算した時、排尿およびカテーテル採取試料は、Ｃｔ比の類似した範囲に広がっており（図１０ｄ−ｆ）、高発現マーカーおよびＬＴＢ４ＤＨのような低発現マーカーの間の遺伝子発現シグニチャーの計算により、異なった尿採取方法によって導入されたマーカーレベルの変動が補償されることを図示している。
【０１２８】
低グレード腫瘍を有する患者からの尿試料は、これらの試料中に脱落細胞の少数のみが存在することから、ＢＴＭの蓄積ではしばしばボーダーライン上にある。これらの試料はそれ故、試料採取法または尿濃度の変動のために、分類が不正確であるという高いリスクがある。
【０１２９】
ＴＣＣの検出のための下方制御遺伝子を組み込んだ遺伝子発現比の有用性は、それ故、低グレードＴＣＣの検出に応用された時に顕著である可能性が高い。この効果を示すために、低グレードＴＣＣを有する患者からの排尿採取された４３の尿試料のコホートと、１２３のコントロールを、マーカーＩＧＦＢＰ５、ＨｏｘＡ１３およびＬＴＢ４ＤＨについて検定した。コホートの臨床的特徴を図１３に要約する。ＩＧＦＢＰ５およびＨｏｘＡ１３に関するｑＰＣＲデータを、検定の正確さの尺度としてＲＯＣ曲線下の面積を用いて（ＳＴＡＴＡ統計パッケージ）、単独でおよびＬＴＢ４ＤＨとの比で分析した。結果を図１４に要約する。ＩＧＦＢＰ５マーカーを用いると、ＬＴＢ４ＤＨは、低グレード（グレード１−２）ステージＴａのＴＣＣの検出精度を９％、いずれかのステージの低グレードＴＣＣを８％増加させた。低グレードステージＴａのＴＣＣのＨｏｘＡ１３検定の精度は、３％増加した。
【０１３０】
ＬＴＢ４ＤＨを用いたｑＰＣＲデータの線形識別分析
線形識別分析（ＬＤＡ）は、二つ以上の群の間に最大の分離が存在するように、変数の線形の組み合わせを生成する、統計的手法である(Fisher R.A. "The Use of Multiple Measurements in Taxonomic Problems", Annals of Eugenics 7 179 (1936))。この変数の線形の組み合わせは、「線形判別」と呼ばれ、データセットのクラスの分離を最大にするインプット変数の線形関数である。ｑＰＣＲデータのような特定のデータセットを特徴付けるために、ＬＤＡ（またはいずれかの他の分類手法）の能力は、相互検証を用いて検定できる。この方法において、データセットの一部は、分類子を生成するために用い、またデータベースの一部は、分類子の有効性を測るために用いる。データベースを訓練と検定への分割は、複数回反復することができる（毎回新分類子を生成する）。ｋ−倍相互検証において、データベースはｋ−通りに分割され、各サブセットは、訓練と検証のｋ回目の一つにおいて、検定セットとして用いる。これは一つを抜き出す相互検証（leave-one-out cross-validation (LOOCV)）にまで伸張することができ、ここで各試料は、データベースにおける残りの試料から生成する分類子に従って分類する（“leave one out”；検定される試料を抜き出す）。
【０１３１】
ＬＤＡおよびＬＯＯＣＶは、ＴＣＣの診断を改良することにおいて、下方制御ＢＴＭであるＬＴＢ４ＤＨの有用性を例示するために用いた。ｑＰＣＲを最初に、さらなる３０のグレード３腫瘍（５＞ステージ１、１３＝ステージ１、４＝Ｔｉｓ，および８＝Ｔａ）を補足した、図１３に記載したコントロールおよびＴＣＣ尿試料のコホートについて行った。六つの遺伝子ＬＴＢ４ＤＨ、ＭＤＫ、ＩＧＦＢＰ５、ＨＯＸＡ１３、ＴＯＰ２ａおよびＣＤＣ２の組み合わせを、ＬＯＯＣＶによって判定して、分類子性能に関して検定した。事後確率（「脱落」した試料はＴＣＣ試料であったこと）を、Ｒ統計プログラミング環境のＲＯＣＲパッケージを用いてＲＯＣ曲線を作製するために用いた。一定の特異性に対する分類子の感度は適切なＲＯＣ曲線を参照して得た。
【０１３２】
ＬＴＢ４ＤＨを伴う、または伴わない上方制御ＢＴＭの組み合わせを用いたＴＣＣの検出感度は、８５％の特異性で測定した。この分析の結果を図１５に示す。上方制御されるＢＴＭｓであるＭＤＫ、ＩＧＦＢＰ５、Ｔｏｐ２ａ、ｃｄｃ２およびＨｏｘＡ１３の組み合わせを含むアッセイにＬＴＢ４ＤＨを加えることにより、総合感度を１〜２％、およびＴａステージの腫瘍、グレード１〜２の腫瘍およびグレード３の腫瘍の検出感度を３％上昇することが分かる。
【０１３３】
先の記述において、公知の同等物を有する完全体または構成成分について参照したが、そのような同等物は、個々に述べられたとして本明細書に援用される。
【０１３４】
本発明は、例証として、およびそれらの可能な実施態様を参照して説明したが、当然のことながら、本発明の範囲または精神から逸脱することなく、改良および／または改変してもよい。
【０１３５】
産業上の利用可能性
ＢＴＭファミリーメンバーの検出法には、マイクロアレイおよび／またはリアルタイムＰＣＲ法を用いた、核酸、タンパクおよびペプチドの検出を含む。本発明の組成物および方法は、疾患の診断、治療法の有効性の評価、ならびにＢＴＭファミリーメンバーの発現を測定するのに適した試薬および試験キットを製造するために有用である。
【図面の簡単な説明】
【０１３６】
本発明を、特定の本発明の実施態様に準拠しておよび図を参照して説明するが、ここで：
【図１−１】図１は、ｑＰＣＲ分析において用いられた尿試料の特徴を示す表を示す。
【図１−２】図１は、ｑＰＣＲ分析において用いられた尿試料の特徴を示す表を示す。
【図２】図２は、本発明に拠る膀胱癌のｑＰＣＲ分析のためのマーカーのプライマーおよびオリゴヌクレオチドの表を示す。
【図３−１】図３は、膀胱癌の試料についてマイクロアレイ法を用いて同定した低発現膀胱腫瘍マーカーの表を示す。
【図３−２】図３は、膀胱癌の試料についてマイクロアレイ法を用いて同定した低発現膀胱腫瘍マーカーの表を示す。
【図３−３】図３は、膀胱癌の試料についてマイクロアレイ法を用いて同定した低発現膀胱腫瘍マーカーの表を示す。
【図３−４】図３は、膀胱癌の試料についてマイクロアレイ法を用いて同定した低発現膀胱腫瘍マーカーの表を示す。
【図３−５】図３は、膀胱癌の試料についてマイクロアレイ法を用いて同定した低発現膀胱腫瘍マーカーの表を示す。
【図３−６】図３は、膀胱癌の試料についてマイクロアレイ法を用いて同定した低発現膀胱腫瘍マーカーの表を示す。
【図３−７】図３は、膀胱癌の試料についてマイクロアレイ法を用いて同定した低発現膀胱腫瘍マーカーの表を示す。
【図３−８】図３は、膀胱癌の試料についてマイクロアレイ法を用いて同定した低発現膀胱腫瘍マーカーの表を示す。
【図３−９】図３は、膀胱癌の試料についてマイクロアレイ法を用いて同定した低発現膀胱腫瘍マーカーの表を示す。
【図３−１０】図３は、膀胱癌の試料についてマイクロアレイ法を用いて同定した低発現膀胱腫瘍マーカーの表を示す。
【図３−１１】図３は、膀胱癌の試料についてマイクロアレイ法を用いて同定した低発現膀胱腫瘍マーカーの表を示す。
【図３−１２】図３は、膀胱癌の試料についてマイクロアレイ法を用いて同定した低発現膀胱腫瘍マーカーの表を示す。
【図３−１３】図３は、膀胱癌の試料についてマイクロアレイ法を用いて同定した低発現膀胱腫瘍マーカーの表を示す。
【図３−１４】図３は、膀胱癌の試料についてマイクロアレイ法を用いて同定した低発現膀胱腫瘍マーカーの表を示す。
【図３−１５】図３は、膀胱癌の試料についてマイクロアレイ法を用いて同定した低発現膀胱腫瘍マーカーの表を示す。
【図３−１６】図３は、膀胱癌の試料についてマイクロアレイ法を用いて同定した低発現膀胱腫瘍マーカーの表を示す。
【図３−１７】図３は、膀胱癌の試料についてマイクロアレイ法を用いて同定した低発現膀胱腫瘍マーカーの表を示す。
【図３−１８】図３は、膀胱癌の試料についてマイクロアレイ法を用いて同定した低発現膀胱腫瘍マーカーの表を示す。
【図３−１９】図３は、膀胱癌の試料についてマイクロアレイ法を用いて同定した低発現膀胱腫瘍マーカーの表を示す。
【図３−２０】図３は、膀胱癌の試料についてマイクロアレイ法を用いて同定した低発現膀胱腫瘍マーカーの表を示す。
【図３−２１】図３は、膀胱癌の試料についてマイクロアレイ法を用いて同定した低発現膀胱腫瘍マーカーの表を示す。
【図３−２２】図３は、膀胱癌の試料についてマイクロアレイ法を用いて同定した低発現膀胱腫瘍マーカーの表を示す。
【図３−２３】図３は、膀胱癌の試料についてマイクロアレイ法を用いて同定した低発現膀胱腫瘍マーカーの表を示す。
【図３−２４】図３は、膀胱癌の試料についてマイクロアレイ法を用いて同定した低発現膀胱腫瘍マーカーの表を示す。
【図３−２５】図３は、膀胱癌の試料についてマイクロアレイ法を用いて同定した低発現膀胱腫瘍マーカーの表を示す。
【図３−２６】図３は、膀胱癌の試料についてマイクロアレイ法を用いて同定した低発現膀胱腫瘍マーカーの表を示す。
【図３−２７】図３は、膀胱癌の試料についてマイクロアレイ法を用いて同定した低発現膀胱腫瘍マーカーの表を示す。
【図３−２８】図３は、膀胱癌の試料についてマイクロアレイ法を用いて同定した低発現膀胱腫瘍マーカーの表を示す。
【図３−２９】図３は、膀胱癌の試料についてマイクロアレイ法を用いて同定した低発現膀胱腫瘍マーカーの表を示す。
【図３−３０】図３は、膀胱癌の試料についてマイクロアレイ法を用いて同定した低発現膀胱腫瘍マーカーの表を示す。
【図３−３１】図３は、膀胱癌の試料についてマイクロアレイ法を用いて同定した低発現膀胱腫瘍マーカーの表を示す。
【図３−３２】図３は、膀胱癌の試料についてマイクロアレイ法を用いて同定した低発現膀胱腫瘍マーカーの表を示す。
【図３−３３】図３は、膀胱癌の試料についてマイクロアレイ法を用いて同定した低発現膀胱腫瘍マーカーの表を示す。
【図３−３４】図３は、膀胱癌の試料についてマイクロアレイ法を用いて同定した低発現膀胱腫瘍マーカーの表を示す。
【図３−３５】図３は、膀胱癌の試料についてマイクロアレイ法を用いて同定した低発現膀胱腫瘍マーカーの表を示す。
【図３−３６】図３は、膀胱癌の試料についてマイクロアレイ法を用いて同定した低発現膀胱腫瘍マーカーの表を示す。
【図３−３７】図３は、膀胱癌の試料についてマイクロアレイ法を用いて同定した低発現膀胱腫瘍マーカーの表を示す。
【図３−３８】図３は、膀胱癌の試料についてマイクロアレイ法を用いて同定した低発現膀胱腫瘍マーカーの表を示す。
【図３−３９】図３は、膀胱癌の試料についてマイクロアレイ法を用いて同定した低発現膀胱腫瘍マーカーの表を示す。
【図３−４０】図３は、膀胱癌の試料についてマイクロアレイ法を用いて同定した低発現膀胱腫瘍マーカーの表を示す。
【図３−４１】図３は、膀胱癌の試料についてマイクロアレイ法を用いて同定した低発現膀胱腫瘍マーカーの表を示す。
【図３−４２】図３は、膀胱癌の試料についてマイクロアレイ法を用いて同定した低発現膀胱腫瘍マーカーの表を示す。
【図３−４３】図３は、膀胱癌の試料についてマイクロアレイ法を用いて同定した低発現膀胱腫瘍マーカーの表を示す。
【図３−４４】図３は、膀胱癌の試料についてマイクロアレイ法を用いて同定した低発現膀胱腫瘍マーカーの表を示す。
【図３−４５】図３は、膀胱癌の試料についてマイクロアレイ法を用いて同定した低発現膀胱腫瘍マーカーの表を示す。
【図３−４６】図３は、膀胱癌の試料についてマイクロアレイ法を用いて同定した低発現膀胱腫瘍マーカーの表を示す。
【図３−４７】図３は、膀胱癌の試料についてマイクロアレイ法を用いて同定した低発現膀胱腫瘍マーカーの表を示す。
【図３−４８】図３は、膀胱癌の試料についてマイクロアレイ法を用いて同定した低発現膀胱腫瘍マーカーの表を示す。
【図３−４９】図３は、膀胱癌の試料についてマイクロアレイ法を用いて同定した低発現膀胱腫瘍マーカーの表を示す。
【図３−５０】図３は、膀胱癌の試料についてマイクロアレイ法を用いて同定した低発現膀胱腫瘍マーカーの表を示す。
【図３−５１】図３は、膀胱癌の試料についてマイクロアレイ法を用いて同定した低発現膀胱腫瘍マーカーの表を示す。
【図４−１】図４は、膀胱癌の試料についてマイクロアレイ法を用いて同定した、全血においては殆ど発現していないが、正常膀胱組織においては高度に発現している低発現膀胱腫瘍マーカーの表を示す。
【図４−２】図４は、膀胱癌の試料についてマイクロアレイ法を用いて同定した、全血においては殆ど発現していないが、正常膀胱組織においては高度に発現している低発現膀胱腫瘍マーカーの表を示す。
【図４−３】図４は、膀胱癌の試料についてマイクロアレイ法を用いて同定した、全血においては殆ど発現していないが、正常膀胱組織においては高度に発現している低発現膀胱腫瘍マーカーの表を示す。
【図４−４】図４は、膀胱癌の試料についてマイクロアレイ法を用いて同定した、全血においては殆ど発現していないが、正常膀胱組織においては高度に発現している低発現膀胱腫瘍マーカーの表を示す。
【図５】図５は、非悪性泌尿器疾患またはＴＣＣを有する患者からの尿試料について、三つの膀胱移行上皮癌（ＴＣＣ）マーカー（HoxA13、IGFBP5およびMDK）と低発現マーカーＬＴＢ４ＤＨとの比を示すボックスアンドウィスカープロット（箱髭図）を表す。ボックスは第２５、５０および７５番パーセンタイルを規定し、水平のバーは隣接の値を印す。異常値は丸で示す。中空ボックスは非悪性疾患コントロールからの試料を表し、斜線ボックスはＴＣＣ患者からの試料を表す。
【図６】図６は、ＬＴＢ４ＤＨを含む試験のための、ＴＣＣ検出の感度および特異性の例を示す。（ａ）単独試験；（ｂ）ＬＴＢ４ＤＨおよび三つのマーカーＨｏｘＡ１３、ＩＧＦＢＰ５およびＭＤＫの内の二つを用いた組み合わせ試験。
【図７】図７ａ〜ｃは、ＬＴＢ４ＤＨを含む比を用いた、尿試料中のＴＣＣの検出の感度および特異性に関するＲＯＣ曲線を示す。７ａ．ＩＧＦＢＰ５／ＬＴＢ４ＤＨ；７ｂ．ＭＤＫ／ＬＴ４ＢＤＨ；７ｃ．ＨｏｘＡ１３／ＬＴＢ４ＤＨ。
【図８ａ】図８ａ〜ｆは、組み合わせ試験の散乱プロットを示し、ａ〜ｃは、ＬＴＢ４ＤＨおよび三つのマーカーHoxA13、IGFBP5およびMDKの内の二つを用い、ｄ〜ｆは、ＬＴＢ４ＤＨの代わりにＢＡＧ１を用いて繰り返した。８ａ．ＭＤＫ／ＬＴＢ４ＤＨおよびＩＧＦＢＰ５／ＬＴＢ４ＤＨ。
【図８ｂ】図８ａ〜ｆは、組み合わせ試験の散乱プロットを示し、ａ〜ｃは、ＬＴＢ４ＤＨおよび三つのマーカーHoxA13、IGFBP5およびMDKの内の二つを用い、ｄ〜ｆは、ＬＴＢ４ＤＨの代わりにＢＡＧ１を用いて繰り返した。８ｂ．ＭＤＫ／ＬＴＢ４ＤＨおよびＨｏｘＡ１３／ＬＴＢ４ＤＨ；ＩＧＦＢＰ５／ＬＴＢ４ＤＨおよびＨｏｘＡ１３／ＬＴＢ４ＤＨ。
【図８ｃ】図８ａ〜ｆは、組み合わせ試験の散乱プロットを示し、ａ〜ｃは、ＬＴＢ４ＤＨおよび三つのマーカーHoxA13、IGFBP5およびMDKの内の二つを用い、ｄ〜ｆは、ＬＴＢ４ＤＨの代わりにＢＡＧ１を用いて繰り返した。
【図８ｄ】図８ａ〜ｆは、組み合わせ試験の散乱プロットを示し、ａ〜ｃは、ＬＴＢ４ＤＨおよび三つのマーカーHoxA13、IGFBP5およびMDKの内の二つを用い、ｄ〜ｆは、ＬＴＢ４ＤＨの代わりにＢＡＧ１を用いて繰り返した。８ｄ．ＭＤＫ／ＢＡＧ１およびＩＧＦＢＰ５／ＢＡＧ１。
【図８ｅ】図８ａ〜ｆは、組み合わせ試験の散乱プロットを示し、ａ〜ｃは、ＬＴＢ４ＤＨおよび三つのマーカーHoxA13、IGFBP5およびMDKの内の二つを用い、ｄ〜ｆは、ＬＴＢ４ＤＨの代わりにＢＡＧ１を用いて繰り返した。８ｅ．ＭＤＫ／ＢＡＧ１およびＨｏｘＡ１３／ＢＡＧ１。
【図８ｆ】図８ａ〜ｆは、組み合わせ試験の散乱プロットを示し、ａ〜ｃは、ＬＴＢ４ＤＨおよび三つのマーカーHoxA13、IGFBP5およびMDKの内の二つを用い、ｄ〜ｆは、ＬＴＢ４ＤＨの代わりにＢＡＧ１を用いて繰り返した。８ｆ．ＩＧＦＢＰ５／ＢＡＧ１およびＨｏｘＡ１３／ＢＡＧ１。
【図９ａ】図９ａ〜ｂは、ＩＧＦＢＰ５に関するΔＣｔならびにＩＧＦＢＰ５／ＬＴＢ４ＤＨおよび尿クレアチニン濃度に関するΔＣｔ比の間の相関関係を示す散乱プロットを示す。９ａ．ＴＣＣを有する患者からの尿試料。
【図９ｂ】図９ａ〜ｂは、ＩＧＦＢＰ５に関するΔＣｔならびにＩＧＦＢＰ５／ＬＴＢ４ＤＨおよび尿クレアチニン濃度に関するΔＣｔ比の間の相関関係を示す散乱プロットを示す。９ｂ．非悪性疾患を有する患者からの尿試料。
【図１０ａ】図１０ａ〜ｆは、膀胱腫瘍マーカーＭＤＫ、ＩＧＦＢＰ５およびＨｏｘＡ１３単独またはＬＴＢ４ＤＨとの比を用いて分析したＴＣＣ患者からの、排泄採取およびカテーテル採取試料の分布を示す、自己散乱プロット（Self-self scatter plots）を表す。
【図１０ｂ】図１０ａ〜ｆは、膀胱腫瘍マーカーＭＤＫ、ＩＧＦＢＰ５およびＨｏｘＡ１３単独またはＬＴＢ４ＤＨとの比を用いて分析したＴＣＣ患者からの、排泄採取およびカテーテル採取試料の分布を示す、自己散乱プロット（Self-self scatter plots）を表す。
【図１０ｃ】図１０ａ〜ｆは、膀胱腫瘍マーカーＭＤＫ、ＩＧＦＢＰ５およびＨｏｘＡ１３単独またはＬＴＢ４ＤＨとの比を用いて分析したＴＣＣ患者からの、排泄採取およびカテーテル採取試料の分布を示す、自己散乱プロット（Self-self scatter plots）を表す。
【図１０ｄ】図１０ａ〜ｆは、膀胱腫瘍マーカーＭＤＫ、ＩＧＦＢＰ５およびＨｏｘＡ１３単独またはＬＴＢ４ＤＨとの比を用いて分析したＴＣＣ患者からの、排泄採取およびカテーテル採取試料の分布を示す、自己散乱プロット（Self-self scatter plots）を表す。
【図１０ｅ】図１０ａ〜ｆは、膀胱腫瘍マーカーＭＤＫ、ＩＧＦＢＰ５およびＨｏｘＡ１３単独またはＬＴＢ４ＤＨとの比を用いて分析したＴＣＣ患者からの、排泄採取およびカテーテル採取試料の分布を示す、自己散乱プロット（Self-self scatter plots）を表す。
【図１０ｆ】図１０ａ〜ｆは、膀胱腫瘍マーカーＭＤＫ、ＩＧＦＢＰ５およびＨｏｘＡ１３単独またはＬＴＢ４ＤＨとの比を用いて分析したＴＣＣ患者からの、排泄採取およびカテーテル採取試料の分布を示す、自己散乱プロット（Self-self scatter plots）を表す。
【図１１−１】図１１は、浸潤性膀胱腫瘍からの既知の過剰発現マーカーを示す。
【図１１−２】図１１は、浸潤性膀胱腫瘍からの既知の過剰発現マーカーを示す。
【図１１−３】図１１は、浸潤性膀胱腫瘍からの既知の過剰発現マーカーを示す。
【図１１−４】図１１は、浸潤性膀胱腫瘍からの既知の過剰発現マーカーを示す。
【図１１−５】図１１は、浸潤性膀胱腫瘍からの既知の過剰発現マーカーを示す。
【図１１−６】図１１は、浸潤性膀胱腫瘍からの既知の過剰発現マーカーを示す。
【図１１−７】図１１は、浸潤性膀胱腫瘍からの既知の過剰発現マーカーを示す。
【図１１−８】図１１は、浸潤性膀胱腫瘍からの既知の過剰発現マーカーを示す。
【図１１−９】図１１は、浸潤性膀胱腫瘍からの既知の過剰発現マーカーを示す。
【図１１−１０】図１１は、浸潤性膀胱腫瘍からの既知の過剰発現マーカーを示す。
【図１１−１１】図１１は、浸潤性膀胱腫瘍からの既知の過剰発現マーカーを示す。
【図１１−１２】図１１は、浸潤性膀胱腫瘍からの既知の過剰発現マーカーを示す。
【図１１−１３】図１１は、浸潤性膀胱腫瘍からの既知の過剰発現マーカーを示す。
【図１１−１４】図１１は、浸潤性膀胱腫瘍からの既知の過剰発現マーカーを示す。
【図１１−１５】図１１は、浸潤性膀胱腫瘍からの既知の過剰発現マーカーを示す。
【図１１−１６】図１１は、浸潤性膀胱腫瘍からの既知の過剰発現マーカーを示す。
【図１２−１】図１２は、表在性膀胱腫瘍からの既知の過剰発現マーカーを示す。
【図１２−２】図１２は、表在性膀胱腫瘍からの既知の過剰発現マーカーを示す。
【図１２−３】図１２は、表在性膀胱腫瘍からの既知の過剰発現マーカーを示す。
【図１２−４】図１２は、表在性膀胱腫瘍からの既知の過剰発現マーカーを示す。
【図１２−５】図１２は、表在性膀胱腫瘍からの既知の過剰発現マーカーを示す。
【図１２−６】図１２は、表在性膀胱腫瘍からの既知の過剰発現マーカーを示す。
【図１２−７】図１２は、表在性膀胱腫瘍からの既知の過剰発現マーカーを示す。
【図１２−８】図１２は、表在性膀胱腫瘍からの既知の過剰発現マーカーを示す。
【図１２−９】図１２は、表在性膀胱腫瘍からの既知の過剰発現マーカーを示す。
【図１２−１０】図１２は、表在性膀胱腫瘍からの既知の過剰発現マーカーを示す。
【図１２−１１】図１２は、表在性膀胱腫瘍からの既知の過剰発現マーカーを示す。
【図１２−１２】図１２は、表在性膀胱腫瘍からの既知の過剰発現マーカーを示す。
【図１２−１３】図１２は、表在性膀胱腫瘍からの既知の過剰発現マーカーを示す。
【図１２−１４】図１２は、表在性膀胱腫瘍からの既知の過剰発現マーカーを示す。
【図１２−１５】図１２は、表在性膀胱腫瘍からの既知の過剰発現マーカーを示す。
【図１３】図１３は、ＲＯＣ曲線分析で使用した低段階ＴＣＣ試料およびコントロールの臨床的特徴を示す。
【図１４】図１４は、ＲＯＣ曲線分析の結果を示す。ＬＴＢ４ＤＨがＨｏｘＡ１３およびＩＧＦＢＰ５との比として用いられた時得られる試験の正確度の増加の図示。
【図１５】図１５は、ＴＣＣの検出に関して、ＬＴＢ４ＤＨの存在および非存在下での、ＢＴＭの線形識別分析の結果を示す。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、癌の検出に関する。具体的には、本発明は膀胱癌の検出のためのマーカーの使用に関する。より具体的には、本発明は、膀胱癌検出のため、低発現（under-expressed）マーカーを少なくとも一つの他のマーカーと組み合わせた使用に関する。
【０００２】
背景
癌患者の生存は、癌を初期に治療すると、大きく増大する。膀胱癌の場合、進行した疾患と診断された患者の約１５〜３０％と比較して、疾患の初期段階と診断された患者は、＞９０％以上の５年生存率を有する。それ故、膀胱癌の早期診断につながる進歩によって、患者の予後の改善がもたらされる。尿試料を用いた、実施されている膀胱癌検出方法は、細胞診断である。しかしながら、細胞診断は、浸潤性膀胱癌の検出には７５％感度、および表在性膀胱癌の検出にはたった約２５％の感度であることが知られている(Lotan and Roehrborn, Urology 61 , 109-118 (2003))。
【０００３】
尿中の特異的なマーカーの同定によって、癌の早期診断のための価値ある方法が提供でき、早期治療と予後の改善につながる。特異的な癌マーカーはまた、疾患の進行を監視する方法を提供し、外科、放射線療法、化学療法治療の有効性を監視することが可能になる。
【０００４】
現在、膀胱癌を検出するための最も信頼できる方法は、生検病変部の組織学的検査を伴う細胞検査である。しかしながら、この技法は時間がかかり、侵襲的であり、その感度は約９０％であるに過ぎず、癌の約１０％はこの方法を用いても検出されないことを意味する。非侵襲的な方法としては、剥脱した悪性細胞を顕微鏡的に検出する尿の細胞診断が、現在の好まれる方法である。細胞診断は約９５％の特異性を有するが、低段階の病変部については感度（９〜２５％）が不十分であり、試料の品質に非常に依存し、観察者間での変異が大きいことに悩まされている。
【０００５】
幾つかの尿タンパクマーカーが知られている。これらマーカーに関する試験は、細胞診断よりも感度が良好であるが、これらマーカー値の上昇はまた、炎症、尿路結石症および良性前立腺肥大を含む、非悪性疾患を有する患者において一般に観察されることから、特異性が不十分であることに悩まされる傾向がある。例えば、特異的核マトリックスタンパクを検出するＮＭＰ２２は、４７〜８７％の感度および５８〜９１％の特異性を有する。
【０００６】
尿検査に付随する一つの欠陥は、個々のマーカー値は、以下によって有意に変化する可能性があることである：(i)異なった尿採取方法（カテーテル採取尿、排尿、尿沈殿物）；(ii)尿採取の日周タイミング；(iii)排尿時の採取点（例えば中間点対終了時点の試料）；および(iv)変動する液体摂取、腎臓機能および血漿体積に影響する疾患、に伴う尿の濃度。これらの変動によって、擬陽性および擬陰性を招く可能性がある。この変動の幾つかは厳密な標準的操作手法を用いて減少させることができるが、これらの手法を患者が順守することは信頼できない可能性がある。変動する尿濃度の影響は、ある症例では、尿クレアチニンに対する相対的なマーカーレベルを評価することにより、説明できるが、これは、特に試料調製または貯蔵方法がマーカー検出とクレアチニン測定で異なる場合、試験コストを増大させ、試験がさらに複雑になる。
【０００７】
癌の早期検出と診断のための簡単なツールが必要である。本発明は、膀胱癌の検出および診断に役立つための、マーカーに基づく、特に膀胱癌マーカーの比、回帰または分類分析に基づく方法、装置およびキットをさらに提供する。
【０００８】
発明の要約
本発明は、以下のステップを含む、対象における癌の存在を決定する方法、を提供する：
（ａ） 対象からの試料を提供するステップ；
（ｂ） 前記試料中の、少なくとも一つの腫瘍マーカー（ＴＭ）が低発現ＴＭである、少なくとも二つのＴＭファミリーメンバーの発現レベルを検出するステップ；および
（ｃ） あらかじめ定めた閾値に従って、患者が癌を有するかを立証するステップ。
【０００９】
ステップ（ｃ）は、前記ＴＭの発現比を測定することによって、またはＴＭ発現レベルの回帰または分類分析を行うことによって行うことができる。
【００１０】
ＴＭはＢＴＭであることが可能である。検出される癌は膀胱癌であることがあり得るし、ある特定の実施態様では、ＴＭの少なくとも一つは過剰発現ＢＴＭである。過剰発現ＢＴＭは、図１１または図１２に要約された群から選択してもよい。
【００１１】
ある特定の実施態様では、少なくとも一つの低発現ＴＭは、図３または図４に概要を述べた群から選択してもよい。
【００１２】
本発明の他の実施態様では、検出ステップは、ＢＴＭ ｍＲＮＡ、ＢＴＭタンパクまたはＢＴＭペプチドの過剰発現を検出することによって行う。
【００１３】
試料は、生検、血液、血清、腹膜洗浄液、脳脊髄液、尿および便試料のいずれかであり得る。
【００１４】
本発明はまた、以下を含む、ＴＭを検出するための装置を提供する：
その上にＴＭキャプチャー試薬を有する基材；および
該基材に付随する検出器であって、該キャプチャー試薬に結合している低発現ＴＭを検出することができる該検出器。
【００１５】
ＴＭはＢＴＭであることが可能である。
【００１６】
ＴＭキャプチャー試薬がオリゴヌクレオチドまたは抗体であることが可能である。
【００１７】
ある特定の実施態様では、ＴＭは図３または図４に概要を述べた群から選択されるＢＴＭであることが可能である。
【００１８】
本発明はまた、以下を含む、対象における癌の存在を判定するためのキットを提供する：
基材；
少なくとも一つのＴＭが低発現ＴＭである、少なくとも二つのＴＭキャプチャー試薬；
および
使用のための取扱説明書。
【００１９】
ＴＭはＢＴＭであることが可能である。
【００２０】
ＴＭキャプチャー試薬は、ＴＭ特異的オリゴヌクレオチドまたはＴＭ特異的な抗体であってもよい。
【００２１】
キットによって検出されるＴＭは、図３または図４に概要を述べた群から選択されるＢＴＭであってもよい。
【００２２】
キットによって検出される少なくとも一つのＴＭは、過剰発現ＴＭまたは過剰発現ＢＴＭであってもよい。過剰発現ＢＴＭは、図１１または図１２に概要を述べた群から選択されてもよい。
【００２３】
発明の詳細な説明
定義
用語「マーカー」は、生物現象の存在と定量的に、または定性的に関連する分子を意味する。マーカーの例としては、遺伝子、遺伝子断片、ＲＮＡまたはＲＮＡ断片のようなポリヌクレオチド；ペプチド、オリゴペプチド、タンパクまたはタンパク断片のようなポリペプチドを含む遺伝子産物；または現象の基礎となるメカニズムに直接的に関係していようが、間接的に関係していようが、関連代謝物、副産物または抗体または抗体断片のような他の識別分子が挙げられる。本発明のマーカーとしては、本明細書に開示した核酸配列（例えばGenBank配列）、具体的には全長配列、任意のコード配列、ノンコード配列および断片、またはそれらの任意の相補体、および上に規定したような任意の測定可能なそれらのマーカーが挙げられる。
【００２４】
用語「感度」は、試験で陽性（モデルによっては）である、疾患を有する個人の比率を意味する。従って、感度が増加することは、試験結果に擬陰性がより少ないことを意味する。
【００２５】
用語「特異性」は、試験で陰性（モデルによっては）である、疾患を有しない個人の比率を意味する。従って特異性が増加することは、試験結果に擬陽性がより少ないことを意味する。
【００２６】
用語「発現」は、ポリヌクレオチドおよびポリペプチドの生産、具体的には遺伝子または遺伝子の部分からのＲＮＡ（例えばｍＲＮＡ）の生産を含み、ならびにＲＮＡまたは遺伝子または遺伝子の部分によってコードされるポリペプチドの生産を含み、発現と関連する検出可能な物質の出現を含む。例えば、ポリペプチド-ポリペプチド相互作用、ポリペプチド-ヌクレオチド相互作用等からの複合体の形成は、用語「発現」の範囲内に含まれる。別の例としては、ハイブリダイゼーションプローブまたは抗体のような結合リガンドの、遺伝子もしくは他のポリヌクレオチド、ポリペプチドもしくはタンパク断片との結合、および結合リガンドの可視化も含まれる。従って、マイクロアレイ上の、ノーザンブロットのようなハイブリダイゼーションブロット上の、またはウエスタンブロットのような免疫ブロット上の、またはビーズアレイ上の、またはＰＣＲ分析による、スポットの密度は、根本的な生物分子の用語「発現」の範囲内に含まれる。
【００２７】
用語「過剰発現」は、ある細胞または細胞型におけるマーカーの発現が、他の同等の細胞または細胞型におけるマーカーの発現よりも多い場合に用いる。
【００２８】
用語「低発現」は、ある細胞または細胞型におけるマーカーの発現が、他の同等の細胞または細胞型におけるマーカーの発現よりも少ない場合に用いる。
【００２９】
用語「ＴＭ」または「腫瘍マーカー」または「ＴＭファミリーメンバー」は、特定の癌に関連するマーカーを意味する。用語ＴＭはまた、その組み合わせが癌の検出の感度および特異性を改良する、個々のマーカーの組み合わせをも含む。当然のことながら、用語「ＴＭ」は、マーカーが特定の腫瘍にのみ特異的であることは必要としない。むしろ、ＴＭの発現は、他の型の細胞、疾患細胞、悪性腫瘍を含む腫瘍において変化することが可能である。
【００３０】
ＴＭは、膀胱癌を有すると疑われる患者からの組織試料からＲＮＡを抽出し、その上に多くのオリゴヌクレオチドを有するマイクロアレイにＲＮＡまたはｃＤＮＡコピーを加え、アレイ上のオリゴヌクレオチドに試料ＲＮＡをハイブリダイズさせ、各アレイスポットに結合した測定ＲＮＡのレベルを定量することにより、同定することができる。もしマーカーの存在が、マイクロアレイ法を用いて、正常、非悪性組織において見出される値の少なくとも約１．２倍に閾値より低い場合は、マーカーは低発現ＴＭであると考えられる。代わりに、閾値は、正常値の約２倍より低い、正常値の約３分の１、正常値の約４分の１または約５分の１であることも可能である。「正常」は、ここでは正常の集団の９０パーセンタイルより小さいことを意味する。他の場合、正常とは、９５パーセンタイル（すなわち平均値から約２標準偏差（ＳＤ））の存在のレベルを意味することも可能であり、また他の場合、約９７．５パーセンタイル未満（すなわち約３ＳＤ）または９９パーセンタイルであることも可能である。
【００３１】
用語「低発現ＴＭ」は、非悪性膀胱組織におけるよりも膀胱腫瘍において低い発現を示すマーカーを意味する。
【００３２】
用語「過剰発現ＴＭ」は、非悪性膀胱組織におけるよりも膀胱腫瘍において高い発現を示すマーカーを意味する。
【００３３】
用語「ＢＴＭ」または「膀胱腫瘍マーカー」または「ＢＴＭファミリーメンバー」は、膀胱癌に関連するＴＭを意味する。用語ＢＴＭはまた、その組み合わせが膀胱癌検出の感度および特異性を改良する、個々のマーカーの組み合わせを含む。当然のことながら、用語ＢＴＭは、マーカーが膀胱腫瘍に対してのみ特異的であることを必要としない。むしろ、ＢＴＭの発現は、他の型の細胞、疾患細胞、悪性腫瘍を含む腫瘍において変化することができる。
【００３４】
用語「低発現ＢＴＭ」は、非悪性膀胱組織においてよりも、膀胱腫瘍において低い発現を示すマーカーを意味する。
【００３５】
用語「過剰発現ＢＴＭ」は、非悪性膀胱組織においてよりも、膀胱腫瘍において高い発現を示すマーカーを意味する。
【００３６】
用語「ｑＰＣＲ」は、定量的ポリメラーゼ連鎖反応を意味する。用語「ｑＰＣＲ」又は「ＱＰＣＲ」は、例えばPCR Technique: Quantitative PCR, J.W. Larrick, ed., Eaton Publishing, 1997 および A-Z of Quantitative PCR, S. Bustin, ed., IUL Press, 2004に記載する定量的ポリメラーゼ連鎖反応を言う。
【００３７】
用語「ＴＣＣ」は、膀胱の移行上皮細胞癌を意味する。ＴＣＣは全膀胱癌の〜９５％を占める。
【００３８】
本明細書では、「抗体」および同様の用語は、免疫グロブリン分子および免疫グロブリン（Ｉｇ）分子の免疫学的に活性な部分、すなわち抗原と特異的に結合する（免疫反応する）抗原結合部位を含む分子、を言う。これらにとしては、限定されないが、多クローン抗体、単クローン抗体、キメラ、単鎖、Ｆｃ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’およびＦａｂ２断片、ならびにＦａｂ発現ライブラリーが挙げられる。抗体分子は、クラスＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＥおよびＩｇＤのいずれかに関連しており、それらは分子中に存在する重鎖の性質によって互いに異なっている。これらはＩｇＧ１、ＩｇＧ２、およびその他のようなサブクラスを含む。軽鎖は、カッパ鎖またはラムダ鎖であってもよい。本明細書における抗体の参照には、全てのクラス、サブクラスおよびタイプに対する参照が含まれる。更に、例えばマウスまたはヒトの配列のように一つを越える供給源に対して特異的である単クローン抗体またはその断片のようなキメラ抗体も含まれる。更にまた、ラクダ科動物の抗体、サメの抗体またはナノボディも含まれる。
【００３９】
用語「癌」および「癌性の」は、異常なまたは制御されない細胞増殖を通常、特徴とする哺乳動物における生理的状態を言うか、または述べている。癌および癌の病理は、例えば、転移；隣接する細胞の正常機能に対する阻害；サイトカインまたは他の分泌産物の異常量の放出；炎症または免疫反応の抑制または悪化；腫瘍形成；前悪性の状態；悪性の状態；リンパ節等の周縁または遠隔組織または器官の侵入；に関与する可能性がある。
【００４０】
用語「腫瘍」は、悪性であろうと良性であろうと、全ての腫瘍性の細胞成長および増殖、ならびに全ての前癌および癌細胞および組織を言う。
【００４１】
用語「マイクロアレイ」は、キャプチャー剤、好ましくはポリヌクレオチド（例えばプローブ）またはポリペプチドが基質上に規則的に、または不規則に配置したものを言う。例えば、Microarray Analysis, M. Schena, John Wiley & Sons, 2002; Microarray Biochip Technology, M. Schena, ed., Eaton Publishing, 2000; Guide to Analysis of ＤＮＡ Microarray Data, S. Knudsen, John Wiley & Sons, 2004; and Protein Microarray Technology, D. Kambhampati, ed., John Wiley & Sons, 2004を参照のこと。
【００４２】
用語「オリゴヌクレオチド」は、ポリヌクレオチド、通常はプローブまたはプライマーを言い、限定されないが、一本鎖デオキシリボヌクレオチド、一本鎖または二本鎖のリボヌクレオチド、ＲＮＡ：ＤＮＡハイブリッドおよび二本鎖ＤＮＡが挙げられる。一本鎖ＤＮＡプローブオリゴヌクレオチドのようなオリゴヌクレオチドは、化学的方法、例えば市販の自動化オリゴヌクレオチド合成装置を用いて、またはインビトロ発現システム、組み換え技術、ならびに細胞および生物における発現を含む種々の他の方法により、しばしば合成される。
【００４３】
用語「ポリヌクレオチド」は、単数または複数形で用いられた時、いずれかのポリヌクレオチドまたはポリデオキシヌクレオチドを言い、それらは改変されないＲＮＡもしくはＤＮＡ、または改変されたＲＮＡもしくはＤＮＡであってもよい。これは、非限定的に、一本鎖および二本鎖ＤＮＡ、一本鎖および二本鎖領域を含むＤＮＡ、一本鎖および二本鎖ＲＮＡ、ならびに一本鎖および二本鎖領域を含むＲＮＡ、一本鎖もしくは、より一般的には二本鎖であってもよい、または一本鎖および二本鎖領域を含む、ＤＮＡおよびＲＮＡを含むハイブリド分子を含む。更に、ＲＮＡもしくはＤＮＡ、またはＲＮＡおよびＤＮＡの両方を含む三本鎖領域も含まれる。ｍＲＮＡ、ｃＤＮＡおよびゲノムＤＮＡおよびそれらの断片が、特に含まれる。この用語は、トリチウム標識された塩基またはイノシンのような異常塩基などの改変された一つ以上の塩基を含有するＤＮＡおよびＲＮＡを含む。本発明のポリヌクレオチドは、コーディングまたはアンチコーディング配列もしくはセンスまたはアンチセンス配列を包含することができる。当然のことながら、本明細書で、「ポリヌクレオチド」または同様な用語の参照には、全長配列ならびにそれらのいずれかの断片、誘導体または変異体を含まれる。
【００４４】
本明細書で用いる「ポリペプチド」は、オリゴペプチド、ペプチドもしくはタンパク配列、またはそれらの断片、および天然分子、組み換え分子、合成または半合成分子を言う。天然に存在するタンパク分子のアミノ酸配列に言及するために、「ポリペプチド」を本明細書に列挙する場合、「ポリペプチド」または同様な用語は、アミノ酸配列を全長分子の完全な天然アミノ酸配列に限定することを意味するものではない。当然のことながら、本明細書において、「ポリペプチド」または同様な用語の各参照には、全列配列ならびにそれらの任意の断片、誘導体または変異体が含まれるであろう。
【００４５】
ハイブリダイゼーション反応の「ストリンジェンシー」は当業者により容易に決定でき、一般的に、プローブの長さ、洗浄温度および塩濃度に依存した経験的な計算でなされる。一般的に、プローブが長くなると適切なアニ―リングのために、より高い温度が必要となり、一方プローブが短くなると、より低い温度が必要となる。ハイブリダイゼーションは、一般的に、その融点より低い環境に相補鎖が存在する場合、変性したＤＮＡが再アニーリングする能力に依存する。プローブとハイブリダイズさせる配列間の所望の相同性の度合いが高いほど、適用することができる相対温度は高くなる。その結果、相対温度が高いほど、反応条件がよりストリンジェントになるであろうし、一方相対温度が低いほどストリンジェンシーはより少なくなる。ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーの更なる詳細および説明は、例えば、Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, Wiley lnterscience Publishers, (1995)に見られる。
【００４６】
「ストリンジェントな条件」または「高度なストリンジェンシー条件」は、本明細書では、通常は（１）洗浄において低イオン強度および高温を用い、例としては０．０１５M塩化ナトリウム／０．００１５Mクエン酸ナトリウム／０．１％ドデシル硫酸ナトリウム、５０℃；（２）ホルムアミドのような変性剤をハイブリダイゼーション中に用い、例としては、５０％（ｖ／ｖ）ホルムアミドを０．１％ウシ血清アルブミン／０．１％Ｆｉｃｏｌｌ／０．１％ポリビニルピロリドン／５０mMリン酸ナトリウムバッファー、ｐＨ６．５、７５０mM塩化ナトリウム、７５mMクエン酸ナトリウム中に、４２℃；または（３）５０％ホルムアミド、５ＸＳＳＣ（０．７５M ＮａＣｌ、０．０７５Ｍクエン酸ナトリウム）、５０mMリン酸ナトリウム（ｐＨ６．８）、０．１％ピロリン酸ナトリウム、５Ｘ Denhardt's溶液、超音波処理サケ精子ＤＮＡ（５０μg／ml）、０．１％ＳＤＳ、および１０％デキストラン硫酸、４２℃を用い、洗浄は４２℃において、０．２ＸＳＳＣ（塩化ナトリウム／クエン酸ナトリウム）および５０％ホルムアミドで５５℃、次いでＥＤＴＡを含む０．１ＸＳＳＣで５５℃から成る高ストリンジェンシー洗浄を行う。
【００４７】
「中程度にストリンジェントな条件」は、Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, New York: Cold Spring Harbor Press, 1989に記載されたものを参照としても良く、上記のものよりはストリンジェンシーの低い洗浄溶液およびハイブリダイゼーション条件（例えば、温度、イオン強度およびＳＤＳ％）の使用を含む。中程度にストリンジェントな条件の例としては、２０％ホルムアミド、５ＸＳＳＣ（１５０mM ＮａＣｌ、１５mMクエン酸酸三ナトリウム）、５０mMリン酸ナトリウム（ｐＨ７．６）、５ＸＤｅｎｈａｒｄｔ’ｓ溶液、１０％デキストラン硫酸、および２０mg／mlの変性、せん断したＤＮＡを含む溶液中で３７℃一夜インキュベートし、次いでフィルターを１ＸＳＳＣ中で約３７〜５０℃にて洗浄する。当業者であれば、温度、イオン強度等を、プローブの長さ等のような因子に適応するため必要に応じて、調整する方法を認識するであろう。
【００４８】
本発明の実施には、別段指定のない限り、当技術分野の範囲にある、分子生物学（組み換え技術を含む）、微生物学、細胞生物学および生化学の通常の技術が用いられるであろう。そのような技術はMolecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd edition, Sambrook et al., 1989; Oligonucleotide Synthesis, MJ Gait, ed., 1984; Animal Cell Culture, R.I. Freshney, ed., 1987; Methods in Enzymology, Academic Press, Inc.; Handbook of Experimental Immunology, 4th edition, D .M. Weir & CC. Blackwell, eds., Blackwell Science Inc., 1987; Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells, J. M. Miller & M.P. Calos, eds., 1987; Current Protocols in Molecular Biology, F.M. Ausubel et al., eds., 1987; および PCR: The Polymerase Chain Reaction, Mullis et al., eds., 1994、のような文献に十分に説明している。
【００４９】
本発明の実施態様の説明
マイクロアレイ分析および定量的ポリメラーゼ連鎖反応（ｑＰＣＲ）の組み合わせを用いて、腫瘍において低発現の、膀胱の移行上皮細胞癌（ＴＣＣ）のマーカーを同定した。驚くべきことには、これらのマーカー、および他の膀胱腫瘍マーカー（ＢＴＭ）、特に腫瘍において過剰発現しているマーカーとの間の比は、膀胱癌の診断に関するものであることを見出した。
【００５０】
比（マーカーの絶対値を測定するよりもむしろ）は、膀胱癌細胞の特徴を表している、単純な遺伝子発現「兆候」を同定し、驚くべきことに、試料採取技術または尿濃度の変動に対して、より耐性がある。更に、低発現マーカーと過剰発現マーカーを組み合わせると、患者から試料と非悪性コントロールからの試料の間の差が最大になり、試験の信頼性が向上する。本明細書に記載する低発現マーカーは、(i)ＴＣＣにおける強く、一貫した下方制御、(ii)正常組織における高発現、および(iii)血尿を呈する患者での擬陽性のリスクを最小にするため、全血における発現がわずかであること、に基づいて選択した。
【００５１】
二つのＢＴＭ比の測定の代用として、低発現および過剰発現ＢＴＭを回帰分析または線形識別分析を含む分類分析で分析できることも発見され、これらの分析の結果はまた、膀胱癌の存在の指標である。
【００５２】
試験には、癌を有すると疑われる、または癌を有するリスクのある患者からの試料中の、ＢＴＭのようなＴＭマーカーの少なくとも二つの測定が含まれており、ＴＭの少なくとも一つは低発現ＴＭである。低発現ＴＭと他のＴＭの比は癌の存在の指標である。第二のＴＭは当技術分野で知られている任意のＴＭでも可能であるが、好ましくは過剰発現ＢＴＭである。図３は、本発明で使用適性のある多くの低発現マーカーを示す。
【００５３】
試験は、一つの低発現ＴＭを一つの過剰発現ＴＭと組み合わせて使用して行うのが最良である。例えば任意の過剰発現ＴＭも使用することができる。浸潤性膀胱腫瘍（本明細書ではステージ１以上の腫瘍として規定される）から特定された既知の過剰発現ＢＴＭは、表１１に概要を述べてあり、表在性膀胱腫瘍（本明細書ではステージＴａおよびＴｉｓ腫瘍として規定される）から特定された過剰発現ＢＴＭを図１２に示す。
【００５４】
本発明に使用する好ましい低発現ＢＴＭは、全血において有意には上昇しておらず、腫瘍細胞および非悪性膀胱細胞の両方において十分に高いコピー数存在することが立証されたことはまた驚くべきことである。図４に好ましい低発現ＢＴＭの概要を述べる。
【００５５】
癌マーカーは、任意の適切な技術を用いて試料中に検出することができ、限定されないが、オリゴヌクレオチドプロ−ブ、ｑＰＣＲまたは癌マーカーに対する抗体、が含まれる。
【００５６】
当然のことながら、試験される試料は、腫瘍であると疑われる組織の試料に限定されない。マーカーは、血清中に分泌され、細胞膜から脱落し、溶解した細胞から放出され、または尿中へと失われる細胞に付着している可能性がある。それ故、試料としては任意の身体試料を含み、生検試料、血液、血清、腹膜洗浄液、脳精髄液、尿および便試料が挙げられる。
【００５７】
当然のことながら、本発明はヒトにおける癌の検出に限られておらず、限定されないが、イヌ、ネコ、ウマ、ウシ、ヒツジ、シカ、ブタおよび癌に罹患することが知られている任意の他の動物を含む、任意の動物において癌の検出に適している。
【００５８】
癌検出の一般的方法
以下の方法は、ＴＭを測定するために用いることができる非限定的な方法である。個々のＴＭの測定後、高および低発現ＢＴＭファミリーメンバーの間の比を測定する。これらの比は癌が存在するかしないかを予測するために使用する。
【００５９】
あるいは、ＴＭの高および低発現は、回帰または分類分析に用いる。これらの分析結果もまた、癌が存在するかしないかを予測するために使用する。
【００６０】
当然のことながら、発現レベルを測定するどのような方法も適切であろうが、発現レベルを測定する一般方法の概要を以下に述べる。
【００６１】
定量的ＰＣＲ（ｑＰＣＲ）
定量的ＰＣＲ（ｑＰＣＲ）は、ＢＴＭ特異的プライマーおよびプローブを用いて、腫瘍試料、血清、血漿および尿試料について行うことができる。コントロール反応において、ＰＣＲ反応で生成した産物の量は、出発テンプレートの量と相関する(Sambrook, J., E Fritsch, E. and T Maniatis, Molecular Cloning: A Laboratory Manual 3rd. Cold Spring Harbor Laboratory Press: Cold Spring Harbor (2001))。ＰＣＲ産物の定量化は、試薬が律速になる前に、対数期にある時にＰＣＲ反応を停止させることによって行うことができる。それからＰＣＲ産物をアガロースまたはポリアクリルアミドゲル中で電気泳動させ、臭化エチジウム染色または同等のＤＮＡ染色を行い、染色の強度をデンシトメトリーによって測定する。または、ＰＣＲ反応の進行を、産物の蓄積をリアルタイムで測定するApplied Biosystems1 Prism 7000または the Roche LightCyclerのようなＰＣＲ装置を用いて測定することができる。リアルタイムＰＣＲは、Sybr Greenのような色素を合成ＰＣＲ産物へ挿入してＤＮＡ蛍光を測定するか、または消光分子から切断された時に、レポーター分子によって放出される蛍光を測定する；レポーターおよび消光分子は、プライマーオリゴヌクレオチドからのＤＮＡ鎖伸長の後、標的ＤＮＡ分子にハイブリダイズさせるオリゴヌクレオチドプローブに組み込ませておく。オリゴヌクレオチドプローブは、次のＰＣＲサイクルにおいてＴａｑポリメラーゼの酵素作用により、置換されかつ分解され、消光分子からレポーターを放出させる。Scorpion（登録商標）として知られる一つの変法においては、プローブはプライマーに共有結合している。
【００６２】
逆転写ＰＣＲ（ＲＴ−ＰＣＲ）
ＲＴ−ＰＣＲは、薬剤治療を受ける、または受けない正常および腫瘍組織において、異なった試料群におけるＲＮＡレベルを比較し、発現の型を特徴づけ、近縁関係にあるＲＮＡを識別し、ＲＮＡ構造を分析するために用いることができる。
【００６３】
ＲＴ−ＰＣＲについては、最初のステップは標的試料からＲＮＡを分離することである。出発物質は、通常は、ヒトの腫瘍または腫瘍細胞株、およびそれぞれに対応する正常組織または細胞株である。ＲＮＡは、乳房、肺、結腸（例えば大腸または小腸）、結腸直腸、胃、食道、肛門、直腸、前立腺、脳、肝臓、すい臓、脾臓、胸腺、精巣、卵巣、子宮、膀胱等からの腫瘍試料、原発性腫瘍または腫瘍細胞株からの、および健常提供者からのプールさた組織、のような種々の試料から分離することができる。もしＲＮＡ源が腫瘍ならば、ＲＮＡは、例えば、凍結したまたは保存したパラフィン包埋および固定（ホルマリン固定）した組織試料から抽出することができる。
【００６４】
ＲＴ−ＰＣＲによる遺伝子発現プロファイリングの最初のステップは、ＲＮＡテンプレートのｃＤＮＡへの逆転写であり、次いでＰＣＲ反応における指数関数的な増幅を行う。二つの最も普通に使用されている逆転写酵素はトリ骨髄芽球症ウイルスの逆転写酵素（ＡＭＶ−ＲＴ）およびＭｏｌｏｎｅｙマウス白血病ウイルス逆転写酵素（ＭＭＬＶ−ＲＴ）である。逆転写ステップは、通常は、状況と発現プロファイリングの目的に応じて、特異的なプライマー、ランダムヘキサマーまたはオリゴｄＴプライマーを用いて開始する。例えば、抽出されたＲＮＡは、GeneAmp RNA PCR キット (Perkin Elmer, CA, USA)を用いて、メーカーの指示に従って、逆転写することができる。得られたｃＤＮＡを次のＰＣＲ反応におけるテンプレートとして用いることができる。
【００６５】
ＰＣＲステップは種々の熱安定性のＤＮＡ依存ＤＮＡポリメラーゼを用いることができるが、通常は、５’‐３’ヌクレーゼ活性を有するが、３’‐５’プルーフリーディングエンドヌクレアーゼ活性を欠くＴａｑＤＮＡポリメラーゼを用いる。従って、ＴａｑＭａｎ（ｑ）ＰＣＲは通常は、ＴａｑまたはＴｔｈポリメラーゼの５’ヌクレアーゼ活性を、標的アンプリコン結合しているハイブリダイゼーションプローブを加水分解するために用いるが、同等の５’ヌクレアーゼ活性を有するいかなる酵素も用いることができる。
【００６６】
二つのオリゴヌクレオチドプライマーが、ＰＣＲ反応に典型的なアンプリコンを生成するために用いる。第三のオリゴヌクレオチドまたはプローブは、二つのＰＣＲプライマーの間に存在するヌクレオチド配列を検出するために設計される。プローブはＴａｑＤＮＡポリメラーゼ酵素によっては伸長されず、レポーター蛍光色素および消光蛍光色素で標識されている。二つの色素が、プローブ上でのように接近して存在する場合、レポーター色素からの、いかなるレーザー誘導発光も消光色素によって消光される。増幅反応の間、ＴａｑＤＮＡポリメラーゼ酵素はプローブを、テンプレート依存的に切断する。その結果のプローブ断片は、溶液中に分散し、放出されたレポーター色素からのシグナルは、第二のフルオロフォアの消光効果を受けない。新分子が合成されるごとに、レポーター色素１分子が放出され、消光されないレポーター色素の検出により、データの定量的解釈の基盤が与えられる。
【００６７】
ＴａｑＭａｎＲＴＰＣＲは、例えばABI PRISM 7700 Sequence Detection System (Perkin-Elmer-Applied Biosystems, Foster City, CA, USA), または Lightcycler (Roche Molecular Biochemicals, Mannheim, Germany)のような市販の装置を用いて行うことができる。好ましい一実施態様では、５’ヌクレアーゼ手順は、ABI PRISM 7700tam Sequence Detection Systemのようなリアルタイム定量ＰＣＲ装置で行われる。システムは、サーモサイクラー、レーザー、チャージカップル装置（ＣＣＤ）、カメラおよびコンピュータから成る。システムは、サーモサイクラー上の９６穴型中の試料を増幅する。増幅中、レーザー誘導蛍光シグナルをリアルタイムで、光ファイバーケーブルを通じて全９６穴から集め、ＣＣＤで検出する。システムは機器の操作とデータ分析のためのソフトウエアを含む。
【００６８】
５’ヌクレアーゼアッセイデータは、はじめにＣｔまたは閾値サイクルとしてとして表される。上に考察したように、蛍光値は、各サイクルの間記録され、増幅反応におけるその時点での増幅された産物の量を表す。蛍光シグナルが、統計的に有意であると最初に記録された時点が、閾値サイクルである。
【００６９】
リアルタイム定量ＰＣＲ（ｑＰＣＲ）
ＲＴ−ＰＣＲ技術の最近の変種は、二重標識蛍光プローブ（すなわちＴａｑＭａｎプローブ）によって、ＰＣＲ産物の蓄積を測定するリアルタイム定量ＰＣＲである。リアルタイムＰＣＲは、競合定量ＰＣＲと相対定量ＰＣＲの両方に適合する。前者は、基準化のために各標的配列に対して内部競合剤を用い、一方後者は、試料中に含まれる基準化遺伝子、またはＲＴ−ＰＣＲについてはハウスキーピング遺伝子を用いる。更なる詳細は、例えばHeld et al., Genome Research 6: 986-994 (1996)によって与えられる。
【００７０】
発現レベルは、ＲＮＡ源として固定したパラフィン包埋組織を用いて測定可能である。
本発明の一態様によれば、ＰＣＲプライマーおよびプローブは、増幅されるべき遺伝子のイントロン配列に基づいて設計する。この実施態様では、プライマー／プローブ設計の第一段階は遺伝子内のイントロン配列の描写である。これは、Kent, W. J., Genome Res. 12 (4): 656-64 (2002)が開発したＤＮＡ ＢＬＡＴソフトウエアのような公的に入手可能なソフトウエア、またはその変種を含むＢＬＡＳＴソフトウエアによって行うことができる。その後の段階として、ＰＣＲプライマーおよびプローブ設計についての定評のある方法が続く。
【００７１】
非特異的なシグナルを避けるためにプライマーおよびプローブを設計する時にイントロン内の反復配列をマスクすることが有用である。これは、ベイラー医科大学を通じてオンラインで得られるRepeat Maskerプログラムを用いて容易に実施することができ、このプログラムはＤＮＡ配列を反復要素のライブラリーに対してスクリーニングし、反復要素がマスクされたクエリー配列を返す。マスクされた配列を、Primer Express (Applied Biosystems)；MGB assay-by-design (Applied Biosystems)；Primer3 (Steve Rozen and Helen J. Skaletsky (2000)、のような、いずれかの市販のまたは公的に得られるプライマー／プローブパッケジを用いて、プライマーおよびプローブを設計するために用いることができる。Primer3は一般利用者のためにはＷＷＷにあり、生物学プログラマーのために
Krawetz S, Misener S (eds) Bioinformatics Methods and Protocols: Methods in Molecular Biology. Humana Press, Totowa, NJ, pp 365-386)に記載している。
【００７２】
ＰＣＲプライマー設計において考慮すべき最も重要な要素としては、プライマー長、融点（Ｔｍ）およびＧ／Ｃ含量、特異性、相補的プライマー配列および３’末端配列が挙げられる。一般的に、最適ＰＣＲプライマーは、一般的に１７〜３０塩基長であり、約２０〜８０％、例えば約５０〜６０％Ｇ＋Ｃ塩基を含む。融点は５０と８０℃の間、例えば約５０から７０℃が通常、好まれる。ＰＣＲプライマーおよびプローブ設計に関する更なる指針としては、例えばDieffenbach, C. W. et al., General Concepts for PCR Primer Design in: PCR Primer, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York, 1995, pp. 133-155; lnnis and Gelfand, Optimization of PCRs in: PCR Protocols, A Guide to Methods and Applications, CRC Press, London, 1994, pp. 5-11 ; and Plasterer, T. N. Primerselect: Primer and probe design. Methods MoI. Biol. 70: 520-527 (1997)を参照されたい。これらの全開示内容は、参照により本明細書に明確に援用される。
【００７３】
マイクロアレイ分析
差次的発現はまた、マイクロアレイ技術を用いて同定または確認することができる。従って、ＣＣＰＭｓの発現プロフィールは、新鮮腫瘍組織またはパラフィン包埋腫瘍組織のどちらかで、マイクロアレイ技術を用いて測定することができる。この方法では、対象となるポリヌクレオチド配列（ｃＤＮＡおよびオリゴヌクレオチド）をマイクロチップ基材上に蒔く、または整列させる。整列した配列（すなわちキャプチャープローブ）は、対象となる細胞または組織（すなわち標的）からの特定のポリヌクレオチドとハイブリダイゼ−ションさせる。ＲＴ−ＰＣＲ法におけるように、ＲＮＡの源は、通常、ヒト腫瘍または腫瘍細胞株、および対応する正常組織または細胞株から分離した全ＲＮＡである。従って、ＲＮＡは、種々の原発腫瘍または腫瘍細胞株から分離することができる。もしＲＮＡ源が原発腫瘍である場合は、ＲＮＡは、日常の診療において常に調製し保存している、例えば凍結した、または保存したホルマリン固定パラフィン包埋（ＦＦＰＥ）組織試料および固定(例えばホルマリン固定)組織試料から抽出することができる。
【００７４】
マイクロアレイ技術の具体的な実施態様では、ｃＤＮＡクローンのＰＣＲ増幅された挿入断片を基材に添加する。基材は、１、２、５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、または７５までのヌクレオチド配列を含むことができる。他の態様では、基材は少なくとも１０，０００ヌクレオチド配列を含むことができる。マイクロアレイの配列は、マイクロチップ上に固定され、ストリンジェントな条件下でハイブリダイゼ−ションを行うのに適している。他の実施態様として、マイクロアレイの標的は、少なくとも５０、１００、２００、４００、５００、１０００、または２０００塩基長；または５０〜１００、１００〜２００、１００〜５００、１００〜１０００、１００〜２０００または５００〜５０００塩基長であり得る。更なる実施態様として、マイクロアレイのためのキャプチャープローブは、少なくとも１０、１５、２０、２５、５０、７５、８０、または１００塩基長：または１０〜１５、１０〜２０、１０〜２５、１０〜５０、１０〜７５、１０〜８０または２０〜８０塩基長であり得る。
【００７５】
蛍光標識ｃＤＮＡプローブは、対象となる組織から抽出されたＲＮＡの逆転写による蛍光ヌクレオチドの組み込みによって作製してもよい。チップに添加された標識ｃＤＮＡプローブは、アレイ上のＤＮＡの各スポットに、特異性をもってハイブリダイゼ−ションする。非特異的に結合したプローブを除去するためのストリンジェントな洗浄の後、共焦点レーザー顕微鏡またはＣＣＤカメラのような別の検出方法で、チップを走査する。各アレイの要素のハイブリダイゼ−ションの定量によって、対応するｍＲＮＡの存在量の評価が可能になる。二つの源からのＲＮＡから作製した、二重蛍光色で別々に標識されたｃＤＮＡプローブは、対としてアレイとハイブリダイゼ−ションさせる。それぞれの特定遺伝子に対応する二つの源からの転写物の相対的な存在量を、このようにして同時に測定する。このための代表的なプロトコルは、実施例４に詳細に記述する。
【００７６】
ハイブリダイゼ−ションの小型化によって、膨大な遺伝子の発現型の便利で迅速な評価が利用可能になる。該方法は、細胞あたり数コピーで発現する、稀有な転写物を検出するために、および発現レベルにおける約２倍の差を再現性良く検出するために、必要となる感度を有することが示された(Schena et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93 (2): 106-149 (1996))。マイクロアレイ分析は、Affymetrix GenChip technology, lllumina microarray technology またはIncyte's microarray technologyのような市販の装置によって、メーカーのプロトコルに従って行うことができる。遺伝子発現の大規模分析のためのマイクロアレイ法の開発によって、癌分類の分子マーカーを体系的に探査すること、種々の腫瘍型における効果予測することが可能になる。
【００７７】
ＲＮＡの分離、精製および増幅
当技術分野においてｍＲＮＡ抽出のための一般的方法は良く知られており、Ausubel et al., Current Protocols of Molecular Biology, John Wiley and Sons (1997)を含む標準的な分子生物学の教科書に開示されている。パラフィン包埋組織からのＲＮＡ抽出法は例えばRupp and Locker, Lab Invest. 56: A67 (1987), and De Sandres et al., BioTechniques 18: 42044 (1995)に開示している。特に、ＲＮＡ抽出は、Ｑｉａｇｅｎのような業者からの精製キット、バッファーセットおよびプロテアーゼを用いて、メーカーの指示に従って行うことができる。例えば、培養細胞らの全ＲＮＡはQiagen RNeasy mini-columnsを用いて分離することができる。他の市販のＲＮＡ分離キットとしては、MasterPure Complete ＤＮＡ and ＲＮＡ Purification Kit (EPICENTRE (D, Madison, Wl)およびParaffin Block ＲＮＡ Isolation Kit (Ambion, Inc.)が挙げられる。
組織試料からの全ＲＮＡは、ＲＮＡ Stat-60 (Tel- Test)を用いて分離することができる。腫瘍から調製されたＲＮＡは、塩化セシウム密度勾配遠心法によって分離できる。
【００７８】
固定パラフィン包埋組織をＲＮＡ源として用い、ｍＲＮＡ分離、精製、プライマー伸長および増幅を含む、遺伝子発現のプロファイリングのための代表的なプロトコルのステップは、種々の公刊された雑誌の論文に与えられている(例えば: T. E. Godfrey et al. J. Molec. Diagnostics 2: 84-91 (2000); K. Specht et al., Am. J. Pathol. 158: 419-29 (2001))。手短に説明すれば、代表的な手順は、パラフィン包埋腫瘍組織試料の約１０μｍ厚の切片を切ることから始まる。それからＲＮＡを抽出し、タンパクとＤＮＡを除去する。ＲＮＡの濃度の分析後、必要であれば、ＲＮＡ修復および／または増幅ステップを含めても良く、それからＲＮＡを、遺伝子特異的なプロモータを用いて逆転写し次いでＲＴ−ＰＣＲを行う。最後に、データを分析し、検査した腫瘍試料において同定された特徴的な遺伝子発現パターンに基づき、患者が得られる最良の治療の選択を明らかにする。
【００７９】
免疫組織化学およびプロテオミクス
免疫組織化学法はまた、本発明の増殖マーカーの発現レベルを検出するのに適している。従って、各マーカーに特異的な、抗体または抗血清、好ましくはポリクロナール抗血清、最も好ましくはモノクロナール抗体を、発現を検出するために用いる。抗体は、例えば放射線標識、蛍光標識、ビオチンのようなハプテン標識、またはセイヨウワサビペルオキシダーゼまたはアルカリホスファターゼのような酵素での、抗体自身の直接標識によって検出することができる。あるいは、未標識の第一次抗体を、第一次抗体に特異的な抗血清、ポリクロナール抗血清またはモノクロナール抗体を含む標識された第二次抗体と組み合わせて用いる。免疫組織化学プロトコルおよびキットは当技術分野で良く知られており、市販されている。
【００８０】
プロテオミックスは、試料中（例えば、組織、器官または培養細胞）に存在するポリペプチドをある時点において分析するために用いることができる。特に、プロテオミック技術は試料中のポリペプチド発現の包括的な変化の評価をするために用いることができる（発現プロテオミックスとも呼ばれる）。プロテオミック分析は、通常は：（１）二次元ゲル電気泳動法（２−ＤＰＡＧＥ）による試料中の個々のポリペプチドの分離；（２）ゲルから回収された個々のポリペプチドの同定、例えば質量分光分析またはＮ末端配列決定による；および（３）生物情報科学を用いての分析を含む。プロテオミックス法は、単独で、または本発明の増殖マーカーの産物を検出するための他の方法と組み合わせて、遺伝子発現プロファイリングの他の方法に対する貴重な補助である。
【００８１】
マーカーに対して選択的である核酸プローブを用いたハイブリダイゼ−ション方法
これらの方法は、核酸プローブを支持体に結合させ、試験試料から由来したＲＮＡまたはｃＤＮＡと適切な条件下でハイブリダイゼ−ションさせることを含む(Sambrook, J., E Fritsch, E. and T Maniatis, Molecular Cloning: A Laboratory Manual 3rd. Cold Spring Harbor Laboratory Press: Cold Spring Harbor (2001))。これらの方法は、組織または液体試料から由来したＢＴＭに適用することができる。ＲＮＡまたはｃＤＮＡ製剤は、通常は検出と定量を可能にするために、蛍光または放射性分子で標識されている。いくつかの応用では、ハイブリダイゼ−ションするＤＮＡは、シグナル強度を増強するために、分岐した蛍光標識構造でタグを付けることができる(Nolte, F.S., Branched ＤＮＡ signal amplification for direct quantitation of nucleic acid sequences in clinical specimens. Adv. Clin. Chem. 33, 201- 35 (1998))。ハイブリダイゼ−ションしない標識は、蛍光検出またはゲル像のデンシトメトリーによってハイブリダイゼ−ションの量を定量する前に、０．１ＸＳＳＣ、０．５％ＳＤＳのような低塩溶液中での強い洗浄によって除去する。支持体はナイロンまたはニトロセルロースのような固体であっても、液体懸濁状態でハイブリダイゼ−ションする小球体またはビーズであってもよい。洗浄と精製を可能にするために、ビーズは磁石であってもよいし(Haukanes, B-I and Kvam, C, Application of magnetic beads in bioassays. Bio/Technology 11, 60-63 (1993))、またはフローサイトメトリーを可能にするために蛍光標識されていてもよい(例えば: Spiro, A., Lowe, M. and Brown, D., A Bead-Based Method for Multiplexed Identification and Quantitation of ＤＮＡ Sequences Using Flow Cytometry. Appl. Env. Micro. 66, 4258-4265 (2000)を参照)。
【００８２】
ハイブリダイゼ−ション技術の変種は、蛍光ビーズ支持体と分岐ＤＮＡシグナル増幅を組み合わせたQuantiGene Plex（登録商標）アッセイ(Genospectra, Fremont)である。ハイブリダイゼ−ション技術の更に別の変種は、Quantikine（登録商標）ｍＲＮＡアッセイ (R&D Systems, Minneapolis)である。方法はメーカーの指示書中に記述してある。簡単に説明すれば、このアッセイは、ジゴキシゲニンと結合したオリゴヌクレオチドハイブリダイゼ−ションプローブを用いる。ハイブリダイゼ−ションは、呈色反応アッセイにおいて、アルカリホスファターゼと結合した抗ジゴキシゲニン抗体を用いて検出される。
【００８３】
追加の方法は、当技術において周知であり、本明細書にさらに記述する必要はない。
【００８４】
酵素結合免疫アッセイ（ＥＬＩＳＡ）
簡単に説明すれば、サンドイッチＥＬＩＳＡアッセイにおいては、ＢＴＭに対するポリクローンまたはモノクローン抗体は固体の支持体(Crowther, J. R. The ELISA guidebook. Humana Press: New Jersey (2000); Harlow, E. and Lane, D., Using antibodies: a laboratory manual. Cold Spring Harbor Laboratory Press: Cold Spring Harbor (1999))、または懸濁ビーズに結合している。他の方法は当技術分野において周知であり、更に本明細書で説明する必要はない。モノクロナール抗体は、ハイブリドーマ由来であることもできるし、またはファージ抗体ライブラリーから選択することができる(Hust M. and Dubel S., Phage display vectors for the in vitro generation of human antibody fragments. Methods MoI Biol. 295:71-96 (2005))。非特異的な結合部位は、非標的タンパク製剤および界面活性剤でブロックされる。それからキャプチャー抗体を、ＢＴＭ抗原を含む尿または組織の調製物とインキュベートする。抗体／抗原複合体を、標的ＢＴＭを検出する第二の抗体とインキュベートする前に、混合物を洗浄する。第二の抗体は通常は、酵素反応またはレポーターと結合している第三の抗体のいずれかによって検出される、蛍光分子または他のレポーター分子と結合している(Crowther, Id.)。または、直接ＥＬＩＳＡにおいては、ＢＴＭを含む調製物は、支持体またはビーズに結合でき、標的抗原は抗体―レポーター抱合体で直接検出される(Crowther, Id.)。
【００８５】
モノクロナール抗体およびポリクロナール抗血清を製造する方法は当技術分野においては公知であり、本明細書で更に説明する必要はない。
【００８６】
免疫検出
腫瘍を除くための手術の前後に採取された膀胱癌患者からの血清または血漿におけるマーカーファミリーメンバーの免疫検出；限定されないが、結腸直腸、膵臓、卵巣、黒色肉腫、肝臓、食道、胃、子宮内膜および脳を含む、他の癌を有する患者におけるマーカーファミリーメンバーの免疫検出；および膀胱癌患者からの尿および便試料におけるマーカーファミリーメンバーの免疫検出；のために、本方法を用いることもできる。
【００８７】
ＢＴＭはまた、免疫ブロッティングまたは免疫沈降のような他の標準的な免疫検出法を用いて、組織または尿中で検出することができる(Harlow, E. and Lane, D., Using antibodies: a laboratory manual. Cold Spring Harbor Laboratory Press: Cold Spring Harbor (1999))。免疫ブロッティングにおいては、ＢＴＭを含む組織または液体からのタンパク調製物を、変性または非変性状態で、ポリアクリルアミドゲルを介して電気泳動する。それからタンパクを、ナイロンのような膜状支持体に移動させる。その後、ＢＴＭを直接または間接的に、免疫組織化学について記述したように、モノクロナール抗体またはポリクロナール抗体と反応させる。あるいは、ある調製物では、タンパクを先に電気泳動分離することなしに膜に直接スポットすることができる。シグナルはデンシトメトリーにより定量することができる。
【００８８】
免疫沈降において、ＢＴＭを含む可溶性の調製物をＢＴＭに対するモノクロナール抗体またはポリクロナール抗体とインキュベートする。反応混合物を、それから共有結合したプロテインＡまたはプロテインＧを有するアガロースまたはポリアクリルアミドからなる不活性なビーズとインキュベートする。プロテインＡまたはプロテインＧビーズは、ビーズに結合した抗体−ＢＴＭ−抗原の固定された複合体を形成する抗体と特異的に相互作用する。洗浄後、結合したＢＴＭは免疫ブロッティングまたはＥＬＩＳＡによって検出および定量することができる。
【００８９】
閾値の決定
下方制御されたＢＴＭを用いた、比率または回帰分析のいずれかにおける試験のために、試料をＴＣＣに関して陽性または陰性と呼ぶことを可能にする、閾値を誘導する。これらの閾値は、ＴＣＣの存在を調査されている患者のコホートの分析によって決定されるであろう。閾値は異なった試験の適用により変動する可能性がある；例えば集団のスクリーニングにおける試験に使用する閾値は、主として泌尿器症状の無い患者のコホートを用いて決定されるであろうし、これらの閾値は、ＴＣＣ再発の監視下にある患者、または血尿のような泌尿器症状の存在を調査される患者に対する試験に用いる閾値とは異なっている可能性がある。閾値は、要求される臨床状況において試験の特異性の実用的なレベルを提供するために選択することができる；すなわち擬陽性の結果を受ける患者の数が過剰ではないような、適度な感度を可能にする特異性である。この特異性は８０〜９０％の範囲内にあればよい。試験の閾値を得る代替法の一つは、異なった試験の閾値について、感度を特異性に対してプロットし（ＲＯＣ曲線）、それから曲線の変曲点を選択する方法である。
【００９０】
単一閾値の代用として、試験は、疾患の存在の可能性の程度が異なる、およびそれらに関連した臨床結果が異なる、試験区間を用いてもよい。例えば、試験は三つの区間を有してもよい：一つはＴＣＣの存在の高リスク（例えば９０％）と関連する区間、第二はＴＣＣの低リスクと関連する区間、および第三は疾患の疑いがあると見なされる区間である。「疑わしい区間」は、規定された期間での再試験の推奨と関連し得る。
【００９１】
尿中の膀胱癌マーカーを検出する方法
いくつかの実施態様では、ＢＴＭに関するアッセイは、尿試料について行うことできることが望ましい。一般的に、これらの液体中のオリゴヌクレオチド、タンパクおよびペプチドに関するアッセイ方法は当技術分野では知られている。しかしながら、例示の目的で、ＢＴＭの尿レベルはサンドイッチ型酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）を用いて定量することができる。血漿または血清アッセイのために、適切に希釈した試料または段階希釈した標準ＢＴＭ５μl、およびペルオキシダーゼ抱合抗ヒトＢＴＭ抗体７５μlを、マイクロタイタープレートのウエルに加える。３０分間３０℃のインキュベーション期間の後、結合していない抗体を除くために、ウエルをリン酸バッファー食塩水（ＰＢＳ）中０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０で洗浄する。ＢＴＭと抗ＢＴＭ抗体の結合した複合体は、それからＨ２Ｏ２を含むo-フェニレンジアミンと１５分間３０℃でインキュベートする。当然のことながら、反応を１M Ｈ２ＳＯ４を加えて停止し、４９２nmでの吸光度をマイクロタ-イタープレートリーダーで測定する。抗ＢＴＭ抗体は、モノクロナール抗体またはポリクロナール抗体であり得る。
【００９２】
多くのタンパクは、（１）細胞によって分泌され、（２）細胞膜から切断され、（３）細胞死時に細胞から喪失するか、または（４）脱落した細胞内に含まれる、のいずれかであることから、当然のことながら、ＢＴＭは尿中で検出される可能性もある。更に加えて、膀胱癌の診断は、試料中のＢＴＭの発現、または試料中のＢＴＭの蓄積のいずれかを測定することにより決定することができる。診断の先行技術における方法には、膀胱鏡検査、細胞学的検査およびこれらの処置の間に抽出された細胞の検査が挙げられる。該方法は、尿中または尿路上皮のこすり取った試料中の、又は他の症例の場合、膀胱壁の生検試料中の腫瘍細胞の同定に依存した。これらの方法は、試料採取の誤り、観察者間の同定における誤差等を含む、数種類の誤差を被る。
【００９３】
膀胱腫瘍マーカーに対する抗体
更なる態様では、本発明は、ＢＴＭに対する抗体の製造を含む。本明細書に記載する方法を用いて、新規のＢＴＭを、マイクロアレイおよび／またはｑＰＣＲを用いて同定することができる。ひとたび推定マーカーが同定されると、免疫反応を誘発するのに十分な量の推定マーカーを製造することができる。場合によっては、全長ＢＴＭを用いることができ、他の場合は、免疫原としてＢＴＭのペプチド断片が十分であるかも知れない。免疫原は、適切な宿主（例えば、マウス、ウサギ等）に注射することができ、必要に応じて、完全フロイントアジュバント、フロイント不完全アジュバントのようなアジュバントを、免疫反応を増強させるために注射することができる。当然のことながら、免疫技術においては抗体を作成することは、ルーチンであり、本明細書でさらに記述する必要はない。その結果、本明細書に記載した方法を用いて、同定されたＢＴＭに対する抗体を製造することができる。
【００９４】
更なる実施態様では、本明細書で同定された腫瘍マーカーのタンパクまたはタンパクコアに対して、またはＢＴＭに特有のオリゴヌクレオチド配列に対して、抗体を作製することができる。ある種のタンパクはグリコシル化が可能であるが、グリコシル化のパターンの変種は、ある状況下においては、通常のグリコシル化パターンを欠いたＢＴＭの形を検出間違いする可能性がある。従って、本発明のある態様では、ＢＴＭ免疫原は、脱グリコシルＢＴＭまたは脱グリコシルＢＴＭ断片を含むことができる。脱グリコシル化は、当技術分野において知られる一つ以上のグリコシダーゼを用いて達成することができる。あるいは、ＢＴＭｃＤＮＡを、大腸菌等を含む原核生物細胞株のようなグリコシル化欠損細胞株において発現させることができる。
【００９５】
ＢＴＭをコードするオリゴヌクレオチドを有するベクターを作成することができる。多くのそのようなベクターは、当技術分野において周知の公知の標準ベクターを基礎とすることができる。ベクターは、種々の細胞株をトランスフェクトして、ＢＴＭを製造する細胞株を作製するために用いることができる。特異的抗体、またはＢＴＭ検出用の他の試薬を開発するため、またはＢＴＭに対して開発されたアッセイを基準化するため、ＢＴＭを製造する細胞株を用いて、所望量のＢＴＭを製造することができる。
【００９６】
キット
本発明の発見に基づいて、数種のタイプの試験キットを想定し製造することができる。第一に、検出分子（またはキャプチャー試薬）を予め搭載した検出装置を有するキットを作製できる。ＢＴＭｍＲＮＡの検出に関する実施態様では、該装置は、基材（例えば、ガラス、シリコン、石英、金属等）を含むことが可能であり、基材の上には、検出されるべきｍＲＮＡとハイブリダイゼ−ションするオリゴヌクレオチドがキャプチャー試薬として結合している。いくつかの実施態様では、ｍＲＮＡの直接検出は、ｍＲＮＡ（ｃｙ３、ｃｙ５、放射線標識または他の標識で標識されている）を基材上のオリゴヌクレオチドにハイブリダイゼ−ションさせることにより達成することが可能である。他の実施態様では、ｍＲＮＡの検出は、所望のｍＲＮＡに対する相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）をまず作製することによって達成可能である。それから、標識ｃＤＮＡを、基質上のオリゴヌクレオチドとハイブリダイゼ−ションさせ、検出できる。
【００９７】
抗体をキット中でキャプチャー試薬として用いることもできる。いくつかの実施態様では、基材（例えばマルチウエルプレート）はそこに付着した特異的ＢＴＭキャプチャー試薬を有することが可能である。いくつかの実施態様では、キットにブロッキング試薬を含ませることも可能である。ブロッキング試薬は非特異的な結合を減少させるために使用できる。例えば、非特異的なオリゴヌクレオチド結合は、サケ精子ＤＮＡのようなＢＴＭオリゴヌクレオチドを含まない、任意の都合の良い供給源からのＤＮＡの過剰量を用いて減少させることができる。非特異的な抗体の結合は、血清アルブミンのようなブロッキングタンパクの過剰量を用いて減少させることができる。当然のことながら、オリゴヌクレオチドおよびタンパクを検出するための数多くの方法が、当技術分野で知られており、ＢＴＭ関連分子を特異的に検出することが可能ないかなる戦略も使用することができ、本発明の範囲内にあると考えることができる。
【００９８】
基材に加えて、試験キットはキャプチャー試薬（プローブのような）、洗浄液（例えばＳＳＣ、他の塩、バッファー、洗剤等）ならびに検出部分（例えば、ｃｙ３、ｃｙ５、放射線標識等）を含むことができる。キットはまた、使用のための取扱説明書および包装を含むことができる。
【００９９】
膀胱癌Ｉの検出のために用いるＢＴＭ比
一連の実施態様では、過剰発現するＢＴＭと組み合わせてＢＴＭＬＴＢＤＨ４を検査するための試薬は、膀胱癌を検出するための、分画されない尿または尿細胞沈殿物の試験のためのキットに組み込むことができる。尿試料は、疾患の進行または治療に対する反応の監視を必要とする、膀胱癌と診断された患者、肉眼または顕微鏡的な血尿を含む泌尿器症状を有する個人、または無症状の個人、から採取することができる。分画されない尿中のＢＴＭを測定するキットを用いて試験される患者または個人については、試験用に尿の約２mlを採取して試験することができる。尿の沈殿物に関する試験については、＞１０mlの尿を採取することができる。
【０１００】
適切なキットとして：(i)使用および結果の解釈のための取扱説明書、(ii)任意の回帰分析分類子または式を含む、多遺伝子分析の解釈のためのソフトウエア、(iii)未分画の尿または尿沈殿物からのＲＮＡの安定化および精製のための試薬、(iv)ｄＮＴＰおよび逆転写酵素を含む、ｃＤＮＡの合成のための試薬、および(v)ＢＴＭｃＤＮＡの定量化のための試薬、が挙げられる。一つの形では、これらの試薬は、定量ＰＣＲに用いても良く、ＰＣＲに必要とされる、特異的なエクソンにまたがるオリゴヌクレオチドプライマー、検出のためのプローブで標識された第三のオリゴヌクレオチド、Ｔａｑポリメラーゼおよび他のバッファー、塩およびｄＮＴＰｓを含む。キットは、標識プローブまたは分岐ＤＮＡ技術によるＢＴＭ ＲＮＡの直接ハイブリダイゼ−ションのような転写物の検出のための他の方法；および(vi)品質管理測定としての機能を果たす、βアクチンのような高度に転写される遺伝子からの転写物を検出するためのオリゴヌクレオチドおよびプローブ、も使用できる。
【０１０１】
ＢＴＭ比を用いた膀胱癌の進行の評価
膀胱腫瘍の進行を評価するために、組織試料を膀胱壁の生検によって得、または膀胱癌を有する患者から尿試料を長い時間をかけて採取する。ＢＴＭまたはそれらの組み合わせの比の評価を、異なった時間に採取された試料について行う。特定の範囲内のＢＴＭ比は膀胱癌の進行を示す。
【０１０２】
ＢＴＭ比を用いた膀胱癌の治療の評価
膀胱腫瘍のための治療の効果を評価するために、組織および／または尿の試料を治療開始前に得る。一つ以上のＢＴＭのベースライン値を、互いに関して種々のＢＴＭの比を測定するのと同じように、測定する。治療を開始し、治療には、疾患の種類と段階に応じて、手術、放射線治療または化学療法を含めて、当技術分野において知られている任意の治療法を挙げることができる。治療過程の間、組織および／または尿の試料を採取し、ＢＴＭの存在および量を分析する。種々のＢＴＭの比を測定し、結果を（１）治療前の患者のベースライン値、または（２）膀胱癌を有しない個人の集団から得た正常値と比較する。
【０１０３】
ＴＣＣ療法の進行を監視するためのＢＴＭ比の使用
ＴＣＣの迅速診断および早期検出に加えて、組織、血清または尿において検出されたＢＴＭマーカー比は、治療に対する患者の反応を監視するために使用することができる。これらの応用において、尿および／または血清試料は、全身、小胞内または血管内化学療法、放射線療法または免疫療法の開始後、周期的に採取することができる。マーカー比の変化は、有効な治療を示す腫瘍サイズの減少を示す可能性がある。変化の比率は各患者または治療法のための最良の治療用量を予想するために用いることができる。
【０１０４】
ＢＴＭ回帰分析の利用
ＢＴＭ比に加えて、高および低発現ＢＴＭファミリーメンバーを含む、回帰または分類分析は上記の応用に用いることができる。
【０１０５】
評価したマーカーは、既知のヒト遺伝子から選択する。評価した遺伝子は図３および４に示す。図３および４に含まれるものは、遺伝子名、ＨＵＧＯ識別子、ＭＷＧオリゴ数、ＮＣＢＩ ｍＲＮＡ参照配列番号およびタンパク参照番号である。全長配列は、http://www.ncbi.nlm. nih.gov/entrez/に見出すことができる。
【０１０６】
実施例
本明細書で記述した実施例は本発明の実施態様を例示するためのものであって、本発明の範囲を制限する意図はない。他の実施態様、方法および分析の方法は分子診断技術における当業者の範囲内にあり、本明細書において詳細に記述する必要はない。本明細書の教えに基づく当技術分野の範囲内にある他の実施態様は、本発明の部分であると考えられる。
【０１０７】
方法
腫瘍の採取
膀胱腫瘍試料および非悪性尿路上皮試料は日本の京都大学病院において切除された外科手術標本から採取した。
【０１０８】
尿の採取
非悪性コントロールおよび膀胱癌患者からの尿試料は、日本の京都大学病院から得た。健常コントロール試料は日本人志願者から得た（図１）。
【０１０９】
ＲＮＡ抽出
腫瘍組織はTriReagent：水（３：１）混合物中でホモゲナイズし、それからクロロホルムで抽出した。その後、全ＲＮＡはそれからRNeasy（商標）手順(Qiagen)を用いて水相から精製した。ＲＮＡは、また１６の癌細胞株からも抽出し、参照ＲＮＡとして役立つようにプールした。
【０１１０】
ＲＮＡは、尿試料を等量の溶解バッファー（５．６４Ｍグアニジン−塩酸、０．５％サルコシル、５０ｍＭ酢酸ナトリウム（ｐＨ６．５）、および１mM β−メルカプトエタノール；ｐＨは７．０に１．５M Ｈｅｐｅｓ ｐＨ８で調整）と混合することにより、尿から抽出した。尿中のＲＮＡ量が低いことから、担体として作用させるために、全バクテリアＲＮＡ７．５μgを尿／溶解バッファー混合物に加えた。それから全ＲＮＡを、ＴｒｉｚｏｌおよびRNeasy（商標）手順を用いて抽出した。ＲＮＡ調製品は、Qiagen QIAquick（商標）PCR精製キットを用いて、ｃＤＮＡ合成の前に更に精製した。
【０１１１】
ＲＮＡは、３人の健常な志願者の血液から、３．６％デキストランにおける沈降を用いて全血から濃縮した細胞についてTrizol/RNeasy（商標）抽出を行うことにより抽出した。
【０１１２】
マイクロアレイスライドの調製
エポキシコーティングしたガラススライド(MWG Biotech)を、Gene Machinesマイクロアレイ作製ロボットを用いて、メーカーのプロトコルに従って、〜３０，０００の５０merオリゴヌクレオチド(MWG Biotech)でプリントした。
【０１１３】
ＲＮＡ標識およびハイブリダイゼーション
ｃＤＮＡは、５μg全ＲＮＡから、５−（３−アミノアリル）−２’デオキシウリジン−５’−三リン酸を含む反応において、Superscript II（商標）逆転写酵素(Invitrogen)を用いて転写した。反応混合物を、Ｃｙ３またはＣｙ５と炭酸水素塩バッファー中で１時間室温にてインキュベートする前に、Microconカラムで脱イオン化した。組み込まれていない色素はQiaquick カラム(Qiagen)を用いて除去し、SpeedVac中で試料を１５μlに濃縮した。Ｃｙ３およびＣｙ５で標識されたｃＤＮＡは、それからAmbion ULTRAhyb（商標）バッファーと混合し、１００℃、２分間で変性させ、ハイブリダイゼ−ションチェンバー内のマイクロアレイスライドと４２℃で１６時間ハイブリダイゼ−ションさせた。それからスライドを洗浄し、Axon 4000A（商標）スキャナー内で、２出力セッティングで２回走査した。
【０１１４】
癌マーカー遺伝子のマイクロアレイ分析
５３の膀胱腫瘍および２０の非悪性（「正常」）膀胱組織試料からのＲＮＡをＣｙ５で標識し、Ｃｙ３標識参照ＲＮＡと二重または三重でハイブリダイゼ−ションさせた。標準化した後、２９，７１８遺伝子のそれぞれの発現の変化を、倍変化率および統計的確率によって推定した。
【０１１５】
標準化手順
Genepix（商標）ソフトウエアにより検出した蛍光強度の中央値を、局所的なバックグラウンド強度を引き算することにより補正した。バックグラウンド補正強度がゼロ未満のスポットは排除した。標準化を容易にするために、強度比および総合的スポット強度を対数変換した。対数化した強度比は、LOCFIT（商標）パッケージで実施した局所回帰を用いて、色素および空間的バイアスに関して補正した。対数化した強度比は、総合的スポット強度および場所に関して同時に回帰させた。局所回帰の残余は、補正された対数化した倍変化率を与えた。品質管理のために、各標準化されたマイクロアレイの比をスポットの強度および局在化に関してプロットした。プロットをその後、人為産物の残余のいずれかが存在するかを肉眼的に検査した。更にANOVA モデルをpin-tipバイアスを検出するために適用した。統計分析のために、標準化の全ての結果およびパラメータをPostgresデータベースに挿入した。
【０１１６】
統計分析
アレイ間の測定倍変化率の比較を改良するために、log2(比)を、アレイ当たり同じ総合的標準偏差を有するように、率に応じて決めた。この標準化は平均組織内クラス変動率を減少させた。それから倍変化率に基づくランク検定を、ノイズロバスト性を改善するために用いた。この検定は、(i)アレイ内の倍変化率のランク（Rfc）の計算、およびii)腫瘍組織の(Rfc)中央値から正常組織の(Rfc)中央値を引く、と言う２段階より成る。両ランクの中央値の差は、倍変化率のランクのスコアを規定する。更に三つの統計検定を、標準化されたデータについて行った：１）２サンプルステューデントt-検定、２）Wilcoxon検定、および３）マイクロアレイの統計分析（SAM）。各統計方法で（ランク倍変化率、t-検定、Wilcoxon検定およびSAM）最も有意に下方制御された遺伝子は、各検定においてランクスコアを与えられた。全てのランクスコアを加えて、一つの合計ランクスコアにした。
【０１１７】
尿ＲＮＡからのｃＤＮＡ合成
全尿ＲＮＡは、順方向プライマーを０．０１μg含む５０μlの反応液において、７０℃でインキュベートし、それから氷上で２分間冷却することにより、膀胱腫瘍マーカーのそれぞれに対して遺伝子特異的なプライマーとアニールさせた。各ｃＤＮＡ反応液には、最終容積２０μl中、アニールしたＲＮＡおよび5x Superscript Il逆転写酵素バッファー(Invitrogen, USA)４μl、０．１ＭＤＴＴ(Invitrogen, USA) ２μl、ＲＮａｓｅ ｏｕｔ（４０Ｕ／μl(Invitrogen, USA)０．５μl、１０mM ｄＮＴＰ(Invitrogen, USA) ４μlおよびSuperscript Il逆転写酵素（２００Ｕ／μl）(Invitrogen, USA)０．５μlが含まれていた。反応液を４２℃で1時間、７０℃で１０分および８０℃で１分インキュベートした。ｑＰＣＲに先立って、反応液をQiagen QIAquick PCR精製カラム(Qiagen, Victoria, Australia)で精製し、−８０℃で保存した。
【０１１８】
定量的リアルタイムＰＣＲ
リアルタイムまたは定量ＰＣＴＲ（ｑＰＣＲ）は、ＰＣＲテンプレートコピー数の絶対的または相対的定量のために用いた。Taqman（商標）プローブおよびプライマーセットは、Primer Express V 2.0（商標）(Applied Biosystems)を用いて設計した。可能であれば、全ての潜在的スプライス変種は、結果として得られるアンプリコンに含め、アンプリコン優先権は、MWG-Biotech-由来マイクロアレイオリゴヌクレオチドによって包含される領域に与えた。プライマーおよびプローブの配列は図２に示す。あるいは、もし標的遺伝子が、所望のアンプリコンを包含して、Assay-on-Demand（商標）発現アッセイ(Applied Biosystems)によって表される場合は、それらを用いた。自家設計アッセイにおいて、プライマー濃度は、SYBR green標識プロトコルおよび参照ＲＮＡから作製したｃＤＮＡを用いて、滴定した。増幅はABI Prism（商標）7000配列検出システムで、標準的なサイクリング条件で行った。解離曲線において単一の増幅産物を観察した場合は、最適プライマー濃度および5’FAM - 3’TAMRA リン酸塩 Taqman（商標）プローブ(Proligo)を最終濃度２５０nMで用いて、６２５倍の濃度範囲にわたって標準曲線を作出した。０．９８を越える回帰係数を有する標準曲線を与えるアッセイを、次の分析に用いた。
【０１１９】
アッセイは９６穴プレートで行った。各プレートは、６２５倍の濃度範囲にわたって、参照ｃＤＮＡ標準曲線を含んだ。尿ｑＰＣＲについては、各反応において〜５mlの未分画尿から抽出した全ＲＮＡを用いた。ΔＣｔ（標的遺伝子Ｃｔ−平均参照ｃＤＮＡ Ｃｔ）を、各マーカーについて計算し、それに続く比率、回帰または分類分析において用いた。
【０１２０】
血液におけるマーカーの発現
図３および４に示すマーカーの全血における発現を、コンピュータシミュレーションで決定した。マイクロアレイプローブは、それらの標的ｍＲＮＡのGenBank登録番号を介してUniGeneクラスターに接続し、UniGeneからの組織発現プロフィールを、血液ライブラリーにおける発現配列タグ（ＥＳＴｓ）の数を決定するために用いた。０または１個の発現配列タグ（ＥＳＴ）を有する遺伝子のみを図４に示す。全血におけるＬＴＢ４ＤＨの低発現を確認するために、図２に示すプライマーおよびプローブを用いて、全血から抽出された全ＲＮＡについて、ＲＴ−ｑＰＣＲを実施した。有意な発現は観察されなかった（結果は示さず）。
【０１２１】
下方制御された膀胱癌マーカーの同定
膀胱癌の下方制御されたマーカーを同定するために、３０，０００オリゴヌクレオチドチップを用いて、５３の膀胱腫瘍および２０の非悪性膀胱組織試料からのＲＮＡについて、マイクロアレイ研究を、我々は行った。図３は、非悪性膀胱組織と比較して、膀胱癌組織において有意な下方制御を示す３００の遺伝子に関するマイクロアレイデータの統計分析を示す。図３は、ＨＵＧＯ遺伝子名および略語、タンパク参照配列番号、ＮＣＢＩｍＲＮＡ参照配列番号、MWG Biotechプローブオリゴヌクレオチド番号、腫瘍および非悪性組織の間の遺伝子発現における倍変化率中央値、本来の補正されないＳｔｕｄｅｎｔのｔ検定の結果、２-サンプルＷｉｌｃｏｘｏｎ検定の結果、ＳＡＭ検定の結果および合計ランクスコアを含む。
【０１２２】
膀胱癌のための尿試験における、好ましい低発現膀胱腫瘍マーカーの同定
血尿は、膀胱癌に伴う普通の共出現症状であることから、膀胱癌マーカーが全血において有意に上昇していないことが、有利である。更に、下方制御されるマーカーは、比率、回帰または分類分析に用いることから、それらが、腫瘍細胞および非悪性膀胱細胞に十分に高いコピー数で存在することは、尿における信頼性のある検出を可能にするために、有利である。適切なマーカーを同定するために、我々は、血液ＥＳＴライブラリーにおいてはほとんど、または全く代表されておらず、かつ非悪性組織において中央値よりも高い発現を有する、サブセットについて、図３における遺伝子をスクリーニングした。発現中央値は、アレイ上の３０，０００オリゴヌクレオチドを、マイクロアレイ試験において分析された試料における、それらの強度の中央値によってランク付けを行うことにより推測した。この基準に合うマーカーを図４に示す。図４は、ＨＵＧＯ遺伝子名および略語、タンパク参照配列番号、ＮＣＢＩｍＲＮＡ参照配列番号、倍変化率中央値、ランクスコア、腫瘍組織および非悪性組織におけるマイクロアレイスポット強度のランクの中央値、および血液ＥＳＴライブラリーに存在するＥＳＴ数を含む。
【０１２３】
アレイデータで観察した下方制御は、図４に示す三つの遺伝子、ＬＴＢ４ＤＨ、ＢＡＧ１およびＦＬＪ２１５１１について、ｑＰＣＲによって確証された。これらの遺伝子は、１０の腫瘍試料および１０の非悪性試料からの全ＲＮＡについて試験した。ＬＴＢ４ＤＨ、ＢＡＧ１およびＦＬＪ２１５１１は、これらの試料において、それぞれ２．５倍、１．４倍および６．１、倍の非悪性組織と比較して、膀胱癌において平均下方制御を示した。
【０１２４】
ＬＴＢ４ＤＨを用いた尿のｑＰＣＲ分析
ＴＣＣ患者および非悪性泌尿器状態を有するコントロールからの尿を、排尿またはカテーテルによって採取した。全ＲＮＡを、４２のコントロールの排尿採取尿、および３７のＴＣＣ患者の排尿採取尿またはカテーテル採取尿から抽出し、ＬＴＢ４ＤＨおよび三つの過剰発現マーカー、ＩＧＦＢＰ５、ＭＤＫおよびＨｏｘＡ１３に対するプライマーとプローブを用いる定量ＲＴ−ＰＣＲにおいて使用した。ΔＣｔ比を、ＩＧＦＢＰ５／ＬＴＢ４ＤＨ、ＭＤＫ／ＬＴＢ４ＤＨおよびＨｏｘＡ１３／ＬＴＢ４ＤＨについて決定した。このデータは図５のボックスプロットよって図示され、３回の検定のそれぞれにおけるコントロールおよびＴＣＣ患者からの尿試料の間のデータの広がりに明瞭な差を示す。最も正確な検定は、試料コホートにおいてそれぞれ８７％と８８％の感度および特異性を示したＩＧＦＢＰ５／ＬＴＢ４ＤＨであった(図６ａ)。これらの検定のそれぞれに関する、感度と特異性の間の対応を図示するために、ＲＯＣ曲線を図７に示す。ＩＧＦＢＰ５／ＬＴＢ４ＤＨ、ＭＤＫ／ＬＴＢ４ＤＨおよびＨｏｘＡ１３／ＬＴＢ４ＤＨに関する曲線下の面積は、それぞれ０．９２２３、０．９１９９および０．７４９７である。検定の正確さを測定するこれらの面積は、全ての３つのＬＴＢ４ＤＨとの比率が有用なこと、特にＩＧＦＢＰ５／ＬＴＢ４ＤＨおよびＭＤＫ／ＬＴＢ４ＤＨが有用なことを示している。
【０１２５】
ＴＣＣ検出の感度と特異性を増加させるために、二つの検定の組み合わせを用いた。これらの検定の組み合わせの最適感度および特異性を図６ｂに示す。図８ａ−ｆは、ＬＴＢ４ＤＨおよびＢＡＧ１を用いる三つの検定のそれぞれについての２次元空間でのデータ分離を示す。このデータは、下方制御ＢＴＭであるＬＴＢ４ＤＨまたはＢＡＧ１のいずれかを含む二つ以上の検定の組み合わせが、９０％を越える感度と特異性を達成することができることを示す。更に、これらの検定は単純な遺伝子発現シグニチャー（signature）を測定し、マーカーの絶対レベルを測定するのではないことから、これらは尿濃度の変動に対して耐性があるであろう。
【０１２６】
ＬＴＢ４ＤＨとの比が関与した検定の、尿濃度に対するロバスト性を示すために、ＩＧＢＰ５単一(ΔＣｔ)およびＩＧＦＢＰ５／ＬＴＢ４ＤＨのレベルを、尿濃度の関数としてプロットし（図９ａ−ｂ）、データにトレンドラインをフィットさせた。非悪性コントロールおよびＴＣＣを有する患者からのつのｒｙｏｕ尿試料について、尿濃度の増加に伴い、ＩＧＦＢＰ５ΔＣｔが減少することが分かるが、これはＩＧＦＢＰ５／ＬＴＢ４ＤＨ比に関しては存在しない。この効果は非悪性試料について最も顕著であったが、これはＩＧＦＢＰ５およびＬＴＢ４ＤＨの発現においては腫瘍の大きさおよび腫瘍の不均一さのような他の影響がないからである。
【０１２７】
場合によっては、膀胱癌アッセイにおいて単一マーカーを用いた時、尿試料採取の方法は、採取された脱落膀胱細胞の数の変動により、検出されるべきマーカーの量に影響し得る。このバイアスは、試料の少ない割合で、擬陽性または擬陰性の結果になり得る。ＬＴＢ４ＤＨまたは他の低発現遺伝子を含む比を使用は、異なった方法を補償するための方法を提供するはずである。この仮説を検証するために、単純な排尿採取(９試料)またはカテーテルによる採取（２８試料）によるＴＣＣ患者からの採取試料を、ＴＣＣマーカーおよびＬＴＢ４ＤＨの存在について検定した。ＴＣＣマーカー単独での分析により、排尿採取試料は、データの範囲の低い端に（より高いＣｔ）より多く代表されていることが示され、カテーテル採取試料に比べて、これらの試料中に脱落細胞の平均数がより少ないことと一致している。このことは、図１０ａ−ｃに、ＩＧＦＢＰ５、ＭＤＫおよびＨｏｘＡ１３に関する自己散乱プロットで図示している。対照的に、これらのマーカーとＬＴＢ４ＤＨの間の比率を計算した時、排尿およびカテーテル採取試料は、Ｃｔ比の類似した範囲に広がっており（図１０ｄ−ｆ）、高発現マーカーおよびＬＴＢ４ＤＨのような低発現マーカーの間の遺伝子発現シグニチャーの計算により、異なった尿採取方法によって導入されたマーカーレベルの変動が補償されることを図示している。
【０１２８】
低グレード腫瘍を有する患者からの尿試料は、これらの試料中に脱落細胞の少数のみが存在することから、ＢＴＭの蓄積ではしばしばボーダーライン上にある。これらの試料はそれ故、試料採取法または尿濃度の変動のために、分類が不正確であるという高いリスクがある。
【０１２９】
ＴＣＣの検出のための下方制御遺伝子を組み込んだ遺伝子発現比の有用性は、それ故、低グレードＴＣＣの検出に応用された時に顕著である可能性が高い。この効果を示すために、低グレードＴＣＣを有する患者からの排尿採取された４３の尿試料のコホートと、１２３のコントロールを、マーカーＩＧＦＢＰ５、ＨｏｘＡ１３およびＬＴＢ４ＤＨについて検定した。コホートの臨床的特徴を図１３に要約する。ＩＧＦＢＰ５およびＨｏｘＡ１３に関するｑＰＣＲデータを、検定の正確さの尺度としてＲＯＣ曲線下の面積を用いて（ＳＴＡＴＡ統計パッケージ）、単独でおよびＬＴＢ４ＤＨとの比で分析した。結果を図１４に要約する。ＩＧＦＢＰ５マーカーを用いると、ＬＴＢ４ＤＨは、低グレード（グレード１−２）ステージＴａのＴＣＣの検出精度を９％、いずれかのステージの低グレードＴＣＣを８％増加させた。低グレードステージＴａのＴＣＣのＨｏｘＡ１３検定の精度は、３％増加した。
【０１３０】
ＬＴＢ４ＤＨを用いたｑＰＣＲデータの線形識別分析
線形識別分析（ＬＤＡ）は、二つ以上の群の間に最大の分離が存在するように、変数の線形の組み合わせを生成する、統計的手法である(Fisher R.A. "The Use of Multiple Measurements in Taxonomic Problems", Annals of Eugenics 7 179 (1936))。この変数の線形の組み合わせは、「線形判別」と呼ばれ、データセットのクラスの分離を最大にするインプット変数の線形関数である。ｑＰＣＲデータのような特定のデータセットを特徴付けるために、ＬＤＡ（またはいずれかの他の分類手法）の能力は、相互検証を用いて検定できる。この方法において、データセットの一部は、分類子を生成するために用い、またデータベースの一部は、分類子の有効性を測るために用いる。データベースを訓練と検定への分割は、複数回反復することができる（毎回新分類子を生成する）。ｋ−倍相互検証において、データベースはｋ−通りに分割され、各サブセットは、訓練と検証のｋ回目の一つにおいて、検定セットとして用いる。これは一つを抜き出す相互検証（leave-one-out cross-validation (LOOCV)）にまで伸張することができ、ここで各試料は、データベースにおける残りの試料から生成する分類子に従って分類する（“leave one out”；検定される試料を抜き出す）。
【０１３１】
ＬＤＡおよびＬＯＯＣＶは、ＴＣＣの診断を改良することにおいて、下方制御ＢＴＭであるＬＴＢ４ＤＨの有用性を例示するために用いた。ｑＰＣＲを最初に、さらなる３０のグレード３腫瘍（５＞ステージ１、１３＝ステージ１、４＝Ｔｉｓ，および８＝Ｔａ）を補足した、図１３に記載したコントロールおよびＴＣＣ尿試料のコホートについて行った。六つの遺伝子ＬＴＢ４ＤＨ、ＭＤＫ、ＩＧＦＢＰ５、ＨＯＸＡ１３、ＴＯＰ２ａおよびＣＤＣ２の組み合わせを、ＬＯＯＣＶによって判定して、分類子性能に関して検定した。事後確率（「脱落」した試料はＴＣＣ試料であったこと）を、Ｒ統計プログラミング環境のＲＯＣＲパッケージを用いてＲＯＣ曲線を作製するために用いた。一定の特異性に対する分類子の感度は適切なＲＯＣ曲線を参照して得た。
【０１３２】
ＬＴＢ４ＤＨを伴う、または伴わない上方制御ＢＴＭの組み合わせを用いたＴＣＣの検出感度は、８５％の特異性で測定した。この分析の結果を図１５に示す。上方制御されるＢＴＭｓであるＭＤＫ、ＩＧＦＢＰ５、Ｔｏｐ２ａ、ｃｄｃ２およびＨｏｘＡ１３の組み合わせを含むアッセイにＬＴＢ４ＤＨを加えることにより、総合感度を１〜２％、およびＴａステージの腫瘍、グレード１〜２の腫瘍およびグレード３の腫瘍の検出感度を３％上昇することが分かる。
【０１３３】
先の記述において、公知の同等物を有する完全体または構成成分について参照したが、そのような同等物は、個々に述べられたとして本明細書に援用される。
【０１３４】
本発明は、例証として、およびそれらの可能な実施態様を参照して説明したが、当然のことながら、本発明の範囲または精神から逸脱することなく、改良および／または改変してもよい。
【０１３５】
産業上の利用可能性
ＢＴＭファミリーメンバーの検出法には、マイクロアレイおよび／またはリアルタイムＰＣＲ法を用いた、核酸、タンパクおよびペプチドの検出を含む。本発明の組成物および方法は、疾患の診断、治療法の有効性の評価、ならびにＢＴＭファミリーメンバーの発現を測定するのに適した試薬および試験キットを製造するために有用である。
【図面の簡単な説明】
【０１３６】
本発明を、特定の本発明の実施態様に準拠しておよび図を参照して説明するが、ここで：
【図１−１】図１は、ｑＰＣＲ分析において用いられた尿試料の特徴を示す表を示す。
【図１−２】図１は、ｑＰＣＲ分析において用いられた尿試料の特徴を示す表を示す。
【図２】図２は、本発明に拠る膀胱癌のｑＰＣＲ分析のためのマーカーのプライマーおよびオリゴヌクレオチドの表を示す。
【図３−１】図３は、膀胱癌の試料についてマイクロアレイ法を用いて同定した低発現膀胱腫瘍マーカーの表を示す。
【図３−２】図３は、膀胱癌の試料についてマイクロアレイ法を用いて同定した低発現膀胱腫瘍マーカーの表を示す。
【図３−３】図３は、膀胱癌の試料についてマイクロアレイ法を用いて同定した低発現膀胱腫瘍マーカーの表を示す。
【図３−４】図３は、膀胱癌の試料についてマイクロアレイ法を用いて同定した低発現膀胱腫瘍マーカーの表を示す。
【図３−５】図３は、膀胱癌の試料についてマイクロアレイ法を用いて同定した低発現膀胱腫瘍マーカーの表を示す。
【図３−６】図３は、膀胱癌の試料についてマイクロアレイ法を用いて同定した低発現膀胱腫瘍マーカーの表を示す。
【図３−７】図３は、膀胱癌の試料についてマイクロアレイ法を用いて同定した低発現膀胱腫瘍マーカーの表を示す。
【図３−８】図３は、膀胱癌の試料についてマイクロアレイ法を用いて同定した低発現膀胱腫瘍マーカーの表を示す。
【図３−９】図３は、膀胱癌の試料についてマイクロアレイ法を用いて同定した低発現膀胱腫瘍マーカーの表を示す。
【図３−１０】図３は、膀胱癌の試料についてマイクロアレイ法を用いて同定した低発現膀胱腫瘍マーカーの表を示す。
【図３−１１】図３は、膀胱癌の試料についてマイクロアレイ法を用いて同定した低発現膀胱腫瘍マーカーの表を示す。
【図３−１２】図３は、膀胱癌の試料についてマイクロアレイ法を用いて同定した低発現膀胱腫瘍マーカーの表を示す。
【図３−１３】図３は、膀胱癌の試料についてマイクロアレイ法を用いて同定した低発現膀胱腫瘍マーカーの表を示す。
【図３−１４】図３は、膀胱癌の試料についてマイクロアレイ法を用いて同定した低発現膀胱腫瘍マーカーの表を示す。
【図３−１５】図３は、膀胱癌の試料についてマイクロアレイ法を用いて同定した低発現膀胱腫瘍マーカーの表を示す。
【図３−１６】図３は、膀胱癌の試料についてマイクロアレイ法を用いて同定した低発現膀胱腫瘍マーカーの表を示す。
【図３−１７】図３は、膀胱癌の試料についてマイクロアレイ法を用いて同定した低発現膀胱腫瘍マーカーの表を示す。
【図３−１８】図３は、膀胱癌の試料についてマイクロアレイ法を用いて同定した低発現膀胱腫瘍マーカーの表を示す。
【図３−１９】図３は、膀胱癌の試料についてマイクロアレイ法を用いて同定した低発現膀胱腫瘍マーカーの表を示す。
【図３−２０】図３は、膀胱癌の試料についてマイクロアレイ法を用いて同定した低発現膀胱腫瘍マーカーの表を示す。
【図３−２１】図３は、膀胱癌の試料についてマイクロアレイ法を用いて同定した低発現膀胱腫瘍マーカーの表を示す。
【図３−２２】図３は、膀胱癌の試料についてマイクロアレイ法を用いて同定した低発現膀胱腫瘍マーカーの表を示す。
【図３−２３】図３は、膀胱癌の試料についてマイクロアレイ法を用いて同定した低発現膀胱腫瘍マーカーの表を示す。
【図３−２４】図３は、膀胱癌の試料についてマイクロアレイ法を用いて同定した低発現膀胱腫瘍マーカーの表を示す。
【図３−２５】図３は、膀胱癌の試料についてマイクロアレイ法を用いて同定した低発現膀胱腫瘍マーカーの表を示す。
【図３−２６】図３は、膀胱癌の試料についてマイクロアレイ法を用いて同定した低発現膀胱腫瘍マーカーの表を示す。
【図３−２７】図３は、膀胱癌の試料についてマイクロアレイ法を用いて同定した低発現膀胱腫瘍マーカーの表を示す。
【図３−２８】図３は、膀胱癌の試料についてマイクロアレイ法を用いて同定した低発現膀胱腫瘍マーカーの表を示す。
【図３−２９】図３は、膀胱癌の試料についてマイクロアレイ法を用いて同定した低発現膀胱腫瘍マーカーの表を示す。
【図３−３０】図３は、膀胱癌の試料についてマイクロアレイ法を用いて同定した低発現膀胱腫瘍マーカーの表を示す。
【図３−３１】図３は、膀胱癌の試料についてマイクロアレイ法を用いて同定した低発現膀胱腫瘍マーカーの表を示す。
【図３−３２】図３は、膀胱癌の試料についてマイクロアレイ法を用いて同定した低発現膀胱腫瘍マーカーの表を示す。
【図３−３３】図３は、膀胱癌の試料についてマイクロアレイ法を用いて同定した低発現膀胱腫瘍マーカーの表を示す。
【図３−３４】図３は、膀胱癌の試料についてマイクロアレイ法を用いて同定した低発現膀胱腫瘍マーカーの表を示す。
【図３−３５】図３は、膀胱癌の試料についてマイクロアレイ法を用いて同定した低発現膀胱腫瘍マーカーの表を示す。
【図３−３６】図３は、膀胱癌の試料についてマイクロアレイ法を用いて同定した低発現膀胱腫瘍マーカーの表を示す。
【図３−３７】図３は、膀胱癌の試料についてマイクロアレイ法を用いて同定した低発現膀胱腫瘍マーカーの表を示す。
【図３−３８】図３は、膀胱癌の試料についてマイクロアレイ法を用いて同定した低発現膀胱腫瘍マーカーの表を示す。
【図３−３９】図３は、膀胱癌の試料についてマイクロアレイ法を用いて同定した低発現膀胱腫瘍マーカーの表を示す。
【図３−４０】図３は、膀胱癌の試料についてマイクロアレイ法を用いて同定した低発現膀胱腫瘍マーカーの表を示す。
【図３−４１】図３は、膀胱癌の試料についてマイクロアレイ法を用いて同定した低発現膀胱腫瘍マーカーの表を示す。
【図３−４２】図３は、膀胱癌の試料についてマイクロアレイ法を用いて同定した低発現膀胱腫瘍マーカーの表を示す。
【図３−４３】図３は、膀胱癌の試料についてマイクロアレイ法を用いて同定した低発現膀胱腫瘍マーカーの表を示す。
【図３−４４】図３は、膀胱癌の試料についてマイクロアレイ法を用いて同定した低発現膀胱腫瘍マーカーの表を示す。
【図３−４５】図３は、膀胱癌の試料についてマイクロアレイ法を用いて同定した低発現膀胱腫瘍マーカーの表を示す。
【図３−４６】図３は、膀胱癌の試料についてマイクロアレイ法を用いて同定した低発現膀胱腫瘍マーカーの表を示す。
【図３−４７】図３は、膀胱癌の試料についてマイクロアレイ法を用いて同定した低発現膀胱腫瘍マーカーの表を示す。
【図３−４８】図３は、膀胱癌の試料についてマイクロアレイ法を用いて同定した低発現膀胱腫瘍マーカーの表を示す。
【図３−４９】図３は、膀胱癌の試料についてマイクロアレイ法を用いて同定した低発現膀胱腫瘍マーカーの表を示す。
【図３−５０】図３は、膀胱癌の試料についてマイクロアレイ法を用いて同定した低発現膀胱腫瘍マーカーの表を示す。
【図３−５１】図３は、膀胱癌の試料についてマイクロアレイ法を用いて同定した低発現膀胱腫瘍マーカーの表を示す。
【図４−１】図４は、膀胱癌の試料についてマイクロアレイ法を用いて同定した、全血においては殆ど発現していないが、正常膀胱組織においては高度に発現している低発現膀胱腫瘍マーカーの表を示す。
【図４−２】図４は、膀胱癌の試料についてマイクロアレイ法を用いて同定した、全血においては殆ど発現していないが、正常膀胱組織においては高度に発現している低発現膀胱腫瘍マーカーの表を示す。
【図４−３】図４は、膀胱癌の試料についてマイクロアレイ法を用いて同定した、全血においては殆ど発現していないが、正常膀胱組織においては高度に発現している低発現膀胱腫瘍マーカーの表を示す。
【図４−４】図４は、膀胱癌の試料についてマイクロアレイ法を用いて同定した、全血においては殆ど発現していないが、正常膀胱組織においては高度に発現している低発現膀胱腫瘍マーカーの表を示す。
【図５】図５は、非悪性泌尿器疾患またはＴＣＣを有する患者からの尿試料について、三つの膀胱移行上皮癌（ＴＣＣ）マーカー（HoxA13、IGFBP5およびMDK）と低発現マーカーＬＴＢ４ＤＨとの比を示すボックスアンドウィスカープロット（箱髭図）を表す。ボックスは第２５、５０および７５番パーセンタイルを規定し、水平のバーは隣接の値を印す。異常値は丸で示す。中空ボックスは非悪性疾患コントロールからの試料を表し、斜線ボックスはＴＣＣ患者からの試料を表す。
【図６】図６は、ＬＴＢ４ＤＨを含む試験のための、ＴＣＣ検出の感度および特異性の例を示す。（ａ）単独試験；（ｂ）ＬＴＢ４ＤＨおよび三つのマーカーＨｏｘＡ１３、ＩＧＦＢＰ５およびＭＤＫの内の二つを用いた組み合わせ試験。
【図７】図７ａ〜ｃは、ＬＴＢ４ＤＨを含む比を用いた、尿試料中のＴＣＣの検出の感度および特異性に関するＲＯＣ曲線を示す。７ａ．ＩＧＦＢＰ５／ＬＴＢ４ＤＨ；７ｂ．ＭＤＫ／ＬＴ４ＢＤＨ；７ｃ．ＨｏｘＡ１３／ＬＴＢ４ＤＨ。
【図８ａ】図８ａ〜ｆは、組み合わせ試験の散乱プロットを示し、ａ〜ｃは、ＬＴＢ４ＤＨおよび三つのマーカーHoxA13、IGFBP5およびMDKの内の二つを用い、ｄ〜ｆは、ＬＴＢ４ＤＨの代わりにＢＡＧ１を用いて繰り返した。８ａ．ＭＤＫ／ＬＴＢ４ＤＨおよびＩＧＦＢＰ５／ＬＴＢ４ＤＨ。
【図８ｂ】図８ａ〜ｆは、組み合わせ試験の散乱プロットを示し、ａ〜ｃは、ＬＴＢ４ＤＨおよび三つのマーカーHoxA13、IGFBP5およびMDKの内の二つを用い、ｄ〜ｆは、ＬＴＢ４ＤＨの代わりにＢＡＧ１を用いて繰り返した。８ｂ．ＭＤＫ／ＬＴＢ４ＤＨおよびＨｏｘＡ１３／ＬＴＢ４ＤＨ；ＩＧＦＢＰ５／ＬＴＢ４ＤＨおよびＨｏｘＡ１３／ＬＴＢ４ＤＨ。
【図８ｃ】図８ａ〜ｆは、組み合わせ試験の散乱プロットを示し、ａ〜ｃは、ＬＴＢ４ＤＨおよび三つのマーカーHoxA13、IGFBP5およびMDKの内の二つを用い、ｄ〜ｆは、ＬＴＢ４ＤＨの代わりにＢＡＧ１を用いて繰り返した。
【図８ｄ】図８ａ〜ｆは、組み合わせ試験の散乱プロットを示し、ａ〜ｃは、ＬＴＢ４ＤＨおよび三つのマーカーHoxA13、IGFBP5およびMDKの内の二つを用い、ｄ〜ｆは、ＬＴＢ４ＤＨの代わりにＢＡＧ１を用いて繰り返した。８ｄ．ＭＤＫ／ＢＡＧ１およびＩＧＦＢＰ５／ＢＡＧ１。
【図８ｅ】図８ａ〜ｆは、組み合わせ試験の散乱プロットを示し、ａ〜ｃは、ＬＴＢ４ＤＨおよび三つのマーカーHoxA13、IGFBP5およびMDKの内の二つを用い、ｄ〜ｆは、ＬＴＢ４ＤＨの代わりにＢＡＧ１を用いて繰り返した。８ｅ．ＭＤＫ／ＢＡＧ１およびＨｏｘＡ１３／ＢＡＧ１。
【図８ｆ】図８ａ〜ｆは、組み合わせ試験の散乱プロットを示し、ａ〜ｃは、ＬＴＢ４ＤＨおよび三つのマーカーHoxA13、IGFBP5およびMDKの内の二つを用い、ｄ〜ｆは、ＬＴＢ４ＤＨの代わりにＢＡＧ１を用いて繰り返した。８ｆ．ＩＧＦＢＰ５／ＢＡＧ１およびＨｏｘＡ１３／ＢＡＧ１。
【図９ａ】図９ａ〜ｂは、ＩＧＦＢＰ５に関するΔＣｔならびにＩＧＦＢＰ５／ＬＴＢ４ＤＨおよび尿クレアチニン濃度に関するΔＣｔ比の間の相関関係を示す散乱プロットを示す。９ａ．ＴＣＣを有する患者からの尿試料。
【図９ｂ】図９ａ〜ｂは、ＩＧＦＢＰ５に関するΔＣｔならびにＩＧＦＢＰ５／ＬＴＢ４ＤＨおよび尿クレアチニン濃度に関するΔＣｔ比の間の相関関係を示す散乱プロットを示す。９ｂ．非悪性疾患を有する患者からの尿試料。
【図１０ａ】図１０ａ〜ｆは、膀胱腫瘍マーカーＭＤＫ、ＩＧＦＢＰ５およびＨｏｘＡ１３単独またはＬＴＢ４ＤＨとの比を用いて分析したＴＣＣ患者からの、排泄採取およびカテーテル採取試料の分布を示す、自己散乱プロット（Self-self scatter plots）を表す。
【図１０ｂ】図１０ａ〜ｆは、膀胱腫瘍マーカーＭＤＫ、ＩＧＦＢＰ５およびＨｏｘＡ１３単独またはＬＴＢ４ＤＨとの比を用いて分析したＴＣＣ患者からの、排泄採取およびカテーテル採取試料の分布を示す、自己散乱プロット（Self-self scatter plots）を表す。
【図１０ｃ】図１０ａ〜ｆは、膀胱腫瘍マーカーＭＤＫ、ＩＧＦＢＰ５およびＨｏｘＡ１３単独またはＬＴＢ４ＤＨとの比を用いて分析したＴＣＣ患者からの、排泄採取およびカテーテル採取試料の分布を示す、自己散乱プロット（Self-self scatter plots）を表す。
【図１０ｄ】図１０ａ〜ｆは、膀胱腫瘍マーカーＭＤＫ、ＩＧＦＢＰ５およびＨｏｘＡ１３単独またはＬＴＢ４ＤＨとの比を用いて分析したＴＣＣ患者からの、排泄採取およびカテーテル採取試料の分布を示す、自己散乱プロット（Self-self scatter plots）を表す。
【図１０ｅ】図１０ａ〜ｆは、膀胱腫瘍マーカーＭＤＫ、ＩＧＦＢＰ５およびＨｏｘＡ１３単独またはＬＴＢ４ＤＨとの比を用いて分析したＴＣＣ患者からの、排泄採取およびカテーテル採取試料の分布を示す、自己散乱プロット（Self-self scatter plots）を表す。
【図１０ｆ】図１０ａ〜ｆは、膀胱腫瘍マーカーＭＤＫ、ＩＧＦＢＰ５およびＨｏｘＡ１３単独またはＬＴＢ４ＤＨとの比を用いて分析したＴＣＣ患者からの、排泄採取およびカテーテル採取試料の分布を示す、自己散乱プロット（Self-self scatter plots）を表す。
【図１１−１】図１１は、浸潤性膀胱腫瘍からの既知の過剰発現マーカーを示す。
【図１１−２】図１１は、浸潤性膀胱腫瘍からの既知の過剰発現マーカーを示す。
【図１１−３】図１１は、浸潤性膀胱腫瘍からの既知の過剰発現マーカーを示す。
【図１１−４】図１１は、浸潤性膀胱腫瘍からの既知の過剰発現マーカーを示す。
【図１１−５】図１１は、浸潤性膀胱腫瘍からの既知の過剰発現マーカーを示す。
【図１１−６】図１１は、浸潤性膀胱腫瘍からの既知の過剰発現マーカーを示す。
【図１１−７】図１１は、浸潤性膀胱腫瘍からの既知の過剰発現マーカーを示す。
【図１１−８】図１１は、浸潤性膀胱腫瘍からの既知の過剰発現マーカーを示す。
【図１１−９】図１１は、浸潤性膀胱腫瘍からの既知の過剰発現マーカーを示す。
【図１１−１０】図１１は、浸潤性膀胱腫瘍からの既知の過剰発現マーカーを示す。
【図１１−１１】図１１は、浸潤性膀胱腫瘍からの既知の過剰発現マーカーを示す。
【図１１−１２】図１１は、浸潤性膀胱腫瘍からの既知の過剰発現マーカーを示す。
【図１１−１３】図１１は、浸潤性膀胱腫瘍からの既知の過剰発現マーカーを示す。
【図１１−１４】図１１は、浸潤性膀胱腫瘍からの既知の過剰発現マーカーを示す。
【図１１−１５】図１１は、浸潤性膀胱腫瘍からの既知の過剰発現マーカーを示す。
【図１１−１６】図１１は、浸潤性膀胱腫瘍からの既知の過剰発現マーカーを示す。
【図１２−１】図１２は、表在性膀胱腫瘍からの既知の過剰発現マーカーを示す。
【図１２−２】図１２は、表在性膀胱腫瘍からの既知の過剰発現マーカーを示す。
【図１２−３】図１２は、表在性膀胱腫瘍からの既知の過剰発現マーカーを示す。
【図１２−４】図１２は、表在性膀胱腫瘍からの既知の過剰発現マーカーを示す。
【図１２−５】図１２は、表在性膀胱腫瘍からの既知の過剰発現マーカーを示す。
【図１２−６】図１２は、表在性膀胱腫瘍からの既知の過剰発現マーカーを示す。
【図１２−７】図１２は、表在性膀胱腫瘍からの既知の過剰発現マーカーを示す。
【図１２−８】図１２は、表在性膀胱腫瘍からの既知の過剰発現マーカーを示す。
【図１２−９】図１２は、表在性膀胱腫瘍からの既知の過剰発現マーカーを示す。
【図１２−１０】図１２は、表在性膀胱腫瘍からの既知の過剰発現マーカーを示す。
【図１２−１１】図１２は、表在性膀胱腫瘍からの既知の過剰発現マーカーを示す。
【図１２−１２】図１２は、表在性膀胱腫瘍からの既知の過剰発現マーカーを示す。
【図１２−１３】図１２は、表在性膀胱腫瘍からの既知の過剰発現マーカーを示す。
【図１２−１４】図１２は、表在性膀胱腫瘍からの既知の過剰発現マーカーを示す。
【図１２−１５】図１２は、表在性膀胱腫瘍からの既知の過剰発現マーカーを示す。
【図１３】図１３は、ＲＯＣ曲線分析で使用した低段階ＴＣＣ試料およびコントロールの臨床的特徴を示す。
【図１４】図１４は、ＲＯＣ曲線分析の結果を示す。ＬＴＢ４ＤＨがＨｏｘＡ１３およびＩＧＦＢＰ５との比として用いられた時得られる試験の正確度の増加の図示。
【図１５】図１５は、ＴＣＣの検出に関して、ＬＴＢ４ＤＨの存在および非存在下での、ＢＴＭの線形識別分析の結果を示す。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ） 該対象からの試料を提供するステップ；
（ｂ） 少なくとも一つのＴＭが低発現ＴＭである、前記試料中の少なくとも二つのＴＭファミリーメンバーの発現レベルを検出するステップ；および
（ｃ） あらかじめ定めた閾値に従って、患者が癌を有するかを立証するステップ；
を含む、対象における癌の存在を決定する方法。
【請求項２】
ステップ（ｃ）を、前記ＢＴＭの発現比を測定することによって行う、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
ステップ（ｃ）を、該ＢＴＭ発現値の回帰または分類分析によって行う、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
該ＴＭがＢＴＭである、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記癌が膀胱癌である、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
該ＴＭの少なくとも一つが過剰発現ＴＭである、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
該少なくとも一つの低発現ＴＭが、図３に概要を述べた群から選択されるＢＴＭである、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
該少なくとも一つの低発現ＴＭが、図４に概要を述べた群から選択されるＢＴＭである、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
該過剰発現ＴＭが、図１１または図１２に概要を述べた群から選択されるＢＴＭである、請求項６に記載の方法。
【請求項１０】
検出する前記ステップを、ＴＭ ｍＲＮＡの発現を検出することによって行う、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
検出する前記ステップを、ＴＭタンパクの発現を検出することによって行う、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
検出する前記ステップを、ＴＭペプチドの発現を検出することによって行う、請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
該試料が、生検、血液、血清、腹膜洗浄液、脳脊髄液、尿および便試料のいずれか一つである、請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
その上にＴＭキャプチャー試薬を有する基材；および
前記基質に付随する検出器で、前記キャプチャー試薬に結合している低発現ＴＭを検出することができる前記検出器；
を含む、ＴＭを検出するための装置。
【請求項１５】
該ＴＭがＢＴＭである、請求項１４に記載の装置。
【請求項１６】
前記ＴＭキャプチャー試薬がオリゴヌクレオチドである、請求項１４に記載の装置。
【請求項１７】
前記ＴＭキャプチャー試薬が抗体である、請求項１４に記載の装置。
【請求項１８】
該ＴＭが図３に概要を述べた群から選択されるＢＴＭである、請求項１４に記載の装置。
【請求項１９】
該ＴＭが図４に概要を述べた群から選択されるＢＴＭである、請求項１４に記載の装置。
【請求項２０】
基材；
少なくとも一つのＴＭが低発現ＴＭである、少なくとも二つのＴＭキャプチャー試薬；
および
使用のための指示書；
を含む、対象における癌の存在を決定するためのキット。
【請求項２１】
該ＴＭがＢＴＭである、請求項２０に記載のキット。
【請求項２２】
前記ＴＭキャプチャー試薬が、ＴＭ特異的オリゴヌクレオチドである、請求項２０に記載のキット。
【請求項２３】
前記ＴＭキャプチャー試薬が、ＴＭ特異的抗体である、請求項２０に記載のキット。
【請求項２４】
該低発現ＴＭが、図３に概要を述べた群から選択されるＢＴＭである、請求項２０に記載のキット。
【請求項２５】
該低発現ＴＭが、図４に概要を述べた群から選択されるＢＴＭである、請求項２０に記載のキット。
【請求項２６】
少なくとも一つのＴＭが過剰発現ＴＭである、請求項２０に記載のキット。
【請求項２７】
該過剰発現ＴＭが図１１または図１２に概要を述べた群から選択されるＢＴＭである、請求項２６に記載のキット。
【請求項１】
（ａ） 該対象からの試料を提供するステップ；
（ｂ） 少なくとも一つのＴＭが低発現ＴＭである、前記試料中の少なくとも二つのＴＭファミリーメンバーの発現レベルを検出するステップ；および
（ｃ） あらかじめ定めた閾値に従って、患者が癌を有するかを立証するステップ；
を含む、対象における癌の存在を決定する方法。
【請求項２】
ステップ（ｃ）を、前記ＢＴＭの発現比を測定することによって行う、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
ステップ（ｃ）を、該ＢＴＭ発現値の回帰または分類分析によって行う、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
該ＴＭがＢＴＭである、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記癌が膀胱癌である、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
該ＴＭの少なくとも一つが過剰発現ＴＭである、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
該少なくとも一つの低発現ＴＭが、図３に概要を述べた群から選択されるＢＴＭである、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
該少なくとも一つの低発現ＴＭが、図４に概要を述べた群から選択されるＢＴＭである、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
該過剰発現ＴＭが、図１１または図１２に概要を述べた群から選択されるＢＴＭである、請求項６に記載の方法。
【請求項１０】
検出する前記ステップを、ＴＭ ｍＲＮＡの発現を検出することによって行う、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
検出する前記ステップを、ＴＭタンパクの発現を検出することによって行う、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
検出する前記ステップを、ＴＭペプチドの発現を検出することによって行う、請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
該試料が、生検、血液、血清、腹膜洗浄液、脳脊髄液、尿および便試料のいずれか一つである、請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
その上にＴＭキャプチャー試薬を有する基材；および
前記基質に付随する検出器で、前記キャプチャー試薬に結合している低発現ＴＭを検出することができる前記検出器；
を含む、ＴＭを検出するための装置。
【請求項１５】
該ＴＭがＢＴＭである、請求項１４に記載の装置。
【請求項１６】
前記ＴＭキャプチャー試薬がオリゴヌクレオチドである、請求項１４に記載の装置。
【請求項１７】
前記ＴＭキャプチャー試薬が抗体である、請求項１４に記載の装置。
【請求項１８】
該ＴＭが図３に概要を述べた群から選択されるＢＴＭである、請求項１４に記載の装置。
【請求項１９】
該ＴＭが図４に概要を述べた群から選択されるＢＴＭである、請求項１４に記載の装置。
【請求項２０】
基材；
少なくとも一つのＴＭが低発現ＴＭである、少なくとも二つのＴＭキャプチャー試薬；
および
使用のための指示書；
を含む、対象における癌の存在を決定するためのキット。
【請求項２１】
該ＴＭがＢＴＭである、請求項２０に記載のキット。
【請求項２２】
前記ＴＭキャプチャー試薬が、ＴＭ特異的オリゴヌクレオチドである、請求項２０に記載のキット。
【請求項２３】
前記ＴＭキャプチャー試薬が、ＴＭ特異的抗体である、請求項２０に記載のキット。
【請求項２４】
該低発現ＴＭが、図３に概要を述べた群から選択されるＢＴＭである、請求項２０に記載のキット。
【請求項２５】
該低発現ＴＭが、図４に概要を述べた群から選択されるＢＴＭである、請求項２０に記載のキット。
【請求項２６】
少なくとも一つのＴＭが過剰発現ＴＭである、請求項２０に記載のキット。
【請求項２７】
該過剰発現ＴＭが図１１または図１２に概要を述べた群から選択されるＢＴＭである、請求項２６に記載のキット。
【図１−１】
【図１−２】
【図２】
【図３−１】
【図３−２】
【図３−３】
【図３−４】
【図３−５】
【図３−６】
【図３−７】
【図３−８】
【図３−９】
【図３−１０】
【図３−１１】
【図３−１２】
【図３−１３】
【図３−１４】
【図３−１５】
【図３−１６】
【図３−１７】
【図３−１８】
【図３−１９】
【図３−２０】
【図３−２１】
【図３−２２】
【図３−２３】
【図３−２４】
【図３−２５】
【図３−２６】
【図３−２７】
【図３−２８】
【図３−２９】
【図３−３０】
【図３−３１】
【図３−３２】
【図３−３３】
【図３−３４】
【図３−３５】
【図３−３６】
【図３−３７】
【図３−３８】
【図３−３９】
【図３−４０】
【図３−４１】
【図３−４２】
【図３−４３】
【図３−４４】
【図３−４５】
【図３−４６】
【図３−４７】
【図３−４８】
【図３−４９】
【図３−５０】
【図３−５１】
【図４−１】
【図４−２】
【図４−３】
【図４−４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８ａ】
【図８ｂ】
【図８ｃ】
【図８ｄ】
【図８ｅ】
【図８ｆ】
【図９ａ】
【図９ｂ】
【図１０ａ】
【図１０ｂ】
【図１０ｃ】
【図１０ｄ】
【図１０ｅ】
【図１０ｆ】
【図１１−１】
【図１１−２】
【図１１−３】
【図１１−４】
【図１１−５】
【図１１−６】
【図１１−７】
【図１１−８】
【図１１−９】
【図１１−１０】
【図１１−１１】
【図１１−１２】
【図１１−１３】
【図１１−１４】
【図１１−１５】
【図１１−１６】
【図１２−１】
【図１２−２】
【図１２−３】
【図１２−４】
【図１２−５】
【図１２−６】
【図１２−７】
【図１２−８】
【図１２−９】
【図１２−１０】
【図１２−１１】
【図１２−１２】
【図１２−１３】
【図１２−１４】
【図１２−１５】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図１−２】
【図２】
【図３−１】
【図３−２】
【図３−３】
【図３−４】
【図３−５】
【図３−６】
【図３−７】
【図３−８】
【図３−９】
【図３−１０】
【図３−１１】
【図３−１２】
【図３−１３】
【図３−１４】
【図３−１５】
【図３−１６】
【図３−１７】
【図３−１８】
【図３−１９】
【図３−２０】
【図３−２１】
【図３−２２】
【図３−２３】
【図３−２４】
【図３−２５】
【図３−２６】
【図３−２７】
【図３−２８】
【図３−２９】
【図３−３０】
【図３−３１】
【図３−３２】
【図３−３３】
【図３−３４】
【図３−３５】
【図３−３６】
【図３−３７】
【図３−３８】
【図３−３９】
【図３−４０】
【図３−４１】
【図３−４２】
【図３−４３】
【図３−４４】
【図３−４５】
【図３−４６】
【図３−４７】
【図３−４８】
【図３−４９】
【図３−５０】
【図３−５１】
【図４−１】
【図４−２】
【図４−３】
【図４−４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８ａ】
【図８ｂ】
【図８ｃ】
【図８ｄ】
【図８ｅ】
【図８ｆ】
【図９ａ】
【図９ｂ】
【図１０ａ】
【図１０ｂ】
【図１０ｃ】
【図１０ｄ】
【図１０ｅ】
【図１０ｆ】
【図１１−１】
【図１１−２】
【図１１−３】
【図１１−４】
【図１１−５】
【図１１−６】
【図１１−７】
【図１１−８】
【図１１−９】
【図１１−１０】
【図１１−１１】
【図１１−１２】
【図１１−１３】
【図１１−１４】
【図１１−１５】
【図１１−１６】
【図１２−１】
【図１２−２】
【図１２−３】
【図１２−４】
【図１２−５】
【図１２−６】
【図１２−７】
【図１２−８】
【図１２−９】
【図１２−１０】
【図１２−１１】
【図１２−１２】
【図１２−１３】
【図１２−１４】
【図１２−１５】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【公表番号】特表２００９−５２８８１７（Ｐ２００９−５２８８１７Ａ）
【公表日】平成２１年８月１３日（２００９．８．１３）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００８−５５４１７２（Ｐ２００８−５５４１７２）
【出願日】平成１９年２月９日（２００７．２．９）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＮＺ２００７／００００２９
【国際公開番号】ＷＯ２００７／０９１９０４
【国際公開日】平成１９年８月１６日（２００７．８．１６）
【出願人】（５０４３５０１２０）パシフィック エッジ バイオテクノロジー リミティド (9)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２１年８月１３日（２００９．８．１３）
【国際特許分類】
【出願日】平成１９年２月９日（２００７．２．９）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＮＺ２００７／００００２９
【国際公開番号】ＷＯ２００７／０９１９０４
【国際公開日】平成１９年８月１６日（２００７．８．１６）
【出願人】（５０４３５０１２０）パシフィック エッジ バイオテクノロジー リミティド (9)
【Ｆターム（参考）】
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